(57)【要約】  ７６アミノ酸分泌タンパク質（“Ｓｗｉｒ１”）候補の発現が、空腹時トリグリセリドおよびコレステロールレベルと負に相関することが見いだされた。組換えアデノウイルスを使用して２種のマウス肥満モデル、ＫＫ−ＡｙおよびＬｅｐｏｂ／ＬｅｐｏｂマウスにおけるＳｗｉｒ１の発現を増加させた。アデノウイルス注射によるＳｗｉｒ１の過剰発現は両モデルにおける空腹時トリグリセリドおよびコレステロールレベルを有意に、および再現可能に減少させた。その上、Ｓｗｉｒ１タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスが作製された。脂肪生成に関係する主要遺伝子（脂肪酸シンターゼ）の発現およびＦＡＳタンパク質レベルは、Ｌｅｐｏｂ／ＬｅｐｏｂマウスにおけるＳＷＩＲ１アデノウイルス処理により低下した。経口摂取、注射、皮下パッチ、または鼻腔内経路によって送達される全長ＳＷＩＲ１ペプチド、またはそのペプチド誘導体、ホモログ、アナログ、もしくはミメティックは、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、および／またはエネルギー不均衡の治療または診断薬として使用可能であった。
2009502208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドが以下の特徴：
ａ．実質的に均質の調製物である；および
ｂ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１０、１１、１２〜１８に示された配列のいずれか１つに少なくとも７０％の相同性を有する、
を有する、精製されたＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体。
【請求項２】
ペプチドが哺乳動物ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドがマウスペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドがヒトペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
ペプチドが合成ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１０、１１、１２〜１８で示す配列のいずれか１つに対する前記相同性が８５％より大きい、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
相同性が９５％より大きい、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のＳｗｉｒ１ペプチドのいずれか１つ、および薬剤的に受容できるキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項９】
Ｓｗｉｒ１ペプチド、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体を含む治療的有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、体格のホメオスタシスに関連する病態生理を治療するための方法。
【請求項１０】
Ｓｗｉｒ１ペプチド、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体を含む治療的有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、体格のホメオスタシスに関連する病態生理を予防するための方法。
【請求項１１】
Ｓｗｉｒ１ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、および１０〜１８に示された配列のいずれか１つに少なくとも７０％の相同性を有する、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
病態生理が肥満である、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
レプチンおよびアディポネクチンからなる群から選択される化合物を対象に投与することを付加的に含む、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
病態生理が高血糖症、高インスリン血症、インスリン抵抗性、高脂肪血症、および２型糖尿病のいずれか１つを含む、肥満に関連する１種である、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
対象への投与のステップが腹腔内投与を含む、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＳｗｉｒ１ペプチドを生産する培養細胞。
【請求項１８】
細胞が細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
以下のことを含む、Ｓｗｉｒ１ペプチドを調製するための方法：
ａ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含む細胞を、当該ペプチドの発現を規定する条件下で培養すること；および
ｂ．発現された当該ペプチドを回収すること。
【請求項２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸、および薬剤的に受容できるキャリアを含む医薬組成物であって、該核酸がＳｗｉｒ１ペプチドをコードする、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか１つのペプチドに免疫特異的に結合する、抗体、ならびにそのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログ。
【請求項２２】
検出可能なラベルで明示された、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８のペプチドのいずれか１つ、ならびに前記ペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを使用して産生される、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２４】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項２１に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２６】
１つ以上の容器に、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＳｗｉｒ１ペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の核酸配列の一部、または請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のＳｗｉｒ１タンパク質を認識する抗体を含むキット。
【請求項２７】
核酸を含む組換え非ヒト動物であって、当該核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８のＳｗｉｒ１関連ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログのいずれか１つをコードする核酸配列を有する単離された核酸である、前記非ヒト動物。
【請求項２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログの治療的有効量を対象に投与することを含む、対象におけるインスリン抵抗性を改善するか、または軽減する方法。
【請求項２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログの治療的有効量を対象に投与することを含む、対象における糖尿病の症状を改善するか、または治療する方法。
【請求項３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログの治療的有効量を対象に投与することを含む、対象における肥満の開始を予防するか、または遅らせる方法。
【請求項３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログの治療的有効量を対象に投与することを含む、対象における高脂肪血症を改善するか、または軽減する方法。
【請求項３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログの治療的有効量を対象に投与することを含む、対象における血清中総コレステロールを軽減する方法。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログの治療的有効量を対象に投与することを含む、対象における血清トリグリセリドを軽減する方法。
【請求項３４】
レプチンおよびアディポネクチンからなる群から選択される化合物を対象に投与することを付加的に含む、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
外因性プロモーターおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸に対応するｃＤＮＡを保持する細胞を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、ここで、当該細胞が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを構成的に過剰発現する細胞である、前記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３６】
前記外因性プロモーターがアクチンプロモーターである、請求項３５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３７】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項３５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含む、形質転換ベクター。
【請求項３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含む、ホスト細胞。
【請求項４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含む核酸構築物であって、前記配列が哺乳動物において機能できるプロモーターに作動可能なように連結する、核酸構築物。
【請求項４１】
前記プロモーターがアクチンプロモーターである、請求項４０に記載の核酸構築物。
【請求項４２】
請求項４０に記載の核酸構築物により形質転換された動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  米国仮出願番号６０／７０５，９４０の２００５年８月５日の出願日の利益が、すべての国における適用可能な条約および協定の下で主張される。米国では、２００５年８月５日に出願された米国仮出願番号６０／７０５，９４０の利益は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で主張される。
【０００２】
技術分野
[0002]  本発明は、肥満とインスリン抵抗性および脂肪血症の関連、およびエネルギーホメオスタシスの変化に関係することが見いだされ、“ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  １”（Ｓｗｉｒ１）と命名された、新規遺伝子およびその結果として生じるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
[0003]  肥満はますます一般的になっている世界的な疾患であり、流行に相当する程度に到達している。現在の推定では、少なくとも西欧人口の５０％が体重過剰かまたは肥満のいずれかである。肥満、とりわけ腹部肥満は、インスリン抵抗性、脂質代謝異常、肝脂肪症、および高血圧のような他の状態と組み合わせて、メタボリック、またはインスリン抵抗性シンドロームとして公知である。インスリン抵抗性および２型糖尿病に関連した脂質代謝異常の主要な病態生理学的特徴は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）中の増加した血漿トリグリセリド（ＴＧ）、および低下した高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールである。一般的に、増加した循環しているＴＧは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）に加水分解され、肝臓を含む末梢組織によって吸収され、そして肝脂肪症、または非アルコール性脂肪肝を導くことができる。肥満および代謝障害のいくつかの突然変異マウスモデルの研究は、インスリン抵抗性と調節困難なＴＧ間の関連が複雑で末梢性および中枢性の両方の要因を含むことを暗示する。
【０００４】
[0004]  インスリン抵抗性は骨格筋および脂肪組織（ｆａｔ）における、低下したインスリン刺激グルコース取込、ならびに損なわれた肝臓グルコース放出抑制を表す（２）。高血糖症および高脂肪血症は２型糖尿病の病態生理の副作用でもあり、その原因となる要因でもある。グルコース毒性および脂肪毒性は、インスリン作用およびβ‐細胞からの分泌の抑制によって、インスリン抵抗性および２型糖尿病をさらに促進する。高インスリン血症は肝臓グルコース放出を抑制することに初めは成功するが、増大したインスリンの有害な効果が正常な血糖値を維持することに関連した利益を相殺する（２）。高インスリン血症は、高血圧、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、および冠動脈心疾患を含む、一群の代謝異常における要因であると考えられている。ＮＡＦＬＤ疾患は一般にインスリン抵抗性に関連し、２種の転写因子：ステロール調節要素結合タンパク質‐１ｃ（ＳＲＥＢＰ１ｃ）およびペルオキシソーム増殖因子受容体‐γ（ＰＰＡＲγ）を必要とする（３〜６）。肝臓におけるＳＲＥＢＰ１ｃまたはＰＰＡＲγシグナリングの欠如は、肥満インスリン抵抗性マウスにおいて起こる肝脂肪症の発症を阻止する（５〜７）。
【０００５】
[0005]  インスリン抵抗性を説明する一般的な機序を定義することは、インスリン受容体（ＩＲ）シグナリングシステムの複雑さ、およびこの障害の発症に貢献するのは１つではなく多くの要因であるという認識ゆえに、困難であり続けた。２種のアダプタータンパク質、ＩＲＳ１およびＩＲＳ２のチロシンリン酸化はインスリンによるグルコース取込刺激における重要な初期のステップである（８〜１１）。ＩＲＳ１およびＩＲＳ２は固有の酵素活性を持たず、キナーゼ、ホスファターゼまたはユビキチンリガーゼ機能を持つタンパク質の複合体の形成を促進する分子足場の一部として機能を果たすと考えられている（１２）。ＩＲＳとの結合によるホスホイノシチド３′キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の刺激は、インスリン刺激グルコース取込における重要なステップである。ＰＩ３Ｋのｐ１１０触媒サブユニットの活性化は脂質キナーゼドメインを活性化し、それがホスファチジル−４，５−ビホスフェートをリン酸化する。ＰＩ３Ｋの活性化はインスリンによるグルコース取込の最大限の刺激に必須であるが、他の経路がさらに含まれていてもよい（１２）。
【０００６】
[0006]  インスリン抵抗性の発症に通じる代謝状態は、酸化的代謝によるカロリー摂取の不均衡に起因すると考えられている（１３，１４）。研究は、筋肉におけるミトコンドリア機能の低下が肥満に関連したインスリン抵抗性の発症における要因であることを暗示する（１４，１５）。エネルギー消費の刺激および食欲の抑制は共に、肥満および２型糖尿病のマウスモデルにおいて、グルコース代謝改善に帰着する。このことを十分に特徴付ける例としては、アディポサイトカインのレプチンが挙げられる。レプチンは、視床下部および後脳において作用して食欲を抑制し、自律神経系の刺激を通して骨格筋における酸化的代謝を亢進させる（１６〜２０）。しかし、レプチンはまた、食物摂取または体重に対する顕著な効果とは独立して、肝臓のインスリン感受性を改善することができる（１７）。
【０００７】
[0007]  脂肪酸（ＦＡ）の注入は、４〜６時間以内の筋肉のインスリン感受性の迅速な低下と関連する（２１〜２３）。ＦＡがインスリン刺激グルコース取込を低下させる厳密な機序は、依然として論争の種である。最近のデータは、ＦＡがグルコース取込を刺激するＩＲシグナル伝達経路を妨害することを示唆している（２１、２２、２４）。ＦＡおよびジアシルグリセロールの細胞内濃度の増加がセリンプロテアーゼである、タンパク質キナーゼＣθ（ＰＫＣθ）の活性化を導くという１つの仮説がある（２５）。ＰＫＣθによるＳｅｒ３０７でのＩＲＳ１のリン酸化は、ＩＲによるＩＲＳ‐１のリン酸化を阻止し、低下したＰＩ３Ｋの活性化およびインスリンによるグルコース取込の刺激における低下を導く。
【０００８】
[0008]  肥満とインスリン抵抗性間のリンクとしての分泌されたポリペプチドの異常な活性．  肥満とインスリン抵抗性を関連させる機序を特定することは、新規なグルコース低下療法を開発するために重要である。インスリン抵抗性を究明する最近の研究は脂肪細胞に焦点を合わせてきた。肥満は脂肪細胞から分泌されるポリペプチド（アディポサイトカイン）の調節性ネットワークの異常な調節と機能に関連する。レプチン、アディポネクチン、およびレジスチンのようなアディポサイトカインは肝グルコース生産、筋肉におけるグルコース処理、および脂肪細胞における増殖および脂質貯蔵を調節する（２６）。レプチンは、摂取行動、自律神経活動、および代謝を支配する神経内分泌（甲状腺、副腎）を調節する視床下部および後脳に位置するニューロンへの作用を通じてエネルギーホメオスタシスを調節する（１６）。肥満に関連したレプチン抵抗性または低下した血清アディポネクチンは、減少したインスリン‐増感作用を通じて、および脂肪症（細胞内脂肪酸蓄積）発症のリスクを増やすことによってインスリン抵抗性に貢献する要因である（２７、２８）。非脂肪組織はまた、筋肉由来のマスクリン（２９）および肝臓由来のアンギオポイエチン‐関連成長因子（３０）のような、エネルギー代謝およびインスリン感受性に影響を与えるペプチドを分泌する。これらの因子はまた、メタボリックシンドロームの治療にとっての標的であってもよい。
【０００９】
[0009」  肥満とインスリン抵抗性間のリンクを調査するためのメラノコルチン受容体ノックアウト：  中枢神経系の領域において発現された２種のメラノコルチン受容体はエネルギーホメオスタシスに関係する。マウス（Ｍｃ４ｒ−／−またはＭｃ４ｒＫＯマウス）におけるニューロンのメラノコルチン‐４受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子を標的とした枯渇も肥満および高インスリン血症を引き起こし、同様に肝臓の脂質生成遺伝子発現増大および肝脂肪症に関連する。別のニューロンメラノコルチン受容体が欠失しているマウス（Ｍｃ３ｒ−／−またはＭｃ３ｒＫＯマウス）は、高脂肪規定食を与えられるとＭｃ４ｒ−／−マウスと同じ程度の肥満を発症するが、同じレベルのインスリン抵抗性、高脂肪血症および悪化した肝脂肪症を提示しない。Ｍｃ３ｒＫＯおよびＭｃ４ｒＫＯ系統を使用する研究は、両方とも誇張された規定食‐誘発肥満を提示することを示しているが、Ｍｃ４ｒＫＯにおけるインスリン感受性の低下はより速やかで深刻である（３１、３２）。図１Ａ〜１Ｅは、低脂肪規定食または高脂肪規定食のいずれかの関数としての体格に換算して野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）および２種のノックアウトマウスにおける既知の違いの一部を説明する（３１、３２）。マウスおよびヒトにおける重いインスリン抵抗性は、肝腫脹および脂肪症に関連する（３３）。Ｍｃ４ｒＫＯは肥満状態で肝臓のインスリン抵抗性および増大した肝臓の脂質生成を伴う肝腫脹を発症し、高脂肪規定食（ＨＦＤ）で重いグルコースおよびインスリン不耐性に関連したグルコースホメオスタシスの著しい悪化を提示する。図２Ａ〜２Ｅは２種のマウス系統における肝腫脹および脂肪症における違い、さらに脂質代謝に関係した遺伝子発現の違いを示す（４、１７、５７）。一方、脂肪量（ＦＭ）に関してＭｃ４ｒＫＯに匹敵するＭｃ３ｒＫＯは、グルコースホメオスタシスの非常にわずかな悪化を提示する。
【００１０】
[0010]  ＳＷＩＲ１に類似したｃＤＮＡの配列．  ＳＷＩＲ１に相同なタンパク質候補をコードするｃＤＮＡの配列およびオープンリーディングフレーム候補は、ｃＤＮＡの大規模シークエンシングに関係したいくつかのコンソーシアムによって以前に公開されている。Ｒ．Ｌ．Ｓｔａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｉｔｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  １５，０００  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９巻，ｐｐ．１６８９９−１６９０３（２００２）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＣ０２１９４４，完全なコーディング配列をもつｃＤＮＡ）；およびＨ．Ｆ．Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＳＰＤＩ），ａ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｅｆｆｏｒｔ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１３巻，ｐｐ．２２６５−２２７０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１９８５７３，完全なコーディング配列をもつｃＤＮＡ）を参照されたい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の初めの３７アミノ酸残基と類似した相同性を持つタンパク質が同定されている。しかし、この記載されたタンパク質の核酸およびアミノ酸配列はｃＤＮＡシークエンシングの一ヌクレオチドエラーのために不正確であるかもしれない。本明細書に記載されたタンパク質に関して、以前に機能は公開されていない。
【発明の開示】
【００１１】
[0011]  我々は２種の肥満のトランスジェニックマウスモデルを使用した調査に基づいて新規な分泌ペプチド（Ｓｗｉｒ１）を発見している。マイクロアレイ遺伝子発現解析およびリアルタイム定量ＰＣＲによる実証を使用して、重いインスリン抵抗性およびグルコース不耐性Ｍｃ４ｒＫＯおよびレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウスにおいて、７６アミノ酸分泌タンパク質候補をコードするｍＲＮＡ（ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＫ００９７１０）の発現が１／１０に減少していることが見いだされた。対照的に、適度にグルコース不耐性であるが、正常なインスリンへの反応を提示する肥満Ｍｃ３ｒＫＯマウスでは、Ｓｗｉｒ１タンパク質の発現において３０〜４０％の限られた減少が見られた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、肝臓のＳｗｉｒ１ｍＲＮＡ発現と空腹時グルコースレベルにおける負の相関が見いだされた。また、視床下部におけるＳｗｉｒ１の発現は肥満およびインスリン抵抗性によって減少した。我々はまた、ｍＲＮＡが分泌タンパク質をコードすることを確証した。肝臓および脳のＳｗｉｒ１ｍＲＮＡ発現に対する規定食‐誘発肥満の負の作用に基づいてタンパク質をコードする遺伝子は“Ｓｗｉｒ１”（“ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  １”）と呼ばれた。組換えアデノウイルスを使用してマウス肥満モデルにおけるＳｗｉｒ１の発現を増加させた。アデノウイルス注射によるＳｗｉｒ１の過剰発現は、空腹時インスリン、トリグリセリドおよびコレステロールレベルを有意に、および再現可能に低下させた。その上、脂質生成（脂肪酸合成）およびＦＡＳタンパク質レベルに関係する重要な遺伝子の発現はＬｅｐｏｂ／ＬｅｐｏｂマウスにおけるＳｗｉｒ１アデノウイルス処理によって低下した。
【００１２】
[0012]  すべての組織において発現されるヒトβ‐アクチンプロモーターによって制御されるＳｗｉｒ１ＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を使用して、Ｓｗｉｒ１タンパク質を過剰発現するマウスのトランスジェニックＦＶＢ／ＤＮＡ系統が作製された。Ｓｗｉｒ１を過剰発現する雌ＦＶＢ／ＮＪマウスは著しく減少した脂肪量、およびより高い代謝率を有し、これは間接熱量測定法（Ｏｘｙｍａｘ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）を使用して酸素消費（ＶＯ２）を測定することによって特定された。トランスジェニックマウスにおいて観察された代謝率の増大は、Ｓｗｉｒ１を発現する組換えアデノウイルスを注射されたマウスを使用した実験から生じた結果に基づいて予言されていた。Ｓｗｉｒ１を発現する組換えアデノウイルスに感染したマウスは一晩の絶食中にさらに多くの体重を失い、絶食中に代謝率を低下させて補償する能力が損なわれたことを暗示する。ＦＶＢ／ＮＪ  Ｓｗｉｒ１トランスジェニックマウスは、より高い代謝率と関連して、絶食中に同様の過大な体重損失を提示した。Ｓｗｉｒ１の抗糖尿病作用の要素はしたがって、酸化的代謝に関連する経路の刺激を含み得る。すなわち、Ｓｗｉｒ１は身体活動度、基礎代謝率、または両方の組み合わせに対する作用を通じて、部分的に熱（ｋＪ）消費とカロリー支出のバランスを標準化することを通じて、肥満のインスリン抵抗性個体の代謝的特徴を改善し得る。
【００１３】
[0013]  経口摂取、注射、皮下パッチ、または鼻腔内経路によって送達される全長Ｓｗｉｒ１ペプチド、またはそのペプチドフラグメント、誘導体、ホモログ、アナログ、もしくはミメティックは、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、および／またはエネルギー不均衡障害にとっての治療または診断薬として使用可能であった。
【００１４】
[0014]  抗体（ＡＢ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＡＢ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））は、ＢＣ０２１９４４にとって予言されたオープンリーディングフレームに由来するペプチドフラグメントに対して産生され、図５に示される。これらの抗体を使用して、ヒト血清、およびラット脳におけるＳｗｉｒ１‐免疫反応性の存在を証明し、ＢＣ０２１９４４に対して予言されたオープンリーディングフレームが小さい分泌ペプチドをコードするという結論を強く支持した。Ｓｗｉｒ１‐免疫反応性はヒト血漿において検出された（データは示さない）。ラット脳では、Ｓｗｉｒ１免疫反応性を持つニューロンは視床下部の弓状核において同定されている。この観察の重要性は、視床下部の弓状核のニューロンが任意の熱産生および身体活動度の両方に対する、およびグルコースホメオスタシスに対する効果を通じて、エネルギー支出の調節に関係しているということである［Ｃｏｎｅ  ＲＤ．Ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５  Ｍａｙ；８（５）：５７１−８；Ｃｏｐｐａｒｉ  Ｒ，Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  Ｍ，Ｌｅｅ  ＣＥ，Ｐｕｌｌｅｎ  ＡＥ，Ｋｅｎｎｙ  ＣＤ，ＭｃＧｏｖｅｒｎ  ＲＡ，Ｔａｎｇ  Ｖ，Ｌｉｕ  ＳＭ，Ｌｕｄｗｉｇ  Ｔ，Ｃｈｕａ  ＳＣ  Ｊｒ，Ｌｏｗｅｌｌ  ＢＢ，Ｅｌｍｑｕｉｓｔ  ＪＫ．Ｔｈｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ａｒｃｕａｔｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ：ａ  ｋｅｙ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｌｅｐｔｉｎ’ｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２００５  Ｊａｎ；１（１）：６３−７２．］ＦＶＢ／ＮＪトランスジェニックマウスの増大したエネルギー支出および身体活動度は、したがって中枢神経系における、より明確には、視床下部の弓状核におけるニューロンの活動を調節することに基づいた作用を通じた、作用を含んでいてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明を実施するための方法
[0058]  本発明は新規分泌タンパク質（Ｓｗｉｒ１）を開示し、その機能の一部を確認する。このタンパク質の配列はいくつかの哺乳動物種にまたがって高度に保存されていることが見いだされ、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１２〜１８で示される。その上、このタンパク質をコードする核酸を使用して、Ｓｗｉｒ１を発現する組換えアデノウイルスによる感染によって、またはアクチンプロモーターに制御されたＳｗｉｒ１ＤＮＡを使用してトランスジェニック系統を作製することによって、のいずれかで、Ｓｗｉｒ１タンパク質を過剰発現するマウスを作製した。
【００１６】
[0059]  一態様において、Ｓｗｉｒ１タンパク質、フラグメント、誘導体またはアナログを使用して、増大した体格に関連した病態生理、たとえば、肥満、高血糖症、高インスリン血症、インスリン抵抗性、高脂肪血症、およびインスリン非依存的２型糖尿病を治療的に予防することができる。
【００１７】
[0060]  別の態様において、精製されたＳｗｉｒ１タンパク質、フラグメント、誘導体またはアナログは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１における、そして図４に示されるオープンリーディングフレーム由来の少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を使用して、種々の哺乳動物から単離される、または合成される、またはタンパク質、フラグメント、誘導体またはアナログを発現する細胞培養物を使用して作製される。
【００１８】
[0061]  別の態様において、Ｓｗｉｒ１タンパク質、そのフラグメント、誘導体またはアナログに対する抗体が作製される。これらの抗体はキットの状態で使用され、体液を含む種々の試料由来のＳｗｉｒ１タンパク質を同定することができる。
【００１９】
[0062]  別の態様において、活性なプロモーター、たとえばアクチンプロモーターにＳｗｉｒ１配列を連結することにより、Ｓｗｉｒ１タンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物が作製される。別の態様において、少なくともＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレーム（図４において下線を施した部分）を含む形質転換ベクターが作製される。
【実施例１】
【００２０】
Ｓｗｉｒ１タンパク質の発見およびその機能
[0063]  痩せた、および肥満のＭｃ３ｒＫＯマウスにおける肝臓の遺伝子発現を解析するマイクロアレイは、１６，４６３〜１８，４００の７０−マーオリゴヌクレオチドのライブラリー（Ｍｏｕｓｅ  Ａｒｒａｙ−Ｒｅａｄｙ  Ｏｌｉｇｏ  Ｓｅｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０，Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｐｅｒｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）からプリントしたアレイを使用して実施された（３４〜３６）。マイクロアレイデータは、脂質代謝（アポリポタンパク質）および肥満から派生する酸化ストレスに関連する遺伝子の増加した発現を示唆した。興味深いことに、年齢、性、および肥満（ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）にかかわらず、Ｍｃ３ｒＫＯマウスの肝臓において３種の遺伝子だけの発現が低下した。２種の遺伝子：糖タンパク質および糖脂質からシアル酸を切断する酵素をコードするノイラミニダーゼ３（ｎｅｕ３）、および有機アニオントランスポーターをコードする溶質キャリアファミリー（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ２１（ｓｌｃ２１ａ１）は、既知の機能を持つタンパク質をコードした。第３の遺伝子（ＡＫ００９７１０）は新規であり、データベース上に特定された機能は全くなかった。
【００２１】
[0064]  定量的リアルタイム（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲｅａｌＴｉｍｅ）ＰＣＲは、Ｍｃ３ｒＫＯの肝臓におけるＡＫ００９７１０の発現のあまり多くない低下傾向を示すマイクロアレイデータを確証した（図３Ａ）。興味深いことに、ＡＫ００９７１０発現のより劇的な低下が、重いインスリン抵抗性のＭｃ４ｒＫＯおよびレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウスの肝臓で観察された（図３Ｂ）。その上、レプチンの短期間処理（２日間にわたり０．５ｍｇ／ｇレプチンを４回注射）はＬｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂマウスの肝臓におけるＳｗｉｒ１を有意に増加させた。（図３Ｃ）。６週齢の痩せたＭｃ４ｒＫＯにおけるＡＫ００９７１０  の発現は正常であり（データは示さない）、肝臓におけるＭｃ４ｒＫＯの発現の減少は肥満、インスリン抵抗性、および肝脂肪症の年齢に関連した開始から派生していることを示唆する（３２）。さらに、ＡＫ００９７１０発現は、規定食‐誘発肥満Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける空腹時グルコースと負に相関した（ｎ＝１３、Ｒ２＝０．６７、Ｐ＜０．００１）（データは示さない）。
【００２２】
[0065]  結局、これらの結果は、肝臓における発現がインスリン感受性および肝脂肪症と共に減少する小さい分泌タンパク質の同定を示唆する。肝臓におけるＡＫ００９７１０発現の減少が肝脂肪症およびインスリン抵抗性の重症度と相関する、およびこの減少がインスリン増感物質によって逆転するという観察に基づいて、“ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  １”（Ｓｗｉｒ１）という名称が選ばれた。
【００２３】
[0066]  ＡＫ００９７１０のｍＲＮＡを標的としたオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、肥満およびインスリン抵抗性の種々のマウスモデル由来の肝臓ｃＤＮＡにおけるＡＫ００９７１０遺伝子発現を測定した。プライマーの配列は：センス５′−ｃｃｔｇａｇｇｇｔｇｃｔｇｔｃｔｇｔｃａｔｇ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、アンチセンス５′−ｃａｇｔａｇｃａｇｃａａｇａａｇｃｃｔａｃｇ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、プローブ５′−６ＦＡＭ−ｃｔｃｔｃａｔｃｇｃｃａｔｃｇｔｃｔｇｃａ−ＢＨＱ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であった。初めのマイクロアレイの結果と一致して、ＡＫ００９７１０  ｍＲＮＡはＷＴマウスに比較してＭｃ３ｒ−／−マウスの肝臓においてダウンレギュレーションされた（５５％、ｐ＜０．０５；図３Ａ）。次に２種の他の肥満モデル、Ｍｃ４ｒ−／−マウスおよびレプチン‐欠乏Ｌｅｐｏｂ／ＬｅｐｏｂマウスにおけるＡＫ００９７１０肝臓ｍＲＮＡ発現を調べた。ＡＫ００９７１０ｍＲＮＡは野生型マウス（ＷＴ）に比較して、これらの２種のモデルでは約１／１０の低いレベルで発現された（図３Ｂ）。すべての動物を一群に寄せ集めた場合、ＡＫ００９７１０ｍＲＮＡ発現とグルコースおよびインスリン値間の負の関係が観察された（データは示さない）。随意に餌を食べさせた、１６時間絶食させた、または２４時間絶食させ、その後４時間再給餌した、若年および老年ＷＴマウスの肝臓では、ＡＫ００９７１０遺伝子発現は変化しなかった（データは示さない）。ＡＫ００９７１０は栄養状態によって変化しないと考えられる。
【００２４】
[0067]  ＡＫ００９７１０ｍＲＮＡがインスリン抵抗性の発症から二次的に調節される可能性があるかを判断するために、若年、正常インスリン血および老年高インスリン血Ｍｃ４ｒ−／−マウスの肝臓においてＡＫ００９７１０ｍＲＮＡが測定された。若年Ｍｃ４ｒ−／−マウス（平均約７週齢）ではＡＫ００９７１０ｍＲＮＡは野生型マウスに類似していることが観察されたが、老年（約１６週齢）Ｍｃ４ｒ−／−マウスではそれは著しく減少していた（データは示さない）。その上、ＡＫ００９７１０ｍＲＮＡはまた糖尿病および糖尿病でない対象に由来する少数（ｎ＝４）のヒト‐由来肝細胞において測定された。糖尿病試料では発現がより低い傾向であったが、違いは統計的に有意ではなかった（データは示さない）。
【００２５】
[0068]  したがって、Ｍｃ３ｒ−／−およびＭｃ４ｒ−／−マウスの肥満は類似しているが、インスリン抵抗性および上昇した血清脂質（トリグリセリド、コレステロール）はＭｃ４ｒ−／−マウスにとってはずっと深刻であることが知られている。肝臓におけるＡＫ００９７１０遺伝子発現の低下は、Ｍｃ４ｒ−／−マウスのインスリン抵抗性および高脂肪血症の既知の重症度と相関した。
【実施例２】
【００２６】
配列およびバイオインフォマティックス解析
[0069]  ＡＫ００９７１０は、長さ１２４７ｂｐのマウス舌ｃＤＮＡクローンであり、Ｕｎｉｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｍｍ．３４０７４，２３１００４０Ａ０７Ｒｉｋ：ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２３１００４０Ａ０７遺伝子に属する。それは、配列の５′末端に接した５３４アミノ酸のタンパク質をコードできると仮説された。このタンパク質候補がメチオニン残基によって開始しなかった場合、それは切断された産物として記載された。ＮＣＢＩデータベース上の相同なＥＳＴまたはｃＤＮＡ配列に対するＡＫ００９７１０のＢＬＡＳＴ解析は、大規模なＳｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅによって発見された、８７ａａの仮説タンパク質（ＵＮＱ４７０／ＧＡＡＩ４７０）をコードするヒト転写物、ＮＭ１９８５７３との著しい対応を明らかにした（３７）。ヒト配列−ＮＭ＿１９８５７３との対応は、３９２ヌクレオチドにまたがって８５％であった、ｐ＝５ｅ−８３。ヒト配列は、１エキソンにおいて８７アミノ酸タンパク質をコードした。６フレームのＡＫ００９７１０の翻訳は７６アミノ酸のタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をコードするオープンリーディングフレームを明らかにした。このマウスタンパク質候補とＮＭ＿１９８５７３によってコードされたヒトタンパク質（ＧＡＡＩ４７０、またはＵＮＱ４７０）間のアラインメントは、初めの３７残基にわたる強い相同性を明らかにした。ＵＮＱ４７０／ＧＡＡＩ４７０はクロモソーム９ｐ１３．２に位置し、毛様体神経成長因子受容体（ＣＮＴＦＲ）遺伝子に隣接する。
【００２７】
[0070]  ＡＫ００９７１０の配列はマウス肝臓から単離されたｃＤＮＡを使用して確証された。その上、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＭＧＣ）プログラムによってマウス肝臓からクローニングされ、最近ＮＣＢＩデータベースに提供された、受託番号ＢＣ０２１９４４を持つ８６８ｂｐのｃＤＮＡは、我々の配列データに一致した（図４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。ＢＬＡＳＴ解析は、マウスの予言された７６ａａ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）はいくつかの哺乳動物種（図５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ラット）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３（チンパンジー）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４（ヒト）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５（イヌ）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（ブタ）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（ウシ）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８（ヒツジ））に高度に保存されていることを明らかにした。図５では、ｐＡＢ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびｐＡＢ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）は、ポリクローナル抗体を生み出すために使用される分泌タンパク質候補の領域を表す。予言されたシグナル配列には下線を施す。その上、マウスタンパク質、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の３４〜７６までのアミノ酸（Ｓｗｉｒ１３４−７６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、および３９〜７６までのアミノ酸（Ｓｗｉｒ１３９−７６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）に対応するペプチドが合成された。
【００２８】
[0071]  ＡＫ００９７１０由来のマウス配列候補とヒトＧＡＡＩ１４７０のそれ以上の解析は、ＧｅｎＢａｎｋ上のヒト配列における１ヌクレオチドギャップを明らかにした。したがって、マウスＡＫ００９７１０のＰＣＲ産物は両方向においてクローニングされ、配列決定されて、マウスまたはヒトのいずれの配列が正しいかを確証した。配列が実証されたＡＫ００９７１０マウスクローンは７６アミノ酸翻訳産物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を明らかにした（図４）。一般に利用できるヒトＧＡＡＩ４７０のＯｒｉｇｅｎｅクローンが解析され、ヌクレオチドギャップを含まないことが示され、ＧｅｎＢａｎｋのＮＭ＿１９８５７３配列におけるシークエンシングエラーを示唆した。ヒトを含む、異なる種由来のＡＫ００９７１０配列のアラインメントは、タンパク質レベルでラット、ヒト、マウスおよびチンパンジー間の１００％相同性を明らかにした（図５）。
【００２９】
[0072]  バイオインフォマティックス解析は、このタンパク質が位置３３および３４間に最も可能性のある開裂部位を持つ分泌タンパク質（８７％の確率、ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０）である可能性が高いことを明らかにした。ヒト配列は、予言された開裂点に対してすべて３′の１つの可能性のあるセリン部位、および１つの可能性のあるトレオニンリン酸化部位、ならびに開裂部位に対して同様にすべて３′の６つの可能性のあるグリコシル化部位を含む。
【実施例３】
【００３０】
Ｓｗｉｒ１の組織分布
[0073]  ＡＫ００９７１０ｍＲＮＡの組織分布を調べるために、７６アミノ酸タンパク質ＳＷＩＲ１を含む２１０ｎｔ配列およびｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してノーザンブロットを行った。図６Ａで見ることができるように、約１．３５ｋｂの単一バンドはヒトでは脳および肝臓試料だけに検出され、最も高レベルは肝臓において検出された、しかし、図６Ｂで見られるように、Ｓｗｉｒ１はマウスでは肝臓、脳、および筋肉において見いだされた。
【実施例４】
【００３１】
Ｓｗｉｒ１が分泌タンパク質であるという確証
[0074]  バイオインフォマティックス解析は、ＡＫ００９７１０が分泌タンパク質であることを暗示するシグナル配列候補の存在を予言した。これを試験するために、７６アミノ酸タンパク質のコーディング配列は、制限部位Ｎｏｔ１  （５′−ｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃａｃｃａｔｇｇｇｇｇｃａｇｃｃａｔｃｔｃｃｃａａ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））およびＸｈｏ１（５′−ｇｇｇｃｔｃｇａｇｇｇｃｃａｇａｇｃｃｃｔｔｃａｇｇｇｃｔｇｃａｇ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））を付加したプライマーを使用して、マウス肝臓ｃＤＮＡから増幅された。産物はＣ−末端にＦＬＡＧエピトープを持つｐＣＭＶ−Ｔａｇ１ベクター（ｐＣＭＶ−Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧ）に連結され、その後ＨＥＫヒト腎臓由来細胞に一過性にトランスフェクションされた。また、この産物を使用して、２種のアデノウイルス構築物ＦＬＡＧエピトープに結合したＳｗｉｒ１を持つ１種（Ａｄ−Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧ）、およびＦＬＡＧエピトープのない別の１種（Ａｄ−Ｓｗｉｒ１）を作製した。
【００３２】
[0075]  ＨＥＫ２９３細胞は、ｐＣＭＶ−Ｓｗｉｒ１またはｐＣＭＶ−Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧをトランスフェクションされた。培地は１６時間後に集め、免疫沈降し、その後２０％ポリアクリルアミドゲルに流し、抗‐ＦＬＡＧ抗体によって視覚化した。これらの実験は生来の、またはＦＬＡＧ‐標識Ｓｗｉｒ１を発現する組換えアデノウイルス（Ａｄ５）を使用して繰り返された。
【００３３】
[0076]  ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションされなかった（レーン１、２）、または空の（ｅｍｐｔｙ）ベクター（レーン５、６）もしくはＧＦＰを含むベクター（レーン７、８）をトランスフェクションされた場合、ＦＬＡＧ‐免疫反応性バンドは視覚化されなかった（図６Ｃ）。しかし、ｐＣＭＶ−Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧ構築物がＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションされた（レーン３、４）場合、ＦＬＡＧ‐陽性免疫反応性が培地および細胞ペレットの両方に検出され、少なくともトランスフェクションされたＳｗｉｒ１産物の一部が細胞によって培地に能動的に分泌されていたことを示唆した。類似の結果がＡｄ−Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧに感染したＨＥＫ２９３細胞（図８、レーン９）の培地において観察された。レーン１０および１１は、それぞれＦＬＡＧエピトープがない、またはＧＦＰの付いたＳｗｉｒ１を含むアデノウイルスに感染した細胞の培地においてＦＬＡＧ免疫反応が全くないことを示した。したがって、エピトープで標識した融合タンパク質（ｐＣＭＶ−Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧ）を発現する発現ベクターをトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の培地におけるＦＬＡＧ免疫反応性の存在は、７６ａａタンパク質の定義されていない部分が分泌されることを確証した。
【００３４】
[0077]  尾静脈に注射された大部分のアデノウイルスは肝臓に感染する（３８）。アデノウイルスの尾静脈注射が肝臓、および他の組織におけるＳｗｉｒ１ｍＲＮＡの増加した発現を導くかどうかを試験するために、３匹のＭｃ４ｒ−／−マウスはＡｄ−Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧアデノウイルスを注射され、４日後に組織が集められた。ウェスタンブロットによる解析は、肝臓、筋肉、および脳組織におけるＦＬＡＧ免疫反応性の存在を明らかにし、これらの組織におけるＳｗｉｒ１の存在を示唆した（図６Ｄ）。Ａｄ−Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧに感染したマウス組織におけるＳｗｉｒ１ＦＬＡＧ免疫反応性の分布は肝臓から循環系に分泌されるポリペプチドと一致する。これらの試験は共にＳｗｉｒ１が分泌タンパク質であることを示唆した。
【実施例５】
【００３５】
Ａｄ−Ｓｗｉｒ１による肥満インスリン抵抗性マウスの処理：Ｍｃ４ｒＫＯ
[0078]  組換えアデノウイルスベクター‐媒介発現を使用して肝代謝の調節およびインスリン感受性を検討してきた（３９〜４１）。７６ａａタンパク質（Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１）、Ｃ−末端ＦＬＡＧ‐標識融合タンパク質（Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧ）、または陰性対照のための緑色蛍光タンパク質を発現する３種の組換えアデノウイルスベクターが構築された。尾静脈注射後のタンパク質の発現は、抗‐ＦＬＡＧ抗体を使用して確証された（図６Ｄ、データは示さない）。分泌タンパク質候補のＮ−およびＣ−末端領域に対するポリクローナル抗体（図５におけるｐＡＢ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）＆ｐＡＢ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））を使用して、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞におけるＳｗｉｒ１の合成が確証された（図７Ａ、Ｂ）。
【００３６】
[0079]  Ｓｗｉｒ１がグルコース代謝に関係するかどうかを検討するために、２０週齢の雄および雌Ｍｃ４−／−（１群につきそれぞれの性のｎ＝３）の尾静脈にＡｄ５‐ＳＷＡＩＲ１またはＡｄ５‐ＧＦＰ（５ｘ１０８ｐｆｕ）を注射した。両群の動物は、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰ注射の前に、体重、グルコースレベルおよびグルコース耐性を対応させた。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰ注射の１週間前に、腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）が実施され、すべてのマウスがグルコース不耐性であることが観察された。ＩＰＧＴＴは、Ｗ．Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｌｅｖｅｌｓ，”Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１巻，ｐｐ．９３０７２−３０７９（２０００）に記載のように、一晩絶食したマウスに、１ｇ／ｋｇグルコースを１回腹腔内注射し、血糖は血糖メーターおよび試験細片（Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ，  Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．，  Ｅｌｋｈａｒｔ，  Ｉｎｄｉａｎａ）により数回、間隔をあけて動物の尾部血液から測定することによって実施した。
【００３７】
[0080]  マウスは１００μＬの希釈液（ＤＭＥＭ）中の５ｘ１０８ｐｆｕのＡｄ５−Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５−ＧＦＰを尾静脈に注射された。動物は４日間の実験を通して観察され、毎日体重を測定された。４日目に、マウスは別のＩＰＧＴＴ（０．４ｍｇグルコース／ｇ体重）を与えられた。
【００３８】
[0081]  ＩＰＧＴＴを使用して測定されるように、マウスはＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１注射後４日目に改善されたグルコース耐性を証明した（データは示さない）。実験を通して体重、血糖、またはコレステロールレベルにおける変化は見られなかった。インスリンおよび血清トリグリセリドレベルにおける減少傾向が見られた（表１）。
【００３９】
【表１】
2009502208.tif 000003
【実施例６】
【００４０】
Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１による肥満インスリン抵抗性マウスの処理：Ｂ６Ａｙ／ａ
[0082]  第２のアデノウイルスによる実験は、約３ヶ月間、超高脂肪規定食で維持されてきた雄Ｃ５７ＢＬ／６  Ａｙ／ａマウス（１群につきｎ＝９）の尾静脈にＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰを注射することによって実施された。マウスを１週間注射から回復させた後、ＩＰＧＴＴが実施された。その後マウスをもう１週間回復させ、インスリン抵抗性試験（ＩＴＴ）が実施された。
【００４１】
[0083]  注射後２０日目に、体重（Ａｄ５−ＳＷＩＲ１マウスの場合、４０．３±１．３ｇ；Ａｄ５−ＧＦＰマウスの場合４１．４±１．２ｇ）、空腹時インスリン（Ａｄ５−ＳＷＩＲ１マウスの場合、０．９７±０．２ｎｇ／ｍＬ；Ａｄ５−ＧＦＰマウスの場合、１．１３±０．２ｎｇ／ｍＬ）、または空腹時グルコースレベル（Ａｄ５−ＳＷＩＲ１マウスの場合、１２６±７ｍｇ／ｄＬ；Ａｄ５−ＧＦＰマウスの場合、１３９±８ｍｇ／ｄＬ）における違いは観察されなかった。注射後７日目のＩＰＧＴＴは、Ａｄ５−ＳＷＩＲ１群の３０分時点（ｐ＝０．０６）および４５分時点（ｐ＝０．１５）におけるグルコース耐性の非常にわずかな程度の改善を明らかにした。注射後１４日目の血糖値の変化は群間で著しく異なり、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１群では著しく低下した（データは示さない）。注射後１４日目のＩＴＴは、いずれの時点でもインスリン感受性の有意な差は明らかではなかったが、Ｋｉ（基準グルコースからインスリン注射後３０分のグルコースを引き、３０で割ったものとして計算する）は有意に異なった。
【００４２】
[0084]  注射後１４日目にこれらのマウスにおいて観察された、より低い空腹時血糖値は、注射後２１日目では明白ではなかった。Ｍｃ４−／−マウスにおける初めのアデノウイルスの実験と一致して、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１群では血清トリグリセリドにおける減少傾向が見られた（表２）。
【００４３】
【表２】
2009502208.tif 000004
【実施例７】
【００４４】
Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１による肥満インスリン抵抗性マウスの処理：Ａｇｏｕｔｉ（ＫＫ−Ａｙ）マウス（遺伝的な肥満および高脂肪血マウス）
[0085]  血液脂質の尺度に対するアデノウイルス注入の効果をより明確に検討するために、アデノウイルス構築物はさらに精製され、汚染しているウイルス粒子および細胞の破片をすべて除去した。次に、遺伝的な肥満および高脂肪血ＫＫ−Ａｙマウス（１群につきｎ＝６の雌）の尾静脈にＡｄ５‐ＳＷＩＲ１またはＡｄ５‐ＧＦＰＡｄ５‐ＧＦＰを注射することによって別のアデノウイルスの実験が行われた。マウスはウイルス注射後５日目にＩＰＧＴＴを与えられ、その後一晩絶食し、２日目に死に至らせた。
【００４５】
[0086]  ＩＰＧＴＴはＡｄ５‐ＧＦＰ処理に比較してＡｄ５‐ＳＷＩＲ１処理によって有意にグルコース耐性が改善されないことを示した。Ａｄ５‐ＧＦＰ対照に比較して、Ａｄ５‐ＳＷＩＲ１の循環トリグリセリド（２８％、ｐ＝０．０４）およびコレステロール（２０％、ｐ＝０．０２）における統計的に有意な低下が観察された（表１）。Ａｄ５‐ＳＷＩＲ１マウスの肝重量はＡｄ５‐ＧＦＰ対照の肝重量より低い傾向が見られた（表２）。体重、ならびに血清グルコースおよびインスリンレベルは、Ａｄ５‐ＳＷＩＲ１とＡｄ５‐ＧＦＰ対照間に有意な差は見られなかった（表２）。
【００４６】
【表３】
2009502208.tif 000005
[0087]  Ｓｗｉｒ１ｍＲＮＡは、Ａｄ５‐ＧＦＰ処理マウスに比較して、ＫＫ−Ａｙ  Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１処理マウスの肝臓において約４倍上昇した（データは示さない）。
【実施例８】
【００４７】
Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１による肥満インスリン抵抗性マウスの処理：Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂマウス
[0088]  アデノウイルス媒介性のＳｗｉｒ１過剰発現の脂質低下効果を確証するために、高脂肪血、脂肪症およびインスリン抵抗性の別のマウスモデルである、Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ（ＯＢＯＢ）マウスの尾静脈にＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰが注射され、別の実験が行われた（１群につきｎ＝７〜８）。注射されたマウスはＩＰＧＴＴを与えられないが、体重変化をモニターされ、一晩絶食後、注射７日目に死に至らせた。
【００４８】
[0089]  Ａｄ５‐ＧＦＰ処理マウスは７日間でおよそ１ｇ体重が増加した。しかし、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１処理はこれらの肥満Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂマウスにおける体重増加を遮断した。平均体重は群間で統計的に差がなく、食物摂取は測定されなかった。ＫＫ−Ａｙマウスで観察されたもの（先の実施例７を参照されたい）と類似の表現型の変化が同様に観察された。血清トリグリセリドはＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１群で４０％低下した（Ａｄ５−ＧＦＰ  ６３±６ｍｇ／ｄＬ（Ａｄ５−ＧＦＰ）；３８±４ｍｇ／ｄＬ（Ａｄ５−ＳＷＩＲ１）、ｐ＝０．００６；表２）。血清コレステロールの１５％低下も観察された（１７３±６ｍｇ／ｄＬ（Ａｄ５−ＧＦＰ）；１４６±８ｍｇ／ｄＬ（Ａｄ５−Ｓｗｉｒ１）、ｐ＝０．０２；表２）。肝重量低下の傾向が観察され、それは体重の百分率として表した場合有意ではなかった（ｐ＝０．１２）。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１群における空腹時血糖およびインスリンレベル低下の傾向は統計的有意に及ばなかった。
【００４９】
[0090]  アデノウイルス構築物の精製およびＫＫ−ＡｙマウスおよびＬｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ（ＯＢＯＢ）マウスを使用した実験におけるより大きな試料集団の使用は、７〜８日間のＳｗｉｒ１の過剰発現が対照マウスと比較して、低下した循環トリグリセリドおよびコレステロールレベルを導くことを証明した。（表２）。これらの効果の傾向は未精製アデノウイルスを使用した以前の実験において、より後の時点での観察によって観察された。肝臓におけるＳｗｉｒ１遺伝子発現はこれらの実験においてＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１処理群で上昇したが、以前の実験において、より後の時点における増加は検出可能でなかった。この理論に束縛されることを望まないが、Ｓｗｉｒ１の増加した遺伝子発現が増加したＳｗｉｒ１タンパク質の循環レベルを導くと考えられる。
【実施例９】
【００５０】
Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１による肥満インスリン抵抗性マウス処理の結果の概要
[0091]  要約すると、５ｘ１０９ｐｆｕのＡｄ５−Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５−ＧＦＰが、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｍａｉｎｅ）から購入したＫＫＡｙ、Ｂ６  Ａｙ／ａ、またはＯＢＯＢマウスの尾静脈に投与された。図７Ｃに示した処理プロトコルは、この期間にＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧのピーク発現を証明するパイロット実験に基づいた（データは示さない）。動物と食物の重量は毎日記録した。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１感染はこれらの実験のために使用されるマウス系統において十分に許容された。処理期間にわたり、Ａｄ５‐ＧＦＰに感染した対照と比較して、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１に感染したマウスの体重に著しい変化は見られなかった（表２）。Ａｄ５‐ＧＦＰで処理した対照と比較して、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１に感染したマウスではＳｗｉｒ１ｍＲＮＡの４〜５倍の増加が観察された（データは示さない）。
【００５１】
[0092]  肝重量および脂質含量はＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１に感染したマウスにおいて首尾一貫して低下した。ＫＫ‐ＡｙおよびＯＢＯＢマウスでは、空腹時トリグリセリドおよび総コレステロールの有意な低下（約４０％）が観察された。類似の減少がＡｙ／ａマウスにおいて観察された。肥満ＯＢＯＢ、ＫＫ‐ＡｙおよびＡｙ／ａマウスを使用したいくつかの実験に由来するデータのメタ解析は、ＯＢＯＢ、ＫＫ‐ＡｙおよびＡｙ／ａマウスにおけるＨＯＭＡ−ＩＲ［（空腹時インスリンｘグルコース）／２２．５］の４０％低下を示唆した。Ａｙ／ａマウスでは、空腹時インスリンレベルはＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１により有意に低下（２．６±０．４対３．９±０．３ｎｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０５）し、血糖は差がなかった（１７５±１２  対  １６２±１１ｍｇ／ｄＬ）。
【００５２】
【表４】
2009502208.tif 000006
【実施例１０】
【００５３】
脂質生合成に関係する遺伝子に対するＳｗｉｒ１過剰発現の効果
[0093]  アディポサイトカインによる肝脂肪症の逆転は少なくとも部分的に肝脂肪形成の抑制および脂肪酸酸化の刺激に起因すると考えられる（４２、４３）。Ｓｗｉｒ１が肝脂肪含量を低下させる機序を検討するために、脂肪形成に関係する遺伝子の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した（図８Ａ〜８Ｄ）。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１に感染したＯＢＯＢ、およびＫＫＡｙマウス肝臓の脂肪形成に関連するいくつかの遺伝子の発現において同等の４０〜５０％の低下が見られた。Ｓｗｉｒ１はしたがって、少なくとも部分的に、肝臓の脂肪形成を阻止することによって肝脂肪含量を低下させる可能性がある。
【００５４】
[0094]  Ａｄ５‐ＧＦＰ対照と比較してＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１処理群における脂肪酸シンターゼ（Ｆａｓｎ）ｍＲＮＡにおける有意な減少（図８Ａ、ｐ＝０．０２）、およびタンパク質レベルの減少（データは示さない）が観察された。Ｆａｓｎ  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの減少はＤ．Ｃ．Ａｌｂａｒａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−４  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｉｃｅ，”Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４５巻，ｐｐ．２４３−２５２（２００４）に記載のように、定量的リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロットを使用して測定された。脂肪酸トランスロカーゼＣＤ３６の遺伝子発現もＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１群において有意に上昇した（ｐ＝０．０２、データは示さない）。図８Ａは、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰのいずれかを注射後８日目の肥満したレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウス由来の肝臓における脂肪酸シンターゼ（Ｆａｓｎ）の発現レベルを説明する。データは任意単位（ＡＵ）で表した（ｎ＝６〜８／群、“＊”ｐ＜０．０５）。Ｓｗｉｒ１過剰発現はＦａｓｎの減少を引き起こした。図８Ｂは、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰのいずれかを注射後８日目の肥満したレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウス由来の肝臓におけるステアロイル‐ＣｏＡデサチュラーゼ（Ｓｃｄ１）タンパク質の発現レベルを説明する。データは任意単位（ＡＵ）で表した（ｎ＝６〜８／群、“＊”ｐ＜０．０５）。さらにまた、Ｓｗｉｒ１過剰発現はＳｃｄ１の減少を引き起こした。図８Ｃは、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰのいずれかを注射後８日目の肥満したレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウス由来の肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ）ｍＲＮＡの発現レベルを説明する。データは任意単位（ＡＵ）で表した（ｎ＝６〜８／群、“＊”ｐ＜０．０５）。さらにまた、Ｓｗｉｒ１を持つマウスは肝臓Ａｃｃのより低いレベルを示した。図８Ｄは、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰのいずれかを注射後８日目の肥満したレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウス由来の肝臓におけるインスリン抵抗性に関係する遺伝子（サイトカインシグナリングのサプレッサー３またはＳｏｃｓ３）発現レベルを説明する。データは任意単位（ＡＵ）で表した（ｎ＝６〜８／群、“＊”ｐ＜０．０５）。Ｓｗｉｒ１の存在はさらにまたＳｏｃｓ３遺伝子発現を減少させた。
【実施例１１】
【００５５】
トランスジェニックによるＳｗｉｒ１過剰発現（ＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１）
[0095]  ヒトβ‐アクチンプロモーター、合成エキソン１およびイントロン、ならびに７６ａａＳｗｉｒ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む構築物（ＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１）を使用して、Ｓｗｉｒ１を過剰発現するトランスジェニック系統が生み出された（図９Ａ；図４を参照されたい、オープンリーディングフレームは下線を施される）。８匹のファウンダーが得られた（２ＦＶＢ／ＮＪ、６Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）。ＦＶＢ系統の１種［ＦＶＢ／ＮＪ．Ｔｇ−（ＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１）ＡＡＢ２０］、以後ＦＶＢ．Ｔｇと表す、は５〜６週齢において肝Ｓｗｉｒ１発現の増加を提示した（図９Ｂ）。図１０は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ卵母細胞へのＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１の１回目の注射における仔のＰＣＲスクリーニングの結果を説明し、６匹の仔（６、８、１４、１９、２１、および２２）がゲノムにトランスジーンを組み込んだことを示した。
【００５６】
[0096]  ＦＶＢ．Ｔｇでは、５〜６週齢で血清ＴＧおよびＴＣの低下がすでに明白であった（表５、図９ｃ）。ＦＶＢ．Ｔｇトランスジェニックの体重（表５）およびＦＭ（図９Ｄ）はＷＴ同腹仔に比較して低下していた。ＦＶＢ．Ｔｇマウスの体重増加もＨＦＤ（６０％ＫＪ／脂肪）の状態で低下し、規定食‐誘発肥満からの保護を示唆した（図９Ｅ）。低下した体重および脂肪含量はＨＦＤを食べて１ヶ月後でも依然として観察され、ＷＴ対照に比較してＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニックの低下した空腹時インスリンレベルの傾向に関連した（１８０±６０対３１０±４０ｐｇ／ｍｌ、両側‐スチューデントのｔ‐検定Ｐ＝０．０８５）。
【００５７】
【表５】
2009502208.tif 000007
[0097]  上に示すように、Ｓｗｉｒ１過剰発現は絶食に対する代謝的適合を損ない、増加したエネルギー支出を示唆することが観察された。Ｓｗｉｒ１がエネルギー支出を増加させるかどうかを特定するために、ＶＯ２およびＲＥＲが間接熱量測定によって測定された（１５、４６、５０）。Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒは、温度制御されたインキュベーターに入れられた１６チャンバー総合的実験動物モニタリングシステム（ＣＬＡＭＳ）を有する。ＣＬＡＭＳは、酸素消費（ＶＯ２）、呼吸交換比（ＲＥＲ、丸ごとの動物の基質酸化の指標）、ＸおよびＺ軸における身体活動度、および食物摂取を同時に測定する。マウスはＣＬＡＭＳシステムに置かれ、示されたパラメータを７２時間記録した。マウスは４８時間随意に餌を与え、最後の２４時間は絶食させた。ＦＶＢ．Ｔｇの結果は図１３Ａ〜１３Ｆに示す。肥満したＫＫ−Ａｙ、Ａｄ５Ｓｗｉｒ１を発現する肥満したＢ６  Ａｙ／ａマウス（Ａｄ５−Ｓｗｉｒ１対Ａｄ５−ＧＦＰの一晩絶食後の％体重損失：５．５±０．４％対３．５±０．４％、Ｐ＜０．０１）、および９週齢の痩せたＦＶＢ．Ｔｇ（１３．６±１．１％対１０．０±０．７％、Ｐ＜０．０５）において一晩絶食後の体重損失の増加が観察された。１ヶ月の高脂肪食による飼育後、間接熱量測定によるトランスジェニックマウスにおけるエネルギー代謝の測定は、対照と比較して、著しく増加した酸素消費（ＶＯ２、ｍｌ／ｈ：ＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１  Ｔｇ  ４５５１±２４０、ＷＴ  ＦＶＢ  ３８０７±１４５、Ｐ＜０．０５）および光を消した状態での身体活動度（１時間ごとのＸビームブレーク：ＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１  Ｔｇ  １４３１±１８１；ＷＴ  ＦＶＢ  ２６７８±３２７、Ｐ＜０．０１）を示唆した。増加したエネルギー支出はしたがって、Ｓｗｉｒ１による規定食‐誘発肥満およびインスリン抵抗性の改善における要因であり得る。
【実施例１２】
【００５８】
Ｓｗｉｒ１は脂肪細胞を操作する
[0098]  組換えまたは合成型の短い分泌ポリペプチドＳｗｉｒ１３４〜７６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の使用を試験するために実験が行われた。合成Ｓｗｉｒ１３４〜７６に対する脂肪細胞および肝細胞（２種の潜在的なＳｗｉｒ１作用の部位）の反応は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の変化を分析した。ＥＲＫ１／２およびｐ３８αは脂肪細胞における脂肪分解および熱発生の調節において重要である。
【００５９】
[0099]  １μｇ／ｍｌのＳｗｉｒ１３４〜７６の適用は十分に分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（図１１Ａ）、およびＨｅｐＧ２細胞（図１１Ｂ）における、Ｅｒｋ１リン酸化の盛んな増加に関係した。これらの結果は、Ｓｗｉｒ１３４〜７６にとっての機能的受容体が脂肪細胞および肝細胞において活性であること、および合成ペプチドが生物学的に活性であることを示唆した。その上、より短い、第２のペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸３９〜７６までを使用して合成され、“Ｓｗｉｒ１３９〜７６”（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）と呼ばれた。脂肪細胞および肝細胞を使用して、類似の結果がこのペプチドに関して観察された。４つのアミノ酸の損失はＳｗｉｒ１機能に影響を与えるように見えなかった。
【実施例１３】
【００６０】
視床下部におけるＳｗｉｒ１機能
[0100]  視床下部Ｓｗｉｒ１は、エネルギーホメオスタシスの調節に関係する可能性がある。ｐＡＢ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を使用した予備的な解析は、視床下部の弓状核に位置するニューロンにおいてＳｗｉｒ１免疫反応性の存在を証明した。視床下部Ｓｗｉｒ１発現と肥満およびインスリン抵抗性間には負の相関が存在することが予言された。言い換えると、肥満の状況における肝臓および視床下部でのＳｗｉｒ１合成の低下が肥満およびインスリン抵抗性に貢献する要因である可能性がある。
【００６１】
[0101]  Ｓｗｉｒ１のｍＲＮＡ発現は、対照（低脂肪規定食）および規定食‐誘発肥満Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｍｃ３ｒＫＯおよびＭｃ４ｒＫＯマウス由来の視床下部内側底部ブロックにおいて定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定された（図１２Ａ〜１２Ｂ）。予言したように、視床下部における多量のＳｗｉｒ１ｍＲＮＡは肥満状態において低下した（図１２Ａ）。Ｓｗｉｒ１発現は、インスリン抵抗性の指標である高いＨＯＭＡ−ＩＲ値を持つマウスにおいても低かった（図１２Ｂ）。
【００６２】
[0102]  対照的に、Ｓｏｃｓ３ｍＲＮＡ発現は肥満およびインスリン抵抗性の状況において上昇した（図１１Ｃ）。このデータは肥満の状況における低下したＳｗｉｒ１合成は肝臓に限定されないことを示唆した。視床下部における低下したＳｗｉｒ１活性も、肥満およびインスリン抵抗性の発症に貢献することになる。
【００６３】
[0103]  要約すると、カルボキシ末端にエピトープ‐タグを持つ、予言された７６残基のＳｗｉｒ１（ＢＣ０２１９４４のヌクレオチド２０７〜４３７間；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をコードする部分的ｃＤＮＡ配列を使用して発現ベクターが構築され、タグに対する市販の抗体を使用したウェスタンブロットでのタンパク質の視覚化を可能にした。この構築物を使用して、報告された配列が分泌タンパク質をコードすることを実証した。次にこの発現ベクターとエピトープラベルを持たない生来のタンパク質をコードする発現ベクターを使用して、マウスの研究における使用のための組換えアデノウイルス（Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１）を構築した。アデノウイルス５ｘ１０８ｐｆｕの尾静脈への注射は、主に肝臓、そしてより低い程度に膵臓の感染に帰着した。エピトープ‐タグＳｗｉｒ１を発現するアデノウイルスを使用して、ウイルスの注射後５日目に肝臓、脳、および骨格筋においてＳｗｉｒ１タンパク質の広範な分布が見られることが証明された。生来の形態のＳｗｉｒ１を発現するこのアデノウイルスを使用して、分泌タンパク質にとっての新規な機能（空腹時血清トリグリセリドおよびコレステロールの低下）が示された。肝臓Ｓｗｉｒ１ｍＲＮＡ発現の低下が高脂肪血の肥満マウスにおいて観察され、低下の程度は総コレステロールとトリグリセリドの増加と相関した。生来の形態のＳｗｉｒ１を発現するこのアデノウイルスを使用して、高コレステロールおよびトリグリセリドの状態の肥満マウスモデルにおいてＳｗｉｒ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を増加させることがコレステロールおよびトリグリセリドの両方を正常レベルに低下させることにおいて有効であることが示された。トリグリセリドおよび総コレステロールを低下させるＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１感染の効果は再現可能であり、３種の異なるマウス系統（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ、ＫＫ−Ａｙ、およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ）において観察された。一部のマウスでは、より低い空腹時インスリンおよびグルコースの傾向においてインスリン感受性の改善が観察され、グルコース耐性試験における改善が生じる。後者の観察は、Ｓｗｉｒ１が肥満した、インスリン抵抗性患者においてインスリン感受性を改善することにおいて有効であり得ることを示唆する。
【００６４】
[0104]  データは、経口摂取、注射、皮下パッチ、または鼻腔内経路によって送達された全長Ｓｗｉｒ１ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、またはそのペプチド誘導体、ホモログ、アナログ、もしくはミメティックが、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、および／またはエネルギー不均衡の治療または診断薬として使用可能であることを暗示する。当該技術分野で公知の方法により、生来のコーディング配列内の置換物を作製し、増大した安定性および／または生物学的潜在力を持つＳｗｉｒ１の誘導体を作製することができる。その上、Ｓｗｉｒ１は総コレステロール、トリグリセリド、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、および／またはエネルギー不均衡を低下させることを目的とした療法の開発のための潜在的な薬物標的であるため、Ｓｗｉｒ１ペプチドを使用して、未だ同定されていない受容体として使用しうるその細胞受容体を同定することができる。
【００６５】
[0105]  新規な分泌タンパク質、Ｓｗｉｒ１は肥満状態におけるインスリン抵抗性および肝脂肪症の病因における重要な要因であり、中等症〜重症の糖尿肥満（ｄｉａｂｅｔｙ）のマウスモデルにおける遺伝子発現のマイクロアレイ解析によって同定されている。Ｓｗｉｒ１は、２型糖尿病のマウスモデルにおける空腹時インスリンおよびグルコースの指標であるＨＯＭＡ−ＩＲ、および血清脂質を有意に低下させ、そして肝脂質を低下させて、肝脂肪症の逆転を示唆する。Ｓｗｉｒ１のトランスジェニック過剰発現は痩せた表現型に関連する。Ｓｗｉｒ１はレプチンおよびアディポネクチンに類似した様式で働くようであり、エネルギー支出を刺激し、酸化的代謝を増やすことにより、肥満したインスリン状態における代謝の特性を改善する。
【実施例１４】
【００６６】
Ｓｗｉｒ１処理は肝インスリン抵抗性を逆転することになる
[0106]  Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１およびＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニック由来の予備データ（先に記載）は、改善されたインスリン作用および脂質代謝を示唆した。ＦＶＢ．Ｔｇマウスでは、増加した酸化的代謝がこれらの効果を説明する有望な因子である。ＦＭの低下に対して二次的なそれらから、Ｓｗｉｒ１の抗糖尿病作用を詳細に分析することが可能でないかもしれない。組換えアデノウイルスを使用した予備データは、肥満に対する効果とは独立して、Ｓｗｉｒ１が高インスリン血および高脂肪血を低下させることを示唆する。したがって、組換えアデノウイルスおよび合成ペプチドを使用した別の実験が、肝臓代謝およびインスリン感受性に対するＳｗｉｒ１の‘直接’効果に関する重要な情報を提供してもよい。
【００６７】
[0107]  インスリン受容体シグナリングを測定することにより、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１処理による肝脂肪症の逆転が、肝臓および骨格筋において改善されたインスリン感受性に関連するかどうかを特定する実験が行われることになる。これらはインスリン受容体チロシンキナーゼにとって遠位であるインスリン受容体基質１および２のリン酸化の解析を含む。グルコース輸送の調節に関係し、ホスファチジル−３′キナーゼの下流である（４４、４５）、セリン／トレオニンキナーゼであるタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）／Ａｋｔの活性も、インスリン受容体活性化の指標として測定されることになる。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１に感染したマウスの著しく大きな体重損失を示すパイロットデータは、増加した基礎代謝率を暗示した。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１が食後および空腹状態中の全身代謝率を増すかどうかは、間接熱量測定を使用して特定されることになる。肝臓、骨格筋および褐色脂肪組織由来の組織溶解産物における酸化的代謝も特定されることになる。
【００６８】
[0108]  アデノウイルス処理の基本的プロトコルは図７Ｃに示す。手短に述べると、すべてのマウスは、５ｘ１０９ｐｆｕのＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰを尾静脈に注射される（ｎ＝１２／群、全部で２４）。マウスは４日間回復させた後に、次の実験で使用される。終了時に採取された肝臓試料を使用し、リアルタイムＰＣＲおよびノーザンブロット解析によりＳｗｉｒ１ｍＲＮＡを測定することによって感染を推定する。予備実験では、Ｓｗｉｒ１ｍＲＮＡの４倍の増加が感染後４〜７日目に観察された。Ｓｗｉｒ１タンパク質はまた、ウェスタンブロットにより、または現在開発中のアッセイ（ＲＩＡ／ＥＬＩＳＡ）の使用を通じてのいずれかで測定される。マウスはアデノウイルス注射の当日、ならびに絶食前および後に体重測定される。可能ならば、身体組成は核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を使用して特定される（１５、３２、４６）。以前に記載のように、マウスは食物摂取およびこぼした量の測定を考慮するワイアメッシュケージでの飼育に慣らされることになる（１５）。
【００６９】
[0109]  ＦＶＢ．Ｔｇの性的二形が再現可能であり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上のＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニックにおいて観察される場合、Ａｄ５実験は改変されて雄および雌の反応を検討することになる。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１処理に対する肥満したインスリン抵抗性マウスの反応を検討する実験の大部分は雄を使用した；雌は異なる反応、おそらく改善されたインスリン感受性に加えて、体重損失を提示することになるかもしれない。このことは新規なことではなく、たとえば性的二形はインスリンおよびレプチンの食欲抑制作用に対する雄および雌の反応において観察されている（４７、４８）。
【００７０】
[0110]  肝脂肪症の逆転が増加したインスリン感受性に関連するかどうかを判断すること。  この実験は２群の遺伝子型（Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１、Ａｄ５‐ＧＦＰ対照）内の１２匹が含まれるＫＫ−ＡｙおよびＡｙ／ａマウスを含むことになる（２４  ＫＫＡｙ、２４  Ａｙ／ａ）。一晩絶食後５日目に、Ａｄ５‐ＳＷＡＩＲ１およびＡｄ５‐ＧＦＰ群の６匹はインスリン（１Ｕ／ｋｇ）を１回腹腔内投与され、残りの６匹は生理食塩水を与えられる。マウスは注射後１０または２０分のいずれかに死に至らせ（ｎ＝３／群）、組織試料（肝臓、大腿四頭筋）が集められ、即座に液体窒素で凍結される。ＩＲＳリン酸化、ＰＫＢ活性、およびＦｏｘＯ１リン酸化は先に記載のように測定される（１５、４９）。この実験は、インスリンおよびグルコース耐性試験を行うために、１群につき８匹のマウスだけでさらに２回繰り返される。
【００７１】
[0111]  Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１の抗‐脂肪症効果は、肝臓におけるインスリン受容体チロシンキナーゼのインスリンに刺激された活性を増加させることになる。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１はまた、筋肉および／または脂肪組織におけるインスリンシグナリングを改善してもよい。グルコースクリアランスを検討する初期の研究は、おそらく最適下の実験デザイン［すなわち、少数のマウス（ｎ＝４〜５）；アデノウイルス注射後多様な時間（２週間まで）において実施された］のために混合した結果に終わった。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１はグルコース／インスリン注射に反応してグルコースクリアランスを改善することになる。
【００７２】
[0112]  Ｓｗｉｒ１が全身のエネルギー支出および酸化的代謝を増加させるかどうかを判断すること。  Ｓｗｉｒ１の肝発現がエネルギー支出を増加させるかどうかを特定するために、間接熱量測定を使用して、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰを注射された、肥満したＡｙ／ａならびに痩せた、および規定食‐誘発肥満Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＶＯ２およびＲＥＲが測定される（１５、４６、５０）。Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒは、温度制御されたインキュベーターに入れられた１６チャンバー総合的実験動物モニタリングシステム（ＣＬＡＭＳ）を有する。ＣＬＡＭＳは、酸素消費（ＶＯ２）、呼吸交換比（ＲＥＲ、丸ごとの動物の基質酸化の指標）、ＸおよびＺ軸における身体活動度、および食物摂取を同時に測定する。マウスはＣＬＡＭＳシステムに９６時間置かれ、示されたパラメータを７２時間記録する。マウスは４８時間随意に餌を与え、最後の２４時間は絶食させる。別個の実験において、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰに感染したＡｙ／ａおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８／群）から集めた肝臓、腓腹筋、および褐色脂肪組織における脂肪酸酸化（Ｃ１４−パルミテート）およびミトコンドリア酵素機能（シトレートシンターゼ活性、シトクロムｃオキシダーゼ）が測定される。転写因子（すなわち、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＰＰＡＲγ）のｍＲＮＡおよびタンパク質発現、ならびに脂肪生成に関係する酵素の測定のために肝臓の一部が集められ、即座に凍結される（３２）。
【００７３】
[0113]  Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１に感染したマウスの増大した体重損失は、増大した基礎代謝率を示唆し、発見はＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニック由来の空腹時体重損失および間接熱量測定データにより確証された（図１３Ａ〜Ｆを参照されたい）。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１による感染はＶＯ２を増加させることが予言されているが、このことは空腹相中だけに明白であってもよい。肝臓だけにおけるミトコンドリア酸化酵素活性の増加は、オートクリン／パラクリン因子として働くＳｗｉｒ１と一致することになる。骨格筋および褐色脂肪組織における増加したミトコンドリア酸化酵素活性は、自律神経系を通じて、または筋肉および／または褐色脂肪組織において発現される受容体を通じてのいずれかで働く内分泌機能を暗示することになる。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１は著しくエネルギー支出を増加させている（ＦＶＢ．Ｔｇにおいて観察されるように）が、体重に影響を与えていない場合、食物摂取の代償的増加が予言されることになる。Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１で処理されたＯＢＯＢマウスにおいて観察される、脂肪生成に関係する遺伝子発現の低下が同様に予言される（図８Ａ〜８Ｄ）。
【実施例１５】
【００７４】
Ｓｗｉｒ１のトランスジェニック発現は肥満およびインスリン抵抗性を予防する
[0114]  レプチン（５１、５２）およびアディポネクチン（５３、５４）を過剰発現するトランスジェニックマウスは、いずれかのタンパク質の過剰発現の抗糖尿病作用を証明している。Ｓｗｉｒ１の過剰発現はアディポネクチンおよびレプチンの過剰発現で観察されたものに匹敵する結果；すなわち、規定食によって‐および遺伝的に誘発された肥満の状況における改善されたインスリン感受性およびグルコース耐性、ならびにより低い空腹時脂質を有することになると予測される。Ｓｗｉｒ１は肝臓、骨格筋および／または褐色脂肪組織における酸化的代謝を増加させることによりエネルギー支出を増加させることが同様に予測される。Ｓｗｉｒ１作用の生理学の包括的解析は、このポリペプチドがエネルギー代謝およびインスリンシグナリングを調節する機序に焦点を合わせる将来の実験にとって重要である。
【００７５】
[0115]  トランスジェニック：  ７６ａａタンパク質をコードする配列はヒトβ‐アクチンプロモーターによって制御される合成トランスジーンに連結されている（図９Ａ）。Ｓｗｉｒ１は分泌タンパク質であり、それゆえ組織選択性はこれらのトランスジェニック研究にとって重要ではない。内因性遺伝子の抑制が過剰発現の効力を限定する可能性があるため、内因性遺伝子が豊富に発現されている場合、組織特異的プロモーターは使用されていない（５３、５４）。ｍＲＮＡ発現の包括的解析は、先に記載（３１、３２、４６）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）およびノーザンブロット解析を使用して完了することになる。タンパク質レベルは、Ｓｗｉｒ３４〜７６のＮ−およびＣ−末端に対する２種のポリクローナル抗体（ｐＡＢ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ｐＡＢ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））を使用して、ウェスタンブロットにより測定される（図５）。これは免疫沈降を使用してタンパク質を検出することを必要としてもよい。あるいは、手持ちの、または開発中の抗体が、感度のよい、定量的アッセイを開発するために有用である場合、これらが使用されることになる。トランスジーンコピー数はサウザンブロット解析によって特定される。この実験の下位の目的はしたがって、マウス組織（肝臓、視床下部、前脳、後脳、骨格筋および心筋、腹膜後および鼠径脂肪貯留物、胃、腸、膵臓、腎臓）におけるＳｗｉｒ１ｍＲＮＡ発現のいっそう包括的な解析である。主要臓器（心臓、腎臓、腸、肝臓）は重量を測定され、主要な形態学的変化を組織学的に精査されることになる。
【００７６】
[0116]  本発明者らは、Ｓｗｉｒ１が、過剰発現された場合に肥満およびインスリン抵抗性のマウスモデルにおける代謝特性を改善する（すなわち、増加したインスリン感受性、低下した肝脂肪生成）分泌ポリペプチドの小グループ（レプチン、アディポネクチン）の中の１種であることを示した。Ｓｗｉｒ１の過剰発現はエネルギー代謝に対してレプチン様の効果を有し、規定食‐誘発肥満およびインスリン抵抗性から保護する。Ｓｗｉｒ１を投与することは規定食‐および遺伝‐誘発肥満に関連するインスリン抵抗性および脂質代謝異常を逆転することができ、そして２型糖尿病の開始を予防するか、または遅らせることができる。
【００７７】
その他
[0117]  本明細書および特許請求の範囲で使用する“Ｓｗｉｒ１”という用語は、タンパク質Ｓｗｉｒ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、その機能的ペプチド（たとえばＳｗｉｒ１３４〜７６）、誘導体およびアナログを表す。“誘導体”および“アナログ”という用語は構造がＳｗｉｒ１に類似し、そして改変されていないＳｗｉｒ１に質的に類似した効果を提示するタンパク質であると理解される。“機能的ペプチド”という用語は依然としてＳｗｉｒ１受容体に結合するか、または身体細胞、たとえば、脂肪細胞または肝細胞内の変化を活性化しうるＳｗｉｒ１タンパク質の一部を表す。
【００７８】
[0118]  本発明に記載のＳｗｉｒ１、その機能的ペプチド、そのアナログおよび誘導体の投与を使用して、インスリン抵抗性および脂質代謝異常を逆転し、肥満の開始を予防するか、または遅らせてもよい。これらの化合物はまた、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、肥満、および糖尿病の治療または診断薬として使用されうる。
【００７９】
[0119]  本明細書で使用する、“治療的有効量”という用語は、統計的に有意な程度（ｐ＜０．０５）に、インスリン抵抗性患者において、身体エネルギー支出を増加させる、血清トリグリセリドを減少させる、血清コレステロールを減少させる、高脂肪血を軽減する、インスリン抵抗性を軽減する、または２型糖尿病の開始を遅らせるか、もしくは軽減する、のいずれかに十分なＳｗｉｒ１タンパク質、フラグメント、または誘導体もしくはアナログの量を表す。Ｓｗｉｒ１タンパク質投与のための投薬量範囲は所望する効果を生み出す範囲である。一般に、投薬量は患者の年齢、体重、状態、および性と共に変化することになる。当業者は本明細書の教示が与えられる場合、適切な投薬量範囲を容易に特定してもよい。投薬量はいかなる禁忌の事象においても個々の医師によって調整されうる。どんな事象においても、治療の有効性は身体代謝、体重、または血清グルコース、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルのいずれかを当業者に公知の方法によりモニターすることによって決定しうる。その上、Ｓｗｉｒ１は当該技術分野で公知の薬剤的に受容できるキャリアに加えることができる。
【００８０】
[0120]  この治療方法は一般に、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む、哺乳動物において使用してもよい。本発明に記載のペプチドは、経口、静脈内、非経口、皮下、肺内、および鼻腔内投与を含む、いずれか適切な手段によって患者に投与されてもよい。
【００８１】
[0121]  非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、または腹腔内投与が挙げられる。ペプチドはまた、たとえば徐放性皮下インプラントの形態で、またはカプセル剤、粉末剤もしくは顆粒剤の形態で経皮的に投与されてもよい。それはまた、吸入によって投与されてもよい。
【００８２】
[0122]  非経口投与のための薬剤的に受容できるキャリア製剤には、滅菌、水性または非水性溶液、懸濁液、および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。水性キャリアには、生理食塩水および緩衝液を含む水、アルコール性／水性溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。非経口ベヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または不揮発油が挙げられる。ペプチドは薬剤的に受容できる賦形剤と混合されてもよく、そして活性成分に匹敵する。適切な賦形剤には、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールおよびエタノール、またはその組み合わせが挙げられる。静脈内ベヒクルには、流動物および栄養素補充剤、電解質補充剤、たとえば、リンゲルデキストロースに基づいたものなどが挙げられる。保存剤および他の添加剤、たとえば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスが同様に存在してよい。
【００８３】
[0123]  形態は投与経路に依存して変化してもよい。たとえば、注射用組成物はそれぞれが単位投薬量を含むアンプルの形態で、または複数の投薬量を含む容器の形態で提供されてもよい。
【００８４】
[0124]  化合物は薬剤的に受容できる塩として治療用組成物に製剤されてもよい。これらの塩には、無機酸、たとえば塩酸もしくはリン酸塩、または酢酸、蓚酸、もしくは酒石酸のような有機酸などと共に製剤される酸付加塩が挙げられる。塩はまた、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄の水酸化物のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から形成される塩が挙げられる。組成物は静脈内、皮下、または筋肉内に投与されてもよい。
【００８５】
[0125]  制御された送達は、ペプチドを適切な高分子、たとえばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロラミン、またはラクチド／グリコリドコポリマーと混合することによって成し遂げられてもよい。活性化合物の放出速度は高分子の濃度を変化させることにより制御されてもよい。
【００８６】
[0126]  作用時間を制御するための別の方法は、ポリエステル、ペプチド、ヒドロゲル、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレンビニルアセテートコポリマーのような重合物質の粒子にペプチドを取り込むことを含む。あるいは、ペプチドは、たとえばコアセルべーション技術により、もしくはたとえばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン‐マイクロカプセルまたはポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルそれぞれの使用による界面ポリマー化により作製されたマイクロカプセル中に、またはコロイド薬物送達系中にカプセル化されてもよい。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノ‐カプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型乳濁液、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質を基礎にした系が挙げられる。
【００８７】
[0127]  その上、核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（たとえば、図４の下線を施したオープンリーディングフレーム）のすべてまたは一部を使用してプラスミドまたはベクターを作り、Ｓｗｉｒ１遺伝子を微生物に組み込んで、Ｓｗｉｒ１タンパク質の生産を増加させることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の核酸配列はＳｗｉｒ１タンパク質を生産するために使用できる唯一の配列ではないことを当業者は理解するであろう。また、同一のタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮退のために異なる核酸配列を有する核酸配列も企図される。遺伝コードは、たとえばＢ．Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７）の２１４ページの図９．１を含む非常にたくさんの遺伝学および生物学に関係する参考文献に見いだされてもよい。Ｌｅｗｉｎの２１６ページの図９．３は直接遺伝コードの縮退を説明する。たとえば、アスパラギンのコドンはＡＡＴまたはＡＡＣであってもよい。
【００８８】
[0128]  本発明はまた、受容体結合またはタンパク質分泌に関係しない分子の部分における１以上のサイレントアミノ酸変化を有するＳｗｉｒ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。たとえば、与えられた部位において化学的に等価なアミノ酸を生産することになるヌクレオチド配列の変更が企図され；したがって、疎水性アミノ酸である、アミノ酸アラニンのコドンは、グリシンのような、別の疎水性アミノ酸をコードするコドンによって置換されてもよく、またはバリン、ロイシン、またはイソロイシンのようなさらに疎水性の強い残基によって置換されてもよい。同じように、１つの負に荷電した残基を別の物、たとえばグルタミン酸に対してアスパラギン酸、または１つの正に荷電した残基を別の物、たとえばアルギニンに対してリジンと置換することになる変化も生物学的に等価な産物を生産することが予想されうる。たとえば、遺伝コードによってコードされる“標準”２０アミノ酸の側鎖の性質を示すＬｅｗｉｎ（１９９７）の１０ページの図１．８を参照されたい。（また、刊行された図の誤植、すなわち、グルタミンの略は“Ｇｌｕ”であるべきであることを注意されたい）。
【００８９】
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59. Heisler, L. K., Jobst, E. E., Sutton, G. M., Zhou, L., Borok, E., Thornton-Jones, Z., Liu, H. Y., Zigman, J. M., Balthasar, N. et al. (2006) Serotonin Reciprocally Regulates Melanocortin Neurons to Modulate Food Intake. NeuronJul 20;51(2):239-249.
60. Butler, A. A., Kesterson, R. A., Khong, K., Cullen, M. J., Pelleymounter, M. A., Dekoning, J., Baetscher, M. & Cone, R. D. (2000) A unique metabolic syndrome causes obesity in the melanocortin-3 receptor-deficient mouse. Endocrinology 141: 3518-3521.
[0129]  本明細書に引用されたすべての参考文献の完全な開示は参照として本明細書に援用される。しかし、別の相容れない対立となった場合、本明細書が照査することになる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】[0015]  図１Ａは、３種の異なる系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の、低脂肪規定食（ＬＦ）または高脂肪規定食（ＨＦ）のいずれかを１２週間与えた後の６ヶ月齢の雌マウスにおける体格の違いを例示する。（規定食の有意な効果は“＊”（ｐ＜０．００１）または“＃”（ｐ＜０．０５）によって示される；規定食内の有意な効果は文字によって示され、有意に異なる（ｐ＜０．０５）群は異なる文字を与えられる；有意性は２−ｗａｙ  ＡＶＯＶＡに基づく）  [0016]  図１Ｂは、３種の異なる系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の、低脂肪規定食（ＬＦ）または高脂肪規定食（ＨＦ）のいずれかを１２週間与えた後の６ヶ月齢の雌マウスにおける体重増加の違いを例示する。（規定食の有意な効果は“＊”（ｐ＜０．００１）または“＃”（ｐ＜０．０５）によって示される；規定食内の有意な効果は文字によって示され、有意に異なる（ｐ＜０．０５）群は異なる文字を与えられる；有意性は２−ｗａｙ  ＡＶＯＶＡに基づく）  [0017]  図１Ｃは、３種の異なる系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の、低脂肪規定食（ＬＦ）または高脂肪規定食（ＨＦ）のいずれかを１２週間与えた後の６ヶ月齢の雌マウスにおける体脂肪率の違いを例示する。（規定食の有意な効果は“＊”（ｐ＜０．００１）または“＃”（ｐ＜０．０５）によって示される；規定食内の有意な効果は文字によって示され、有意に異なる（ｐ＜０．０５）群は異なる文字を与えられる；有意性は２−ｗａｙ  ＡＶＯＶＡに基づく）  [0018]  図１Ｄは、３種の異なる系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の、低脂肪規定食（ＬＦ）または高脂肪規定食（ＨＦ）のいずれかを１２週間与えた後の６ヶ月齢の雌マウスにおける脂肪量の違いを例示する。（規定食の有意な効果は“＊”（ｐ＜０．００１）または“＃”（ｐ＜０．０５）によって示される；規定食内の有意な効果は文字によって示され、有意に異なる（ｐ＜０．０５）群は異なる文字を与えられる；有意性は２−ｗａｙ  ＡＶＯＶＡに基づく。）  [0019]  図１Ｅは、３種の異なる系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の、低脂肪規定食（ＬＦ）または高脂肪規定食（ＨＦ）のいずれかを１２週間与えた後の６ヶ月齢の雌マウスにおける除脂肪量の違いを例示する。（規定食の有意な効果は“＊”（ｐ＜０．００１）または“＃”（ｐ＜０．０５）によって示される；規定食内の有意な効果は文字によって示され、有意に異なる（ｐ＜０．０５）群は異なる文字を与えられる；有意性は２−ｗａｙ  ＡＶＯＶＡに基づく）
【図２】[0020]  図２Ａは、高脂肪規定食を与えられた雌マウス由来の、ヘマトキシリンおよびエオジンにより染色した肝臓横断図で示した肝臓微細構造の、３種のマウス系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の比較を例示する。
【００９１】
[0021]  図２Ｂは、低および高脂肪規定食両方を与えられたマウスにおける肥満（ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）（体脂肪率）の相関的要素としての肝重量における、３種のマウス系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の違いを例示する。
【００９２】
[0022]  図２Ｃは、適度の高脂肪規定食を与えられた雄および雌マウスの平均肝重量（ｎ＝５〜６／群）における３種のマウス系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の違いを例示する。（“＊”はＷＴおよびＭｃ３ｒＫＯマウスに対してｐ＜０．０５を示す）。
【００９３】
[0023]  図２Ｄは、高脂肪規定食を与えられたマウス肝臓のステアロイル‐ＣｏＡデサチュラーゼ１（ＳＣＤ１）発現における３種のマウス系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の違いを例示する。データは任意単位（ａ．ｕ．）として表される。（“＊”はＷＴおよびＭｃ３ｒＫＯマウスに対してｐ＜０．０５を示す。）
[0024]  図２Ｅは、高脂肪規定食を与えられたマウス肝臓のアポリポタンパク質Ａ４（ＡｐｏＡ４）発現における３種のマウス系統、野生型（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）およびＭｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）間の違いを例示する。（“＊”はＷＴおよびＭｃ３ｒＫＯマウスに対してｐ＜０．０５を示し、“＃”は同性内の、ＷＴマウスに対してｐ＜０．０５を示す）。
【図３】[0025]  図３Ａは、野生型（ＷＴ）マウスおよび肥満Ｍｃ３ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ３ｒＫＯ）における肝ＡＫ００９７１０ｍＲＮＡ発現の量（ＷＴ発現の百分率として示される）を例示する。
【００９４】
[0026]  図３Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）、Ｍｃ４ｒ−／−欠失マウス（Ｍｃ４ｒＫＯ）およびレプチン‐欠乏Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂマウス（２種の肥満モデル）における肝ＡＫ００９７１０ｍＲＮＡ発現の量（ＷＴ発現の百分率として示される）を例示する。
【００９５】
[0027]  図３Ｃは、２日間にわたり生理食塩水またはレプチン（０．５ｍｇ／ｇ）のいずれかを４回注射された、レプチン‐欠乏Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂマウスにおける肝ＡＫ００９７１０ｍＲＮＡ発現の量（生理食塩水による発現の百分率として示される）を例示する。
【図４】[0028]  下線を施したＳｗｉｒ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを持つ、Ｓｗｉｒ１遺伝子（ＢＣ０２１９４４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のｍＲＮＡ配列を示し、そのアミノ酸翻訳産物Ｓｗｉｒ１候補（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す。
【図５】[0029]  マウス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ヒト（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ラット（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、イヌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ブタ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ウシ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ヒツジ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、およびチンパンジーのＳｗｉｒ１タンパク質候補配列のアラインメントを説明し、ポリクローナル抗体（ｐＡＢ１（（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびｐＡＢ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を生み出すために使用される分泌ポリペプチド候補の領域を示す。
【図６】[0030]  図６Ａは、ヒト組織試料の、Ｓｗｉｒ１タンパク質をコードするＡＫ００９７１０ＤＮＡ配列の放射活性標識部分を使用したノーザンブロット解析の結果を例示する（レーン１〜８は心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓をそれぞれ表す）。
【００９６】
[0031]  図６Ｂは、マウス組織試料上の全長マウスＡＫ００９７１０ＤＮＡプローブを使用したノーザンブロット解析に由来するＳｗｉｒ１ｍＲＮＡバンドの相対強度を例示する。
【００９７】
[0032]  図６Ｃは、培地（Ｍ）およびｐＣＭＶ‐Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧ、ｐＣＭＶ‐ＧＦＰをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３ヒト‐腎臓由来細胞の細胞溶解産物（Ｐｅｌ）における、またはＳｗｉｒ１：ＦＬＡＧ融合タンパク質を発現するアデノウイルスベクターに感染したＨＥＫ２９３細胞由来の培地におけるＦＬＡＧ免疫反応性に関するウェスタンブロット解析の結果を例示する［ＤＮＡをトランスフェクションしない（レーン１、２）；ｐＣＭＶ‐Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧ構築物によるトランスフェクション（レーン３、４）；ｐＣＭＶ‐Ｓｗｉｒ１によるトランスフェクション（レーン５、６）；またはｐＣＭＶ‐ＧＦＰによるトランスフェクション（レーン７、８）；Ａｄ５Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧに感染（レーン９）；Ａｄ５Ｓｗｉｒ１に感染（レーン１０）；またはＡｄＧＦＰに感染（レーン１１）］。Ｓｗｉｒ１タンパク質を視覚化するために、Ｃ−末端ＦＬＡＧ‐エピトープタグを持つ融合タンパク質が作製された。
【００９８】
[0033]  図６Ｄは、アッセイ４日前にＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧを注射されたＭｃ４ｒ−／−マウス由来の種々の組織（肝臓、筋肉、および脳）、ならびに陽性（Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧにより感染したＨＥＫ２９３細胞）および陰性（注射されないＭｃ４ｒ−／−マウス由来の肝臓）の両方の対照におけるＳｗｉｒ１タンパク質ウェスタンブロット解析の結果を例示する。
【図７】[0034]  図７Ａは、Ｓｗｉｒ１（図５に示す）のＮ−末端に対するポリクローナル抗体（ｐＡＢ１）とのインキュベーション後に、組換えＡｄ５‐Ｓｗｉｒ１（生来のタンパク質）またはＡｄ５Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧ（Ｃ−末端にＦＬＡＧを付けた融合タンパク質）に感染したＨＥＫ２９３細胞由来の溶解産物を使用したウェスタンブロット解析の結果を例示する。
【００９９】
[0035]  図７Ｂは、Ｓｗｉｒ１（図５に示す）のＣ−末端に対するポリクローナル抗体（ｐＡＢ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）とのインキュベーション後に、組換えＡｄ５Ｓｗｉｒ１（生来のタンパク質）またはＡｄ５Ｓｗｉｒ１：ＦＬＡＧ（Ｃ−末端にＦＬＡＧを付けた融合タンパク質）に感染したＨＥＫ２９３細胞由来の溶解産物を使用したウェスタンブロット解析の結果を例示する。
【０１００】
[0036]  図７Ｃは、種々の系統のマウスの尾静脈にＡｄ５Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰを投与してマウス代謝へのＳｗｉｒ１処理の効果を試験する（結果は表１に示す）ために使用される処理プロトコルを例示する。
【図８】[0037]  図８Ａは、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰのいずれかを注射後８日目の肥満したレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウス由来の肝臓における脂肪酸シンターゼ（Ｆａｓｎ）ｍＲＮＡの発現レベルを例示する。データは任意単位（ＡＵ）で表した（ｎ＝６〜８／群、“＊”ｐ＜０．０５）。
【０１０１】
[0038]  図８Ｂは、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰのいずれかを注射後８日目の肥満したレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウス由来の肝臓におけるステアロイル‐ＣｏＡデサチュラーゼ（Ｓｃｄ１）タンパク質の発現レベルを例示する。データは任意単位（ＡＵ）で表した（ｎ＝６〜８／群、“＊”ｐ＜０．０５）。
【０１０２】
[0039]  図８Ｃは、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰのいずれかを注射後８日目の肥満したレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウス由来の肝臓におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ）ｍＲＮＡの発現レベルを例示する。データは任意単位（ＡＵ）で表した（ｎ＝６〜８／群、“＊”ｐ＜０．０５）。
【０１０３】
[0040]  図８Ｄは、Ａｄ５‐Ｓｗｉｒ１またはＡｄ５‐ＧＦＰのいずれかを注射後８日目の肥満したレプチン‐欠乏（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）マウス由来の肝臓におけるインスリン抵抗性に関係する遺伝子（サイトカインシグナリングのサプレッサー）の発現レベルを例示する。データは任意単位（ＡＵ）で表した（ｎ＝６〜８／群、“＊”ｐ＜０．０５）。
【図９】[0041]  図９Ａは、Ｓｗｉｒ１を過剰発現するトランスジェニックマウス系統を生み出すために使用されるトランスジーン（ＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１）の構築を例示する。
【０１０４】
[0042]  図９Ｂは、５週目のＦＶＢ／ＮＪファウンダー由来のトランスジェニックマウスの仔（図９Ａのトランスジーンを使用して生み出された）由来の肝臓におけるＳｗｉｒ１発現の量を例示する。
【０１０５】
[0043]  図９Ｃは、９週目のＦＶＢ／ＮＪファウンダー由来のトランスジェニックマウスの仔（図９Ａのトランスジーンを使用して生み出された）の血清由来の空腹時トリグリセリド（ＴＧ）のレベルを例示する。
【０１０６】
[0044]  図９Ｄは、５および９週目の対照と比較した、ＦＶＢ／ＮＪファウンダー由来のトランスジェニックマウスの仔（図９Ａのトランスジーンを使用して生み出された）の、体脂肪率（％体脂肪；左のグラフ）および脂肪量（除脂肪量（ＦＦＭ）および脂肪量（ＦＭ）の両方を示す；右のグラフ）によって測定された身体組成を例示する。
【０１０７】
[0045]  図９Ｅは、６０％高脂肪規定食を食べて７日目のＦＶＢ／ＮＪファウンダー由来のトランスジェニックマウスの仔（図９Ａのトランスジーンを使用して生み出された）の脂肪量（除脂肪量（ＦＦＭ）および脂肪量（ＦＭ）の両方を示す）の変化を例示する。
【図１０】[0046]  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの仔のゲノムへのＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１の組み込み（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ卵母細胞へのＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１の注入に由来）のＰＣＲスクリーニングから生じた結果を例示し、２３匹のうち６匹の仔のゲノムへのトランスジーンの組み込みを示す。
【図１１】[0047]  図１１Ａは、タンパク質Ｓｗｉｒ１（Ｓｗｉｒ１３４−７６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の分泌される部分の適用１５分後の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＥｒｋリン酸化の増加を例示する。
【０１０８】
[0048]  図１１Ｂは、分泌タンパク質Ｓｗｉｒ１（Ｓｗｉｒ１３４−７６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の適用１５分後のＨｅｐＧ２肝細胞におけるＥｒｋリン酸化の増加を例示する。
【図１２】[0049]  図１２Ａは、２種の規定食（ＬＦ＝１０％ｋＪ／脂肪；ＨＦ＝６０％ｋＪ／脂肪）のうちの１種を３ヶ月間与えられた３種の系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒＫＯ（Ｍｃ３ｒ）またはＭｃ４ｒＫＯ（Ｍｃ４ｒ）の６ヶ月齢マウスにおける視床下部Ｓｗｉｒ１ｍＲＮＡ発現と体重間の関連を例示する。
【０１０９】
[0050]  図１２Ｂは、２種の規定食（ＬＦ＝１０％ｋＪ／脂肪；ＨＦ＝６０％ｋＪ／脂肪）のうちの１種を３ヶ月間与えられた３種の系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒＫＯ（Ｍｃ３ｒ）またはＭｃ４ｒＫＯ（Ｍｃ４ｒ）の６ヶ月齢マウスにおける視床下部Ｓｗｉｒ１ｍＲＮＡ発現とＨＯＭＡ−ＩＲ（空腹時インスリンｘグルコース／２２．５）間の関連を例示する。
【０１１０】
[0051]  図１２Ｃは、２種の規定食（ＬＦ＝１０％ｋＪ／脂肪；ＨＦ＝６０％ｋＪ／脂肪）のうちの１種を３ヶ月間与えられた３種の系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）、Ｍｃ３ｒＫＯ（Ｍｃ３ｒ）またはＭｃ４ｒＫＯ（Ｍｃ４ｒ）の６ヶ月齢マウスにおけるＨＯＭＡ−ＩＲ（空腹時インスリンｘグルコース／２２．５）と視床下部Ｓｏｃｓ３（サイトカインシグナリングのサプレッサー３）ｍＲＮＡ発現間の関連を例示する。
【図１３−１】[0052]  図１３Ａは、３日間にわたる野生型（ＷＴ）およびＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニックマウス（ＦＶＢ．Ｔｇ）における身体活動度（ビームブレーク／１０分で測定）を例示する。
【０１１１】
[0053]  図１３Ｂは、２４時間にわたる野生型（ＷＴ）およびＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニックマウス（ＦＶＢ．Ｔｇ）における暗期および明期の身体活動度（その期間の平均ビームブレーク／１０分で測定）を例示する。
【図１３−２】[0054]  図１３Ｃは、２４時間にわたる野生型（ＷＴ）およびＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニックマウス（ＦＶＢ．Ｔｇ）における暗期および明期の全身脂肪酸化（ＲＥＲ）を例示する。
【０１１２】
[0055]  図１３Ｄは、２４時間にわたる野生型（ＷＴ）およびＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニックマウス（ＦＶＢ．Ｔｇ）における暗期および明期の代謝率（ＶＯ２（ｍｌ／ｈｘ１０３）として測定）を例示する。
【０１１３】
[0056]  図１３Ｅは、２４時間にわたる野生型（ＷＴ）およびＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニックマウス（ＦＶＢ．Ｔｇ）における暗期および明期の遊離脂肪量（ＶＯ２（ｍｌ／ｈ／ｇＦＦＭｘ１０３）として測定）の関数としての代謝率を例示する。
【０１１４】
[0057]  図１３Ｆは、２４時間にわたる野生型（ＷＴ）およびＢＡＰ−Ｓｗｉｒ１トランスジェニックマウス（ＦＶＢ．Ｔｇ）における暗期および明期の体重（ＶＯ２（ｍｌ／ｈ／ｇＢＷｘ１０３）として測定）の関数としての代謝率を例示する。
【図１】
2009502208.tif 000008
【図２】
2009502208.tif 000009
【図３】
2009502208.tif 000010
【図４】
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【図５】
2009502208.tif 000012
【図６】
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【図７】
2009502208.tif 000014
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2009502208.tif 000016
【図８Ｃ】
2009502208.tif 000017
【図８Ｄ】
2009502208.tif 000018
【図９】
2009502208.tif 000019
【図１０】
2009502208.tif 000020
【図１１Ａ】
2009502208.tif 000021
【図１１Ｂ】
2009502208.tif 000022
【図１２】
2009502208.tif 000023
【図１３−１】
2009502208.tif 000024
【図１３−２】
2009502208.tif 000025
【配列表】
2009502208000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月15日(2008.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されたＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体であって、ペプチドが：
ａ．実質的に均質の調製物であり；
ｂ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１０、１１、１２〜１８に示された配列のいずれか１つに少なくとも７０％の相同性を有する
ことを特徴とする、前記ペプチド、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体。
【請求項２】
ペプチドが哺乳動物ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドがマウスペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドがヒトペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
ペプチドが合成ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１０、１１、１２〜１８で示す配列のいずれか１つに対する前記相同性が８５％より大きい、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
相同性が９５％より大きい、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示された配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示された配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のＳｗｉｒ１ペプチドのいずれか１つ、および薬剤的に受容できるキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
Ｓｗｉｒ１ペプチド、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体を含む、体格のホメオスタシスに関連する病態生理を治療するための医薬組成物。
【請求項１２】
Ｓｗｉｒ１ペプチド、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体を含む、体格のホメオスタシスに関連する病態生理を予防するための医薬組成物。
【請求項１３】
Ｓｗｉｒ１ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、および１０〜１８に示された配列のいずれか１つに少なくとも７０％の相同性を有する、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
病態生理が肥満である、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
レプチンおよびアディポネクチンからなる群から選択される化合物を付加的に含む、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
病態生理が高血糖症、高インスリン血症、インスリン抵抗性、高脂肪血症、および２型糖尿病のいずれか１つを含む、肥満に関連する１種である、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
腹腔内投与用である、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＳｗｉｒ１ペプチドを生産する培養細胞。
【請求項２０】
細胞が細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
以下のことを含む、Ｓｗｉｒ１ペプチドを調製するための方法：
ａ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含む細胞を、当該ペプチドの発現を規定する条件下で培養すること；および
ｂ．発現された当該ペプチドを回収すること。
【請求項２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸、および薬剤的に受容できるキャリアを含む医薬組成物であって、該核酸がＳｗｉｒ１ペプチドをコードする、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜９のいずれか１つのペプチドに免疫特異的に結合する、抗体、ならびにそのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログ。
【請求項２４】
検出可能なラベルで標識された、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８のペプチドのいずれか１つ、ならびに前記ペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを使用して産生される、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２６】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項２３に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２８】
１つ以上の容器に、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＳｗｉｒ１ペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の核酸配列の一部、または請求項２３〜２７のいずれか１項に記載のＳｗｉｒ１タンパク質を認識する抗体を含むキット。
【請求項２９】
核酸を含む組換え非ヒト動物であって、当該核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８のＳｗｉｒ１関連ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログのいずれか１つをコードする核酸配列を有する単離された核酸である、前記非ヒト動物。
【請求項３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを含む、インスリン抵抗性を改善するか、または軽減するための医薬。
【請求項３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを含む、糖尿病の症状を改善するか、または治療するための医薬。
【請求項３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを含む、肥満の開始を予防するか、または遅らせるための医薬。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを含む、高脂肪血症を改善するか、または軽減するための医薬。
【請求項３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを含む、血清中総コレステロールを減少させるための医薬。
【請求項３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを含む、血清トリグリセリドを減少させるための医薬。
【請求項３６】
レプチンおよびアディポネクチンからなる群から選択される化合物を付加的に組合わせてなる、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項３７】
外因性プロモーターおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸に対応するｃＤＮＡを保持する細胞を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、ここで、当該細胞が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および８〜１８で与えられた配列を持つＳｗｉｒ１ペプチド、ならびにそのようなペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログおよびアナログを構成的に過剰発現する細胞である、前記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３８】
前記外因性プロモーターがアクチンプロモーターである、請求項３７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３９】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項３７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含む、形質転換ベクター。
【請求項４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含む、ホスト細胞。
【請求項４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のオープンリーディングフレームの少なくとも２０のアミノ酸をコードする核酸を含む核酸構築物であって、前記配列が哺乳動物において機能できるプロモーターに作動可能なように連結する、核酸構築物。
【請求項４３】
前記プロモーターがアクチンプロモーターである、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項４４】
請求項４２に記載の核酸構築物により形質転換された非ヒト動物。