(57)【要約】  組織透過性に優れた近赤外領域の波長を利用可能な活性酸素測定用試薬であって、(i)  第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基とが結合しており、(ii)  第一のシアニン化合物残基は活性酸素種と容易に反応して分解する性質を有し、(iii)  第二のシアニン化合物残基は活性酸素種に対して第一のシアニン化合物残基と同等以上に安定であり、第一のシアニン化合物残基が第二のシアニン化合物残基に対して消光団として作用する試薬。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性酸素測定用試薬であって、以下の(i)〜(iii)の特徴を有する第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基が結合した化合物を含む試薬。
(i)  第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基とが、第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基のそれぞれに置換した置換基で直接結合しているか、又は第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基がリンカーを介して結合されており、
(ii)  第一のシアニン化合物残基は活性酸素種と容易に反応して分解する性質を有しており、
(iii)  第二のシアニン化合物残基は活性酸素種に対して第一のシアニン化合物残基と同等以上に安定であり、第一のシアニン化合物残基が第二のシアニン化合物残基に対して消光団として作用する性質を有している。
【請求項２】
第一のシアニン化合物残基の共役ポリメチン鎖の１つの炭素に-S-基が置換している請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
第二のシアニン化合物残基の含窒素複素環部位に１つ又は２つのスルホ基を有している請求項1又は２に記載の試薬
【請求項４】
第一のシアニン化合物残基が蛍光団中に下記の部分構造：
【化１】
2009107769.tif 000012
を有するシアニン化合物残基である請求項１ないし３に記載の試薬。
【請求項５】
第二のシアニン化合物残基が近赤外領域に極大蛍光波長を有しており、かつ蛍光量子収率が0.03以上である請求項１ないし４に記載の試薬。
【請求項６】
第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基をリンカーを介して結合させた請求項１ないし５に記載のいずれか1項に記載の試薬。
【請求項７】
第二のシアニン化合物残基がカルボキシ基又はスルホ基でリンカーと結合する請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
第一のシアニン化合物残基及び第二のシアニン化合物残基がテトラメチルインドカルボシアニン化合物残基である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項９】
下記の式で表される活性酸素測定用蛍光プローブ。
【化２】
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【請求項１０】
活性酸素種の測定方法であって、下記の工程：(A)請求項１に記載の試薬と活性酸素種とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した請求項１に記載の試薬由来の分解物の蛍光を測定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は2個のシアニン化合物残基をリンカーを介して結合させた活性酸素測定用試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素種は生体において様々な重要な役割を演じていることが報告されている。例えば、一酸化窒素は情報伝達のセカンドメッセンジャーとして作用しており、循環器系において血圧の制御を行うなど多様な生理作用を発揮していることが知られている。スーパーオキサイドアニオンや過酸化水素は免疫系などにおいて重要な生理作用を発揮していることが明らかにされている。ヒドロキシルラジカルは血管障害や虚血後の脳障害、あるいは紫外線によるDNA修飾に関わる知見が多数報告され、病因・病態との関係で特に障害性が高い活性酸素種と考えられている。【０００３】
また、一酸化窒素とスーパーオキサイドアニオンが反応することにより生成するパーオキシナイトライト(ONOO-)は芳香環のニトロ化が可能であるなど高い酸化能を有しており、チロシンのニトロ化を効率よく行うなど、特徴的な反応性を有する。最近の報告によれば、チロシンがニトロ化されることにより、チロシンのリン酸化が阻害され、MAPK、PI3K/Aktカスケードなどの情報伝達に重要な影響を及ぼすことが指摘されている。さらに、近年、次亜塩素酸イオンの生体内での作用が注目されている。好中球による殺菌作用は主に次亜塩素酸イオンによると考えられており、アズール顆粒中のミエロペルオキシダーゼにより、過酸化水素と塩化物イオンから次亜塩素酸イオンが生成することがイン・ビトロで示された（Klebanoff, S. J. et al., The Neutrophils: Function and Clinical Disorders, North-Holland Publishing Company, Amsterdam, Netherlands, 1978）。また、次亜塩素酸イオンは血小板活性化因子に誘導される微小循環障害の血管内皮表面の損傷において重要な役割を果たすとの報告がある（Suematsu, M., et al., J. Biochem., 106, pp.355-360, 1989）。【０００４】
このように活性酸素種は炎症、老化、動脈硬化等の各種疾患や情報伝達に関与していることから、種々の活性酸素種の生体内での役割の解明の重要性が高まっており、生体内の活性酸素種を測定するため、いくつかの蛍光プローブが提案されている。例えば、国際公開WO 01/64664の活性酸素蛍光プローブ（J. Biol. Chem., 278, pp.3170-3175, 2003）、国際公開WO99/51586、及び国際公開WO02/18362に記載の一重項酸素蛍光プローブ、特開平10-226688、及び国際公開WO 2004/76466に記載の一酸化窒素蛍光プローブ、H2DCFDA（2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、モレキュラー・プローブス社、カタログ番号D-399）などが知られている。また、ウミホタルルシフェリン誘導体MCLAを用いて化学発光法によってスーパーオキサイドアニオンを測定する方法（Clinica Chimica Acta, 179, pp.177-182, 1989）、一重項酸素を測定する方法（J. Biolumin. Chemilumin., 6, pp.69-72, 1991）、及びルシフェリン誘導体を活性酸素種に対する生物発光プローブとして使用した活性酸素種の測定方法（国際公開WO2007/111345）などが提案されている。しかしながら、これらの蛍光プローブの多くは組織透過性の低い可視光領域に吸収及び蛍光（発光）波長を有しており、イン・ビボにおいて活性酸素種を可視化できるプローブではない。【０００５】
一方、近年、生命化学研究において非侵襲的に生体現象をイメージングするための蛍光プローブとして650nm〜950nm付近の近赤外領域の吸収・蛍光波長を利用したイメージング技術が注目されている。例えば、カルボシアニン系色素は、生体分子による吸収が比較的少ない650nm〜950nm付近の近赤外領域に極大吸収波長及び極大蛍光波長を持つため、生体組織の深部まで透過できる波長の光を使用できる利点を有する。加えて、近赤外領域は生体成分からの自家蛍光も少ない。すなわち、カルボシアニン系色素の特性はイン・ビボイメージングにとって好適である。最近、生体分子を直接蛍光ラベルするためのシアニン系色素に加え、生体分子と特異的に反応することで蛍光強度が変化するカルボシアニン色素が開発された。一つはカルシウムイオンに対する近赤外蛍光プローブであり（Ozmen, B., et al., Tetrahedron Lett., 41, pp.9185-9188, 2000）、もう一つは一酸化窒素（NO）に対する近赤外蛍光プローブである（国際公開WO2005/080331）。これらの蛍光プローブは生体分子との特異的な反応の前後で励起/蛍光波長が変化することなく、蛍光強度のみが変化するプローブである。【０００６】
また、本発明者は、レシオ法により亜鉛イオン濃度がイメージング可能なトリカルボシアニン系蛍光プローブ（国際公開WO2005/080331）およびレシオ法によりpHがイメージング可能なトリカルボシアニン系蛍光プローブ（国際公開WO2008/099914）を提案している。これらは亜鉛イオン濃度、pH変化に応じて励起波長が移動するレシオ蛍光プローブである。さらに本発明者らは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）による蛍光変化を利用したpH測定用のトリカルボシアニン系蛍光プローブも提案している（国際公開WO2008/108074）。これらのレシオ法による蛍光プローブは、プローブ濃度、光源強度、細胞の大きさなどに関係なく測定対象を定量的に測定可能である利点を有する。さらに様々な酵素に対するトリカルボシアニン系色素を利用したプローブも提案されている。例えば、国際公開WO99/58161に記載のプロテアーゼに対する蛍光プローブ、J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4158-4159に記載のβ-ラクタマーゼに対する蛍光プローブ、Nat. Chem. Biol. 2007, 10, 668-677に記載のシステインプロテアーゼに対する蛍光プローブなどがある。これらの様々な酵素に対する蛍光プローブはリンカーを介して蛍光色素と消光団が結合しており、酵素反応によって蛍光色素と消光団の結合が切断され活性な蛍光色素が形成されるものである。しかしながら、カルボシアニン色素を活性酸素種に対する蛍光プローブとして使用する方法についてはNOに対する蛍光プローブ以外はほとんど知られていなかった。
【特許文献１】国際公開WO01/64664
【特許文献２】国際公開WO99/51586
【特許文献３】国際公開WO02/18362
【特許文献４】特開平10-226688号公報
【特許文献５】国際公開WO2004/76466
【特許文献６】国際公開WO2007/111345
【特許文献７】国際公開WO2005/080331
【特許文献８】国際公開WO2008/099914
【特許文献９】国際公開WO2008/108074
【特許文献１０】国際公開WO99/58161
【非特許文献１】Clinica Chimica Acta, 179, pp.177-182, 1989
【非特許文献２】J. Biolumin. Chemilumin., 6, pp.69-72, 1991
【非特許文献３】J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4158-4159
【非特許文献４】Nat. Chem. Biol. 2007, 10, 668-677
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は活性酸素測定用試薬を提供することにあり、より詳しくは、組織透過性に優れた近赤外領域の波長を利用可能な蛍光プローブとしての活性酸素測定用試薬を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
シアニン化合物は近赤外領域の蛍光測定で広く利用されている代表的な色素である。本発明者らは、シアニン化合物を利用して近赤外領域において活性酸素種を測定可能なプローブを提供すべく鋭意研究を行った。シアニン化合物は長い共役ポリメチン鎖を有していることから、活性酸素種と該共役ポリメチン鎖が容易に反応して分解し、近赤外領域における吸収及び蛍光を失うという性質を有している。そこで、この性質を利用して、長い共役ポリメチン鎖を有する第一のシアニン化合物残基を活性酸素種の捕捉（反応）部位として、活性酸素種に対して安定な第二のシアニン化合物残基と組み合わせ、第一のシアニン化合物残基を第二のシアニン化合物残基に対して消光団として作用させるように活性酸素測定用試薬を設計した。この試薬を活性酸素測定用の蛍光プローブとして使用したところ、第一のシアニン化合物残基が活性酸素種と反応して分解することにより、第二のシアニン化合物残基の蛍光が回復して近赤外領域の光照射により強い蛍光を発することが確認され、活性酸素測定用試薬として極めて優れた性質を有していることが確認できた。本発明は上記の知見を基にして完成された。【０００９】
すなわち、本発明により、活性酸素測定用試薬であって、以下の(i)〜(iii)の特徴を有する第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基が結合した化合物を含む試薬が提供される。
(i)  第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基とが、第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基のそれぞれに置換した置換基で直接結合しているか、又は第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基がリンカーを介して結合されており、
(ii)  第一のシアニン化合物残基は活性酸素種と容易に反応して分解する性質を有しており、
(iii)  第二のシアニン化合物残基は活性酸素種に対して第一のシアニン化合物残基と同等以上に安定であり、第一のシアニン化合物残基が第二のシアニン化合物残基に対して消光団として作用する性質を有している。【００１０】
この発明の好ましい態様によれば、上記の試薬として、第一のシアニン化合物残基の共役ポリメチン鎖の１つの炭素に-S-基が置換しており、第二のシアニン化合物残基の含窒素複素環部位に１つ又は２つのスルホ基を有している試薬が提供される。【００１１】
さらに、この発明の好ましい態様によれば、第一のシアニン化合物残基が蛍光団中に下記の部分構造：
【化１】
2009107769.tif 000003
を有するシアニン化合物残基である上記の試薬；第二のシアニン化合物残基が近赤外領域、好ましくは650 nm以上に極大蛍光波長を有しており、かつ蛍光量子収率が0.03以上である上記の試薬；第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基とをリンカーを介して結合させた上記の試薬；リンカーが第二のシアニン化合物残基のカルボキシ基又はスルホ基で結合する上記の試薬；第一のシアニン化合物残基及び第二のシアニン化合物残基がテトラメチルインドカルボシアニン化合物残基である上記の試薬；リンカーの連結原子数が4から10個である上記の試薬；が提供される。【００１２】
上記発明の特に好ましい態様として、下記の式：
【化２】
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で表される活性酸素測定用蛍光プローブが上記の試薬として提供される。【００１３】
別の観点からは、本発明により、活性酸素種の測定方法であって、下記の工程：(A)上記の試薬と活性酸素種とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した上記試薬由来の分解物の蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により提供される活性酸素測定用試薬は、それ自体は極僅かな蛍光性を有し、多様な活性酸素種と反応した後に近赤外領域で強い蛍光を発する性質を有していることから、細胞や組織に傷害を与えることなしにイン・ビボにおいて活性酸素種を高い感度で測定することができるという優れた特徴を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例の例１で得られた化合物2（第二のシアニン化合物残基を構成するシアニン化合物）及び化合物3（第一のシアニン化合物残基を構成するシアニン化合物）のUVスペクトル及び蛍光スペクトルを示した図である。
【図２】Cy5、Cy7、実施例の例１で得られた化合物2及び実施例の例１で得られた化合物3をヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、スーパーオキサイドアニオンと反応させて極大吸収波長における吸光度変化を測定した結果を示した図である。
【図３】本発明の活性酸素測定用試薬と各種の活性酸素種とを反応させた結果を示した図である。図中、(a)、(b)、（c）、(d)、（e）、及び(f)はそれぞれヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、スーパーオキサイドアニオン、一重項酸素、過酸化水素を示す。
【図４】本発明の活性酸素測定用試薬を用い、PMA添加によってHL60細胞が産生するスーパーオキサイドアニオンを測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の試薬において、第一のシアニン化合物残基としては活性酸素種と容易に反応して分解する性質を有し、かつ第二のシアニン化合物残基の消光団として機能するシアニン化合物残基を選択する必要がある。本明細書において「シアニン化合物残基」とは、シアニン化合物（例えば、カルボシアニン化合物、チアカルボシアニン化合物、テトラメチルインドカルボシアニン化合物；以下、これらを総称してカルボシアニン化合物と呼ぶ場合がある）の1つの水素原子を除いて生成する一価の基を意味する。活性酸素種と容易に反応して分解する性質については、例えば、活性酸素種の１つであるヒドロキシルラジカル（・OH）を生成する標準的な方法として広く用いられているフェントン反応により色素が分解する度合いに基づいて判定することができる。例えば、10μMのシアニン化合物のリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4)をフラスコ内で激しく攪拌しながら1 M 過酸化水素（H2O2）水溶液を終濃度1 mMとなるように加え、10 mM 鉄(II)水溶液を終濃度50μMとなるように滴下する。シアニン化合物の極大吸収波長における吸光度をこの操作を行う前後で比較し、その減少の有無で活性酸素種に対する反応性を定義することができる。例えば、このフェントン反応により、37℃において1分以内に20％以上分解する場合に活性酸素種と容易に反応して分解すると判定することができる。第一のシアニン化合物残基は、活性酸素種に対して第二のシアニン化合物残基と同等か、又はそれ以上の反応性を有していればよく、第二のシアニン化合物残基は、実質的に活性酸素種に対して安定であることが好ましい。ここで、活性酸素種に対して実質的に安定とは、活性酸素種による反応（分解や修飾）を全く受けない場合だけでなく、活性酸素種による反応を受けた場合でも、第二のシアニン残基の蛍光特性が、第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基の関係において変化しないことを指す。【００１７】
第一のシアニン化合物残基としては、例えば、上記［化１］に示した部分構造を有するシアニン化合物残基が好ましい。より具体的には、例えば、下記の一般式(I)：
【化３】
2009107769.tif 000005
〔式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、及びR8はそれぞれ独立に水素原子、スルホ基、ホスホ基、ニトロ基、ハロゲン原子、又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示し；R9及びR10はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基を示し；R11は水素原子又は置換基を有していてもよいC1-18アルキル基を示す；Zは酸素原子、硫黄原子、又は-N(R12)-(式中、R12は水素原子又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す。ただし、Zが-N(R12)-の場合、R11とR12は、活性酸素種と反応して、第二のシアニン化合物残基の蛍光特性に影響を与える基は除かれる）を示し；Y1及びY2はそれぞれ独立に-O-、-S-、又は-C(R13)(R14)-（式中、R13及びR14はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）を示し；M-は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示す〕で表されるシアニン化合物の残基が好ましい。【００１８】
本明細書において、特に言及しない場合にはアルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。アルキル基が置換基を有する場合には、置換基の種類、個数、置換位置は特に限定されないが、例えば、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよい）、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基若しくはそのエステル、スルホ基若しくはそのエステルなどを置換基として有していてもよい。【００１９】
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、又はR8が示すC1-6アルキル基としては、メチル基又はエチル基などが好ましく、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、又はR8が示すハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子などが好ましい。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、又はR8が示すスルホ基又はホスホ基は、それぞれエステルを形成していてもよい。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、又はR8がすべて水素原子であってもよい。【００２０】
R9、R10、及びR11が示すC1-18アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、tert-ペンチル基、1-メチルブチル基、2-メチルブチル基、1-エチルプロピル基、n-ヘキシル基、1-メチルペンチル基、2-メチルペンチル基、3-メチルペンチル基、4-メチルペンチル基、2,3-ジメチルブチル基、1,3-ジメチルブチル基、1,2-ジメチルブチル基、1-エチルブチル基、2-エチルブチル基、1-イソプロピルプロピル基、n-ヘプチル基、n-オクチル基、n-ノニル基、n-デシル基、n-ウンデシル基、n-ドデシル基、n-トリデシル基、n-テトラデシル基、n-ペンタデシル基、n-ヘキサデシル基、n-ヘプタデシル基、又はn-オクタデシル基などを挙げることができる。アルキル基としては、直鎖状のアルキル基が好ましい。R9及びR10が示すC1-18アルキル基上に存在可能な置換基としては、例えば、アルコキシ基、アリール基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよい）、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基若しくはそのエステル、又はスルホ基若しくはそのエステルなどを挙げることができるが、これらのうち、カルボキシ基、スルホ基又はアミノ基などが好ましく、特にカルボキシ基又はスルホ基が好ましい。R9及びR10の両者が無置換のC1-18アルキル基であってもよく、あるいはそれらのいずれか片方のC1-18アルキル基が置換基を有することも好ましい。R9及びR10がともに無置換アルキル基であることが好ましく、ともにメチル基であることがより好ましい。R11はカルボキシ基で置換されたC1-4アルキル基であることが好ましく、このカルボキシ基でリンカーに結合することが好ましい。リンカーとの結合様式は特に限定されないが、例えば、エステル結合やアミド結合などが挙げられる。第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基が第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基に置換した置換基で直接結合する場合には、R9、R10、及びR11が示す置換基を有していてもよいC1-18アルキル基に置換したカルボキシ基、スルホ基又はアミノ基などを利用してエステル結合やアミド結合で第二のシアニン化合物残基と結合することが好ましい。【００２１】
Zはリンカーに結合する酸素原子、硫黄原子、又は-N(R12)-（Zが-N(R12)-の場合、R11とR12は、活性酸素種と反応して、第二のシアニン化合物残基の蛍光特性に影響を与える基は除かれる）を示し、R12は水素原子又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す。Zがイオウ原子であることが好ましい。Zがイオウ原子である場合には第一のシアニン化合物残基の酸化電位が低下し、活性酸素種に対する反応性が増す効果が得られる。R12は水素原子又はメチル基などが好ましい。Y1及びY2はそれぞれ独立に-O-、-S-、又は-C(R13)(R14)-を示し、R13及びR14はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す。Y1及びY2が-C(R13)(R14)-であることが好ましく、R13及びR14としてはメチル基が好ましい。M-は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示す。対イオンとしては、例えば、塩化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、過塩素酸アニオン、メタンスルホン酸アニオン、p-トルエンスルホン酸アニオン、シュウ酸アニオン、クエン酸アニオン、酒石酸アニオンなどの有機酸アニオン、グリシンなどのアミノ酸のイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオンなどの金属イオン、4級アンモニウムイオンなどを挙げることができる。例えば、一般式(I)においてR9及びR10が示すC1-18アルキル基にカルボキシ基、スルホ基などが存在する場合、あるいはR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、及びR8のうちのいずれか1個以上がスルホ基又はホスホ基であり、対イオンとしてナトリウムイオンを用いる場合には、M-として2個以上の対イオンが必要になる場合がある。また、一般式(I)においてR9又はR10が示す一方のC1-18アルキル基に１個のカルボキシ基又はスルホ基などが存在する場合には、R10が結合する４級窒素原子上の陽電荷とカルボキシ基又はスルホ基のアニオンとが分子内ツビッターイオンを形成するので、電荷の中和に必要な対イオンが不必要になる場合もある。さらに、第二のシアニン化合物残基に電荷の中和に必要な数のカルボキシ基又はスルホ基などを有する場合には、それらのアニオンと分子内ツビッターイオンを形成するので、電荷の中和に必要な対イオンが不必要になる場合もある。【００２２】
第一のシアニン化合物残基を構成するシアニン化合物として特に好ましい化合物の一例を下記に挙げるが、第一のシアニン化合物残基を構成するシアニン化合物は下記の特定の化合物に限定されることはない。この化合物のカルボキシ基がリンカーとアミド結合などを形成することが好ましい。
【化４】
2009107769.tif 000006
【００２３】
第二のシアニン化合物残基は、活性酸素種に対して実質的に安定であり、消光団として機能する第一のシアニン化合物残基と同等以上に安定であればよく、多様なシアニン化合物残基を用いることができる。例えば、近赤外領域、好ましくは650 nm以上に極大蛍光波長を有しており、かつ蛍光量子収率が0.03以上であるシアニン化合物の残基を用いることが好ましく、蛍光団中に下記の部分構造：-CH=CH-CH=CH-CH=を有するものが特に好ましい。【００２４】
第二のシアニン化合物の残基としては、例えば、下記の一般式(II)：
【化５】
2009107769.tif 000007
〔式中、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、及びR28はそれぞれ独立に水素原子、スルホ基、ホスホ基、ハロゲン原子、又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示し；R29及びR30はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基を示し；Y11及びY12はそれぞれ独立に-O-、-S-、又は-C(R31)(R32)-（式中、R31及びR32はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）を示す〕で表されるシアニン化合物の残基が好ましい。【００２５】
R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、又はR28が示すC1-6アルキル基としては、メチル基又はエチル基などが好ましく、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、又はR28が示すハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子などが好ましい。R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、又はR28が示すスルホ基又はホスホ基は、それぞれエステルを形成していてもよい。R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、又はR28がすべて水素原子であってもよい。R21、R22、R23、又はR24の内の１つがスルホ基などの電子吸引性の基（但し、ニトロ基を除く）であるか、R25、R26、R27、又はR28の内の１つがスルホ基などの電子吸引性の基（但し、ニトロ基を除く）であることが好ましく、R21、R22、R23、又はR24の内の１つがスルホ基などの電子吸引性の基（但し、ニトロ基を除く）であり、かつR25、R26、R27、又はR28の内の１つがスルホ基などの電子吸引性の基（但し、ニトロ基を除く）であることがより好ましく、特にR22及びR26が共にスルホ基であることが好ましい。このような場合には、第二のシアニン化合物残基の酸化電位が高まり、活性酸素種に対する安定性が増す効果が得られる。【００２６】
R29及びR30はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基を示す。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、tert-ペンチル基、1-メチルブチル基、2-メチルブチル基、1-エチルプロピル基、n-ヘキシル基、1-メチルペンチル基、2-メチルペンチル基、3-メチルペンチル基、4-メチルペンチル基、2,3-ジメチルブチル基、1,3-ジメチルブチル基、1,2-ジメチルブチル基、1-エチルブチル基、2-エチルブチル基、1-イソプロピルプロピル基、n-ヘプチル基、n-オクチル基、n-ノニル基、n-デシル基、n-ウンデシル基、n-ドデシル基、n-トリデシル基、n-テトラデシル基、n-ペンタデシル基、n-ヘキサデシル基、n-ヘプタデシル基、又はn-オクタデシル基などを挙げることができる。アルキル基としては、直鎖状のアルキル基が好ましい。R29及びR30が示すC1-18アルキル基上に存在可能な置換基としては、例えば、アルコキシ基、アリール基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよい）、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基若しくはそのエステル、又はスルホ基若しくはそのエステルなどを挙げることができるが、これらのうち、カルボキシ基、スルホ基又はアミノ基などが好ましく、特にカルボキシ基又はスルホ基が好ましい。R29及びR30の両者が無置換のC1-18アルキル基であってもよく、あるいはそれらのいずれか片方のC1-18アルキル基が置換基を有することも好ましい。R29及びR30のうちのいずれかに置換するカルボキシ基又はスルホ基がリンカーと結合することが好ましい。リンカーとの結合様式は特に限定されないが、例えばアミド結合、エステル結合、スルホアミド結合などが挙げられる。R29及びR30のうちのいずれかに置換するカルボキシ基又はスルホ基がリンカーを介さずに第一のシアニン化合物残基の-Z-R11(ただし、R11は水素原子を示す)とアミド結合、エステル結合、チオエステル結合、スルホアミド結合などで直接結合してもよく、R29及びR30のうちのいずれかに置換するカルボキシ基、スルホ基又はアミノ基がリンカーを介さずに一般式(Ｉ)で表される第一のシアニン化合物の残基のR9、R10、及びR11が示す置換基を有していてもよいC1-18アルキル基に置換したカルボキシ基、スルホ基又はアミノ基とアミド結合、エステル結合、スルホアミド結合などで直接結合してもよい。Y11及びY12はそれぞれ独立に-O-、-S-、又は-C(R31)(R32)-を示し、R31及びR32はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す。Y11及びY12が-C(R31)(R32)-であることが好ましく、R31及びR32としてはメチル基が好ましい。【００２７】
第二のシアニン化合物の残基を構成するシアニン化合物の特に好ましい例として下記の化合物を挙げることができるが、第二のシアニン化合物残基を構成するシアニン化合物は下記の例に限定されることはない。この化合物の2個のカルボン酸のうちの1個の水素原子を除去して得られる残基が好ましく、該カルボン酸がリンカーとアミド結合することがさらに好ましい。
【化６】
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【００２８】
リンカーは、第一のシアニン化合物残基が第二のシアニン化合物残基に対して消光団として作用することができるように選択されるが、この性質を有している限り、リンカーの種類は特に限定されることはない。リンカーは炭素原子のみからなるリンカーであってもよいが、窒素原子、イオウ原子、又は酸素原子などのヘテロ原子を1個又は2個以上含むリンカーでもよい。リンカーは直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるものであってもよい。例えば、リンカーの連結原子数は１から10個程度であり、4から10個程度であることが好ましい。本明細書において、リンカーの連結原子数とは、リンカーの一方の末端の原子から他方の末端の原子に至る最短経路に含まれる原子個数を意味する。リンカーは1又は2個以上の置換基を有していてもよい。リンカーの一例として、例えば、下記のリンカーを挙げることができるが、このリンカーの連結原子数は6である。
【化７】
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【００２９】
第一のシアニン化合物残基が第二のシアニン化合物残基に対して消光団として作用するか否かは、例えば、第二のシアニン化合物残基の蛍光スペクトルに対して十分に吸収スペクトルが重なる第一のシアニン化合物残基を選択して、第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基の蛍光量子収率をそれぞれ測定し、両者の蛍光量子収率を比較することにより予測可能であり、第二のシアニン化合物残基の蛍光量子収率に対して第一のシアニン化合物残基の蛍光量子収率が4分の1以下であることが好ましい。【００３０】
また、第二のシアニン化合物残基から第一のシアニン化合物残基に効率的にFRETが起るように第二のシアニン化合物残基の蛍光スペクトルに対して十分に吸収スペクトルが重なる第一のシアニン化合物残基を選択すれば、第一のシアニン化合物残基は消光団に限らず実質的に蛍光量子収率の高い蛍光団であってもよい（本明細書中、第一のシアニン化合物残基としての「消光団」には、第二のシアニン化合物残基からのFRETによって効率的に蛍光を発する蛍光団も含む）。この場合、本発明の活性酸素測定用試薬は、第二のシアニン化合物残基の極大吸収波長で励起すると、活性酸素種との反応前には、FRETによって第一のシアニン化合物残基からの蛍光が観察され、活性酸素種との反応後には、第一のシアニン化合物残基が活性酸素種によって分解されるためにFRETが起らず第二のシアニン化合物残基からの蛍光が観察されることから、一波長励起二波長蛍光測定型のFRET蛍光プローブとして活性酸素種を測定する試薬とすることもできる。【００３１】
消光団として機能する第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基の組み合わせは、第一のシアニン化合物残基が活性酸素種に対して第二のシアニン化合物残基と同等か、又はそれ以上の反応性を有している組み合わせであればよく、言い換えれば、第二のシアニン化合物残基は活性酸素種に対して第一のシアニン化合物残基と同等以上に安定であればよい。一方、インドカルボシアニン化合物などのカルボシアニン化合物では、化合物中の共役ポリメチン鎖が長くなるほど酸化電位が低くなり活性酸素種に対する反応性が上昇する。よって、第一のシアニン化合物残基と第二のシアニン化合物残基の組み合わせは、例えば、ジカルボシアニン化合物とジカルボシアニン化合物、トリカルボシアニン化合物とトリカルボシアニン化合物、トリカルボシアニン化合物とジカルボシアニン化合物の組み合わせが好ましい。
【表１】
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【００３２】
一般式(I)のR1ないしR10および一般式（II）のR21ないしR30のうち１つ又は２つは細胞膜内に埋没可能な基であってもよい。この場合、本発明の試薬を膜局在型の蛍光プローブとして使用して、細胞膜近傍で生成する活性酸素種を効率的に測定できる。細胞膜内に埋没可能な基としては、直鎖又は分岐C7-18アルキル基及びリン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カルジオリピン類、スフィンゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホスホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、1,2-ジミリストイル-1,2-デオキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、又はホスファチジン酸類が挙げられるが、これらのリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されず、炭素数12〜20個程度の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を1個又は2個有するリン脂質を用いることができる）が好ましい。【００３３】
本発明の試薬を細胞、生体組織又はイン・ビボで使用する場合には、一般式(I)のR1ないしR10及び一般式（II）のR21ないしR30に置換する基、又は一般式(I)のR1ないしR10及び一般式（II）のR21ないしR30の置換基を有していてもよいアルキル基の置換基を適宜選択して本発明の試薬の水溶性を調節し、細胞膜透過型及び非膜透過型のプローブとして使用することができる。例えば、スルホ基及びカルボキシ基を1つ又は2つ、好ましくは3つ以上有する本発明の化合物は水溶性が非常に高く非膜透過性を示して細胞内に取り込まれないため、細胞外に放出される活性酸素種の検出に好適に用いることができる。また、例えば、置換基としてポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール鎖を置換基として１つ又は２つ導入すれば、導入したポリアルキレングリコール置換基の数とポリアルキレングリコール鎖の長さによって所望の水溶性を適宜本発明の試薬に付加できる。【００３４】
本発明の試薬は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、いずれも本発明の範囲に包含される。また、本発明の試薬は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。【００３５】
本発明の試薬の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応剤などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、本発明の試薬を容易に製造することができる。【００３６】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の活性酸素種の測定方法は、一般的には、(A)上記の試薬と活性酸素種とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した上記試薬由来の分解物の蛍光を測定する工程を含んでいる。  本発明の試薬により測定可能な活性酸素種としては、ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、一酸化窒素、過酸化水素、スーパーオキサイドアニオン、及び一重項酸素などを挙げることができる。【００３７】
本発明の試薬を用いた蛍光測定手段は特に限定されないが、イン・ビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてイン・ビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましいが、例えば定量的なヒドロキシルラジカルの発生系としてガンマーラジオリシス法などを利用することができ、一重項酸素の発生系として、例えば、ナフタレンエンドパーオキシド系（Saito, I,. et al., J. Am. Chem. Soc., 107, pp.6329-6334, 1985）などを利用することができる。本発明の試薬はマイクロインジェクション法等により細胞内に取り込ませれば、個々の細胞内に局在する活性酸素種をバイオイメージング手法により高感度にリアルタイムで測定することができるほか、細胞培養液又は組織切片等の培養液又は灌流液中に用いることで細胞や生体組織が放出する活性酸素種を測定できる。すなわち、本発明の試薬を用いることにより、細胞又は生体組織での酸化ストレスをリアルタイムに測定することが可能であり、疾患病態の原因究明、治療薬の開発などに好適に利用できる。【００３８】
本発明の試薬は、必要に応じて試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：本発明の活性酸素測定用試薬の製造
【化８】
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【００４０】
(1)化合物5
ヒドラジノベンゼンスルホン酸 4 (12.9 g, 67 mmol)と3-メチル-2-ブタノン (7 mL, 67 mmol)を酢酸 (30 mL) に溶解させ、攪拌しながら14時間加熱還流した。室温まで放冷後、濾取して得られる沈殿物をジエチルエーテルで洗い目的物 (18.0 g)を得た。【００４１】
(2)化合物6
化合物5 (18.0 g, 59 mmol)をメタノール (20 mL) に溶解させ、飽和水酸化カリウムイソプロピルアルコール溶液 (300 mL) を加えて攪拌した。濾取して得られる黄色い沈殿物をイソプロピルアルコールで洗い目的物 (15.2 g) を得た。【００４２】
(3)化合物7
化合物6 (30.5 g, 0.11 mol)及び3-ヨードプロピオン酸 (25.0 g 0.13 mol) をo-ジクロロベンゼン (150 mL) に溶解させ、攪拌しながら110℃で19時間加熱した。室温まで放冷後、上清を捨て、残渣をイソプロピルアルコール及びジエチルエーテルで洗い目的物 (26.5 g) を得た。【００４３】
(4)化合物2
マロンアルデヒドジアニリド・塩酸塩 (2.5 g, 9.8 mmol) を塩化メチレン (15 mL) 及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン (1.5 mL) 混合液に溶解させた。室温で攪拌しながら、この溶液に無水酢酸 (1.5 mL) と塩化メチレン (5 mL) の混合液を滴下し、さらに室温で4時間攪拌した。化合物7 (6.8 g, 19 mmol) 及び酢酸カリウム (1.0 g, 10 mmol) のメタノール溶液 (20 mL)を 加熱還流させ、上記で得られた黄色溶液を滴下した。さらに10時間加熱し、室温まで放冷後、濾取して得られる沈殿物をイソプロピルアルコール及びジエチルエーテルで洗い、逆相シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物 (1.1 g) を得た。【００４４】
(5)化合物3
IR-786 過塩素酸塩 (CAS No.115970-66-6, 1.5 g, 2.6 mmol) をジメチルホルムアミド (DMF, 10 mL) に溶解させ、 3-メルカプトプロピオン酸 (265μL, 3.0 mmol) 及びトリエチルアミン (425μL, 3.0 mmol)を加えた後、室温で20時間攪拌した。反応液に塩化メチレンを加えて、塩化メチレン/飽和食塩水で抽出した。有機層を集めて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過後、溶媒を留去した。イソプロピルアルコールより再結晶して目的物 (1.3 g) を得た。【００４５】
(6)化合物8
化合物 3 (217 mg, 0.39 mmol) 及び O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（HBTU ,173 mg, 0.46 mmol) を塩化メチレン (10 mL) に溶解させ、さらにN-tert-ブトキシカルボニル-trans-1,4-シクロヘキサンジアミン (98 mg, 0.46 mmol) 及び N,N-ジイソプロピルエチルアミン (75μL) を加えた。室温にて4時間攪拌した後、反応液に塩化メチレンを加えて、塩化メチレン/飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出した。有機層を集めて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過後、溶媒を留去した。この化合物を精製せずに次の反応に用いた。【００４６】
(7)化合物9
化合物 8 を50%トリフルオロ酢酸/塩化メチレン溶液 (20 mL) に溶解させ、室温で3時間攪拌した。溶媒を留去し、少量のメタノールに溶解させた後、ジエチルエーテル (約200 mL) を加えて再沈殿させた。濾過して得られる沈殿物をイソプロピルアルコールより再結晶して目的物 (104 mg) を得た。【００４７】
(8)化合物1（FOSCY-1）
化合物 2 (233 mg, 0.33 mmol) をジメチルホルムアミド (10 mL) に溶解させ、これにHBTU (108 mg, 0.28 mmol) のジメチルホルムアミド溶液 (10 mL)、続いて化合物 9 (80 mg, 0.12 mmol) 及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン (25μL) のジメチルホルムアミド 溶液(10 mL) を滴下した。室温で9時間攪拌したのち、溶媒を留去した。得られる残渣を分取HPLCにより精製して目的物 (40 mg) を得た。
1H NMR (300 MHz, DMF-d7): δ 8.77 (d, 2H, J = 14.1 Hz), 8.47 (m, 2H), 8.33 (br, 1H), 7.85-7.26 (m, 15H), 6.64-6.53 (m, 2H), 6.37 (m, 3H), 4.42 (br, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.04 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.63 (m, 4H), 2.46 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.83-1.68 (m, 30H), 1.20-1.07 (m, 4H).
13C-NMR (100 MHz, DMF-d7): δ 179.6, 178.9, 178.4, 177.8, 174.6, 174.5, 168.2, 167.9, 161.0, 160.0, 151.8, 151.6, 150.7, 149.0, 147.8, 147.7, 146.8, 146.5, 146.4, 138.9, 134.2, 131.9, 131.8, 130.5, 128.0, 125.6, 125.5, 116.7, 116.1, 115.8, 110.1, 109.5, 107.2, 54.9, 54.7, 54.6, 53.2, 53.1, 51.6, 51.5, 51.2, 41.5, 38.9, 37.6, 36.7, 32.8, 32.3, 31.6, 26.5, 14.1, 14.0, 13.7.
HRMS (ESI-): m/z calcd for (M - H)-, 1287.53328; found, 1287.53710.【００４８】
上記で得られた化合物2（第二のシアニン化合物残基を構成するシアニン化合物）及び化合物3（第一のシアニン化合物残基を構成するシアニン化合物）のUVスペクトル及び蛍光スペクトルを図１に示す。図中、実線は吸収スペクトルを、点線は蛍光スペクトルを示している。この結果、化合物2の蛍光スペクトルと化合物3の吸収スペクトルは大きな重なりがあり、共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせとして適していることが分かる。
また、化合物１（FOSCY-1）の光化学的性状は以下のとおりであった。
極大吸収波長: 644 nm（100mMリン酸バッファー(pH 7.4)中）
極大蛍光波長: 668 nm（100mM リン酸バッファー(pH 7.4)中）
量子収率φ： 0.014（メタノール中のクレジルバイオレットを蛍光標準0.54とした相対値）
モル吸光係数ε (×105M-1cm-1)：1.5【００４９】
例２
Cy5、Cy7、上記で得られた化合物2（第二のシアニン化合物残基を構成するシアニン化合物）及び化合物3（第一のシアニン化合物残基を構成するシアニン化合物）をヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、スーパーオキサイドアニオンと反応させて極大吸収波長における吸光度変化を測定した。測定は、10μMのCy5、Cy7、化合物2及び化合物3の0.1Mリン緩衝液を調製し、調製した溶液を以下の条件：
(a)ヒドロキシルラジカル
過酸化水素及び過塩素酸鉄(II)をそれぞれ終濃度１mM、50μMとなるよう添加
(b)パーオキシナイトライト
パーオキシナイトライトを終濃度10μMとなるよう添加
(c)次亜塩素酸イオン
次亜塩素酸イオンを終濃度10μMとなるよう添加
(d)スーパーオキサイドアニオン
キサンチンオキシダーゼ及びキサンチンをそれぞれ終濃度4mU、33μMとなるよう添加、
で行った。結果を図２に示す。図中、各活性酸素種における測定結果は、左からCy5、化合物2、Cy7及び化合物3の順で示している。【００５０】
図２より、トリカルボシアニン化合物であるCy7は、全ての活性酸素種の添加によってジカルボシアニン化合物であるCy5より大きな吸光度の減少を示しており、Cy5より活性酸素種に対する反応性が高いことが確認された。また、共役ポリメチン鎖にチオエーテル基を導入したCy7誘導体である化合物3は、全ての活性酸素種に対してCy7より大きな吸光度の減少を示しており、Cy7より活性酸素種に対する反応性が高いことが確認された。このことから、共役ポリメチン鎖にチオエーテル基を導入することにより、シアニン化合物の活性酸素種に対する反応性が向上することが示された。一方、インドレニン部位に電子吸引性のスルホ基を導入したCy5誘導体である化合物2では、全ての活性酸素種に対して最も吸光度の減少が小さく、特にスーパーオキサイドアニオンでは全く吸光度が減少しなかった。このことから、インドレニン部位にスルホ基などの電子吸引性の置換基を導入することで、シアニン化合物の活性酸素種に対する安定性が向上することが示された。【００５１】
例３
本発明の活性酸素測定用試薬を種々の活性酸素種と反応させて蛍光スペクトル変化を測定した。測定は以下のように行った。
（１）ヒドロキシルラジカル
1μMの化合物1のリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.1% DMFを含む)を室温下、フラスコ内で激しく攪拌しながら1 M H2O2水溶液を終濃度0.1 mMとなるように加え、次いで1 mMの過塩素酸鉄(II)水溶液を終濃度0μM、0.13μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM、3μMとなるように滴下した。1分後に蛍光光度計で644nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００５２】
（２）パーオキシナイトライト
1μMの化合物1のリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.1% DMFを含む)を室温下、キュベット中で攪拌しながら、1 mM パーオキシナイトライトの0.1N水酸化ナトリウム水溶液を終濃度0μM、0.3μM、0.7μM、1μM、2μMとなるように滴下した。1分後に蛍光光度計で644nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。
（３）次亜塩素酸イオン
1μMの化合物1のリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.1% DMFを含む)を室温下、キュベット中で攪拌しながら、1 mM次亜塩素酸ナトリウムの0.1N水酸化ナトリウム水溶液を終濃度0μM、0.3μM、0.7μM、1μM、2μM、3μMとなるように滴下した。1分後に蛍光光度計で644nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００５３】
（４）スーパーオキサイドアニオン
1μMの化合物1のリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.1% DMFを含む)を室温下、キュベット中で攪拌しながら、終濃度4 mU/mLとなるようキサンチンオキシダーゼ水溶液を加え、続いて終濃度33μMのキサンチン-DMF溶液を添加した。30分後に蛍光光度計で644nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。スーパーオキサイドジスムターゼで処理した場合には、終濃度60 U/mLのスーパーオキサイドジスムターゼ水溶液をキサンチンオキシダーゼ水溶液を添加する前に加えた。
（５）一重項酸素
1μMの化合物1の重水溶液を37℃、キュベット中で攪拌しながら、熱依存的に一重項酸素を放出することが知られている一重項酸素放出剤EP-1（3-(1,4-ジヒドロ-1,4-エピジオキシ-1-ナフチル)プロピオン酸）のDMF溶液を終濃度0.2 mMになるように添加し、30分後に蛍光光度計で644nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００５４】
（６）過酸化水素
1μMの化合物１のリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.1% DMFを含む)を室温下、キュベット中で攪拌しながら1 M H2O2水溶液を終濃度10 mMとなるように添加し、30分後に蛍光光度計で644nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。
結果を図３に示す。図３より、本発明の化合物1は、ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオンと濃度依存的に反応して668nmの蛍光強度が上昇することが確認できる。また、スーパーオキサイドアニオン、一重項酸素の添加によっても668nmの蛍光強度が上昇することが確認できることから、化合物1はヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、スーパーオキサイドアニオン、一重項酸素を644nmの近赤外領域の励起光を使って測定可能であることが示された。【００５５】
例４
ヒト前骨髄性白血病由来のHL60細胞が産生するスーパーオキサイドアニオンの測定
10%(V/V)ウシ胎児血清、ペニシリン（100U/mL）ストレプトマイシン（100μg/mL）を含むRoswell Park Memorial Institute (RPMI) 培地でCO2インキュベーターを用いて培養したHL60細胞をHanks' balanced salts solution (HBSS)で1×106cell/mLとなるように希釈し、3mLをプラスチックキュベット中に移した。化合物1を最終濃度0.1μM（共溶媒としてDMF 0.1%を含む）を加え、溶液をゆっくりと37℃攪拌した。測定開始後1分にPhorbol 12-Myristate 13- Acetate（PMA）1μg（共溶媒としてDMF 0.2%を含む）、又は対象としてDMF 3μLを加えた。スーパーオキサイドジスムターゼで処理した場合には、終濃度60 U/mLのスーパーオキサイドジスムターゼ（SOD）をPMA添加前に加えた。励起光645nm、蛍光波長668nmで一分毎に蛍光強度を測定した。結果を図４に示す。PMA添加後に顕著な蛍光上昇が観察され、HL60細胞からスーパーオキサイドアニオンが細胞外に産生放出されていることが分かる。測定液内にあらかじめSODを添加するとこの上昇が抑制されることから活性酸素種がスーパーオキサイドアニオンであることが確認できる。このように、本発明の活性酸素測定用試薬を使用すると生細胞が産生する活性酸素種を感度良く測定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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