(57)【要約】  本発明の課題は、生体内での安定性を向上できる代謝症候群の治療又は予防剤等を提供することである。  代謝症候群の治療又は予防剤は、受容体活性改変タンパク質（ＲＡＭＰ）２をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する。  （ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ  （ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ  （ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ  （ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
2009069546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体活性改変タンパク質（ＲＡＭＰ）２をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する代謝症候群の治療又は予防剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項２】
代謝症候群の検査方法であって、
被験者の細胞からＤＮＡを抽出する抽出手順と、
抽出された前記ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅手順と、
増幅されたＤＮＡの塩基配列を解読する解読手順と、
解読された塩基配列を、配列番号３記載の塩基配列と比較する比較手順と、を含む検査方法。
【請求項３】
配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマー、又は、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする代謝症候群の検査薬。
【請求項４】
代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号２記載のアミノ酸配列、又は配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと被検物質とを接触させる手順と、
前記ポリペプチドと前記被検物質との結合を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
【請求項５】
代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
内在性ＲＡＭＰ２遺伝子が変異又はノックアウトされた動物に被検物質を投与する手順と、
代謝症候群の症状改善を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
【請求項６】
代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記ＤＮＡの発現量の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
【請求項７】
代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記ＤＮＡから合成されるタンパク質の細胞内局在の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
【請求項８】
代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号６記載のアミノ酸配列、又は配列番号６記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、このポリペプチドを分解可能な酵素、及び被検物質を共存させる手順と、
所定期間後における前記ポリペプチドの残存量を測定する手順と、
残存量の測定値を、前記被検物質の非存在下で測定された残存量と比較する手順と、を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号４を有するＤＮＡ、配列番号４記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号４記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、を発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡでコードされるリガンドの刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導、又は前記リガンドの刺激に基づくＧタンパク質の活性化を検出する手順を含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝症候群の治療もしくは予防剤、検査方法、検査薬、及び代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、代謝症候群の患者が、先進国を中心に急速に増加している。代謝症候群とは、内臓脂肪型肥満（内臓肥満・腹部肥満）と、高血糖・高血圧・高脂血症の２種以上とが合併した複合生活習慣病である。かかる複合的症状ゆえに、代謝症候群は、心臓病、脳卒中等の進行を促進し、高齢者の健康寿命やＱＯＬを著しく悪化する最大の原因である。このような背景の下、社会全体の活力維持や医療コストの低減のため、代謝症候群の征圧は大きな社会的ニーズとなっている。【０００３】
代謝症候群と、動脈硬化、血管合併症、臓器障害発症との間を結ぶ重要な分子基盤として、アディポカイン等の多彩な生理活性を有する液性因子が注目されている。液性因子は脂肪組織以外の様々な末梢臓器でも産生され、これら末梢臓器が液性因子を介して密に連携し合うことで生体内の恒常性が維持される一方、液性因子のバランスの破綻が動脈硬化や臓器障害発症の一端を担っていると考えられている。本発明者らは、液性因子群の一つとして、アドレノメデュリン（ＡＭ）及びその受容体活性調節タンパク（ＲＡＭＰ）システムに注目している。【０００４】
アドレノメデュリン（ＡＭ）は、血管をはじめ全身の組織で産生されるペプチドである。ＡＭは、血管拡張作用に加え、体液量調節作用、ホルモン分泌調節作用、抗酸化作用、抗炎症作用等、多彩な生理活性を持つことが明らかとなってきた。本発明者らはこれまで、ＡＭノックアウトマウスのヘテロ接合体では血圧上昇が認められ、心血管系に傷害を加えたときの心肥大、線維化、腎障害、動脈硬化が亢進するのに対して、ＡＭ過剰発現マウスでは逆に血圧低下が認められ、臓器傷害や動脈硬化への抵抗性が示されることから、ＡＭが臓器保護作用、抗動脈硬化作用を有することを報告してきた（非特許文献１〜３参照）。【０００５】
また、本発明者らは、ＡＭノックアウトマウスのホモ接合体が不充分な血管発達ゆえに胎生中期にびまん性出血や浮腫が原因で致死することから、ＡＭが、血管の成熟、血管構造の安定化そのものに必須な物質であることを初めて明らかとした（非特許文献４参照）。更に最近、血中ＡＭ濃度が肥満に伴い上昇し、Ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘと相関すること、ＡＭが脂肪組織においても発現し、この発現が肥満状態で亢進すること（非特許文献５、６参照）が報告されている。一方で、ＡＭノックアウトマウスでは、加齢に従い、肥満、耐糖能異常、及び生体内酸化ストレス亢進に伴う臓器障害の進展が観察されたことから、ＡＭと代謝症候群との関連性が示唆されている。
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｄｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２０００
【非特許文献２】Ｉｍａｉ  Ｙ，  Ｓｈｉｎｄｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＴＶＢ  ２００２
【非特許文献３】Ｎｉｕ  Ｐ，  Ｓｈｉｎｄｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００４
【非特許文献４】Ｓｈｉｎｄｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２００１
【非特許文献５】Ｋａｔｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｓ．  ２００２
【非特許文献６】Ｎｕｍｂｕ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ．  ２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＡＭは、血中半減期が短いため、慢性疾患である代謝症候群の治療薬として使用するには多くの制約を抱えている。【０００７】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、生体内での安定性を向上できる代謝症候群の治療又は予防剤を提供することを目的とする。また、本発明は、代謝症候群の検査方法及び検査薬、並びに代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究する過程で、ＡＭの受容体システムに注目するに至った。ＡＭ受容体本体は、Ｇタンパク共役型受容体ｃｌａｓｓ  Ｂに属するＣＲＬＲ（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれる７回膜貫通型受容体である。ＣＲＬＲは、一回膜貫通型タンパクであるＲＡＭＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）１、２、３サブアイソフォームのいずれかと結合し、ヘテロダイマーを形成する。【０００９】
本発明者らは、ＣＲＬＲに結合するＲＡＭＰのサブアイソフォームを適宜変化することで、ＡＭ受容体及びリガンドの親和性が制御されることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。【００１０】
（１）  受容体活性改変タンパク質（ＲＡＭＰ）２をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する代謝症候群の治療又は予防剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ【００１１】
（２）  代謝症候群の検査方法であって、
被験者の細胞からＤＮＡを抽出する抽出手順と、
抽出された前記ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅手順と、
増幅されたＤＮＡの塩基配列を解読する解読手順と、
解読された塩基配列を、配列番号３記載の塩基配列と比較する比較手順と、を含む検査方法。【００１２】
（３）  配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマー、又は、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする代謝症候群の検査薬。【００１３】
（４）  代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号２記載のアミノ酸配列、又は配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと被検物質とを接触させる手順と、
前記ポリペプチドと前記被検物質との結合を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。【００１４】
（５）  代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
内在性ＲＡＭＰ２遺伝子が変異又はノックアウトされた動物に被検物質を投与する手順と、
代謝症候群の症状改善を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。【００１５】
（６）  代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記ＤＮＡの発現量の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。【００１６】
（７）  代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記ＤＮＡから合成されるタンパク質の細胞内局在の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。【００１７】
（８）  代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号６記載のアミノ酸配列、又は配列番号６記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、このポリペプチドを分解可能な酵素、及び被検物質を共存させる手順と、
所定期間後における前記ポリペプチドの残存量を測定する手順と、
残存量の測定値を、前記被検物質の非存在下で測定された残存量と比較する手順と、を含むスクリーニング方法。【００１８】
（９）  代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号４を有するＤＮＡ、配列番号４記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号４記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、を発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡでコードされるリガンドの刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導、又は前記リガンドの刺激に基づくＧタンパク質の活性化を検出する手順を含むスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ＲＡＭＰ２又はその機能的同等物が体内に供給されるため、代謝症候群を効果的に治療又は予防できる。しかも、ＲＡＭＰ２又はその機能的同等物は、膜タンパク質であるため、長い血中半減期を有し、生体での安定性を向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＲＡＭＰ２＋／−、ｏｂ／ｏｂマウスから採取した肝臓のＨＥ染色写真（ａ）、及びオイルレッドＯ染色写真（ｂ）である。
【図２】ＲＡＭＰ２＋／−マウスの大腿動脈とその周囲の切片写真（ａ）、及び大動脈部分拡大図（ｂ）である。
【図３】ＲＡＭＰ２＋／−マウスの大腿動脈切片写真である。
【図４】ＲＡＭＰ２＋／−マウスの大腿動脈における各遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図５】ＲＡＭＰ２＋／−マウスの別の大腿部切片写真である。
【図６】ＲＡＭＰ２＋／−マウスにおける大腿動脈の血栓量を示すグラフである。
【図７】ＲＡＭＰ２＋／−マウスにおける大腿動脈の血管狭窄量を示すグラフである。
【図８】ＲＡＭＰ２＋／−マウスの別の大腿部切片写真である。
【図９】ＲＡＭＰ２遺伝子を内皮細胞特異的にノックアウトするためのベクターの概略図である。
【図１０】血管内皮細胞特異的ＲＡＭＰ２ノックアウトマウス由来の細胞におけるＲＡＭＰ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１１】血管内皮細胞特異的ＲＡＭＰ２ノックアウトマウスから採取した肺の染色写真（ａ）、及びその部分拡大図（ｂ）である。
【図１２】血管内皮細胞特異的ＲＡＭＰ２ノックアウトマウスから採取した腎臓の外観写真（ａ）、断面写真（ｂ）、及び切片の染色写真（ｃ）である。
【図１３】図１２（ｃ）の部分拡大図である。
【図１４】ＲＡＭＰ２遺伝子を心筋細胞特異的にノックアウトするための別のベクターの概略図である。
【図１５】心筋細胞特異的ＲＡＭＰ２ノックアウトマウスから採取した心臓の外観写真（ａ）、切片の染色写真（ｂ）である。
【図１６】図１５（ｂ）の部分拡大図である。
【図１７】図１５の心臓の心筋細胞の横径を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００２２】
＜治療薬・予防薬＞
本発明の代謝症候群の治療又は予防薬は、受容体活性改変タンパク質（ＲＡＭＰ）２をコードする以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、又はこのＤＮＡがコードするポリペプチドを有効成分として含有する。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００２３】
なお、本明細書における「代謝症候群」は、内臓脂肪型肥満（内臓肥満・腹部肥満）と、高血糖・高血圧・高脂血症の２種以上とが合併した状態を指し、動脈硬化、虚血性疾患（心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症）、血管不全、臓器不全等の合併症も包含し、又はこれら合併症の原因の一つであると想定される。
【００２４】
本発明における「ＤＮＡ」は、センス鎖又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖と二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、合成されたＤＮＡであってもよい。
【００２５】
本発明のＤＮＡの最も好ましい態様は、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡであるが、本発明のＤＮＡには、更に、代謝症候群の治療又は予防効果を有する種々の変異体やホモログが含まれる。ここで「代謝症候群の治療又は予防効果」は、内臓脂肪型肥満（内臓肥満・腹部肥満）、高血糖、高血圧、高脂血症の少なくとも１種の症状が改善され又は症状悪化が抑制される効果であって、改善又は抑制が統計的に有意である効果を指す。
【００２６】
配列番号１は、ヒトＲＡＭＰ２の細胞外ドメインをコードする塩基配列である。この配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、例えば、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜６０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００２７】
また、配列番号２は、ヒトＲＡＭＰ２タンパク質の細胞外ドメインを構成することが知られている（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．  ３１，  Ｎｏ．１１，  ｐｐ．６３１−６３８）。かかる配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。ここで「１もしくは複数」とは、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。筋特異的チロシンキナーゼを活性化する能力を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００２８】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００２９】
更に、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、配列番号１記載の塩基配列と高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、好ましくは、配列番号１記載の塩基配列と９０％以上、更に好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有する。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００３０】
本発明のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調整する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００３１】
＜ポリペプチド＞
本発明の治療又は予防剤で使用されるポリペプチドは、前述のＤＮＡによりコードされ、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列を有し、又は配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する。
【００３２】
上記のポリペプチドは、ヒトＲＡＭＰ２タンパク質の膜貫通領域及び細胞内ドメインの全部は有しないために高い可溶性を備えることが期待され、以下の方法等で容易に精製できる。また、ＲＡＭＰ２の細胞外ドメインは、ＣＲＬＲと結合して複合体を形成するために必須であることが分かっている（データ示さず）。このため、上記のポリペプチドは、投与された細胞膜上のＣＲＬＲと複合体を形成し、代謝症候群の治療又は予防効果を奏する。
【００３３】
本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドは、例えば、前述のＤＮＡを含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することで、作製できる。即ち、まず、この形質転換体を適宜の条件で培養し、このＤＮＡがコードするタンパク質（ポリペプチド）を合成させる。そして、合成されたタンパク質を形質転換体又は培養液から回収することにより、本発明のポリペプチドを得ることができる。
【００３４】
形質転換体の培養は、ポリペプチドが大量に且つ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）。
【００３５】
ポリペプチドの単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。なお、本発明で使用できるベクター及び形質転換体を以下に説明する。
【００３６】
（ベクター）
発現ベクターは、適当なベクターに上述のＤＮＡを挿入することにより、作製できる。「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、ＤＮＡを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択でき、ポリペプチドを取得したい場合には発現ベクターを選択できる。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平１１−２９５９９号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。
【００３７】
（形質転換体）
形質転換体は、前述のＤＮＡを含むベクターを宿主に導入することにより、作製できる。このような宿主は、本発明のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００３８】
ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できるものである。その具体例としては、特に限定されないが、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００３９】
本明細書における「有効成分」は、代謝症候群の所望の治療又は予防効果を得るために必要な量で含有される成分を指し、効果が所望のレベル未満にまで損なわれない限りにおいて、他の成分も含有されてよい。また、医薬組成物の投与経路は、経口又は非経口のいずれであってもよく、適宜設定される。
【００４０】
経口投与の場合、医薬組成物は、一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加剤を含有してよく、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤等の種々の形状に製剤化される。また、医薬組成物は、内用水剤、懸濁剤、乳剤シロップ剤等の液体状態であってもよく、使用時に再溶解される乾燥状態であってもよい。
【００４１】
非経口投与の場合、医薬組成物は、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤も含有してよく、通常、単位投与量アンプルもしくは多投与量容器又はチューブ内に収容された状態で流通される。また、医薬組成物は、使用時に、適当な担体（滅菌水等）で再溶解可能な粉体に製剤化されてもよい。
【００４２】
＜検査方法、検査薬＞
前述のＤＮＡは、代謝症候群への罹患の有無についての検査に利用できる。本発明に係る代謝症候群の検査方法は、抽出手順、増幅手順、解読手順、及び比較手順を含む。
【００４３】
抽出手順では、被験者の細胞からＤＮＡを抽出する。抽出の手法は常法に従えばよい。
【００４４】
増幅手順では、抽出されたＤＮＡを鋳型とし、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はその発現制御領域のＤＮＡの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う。これにより、配列番号３の一部又は全部を有するＤＮＡが特異的に増幅される。なお、配列番号３は、ヒトＲＡＭＰ２遺伝子の全塩基配列である。
【００４５】
解読手順では増幅されたＤＮＡの塩基配列を解読し、比較手順では、解読された塩基配列を、配列番号３記載の塩基配列と比較する。塩基配列の解読及び比較は常法に従えばよい。比較の結果、取得したＤＮＡの塩基配列が、配列番号３と相違する場合、被疑者が代謝症候群に既に罹患し又は罹患しやすいものと判断し得る。
【００４６】
また、本発明の検査方法は、例えば、増幅手順において増幅されたＤＮＡを、ＲＡＭＰ２が変異又はノックアウトされた細胞、組織、器官、又は個体に導入し、代謝症候群に属する症状が改善され、又は悪化が抑制されるか否かを判断する判断手順を更に備えてもよい。これにより、増幅されたＤＮＡの塩基配列と配列番号１記載の塩基配列との差異が単なる多型である場合等を排除できるので、検査精度が向上する。
【００４７】
（ノックアウト体）
前述のＤＮＡを変異又はノックアウトすることにより、非ヒト形質転換細胞、組織、器官、及び個体を作製できる。非ヒト動物としては、特に限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
【００４８】
非ヒト形質転換動物の作製方法は、例えば、次の通りである。まず、本発明のＤＮＡ、ＤＮＡの変異、又はＤＮＡと相同組換えされるＤＮＡを非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する。そして、この受精卵を雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のＤＮＡが形質転換された非ヒト形質転換動物を作製できる。
【００４９】
非ヒト形質転換動物の作製は、より具体的には、例えば、次のように行うことができる。まず、ホルモン投与により過剰排卵させた後の雌個体を、雄と交配する。次いで、交配後１日目の雌個体の卵管から受精卵を摘出し、変異されたＤＮＡ又はＤＮＡと相同組換え可能なＤＮＡを含むベクターを、受精卵にマイクロインジェクション等の方法で導入する。そして、導入後の受精卵を適当な方法で培養した後、生存した受精卵を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の子宮に移植し、新生仔を出産させる。この新生仔においてＤＮＡが形質転換されているか否かは、この新生仔の細胞から抽出したＤＮＡについて、サザン解析により確認できる。
【００５０】
その他、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株において遺伝子導入及び選別を行った後、生殖系列に寄与したキメラ動物を作製し、交配することによって、非ヒト形質転換動物を作製してもよい。
【００５１】
別の検査方法は、被験者由来の細胞における配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡの発現量を検出する検出手順と、検出されたＤＮＡの発現量を、健常者における配列番号１記載のＤＮＡの発現量と比較する比較手順と、を含む。
【００５２】
ここで「ＤＮＡの発現」には、転写レベル（ｍＲＮＡの発現）及び翻訳レベル（タンパク質の発現）が含まれる。従って、発現量は、配列番号１記載の塩基配列の一部又は全部を有するＤＮＡを特異的に増幅できるプライマーを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことで検出してもよいし、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを用いてウェスタン解析等を行うことで検出してもよい。
【００５３】
この検査方法によれば、比較の結果、被験者におけるＤＮＡの発現量が、健常者におけるＤＮＡの発現量と有意に相違する場合、被疑者が代謝症候群に既に罹患し又は罹患しやすいものと判断し得る。
【００５４】
本発明に係る代謝症候群検査薬は、配列番号１記載の塩基配列の一部又は全部を有するＤＮＡを特異的に増幅できるプライマー、又は、上述した抗体又は抗体フラグメントを有効成分として含有する。
【００５５】
＜スクリーニング方法＞
本発明に係る代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法は、内在性ＲＡＭＰ２遺伝子がノックアウトされた動物に被検物質を投与する手順と、代謝症候群の症状改善を検出する手順と、を含む。
【００５６】
このスクリーニング方法によれば、症状改善が検出された被検物質は、ＲＡＭＰ２の機能を補完又は代替できるため、代謝症候群の治療薬の候補化合物として特定できる。
【００５７】
別のスクリーニング方法は、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、前記ＤＮＡの発現量の変化を検出する手順と、を含む。
【００５８】
配列番号１等のＤＮＡの発現量の変化が検出された被検物質は、ＲＡＭＰ２の機能を強化又は減退できると推測される。具体的には、ＤＮＡ発現量を増加する物質は、ＲＡＭＰ２の機能を強化できるので、投与されると代謝症候群を治療できることが推測される。一方、ＤＮＡ発現量を低下する物質はＲＡＭＰ２の機能を減退できるので、この物質を阻害する物質を投与することで、代謝症候群を治療できることが推測される。
【００５９】
なお、この方法及び以下の方法で使用される細胞は、内在性ＲＡＭＰ２を発現していても、発現していなくてもよい。ただし、内在性ＲＡＭＰ２による不明確な影響を除外できる点で、内在性ＲＡＭＰ２を発現しない細胞（例えば、ＣＯＳ７）が好ましい。
【００６０】
別のスクリーニング方法は、配列番号２記載のアミノ酸配列、又は配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと被検物質とを接触させる手順と、前記ポリペプチドと前記被検物質との結合を検出する手順と、を含む。
【００６１】
このスクリーニング方法によれば、配列番号２等のポリペプチドに結合する被検物質が得られる。かかる被検物質は、配列番号２等のポリペプチドを介した代謝症候群の治療経路に関与する可能性を有し、代謝症候群を治療できることが推測される。
【００６２】
別のスクリーニング方法は、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、前記ＤＮＡから合成されるタンパク質の細胞内局在の変化を検出する手順と、を含む。
【００６３】
このスクリーニング方法によれば、配列番号１等から合成されるタンパク質の細胞内局在を変化させる被検物質が得られる。ここで、ＲＡＭＰ２は、ＡＭ及び受容体が結合して初めて、受容体と共にエンドサイトーシスで細胞内に取り込まれ、外部からＡＭへの刺激がなければ、細胞が生きている限り、細胞膜上に安定して存在し続ける。また、エンドサイトーシスで、一旦細胞内に取り込まれても、その一部は再び細胞膜に戻り、リサイクルされていることが推測される。よって、得られた被検物質は、ＲＡＭＰ２を介した代謝症候群の治療効果を向上できる可能性を有し、代謝症候群の治療薬として期待できる。
【００６４】
別のスクリーニング方法は、配列番号６記載のアミノ酸配列、又は配列番号６記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、このポリペプチドを分解可能な酵素、及び被検物質を共存させる手順と、所定期間後における前記ポリペプチドの残存量を測定する手順と、残存量の測定値を、前記被検物質の非存在下で測定された残存量と比較する手順と、を含む。
【００６５】
配列番号６は、ヒトアドレノメデュリン（ＡＭ）の全アミノ酸配列である。このスクリーニング方法によれば、配列番号６記載のアミノ酸配列等を有するポリペプチド（ＡＭ等）の生体内安定性を変化することが期待される物質が得られる。かかる物質は、ＲＡＭＰ２を介した代謝症候群の治療効果を向上できる可能性を有し、代謝症候群の治療薬として期待できる。なお、この方法で使用される酵素は、上記のポリペプチドに特異的又は非特異的であってもよく、例えばエンドペプチダーゼであってよい。
【００６６】
別のスクリーニング方法は、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号４を有するＤＮＡ、配列番号４記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号４記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、を発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡでコードされるリガンドの刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導、又は前記リガンドの刺激に基づくＧタンパク質の活性化を検出する手順を含む。
【００６７】
配列番号４は、Ｇタンパク共役型受容体ｃｌａｓｓ  Ｂに属するＣＲＬＲ（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれる７回膜貫通型受容体を構成するアミノ酸配列である。また、配列番号５は、ヒトＲＡＭＰ２遺伝子の全塩基配列である。また、配列番号５は、ヒトアドレノメデュリン（ＡＭ）遺伝子の全塩基配列である。
【００６８】
このスクリーニング方法によれば、ＲＡＭＰ２及びＣＲＬＲが共発現された細胞における、ＡＭ刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導、又はＧタンパク質の活性化する物質が得られる。この物質は、細胞内シグナル伝達の誘導又はＧタンパク質の活性化を介して、ＲＡＭＰ２による代謝症候群の治療効果を向上できる可能性を有し、代謝症候群の治療薬として期待できる。
【００６９】
なお、細胞内シグナル伝達の誘導は、細胞内のｃＡＭＰ、Ｃａ、ＮＯレベル、ＰＫＡの活性レベル、Ａｋｔ、ＥＲＫ、Ｐ３８ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋのリン酸化レベル等の変化（特に上昇）を指標に検出できる。
【００７０】
別のスクリーニング方法は、配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドとの複合体が形成する結合ポケットの立体構造を特定する手順と、前記立体構造に基づいて前記複合体と前記結合ポケットを介して結合可能と予測される物質を既知の構造ライブラリからコンピュータ上で選別する手順と、を含む。
【００７１】
このスクリーニング方法によれば、ＲＡＭＰ２及びＣＲＬＲの複合体に結合し得る候補を、膨大数の物質から大幅に絞り込むことができる。絞り込まれた候補を更に上記いずれかのスクリーニング方法を用いて更に制限することで、ＲＡＭＰ２による代謝症候群の治療効果を向上できる更に高い可能性を有し、代謝症候群の治療薬として更に期待できる。なお、かかるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング方法の手順自体は、常法に従って行えばよい。
【実施例】
【００７２】
［試験例１］  ＲＡＭＰ２遺伝子ノックアウトマウスの作製
次の手順でターゲティングベクターを作製した。即ち、ＲＭＡＰ２を含むゲノムＤＮＡ配列のうち、５’側の相同配列として、ＲＡＭＰ２のエクソン１の上流から、イントロン１の途中までを含む約３ｋｂの配列をＰＣＲにて合成（５’  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｒｍ）し、中間の相同配列として、イントロン１の途中からエクソン４の下流までをＰＣＲにて合成（ｌｏｘＰ  ａｒｍ）し、３’側の相同配列として、エクソン４の下流、約３ｋｂの配列をＰＣＲにて合成（３’  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｒｍ）した。【００７３】
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに、５’側から３’側の方向に、５’  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｒｍ、ｌｏｘＰ、ｌｏｘＰ  ａｒｍ、ネオマイシン耐性遺伝子の配列（ｐＧＫ−ｎｅｏ）、ｌｏｘＰ、３’  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｒｍの順でサブクローニングすることで、ターゲティングベクターを作製した。即ち、２つのｌｏｘＰサイトが、ＲＭＡＰ２のエクソン２−４を挟むように設計した。【００７４】
得られたターゲティングベクターを制限酵素処理にて線状にした後、エレクトロポレーションでマウスＥＳ細胞に導入した。組換えを起こしたＥＳ細胞クローンを、ネオマイシン耐性を指標として濃縮し、更にサザンブロッティングにより相同組換えＥＳ細胞を選別した。【００７５】
選別されたＥＳ細胞をマウス胚盤胞へマイクロインジェクションすることで、キメラマウスを作製した。このキメラマウスを野生型マウスと交配して、ゲノム配列の片方のＲＡＭＰ２遺伝子のイントロン１と、エクソン４の下流とにｌｏｘＰサイトが挿入されたマウス（ヘテロｆｌｏｘマウス）を作製した。【００７６】
作製されたヘテロｆｌｏｘマウスを、ＣＡＧプロモータ下にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を発現する遺伝子が導入されたマウス（ＣＡＧ−Ｃｒｅマウス）と交配することで、ｌｏｘＰで挟まれる領域が除去されたＲＡＭＰ２へテロノックアウトマウスを得た。これらＲＡＭＰ２へテロノックアウトマウス同士を交配し、ＲＡＭＰ２ホモノックアウトマウスを得た。【００７７】
［試験例２］  遺伝的肥満マウスとの交配
試験例１で得たＲＡＭＰ２ヘテロノックアウトマウス（ＲＡＭＰ２＋／−）を、遺伝的肥満マウスであるレプチン欠損（ｏｂ／ｏｂ）マウスと交配し、子世代マウス（ＲＡＭＰ２＋／−、ｗｔ／ｏｂ）をｏｂ／ｏｂマウスと戻し交配することで、孫世代マウス（ＲＡＭＰ２＋／−、ｏｂ／ｏｂ）を作製した。【００７８】
ｏｂ／ｏｂマウスも肥満症状を呈するが、ＲＡＭＰ２＋／−、ｏｂ／ｏｂマウスはより重度の肥満症状を呈していた。この結果は、ＲＡＭＰ２の発現減少が肥満症状の悪化の原因であることを示唆する。【００７９】
［試験例３］  脂肪肝
ｏｂ／ｏｂマウス及びＲＡＭＰ２＋／−、ｏｂ／ｏｂマウスから肝臓を採取し、その切片を染色した。ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）による染色写真を図１（ａ）に、オイルレッドＯによる染色写真を図１（ｂ）にそれぞれ示す。【００８０】
図１（ａ）に示されるように、ＲＡＭＰ２＋／−、ｏｂ／ｏｂマウスでは、脂肪滴と見られる白い斑点がｏｂ／ｏｂマウスよりも格段に広い範囲に観察された。この結果は、ＲＡＭＰ２＋／−、ｏｂ／ｏｂマウスでｏｂ／ｏｂマウスよりもはるかに、脂肪滴の染色による赤色度の強い画像が得られた図１（ｂ）の結果とも一致する。これらの結果から、ＲＡＭＰ２の発現減少が脂肪肝の症状悪化の原因であることが示される。【００８１】
［試験例３］  動脈硬化
（形態学）
試験例１で得たＲＡＭＰ２へテロノックアウトマウス（ＲＡＭＰ２＋／−）、及び野生型マウス（ＲＡＭＰ２＋／＋）の大腿動脈周囲に、ポリエチレンチューブのカフを４週間留置することで、血管傷害による動脈硬化を誘導した。留置後のマウスの大腿部カフ留置部の標本切片をエラスティカファンギーソン染色にて染色した低倍率の写真を図２（ａ）に、大腿動脈部分の拡大写真を図２（ｂ）に示す。【００８２】
図２（ａ）に示されるように、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは野生型マウスに比べ、平滑筋の増殖、炎症細胞の浸潤、細胞外マトリクスの増生が亢進されていた。また、図２（ｂ）に示されるように、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは、野生型マウスに比較して、血管内腔側に顕著な新生内膜の形成が観察された。以上の結果より、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは、野生型マウスに比べ、形態学的観点から動脈硬化症がはるかに悪化していることが判明した。【００８３】
（免疫学）
図２の結果を免疫学的観点でも確認するため、試験例３における留置後のマウスの大腿動脈におけるＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、ＭＣＰ１、及びＰＣＮＡタンパク質の発現量を検討した。具体的には、各タンパク質に結合するモノクローナル抗体を用い、常法に従って大腿動脈を免疫染色し、この結果を図３（ａ）〜（ｄ）に示す。【００８４】
図３（ａ）〜（ｄ）に示されるように、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、ＭＣＰ１、及びＰＣＮＡは、いずれも野生型マウスよりもＲＡＭＰ２＋／−マウスにおいて格段に多量に発現されていた。【００８５】
ＩＣＡＭ１及びＶＣＡＭ１は、組織炎症に伴って発現亢進される接着因子であることから、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは野生型マウスよりも強い炎症が生じていることが示唆される。この示唆は、ケモカインであるＭＣＰ１の発現が野生型マウスよりもＲＡＭＰ２＋／−マウスにおいて亢進されていることからも裏付けられる。【００８６】
また、ＰＣＮＡは増殖細胞のマーカーであるから、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは野生型マウスよりも、平滑筋の増殖が亢進されていることが確認された。【００８７】
図３（ｆ）は留置後のマウスの大腿動脈切片のジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）染色図であり、図３（ｅ）はｐ６７ｐｈｏｘ抗体による大腿動脈切片の免疫染色図である。【００８８】
図３（ｆ）に示されるように、スーパーオキシドの存在を示す赤色の染色は、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは、野生型マウスに比べ、はるかに広範囲且つ強く観察された。これにより、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは、野生型マウスよりも病変部での酸化ストレスが亢進されていることが確認された。【００８９】
一方、図３（ｅ）に示されるように、ｐ６７ｐｈｏｘは、野生型マウスよりもＲＡＭＰ２＋／−マウスにおいて格段に多量に発現されていた。ｐ６７ｐｈｏｘは活性酸素の発生に関与するＮＡＤＰＨオキシダーゼのサブユニットであることを踏まえると、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の亢進が病変部での酸化ストレスの亢進の原因になっていることが示唆される。【００９０】
以上の結果より、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは、野生型マウスに比べ、免疫学的観点からも動脈硬化症がはるかに悪化していることが判明した。【００９１】
（分子遺伝学）
前述の留置前後のマウスについて、ＲＡＭＰ２、ＲＡＭＰ３、ＣＲＬＲ、及びＡＭの発現量について調査した。つまり、留置前後のマウスから大腿動脈近傍の組織を採取し、この組織から抽出した全ＲＮＡを鋳型とし、各遺伝子に特異的な配列のプライマーを用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った。具体的な手順は常法に従った。この結果を図４に示す。【００９２】
図４に示されるように、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは、野生型マウスに比べ、留置前後に亘ってＲＡＭＰ２の発現量が有意に低い一方、ＲＡＭＰ３及びＣＲＬＲの発現量は統計的に同等であった。このことから、試験例３で示された結果、つまりＲＡＭＰ２＋／−マウスにおいて野生型マウスよりも動脈硬化症が悪化するという結果は、ＲＡＭＰ２の発現量が低いことによるものであることが示唆された。【００９３】
また、傷害前の状態では、ＡＭの発現がＲＡＭＰ２＋／−マウスで亢進されていた。これは、成体においても、ＲＡＭＰ２発現量が低下すると、リガンドであるＡＭの発現がポジティブフィードバックにより上昇することを示唆する。換言すれば、胎生期の血管だけでなく、成体期の血管においても、ＲＡＭＰ２が、ＡＭシグナルを伝える中心的役割を果たすことが示される。【００９４】
傷害後にＡＭの発現量が野生型及びＲＡＭＰ２＋／−マウスの間で有意差がなくなるのは、野生型でも傷害後ではＡＭの発現亢進が起こるためと考えられる。そして、ＲＡＭＰ２＋／−マウスで、ベースラインでのＡＭの発現量が亢進しているのにも関わらず（あるいは、傷害後、野生型マウスでのＡＭ発現量との有意差がなくなるにも関わらず）、動脈硬化がＲＡＭＰ２＋／−マウスにおいて重度であるのは、ＡＭ発現が亢進されても、ＲＡＭＰ２発現量が低いために、ＡＭによる抗動脈硬化作用が充分に発揮されていないためと考えられる。以上の機構からも、抗動脈硬化作用は、ＡＭ発現量のみの亢進では発揮されず、ＲＡＭＰ２発現量を亢進する他ないことが推測される。【００９５】
［試験例４］  血管閉塞
（形態学）
試験例１で得たＲＡＭＰ２へテロノックアウトマウス（ＲＡＭＰ２＋／−）、及び野生型マウス（ＲＡＭＰ２＋／＋）の大腿動脈の外周に、１０％塩化鉄溶液を塗布し、塗布２４時間後に各マウスの大腿部を採取した。その切片のＨＥ染色写真を図５に示す。また、採取した大腿動脈の横断切片（ｎ＝５）にて、血栓の断面積を定量化した。更に、血栓の断面積と、血管内腔の全面積との比に基づいて血管の狭窄率を計算した。血栓サイズを図６に、血管の狭窄率を図７にそれぞれ示す。【００９６】
図５に示されるように、野生型マウスと比較して、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは、大きな血栓の存在が観察された。この結果は、野生型マウスよりもＲＡＭＰ２＋／−マウスにおいて、血栓量（図６）及び血管の狭窄率（図７）が有意に高いことと一致する。これらの結果から、ＲＡＭＰ２発現の低下が血栓症を悪化させ、血管閉塞を促進していること形態学的観点から示唆される。【００９７】
（免疫学）
試験例４における大腿動脈におけるＭＣＰ−１及びＭａｃ−１タンパク質の発現量を調査した。具体的には、各タンパク質に結合する抗体を用い、常法に従って大腿動脈を免疫染色し、この結果を図８に示す。【００９８】
図８に示されるように、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは、野生型マウスよりも広い範囲に亘り、ＭＣＰ−１及びＭａｃ−１タンパク質が発現されていた。ＭＣＰ−１及びＭａｃ−１タンパク質は組織炎症に伴って発現亢進されるケモカイン及び接着因子であることから、ＲＡＭＰ２＋／−マウスでは野生型マウスよりも、閉塞箇所に強い炎症が生じていることが示唆された。【００９９】
［試験例５］  コンディショナルターゲティング
ＡＭ−ＲＡＭＰ２システムの病態生理学的意義を解明するためにはＲＡＭＰ２ノックアウトマウスのホモ接合体が必要であるが、ホモ接合体（ＲＡＭＰ２−／−）は胎生致死である。そこで、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いてＲＡＭＰ２遺伝子のコンディショナルターゲティングを行い、ＲＡＭＰ２を各細胞系列特異的に欠損させることにした。【０１００】
（血管内皮細胞）
具体的には、常法に従って、ＲＡＭＰ２遺伝子座がＦｌｏｘ配列で挟まれたｌｏｘＰマウスを樹立した。一方、血管内皮細胞特異的に発現するＶＥカドヘリン（Ｃｄｈ５）のプロモータ配列がＣｒｅ配列の５’側に位置するベクター（図９参照、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００６；９８：８９７−９０４）が導入されたＣｒｅマウスを樹立した。ｌｏｘＰマウス及びＣｒｅマウスを交配することで、血管内皮細胞特異的にＲＡＭＰ２がノックアウトされたマウスを得た。【０１０１】
作製した８〜１０週令の成体マウスを麻酔後に開腹し、肝臓内をコラゲナーゼ含有培養液で灌流し、分離培養した類洞内皮細胞を初代培養した。この細胞から抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写し、ＲＡＭＰ２に特異的な配列を有するプライマーを用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った。この結果、図１０に示されるように、血管特異的ＲＡＭＰ２ノックアウトマウスでは、野生型マウスに比べ、はるかに少量（約２０％）しかＲＡＭＰ２が発現されていないことが確認された。【０１０２】
また、血管特異的ＲＡＭＰ２ノックアウトマウス及び野生型マウスから肺を採取し、この肺の切片のＨＥ染色写真を図１１に示す。図１１（ａ）に示されるように、ノックアウトマウスでは炎症（図１１（ａ）中、丸で囲まれた部分）が数多く観察され、図１１（ａ）の部分拡大図である図１１（ｂ）に示されるように、ノックアウトマウスでは野生型マウスに比べ炎症が重度であることも確認された。【０１０３】
次に、血管特異的ＲＡＭＰ２ノックアウトマウス及び野生型マウスから腎臓を採取し、この腎臓の外観写真を図１２（ａ）に、断面写真を図１２（ｂ）に、切片のＨＥ染色写真を図１２（ｃ）に、図１２（ｃ）の部分拡大図を図１３にそれぞれ示す。ノックアウトマウスでは野生型マウスに比べ、全体が膨張しており（図１２（ａ）参照）、糸球体硬化症、嚢胞の形成、水腎症等の腎臓障害が確認された（図１２（ｂ）、（ｃ）、図１３参照）。【０１０４】
図１０〜図１３の結果を踏まえると、ＲＡＭＰ２発現量の低下が種々の臓器にて傷害を促進することが示唆される。【０１０５】
（心筋細胞）
心筋細胞特異的に発現するα−ＭＨＣのプロモータ配列がＣｒｅ配列の５’側に位置し、且つＣｒｅの両側にタモキシフェンが結合する変異型エストロゲンレセプター（Ｍｅｒ）配列が位置するベクター（図１４参照、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ２００１；８９：２０−２５．）が導入されたＣｒｅマウスを樹立した。このＣｒｅマウスを用いた点を除き、上記と同様の手順で、心筋細胞特異的にＲＡＭＰ２がノックアウトされたマウスを得た。【０１０６】
作製したマウスにタモキシフェン３０ｍｇ／ｋｇ／日を腹腔内投与し、投与開始１週間後に心臓を採取した。この心臓の外観写真を図１５（ａ）に、切片のマッソントリクローム染色写真を図１５（ｂ）にそれぞれ示す。また、心臓の横断組織切片にて心筋細胞の横径を測定した結果を図１７に示す。図１５（ａ）、（ｂ）に示されるように、心筋細胞特異的ＲＡＭＰ２ノックアウトマウスでは野生型マウスに比べ心臓が肥大することが確認され、この心臓肥大は心筋細胞の肥大（図１７）に伴うものであった。これらの症状は、ＲＡＭＰ２発現量の低下に起因することが推測される。【０１０７】
図１５（ｂ）の部分拡大図を図１６に示す。図１６に示されるように、心筋細胞特異的ＲＡＭＰ２ノックアウトマウスでは線維化して硬化した病変箇所が多数観察された一方、野生型マウスでは病変箇所は観察されなかった。このような心臓の線維化は、ＲＡＭＰ２発現量の低下に起因することが推測される。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
以上の結果から、ＡＭの多彩な生理作用がＲＡＭＰ２によって規定されていること、換言すれば、ＲＡＭＰ２を標的とすることで、ＡＭの生理作用を人為的に操作し、代謝症候群を包括的に治療又は予防できることが示された。ＲＡＭＰ２は低分子の１回膜貫通型タンパク質であるため、長い血中半減期を有し生体内での安定性に優れるのみならず、その構造解析や、この系を人為的に制御できる低分子化合物アゴニストの探索等が容易である。このため、ＲＡＭＰ２は治療標的分子として極めて有望である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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