(57)【要約】本開示は、乳酸菌において組換えアポリポタンパク質（例えば、エンドトキシンを含まない組換えアポリポタンパク質）を生成するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、乳酸菌において発現可能な発現ベクターを提供し、このベクターは、アポリポタンパク質をコードするヌクレオチドコード配列、および該ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結されて該ヌクレオチドコード配列の発現を制御する１つ以上の調節ヌクレオチド配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌において発現可能な発現ベクターであって、アポリポタンパク質をコードするヌクレオチドコード配列、および該ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結されて該ヌクレオチドコード配列の発現を制御する１つ以上の調節ヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項２】
前記ヌクレオチドコード配列は、ヒトアポリポタンパク質をコードする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記ヌクレオチドコード配列は、プレプロアポリポタンパク質、プレプロＡｐｏＡ  Ｉ、プロＡｐｏＡ  Ｉ、ＡｐｏＡ  Ｉ、プレプロＡｐｏＡ  ＩＩ、プロＡｐｏＡ  ＩＩ、ＡｐｏＡ  ＩＩ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＶ、プロＡｐｏＡ  ＩＶ、ＡｐｏＡ  ＩＶ、ＡｐｏＡ  Ｖ、プレプロＡｐｏＥ、プロＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ、プレプロＡｐｏＡ  ＩＭｉｌａｎｏ、プロＡｐｏＡ  ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ  ＩＭｉｌａｎｏ、プレプロＡｐｏＡ  ＩＰａｒｉｓ、プロＡｐｏＡ  ＩＰａｒｉｓ、およびＡｐｏＡ  ＩＰａｒｉｓから選択されるヒトアポリポタンパク質をコードする、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記調節ヌクレオチド配列のうちの１つは、前記ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結される構成性プロモーターを含む、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記調節ヌクレオチド配列のうちの１つは、前記ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結される調節性プロモーターを含む、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記プロモーターは、乳酸菌由来である、請求項４または５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記プロモーターは、ｐＨ、温度、および酸素からなる群より選択される因子によって調節される、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記調節性プロモーターは、Ｐ１７０プロモーターである、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記ベクターは、自律的に複製するレプリコンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記ベクターは、プラスミド、転移可能要素、バクテリオファージ、またはコスミドから選択される、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記ベクターは、前記宿主細胞染色体に安定に組み込まれる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１、２または３のいずれか１項に記載のヌクレオチドコード配列を含む、乳酸菌。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、乳酸菌。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヌクレオチドコード配列によってコードされるタンパク質を発現する、乳酸菌。
【請求項１５】
請求項１２、１３または１４のいずれか１項に記載の乳酸菌であって、該乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．およびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．から選択される、乳酸菌。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発現ベクターで形質転換された乳酸菌によって生成される、エンドトキシン非含有のアポリポタンパク質。
【請求項１７】
エンドトキシン非含有のアポリポタンパク質を生成するための方法であって、
ａ）アポリポタンパク質をコードするヌクレオチドコード配列を含む乳酸菌を、該アポリポタンパク質の発現に適した条件下で培養する工程；および
ｂ）該形質転換された乳酸菌から該アポリポタンパク質を回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記乳酸菌は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発現ベクターで形質転換される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチドコード配列は、ヒトアポリポタンパク質をコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチドコード配列は、プレプロアポリポタンパク質、プレプロＡｐｏＡ  Ｉ、プロＡｐｏＡ  Ｉ、ＡｐｏＡ  Ｉ、プレプロＡｐｏＡ  ＩＩ、プロＡｐｏＡ  ＩＩ、ＡｐｏＡ  ＩＩ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＶ、プロＡｐｏＡ  ＩＶ、ＡｐｏＡ  ＩＶ、ＡｐｏＡ  Ｖ、プレプロＡｐｏＥ、プロＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ、プレプロＡｐｏＡ  ＩＭｉｌａｎｏ、プロＡｐｏＡ  ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ  ＩＭｉｌａｎｏ、プレプロＡｐｏＡ  ＩＰａｒｉｓ、プロＡｐｏＡ  ＩＰａｒｉｓ、およびＡｐｏＡ  ＩＰａｒｉｓから選択されるヒトリポタンパク質をコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記調節ヌクレオチド配列のうちの１つは、前記ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結される構成性プロモーターを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記調節ヌクレオチド配列のうちの１つは、前記ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結される調節性プロモーターを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロモーターは、乳酸菌由来である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーターは、ｐＨ、温度、および酸素からなる群より選択される因子によって調節される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記調節性プロモーターは、Ｐ１７０プロモーターを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクターは、自律的に複製するレプリコンを含む、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ベクターは、プラスミド、転移可能要素、バクテリオファージまたはコスミドから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ベクターは、前記宿主細胞染色体に安定に組み込まれる、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．およびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．関連出願の引用）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、米国特許出願第号６０／７１２，２９５号（２００５年８月２６日出願）に対する利益を主張する。この内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（２．背景）
循環性コレステロールは、２つの主要なコレステロールキャリア、すなわち、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によって運ばれる。ＬＤＬは、肝臓（ここで、コレステロールは、合成または食事から得られる）から、身体中の肝臓外組織へのコレステロールの送達を担うと考えられる。血漿ＨＤＬ粒子は、コレステロール調節において主要な役割を果たし、組織コレステロールのスカベンジャーとして作用していると考えられている。
【０００３】
アテローム硬化症は、動脈壁内のコレステロール蓄積によって特徴付けられる進行性疾患である。アテローム硬化病変に沈着した脂質は、主に血漿ＬＤＬからもたらされる；従って、ＬＤＬは、一般に、「悪い」コレステロールとして公知になった。対照的に、ＨＤＬ血清レベルは、冠状動静脈心臓疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）と逆に相関し、そして結果として；高血清レベルのＨＤＬは、ネガティブリスク因子であるとみなされている。従って、ＨＤＬは、一般に、「良い」コレステロールとして公知になった。
【０００４】
ＨＤＬの保護機構の最近の研究は、ＨＤＬの主要成分であるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）に焦点を当てている。高血漿レベルのＡｐｏＡ−Ｉは、冠状動静脈病変の非存在または軽減と関連している（非特許文献１；非特許文献２）。しかし、Ａｐｏ  Ａ−１および公知のＡｐｏＡ−Ｉ改変体、ならびに再構築ＨＤＬの治療的使用は、全体的に低い収量を考慮すると、治療的投与に必要とされるアポリポタンパク質の量が大量であることおよびタンパク質生成の費用によって制限されている。従って、冠動脈内のコレステロール蓄積を処置および／または予防するために使用され得るＡｐｏ  Ａ−Ｉを生成するための代替方法を開発する必要がある。
【非特許文献１】Ｍａｃｉｅｊｋｏら，１９８３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３０９：３８５−８９
【非特許文献２】Ｓｅｄｌｉｓら，１９８６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ７３：９７８−８４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（３．要旨）
本開示は、エンドトキシンを含まない組換えアポリポタンパク質を生成するための組成物および方法を提供する。本明細書中に記載される方法を使用して作製され得る組換えアポリポタンパク質としては、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−ＶおよびＡｐｏＥのプレプロアポリポタンパク質形態；ヒトＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶおよびＡｐｏＥのプロ形態および成熟形態；ならびに活性な多型性形態、アイソフォーム、改変体および変異体、ならびに末端切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態が挙げられるが、これらに限定されず、これらのうちの最も一般的なものは、ＡｐｏＡ−ＩＭ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）およびＡｐｏＡ−ＩＰ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）である。
【０００６】
いくつかの局面において、本開示は、発現ベクター、上記発現ベクターを含む宿主細胞、およびエンドトキシン非生成細菌（例えば、乳酸菌）において目的のアポリポタンパク質を生成するためのベクターを使用する方法を提供する。適した乳酸菌としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．およびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．が挙げられるが、これらに限定されない。適切な調節ヌクレオチド配列は、上記アポリポタンパク質をコードする上記ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結されて、乳酸菌においてアポリポタンパク質を発現させる。調節ヌクレオチド配列としては、構成性プロモーターおよび調節性プロモーター（すなわち、誘導性プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記調節配列は、乳酸菌の調節配列を含む。
【０００７】
いくつかの局面において、上記方法は、アポリポタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびこれに作動可能に連結されてこのコード配列の発現を制御する適切な調節ヌクレオチド配列を含む組換え乳酸菌を構築する工程、上記アポリポタンパク質を発現させるのに有効な条件下で上記組換え乳酸菌を培養する工程、ならびに上記乳酸菌または上記培養培地から上記アポリポタンパク質を回収する工程を包含する。
【０００８】
上記組換えアポリポタンパク質は、種々の障害および状態（脂質異常症が挙げられる）ならびに／または種々の疾患、障害および／またはこれらと関連する状態を、処置ならびに／あるいは予防するために、使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（４．詳細な説明）
候補治療用タンパク質の高スループットの初期発見および高収量生成において、Ｅ．ｃｏｌｉベースの発現系が、広く使用されている。しかし、全てのタンパク質が、宿主生物としてＥ．ｃｏｌｉを使用して高収量で生成することができるわけではない。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおける成功裏の組換えタンパク質発現／精製は、精製タンパク質がエンドトキシンのような汚染物質を含まないようにすることができる信頼性の高い系に依存する。このＥ．ｃｏｌｉから得られる精製タンパク質サンプルにおけるエンドトキシンの存在は、多くの場合検出されない。さらに、汚染物質を除去するために一般に使用される方法（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー）は、エンドトキシンを除去しない。例えば、ＭｃＫｉｎｓｔｒｙら，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３５：７２４−６を参照のこと。
【００１０】
Ｅ．ｃｏｌｉでのアポリポタンパク質Ａ−Ｉの生成は、低い。例えば、米国特許第５，０５９，５２８号およびそこで引用される参考文献を参照のこと；ＭｃＧｕｉｒｅら，１９９６，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３７：１５１９−１５２８；Ｐａｎａｇｏｔｏｐｕｌｏｓら，２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２５：３５３−６１；およびＲｙａｎら，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２７：９８−１０３もまた参照のこと。エンドトキシンを除去するために必要とされる精製工程は、収率をさらに低くし得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される組換えタンパク質に依存して、夾雑するエンドトキシンを排除しかつ現行のＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ｃＧＭＰ）と適合する純度レベルを達成することは可能でないこともある。例えば、Ｍａら，２００４，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ．３６：４１９−２４を参照のこと。例えば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、エンドトキシン（リポ多糖（ＬＰＳ））に結合して、その毒性を中和する（例えば、Ｍａら，２００４，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ．３６（６）：４１９−２４を参照のこと）。従って、精製組換えアポリポタンパク質をエンドトキシン非含有にすることができるＥ．ｃｏｌｉの信頼性の高い系を開発することは不可能かもしれない。他の発現系（例えば、酵母および昆虫細胞）におけるアポリポタンパク質の生成もまた、低い。例えば、米国特許第５，０５９，５２８号およびそこで引用される参考文献を参照のこと。
【００１１】
本開示は、エンドトキシン非生成細菌（例えば、乳酸菌）において組換えアポリポタンパク質を生成するための組成物および方法を提供する。アポリポタンパク質を生成するための非エンドトキシン細菌（例えば、乳酸菌）を使用することの利点としては、以下が挙げられる：（１）エンドトキシンが存在しないこと（エンドトキシンは、大部分のグラム陰性細菌における細胞壁の成分であるが、乳酸菌における細胞壁の成分としては存在しない）；（２）細胞外プロテアーゼを産生しない乳酸菌株（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ株が挙げられる）の利用性；（３）乳酸菌は操作しやすいこと；（４）乳酸菌の、組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を分泌する能力（これら組換えペプチドは、安定しておりかつ精製しやすい）；（５）酸素の局所的ポケット（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｏｃｋｅｔ）（これは、存在する場合、細胞増殖を減少させ収量を低下させ得る）を避けるために必要とされる特別に設計された装置の必要性を低減させるまたは排除することによって、タンパク質生成の規模拡大を単純化する、醗酵代謝（すなわち、酸素の非存在下で起こる醗酵）の使用；（６）発現される遺伝子生成物の収量を増加させるための誘導性発現系が利用できること；ならびに（７）食品産業において乳酸菌は安全に使用されているという長い歴史があること（このことは、乳酸菌を治療用タンパク質（例えば、アポリポタンパク質）の生成に魅力的なクローニング宿主にしている）。
【００１２】
（４．１  乳酸菌）
上記に鑑みると、本開示は、乳酸菌においてアポリポタンパク質を発現するための組成物および方法を提供する。本明細書において使用される場合、用語「乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」とは、糖を醗酵するとともに酸（主に生成される酸としては、乳酸が挙げられる）を生成するグラム陽性の微好気性細菌または嫌気性細菌をいう。代表的には、上記方法および組成物は、産業上利用されている乳酸菌（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．およびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）を使用する。厳密には嫌気性属に属する乳酸生成細菌（ビフィドバクテリア、すなわち、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）は、食品のスターター培養物として単独で、または乳酸菌と組み合わせて頻繁に使用されており、この乳酸生成細菌はまた、乳酸菌の科内に含まれ得る。
【００１３】
他のエンドトキシン非生成細菌（当業者に公知の他のグラム陽性細菌が挙げられる）が、組換えアポリポタンパク質を生成するために使用され得、組換えアポリポタンパク質の生成の範囲が、上記の乳酸菌に限定されないことが理解されるべきである。
【００１４】
組換え乳酸菌は、アポリポタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むように構築され得る。上記アポリポタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、適切な調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結されて、当該分野で周知の方法を用いて上記コード配列の発現を制御し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと）。さらに、種々のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種から選択された多くの遺伝子のコドン使用頻度パターンが分析されて、必要であれば、コドンの偏りを回避するためのアプローチを開発することが可能である。例えば、ＰｏｕｗｅｌｓおよびＬｅｕｎｉｓｓｅｎ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：９２９−９３６を参照のこと。
【００１５】
（４．２  アポリポタンパク質およびアポリポタンパク質ペプチド）
乳酸菌において組換え発現されるアポリポタンパク質の性質は、成功するのに重要ではない。本明細書中に記載されるような治療上の利益および／または予防上の利益を提供する実質的に任意のアポリポタンパク質および／またはその誘導体もしくはアナログが、乳酸菌の科を構成するメンバーのうちの１種以上において発現され得る。さらに、脂質と会合したときにＬＣＡＴを活性化し得るかまたは円盤状粒子（ｄｉｓｃｏｉｄａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）を形成し得るという点で、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ）の活性を「模倣」する任意のαヘリックスペプチドもしくはペプチドアナログ、または任意の他の型の分子が、乳酸菌において組換え発現され得、従って、「アポリポタンパク質」の定義内に含まれる。適切なアポリポタンパク質の例としては、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、およびＡｐｏＥのプレプロアポリポタンパク質形態；ヒトＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥのプロ形態および成熟形態；ならびに活性な多型性形態、アイソフォーム、改変体および変異体、ならびに末端切断型形態が挙げられるが、これらに限定されず、このうちの最も一般的なものは、ＡｐｏＡ−ＩＭ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）およびＡｐｏＡ−ＩＰ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）である。ＡｐｏＡ−ＩＭは、ＡｐｏＡ−ＩのＲ１７３Ｃ分子改変体である（例えば、Ｐａｒｏｌｉｎｉら，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８（７）：４７４０−６；Ｃａｌａｂｒｅｓｉら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１６３０７−１４；およびＣａｌａｂｒｅｓｉら，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１２４２８−３３を参照のこと）。ＡｐｏＡ−ＩＰは、ＡｐｏＡ−Ｉの  Ｒ１５１分子改変体である（例えば、Ｄａｕｍら，１９９９，Ｊ  ＭｏＩ  Ｍｅｄ．７７（８）：６１４−２２を参照のこと）。システイン残基を含むアポリポタンパク質変異体もまた公知であり、使用され得る（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１８１３７２号を参照のこと）。上記アポリポタンパク質は、モノマーまたはダイマーの形態であり得、これらは、ホモダイマーであってもよいし、ヘテロダイマーであってもよい。例えば、プロＡｐｏＡ−Ｉおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒら，１９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１６（１２）：１４２４−２９）、プロＡｐｏＡ−ＩＭおよび成熟ＡｐｏＡ−ＩＭ（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら，１９８５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６０：１６３２−３５）、プロＡｐｏＡ−ＩＰおよび成熟ＡｐｏＡ−ＩＰ（Ｄａｕｍら，１９９９，Ｊ  ＭｏＩ  Ｍｅｄ．７７：６１４−２２）、プロＡｐｏＡ−ＩＩおよび成熟ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｓｈｅｌｎｅｓｓら，１９８５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６０（１４）：８６３７−４６；Ｓｈｅｌｎｅｓｓら，１９８４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５９（１５）：９９２９−３５）、プロＡｐｏＡ−ＩＶおよび成熟ＡｐｏＡ−ＩＶ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒら，１９９１，Ｅｕｒｏ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（２）：３７３−８３）、プロＡｐｏＥおよび成熟ＡｐｏＥ（ＭｃＬｅａｎら，１９８３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５８（１４）：８９９３−９０００）、プロＡｐｏＪおよび成熟ＡｐｏＪならびにプロＡｐｏＨおよび成熟ＡｐｏＨのホモダイマーおよびヘテロダイマー（可能な場合）が、使用され得る。上記アポリポタンパク質は、上記アポリポタンパク質が複合体中に含まれる場合にある生物学的活性を保持する限りにおいて、それらの単離を容易にする要素に対応する残基（例えば、Ｈｉｓタグ）または他の目的で設計される他の要素に対応する残基を含み得る。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記アポリポタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ヒトから得られ得る。ヒトアポリポタンパク質配列の非限定的な例は、米国特許第５，８７６，９６８号、同第５，６４３，７５７号、および同第５，９９０，０８１号、ならびにＷＯ  ９６／３７６０８において開示される；これらの開示は、本明細書中においてその全体が参考として援用される。
【００１７】
上記参考文献に加えて、ヒトアポリポタンパク質の配列としては、種々の配列データベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ）において入手可能である配列が挙げられる。例えば、ヒトＡｐｏＡ−ＩについてのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号としては、ＮＰ＿００００３０およびＡＡＢ５９５１４、Ｐ０２６４７、ＣＡＡ３０３７７、ならびにＡＡＡ５１７４６が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトＡｐｏＡ−ＩＩについてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号としては、ＮＰ＿００１６３４およびＰ０２６５２が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトＡｐｏＡ−ＩＶについてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号としては、ＡＡＢ５０１３７、Ｐ０６７２７、ＮＰ＿０００４７３、およびＮＰ＿００１６３４が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトＡｐｏＡ−ＶについてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号としては、ＮＰ＿４４３２００、ＡＡＢ５９５４６、およびＱ６Ｑ７８８が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトＡｐｏＥについてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号としては、Ｑ６Ｑ７８８、Ｐ０２６４９、ＡＡＢ５０１３７、ＢＡＡ９６０８０、ＡＡＧ２７０８９、ＡＡＬ８２８１０、ＡＡＢ５９５４６、ＡＡＢ５９３９７、ＡＡＨ０３５５７、ＡＡＤ０２５０５、ＮＰ＿００００３２、およびＡＡＢ５９５１８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記アポリポタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、非ヒトから得られる（例えば、米国特許出願公開第２００４／００７７５４１号（その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される））。アポリポタンパク質Ａ−Ｉタンパク質が、多くの非ヒト動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒヒ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ハリネズミ、アナグマ、マウス、ラット、ネコ、モルモット、ハムスター、アヒル、ニワトリ、サケおよびウナギにおいて同定された（Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔｔｅら，２００１，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１５３１：４−４６；Ｙｕら，１９９１，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ．１６（４）：３４７−５５；ＣｈｅｎおよびＡｌｂｅｒｓ，１９８３，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７５３（１）：４０−６；Ｌｕｏら，１９８９，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３０（１１）：１７３５−４６；Ｂｌａｔｏｎら，１９７７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：２１５７−６３；Ｓｐａｒｒｏｗら，１９９５，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３６（３）：４８５−９５；Ｂｅａｕｂａｔｉｅら，１９８６，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２７：１４０−４９；Ｊａｎｕｚｚｉら，１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４（４）：１０８１−８；ＧｏｕｌｉｎｅｔおよびＣｈａｐｍａｎ，１９９３，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３４（６）：９４３−５９；Ｃｏｌｌｅｔら，１９９７，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３８（４）：６３４−４４；ならびにＦｒａｎｋおよびＭａｒｃｅｌ，２０００，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４１（６）：８５３−７２）。
【００１９】
非ヒト動物種由来のアポリポタンパク質Ａ−Ｉタンパク質は、同様の大きさであり（Ｍｒ  約２７，０００〜２８，０００）かつかなりの相同性を共有する（Ｓｍｉｔｈら，１９７８，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：７５１−７）。例えば、ウシＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、２４１アミノ酸残基を含み、一連の反復性両親媒性αヘリックス領域を形成し得る。ウシＡｐｏＡ−Ｉタンパク質には、１０個の両親媒性αヘリックス領域が存在し、代表的には、残基４３〜６４、６５〜８６、８７〜９７、９８〜１１９、１２０〜１４１、１４２〜１６３、１６４〜１８４、１８５〜２０６、２０７〜２１７および２１８〜２４１の間に存在する（Ｓｐａｒｒｏｗら，１９９２，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１１２３：１４５−１５０、およびＳｗａｎｅｙ，１９８０，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６１７：４８９−５０２を参照のこと）。ヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿５２１０６またはＮＭ＿００００３９）とウシＡｐｏＡ−Ｉタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ５６８５８）との間の、プログラムＢＬＡＳＴを使用するアミノ酸配列比較により、これら配列は７７％同一であることが明らかになっている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−１０）。
【００２０】
ブタ（ｐｉｇ）（ブタ：ｐｏｒｃｉｎｅ）ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、分子量約３０，２８０を有する、約２６４アミノ酸残基を含む。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ３１３９４は、分子量３０，２５４を有する２６４残基のブタＡｐｏＡ−Ｉ配列を提供する一方で、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＴ０６７２は、分子量３０，３２０を有する２６５残基のブタＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を提供する（Ｗｅｉｌｅｒ−Ｇｕｔｔｌｅｒら，１９９０，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５４（２）：４４４−４５０；Ｔｒｉｅｕら，１９９３，Ｇｅｎｅ  １２３（２）：１７３−７９；Ｔｒｉｅｕら，１９９３，Ｇｅｎｅ  １３４（２）：２６７−７０もまた参照のこと）。
【００２１】
ニワトリＡｐｏＡ−Ｉ前駆体は、２６４アミノ酸残基を有する；上記配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＬＰＣＨＡ１で提供されている。Ｊａｃｋｓｏｎらは、ニワトリ（ｈｅｎ）ＡｐｏＡ−Ｉを、２３４アミノ酸残基を含み、分子量約２８，０００を有しかつヒトＡｐｏＡ−Ｉとはイソロイシンの存在が異なると説明した（Ｊａｃｋｓｏｎら，１９７６，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．４２０（２）：３４２−９）。Ｙａｎｇらは、成熟ニワトリＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を、２４０アミノ酸残基から構成され、ヒトと５０％未満の相同性を有すると説明した（Ｙａｎｇら，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２４（２）：２６１−６、ＳｈａｃｋｅｌｆｏｒｄおよびＬｅｂｈｅｒｚ；１９８３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５８（１１）：７１７５−７１８０、Ｂａｎｊｅｒｊｅｅら，１９８５，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１（４）：１２１９−１２２６、Ｒａｊａｖａｓｈｉｓｔｈら，１９８７，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６２（１５）：７０５８−６５、Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８７，Ｇｅｎｅ  ６０（１）：３９−４６、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａら，１９９１，Ｇｅｎｅ  １０４（２）：１６３−１６８；Ｌａｍｏｎ−Ｆａｖａら，１９９２，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３３（６）：８３１−４２もまた参照のこと）。ニワトリＡｐｏＡ−Ｉタンパク質の円偏光二色性分光分析（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）研究により、このタンパク質は、脂質なしの状態において、両親媒性αヘリックスの束（ｂｕｎｄｌｅ）として構成されることが実証されている（Ｋｉｓｓら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（１４）：４３２７−３４）。ニワトリ、ヒト、ウサギ、イヌおよびラットの間での二次構造特徴の比較は、ヒトＡｐｏＡ−Ｉに対する、特に、このタンパク質のＮ末端から３分の２において、ＡｐｏＡ−Ｉの二次構造の良好な保存を示す（Ｙａｎｇら，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２４（２）：２６１−６）。
【００２２】
七面鳥におけるリポタンパク質研究により、ヒトＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−ＩＩに対する類推において表されたリポタンパク質のＡｐｏＡクラスが同定された。七面鳥におけるＡｐｏＡ−Ｉは、分子量約２７，０００を有する主要なＡｐｏＡポリペプチドであった（ＫｅｌｌｅｙおよびＡｌａｕｐｏｖｉｃ，１９７６，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２４（１−２）：１５５−７５、ＫｅｌｌｅｙおよびＡｌａｕｐｏｖｉｃ，１９７６，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２４（１−２）：１７７−８７）。アヒルＡｐｏＡ−Ｉは、約２４６アミノ酸残基を含み得かつ分子量約２８，７４４を有する（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ６１４４８、Ｇｕら，１９９３，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１２（５）：５８５−９１）。
【００２３】
アポリポタンパク質に対応するペプチドおよびペプチドアナログ、ならびにＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＭ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶおよびＡｐｏＥの活性を模倣し、乳酸菌における発現に適したアゴニストの非限定的な例は、米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号、同第６，０４６，１６６号、および同第５，８４０，６８８号、米国特許出願公開第２００４／０２６６６７１号、同第２００４／０２５４１２０号、同第２００３／０１７１２７７号、同第２００３／００４５４６０号、および同第２００３／００８７８１９号（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示されている。
【００２４】
（４．３  乳酸菌発現ベクターおよび調節配列）
上記組換え乳酸菌は、上記コードヌクレオチド配列に作動可能に連結された、少なくとも１つの構成性プロモーターまたは少なくとも１つの調節性プロモーターを含み得る。本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結」とは、機能的関係があるヌクレオチド配列要素の連結をいう。例えば、「作動可能に連結」されているプロモーターとは、この調節要素が、ＲＮＡポリメラーゼ開始およびこの核酸の発現を制御する（例えば、上記コード配列の転写に影響を及ぼす）のに、ヌクレオチドコード配列に対する関係において適切な位置および配向にあることを意味する。上記プロモーター領域は、任意の原核生物細胞に存在する、乳酸菌において機能し得る（例えば、作動可能に連結された核酸配列の発現を促進し得る）プロモーターに基づき得るが、いくつかの実施形態においては、このプロモーターは、乳酸菌種由来である。例えば、いくつかの実施形態において、上記プロモーター領域は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（例えば、ＭＧ１３６３とよばれる株（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓとも文献中では言及される）（Ｎａｕｔａら，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：９８０−９８３））およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓを含む）のプロモーター領域由来であり得る。組換え乳酸菌の構築における使用に適した他のプロモーター領域の例は、プロモーターＰ１７０およびその誘導体を含む領域を含めて、ＷＯ  ９４／１６０８６において開示されている。その例は、ＷＯ  ９８／１００７９および米国特許出願公開第２００２／０１３７１４０号（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示されている。
【００２５】
いくつかの実施形態において、組換えアポリポタンパク質を発現するために使用される乳酸菌は、その細胞外ハウスキーピングプロテアーゼであるＨｔｒＡが不活性化された改変体であり得る。例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉら，２００２，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：３１４１−３１４６（この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記組換え乳酸菌において使用されるプロモーターは、調節性または誘導性のプロモーターであり得る。上記プロモーターを調節または誘導する因子としては、プロモーター配列の活性を調節し得る任意の物理的因子および化学的因子が挙げられる。これらの因子としては、物理的条件（例えば、温度および光）；化学物質（例えば、ＩＰＴＧ、トリプトファン、ラクテートまたはナイシン）；および環境条件または増殖条件の因子（例えば、ｐＨ、インキュベーション温度、および酸素含有量）が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーター活性を調節するための他の条件としては、とりわけ、熱ショック遺伝子の発現を誘起する温度シフト；増殖培地の組成（例えば、イオン強度／ＮａＣｌ含有量）；細胞内または培地中での代謝産物（乳酸／ラクテートを含む）の蓄積；必須の細胞構成要素またはそのための前駆体の存在／非存在；細菌の増殖期または増殖速度が挙げられ得る。例えば、米国特許出願公開第２００２／０１３７１４０号（この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００２７】
乳酸菌において使用するための多くの誘導性遺伝子発現系が開発されてきた（例えば、Ｋｏｋ，１９９６，Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．７０：１２９−１４５；Ｋｕｉｐｅｒｓら，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：１３５−４０；Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ  ａｎｄ  Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，１９９８，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：１２７−１３９；Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら，１９９７，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１−４５８４を参照のこと）。有用な乳酸菌発現系としては、ＮＩＣＥ系（ｄｅ  Ｒｕｙｔｅｒら，１９９６，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：３６６２−３６６７）が挙げられる。この系は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおける抗微生物性ペプチドであるナイシンの生合成を制御する２成分系からの遺伝的要素に基づいている。他の有用な誘導性発現系は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓのバクテリオファージであるｆ３１（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら，１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．），１４：８２−８７；ならびにＷａｌｋｅｒおよびＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，１９９８，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８０：９２１−９３１）ならびにｒｌｔ（Ｎａｕｔａら，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：９８０−９８３）、環境変化（例えば、ｐＨ（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら，１９９５，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：２５４０−２５４７）、Ｚｎ２＋（ＬｌｕｌｌおよびＰｏｑｕｅｔ，２００４，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：５３９８−５４０６）、塩濃度（Ｓａｎｄｅｒｓら，１９９８，ＭｏＩ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，２５７：６８１−６８５）、および宿主細胞によって生成されるかもしくは宿主細胞増殖の間に天然に存在する条件によって生成される代謝産物）によって誘導されるプロモーターからの遺伝的要素の使用を包含する。このようなプロモーターとしては、ＷＯ  ９４／１６０８６、ＷＯ  ９８／１００７９、米国特許出願公開第２００２／０１３７１４０号、およびＭａｄｓｅｎら，１９９９，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０７：７５−８７に開示されるように、とりわけ、ｐＨ誘導性Ｐ１７０プロモーターおよびその誘導体が挙げられる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記プロモーターおよび上記アポリポタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、自律的に複製するレプリコン（例えば、プラスミド、転移可能要素（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、バクテリオファージ、またはコスミド）で上記乳酸菌に導入され得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターおよび上記アポリポタンパク質ヌクレオチドコード配列は、上記アポリポタンパク質ヌクレオチドコード配列の細菌中での安定な維持を提供するように、上記アポリポタンパク質ヌクレオチドコード配列が上記乳酸菌細胞染色体に組み込まれる条件下で導入され得る。組み込みは、とりわけ、相同組換え、トランスポゾン、接合移入（ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）およびファージインテグラーゼ（例えば、Ｆｒａｚｉｅｒら，２００３，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（２）：１１２１−８；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら，１９９４，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６（４）：１０６９−７６；Ｒｏｍｅｒｏら，１９９２，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８（２）：６９９−７０２；Ｒｏｍｅｒｏら，１９９１，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３（２３）：７５９９−６０６；Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓら，１９９１，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７（９）：２５６２−７；Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓら，１９９０，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６（９）：２７２６−２７３５；Ｃｈｏｐｉｎら，１９８９，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５（７）：１７６９−７４；およびＳｃｈｅｉｒｌｉｎｃｋら，１９８９，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５（９）：２１３０−７を参照のこと）に基づく組み込み系によって影響を受け得る。
【００２９】
他の実施形態において、上記アポリポタンパク質ヌクレオチドコード配列は、上記選択された宿主生物の染色体に天然に存在するプロモーターに作動可能に連結される位置で、上記乳酸菌細胞染色体へ導入され得る（例えば、Ｒａｕｃｈら，１９９２，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（４）：１２８０−７；Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら，１９９３，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９（１）：２１−２６；およびＭａｇｕｉｎら，１９９６，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（３）：９３１−５を参照のこと）。
【００３０】
いくつかの実施形態において、上記アポリポタンパク質ヌクレオチドコード配列は、上記遺伝子生成物を上記細菌から上記培養培地へと分泌させ得る、シグナルペプチド（ＳＰ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。乳酸菌における使用に適したシグナルペプチド（Ｕｓｐ  ４５が挙げられる）は、米国特許出願公開第２００２／０１３７１４０号（この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）において開示されている。
【００３１】
いくつかの実施形態において、さらなるヌクレオチド配列（例えば、乳酸菌における異種タンパク質の生成および分泌を改善するために使用されるもの）が、本明細書中に記載される方法および組成物において使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃａｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）（Ｎｕｃ）をコードするヌクレオチド配列および合成ペプチドＬＥＩＳＳＴＣＤＡをコードするヌクレオチド配列は、アポリポタンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結され得る。例えば、Ｎｏｕａｉｌｌｅら，２００５，Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．３８：３５３−３５９（この開示は、その全体が本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。
【００３２】
いくつかの実施形態において、乳酸菌において使用するために開発された発現ベクターは、乳酸菌において組換えアポリポタンパク質を発現するために使用され得る。これらのベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐＬＦ２２（例えば、Ｔｒａｋａｎｏｖら，２００４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７３：１７０−１７５を参照のこと）およびｐＴＲＥＸ（例えば、Ｒｅｕｔｅｒら，２００３，「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８７：１０１−１１４を参照のこと）。
【００３３】
種々の実施形態において、アポリポタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む上記乳酸菌は、例えば、米国特許出願公開第２００２／０１３７１４０号において開示されるように、エンドトキシン非含有のアポリポタンパク質を生成するために培養され得る。上記方法は、上記形質転換された乳酸菌を、上記アポリポタンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、および上記形質転換された乳酸菌から上記アポリポタンパク質を回収する工程を包含し得る。上記組換え細胞および／または上記アポリポタンパク質は、当業者に公知の従来からの技術を使用して収集され得る。例えば、米国特許出願公開第２００２／０１３７１４０号（この開示は、その全体が本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。
【００３４】
いくつかの実施形態において、短鎖アシルリン脂質が、上記組換えアポリポタンパク質を含む上記乳酸菌（上記のとおり）を培養するために使用される培地（すなわち、醗酵培地）に添加される。上記乳酸菌は、栄養源として上記短鎖アシルリン脂質を利用し得る。さらに、上記短鎖アシルリン脂質は、上記発現されるアポリポタンパク質を可溶化するための一助として使用され得る。上記短鎖アシルリン脂質は、上記アシル鎖を切断するホスホリパーゼを添加し、短鎖脂肪酸と短鎖溶解性ＰＬ（ｌｙｓｏＰＬ）とを遊離させることによって、容易に除去され得る。上記短鎖脂肪酸および溶解性ＰＬは可溶性であるので、上記アポリポタンパク質は、沈殿および精製させられ得る。
【００３５】
（４．４  組換えアポリポタンパク質−脂質複合体）
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の上記組換えアポリポタンパク質は、アポリポタンパク質−脂質複合体において処方および投与され得る。このアプローチは、特に、上記複合体がＨＤＬに、そして特にプレ−β−１またはプレ−β−２  ＨＤＬ集団に類似の大きさおよび密度を有する場合に、上記複合体が循環中で増大した半減期を有するはずであるので、いくつかの利点を有する。上記アポリポタンパク質−脂質複合体は、以下に記載の多くの方法のうちのいずれかによって従来通り調製され得る。米国特許第６，００４，９２５号（この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと。長期貯蔵寿命を有する安定な調製物が、凍結乾燥によって作製され得る。上記凍結乾燥したアポリポタンパク質−脂質複合体は、薬学的再処方のためのバルクを調製するため、または被験体へ投与する前に滅菌水もしくは適切な緩衝化溶液で再水和することによって再構成され得る個々のアリコートもしくは投与単位を調製するために、使用され得る。
【００３６】
当業者に周知の種々の方法が、上記アポリポタンパク質−脂質小胞または複合体を調製するために使用され得る。この目的のために、リポソームまたはプロテオリポソームを調製するために利用可能な多くの技術が、使用され得る。例えば、上記アポリポタンパク質は、適切な脂質と一緒に超音波処理されて（バスまたはプローブソニケーターを用いて）、複合体を形成し得る。あるいは、上記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質−脂質複合体の自発的形成を生じる予備形成された脂質小胞と合わせられ得る。なお他の実施形態において、上記アポリポタンパク質−脂質複合体は、界面活性剤透析方法によって形成され得る；例えば、上記アポリポタンパク質と、脂質と、界面活性剤との混合物が、透析されて、上記界面活性剤を除去して、アポリポタンパク質−脂質複合体を再構成もしくは形成する（例えば、Ｊｏｎａｓら，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８：５５３−５８２を参照のこと）。
【００３７】
前述のアプローチは実現可能であるが、各方法は、費用、収率、再現性および安全性の面で、それら自体に特有の生成課題を示す。ＨＤＬに類似の特性を有するアポリポタンパク質−リン脂質複合体を調製するための単純な方法は、米国特許第６，００４，９２５号（この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００３８】
上記凍結乾燥した生成物は、上記ペプチド−脂質複合体の溶液または懸濁物を得るために再構成され得る。この目的のために、上記凍結乾燥粉末は、適切な容量（しばしば、静脈内注射に都合の良い、５ｍｇペプチド／ｍｌ）になるまで水溶液で再水和される。いくつかの実施形態において、上記凍結乾燥粉末は、リン酸緩衝化生理食塩水または生理食塩水で再水和される。その混合物は、攪拌またはボルテックスされて、再水和を容易にし得る。そして、大部分の場合、その再構成工程は、上記複合体の脂質成分の相転移温度以上の温度で行われ得る。
【００３９】
得られた再構成調製物のアリコートを、上記調製物中の複合体が望ましいサイズ分布；例えば、ＨＤＬのサイズ分布を有することを確認するために特徴付けられ得る。この目的のための例示的方法は、ゲル濾過クロマトグラフィーである。以下に記載の作業実施例において、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＦＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーシステムを使用した。使用した緩衝液は、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中に１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む。代表的なサンプル容積は、５ｍｇペプチド／ｍｌを含む複合体を２０〜２００μｌである。カラム流速は、０．５ｍｌ／分である。既知の分子量およびストークス直径の一連のタンパク質、ならびにヒトＨＤＬを、カラムを較正するための標準物質として使用し得る。上記タンパク質およびリポタンパク質複合体は、波長２５４ｎｍまたは２８０ｎｍの光の吸収または散乱によってモニターされ得る。
【００４０】
上記組換えアポリポタンパク質は、種々の脂質（飽和脂質、不飽和脂質、天然脂質および合成脂質ならびに／またはリン脂質が挙げられる）と複合体形成され得る。適したリン脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：短いアルキル鎖のリン脂質、卵ホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロールホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ジラウリルホスファチジルコリン、（１，３）−Ｄ−マンノシル−（１，３）ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、３−コレステリル−６’−（グリコシルチオ）ヘキシルエーテル糖脂質、ならびにコレステロールおよびその誘導体。
【００４１】
他の実施形態において、組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、上記組換えアポリポタンパク質と、米国特許出願第６０／６６５，１８０号（発明の名称「Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」、２００５年３月２４日出願）、および国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００６３５において開示される脂質とを複合体形成することによって作製され得る。
【００４２】
（４．５  薬学的組成物）
本開示によって企図される薬学的組成物は、インビボでの投与および送達に適した薬学的に受容可能なキャリア中の活性成分として、本明細書中に記載の組換えアポリポタンパク質または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体を含む。ペプチド模倣性アポリポタンパク質を使用する実施形態において、上記ペプチド模倣性アポリポタンパク質は、遊離の酸もしくは塩基の形態、または薬学的に受容可能な塩の形態のいずれかにおいて、上記組成物中に含まれ得る。改変タンパク質（例えば、アミド化タンパク質、アシル化タンパク質、アセチル化タンパク質またはｐｅｇ化タンパク質）もまた、使用され得る。
【００４３】
注射可能な組成物は、水性または油性のビヒクル中に、活性成分の滅菌の懸濁液、溶液またはエマルジョンを含み得る。上記組成物はまた、処方剤（例えば、懸濁剤、安定剤および／または分散剤）を含み得る。上記注射用組成物は、単位投与形態において（例えば、アンプルにおいて）または複数用量容器において提示され得、そして添加保存剤を含み得る。注入用には、組成物は、荷電したリポタンパク質複合体と適合性の材料（例えば、エチレンビニルアセテートまたは当該分野で公知の任意の他の適合性材料）から製造される注入バッグ中に供給され得る。
【００４４】
あるいは、上記注入用組成物は、使用前に適切なビヒクル（滅菌した発熱物質を含まない水、緩衝液、デキストロース溶液などが挙げられるが、これらに限定されない）で再構成するために散剤形態で提供され得る。この目的のために、上記組換えアポリポタンパク質が凍結乾燥され得るか、または同時に凍結乾燥されたアポリポタンパク質−脂質複合体が調製され得る。上記保管された組成物は、単位投与形態において供給され得、そしてインビボで使用する前に再構成され得る。
【００４５】
長期間の送達のために、上記活性成分は、移植による投与；例えば、皮下注射、皮内注射、または筋肉内注射のために、デポー組成物として処方され得る。従って、例えば、組換えアポリポタンパク質−脂質複合体または組換えアポリポタンパク質単独は、適したポリマー物質または疎水性物質と一緒に（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）またはリン脂質フォーム（ｆｏａｍ）もしくはイオン交換樹脂中に処方され得る。
【００４６】
あるいは、経皮的吸収のために活性成分をゆっくりと放出する接着性ディスクまたはパッチとして製造される経皮送達系が、使用され得る。この目的のために、透過性増強剤が、上記活性成分の経皮的透過性を促進するために使用され得る。特定の利益は、本明細書中に記載される荷電した複合体を、虚血性心疾患および高コレステロール血症を有する患者における使用のためのニトログリセリンパッチに組み込むことによって達成され得る。
【００４７】
あるいは、上記送達は、カテーテルもしくは灌流器（ｐｅｒｆｕｓｏｒ）を用いて局所にまたは壁内に（脈管壁内に）行われ得る（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０９４４２号を参照のこと）。
【００４８】
上記組成物は、望ましい場合、上記活性成分を含む、１つ以上の単位投与形態を含み得るパックまたはディスペンサーで提示され得る。上記パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイル（例えば、ブリスターパック）を含み得る。上記パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付属し得る。
【００４９】
（４．６  処置方法）
本明細書中に記載の組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体ならびに組成物は、リポタンパク質複合体が有用であると示された実質的にあらゆる目的のために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記複合体および組成物は、脂質異常症ならびに／または脂質異常症と関連する実質的に任意の疾患、状態および／もしくは障害を処置または予防するために使用され得る。本明細書において使用される場合、用語「脂質異常症」または「脂質異常性」とは、血漿中の脂質のレベルが異常に上昇しているかまたは異常に減少していることをいう。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：以下の状態と関連した、脂質の変化したレベル：冠状動静脈心疾患；冠状動脈疾患；心臓血管の疾患、高血圧、再狭窄、脈管もしくは脈管周囲の疾患；脂質異常性障害；リポタンパク質異常血症（ｄｙｓｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）；高レベルの低密度リポタンパク質コレステロール；高レベルの超低密度リポタンパク質コレステロール；低レベルの高密度リポタンパク質；高レベルのリポタンパク質Ｌｐ（ａ）コレステロール；高レベルのアポリポタンパク質Ｂ；アテローム硬化症（アテローム硬化症の処置および予防を含む）；高脂血症；高コレステロール血症；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）；家族性複合型高脂血症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）（ＦＣＨ）；リポタンパク質リパーゼ欠損症（例えば、高トリグリセリド血症、低αリポタンパク質血症、および高コレステロールリポタンパク質血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）。
【００５０】
脂質異常症と関連する疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：冠状動静脈心疾患、冠状動脈疾患、急性冠状動静脈症候群、心臓血管疾患、高血圧、再狭窄、脈管もしくは脈管周囲の疾患；脂質異常性障害；リポタンパク質異常血症；高レベルの低密度リポタンパク質コレステロール；高レベルの超低密度リポタンパク質コレステロール；低レベルの高密度リポタンパク質；高レベルのリポタンパク質Ｌｐ（ａ）コレステロール；高レベルのアポリポタンパク質Ｂ；アテローム硬化症（アテローム硬化症の処置および予防を含む）；高脂血症；高コレステロール血症；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）；家族性複合型高脂血症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）（ＦＣＨ）；リポタンパク質リパーゼ欠損症（例えば、高トリグリセリド血症、低αリポタンパク質血症、および高コレステロールリポタンパク質血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）。
【００５１】
いくつかの実施形態において、上記方法は、脂質異常症と関連する疾患を処置または予防する方法を包含し、この方法は、投与後少なくとも１日間、投与前のベースライン（初期）レベルより約１０ｍｇ／ｄＬ〜３００ｍｇ／ｄＬ高い範囲内で、血清レベルで複合体化アポリポタンパク質を達成するに有効な量で、組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体を被験体に投与する工程を包含する。
【００５２】
他の実施形態において、上記方法は、脂質異常症と関連する疾患を処置または予防するための方法を包含し、この方法は、投与後の少なくとも１日間、投与前の初期ＨＤＬ−コレステロール画分より少なくとも約１０％高い、ＨＤＬ−コレステロール画分の循環血漿濃度を達成するに有効な量で、組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体を被験体に投与する工程を包含する。
【００５３】
他の実施形態において、上記方法は、脂質異常症と関連する疾患を処置または予防するための方法を包含し、この方法は、投与後の５分間〜１日間の間に、３０〜３００ｍｇ／ｄＬの間のＨＤＬ−コレステロール画分の循環血漿濃度を達成するに有効な量で、本明細書中に記載の荷電されたリポタンパク質複合体または組成物を被験体に投与する工程を包含する。
【００５４】
他の実施形態において、上記方法は、脂質異常症と関連する疾患を処置または予防するための方法を包含し、この方法は、投与後の５分間〜１日間の間に、３０〜３００ｍｇ／ｄＬの間のコレステリルエステルの循環血漿濃度を達成するに有効な量で、組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体を被験体に投与する工程を包含する。
【００５５】
他の実施形態において、上記方法は、脂質異常症と関連する疾患を処置または予防するための方法を包含し、この方法は、投与後の少なくとも１日間、投与前のベースライン（初期）レベルを少なくとも約１０％上回る糞便コレステロール排泄の増加を達成するために有効な量で、組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体を被験体に投与する工程を包含する。
【００５６】
本明細書中に記載の組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体あるいは組成物は、単独で、または前述の状態を処置もしくは予防するために使用される他の薬物との併用療法において、使用され得る。このような治療としては、必要とされる薬物の同時投与または連続的投与が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、高コレステロール血症またはアテローム硬化症の処置において、組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、現在使用しているコレステロール低下治療のうちの１つ以上と一緒に施され得る；これらのコレステロール低下治療としては、例えば、胆汁酸樹脂、ナイアシン、スタチン、コレステロール吸収インヒビターおよび／もしくはフィブリン酸が挙げられる。このような併用レジメンは、特に有益な治療上の効果をもたらし得る。なぜなら、各薬物は、コレステロールの合成および輸送における異なる標的に対して作用するからである；すなわち、胆汁酸樹脂は、コレステロール再循環、カイロミクロンおよびＬＤＬ集団に影響を及ぼす；ナイアシンは、主に、ＶＬＤＬおよびＬＤＬ集団に影響を及ぼす；スタチンは、コレステロール合成を阻害し、ＬＤＬ集団（およびおそらく増加するＬＤＬレセプター発現）を減少させる；それに対して、本明細書中に記載される荷電したリポタンパク質複合体は、ＲＣＴに影響を及ぼし、ＨＤＬを増加させ、コレステロール排出（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ）を促進する。
【００５７】
他の実施形態において、上記組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、冠状動脈心臓疾患；冠状動脈疾患；心臓血管疾患、高血圧、再狭窄、脈管もしくは脈管周囲の疾患；脂質異常性障害；リポタンパク質異常血症；高レベルの低密度リポタンパク質コレステロール；高レベルの超低密度リポタンパク質コレステロール；低レベルの高密度リポタンパク質；高レベルのリポタンパク質Ｌｐ（ａ）コレステロール；高レベルのアポリポタンパク質Ｂ；アテローム硬化症（アテローム硬化症の処置および予防を含む）；高脂血症；高コレステロール血症；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）；家族性複合型高脂血症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）（ＦＣＨ）；リポタンパク質リパーゼ欠損症（例えば、高トリグリセリド血症、低αリポタンパク質血症、および高コレステロールリポタンパク質血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）を処置または予防するためにフィブリン酸とともに使用され得る。
【００５８】
上記組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、循環でのバイオアベイラビリティーを確実にする任意の適した経路によって投与され得る。例えば、上記組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、小さなＨＤＬ画分、例えば、プレ−β様、プレ−γ様およびプレ−β様のＨＤＬ画分、αＨＤＬ画分、ＨＤＬ３画分および／またはＨＤＬ２画分を増大させる投与量において投与され得る。いくつかの実施形態において、上記投与量は、例えば、画像化技術（例えば、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）または脈管内超音波（ＩＶＵＳ））によって測定される場合に、アテローム硬化斑の低減を達成するために有効である。ＩＶＵＳによって追跡すべきパラメーターとしては、ベースラインからのアテローム容積の変化の％、および全アテローム容積の変化が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＲＩによって追跡すべきパラメーターとしては、ＩＶＵＳについてのもの、ならびに脂質組成および斑のカルシウム沈着が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
上記斑の退縮は、最後の注入の終わりに、または最後の注入後数週間以内に、あるいは治療開始後３ヶ月以内、６ヶ月以内または１年以内に、それ自体のコントロールである時間ゼロ  対  時間ｔとして患者を用いて測定され得る。
【００６０】
投与は、最良には、非経口投与経路（静脈内（ＩＶ）注射、筋肉内（ＩＭ）注射、皮内注射、皮下（ＳＣ）注射、および腹腔内（ＩＰ）注射が挙げられる）によって達成され得る。特定の実施形態において、投与は、灌流器、浸透器（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｏｒ）またはカテーテルによるものである。いくつかの実施形態において、荷電したリポタンパク質複合体は、注射によって、皮下移植可能ポンプによってまたはデポー調製物によって、非経口投与を介して得られるものに等しい循環血清濃度を達成する量において、投与される。上記複合体はまた、例えば、ステントまたは他のデバイスに取り込まれ得る。
【００６１】
投与は、種々の異なる処置レジメンを通じて達成され得る。例えば、いくらかの静脈内注射は、１日の間に周期的に投与され得、上記注射の全累積容量は、１日の毒性用量に達しない。あるいは、１回の静脈内注射が、約３〜１５日間毎に、好ましくは、約５〜１０日間毎に、最も好ましくは約１０日間毎に施され得る。なお別の代替法において、段階的に上昇する用量が投与され得、１回の投与につき５０〜２００ｍｇの間の用量において約１〜５用量で開始して、次に、１回の投与につき２００ｍｇ〜１ｇの反復用量が続く。患者の必要性に依存して、投与は、１時間より長い持続時間でのゆっくりとした注入によるか、１時間以下の迅速な注入によるか、１回のボーラス注射によるものであり得る。
【００６２】
いくつかの実施形態において、投与は、注射のシリーズとして行われ得、その後、６ヶ月〜１年間にわたって中止され得、その後、別のシリーズが開始され得る。その後、注射の維持シリーズが、１年ごとに投与され得るかまたは３〜５年ごとに投与され得る。上記注射のシリーズは、１日中行われ得るか（複合体の特定の血漿レベルを維持するための注入）、数日間行われ得るか（例えば、８日間の期間で４回の注射）、または数週間行われ得（例えば、４週間の期間で４回の注射）、その後、６ヶ月〜１年後に再度開始され得る。
【００６３】
他の投与経路が使用され得る。例えば、消化管を介する吸収は、例えば、口内粘膜、胃および／または小腸の刺激の強い環境において、活性成分の分解を回避するかまたは最小にするために適切な処方（例えば、超陽性コーティング）が使用されるのであれば、経口投与経路（経口摂取経路、口内経路および舌下経路が挙げられるが、これらに限定されない）によって達成され得る。あるいは、粘膜組織を介する投与（例えば、膣投与様式および直腸投与様式）は、消化管における分解を回避または最小にするために利用され得る。他の実施形態において、本発明の処方物は、経皮的に（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）（例えば、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ））、または吸入によって投与され得る。好ましい経路は、レシピエントの状態、年齢およびコンプライアンスによって変動し得ることが理解される。
【００６４】
組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体あるいは組成物の実際の用量は、投与経路によって変動し得る。
【００６５】
種々の組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体の毒性および治療上の効力は、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順を使用して決定され得る。毒性効果と治療上の効果との間の上記用量比率は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。高い治療指数を示す組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体が好ましい。追跡され得るパラメーターの非限定的な例としては、肝機能トランスアミナーゼ（２×正常ベースラインレベル以下）が挙げられる。これは、非常に多くのコレステロールが肝臓にもたらされかつ肝臓がこのような量を同化できないという指標である。赤血球に対する効果もまた、モニターされ得る。なぜなら、赤血球からのコレステロール移動は、赤血球を脆くするかまたはそれらの形状に影響を及ぼすからである。
【００６６】
患者は、ある医療行為（例えば、予防処置）を受ける前に、またはその間またはその後に、数日間から数週間、処置され得る。投与は、別の侵襲性治療（例えば、血管形成術、頸動脈切断（ｃａｒｏｔｉｄ  ａｂｌａｔｉｏｎ）、ロトブレーダー（ｒｏｔｏｂｌａｄｅｒ）または臓器移植（例えば、心臓、腎臓、肝臓など）に付随（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）してもよいし、同時（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）であってもよい。
【００６７】
特定の実施形態において、組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、コレステロール合成がスタチンまたはコレステロール合成インヒビターによって制御されている患者に投与される。他の実施形態において、組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、胆汁酸塩およびコレステロールを捕らえるために、胆汁酸排出を上げて血中コレステロール濃度を低下させるために、結合樹脂（例えば、半合成樹脂（例えば、コレスチルアミン））で、または線維（例えば、植物性繊維）での処置を受けている患者に投与される。
【００６８】
（４．７  他の用途）
本明細書中に記載の組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体および組成物は、例えば、診断目的で、血清ＨＤＬを測定するためにインビトロでのアッセイにおいて使用され得る。ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩおよびＡｐｏペプチドは、血清のＨＤＬ成分と会合するので、組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、ＨＤＬ集団、ならびにプレ−βおよびプレ−β２  ＨＤＬ集団の「マーカー」として使用され得る。さらに、上記組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、ＲＣＴにおいて有効なＨＤＬの亜集団のマーカーとして使用され得る。この目的のために、組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、患者血清サンプルに添加され得るかまたは患者血清サンプルと混合され得る；適切なインキュベーション時間の後に、上記ＨＤＬ成分は、組み込まれた組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体を検出することによってアッセイされ得る。これは、標識された組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体（例えば、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、色素など）を使用して、あるいは組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体に対して特異的な抗体（または抗体フラグメント）を使用するイムノアッセイによって、達成され得る。
【００６９】
あるいは、標識された組換えアポリポタンパク質および／または組換えアポリポタンパク質−脂質複合体は、循環系を可視化するために、またはＲＣＴをモニターするために、またはＨＤＬがコレステロール排出において活性であるはずである脂肪線条（ｆａｔｔｙ  ｓｔｒｅａｋ）、アテローム硬化病変などにおけるＨＤＬの蓄積を可視化するために、画像化手順（例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩスキャン）において使用され得る。
【００７０】
全ての引用された参考文献は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、それらの全体が全ての目的で本明細書中に参考として援用されていることが詳細にかつ個々に示されたのと同程度にまで、それら全体が全ての目的で本明細書中に参考として援用される。
【００７１】
いずれの刊行物の引用も、出願日より前の開示に関するものであり、本発明が先行発明によってこのような刊行物に先んじて権利化されないという承認として解釈されるべきでない。
【００７２】
本発明の多くの改変およびバリエーションが、当業者にとって明らかなように、その趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得る。記載される特定の実施形態は、例示目的で提供されるに過ぎず、本発明は、権利化される特許請求の範囲に対する等価物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるものとする。
【国際調査報告】
2009505652.tif 000002
2009505652.tif 000003
2009505652.tif 000004