(57)【要約】  本発明の目的は、基材の生分解性を簡便に評価できるスループットの高い生体外評価方法を提供することである。本発明によれば、基材と基材を分解する成分を含む溶液とを、該基材と該溶液とが接する面積が実質的に一定となる条件下において接触させて、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定することを特徴とする、基材の生分解性を生体外で評価する方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と基材を分解する成分を含む溶液とを、該基材と該溶液とが接する面積が実質的に一定となる条件下において接触させて、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定することを特徴とする、基材の生分解性を生体外で評価する方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１に記載の方法。
（１）  基材を、筒形又は柱形の容器の底部から中部に位置するように調製又は導入する工程；
（２）  前記の基材を含む容器に、基材の上部から、基材を分解する成分を含有する溶液を添加する工程；及び
（３）  前記の基材と基材を分解する成分を含有する溶液を含む容器の側面から、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定する工程：
【請求項３】
工程（３）において、容器の底部から、基材と基材を分解する成分を含む溶液が接する位置までの距離を経時的に測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、請求項１に記載の方法。
（１）  基材を、筒形又は柱形の容器の底部から中部に位置するように調製又は導入する工程；
（２）  前記の基材を含む容器に、基材の上部から、基材を分解する成分を含有する溶液を添加する工程；
（３）  前記の基材および溶液を含む容器を動かす工程；及び
（４）  前記の基材と基材を分解する成分を含有する溶液を含む容器の側面から、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定する工程：
【請求項５】
工程（４）において、容器の底部から、基材と基材を分解する成分を含む溶液が接する位置までの距離を経時的に測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
容器が、マイクロチューブ、毛細管、ガラス管、チューブ、又はガラス管である、請求項２から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
基材がタンパク質であり、基材を分解する成分が酵素である、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
基材がゼラチンであり、基材を分解する成分がサーモライシンである、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材の生分解の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体医療材料として利用される基材の機能の１つとして、生体組織中での分解性（生分解性）が挙げられている。すなわち基材の生分解性を評価することは、基材の用途の決定に影響を与える重要な評価項目と認識されている。【０００３】
例えば基材をヒトまたはヒト以外の動物に用いる場合に、基材の生分解性を評価する方法として、in vivoである動物試験を行うのが最も信頼性が高いと考えられる。しかし、動物を飼育する設備等が必要であるため試験を行うことができる機関が限られていること、データのばらつきが大きいこと、コストが高いこと等の問題がある（非特許文献１）。【０００４】
また生分解性をin vitroで評価する方法として、基材の残存重量を経時的に測定する方法が試みられているが（特許文献１）、基材を分解する成分を含む溶液から該基材を分離してから乾燥させてから重量を測定するという煩雑な工程が必要であり、実験の効率が低い。また基材を分解する成分を含む溶液により該基材が分解されたことにより生じる分解産物を光学測定機器を用いて経時的に測定する方法も試みられているが（非特許文献２）、スループットの低い光学機器を用いているため、多量のサンプル測定には不向きである。【０００５】
【非特許文献１】Biomaterials20（1999）2169-2175
【非特許文献２】Biomacromolecules5（2004）1662-1666
【特許文献１】特開２００４−１８７５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、生分解性をin vitroにおいて評価する場合には、煩雑な実験工程やスループットの低い測定機器を用いる必要があることが問題であった。従って、本発明の目的は、基材の生分解性を簡便に評価できるスループットの高い生体外評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、基材と基材を分解する成分を含む溶液とを、該基材と該溶液とが接する面積が実質的に一定となる条件下において接触させて、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定することによって生分解性を簡便に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明によれば、基材と基材を分解する成分を含む溶液とを、該基材と該溶液とが接する面積が実質的に一定となる条件下において接触させて、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定することを特徴とする、基材の生分解性を生体外で評価する方法が提供される。【０００９】
好ましくは、本発明の方法は、以下の工程を含む。
（１）  基材を、筒形又は柱形の容器の底部から中部に位置するように調製又は導入する工程；
（２）  前記の基材を含む容器に、基材の上部から、基材を分解する成分を含有する溶液を添加する工程；及び
（３）  前記の基材と基材を分解する成分を含有する溶液を含む容器の側面から、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定する工程：【００１０】
好ましくは、工程（３）において、容器の底部から、基材と基材を分解する成分を含む溶液が接する位置までの距離を経時的に測定する。【００１１】
好ましくは、本発明の方法は、以下の工程を含む。
（１）  基材を、筒形又は柱形の容器の底部から中部に位置するように調製又は導入する工程；
（２）  前記の基材を含む容器に、基材の上部から、基材を分解する成分を含有する溶液を添加する工程；
（３）  前記の基材および溶液を含む容器を動かす工程；及び
（４）  前記の基材と基材を分解する成分を含有する溶液を含む容器の側面から、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定する工程：【００１２】
好ましくは、工程（４）において、容器の底部から、基材と基材を分解する成分を含む溶液が接する位置までの距離を経時的に測定する。【００１３】
好ましくは、容器は、マイクロチューブ、毛細管、ガラス管、チューブ、又はガラス管である。
好ましくは、基材はタンパク質であり、基材を分解する成分は酵素である。
好ましくは、基材はゼラチンであり、基材を分解する成分はサーモライシンである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の基材の生分解性の生体外評価方法は、容器の外側から基材の変化量の測定を行うことによって評価するため、測定に必要な工程数少なく、スループットを高めることも容易である。これによって本発明の生体外評価方法によれば、基材の生分解性の評価を効率よく行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、基材とは生体高分子、合成高分子、脂質等いずれでも構わない。さらに、生体由来の生体高分子は糖、タンパク質およびそれらの誘導体のいずれでも構わないが、好ましくはコラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸等を指す。また、タンパク質の由来は特に限定するものではなく、牛、豚、魚、および遺伝子組み換え体のいずれも用いることができる。【００１６】
本発明において、基材を分解する成分を含む溶液とは、基材を分解し得る酵素や該酵素を生産する細胞あるいは貪食作用を有する細胞を溶媒に溶解あるいは分散させたもの等を意味する。溶媒としては、水、緩衝液、生理食塩水などを用いることができるが、特に限定されるものではない。例えば基材を分解し得る酵素として、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、サーモライシン、キチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、トリプシン、プロテナーゼA等が挙げられる。また該酵素を発現させた細胞破砕液および細胞培養液を使用してもよい。更に血液、唾液、脳脊髄液などのヒトあるいはヒト以外の動物由来の体液あるいは該体液に由来するものを用いることも可能であり、そのため生体環境に非常に近い条件で生分解性の評価も可能である。【００１７】
本発明においては、基材と基材を分解する成分を含む溶液とを、該基材と該溶液とが接する面積が実質的に一定となる条件下において接触させる。基材と溶液とが接する面積が実質的に一定となる条件下とは、評価の期間中に基材が基材を分解する成分を含む溶液によって分解されて体積が小さくなっても、基材と基材を分解する成分を含む溶液とが接する面積が実質的に一定となる状態を意味する。この条件は、断面積が一定の容器に基材を作製することで達成され、容器としては、例えばマイクロチューブ、毛細管、ガラス管、チューブ、ガラス管等を使用してよい。また断面積が一定でない容器であっても、断面積が一定である部分が一部分でもあれば、その一部分を利用して評価することも可能である。【００１８】
本発明の一例としては、本発明の方法は、以下の工程により行うことができる。
（１）  基材を、筒形又は柱形の容器の底部から中部に位置するように調製又は導入する工程；
（２）  前記の基材を含む容器に、基材の上部から、基材を分解する成分を含有する溶液を添加する工程；及び
（３）  前記の基材と基材を分解する成分を含有する溶液を含む容器の側面から、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定する工程。【００１９】
本発明の別の例としては、本発明の方法は、以下の工程により行うことができる。
（１）  基材を、筒形又は柱形の容器の底部から中部に位置するように調製又は導入する工程；
（２）  前記の基材を含む容器に、基材の上部から、基材を分解する成分を含有する溶液を添加する工程；
（３）  前記の基材および溶液を含む容器を動かす工程；及び
（４）  前記の基材と基材を分解する成分を含有する溶液を含む容器の側面から、該基材と該溶液が接する位置の変化を経時的に測定する工程【００２０】
基材と溶液が接する位置の変化の測定は、例えば、容器の底部から、基材と基材を分解する成分を含む溶液が接する位置までの距離を経時的に測定することによって行うことができる。本発明において、基材と基材を分解する成分を含む溶液の位置の変化を測定する方法として、所定時間ごとに定規等で測定することもでき、所定時間ごとに印をつけて後で位置の変化を測定してもよい。【００２１】
本発明において基材および溶液を含む容器を動かす場合は、例えば、ローテーター、シェーカー、スィングロールミキサーなどを用いて容器を動かしてもよい。特に好ましくは、ローテーターを用いて容器を回転させることができる。【００２２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
本発明の実施形態の１つを用いて、2種類の架橋ゼラチンの生分解性の評価を行った。
＜架橋ゼラチンの作製＞
架橋ゼラチンは以下のようにして作製した。
PSK（新田ゼラチン（株））及び特開平11-338090に記載されたP４ゼラチン１gにミリQ精製水10mlを加え、室温下で1時間膨潤させた後、50℃で1時間温浴させて溶解させた。このゼラチン水溶液500μlと25% グルタルアルデヒド溶液（和光純薬工業（株））25μlおよび10×PBS緩衝液（和光純薬工業（株））100μlを1.5mlチューブ（富士フィルム（株））中で混合し、短時間遠心機にかけ、室温で1日間放置した。【００２４】
＜基材を分解する成分を含む溶液の作製＞
サーモライシン（シグマ アルドリッチ ジャパン（株））1.73gをミリQ水1mlに溶解し、サーモライシン水溶液を作製した。【００２５】
＜生分解性の評価＞
1.5mlチューブに作製した架橋ゼラチンのチューブ側面に、架橋ゼラチン上面に位置する場所に印をつけ、サーモライシン水溶液を400μl添加した。ただちに該チューブをローテーターにつけて、1分間に10回転の速度で回転させた。所定時間毎に、ゼラチンとサーモライシン水溶液との境界の位置に、チューブ側面に印をつけた。サーモライシン水溶液添加6時間後まで1時間毎に印をつけ、測定終了後にチューブ底部から印までの距離を全て測定した。各測定値は、サーモライシン水溶液を添加する前の値で除し、グラフを描いた。結果を図１に示す。この結果、PSKが経時的に生分解されるが、P4はほとんど生分解されることがなかった。すなわち本発明により、実験工程が少ない簡易な方法で生分解性を評価することができた。【００２６】
＜in vivo動物実験による評価との比較＞
前記に用いた2種類の架橋ゼラチンについて、さらにSDラット（日本チャールズ・リバー（株））を用いてin vivoでの生分解性の評価も行った。該ゼラチンを切り出して凍結乾燥して重量を測定しておき、ラットの背部皮下に埋め込んで2週間後に取り出し、凍結乾燥して重量を測定した。各測定値は皮下に埋め込む前の値で除し、グラフを描いた。結果を図２に示す。この結果、PSKが経時的に生分解されるが、P4はほとんど生分解されることがなかった。さらにこのin vivoでの生分解性の結果は前記のin vitroでの生分解性の結果と相関があることを示唆している。以上の結果から、本発明の方法によりin vivoでの生分解性を予測しうることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明の生体外評価方法によれば、基材の生分解性の評価を効率よく行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、サーモライシン水溶液に対する２種類の架橋ゼラチンのin vitro生分解性を示す。
【図２】図２は、ラットの背部皮下に包埋したときの２種類の架橋ゼラチンのin vivo生分解性を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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