(57)【要約】本発明は、花卉のフラボノイド生合成の色素前駆物質のＢ環の水酸化を制御し、ペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジンの生合成に関与する複対立遺伝子（ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯ）を含む、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐ（ここで、ＸおよびＹは、上記Ｔ、Ｆ、Ｄ、ＺまたはＯであり、ＸとＹは異なる。）を有する花卉に、放射線を照射することを含む、花卉の突然変異体を作出する方法に関する。
2009119914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイド生合成の経路式（Ｉ）：
【化１】
2009119914.tif 000036
（式中、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯは、フラボノイド生合成の色素前駆物質のＢ環の水酸化に関わるフラボノイド３’，５’−水酸化酵素を含む花卉の酵素反応系の花粉親配偶子および種子親配偶子由来の複対立遺伝子を示し、
ＨＴは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）およびシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＦは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＤまたはＨＺは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＯは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
Ｐｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙおよびＤｐ／ｄｐは、それぞれペラルゴニジン（Ｐｇｎ）、シアニジン（Ｃｙｎ）、デルフィニジン（Ｄｐｎ）色素の遺伝子座を示す。）に示された、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯからなる群から選択され組合わされた複対立遺伝子型を含む、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐ（ここで、ＸおよびＹは、上記Ｔ、Ｆ、Ｄ、ＺまたはＯであり、ＸとＹは異なる。）を有する花卉に、放射線を照射することを含む、花卉の突然変異体を作出する方法。
【請求項２】
突然変異体が、放射線を照射する前の当代と比較して、花色が変化した形質、花弁が変形した形質、花弁数が増加した形質、花弁に縦縞の模様が入った形質、花弁に斑が入った形質、花弁に不均一な模様が入った形質、および単色系から二色系の花に変化した形質からなる群から選択される形質を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
花卉が、トルコギキョウである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
花卉が、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐを有し、かつＨＸＨＹの複対立遺伝子型が、ＨＴとＨＤ、ＨＴとＨＺ、ＨＴとＨＯ、ＨＦとＨＤ、ＨＦとＨＺ、ＨＦとＨＯ、またはＨＤとＨＯの組み合わせである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
花卉が、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐを有し、かつ複対立遺伝子ＨＤまたはＨＺで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ２）と、複対立遺伝子ＨＴまたはＨＦで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ３）とを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
花卉が、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐを有し、かつ複対立遺伝子ＨＴまたはＨＦで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ３）と、複対立遺伝子ＨＯで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ１）または複対立遺伝子ＨＤもしくはＨＺで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ２）とを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
放射線を花卉の種子に照射する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
放射線がイオンビームである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
放射線の照射線量が１０Ｇｙ〜１２０Ｇｙである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
放射線を累代照射する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
突然変異体が照射当代である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法により作出された、花卉の突然変異体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の突然変異体の後代。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花卉の突然変異体を作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオンビームを用いた育種は、これまでにイネ、オオムギ、メロン、トマト、タバコ、カーネーション、バーベナ、キクなど多数の植物で報告されている（非特許文献１）。このうち、花卉の育種に関しては、カーネーションの葉片または花弁由来の組織片に照射することで、多様な花色の変異体の作製に成功している（非特許文献２）。トルコギキョウでは種子へのイオンビームの照射が報告されているが、花色の変異は報告されていない（非特許文献３）。
放射線育種では、第１世代の放射線としてガンマ線とＸ線が使われてきた。現在まで、ガンマーフィールド（放射線育種場）の活用により２８０品種近くが育成されている。ガンマ線の利用では、近年、照射と組織培養技術の組み合わせにより、キメラ変異を解消し、照射当代の１変異細胞から１変異体を再生する方法が確立されてきている（非特許文献４）。花卉を例にとると、６０Ｃｏを据え付けたガンマーフィールドにキクの幼苗を植付け、ガンマ線の緩照射後、色や形態の異なる花弁を選抜、葉片や変異花弁を培養して再分化個体を得て、花色や花形の異なる変異体が育成された。トルコギキョウでは、同様の手法により小輪や多花性などの有用変異体が選抜された（非特許文献５）。軟Ｘ線の利用例としては、鉢物栽培に適したマーガレットの育成が行われた（非特許文献６）。
しかしながら、ガンマ線やＸ線による変異の頻度は必ずしも高くなく、変異の幅や効率を高めるための新規変異原が求められ、第２世代の放射線として中性子線が利用された。その後、中性子線の能力をさらに高めるために、イオンビームが第３世代の放射線として注目されてきている。
荷電粒子線であるイオンビームは、飛程の終端近くでエネルギーを急激に放出してエネルギーを失う現象であるブラッグ・ピークを有し、電磁波であるガンマ線やＸ線に比べ、高い線エネルギー付与（ＬＥＴ）をもっている。すなわち、被照射組織内において、荷電粒子の飛跡に沿って高密度に電離・励起を生じる。このため、イオンビームではガンマ線やＸ線に比べ、ＤＮＡ損傷が非常に近接した状態（クラスター損傷）で生じる確率が高いと推察され、結果として特異的な突然変異を誘発することが示唆されている（非特許文献４、非特許文献７）。
被照射材料としては、種子、葉・花弁などの培養片、花粉、プロトプラストなど多岐にわたっている。現在のところ、イオンビームとしては炭素イオンがよく使われており、変異誘発頻度の指標である遺伝子座あたりの変異頻度は、種子照射において炭素イオンは電子線に比べ約２０倍高いことが明らかとなり、実用品種の育成が期待されてきた（非特許文献７）。
イオンビーム育種による花卉の新規突然変異体としては、組織／細胞培養系との組み合わせで無側枝性のキクや、カーネーションの花色、花型変異体が育成されている（非特許文献８、非特許文献２）。
特許文献１には、キクの葉片または花弁由来の組織片に照射することで、無側枝性（ｂｒａｎｃｈ  ｌｅｓｓ）または少側枝性（ｌｏｗ  ｂｒａｎｃｈ）のキクの作出に成功したことが開示されている。
特許文献２には、花卉の花色遺伝型交配法が開示されている。これによれば、「花色素生合成の遺伝を明らかにし、花きの花色遺伝と色素遺伝子型の関係を明らかにし、花きの新花色作出について実用的花色遺伝型交配法を提供するもの」との記載があり、また、「花色遺伝型が経路式（Ｉ）（後述）のフラボノイド生合成に関与し、フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’Ｈ）やフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’，５’Ｈ）の遺伝が五つの複対立遺伝子によって制御されているという新しい法則を見出し、結果として、遺伝子組み替え、放射線等照射などによる突然変異を起こさせる方法を用いなくても、花きの色素遺伝子型からその花色を自由に創成できる、遺伝子型Ｄ／ｄ・Ｅ／ｅ・ＨＸＨＸ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐを用い、新花色を作出する方法である。」との記載がある。ここで、Ｄ／ｄは八重の花冠の遺伝子型、Ｅ／ｅは覆輪の花冠の遺伝子型、ＨＸＨＸはフラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関する複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯのいずれかから選択され組合わされる遺伝子型、Ｐｇ／ｐｇはペラルゴニジンの遺伝子型、Ｃｙ／ｃｙはシアニジンの遺伝子型、Ｄｐ／ｄｐはデルフィニジンの遺伝子型を示す。
【特許文献１】特開２００４−３２１０５７号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４／１０３０６５号パンフレット
【非特許文献１】田中淳、「イオンビーム育種技術の開発と特徴」、放射線と産業、２００３年、Ｎｏ．９９、ｐ．４−１０
【非特許文献２】岡村正愛、「イオンビーム育種の実用化−カーネーション品種シリーズの育成−」、放射線と産業、２００２年、放射線利用技術データベース、データ番号：０２０２２１
【非特許文献３】宮坂昌実、他２名、「トルコギキョウ吸水種子への重イオンビーム照射の影響」、園芸学雑誌、２００３年、第７２巻、別冊１、ｐ．１１４
【非特許文献４】古田雅一、「農学・生物学分野‐農業における放射線利用の基盤技術‐」、先進放射線利用、飯田敏行監修、大阪大学出版会、２００５年３月、ｐ．１５２−１５７
【非特許文献５】森下敏和、「ガンマーフィールドにおける放射線育種研究〜これまでの研究と最近の成果〜」、放射線と産業、２００６年、Ｎｏ．１１１、ｐ．２８
【非特許文献６】大塚寿夫、「放射線育種の現状」、放射線と産業、２００３年、Ｎｏ．９８、ｐ．３０−３４
【非特許文献７】鹿園直哉と田中淳、「イオンビームによる生物突然変異」、放射線化学のすすめ、日本放射線化学会編、学会出版センター、２００６年２月、ｐ．１４７−１５０
【非特許文献８】Ｋ．Ｕｅｎｏ，他４名，「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  Ｌｅａｆ  Ｄｉｓｃ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｏｎ−Ｂｅａｍ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＪＡＥＲＩ  ＴＩＡＲＡ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００２（ＪＡＥＲＩ−Ｒｅｖｉｅｗ  ２００３−０３３），５２−５４（２００３）
【発明の開示】
【０００３】
従来、キクなどにイオンビームを照射した場合、変異体が容易に得られることが明らかにされ、また、その利用方法が発明されたものの、同様な手法でトルコギキョウを照射した場合、花色の変異体が得られるかどうか不明であったため、実用化には至らなかった。また、照射一代目（以下、Ｍ１またはＭ１世代と称す）に変異が認められることは大変希であり、通常変異は劣性遺伝であるため変異二代目（以下、Ｍ２またはＭ２世代と称す）を得ることにより劣性変異が初めて確認されることから多大な労力と時間を要するという問題があった。さらに、花色発現に関わるヘテロ遺伝子型を用いればＭ１世代が容易に得られるかどうか不明で、Ｍ１変異体に新奇な花型、新奇な模様が入ることは予測できなかった。また、変異の認められなかった後代を累代照射し、累代照射当代のトルコギキョウに変異が認められるかどうか知られていなかった。これらＭ１または照射当代の変異体の作出方法を確立できれば、新奇なトルコギキョウを比較的短時間で得ることが可能となり、これを育種親として用いればトルコギキョウ新品種の作出にさらに効果的であるものと考えられる。
また、特許文献２の「花きの花色遺伝型交配法」は、花色素生合成の遺伝を明らかにし、花卉の花色遺伝と色素遺伝子型の関係を明らかにし、花卉の新花色作出について実用的な花色遺伝型交配法を提供したものであり、花卉について実際に放射線等照射などによる突然変異を起こさせた場合、花色遺伝子型に係わるフラボノイド生合成の、フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’−Ｈ）やフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’，５’−Ｈ）の遺伝がどのようになっているか想定することは困難であって、これらの酵素の反応系の５つの複対立遺伝子（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｌｅｌｅ、５つの複対立遺伝子をそれぞれＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯと称す）がどのように制御されているか、不明であった。
また、５つの複対立遺伝子で表記される花卉の遺伝子型ＨＸＨＸ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐ（ここで、Ｘは、Ｔ、Ｆ、Ｄ、ＺまたはＯのいずれかである。）がどのような遺伝子型であれば放射線等照射などによって突然変異を起こさせることができるのかも不明であった。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、複対立遺伝子型がヘテロ型であるＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐの形質を保有する花卉の個体を用いて放射線照射を行えば、Ｍ１世代（照射当代）に突然変異を容易に発現せしめることを明らかにした。また、一度放射線を照射した後代の交配によりヘテロ型を作出し、その複対立遺伝子型がヘテロ型であるＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐの形質を保有する個体を用いて放射線の累代照射を行えば、累代照射当代に突然変異を容易に発現せしめることを明らかにし、本発明を完成した。
本発明は、要約すると以下の通りである。
［１］  フラボノイド生合成の経路式（Ｉ）：
【化１】
2009119914.tif 000003
（式中、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯは、フラボノイド生合成の色素前駆物質のＢ環の水酸化に関わるフラボノイド３’，５’−水酸化酵素を含む花卉の酵素反応系の花粉親配偶子および種子親配偶子由来の複対立遺伝子を示し、
ＨＴは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）およびシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＦは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＤまたはＨＺは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＯは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
Ｐｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙおよびＤｐ／ｄｐは、それぞれペラルゴニジン（Ｐｇｎ）、シアニジン（Ｃｙｎ）、デルフィニジン（Ｄｐｎ）色素の遺伝子座を示す。）に示された、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯからなる群から選択され組合わされた複対立遺伝子型を含む、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐ（ここで、ＸおよびＹは、上記Ｔ、Ｆ、Ｄ、ＺまたはＯであり、ＸとＹは異なる。）を有する花卉に、放射線を照射することを含む、花卉の突然変異体を作出する方法。
［２］  突然変異体が、放射線を照射する前の当代と比較して、花色が変化した形質、花弁が変形した形質、花弁数が増加した形質、花弁に縦縞の模様が入った形質、花弁に斑が入った形質、花弁に不均一な模様が入った形質、および単色系から二色系の花に変化した形質からなる群から選択される形質を有する、［１］に記載の方法。
［３］  花卉が、トルコギキョウである、［１］または［２］に記載の方法。
［４］  花卉が、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐを有し、かつＨＸＨＹの複対立遺伝子型が、ＨＴとＨＤ、ＨＴとＨＺ、ＨＴとＨＯ、ＨＦとＨＤ、ＨＦとＨＺ、ＨＦとＨＯ、またはＨＤとＨＯの組み合わせである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  花卉が、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐを有し、かつ複対立遺伝子ＨＤまたはＨＺで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ２）と、複対立遺伝子ＨＴまたはＨＦで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ３）とを有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［６］  花卉が、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐを有し、かつ複対立遺伝子ＨＴまたはＨＦで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ３）と、複対立遺伝子ＨＯで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ１）または複対立遺伝子ＨＤもしくはＨＺで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ２）とを有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［７］  放射線を花卉の種子に照射する、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］  放射線がイオンビームである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］  放射線の照射線量が１０Ｇｙ〜１２０Ｇｙである、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］  放射線を累代照射する、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］  突然変異体が照射当代である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］  ［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法により作出された、花卉の突然変異体。
［１３］  ［１２］に記載の突然変異体の後代。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−０８８０８５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、試料パレット上に配置されたシャーレを示す。
図２は、ガラスシャーレの横断面図を示す。
図３は、イオンビーム照射直前のガラスシャーレを示す。
図４は、アルミニウム製コリメータを示す。
図５は、種子留め置き用のプラスチックドーナツ板を示す。
図６は、実施例２においてイオンビーム照射を行っていない正常なＲＶｘＡＫ系統の個体を示す。
図７は、実施例２において２０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶｘＡＫ２０  Ｇ−４の突然変異体の花を示す。
図８は、実施例２において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶｘＡＫ４０  Ｊ−４の突然変異体の花を示す。
図９は、実施例２において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶｘＡＫ４０  Ｊ−８の突然変異体の花を示す。
図１０は、実施例２において６０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶｘＡＫ６０  Ｊ−４の突然変異体の花を示す。
図１１は、実施例２において８０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶｘＡＫ８０  Ｊ−１２の突然変異体の花を示す。
図１２は、実施例２において８０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶｘＡＫ８０  Ｊ−１９の突然変異体の花を示す。
図１３は、実施例２において１００Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶｘＡＫ１００  Ｊ−１３の突然変異体の花を示す。
図１４は、実施例２においてイオンビーム照射を行っていない正常な白八重ｘＤ系統の３個体の花を示す。
図１５は、実施例２において２０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れた白八重ｘＤ２０  Ｇ−１８の突然変異体の花を示す。
図１６は、実施例２において２０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れた白八重ｘＤ２０  Ｇ−２１の突然変異体の花を示す。
図１７は、実施例２において２０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れた白八重ｘＤ２０  Ｇ−２５の突然変異体の花を示す。
図１８は、実施例２において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れた白八重ｘＤ４０  Ｇ−２７の突然変異体の花を示す。
図１９は、実施例３においてイオンビーム照射を行っていない変異の認められないＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ系統の花を示す。
図２０は、実施例３において２０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ２０  Ｇ−３１の突然変異体の花を示す。
図２１は、実施例３において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ４０  Ｇ−２の突然変異体の花を示す。
図２２は、実施例３において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ４０  Ｇ−３の突然変異体の花を示す。
図２３は、実施例３において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ４０  Ｇ−２３の突然変異体の花を示す。
図２４は、実施例３において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ４０  Ｇ−２８の突然変異体の花を示す。
図２５は、実施例３において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ４０  Ｇ−３７の突然変異体の花を示す。
図２６は、実施例３において６０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ６０  Ｇ−２７の突然変異体の花を示す。
図２７は、実施例３において６０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ６０  Ｇ−２９の突然変異体の花を示す。
図２８は、実施例３においてイオンビーム照射を行っていない変異の認められないＭｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰ系統の花を示す。
図２９は、実施例３において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＭｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰ４０  Ｇ−２の突然変異体の花の写真を示す。
図３０は、実施例３において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＭｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰ４０  Ｇ−４の突然変異体の花を示す。
図３１は、実施例３において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＭｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰ４０  Ｇ−３２の突然変異体の花を示す。
図３２は、実施例３において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＭｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰ４０  Ｇ−３９の突然変異体の花を示す。
図３３は、実施例３において６０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＭｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰ６０  Ｇ−２４の突然変異体の花を示す。
図３４は、実施例４においてイオンビーム照射を行っていない変異の認められないＭＲＲＶ３３１３Ｄ１５ｘＥＸ２７Ｃ５系統の３個体の突然変異体の花を示す。
図３５は、実施例４において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＭＲＲＶ３３１３Ｄ１５ｘＥＸ２７Ｃ５の３個体の突然変異体の花を示す。
図３６は、実施例４において６０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＭＲＲＶ３３１３Ｄ１５ｘＥＸ２７Ｃ５の２個体の突然変異体の花を示す。
図３７は、実施例４においてイオンビーム照射を行っていない変異の認められないＲＲＰｘＲＶ（ｒ３）Ｃ４６系統の３個体の突然変異体の花を示す。
図３８は、実施例４において２０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＲＰｘＲＶ（ｒ３）Ｃ４６の６個体の突然変異体の花を示す。
図３９は、実施例４において４０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＲＰｘＲＶ（ｒ３）Ｃ４６の５個体の突然変異体の花を示す。
図４０は、実施例４において６０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＲＰｘＲＶ（ｒ３）Ｃ４６の２個体の突然変異体の花を示す。
図４１は、実施例４において２０Ｇｙのイオンビーム照射を行って現れたＲＲＰｘＲＶ（ｒ３）Ｃ４６の１個体の突然変異体の葉を示す。
図４２は、実施例５においてイオンビーム照射を行って斑入りが現れた個体の写真を示す。パネル１の写真は非照射個体を示し、パネル２の写真は４０Ｇｙのイオンビームを照射して出現した突然変異個体（ＲＶｘＡＫ４０  Ｊ−４）を示し、パネル３の写真は８０Ｇｙのイオンビームを照射して出現した突然変異個体（ＲｖｘＡＫ８０  Ｊ−１９）を示す。
図４３は、実施例５においてイオンビーム照射を行って斑入りが現れた突然変異体のＦ３’，５’−Ｈ遺伝子のゲノム領域の解析の電気泳動の図を示す。レーン１：ＲＶ×ＡＫ４０Ｊ−４のピンク色の部分、レーン２：ＲＶ×ＡＫ４０Ｊ−４の紫色の部分、レーン３：ＡＫ、レーン４：ＲＶ、レーンＭ：マーカー。
図４４は、実施例５においてイオンビーム照射を行って斑入りが現れた突然変異体のＦ３’５’−Ｈ遺伝子の発現の電気泳導の図を示す。レーンＭ：マーカー、レーン１：照射を行っていない個体、レーン２：ＲＶ×ＡＫ４０Ｊ−４のピンク色の部分、レーン３：ＲＶ×ＡＫ４０Ｊ−４の紫色の部分、レーン４：ＲＶ×ＡＫ８０Ｊ−１９のピンク色の部分、レーン５：ＲＶ×ＡＫ８０Ｊ−１９の紫色の部分。
【符号の説明】
【０００５】
１  試料パレット
２  シャーレ
３  コリメータ
４  シャーレの中心開口部
５  寒天培地
６  ドーナッツ板
７  被照射種子
８  円柱
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（１）本発明に用いられる花卉
本発明の花卉の突然変異体を作出する方法には、フラボノイド生合成の色素前駆物質のＢ環の水酸化に関わるフラボノイド３’，５’−水酸化酵素を含む花卉の酵素反応系の花粉親配偶子（雄性配偶子）および種子親配偶子（雌性配偶子）由来の複対立遺伝子がヘテロ型である、ＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐを有する花卉が用いられる。
花卉とは、フラボノイドを含む花を有する被子植物、特に双子葉植物および単子葉植物をいう。具体的には、例えばトルコギキョウ、スイートピー、ペチュニア、デルフィニウム、パンジー、トレニア、キク、キンギョソウ、アサガオ、ロベリア、ナデシコ類、ニチニチソウ、ポピー、ホウセンカ、サルビア、ヒマワリ、ジギタリス、カンパニュラ、ベゴニア、ストック、ツンベルギア、プリムラなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましい花卉は、トルコギキョウである。
遺伝子型ＨＸＨＹは、経路式（Ｉ）：
【化２】
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に示される５つの複対立遺伝子、すなわちＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯからなる群から選択され、組合わされたヘテロの遺伝子型である。ここで、ＸおよびＹはＴ、Ｆ、Ｄ、ＺまたはＯであり、ＸとＹは異なる。
ＨＴは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）およびシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する複対立遺伝子であり、ＨＦは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する複対立遺伝子であり、ＨＤまたはＨＺは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する複対立遺伝子であり、ＨＯは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する複対立遺伝子である（特許文献２および特開２００７−３２５５３３号公報参照）。
上記５つの複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤおよびＨＯは、該複対立遺伝子によって制御される３つのフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’，５’−Ｈ）遺伝子群に基づいて、（ｉ）ＨＴとＨＦ、（ｉｉ）ＨＺとＨＤ、および（ｉｉｉ）ＨＯに分類できる。
（ｉ）ＨＴまたはＨＦによって制御されるＦ３’，５’−Ｈ遺伝子は、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列を有し、９９１ｂｐと１０００ｂｐからなる２つのエクソンの間に１１２９ｂｐのイントロンを保有し、さらに９９１ｂｐの第１エクソンの４９１ｂｐと５００ｂｐとの間に５４０５ｂｐのレトロトランスポゾン（配列番号４の塩基配列を含むレトロトランスポゾン様因子ｒＴｅｇ１（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  １））が挿入された構造を有し、レトロトランスポゾン挿入遺伝子ＥｇＨｆ３と称する。
（ｉｉ）ＨＤまたはＨＺによって制御されるＦ３’，５’−Ｈ遺伝子は、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列を有し、９８６ｂｐと１０００ｂｐからなる２つのエクソンの間に、１１２９ｂｐのイントロンを保有した構造を有し、紫色遺伝子ＥｇＨｆ２と称する。
（ｉｉｉ）ＨＯによって制御されるＦ３’，５’−Ｈ遺伝子は、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列を有し、９８６ｂｐと１０００ｂｐからなる２つのエクソンの間に、５１２ｂｐのイントロンを保有した構造を有し、ＥｇＨｆ１と称する。
また、本発明において、Ｆ３’，５’−Ｈ遺伝子には、以下のものが含まれる：
ＨＴを表わす、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）とシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与するＤＮＡであって、配列番号１の塩基配列、その相補的配列、またはそれらの配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、より好ましくは９５％、９８％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、
ＨＦを表わす、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与するＤＮＡであって、配列番号１の塩基配列、その相補的配列、またはそれらの配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、より好ましくは９５％、９８％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、
ＨＤまたはＨＺを表わす、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与するＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、より好ましくは９５％、９８％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、および
ＨＯを表わす、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与するＤＮＡであって、配列番号３の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、より好ましくは９５％、９８％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
「％同一性」とは、対象の複対立遺伝子のＤＮＡ配列との配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を、ギャップを導入して又はギャップを導入しないで行い、対象のＤＮＡ配列の全塩基数に対する同一塩基数の百分率（％）をいう。配列比較は、通常、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを利用して行うことができる（例えば、Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｄ．Ｓ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））。
「ストリンジェントな条件」とは、対象の複対立遺伝子のＤＮＡに対してハイブリダイズすることができる条件であって、例えば３０〜５０℃で、３〜５×ＳＳＣ、０．１〜１％ＳＤＳ中で１〜１５時間のハイブリダイゼーション、その後の、例えば０．１〜２×ＳＳＣ、０．１〜１％ＳＤＳ中、室温〜７０℃での洗浄からなる条件をいう。このような条件下で対象の複対立遺伝子のＤＮＡにハイブリダイズすることができるＤＮＡは、例えば該複対立遺伝子の変異体又はホモログである。ここで、ホモログは、対象植物とは異なる植物又は植物品種の同族の複対立遺伝子を指す。
また、複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦに関わる、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列から予測されるアミノ酸配列は、配列番号５に示す１３６個のアミノ酸配列と、配列番号６に示す３８６個のアミノ酸配列であり、配列番号１に示す塩基配列から２種類のタンパク質が翻訳される。複対立遺伝子ＨＺ、ＨＤに関わる、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列から予測されるアミノ酸配列は、配列番号７に示す５１０個のアミノ酸配列である。複対立遺伝子ＨＯに関わる、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列から予測されるアミノ酸配列は、配列番号８に示す５１０個のアミノ酸配列である。
また、上記経絡式（Ｉ）において、花卉の花色発現に関わる主要アントシアニジン色素のペラルゴニジン（Ｐｇｎ）、シアニジン（Ｃｙｎ）、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の遺伝について、Ｐｇｎ、Ｃｙｎ、Ｄｐｎ色素の遺伝子座をそれぞれＰｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙ、Ｄｐ／ｄｐとして示す。Ｐｇｎ、Ｃｙｎ、Ｄｐｎの生合成に関与するジヒドロフラボノールリダクターゼ（ＤＦＲ）およびアントシアニジンシンターゼ（ＡＳ）の酵素系の遺伝が、それぞれＰｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙ、Ｄｐ／ｄｐの遺伝子によって制御されている（特許文献２参照）。
本発明に用いられる花卉が保有する遺伝子型は、フラボノイド色素前駆体のＢ環の水酸化に関与するフラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’−Ｈ）とフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’，５’−Ｈ）の酵素反応系の遺伝子型を、上記のとおり、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺ、ＨＯの５つの複対立遺伝子で示し、Ｐｇ／ｐｇの記号のうち２つを選択し（すなわち、ＰｇＰｇ、Ｐｇｐｇ、ｐｇｐｇの組合せ記号のうち１つを選択し）、Ｃｙ／ｃｙの記号のうち２つを選択し（すなわち、ＣｙＣｙ、Ｃｙｃｙ、ｃｙｃｙの組合せ記号のうち１つを選択し）、Ｄｐ／ｄｐの記号のうち２つを選択し（すなわち、ＤｐＤｐ、Ｄｐｄｐ、ｄｐｄｐの組合せ記号のうち１つを選択し）、また、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺ、ＨＯの記号のうち２つを選択し、ただし２つとも同じ記号を選択せず（すなわち、ＨＴＨＦ、ＨＴＨＤ、ＨＴＨＺ、ＨＴＨＯ、ＨＦＨＤ、ＨＦＨＺ、ＨＦＨＯ、ＨＤＨＺ、ＨＤＨＯ、ＨＺＨＯの組合せ記号のうち１つを選択し）、ＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐとして表わすことができる。ＨＸＨＹは、より好ましくは、紫色を発現するＨＤまたはＨＺとＨＯに対して、ピンク〜赤色を発現するＨＴまたはＨＦを組み合わせた、ＨＴＨＤ、ＨＴＨＺ、ＨＴＨＯ、ＨＦＨＤ、ＨＦＨＺまたはＨＦＨＯ、あるいは、ＨＤＨＯなどであるが、これらに限定されない。
遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐを有する花卉は、例えば、遺伝的に複対立遺伝子がヘテロ型になるように系統同士を掛け合わせて作出することができる。例えば、ＨＤＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ遺伝子型をもつ系統とＨＴＨＴＰｇＰｇＣｙＣｙＤｐＤｐ遺伝子型をもつ系統を交配すると、遺伝子型ＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐのＦ１植物が得られる。
放射線を照射する花卉は、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐを有し、かつＨＸＨＹの複対立遺伝子型が、ＨＴとＨＤ、ＨＴとＨＺ、ＨＴとＨＯ、ＨＦとＨＤ、ＨＦとＨＺ、ＨＦとＨＯ、またはＨＤとＨＯの組み合わせを有することが好ましい。
また、放射線を照射する花卉は、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐを有し、かつ複対立遺伝子ＨＤまたはＨＺで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ２、紫色の花色を発現する）と、複対立遺伝子ＨＴまたはＨＦで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ３、ピンク〜赤色の花色を発現する）とを有することが好ましい。また、該花卉は、これらの遺伝子を、１つずつ、配偶子として保有しうる。
あるいは、放射線を照射する花卉は、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐを有し、かつ複対立遺伝子ＨＴまたはＨＦで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ３、ピンク〜赤色の花色を発現する）と、複対立遺伝子ＨＯで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ１、紫色の花色を発現する）または複対立遺伝子ＨＤもしくはＨＺで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ２、紫色の花色を発現する）とを有することが好ましい。また、該花卉は、これらの遺伝子を、１つずつ、配偶子として保有しうる。
上記花卉に、放射線、好ましくはイオンビームの照射を行うと、放射線を照射する前の当代と比較して、花色が変化し、花弁が変形し、花弁数が増加し、花弁に縦縞の模様が入り、花弁に斑が入り、花弁に不均一な模様が入り、あるいは、単色系から二色系の花に変化しうる。例えば、紫色の花色を発現するＥｇＨｆ２またはＥｇＨｆ１の遺伝子の発現を抑えて、ピンク〜赤色の花色を発現するＥｇＨｆ３の遺伝子を発現させることができる。これにより、例えば、花の全体または一部の花色を、より白く、すなわち紫色からピンク〜赤色、赤色からピンク、ピンクからピンクがかった白色などに変化させることができる。
（２）放射線の照射
本発明の花卉の突然変異体を作出する方法は、上記遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐを有する花卉に、放射線を照射することを含む。
放射線としては、例えばイオンビーム、Ｘ線、ガンマ線、電子線、中性子線などが挙げられ、特に限定されないが、イオンビーム（例えば、ネオンイオンビーム、炭素イオンビーム、アルゴンイオンビームなど）が好ましい。イオンビームの照射には、例えば日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所イオン照射研究施設（ＴＩＡＲＡ）に設置されているＡＶＦ（Ａｚｉｍｕｔｈａｌｌｙ  ｖａｒｙｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ）サイクロトロンの深度制御種子照射装置を用いることができる。イオン加速器としての装置は、住友重機械工業（株）製９３０型ＡＶＦサイクロトロン本体、イオンを生成するイオン源系、イオン注入系、加速されたイオンを標的まで運ぶビーム輸送系、その他計算機制御系等から構成され、軽イオン（Ｈ＋）から重イオン（１９７Ａｕ３１＋）まで利用可能である。使用するイオンビームは、エネルギー２２０ＭｅＶ、ビーム強度８０ｐｎＡの炭素イオン（１２Ｃ５＋）が特に好ましい。また、ビーム強度は、電流値を変えるアッテネータにより１／１０毎に減衰させることも可能である。
上記深度制御種子照射装置は、サイクロトロンの垂直ビームラインに設置され、イオンビームを厚さ３０μｍのチタン箔を介して大気中に取り出し、水平に置かれた試料を上方から照射することを特徴とし、ビームスキャナーにより最大５０ｍｍ×５０ｍｍの範囲を均一にスキャンすることができる。なお、試料中でのイオンの飛程は、２２０ＭｅＶ炭素イオンビームの場合、水溶液中で約１ｍｍである。
照射時間は試料１個につき３０秒〜数分間で、単位時間に単位面積を通過するイオン粒子数を表すフルエンス率は、２２０ＭｅＶ炭素イオンビームの最大電流で照射した場合、６×１０９ｐ／ｃｍ２・秒となる。通常は、フルエンス率５×１０８ｐ／ｃｍ２・秒（毎秒１００Ｇｙ（グレイ）に相当）程度か、さらに１桁毎に１０−１〜１０−９に減衰させたフルエンス率で照射することが好ましい。予定フルエンスは、荷電粒子線のフルエンス計測器の一つであるファラディーカップで計測したビーム電流値と照射時間から計算される。表１に、吸収線量に対する最適な電流値、照射時間等を示す。
【表１】
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深度制御種子照射装置の設置されている第２重イオン室は、イオンビームの利用によって放射性核種が生成する第２種放射線管理区域にあり、イオンビーム照射実験計画の立案にあたっては、照射試料の放射化量等に関する事前の安全評価が必要である。照射実験終了後は、放射線安全管理官の立会いのもと放射能測定が行われ、照射試料を放射線管理区域から持ち出すことが可能となる。放射化量の評価では、生成放射化量および核種の濃度が「放射性同位元素等による放射線障害の防止に関する法律」（「放射線障害防止法」という。）で定める核種の規制対象下限値（濃度）に対する割合の和が０．１未満となることが照射の必須条件となる。
イオンビームと試料構成元素との核反応によって生成する放射性核種の量および核種の濃度は、ＩＲＡＣ（Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｄｅ）コードシステムを用いた計算データにより評価する。イオンビームのターゲットとなる物質は、照射試料のみならず、試料の梱包に使用するプラスチックフィルム、容器に入れて照射する場合はその容器も含まれる。照射対象が種子の場合、耐放射線のカプトン膜、寒天培地、ガラスシャーレを用いることが好ましい。
生成放射化物の濃度は試料に生成する放射化物の全量を試料との重量で割った値である。本発明では、照射試料の放射化量に関する安全評価をクリアーするための工夫を施した。より詳しくは、試料に照射されるイオン粒子数を制御することができる２ｍｍ厚のアルミニウム製コリメータと容器（例えば、寒天培地＋ガラスシャーレ）の使用である。ビーム照射に使用する容器を図１〜５に示す。図１は、試料パレット１に配置されたガラスシャーレ２、コリメータ３を示す。シャーレの中心開口部４がイオンビームが入射される範囲である。図２は、シャーレ２の横断面図である。図３は、１０ｍｍ厚さの寒天培地５上に２ｍｍ厚アクリル製ドーナッツ板６とコリメータ３が配置されたガラスシャーレ２を示し、前記ドーナッツ板（種子留め置き板）６は、コリメータ３を通過したイオン粒子が被照射種子７に正確に照射されるようにしたものである。被照射種子はドーナッツ板内側に静置される。図４は、コリメータ３を示す。図５は、ドーナッツ板６を示し、ドーナッツ板６に取り付けたアクリル製円柱８（２ｍｍφ、４ｍｍ長）は、ドーナッツ板６を寒天培地に固定するものである。
本発明では、突然変異誘発率が高く、植物に多様な形態を生じさせ得るイオンビームを種子に照射し、当該照射を施した植物を経過観察した結果、新奇な形質の突然変異植物を作出することに成功した。
照射に使用する線質は、植物遺伝子の変異を創出できるものであればいずれでもよく、種子の構造、感受性等により適切なものを選択することができる。照射対象が例えばトルコギキョウの乾燥種子の場合、炭素イオンビームを用いることが好ましい。
照射線量は、種子の種類や状態、感受性、または線質等によって好適な線量を照射する。放射線の照射線量は、１０Ｇｙ〜１２０Ｇｙが好ましい。トルコギキョウの乾燥種子にイオンビームを照射する場合、設定条件はより好ましくは２０〜１００Ｇｙ、さらに好ましくは４０〜６０Ｇｙである。
照射対象は、照射による遺伝子型の改変が創出されるもの全てが含まれる。例えば、種子、成植物、幼苗、植物組織（葯、花粉、胚、胚珠、茎頂、葉片など）、植物細胞（カルス、プロトプラストなど）が挙げられ、特に限定されない。種子であれば、カプトン膜を袋状にして種子を封入し密閉する、もしくはシャーレ内の寒天培地に置床して直接照射してもよい。
また、上記放射線の照射前あるいは照射後に、照射対象に突然変異原をさらに作用させてもよい。変異原としては、化学物質（Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア、エチルメタンスルホネート、アジ化ナトリウムなど）、放射線（イオンビーム、Ｘ線、ガンマ線、電子線、中性子線など）が挙げられる。放射線を毎代照射する累代照射を行ってもよい。
（３）突然変異体
上記放射線照射により得られた突然変異体は、放射線を照射する前の当代と比較して、花色が変化した形質、花弁が変形した形質、花弁数が増加した形質、花弁に縦縞の模様が入った形質、花弁に斑が入った形質、花弁に不均一な模様が入った形質、および単色系から二色系の花に変化した形質からなる群から選択される形質を有するが、これらに限定されず、葉に斑入りの形質なども有し得る。放射線を照射する前の当代は、交配親の遺伝形質による表現型を表すが、放射線を照射するとその表現型と異なる表現型が表われ得る。
例えば、トルコギキョウの遺伝子型ＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐは花色が紫色であるが（図６）、放射線を種子に照射して、育苗、開花させると、花弁の色が紫色からピンク色になった花（図８、図１２など）、変形した花弁（図７、図９、図１３など）、紫色の地色にピンク色や白色の縦縞の模様が入った花弁（図８、図９など）、色の濃淡による斑入りの花弁（図１０など）、紫色の地色に白色やピンク色の斑入りの花弁（図１１、図１２など）、１枚の花弁に大きな縦縞と斑が入って不均一な模様を有する花弁（図８〜１２など）、白と紫色もしくは紫色とピンク色の二色系となった花（図８〜１２など）などが見られた。
花弁の色素について調べたところ、紫色の部分には、紫色を発現するデルフィニジン色素と赤色を発現するシアニジンとペラルゴニジン色素が含まれ、ピンク色の部分には、赤色を発現するシアニジンとペラルゴニジン色素が含まれていた。
また、上記遺伝子型ＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐの突然変異体の花弁について、花弁が紫色の部分とピンク色の部分の紫色遺伝子ＥｇＨｆ２（配列番号２）およびレトロトランスポゾン挿入遺伝子ＥｇＨｆ３（配列番号１）のＤＮＡをＰＣＲと電気泳動で調べた。遺伝子型ＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐの親は、一方が遺伝子型ＨＤＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐで、紫色の花色、紫色遺伝子ＥｇＨｆ２を有し、もう一方が遺伝子型ＨＴＨＴＰｇＰｇＣｙＣｙＤｐＤｐで、ピンク色の花色、レトロトランスポゾン挿入遺伝子ＥｇＨｆ３を有する。紫色、ピンク色の部分はともに、紫色遺伝子ＥｇＨｆ２およびトランスポゾン挿入遺伝子ＥｇＨｆ３を有しており（図４３のレーン１および２）、親世代と同じ遺伝子を保有していた。
さらに、上記遺伝子型ＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐの突然変異体の花弁について、花弁が紫色の部分とピンク色の部分のＦ３’，５’−Ｈ遺伝子のｍＲＮＡの発現をＰＣＲと電気泳動で調べた。花弁が紫色の部分ではＦ３’，５’−Ｈ遺伝子の発現がみられ（図４４のレーン３および５）、ピンク色の部分では抑制されていることがわかった（図４４のレーン２および４）。従って、花弁のピンク色の部分では、紫色遺伝子ＥｇＨｆ２を有しているにもかかわらず、放射線照射によって部分的に発現が抑えられ、デルフィニジンの蓄積が減少し、結果としてピンク色が発現していることがわかった。
本発明によれば、花弁の色、花弁の模様（縦縞、斑入り、覆輪等）、花弁の変形、花弁数の増加（八重）などの形質の変化が組合わさって、様々な形質を有する突然変異体が得られる。
このような形質の変化は、放射線が照射された当代から見られるが、照射された当代で形質が変化しなくても、累代照射を行うことにより形質が変化し得る。
また、突然変異体の茎頂培養、カルス培養など公知の手法により増殖された植物も本発明の突然変異体に含まれる。さらに、突然変異体を交配親に用いて後代（子孫）を得ることができる。突然変異体および／またはその後代、あるいは従来の系統を様々に組合わせて交配し、新品種の花卉を作出することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
トルコギキョウの種子へのイオンビームの照射方法
（１）種子の照射位置
長さ３２０ｍｍ×幅６０ｍｍのアルミニウム製パレットの上に３個の試料を固定し、チタン箔のビーム取り出し窓の照射野内に移動して照射する。試料搬送機のストッカーには一度に２０枚の試料パレットを収容できるため、最大６０個の試料を連続して照射可能である。正味の照射時間以外に試料パレットの移動などに試料１個当たり約２０秒を要した。
（２）種子の照射方法
トルコギキョウ種子に対するイオンビーム照射は、住友重機械工業製９３０型ＡＶＦサイクロトロンを使用した。イオン種は２２０ＭｅＶ炭素イオンビーム（１２Ｃ５＋）を用いた。サイクロトロンから引き出されたビームは偏向を繰り返し、試料に対して垂直照射を行う。照射面積は５０ｍｍ×５０ｍｍであるが２０ｍｍ×２０ｍｍまでビームスキャナーが可能である。ここでは試料以外の放射化を防ぎつつ種子に対して確実に照射するため、試料上に図１のとおり、アルミニウムの遮蔽板（コリメータ３）を使用した。試料照射前、線量の確認はチェンバー中心のファラディーカップで行った。試料照射時、中心のファラディーカップは遠隔操作で照射位置から移動し、チェンバー両サイドのファラディーカップで確認した。ビーム電流は１０ｎＡに設定したが、照射線量と照射時間に応じてアッテネータで減衰制御される。制御された結果、試料に対する線量率は０．３Ｇｙ毎秒〜７Ｇｙ毎秒であった。チェンバー内部での大気の放射化を防ぐため、ヘリウムガスを流した。
試料は図１の照射パレット１で照射位置へ搬送され、照射が行われる。照射パレットに固定する試料の数は３つであり、試料は照射パレットをはみ出る大きさであってはならない。照射パレットを格納するストッカーは計２０段ある。
照射条件設定においては、まずイオン種を選択する。照射方法はタイマー照射と線量照射があるが、ここでは線量照射を選択した。照射線量は各試料に対して個別に設定が可能である。
【実施例２】
【０００８】
イオンビーム照射後からのトルコギキョウの栽培と開花結果
（１）Ｆ１個体の照射とその突然変異体（ＲＶｘＡＫ系統）
２００５年夏にトルコギキョウのロイヤルバイオレット自殖系統（ＲＶと称す、ホモ型、遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）と、あすかの紅自殖系統（ＡＫと称す、ホモ型、遺伝子型ｄｄｅｅＨＴＨＴＰｇＰｇＣｙＣｙＤｐＤｐ遺伝子型）を交配し、Ｆ１個体の種子（ＲＶｘＡＫと称す、遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を得た。なお、Ｄ／ｄは八重の花冠形質、Ｅ／ｅは覆輪の花冠形質を示す。
２００６年２月２８日ＴＩＡＲＡのサイクロトロンを用いて、このＲＶｘＡＫのＦ１種子（遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を約数百粒ずつ２０、４０、６０、８０、１００Ｇｙのイオンビームを照射した。照射した種子は、文献記載の方法（Ｕｄｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．，７１：４０−４７，２００２）で播種し、育苗、開花させた。その結果、２０Ｇｙで１個体、４０Ｇｙで２個体、６０Ｇｙで１個体、８０Ｇｙで２個体、１００Ｇｙで１個体の突然変異体を得ることができた。図６に、イオンビームを全く照射していないＲＶｘＡＫの花、図７に２０Ｇｙで得られた１個体（２０Ｇ−４）の突然変異体の花、図８および図９に４０Ｇｙで得られた２個体（４０Ｊ−４、４０Ｊ−８）の突然変異体の花、図１０に６０Ｇｙで得られた１個体（６０Ｊ−４）の突然変異体の花、図１１および図１２に８０Ｇｙで得られた２個体（８０Ｊ−１２、８０Ｊ−１９）の突然変異体の花、図１３に１００Ｇｙで得られた１個体（１００Ｊ−１３）の突然変異体の花を示す。
図７の２０Ｇｙで得られた１個体の突然変異体の花は、開花２０個体中に出現した変異体で、変異体出現率は５％であった。図８および図９の４０Ｇｙで得られた２個体の突然変異体の花は、開花４８個体中に出現した変異体で、変異体出現率は４．１％であった。図１０の６０Ｇｙで得られた１個体の突然変異体の花は、開花４４個体中に出現した変異体で、変異体出現率は２．２％であった。図１１および図１２の８０Ｇｙで得られた２個体の突然変異体の花は、開花４４個体中に出現した変異体で、変異体出現率は４．５％であった。図１３の１００Ｇｙで得られた１個体の突然変異体の花は、開花４４個体中に出現した変異体で、変異体出現率は２．２％であった。この様に、Ｆ１照射当代で突然変異体を容易に得られることが分かる。
（２）Ｆ１個体の照射とその突然変異体（白八重ｘＤ系統）
２００５年夏にトルコギキョウの白花八重系統（白八重と称す、ヘテロ型、遺伝子型ＤｄｅｅＨＦＨＦｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）と、ロイヤルバイオレット自殖系統（Ｄと称す、ホモ型、遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を交配し、Ｆ１個体の種子（白八重ｘＤと称す、遺伝子型ＤｄｅｅＨＦＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐと遺伝子型ｄｄｅｅＨＦＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐの混合した種子）を得た。２００６年２月２８日群馬県高崎研究所のサイクロトロンを用いて、この白八重ｘＤのＦ１種子（遺伝子型ＤｄｅｅＨＦＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐと遺伝子型ｄｄｅｅＨＦＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐの混合した種子）を約数百粒ずつ２０、４０、６０、８０、１００Ｇｙのイオンビームを照射した。照射した種子は、上記Ｕｄｄｉｎらの文献に記載の方法と同様にして播種し、育苗、開花させた。その結果、２０Ｇｙで３個体、４０Ｇｙで１個体の突然変異体を得ることができた。図１４に、イオンビームを全く照射していない白八重ｘＤの３個体の花（花型が八重型と一重型のヘテロ型と分かる）、図１５、図１６、図１７にそれぞれ２０Ｇｙで得られた３個体（２０Ｇ−１８、２０Ｇ−２１、２０Ｇ−２５）の突然変異体の花、図１８に４０Ｇｙで得られた１個体（４０Ｇ−２７）の突然変異体の花を示す。
図１５、図１６、図１７で示した２０Ｇｙで得られた３個体の突然変異体の花は、開花３２個体中に出現した変異体で、変異体出現率は９．３％であった。図１８の４０Ｇｙで得られた１個体の突然変異体の花は、開花４４個体中に出現した変異体で、変異体出現率は２．２％であった。この様に、Ｆ１照射当代で突然変異体を容易に得られることが分かる。
【実施例３】
【０００９】
イオンビーム累代照射後からのトルコギキョウの栽培と開花結果
（１）Ｆ１個体の累代照射とその突然変異体（ＲＶ（ｒ１）ｘＡＫ系統）
２００５年夏にトルコギキョウのＲＶ（ｒ１）自殖系統（ＲＶ（ｒ１）と称す、ホモ型、遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）とあすかの紅自殖系統（ＡＫと称す、ホモ型、遺伝子型ｄｄｅｅＨＴＨＴＰｇＰｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を交配し、Ｆ１個体の種子（ＲＶ（ｒ１）ｘＡＫと称す、遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を得た。ＲＶ（ｒ１）自殖系統は、先にイオンビームを照射したが、見かけ上変異が認められなかった系統である。２００６年２月２８日ＴＩＡＲＡのサイクロトロンを用いて、このＲＶ（ｒ１）ｘＡＫのＦ１種子（遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ遺伝子型）を約数百粒ずつ２０、４０、６０、８０、１００Ｇｙのイオンビームを照射した。照射した種子は、上記Ｕｄｄｉｎらの文献に記載の方法と同様にして播種し、育苗、開花させた。その結果、２０Ｇｙで１個体、４０Ｇｙで５個体、６０Ｇｙで２個体の突然変異体を得ることができた。図１９にイオンビームを全く照射していないＲＶ（ｒ１）ｘＡＫの花、図２０に２０Ｇｙで得られた１個体（２０Ｇ−３１）の突然変異体の花、図２１〜２５に４０Ｇｙで得られた５個体（４０Ｇ−２、４０Ｇ−３、４０Ｇ−２３、４０Ｇ−２８、４０Ｇ−３７）の突然変異体の花、図２６と図２７に６０Ｇｙで得られた２個体（６０Ｇ−２７、６０Ｇ−２９）の突然変異体の花を示す。
図２０で示した２０Ｇｙで得られた１個体の突然変異体の花は開花４０個体中に出現した変異体で、変異体出現率は２．５％であった。図２１〜図２５の４０Ｇｙで得られた５個体の突然変異体の花は開花４８個体中に出現した変異体で、変異体出現率は１０．４％であった。図２６と図２７の６０Ｇｙで得られた２個体の突然変異体の花は開花３２個体中に出現した変異体で、変異体出現率は６．２％であった。この様に、累代のＦ１照射当代で突然変異体を容易に得られることが分かる。
（２）Ｆ１個体の累代照射とその突然変異体（Ｍｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰ系統）
２００５年夏にトルコギキョウのＭｅ１Ｄ（ｒ３）自殖系統（Ｍｅ１Ｄ（ｒ３）と称す、ホモ型、遺伝子型ｄｄｅｅＨＯＨＯｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）とエクローサピンク自殖系統（ＥＰＰと称す、ホモ型、遺伝子型ＤｄＥｅＨＦＨＦｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を交配し、Ｆ１個体の種子（Ｍｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰと称す、遺伝子型Ｄ／ｄ・Ｅ／ｅ・ＨＯＨＦｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を得た。Ｍｅ１Ｄ（ｒ３）自殖系統は、先にイオンビームを照射したが、見かけ上変異が認められなかった系統である。２００６年２月２８日ＴＩＡＲＡのサイクロトロンを用いて、このＭｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰのＦ１種子（Ｄ／ｄ・Ｅ／ｅ・ＨＯＨＦｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ遺伝子型）を約数百粒ずつ２０、４０、６０、８０、１００Ｇｙのイオンビームを照射した。照射した種子は、上記Ｕｄｄｉｎらの文献に記載の方法と同様にして播種し、育苗、開花させた。その結果、４０Ｇｙで４個体、６０Ｇｙで１個体の変異体を得ることができた。図２８に、イオンビームを全く照射していないＲＭｅ１Ｄ（ｒ３）ｘＥＰＰの４個体の花（花型が八重型と一重型のヘテロ型であって、覆輪型が全色型と覆輪型のヘテロ型であることが分かる）、図２９〜３２に４０Ｇｙで得られた４個体（４０Ｇ−２、４０Ｇ−４、４０Ｇ−３２、４０Ｇ−３９）の突然変異体の花、図３３に６０Ｇｙで得られた１個体（６０Ｇ−２４）の突然変異体の花を示す。
図２９〜３２で示した４０Ｇｙで得られた４個体の突然変異体の花は開花４４個体中に出現した変異体で、変異体出現率は９．０％であった。図３３の６０Ｇｙで得られた１個体の突然変異体の花は開花３６個体中に出現した変異体で、変異体出現率は２．７％であった。この様に、累代のＦ１照射当代で突然変異体を容易に得られることが分かる。
【実施例４】
【００１０】
イオンビーム照射および累代照射後からのトルコギキョウの栽培と開花結果
（１）Ｆ１個体の照射とその突然変異体（ＭＲＲＶ３３１３Ｄ１５ｘＥＸ２７Ｃ５系統）
２００６年夏にトルコギキョウのＭＲＲＶ３３１３Ｄ１５自殖系統（ホモ型、遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）とＥＸ２７Ｃ５自殖系統（ホモ型、遺伝子型ｄｄｅｅＨＯＨＯｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を交配し、Ｆ１個体の種子（ＭＲＲＶ３３１３Ｄ１５ｘＥＸ２７Ｃ５と称す、遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＯｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を得た。２００７年２月２８日ＴＩＡＲＡのサイクロトロンを用いて、このＭＲＲＶ３３１３Ｄ１５ｘＥＸ２７Ｃ５のＦ１種子（遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＯｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を約数百粒ずつ２０、４０、６０、８０、１００Ｇｙのイオンビームを照射した。照射した種子は、上記Ｕｄｄｉｎらの文献に記載の方法と同様にして播種し、育苗、開花させた。その結果、４０Ｇｙで３個体、６０Ｇｙで５個体の変異体を得ることができた。図３４にイオンビームを全く照射していないＭＲＲＶ３３１３Ｄ１５ｘＥＸ２７Ｃ５の花、図３５に４０Ｇｙで得られた３個体の突然変異体の花、図３６に６０Ｇｙで得られた２個体の突然変異体の花を示す。
図３５で示した４０Ｇｙで得られた３個体の突然変異体の花は開花９５個体中に出現した変異体で、変異体出現率は３．１％であった。図３６の６０Ｇｙで得られた２個体の突然変異体の花の他、６０Ｇｙ照射では同様な突然変異体の花が他に３個体得られ、これら５個体は開花８３個体中に出現した変異体で、変異体出現率は６．０％であった。この様に、Ｆ１照射当代で突然変異体を容易に得られることが分かる。
（２）Ｆ１個体の累代照射とその突然変異体（ＲＲＰｘＲＶ（ｒ３）Ｃ４６系統）
２００６年夏にトルコギキョウのＲＲＰ系統（ヘテロ型、遺伝子型ＤｄＥｅＨＴＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）とＲＶ（ｒ３）Ｃ４６自殖系統（ホモ型、遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ）を交配し、Ｆ１個体の種子（ＲＲＰｘＲＶ（ｒ３）Ｃ４６と称す、遺伝子型Ｄ／ｄ・Ｅ／ｅ・ＨＴＨＤ・Ｐｇ／ｐｇ・ＣｙＣｙＤｐＤｐ）を得た。ＲＶ（ｒ３）Ｃ４６自殖系統は、先にイオンビームを照射したが、見かけ上変異が認められなかった系統である。２００７年２月２８日ＴＩＡＲＡのサイクロトロンを用いて、このＲＲＰｘＲＶ（ｒ３）Ｃ４６のＦ１種子（遺伝子型Ｄ／ｄ・Ｅ／ｅ・ＨＴＨＤ・Ｐｇ／ｐｇ・ＣｙＣｙＤｐＤｐ）を約数百粒ずつ２０、４０、６０、８０、１００Ｇｙのイオンビームを照射した。照射した種子は、上記Ｕｄｄｉｎらの文献に記載の方法と同様にして播種し、育苗、開花させた。その結果、２０Ｇｙで６個体、４０Ｇｙで５個体、６０Ｇｙで２個体の突然変異体を得ることができた。図３７に、イオンビームを全く照射していないＲＲＰｘＲＶ（ｒ３）Ｃ４６系統の花、図３８に２０Ｇｙで得られた６個体の突然変異体の花、図３９に４０Ｇｙで得られた５個体の突然変異体の花、図４０に６０Ｇｙで得られた２個体の突然変異体の花を示す。また、図４１に２０Ｇｙで得られた葉に斑が入った１個体の突然変異体を示す。
図３８で示した２０Ｇｙで得られた６個体の突然変異体の花は開花１２１個体中に出現した変異体で、変異体出現率は４．９％であった。図３９の４０Ｇｙで得られた５個体の突然変異体の花の他、４０Ｇｙ照射では同様な突然変異体の花が他に７個体得られ、これら１２個体は開花９８個体中に出現した変異体で、変異体出現率は１２．２％であった。図４０で示した６０Ｇｙで得られた２個体の突然変異体の花は開花３５個体中に出現した変異体で、変異体出現率は５．７％であった。この様に、累代照射のＦ１照射当代で突然変異体を容易に得られることが分かる。
【実施例５】
【００１１】
（１）二色系の花色の花弁に含まれるアントシアニジン色素の分析
遺伝子型ＨＸＨＹがホモである個体、ロイヤルバイオレット（ＲＶ）の自殖系統（花色紫、ＣｙｎＤｐｎ色素表現型、遺伝子型ＨＤＨＤ）やあすかの紅（ＡＫ）の自殖系統（花色ピンク、ＰｇｎＣｙｎ色素表現型、遺伝子型ＨＴＨＴ）にイオンビームを照射しても、花色に斑入り（ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎまたはｃｏｌｏｒ  ｚｏｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｌｏｗｅｒｓ）などのはっきりわかる変化は見られなかった。一方、ＲＶとＡＫを交配したＦ１のＲＶ×ＡＫ系統（花色紫、ＣｙｎＤｐｎ色素表現型、遺伝子型ＨＤＨＴ）にイオンビームを照射すると、紫の地色にピンクの斑入りが発生する個体が得られた（図４２）。図４２で、パネル１の写真は非照射個体を示し、パネル２の写真は４０Ｇｙのイオンビームを照射して出現した突然変異個体（ＲＶｘＡＫ４０  Ｊ−４と称す）、パネル３の写真は８０Ｇｙのイオンビームを照射して出現した突然変異個体（ＲｖｘＡＫ８０  Ｊ−１９と称す）を示す。パネル１からパネル３のいずれの個体も、上記花色遺伝子型交配法（特許文献２）による遺伝子型は、遺伝子型ｄｄｅｅＨＤＨＴＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐである。このパネル２とパネル３の写真に示した斑入りのＲＶ×ＡＫ系統の花弁を、紫色の部分とピンク色の部分に分けて採取し、アントシアニジンの組成をＨＰＬＣで測定した。測定条件および測定装置は、上記Ｕｄｄｉｎらの文献に記載の方法を用いた。
この結果、紫色の部分には紫色を発現するデルフィニジン色素と赤色を発現するシアニジンとペラルゴニジン色素が含まれていた。一方、ピンク色の部分には赤色を発現するシアニジンとペラルゴニジン色素が含まれていた。この結果、本来、図４２のパネル１の写真のように、放射線照射がなければ全色系の紫色に発現する花弁が、放射線照射によって、パネル２とパネル３の写真のように、花弁の部分的にデルフィニジンの色素の蓄積が無くなるためにピンク色に改変されたことが分かる。
（２）紫色の部分とピンク色の部分のそれぞれのＦ３’５’−Ｈ遺伝子のＤＮＡと該遺伝子の発現の調査
（ｉ）Ｆ３’，５’−Ｈ遺伝子のＤＮＡ
ＤＮＡの調査はトルコギキョウの突然変異体の紫色の部分とピンク色の部分から、Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉキット（バイオジーン社）を使用し、ＤＮＡを抽出した。Ｆ３’，５’−Ｈ遺伝子を増幅するプライマー５’−ＧＴＡＣＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号９）と、５’−ＧＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＡＴ−３’（配列番号１０）または５’−ＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１１）を設計して用いた。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ９７００システム（ＡＢＩ社）を使用して行った。反応液２０μｌ中には１０ｎｇ  ＤＮＡ、０．５ｕｎｉｔｓ  ＴＡＫＡＲＡ  ＥＸＴａｑ（もしくはＬＡＴａｑ）（タカラバイオ社）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ，０．５μＭ、２μｌ１０×ＥＸ（もしくはＬＡ）Ｔａｑバッファーが含まれる。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６５℃で３０秒間のアニール、７２℃で１−１０分間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、１％ＬＥアガロースゲル（バイオジーン社）上の電気泳動によりバンドの確認を行った。
ＤＮＡの存在を確認した結果、あすかの紅の花弁由来のレトロトランスポゾン挿入遺伝子ＥｇＨｆ３（図４３のレーン３）とロイヤルバイオレットの花弁由来の紫色遺伝子ＥｇＨｆ２（図４３のレーン４）の両者の遺伝子を、放射線処理後も保有していたことが分かった（レーン１および２）。従って、照射された図４２のパネル２とパネル３の変異個体は、紫色の部分とピンク色の部分のＦ３’５’−Ｈ遺伝子は、親世代と同じ遺伝子を保有しており、放射線照射によって変化を受けなかったことが分かる（図４３）。
（ｉｉ）Ｆ３’，５’−Ｈ遺伝子の発現
遺伝子発現の調査はトルコギキョウの突然変異体の紫色の部分とピンク色の部分から、Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（バイオジーン社）を使用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて製造者の推奨する方法でｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡの場合と同じようにＰＣＲを行った。
その結果、ｍＲＮＡレベルでは、デルフィニジンが存在している花弁が紫色の部分では、Ｆ３’，５’−Ｈ遺伝子の発現が見られた（図４４のレーン３とレーン５）。これに対して、デルフィニジンが存在しない花弁がピンク色の部分では、Ｆ３’，５’−Ｈ遺伝子の発現は強く抑制されて、発現が押さえられていた（図４４のレーン２とレーン４）。
以上の実施例から、複対立遺伝子ＨＸＨＹがヘテロ型の個体に放射線を照射すれば高頻度で突然変異体を作出することができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００１２】
本発明の花卉の突然変異体を作出する方法によれば、照射当代で変異が現れ、高い頻度で突然変異体を作出できる。また、放射線照射前の花卉と比較して様々に変化した形質を有する花卉を、短時間で作出でき、育種の効率化を図ることができる。
複対立遺伝子がヘテロ型である遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐを保有する花卉を用いて放射線照射を行うことにより、様々な形質を有する突然変異体を作出でき、これらの突然変異体は育種や花色の研究等に有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年1月22日(2010.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
フラボノイド生合成の経路式（Ｉ）：
【化１】
2009119914.tif 000081
（式中、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯは、フラボノイド生合成の色素前駆物質のＢ環の水酸化に関わるフラボノイド３’，５’−水酸化酵素を含むトルコギキョウの酵素反応系の花粉親配偶子および種子親配偶子由来の複対立遺伝子を示し、
ＨＴは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）およびシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＦは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＤまたはＨＺは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＯは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
Ｐｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙおよびＤｐ／ｄｐは、それぞれペラルゴニジン（Ｐｇｎ）、シアニジン（Ｃｙｎ）、デルフィニジン（Ｄｐｎ）色素の遺伝子座を示す。）に示された、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯからなる群から選択され組合わされた複対立遺伝子型を含む、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐ（ここで、ＸおよびＹは、上記Ｔ、Ｆ、Ｄ、ＺまたはＯであり、ＸとＹは異なる。）を有し、ＨＸＨＹの複対立遺伝子型が、ＨＴとＨＤ、ＨＴとＨＺ、ＨＴとＨＯ、ＨＦとＨＤ、ＨＦとＨＺ、ＨＦとＨＯ、またはＨＤとＨＯの組み合わせであるトルコギキョウの種子に、イオンビームを照射して、複対立遺伝子ＨＯで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ１）および／または複対立遺伝子ＨＤもしくはＨＺで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ２）の発現を抑えることを含む、花色が変化したトルコギキョウを作出する方法。
【請求項１５】
トルコギキョウが、複対立遺伝子ＨＴまたはＨＦで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ３）をさらに有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
イオンビームの照射線量が１０Ｇｙ〜１２０Ｇｙである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
イオンビームを累代照射する、請求項１４、１５または１８に記載の方法。
【請求項２０】
花色が変化したトルコギキョウが照射当代である、請求項１４、１５、１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
花色が変化したトルコギキョウが、イオンビームを照射する前の当代と比較して、花弁が変形した形質、花弁数が増加した形質、花弁に縦縞の模様が入った形質、花弁に斑が入った形質、花弁に不均一な模様が入った形質、および単色系から二色系の花に変化した形質からなる群から選択される形質をさらに有する、請求項１４、１５、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
請求項１４、１５、１８、１９、２０または２１に記載の方法により作出された、トルコギキョウ。
【請求項２４】
請求項２３に記載のトルコギキョウの後代。
【手続補正書】
【提出日】平成22年9月17日(2010.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイド生合成の経路式（Ｉ）:
【化１】
2009119914.tif 000082
（式中、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯは、フラボノイド生合成の色素前駆物質のＢ環の水酸化に関わるフラボノイド３’，５’−水酸化酵素を含むトルコギキョウの酵素反応系の花粉親配偶子および種子親配偶子由来の複対立遺伝子を示し、
ＨＴは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）およびシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＦは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＤまたはＨＺは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
ＨＯは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、
Ｐｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙおよびＤｐ／ｄｐは、それぞれペラルゴニジン（Ｐｇｎ）、シアニジン（Ｃｙｎ）、デルフィニジン（Ｄｐｎ）色素の遺伝子座を示す。）
に示された、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺおよびＨＯからなる群から選択され組合わされた複対立遺伝子型を含む、遺伝子型ＨＸＨＹ・Ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐまたはＨＸＨＹ・ｐｇｐｇ・ＣｙＣｙ・ＤｐＤｐ（ここで、ＸおよびＹは、上記Ｔ、Ｆ、Ｄ、ＺまたはＯであり、ＸとＹは異なる。）を有し、ＨＸＨＹの複対立遺伝子型が、ＨＴとＨＤ、ＨＴとＨＺ、ＨＴとＨＯ、ＨＦとＨＤ、ＨＦとＨＺ、ＨＦとＨＯ、またはＨＤとＨＯの組み合わせであるトルコギキョウの種子に、イオンビームを照射して、複対立遺伝子ＨＯで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ１）および／または複対立遺伝子ＨＤもしくはＨＺで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ２）の発現を抑えることを含む、花色が変化したトルコギキョウを作出する方法。
【請求項２】
トルコギキョウが、複対立遺伝子ＨＴまたはＨＦで制御されるフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＥｇＨｆ３）をさらに有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イオンビームの照射線量が１０Ｇｙ〜１２０Ｇｙである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
イオンビームを累代照射する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
花色が変化したトルコギキョウが照射当代である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
花色が変化したトルコギキョウが、イオンビームを照射する前の当代と比較して、花弁が変形した形質、花弁数が増加した形質、花弁に縦縞の模様が入った形質、花弁に斑が入った形質、花弁に不均一な模様が入った形質、および単色系から二色系の花に変化した形質からなる群から選択される形質をさらに有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により作出された、トルコギキョウ。
【請求項８】
請求項７に記載のトルコギキョウの後代。
【国際調査報告】
2009119914.tif 000083
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