(57)【要約】  核酸の混合物中の突然変異体核酸を増大させるための方法であって、(a)親核酸および親核酸の突然変異体核酸を含む核酸混合物を用意するステップ、および(b)核酸混合物中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するステップを含み、突然変異体核酸は、完全に相補的な核酸配列と対形成して親核酸のAPリッチ核酸変異体を形成する親核酸のG→A突然変異体であり、親核酸の増幅を可能にする最低変性温度(Tp)よりも1〜3℃低い変性温度を使用してPCRを実施することにより、ATリッチ核酸変異体を変性させ、選択的に増幅して、それにより核酸混合物中の突然変異体核酸を増大させる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の混合物中のGCリッチ核酸、特にGCリッチ突然変異核酸をin vitroで増大させるための方法であって、GCリッチ核酸、特にGCリッチ突然変異核酸は、存在する場合、親核酸に対してGCが増大した核酸であり、
(a)前記親核酸および前記親核酸のGCリッチ核酸を含む核酸混合物を用意するステップ、
(b)核酸混合物中の核酸の示差的増幅をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって実施するステップであって、前記示差的増幅のために、親核酸の増幅を可能にする最低変性温度(Tp)よりも1〜10℃、例えば1〜6℃特に1〜3℃低い変性温度を使用してPCRを実施することにより、GCリッチ核酸を変性させ、選択的に増幅して、それにより核酸混合物中のGCリッチ核酸を増幅し、
前記示差的PCRを、デオキシイノシン(dITP)を含む反応媒体、またはデオキシ2,6-ジアミノプリン三リン酸(dDTP)を含む反応媒体、またはdITPおよびdDTPを含む反応媒体中で実施するステップ、および
(c)任意選択で、PCRの産物を検出するステップを含む方法。
【請求項２】
ステップa)が、
(i)任意選択で、逆転写のステップおよび/または任意選択で標準的な増幅のステップ、例えば親核酸およびGCリッチ核酸、特に突然変異体または変異体または対立遺伝子の混合物を増大させるためのPCR増幅を実施すること、および
(ii)特にPCR反応によって前記核酸混合物のDNA(開始DNA)を、グアニン塩基(G)がイノシン塩基(I)に変換され、アデノシン塩基(A)が2,6-ジアミノプリン塩基(D)に変換されているDNAに変換することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
示差的増幅が、等モル比のdTTP、dCTP、dDTPおよびdITPを使用して実施される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
増幅が、Taqポリメラーゼまたはその変異体を用いて実施される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
核酸の混合物が、増幅するGCリッチ核酸に対応する前記親核酸を欠いている、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
標準的な増幅が、以下のバッファー条件、50μlの最終体積中、2.5mMのMgCl2、50mMのKCl、10mMのTris-HCl(pH8.3)、200μMの各プライマーおよび5UのTaqDNAポリメラーゼまたはその変異体で実施される、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
示差的増幅が、変換ステップの結果として得たDNA物質の分画に対して実施される、請求項2から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
示差的増幅が、変性温度中に温度勾配を作製して、対応する親核酸の増幅に対して選択的にGCリッチ突然変異核酸の増幅を可能にすることができるPCR条件で実施される、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
示差的増幅に関する温度勾配が、親核酸に関する最小変性温度を決定するのに適している、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
示差的増幅が、1〜15℃、特に1〜10℃の範囲の変性温度勾配で実施される、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
重合が、GCリッチ核酸の最小変性勾配温度と等しい一定温度で実施され、および/または最終伸長ステップが同じ温度で実施される、請求項8から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
標準的な増幅がネステッドPCRとして実施される、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
示差的増幅におけるPCRに使用するプライマーが、その3'末端の1〜6ヌクレオチドにおいてAおよびT核酸塩基を欠いている、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
核酸の混合物中で増大する標的突然変異核酸が対象の遺伝子の断片であり、前記断片が突然変異、特に超変異に対して感受性である、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
増大する標的突然変異核酸が、多型を含む対象の遺伝子の断片である、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
増大するGCリッチ核酸が、病原性生物、または宿主における病状と関係がある遺伝子に由来する、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
病原性生物がウイルスである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスが弱毒化株である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスがRNAウイルスまたはDNAウイルスであり、特にレトロウイルスまたはネガティブRNAウイルス、セグメントまたは非セグメントネガティブRNAウイルスのいずれか、特にMVまたはRVFVを含めたパラミクソウイルス科などのモノネガウイルス目である、請求項16から17のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
宿主における病状と関係がある遺伝子が腫瘍状態と関連している、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
GCリッチ核酸が、完全に相補的な核酸配列と対形成する、親核酸のA→G、A→C、T→GまたはT→C対立遺伝子、変異体または突然変異体である、請求項1から20のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
GCリッチ核酸変異体が、親核酸の小さな欠失突然変異体である、請求項1から21のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
欠失が1bpまたは2bpを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
核酸混合物が、親核酸、および親核酸の増幅と比較して選択的に増幅される親核酸の1個または数個のA→GまたはA→C突然変異体を含む、請求項1から23のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
核酸の混合物中の突然変異核酸を増大させるための方法であって、
(a)親核酸および親核酸の突然変異核酸を含む核酸混合物を用意するステップ、
(b)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって核酸混合物中の核酸を増幅するステップ、および
(c)任意選択で、PCRの産物を検出するステップを含み、
突然変異核酸が親核酸のATリッチ核酸変異体であり、
親核酸の増幅を可能にする最低変性温度(Tp)よりも1〜3℃低い変性温度を使用してPCRを実施することにより、ATリッチ核酸変異体を変性させ、選択的に増幅して、それにより核酸混合物中の突然変異核酸を増大させる方法。
【請求項２６】
ATリッチ核酸変異体が、完全に相補的な核酸配列と対形成する、親核酸のG→A、C→A、G→TまたはC→T突然変異体である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
ATリッチ核酸変異体が親核酸の小さな欠失突然変異体である、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
欠失が1bpまたは2bpを含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
核酸混合物が、親核酸、および親核酸の増幅と比較して選択的に増幅される親核酸の1個のG→AまたはC→A突然変異体を含む、請求項25から28のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
核酸混合物が、親核酸、および親核酸の2個以上のG→AまたはC→A突然変異核酸を含み、各突然変異核酸が親核酸の増幅と比較して選択的に増幅される、請求項25から28のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
核酸混合物が、親核酸、および60%までのG残基が親核酸中のAによって置換されている親核酸の1個のG→A突然変異核酸を含み、混合物中の突然変異核酸が親核酸の増幅と比較して選択的に増幅される、請求項25から29のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
示差的増幅におけるPCRに使用するプライマーが、その3'末端の1〜6ヌクレオチドにおいてGおよびC核酸塩基を欠いている、請求項25から31のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
PCRの産物が、アガロースまたはアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、またはクロマトグラフィーによって検出される、請求項1から32のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
PCRの産物がゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーによって検出される、請求項1から33のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
PCRの産物がゲル中の相対的な位置によって同定される、請求項1から33のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
突然変異核酸が核酸混合物中の親核酸の超変異体であり、変性温度がTpよりも約1℃〜約3℃低い、請求項1から35のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
突然変異核酸が、親核酸と比較して1〜18個のG→A突然変異を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項３８】
PCRによる核酸の増幅のステップb)が修飾塩基を用いて実施される、請求項1から37のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
修飾塩基がdUTP、4-メチルdCTP、5-ブロモdCTP、または5-ヨードdCTP、またはこれらの混合物である、請求項25に記載の方法。
【請求項４０】
PCRによる核酸の増幅のステップb)が、テトラエチル-塩化アンモニウム、メタノール、またはポリエチレングリコールを含む非標準的PCRバッファーを用いて実施される、請求項25に記載の方法。
【請求項４１】
親核酸が40〜500塩基を含む、請求項1から40のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
親核酸が40〜80塩基を含む、請求項1から41のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
親核酸がHIV-1またはHIV-2核酸からなる、請求項1から42のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
親核酸がウイルス核酸(HIV、ポリオウイルス、麻疹ウイルス)である、請求項1から42のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
親核酸がポリオウイルス核酸である、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
親DNAの起源をin vitroで特徴付けるための、またはヒト遺伝子障害に特徴的な突然変異を検出するための、請求項1から45のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項４７】
抗レトロウイルス剤に耐性があるHIVのG→A突然変異菌株(G→A超変異体)を検出するための、またはHIVのA->G突然変異菌株(A→G超変異体)を検出するための、請求項1から46のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項４８】
ワクチン関連麻痺性灰白髄炎を引き起こす神経毒性ワクチン由来ポリオウイルス分離株を検出するための、請求項1から47のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項４９】
親核酸および突然変異核酸が麻疹ウイルスに由来する、請求項44に記載の方法。
【請求項５０】
核酸の混合物中の突然変異核酸を増大させるための方法であって、
(a)親核酸の突然変異核酸を含む核酸混合物を用意するステップ、
(b)核酸混合物中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するステップ、および
(c)任意選択で、PCRの産物を検出するステップを含み、
突然変異核酸が親核酸のATリッチ核酸変異体であり、
親核酸の増幅を可能にする最低変性温度(Tp)よりも1〜3℃低い変性温度を使用してPCRを実施することにより、ATリッチ核酸変異体を変性させ、選択的に増幅して、それにより核酸混合物中の突然変異核酸を増大させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の混合物におけるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸、特に突然変異核酸の示差的増幅に関する。より詳細には本発明は、核酸の混合物中の、特異的ATを有するか、あるいは特異的GC組成を有する1つまたは複数の核酸、例えば増幅の標的としてみなされる1つまたは複数の突然変異核酸のコピーを優先的に増幅することに関するものであり、前記混合物は突然変異核酸のコピーの混合物を増大させるために突然変異核酸の親核酸もおそらく含む。
【背景技術】
【０００２】
特定の対立遺伝子または突然変異の同定および特徴付けは、生物学および医学の各部門において歴史的に重要である。突然変異の研究は、通常の生理プロセスと疾患の原因の両方の機構および経路の理解に有意に貢献してきている。現在はタンパク質の構造と機能の間の関係、および遺伝子型と疾患表現型の間の相関関係の研究に移行している。
【０００３】
分子遺伝学および生物学における様々な発展は、ヌクレオチド配列レベルで遺伝子を分析する能力に大変革をもたらした。分子病理学の進展において新たに生じた制約は、突然変異遺伝子型と疾患表現型を関連付ける能力であるようである。
【０００４】
したがって、核酸配列中の1個または数個の塩基に対する改変と関係がある、わずかな突然変異または多型を検出する必要性が当技術分野において存在する。より詳細には、混合物中の突然変異核酸のコピーを選択的かつ優先的に生成する必要性が当技術分野において存在し、前記混合物は親核酸もおそらく含み、したがって突然変異核酸をさらに試験することができる。これらの目的のために、方法はサンプルの質および量、時間、および手動労力に関する要件を減らしながら、特定配列の迅速な分析を可能にしなければならない。
【非特許文献１】Buttinelliら、J.Gen.Virol.2003、84、1215〜1221
【非特許文献２】Georgescuら、J.Viral.1997、71、7758〜7768
【非特許文献３】Maniatis(Molecular Cloning)
【非特許文献４】Jarmuzら、2002;http://genecards.bcgsc.bc.ca
【非特許文献５】www.iah.bbsrc.ac.ulc/virus/picornaviridae/SequenceDatabase/alignments/entero_pep.txt
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明は、当技術分野においてこの必要性を満たすのを容易にする。本発明の一実施形態は、核酸の混合物中の突然変異核酸を増大させるための方法を提供する。この方法は、(a)親核酸および親核酸の突然変異核酸を含む核酸混合物を用意するステップ、および(b)核酸混合物中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するステップを含む。突然変異核酸は、親核酸のATリッチ核酸変異体である。親核酸の増幅を可能にする最低変性温度(TpまたはTd)よりも1〜3℃低い変性温度を使用してPCRを実施することにより、ATリッチ核酸変異体を変性させ、選択的に増幅する。それにより、突然変異核酸が核酸混合物中で増大する。一実施形態では、親核酸のG→A突然変異体は、完全に相補的な核酸配列と対形成して、APリッチ核酸変異体を形成する。
【０００６】
本発明は、核酸の混合物中の突然変異核酸を増大させるための方法であって、(a)親核酸および親核酸の突然変異核酸を含む核酸混合物を提供するステップ、および(b)核酸混合物中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するステップを含む方法も提供する。この実施形態中の突然変異核酸は、親核酸のGCリッチ核酸変異体である。親核酸の増幅を可能にする最低変性温度(TpまたはTd)よりも1〜3℃低い変性温度を使用してPCRを実施することにより、GCリッチ核酸変異体を変性させ、選択的に増幅して、それにより核酸混合物中の突然変異核酸が増大する。PCRは、デオキシイノシン三リン酸(dITP)を含む反応媒体、または2,6-ジアミノプリン三リン酸(dDTP)を含む反応媒体、またはdITPおよびdDTPを含む反応媒体中で実施する。
【０００７】
本発明の方法は、PCRの産物を検出する任意選択のステップを含むことができる。さらに、親核酸の不在下でPCRを実施することができる。
【０００８】
図面を参照しながら、本発明をさらに詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
アデノシン(A)はチミン/ウラシル(T/U)と対形成し、一方グアノシン(G)はシチジン(C)と対形成することは遺伝学の自明の理の1つである。対形成は、A:T対に関して2個、G:C対に関して3個の非共有水素結合を含む。
【００１０】
同科由来のウイルスゲノムは広範囲のそれらのDNAのGC含有量を示す可能性があり、一方ウイルス超変異体はそれらの親ゲノムからのGC含有量が実質的に異なる。AT多量DNAはGC多量DNAより低い温度で溶解するので、PCR中のより低い変性温度の使用は準種内のAT多量ゲノムまたは変異体の示差的増幅を可能にするはずである。最初にウイルスゲノムに実施したこの実験観察から、サンプル中のATリッチ核酸を選択的に増幅するための、より一般的に利用可能な方法が導かれている。後者の状況は、それらのAT含有量が異なる一連の明確に定義されたウイルス配列を使用することによる、2ステップの方法で明らかに検索されてきている。第一に、親配列の増幅を可能にする最低変性温度(Tp)を決定した。第二に、AT多量ウイルス変異体の示差的増幅を、Tpより1〜3℃低い変性温度を使用することにより実施した。この高感度法を2つの異なるウイルスに適用することによって、ポリオウイルス突然変異のスペクトル内でAT多量変異体が選択的に増幅するとは予想しなかった状況で、ヒト免疫不全ウイルス1型のG→A超突然変異を同定することができた。
【００１１】
したがって、本発明による方法は、1個から多くのGC→AT転移が異なるDNAセグメントの示差的増幅を可能にする。置換度はDNAの溶解温度に直接影響を与えるので、変性温度が低いほど、増幅されるゲノムは置換される。異なる遺伝子座は広く異なる塩基組成を有する可能性があるので、各セグメントに関する状態を最適化することができる。ウイルス核酸に最初に実施したこの観察は、細菌性またはヒト遺伝子を含む細胞核酸を含めた、他の供給源の核酸にさらに拡大している。したがって本発明の方法は、起源に関係なくゲノムDNA、またはcDNA(逆転写されたRNA)を含めたDNAに適用する。核酸の適切な供給源はウイルス、DNAまたはRNAウイルスのいずれか、特にネガティブRNAウイルス、またはレトロウイルスである。RNAネガティブウイルスは、セグメントまたは非セグメントウイルスである。例はHIV-1、HIV-2、ポリオウイルス、および麻疹ウイルスである。核酸の他の供給源は、細菌などの他の病原性生物である。本発明は細胞核酸、または腫瘍関連抗原に特徴的な核酸に実施することもできる。
【００１２】
本発明はその広義において、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNAのセグメントの増幅に関する。本明細書で使用する用語「ポリメラーゼ連鎖反応」および「PCR」は、標的DNA中の対向鎖とハイブリダイズし当該の領域と隣接する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、特異的DNA配列の酵素合成のためのin vitro法として、それらの従来の意味で使用する。鋳型変性、プライマーアニーリング、およびDNAポリメラーゼによるアニーリングプライマーの伸張を含む一連の反復サイクルは、プライマーの5'末端によってその末端が定義される特異的断片の指数関数的蓄積をもたらす。1サイクル中で合成されるプライマー伸張産物は次のサイクル中で鋳型として働くことができるので、標的DNAのコピー数は各サイクルで約2倍になる。サーマスアクアチクス(Thermus aquaticus)または変異体から単離したTaqポリメラーゼ、または関連Taqポリメラーゼなどの熱安定性DNAポリメラーゼの使用は、簡潔かつ確実な形式での本発明のPCR反応の実施を可能にし、これは従来の熱サイクルデバイスを使用して自動化することができる。
【００１３】
本発明のPCR反応は、従来の反応要素、鋳型DNA、プライマー、Taqまたは他のポリメラーゼ、dNTP、およびバッファーなどを使用して実施することができる。反応チャンバー内の温度を単に循環させることによって、従来の方法で反応を実施することができる。増幅反応の特異性および収率は、よく知られているパラメータ、酵素、プライマー、dNTP、およびMg++濃度、および温度サイクルプロファイルなどを調節することによって制御することができる。
【００１４】
PCRを本発明に従って使用する広く様々な適用例のために、全ての状況に関する1セットの条件を記載することはできない。製造者によって推奨される「ステップ-サイクル」プログラムおよび試薬を使用してDNAサーマルサイクラー(Perkin-Elmer Cetus Instruments)において、増幅を最初に実施することができる。オリゴヌクレオチドプライマーの任意の所与の対に関して、最適なセットの条件をしたがって確立することができる。
【００１５】
ひとたび増幅する標的核酸配列用の試薬およびステップ-サイクルプログラムを確立した後、親配列の増幅を可能にする最低変性温度を決定する。この最低変性温度はTpと呼ぶ。ATリッチ核酸変異体(対立遺伝子とも表す)、または本発明の他の態様ではGCリッチ核酸変異体(対立遺伝子とも表す)のいずれかの示差的増幅は、ATリッチ核酸に関する同じ試薬、またはGCリッチ核酸に関する本明細書に以後記載する異なる試薬、およびPCRの各サイクルに関する変性温度がTpより約1〜10℃、特に約1〜6℃、およびより詳細には約1〜3℃、好ましくは1℃低いこと以外同じステップ-サイクルプログラムを使用することによって実施する。したがって、PCRの変性ステップに利用する温度は、突然変異核酸が親核酸に対して優先的に増幅される温度であるはずである。優先的増幅は、例えばゲル電気泳動によって、あるいはPCR産物の直接的なシークエンシングによって、あるいは標識プローブを用いた検出によって測定することができる。
【００１６】
本発明の方法中で利用する核酸混合物は、親核酸および/または少なくとも1個の親核酸の突然変異核酸を含むことができる。第一の実施形態では、突然変異核酸は親核酸に対する少なくとも1個のG→A突然変異を含み、塩基対形成後に親核酸のATリッチ核酸変異体を形成することができる。他の実施形態では、突然変異核酸は親核酸に対する少なくとも1個のA→G突然変異を含み、塩基対形成後に親核酸のGCリッチ核酸変異体を形成することができる。混合物が異なる遺伝子座にG→AとA→G突然変異の両方を有する突然変異核酸を含むことができる、あるいは混合物が1つまたは複数のG→A突然変異または1つまたは複数のA→G突然変異のいずれかをそれぞれ含む2個以上の核酸突然変異体を含むことができることは理解されるはずである。突然変異核酸中の突然変異の数は、親核酸と比較して典型的には1〜18個の突然変異である。
【００１７】
本発明の方法は、起源が何であれ任意のDNAまたはcDNA(逆転写RNA)断片に適用する。特に診断用途における、本発明のPCR反応の重要な性質は、粗製DNA調製物から、および分解したDNA鋳型から標的配列を増幅する能力である。増幅するサンプル中のDNAは、サンプルがポリメラーゼの阻害剤を含まないという条件で、鋳型として働くために化学的に純粋である必要はない。粗製DNAサンプルから特定の配列を増幅する能力は、研究用途、医学的診断用途、および科学捜査に関する重要な関係を有する。
【００１８】
PCR中で使用するプライマーは、それらが塩基対形成する配列に対するミスマッチを含む可能性がある。例えば、本明細書の以後の実施例中でHIV-1エンベロープ遺伝子のV1V2領域とのハイブリダイズのために使用したプライマーSK122/SK123に関して記載したのと同様に、プライマーは縮重性である可能性がある。プライマーが、それらが塩基対形成する配列に対するミスマッチを含む場合、PCRのハイブリダイゼーションステップは、PCRの変性ステップと無関係に最適化することができる。さらに、プライマーが親配列に対するミスマッチを含む可能性があることは理解されるはずである。
【００１９】
プライマーの長さが、本発明の方法を実施する際に重要であることは分かっていない。標準的な長さのプライマーを利用することができ、最適なプライマーの長さは通常の実験によって決定することができる。典型的には、プライマーは約20〜25bpであるはずであるが、さらに長いかあるいは短くてよい。
【００２０】
同様に、親配列の長さが、本発明の方法を実施する際に重要であることは分かっていない。典型的には、親配列は約500bpまでであり、特に約40〜約500塩基を有するはずである。さらに長いかあるいは短い配列を利用することができることは、理解されるはずである。
【００２１】
さらに、増幅する標的突然変異核酸のサイズは、本発明の方法において重要であることは分かっていない。約500bpまでの突然変異核酸を利用することができるが、さらに短い配列を使用することが、より好都合であることが多いはずである。
【００２２】
2つのプライマー間のウインドウとも呼ばれる増幅する突然変異核酸の領域は、標的核酸に応じて変わる可能性がある。例えば、増幅する領域は約20、30、40、50、60bp、または80bpを含むことができるが、さらに長いかあるいは短い配列が本発明によって企図される。p12ras遺伝子に関する19および30bpの増幅領域を、本明細書の以後の実施例中に記載する。
【００２３】
幾つかの場合、増幅領域が増幅核酸を検出する方法に影響を与える可能性がある。例えば、単一点突然変異を検出するためには、2つのプライマー間のウインドウは3〜12ヌクレオチドであってよいが、この場合20bpのプライマーを使用して、PCR産物のバンドは約43〜52塩基対である。このサイズの核酸分子はアガロースゲル中での電気泳動によって容易に検出することはできないが、それらはポリアクリルアミドゲル中で検出することができる。
【００２４】
任意の事象において、検出法を増幅PCR産物の特性に適合させることが可能である。好ましい検出法は、アガロースまたはアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、またはクロマトグラフィー、特にゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーである。
【００２５】
本発明の方法は広く様々な用途を有する。例えば、本発明の方法を利用して親DNAの起源を特徴付けることができ、あるいはヒト遺伝子障害に特徴的な突然変異を検出することができる。本発明の方法は、抗レトロウイルス剤に耐性があるHIVのG→A突然変異菌株、特にG→A超変異体を検出するためにも利用することができる。さらに、本発明の方法は、ワクチン関連麻痺性灰白髄炎を引き起こす神経毒性ワクチン由来ポリオウイルス分離株を検出するために利用することができる。ポリオウイルスのワクチン株のヌクレオチド変異に関する書誌参照文献に関しては、Buttinelliら、J.Gen.Virol.2003、84、1215〜1221およびGeorgescuら、J.Viral.1997、71、7758〜7768を参照。本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して、麻疹ウイルスから親核酸および突然変異核酸を増幅する。
【００２６】
本発明の方法は、事前に特徴付けおよびシークエンスした特定部位における特定の突然変異を検出するのに有用であることは、理解されるはずである。本発明の方法は、所与の長さのDNAにおける未知の配列の違いの存在を検出するのにも有用である。本発明の方法は知られている突然変異を検出するのに有用であり、多数の対立遺伝子の遺伝子座を迅速に検出するのに特に有用である。本発明の方法を使用して1または2bpの欠失などの小さな欠失を含む配列を増幅することもできることは、理解されるはずである。
【００２７】
本発明の方法は示差的増幅を可能にするが、それ自体は定量的ではない。しかしながら、投入DNAの限界希釈と結び付けて、サンプル内のAT多量ゲノムの分画を定量化することができる。あるいは、TaqmanPCRを95℃および選択温度で実施して、サンプル当たりのコピー数を測定することができる。2つの値の比は、全対立遺伝子の全体濃度に対するAT多量対立遺伝子の相対濃度を与えることができる。
【００２８】
本発明による方法は、DNAの溶解温度にわずかに影響を与える可能性がある修飾塩基を使用する変形を含む。例えば、dUTPを使用してdTTPを置換することができる(図5)。その違いは、わずかであるはずである。同様に、5-メチルdCTP、5-フルオロdCTP、5-クロロdCTP、5-ブロモdCTP、または5-ヨードdCTPなどのdCTPの修飾誘導体を使用することができ、これらはTaqポリメラーゼまたは他の熱安定性DNAポリメラーゼによってDNA中に取り込ませることが可能である(図5)。これらのdCTP類似体は、DNA中に取り込まれると、DNAがより高い温度に溶解するので特に興味深い(Hoheiselら、1990、Wongら、1991)。したがって、これらの修飾塩基のいずれか1つの使用によって、親配列とAT多量対立遺伝子の間の区別が進むはずである。
【００２９】
同様に、本発明の方法は非標準的PCRバッファー条件の使用、特に幾つかの塩および塩濃度の使用、ならびに有機分子の使用を含む。イオンの性質およびイオン強度、例えばテトラエチル塩化アンモニウム(Muraokaら、1980)、および2例だけ列挙するとメタノールまたはポリエチレングリコールなどの小さな有機分子の使用(Muraokaら、1980、Votavovaら、1986)によって、変性温度が影響を受ける可能性があることはよく知られている。
【００３０】
本発明の方法を使用して、対立遺伝子における小さな欠失を検出することができる。溶解温度は、2つの対立遺伝子を区別する水素結合の数の関数である。一塩基の欠失は2または3個の水素結合を除去するはずであり、それ故より低い温度に溶解するはずである。大きな欠失はさらに容易に検出されるはずである。それ故、本発明の方法を使用して、小さな欠失を有する対立遺伝子、例えば疾患易罹患性遺伝子と関係があるミトコンドリアDNAまたはマイクロサテライトを選択的に増幅することができるが、これらは実施例として述べ、本発明を制限するものではない。
【００３１】
標的核酸の増幅する領域のサイズ、すなわちPCR断片のサイズを60〜80塩基に縮小することによって、1つのGC→AT置換によって異なる対立遺伝子を示差的増幅することが可能である。それ故、本発明の方法は単一ヌクレオチド多型(SNP)の検索において使用することができる。温度に基づくと、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは必要ではない。
【００３２】
観察のウインドウは一般に10〜30塩基(60〜80bp-2×25bpのプライマー)であり、本発明の方法は、それが対立遺伝子の溶解温度を低下させるという条件で、任意の突然変異を検出することができる。GC→AT置換はヒト遺伝子障害、p53不活性化突然変異またはオーソロガス遺伝子と比較した偽遺伝子の突然変異を特徴付ける最も頻繁な置換(40〜50%)であるので、本発明の方法は、血液サンプル中の腫瘍前細胞を特徴付ける突然変異を検出するため、あるいはSNP分類によるヒト遺伝子型の特徴付けにおいて適用することができる。
【００３３】
「3DPCR」(示差的DNA変性-PCRで)表す本発明の方法を使用して、通常の対応物からAT多量対立遺伝子を選択的に増幅することができる。これはA:T塩基対は2個の水素結合を含み、一方G:C対は3個を含む事実に従う(図1)。したがって、AT多量対立遺伝子の変性温度は、通常の対応物の変性温度よりわずかに低いことが実証されている。通常の対応物と比較したG:C多量対立遺伝子の逆の選択的増幅は3DPCRによる分析に適していない、何故ならそれは通常の対立遺伝子より高い温度で溶解する可能性があり、かつ高温では通常の対立遺伝子とGC多量対立遺伝子の両方が増幅する可能性があるからである。
【００３４】
本発明はこの問題に対処する他の方法を提供する。デオキシイノシン三リン酸(dITP)は、核酸、特に参照の対立遺伝子と比較したGCリッチ核酸、特にGC多量対立遺伝子の選択的増幅用に設計したPCRにおいてdGTPに置換することができる。イノシンはグアノシンと比較して位置2にアミノ基を欠いている。結果として、dITPはdCTPとわずか2個の水素結合を形成する(図5)。それ故、水素結合の数が3個から2個に減少しながら、その情報と共に、塩基対形成の特異性が保たれる(GまたはIはCと対形成する)。対照的に、2,6-ジアミノプリン(D)は、アデノシン(2-アミノプリン)と比較して追加的なアミノ基を有する。さらに、それは3個の水素結合によってチミジンと塩基対形成する(図5)。ここでも情報内容は保たれる(DまたはAはTと対形成する)。したがってdDTPを使用して、核酸、特に参照の対立遺伝子と比較したGCリッチ核酸、特に対立遺伝子の選択的増幅用に設計した示差的PCRにおいてdATPを置換することができる。
【００３５】
本発明の特定の態様では、選択的増幅によって参照核酸のGC多量突然変異体または超変異体を増幅することができる。
【００３６】
したがって、dDTPおよびdITPはPCR反応においてそれぞれdATPおよびdGTPを置換することができることは知られているが、実際両者を同一反応内で使用することができ、そのように誘導したPCR物質は、標準塩基、dATPおよびdGTPを有する産物と比較して逆の溶解性を有するはずである。G:C多量対立遺伝子(I:C実際、2個の水素結合)は、通常のA:T対立遺伝子よりわずかに低い温度で溶解するはずである(D:T実際、3個の水素結合)。
【００３７】
したがって、これらの修飾塩基を用いて本発明の3DPCRを実施することによって、A:Tリッチ核酸、特に対立遺伝子を選択的に増幅することができ、および3DIPCRを実施することによって、C:Gリッチ核酸、特に対立遺伝子を選択的に増幅することができる。したがって本発明は、より低い溶解温度を使用して、部分的に低いDNA溶解温度によって区別することができる核酸の小集団、特に対立遺伝子を増幅することに関する。したがって本発明は、G:C多量対立遺伝子をより低い温度で溶解するDNAに転換するための手段としてのdDTPおよびdITPの使用も含む。本発明のこの方法は「逆3DPCR」または「i3DPCR」または「3DIPCR」と呼び、それが3DPCRが増幅するA:T多量対立遺伝子ではなくG:C多量対立遺伝子を増幅することができることを強調する。
【００３８】
ウイルスRNAのアデノシン脱アミノ化に対するさらに新たな関心が近年存在する。これはインターフェロン誘導型宿主細胞酵素、ADAR、およびそのイソ型によるRNA中のアデノシン残基の編集に起因する。この酵素はAを脱アミノ化してイノシン(I)が生成する。反復すると、これによってA→G超変異体が生成する。というのは前述のように、IはGと同様に対形成するからである。
【００３９】
したがって、本発明は、核酸の混合物中のGCリッチ核酸をin vitroで増大させるための方法であって、GCリッチ核酸は、存在する場合、親核酸に対してGCが増大した核酸であり、
(a)前記親核酸および前記親核酸のGCリッチ核酸を含む核酸混合物を用意するステップ、
(b)核酸混合物中の核酸の示差的増幅をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって実施するステップであって、前記示差的増幅のために、親核酸の増幅を可能にする最低変性温度(Tp)よりも1〜10℃、例えば1〜6℃特に1〜3℃低い変性温度を使用してPCRを実施することにより、GCリッチ核酸を変性させ、選択的に増幅して、それにより核酸混合物中のGCリッチ核酸を増幅し、
前記示差的PCRを、デオキシイノシン三リン酸(dITP)を含む反応媒体、またはデオキシ2,6-ジアミノプリン(dDTP)を含む反応媒体、またはdITPおよびdDTPを含む反応媒体中で実施するステップ、および
(c)任意選択で、PCRの産物を検出するステップを含む方法に関する。
【００４０】
表現「GCが増大した核酸」は、前記核酸のGおよびC核酸塩基の組成が、親核酸に対するGおよび/またはC核酸塩基によるA、T、および/またはU核酸塩基の置換の結果として、親核酸の組成に対して増大していることを意味する。
【００４１】
本発明の特定の実施形態によれば、GCリッチ核酸は、親核酸に対する突然変異核酸である。
【００４２】
特定の実施形態によれば、GCリッチ核酸(特に核酸の混合物中のGCリッチ突然変異体または変異体または対立遺伝子)は、前に開示したステップaと同様である)を増幅する(増大する)ための本発明の方法は、
(i)任意選択で、逆転写のステップおよび/または任意選択で標準的な増幅のステップ、例えば親核酸およびGCリッチ核酸(特に突然変異体または変異体または対立遺伝子)の混合物を増大させるためのPCR増幅のステップを実施すること、および
(ii)特にPCR反応によって前記核酸混合物のDNA(開始DNA)を、グアニン塩基(G)がイノシン塩基(I)に変換され、アデノシン塩基(A)が2,6-ジアミノプリン塩基(D)に変換されているDNAに変換することを含む。
【００４３】
本発明のこの方法の特定の実施形態によれば、示差的増幅は、等モル比のdTTP、dCTP、dDTPおよびdITPを使用して実施される。
【００４４】
この方法の特定の実施形態によれば、増幅を実施するのに適したポリメラーゼは、Taqポリメラーゼまたはその変異体、例えば本願明細書に例示したものである。
【００４５】
本発明の方法の他の特定の実施形態によれば、核酸の混合物は、増大させるGCリッチ核酸に対応する前記親核酸、特に親核酸のGCリッチ突然変異体、変異体または対立遺伝子を欠いている。
【００４６】
以下の条件は、増幅に適したバッファー条件の一例を表す:50μlの最終体積中、2.5mMのMgCl2、50mMのKCl、10mMのTris-HCl(pH8.3)、200μMの各プライマーおよび5UのTaqDNAポリメラーゼまたはその変異体。より一般的には、PCR増幅は、以下の実施例中に詳述しManiatis(Molecular Cloning)中などの文献中でも開示されたような、当業者によく知られている条件で実施する。
【００４７】
核酸混合物の親核酸のGCリッチ突然変異体、変異体または対立遺伝子を増大させる(増幅する)ための開示した方法の特定の実施形態は、示差的増幅が、変換ステップの結果として得たDNA物質の分画に対して実施される、本明細書で開示する方法を含む。
【００４８】
本発明の方法の特定の実施形態によれば、示差的増幅は、変性温度中に温度勾配を作製して、対応する親核酸の増幅に対して選択的にGCリッチ核酸の増幅を可能にすることができるPCR条件で実施される。
【００４９】
対応する親核酸に対してGCリッチ核酸の選択的増幅を可能にする変性温度を決定するためには、親核酸の変性温度を知らなければならない、またはそれを決定しなければならない。
【００５０】
本発明の特定の実施形態によれば、親核酸は、本発明を実施するために使用する核酸混合物中に存在する。
【００５１】
親核酸が前記混合物中に本来存在しない場合、その変性温度を知るか、または変性温度を前記親核酸の対照サンプルにおいて決定するか、または前記親核酸を前記測定用のアッセイ混合物中に対照として加えるかのいずれかである。この対照は、ベクター、特にクローニングされる親核酸またはその適切な断片を有するプラスミドとして提供することができる。
【００５２】
特定の実施形態によれば、示差的増幅は、最初のステップで親核酸に関する最小変性温度を決定することができる変性温度勾配で実施される。
【００５３】
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、親核酸の最小変性温度を決定するための、決定される変性温度から1〜15℃、特に1〜10℃の範囲内にある示差的増幅用の温度勾配を含む。
【００５４】
本発明の方法は特に、重合が、GCリッチ核酸の最小変性勾配温度と等しい一定温度で実施され、および/または最終伸長ステップが同じ温度で実施されるように実施される。
【００５５】
標準的な増幅のステップは、必ずではないがネステッドPCRとして実施することができる。
【００５６】
様々なPCR反応に適したプライマーは、当業者によく知られているパラメータに従い設計される。これらのパラメータの一部は、本願明細書、特に実施例で開示する通り、増幅される特定の核酸に適合される。
【００５７】
プライマーは、一方では標準的な増幅および転換増幅反応用に、他方ではディファレンシャル増幅用に同じであってよく、または異なってよい。
【００５８】
本発明の特定の実施形態では、示差的増幅におけるPCRに使用するプライマーは、親核酸中の相補配列に対して、その3'末端の突然変異核酸塩基を欠いている。
【００５９】
本発明の方法の特定の実施形態では、示差的増幅におけるPCRに使用するプライマーは、その3'末端の1〜6ヌクレオチドにおいてAおよびT核酸塩基を欠いている。
【００６０】
特定の実施形態では、核酸の混合物中で増大する標的突然変異核酸は、対象の遺伝子の断片であり、その断片は、突然変異、特に超変異に対して感受性である。
【００６１】
特に、増大させる標的GCリッチ核酸は、多型（複数可）を含む対象の遺伝子の断片であり、前記多型を含む領域が増幅される。
【００６２】
本発明の方法を実施して、増幅によってGCリッチ核酸を検出することができ、増幅によって増大させるGCリッチ核酸は、病原性生物、または宿主における病状、特にヒト遺伝子障害または腫瘍、または癌と関係がある遺伝子に由来する。
【００６３】
病原性生物はウイルスまたは細菌であってよい。
【００６４】
ウイルスは弱毒化株であってよく、特にワクチン株であってよい。
【００６５】
特定の実施形態によれば、ウイルスはRNAウイルスまたはDNAウイルスであり、特にウイルスはレトロウイルスまたはネガティブRNAウイルス、セグメントまたは非セグメントネガティブRNAウイルスのいずれか、特に麻疹ウイルス(MV)、またはリフトバレー熱ウイルス(RVFV)を含めたパラミクソウイルス科などのモノネガウイルス目である。
【００６６】
他の実施形態によれば、宿主における病状と関係がある遺伝子は腫瘍状態と関連している。
【００６７】
本発明の他の実施形態によれば、GCリッチ核酸変異体は、親核酸の小さな欠失突然変異体であり、特に欠失は1bpまたは2bpを含む。
【００６８】
特定の実施形態では、この方法は、核酸混合物に対して実施され、この核酸混合物は、親核酸および親核酸の2個以上のA→G突然変異核酸を含み、それぞれの突然変異核酸は、親核酸の増幅と比較して選択的に増幅される。
【００６９】
本発明の方法は、アガロースまたはアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、またはクロマトグラフィーによって示差的PCRの産物を検出するステップを含むことができる。
【００７０】
特に、示差的PCRの産物は、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーによって検出される。
【００７１】
他の実施形態によれば、PCRの産物は、ゲル中の相対的な位置によって同定される。
【００７２】
特定の実施形態では、GCリッチ核酸は核酸混合物中の親核酸の超変異体であり、その変性温度はTp(親株の変性温度)よりも約1℃〜約3℃低い。
【００７３】
本発明の方法は、GCリッチ核酸変異体が、完全に相補的な核酸配列と対形成する親核酸のA→G、またはA→C突然変異体である一実施形態を含む。
【００７４】
一実施形態によれば、GCリッチ核酸変異体は、完全に相補的な核酸配列と対形成する親核酸のT→CまたはT→G突然変異体である。
【００７５】
本発明の方法は、親DNAの起源を特徴付けるために、またはヒト遺伝子障害に特徴的な突然変異を検出するために使用することができる。
【００７６】
他の実施形態によれば、本発明の方法は、抗レトロウイルス剤に耐性があるHIVのA→G突然変異菌株(A→G超変異体)を検出するために使用される。
【００７７】
他の実施形態によれば、本発明の方法は、ワクチン関連麻痺性灰白髄炎を引き起こす神経毒性ワクチン由来ポリオウイルス分離株を検出するために使用する。
【００７８】
他の実施形態によれば、親核酸および突然変異核酸は麻疹ウイルスに由来する。
【００７９】
本発明によるi3DPCR法は、このようなウイルス超変異体を選択的に増幅するのに充分適合している。ウイルスの典型は麻疹ウイルス超変異体に関する。しかしながら、さらに低い程度で、他のネガティブRNAウイルス、セグメントまたは非セグメントネガティブRNAウイルスのいずれか、特に麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルス科、または水疱性口内炎ウイルスなどの他のモノネガウイルス目ラブドウイルス科、または他のRNAウイルス、および例えばパラインフルエンザウイルスまたは呼吸器合胞体ウイルスに関するA→G超変異体が記載されてきており、それは幾つかのレトロウイルス、特にHIVを含めたレンチウイルスに関しても観察されてきている。したがって本発明の方法は、これらおよび他の疾患に関する基礎研究において有用である。
【００８０】
i3DPCR法は、1個から多くのAT→GC転移が異なるDNAセグメントの示差的増幅を可能にする。置換度はDNAの溶解温度に直接影響を与えるので、変性温度が低いほど、増幅されるゲノムは置換される。異なる遺伝子座は広く異なる塩基組成を有する可能性があるので、各セグメントに関する状態を最適化することができる。
【００８１】
i3DPCR法は示差的増幅を可能にするが、それ自体は定量的ではない。しかしながら、投入DNAの限界希釈と結び付けて、サンプル内のGC多量ゲノムの分画を定量化することができる。あるいは、TagmanPCRを95℃および選択温度で実施して、サンプル当たりのコピー数を測定することができる。2つの値の比は、全対立遺伝子の全体濃度に対するGC多量対立遺伝子の相対濃度を与えることができる。
【００８２】
i3DPCR法は、DNAの溶解温度にわずかに影響を与える可能性がある修飾塩基を使用する変形を含む。例えば、5-ブロモUTPまたはdUTPを使用してdTTPを置換することができる。その違いは、わずかであるはずである。したがって、これらの修飾塩基のいずれか1つの使用によって、親配列とGCリッチ核酸、特にGC多量突然変異体またはGC多量対立遺伝子の間の区別が進むはずである。
【００８３】
同様に、i3DPCR法は非標準的PCRバッファー条件の使用、特に幾つかの塩および塩濃度の使用、および有機分子の使用も含む。イオンの性質およびイオン強度、例えばテトラエチル塩化アンモニウム(Muraokaら、1980)、および2例だけ列挙するとメタノールまたはポリエチレングリコールなどの小さな有機分子の使用(Muraokaら、1980、Votavovaら、1986)によって、変性温度が影響を受ける可能性があることはよく知られている。
【００８４】
低い変性温度を使用してランダムなPCRを実施する場合、i3DPCRはゲノムからGC多量DNAを増幅することができる。G:C多量DNAは通常コード領域と同義であり、ゲノム内の遺伝子を同定する際に役立つ可能性がある。
【００８５】
より重要なことに、3DPCRと同様に、i3DPCRを使用して小さなウインドウ内の単一点突然変異を同定することができる。既に3DPCRを使用して、60〜80塩基対(bp)の小さな遺伝子座における1つのG→A塩基の変化を同定している。同様に、i3DPCRは60〜80bpの小さな遺伝子座における1つのA→GまたはT→C突然変異を同定することができる。それ故、i3DPCR法を使用して正常A:T対立遺伝子の集団内G/C多量点突然変異を有する対立遺伝子を同定することができる。明らかな例は、腫瘍前細胞に特徴的な突然変異の検索である。
【００８６】
3DPCRとi3DPCRを一緒にして、ヒト遺伝子障害またはp53不活性化病変に特徴的な全突然変異の85%までを得ることができる(Krawczakら、1995、Liら、1984)。残りの突然変異の15%はG<→CおよびA<→T塩基転換に関する。塩基対の数は突然変異によって変わらないが、スタッキングエネルギーが影響を受け、それが溶解温度の変化をもたらす可能性があることは考えられる。そうである場合、したがって3DPCRおよびi3DPCRを使用して、これらの突然変異を同定することもできる。
【００８７】
本発明は、以下の実施例中にさらに詳細に記載する。
【実施例１】
【００８８】
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)Vifタンパク質は宿主細胞タンパク質APOBEC3FおよびAPOBEC3Gを妨害し、出芽ビリオン中へのそれらの取り込みを妨げる(Harrisら、2003; Wiegandら、2004; Zhengら、2004)。生成するVif/APOBEC3複合体はプロテアソームの分解に施す(Sheehyら、2003; Yuら、2003)。ヒト染色体22上の7個のAPOBEC3遺伝子のうち、少なくとも5個が転写される(Jarmuzら、2002;http://genecards.bcgsc.bc.ca)。これらはシチジンデアミナーゼの群に属し、これらの原型は、腸の環境内でアポリポタンパク質BmRNAを特異的に編集するAPOBEC1である(Tengら、1993)。mRNA編集機能は如何なるAPOBEC3分子に対しても依然として認められていないが、APOBEC3C、-3Fおよび-3Gは一本鎖DNAを大々的に脱アミノ化することができる(Harrisら、2003; Lecossierら、2003; Suspeneら、2004; Wiegandら、2004; Yuら、2004)。
【００８９】
HIVΔvifウイルスの一状況では、APOBEC3Fおよび-3Gのみがビリオンにパッケージされるようである(Harrisら、2003; Bishopら、2004; Liddamentら、2004; Wiegandら、2004; Zhengら、2004)。APOBEC3Fおよび-3Gはドナー細胞からの出芽中にパッケージされ、後継ビリオンの複製複合体に入らないことは、注目すべきことである。したがって、マイナス鎖ウイルスcDNAが次回の感染で合成されるとすぐに、非常に多数のC残基が脱アミノ化され、Uが生成する。ウイルスのプラス鎖を参照すると、プラス鎖DNA合成後、U残基がAにコピーされ、いわゆるG→A超変異体が生成する(Pathak & Temin、1990; Vartanianら、1991)。
【００９０】
G→A超変異体は致死表現型、vifの不在と関係があるので、本来の設定におけるそれらの検出が非常に様々であるのは驚くべきことではなく、それらの頻度は非常に低い。しかしながら、GRA超変異体はAによって置換された20〜60%のG残基を示すことが多いので、それらの塩基組成は親配列の塩基組成から大幅に変化する。それ故、親配列ではなくAT多量変異体の増幅を可能にする方法の必要性が存在する。
【００９１】
HIVGRA超変異体に関する以前の研究から、G→A転移の数が独自に異なるHIV-1エンベロープ遺伝子のV1V2領域に対応する、分子クローンの大集合が利用可能であった。この断片内のさらに小さな領域を、Taqポリメラーゼ、および標準SK122/SK123対(Goodenowら、1989)の誘導体であった縮重プライマーを使用することによって増幅させて、超変異ゲノムのより良い増幅をもたらした。それらの配列はSK122intD、5'-AAARCCTAAARCCATRTRTA[配列番号1];SK123intD、5'-TAATGTATGGGAATTGGYTYAA[配列番号2]であった。PCR変性温度を83℃に低下させると(反応プロファイルは83℃で5分間、83℃で1分間、45℃で30秒間および72℃で30秒間、次に72℃で10分間の25サイクル)、少なくとも3個の突然変異を有するクローンを独自に増幅することができ、一方で親配列は増幅しなかった(突然変異なし;図1a、b)。
【実施例２】
【００９２】
増幅した物質が実際に超変異でありPCR産物ではなかったことを確認するために、HA-イエロー(Hanse Analytik)、AT多量DNAの小さな溝と優先的に相互作用し、それによって移動を遅らせる(Abu-Dayaら、1995; Abu-Daya & Fox、1997; Janiniら、2001)ペグ化ビスベンズアミドを含むアガロースゲル中での電気泳動に産物を施した。図1(c)において見ることができるように、1UHA-イエロー(mlアガロース)-1を含むゲル中でのPCR産物の移動は、配列当たり0〜18の転移で動くと徐々に遅れ、83℃でのG→A超変異DNAの選択的増幅を確認した。
【実施例３】
【００９３】
産物回収と超変異の程度に関係があったことは、図1(b)から明らかである。変性温度とクローン当たりのG→A転移の数の間の関係をさらに注意深く調べるために、V1V2領域内の他の遺伝子座に広がる他系のG→A超変異参照クローンを、Taqポリメラーゼおよびプライマー、RT3およびRT4の異なる対を使用することによって分析した(Martinezら、1994)。変性温度が1℃ずつ徐々に低下すると、超変異配列はより大々的に増幅した(図1d)。変性温度と配列のAT含有量の間の強い関係を考慮すると、増幅の成功はPCR機器の較正およびおそらく維持状態および形状にも依存する可能性がある。したがって、全てのPCRは同じ機器で実施した。
【００９４】
これらの発見は、G→A超変異体の選択的増幅は実際、標的DNAの溶解温度と一般に関連していることを示す。本発明のこの方法は、示差的DNA変性PCR、または3D-PCRと呼ばれる。
【実施例４】
【００９５】
図1は、293T細胞のトランスフェクション後HIV-1pNL4.3のΔvif誘導体を感染させた末梢血単核細胞(PBMC)から増幅させた同じV1V2領域に対応する、ネステッドPCR物質(293T/PBMC)も示す。変性温度は83℃であった。3D-PCR産物をHA-イエローを含むゲル中での電気泳動に施したとき、この物質が示差的増幅したG→A超変異体を表した事実が示された(図1c、293T/PBMC)。3D-PCR産物をクローニングおよびシークエンスすると、大部分の配列は大々的に超変異し、参照配列と比較して3個と18個の間のGRA転移を有していた(図2)。G→A転移を有する18個の部位のうち、15個はGpA状態であり、95℃で増幅したPCR物質は野生型DNAのみを同定した(示さず)。
【００９６】
ここでの驚きは、HIV-1Δvifウイルスストックを、容易にトランスフェクトすることができるとして広く使用されているだけでなく、APOBEC3分子を発現させないとも考えられる293T細胞系を使用することによって作製したことである。G→A超変異の機構の周知のことから、最も簡単な説明は、293T細胞系はクローンとして異なる状態になっており、したがってAPOBEC3G[(5'CpC優先、またはプラス鎖上のGpG(Harrisら、2003; Lecossierら、2003; Suspeneら、2004)]とは対照的に、APOBEC3F[5'TpCジヌクレオチドに関して優先、ウイルスプラス鎖上のGpA(Harrisら、2003; Liddamentら、2004; Wiegandら、2004; Zhengら、2004)]が、細胞の小集団中で発現されていたということである。おそらく3D-PCRは、この小集団によって生成されたウイルス由来のDNAを採取していた。
【実施例５】
【００９７】
予防接種後の急性弛緩性麻痺(Balanantら、1991)を有する10人の患者由来のポリオウイルスVP1のPCR産物を調べた。小さな480bpのネスト状セグメントを標的化し、変性状態はプライマー対UG1/UC1を使用することによって調べた(Guillotら、2000)。クローニングDNAを使用した較正によって、参照セービン株1型の配列は、90〜80℃ではなく95〜91℃の変性温度を使用することによって増幅したことを示した。セービン株2型および3型標的は、92℃未満で増幅することができなかった点においてセービン株1型とわずかに異なっていた。前に記載したHIV-1遺伝子座と比較して高い、ここで使用した変性温度は、標的の高いGC含有量によって説明できる(HIV-1に関する34%と比較して48%)。10個のサンプル中、1個のサンプルのみが、以下の反応プロファイル:90℃で5分間、90℃で1分間、45℃で30秒間および72℃で30秒間、次に72℃で10分間の25サイクルで3D-PCRによって強いシグナルを示した。クローニングおよびシークエンスすると、エンテロウイルスポリタンパク質のアラインメント中のVP1残基560〜728に特にマッピングされた置換を有する一連のAT多量配列を得た(www.iah.bbsrc.ac.ulc/virus/picornaviridae/SequenceDatabase/alignments/entero_pep.txt)。これらの配列は、セグメント当たり1〜6個の置換を有していた。34個の異なる置換のうち、28個が非同義的であった(2個のナンセンスを含む)、これは純化淘汰を受けていない準種内の変異に典型的である。一置換を除いた全ての置換によって、AおよびTが増大したゲノムが生成した。95℃で得たPCR物質の増幅、クローニングおよびシークエンスによって、図3中に示した遺伝子座にわずか2個の置換を有していた17個のクローンが明らかとなった(データ示さず)。それ故、3D-PCRはポリオウイルス突然変異スペクトルのAT多量末端を実際増幅していたと結論付けることができる。1個のサンプルのみを示差的増幅することができたので、AT多量変異体はおそらく異常に広い突然変異スペクトルを示し、予防接種後の症状とは何の関係もない。
【実施例６】
【００９８】
ウインドウの長さは、GC含有量が異なる対立遺伝子を区別する能力に影響を与える。DNAセグメントが長くなるほど、識別はしづらくなる。わずか30塩基の小さなウインドウ中の単一点突然変異を同定するための試みを実施した点で、逆は真である。選択した例はp21ras遺伝子、およびこの遺伝子を癌遺伝子に形質転換するコドン12の「有名な」突然変異であった。2個の対立遺伝子の配列は図4A中に示す。PCRプライマーには下線を引き、癌遺伝子においてTに突然変異した野生型配列中の1個のG残基にも下線を引く。2個のプライマー間の「ウインドウ」は29bpである。
【００９９】
標準的なPCR条件下では、野生型対立遺伝子が89℃以上の温度で増幅したことは明らかである。対照的に、変異対立遺伝子は88℃以上の温度で増幅することが可能であった。それ故、1個のGC→AT置換に基づいて対立遺伝子を選択的に増幅することは実際可能である。
【０１００】
さらに小さい19bpのウインドウ中の増幅の影響を調べた。プライマーは図4B中に示す。標準的なPCR条件を再度使用して、変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子を区別することができた。より小さなDNA断片(79bpと比較して69bp)に関して予想したように、変性温度はさらに低下した。86.2℃では変異対立遺伝子のみを同定することができ、一方87.3℃では、変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子の両方が増幅した(示さず)。再度、約1℃は示差的増幅を可能にするのに充分である。
【０１０１】
PCRに関しては技術的に実現可能であるが、69bp未満にすることはアガロースゲル電気泳動による分析に不都合となる可能性がある、何故なら、そのバンドをプライマージマーのバンドと区別することがますます難しくなるからである。しかしながら、幾分利便性が低いアクリルアミドゲル電気泳動は、より小さなバンドを区別することができる。
【０１０２】
要約すると、本発明の方法、すなわち3D-PCRを使用して、親ゲノムと比較してAT増大ゲノムを示差的増幅することができる。レトロウイルス超変異体は3D-PCRの好ましい標的であるが、3D-PCRは突然変異または突然変異スペクトルが存在する任意のサンプルに施用することができる。
【０１０３】
3D-PCRは、わずか数個のGC→AT転移によって異なるゲノムの示差的増幅を可能にする。置換度はDNAの溶解温度に直接影響を与えるので、変性温度が低下するほど、増幅されるゲノムは置換される。異なる遺伝子座は広く異なる塩基組成を有する可能性があるので、各セグメント用に条件を最適化することができる。本発明の方法は示差的増幅を可能にするが、それ自体は定量的ではない。しかしながら、投入DNAの限界希釈と結び付けて、サンプル内のAT多量ゲノムの分画を定量化することができる。3D-PCRを使用して、不均質天然サンプル、新たな脱アミノ化免疫グロブリンV領域、または大々的メチル化の後に大々的5-MeC脱アミノ化を受けたプロモーター領域内のAT多量細菌16SrDNA配列を増幅することができる。
【０１０４】
HIVの正確な設定において、3D-PCRは、Δvifゲノムの複製を支持するために広く使用されている1つの細胞系はおそらくクローンとして異なることを示しており、いずれかのサンプル中にバックグラウンドG→A超変異シグナルが存在することを意味する。バックグラウンドでAT多量変異体を区別する能力は、この技法は生物学的問題に対する様々な適用例において利用することができることを示す。
【実施例７】
【０１０５】
ウイルスゲノム中のCG超変異ポリヌクレオチドまたはCG多量対立遺伝子の検出
導入
GC塩基対は3個の水素結合を有し、一方ATは2個を有することは自明の理である。実際、WatsonとCrickは1953年にさかのぼるまで全くそう思っていなかった(1、2)。1956年にGC対中の第三の水素結合の妥当性を実証したのは、PaulingとCoreyであった(3)。第三の水素結合は、何故GC多量DNAがAT多量DNAより高温で溶解するのか理解するのを助ける。実際、GC多量セグメントにおいてPCRを実施する際に、変性温度を時折増大させて完全なDNA溶解を確実にする(4)。
【０１０６】
一般的にいえば、変性温度はPCRにおける変数として考えられてきていない。近年、低い変性温度を利用して、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のいわゆるG→A超変異体を選択的に増幅した(5)。これらはAPOBEC3ファミリーの2つの宿主細胞シチジンデアミナーゼによる初期ウイルスcDNAの遺伝的編集から生じる(6〜11)。ウイルスマイナス鎖における多数のシチジン(C)残基の脱アミノ化によって多数のウラシル(U)残基が生成し、これらはチミジン(T)として読まれる。参照としてのウイルスプラス鎖に対して、これらは多数のG→A転移を有するゲノムとして現れ、用語G→A超変異体を生み出す(12、13)。わずか1〜2℃の温度差は、104倍ほども過剰な野生型、または参照ゲノムの存在下でのA多量超変異体の示差的増幅を可能にするのに充分であった(14、15)。この方法を、示差的DNA変性PCR、または略して3D-PCRと呼んだ(5)。参照クローンに対するGC多量対立遺伝子の選択的増幅である、逆が考えられないことは明らかである、何故ならこのような対立遺伝子は、さらに高い温度で溶解する可能性があるからである。
【０１０７】
これはウイルス学においては問題点ではない。というのは、その典型が麻疹ウイルス(MV)である、A→G超変異RNAウイルスゲノムの幾つかの例が存在するからである。MV関連亜急性硬化性全脳炎および封入体脳炎の症例由来の剖検サンプルにおいて、このようなゲノムが同定されてきている(16)。これらは、ADARファミリーのアデノシンデアミナーゼにより、二本鎖RNA(dsRNA)の状態での多数のアデノシン残基の脱アミノ化から生じる(総説に関しては(17)を参照)。アデノシンの編集によってイノシン(I)が生成する。イノシンの水素はグアノシン(G)とほぼ同様に結合するので、編集RNA配列はG多量対立遺伝子として回収する。編集の程度はわずか数個の塩基から考えられる標的アデノシン残基の50%まで変わる可能性がある(18、19)。
【０１０８】
2つのADAR1遺伝子転写産物ADAR-1Lおよび-1Sのうち、インターフェロンα/βおよびγによって前者のみを誘導することができる(20)。これにもかかわらず、ADAR編集RNAウイルス配列の例の数は一握りにすぎない状態であり、主に水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスおよびパラミクソウイルスなどのネガティブ鎖ウイルスに限られ(19、21、22)、in vivoでのシグナルの例外は麻疹ウイルスであった。D型肝炎サテライトウイルスのゲノムは、ADAR-1Lによって編集することもできる(23)。それにもかかわらず、ADAR-1L編集がRNAウイルス複製に対してどのような影響を有するかは、それほど明らかではない(24)。
【０１０９】
これを考慮すると、GC多量対立遺伝子の選択的増幅を可能にするPCRに基づく方法を有することは、有用であるはずである。GCとAT塩基対に関する3:2の水素結合の法則を鑑みると、標的DNAの示差的変性は問題外であるはずである。イノシンはGC塩基対に典型的な3つではなく2つの水素結合によってシチジンと塩基対形成することを記し(図6)、本発明者は現在、これはGC多量対立遺伝子の選択的増幅に適した方法の設計に関係し得ると考えている。
【０１１０】
修飾塩基は、通常は宿主の制限酵素を回避するための手段として、DNAバクテリオファージのゲノムにおいてしばしば見られる(25)。修飾は常にシチジンまたはチミジン、例えばファージT4DNAにおける5-ヒドロキシメチルシチジンを含む。しかしながら、修飾プリンのただ1つの例、2,6-アミノアデノシンが存在する。それはアデノシンが2,6-ジアミノプリン(26)、すなわち「D」によって完全に置換されているシアノファージS-2LのDNAゲノムにおいて見られ、3つの水素結合によるチミジン(T)との塩基対形成という1つの特徴を有する(図6)。dITPおよびdDTPは市販されており、幾つかの熱安定性DNAポリメラーゼの基質であり(27)、したがってこれらは、GC多量対立遺伝子の選択的増幅を可能にするPCRに基づく方法に含めることができる。修飾塩基、すなわちdITPおよびdDTPを使用する示差的変性PCRの組合せを含む、このような方法を設計した。
【０１１１】
結果
広く様々な熱安定性DNAポリメラーゼは、dTTP、dCTP、dITPおよびdDTPを使用してDNAを増幅するそれらの能力に関して最初にスクリーニングした。標準的なバッファーおよび95℃の変性温度を使用すると、8個のうち5個の熱安定性ポリメラーゼが、1分間の長期伸長時間を使用すると30サイクル後に妥当な産物回収をもたらした(図7A)。5個全てが、市販のTaqポリメラーゼの変異体であった。20サイクルで、バイオライン酵素はより良い産物回収をもたらし、したがって後の全ての実験で使用した(示さず)。しかしながら、産物回収は標準的なdNTPを使用した増幅と比較して悪かった。dITPおよびdDTPの濃度を300μMまで増大させることによって、産物の収率が増大することはなかった。イノシンはグアニンとほぼ同様に塩基対形成するが、イノシンはTおよびAと塩基対形成することができ、それ故PCRにおけるdITPの使用は幾分突然変異を誘発しやすい(28)。dC:dITP対形成を助長するための試みでは、dCTPの濃度を200から300μMに増大させ、一方dTTPは100μMに低下させて、忠実性を等モルの200μMdNTPを使用した増幅から生じた忠実性と比較した。PCRの忠実性に変化が見られなかったので(塩基当たり4.110-3対3.910-3倍)、後の全ての増幅は等モルのdNTPを使用して実施した。
【０１１２】
2個の修飾塩基を含むPCRDNA(TCIDDNA)の変性の性質を、遺伝子座中に分布する23個までのG/A転移のみ異なっていた一連の7個の262bpの分子クローンに関して確定した(図10)。SYBRGreen溶解プロファイルから見ることができるように、70.3℃および72.6℃の中間点変性温度(Td)を、水素結合パターンの変化から予想したように、TCIDDNAG/IおよびA/D多量クローンそれぞれに関して得た(図7B)。標準的なPCR産物(すなわち、TCGADNA)に関しては逆が示された、すなわちA多量対立遺伝子はG多量対立遺伝子(79.4℃、図7C)より低い温度、Td=75.9℃で変性した。7個の分子クローンの中間点Tdは、G/IまたはA/D含有量と共に直線的に変化した(図2D)。G/I含有量に対するTCIDDNAの温度感受性は、TCGADNAのそれのわずか60%までであった。2つの勾配が交差しないことは、全体的なdI置換はdD置換がDNAのTdを増大させるよりそれを低下させるという以前の観察結果と一致する(27)。
【０１１３】
in vitroでのハイパーエディットMV配列の回収
我々は、インターフェロン感受性細胞系MRC-5において増殖させたMVサンプルを使用する方法を検証しようと試みた。対照として、インターフェロン-β生成に欠陥があるVero細胞を使用した。弱毒化MVSchwartz株を使用した、何故ならそれはインターフェロンの優れた誘導物質だからである。感染後2日で、上清および細胞ペレットを回収し、全RNAを抽出した。cDNAはPCR産物に転換し、その分画は95℃の変性温度を使用してTCIDPCR産物に転換した。63〜72℃の変性勾配を使用して、選択的TCID増幅を次いでTCIDDNAに施した。図3Aから見ることができるように、Vero細胞からMVゲノムを増幅することが可能であった最小温度は67.4℃であった。対照的にMV特異的産物は、65℃未満でMRC-5細胞から増幅することが可能であった。最小Tdで増幅したTCID産物は、TOPOプラスミドへの分子クローニングに使用した。おそらく異常塩基を鑑みると、クローニングTCID産物を用いた標準的な細菌の形質転換は非常に低い有効性をもたらしただけでなく、MV配列内の大きな欠失を常に伴った。これを克服するために、TCIDPCR産物の分画は正常dNTPを使用する10サイクルのPCRによって標準的なDNAに転換し、次いでクローニングした。対照として、Td=95℃を使用して反応混合物から増幅したDNAもクローニングし、シークエンスした。
【０１１４】
図8Bから見ることができるように、MRC-5細胞から選択的に増幅したMVゲノム(Td=65℃)には、A→G転移が散乱していた。実際、83.3%までのA残基を編集することができた(m=70%、範囲3.3〜83.3%)。対照的に、最小可能温度(Td=67.4℃)でMV感染Vero細胞から増幅したゲノムは、RNAウイルスの準種変異体に典型的であった。置換マトリックスにおけるわずかなAU→GC非対称(図8C)は、選択的PCRプロトコルを考慮すると理解することができる。標準的なPCR条件(Td=95℃、正常dNTP)下で増幅したMV配列は、バランスのとれた突然変異マトリックスを示した(図8C)。これはMRC-5細胞系から高度に編集された配列は小集団を表すはずであること、および選択的PCRプロトコルは実際GC多量対立遺伝子を回収することができたことを示す。それらの頻度を確認するために、初期TCID産物を連続的に希釈し、標準的かつ選択的なPCRを実施した。標準的なPCRからのシグナルは選択的PCRより100倍を超えて滴定し、高度に編集されたゲノムが1%までサンプル中に存在したことを示した(データ示さず)。
【０１１５】
MRC-5由来MV配列に関する置換マトリックスから見ることができるように(Td=65℃、図8C)、多数を占めるA→G転移はネガティブ鎖ウイルスゲノムの編集と一致する。しかしながら、U→C転移はC→Uよりわずかに数が多かった。配列を調べることによって、その1個がA→GとU→C転移の両方を有しており、他方がU→C転移のみを有していた22個中2個の配列が明らかになった(図8D)。後者はMVアンチゲノムのADAR編集と一致し、一方前者はゲノムとアンチゲノムの両方の編集を表すが、編集の順序を確定することはできない。A→G超変異体をMV感染MRC-5細胞由来のウイルス上清中で発見することができたので、これは、編集MVゲノムはパッケージすることができること、またはRNA編集はパッケージ後に起こる可能性があることのいずれかを示唆する(図11)。
【０１１６】
我々はこの新規な方法を逆示差的DNA変性PCR、または3DI-PCRと呼んで、AT多量DNAの増幅を可能にする3D-PCRとこの方法を区別する(5)。
【０１１７】
セグメントウイルスRNAの編集
編集MVゲノムの相対的欠乏を考慮して、MVとHDVを別々に、それに関するADAR編集RVFVゲノムの報告が存在しない、他の(-)RNAウイルス、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)、セグメントネガティブ鎖RNAウイルスを試験することを我々は決定した。要するに、3DI-PCRは新規な発見をすることができるのだろうか?RVFVクローン13(29)は、NS遺伝子内に549bpのインフレーム欠失をコードする、非常に免疫原性がある依然として弱毒化状態の株である。残存NSタンパク質はインターフェロン生成をアンタゴナイズするその能力を失っているので、毒性株と異なり、クローン13はインターフェロンの優れた誘導物質である(29)。クローン13はVero細胞においてよく増殖したが、ウイルス力価はMRC-5細胞において100倍低かった。
【０１１８】
クローン13は両方の細胞系で3日間培養し、全細胞RNAを回収した。L遺伝子由来の257bp断片に特異的なプライマーを使用して、3DI-PCRによって、許容的Vero細胞培養物と比較して制限的MRC-5培養物から低温で、67.2℃と比較して66.3℃で、RVFVゲノムを回収することができた(図9A)。PCR産物のクローニングおよびシークエンスによって、MRC-5培養物、およびVero細胞由来の単なる準種変異体からのウイルスRNAの大々的なA→G編集が明らかになった(図9B、C)。一握りのハイパーエディット配列を示し、MRC-5感染由来の全26クローンは異なっており、編集したアデノシン標的の63〜77%を有していた。したがって、MRC-5におけるRVFVRNAのハイパーエディットは、同じ細胞系におけるMVと同程度大々的である可能性がある。標準的なPCR(Td=95℃、正常dNTP)によって分析すると、突然変異マトリックスはバランスがとれており、同定した高度に編集されたRVFVゲノムは少数を表すことが示された(図9C)。完全なRVFVの配列セットは図12中に見ることができる。
【０１１９】
選択的増幅テーマの変形
図7Dから見ることができるように、3DI-PCRは3D-PCRよりGC含有量の違いに対する感受性が低い。TCIDDNAの変性感受性を操作するための試みでは、わずかな溝を介してDNAと結合する小さな有機分子、すなわちHoechstビスベンズミド色素H33258、dUTP、5-MedCTPおよび7-deazadGTPなどの修飾塩基、一価(K+)および二価カチオン(Mn2+)の範囲を調べた。絶対Tdは変化したが、如何なる試薬も、7個の標準の変性温度/塩基組成の関係に対して如何なる有意な影響もなかった(示さず)。最後に、DNAのTdを低下させるDAPIなどのGC挿入試薬は有用ではなかった。というのは、それらは非常に低い濃度(10nM)においてさえ増幅を阻害したからである。要するに、全体的なTdを操作することはできるが、TCIDDNAの変性温度/塩基組成の関係は比較的操作しにくい。
【０１２０】
考察
示差的DNA変性PCRは他の水素結合から生じるGC塩基対の固有の安定性を利用し、AT多量DNAの選択的増幅を可能にする。修飾塩基を使用することによって、3:2の法則を逆にすることができ、GC多量対立遺伝子の選択的増幅を可能にする。ある範囲の市販のTaqポリメラーゼは2個の修飾塩基の取り込みを開始させることが可能であったが、産物収率は標準dNTPを使用するときより幾分低い。3D-および3DI-PCRに関する温度/GC含有量係数は等しくなく、後者は前者の60%未満であった(図7D)。それにもかかわらず、3DI-PCRは簡潔であり、ウイルス学において有用であることを証明するのに充分確かなものである。3DI-PCRはそれがDNAからTCIDDNAへの最初の転換を必要とする点で、3D-PCRより多少時間がかかる。
【０１２１】
麻疹ウイルスに適用したとき、ADAR編集ウイルスゲノム、高度に編集されたゲノムの典型例はMRC-5培養物から回収した。MVゲノムはin vivoより大々的に培養ウイルスから編集されるだけでなく、それらはさらに不均質である(19)。このようなゲノムがMRC-5培養物中に1%までの頻度で存在したことは、何故培養物中のMVのA→G超変異体が以前に記載されなかったかを、説明するのを手助けすることができる。RVFVクローン13の培養物中の多数のA→G超変異体の発見も新規であり、ネガティブ鎖RNAウイルスは一般にインターフェロンの優れた誘導物質なので、インターフェロン感受性細胞で増殖した場合、このようなウイルスに関して同様の発見を得ることができたことを示唆する。
【０１２２】
「わずか」1%の超変異ウイルスゲノムを生成するインターフェロン誘導型応答の有意性の問題は注目に値する。図8B中に示すMV配列セットは最も低いプラスのTd、すなわち65℃で得た。ここには示さなかったが、サンプルTd=66.2℃から得たMV配列はそれほど大々的には置換されず、おそらくADAR-1L発現のレベルおよびパッケージされたデアミナーゼの数を表す、広範囲の編集度が存在することが示唆されることを我々は知っている。より大きなセグメントを分析した場合、編集配列の割合は大幅に増大するはずである。それ故、編集MVゲノムの真の数はおそらく1%よりはるかに多い。MVに関するゲノム突然変異率(サイクル(30)当たり1.4までの置換)はRNAウイルスに関する誤差閾値に近いので、少数のアデノシン脱アミノ化はウイルスを殺傷するのに充分なはずである(31)。
【０１２３】
3DI-PCRは明らかにハイパーエディットゲノムを増幅することができるが、検出可能な編集の下限は何であるのか?図7Dから、265bp断片内に3〜4の編集部位を有するクローンは、互いに区別することができることは明らかであるはずである。大部分のMVおよびRVFVゲノムは大々的に編集されたが、2つのA→G転移のみを有する1つのMVクローンが存在した。それ故、下限は約〜2部位/265bpである可能性があるようである。実際の限界は〜0.3〜0.4℃である勾配Mastercyclerの熱安定性に起因する。時折3〜5の塩基を編集することができる場合(32、33)、ADAR編集細胞mRNAの分析において3DI-PCRが有用となり得ることは考えられる。
【０１２４】
3DI-PCRは確かで実施するのが簡単であり、dDTPおよびdITPは市販の試薬である。3DI-PCRは、選択的増幅を実施するため、および妥当なクローニング効率を得るために過剰なPCRステップが必要である点で、多少時間がかかる。PCRの変性温度はこれまで一定に保ってきた、理解されるように、したがってその目的は全てのDNAを変性させることであった。修飾ヌクレオチドの使用によって、現在PCRを拡大して、AT多量DNAとGC多量DNAの両方の選択的増幅を可能にすることができる。
【０１２５】
材料および方法
ウイルス。MRC5およびVero細胞を、5%CO2の存在下において5〜10%のウシ胎児血清および抗生物質(5U/mlのペニシリンおよび5μg/mlのストレプトマイシン)を含むダルベッコの改変イーグル培地中で増殖させた。6ウエルプレート中の細胞単層に、弱毒化生麻疹ウイルス(Vero細胞において増幅させたSchwarz株)をVero細胞に関して0.1およびMRC-5に関して3の感染多重度で感染させた。感染後2日で培養培地を回収し、細胞をトリプシン処理した。細胞残骸の浄化後、RNAを抽出した。低融合性単層にRVFVクローン13を細胞当たり0.01pfuの感染多重度で感染させ、37℃で3日間インキュベートした。
【０１２６】
RNA抽出、オリゴヌクレオチドおよびPCR試薬およびクローニング。細胞溶解物およびウイルス上清を含むサンプルを、2時間56℃においてSDS/プロテイナーゼKバッファー(0.1mg/ml、Eurobio)中で消化させた。製造者の手順に従いMaserPureTM完全DNAおよびRNA精製キット(Epicentre)を使用して全核酸を抽出した。1×バッファー反応混合物(Gibco)、300ngのランダムヘキサマー(Pharmacia)、各500μMの標準dNTP、10UのMLV逆転写酵素(Invitrogen)および10UのRNAsin(Promega)を含む最終体積20μlの混合物中で全RNAを次いで逆転写した。反応混合物の10パーセントをPCR増幅用に使用した。
【０１２７】
MVのM遺伝子およびRVFVクローン13のL遺伝子の断片を、ネステッドPCR手順によって増幅させた。感受性および特異性を増大させるために、ホットスタートPCRを両方の増幅に実施した。MV用の第一ラウンドのプライマーは5'ROUoutおよび3'ROUoutそれぞれ5'GGCAGGCYGGYGCCCCAGGYCAGAGおよび5'GGRRCCTCTGCGGGGTRTCGRGCGGであった、これをSchwarzゲノムにおいて3522〜3903にマッピングする。これらのプライマーはPCR転換反応に使用することもできる。
【０１２８】
第二ラウンド(すなわち、示差的PCRによる選択的増幅)用に、プライマーは5'ROUinおよび3'ROUin、それぞれ
5'AGAYCCYGGYCYAGGCGACAGGAAGGおよび
5'GCRTTGCRCRCTTGGTTTGCGTTGであった、前式でY=T/CおよびR=A/Gであった。RVFV増幅用の第一ラウンドプライマーは5'RFoutおよび3'RFoutそれぞれ
5'GTCGCCAATGYCGAGGAGGCCCAYGAおよび
5'CTCCAGATCATCTRTCCTRRTGCTTCCであった、これをRVFVのL断片において5872〜6255にマッピングする。第二ラウンド用に、プライマーは5'RFinおよび3'RFinそれぞれ、
5'GATGATAGAAGAYGCCAAGAACAAYGCおよび
5'TGCTTCCTTCTGGTCTCTGTRGRGTTCであった。
【０１２９】
標準dNTPはSigmaから購入し、dDTP、dITP、dUTP、5Me-dCTPはBiolinkから購入した。DAPIはFlukaから購入し、一方7-deazadGTPおよびHoechstビスベンズアミド色素(H33258)はSigmaから購入した。PCR産物はアガロースゲルから精製し、TOPOTAクローニングベクターに結合させ、記載したようにクローニングおよびシークエンスした(5)。
【０１３０】
PCRプロトコル。超変異ゲノムを3ステップのプロトコルによって同定した。第一反応は充分な物質を生成するためのPCRの標準的な増幅を含んでいた。条件は2.5mMのMgCl2、50mMのKCl、10mMのTris-HCl(pH8.3)、200μMのdATP、dTTP、dCTPおよびdGTP、100μMの各プライマー、および5UのBioTaqDNAポリメラーゼ(バイオライン)、50μlの最終体積中であった。第二反応は、標準DNAをTCIDDNAと呼ばれる修飾塩基DおよびIを含むDNAに転換した。投入物質がTCGADNAである場合、GC多量対立遺伝子のTdは本来の塩基対形成の法則によって支配され、したがって示差的増幅することができないので、これは必須である。それぞれ200μMのdTTP、dCTP、dDTPおよびdITP、100μMの各プライマーおよび10UのBioTaqDNAポリメラーゼ(バイオライン)を50μlの最終体積中で使用したこと以外、条件は前と同じであった。変性温度は95℃であった。
【０１３１】
示差的増幅を、変性温度中に2〜10℃の勾配を生成するようにプログラムしたエッペンドルフ勾配MastercyclerSを使用して第三ラウンドに実施した。反応パラメータは、例えば8℃の変性勾配を5分間、次に35サイクル(8℃の変性勾配を30秒間、アニーリング55℃で30秒間、および最小変性勾配温度と等しい一定重合温度で1分間)および伸長を終了させるために最後に最小変性勾配温度で10分間使用することによって実施した。変性勾配の程度は変えることができるが、一定重合温度は最小変性勾配温度と常に等しい。バッファー条件は2.5mMのMgCl2、50mMのKCl、10mMのTris-HCl(pH8.3)、それぞれ200μMのdTTP、dCTP、dDTPおよびdITP、100μMの各プライマーおよび10UのBioTaqDNAポリメラーゼ(バイオライン)、50μlの最終体積中であった。
【実施例８】
【０１３２】
細胞のmRNA中のAlu配列に基づく検出アッセイ
ADAR編集はA残基に関するものであり、G残基を生成するので、それぞれの配列に関するAおよびG含有量をそれぞれy軸およびx軸上に表すことができる。2つの異なる細胞系からの2セットのデータを示す。麻疹ウイルスによって感染させたMRC細胞系由来のメッセンジャーRNAを使用した。この細胞系において、I型インターフェロンを誘導し、それによってADAR-1Lの発現をもたらす。Vero細胞も麻疹ウイルスによって感染させた。しかしながら、この細胞系ではインターフェロンβ遺伝子の欠陥が存在するので、I型インターフェロンは生成されない。
【０１３３】
白い四角形は、95℃の変性温度を使用して標準的なPCR増幅によって誘導したmRNAを含むAlu配列のA対Gの塩基組成を示す。白丸は、63.8℃の変性温度で3DI-PCRによって誘導したmRNAを含むAlu配列のA対Gの塩基組成を示す。投入cDNA物質は2つの増幅に関して同じであった。見ることができるように、修飾塩基dDTPおよびdITPの使用を考慮して、3DI-PCRは予想通り古典的PCRと比較してG多量配列を選択的に増幅した。
【０１３４】
再度、これによって概念実証、GCリッチ核酸の増幅を与える。しかしながら、それが方法の使用をウイルス学を越えて細胞生物学および一般的mRNA編集の範囲に拡大する点で、この実施例は興味深い。この技法を使用して、細菌/始原細菌または体細胞的に修飾された免疫グロブリンV遺伝子配列のGC多量変異体の混合物からGC多量対立遺伝子、GC多量DNAを増幅することができることは予想される。これらはしかしながら数例である。この方法は、任意のGC多量配列または変異体に適用する。
【０１３５】
材料および方法
細胞。MRC5およびVero細胞を、5%CO2の存在下において5〜10%のウシ胎児血清および抗生物質(5U/mlのペニシリンおよび5μg/mlのストレプトマイシン)を含むダルベッコの改変イーグル培地中で増殖させた。6ウエルプレート中の細胞単層に、弱毒化生麻疹ウイルス(Vero細胞において増幅させたSchwarz株)をVero細胞に関して0.1およびMRC-5に関して3の感染多重度で感染させた。感染後2日で培養培地を回収し、細胞をトリプシン処理した。細胞残骸の浄化後、RNAを抽出した。低融合性単層にRVFVクローン13を細胞当たり0.01pfuの感染多重度で感染させ、37℃で3日間インキュベートした。
【０１３６】
RNA抽出、オリゴヌクレオチドおよびPCR試薬およびクローニング。細胞溶解物およびウイルス上清を含むサンプルを、2時間56℃においてSDS/プロテイナーゼKバッファー(0.1mg/ml、ユーロバイオ)中で消化させた。製造者の手順に従いMaserPureTM完全DNAおよびRNA精製キット(Epicentre)を使用して全核酸を抽出した。1×バッファー反応混合物(Gibco)、300ngのランダムヘキサマー(Pharmacia)、各500μMの標準dNTP、10UのMLV逆転写酵素(Invitrogen)および10UのRNAsin(プロメガ)を含む最終体積20μlの混合物中で全RNAを次いで逆転写した。cDNAプライマーは、Alu1であった（下記参照）。反応混合物の10パーセントをPCR増幅用に使用した。
【０１３７】
mRNAを含むAlu配列の増幅に特異的なプライマーは以下の通りであった:
Alu15'CACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGG
Alu25'TGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGG
【０１３８】
これらはAthanasiadisら(33)による論文の図8によって助長された。
【０１３９】
標準dNTPはSigmaから購入し、dDTPおよびdITPはBiolinkから購入した。PCR産物はアガロースゲルから精製し、TOPOTAクローニングベクターに結合させ、記載したようにクローニングおよびシークエンスした(Suspene、Rら、(5)。
【０１４０】
PCRプロトコル。超変異ゲノムを3ステップのプロトコルによって同定した。第一反応は充分な物質を生成するためのPCRの標準的な増幅を含んでいた。条件は2.5mMのMgCl2、50mMのKCl、10mMのTris-HCl(pH8.3)、200μMのdATP、dTTP、dCTPおよびdGTP、100μMの各プライマー、および5UのBioTaqDNAポリメラーゼ(Bioline)、50μlの最終体積中であった。第二反応は、標準DNAをTCIDDNAと呼ばれる修飾塩基DおよびIを含むDNAに転換した。投入物質がTCGADNAである場合、GC多量対立遺伝子のTdは本来の塩基対形成の法則によって支配され、したがって示差的増幅することができないので、これは必須である。それぞれ200μMのdTTP、dCTP、dDTPおよびdITP、100μMの各プライマーおよび10UのBioTaqDNAポリメラーゼ(バイオライン)を50μlの最終体積中で使用したこと以外、条件は前と同じであった。変性温度は95℃であった。
【０１４１】
示差的増幅を、変性温度中に2〜10℃の勾配を生成するようにプログラムしたエッペンドルフ勾配MastercyclerSを使用して第三ラウンドに実施した。反応パラメータは、15℃(75℃〜60℃)の変性勾配を5分間、次に35サイクル(15℃(75℃〜60℃)の変性勾配を30秒間、アニーリング55℃で30秒間、および最小変性勾配温度と等しい一定重合温度で1分間)および伸長を終了させるために最後に最小変性勾配温度で10分間使用することによって実施した。変性勾配の程度は変えることができるが、一定重合温度は最小変性勾配温度と常に等しい。バッファー条件は2.5mMのMgCl2、50mMのKCl、10mMのTris-HCl(pH8.3)、それぞれ200μMのdTTP、dCTP、dDTPおよびdITP、100μMの各プライマーおよび10UのBioTaqDNAポリメラーゼ(バイオライン)、50μlの最終体積中であった。
(参考文献)
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【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】（ａ）は、G→A超変異HIV-1ゲノムの示差的DNA変性増幅を示す図である。参照配列(0)と比較して3、8、14および18のG→A転移を有する4個の配列を、95℃の変性温度で標準的なPCR条件下で増幅させた。MおよびCはそれぞれ、分子量マーカーおよび陰性対照を示す。293T/PBMCは、293T細胞のトランスフェクションによって生成したHIV-1Δvifウイルスストックに感染させたPBMCから増幅させた物質を指す。（ｂ）は、G→A超変異HIV-1ゲノムの示差的DNA変性増幅を示す図である。(a)と同じサンプルを83℃の変性温度で増幅させた。（ｃ）は、G→A超変異HIV-1ゲノムの示差的DNA変性増幅を示す図である。(b)中と同じPCR産物を、1UHA-イエロー(mlアガロース)-1でアガロースゲル中での電気泳動に施した。83℃で増幅しなかった野生型対照(0)に関する物質はレーン0、図1(a)由来のものであった。黒線を加えて、HA-イエローによるAT多量DNAの遅延を視覚化するのを手助けした。（ｄ）は、G→A超変異HIV-1ゲノムの示差的DNA変性増幅を示す図である。変性温度(Td)と選択的増幅の間の関係を、参照配列(0)に対して0、5、10、15、20および24のG→A転移を有する他系のクローンを使用することによって調べた。
【図２】293T細胞[293T/PBMC、図1(a〜c)]において増殖させたΔvifウイルスストック由来のG→A超変異HIV-1V1V2領域配列の集合を示す図である。明確にするために、増幅させた304bpセグメントの189bp領域のみを示す。配列は親配列に対して一直線に並べる。違いのみを示す。ハイフンはギャップを示す。クローンの表示は左側に示す。95℃の増幅由来の物質の分析によって、如何なる超変異ゲノムも同定することはできなかった。
【図３】予防接種後の急性弛緩性麻痺を有する患者由来のAT多量ポリオウイルスVP1セグメントの集合を示す図である。明確にするために、増幅させた480bpセグメントの109bp領域のみを示す。配列はポリオウイルスセービン株I型に対して一直線に並べる。違いのみを示す。クローンの表示は右側に示す。3D-PCR増幅セグメントは、セービン株I型と比較して1〜6個のGC→AT転移を有していた。95℃の増幅由来の物質の分析によって、同じ配列における17のクローン中で2個の置換を得た。
【図４】Ａは、p21ras遺伝子の2個の対立遺伝子の配列を示す図である。図中、プライマーには下線を引く。Ｂは、19bpウインドウのp21ras遺伝子を増幅するためのプライマーを示す図である。
【図５】dTTPを場合によって置換することができる、dUTPおよびdCTP類似体の化学構造を示す図である。
【図６】本来の3:2水素結合の法則の逆となり得る、標準的なDNA塩基対、および修飾塩基、イノシン(I)および2,6-ジアミノプリン(D)の塩基対形成の図である。
【図７】Ａは、dITPおよびdDTP基質を使用するPCRおよび変性プロファイルの図である。8個の市販の熱安定性ポリメラーゼのうち5個が、dITPおよびdDTPをDNAに効率良く取り込ませることができる。dNTP濃度は全体で200μM、[Mg2+]=2.5mM、Td=95℃であった。C=陰性ポリメラーゼ対照、M=マーカー、bp単位。バイオライン、ユーロバイオ、プロメガ、キアゲンおよびタカラ酵素はいずれもTaqポリメラーゼの変異体である。タカラIおよびIIは、製造者によって供給された2個のバッファーを指す。Ｂは、dITPおよびdDTP基質を使用するPCRおよび変性プロファイルの図である。HIV-1V1V2領域に対応するTCGADNAに関するSYBRGreen溶解プロファイル。参照は「0」で記し、一方「23」は23のG→A転移が独自に異なるクローンを示す。中間点Tdsはx軸の下に与える。Ｃは、dITPおよびdDTP基質を使用するPCRおよび変性プロファイルの図である。HIV-1V1V2領域に対応するTCIDDNAに関するSYBRGreen溶解プロファイル。中間点Tdsはx軸の下に与える。Ｄは、dITPおよびdDTP基質を使用するPCRおよび変性プロファイルの図である。中間点Tdとその配列を図10中に与える7個のHIV-1クローンのG/IまたはA/D組成の間の線形相関。
【図８】Ａは、ADAR編集した麻疹ウイルス（ＭＶ）ゲノムの3DI-PCR増幅の図である。麻疹ウイルスを感染させたVeroおよびMRC-5細胞から増幅したTCIDDNAのアガロースゲル。65.0℃と66.2℃の間で後者から増幅したPCR産物はGCが増大したゲノムを示す、C、陰性対照、M分子量マーカー。Ｂは、ADAR編集した麻疹ウイルス（ＭＶ）ゲノムの3DI-PCR増幅の図である。最低変性温度(65.0℃)での増幅由来のMV配列。配列は参照MV配列に対して一直線に並べ、違いのみを示す。単調なA→G転移はADAR編集に特有である。完全な配列セットは図11中に与える。Ｃは、ADAR編集した麻疹ウイルス（ＭＶ）ゲノムの3DI-PCR増幅の図である。配列セットに関する突然変異マトリックス。マトリックス当たりの配列の数は、左上から始まり時計回りに進んでn=15、13、21および19である。95℃の増幅対照における突然変異マトリックスの対称性は、ウイルス準種に特有である。3DI-PCRがGC多量配列を増幅させ突然変異スペクトルのGC多量末端を表すことを考慮すると、AU→GCからのVero/MV67.4℃マトリックスに対するわずかな非対称は理解される。Ｄは、ADAR編集した麻疹ウイルス（ＭＶ）ゲノムの3DI-PCR増幅の図である。参照ゲノムと比較した2個のC多量MV配列の配列。第一の配列はA→GおよびU→C転移をコードし、ウイルスゲノムおよびアンチゲノムの編集から生じており、一方で後者のU→C転移はアンチゲノムのみの編集を示す。
【図９】Ａは、リフトバレー熱ウイルス（Ｒｉｆｔ）ゲノムの大量のアデノシン脱アミノ化の図である。RVFVを感染させたVeroおよびMRC-5細胞から増幅したTCIDDNAのアガロースゲル。66.3℃と66.7℃の間で後者から増幅したPCR産物はGCが増大したゲノムを示す、C、陰性対照、M分子量マーカー。Ｂは、リフトバレー熱ウイルス（Ｒｉｆｔ）ゲノムの大量のアデノシン脱アミノ化の図である。最低変性温度(66.3℃)での増幅由来のRVFV配列。配列は参照MV配列に対して一直線に並べ、違いのみを示す。単調なA→G転移はADAR編集に特有である。完全な配列セットは図12中に与える。Ｃは、リフトバレー熱ウイルス（Ｒｉｆｔ）ゲノムの大量のアデノシン脱アミノ化の図である。配列セットに関する突然変異マトリックス。マトリックス当たりの配列の数は、左上から始まり時計回りに進んでn=6、10、11および26である。95℃の増幅対照における突然変異マトリックスの対称性は、ウイルス準種に特有である。
【図１０】中間点変性温度を計算するために使用した7個の分子クローンの配列の図である。それらを「0」として定義した参照配列と区別する3、6、9、12、15および23のG→A転移は右側に示す。それらはヒト免疫不全1型(HIV-1)env遺伝子のセグメント、特にV1V2超可変領域を表し、APOBEC3G編集のin vitro試験から導いた(10)。増幅プライマーはRT3：  5'GCGTCTAGAAGTATCATTATCTATTGGTAおよびRT4：  5'GCGGTCGACCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAであった。
【図１１ａ】完全なMV配列セットの図である（上清／ＭＲＣ５／麻疹ウイルス／ＰＣＲ＠65.0℃）。Schwarz参照配列に対する違いのみを示す。
【図１１ｂ】完全なMV配列セットの図である（上清／ＭＲＣ５／麻疹ウイルス／ＰＣＲ＠95℃）。Schwarz参照配列に対する違いのみを示す。
【図１１ｃ】完全なMV配列セットの図である（細胞／ＭＲＣ５／麻疹ウイルス／ＰＣＲ＠65.0℃）。Schwarz参照配列に対する違いのみを示す。
【図１１ｄ】完全なMV配列セットの図である（細胞／ＭＲＣ５／麻疹ウイルス／ＰＣＲ＠95℃）。Schwarz参照配列に対する違いのみを示す。
【図１１ｅ】完全なMV配列セットの図である（上清／Ｖｅｒｏ／麻疹ウイルス／ＰＣＲ＠66.4℃）。Schwarz参照配列に対する違いのみを示す。
【図１１ｆ】完全なMV配列セットの図である（上清／Ｖｅｒｏ／麻疹ウイルス／ＰＣＲ＠95℃）。Schwarz参照配列に対する違いのみを示す。
【図１１ｇ】完全なMV配列セットの図である（細胞／Ｖｅｒｏ／麻疹ウイルス／ＰＣＲ＠67.4℃）。Schwarz参照配列に対する違いのみを示す。
【図１１ｈ】完全なMV配列セットの図である（細胞／Ｖｅｒｏ／麻疹ウイルス／ＰＣＲ＠95℃）。Schwarz参照配列に対する違いのみを示す。
【図１２ａ】完全なRVFV配列セットの図である（細胞／ＭＲＣ５／リフトバレー熱ウイルス／ＰＣＲ＠66.3℃）。RVFVクローン13参照配列に対する違いのみを示す。配列が2回以上見られたとき、その頻度を配列の右側に与える。
【図１２ｂ】完全なRVFV配列セットの図である（細胞／ＭＲＣ５／リフトバレー熱ウイルス／ＰＣＲ＠66.3℃、細胞／ＭＲＣ５／リフトバレー熱ウイルス／ＰＣＲ＠95℃、及び細胞／Ｖｅｒｏ／リフトバレー熱ウイルス／ＰＣＲ＠67.2℃）。RVFVクローン13参照配列に対する違いのみを示す。配列が2回以上見られたとき、その頻度を配列の右側に与える。
【図１２ｃ】完全なRVFV配列セットの図である（細胞／Ｖｅｒｏ／リフトバレー熱ウイルス／ＰＣＲ＠67.2℃及び細胞／Ｖｅｒｏ／リフトバレー熱ウイルス／ＰＣＲ＠95℃）。RVFVクローン13参照配列に対する違いのみを示す。配列が2回以上見られたとき、その頻度を配列の右側に与える。
【図１３】宿主細胞mRNA配列中に含まれる増幅Alu配列の塩基組成を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１１ｇ】
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【図１１ｈ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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