(57)【要約】  本発明は、骨形成及び抗脂肪細胞形成オキシステロール類を開示する。骨髄間質細胞を、骨芽細胞分化に対する酸化ストレスの阻害作用から保護し、ブロックし、又は救出する薬剤及び方法を開示する。代表的な薬剤としては、単独又は相乗的な組合せでのオキシステロール、並びにヘッジホッグ又はＷｎｔシグナル伝達経路の活性剤が挙げられる。オキシステロール類と骨形成タンパク質との相乗効果もまた開示する。
2009512422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の薬剤により哺乳動物間葉細胞を処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞における骨芽細胞分化を誘導する方法であって、前記薬剤が、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される方法。
【請求項２】
薬剤が、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される、任意の少なくとも２種のオキシステロールの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物間葉幹細胞が、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択されるオキシステロールにより前処理される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物間葉細胞を、副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子II及び形質転換成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも１種の第二薬剤で処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物間葉細胞を、チトクロームＰ４５０阻害剤、ホスホリパーゼ活性剤、アラキドン酸、ＣＯＸ酵素活性剤、骨形成プロスタノイド及びＥＲＫ活性剤を含む群から選択される少なくとも１種の第二薬剤で処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞を、選択される用量の少なくとも１種の薬剤に曝露することを含む、未処理細胞中の生物学的マーカーのレベルよりも高いレベルで骨芽細胞分化の生物学的マーカーを発現させるために哺乳動物細胞を刺激する方法であって、前記少なくとも１種の薬剤が、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される方法。
【請求項７】
薬剤が、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択されるオキシステロール類の組合せである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生物学的マーカーが、アルカリホスファターゼ活性、カルシウムの取込み、石灰化、オステオカルシンｍＲＮＡの発現、Ｒｕｎｘ２のＤＮＡへの結合、及びＲｕｎｘ２タンパク質の発現のうちの少なくとも１つにおける増加である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物細胞が、間葉幹細胞、骨芽前駆細胞、及び頭蓋冠器官培養物を含む群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物間葉細胞をヘッジホッグシグナル伝達阻害剤により処理することを含む、オキシステロールにより哺乳動物間葉細胞における骨芽細胞分化を阻害する方法。
【請求項１１】
哺乳動物間葉細胞をヘッジホッグシグナル伝達活性剤で処理することを含む、哺乳動物間葉細胞における骨芽細胞分化を誘導する方法。
【請求項１２】
哺乳動物間葉細胞をＷｎｔシグナル伝達阻害剤で処理することを含む、哺乳動物間葉細胞においてオキシステロールにより骨芽細胞分化を阻害する方法。
【請求項１３】
哺乳動物間葉細胞をＷｎｔシグナル伝達活性剤で処理することを含む、哺乳動物細胞においてオキシステロールにより骨芽細胞分化を誘導する方法。
【請求項１４】
少なくとも１種の薬剤で哺乳動物間葉細胞を処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞の脂肪細胞分化を阻害する方法であって、前記少なくとも１種の薬剤が、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される方法。
【請求項１５】
骨粗しょう症の症状を改善するために、少なくとも１種の薬剤を、有効な剤形における治療的有効量で、選択される間隔にて投与することを含む、骨粗しょう症の臨床症状を示す患者を治療する方法であって、前記少なくとも１種のオキシステロールが、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される方法。
【請求項１６】
少なくとも１種の薬剤が、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択されるオキシステロール類の組合せである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物間葉幹細胞を採取するステップ；
少なくとも１種の薬剤で哺乳動物間葉細胞を処理するステップであって、前記少なくとも１種の薬剤が、間葉幹細胞を誘導し、骨芽細胞分化の少なくとも１種の細胞マーカーを発現させるステップ；
その分化細胞を患者に投与するステップであって、前記少なくとも１種の薬剤が、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される、ステップ；
を含む、骨形成を誘導するために患者を治療する方法。
【請求項１８】
少なくとも１種の薬剤が、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択されるオキシステロール類の組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１種のオキシステロールを、有効な剤形における治療的有効量で、選択される間隔にて投与することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
全身投与により患者に分化細胞を投与することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
骨形成が求められる選択部位に細胞を適用して、患者に分化細胞を投与することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
表面を有する基材を含む、ヒト身体に使用するインプラントであって、前記インプラントの少なくとも表面が、周囲の骨組織に骨形成を誘導させるのに十分な量で５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される少なくとも１種の薬剤を含むインプラント。
【請求項２３】
基材が、ピン、スクリュー、プレート、又は人工関節の形状に形成される請求項２２に記載のインプラント。
【請求項２４】
５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される少なくとも１種のオキシステロールを治療的有効量で含む、骨疾患の治療に使用する薬物。
【請求項２５】
少なくとも１種のオキシステロール及び少なくとも１種の骨形成タンパク質で哺乳動物間葉細胞を処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞の骨芽細胞分化を誘導する方法であって、少なくとも１種のオキシステロールが、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される方法。
【請求項２６】
少なくとも１種の骨形成タンパク質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、又はＢＭＰ１４である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子II、形質転換成長因子ベータ、ビスホスホネート類、エストロゲン受容体モジュレーター、カルシトニン、ビタミンＤ及びカルシウムを含む群から選択される少なくとも１種の第二薬剤で哺乳動物間葉細胞を処理することをさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物細胞を、選択される用量の少なくとも１種のオキシステロール及び少なくとも１種の骨形成タンパク質に曝露することを含む、未処理細胞における生物学的マーカーのレベルよりも高いレベルで骨芽細胞分化の生物学的マーカーのレベルを発現させるために哺乳動物細胞を刺激する方法であって、前記少なくとも１種のオキシステロールが、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択され、少なくとも１種の骨形成タンパク質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びＢＭＰ１４を含む群から選択される方法。
【請求項２９】
生物学的マーカーが、アルカリホスファターゼ活性、カルシウムの取込み、石灰化、オステオカルシンｍＲＮＡの発現、Ｒｕｎｘ２のＤＮＡへの結合、及びＲｕｎｘ２タンパク質の発現のうちの少なくとも１つにおける増加である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物細胞が、間葉幹細胞、骨芽前駆細胞、又は頭蓋冠器官培養物を含む群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１種のオキシステロール及び少なくとも１種の骨形成タンパク質を、有効な剤形における治療的有効量で、選択される間隔にて投与して、骨組織に存在する骨芽細胞数を増加させることを含む、骨芽細胞に骨髄間質細胞分化を増加させるために患者を治療する方法であって、前記少なくとも１種のオキシステロールが、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択され、前記少なくとも１種の骨形成タンパク質が、ＢＮＰ２、ＢＭＰ７、及びＢＭＰ１４を含む群から選択される方法。
【請求項３２】
少なくとも１種のオキシステロール及び少なくとも１種の骨形成タンパク質を、有効な剤形における治療的有効量で、選択される間隔にて投与して、骨形成を増加させ、骨修復を亢進させることを含む、骨形成を誘導するために患者を治療する方法であって、前記少なくとも１種のオキシステロールが、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択され、前記少なくとも１種の骨形成タンパク質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びＢＭＰ１４を含む群から選択される方法。
【請求項３３】
骨形成が、軟骨内又は膜内骨形成である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
全身投与により患者に分化細胞を投与することをさらに含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
骨形成が求められる選択部位に細胞を適用して、患者に分化細胞を投与することをさらに含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
表面を有する基材を含む、骨形成のためにヒト身体に使用するインプラントであって、前記インプラントの少なくとも表面が、インプラントに近接する骨組織に骨形成を誘導させるのに十分な量の少なくとも１種のオキシステロール及び少なくとも１種の骨形成タンパク質を含み、前記少なくとも１種のオキシステロールが、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択されるインプラント。
【請求項３７】
５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される少なくとも１種のオキシステロールを治療的有効量で含む、骨疾患の治療に使用する薬物。
【請求項３８】
５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される少なくとも１種のオキシステロールで哺乳動物間葉細胞を同時に処理することを含む、酸化ストレス条件下での哺乳動物間葉幹細胞の骨芽細胞分化阻害をブロックする方法。
【請求項３９】
オキシステロール類による哺乳動物間葉幹細胞の骨芽細胞分化阻害のブロックが、アルカリホスファターゼ活性、石灰化、及び／又は骨形成の増加により測定される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
酸化ストレス前に少なくとも１種のオキシステロールで哺乳動物間葉細胞を前処理することを含む、酸化ストレス条件下での哺乳動物間葉幹細胞の骨芽細胞分化阻害を防ぐ方法。
【請求項４１】
酸化ストレス条件下での哺乳動物間葉幹細胞の骨芽細胞分化阻害を防ぐ方法が、少なくとも１種の骨形成タンパク質により哺乳動物間葉細胞を前処理することをさらに含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに骨芽細胞分化を誘導する上で活性である、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールのうちの任意の１種の部分を含む群から選択される少なくとも１種のオキシステロールで哺乳動物間葉細胞を酸化ストレス後に処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞を酸化ストレス条件による骨芽細胞分化阻害から救出（rescue）する方法。
【請求項４３】
哺乳動物間葉幹細胞を酸化ストレス条件による骨芽細胞分化阻害から救出する方法が、少なくとも１種の骨形成タンパク質で哺乳動物間葉細胞を処理することを含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
酸化ストレスが、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ及び最少限に酸化されたＬＤＬなどの炎症性酸化脂質により少なくとも一部誘導される請求項３８、４０又は４２に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１種のオキシステロールにより哺乳動物間葉細胞を処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞の脂肪細胞への分化を阻害する方法であって、少なくとも１種のオキシステロールが、５−コレステン−３ベータ、２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）、２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシクロエステロール、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールを含む群から選択される方法。
【請求項４６】
細胞を、少なくとも１種のオキシステロール又はオキシステロールの活性部分と接触させること；及び
所望の生物学的効果の指標に関して細胞を観察すること
を含む、ヘッジホッグシグナル伝達経路により調節される生物学的効果を引き起こすために少なくとも１種のオキシステロール又はオキシステロール分子の活性部分を用いて、細胞のヘッジホッグシグナル伝達経路を作動させる方法。
【請求項４７】
所望の生物学的効果が、骨成形、骨形成、又は脂肪細胞形成の阻害である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
骨成形の生物学的効果の指標が、アルカリホスファターゼ活性、カルシウムの取込み、石灰化、オステオカルシンｍＲＮＡの発現、Ｒｕｎｘ２のＤＮＡへの結合、及びＲｕｎｘ２タンパク質の発現のうちの少なくとも１つにおける増加である請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本研究は、National Institutes of Health/National Institutes on Aging Pepper Center、助成金番号ＩＰ６０ＡＧ１０４１５−１１により援助される。本発明において政府は一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
骨格の統合性を維持するために成人の生涯に亘って生じる正常な骨再構築は、破骨細胞による再吸収及び骨芽細胞による骨形成を含んでいる。したがって、骨形成と骨再吸収とのバランス間の干渉は、骨ホメオスタシス、骨形成及び修復に影響を及ぼし得る。
【０００３】
骨芽細胞は、骨髄間質細胞（間葉幹細胞；ＭＳＣとしても知られている）のプールから生じる。これらの細胞は、種々の組織に存在し、骨髄間質の至る所にある。ＭＳＣは、多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞、及び脂肪細胞に分化することができる。
【０００４】
骨粗しょう症は、高齢者における罹患率及び死亡率の主要原因であり、米国ヘルスケアシステムに対する年間費用は、少なくとも１００億ドルである。男性及び女性の双方は、年齢と共に骨粗しょう症による骨量の減少に悩まされている。加齢に伴う性ホルモンの低下が、これらの有害な変化に強い影響を与えると考えられている。例えば、骨粗しょう症は、閉経後の女性に増加する。
【０００５】
骨芽細胞数及び活性が加齢に伴って減少することが、蓄積された証拠から示唆されているが、この変化の理由は明確ではない。さらに、骨芽細胞形成を犠牲にすると思われる骨粗しょう症の骨髄において脂肪細胞の形成が増加する。さらに、骨中の脂肪組織の容量は、正常な対象において加齢に伴って増加し、骨梁の喪失程度と平行して増加する骨梁に隣接する脂肪細胞数と共に年齢関連骨粗しょう症が実質的に上昇する。これと同様の知見に基づいて、加齢に伴う骨粗しょう症における骨量の減少の少なくとも一部は、骨芽細胞への分化から脂肪細胞経路へのシフトによるものであることが示唆されている。
【０００６】
骨折治癒は、高齢者において悪くなり、他のものは、骨折部位に正常に移動し、新たな骨形成を生じ得るＭＳＣの数及び活性の減少を示している。
【０００７】
現在、骨粗しょう症の唯一の治療方法は、破骨細胞による骨再吸収を標的にするものである。これらのＦＤＡ承認療法としては、ビスホスホネート類、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、カルシトニン、及びビタミンＤ／カルシウム補充などのホルモン補充療法が挙げられる。しかしながら、これらの治療方法は、骨質量においてわずかな改善をもたらすのみであり、骨粗しょう症の総合的予防及び治療にとって十分ではない。
【０００８】
現在、骨粗しょう症の治療のためにＦＤＡで唯一承認されたアナボリック薬剤は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である。ＰＴＨは現在、破骨細胞アポトーシスを阻害することによって骨形成を増加させると考えられている。骨粗しょう症患者において、ＰＴＨは、間欠注射により骨質量を増加させ、骨折発生率が減少することが判明している。しかしながら、ＰＴＨによる連続処理及び／又はその蓄積は、患者に全身性の副作用を生じさせ得ることから、その用量を厳密に調節しなければならない。さらに、ＰＴＨ処理はかなり高価である。その結果、ＰＴＨ処理は、最も重症の骨粗しょう症患者だけに予定されている。
【０００９】
骨芽細胞による骨形成を増強させる他の可能性のある療法としては、フッ化ナトリウム及び骨に対して促進効果を有する成長因子（例えば、インスリン様成長因子Ｉ及びII並びに形質転換成長因子ベータ）が挙げられる。しかしながら、これまでのところ、これらの因子は、望ましくない副作用を示している。
【００１０】
ヒトにおける骨関連の障害を治療するための幹細胞の使用についても、また調べられている。例えば、骨形成不全症は、患者の骨芽細胞が適切な形態においてコラーゲンＩを生成しないことによって、骨が脆くなる骨格疾患である。健常個体から疾患個体へ骨芽細胞の前駆幹細胞を注入することにより、これら患者の骨密度が改善することが示されている。
【００１１】
したがって、骨ホメオスタシス、骨形成及び骨修復を調節する薬剤及び方法が望まれている。
【００１２】
骨粗しょう症における骨量の減少は、腰、脊椎、及び他の部位における骨折発生率の増加をもたらし得る（Cummings and Melton 2002. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. The Lancet 359: 1761-1767;及びEttinger 2003. Aging bone and osteoporosis. Arch Interm Med 163: 2237-2246）。考察されているように、骨粗しょう症は、骨芽細胞数及び骨形成活性の著しい減少と関連している（Quarto, et al. 1995. Bone progenitor cell deficits and the age-associated decline in bone repair capacity. Calcif Tissue Int 56: 123-129; Mullender et al. 1996. Osteocyte density changes in aging and osteoporosis. Bone 18: 109-113; Chan and Duque 2002. Age-related bone loss: old bone, new facts. Gerontology 48: 62-71; Ichioka et al. 2002. Prevention of senile osteoporosis in SAMP6 mice by intrabone marrow injection of allogeneic bone marrow cells. Stem Cells 20: 542-551;及びChen et al. 2002. Age-related osteoporosis in biglycan-deficient mice is related to defects in bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res 17: 331-340）。骨芽細胞により骨形成を増加させる方策は、骨の健康状態を改善し、骨粗しょう症における骨量の減少を抑制するために、進展させることができる（Mundy 2002. Directions of drug discovery in osteoporosis. Annu Rev Med 53: 337-354;及びRodan and Martin 2002. Therapeutic approaches to bone diseases. Science 289: 1508-1514）。
【００１３】
加齢に伴い及び閉経後において骨芽細胞の活性並びに骨形成が減少する理由については、明確に理解されていないが、骨細胞に対する酸化ストレスの増加により、この骨形成活性の減少理由を部分的には説明できる。加齢及び閉経の双方は、酸化ストレスの増加及び抗酸化防御機構の減少に関連している（Sohal et al. 2002. Mechanism of aging: an appraisal of the oxidative stress hypothesis. Free Radical Biol Med 33: 575-586;及びChang et al. 2002. Effects of hormonal replacement therapy on oxidative stress and total antioxidant capacity in postmenopausal hemodialysis patients. Ren Fail 24: 49-57）。尿中イソプロスタン、すなわち８−イソ−ＰＧＦ２α（酸化ストレスのバイオマーカー）の増加レベルは、ヒトの骨中無機質密度と負に関連する（Basu et al. 2001. Association between oxidative stress and bone mineral density. Biochem Biophys Res Commun 288: 275-279. 12）。さらに、対照と比較して骨粗しょう症の加齢女性において、ビタミンＣ及びＥ、スーパーオキシドジスムターゼ、及びグルタチオンペルオキシダーゼなどの血漿中の抗酸化物質が著しく減少していることが報告された（Maggio et al. 2003. Marked decrease in plasma antioxidants in aged osteoporotic women: results of a cross-sectional study. Clin Endocrinol & Metab 88: 1523-1527）。さらに、幾つかの疫学的調査により、食事中の抗酸化物質が増加すると、骨の健康状態に対する保護効果が得られることが示されている（Melhus et al. 1999. Smoking, antioxidant vitamines, and the risk of hip fracture. J Bone Miner Res 14: 129-135;及びSchaafsma et al. 2001. Delay of natural bone loss by higher intake of specific minerals and vitamins. Crit Rev Food Sci Nutr 41: 225-249）。
【００１４】
酸化ストレスは、破骨細胞形成及び骨再吸収を刺激することにより（Garrett et al. 1990. Oxygen-derived free radicals stimulate osteoclastic bone resorption in rodent bone in vitro and in vivo. J Clin Invest 85: 632-639）、並びに骨芽前駆細胞の骨芽分化を阻害することにより（Mody et al. 2001. Differential effects of oxidative stress on osteoblastic differentiation of vascular and bone cells. Free Radical Res & Med 31: 509-519）、骨ホメオスタシスに対して負の影響を及ぼし得る。キサンチン／キサンチンオキシダーゼ又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ−ＬＤＬ）により誘導された酸化ストレスにより、骨芽細胞に分化できるＭ２−１０Ｂ４（Ｍ２）の多機能骨髄間質細胞の培養物及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の頭蓋冠前骨芽細胞の培養物において骨芽細胞分化及び石灰化を阻害する（同文献）。
【非特許文献１】Cummings and Melton 2002. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. The Lancet 359: 1761-1767
【非特許文献２】Ettinger 2003. Aging bone and osteoporosis. Arch Interm Med 163: 2237-2246
【非特許文献３】Quarto, et al. 1995. Bone progenitor cell deficits and the age-associated decline in bone repair capacity. Calcif Tissue Int 56: 123-129
【非特許文献４】Mullender et al. 1996. Osteocyte density changes in aging and osteoporosis. Bone 18: 109-113
【非特許文献５】Chan and Duque 2002. Age-related bone loss: old bone, new facts. Gerontology 48: 62-71
【非特許文献６】Ichioka et al. 2002. Prevention of senile osteoporosis in SAMP6 mice by intrabone marrow injection of allogeneic bone marrow cells. Stem Cells 20: 542-551
【非特許文献７】Chen et al. 2002. Age-related osteoporosis in biglycan-deficient mice is related to defects in bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res 17: 331-340
【非特許文献８】Mundy 2002. Directions of drug discovery in osteoporosis. Annu Rev Med 53: 337-354
【非特許文献９】Rodan and Martin 2002. Therapeutic approaches to bone diseases. Science 289: 1508-1514
【非特許文献１０】Sohal et al. 2002. Mechanism of aging: an appraisal of the oxidative stress hypothesis. Free Radical Biol Med 33: 575-586
【非特許文献１１】Chang et al. 2002. Effects of hormonal replacement therapy on oxidative stress and total antioxidant capacity in postmenopausal hemodialysis patients. Ren Fail 24: 49-57
【非特許文献１２】Basu et al. 2001. Association between oxidative stress and bone mineral density. Biochem Biophys Res Commun 288: 275-279. 12
【非特許文献１３】Maggio et al. 2003. Marked decrease in plasma antioxidants in aged osteoporotic women: results of a cross-sectional study. Clin Endocrinol & Metab 88: 1523-1527
【非特許文献１４】Melhus et al. 1999. Smoking, antioxidant vitamines, and the risk of hip fracture. J Bone Miner Res 14: 129-135
【非特許文献１５】Schaafsma et al. 2001. Delay of natural bone loss by higher intake of specific minerals and vitamins. Crit Rev Food Sci Nutr 41: 225-249
【非特許文献１６】Garrett et al. 1990. Oxygen-derived free radicals stimulate osteoclastic bone resorption in rodent bone in vitro and in vivo. J Clin Invest 85: 632-639
【非特許文献１７】Mody et al. 2001. Differential effects of oxidative stress on osteoblastic differentiation of vascular and bone cells. Free Radical Res & Med 31: 509-519
【非特許文献１８】Bjorkhem and Diczfalusy 2002. Oxysterols: friends, foes, or just fellow passengers? Arterioscler Thromb Vasc Biol 22: 734-742
【非特許文献１９】Edwards and Ericsson 1999. Sterols and isoprenoids: signaling molecules derived from the cholesterol biosynthetic pathway. Annu Rev Biochem 68: 157-185
【非特許文献２０】Schroepfer 2000. Oxysterols: modulators of cholesterol metabolism and other processes. Physiol Rev 80: 361-554
【非特許文献２１】Russell 2000. Oxysterol biosynthetic enzymes. Biochim Biophys Acta 1529: 126-135
【非特許文献２２】Lyons et al. 1999. Rapid hepatic metabolism of 7-ketocholesterol in vivo: implications for dietary oxysterols. J Lipid Res 40: 1846-1857
【非特許文献２３】Kha et al. 2004. Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19: 830-840
【非特許文献２４】Parhmi, F. et al.、J. Bone Miner. Res. 14、2067-2078 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、酸化ストレスの負の作用から骨形成細胞を保護し、ブロックし、又は救出するための方法及び組成物は、骨形成を誘導し、骨粗しょう症における骨量の減少を治療するために臨床的に有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、骨ホメオスタシスを維持し、骨形成を増強し、及び／又は骨修復を増強する薬剤及び方法に関する。
【００１７】
本発明は、少なくとも１種のオキシステロールにより哺乳動物間葉細胞を処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞における骨芽細胞への分化（骨芽細胞分化）を誘導する方法を含み、少なくとも１種の該オキシステロールが、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート（２０Ａ−ヒドロキシコレステロールとしても知られている）、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（セレブロステロールとしても知られている）、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、及び２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシステロール、並びに５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール、２６−ヒドロキシコレステロール、及び４ベータ−ヒドロキシステロールの中で任意の１種の活性部分を含む群から選択される。これらの分子は、骨芽細胞分化を誘導するためにも使用できる骨形成性を有する他の分子、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールと構造類似性を共有する。これらのオキシステロールの活性な部分もまた、本発明に有用であり得る。
【００１８】
本発明は、少なくとも１種の薬剤により哺乳動物間葉細胞を処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞における骨芽細胞分化などの方法を含み、該薬剤は、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分を含む群から選択される。
【００１９】
本発明は、哺乳動物細胞を、選択される用量の少なくとも１種の薬剤に曝露することを含む、未処理細胞中の生物学的マーカーのレベルよりも高いレベルで骨芽細胞分化の生物学的マーカーを発現させるために哺乳動物細胞を刺激する方法を含み、少なくとも１種の該薬剤が、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択される。
【００２０】
本発明は、哺乳動物間葉細胞をヘッジホッグシグナル伝達阻害剤により処理することを含む、オキシステロールにより哺乳動物間葉細胞における骨芽細胞分化を阻害する方法、及び哺乳動物間葉細胞をヘッジホッグシグナル伝達活性剤により処理することを含む、哺乳動物間葉細胞において骨芽細胞の分化を誘導する方法を含む。
【００２１】
本発明は、細胞を少なくとも１種のオキシステロール又はオキシステロールの活性部分と接触させること；所望の生物学的効果の指標に関して細胞を観察することなど、ヘッジホッグシグナル伝達経路により調節される生物学的な効果を生じさせるために少なくとも１種のオキシステロール又はオキシステロール分子の活性部分を用いることにより、細胞のヘッジホッグシグナル伝達経路を作動させる方法を含む。
【００２２】
本発明は、哺乳動物間葉細胞をＷｎｔシグナル伝達阻害剤により処理することを含む、哺乳動物間葉細胞においてオキシステロールにより骨芽細胞分化を阻害する方法、及び哺乳動物間葉細胞をＷｎｔシグナル伝達活性剤により処理することを含む、哺乳動物細胞においてオキシステロールにより骨芽細胞分化を誘導する方法を含む。
【００２３】
本発明はまた、少なくとも１種の薬剤により哺乳動物間葉細胞を処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞の脂肪細胞への分化を阻害する方法を含み、少なくとも１種の該薬剤が、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択される。
【００２４】
本発明は、骨粗しょう症の症状を改善するために、少なくとも１種の薬剤を、有効な剤形における治療的有効量で、選択される間隔にて投与することを含む、骨粗しょう症の臨床症状を示す患者を治療する方法を含み、少なくとも１種の該オキシステロールが、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択される。
【００２５】
本発明は、１）哺乳動物間葉幹細胞を採取するステップ；２少なくとも１種の薬剤で哺乳動物間葉細胞を処理するステップであって、前記少なくとも１種の薬剤が、間葉幹細胞を誘導し、骨芽細胞分化の少なくとも１種の細胞マーカーを発現させるステップ；及び３）その分化細胞を患者に投与するステップであって、少なくとも１種の該薬剤が、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択されるステップを含む、骨形成を誘導するために患者を治療する方法を含む。
【００２６】
本発明は、表面を有する基材を含む、ヒト身体に使用するインプラントを含み、そのインプラントの少なくとも表面が、周囲の骨組織に骨形成を誘導させるのに十分な量の、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択される少なくとも１種の薬剤を含む。
【００２７】
本発明は、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択される少なくとも１種のオキシステロールを治療的有効量で含む、骨疾患の治療に使用する薬物をさらに含む。
【００２８】
本発明は、少なくとも１種のオキシステロール及び少なくとも１種の骨形成タンパク質で哺乳動物間葉細胞を処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞の骨芽細胞の分化を誘導する方法を含み、少なくとも１種の該オキシステロールが、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択される。
【００２９】
本発明は、哺乳動物細胞を、選択される用量の少なくとも１種のオキシステロール及び少なくとも１種の骨形成タンパク質に曝露することを含む、未処理細胞における生物学的マーカーのレベルよりも高いレベルで骨芽細胞分化の生物学的マーカーのレベルを発現させるために哺乳動物細胞を刺激する方法を含み、少なくとも１種の該オキシステロールが、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択され、少なくとも１種の該骨形成タンパク質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びＢＭＰ１４を含む群から選択される。
【００３０】
本発明は、少なくとも１種のオキシステロール及び少なくとも１種の骨形成タンパク質を、有効な剤形における治療的有効量で、選択される間隔にて投与して、骨組織に存在する骨芽細胞数を増加させることを含む、骨芽細胞に骨髄間質細胞の分化を増加させるために患者を治療する方法を含み、少なくとも１種の該オキシステロールが、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択され、少なくとも１種の該骨形成タンパク質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びＢＭＰ１４を含む群から選択される。
【００３１】
本発明は、少なくとも１種のオキシステロール及び少なくとも１種の骨形成タンパク質を、有効な剤形における治療的有効量で、選択される間隔にて投与して、骨形成を増加させ、骨修復を亢進させることを含む、骨形成を誘導するために患者を治療する方法を含み、少なくとも１種の該オキシステロールが、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択され、少なくとも１種の該骨形成タンパク質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びＢＭＰ１４を含む群から選択される。
【００３２】
本発明は、上記に特定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択される少なくとも１種のオキシステロールで哺乳動物間葉細胞を同時に処理することを含む、酸化ストレスの条件下での哺乳動物間葉幹細胞の骨芽細胞の分化阻害をブロックする方法を含む。
【００３３】
本発明は、上記に同定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択される少なくとも１種のオキシステロールにより哺乳動物間葉細胞を前処置することを含む酸化ストレスの条件下、哺乳動物間葉幹細胞の骨芽細胞の分化阻害から保護する方法を含む。
【００３４】
本発明は、少なくとも１種のオキシステロールにより哺乳動物間葉細胞を処理することを含む、哺乳動物間葉幹細胞の脂肪細胞への分化を阻害する方法を含み、少なくとも１種のオキシステロールが上記に同定されたオキシステロール及びオキシステロールの部分の群から選択される。
【００３５】
骨形成細胞分化に関して、骨形成オキシステロールにより酸化ストレスを阻害用薬剤及び方法。本発明は、骨芽細胞の分化又は骨形成を生じさせる上で活性であることが判明しているオキシステロール分子の任意の部分をさらに含む。本発明は、オキシステロールが骨芽細胞の分化又は骨形成を生じさせる上で活性である分子の活性化をさらに含むことができる。本発明はまた、同様の作用機序、及び／又は、骨芽細胞の分化又は骨形成に対して促進効果を有すると思われる同様の受容体を介して親分子に同様に作用すると思われる上記オキシステロールの活性部分を模倣するように設計された他の脂質分子又は類縁体を含むことができる。
【００３６】
本発明はまた、骨芽細胞の骨形成を誘導する薬剤の使用を含むことができる。本発明に有用となり得る薬剤としては、限定はしないが、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）類、ＰＴＨ、フッ化ナトリウム及びインスリン様成長因子Ｉ及びII並びに形質転換成長因子ベータなどの成長因子が挙げられる。本発明は、破骨細胞の骨再吸収を阻害する薬剤の使用を含むことができる。破骨細胞の骨再吸収作用に対して本発明に有用となり得る薬剤は、限定はしないが、ビスホスホネート類、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、カルシトニン、及びビタミンＤ／カルシウム補充が挙げられる。
【００３７】
本発明は、骨ホメオスタシスを維持し、骨形成を増強し、及び／又は骨修復を増強するために薬剤による全身送達又は局所処理の方法を含むことができる。本発明は、骨ホメオスタシスを維持し、骨形成を増強し、及び／又は骨修復を増強するために分化骨芽細胞による全身送達又は局所処理の方法を含むことができる。
【００３８】
本発明はまた、骨ホメオスタシスを誘導し、骨修復の形成又は増強するために物質のコーティングを有するか、又は分化細胞が接種されたインプラントを含むことができる。本発明はまた、骨形成又は骨修復が求められる部位で物質又は分化細胞の適用を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、骨芽細胞分化の誘導、骨ホメオスタシスの維持、骨形成の増強及び／又は骨修復の増強用の薬剤及び方法に関する。
【００４０】
本発明は、骨ホメオスタシスの維持、骨形成の増強及び／又は骨修復の増強用の薬剤の全身及び／又は局所適用を含み得る。骨ホメオスタシスを維持する方法又は化合物の能力の臨床的指標は、ＤＥＸＡスキャニングにより評価された身体の至る所の種々の部位における骨密度の改善により示されている。骨折治癒における骨形成の増強は、選択された時間間隔での骨折部位における規則的なＸ線によりルーチンに評価される。定量的ＣＴスキャニングなどの、上記指標を測定するためのさらに進んだ技法を使用できる。
【００４１】
本発明は、骨芽細胞の骨形成を刺激する薬剤の使用を含むことができる。本発明は、骨芽細胞へのＭＳＣの分化に影響を及ぼす薬剤の使用を含むことができる。
【００４２】
本発明において骨芽細胞の分化に影響を及ぼすのに有用となり得る薬剤としては、限定はしないが、個々のオキシステロール類又はそれらの組合せが挙げられる。
【００４３】
骨形成の分化、石灰化（mineralization）を誘導し、脂肪細胞への分化を阻害するオキシステロール類の能力は、骨ホメオスタシスの維持、骨形成の誘導又は骨修復の誘導に有益性を提供し得る。
【００４４】
コレステロールの生合成は、メバロネートにより抑制させ得る、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の阻害効果により示されているように、骨髄間質細胞（ＭＳＣ）分化に関与することが最近示された。さらに、オキシステロール類は、骨芽細胞の分化、さらにインビトロでＭＳＣの石灰化を誘導する能力により明白にされた骨形成能力を有することが示されている。最後にオキシステロール類は、抗脂肪細胞形成効果を有し、ＭＳＣの脂肪細胞への分化を阻害することが示されている。
【００４５】
オキシステロール類の骨形成効果及び抗脂肪細胞形成効果を示すために用いられるインビトロモデルは妥当であり、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）など他の化合物の同様の挙動を明らかにする際にこれまで用いられている。骨髄間質細胞（Ｍ２細胞）を含む骨芽前駆細胞は、動物及びヒトにインビボで存在するものと同様に作用することが示されている。これらのインビトロモデルによって、ＢＭＰなどの化合物及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）のインビボにおける骨形成効果がこれまでに首尾よく予測できている。さらに、マウス新生仔頭蓋冠を用いる骨器官培養モデルにおいてオキシステロール類の骨形成効果は示されている。この骨器官培養モデルはまた、ＢＭＰなどの種々の化合物のインビボにおける骨形成効果を首尾よく予測するためにこれまで用いられている。したがって、これら同様の知見に基づいて、オキシステロール類は、動物及びヒトのインビボでの骨形成効果を有することが予想される。これらインビトロでの化合物の骨形成効果の判定及び器官培養モデルは、動物及びヒトのインビボでのそれらの効果を示すと思われる治験に先立って必要である。
【００４６】
オキシステロール類は、ヒト及び動物の循環系及び組織に存在するコレステロールの酸化誘導体の大きなファミリーを形成する（Bjorkhem and Diczfalusy 2002. Oxysterols: friends, foes, or just fellow passengers? Arterioscler Thromb Vasc Biol 22: 734-742; Edwards and Ericsson 1999. Sterols and isoprenoids: signaling molecules derived from the cholesterol biosynthetic pathway. Annu Rev Biochem 68: 157-185; 及びSchroepfer 2000. Oxysterols: modulators of cholesterol metabolism and other processes. Physiol Rev 80: 361-554）。それらは、脂質過酸化の二次的副生成物としての自動酸化により、又は、大部分がチトクロームＰ４５０の酵素ファミリーのメンバーである特定のモノオキシゲナーゼ類の作用により少なくとも形成できる（Russell 2000. Oxysterol biosynthetic enzymes. Biochim Biophys Acta 1529: 126-135）。オキシステロール類はまた、食物から得られうる（Lyons et al. 1999. Rapid hepatic metabolism of 7-ketocholesterol in vivo: implications for dietary oxysterols. J Lipid Res 40: 1846-1857）。特定のオキシステロール類の役割は、細胞分化、炎症、アポトーシス、ステロイド産生、及びアテローム発生など、生理学的かつ病理学的過程に関係している（Bjorkhem and Diczfalusy 2002. Oxysterols: friends, foes, or just fellow passengers? Arterioscler Thromb Vasc Biol 22: 734-742; Edwards and Ericsson 1999. Sterols and isoprenoids: signaling molecules derived from the cholesterol biosynthetic pathway. Annu Rev Biochem 68: 157-185; 及びSchroepfer 2000. Oxysterols: modulators of cholesterol metabolism and other processes. Physiol Rev 80: 361-554）。特定のオキシステロール類、すなわち２２Ｒ−又は２２Ｓ−及び２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せは、非常に強力な骨形成活性を有する（Kha et al. 2004. Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19: 830-840）。これらのオキシステロールの組合せは、Ｍ２骨髄間質細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１頭蓋冠細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２胚性線維芽細胞、及びプライマリーなマウス骨髄細胞など、種々の間葉骨芽前駆細胞の骨芽細胞の分化を誘導する（Kha et al. 2004. Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19: 830-840）。オキシステロール類の骨形成作用は、ＣＯＸ／ＰＬＡ２依存的及びＭＡＰＫ依存的な機序を介して媒介されると考えられている（Kha et al. 2004. Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19: 830-840）。また、オキシステロール類は合成される限り、それらもまた本発明に使用される。
【００４７】
骨芽細胞の分化を生じさせるために本発明に有用となり得る薬剤としては、限定はしないが、個々に又は互いに組み合せて、２２Ｒ−、２２Ｓ−、２０Ｓ−及び２５−ヒドロキシコレステロール、プレグナノロン、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート（２０Ａ−ヒドロキシコレステロールと称される）、２４−ヒドロキシコレステロール、２４Ｓ，２５−エポキシコレステロール、２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシコレステロールなどのオキシステロールが挙げられる。
【００４８】
本発明に有用であり得る特定のオキシステロール類の組合せの例としては：１）２２Ｒ−と２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２）２２Ｓ−と２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、３）２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール＋２０Ａ−ヒドロキシコレステロール、４）２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールと２０Ａ−ヒドロキシコレステロール、５）２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２６−ヒドロキシコレステロール、及び６）２０Ａ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、が挙げられる。
【００４９】
また、本発明は、骨芽細胞分化又は骨形成を生じさせるのに活性であることが判明しているオキシステロール分子の任意の部分を含むことができる。また、本発明は、オキシステロール類が骨芽細胞の分化又は骨形成に作用する上で活性である分子の活性化を含むことができる。また、本発明は、骨ホメオスタシスに対して促進効果を及ぼすと思われる同様の作用機序及び同様の受容体を介して親分子と同様に作用すると思われる上記オキシステロール類の活性部分を模倣するために設計された他の脂質分子又は類縁体を含むこともできる。
【００５０】
作用機序。オキシステロールが生理的に活性である機序は調べられており、オキシステロール類は活性であり、種々の細胞経路により作用することが示されている。第一に、骨芽細胞の分化に対するオキシステロール類の効果は、チトクロームＰ４５０阻害剤により増強されることが示されている。骨芽細胞の分化に対するオキシステロール類の効果はまた、アラキドン酸代謝経路の酵素、すなわち、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）及びホスホリパーゼＡ２、及びＥＲＫにより媒介される。第二に、例えば、細胞のホスホリパーゼ活性から放出されたアラキドン酸は、骨芽細胞の分化に対するオキシステロールの効果について促進効果を発揮する。第三に、プロスタグランジンＥ２及びＣＯＸ酵素により代謝された骨形成プロスタノイドなどのプロスタグランジン類は、骨芽細胞の分化に対するオキシステロールの効果について促進効果を発揮する。第四に、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性は、オキシステロール類により増加し、骨芽細胞の分化及び石灰化と相関する。したがって、これらの薬剤又はオキシステロールの作用機序を刺激する薬剤もまた、本発明に有用となり得る。
【００５１】
さらに、オキシステロール類は、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）と呼ばれる核ホルモン受容体に結合し、活性化することが知られており、次いでＬＸＲにより調節される遺伝子のプロモーター上のコンセンサス結合部位に結合する。さらにオーファン核ホルモン受容体もまた、オキシステロール類の幾つかの調節効果を媒介し得るオキシステロールの結合部位として役立ち得る。本発明は、破骨細胞の骨再吸収を阻害する薬剤の使用を含むことができる。
【００５２】
本発明は、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグナノロン、５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート（２０Ａ−ヒドロキシコレステロールと称される）、２４−ヒドロキシコレステロール、２４Ｓ，２５−エポキシコレステロール、２６−ヒドロキシコレステロール、４ベータ−ヒドロキシコレステロール、及びこれらオキシステロール類のいずれか１種の活性部分を含む群から選択される少なくとも１種のオキシステロールを治療的有効量で含む骨疾患の治療に使用する薬物を含む。
【００５３】
治療的有効量。本発明に有用な薬剤の治療的有効量とは、上記のとおり、骨芽細胞の分化誘導や、骨ホメオスタシス、骨形成又は骨修復を改善する薬剤の能力により測定された、患者に対する好ましい臨床効果を有する用量である。各薬剤の治療的有効量は、負の副作用を最少限にしながら所望の臨床効果を生じさせるために調節できる。薬剤の投与量は、特定の患者に適した個々の治療法及び用量レベルを決定する際に、投与経路、疾患の重度、患者の年齢及び体重、患者が服用する他の薬物、担当医師により通常考慮される他の因子に依って個々の患者に対して選択できる。
【００５４】
例として、本発明は、患者の基礎レベルよりも内因性、循環オキシステロールレベルを上昇させることを含み得る。正常な成人におけるレベルは、年齢及び質量分析により測定されたオキシステロールのタイプにも依るが、約１０〜４００ｎｇ／ｍｌである。薬理学分野の当業者は、基礎レベルよりも循環レベルの増加が生じたかどうかを判定するために用量を選択し、モニターできるであろう。
【００５５】
剤形。剤形に含まれる薬剤の治療的有効量は、選択された薬剤のタイプ及び投与経路を考慮することにより選択できる。この剤形には、製薬分野の当業者に知られているように、患者への投薬を容易にするためにアジュバント及び製薬的に許容できる担体など、他の不活性な成分と組合せた薬剤を含むことができる。一実施形態において、この剤形は、摂取した際、体内において薬剤のレベルの上昇をもたらす経口用製剤（例えば、液体、カプセル、カプレットなど）であり得る。経口用製剤は、希釈剤、結合剤、限時放出剤、滑剤及び崩壊剤などの担体を含むことができる。
【００５６】
この剤形は、皮膚塗布用に局所製剤（例えば、ローション、クリーム、軟膏、経皮パッチなど）で提供できる。この剤形はまた、骨芽細胞分化、骨形成又は修復が求められる部位又は部位の近くへの配置用製剤（preparations for placement）、又は、例えば、皮下（遅延放出カプセルなど）、静脈内、腹腔内、筋内又は呼吸器適用のための製剤で提供され得る。
【００５７】
いずれか１種の薬剤又はそれらの組合せは、剤形に含ませることができる。あるいは、薬剤の併用は、別個の剤形で患者に投与できる。薬剤の併用は、治療のために少なくとも２種の薬剤に患者が曝されるように同時に、又は治療のために少なくとも２種の薬剤に患者が曝されるように連続的に投与できる。
【００５８】
付加的な薬剤。本発明は、骨ホメオスタシスの維持、骨形成の増強及び／又は骨修復の増強のために、第一の薬剤と独立して又は相乗的に作用する付加的な薬剤による処理を含むことができる。
【００５９】
付加的な薬剤は、オキシステロール類が骨芽細胞の分化を増強させる機構経路を刺激する薬剤であり得る。
【００６０】
ＢＭＰは、インビトロ及びインビボの双方で骨芽細胞の分化において役割を果たすことが判明している。ＢＭＰは、成長因子のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのメンバーであり、１０以上の異なるタンパク質からなる。ＢＭＰ２及びＢＭＰ７は、強力な骨同化作用因子として注目されている。ＢＭＰ２は、インビボ骨形成の最も強力な公知の誘導物質であり、インビトロＭ２細胞の骨芽前駆細胞前駆体の分化を増強させる。
【００６１】
予想外にも、オキシステロール類は、ＢＭＰと相乗的に作用して骨芽細胞の分化を誘導し、個々のオキシステロール類（２０Ｓ−、２２Ｓ−、２２Ｒ−オキシステロール）又はＢＭＰ単独の骨形成効果を増強させる。さらに、石灰化は、２２Ｒ−＋２０Ｓ又は２２Ｓ−＋２０Ｓオキシステロール及びＢＭＰ２の組合せを用いてインビトロで観察された。研究により、ＢＭＰ２によるＭＳＣの刺激は、骨形成への分化を増強できるが、オキシステロール類の骨形成効果は、２２Ｒ及び２０Ｓオキシステロールの組合せにより４日又は８日間処理された細胞においてＢＭＰ２ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析により評価されるように、ＢＭＰ２発現誘導の結果ではないように思われる。
【００６２】
したがって、本発明は、骨芽細胞の分化、骨ホメオスタシス、骨形成又は骨修復を誘導するために、少なくとも１種のオキシステロールと、少なくとも１種のＢＭＰとの使用を含むことができる。骨ホメオスタシスを維持し、骨形成を増強させ、及び／又は骨修復を増強させるために、これらの薬剤の併用は、相乗効果の結果、各薬剤の投与量が減少できる点で少なくとも望ましいと言える。一例において、ＢＭＰ２は、骨折治癒における局所使用について使用できる。使用される投与量は、送達方法に依って変わる。例えば、ＢＭＰ２の１０〜１００マイクログラムでコートされたビーズは、マウス骨折試験で使用されている。サルの試験において、ＢＭＰ７は、５００〜２０００マイクログラムの範囲の投与量で使用されている。イヌの試験において、ＢＭＰ２は、２００〜２０００マイクログラムで使用されている。ＢＭＰ２が骨折部位に移植されたスポンジにて送達された試験において、使用された投与量は１．５ｍｇ／ｍｌであった。融合が達成された脊椎融合試験において、１０ｍｇという大用量のＢＭＰ２が使用された。ヒトにおける脛骨偽関節骨折のヒト試験において、ＢＭＰ７は、数ｍｇの投与量が使用された。
【００６３】
本発明において単独又はオキシステロール類と併用して有用であり得る薬剤のさらなるクラスとしては、限定はしないが、ＳＫＦ５２５ＡなどのチトクロームＰ４５０阻害剤が挙げられる。本発明に有用な他のクラスの薬剤としては、ホスホリパーゼ活性剤、又はアラキドン酸が挙げられる。本発明に有用な他のクラスの薬剤としては、ＣＯＸ酵素活性剤、又はプロスタグランジン類若しくは骨形成プロスタノイド類が挙げられる。本発明に有用な他のクラスの薬剤としては、ＥＲＫ活性剤が挙げられる。
【００６４】
本発明は、オキシステロール類及び骨形成、修復又はホメオスタシスに影響を及ぼす他の療法との併用処理を含むことができる。例えば、オキシステロール類は、ビスホスホネート類、エストロゲン受容体モジュレーターなどのホルモン療法処理、カルシトニン、及びビタミンＤ／カルシウム補充ＰＴＨ（Forteo又はteriparatide、Eli Lilly社製）、フッ化ナトリウム及びインスリン様成長因子Ｉ及びII並びに形質転換成長因子ベータなどの骨に対して促進効果を有する成長因子と併用する。当業者は、標準的な治療用量のパラメータを用いて各療法に対して許容される投与量を決定することができるであろう。  
【００６５】
本発明は、骨ホメオスタシスの維持、骨形成の増強及び／又は骨修復の増強に、分化骨芽細胞による全身送達又は局所処理の方法を含むことができる。この処理は、上記のとおり、単独で又は他の薬剤（１種又は複数種）の投与と併用して患者に投与できる。図１は、本発明による一方法のフローチャートを示している。この方法の実施形態において、哺乳動物の間葉幹細胞を、患者又は細胞ドナーから採取できる（１００）。次に細胞を、細胞の骨芽細胞分化を誘導するために少なくとも１種の薬剤により処理できる（１０２）。次いでこの細胞を、患者に全身又は骨ホメオスタシス、骨形成又は骨修復が求められる選択された部位に再投与できる（１０４）。さらに、患者は、骨ホメオスタシス、骨形成又は骨修復を生じさせる少なくとも１種の第二の薬剤により局所的又は全身に処理を受けることができる（１０６）。
【００６６】
本発明のこの態様において、ＭＳＣは、アルカリホスファターゼ活性、カルシウムの取り込み、石灰化、オステオカルシンｍＲＮＡの発現、Ｒｕｎｘ２のＤＮＡへの結合、及びＲｕｎｘ２タンパク質の発現、又は骨芽細胞分化の他の指標のいずれか１つの増加により測定された骨芽細胞分化を刺激する薬剤（１種又は複数種）により処理できる。本発明の実施形態において、ＭＳＣ細胞を患者から採取し、少なくとも１種のオキシステロールにより処理し、骨芽細胞を患者に投与する。
【００６７】
本発明は、骨芽細胞に分化したＭＳＣを患者に全身投与することを含むことができる。
【００６８】
本発明は、患者の体内の選択される部位に、骨芽細胞に分化したＭＳＣを配置すること、又は配置後オキシステロール類を含む薬剤により骨芽細胞の分化を誘導することを含むことができる。本発明の一実施形態において、細胞を、骨ホメオスタシス、骨形成及び／又は骨修復が求められる部位に注入できる。
【００６９】
本発明の一適用において、薬剤及び方法を、限定はしないが、骨粗しょう症などの骨関連疾患の治療又は進行の遅延化に適用できる。
【００７０】
本発明の適用において、薬剤及び方法を、限定はしないが、歯周炎、歯周部再生、歯インプラント再構築用歯槽堤増大、偽関節骨折の治療、膝／腰／関節の修復部位又は置換手術部位に細胞又は薬剤の適用を行うことができる。
【００７１】
図２は、本発明の２つの実施形態を示している。図２Ａにおいて、本発明は、表面を有する基材（２０１）を含むヒト身体に使用のインプラント（２００）を含み、インプラント表面の少なくとも一部が、骨芽細胞の分化、骨ホメオスタシス、周囲の組織の形成又は修復を誘導させるのに十分な量の少なくとも１種のオキシステロール（２０３）を含むか、又はインプラントは、骨形成を誘導するか、又は骨修復を増強させるために骨芽細胞への分化が可能である哺乳動物細胞、又は骨芽細胞の哺乳動物細胞、若しくはそれらの組合せを含む。例えば、インプラントとしては、限定はしないが、骨折を固定化するか、骨形成を増強するか、又は骨除去部位、骨折又は他の骨傷害部位（２０４）の形成若しくは修復を刺激することによって人工インプラントを安定化させるために使用される、骨（２０２）に近接させて又は骨と接触させて配置できるピン、スクリュー、プレート、又は人工関節を挙げることができる。
【００７２】
図２Ｂに示されるように、本発明はまた、骨形成若しくは骨修復が求められる骨除去部位、骨折又は他の骨傷害部位（２０４）で、骨（２０２）に近接させて又は骨と接触させて少なくとも１種の薬剤又は分化細胞（２０６）の適用をすることを含むことができる。
【００７３】
本発明は、酸化ストレスを軽減するために、単一のオキシステロール又はオキシステロール類の組合せのみを使用するための組成物、基材及び方法を含むことができる。本発明は、酸化ストレスを軽減するために、ＢＭＰ単独又は１種以上のオキシステロール類の組合せの使用を含むことができる。さらに具体的には、少なくともアルカリホスファターゼ活性及び／又は骨髄間質細胞によるカルシウム取り込みの減少により測定されるように、骨形成分化を阻害する酸化ストレスの作用を最少限にするか、又は除去するために、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）及び／最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ−ＬＤＬ）（又は同様の分子機序により作用する薬剤）などの薬剤により部分的又は全体的に引き起こされる酸化ストレスの前、それと同時、又はその後に、２２Ｓ＋２０Ｓオキシステロールというオキシステロールの組合せを使用できる。それに加えて又はそれに代えて、少なくともアルカリホスファターゼ活性及び／又は骨髄間質細胞によるカルシウム取り込みの減少により測定されるように、骨形成分化を阻害する酸化ストレスの作用を最少限にするか、又は除去するために、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）及び／最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ−ＬＤＬ）（又は同様の分子機序により作用する薬剤）などの薬剤により部分的又は全体的に引き起こされる酸化ストレスの前、それと同時、又はその後に、ｒｈＢＭＰ２を使用できる。
［実施例］
【００７４】
材料：オキシステロール類、ベータ−グリセロホスフェート（βＧＰ）、硝酸銀、オイルレッドＯは、Sigma社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から、ＲＰＭＩ  １６４０、アルファ改変必須培地（α−ＭＥＭ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Irvine Scientific社（サンタアナ、カリフォルニア州、米国）から、及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、Hyclone社（ローガン、ユタ州、米国）から入手した。ＰＤ９８０５９は、BIOMOL Research Labs社（プリマスミーティング、ペンシルバニア州、米国）から、ＴＯ−９０１３１７、ＳＣ−５６０、ＮＳ−３９８、イブプロフェン、及びフルルビプロフェンは、Cayman Chemical社（アンアーバー、ミシガン州、米国）から、ＡＣＡ及びＡＡＣＯＣＦ３は、Calbiochem社（ラジョラ、カリフォルニア州、米国）から、組換えヒトＢＭＰ２は、R&D Systems社（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から購入した。リン酸化及び天然ＥＲＫに対する抗体は、New England Biolabs社（ビバリー、マサチューセッツ州、米国）から、及びトログリタゾンは、Sankyo社（東京、日本国）から入手した。
【００７５】
細胞：American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、ロックビレ、メリーランド州、米国）から入手したＭ２−１０Ｂ４マウス骨髄間質細胞は、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）Ｆ１マウスの骨髄間質細胞に由来し、長期培養（ＡＴＣＣに従って）におけるヒト及びマウスの骨髄形成を支持し、骨芽細胞及び脂肪細胞へ分化する能力を有する。指定されない限り、これらの細胞を、１０％の加熱不活化したＦＢＳを含有し、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（全てIrvine Scientific社製）が添加されたＲＰＭＩ １６４０中で培養した。
【００７６】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウスの前骨芽細胞系を、ＡＴＣＣから購入し、１０％の加熱不活化したＦＢＳ及び上記のとおりの添加物を含有するα−ＭＥＭ中で培養した。
【００７７】
Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２マウスの多能性胎仔線維芽細胞は、Kristina Bostrom博士（ＵＣＬＡ）より恵与され、該細胞を、１０％の加熱不活化したＦＢＳ及び上記のとおりの添加物を含有するＤＭＥＭ中で培養した。プライマリーなマウス骨髄間質細胞を、オスの４〜６月齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離し、文献に報告されたとおり培養し、増殖させた。参照としてその全体が本明細書に組み込まれている、Parhami, F. et al.、J. Bone Miner. Res. 14、2067-2078 (1999)。
【００７８】
アルカリホスファターゼ活性アッセイ：細胞全抽出物に対する比色アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性アッセイは、以前に記載されたとおりに実施した。
【００７９】
Von Kossa及びオイルレッドＯ染色−細胞単層内のマトリックスの石灰化を、文献に記載されたとおり硝酸銀により検出した。脂肪細胞の検出のためにオイルレッドＯ染色を、文献に記載されたとおり実施した。
【００８０】
４５Ｃａ取り込みアッセイ−細胞単層内のマトリックスの石灰化を、以前に記載されたとおり４５Ｃａ取り込みアッセイを用いて定量した。
【００８１】
ウェスタンブロット解析−処理後、細胞を溶解用緩衝液中で溶解し、タンパク質濃度をBio-Rad社のタンパク質アッセイ（ヘルクレス、カリフォルニア州、米国）を用いて測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、前述したとおり実施した。天然及びリン酸化ＥＲＫに対する探査は、文献に記載されたとおりに実施した。
【００８２】
ＲＮＡの単離及びノーザンブロット解析−適切な実験条件下で細胞処理後、総ＲＮＡを、Stratagene社（ラジョラ、カリフォルニア州、米国）からのＲＮＡ単離用キットを用いて単離した。総ＲＮＡ（１０ｍｇ）を、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で泳動し、Duralon−ＵＶ膜（Stratagene社製、カリフォルニア州、米国）に移し、ＵＶ光により架橋固定した。該膜を、それぞれGeneka Biotechnology社（モントリオール、ケベック州、カナダ国）及びMaxim Biotech社（サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）から入手した３２Ｐ標識マウスオステオカルシンｃＤＮＡプローブ、マウス脂質タンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、マウス脂肪細胞タンパク質２（ａＰ２）ＰＣＲ生成プローブ、ヒト２８Ｓ又は１８Ｓ ｒＲＮプローブにより６０℃で一晩ハイブリダイズした。以下の設計書：３０９塩基対のＰＣＲ産物を作出するマウスＰ２遺伝子（アクセッション番号Ｍ１３２６１）；センス（７５〜９５）５’−ＣＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡ−３’、アンチセンス（３６２〜３８３）５’−ＣＡＧＣＡＣＴＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＴＣ−３’、及び設計書：７９９塩基対のＰＣＲ産物を作出するマウスＬＰＬ（アクセッション番号ＸＭ＿１３４１９３）；センス（１０３８〜１０５８）５’−ＧＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡ−３’、アンチセンス（１８１６〜１８３６）５’−ＴＧＧＧＣＣＡＴＴＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＣ−３’：にしたがってInvitrogen社（カールスバッド、カリフォルニア州、米国）により合成されたプライマーセットを用いて、ＰＣＲ産物を作製した。ＰＣＲ産物はゲル精製を行い、ＵＣＬＡで配列決定コア（sequencing core）により配列決定したところ、それぞれGenBankのエントリーと最高の類似性を示した。ハイブリダイゼーション後、ブロットを２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにより室温で２回、次いで０．５×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにより６０℃で２回洗浄し、Ｘ線フィルムに感光させた。遺伝子の誘導の程度を、濃度測定法により測定した。
【００８３】
統計解析−コンピュータによる統計解析は、StatView４．５プログラムを用いて実施した。全てのｐ値を、ＡＮＯＶＡ及びフィッシャーの提案した最小有意差（ＰＬＳＤ）有意検定を用いて算出した。ｐ＜０．０５の値を、有意であると見なした。
【００８４】
実施例Ａ：ＭＳＣにおけるオキシステロイド類の骨形成効果
試験１：１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸塩及び３ｍＭベータ−グリセロホスフェート（μＧＰ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０からなる骨形成培地中、コンフルエントなＭ２細胞を、対照ビヒクル（Ｃ）、又は１０μＭオキシステロール類により処理した。インキュベーション３日後、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を、細胞ホモジネート中の比色アッセイにより測定した。代表的な５つの実験結果を、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均±ＳＤとして記載した（Ｃ対オキシステロール処理細胞に関して＊ｐ＜０．０１）。図３Ａは、対照細胞と比較したＭ２細胞中、アルカリホスファターゼ活性に対する種々のオキシステロール類の効果を示す棒グラフである。
【００８５】
コンフルエントなＭ２細胞を、対照ビヒクル（Ｃ）又は指定された濃度の２２Ｒ及び２０Ｓオキシステロールの組合せによる骨形成培地中で処理した。ＡＬＰ活性は、上記のとおり３日後に測定した。代表的な４つの実験結果を、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均±ＳＤとして記載した（Ｃ対オキシステロール処理細胞に関して＊ｐ＜０．０１）。図３Ｂは、Ｍ２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対する、種々の用量でのオキシステロール類の組合せの効果を示す棒グラフである。
【００８６】
コンフルエントなＭ２細胞を、対照ビヒクル又は５μＭオキシステロール類の単独若しくは指定された濃度の組合せによる骨形成培地中で処理した。１４日後、石灰化は、黒色が現れるvon Kossa染色により確認された。図３Ｃは、種々の条件に曝されたＭ２細胞をvon Kossa染色した図である。
【００８７】
Ｍ２細胞を、対照ビヒクル（Ｃ）又は濃度を増加させた２２Ｒ及び２０Ｓオキシステロールの組合せにより処理した。１４日後、培養物中のマトリックスの石灰化を、４５Ｃａの取り込みアッセイを用いて定量化した。代表的な４つの実験結果を、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均±ＳＤとして記載した（Ｃ対オキシステロール処置細胞に関して＊ｐ＜０．０１）。図３Ｄは、Ｍ２細胞におけるカルシウム取り込みに対する、種々の用量でのオキシステロール類の組合せの効果を示す棒グラフである。
【００８８】
コンフルエントなＭ２細胞を、対照ビヒクル（Ｃ）又は骨形成培地中、２２Ｒ及び２０Ｓオキシステロール（各５μＭ）の組合せにより処理した。４日及び８日後、二回反復のサンプルから総ＲＮＡを単離し、記載されたノーザンブロット法によりオステオカルシン（Ｏｓｃ）及び２８Ｓ ｒＲＮＡ発現に関して分析を行なった。図３Ｅは、対照又は４日若しくは８日間、オキシステロールの組合せに曝されたＭ２細胞中のオステオカルシンｍＲＮＡのノーザンブロットのＸ線写真である。図３Ｆは、対照又は４日若しくは８日間、オキシステロールの組合せに曝されたＭ２細胞中のオステオカルシンｍＲＮＡの相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。ノーザンブロットの濃度測定解析からのデータを、２８Ｓ ｒＲＮＡで正規化し、二回反復のサンプルの平均値として（Ｆ）に示した。
【００８９】
試験１の結果：ＭＳＣの培養物において、アルカリホスファターゼ活性の活性化、オステオカルシン遺伝子発現、及び細胞コロニーの石灰化は、骨芽細胞表現型への分化の増加の指標である。特定のオキシステロール類、すなわち２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール（２２Ｒ）、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール（２０Ｓ）、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール（２２Ｓ）の各々は、多能性Ｍ２−１０Ｂ４マウスＭＳＣ（Ｍ２）中のアルカリホスファターゼ活性、骨形成分化の早期マーカーを誘導した。７−ケトコレステロール（７Ｋ）は、これらの細胞中のアルカリホスファターゼ活性を誘導しなかった。
【００９０】
アルカリホスファターゼ活性の誘導は、０．５〜１０μＭ間の濃度で用量及び時間双方に依存し、２０Ｓ＞２２Ｓ＞２２Ｒという相対的効力を示した。これらオキシステロール類への４時間の曝露に次ぐ、オキシステロール類を含まない骨形成培地による置換は、培養４日後に測定したように、Ｍ２細胞中のアルカリホスファターゼ活性を誘導するのに十分であった。
【００９１】
０．５μＭから１０μＭ未満の濃度での個々のオキシステロール（２２Ｒ、２０Ｓ及び２２Ｓ）は、１４日ほどの処理後でも、石灰化又はオステオカルシン遺伝子発現を誘導できなかった（データは示さず）。しかしながら、２２Ｒ+２０Ｓ又は２２Ｓ+２０Ｓオキシステロールの組合せによるＭ２培養では、各オキシステロールが１〜５μＭの用量で、アルカリホスファターゼ活性（図３Ｂ）、強い石灰化（図３Ｃ及びＤ）及びオステオカルシン遺伝子発現（図３Ｅ及びＦ）が全ての場合に誘導された。
【００９２】
試験２：Ｍ２細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ培地中で増殖させた。コンフルエントなＭ２細胞を、５％ＦＢＳプラス５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩及び３ｍＭのβ−グリセロホスフェートを含有するＲＰＭＩ中で処理して骨芽細胞分化を誘導させた。脂肪細胞への分化は、増殖培地プラス１０〜Ｍトログリタゾン中で細胞を処理することにより誘導させた。ビヒクル（Ｃ）又はオキシステロール（２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール；２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール；７−ケトコレステロール）処理は、種々の用量（μＭ）で細胞に適用した。細胞は常に９０％の集密度で処理した。４日後、アルカリホスファターゼ活性を、細胞全溶解液中で測定し、タンパク質で正規化した。あるいは、ＭＳＣ培養物を調製し、上記のとおりオキシステロール類で処理した。細胞を、各々５μＭの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール及び２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せで４時間から９６時間、９０％の集密度で処理した。オキシステロール類を除去した後、オキシステロール類を含まない新鮮な培地を９６時間の全期間に持続的に加えた。アルカリホスファターゼ活性は、細胞全抽出物中で測定し、タンパク質で正規化した。
【００９３】
試験２の結果：図４Ａは、曝露４日後のＭ２細胞に対して種々の用量での種々のオキシステロール類の効果を示す棒グラフである。オキシステロール類は、アルカリホスファターゼ活性、骨芽細胞分化の早期マーカーを誘導した。
【００９４】
図４Ｂは、処理から２４時間後のＭ２細胞に対して種々の用量での種々のオキシステロール類の効果を示す棒グラフである。ビヒクル（Ｃ）、又は各々５μＭのオキシステロール類２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール及び２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの単独又は組合せにより、９０％の集密度で細胞を処理した。２４時間後、細胞をリンスし、オキシステロール類を含まない培地に置き換えた。４日後、アルカリホスファターゼ活性を、細胞全抽出物中で測定し、タンパク質で正規化した。アルカリホスファターゼ活性は、オキシステロール類による処理から２４時間経過しただけで数倍に誘導された。
【００９５】
図４Ｃは、Ｍ２細胞に対するオキシステロール類による処理期間の効果を示す棒グラフである。オキシステロール類（各々５μＭの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール及び２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール）の組合せによる処理は、処理から４日間測定しているように、処理後４〜９６時間においてアルカリホスファターゼ活性を誘導した。
【００９６】
図４Ｄは、Ｍ２細胞に対する、種々の用量のオキシステロール類の組合の効果を示す棒グラフである。Ｍ２細胞に対するオキシステロール類の組合せの効果は、アルカリホスファターゼ活性の誘導に関して用量依存的であった。
【００９７】
図４Ｅは、Ｍ２細胞に対する、種々の用量のオキシステロール類の組合せの効果を示す棒グラフである。２２Ｒ及び２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せにより処理した。１０日後に、骨の石灰化を評価するために４５Ｃａの取り込みを測定し、タンパク質で正規化した。Ｍ２細胞に対するオキシステロール類の組合せの効果は、同様に、骨の石灰化の誘導に関して用量依存性であった。
【００９８】
実施例Ｂ：オキシステロールのチトクロームＰ４５０阻害効果。Ｍ２細胞を、チトクロームＰ４５０阻害剤（ＳＫＦ５２５Ａ  １０μＭ（＋））の不在又は存在下、ビヒクル（Ｃ）、（０．５μＭ）又は（１μＭ）でのオキシステロール類２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール又は２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールにより９０％の集密度で処理した。ＭＳＣ培養物はまた、チトクロームＰ４５０活性剤（ベンジルイミダゾール５０μＭ）又はＳＫＦ５２５Ａ（１０μＭ）の不在又は存在下、ビヒクル（Ｃ）、又は２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール（２μＭ）により９０％の集密度で処理した。４日後、細胞全抽出物中のアルカリホスファターゼ活性を測定し、タンパク質で正規化した。
【００９９】
実施例Ｂの結果：図５Ａは、骨髄間質細胞に対するオキシステロール類及びチトクロームＰ４５０阻害剤ＳＫＦ５２５Ａの効果を示す棒グラフである。４日後、細胞全抽出物中のアルカリホスファターゼ活性を測定し、タンパク質で正規化した。チトクロームＰ４５０阻害剤の使用により、オキシステロール類の骨形成効果が増強した。このことから、オキシステロール類はチトクロームＰ４５０酵素により代謝され、該酵素により阻害されることが示唆された。
【０１００】
図５Ｂは、Ｍ２細胞に対するオキシステロール類及びチトクロームＰ４５０活性剤ベンジルイミダゾール並びに阻害剤ＳＫＦ５２５Ａの効果を示す棒グラフである。チトクロームＰ４５０酵素、ベンジルイミダゾールの刺激剤による処理は、恐らくオキシステロール分解を増強させることにより、オキシステロールの効果を阻害した。
【０１０１】
実施例Ｃ：オキシステロール類による、ＭＳＣにおける脂肪細胞形成の阻害。ＭＳＣを含む脂肪細胞前駆体の脂肪細胞形成は、リガンド結合による活性化の際に脂肪細胞特異的遺伝子の転写を調節する転写因子ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）により調節される。
【０１０２】
試験１：９０％の集密度のＭ２細胞を、ビヒクル（Ｃ）、ＰＰＡＲ−γ活性剤、トログリタゾン１０μＭ（Ｔｒｏ）により処理し、さらに１０μＭオキシステロール類２０Ｓ−、２２Ｒ−、又は２５Ｓ−ヒドロキシコレステロールの単独又は組み合せにて処理した。８日後、脂肪細胞を、オイルレッドＯ染色により確認し、位相差顕微鏡下でカウントして定量化した。図６Ａは、ＭＳＣにおける脂肪細胞形成減少に対する、オキシステロール類の効果を示す棒グラフである。骨形成オキシステロール類は、ＭＳＣ培養物において脂肪細胞形成を阻害した。
【０１０３】
試験２：（Ａ）コンフルエントなＭ２細胞を、１０μＭの２０Ｓ−又は２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールの不在又は存在下、対照ビヒクル又は１０μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏ）と共に１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中で処理した。１０日後、脂肪細胞を、オイルレッドＯ染色により可視化し、（Ｂ）に示された光学顕微鏡により定量化した。代表的な４つの実験のデータを示し、四回反復試験測定値の平均ＳＤとして記載した（Ｔｒｏ対Ｔｒｏ＋２０Ｓ及びＴｒｏ＋２２Ｓに関してｐ＜０．００１）。（Ｃ）Ｍ２細胞を、１０μＭ  Ｔｒｏ単独で、又は１０μＭの２０Ｓオキシステロールと組み合せて、コンフルエントな状態で処理した。１０日後、総ＲＮＡを単離し、記載されたノーザンブロット法（参考文献）により、脂質タンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、脂肪細胞Ｐ２遺伝子（ａＰ２）又は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現に関して解析した。ノーザンブロットの濃度測定解析のデータを、１８Ｓ ｒＲＮＡで正規化し、二回反復サンプルの平均値として（Ｄ）に示した。
【０１０４】
図７：Ａ）オイルレッドＯ染色により脂肪細胞が可視化されたＭ２細胞培養物を示す図であり；Ｂ）各処理群における、脂肪細胞数／視野を示す棒グラフであり；Ｃ）対照又は処理サンプルに曝されたＭ２細胞における、脂質タンパク質リパーゼ、脂肪細胞Ｐ２遺伝子又は１８Ｓ ｒＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真であり；Ｄ）対照又は処理サンプルに曝されたＭ２細胞における、脂質タンパク質リパーゼ、脂肪細胞Ｐ２遺伝子ｍＲＮＡの相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。
【０１０５】
脂肪細胞形成を誘導するＴｒｏ（ＰＰＡＲγ活性剤、トログリタゾン（Ｔｒｏ））により処理されたＭ２細胞において、さらに２０Ｓ、２２Ｓ、及び２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール単独又は組合せにより処理したところ、脂肪細胞形成が阻害された。これらオキシステロール類の相対的な抗脂肪細胞形成効力は、２０Ｓ＞２２Ｓ＞２２Ｒであって、Ｍ２細胞においてアルカリホスファターゼ活性を活性化するそれらの相対的効力と同様であった。その骨形成作用の欠如と同様に、７Ｋは、Ｍ２細胞における脂肪細胞形成をも阻害できなかった（データは示さず）。脂肪細胞形成阻害を、２０Ｓによる脂肪細胞形成遺伝子の脂質タンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）及び脂肪細胞Ｐ２遺伝子（ａＰ２）の発現阻害によっても評価した（図７Ｃ及びＤ）。脂肪細胞形成に対するこれらオキシステロール類の阻害効果はまた、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２及びプライマリーなマウスＭＳＣを用いて示し、脂肪細胞形成は、Ｔｒｏ又はデキサメタゾン及びイソブチルメチルキサンチンからなる標準的な脂肪細胞形成混合物により誘導した。
【０１０６】
実施例Ｄ：オキシステロールの作用機序。肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）は、オキシステロール類に対して一定の細胞応答を部分的に媒介する核ホルモン受容体である。ＬＸＲαは、組織特異的に発現されるが、一方、ＬＸＲβは、遍在的に発現される。ノーザンブロット解析により、Ｍ２細胞の集密培養においてＬＸＲαではなくてＬＸＲβの発現が示された。骨形成オキシステロールの作用を媒介する際にＬＸＲが果たす可能性のある役割を評価するために、薬理的ＬＸＲリガンドＴＯ−９０１３１７（ＴＯ）によりＬＸＲβの活性化を調べた。
【０１０７】
試験１：１〜１０μＭでのＴＯは、Ｍ２細胞におけるアルカリホスファターゼについて用量依存的な阻害を生じさせた（Ｃ：１８±２；１０μＭで用いたリガンド：２２Ｒ＝４５±５；２０Ｓ＝１４０±１２；及びＴＯ＝３±０．５活性単位／ｍｇタンパク質±ＳＤ；Ｃ対全てのリガンドに関してｐ＜０．０１）。さらに、ＴＯ処理は、１０日後、オステオカルシン遺伝子発現又は石灰化を誘導しなかった。したがって、このようにＭ２細胞に対するオキシステロール類の骨形成効果は、非ＬＸＲオキシステロールリガンド２２Ｓの強力な骨形成活性及びＬＸＲリガンドＴＯに対する応答において骨形成作用の欠如により示唆されるように、これまでのところＬＸＲ−ベータ受容体から独立しているように思われる。
【０１０８】
試験２：９０％の集密度のＭＳＣ細胞は、ビヒクル（Ｃ）、又は２つの関連のないＬＸＲリガンド（１〜４μＭでのＴＯ及びＧＬ）、又は２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）で処理した。４日後、細胞全溶解液のアルカリホスファターゼ活性を測定し、タンパク質で正規化した。図８は、ＭＳＣの骨芽細胞への分化の阻害に対するＬＸＲ活性剤の効果を示す棒グラフである。ＬＸＲベータはＭＳＣに存在するが、ＬＸＲの特定の活性剤による処理は、骨芽細胞への分化及びこれら細胞の石灰化を阻害したことから、上記のオキシステロール類の骨形成作用はＬＸＲ−ベータを介しているとは思われない。
【０１０９】
実施例Ｅ：ＭＳＣにおけるオキシステロール類の骨形成活性の機序
骨芽細胞への間葉細胞の分化は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性により調節される。ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の双方は、骨芽細胞に存在し、それぞれ、骨ホメオスタシス及び修復に主として関与していると思われる。ＣＯＸ類による、アラキドン酸のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などのプロスタグランジン類への代謝は、これら酵素の骨形成作用を媒介する。ＣＯＸ産物及びＢＭＰ２は、補足的かつ付加的な骨形成作用を有する。
【０１１０】
（Ａ）コンフルエントなＭ２細胞を、先に記載された骨形成培地中、対照ビヒクル（Ｃ）又は１０μＭのＣＯＸ−１阻害剤ＳＣ−５６０（ＳＣ）により４時間の前処理を行った。次に、２２Ｒ及び２０Ｓオキシステロール（ＲＳ、各２．５μＭ）の組合せを、指定されるようにＳＣの存在下又は不在下で加えた。３日後、ＡＬＰ活性を先に記載されたとおり測定した。代表的な３つの実験のデータを、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した（ＲＳ対ＲＳ＋ＳＣに関してｐ＜０．００１）。（Ｂ）Ｍ２細胞を、（Ａ）に記載されたとおり処理し、１０日後、培養物中のマトリックスの石灰化を、先に記載されたとおり４５Ｃａの取り込みアッセイにより定量化した。代表的な３つの実験のデータを、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した。（Ｃ）Ｍ２細胞を、２０μＭＳＣで４時間前処理し、次いで上記のとおりＳＣの存在下又は不在下でＲＳを加えた。８日後、総ＲＮＡを単離し、オステオカルシン（Ｏｓｃ）及び１８Ｓ ｒＲＮＡ発現を、先に記載されたとおりのノーザンブロット法により解析した。ノーザンブロットの濃度測定解析のデータを、１８Ｓ ｒＲＮＡで正規化し、二回反復サンプルの平均値として（Ｄ）に示した。（Ｅ）コンフルエントなＭ２細胞を、骨形成培地中、対照ビヒクル（Ｃ）、又はＰＬＡ２阻害剤ＡＣＡ（２５μＭ）及びＡＡＣＯＣＦ３（ＡＡＣ、２０μＭ）で２時間前処理した。次に、２２Ｒ及び２０Ｓオキシステロール（ＲＳ、２．５μＭ）の組合せを、指定されるように阻害剤の存在下又は不在下で加えた。３日後、ＡＬＰ活性を先に記載されたとおり測定した。代表的な３つの実験のデータを、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した（ＲＳ対ＲＳ＋ＡＣＡ及びＲＳ＋ＡＡＣに関してｐ＜０．０１）。（Ｆ）Ｍ２細胞を（Ｅ）に記載されたとおり処理した。１０日後、培養物中のマトリックスの石灰化を、先に記載されたとおり４５Ｃａの取り込みアッセイを用いて定量化した。代表的な３つの実験のデータを、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した（ＲＳ対ＲＳ＋ＡＣＡ及びＲＳ＋ＡＡＣに関してｐ＜０．０１）。
【０１１１】
図９：Ａ）Ｍ２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対する、ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフであり；Ｂ）Ｍ２細胞におけるカルシウムの取り込みに対する、ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフであり；Ｃ）ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロールに曝されたＭ２細胞における、オステオクラスチン１８Ｓ ｒＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真であり；Ｄ）ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロールに曝されたＭ２細胞における、オステオクラスチンｍＲＮＡの相対的な濃度測定単位を示す棒グラフであり；Ｅ）Ｍ２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対する、ＰＬＡ２阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフであり；及びＦ）Ｍ２細胞におけるカルシウムの取り込みに対する、ＰＬＡ２阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフである。
【０１１２】
実験条件に対応するウシ胎仔血清の存在下、培養物中のＭ２細胞は、骨形成分化の全段階においてＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２ｍＲＮＡの双方を発現する。骨形成におけるＣＯＸの役割と一致して、その結果から、１〜２０μＭでＣＯＸ−１選択的阻害剤ＳＣ−５６０が、２２Ｒ＋２０Ｓ及び２２Ｓ＋２０Ｓオキシステロールの組合せの骨形成作用を有意に阻害したことが示される。ＳＣ−５６０は、オキシステロール誘導アルカリホスファターゼ活性（図９Ａ）、石灰化（図９Ｂ）、及びオステオカルシン遺伝子発現（図９Ｃ及び９Ｄ）を阻害した。ＳＣ−５６０よりも作用が低いが、１〜１０μＭの非毒性用量において非選択的ＣＯＸ阻害剤であるイブプロフェン及びフルリプロフェンもまた、２２Ｒ＋２０Ｓのオキシステロールの組合せの骨形成作用を２５〜３０％まで有意に阻害した。対照的に２０μＭの非毒性の最高用量において、選択的ＣＯＸ−２阻害剤、ＮＳ−３９８は、無視できる阻害作用のみを示した。
【０１１３】
さらに、アルカリホスファターゼ活性に対するオキシステロールの組合せの骨形成作用（図９Ｅ）及び石灰化（図９Ｆ）に対する、オキシステロールの組合せの骨形成作用もまた、一般的なホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害剤であるＡＣＡ及び選択的細胞基質であるＰＬＡ２阻害剤、ＡＡＣＯＣＦ３（ＡＡＣ）により阻害された。ＰＬＡ２の活性化により細胞リン脂質からアラキドン酸が放出され、それは、ＣＯＸ酵素によるプロスタグランジン類へのさらなる代謝に利用される。さらに、救出実験（rescue experiment）では、オキシステロール誘導アルカリホスファターゼ活性に対するＣＯＸ−１及びＰＬＡ２阻害剤の作用が、それぞれ１μＭのＰＧＥ２及び２５μＭのアラキドン酸の添加により阻害されることが示された（データは示さず）。オキシステロール刺激によるアラキドン酸の代謝に関する文献の報告と一致して、当該結果により、ＭＳＣにおけるオキシステロール類骨形成活性は、ＰＬＡ−２誘導アラキドン酸放出の活性化、及びＣＯＸ経路による骨形成プロスタノイドへのその代謝によりある程度媒介されることが示唆された。
【０１１４】
実施例Ｆ：オキシステロール類に対するＭＳＣの応答を媒介する上でのＥＲＫの役割。細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）経路は、先に骨芽前駆細胞の骨芽細胞分化に関連した別の主要なシグナル伝達経路である。ＥＲＫ類の持続活性は、ヒトＭＳＣ５２の骨形成分化を媒介し、ヒト骨芽細胞におけるＥＲＫ類の活性化により、発現の増強及び骨形成分化のマスター（master）調節因子であるＣｂｆａ１のＤＮＡ結合活性を生じる。さらに、ＥＲＫの活性化は、ヒト骨芽細胞の増殖、分化、及び適切な機能に必須であるように思われる。
【０１１５】
（Ａ）コンフルエントなＭ２細胞を、１％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩにより４時間前処理し、対照ビヒクル又は５μＭの２０Ｓオキステロールで１時間、４時間又は８時間処理した。次に、細胞全抽出物を調製し、先に記載された特異的抗体を用いて天然又はリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルを分析した。代表的な４つの実験のデータを示し、各処理は二回反復のサンプルで示す。（Ｂ）コンフルエントなＭ２細胞を、先に記載された骨形成培地中、対照ビヒクル（Ｃ）又は２０μＭのＰＤ９８０５９（ＰＤ）により２時間前処理を行った。次に、２２Ｒ及び２０Ｓオキシステロール（ＲＳ、各５μＭ）の組合せを、指定された適切なウェルに添加した。インキュベーション１０日後、マトリックスの石灰化を、先に記載された４５Ｃａの取り込みアッセイにより定量化した。代表的な３つの実験のデータを、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した（ＲＳ対ＲＳ＋ＰＤに関してｐ＜０．０１）。（Ｃ）コンフルエントなＭ２細胞を、５％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中、２０□ＭのＰＤ９８０５９（ＰＤ）により２時間前処理した。次に、細胞を、対照ビヒクル（Ｃ）、１０μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏ）、又は１０μＭの２０Ｓ及び２２Ｓオキシステロールの単独又は指定された組合せにて処理した。１０日後、脂肪細胞をオイルレッドＯ染色により可視化し、先に記載された光学顕微鏡により定量化した。代表的な３つの実験のデータを、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した。
【０１１６】
図１０：Ａ）対照又はオキシステロール処理に曝されたＭ２細胞において発現するｐＥＲＫ又はＥＲＫに関するウェスタンブロットであり；Ｂ）Ｍ２細胞におけるカルシウムの取り込みに対する、ＰＤ９８０５９又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフであり；（Ｃ）各処理群における、脂肪細胞数／視野を示す棒グラフである。
【０１１７】
興味深いことに、単独又は２２Ｒオキシステロールとの組合せで用いられる２０Ｓオキシステロールは、Ｍ２細胞においてＥＲＫ１及びＥＲＫ２について持続的な活性化を生じさせた（図１０Ａ）。阻害剤ＰＤ９８０５９によるＥＲＫ経路の阻害は、オキシステロール誘導による石灰化を阻害したが（図１０Ｂ）、Ｍ２細胞培養物におけるアルカリホスファターゼ活性又はオステオカルシンｍＲＮＡ発現を阻害しなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＥＲＫの持続的な活性化が、全てではないものの、オキシステロール類の一定の特異的骨形成作用を調節する上で重要であることを示唆している。
【０１１８】
実施例Ｇ：２０Ｓと、２２Ｒ又は２２Ｓとの組合せもまた、アルカリホスファターゼ活性及び石灰化の活性化により評価されるように、マウス多能性胚性線維芽細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、マウス頭蓋冠前骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、及びプライマリーマウスＭＳＣにおいて骨形成効果を生じた。
【０１１９】
骨髄間質細胞の骨形成活性に対する活性化効果を発揮したオキシステロール類の他の組合せは、双方とも５μＭの２２Ｒ＋プレグナノロン、２０Ｓ＋プレグナノロンであった。プレグナノロンは、ＰＸＲと呼ばれる別の核ホルモン受容体の活性化因子である。しかしながら、アルカリホスファターゼ及び骨形成の誘導の双方を含む骨髄間質細胞の強力な骨形成活性を一貫して誘導したオキシステロール類の最も有効な組合せは、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール類と組合せた２２Ｒ−又は２２Ｓ−であった。
【０１２０】
実施例Ｈ：７日齢のＣＤ１仔犬の頭蓋冠を、外科的に取り出し（１処理当り６匹）、２２Ｒ＋２０Ｓ（各５μＭ）の存在下又は不在下、２％ウシ胎仔血清を含有するＢＧＪ培地中で７日間培養した。次いで、頭蓋冠を用意し、切片にした。頭蓋冠切片をＨ＆Ｅ染色した頭頂骨のデジタル画像を用いて、骨領域（ＢＡｒ）及び組織領域（ＴＡｒ）を測定した。１頭蓋冠当り８〜１０の画像を捕捉し、各画像は、全体切片が画像化されるまで頭蓋冠の長さに沿って１視野を前進させた。分析領域は、側面の筋肉付着部分（lateral muscle attachment）から拡げ、矢状の縫合領域を除いて頭蓋冠切片全体を含んでいる。頭頂骨の交差切片を、冠状かつラムダ状縫合から凡そ等距離で、各個体に関して同じ一般的な領域で採取した。この領域の切片は、冠状かつラムダ状領域の縫合組織が殆ど無いことから、分析された。ＢＡｒは、過形成性ではなく、基礎的な層状の（basic lamellar）コラーゲンパターンを示したピンク染色組織として特定された。ＴＡｒは、内皮細胞（lining cell）の背側層と腹側層との間の組織の領域として特定され、未分化細胞組織及びマトリックスだけでなく、ＢＡｒを含んでいる。分離測定は、ＢＡｒ内の骨髄空間として特定され、ＢＡｒ％ＴＡｒの算出前にＢＡｒ測定値から差し引かれた空隙空間に関して成された。個体間でのＴＡｒにおける分化を説明するために、ＢＡｒは、測定された全ＴＡｒに対するパーセントとして記載している。組織形態計測的データ（連続変数）は、ワンウェイＡＮＯＶＡ、次いでスチューデントｔ検定及びダネット検定対対照を用いて評価した。０．００５のｐ値は、群間の有意差を線引きするために使用した。結果は、平均値±ＳＤとして表した。
【０１２１】
結果。図１１は、マウス頭蓋冠骨形成に対する２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロールの組合せの効果を示す表である。対照ビヒクルにより処理されたものと比較して、オキシステロールの組合せで処理された頭蓋冠内の骨形成では、２０％の増加が見られ、さらにエキソビボのオキシステロール類の組合せの骨形成活性をサポートした。図１２は、ビヒクル（Ａ）又は２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロールにより処理された頭蓋冠の代表的な切片である。
【０１２２】
実施例Ｉ：ＭＳＣにおけるオキシステロール類及びＢＭＰ２の相乗的な骨形成効果。（Ａ）コンフルエントなＭ２細胞を、骨形成培地中、対照ビヒクル（Ｃ）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＢＭＰ２、又は２２Ｒ及び２０Ｓオキシステロールの組合せ（ＲＳ、各２．５μＭ）を単独又は組み合せて処理した。ＡＬＰ活性は、記載されたとおり２日後に測定した。代表的な４つの実験のデータを、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した（ＢＭＰ＋ＲＳ対ＢＭＰ及びＲＳ単独に関してｐ＜０．００１）。（Ｂ）Ｍ２細胞を、（Ａ）に記載されたとおり処理した。１０日後、培養物中のマトリックスの石灰化は、記載されたとおりの４５Ｃａの取り込みアッセイを用いて定量化した。代表的な４つの実験の結果を、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した（ＢＭＰ＋ＲＳ対ＢＭＰ及びＲＳ単独に関してｐ＜０．０１）。（Ｃ）Ｍ２細胞を、上記のものと同様の条件下で処理した。８日後、総ＲＮＡを単離し、先に記載されたノーザンブロット法により、オステオカルシン（Ｏｓｃ）及び１８Ｓ ｒＲＮＡの発現を解析した。ノーザンブロットによる濃度測定解析のデータを、１８Ｓ ｒＲＮＡで正規化し、二回反復のサンプルの平均値として（Ｄ）に示した。
【０１２３】
結果。図１３：Ａ）Ｍ２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対する、ＢＭＰ、オキシステロール、又は組合せ処理の効果を示す棒グラフであり；Ｂ）Ｍ２細胞におけるカルシウム取り込みに対する、ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフであり；（Ｃ）ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理に曝されたＭ２細胞における、オステオクラシン又は１８Ｓ ｒＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真であり；Ｄ）ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理に曝されたＭ２細胞におけるオステオクラシンｍＲＮＡの相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。２０Ｓ、２２Ｓ及び２２Ｒオキシステロールの骨形成組合せ並びに２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロールの組合せは、アルカリホスファターゼ活性の誘導について、ＢＭＰ２と相乗的に作用し（図１３Ａ）、２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロールの組合せは、ＢＭＰ２と相乗的に作用してオステオクラスチンｍＲＮＡ発現を誘導し（図１３Ｃ及びＤ）、２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロールの組合せは、ＢＭＰ２と相乗的に作用してＭ２細胞による石灰化を誘導した（図１３Ｂ）。
【０１２４】
実施例Ｊ：酸化ストレスによる骨形成分化の阻害は、オキシステロール類によりブロックされ、抑制される。
材料及び方法−オキシステロール類、ベータ−グリセロホスフェート、アスコルビン酸塩、キサンチン及びキサンチンオキシダーゼはSigma社から、ＲＰＭＩ  １６４０はIrvine Scientific社（サンターナ、カリフォルニア州、米国）から、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はHyclone社（ローガン、ユタ州、米国）から、ＳＣ−５６０はCayman Chemical社（アンアーバー、ミシガン州、米国）から入手した。
【０１２５】
細胞培養−Ｍ２−１０Ｂ４マウス骨髄間質細胞系（American Type Culture Collection、「ＡＴＣＣ」、ロックビレ、メリーランド州、米国）は、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）Ｆ１マウスの骨髄間質細胞に由来し、長期培養（ＡＴＣＣに従って）におけるヒト及びマウスの骨髄形成を支持する。これらの細胞を、１０％の加熱不活化したＦＢＳを含有し、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（全てIrvine Scientific社から入手）が添加されたＲＰＭＩ １６４０中で培養した。これら試験の骨形成培地は、上記全ての添加物を有するＲＰＭＩ １６４０からなり、さらに５％ＦＢＳ、２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸塩及び３ｍＭベータ−グリセロホスフェートが添加された。
【０１２６】
脂質タンパク質の調製及び酸化−血清を密度勾配遠心分離してヒトＬＤＬを単離し、それを、０．０１％ＥＤＴＡを含み、リン酸緩衝化した０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で保存した。最少限に酸化されたＬＤＬは、先に記載されたとおり、ヒトＬＤＬの鉄酸化により調製された（Parhami et al. 1999. Atherogenic diet and minimally oxidized low density lipoprotein inhibit osteogenic and promote adipogenic differentiation of marrow stromal cells. J Bone Miner Res 14: 2067-2078）。本試験に用いられる脂質タンパク質の濃度は、タンパク質についてマイクログラム単位で記載されている。脂質タンパク質は、リポ多糖レベルに関して酸化前及び酸化後に試験され、培地１ｍｌ中に、＜３０ｐｇのリポ多糖が含まれることが判明した。
【０１２７】
アルカリホスファターゼ活性アッセイ−細胞全抽出物に対する、比色分析のアルカリホスファターゼ活性アッセイは、先に記載されたとおりに実施した（Kha et al. 2004. Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19: 830-840）。
【０１２８】
４５Ｃａの取り込みアッセイ−細胞単層内のマトリックスの石灰化は、先に記載されたとおり、４５Ｃａの取り込みアッセイを用いて定量化した（Kha et al. 2004. Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 19: 830-840）。
【０１２９】
ＲＮＡ単離及びノーザンブロット解析−総ＲＮＡを、Stratagene社（ラジョラ、カリフォルニア州、米国）のＲＮＡ単離用キットを用いて単離した。オステオカルシンｍＲＮＡ及び１８Ｓ ｒＲＮＡ発現に関するノーザンブロット法は、先に記載されたとおりに実施した。
【０１３０】
統計解析−コンピュータによる統計解析は、StatView４．５プログラムを用いて実施した。全てのｐ値は、ＡＮＯＶＡ及びフィッシャーの提案した最小有意差（ＰＬＳＤ）有意検定を用いて算出された。ｐ＜０．０５の値を、有意であると見なした。
【０１３１】
結果−骨形成オキシステロール類によるＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬ作用の阻害。前駆細胞の骨芽細胞分化は、アルカリホスファターゼ活性、オステオカルシンｍＲＮＡ発現、及び石灰化を含むマーカーの発現増加により示される（Rickard et al 1994. Induction of rapid osteoblast differentiation in rat bone marrow stromal cell cultures by dexamethasone and BMP-2. Dev Biol 161: 218-228;及びHicok et al. 1998. Development and characterization of conditionally immortalized osteoblast precursor cell lines from human bone marrow stroma. J Bone Miner Res 13: 205-217）。ＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬによる骨芽細胞の分化阻害に対する骨形成オキシステロール類の効果を評価するために、ＸＸＯ又はＭＭ−ＬＤＬ単独、若しくは骨形成オキシステロール２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ）と組み合せて処理したＭ２細胞の培養物中において、上記分化マーカーを調べた。アルカリホスファターゼ活性は、ＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬにより６日間処理したＭ２細胞において阻害された（図１４Ａ、１５Ａ）。１．２５〜５μＭの濃度のオキシステロール類（ＳＳ）との共処理により、用量依存的にＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬの作用を阻害した（図１４Ａ、１５Ａ）。ＸＸＯによるアルカリホスファターゼ活性の阻害は、たった１．２５μＭのオキシステロール類（ＳＳ）によりブロックされ、一方、ＭＭ−ＬＤＬ作用の有意な阻害は、２．５μＭのオキシステロール類（ＳＳ）により達成された。Ｍ２細胞が骨形成培地中で培養された場合、オステオカルシンｍＲＮＡの発現は、Ｍ２細胞の骨芽細胞分化の間、時間と共に増加した。ＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬは、８日後のオステオカルシンｍＲＮＡの発現を阻害し、この阻害は、オキシステロール類（ＳＳ）の存在下で完全に緩和された（図１４Ｂ、１５Ｂ）。さらに、Ｍ２細胞の培養物中の石灰化に対するＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬの阻害作用もまたオキシステロール類（ＳＳ）の存在下で完全に緩和された（図１６）。要するに、これらの結果により、Ｍ２細胞における酸化ストレスを引き起こし、その骨形成分化を阻害する少なくとも２つの因子、ＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬによる負の影響を、骨形成オキシステロール類が阻害することが示された。
【０１３２】
最後に、酸化ストレスからの保護能力と骨形成分化の誘導との間の相関も、ｒｈＢＭＰ２の場合に示された。Ｍ２細胞のｒｈＢＭＰ２（２５０ｎｇ／ｍｌ）による４８時間の前処理により、骨形成分化に対する酸化ストレスの負の影響からこれらの細胞が保護された（データは示さず）。
【０１３３】
骨形成オキシステロール類は、ＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬの作用から保護する。Ｍ２細胞における骨形成分化マーカー発現に対するＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬの阻害作用をブロックすることに加えて、骨形成オキシステロール類によるＭ２細胞の前処理が、酸化ストレスからこれらの細胞を保護できるかどうかを調べるために、Ｍ２細胞を２．５μＭのオキシステロール類（ＳＳ）により４８時間前処理した。４８時間後、オキシステロール類（ＳＳ）を除去し、ＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬを、オキシステロール類（ＳＳ）又は対照ビヒクルで前処理した細胞に添加した。アルカリホスファターゼ活性を、６日後に測定した。対照ビヒクルで前処理した細胞とは対照的に、アルカリホスファターゼ活性は酸化ストレスにより阻害され、オキシステロール類で前処理した細胞は、ＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬ双方の阻害作用から完全に保護された（図１７Ａ）。同様に、オキシステロール類（ＳＳ）の保護作用は、石灰化に対しても見られた（図１７Ｂ）。ＳＳ及びＣＯＸ−１阻害剤ＳＣ−５６０により前処理された細胞については、ＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬの負の影響に対して、もはや保護されなかったことから、骨形成オキシステロール類の保護作用は、ＣＯＸ−１に依存するように思われる（図１８）。
【０１３４】
骨形成オキシステロール類は、ＸＸＯ及びＭＭ−ＬＤＬの作用から細胞を救出する。最後に、酸化ストレスの阻害作用から細胞を救出する骨形成オキシステロール類の能力を調べた。Ｍ２細胞を、ＭＭ−ＬＤＬ又はＸＸＯで２日間前処理し、次いでそれらを除去し、さらに４日間又は１２日間オキシステロール類（ＳＳ）又は対照ビヒクルを添加し、その後、アルカリホスファターゼ活性及び石灰化を測定した。その結果、アルカリホスファターゼ活性（図１９Ａ）及び石灰化（図１９Ｂ）は、ＭＭ−ＬＤＬ又はＸＸＯで２日間処理された細胞において阻害され、オキシステロール類（ＳＳ）の添加により、ＭＭ−ＬＤＬ及びＸＸＯの負の影響から細胞が救出されたことが示された。
【０１３５】
実施例Ｋ
骨髄間質細胞における、骨芽細胞マーカー発現へのキサンチン／キサンチンオキシダーゼによる阻害に対する、オキシステロール類の効果を試験した。（Ａ）コンフルエントに増殖させたＭ２細胞を、骨形成培地中、対照ビヒクル（Ｃ）、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（Ｘ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又はオキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；０．１、０．３又は０．５μＭ）の単独又は組み合せにて処理した。６日後、細胞全抽出物におけるアルカリホスファターゼ活性を、各処理群について測定した。代表的な３つの個々の実験結果を、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した。さらに、コンフルエントなＭ２細胞を、骨形成培地中、対照ビヒクル（Ｃｏｎｔ）、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又はオキシステロール類（ＳＳ）（５μＭ）の単独又は組み合せにて処理した。８日後、二回反復のサンプルからの総ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット法によりオステオカルシン又は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現について解析した。ノーザンブロットの濃度測定解析のデータを、１８Ｓ ｒＲＮＡで正規化し、二回反復のサンプルの平均値として示した。
【０１３６】
結果。図１４Ａ）は、対照ビヒクル（Ｃ）と比較した、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（Ｘ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）によるアルカリホスファターゼ活性の阻害作用、及び、オキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；μＭ）での処理によるその遮断及び抑制（Ｃ対Ｘ、及び０．３及び０．５μＭのＳＳでＸ対Ｘ＋ＳＳに関して＊ｐ＜０．０１）を示す棒グラフであり；Ｂ）は、対照（Ｃｏｎｔ）、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ又はキサンチン／キサンチンオキシダーゼ及びオキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ）による処理から８日後のオステオカルシン又は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現を示すノーザンブロットであり；Ｃ）は、図１４Ｂ）に示されるような、二回反復のサンプルのオステオカルシンｍＲＮＡ発現の相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。
【０１３７】
実施例Ｌ
骨髄間質細胞における、最少限に酸化されたＬＤＬによる骨芽細胞マーカー発現への阻害に対する、オキシステロール類の効果を試験した。コンフルエントなＭ２細胞を、骨形成培地中、対照ビヒクル（Ｃ）、最少限に酸化されたＬＤＬ（Ｍ；２００μｇ／ｍｌ）又はオキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；μＭ）の単独又は組み合せにて処理した。６日後、細胞全抽出物におけるアルカリホスファターゼ活性を測定した。代表的な３つの個々の実験結果を、タンパク質濃度で正規化し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した。さらに、コンフルエントなＭ２細胞を、対照ビヒクル（Ｃｏｎｔ）、最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μＭ／ｍｌ）又はオキシステロール類（ＳＳ）（５μＭ）の単独又は組み合せにて処理した。８日後、二回反復のサンプルから総ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット法によりオステオカルシン又は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現について解析した。ノーザンブロットの濃度測定解析のデータを、１８Ｓ ｒＲＮＡで正規化し、二回反復のサンプルの平均値として示した。
【０１３８】
結果。図１５Ａ）は、対照ビヒクル（Ｃ）と比較した、最少限に酸化されたＬＤＬ（Ｍ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）によるアルカリホスファターゼ活性の阻害作用、及び、オキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５、５、１０μＭ）での処理によるその遮断及び抑制（Ｃ対Ｍ、及び全てＳＳ濃度でＭ対Ｍ＋ＳＳに関して＊ｐ＜０．０１）を示す棒グラフであり；Ｂ）は、対照（Ｃｏｎｔ）、最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ）及びオキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ）による処理から８日後のオステオカルシン又は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現を示すノーザンブロットであり；Ｃ）は、図１５Ｂに示されるような、二回反復のサンプルのオステオカルシンｍＲＮＡ発現の相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。
【０１３９】
実施例Ｍ
骨髄間質細胞における石灰化の阻害に対する、オキシステロール類の作用を試験した。コンフルエントなＭ２細胞を、１条件当り４ウェル、１ｃｍ２当りの細胞数２０，０００個で平板培養し、骨形成培地中、対照ビヒクル（Ｃ）、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）、最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；１００μｇ／ｍｌ）、又はＳＳ（５μＭ）の単独又は組み合せにて処理した。１４日後、培養物中のマトリックスの石灰化を、４５Ｃａの取り込みアッセイを用いて定量化した。代表的な３つの実験のデータを示し、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した。
【０１４０】
結果。図１６は、対照ビヒクル（Ｃ）と比較した、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）、又は、最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；１００μｇ／ｍｌ）による、カルシウム取り込みの阻害作用、及び、オキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；５μＭ）での処理によるその遮断及び抑制（Ｃ対ＸＸＯ及びＭＭ、並びにＸＸＯ対ＸＸＯ＋ＳＳ及びＭＭ対ＭＭ＋ＳＳに関して＊ｐ＜０．０１）作用を示す棒グラフである。
【０１４１】
実施例Ｎ
キサンチン／キサンチンオキシダーゼ及び最少限に酸化されたＬＤＬの骨芽細胞マーカー発現への阻害作用に対する、オキシステロール類による骨髄間質細胞の保護を調べた。コンフルエントなＭ２細胞を、対照ビヒクル（Ｃ）及びオキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）で４８時間前処理した。次にオキシステロール（ＳＳ）を除去し、細胞をリンスし、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）を骨形成培地に添加した。ＸＸＯ又はＭＭでの処理から５日後又は１４日後、（Ａ）アルカリホスファターゼ活性及び（Ｂ）石灰化を、先に記載されたとおり、それぞれ５日後又は１４日後に測定した。代表的な３つの個々の実験結果を、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとしてを記載した。
【０１４２】
結果。図１７Ａ）は、対照ビヒクル（Ｃ）又はＸＸＯ若しくはＭＭの単独処理と比較した、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）によるアルカリホスファターゼ活性の阻害作用に対する、２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；５μＭ）の保護効果を示す棒グラフであり；Ｂ）対照ビヒクル（Ｃ）又はＸＸＯの単独処理と比較した、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）によるカルシウム取り込みの阻害作用に対する、２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；５μＭ）の保護効果を示す棒グラフである；（ＡにおけるＣ対ＸＸＯ及びＭＭ、並びにＸＸＯ対ＳＳ／ＸＸＯ及びＭＭ対ＳＳ／ＭＭ、及びＢにおけるＣ対ＸＸＯ、並びにＸＸＯ対ＳＳ／ＸＸＯに関して＊ｐ＜０．０１）。
【０１４３】
実施例Ｏ
オキシステロール類による骨髄間質細胞の保護に対する、シクロオキシゲナーゼ１阻害剤の効果を試験した。コンフルエントなＭ２細胞を、対照ビヒクル（Ｃ）又はシクロオキシゲナーゼ１阻害剤、ＳＣ−５６０（ＳＣ；２０μＭ）で２時間前処理した。次にオキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）を添加した。処理から４８時間後、ＳＳ及びＳＣを除去し、細胞をリンスし、最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）又はキサンチン／キサンチンオキシダーゼ（Ｘ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）を添加した。ＭＭ又はＸによる処理から５日後、細胞抽出物中のアルカリホスファターゼ活性を測定した。代表的な３つの個々の実験結果を、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した。
【０１４４】
結果。図１８は、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（Ｘ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）のアルカリホスファターゼ活性への阻害作用からの２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）による保護に対する、シクロオキシゲナーゼ１（ＳＣ）の抑制効果を、対照ビヒクル（Ｃ）又はＳＳ組合せ処理の場合と比較して、示す棒グラフである；（Ｃ対ＭＭ及びＸ、ＭＭ対ＳＳ／ＭＭ及びＸ対ＳＳ／Ｘ、及びＳＳ／ＭＭ対ＳＳ＋ＳＣ／ＭＭ並びにＳＳ／Ｘ対ＳＳ＋ＳＣ／Ｘに関して＊ｐ＜０．０１）。
【０１４５】
実施例Ｐ
キサンチン／キサンチンオキシダーゼ及び最少限に酸化されたＬＤＬによる骨芽細胞マーカー発現への阻害作用からの、骨髄細胞のオキシステロールによる救出を試験した。コンフルエントなＭ２細胞を、骨形成培地中、対照ビヒクル（Ｃ）、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）により２日間、前処理した。次にＸＸＯ及びＭＭを除去し、ビヒクル又は２２Ｓ＋２０Ｓオキシステロールの組合せ（ＳＳ；２．５μＭ）を添加した。（Ａ）アルカリホスファターゼ活性及び（Ｂ）石灰化を、それぞれオキシステロール類で処理した４日後又は１２日後に測定した。代表的な３つの個々の実験結果を、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして記載した。
【０１４６】
結果。図１９Ａ）は、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）のアルカリホスファターゼ活性への阻害作用からの、２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）の救出効果を、対照ビヒクル（Ｃ）又はＸＸＯ若しくはＭＭの単独前処理と比較して、示す棒グラフであり；Ｂ）は、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）のカルシウム取り込みへの阻害作用からの、２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）の救出効果を、対照ビヒクル（Ｃ）又はＸＸＯ若しくはＭＭの単独前処理と比較して、示す棒グラフである。（Ａ及びＢにおけるＣ対ＸＸＯ及びＭＭ、並びにＸＸＯ対ＸＸＯ／ＳＳ及びＭＭ対ＭＭ／ＳＳに関して＊ｐ＜０．０１）。
【０１４７】
実施例Ｑ
本試験の目的は、先に同定されたオキシステロール類の化学構造に基づいて、他の骨形成及び抗脂肪細胞形成オキシステロール類を同定することであった。骨髄間質細胞（骨を形成する骨芽細胞の前駆細胞である）の培養において骨芽細胞の形成を誘導するような候補オキシステロール分子の能力を試験した。細胞の骨形成分化を評価するために、骨形成分化の１つ以上のマーカーを、未処理細胞及び試験オキシステロール類で処理した細胞において測定した。これらのマーカーとしては：骨髄間質細胞の培養においてアルカリホスファターゼ活性、オステオカルシンｍＲＮＡ発現及び石灰化物形成が挙げられる。単一又は組合せのオキシステロール類による１つ又は１つ以上のマーカーの活性化は、それらの骨形成特性を示している。
【０１４８】
方法。細胞をオキシステロール類（５μＭ）で４日間処理し、その後、それらを採取し、アルカリホスファターゼ活性に関する比色アッセイにより分析した。代表的な実験結果を、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして示した。また、細胞を、オキシステロール類で１４日間処理し、その後、培養で形成された石灰化物量を、放射性４５Ｃａの取り込みアッセイを用いて定量化した。代表的な実験結果を、四回反復試験測定値の平均値±ＳＤとして示した。
【０１４９】
結果。上記の方法論により、以下の新規なオキシステロール類が単独又は元来記載された任意のオキシステロール類と組み合せて使用される場合に骨誘導性物として同定された。これらの骨形成オキシステロール類はまた、上記に示されるように抗脂肪細胞形成性を有する。新規に同定されたオキシステロール類は：５−コレステン−３ベータ，２０アルファ−ジオール３−アセテート（２０Ａ−ヒドロキシコレステロールと称される）、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２４Ｓ，２５−エポキシコレステロール、２６−ヒドロキシコレステロール、及び４ベータ−ヒドロキシコレステロールである。
【０１５０】
【表１】
2009512422.tif 000003
【０１５１】
【表２】
2009512422.tif 000004
【０１５２】
方法：Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、オキシステロール（５μＭ）又は対照ビヒクルにより８日間オキシステロール類で処理した。細胞を採取し、ｍＲＮＡを抽出した。図２０は、１）対照、２）４ベータ−ヒドロキシコレステロール、３）２４Ｓ，２５−エポキシコレステロール、４）７アルファ−ヒドロキシコレステロール、及び５）２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール＋２０Ａ−ヒドロキシコレステロールのオキシステロール類（５μＭ）又は対照ビヒクルにより８日間処理したＭ２−１０Ｂ４細胞における、オステオカルシンｍＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真である。
【０１５３】
結果。図２０に示されるように、対照と比較して、２４Ｓ，２５−エポキシコレステロール、及び２２Ｓ−ヒドロキシステロール＋２０Ａ−ヒドロキシコレステロールは、オステオカルシンｍＲＮＡのレベルを増加させた。４ベータ−ヒドロキシコレステロールは、オステオカルシンｍＲＮＡにおいて、対照群に対して中等度の増加を示し、一方、７アルファ−ヒドロキシステロールは、オステオカルシンｍＲＮＡのレベルに対して、有意な影響を及ぼさなかった。これは、ステロール類の炭素側鎖及びヒドロキシル基の位置が、骨形成ステロール類の重要な特徴であり得ることを示唆している。
【０１５４】
オキシステロール類（エストレン、エストロン及びベータ−エストラジオール）といくらかの構造類似性を共有するが、炭素側鎖を有さず、それらの二重結合の位置及び数に差異を有する他のコレステロール誘導体は、いずれも骨形成特性を有さなかった。
【０１５５】
実施例Ｒ
ＭＳＣにおける、オキシステロール類と、ＢＭＰ７又はＢＭＰ１４との骨形成相乗効果。Ａ）骨髄間質細胞を、対照ビヒクル（Ｃ）、ＢＭＰ７（５０ｎｇ／ｍｌ）、又は組合せ２２Ｓ＋２０Ｓオキシステロール（ＳＳ、２．５μＭ）の単独又は組み合せにて処理した。８日後、ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット法によりオステオカルシン（Ｏｓｃ）又は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現に関して解析し；Ｂ）骨髄間質細胞を、対照ビヒクル（Ｃ）、ＢＭＰ１４（５０ｎｇ／ｍｌ）、又は組合せ２２Ｓ＋２０Ｓオキシステロール（ＳＳ、２．５μＭ）の単独又は組み合せにて処理した。８日後、ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット法により、オステオカルシン（Ｏｓｃ）又は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現に関して解析した。
【０１５６】
結果。図２１：Ａ）は、オキシステロール類とＢＭＰ７との組合せによりオステオカルシン発現の相乗的誘導を示す、オステオカルシン（Ｏｓｃ）及び１８Ｓ ＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真であり；Ｂ）は、オキシステロール類とＢＭＰ１４との組合せによりオステオカルシン発現の相乗的誘導を示す、オステオカルシン（Ｏｓｃ）及び１８Ｓ ＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真である。
【０１５７】
骨形成オキシステロール類は、示された骨形成分化マーカーであるオステオクラシンの相乗的誘導により証明された骨形成分化を誘導するために、ＢＭＰ７及びＢＭＰ１４と相乗的に作用する。骨形成分化、アルカリホスファターゼ活性及び石灰化の他のマーカーもまた、オキシステロール類並びにＢＭＰ７及びＢＭＰ１４により相乗的に誘導された。
【０１５８】
実施例Ｓ
方法：骨髄間質細胞（Ｍ２−１０Ｂ４（Ｍ２））を、５〜１５μＭの用量の２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールで処理した。
【０１５９】
結果。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性、Ｒｕｎ×２のＤＮＡへの結合、Ｒｕｎ×２タンパク質の発現、オステオカルシンｍＲＮＡ発現及び石灰化の誘導によって示されるように、処理により成熟骨芽細胞の形成を誘導した。
【０１６０】
方法：骨髄間質細胞（Ｍ２−１０Ｂ４（Ｍ２））を、５〜１５μＭの用量の２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールで処理した。細胞群は、２２Ｓ又は２２Ｒで前処理した。
【０１６１】
結果。２２Ｓ又は２２Ｒオキシステロール類による細胞の前処理及び共処理は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性、Ｒｕｎ×２のＤＮＡへの結合、Ｒｕｎ×２タンパク質の発現、オステオカルシンｍＲＮＡ発現及び石灰化への２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの誘導による骨形成効果を大きく増強させた。この結果は、２２Ｓ及び２２Ｒが、２０Ｓオキシステロールに対するより良好な応答性に向けて、骨芽前駆細胞を刺激していることを示唆している。
【０１６２】
実施例Ｔ
方法：骨髄間質細胞（Ｍ２−１０Ｂ４（Ｍ２））を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、シクロパミン（１〜１０μＭ）で前処理し、次いで２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール及び２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールで処理した。
【０１６３】
結果。ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、シクロパミンによるＭ２細胞の前処理により、ＳＳ−誘導アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性、Ｒｕｎ×２のＤＮＡへの結合、Ｒｕｎ×２タンパク質の発現、オステオカルシンｍＲＮＡ発現及び石灰化を阻害した。これは、オキシステロール誘導による骨形成分化が、ヘッジホッグ依存性の機序を介して媒介されてることを示唆している。
【０１６４】
実施例Ｕ
方法：骨髄間質細胞（Ｍ２−１０Ｂ４（Ｍ２））を、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤、ＤＫＫ−１（１μｇ／ｍｌ）で前処理し、次いで２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール及び２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールで処理した。
【０１６５】
結果：Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤によるＭ２細胞の前処理は、ＳＳ−誘導アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性、オステオカルシンｍＲＮＡ発現、及び石灰化を阻害したが、Ｒｕｎ×２タンパク質の発現を阻害しなかった。これは、オキシステロール誘導による骨形成分化が、Ｗｎｔ依存性機序を介して媒介されることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】本発明による一方法のフローチャートを示す図である。
【図２】本発明の２つの実施形態を示す図である。
【図３Ａ】Ｍ２細胞における、アルカリホスファターゼ活性に対する種々のオキシステロール類の効果を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】Ｍ２細胞における、アルカリホスファターゼ活性に対する、種々の用量でのオキシステロール類の併用効果を示す棒グラフである。
【図３Ｃ】種々の条件に曝されたＭ２細胞をvon Kossa染色した図である。
【図３Ｄ】Ｍ２細胞における、カルシウムの取り込みに対する、種々の用量でのオキシステロール類の併用効果を示す棒グラフである。
【図３Ｅ】４日間又は８日間対照又はオキシステロール類の組合せに曝されたＭ２細胞における、オステオカルシンｍＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真である。
【図３Ｆ】４日間又は８日間対照又はオキシステロール類の組合せに曝されたＭ２細胞における、オステオカルシンｍＲＮＡの相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。
【図４Ａ】Ｍ２細胞に対する、種々の用量での種々のオキシステロール類の効果を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】Ｍ２細胞に対する、種々の用量での種々のオキシステロール類の効果を示す棒グラフである
【図４Ｃ】Ｍ２細胞に対する、オキシステロール類処理の持続時間の効果を示す棒グラフである。
【図４Ｄ】Ｍ２細胞に対する、種々の用量のオキシステロール類の組合せの効果を示す棒グラフである。
【図４Ｅ】Ｍ２細胞に対する、種々の用量のオキシステロール類の組合せの効果を示す棒グラフである。
【図５Ａ】Ｍ２細胞に対する、オキシステロール類及びチトクロームＰ４５０阻害剤ＳＫＦ５２５Ａの効果を示す棒グラフである。
【図５Ｂ】Ｍ２細胞に対する、オキシステロール類並びにチトクロームＰ４５０活性剤ベンジルイミダゾール及び阻害剤ＳＫＦ５２５Ａの効果を示す棒グラフである。
【図６】Ｍ２細胞における脂肪細胞形成減少に対する、オキシステロール類の効果を示す棒グラフである。
【図７Ａ】脂肪細胞がオイルレッドＯ染色により視覚化されたＭ２細胞培養物を示す図である。
【図７Ｂ】各処理群における、脂肪細胞数／視野を示す棒グラフである。
【図７Ｃ】対照又は処理サンプルに曝されたＭ２細胞における、脂質タンパクリパーゼ、脂肪細胞Ｐ２遺伝子又は１８Ｓ ｒＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真である。
【図７Ｄ】対照又は処理サンプルに曝されたＭ２細胞における、脂質タンパクリパーゼ、脂肪細胞Ｐ２遺伝子ｍＲＮＡに関する相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。
【図８】Ｍ２細胞に対する、合成ＬＸＲ活性剤の効果を示す棒グラフである。
【図９Ａ】Ｍ２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対する、ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフである。
【図９Ｂ】Ｍ２細胞における、カルシウムの取り込みに対する、ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフである。
【図９Ｃ】ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理に曝されたＭ２細胞における、オステオクラスチン又は１８Ｓ ｒＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真である。
【図９Ｄ】ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロー処理置に曝されたＭ２細胞における、オステオクラスチンｍＲＮＡの相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。
【図９Ｅ】Ｍ２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対する、ＰＬＡ２阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフである。
【図９Ｆ】Ｍ２細胞におけるカルシウムの取り込みに対する、ＰＬＡ２阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフである。
【図１０Ａ】対照又はオキシステロール処理に曝されたＭ２細胞において発現するｐＥＲＫ又はＥＲＫに関するウェスタンブロットを示す図である。
【図１０Ｂ】Ｍ２細胞におけるカルシウムの取り込みに対する、ＰＤ９８０５９又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフである。
【図１０Ｃ】各処理群における、脂肪細胞数／視野を示す棒グラフである。
【図１１】マウス頭蓋冠骨形成に対する、２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロールの組合せの効果を示す表である。
【図１２】ビヒクル（Ａ）又は２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロール（Ｂ）により処理された頭蓋冠骨の代表的な切片を示す図である。
【図１３Ａ】Ｍ２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対する、低用量のＢＭＰ、オキシステロール、又は組合せ処理の効果を示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】Ｍ２細胞におけるカルシウムの取り込みに対する、ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理の効果を示す棒グラフである。
【図１３Ｃ】ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理に曝されたＭ２細胞における、オステオクラスチン又は１８Ｓ ｒＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真である。
【図１３Ｄ】ＣＯＸ−１阻害剤又はオキシステロール処理に曝されたＭ２細胞におけるオステオクラスチンｍＲＮＡの相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。
【図１４】Ａ）対照ビヒクル（Ｃ）と比較した、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（Ｘ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）によるアルカリホスファターゼ活性の阻害への効果、並びに、オキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；μＭ）での処理によるその遮断及び抑制（０．３及び０．５μＭ  ＳＳにおいてＣ対Ｘ、Ｘ対Ｘ＋ＳＳに関して＊ｐ＜０．０１）の効果を示す棒グラフであり；Ｂ）対照（Cont.）、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ又はキサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）及びオキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ）による処理から８日後のオステオカルシン又は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現を示すノーザンブロットであり；Ｃ）図１４Ｂに示されるような二回反復のサンプルにおける、オステオカルシンｍＲＮＡ発現の相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。
【図１５】Ａ）対照ビヒクル（Ｃ）と比較した、最少限に酸化されたＬＤＬ（Ｍ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）によるアルカリホスファターゼ活性の阻害への効果、並びに、オキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５、５、１０μＭ）での処置によるその遮断及び抑制（全てＳＳ濃度においてＣ対Ｍ、及びＭ対Ｍ＋ＳＳに関して＊ｐ＜０．０１）の効果を示す棒グラフであり；Ｂ）対照（Cont.）、最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ）及びオキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ）による処理から８日後のオステオカルシン又は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現を示すノーザンブロットであり；Ｃ）図１５Ｂに示されるような二回反復のサンプルにおける、オステオカルシンｍＲＮＡ発現の相対的な濃度測定単位を示す棒グラフである。
【図１６】対照ビヒクル（Ｃ）と比較した、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；１００μｇ／ｍｌ）によるカルシウム取り込みの阻害への効果、並びに、オキシステロールの組合せ２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；５μＭ）での処理によるその遮断及び抑制（Ｃ対ＸＸＯ及びＭＭ、ＸＸＯ対ＸＸＯ＋ＳＳ並びにＭＭ対ＭＭ＋ＳＳに関して＊ｐ＜０．０１）の効果を示す棒グラフである。
【図１７】Ａ）対照ビヒクル（Ｃ）又はＸＸＯ若しくはＭＭの単独処理と比較した、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）によるアルカリホスファターゼ活性の阻害に対する、２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）の保護効果を示す棒グラフであり；Ｂ）対照ビヒクル（Ｃ）又はＸＸＯの単独処理と比較した、キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）によるカルシウム取り込みの阻害に対する、２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）の保護効果を示す棒グラフである；（ＡにおけるＣ対ＸＸＯ及びＭＭ、ＸＸＯ対ＳＳ／ＸＸＯ並びにＭＭ対ＳＳ／ＭＭ、ＢにおけるＣ対ＸＸＯ及びＸＸＯ対ＳＳ／ＸＸＯに関して＊ｐ＜０．０１）。
【図１８】キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（Ｘ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）のアルカリホスファターゼ活性への阻害作用からの２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）の保護に対する、シクロオキシゲナーゼ１（ＳＣ）の抑制効果を、対照ビヒクル（Ｃ）又はＳＳの組合せ処理と比較して、示す棒グラフである；（Ｃ対ＭＭ及びＸ、ＭＭ対ＳＳ／ＭＭ及びＸ対ＳＳ／Ｘ、並びにＳＳ／ＭＭ対ＳＳ＋ＳＣ／ＭＭ及びＳＳ／Ｘ対ＳＳ＋ＳＣ／Ｘに関して＊ｐ＜０．０１）。
【図１９】キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）のアルカリホスファターゼ活性への阻害からの、２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）の救出作用を、対照ビヒクル（Ｃ）又はＸＸＯ若しくはＭＭの単独前処理と比較して、示す棒グラフであり；Ｂ）キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ；２５０μＭ／４０ｍＵ／ｍｌ）又は最少限に酸化されたＬＤＬ（ＭＭ；２００μｇ／ｍｌ）のカルシウム取り込みへの阻害からの、２２Ｓ＋２０Ｓ（ＳＳ；２．５μＭ）の救出作用を、対照ビヒクル（Ｃ）又はＸＸＯ若しくはＭＭの単独前処理と比較して、示す棒グラフである；（Ａ及びＢにおいてＣ対ＸＸＯ及びＭＭ、及びＸＸＯ対ＸＸＯ／ＳＳ並びにＭＭ対ＭＭ／ＳＳに関して＊ｐ＜０．０１）。
【図２０】８日間のオキシステロール類（５μＭ）、１）対照、２）４ベータ−ヒドロキシコレステロール、３）２４Ｓ，２５−エポキシコレステロール、４）７アルファ−ヒドロキシコレステロール、及び５）２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール＋２０Ａ−ヒドロキシコレステロール又は対照ビヒクルにより処理したＭ２−１０Ｂ４細胞中のオステオカルシンｍＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真である。
【図２１】Ａ）オキシステロール類及びＢＭＰ７の組合せによるオステオカルシン（Ｏｓｃ）発現の相乗的誘導を示す、オステオカルシン及び１８Ｓ ＲＮＡに関するノーザンブロットのＸ線写真であり；Ｂ）オキシステロール類及びＢＭＰ１４の組合せによるオステオカルシン（Ｏｓｃ）発現の相乗的誘導を示すオステオカルシン及び１８Ｓ ＲＮＡに関するノーザンブロット法のＸ線写真である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月8日(2008.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月28日(2009.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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