(57)【要約】本発明は、白血球遊走および機能を調節する組成物および方法を提供する。本発明は、好中球の肺浸潤に関連する肺傷害および損傷を防止および阻害する組成物および方法も提供する。本開示は、ＰＡＫを、好中球依存性の肺傷害の中心的な媒介物質として特定する。ＰＡＫをブロックすることにより、マウスおよびヒト好中球における走化性、アクチン重合、および接着により誘発される活性酸素産生が阻害される。したがって、本発明は、白血球活性または浸潤の増加に関連する肺疾患および障害、および炎症を含めた、白血球に関連する疾患および障害におけるＰＡＫ経路の標的化を含む。
2009524674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球機能を阻害する方法であり、前記方法が、前記白血球を、ＰＡＫおよびＰＩＸ調節経路からなる群より選択されるタンパク質調節経路の少なくとも一つの阻害剤の有効量と接触させることにより、白血球機能を阻害するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記白血球が、哺乳類白血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳類白血球が、ヒト白血球である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記白血球が、好中球、好酸球、好塩基球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびそれらの誘導体および運動性前駆体からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記白血球が、好中球である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記機能が、接着、遊走、停止、ＰＡＫ活性化、ＰＩＸ活性化、ＰＡＫ活性、ＰＩＸ活性、ＲＯＳ形成誘起、ＲＯＳ放出、および細胞骨格再構築からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも一つの阻害剤が、成長因子により刺激される好中球機能、またはサイトカインにより刺激される好中球機能を阻害する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも一つの阻害剤が、ＣＸＣＲ２に依存性のＰＡＫ活性化を阻害する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも一つの阻害剤が、細菌毒素により刺激される好中球機能を阻害する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも一つの阻害剤が、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、キナーゼ阻害剤、および抗体からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号１および５からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびそれらの生物学的に活性のフラグメント、ホモログ、誘導体、および修飾体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも一つの阻害剤が、タンパク相互作用または複合体形成を阻害する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
白血球浸潤または活性の増加に関連する疾患または障害の治療が必要な対象において、白血球浸潤または活性の増加に関連する疾患または障害を治療する方法であり、前記方法が、ＰＡＫおよびＰＩＸ調節経路からなる群より選択されるタンパク質調節経路の少なくとも一つの阻害剤を有効量含む医薬組成物を、前記対象に投与することにより、白血球浸潤または活性の増加に関連する疾患または障害を治療するステップを含む、方法。
【請求項１４】
前記疾患または障害が、急性または慢性炎症を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
急性または慢性炎症を含む前記疾患または障害が、関節炎、喘息、多発性硬化症、中枢神経系の炎症性疾患、神経炎、末梢神経系の炎症性疾患、アトピー性疾患、炎症性腸疾患、皮膚の炎症性疾患、粘膜の炎症性疾患、肝炎、腎臓の炎症性疾患、敗血症、敗血症性ショック、および癌からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患または障害が、肺疾患または障害である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記肺疾患または障害が、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、人工呼吸器による肺傷害、敗血症により誘発される肺不全、および肺炎からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記白血球が、好中球である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記好中球が、前記経路を構成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
白血球浸潤または活性の増加に関連する疾患または障害を阻害する化合物を投与するためのキットであり、前記キットが、ＰＡＫおよびＰＩＸ調節経路からなる群より選択されるタンパク質調節経路の少なくとも一つの阻害剤を含む医薬組成物、アプリケータ、およびその使用教材を含む、キット。
【請求項２１】
ＰＡＫおよびＰＩＸにより調節される白血球機能を阻害する化合物を同定する方法であり、前記化合物が、ＰＡＫおよびＰＩＸからなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質調節経路を阻害し、前記方法が、
前記調節経路の少なくとも一つを含むテスト白血球を、テスト化合物と接触させるステップと；
前記調節経路の少なくとも一つの活性または機能を測定するステップ
を含み、
前記テスト白血球における前記活性または機能のレベルが、前記テスト化合物と接触しない以外は同一の白血球における活性または機能のレベルと比較して低いことが、前記テスト化合物が白血球機能を阻害する指標となる、方法。
【請求項２２】
前記機能が、接着、遊走、停止、ＰＡＫ活性化、ＰＩＸ活性化、ＰＡＫ活性、ＰＩＸ活性、ＲＯＳ形成誘起、ＲＯＳ放出、および細胞骨格再構築からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記調節経路が、ＰＡＫである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、ＰＡＫリン酸化を測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記白血球が、好中球である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、タンパク質―タンパク質相互作用または複合体形成を測定する、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年1月２４日に出願された、米国仮特許出願第６０／７６１，４７１号に対する米国特許法第１１９（ｅ）条の優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／７６１，４７１号は、その全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
政府の支援による研究または開発に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって与えられたグラント番号ＧＭ４７２１４およびＨＬ７３３６１の下で米国合衆国政府の支援によりなされた。米国合衆国政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
背景
急性炎症性疾患は、多形核好中球（ＰＭＮ）の急速な動員を特徴とする。急性細菌感染症においては、このＰＭＮ動員が防御となりうるが、人工呼吸器による肺傷害、インフルエンザ感染、急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）などの多くの病気においては、ＰＭＮ動員は不適当であり、組織損傷をもたらし、患者の死に至ることもある。
【０００４】
抗体、ペプチドまたは小分子による白血球接着分子のブロックを含め、好中球動員を抑制するための様々な戦略が開発されている。これらの戦略のいくつかにより、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈが生産する乾癬に有効なＬＦＡ―１抗体など、今日市販されている有用な治療薬が生まれた。ＰＭＮ動員をブロックする別のアプローチは、たとえばＣＸＣケモカインレセプター２など、Ｇタンパク質共役走化性因子受容体のブロックである。
【０００５】
ＰＭＮの細胞骨格は、Ｆアクチンと、その重合の時間および空間を調節する何百ものタンパク質からなる。遊走には、現在発見されている経路による細胞骨格の連続的かつ急速なリモデリングが必要である。遊走が好中球機能の中心であるため、これらの経路は、好中球遊走の薬理学的操作ための標的として興味深い。好中球および他の炎症細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）の遊走は、非炎症性細胞の遊走より１０〜１００倍速く、他の身体機能を妨げずに選択的ブロックが達成されうることが示唆される。
【０００６】
実験的研究においては、ＰＭＮの枯渇により肺損傷が抑制されることが示されている（１）。臨床的観察は、ＡＲＤＳ患者の肺機能が、血液中の好中球数と負の相関関係にあることを示唆する（２）。ＰＭＮ浸潤が、ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおいて機能的に重要であるという説得的な証拠はあるが、好中球動員を調節するための臨床的に実証された戦略は、現在存在しない。この不備は、肺へのＰＭＮ遊走の基礎となる分子機序についての理解が不完全であることが原因であろう。ＡＬＩ／ＡＲＤＳの死亡率は依然として高く、機械換気を越える具体的な療法や他の有効なアプローチは存在しない（３）。
【０００７】
炎症を起こした肺へのＰＭＮのトラフィッキングに必要な分子は、他の組織のそれとは根本的に異なり（４）、肺傷害のモデルに強く依存する。多くの血管床においてＰＭＮと内皮の間の接触を開始するために必須の、セレクチンおよびそのリガンドは、肺におけるＰＭＮ接着を媒介するためには必要とされず、肺においては、ＰＭＮ活性化が十分であるためにＰＭＮが肺微小循環の小さな毛細血管に留まることが可能になりうる（５）。しかし、肺間質および肺胞空間への好中球トランスマイグレーションには、遺伝子操作マウスおよび抗体のブロッキング戦略を用いた研究に示されるように、接着分子およびケモカインレセプターを含む、ＰＭＮおよび内皮の両方の分子が必要である（６）、（７）。内皮に対する接着が確立されたあと、刺激によるＰＭＮおよび内皮細胞の細胞骨格再構築により、トランスマイグレーションが開始する。好中球の先端でアクチンが重合し、走化性因子への有向運動を媒介する葉状仮足を形成する。これらのプロセスは、ＰＭＮの有向運動および炎症部位への遊走に重要な役割を果たすことがいずれも示されているＲａｃおよびＣｄｃ４２などの、小さなＧＴＰアーゼを必要とする（８、９）。
【０００８】
小さなＧＴＰアーゼＲａｃおよびＣｄｃ４２は、好中球細胞骨格の中心的な形成体である。これらのＧＴＰアーゼは、感染および傷害の間の細菌産物、炎症性ケモカインおよびサイトカイン、および細胞接触に依存するシグナル伝達事象に反応して、好中球および他の白血球において活性化される。ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）１、２および３が、ＲａｃおよびＣｄｃ４２により活性化されるセリン／トレオニンキナーゼのファミリーを構成する（１０）。ＰＡＫは、アクチン重合およびミオシンリン酸化の両方を調節して運動性を制御する。さらに、ＰＡＫは、組織損傷の有意な要因である反応性酸素を生産するＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体の成分である。
【０００９】
触媒ドメインは、ＰＡＫアイソフォーム間、および種全体で高度に保存されている。ＰＡＫ１（１１、１２）およびＰＡＫ２（１３、１４）の両方の発現が好中球において実証されており、これらは走化性に関係している。阻害ペプチドはＰＡＫアイソフォームを区別しないため（２０）、本文全体にわたり、三つのアイソフォームの任意のものをあらわす用語がＰＡＫである。
【００１０】
静止状態下では、ＰＡＫはホモ二量体を形成し、Ｎ末端の阻害ドメインを対立する触媒サブユニットに結合することにより、触媒活性がブロックされる（非特許文献１（１５））。ＰＡＫの活性化は、ｔｈｒ４２３およびｓｅｒ１４１残基のリン酸化、二量体の解離、および触媒ドメインの放出を伴う（非特許文献２（１６））。ＰＡＫは、ＮｃｋおよびＰＡＫ関連グアニンヌクレオチド交換因子（ＰＩＸ）を含む、ＳＨ３含有アダプタータンパク質に結合し、これらが細胞膜および細胞―細胞間結合部においてＰＡＫの標的への移行を媒介し（非特許文献４（１７）、非特許文献４（１８））、最終的には細胞骨格リモデリングおよび細胞収縮性がもたらされる（非特許文献５（１９））。ＰＩＸαおよびＰＩＸβに結合するＰＡＫ中の配列は、ＰＰＰＶＩＡＰＲＰＥＨＴＫＳＶＹＴＲ（配列番号４）である（Ｍａｎｓｅｒ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９９８  １：２：１８３―９２）。ＰＡＫとＮｅｋの相互作用への干渉により、内皮の遊走および血管形成がブロックされる（非特許文献６（２０））。内皮細胞においては、サイトカインにより誘発されるＰＡＫリン酸化および細胞―細胞結合部への移行が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの単層の透過性を増加させることが示されている（非特許文献７（２１））。さらに、インテグリン媒介フォーカルコンプレックスおよびフォーカル接着へのＰＡＫの移行が、上皮細胞（非特許文献８（２２））および繊維芽細胞（非特許文献（２３））において報告されており、それがアクチン微小突起の形成を媒介し、接着およびストレスファイバの減少を誘発し、細胞伸展およびトランスマイグレーションにおける役割が示唆される（非特許文献１０（２４））。好中球においては、ｆＭＬＰなどの化学遊走物質によりＰＡＫが活性化され（非特許文献１１（２５）、非特許文献１２（２６））、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける走化性勾配へのＰＭＮの有向運動に関係する（非特許文献１３（２７））。
【非特許文献１】Ｐａｒｒｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９，７３−８３（２９９２）
【非特許文献２】Ｌｅｉ，Ｍら、Ｃｅｌｌ  １０２，３８７−３９７（２０００）
【非特許文献３】Ｂｏｋｏｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２５７４６−２５７４９（１９９６）
【非特許文献４】Ｍａｎｓｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １，１８３−１９２（１９９８）
【非特許文献５】Ｓｅｌｌｓら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７，２０２−２１０（１９９７）
【非特許文献６】Ｋｉｏｓｓｅｓ，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９０，６９７−７０２（２００２）
【非特許文献７】Ｓｔｏｃｋｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４６６２１−４６６３０（２００４）
【非特許文献８】Ｍａｎｓｅｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７，１１２９−１１４３（１９９７）
【非特許文献９】Ｓｅｌｌｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５１，１４４９−１４５８（２０００）
【非特許文献１０】Ｚｈａｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８，２１５３−２１６３（１９９８）
【非特許文献１１】Ｋｎａｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，２２１−２２３（１９９５）
【非特許文献１２】Ｍａｒｔｙｎら、Ｂｌｏｏｄ  １０６，３９６２−３９６９（２００５）
【非特許文献１３】Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  １１４，２１５−２２７（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
当技術分野においては、白血球遊走を調節するための新規の組成物および方法へのニーズが長いこと存在する。本発明は、これらのニーズを満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本開示は、ＰＡＫを、好中球依存性の肺傷害の中心的な媒介物質として特定する。ＰＡＫをブロックすることにより、マウスおよびヒト好中球における走化性、アクチン重合、および接着により誘発される活性酸素産生が阻害される。したがって、本発明は、白血球活性または浸潤の増加に関連する肺疾患および障害、および炎症を含めた、白血球に関連する疾患および障害におけるＰＡＫ経路の標的化を含む。
【００１３】
ＰＡＫ１，２および３をブロックするｔａｔ結合ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの好中球遊走をブロックし、マウスの肺炎症モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏの好中球動員をブロックする。ペプチドの適用には、明白な有害な副作用はない。肺への好中球遊走のブロックは、ほぼ１００％であるため、このペプチドは他の公知の抗炎症治療よりはるかに有効である。特定の理論に拘束されるものではないが、ＰＡＫ機能を阻害するペプチドが、白血球接着および遊走を阻害し、したがって抗炎症薬の開発に有用であると仮定される。したがって、ＰＡＫ１、２および３が、抗炎症薬開発のための標的として本明細書に含まれる。マウスＰＡＫｓのヒトオルソログは、公知であり（ＰＡＫ１はｇｉ｜４２７９４７６９｜ＮＰ＿００２５６７、ＰＡＫ２はｇｉ｜３２４８３３９９｜ＮＰ＿００２５６８、ＰＡＫ３はｇｉ｜４７１１７８１８｜Ｏ７５９１４）、マウスＰＡＫに高度の相同性をもつ（ＰＡＫ１では８８％同一のアミノ酸配列）。本発明の一態様によれば、ＰＡＫファミリーメンバーの一つ以上が、ペプチドまたは他の手段によって阻害され、または細胞内の他の分子とそれらの相互作用が、任意の形で改変、ブロック、増強、または修飾されうる。
【００１４】
本発明は、とりわけ、任意のＰＡＫファミリーメンバーが、好中球、好酸球、好塩基球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびこれらの白血球の誘導体および運動性前駆体を含む任意の白血球に、ペプチド、小分子、ドミナントネガティブ、アンチセンスまたは小干渉ＲＮＡ、アプタマー、抗体、天然物質、または他の手段を含む任意の手段によって標的化される全ての適用を含む。一態様では、本発明は、白血球遊走を阻害する組成物および方法を提供する。一態様では、白血球は、好中球である。一態様では、組成物は、ｔａｔ―ＰＡＫペプチドを含む。一態様では、本発明のｔａｔ―ＰＡＫペプチドおよび他の分子は、肺および気管支肺胞洗浄液中へのＰＭＮ動員を阻害する。したがって、本発明に含まれる方法および組成物は、好中球の流入に関連した急性または慢性肺傷害または疾患または状態を治療するために有用である。
【００１５】
一実施形態においては、本発明に含まれるｔａｔ―ＰＡＫペプチドおよび他の分子が、白血球機能を阻害する。一態様では、本発明のペプチドが、内皮細胞におけるＰＡＫ経路を阻害することにより、好中球遊走を阻害する（図４を参照）。一態様では、阻害される機能は、成長因子、ケモカイン、他のペプチド、または内因性または外因性の炎症性メディエータにより誘発されるものである。一態様では、ケモカインは、ＭＩＰ―２（ＣＸＣＬ２）である。本発明は、ＰＡＫ合成、レベル、または活性を調節する薬物および他の分子、その前駆体、誘導体をさらに提供する。本発明は、ＰＡＫファミリーの分子のリン酸化を改変する方法、ならびにＰＡＫファミリー分子のその他の修飾方法をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、好中球、好酸球、好塩基球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびこれらの白血球の誘導体および運動性前駆体を含む、全ての白血球に適用できる。このために、本出願は、急性肺炎症のモデルにおける、特異的ＰＡＫ阻害ペプチドの強い阻害効果を開示する。
【００１７】
本発明は、相互作用部位を争って白血球機能に関連したシグナル伝達経路を含むＰＡＫおよびＰＩＸ調節経路を阻害するペプチド、およびその生物学的に活性の修飾体、フラグメント、誘導体、ホモログ、およびアナログを含む。このような化合物は、阻害または競合化合物と呼ばれる。一態様では、本発明の阻害化合物が、タンパク質の複合体形成または相互作用を阻害する。
【００１８】
本発明は、白血球のＰＡＫファミリーが標的とされるあらゆる場合の、診断、治療、予防、化粧品、ライフスタイルおよびその他の用途の組成物および方法を提供する。最適な用途の多くは炎症性疾患であり、そのいくつかの例は以下に列挙される。本発明は、たとえば、炎症を阻害することにより増殖または転移を減少させうる癌など、主としては炎症性ではないが、炎症性の部分をもつ疾患においても有用でありうる。
【００１９】
一実施形態においては、本発明は、ＡＲＤＳ、人工呼吸器による肺傷害、敗血症により誘発される肺不全、インフルエンザにより誘発される肺炎など一定の形の肺炎を含むがこれに限られない、全ての形の急性肺傷害を治療する方法を提供する。
【００２０】
別の実施形態においては、本発明は、関節炎（慢性関節リウマチおよび他の形）、喘息、多発性硬化症および他の中枢神経系の炎症性疾患、神経炎および他の末梢神経系の炎症性疾患、アトピー性疾患、炎症性腸疾患、皮膚または粘膜の炎症性疾患、肝炎、糸球体腎炎および他の腎臓の炎症性疾患、敗血症性ショックを含む敗血症、炎症の部分を有する癌または他の腫瘍、細胞遊走の阻害が有益である癌、および、細胞遊走の阻害が有益である他の任意の炎症性疾患または他の疾患を含むがこれに限られない、様々な形の急性または慢性炎症を治療する方法を提供する。
【００２１】
一実施形態においては、本発明は、本発明のペプチドまたは他の化合物を、必要とする対象に投与する方法を提供する。
【００２２】
一実施形態によれば、ＰＡＫ阻害剤と薬理学上許容可能な担体とを含む組成物が提供される。一実施形態においては、組成物は、静脈内送達のために調製される。ＰＡＫ阻害剤は、たとえば、ＰＡＫのキナーゼドメインおよびＰＡＫのｐ２１（例えばＣｄｃ４２またはＲａｃ１）結合ドメインのいずれかまたは両者、またはＰＡＫの自己リン酸化部位を結合またはブロックする薬剤でありうる。一実施形態においては、ＰＡＫ阻害剤は、ドミナントネガティブ活性をもつＰＡＫからの配列を含む短いペプチドである（Ｋｉｏｓｓｅｓ等，２００２，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０：６９７）。このペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭ；配列番号１）は、細胞へのエントリーを促進するＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の多塩基配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号３）（Ｓｃｈｗａｒｚｅ等，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９）に融合された、ＰＡＫの一番目のプロリンリッチドメインからの配列ＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭ（配列番号２）からなる。ＴＡＴ配列は、他の有用な配列とともに用いられてもよい。このペプチド（配列番号１）は、全長ドミナントネガティブコンストラクトと同様にＰＡＫ機能を阻害する。ペプチドは、それ自体としてはＰＡＫキナーゼ活性をブロックしないが、細胞―細胞結合部を含む作用部位からＰＡＫを除去し、これにより細胞収縮性、遊走および透過性に対する効果が十分に妨げられる。
【００２３】
ＰＩＸαおよびＰＩＸβに結合するＰＡＫ中の配列は、ＰＰＰＶＩＡＰＲＰＥＨＴＫＳＶＹＴＲ（配列番号４）である。本発明は、ＰＡＫのＰＥＸとの相互作用を防害または阻害するための、配列番号４へのＴＡＴ配列の付加を含む。
【００２４】
無傷細胞へのペプチドの導入を助けるために、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）のｔａｔ配列が一般に使用される。ｔａｔ配列は、ＨＩＶ病原性をもたず、広く使用されている。他の配列も存在する。特定の理論に拘束されるものではないが、本明細書では、そのような他の配列が、ＰＭＮおよび他の炎症細胞によるペプチドの取込みを促進する際に等しく有効であると仮定される。
【００２５】
本開示は、本発明に使用される他のＰＡＫ調節因子も含む。さらなるＰＡＫ調節因子を同定するために有用なアッセイは、本明細書ならびに米国特許第６，２４８，５４９号、２００４年７月１５日に公開の米国特許出願公開第２００４０１３８１３３号、２００６年８月９日に出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６０３１２２９号に記載されており、それらの開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
白血球機能を調節するＰＡＫおよびＰＩＸ活性、および調節経路の阻害剤を同定する方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【００２７】
本出願は、本明細書に同定される経路をブロックするためのｓｉＲＮＡの使用を含む。本発明のｓｉＲＮＡは、さらに、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、本明細書に記載のペプチドをコードする核酸、アプタマー、抗体、キナーゼ阻害剤、および薬物／薬剤／化合物など、本明細書に記載または公知の他の調節因子とともに使用されうる。別の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載のシグナル伝達経路のタンパク質に対するｓｉＲＮＡを提供する。
【００２８】
さらなる態様では、第一のｓｉＲＮＡが、第一のものとわずかに異なる配列を有する第二のｓｉＲＮＡと組み合わせて用いられ、または第二のｓｉＲＮＡが全体として異なる配列に対するものでありうる。
【００２９】
一態様では、本発明は、ｓｉＲＮＡのハイスループットスクリーニングおよびコンビナトリアルケミカルライブラリの使用を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
省略形および頭字語
ＡＬＩ―急性肺傷害
ＡＮＯＶＡ―一元配置分散分析
ＡＲＤＳ―急性呼吸不全症候群
ＢＡＥＣ―ウシ大動脈内皮細胞
ＢＡＬ―気管支肺胞洗浄液
ｄｈＣＢ―ジヒドロサイトカラシンＢ
ＤＭＥＭ―ダルベッコの変法イ―グル培地
ＥＣＧＳ―内皮細胞増殖補助剤
ＥＣＬ―増強化学発光
ＦＩＴＣ―フルオレセインイソチオシアネート
ＬＰＳ―リポ多糖
ＰＡＫ―ｐ２１活性化キナーゼ
ＰＥＣ―肺内皮細胞
ＰＩＸ―ＰＡＫ関連グアニンヌクレオチド交換因子
ＰＭＮ―多形核白血球
ＲＯＳ―活性酸素種
ＳＯＤ―スーパーオキシドジスムターゼ
ＴＮＦ―腫瘍壊死因子。
【００３１】
定義
本発明の記載および請求においては、以下の用語が、以下に記載する定義にしたがって用いられる。
【００３２】
本明細書で使用されるところの、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の一つまたは二つ以上、すなわち少なくとも一つをさす。一例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、一つの要素または二つ以上の要素を意味する。
【００３３】
本明細書で使用されるところの、「罹患した細胞」という用語は、罹患した細胞が、疾患、条件または障害に冒されていない対象と比較して改変された表現型を有する、疾患または障害に冒された対象の細胞をさす。
【００３４】
細胞または組織が、病気、条件または障害に冒されていない対象の同じ細胞または組織と比較して改変された表現型を有する場合には、細胞または組織が病気または障害に「罹患している」。
【００３５】
本明細書で使用されるところの「アミノ酸」は、下表に示されるそのフルネーム、これに対応する三文字のコード、またはこれに対応する一文字のコードで表わされる。
【００３６】
フルネーム  三文字のコード  一文字のコード
アスパラギン酸    Ａｓｐ            Ｄ
グルタミン酸      ＧＩｕ            Ｅ
リシン            Ｌｙｓ            Ｋ
アルギニン        Ａｒｇ            Ｒ
ヒスチジン        Ｈｉｓ            Ｈ
チロシン          Ｔｙｒ            Ｙ
システイン        Ｃｙｓ            Ｃ
アスパラギン      Ａｓｎ            Ｎ
グルタミン        Ｇｌｎ            Ｑ
セリン            Ｓｅｒ            Ｓ
トレオニン        Ｔｈｒ            Ｔ
グリシン          Ｇｌｙ            Ｇ
アラニン          Ａｌａ            Ａ
バリン            Ｖａｌ            Ｖ
ロイシン          Ｌｅｕ            Ｌ
イソロイシン      Ｉｌｅ            Ｉ
メチオニン        Ｍｅｔ            Ｍ
プロリン          Ｐｒｏ            Ｐ
フェニルアラニン  Ｐｈｅ            Ｆ
トリプトファン    Ｔｒｐ            Ｗ。
【００３７】
本明細書で用いられるところの「アミノ酸」という表現は、天然および合成アミノ酸の両方、およびＤおよびＬアミノ酸の両方を含む意味である。「標準アミノ酸」とは、天然のペプチドに一般に見られる２０の標準Ｌアミノ酸の任意のものを意味する。「非標準アミノ酸残基」は、合成的に調製されるか天然のソースに由来するかを問わず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。本明細書で使用されるところの「合成アミノ酸」は、塩類、アミノ酸誘導体（アミドなど）および置換体を含むがこれに限られない、化学修飾されたアミノ酸も含む。本発明のペプチドに含まれるアミノ酸は、特にカルボキシ末端またはアミノ末端で、メチル化、アミド化、アセチル化またはペプチドの活性に悪影響を与えずに循環半減期を変更できる他の化学基による置換により修飾されうる。さらに、本発明のペプチドにはジスルフィド結合が存在し、または非存在でありうる。
【００３８】
「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換可能に用いられ、遊離アミノ酸およびペプチドのアミノ酸残基をさしうる。遊離アミノ酸をさすか、ペプチドの残基をさすかは、用語が用いられる文脈から明白である。
【００３９】
アミノ酸は、以下の一般的構造を有する：
【００４０】
【化１】
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アミノ酸は、側鎖Ｒにもとづいて七つの群に分類されうる：（１）脂肪族側鎖；（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含む側鎖；（３）硫黄原子を含む側鎖；（４）酸性基またはアミド基を含む側鎖；（５）塩基性基を含む側鎖；（６）芳香環を含む側鎖；および（７）側鎖がアミノ基に融合されたイミノ酸であるプロリン。
【００４１】
本明細書で使用されるところの、「保存的なアミノ酸置換」という用語は、本明細書においては、以下の五つの群の中の置換として定義される。
【００４２】
Ｉ．小さな脂肪族の、無極性またはやや極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の、負に帯電した残基およびそのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性の、正に帯電した残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大きな、脂肪族の、無極性の残基：
ＭｅｔＬｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａＩ、Ｃｙｓ
Ｖ．大きな、芳香族の残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００４３】
本発明のペプチド化合物を記載するために用いられる命名法は、慣行に従い、アミノ基が各アミノ酸残基の左に、カルボキシ基が右に示される。本発明の選択された特定の実施形態を表す化学式においては、アミノおよびカルボキシ末端基は、特に示されてはいないが、特に明記しない限り生理学的ｐＨ値でとる形であると理解されるものとする。
【００４４】
本明細書で用いられるところの、「塩基性」または「正に帯電した」アミノ酸という用語は、Ｒ基がｐＨ７．０で正味正電荷を有するアミノ酸をさし、標準アミノ酸リシン、アルギニン、およびヒスチジンを含むがこれに限られない。
【００４５】
本明細書で使用されるところの、化学化合物の「アナログ」とは、例えば、他に構造が似ているが必ずしも異性体ではない化合物である（例えば、５―フルオロウラシルは、チミンのアナログである）。
【００４６】
「対照」細胞は、テスト細胞と同じ細胞型を有する細胞である。対照細胞は、例えば、テスト細胞が検査される時間と正確に同じ、またはほぼ同じ時間に検査されうる。また、対照細胞は、例えば、テスト細胞が検査される時間から離れた時間に検査され、対照細胞の検査の結果が記録され、記録された結果がテスト細胞の検査により得られた結果と比較されてもよい。
【００４７】
「テスト」細胞は、検査されている細胞である。
【００４８】
「疾病指標」細胞は、組織に存在する場合に、組織のある（または組織を得た）動物が疾患または障害に冒されているという指標となる細胞である。
【００４９】
「病原性」細胞は、組織に存在する場合に、組織のある（または組織を得た）動物の疾患または障害の原因または一因となる細胞である。
【００５０】
疾患または障害に冒されていない動物の組織に一つ以上の細胞が存在する場合には、組織が細胞を「正常に含む」。
【００５１】
「競合配列」という用語は、別のペプチドと同じ結合部位を争うペプチドまたは修飾体、フラグメント、誘導体、またはそのホモログをさす。
【００５２】
本明細書で、タンパク質に関して用いられるところの「複合体」という用語は、二つ以上のタンパク質の結合または相互作用をさす。複合体形成または相互作用には、結合、三次構造の変化、および別のタンパク質によるタンパク質の修飾、たとえばリン酸化などが含まれうる。
【００５３】
本明細書で用いられるところの「化合物」とは、薬物、または薬物として使用するための候補であると一般に考えられる、任意の種類の物質または薬剤、ならびに上記の組み合わせおよび混合物をいう。
【００５４】
本明細書で用いられるところの「サイトカイン」とは、細胞間シグナル伝達分子をさし、最もよく知られるものは、哺乳類体細胞の調節に関わる。たとえばインターロイキン、インターフェロン、およびトランスフォーミング成長因子を含め、成長促進および成長阻害の効果をもつ多くのサイトカインファミリーが特徴づけられている。他の多くのサイトカインが、当業者に公知である。これらのサイトカインのソース、特徴、標的およびエフェクター活性が、記載されている。
【００５５】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持できず、疾患が改善されない場合には動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。これに対して、動物の「障害」は、動物がホメオスタシスを維持できるが、動物の健康状態が、障害の非存在下より好ましくない健康状態である。未治療のままである場合に、障害が動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
【００５６】
疾患または障害の症状の重症度、このような症状を患者が経験する頻度、または両方が減少する場合には、疾患、状態または障害が「軽減される」。
【００５７】
「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも一つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部、少なくとも一つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部である。「フラグメント」および「セグメント」という用語は、本明細書において互換可能に用いられる。ペプチドまたはタンパク質の「生物学的に活性のフラグメント」は、天然リガンドに対する結合またはタンパク質の機能の実行など、親ペプチドの活性を維持するものである。
【００５８】
本明細書で使用されるところの、「機能的」生体分子とは、それが特徴づけられる性質または活性を示す形の生体分子である。たとえば、機能的酵素とは、酵素を特徴づける特徴的な触媒活性を示すものである。
【００５９】
本明細書で用いられるところの「相同」とは、二つのポリマー分子間、たとえば二つの核酸分子間、たとえば二つのＤＮＡ分子または二つのＲＮＡ分子間、または二つのポリペプチド分子間の、サブユニット配列類似性をいう。二つの分子の両方のサブユニットの位置が、同じ単量体サブユニットにより占められる場合、たとえば、二つのＤＮＡ分子の各々における位置をアデニンが占める場合には、二つはその位置で相同である。二つの配列間の相同性は、マッチする位置または相同の位置の数の直接関数であり、たとえば、二つの化合物配列の位置の半分（例えば十サブユニットの長さのポリマーの五つの位置）が相同である場合には、二つの配列は５０％相同であり、位置の９０％、例えば１０のうち９がマッチまたは相同なら、二つの配列は９０％の相同性を共有する。例えば、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有する。
【００６０】
本明細書で使用されるところの、「相同性」は、「同一性」と同義的に用いられる。
【００６１】
二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性％の測定は、数学的アルゴリズムを用いて達成されうる。例えば、二つの配列の比較に有用な数学的アルゴリズムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４―２２６８）が修正された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌに記載のもの（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３―５８７７）である。このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれ（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３―４１０）、たとえば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＫＣＢＩ）ワールドワイド・ウェブサイトなどで利用できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と指定）で、以下のパラメータ：ギャップペナルティ＝５；ギャップ伸張ペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；マッチリウォード＝１；期待値１０．０；およびワードサイズ＝１１を用いて、本明細書に記載の核酸と相同のヌクレオチド配列を得ることにより実行されうる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と指定）またはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムで、以下のパラメータ：期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを用いて、本明細書に記載のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることにより実行されうる。比較の目的でギャップありのアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９―３４０２）に説明されるように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用されうる。あるいは、分子間の遠縁関係（同上）および共通のパターンを共有する分子間の関係を検出する反復検索を実行するために、ＰＳＩ―ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ―Ｂｌａｓｔが使用されうる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ―Ｂｌａｓｔ、およびＰＨＩ―Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用されうる。
【００６２】
二つの配列間の同一性％は、ギャップを許容して、または許容せずに、上記のものと同様の技術を用いて測定されうる。同一性％を計算する際には、典型的には完全マッチがカウントされる。
【００６３】
本明細書で用いられるところの、「阻害する」という用語は、記載の機能を弱めまたは妨げる、化合物または任意の薬剤の能力をいう。阻害は少なくとも１０％であるのが好ましく、少なくとも２５％であるのがより好ましく、少なくとも５０％であるのがさらに好ましく、機能が少なくとも７５％阻害されるのが最も好ましい。「阻害する」という用語は、「阻止する」および「ブロックする」と互換可能に用いられる。
【００６４】
本明細書で用いられるところの、「複合体を阻害する」という用語は、二つ以上のタンパク質の複合体の形成または相互作用を阻害すること、ならびに複合体の機能または活性を阻害することをさす。用語は、形成された複合体を破壊することも含む。しかし、用語は、これらの機能のいずれもが同時に阻害されなければならないことを意味しない。
【００６５】
本明細書で用いられるところの、「タンパク質を阻害する」という用語は、タンパク質合成、レベル、活性、または機能を阻害する任意の方法または技術、ならびに目的のタンパク質の合成、レベル、活性、または機能の誘発または刺激を阻害する方法をさす。用語は、目的のタンパク質の合成、レベル、活性、または機能を調節できる任意の代謝または調節経路もさす。用語は、他の分子との結合および複合体形成を含む。したがって、「タンパク質阻害剤」という用語は、適用によりタンパク質機能またはタンパク質経路機能の阻害が生じる任意の薬剤または化合物をさす。しかし、用語は、これらの機能のいずれもが同時に阻害されなければならないことを意味しない。
【００６６】
「単離された核酸」とは、天然の状態で隣接する配列から分離されている核酸セグメントまたはフラグメント、たとえばそのフラグメントに通常隣接する配列、たとえば、それが自然に存在するゲノムにおいてフラグメントに隣接する配列から除去されているＤＮＡフラグメントをさす。用語は、たとえば、細胞内で核酸に自然に伴うＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質など、核酸に自然に伴う他の成分から実質的に精製された核酸にもあてはまる。したがって、用語は、たとえば、ベクター、自己複製するプラスミドまたはウィルス、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、または他配列から独立した分子として存在する（たとえばｃＤＮＡまたはＰＣＲまたは制限酵素消化により産出されたゲノムまたはｃＤＮＡフラグメント）組換えＤＮＡを含む。また、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。
【００６７】
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含みうる。
【００６８】
本明細書で使用されるところの、「教材」には、本明細書に詳述される様々な疾患または障害の軽減をもたらす上での、キット内の本発明の化合物の有用性を伝えるために使用されうる、刊行物、記録、図表、または他の任意の表現媒体を含む。選択的または代替的に、教材は、哺乳類の細胞または組織の疾患または障害を軽減する一つ以上の方法を記載しうる。本発明のキットの教材は、例えば、同定された化合物発明を含む容器に固定され、または同定された化合物を含む容器と共に輸送されうる。あるいは、教材と化合物がレシピエントにより協調して用いられるという意図で、教材が容器とは別に輸送されうる。
【００６９】
本明細書で使用されるところの、「白血球」という用語は、好中球、好酸球、好塩基球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびこれらの白血球の誘導体および運動性前駆体を含む任意の白血球を含むがこれに限られない。
【００７０】
本明細書で用いられるところの、「白血球に関連する疾患または障害」という用語は、白血球の活性または機能が、炎症など、疾患または障害のある側面に対して促進または寄与する疾患または障害をさす。例には、好中球依存性の急性肺傷害が含まれるがこれに限られない。
【００７１】
本明細書で用いられるところの、「白血球機能」という用語は、多形核（好中球）細胞を含むがこれに限られない、白血球の機能および活性を含む。定義に含まれる機能および活性には、接着、遊走、停止、ＰＡＫの活性化および細胞内の活性、ＲＯＳ（活性酸素産生）の誘発および放出、細胞骨格再構築、ならびにＰＡＫおよびＰＡＫ活性および関連する経路の上流および下流調節が含まれるがこれに限られない。
【００７２】
本明細書で用いられるところの、「白血球遊走」という用語は、トランスマイグレーション、経上皮遊走および経内皮遊走、ならびに炎症の部位への白血球の動員（すなわち走化）を含む、任意の白血球の運動をさす。
【００７３】
本発明に含まれる方法および組成物は、好中球の流入と関連した慢性肺傷害または疾患または状態を治療するためにも有用である。
【００７４】
本明細書で使用されるところの、「リガンド」は、標的化合物または分子に特異的に結合する化合物である。化合物の不均一試料中の化合物の存在を決定する結合反応においてリガンドが機能する場合には、リガンドが化合物に「特異的に結合」または「特異的に反応」する。
【００７５】
本明細書で使用されるところの、「連結」とは、二つの基間の結び付きを指す。連結は、共有結合的でも非共有結合的でもあり得、イオン結合、水素結合、および疎水性／親水性相互作用を含むがこれに限られない。
【００７６】
本明細書で使用されるところの、「リンカー」という用語は、他の二つの分子を共有結合または非共有結合的に、たとえば、イオン結合または水素結合またはファンデルワールス相互作用によって結合する分子をさす。本明細書で使用されるところの、「核酸」という用語は、ＲＮＡならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および類似の用語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステル骨格以外を有するアナログも含む。たとえば、従来技術において周知であり、骨格にホスホジエステル結合のかわりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内と考えられる。
【００７７】
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含みうる。
【００７８】
本明細書で使用されるところの、「核酸」という用語は、ＲＮＡならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語および同様の用語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステル骨格以外を有するアナログも含む。たとえば、従来技術において周知であり、骨格にホスホジエステル結合のかわりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内と考えられる。「核酸」は、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドからなり、ホスホジエステル連結または修飾連結からなる、たとえばホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カルボナート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロアミダート、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、ホスホロチオアート、メチルホスホナート、ホスホロジチオアート、架橋ホスホロチオアート、またはスルホン連結、およびこのような連結の組み合わせなどからなる、任意の核酸を意味する。核酸という用語は、五つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基からなる核酸も特に含む。本明細書においては、ポリヌクレオチド配列を記載するために従来の表記法が用いられる：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’へのヌクレオチド付加の方向は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」と呼ばれ、ＤＮＡ上の基準点の５’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれ、ＤＮＡ上の基準点の３’側であるＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。
【００７９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には短いポリヌクレオチド、一般に約５０以下のヌクレオチドをさす。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合には、これには「Ｕ」が「Ｔ」に置き換えられたＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含まれると理解されるものとする。
【００８０】
本明細書で用いられるところの、「ＰＡＫ機能」という用語は、他の分子とのＰＡＫの結合、キナーゼ活性、自己リン酸化、転位、他の分子による活性化などを含むがこれに限らない、ｐ２１活性化キナーゼの任意の活性または機能をさす。本明細書においては、「ＰＡＫ機能」は「ＰＡＫ活性」と互換可能に用いられる。本明細書で用いられるところの、「ＰＡＫの阻害」とは、ＰＡＫ合成の阻害を含む、ＰＡＫの任意の活性または機能の阻害を指す。
【００８１】
「ペプチド」という用語は典型的には、短いポリペプチドをいう。
【００８２】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合、関連する天然の構造変異体、およびその合成の非天然のアナログを介して連結された、アミノ酸残基、関連する天然の構造変異体、およびその合成の非天然のアナログからなるポリマーをさす。合成ポリペプチドは、例えば、自動化されたポリペプチドシンセサイザを用いて合成されうる。
【００８３】
「タンパク質」という用語は典型的には、大きなポリペプチドをいう。
【００８４】
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドの発現により産出されるものである。
【００８５】
ペプチドは、アミノ酸が天然または合成の（非天然の）アミノ酸である、２つ以上のアミノ酸の配列を含む。ペプチドミメティクスは、以下の修飾の一つ以上を有するペプチドを含む：
１．一つ以上のペプチジル――Ｃ（Ｏ）ＮＲ――連結（結合）が、――ＣＨ２―カルバメート連結（――ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ――）、ホスホナート連結、―ＣＨ２―スルホンアミド（―ＣＨ２――Ｓ（Ｏ）２ＮＲ――）連結、尿素（――ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ――）連結、――ＣＨ２―二級アミン連結などの非ペプチジル連結、またはアルキル化ペプチジル連結（―−Ｃ（Ｏ）ＮＲ――）（ＲはＣ１―Ｃ４アルキル）で置換されている、ペプチド；
２．Ｎ―末端が、――ＮＲＲ１基、――ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、――ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、――ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、――ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基（ＲおよびＲ１は、水素またはＣ１―Ｃ４アルキルであるが、両方とも水素となることはない）に誘導化される、ペプチド；
３．Ｃ末端が、Ｒ２がＣ１―Ｃ４アルコキシからなる群より選択される――Ｃ（Ｏ）Ｒ２、および、Ｒ３およびＲ４が水素およびＣ１―Ｃ４アルキルからなる群より独立して選択される――ＮＲ３Ｒ４に誘導化される、ペプチド。
【００８６】
本明細書で用いられるところの、「透過性」という用語は、細胞および組織の間またはこれを通る、流体、細胞または細片の通過をさす。
【００８７】
本明細書で使用されるところの、「薬理学上許容可能な担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水または水／油乳濁液等の乳濁液、および様々な種類の湿潤剤など、任意の標準の医薬担体を含む。用語は、ヒトを含む動物用として米国連邦政府の監督官庁に承認されているか米国薬局方にリストされている任意の薬剤も含む。
【００８８】
本明細書で使用されるところの、末端アミノ基に関する「保護基」とは、末端アミノ基が、ペプチド合成に伝統的に用いられる様々なアミノ末端保護基のいずれかに結合した、ペプチドの末端アミノ基をさす。このような保護基は、例えば、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、サクシニル、およびメトキシサクシニルなどのアシル保護基；ベンジルオキシカルボニルなどの芳香族ウレタン保護基；およびｔｅｒｔ―ブトキシカルボニルまたはアダマンチルオキシカルボニルなどの脂肪族ウレタン保護基を含む。適切な保護基については、ＧｒｏｓｓおよびＭｉｅｎｈｏｆｅｒ，編，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．３，ｐｐ．３―８８（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）を参照。
【００８９】
本明細書で使用されるところの、末端カルボキシ基に関する「保護基」とは、末端カルボキシル基が、様々なカルボキシル末端保護基のいずれかに結合した、ペプチドの末端カルボキシル基をさす。このような保護基は、例えば、エステルまたはエーテル結合により末端カルボキシル基に結合されたｔｅｒｔ―ブチル、ベンジル、または他の許容可能な基を含む。
【００９０】
本明細書で使用されるところの、「精製」および類似の用語は、天然の環境において分子または化合物に通常伴う他成分と比較した、分子または化合物の濃縮に関する。「精製」という用語は、プロセス中に特定の分子の完全な純度が達成されていることを必ずしも意味しない。本明細書で用いられるところの、「高度に精製された」化合物は、９０％を上回る純度の化合物をさす。
【００９１】
本明細書で用いられるところの、「タンパク質の調節経路」という用語は、タンパク質を調節する上流の調節経路、およびそのタンパク質が調節する下流事象の両方をさす。このような調節は、転写、翻訳、レベル、活性、翻訳後修飾、および目的のタンパク質の機能、ならびにタンパク質が調節する下流事象を含むがこれに限られない。
【００９２】
本明細書においては、「タンパク質経路」および「タンパク質の調節経路」という用語は、互換可能に用いられる。
【００９３】
「調節する」という用語は、目的の機能または活性を刺激または阻害することをさす。
【００９４】
「小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）」は、とりわけセンスおよびアンチセンス鎖の両方を含む単離されたｄｓＲＮＡ分子を意味する。一態様では、長さが１０ヌクレオチドより長い。ｓｉＲＮＡは、たとえばヘアピンなど、標的遺伝子からのセンスおよび相補的アンチセンス配列を有する単一の転写産物もさす。ｓｉＲＮＡは、任意の形のｄｓＲＮＡ（タンパク分解的に切断されたより大きなｄｓＲＮＡの産物、部分精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成のＲＮＡ、組み換えにより作製されたＲＮＡ）、ならびに一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または改変により天然のＲＮＡと異なる改変されたＲＮＡをさらに含む。
【００９５】
本明細書で用いられるところの、「特異的に結合する」という用語は、特定のタンパク質を認識し、結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗体を意味し、または、タンパク質が試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない場合の細胞調節プロセスの一部としての二つ以上のタンパク質間の結合を意味する。
【００９６】
本明細書で用いられるところの、「標準」という用語は、比較のために用いられるものをいう。例えば、それは、テスト化合物を加えた場合の結果を比較するために投与または付加および使用される公知の標準の薬剤または化合物、または、パラメータまたは機能に対する薬剤または化合物の効果を測定する際の対照値を得るために測定される、標準のパラメータまたは機能でありうる。標準は、試料に既知量で加えられ、目的のマーカが測定される前に試料が処理または精製または抽出処置される場合の、精製または回収率などの測定に有用である薬剤または化合物などの「内部標準」もさしうる。内部標準は、多くの場合、内因性マーカと区別できるように放射性同位元素などでラベルされている、精製された目的のマーカである。
【００９７】
診断または治療の「対象」は、ヒトを含む哺乳類である。
【００９８】
本明細書で用いられるところの、「症状」という用語は、患者が経験し、疾患を表す、構造、機能または感覚の、任意の病理的現象または正常からの離脱である。これに対して、兆候は、病気の客観的な証拠である。例えば、鼻血は兆候である。それは、患者、医師、看護士および他の観察者に明らかである。
【００９９】
本明細書で使用されるところの、「治療」という用語は、特定の疾患、障害または状態の予防、または特定の疾患、障害または状態に関連した症状の軽減、および／または当該症状の防止または除去を含む。「予防的」処置は、病気に関連した症状を発病するリスクを減少させるために、病気の兆候を示さないか、病気の初期兆候のみを示す対象に施される処置である。
【０１００】
「治療的」処置は、症状の兆候を示す対象に対して、それらの兆候を減少または排除するために施される処置である。
【０１０１】
化合物の「治療上有効量」は、化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。
【０１０２】
本発明の方法に従って治療されうる病気のいくつかの例が、本明細書に記載される。現在未知である他の白血球に関連する疾患も、一旦知られれば本発明の方法を用いて治療することが可能でありうるため、本発明がこれらの例だけに制限されると解釈されてはならない。
【０１０３】
本発明に含まれるペプチドは、以下を含む：
配列番号１―ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭ
配列番号２―ＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭ
配列番号３―ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ
配列番号４―ＰＰＰＶＩＡＰＲＰＥＨＴＫＳＶＹＴＲ
配列番号５―ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＰＰＰＶＩＡＰＲＰＥＨＴＫＳＶＹＴＲ
配列番号６―ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＰＰＰＶＩＡＰＡＡＥＨＡＫＳＶＹＴＲ
配列番号１は、細胞へのエントリーを促進するＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質（Ｓｃｈｗａｒｚｅ等，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９）からの多塩基配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号３）に融合された、ＰＡＫの一番目のプロリンリッチドメインからの配列ＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭ（配列番号２）からなる。ペプチド（配列番号１）は、全長ドミナントネガティブコンストラクトと同様にＰＡＫ機能を阻害する。ペプチドは、それ自体はＰＡＫキナーゼ活性をブロックしないが、細胞―細胞結合部を含む作用部位からＰＡＫを除去し、これにより細胞収縮性、遊走および透過性に対する効果が十分に妨げられる。ＰＩＸαおよびＰＤＣβに結合するＰＡＫ中の配列は、ＰＰＰＶＩＡＰＲＰＥＨＴＫＳＶＹＴＲ（配列番号４）である。配列番号５は、配列番号３および４の配列の組み合わせである。配列番号６は、二つのアミノ酸変異／置換（上の配列番号６に太字で示される）を含む配列番号５の対照ペプチドである。
【０１０４】
本発明は白血球機能を阻害する組成物および方法に関する。一態様では、白血球は、好中球である。一態様では、阻害される機能は、肺疾患または障害、または急性または慢性炎症に関連する。
【０１０５】
一実施形態においては、本発明は、ＰＡＫのＰＩＸに対する結合をブロックすることにより、白血球機能を阻害する方法を提供する。一態様では、本発明は、ＰＡＫのＰＩＸに対する結合をブロックするペプチドを提供する。本発明は、ペプチドのアナログ、ホモログ、誘導体、および修飾体をさらに含む。
【０１０６】
本発明は、ペプチド、抗体、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡを含むがこれに限られない阻害剤を含む。
【０１０７】
別の実施形態においては、ＰＡＫ活性または機能の阻害剤は、他のタンパク質または分子のＰＡＫとの結合をブロックしうる。一態様では、白血球機能の阻害剤は、他のタンパク質または分子と結合して、それらのＰＡＫとの相互作用を阻害する。別の態様では、阻害剤は、ＰＡＫと結合して、他のタンパク質または分子のＰＡＫとの結合を阻害する。一態様では、本発明の阻害剤は、ＰＡＫのＰＩＸとの相互作用を阻害する。一態様では、阻害剤はペプチドである。一態様では、ペプチドは、ペプチドの細胞へのエントリーを助ける配列を含むように修飾されている。
【０１０８】
本出願は、本明細書に同定される経路をブロックするための、ｓｉＲＮＡの使用をさらに含む。本発明のｓｉＫＮＡはさらに、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、本明細書に記載のペプチドをコードする核酸、アプタマー、抗体、キナーゼ阻害剤、および薬物／薬剤／化合物など、本明細書に記載または従来技術において公知の他の調節因子とともに使用されうる。
【０１０９】
化合物がＰＡＫおよびＰＩＸのシグナル伝達の成分および調節経路を調節するかを当業者がモニタできる、多数のアッセイおよび方法が、本明細書に記載され、または公知技術であり、これらのアッセイおよび方法が、本発明の方法の範囲内に含まれる。このようなアッセイは、タンパク質および経路の調節因子を同定するためにも有用である。
【０１１０】
例えば、ＰＡＫリン酸化および細胞―細胞結合部への転位などを分析することにより、ＰＡＫ活性および機能がモニタされうる。このようなアッセイは、Ｓｃｈｗａｒｔｚ等（内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、１０／２０／０５に公開の米国特許出願公開第２００５／０２３３９６５号）に記載される。ＰＡＫ―１、―２、および―３は、ＡＩＤと呼ばれる調節Ｎ末端の配列とのキナーゼドメインの相互作用を介して不活性なコンホメーションに保たれる（Ｂｏｋｏｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，７２：７４３）。活性化されたＲａｃまたはＣｄｃ４２のＰＡＫに対する結合は、ＰＡＫキナーゼ活性の持続的増加をもたらす、いくつかの部位の自己リン酸化につながる（Ｇａｔｔｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：３２５６５；Ｃｈｏｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６：１７３４７）。これらの部位の一つ、ＰＡＫ２のＳｅｒ１４１（ＰＡＫ１のＳｅｒ１４４に対応する）は、ＡＩＤに含まれ、そのリン酸化は、ＡＩＤのキナーゼドメインとの相互作用をブロックすることにより、活性化に寄与する。細胞内における活性化ＰＡＫの局所化のため、リン酸化されたＳｅｒ１４１部位を特異的に認識する抗体が使用されうる。
【０１１１】
テスト化合物／阻害剤に反応した細胞内のＰＡＫリン酸化を評価するため、１８時間血清飢餓状態に（０．５％血清）した後１０％の血清で刺激されるコンフルエントのウシ大動脈およびヒト臍静脈内皮細胞を用いて、血清（それぞれＢＡＥＣおよびＨＵＶＥＣ）の効果と化合物が比較されうる。ＰＡＫリン酸化の変化を分析するために、抗―ホスホ―ＰＡＫ  Ｓｅｒ１４１抗体によるウェスタンブロッティングが使用されうる。活性化されたタンパク質のフラクションが主に細胞―細胞結合部に局所化されるかを分析することにより、血清、処置なし、およびテスト化合物に反応したＰＡＫリン酸化の変化を示すために、抗―ホスホ―ＰＡＫ  Ｓｅｒ１４１（ｐＰＡＫ）による、同様に処置された細胞の蛍光染色が使用されうる。
【０１１２】
本発明は、本明細書に記載のタンパク質および経路の調節因子を同定するための、イースト２―ハイブリッドシステムの使用をさらに含む。このような調節因子は、薬物、化合物、ペプチド、核酸等でありうる。このような調節因子は、内因性調節因子を含みうる。
【０１１３】
一般に、イースト２―ハイブリッドアッセイは、新規のタンパク質―タンパク質相互作用およびそれらの相互作用を改変しうる化合物を同定できる。多様なタンパク質を潜在的結合パートナーとして用いることにより、以前に特徴付けられていない相互作用を検出することが可能である。第二に、イースト２―ハイブリッドアッセイを用いて、生じることが既知の相互作用を特徴づけることができる。特徴づけは、短縮タンパク質を用いての、どのタンパク質ドメインが相互作用を担うかの決定、または細胞内環境を変化させることによる、相互作用が起こる条件の決定を含みうる。これらのアッセイは、相互作用のモジュレーターのスクリーニングにも使用できる。
【０１１４】
本発明は、本明細書に記載のタンパク相互作用および経路のアンタゴニストとしての役割をする（阻害する）化合物を同定するための、化合物のスクリーニング方法を含む。アンタゴニスト化合物候補のスクリーニングアッセイは、本明細書に記載のペプチドと結合または複合体を形成し、あるいはペプチドの他の細胞タンパク質との相互作用を妨げる化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニングアッセイは、ケミカルライブラリのハイ―スループットスクリーニングに適し、小分子の候補薬を同定するのに特に適するアッセイを含む。
【０１１５】
アッセイは、本明細書および従来技術において特徴が詳述される、タンパク質―タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞ベースのアッセイを含む、様々なフォーマットで実行されうる。
【０１１６】
全てのアンタゴニストのアッセイは、化合物または候補薬を本明細書に特定されるペプチドまたは細胞と、これらの二成分を相互作用させる条件下で十分な時間接触させることを必要とする点で共通する。
【０１１７】
結合アッセイにおいては、相互作用は結合であり、形成された複合体が単離され、または反応混合物中に検出されうる。特定の実施形態においては、本明細書に記載の複合体のペプチドの一つ、またはテスト化合物または候補薬が、たとえばミクロタイタープレートなど、固相に共有結合または非共有結合により固定される。非共有結合は通常、固体の表面をペプチドの溶液でコートし、乾かすことにより達成される。あるいは、例えば固定されるペプチドに特異的な単クローン抗体など、固定された抗体を用いて、固体の表面に固定しうる。例えば固定された成分を含むコーティング表面など、固定された成分に、検出可能な標識でラベルされうる固定されていない成分を加えることにより、アッセイが実行される。反応が終了したら、反応していない成分が、たとえば洗浄により除去され、固体の表面上に固定された複合体が検出される。元々固定されていない成分が検出可能な標識を担持する場合には、表面に固定された標識の検出が、複合体形成が生じたことを示す。元々固定されていない成分が検出可能な標識を担持しない場合には、例えば、固定された複合体に特異的に結合するラベルされた抗体を用いて、複合体形成が検出されうる。
【０１１８】
候補化合物が、本明細書に特定される特定のペプチドと相互作用するが結合しない場合は、タンパク質―タンパク質相互作用を検出するための公知の方法により、そのペプチドとの相互作用が分析されうる。このようなアッセイは、例えば、架橋、免疫共沈降、および勾配またはクロマトカラムによる同時精製など、従来のアプローチを含む。さらに、タンパク質―タンパク質相互作用は、ＣｈｅｖｒａｙおよびＮａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９―５７９３（１９９１）により開示されるとおり、Ｆｉｅｌｄｓおよび共同研究者により記載される、酵母ベースの遺伝系を用いてモニタされうる（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３４０：２４５―２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎ等．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８―９５８２（１９９１））。２ハイブリッド技術を用いて、二つの特定のタンパク質間のタンパク質―タンパク質相互作用を同定するための、完全なキットが入手可能である。このシステムを延長して、特定のタンパク相互作用に関わるタンパク質ドメインをマッピングすることや、これらの相互作用に重要なアミノ酸残基を特定することもできる。
【０１１９】
本明細書に特定されるペプチドおよび他の細胞内または細胞外成分の相互作用を妨げる化合物が、以下のようにテストされうる：通常は、遺伝子産物と細胞内または細胞外成分とを含む反応混合物が、二つの産物の相互作用および結合を許容する条件下および時間で調製される。結合を阻害する候補化合物の能力をテストするために、テスト化合物の存在下および非存在下で反応が行われる。さらに、第三の反応混合物に、陽性対照としてプラセボが加えられうる。混合物中のテスト化合物と細胞内または細胞外成分との結合（複合体形成）が、前述のようにモニタされる。テスト化合物を含む反応混合物ではなく対照反応物（単数または複数）における複合体の形成は、テスト化合物がテスト化合物とその反応パートナーの相互作用を妨げることを示す。
【０１２０】
アンタゴニストを測定するために、ペプチドが化合物とともに細胞に加えられて特定の活性につきスクリーニングされればよく、ペプチドの存在下で目的の活性を阻害する化合物の能力は、化合物がペプチドに対するアンタゴニストであることを示す。ペプチドは、例えば放射能によってラベルされうる。
【０１２１】
例えばｐｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）の使用およびリバースイースト２―ハイブリッドアッセイなど、他のアッセイおよびライブラリが本発明の範囲内に含まれる（参照により各刊行物の内容の全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｔｔ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４：１７７；Ｗａｔｔ，米国特許第６，９９４，９８２号；Ｗａｔｔ，米国特許出願公開第２００５／０２８７５８０号；Ｗａｔｔ，米国特許第６，５１０，４９５号；Ｂａｒｒ等，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：４１：４３１７８―４３１８９を参照）。Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）は、天然タンパク質のサブドメインに由来し、そのため従来の短いランダムペプチドよりも潜在的に安定する。Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）は、ヒトではない起源の生物ゲノムから供給される。この特徴により、ヒトタンパク質標的に対するＰｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）に伴う能力が有意に増強される。Ｐｈｙｌｏｇｉｃａの現在のＰｈｙｌｏｍｅｒ（商標）ライブラリは、５０，０００，０００クローンの複雑度を有し、これはランダムペプチドまたは抗体Ｆａｂフラグメントライブラリの数値的複雑度に匹敵する。Ｂ４２活性化ドメインに融合された６３，０００，０００ペプチドを含む相互作用ペプチドライブラリを用いて、フォワードイースト２ハイブリッドスクリーンにおいて標的タンパク質に結合できるペプチドを単離できる。第二は、２，０００，０００以上のペプチドからなるブロッキングペプチドライブラリであり、これを用いて、リバース２―ハイブリッドシステムを用いて特定のタンパク質相互作用を妨害できるペプチドをスクリーニングできる。
【０１２２】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒ（商標）ライブラリは、多様な細菌ゲノムから供給されているタンパク質フラグメント含む。ライブラリは、安定したサブドメインを多く含む（１５―５０アミノ酸の長さ）。この技術は、ファージディスプレイおよび逆イースト２―ハイブリッドトラップなど、ハイスループットスクリーニング技術と統合されうる。
【０１２３】
本発明は有用なアプタマーに関する。一実施形態においては、アプタマーは、別の化合物（この場合は同定されたタンパク質）に優先的に結合する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択される化合物である。一態様では、ヌクレオチドまたはアミノ酸（天然または合成的に作製されたものの両方）からランダム配列が容易に大量に生成されうるため、アプタマーは核酸またはペプチドであるが、当然のことながらこれらに限られる必要はない。別の態様では、核酸アプタマーは、タンパク質標的に結合する短鎖のＤＮＡである。一態様では、アプタマーは、オリゴヌクレオチドアプタマーである。オリゴヌクレオチドアプタマーは、目的の特定のタンパク質の配列に結合できるオリゴヌクレオチドである。アプタマーを同定する一般的な方法は、部分縮重オリゴヌクレオチドで開始し、所望のタンパク質に結合する能力につき、何千というオリゴヌクレオチドを同時にスクリーニングすることである。結合したオリゴヌクレオチドがタンパク質から溶出され、配列が決定されて、特定の認識配列が同定されうる。化学的に安定化された多くのアプタマーの細胞への導入により、目的のポリペプチドに対する特異的結合が生じて、その機能がブロックされうる。［例えば、アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を記載する以下の刊行物を参照：Ｋｌｕｇ等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０：９７―１０７（１９９４）；Ｗａｌｌｉｓ等，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５４３―５５２（１９９５）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４：４２７―４２９（１９９４）；Ｌａｔｏ等，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：２９１―３０３（１９９５）；Ｃｏｎｒａｄ等，Ｍｏｌ．Ｄｉｖ．１：６９―７８（１９９５）；およびＵｐｈｏｆｆ等，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：２８１―２８７（１９９６)］。
【０１２４】
本明細書で使用されるところの、アンタゴニストまたはブロッキング剤は、限定されるものではないが、抗体、その抗原結合性部分または特定の標的タンパク質に結合する生合成抗体結合部位；標的タンパク質またはこれに関連する調節要素をコードする核酸にｉｎ  ｖｉｖｏでハイブリダイズするアンチセンス分子、または標的タンパク質に結合および／または阻害する、または、標的タンパク質をコードする核酸の発現を結合および／または阻害、減少あるいは調節する、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、または小分子を含みうる。
【０１２５】
アプタマーは、標的遺伝子のタンパク質産物に高親和性および特異性で結合する能力により、標的遺伝子機能を人為的に妨げる他のオリゴヌクレオチドベースのアプローチを上回る利点を提供する。しかし、ヌクレアーゼ耐性アプタマーも細胞内コンパートメントに効率的に到達しないため、細胞内タンパク質を標的とするＲＮＡアプタマーの能力は制限されうる。さらに、ベクターベースのアプローチにより哺乳類細胞内にＲＮＡアプタマーを発現させる試みは、それらの機能的コンホメーションを改変しうる、発現ＲＮＡアプタマーにおけるさらなる隣接配列の存在により妨げられている。
【０１２６】
一本鎖核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡアプタマー）を用いてタンパク質分子を標的化する考えは、標的タンパク質に高親和性および特異性で結合することを可能とする独特の３Ｄコンホメーションに折りたためる短配列（８０マーから２０マー）の能力に基づく。ＲＮＡアプタマーは、イーストおよび多細胞生物などの真核細胞にうまく発現されており、細胞環境において標的タンパク質に対して阻害作用を有することが示されている。
【０１２７】
本出願は、本明細書に記載のタンパク質を阻害する組成物および方法を開示し、開示されない従来技術において周知のものは、本発明の範囲内に含まれる。例えば、抗体、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子などの生物学的に活性の核酸、または当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識するリボザイム、アプタマー、ペプチドまたは低分子量の有機化合物など、様々なモジュレーター／エフェクターが公知である。
【０１２８】
目的の表現型に関連するメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の発現または翻訳を阻害するために、一定のＲＮＡ阻害剤が利用されうる。本明細書における使用に適するこのような薬剤の例は、短鎖干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）、リボザイム、アプタマー、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むがこれに限られない。
【０１２９】
いくつかの場合には、１８―２５ヌクレオチドの範囲が、ｓｉＲＮＡｓの最も好ましいサイズである。ｓｉＲＮＡｓは、ｓｉＲＮＡ二重鎖の両方の鎖が単一のＲＮＡ分子に含まれる、短鎖ヘアピンＲＮＡｓも含みうる。ｓｉＲＮＡは、任意の形のｄｓＲＮＡ（タンパク加水分解的に切断されたより大きなｄｓＲＮＡの産物、部分精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成のＲＮＡ、組み換えにより作製されたＲＮＡ）、ならびに一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により天然のＲＮＡと異なる改変されたＲＮＡを含む。このような改変は、ＲＮＡ末端（単数または複数）または内部（ＲＮＡの一つ以上のヌクレオチド）での、非ヌクレオチド材料の付加を含みうる。
【０１３０】
一実施形態においては、ＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準ヌクレオチドも含みうる。このような改変されたＲＮＡｓは、全て集合的にＲＮＡのアナログと呼ばれる。本発明のｓｉＲＮＡｓは、天然のＲＮＡに十分類似するためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する能力を有すれば足りる。
【０１３１】
本明細書に開示されまたは含まれる配列に基づくｓｉＲＮＡｓは、１００塩基対未満であり、通常は３０ｂｐｓ以下であり、従来技術で公知のアプローチにより作られる。
【０１３２】
標的細胞の遺伝子発現を阻害する二重鎖ＲＮＡを設計する方法は、公知である（たとえば、米国特許第６，５０６，５５９号；Ｅｌｂａｓｈｉｒ等．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９―２１３，２００２；Ｃｈａｌｋ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３１９：２６４―２７４，２００４；Ｃｕｉ等．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｓｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７５：６７―７３，２００４，Ｗａｎｇ等，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０：１８１８―１８２０，２００４を参照）。例えば、ｓｉＲＮＡｓ（ヘアピンを含む）の設計は通常、公知の熱力学的法則に従う（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｚ，等，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９―２０８，２００３；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ等，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３２６―３０，２００４；Ｋｈｖｏｒｏｖａ，等，Ｃｅｌｌ  １１５：２０９―１６，２００３を参照）。適切な標的部位である配列の領域を選択するために、多くのコンピュータプログラムが利用可能である。これらは、Ａｍｂｉｏｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｚｉａｇｅｎ、およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔなどの市販ソース、ならびにＥＭＢＯＳＳ、Ｔｈｅ  Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、およびその他の市販以外のソースにより利用可能なプログラムを含む。
【０１３３】
例えば、設計は、以下の考慮に基づきうる。典型的には、短い配列、すなわち約３０ヌクレオチド未満が選択される。ｍＲＮＡのコード領域が、通常標的とされる。非翻訳領域結合タンパク質および／または翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げうるため、適切な標的配列の検索は、開始コドンの５０―１００ヌクレオチド下流で選択的に開始する。たとえばＥｌｂａｓｈｉｒ等の研究に基づくアルゴリズム（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９―２１３，２００２）は、約５０％のＧ／Ｃ含量（３０％〜７０％も成功した）の選択された配列モチーフおよび選択されたヒットを検索する。適切な配列が見つからない場合には、検索が延長される。
【０１３４】
例えば、リボザイム、アンチセンスなど他の核酸も、公知の原理に基づいて設計されうる。例えば、Ｓｆｏｌｄ（たとえばＤｉｎｇ，等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ，Ｗ１３５―Ｗ１４１，Ｄｉｎｇ  ＆  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：７２８０，７３０１，２００３；およびＤｉｎｇ  ＆  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１０３４―１０４６，２００１を参照）は、リボザイムおよびアンチセンスならびにｓｉＲＮＡｓの設計に関するプログラムを提供する。
【０１３５】
いくつかの実施形態においては、ｓｉＲＮＡｓが投与される。ｓｉＲＮＡ療法は、本発明のｓｉＲＮＡｓをコードする標準的なベクターにより、および／または合成ｓｉＲＮＡ分子を送達するなどの遺伝子送達システムにより、ｓｉＲＮＡを対象に投与することにより行われる。典型的には、ｉｎ  ｖｉｖｏのヌクレアーゼ分解を防ぐために、合成ｓｉＲＮＡ分子が化学的に安定化される。化学的に安定化されたＲＮＡ分子を調製する方法は、公知技術である。典型的には、このような分子は、ＲＮＡ分解酵素の作用を防ぐために修飾された骨格およびヌクレオチド含む。他の修飾も可能であり、例えば、コレステロールと結合したｓｉＲＮＡｓは、薬理学的性質の改善を示している（たとえばＳｏｎｇ等．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：３４７―３５１（２００３）を参照。
【０１３６】
本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはそのペプチド断片に対する抗体は、公知技術の方法を用いて生成されうる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願第０７／４８１，４９１号は、ペプチドに対する抗体を得る方法を開示する。抗体産出のために、ポリペプチドまたはそのペプチド断片を注射することにより、ウサギ、マウス、およびラットを含むがこれに限られない様々な宿主動物が免疫されうる。免疫応答を増加するため、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオルなどの界面活性物質、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（バシル  カルメット―ゲラン）およびコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがこれに限られない様々なアジュバントが、宿主種に応じて使用されうる。
【０１３７】
単クローン抗体の調製のためには、連続的な細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用されうる。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ技術（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５―４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ等，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、およびＥＢＶ―ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ等，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７―９６）が、ヒト単クローン抗体を生産するために使用されうる。別の実施形態においては、参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５号に記載される技術を利用して、無菌動物において単クローン抗体が産出される。
【０１３８】
本発明によれば、ヒトハイブリドーマ(Ｃｏｔｅ等，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６―２０３０)を用いて、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＢ細胞をＥＢＶウィルスにより形質転換することによって（Ｃｏｌｅ等，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７―９６）、ヒト抗体が使用および入手されうる。さらに、ＳＬＬＰポリペプチドのエピトープに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分子の遺伝子とともにスプライシングすることにより、「キメラ抗体」を産出するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１―６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４―６０８；Ｔａｋｅｄａ等，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２―４５４）が利用でき、このような抗体は本発明の範囲内である。特異的な単クローン抗体が開発されたら、従来技術によるこれらの突然変異体および変異体の調製も利用可能である。
【０１３９】
一実施形態では、一本鎖抗体の産出のために記載される技術（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９４６，７７８号）が応用されて、タンパク質特異的一本鎖抗体が産出される。別の実施形態においては、本発明の特異抗原、タンパク質、誘導体またはアナログに対する所望の特異性を持つ単クローンＦａｂフラグメントの迅速かつ簡単な同定を可能とするために、Ｆａｂ発現ライブラリの構築のために記載される技術（Ｈｕｓｅ等，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５―１２８１）が利用される。
【０１４０】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術により産出されうる。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により産出されうるＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されうるＦａｂ’フラグメント；抗体分子をパパインおよび還元剤で処置することにより生成されうるＦａｂフラグメント；およびＦｖフラグメントを含むがこれに限られない。
【０１４１】
多クローン抗体の生成は、所望の動物に抗原を接種し、抗原に特異的に結合する抗体を単離することにより達成される。
【０１４２】
タンパク質またはペプチドの完全長またはペプチド断片に対する単クローン抗体は、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ等（１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）およびＴｕｓｚｙｎｓｋｉ等（１９８８，Ｂｌｏｏｄ，７２：１０９―１１５）に記載されるものなどの、任意の周知の単クローン抗体の調製手順を用いて調製されうる。化学合成技術を用いて、所望のペプチドを多量に合成することもできる。あるいは、所望のペプチドをコードするＤＮＡが複製され、大量のペプチドの生成に適した細胞の適切なプロモータ配列に発現されうる。本明細書に参照される標準の手順を用いて、ペプチドで免疫されたマウスから、ペプチドに対する単クローン抗体が生成される。
【０１４３】
従来技術で利用可能であり、たとえばＷｒｉｇｈｔ等（１９９２，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３，４）：１２５―１６８）およびその中の引用文献などに記載されている技術を用いて、本明細書に記載の手順を用いて得られた単クローン抗体をコードする核酸が複製され、配列が決定されうる。さらに、Ｗｒｉｇｈｔ等、（上記）およびその中の引用文献、およびＧｕ等（１９９７，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７（４）：７５５―７５９）に記載される技術を用いて、本発明の抗体が「ヒト化」されうる。
【０１４４】
ファージ抗体ライブラリを作製するために、例えば所望の抗体など、ファージ表面に発現される所望のタンパク質を発現する、例えばハイブリドーマなどの細胞から単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリがまず得られる。逆転写酵素を用いて、ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーが産出される。ＰＣＲにより、免疫グロブリンフラグメントを特定するｃＤＮＡが得られ、得られたＤＮＡが適切なバクテリオファージベクターにクローニングされて、免疫グロブリン遺伝子を特定するＤＮＡを含むバクテリオファージＤＮＡライブラリが作製される。異種ＤＮＡを含むバクテリオファージライブラリを作製するための手順は公知技術であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載される。
【０１４５】
所望の抗体をコードするバクテリオファージは、タンパク質が、対応する結合タンパク質、たとえば抗体の抗原に結合できるようにその表面にディスプレイされるように設計されうる。したがって、特異抗体を発現するバクテリオファージが、対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートされると、バクテリオファージが細胞に結合する。抗体を発現しないバクテリオファージは、細胞に結合しない。このようなパニング技術は、公知技術である。
【０１４６】
上記のもののようなプロセスは、Ｍ１３バクテリオファージディスプレイを用いたヒト抗体の産生のために開発されている（Ｂｕｒｔｏｎ等，１９９４，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１―２８０）。基本的には、抗体産生細胞の集団から得られるｍＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリが作製される。ｍＲＮＡは、再配列された免疫グロブリン遺伝子をコードし、したがって、ｃＤＮＡが同をコードする。増幅されたｃＤＮＡは、Ｍ１３発現ベクターにクローニングされ、表面上にヒトＦａｂフラグメントを発現するファージのライブラリが作製される。抗原結合により目的の抗体を発現するファージが選択され、細菌内で繁殖させられて可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンが産出される。したがって、従来の単クローン抗体合成とは対照的に、この手順は、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなく、ヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不死化する。
【０１４７】
今示された手順は、抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの生成を記載する。しかし、本発明が、Ｆａｂ抗体をコードするファージの生成だけに制限されると解釈されてはならない。むしろ、一本鎖抗体をコードするファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリ）も、本発明に含まれる。Ｆａｂ分子は、Ｉｇ軽鎖全体を含む。すなわち、軽鎖の可変および定常領域の両方を含むが、重鎖の可変領域と第一定常領域ドメイン（ＣＨｌ）だけを含む。一本鎖抗体分子は、Ｉｇ  Ｆｖフラグメントを含む一本鎖のタンパク質を含む。Ｉｇ  Ｆｖフラグメントは、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域だけを含み、定常領域を含まない。Ｍａｒｋｓ等、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１―５９７に記載される手順に従って、ｓｃＦｖ  ＤＮＡを含むファージライブラリが作製されうる。所望の抗体を単離するための、こうして生成されたファージのパニングは、Ｆａｂ  ＤＮＡを含むファージライブラリのために記載されるものと類似の様式で実施される。
【０１４８】
本発明は、重鎖および軽鎖可変領域が可能な特異性をほぼ全て含むように合成されうる、合成ファージディスプレイライブラリも含むと解釈されなければならない（Ｂａｒｂａｓ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：８３７―８３９；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ等．１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７―１０５）。
【０１４９】
抗体産出においては、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）など、公知の技術により、所望の抗体のスクリーニングが達成されうる。本発明により生成される抗体は、多クローン、単クローン、キメラ（すなわち「ヒト化」）、および一本鎖（組換え）抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリにより産出されるフラグメントを含みうるがこれに限られない。
【０１５０】
本発明のペプチドは、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８４，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓの中でＳｔｅｗａｒｔ等により記載される；および、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ―Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの中でＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙにより記載される、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）など、標準の確立された技術により容易に調製されうる。初めに、「適切に保護された」アミノ酸残基が、そのカルボキシル基を解して、架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂などの、誘導体化された不溶性ポリマーサポートに付加される。「適切に保護された」とは、アミノ酸のα―アミノ基および任意の側鎖官能基の両方における保護基の存在をさす。側鎖保護基は、合成の間に使用される溶媒、試薬および反応条件に対して一般に安定し、最終的なペプチド生成物に影響しない条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、初期アミノ酸からのＮ―保護基の除去、および、所望のペプチドの配列における次のアミノ酸のカルボキシル末端の結合により行われる。このアミノ酸も、適切に保護される。次のアミノ酸のカルボキシルは、カルボジイミド、対称型酸無水物、またはヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェニルエステルなどの「活性エステル」基の形成など、反応基の形成により、サポートに結合したアミノ酸のＮ末端と反応するように活性化されうる。固相ペプチド合成の方法の例には、α―アミノ保護基としてｔｅｒｔ―ブチロクスカルボニル（ｔｅｒｔ―ｂｕｔｙｌｏｘｃａｒｂｏｎｙｌ）を利用したＢＯＣ法、およびアミノ酸残基のα―アミノを保護するために９―フルオレニルメチルオクスカルボニル（９―ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｃａｒｂｏｎｙｌ）を利用するＦＭＯＣ法が含まれ、両方法が当業者に周知である。
【０１５１】
固相ペプチド合成方法の従前のプロトコルを用いて、Ｎ―および／またはＣ―ブロック基の取り込みを達成することもできる。Ｃ末端ブロック基の取り込みのために、例えば、樹脂からの切断により所望のＣ末端ブロック基を有するペプチドが生じるように化学修飾されているサポート樹脂を固相として用いて、所望のペプチドの合成が通常行われる。Ｃ末端が一級アミノ基のブロック基を持つペプチドを提供するために、例えば、ｐ―メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を用いた合成が行われ、これによりペプチド合成が完了すると、フッ化水素酸による処理によりＣ―末端がアミド化された所望のペプチドが解離する。同様に、Ｃ末端のＮ―メチルアミンブロック基の取り込みは、Ｎ―メチルアミノエチルで誘導体化されたＤＶＢ樹脂を用いて達成され、ＨＦ処理によりＮ―メチルアミド化されたＣ末端を持つペプチドが解離する。エステル化によるＣ末端のブロックも、従来の手順を用いて達成されうる。これは、樹脂／ブロック基の組み合わせを使用して樹脂から側鎖ペプチドを解離させ、所望のアルコールとの後続反応によりエステル基を形成させることを伴う。この目的で、メトキシアルコキシベンジルアルコールまたは同等のリンカーで誘導体化されたＤＶＢ樹脂と組み合わせたＦＭＯＣ保護基が使用でき、ジコロロメタン（ｄｉｃｈｏｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）中のＴＦＡによりサポートからの切断が行われる。そして、所望のアルコールの付加により、例えばＤＣＣにより適切に活性化されたカルボキシル官能基のエステル化が進行し、その後エステル化されたペプチド産物が脱保護および単離されうる。
【０１５２】
たとえば適切な無水塩およびニトリルによる処理により、合成されたペプチドが樹脂にまだ付着している間に、Ｎ末端ブロック基の取り込みが達成されうる。Ｎ末端にアセチル―ブロック基を取り込むために、例えば、樹脂と結合したペプチドが、アセトニトリル中２０％の無水酢酸で処置されうる。そして、Ｎ末端がブロックされたペプチド産物が樹脂から切断され、脱保護された後単離されうる。
【０１５３】
化学または生物学的合成技術から得られたペプチドが、所望のペプチドであることを確実にするために、ペプチド組成物の分析が実施されなければならない。このようなアミノ酸組成分析は、高分解能質量分析を用いてペプチドの分子量を測定することにより実施されうる。代替的または追加的に、酸性水溶液中でペプチドを加水分解し、ＨＰＬＣまたはアミノ酸分析計を用いて混合物の成分を分離、同定、および定量化することにより、ペプチドのアミノ酸含量が確認されうる。ペプチドを順次分解し、アミノ酸を順に同定するタンパク質配列解析器も、ペプチドの配列を明確に決定するために使用されうる。使用の前に、ペプチドは、不純物を除去するために精製される。この点に関しては、いうまでもなく、ペプチドは、適切な規制機関によって定められた基準を満たすように精製される。必要なレベルの純度を達成するために、例えば、Ｃ４―、Ｃ８―またはＣ１８―シリカなどのアルキル化シリカカラムを用いた逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）含め、多数の従来の精製手順のいずれか一つが使用されうる。例えば、少量のトリフルオロ酢酸を通常含む水性緩衝液中のアセトニトリルなど、有機含量が増加する勾配移動層が、精製を達成するために一般に用いられる。電荷に基づいてペプチドを分離するイオン交換クロマトグラフィも、使用されうる。
【０１５４】
もちろん、ペプチドまたは抗体、誘導体またはそのフラグメントは、活性に影響を及ぼすことなく修飾されたアミノ酸残基を組み込みうる。例えば、ブロック基、すなわち、Ｎ―およびＣ―末端を「不適当な分解」から保護および／または安定化するために適切な化学的置換基を含むように末端が誘導体化されうる。「不適当な分解」とは、化合物の機能に影響を及ぼしうる、化合物の末端における任意の種類の酵素的、化学的または生化学的分解、すなわち化合物の末端での逐次分解を含む意味の用語である。
【０１５５】
ブロック基は、ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性に悪影響を与えない、ペプチド化学の従来技術において用いられる保護基を含む。例えば、Ｎ末端のアルキル化またはアシル化によって、適切なＮ末端ブロック基が導入されうる。適切なＮ末端ブロック基の例には、Ｃ１―Ｃ５分枝または非分枝アルキル基、ホルミルおよびアセチル基などのアシル基、ならびにアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基など、その置換された形が含まれる。アミノ酸のデスアミノアナログも有用なＮ末端ブロック基であり、ペプチドのＮ末端に結合されるか、Ｎ末端残基の代わりに用いられうる。Ｃ末端のカルボキシル基が組み込まれるか組み込まれない適切なＣ末端ブロック基には、エステル、ケトンまたはアミドが含まれる。エステルまたはケトンを形成するアルキル基、特にメチル、エチルおよびプロピルなどの低級アルキル基、および一級アミン（―ＮＨ２）などのアミドを形成するアミノ基、およびメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノなどのモノおよびジアルキルアミノ基は、Ｃ末端ブロック基の例である。アグマチンなどの脱カルボキシル化されたアミノ酸アナログも、有用なＣ末端ブロック基であり、ペプチドのＣ末端残基に結合されるか、代わりに用いられうる。さらに、いうまでもなく、末端の遊離アミノおよびカルボキシル基がペプチドから全て除去されて、ペプチド活性への影響を伴わずにデスアミノおよび脱カルボキシル化された形が産出されうる。
【０１５６】
他の修飾も活性に悪影響を与えることなく取り入れることができ、これらには、自然のＬ異性体の形の一つ以上のアミノ酸の、Ｄ異性体の形のアミノ酸による置換が含まれるがこれに限られない。したがって、ペプチドは一つ以上のＤ―アミノ酸残基を含み、または全てＤ形であるアミノ酸を含みうる。例えば全てのアミノ酸がＤ―アミノ酸の形により置換される逆転ペプチドなど、本発明によるペプチドのレトロ―インベルソ形も考えられる。
【０１５７】
本発明の酸付加塩も、機能的等価物として考えられる。したがって、ペプチドの水溶性塩を提供するために、塩化水素、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸（ｔａｔａｒｉｃ）、クエン酸、安息香酸、ニッケイ酸（ｃｉｎｎａｍｉｅ）、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ―トルエンスルホン酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）などの有機酸で処置された本発明のペプチドは、本発明の使用に適する。
【０１５８】
本発明は、タンパク質およびペプチドのホモログも提供する。ホモログは、保存的なアミノ酸配列の差異、または配列に影響しない修飾、または両者により、天然のタンパク質またはペプチドと異なりうる。
【０１５９】
例えば、タンパク質またはペプチドの一次配列を改変するが、機能は通常改変しない保存的なアミノ酸変更がなされうる。そのために、ペプチドのサイズに応じて、１０以上の保存的なアミノ酸変更は通常ペプチド機能に影響しない。
【０１６０】
修飾（一次配列を通常改変しない）は、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的誘導体化、たとえばアセチル化またはカルボキシル化を含む。合成および処理過程中またはさらなる処理工程において、たとえばポリペプチドをグリコシル化に影響を与える酵素、たとえば哺乳類グリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素に曝露することによりポリペプチドのグリコシル化パターンを変更することにより行われる、グリコシル化の修飾も含まれる。例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンなど、リン酸化されたアミノ酸残基を有する配列も含まれる。
【０１６１】
タンパク質分解に対するそれらの抵抗を高めるために、または溶解性を最適化するために、または治療薬としてより適切にするために、通常の分子生物学的技術を用いて修飾されているポリペプチドまたは抗体フラグメントも含まれる。このようなポリペプチドのホモログは、たとえばＤ―アミノ酸または非天然の合成アミノ酸など、天然のＬアミノ酸以外の残基を含むものを含む。本発明のペプチドは、本明細書に挙げられた特定の例示的プロセスのいずれの産物にも制限されない。
【０１６２】
本明細書に記載されるとおりに得られる実質的に純粋なタンパク質は、以下の公知のタンパク質精製手順に従って精製でき、その場合においては、免疫学的、酵素的または他のアッセイを用いて、手順の各段階で精製がモニタされる。タンパク質精製の方法は公知技術であり、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ等（ｅｄ．，１９９０，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に記載される。
【０１６３】
本発明は、本発明のペプチド、タンパク質および抗体をコードする核酸も提供する。「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドからなり、ホスホジエステル結合または修飾結合からなる、たとえばホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カルボナート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロアミダート、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、ホスホロチオアート、メチルホスホナート、ホスホロジチオアート、架橋ホスホロチオアート、またはスルホン連結、およびこのような連結の組み合わせなどからなる、任意の核酸を意味する。核酸という用語は、五つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基からなる核酸も特に含む。
【０１６４】
本発明が、利用される核酸の性質によって制限されるものではない。標的核酸は、天然または合成された核酸でありうる。核酸は、ウィルス、細菌、動物またはプラントがソースでありうる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、二本鎖、一本鎖、または部分的に二本鎖の形で存在しうる。さらに、核酸は、ウィルスまたは他の巨大分子の一部として見られうる。たとえば、Ｆａｓｂｅｎｄｅｒ等，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６４７９―８９（アデノウイルスの形でのＤＮＡのポリリジンによる圧縮）を参照。
【０１６５】
本発明において有用な核酸には、たとえばオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、たとえばアンチセンスＤＮＡｓおよび／またはＲＮＡｓ；リボザイム；遺伝子治療のためのＤＮＡ；ウィルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むウィルスフラグメント；ＤＮＡおよび／またはＲＮＡキメラ；ｍＲＮＡ；プラスミド；コスミド；ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；遺伝子フラグメント；一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、スーパーコイルＤＮＡおよび／または三重螺旋のＤＮＡを含む様々な構造のＤＮＡ；Ｚ―ＤＮＡ；などが含まれる。核酸は、大量の核酸を調製するために通常用いられる、任意の従来の手段によって調製されうる。例えば、市販の試薬および合成装置を用いて、従来技術において周知の方法により、ＤＮＡｓおよびＲＮＡｓが化学的に合成されうる（たとえば、Ｇａｉｔ，１９８５，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照）。ＲＮＡは、ＳＰ６５（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などのプラスミドを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により高収率で産出されうる。
【０１６６】
ヌクレアーゼ安定性が高められることが望ましい場合など、いくつかの状況においては、改変されたインターヌクレオシド連結を有する核酸が好ましい。修飾されたインターヌクレオシド連結を含む核酸も、公知技術の試薬および方法を用いて合成されうる。たとえば、ホスホナートホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロアミダートメトキシエチルホスホロアミダート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミダート、カルバメート、ジメチレン―スルフィド（―ＣＨ２―Ｓ―ＣＨ２）、ジイネチレン（ｄｉｉｎｅｔｈｙｌｅｎｅ）―スルホキシド（―ＣＨ２―ＳＯ―ＣＨ２）、ジメチレン―スルホン（―ＣＨ２―ＳＯ２―ＣＨ２）、２’―Ｏ―アルキル、および２’―デオキシ２’―フルオロホスホロチオアートインターヌクレオシド連結を含む核酸を合成する方法が、公知技術である（Ｕｈｌｍａｎｎ等，１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３―５８４；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等，１９９０，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５およびその引用文献を参照）。
【０１６７】
核酸は、任意の適当な手段ならびに公知技術の手段により精製されうる。たとえば、逆相またはイオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィまたはゲル電気泳動により、核酸が精製されうる。もちろん、熟練技術者には当然ながら、精製の方法は、精製されるＤＮＡのサイズに一部依存する。
【０１６８】
核酸という用語は、五つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基からなる核酸も特に含む。
【０１６９】
本発明は、本発明の白血球機能阻害化合物を含む医薬組成物も目的とする。特に、このような化合物は、当業者に公知の標準の薬理学上許容可能な担体、充填剤、溶解剤（ｓｏｌｕｂｌｉｚｉｎｇａｇｅｎｔｓ）および安定剤を用いて、医薬組成物として調製されうる。
【０１７０】
本発明は、本発明の化合物を対象に投与する方法も目的とする。一実施形態では、本発明は、本発明の記載の方法を用いて同定される化合物を投与することにより、白血球に関連する疾患、障害または状態の対象を処置する方法を提供する。化合物は、白血球機能を阻害するために化合物が用いられない対照と比較して、白血球機能を少なくとも１０％阻害することが好ましい。本発明の化合物が、未処置の対照と比較して、白血球機能を少なくとも２５％阻害することが、より好ましい。本発明の化合物が、未処置の対照と比較して白血球機能を少なくとも５０％阻害することが、さらに好ましい。本発明の化合物が、未処置の対照と比較して白血球機能を少なくとも７５％阻害することが、さらに好ましい。本発明の化合物が、未処置の対照と比較して白血球機能を少なくとも９０％阻害することも好ましい。さらに別の態様では、本発明の化合物が、未処置の対照と比較して白血球機能を少なくとも９５％阻害することが好ましい。本発明の一態様では、ＰＡＫ機能または活性の阻害により、白血球機能が阻害される。一態様では、白血球は好中球である。一態様では、疾患または障害は、肺の疾患または障害である。「阻害する」および「ブロックする」という用語は、本明細書において互換可能に用いられる。
【０１７１】
本化合物を含む医薬組成物は、局所、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、または直腸の手段を含むがこれに限られない任意の数の経路により、必要とする個人に投与される。
【０１７２】
一実施形態によれば、処置を必要とする対象の白血球に関連する疾患、障害または状態を処置する方法が、提供される。方法は、少なくとも一つの本発明の白血球機能阻害化合物を含む医薬組成物を、これを必要とする患者に投与するステップを含む。ＰＡＫまたはＰＩＸ経路を介して白血球機能を調節する、本発明の方法により同定される化合物は、公知の白血球阻害化合物または他の薬とともに、投与されてもよい。化合物が、ヒトに投与されるのが好ましい。
【０１７３】
本発明は、本発明の方法を実施するための、適切な化合物、ホモログ、フラグメント、アナログ、またはその誘導体の使用医薬組成物も含み、組成物は、少なくとも一つの適切な化合物、ホモログ、フラグメント、アナログ、またはその誘導体、および薬理学上許容可能な担体を含む。
【０１７４】
本発明を実施するために有用な医薬組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日から１００ｍｇ／ｋｇ／日の間の用量を送達するように投与されうる。本発明の方法で有用な医薬組成物は、経口の固体製剤、点眼薬、坐薬、エアロゾル、局所剤、または他の類似の製剤において全身的に投与されうる。このような医薬組成物は、適切な化合物に加えて、薬物投与を増強および促進することが知られる薬理学上許容可能な担体および他の成分を含みうる。ナノパーティクル、リポソーム、再封入赤血球、および免疫学ベースのシステムなど、他の考えられる製剤も、本発明の方法により適切な化合物を投与するために用いられうる。
【０１７５】
本明細書に記載される方法の任意のものを用いて同定される化合物が調製され、本明細書に開示される疾患の処置のために哺乳類に投与されうるを、次に記載する。
【０１７６】
本発明は、本明細書に開示される状態、障害および疾患の処置に有用な化合物を活性成分として含む医薬組成物の調製および使用を含む。このような医薬組成物は、対象への投与に適する形の活性成分を単独で含めばよく、または、医薬組成物は、活性成分および一つ以上の薬理学上許容可能な担体、一つ以上のさらなる成分、またはこれらの組み合わせを含みうる。活性成分は、周知のように、生理的に許容可能なカチオンまたはアニオンとの組み合わせなど、生理的に許容可能なエステルまたは塩の形で医薬組成物中に存在しうる。
【０１７７】
本明細書で使用されるところの、「生理的に許容可能な」エステルまたは塩という用語は、医薬組成物の任意の他の成分と両立し、組成物が投与される対象に有害でない活性成分のエステルまたは塩の形を意味する。
【０１７８】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術において公知であるか今後開発される任意の方法によって調製されうる。一般に、このような調製方法は、活性成分を担体または一つ以上の他の副成分と合わせてから、必要または所望の場合には、産物を所望の単一用量または複数用量単位に成形またはパッケージするステップを含む。
【０１７９】
本明細書に提供される医薬組成物の記載は、主にヒトに対する倫理的投与に適切な医薬組成物を目的とするが、熟練技術者には当然ながら、このような組成物は一般に、あらゆる種類の動物への投与に適する。組成物を様々な動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適切な医薬組成物の修飾は周知であり、通常の熟練の獣医薬理学者は、仮に行うとしても通常の実験だけで、このような修飾を設計および実行しうる。本発明の医薬組成物の投与が予定される対象には、ヒトおよび他の霊長類、牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌなどの商業的に関連する哺乳類を含む哺乳類、ニワトリ、カモ、ガチョウおよびシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類を含む鳥類が含まれるがこれに限られない。本発明の方法において有用な医薬組成物は、経口、直腸、膣内、非経口、局所、肺、鼻腔内、口腔、点眼、髄こう内または別の投与経路に適切な製剤として調製、パッケージ、または販売されうる。他の考えられる製剤には、射出ナノパーティクル、リポソーム製剤、活性成分を含む再封止赤血球、および免疫ベースの製剤が含まれる。
【０１８０】
本発明の医薬組成物は、単一の単位投与量として、または複数の単位投与量として、大量に調製、パッケージ、または販売されうる。本明細書で使用されるところの、「単位投与量」は、予め決められた量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投与量、またはこのような投与量の二分の一または三分の一など、そのような投与量の都合のいい画分と等しい。
【０１８１】
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬理学上許容可能な担体、および任意の他の成分の相対量は、処置される対象の個性、サイズ、および状態により、さらには組成物が投与される経路により異なりうる。例えば、組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含みうる。
【０１８２】
本発明の医薬組成物は、活性成分に加えて、一つ以上のさらなる薬理学的に活性の薬剤を含みうる。特に考えられるさらなる薬剤には、制吐薬およびシアニドおよびシアネート捕捉剤などの捕捉剤を含む。
【０１８３】
従来の技術を用いて、本発明の医薬組成物の徐放性または持効性製剤が作られうる。経口投与に適した本発明の医薬組成物の製剤は、予め決められた量の活性成分をそれぞれ含む錠剤、硬カプセルまたは軟カプセル、カシェ剤、トローチ剤、またはロゼンジを含むがこれに限られない個別の固体の用量単位の形で調製、パッケージ、または販売されうる。経口投与に適切な他の製剤には、粉末状または粒状製剤、水性または油性懸濁液、水性または油性溶液、または乳濁液が含まれるがこれに限られない。
【０１８４】
本明細書で使用されるところの、「油性」液とは、炭素を含む液体分子を含み、水より弱い極性をもつものである。
【０１８５】
活性成分を含む錠剤は、たとえば、活性成分を選択的に一つ以上のさらなる成分とともに圧縮または成形することにより、つくられうる。適切なデバイス内で、結合剤、潤滑剤、賦形剤、表面活性剤、および分散剤の一つ以上と選択的に混合された、粉剤または粒状製剤のような自由に流動する形の活性成分を圧縮することにより、圧縮錠剤が調製されうる。適切なデバイス内で、活性成分、薬理学上許容可能な担体、および混合物を湿らせるのに少なくとも十分な液体の混合物を成形することにより、成形錠剤がつくられうる。錠剤の製造において用いられる薬理学上許容可能な賦形剤には、不活性希釈剤、造粒および崩壊剤、結合剤、および平滑剤を含むがこれに限られない。公知の分散剤には、ジャガイモ澱粉および澱粉グリコール酸ナトリウムが含まれるがこれに限られない。公知の表面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれるがこれに限られない。公知の希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、およびリン酸ナトリウムが含まれるがこれに限られない。公知の造粒および崩壊剤には、トウモロコシ澱粉およびアルギン酸が含まれるがこれに限られない。公知の結合剤には、ゼラチン、アカシア、プレゲル化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれるがこれに限られない。公知の平滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカ、およびタルクが含まれるがこれに限られない。錠剤は、非コートであっても、対象の胃腸管内での崩壊の遅延を達成することにより活性成分の持続的放出および吸収を提供するために、公知の方法を用いてコートされてもよい。例えば、錠剤をコートするために、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような材料が使用されうる。さらに例として、浸透圧制御放出錠剤を形成するために、米国特許第４，２５６，１０８号；第４，１６０，４５２号；および第４，２６５，８７４号に記載される方法を用いて、錠剤がコートされうる。薬剤的に洗練されて味のよい製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、保存剤、またはこれらの組み合わせが、錠剤にさらに含まれうる。
【０１８６】
ゼラチンなど生理的分解可能な組成物を用いて、活性成分を含む硬カプセルが作られうる。このような硬カプセルは、活性成分を含み、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンなどの不活性固体希釈剤を含むさらなる成分をさらに含みうる。ゼラチンなど生理的分解可能な組成物を用いて、活性成分を含む軟カプセルが作られうる。このような軟カプセルは、水または落花生油、流動パラフィン、またはオリーブ油などの油性媒体と混合されうる活性成分を含む。
【０１８７】
経口投与に適する本発明の医薬組成物の液体製剤は、液体の形、または使用前に水または別の適切な媒体でもどすことが予定される乾燥製品の形で、調製、パッケージ、および販売されうる。
【０１８８】
液体懸濁液は、水性または油性媒体における活性成分の懸濁液を得るための従来法を用いて調製されうる。水性媒体には、例えば、水および等張食塩水が含まれる。油性媒体には、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、落花生油、オリーブ油、胡麻油、またはヤシ油などの植物油、精留された植物油、および流動パラフィンなどの鉱油が含まれる。液体懸濁液は、懸濁剤、分散または湿潤剤、乳化剤、緩和剤、保存剤、緩衝剤、塩類、香味料、着色剤、および甘味剤を含むがこれに限られない一つ以上のさらなる成分をさらに含みうる。油性懸濁液は、増粘剤をさらに含みうる。公知の懸濁剤には、ソルビトールシロップ、水素化された食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体が含まれるがこれに限られない。
【０１８９】
公知の分散または湿潤剤には、レシチンなどの天然のホスファチド、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分エステル、または脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルと、アルキレンオキシドの縮合物（例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアラート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が含まれるがこれに限られない。公知の乳化剤には、レシチンおよびアカシアが含まれるがこれに限られない。公知の保存剤には、メチル、エチルまたはｎ―プロピルパラヒドロキシベンゾアート、アスコルビン酸、およびソルビン酸が含まれるがこれに限られない。公知の甘味剤には、たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、およびサッカリンが含まれる。油性懸濁液の公知の増粘剤には、たとえば、蜜蝋、固形パラフィン、およびセチルアルコールが含まれる。
【０１９０】
水性または油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液とほぼ同じ様式で調製でき、活性成分が溶媒中に懸濁されるのではなく溶解されることが主な差異である。本発明の医薬組成物の液体溶液は、懸濁剤が、溶媒中の活性成分の溶解を補助するとは限らないことを理解した上で、液体懸濁液に関して記載された各成分を含みうる。水性溶媒には、たとえば、水および等張食塩水が含まれる。油性溶媒には、たとえば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、落花生油、オリーブ油、胡麻油、またはヤシ油などの植物油、精留された植物油、および流動パラフィンなどの鉱油が含まれる。
【０１９１】
本発明の医薬品の粉末状のおよび粒状製剤は、公知の方法を用いて調製されうる。このような製剤は、直接対象に投与され、例えば錠剤を形成するために、カプセル満たすために、または水性または油性媒体の付加により水性または油性懸濁液または溶液を調製するために用いられればよい。これらの製剤の各々は、分散または湿潤剤、懸濁剤、および保存剤の一つ以上をさらに含みうる。充填剤および甘味、香味、または着色剤などのさらなる賦形剤も、これらの製剤に含まれうる。
【０１９２】
本発明の医薬組成物は、水中油乳剤または油中水乳剤の形で調製、パッケージ、または販売されてもよい。油性相は、オリーブまたは落花生油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱油、またはこれらの組み合わせでありうる。このような組成物は、アラビアゴムまたはトラガカント等の天然のゴム、大豆またはレシチンホスファチド等の天然のホスファチド、ソルビタンモノオレアート等、脂肪酸とヘキシトール無水物の組み合わせから誘導されるエステルまたは部分エステル、および、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート等、エチレンオキサイドとこのような部分エステルの縮合物などの一つ以上の乳化剤をさらに含みうる。これらの乳濁液は、甘味または香味剤を例として含むさらなる成分も含みうる。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、直腸投与、膣内投与、経鼻、肺、および非経口投与に適する製剤において調製、パッケージ、または販売されてもよい。経鼻および肺投与は、エアロゾルなどの手段により達成されうる。
【０１９４】
本医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液または溶液の形で調製、パッケージ、または販売されればよい。この懸濁液または溶液は、公知の技術により調製されればよく、活性成分に加えて、本明細書に記載される分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などのさらなる成分を含みうる。このような無菌注射可能製剤は、たとえば水または１，３ブタンジオールなど、無毒性の非経口的に許容可能な希釈液または溶媒を用いて調製されうる。他の許容可能な希釈液および溶媒には、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの不揮発性油が含まれるがこれに限られない。他の有用な非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）投与可能な製剤には、活性成分を微結晶の形で、リポソーム製剤において、または生分解性ポリマーシステムの成分として含むものが含まれる。持続的放出または埋め込みのための組成物は、乳濁液、イオン交換樹脂、やや難溶のポリマー、またはやや難溶の塩などの薬理学上許容可能なポリマー材料または疎水性材料を含みうる。
【０１９５】
局所投与に適切な製剤には、リニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペーストなどの水中油乳剤または油中水乳剤、および溶液または懸濁液などの液体または半液体製剤が含まれるがこれに限られない。局所投与可能な製剤は、例えば、約１％から約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含みうるが、活性成分の濃度は、溶媒における活性成分の溶解限度でありうる。局所投与用製剤は、本明細書に記載されるさらなる成分の一つ以上をさらに含みうる。
【０１９６】
本発明の医薬組成物は、口腔経由の肺投与のために適切な製剤において調製、パッケージ、または販売されうる。このような製剤は、活性成分を含み、約０．５から約７ナノメートル、好ましくは約１から約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含みうる。このような組成物は、粉剤を分散させるために推進薬の流れが導かれる乾燥粉末貯蔵部を含むデバイスを用いた投与、または低沸点推進薬に溶解または懸濁された活性成分を密封コンテナ中に含むデバイスなど、自己推進溶媒／粉剤分配コンテナを用いた投与のために、都合よく乾燥粉末の形である。このような粉剤は粒子を含み、粒子の少なくとも９８重量％が、０．５ナノメートルより大きい直径を有し、粒子数の少なくとも９５％が、７ナノメートル未満の直径を有するのが好ましい。粒子の少なくとも９５重量％が、１ナノメートルより大きい直径を有し、粒子数の少なくとも９０％が、６ナノメートル未満の直径を有するのがより好ましい。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉末希釈液を含むのが好ましく、単位投与量形において都合よく提供される。
【０１９７】
低沸点推進薬は一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体推進薬を含む。一般に、推進薬は組成物の５０から９９．９％（ｗ／ｗ）を構成し、活性成分は、組成物の０．１から２０％（ｗ／ｗ）を構成しうる。推進薬は、液体非イオンまたは固体アニオン界面活性剤または固体希釈剤などのさらなる成分をさらに含みうる（好ましくは活性成分を含む粒子と同オーダーの粒径を有する）。
【０１９８】
肺送達のために調製される本発明の医薬組成物は、溶液または懸濁液の液滴の形で活性成分を提供することもできる。このような製剤は、活性成分を含む、選択的に無菌の、水性または希釈アルコール溶液または懸濁液として調製、パッケージ、または販売され、任意の噴霧または微粒化デバイスを用いて、都合よく投与されうる。このような製剤は、サッカリンナトリウムなどの香味剤、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、またはメチルヒドロキシベンゾアートなどの保存剤を含むがこれに限られない、一つ以上のさらなる成分をさらに含みうる。この投与経路により提供される液滴は、約０．１から約２００ナノメートルの範囲の平均直径を有するのが好ましい。
【０１９９】
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、本発明の医薬組成物の鼻腔内送達にも有用である。鼻腔内投与に適切な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２から５００マイクロメートルの平均的な粒子を有する粗末である。このような製剤は、鼻吸入が行われる様式において、すなわち鼻孔の近くに持った粉剤のコンテナから鼻管を通して迅速に吸入することにより投与される。
【０２００】
経鼻投与に適切な製剤は、例えば、活性成分をわずか約０．１％（ｗ／ｗ）から１００％（ｗ／ｗ）まで含むことができ、本明細書に記載されるさらなる成分の一つ以上からをさらに含みうる。本発明の医薬組成物は、口腔投与に適切な製剤において調製、パッケージ、または販売されうる。このような製剤は、例えば、従来法を用いて作られた錠剤またはロゼンジであり得、例えば、０．１から２０％（ｗ／ｗ）の活性成分と、残りには口内溶解性または分解可能な組成物、および選択的に本明細書に記載のさらなる成分の一つ以上を含めばよい。あるいは、口腔投与に適切な製剤は、活性成分を含む粉剤またはエアロゾル化または霧化された溶液または懸濁液を含みうる。このような粉末状、エアロゾル化、またはエアロゾル化製剤は、分散されると、好ましくは約０．１から約２００ナノメートルの範囲の平均的な粒子または液滴サイズを有し、本明細書に記載されるさらなる成分の一つ以上をさらに含みうる。
【０２０１】
本発明の医薬組成物は、点眼投与に適切な製剤において調製、パッケージ、または販売されうる。このような製剤は、例えば、水性または油性液状担体中に活性成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）溶液または懸濁液を含む点眼薬の形でありうる。このような滴は、緩衝剤、塩類、または本明細書に記載の他のさらなる成分の一つ以上をさらに含みうる。有用な他の点眼（ｏｐｔｈａｌｍｉｃａｌｌｙ）投与可能な製剤には、微結晶の形またはリポソーム製剤の活性成分を含むものが含まれる。
【０２０２】
本明細書で使用されるところの、「さらなる成分」は、以下の一つ以上を含むがこれに限られない：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒および崩壊剤；結合剤；平滑剤；甘味剤；香味剤；着色剤；保存剤；ゼラチンなどの生理的分解可能な組成物；水性賦形剤および溶媒；油性賦形剤および溶媒；懸濁剤；分散または湿潤剤；乳化剤、緩和剤；緩衝剤；塩類；増粘剤；充填剤；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；および薬理学上許容可能なポリマーでまたは疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれうる他の「さらなる成分」は、従来技術において周知であり、たとえば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎａｒｏ，ｅｄ．，１９８５，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載される。
【０２０３】
動物、好ましくはヒトに投与されうる本発明の化合物の投与量は通常、対象の体重１ｋｇあたり１μｇから約１００ｇの範囲の量である。投与される正確な用量は多くの要素により異なり、要素には、治療される動物の種類および疾患状態の種類、動物の年齢および投与経路が含まれるがこれに限られない。好ましくは、化合物の投与量は、動物の体重１ｋｇあたり約１ｍｇから約１０ｇまで変動する。より好ましくは、投与量は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇから約１ｇまで変動する。
【０２０４】
化合物は、一日に数回の頻度で対象に投与されればよく、または一日一回、一週間に一回、二週間毎に一回、月一回など、より低い頻度で、または数ヶ月毎に一回または一年に一回以下など、さらに低い頻度で投与されうる。服用の頻度は熟練技術者に明らかであり、治療される疾患の種類および重症度、対象の種類および年齢など、多くの要素に依存する。
【０２０５】
本発明は、本発明の化合物と、対象の細胞または組織への組成物の投与を記載した教材とを含むキットも含む。別の実施形態においては、このキットは、対象に化合物を投与する前に本発明の組成物を溶解または懸濁させるために適切な、（好ましくは無菌の）溶媒を含む。本発明は、本明細書に記載される白血球機能の阻害剤を同定するためのキットも提供し、当該キットは、例えば、ｐ２１活性化キナーゼを含む組織または細胞の試料、ｐ２１活性化キナーゼの標準の調節因子、アプリケータ、およびその使用教材を含む。
【０２０６】
通常の技術を有する当業者は、さらなる記載がなくても、以上の記載および以下の実施例を用いて、本発明の化合物を作成および利用し、請求の方法を実施できると考えられる。したがって、以下実用的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を特に指摘し、本開示の残部をどのような形でも制限するものと解釈されてはならない。
【実施例】
【０２０７】
次に、本発明が以下の実施例に関連して記載される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、本発明は、これらの実施例に限定されると解釈されてはならならず、本明細書に提供される教示によって明らかになる変化形の一切を含むと解釈されなければならない。
【０２０８】
方法
ＰＡＫ阻害ペプチド
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＡＫ機能をブロックするために、アダプタータンパク質ＮｃｋのＳＨ３ドメインに選択的に結合し、ＰＡＫの細胞膜への移行を妨害する阻害ＰＡＫペプチドを使用した（６３）。ペプチドは、細胞への導入を促進するためにＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質からの形質導入配列に結合されたＰＡＫの一番目のプロリンリッチドメインを含む。ＳＨ３結合に重要な二つのプロリンがアラニンに変異したペプチドが、対照として用いられた。細胞への導入を検出するために、ペプチドが、Ｎ末端フルオレセイン（ＦＩＴＣ）部分を伴って合成された（６４）。
【０２０９】
使用されたｔａｔ―ＰＡＫペプチドの配列は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭであった。ＰＡＫ阻害剤は、ドミナントネガティブ活性をもつＰＡＫからの配列を含む短いペプチドである（Ｋｉｏｓｓｅｓ等，２００２，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０：６９７）。このペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭ；配列番号１）は、細胞への導入を促進するＨＴＶ  ＴＡＴタンパク質（Ｓｃｈｗａｒｚｅ等，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９）からの多塩基配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号３）に融合された、ＰＡＫの一番目のプロリンリッチドメインからの配列ＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭ（配列番号２）を含む。ペプチド（配列番号１）は、完全長ドミナントネガティブコンストラクトと同様にＰＡＫ機能を阻害する。他のＰＡＫの阻害ペプチドが作製され、同様またはこれ以上に役立ちうる。ＰＡＫを調節する他のペプチドおよびそれらの使用、ならびにＰＡＫを調節する他の分子が、参照により全体として本明細書に組み込まれる、２００６年８月９日に出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６０３１２２９号に記載される。
【０２１０】
Ｆアクチン形成
健常なドナーからヒトＰＭＮが精製され（１―Ｓｔｅｐ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｓ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）、ＰＡＫ―または対照―ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートされた。その後、ＰＭＮがフィブロネクチンコートされたガラススライドにプレートされ、一部はＣＸＣＬ１（１００ｎｇ／ｍｌ）で１０分間刺激された。細胞は、固定および透過処理され、記載のとおりＦアクチンが染色された（６５）。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡で画像化が行われ、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（バージョン３．５）を用いて画像が編集された。細胞の存在を確認するために、微分干渉顕微鏡が用いられた。別の実験において、フローサイトメトリを用いて、懸濁液中のＰＭＮのＦアクチン含量が測定された（６６）。
【０２１１】
ＰＭＮ接着アッセイ
ヒトＰＭＮを上述のように単離し、ＰＡＫ―または対照―ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で１時間前処理し、カルセインＡＭでラベルし、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋の存在下で、フィブリノーゲンコート（２μｇ／ｍｌ）された９６穴プレートの底に２時間接着させた。指示されるように、一部のＰＭＮはＣＸＣＬ１（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。非接着細胞が洗浄除去され、プレートリーダーで蛍光が測定された。
【０２１２】
ＰＭＮの活性酸素産生
接着ＰＭＮの活性酸素産生が、記載のとおり、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）で阻害可能なシトクロムｃの還元を測定することにより定量された（６７）。簡潔にいうと、ＰＭＮ（ＨＢＳＳ―０．１％ヒト血清アルブミン中１．５×１０６／ｍｌ）が、ＰＡＫペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を伴って、または伴わずに、振盪水槽中ポリプロピレンチューブ内（１時間；３７℃）でインキュベートされた。ＰＭＮは、フィブリノーゲンコートされた９６穴組織培養プレートへ移された。シトクロムｃ（１．４４ｍｇ／ｍｌ）およびカタラーゼ（０．０６２ｍｇ／ｍｌ）（ともにＳｉｇｍａ）が、ＴＮＦアルファ（１０Ｕ／ｍｌ）を伴って、または伴わずにウェルに加えられた。ＳＯＤを伴い、マッチされた対照に対して、指示された時間において５５０ｎｍにおける光学密度が測定された。一部のＰＭＮは、表面上に細胞が広がるのを妨げるためにジヒドロサイトカラシンＢ（ｄｈＣＢ）（１μｇ／ｍｌ）で処置された（６８）。これらの試料は、陰性対照となった。
【０２１３】
ウェスタンブロッティング
上述のように精製されたＣ５７Ｂ１／６マウスからのＰＭＮが、指示された時間ＣＸＣＬ２／３（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激され、冷たいＰＢＳで洗浄され、改変ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．４、０．５％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；プラスＳｉｇｍａプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル）で溶解された。２０分後、１０分間の１４，０００ｇでの遠心分離により溶解物が浄化され、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで分離された。タンパク質がＰＶＤＦ膜に転写され、５％のミルクを加えたトリス―緩衝食塩水＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０でブロッキングされた。１％のＢＳＡ―ＴＢＳＴ中の抗ＰＡＫ２（１：１０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはｐＳ１４１ＰＡＫ（１：２０００；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）のいずれかにより、一晩ブロットがプローブされた。ブロットが洗浄され、１％のＢＳＡ―ＴＢＳＴ中のＨＲＰ結合二次抗体によりＲＴで２ｈプローブされ、その後、増強化学発光基質（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて視覚化された。
【０２１４】
さらに、全肺組織の溶解物のＰＡＫ２、ホスホ―Ｓｅｒ１４１ＰＡＫおよび核因子―κＢの活性化のマーカ、ホスホ―Ｓｅｒ５３６ｐ６５がプローブされた。簡潔にいうと、肺が急速冷凍され、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ―４０、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、プロテアーゼおよびホスファターゼＩおよびＩＩ阻害剤）において溶解された。２０分間１４，０００ｘｇでの遠心分離により溶解物が浄化され、ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてタンパク質濃度が測定された。ＳＤＳ―ＰＡＧＥを用いて、各試料から３０μｇのタンパク質が分離され、ＰＶＤＦ膜に転写され（ＢｉｏＲａｄ）、上述のようにプローブされた。
【０２１５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスマイグレーションアッセイ
ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、記載のとおり、１０％ウシ血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）、１００μｇ／ｍｌジヒドロストレプトマイシン、および６０Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む低グルコースダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた（６９）。ＣＤ３１陽性免疫磁気選択を用いて肺内皮細胞（ＰＥＣ）が単離された（Ｍｅｃ１３．３）（ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）（７０）。１０％ＦＣＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および５０μｇ／ｍｌ血管内皮細胞増殖補助剤（ＥＣＧＳ，Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（Ｌ―バリンの代わりにＤ―バリン、Ｃｈｅｍｉｋｏｎ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）で、ＰＥＣｓが培養された。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステム（直径６．５ｍｍ、孔径３．０μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＪ）のフィブロネクチンコートされたフィルタに内皮細胞をプレートし、コンフルエントまで成長させた（７２ｈ）。実験の２時間前に、１％のＦＢＳを含むフェノールフリーＤＭＥＭに培地が交換された。内皮細胞を伴わないフィルタが、陰性対照となった。
【０２１６】
三層Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を用いて（７８、６６および５４％）、Ｃ５７Ｂ１／６マウスからのＰＭＮが骨髄から単離された（７１）。ＰＭＮ、内皮細胞、または両者が、ＰＡＫ機能ブロッキングペプチド（２０μｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートされた。このペプチドは、ＰＡＫに対するＮｃｋ結合を阻害し、これによりＰＡＫ移行および下流事象の活性化をブロックする（７２、７３）。対照は、このペプチドの不活性の変異体とともにインキュベートされた。最後の１５分間で、ＰＭＮがカルセインＡＭ（５μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）でラベルされ、二回洗浄された。ＣＸＣＬ２／３（ＭＩＰ―２、２５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を伴う、または伴わない４００μｌのフェノールフリーＤＭＥＭを含む外側のウェルへフィルタが移動された（７４）。２．５×１０５ＰＭＮが、内皮細胞を伴って、または伴わずにフィルタにプレートされた。フィルタが３７℃で２時間インキュベートされ、ボトムウェルにおいて蛍光が測定された（４８５ｎｍ励起；５３０ｎｍ発光）。
【０２１７】
ＰＡＫ阻害ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ分布
ＦＩＴＣ標識されたＰＡＫペプチド７５が、ｉｎ  ｖｉｖｏ分布を測定するために、腹膜内に注射された。注射の６時間後に、ＰＡＫ陽性細胞がフローサイトメトリにより同定され、それらのＣＤ３１およびＣＤ４５発現が測定された。さらなる実験においては、蛍光ＰＡＫペプチドの腹腔内注射の後、マウスにＬＰＳを吸入させた。１２時間後に、ＣＤ４５、ＧＲ―１、および７／４の発現により、血液、肺およびＢＡＬ中においてＰＭＮが同定され、ペプチドの取込みが調査された。一部の実験においては、これらのマウスからの肺が、共焦点顕微鏡検査のために固定された。対照は、ペプチドを受けなかった。
【０２１８】
生体顕微鏡検査
精巣挙筋露出の一時間前に、マウスに、１ｍｇのＰＡＫまたは対照ペプチドのいずれかを腹腔内注射した。前述のように、生体顕微鏡検査のために精巣挙筋が準備された（７６）。簡潔にいうと、気管内挿管および左頸動脈のカニューレ挿入後、精巣挙筋が露出され、食塩水浸液系対物レンズ（ＳＷ４０／０．７５開口数）により、四つの後毛細管小静脈が各マウスにおいて視覚化された（直径２０―４０μｍ，Ａｘｉｏｓｋｏｐ；Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）。ＣＣＤカメラ（モデルＶＥ―１０００ＣＤ，Ｄａｇｅ―ＭＴＩ）が記録のために用いられ、記載の通り、５００ｎｇのＣＸＣＬ１の投与の前後で停止した白血球の数が特定された（７７）。停止は、３０秒より長い白血球接着と定義され、血管の直径および長さから計算される（Ｓ＝π＊ｄ＊ｌｖ）表面積あたりの細胞として表された。記載のとおり、血液中の白血球数、血管直径、および壁せん断速度が、両群において測定された（７８）。
【０２１９】
急性肺傷害のマウスモデル
野生型雄Ｃ５７Ｂ１／６マウスが、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得られた。全ての動物実験は、ヴァージニア大学のＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物実験委員会）の承認を得た。マウスは、生後８から１２週間目であった。エアネブライザー（ＭｉｃｒｏＡｉｒ，Ｏｍｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＥＬ）に連結されたカスタムメイドの円筒形チャンバ（２０×９ｃｍ）において、最高四匹のマウスがエアロゾル化されたＬＰＳに曝露された。サルモネラエンテリティディス（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＬＰＳを、０．９％の食塩水に溶解し（５００μｇ／ｍｌ）、マウスに３０分間ＬＰＳを吸入させた。前に示されたとおり、これは、肺の全コンパートメントへのＰＭＮ動員、血管透過性の増加（７９）、ケモカインの放出および肺構造の破壊（８０）を含む、急性肺傷害のいくつかの側面を模倣する。対照マウスは、食塩水エアロゾルに曝露された。
【０２２０】
肺のＰＭＮ輸送
肺の様々なコンパートメント（肺血管系、間質、肺胞空間）へのＰＭＮ動員が、記載のとおり評価された（８１）。簡潔にいうと、ＬＰＳ曝露の２４時間後に、Ａｌｅｘａ６３３でラベルされたＧＲ―１のマウスＰＭＮへの静脈内注射により、血管内のＰＭＮがラベルされた。５分後にマウスを安楽死させ、自発的に拍動する右心室に２５ｃｍＨ２Ｏで１０ｍｌのＰＢＳを流すことにより、非接着ＰＭＮを肺血管から除去した。ＢＡＬが回収され、肺が除去され、ミンスされ、注射された抗体がリンパ管外のＰＭＮに結合する可能性を防止するために、過剰のラベルされない抗ＧＲ―１の存在下で消化された。７０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に消化された肺を通すことにより、細胞懸濁液が調製された。ＢＡＬおよび肺の全細胞がカウントされ、ＰＭＮの割合がフローサイトメトリにより測定された。ＢＡＬにおいては、前方／側方散乱の典型的な外観、およびＣＤ４５（クローン３０―Ｆ１１）、７／４（クローン７／４）、およびＧＲ―１（クローンＲＢ６―８Ｃ５）の発現により、ＰＭＮが同定された。肺においては、ＧＲ―１の発現を用いて、血管内（ＣＤ４５＋７／４＋ＧＲ―１＋）が、注射された抗体が到達しなかった間質（ＣＤ４５＋７／４＋ＧＲ―１−）のＰＭＮから区別された８２。
【０２２１】
肺のｐＰＡＫ発現細胞
エアロゾル化ＬＰＳ発現ｐＰＡＫに応答して好中球が肺に動員されたかを特定するために、ＬＰＳ曝露の３時間後に肺がホモジナイズされた（対照はＬＰＳを受けなかった）。細胞が透過処理され（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ，ＢＤ）、蛍光でラベルされた（Ｚｅｎｏｎ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｋｉｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）抗ホスホＳｅｒ１４１ＰＡＫ抗体でプローブされた（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）。全白血球（ＣＤ４５＋）、ＰＭＮ（ＣＤ４５＋、ＧＲ―１ｈｉｇｈ）およびリンパ球（ＣＤ４５＋、ＧＲ―１−）において、ｐＰＡＫ発現が分析された。抗ｐＰＡＫを伴わない試料が、様々な細胞型の自己蛍光の対照となった。
【０２２２】
統計的分析
ＪＭＰ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン５．１，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）により、統計的分析が実行された。群間の差が、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔ  ｈｏｃテストにより評価された。データは平均値±ＳＥＭとして示され、Ｐ＜０．０５が統計学的に有意であると考えられた。
【０２２３】
結果
静脈内に注射されると、ｔａｔ―ＰＡＫペプチドは好中球により取り込まれる（図１）。マウス全血のフローサイトメトリは、蛍光でラベルされたＰＡＫペプチドの好中球への取込みを示した。標準の手順を用いて赤血球細胞が溶解され、好中球が、ＣＤ４５＋７―４＋Ｇｒ―１＋として同定された。血液試料がとられる１２時間前に、１ｍｇ用量のＰＡＫペプチドがｉ．ｖ．注射された。灰色のヒストグラムは、ＰＡＫペプチドを注射されなかったマウスからの好中球を示す。
【０２２４】
エアロゾル化したリポ多糖（ＬＰＳ）誘発性の肺炎症モデル（Ｒｅｕｔｅｒｓｈａｎ等，２００５．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｌ８０７―８１５）においては、ＰＡＫペプチド陽性好中球は、肺への遊走が減少し、気腔を満たす気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）に遊走できない。
【０２２５】
次に、ＰＡＫペプチド陽性好中球がＢＡＬに遊走できないことが、実証された（図２）。肺が採取され、記載のとおり消化され（９）、ＢＡＬが採取され、両者のフローサイトメトリが行われた。蛍光でラベルされたＰＡＫペプチドを注射されたマウスにおいては、好中球のＢＡＬへのＬＰＳ誘発性の遊走が抑制された。これに対して血液中では、大部分のＰＭＮがＰＡＫペプチド＋であり（図１）、肺のＰＭＮのわずか１／３がＰＡＫペプチドを含み、ＢＡＬに見られるほぼ全ての好中球が非蛍光性であり、ＰＡＫペプチドを取り込んでいるＰＭＮのほぼ全てがＢＡＬ空間に遊走できなかったことが示される。標準の手順を用いて赤血球細胞が溶解され、好中球が、ＣＤ４５＋７―４＋Ｇｒ―１＋として同定された。血液試料がとられる１２時間前に、１ｍｇ用量のＰＡＫペプチドがｉ．ｖ．注射された。灰色のヒストグラムは、ＰＡＫペプチドを注射されなかったマウスからの好中球を示す。
【０２２６】
約３０ｍｇ／ｋｇの用量でのマウスへのｔａｔ―ＰＡＫペプチドの注射により、エアロゾル化されたリポ多糖（ＬＰＳ）に反応した、肺およびＢＡＬへのＰＭＮ動員が阻害された。
【０２２７】
図３は、ＬＰＳに反応した、血管コンパートメント、肺間質コンパートメント、およびＢＡＬにおけるＰＭＮの数（百万）を示す。データは、ＰＡＫペプチドがＢＡＬへの好中球遊走を７０％、ＩＳへの遊走を６０％阻害した（有意、ｐ＜０．０１）が、対照ペプチドは阻害しなかったことを示す。ＬＰＳは、エアロゾルとして３０分間投与された。対照群は、ＬＰＳを受けなかった。
【０２２８】
ｔａｔ―ＰＡＫペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養肺内皮細胞（ＰＥＣ）とともにインキュベートされるＰＭＮにより誘発される透過性の増加を阻害する。ｔａｔ―ＰＡＫが、内皮細胞に対する公知の効果とは別にＰＭＮ対する効果を有するかをテストするために、ＰＥＣ、ＰＭＮまたは両者がｔａｔ―ＰＡＫペプチドとともにインキュベートされた。
【０２２９】
図４に示される結果は、ケモカインＭＩＰ―２（ＣＸＣＬ２）がＰＭＮ遊走を誘発することを示す。ＰＥＣをｔａｔ―ＰＡＫとともにインキュベートすることにより、ＰＭＮ遊走が有意に減少する。ＰＭＮをｔａｔ―ＰＡＫとともにインキュベートした場合にも、同様の効果が達成された。ＰＭＮおよびＰＥＣの効果は、相加的だった。ケモカインが存在しない場合にも、同様の結果が得られた。ＰＭＮおよびＰＥＣｓの両方がｔａｔ―ＰＡＫに曝露された場合には、遊走がほぼ完全に阻害された（ｐ＜０．００１）。
【０２３０】
ＰＡＫがヒトＰＭＮの細胞骨格再構築を調節する
炎症性刺激に反応した細胞骨格のリモデリングは、ＰＭＮの遊走活性に重要である。そこで、ＣＸＣＬ１により刺激されたヒトＰＭＮのアクチン重合におけるＰＡＫの役割を調査した。ＣＸＣＬ１活性化は、典型的な半月状の形においてＦアクチンの顕著な増加をもたらした（図１Ａ）。阻害ペプチドの付加によるＰＡＫ機能の阻害により、アクチン重合が大幅に減少し、葉状仮足の先端へのＦアクチン局在化が妨げられた。二つの重要なプロリンが変異した対照ペプチドは、検出可能な効果を有しなかった。フローサイトメトリによる定量化は、ＰＡＫ阻害ペプチドにより、対照細胞と比較して〜３０倍のＦアクチンの減少がもたらされることを示した（図１Ｂ）。
【０２３１】
フィブリノーゲンに対するＰＭＮの接着がＰＡＫにより媒介される
ＰＡＫペプチドが生体表面に対する細胞接着を妨げるかをテストするために、静的接着アッセイを行った。ＣＸＣＬ１を伴って、または伴わずに、フィブリノーゲンコートされたウェルにヒトＰＭＮを接着させた。ＣＸＣＬ１は、接着の有意な増加を誘発した（Ｐ＜０．０５）（図２Ａ）。ＰＡＫ阻害ペプチドにより、細胞接着がベースラインレベルに減少した（Ｐ＜０．０５）が、対照ペプチドは効果がなかった。
【０２３２】
接着ＰＭＮの活性酸素産生がＰＡＫに依存する
ＰＭＮからの活性酸素種（ＲＯＳ）の無制限の放出は、急性肺傷害の場合において有害でありうる（２９）。ＲＯＳ形成は、好中球の活性化に応じて生じ、表面接着ＰＭＮにおけるインテグリン依存性の細胞骨格再構築を伴う（３０、３１）。そこで、接着ＰＭＮのＲＯＳ形成におけるＰＡＫの役割を調査した。
【０２３３】
生体表面への接着に反応した活性酸素産生が、ＳＯＤ阻害可能なシトクロムｃの還元として調査された。ＴＮＦ―αで処理されたＰＭＮが、ＰＡＫペプチドで前処理された場合には、接着により誘発される活性酸素産生が顕著に減少した（図２Ｂ＋Ｃ）。ジヒドロサイトカラシンＢ（ｄｈＣＢ）により細胞骨格のアクチン重合が妨げられた場合にも同様の阻害が観察され、ＰＡＫが、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を直接誘発するのに加え、アクチン依存性の活性酸素産生を媒介することが示唆された（３２）。ＰＡＫ活性は、懸濁液中のＰＭＮからの活性酸素種の放出には影響しなかった（データは示されない）。
【０２３４】
ＣＸＣＲ２に依存するＰＡＫ活性化
ＣＸＣＬ２／３（マウスのＭＩＰ―２）は、肺傷害における重要なＣＸＣＲ２リガンドである３３、３４。ＣＸＣＲ２連結に続いてＰＡＫがリン酸化さうるかを直接テストするために、マウスのＰＭＮがＣＸＣＬ２／３（ＭＥＰ―２）により刺激され、これによりＰＭＮにおける、１５〜３０分の間をピークとするＰＡＫのｓｅｒ１４１の一時的リン酸化が誘発され（図３Ａ）、ＣＸＣＲ２依存性の急性肺傷害モデルにおいてＰＡＫが果たしうる役割と整合した。
【０２３５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスマイグレーションにおける好中球ＰＡＫの役割
次に、ＰＭＮのトランスマイグレーションにおけるＰＡＫの役割を調査した。ＰＭＮがＰＡＫ阻害ペプチドで前処理された場合には、ベースラインおよびＣＸＣＬ２／３で刺激されたＰＭＮのＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルタの遊走がともに減少し（Ｐ＜０．０５対未処置の対照）（図３Ｂ）、ＰＭＮ遊走におけるＰＡＫの重要な役割と整合した。経内皮遊走におけるＰＡＫの役割を調査するために、肺内皮細胞単層をＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルタで増殖させ、ＰＭＮを下のウェルに遊走させた。ＰＭＮおよび内皮細胞に対する効果を区別するために、各細胞型がＰＡＫ阻害ペプチドで１ｈ前処理されてから、アッセイ開始前に洗浄された。ＰＭＮまたは内皮細胞のいずれかが阻害ＰＡＫペプチドで前処理された場合には、遊走が減少した（図３Ｃ）。両集団の処理により、より効率的に阻害された（Ｐ＜０．０５対未処置の対照）。自発的遊走およびＣＸＣＬ２／３誘発性遊走の両方に、有意な阻害が観察された。したがって、内皮およびＰＭＮの両方におけるＰＡＫが、トランスマイグレーションに寄与する。
【０２３６】
ＰＡＫペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ分布
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける阻害ＰＡＫペプチドの細胞標的の調査のために、ＦＩＴＣで標識されたＰＡＫペプチドをマウスに注射した。肺が採取され、消化され、ＰＡＫペプチド陽性細胞がゲートされ、そのＣＤ３１、内皮細胞マーカ、および白血球のマーカＣＤ４５の発現が調査された（図４Ａ）。ＰＡＫ陽性細胞の約１０％が、ＣＤ３１陽性であり（図示せず）、内皮細胞におけるＰＡＫの前述の役割と整合した（３５）。しかし、ＰＡＫ陽性細胞の大半（８０％）がＣＤ４５陽性であり、白血球におけるＰＡＫの役割が示唆された。肺におけるペプチドの取込みが、共焦点顕微鏡検査により確認された（図４Ｂ）。観察されたパターンは、内皮細胞および好中球の両者におけるＰＡＫペプチドと整合した。
【０２３７】
ＰＭＮ停止におけるＰＡＫの役割
炎症の間に、白血球は内皮に沿って進み、ケモカインと出会った後に停止する。ＣＸＣＲ２リガンドは、ＰＭＮの有効な停止ケモカインであることが知られる（３６）。精巣挙筋の微小循環において、ケモカイン誘発性の白血球停止が調査された。ＣＸＣＬ１注射により、対照群において有意な白血球停止が誘発された（図４Ｃ）。ＰＡＫ機能が阻害されると、白血球停止が有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。血液中の白血球数、血管直径、および壁せん断速度は、両群間で異ならなかった（データは示されない）。この結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏの血液中に流れる白血球接着におけるＰＡＫの役割を示唆する。
【０２３８】
肺へのＬＰＳ誘発性ＰＭＮ遊走にＰＡＫが必要とされる
急性肺傷害のマウスモデルにおいてＰＡＫの役割を調査するために、エアロゾル化したＬＰＳにマウスが曝露された。この処置は、肺の血管系および間隙、ならびに気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）への有意なＰＭＮ浸潤を誘発する（３７）。ウェスタンブロットにより示されるように、全肺抽出物においてＬＰＳ曝露によりＰＡＫ２および核因子―κＢの活性化マーカｐ６５のリン酸化が生じ、ＰａｋがＬＰＳ誘発性の肺傷害に関与することが示唆された（図５Ａ）。マウスがＰＡＫ阻害ペプチドで前処理された場合には、血管腔におけるＰＭＮ蓄積はわずかに影響されるにとどまった（図５Ｂ）。しかし、肺間質および肺胞腔へのＰＭＮ遊走は、それぞれ６０および７０％減少した（Ｐ＜０．０５）（図５Ｃおよび５Ｄ）。不活性の対照ペプチドは、ＰＭＮ遊走に影響しなかった。
【０２３９】
ＰＡＫペプチドを取り込んでいるＰＭＮが、肺へのＬＰＳ誘発性遊走活性を維持するかを調査するために、マウスに、ＦＩＴＣでラベルされたＰＡＫペプチドを注射し、ＬＰＳに曝露した。ＬＰＳ吸入の１２時間後に、ＰＭＮのＰＡＫペプチドの取込みにつき、血液、肺組織、およびＢＡＬを調査した（図６）。血液中では、ＰＭＮの大半がＦＩＴＣ―ＰＡＫペプチドを取り込んでいた。これに対して、ＢＡＬにおいてはＦＩＴＣ―ＰＡＫペプチド陽性ＰＭＮは見られず、肺組織にはいくつかしか見られなかった。これらの所見は、ＰＡＫペプチドの取込みによりＰＭＮが肺間質および肺胞腔に入るのが妨げられることを示唆し、経内皮（血液から間質）および経上皮（間質から肺胞腔）遊走におけるＰＡＫの役割が暗示される。
【０２４０】
ＬＰＳがｐＰＡＫ発現ＰＭＮおよびマクロファージの動員を誘発する
ＬＰＳ誘発性の肺傷害に動員された好中球がＰＡＫをリン酸化するかを特定するために、肺ホモジネートのｐＰＡＫ発現を分析した。静止肺の白血球（図７Ａ）には、リンパ球（ＣＤ４５＋ＧＲ―１−）、ＰＭＮ（ＣＤ４５＋ＧＲ―１ｈｉｇｈ）、および他の細胞（大半はマクロファージ、データは示されない）が含まれた。ＰＭＮにおいてｐＰＡＫ発現が検出されたが、リンパ球では検出されなかった。ＬＰＳ吸入の３時間後に（図７Ｂ）、大多数の白血球はｐＰＡＫ発現ＰＭＮであったが、リンパ球はわずかな部分であった。大部分のＰＭＮがｐＰＡＫを発現したが、リンパ球では少数にとどまった。
【０２４１】
考察
本出願においては、ＬＰＳ誘発性の肺炎症における重要なシグナル伝達分子として好中球ＰＡＫが開示される。ＡＬＩ／ＡＲＤＳのマウスモデルにおいては、ＰＡＫの阻害により、肺間質および肺胞腔へのＰＭＮ遊走が大幅に減少した。炎症を起こした肺に動員されるＰＭＮはｐＰＡＫを発現し、ＰＡＫ阻害ペプチドを取り込んでいるＰＭＮは炎症を起こした肺に動員され得なかった。本出願は、ＰＡＫがヒト好中球活性化に関係することをさらに開示し、炎症性疾患における白血球依存性の炎症反応の調節における、ＰＡＫの潜在的役割を示唆する。
【０２４２】
内皮細胞および他の非白血球において、ＰＡＫの効果が示されている（３８、３９）。さらに、好中球ＰＡＫは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける走化の調節に関係している（４０）。ＰＭＮにおけるＰＡＫ２は、ｆＭＬＰ４１および他の化学遊走物質に反応して速やかにリン酸化されるが（４２）、ｉｎ  ｖｉｖｏの好中球トランスマイグレーションにおけるＰＡＫの役割は示されなかった。リン酸化はいくつかの部位で生じ、様々な刺激に応答して異なるキネティクスにしたがう（４３）。ＰＡＫは、ＰＭＮからのＮＡＤＰＨオキシダーゼ依存性スーパーオキシド放出（４４）および食細胞作用（４５）に関係している。ＰＡＫ依存性の細胞骨格リモデリングがマウスＰＭＮにおいて示され、そこにおいては、Ｃ５ａがＰＩＸを欠く細胞のＦアクチン極性化を誘発できなかった（４６）。ＰＡＫおよびＮｃｋの間の相互作用を妨害することによる同様の結果が、本明細書に示される。極性化の不能は、ｉｎ  ｖｉｖｏの好中球接着および遊走の低下の原因でありうる。それは、ＰＡＫ阻害ペプチドを取り込んだＰＭＮにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのトランスマイグレーションが減少した理由も説明しうる。さらに、ＰＭＮの接着から独立した活性酸素産生ではなく、接着依存性の活性酸素産生にはＰＡＫが必要であることが本明細書に開示される。この種の酸素ラジカル産生は、好中球依存性組織傷害に関連が高い（４７）。酸素ラジカル産生を阻害するＰＡＫペプチドの能力は、このアプローチが抗炎症治療として有用でありうることを示唆する。
【０２４３】
分子レベルでＰＡＫの役割を理解するための相当の努力と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞運動および遊走におけるＰＡＫの役割についての説得的証拠があるにもかかわらず、疾患モデルにおいてその機能を取り上げた研究は少数にとどまる。最近の研究は、ＰＡＫがアルツハイマー病に関係することを示唆した（５７）。最近の疫学調査は、ＡＲＤＳの発生率が以前の報告で示唆されるよりはるかに高いことを示す（５８）。好中球は疾患の発症、進行および予後に重要であるが（５９、６０）、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの病態生理学の理解の進歩にもかかわらず、肺への好中球遊走の基礎となる分子機序の解明は不十分なままである（６１）。現時点では、ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおいてＰＭＮ遊走を減少させるための治療的な戦略はない。非特異的抗炎症アプローチは、効力を示せていない（６２）。ＡＬＩおよびＡＲＤＳが今も有意な罹患率および死亡率の原因であるため、本出願は急性肺傷害のモデルを利用した。
【０２４４】
本出願は、炎症を起こした肺組織に動員される好中球が、ＰＡＫをリン酸化することをさらに開示する。ＰＡＫ阻害ペプチドによりＰＡＫ活性が阻害されると、ペプチドを取り込む好中球だけが肺組織に動員されない。ＢＡＬに到達する好中球においてはＰＡＫの必要がさらに強く、ＰＡＫが経内皮および経上皮遊走の両方に関わることが示唆される。結論として、本研究は、過剰なＰＭＮ浸潤およびＰＭＮ依存性肺傷害の減少により肺損傷を制御するために、ＰＡＫ標的化が有用でありうることを示唆する。
【０２４５】
本明細書にあげられる全ての特許、特許出願、および刊行物の開示が、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０２４６】
見出しは参照のため、および一定のセクションを特定する上で役立つように本明細書に含まれる。これらの見出しは、その中に記載される概念の範囲を制限するものではなく、これらの概念は、明細書の全体において他のセクションにも適用されうる。
【０２４７】
開示された実施形態の以上の記載は、任意の当業者が本発明を作成または利用できるように提供される。これらの実施形態に対する様々な修正は、当業者に明らかであり、本明細書に定義される一般原理は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく他の実施形態に適用されうる。したがって、本発明は、本明細書に示される実施形態に限定されるものではなく、本明細書に開示される原理および新規の特徴と整合する最も広い範囲を与えられるものである。
【０２４８】
（参考文献一覧）
【０２４９】
【数１】
2009524674.tif 000004
【０２５０】
【数２】
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【０２５１】
【数３】
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【０２５２】
【数４】
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【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１】好中球の、蛍光標識されたＰＡＫペプチドの取込み（横軸）を示すマウス全血のフローサイトメトリ（オープンヒストグラム）。標準の手順を用いて赤血球細胞が溶解され、好中球がＣＤ４５＋７―４＋Ｇｒ―１＋として同定された。血液試料がとられる１２時間（ｈ）前に、ＰＡＫペプチドが、１ミリグラム（ｍｇ）の用量でｉ．ｖ．注射された。灰色のヒストグラムは、ＰＡＫペプチドが注射されなかったマウスからの好中球を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂを含む図２は、ＰＡＫペプチド陽性好中球が、ＢＡＬに遊走できないことをグラフで示す。記載のように肺が採取され、消化され（Ｒｅｕｔｅｒｓｈａｎ等，２００５，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｌ８０７―８１５）、ＢＡＬが採取され、両方のフローサイトメトリが行われた。蛍光標識されたＰＡＫペプチド（横軸）を注射されたマウスにおいては、ＬＰＳにより誘発される好中球（オープンヒストグラム）のＢＡＬへの遊走に障害がみられる（図２Ｂ）。他方で、血液中ではほとんどのＰＭＮがＰＡＫペプチド＋であり（図１）、肺（図２Ａ）のＰＭＮは三分の一だけがＰＡＫペプチドを含み、ＢＡＬ（図２Ｂ）ではさらに少ない。標準の手順を用いて赤血球細胞が溶解され、好中球が、ＣＤ４５＋７―４＋Ｇｒ―１＋として同定された。血液試料がとられる１２ｈ前に、ＰＡＫペプチドが１ミリグラム（ｍｇ）の用量でｉ．ｖ．注射された。灰色のヒストグラムは、ＰＡＫペプチドが注射されなかったマウスからの好中球を示す。
【図３】図３．ＬＰＳに反応した血管コンパートメント（ＩＶ、黒）、間質性肺コンパートメント（ＩＳ、斜線）、およびＢＡＬ（ＢＡＬ、白）におけるＰＭＮの数（百万）。ＰＡＫペプチドは、ＢＡＬへの好中球遊走を７０％、ＩＳへの好中球遊走を６０％阻害する（統計学的に有意、ｐ＜０．０１）が、対照ペプチドは阻害しない。ＬＰＳが、３０分間エアロゾルとして投与された。対照：ＬＰＳなし。ＰＡＫ対照：不活性の対照ペプチド。
【図４】図４．ケモカインＭＩＰ―２（ＣＸＣＬ２）が、ＰＭＮ遊走を誘発する（左の灰色棒）。ＰＥＣをｔａｔ―ＰＡＫとともにインキュベートすることにより、ＰＭＮ遊走が有意に減少する（第二の灰色棒）。ＰＭＮがｔａｔ―ＰＡＫとともにインキュベートされる場合も、同様の効果が達成される（第三の灰色棒）。ＰＭＮおよびＰＥＣの効果は、相加的である（右の灰色棒）。ケモカインの非存在下でも同様の観察（ランダム遊走、白色棒）。ＰＭＮおよびＰＥＣｓの両方がｔａｔ―ＰＡＫに曝露される場合には、遊走がほぼ完全に阻害される（統計学的に有意、ｐ＜０．００１）。
【図５】図５．ＣＸＣＬ１により誘発される細胞骨格リモデリングに、ＰＡＫ活性が必要とされる。フィブロネクチンコートしたガラススライドにヒトＰＭＮがプレートされ、ＣＸＣＬ１を伴わずに（対照）、またはＣＸＣＬ１だけで、ＣＸＣＬ１とＰＡＫで、またはＣＸＣＬ１と対照ペプチドで処理され、固定され、Ｆアクチンが染色された。顕微鏡写真が図５Ａに示される（四つのパネル／顕微鏡写真を含む）。図５Ａにおいて、左上パネルは対照、右上パネルはＣＸＣＬ１、左下パネルはＣＸＣＬ１＋ペプチド、右下パネルはＣＸＣＬ１＋対照ペプチドである。図５Ｂは、フローサイトメトリにより分析された、懸濁されたＰＭＮにおけるＦアクチン含量をグラフで示す。
【図６Ａ】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃを含む図６は、ヒトＰＭＮの接着および活性酸素産生におけるＰＡＫの役割をグラフで示す。ヒトＰＭＮがカルセインでラベルされ、フィブリノーゲンコートしたウェルで、ＣＸＣＬ１を伴っておよび伴わずに２時間インキュベートされた。図６Ａは、四つの群を示す。第一の対照群は、ＣＸＣＬ１で処理されず（左の棒）、他の三群は、ＣＸＣＬ１（第二の棒）、またはＣＸＣＬ１プラスＰＡＫ（第三の棒）、またはＣＸＣＬ１プラス対照ペプチド（第四の棒）で処理された。ＣＸＣＬ１単独の処理は、細胞接着の有意な（Ｐ＜０．０５）増加を誘発した（第二の棒）。ＰＡＫペプチドは接着を有意に（Ｐ＜０．０５）減少させたが、対照ペプチドは減少させなかった（図６Ａ）。接着により誘発されるスーパーオキシド生産が、ＳＯＤ阻害可能なシトクロムｃの還元として測定された。阻害ＰＡＫペプチドおよびジヒドロサイトカラシンＢ（ｄｈＣＢ）の両方が、ＴＮＦ―αを加えた接着ＰＭＮの酸化活性を同様に減少させ、スーパーオキシド生産におけるＰＡＫの重要な役割が示された（６Ｂ）。ＴＮＦ―αを伴わない（左）または伴う（右）、最大応答の呼吸バースト。ＴＮＦ―αで処理された接着ＰＭＮによるスーパーオキシド生産が、１００％に等しくなるように設定された（６Ｃ）。＊Ｐ＜０．０５対陰性対照、＃Ｐ＜０．０５対陽性対照。ＰＡＫペプチドは、細胞懸濁液においては活性酸素産生に対して効果を有しなかった（データは示されない）。
【図６Ｂ】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃを含む図６は、ヒトＰＭＮの接着および活性酸素産生におけるＰＡＫの役割をグラフで示す。ヒトＰＭＮがカルセインでラベルされ、フィブリノーゲンコートしたウェルで、ＣＸＣＬ１を伴っておよび伴わずに２時間インキュベートされた。図６Ａは、四つの群を示す。第一の対照群は、ＣＸＣＬ１で処理されず（左の棒）、他の三群は、ＣＸＣＬ１（第二の棒）、またはＣＸＣＬ１プラスＰＡＫ（第三の棒）、またはＣＸＣＬ１プラス対照ペプチド（第四の棒）で処理された。ＣＸＣＬ１単独の処理は、細胞接着の有意な（Ｐ＜０．０５）増加を誘発した（第二の棒）。ＰＡＫペプチドは接着を有意に（Ｐ＜０．０５）減少させたが、対照ペプチドは減少させなかった（図６Ａ）。接着により誘発されるスーパーオキシド生産が、ＳＯＤ阻害可能なシトクロムｃの還元として測定された。阻害ＰＡＫペプチドおよびジヒドロサイトカラシンＢ（ｄｈＣＢ）の両方が、ＴＮＦ―αを加えた接着ＰＭＮの酸化活性を同様に減少させ、スーパーオキシド生産におけるＰＡＫの重要な役割が示された（６Ｂ）。ＴＮＦ―αを伴わない（左）または伴う（右）、最大応答の呼吸バースト。ＴＮＦ―αで処理された接着ＰＭＮによるスーパーオキシド生産が、１００％に等しくなるように設定された（６Ｃ）。＊Ｐ＜０．０５対陰性対照、＃Ｐ＜０．０５対陽性対照。ＰＡＫペプチドは、細胞懸濁液においては活性酸素産生に対して効果を有しなかった（データは示されない）。
【図６Ｃ】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃを含む図６は、ヒトＰＭＮの接着および活性酸素産生におけるＰＡＫの役割をグラフで示す。ヒトＰＭＮがカルセインでラベルされ、フィブリノーゲンコートしたウェルで、ＣＸＣＬ１を伴っておよび伴わずに２時間インキュベートされた。図６Ａは、四つの群を示す。第一の対照群は、ＣＸＣＬ１で処理されず（左の棒）、他の三群は、ＣＸＣＬ１（第二の棒）、またはＣＸＣＬ１プラスＰＡＫ（第三の棒）、またはＣＸＣＬ１プラス対照ペプチド（第四の棒）で処理された。ＣＸＣＬ１単独の処理は、細胞接着の有意な（Ｐ＜０．０５）増加を誘発した（第二の棒）。ＰＡＫペプチドは接着を有意に（Ｐ＜０．０５）減少させたが、対照ペプチドは減少させなかった（図６Ａ）。接着により誘発されるスーパーオキシド生産が、ＳＯＤ阻害可能なシトクロムｃの還元として測定された。阻害ＰＡＫペプチドおよびジヒドロサイトカラシンＢ（ｄｈＣＢ）の両方が、ＴＮＦ―αを加えた接着ＰＭＮの酸化活性を同様に減少させ、スーパーオキシド生産におけるＰＡＫの重要な役割が示された（６Ｂ）。ＴＮＦ―αを伴わない（左）または伴う（右）、最大応答の呼吸バースト。ＴＮＦ―αで処理された接着ＰＭＮによるスーパーオキシド生産が、１００％に等しくなるように設定された（６Ｃ）。＊Ｐ＜０．０５対陰性対照、＃Ｐ＜０．０５対陽性対照。ＰＡＫペプチドは、細胞懸濁液においては活性酸素産生に対して効果を有しなかった（データは示されない）。
【図７Ａ】図７Ａから７Ｃを含む図７は、ＣＸＣＲ２依存性ＰＡＫリン酸化およびｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスマイグレーションを示す。図７Ａは、マウスＰＭＮにおけるＣＸＣＬ２／３（１００ｎｇ／ｍｌ）誘発性ＰＡＫ―リン酸化の結果を示すウェスタンブロットを表わし、１５から３０分の間がピークである（７Ａ）。Ｃ５７Ｂ１／６マウスからのカルセインでラベルしたＰＭＮを、下のウェルにＣＸＣＬ２／３を加えて、または加えずに、３μｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルタを遊走させた。阻害ＰＡＫペプチドでＰＭＮが前処理された場合には、遊走が減少した（黒色棒）（７Ｂ）。ＰＭＮ、内皮細胞、または両者がＰＡＫペプチドで前処理され、ＣＸＣＬ２／３を伴わない（オープンバー）または伴う（黒色バー、２５０ｎｇ／ｍｌ）培地を下のウェルに加える前に洗浄された以外では同様のプロトコルを用いて、肺内皮細胞層全体のＰＭＮ遊走が調査された（７Ｃ）。平均蛍光値がベースライン蛍光値で補正された（内皮細胞のみ）。ｎ＝３実験の平均±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５対陽性対照。
【図７Ｂ】図７Ａから７Ｃを含む図７は、ＣＸＣＲ２依存性ＰＡＫリン酸化およびｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスマイグレーションを示す。図７Ａは、マウスＰＭＮにおけるＣＸＣＬ２／３（１００ｎｇ／ｍｌ）誘発性ＰＡＫ―リン酸化の結果を示すウェスタンブロットを表わし、１５から３０分の間がピークである（７Ａ）。Ｃ５７Ｂ１／６マウスからのカルセインでラベルしたＰＭＮを、下のウェルにＣＸＣＬ２／３を加えて、または加えずに、３μｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルタを遊走させた。阻害ＰＡＫペプチドでＰＭＮが前処理された場合には、遊走が減少した（黒色棒）（７Ｂ）。ＰＭＮ、内皮細胞、または両者がＰＡＫペプチドで前処理され、ＣＸＣＬ２／３を伴わない（オープンバー）または伴う（黒色バー、２５０ｎｇ／ｍｌ）培地を下のウェルに加える前に洗浄された以外では同様のプロトコルを用いて、肺内皮細胞層全体のＰＭＮ遊走が調査された（７Ｃ）。平均蛍光値がベースライン蛍光値で補正された（内皮細胞のみ）。ｎ＝３実験の平均±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５対陽性対照。
【図７Ｃ】図７Ａから７Ｃを含む図７は、ＣＸＣＲ２依存性ＰＡＫリン酸化およびｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスマイグレーションを示す。図７Ａは、マウスＰＭＮにおけるＣＸＣＬ２／３（１００ｎｇ／ｍｌ）誘発性ＰＡＫ―リン酸化の結果を示すウェスタンブロットを表わし、１５から３０分の間がピークである（７Ａ）。Ｃ５７Ｂ１／６マウスからのカルセインでラベルしたＰＭＮを、下のウェルにＣＸＣＬ２／３を加えて、または加えずに、３μｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルタを遊走させた。阻害ＰＡＫペプチドでＰＭＮが前処理された場合には、遊走が減少した（黒色棒）（７Ｂ）。ＰＭＮ、内皮細胞、または両者がＰＡＫペプチドで前処理され、ＣＸＣＬ２／３を伴わない（オープンバー）または伴う（黒色バー、２５０ｎｇ／ｍｌ）培地を下のウェルに加える前に洗浄された以外では同様のプロトコルを用いて、肺内皮細胞層全体のＰＭＮ遊走が調査された（７Ｃ）。平均蛍光値がベースライン蛍光値で補正された（内皮細胞のみ）。ｎ＝３実験の平均±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５対陽性対照。
【図８】図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃを含む図８は、ＰＡＫペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ分布を示す。ＦＩＴＣで標識したＰＡＫペプチドが、腹膜内に注射された。６時間後、フローサイトメトリのために、肺からの単個細胞浮遊液が調製された。側散乱（ＳＳＣ）およびＦＩＴＣにより、ＦＩＴＣ陽性細胞がゲーティングされた。左（ＰＡＫ）および右（ＣＤ４５）パネルを含む図８Ａは、ＰＡＫペプチドを取り込んでいる細胞が８０％ＣＤ４５＋であったことをグラフで示す。左（対照）および右パネルを含む図８Ｂは、肺へのペプチドの取込みを確認した、共焦顕微鏡の像を表す。図８Ｃは、マウス精巣挙筋の小静脈の生体顕微鏡検査が、ＣＸＣＬ１（５００ｎｇ、ｉ．ｖ．注射、オープン記号）に反応して有意な白血球停止を示し、これはＰＡＫ活性が阻害されると有意に減少した（黒色記号）という事実のグラフ描写である。データは、ｎ＝３マウスの各々の四血管からの平均値±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５対対照ペプチド。
【図９−１】図９Ａから９Ｄを含む図９は、ＬＰＳにより誘発されるＰＭＮの肺への遊走におけるＰＡＫの役割を示す。図９Ａは、マウスがＬＰＳ吸入の前に阻害ＰＡＫペプチドの腹腔内注射を受けた実験の、ウェスタンブロット分析を表す。肺抽出物が、ｓｅｒ５３６のＮＦ―κＢｐ６５リン酸化（ｐ―ｐ６５）、ｓｅｒ１４１のＰＡＫリン酸化（ｐＳ１４１ＰＡＫ）、またはローディング対照としての全ＰＡＫ２（γＰＡＫ）のウェスタンブロットにより分析された（９Ａ）。図９Ｂから９Ｃは、血管系（ＩＶ）（９Ｂ）、肺間質（ＩＳ）（９Ｃ）、および気管支肺胞腔（ＢＡＬ）（９Ｄ）のＰＭＮ蓄積をグラフで示す。図９Ｂから９Ｄにおいては、二から四番目の棒は、ＬＰＳエアロゾル処置後である。値は、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４である。＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳなしの陰性対照。＃Ｐ＜０．０５対ＬＰＳありの陽性対照。
【図９−２】図９Ａから９Ｄを含む図９は、ＬＰＳにより誘発されるＰＭＮの肺への遊走におけるＰＡＫの役割を示す。図９Ａは、マウスがＬＰＳ吸入の前に阻害ＰＡＫペプチドの腹腔内注射を受けた実験の、ウェスタンブロット分析を表す。肺抽出物が、ｓｅｒ５３６のＮＦ―κＢｐ６５リン酸化（ｐ―ｐ６５）、ｓｅｒ１４１のＰＡＫリン酸化（ｐＳ１４１ＰＡＫ）、またはローディング対照としての全ＰＡＫ２（γＰＡＫ）のウェスタンブロットにより分析された（９Ａ）。図９Ｂから９Ｃは、血管系（ＩＶ）（９Ｂ）、肺間質（ＩＳ）（９Ｃ）、および気管支肺胞腔（ＢＡＬ）（９Ｄ）のＰＭＮ蓄積をグラフで示す。図９Ｂから９Ｄにおいては、二から四番目の棒は、ＬＰＳエアロゾル処置後である。値は、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４である。＊Ｐ＜０．０５対ＬＰＳなしの陰性対照。＃Ｐ＜０．０５対ＬＰＳありの陽性対照。
【図１０】図１０は、図１０Ａ（二つのパネル）および１０Ｂ（三つのパネル）を含む。図１０Ａの右パネルは、ＣＤ４５がゲーティングされている（左パネルを参照）。図１０Ｂは、図１０Ａ右パネル（好中球）の右上４分の１がゲーティングされている。この図は、ＰＭＮ（ＣＤ４５＋ＧＲ―１ｈｉｇｈ７／４ｈｉｇｈとして同定；１０Ａ）、およびＬＰＳ吸入から１２時間後の蛍光ラベルされたＰＡＫ阻害ペプチドの取込みにつき分析された血液、肺組織、およびＢＡＬ（１０Ｂ；オープンヒストグラム）をグラフで示す。データは、３つの実験を代表する。陰影のヒストグラムは、注射されていないマウスのバックグラウンド蛍光値を示す。
【図１１】図１１Ａ（四つのパネル）および１１Ｂ（四つのパネル）を含む図１１は、ｐＰＡＫ発現細胞につき分析された、肺ホモジェネートの分析結果をグラフで示す。静止している肺においては（１１Ａ）、全白血球（全Ｌｅｕ、ＣＤ４５＋）の大部分が、ｐＰＡＫ陰性だった。細胞型の特徴づけにより、リンパ球（ＣＤ４５＋、ＧＲ―１−）がｐＰＡＫを発現しないことが分かった。いくつかのｐＰＡＫ陽性ＰＭＮ（ＣＤ４５＋、ＧＲ―１ｈｉｇｈ）が、静止している肺に存在した。ＬＰＳ吸入（１１Ｂ）は、ｐＰＡＫ陽性ＰＭＮの顕著な増加をもたらしたが、大部分のリンパ球はｐＰＡＫ陰性のままだった。データは、各群の四実験を代表する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月25日(2008.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球機能を阻害するための組成物であり、前記組成物が、ＰＡＫおよびＰＩＸ調節経路からなる群より選択されるタンパク質調節経路の少なくとも一つの阻害剤の有効量を含み、前記組成物は前記白血球と接触させられて、白血球機能を阻害することを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記白血球が、哺乳類白血球である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
哺乳類白血球が、ヒト白血球である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記白血球が、好中球、好酸球、好塩基球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびそれらの誘導体および運動性前駆体からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記白血球が、好中球である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記機能が、接着、遊走、停止、ＰＡＫ活性化、ＰＩＸ活性化、ＰＡＫ活性、ＰＩＸ活性、ＲＯＳ形成誘起、ＲＯＳ放出、および細胞骨格再構築からなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも一つの阻害剤が、成長因子により刺激される好中球機能、またはサイトカインにより刺激される好中球機能を阻害する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも一つの阻害剤が、ＣＸＣＲ２に依存性のＰＡＫ活性化を阻害する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも一つの阻害剤が、細菌毒素により刺激される好中球機能を阻害する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも一つの阻害剤が、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、キナーゼ阻害剤、および抗体からなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号１および５からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびそれらの生物学的に活性のフラグメント、ホモログ、誘導体、および修飾体を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも一つの阻害剤が、タンパク相互作用または複合体形成を阻害する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
白血球浸潤または活性の増加に関連する疾患または障害の治療が必要な対象において、白血球浸潤または活性の増加に関連する疾患または障害を治療するための組成物であり、前記組成物が、ＰＡＫおよびＰＩＸ調節経路からなる群より選択されるタンパク質調節経路の少なくとも一つの阻害剤を有効量含むみ、前記組成物は前記対象に投与されて、白血球浸潤または活性の増加に関連する疾患または障害が治療されることを特徴とする、組成物。
【請求項１４】
前記疾患または障害が、急性または慢性炎症を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
急性または慢性炎症を含む前記疾患または障害が、関節炎、喘息、多発性硬化症、中枢神経系の炎症性疾患、神経炎、末梢神経系の炎症性疾患、アトピー性疾患、炎症性腸疾患、皮膚の炎症性疾患、粘膜の炎症性疾患、肝炎、腎臓の炎症性疾患、敗血症、敗血症性ショック、および癌からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記疾患または障害が、肺疾患または障害である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記肺疾患または障害が、急性肺傷害、急性呼吸不全症候群、人工呼吸器による肺傷害、敗血症により誘発される肺不全、および肺炎からなる群より選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記白血球が、好中球である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記好中球が、前記経路を構成する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
白血球浸潤または活性の増加に関連する疾患または障害を阻害する化合物を投与するためのキットであり、前記キットが、ＰＡＫおよびＰＩＸ調節経路からなる群より選択されるタンパク質調節経路の少なくとも一つの阻害剤を含む医薬組成物、アプリケータ、およびその使用教材を含む、キット。
【請求項２１】
ＰＡＫおよびＰＩＸにより調節される白血球機能を阻害する化合物を同定する方法であり、前記化合物が、ＰＡＫおよびＰＩＸからなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質調節経路を阻害し、前記方法が、
前記調節経路の少なくとも一つを含むテスト白血球を、テスト化合物と接触させるステップと；
前記調節経路の少なくとも一つの活性または機能を測定するステップ
を含み、
前記テスト白血球における前記活性または機能のレベルが、前記テスト化合物と接触しない以外は同一の白血球における活性または機能のレベルと比較して低いことが、前記テスト化合物が白血球機能を阻害する指標となる、方法。
【請求項２２】
前記機能が、接着、遊走、停止、ＰＡＫ活性化、ＰＩＸ活性化、ＰＡＫ活性、ＰＩＸ活性、ＲＯＳ形成誘起、ＲＯＳ放出、および細胞骨格再構築からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記調節経路が、ＰＡＫである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、ＰＡＫリン酸化を測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記白血球が、好中球である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、タンパク質―タンパク質相互作用または複合体形成を測定する、請求項２０に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月31日(2008.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009524674000001.app
【国際調査報告】
2009524674.tif 000026