(57)【要約】  本発明の課題は、オートファジー性細胞死を誘導できる薬剤、及びそれを用いた抗腫瘍剤を提供することである。本発明によれば、Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、その変異体ペプチド、又は上記ペプチドに細胞膜透過性ペプチド又は白血病細胞選択的結合ペプチドを直接又はリンカーを介して連結させたペプチドを含む、オートファジー性細胞死誘導剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の何れかのペプチド又は薬学的に許容されるその塩を含む、オートファジー性細胞死誘導剤。
（１）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)
で示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列において、Trp-Phe-Pro 以外の１から３個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているアミノ酸配列からなり、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するペプチド：又は
（３）上記（１）又は（２）に記載のペプチドに細胞膜透過性ペプチド又は白血病細胞選択的結合ペプチドを直接又はリンカーを介して連結させたペプチド：
【請求項２】
細胞膜透過性ペプチドがHIV-1 Tatペプチドであり、白血病細胞選択的結合ペプチドがAla-Cys-Ala-Tyr-His-Arg-Leu-Arg-Arg-Cys（配列番号２）である、請求項１に記載のオートファジー性細胞死誘導剤。
【請求項３】
以下の何れかのペプチド又は薬学的に許容されるその塩を含む、抗腫瘍剤。
（１）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列において、Trp-Phe-Pro 以外の１から３個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているアミノ酸配列からなり、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するペプチド：又は
（３）上記（１）又は（２）に記載のペプチドに細胞膜透過性ペプチド又は白血病細胞選択的結合ペプチドを直接又はリンカーを介して連結させたペプチド：
【請求項４】
細胞膜透過性ペプチドがHIV-1 Tatペプチドであり、白血病細胞選択的結合ペプチドがAla-Cys-Ala-Tyr-His-Arg-Leu-Arg-Arg-Cys（配列番号２）である、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
白血病、悪性リンパ腫、乳癌、前立腺癌、又は神経膠腫の治療又は抑制のために使用される、請求項３又は４に記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジー性細胞死誘導剤に関する。より詳細には、本発明は、ヒトNotch-1のRBP-jκ-associated molecule (RAM) 領域の部分ペプチドを用いたオートファジー性細胞死誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートファジー（自食作用）は、細胞内成分を分解するための機構の一つであり、全ての真核生物に備わっている普遍的な機構である (非特許文献１、及び非特許文献２)。オートファジー誘導が起こると、オートファゴソームと呼ばれる一過性に形成される隔離膜が形成され、細胞内の物質が取り込まれる。さらに、オートファゴソームにリソソームが融合し、オートリソソームが形成されることで、リソソーム含有のプロテアーゼにより隔離膜中の物質が丸ごと分解される。そして、分解により再生されたアミノ酸や脂質は、細胞の生存維持に利用される。【０００３】
本機構は、当初、飢餓に応答した生物の生存戦略の一つと考えられていたが、最近、飢餓の栄養素確保以外にも多様な役割を担っていることがわかってきた。例えば、がんの発生とその進展と密接に関わっていることや、行き過ぎたオートファジー誘導は、ミトコンドリアなど細胞内オルガネラや恒常性維持に必須の分子までも分解してしまうことから、生存には働かず、むしろ細胞死を招く方向に進むことが明らかになってきた (非特許文献３)。このような細胞死は、Clarkeによるプログラムされた細胞死の分類 (非特許文献４)でいうタイプ２細胞死に該当し、「オートファジー性細胞死」と呼ばれる。この細胞死は、形態学的観点からアポトーシスやネクローシス性の細胞死とは明確に区別されている。一般に、タイプ１のアポトーシスに比べ、タイプ２のオートファジー性細胞死の判定は難しいが、１）細胞死に先立ちオートファゴソームやオートファゴリソゾームの形成が認められる、２）3-methyladenineやwortmanninなどのオートファジー阻害剤により細胞死の抑制がかかる、３）カスパーゼ非依存的であること、がその基準となる (非特許文献５)。近年、本機構の分子機序の解明が進み、モニタリングも比較的容易に行なえるようなった。すなわち、微小管関連分子LC3（Atg8）のphosphatidylethanolamine（PE）付加によるLC3-IからLC3-IIへの変換 (非特許文献６)、もしくは蛍光タンパク質融合体GFP-LC3の細胞内挙動を調べることで、オートファゴソーム形成をモニターできる (非特許文献７)。【０００４】
近年、オートファジーを制御することにより、がんを治療しようとする取り組みが始まっている (非特許文献５；非特許文献８)。すなわち、（１）オートファジーを活性化させてオートファジー性細胞死を誘導する、（２）オートファジー抑制によってアポトーシス効率を高める、といった戦略である。がん細胞の状態や治療局面に応じて使い分ける必要があるが、オートファジー促進剤であるrapamycin誘導体やオートファジー阻害剤hydorxychloroquineを併用することで治療効率を上げようとする取り組みがなされている。しかしながら、（１）の目的に適うような単剤で直接オートファジー性細胞死を強く誘導する化合物は現在のところ見当たらない。今後、オートファジー制御によるがん治療を確立するためには、さらなるオートファジー関連分子の解析のみならず、オートファジー活性を修飾する新たな薬剤を用いたオートファジー機構の分子機序解明も必要であると考えられる。【０００５】
【非特許文献１】Klionsky, D.J. (2007). Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 931-937.
【非特許文献２】Maiuri, M.C., Zalckvar, E., Kimchi, A., and Kroemer, G. (2007). Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 741-752.
【非特許文献３】Pattingre, S., Tassa, A., Qu, X., Garuti, R., Liang, X.H., Mizushima, N., Packer, M., Schneider, M.D., and Levine, B. (2005). Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell 122, 927-939.
【非特許文献４】Clarke, P.G. (1990). Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms. Anat Embryol (Berl) 181, 195-213
【非特許文献５】Kondo, Y., and Kondo, S. (2006). Autophagy and cancer therapy. Autophagy 2, 85-90
【非特許文献６】Mizushima, N., and Yoshimori, T. (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3, 542-545
【非特許文献７】Kuma, A., Matsui, M., and Mizushima, N. (2007). LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy 3, 323-328
【非特許文献８】Rubinsztein, D.C., Gestwicki, J.E., Murphy, L.O., and Klionsky, D.J. (2007). Potential therapeutic applications of autophagy. Nat Rev Drug Discov 6, 304-312
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、オートファジー性細胞死を誘導できる薬剤、及びそれを用いた抗腫瘍剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒトNotch-1（Gene ID 4851, Refseq ID NM＿017617）のRBP-jκ-associated molecule (RAM) 領域の部分ペプチドであるRRQHGQLWFPEGF（Ram13：Arg1761〜Phe1774）が、オートファジー性細胞死を誘導できる活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の何れかのペプチド又は薬学的に許容されるその塩を含む、オートファジー性細胞死誘導剤が提供される。
（１）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列において、Trp-Phe-Pro 以外の１から３個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているアミノ酸配列からなり、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するペプチド：又は
（３）上記（１）又は（２）に記載のペプチドに細胞膜透過性ペプチド又は白血病細胞選択的結合ペプチドを直接又はリンカーを介して連結させたペプチド：【０００９】
さらに本発明によれば、以下の何れかのペプチド又は薬学的に許容されるその塩を含む、抗腫瘍剤が提供される。
（１）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列において、Trp-Phe-Pro 以外の１から３個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているアミノ酸配列からなり、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するペプチド：又は
（３）上記（１）又は（２）に記載のペプチドに細胞膜透過性ペプチド又は白血病細胞選択的結合ペプチドを直接又はリンカーを介して連結させたペプチド：【００１０】
好ましくは、細胞膜透過性ペプチドはHIV-1 Tatペプチドであり、白血病細胞選択的結合ペプチドはAla-Cys-Ala-Tyr-His-Arg-Leu-Arg-Arg-Cys（配列番号２）である。
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤は、白血病、悪性リンパ腫、乳癌、前立腺癌、又は神経膠腫の治療又は抑制のために使用される。【００１１】
さらに本発明によれば、以下の何れかのペプチド又は薬学的に許容されるその塩を被験者又は患者に投与することを含む、オートファジー性細胞死を誘導する方法、又は腫瘍を抑制する方法が提供される。
（１）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列において、Trp-Phe-Pro 以外の１から３個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているアミノ酸配列からなり、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するペプチド：又は
（３）上記（１）又は（２）に記載のペプチドに細胞膜透過性ペプチド又は白血病細胞選択的結合ペプチドを直接又はリンカーを介して連結させたペプチド：【００１２】
さらに本発明によれば、オートファジー性細胞死誘導剤又は抗腫瘍剤の製造のための、以下の何れかのペプチド又は薬学的に許容されるその塩の使用が提供される。
（１）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列において、Trp-Phe-Pro 以外の１から３個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているアミノ酸配列からなり、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するペプチド：又は
（３）上記（１）又は（２）に記載のペプチドに細胞膜透過性ペプチド又は白血病細胞選択的結合ペプチドを直接又はリンカーを介して連結させたペプチド：
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、オートファジー性細胞死を誘導できる新規な薬剤を提供することが可能になった。本発明のオートファジー性細胞死誘導剤は、抗腫瘍剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、以下の何れかのペプチド又は薬学的に許容されるその塩を含む、オートファジー性細胞死誘導剤、並びに抗腫瘍剤に関する。
（１）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列において、Trp-Phe-Pro 以外の１から３個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているアミノ酸配列からなり、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するペプチド：又は
（３）上記（１）又は（２）に記載のペプチドに細胞膜透過性ペプチド又は白血病細胞選択的結合ペプチドを直接又はリンカーを介して連結させたペプチド：【００１５】
Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列において、Trp-Phe-Pro 以外の１から３個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているアミノ酸配列からなり、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するペプチドは、当業者であれば適宜製造又は入手することができる。即ち、上記の化学合成又は遺伝子工学的手法により、Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe（配列番号１）又はGly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Ser-Asn-Tyr(配列番号９)で示されるアミノ酸配列において、Trp-Phe-Pro 以外の１から３個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されているアミノ酸配列からなるペプチドを製造し、次いで、当該ペプチドが、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するか否かを、例えば、本願明細書の実施例の（１−３）細胞死の評価、及び（１−６）オートファジー誘導の解析に記載した方法、またはこれに準じた方法により分析することによって、オートファジー性細胞死を誘導する活性を有するペプチドを選択すればよい。【００１６】
本発明では、上記（１）又は（２）に記載のペプチドを用いてもよいし、あるいは上記（１）又は（２）に記載のペプチドに細胞膜透過性ペプチド又は白血病細胞選択的結合ペプチドを直接又はリンカーを介して連結させたペプチドを用いてもよい。細胞膜透過性ペプチドとしては、HIV-1 Tat (Vives, E., Brodin, P., and Lebleu, B. (1997). A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem 272, 16010-16017)、Penetratin: Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys （配列番号６）(Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G., and Prochiantz, A. (1994) The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes., J Biol Chem, 269, 10444-10450)、及びOligo-arginin: Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg （配列番号７）（Futaki, S., Suzuki, T., Ohashi, W., Yagami, T., Tanaka, S., Ueda, K., and Sugiura, Y. (2001) Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery, J Biol Chem, 276, 5836-5840）などを用いることができ、白血病細胞選択的結合ペプチドとしては、Ala-Cys-Ala-Tyr-His-Arg-Leu-Arg-Arg-Cys（Nishimura, S., et al, (2008). Combinatorial targeting of the macropinocytotic pathway in leukemia and lymphoma cells. J Biol Chem, in press）などを用いることができるが、これらに限定されるものでもない。【００１７】
本発明のペプチドの好ましい具体例としては下記を挙げることができる。
Tat-Ram13:
Gly-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe （配列番号３）【００１８】
LCTP1-Ram13:
Ala-Cys-Ala-Tyr-His-Arg-Leu-Arg-Arg-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Gln-His-Gly-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe （配列番号４）
Tat-PLCg1P1：
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro- Ser-Asn-Tyr（配列番号８）【００１９】
本発明のペプチドの入手・製造方法は特に限定されず、化学合成したペプチドでも、遺伝子組み換え技術により作製した、組み換えペプチドの何れでもよい。化学合成ペプチドを入手する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って、本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して、本発明のペプチドを合成することもできる。合成後は、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明で用いるペプチドを精製することができる。本発明のペプチドを組み換え蛋白質として産生するには、該ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを入手し、これを好適な発現系に導入することにより本発明のペプチドを製造することができる。【００２０】
本発明では、上記ペプチドの薬学的に許容される塩を有効成分として用いることもできる。薬学的に許容される塩としては、ナトリウム又はカリウム等のアルカリ金属との塩；カルシウム又はマグネシウム等のアルカリ土類金属との塩；アルミニウム塩又はアンモニウム塩等の無機塩基との塩；トリメチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン又はＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩；塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸又はリン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩；およびタンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の重合酸との塩などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。【００２１】
上記した本発明のペプチドは、オートファジー性細胞死を誘導することによって、抗腫瘍活性を示すことができる。従って、本発明によれば、上記したペプチドを含む、オートファジー性細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤が提供される。【００２２】
本発明の抗腫瘍剤の適用対象となる癌の種類は特に限定されず、例えば、胃癌、大腸癌、食道癌、膵臓癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、メラノーマ（悪性黒色腫）、皮膚癌、骨肉腫、褐色細胞腫、頭頸部癌、脳腫瘍、白血病（慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病など）、悪性リンパ腫、神経膠腫、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、又は軟部組織肉腫などに適用することができる。上記の中でも、好ましくは、本発明の抗腫瘍剤は、白血病、悪性リンパ腫、乳癌、前立腺癌、又は神経膠腫の治療又は抑制のために使用することができる。【００２３】
本発明のオートファジー性細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与等）のいずれの投与経路により投与してもよい。経口投与に適する製剤形態としては、固形又は液体の形態が挙げられ、非経口投与に適する製剤形態としては、注射剤、点滴剤、坐剤、外用剤、点眼剤、点鼻剤等の形態が挙げられる。本発明のオートファジー性細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤は、その製剤形態により必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤が加えられていてもよい。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、着色剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤及び／又は薬学的アジュバント等が挙げられる。【００２４】
経口用の固形製剤形態の本発明のオートファジー性細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤は、例えば、有効成分であるペプチドに賦形剤を加え、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、又は矯味剤などの製剤用添加物を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤として調製することができる。経口用の液体製剤形態の本発明のオートファジー性細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤は、有効成分であるペプチドに矯味剤、安定化剤、又は保存剤など製剤用添加物の１種又は２種以上を加え、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等として調製することができる。【００２５】
本発明のオートファジー性細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤を液体製剤として処方するために使用される溶媒は、水性又は非水性のいずれでもよい。液体製剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、注射剤は、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水等の溶剤に溶解した後、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプル等）に充填することにより調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、又は血清アルブミンを含む生理食塩水等が挙げられる。【００２６】
本発明のオートファジー性細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分として用いる物質の種類等を考慮して、当業者が決定することができる。本発明のオートファジー性細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤の投与量は、例えば、有効成分量として、成人一人当たり、約0.1μg〜約100 mg/kg、好ましくは約1μg〜約10 mgである。本発明のオートファジー性細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤の投与頻度は、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回であればよい。【００２７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１：
（１）材料と方法
（１−１）ペプチド合成
Fmoc chemistryを利用した固相合成によりペプチドを調製した。Fmocアミノ酸誘導体と縮合剤としてHBTU/HOBtを用いて自動ペプチド合成機Pioneer(Applied Biosystems)を用いて合成した後、ペプチドをレジンからトリフルオロ酢酸（TFA）で切り出した。ペプチドは逆層系高速液体クロマトグラフィを用いて、0.1%TFA含有0-50%アセトニトリルで溶出することにより精製を行った（純度＞９５％）。得られた精製画分をマススペクトル解析することで分子量を測定し、目的ペプチドであることを確認した。【００２９】
合成したペプチドの略名とその配列（アミノ酸１文字表記）は以下の通りである。
Tat-Ram13: G-GRKKRRQKRRR-GG-RRQHGQLWFPEGF（配列番号３）
Tat-mRam13: G-GRKKRRQKRRR-GG-RRQHGQLAAAEGF（配列番号５）
LCTP1-Ram13: A-CAYHRLRRC-GG-RRQHGQLWFPEGF（配列番号４）
いずれのペプチドも白色の凍結乾燥粉末として得られ、水溶性であった。【００３０】
（１−２）細胞の培養
白血病細胞株および悪性リンパ腫細胞株は、10% ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むRPMI-1640培地で、付着性の上皮系腫瘍細胞株は、10% FBSを含むDMEM培地中で、37℃、 5% CO2を含む大気下で培養を行った。また、それぞれの培地には、抗生物質として20 U/mL  ペニシリン、20μg/mL  ストレプトマイシンを加えた。用いた細胞は以下のとおりである。
白血病細胞株：CCRF-CEM、 Molt-4、 Jurkat-T、 HPB-ALL、 T-ALL1、 HL-60、 THP-1、 K562
悪性リンパ腫細胞株：U937、 乳がん細胞株：MCF-7、 肺がん細胞株：PC-9、 前立腺がん細胞株：PC-3、 神経膠腫細胞株：DAOY【００３１】
健常人ボランティア末梢血を2.5 mM EDTA、 PBSで２分の１希釈した後、Lympholyte-H (Cedarlane社) またはLymphoprep (Alexis社) を用いた遠心分離によって単核球（リンパ球、単球）を得た。さらに、組織培養用プラスチックディシュへ播種して２時間、 ３７℃でインキュベートし、付着した細胞を単球、浮遊している細胞をT-リンパ球として用いた。単球はさらに5 nM M-CSF（Peprotech社）を含む10％ FBS、RMPI-1640培地で７日間培養を行い、マクロファージへと分化させ、実験に用いた。【００３２】
（１−３）細胞死の評価
Tat-Ram13ペプチドの細胞死誘導効果を、細胞傷害性アッセイとトリパンブルー染色による細胞生存率で評価した。
（１−３−１）細胞傷害性アッセイ
Cell counting kit-8（同仁化学）を用いて以下の通りに行った。対数増殖期の白血病細胞株および悪性リンパ腫細胞株（3x104コ/ウェル）、または上皮系細胞株（5x103コ/ウェル）を96穴マルチプレートに播種した。播種してから12時間後、各種ペプチド（Tat-Ram13、 Tat-mRam13、 LCTP1-Ram13）、etoposide（終濃度 2μM）や溶媒（終濃度0.01%ジメチルスルホキシド）を加えて、37℃、 5% CO2を含む大気中で培養した。所定の時間（24〜48時間）培養後、WST-8試薬を各ウェルに10μLずつ添加し、同様に1〜4時間インキュベートして発色させ、マイクロプレートリーダー（Molecular Device社）を用いて450 nmの吸光度を測定した。溶媒単独添加の吸光度を１００％として、細胞生存率を算定した。【００３３】
各種阻害剤を用いた実験は、CCRF-CEM細胞を用いて行なった。試験を行なう3時間前にカスパーゼ阻害剤zVAD-fmk（50μM）、またはwortmannin（100 nM）を添加し、Tat-Ram13ペプチド（100μM）を加えて24時間インキュベーションを行ない、WST-8試薬により細胞傷害性を評価した。【００３４】
（１−３−２）トリパンブルー染色
Tat-Ram13とetoposideを処理した後に細胞を回収し、トリパンブルー液を加えて細胞を染色した。血球計数盤を用いて、青く染まった細胞を死細胞、染まらなかった細胞を生細胞とし、両細胞数を算定した。細胞生存率は、（生細胞数−死細胞数）／全細胞数ｘ100（％）として求めた。【００３５】
（１−４）Tat-Ram13、およびetoposide処理による細胞形態の変化
CCRF-CEM細胞を3x104コ/100μLになるように計数し、96穴マルチプレートに播種した。各ウェルにそれぞれTat-Ram13およびetoposide（2μM）を加え、37℃、5%CO2を含む大気下で培養を行った。24時間後、各ウェルにHoechst3342（2.5μg/mL）を添加した後、同様に１時間インキュベートした。細胞死を起こした細胞の形態を明視野像として観察する他、蛍光顕微鏡により核形態を観察した。【００３６】
（１−５）アポトーシスの検出
（１−５−１）細胞刺激
各細胞株を1x106コ/1mLとなるように、24穴マルチプレートに播種した。各ウェルにそれぞれ100μM Tat-Ram13、もしくは2μM etoposideを加え、37℃、5% CO2を含む大気下で所定の時間、インキュベートした後、ウェスタンブロット解析に供した。【００３７】
（１−５−２）ウェスタンブロット解析
種々の条件で細胞を処理した後、細胞を冷PBSで洗った後、細胞を回収した。細胞にlysis buffer（1% TritonX-100、 150 mM NaCl、 20 mM Tris-HCl、 TBS、 10 mM NaF、 2 mM Na3VO4、 1mM PMSF、 1μg/mL pepstatin A、 1μg/mL leupeptin、 pH 7.4）を加えて、4℃、１時間インキュベートして可溶化した。遠心を行い、細胞抽出液を得た。タンパク質の定量はBCAタンパク質アッセイキット（Pierce社）を用いて行った。次に、この細胞抽出液（20μg）を還元条件下で変性させ、12%ポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、タンパク質を分離した。SDS-PAGE終了後、セミドライ・ブロッティング装置を用いて、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写した。転写膜を５％ウシ血清アルブミン（BSA）、 TBS（150 mM NaCl、 20 mM Tris、 pH 7.4）で室温、1時間インキュベートしてブロッキングを行った。続いて、TBS、 0.1% Tween20で希釈した抗活性化カスパーゼポリクローナル抗体（Asp175、 Cell Signaling社）とゆるやかに震盪しながら4℃で16時間反応させた。二次抗体反応は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識したヤギ抗体を用いて室温、１時間行った。そして、化学発光基質と室温で5分間反応させた後、冷却型CCDカメラ（LAS1000 plus、富士写真フィルム）を用いて化学発光を検出した。各操作の間の洗浄は、TBS、 0.1% Tween20を用いて5分間震盪を3回行った。【００３８】
（１−６）オートファジー誘導の解析
CCRF-CEM細胞を1x106コ/1 mLとなるように、24穴マルチプレートに播種した。各ウェルにそれぞれ100μM Tat-Ram13、またはTat-mRam13を加えて、37℃、 5% CO2を含む大気下でインキュベートした。LC3の分解阻害を観察するために、リソソームプロテアーゼ阻害剤E64d（ペプチド研）とpepstatin A（ペプチド研）をペプチド添加の４時間前に加えた。所定の時間インキュベートした後、細胞を回収し、ウェスタンブロット解析に供した。一次抗体として、抗LC3Bマウス単クローン抗体（クローン5F10、NanoTools社）を用いて、転写膜と4℃、16時間反応させた。LC3分子の検出は、HRP標識二次抗体と反応させた後、化学発光試薬を用いて行った。オートファジーが誘導されているかは、LC3のI型（18 kDa）とII型（16 kDa）への移行、およびII型の減少で評価した。【００３９】
（２）試験結果
ヒトNotch-1（Gene ID 4851、 Refseq ID NM＿017617）のRBP-jκ-associated molecule (RAM) 領域の部分ペプチドRRQHGQLWFPEGF（Ram13：Arg1761〜Phe1774）(Lubman, O.Y., Ilagan, M.X., Kopan, R., and Barrick, D. (2007). Quantitative dissection of the Notch:CSL interaction: insights into the Notch-mediated transcriptional switch. J Mol Biol 365, 577-589) に細胞膜透過性ペプチドHIV-1 Tat (Vives, E., Brodin, P., and Lebleu, B. (1997). A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem 272, 16010-16017) あるいは白血病細胞選択的結合ペプチドACAYHRLRRC（Nishimura, S., Takahashi, S., Kamikatahira, H., Kuroki, Y., Jaalouk, D.E., O'Brien, S., Koivunen, E., Arap, W., Pasqualini, R., Nakayama, H., Kuniyasu, A. (2008). Combinatorial targeting of the macropinocytotic pathway in leukemia and lymphoma cells. J Biol Chem in press）を連結させたキメラペプチド（Tat-Ram13，LCTP1-Ram13）を設計・合成した。また、Ram13配列中、標的分子CSLとの相互作用に重要なモチーフWFPをAlaに置換したTat-mutated Ram13（Tat-mRam13：RRQHGQLAAAEGF）をコントロールペプチドとした。【００４０】
Tat-Ram13を種々の白血病細胞株に添加し、24時間培養を行い、その抗腫瘍効果を細胞生存率で評価した。その結果、T-ALL1を除く白血病細胞株（CCRF-CEM、 Molt-4、 Jurkat-T、 HPB-ALL、 HL-60、 THP-1、 K562）と悪性リンパ腫細胞株（U937）に細胞死を誘導した（図１）。それに対して、健常者由来のT-リンパ球と単球では生存率を減少させることはなかった（図２）。また、Ala置換体であるTat-mRam13は、いずれの細胞においても生存率に対して影響を示さず、この効果は配列依存的であるといえる（図１、図２）。さらに、上皮系腫瘍細胞株に対するTat-Ram13の効果を調べたところ、その効果は白血病細胞ほどではなかったが、乳がん細胞株MCF-7、前立腺がん細胞PC-3、神経膠腫細胞DAOYで濃度依存的に生存率を低下させ、抗腫瘍効果が確認された（図３）。また、Tatペプチドの代りにCAYHRLRRC（Nishimura et al.、 2008）を連結したLCTP1-Ram13もCCRF-CEM、 Molt-4、 Jurkat-T細胞株に著明な細胞死誘導を示した（図４）。よって、Ram13配列に細胞死誘導活性があると考えられる。【００４１】
次に、Tat-Ram13による細胞傷害性の時間経過を調べた。Tat-Ram13処理後、トリパンブルー染色を用いて細胞生存率を経時的に求めたところ、1時間から既にトリパンブルー陽性の死細胞が観察され、6時間では大部分の細胞が死に至っていることが分かった（図5）。一方、トポイソメラーゼII阻害剤etoposideでは6時間位から細胞死が観察されはじめ、徐々に死細胞の割合が増え、24時間後にTat-Ram13と同じ程度になった。すなわち、Tat-Ram13ではetoposideと比較するとその細胞死誘導は非常に速いことがわかった。【００４２】
そこで、Tat-Ram13によって引きこされる細胞死が典型的な細胞死であるアポトーシスか否かを調べた。CCRF-CEM細胞にTat-Ram13（100μM）およびetoposide（2μM）を添加し、24時間後の細胞形態変化を光学顕微鏡観察とHoechst 33342染色による核染色によって調べた。その結果、etoposideでは、核の断片化と多数のアポトーシス小胞が観察され（矢印）、顕著なアポトーシスが観察された（図６）。これに対しTat-Ram13添加群では、核の萎縮（矢頭）は観察されたが、断片化やアポトーシス小胞は観察されなかった。この結果は、Tat-Ram13による細胞死は、形態学的に見てアポトーシスとは明らかに異なっていることを示している。【００４３】
続いて、Tat-Ram13による細胞死がアポトーシスによるか検討した。Tat-Ram13の処理によってアポトーシスの指標であるcleaved caspase-3が検出されるか調べた。ウェスタンブロット法において、etoposide処理ではcleaved caspase-3が24時間で著明に検出された。しかし、Tat-Ram13処理では細胞死が起こっている3時間でも全く検出されなかった（図７Ａ）。次に、caspase阻害剤zVAD-fmkの影響を調べた結果、etoposideでは著明な生存率の回復がみられたが、Tat-Ram13ではその生存率に回復はみられなかった（図７B）。以上の結果から、CCRF-CEM細胞のTat-Ram13による細胞死では、アポトーシスは起きていないことがわかった。【００４４】
そこで、Tat-Ram13処理において核の萎縮が観察されたことにより、オートファジー性細胞死の可能性を考え、オートファジーが誘導されているか、LC3の挙動をウェスタンブロット法で調べた。CCRF-CEM細胞において、Tat-Ram13処理により速やかにLC3-I型が消失し、LC3-II型が増加した。さらに、LC-II型は時間経過に伴い減少した（図８A）。このLC3-II型の減少は、リソソームプロテアーゼ阻害剤であるE-64d、 pepstatin Aで抑制された（図８C）。これに対して、細胞死を引き起こさないTat-mRam13では、このようなLC3の分子挙動が変化することはなかった（図８B）。これらの結果は、Tat-Ram13により、オートファジー誘導が起こり、その進行に伴いオートリソソームの内側に結合したLC3-II型がリソソームプロテアーゼによって分解されたと考えられる ( Tanida, I., Yamaji, T., Ueno, T., Ishiura, S., Kominami, E., and Hanada, K. (2007). Consideration about negative controls for LC3 and expression vectors for four colored fluorescent protein-LC3 negative controls. Autophagy 4.)。【００４５】
最後に、Tat-Ram13による細胞死がオートファジー性であることを確認するために、クラス3 PI3K 阻害剤wortmanninを用いて調べた。CCRF-CEM細胞を100 nM wortmanninで前処理した後、70 μM Tat-Ram13を添加し、12時間後の細胞生存率を求めた。その結果、wortmanninによりTat-Ram13で誘導される細胞死が40％抑制された（図９A）。【００４６】
（３）考察
Tat-Ram13添加によって速やかにオートファゴソーム形成が観察され、またオートファジー阻害剤により細胞死が抑制されることなどから、この細胞死はオートファジー性であることがわかった。興味深いことに、Tat-Ram13は短時間でオートファジー性細胞死を誘導するという点で、これまでに報告されている誘導剤と異なる特性を有していた。さらに、その細胞死誘導はペプチド配列依存的であった。これらの点から、Tat-Ram13はオートファジー機構の主要な役割を担う分子に直接作用していると想像された。また、Tat-Ram13は健常人末梢血由来の細胞生存率に全く影響を及ぼさなかったことから、腫瘍特異的にオートファジー性細胞死を誘導できることを意味しており、副作用の少ない治療薬の創製に強く結びつくものと期待される。【００４７】
実施例２：
Ram13ペプチドと類似性のある分子をBLAST検索した結果、ヒトphospholipase C gamma 1 (Reference #: P19174 (SwissProt))と相同性が高い領域があることが分かった。Ram13とGln-Leu-Trp-Phe-Proの５つのアミノ酸が同一であったGly-834〜Tyr-845の部分（Gly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro- Ser-Asn-Tyr(配列番号９)）をHIV  Tatと連結させたキメラペプチドTat-PLCg1P1：
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Lys-Lys-Gln-Leu-Trp-Phe-Pro- Ser-Asn-Tyr（配列番号８）
を合成した。このペプチドをJurkat-T細胞株に添加し、WST-8アッセイを行い、細胞傷害性を評価した。その結果、Tat-Ram13とほぼ同等の細胞傷害効果が認められた（図１０）。従って、Gln-Leu-Trp-Phe-Proの配列は、Tat-Ram13による細胞殺傷能に重要である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、Tat-Ram13の抗腫瘍効果を示す。種々の白血病細胞株に対して、Tat-Ram13ペプチドは、一部の細胞株を除きそれらの細胞生存率を濃度依存的かつRam13配列特異的に減少させた。
【図２】図２は、Tat-Ram13の抗腫瘍効果を示す。健常者由来の血球系細胞の細胞生存率対して、Tat-Ram13は影響を与えなかった。
【図３】図３は、Tat-Ram13の抗腫瘍効果を示す。種々の上皮系腫瘍細胞においても、Tat-Ram13ペプチドは細胞生存率を濃度依存的に低下させた。
【図４】図４は、LCTP1-Ram13の細胞死誘導効果を示す。種々の白血病細胞株に対して、LCTP1-Ram13ペプチドも細胞死誘導効果がみられた。
【図５】図５は、Tat-Ram13による細胞傷害性の時間経過を示す。CCRF-CEM細胞において、Tat-Ram13ペプチドの急速な細胞死を引き起こす。
【図６】図６は、Tat-Ram13によって引きこされる細胞死がアポトーシスか否かを調べた結果を示す。Tat-Ram13によるCCRF-CEM細胞死形態は、アポトーシスと異なる
【図７】図７は、Tat-Ram13による細胞死がアポトーシスによるかを調べた結果を示す。Tat-Ram13によるCCRF-CEM細胞の細胞死は、caspase-3の活性化を伴わないことからアポトーシスではないといえる。
【図８】図８は、Tat-Ram13処理によりオートファジーが誘導されているかどうかを調べた結果を示す。CCRF-CEM細胞において、Tat-Ram13の添加によりオートファジーマーカーLC3の分子挙動を変化させ、著明なII型の減少がみられたことから、オートファジー誘導を引き起こしている。
【図９】図９は、Tat-Ram13による細胞死がオートファジー性であることを確認するために、クラス3 PI3K 阻害剤wortmanninを用いて調べた結果を示す。Tat-Ram13によるCCRF-CEM細胞の細胞死は、オートファジー阻害剤のひとつwortmanninで抑制がみられたことからオートファジー性である。
【図１０】図１０は、Tat-PLCg1P1の細胞傷害性を評価した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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