(57)【要約】  試料流体を分析するためのセンサを調製する方法が開示されており、前記試料流体は１又は複数の標的分子を含有している。当該方法は、多孔性基板を装備したチャンバ内に前記試料流体を導入するステップを含み、１又は複数のプローブ分子が前記多孔性基板に与えられ、前記プローブは前記１又は複数の標的分子に特異的に結合することができる。当該方法は、前記試料流体を前記多孔性基板の孔に通して流し込み、１又は複数の標的分子を1又は複数のプローブ分子で捕獲するために、前記基板と前記チャンバを互いに相対的に移動させるステップをさらに含む。試料流体を分析するためのセンサも開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数の標的分子を含有する試料流体を分析するためのセンサを調製する方法であって、当該方法が：
多孔性基板を装備したチャンバ内に前記試料流体を導入するステップであって、１又は複数のプローブ分子が前記多孔性基板に与えられ、前記プローブが前記１又は複数の標的分子に特異的に結合することができる、ステップ、及び
前記試料流体を前記多孔性基板の孔に通して流し込み、前記１又は複数の標的分子を前記1又は複数のプローブ分子で捕獲するために、前記基板と前記チャンバを互いに相対的に移動させるステップ；
を含む方法。
【請求項２】
前記多孔性基板と前記チャンバの相対的移動を、前記多孔性基板の表面に対して垂直の方向で実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多孔性基板が多数の別々の及び分離した領域をその表面に渡り含み、前記領域のそれぞれがプローブ分子と結合する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記基板がポリマーを含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記基板が、ポリアミドのホモポリマー又はコポリマーを含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリアミドのホモポリマー又はコポリマーが、四級アンモニウムの導入、加溶媒分解、又は、アミド基のアミジン基への誘導体化により修飾される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記基板がセルロース系材料を含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記基板が熱可塑性のフッ化ポリマーを含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記１又は複数の標的分子の存在及び／又は濃度を決定するように、前記多孔性基板を分析するステップをさらに含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
１又は複数のプローブ分子が与えられた多孔性基板を含むチャンバ、
１又は複数の標的分子を含有する試料流体を、前記チャンバ内に導入する手段、及び
前記チャンバに相対して前記多孔性基板を移動させる手段、
を含むセンサ。
【請求項１１】
前記１又は複数の標的分子の存在及び／又は濃度を決定するように、前記多孔性基板を分析する手段をさらに含む、請求項１０に記載のセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料流体を分析するためのセンサを調製及び使用する方法に関する。本発明は、生体分子を分析するための改善されたセンサにも関する。特に、本発明は、生物学的試料内の生体分子の分析のためのセンサを調製及び使用する、改善された能率の良い方法に関する。操作中、そのセンサは、生物学的試料を収容するためのチャンバ、及び、該チャンバに含まれた基板を含み、該基板は前記生体分子に結合するためにそこに与えられたプローブを有し、さらに、前記方法は、基板とチャンバを互いに相対的に移動させるステップを含む。より明確には、本発明は、マイクロアレイアッセイに有用に利用できるセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
１又は複数の他の分子を含有する生物学的試料内の、それだけに限らないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は蛋白質等の、特異的標的分子の存在及び濃度を、これらの標的分子の捕獲分子との複合結合を使用することにより決定することができる。伝統的なウエスタン／サザン／ノーザンブロット法の場合、標的分子がブロット表面上に固定化され、後で溶性の検出分子により検出される。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、又は、マイクロアレイベースの検査では、代わりに固定化されているのは捕獲分子である。マイクロアレイ技術では、一組の特異的プローブ分子が、１つ特定の標的と特異的に相互作用するためにそれぞれ選ばれ、固体表面の特定の位置で固定化される。一方、標的分子は、検出可能なラベル分子（例えば、フルオロフォア又は磁気ビーズ）によりラベルされる。前記固体表面を生物学的試料と接触させることにより、標的分子は、その特異的プローブに対応した位置で固定される。従って、生物学的試料における標的分子の検出、及び、その濃度の評価は、標的に結合した検出分子により生じる信号の位置測定及び強度の測定によりそれぞれ処理される。標準的なマイクロアレイの平面表面のため、生物学的試料流体内の分子輸送は、拡散法により主に支配されている。これらのアレイはかなりの表面領域を有しているので、十分な結合を得るために、数時間のハイブリッド形成時間を必要とする場合がある。拡散の制限による影響は、撹拌、液体輸送（ポンピング）又は表面弾性波によりいくらか減少することができる。しかし、より小さな生物学的試料容積を使用することの必要性、及び、結果として基板の上面に生じる液体の薄膜のため、そのような撹拌の能率は低く、表面上での直接的な乱流混合を可能にしていない。さらに、標準的なマイクロアレイは、測定に先立ち、アレイの上部からこの残りの液体層を除去するために、洗浄ステップを必要としている。これは、異なる時点（測定のダイナミックレンジを改善するため）、及び／又は、温度（非特異的結合の影響を減少することにより特異性を改善するため）での一連の継続的な測定が価値の高い追加の情報を提供する動態測定のために、そのようなマイクロアレイを使用する可能性を事実上制限又は除去してしまう。
【０００３】
そのような方法は、例えば、表面に３つの異なるオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブが配置され、その表面が３つの異なる相補ＤＮＡ標的の試料プールとハイブリッド形成した、ＷＯ０３／００４１６２号に開示されている。その標的は蛍光ラベル（フルオレセインイソチオシアネート）で修飾され、表面上での直接の検出を可能にしている。生物学的試料が表面に接触するに従い、特異的標的はプローブにより溶液から表面上へ捕獲され、検出が落射蛍光顕微鏡により実行される。ＷＯ０３／００４１６２号は、任意選択でポンピングシステムの使用により、生物学的試料が表面を流れ抜けることによりプローブに接触するのを可能のするための多孔性の基板の使用等、上記の一般的な方法に対するいくつかの改善点を開示している。この方法は、ハイブリッド形成をしっかりと固定するという利点を有している。別の改善点は、生物学的試料の温度を調節するためのサーマルチャンバの使用である。ハイブリッド形成は温度依存性の現象であり、温度調節は、例えば核酸分析等に利点を提供する。
【０００４】
しかし、ポンピングシステムは、高価でも漏出の潜在源でもあり、頻繁にメンテナンスする必要がある。さらに、回路における空気の存在は回避するのが難しいことが非常に多く、検出処理を妨げる過度の量の気泡を形成してしまう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、当技術分野において、基板上に生体分子のハイブリッド形成を固定するための、改善されより能率的な方法が必要である。安価でもあり、維持するのが容易でもある装備を用いた、より時間のかからない分析方法も、当技術分野において必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概して、本発明は、第１の態様において、標的分子を含んだ試料流体を分析するためのセンサを調製する方法に関し、当該方法は、プローブ分子が与えられた多孔性の膜を、前記試料流体を含有するチャンバに相対して移動させるステップに存ずる。本発明は、第2の態様において、チャンバ、与えられたプローブ分子を有する多孔性基板、標的分子を含有する試料流体をチャンバ内に導入する手段、及び、前記多孔性基板をチャンバに相対して移動させる手段を含んだセンサにも関する。
【０００７】
その最も広い意味及び第１の態様において、本発明は、１又は複数の標的分子を含有する試料流体を分析するためのセンサを調製又は使用する方法に関し、当該方法は：
（１）  １又は複数のプローブ分子が与えられた多孔性基板を装備したチャンバ内に、前記試料流体を導入するステップであって、前記プローブが前記１又は複数の標的分子に特異的に結合することができる、ステップ；及び
（２）  前記試料流体を前記多孔性基板の孔に通して流し込み、前記１又は複数の標的分子を前記プローブ分子で捕獲するために、前記基板と前記チャンバを互いに相対的に移動させるステップ；
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書において使用される「種類」という用語は、標的分子又は生物学的化合物に使用された場合、他に述べられていない限り、その分子構造により関係のある化合物の群を示している。本発明に関与している標的分子の典型的な種類は、それだけに限らないが、ＤＮＡ生物学的化合物、ＲＮＡ生物学的化合物、ポリペプチド、酵素、蛋白質、抗体等を含む。
【０００９】
本明細書において使用される「マイクロアレイアッセイ」という用語は、他に述べられていない限り、標的となる生物学的化合物を含んだ試料、好ましくは生物学的流体試料（任意選択で、その中に懸濁した少量の固体又はコロイド状粒子を含有する）が、膜と（例えば流れ抜けて）接触するアッセイを示している。その膜は、多数の別々の及び分離した領域をその表面に渡り含んでおり、前記領域のそれぞれが、そこに与えられた１又は複数のプローブを有し、さらに、前記プローブのそれぞれが、標的となる生物学的化合物と特異的に結合するその能力のため選ばれる。
【００１０】
本明細書において使用される「標的」という用語は、他に述べられていない限り、分析の目的又は要点として定められた分子化合物を示している。標的は、それだけに限らないが、核酸及び関連化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又はその類似体、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体、プラスミド等）、蛋白質及び関連化合物（例えば、ポリペプチド、単クローン抗体、受容体、転写因子等）、抗原、リガンド、ハプテン、炭水化物及び関連化合物（例えば、多糖類、少糖類等）、細胞小器官、無処理の細胞等の分子化合物を含む。
【００１１】
本明細書において使用される「プローブ」という用語は、他に述べられていない限り、基板の表面上及び／又は基板内に固定化され、試料の一部である「標的」の存在下で、又は、前記標的と反応した場合、前記標的と特異的に相互作用することができ、並びに、前記特異的標的の存在を検出するために使用される物質を示している。プローブは、それだけに限らないが、核酸及び関連化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又はその類似体、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体、プラスミド等）、蛋白質及び関連化合物（例えば、ポリペプチド、単クローン抗体、受容体、転写因子等）、抗原、リガンド、ハプテン、炭水化物及び関連化合物（例えば、多糖類、少糖類等）、細胞小器官、無処理の細胞等の分子化合物を含む。
【００１２】
本明細書において使用される「ラベル」という用語は、他に述べられていない限り、その物質の分配、及び／又は、送達される信号の強度の検出を可能にするように適切な手段により容易に検出可能である物質を示している。そのラベルは、それだけに限らないが、発光分子（例えば、蛍光剤、リン光剤、化学発光剤、生物発光剤等）、着色した分子、反応後に色を生じる分子、酵素、磁気ビーズ、放射性同位体、特異的に結合可能なリガンド、音波共鳴により検出可能な微小気泡等である。
【００１３】
本明細書において使用される「標識する」という用語は、他に述べられていない限り、プローブの存在下にラベルを導く、又は、ラベルをプローブと連結若しくは相互作用（例えば反応）させる措置を示している。
【００１４】
分析されることになる試料、好ましくは流体試料に存在する前記１又は複数の標的分子が、それだけに限らないが、以下の：
約５個のアミノ酸ユニットから５０個のアミノ酸ユニットを有するオリゴペプチド、
５０個を超えるアミノ酸ユニットを有するポリペプチド、
酵素を含めた蛋白質、
オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、
抗体、又はその断片、
ＲＮＡ、並びに、
ＤＮＡ
等の分子である場合に、本発明の方法は特に有用である。
【００１５】
特定の標的分子には、変性ステップが有益である場合があり、例えば、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に引き離し、膜上にスポットさせた捕獲プローブへのその一本鎖の特異的結合を可能にする。そのような変性ステップを、簡便な方法、例えば基板（ウエーハ又は膜）若しくは試料、又はその両方を加熱することにより、実行することができる。試料がそのような変性ステップで加熱される場合、鎖同士を引き離しておくために任意の冷却ステップを実行することができる。
【００１６】
方法のうち第１ステップにおいて前記標的となる生物学的化合物を標識するために使用され、方法のうち最後のステップにおいてその検出を最終的に可能にするラベルは、発光（蛍光、リン光、化学発光）、放射性、酵素的、比色、音波（例えば、微小気泡の共鳴）、又は磁気性質のラベルであり得る。特異的に結合可能なリガンドを、ラベルの代わりに使用することができる。この最後の場合において、リガンドは次のステップで適合性のあるラベルを含んだ物質に結合する。
【００１７】
適切な蛍光又はリン光ラベルは、それだけに限らないが、例えば、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等である。
【００１８】
適切な化学発光ラベルは、それだけに限らないが、例えば、ルミノール及びサイリューム等である。
【００１９】
適切な放射性ラベルは、それだけに限らないが、例えば、１２５Ｉ又は３２Ｐのような同位体である。
【００２０】
適切な酵素的ラベルは、それだけに限らないが、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等である。
【００２１】
適切な比色ラベルは、それだけに限らないが、例えば、コロイド金等である。
【００２２】
適切な音波ラベル（ｓｏｎｉｃ  ｌａｂｅｌ）は、それだけに限らないが、例えば、微小気泡等である。
【００２３】
適切な磁気ビーズは、それだけに限らないが、例えば、ダイナビーズ等である。
【００２４】
各標的分子を、感度を増すために、（例えば、最後のＰＣＲ増幅ステップ中に）約３００個までの同一のラベルで標識することができる。任意のステップとして、標的分子に取り込まれておらず、それでも試料流体に存在する未結合のラベルを、後の測定中のバックグラウンド信号を減少するために、化学的及び／又は物理的処理（例えば、化学的なＰＣＲ精製、透析、又は逆透析）により試料流体から除去することができる。
【００２５】
試料流体は、産業又は自然由来であり得る。本発明の方法を実行するのに適切な試料流体の例は、それだけに限らないが、哺乳動物（特にヒト）、鳥類、及び魚類を含めたいかなる動物からの喀痰、血液、尿、唾液、糞、又は血漿等の体液であり得る。他の制限しない例として、植物、線虫、バクテリア等からの生物学的物質を含めた流体が挙げられる。本発明の方法の適切な実行に対する唯一の必要条件は、前記生物学的物質が、例えば、適切な溶解培地内の溶液中等、実質的に流体、好ましくは液体状の流体に存在することである。本発明の方法において使用される試料流体の容積は、約５μｌから１ｍｌ、好ましくは約５０μｌから４００μｌのいかなる値も取ることができる。
【００２６】
多くの場合、緩衝液（例えば、ハイブリッド形成緩衝液）を、分析されることになる試料流体内に直接、又は、（例えば、流体として若しくは凍結乾燥された状態で、基板の上若しくは下に加えられる）検出ユニットの一体部分として組み入れ、このようにして、独立したハイブリッド形成緩衝液用貯蔵所の必要性を除去することが所望される。
【００２７】
テストチャンバに存在する基板は、２つの表面、上面及び下面を与えている。前記基板は多孔性であり、試料流体を前記膜の上面から下面に、及び／又は、下面から上面に通して流し込むことを可能にしている。
【００２８】
多孔性基板は、種々の形状及び寸法の複数の孔、開口部、及び／又はチャネルを有する網状組織を含むことができる。基板は、ナノポーラス又はマイクロポーラスでありえ、すなわち、孔、開口部、及び／又はチャネルの平均サイズは０．０５μｍから１０．０μｍ、優先的には０．１μｍから１．０μｍ、より優先的には０．３から０．６μｍで構成されることが適切であり得る。気孔径分布は実質的に均一であり得るか、又は、前記基板の製造技術に応じて、約１．１から約４．０までの多分散を有する場合がある。その孔、開口部、又はチャネルに対応する表面は、多孔性基板の上面又は下面の全表面のうち約１から９９％、好ましくは約１０％から９０％、及び、より好ましくは約２０％から８０％に相当することができる。
【００２９】
基板、例えば膜の厚さは、本発明の限定的な特徴ではなく、約１０μｍから１ｍｍ、好ましくは５０μｍから４００μｍ、より好ましくは７０μｍから２００μｍまで変更することができる。基板、例えば膜の形状は、本発明の限定的な特徴ではない。その形状は、例えば、直径が約３から１５ｍｍに及ぶ円形であり得るが、本発明の方法は、他のいかなる基板形状及び／又はサイズにも適用することができる。
【００３０】
プローブが与えられた（例えば、スポットされた）多孔性基板は、本発明の限定的な特徴ではなく、従って、多孔性基板上での生体分子固定化のために適切な基板として当分野においてすでに記載されているいかなる材料からも作製することができる。そのような材料の限定的ではない例として：
ポリアミドのホモポリマー若しくはコポリマー（例えばナイロン）、熱可塑性のフッ化ポリマー（例えばＰＶＤＦ）、ポリビニルハライド、ポリスルホン、ニトロセルロース若しくは酢酸セルロース等のセルロース系材料、ポリオレフィン、又は、ポリアクリルアミド等の有機ポリマー、及び
ガラス、石英、シリカ、他のシリコン含有セラミック材料、酸化アルミニウム等の金属酸化物の材料等の無機材料
が典型として挙げられる。
【００３１】
これらの基板材料は不活化できる、又は、少なくともその表面の一部を活性化できる。活性化できる場合、その活性化は、化学的又は物理的処理により行うことができる。適切な活性化の手段は、それだけに限らないが、プラズマ処理、コロナ処理、ＵＶ処理、火炎処理、及び、化学修飾を含む。材料の種類に応じて、適切な化学修飾は、それだけに限らないが、（例えばポリアミドへの）四級アンモニウムイオンの導入、加溶媒分解（例えば加水分解）、（例えばポリアミドにおける）アミド基のアミジン基への誘導体化、ヒドロキシル化、カルボキシル化、又はシリル化を含む。本発明の方法の適切な実行に活性化を必要としない基板材料の限定的ではない例は、ナイロン（ポリアミドのホモポリマー）であり、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分析に使用される場合、ナイロンはオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドに対して固有の親和性を有しているため、適切な例として挙げられる。
【００３２】
本発明に使用されるプローブは、標的となる生物学的化合物に対するその親和性、又は、前記標的となる生物学的化合物の関連する修飾に対するその親和性から適切に選ばれるべきである。例えば、標的となる生物学的化合物がＤＮＡである場合、プローブは、それだけに限らないが、合成のオリゴヌクレオチド、その類似体、又は特異的抗体であり得る。標的となる生物学的化合物の適切な修飾の限定的ではない例は、ビオチンで置換された標的となる生物学的化合物であり、その場合、プローブはアビジン官能性を有することができる。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、１を超える異なるプローブが基板に与えられ、さらにより好ましい実施形態において、複数の異なるプローブが、異なる標的の平行の測定を可能にするために、アレイ方法で、前記基板の一表面に沿って物理的に異なる位置でスポットされる。
【００３４】
後の検出及び特定をより容易に支えるために、１又は複数の追加のスポット（例えば、強度較正及び／又は位置検出用）も、基板の表面上にスポットすることができる。
【００３５】
スポッティングに続き、プローブは、その基板（例えば、膜）固有の、若しくは（例えば活性化により）獲得した性質のため自然に、又は、（例えば、それだけに限らないが、乾燥、加熱を介する、又は光源への曝露を介する架橋結合等、）追加の物理的処理ステップを介して、基板の表面上に固定化されるようになる。
【００３６】
基板（例えば、膜）、及び、基板に付着したプローブの有効期間を改善するため、膜が使用されていない時に、膜を乾燥させることは有用であり得る。膜はその後、試料流体と接触し再水和される。
【００３７】
プローブが（例えば、インクジェットスポッティングにより）基板の表面上に与えられると、基板のうちスポットされていない領域を不活性化するための遮断薬を効果的な量追加することは、スポットされていない領域への標的となる生物学的化合物の、又は、未結合ラベルの非特異的な結合（不必要なバックグラウンド信号を生じるであろう）を防ぎ、従って、信号対雑音比を増加するために有用であり得る。適切な遮断物質又は遮断薬の例として、それだけに限らないが、サケの精液、脱脂乳、又はポリアニオンが通常挙げられる。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、異なるラベルを同時に使用して：
（ｉ）異なる試料流体（例えば、血液及び喀痰のような異なる試料流体、若しくは、異なる位置から生じる異なる試料流体）からの１又は複数の標的分子、又は
（ｉｉ）  複数の試料流体からの分析物の差次発現（例えば、処理対未処理、病的対病的等）、又は
（ｉｉｉ）同じ試料流体からの異なる種類の標的分子（例えば、血液試料流体のＤＮＡ及びＲＮＡ含有量の分析）
を同時に測定することができる。
【００３９】
実際の感知ステップ中、試料流体は多孔性基板（例えば、膜）表面を通して流し込まれ、それは、試料を含んだチャンバに対する前記多孔性基板の相対的移動によるものである。より能率を良くするために、前記試料を含んだチャンバに相対した多孔性基板の移動は、試料流体を前記多孔性基板に通して流し込む間、前記多孔性基板の表面に対して実質的に垂直の方向で行うことが好ましい。次に続く分析の感度及び特異性を増加するために、前記の基板移動ステップを、同じ条件（例えば、温度、ｐＨ、若しくは、イオン濃度）設定下又は異なる条件設定下において、規則正しい又は不規則な間隔で、必要なだけ何度も繰り返すことができる。
【００４０】
チャンバに対する膜の相対的移動は、一方向又は両方向でありえ、好ましくは両方向である。一方向の場合、基板は、例えば、チャンバの一側面から前記チャンバの反対側の側面まで一度移動させられる。
【００４１】
両方向の場合、基板は、例えば、チャンバの一方の側からもう一方の側まで何度も繰り返し移動させられる。
【００４２】
チャンバに対する膜の各相対的移動の後、新たな標的分子が基板（例えば、膜）の表面に存在するプローブと結合する機会を有する。基板の移動により：
（ｉ）  標的生体分子がプローブに接触し、相互に作用するためのより短い拡散時間；小さい直径の孔により、標的分子は、前もってスポットされたプローブに近接するようになり、このようにして、相互作用／ハイブリッド形成のチャンスを有意に増し、さらに、非多孔性の基板を利用する技術に対して存在する拡散という問題を克服すること、
（ｉｉ）  結合処理の動態学を理解するために、チャンバに対する膜の各相対的移動の後、１つの測定又はプローブ検出を行うこと、及び、
（ｉｉｉ）光学検知の場合、測定領域を分離する光透過性の窓と、分析されることになる試料を含んだチャンバとの距離を減少すること
が可能になる。
【００４３】
ポンプの欠乏、及び、チャンバに相対して多孔性基板（例えば、膜）を移動させるという概念での置き換えは、起こりうるチャンバへの空気の入り込みを制限することにより泡状物質の形成を実質的に制限する、並びに、大部分の状況で抑制することを可能にする。さらに、多孔性の膜が試料流体中を移動するステップは、試料流体が混合され、同時に均質化することを保証している。
【００４４】
例えば、各基板移動ステップ又はサイクル（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｍｏｖｉｎｇ  ｓｔｅｐｓ  ｏｒ  ｃｙｃｌｅｓ）の後等、所定の数の基板移動ステップ又はサイクルの後、ラベルの存在を定量的に測定することは有用であり得る。そのような定量的測定の結果は、実際の基板の及び／又は試料流体の温度の知識と組み合わせて、標的となる生物学的化合物の動態特徴を決定することを可能にしている。試料流体を規定された温度まで加熱することは、より厳しい結合条件を与えることを介して、結合性質、特に結合特異性のより正確な調節を可能にしている。この加熱ステップは、膜若しくは試料流体、又は、その両方を加熱することによっても達成することができる。所望の温度に達した後、次に試料流体は、基板と接触させられる。
【００４５】
結合特異性及び／又は方法の感度を、それだけに限らないが、以下の適切な手段により増加することができる：
適切な温度特性を使用するステップ（例えば、任意選択で継続的な加熱ステップ間に適切な平衡時間を持った、一連の１又は複数の加熱ステップ）
基板移動サイクルの数を適応させるステップ、及び
連続した測定のために、測定されたラベル信号を信号後処理するステップ（例えば、蛍光画像を画像処理するステップ）、及び
捕獲された標的となる生物学的化合物が最適に結合する、又は、再び離れる温度を決定するステップ。
【００４６】
例えば、温度を上げた場合、測定された信号の激減により、所与の捕獲プローブ−標的となる生物学的化合物複合体の分離（溶解）温度に達したことが示される。この性質を使用して、特異的結合と非特異的結合を区別することができる。特異性をさらにもっと改善するために、溶解温度の許容限界を超えた後にも、測定サイクルを続けることができる。この場合、標的となる生物学的化合物の再結合が、適切な特異的溶解温度よりも下で再び発生することを確かめるために、継続的に温度は下げられる。
【００４７】
次に、方法のうちの任意の最終ステップは、未結合のラベル及び／又は分子によるバックグラウンド信号をさらに減少するために、検出チャンバから残りの試料流体を除去することにある。
【００４８】
検出チャンバの形状は、未結合のラベル及び／又は分子が、測定中、例えば、（ラベルが発光分子である場合に）膜の下にある試料流体から放出される光に対する光路長の妨害を介して、又は、光透過性の窓の近くまで膜を動かし、それによって上澄み液をなくすことにより、検出システムから隠れるように設計されるのが好ましい。内蔵のホイッパーにより上澄み液をホイップすることによって、バックグラウンド信号をさらに減少することができる。試料流体の除去並びに検出チャンバの形状の設計により、検出システムに面している基板表面並びに膜の反対側が最小限の量の試料流体を表面層として有することが保証されている。これは、未結合ラベル及び／又は未結合分子からのバックグラウンド信号を減少する。
【００４９】
基板が試料流体と適切な時間の間接触した後、例えば、適切な膜移動サイクルの後、プローブに結合した標的となる生物学的化合物のラベルが検出及び測定される。さらに、膜の移動の間も、ラベルを測定することができる。
【００５０】
観察された各信号の物理的な位置、性質、及び強度により、どの標的となる生物学的化合物が捕獲されたかを特定する、どの試料からこの標的となる生物学的化合物は生じているか、及び／又は、どの種類の生物学的化合物に属しているか特定する、並びに、その濃度を評価することが可能である。
【００５１】
本発明の方法の最終ステップにおける基板の分析を、落射蛍光顕微鏡及びＣＣＤ（電荷結合素子）カメラ、又はいかなる他の種類のカメラを含んだ光学機構により実行することができる。この光学機構は、蛍光ラベル又はリン光ラベルの場合、そのそれぞれの励起波長でラベルを励起する能力を持つ（好ましくはＵＶ）光源を含んでいることが好ましい。
【００５２】
化学発光ラベルの検出は、例えば、ラベルに適切な反応物質を添加し、その蛍光を顕微鏡の使用により観察することによって実行される。
【００５３】
放射性ラベルの検出は、例えば、医用Ｘ線フィルムを基板に対して直接配置することにより実行される。Ｘ線がラベルに曝露されるに従い現れ、黒い領域をつくりだし、その黒い領域は、関心のあるプローブの位置に合致している。
【００５４】
酵素的ラベルの検出は、例えば、ラベルに適切な基質を添加し、酵素により触媒された反応の結果（例えば、色の変化）を観察することにより実行される。
【００５５】
比色ラベルの検出は、例えば、ラベルに適切な反応物質を添加し、結果として生じる状況又は色の変化を観察することにより実行される。
【００５６】
音波微小気泡ラベルの検出は、例えば、前記ラベルを特定の周波数の音波に曝露し、結果として生じる共鳴を記録することにより実行される。
【００５７】
磁気ビーズの検出は、例えば、磁気センサにより実行される。
【００５８】
本発明の方法は、本明細書において上記のように、相当数の要素への言及により記述されてきた。その要素のそれぞれが、好ましい、若しくは、さらにより好ましい価値基準又は実施形態の可能な選択を含んでいる。要素の特定の組合せに関して、他に説明がない限り、１つのそのような要素に対する各好ましい範囲又は実施形態を、１又は複数の他の要素に対する各好ましい範囲又は実施形態と任意に組み合わせることができるということが理解されたい。
【国際調査報告】
2009520979.tif 000002
2009520979.tif 000003
2009520979.tif 000004