(57)【要約】  本発明は、肝疾患、特にＨＣＣの新しい診断方法の提供を目的とする。本発明者らは血清中糖鎖発現量の定量的発現プロファイルをもとに各罹患状態との関連性を解析して、肝疾患の進行に伴って変動する糖鎖を見出し、新たなバイオマーカーとなる血清糖鎖を提供した。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ２、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１７、Ｇ１８、Ｇ２０、Ｇ２１、Ｇ２３、Ｇ２６、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３１、Ｇ３３、Ｇ３７、Ｇ４５、およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、肝疾患の診断方法。
【請求項２】
Ｇ２、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１５、Ｇ１７、Ｇ２１、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３７、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、肝細胞癌の診断方法。
【請求項３】
Ｇ３７および／またはＧ５６の糖鎖の発現量を指標とする、請求項２記載の診断方法。
【請求項４】
Ｇ２、Ｇ２０、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、肝細胞癌の予後を予測する方法。
【請求項５】
Ｇ２０および／またはＧ２６の糖鎖の発現量を指標とする、肝細胞癌の早期診断方法。
【請求項６】
Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、肝障害の診断方法。
【請求項７】
Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、良性肝疾患の診断方法。
【請求項８】
糖鎖の血清中発現量を指標とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ｇ２、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１７、Ｇ１８、Ｇ２０、Ｇ２１、Ｇ２３、Ｇ２６、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３１、Ｇ３３、Ｇ３７、Ｇ４５、およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の肝疾患マーカーとしての使用。
【請求項１０】
Ｇ２、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１５、Ｇ１７、Ｇ２１、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３７、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、肝細胞癌マーカーとしての使用。
【請求項１１】
Ｇ３７および／またはＧ５６の糖鎖の、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
Ｇ２、Ｇ２０、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、肝細胞癌の予後予測のためのマーカーとしての使用。
【請求項１３】
Ｇ２０および／またはＧ２６の糖鎖の、肝細胞癌の早期診断のためのマーカーとしての使用。
【請求項１４】
Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、肝障害マーカーとしての使用。
【請求項１５】
Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、良性肝疾患マーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖分析を用いた肝疾患の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界的に最も多い癌の１つで、毎年約１００万人が本疾患で死亡している。ＨＣＣの多くはウイルス性肝炎から発生する。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のＨＣＣが７０〜８０％で最多であり、次いでＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来のＨＣＣが１０％〜２０％と多い。その他、ＢＣ重複感染型と非Ｂ非Ｃ型が数％ずつある。日本や西欧ではＣ型肝炎が原因として多いが、その他のアジアやアフリカではＢ型肝炎が多い。中国では１９９０年以降、２番目に死亡者の多い癌となっている。ＨＣＣは多くの場合は慢性肝炎や肝硬変を持つ患者におこり、症状や兆候は肝硬変の進行と類似しているために発見は難しい。【０００３】
現在広く利用されているＨＣＣマーカーは癌胎児性抗原のＡＦＰ（アルファフェトプロテイン）である。20 mg/mlまたはそれ以上のＡＦＰレベルが診断に役立つと考えるのであれば、ＨＣＣ症例の６０〜８０％が検出されるが、小さい腫瘍の場合には、その感度は著しく低い（４０％）（後記非特許文献１参照）。ＨＣＣマーカーとしてのＡＦＰ使用に伴うもう１つの問題は、特異性に欠けることである。例えば、ＡＦＰの有意な上昇（20〜200 ng/ml）は、かなりの数の慢性肝疾患患者で見られる（後記非特許文献２参照）。また、慢性肝炎患者の１５〜５８％、および硬変患者の１１〜４７％が、高い血清ＡＦＰを有することが報告されている（後記非特許文献３参照）。従って、ＨＣＣ患者および硬変患者の血清ＡＦＰレベルが重複することは珍しくなく、これが、ＡＦＰアッセイの結果の解釈を混乱させる。結果として、ＨＣＣの危険に曝されている患者に関する調査ツールとしてのＡＦＰ測定の有用性は疑問視されてきた（後記非特許文献４参照）。
そこで、ＡＦＰの測定が正当であると判断される唯一の環境は、画像技術に基づいた初期診断の確認のためであることが提唱されてきた（後記非特許文献４参照）。この数年間で、幾つかの新しい潜在的なＨＣＣ用マーカーが研究されたが、ＡＦＰより明らかに優れたものは発見されていない（後記非特許文献５参照）。【０００４】
超音波検査法であろうと、ＣＴスキャンまたはＭＲＩであろうと、画像法による小病変の診断は、比較的不正確である（後記非特許文献６、７参照）。特に、放射線学的にＨＣＣによく似ている可能性がある二つの病変は、硬変性小結節および異形成小結節である。小病変の肝生検もまた、感度または特異性が不十分である（後記非特許文献８参照）。針生検を用いても、この手技で通常得られる検体の量が限られているため、十分に分化した癌を、良性病変と識別することは困難かもしれない（後記非特許文献９参照）。従って、難しい症例でＨＣＣを良性の肝病変と識別するための適当な分子マーカーが、画像技術の進歩にもかかわらず依然として必要である。
また、近年超音波検査の進歩により小さい段階で癌がみつかるようになってきているが、こうした高分化の癌はＡＦＰ陰性のケースが多いので、新しい血清マーカーの開発が求められている。【０００５】
上述のように、血清ＡＦＰはＨＣＣおよびヨークサック腫瘍に特異性の高い腫瘍マーカーとして診断に用いられているが、慢性肝炎、肝硬変等の良性肝疾患でも高値となるため、血清ＡＦＰ値のみを指標とした場合、良性疾患とＨＣＣの鑑別は困難である。そこで近年、ＡＦＰの糖鎖構造の癌性変化を、レクチン親和性電気泳動と抗体親和転写法と組み合わせたレンズマメレクチン−Ａ（ＬＣＡ−Ａ）反応性によるＡＦＰ−Ｌ３分画比を測定することにより、ＨＣＣと良性肝疾患の鑑別等に用いる診断法が開発された。従来、ＨＣＣの診断として行われてきた、超音波検査やＸ線ＣＴ等の各種画像診断に加えてＡＦＰ−Ｌ３分画比の測定を加えることにより、ＨＣＣと良性肝疾患との鑑別、ＨＣＣの早期診断およびＨＣＣの治療後の予後管理に有用であることが示唆されているものの、診断項目が多岐にわたり、ＡＦＰ−Ｌ３分画比による診断自身の感度および特異性も未だ十分とは言えず、新しい血清マーカーの開発が求められている現状に変わりはない。【０００６】
【非特許文献１】トレヴィザーニ(Trevisani)ら、  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．，  ３４：５７０−５７５  （２００１年）。
【非特許文献２】コリヤー(Collier)ら、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，４：３１−４１（１９９８年）。
【非特許文献３】タケタ(Taketa)，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  １２：１４２０−１４３２（１９９０年）。
【非特許文献４】シャーマン(Sherman)，  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．，３４：６０３−６０５（２００１年）。
【非特許文献５】スカウ(Scow)ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１：１２４９−１２６３（２００１年）。
【非特許文献６】フォング(Fong)ら著、Cancer ofthe Liver and Binary Tree in Cancer:Principles & Practice Oncology、第６版、１１６２−１１９９（２００１年）。
【非特許文献７】ムラカミ(Murakami)ら著、Detectability of hypervascular hepatocellular carcinomaby arterial phase images of MR and spiral CT、  Ａｃｔａ  Ｒａｄｉｏｌ．，３６：３７２−３７６（１９９５年）。
【非特許文献８】レビー(Levy)ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．，２３４：２０６−２０９（２００１年）。
【非特許文献９】フォング(Fong)ら著、肝癌および癌における二分木原理および実践腫瘍学(Cancer of the Liver and Binary Tree in Cancer:Principles & Practice Oncology)、第６版、１１６２−１１９９（２００１年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の血清ＡＦＰによる診断では、慢性肝炎・肝硬変・妊娠などにおいてもその値が上昇するため、肝癌に対する特異性が低く偽陽性が検出されやすい。より鋭敏にかつ特異性および感度の高い早期診断の可能なあるいは、予後予測可能な新たな血清マーカーを開発することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、既に開発された高速網羅的糖鎖エンリッチ技術〔西村等(Nishimura, S, K Niikura, M Kurogochi, T Matsushita, M Fumoto, H Hinou, R Kamitani, H Nakagawa, K Deguchi, N Miura, K Monde, and H Kondo)「ハイスループット・プロテイングライコミクス：化学選択的グリコブロッティングとマルディトフ／トフ質量分析との併用」 “High-Throughput Protein Glycomics: Combined Use of Chemoselective Glycoblotting and Maldi-Tof/Tof Mass Spectrometry.” Angew Chem Int Ed Engl 44, no. 1 (2004): 91-96〕に基づいて調製された血清中糖鎖にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ等の質量分析技術を適用し、各罹患状態の患者血清を大規模解析した。そして各患者の血清中糖鎖の定量的発現プロファイルをもとに各罹患状態を結びつけ、変動する糖鎖を見出し、新たなバイオマーカーとなる血清糖鎖あるいは、変動する糖鎖を有する糖タンパク質あるいは変動する糖鎖の生合成経路に関わる分子群を同定し、感度および特異度の高い診断方法を確立するに至った。
本発明は、（１）Ｇ２、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１７、Ｇ１８、Ｇ２０、Ｇ２１、Ｇ２３、Ｇ２６、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３１、Ｇ３３、Ｇ３７、Ｇ４５、およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、肝疾患の診断方法に関する。さらに詳しくは以下の（２）〜（２４）に関する。
（２）Ｇ２、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１５、Ｇ１７、Ｇ２１、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３７、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、ＨＣＣの診断方法。
（３）Ｇ３７および／またはＧ５６の糖鎖の発現量を指標とする、（２）記載の診断方法。
（４）Ｇ２、Ｇ２０、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、ＨＣＣの予後を予測する方法。
（５）Ｇ２０および／またはＧ２６の糖鎖の発現量を指標とする、ＨＣＣの早期診断方法。
（６）Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、肝障害の診断方法。
（７）Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、良性肝疾患の診断方法。
（８）糖鎖の血清中発現量を指標とする、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）生体試料に含まれる糖鎖を解析し、Ｇ２、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１７、Ｇ１８、Ｇ２０、Ｇ２１、Ｇ２３、Ｇ２６、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３１、Ｇ３３、Ｇ３７、Ｇ４５、およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として判定することを特徴とする、肝疾患の診断方法。
（１０）生体試料に含まれる糖鎖を解析し、Ｇ２、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１５、Ｇ１７、Ｇ２１、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３７、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として判定することを特徴とする、ＨＣＣの診断方法。
（１１）Ｇ３７および／またはＧ５６の糖鎖の発現量を指標とする、（１０）記載の診断方法。
（１２）生体試料に含まれる糖鎖を解析し、Ｇ２、Ｇ２０、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として判定することを特徴とする、ＨＣＣの予後を予測する方法。
（１３）生体試料に含まれる糖鎖を解析し、Ｇ２０および／またはＧ２６の糖鎖の発現量を指標として判定することを特徴とする、ＨＣＣの早期診断方法。
（１４）生体試料に含まれる糖鎖を解析し、Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として判定することを特徴とする、肝障害の診断方法。
（１５）生体試料に含まれる糖鎖を解析し、Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として判定することを特徴とする、良性肝疾患の診断方法。
（１６）生体試料が血液である、（９）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）生体試料が血清である、（９）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１８）Ｇ２、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１７、Ｇ１８、Ｇ２０、Ｇ２１、Ｇ２３、Ｇ２６、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３１、Ｇ３３、Ｇ３７、Ｇ４５、およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の肝疾患マーカーとしての使用。
（１９）Ｇ２、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１５、Ｇ１７、Ｇ２１、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３７、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、ＨＣＣマーカーとしての使用。
（２０）Ｇ３７および／またはＧ５６の糖鎖の、（１９）記載の使用。
（２１）Ｇ２、Ｇ２０、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、ＨＣＣの予後予測のためのマーカーとしての使用。
（２２）Ｇ２０および／またはＧ２６の糖鎖の、ＨＣＣの早期診断のためのマーカーとしての使用。
（２３）Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、肝障害マーカーとしての使用。
（２４）Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、良性肝疾患マーカーとしての使用。
（２５）
（ｉ）生体試料に含まれる糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人におけるＧ２、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１７、Ｇ１８、Ｇ２０、Ｇ２１、Ｇ２３、Ｇ２６、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３１、Ｇ３３、Ｇ３７、Ｇ４５、およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量と被験サンプルの糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含する肝疾患の診断方法。
（２６）
（ｉ）生体試料に含まれる糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人におけるＧ２、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１５、Ｇ１７、Ｇ２１、Ｇ２７、Ｇ３０、Ｇ３７、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量と被験サンプルの糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含するＨＣＣの診断方法。
（２７）
Ｇ３７および／またはＧ５６の糖鎖の発現量を比較する、（２６）記載の診断方法。
（２８）
（ｉ）生体試料に含まれる糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人におけるＧ２、Ｇ２０、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量と被験サンプルの糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含するＨＣＣの予後を予測する方法。
（２９）
（ｉ）生体試料に含まれる糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人におけるＧ２０および／またはＧ２６の糖鎖の発現量と被験サンプルの糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含するＨＣＣの早期診断方法。
（３０）
（ｉ）生体試料に含まれる糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人におけるＧ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量と被験サンプルの糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含する肝障害の診断方法。
（３１）
（ｉ）生体試料に含まれる糖鎖を解析する工程、
（ii）健常人におけるＧ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１およびＧ３３よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量と被験サンプルの糖鎖の発現量を比較する工程、
を包含する良性肝疾患の診断方法。
（３２）糖鎖の血清中発現量を指標とする、（２５）〜（３１）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、肝疾患患者のＨＣＣの担癌状態を良性肝疾患から識別することができる。特に本法の優れた点として、一度の測定で得られた解析結果から、診断に用いる項目（糖鎖の種類）を任意に選べることが挙げられ、いくつも検査を行い、組み合わせる必要がないので、被験者の負担も極めて少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明によれば、被験者血清からグリコブロッティング(Glycoblotting)法により血中の全Ｎ−型糖鎖を回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより定量的プロファイルを取得する。このとき、内部標準として既知量のオリゴ糖を添加しておけば、そのスペクトル上の面積より、他の血清由来糖鎖量を容易に算出できる。検出されるオリゴ糖は例えば表１に示すとおりである。【００１１】
【表１】
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（表中、Manはマンノース、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン、Hexはヘキソース、HexNAcはＮ−アセチルヘキソサミン、NeuAcはＮ−アセチルノイラミン酸を表す。）
その後、一つまたは二つ以上の糖鎖発現量または糖鎖発現量の増減から対応する肝疾患の罹患を推定し、肝疾患の診断および予後の管理・予測に有用な方法を得ることができる。
例えば、Ｇ５６、Ｇ３７、Ｇ２、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１５、Ｇ１７、Ｇ２１、Ｇ２７、Ｇ３０およびＧ４５の各糖鎖はＨＣＣのみで発現が増える傾向にある。中でも、Ｇ５６糖鎖の発現量は肝線維化には全く依存せず、肝炎の有無にも影響されないのでこれをマーカーとして用いればＨＣＣ群を有意に識別することができる（後記実施例１参照）。また、複数の糖鎖発現量の変動を組み合わせると診断効率をさらに上げることができ、例えばＧ５６とＧ３７の両糖鎖を併せて用いることでより正確なＨＣＣ診断が可能となる。【００１２】
肝障害によって変動するマーカーとしてはＧ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１、およびＧ３３の各糖鎖が挙げられる。これら糖鎖の発現量は癌の存在に影響を受けずに変動するので、良性肝疾患の段階での診断に有望なマーカーであると考えられる（後記実施例２参照）。中でも、Ｇ８糖鎖については有意差が大きいことから良性肝疾患の段階での診断に好ましいマーカーであると考えられる。【００１３】
肝疾患の進行に伴ってその発現が高くなる糖鎖も存在する。Ｇ２０およびＧ２６の各糖鎖は肝炎において発現が高くなり、担癌状態においてさらにその発現が上昇する傾向が認められるので、肝障害の段階での診断に有望なマーカーであると考えられる。特にＧ２０糖鎖はそのような傾向が顕著であって、良性肝疾患から担癌状態へと進行する場合が少なからずあることを考えると極めて有意義である（後記実施例３参照）。さらには、上記Ｇ８糖鎖等の良性肝疾患の段階でのマーカーと併せて比較することにより、ＨＣＣの早期診断に有効性を見いだせる可能性がある。【００１４】
一方、Ｇ４９およびＧ５４のように肝障害により減少する糖鎖も存在する。これらも肝障害のマーカーとして有用である。
また、Ｇ５６、Ｇ２、Ｇ４５およびＧ２０の各糖鎖はその値が高いほど生存率が低い。従って、これら糖鎖は予後管理のためのマーカーとして有効である。好ましくはＧ２０、Ｇ４５およびＧ５６よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量をマーカーとして利用すれば、ＨＣＣの予後を予測することが可能となる（後記実施例４参照）。さらに好ましくはＧ５６糖鎖の発現量によって予後予測を行うことができる。
以下に実施例を記載して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
ＨＣＣ患者および／またはＢ型若しくはＣ型肝炎患者、並びに健常人計２１６名の血清からグリコブロッティング(Glycoblotting)法により血中の全Ｎ−型糖鎖を回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより定量的プロファイルを取得した。内部標準として加えた既知量のオリゴ糖のスペクトル上の面積より、表１の各血清由来糖鎖量を算出した。
ここで用いた患者血清の内訳は下表２および３の通りである。
【表２】
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【表３】
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次いで、各検体における各糖鎖の定量値を糖鎖の発現量とし、肝炎や肝線維化による影響を受けず、肝癌のみで変化する糖鎖の存在について統計学的手法により検討した結果、Ｇ５６、Ｇ３７、Ｇ２、Ｇ９、Ｇ１２、Ｇ１５、Ｇ１７、Ｇ２１、Ｇ２７、Ｇ３０およびＧ４５の糖鎖においてＨＣＣのみで発現が増える傾向を見出した。その中でも特に顕著な有意差が確認されたＧ５６およびＧ３７の糖鎖について箱ひげ図を示す（図１、２）。【００１６】
Ｇ５６糖鎖の発現量は肝線維化には全く依存せず、肝炎の有無にも影響されなかった。一方で、ＨＣＣ担癌患者の群においてのみ特異的にその発現が上昇し、健常人と良性肝疾患の群からＨＣＣ群は有意に識別された。Ｇ５６糖鎖のＲＯＣ曲線を図３（左図）に示す。閾値を２．４μＭとした時の感度が８０％、特異度が８５％と非常に優れた診断法となる可能性が示唆された。図３（右図）にはＧ３７糖鎖のＲＯＣ曲線を示す。閾値２．３μＭにおいて有効な診断が得られるとの結果が示されている。Ｇ５６およびＧ３７の各糖鎖はそれぞれ単独でも診断に有効であるが、両糖鎖による診断を組み合わせることによってさらに診断誤差を減らすことができるものと考えられる。
【実施例２】
【００１７】
本例では、癌の存在に影響を受けずに肝障害によって変動する糖鎖群の探索を行った。その結果、Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１８、Ｇ２３、Ｇ３１、およびＧ３３の各糖鎖にそのような傾向が見出された。Ｇ８およびＧ３３の各糖鎖の結果を図４および図５にそれぞれ示す。これらは、良性肝疾患の段階での診断に有望なマーカー候補であると考えられる。
【実施例３】
【００１８】
本例では、肝炎において発現が高くなり、担癌状態においてさらにその発現が上昇する糖鎖の同定を行った。肝疾患の進行に伴ってその発現が高くなる傾向を示すもので、Ｇ２０およびＧ２６糖鎖に、その傾向が見出された。Ｇ２０糖鎖の結果を図６に示す。これらは肝障害の段階での診断に有望なマーカー候補であると考えられる。
【実施例４】
【００１９】
各糖鎖による生存率を評価したところ、Ｇ２０、Ｇ４５およびＧ５６の各糖鎖はその値が高いほど予後が悪いことが判明した。各糖鎖について、生存率およびログランク検定を用いた有効性の確認結果を図７〜図９にそれぞれ示す。いずれも各糖鎖の発現が高い患者ほど予後不良であることが明らかとなった。また、ログランク検定から、偶然による差ではないことが明らかで、これら糖鎖は予後予測にも有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明によれば、肝疾患患者のＨＣＣの担癌状態を良性肝疾患から識別することができ、良性肝疾患の有無にかかわらず、ＨＣＣを有意に識別し診断することが可能となる。また、肝疾患患者の予後を予測することが可能となる。その結果、適確な医療処置を施すことで、治療効果および予後の改善に貢献することが大いに期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｇ５６糖鎖発現量と肝線維化または肝疾患との相関関係を示す図である。Ａ）は、各線維化のスコア毎に、Ｂ）は肝炎なしおよび肝炎ありの各群毎に、そしてＣ）は健常者、肝炎、およびＨＣＣの各群毎にＧ５６糖鎖発現量をプロットした。
【図２】Ｇ３７糖鎖発現量と肝線維化または肝疾患との相関関係を示す図である。Ａ）は、線維化の各スコア毎に、Ｂ）は肝炎なしおよび肝炎ありの各群毎に、そしてＣ）は健常者、肝炎、およびＨＣＣの各群毎にＧ３７糖鎖発現量をプロットした。
【図３】Ｇ５６糖鎖（左図）およびＧ３７糖鎖（右図）について、ＲＯＣ（受信者動作特性：Receiver Operation Characteristic）曲線を示す。縦軸は真陽性率、横軸は偽陽性率である。
【図４】Ｇ８糖鎖発現量と肝線維化または肝疾患との相関関係を示す図である。Ａ）は、線維化の各スコア毎に、Ｂ）は肝炎なしおよび肝炎ありの各群毎に、そしてＣ）は健常者、肝炎、およびＨＣＣの各群毎にＧ８糖鎖発現量をプロットした。
【図５】Ｇ３３糖鎖発現量と肝線維化または肝疾患との相関関係を示す図である。Ａ）は、線維化の各スコア毎に、Ｂ）は肝炎なしおよび肝炎ありの各群毎に、そしてＣ）は健常者、肝炎、およびＨＣＣの各群毎にＧ３３糖鎖発現量をプロットした。
【図６】Ｇ２０糖鎖発現量と肝線維化または肝疾患との相関関係を示す図である。Ａ）は、線維化の各スコア毎に、Ｂ）は肝炎なしおよび肝炎ありの各群毎に、そしてＣ）は健常者、肝炎、およびＨＣＣの各群毎にＧ２０糖鎖発現量をプロットした。
【図７】Ｇ２０糖鎖発現量による生存率評価であり、Ｇ２０糖鎖発現量分布を発現量の少ない側から６３パーセントタイルで二群に分け両群の全生存率をそれぞれ示した。下側の折れ線が糖鎖発現量の高い（６３パーセントタイル以上の）群である。有意差についてはログランク検定により確認した。
【図８】Ｇ５６糖鎖発現量による生存率評価であり、Ｇ５６糖鎖発現量分布を発現量の少ない側から７６パーセントタイルで二群に分け両群の全生存率をそれぞれ示した。下側の折れ線が糖鎖発現量の高い（７６パーセントタイル以上の）群である。有意差についてはログランク検定により確認した。
【図９】Ｇ４５糖鎖発現量による生存率評価であり、Ｇ４５糖鎖発現量分布を発現量の少ない側から７６パーセントタイルで二群に分け両群の全生存率をそれぞれ示した。下側の折れ線が糖鎖発現量の高い（７６パーセントタイル以上の）群である。有意差についてはログランク検定により確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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