(57)【要約】  リボヌクレアーゼ、抗生物質、細菌毒素およびウィルスは、タンパク質合成を阻害し、哺乳動物細胞のアポトーシスを起こす。タンパク質のＢＣＬ−２ファミリーが、タンパク質合成の遮断に応答して如何にアポトーシスを調節するのかは、不明である。本発明によれば、大腸菌毒素ＭａｚＦが、細胞ｍＲＮＡの切断によりタンパク質合成を阻害し、哺乳動物細胞のアポトーシスを誘発した。ＭａｚＦ誘発アポトーシスには、アポトーシス促進性ＢＡＫ、およびその上流側にある調節因子のアポトーシス促進性ＢＨ３限定タンパク質、ＮＢＫ／ＢＩＫが必要であったが、ＢＩＭ、ＰＵＭＡまたはＮＯＸＡは不要であった。さらに、ＮＢＫ／ＢＩＫまたはＢＡＫ欠損細胞は、薬理作用的翻訳抑制およびタンパク質合成のウィルス媒介遮断により誘発される細胞死に耐性を示した。したがって、ＢＨ３限定タンパク質ＮＢＫ／ＢＩＫは、タンパク質合成の遮断に応答に応答するＢＡＫ依存性アポトーシス経路の先端側調節因子である。ＮＢＫ／ＢＩＫは、発生にとって必須ではないが、ウィルスによる不活性化の標的となるＢＨ３限定タンパク質であり、したがって、アポトーシス活性化を介した病原体／毒素への応答において、ある役割を演じていることが示唆される。
2009505656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞においてアポトーシスを選択的に調節する方法であって、
ａ．ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を含む第１の発現ベクターを調製するステップ、
ｂ．ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を含む第２の発現ベクターを調製するステップ、
ｃ．第１の発現ベクターを哺乳動物細胞に導入するステップ、
ｄ．第２の発現ベクターを哺乳動物細胞に適宜導入するステップ、
ｅ．ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、第１の発現ベクターの発現を選択的に誘発することにより、前記細胞のアポトーシスを誘発するステップ、および
ｆ．ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの断片をコードする、第２の発現ベクターの発現を選択的に適宜誘発することにより、前記細胞のアポトーシスを抑制するステップ
を含む方法。
【請求項２】
第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターが、各々少なくとも１つの調節配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの調節配列が、少なくとも１つの誘導プロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１の発現ベクターにおける少なくとも１つの誘導プロモーターが、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする前記核酸配列に、作動可能に連結されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第２の発現ベクターにおける少なくとも１つの誘導プロモーターが、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの断片をコードする前記核酸配列に、作動可能に連結されている、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片が、前記細胞中で発現した際、細胞メッセンジャーＲＮＡにおける少なくとも１つの第１のｍＲＮＡインターフェレース認識配列を認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの第１のｍＲＮＡインターフェレース認識配列は、アデニン−シトシン−アデニンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドが、原核生物ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドがＭａｚＦである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドが、原核生物ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドがＭａｚＥである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
標的の哺乳動物細胞がＢａｋ欠損性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標的の哺乳動物細胞がＢａｋ・Ｂａｘ欠損性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
標的の哺乳動物細胞が腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
標的の哺乳動物細胞が、病原体に感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
病原体が、細菌、ウィルス、真菌、寄生虫またはプリオンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
標的の哺乳動物細胞が幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
標的の哺乳動物細胞が分化細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
分化細胞が、筋細胞、腎細胞、肺細胞、甲状腺細胞、膵細胞、血球、神経細胞、グリア細胞、または感覚細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標的の哺乳動物細胞が免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
標的の哺乳動物細胞が遺伝的損傷細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
標的の哺乳動物細胞が毒素損傷細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を維持する方法であって、
ａ．ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を含む発現ベクターを調製するステップ、および
ｂ．哺乳動物細胞に発現ベクターを導入するステップ
を含み、哺乳動物細胞の少なくとも１つのアポトーシス経路が阻止されている方法。
【請求項２４】
ｃ．ステップｂの後に、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片の発現を誘発するステップ
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
発現ベクターが、少なくとも１つの調節配列をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの調節配列が、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする前記核酸配列に、作動可能に連結されている少なくとも１つの誘導プロモーターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片が、細胞中で発現した際、細胞メッセンジャーＲＮＡにおける少なくとも１つのｍＲＮＡインターフェレース認識配列を認識する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのｍＲＮＡインターフェレース認識配列が、アデニン−シトシン−アデニンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドが原核生物ポリペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドがＭａｚＦである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物細胞が、ＢＡＫ欠損性、ＮＢＫ／ＢＩＫ欠損性、またはＢＡＫ欠損性であり、ＮＢＫ／ＢＩＫ欠損性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を保持する哺乳動物細胞であって、該細胞の少なくとも１つのアポトーシス経路が阻止されている哺乳動物細胞。
【請求項３３】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を含む発現ベクターにより形質導入されている、請求項３２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３４】
発現ベクターが、少なくとも１つの調節配列をさらに含む、請求項３３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３５】
少なくとも１つの調節配列が、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする前記核酸配列に、作動可能に連結されている少なくとも１つの誘導プロモーターである、請求項３４に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３６】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片が、細胞中で発現した際、細胞メッセンジャーＲＮＡにおける少なくとも１つのｍＲＮＡインターフェレース認識配列を認識する、請求項３２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３７】
少なくとも１つのｍＲＮＡインターフェレース認識配列が、アデニン−シトシン−アデニンである、請求項３６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３８】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドが原核生物ポリペプチドである、請求項３２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３９】
ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドがＭａｚＦである、請求項３８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項４０】
ＢＡＫ欠損性、ＮＢＫ／ＢＩＫ欠損性、またはＢＡＫ欠損性であり、ＮＢＫ／ＢＩＫ欠損性である、請求項３２に記載の哺乳動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、「ＮＢＫ／ＢＩＫ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＢＡＫ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」という名称の米国仮出願第６０／８１７，２７３号（２００６年６月２９日出願）および「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＢＡＫ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ＢＡＫ−ａｎｄ  ＢＡＸ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」という名称の米国仮出願第６０／７１０，９００号（２００５年８月２４日出願）に対する優先権の利益を請求する。
本発明は、哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡインターフェレース誘発アポトーシスの調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、遺伝的にお膳立てされた、Ｃ．エレガンスから脊椎動物までの生物に保存されている細胞死過程である（Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：２４８１〜２４９５頁（２００３）；Ｄａｎｉａｌ，Ｎ．Ｎ．およびＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  １１６：２０５〜２１９頁（２００４））。アポトーシスは、胚発生中における複雑な多細胞組織の精巧な作製の実現、および成体生物における正常な細胞恒常性の維持にとって必須であるだけでなく、ストレスまたは病原体感染により損傷した細胞の除去にも必要である（Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１３：１〜７頁（２００６））。アポトーシス調節の臨界点は、Ｂｃｌ−２ファミリーのどのメンバーであるかにより制御される。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーは、Ｂｃｌ−２相同性（ＢＨ１〜４）ドメインの保存に基づいて３種のサブクラスに分類することができる。即ち、マルチドメイン・アポトーシス抑制タンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＷおよびＢｆｌ−１／Ａ１）、マルチドメイン・アポトーシス促進タンパク質（ＢＡＸおよびＢＡＫ）、ならびにＢＨ３限定アポトーシス促進タンパク質（ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡおよびＮＢＫ／ＢＩＫ）である（Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：２４８１〜２４９５頁（２００３）；Ｄａｎｉａｌ，Ｎ．Ｎ．およびＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  １１６：２０５〜２１９頁（２００４）；Ｇｅｌｉｎａｓ，Ｃ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９：１２６３〜１２６８頁（２００５）；Ｗｉｌｌｉｓ，Ｓ．Ｎ．およびＡｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：１〜９頁（２００５））。注目すべきことに、ＢＨ３限定タンパク質は、ＢＡＸおよびＢＡＫを欠いた細胞を死滅させることができず、ＢＨ３限定タンパク質が、ＢＡＸおよびＢＡＫの上流にあり、それらに依存していることを示す（Ｚｏｎｇ，Ｗ．Ｙ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１４８１〜１４８６頁（２００１））。
【０００３】
ＢＨ３限定アポトーシス促進タンパク質は、サイトカイン欠乏、活性化癌遺伝子、ＤＮＡ損傷、化学療法およびγ線照射により誘発される死滅の最も先端側のメディエーターである。例えば、ＢＩＤは、死滅受容体のシグナル伝達により媒介されるアポトーシスの必須メディエーターである（Ｌｉ，Ｈ．等、Ｃｅｌｌ  ９４：４９１〜５０１頁（１９９８）；Ｌｕｏ，Ｘ．等、Ｃｅｌｌ  ９４：４８１〜４９０頁（１９９８））。ＢＩＭは、タキサン応答性の決定因子であり（Ｂｏｕｉｌｌｅｔ，Ｐ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：１７３５〜１７３８頁（１９９９）；Ｔａｎ，Ｔ．Ｔ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７：２２７〜２３８頁（２００５））、ＰＵＭＡおよびＮＯＸＡは、ｐ５３誘発アポトーシスの中心的メディエーターであり（Ｊｅｆｆｅｒｅｓ，Ｊ．Ｒ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４：３２１〜３２８頁（２００３）；Ｓｈｉｂｕｅ，Ｔ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：２２３３〜２２３８頁（２００３）；Ｖｉｌｌｕｎｇｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：１０３６〜１０３８頁（２００３））、ＢＡＤは、成長因子／サイトカインのシグナル伝達により媒介されるアポトーシスを調節する（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６：４１〜５１頁（２０００）；Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．等、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ３：６３１〜６４３頁（２００２））。一方、ＮＢＫ／ＢＩＫ媒介アポトーシス経路を特異的に惹起する細胞応答の特徴は、十分に解明されていない。
【０００４】
哺乳動物細胞の場合同様、細菌細胞も細胞死を調節する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞では、増殖阻害およびその後の細胞死は、「中毒（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）モジュール」または「毒素−抗毒素モジュール」と称する独特の遺伝子系を介して媒介されており、その系は、一方が安定毒素用、他方が不安定抗毒素用の２成分をコードする一対の遺伝子からなる（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：６６〜７１頁（２００４）；Ｇｅｒｄｅｓ  Ｋ．等、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３７１〜３８２頁（２００５））。抗毒素および毒素は、普通、同じオペロン中に共発現され（「中毒モジュール」または「抗毒素−毒素系」と称する）、その発現および機能は、抗毒素および毒素の複合体、抗毒素単独のいずれかによって負に自己調節されている。抗毒素および毒素の共発現が阻害されると、抗毒素が特異的プロテアーゼにより急速に分解され、毒素の標的に対する作用が可能となる。このような細菌細胞の増殖阻害に対する遺伝子系は、大腸菌のいくつもの染色体外因子において報告されてきた（Ｇｅｒｄｅｓ  Ｋ．等、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３７１〜３８２頁（２００５））。
【０００５】
大腸菌染色体上の中毒モジュールの１種であるｍａｚＥＦ系は、ｒｅｌＡ遺伝子の下流にある２種の隣接遺伝子、ｍａｚＥおよびｍａｚＦからなる（Ａｉｚｅｎｍａｎ，Ｅ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６０５９〜６０６３頁（１９９６））。ＭａｚＦは、ＡＣＡ配列で１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を特異的に切断する配列特異的エンドリボヌクレアーゼである。「エンドヌクレアーゼ」とは、核酸連鎖内の位置で核酸を特異的に切断する、大きな一群の酵素の１種である。エンドリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼは、ＲＮＡに特異的である。ＭａｚＦは、インビボでの主たる標的がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるために、ｍＲＮＡインターフェレースと呼称される。ＭａｚＦが安定毒素であるのに対し、ＭａｚＥは、ＡＴＰ依存性セリンプロテアーゼであるＣｈｐＰＡにより速やかに分解される不安定抗毒素である（Ａｉｚｅｎｍａｎ，Ｅ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６０５９〜６０６３頁（１９９６））。ＭａｚＦは、大腸菌ｍＲＮＡをＡＣＡ三塩基配列で特異的に切断することにより、タンパク質のデノボ合成を阻止する結果、細胞増殖の停止およびその後の細菌細胞死を起こす、配列特異的エンドリボヌクレアーゼであるであることが最近実証された（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３））。さらに、ＭａｚＥは、ＭａｚＦのエンドリボヌクレアーゼ活性に拮抗することを担当していることが示された（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３））。この中毒モジュールの目的は、それをコードする細菌へ競合的増殖の利点を与えることである。
【０００６】
細菌の場合同様、リボヌクレアーゼ媒介ＲＮＡ切断、抗生物質による翻訳静止（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）、または病原体感染によって誘発される、哺乳動物細胞におけるタンパク質合成の阻害も、プログラム細胞死を起こす。ウィルス感染に応答して、インターフェロンが、１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ  Ｌを活性化し、その結果タンパク質合成が阻害され、最終的に、シトクロムｃの放出およびカスパーゼ−３の活性化により媒介されるアポトーシスを誘発することにより、ウィルス感染細胞を除去する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１８０５〜１８１２頁（２００３）；Ｘｉａｎｇ，Ｙ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６７９５〜６８０１頁（２００３））。ウィルス産生２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化し、そのキナーゼが、真核生物開始因子（ｅＩＦ−２）をリン酸化することにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻害し、アポトーシスを起こす（Ｇｉｌ，Ｊ．およびＥｓｔｅｂａｎ，Ｍ．、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ５：１０７〜１１４頁（２０００））。入れ替わりに、ウィルスは、宿主タンパク質ではなく、ウィルスタンパク質の合成を可能とし（Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ａ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５０５〜５１３頁（２００５））、アポトーシスを抑制することによって（Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１３：１〜７頁（２００６）；Ｒｏｕｌｓｔｏｎ，Ａ．等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：５７７〜６２８頁（１９９９））、これらおよび他の宿主防御を逃れる機構を発展させてしまう。例えば、アデノウィルスは、インターフェロン媒介遺伝子発現を阻止し、ＰＫＲ活性化を阻害し、アポトーシスを妨げる因子をコードしている（Ｒｏｕｌｓｔｏｎ，Ａ．等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：５７７〜６２８頁（１９９９）；Ｃｕｃｏｎａｔｉ，Ａ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２４６５〜２４７８頁（２００２））。このために、細胞死を起こさずに、細胞タンパク質ではなく、ウィルスタンパク質の合成が可能となる。最後に、シクロヘキシミド（ＣＨＫ）、ピューロマイシン、エメチンなどの抗生物質は、様々な機構によりタンパク質合成を標的とすることによって、病原体を抑制し、死滅させるために使用する抗細菌兵器庫の一部をなす（Ｍｅｉｊｅｒｍａｎ，Ｉ．等、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５６：４６〜５５頁（１９９９））。様々な手段によるタンパク質合成の阻害は、選択的利点を得る普遍的武器であり、哺乳動物細胞においてアポトーシス応答を活性化することが知られているが、アポトーシスの活性化に利用される経路は不明である。
【０００７】
細菌毒素ＭａｚＦが、細菌中とまったく同様に哺乳動物細胞において、細胞ｍＲＮＡの目覚しい分解およびタンパク質合成の阻害を誘発することが、今や実証された。哺乳動物細胞におけるＭａｚＦの発現は、カスパーゼ−３の活性化およびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（「ＰＡＲＰ」）の切断を起こすが、こうしたことは、アポトーシス細胞死の特質であり、そのすべてが抗毒素ＭａｚＥにより阻止された。興味深いことに、ｂａｘおよび／またはｂａｋ、あるいはＢＨ３限定アポトーシス促進遺伝子（ｐｕｍａ、ｂｉｍ、ｎｏｘａおよびｎｂｋ／ｂｉｋ）が欠損した、ベビーマウスの不死化腎臓（「ｉＢＭＫ」）におけるＭａｚＦの発現により、ＮＢＫ／ＢＩＫおよびＢＡＫが、ＭａｚＦが誘発するアポトーシスに必要であることが判明した。その上、ＢＡＸおよびＢＡＫ、ＢＡＫまたはＮＢＫ／ＢＩＫが欠損すると、シクロヘキシミドによるタンパク質合成阻害およびウィルス感染が誘発するタンパク質合成の遮断に対して、抵抗性が付与された。タンパク質合成の遮断は病原体に対する細胞応答であることが多いので、この事実は、ＮＢＫ／ＢＩＫおよびＢＡＫに特異的なアポトーシス経路がこの過程を制御し得ることを意味している。
【特許文献１】米国仮出願第６０／８１７，２７３号
【特許文献２】米国仮出願第６０／７１０，９００号
【非特許文献１】Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：２４８１〜２４９５頁（２００３）
【非特許文献２】Ｄａｎｉａｌ，Ｎ．Ｎ．およびＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  １１６：２０５〜２１９頁（２００４）
【非特許文献３】Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１３：１〜７頁（２００６）
【非特許文献４】Ｇｅｌｉｎａｓ，Ｃ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９：１２６３〜１２６８頁（２００５）
【非特許文献５】Ｗｉｌｌｉｓ，Ｓ．Ｎ．およびＡｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：１〜９頁（２００５）
【非特許文献６】Ｚｏｎｇ，Ｗ．Ｙ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１４８１〜１４８６頁（２００１）
【非特許文献７】Ｌｉ，Ｈ．等、Ｃｅｌｌ  ９４：４９１〜５０１頁（１９９８）
【非特許文献８】Ｌｕｏ，Ｘ．等、Ｃｅｌｌ  ９４：４８１〜４９０頁（１９９８）
【非特許文献９】Ｂｏｕｉｌｌｅｔ，Ｐ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：１７３５〜１７３８頁（１９９９）
【非特許文献１０】Ｔａｎ，Ｔ．Ｔ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７：２２７〜２３８頁（２００５）
【非特許文献１１】Ｊｅｆｆｅｒｅｓ，Ｊ．Ｒ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４：３２１〜３２８頁（２００３）
【非特許文献１２】Ｓｈｉｂｕｅ，Ｔ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：２２３３〜２２３８頁（２００３）
【非特許文献１３】Ｖｉｌｌｕｎｇｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：１０３６〜１０３８頁（２００３）
【非特許文献１４】Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６：４１〜５１頁（２０００）
【非特許文献１５】Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．等、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ３：６３１〜６４３頁（２００２）
【非特許文献１６】Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：６６〜７１頁（２００４）
【非特許文献１７】Ｇｅｒｄｅｓ  Ｋ．等、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３７１〜３８２頁（２００５）
【非特許文献１８】Ａｉｚｅｎｍａｎ，Ｅ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６０５９〜６０６３頁（１９９６）
【非特許文献１９】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３）
【非特許文献２０】Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１８０５〜１８１２頁（２００３）
【非特許文献２１】Ｘｉａｎｇ，Ｙ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６７９５〜６８０１頁（２００３）
【非特許文献２２】Ｇｉｌ，Ｊ．およびＥｓｔｅｂａｎ，Ｍ．、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ５：１０７〜１１４頁（２０００）
【非特許文献２３】Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ａ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５０５〜５１３頁（２００５）
【非特許文献２４】Ｒｏｕｌｓｔｏｎ，Ａ．等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：５７７〜６２８頁（１９９９）
【非特許文献２５】Ｃｕｃｏｎａｔｉ，Ａ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２４６５〜２４７８頁（２００２）
【非特許文献２６】Ｍｅｉｊｅｒｍａｎ，Ｉ．等、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５６：４６〜５５頁（１９９９）
【非特許文献２７】Ｔｉｍｍｅｒ等、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９６（２）：１２５〜３４頁（２００２）
【非特許文献２８】Ｚｏｎｇ等、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６２（１）：５９〜６９頁（２００３）
【非特許文献２９】Ａｎｔｏｎｓｓｏｎ、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、３０６（３）：３４７〜６１頁（２００１）
【非特許文献３０】Ｚｈａｎｇ等、Ｈｕ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０（２１）：２３２９〜３９頁（２００１）
【特許文献３】米国特許第５６５６４９３号
【特許文献４】米国特許第５３３６７５号
【特許文献５】米国特許第５２３４８２４号
【特許文献６】米国特許第５１８７０８３号
【非特許文献３１】Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）
【非特許文献３２】Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２：１９３〜２０３頁（２００２）
【非特許文献３３】Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４１２７〜１４１３４頁（２００２）
【非特許文献３４】Ｈａｎ，Ｊ．、Ｓａｂｂａｔｉｎｉ，Ｐ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：５８５７〜５８６４頁（１９９６）
【非特許文献３５】Ｉｏｆｆｅ，Ｍ．Ｌ．等、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６１：２４３〜２４７頁（２００４）
【非特許文献３６】Ｐｅｒｅｚ，Ｄ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４１：１２５５〜１２６６頁（１９９８）
【非特許文献３７】Ｐｅｒｅｚ，Ｄ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６：５３〜６３頁（２０００）
【非特許文献３８】Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１８：２０９５〜２１０７頁（２００４）
【非特許文献３９】Ｃｕｃｏｎａｔｉ，Ａ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：２９２２〜２９３２頁（２００３）
【非特許文献４０】Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９５：１５８〜６７頁（２００３）
【非特許文献４１】Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．印刷中（２００６）
【非特許文献４２】Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、５１〜６４頁（２００６）
【非特許文献４３】Ｃｕｃｏｎａｔｉ，Ａ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４５４７〜４５５８頁（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを選択的に調節する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを選択的に調節する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を含む第１の発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を含む第２の発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）第１の発現ベクターを哺乳動物細胞に導入するステップ、（ｄ）第２の発現ベクターを哺乳動物細胞に適宜導入するステップ、（ｅ）ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、第１の発現ベクターの発現を選択的に誘発することにより、前記細胞のアポトーシスを誘発するステップ、および（ｆ）ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの断片をコードする、第２の発現ベクターの発現を選択的に適宜誘発することにより、前記細胞のアポトーシスを抑制するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターは、各々少なくとも１つの調節配列をさらに含む。別の実施形態では、少なくとも１つの該調節配列は少なくとも１つの誘導プロモーターである。別の実施形態では、第１の発現ベクター中の少なくとも１つの該誘導プロモーターは、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする核酸配列に、作動可能に連結されている。別の実施形態では、第２の発現ベクター中の少なくとも１つの該誘導プロモーターは、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドの断片をコードする核酸配列に、作動可能に連結されている。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片は、細胞中で発現した際、細胞メッセンジャーＲＮＡにおける少なくとも１つの第１のｍＲＮＡインターフェレース認識配列を認識する。別の実施形態では、少なくとも１つの第１のｍＲＮＡインターフェレース認識配列は、アデニン−シトシン−アデニンである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドは原核生物ポリペプチドである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドはＭａｚＦである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドは原核生物ポリペプチドである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース拮抗ポリペプチドはＭａｚＥである。別の実施形態では、標的の哺乳動物細胞はＢａｋ欠損性である。別の実施形態では、標的の哺乳動物細胞はＢａｋ・Ｂａｘ欠損性である。別の実施形態では、標的の哺乳動物細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態では、標的の哺乳動物細胞は病原体に感染している。別の実施形態では、病原体は、細菌、ウィルス、真菌、寄生虫またはプリオンである。別の実施形態では、標的の哺乳動物細胞は幹細胞である。別の実施形態では、標的の哺乳動物細胞は分化細胞である。別の実施形態では、分化細胞は、筋細胞、腎細胞、肺細胞、甲状腺細胞、膵細胞、血球、神経細胞、グリア細胞、または感覚細胞である。別の実施形態では、標的の哺乳動物細胞は免疫細胞である。別の実施形態では、標的の哺乳動物細胞は遺伝的損傷細胞である。別の実施形態では、標的の哺乳動物細胞は毒素損傷細胞である。
【００１０】
別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を維持する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を含む発現ベクターを調製するステップ、および（ｂ）哺乳動物細胞に発現ベクターを導入するステップを含み、哺乳動物細胞の少なくとも１つのアポトーシス経路が阻止されている方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）の後に、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片の発現を誘発するステップ（ｃ）をさらに含む。別の実施形態では、発現ベクターは、少なくとも１つの調節配列をさらに含む。別の実施形態では、少なくとも１つの調節配列は、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする核酸配列に、作動可能に連結されている少なくとも１つの誘導プロモーターである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片は、細胞中で発現した際、細胞メッセンジャーＲＮＡにおける少なくとも１つのｍＲＮＡインターフェレース認識配列を認識する。別の実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡインターフェレース認識配列は、アデニン−シトシン−アデニンである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドは原核生物ポリペプチドである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドはＭａｚＦである。別の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＢＡＫ欠損性、ＮＢＫ／ＢＩＫ欠損性、またはＢＡＫ欠損性であり、ＮＢＫ／ＢＩＫ欠損性である。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を保持する哺乳動物細胞であって、該細胞の少なくとも１つのアポトーシス経路が阻止されている哺乳動物細胞を提供する。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする、単離された核酸配列を含む発現ベクターにより形質導入されている。別の実施形態では、発現ベクターは、少なくとも１つの調節配列をさらに含む。別の実施形態では、少なくとも１つの調節配列は、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片をコードする核酸配列に、作動可能に連結されている少なくとも１つの誘導プロモーターである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチド、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの誘導体、またはｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの断片は、細胞中で発現した際、細胞メッセンジャーＲＮＡにおける少なくとも１つのｍＲＮＡインターフェレース認識配列を認識する。別の実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡインターフェレース認識配列は、アデニン−シトシン−アデニンである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドは原核生物ポリペプチドである。別の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドはＭａｚＦである。別の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＢＡＫ欠損性、ＮＢＫ／ＢＩＫ欠損性、またはＢＡＫ欠損性であり、ＮＢＫ／ＢＩＫ欠損性である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下の定義は、本発明のパラメーターについて述べる。
略号「ＡＣＡ」は、アデニン−シトシン−アデニンの配列を指す。
本明細書で使用する場合の用語「アポトーシス」は、個々の細胞が、周辺領域中に有害な物質を放出することなく、整然と非常に制御されて死滅する、プログラムされた一連の事象を伴う正常な細胞過程を指す。これは、不可逆的な傷害に続く変性現象であるもう１種の細胞死、壊死とは異なる。アポトーシス細胞は、カスパーゼの名で知られるシステイン・プロテアーゼのファミリーが編成する特定の形態的・生化学的変化を特徴とし得る。形態的には、アポトーシスには、核クロマチンおよび細胞質の凝縮、核の断片化、および細胞全体の出芽が伴い、そのため当初は無傷の細胞小器官が含まれる膜結合体が生成する。こうした結合体は、炎症を起こさずに隣接細胞によって処理される。生化学的には、アポトーシスでは、壊死で認められるランダムなＤＮＡ分解と異なり、ヌクレオソーム間での特徴的なＤＮＡ切断が起こる。
【００１３】
分子レベルでは、アポトーシスは厳密に調節されている。アポトーシス細胞死を起こす主要経路には２経路、即ち死滅受容体経路（外因経路とも呼称される）およびミトコンドリア（内因）経路がある。死滅受容体経路には、死滅受容体、即ち、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体１や膜結合細胞表面Ｆａｓ受容体などの、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）／ＮＧＦ（神経成長因子）受容体スーパーファミリー（Ｔｉｍｍｅｒ等、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９６（２）：１２５〜３４頁（２００２）により総説されている）に属する少なくとも５種の膜貫通受容体の１種と、そのリガンドとの相互作用が関与していると考えられている。
【００１４】
Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進およびアポトーシス抑制構成員は、ミトコンドリアの関与に依存する、第２経路またはミトコンドリア経路を調節すると考えられている。ミトコンドリア経路は、ミトコンドリア膜の透過およびシトクロムｃの放出により媒介される。細胞ストレスによって、アポトーシス促進Ｂｃｌ−２ファミリー構成員は、細胞質ゾルからミトコンドリアへ転位するように誘導された後、そこでシトクロムｃの放出を誘発する一方で、アポトーシス抑制Ｂｃｌ−２タンパク質は、ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を妨げるように作用することにより、細胞の生存を維持する。細胞質中に放出されるや、シトクロムｃは、アポトーシス・プロテアーゼ活性化因子１のオリゴマー化を触媒し、それによりプロカスパーゼ−９の活性化を促進し、次いでプロカスパーゼ−３を活性化する。ミトコンドリア膜の透過性および内因アポトーシス経路の機能には、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫが必要とされる。ミトコンドリア関連機能以外に、ＢＡＸおよびＢＡＫはまた、小胞体（ＥＲ）に局在し、カスパーゼ（カスパーゼ−１２）活性化およびアポトーシスの並行経路を開始する。（Ｚｏｎｇ等、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６２（１）：５９〜６９頁（２００３））。
【００１５】
代替的には、腫瘍壊死因子受容体１およびＦａｓ受容体のような死滅受容体の連結反応により、プロカスパーゼ−８の活性化が起こる。その成熟カスパーゼは、プロカスパーゼ−３を直接活性化するか、またはアポトーシス促進ＢＨ３限定タンパク質のＢＩＤを切断した後、シトクロムｃ放出を誘発する場合がある。大部分の細胞は、この外因経路を増幅するために、ＢＩＤが媒介するＢＡＸおよびＢＡＫの活性化を使用する。
【００１６】
両経路の最終結果は、カスパーゼ活性化および特定の細胞基質の切断であり、その結果、アポトーシス表現型に関連する形態的・生化学的変化が生じる。
本明細書で使用する場合の用語「異常アポトーシス」とは、過剰アポトーシスまたはアポトーシスの不全を指す。異常アポトーシスは、有害となる場合があり、多様な疾患、障害、症候群、異常状態または傷害を起こし、またはその一因となる恐れがある。例えば、異常アポトーシスは、限定するわけではないが、癌、自己免疫障害、ハンチントン病、アルツハイマー病を含む神経変性障害、および卒中に関係してきた。
【００１７】
本明細書で使用する場合の用語「疾患」または「障害」とは、健康の障害または異常な機能状態を指す。本明細書で使用する場合の用語「症候群」とは、何らかの疾患または異常状態を示す症状のパターンを指す。本明細書で使用する場合の用語「傷害」とは、物理的、化学的を問わず、外部作用剤または外力が起こす、身体の構造または機能に対する損傷または危害を指す。本明細書で使用する場合の用語「異常状態」とは、多様な健康状態を指し、任意の基因となる機構、障害または傷害で起こる障害または疾患を包含することを意図している。
【００１８】
本発明は、標的哺乳動物細胞におけるアポトーシスを選択的（別種または他種に優先して選ぶ、即ち選び出すことを意味する）に調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的哺乳動物細胞においてアポトーシスを抑制するために使用される。いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、ウィルス、細菌、真菌、寄生虫またはプリオンなどの病原体（細胞の正常な生理状態を撹乱し、疾患の症状を起こす作用剤を意味する）に感染させることができる。いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は分化細胞である。いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、転移性腫瘍細胞を含めた腫瘍細胞であるが、それだけに限らない。いくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、遺伝的損傷細胞、即ち、細胞損傷の種類が、子孫に引き継がれる変化を起こすような細胞である。いくつかの実施形態では、該標的細胞は毒素損傷細胞であり、生体組織中に導入すると毒性を示す（生命にとって有毒、発癌性またはそれ以外で直接有害であることを意味する）天然または合成物質に曝され、損傷された細胞を意味する。いくつかの実施形態では、該標的細胞は異常アポトーシスを示す免疫細胞であり、本発明の方法は、正常な免疫系機能を回復するために使用される。
【００１９】
用語「拮抗剤」および「阻害剤」は、本明細書では互換的に使用され、別の作用剤の効果を防止、低減、阻止、中和または相殺する作用剤を指す。
用語「Ｂｃｌ−２タンパク質」（「Ｂ細胞リンパ腫２タンパク質」）とは、アポトーシス経路の１種または複数の成分の活性を調節する、膜貫通タンパク質のファミリーを指す。理論に拘るわけではないが、その主要な作用機構は、ミトコンドリア膜の透過性の調節であると考えられる。このファミリーの構成員の一部はアポトーシス促進的であるが、他のものはアポトーシス抑制的である。本明細書で使用する場合の用語「アポトーシス促進的」とは、細胞死を促進する活性、成分または効果を指す。Ｂｃｌ−２スーパーファミリーのアポトーシス促進的構成員は、ミトコンドリア膜の透過性を増加させると考えられている。本明細書で使用する場合の用語「アポトーシス抑制的」とは、少なくとも部分的にミトコンドリア膜の透過性のこの増加に抗することによって、アポトーシスを抑制する活性、成分および効果を指す。Ｂｃｌ−２ファミリーは、ＢＣＬ−２相同性（またはＢＨ）として知られているいくつかの相同領域を共有する、３つのサブファミリーに分類される。アミノ末端（Ｎ）から始め、左側から右側へＣ末端（Ｃ）に向かって移動すると、該ＢＨ領域は、以下のように
Ｎ−ＢＨ４−ＢＨ３−ＢＨ１−ＢＨ２−ＴＭ−Ｃ
と配置されており、式中ＴＭは膜貫通横断領域を指す。Ｂｃｌ−２サブファミリーには、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗおよびＭＣＬ−１が含まれるが、それだけに限らない。そうしたものは、アポトーシス抑制的であり、細胞の生存を促進する。
【００２０】
本明細書で使用する場合の用語「Ｍｃｌ−１」（骨髄性細胞白血病配列１）とは、ヒト骨髄性白血病細胞から元々単離されたＢｃｌ−２関連のアポトーシス抑制タンパク質を指す。
【００２１】
ＢＨ３限定タンパク質は、（１）ＢＡＸおよびＢＡＫを活性化し、（２）ＢＣＬ−２のようなアポトーシス抑制タンパク質に拮抗して、アポトーシスを誘発する。Ｂｃｌ−２タンパク質のＢＡＸサブファミリーには、ＢＡＸおよびＢＡＫが含まれる。こうしたタンパク質は、アポトーシス促進的であり、細胞死を促進する。該タンパク質は、ＢＨ１、ＢＨ２およびＢＨ３領域でＢｃｌ−２サブファミリーと配列相同性を示すが、ＢＨ４領域では異なる。Ｂｃｌ−２との広範な配列相同性のために、ＢＡＸはＢｃｌ−２とヘテロ二量体を形成することができる。ＢＡＸのホモまたはヘテロ二量体は、Ｂｃｌ−２のアポトーシス抑制活性を抑える。
【００２２】
ＢＨ３限定サブファミリーには、細胞死を促進するアポトーシス促進タンパク質である、ＢＡＤおよびＢＩＤタンパク質が含まれる。該タンパク質は、ＢＨ３領域でＢｃｌ−２サブファミリーと配列相同性を共有するに過ぎない。ＢＩＤは、膜貫通横断領域も欠如している。
【００２３】
用語「Ｂｉｍ」とは、ＢＨ１〜３マルチドメインタンパク質であるＢＡＸまたはＢＡＫの活性化を介して、アポトーシスのミトコンドリア経路で必須の役割を演じる、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進構成員を指す。
【００２４】
「ＮＢＫ／Ｂｉｋ」とは、「生来のキラー／Ｂｃｌ−２相互作用キラー（ｎａｔｕｒａｌ  ｂｏｒｎ  ｋｉｌｌｅｒ／Ｂｃｌ−２  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｋｉｌｌｅｒ）」を意味し、アポトーシス促進Ｂｃｌ−２関連タンパク質を指す。
用語「ＰＵＭＡ」（「アポトーシスのｐ５３上方制御モジュレーター（ｐ５３−Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」）とは、ｐ５３の下流およびｐ５３欠損細胞で機能する、ｐ５３のアポトーシス促進ＢＨ３限定転写標的を指す。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷または他の細胞ストレスに応答して細胞周期の停止またはアポトーシスを誘発する遺伝子の転写を促進する、細胞周期関連の転写因子であって腫瘍抑制剤である。大部分の証拠は、アポトーシス誘発機構としてＰＵＭＡのｐ５３への結合を支持していない。
【００２５】
次の表（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎ、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、３０６（３）：３４７〜６１頁（２００１）およびＺｈａｎｇ等、Ｈｕ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０（２１）：２３２９〜３９頁（２００１）を改変した）は、既知のｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのまとめである。
【表１】
2009505656.tif 000003
【００２６】
本明細書で使用する場合の用語「カスパーゼ」とは、アスパラギン酸残基のまさしくＣ末端部位でタンパク質を選択的に切断し、夥しい細胞タンパク質の切断によりアポトーシス中の細胞の破壊を担当している、システイン・プロテアーゼのファミリーを指す。カスパーゼは、不活性プロカスパーゼとして合成された後、タンパク分解的切断により活性カスパーゼに活性化される。アポトーシス促進調節剤（例えば、ＢＡＸ）は、カスパーゼ活性化を促進する。
【００２７】
用語「ｃＤＮＡ」とは、逆転写酵素という酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成される１本鎖の相補またはコピーＤＮＡを指す。この１本鎖ｃＤＮＡは、対象とするＤＮＡ断片または遺伝子における相補配列を同定するプローブとして、しばしば使用される。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「分化細胞」（単一）または「分化細胞」（複数）とは、特定の機能を専門とし、他種の細胞を生成する能力を維持しておらず、または専門性のより低い細胞に戻ることのない細胞を指す。そうした細胞には、それだけに限らないが、筋細胞（即ち、機械的力の生成に特化している細胞）、腎尿細管細胞、肺（胞）細胞、甲状腺細胞、膵細胞、血球（それだけに限らないが、赤血球、白血球（リンパ球、マクロファージおよび好中球を含む）および血小板を含む）、グリア細胞、神経細胞またはニューロン（即ち、情報伝達に特化している細胞）、ならびに感覚細胞（外部刺激を検知する細胞、例えば内耳の有毛細胞、眼の網膜桿状体細胞）が挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、指定した核酸に関する用語「コードする」、「コードしている」または「コードされる」とは、指定したタンパク質に翻訳される、核酸中に保存されている情報を指す。タンパク質をコードする核酸は、その核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含み得るし、または介在するそのような非翻訳配列を欠く場合もある（例えば、ｃＤＮＡの場合）。タンパク質をコードする情報は、コドンの使用によって指定される。通常、アミノ酸配列は、「普遍的」遺伝暗号を用いて核酸によりコードされる。
【００３０】
コードされた配列中で単一アミノ酸または小比率のアミノ酸を変更、付加または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または付加が、その変更により、化学的に類似したアミノ酸によるあるアミノ酸の置換が起こる「保存的に修飾された変異体」であることは、当業者であれば認識されよう。用語「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列、核酸配列の双方に当てはまる。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体とは、当該アミノ酸配列の同一の変異体または保存的に修飾された変異体をコードする核酸を指す。遺伝暗号の縮重のために、機能的に同一な多数の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡおよびＣＵＧの各コドンはすべて、アミノ酸のロイシンをコードする。したがって、あるコドンがロイシンを指定するあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変更することなく、そのコドンを前記の対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸変異体は、「静的（ｓｉｌｅｎｔ）変異体」であり、保存的に修飾された変異体の１種を表す。あるポリペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列によっても、遺伝暗号を参照することにより、その核酸のありとあらゆる静的変異体が記述される。核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＵＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を生じるように改変できることは、当業者であれば認識されよう。したがって、本発明のポリペプチドをコードする核酸の各静的変異体は、本発明の範囲に入る。
【００３１】
本発明は、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの活性部分、断片、誘導体、変異体および機能的変異体を、このような活性部分、断片、誘導体および機能的変異体が、ｍＲＮＡインターフェレースの生物学的性質のいずれかを保持する程度まで包含する。ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペプチドの「活性部分」とは、全長ポリペプチドより短いが、測定可能な生物活性を保持しているペプチドを意味する。ｍＲＮＡインターフェレースの「断片」とは、少なくとも５〜７個の隣接アミノ酸、しばしば少なくとも約７〜９個の隣接アミノ酸、通常は少なくとも約９〜１３個の隣接アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０〜３０個以上の隣接アミノ酸からなる、アミノ酸残基の長さを意味する。ｍＲＮＡインターフェレースの「誘導体」またはその断片とは、当該タンパク質のアミノ酸配列の変更、例えば、該タンパク質をコードする核酸の操作、または該タンパク質自体の改変により修飾されるポリペプチドを意味する。天然アミノ酸配列のこのような誘導体は、１個または複数のアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換を伴う場合があり、元のｍＲＮＡインターフェレースの必須活性を改変することも、改変しないこともある。
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼは、本明細書でＧＡＰＤＨと略記される。
【００３２】
用語「遺伝子」とは、ＤＮＡのセグメント上にある特定の位置に配置され、特定の機能的産物（即ち、タンパク質またはＲＮＡ分子）をコードする、規則的なヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、コードＤＮＡに先行し、後続する各領域、ならびにエキソン間のイントロンを含むことができる。
【００３３】
本明細書で使用する場合の用語「免疫細胞」とは、侵入体から対象を防御する過程で、メッセンジャー、調節剤またはヘルパーを促し、警告し、促進し、活性化し、包囲し、死滅させ、一掃し、または合成・分泌する、免疫系の細胞を指し、それには、スカベンジャー細胞（例えば、単球／マクロファージ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびリンパ球（それだけに限らないが、Ｂ細胞およびＴ細胞を含む）が含まれるが、それだけに限らない。
【００３４】
用語「誘導する」または「誘導可能な」とは、ある誘導因子または状態に対する当該細胞の曝露により、転写または合成が増加する遺伝子または遺伝子産物を指す。
用語「誘導因子」または「誘導剤」とは、リプレッサー・タンパク質と結合することにより、オペレーターともはや結合できない複合体を産生する、低分子量化合物または物理的作用剤を指す。
【００３５】
核酸を細胞内に挿入することに関する用語「導入される」、「トランスフェクション」、「形質転換」、「形質導入」は、核酸の原核細胞または真核細胞中への組み込みの指示を包含し、細胞内で核酸は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）中に組み込まれ、自律的レプリコンに変換され、あるいは過渡的に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）場合がある。
【００３６】
用語「単離される」とは、天然環境中で見出されたときには通常、付随または相互作用している成分が、実質的に含まれていない核酸やタンパク質などの物質を指す。該単離物質は、自然環境中のその物質では見出されない物質を含んでもよい、または、該物質が自然環境中にあるとしても、該物質は、人間の慎重な介入によって合成的（非自然的）に改変されたものである。例えば、「単離核酸」は、プラスミドやウィルスベクターなどのベクター中に挿入されている、あるいは原核もしくは真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれているＤＮＡ分子を包含し得る。ＲＮＡに適用した場合、「単離核酸」とは、前記のように単離されたＤＮＡ分子がコードするＲＮＡ分子を主に指す。あるいは、この用語は、自然状態（即ち、細胞または組織中）では概して結合している相手の他の核酸分子から十分に分離されたＲＮＡ分子を指してもよい。単離核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれか）は、さらに、生物的または合成的手段で直接生成され、その生成中に存在する他の成分から分離された分子を表してもよい。
【００３７】
本明細書で使用する場合の用語「ＭａｚＥ」とは、ＭａｚＦのエンドリボヌクレアーゼ活性、ならびに本発明におけるＭａｚＦポリペプチドの役割と合致したそれとの構造および配列相同性を有する、その活性な断片および誘導体の前記活性に拮抗する、抗毒素の一般クラスを指す。
【００３８】
本明細書で使用する場合の用語「ＭａｚＦ」とは、エンドリボヌクレアーゼの一般クラスを指し、その特定名称を有する特定酵素、ならびに本発明におけるＭａｚＦポリペプチドの役割と合致したそれとの構造および配列相同性を有する、その活性な断片および誘導体を指す。
【００３９】
本発明が包含する酵素のファミリーは、「ｍＲＮＡインターフェレース」と呼称される。本発明は、本発明におけるこのファミリーの役割と合致した構造的および機能的類似性を有する分子まで拡張されることを意図している。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」または「核酸分子」は、１本鎖、２本鎖を問わず任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を包含し、１本鎖の場合、線状、環状いずれの形態のその相補配列の分子も包含する。核酸分子を考察する際、特定の核酸分子の配列または構造は、本明細書では、５’から３’方向に配列を示す通常の慣行に従って記述し得る。別途限定しない限り、この用語は既知の類縁体を包含する。
【００４１】
用語「オペレーター」とは、遺伝子（複数も）から上流（５’）にあり、１種または複数の調節タンパク質（リプレッサーまたはアクチベーター）の結合を受けて遺伝子（複数も）の発現を制御する、ＤＮＡの領域を指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「オペロン」とは、遺伝子発現を制御するための機能的に統合された遺伝単位を指す。それは、１種または複数のポリペプチドをコードする１種または複数の遺伝子、および該構造遺伝子の転写を調節することにより、その発現を制御する隣接部位（プロモーターおよびオペレーター）からなる。用語「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写および翻訳制御配列を有し得るもので、宿主の細胞または生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する、核酸セグメントを指す。
【００４３】
語句「作動的に連結される」とは、プロモーターと第２の配列との機能的連結の指示を包含し、その場合プロモーター配列は、第２の配列に相当するＤＮＡ配列の転写を開始し、媒介する。一般に、作動的に連結されるとは、連結し合う核酸配列が、隣接しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、隣接し、しかも同じリーディングフレーム内にあることを意味する。
【００４４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書では互換的に使用される。こうした用語は、天然アミノ酸のポリマーだけでなく、１個または複数のアミノ酸残基が、相当する天然アミノ酸の人工的な化学類縁体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４５】
略称「ＰＣＲ」とは、ポリメラーゼ連鎖反応のことであり、ＤＮＡ量を増幅し、したがってＤＮＡの単離、クローニングおよび配列決定を簡易化する技法である。例えば、その各々が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５６５６４９３号、第５３３６７５号、第５２３４８２４号および第５１８７０８３号を参照されたい。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」とは、転写開始部位より上流（５’）にあり、転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与する、ＤＮＡの領域の指示を含む。用語「誘導プロモーター」とは、特定の化合物、即ち誘導因子もしくは誘導剤の存在、または所定の外部条件、例えば高い温度に応答した、プロモーターの活性化を指す。
【００４７】
本明細書で使用する場合の用語「調節する」とは、何らかの基準もしくは原理により抑制、促進、制御、管理、指示もしくは調整する行為、または抑制、促進、制御、管理、指示もしくは調整される状態を指す。
【００４８】
用語「リプレッサー」は、遺伝子またはオペロンの転写開始部位より上流にある特定のＤＮＡ配列（オペレーター）に結合し、遺伝子をオン・オフにより調節できるタンパク質または作用剤を包含する。
【００４９】
用語「リボソームＲＮＡ」（ｒＲＮＡ）とは、全生存細胞のタンパク質製造機械一式であるリボソームの中心成分を指す。こうした機械は、複数のリボソームタンパク質の存在下、自己組織化して２つの複雑な折畳み構造（大型および小型サブユニット）になる。細菌、古細菌、ミトコンドリアおよび葉緑体では、小型リボソームサブユニットは１６Ｓ  ｒＲＮＡを含有し、１６Ｓ中のＳはスベドベリ単位を表し、大型リボソームサブユニットは、ｒＲＮＡを２種含有する（５Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ）。細菌の１６Ｓ、２３Ｓおよび５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、共同転写オペロンとして通常組織化されている。ゲノム中には、オペロンのコピーが１個または複数分散している場合がある。真核細胞は、縦列反復中に組織化されたｒＲＮＡ遺伝子のコピーを一般に多数有している。大部分の真核生物における１８Ｓ  ｒＲＮＡは、小型リボソームサブユニット中にあり、大型サブユニットはｒＲＮＡを３種含有する（５Ｓ、５．８Ｓおよび２５Ｓ／２８Ｓ  ｒＲＮＡ）。
【００５０】
用語「総ＲＮＡ」には、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」であり、細胞内でＤＮＡからの情報をタンパク質合成のリボソーム部位に運び、その情報をタンパク質に翻訳させるＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（「ｔＲＮＡ」であり、特定のアミノ酸をタンパク質翻訳中に成長中のポリペプチド鎖に転移する小さいＲＮＡ鎖）、リボソームＲＮＡ（「ｒＲＮＡ」）、および非コードＲＮＡ（ＲＮＡ遺伝子または小分子ＲＮＡの名でも知られており、タンパク質に翻訳されないＲＮＡをコードする遺伝子を意味する）が含まれる。
用語「ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動」はＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記される。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「幹細胞」（単一）または「幹細胞」（複数）は、互換的に使用され、自己再生能と共に高い増殖能を有し、傷害領域に移動でき、最終的に複数の異なる細胞表現型へ分化を受けられる娘細胞を生成できる、未分化細胞（特化した、即ち成熟した構造または機能がまったくない細胞を意味する）を指す。
核酸の特定配列の用語「変異体」、「突然変異体」および「誘導体」とは、特定配列と密接に関係しているが、自然にまたは設計によって、配列または構造の変化を有し得る核酸配列を指す。「密接に関係している」とは、配列中のヌクレオチドの少なくとも約６０％であるが、しばしば８５％超が、核酸配列の所定の長さにわたり一致することを意味している。密接に関係している核酸配列間のヌクレオチド配列の変化または差異は、特定の核酸配列の自然界での正常な反復または複製の過程中に起こる、配列内ヌクレオチド変化を表す場合もある。他の変化は、特定の設計を受け、特定の目的のために配列中に導入される場合もある。このような特定の変化は、多様な変異形成技法を用いてインビトロで起こし得る。特定して生成したこのような配列変異体は、元の配列の「突然変異体」または「誘導体」と呼称してもよい。
【００５２】
同様に、当業者は、アミノ酸の１個または複数の置換、欠失、付加または代替を有するタンパク質変異体を作製することができる。こうした変異体は、特に（ａ）１個または複数のアミノ酸残基が、保存的または非保存的アミノ酸で置換されている変異体、（ｂ）１個または複数のアミノ酸が付加されている変異体、（ｃ）少なくとも１個のアミノ酸が置換基を含んでいる変異体、（ｄ）１つの種由来のアミノ酸残基が、別の種における対応残基の代わりに保存的または非保存的位置に置換されている変異体、および（ｄ）標的タンパク質が、融合相手、タンパク質タグ、または他の化学成分などの標的タンパク質に有用な性質を付与し得る別のペプチドまたはポリペプチド、例えば、抗体に対するエピトープなどと融合している変異体を包含し得る。遺伝的（抑制、欠失、突然変異など）、化学的および酵素的技法を含めた、このような変異体を得る技法は、当業者に公知である。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」および「発現ベクター」とは、レプリコン、即ち、ファージ、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、ウィルスなどの担体または輸送体として作用する任意の作用剤を指し、それに遺伝子の別の配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を結合することにより、結合した配列または要素の複製を起こし、さらに配列または要素を宿主細胞中に搬送することができるようにし得る。
【００５４】
本明細書および付属の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の指示をしない限り、複数の指示対象を包含する。本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、同一の意味を有する。
【００５５】
別途定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の技術者が共通に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または等価な任意の方法および材料も、本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料を今から説明する。本明細書に記載のすべての刊行物は、引用した刊行物と関係するその方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれている。
【００５６】
［実施例］
以下の実施例は、当業者に本発明を作製し、使用する次第に関する完全な開示および説明をするために提示しているのであって、本発明者等が想定している自らの発明の範囲を限定する意図もないし、以下の実験が実施した実験のすべてまたはそれだけであることを表す意図もない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関しては正確さを保証することに努めたが、ある程度の実験上の誤差および偏差を考慮すべきである。別途指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【実施例１】
【００５７】
材料および方法
プラスミド
クローニング技法は、概して、参照により本明細書に組み込まれているＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）に見出し得る。テトラサイクリン誘導ＭａｚＦ発現プラスミドのｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍａｚＦは、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位中にＭａｚＦコード領域を挿入することにより構築した。ＭａｚＥ発現プラスミドのｐｃＤＮＡ３／ｍａｚＥは、ＭａｚＥコード領域とＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）との連結により創製した。ｐｃＤＮＡ６／Ｈｉｓ／ＬａｃＺプラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。
【００５８】
細胞系
不死化ベビーマウス腎（「ｉＢＭＫ」）細胞系（Ｗ２）、ならびに同系のｂａｘ−／−でｂａｋ−／−（Ｄ３）、ｂａｘ−／−（Ｘ２）およびｂａｋ−／−（Ｋ１）の細胞系（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２：１９３〜２０３頁（２００２）；Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４１２７〜１４１３４頁（２００２））は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中３８．５℃で増殖させた。ＭａｚＦ単独を安定に発現するか、またはＭａｚＦと共にＭａｚＥを共発現するヒト胎児腎細胞系（Ｔ−Ｒｅｘ−２９３）を樹立するために、テトラサイクリン・リプレッサー発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ）を安定にトランスフェクトしたＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）により製造業者の教示に従って、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍａｚＦおよびｐｃＤＮＡ３、またはｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍａｚＦおよびｐｃＤＮＡ３／ｍａｚＥで共トランスフェクトして、以下のように選択した：ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ；５μｇ／ｍｌブラスティサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍａｚＦ；４０μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびｐｃＤＮＡ３／ｍａｚＥ；０．５μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、さらにリングクローニング。個々のクローン１個を分析用に選択した。２つの細胞系、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）およびＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）は、ゼオシン４０μｇ／ｍｌ、ブラスティサイジン５μｇ／ｍｌおよびジェネティシン０．５μｇ／ｍｌを含有する１０％ウシ血清−ＤＭＥＭ中に維持した。
【００５９】
トリパンブルー排除法
Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞の生存率は、前記したようにトリパンブルー排除法によって決定した（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４１２７〜１４１３４頁（２００２））。Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）細胞およびＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞は、テトラサイクリン処理前に２４時間培養し、次いでテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌの存在下または非存在下の３７℃で０、２４、４８および７２時間インキュベートした。処理後、上清と付着細胞とを遠心分離することにより細胞を集め、トリプシン処理により採集した。細胞を０．１％トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む新鮮培地５００μｌ中に再懸濁した後、血球計数器で計数することにより、死滅青色細胞数および計数した全細胞数を評価した。アポトーシス細胞死の対照として、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞をテトラサイクリン処理と同時に同じ期間、１μＭスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で処理した。
【００６０】
β−ガラクトシダーゼ・アッセイ
ＬａｃＺおよびＭａｚＦを共発現するｉＢＭＫ細胞の生存率を決定するためのβ−ガラクトシダーゼ・アッセイを、以前に記載のように行った（Ｈａｎ，Ｊ．、Ｓａｂｂａｔｉｎｉ，Ｐ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：５８５７〜５８６４頁（１９９６））。ｐｃＤＮＡ６／Ｈｉｓ／ＬａｃＺ、およびｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍａｚＦまたはｐｃＤＮＡ３で共トランスフェクトしたＷ２、Ｄ３、Ｘ２およびＫ１を１％グルタールアルデヒド中４８時間固定した後、０．２％Ｘ−ｇａｌ溶液で３７℃、２４時間染色した。β−ガラクトシダーゼ陽性青色細胞および全細胞数（細胞約２００個）を６ｃｍ径の皿上で別々に計数した。
【００６１】
ＭＴＴアッセイ
パクリタキセル、ＣＨＸ、またはマウスＴＮＦ−α、ＣＨＸの両方で処理したｉＢＭＫ細胞の生存率を測定するための３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを、以前に記載のように行った（Ｉｏｆｆｅ，Ｍ．Ｌ．等、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６１：２４３〜２４７頁（２００４））。
【００６２】
蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析
テトラサイクリンで０、２４、４８および７２時間処理したＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）細胞およびＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞を、トリプシン処理により採集し、遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳ中に再懸濁した。その細胞を氷冷７０％エタノールで３０分固定し、ヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍｌ）およびＲＮａｓｅ  Ａ（１００μｇ／ｍｌ）で染色した。その細胞をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。
【００６３】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロット分析および免疫蛍光は、以前に記載のように行った（Ｐｅｒｅｚ，Ｄ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４１：１２５５〜１２６６頁（１９９８）；Ｐｅｒｅｚ，Ｄ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６：５３〜６３頁（２０００））。用語「ウェスタンブロット」とは、複雑な混合物中のタンパク質を同定する方法を指し、該方法では、タンパク質をゲル媒体中で電気泳動により分離し、そのゲルからタンパク質結合性のシートまたは膜へ移し、次いで結合する特異抗体に曝した、分離タンパク質を含有する該シートまたは膜が、対象とするタンパク質（複数も）を位置づけ、その可視化を可能とする。Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）およびＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞を、テトラサイクリンまたはスタウロスポリンで処理してから０、２４、４８および７２時間後に掻き取りおよび遠心分離により採集した。細胞ペレットはすべて、２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解させた。細胞溶解物を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動に掛けた後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上へ移した。そのブロットは以下の抗体と共にインキュベートした。即ち、抗活性カスパーゼ−３ウサギ・ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、抗ＢＡＸ抗ＢＡＫウサギ・ポリクローナル抗体（ＮＴ）（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）、抗ＢＩＤヤギ・ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、抗Ｂｉｍウサギ・ポリクローナル抗体（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、抗ＢＣＬ−２ハムスター・モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、抗ＢＣＬ−ＸＬマウス・モノクローナル抗体（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、抗ＭＣＬ−１ウサギ・ポリクローナル抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｃａｎａｄａ）、抗ＰＡＲＰマウス・モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、抗ＰＵＭＡウサギ・ポリクローナル抗体（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１８：２０９５〜２１０７頁（２００４））、抗Ｅ１Ａモノクローナル抗体、抗アクチン・モノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）および抗Ｘｐｒｅｓｓモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ヒトＮＢＫ／ＢＩＫに対する抗体は、Ｎ末端７８アミノ酸領域をコードするＧＳＴタグ付きヒトＮＢＫ／ＢＩＫ融合タンパク質の細菌における発現、およびウサギの免疫（Ｃｏｃａｌｉｃｏ）によって生成した。ウェスタンブロットは、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体で発色させた。
【００６４】
免疫蛍光
ｐｃＤＮＡ６／Ｈｉｓ／ｌａｃＺとｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍａｚＦまたはｐｃＤＮＡ３とのプラスミドの組合せで電気穿孔によりトランスフェクトしたＷ２、Ｄ３、Ｘ２およびＫ１を、カバーグラス上で２４時間増殖させ、１００％メタノール中−２０℃で１０分固定した。１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中３７℃で１時間ブロッキングした後、カバーグラス上の細胞を抗活性カスパーゼ−３ウサギ・ポリクローナル抗体および抗Ｘｐｒｅｓｓマウス・モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共に３７℃、１時間インキュベートし、その後ローダミン結合抗ウサギＩｇＧおよびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体と共に３７℃、１時間インキュベートした。染色は、落射蛍光光学系を備えたＮｉｋｏｎ  ＦＸＡ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｇａｒｄｅｎ  Ｃｉｔｙ、ＮＹ）によって可視化した。活性カスパーゼ−３が陽性の細胞の比率（％）を、各カバーグラス上の細胞５０〜１００個採点することにより決定した。
【００６５】
ＲＮＡ分析
ノーザンブロット分析および実時間ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、以前に記載のように行った（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３）；Ｃｕｃｏｎａｔｉ，Ａ．等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：２９２２〜２９３２頁（２００３））。テトラサイクリン処理（０、２４、４８および７２時間）または非処理（０、２４、４８および７２時間）のＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）およびＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞からの総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて単離した。ノーザンブロット分析のために、各条件からの総ＲＮＡ１０μｇをホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動に掛けた後、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ膜（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）上に移した。そのブロットを３２Ｐ標識ヒトＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンのｃＤＮＡとハイブリッド形成した。総ＲＮＡ１００ｎｇをＴａｑｍａｎ  ＥＺ−ＲＴ  ＰＣＲキット（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により、製造供給元が示した推奨条件を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに掛けた。ヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの量を分析するプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手し、ＧＡＰＤＨ用プローブは、リポーター色素２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）への５’連結、および消光剤６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＵＲＡ）への３’連結によって得た。β−アクチン・プライマー配列は、５’−ＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴ−３’および５’−ＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴ−３’であった。β−アクチン・プローブ配列は、ＦＡＭ−５’−ＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣＣ−３’−ＴＡＭＵＲＡであった。反応は３回繰り返して行い、ヒトＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンのｍＲＮＡ相対量は、２４、４８および７２時間の試料における蛍光シグナルを対応する０時間試料と比較した差異から算出した。
【００６６】
３５Ｓ−メチオニン代謝標識
Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）およびＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞をテトラサイクリン含有完全ＤＭＥＭ中、０、２４および４８時間インキュベートした後、３５Ｓ−メチオニン１０μＣｉ／ｍｌを含有する新鮮なメチオニン非含有ＤＭＥＭ中、１時間インキュベートした。次いで、その細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛けた後、オートラジオグラフィーおよびクマシー・ブルー染色を行った。シグナル強度をＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ  ＳＴＯＲＭ  ８６０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって測定した。
【実施例２】
【００６７】
ＭａｚＦは哺乳動物細胞において細胞ｍＲＮＡの分解を誘発する。
大腸菌においては、ＭａｚＦは、ｍＲＮＡインターフェレースとして機能することにより、細胞ｍＲＮＡを切断するが、抗毒素ＭａｚＥは、ＭａｚＦのエンドリボヌクレアーゼ活性に拮抗する（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３））。こうした知見に促されて、ＭａｚＦが哺乳動物細胞においてエンドリボヌクレアーゼとして機能するか否かという疑問を探索した。このために、Ｔｅｔリプレッサーを安定に発現するＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞におけるテトラサイクリン（Ｔｅｔ）誘導性ＭａｚＦ発現系を、Ｔｅｔ誘導性ＭａｚＦ発現プラスミドのｐｃＤＮＡ３または構成的ＭａｚＥ発現プラスミドとの共トランスフェクションにより発生させた。ＭａｚＦまたはＭａｚＥコード領域に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、樹立Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞系におけるＭａｚＦ  ｍＲＮＡのＴｅｔ依存的発現およびＭａｚＥの構成的発現（遺伝子が、発現に対する制御を受けずに継続的に発現することを意味する）が実証された（データは示していない）。このシステムを使用して、細胞ｍＲＮＡが、ＭａｚＦ発現を誘発した際に哺乳動物細胞中で分解するか否かを最初に調べた。
【００６８】
細胞ｍＲＮＡ量を評価するために、Ｔｅｔ処理または非処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞の全細胞から総ＲＮＡを単離し、ヒトＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンのｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析に掛けた。本明細書で使用する場合の用語「ノーザンブロット」とは、試料からのＲＮＡを電気泳動によりゲル上で成分部分に分離し、特定の変性をした支持体紙に移すことにより、そのｍＲＮＡを電気泳動時の位置に固定する技法を指す。次いで、追求している特定の該ｍＲＮＡに相補的な標識した１本鎖ＤＮＡ断片を、その結合ｍＲＮＡとハイブリッド形成させ、標識を適当な手段で検出する。ＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンの遺伝子がハウスキーピング遺伝子であることが知られており、両ｍＲＮＡが豊富に存在し、いずれも多様な条件下で安定であるため、ＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンのｍＲＮＡを、ＭａｚＦの標的として選定した。その上、ＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンのｍＲＮＡは、タンパク質コード領域中にＭａｚＦ切断の標的となるＡＣＡ配列を各々２０個および２２個有している（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３））。
【００６９】
図１に示すように、ＭａｚＦ発現は、哺乳動物細胞において細胞ｍＲＮＡの分解を起こす。パネル（Ａ）は、ヒトＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンのノーザンブロット分析を示す。表示した時点におけるＴｅｔ処理または非処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞からの総ＲＮＡを、ヒトＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンの３２Ｐ標識ｃＤＮＡで探した。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、アガロース−ホルムアルデヒド・ゲル電気泳動の後、臭化エチジウム染色を行うことにより可視化した。パネル（Ｂ）はｍＲＮＡ量の定量を示す。ヒトＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンのｍＲＮＡ量は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量した。ｍＲＮＡの相対量は、２４時間、４８時間および７２時間の試料における蛍光シグナルを、対応する０時間試料と比較して計算した。
【００７０】
このデータから、ＧＡＰＤＨ、β−アクチンの両ｍＲＮＡ量は、２４時間後のＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）細胞において激減し、ＭａｚＦの誘導後４８時間までにほぼ完全に消失することが明らかとなった（図１Ａ）。対照的に、両ｍＲＮＡ量は、ＭａｚＥのＭａｚＦとの共発現によって、Ｔｅｔ非処理対照と同様に誘導期間を通して維持されていた（図１Ａ）。ＡＣＡ配列を各々２個含んだヒトＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンのｃＤＮＡ配列を増幅するために、特異的プライマーを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによっても同じ結果が得られた（図１Ｂ）。このデータから、７２時間のＭａｚＦ誘導時に両ｍＲＮＡは顕著に減少する（＞９０％）が、ＭａｚＥ、ＭａｚＦの両方を発現する細胞では、Ｔｅｔ非処理対照と同様に両ｍＲＮＡ量が一定に維持されることが明らかとなった。さらに、７２時間ＭａｚＦを発現しても、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの量は変化しない（図１Ａ）ことは注目に値し、細胞内のリボソームタンパク質と相互作用するリボソームＲＮＡは、ＭａｚＦによる分解から保護し得ることを示した。まとめると、こうしたデータは、ＭａｚＦが、ＡＣＡ配列含有細胞ｍＲＮＡを特異的に除去するが、リボソームＲＮＡは除去しないこと、およびＭａｚＥが、大腸菌細胞で見出されるように、哺乳動物細胞においてもＭａｚＦのエンドヌクレアーゼ機能を中和することを示している（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３））。
【実施例３】
【００７１】
ＭａｚＦは哺乳動物細胞においてタンパク質合成を阻害する。
大腸菌細胞では、ＭａｚＦ誘導は、細胞ｍＲＮＡの分解を介してタンパク質合成の阻害を起こし、ＭａｚＦがタンパク質合成の一般阻害剤であることを示唆する（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３））。そこで、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞におけるＭａｚＦのタンパク質合成に対する効果を調べた。
【００７２】
図２に示すように、ＭａｚＦは哺乳動物細胞においてタンパク質合成を阻害する。パネル（Ａ）はＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞における３５Ｓ−メチオニンの取込みを示す。表示した時点におけるＴｅｔ処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞からの３５Ｓ−メチオニン標識総タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー（左側）に掛け、クマシー・ブルーで染色した（右側）。パネル（Ｂ）は３５Ｓ−メチオニン標識タンパク質の定量を示す。パネル（Ａ）のゲル上のタンパク質バンドをＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ  ＳＴＯＲＭ  ８６０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により走査し、シグナル強度を計算した。
【００７３】
ＭａｚＦ誘導後０、２４および４８時間における３５Ｓ−メチオニンの取込みに関して評価した、Ｔｅｔ処理したＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）およびＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞からの全細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、タンパク質合成が早くも２４時間で顕著に阻害されることが実証された（図２Ａ）。対照的に、ＭａｚＥの共発現は、ＭａｚＦのタンパク質合成に対する阻害効果を明瞭に妨げた（図２Ａおよび図２Ｂ）。さらに、３５Ｓ−メチオニンの取込みの喪失は、総タンパク質量が４８時間の誘導期間にわたって一定を保っているので、ＭａｚＦ発現細胞における細胞タンパク質の全般的喪失によるものではなかった（図２Ａ）。このデータは、ＭａｚＦが、タンパク質合成の阻害剤として機能すること、およびＭａｚＥが、大腸菌細胞で見出されるように、哺乳動物細胞においてＭａｚＦによるタンパク質合成の阻害を抑制することを示している（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３））。
【実施例４】
【００７４】
ＭａｚＦは哺乳動物細胞においてアポトーシス細胞死を誘発する。
大腸菌細胞では、ＭａｚＦによる配列特異的ｍＲＮＡ干渉が、細胞増殖の急速な停止および最終的な細胞死を起こす（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜９２３頁（２００３））。そこで、ＭａｚＦ発現、ｍＲＮＡ除去およびタンパク質合成の阻害が哺乳動物細胞の増殖および生存率に及ぼす影響を調べた。
【００７５】
図３は、ＭａｚＦが、哺乳動物細胞におけるアポトーシス細胞死を誘発することを示す。パネル（Ａ）は、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３のＴｅｔ処理細胞またはＴｅｔ非処理細胞の位相差写真（倍率１００倍）を示す。パネル（Ｂ）は、（Ａ）のＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞の生存率分析を示す。表示した時点におけるＴ−Ｒｅｘ−２９３のＴｅｔ処理細胞または非処理細胞は、トリパンブルー排除に掛けた。生存率は、０時間における全細胞の比率（％）として表した。パネル（Ｃ）は、ＦＡＣＳで測定した、Ｔｅｔ処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞中のヨウ化プロピジウム標識の代表的例示である。パネル（Ｄ）は、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞の溶解物のウェスタンブロット分析である。表示した時点におけるＴｅｔ処理またはスタウロスポリン処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞の全細胞溶解物を、抗活性カスパーゼ−３抗体（上部）、抗ＰＡＲＰ抗体（中央）および抗アクチン抗体（下部）で免疫ブロットした。
【００７６】
Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞におけるＭａｚＦの誘導は、ＭａｚＦ誘導の経過中に細胞蓄積を停止させ、進行性の細胞変性効果（ＣＰＥ）（細胞の退行性変化を意味する）を誘発した（図３Ａ）。注目すべきことに、付着細胞数はＭａｚＦの誘導後７２時間に激減した（図３Ａ）。対照的に、ＭａｚＥをＭａｚＦと共発現させた細胞では、細胞数および形態が、ＭａｚＦ誘導をしない細胞と同様に維持された（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３  Ｔｅｔ（−）およびｍａｚＦ／ｍａｚＥ  Ｔｅｔ（−））（図３Ａ）。したがって、ＭａｚＥは、哺乳動物細胞に対するＭａｚＦの傷害作用を中和することができる。
【００７７】
ＭａｚＦを発現するＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞の生存率は、トリパンブルー排除により定量した。ＭａｚＦ発現を誘発した場合、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）細胞の生存率は顕著に低下した（図３Ｂ）。対照的に、ＭａｚＥのＭａｚＦとの共発現は、ＭａｚＦ媒介殺滅性に耐性を付与し（図３Ｂ）、ＭａｚＦがないか、またはＭａｚＥだけの細胞も、生存を維持した（図３Ｂ）。生存率も、ＤＮＡ含量を求める蛍光細胞計測法により分析し、こうした結果は、サブＧ１ピークの蓄積が示すＭａｚＦ誘導によるアポトーシス細胞死について、トリパンブルー排除と同じ傾向を示した。Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）のサブＧ１ピークは、Ｔｅｔ処理時間依存的に７２時間の誘導で６５．９％まで増加したが、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）のサブＧ１ピークは、低い値に留まった（７２時間の誘導で１１．４％）（図３Ｃ）。こうしたデータは、ＭａｚＦ毒素が細胞死を誘発すること、およびＭａｚＥ抗毒素が、哺乳動物細胞におけるＭａｚＦ依存的細胞死を妨げることを示している。
【００７８】
ＭａｚＦ誘発性の時間依存的細胞死の誘発は、ヒト細胞２９３個におけるＭａｚＦ誘発性アポトーシスの発生と合致していた。ＭａｚＦにより誘発される細胞死がアポトーシスであることを確認するために、アポトーシス経路における執行カスパーゼの１種、カスパーゼ−３が、ＭａｚＦを発現するＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞内で活性化されているか否かを調べた。切断され、活性化されたカスパーゼ−３を認識する抗体を用いるウェスタンブロット分析により、Ｔｅｔで処理したＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）細胞からの抽出物中に、プロセシングされた活性型カスパーゼ−３が存在することが明らかになった（図３Ｄ）。既知のアポトーシス誘発剤であるスタウロスポリンで処理したＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞からの抽出物中にも、活性カスパーゼ−３が検出された（図３Ｄ）。対照的に、カスパーゼ−３の活性化は、ＭａｚＥのＭａｚＦとの共発現により阻害された（Ｔｅｔ処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞、図３Ｄ）。その上、活性化カスパーゼ−３の基質であるＰＡＲＰの切断も調べた。切断されたＰＡＲＰは、４８時間Ｔｅｔで処理したＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）細胞からの抽出物中に検出され、その量は、スタウロスポリン処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞と同様に、ＭａｚＦの誘導後７２時間にさらに増加した。予想した通り、プロセシングされた活性カスパーゼ−３が検出されない、ＭａｚＥ、ＭａｚＦ双方を発現する細胞の抽出物中には、切断されたＰＡＲＰは存在しなかった（図３Ｄ）。まとめると、このデータは、大腸菌の配列特異的エンドリボヌクレアーゼのＭａｚＦ毒素は、哺乳動物細胞のアポトーシス細胞死を誘発するが、この細胞死は、ＭａｚＥ抗毒素の共発現により防止できることを明瞭に示している。
【実施例５】
【００７９】
ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質量は、ＭａｚＦ誘発アポトーシス中に変化しない
カスパーゼ−３活性化の上流にあるＭａｚＦによるアポトーシス誘導の機構を洞察するために、アポトーシス抑制（ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬおよびＭＣＬ−１）またはアポトーシス促進（ＢＡＫ、ＢＡＫ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＢＫ／ＢＩＫおよびＰＵＭＡ）タンパク質量を、ＭａｚＦ媒介ｍＲＮＡ切断による調節に対して調べた。０、２４、４８および７２時間Ｔｅｔ処理したＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｐｃＤＮＡ３）およびＴ−Ｒｅｘ−２９３（ｍａｚＦ／ｍａｚＥ）細胞からの細胞溶解物を、ウェスタンブロット分析に掛けた。
【００８０】
図４は、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質量が、ＭａｚＦ誘導中に一定していることを示す。Ｔｅｔ処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞からの全細胞溶解物は、図中に表示したアポトーシス抑制またはアポトーシス促進タンパク質を特異的に認識する抗体で免疫ブロットした。ＭａｚＦ誘発アポトーシス中に、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質量は変化しておらず、切断ＢＩＤ（ｔＢＩＤ）も検出できなかった。こうしたデータの示唆によれば、アポトーシス抑制ＢＣＬ−２ファミリー構成員であるＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬおよびＭＣＬ−１の喪失、またはアポトーシス促進性のＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＮＢＫ／ＢＩＫおよびＰＵＭＡタンパク質の上方調節が、ＭａｚＦ媒介アポトーシスの原因ではなかった。最後に、ＭａｚＦ発現細胞中にｔＢＩＤが存在しなかったので、ｔＢＩＤを介する死滅受容体が媒介するアポトーシス経路も関与していないことが示唆される。
【実施例６】
【００８１】
ＭａｚＦ誘発アポトーシスにはＢＡＫは必要であるが、ＢＡＸは必要でない
ＢＣＬ−２ファミリーのアポトーシス促進構成員ＢＡＸおよびＢＡＫは、ＢＨ３限定タンパク質の下流で多数のアポトーシス刺激が誘発するミトコンドリア依存性アポトーシス経路において、決定的ではあるが、主として機能的に重複した役割を演じている（Ｄａｎｉａｌ，Ｎ．Ｎ．およびＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  １１６：２０５〜２１９頁（２００４）；Ｇｅｌｉｎａｓ，Ｃ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９：１２６３〜１２６８頁（２００５）；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９５：１５８〜６７頁（２００３）；Ｗｉｌｌｉｓ，Ｓ．Ｎ．およびＡｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：１〜９頁（２００５））。ＭａｚＦ媒介アポトーシスにおけるＢＡＸおよび／またはＢＡＫの関与可能性を検証するために、Ｗ２（ｂａｘ＋／−ｂａｋ＋／＋）、Ｄ３（ｂａｘ−／−ｂａｋ−／−）、Ｘ２（ｂａｘ−／−ｂａｋ＋／−）およびＫ１（ｂａｘ＋／−ｂａｋ−／−）ｉＢＭＫ細胞を利用した（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ．およびＷｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．印刷中（２００６）；Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、５１〜６４頁（２００６）；Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２：１９３〜２０３頁（２００２）；Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４１２７〜１４１３４頁（２００２））。
【００８２】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）はＷ２、Ｘ２およびＫ１  ｉＢＭＫ細胞中でアポトーシスを誘発するが、Ｄ３  ｉＢＭＫ細胞は、ＴＮＦ−α誘発アポトーシスおよび他の多数の刺激が媒介するアポトーシスに対して耐性を示す（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，Ｋ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４１２７〜１４１３４頁（２００２））。始めに、ＭａｚＦ発現プラスミドのｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍａｚＦを、ｌａｃＺ発現プラスミドのｐｃＤＮＡ６／Ｈｉｓ／ｌａｃＺと共にＷ２、Ｄ３、Ｘ２およびＫ１細胞中に過渡的に共発現させ、次いでβ−ガラクトシダーゼ・アッセイを行ってＭａｚＦの過渡的発現の影響をモニターした。
【００８３】
図５は、ＭａｚＦ誘発アポトーシスには、ＢＡＫ機能が必要であることを示す。パネル（Ａ）は、ＭａｚＦを過渡的に発現するｉＢＭＫ細胞の生存率を示す。ＬａｃＺおよびＭａｚＦを過渡的に共発現するＷ２、Ｄ３、Ｘ２およびＫ１細胞を、トランスフェクションから４８時間後にβ−ガラクトシダーゼ・アッセイに掛けた。β−ガラクトシダーゼ陽性青色細胞は、全細胞数の比率（％）として算出した。パネル（Ｂ）は、ｉＢＭＫ細胞における活性化カスパーゼ−３の免疫蛍光を示す。ＬａｃＺおよびＭａｚＦを過渡的に共発現するＷ２、Ｄ３、Ｘ２またはＫ１細胞を、抗Ｘｐｒｅｓｓおよび抗活性カスパーゼ−３抗体で共染色した。ＦＩＴＣ（緑）およびローダミン（赤）染色は、各々ＬａｃＺおよび活性化カスパーゼ−３を発現する細胞を表す。数値は、活性化カスパーゼ−３陽性細胞の比率（％）を表す。白矢印は、適合するＦＩＴＣ染色細胞からの対応する活性化カスパーゼ−３陽性細胞を示す。パネル（Ｃ）は、ＭａｚＦおよびＭａｚＥを過渡的に共発現するｉＢＭＫ細胞の生存率を示す。ＬａｃＺと、ＭａｚＦおよび／またはＭａｚＥとを過渡的に共発現するＷ２、Ｄ３、Ｘ２およびＫ１細胞を、β−ガラクトシダーゼ・アッセイに掛けた。β−ガラクトシダーゼ陽性青色細胞は、上記の通り算出した。
【００８４】
図５に示すように、Ｗ２細胞におけるＭａｚＦ発現は、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞の有意な減少を起こした（図５Ａ）。対照的に、ＭａｚＦを発現するＤ３細胞では、β−ガラクトシダーゼ発現に対する効果が殆ど認められなかった（図５Ａ）。興味深いことに、Ｘ２細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の個数は、Ｗ２細胞同様に有意に減少したが、Ｋ１細胞はＭａｚＦに対して選択的に耐性を示したので、ＭａｚＦ発現に対する耐性を得るには、ＢＡＫ欠損で十分であることが示唆された。さらに、Ｋ１細胞においてＭａｚＦによりβ−ガラクトシダーゼ発現を維持したことは、その発現喪失が、アポトーシスに因るものであるが、β−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの消失に因るものではないことを示す。
【００８５】
Ｗ２およびＸ２細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の欠如が、アポトーシスに起因していたか否かを検証するために、活性カスパーゼ−３についてＭａｚＦ発現細胞を調べた。抗活性カスパーゼ−３抗体を用いた免疫蛍光によれば、活性カスパーゼ−３陽性細胞（赤色）の存在が、ｐｃＤＮＡ３トランスフェクトＷ２およびＸ２細胞の＜０．１％と比較して、ＭａｚＦを過渡的に発現するＷ２細胞の５８．１％およびＸ２細胞の４７．２％において示された（図５Ｂ）。しかし、ＭａｚＦを過渡的に発現するＤ３およびＫ１細胞には、活性化カスパーゼ−３を有する細胞が殆どなかった（＜０．１％）（図５Ｂ）ので、ＭａｚＦによるカスパーゼ−３活性化を防止したのは主にＢＡＫの喪失であることを示した。まとめると、このデータは、ＭａｚＦが、カスパーゼ−３およびアポトーシスを活性化するために、ＢＡＫ依存性であるが、ＢＡＸ非依存性の機構（複数も）を誘発することを示す。
【００８６】
ＭａｚＥが、ＭａｚＦに誘発されるＢＡＫ媒介アポトーシスを抑制できるか否かを調べるために、ＭａｚＥを、ＭａｚＦと共にＷ２、Ｄ３、Ｘ２またはＫ１細胞中で過渡的に共発現させた。β−ガラクトシダーゼ・アッセイの結果から、ＭａｚＦを有するＷ２およびＸ２細胞におけるＭａｚＥ発現は、ｐｃＤＮＡ３またはＭａｚＥ発現プラスミドの単独をトランスフェクトしたＷ２およびＸ２細胞と同様に、ＭａｚＦ誘発細胞死を有意に抑制することが示された（図５Ｃ）。
【実施例７】
【００８７】
タンパク質合成の阻害で誘発される細胞死には、ＮＢＫ／ＢＩＫが必要である
タンパク質合成の阻害がＢＡＫ媒介アポトーシスを誘発する経路を特定するために、上流のＢＨ３限定アポトーシス促進タンパク質に対する機能要件を調べた。個々のＢＨ３限定アポトーシス促進タンパク質（ＰＵＭＡ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡおよびＮＢＫ／ＢＩＫ）が欠損したｉＢＭＫ細胞系（Ｔａｎ，Ｔ．Ｔ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７：２２７〜２３８頁（２００５））を、ＭａｚＦ媒介アポトーシスに対する耐性について試験した。ＭａｚＦを、ＬａｃＺと共にｐｕｍａ−／−、ｂｉｍ−／−、ｎｏｘａ−／−またはｎｂｋ／ｂｉｋ−／−のｉＢＭＫ細胞中に過渡的に共発現させ、そのβ−ガラクトシダーゼをモニターした。
【００８８】
図６は、ＮＢＫ／ＢＩＫが、ＭａｚＦ誘発またはＣＨＸ誘発細胞死を媒介することを示す。パネル（Ａ）は、ＭａｚＦを過渡的に発現するｉＢＭＫ細胞の生存率を示す。ＬａｃＺおよびＭａｚＦを共発現するｎｂｋ／ｂｉｋ−／−、ｂｉｍ−／−、ｎｏｘａ−／−またはｐｕｍａ−／−のｉＢＭＫ細胞を、β−ガラクトシダーゼ・アッセイに掛けた。β−ガラクトシダーゼ陽性青色細胞は、全細胞数の比率（％）として算出した。パネル（Ｂ）および（Ｃ）は、ＣＨＸ処理ｉＢＭＫ細胞の生存率を示す。ＣＨＸで処理した、Ｗ２、Ｄ３、Ｘ２およびＫ１細胞（パネルＢ）ならびにｎｂｋ／ｂｉｋ−／−Ｂ、ｂｉｍ−／−、ｎｏｘａ−／−またはｐｕｍａ−／−の細胞（パネルＣ）を、ＭＴＴアッセイに掛けた。パネル（Ｄ）および（Ｅ）は、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ処理およびパクリタキセル処理ｉＢＭＫ細胞の生存率を示す。ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（０．０５μｇ／ｍｌ）（パネルＤ）およびパクリタキセル（パネルＥ）で処理した、Ｗ２、Ｄ３および独立した３つのｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞系（Ａ、ＢおよびＣ）を、ＭＴＴアッセイに掛けた。
【００８９】
図６は、ＭａｚＦを過渡的に発現するｐｕｍａ−／−、ｂｉｍ−／−、ｎｏｘａ−／−細胞中のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の個数が、Ｗ２およびＸ２細胞（図５Ａ）同様に、有意に減少したことを示す（図６Ａ）。興味深いことに、ｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞は、Ｄ３およびＫ１細胞（図５Ａ）同様に、ＭａｚＦ誘発細胞死に選択的に耐性を示した（図６Ａ）。このことから、ＭａｚＦ媒介アポトーシスには、ＢＡＫを介してシグナル伝達するＮＢＫ／ＢＩＫが必要であることが示唆される。
【００９０】
一般翻訳抑制が媒介するアポトーシスが、特定のＢＨ３限定タンパク質に依存するか否かを検証するために、ｐｕｍａ−／−、ｂｉｍ−／−、ｎｏｘａ−／−、ｎｂｋ／ｂｉｋ−／−のｉＢＭＫ細胞の翻訳抑制に対するアポトーシス応答を、ＣＨＸを用いて試験した。Ｗ２、Ｄ３、Ｘ２またはＫ１細胞に加え、ｐｕｍａ−／−、ｂｉｍ−／−、ｎｏｘａ−／−、ｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞も、翻訳抑制を誘発するために、ＣＨＸの増加する濃度（０．０５、０．５、１．０、５．０および１０．０μｇ／ｍｌ）で処理し、生存率を評価した。ＣＨＸで処理したＷ２、Ｘ２、ｐｕｍａ−／−、ｂｉｍ−／−およびｎｏｘａ−／−細胞の生存率は、用量依存的に減少した（図６ＢおよびＣ）。対照的に、Ｄ３、Ｋ１（図６Ｂ）およびｎｂｋ／ｂｉｋ−／−（図６Ｃ）細胞をＣＨＸで処理した場合、細胞生存率は高い値を維持した。その上、Ｗ２および独立した３つのｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞系は、ＴＮＦ−α（図６Ｄ）およびパクリタキセル誘発細胞死（図６Ｅ）に明瞭な感受性を示した。対照的に、Ｄ３は、ＴＮＦ−αおよびパクリタキセルで誘発される細胞死に耐性を示した（図６ＤおよびＥ）。こうした結果は、ＮＢＫ／ＢＩＫが、ＭａｚＦ誘発ｍＲＮＡ分解およびＢＡＫ上流でのＣＨＸ誘発翻訳抑制に応答したタンパク質合成の阻害により被る、細胞死に必要なＢＨ３限定アポトーシス促進タンパク質であることを明白に示している。さらに、ＮＢＫ／ＢＩＫは、ｔＢＩＤを介してシグナル伝達するＴＮＦ−α媒介アポトーシスには不要であり（図６Ｄ）（Ｌｉ，Ｈ．等、Ｃｅｌｌ  ９４：４９１〜５０１頁（１９９８）；Ｌｕｏ，Ｘ．等、Ｃｅｌｌ  ９４：４８１〜４９０頁（１９９８））、ＢＩＭに依存する、タキサンが誘発するアポトーシスにもＮＢＫ／ＢＩＫは不要であった（Ｂｏｕｉｌｌｅｔ，Ｐ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：１７３５〜１７３８頁（１９９９）；Ｔａｎ，Ｔ．Ｔ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７：２２７〜２３８頁（２００５））。これらの知見は、個別のアポトーシス刺激に対する応答を制御する特異的ＢＨ３限定タンパク質の役割を支持している。
【実施例８】
【００９１】
ＮＢＫ／ＢＩＫはアデノウィルス感染で誘発されるアポトーシスのメディエーターである。
アデノウィルスの増殖感染は、宿主細胞のタンパク質合成を排除し、アポトーシス誘発のきっかけとなる。ＮＢＫ／ＢＩＫが、宿主細胞のタンパク質合成の遮断と同時発生するアデノウィルス誘発アポトーシスに必要か否かを調べるために、Ｗ２、Ｄ３およびｎｂｋ／ｂｉｋ−／−のｉＢＭＫ細胞を、野生型アデノウィルス５型（Ａｄ５ｄ／３０９）およびＥ１Ｂ  １９Ｋ遺伝子欠失（抗ｖＢＣＬ−２）変異体（Ａｄ５ｄ／３３７）で感染させ、ＣＰＥをモニターした。
【００９２】
図７は、ＮＢＫ／ＢＩＫが、アデノウィルス誘発アポトーシスを媒介することを示す。パネル（Ａ）は、アデノウィルス感染ｉＢＭＫ細胞の位相差写真（倍率１００倍）を示す。パネル（Ｂ）は、ウィルス感染ｉＢＭＫ細胞の溶解物を用いたウェスタンブロット分析を示す。モック感染、Ａｄ５ｄ／３０９またはＡｄ５ｄ／３３７感染した、Ｗ２、Ｄ３およびｎｂｋ／ｂｉｋ−／−Ｂ細胞からの全細胞溶解物を、抗活性カスパーゼ−３抗体（上部）、抗Ｅ１Ａ抗体（中央）および抗アクチン抗体（下部）で免疫ブロットした。パネル（Ｃ）は、タンパク質合成の遮断により誘発されるアポトーシス経路を示す。
【００９３】
Ａｄ５ｄ／３０９に感染したＷ２、Ｄ３およびｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞の細胞形態は、モック感染したＷ２、Ｄ３およびｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞と同様に維持された結果となり、Ｅ１Ｂ  １９Ｋがアデノウィルス誘発アポトーシスを防止することを示す（図７Ａ）。Ａｄ５ｄ／３３７によるＷ２細胞中への感染は、予想通り（Ｃｕｃｏｎａｔｉ，Ａ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４５４７〜４５５８頁（２００２））、アポトーシスを示す感染後４８時間における単層のほぼ完全な破壊を起こした（図７Ａ）。対照的に、Ａｄ５ｄ／３３７感染Ｄ３細胞は、予想通り（Ｃｕｃｏｎａｔｉ，Ａ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４５４７〜４５５８頁（２００２））、アデノウィルス誘発アポトーシスに耐性を示した（図７Ａ）。興味深いことに、Ａｄ５ｄ／３３７感染ｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞にはアポトーシスＣＰＥが認められなかった（図７Ａ）。
【００９４】
感染ｉＢＭＫ細胞のアポトーシスは、カスパーゼ−３の活性化をモニターすることにより評価した。Ａｄ５ｄ／３０９に感染したＷ２およびＤ３細胞では、プロセシングされた活性型カスパーゼ−３は検出できなかった（図７Ｂ）。活性化カスパーゼ−３は、Ａｄ５ｄ／３０９に感染したｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞にも見られなかった（図７Ｂ）。予想通り（Ｃｕｃｏｎａｔｉ，Ａ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４５４７〜４５５８頁（２００２））、多量の活性化カスパーゼ−３が、Ａｄ５ｄ／３３７感染Ｗ２細胞からの抽出物中に存在していたが、Ａｄ５ｄ／３３７感染Ｄ３細胞からの抽出物中に活性化カスパーゼ−３が出現しなかった（図７Ｂ）。興味深いことに、Ａｄ５ｄ／３０７に感染したｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞中で検出された活性化カスパーゼ−３の量は、Ａｄ５ｄ／３０７感染Ｗ２細胞での検出量より有意に少なく（図７Ｂ）、そのことは、ｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞のＡｄ５ｄ／３３７誘発細胞死に対する耐性と合致していた（図７Ａ）。ｉＢＭＫ細胞が感染した後、ウィルスタンパク質を発現していたことを確認するために、細胞溶解物のＥ１Ａタンパク質量を分析した。本明細書で使用する場合の用語「Ｅ１Ａ」とは、細胞タンパク質に結合し、封鎖することにより細胞機能に影響し、そのため該タンパク質が細胞過程に関与するのを妨げるアデノウィルスタンパク質を指す。ｉＢＭＫ細胞を不死化するためにＥ１Ａを使用したので、非感染細胞内に低レベルのＥ１Ａタンパク質発現が検出された（図７Ｂ）。Ｅ１Ａ量は、Ａｄ５ｄ／３０９に感染したＷ２、Ｄ３およびｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞中で有意に増加した結果となり（図７Ｂ）、そのことは、ウィルス感染細胞がウィルスゲノムからＥ１Ａを発現したことを示す。より多量のＥ１Ａが、Ａｄｄ／３３７に感染したＤ３およびｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞で認められた（図７Ｂ）が、この結果は、Ａｄｄ／３３７感染Ｄ３およびｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞におけるＥ１Ａ産生が、ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＮＢＫ／ＢＩＫの欠損によるアポトーシスの欠如に起因していたことを示す。したがって、こうしたデータは、ＮＢＫ／ＢＩＫが、アデノウィルス感染により誘発されるアポトーシスをＢＡＸおよびＢＡＫの上流で調節する、メディエーターであることを示している。
【００９５】
本発明をその特定の実施形態に関して説明してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱せずに、多様な変更をなし得ること、および等価なものを代用し得ることは、当業者には理解されるはずである。その上、特定の状況、材料、材料組成、プロセス、１つまたは複数のプロセスステップを本発明の目的、趣旨および範囲に適合するように、多くの改変もなし得る。このような改変はすべて、本明細書に付属している特許請求の範囲に入ることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＭａｚＦの発現が、哺乳動物細胞における細胞ｍＲＮＡの分解を起こすことを示す図である。（Ａ）ヒトのＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンのノーザンブロット分析。表示した時点におけるＴ−Ｒｅｘ−２９３のＴｅｔ処理細胞またはＴｅｔ非処理細胞の総ＲＮＡを、ヒトＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンの３２Ｐ標識ｃＤＮＡで調べた。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、アガロース−ホルムアルデヒド・ゲル電気泳動の後、臭化エチジウム染色により可視化した。（Ｂ）ｍＲＮＡ量の定量。ヒトＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンのｍＲＮＡ量は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量した。ｍＲＮＡの相対量は、２４時間、４８時間および７２時間の試料における蛍光シグナルを、対応する０時間試料と比較して計算した。
【図２】ＭａｚＦが、哺乳動物細胞におけるタンパク質合成を阻害することを示す図である。（Ａ）Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞における３５Ｓ−メチオニンの取込み。表示した時点におけるＴｅｔ処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞の３５Ｓ−メチオニン標識総タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーに掛け（左側）、クマシー・ブルーで染色した（右側）。（Ｂ）３５Ｓ−メチオニン標識タンパク質の定量。（Ａ）のゲル上のタンパク質バンドをＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ  ＳＴＯＲＭ  ８６０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）により走査し、シグナル強度を計算した。
【図３】ＭａｚＦが、哺乳動物細胞におけるアポトーシス細胞死を誘発することを示す図である。（Ａ）Ｔ−Ｒｅｘ−２９３のＴｅｔ処理細胞またはＴｅｔ非処理細胞の位相差写真（倍率１００倍）。（Ｂ）（Ａ）のＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞の生存率分析。表示した時点におけるＴ−Ｒｅｘ−２９３のＴｅｔ処理細胞または非処理細胞は、トリパンブルー排除に掛けた。生存率は、０時間における全細胞数の比率（％）として表した。（Ｃ）ＦＡＣＳで測定した、Ｔｅｔ処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞中のヨウ化プロピジウム標識の代表的例示。（Ｄ）Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞の溶解物を用いたウェスタンブロット分析。表示した時点におけるＴｅｔ処理またはスタウロスポリン処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞の全細胞溶解物を、抗活性カスパーゼ−３抗体（上部）、抗ＰＡＲＰ抗体（中央）および抗アクチン抗体（下部）で免疫ブロットした。
【図４】ＭａｚＦ誘導中に、ＢＣＬ−２ファミリーの各タンパク質量が一定のままであることを示す図である。Ｔｅｔ処理Ｔ−Ｒｅｘ−２９３細胞の全細胞溶解物を、図に表示したアポトーシス抑制およびアポトーシス促進タンパク質を特異的に認識する各抗体で免疫ブロットした。
【図５】ＭａｚＦ誘発アポトーシスには、ＢＡＫ機能が必要であることを示す図である。（Ａ）ＭａｚＦを過渡的に発現するｉＢＭＫ細胞の生存率。ＬａｃＺおよびＭａｚＦを過渡的に共発現するＷ２、Ｄ３、Ｘ２およびＫ１細胞を、トランスフェクションから４８時間後にβ−ガラクトシダーゼ・アッセイに掛けた。β−ガラクトシダーゼ陽性青色細胞は、全細胞数の比率（％）として算出した。（Ｂ）ｉＢＭＫ細胞における活性化カスパーゼ−３の免疫蛍光。ＬａｃＺおよびＭａｚＦを過渡的に共発現するＷ２、Ｄ３、Ｘ２またはＫ１細胞を、抗Ｘｐｒｅｓｓおよび抗活性カスパーゼ−３抗体で共染色した。ＦＩＴＣ（緑）およびローダミン（赤）染色は、各々ＬａｃＺおよび活性化カスパーゼ−３を発現する細胞を表す。数値は、活性化カスパーゼ−３陽性細胞の比率（％）を表す。白矢印は、適合するＦＩＴＣ染色細胞からの対応する活性化カスパーゼ−３陽性細胞を示す。（Ｃ）ＭａｚＦおよびＭａｚＥを過渡的に共発現するｉＢＭＫ細胞の生存率。ＬａｃＺと、ＭａｚＦおよび／またはＭａｚＥとを過渡的に共発現するＷ２、Ｄ３、Ｘ２およびＫ１細胞を、β−ガラクトシダーゼ・アッセイに掛けた。β−ガラクトシダーゼ陽性青色細胞は、上記の通り算出した。
【図６】ＮＢＫ／ＢＩＫが、ＭａｚＦ誘発またはＣＨＸ誘発細胞死を媒介することを示す図である。（Ａ）ＭａｚＦを過渡的に発現するｉＢＭＫ細胞の生存率。ＬａｃＺおよびＭａｚＦを共発現するｎｂｋ／ｂｉｋ−／−、ｂｉｍ−／−、ｎｏｘａ−／−またはｐｕｍａ−／−のｉＢＭＫ細胞は、β−ガラクトシダーゼ・アッセイに掛けた。β−ガラクトシダーゼ陽性青色細胞は、全細胞数の比率（％）として算出した。（Ｂ）および（Ｃ）ＣＨＸ処理ｉＢＭＫ細胞の生存率。ＣＨＸで処理した、Ｗ２、Ｄ３、Ｘ２およびＫ１細胞（Ｂ）ならびにｎｂｋ／ｂｉｋ−／−、ｂｉｍ−／−、ｎｏｘａ−／−またはｐｕｍａ−／−の細胞（Ｃ）を、ＭＴＴアッセイに掛けた。（Ｄ）および（Ｅ）ＴＮＦ−α／ＣＨＸ処理およびパクリタキセル処理ｉＢＭＫ細胞の生存率。ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（０．０５μｇ／ｍｌ）（Ｄ）およびパクリタキセル（Ｅ）で処理した、Ｗ２、Ｄ３および独立した３つのｎｂｋ／ｂｉｋ−／−細胞系（Ａ、ＢおよびＣ）を、ＭＴＴアッセイに掛けた。
【図７】ＮＢＫ／ＢＩＫが、アデノウィルス誘発アポトーシスを媒介することを示す図である。（Ａ）アデノウィルス感染ｉＢＭＫ細胞の位相差写真（倍率１００倍）。（Ｂ）ウィルス感染ｉＢＭＫ細胞の溶解物を用いたウェスタンブロット分析。モック感染、Ａｄ５ｄ／３０９またはＡｄ５ｄ／３３７感染した、Ｗ２、Ｄ３およびｎｂｋ／ｂｉｋ−／−Ｂ細胞からの全細胞溶解物を、抗活性カスパーゼ−３抗体（上部）、抗Ｅ１Ａ抗体（中央）および抗アクチン抗体（下部）で免疫ブロットした。（Ｃ）タンパク質合成の遮断により誘発されるアポトーシス経路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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