(57)【要約】  本発明は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ酵素阻害剤およびその使用に関する。より詳細には、ウイルス性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素に結合またはそれを阻害し得るタンパク質、およびその治療薬としての、特に抗ウイルス剤としての使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素を阻害する能力を有するその変異体または断片。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
【請求項５】
請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３に記載の遺伝子構築物を含むベクター。
【請求項６】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の遺伝子構築物、または請求項５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のタンパク質を産生させる条件下、請求項６に記載の細胞を培養し、そうすることが望ましい場合には、前記タンパク質を培養液から回収することを含む、請求項１に記載のタンパク質を得る方法
【請求項８】
請求項１に記載のタンパク質および不活性ビヒクルを含む組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のタンパク質を、１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に含む薬学的組成物。
【請求項１０】
抗ウイルス性薬学的組成物の調製における、請求項１に記載のタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素を阻害するタンパク質、およびその治療薬としての、特に、抗ウイルス剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび動物、特にヒトのウイルス感染は、広範囲に広がり、医療従事者に多くの問題を課している。ウイルスと効果的に特異的に戦うことのできる医薬品は、数が非常に限られており、しかも一般に望ましくない副次的効果を引き起こす。ウイルス感染は宿主細胞を破壊するだけでなく、様々なタンパク質および酵素の機能に影響を及ぼす。ウイルスによる侵入は、他の病原因子（他のウイルス、細菌、真菌など）による感染を助ける。したがって、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、それが引きこした免疫の喪失により、他のウイルス（単純ヘルペス、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）およびヒト身体に侵攻する他の病原因子に扉を開け、危険な状況を作り出す。
【０００３】
懸命の努力にも関わらず、これまでのところ、ウイルス性因子により引き起こされる病気の発症を、その起源でまたは症状に関してのいずれかで、邪魔するのに成功したと本質的に承認し得る化学療法薬を見出すことに成功していない。したがって、化学療法薬によるウイルス性疾患の治療は依然として不完全である。
【０００４】
複合型またはハイブリッドモノクローナル抗体と毒素により形成される抗体複合体が、標的細胞の特定のコロニーを根絶するのに用いられてきた。これらにより表面標的抗原を保有する「望ましくない」標的細胞を狙ってそれらを破壊するのである。様々な研究者が用いてきた様々な毒素は、大きく２つのグループに分けることができる。第一のグループは、未変化の毒素（未変化のリシンなど）からなる。こうした毒素はその致死毒性のため、ｉｎ  ｖｉｖｏでは安全に用いることができない恐れがある。第二のグループの毒素は、ヘミトキシン（ｈｅｍｉｔｏｘｉｎ）と呼ばれる。ヘミトキシンは、一本鎖リボソーム不活性化タンパク質で、真核生物リボソームに触媒的に作用して６０Ｓサブユニットを不活性化することで、ペプチド伸長レベルで細胞タンパク質合成を用量に依存して阻害する。
【０００５】
目的のヘミトキシンは、フィトラッカ・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）から単離されるヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質（ＰＡＰ）である。長年の間、ＰＡＰが抗ウイルス活性を有することは認識されていた。ＰＡＰが植物でＲＮＡ含有ウイルスの伝染を遮断することが実証されている。ＰＡＰがＲＮＡ含有動物ウイルス２種（ポリオウイルスおよびインフルエンザウイルス）の複製を阻害すること、およびＰＡＰが単純ヘルペスウイルスＩ型およびＩＩ型の分裂増殖を阻害することも報告されている（米国特許第４，６７２，０５３号）。ＰＡＰモノクローナル抗体複合体Ｇ３．７／ＣＤ７、Ｆ１３／ＣＤ１４、およびＢ４３／ＣＤ１９がＨＩＶ-１の複製を阻害することが報告されているものの、これらの複合体のウイルスの複製を阻害する能力に一貫性がないことが判明している。
【０００６】
上記を踏まえて、新規抗ウイルス性化合物または薬を提供する必要が依然としてある。有利なように、こうした新規抗ウイルス性剤は、当該分野で開示される抗ウイルス性剤の有効性と等しいかそれより大きい有効性を示すべきであり、望ましくない副次的効果を引き起こすべきではない。
【０００７】
大部分の原核細胞および真核細胞は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素をコードする。この酵素の機能は、シトシン脱アミノ化により、または複製プロセス中のｄＵＭＰの不正確な取り込みによりＤＮＡに出現したウラシル残基を取り除くことである。例えば、シトシン脱アミノ化が生じてそれが修復されなかった場合、この脱アミノ化が起こってしまったＤＮＡ鎖ではＣ-ｔｏ-Ｔ移行変異が生じ、その結果、次の複製段階後、相補鎖でＧ-ｔｏ-Ａ移行変異が起こるだろう。いったんＵＤＧ酵素によりこのウラシルが取り除かれると、アプリン部位のない、またはアピリミジン部位（ＡＰ部位）が作られる。こうしたＡＰ部位の修復に取りかかる機構は、塩基スプライシング修復経路である。
【０００８】
ヒト細胞では、ＵＤＧ活性を有する異なる酵素が５種類まで同定されている。おかしなことに、これらの酵素のうちの１つ、ＵＮＧ２と呼ばれるものは、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ-１）の粒子にも存在する。そのうえ、ＤＮＡウイルス（ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスなど）の中には、それら自身のＵＤＧ活性をコードするものもいる。異なるヘルペスウイルスのウイルス複製に影響を及ぼすＵＤＧ酵素の能力の結果として、前記酵素は宿主細胞におけるウイルス複製機構と関係してきた。上記のウイルスにおいて、ＵＤＧ酵素は感染プロセスに不可欠であることが既知である。ウイルス複製プロセスにおけるこの酵素の機能はそれらウイルスの非分裂細胞で複製する能力に関係し、ここで細胞ＵＤＧ酵素のレベルは低いと見なされることが提案されており（Ｐｒｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １７：４７９−４９０）、したがって、その阻害は治療上興味が持たれる。これまでのところ、単純ヘルペスウイルス１型（ＳＨＶ-１）によりコードされるＵＤＧ酵素の阻害剤がいくつか設計されている。これらの非タンパク質合成化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で試験されている。一方で、ＰＢＳ２バクテリオファージがコードするＵＧＩタンパク質はＳＨＶ-１ウイルスのＵＤＧ酵素を阻害することが既知である。しかしながら、この阻害剤の短所の１つは、これがヒトＵＮＧ２酵素のＵＤＧ活性も遮断することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＵＤＧ酵素を阻害する能力を有するタンパク質の発見に基づく。いくつかのウイルスのＵＤＧ活性は感染プロセスに不可欠であるため、前記タンパク質は抗ウイルス性化合物を設計するのに有用な道具となり得る。
【００１０】
したがって、本発明の１つの態様は、配列番号１のアミノ酸配列、またはＵＤＧ酵素を阻害する能力を有するその変異体もしくは断片を含むタンパク質に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、前記タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチドまたは前記遺伝子構築物を含むベクターに関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチド、または前記遺伝子構築物、または前記ベクターを含む細胞に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、前記タンパク質を得る方法に関し、この方法は、前記タンパク質を産生させ、そうすることが望ましい場合には、前記タンパク質を培養液から回収する条件下、前記細胞を培養することを含む。
【００１６】
別の態様において、本発明は、前記タンパク質を含む組成物に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、前記タンパク質を１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に含む薬学的組成物に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、抗ウイルス性薬学的組成物の調製における前記タンパク質の使用に関する。
【００１９】
本発明は、概して、配列番号１のアミノ酸配列を含む、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素を阻害する能力を持つタンパク質、またはＵＤＧ酵素を阻害する前記能力を維持する変異体もしくは断片、および治療薬としての、特に抗ウイルス剤としてのその使用に関する。
【００２０】
１つの態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素を阻害する能力を持つその変異体もしくは断片に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
簡単のため、「本発明のタンパク質」という表現は、配列番号１のアミノ酸配列を含むこのタンパク質、またはＵＤＧ酵素を阻害する能力を持つその変異体もしくは断片を含む。「タンパク質」という用語は、本明細書中使用される場合、翻訳後修飾の全ての形（例えば、グリコシル化、リン酸化、またはアセチル化）を含む。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明のタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、それで構成され、そして、少なくとも、このＵＤＧ酵素に結合してその活性を阻害する能力を示す。このため本発明のタンパク質は、抗ウイルス剤として用いることができる。具体的な実施形態において、本発明のタンパク質は、いわゆるファイ２９（φ２９）バクテリオファージのタンパク質ｐ５６である。
【００２３】
本明細書中用いられる意味において、「変異体」という用語は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に相同であり機能的に等価であるペプチドを示す。本明細書中使用される場合、ペプチドは、そのアミノ酸配列が前記タンパク質のアミノ酸配列に関して、少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、そしてより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する場合、前記タンパク質と「実質的に相同」である。同様に、「機能的に等価」という表現は、本明細書中使用される場合、問題のペプチドがＵＤＧ酵素活性を阻害する能力を維持していることを意味する。ＵＤＧ酵素活性を阻害する能力は、実施例１に記載されるアッセイ（材料および方法の第１．６節を参照）で求めることができる。同様に、ペプチドまたはタンパク質のＵＤＧ酵素に結合する能力は、実施例１に記載されるアッセイ（材料および方法の第１．６節を参照）で求めることができる。
【００２４】
特定の実施形態において、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の、ＵＤＧ酵素活性を阻害する能力を維持した突然変異形である。この突然変異形は、配列番号１を含むタンパク質に関して１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または修飾があってもよいが、ただしＵＤＧ酵素活性を阻害する能力を保持する。
【００２５】
本発明の範囲内に含まれる変異体の非制限的な例示としての例として、本記載においてタンパク質ｐ５６ＦＬＡＧとして同定されるタンパク質が挙げられ、このタンパク質は、遺伝子５６（これはφ２９のタンパク質ｐ５６をコードする）が、実施例１に記載されるように、Ｃ-末端に結合したアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧペプチド）［配列番号９］を含有するｐ５６タンパク質をコードするように修飾されることにより得られる（材料および方法の第１．３節を参照）。アフィニティークロマトグラフィーにより、前記タンパク質ｐ５６ＦＬＡＧがＵＤＧ酵素と相互作用することが示されている（実施例１を参照）。
【００２６】
同様に、本明細書中用いられる意味において、「断片」という用語は、配列番号１のアミノ酸配列を含む前記タンパク質の一部分、すなわち、前記配列番号１に含まれる隣接しあうアミノ酸の配列を含むペプチドを示す。本発明で用いられるために、前記断片はＵＤＧ酵素活性を阻害する能力を有さなければならない。
【００２７】
本発明のタンパク質は、それを産生する生物から得ることができ、前記タンパク質を発現するのに適した条件下で前記生物を培養することおよびそれを回収することからなる方法を用いる。本発明の特定の実施形態において、産生生物はφ２９バクテリオファージである。実施例１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、具体的には、φ２９のタンパク質ｐ５６、ならびにＵＤＧ酵素に結合してその酵素活性を阻害する能力を有するその変異体（ｐ５６ＦＬＡＧ）の、産生、単離、および精製を開示する。
【００２８】
さらに、本発明のタンパク質は融合タンパク質の一部であってもよい。これに関して、制限ではなく例示の目的で、前記融合タンパク質は、本発明のタンパク質を含む第一のペプチドからなる領域Ａとこれが結合した第二のペプチドを含む領域Ｂを含有してもよい。前記第二のペプチドは、任意の適したペプチド（例えば、抗ウイルス活性を持つペプチド）であってもよい。特定の実施形態において、前記第二のペプチドは、本発明のタンパク質であってもよい。前記領域Ｂは前記領域Ａのアミノ末端領域に結合してもよく、あるいは、前記領域Ｂは、前記領域Ａのカルボキシル末端領域に結合してもよい。領域Ａおよび領域Ｂの両方が、直接、または前記領域Ａおよび領域Ｂの間にあるスペーサーペプチド（リンカー）を通して結合してもよい。融合タンパク質は、当業者に既知の従来法、例えば、適切な宿主細胞で前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の遺伝子発現により、得ることができる。
【００２９】
本発明のタンパク質は、それが望ましければ、本発明の前記タンパク質と不活性ビヒクルを含む組成物に見ることができる。前記組成物は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００３０】
事実上、任意の不活性ビヒクル、すなわち、本発明のタンパク質に害を及ぼさないものを、前記組成物の調製に用いることができる。特定の実施形態において、制限ではなく例示の目的で、前記組成物は、本発明のタンパク質と、精製した本発明のタンパク質を-７０℃に維持するのに適した、５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、７ｍＭのβ-メルカプトエタノール、および５０％のグリセロールからなる緩衝液とを含む。
【００３１】
本発明のタンパク質により得られる情報から、前記タンパク質をコードする核酸配列は、当業者に既知の従来技法；例えば、前記タンパク質を産生する生物からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）またはコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のゲノムライブラリーを作り；前記ゲノムライブラリーを調べるように設計されたプローブを得るのに用いることができる、前記タンパク質を産生する生物のゲノムクローンの領域を、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で増幅するのに適したオリゴヌクレオチドを設計し；そして陽性クローンを分析および選択することにより、同定および単離することができる。
【００３２】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明の前記タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド（本明細書中以下、本発明のポリヌクレオチド）に関する。
【００３３】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなるものである。具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、φ２９のタンパク質ｐ５６をコードする。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列に関して、その配列に変異を示してもよい：例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入および／または欠失であるが、ただし得られるポリヌクレオチドは本発明のタンパク質をコードする。したがって、本発明の範囲は、配列番号２のポリヌクレオチドと実質的に相同であり本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３４】
本明細書中用いられる意味において、ポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が、配列番号２のヌクレオチド配列に関して、少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、そしてより好ましくは少なくとも、９５％の相同性を有する場合、配列番号２のポリヌクレオチドと「実質的に相同」である。代表的には、配列番号２のポリヌクレオチドと実質的に相同であるポリヌクレオチドは、前記配列番号２に含まれる情報に基づいて本発明のタンパク質を産生するか、配列番号２に示されるＤＮＡ配列に基づいて構築された生物から単離することができる；例えば、保存的または非保存的置換を導入することによる。可能な修飾の他の例として、配列に１つまたは複数のヌクレオチドを挿入すること、配列の末端いずれかに１つまたは複数のヌクレオチドを加えること、または配列の末端いずれかもしくは配列内において１つまたは複数のヌクレオチドを取り去ることが挙げられる。
【００３５】
別の態様において、本発明は、本発明の前記ポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物（本明細書中以下、本発明の遺伝子構築物）に関する。
【００３６】
本発明の遺伝子構築物は、操作可能なように結合した本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する配列を組み込み、そして発現カセットを形成することができる。本明細書中用いる場合、「操作可能なように結合した」という表現は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる本発明のタンパク質が、発現制御もしくは調節配列の制御下、正しい読み枠内で発現されることを意味する。
【００３７】
制御配列は、本発明のタンパク質の転写、および適切ならば、翻訳を制御調節する配列で、プロモーター配列、転写調節コード配列、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）および／または転写終結配列を含む。特定の実施形態において、前記発現制御配列は、原核細胞および原核生物（例えば、細菌など）で機能する。一方、別の特定の実施形態において、前記発現制御配列は真核細胞および真核生物（例えば、昆虫細胞、野菜細胞、哺乳類細胞など）で機能する。有利には、本発明の構築物はさらに、前記構築物により形質転換した宿主細胞の選択を可能にするモチーフまたは表現形をコードするマーカーまたは遺伝子を含む。
【００３８】
本発明の遺伝子構築物は、当該分野で広く既知である技法を用いて得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ，１９８９  Ｖｏｌ．１−３）。
【００３９】
本発明の遺伝子構築物は、適切なベクターに挿入されてもよい。したがって、別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の遺伝子構築物を含む組換えベクター（本明細書中以下、本発明のベクター）に関する。ベクターの選択は、それがその後導入されるであろう宿主細胞に依存する。特定の実施形態において、本発明のベクターは発現ベクターである。
【００４０】
例示を目的として、前記核酸配列が導入されたベクターはプラスミドであってもよく、このプラスミドは宿主細胞に導入された場合、前記細胞のゲノムに組み込まれるか組み込まれない。本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の遺伝子構築物を挿入することができるベクターの、非制限的な例示としての例として、インビトロジェンから市販されているプラスミドｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯ（Ｅ．コリの発現ベクター）、またはプラスミドｐＰＲ５３（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の発現ベクター）（Ｂｒａｖｏ  ａｎｄ  Ｓａｌａｓ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：１０２−１１２）が挙げられる。
【００４１】
本発明のベクターは、当業者に既知の従来法により得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ，１９８９  Ｖｏｌ．１−３）。特定の実施形態において、前記ベクターは動物細胞を形質転換するのに有用なベクターである。
【００４２】
本発明のベクターは、前記ベクターにより形質転換、形質移入、または感染しやすいと思われる細胞を形質転換、形質移入、または感染するのに用いることができる。こうした細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。本発明のベクターは、酵母菌細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））などの真核細胞、または細菌（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはバチルス・サブチリスなど）などの原核細胞を形質転換するのに用いることができる。本発明のベクターにより形質転換、形質移入、または感染しやすいと思われる細胞の非制限的な例示としての例として、Ｅ．コリＴＯＰ１０（インビトロジェン）、Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ（１９８６）Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０）．サブチリス１１０ＮＡ（Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｖｉｔｒｏｌｏｇｙ  ６２：１−１６）、およびＢ．サブチリスＹＢ８８６（Ｙａｓｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｇｅｎｅ  １２：１５５−１５９）が挙げられる。
【００４３】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明により提供されるベクターで形質転換、形質移入、または感染する宿主細胞（本明細書中以下、本発明の細胞）に関する。したがって、本発明の細胞は、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明により提供される発現カセット、または本発明のベクターを含み、本発明のタンパク質を発現することができる。
【００４４】
本発明の細胞は、酵母菌細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ）などの真核細胞であっても、微生物（例えば、Ｅ．コリまたはＢ．サブチリス）などの原核細胞であってもよい。本発明の細胞を得るのに用いることができる細胞の非制限的な例示としての例として、Ｅ．コリＴＯＰ１０（インビトロジェン）、Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ（１９８６）Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０）、Ｂ．サブチリス１１０ＮＡ（Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｖｉｔｒｏｌｏｇｙ  ６２：１−１６）、およびＢ．サブチリスＹＢ８８６（Ｙａｓｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｇｅｎｅ  １２：１５５−１５９）が挙げられる。
【００４５】
本発明の細胞は、当業者に既知の従来法により得ることができる［Ｓａｍｂｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，前出］。
【００４６】
別の態様において、本発明は本発明のタンパク質を得る方法に関し、この方法は、本発明のタンパク質を産生させ、そうすることが望ましければ、前記タンパク質を培養培地から回収することを可能にする条件下で前記細胞を培養することを含む。前記細胞の培養を最適にする条件は、用いる細胞に依存するだろう。本発明のタンパク質を産生する方法は、随意に、この本発明のタンパク質を単離精製することを含む。
【００４７】
上記に記載のとおり、本発明のタンパク質はＵＤＧ酵素を阻害する能力を有し、このため、治療薬として、特に抗ウイルス剤として用いることができる。
【００４８】
したがって、別の態様において、本発明は、治療薬としての本発明のタンパク質に関する。特定の実施形態において、本発明は、抗ウイルス剤としての本発明のタンパク質に関する。
【００４９】
一般に、被検体に投与する目的で、本発明のタンパク質は薬学的組成物に配合されるだろう。したがって、別の態様において、本発明は、本発明のタンパク質を、１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤とともに含む薬学的組成物（本明細書中以下、本発明の薬学的組成物）に関する。
【００５０】
「被検体」という用語は、本明細書中使用される場合、哺乳類の一員を示し、ペット、霊長類、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、被検体はヒトであり、任意の年齢または人種の男性または女性である。
【００５１】
より詳細には、被検体に投与する目的で、本発明のタンパク質は、任意の投与経路で被検体に投与するのに適した薬学的形態に配合されるだろう。そのために、本発明の薬学的組成物は、選択された投与用の薬学的形態を調製するのに必要な薬学的に許容可能なビヒクルおよび賦形剤を含むだろう。
【００５２】
本発明の薬学的組成物は、少なくとも、本発明のタンパク質を治療上有効な量で含む。本明細書中用いられる意味において、「治療上有効な量」という表現は、所望の効果をもたらすように計算された本発明のタンパク質の量を示し、一般に、他の原因よりも、タンパク質の特性および達成されるべき治療効果によって決定されるだろう。
【００５３】
例示を目的として、被検体に投与されるべき本発明のタンパク質の用量は、治療上有効な量であり、広い範囲で変化するだろう。本発明の薬学的組成物は、予防目的または治療目的で１日に１回または複数回投与されてもよい。投与されるべき本発明のタンパク質の用量は、多数の要因に依存し、要因として、用いる本発明のタンパク質の特性（例えば、その活性および生物学的半減期など）、本発明のタンパク質の薬学的組成物中の濃度、被検体の臨床状態、感染または病状の重篤度、選択した投与用の薬学的形態などが挙げられる。このため、本発明で記載される用量は、当業者への案内に過ぎず、当業者は上記の変数に基づいて用量を調節しなければならないことが理解されるはずである。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は、任意の適した投与経路で投与されるために、固体の薬学的形態（例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒、坐剤など）、または液体の形態（溶液、懸濁液、乳濁液など）に配合することができる。特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、経口、直腸、局所的、または非経口経路（例えば、筋肉内、皮下、静脈内など）で投与される。それぞれの場合において、選択された薬学的形態および投与経路に適した薬学的に許容可能な賦形剤が選択されるだろう。
【００５５】
特定の実施形態において、本発明のタンパク質は、局所的投与に適した薬学的形態に配合されるだろう。前記薬学的形態の非制限的な例示としての例として、エアロゾル、溶液、懸濁液、乳濁液、ゲル、軟膏、クリーム、包帯、パッチ、洗口液などが挙げられる。そのために、本発明の薬学的組成物は、その薬学的形態を調製するために必要な薬学的に許容可能なビヒクルおよび賦形剤を含むだろう。前記ビヒクルおよび賦形剤について、ならびに本発明のタンパク質を投与するためのこの薬学的形態についての情報は、製剤学論文に見つけることができる。一般に、薬について、その投与の様々な薬学的形態およびその調製法の総説は、「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌeｎｉｃａ」（Ｃ．Ｆａｕｌi  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３，Ｌｕｚaｎ  ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ）という本に見つけることができる。
【００５６】
別の特定の実施形態において、本発明のタンパク質は、経口投与に適した薬学的形態に配合されるだろう。特定の実施形態において、本発明のタンパク質の経口投与用の前記薬学的形態は固体であっても液体であってもよい。経口経路で本発明のタンパク質を投与するのに適した薬学的形態の非制限的な例示としての例として、錠剤、カプセル剤、シロップおよび溶液が挙げられ、結合剤（例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドンなど）；増量剤（ｌｏａｄｓ）（例えば、ラクトース、糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシンなど）；錠剤を調製するための潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）；離解剤（例えば、デンプン、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、微結晶性セルロースなど）；薬学的に許容可能な湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウムなど）の、当該分野で既知の従来賦形剤を含んでもよい。前記ビヒクルまたは賦形剤について、ならびに本発明のタンパク質を投与するための前記薬学的形態についての情報は、「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌeｎｉｃａ」（Ｃ．Ｆａｕｌi  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３，Ｌｕｚaｎ  ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ、前出）という本に見つけることができる。
【００５７】
別の特定の実施形態において、本発明のタンパク質は、非経口投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内など）に適した薬学的形態、例えば、適した単位薬学的形態の、滅菌溶液、懸濁液、または凍結乾燥生成物の形に配合されるだろう。適した賦形剤（緩衝剤、界面活性剤、保存料など）を用いることができる。前記ビヒクルまたは賦形剤について、ならびに本発明のタンパク質を投与するための前記薬学的形態についての情報は、「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌeｎｉｃａ」（Ｃ．Ｆａｕｌi  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３，Ｌｕｚaｎ  ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ、前出）という本に見つけることができる。
【００５８】
選択した経路のいずれかにより本発明のタンパク質を投与するための前記薬学的形態の製造は、当業者に既知の従来法（スペインおよび米国薬局方に、および同様な参照文献に記載または記述のある習慣的方法など）により行うことができる。例示を目的として、本発明のタンパク質を投与するための前記薬学的形態の製造法についての情報は、「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌeｎｉｃａ」（Ｃ．Ｆａｕｌi  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３，Ｌｕｚaｎ  ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ、前出）という本に見つけることができる。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、抗ウイルス剤として、すなわち、ウイルス感染（ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスに引き起こされる感染など）の治療および／または予防に用いられる。
【００６０】
本発明の薬学的組成物は、他の薬と一緒に用いて併用療法を提供することができる。他の薬は、同じ組成物の一部であってもよく、本発明の薬学的組成物と同時に（同時投与）または別々に（逐次投与）される別々の薬学的組成物として供給されてもよい。特定の実施形態において、併用療法に用いられる前記薬として抗ウイルス剤が挙げられる。
【００６１】
別の態様において、本発明は、抗ウイルス薬学的組成物の調製、すなわち、ウイルス感染の治療および／または予防用薬学的組成物の調製における本発明のタンパク質の使用に関する。
【００６２】
本発明の薬学的組成物である前記抗ウイルス薬学的組成物は、少なくとも１種の本発明のタンパク質を、１種または複数の薬学的に許容可能なビヒクルまたは賦形剤とともに含む。
【００６３】
特定の実施形態において、前記抗ウイルス薬学的組成物は、本発明のタンパク質の抗ウイルス剤としての有効性を増加させ、それにより併用療法をもたらす目的で、本発明のタンパク質の他に、タンパク質起源またはそれ以外の１種または複数のさらなる抗ウイルス性化合物または薬を含んでもよい。前記さらなる薬は、同じ薬学的組成物の一部であってもよく、あるいは、本発明の薬学的組成物の投与に関して同時または連続して（時系列で）投与される別々の組成物の形で供給されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
以下の例は、本発明を例示するが、その範囲を限定すると理解されるべきではない。
【実施例１】
【００６５】
タンパク質ｐ５６はＵＤＧ酵素活性を阻害し、そのうえＵＤＧ酵素に結合する
１．材料および方法
１．１  プラスミドｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯ．ｐ５６の構築
インビトロジェンが開発したＴＯＰＯ  ＴＡクローニングシステムを用いた。簡単には、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、φ２９の遺伝子５６を含むＤＮＡ領域を、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅した：
５’-ＣＧＣＡＴＴＧＴＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＴＡＧＧＡＴＧＧ-３’［配列番号３］
５’-ＧＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣ-３’［配列番号４］
【００６６】
この増幅では、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたが、これは、増幅した断片（２６７ｐｂ）の３’末端にデオキシアデノシン残基を付加して、それにより突出末端を生成する特性を有する。誘導性発現ベクターとして、インビトロジェンが販売する直線形のプラスミドｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯを用いた。その突出３’末端は、デオキシチミジン残基を有し、ワクシニアウイルスのＤＮＡトポイソメラーゼＩ酵素に共有結合している。このクローニングシステムを用いると、制限酵素での消化およびＤＮＡリガーゼの使用は必要ない。なぜならＤＮＡトポイソメラーゼＩが核酸連結反応を担うからである。続いて、核酸連結混合物を用いてＥ．コリ株ＴＯＰ１０（インビトロジェン）を形質転換した。カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）耐性の形質転換体を選択して、制限酵素で消化することによりプラスミド含量を分析した。組換えプラスミドは、ｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯ．ｐ５６と呼ぶことにした。遺伝子５６の完全性は、配列決定で確認した。
【００６７】
１．２  プラスミドｐＰＲ５３．ｐ５６の構築
遺伝子５６を保有するプラスミドｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯ．ｐ５６の２７２-ｐｂ  ＰｓｔＩ断片を、発現ベクターｐＰＲ５３（Ｂｒａｖｏ  ａｎｄ  Ｓａｌａｓ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：１０２−１１２）のＰｓｔＩ部位でクローニングした。クローニングのため、Ｂ．サブチリスＹＢ８８６株（Ｙａｓｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｇｅｎｅ  １２：１５１−１５９）を用いた。フレオマイシン（０．８μｇ／ｍｌ）耐性の形質転換体を選択した。組換えプラスミドは、ｐＰＲ５３．ｐ５６と呼ぶことにした。ＹＢ８８６［ｐＰＲ５３．ｐ５６］株は、構成的にタンパク質ｐ５６を産生する。
【００６８】
１．３．プラスミドｐＰＲ５３．ｐ５６ＦＬＡＧの構築
Ｃ末端に融合したＤＹＫＤＤＤＤＫペプチドを保有するｐ５６タンパク質（タンパク質ｐ５６ＦＬＡＧ）を遺伝子５６がコードできるように、遺伝子５６の配列を定方向突然変異誘発で修飾した。この突然変異誘発は２工程で行った。最初に、遺伝子５６を、テンプレートとしてのプラスミドｐＰＲ５３．ｐ５６およびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで増幅した：
５’-ＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧ-３’［配列番号５］
５’-ＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＧＴＣＡＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＧ-３’［配列番号６］
【００６９】
第二の工程では、２９８ｐｂの増幅した断片をテンプレートとして用い、配列番号５および配列番号７［５’-ＣＣＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＧＴＣ-３’］として同定されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。
【００７０】
配列番号５および配列番号７のプライマーオリゴヌクレオチドは、ＰｓｔＩ酵素の認識配列を保有する。続いて、増幅した断片（３２２ｐｂ）をＰｓｔＩ酵素で消化し、２９３-ｐｂの消化産物を、発現ベクターｐＰＲ５３（Ｂｒａｖｏ  ａｎｄ  Ｓａｌａｓ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：１０２−１１２）のＰｓｔＩ部位にクローニングした。核酸連結混合物を用いて、Ｂ．サブチリスＹＢ８８６株（Ｙａｓｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｇｅｎｅ  １２：１５１−１５９）を形質転換した。フレオマイシン（０．８μｇ／ｍｌ）耐性の形質転換体を選択した。組換えプラスミドは、ｐＰＲ５３．ｐ５６ＦＬＡＧと呼ぶことにした。ＹＢ８８６［ｐＰＲ５３．ｐ５６ＦＬＡＧ］株は、構成的にタンパク質ｐ５６ＦＬＡＧを産生する。続いて、ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質タンパク質相互作用研究を行う目的で、プラスミドｐＰＲ５３．ｐ５６ＦＬＡＧをＢ．サブチリス１１０ＮＡ株（Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｖｉｔｒｏｌｏｇｙ  ６２：１−１６）に導入した。
【００７１】
１．４タンパク質ｐ５６の精製
プラスミドｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯ．ｐ５６を、電気穿孔技法によりＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入した。ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯ．ｐ５６］株を、３４℃で、カナマイシン含有ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ）で増殖させた。培養物の光学密度が５６０ｎｍ（ＯＤ５６０）で０．９に達したところで、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで加えた。３０分後、リファンピシンを加え（１２０μｇ／ｍｌ）、培養物のインキュベートを７５分間続けた。細胞ペレットは、使用するまで-７０℃に保った。ｐ５６を精製する目的で、０．６５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、７ｍＭのβ-メルカプトエタノール、５％のグリセロール）中、アルミナで細胞を溶解した。アルミナおよび細胞残渣を遠心分離で除去した後、溶菌液をポリエチレンイミン（０．３％）と一緒に２０分間インキュベートし、続いてこれをＳｏｒｖａｌｌ-ＧＳＡローター中１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットを、０．７ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａで洗浄した。遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ-ＳＳ３４ローター中１２，０００ｒｐｍで２０分間）に続いて、硫酸アンモニウムでの逐次沈殿工程を行った（それぞれ、６５％飽和、４５％飽和、および３０％飽和）。最後の沈殿の上清を最終濃度５０％にした。遠心分離に続いて、ペレットを、塩濃度が５５ｍＭ（伝導率から見積もって）である緩衝液Ａに再懸濁させた。タンパク質調製物を、５５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａで平衡化したＭｏｎｏ  Ｑカラムにロードした。タンパク質ｐ５６は、０．３ＭのＮａＣｌでカラムから溶出した。最後に、タンパク質調製物を、グリセロール勾配（１５％〜３０％）中にロードして、Ｂｅｃｋｍａｎ-ＳＷ．６５ローター中６２，０００ｒｐｍで２０時間遠心分離した。タンパク質ｐ５６を含有する画分を収集して７０％硫酸アンモニウムで沈殿させた。タンパク質ｐ５６を５０％グリセロール含有緩衝液Ａに再懸濁させて-７０℃で貯蔵した。
【００７２】
１．５  タンパク質ｐ５６により媒介されるＵＤＧ活性の阻害
Ｂ．サブチリス抽出物中のＵＤＧ活性の検出
細胞抽出物を調製する目的で、Ｂ．サブチリス１１０ＮＡ株（Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｖｉｔｒｏｌｏｇｙ  ６２：１−１６）を、ＬＢ培地中３０℃で、培養１ｍｌあたり１０８の生細胞数に等しいＯＤ５６０まで増殖させた。次いで、培養物を、ロシェ・アプライド・サイエンスから得たプロテアーゼ阻害剤混合物（「コンプリート、ミニ、ＥＤＴＡフリー」の１０ｍｌ用の錠剤）を含有する緩衝液Ｕ（５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのβ-メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡ）中、１０倍に濃縮した。培養物を、フレンチプレス（２０，０００ｐｓｉ）を用いて溶解させ、続いて溶菌液を、Ｓｏｒｖａｌｌ-ＳＳ．３４ローター中７，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離した。上清（細胞抽出物）を、最大で２週間、４℃に維持した。抽出物中の合計タンパク質濃度（１．３５ｍｇ／ｍｌ）は、Ｌｏｗｒｙ法で計算した。
【００７３】
Ｆａｍｉｌｙ-１に属するＵＤＧ活性を持つ酵素は、単鎖ＤＮＡおよび二重鎖ＤＮＡの両方からウラシル残基を除去する。ウラシル残基の除去は、ＤＮＡに無塩基部位（ＡＰ部位）を作り出し、これは、Ｂ．サブチリスでは、タンパク質ＥｘｏＡにより認識されてプロセシングされる。ＡＰエンドヌクレアーゼ活性がない場合、ＮａＯＨと熱で処理することにより、ＡＰ部位でＤＮＡ鎖スプライシングを行うことが可能である。細胞抽出物中のＵＤＧ活性を測定する目的で、１６位にウラシル残基を保有する単鎖ＤＮＡ（３４ヌクレオチド）（ｓｓＤＮＡ-Ｕ１６基質）を用いた。ｓｓＤＮＡ-Ｕ１６ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は以下のとおりである：５’-ＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＧＣＵＧＴＡＣＣＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＧ-３’［配列番号８］。［γ-３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、このＤＮＡの５’末端に放射活性標識を付けた。反応混合物（２０μｌ）は、０．５５ｎｇのｓｓＤＮＡ-Ｕ１６基質および記載される量の細胞抽出物（０．０５μｇ〜３．２μｇ）を緩衝液Ｕ中に含むものであった。混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。続いて、これをＮａＯＨ（０．２Ｍ）で処理して、９０℃で３０分間インキュベートした。試料を、尿素含有（８Ｍ）ポリアクリルアミドゲル（２０％）中で電気泳動して分析した。得られた結果を図１Ａに示す。
【００７４】
タンパク質ｐ５６がＵＤＧ活性の阻害剤であるかどうかを分析する目的で、ｓｓＤＮＡ-Ｕ１６基質（０．５５ｎｇ）を、１．６μｇの細胞抽出物（基質の全スプライシングを得るのに充分な量）と一緒に、および様々な量のタンパク質ｐ５６（０．５ｎｇ〜１６ｎｇの間）と一緒にインキュベートした。上記のように、反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートして、ＮａＯＨ（０．２Ｍ）で処理して、９０℃で３０分間インキュベートした。
【００７５】
１．６  タンパク質ｐ５６とＵＤＧ酵素との相互作用
ＵＤＧ酵素がタンパク質ｐ５６の細胞標的であるかどうかを分析する目的で、アフィニティークロマトグラフィーアッセイを行った。簡単には、Ｂ．サブチリス１１０ＮＡ［ｐＰＲ５３．ｐ５６ＦＬＡＧ］株を、フレオマイシン（０．８μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で、３０℃で、１ｍｌあたり１０８の生細胞数に等しいＯＤ５６０まで増殖させた。培養物を、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中１０倍に濃縮して、フレンチプレス（２０，０００ｐｓｉ）を用いて溶解させた。溶菌液を、Ｓｏｒｖａｌｌ-ＳＳ．３４ローター中７，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離した。上清を抗ＦＬＡＧ  Ｍ２カラム（Ｓｉｇｍａ）にロードした。カラムに結合したタンパク質を、ＦＬＡＧペプチド（５００μｇ／ｍｌ）含有ＴＢＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で溶出させた。溶出したタンパク質をアセトンで沈殿させ、ロード緩衝液（６０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％のＳＤＳ、５％のβ-メルカプトエタノール、３０％のグリセロール）中に再懸濁させ、ポリアクリルアミド／トリシン／ＳＤＳゲル（Ｓｈａｇｇｅｒ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：３６８−３７９）中電気泳動して分離した。ゲルをＳｙｐｒｏＲｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。陰性対照として、１１０ＮＡ［ｐＰＲ５３］株の抽出物を用いた。第二の実験では、タンパク質ｐ５６（２μｇ）をＥ．コリのＵＤＧ酵素（０．２μｇ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とともにインキュベートした。周辺温度で１５分後、反応物を自然のポリアクリルアミドゲル（１６％）中電気泳動して分析した。ゲルをＳｐｙｒｏＲｕｂｙで染色した。
【００７６】
ＩＩ．結果
２．１  タンパク質ｐ５６はＵＤＧ酵素と相互作用する
基質（ｓｓＤＮＡ-Ｕ１６）を０．２μｇのＢ．サブチリス細胞抽出物とともにインキュベートすると、スプライシング産物が産生された。そのうえ、実験結果は、１．６μｇの細胞抽出物を用いた場合、この基質が完全にスプライシングされたことを示す（図１Ａ）。基質をＥ．コリのＵＤＧ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とともにインキュベートした場合、同じスプライシング産物が検出された。したがって、この結果は、Ｂ．サブチリス抽出物が、ウラシル残基を基質から除去してＡＰ部位を作り出すことができた、すなわち前記抽出物がＵＤＧ活性を有することを示す。しかしながら、反応混合物をＮａＯＨで処理しなかった場合、基質のスプライシングは検出されなかった（図１Ａ）ことから、アッセイを行った条件下（Ｍｇ２＋の不在）、Ｂ．サブチリス抽出物はＡＰエンドヌクレアーゼ活性を欠いていた。
【００７７】
２．２．タンパク質ｐ５６はＵＤＧ活性を阻害する
タンパク質ｐ５６がＵＤＧ活性の阻害剤であることを証明する目的で、ｓｓＤＮＡ-Ｕ１６基質（０．５５ｎｇ）を１．６μｇの細胞抽出物（基質の全スプライシングを得るのに充分な量）とともに、および様々な量のタンパク質ｐ５６（０．５ｎｇ〜１６ｎｇの間）とともにインキュベートした。材料および方法の第１．５節ですでに記載したとおり、反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、ＮａＯＨ（０．２Ｍ）で処理して、９０℃で３０分間インキュベートした。図１Ｂは得られた結果を示す。２ｎｇのタンパク質ｐ５６の存在下、スプライシング産物量の減少が検出された。さらに、８ｎｇのタンパク質ｐ５６を加えた場合、基質は無傷のままだった。すなわち、この結果は、タンパク質ｐ５６がＵＤＧ活性を阻害することを示す。
【００７８】
図２Ａに示すとおり、５種のタンパク質（Ａ〜Ｅ）がｐ５６ＦＬＡＧと同時溶出した。ペプチドマスフィンガープリンティング法とＭＡＳＣＯＴプログラム（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０：３５５１−３５６７）を用いて、タンパク質ＤがＵＤＧ酵素（２６ｋＤａ）であると同定した。遊離ＵＤＧよりも速く移動したバンドが検出された（図２Ｂ）。ウエスタンブロット法およびペプチドマスフィンガープリンティング法を用いて、前記バンドがｐ５６およびＵＤＧを含有することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】Ｂ．サブチリス抽出物でのＵＤＧ活性を示す。放射活性な標識を付けたｓｓＤＮＡ-Ｕ１６基質（Ｓ）（０．５５ｎｇ）をＭｇ２＋なしで、記載される量の抽出物とともにインキュベートした。内部標準として、基質をＥ．コリのＵＤＧ酵素とともにインキュベートした。反応混合物をＮａＯＨありまたはなしで処理した。スプライシング産物（Ｐ）の形成を、ポリアクリルアミド-尿素ゲルで分析した。
【図２】タンパク質ｐ５６によるＢ．サブチリスのＵＤＧ活性の阻害を示す。記載される量のｐ５６を１．６μｇの抽出物に加えた。反応物をＮａＯＨで処理した。
【図３】抗ＦＬＡＧＭ２カラム（Ｓｉｇｍａ）を用いた、Ｂ．サブチリスのＵＤＧとタンパク質ｐ５６ＦＬＡＧとの同時溶出を示す。用いたマーカーの分子質量（ｋＤａ）は、右側に示す。
【図４】未変性ポリアクリルアミドゲルで分析した、タンパク質ｐ５６とＥ．コリのＵＤＧ酵素との相互作用を示す。
【図２】
2009520487.tif 000002
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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