(57)【要約】本発明は、ＵＶ−ＶＩＳ、遠赤外および近赤外波長のスペクトルで蛍光し、非対称脂肪親和性アルキル鎖を有する染料のファミリーに関する。本発明の染料は市販の膜染色染料に溶解性であって、細胞中または細胞から単離された膜および細胞中によく保持された膜のような脂肪親和性構造を迅速に染色するプローブとして有用である。イン・ビボ(in vivo)およびイン・ビトロ(in vitro)の両方で染色された細胞を検出するために染料を利用する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
恒温動物の成熟表面上皮細胞の異常な細胞脱離速度を検出するイン・ビボ(in vivo)の方法であって、
動物の標的部位における成熟表面上皮細胞をシアニン染料で標識し、ついで
該標識工程の後に、標識の存在または不存在について該部位をモニターする
工程を含み、ここに該染料が、式：
【化１】
2009524580.tif 000024
［式中、「-Y=」は、-CR1=、-CR1=CR2-CR3=、
【化２】
2009524580.tif 000025
よりなる群から選択され、
各R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12およびR13は、独立して、Ｈ、ハロゲンまたは１−４の炭素を有するアルキル基であり;
ＸはＨ、ハロゲン、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキルおよびＳ−アリールよりなる群から選択され;
Ｚは生物学的に和合性のカウンターイオンであり；
「Ａ−」は、
【化３】
2009524580.tif 000026
よりなる群から選択される構造であり；および
「＝Ｂ」は、
【化４】
2009524580.tif 000027
よりなる構造の群から選択される
（式中、ＤおよびＥは各々独立して、Ｏ、ＳまたはＣＲ１４Ｒ１５であり、ここにＲ１４およびＲ１５は同一または異なっていてもよく、独立して、１−４の炭素を有するアルキル基であり；
ＲおよびＲ’は各々独立して、７−３６の炭素を有する直鎖型または分枝鎖型の飽和または不飽和の炭化水素であるが、但し、（ｉ）ＲおよびＲ'のうちの１は少なくとも３の炭素でなければならず、各Ｒ１６−Ｒ４７は独立して、Ｈ、ハロゲン、フェニル、フェニルスルホネート、ＮＯ２または１−４の炭素のアルキル基である）］で示されることを特徴とする該方法。
【請求項２】
シアニン染料が
【化５】
2009524580.tif 000028
【化６】
2009524580.tif 000029
【化７】
2009524580.tif 000030
【化８】
2009524580.tif 000031
【化９】
2009524580.tif 000032
【化１０】
2009524580.tif 000033
よりなる構造の群から選択される式である請求項１記載の方法。
【請求項３】
式：
【化１１】
2009524580.tif 000034
を有する化合物。
【請求項４】
構造式：
【化１２】
2009524580.tif 000035
を有する化合物。
【請求項５】
構造式：
【化１３】
2009524580.tif 000036
を有する化合物。
【請求項６】
構造式：
【化１４】
2009524580.tif 000037
を有する化合物。
【請求項７】
構造式：
【化１５】
2009524580.tif 000038
を有する化合物。
【請求項８】
構造式：
【化１６】
2009524580.tif 000039
を有する化合物。
【請求項９】
構造式：
【化１７】
2009524580.tif 000040
を有する化合物。
【請求項１０】
構造式：
【化１８】
2009524580.tif 000041
を有する化合物。
【請求項１１】
構造式：
【化１９】
2009524580.tif 000042
を有する化合物。
【請求項１２】
構造式：
【化２０】
2009524580.tif 000043
を有する化合物。
【請求項１３】
構造式：
【化２１】
2009524580.tif 000044
を有する化合物。
【請求項１４】
構造式：
【化２２】
2009524580.tif 000045
を有する化合物。
【請求項１５】
構造式：
【化２３】
2009524580.tif 000046
を有する化合物。
【請求項１６】
構造式：
【化２４】
2009524580.tif 000047
を有する化合物。
【請求項１７】
構造式：
【化２５】
2009524580.tif 000048
を有する化合物。
【請求項１８】
構造式：
【化２６】
2009524580.tif 000049
を有する化合物。
【請求項１９】
構造式：
【化２７】
2009524580.tif 000050
を有する化合物。
【請求項２０】
構造式：
【化２８】
2009524580.tif 000051
を有する化合物。
【請求項２１】
構造式：
【化２９】
2009524580.tif 000052
を有する化合物。
【請求項２２】
構造式：
【化３０】
2009524580.tif 000053
を有する化合物。
【請求項２３】
構造式：
【化３１】
2009524580.tif 000054
を有する化合物。
【請求項２４】
構造式：
【化３２】
2009524580.tif 000055
を有する化合物。
【請求項２５】
恒温動物の成熟表面上皮細胞の異常な細胞脱離速度を検出するイン・ビボ(in vivo)の方法であって、
動物の標的部位における成熟表面上皮細胞を標識し、
該標的部位を光源で励起し；ついで
それから生じた蛍光の存在または不存在について該部位をモニターする
工程を含む方法。
【請求項２６】
該部位が粘膜表面である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
粘膜表面が胃腸管、呼吸器管、または尿生殖器管の表面に沿って並ぶ請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
該部位が胃の粘膜表面である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
該部位が大腸の粘膜表面である請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
細胞の脱離を、該標識工程の後の予め選択した時間における該部位の標識のレベルの変化を観察することによって検出する請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
励起光が約６００ｎｍないし約１０００ｎｍの波長を有する請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
上皮細胞を、標識組成物を該部位に直接適用することによって標識する請求項２５記載の方法。
【請求項３３】
恒温動物の粘膜表面上の成熟表面上皮細胞の脱離速度を評価する方法であって、
標的部位における成熟表面上皮細胞に、シアニン染料を含む標識組成物を適用し、ついで
該標的部位からシアニン染料が消失する速度を観察する
工程を含み、ここに該シアニン染料が、式：
式：
【化３３】
2009524580.tif 000056
［式中、「-Y=」は、-CR1=、-CR1=CR2-CR3=、
【化３４】
2009524580.tif 000057
よりなる群から選択され、
各R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12およびR13は、独立して、Ｈ、ハロゲンまたは１−４の炭素を有するアルキル基であり;
ＸはＨ、ハロゲン、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキルおよびＳ−アリールよりなる群から選択され;
Ｚは生物学的に和合性のカウンターイオンであり；
「Ａ−」は、
【化３５】
2009524580.tif 000058
よりなる群から選択される構造であり；および
「＝Ｂ」は、
【化３６】
2009524580.tif 000059
よりなる構造の群から選択される
（式中、ＤおよびＥは各々独立して、Ｏ、ＳまたはＣＲ１４Ｒ１５であり、ここにＲ１４およびＲ１５は同一または異なっていてもよく、独立して、１−４の炭素を有するアルキル基であり；
ＲおよびＲ’は各々独立して、７−３６の炭素を有する直鎖型または分枝鎖型の炭化水素であるが、但し、（ｉ）ＲおよびＲ'のうちの１は少なくとも３の炭素でなければならず；各Ｒ１６−Ｒ４７は独立して、Ｈ、ハロゲン、フェニル、フェニルスルホネート、ＮＯ２または１−４の炭素のアルキル基である）］で示されることを特徴とする該方法。
【請求項３４】
該標識組成物が医薬上許容し得るビヒクルを含む請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
実施例に参照して実質的にここに記載されている請求項１に記載の恒温動物の成熟表面上皮細胞の異常な細胞脱離速度を検出するイン・ビボ(in vivo)方法。
【請求項３６】
実施例に参照して実質的にここに記載されている請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
実施例に参照して実質的にここに記載されている請求項３３に記載の細胞を標識する方法。
【請求項３８】
構造式：
【化３７】
2009524580.tif 000060
を有する化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染料およびプローブとして有用な蛍光性の膜インターカレート化合物に関する。より詳細には、本発明は、細胞、リポソーム、マイクロスフェアおよびウイルス粒子を含む、種々の脂肪親和性粒子または脂肪親和性構造を含む対象物、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を迅速に標識するのに有用である高い信号対雑音比を有する脂肪親和性の蛍光化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光染料が多くの用途を有し、蛍光の高い検出感度が望ましい生物学的適用に特に好適であることが知られている。試料中の特定の生物学的成分に結合することによって、蛍光染料を用いて試料中の特定成分の存在または量を示すことができる。種々の蛍光染料が蛍光染色に利用可能であり、かかる染料は例えば細胞、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡの定量に利用されている。蛍光染料は、種々の生理学的条件に応答した細胞の通話をモニターすることにも利用されている。かかる染料は、細胞ソーティングならびに細胞の通話、増殖および他の応答のモニターが望まれる臨床および研究適用の両方において広範囲の利用性を有している。
【０００３】
蛍光染料は、高感度の検出試薬が望ましい生物学的適用に特に好適であることが知られている。試料中の特定の生物学的成分またはコンポーネントに優先的に結合することができる染料により、観察者は、その特定の成分またはコンポーネントの存在、量または場所を決定することが可能となる。また、特定の生物システムを多様な環境におけるその空間的および時間的な分布に関してモニターすることができる。シアニンは、その高い吸光率および励起および放出特性における予想可能なシフトを提供する構造変化の系統的な選択の従順性により、かかる適用に特に有利である。その結果、シアニン染料は、種々の生物学的適用において使用されている。生きている細胞を標識する、染色した細胞をイン・ビボ(in vivo)で追跡する、および細胞増殖速度を測定する目的で細胞を染色するための、浸透調節剤と組み合わせたDiIC18(3)、DiOC18(3)およびそれらのC１２ないしC２２ホモログを包含するある種のカチオン性脂肪親和性シアニン染料の使用が、以前に記載されている。
【０００４】
出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第4,762,701号は、可視領域のスペクトルで蛍光するシアニン標識した細胞を追跡し、ついで対象に投与した標識した細胞中の染料が消失する速度を測定することによって細胞寿命を決定するイン・ビボ(in vivo)方法に言及している。
【０００５】
出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第4,783,401号は、数ある中でも、培養細胞の増殖速度を測定するために、可視領域のスペクトルで蛍光するシアニン染料で生きている細胞を標識する方法に言及している。
【０００６】
出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第4,859,584号は、イン・ビトロ(in vitro)およびイン・ビボ(in vivo)で増殖する可視領域のスペクトルで蛍光するシアニン標識した細胞の増殖速度を測定する方法に言及している。
【０００７】
出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,804,389号は、可視領域のスペクトルで蛍光するシアニン染料で細胞膜を標識し、ついで粘膜細胞から標識した細胞が脱離する際の速度を観察することによって異常な細胞の脱離速度を測定する方法に言及している。
【０００８】
その教示を出典明示して本明細書の一部とみなすLeungらに付与された米国特許第6,004,536号は、好ましくは長さが等しく、かつ、細胞もしくは組織中の膜、細胞から単離した膜、天然もしくは人工のリポソーム、リポタンパク質またはポリマーのような脂肪親和性構造を染色するのに有用である反応性官能基、またはフェニル、スルホ、スルホフェニル、またはブロモもしくはクロロ置換基のいずれかを取り込む２の脂肪親和性アルキル鎖を有するシアニン染料に言及している。Leungらは、その染料が好ましくは水性環境で溶解性であることを教示している。
【０００９】
フローサイトメトリーおよび蛍光活性化選別が血液中および骨髄中の細胞集団における異なるクラスの細胞を分離するためによく使用されている。かかる方法は、研究および治療用途について、白血病およびリンパ腫のタイピングのツールとして、異なるタイプの白血球を互いに分離するのに（例えば、米国特許第5,234,816号を参照されたい）、および他の細胞型から単離した血液幹細胞始原画分を得るのに（1992年8月11日、米国特許第5,137,809号）特に有用である。フローサイトメーターは臨床研究用途においては日常的なものとなってきている。細胞のいくつかのパラメータ：前方散乱光を用いて細胞サイズを測定する；および、第２の散乱検出器は種々のタイプの白血球を識別するために用いる、細胞の細胞質の粒状に対する情報を提供する。各々が特定の細胞標的分子に結合した種々の「発蛍光団」から発せられた蛍光はサイトメーターによって収集される。これらのパラメータは、特異性および染料コンジュゲート分子およびその標的の組合せに依存して広範囲の適用を創製する。
【００１０】
今日のサイトメトリーは３−４色のデータの相関分析に依拠しているが、当該技術分野は、複雑な混合物中の種々の細胞の亜集団の特徴を分析することによって、複雑な細胞間および細胞内事象（例えば、発生している免疫応答におけるような事象）を解剖するより多くのプローブ／細胞の使用に向かって迅速に動いている。蛍光色素の励起および放出特徴の性質は、波長において十分に分離した放出を提供してgoorな空間および／またはスペクトル識別を与える細胞に結合可能な３もしくは４を超える可視光放出蛍光色素を選択することを困難にしている。
【００１１】
安定した蛍光プローブでの細胞タンパク質または膜の一般的標識は、例えば、免疫系機能を分析する場合のような複雑な細胞−細胞相互作用を明確に描写するための強力な方法でもある。しかしながら、CFSE（Molecular Probes）およびPKH染料（Sigma）のような現在利用可能なタンパク質および膜の標識は、イン・ビボ(in vivo)およびイン・ビトロ(in vitro)の両方における細胞相互作用および応答を調べる場合に重大な制限を有している。それらは可視領域のスペクトルで励起および蛍光するため、高レベルの組織散乱および自己蛍光がインタクトな動物における光学イメージングにかかる染料を不適当なものにしかねない。また、細胞自己蛍光は達成することができる信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）比を制限し、他の一般的に使用される可視光発色団との重大なスペクトル重複はかかる染料をフローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡に用いる場合に機器設定を複雑にする。一般的な膜染色に適用可能であるDiOおよびDiIのより長い波長のアナログが当該技術分野で知られているが、これらの染料を用いて最適な染色を達成するためには時間ならびに濃度を変化しなければならない。
【００１２】
複雑な細胞型、追跡および局在パターン、シグナリング機構および初期の免疫系を構成する調節フィードバックループにより、特定の抗原または病原菌に対してそれが非常に選択的に応答することが可能となり、応答を選択的に高めるまたは妨害する可能性も付与する。しかしながら、この選択性は、組織特異的接着分子ならびにケモカインおよびサイトカインのような分泌分子メッセンジャーの関係における、抗原、抗原提示細胞およびリンパ球を含む局在した相手に主に基づいて達成される。したがって、免疫監視および応答プロセスにおける生産的仲介は、イン・ビトロ(in vitro)、エクス・ビボ(ex vivo)およびイン・ビボ(in vivo)における複雑な細胞相互作用を解剖およびモニターする能力を必要とする。異なる細胞型を選択的にタグし、それらの運命を追跡する能力は、十分詳細に免疫系を理解して免疫療法を含む効果的な治療戦略を設計および最適化するために極めて重要である。
【００１３】
細胞膜に安定してインターカレートする蛍光脂肪親和性染料を用いた一般的な膜標識は、単純、迅速であってほぼいずれの細胞型にも適用できる。現在利用可能なこのタイプのプローブは、特定の細胞型を追跡および同定する目的で利用されており、それは、かかる目的で一般的なタンパク質標識を利用することに対していくつかの利点を付与する。標識は非共有であって、脂質二重膜に分割することによって起こるため、共有タンパク質標識(CFSE）に必要であるような、蛍光強度が安定するまでの待機時間がなく、細胞の受容体−リガンド相互作用に対する困った効果および関連する応答は典型的に最小限である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
細胞および生体分子を標識するために用いる最も一般的な発蛍光団は、顕微鏡、および利用可能な光源およびヒトの眼、主にＵＶおよび可視領域のスペクトル（４００ないし６００ｎｍ）の蛍光との適合性の理由でもともと開発された。娘細胞の中での膜インターカレート染料の希釈は、複雑な集団中における異なる細胞増殖応答をモニターするため、および、抗原性の攻撃のような刺激に応答した細胞を追跡するために非常に有用であることを証明した。一般的なタンパク質標識と同様に、膜染料の濃度は各細胞分裂で半分になり、したがって長期間の追跡のための使用を制限している。また、一般的なタンパク質標識および蛍光膜標識の両方において、高い標識強度（あざやかな抗体標識よりも１−２桁大きい場合もある）は、他のプローブと組み合わせて使用する場合にフィルター選択および色補正を複雑にしかねない。
【００１５】
蛍光標識に対する上記したチャレンジおよび制限は、ＦＲおよびＮＩＲ波長で励起および放出する発色団の開発における関心を増大させている。文献における用法はかなり変動するが、本発明者らは、本明細書においてＦＲを６００−７００ｎｍと、ＮＩＲを７００−９００ｎｍと定義する。水の吸収および熱のバックグラウンドが＞９００−１０００ｎｍで生物学的蛍光の測定を妨害し始めるからである。ＦＲまたはＮＩＲ発色団の使用は、一般的に生物系において、および特に細胞分析については多数の顕著な利点を有する。これらには、ｉ）組織またはタンパク質の自己蛍光によって引き起こされる低いバックグラウンド、ｉｉ）ラマン散乱によって引き起こされる低いバックグラウンド、ｉｉｉ）一般的なＵＶまたは可視光発色団と結合して用いた場合の少ないスペクトル重複、およびｉｖ）安価な励起源（例えば、ダイオードレーザー）および検出器（例えば、アバランシェダイオード）の使用と親和性の励起および放出特性が含まれる。ＦＲ蛍光アナログは現存するフローサイトメーターおよび共焦点顕微鏡で使用することができる。これらの機器の多くはＦＲ励起能力（ＨｅＮｅ、６３５ｎｍダイオードまたは６４７ｎｍ  Ｋｒ／Ａｒレーザー）を有するからである。したがって、ＦＲアナログの使用は、ｉ）減少したバックグラウンドおよび改善された信号対雑音比による分割細胞の長期間のイン・ビトロ(in vitro)およびイン・ビボ(in vivo)追跡を行う能力、およびｉｉ）減少したスペクトル重複による単純な機器設定、を提供する。
【００１６】
ＮＩＲ蛍光の利用は、インタクトな組織または動物のイン・ビボ(in vivo)光学イメージのためのＦＲイメージングを超える顕著な利点を有する。また、自己蛍光およびラマン散乱による低いバックグラウンドに加えて、ＮＩＲ光はイン・ビボ(in vivo)で良好に透過し、したがってミリメートルないしセンチメートル単位の組織を通してリアル−タイム蛍光イメージングを行うことができる。実際、励起光またはＮＩＲ蛍光の波長が長ければ長いほど、低い弾性散乱およびこの領域で吸収するほんの少数の生体分子が弱くだけそのようになるという事実により、組織浸透性もよくなる。ＦＲおよびＮＩＲ標識した抗体またはポリマーが正常な組織と腫瘍との間のコントラストを高めることが示されている。現在の検出深度は０.５−１ｃｍの範囲であるが、ＮＩＲ光は５−６ｃｍ組織を通って到達することができる。
【００１７】
シアニン染料の芳香族基を分離する芳香族基および多数のメチン基の組成の調節が、これらの染料の光励起および放射パターンにおける変化を引き起こすことが知られている。一般的に、染料の芳香族コンポーネントを分離するメチン基の数を増加することは、放出スペクトルを赤色および近赤外波長に向けてシフトする。しかしながら、芳香族基間のメチン架橋の長さを増大すると、標準的な生理学培地および脂肪親和性物質の塩の負のインパクトを最小限化しつつ、感受性の生物学的材料（例えば、細胞）と親和性になる水性溶解度の全体的な脂肪親和性も増大する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
したがって、本発明は、遠赤外、近赤外、緑色およびＵＶ−ＶＩＳ領域セグメントで蛍光し、市販の膜染色希釈剤に溶解性である新規な膜インターカレート染料（本明細書中では「プローブ」ともいう）に指向される。これらのプローブは、診断適用、および潜在的には光力学的療法において有用である。また、本発明は、生物学的材料を染色するのに好適な水性および非水性標識ビヒクル中にプローブを含有する組成物にも指向される。
【００１９】
もう１の態様において、本発明は、プローブと細胞および／または他の脂肪親和性構造とを接触させ、該プローブが該脂肪親和性構造にインターカレートすることを許容し、ついでそれから放出される蛍光に基づいてイン・ビトロ(in vitro)およびイン・ビボ(in vivo)で細胞または他の脂肪親和性構造を検出する方法を提供する。
【００２０】
好ましい形態において、本発明は、シアニン染料で上皮細胞をイン・ビボ(in vivo)で標識して、成熟上皮細胞の中の異常な細胞脱離速度の存在によって特徴付けられる疾患状態を診断するイン・ビボ(in vivo)方法を提供する方法に指向される。
【００２１】
これらおよび他の目的を達成するために、本発明は、標的部位の成熟表面上皮細胞をＵＶ−ＶＩＳ、ＦＲおよびＮＩＲプローブで標識し、その後、標識の存在または不存在について部位モニターする工程を含む、恒温動物の粘膜表面の上皮細胞のような成熟上皮細胞の中の異常な細胞脱離速度を検出するイン・ビボ(in vivo)方法を提供する。
【００２２】
もう１の形態において、標識する細胞は粘膜表面上に存在し、その中で胃腸管の粘膜表面は特に好ましい標的を提供する。本発明は、成熟上皮細胞を本発明のＵＶ−ＶＩＳ、ＦＲおよびＮＩＲプローブで標識し、標識した細胞の脱離速度を測定し、標識した細胞の脱離速度を同様に局在する健全な上皮細胞の知られている脱離速度と比較することを含む、恒温動物の成熟上皮細胞の中の異常な細胞脱離速度によって特徴付けられる疾患状態を診断する方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
ここに本発明の現在好ましい形態に詳細に参照する。本発明は、ＵＶ−ＶＩＳ、遠赤外および近赤外領域のスペクトルで蛍光する新規な膜インターカレート染料（本明細書中では「プローブ」ともいう）である化合物およびその使用方法を提供する。本発明は、標識ビヒクル中に溶解したプローブを含む標識組成物も提供する。プローブは、生物および／または溶媒感受性と親和性のビヒクルに溶解する。
【００２４】
化合物は、いくつかの形態において長さが等しい脂肪親和性のテイル（本明細書中では「Ｒ」および「Ｒ'」の構造という）を含むが、いくつかの好ましい形態においてＲとＲ'とは同じでない。
【００２５】
本発明のプローブは、マルチパラメータ細胞追跡およびソーティング法の他の標識技術および試薬と結合して使用し得ることが予期される。他のものと結合した染料の有用性は、光エネルギー相互作用のスペクトルの２の態様によって典型的に決定する：（１）単一の発光波長または狭いバンドの波長によって染料分子が励起される程度、および（２）ユニークな色またはピークと識別し得るように他の染料から十分に異なる波長の光を各々の励起された染料分子が放出する程度。第１の態様は、使用者が単一の波長を用いて多様に染色した生物試料を発光させることを許容し、第２の態様は、使用者が、各々特定の細胞型または構造と関連する異なる色の発光を観察および記録することを許容する。
【００２６】
光の全体的なスペクトルを収集し、ついで各プローブの発光に特徴的な曲線を全体的なスペクトルにわたってとった塊のシグナルから移す多数の新たな検出器が開発中である。また、本発明のプローブはかかる機器を用いて容易に検出されるであろうことも予期される。
【００２７】
本発明のプローブは、イン・ビトロ(in vitro)、エクス・ビボ(ex vivo)およびイン・ビボ(in vivo)で選択的に細胞膜を染色する膜−インターカレート染料として使用する場合に細胞の性質に望ましくない影響を及ぼさない。プローブおよびそれが結合するようになる細胞もしくは他の脂肪親和性構造は、それらが放出する蛍光によって容易に同定することができる。また、本発明の化合物は、適当な濃度で使用した場合に細胞毒性はなく、細胞膜に安定して保持され、細胞を迅速に染色する。プローブは、数分間細胞に適用するだけでバックグラウンド自己蛍光よりも１００−１０００倍大きな染色強度が達成される。本発明の化合物のもう１の有利な態様は、Diluent C（Sigma-Aldrich Corporation）のような膜標識に好適な等張塩を含まない希釈剤に溶解性であることである。本発明のプローブは、一般的には、基礎（研究室）および臨床研究の両方のための、イン・ビトロ(in vitro)およびイン・ビボ(in vivo)の細胞標識、細胞ソーティングおよび細胞追跡用の試薬として有用である。かかる使用の例については、その開示を出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,385,822号；および、米国特許第4,859,584号;4,783,401号および4,762,701号を参照されたい。かかるプローブは、例えば、ＦＲおよび／またはＮＩＲ能を有する現存のフローサイトメーターおよび共焦点イメージングシステムに使用するための研究試薬として有用であろう。
【００２８】
本発明のプローブは、１）自己蛍光と比較して良好なシグナルを与えるのに十分な数で細胞に結合し；２）そのレベルで細胞に毒性がなく、および３）細胞の特定のサブグループの追跡および／またはソーティングを完了するのに十分に長く細胞膜に保持される、であろう。
【００２９】
本発明のプローブの脂肪親和性性質は、細胞およびウイルス膜、リポソーム、マイクロスフェアなどを含む種々の脂質を含有するまたは疎水性の構造にプローブを効率的に取り込ませることを提供する。プローブを細胞およびビリオンに取り込ませる場合、プローブおよび水性標識ビヒクルを含む標識組成物を標識する標的と混合する。標識組成物は、適用が安全であって再現可能な細胞標識を提供するビヒクル（希釈剤）中にシアニン染料を含有する。少なくとも標識に必要な時間安定な溶液をシアニン染料が形成する浸透性調節剤を使用することができる。許容し得る浸透性調節剤は、グルコース、フルクトース、ソルボース、キシロース、リボースのような単糖類、スクロースのような二糖類；マンニトール、グリセロール、イノシトール、キシリトールおよびアドニトールを包含する糖アルコール；グリシンおよびアルギニンを含むアミノ酸；ならびに、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチル−３−アミノプロパンスルホン酸のようなある種の良好な緩衝液から選択することができる。少量の緩衝剤を標識培地に添加して、水素イオン濃度（ｐＨ）を生理学的および／または無毒なレベルに調節することができる。抗生物質および保存料のような他の慣用的な剤もビヒクルに使用し得るが、それらが染料のミセルまたは凝縮の迅速な形成を誘導する塩濃度とならない程度でのみ使用することができる。
【００３０】
プローブをマイクロスフェアまたはリポソームおよび悪影響なしに非水性標識ビヒクルへの曝露に耐え得る同様の材料に取り込ませる場合、プローブおよび非水性の水性標識ビヒクルを含む標識組成物を標識すべき標的と混合する。非水性標識ビヒクルには、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシドなどのような極性有機溶媒が含まれる。
【００３１】
それらの脂肪親和性性質にもかかわらず、本発明者らは、本発明のプローブが水性ビヒクルに効率的に溶解性であって、極性有機溶媒に対する曝露によって悪影響を受ける脂肪親和性構造（膜など）の効率的かつ迅速な染色を許容することを見出した。
【００３２】
研究では、ＤＭＦ中の良好な溶解性が、高濃度の染料をナイロンフィルターにコーティングし、それを組織に挿入することによって組織調製物中の遠方の細胞を間接的に標識するのに有利であることが示されている（B. Fritzchら, Brain Res. Bull., 66 249-258 (2005)を参照されたい）。
【００３３】
検出段階では、例えば、励起波長の散乱光を吸収し、かつ、標本と使用する特定の染料標識に対応する蛍光に対応する波長を通すフィルターを有する、膀胱鏡または内視鏡のようなファイバー光学診断装置のようなルミネセンス顕微鏡または他の光学イメージング装置を用い得る。観察および分析の好ましい方法には、励起および放出波長に適当な光源およびフィルターを備えた顕微鏡による直接視覚化、およびそれに結合したカメラの使用が含まれる。
【００３４】
このクラスのプローブ試薬で適当に染色した生きている細胞の細胞分離および計数のための本発明の好ましい方法は、ＦＡＣＳＣaliburアナライザーまたはＦＡＣＳＶantageせるソーティング機器のようなフローサイトメトリー装置の使用による。これらの機器は混合した細胞集団を例えばアルゴンレーザー光源による所定の波長で照らし、当該技術分野でよく知られている技術を用いて発せられた光を収集するために種々のバンドパス・フィルターを用いる検出器を通してそれが流動するに従って、緩衝液のような流動する流体中で検出した各細胞からの発光シグナルを用いて各細胞をソートする。装置は、細胞集団をカウントおよび／または収集して、さらなる分析および使用のためのデータおよび細胞画分の両方を得ることができる。
【００３５】
もう１の好ましい形態において、細胞は、本発明のプローブおよび標識した細胞に結合する１またはそれを超えるさらなる細胞マーカーで標識する。ついで、プローブおよびさらなる細胞マーカーをフローサイトメトリーによって検出する。あるいは、本発明のプローブで標識されていない細胞を認識するマーカーを選択してもよい。本発明のプローブに加えたまたはその代わりの複数のマーカーの検出により、複数の表現型に基づく特定のサブグループの細胞の同定および／または分離が可能となる。個々の細胞表面リガンドに特異的な蛍光標識したモノクローナル抗体のような多くのさらなる細胞マーカーが当該技術分野において知られている。
【００３６】
最近の技術の進歩により、顕微鏡（細胞または亜細胞）レベルでのみならず、巨視的（全組織または全身）レベルでも蛍光イメージングが可能となっている。本発明のプローブは、共焦点イメージングまたは他の定量的顕微鏡技術を用いたマルチプローブ実験を行う際にしばしば遭遇するスペクトルの「汚染」またはこぼれの問題に対して有用な解決法を提供する。また、ＮＩＲプローブは、巨視的イメージング法と組合せ場合に、インタクトな動物における免疫細胞の追跡、位置決定および再分配をモニターするための放射性標識ならびに光力学的診断および／または光療法に使用する潜在性に対する有用な別法を提供する。
【００３７】
もう１の好ましい形態において、本発明のプローブは、米国特許第5,804,389号に記載されているようなイン・ビボ(in vivo)で異常な上皮細胞の脱離速度を検出するために対象に投与する。この方法において、恒温動物における上皮細胞の異常な脱離を決定する。この方法には、標的部位で本発明の化合物で成熟表面上皮細胞を標識し、細胞を励起波長の光に曝露し、その後に標識の存在または不存在について部位をモニターし、ついで、所定の時間にわたる検出可能な標識の損失によって観察する工程が含まれる。また、本発明は、成熟上皮細胞を標識し、標識した細胞の脱離速度を測定し、ついで標識した細胞の脱離速度を同様に位置する健全な上皮細胞の公知の脱離速度と比較することを含む、恒温動物の成熟上皮細胞の中のかかる異常な細胞の脱離速度によって特徴付けられる疾病状態を診断する方法も提供する。
【００３８】
本発明のプローブを利用して、いずれの身体の上皮表面の異常な脱離速度も測定することができる。表面には、胃、胆管、大腸、尿管、血管、鼻腔を含む呼吸器管、角膜、食道、膵臓管、小腸、ならびに膣および卵巣管を含む生殖器官ならびに前立腺のものが含まれる。好ましくは、溶液形態の組成物は、内視鏡による直接視野下で上皮粘膜の表面への直接適用（例えば、噴霧）によって、表面に多量の溶液を注ぐことによって、または、飲料の形態で溶液を対象に経口投与することによって投与する。
【００３９】
ヒトにおけるイン・ビボ(in vivo)の使用を意図する場合、本発明のいずれの化合物の溶液は、水および極性有機溶媒の両方と混合し得る、等浸透圧の水性で好ましくは塩類を含まない溶媒に有効量のプローブを溶解することによって調製することができる。本発明によるイン・ビボ(in vivo)使用の組成物中の染料の濃度レベルは、それらの染料の以前に知られているイン・ビトロ(in vitro)細胞染色適用で使用されている濃度レベルと同様であろう。投与すべき正確な濃度は変動することができ、容易に最適化し得る。投与すべきプローブ組成物の体積は、組成物中のシアニン染料の濃度および標的部位のサイズに依存して変化するであろう。投与体積は、例えば、約１ないし１００ｍｌで変化させることができ、容易に最適化することができる。プローブ組成物の約１０ｍｌの投与体積は、多くの適用において使用することができる。投与経路は、標識すべき細胞の型に依存して変化するであろう。前記に示したように、上皮細胞の染色は、経口投与または直接適用によって最良に達成することができる。皮下、筋肉内および静脈内注射などのような他の様式の投与も予定している。
【００４０】
本発明の好ましい方法によれば、シアニン染料標識は標識した細胞の部位を励起光に曝露し、蛍光の強度を観察するおよび／または測定することによって検出する。
【００４１】
本発明のプローブは、以下の実施例に詳細に記載するように合成することができる。
【００４２】
本発明のＵＶ−可視光、ＦＲおよびＮＩＲプローブは、４００−７００ｎｍ領域で吸収し、４００−６００ｎｍのＵＶ−可視光領域、６００−７００ｎｍのＦＲおよび＞７００ｎｍ領域のＮＩＲで放出する発色団を励起する能力を備えた市販のサイトメトリー機器（例えば、BD FACSVantage、FACSCalibur、Beckman Coulter AltraおよびCytomation MoFlo flow cytometer/sorters、ならびにBioRad 1024ES または1024MP共焦点イメージングシステム）によって検出することができる。安価なダイオードレーザーおよびダイオード検出系を取り込んだBiometric Imaging/BDによって、開発中の小さなベンチトップ型サイトメーター（例えば、体積キャピラリーサイトメーター）の出現はＮＩＲ蛍光を定量化するためのさらなる検出系を提供するであろう。
【００４３】
この領域におけるバックグラウンド蛍光が生物系において低く、高い感度を達成し得る点において、この近赤外／遠赤外波長も有利である。
【００４４】
本発明の好ましい標識組成物は、式：
【００４５】
【化１】
2009524580.tif 000002
【００４６】
［式中、「-Y=」は、-CR1=、-CR1=CR2-CR3=、
【００４７】
【化２】
2009524580.tif 000003
よりなる群から選択され、
各R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12およびR13は、独立して、H、ハロゲンまたは１−４の炭素を有するアルキル基であり;
ＸはＨ、ハロゲン、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキルおよびアリールよりなる群から選択され;
Ｚは生物学的に和合性のカウンターイオンであり；
「Ａ−」は、
【００４８】
【化３】
2009524580.tif 000004
よりなる群から選択される構造であり；および
「＝Ｂ」は、
【００４９】
【化４】
2009524580.tif 000005
【００５０】
よりなる構造の群から選択される。
（式中、ＤおよびＥは互いに独立してＯ、ＳまたはＣＲ１４Ｒ１５であり、ここにＲ１４およびＲ１５は同一または異なっていてもよく、独立して、１−６の炭素を有するアルキル基である。あるいは、Ｒ１４およびＲ１５は一緒に結合して、５−または６−員の飽和環を完成する。好ましくはＸはＹと等しい（対称シアニンを与える）。いくつかの好ましい形態において、ＤおよびＥの両方はＣＲ１４Ｒ１５であり、ここにＣＲ１４Ｒ１５はメチルまたはエチル、より典型的にはメチルである）
【００５１】
各Ｒ１６−Ｒ４７は独立して、Ｈ、ハロゲン、フェニル（所望により、ハロゲン、シアノおよびニトロで置換されていてもよい）、フェニルスルホネート、ＮＯ２または１−４の炭素のアルキル基である。
【００５２】
ＲおよびＲ'は、各々独立して、７−３６の炭素を有する飽和または不飽和二重結合を含む直鎖型または分枝型の炭化水素であるが、但し、ＲおよびＲ'のうちの１は少なくとも３の炭素でなければならない。
【００５３】
Ｚはシアニン染料の固有のプラスの電荷を平衡させる典型的にはアニオンであり、全体的な分子が電気的に中性になるような数で存在し、かかる全体電荷を有する。本明細書で用いる生物学的に和合性である物質は用いるように毒性でなく、生体分子に対して実質的に有害な効果を有しない。かかる化合物は、標識に必要な濃度で細胞生存性に望ましくない影響も及ぼしてはならない。したがって、ヨウ化物塩以外のシアニン染料の医薬上許容し得る形態を、他の医薬上許容し得る塩を含むいくつかの例において用いることができる。正味陽性の電荷を有する染料の有用なカウンターイオンの例には、限定されるものではないが、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、硫酸イオン、アルカンスルホン酸イオン、アリールスルホン酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、硝酸イオンおよび芳香族または脂肪族カルボン酸イオンが含まれる。しかしながら、適当なアニオンの選択は、溶解性に対する特定のアニオンの影響によって制限されるであろう。種々の脂肪親和性分子と会合するアニオンが化合物の溶解性に影響し得ることが知られているからである。
【００５４】
好ましい形態において、カウンターイオンはヨウ素イオンである。ある種の例において、プローブのイン・ビボ(in vivo)投与のためのように、ヨウ素カウンターイオンと塩素イオンとを置換することが好ましい場合もある。ヨウ素に対してアレルギー性である個人も存在するからである。
【００５５】
以下の実施例において本発明をさらに記載するが、それらは説明目的のものであって、それに限定されることを意図するものではない。当該技術分野でよく知られている標準的な技術または以下に具体的に記載する技術を利用する。
【００５６】
実施例１  ほぼ６６５ｎｍの放出を有する非置換型ＦＲシアニン染料F279A、F280A、F283A、F284A、F285A、F299A、F300Aの合成
【００５７】
前記した放出を有するこれらの膜プローブは、必要な炭化水素テイル長を提供するために適当なアルキルヨウ化物またはアルキル４−クロロベンゼンスルホン酸エステルまたは不飽和アルキル４−クロロベンゼンスルホン酸エステルを用いる以下に記載するのと同一の一般的合成式および反応条件を用いて調製した。
【００５８】
反応式１
【００５９】
【化５】
2009524580.tif 000006
【００６０】
ヨウ化１−テトラデシル−２,３,３−トリメチルインドリニウム（化合物５）の調製を以下のプロトコールに従って行った。テトラデシル−１−（４−クロロベンゼンスルホン酸）：室温にて、ジクロロメタン（５００ｍｌ）中のテトラデカノール（２６.３ｇ、０.１２３モル、Aldrich Chemical Co., ワイオミング州、ミルウォーキー）および塩化４−クロロベンゼンスルホニル（２４.４８ｇ、０.１２３モル、Aldrich）の攪拌溶液に、ジクロロメタン（２００ｍｌ）中のトリエチルアミン（２８ｍｌ、Aldrich）を滴下した。得られた溶液を４８時間攪拌した。ついで、反応混合物を水で洗浄（３×４００ｍｌ）し、ジクロロメタン層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。得られた粗製固形物をメタノールから再結晶化させて純粋なテトラデシル−１−（４−クロロベンゼンスルホン酸）（２９.９ｇ、６２％）を白色固形物として得た。
200MHz プロトンNMR (CDCl3): 0.88 (t, Jm 7.0Hz, 3H), 1.10-1.80 (m, 24H), 4.05 (t, J= 7.0Hz, 2H), 7.50-7.60 (m, 2H), 7.80-7.90 (m, 2H).
【００６１】
２,３,３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレイン（４）（６.３６ｇ、０.０４モル、Aldrich）およびテトラデシル−１−（４−クロロベンゼンスルホン酸）（１５.５２ｇ、０.０４モル）を１３０−１４０℃にて３時間攪拌しつつ一緒に加熱した。ついで、その反応混合物を室温まで冷却し、エタノール（２００ｍｌ）に溶解した。ヨウ化カリウム（２００ｍｌ）の飽和溶液を添加し、この混合物を３０分間攪拌した。ついで、１.５Ｌの蒸留水を添加し、さらに１５分後に固形沈澱物を収集し、水洗し、真空下で乾燥した。粗製物質を酢酸エチルから再結晶化して、純粋な中間化合物５（１１.９ｇ、６２％）を得た。
300MHz プロトン NMR (CDCl3): 0.88 (t, J=7Hz, 3H), 1.25-1.50 (m), 1.67 (s, 6H), 1.93 (m, 2H), 3.13 (s, 3H), 4.70 (t, J= 7.70Hz, 2H), 7.60-7.66 (m, 4H).
【００６２】
ヨウ化１−ドコサニル−２,３,３−トリメチルインドリニウム（６）の調製
【００６３】
ドコサニル−１−（４−クロロベンゼンスルホン酸）：室温にて、ジクロロメタン（５００ｍｌ）中のドコサノール（４７.８ｇ、０.１５モル）および塩化４−クロロベンゼンスルホニル（３４.０１ｇ、０.１６ｍｌ、Aldrich）の攪拌溶液に、ジクロロメタン（２００ｍｌ）中のトリエチルアミン（３３.５ｍｌ、Aldrich)を滴下した。得られた溶液を４８時間攪拌した。ついで、その反応混合物を水洗（３×４００ｍｌ）し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、〜４００ｍｌまで濃縮すると生成物の結晶化が始まった。冷却および熟成の後、濾過によって沈澱物を収集し、真空下で乾燥させて純粋なドコサニル−１−（４−クロロベンゼンスルホン酸）（４８.９ｇ、７３％）を白色固形物として得た。
300MHz プロトン nmr (CDCl3): 0.88 (t, J=7.0Hz, 3H), 1. 1 5 1.40 (m), 1.55-1.75 (m, 2H), 4.02 (t, J= 7.0Hz, 2H), 7.48-7.60 (m, 2H), 7.78-7.90 (m,2H).
【００６４】
２,３,３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレイン（６.３ｇ、０.０４モル、Aldrich）およびドコサニル−１−（４−チクロベンゼンスルホン酸）（２０.０ｇ、０.０４モル）を１３０−１４０℃にて３時間攪拌しつつ一緒に加熱した。ついで、その反応混合物を室温まで冷却し、ワックス状固形物をエタノール（２５０ｍｌ）に溶解した。ヨウ化カリウムの飽和溶液（２００ｍｌ）を添加し、この混合物を３０分間攪拌した。ついで、１.０Ｌの蒸留水を添加し、さらに１５分間攪拌した後に固形沈澱物を収集し、水洗し、真空下で乾燥させた。その粗製物質をジクロロメタン／ヘキサンから再結晶化して純粋な中間化合物６を得た（１４.５ｇ、６１％）。
200MHz プロトン NMR (CDCl3): 0.87 (t, J=7.0Hz, 3H), 1.15-1.50 (m), 1.67 (s, 6H), 1.85-2.00 (m, 2H), 3.10 (s, 3H), 4.70 (t, J= 7.7Hz, 2H), 7.55-7.70 (m, 4H).
【００６５】
ヨウ化１−ドコサニル−２−[（４−Ｎ−フェン−Ｎ−アセチルアミノ）−１,３−ブタジエニル]−３,３−ジメチルインドリニウム（７）の調製
【００６６】
無水酢酸（３０ｍｌ）中の（６）（２−３８ｇ、４ミリモル）およびマロンアルデヒド＝ビスフェニルイミン塩酸（１.１０ｇ、４.４ミリモル、TCI America, オレゴン州、ポートランド）の溶液を１００−１１０℃にて１時間加熱し、室温に冷却し、濾過した。ついで、その濾液を３００ｍｌの水で希釈し、０−５℃の冷蔵庫に１時間入れた。得られた沈澱物を収集し、真空下にて乾燥させて（７）（０.６５ｇ、２１％）を得た。
300MHz プロトン NMR (CDCl3): 0.88 (t, J= 6.5Hz, 3H), 1.20-1.40 (m), 1.70 (m), 1.80 (s, 6H), 2.24 (s, 3H), 4.36 (t, J-z 7.5Hz, 2H), 5.79 (t, Jm 12.8Hz, I H), 6.71 (d, J = 15.0 Hz, I H), 7.25-7.70 (m, I OH).
【００６７】
中間化合物７（０.５４４ｇ、０.７１ミリモル）および中間体５（０.３４３ｇ、０.７１ミリモル）を１０滴のトリエチルアミンを含有する環流ジクロロメタン（１０ｍｌ）中で一緒に３時間加熱した。反応は、ＴＬＣ（ジクロロメタン中の５％メタノール）によってモニターした。ついで、反応混合物をロータリーエバポレータによって濃縮し、残渣を−２０℃のメタノールから一晩結晶化した。固形物を収集し、ジクロロメタン中の５−７.５％メタノールで溶出するシリカゲル・フラッシュカラム・クロマトグラフィーによってさらに精製した。純粋な画分を合し、濃縮して化合物８（２１０ｍｇｓ、３０％）を得た。
HPLCによって純度>97%
300MHz プロトン NMR (CDCl3): 0.88 (t, J=6.3Hz, 6H), 1.25-1.55 (m), 1.66 (m), 1.81 (s, 16H), 4.04 (t, J=7.4HZ, 4H), 6.29 (d, J=13.6Hz, 2H), 6.78 (t, J=12.4Hz, IH), 7.05 (d, J=7.8Hz, h.), 7.20-7.70 (m, 2H), 7.33-7.38 (m, 4H), 8.32 (t, J=13.0Hz, 2H).
電子スプレーマススペクトルM' = 860. UV/VIS (エタノール): λmax= 648nm, c = 189,270M-lcm-1. 蛍光 (エタノール): 最大励起= 653nm, 最大放出= 672nm.
【００６８】
この放出波長を有するプローブを合成に選択した。それは細胞標識に用いる大部分の他の可視蛍光プローブと比べて＞１００ｎｍ赤色側にシフトしており、したがってそれらと重複する最小限のスペクトルを有するからである。したがって、かかるプローブは、マルチプローブ標識が要求される場合のフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡における使用に理想的であり得る。必要により、変化するアルキル鎖長を取り込んで膜結合の張度／安定性を調節することができる。
【００６９】
実施例２  ＦＲプローブＦ２８８Ａの合成
【００７０】
この化合物は、出発物質として５−tert−ブチル−２,３,３−トリメチル（３Ｈ）インドレニンを用いる以外は、同様の型の反応および条件を用いて上記反応図式１に示したように調製する。
【００７１】
実施例３  ＦＲプローブＦ２８９Ａの合成
ａ．この化合物は、出発物質として５−ブロモ−２,３,３−トリメチル（３Ｈ）インドレインを用いる以外は、同様の型の反応および条件を用いて上記反応図式１に示したように調製する。
【００７２】
実施例４  ＮＩＲプローブＦ２７７Ａの合成
【００７３】
この化合物は、すでに前記したのと同様の型の反応および条件を用いて下記反応図式２に示したように調製する。
【００７４】
実施例５  ＮＩＲプローブＦ３０１Ａの合成
ａ．この化合物は、出発物質として２,３,３−トリメチル（３Ｈ）インドレインを用いる以外は、すでに前記したのと同様の型の反応および条件を用いて下記反応図式２に示したように調製する。
【００７５】
反応図式２
【００７６】
【化６】
2009524580.tif 000007
【００７７】
実施例６  ＮＩＲプローブＦ２９１Ａの合成
【００７８】
この化合物は、出発物質として２,３,３−トリメチル（３Ｈ）インドレインを用い、室温のジメチルホルムアミド中のベンゾチオール酸ナトリウムとの反応の際に、架橋シクロヘキサン環上のクロロ官能基をチオフェニル基で置き換える以外は、すでに前記したのと同様の型の反応および条件を用いて下記反応図式２に示したように調製する。
【００７９】
反応図式３
【００８０】
【化７】
2009524580.tif 000008
【００８１】
中間体１７は、当該技術分野の技術にしたがってシクロヘキサnonnンから２８％の収率で調製した。１７と２モル等量の１０のカップリングの最適条件は酢酸ナトリウムを含有するエタノール中の環流である。得られる化合物をヨウ化カリウムで処理し、つづいてシリカゲル・クロマトグラフィーを用いて精製した。
【００８２】
実施例７  プローブＦ２９５Ｂの合成
【００８３】
この化合物は、ヘッド基の１の側の出発物質として６−フェニル−２,３,３−トリメチル（３Ｈ）を用い、他の側に２,３,３−トリメチル（３Ｈ）インドレインを用いる以外は同様の型の反応および条件を用いて上記反応図式１に示したように調製する。
【００８４】
実施例８  プローブＦ２９６Ｂの合成
【００８５】
この化合物は、ヘッド基の両方の側の出発物質として６−フェニル−２,３,３−トリメチル（３Ｈ）インドレインを用いる以外は同様の型の反応および条件を用いて上記反応図式１に示したように調製する。
【００８６】
実施例９  プローブＦ２９７Ｂの合成
【００８７】
Ｆ２９７Ｂは、濃硫酸の溶液中の２０％発煙硫酸で処理する際にＦ２９５Ｂから調製した。収率は６５％であった。
【００８８】
実施例１０  プローブ２９８Ｂの合成
【００８９】
Ｆ２９８Ｂは濃硫酸の溶液中の２０％発煙硫酸で処理する際にＦ２９６Ｂから調製した。収率は各々７９％であった。
【００９０】
実施例１１  プローブＦ３０５Ｂの合成
【００９１】
Ｆ３０５Ｂは以下に示すように合成した。
【００９２】
【化８】
2009524580.tif 000009
【００９３】
２−メチルチオ−ベンゾチアゾールとテトラデシル−４−クロロベンゼンスルホン酸エステルとを１２０℃にて２時間反応させて塩（１）を得、２−メチルベンゾチアゾールとドコサニル−４−クロロベンゼンスルホン酸エステルとを１２０℃にて１２時間反応させ、つづいて飽和ヨウ化カリウムで処理して塩（２）を得た。ついで、ＤＭＦ中のＤＢＵを用いて（１）および（２）を６０−７０℃にて３−４時間カップリングさせてＦ３０５Ｂを得、それを再結晶化およびクロマトグラフィーによって精製した。
【００９４】
実施例１２  プローブＦ３０６Ｂの合成
【００９５】
工程１：
【００９６】
【化９】
2009524580.tif 000010
【００９７】
１００ｍｌの丸底フラスコに７.２５ｇ（０.０４４モル）の２−アミノ−４−tert−ブチルフェノール（Aldrich、カタログ番号193282）と６.０ｇ（０.０５５モル）の塩酸アセトイミド酸メチル（Aldrich、カタログ番号254940）と５０ｍｌのＭｅＯＨを入れた。これを４時間環流した。ついで、真空下にてＭｅＯＨを除去した。これを５０ｍｌのエーテルおよび５０ｍｌの水の間で分離した。エーテルを分離し、乾燥し、真空下にて除去した。ついで、５０ｍｌのヘキサンを得られた固形物に添加した。残っている２−アミノ−４−tert−ブチルフェノールはヘキサン中に不溶性であり、濾過によって除去した。残った油性物を２％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いてクロマトグラフィーに付して５−tert−ブチル−２−メチルベンゾオキサゾールを得た（収率＝２ｇ、２４％）。
【００９８】
工程２：
【００９９】
【化１０】
2009524580.tif 000011
【０１００】
１００ｍｌ丸底フラスコに、アルゴン下、２ｇ（０.０１０６モル）のＳＭ１および４.７ｇ（０.０１０６モル）のＳＭ２を入れた。これを１５０℃にて４時間加熱した。ついで、油浴を１２０℃まで放冷して、４.７１ｇ（０.０３１８モル）および２０ｍｌの無水ピリジンをアルゴン下で添加し、２時間環流した。室温まで冷却した後に、反応混合物を１００ｍｌの５％ＫＩ溶液に注ぎ、０−５℃の冷蔵庫に一晩置いた。残った残渣を２×１００ｍｌの水で洗浄し、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いるクロマトグラフィーに付してＰＴＩＲ（収率＝８４０ｍｇ、７％）を得た。
【０１０１】
実施例１３  プローブＦ３０４Ｂの合成
【０１０２】
この化合物は、オクタデシル−４−クロロベンゼンスルホン酸エステルの代わりにＳＭ２としてヘキサデシル−４−クロロベンゼンスルホン酸エステルを用いる以外は、ＰＴＩＲ３０６と同様に作製した。
【０１０３】
実施例１４  プローブＦ３０８Ｂの合成
【０１０４】
工程１：
【０１０５】
【化１１】
2009524580.tif 000012
【０１０６】
２ｇのＳＭＩ（０.００３６５モル）と１５ｍｌのＨ２ＳＯ４とを２５ｍｌの丸底フラスコに入れた。これを氷浴中で１５分間攪拌し、ついで０.３ｇ（０.００３６５モル）ＮａＮＯ３を一度にすべて添加した。氷浴中で３０分間攪拌した後に、反応混合物を室温にて３時間攪拌した。ついで、これを５０グラムの氷上に注いだ。ついで、ＮａＣｌを飽和になるまで攪拌しつつ添加した。茶色固形物を分離した。大部分の水をデカンテーションした。固形物をＣＨＣｌ３に溶解し、５０ｍｌの水で２回洗浄した。ＣＨＣｌ３を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下にて除去した。その残渣を、１０％ＭｅＯＨ／９０％ＣＨ２Ｃｌ２で溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィーに付して、ニトロ生成物を得た（収率＝１.１２ｇ、７７％）。
【０１０７】
工程２：
【０１０８】
【化１２】
2009524580.tif 000013
【０１０９】
５０ｍｌ丸底フラスコに、１ｇのＳＭ１（０.００１７モル）および０.４６ｇ（０.００１７モル）のＳＭ２を２５ｍｌのＡｃ２Ｏと一緒に入れた。これを１５０℃に予め加熱した油浴中で１時間環流した。ついで、これを１００ｍｌの１０％ＫＩに注ぎ、一晩冷蔵庫に入れた。得られた固形物はさらに精製することなく、次の工程で用いた。
【０１１０】
工程３：
【０１１１】
【化１３】
2009524580.tif 000014
【０１１２】
１００ｍｌの丸底フラスコに、１.３８ｇのＳＭ１（０.００１８モル）および０.７２ｇのＳＭ２（０.００１８モル）を５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２と一緒に入れ、その混合物を１時間環流した。ついで、これを茶色が全く消失するまで、１０％のＨ２Ｏ／９０％ＭｅＯＨおよび０.１％ＴＦＡを流す７５ｇの逆相シリカ上に置いた。ついで、カラムを１００％ＭｅＯＨ／０.１％ＴＦＡで溶出して、純粋な生成物を得た（収率＝０.２９ｇ、１６％）。
【０１１３】
実施例１５  プローブＦ３１７Ｂの合成
【０１１４】
工程１：
【０１１５】
【化１４】
2009524580.tif 000015
【０１１６】
１００ｍｌの丸底フラスコに、５ｇのＳＭ１（０.００６８モル）、１.７５ｇのＳＭ２（０.００６８モル）および６０ｍｌのＡｃ２Ｏを入れた。これを予め加熱した油浴中、１５０℃にて１時間加熱した。ついで、これを３００ｍｌの１０％ＫＩ溶液に注ぎ、ついで冷蔵庫に一晩入れた。固形物を収集し、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下にて除去した。生成物は工程３にそのまま使用した。
【０１１７】
工程２：
【０１１８】
【化１５】
2009524580.tif 000016
【０１１９】
５０ｍｌの丸底フラスコに、２.８６ｇのレピジン（２０ミリモル）および４.０４ｇの１−ヨードブタン（２２ミリモル）を入れた。ついで、その反応物を一晩加熱環流した。ついで、溶液を４０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２にとり、４０ｍｌの５％  Ｎａ２ＣＯ３およびついで、２×４０ｍｌのＨ２Ｏで洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下にて濃縮して生成物を得た（収率＝６ｇ、９２％）。
【０１２０】
工程３：
【０１２１】
【化１６】
2009524580.tif 000017
【０１２２】
１００ｍｌの丸底フラスコに、２.４ｇのＳＭ１（０.００３モル）および０.９８ｇのＳＭ２（０.００３モル）、０.４５ｇのＤＢＵ（０.００３モル）を５０ｍｌのＥｔＯＨと一緒に入れた。ついで、その反応混合物を攪拌しながら１時間環流した。この時間の後に環流を終結し、混合物を一晩攪拌した。ついで、ＥｔＯＨを真空下で除去し、得られた物質を５０ｇの逆相シリカ上に置いた。カラムを２０％Ｈ２Ｏ／８０％ＭｅＯＨ＋０.１％ＴＦＡで最初に溶出し、ついで１００％ＭｅＯＨ＋０.１ＴＦＡで溶出した。純粋な画分を収集し、濃縮した。得られた物質をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下にて濃縮して生成物を得た（収率＝１５６.６ｍｇ、６％）。
【０１２３】
実施例１６  プローブＦ３１９Ｂの合成
【０１２４】
工程１：
【０１２５】
【化１７】
2009524580.tif 000018
【０１２６】
１００ｍｌの丸底フラスコに、４.８６ｇのＮ−テトラデシル−２,３,３−トリメチルインドリニウム＝４−クロロベンゼンスルホン酸塩（Ａ）（０.８８ミリモル）および５０ｍｌのＨ２ＳＯ４を入れた。この溶液を氷浴中で１５分間攪拌し、ついで０.７５ｇの亜硝酸ナトリウム（０.８８ミリモル）を添加した。氷浴中で３０分間攪拌した後に、反応混合物を室温にて３時間攪拌した。ついで、それを１００ｇの氷上に注いで氷を一旦融解し、飽和塩溶液が得られるまで塩化ナトリウムを攪拌しながら添加した。分離した茶色固形物および大部分の水をデカンテーションした。得られた固形物を２００ｍｌのＣＨＣｌ３に溶解し、１００ｍｌのＨ２Ｏで２回洗浄した。ＣＨＣｌ３を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィーに付して生成物（Ｂ）を得た。収率＝４８％。
【０１２７】
工程２：
【０１２８】
【化１８】
2009524580.tif 000019
【０１２９】
１００ｍｌの丸底フラスコに、５０ｍｌのＡｃ２Ｏを２ｇのヨウ化Ｎ−ドコサニル−２,３,３−トリメチルインドリニウム（Ｃ）および１.０５ｇの塩酸グルタコンアルデヒドジアニール（３.７ミリモル）と一緒に入れた。この混合物を予め加熱した油浴中、１５０℃にて２時間環流した。ついで、これを室温まで放冷して２００ｍｌの１０％ＫＩ溶液に注いだ。得られた固形物を濾別した。固形物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、残渣水を分離によって除去した。その有機相を濃縮し、得られた２.６４ｇの物質（Ｄ）をさらに精製することなく用いた。
【０１３０】
工程３：
【０１３１】
【化１９】
2009524580.tif 000020
【０１３２】
５０ｍｌの丸底フラスコに、２５ｍｌのＣＨＣｌ３を０.７９２ｇ（１.０ミリモル）の（Ｄ）および０.４ｇ（１.０ミリモル）の（Ｂ）と一緒に入れた。これを１時間環流し、ついで放冷した。真空下にて溶媒を除去した。その残渣を順相シリカゲルカラム上に置き、そのカラムに３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンにつづいて１００％ＣＨ２Ｃｌ２および最後に１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を流して生成物を取り出した。得られた物質は７５ｇのＣ１８逆相シリカを用い、１０％Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ／０.１％ＴＦＡにつづいて１００％ＭｅＯＨ／０.１％ＴＦＡで溶出してさらに精製した。９０ｍｇの（Ｅ）を得た（８.５％収率）。
【０１３３】
実施例１７  吸収／放出スペクトル
ここに表１および２に参照すると、本発明の幾つかの例の化合物の最大吸収および放出が示されている。吸収および蛍光スペクトルは、各々、Jasco, Inc. UV-530 UV/VIS吸光度計およびFP 750分光蛍光計上でエタノール中の０.２５μＭ溶液を用いて行った。スペクトル特性を表１および表２に要約する。近似の吸光率は、最大吸収を名目濃度（２５μＭ）で除することによって吸収スキャンから概算した。
【０１３４】
【表１】
2009524580.tif 000021
【０１３５】
【表２】
2009524580.tif 000022
【０１３６】
実施例１８  ＦＲ／ＮＩＲプローブの化学的安定性
固形物としてまたはエタノール中の１ｍＭ溶液として室温で保存した場合の本発明の例示化合物の化学的安定性を、前記と同じ条件を用いてＨＰＬＣによって測定した。２６０ｎＭで本発明の例示化合物について決定したピークの積分を用いて、化学的安定性を概算した。試験したある種の化合物は、ほぼ２ヶ月間室温で固形物として保持した場合、および、ほぼ１ヶ月間室温でエタノール中の１ｍＭ液体溶液として保持した場合に、ＨＰＬＣ純度において＜５％変化を示した。
【０１３７】
実施例１９  ＦＲ／ＮＩＲプローブの光安定性
通常の蛍光照明下、２４時間溶液で保存した場合の本発明の例示化合物の光安定性を表３に表す。＞６０％エタノール中の示したプローブの１ｍＭ溶液を、通常の室内蛍光照明下に置いた。調製後直ちに各試料からアリコットをとり、例示化合物についての最大吸収の吸収を測定した。通常の蛍光照明下、室温にて２４時間後に、各試料の吸収を再度測定した。試験したある種の化合物は＜２０％光漂白を示した。
【０１３８】
実施例２０  ＦＲ／ＮＩＲプローブの溶解性
【０１３９】
本発明の化合物の安定性に対する非対称および対称側鎖およびメチレン架橋の種々の組合せの効果を調べた。市販されているプローブ希釈物、Diluent Cにおける溶解度も試験した。ストックした１ｍＭプローブ溶液の３回１：５０希釈物をエタノールまたは試験希釈物のいずれかで作製した。室温にて３０分後に、溶液を１０,０００×ｇにて１０分間遠心していずれの微小沈殿も除去し、１００ｍｌアリコットを吸収測定のために２.０ｍｌのエタノールに移した。結果は、表３に示すように１００％エタノール中に希釈した対照から得た吸収の％として表す。Leungらの教示および市販の希釈物についての分析のSigma証明書（３０分における希釈上清吸収、３０分後の少なくとも６０％のエタノール上清吸収）に見出される溶解度規格に基づいて、少なくとも６０％のエタノール対照の予備規格を、１００よりも大きいＳ／Ｎ比で細胞標識を達成し、および、標識の明るさまたは再現性を含む潜在的な問題を最小限化するために十分な溶解度の代理として設定した。ある種の例示化合物は、Diluent Cにおいて３０分後に溶解性であった。
【０１４０】
【表３】
2009524580.tif 000023
【０１４１】
Diluent Cは、一般的に使用される市販されている塩を含有しないビヒクル（Sigma-Aldrich Chemical Company)である。この例は、本発明の修飾比対称プローブが市販されている膜プローブ希釈物に溶解性であることを示している。また、等浸透性の希釈物における溶解度がHoranらによって教示されたものより小さい場合でさえ、有用レベルの細胞標識が得られることも示している。
【０１４２】
実施例２１  細胞生存能力、細胞増殖およびＳ／Ｎ比に対する紫色プローブ効果の特徴付け
【０１４３】
Ｕ９３７細胞を、Diluent C中に懸濁した２×細胞とDiluent C中の２×プローブとを迅速に混合することによってプローブの増大する濃度を用いて、１０７細胞／ｍｌの濃度で染色した。室温にて５分後に、細胞培養培地を添加することによって染色を終結した。ついで、細胞をよく洗浄し、標準条件下で２２−２４時間培養した。細胞数を希釈物単独を用いて試験した対照培養物におけるものと比較した。
【０１４４】
市販の参照染料（ＰＫＨ２６）またはＦ３０５Ｂで染色した培養Ｕ９３７細胞が４日間毎日モニターした場合に匹敵した増殖を示したため、Ｆ３０５Ｂの最大許容濃度（ＭＴＣ）は２０マイクロモル／Ｌであることが見出された。また、両方の染料で標識した細胞は、ＰＫＨ２６については４８８ｎｍ励起を用い、Ｆ３０５Ｂについては４０５ｎｍ励起を用いるＦＡＣＳＡriaフローサイトメーターを用いて、平均蛍光強度（ＭＦＩ）における変化について毎日モニターした。増大する細胞カウント（細胞増殖）と減少する蛍光強度（染料希釈）の間の相関がＦ３０５ＢおよびＰＫＨ２６について匹敵することも見出されたことは、Ｆ３０５ＢはＰＫＨ２６と同様に、優れた膜保持特性を有し、染料希釈法を用いる細胞増殖モニターに好適であることを示している。予想されたように、紫外および紫領域における高レベルの細胞自己蛍光に起因して、Ｆ３０５ＢはＰＫＨ２６よりもＴ０においてより低い信号対雑音比を有した。しかしながら、標識細胞の蛍光強度分布が非染色細胞のものと実質的に重複し始める前は、初期ＭＦＩは少なくとも４およびおそらく５または６倍化を検出するのに十分に高かった。４８８ｎｍまたは６３３ｎｍ励起染料の検出に用いたフィルターウィンドウへのＦ３０８Ｂの色重複は最小限であった。４０５ｎｍ励起染料は４８８ｎｍ励起染料よりもあまり市販されていないため、したがって、この性質を有する６３３ｎｍ励起染料は、その幾分小さい信号対雑音比にもかかわらず、膜標識細胞およびその増殖をモニターするために用いるスペクトルウィンドウの選択に大きな融通性を提供するのに有用であると考えられた。
【０１４５】
各染料のＭＴＣにおいて市販の参照染料（ＰＫＨ２６）またはＦ３０８Ｂで染色したＵ９３７細胞が４日間毎日モニターした場合（ほぼ４細胞倍化）に匹敵した増殖を示したので、前記した方法に従ってDiluent Cで標識した培養Ｕ９３７細胞（連続骨髄腫前駆細胞系統）について、Ｆ３０８Ｂの最大許容濃度（ＭＴＣ）は１５マイクロモル／Ｌであることが見出された。両方の染料で標識した細胞も、ＰＫＨ２６については４８８ｎｍ励起を用いる、およびＦ３０８Ｂについては６３３ｎｍ励起を用いるＦＡＣＳＣaliburフローサイトメーターを用いて、平均蛍光強度（ＭＦＩ）における変化について毎日モニターした。増大する細胞カウント（細胞増殖）および減少する蛍光強度（染料希釈）の間の相関もＦ３０８ＢおよびＰＫＨ２６に匹敵することが見出され、Ｆ３０８ＢはＰＫＨ２６と同様に優れた膜保持特性を有し、染料希釈法を用いた細胞増殖モニターに好適であることが示された。予想されたように、Ｆ３０８Ｂは、遠赤外におけるより低レベルの細胞自己蛍光に起因して、ＰＫＨ２６よりもＴ０においてより大きな信号対雑音比を有していた。細胞は４倍化のみの後であったが、染料希釈曲線は、少なくとも７−８およびおそらく９細胞倍化まで、標識細胞の蛍光強度分布が非染色細胞のものと実質的に重複し始める前はＦ３０８Ｂを用いてモニターし得ることを示唆した。Ｆ３０８Ｂの色重複は、フルオロセインまたはフィコエリスリンの検出に用いたフィルターウィンドウにおいて最小であり、テキサスレッドまたはＰＥ−Ｃｙ５タンデムコンジュゲート染料を検出するために用いたフィルターウィンドウにおいては適当であるが容易に補正可能であった。
【０１４６】
各染料のＭＴＣにおいて市販の参照染料（ＰＫＨ２６）またはＦ３０８Ｂで染色したＵ９３７細胞が４日間毎日モニターした場合（ほぼ４細胞倍化）に匹敵した増殖を示したので、１×１０７細胞／ｍＬの最終細胞濃度まで前記した方法に従ってDiluent Cで標識した培養Ｕ９３７細胞（連続骨髄腫前駆細胞系統）について、Ｆ３１７Ｂの最大許容濃度（ＭＴＣ）は、２０マイクロモル／Ｌであることが判明した。各染料のＭＴＣの市販されている参照染料（ＰＫＨ２６）またはＦ３１７Ｂで染色したＵ９３７細胞は、４日間毎日モニターした場合（ほぼ４細胞倍化）について、匹敵する増殖を示した。両方の染料で標識した細胞も、ＰＫＨ２６については４８８ｎｍ励起を用いる、およびＦ３１７Ｂについては６３３ｎｍ励起を用いるＦＡＣＳＣaliburフローサイトメーターを用いて、平均蛍光強度（ＭＦＩ）における変化について毎日モニターした。増大する細胞カウント（細胞増殖）および減少する蛍光強度（染料希釈）の間の相関もＦ３１７ＢおよびＰＫＨ２６に匹敵することが見出され、Ｆ３１７ＢはＰＫＨ２６と同様に優れた膜保持特性を有し、染料希釈法を用いた細胞増殖モニターに好適であることが示された。しかしながら、Ｆ３１７Ｂについての最大励起がＦ３０８Ｂのもののように６３３ｎｍレーザーに同様に合致しないことに起因して、信号対雑音比はＦ３０８ＢについてよりもＦ３１７Ｂについて実質的に低く、標識細胞の蛍光強度分布が非染色細胞のものと実質的に重複し始める前にせいぜい４細胞倍化しかモニターし得なかった。ＦＡＣＳＣalibur上のすべてのフィルターウィンドウにおいてＦ３１７Ｂについて実質的な色重複が示され、これは、Ｆ３０８Ｂが遠赤外波長における増殖モニターについて良好な染料であることをさらに示している。
【０１４７】
１×１０７細胞／ｍＬの最終細胞濃度まで前記した方法に従ってDiluent Cで標識した培養Ｕ９３７細胞（連続骨髄腫前駆細胞系統）について、Ｆ３１９Ｂの最大許容濃度（ＭＴＣ）は、２０マイクロモル／Ｌであることが判明した。匹敵する濃度の市販の参照染料（ＰＫＨ２６、１２マイクロモル／Ｌ）またはＦ３１９Ｂ（１２.５マイクロモル／Ｌ）で標識し、つぎの６日間毎日モニターしたＵ９３７細胞は匹敵する増殖を示した。ＰＫＨ２６またはＦ３１９Ｂのいずれかで標識した細胞も、ＰＫＨ２６については４８８ｎｍ励起を用いる、およびＦ３１９Ｂについては７８５ｎｍ励起を用いるＦＡＣＳＡriaフローサイトメーターを用いて、平均蛍光強度（ＭＦＩ）における変化について毎日モニターした。増大する細胞カウント（細胞増殖）および減少する蛍光強度（染料希釈）の間の相関もＦ３１９ＢおよびＰＫＨ２６に匹敵することが見出され、Ｆ３１９ＢはＰＫＨ２６と同様に優れた膜保持特性を有し、染料希釈法を用いた細胞増殖モニターに好適であることが示された。Ｆ３１９Ｂは、近赤外における細胞自己蛍光の低レベルに一部分起因して、および、ＰＫＨ２６についてよりもこの染料についてレーザー線と最大励起との間のより最適な合致に一部分起因して、Ｆ３１９ＢはＰＫＨ２６（ほぼ５×）よりもＴ０において実質的により大きな信号対雑比を有していた。ＰＫＨ２６で標識した場合には、細胞は４−５倍化のみ続き得たが、標識細胞の蛍光強度分布が非染色細胞のものと実質的に重複し始める前にＦ３１９Ｂを用いて少なくとも６倍化をモニターし得た。Ｆ３１９Ｂの色重複は、フルオレセイン、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびＰＥ−テキサスレッド、ＰＥ−Ｃｙ５またはＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５タンデムコンジュゲート染料の検出に用いたフィルターウィンドウで最小であった。ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムコンジュゲート染料を検出するために用いたフィルターウィンドウにおいては適度であるが簡単に補正可能な重複が示され、Ａｌｅｘａ７００染料を検出するために用いたフィルターウィンドウにおいてはより顕著であるがいまだ補正可能な重複が示された。
【０１４８】
前記の記載及び図面は本発明の目的、特徴および利点を達成するために好ましい形態を説明だけを意図するものであって、本発明がそれに限定されることを意図するものではない。以下の特許請求の範囲の趣旨および範囲に入る本発明のいずれの修飾も本発明の考慮される部分である。
【国際調査報告】
2009524580.tif 000061