(57)【要約】  本願は、（１）トランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された治療用遺伝子からなる発現ユニット、及び（２）（１）記載の転写調節配列からの転写を誘導する活性を有さず、かつ特定の因子の作用により活性型のトランス作用因子に転換されるトランス作用因子の前駆体、又は当該前駆体をコードする遺伝子が発現可能な形態に配置されている発現ユニット：を包含する遺伝子発現システムを提供する。適切なトランス作用因子の前駆体の設計により、疾病特異的な治療用遺伝子の発現が達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構成要素を包含する遺伝子発現システム：
（１）トランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された治療用遺伝子からなる発現ユニット、及び
（２）（１）記載の転写調節配列からの転写を誘導する活性を有さず、かつ特定の因子の作用により活性型のトランス作用因子に転換されるトランス作用因子の前駆体、又は当該前駆体をコードする遺伝子が発現可能な形態に配置されている発現ユニット。
【請求項２】
特定の因子が、がん化もしくはウイルスの感染により細胞内に発現されるポリペプチドである請求項１記載の遺伝子発現システム。
【請求項３】
治療用遺伝子が、ポリペプチド、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉作用を示すＲＮＡから選択されるものをコードする遺伝子である請求項１又は２記載の遺伝子発現システム。
【請求項４】
治療用遺伝子が、プロテアーゼ活性を有するポリペプチド、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、サイトカインから選択されるポリペプチドをコードする遺伝子である請求項３記載の遺伝子発現システム。
【請求項５】
治療用遺伝子が一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である請求項４記載の遺伝子発現システム。
【請求項６】
転写調節配列が免疫不全ウイルスのＬＴＲに由来するプロモーターである請求項１〜５のいずれか１項記載の遺伝子発現システム。
【請求項７】
トランス作用因子が免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質に由来するポリペプチドである請求項６記載の遺伝子発現システム。
【請求項８】
トランス作用因子の前駆体が、リン酸化、脱リン酸化、糖鎖付加、糖鎖除去、限定分解から選択される修飾により活性型トランス作用因子に転換されるポリペプチドである請求項１〜７のいずれか１項記載の遺伝子発現システム。
【請求項９】
トランス作用因子の前駆体がウイルス由来のプロテアーゼの作用により活性型トランス作用因子に転換されるポリペプチドである請求項８記載の遺伝子発現システム。
【請求項１０】
トランス作用因子の前駆体が、Ｃ型肝炎ウイルス由来のプロテアーゼの作用により活性型トランス作用因子に転換されるポリペプチドである請求項９記載の遺伝子発現システム。
【請求項１１】
トランス作用因子の前駆体が、トランス作用因子のＮ末端側にウイルス由来のプロテアーゼにより限定分解されうるペプチド鎖を介して他のポリペプチドが融合された融合ポリペプチドである請求項９記載の遺伝子発現システム。
【請求項１２】
（１）の発現ユニット、並びに（２）の発現ユニットが同一のベクター上に挿入されている請求項１〜１１のいずれか１項記載の遺伝子発現システム。
【請求項１３】
（１）の発現ユニットが挿入されている第一のベクター、並びに（２）の発現ユニットが挿入されている第二のベクター、を包含する請求項１〜１１のいずれか１項記載の遺伝子発現システム。
【請求項１４】
トランス作用因子の前駆体であって、トランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列からの転写を誘導する活性を有さず、かつ特定の因子の作用により活性型のトランス作用因子に転換されるトランス作用因子の前駆体。
【請求項１５】
トランス作用因子と他のポリペプチドとがプロテアーゼにより限定分解されうるペプチド鎖を介して人為的に融合されており、かつ前記トランス作用因子が本来的に転写を誘導する活性を示す転写調節配列に対する転写を誘導する活性を失っていることを特徴とする請求項１４記載のトランス作用因子の前駆体。
【請求項１６】
トランス作用因子が免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質に由来するポリペプチドである請求項１５記載のトランス作用因子の前駆体。
【請求項１７】
ウイルス由来のプロテアーゼの作用により限定分解されうるペプチド鎖を介して融合されている請求項１５又は１６記載のトランス作用因子前駆体。
【請求項１８】
Ｃ型肝炎ウイルス由来のウイルス由来のプロテアーゼの作用により限定分解されうるペプチド鎖を介して融合されている請求項１７記載のトランス作用因子の前駆体。
【請求項１９】
トランス作用因子のＮ末端側に他のポリペプチドがプロテアーゼにより限定分解されうるペプチド鎖を介して人為的に融合されている請求項１５記載のトランス作用因子の前駆体。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれか１項記載のトランス作用因子の前駆体をコードする核酸。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の遺伝子発現システムを生体もしくは細胞に導入する工程を包含する疾病の治療又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用遺伝子を有効成分として疾患の治療又は予防を行うために有用な核酸構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、細胞のもつ「遺伝情報の誤り」に起因する疾病（遺伝病やがん等）について、正しい遺伝子情報の付加によってその細胞の機能を修正したり、細胞が本来持っていなかった新しい「保護遺伝子」を付加したりして病気の治療又は予防する治療法として開発されてきた。【０００３】
現在では前記の態様とは異なり、生体にとって有害な細胞（がん細胞や病原微生物の感染した細胞等）の選択的な排除を目的として、細胞毒性を発揮する産物をコードする遺伝子の利用も精力的に研究されている。例えばヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子を標的細胞内で発現させた後に無害な前駆体医薬（ガンシクロビル）を生体に投与すると、標的細胞特異的に前駆体医薬が活性化される結果、前記医薬の細胞毒性のために標的細胞が破壊される。【０００４】
細胞毒性を発揮するポリペプチドとして原核生物のトキシン−アンチトキシン系遺伝子にコードされるトキシンが知られている。ｍａｚＥ−ｍａｚＦ系のトキシンであるＭａｚＦ（非特許文献１）、ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫ系トキシンであるＰｅｍＫ（非特許文献２）はどちらも特定の塩基配列を認識する一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有することが知られており、これらのトキシンを増殖性疾患の治療に利用することが提案されている（特許文献１）。【０００５】
ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）はＣＤ４分子を発現する細胞、例えばＴ細胞に感染し、前記細胞を破壊する。このため、ＨＩＶの感染を受けたヒトの体内ではＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）の減少と細胞性免疫の低下が起こる。ついには重度の免疫不全状態に陥り、カリニ肺炎のような日和見感染症を発症する。この状態は後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ）と称されている。【０００６】
ＨＩＶ感染症の治療方法として、ＨＩＶ生活環を遮断する抗ウイルス剤（逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等）やワクチンの開発が行われており、いくつかの抗ウイルス剤がすでに実用化されている。しかし、変異頻度の高いＨＩＶでは感染した個体内で前記の薬剤の効果の及ばない変異体の出現することがあり、必ずしも特効薬として完成された状況にはない。別のアプローチとしてＲＮＡデコイやリボザイムのような核酸、トランスドミナント変異タンパクや細胞内抗体のようなタンパク質を有効成分としてＨＩＶの増殖を阻止する遺伝子治療薬を開発する試みもいまだ完成の域には達していない。【０００７】
また、ＨＩＶの感染した細胞に特異的に細胞死を起こさせる方法が考案されている（例えば特許文献２、非特許文献３、４、５）。前記の方法はＨＩＶ由来のＬＴＲプロモーターの下流に細胞毒性を示す産物をコードする遺伝子を接続するものであるが、これまでのところ臨床的に応用された例は知られていない。【０００８】
特許文献３には前記の細胞毒性を示す産物として一本鎖ＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼを使用することが記載されている。本方法ではＨＩＶの感染にともなって発現されるＴａｔタンパク質依存的に一本鎖ＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼの発現が誘導され、ＨＩＶゲノムを含む細胞内の一本鎖ＲＮＡが分解される。この結果、当該細胞ではＨＩＶの複製、出芽が阻止される。ＨＩＶ由来のＲＮＡが分解されてＴａｔタンパク質の発現が停止し、かつ発現されていたＴａｔタンパク質が細胞から消失するとエンドリボヌクレア−ゼの発現も停止する。この間、細胞内のリボソームやｔＲＮＡは破壊されず、前記エンドリボヌクレア−ゼの発現の停止とともに通常のタンパク質合成が再開されるため、この時点で破壊されていない細胞は増殖を再開する。【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００４／１１３４９８号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５５５４５２８号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０２０８７３号パンフレット
【非特許文献１】モレキュラー  セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ）、第１２巻、ｐ９１３−９２３（２００３）
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２７９巻、ｐ２０６７８−２０６８４（２００４）
【非特許文献３】ヒューマン  ジーン  セラピー（Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第２巻、ｐ５３−６０（１９９１）
【非特許文献４】プロシーディングス  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９１巻、ｐ３６５−３６９（１９９４）
【非特許文献５】ヒューマン  ジーン  セラピー（Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１０巻、ｐ１０３−１１２（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献３記載の技術は、ＨＩＶ感染を引き金として有効量のエンドリボヌクレアーゼを発現しうることが示されており、治療遺伝子発現系として優れたものであるが、ＨＩＶ感染症以外への利用は困難である。本発明は上記従来技術を鑑みて行われたものであり、本発明の目的は、広範な疾病に適用できる治療用遺伝子発現系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、種々の疾病について治療用遺伝子を発現させることが可能な発現システムについて検討した。この結果、治療用遺伝子の転写調節配列のｏｎ／ｏｆｆを行うトランス作用因子を前駆体化することにより、疾病特異的な治療用遺伝子の発現が可能となることを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は、
［１］下記の構成要素：
（１）トランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された治療用遺伝子からなる発現ユニット、及び
（２）（１）記載のトランス作用因子の前駆体、又は（１）記載のトランス作用因子の前駆体をコードする遺伝子が発現可能な形態に配置されている発現ユニット、ここで、当該前駆体は（１）記載の転写調節配列からの転写を誘導する活性を有さず、かつ特定の因子の作用により活性型のトランス作用因子に転換される：を包含する遺伝子発現システム、
［２］特定の因子が、がん化もしくはウイルスの感染により細胞内に発現されるポリペプチドである［１］の遺伝子発現システム、
［３］治療用遺伝子が、ポリペプチド、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉作用を示すＲＮＡから選択されるものをコードする遺伝子である［１］又は［２］の遺伝子発現システム、
［４］治療用遺伝子が、プロテアーゼ活性を有するポリペプチド、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、サイトカインから選択されるポリペプチドをコードする遺伝子である［３］の遺伝子発現システム、
［５］治療用遺伝子が一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である［４］の遺伝子発現システム。
［６］転写調節配列が免疫不全ウイルスのＬＴＲに由来するプロモーターである［１］〜［５］いずれか記載の遺伝子発現システム、
［７］トランス作用因子が免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質に由来するポリペプチドである［６］の遺伝子発現システム、
［８］トランス作用因子の前駆体が、リン酸化、脱リン酸化、糖鎖付加、糖鎖除去、限定分解から選択される修飾により活性型トランス作用因子に転換されるポリペプチドである［１］〜［７］いずれか記載の遺伝子発現システム、
［９］トランス作用因子の前駆体がウイルス由来のプロテアーゼの作用により活性型トランス作用因子に転換されるポリペプチドである［８］の遺伝子発現システム、
［１０］トランス作用因子の前駆体がＣ型肝炎ウイルス由来のプロテアーゼの作用により活性型トランス作用因子に転換されるポリペプチドである［８］の遺伝子発現システム、
［１１］トランス作用因子の前駆体が、トランス作用因子のＮ末端側にウイルス由来プロテアーゼにより限定分解されうるペプチド鎖を介して他のポリペプチドが融合された融合ポリペプチドである［９］の遺伝子発現システム。
［１２］（１）の発現ユニット、並びに（２）の発現ユニットが同一のベクター上に挿入されている［１］〜［１１］いずれか記載の遺伝子発現システム、
［１３］（１）の発現ユニットが挿入されている第一のベクター、並びに（２）の発現ユニットが挿入されている第二のベクターを包含する請求項［１］〜［１１］いずれか記載の遺伝子発現システム、
［１４］トランス作用因子の前駆体であって、トランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列からの転写を誘導する活性を有さず、かつ特定の因子の作用により活性型のトランス作用因子に転換されるトランス作用因子前駆体、
［１５］トランス作用因子と他のポリペプチドとがプロテアーゼにより限定分解されうるペプチド鎖を介して人為的に融合されており、かつ前記トランス作用因子が本来的に転写を誘導する活性を示す転写調節配列に対する転写を誘導する活性を失っていることを特徴とする［１４］のトランス作用因子前駆体、
［１６］トランス作用因子が免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質に由来するポリペプチドである［１５］のトランス作用因子前駆体、
［１７］ウイルス由来のプロテアーゼの作用により限定分解されうるペプチド鎖を介して融合されている［１５］又は［１６］のトランス作用因子前駆体、
［１８］Ｃ型肝炎ウイルス由来のウイルス由来のプロテアーゼの作用により限定分解されうるペプチド鎖を介して融合されている［１７］のトランス作用因子前駆体、
［１９］トランス作用因子のＮ末端側に他のポリペプチドがプロテアーゼにより限定分解されうるペプチド鎖を介して人為的に融合されている、請求項１５記載のトランス作用因子前駆体、
［２０］［１４］〜［１９］いずれか記載のトランス作用因子前駆体をコードする核酸、及び
［２１］［１］〜［１３］いずれか記載の遺伝子発現システムを生体もしくは細胞に導入する工程を包含する疾病の治療又は予防方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、種々の疾病に対して選択的に治療用遺伝子を発現させ得ることが可能な治療用遺伝子発現系が提供される。本発現系は種々の疾病に応じて適切なシステムをデザインすることが可能であり、広く遺伝子治療に適用することが可能であり、また、前記のレトロウイルスベクターは、がん、ウイルス感染症の治療、予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬの構成を示す図である。
【図２】ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬの構成を示す図である。
【図３】ｐＭＴＤ３Ｈ―ＺｓＧｒｅｅｎ／ＳＮの構成を示す図である。
【図４】フローサイトメーターによる蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ発現細胞の測定結果を示す図であり、ＴａｔとＨＳＡの位置の違いによるＴａｔ不活化の差異を示す図である。
【図５】フローサイトメーターによる蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ発現細胞の測定結果を示す図であり、ＨＳＡとＴａｔの融合タンパク質にＮＳ３プロテアーゼが作用することにより、Ｔａｔが活性化することを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において使用される治療用遺伝子には特に限定はなく、治療、予防が望まれる疾病において好ましい作用を発揮するものであればよく、ポリペプチド、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉作用を示すＲＮＡ等が例示される。本発明の発現システムは、疾病の発症、例えば発がんやウイルス感染に応じて治療用遺伝子の発現をもたらすものであることから、癌細胞やウイルス感染細胞の排除に有用な遺伝子、例えば細胞毒性を発揮しうる遺伝子を使用することができる。【００１６】
本発明に使用される、ポリペプチドをコードする治療用遺伝子としては、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、核酸代謝に関わる遺伝子等が例示される。【００１７】
本発明の好適な一態様としては、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が例示される。原核生物のトキシン−アンチトキシン系遺伝子のトキシンのうちには配列特異性を有し、リボソーム非依存的に一本鎖ＲＮＡを分解する活性を有するポリペプチドがあり、特に本発明に好適である。例えば、モレキュラー  セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ）、第１２巻、ｐ９１３−９２３（２００３）、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２７９巻、ｐ２０６７８−２０６８４（２００４）にそれぞれ記載された、トキシン−アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼであるＭａｚＦやＰｅｍＫをコードする遺伝子を本発明に使用することができるが、これらに限定されるものではない。これらのエンドリボヌクレアーゼは、ヒト胎盤由来リボヌクレアーゼインヒビターのような、細胞質リボヌクレアーゼインヒビターにより阻害されることがないので（国際公開第２００４／１１３４９８号パンフレット）、本発明への使用に適している。前記のエンドリボヌクレアーゼが持続的に発現された場合、細胞では新たなタンパク質の合成が起こらなくなるため、細胞は増殖阻害を起こし、更には細胞死が誘導される。また、当該細胞に感染しているウイルスはウイルスを構成しているタンパク質の合成が阻害されるために、ウイルスの複製、出芽が起こらなくなる。【００１８】
前記の治療用遺伝子は、トランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列によりその発現制御が行われる。本発明に使用される「トランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列」は、特定のトランス作用因子の結合／解離により転写のｏｎ／ｏｆｆが行われる配列であれば特に限定はない。当該転写調節配列の制御下に、例えばその下流に治療用遺伝子を配置することにより、治療用遺伝子発現ユニットを作製することができる。なお、当該トランス作用因子は、そのアミノ酸配列が明らかにされているポリペプチドが好ましく、そのアミノ酸情報を利用して前駆体化される。【００１９】
本発明に使用されるトランス作用因子の前駆体は、転写調節配列からの転写を誘導する活性を有さないが、特定の因子により前記活性を保持する活性型のトランス作用因子に転換される。ここで、前記の前駆体から活性型への転換は、特に本発明を限定するものではないが、例えばリガンドの結合やポリペプチドの修飾により達成することができる。ポリペプチドの修飾としては、リン酸化、脱リン酸化、糖鎖付加、糖鎖除去、限定分解などが例示され、それぞれキナーゼ、ホスファターゼ、糖転移酵素、グリコシダーゼ、プロテアーゼ等の酵素の作用を利用して活性型への転換を行うことができる。当該前駆体は例えばリン酸化部位や糖鎖結合部位の導入、削除や、適当なポリペプチドの付加といった手段を選択し、その遺伝子を遺伝子工学的に作製することができる。好ましくは、標的とする細胞や対象となる疾病の特性等を考慮して適切な手段を選択する。【００２０】
例えば、細胞のがん化や細胞へのウイルス感染により細胞内に発現、もしくは放出されるポリペプチドの作用により、活性型への転換が起こるような前駆体をデザインすることができる。例えば、いくつかのウイルスはその複製において自身のプロテアーゼの作用を必要とすることが知られており（例えば免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス等）、治療剤創薬の標的とされている。このようなプロテアーゼによる限定分解の結果、活性型への転換が起こるようにトランス作用因子の前駆体をデザインすることにより、ウイルス感染によって治療用遺伝子の発現が誘導されるシステムを構築することができる。また、疾病特異的に細胞内に発現もしくは放出される複数種のポリペプチドが知られている場合、いずれのポリペプチドの作用によっても活性型への転換が起こるような前駆体をデザインすることも可能である。例えば、ウイルス感染によって基質特異性が異なる２種類のプロテアーゼが発現される場合は、どちらのプロテアーゼの作用でも活性型への転換が起こるような前駆体をデザインすることができる。さらには、複数種のポリペプチドのいずれかの作用により、活性型への転換が起こるような複数種の前駆体をデザインすることもできる。例えば、ウイルス感染によって基質特異性が異なる２種類のプロテアーゼが発現もしくは放出される場合は、それぞれのプロテアーゼに対して前駆体をデザインし、これらをウイルス感染の治療のために併用することができる。【００２１】
本発明に使用可能なトランス作用因子の前駆体は、例えば下記のような方法で作成することができる。まず天然のトランス作用因子に前記のプロテアーゼにより認識、切断されるアミノ酸配列が付加され、さらに前記アミノ酸配列を挟んで任意のポリペプチドが付加された融合ポリペプチドをコードする核酸を作製する。次いで前記核酸を適当なプロモーターの下流に配置したベクターを作製する。前記のトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列の下流に適当なレポーター遺伝子を接続した核酸を導入した細胞を作製し、この細胞に前記のベクターを導入した際に当該レポーター遺伝子の発現が見られなかった場合、このベクターには転写誘導能が失われたトランス作用因子の前駆体がコードされている。ここで、前記のレポーター遺伝子は当該遺伝子の発現の有無が何らかの方法で確認できるものであればよく、適切な検出手段、例えば検出に使用できる抗体が存在するものであれば生理活性を有さないポリペプチドであってもよい。さらに、こうして選択されたベクターのうちから、プロテアーゼの作用によって活性型のトランス活性化因子に転換される融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含むものを選択することにより、本発明に使用可能なトランス作用因子の前駆体並びに当該前駆体をコードする遺伝子を取得することができる。また天然のトランス作用因子に前記プロテアーゼにより認識、切断されるアミノ酸配列を含有する任意のポリペプチドが付加された融合ポリペプチドも使用できる。【００２２】
ＨＩＶ由来プロテアーゼやＣ型肝炎ウイルス由来プロテアーゼが認識、切断するアミノ酸配列は研究されており［例えば、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６６巻、ｐ１４５５４−１４５６１（１９９１）、ジャーナル  オブ  ヴィロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）、第６７巻、ｐ２８３２−２８４３（１９９３）、ジャーナル  オブ  ヴィロロジー、第７１巻、ｐ６２０８−６２１３（１９９７）］、この情報に基づいて前記の融合ポリペプチド遺伝子を設計することができる。また、トランス作用因子に融合される任意のポリペプチドも、トランス作用因子と融合させた場合に当該因子の活性を抑制できるものであれば特に限定はない。例えば、ランダムなポリペプチドをコードする核酸のライブラリー、ある生物もしくは細胞由来のｃＤＮＡ又はその断片のライブラリー等を使用してスクリーニングに供する融合ポリペプチド遺伝子のライブラリーを構築すればよい。【００２３】
上記の操作により作製、選択されたトランス作用因子の前駆体、もしくは当該前駆体をコードする遺伝子は、前記の治療用遺伝子発現ユニットとともに、もしくは当該ユニットと前後して細胞に導入することにより、当該治療用遺伝子転写ユニットの制御に供される。好ましくは、トランス作用因子の前駆体をコードする遺伝子が適切なプロモーターの制御下に、例えばその下流に配置された、前記前駆体の発現ユニットが使用される。前記のトランス作用因子の前駆体は細胞内に定常的に発現されていることが好ましいことから、通常、定常的な転写活性を有するプロモーターがその発現のために使用される。例えば、ハウスキーピング遺伝子由来のプロモーターやウイルス由来のプロモーター（ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）やその誘導体が例示される。トランス作用因子の前駆体をポリペプチドの形で導入する際には、公知の、細胞へのタンパク質導入手段を使用してもよい。【００２４】
本発明の特に好適な態様として、治療用遺伝子発現用の転写調節配列に免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ由来の転写調節配列、すなわちＬＴＲに由来するプロモーターを使用し、その転写活性を免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質に由来する前駆体によって制御する治療用遺伝子発現システムが挙げられる。ＨＩＶに由来するＴａｔタンパク質は、ＬＴＲプロモーターのＴＡＲ配列に結合してその転写活性を著しく増強する。このため、Ｔａｔタンパク質前駆体の活性型Ｔａｔへの転換に応じて著量の治療用遺伝子が転写、発現され、治療効果が発揮される。前記のＴａｔタンパク質前駆体はＴＡＲ結合活性を有しないか、もしくはＴＡＲに結合してもプロモーターからの転写を増強しない。【００２５】
なお、前記の転写調節配列は天然の塩基配列のＬＴＲプロモーターのみならず、当該配列に適切な改変、例えば、プロモーター内に存在する宿主細胞由来の転写因子との結合部位の欠失やＴａｔタンパク質特異的な転写に不要な領域の欠失が施されたものであってもよい。後者の、Ｔａｔタンパク質特異的な転写に不要な領域の欠失としてＬＴＲのＵ５領域やＴＡＲ配列より下流の領域（Ｒ領域の一部及びＵ５領域）の欠失が例示される。【００２６】
以上の、（１）トランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された治療用遺伝子からなる発現ユニット、及び
（２）（１）記載のトランス作用因子の前駆体、又は（１）記載のトランス作用因子の前駆体をコードする遺伝子が発現可能な形態に配置されている発現ユニット、によって本発明の治療用遺伝子発現システムが構築される。前記の治療用遺伝子発現システムは他の構成要素、例えば当該システムの細胞への導入に使用されるベクターや導入用試薬等をさらに含んでもよい。【００２７】
本発明の遺伝子発現システムは、細胞への導入にあたって、適切なベクターに搭載して使用することができる。その態様としては（Ａ）治療用遺伝子発現ユニットとトランス作用因子の前駆体発現ユニットを同一のベクターに搭載したシステム、（Ｂ）治療用遺伝子発現ユニットとトランス作用因子の前駆体発現ユニットをそれぞれ異なるベクターに搭載したシステム、の２とおりがある。どちらのシステムを選択するかは、適用する細胞や疾患、その取り扱いの難易等に応じて適宜選択すればよい。前記の、トランス作用因子の前駆体をポリペプチドの形で導入する態様においては、治療用遺伝子発現ユニットのみが搭載されたベクターが細胞に導入される。【００２８】
本発明のシステムに使用されるベクターには特に限定はなく、所望の宿主、例えば哺乳動物細胞への遺伝子導入、遺伝子発現に使用できるものであればよい。非ウイルスベクターとしては、プラスミドベクターが例示される。前記のプラスミドベクターは、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用して目的の細胞に導入することができる。【００２９】
本発明に使用できるウイルスベクターにも特に限定はなく、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等を使用することができる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。特に好適には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが使用される。【００３０】
本発明の治療用遺伝子が導入された細胞では、がん化やウイルスの感染によって細胞内に発現、もしくは放出される因子の作用によってまず活性型のトランス作用因子が生成し、その作用に基づいて治療用遺伝子が発現される。疾病の種類に応じて適切なトランス作用因子の前駆体をデザイン可能であり、多数の疾病に適用可能である点が本発明の特徴である。また、疾病の発症、進行に依存して治療効果が発揮されることから、本発明のシステムを使用することにより、治療用遺伝子の機能を最大限に利用した疾病の治療、予防が可能となる。本発明の治療用遺伝子発現システムを使用する疾病の治療、予防方法も本発明に包含される。【００３１】
本発明の治療用遺伝子発現システムを疾病の治療又は予防に使用する際には、当該システムを生体に導入する。その手段として、本発明の治療用遺伝子発現システム（もしくは当該システムが搭載された１又は２のベクター）を生体に直接導入するイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）法、体外に取り出した細胞に本発明の治療用遺伝子発現システム（もしくは当該システムが搭載された１又は２のベクター）を導入した後にこの細胞を生体に移植するエクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）法の２つが例示される。どちらの方法を選択するかは、疾病の種類、使用する治療用遺伝子の作用機作や性質、ベクターの種類等を考慮して決定すればよい。【００３２】
本発明は、トランス作用因子の前駆体であって、トランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列からの転写を誘導する活性を有さず、かつ特定の因子の作用により活性型のトランス作用因子に転換されるトランス作用因子の前駆体を提供する。【００３３】
その好適な態様として、疾病に特異的なプロテアーゼによる限定分解により転写調節配列からの転写誘導活性を保持した活性型トランス作用因子に転換される、人為的に構築されたトランス作用因子の前駆体を提供する。【００３４】
本発明のトランス作用因子の前駆体は、トランス作用因子と他のポリペプチドとの融合ポリペプチドであり、前記トランス作用因子が本来的に転写を誘導する活性を示す転写調節配列に対する転写を誘導する活性を失っている。トランス作用因子に融合する他のポリペプチドは、トランス作用因子の転写誘導活性を消失させ得る限り、そのＮ末端側に融合されていてもＣ末端側に融合されていても良い。【００３５】
前記のトランス作用因子の前駆体はトランス作用因子由来の領域と他のポリペプチド由来の領域の間、及び／又は他のポリペプチド由来の領域内に疾病特異的なプロテアーゼにより認識、切断されるアミノ酸配列を有する。前記のアミノ酸配列が切断されると、転写誘導活性を保持したトランス作用因子に転換される。またトランス作用因子に前記プロテアーゼにより認識、切断されるアミノ酸配列を含有する任意のポリペプチドが付加された融合ポリペプチドでもよい。なお、疾病特異的なプロテアーゼが複数種存在する場合、前記のトランス作用因子の前駆体は、これらのプロテアーゼの認識配列に対応する２以上のプロテアーゼの認識配列を、トランス作用因子由来の領域と他のポリペプチド由来の領域の間、及び／又は他のポリペプチド由来の領域内に有していても良い。【００３６】
本発明のトランス作用因子の前駆体はいかなるトランス作用因子に基づいて作製してもよい。一つの態様として、免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質に基づいて構築されたトランス作用因子の前駆体が例示される。分子量が小さいこと、単独で転写誘導活性を発揮しうることから、Ｔａｔタンパク質は本発明の目的に特に好適である。トランス作用因子としてＴａｔタンパク質を用いる場合、本発明のトランス作用前駆体の好適な態様としては、特に限定するものではないが、Ｔａｔタンパク質のＮ末端側に他のポリペプチドが融合されたトランス作用因子前駆体が例示される。【００３７】
本発明のトランス作用因子の前駆体は、前記の手法でその設計を行い、また、所望の機能を有するものを選択して取得することができる。その構築において、その活性化をなしうるプロテアーゼは任意に選択することが可能であり、当該プロテアーゼにより認識、切断されるアミノ酸配列を導入することにより自由に設計できる。特に好適な態様としては、免疫不全ウイルス又はＣ型肝炎ウイルス由来のプロテアーゼの認識、切断配列を有するトランス作用因子前駆体が例示される。当該前駆体は、本発明の治療用遺伝子発現システムを使用する免疫不全ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療、予防に利用される。【００３８】
本発明のトランス作用因子前駆体において、トランス作用因子に融合されるポリペプチドは、トランス作用因子と融合させた場合にその活性を抑制できるものであれ特に限定はない。例えば、分子量１０ｋ〜１００ｋＤａ程度で、単量体として存在しうるポリペプチドが使用される。特に本発明を限定するものではないが、下記実施例に記載されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＡＡＨ３４０２３．１）、ｂｒａｉｎ  ａｂｕｎｄａｎｔ，  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＢＡＳＰ１、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００６３０８）、及びラミニンα１（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００５５５０）又はその部分配列、並びにこれらのポリペプチドのホモローグがトランス作用因子に融合されるポリペプチドとして例示される。なお、特に限定するものではないが、本明細書においてポリペプチドのホモローグとは、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％以上又は９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチドのことを言う。また、本発明のトランス作用因子前駆体においては、同一種類又は異なる種類のポリペプチドが２以上直列に融合したものが、トランス作用因子に融合されていても良い。【００３９】
本発明のトランス作用因子の前駆体において、疾病特異的なプロテアーゼにより認識、切断されるアミノ酸配列としては、特に限定するものではないが、免疫不全ウイルス由来プロテアーゼの認識配列やＣ型肝炎ウイルス由来ＮＳ３プロテアーゼの認識配列が例示される。なお、ＮＳ３プロテアーゼが認識するコンセンサス配列は、（Ａｓｐ／Ｇｌｕ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｃｙｓ／Ｔｈｒ）↓（Ｓｅｒ／Ａｌａ）〔Ｘａａは全てのアミノ酸残基を示し、↓はＮＳ３プロテアーゼにより切断されるペプチド結合の位置を示す〕であることが提唱されている〔ジャーナル  オブ  ヴィロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）、第６７巻、ｐ２８３２−２８４３（１９９３）〕。このようなＮＳ３プロテアーゼ認識配列の好適な例としては、ＮＳ５ａ／５ｂサイト、ＮＳ４ｂ／５ａサイト、及びＮＳ４ａ／４ｂサイトが挙げられる〔ジャーナル  オブ  ヴィロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）、第６８巻、ｐ８１４７−８１５７（１９９４）〕。また、ＮＳ５ａ／５ｂサイト、ＮＳ４ｂ／５ａサイト、及びＮＳ４ａ／４ｂサイトのアミノ酸配列の例としては、それぞれＧｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ、及びＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａを含むアミノ酸配列が挙げられる。本発明のトランス作用因子の前駆体における疾患特異的なプロテアーゼにより認識切断される配列としては、これらのプロテアーゼ認識配列を複数有するものであっても良い。【００４０】
前記の、本発明のトランス作用因子の前駆体をコードする遺伝子も本発明の態様の一つである。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。【００４２】
実施例１  ＭａｚＦ発現プラスミドの構築
（１）ＭａｚＦ発現レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬの構築
プラスミドｐＱＢＩ−ＬＴＲｇａｇＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）に挿入されているｇａｇ、ｓｇＧＦＰ及びＲＲＥをコードする領域を制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩの二重消化によって除去したうえ、ここにＭａｚＦをコードする、配列表の配列番号２に示す塩基配列の化学的に合成されたＤＮＡを挿入した。こうして構築されたプラスミドをｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１と命名した。ｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１を鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲ法でＨＩＶ−ＬＴＲからＭａｚＦをコードする領域を増幅し、得られた増幅断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＥｃｏ５２Ｉで消化した。このＤＮＡ断片をＨＩＶ−ＬＴＲ−ＭａｚＦカセットと命名した。【００４３】
ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１プラスミド（クロンテック社製）を鋳型とし、配列番号５及び配列番号６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲ法でヘルペス単純ウイルス１型由来のポリＡシグナルを含むＤＮＡ断片を増幅し、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩで消化した。このＤＮＡ断片をｐＡ断片と命名した。【００４４】
ｐＱＢＩ−ｐｇｋ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）を鋳型とし、配列番号７及び配列番号８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲ法でマウスＰＧＫプロモーターを含む断片を増幅し、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩで消化後、末端を平滑化し、更にＢａｍＨＩで消化した。このＤＮＡ断片をｐＰＧＫ断片と命名した。【００４５】
レトロウイルス産生細胞ＳＦＣＭＭ−３［ヒューマン  ジーン  セラピー、第９巻、ｐ２２４３−２２５１（１９９８）］のゲノムを鋳型とし、配列番号９及び配列番号１０に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲ法でヒトＬｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒの細胞外ドメインを増幅し、得られた増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した。このＤＮＡ断片をＬＮＧＦＲ断片と命名した。【００４６】
ｐＭＴベクター［ジーン  セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第７巻、７９７〜８０４頁（２０００）に記載されるｐＭベクター］のＭｌｕＩ、ＢａｍＨＩ部位に上記遺伝子断片を順次挿入し、図１に示す組換えレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬを得た。このベクターでは、ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＭａｚＦカセットがレトロウイルスベクターゲノムの転写とは逆方向に挿入されているのが特徴である。【００４７】
（２）ＭａｚＦ発現レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬの構築
ｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬとの比較に使用する目的で、ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＭａｚＦカセットがレトロウイルスベクターゲノムの転写と同じ方向に挿入され、遺伝子導入後はレトロウイルスゲノムの転写が抑制される自己不活型レトロウイルスベクターｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬを構築した（図２）。この調製にはｐＭＴベクターの３’ＬＴＲのＵ３領域について、当該領域４３〜３０９番目の塩基にわたる部分を欠損させたプラスミドベクターｐＭＴＤ３を使用し、そのＭｌｕＩ、ＢａｍＨＩ部位に（１）で調製したＤＮＡ断片を図２のとおりに挿入して構築した。【００４８】
実施例２  レトロウイルス産生細胞の樹立とレトロウイルスベクターの調製
ｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬとＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いた一過性のウイルス産生を行い、エコトロピックＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬウイルスを獲得した。エコトロピックＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬウイルスを、ＧａＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）にポリブレン（シグマアルドリッチ社製）８μｇ／ｍＬ存在下に感染させ、遺伝子導入細胞を獲得した。前記の細胞を９６穴プレートに限界希釈して播種し、増殖してきたクローンの培養上清を採取して実施例３記載のリアルタイムＰＣＲ法によりウイルス力価を測定した。高力価のウイルス産生が見られたクローン１株を選択してレトロウイルスベクター産生細胞株ＰＧ１３／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬを樹立した。【００４９】
ＰＧ１３／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬは１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地（シグマ社製）（５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）で培養し、セミコンフルエントに生育したところで５ｍＭの酪酸ナトリウムを含む新鮮な１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ培地（０．１ｍＬ／ｃｍ２）と交換し、２４時間後に上清を０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）でろ過してＧａＬＶ／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬ組換えレトロウイルス液を得た。得られたウイルス液は小分けして分注し、−８０℃フリーザーで保存し、以下の遺伝子導入実験に供した。【００５０】
実施例３  ウイルス力価の測定
Ｒｅｔｒｏ−Ｘ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いてウイルス液１μＬを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ反応を行い、検量線からウイルス液中のＲＮＡコピー数を算出した。実施例２で得たＧａＬＶ／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬウイルス液の力価は９．７８×１０９ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬであった。【００５１】
実施例４  ＭａｚＦ遺伝子を保持する細胞株の作製
実施例２で作製されたＧａＬＶ／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬ組換えレトロウイルスをヒト細胞株に感染させる。遺伝子導入された細胞をＣＤ２７１  マイクロビーズキット（ミルテニーバイオテク社製）で選択することにより、当該ウイルスで形質転換されたポリクローナルな細胞株を作製する。【００５２】
実施例５  Ｔａｔ前駆体遺伝子の作製と選択
Ｔａｔタンパク質をコードする遺伝子を合成するか、もしくは市販のプラスミド（例えばＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製のプラスミドｐＱＢＩ−ｔａｔＧＦＰ）より単離し、真核細胞用発現ベクターのプロモーターの下流に挿入したベクターを作製する。このベクターのＴａｔタンパク質コード領域のＣ末端部分にＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼが認識、切断するアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡを挿入し、さらにその下流にヒトｃＤＮＡライブラリーからランダムに増幅した構造遺伝子断片を接続したベクターを作製する。このベクターはＴａｔタンパク質を含む融合ポリペプチドの遺伝子のライブラリーである。【００５３】
このベクターを用いて実施例４で作製されたポリクローナルな細胞株を形質転換する。生育能を保持した形質転換細胞はＭａｚＦが発現していない細胞であり、Ｔａｔタンパク質の転写誘導能が失われた融合ポリペプチドをコードするベクターで形質転換されていることが期待できる。【００５４】
成育した細胞にＮＳ３プロテアーゼ遺伝子を導入して当該遺伝子を発現させる。その結果、細胞死を起こした細胞はＮＳ３プロテアーゼにより活性型のＴａｔタンパク質が生成してＭａｚＦが発現された細胞である。この細胞よりベクターを回収してＮＳ３プロテアーゼ消化により転写誘導活性が付与されるＴａｔタンパク質融合ポリペプチド、すなわち本発明のトランス作用因子前駆体をコードする遺伝子を取得する。【００５５】
別法として、生育した細胞よりベクターを回収し、そこにコードされている融合ポリペプチドのアミノ酸配列を確認する。さらに、この融合ポリペプチドを調製してＮＳ３プロテアーゼによる切断について試験し、ＮＳ３プロテアーゼ消化により転写誘導活性が付与されるＴａｔタンパク質融合ポリペプチドをコードする遺伝子を取得する。【００５６】
実施例６：ＴＡＲ−ＺｓＧｒｅｅｎ導入細胞の作製
（１）ｐＭＴＤ３Ｈ―ＺｓＧｒｅｅｎ／ＳＮプラスミドの構築
まず、Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）の３´ＬＴＲのＵ３領域を欠損させたベクターを作製するため、ｐＭＴベクターを鋳型に、配列番号１１記載のＳＣＶ３ＬＢプライマー及び配列番号１２記載のＳＣＶ３ＬＲＩプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−３´ＬＴＲプラスミドと命名した。【００５７】
次に、ｐＭＴベクターを鋳型に、配列番号１３記載の３´ＬＴＲ−２プライマー及び配列番号１２記載のＳＣＶ３ＬＲＩプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで切断した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−３´ＬＴＲプラスミドのＮｈｅＩ―ＳａｌＩサイトにクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐｒｅＭＴＤ３プラスミドと命名した。【００５８】
続いて、ｐｒｅＭＴＤ３プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、得られた断片をｐＭＴベクターのＢａｍＨＩ―ＳａｌＩサイトにクローニングした。こうして構築されたｐＭＴＤ３プラスミドと命名した。なお、ｐＭＴＤ３プラスミドは、３´ＬＴＲのＵ３が欠損したプラスミドである。【００５９】
次に、ｐＱＢＩ−ＬＴＲｇａｇＧＦＰベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）を鋳型に、配列番号１４記載の５´ＨＩＶ１―Ｕ３プライマー及び配列番号１５記載の３´ＨＩＶ-ＴＡＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＭｌｕＩとＡｐａＩで切断し、ｐＭＴＤ３プラスミドのＭｌｕＩ―ＡｐａＩサイトにクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐＭＴＤ３Ｈプラスミドと命名した。【００６０】
次に、ｐＺｓＧｒｅｅｎ−Ｎ１ベクター（クロンテック社製）を鋳型に、配列番号１６記載のＺｓＧｒｅｅｎ５プライマー及び配列番号１７記載のＺｓＧｒｅｅｎ３プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断した後、ｐＭＴＤ３ＨプラスミドのＢａｍＨＩ―ＸｈｏＩサイトにクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐＭＴＤ３Ｈ−ＺｓＧｒｅｅｎプラスミドと命名した。【００６１】
最後に、ｐＤＯＮ−ＡＩベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素ＳａｌＩとＸｈｏＩで切断し、得られた断片をｐＭＴＤ３Ｈ−ＺｓＧｒｅｅｎプラスミドのＸｈｏＩサイトにクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐＭＴＤ３Ｈ―ＺｓＧｒｅｅｎ／ＳＮプラスミドと命名した。図３にｐＭＴＤ３Ｈ―ＺｓＧｒｅｅｎ／ＳＮプラスミドの概略を示す。【００６２】
（２）ＭＴＤ３Ｈ―ＺｓＧｒｅｅｎ／ＳＮレトロウイルスベクターの作製
実施例６−（１）で作製したｐＭＴＤ３Ｈ―ＺｓＧｒｅｅｎ／ＳＮプラスミドを、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）に含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ａｍｐｈｏとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換した。得られた形質転換細胞を２日間培養した後、細胞上清液を獲得し、これを０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、レトロウイルスベクター（ＭＴＤ３Ｈ―ＺｓＧｒｅｅｎ／ＳＮ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターと命名）を得た。【００６３】
（３）形質転換細胞の調製
実施例６−（２）で作製したＭＴＤ３Ｈ―ＺｓＧｒｅｅｎ／ＳＮ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターを、終濃度８μｇ／ｍＬのポリプレンを用いて、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０に感染させた後、感染細胞を５００μｇ／ｍＬのジェネティシン含有ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）で培養して遺伝子導入細胞を選択し、ＨＩＶ１のＵ３ＴＡＲプロモーターに制御されるＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子とＳＶ４０プロモーターに制御されるネオマイシン耐性遺伝子が導入されたＨＴ１０８０細胞（ＨＴ１０８０；；ＺｓＧと命名）を得た。【００６４】
ＭＴＤ３Ｈ―ＺｓＧｒｅｅｎ／ＳＮ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターは３´ＬＴＲのＵ３が欠損しており、ＨＴ１０８０；；ＺｓＧに感染してゲノムに導入される際、５´ＬＴＲは３´ＬＴＲの配列と置き換わるため、ゲノム上ではＵ３のプロモーター活性を持たない。従ってＺｓＧｒｅｅｎはＨＩＶ１のＵ３ＴＡＲプロモーターにのみ制御される。【００６５】
実施例７：ＮＳ３プロテアーゼ遺伝子導入細胞の作製
（１）ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ発現プラスミドの構築
ＨＣＶ  ＮＳ３−ＮＳ４ａ（ＮＣＢＩ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＦ６５９６４．１の１０２７−１７１１）に相当するＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ２０７７７４．１の３４０８−５４６２）の上流側に制限酵素ＢｇｌＩＩサイト及び開始コドン（ＡＴＧ）を、下流側に終止コドン及び制限酵素ＮｏｔＩサイトを付加し、さらに４箇所においてコードするアミノ酸を変えずに塩基配列置換した配列（配列番号１８）を化学合成し、ｐＭＤ１９−Ｔベクター（タカラバイオ社製）にクローニングした。こうして構築されたプラスミドをＳＹＮ１６１９−１７プラスミドと命名した。【００６６】
次に、ｐＳＹＮ１６１９−１７プラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで切断して得た約２．１ｋｂのＤＮＡ断片をｐＬＰＣＸベクター（クロンテック社製）のＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐＬＰＣＸ  ＮＳ３−４ａプラスミドと命名した。【００６７】
（２）ｐＤＯＮ５ＳＨｙｇ−ＮＳ３プラスミドの構築
ｐＴｒｉＥｘ−３  Ｈｙｇｒｏベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｔＸＩで切断し、得られた断片をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＭＥＩ−５  Ｎｅｏベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素ＦｂａＩとＸｈｏＩで切断して平滑末端化したサイトにクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐＭＥＩ−５  Ｈｙｇｒｏプラスミドと命名した。【００６８】
次に、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２ベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素ＳｓｐＩとＭｌｕＩで切断し、得られた断片をｐＭＥＩ−５  ＨｙｇｒｏプラスミドのＳｓｐＩ―ＭｌｕＩサイトにクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐＤＯＮ５―Ｈｙｇｒｏベクターと命名した。【００６９】
続いて、実施例７−（１）で作製したｐＬＰＣＸ  ＮＳ３−４ａプラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断後にＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、さらにＮｏｔＩで切断し、ｐＤＯＮ５−ＨｙｇｒｏベクターのＰｍａＣＩ―ＮｏｔＩサイトにクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐＤＯＮ５ＳＨｙｇ−ＮＳ３プラスミドと命名した。【００７０】
（３）ＤＯＮ５ＳＨｙｇ−ＮＳ３レトロウイルスベクターの作製
実施例７−（２）で作製したｐＤＯＮ５ＳＨｙｇ−ＮＳ３プラスミドを、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏに含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ａｍｐｈｏとともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換細胞を２日間培養した後、細胞上清液を獲得し、これを０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、レトロウイルスベクター（ＤＯＮ５ＳＨｙｇ−ＮＳ３／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターと命名）を得た。【００７１】
（４）形質転換細胞の調製
実施例７−（３）で作製したＤＯＮ５ＳＨｙｇ−ＮＳ３／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターを、終濃度８μｇ／ｍＬのポリプレンを用いて、実施例６−（３）で作製したＨＴ１０８０；；ＺｓＧに感染させ、感染細胞を２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン含有ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）で培養して遺伝子導入細胞を選択し、ＨＩＶ１のＵ３ＴＡＲプロモーターに制御されるＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子とＳＶ４０プロモーターに制御されるネオマイシン耐性遺伝子、及びＭＭＬＶ  ＬＴＲプロモーターで制御されるＮＳ３遺伝子が導入されたＨＴ１０８０細胞（ＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３と命名）を得た。【００７２】
実施例８：Ｔａｔ融合タンパク発現レトロウイルスベクターの作製
（１）ｐＤＯＮ５−Ｎｅｏベクターの作製
ｐＤＯＮ−ＡＩ−２ベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素ＳｓｐＩとＭｌｕＩで切断し、得られた断片をｐＭＥＩ−５  Ｎｅｏベクター（タカラバイオ社製）のＳｓｐＩ−ＭｌｕＩサイトにクローニングした。こうして構築されたベクターをｐＤＯＮ−５−Ｎｅｏベクターと命名した。【００７３】
（２）Ｔａｔタンパク質発現プラスミドの構築
プラスミドｐＱＢＩ−ｔａｔＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）を鋳型に、配列番号２４記載のＴａｔ  Ｓａｃ２  Ｆプライマー及び配列番号２０記載のＴａｔ  ＥｃｏＲ１  Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＳａｃＩＩとＥｃｏＲＩで切断した後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、ｐＤＯＮ−ＡＩベクター（タカラバイオ社製）のＰｍｅＩサイトにクローニングした。こうして得られたプラスミドをｐＤＯＮ−Ｔａｔプラスミドと命名した。【００７４】
（３）ＨＳＡ  ＯＲＦ  ｃＤＮＡ  のクローニング
Ｈｕｍａｎ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（タカラバイオ社製）を鋳型とし、配列番号２１記載のｈＡＬＢＦ１プライマー及び配列番号２２記載のｈＡＬＢＲ１プライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号２３記載のリン酸化したｈＡＬＢＦ２プライマー及び配列番号２２記載のリン酸化したｈＡＬＢＲ１プライマーを用いてＰＣＲを行い、ｍａｔｕｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＨＳＡ）のコード領域に相当するｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ  Ａｃｃ．Ｎｏ．  ＢＣ０３４０２３．１  ＯＲＦ  ７３−１８３０）を増幅した。得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＨｉｎｃＩＩ消化後に脱リン酸化したｐＵＣ１８ベクターにクローニングし、構築されたプラスミドをｐＵｈＡ２プラスミドと命名した。【００７５】
（４）ＨＩＶ  Ｔａｔ  ＯＲＦのクローニング
実施例８−（２）で作製したｐＤＯＮ−Ｔａｔプラスミドを鋳型として配列番号２４記載のリン酸化したＴａｔ  Ｓａｃ２  Ｆプライマーと配列番号２５記載のリン酸化したＴａｔＢｍＲ１プライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＨｉｎｃＩＩ消化後に脱リン酸化したｐＵＣ１８ベクターにクローニングし、ｐＵＴａｔＢｍプラスミドを得た。【００７６】
（５）Ｔａｔ−ＮＳ３プロテアーゼサイトプラスミドの構築
配列番号２６記載の合成ＤＮＡ  ｓｔｏｐ  ｊｃｔＵと配列番号２７記載のｓｔｏｐ  ｊｃｔＬをアニーリングした後、これを実施例８−（１）で作製したｐＤＯＮ５−ＮｅｏベクターのＢａｍＨＩ−ＨｐａＩサイトにクローニングしたプラスミドを作製した。このプラスミドのＳａｃＩＩ−Ａｏｒ５１ＨＩサイトに、実施例８−（４）で作製したｐＵＴａｔＢｍプラスミドをＳａｃＩＩとＢａｍＨＩで切断して得られる約０．２７ｋｂの断片及び配列番号２８記載の合成ＤＮＡ  ｓｉｔｅＡ１Ｕと配列番号２９記載の合成ＤＮＡ  ｓｉｔｅＡ１Ｌとをアニーリングして得られたＤＮＡ断片をクローニングした。こうして構築されたプラスミドを、ｐＤ５ＮＴａｔＡ１プラスミドと命名した。また、合成ＤＮＡ  ｓｉｔｅＡ１Ｕと合成ＤＮＡ  ｓｉｔｅＡ１Ｌとをアニーリングして得られたＤＮＡ断片を用いる代わりに、配列番号３０記載の合成ＤＮＡ  ｓｉｔｅＢ１Ｕと配列番号３１記載の合成ＤＮＡ  ｓｉｔｅＢ１ＬをアニーリングしたＤＮＡ断片を用いてｐＤ５ＮＴａｔＡ１プラスミドの構築と同様の方法でプラスミドを構築し、これをｐＤ５ＮＴａｔＢ１プラスミドと命名した。【００７７】
（６）ｐＤ５ＮＴＡ１Ｈプラスミドの構築
実施例８−（３）で作製したｐＵｈＡ２プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＨＳＡ遺伝子を含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて末端平滑化した後、実施例８−（５）で作製したｐＤ５ＮＴａｔＡ１プラスミドのＡｏｒ５１ＨＩサイトに挿入し、Ｔａｔタンパク質のＣ末端側にＮＳ３プロテアーゼ認識配列ＮＳ３／４ａサイトをはさんでＨＳＡが連結した融合タンパク質をコードする配列を有するプラスミド（ｐＤ５ＮＴＡ１Ｈプラスミドと命名）を得た。【００７８】
（７）ｐＤ５ＮＨＡ１Ｔプラスミドの構築
実施例８−（２）で作製したｐＤＯＮ−Ｔａｔプラスミドを鋳型として配列番号３２記載のＮＳＴａｔＦ１プライマー及び配列番号３３記載のＴａｔＲＨｐａプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を鋳型として配列番号３４記載のＮＳＴａｔＦ２プライマー及び配列番号３３記載のＴａｔＲＨｐａプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｔａｔ遺伝子にＮＳ３プロテアーゼ認識配列ＮＳ３／４Ａサイトの一部を付加したＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ断片をｐＵＣ１１８ベクターのＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした後、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＨｐａＩで切断し、約０．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を実施例８−（１）で作製したｐＤＯＮ５−ＮｅｏベクターのＳａｃＩＩ−ＨｐａＩサイトにクローニングし、構築されたプラスミドをｐＤ５ＮＴプラスミドと命名した。【００７９】
次に、実施例８−（３）で作製したｐＵｈＡ２プラスミドを鋳型として配列番号３５記載のＨＳＡＫＦプライマー及び配列番号３６記載のＨＳＡＮＳＲ１プライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を鋳型として配列番号３５記載のＨＳＡＫＦプライマー及び配列番号３７記載のＨＳＡＮＳＲ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＨＳＡ遺伝子にＮＳ３プロテアーゼ認識配列ＮＳ３／４Ａサイトの一部を付加したＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ断片をｐＵＣ１１８ベクターのＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした後、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＳａｌＩで切断した。得られた約１．８ｋｂのＤＮＡ断片をｐＤ５ＮＴプラスミドのＳａｃＩＩ−ＳａｌＩサイトにクローニングし、ＨＳＡタンパク質のＣ末端側にＮＳ３プロテアーゼ認識配列ＮＳ３／４ａサイトをはさんでＴａｔタンパク質が連結した融合タンパク質をコードする配列を有するプラスミド（ｐＤ５ＮＨＡ１Ｔプラスミドと命名）を得た。【００８０】
（８）ｐＤ５ＮＨＢ１Ｔプラスミドの構築
実施例８−（７）で作製したｐＤ５ＮＨＡ１Ｔプラスミドを制限酵素ＳａｃＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ＨＳＡ遺伝子を含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を実施例８−（５）で作製したｐＤ５ＮＴａｔＢ１プラスミドのＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩサイトにＴａｔ遺伝子と入れ替えて挿入した。こうして構築されたプラスミドをｐＤ５ＮＨＢ１プラスミドと命名した。【００８１】
次に実施例８−（２）で作製したｐＤＯＮ−Ｔａｔプラスミドを鋳型として配列番号３８記載のＴａｔＦＡｏｒプライマー及び配列番号３３記載のＴａｔＲＨｐａプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｔａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ断片をｐＵＣ１１８ベクターのＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした後、制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩ及びＨｐａＩで切断し、約０．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＤ５ＮＨＢ１プラスミドのＡｏｒ５１ＨＩ−ＨｐａＩサイトに挿入し、ＨＳＡタンパク質のＣ末端側にＮＳ３プロテアーゼ認識配列ＮＳ５ａ／５ｂサイトをはさんでＴａｔが連結した融合タンパク質をコードする配列を有するプラスミド（ｐＤ５ＮＨＢ１Ｔプラスミドと命名）を得た。【００８２】
（９）Ｔａｔ発現レトロウイルスベクターの作製
実施例８−（２）で作製したｐＤＯＮ−Ｔａｔプラスミドを、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏに含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ａｍｐｈｏとともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。この形質転換細胞を２日間培養した後、細胞上清液を獲得し、これを０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、Ｔａｔを発現するレトロウイルスベクター（ＤＯＮ−Ｔａｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターと命名）を得た。【００８３】
（１０）ＴａｔとＨＳＡ融合タンパク質発現レトロウイルスベクターの作製
実施例８−（６）で作製したｐＤ５ＮＴＡ１Ｈプラスミドを、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏに含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ａｍｐｈｏとともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。この形質転換細胞を２日間培養した後、細胞上清液を獲得し、これを０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、ＮＳ３認識配列ＮＳ３／４Ａサイトを介してＮ末側にＴａｔを有し、Ｃ末側にＨＳＡを有する融合タンパク質を発現するレトロウイルスベクター（Ｄ５ＮＴＡ１Ｈ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターと命名）を得た。【００８４】
また、実施例８−（７）で作製したｐＤ５ＮＨＡ１Ｔプラスミドを、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏに含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ａｍｐｈｏとともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換した。この形質転換細胞を２日間培養した後、細胞上清液を獲得し、これを０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、ＮＳ３認識配列ＮＳ３／４Ａサイトを介してＮ末側にＨＳＡを有し、Ｃ末側にＴａｔを有する融合タンパク質を発現するレトロウイルスベクター（Ｄ５ＮＨＡ１Ｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターと命名）を得た。【００８５】
さらに、実施例８−（８）で作製したｐＤ５ＮＨＢ１Ｔプラスミドを、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏに含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ａｍｐｈｏとともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換した。この形質転換細胞を２日間培養した後、細胞上清液を獲得し、これを０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、ＮＳ３認識配列ＮＳ５Ａ／５Ｂサイトを介してＮ末側にＨＳＡを有し、Ｃ末側にＴａｔを有する融合タンパク質を発現するレトロウイルスベクター（Ｄ５ＮＨＢ１Ｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターと命名）を得た。【００８６】
実施例９：Ｔａｔ活性の測定
（１）ＴａｔとＨＳＡの位置の違いによるＴａｔ不活化の差異の測定
実施例６−（３）で調製したＨＴ１０８０；；ＺｓＧに、実施例８−（１０）で作製したＤ５ＮＴＡ１Ｈ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクター、Ｄ５ＮＨＡ１Ｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクター、及び実施例８−（９）で作製したＤＯＮ−Ｔａｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターをそれぞれ感染させ、３日培養した後、フローサイトメーター（ベックマン・コールター社製）にて解析した。図４にフローサイトメーターによる蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ発現細胞の測定結果を示す。【００８７】
陽性コントロールのＤＯＮ−Ｔａｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターを感染させたＨＴ１０８０；；ＺｓＧは、６２．２１％の細胞が陽性であり、過半数の細胞においてＴａｔによりＨＩＶ１のＵ３ＴＡＲプロモーターからＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子が発現していた［図４（ｂ）］。ＮＳ３認識配列ＮＳ３／４Ａサイトを介してＮ末側にＴａｔをＣ末側にＨＳＡを有する融合タンパク質を発現するＤ５ＮＴＡ１Ｈ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターを感染させたＨＴ１０８０；；ＺｓＧは、３５．７１％の細胞が陽性であり、ＨＳＡによるＴａｔの不活化が完全ではなかった［図４（ｃ）］。【００８８】
一方、ＮＳ３認識配列ＮＳ３／４Ａサイトを介してＮ末側にＨＳＡをＣ末側にＴａｔを有する融合タンパク質を発現するＤ５ＮＨＡ１Ｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターを感染させたＨＴ１０８０；；ＺｓＧは、３．０９％の細胞が陽性であり、ＨＳＡによってＴａｔがほぼ完全に不活化されていた［図４（ｄ）］。このことより、トランス作用因子を不活化するためには、不活化用のタンパク質のＴａｔのＮ末側への付加が効果的である事が判明した。【００８９】
（２）ＮＳ３プロテアーゼによるＴａｔの活性化の測定
実施例６−（３）で調製したＨＴ１０８０；；ＺｓＧ、及び実施例７−（４）で調製したＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３に、実施例８−（１０）で作製したＤ５ＮＨＢ１Ｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクター、及び実施例８−（９）で作製したＤＯＮ−Ｔａｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターをそれぞれ感染させ、３日培養した後、フローサイトメーターにて解析した。図５にフローサイトメーターによる蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ発現細胞の測定結果を示す。【００９０】
陽性コントロールのＤＯＮ−Ｔａｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターを感染させた細胞は、ＨＴ１０８０；；ＺｓＧで９１．７％の細胞が陽性、ＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３で９３．４％の細胞が陽性であり、ＮＳ３プロテアーゼの有無に関係なくほとんどの細胞において、ＴａｔによりＨＩＶ１のＵ３ＴＡＲプロモーターからＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子が発現していた［図５（ｂ）］。一方、Ｄ５ＮＨＢ１Ｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターを感染させた細胞は、ＨＴ１０８０；；ＺｓＧで０．７９％の細胞が陽性でありＮＳ３プロテアーゼが無い場合はＴａｔがほぼ完全に不活化されていたが、ＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３で１５．２％の細胞が陽性であり、ＮＳ３プロテアーゼにより認識配列が切断されてＴａｔが活性化し、活性化したＴａｔによってＨＩＶ１のＵ３ＴＡＲプロモーターに制御されている遺伝子が発現する事が判明した［図５（ｃ）］。【００９１】
実施例１０  Ｔａｔの融合パートナーとして用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ断片のクローニング
（１）ヒトラミニンα１部分配列をコードするＤＮＡのクローニング
Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｃｅｎｔａ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）及び配列番号４７記載のＡ１Ｆ５４８２（ＡｇｅＩ）プライマーと配列番号４８記載のＡ１Ｒ８６０８（ＮｏｔＩ）プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片をＭｉｇｈｔｙ  ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）を用いて当該キットに添付されたｐＭＤ２０−Ｔベクターに挿入したライブラリーを作製し、ヒトラミニンα１鎖の部分配列をコードする遺伝子断片（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５５５９の５４８２−８６０８位に相当するｃＤＮＡ）を保持するクローンを選択した。このクローンのプラスミドをｐＭＤ２０−Ａ１（５４８２−８６０８）３５と命名した。【００９２】
先述のｐＭＤ２０−Ａ１（５４８２−８６０８）３５を鋳型として、配列番号４９記載のリン酸化したＬＭＦ１プライマーと配列番号５０記載のリン酸化したＬＭＲ１プライマーを用いたＰＣＲ、及び配列番号５１記載のリン酸化したＬＭＦ２プライマーと配列番号５２記載のリン酸化したＬＭＲ２プライマーを用いたＰＣＲを行った。各反応により得られたＰＣＲ断片をｐＵＣ１８のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングし、構築されたプラスミドをそれぞれｐＵＬＭ１プラスミド及びｐＵＬＭ２プラスミドと命名した。【００９３】
（２）ＢＡＳＰ１遺伝子のクローニング
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｂｒａｉｎ  ａｂｕｎｄａｎｔ，  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＢＡＳＰ１）  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製）を鋳型に、配列番号５７記載のＢＡＳＰＫＦプライマー及び配列番号５８記載のＢＡＳＰＮＳＲ１プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片をｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ社製）のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。こうして構築されたプラスミドをｐＵＣ−ＢＡＳＰＫＦＮＳＲ１プラスミドと命名した。【００９４】
また、ＰＣＲのプライマーとして配列番号６３記載のＢＡＳＰＦＨ２プライマー及び配列番号６４記載のＢＡＳＰＲＨ２プライマーを用いる以外はｐＵＣ−ＢＡＳＰＫＦＮＳＲ１プラスミドと同様の方法でプラスミドを構築し、構築されたプラスミドをｐＵＣ−ＢＡＳＰＦＨ２ＲＨ２プラスミドと命名した。【００９５】
実施例１１  Ｔａｔと他のポリペプチドとの融合タンパク質発現用のレトロウイルスベクタープラスミドの作製
（１）ＴａｔのＮ末側に融合パートナーが融合した融合タンパク質発現用のレトロウイルスベクタープラスミドの構築−１
実施例１０−（１）で得られたｐＵＬＭ１プラスミドを制限酵素ＳａｃＩＩとＢａｍＨＩで消化して得られた１．００ｋｂｐのＤＮＡ断片を実施例８−（８）で作製したｐＤ５ＮＨＢ１ＴプラスミドのＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入されているＨＳＡをコードするＤＮＡ断片と入れ替えた。得られたプラスミドをｐＤ５ＮＬＢ１Ｔプラスミドと命名した。【００９６】
実施例１０−（２）で得られたｐＵＣ−ＢＡＳＰＫＦＮＳＲ１プラスミドを制限酵素ＰｍａＣＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ＢＡＳＰ１遺伝子を含む約７００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、実施例８−（８）で作製したｐＤ５ＮＨＢ１ＴプラスミドをＡｐａＩで切断後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて末端平滑化し、さらにＢａｍＨＩで切断して、ＨＳＡをコードするＤＮＡ断片を除去した。除去したＤＮＡ断片と入れ替えに上記のＢＡＳＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入した。こうして構築されたプラスミドをｐＤ５ＮＢＢ１Ｔプラスミドと命名した。【００９７】
（２）ＴａｔのＣ末側に融合パートナーが融合した融合タンパク質発現用のレトロウイルスベクタープラスミドの構築
実施例１０−（１）で得られたｐＵＬＭ２プラスミドを制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩとＨｐａＩで消化して得られた０．９９ｋｂｐのＤＮＡ断片を実施例８−（５）で作製したプラスミドｐＤ５ＮＴａｔＢ１のＡｏｒ５１ＨＩ−ＨｐａＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをｐＤ５ＮＴＢ１Ｌプラスミドと命名した。【００９８】
実施例１０−（２）で得られたｐＵＣ−ＢＡＳＰＦＨ２ＲＨ２プラスミドを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、ＢＡＳＰ１遺伝子を含む約７００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を実施例８−（５）で作製したｐＤ５ＮＴａｔＢ１プラスミドのＡｏｒ５１ＨＩサイトに挿入した。こうして構築されたプラスミドをｐＤ５ＮＴＢ１Ｂプラスミドと命名した。【００９９】
（３）実施例１１−（１）及び１１−（２）で構築したウイルスベクタープラスミドに挿入されているＤＮＡ断片がコードする融合タンパク質の特徴
実施例１１−（１）及び１１−（２）で構築したウイルスベクタープラスミドに挿入されているＤＮＡ断片がコードする融合タンパク質の特徴を表１に示す。なお、各融合タンパク質はいずれも、Ｔａｔと他のポリペプチドとの間にＮＳ３プロテアーゼ認識配列ＮＳ５ａ／５ｂを有している。【０１００】
【表１】
2009051078.tif 000002
【０１０１】
実施例１２  各種レトロウイルスベクターの作製
実施例１１−（１）及び１１−（２）で構築したウイルスベクタープラスミド、ｐＤ５ＮＬＢ１Ｔプラスミド、ｐＤ５ＮＢＢ１Ｔプラスミド、ｐＤ５ＮＴＢ１Ｌプラスミド、ｐＤ５ＮＴＢ１Ｂプラスミドをそれぞれ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏに含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ａｍｐｈｏとともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換して２日間培養した後、細胞上清液を獲得し、これを０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、Ｄ５ＮＬＢ１Ｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクター、Ｄ５ＮＢＢ１Ｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクター、Ｄ５ＮＴＢ１Ｌ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクター、Ｄ５ＮＴＢ１Ｂ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターをそれぞれ得た。【０１０２】
実施例１３  形質転換細胞の再調製
（１）実施例６−（３）で調製したＨＴ１０８０；；ＺｓＧを、ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）で限界希釈法にて単一クローン（ＨＴ１０８０；；ＺｓＧＳＣと命名）を取得した。【０１０３】
（２）実施例７−（４）で調製したＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３を、ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）で限界希釈法にて単一クローンを取得した。得られた単一クレーンに、実施例７−（３）で作製したＤＯＮ５ＳＨｙｇ−ＮＳ３／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターを、終濃度８μｇ／ｍＬのポリプレンを用いて感染させ、感染細胞を２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン含有ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）で培養して遺伝子導入細胞を選択し、ＨＩＶ１のＵ３ＴＡＲプロモーターに制御されるＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子とＳＶ４０プロモーターに制御されるネオマイシン耐性遺伝子、及びＭＭＬＶ  ＬＴＲプロモーターで制御されるＮＳ３遺伝子が追加導入されたＨＴ１０８０細胞（ＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３Ｗと命名）を得た。【０１０４】
実施例１４  Ｔａｔ活性の不活化及びＮＳ３プロテアーゼによるＴａｔの活性化の測定
実施例１３−（１）で調製したＨＴ１０８０；；ＺｓＧＳＣ、及び実施例１３−（２）で調製したＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３Ｗに、実施例１２で作製した各種レトロウイルスベクター、及び実施例８−（９）で作成したＤＯＮ−Ｔａｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターをそれぞれ感染させ、３日培養した後、フローサイトメーター（ベックマン・コールター社製）にて解析した。表２にフローサイトメーターによる蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ発現細胞の測定結果を示す。【０１０５】
陽性コントロールのＤＯＮ−Ｔａｔ／Ａｍｐｈｏレトロウイルスベクターを感染させた細胞は、ＨＴ１０８０；；ＺｓＧＳＣで９６．４％の細胞が陽性、ＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３Ｗで９６．９％の細胞が陽性であり、ＮＳ３プロテアーゼの有無に関係なくほとんどの細胞において、ＴａｔによりＨＩＶ１のＵ３ＴＡＲプロモーターからＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子が発現していた。【０１０６】
ＮＳ３認識配列ＮＳ３／４Ａサイトを介してＮ末側にＴａｔをＣ末側に融合パートナーを有する融合タンパク質を発現するＤ５ＮＴＢ１Ｌ／ＡｍｐｈｏやＤ５ＮＴＢ１Ｂ／Ａｍｐｈｏを感染させたＨＴ１０８０；；ＺｓＧＳＣは、９０％以上の細胞が陽性であり、融合パートナーによるＴａｔの不活化が認められなかった。【０１０７】
一方、ＮＳ３認識配列ＮＳ３／４Ａサイトを介してＣ末側にＴａｔをＮ末側に融合パートナーを有する融合タンパク質を発現するＤ５ＮＬＢ１Ｔ／ＡｍｐｈｏやＤ５ＮＴＢＢ１Ｔ／Ａｍｐｈｏを感染させたＨＴ１０８０；；ＺｓＧＳＣは、それぞれ０．３％及び１．３％の細胞が陽性であり、融合パートナーによりＴａｔがほぼ完全に不活化されていた。このことからトランス作用因子を不活化するためには、ＴａｔのＮ末側への不活化用のタンパク質の付加が効果的であることが確認できた。【０１０８】
また、Ｄ５ＮＬＢ１Ｔ／Ａｍｐｈｏを感染させたＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３Ｗ、及びＤ５ＮＴＢＢ１Ｔ／Ａｍｐｈｏを感染させたＨＴ１０８０；；ＺｓＧ＋ＮＳ３Ｗでは、それぞれ２２．７％、及び４９．５％の細胞が陽性であった。このことから、ＮＳ３認識配列ＮＳ３／４Ａサイトを介してＣ末側にＴａｔをＮ末側に融合パートナーを有する融合タンパク質を用いた場合、ＮＳ３プロテアーゼにより認識配列が切断されてＴａｔが活性化し、活性化したＴａｔによってＨＩＶ１のＵ３ＴＡＲプロモーターに制御されている遺伝子が発現する事が確認できた。【０１０９】
【表２】
2009051078.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明により、疾病特異的に遺伝子発現を誘導することが可能な治療用遺伝子発現システムが提供される。当該システムは、種々の疾病の特質に基づいて、所望の効果を発揮できるように設計することが可能である。本発明の治療用遺伝子発現システムは種々の疾病、特にがんやウイルス感染症の治療、予防に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
SEQ ID NO:2 ; Synthetic DNA encoding MazF.
SEQ ID NO:3 ; Primer to amplify HIV-LTR-MazF cassette.
SEQ ID NO:4 ; Primer to amplify HIV-LTR-MazF cassette.
SEQ ID NO:5 ; Primer to amplify pA fragment.
SEQ ID NO:6 ; Primer to amplify pA fragment.
SEQ ID NO:7 ; Primer to amplify pPGK fragment.
SEQ ID NO:8 ; Primer to amplify pPGK fragment.
SEQ ID NO:9 ; Primer to amplify LNGFR fragment.
SEQ ID NO:10 ; Primer to amplify LNGFR fragment.
SEQ ID NO:11-17 ; PCR primer.
SEQ ID NO:18 ; Synthetic DNA encoding HCV NS3 protease.
SEQ ID NO:19-25 ; PCR primer.
SEQ ID NO:26-27 ; Synthetic DNA to remove a stop codon.
SEQ ID NO:28-29 ; Synthetic DNA to introduce the NS3 protease NS3/4a cleavage site.
SEQ ID NO:30-31 ; Synthetic DNA to introduce the NS3 protease NS5a/5b cleavage site.
SEQ ID NO:32-68 ; PCR primer.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2009051078000001.app
【国際調査報告】
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