(57)【要約】対照基質と異なる検出基質セットを利用してサンプル中の異なるターゲットが分析され、各セットは特定のターゲットをとらえるように構成される。基質は、検出ステップにおいてシグナルを生成する識別子、例えば蛍光色素を含む。偽陰性、偽陽性、および検出基質の誤識別を最小化するために、基質からの予測されるシグナルは、対照基質からのシグナルに基づいて計算され、このデータはサンプル中にどのターゲットが存在するかを決定するために利用される。
2009505103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の複数の異なるターゲットを検出する方法であって、
ａ）少なくとも第一の検出基質および第二の検出基質と、少なくとも一つの対照基質とを含む検出システムを選択するステップであって、
各検出基質および対照基質は、それらと結合する少なくとも一つの識別子を持ち、該識別子は各検出基質および対照基質それぞれについて検出可能なシグナルを生成することができ、
各検出基質および対照基質についての該検出可能なシグナルは異なり、
該第一の検出基質は、該サンプル中の第一の選択されたターゲットをとらえるように適合され、該第二の検出基質は、該サンプル中の第二の選択されたターゲットをとらえるように適合され、該第一の選択されたターゲットと、第二の選択されたターゲットとは異なる、ステップと、
ｂ）該検出基質および該対照基質に検出可能なシグナルを生成させ、該生成された検出可能なシグナルの強度を決定するステップと、
ｃ）各検出基質についての相対比率を生成するために、該検出基質から該対照基質までの検出可能なシグナルの比率を確認するステップと、
ｄ）ターゲットをとらえるために、該サンプルと、該第一の検出基質および第二の検出基質とを接触させるステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の後、該検出基質および該対照基質に、第一の検出可能なシグナルおよび第二の検出可能なシグナルを生成させ、該生成された検出可能なシグナルの強度を決定するステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）からの該対照基質の該生成された検出可能なシグナルの該決定された強度と、ステップ（ｃ）からの各検出基質に対する該相対比率に基づいて、該検出基質の各セットの予測される検出可能なシグナル強度を確認するステップと、
ｇ）ステップ（ｅ）の該生成された検出可能なシグナルのうちの少なくとも一部を、該検出基質のそれぞれのセットと関連付けるために、ステップ（ｅ）からの該検出基質の該決定された強度を、ステップ（ｆ）からの該予測された検出可能なシグナル強度と比較するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｄ）は、前記サンプルを、前記セットのいずれの一部でもない、関連付けられていない基質と接触させるステップを含み、ステップ（ｅ）において生成される前記検出可能なシグナルの一部は、該関連付けられていない基質からであり、前記比較するステップ（ｇ）は、該関連付けられていない基質から生成されるものとしてシグナルを識別するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｆ）および（ｇ）はコンピュータ上で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルと前記対照基質とを接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｄ）は、前記サンプルと前記対照基質を接触させるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対照基質は検出基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対照基質は前記検出基質のそれぞれとは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対照基質は、前記サンプル中に存在するいかなるターゲットもとらえる能力を実質的に持たない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記識別子は蛍光標識である、請求項１〜請求項８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光標識は近赤外蛍光を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも一つの検出基質または少なくとも一つの対照基質は、それらと結合する少なくとも二つの識別子を有し、各識別子は異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
各検出基質および対照基質は、それらと結合する第一の識別子および第二の識別子を有し、該第一の識別子および該第二の識別子は、各検出基質および対照基質それぞれについての第一の検出可能なシグナルおよび第二の検出可能なシグナルのセットを生成可能であり、該第一の検出可能なシグナルと該第二の検出可能なシグナルとは異なり、各検出基質および対照基質からの該第一の検出可能なシグナルと、該第二の検出可能なシグナルのセットとの強度は互いに異なる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出基質の少なくとも一つまたは前記対照基質の少なくとも一つは、それらと結合する三つ以上の識別子を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出基質の少なくとも一つは、前記サンプル中のターゲットをとらえるように適合され、該ターゲットはそれと結合する検出色素を有し、該検出色素に検出可能なシグナルを生成させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出色素から前記検出可能なシグナルを検出し、該検出色素と前記ターゲットとを結合するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記基質はビーズである、請求項１〜請求項１５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記基質はビーズであり、ステップ（ｂ）または（ｅ）の少なくとも一つはマルチプルウェルプレートまたはフローサイトメータを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
サンプル中の複数の異なるターゲットを検出するためのシステムであって、
少なくとも第一の検出基質および第二の検出基質と、少なくとも一つの対照基質とを含み、
各基質はそれらと結合する第一の識別子および第二の識別子を有し、
該第一の識別子および該第二の識別子は、第一の検出可能なシグナルおよび第二の検出可能なシグナルをそれぞれ生成可能であり、
該第一の検出可能なシグナルと該第二の検出可能なシグナルとは異なり、
該第一の検出基質は、該サンプル中の第一の選択されたターゲットをとらえることができ、該第二の検出基質は、該サンプル中の第二の選択されたターゲットをとらえることができ、該第一の選択されたターゲットと該第二の選択されたターゲットとは異なり、
各検出基質からの該検出可能なシグナルと該対照基質からの該検出可能なシグナルとの強度は、該検出可能なシグナルの少なくとも一つに関して互いに異なる、システム。
【請求項１９】
サンプル中の複数の異なるターゲットを分析するためのキットであって、
ａ）少なくとも第一の検出基質および第二の検出基質と、少なくとも一つの対照基質とを含む検出システムであって、
各検出基質および対照基質は、それらと結合する少なくとも一つの識別子を有し、該識別子は各検出基質および対照基質のそれぞれに対して検出可能なシグナルを生成可能であり、
各検出基質に対する該検出可能なシグナルは異なり、
該第一の検出基質は該サンプル中の第一の選択されたターゲットをとらえるように適合され、該第二の検出基質は該サンプル中の第二の選択されたターゲットをとらえるように適合され、該第一の選択されたターゲットと第二の選択されたターゲットとは異なる、検出システムと、
ｂ）該検出基質の各セットに対する、予測される検出可能なシグナル強度を、該対照基質からの該検出可能なシグナルの決定された強度に基づいて計算するためのデータを提供する媒体と
を含む、キット。
【請求項２０】
前記対照基質は前記検出基質のうちの一つと同じである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記対照基質は前記検出基質のそれぞれと異なる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記対照基質は、前記サンプル中に存在するいかなるターゲットをとらえる能力も実質的に有さない、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
各検出基質および対照基質は、それらと結合する第一の識別子および第二の識別子を有し、該第一の識別子および該第二の識別子は、各検出基質および対照基質それぞれに対する第一の検出可能なシグナルおよび第二の検出可能なシグナルのセットを生成することができ、該第一の検出可能なシグナルと該第二の検出可能なシグナルとは異なり、各検出基質および対照基質からの第一の検出可能なシグナルと第二の検出可能なシグナルのセットとの強度は互いに異なる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２４】
アッセイを実施するための説明書を含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２５】
前記アッセイを実施するための前記説明書は、
ｉ）選択されたターゲットをとらえるために、前記サンプルと前記検出基質を接触させるステップと、
ｉｉ）ステップ（ｉ）の後、該検出基質と前記対照基質に前記第一の検出可能なシグナルおよび前記第二の検出可能なシグナルを生成させ、該検出可能なシグナルの強度を決定するステップと、
ｉｉｉ）該検出基質の各セットに対する予測される検出可能なシグナル強度を、ステップ（ｉｉ）からの該対照基質の該検出可能なシグナルの該決定された強度および前記キットにおいて提供されるデータに基づいて確認するステップと、
ｉｖ）ステップ（ｉｉ）の該検出可能なシグナルの少なくとも一部を該検出基質のそれぞれのセットと関連付けるために、ステップ（ｉｉ）からの該検出基質の該決定された強度と、ステップ（ｉｉｉ）からの該予測された検出可能なシグナル強度とを比較するステップ
の説明を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記基質はビーズであり、前記対照基質の直径は、前記検出基質より少なくとも１０％大きいか、または少なくとも１０％小さい、請求項１、１８、または１９に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、２００５年８月１９日に出願された米国特許出願第１１／２０８，１４５号に対する優先権を主張し、該出願の全内容は、本明細書において、参考により援用される。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中の複数の異なるターゲットを検出するための、異なる種類と量の蛍光色素で標識された基質を用いるシステムが公知である。検出ステップの間、様々な基質間で識別するために、蛍光色素は異なる検出可能なシグナルを生成する。多くの場合粒子またはビーズである、それぞれの異なる種類の基質は、サンプル中の異なるターゲットをとらえるように適合され、結果として、サンプル中の複数の異なるターゲットが同時に検出されることを可能にする。
【０００３】
そのようなシステムに関連する問題は、蛍光色素から、どのシグナルが特定のビーズと関連しているかを決定するのが困難で、結果として、ターゲットに関していくらかの偽陽性および偽陰性の原因となることである。異なる機器によるばらつきもまた、不正確さの原因になり得る。使用される異なる種類のビーズの数が増加するにつれて、不正確さの量は増加し得、シグナルを特定のビーズに関連付けることを難しくし得る。また、壊れたビーズやその他の残渣によって偽のシグナルがもたらされることもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、偽陽性や偽陰性、検出基質の誤識別の数が減少される、サンプル中の複数のターゲットを同時に検出するための信頼性が高く、正確なシステムへのニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、このニーズを満たす、サンプル中の複数の異なるターゲットを検出するための検出システムを提供する。該検出システムは、少なくとも二つの検出基質（すなわち、第一および第二の検出基質）と少なくとも一つの対照基質を含む。該基質は、典型的にはビーズセットである。各基質は、それらと結合する少なくとも一つの識別子、典型的には蛍光標識を有する。識別子は検出可能なシグナルを生成することができ、各検出基質および対照基質に対する検出可能なシグナルは異なる。好ましくは、各検出基質および対照基質は、それらと結合する第一および第二の識別子を持ち、第一および第二の識別子は、各検出基質および対照基質のそれぞれに対する、第一および第二の検出可能なシグナルのセットを生成することができ、ここで第一および第二の検出可能なシグナルは異なり、各検出基質および対照基質からの第一および第二の検出可能なシグナルのセットの強度は、互いに異なる。より好ましくは、識別子は、近赤外波長の検出可能なシグナルを生成するシアニン色素である。
【０００６】
第一の検出基質は、サンプル中の第一の選択されたターゲットをとらえることができ、第二の検出基質は同様にサンプル中の第二の選択されたターゲットをとらえることができ、ここで第一および第二の選択されたターゲットは異なる。好ましくは、ターゲットはそれらと結合する検出色素を持ち、検出色素は検出可能なシグナルを生成することができる。
【０００７】
一つの実施形態では、対照基質は、実質的にサンプル中に存在するいかなるターゲットもとらえることができない。別の実施形態では、対照基質は検出基質のうちの一つと同じ種類の基質である。
【０００８】
検出基質と対照基質に検出可能なシグナルを生成させ、対照基質から得られるシグナル強度に対する、検出基質から得られるシグナル強度の相対比率をコンピュータ処理することによって、検出システムが正規化される。
【０００９】
アッセイでは、サンプル中のターゲットをとらえるためにサンプルを検出基質と接触させる。次に、検出基質と対照基質に検出可能なシグナルを生成させ、生成されたシグナルの強度を決定する。それらの特異的なターゲットをとらえ、自らに結合された検出色素を有する基質もまた、分析用の検出シグナル、例えば蛍光発光を生成することができる。基質は、自身に組み込まれた識別子の固有の組み合わせによって少なくとも部分的に識別される。本発明に従うと、検出基質の各セットに対する予測される検出可能なシグナルは、正規化データを用いて、対照基質からのシグナルの決定強度に基づいて確認される。予測される検出可能なシグナルを、ルックアップテーブルなどからの対照基質を用いてコンピュータ処理することができ、これにより使用されている検出システムに「正規化」データを提供する。次に、生成された検出可能なシグナルの少なくとも一部をそれぞれの検出基質と関連付けるために、生成される検出基質の強度を予測される検出可能なシグナルの強度と比較する。
【００１０】
本発明はまた、サンプル中の複数のターゲットを分析するためのキットを提供する。キットは、検出システムと、各検出基質セットに関する正規化データを含む媒体、例えばコンピュータディスクまたは印刷された文書を含む。キットはまた、アッセイを実施するための説明書を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の、これらの、ならびにその他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および付属の図面によってより明確に理解されるであろう。
【００１２】
本発明は、サンプル中の複数の異なるターゲットを検出するために実施されるアッセイの改良を目的とする。本発明は、各基質に対して「相対比率」係数を割り当てることによって、コード化された（すなわち標識された）基質、例えばビーズの母集団を自動的にそれらのターゲット検体に関連付けることによって既存のアッセイを改良する。
【００１３】
本発明では、検出システムが使用され、この検出システムは少なくとも二つの検出基質と少なくとも一つの対照基質を含む。各検出基質および対照基質は、例えば蛍光標識など、各検出基質と各対照基質に対して異なる検出可能なシグナルを生成する一つ以上の識別子を有する。「異なる」検出可能なシグナルとは、シグナルが互いに分光的に区別できることを意味する。例えば、一対の蛍光色素識別子の場合、第一および第二の識別子の波長が分光的に区別可能であり（例えば、第一および第二の検出可能なシグナルは少なくとも約１０ｎｍ離れた発光極大を有する）、各検出基質からの第一および第二の識別子の強度は、識別子のうち少なくとも一つに関して互いに異なる。代替的には、識別子は異なる大きさであり得、異なる散乱強度に基づいて区別され得る。
【００１４】
この検出システムでは二つの種類の基質、検出基質と対照基質が使用される。用語「検出」には、ターゲットの定量的分析および定性的分析の両方が含まれる。用語「ターゲット」は、その存在、活性および／または量が決定されることが望ましい物質を意味する。ターゲットを含むサンプルは、分析されるべきあらゆる種類の流体、例えば液体であってもよい。サンプルは、血液、血清、尿、脊髄液、涙などの液体であってもよい。
【００１５】
一つの実施形態では、対照基質と検出基質は異なり、対照基質はサンプル中に存在するいかなるターゲットもとらえる能力を実質的に持たない。この実施形態によると、アッセイにおいて使用されるとき、対照基質を個別に（サンプルあり、またはサンプルなしで）分析することができ、または同一のアッセイにおいて（サンプルありで）検出基質として分析することができる。別の実施形態では、対照基質は検出基質の一つと同じであってもよい（すなわち、対照基質は検出基質でもある）。この実施形態によると、アッセイにおいて使用されるとき、対照基質はその他の検出基質とアッセイされ得、または検出基質とは個別に（サンプルがない状態）分析されてもよい。
【００１６】
ターゲットは、合成物質または天然発生物質であり得る。それらは、変化していない状態、またはその他の化学種、例えば抗体および蛍光プローブなどのシグナル発生物質との集合体の状態で用いられてもよい。ターゲットを共有結合的に、または非共有結合的に、直接または特異的な結合物質を介して結合メンバーに結合させることができる。本発明が使用され得るターゲットの例には、受容体（小胞、脂質、細胞膜上の受容体、または様々なその他の受容体）；代謝小分子（例えばグルコース、フルクトース、乳糖、またはガラクトースなどのサッカライド）；アンモニア、尿素、尿酸、コレステロール、アセトアミノフェン、ビリルビンおよびクレアチニン、リガンド、特異的な受容体と結合するアゴニストまたはアンタゴニスト；ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、特異的な抗原決定基（例えばウイルス、細胞、またはその他の物質上の抗原決定基）と反応性の抗血清；薬剤；核酸またはポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ、ＥＳＴｓ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅産物、変異、変異体、またはそれらの一時的変異を含む）；タンパク質（酵素、例えば神経伝達物質の開裂に関与するもの、プロテアーゼ、キナーゼなどを含む）；酵素のための基質；ペプチド；共同因子；レクチン；糖；ポリサッカライド；細胞（細胞表面抗原を含み得る）；細胞膜；細胞小器官；複合、共有結合、または架橋状態で存在し得る他のそのような分子もしくはその他の物質が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、用語、核酸、ポリヌクレオチド、ポリ核酸、およびオリゴヌクレオチドは入れ替えて使用できる。ターゲットもまた、検体としての意味を有することができる。
【００１７】
検出基質は、サンプル中の特異的なターゲットをとらえることができる。例えば、検出基質は、特異的なターゲットを、定性的にまたは定量的に検出するために調整されるビーズ（「粒子」とも呼ばれる）であり得る。特定のターゲットをとらえるために基質を適合する技術は、米国特許出願公開第２００３／００９２００８号、同第２００３／００９２０６２号、同第２００４／０２０９２６１号に記述されており、これらは参照により本明細書に援用される。適切な調製技術の一例は、参照により本明細書に援用される米国特許第４，６０９，６８９号で説明されている。代替的には、ビーズ／粒子を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、またはＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）などの供給業者から得ることができる。
【００１８】
典型的には、検出基質および対照基質は、粒子、例えばビーズである。ビーズは実質的に同じ大きさと形状になり得るが、同じ大きさである必要はない。サイトメトリ用のビーズの大きさは、典型的には約０．１μｍから約５０μｍの範囲で、より典型的には直径が約１μｍから約２０μｍである。それらの密度は、典型的には約０．５ｇ／ｍＬから約２ｇ／ｍＬである。しかし、検出基質と大きさが異なる対照基質が使用される場合、対照基質を区別しやすくするために、好ましくは対照基質の直径がその他の基質より、少なくとも１０％大きいまたは１０％小さく、より好ましくは少なくとも２０％大きいまたは２０％小さい。
【００１９】
基質は、例えばシリカ、アルミニウム、金属、セラミックおよびポリマーなどの材料から形成され得る。基質は、ポリスチレンラテックス粒子、アクリレートまたはメタクリレート由来の粒子、ヒドロゲルポリマー粒子、重合ミセル粒子、研磨鋳造フィルムによって作成される粒子、水性エマルジョンの光重合によって作成される粒子、米国特許第４，３０２，１６６号や第４，１６２，２８４号に説明されるような溶媒キャストによって作成される粒子を含む、サイトメトリに用いられているあらゆる種類のものであり得る。典型的には、本発明にて用いられる基質は、ポリスチレンなどのポリマー材料から通常構成されるビーズである。本発明において有用な、そのようなビーズの適切な調製技術は、一般的に当業者に公知である。適切な調製技術の一例は、参考により本明細書に援用される、米国特許第４，６０９，６８９号、第６，５９９，３３１号、および第６，６３２，５２６号にて説明されている。代替的には、ビーズ／粒子は、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）またはＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）などの供給業者から入手してもよい。
【００２０】
各検出基質および対照基質は、基質の種類を特定できるようにコード化指標、すなわち識別子を有し、その結果として分析システムが、基質からの測定シグナルを、基質が相互作用する特異的なターゲットに割り当てることを可能にする。識別子は基質の特性（例えば大きさ、磁性、光強度、および一つ以上の波長における吸光度、光散乱、色、および蛍光性を含むその他の分光学的特性）であり得る。本明細書で用いられる場合、基質、ビーズ、または粒子の「種類」は、所与のターゲットと、同じように相互作用する全ての基質を意味する。当然ながら、試薬混合液が、同じターゲットと異なる方式で相互作用する二つ以上の異なる種類の基質を含むことが可能である。
【００２１】
例えば、粒子の大きさまたは色が、ビーズ／粒子の部分母集団間を区別するためのパラメータとして用いられ得る。ビーズ／粒子の蛍光特性はまた、様々な分析システムにおいて使用され得る。蛍光標識は、ビーズ／粒子をコード化するために望ましいマーカであり、単一の、および複数の蛍光物質を標識として用いるステップなどの様々な異なる手法において使用され得る。フローサイトメトリシステムにおける蛍光標識のマーカとしての使用は、例えば米国特許第４，７４５，２８５号、第５，０２８，５４５号、第５，６８２，０３８号、第５，８８０，４７４号で説明され、これら全ては参照することにより本明細書に援用される。
【００２２】
複合分析については、システムがサンプル中の複数のターゲットを同時に分析できることが望ましい。従って、必須ではないが、システムが複数の粒子の部分母集団を区別できるように、基質が複数の標識でコード化されることが望ましい。さらに、必須ではないが、蛍光標識がコード化指標として用いられる場合、目的とする検体／ターゲットのための発光スペクトル用に個別のスペースが確保されていることもまた好ましい。
【００２３】
本発明は、サンプル中の複数のターゲットの同時検出を目的としているため、好ましくは、少なくとも二つの検出基質セットが存在し、各セットが異なるターゲットを検出できる。典型的には、１０を超えるそのようなセットが存在し、多くて１００以上の検出基質のセットが存在しうる。
【００２４】
放射性化合物、発光化合物、および蛍光化合物を含む、一般的にアッセイで用いられるあらゆる種類の識別子を本発明において用いることができる。識別子は、検出可能なシグナルを生成する化合物である必要はないが、検出可能なシグナルを生成する別の化合物と結合する化合物であってもよい。好適な識別子は、光源、例えばレーザ光によって走査した場合、検出可能な光を生成する蛍光標識（蛍光色素としても公知）である。より好ましくは、蛍光色素は、近赤外（ＮＩＲ）領域に吸光度と発光スペクトルを有する、すなわち、可視領域（例えば約６００ｎｍ〜約１６００ｎｍ）のほんの少し超えた範囲の吸光度と発光を有する。適切な蛍光色素の例には、シアニン色素（例えば、フタロシアニンとカルボシアニン）とスクアレインなどが含まれる。
【００２５】
適切な蛍光色素は、ポリマービーズに組み込むことができる、一般的に安定な疎水性化合物である。個々の種類のビーズを標識するために、公知の蛍光色素を用いることができる。例としては、指定番号ＩＲ７９２（［２−［２−［３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−インドール−２−イリジン）エチリジン］−２−（フェニルチオ）−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルインドリウムペルクロレート］）、ＩＲ７６８（［２−［２−［３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−インドール−２−イリジン）エチリジン］−２−フェノキシ−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルインドリウムペルクロレート］）、ＹＬ２２（［２−［２−［３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリジン）エチリジン］−２−（フェニルチオ）−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルベンゾインドリウムヨージド］）、ＩＲ７８０（［２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−インドール−２−イリジン）エチリジン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルインドリウムペルクロレート］）、ＪＭ５４８８−４８（［２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−デカニル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリジン）エチリジン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−デカニルベンゾインドリウムヨージド］）、ＪＭ５４８８−７２（［２−［２−［−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−デカニル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリジン）エチリジン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−デカニルベンゾインドリウムヨージド］）ＩＲ１４０およびＩＲ１４３、ならびにそれらの誘導体がある。適切な蛍光色素は、参照することによって本明細書に援用される米国特許第６，８３８，２８９号で説明される。それらで説明されているように、様々な量または比率での色素の組み合わせは、各種類の基質／粒子に対して固有の識別子を提供するために用いることができる。基質を標識するために用いられる識別子に加えて、別の識別子、例えばフルオレセインは一般的に、とらえたターゲットを標識するために使用される。
【００２６】
個々の種類のビーズを標識するために、または目的とする検体との複合体化または反応を示すために有用な蛍光色素のさらなる例が、当該分野で公知である。例えば、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２、および、Ｍａｓａｒｕ  Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ａｂｓｏｒｂｉｎｇ  Ｄｙｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）を参照されたい。
【００２７】
好ましいが必須ではない実施形態では、各基質は、二つ以上の識別子、例えば、蛍光標識でコード化される。各種類の基質と結合する異なる識別子の組み合わせを変化させることで、検出ステップの際に異なる種類の基質を互いから区別することができる。例えば、二つの異なる蛍光標識が、二つの種類の検出基質に対するコード化指標として様々な組み合わせで使用されるとき、各検出基質に対する固有の検出可能なシグナルのセットが生成される。このようにして、異なる検出基質と対照基質を互いから区別することができる。例えば、一つの部分の識別子Ａと二つの部分の識別子Ｂを有する基質は、二つの部分の識別子Ａと一つの部分の識別子Ｂを有する第二の基質から区別できる。これらの基質は、二つの部分の識別子Ａと四つの部分の識別子Ｂ、または四つの部分の識別子Ａと二つの部分の識別子Ｂを有する第三の基質から区別できる。これらの基質はまた、Ａの部分を持たず、四つの部分のＢを有する（すなわち、ただ一つの識別子のみが用いられる）第四の基質から区別できる。参照することによって本明細書に援用される米国特許第６，８３８，２８９号において、このことがさらに説明されている。二つを超える識別子、例えば三つ以上の識別子で基質をコード化すると、固有に同定可能な基質の数が増える。
【００２８】
マルチターゲット検出システムにおいて使用するための例示的な基質／粒子を、図１に示す。図１に示すように、粒子１２は、蛍光標識１４Ａ、１４Ｂで標識され、ターゲット受容体１３は粒子１２と結合する。次に、ターゲット受容体１３を含む粒子は、目的とするターゲット１５の特定のサンプルを分析するために使用される。蛍光性ターゲット検出色素１６も存在する。受容体に特異的なターゲットもサンプル中に存在する場合、ターゲット検出色素１６は蛍光シグナルを発光する。
【００２９】
蛍光性ターゲット検出色素は、検出システムにおけるエネルギの移動によって活性化される、単一の蛍光物質またはドナー受容体色素対であってもよく、合成発生または天然発生のフルオレセインであってもよい。目的とするターゲットとの複合体化または相互作用を示すために用いられ得る好適な色素構造には、指定番号Ｃｙ５、ジベンゾＣｙ５、Ｃｙ７、ジベンゾＣｙ７として公知のシアニン色素に加えて、ナイルブルーの誘導体、例えばＥＴＨ５２９４が含まれる。
【００３０】
蛍光性ターゲット検出色素は、特異的な分析用反応において用いられる特定のアッセイに応じて、当業者に公知の様々な方法によって粒子と複合体化される。例えば、蛍光性ターゲット検出色素１６を、受容体（示さず）、またはターゲット１５（図１Ｂ）に結合させることができる、あるいはターゲットは天然発生の蛍光色素（示さず）を含むことができる。蛍光性ターゲット検出色素を、図１Ａに例示するように受容体‐ターゲット二重複合体（例えば、「サンドイッチ構造」）内の第二の受容体に結合させることもできる。
【００３１】
図２は、識別子が蛍光標識の場合に、本発明において用いることができるシステムの典型的な概略図である。光学サブシステム内の光源２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、例えばレーザまたはアークランプを励起することにより、光エネルギ２３がフローサイトメータに提供される。好ましくは、長い波長の励起レーザは、基質２１をマークするために使用される蛍光標識を同時に励起するために用いられ、一つ以上の短い波長の励起レーザが、蛍光性ターゲット検出色素を励起するために使用される。サイトメトリ機器の光学サブシステムは、適切なレーザ線フィルタ、ビーム拡大器、ミラー、レンズ、フローセルに加えて、サイトメトリ機器を運転する上で有益なその他の要素を含むことができる。
【００３２】
検出器のサブシステム内で、特定の発射光２４を検出するのに適切な検出器２５が使用される。検出器２５は、光シグナルを電子インパルスに変換し、これにより検出されたシグナルをその蛍光源に関連付ける、光ダイオードまたは光電子増倍管、または同様の装置であってもよい。前方および側方の散乱光を検出するための検出器は当該分野で公知であり、検出システム内の光散乱を検出するために使用できる。検査ゾーン内にある各粒子に関して、光散乱および蛍光発光を同時に検出できる。本発明の好ましいが必須ではない態様では、検出サブシステム内で、前方散乱検出器、側方散乱検出器、光電子増倍管が使用される。検出器のサブシステムはまた、フィルタ、ミラーに加えて、サイトメトリ機器を運転する上で有益なその他の要素を含むシステムを用いることもできる。検出器２５からの電気シグナル２６は、シグナルおよび表示処理、保存、および／またはさらなる処理のために、典型的にはシステムの電子機器に送られる。
【００３３】
分析サブシステムでは、ハードウェア、例えばマイクロプロセッサ２７は記憶装置２８、例えばコンピュータ内のハードドライブと組み合わせて、検出されたデータを収集し、そのデータを処理する。データ処理およびシグナル処理に使用される解析システムソフトウェアは、分析結果を作成するために、検出されたデータを既知のデータと相関させる。分析サブシステムは、各粒子に関連する電気シグナルからのデータを収集する。
【００３４】
図３を参照すると、本発明の方法は、一般的に、上述のように様々な粒子の部分母集団が作成されコード化される粒子作成段階３２を含み、またターゲットをとらえるために上述のように検出粒子が修正される。次に、正規化されたデータを提供するため、粒子分析段階３３において粒子の一部が分析される。粒子は、段階３４で分析用サンプルおよびいずれかの適切な試薬と混合され、曝露される。次に、検出段階３６において、粒子は分析され、既定の分類に従って特定のサブセットに割り当てられる。相関段階３７では、各検体セットに関連する測定値は蓄積され、蓄積されたデータは処理され、解釈され、解釈された結果がアウトプット３８としてユーザに提供される。
【００３５】
相関段階３７では、粒子分析段階３３で作成された基準蛍光発光測定値および散乱基準測定値を参照して、類似した蛍光発光と前方および側方散乱測定値を有する粒子の母集団が検体の特異性と関連付けられる。
【００３６】
複数のターゲットを同時に検出する検出システムに関するさらなる情報は、参照によって本明細書に援用される米国特許第６，８３８，２８９号から入手できる。
【００３７】
より具体的には、図３を参照して、以下のステップが行われ得る。
【００３８】
１．粒子作成段階３２では、検出されるべきターゲットに適した検出システムが選択される。検出システムは、少なくとも二つの検出基質と少なくとも一つの対照基質を持ち、検出基質はそれらと結合する少なくとも一つの異なる識別子を有する。各検出基質および対照基質について適切な化学反応が実施され、検出ステップの際に一つの基質セットを互いに区別することができるように、識別子でコード化された各基質が選択される。本明細書の実施例において明らかになる対照基質の重要性のため、対照基質中の識別子によって生成される検出可能なシグナルの強度が、検出基質からのシグナルより著しく大きくない、または著しく小さくないことが望ましい。対照基質中の識別子のシグナルの強度が、少なくとも一つの検出基質セットからシグナルの強度より大きいことが好ましく、検出基質の全てのセットからのシグナルの強度より大きいことがより好ましい。第二の識別子についても、またシステム中に存在する可能性があるさらなる識別子のいずれについても同様のことが言える。適切な化学反応はまた、各検出基質について実施され、ターゲットをとらえるために検出基質が適切に適合される。
【００３９】
２．次に、粒子分析段階３３では、検出機器上で検出基質と対照基質が分析され、ここでは検出基質と対照基質に検出可能なシグナルを生成させ、生成された検出可能なシグナルの強度が決定される。次に検出基質は「正規化」される、すなわち、対照基質からの実際のシグナルの強度に対する検出基質からの実際のシグナルの強度の相対比率が決定される。これはサンプルが全く存在しない状態で行ってもよいし、または正規化サンプルを用いて行うこともできる。
【００４０】
検出基質をそれらのターゲット／検体に自動で結合させることによって、検出基質は「正規化」される。このことは、「相対比率」係数を各検出基質に割り当てることで行われる。
【００４１】
「相対比率」係数は、各識別子に対する対照基質の強度で、与えられた検出基質の強度を割ることで得られる。各検出基質に対する相対比率は、以下の公式で表される：
Ｒｉｊ＝ＩＮｉｊ／ＣＮｊ
ここで：
Ｒｉｊ＝検出基質ｉおよび識別子ｊに対する相対比率；
ＩＮｉｊ＝正規化ステップＮにおける、識別子ｊに対する検出基質ｉからのシグナルの測定強度；
ＣＮｊ＝正規化ステップＮにおける、識別子ｊに対する対照基質からのシグナルの測定強度である。
【００４２】
各検出基質に関する正規化データは、複数の構成単位について収集され、平均化され得る。検出システムのユーザにこのデータを媒体として提供できる。媒体は、印刷したデータ、またはユーザが特定の分析機器にダウンロードできる電子形態のデータとして提供されてもよい。
【００４３】
３．混合段階３４では、ターゲットをとらえるために、サンプルを検出基質に接触させることによって、検出システムが用いられる。接触のインキュベーションの時間は、アッセイの目的を達成するように十分に長くする。例えば、アッセイがサンプル中に特定のターゲットが存在するかどうかを決定するために実施される場合は、サンプル中のターゲットの有効濃度を決定したい場合より、インキュベーションの時間は短くてよい。
【００４４】
４．検出段階３６では、検出基質と対照基質に検出可能なシグナルを生成させ、生成された検出可能なシグナルの強度を決定する。例えば、フローサイトメータでは、入力されるレーザ光によってビーズが「活性化」され、結果として存在する蛍光標識が検出可能な光を発し、これを検出する。
【００４５】
５．相関段階３７では、本発明は、検出されたシグナルをどのように異なる検出基質セットに関連付けるかという点において、従来の技術を改良する。特に、予測されるシグナル強度は、段階３３において計算された相対比率を、検出段階３６において対照基質について決定されたシグナル強度で乗じることによって計算される。
【００４６】
例えば、特定の標識について：
ＩＥｉｊ＝Ｃｊ＊Ｒｉｊ
ここで
ＩＥｉｊ＝検出基質ｉ、識別子ｊについて予測されるシグナル強度；
Ｃｊ＝識別子ｊに対して、検出段階３６において対照基質から生成されたシグナルの測定強度；
Ｒｉｊ＝粒子分析段階３３において決定された相対比率である。
【００４７】
次に、検出段階３６において決定された実際のシグナル強度を、検出基質について計算された予測されるシグナル強度と比較する。これらの比較を通して、生成されたシグナルの少なくとも一部を、適切な検出基質に関連付けることが可能である。この方法によって、試験結果から、偽のシグナルを除外することもできる。例えば、検出システムは、いずれのセットにも関連しない基質を含むことができ、故に相関段階３６において、検出基質のいずれのセットにも適合しないことが予測される。故に、関連しない基質からのシグナルを識別でき、分析に用いることができる。
【００４８】
生成されたシグナルを適切な検出基質と関連付けた後、各検出基質に対する分析シグナルのレベルを決定する。次に、例えば、各検出基質についての検体濃度を決定するために計算をさらに実施する。
【００４９】
６．アウトプット段階３８では、例えば、検体の種類や検体濃度の情報を含む、レポートが作成される。
【００５０】
本発明はまたキットを含む。そのようなキットは（ａ）（ｉ）少なくとも二セットの検出基質と、（ｉｉ）対照基質とを含む、上記で特定した検出システムと、（ｂ）粒子分析段階３３で得られた正規化データを提供する媒体とを含む。任意で、キットはアッセイを実施するための使用説明書を含む。媒体は、単純な書類、バーコード、コンピュータディスク、またはＤＶＤ、ＣＤまたはサムドライブなどの、デジタルデータを保存するためのその他の媒体であってもよい。任意で、インターネットを介してデータを送信してもよい。
【００５１】
キットは、全ての基質を一緒にして、または異なる基質セットを別々にして提供されても、検出基質と一緒にされた対照基質があってもなくてもよい。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
（基質準備）
様々な量の二つの異なる蛍光標識を、１２の異なる基質に組み入れることで、１２セットのビーズを含むビーズの母集団を作成した。ビーズ中に含まれる色素を変化させることで、各ビーズセット、すなわち、異なる検出基質と対照基質をコード化した。
【００５３】
参照によって本明細書に援用される、Ｌ．Ｂ．Ｂａｎｇｓ（Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｌａｔｅｘ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ｓｅｒａｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、１９８４、ｐ．４０）によって説明されるｓｈｒｉｎｋ−ｓｗｅｌｌ法を利用して、二つの異なる蛍光標識を、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）から入手したカルボキシル化された、架橋ポリスチレンビーズ（直径５．５０マイクロメータ）に組み込むように、ビーズを準備した。ｓｗｅｌｌ−ｓｈｒｉｎｋプロセスは、攪拌した粒子に油溶性または疎水性色素を添加するステップからなり、インキュベーションの時間の後、粒子によって吸収されない色素は全て洗浄される。このプロセスは、米国特許第６，８３８，２８９号でも説明される。二つの色素は、ビーズコード色素１（ＢＣＤ１）（１，３−ビス［４−（ジブチルアミノ）フェニル］−２，４−ジヒドロキシシクロブテンジイリウムジヒドロキシド，ビス［内塩］）およびビーズコード色素２（ＢＣＤ２）、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から入手されるＩＲ６７６である。ＢＣＤ１は、６７５ｎｍにピーク発光があり、ＢＣＤ２は７１５ｎｍにピーク発光がある。
【００５４】
以下の表１に示すターゲット検体をとらえるようにビーズセット１−１１を修飾する。ビーズセット１２は、ターゲット検体をとらえるように修飾しなかった。一般的な手技、例えばＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  ２０５、Ｒｅｖ．  ００３に記載されているようなものを用いて、これらのターゲットをとらえるためのタンパク質の結合を行った。
【００５５】
【表１】
2009505103.tif 000003
（実施例２）
（基質正規化）
二つの研究用フローサイトメータユニット（「ユニット６」と「ユニット７」）と、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）から販売される、ＦＣ５００ユニットを用いて各ビーズセットについて生成された検出可能なシグナルの強度を決定した。これらのシステムはそれぞれ、４８８ｎｍレーザと６３５ｎｍレーザの二つのレーザを含み、前方散乱と側方散乱を測定する。システムはまた、蛍光発光を得るための三つの光電子増倍管（ＰＭＴ）を含み、各ＰＭＴの前に、５２５ｎｍ、６６０ｎｍ、７８０ｎｍからの光を各検出器に対して通過可能にする帯域通過フィルタも有する。ユニット６とユニット７システムと同等の市販のシステムには、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）社販売のＦＣ５００とＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡシステムが含まれる。図４ａは、二つの異なるサイトメーターユニット（ユニット６とユニット７）からの、二つの異なるコード化チャネル（６６０ｎｍと７８０ｎｍ）における、１２個の基質母集団に対する平均測定強度のプロットである。図４ｂは、二つの異なるコード化チャネル（６６０ｎｍと７８０ｎｍ）における、市販のＦＣ５００ユニットからの、１２個の基質母集団に対する平均測定強度のプロットである。図４ａと４ｂは、使用される特定の機器に起因する分散を示す。この分散のために、結果を特定のビーズセットのいずれかに関連付けることは難しい。
【００５６】
二つの異なるコード化チャネルにおける、各検出基質についての正規化された結果または「相対比率」係数が計算された。ビーズの母集団は、対照として使用されたビーズセット１２について測定された値に基づいて正規化された。ビーズセット１２には値「１」が任意で与えられ、表中のその他のビーズの値は、ビーズセット１２の測定強度に対する各セットの測定強度の割合として表される。各コード化チャネルについて、各検出基質の計算された相対比率係数を表２および表３に示す。表４は、三つの異なるサイトメーターと割り当てられた検体からの平均相対比率係数を記載する。
【００５７】
【表２】
2009505103.tif 000004
【００５８】
【表３】
2009505103.tif 000005
【００５９】
【表４】
2009505103.tif 000006
図５は、表４のデータ同様に、検出基質の平均相対比率と、対照としてのビーズセット１２を用いた、正規化されプロット化されたデータを示す。これは、異なる機器の使用に起因して認められた分散を、この手法が減らすことにより、強度データを特定のビーズセットに関連付けるのを簡単にすることを示している。
【００６０】
サンプルとの接触後の基質の処理に適した別の機器は、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００４／００９６９７７号で説明されている。この機器は、本体を有する処理装置と、本体内の処理セクションと、処理セクションにそれぞれ入出する、供給流入管と供給流出管とを含む。処理セクションは、処理セクション内で、粒子が重ならないように粒子を位置決定するための位置決定手段を含む。位置決定手段は、一つの粒子のみを受け取るような大きさの複数のポケットであり得る。この機器をフローサイトメータの代わりに用い得る。
【００６１】
その特定の好適な形態に関して本発明を詳細に説明したが、他の形態も可能である。例えば、サンプルを接触させるステップの際に対照ビーズを用いてもよいし、あるいは任意でサンプルを全く接触させなくてもよい。従って、添付の特許請求の範囲の精神と範囲は、本明細書に含まれる好適な形態の説明に必ずしも限定されるべきではない。
【００６２】
特許請求の範囲、要約書、および図面を含む、明細書において開示される全ての特徴、開示される任意の方法または任意のプロセスにおける全てのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相容れない組み合わせを除いて、いかなる組み合わせとして組み合わされてもよい。特許請求の範囲、要約書、および図面を含む、明細書において開示される各特徴は、そうでないと明確に記載されている場合を除いて、同じ、同等の、または同様の目的にかなう代替的な特徴に置き換えられてもよい。故に、そうでないと明確に記載されている場合を除いて、開示される各特徴は、同等の、または同様の一連の一般的な特徴の一例に過ぎない。
【００６３】
特定の機能を実施するための「手段」、または特定の機能を実施するための「ステップ」を明確には記載していない請求項におけるいかなる要素も、米国特許法第１１２条で規定されているように、「ステップ」の文節のための「手段」と解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１Ａと図１Ｂは、本発明による複数のターゲット粒子ベースのアッセイにおいて使用するための典型的な粒子を図示し、ターゲット１は粒子−受容体−ターゲット−受容体複合体を示し、粒子２は粒子−受容体−ターゲット複合体を示す。
【図２】図２は、本発明に基づく、典型的なフローサイトメトリシステムの概略図である。
【図３】図３は、図１に例示するような粒子検出システムを用いて、また本発明を組み込んで実施される方法のフローチャートである。
【図４ａ】図４は、正規化せずに三つの異なるサイトメーター上で、１２のビーズ母集団（１１の検出基質と１つの対照基質）を用いて実施されたアッセイから得られた測定強度を示す。
【図４ｂ】図４は、正規化せずに三つの異なるサイトメーター上で、１２のビーズ母集団（１１の検出基質と１つの対照基質）を用いて実施されたアッセイから得られた測定強度を示す。
【図５】図５は、本発明に従う、図４に示される同一の結果を、正規化して示す。
【図１】
2009505103.tif 000007
【図２】
2009505103.tif 000008
【図３】
2009505103.tif 000009
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
2009505103.tif 000013
2009505103.tif 000014
2009505103.tif 000015