(57)【要約】  生存可能な前駆細胞が凍結臍帯組織から抽出される。態様では、臍帯組織が脈管ウォートンゼリーを持つ血管であり、そして抽出された前駆細胞はＨＵＣＰＶＣである。
2009520466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結した臍帯組織から生存可能な細胞を回収する方法であって：
１）極低温で保存した帯組織を得、ここで帯組織は
ａ）生存可能な細胞を含んでなる臍帯組織を得、
ｂ）臍帯組織を、血清を含有する細胞培養培地および低温保存剤を含んでなる低温保存溶液と組み合わせ、そして
ｃ）組み合わせ物を、低温保存剤が組織に浸透できる期間および温度で、液体として組み合わせ物が冷蔵される冷却工程に供し、
ｄ）冷却した組み合わせ物を凍結して凍結組織を提供し、そして次に場合により
ｅ）凍結組織を極低温条件下に保存する、
工程を含んでなる方法により調製され；
２）凍結した帯組織を解凍し；
３）低温保存剤を水と置き換えるように解凍した帯組織を処理し；そして
４）生存可能な細胞をそのように処理した帯組織から回収する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項２】
臍帯組織に存在する細胞の生存能を保存する方法であって、
ａ）生存可能な細胞を含んでなる臍帯組織を得；
ｂ）臍帯組織を、血清を含有する細胞培養培地および低温保存剤を含んでなる低温保存溶液と組み合わせ、
ｃ）組み合わせ物を、低温保存剤が組織に浸透できる期間および温度で、液体として組み合わせ物が冷蔵される冷却工程に供し、
ｄ）冷却した組み合わせ物を凍結し、そして次に場合により次に
ｅ）凍結した組み合わせ物を極低温条件下に保存する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項３】
低温保存剤がＤＭＳＯである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞培養培地がウシ胎児血清である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
低温保存溶液が、容量で５〜２５％のＤＭＳＯ、および７５〜９５％のウシ胎児血清を含んでなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
低温保存溶液が１０％ＤＭＳＯ、および９０％ウシ胎児血清である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
臍帯組織が、前駆細胞を含んでなる脈管周囲ウォートンゼリーを持つ臍帯血管またはそのセグメントである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
臍帯組織がヒトの臍帯組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
臍帯組織が本質的に血液を含まない請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
冷却工程が約４Ｃで少なくとも２０分間行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
凍結工程が約−７０Ｃで行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
極低温保存が約−１９６Ｃで行われる前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
解凍工程が約３７Ｃで行われる請求項１および３ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
解凍した帯が約４Ｃの水またはバッファーに含浸することにより処理される、請求項１および３ないし１３のいずかれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
保存した帯から回収した生存可能な細胞が、ヒトの臍帯脈管周囲細胞である請求項１および３ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
生存可能な細胞がウォートンゼリーの消化により回収される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
低温保存状態であり、そして請求項２ないし１４のいずれか１項に記載の方法により調製する場合はいつも生存可能な状態で回収可能な前駆細胞を含んでなる、臍帯組織。
【請求項１８】
それぞれが帯組織のサンプルを含んでなる複数の容器、および各容器の内容を参照するカタログを含んでなる組織バンク状態の請求項１７に記載の臍帯組織。
【請求項１９】
臍帯組織が、前駆細胞を含んでなる脈管周囲ウォートンゼリーを持つ帯血管またはそのセグメントである請求項１７または１８に記載の臍帯組織。
【請求項２０】
凍結した臍帯組織から生存可能なＨＵＣＰＶＣを回収する方法であって：
１）極低温で保存した帯組織を得、ここで帯組織は随伴する脈管周囲ウォートンゼリーを持つ、新鮮な、単離されたヒト臍帯血管またはそのセグメントであり、そして
ａ）該臍帯組織を得、
ｂ）臍帯組織を、血清を含有する細胞培養培地およびＤＭＳＯを含んでなる低温保存溶液と組み合わせ、
ｃ）組み合わせ物を、ＤＭＳＯが組織に浸透できる期間および温度で、液体として組み合わせ物が冷蔵される冷却工程に供し、
ｄ）冷却した組み合わせ物を凍結し、そして
ｅ）凍結した組み合わせ物を一定期間、極低温条件下に保存する、
工程を含んでなる方法により調製されており、そして次いで
２）保存した帯組織を解凍し；
３）ＤＭＳＯを水と置き換えるように解凍した帯組織を処理し；そして
４）保存した管を伴うウォートンゼリーを消化して生存可能なＨＵＣＰＶＣを放出する、工程を含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、臍帯（ＵＣ）の結合組織から急速に増殖しているヒト細胞集団の採取；そのような細胞の骨形成、軟骨形成、脂質生成および筋性条件での培養；細胞表面組織適合抗原の欠如により表されるような、これら集団中に免疫学的に不適格な細胞が高率である証明；および様々な細胞に基づく治療のために万能前駆細胞の供給源として使用されるこれら細胞の能力に主眼をおいている。より詳細には本発明は、そのような価値ある前駆細胞の供給源として凍結組織の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
発明の背景
ＵＣは原腸形成（３つの胚葉の形成）に続いて形成される最初の構造の１つである。屈曲が始まると、胚盤胞は卵黄管および尿嚢管を介して原始中腸（脈原始体）により原始卵黄嚢（外部胚原始体）に結合するようになり、これが次に発生して臍血管（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｓｓｅｌ）を形成する（非特許文献１；２；３）。これらの脈管は、ウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  Ｊｅｌｌｙ：ＷＪ）と呼ばれる初期胚外部派生物の初期間葉組織と一般に考えられるものの中に支持され、そして囲まれている（非特許文献４）。この初期段階から、妊娠中、ＵＣは成長して出産時には３０〜５０ｃｍの帯が見られるようになる。したがってＷＪは文献に（以下参照のこと）記載されたような繊維芽細胞様または筋繊維芽細胞様の細胞だけでなく、胚および胎児の発育中に帯の成長を支えるために必要なＷＪの増大する容量を細胞に生じることができる前駆体細胞集団も含むと期待される。
【０００３】
ＷＪは最初にＴｈｏｍａｓ  Ｗｈａｒｔｏｎにより記載され、彼は学術論文Ａｄｅｎｏｇｒａｐｈｉａに公開した（１６５６）（非特許文献５）。その後、これはヒアルロン酸（非特許文献６）および異なる種類のコラーゲン（非特許文献７）を含むプロテオグリカンからなる無定形の下地物質（ｇｒｏｕｎｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）中に分散した細胞からなるゼラチン状のゆるい粘膜結合組織と定められた。このマトリックス中に分散する細胞は、弛緩した帯では星状の形であり、膨張した帯では延びている「繊維芽細胞様」と記載されてきた（非特許文献８）。平滑筋細胞が最初にこのマトリックス内で観察されたが（非特許文献９）、これはそれらを表面上は平滑筋細胞に似ている幾分「異常な（ｕｎｕｓｕａｌ）繊維芽細胞」と記載したＰａｒｒｙ（非特許文献８）により論破された。その後、Ｔａｋｅｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献１０）がこれらの細胞について免疫組織化学的調査を行った１９９３年まで、これらの細胞を特徴付ける研究はほとんどなされなかった。彼らはこの細胞を、「長い細胞質プロセスで紡錘状または星状の、そして無定形の下地物質のコラーゲン繊維の波状ネットワークである「繊維芽細胞様」と記載した（非特許文献１０）。免疫組織化学的染色について、彼らはどの種類のミオシンがＷＪ繊維芽細胞に関係しているのかを決定するために、アクチンおよびミオシン（細胞質の収縮性タンパク質）およびヴィメンチン（胚間葉起源の繊維芽細胞に特徴的）およびデスミン（筋原性起源の細胞に特異的）に対する１次抗体を使用した。彼らは高レベルの化学的に抽出可能なアクトミオシンを観察し、そして繊維芽細胞は細胞質アクトミオシンを含むものの、それらはアクチンまたはミオシンで染色されず、一方、ＷＪ繊維芽細胞は双方に陽性に染色された。さらにビメンチンおよびデスミンの両方に対する陽性染色が観察され、ＷＪ中のこれらの修飾された繊維芽細胞は初期間葉組織（非特許文献１０）から誘導されたという結論を導いた。その後、さらに最近のＮａｎａｅｖ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献７）の研究では、予定日前（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ）の帯中で増殖している間葉前駆細胞の５段階の分化を証明した。彼らの知見は、筋繊維芽細胞がＷＪマトリックス中に存在するという示唆を支持した。ＷＪ細胞の免疫組織化学的特性決定は、骨の形態形成における骨原性細胞の主要な供給源となり、そして培養で（非特許文献１１）コロニー形成単位−骨繊維芽細胞（ＣＦＵ−Ｏ）と呼ばれる骨の小結節を形成することができると知られている周皮細胞と驚くほどの類似を表す（非特許文献１２）。
【０００４】
最近の刊行物は、ＵＣ血液ではなくＵＣから細胞を採取する方法を報告している。Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献１３）は、最初に臍血管を取り出し、そして捨てて、残る組織を採取する方法を報告した。残るＷＪ（その中には、臍血管がＷＪに完全に包まれるので、管と一緒に捨てられてきたものもある）および羊膜上皮の両方を含む後者が、次いでさいの目に切られて、組織培養プレートに移される小さい組織フラグメントを生成する。これらの組織フラグメントは、次いで一次外移植片として使用され、これから細胞は培養基層に移動する。
【０００５】
別の刊行物では、Ｒｏｍａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献１４）が、帯の血管から間葉幹細胞様の細胞を単離することに成功したことを示すが、彼らもまたＷＪからの細胞を含まないカルチャーを示す。具体的には彼らは臍静脈内から１回の１５分間のコラゲナーゼ消化を採用し、これは脈管内皮および内皮下細胞の混合集団を生じる。Ｒｏｍａｎｏｖ
ｅｔ  ａｌ．は７日後に採取したこの細胞から少数の繊維芽細胞様の細胞が現れることを示した。
【０００６】
また特許文献１は、ヒトＵＣのＷＪから「幼弱軟骨細胞」を単離する方法、および軟骨を生成するためのそれらの使用を記載する。特にこの方法は帯を長軸方向に１インチの断片に切り明け、血管および「ケーシング」を切り取り、それを廃棄し、そしてＷＪを滅菌容器に集め、ここでそれを培養のための２〜３ｍｍ３の切片に切断することを含んでなる。好適な方法では、細胞はペトリ皿の底上のガラススライド上にＷＪの２〜３ｍｍ３切片を置き、それに別のスライドをかぶせ、そして「幼弱軟骨細胞」が培養皿の表面から外に移動することができるようにするために、１０〜１２日間培養することにより単離される。
【０００７】
２００５年６月７日に公開された特許文献２でＤａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌは、脈管周囲領域と呼ばれるウォートンゼリーの周辺領域から独自の前駆細胞集団の単離を記載する。この領域中のウォートンゼリーは、帯血管の外壁上にあるか、またはそれを伴い、そしてそれらが帯から摘出される時に管に付いたままとなる。前駆細胞集団は著しく短い倍加時間を有し、そして万能であり、そして脂肪、骨、軟骨、筋肉および内皮を含む種々の間葉組織を生じる細胞；骨を形成する骨芽細胞に自然に分化する細胞；およびＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩマーカーを欠く細胞である細胞を含む広範囲の貴重な特性を有する前駆細胞を含んでなる。ヒトの臍帯血管の脈管周囲領域のウォートンゼリーから得た前駆細胞は、本明細書においてＨＵＣＰＶＣを指す。
【０００８】
このように帯組織は、前駆細胞および組織工学および他の医学手法において使用するための他の細胞の重要な供給源となる見込みがある。現在のプラクティスでは、帯に由来する細胞を極低温条件下で長期保存し、そしてそれらから生存可能な細胞を回収することが可能である。しかし帯細胞自体とは異なり、凍結または極低温で保存した帯組織から生存可能な細胞の回収を可能とする技術が開発された。したがって帯組織に由来する生存可能な細胞の回収が必要な場合、そのような細胞が未だ生存可能である間に、所望の組織を摘出し、そして所望の細胞を単離し、培養し、そして凍結保存できるために、帯組織が新鮮な間に、通常は帯の摘出から２４時間以内に帯組織を即座に処理するために作業する技術者が必要である。明らかに帯組織を保存し、生存可能な細胞の要求に応じた供給源として役立てることを可能にする方法を提供することは有用である。
【参考文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，９１９，７０２号明細書
【特許文献２】米国特許出願第２００５／０１４８０７４号明細書
【非特許文献１】Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ，ＳＥ，ｅｔ  ａｌ．，細胞に基づく組織工学療法：全身生理学の影響（Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ；ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）；Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，１９９８，ｖ．３３，ｐ．３−１４
【非特許文献２】Ｐｅｒｅｄａ  ａｎｄ  Ｍｏｔｔａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ヒト胎生学における新たな進歩：胚と卵黄嚢との間の形態機能的関係（Ｎｅｗ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ：ｍｏｒｐｈｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｙｏｌｋ  ｓａｃ）；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，２００２，ｖ．３２，ｐ．６７−７８
【非特許文献３】Ｔｕｃｈｍａｎｎ−Ｄｕｐｌｅｓｓｉｓ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９７２，ｐ．５４−６１
【非特許文献４】Ｗｅｉｓｓ，Ｌ，組織学：細胞および組織生物学（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、ニューヨーク、Ｅｌｓｅｉｖｅｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，１９８３，ｐ．９９７−９９８
【非特許文献５】Ｗｈａｒｔｏｎ  ＴＷ，１６５６，Ａｄｅｎｏｇｒａｐｈｉａ．Ｆｒｅｅｒ  Ｓ．（１９９６）により翻訳。オックスフォード、英国；オックスフォード大学出版，１６５６：２４２−２４８
【非特許文献６】Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ，ＭＤ  ｅｔ  ａｌ．，結合組織Ｖに関する研究、ウォートンゼリー中のフェバーの形成（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  Ｖ，Ｆｅｂｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  Ｊｅｌｌｙ），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１９６０，ｖ，ｐ．３５０−３５５
【非特許文献７】Ｎａｎａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献８】Ｐａｒｒｙ，ＥＷ，完全期臍帯の間葉構造に関する電子顕微鏡での幾つかの考察（Ｓｏｍｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｔｅｒｍ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ）：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｙ，ｖ．１０７，ｐ．５０５−５１８，１９７０
【非特許文献９】Ｃｈａｃｋｏ，ＡＷ，ｅｔ  ａｌ．，広がった、または広がっていないヒト臍帯組織の構造、動脈および静脈に関する特別な論及（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｅｉｓｔｅｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎｄｉｓｔｅｎｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｒｔｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｖｅｉｎｓ）；Ｃａｒｎｅｇｉｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，ｖ．３５，ｐ．１３５−１５０．
【非特許文献１０】Ｔａｋｅｃｈｉ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，ウォートンゼリー臍帯細胞の超構造的および免疫組織化学的研究（Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  ｊｅｌｌｙ  ｕｍｂｉｌｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｃｅｌｌｓ）：Ｐｌａｃｅｎｔａ，１９９３，ｖ．１４，ｐ．２３５−２４５
【非特許文献１１】Ｃａｎｆｉｅｌｄ，ＡＥ，ｅｔ  ａｌ．，脈管周皮細胞の骨原性能力（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ），ＪＥ  Ｄａｖｉｅｓ（編集）、Ｂｏｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＥＭ  Ｓｑｕａｒｅｄ，Ｉｎｃ．，２０００，ｐ．１４３−１５１
【非特許文献１２】Ａｕｂｉｎ，ＪＥ，骨幹細胞（Ｂｏｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｕｐｐｌ，ｖ．３０−３１，ｐ．７３−８２，１９９８
【非特許文献１３】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ＫＥ  ｅｔ  ａｌ．ウォートンゼリーに由来するマトリックス細胞がニューロンおよびグリアを形成する（Ｍａｔｒｉｘ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  ｊｅｌｌｙ  ｆｏｒｍ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｌｉａ）：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００３  ｖ．２１，ｐ．５０−６０
【非特許文献１４】Ｒｏｍａｎｏｖ，ＹＡ，ｅｔ  ａｌ．生後ヒト間葉幹細胞の代替的供給源に関する調査：臍帯からの候補ＭＳＣ様細胞（Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ＭＳＣ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ  ｆｒｏｍ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ）：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００３，ｖ．２１，ｐ．１０５−１１０
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
今、生存可能な細胞が凍結された臍帯組織から回収できることが確定された。したがって本発明は、そのような組織を分娩後に極低温で「バンキング」して、凍結した帯組織から生存可能な細胞を必要に応じて抽出するための持続的な供給源を提供するプラクティスを意図する。
【００１１】
より詳細には、そしてその観点の１つに従い、本発明は分娩後の臍帯組織を得、そして分娩後の臍帯組織を凍結する工程を含んでなる。好適な観点では、本発明は生存可能な細胞を含んでなる臍帯組織を得、臍帯組織を、血清を含有する細胞培養培地および低温保存剤を含んでなる低温保存溶液と合わせ、組み合わせ物を、組み合わせ物が最初に一定期間、そして低温保存剤が組織に浸透できる温度で液体として冷蔵され、次いで冷却した組み合わせ物を凍結する冷凍工程に供し、そして次に凍結した組み合わせ物を極低温条件下に保存する工程を含んでなる方法を使用して、臍帯組織中に存在する細胞の生存能を保存するために応用される。
【００１２】
その別の観点に従い、本発明は臍帯組織から生存可能な細胞を得る方法を提供し、この方法はそのような組織を凍結状態で得、凍結組織を解凍し、そして解凍した組織から生存可能な細胞を抽出する工程を含んでなる。好適な観点では、本発明は、凍結した、そして場合により極低温で保存された、特に本発明の方法により保存された帯組織を得、凍結組織を解凍し、解凍した組織を洗浄して低温保存剤を除去し、そして生じた組織から生存可能な細胞を抽出する工程を含んでなる方法を使用して帯組織から生存可能な細胞を回収するために応用される。
【００１３】
このようにその別の観点では、本発明は臍帯組織から生存可能な細胞を得るための方法を提供し、ここで細胞は事前に凍結された臍帯組織から抽出される。
【００１４】
さらなる観点では、本発明は凍結状態であり、そして任意に本発明の方法により調製する場合はいつも生存可能な状態で回収可能な前駆細胞を含んでなる低温保存状態の臍帯組織を提供する。
【００１５】
本発明の関連する観点では、それぞれが該凍結帯組織のサンプルを含んでなる複数の容器、および各容器の内容を参照するカタログを含んでなる組織バンク状態の臍帯組織が提供される。具体的な態様では、容器は極低温保存に適する容器である。
【００１６】
さらなる観点では、本発明は事前に凍結した臍帯組織から生存可能な細胞を得、そして
それらの生存可能な細胞から前駆細胞である細胞を選択する工程を含んでなる方法を提供する。特定の観点では、前駆体がＨＵＣＰＶＣであり、そして本発明が凍結臍帯組織から生存可能なＨＵＣＰＶＣを回収する方法を提供し：この方法は
１）凍結帯組織を得、この凍結帯組織は場合により極低温で保存した帯組織であり、ここで帯組織は随伴する脈管周囲ウォートンゼリーを持つ新鮮な、単離したヒト臍帯血管（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｖｅｓｓｅｌ）またはそのセグメントであり、そして
ａ）該臍帯組織を得、
ｂ）臍帯組織を、血清を含有する細胞培養培地およびＤＭＳＯを含んでなる低温保存溶液と合わせ、
ｃ）組み合わせ物を、組み合わせ物が一定期間、そしてＤＭＳＯが組織に浸透できる温度で液体として冷蔵される冷却工程に供し、
ｄ）冷却した組み合わせ物を凍結して凍結帯組織を提供し、そして任意に
ｅ）凍結した帯組織を一定期間、極低温条件下に保存する、
工程を含んでなる方法により調製されており；そして次いで
２）凍結した帯組織を解凍し；
３）ＤＭＳＯを水と置き換えるために解凍した帯組織を処理し；そして
４）保存した管を伴うウォートンゼリーを消化して生存可能なＨＵＣＰＶＣを放出する、
工程を含んでなる。
【００１７】
詳細な説明
本発明は、１つの観点において臍帯組織を保存するために有用な方法に関する。このプラクティスは、供給源となる個体と組織適合性がある細胞の将来の利用を可能とし、その将来の必要性は例えば細胞もしくは組織修復または再生のような医学的理由のために生じるはずである。
【００１８】
本発明では、臍帯組織が分娩後に得られ、そして凍結に供され、これにより凍結した臍帯組織は次に将来の生存可能な細胞源として保存される。凍結組織から生存可能な細胞を得るために、組織は解凍可能であり、そして次に抽出されて、培養すると生存能を現す細胞を提供する。
【００１９】
本方法は、管壁および内皮を含む血管、ウォートンゼリー、羊膜上皮等のような種々の帯組織に応用することができる。そのような組織が得られる帯は、任意の哺乳動物に由来する帯であることができ、そして好ましくはヒトの臍帯から得られる。本発明の１つの態様では、臍帯組織はウォートンゼリーである。好適な態様では、組織は臍帯血管の脈管周囲領域、望ましくはヒトの臍帯血管を付随するウォートンゼリーである。本発明の別の態様では、臍帯組織は脈管組織である。好適な態様では、組織はウォートンゼリーに結合した脈管周囲領域を付随するウォートンゼリーを有する脈管組織である。特に好適な態様では、凍結される臍帯組織は血管（すなわち管）、および血管が切開した帯内から取り出される時、それに結合して付いているウォートンゼリーである。そのような帯組織は、完全な血管の全長、個別の管、血管が任意に取り出された縦長に切開された形態、およびそのような組織の横断切片を含む。
【００２０】
このように本発明のすべての観点において、好適な帯組織は外壁上またはそれに付随するいずれかのウォートンゼリーを有するヒト帯組織内の管、すなわち帯の脈管周囲領域内にあるウォートンゼリーである。この特定領域内にあるウォートンゼリーは、上記および以下に詳細に記載する前駆細胞の豊富な供給源である。このウォートンゼリーには管壁が大変完全に付いているので、壁からのその分離は手法的に困難である。にもかかわらず、この脈管周囲ウォートンゼリー自体、および伴う管を含まない回収は技術的に可能であり、そして本発明は生存可能な前駆細胞を後で回収するために、凍結され、そして場合により極低温で保存された供給材料として有用な帯組織として、そのように分離した脈管周囲ウォートンゼリーの使用をさらに包含する。
【００２１】
帯組織は望ましくは分娩後組織として新たに得られ、そして任意の切開後に丁度上に記載したような性質の組織を提供し、次いで凍結のために調製される。望ましくは帯組織は回収から約２４時間以内に処理され、そしてこのように抽出された組織は凍結され、そして望ましくは回収から少なくとも約７２時間以内に、そしてさらに望ましくは４８時間以内に、そして特に回収から２４時間以内に極低温保存に入る。新鮮な組織はこの期間中に冷却されることができ、そして望ましくは洗浄され、そして任意に標準的なプラクティスに従い殺菌されるが、細胞の生存能が悪影響を受けないように、この期間中は本明細書に記載するように期待される凍結はなされるべきではない。
【００２２】
好適な態様では、保存される帯組織が脈管周囲ウォートンゼリーを伴う帯血管である場合、管は以下にさらに詳細に記載し、そしてＤａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．により米国特許第２００５／０１４８０７４号明細書に記載されるように抽出することができる。簡単に説明すると、ウォートンゼリーを伴う完全な帯血管は、長軸方向に開いた帯から管を穏やかに引っ張り、そして横方向に切断して１〜３インチ長、例えば約４ｃｍの管セグメントを生じることにより得られる。このプロセスは大半のウォートンゼリーを帯内に落とすが、ウォートンゼリーの脈管周囲領域を摘出した管に付けておく。管の末端は例えばクランプ、縫合糸等を使用することにより括り、管内に残るいかなる血液も漏れないようにする。さらに、または代替的に、管中の血液は塩水またはＰＢＳのような緩衝化塩水のような適切な賦形剤中でのすすぎを繰り替えすことにより除去できる。検体中に血液が無いと、調製物中に混入物として造血起源の前駆体が存在しないことが確実になる。血液が除去される場合、保存に有用な帯血管セグメントには、管を横に切断することにより生じたセグメントだけでなく、長軸方向に切断することに生じたセグメント、特に横断セグメントも含み、別の環状セグメントの一片であるセグメントを生成すると想定される。本方法では、脈管周囲ウォートンゼリーを持つすべての形状の帯血管セグメントが有用である。
【００２３】
生存可能な細胞の回収を可能とする条件下で組織を保存するために、帯組織は極低温保存に適する任意の賦形剤のような凍結工程に適する賦形剤中に置かれる。場合により賦形剤はさらに細胞培養に適する補助物質を含んでなる。１つの態様では、賦形剤はジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、例えば１５〜２５％ＤＭＳＯのような、２０％ＤＭＳＯを含む１０〜３０％ＤＭＳＯを含んでなる。別の態様では、賦形剤は細胞培養補助物質を含んでなり、ＤＭＳＯが１〜２５容量％の賦形剤、例えば８〜１５％、すなわち約１０％のような５〜２０％で存在する。別の態様では、補助物質はウシ胎児血清のような血清に基づく補助物質である。特定の態様では、それ自体が５〜２０容量％（例えば１０％または１５％）のＦＢＳを含んでなるウシ胎児血清培地が、賦形剤の８０〜９５容量％のような７５〜９９％、すなわち約９０％で存在する。さらに具体的な態様では、賦形剤は９０容量％の１０％ＦＢＳ溶液および１０％ＤＭＳＯを含んでなる。
【００２４】
本発明の特に好適な観点では、凍結および任意に極低温保存用の組織の調製は、特に低温保存剤が組織に十分に浸透して組織および存在する細胞の両方を保存中に保護し、そして凍結時に、組織および細胞を害する水を置き換えるために設計される段階的な、一時的な冷却工程を介して進行する。特に好適な凍結／低温保存法は、上記のように低温保存剤および血清で補充される細胞培養培地のような細胞栄養培地を含んでなる低温保存溶液を使用する。低温保存剤は、組織および存在する細胞を凍結および氷の形成の悪影響から保護する任意の液体作用物質であるか、または作用物質の溶液であることができる。最も好ましくは、低温保存剤はジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）である。代替となる低温保存剤はグリセロール、またはグリセロールとＤＭＳＯとの混合物である。グリセロールはＤＭＳＯについて本明細書で説明したものと同じ様式および同じ濃度で使用することができる。ＤＭＳＯの特性は、本低温保存手法での使用に特に良く適している。
【００２５】
低温保存剤溶液中に存在する好適な血清補充培養基は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である。あるいは培養基は、ＤＭＥＭ、Ｍ１９９、ＲＰＭＩ１６４０等のような細胞を培養するために適する任意の栄養培地を含んでなることができ、これにＦＢＳ、ヒト血清等のような血清が加えられる。一般に、しかし選択した栄養培地の種類に依存して、培養基の血清成分は、約５〜３０％の血清、例えば１０〜２０％の血清を含んでなる。上に記載したように、好適な低温保存剤溶液は、約１０容量％ＤＭＳＯ、そしてＦＢＳのような約９０％の培養基が好適である。
【００２６】
凍結し、そして続いて極低温保存する組織を調製するために、組織は低温保存溶液と合わせられ、そして一定期間、そして低温保存剤が組織に浸透するために効果的な温度で液体として冷蔵され、このように望ましくは伴う水を置き換える。このために、組織が脈管周囲ウォートンゼリーを持つ帯血管セグメントである場合、組織は適切に約４Ｃの温度で２０〜４０分、そして好ましくは３０分といった約１５〜６０分間、ある温度に維持される。より低い温度は、ＤＭＳＯがこの温度未満で固化し、そして組織浸透が減少すると仮定すると望ましくない。より高い温度が適当だが、取り扱い中に帯内の代謝プロセスを遅らせるために、より低温を使用することが望ましい。冷蔵の用語は変動することができる。低温保存剤は組織に浸透するために十分な時間与えられると同時に、帯を取り扱う時間が減るように、バランスを取る（ｓｔｒｉｋｅ）ことが望ましい。一般に冷蔵期間は短くても約１０分以上となるべきで、そして最大６０分以上に達することができる。
【００２７】
冷蔵工程中、組織は標準的プラクティスに従い例えば５０ｍＬ容量の遠心管のような任意の適切な容器中でインキュベーションすることができる。組織が脈管周囲ウォートンゼリーを持つ帯血管である場合、各容器は約５〜１０個の管セグメントを受けることができる。ＤＭＳＯの浸透が妨害されないように、容器は混まないほうが有用である。
【００２８】
冷蔵後、脈管を凍結工程に供する。この工程は望ましくは凍結組織が極低温保存に直ちに移すことができるように、冷蔵した組織を低温容器に移した後に行われる。１つの態様では、試験管はポリプロピレン等のような滅菌できる脆くないポリマーで作られ、そして保存中に脈管を持つ検体を保持し、そしてその後にその放出を可能にする取り外し可能なフタを受けるように適合している試験管または他の容器の状態で提供される。最も望ましくは、各低温容器は、組織が脈管周囲ウォートンゼリーを持つ帯血管である場合、１つの組織サンプル、例えば容器あたり１つの脈管セグメントを含んでなる。いわゆる低温試験管はポリエチレンバッグとして適切である。このように冷蔵した脈管は、低温容器に移され、そして新たな低温保存溶液に組織を好ましくは完全に浸漬するために十分な容量で合わせられる。
【００２９】
調製した組織は次いで検体を凍結ユニットに置くことにより凍結され、ここで温度は組織を凍結するために必要な低レベルで制御することができる。１つの態様では、組織および溶液を含んでなる容器が冷凍庫に置かれて、温度を約−７０Ｃ、例えば約−４０Ｃ未満に少なくとも約６時間、例えば少なくとも約８〜１２時間下げる。最も好ましくは凍結は、制御された速度の−７０Ｃ冷凍庫を使用して行われる。
【００３０】
凍結組織は出発材料として直接使用することができ、これから生きている細胞を回収できると考えられる。そのような凍結材料は、−７０Ｃで維持された場合、少なくとも幾らかの細胞活性を現すことができ、したがってこの温度で経時的に起こり得る細胞死を回避するために、比較的即座に使用すべきである。より好ましくは本発明の方法に従い、凍結組織を極低温保存に配置し、すなわち細胞の代謝が静止している温度で保存する。
【００３１】
このように組織は凍結された後、凍結組織を含んでなる容器は好ましくは類似の細胞お
よび組織の保存のためにすでに開発された様式で極低温保存に移される。適切には、容器は液体窒素の蒸気相中、約−１８０Ｃ〜−２００Ｃで保存される。他には、凍結細胞を液体二酸化炭素または液体ハロカーボンのような液体窒素以外の媒質中で極低温に保存することができる。
【００３２】
この組織検体は、前駆細胞の供給源が必要である時に回復するために、その極低温状態で数日、数週間、数カ月または数年間、維持することができる。    
【００３３】
必要な時、保存組織中にある生存可能な細胞は、本発明の回収法を使用して得ることができる。より詳細には、極低温で保存した容器中の組織を最初に得、そして解凍してその後の低温保存剤の除去ができるようにする。この組織は例えば温水浴中で一般に４０Ｃを越えない温度で解凍することができる。１０Ｃ〜４０Ｃの温度が適切であり、そして３７Ｃの温度が望ましい。いったん解凍すれば（これは３７Ｃで約５〜１５分、例えば１０分を要する）、組織を５０ｍＬ試験管のような容器に移すことができ、そして洗浄した組織は希釈するか、またはＤＭＳＯを除去する。この洗浄は望ましくは水または緩衝化塩水、例えばＰＢＳのような冷却（例えば４Ｃのように冷蔵された）液体を使用して、組織を冷却液体に浸漬することにより行われる。細胞に対するショックまたは傷害を最少とするために、組織の激しい洗浄は、望ましくは回避される。浸漬した組織は、さらに希釈および低温保存剤の水による置換を可能とするさらなる期間、冷蔵庫に保存しておくことができ、そしてさらに冷却液を加えることにより希釈される。
【００３４】
得られた再保存組織は次いで、新しい帯組織から生存可能な細胞を回収するために確立されたものと同じプラクティスを使用して、組織中にある生存可能な細胞を回収するために使用することができる。本発明はこのように、凍結そして極低温に保存した帯組織から生存可能な細胞の回収を可能とする。そのような細胞の生存能は、この目的のために確立された任意の技術を使用して行うことができる。都合よく、回収した細胞の生存能は、トリパンブルー排除（色素を排除することができない死んだ細胞を同定する手法）により簡単に、あるいはＤＮＡ合成が起きていることを確認するために、ＢｒｄＵの取り込みを検出することにより、より洗練された様式で行うことができる。このように用語「生存可能」とは、本明細書では活発な代謝を現し、そしてさらに望ましくは接着に基づき培養した細胞について、培養支持体に対する接着、そして引き続き蔓延および増殖の特性を提示する細胞を指す。そのような生存能の例を図２２、特にパネルＡおよびＢに示し、これは生存ＨＵＣＰＶＣの蔓延および増殖現象を示す。
【００３５】
本発明の特定の態様では、保存した臍帯組織から回収される生存可能な細胞は前駆細胞である。別の特定の態様では、生存可能な前駆細胞は本明細書で例示するように保存された臍帯血管またはそのセグメントを伴う脈管周囲ウォートンゼリーから回収される。
【００３６】
本発明の保存および回収法は、保存コレクションまたは「バンク」中の帯組織の組織化を可能とし、これは各々が臍帯組織サンプルを含んでなる複数の容器を含んでなると考えられる。そのような臍帯組織サンプルのコレクションまたはバンクは、本発明の別の態様を構成する。組織の各バンクは、各サンプルに関してサンプル起源、例えば供与体となる個体、およびおそらく彼らの遺伝的または医学的病歴、保存時期、サンプルを生成した事務所または人の確認等のような各サンプルに関して有用な関連する任意の情報を示すカタログを伴う。この取り組みで、組織バンクは組織およびその内在する細胞の将来の使用に貯蔵所として役立つことができ、そしてカタログは特定の患者に使用するために、または特定の医学的状態を処置するために、特定の組織および細胞を選択するために使用できる。
【００３７】
保存組織が、脈管周囲ウォートンゼリーを持つ帯血管または脈管セグメントである場合
、生存可能な前駆細胞を回収するために、我々の同時係属国際特許出願である２００４年８月２６日に公開された国際公開第０４／０７２２７３号明細書および米国特許第２００５／０１４８０７４号明細書（これらは引用により本明細書に編入する）に記載されている手順を参照にされたい。さらに詳細には、新鮮な臍帯組織に由来するそのような前駆細胞の単離およびそれらの特性および最終用途を以下に記載する。これらの前駆体は、ヒト臍帯脈管周囲細胞または「ＨＵＣＰＶＣ」を指す。
【００３８】
引用した参考文献は、ヒト臍帯のウォートンゼリーから細胞を抽出するための手順を教示し、これは主要組織適合マーカーを提示しない細胞（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ダブルネガティブ）を含め、急速な増殖、前骨芽細胞および他のヒト前駆細胞の存在を特徴とする独自の細胞群を生じる。この細胞集団は、軟骨、脂肪および筋肉を含めそれから骨および他の結合組織に成長する前駆細胞、ならびに治療目的で前駆細胞を患者に移す内因性および同種異系転移のために有用な供給源である。
【００３９】
さらに詳細には、この手法はウォートンゼリー抽出物を提供し、ここで抽出物はヒト前駆細胞を含んでなり、そしてウォートンゼリーの脈管周囲ゾーンと呼ばれる有用な領域中、ヒト臍帯の血管近傍のウォートンゼリーの酵素的消化により得られる。前駆細胞が抽出されるこの脈管周囲ゾーン内の組織も、脈管周囲組織と呼ぶことができる。この抽出手順は適切に、臍帯血の細胞、ＵＣの上皮細胞または内皮細胞、および帯の脈管構造から誘導される細胞を本質的に含まない抽出物を生じ、ここで脈管構造は動脈または静脈管の最内膜、中膜および外膜と定められる。また生じた抽出物は、脈管構造から分離した大半のウォートンゼリー組織から単離された他のウォートンゼリー抽出物とは明らかに異なる。
【００４０】
このようにこの手順は、本発明の方法に従い得たウォートンゼリー抽出物から細胞を単離する工程を含んでなるヒトの前駆細胞を得る方法を提供する。
【００４１】
この手順は、骨前駆細胞の集団およびＭＨＣ−／−前駆細胞の集団を含め、ウォートンゼリー抽出物中に存在する細胞を培養することにより得られる細胞集団を提供する。
【００４２】
抽出された前駆細胞集団は、抽出した細胞を接着条件下での培養後に得られる接着細胞集団として特徴づけられる。別の態様では、抽出した前駆細胞集団は接着条件下で成長した抽出細胞の上清画分内に存在する非接着（または「後−接着」）（ＰＡ）細胞集団と特徴つけられる。このＰＡ画分は、最初にプレートに播いたＨＵＣＰＶＣの上清を新たなＴ−７５フラスコに移して、まだ接着していない細胞のカルチャー表面への付着を可能とすることにより誘導される。この工程は、残るＰＡ細胞を回収するために、その培地を別の新たなＴ−７５フラスコに移してこの新たなＴ−７５フラスコで繰り返す。このＰＡ細胞集団は、接着条件下で培養した時、前駆細胞の部分集団を含んでなり、急速に増殖し、そして骨の小結節（ｂｏｎｅ  ｎｏｄｕｌｅ）および脂肪細胞を自然に形成する。この技術は酵素的に消化した細胞集団から単離された接着細胞の収量を上げる手段を提供する。
【００４３】
またこの手法は、さもなければ骨細胞への分化に必要となる補充物質の不存在下で培養した時、骨細胞への分化の特性により特徴づけられる約束された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）骨前駆細胞の集団を提供する。
【００４４】
また骨組織、軟骨組織、脂肪細胞および筋肉組織を含む結合組織を生成する方法を提供し、この方法はウォートンゼリー抽出物から得た細胞を、これらの細胞の所望の結合組織の表現型への分化に伝導性の条件にかける工程を含んでなる。これに関して、本発明はさらにそのような細胞の細胞に基づく治療における使用を提供し、その治療には細胞移植が媒介する医学的状態、疾患および傷害の処置を含む。
【００４５】
また、組織工学における組成物およびその使用も提供し、これは本発明による前駆細胞またはそれらの分化した後代、およびそのような細胞を選択した組織部位に送達するために適する担体を含んでなる。
【００４６】
骨前駆細胞を含むヒト前駆細胞を含んでなる迅速に増殖する細胞集団、ならびに免疫不適格細胞の供給源としてウォートンゼリー（ＷＪ）の抽出物が提供される。
【００４７】
抽出された細胞集団は、ヒト臍帯脈管周囲（ＨＵＣＰＶ）細胞と呼ぶことができる。ＨＵＣＰＶ細胞集団は、それらの表現型、特にその中に含まれる様々な細胞の部分集団により現されるようなそれらの表現型が独特な万能前駆細胞の豊富な供給源を構成する。細胞が抽出されるウォートンゼリーの脈管周囲ゾーンは、脈管周囲組織と呼ぶことができる。
【００４８】
本明細書で使用するように、用語「前駆細胞」は、制御下および／または定めた条件下で所定の表現型に分化する細胞を指す。すなわち骨前駆細胞は骨芽系統へ約束された前駆細胞であり、最終的にそのような約束および分化を確立する条件下で培養した時、骨組織を形成する。「免疫−不適格」または「非免疫原性」である前駆細胞は、クラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に会合する表面抗原について負の表現型を有する細胞である。そのような前駆細胞も本明細書ではＨＬＡダブルネガティブまたはＭＨＣ−／−と呼ぶ。
【００４９】
またＷＪから抽出されるＨＵＣＰＶ細胞集団は「迅速な増殖」を特徴とし、これは抽出された細胞が前駆細胞の拡大に関して標準的な条件下で他の既知の前駆細胞集団と比べた場合の成長の速度を指す。本明細書に提示する実験結果から分かるように、および図１６に示すように、前駆細胞集団は少なくとも約２５時間内に、そしてわずか７〜１５時間で倍加することができ、そしてこの拡大は他の既知の骨前駆細胞集団およびＷＪから抽出される他の前駆細胞集団よりもはるかに早く拡大する。
【００５０】
細胞および細胞集団は、ヒト臍帯のＷＪから抽出することにより得ることができる。従来技術とは異なり、そのような細胞は、臍脈管の外壁を伴う、すなわちそれに近傍のＷＪから抽出される。帯血管の外面に結合しているか、またはそれに大変近いウォートンゼリーは、脈管周囲ゾーンと呼ばれる領域内にあり、そして典型的には血管が帯から切り出された時（例えば帯からウォートンゼリーを摘出するか、または帯および随伴するウォートンゼリーから血管を摘出するかのいずれかがなされる時）、血管を伴っている。驚くことにはこの脈管周囲ゾーン内のウォートンゼリー、そして典型的には従来のプラクティスでは捨てられてきたものは、本明細書に記載する特徴を有する前駆細胞の豊富な供給源であることが見いだされた。したがって、ＨＵＣＰＶＣと呼ばれるこのウォートンゼリーの脈管周囲ゾーンに由来する組織を、有用なヒト前駆細胞の供給源として活用する。
【００５１】
態様ではＨＵＣＰＶ細胞集団は、機能的間葉（非造血）の表現型、すなわちＣＤ４５−、ＣＤ３４−、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、Ｔｈｙ−１＋およびＣＤ４４＋を表示する多くのマーカーを有する前駆細胞の存在により特徴づけられる。特に重要であるのは、この集団は周皮細胞を表示するマーカーである３Ｇ５抗体について陽性の細胞を持つと一般的に特徴つけられる点である。抽出された細胞集団は、一般に形態的に均一な線維芽細胞集団であり、これはアルファ−アクチン、デスミンおよびヴィメンチンを発現し、そして所望する細胞の部分集団が培養条件および例えば細胞の分類原理および技術に基づく選択の操作を介することにより得られる大変有用な供給源を提供する。
【００５２】
そのような脈管周囲細胞をヒトの臍帯から抽出するために、臍帯血の細胞、ＵＣの上皮細胞または内皮細胞、および帯の脈管構造（脈管構造は動脈または静脈管の最内膜、中膜および外膜と定められる）から誘導される細胞を抽出することを回避する抽出工程中、注
意を払う。これらの望まない細胞を本質的に含まない抽出物を得ることは、切開前の臍帯の慎重な流水（ｆｌｕｓｈ）および洗浄、続いて帯内からの脈管の慎重な切開により達成される。また脈管は周辺の帯組織から慎重に引き出すことができ、この場合、脈管周囲組織が脈管から摘出される。これらの望まない細胞を抽出することを回避するために注意を払っても、それらは得られる抽出物中にある程度未だ存在するかもしれないと考えられる。これはそれらが本明細書に提示する観察の結果、すなわち間葉そして具体的には中胚葉起源に由来する細胞コロニーの観察、ＣＦＵ−Ｆ、ＣＦＵ−ＯおよびＣＦＵ−Ａの形成の頻度および早さ、および培養した集団中で観察されるＨＬＡ表現型の特性決定を妨害する頻度が大変低いならば許容される。
【００５３】
脈管周囲ゾーンにある組織は、臍血管の外壁近傍のウォートンゼリーであり、そして典型的には脈管の外壁から約３ｍｍ伸びたゾーン中にある。適切には、標的抽出ゾーンは約２ｍｍ内にあることができ、例えば３つの脈管のいずれか１つの外壁から約１ｍｍにある。この領域からのＷＪの抽出は、実施例に記載する技術を使用して容易に行うことができる。この技術では、脈管はＷＪの担体として使用され、そして脈管自体は前駆細胞が抽出される支持体として使用される。すなわち脈管周囲組織の薄いコーティングを持つこの帯血管は、本質的にすべての帯の血液混入物を除去するため徹底的に洗浄した新鮮な臍帯から外科的に、または手作業で摘出される。近位脈管組織またはその区分を持つ脈管は、次いで所望する細胞が存在する脈管周囲組織のコラーゲンマトリックスを消化するために適する酵素を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような抽出媒質中、約３７℃でインキュベーションされる。この目的には、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０．０ｍｇ／ｍＬ以上の範囲内の濃度、例えば０．５ｍｇ／ｍＬでのコラゲナーゼでの消化が適切である。酵素の種類、濃度およびインキュベーション時間は変動することができ、そして代替的な抽出条件は、選択した条件下で細胞の表現型および集団の収量をモニタリングすることにより単に容易に決定することができる。例えば４ｍｇ／ｍＬ（例えば１〜４ｍｇ／ｍＬ）のより高濃度のコラゲナーゼも、約３時間（例えば１〜５時間）の短い消化期間について適切である。抽出中、脈管内に含まれる作用物質による混入を回避するために、脈管の末端を結び、またはクリップで挟み、そして抽出媒質の上に吊るすことができる。このようにウォートンゼリー抽出物は本質的に帯の血液細胞、臍帯の上皮細胞、脈管の内皮細胞および脈管の平滑筋細胞を含まないと考えられる。
【００５４】
本発明に従い、そのような組織を凍結し、そして好ましくは極低温に保存し、そして保存した組織から生存可能なＨＵＣＰＶ前駆細胞の抽出を可能にする様式で、凍結または極低温状態からもとに戻す。
【００５５】
単離工程に使用することができる他の消化酵素は、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ、０．０５〜１０ｍｇ／ｍＬのトリプシンならびにＥＤＴＡである。最適なコラゲナーゼ濃度は３時間の消化時間には４ｍｇ／ｍＬであるが、より廉価な代用は、０．５ｍｇ／ｍｌで１８〜２４時間である。コラゲナーゼ濃度に対するさらに別の選択は、図２１で具体的に説明する。望ましくは図２１に示すように、消化はコラゲナーゼ濃度に依存して異なる時点で起こる管の分解が始まる時、または前に止める。
【００５６】
０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ抽出媒質中で約２４時間後（例えば１８〜２４時間のような１２〜３６時間）、または４．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ抽出媒質中で約３時間後、脈管を取り出してヒト前駆細胞を含む脈管周囲組織抽出物を残す。これらの細胞を前駆細胞の拡大について標準的な条件下で拡大する。細胞は例えば、接着細胞を選択するためにポリスチレン皿またはフラスコのようなポリスチレン上で選択することができ、次いで適切な培養基中で維持される。抽出した細胞は、接着細胞に関する前選択を行うか、または行わずに、事前に例えばＢａｋｓｈ  ｅｔ  ａｌによる国際公開第０２／０８６１０４号明細書（この開示は引用により本明細書に編入する）に記載されているように拡大のために撹拌懸濁の条件下で培養することができる。
【００５７】
抽出したＨＵＣＰＶＣ集団は接着条件下で培養することができ、そして上清にある非接着細胞は、さらなる培養のために回収される。これらの「後−接着」細胞は、骨小結節および脂肪細胞を自然に形成する性質による部分集団として特徴づけられる。すなわちこの手法は脈管周囲組織から抽出した単離された前駆細胞の集団を提供し、この細胞は骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞および筋肉細胞を含む幾つかの分化された細胞型の少なくとも１つを形成する性質を有し、ここでそのような前駆細胞は接着条件下で培養したＨＵＣＰＶＣの非接着画分を構成する。そのような細胞は、脈管周囲組織から抽出したＨＵＣＰＶＣを接着条件下で培養し、非接着細胞集団を選択し、そして次に、非接着細胞集団を（１）該集団を拡大するか、または（２）それらの所望する細胞表現型への分化を引き起こすために有用な条件下で培養することにより得られる。その中で有用な培養条件は、本明細書で例示するようにそのような拡大および分化のためにすでに確立されているものである。
【００５８】
ＨＵＣＰＶの部分集団は、標準的な接着培養条件下で培養し、そして拡大することができる。本明細書で明らかとなるように、そのような接着細胞集団は免疫不適格または非免疫原性の前駆体および間葉前駆体を含んでなることが知られている。
【００５９】
抽出物中に存在する細胞は、直接またはそれらを拡大した後に、確立された技術を使用して分類し、所定の表現型の細胞について濃縮される拡大可能な部分集団を提供することができる。このようにさらに万能間葉前駆細胞、骨前駆細胞が濃縮される脈管周囲組織から抽出した細胞集団、免疫不適格前駆細胞が濃縮される細胞集団、および免疫不能な万能および骨前駆細胞が濃縮される細胞集団が提供される。さらに細胞は周囲細胞マーカー３Ｇ５に陽性である細胞のみをそれに対する抗体を使用して選択するために、およびＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩマーカーの１つまたは両方に陰性であるもののみを選択するために濃縮することができる。また細胞集団は例えば造血細胞を除去するためにＣＤ４５を持つものの消費によるように他の表面マーカーに対する選択により濃縮することもできる。
【００６０】
図１７により明らかとなるように、前駆細胞集団中のＭＨＣマーカーの分布は、凍結−解凍により改変される。新たな細胞の継代で、ＭＨＣダブルネガティブ細胞の頻度は比較的一定／わずかに増加する。しかし前駆体集団中のＭＨＣダブルネガティブ細胞の頻度は、凍結後にプレーティングした細胞中で有意に増加する。すなわち前駆細胞集団中、ＭＨＣダブルネガティブ表現型の細胞は、凍結後に頻度が上昇する性質によりさらに特徴づけられる。そのような凍結は、最初に細胞のアリコートを調製し、次で細胞調製物を所望の期間保存することにより通常の様式で行われる。そのような細胞は、所望により何年も保存することができる。
【００６１】
この方法は、本明細書に記載するように脈管周囲組織抽出物を得ることによりＭＨＣダブルネガティブ前駆細胞を、あるいは抽出物またはその画分を凍結に供し、そして凍結細胞を培養してそのＭＨＣダブルネガティブ濃縮画分を生成するために有用である。記載したように生じた細胞はヒト個体で組織形成を誘導し、または修復するために潜在的に有用となる。
【００６２】
抽出物またはその適切に濃縮されたその画分から得た細胞集団は、直接またはそれらを拡大した後に、分化した細胞集団を提供するために有用である。それらの分画および濃縮、およびそれらの拡大に関して適切なすべての手順は、従来技術により確立されている。拡大は例えばＩＬ−３および幹細胞因子のような因子、および当該技術分野で知られている類似の作用物質の存在下で進行し得る。細胞集団そして特にその中の骨前駆細胞は、そこから形成する骨組織の成長について確立された条件を使用して分化にかけることができる。前駆細胞集団の培養から生じる骨前駆細胞の部分集団は、約束された骨前駆細胞と呼ばれるが、骨形成補充物質の不存在下で分化する能力を示したことに注目されたい。あるいは骨前駆細胞は、デキサメタゾンのような骨形成を刺激する１もしくは複数の作用物質を補充した培地中で培養される。さらに前駆細胞は、軟骨、筋肉、腱、脂肪等を含め他の間葉に由来する結合組織（Ｃａｐｌａｎ，１９９１）への分化を刺激するために適する補充物質を用いても、すべて当該技術分野で標準的なプラクティスに従い培養することができる。
【００６３】
細胞集団で細胞をインビトロ培養する現実的代替として、患者内で所望する組織の直接的形成を誘導するために、細胞はインビボで移植できると考えられる。この経路により、特に骨折および骨粗鬆症を含む様々な骨の状態、疾患および障害に罹患している患者への利益のため、骨のその場での形成は骨前駆体の移植することにより提供される。そのような治療法は、限定するわけではないが軟骨、脂肪および筋肉のような他の結合組織の病気を和らげるために適用することもできる。細胞集団に存在する免疫不適格前駆細胞は、それらの移植後に予想され得る実質的に低下した拒絶応答を仮定すると、これに関して特に貴重である。
【００６４】
移植で使用するために、細胞は操作するために選択された組織部位へのそれらの送達に有用な担体をさらに含んでなる組成物として提供されることができる。細胞は意図する効果に有効な用量で提示される。有効な細胞用量は、投与あたり１０３〜１０７細胞、例えば２ｘ１０５細胞のような１０４〜１０６の範囲にある。それら細胞の送達に選択される担体は、生存可能な細胞の送達のために確立された手法に従い組成物で異なることができる。態様では、細胞は骨の組織工学の目的に活用される。１つの態様では、細胞は欠損または折れた、あるいはインプラントを受けるために外科的に手術された骨の部位へ、インプラントとして細胞を配置するために役立つスカフォールド材料の状態の担体と共に与えられる。様々な材料がこの目的に担体として適する。特定の態様では、担体はリン酸カルシウム、ＰＬＧＡまたはその混合物のような再吸収性材料から形成される。等価の材料は、それらが組成物の形成および送達中に細胞を生存させておくことができ、そして他の点では移植部位で生理学的に適合性があるならば使用することができる。
【００６５】
さらに前駆細胞の送達に適するさらに別の担体は、それらが細胞の生存能に必要なｐＨおよび他の特性を有する限り、ＰＢＳおよびヒアルロン酸、ゼラチン等を含む等価物のような賦形剤を含む。
【００６６】
細胞は遺伝子発現産物を所望の組織部位へ送達するための宿主として有用であると考えられる。すなわち細胞は、遺伝的に操作して、発現すると骨組織の場合にはＰＴＨ、ＢＭＰ、カルシトニン等を有用に含むことができる種々の増殖因子のような組織修復プロセスで有用な産物を生じる遺伝子を受け、そして発現することができる。また細胞は、細胞をより強固にし、または所定の最終目的に、より適するようにするために、細胞の表現型を改変する遺伝子の導入によるような、他の目的のためのトランスジェニックも開発することができる。
【００６７】
本発明の態様は以下の実施例により記載される。
【実施例】
【００６８】
ヒトウォートンゼリーから前駆細胞の採取
ＵＣは、カナダ、トロントのサニーブロック＆ウーマンカレッジ（Ｓｕｎｎｙｂｒｏｏｋ  ＆  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ）病院で出産直後の完全期帝王切開乳児から集めた。ＵＣは外科医により培地（８０％α−ＭＥＭ、２０％抗生物質）を含む滅菌容器に移され、そして直ちにトロント大学のバイオマタリアル  ＆  バイオメディカルエンジニ
アリング研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ＆  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）の我々の研究室に輸送された。
【００６９】
この時点からすべての手順は生物学的に安全なキャビネット中で無菌的に行なわれた。ＵＣはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（−Ｍｇ２＋、−Ｃａ２＋）で３回洗浄して、出来る限り多くのＵＣ血を除き、そして培地を含む容器に戻した。約６ｃｍの長さの帯を滅菌したハサミで切断し、そして滅菌コルク解剖板に配置した。残った帯（３０〜４５ｃｍ）は培地を完全に満たした容器に戻し、そして３７℃のインキュベーターに配置した。６ｃｍの帯の切片をその螺旋に対して反対に「ねじり」、そして両端をピンで止めてＵＣ上皮の平坦かつ真っすぐな表面を露出した。細く尖ったハサミを用いて、ＵＣを約１〜２ｍｍの深さにその長さに沿って切断して、ＷＪを露出した。切断上皮の各「フラップ」から初めて、ＷＪはメスの刃のない側を使用してその内面から細かく切り、そして切り取った上皮（約０．５ｍｍ厚）をピンで止めた。この手順でＷＪが露出し、そしてその長軸に螺旋状に沿うというより、末端から末端に直線状に走って埋められているその３つの管を得た。この切片を常時３７℃のＰＢＳに浸すことに注意した。管の１端をピンセットで離し、これはＷＪからその長軸に沿って、ＷＪマトリックスの大半（ｂｕｌｋ）が離れるまで切り出した。あるいは管の中央をマトリックスから切り取り、ピンセットでつかみ、そしてその両端に向かってマトリックスから切り出すこともできた。いったんいずれかの方法により自由になると、細胞を持つ約１〜２ｍｍのＷＪマトリックスに管は囲まれた。次いで切断した管は、両端を外科用クランプ、モスキートクリップまたは糸で縫合して止めて「ループ」を作成し、管の内外への流体の移動を遮断した。「ループ」は、直ちにハサミと共にＰＢＳ（−Ｍｇ２＋、−Ｃａ２＋）を含む０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液を含有する５０ｍｌの試験管に入れ、そして３７℃のインキュベーターに入れた。残りの２つの管を同様の様式で切り出し、ループを作り、そして同様にインキュベーター中のコラゲナーゼ溶液中に置いた。管の除去に続いて、脈管周囲組織を構成するＷＪ片は上皮を容易に切り取ることができ、そしてコラゲナーゼ溶液を含む５０ｍｌ試験管に入れた。次いで残る上皮層は、バイオハザードの廃棄容器に捨てた。同じプロトコールを残りの３０〜４５ｃｍのＵＣについて使用して、「ループ」または脈管周囲組織片のいずれかを含む１５〜２５の管を作成した。
【００７０】
ウォートンゼリー前駆細胞培養の開始
１８〜２４時間後、「ループ」はそれらについている懸垂クランプまたは縫合糸およびピペットで取り外し、そして残る懸濁液を２〜５倍にＰＢＳで希釈し、そして１１５０ｒｐｍで５分間遠心して細胞画分を試験管／ｓの底にペレットとして得た。上清を除去した後、細胞は混入する赤血球細胞を溶解するために、８倍容量の４％ＮＨ４Ｃｌに５分間、室温で再懸濁した。次いで懸濁液を再度１１５０ｒｐｍで５分間遠心してペレットとして細胞画分を単離し、そして上清を除去した。細胞をヘモサイトメーターでカウントした後、それらをＴ−７５ｃｍ２組織培養ポリスチレン皿に直接プレーティングし、そして細胞がポリスチレン表面に付着するように３７℃で２４〜７２時間インキュベーションした。次いで培地は２日毎に交換した。
【００７１】
以下に詳細に記載する結果は、上記の手順を使用して再現されたが、ここでコラゲナーゼに基づく消化は４ｍｇ／ｍＬで３時間、２ｍｇ／ｍＬで６時間、そして１ｍｇ／ｍＬで１２時間のいずれかであった。
【００７２】
付着した細胞は０．１％トリプシン溶液を使用して７日後に継代させ、この時点でそれらは光学顕微鏡により観察した時、８０〜９０％の集密度を示し、そして位相差顕微鏡下で「鉱化」凝集物形成の証拠が明らかとなり、そして光学的性質に期待通りの変化を示した。継代で、細胞は３５ｍｍの組織培養ポリスチレン皿または６ウェルプレートのいずれかに補充培地（ＳＭ）（７５％α−ＭＥＭまたはＤ−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１０％
抗生物質）中、４ｘ１０３細胞／ｃｍ２でプレーティングし、そして１０−８Ｍ  Ｄｅｘ、５ｍＭ  β−ＧＰおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸で処理して、これら細胞の骨形成能を試験した。これらのプレートは培養の２、３、４および５日にＣＦＵ−Ｏ（さもなくば「骨小結節」の形成とも呼ぶ）について観察した。
【００７３】
これら細胞の軟骨形成能を試験するために、２×１０５細胞はペレットとして細胞を得るために１１５０ｒｐｍで５分間遠心した。いったん上清を除去すれば、細胞は１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）を補充した（および任意に１０−７Ｍのデキサメタゾンを補充）ＳＭで維持した。補充培地は２日毎に交換し、３〜５週間カルチャーを維持し、この時点でそれらを組織学用に採取し（１０％中性ホルマリンバッファー（ＮＦＢ）により固定）、パラフィンに包埋し、６μｍの切片に切り、そしてコラーゲンＩＩ（抗体染色）の存在、およびグリコサミノグリカン（アルシアンブルー染色）の存在について染色した。細胞の脂肪形成分化能を評価するために、それらを最初にＳＭ（Ｄ−ＭＥＭを含む）中、６−ウェルプレートで培養し、これを６０％の集密度に達するまで２日毎に交換した。その時点で、培地を脂肪生成誘導培地（ＡＩＭ）（８８％Ｄ−ＭＥＭ、３％ＦＢＳ、３３μＭビオチン、１７μＭパントテン酸塩、５μＭ  ＰＰＡＲ−ガンマ、１００ｎＭウシインスリン、１μＭデキサメタゾン、２００μＭイソブチルメチルキサンチンおよび１０％抗生物質）に置き換えた。ＡＩＭは２日毎に１０日間交換し、この時点で細胞を１０％ＮＦＢで固定し、そして脂肪細胞の脂質小胞を赤く染めるＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏで染色した。最後に細胞の筋生成能を評価するために、それらを最初にＳＭ（Ｄ−ＭＥＭを含む）中、Ｔ−７５ｃｍ２組織培養フラスコで８０〜９０％の集密度に達するまで培養し、この時点で、培地を筋生成培地（ＭＭ）（７５％Ｄ−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、５０μＭヒドロコルチゾンおよび１０％抗生物質）と交換した。ＭＭは２日毎に交換した。３〜５週間培養した後、細胞をカルチャー表面から取り出し（継代培養プロトコールを参照）、それらのｍＲＮＡを得るために溶解し、そしてＭｙｏＧ、ＭｙｏＤ１、Ｍｙｆ５、ミオシン重鎖、ミオゲニンおよびデスミンを含む幾つかの筋生成遺伝子の存在についてｒｔＰＣＲにより評価した。
【００７４】
脈管周囲組織が誘導する前駆細胞培養を得ることに対する別の有用な取り組みは、以下のプロトコールを使用して適合させた。
１．帝王切開患者から滅菌臍帯（ＵＣ）を得、そして生物学的に安全なキャビネット内の媒質（８０％α−ＭＥＭ、２０％抗生物質）に移す。
２．ＵＣを３回、滅菌した３７℃のリン酸バッファー（ＰＢＳ）で洗浄する。
３．ＵＣを約１〜２インチの切片に鋭いハサミで切断する。
４．ＵＣの各切片を２回、滅菌した３７℃のリン酸バッファー（ＰＢＳ）で洗浄してできるかぎり多くの残存臍帯血（ＵＣＢ）を除去する。
５．１つのＵＣ切片を乾燥した滅菌皿に分ける。
６．２組のピンセットを使用して、約２ｍｍ離れた上皮をつかみ、そして互いに引き離して上皮を裂く。
７．上皮をＵＣ切片の長さに沿ってつかみ、上皮を裂き続け、下のＷＪを露出する。
８．工程６と同様に、約半分の上皮が裂けるまで、上皮を「片（ｓｔｒｉｐ）」状に裂き続ける。
９．臍管はＷＪを介して明らかに見ることができ、そしてＵＣ切片の切断端で末端が遊離する。
１０．１組のピンセットで上皮の残りの部分をつかみ、そして血管の末端をもう１つのピンセットでつかみ、管を大半のＷＪからその周囲の脈管周囲組織（ＰＶＴ）と一緒に「引く（ｐｕｌｌｅｄ）」ことができる。
１１．この工程を、３本すべてが下のＷＪマトリックスから離れるまで各血管で繰り返す。
１２．いったん離れれば  各血管は３７℃のＰＢＳ中に配置される。
１３．工程５〜１２を各ＵＣの切断について、すべての管が滅菌した３７℃のＰＢＳ充填ビーカーに単離されるまで繰り返す。
１４．次いで各管を個別に清潔な滅菌面に配置することにより、縫合糸で二重結びによりループをつくり末端を結紮する。
１５．いったんすべての血管がループに結紮されれば、ループを滅菌した５０ｍｌ試験管内の０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液に入れる。あるいは、そして本発明に従い、管を凍結し、極低温で保存し、そして次いで元に戻し、本発明の方法を使用して存在する前駆細胞（ＨＵＣＰＶＣ）の生存能を維持し、そして解凍し、そして処理した帯組織は中の生存可能な前駆細胞を工程１５で始める方法を使用して回収することができる。
１６．５０ｍｌの試験管を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中の回転台に一晩配置する。
１７．翌日、コラゲナーゼを１ｍｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）で不活性化し、そしてループを懸濁液から取り出す。
１８．残りの懸濁液をＰＢＳで希釈し、１１５０ｒｐｍで５分間遠心し、そして上清を除去する。
１９．次いでペレットを８倍容量の４％ＮＨ４Ｃｌで室温にて５分間、再懸濁してすべての混入赤血球細胞を溶解し、次いで１１５０ｒｐｍで５分間遠心し、そして上清を除去する。
２０．ペレット中に残る細胞を補充培地（ＳＭ）（７５％α−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、２０％抗生物質）に再懸濁し、そしてアリコートをヘモサイトメーターでカウントする。
２１．次いで細胞懸濁液をＴ−７５組織培養ポリスチレンフラスコに播き、そして増殖させる。
２２．２日後、「後−接着」（ＰＡ）細胞を採取するためにフラスコからの上清を新しいＴ−７５フラスコに移す。
２３．２日後、残存するＰＡ細胞を採取するために最初のＰＡフラスコからの上清を新しいＴ−７５フラスコに移す。
２４．ＳＭは、細胞がサブ−コンフルエンス（１〜２週間）に達するまで、すべて３つのＴ−７５フラスコで２日毎に交換し、この時点でそれらを二次培養する（継代）。
【００７５】
全臍帯血管の極低温保存
本発明は、以下に例示される手順を使用して極低温で保存された帯組織から生存可能な細胞の回復を可能とする。
【００７６】
凍結
個々の帯血管は上記のように単離し、そして末端を縫合糸で縛って上記のようなループを形成した。血管を、各々が９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）からなる５ｍＬの低温保存媒質を含有する１５ｍＬのポリプロピレン試験管に入れた。調製した試験管は−７０Ｃの冷凍庫に一晩置き、そして翌日、さらに長期にわたり保存するために液体窒素に入れた。
【００７７】
解凍
調製した検体を含む試験管は、保存から３日後、液体窒素から取り出し、そして即座に３７Ｃの水浴に置いた。いったん完全に解凍したら、約５分、検体ループは上記のようにコラゲナーゼ消化媒質に入れ、そして３７Ｃのインキュベーター中のローティッセリー（ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）に置いた。１８〜２４時間インキュベーションした後、消化した管を取り出し、そして前駆細胞を上記手順を使用して単離した。組織培養プレートにプレーティグし、そしてまた上記のように５〜１５％のＦＢＳ補充培地で培養した後、生存可能な細胞をトリパン排除により同定した。
【００７８】
以下のような改善された方法も開発した。ウォートンゼリーを伴う血管を帯から取り出
し、そして約１〜２インチ、または４ｃｍ長のセグメントに、上記のような除去法を使用して切断した。取り出した血管セグメント（試験管あたり約５〜１０セグメント、詰め込みを避けるために）を、次いで１ｍｌの血管につき５０ｍＬの遠心管中、１０％ＤＭＳＯおよびそして９０％ＦＢＳ（＠４℃に冷却）に入れた。９０％ＦＢＳの代わりに、１０％血清（ＦＢＳまたは他の）および８０％ＤＭＥＭまたは他の細胞培養に適する他の培地のような種々の血清含有混合物またはブレンドを使用することができる。次いでＤＭＳＯ／血清溶液中、血管セグメントを含有する試験管を、最初に３０分、４℃の冷蔵庫中でインキュベーションすることにより一時的に冷却した。次いで試験管を取り出し、そして管を低温試験管（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）として知られている低温保存容器に移した。１つの管セグメントを各試験管に加えた。血管を含有する低温試験管に、４ｃｍの血管切片あたり１ｍＬ、すなわち血管が完全に沈むために十分な低温保護溶液（上記のような９０％血清、１０％ＤＭＳＯ）を加えた。
【００７９】
次いで低温試験管の血管セグメントを、制御された速度の冷凍庫に一晩入れ（約６〜１２時間）、温度を約−７０℃に下げ、そして維持した。その後、試験管を液体窒素保存庫（蒸気相）に移し、確認用のラベルを付し、そして−１９６℃で約１週間維持した。
【００８０】
管を解凍するために、低温試験管を液体窒素保存から取り出した。管を低温試験管から取り出し、そして１０分間、３７℃の水浴で解凍した。次いで血管セグメントを５０ｍＬの試験管に移し、そして冷却（４Ｃ）ＰＢＳ中で管セグメントあたり約１ｍＬのＰＢＳを使用して洗浄した。次いでＰＢＳ中に血管を含む試験管を４℃の冷蔵庫でインキュベーションし、ＤＭＳＯを除去した。次いで各試験管中の冷却ＰＢＳの量を２倍とし、そして試験管をさらに冷蔵庫中で５分間、インキュベーションした。
【００８１】
この手順の後、血管セグメントは、特に本明細書でさらに記載の前駆細胞の抽出、培養および分化技術に従いＨＵＣＰＶＣを含む生存可能な前駆細胞の供給源として直ちに役立つ。
【００８２】
生存可能な細胞がそのように保存された組織から回収可能であることを確認するために、血管セグメントを上記の消化手順に供し、放出された細胞を図２２について記載したようにプレーティングし、そして細胞をＶｉＣｅｌｌ−ＸＲ機械でトリパンブルー排除を使用してカウントした。この後、生存可能であることが確認された細胞を、本明細書で言及する標準的な培養基にプレーティングし、そしてそれらがコロニーを形成し、そして増殖する能力についてパネルＡおよびＢに示すように証明した。
この方法は、標準的な消化手順から取り出される細胞と生物学的に等価である細胞を生じた。
【００８３】
切開した組織の１０％ＤＭＳＯ中での浸漬、次いで−７０Ｃでの凍結工程、続いて極低温保存を含む他の方法も試した。これらの方法は、図２２のパネル２２に示すようにほとんど生存可能な細胞を生じなかった。
【００８４】
前駆細胞アッセイ
細胞増殖アッセイ
週毎の継代手順（６日毎に行う）の間に、３ｘ１０４細胞のアリコートを２４個の６ウェル組織培養ポリスチレンプレートの各ウェルにプレーティングした。培養の１、２、３、４、５および６日目に、６ウェルプレートのうちの４つを継代し、そして細胞をカウントした。これら細胞の指数的増殖をプロットし、そしてこれら培養中の細胞について平均倍加時間を算出した。結果を図１６に示す。ＰＶＷＪ細胞培養に関する倍加時間は、全培養期間にわたり約２４時間であると記録される。対数期中、倍加時間は１６時間であることに注目されたい。これは骨髄間葉細胞について文献で報告された約３３〜３６時間の倍加時間（Ｃｏｎｇｅｔ  ａｎｄ  Ｍｉｎｇｕｅｌｌ，１９９９）、および脂肪組織に由来する間葉幹細胞についての約３．２日（Ｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）と比較される。連続する継代培養での増殖の観察について、３ｘ１０５細胞を４個のＴ−７５フラスコ（ｎ＝４）にプレーティングし、そしてＳＭを供給し、これを２日毎に交換した。培養の６日後に、細胞は植え継がれ（上記の継代培養プロトコールを参照にされたい）、そしてヘモサイトメーターの使用によりカウントされた。３ｘ１０５細胞のアリコートを４つの新たなＴ−７５フラスコに植え、６日間培養し、そしてカウントの工程を繰り返した。この工程をＰ０からＰ９まで４つの帯サンプルについて繰り返した。
【００８５】
図１８はＨＵＣＰＶＣ細胞のＣＦＵ−Ｆ頻度を具体的に説明する。１：３００の頻度は、新生児ＢＭ（１：１０４）を含む他の間葉前駆細胞供給源について観察される頻度よりも有意に高く（Ｃａｐｌａｎ，１９９１）、そして臍帯血由来「非拘束（ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）体性幹細胞」（ＵＳＳＣ）（Ｋｏｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）が１：２ｘ１０８の頻度で起こる。図１９は連続する継代でのＨＵＣＰＶＣの増殖速度を具体的に説明する。Ｐ０で６０時間の初期倍加時間はＰ１で３８時間に落ち、これはＰ２−Ｐ８で２０時間に落ちてそのままとなる。細胞はその後に老化し始め、そしてそれらの増殖速度は急速に低下する。興味深いのは、培養の最初の３０日間を観察した時（図２０）、ＨＵＣＰＶＣは３０日内に２ｘ１０１０細胞を誘導する。１回の治療的用量（ＴＤ）が２ｘ１０５細胞と定められるので（Ｈｏｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）（Ｈｏｒｗｉｔｚ  ＥＭ，Ｐｒｏｃｋｏｐ  ＤＪ，Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ＬＡ，Ｋｏｏ  ＷＷ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＰＬ，Ｎｅｅｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．骨形成不全症の小児における骨髄由来間葉細胞の移植性および治療効果（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ．）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９９，５：３０９−３１３）、ＨＵＣＰＶＣは１ＴＤを培養の１０日以内に、そして培養の２４日以内に１，０００ＴＤを誘導することができる。
【００８６】
図１５に示すように、脈管周囲組織に由来する前駆体は、種々の前駆細胞の部分集合を含んでなる。この集団内に、いわゆる「約束された」骨前駆細胞が存在し、これは通常はそのような分化を誘導するために必要な培養補助物質（デキサメタゾンの存在下で培養するような）の不存在下で形成する能力により特徴づけられる、本明細書で示すような骨小節を形成する能力を特徴とする。これらの約束された骨前駆体はこのように自然に分化して骨小結節を形成する。また前駆体集団内には、デキサメタゾン、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸のような必要な因子の存在下で培養した時、骨小結節を誘導し、形成することができる骨形成細胞がある。すなわち図１５にグラフで示す「全骨形成」部分集団には、「約束された骨形成前駆体」集団ならびに「約束されていない骨形成前駆体」集団を含み、そして骨形成分化経路に沿った分化を誘導することができる細胞の総数が明らかとなる。「約束された」と「約束されていない」集団の間の実際の比率は約１：１であり、そして「全骨形成前駆体」集団と「約束された骨形成前駆体」集団との間の比は約２：１である。前駆細胞の骨形成特性の分析は、以下に記載するように行った。
【００８７】
細胞の軟骨生成、脂肪生成および筋生成の分化も観察した。骨生成および時折の脂肪生成分化は自然に観察されたが、他の表現型は各々の表現型について特異的誘導条件下で培養した時にのみ観察された。
【００８８】
連続希釈およびＣＦＵ−Ｆアッセイ
１ｘ１０５、５ｘ１０４、２．５ｘ１０４、１ｘ１０４、５ｘ１０３、１ｘ１０３の希釈でＨＵＣＰＶＣを６ウェルの組織培養プレートに播き（Ｆａｌｃｏｎ＃３５３０４６）、そして２日毎にＳＭを供給した。コロニーの数（＞１６細胞を含んでなる）を培養１０日目に各ウェルについてカウントし、そして１４日目に確認した。ＣＦＵ−Ｆ頻度、１つのコロニーを形成するため必要な平均細胞数を最終的に１ＣＦＵ−Ｆ／播いた３００のＨＵＣＰＶＣと決定した。この頻度に基づき、３００ＨＵＣＰＶＣを提供するために必要な単位容量（３個の各帯から３連で行った）を算出し、そしてＨＵＣＰＶＣの８回の増分単位容量を６−ウェルプレートの個別のウェルに播いた。再度、コロニー（＞１６細胞を含んでなる）（ＣＦＵ−Ｆｓ）を培養１０日目にカウントして、増分播種でのＣＦＵ−Ｆ頻度をアッセイした。
【００８９】
ＣＦＵ−Ｏアッセイ
週毎の継代手順の間に、試験細胞集団のアリコートは、７５％α−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ（幹細胞バッチ＃：Ｓ１３Ｅ４０）、ペニシリンＧ（１６７単位／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびアンホテリシンＢ（０．３μｇ／ｍｌ）を含有する１０％抗生物質ストック溶液、およびＤｅｘ（１０−８Ｍ）、β−グリセロホスフェート（５ｍＭ）およびＬ−アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を含む骨形成培地中に、１ｘ１０４細胞／ｃｍ２の細胞播種密度で組織培養ポリスチレン上に直接プレーティングされた。カルチャーは１２日間、２日毎に再供給した。カルチャーは骨小結節として検出される鉱化した小結節領域が観察されるまで維持し（通常３日）、その時点でカルチャーはテトラサイクリンを含有する培地を最終カルチャー再供給で再供給し、次いでＫａｒｎｏｖｓｋｙの固定液で固定し、そして分析のために調製した。Ｌｅｉｔｚ  Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｅｓｓｅｌｔｅ  Ｌｅｉｔｚ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ  ＫＧ、シュツットガルト、ドイツ）を使用して、位相差ならびにＵＶ蛍光下でテトラサイクリン標識カルチャーを視覚化し、ＨｉｔａｃｈｉＳ−２０００走査型電子顕微鏡を１５ｋＶの加速電位を使用して、形態学的に同定可能な骨マトリックスの存在を示すための画像を作成した。
【００９０】
ＣＦＵ−Ｃアッセイ
これら細胞の軟骨生成能を試験するために、２×１０５細胞を１１５０ｒｐｍで５分間、細胞をペレットとして得るために遠心した。いったん上清が除去されれば、細胞は１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）（および任意に１０−７Ｍデキサメタゾンを含む）を補充したＳＭ中で維持した。補充培地は２日毎に交換し、３〜５週間維持し、この時点でそれらを組織学用に採取し（１０％の中性ホルマリンバッファー（ＮＦＢ）中で固定することによる）、パラフィンに包埋し、６μｍ切片に切断し、そしてコラーゲンＩＩの存在（抗体染色）およびグルコサミノグリカンの存在（アルシアンブルー染色）について染色した。染色によりインキュベーション条件下での軟骨細胞の形成が確認された。
【００９１】
ＣＦＵ−Ａアッセイ
細胞の脂肪形成性の分化能を評価するために、それらは最初に６−ウェルプレートでＳＭ（Ｄ−ＭＥＭを含む）中にて培養され、ＳＭは細胞が６０％の集密度になるまで２日毎に交換した。その時点で培地を脂肪生成誘導培地（ＡＩＭ）（８８％Ｄ−ＭＥＭ、３％ＦＢＳ、３３μＭビオチン、１７μＭパトンテン酸塩、５μＭ  ＰＰＡＲ−ガンマ、１００ｎＭウシインスリン、１μＭデキサメタゾン、２００μＭイソブチルメチルキサンチンおよび１０％抗生物質）に交換した。ＡＩＭは１０日間、２日毎に交換し、その時点で細胞を１０％ＮＦＢで固定し、そして脂肪細胞の脂質小胞を赤く染めるＯｉｌ  ＲｅｄＯで染色した。染色では脂肪細胞の形成が誘導条件だけでなく、それらの不存在でも、すなわち自然に形成されることが確認された。
【００９２】
ＣＦＵ−Ｍアッセイ
細胞の筋形成能を評価するために、細胞は最初にＳＭ（Ｄ−ＭＥＭを含む）中、Ｔ−７５ｃｍ２組織培養フラスコで８０〜９０％の集密度に達するまで培養し、この時点で、培地を筋形成培地（ＭＭ）（７５％Ｄ−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、５０μＭヒドロコルチゾンおよび１０％抗生物質）と交換した。ＭＭは２日毎に交換した。培養の３〜５週間後、細胞をカルチャー表面から取り出し（継代培養プロトコールを参照）、それらのｍＲＮＡを得るために溶解し、そしてＭｙｏＧ、ＭｙｏＤ１、Ｍｙｆ５、ミオシン重鎖、ミオゲニンおよびデスミンを含む幾つかの筋生成遺伝子の存在についてｒｔＰＣＲにより評価した。結果はこれらの誘導条件下での筋細胞の存在が確認された。
【００９３】
データ分析
テトラサイクリン染色
テトラサイクリン（９μｇ／ｍｌ）を、終了前のカルチャーに加えた。終了時に、細胞はＫａｒｎｏｖｓｋｙの固定液で一晩固定し、そして次いで小結節領域の鉱物成分のテトラサイクリン標識についてＵＶ−励起蛍光画像により観察した。
【００９４】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
ＣＦＵ−Ｏカルチャーの代表的サンプルは、最初にそれらを７０％、８０％、９０％および９５％エタノールに１時間、続いて１００％エタノールに３時間、浸漬することによりＳＥＭ用に調製した。次いでサンプルは臨界点乾燥させた。約３ｎｍ層の金層を、Ｐｏｌａｒｏｎ  ＳＣ５１５  ＳＥＭ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍで検体上にスパッタリング被覆し、これを次いで様々な倍率でＨｉｔａｃｈｉＳ−２０００走査型電子顕微鏡の１５ｋＶ加速電位で調査した。作成した画像は形態学的に同定可能な骨マトリックスの存在を示すために使用する。
【００９５】
ＨＬＡ−タイピングのためのフローサイトメトリー
１ｘ１０５細胞より多い試験細胞集団を、２％ＦＢＳ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｂａｔｃｈ＃：Ｓ１３Ｅ４０）を含有するＰＢＳ中で洗浄し、そしてＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（飽和濃度（１：１００希釈）中、以下の結合マウスＩｇＧ１  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−ＰＥおよびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ，ＤＱ−ＦＩＴＣを含む）に、４℃で３０分間再懸濁した。細胞懸濁液をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、１μｇ／ｍｌの７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、そしてＥｘｐｏＡＤＣＸＬ４ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してフローサイトメーター（ＸＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、マイアミ、フロリダ州）で分析するためにＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁した。陽性染色は、マッチしたアイソタイプ抗体で染色した対照集団から、９９％より多い細胞により得られるレベルを越える蛍光シグナルの発光と定める（ＦＩＴＣ−およびＰＥ−結合マウスＩｇＧ１，κモノクローナルアイソタイプ標準、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。各サンプルについて、少なくとも１０，０００のリストモードイベント（ｌｉｓｔ  ｍｏｄｅ  ｅｖｅｎｔ）を集めた。すべてのプロットはＥＸＰＯ３２ＡＤＣ分析ソフトウェアで作成した。
【００９６】
ＨＬＡタイピングに加えて、ＨＵＣＰＶ細胞集団も他のマーカーについて評価し、以下の結果を得た：
【００９７】
【表１】
2009520466.tif 000003
【００９８】
結果
骨小結節コロニーの光学顕微鏡写真
図３、４および５は、３および５日目のカルチャー中に存在したＣＦＵ−Ｏを具体的に説明する。それらは骨マトリックスを生産している多角形細胞の「凝集」により表される小結節領域の回りの「繊維芽細胞様」細胞のコンフルエントな層を示した。これらＣＦＵ−ＯはＤｅｘ（＋）およびＤｅｘ（−）カルチャーの両方で観察され、そして連続する継代にわたり類似の形態を提示した。
【００９９】
ＣＦＵ−Ｏカルチャーのテトラサイクリン標識
カルチャーのテトラサイクリン標識は、骨の生物学的な無機相に伴う新たに形成されたリン酸カルシウムを標識するために使用した。カルチャーのテトラサイクリン標識は、鉱化小結節領域と一致し、これはカルチャーをＵＶ光に暴露することにより視覚化される。図６および７は、前駆細胞の３日および５日目のカルチャーのテトラサイクリンで標識したＣＦＵ−Ｏカルチャーを表す。これらの画像は、ＵＶ励起蛍光造影により作成され、そして写真撮影された。
【０１００】
走査型電子顕微鏡
ＣＦＵ−Ｏは、鉱化したコラーゲンマトリックスの形成についてＳＥＭ下で観察され、これはコラーゲン形成の初期段階から成熟ＣＦＵ−Ｏでの稠密な鉱化マトリックスの形成までのＣＦＵ−Ｏの形成を示す。図８、９、１０、１１、１２および１４は、ＣＦＵ−Ｏｓの走査型電子顕微鏡写真を表す。
【０１０１】
フローサイトメトリー＆ＨＬＡ−タイピング
両主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を表す細胞表面抗原を同定するフローサイトメトリーは、単離した細胞の７７．４％の集団がＭＨＣ−／−であることを示した。図１３は陰性対照に関するフローサイトメトリーの結果を具体的に説明する。図１７は前駆細胞集団におけるＭＨＣ−／−細胞の頻度に及ぼす凍結−解凍の影響を表す。凍結−解凍の効果は以下のように実験した：
１ｘ１０５細胞より多い試験細胞集団を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中で洗浄し、そしてＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（飽和濃度（１：１００希釈）の以下の結合マウスＩｇＧ１  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃５５５５５３、ロットＭ０７６
２４６）（ＭＨＣ  Ｉ）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃５５５５５８、ロットＭ０７４８４２）（ＭＨＣＩＩ）、およびＣＤ４５−Ｃｙ−サイクロム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃５５５４８４、ロット０００００３５７４６）に４℃で３０分間再懸濁した。細胞懸濁液をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、そしてＥｘｐｏＡＤＣＸＬソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してフローサイトメーター（ＸＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、マイアミ、フロリダ州）で分析するためにＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁した。陽性染色は、マッチしたアイソタイプ抗体で染色した対照集団から９９％より多い細胞により得られるレベルを越える蛍光シグナルの発光と定め（ＦＩＴＣ−、ＰＥ−およびＣｙ−サイクロム−結合マウスＩｇＧ１，κモノクローナルアイソタイプ標準、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、これはヒトＢＭサンプルの陽性蛍光により確認された。各サンプルについて、少なくとも１０，０００のリストモードイベントを集めた。すべてのプロットはＥＸＰＯ３２ＡＤＣ分析ソフトウェアで作成した。
【０１０２】
継代培養＆細胞播種
付着した細胞は、７日後に０．１％トリプシン溶液を使用して継代培養し（継代）、この時点でそれらは光学顕微鏡により観察した時、８０〜９０％の集密度を現した。継代で、細胞はフローサイトメトリーによりＭＨＣ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭＨＣ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱおよびＣＤ４５の発現について観察された。次いで細胞はＴ−７５組織培養ポリスチレンフラスコに、ＳＭ中、４ｘ１０３細胞／ｃｍ２でプレーティングされ、そして１０−８Ｍ  Ｄｅｘ、５ｍＭ  β−ＧＰおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸で処理して、これら細胞の骨形成能を試験した。これらのフラスコは培養の２、３、４、５および６日目にＣＦＵ−Ｏまたは骨小結節の形成について観察した。継代手順からのいかなる残留細胞も、さらに使用するために低温保存された。
【０１０３】
細胞の低温保存
１ｘ１０６のＰＶＴ細胞のアリコートは、９０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−２６５０、ロット＃１１Ｋ２３２０）からなる全１ｍｌ容量中に調製し、そして１ｍｌのポリプロピレン低温バイアル（Ｃｒｙｏ−ｖｉａｌ）にピペットで入れた。このバイアルを−７０℃の冷凍庫に一晩入れ、そして翌日、長期保存のために−１５０℃の冷凍庫に移した。１週間の低温保存後、ＰＶＴ細胞を解凍し、そしてＭＨＣ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭＨＣ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱおよびＣＤ４５の発現についてフローサイトメトリーにより観察した。ＰＶＴ細胞が１週間の低温保存後に解凍される第２プロトコールを使用して、１週間、再培養し、継代し、次いでＭＨＣ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭＨＣ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱおよびＣＤ４５の発現についてフローサイトメトリーにより再分析した。
【０１０４】
結果を図１７に提示する。新たな細胞集団中のＭＨＣ−／−の頻度は、数回の継代を通して維持されることに注目されたい。新たな細胞が継代後に−１５０℃で１週間凍結され、そして直ちにＭＨＣ表現型について分析される場合、この分析された集団は、ＭＨＣ−／−表現型の細胞が顕著に増強された頻度を提示する。すなわちＭＨＣ−／−表現型の細胞は、凍結によりＰＶＴ細胞の集団から便利に濃縮され得る。さらなる濃縮は、以前に凍結された細胞のカルチャーの継代で実現される。特にそして図１７に見られるように、低温保存した細胞の第１代は、ＭＨＣ−／−細胞の関連集団を５０％より多く増し、そして引き続きそのような細胞の凍結そして継代により８０％、８５％、９０％そして９５％より高いＭＨＣ−／−集団を生じる。凍結したＰＶＴ細胞自体は、それらの非免疫原性を仮定するとヒトの治療に潜在的に大変有用である。
【０１０５】
後接着ＨＵＣＰＶ細胞画分の採取
脈管周囲組織から回収した前駆細胞の収量は、以下の様式で濃縮することができる。Ｈ
ＵＣＰＶの「後接着」（ＰＡ）画分を採取するために、最初に播いたＨＵＣＰＶ採取物の上清を、新しいＴ−７５フラスコに再度プレーティングし、そして３７℃で５％ＣＯ２にて２日間インキュベーションした。次いで最初に播種したＨＵＣＰＶフラスコに新しいＳＭを供給した。２日後、この上清は再度、新しいＴ−７５フラスコに移され、そして付着した細胞に新しいＳＭを供給した。最後に第３の播種したフラスコの上清を吸引し、そしてこのフラスコに新しいＳＭを供給した。（続いて各帯に関して、３フラスコを生成する；最初に播種したフラスコ、最初のＰＡ画分および第２ＰＡ画分）これら３つの細胞の同一の特徴に対する類似は、最初に播種した細胞に比べると分かり、より高い細胞の収量はこれらＰＡ画分を単離することにより得られることが確認される。最初に播種したＨＵＣＰＶに類似して、これらＰＡ細胞は迅速な増殖速度を有し、培養で骨小結節を自然に発生し、そして他の３つの系統：軟骨、脂肪および筋肉への分化を誘導することができる。
【０１０６】
前駆細胞を含んでなる組織工学用組成物
この実施例では、細胞は骨工学分野で通常使用されているＣＡＰ／ＰＬＧＡの状態の担体と合わせられる。ＣＡＰ／ＰＬＧＡスカフォールドを播くために、それらを５ｍｍ×５ｍｍの円筒に切断した。次いで２００μｌの２ｘ１０５のＨＵＣＰＶＣ懸濁液を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管に入れ、そしてスカフォールドを懸濁液に入れた。改良されたピペットチップ（５ｍｍの吸引直径の持つ）を使用して、細胞の懸濁液を吸引し、そしてピペットで上下しながらスカフォールドを数回、洗浄した。次いでスカフォールドをこの懸濁液中、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションして、細胞がスカフォールドに付くようにした。４時間後、スカフォールドを懸濁液から取り出し、そして非組織培養処理した２４ウェルプレートの個別のウェルに入れ、１ｍｌのＳＭを供給し、そして３７℃、５％ＣＯ２で１４日間インキュベーションし、ＳＭを２日毎に交換した。次いでスカフォールドはＫａｒｎｏｖｓｋｙの固定液で固定し、そしてＳＥＭ分析用に調製した（上記参照）。培養の１４日後、ＨＵＣＰＶＣは完全にスカフォールドを覆った。
【０１０７】
記載するように、ＰＶＴ前駆細胞集団は間葉細胞および骨以外の組織の分化に適切な条件下で培養することによりそれらを生じるように利用することもできる。例えば脂肪細胞を生成するために、前駆体を１０４細胞／ｃｍ２の濃度で調製し、そして３５ｍｍの組織培養皿にプレーティングする。細胞は前脂肪細胞培地（Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＰＭ）（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１０（１：１、容量／容量）、１０％ウシ胎児血清、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）で３日間維持する。３日後、ＰＭを除去し、そして細胞に脂肪形成培地（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１０栄養ブロス、１：１、容量／容量；ＨＥＰＥＳバッファー（１５ｍＭ）；ウシ胎児血清（３％）；ビオチン（３３μＭ）、パントテン酸塩（１７μＭ）、ヒトインスリン（１００ｎＭ）、デキサメタゾン（０．５μＭ）、ＰＰＡＲＹアゴニスト（１μＭ）および抗生物質）を供給し、そして３日間培養する。３日のインキュベーション後、脂肪生成培地を除去し、そしてカルチャーを脂肪細胞培地（ＡＭ）（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１０（１：１、容量／容量）、３％ウシ胎児血清、１μＭデキサメタゾン、１００ｎＭヒトインスリン、３３μＭ  Ｄ−ビオチン、１７μＭパントテン酸Ｎａ、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌスシレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）に維持し、脂肪細胞はすべての培地が除かれると浮遊するので、半分の培地のみを確実に除去し、等容量のＡＭを再補充しながら３日毎に定期的に供給する。４回の供給（１２日）後、細胞は脂質滴で丸く見える。脂肪細胞へ分化した間葉細胞の正の同定は、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  ＯおよびＮｉｌｅ  Ｒｅｄで染色することにより確認できる。
【０１０８】
同様に、軟骨細胞は１０４細胞／ｃｍ２の濃度で調製した細胞懸濁液を使用し、そして３５ｍｍの組織培養皿にプレーティングすることにより調製することができる。促進するために、軟骨細胞は血清を含まず、そしてトランスフォーミング増殖因子β３を用いて培
養される。細胞ペレットは、多層マトリックスが豊富な形態を発生し、そして組織学的には培養中、プロテオグリカンが豊富な細胞外マトリックスの上昇をに示す。
【０１０９】
筋芽細胞を生成するために、細胞懸濁液は１０４細胞／ｃｍ２の濃度で調製され、そして３５ｍｍの組織培養皿にプレーティングされる。細胞は、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＭＣＤＢ１２０培地で１週間維持する（筋芽細胞増殖培地、ＭＰＭ）。１週間で、基礎培地（ＭＰＭ）中の血清レベルは２％に落ち（筋芽細胞分化培地、ＭＤＭ）、そして培養は７日後に終了する。カルチャーには適切な培養基を１週間に３回、再供給する。
【０１１０】
このように、本発明は骨を含む種々の結合組織の生産、および免疫不適格であり、そして骨の疾患および障害を含む結合組織の状態を処置するためにヒト患者への移植に理想的な前駆細胞の生産に有用な特性を有する生存可能なヒトの前駆細胞の有用な供給源となることができる極低温に保存した臍帯組織を提供する。ヒト前駆細胞は、臍帯の外壁近傍から伸びているヒト臍帯ウォートンゼリーの特定ゾーン（脈管周囲ゾーンと呼ばれる）から生成される。このゾーンから抽出された細胞集団は注目すべき特徴を表し、それらには急速な増殖、すべての継代培養したフラスコで７日前に起こる細胞コロニーの形成により見られるような細胞形態の変化（約７〜１０倍加）、および培養基への骨形成補助物質を添加せずに骨小結節の形成、ならびに比較的高い頻度のＭＨＣダブルネガティブ細胞（この頻度は凍結された細胞の培養で増加する）を含む。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、用語「約」はこの用語により定量される値の＋／−１０％の値を指す。このように「約−７０Ｃ」の温度は、６３Ｃ〜７７Ｃの範囲内の温度を指す。
【０１１２】
以下の参考文献は引用により本明細書に編入する。
【０１１３】
【表２】
2009520466.tif 000004
【０１１４】
【表３】
2009520466.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
本発明の観点は、今、添付する図面を参照にしてさらに詳細に記載し、図面では：
【図１】ヒトＵＣ中に表される組織の３つの異なるゾーンを表す光学顕微鏡写真である。
【図２】コラゲナーゼ溶液中、ループとなった管の代表的な具体的説明である。
【図３】ポリスチレン組織培養表面に付着したＷＪから単離した細胞の光学顕微鏡写真である。
【図４】ＣＦＵ−Ｏの初期形成を具体的に説明する光学顕微鏡写真である。
【図５】成熟ＣＦＵ−Ｏを具体的に説明する光学顕微鏡写真である。
【図６】３５ｍｍのポリスチレン組織培養皿上で、ＵＶ蛍光下、テトラサイクリンで標識したＣＦＵ−Ｏを示す。
【図７】同じテトラサイクリン標識ＣＦＵ−Ｏの位相差光学顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真を並べて具体的に説明する。
【図８】組織培養ポリスチレン表面上の成熟ＣＦＵ−Ｏの走査型電子顕微鏡写真である。
【図９】下地のマトリックスを露出しているＣＦＵ−Ｏの横断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１０】ＣＦＵ−Ｏの前端に位置する軽く鉱化したコラーゲン繊維の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１１】分化している骨生成細胞によりポリスチレン境界上にある（ｌａｉｄ  ｄｏｗｎ）非コラーゲン状マトリックス（小球として見える）の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１２】成熟ＣＦＵ−Ｏの中心を含んでなる重く鉱化したコラーゲンの走査型電子顕微鏡写真である。
【図１３】ＷＪ由来細胞は７７．４％ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩネガティブであることを証明するフローサイトメトリーのデータを具体的に説明する。
【図１４】細胞が（骨細胞）封入されるようになったコラーゲンの分布、および多層の周囲細胞（その幾つかは同化した細胞外マトリックスにより囲まれ始めている）を示す骨小結節のＭａｓｓｏｎのトリクローム染色した横断切片の白黒複製である。
【図１５】約束された骨前駆細胞の部分集団および全骨前駆細胞の部分集団に関連して、接着脈管周囲ＷＪ集団の強力な拡大を表す。
【図１６】脈管周囲ＷＪ細胞の０〜１４４時間の増殖を表し、０〜２４時間の対数期、２４〜７２時間の対数期、および７２〜１２０時間の定常期を持つ通常の成長曲線を具体的に説明する。全培養期間中、倍加時間は２４時間であり、一方、対数期中は１６時間である。
【図１７】５継代にわたり示されるＷＪ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）発現を表し、自由な解凍そしてそれに続く再培養による発現によるそれらの発現の変化を表す。
【図１８】ＨＵＣＰＶＣのＣＦＵ−Ｆ頻度を表す。
【図１９】Ｐ０からＰ９までのＨＵＣＰＶＣの倍加時間を表す。ＨＵＣＰＶＣは比較的安定かつ迅速な２０時間の倍加時間をＰ２からＰ８で示す。そして
【図２０】１０４より多くの細胞を培養の３０日以内に誘導できることを示すＨＵＣＰＶＣの増殖を示す。この急速な拡大で、１，０００治療用量（ＴＤ）が培養の２４時間以内に生成できる。
【図２１】細胞の採取に及ぼすコラゲナーゼ濃度および消化時間の効果を表す。そして
【図２２】低温保存から回収し、そして５％ＦＢＤおよびアルファ−ＭＥＭ（ペニシリンＧ（１６７単位／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０ｇ／ｍｌ）およびアンホテリシンＢ（０．３μｇ／ｍｌ）を含有する）中の組織培養処理表面で培養した４日目（パネルＡ）および９日目（パネルＢ）のトリパンブル排除により生存能が決定された細胞の存在を示す光学顕微鏡写真である。パネルＣは比較のために、帯を事前の冷却無しに１０％ＤＭＳＯ中に浸漬した後に凍結した場合に得られた結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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