(57)【要約】  本発明は、病原性細菌の感染の有無を調べる遺伝子検査において、細胞の単離または核酸の抽出・精製工程を、安全で、簡便で、効率的で、かつ高収率に行うための固体支持体を提供することを目的とする。上記目的を達成するための本発明の細胞結合用固体支持体は、ミコール酸含有糖脂質との結合能を有するポリペプチドが、担体表面に固定化されてなる。また、上記目的を達成するための本発明の核酸結合用固体支持体は、核酸との結合能を有するポリペプチドが、担体表面に固定化されてなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミコール酸含有糖脂質との結合能を有するポリペプチドが、担体表面に固定化されてなる、固体支持体。
【請求項２】
前記担体が、磁性担体であることを特徴とする、請求項１に記載の固体支持体。
【請求項３】
核酸との結合能を有するポリペプチドが、担体表面に固定化されてなる、固体支持体。
【請求項４】
前記担体が、磁性担体であることを特徴とする、請求項３に記載の固体支持体。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ミコール酸含有糖脂質および核酸との結合能を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、ＭＤＰ１またはＭＤＰ１を構成するアミノ酸の少なくとも１つが置換、付加、もしくは欠失したポリペプチドであることを特徴とする、請求項５に記載の固体支持体。
【請求項７】
請求項１、２、５、および６のいずれか１項に記載の固体支持体と、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細菌細胞を含む試料とを接触させる段階を含むことを特徴とする、細胞の単離方法。
【請求項８】
前記固体支持体に含まれる担体が磁性担体である場合、磁気作用を利用して固液分離を行うことをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の細胞の単離方法。
【請求項９】
前記細菌細胞が、結核菌細胞であることを特徴とする、請求項７または８に記載の細胞の単離方法。
【請求項１０】
請求項１、２、５、および６のいずれか１項に記載の固体支持体と、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細菌細胞を含む試料とを接触させて細胞を単離する段階および単離した細胞内の核酸を抽出する段階とを含むことを特徴とする、核酸の抽出方法。
【請求項１１】
前記固体支持体に含まれる担体が磁性担体である場合、磁気作用を利用して固液分離を行う段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸の抽出方法。
【請求項１２】
前記核酸を抽出する段階が、加熱、超音波照射、または化学的処理により細胞を溶解して核酸を遊離させる工程を含むことを特徴とする、請求項１０または１１のいずれか１項に記載の核酸の抽出方法。
【請求項１３】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の固体支持体と、核酸を含む試料とを接触させる段階を含むことを特徴とする、核酸の単離方法。
【請求項１４】
前記固体支持体に含まれる担体が磁性担体である場合、磁気作用を利用して固液分離を行う段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の核酸の単離方法。
【請求項１５】
前記核酸が、ＧＣリッチな配列を有することを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の、核酸の単離方法。
【請求項１６】
請求項１、２、５、および６のいずれか１項に記載の固体支持体と、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細菌細胞を含む試料とを接触させて細胞を単離する段階、単離した細胞内の核酸を抽出する段階、および抽出した核酸を含む試料と、請求項３〜６のいずれか１項に記載の固体支持体とを接触させる段階を含むことを特徴とする、核酸の単離方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の固体支持体を含むことを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体に関する。より詳しくは、本発明は、担体表面にポリペプチドが固定化されてなる固体支持体に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性細菌の感染の有無を調べる遺伝子検査は、患者より採取した臨床検体中に該病原性細菌の核酸が存在するか否かを判別することにより行われる。その検査工程は、主として（１）病原性細菌の集菌（細胞の単離）、（２）溶菌（核酸の抽出・精製）、（３）遺伝子増幅・検出の３過程よりなる。それぞれの工程における病原性細菌細胞および／または核酸の収率が、検査の感度・精度に大きく影響する。【０００３】
上記（１）病原性細菌の集菌の工程において、病原性細菌として例えば結核菌を集菌する場合には、従来、高速遠心分離操作によって該細菌の集菌が行われていた。しかしながら、高速遠心分離操作は以下のような問題点を有することが知られている。第一に、高速遠心分離操作によると、エアロゾルが発生しやすく、また、試料容器の開閉作業を伴う。このため、検体間でクロスコンタミネーションが起こる可能性があり、加えて、作業者の接触感染や環境汚染などのバイオハザードが懸念される。第二に、高速遠心分離機という比較的大型の独立した装置が必要であることから、上記一連の検査工程を連続的に自動化することが困難である。第三に、回収効率を高くするためには、高速遠心分離に長時間を要する。【０００４】
このような高速遠心分離操作に代わる方法として、結核菌などの病原性細菌を安全かつ簡便に、短時間で単離するための、多糖類をリガンドとした固体支持体を用いた集菌技術が開発されている。特に、支持体（担体）に磁性粒子を用いた場合には、磁気作用を利用した固液分離により容易に集菌することができうる、としている（特表２００３−５２００４８号公報）。【０００５】
また、上記（２）溶菌（核酸の抽出・精製）工程においては、工程（１）などで集菌した細菌細胞を適当な方法により溶菌した後、酵素、それ以外のタンパク質、多糖類、および脂質などの核酸増幅反応の阻害物質やその他の汚染物質を含む試料から、核酸を抽出・精製する必要がある。核酸を含む試料から核酸を抽出する方法としては、例えば、フェノール／クロロホルム抽出法などが従来から汎用されている。その後の、フェノール／クロロホルム抽出溶液から核酸を回収する方法としては、エタノール沈殿法が用いられている。【０００６】
さらに、抽出した核酸を精製する方法としては、核酸を二酸化ケイ素、シリカポリマー、ケイ酸マグネシウムなどの吸着媒体表面に吸着させ、これを洗浄した後、核酸を脱離させるなどの操作によって精製する方法がある（例えば、特公平７−５１０６５号公報および特開２００４−３４０８３９号公報参照）。該方法は、吸着媒体の分離性能は優れているものの、同一性能の吸着媒体を工業的に大量生産することが困難なことや、吸着媒体の取扱いが不便であるために種々の形状に加工することが難しいといった問題点を有していた。そこで、上記のケイ素酸化物系の吸着媒体に代わって、アセチルセルロースの表面ケン化物（表面にヒドロキシ基を有する有機高分子）からなる固相に核酸を脱着させる工程を含む、核酸の分離精製方法が開発された。該技術によると、アセチルセルロースの表面ケン化物はケイ素酸化物系の吸着媒体に比べて、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、加工が容易であり、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産できる、としている（特開２００３−１２８６９１号公報）。しかし、上記のいずれの方法においても、吸着媒体に核酸を捕捉する際に、過塩素酸などのカオトロピック剤を使用することが必要であり、さらに、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することや、得られた核酸混合液中に塩が存在することを要するといった問題点があった。核酸吸着能を有する多孔質担体（ガラス繊維、セルロース繊維、およびヒドロキシアパタイトなど）を用いることで、カオトロピック剤などの危険な試薬の使用を回避する方法も開発されているが（特開２００５−８０５５５号公報）、該方法は乾燥工程を含むので、操作が煩雑であり、また大掛かりな装置を必要とした。一方で、近年、組織から核酸を抽出し、オリゴｄＴ配列を固定化した担体を用いることによりｍＲＮＡなどを回収する方法が開発されている（特表２００６−５０６０８９号公報）。【０００７】
上記の病原性細菌からの核酸の単離技術とは別に、病原性抗酸菌に対して免疫原性を有するポリペプチドであるＭＤＰ１（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、および該ＭＤＰ１のワクチンまたは治療剤への利用が開示されている（特開２０００−２１９６９９号公報）。
【発明の開示】
【０００８】
しかしながら、特表２００３−５２００４８号公報に記載の固体支持体による集菌は、細菌の細胞壁に存在するタンパク質と担体に固定化された多糖類との非特異的な相互作用を利用しているために、高速遠心分離法と比べると、その効率が低いという問題点を有しており、特定の細菌細胞を高収率で集菌することが困難であった。また、核酸の精製方法においても、操作の煩雑さや、所望の収率を得られないという問題点を有していた。このような背景から、病原性細菌の感染の有無を調べる遺伝子検査における、集菌または核酸の抽出・精製工程の更なる改善が求められていた
そこで、本発明は、病原性細菌の感染の有無を調べる遺伝子検査において、細胞の単離集菌または核酸の抽出・精製工程を、安全で、簡便で、効率的で、かつ高収率に行うための固体支持体を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明者らは上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、病原性細菌の細胞壁に含まれるミコール酸含有糖脂質または核酸との結合能を有するポリペプチドを固定化した固体支持体を用いることによって、遺伝子検査における細胞の単離または核酸の抽出・精製工程が、安全で、簡便で、効率的で、かつ高収率で行えることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、上記目的を達成するための本発明の固体支持体は、ミコール酸含有糖脂質との結合能を有するポリペプチドが、担体表面に固定化されてなる。
【００１１】
また、上記目的を達成するための本発明の他の固体支持体は、核酸との結合能を有するポリペプチドが、担体表面に固定化されてなる。
【００１２】
本発明の固体支持体によれば、臨床検体から、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する病原性細菌の単離を、安全で、簡便で、効率的で、かつ高収率で行うことができる。つまり、従来のように、コンタミネーションやバイオハザードの虞もなく、煩雑な操作も要せずに、高感度・高精度の検査が可能となる。
【００１３】
また、本発明の他の固体支持体によれば、核酸の抽出・精製を、安全で、簡便で、効率的で、かつ高収率で行うことができる。つまり、従来のように、カオトロピック試薬や有機溶媒などの危険な試薬を用いることないので、その精製工程全体を通じて安全であり、単離される核酸の変性も実質的にない。さらに、遠心分離・ろ過・減圧処置といった操作を行うことなく、高感度・高精度の検査が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の好ましい実施の形態を詳細に説明する。【００１５】
［固体支持体］
本発明の一実施形態に係る固体支持体は、ミコール酸含有糖脂質との結合能を有するポリペプチドが、担体表面に固定化されてなる。該固体支持体（以下、「細胞結合用固体支持体」とも称する）によると、細菌細胞の細胞壁に存在するミコール酸含有糖脂質と固体支持体の担体表面に固定化されたポリペプチドとが結合し、細菌細胞が結合した固体支持体を得ることができる。この細菌細胞が結合した固体支持体を試料中から回収することによって、細胞を単離することができる。そして、細胞を単離した後に、固体支持体に結合した細菌細胞を溶菌処理して核酸を遊離させ、固体支持体に結合した細菌の細胞壁を取り除くことによって、核酸を抽出することができる。【００１６】
また、本発明の他の実施形態に係る固体支持体は、核酸との結合能を有するポリペプチドが、担体表面に固定化されてなる。該固体支持体（以下、「核酸結合用固体支持体」とも称する）によると、核酸と固体支持体の担体表面に固定化されたポリペプチドとが結合し、核酸が結合した固体支持体を得られる。この核酸が結合した固体支持体を試料中から回収することによって、高純度の核酸を得ることができる。【００１７】
（ポリペプチド）
上記細胞結合用固体支持体におけるポリペプチドは、ミコール酸含有糖脂質との結合能を有する。本明細書において、「ポリペプチド」とは、アミノ酸がペプチド結合により重合したポリマー分子であって、高次構造を有するタンパク質及び修飾タンパク質も含む。また、本明細書において、「結合」とは、イオン結合、および水素結合などの他、双極子間相互作用、ファンデルワールス力、および疎水性相互作用などの分子間相互作用による付着・吸着なども含む。該ポリペプチドは、ミコール酸含有糖脂質との結合能を有するものであれば、特に制限なく用いることができる。ミコール酸含有糖脂質はマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属：抗酸菌属）やその近縁菌であるノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ属）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属）などの細胞壁に含まれる糖脂質であり、一般に種々の分子量を持つ類似体の混合物の状態で存在する。マイコバクテリウム（抗酸菌）属には、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）などの病原性を有する細胞内寄生菌が含まれており、増殖が極めて緩慢なため、細胞内寄生を可能にし、また薬剤に対する抵抗性が獲得される。ミコール酸含有糖脂質としては、例えば、アビミコール酸Ｉ、ホミノミコール酸Ｉ、ミコール酸ＩＩａ、ミコール酸ＩＩｂ、ミコール酸ＩＩＩａ、ミコール酸ＩＩＩｂ、コリノミコール酸、トレハロース−６−モノミコレート、トレハロース−６，６’−ジミコレート、およびメロミコール酸などが知られている。このうち、トレハロース６，６’−ジミコレートは、トレハロースの６，６’位にミコール酸が２分子、エステル結合した抗酸菌に特異的な糖脂質であり、マイコバクテリウムの細胞壁を特徴づける主要糖脂質である。【００１８】
上記核酸結合用固体支持体におけるポリペプチドは、トレハロース６，６’−ジミコレートなどのミコール酸含有糖脂質と結合していない場合は、核酸との結合能を有する。すなわち、該ポリペプチドは、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用といった非共有的相互作用を介して、高いアフィニティで核酸と結合する。本明細書において、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および修飾核酸塩基を含むポリヌクレオチドを意味し、一本鎖または二本鎖を問わず、それらのポリペプチドの組み合わせ（部分的なｄｓまたはｓｓ）であってもよく、さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）なども含まれる。核酸結合能を有するポリペプチドは、核酸を可逆的に結合・解離することができる既知のものであれば特に限定されず、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質などの公知の核酸結合タンパク質を適宜採用することができる。使用される核酸結合タンパク質としては、例えば、ヒストン系タンパク質（またはヒストン様のタンパク質）、転写因子、遺伝子修復タンパク質（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、Ｋｕタンパク質など）、リボソームタンパク質などが総称的に挙げられる。ＤＮＡに結合して転写の開始、伸長、終結などの転写調節に関わる転写因子の種類は、５０種類以上を超えている。ＤＮＡ結合タンパク質として具体的には公知のλファージ転写因子ｃｒｏタンパク質、ＡＴＦ２、ｃ−Ｆｏｓ、ＤＰ−１、ｃ−Ｍｙｂ、ｃ／ＥＢＰ、ＣＲＥＢ、ＦｏｓＢ、Ｅ２Ｆ−１、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｇｒ−１、ｃ−Ｊｕｎ、Ｅ２Ｆ−２、Ｉｎｆｌ  １、Ｉｎｆｌ  ２、Ｏｎｃ  １、Ｏｎｃ  ２、Ｏｎｃ  ３、Ｍａｘ、ＨＩＦ−１α、ｃ−Ｒｅｌ、ＪｕｎＤ、Ｒｂ、ＵＳＦ１、ＨＩＦ−１β、ＮＦκＢ  ｐ５０、Ｓｐ−１、ｐ１０７、ＵＳＦ２、Ｏｃｔ  Ｉ、ＮＦκＢ  ｐ６５、  ＳＴＡＴ１、Ｓｐ−１、ｐ５３、Ｏｃｔ  ＩＩなどが挙げられる。なお、ここでいう「ＤＮＡ結合タンパク質」とは、生理的意義が知られた狭義の「ＤＮＡ結合タンパク質」に限定されるものではなく、細胞の核物質中でＤＮＡ分子上の特定部位に特異的に結合し、あるいはＤＮＡと特異的に直接相互作用することでＤＮＡの機能に影響を及ぼすタンパク質を意味する。これらは、遺伝子発現を起動する転写因子、特化された機能を付与するステロイドホルモン受容体、およびゲノムの完全性を維持するＤＮＡ修復タンパク質として、正常細胞の活性において中心的役割を果たしている。また、ＲＮＡ結合タンパク質としては、ＤＲＢＰ（ｄｓＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）などがあり、例えば、ＤＲＢＰ７６、ＰＡＣＴ、ＲＡＸなどが挙げられる。本発明において上記「核酸結合タンパク質」は、どのように調製されたものでもよい。例えばそのタンパク質をコードする遺伝子を用いて、公知の遺伝子工学的手法により試験管内で発現させた遺伝子組換え体であってもよい。あるいは該タンパク質を含む分画を生体や細胞から抽出してもよい。またタンパク質、ペプチドライブラリーから得られるサンプルを使用してもよい。核酸結合能を有するポリペプチドは、上記「核酸結合タンパク質」を化学修飾、部分切断（プロテアーゼ部分消化、ブロムシアン開裂、ジスルフヒドリル基還元など）などによって得られ、核酸結合能を保持��ているポリペプチドも含む。【００１９】
本発明の細胞結合用固体支持体または核酸結合用固体支持体に用いるポリペプチドは、ミコール酸含有糖脂質および核酸の両方との結合能を有することが好ましい。かようなポリペプチドを用いることによって、遺伝子検査における病原性細菌細胞の単離および該細菌中の核酸の抽出・精製を１種の固体支持体で行うことが可能となる。該ポリペプチドとしては、ミコール酸含有糖脂質および核酸の両方と結合することができるポリペプチドであれば、特に制限なく用いることができる。かようなポリペプチドとしては、例えば、マイコバクテリウム属に属するＢＣＧ東京株から分離されたＭＤＰ１（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）が挙げられる。【００２０】
ＭＤＰ１は、抗酸菌に特異的なヒストン様タンパク質であり、核酸コンフォーメーションを認識してＤＮＡ、ＲＮＡ両方に結合することができる。またＭＤＰ１は、遺伝子の発現制御に関与して抗酸菌の遅発育性の原因となるとの報告がある（特開２０００−２１９６９９号公報）。結核菌などの細胞壁には、ＭＤＰ１が存在することが知られ、これはグリコサミノグリカンと強力に相互作用する。さらに本発明者らの研究から、結核菌細胞壁成分のミコール酸含有糖脂質と遊離状態のＭＤＰ１とが強い相互作用をすること、ならびに細胞壁においてもミコール酸含有糖脂質とＭＤＰ１とが実際に結合している可能性が示された。ＭＤＰ１は、ＢＣＧ東京株から得ることができるが、該株に限定されず、ＢＣＧ東京株以外のＢＣＧ株、結核菌などのマイコバクテリウム属の菌から分離精製することによっても得られる。【００２１】
ＭＤＰ１は、２０５個のアミノ酸を有するポリペプチドであるが、ＭＤＰ１の１個または複数個、好ましくは１個〜数個のアミノ酸が特定の位置またはランダムに置換、付加もしくは欠失したポリペプチドであってもよい（本明細書では、これらも「ＭＤＰ１」として言及する）。「１個〜数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個程度を意味する。ここでアミノ酸残基の修飾である「置換」、「付加」、「欠失」は、通常の意味であり、ＭＤＰ１の機能を保持する修飾が許容される。アミノ酸の置換、欠失および／または付加といった変異を導入するには、例えば部位特異的突然変異／ＰＣＲ法などの周知の技術（Ｓ．Ｎ．Ｈｏら、Ｇｅｎｅ  ７７、５１（１９８９）；西郷薫と佐野弓子共訳、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓコンパクト版、分子生物学実験プロトコールＩ、１９９７年６月、丸善）を用いることによって可能である。【００２２】
上記ＭＤＰ１として、６×ヒスチジン融合タンパク質、ＧＳＴ融合タンパク質といった組換えタンパク質の態様が好適に用いられる。このような組換えタンパク質を作製する場合には、まず該タンパク質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。ＭＤＰ１をコードするＤＮＡの入手、その塩基配列などについては特開２０００−２１９６９９号公報に記載されている。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、組換えタンパク質として発現させ、これを抽出しアフィニティクロマトグラフィーによって分離することができる。例えば、ＭＤＰ１をコードするＤＮＡを適当なベクター、例えば、ｐＱＥ３０、ｐＧＥＸなどに組み込み、これを大腸菌、ＢＣＧなどの細菌、酵母などの細胞に導入して形質転換体として培養することによって所望のポリペプチドが産生される（特開２０００−２１９６９９号公報）。【００２３】
ＭＤＰ１は、グアニン（Ｇ）あるいはシトシン（Ｃ）の認識を通じた核酸結合活性をもっている。その結果、核酸は、その配列中に含まれるＧあるいはＣを介して本発明の固定化支持体表面のＭＤＰ１結合することとなる。肝要なことは、ＭＤＰ１がＧ、Ｃ塩基を認識することで、ＧＣリッチな核酸を特異的に捕捉することに優れることである
（担体）
本発明において担体は、上記ポリペプチドを固定化するための基材の役割を果たす。以下、担体の好ましい形態を説明するが、以下の形態は、上述の細胞結合用および核酸結合用のいずれの固体支持体においても特に制限なく採用することができる。担体は、細菌細胞の単離および核酸の抽出・精製工程において固液分離による分離を行うことから、水不溶性の材料からなることが好ましい。ここでいう水不溶性とは、具体的に水、他のいかなる水溶液にも溶解しないことを意味する。担体は、固定、分離などの用途に現在広く使用され、提案されている公知の担体（支持体）またはマトリックスのいずれであってもよい。【００２４】
担体に用いられる材料としては、例えば、無機化合物、金属、金属酸化物、有機化合物またはこれらを組み合わせた複合材料を含む。担体は、抗酸性細菌細胞を結合させ得るものであれば、材質、形状、サイズは特に限定されない。好ましいものは、細胞の結合または核酸の結合のために高い表面積を与える材料である。【００２５】
担体に用いられる具体的な材料としては、特に限定されるものではないが、一般にポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリアミド、ラテックスといった有機ポリマーなどの高分子材料、ガラス、シリカ、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化ナトリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛などの無機物またはステンレス、ジルコニアなどの金属が挙げられる。これらのうち、ガラス、シリカ、ラテックス、または高分子材料が好ましく、なかでも有機ポリマー、特にポリスチレンが好ましい。これらの材料は一般に多孔性を有するなど不規則な表面を持ち、また、粒子、繊維、ウェブ、または焼結体などの様々な形態に加工することが可能である。【００２６】
担体は、全体が同一の材料から構成されている場合の他に、必要に応じて複数の素材から構成されるハイブリッド体であってもよい。例えば、分析の自動化に対応するために、コア部分は酸化鉄、または酸化クロムのような磁気応答性材料で作られ、その表面を有機ポリマーで被覆された粒子が挙げられる。かような磁気応答性材料を含む担体を、本明細書においては、「磁性担体」とも称する。また、磁性担体を担体として用いた固体支持体を、以下、「磁性固体支持体」とも称する。【００２７】
細胞を結合させた磁性担体を含む固体支持体を、試料液から磁石の磁力によって容易に（固液）分離・固体支持体の回収をすることができる点で、その磁性担体が常磁性体、強常磁性体および強磁性体などの磁性体が含有されてなるものであることが好ましく、常磁性体および強常磁性体の両方またはいずれか一方が含有されてなることがより好ましい。特に、残留磁化がないかまたは少ない点で、強常磁性体を用いることが好ましい。【００２８】
かかる磁性体の具体例としては、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンを含む各種合金を挙げることができ、これらのうち、四三酸化鉄が特に好ましい。また、コバルト、ニッケルはヒスチジンタグと親和性を有するという点において好ましい。【００２９】
本発明において用いられる磁性担体は、優れた磁気分離性（すなわち磁気によって短時間で分離する性能）を有し、かつ、ゆるい上下振盪の操作によって再分散し得るものであることが好ましい。【００３０】
磁性担体における磁性体の含有割合は、非磁性体の含有割合が３０質量％以上であることから、７０質量％以下とされるが、好ましくは２０〜７０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％である。磁性体の含有割合が２０質量％未満であると、充分な磁気応答性が発現されず、所要の磁力によって短時間で固体支持体を分離することが困難となることがある。一方、この割合が７０質量％を超えると、担体表面に露出する磁性体の量が多くなるため、該磁性体の構成成分、例えば鉄イオンの溶出などが生じ、使用時に他の材料に悪影響を及ぼすことがあり、また、担体が脆くなって実用的な強度が得られないことがある。【００３１】
従来からも、磁性担体を含む固体支持体を用いた細胞分離法（特表２００３−５２００４８号公報）が開発されているが、これらの固体支持体は、細菌の細胞壁のタンパク質と非特異的に結合する糖をリガンドとして用いていたために、細菌細胞の中には、該固体支持体に付着しない細菌もあった。たとえ、付着する場合であっても、非特異的な結合であっては、目的とする細菌細胞だけを効率よくその表面上に集積することは非常に困難であった。本発明ではミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する病原性抗酸菌（特に結核菌）を確実に単離するため、担体（好ましくは磁気担体）の表面にミコール酸含有糖脂質と結合能を有する基として、ＭＤＰ１を支持体表面に結合（好ましくは共有結合）させている。その固定化量は、支持体材料、固定化方法、必要とする核酸回収量などに基づいて適宜設定される。【００３２】
また、固体支持体として磁性支持体を用いる核酸精製法も、これまでに多数、開発されている。例えば、有毒な溶媒を使用しない分離方法として、カオトロピック試薬を利用してタンパク質、脂質などの夾雑物を水相に可溶化し、核酸をシリカビーズに吸着させて固相で回収した後、その核酸を再び水相に溶解するＢｏｏｍ法（Ｂｏｏｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第２８巻、第４９５〜５０３頁（１９９０））がある。この方法では、過塩素酸などのカオトロピックイオンが必要とされる。したがって抽出された核酸は、短く断片化されているものが多い。本発明の好ましい実施形態では、そのような過酷な試薬を用いない生理的条件下で、磁気ビーズなどの磁気粒子を用いた磁性固体支持体への核酸の結合を促進するため、核酸に対して親和性を有する基として、ＭＤＰ１を担体表面に固定化（好ましくは共有結合）させ、固定化されたＭＤＰ１を介して結合させている。そのＭＤＰ１の固定化量は、担体材料、固定化方法、必要とする核酸回収量などに基づいて適宜設定される。好ましい態様として、特にヒスチジンタグを付した組換えＭＤＰ１（ｒＭＤＰ１）の調製を、遺伝子工学技術に基づいて行うことができ、磁気ビーズ表面上への固定化は、ヒスチジンタグを介して磁気ビーズ上の活性化基への共有結合の形成による。【００３３】
本発明の固体支持体に用いられる担体の形状としては、特に限定されるものではないが、粒状、棒状、板状、シート、ゲル、膜、繊維、毛細管、ストリップ、フィルターなどが挙げられ、好ましくは粒状である。粒状担体、例えばビーズは、結合能力が大きいために一般に好ましく、特にポリマーのビーズが好ましい。【００３４】
本発明の固体支持体に用いられる担体は粒子状であることが好ましく、粒子状の形態としては、例えば球形、楕円体形、錐体、立方形、直方体形などが考えられる。このうち球形粒子の担体は製造がしやすく、各種精製工程において、固体支持体の回転撹拌がしやすいことからも好ましい。細胞を結合させる固体支持体としての担体のサイズは、平均粒子径として０．５〜１０μｍ、好ましくは２〜６μｍであることが好ましい。平均粒子径が０．５μｍ未満である場合、該担体が上述のように磁性体を含有してなるものは、充分な磁気応答性を発現せず、該担体を含む固体支持体を分離するために相当に長い時間を要し、また、分離するために相当に大きい磁力が必要となる。一方、平均粒子径が１０μｍを超える場合には、該担体が水性媒体中で沈降しやすいものとなるため、細胞を捕捉する際に水性媒体中を撹拌する操作が必要となる。また、担体の質量当たりの表面積が小さくなるため、充分な量の細胞を捕捉することが困難となることがある。なお、本明細書中において、「粒子径」とは、粒子の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の距離Ｌを意味する。また、「平均粒子径」の値としては、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）や透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）等の観察手段を用い、数〜数十視野中に観察される粒子の粒子径の平均値として算出される値を採用するものとする。【００３５】
本発明の固体支持体は、上記ポリペプチドを上記担体の表面に固定化することによって製造できる。固定化の方法は、従来公知の技術を適用することによる。固体支持体の好ましい形態のうち、ポリペプチドとしてＭＤＰ１を用い、担体として磁気ビーズを用いる場合においては、例えば、磁気ビーズのトシル基に、ヒスチジンタグを介してペプチドを共有結合させることにより固定化させる。磁気ビーズのコバルトあるいはニッケルと、ヒスチジンタグとを配位結合させて固定化することもできる。または磁気ビーズのトシル基あるいはエポキシ基にポリペプチドのアミノ基を共有結合させることで固定化してもよい。水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下、該ポリペプチド分子のアミノ基を支持体表面に露出するカルボキシル基（アンカーされた無水マレイン酸など）に反応させてアミド結合を形成することにより該ポリペプチドを固定化することができる。ポリスチレンにアンカーされた活性マレイミド基とタンパク質のスルフヒドリル基とのチオエーテル結合形成でもよい。あるいはポリスチレン系のラテックス粒子に該ポリペプチドを物理的に吸着させる方法でもよい。なお、担体上に固定化するポリペプチド量やポリペプチドの種類を当業者が選択することによって、固体支持体に結合させる細胞または核酸の量や特異性を適宜変更することができる。【００３６】
［細胞の単離方法］
本発明の細胞の単離方法は、上記細胞結合用固体支持体と、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細菌細胞を含む試料とを接触させる段階を含むことを特徴とする。本発明の細胞の単離方法によると、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細胞を単離することができる。細胞は、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細胞であれば特に制限はないが、例えば、病原性抗酸菌細胞であることが好ましい。「病原性抗酸菌」（以下、単に「抗酸菌」とも称する）は、抗酸菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）に属するグラム陽性菌で病原性を有する細菌である。特にマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）に属する微生物細胞の単離に好適である。結核菌群およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ（らい菌）以外の培養可能な抗酸菌は、非定型抗酸菌（ａｔｙｐｉｃａｌ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）と呼ばれることもある。【００３７】
抗酸菌のうち、本発明では特に結核菌群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、すなわち結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ヒト型結核菌）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ、ウシ型菌、ウシ菌）、マイコバクテリウム・アフリカンス（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｓ）、ネズミ型結核菌（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の４菌種を対象とする。いずれも遅発育菌群であり、またその遺伝子も極めて類似しているため、遺伝学上は区別できない。これら以外にもエム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、疫学的および臨床的観点から重要である。【００３８】
本発明の細胞の単離方法は、試料液中に含まれる病原性細菌、例えば、病原性抗酸菌細胞を、上記の固体支持体、好ましくは磁気ビーズなどの磁性担体を含む磁性固体支持体に結合させ、該細胞を試料液、不純物から分離して病原性抗酸菌細胞を単離するものである。【００３９】
試料は、上記細菌細胞を含有する生体由来の試料であれば、特に制限はないが、生物由来の検体、培養液もしくは細胞含有溶液が該当する。生物由来の検体としては、例えば全血、血漿、血清、バフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰、脳脊髄液、精液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養液（例えば、細菌培養物等）もしくは細胞含有溶液など生体由来のほとんどの試料が該当する。試料の形態は、好ましくは流体の試料であり、通常は溶液もしくは懸濁液などの液体である。【００４０】
本方法におけるその具体的な操作手順は、上記固体支持体として磁性固体支持体を使用する次の態様が例示されるが、これに限定されるものではない。細胞含有試料と磁性担体（好ましくは磁性ビーズ）を含む磁性固体支持体とを混ぜて撹拌し、試料液中の病原性抗酸菌細胞を、その磁性担体表面に固定化されたポリペプチド（好ましくはＭＤＰ１）に結合させる。その際、磁性固体支持体への該細胞の結合を促進するために、適当な結合バッファーを使用してもよい。上記磁性固体支持体を試料液から固液分離すれば、試料中に含まれる不純物、不要物などが分離除去され、病原性抗酸菌細胞が表面に固定化されたポリペプチドに結合した磁性固体支持体が得られる。【００４１】
次いで、該磁性固体支持体を洗浄バッファーとともに撹拌し、洗浄する操作、引き続いて再び固液分離操作をすることにより、磁性固体支持体に付着する不純物をさらに除去することが好ましい。このように本発明の方法において固液分離の過程が含まれる。その際の固液分離の方法については特に制限はないが、例えば、遠心分離操作や、磁気作用を利用した方法が挙げられ、磁気作用により行われることが好ましい。より好ましくは、その磁性固体支持体を含む容器に外部磁石による磁気を作用させることにより、完全閉鎖系で固液分離が実施される。該方法によれば、操作は遠心分離操作よりも簡便で、コンタミネーションの虞もない。【００４２】
固体支持体が磁気ビーズを用いた磁性固体支持体である場合、磁性固体支持体を試料液と混合する前、混合した後、磁性固体支持体の洗浄時のうち、少なくともいずれかの段階において懸濁させることが好ましい。このように懸濁させる意義は、次の通りである。混合する前においては、磁性固体支持体は、保存中に担体である磁気ビーズ同士の磁力作用で凝集してしまう。そこで懸濁によって磁性固体支持体を分散させると、試料液と混合する際に磁性固体支持体と細胞との接触表面積、接触回数が増大する。試料と混合した後にも懸濁状態を保つと、懸濁によって試料液中で磁性固体支持体が分散し、磁性固体支持体と細胞との接触表面積、接触回数が増える。また洗浄時にあっては、懸濁によって洗浄バッファー中で磁性固体支持体が分散し、洗浄バッファーの洗浄有効物質と磁性固体支持体中の磁気ビーズ（その表面に細胞が付着している）との接触表面積、接触回数が増える。これらの効果によって、それぞれの段階で試料液から細胞、核酸を分離し、回収できる量と純度の向上が期待される。【００４３】
［核酸の抽出方法］
本発明の核酸の抽出方法は、上記細胞結合用固体支持体と、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細菌細胞を含む試料とを接触させて細胞を単離する段階および単離した細胞内の核酸を抽出する段階とを含むことを特徴とする。【００４４】
本方法における、上記固体支持体と、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細菌細胞を含む試料とを接触させて細胞を単離する段階は、上述の細胞の単離方法で用いた方法と同様の方法を用いることができるので、ここでは説明を省略する。その後の、単離した細胞内の核酸を抽出する段階は、細菌細胞を固体支持体に結合させた状態で、超音波処理、加熱、または化学試薬処理などによりその細胞壁および細胞膜や核膜などの生体膜を破壊（溶菌）して核酸を細胞外に放出させ、細胞壁が結合した固体支持体を取り除き、残りの溶液を核酸溶液として分離回収するものである。この方法ではろ過、減圧処置といった操作を含まず、簡便かつ迅速に核酸を単離することができる。さらに、磁性支持体を用いた場合は遠心分離操作を行わずに固液分離が可能である。【００４５】
前記の細胞壁および生体膜の破壊は、公知の様々な物理的方法または化学的方法を用いることができる。物理的方法には、超音波照射法、凍結・溶融法、加熱法などがあり、化学的方法として化学試薬を用いる処理、例えば酵素消化法、カオトロープ試薬、界面活性剤または溶菌剤などによる変性法などが知られている。特開平０６−３１９５２７号公報の表１および２には、マイコバクテリウムなどの細胞を溶菌するための様々のプロトコールがまとめられている。【００４６】
本発明の方法では、溶菌処理として超音波照射法、凍結・溶融法、加熱法などの物理的方法、または化学試薬処理あるいはこれらの組み合わせにより細胞膜破壊が行われることが好ましい。特に、物理的な方法は操作が簡便であり、化学試薬処理のように細胞膜破壊に使用した薬剤（カオトロープ試薬、界面活性剤、または溶菌剤など）を後で除く必要がないため、望ましい。後工程で行われる反応、処理に悪影響を及ぼすそのような薬剤を使用しなければ、単離された核酸は、そのままＤＮＡ増幅反応、ハイブリダイゼーション、制限酵素反応、検出反応または電気泳動分析などに適用することができる。したがってサンプル量が微量であっても、本発明の方法によれば、細胞から核酸を高収率で単離することができる。【００４７】
上記の超音波処理または加熱処理、超音波および加熱の併用処理は、溶菌に有効な処理条件であり、少なくとも核酸が、超音波または熱により変性しない範囲で行う。超音波処理の場合、溶菌に有効である超音波の照射条件、照射時間を適宜設定する。照射量は、使用する超音波分散機の定格出力、照射する懸濁液の量、照射する時間から計算することができる。例えば、超音波強度は、製剤の容量、撹拌条件などによって選択されるが、周波数１０〜１００ｋＨｚ、好ましくは１５〜４５ｋＨｚの超音波を、少なくとも５分間、好ましくは５〜３０分間程度照射することが好ましい。加熱処理の場合、その温度範囲、すなわち７０〜１２０℃、好ましくは８０〜１２０℃、さらに好ましくは８０〜１００℃で、２０秒〜１０分間、好ましくは２０秒〜３００秒間の加熱による。加熱条件（温度、時間）は細胞または菌の種類（大きさ、細胞膜の組成と厚さなど）によって異なるため、上記の範囲で適宜選択する。加熱は、あらゆる適切な加熱手段により行われるが、ドライ・ヒートブロック、湯浴、マイクロウェーブ・オーブン、各種ヒーターなどが例示される。しかし、これらに限定されるものではない。前記病原性抗酸菌細胞を溶解して核酸を遊離させるためのより好ましい処理は、加熱および超音波照射の処理による態様である。超音波照射と加熱を組み合わせた併用処理では、上記のそれぞれの処理条件よりもさらに温和な条件で溶菌が達成できる。【００４８】
［核酸の精製方法］
本発明の核酸の単離方法は、上記核酸結合用固体支持体と、核酸を含む試料とを接触させる段階を含むことを特徴とする。【００４９】
本発明の単離方法の対象とする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、ＤＮＡとしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなど、またＲＮＡとしてｍＲＮＡ、ｔ  ＲＮＡ、ｒ  ＲＮＡなどが含まれる。さらには一本鎖または二本鎖を問わない。単離されるＤＮＡ量は、０．０００５ｎｇ〜２ｍｇ、好適な範囲として０．００１ｎｇ〜１ｍｇ（２００〜２×１０１１  ｃｏｐｉｅｓ）である。【００５０】
精製の対象とする核酸を含む試料としては、細胞溶解により抽出された核酸を含む溶液、電気泳動後の泳動ゲル中から抽出された核酸を含む溶液、酵素反応後の核酸含有溶液などが該当する。ここで細胞溶解により抽出された核酸を含む溶液とは、生物由来の検体、培養液もしくは細胞含有溶液から抽出された核酸を含む溶液であって、細胞膜破壊処理により遊離してきた核酸が存在している。生物由来の検体は特に限定されず、広く生物起源の材料、生体からの試料など、細胞（細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞など）を含む被験物が挙げられる。培養液は、微生物、細胞、組織などを培養した培養液である。また、酵素反応後の核酸含有溶液における酵素反応とは、酵素反応として特に限定されないが核酸が基質などとして関与する酵素反応であり、その結果生じる反応溶液には核酸またはその断片が含有されている。例えば制限酵素、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなどを使用する酵素反応である。【００５１】
本発明において、上記核酸はＧＣリッチな核酸であることが好ましい。ここで「ＧＣリッチな核酸」とは、ＧＣに富む核酸、換言するとＧＣ含量が高い核酸をいい、特にＧＣリッチ（ｒｉｃｈ）な配列を多く含む核酸が該当する。ＧＣ含量は核酸の塩基組成を表す場合、ＧとＣが全体の中で占める割合（％）をいう。ＤＮＡのＧＣ含量は生物ごとに異なり、高等動物では４２％を中心とした狭い範囲の値をとる。核酸塩基としてＧとＣが多く含まれる遺伝子には細胞の生存に必要な基本的な遺伝子が多いとされる。ＧＣリッチな配列は、対象とする核酸の塩基配列において、部分的にＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の含量が高い配列をいう。具体的にはＧＣ含量が６０％以上、好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。例えば遺伝子のプロモーター領域に多い「ＣｐＧ島」が示される。しかしながら、必ずしも「ＣｐＧ島」のようにグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）が隣り合っている配列でなくともよい。【００５２】
本発明の核酸の単離方法に従えば、「核酸結合タンパク質」として予め「核酸結合能を持つタンパク質」を選定しておくことにより、核酸結合タンパク質が認識する特異的な塩基配列を含む核酸またはその断片を「該タンパク質に結合する核酸」として探索することができる。この場合、結合する核酸は、非特異的な相互作用に基づいて結合することもあるが、特異的なタンパク質結合部位（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を有する核酸であってもよい。【００５３】
本発明の核酸の単離方法の好ましい態様は、生物由来の検体、培養液もしくは細胞含有溶液に含まれる細胞の細胞膜破壊により細胞溶解して抽出された核酸、電気泳動後の泳動ゲル（例えばアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルなど）から抽出された核酸、または酵素反応後の核酸含有溶液中の核酸を前記固体支持体と接触させることにより、その表面上のＭＤＰ１に結合させ、該核酸を回収して精製することを特徴とする方法である。さらに好ましい態様では、磁性固体支持体表面のＭＤＰ１に結合した核酸を、磁石、磁気選別機などの手段によって固液分離することにより、細胞膜、その他の細胞内成分、アガロースゲル成分もしくはポリアクリルアミドゲル成分、またはタンパク質などの夾雑物、さらに化学試薬を含んでいる溶解バッファーから分離し、所望する核酸を分離して精製することができる。この方法による核酸の精製では、核酸を捕捉した固体支持体を洗浄する操作、捕捉された核酸を固体支持体から溶離する操作において、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの代替として、磁気作用を利用した固液分離をする。遠心分離、ろ過、減圧処置といった操作を含まないために、簡便かつ迅速に核酸を単離・精製することができる。【００５４】
本発明の好ましい態様としては、上記の細胞の単離、核酸の抽出、核酸の精製方法を組み合わせて病原性細菌細胞を含む試料から核酸を精製する方法すなわち、ミコール酸含有糖脂質との結合能を有するポリペプチドが担体表面に固定化されてなる固体支持体と、ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細菌細胞を含む試料とを接触させて細胞を単離する段階、単離した細菌細胞の核酸を抽出する段階、および核酸との結合能を有するポリペプチドが担体表面に固定化されてなる固体支持体と、核酸を含む試料とを接触させる段階を含む、核酸の単離方法が挙げられる。本方法によると、固体支持体に結合したまま核酸の抽出および抽出された核酸の精製を連続的に進めることができる。細胞の単離、核酸の抽出、核酸の精製の各段階の好ましい操作方法は上述の通りであるので、ここでは説明を省略する。【００５５】
本方法の好ましい態様としては、固体支持体のＭＤＰ１に病原性抗酸菌細胞を結合させた後、物理的方法または化学的方法などにより結合している該細胞を溶解して核酸を遊離させ、固体支持体のＭＤＰ１に結合させて分離する核酸の精製方法が挙げられる。核酸の精製に用いる固体支持体は、細胞の単離に用いたものを再度核酸の精製に用いてもよいし、別の固体支持体を用いてもよい。すなわち、試料に含まれる細胞を固体支持体に一旦結合させ、次いで細胞溶解によって遊離する核酸を同一のまたは別の固体支持体上に回収する態様であってもよい。【００５６】
上記病原性抗酸菌を結合した磁性固体支持体を溶解バッファーに懸濁させ、必要であればさらに加熱、超音波などの変性処理によって細胞膜を破壊する。該細胞から遊離し、磁性固体支持体表面のＭＤＰ１に結合した核酸を、上記手段によって固液分離することにより細胞膜、その他の細胞内成分、さらに化学試薬を含んでいる溶解バッファーから分離し、所望する核酸を単離することができる。しかしながら、細胞の単離、核酸の抽出、核酸の精製の各段階の具体的な方法については、上記の形態に制限されることなく、上述したいかなる方法をも適宜採用することができる。この方法では遠心分離、ろ過、減圧処置といった操作を含まないために、簡便かつ迅速に核酸を単離・精製することができる。【００５７】
本方法により、細胞から核酸を抽出した後に、電気泳動などにより目的の核酸を抽出する工程を含む場合には、電気泳動に用いたアガロースゲルの溶解は、公知の化学試薬と加熱処理によって行うことができる。本発明の方法では、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、６０℃で加熱処理することが好ましい。なお、核酸の抽出後に遊離した核酸を固体支持体上のＭＤＰ１が効果的に捕捉する条件を設定する必要がある。この段階に先立ち、例えば固体支持体を含む懸濁液全体を透析することにより、細胞膜破壊に使用した上記溶解バッファー、アガロースゲル溶解液あるいは酵素反応溶液を除去してもよい。固体支持体上のＭＤＰ１に結合して残留している核酸を洗浄して不要物を除き、次いで固体支持体から分離することによって精製された核酸は、そのままＤＮＡ増幅反応、ハイブリダイゼーション、制限酵素反応、検出反応または電気泳動分析などに適用することができる。したがって試料量が微量であっても、本発明の方法によれば、細胞から高収量でしかも純度が高い核酸を単離することができる。具体的には、前記の細胞膜破壊処理は、溶菌に有効な処理条件であり、またアガロースの溶解処理は、アガロース溶解に有効な処理であり、少なくとも遊離する核酸が変性しない範囲である。固体支持体から核酸を溶出するには、低イオン強度の溶媒、緩衝液を固体支持体に作用させ、必要なら加温する。核酸溶出のための温度は、好ましくは５０〜９０℃、より好ましくは７０〜８０℃である。このような溶出液としては、水、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液などが例示される。溶出された核酸は、上記固液分離操作などにより固体支持体を除去して回収される。【００５８】
上記の核酸精製方法により得られた核酸は、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＬＣＲ、ＬＡＭＰ、ＴＭＡ、ＴＡＳ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡなどのＤＮＡ増幅法に用いたり、例えば塩基配列決定、ハイブリダイゼーション法、サザンブロット分析などの解析に用いたりすることもできる。【００５９】
本発明の核酸の単離方法は、上述の具体的な記載に限定されるものでなく、任意の核酸結合タンパク質と任意の核酸との結合に基づく単離精製をする際にも利用可能であることはいうまでもない。【００６０】
［キット］
本発明に係るキットは、ミコール酸含有糖脂質および／または核酸との結合能を有するポリペプチドが、担体表面に固定化されてなる固体支持体を含む。該キットは、本発明の細胞の単離方法、核酸の抽出方法、または核酸の単離方法あるいはこれらを組み合わせた核酸の単離方法に使用されうる。このため、該キットは、本発明の固体支持体の他にも、本発明の方法を実施するために必要とされる器材一式、具体的には、各種試薬、固体支持体（好ましくは磁気担体を含む固体支持体）、細胞単離および核酸抽出・精製に必要な器具を含みうる。これらの試薬の中には、試料を溶解（または希釈）するための溶解（または希釈）液、洗浄液、各種の緩衝液なども含まれる。本発明の方法を実施するための磁気ビーズ、結合バッファー、細胞洗浄バッファー（細胞洗浄液）、溶解バッファー（再懸濁液）、核酸洗浄バッファー（核酸洗浄液）、核酸溶出バッファー（溶出液）がそれぞれ容器に予め封入されている態様のキットが好ましい。必要な器材一式の中には、さらに細胞を固体支持体に付着もしくは結合させ、その細胞膜を破壊して内部に含まれる核酸を抽出する専用の器具を、キット要素として含めてもよい。これらの器具を用いて上記の本発明の核酸抽出・精製方法を実施することができる。【００６１】
後述する本発明の方法を実施するためには上記以外の用具または機器を必要とすることもあるが、これらは適宜、本発明のキットの構成要素として含められる。固液分離には磁気選別機を使用するが、遠心分離機を利用してもよく、その場合小型遠心機などを使用する。【００６２】
本発明の細胞の単離方法または核酸の抽出方法では、少なくとも２種の緩衝液が使用される。結合バッファーは、塩として塩化ナトリウム、酢酸カリウム、またＥＤＴＡ、界面活性剤などを含んでもよいリン酸系、酢酸系、トリス系、またはＨＥＰＥＳ系の緩衝液が挙げられ、例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳが示される。洗浄バッファーは、上記結合バッファーを４〜５倍に希釈したものを用いてもよいが、異なる種類のバッファーを別途に用意してもよい。溶解バッファーとしては、水または緩衝液、または塩を含有する緩衝液が例示され、特にＴＥ緩衝液が好適である。上記のように、本キットには、従来技術において核酸抽出に用いられてきたクロロホルム、フェノールなどの有機溶媒、カオトロープ試薬、溶菌剤などを含まないことが好ましいが、必要によってはこれらの試薬を適宜採用することも可能である。【００６３】
また、上記細胞の単離、核酸の抽出、核酸の精製方法を組み合わせて病原性細菌細胞を含む試料から核酸を精製する方法では、少なくとも４種の緩衝液が使用される。結合バッファーは、塩として塩化ナトリウム、酢酸カリウム、またＥＤＴＡ、界面活性剤などを含んでもよいリン酸系、酢酸系、トリス系またはＨＥＰＥＳ系の緩衝液が挙げられ、例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳが示される。細胞洗浄バッファーは、上記結合バッファーを４〜５倍に希釈したものを用いてもよいが、異なる種類のバッファーを別途に用意してもよい。溶解バッファーとしては、ＳＤＳなどを含むＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＢＳなどが例示され、特に核酸がＭＤＰ１と結合するのに最適なものが良い。核酸洗浄バッファーは、上記溶解バッファーを４〜５倍に希釈したものを用いてもよいが、異なる種類のバッファーを別途に用意してもよい。核酸溶出バッファーとしては、水または緩衝液、または塩を含有する緩衝液が例示され、特にＴＥ緩衝液が好適である。上記のように、本キットには、従来技術において核酸抽出に用いられてきたクロロホルム、フェノールなどの有機溶媒などは含まないことが好ましいが、必要によってはこれらの試薬を適宜採用することも可能である。【００６４】
必要な器具一式と試薬類を一つのセットとして、本発明の核酸抽出・精製方法専用のキットを構成する。いずれの用具も通常は１回分析用の消耗品として構成されることが好ましい。バッファーなどを含む容器は予め滅菌処理され、雑菌の汚染を防止することが好ましい。【００６５】
本発明の方法を実施する際には、上記の消耗品とともに撹拌のためのミキサー、撹拌子、加熱するためのヒーターもしくは超音波発生器、磁気処理による固液分離に使用する磁石、磁気選別機なども使用される。具体的には、撹拌は試験管ミキサーによる振動、または容器を回転する転倒混和が好ましく、磁石は棒磁石であってもよい。磁石の種類は電磁石、永久磁石のどちらでもよいが、簡便性、操作性から永久磁石、特に磁力の強さからネオジム磁石が好ましい。【００６６】
これらは、通常、検査室に備えられている機器であり、それらの機器を本キットとともに使用して本発明方法を実施することができる。さらに必要であれば、そうした機器の一部をキットの構成物として含めてもよい。【００６７】
上記固体支持体、キットの全体または一部についても、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。【００６８】
予め特定の「核酸結合タンパク質」を選定して、「該タンパク質を結合する核酸」を探索する場合、「核酸」は、前記「核酸結合タンパク質」を特異的もしくは非特異的に結合することが予測される任意の核酸であり得る。本発明のこのような局面において、上記のキットおよび核酸単離方法を利用して、目的とする核酸または特異的な遺伝子の効率的な探索にも供することができる。また、ＤＮＡ−タンパク質相互作用を標的とする化合物、タンパク質および試薬のスクリーニングのためにも利用することができる。この場合、特定のＤＮＡ−タンパク質相互作用に対して影響を及ぼす作用は、ＤＮＡの結合量の測定で評価することができる。【００６９】
本方法の一例として、ＧＣリッチな塩基配列を有するＤＮＡもしくは遺伝子の探索に利用する態様がある。ＧＣリッチな配列を有する遺伝子の遺伝子産物は、サイトカイン、成長因子、キナーゼ、転写因子など重要な生理的意義を持つものが多い。また、上記の「ＣｐＧ島」メチル化現象は、遺伝子の転写活性調節と発現制御に関与し、また疾患と治療に関わるＳＮＰ（一塩基多型）解析にも関係してくる。さらに「トリプレットリピート病」という遺伝子レベルで規定される疾病に関係する既知のトリプレットにＧとＣが占める割合が高い。このようにＧＣリッチな塩基配列、リピート配列を有するＤＮＡもしくは遺伝子（「ＧＣリッチ遺伝子」）の調査・研究は、ゲノム機能と調節、疾患、再生医学、発生、老化などの分野で極めて重要な位置を占めている。それにもかかわらず、ＧＣリッチな塩基配列を有する核酸、遺伝子の研究は、強固な２次構造や配列多様性の低下による高いホモロジーが原因となり、増幅効率の低下、プライマーにおける制約、塩基配列解析における障害、低い翻訳効率、ＳＮＰ検出効率の低下などの障害に直面する。本発明の精製方法およびキットは、Ｇ、Ｃ塩基を認識するＭＤＰ１などを利用するために、ＧＣリッチ核酸のスクリーニングおよびその単離が容易であり、また特異的な遺伝子の探索と同定にも有用である。
【実施例】
【００７０】
本発明の作用効果を、以下の実施例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。【００７１】
［実施例１］
＜ＭＤＰ１の調製および磁気ビーズへの固定化＞
（ＭＤＰ１タンパク質）
ＭＤＰ１タンパク質（以下「ＭＤＰ１」）は、ＢＣＧ東京株（以下「ＢＣＧ」）より特許文献２に記載された方法に従って調製した。その概要は次の通りである。【００７２】
ＢＣＧは、５０ｍｌＴＭＮＳＨ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ＝７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、および６ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に再懸濁し、超音波により破砕した。３００００ｇで２時間遠心分離して得たペレットを、０．２５Ｎ  ＨＣｌに４℃で終夜撹拌することにより再懸濁し、２００００ｇで２０分間遠心分離した。上清に０．１倍量の１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡを激しく撹拌しながら加えた。４℃で４時間静置して形成した沈殿を遠心分離により回収し、アセトン（２０ｍｌ）に０．０１ｍｌの濃塩酸を加えた酸性アセトンで１回洗浄し、アセトンで２回洗浄し、真空デシケーターで乾燥した。乾燥された沈殿を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に再懸濁した。次に、酸可溶性タンパク質を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中のグアニジン塩酸塩ＧｄｎＣｌの直線グラジエントによりファーストフローカラム（ベッドボリューム５ｍＬ、ＨｉＴｒａｐ  ＣＭ  ＦＦ、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社製）を用い、室温でクロマトグラフィーにかけて分画した。グラジエントは、それぞれ０％および５％ＧｄｎＣｌ溶液（１５ｍＬ）を充填したグラジエント装置で行った。流速を１ｍＬ／ｍｉｎに維持し、１ｍＬの各フラクションを集めた。精製されたＭＤＰ１を含むフラクションを、５％ＧｄｎＣｌを含む０．２Ｍのリン酸緩衝液に対して透析し、濃縮した。最後に、ゲルろ過クロマトグラフィーカラム（ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社製）によりさらに精製した。タンパク質の純度は２２０ｎｍの吸光度の測定またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析でモニターした。【００７３】
ＭＤＰ１は、インビトロジェン株式会社製の磁気ビーズであるエポキシ基活性化ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０）のエポキシ基に、ＭＤＰ１中のアミノ基を介して共有結合させることにより固定化させた（ＭＤＰ１−Ｅｐｏｘｙ  ＢＥＡＤＳ）。ＭＤＰ１タンパク質の固定化量は、１〜１．５μｇ／１ｍｇ  ＢＥＡＤＳであった。【００７４】
（組換えＭＤＰ１タンパク質）
ヒスチジンタグを付加した組換えＭＤＰ１（ｒＭＤＰ１）を、以前報告された方法（Ａｏｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９巻：３９７９８〜３９８０６頁（２００４年））に従って調製した。その概要は次の通りである。【００７５】
まず、ｒＭＤＰ１発現ベクター（ｐＥＴ２２Ｂ−ＭＤＰ１）を、大腸菌のコンピテント細胞（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテントセル、インビトロジェン株式会社製）に導入し形質転換させた。この形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）と３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールとを含むＬＢ液体培地中、２２℃で培養し、６００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．６になったとき、最終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加した。１６時間培養することで、ｒＭＤＰ１を発現させた。【００７６】
遠心分離で回収した該大腸菌を、超音波型細胞破砕装置（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ  ＵＣＤ−２００Ｔ、東ソー株式会社製）により超音波処理を行うことによって粉砕し、再び８０００ｇ、３０分間の遠心分離を行った後、上清を溶出タンパク質として回収した。この上清を、メンブレンフィルター（０．２２μｍ）に通すことで、ゴミなどを除去した後、５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ８．０）と、１０ｍＭのイミダゾールと、０．５ＭのＮａＣｌと、０．０１％のＴｗｅｅｎとにより平衡化された金属キレートアフィニティークロマトグラフィー担体（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ、キアゲン株式会社製）に添加した。カラムを洗浄することで、非特異的に吸着しているタンパク質を取り除いた後に、５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ８．０）と、３００ｍＭのイミダゾールと、０．５ＭのＮａＣｌと、０．０１％のＴｗｅｅｎとからなる溶出バッファーにより、ｒＭＤＰ１を溶出した。その後、透析により、該溶出バッファーをＰＢＳに置換した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥした後に、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色することで測定した結果、得られたｒＭＤＰ１の濃度は、１ｍｇ／ｍＬであった。【００７７】
ｒＭＤＰ１は、インビトロジェン株式会社製の磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−ＴＡＬＯＮ）のＢＤ  ＴＡＬＯＮに、ヒスチジンタグを介して配位結合させることにより固定化させた（ｒＭＤＰ１−Ｈｉｓ−ＴＡＬＯＮ  ＢＥＡＤＳ）。ｒＭＤＰ１タンパク質の固定化量は、３０μｇ／１ｍｇ  ＢＥＡＤＳであった。【００７８】
［実施例２］
＜ＭＤＰ１とｒＭＤＰ１固定化磁気ビーズを用いた結核菌（ＢＣＧ）の回収＞
ルシフェラーゼ発現ＢＣＧ（ＢＣＧ−Ｌｕｃ）溶液５０μｌ［５×１０４ｃｆｕ］を、結合バッファー（ＰＢＳ）に懸濁した本発明のＭＤＰ１−Ｅｐｏｘｙ  ＢＥＡＤＳもしくはｒＭＤＰ１−Ｈｉｓ−ＴＡＬＯＮ  ＢＥＡＤＳ  ７．５μｇと攪拌混合した。一方で、同量のＢＣＧ−Ｌｕｃを推奨された溶液条件下において、Ｇｅｎｐｏｉｎｔ社の磁気ビーズＢＵＧＳ’ｎ  ＢＥＡＤＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＴＢ  ７．５μｇと５０μｌ中で撹拌混合した。これを１５分間、２５℃で放置した後、磁気選別機を用いて磁気ビーズと上清を分離することで、ＢＣＧ−Ｌｕｃを該磁気ビーズ上に回収した。ＢＣＧ−Ｌｕｃの回収効率は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、菌数を測定することにより算出した。結果を表１に示す。【００７９】
【表１】
2009066502.tif 000002
【００８０】
ＭＤＰ１−Ｅｐｏｘｙ  ＢＥＡＤＳは、Ｇｅｎｐｏｉｎｔ社磁気ビーズ（ＢＵＧＳ’ｎ  ＢＥＡＤＳ）の２倍以上の集菌効率を示した。また、ｒＭＤＰ１−Ｈｉｓ−ＴＡＬＯＮ  ＢＥＡＤＳは、Ｇｅｎｐｏｉｎｔ社磁気ビーズの４倍以上の集菌効率を示した。【００８１】
［実施例３］
＜ＭＤＰ１固定化磁気ビーズを用いた結核菌（ＢＣＧ）の回収と核酸抽出＞
ＢＣＧ溶液５０μｌ［７．５×１０４ｃｆｕ］を、結合バッファー（ＰＢＳ）に懸濁した本発明のＭＤＰ１−Ｅｐｏｘｙ  ＢＥＡＤＳ  ７．５μｇと攪拌混合した。一方で、同量のＢＣＧを推奨された溶液条件下において、Ｇｅｎｐｏｉｎｔ社の磁気ビーズＢＵＧＳ’ｎ  ＢＥＡＤＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＴＢ  ７．５μｇと５０μｌ中で撹拌混合した。これを１５分間、２５℃で放置した後、磁気選別機を用いて磁気ビーズと上清を分離することで、ＢＣＧを該磁気ビーズ上に回収した。次いで、回収されたＢＣＧを溶解バッファー（ＴＥ）５０μｌに再懸濁し、１０分間２５℃で２８ｋＨｚの超音波処理をすることで、細胞を溶解し、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ溶液を定量ＰＣＲにかけることで核酸の抽出効率の比較を行った。定量ＰＣＲはＲｏｃｈｅ社のマイコバクテリウム核酸キット（コバスＴａｑＭａｎ  ＭＴＢ、ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）を用いて行った。核酸抽出効率は、ＢＵＧＳ’ｎ  ＢＥＡＤＳの回収効率を１として算出した。結果を表２に示す。【００８２】
【表２】
2009066502.tif 000003
【００８３】
ＭＤＰ１磁気ビーズによる核酸抽出効率は、Ｇｅｎｐｏｉｎｔ社磁気ビーズの効率と比べ３倍以上だった。【００８４】
［実施例４］
＜ＭＤＰ１固定化磁気ビーズを用いた核酸精製＞
プラスミドＤＮＡ溶液５０μｌ［２×１０６ｃｏｐｉｅｓ／μｌ］を、結合バッファー（ＰＢＳ）に懸濁した本発明のＭＤＰ１−Ｅｐｏｘｙ  ＢＥＡＤＳもしくはＭＤＰ１を固定化していないＥｐｏｘｙ  ＢＥＡＤＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）７．５μｌに添加し、撹拌混合し、これを１５分間、２５℃で放置した。その後、上清は磁気選別機を用いて、新たなチューブに採取した（Ｓｕｐ）。一方で、ＤＮＡ−磁気ビーズ複合体を洗浄バッファー（ＰＢＳ）で洗浄後、溶出バッファー（ミリＱ水＋０．００５％ＳＤＳ）５０μｌに再懸濁し、５分間９８℃で加熱することで、ＤＮＡを溶出した（Ｅｌｕｔｅ）。得られたＤＮＡ溶液（Ｓｕｐ，Ｅｌｕｔｅ）を定量ＰＣＲにかけることで核酸回収量を算出した。定量ＰＣＲはＲｏｃｈｅ社のマイコバクテリウム核酸キット（コバスＴａｑＭａｎ  ＭＴＢ、ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）を用いて行った。結果を表３に示す。【００８５】
【表３】
2009066502.tif 000004
【００８６】
ＭＤＰ１を固定化した磁気ビーズを用いることで、核酸を回収することができた。
【国際調査報告】
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