(57)【要約】  高い発光効率を有し発光強度に優れ、かつロット間及び粒子間の発光特性のばらつき巾が小さく、安定性・再現性に優れた半導体ナノ粒子を提供する。更に、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法を提供する。本発明の半導体ナノ粒子は、平均粒径が１〜２０ｎｍである半導体ナノ粒子であって、それを構成する主要成分原子と等価の価電子配置をもつ異種原子もしくは当該異種原子の原子対をドーパントとして含有し、かつ当該ドーパントが半導体ナノ粒子表面又はその近傍に分布していることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒径が１〜２０ｎｍである半導体ナノ粒子であって、それを構成する主要成分原子と等価の価電子配置をもつ異種原子もしくは当該異種原子の原子対をドーパントとして含有し、かつ当該ドーパントが半導体ナノ粒子表面又はその近傍に分布していることを特徴とする半導体ナノ粒子。
【請求項２】
前記主要成分原子がシリコン（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の半導体ナノ粒子。
【請求項３】
前記原子対がＢｅ−Ｂｅであることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の半導体ナノ粒子。
【請求項４】
請求の範囲第１項から第３項に記載の半導体ナノ粒子であって、当該半導体ナノ粒子の表面から半径の３０％の範囲以内に前記ドーパントが分布していることを特徴とする半導体ナノ粒子。
【請求項５】
請求の範囲第１項から第４項のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子の表面に生体に親和性を有する、もしくは、接合できる表面修飾化合物を配置したことを特徴とする蛍光標識物質。
【請求項６】
蛍光標識物質が発する蛍光により標的細胞内の分子を可視化する分子・細胞イメージング法において、当該蛍光標識物質が請求の範囲第１項から第４項のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子を有することを特徴とする分子・細胞イメージング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導体ナノ粒子、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞もしくは小動物を対象に生体内の分子をターゲットにした可視化イメージングで分子動態、分子間相互作用、分子位置情報を明らかにし、生命科学機構の解明、創薬スクリーニングに繋げようとする分子イメージングの基礎研究が活発に行われている。生体分子をプローブする従来標識剤には蛍光有機色素、有機蛍光タンパク、ルシフェラーゼ（酵素）−ルシフェリンリン（基質）発光体が一般に用いられている。これら標識剤は、蛍光発光については検出感度向上が従来より要望されており、特に小動物のｉｎ  ｖｉｖｏではより深い領域でのイメージング化という切なる要求に対していまだに十分に応えきれてない状況にあった。これらの要求に対し、新規構造をもつ標識剤を形成し発光もしくは蛍光強度を上げることで対応しようとする研究が行われていた。【０００３】
しかし、検出感度を高めようと励起光強度を上げようとした時には生体分子に侵襲性を齎す光毒性の問題や、標識自体が光分解し耐久性に乏しいという問題が存在する。【０００４】
ところで、ナノテクノロジーにおける最近の進歩は、いわゆるナノ粒子を、検出、診断、感知及びその他の用途に使用することの可能性を示唆している。また、生物系と相互作用するナノ粒子複合体は、最近生物及び医学の分野で広く関心を集めている。これらの複合体は、感知（例えば画像化）及び治療目的（例えば薬物送達）の両方にとって新規血管内プローブとして有望であると考えられている。【０００５】
半導体や金属などの超微細粒子のうち、電子の波長（１０ｎｍ程度）より小さい粒子径を有するナノサイズの粒子は、量子サイズ効果として電子の運動に対するサイズ有限性の影響が大きくなってくるために、バルク体とは異なる特異な物性を示すことが知られている（非特許文献１）。【０００６】
一般に、ナノ・メートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）効果を示す物質、例えば半導体ナノ粒子は、「量子ドット」とも称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。したがって、量子ドットの大きさまたは物質組成を調節すると、エネルギーバンドギャップを調節することができて様々な水準の波長帯のエネルギーを利用することができる。【０００７】
また、量子ドット、すなわち半導体ナノ粒子は、同一組成で、粒径を変化させることで、発光波長をコントロールできるという特徴をもつ。従来技術である有機蛍光色素に比較して安定性、発光の明るさの点で優れており注目されている。【０００８】
なお、当該量子ドットは、粒径を量子効果が現れるサイズまで極小化すると、強い励起子をもたらす量子閉じ込め効果によって発光効率が向上し、目視で確認されるほどの発光が得られることも知られている。【０００９】
しかし、その蛍光発光を各種検出剤として用いるには発光が不足するため、輝度を上げるべく様々な工夫がされてきた。例えば、シリコン半導体ナノ粒子（量子ドット）の表面に酸化ケイ素（ＳｉＯ2）などのシェルを形成すことにより粒子表面の欠陥を減少させ、不動態化することにより発光効率を向上する手段が知られている。しかし、これら従来手段では高い発光性を得るには不十分であり、その上ロット間の安定性及び再現性が不十分で改善が求められていた。【００１０】
これは、シリコン半導体ナノ粒子（量子ドット）の発光が、間接遷移でフォノンを介した発光になるため発光強度が極端に低く、バルクの粒径では殆ど発光しないシリコンにとっては十分でない場合が多い。間接遷移の影響を受けず高い発光性を得る手段として等電子トラップを用いる技術が公開されているが（例えば第６８回応用物理学会  講演予稿集６ａ−Ｌ−４参照）、安定性が十分でなく、同じロットでも粒子間で発光が異なるなど発光の分布も安定しないという問題がある。【００１１】
上記の半導体ナノ粒子（量子ドット）関連技術分野の研究・開発、特に、生物及び医学の分野への応用を目指す研究・開発は、緒に就いたばかりであり、解決すべき課題が山積されている状況にある（例えば、特許文献１〜３参照。）。
【特許文献１】特開２００４−９９３４９号公報
【特許文献２】特開２００５−３１４４０８号公報
【特許文献３】特開２００５−１０１６０１号公報
【非特許文献１】「日経先端技術」、２００３．１．２７号、１〜４ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、高い発光効率を有し発光強度に優れ、かつロット間及び粒子間の発光特性のばらつき巾が小さく、安定性・再現性に優れた半導体ナノ粒子を提供することである。更に、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、半導体ナノ粒子母体を構成する主要成分原子と同じ価電子配置をもつ原子を表面又はその近傍に均一に分布させることによって、高い安定性で高い発光強度の蛍光発光を得られることを見出し、本発明に至った。【００１４】
すなわち、本発明に係る上記課題は下記の手段により解決される。【００１５】
１．平均粒径が１〜２０ｎｍである半導体ナノ粒子であって、それを構成する主要成分原子と等価の価電子配置をもつ異種原子もしくは当該異種原子の原子対をドーパントとして含有し、かつ当該ドーパントが半導体ナノ粒子表面又はその近傍に分布していることを特徴とする半導体ナノ粒子。【００１６】
２．前記主要成分原子がシリコン（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）であることを特徴とする前記１に記載の半導体ナノ粒子。【００１７】
３．前記原子対がＢｅ−Ｂｅであることを特徴とする前記１又は２に記載の半導体ナノ粒子。【００１８】
４．前記１から３に記載の半導体ナノ粒子であって、当該半導体ナノ粒子の表面から半径の３０％の範囲以内に前記ドーパントが分布していることを特徴とする半導体ナノ粒子。【００１９】
５．前記１から４のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子の表面に生体に親和性を有する、もしくは、接合できる表面修飾化合物を配置したことを特徴とする蛍光標識物質。【００２０】
６．蛍光標識物質が発する蛍光により標的細胞内の分子を可視化する分子・細胞イメージング法において、当該蛍光標識物質が前記１から４のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子を有することを特徴とする分子・細胞イメージング法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の上記手段により、高い発光効率を有し発光強度に優れ、かつロット間及び粒子間の発光特性のばらつき巾が小さく、安定性・再現性に優れた半導体ナノ粒子を提供することができる。更に、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法を提供することができる。【００２２】
上記発明の効果は、半導体ナノ粒子母体を構成する主要成分原子と同じ価電子配置をもつ原子をドープしたことによって高い発光効率が得られたこと、特にシリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子については、間接遷移によらない蛍光発光が得られ、高い発光効率性を得ることができたことによる。更には、ドーパントを表面又はその近傍に均一に局在化する工夫により表面欠陥の影響を皆無にし、高発光効率及び発光のロット間及び粒子間の発光特性のばらつき巾を極小化し、安定性・再現性を向上させたことによる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の半導体ナノ粒子は、平均粒径が１〜２０ｎｍである半導体ナノ粒子であって、それを構成する主要成分原子と等価の価電子配置をもつ異種原子もしくは当該異種原子の原子対をドーパントとして含有し、かつ当該ドーパントが半導体ナノ粒子表面又はその近傍に分布していることを特徴とする。この特徴は、請求の範囲第１項から第６項に係る発明に共通する技術的特徴である。【００２４】
なお、本発明の実施態様としては、前記主要成分原子がシリコン（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）であり、前記原子対がＢｅ−Ｂｅである態様が好ましい。【００２５】
また、当該半導体ナノ粒子の表面から半径の３０％の範囲以内に前記ドーパントが分布していることが好ましい。【００２６】
本発明の半導体ナノ粒子は、その表面に生体に親和性を有する、もしくは、接合できる表面修飾化合物を配置することにより蛍光標識物質に適用することができる。【００２７】
また、当該蛍光標識物質は、それが発する蛍光により標的細胞内の分子を可視化する分子・細胞イメージング法に好適に用いることができる。【００２８】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための最良の形態・態様等について詳細な説明をする。【００２９】
〈半導体ナノ粒子〉
本発明に係る半導体ナノ粒子の材料としては、公知の種々の蛍光発光性化合物及びその原料を用いることができる。例えば、従来、半導体ナノ粒子の材料として知られている種々の半導体材料を用いて形成することができる。具体的には、例えば、元素の周期表のIV族、II−VI族、及びIII−Ｖ族の半導体化合物及びこれらの化合物を構成する元素を含む原料化合物を用いることができる。【００３０】
II−VI族の半導体の中では、特に、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ及びＨｇＴｅを挙げることができる。【００３１】
III−Ｖ族の半導体の中では、ＧａＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ及びＡｌＳを挙げることができる。【００３２】
IV族の半導体の中では、Ｇｅ及びＳｉは特に適している。【００３３】
上記の各種半導体材料のうち、安全性を満たす組成という観点から、特に、Ｓｉ、Ｇｅ、ＩｎＮ、ＩｎＰが好ましい材料として挙げられるが、これらのうちで、本発明の半導体ナノ粒子を構成する主要成分原子としては、シリコン（Ｓｉ）及びゲルマニウム（Ｇｅ）が最も好ましい。なお、本願において、「半導体ナノ粒子を構成する主要成分原子」とは、当該半導体ナノ粒子を構成する原子のうち含有比率が最大である原子をいう。【００３４】
なお、本発明においては、半導体ナノ粒子をコア／シェル構造を有する粒子にすることが好ましい。この場合、半導体ナノ粒子は半導体微粒子からなるコア粒子と当該コア粒子を被覆するシェル層とで構成されるコア／シェル構造を有する半導体ナノ微粒子であって、該コア粒子とシェル層の化学組成が相異するものであることが好ましい。これにより、シェルのバンドギャップは、コアより高くすることが好ましい。【００３５】
シェルはコア粒子の表面欠陥を安定化し輝度を向上させるために必要であるし、表面修飾剤が吸着・結合しやすい面を形成するためにも重要となる。本発明の効果にとっても検出感度の精度を向上するうえで重要な構成である。【００３６】
以下、コア粒子とシェル層について説明する。【００３７】
〈コア粒子〉
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＡｌＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｇｅ、Ｓｉ、又はこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導体材料は、Ｓｉである。【００３８】
本発明に係るコアの平均粒径に関しては、０．５〜１５ｎｍであることが好ましい。【００３９】
なお、本発明において、半導体ナノ粒子の平均粒径は、本来３次元で求める必要があるが、微粒子過ぎるため難しく、現実には二次元画像で評価せざるを得ないため、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真の撮影シーンを変えて数多く撮影し平均化することで求めることが好ましい。従って、ＴＥＭで撮影する粒子数としては１００個以上が好ましい。【００４０】
本発明に係る半導体ナノ粒子は、赤外線領域の波長領域において蛍光発光する、すなわち赤外発光するように、コアの平均粒径を調整することが好ましい。【００４１】
〈シェル層〉
シェルに用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＧａＳ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＡｓ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＡｓ、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、又はこれらの混合物等が挙げられる。【００４２】
本発明において、特に好ましい半導体材料は、ＳｉＯ2、ＺｎＳである。【００４３】
なお、本発明に係るシェル層は、コア粒子が部分的に露出して弊害を生じない限り、コア粒子の全表面を完全に被覆するものでなくてもよい。【００４４】
〈ドーパント〉
本発明の半導体ナノ粒子は、それを構成する主要成分原子と等価の価電子配置をもつ異種原子もしくは当該異種原子の原子対をドーパントとして含有し、かつ当該ドーパントが半導体ナノ粒子表面又はその近傍に均一に分布していることを特徴とする。【００４５】
なお、「価電子」とは、原子を構成する電子殻（Ｋ殻、Ｌ殻、Ｍ殻・・・）の最外殻に保有される電子のことをいう。従って、半導体ナノ粒子構成する主要成分原子をシリコン（Ｓｉ）とした場合は、その価電子は４電子を最外殻に配置しているため、等価の価電子配置をとる原子もしくは原子対はＢｅ−Ｂｅ（Ｂｅ対）、Ｍｇ−Ｍｇ（Ｍｇ対）、Ｇｅなどが挙げられる。【００４６】
本発明の半導体ナノ粒子構成する主要成分原子をシリコン（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）にした場合、ドーパントとして、特にＢｅ−Ｂｅが好ましい。【００４７】
なお、本発明において、ドーパントの含有位置としては、半導体ナノ粒子の表面又はその近傍であることを要する。ここで、「表面の近傍」とは、半導体ナノ粒子の表面から半径の３０％の範囲以内、特に好ましくは１５％の以内範囲である。【００４８】
本発明に係るドーパントの分布状態は、Ｘ線光電子分光分析法（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ；ＸＰＳ：Ｘ−ｒａｙ  Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ／ＥＳＣＡ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）により観察・測定することができる。なお、Ｘ線光電子分光分析法は、単色の光（Ｘ線）照射で飛び出す電子の運動エネルギーを測定することにより、固体表面及びその近傍の状態（例えば元素の組成）を調べる方法である。【００４９】
〈半導体ナノ粒子の粒径〉
本発明に係る半導体ナノ粒子の平均粒径は１〜２０ｎｍであることが好ましい。更には、１〜１０ｎｍであることが好ましい。【００５０】
なお、本発明に係る半導体ナノ粒子のうち、電子の波長（１０ｎｍ程度）より小さい粒子径を有するナノサイズの粒子は、量子サイズ効果として電子の運動に対するサイズ有限性の影響が大きくなってくるために、バルク体とは異なる特異な物性を示すことが知られている。一般に、ナノ・メートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）効果を示す半導体ナノ粒子は、「量子ドット」とも称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。したがって、量子ドットの大きさまたは物質組成を調節すると、エネルギーバンドギャップを調節することができて様々な水準の波長帯のエネルギーを利用することができる。また、量子ドット、すなわち半導体ナノ粒子は、同一組成で、粒径を変化させることで、発光波長をコントロールできるという特徴をもつ。【００５１】
本発明に係る半導体ナノ粒子は、３５０〜１１００ｎｍの範囲の蛍光を発光するように調整することができるが、本発明においては、生体細胞自らがもつ発光の影響をなくしＳＮ比を向上するため、近赤外領域の波長の発光も好ましく用いられる。【００５２】
（半導体ナノ粒子の製造方法）
本発明の半導体ナノ粒子の製造方法としては、従来公知の液相法又は気相法による製造方法を用いることができる。【００５３】
液相法の製造方法としては、沈殿法、共沈法、ゾル−ゲル法、均一沈殿法、還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を作製する上で優れた方法である（例えば、特開２００２−３２２４６８号、特開２００５−２３９７７５号、特開平１０−３１０７７０号、特開２０００−１０４０５８号公報等を参照）。【００５４】
なお、液相法により、半導体ナノ粒子を製造する場合においては、当該半導体の前駆体を還元反応により還元する工程を有する製造方法であることが好ましい。また、当該半導体前駆体の反応を界面活性剤の存在下で行う工程を有する態様が好ましい。なお、本発明に係る半導体前駆体は、上記の半導体材料として用いられる元素を含む化合物であり、たとえば半導体がシリコン（Ｓｉ）の場合、半導体前駆体としてはＳｉＣｌ4などが挙げられる。その他半導体前駆体としては、ＩｎＣｌ3、Ｐ（ＳｉＭｅ3）3、ＺｎＭｅ2、ＣｄＭｅ2、ＧｅＣｌ4、トリブチルホスフィンセレンなどが挙げられる。【００５５】
反応前駆体の反応温度としては、半導体前駆体の沸点以上かつ溶媒の沸点以下であれば、特に制限はないが、７０〜１１０℃の範囲が好ましい。【００５６】
〈還元剤〉
半導体前駆体を還元する還元剤としては、従来周知の種々の還元剤を反応条件に応じて選択し用いることができる。本発明においては、還元力の強さの観点から、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム、水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ（ｓｅｃ−Ｃ4Ｈ9）3）及び水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素カリウム、水素化トリエチルホウ素リチウムなどの還元剤が好ましい。特に、還元力の強さから水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4）が好ましい。【００５７】
〈溶媒〉
半導体前駆体の分散用溶媒としては、従来周知の種々の溶媒を使用できるが、エチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、トルエン、デカン、ヘキサンなどの炭化水素類溶媒を使用することが好ましい。本発明においては、特に、トルエン等の疎水性の溶媒が分散用溶媒として好ましい。【００５８】
〈界面活性剤〉
界面活性剤としては、従来周知の種々の界面活性剤を使用でき、陰イオン、非イオン、陽イオン、両性界面活性剤が含まれる。なかでも第四級アンモニウム塩系である、テトラブチルアンモニウムクロリド、ブロミド又はヘキサフルオロホスフェート、テトラオクチルアンモニウムブロミド（ＴＯＡＢ）、またはトリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミドが好ましい。特に、テトラオクチルアンモニウムブロミドが好ましい。【００５９】
なお、液相法による反応は、液中の溶媒を含む化合物の状態により大きく変化する。単分散性の優れたナノサイズの粒子を製造する際には、特に注意を要する必要がある。例えば、逆ミセル反応法では、界面活性剤の濃度や種類により、反応場となる逆ミセルの大きさや状態が変わってくるため、ナノ粒子が形成される条件が限られてしまう。したがって、適切な界面活性剤は溶媒との組み合わせが必要となる。【００６０】
気相法の製造方法としては、（１）対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法（例えば特開平６−２７９０１５号公報参照）、（２）電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法（例えば特表２００３−５１５４５９号公報参照）、（３）レーザーアブレーション法（例えば特開２００４−３５６１６３号参照）、（４）高速スパッタリング法（例えば特開２００４−２９６７８１号参照）などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。【００６１】
〈半導体ナノ粒子形成後の後処理〉
本発明の半導体ナノ粒子の製造方法においては、半導体ナノ粒子形成後、特にシェル形成後にプラズマ、熱、放射線、又は超音波による処理のいずれかの後処理を行う工程を含む態様も好ましい。【００６２】
プラズマ処理であれば、その粒子組成・結晶性・表面性を考慮し低温・高温プラズマ、マイクロ波プラズマ、大気圧プラズマなど適応するものを選択するが、マイクロ波プラズマが好ましい。【００６３】
熱処理については、大気、真空、不活性ガス領域のいずれかを選択し、熱を施すが蛍光体粒子の構成によりその適用する温度領域は異なる。温度が高すぎた場合にはコアとシェルの間にひずみが生じたり、剥がれが生じることもある。低温では効果に乏しく１００℃以上３００℃以下が好ましく用いられる。【００６４】
放射線処理は、高エネルギーを要するＸ線、γ線、中性子線が用いられたり、エネルギーは低いものの真空紫外線（ＶＵＶ）、紫外線や短パルスレーザーなどが用いられる。その処理時間は放射線の種類によって異なる。Ｘ線などにおいては透過能が高いため、どのような組成においても比較的短時間で済むことが多く、紫外線においては比較的長時間の照射が必要となる。【００６５】
これら後処理の効果については、原理的なものは解明できてないがコア／シェル型粒子のコアとシェルの界面の接合性を強化し、不動態化が促進した結果、発光効率が向上したと推定している。赤外発光体にはその影響が著しく現れ、特性に反映したものと推定する。【００６６】
本発明においては、シェルのバンドギャップはコアより高いことが好ましい。シェルはコア粒子の表面欠陥を安定化し輝度を向上させるために必要であるし、蛍光標識剤とする為に表面修飾剤が吸着・結合しやすい面を形成するために重要となる。【００６７】
（蛍光標識物質）
本発明の半導体ナノ粒子は、その表面に適当な表面修飾化合物を配置することにより標的（ターゲット）物質を蛍光標識するための蛍光標識物質（蛍光標識剤）に適用できる。特に、当該粒子表面にその表面に生体に親和性を有する、もしくは、接合できる表面修飾化合物を配置し、タンパク質やペプチドなどの標的物質を蛍光標識するための生体分子蛍光標識剤（生体物質蛍光標識剤）とすることに適している。【００６８】
なお、生体分子蛍光標識剤（生体物質蛍光標識剤）とする場合、近赤外〜赤外励起で赤外発光する特性を有するように半導体ナノ粒子の発光特性を粒径等により調整することが生体分子に対する非侵襲性、生体組織の透過性等の観点から好ましい。【００６９】
本発明においては、表面修飾化合物としては、少なくとも１つの官能基と少なくとも１つの半導体ナノ粒子に結合する基を有する化合物であることが好ましい。後者は疎水性の半導体ナノ粒子に吸着できる基であり、他方は生体物質に親和性があり生体分子に結合する官能基である。互いの表面修飾化合物は互いをつなぐ各種のリンカーを使用してもよい。【００７０】
半導体ナノ粒子に結合する基としては、当該半導体ナノ粒子を形成するための半導体材料に結合する官能基であれば良い。本発明においては、当該官能基として、特にメルカプト基（チオール基）が好ましい。【００７１】
生体物質に親和的に結合する官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、フォスフォン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。【００７２】
なお、ここで、「生体物質」とは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、蛋白質、抗体、抗原、小胞体、核、ゴルジ体等を指す。【００７３】
また、半導体ナノ粒子に結合させる方法としては、表面修飾に適するｐＨに調整することによりメルカプト基を粒子に結合させることができる。それぞれ他端にはアルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基が導入され、生体のアミノ基、カルボキシル基とペプチド結合することができる。また、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドなどにアミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基を導入しても同様に結合させることができる。【００７４】
本発明の半導体ナノ粒子を用いて生体分子蛍光標識剤（生体物質蛍光標識剤）を作製する具体的方法としては、例えば、親水化処理された半導体ナノ粒子を有機分子を介して分子標識物質と結合させる方法を挙げることができる。この方法により作製された生体分子蛍光標識剤（生体物質蛍光標識剤）において、分子標識物質は、標的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の蛍光標識が可能となる。【００７５】
当該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原およびシクロデキストリン等が挙げられる。【００７６】
また、有機分子としては半導体ナノ粒子と分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビンおよびカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。【００７７】
具体的には、半導体ナノ粒子をメルカプトウンデカン酸で親水化処理した場合は、有機分子としてアビジンおよびビオチンを用いることができる。この場合親水化処理された当該ナノ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンがさらにビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさらに分子標識物質と結合することにより生体分子蛍光標識剤（生体物質蛍光標識剤）となる。【００７８】
〔半導体ナノ粒子の親水化処理〕
上述した半導体ナノ粒子表面は、一般的には、疎水性であるため、例えば生体分子標識試薬として使用する場合は、このままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題があるため、半導体ナノ粒子の表面を親水化処理することが好ましい。【００７９】
親水化処理の方法としては、例えば、表面の親油性基をピリジン等で除去した後に粒子表面に表面修飾剤を化学的および／または物理的に結合させる方法がある。表面修飾剤としては、親水基として、カルボキシル基・アミノ基を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオールなどがあげられる。具体的には、例えば、Ｇｅ／ＧｅＯ2型ナノ粒子１０-5ｇをメルカプトウンデカン酸０．２ｇが溶解した純水１０ｍｌ中に分散させて、４０℃、１０分間攪拌し、シェルの表面を処理することで半導体ナノ粒子の表面をカルボキシル基で修飾することができる。【００８０】
なお、半導体ナノ粒子の表面修飾のための具体的調製は、例えば、Ｄａｂｂｏｕｓｉ等（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１０１：９４６３、Ｈｉｎｅｓら（１９９６）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００：４６８−４７１、Ｐｅｎｇ等（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：７０１９−７０２９、及びＫｕｎｏ等（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０６：９８６９に記載されている方法に準拠して行うことができる。【００８１】
（蛍光標識物質とそれを用いた生体分子検出システム）
本発明に係る蛍光標識物質は、上記特徴を有することにより、当該蛍光標識物質を標的となる生細胞又は生組織に供給し、半導体ナノ粒子の放射線励起により放出される蛍光を検出することにより当該標的となる生細胞又は生体組織における生体分子を検出することを特徴とする生体分子検出システムに好ましく適応できる。【００８２】
標的（追跡）生体分子を有する生細胞もしくは生体組織に本発明に係る蛍光標識物質を添加することで、標的分子と結合もしくは吸着し、当該結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光（放射線）を照射し、当該励起光に応じて半導体ナノ粒子（蛍光半導体微粒子）から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上記標的（追跡）生体分子の蛍光動態イメージングを行うことができる。すなわち、本発明に係る蛍光標識物質は、バイオイメージング法（生体物質を構成する生体分子やその動的現象を可視化する技術手段）に利用することができる。【００８３】
なお、励起のための放射線としては、ハロゲンランプ、タングステンランプなどの可視光からＬＥＤ、近赤外レーザー光、赤外レーザー光、Ｘ線、γ線などが含まれる。【００８４】
〈分子・細胞イメージング法〉
本発明の半導体ナノ粒子は、標的（ターゲット）とする細胞組織の内部若しくは表面に存在する分子に特異的に反応するプローブ分子（探索用分子）を結合させて蛍光標識物質として使用することができる。【００８５】
本願において、「標的（ターゲット）」とは、半導体ナノ粒子の標的とする生体分子等をいい、例えば、組織および細胞で優先的に発現したりするタンパクであったり、細胞内のゴルジ体、核、膜タンパクなどである。なお、適当なターゲット物質としては、例えば、酵素および蛋白質、細胞表面受容体；核酸；脂質およびリン脂質を挙げることができるが、これらに限定されない。【００８６】
本発明において、プローブ分子としては、生体内部の画像化、細胞内の物質動態計測等を目的として、標的（測定）物質に対応する適切なプローブ分子を採用することが好ましい。【００８７】
本発明の半導体ナノ粒子を利用した生体分子蛍光標識剤（生体物質蛍光標識剤）は、従来公知の種々の分子・細胞イメージング法に適用することができる。例えば、レーザインジェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などによる分子・細胞イメージング法が挙げられる。これらの方法うち、レーザインジェクション法による分子・細胞イメージング法に適用することが好ましい。【００８８】
ここで、「レーザインジェクション法」とは、レーザ光を細胞に直接照射し、細胞に微細な穴を開けて遺伝子などの外来物質を導入する光学的方法をいう。【００８９】
「マイクロインジェクション法」とは、微細な針（マイクロピペット、マイクロシリンジ）を用いて空気圧で機械的に、細胞内に遺伝子などの外来物質を直接注入して導入する方法をいう。【００９０】
また、「エレクトロポレーション法」（「電気穿孔法」ともいう。）とは、細胞に電気的刺激を印加し、細胞の変形を誘起して細胞内に遺伝子などの外来物質を導入する物理的方法をいう。例えば、細胞懸濁液に数千Ｖ／ｃｍの高電圧を数十マイクロ秒のパルスで与えた時に細胞膜に短時間生じる小孔を通して外液が取り込まれることを利用して、細胞外液にＤＮＡ等の注入したい試料を加えておき、これを細胞内に導入する方法である。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。【００９２】
実施例１
＜半導体ナノ粒子（量子ドット）の調製＞
（シリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子、Ｂｅ対ドープ粒子の調製）
真空チャンバー内にアルゴンガスを注入し高周波コントローラによりイオン化されたアルゴンイオンをＳｉチップ／Ｂｅチップ／石英ガラスからなるターゲット材料に衝突させ、これから放出された（スパッタされた）原子および分子を半導体基盤上に堆積し、Ｂｅ分子がドープされたシリコン原子と酸素原子が混ざった薄膜を形成する。【００９３】
得られた薄膜をアルゴン雰囲気中において、１１００℃まで急速に昇温し、Ｓｉが凝集し結晶化するに必要な時間で加熱処理を行い、膜中にシリコン半導体ナノ粒子（結晶）が析出する。またアニール時間を調整させることによりサイズの異なるシリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子を析出させた。このとき、ドープ原子のＢｅ対のシリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子内部での所在位置は、Ｂｅチップの比率、アニール時間、昇温および降温速度、アニール温度により調製した。【００９４】
次に、得られたシリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子含有薄膜を室温で１％程度のフッ酸水溶液で処理することによりＳｉＯ2膜を除去し、シリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子を露出させる。上記露出した基盤をブタノール中に浸漬させ、超音波照射を施すことでシリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子を基板より離脱させ、シリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子が分散した溶液を得る。なお、このフッ酸処理により、半導体微粒子（結晶）表面のシリコン（Ｓｉ）原子のダングリングボンド（未結合手）が水素終端され、シリコン（Ｓｉ）結晶が安定化する効果を有する。得られたシリコン（Ｓｉ）コア粒子について高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：「ＨＰＬＣ」）による分離処理を行い、残留ＨＦやサイズ・構成比率が異なる副生成物を完全に除いた。得た粒子の平均粒径および分布はシスメックス社ゼータサイザーを用いて測定した。表１に測定結果を示す。【００９５】
上記の調製方法においてドープ原子の導入分布を制御する手段で条件変更を行い、表１に示すドープ位置の異なるシリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子を調製した。表１に記載の各種シリコン半導体ナノ粒子について励起波長３６５ｎｍの光を照射して得られた発光強度も併記した。【００９６】
＜ロット間の安定性の評価＞
上記と同様な方法で５０回粒子形成を行い、そこで得られた粒子強度及び発光波長（λｍａｘ）のばらつき（標準偏差／平均値）を評価し、表１に記した。【００９７】
＜Ｂｅ対の粒子内分布測定＞
ＢｅはＸＰＳを用いることで表面からの深さに合わせたピーク強度から、その存在比を検出した。【００９８】
＜蛍光標識物質の調製＞
（半導体ナノ粒子への表面修飾化合物の導入）
上記半導体ナノ粒子により生体物質を標識する場合、当該粒子と生体物質の双方に、互いに結合する官能基等を導入する必要があり、下記のように行った。【００９９】
メルカプト基（ＳＨ基）同士の結合を利用して半導体ナノ粒子にカルボキシル基を導入する。先ず、上記のシリコン半導体ナノ粒子を３０％過酸化水素水中に１０分間分散させ、結晶表面のＳｉ−Ｈを水酸化させる。次に、溶媒をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランをトルエンの２％加えて、２時間程度かけてシリコン（Ｓｉ）コア粒子の最表面をシラン化すると共にメルカプト基を導入する。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の付いた３−メルカプトプロピオン酸を適量加えて３時間攪拌し、シリコン（Ｓｉ）コア粒子と表面修飾化合物を結合させる。これを標識剤Ａとする。【０１００】
得られた標識剤Ａの作製に用いた各原材料成分を選択的に吸着し、サイズ選択性を付与した複数カラム（カラムの表面組成および孔径を組み合わせて変更を加えたカラムを複数用いる；表面組成はカルボキシル基であったり、アミノ基であったりし、サイズ選択性は表面修飾体の粒径に合わせ、孔径を小さくすることで原材料成分を選択的に吸着させることができる。）を用いて、連続もしくは別々に全てのカラムでのＨＰＬＣ処理を行い、標識Ａ以外の原材料・溶媒などの成分を除いた。【０１０１】
（蛍光標識生体分子観察例）
上記で得た標識体を、個別にＶｅｒｏ細胞培養液中に添加し３７℃２時間培養した。その後トリプシン処理を行って５％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地中に再懸濁させ、ガラスボトムディッシュに播種した。３７℃で一晩培養した細胞を４％ホルマリン溶液で固定しエンドサイトーシスにより取り込まれた標識体の細胞内局在状態を蛍光強度で評価した。この観察の様子を表１に記した。【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
表１に記載したように本発明のシリコン（Ｓｉ）半導体ナノ粒子は発光強度が非常に高く、安定性も高い。しかも標識体として生体分子の検出性が高いことが分かる。【０１０４】
上記結果から、本発明の手段により、高い発光効率を有し発光強度に優れ、かつロット間及び粒子間の発光特性のばらつき巾が小さく、安定性・再現性に優れた半導体ナノ粒子を提供することができることが分かる。更に、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法を提供することができることが分かる。
【国際調査報告】
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