(57)【要約】【課題】  本発明は、天然の第ＶＩＩＩ因子に比して、相互作用の能力および抗原をエンドサイトーシスすることが可能な細胞によってエンドサイトーシスされる能力が減少または阻害される、脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子あるいはその断片を実現することを目的とする。【解決手段】  本発明は、抗原を取り込むことができる細胞と反応する能力及びその細胞に取り込まれることができる能力が、天然の因子ＶＩＩＩによって低下あるいは阻害される脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片である。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を取り込むことができる細胞と反応する能力及びその細胞に取り込まれることができる能力が天然の因子ＶＩＩＩによって低下あるいは阻害される脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項２】
抗原を取り込むことができる上記細胞の表面に存在する受容体と相互作用する能力が低下あるいは阻害される請求項１に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項３】
上記受容体がマンノース固有の請求項２に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項４】
上記受容体がマンノース受容体ＣＤ２０６あるいはＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞固有細胞内接着分子３（ＩＣＡＭ−３）−グラビング非インテグリン）受容体ＣＤ２０９である、請求項３に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。  
【請求項５】
抗原を取り込むことができる上記細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。  
【請求項６】
上記抗原提示細胞（ＡＰＣ）が樹状細胞あるいはＢリンパ球であることを特徴とする、請求項１−５のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項７】
抗原を取り込むことができる上記細胞が、マクロファージ、内皮細胞、肝洞様毛細血管内皮細胞、肝クッパー細胞から選択されることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項８】
脱グリコシル化がノイラミニダーゼ、ベータ・ガラクトシダーゼ、及びアルファ・マンノシダーゼで構成される群から選択される１つあるいは複数の酵素を用いなくても得られることを特徴とする、請求項１−７のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項９】
上記脱グリコシル化がエンドグリコシダーゼ・タイプの単一の酵素の作用で行われることを特徴とする、請求項１−８のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１０】
上記エンドグリコシダーゼ・タイプの酵素がエンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであることを特徴とする、請求項９に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１１】
上記エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼがオリゴマンノース・タイプ及びそのハイブリッド・タイプの糖質構造を切断する能力を有しているが、その複合タイプの糖質構造を切断する能力は有していないことを特徴とする、請求項１０に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１２】
上記エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼがエンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ１及びエンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１０あるいは１１のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１３】
上記エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ１がクリセオバクテリウム（フラボバクテリウム）メニンゴセプチカムであることを特徴とする、請求項１２に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１４】
上記エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨがストレプトマイセス・ピカタスのエンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨであることを特徴とする、請求項１２に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１５】
薬品として使用するための、請求項１−１４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１６】
血友病患者の治療のための医薬品として用いるための、請求項１−１４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１７】
タイプＡあるいはタイプＢの血友病患者の治療のための医薬品として用いるための、請求項１−１４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１８】
血友病患者の治療を目的とする医薬品調製のための、請求項１−１４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項１９】
外来因子ＶＩＩＩと組み合わせて、血友病患者の治療を目的とする医薬品を調製するための請求項１８に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項２０】
タイプＡあるいはタイプＢの血友病患者の治療のための医薬品を調製するための請求項１−１４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項２１】
血友病患者における外来性因子ＶＩＩＩの半減期を延長することを目的とした医薬品調製のための請求項１−１４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項２２】
血友病患者における外来性因子ＶＩＩＩの免疫源性を低下させることを目的とした医薬品調製のための請求項１−１４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片。
【請求項２３】
請求項１−１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片及び１つあるいは複数の薬学的に許容される補助剤及び／又は賦形剤。
【請求項２４】
血友病患者の治療を目的とする医薬品調製のためのマンナンを含む組成物の利用。
【請求項２５】
タイプＡあるいはＢの血友病治療を目的とする医薬品調製のためのマンナンを含む組成物の利用。
【請求項２６】
血友病患者の外因性因子ＶＩＩＩの半減期を延長することを目的とする医薬品調製のためのマンナンを含む組成物の利用。
【請求項２７】
血友病患者の外因性因子ＶＩＩＩの免疫源性低下させることを目的とする医薬品調製のためのマンナンを含む組成物の利用。
【請求項２８】
マンナンを含む上記組成物が、生来タイプの外因性因子ＶＩＩＩ及び／又は請求項１−１４のいずれか１項に記載の脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片を含んでいることを特徴とする、請求項２４−２７のいずれか１項に記載の医薬品調製のためのマンナンを含む組成物の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原をエンドサイトーシスすることが可能な免疫系の細胞によるＦＶＩＩＩ（第ＶＩＩＩ因子）のエンドサイトーシスをブロックすることによって、抗ＦＶＩＩＩ免疫応答を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは染色体Ｘの異常に起因する遺伝性疾患であり、その病気に冒されている人において、それ自体で血餅を形成する能力がないことによって示される。この疾患は、凝固に関与する蛋白質、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の遺伝子における突然変異の結果であり、これは、血液中におけるＦＶＩＩＩの完全な欠如か、またはその部分的な欠乏を引き起こす。
【０００３】
血友病Ａは、血液凝固に影響を与える不全症の中で最も一般的である：フランスにおいて、５０００人のうち１人の男性が冒されている。これは血友病に苦しむ患者の内の８０％に相当する。他のタイプの血友病、血友病Ｂは、血友病に苦しむ患者の２０％にみられ、それは、他の凝固因子、第ＩＸ因子の欠乏に起因する。
【０００４】
血友病（タイプＡまたはＢ）の現在の治療は、欠乏しているかまたは欠如している凝固因子の静脈投与により行われる。フランスにおいて、血友病の治療のためのＦＶＩＩＩは、ラボラトワール、フランセ、デュ、フラクショヌマン、エ、デ、ビオテクノロジ（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ  ｅｔ  ｄｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＬＦＢ）によってまたはインターナショナル・ファーマシューティカル・ラボラトリーズ（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって提供される血液誘導化薬物の形態で、ならびに遺伝子工学方法によって調製された遺伝子組換え薬物の形態で、入手可能である。実際に、ＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡが、単離されおよび哺乳動物細胞において発現され（Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：３３０−３３７）、そしてそのアミノ酸配列がｃＤＮＡから誘導された。
【０００５】
分泌されたＦＶＩＩＩは３００Ｋｄａ（２３３２アミノ酸）の分子量を有する糖蛋白質であり、これは、内因性凝固経路の活性化において重要な役割を果たしている。不活性ＦＶＩＩＩは、以下の６つの領域からなる：Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ１（残基１−３７２）、Ａ２（残基３７３−７４０）、Ｂ（残基７４１−１６４８）、Ａ３（残基１６４９−２０１９）、Ｃ１（残基２０２０−２１７２）およびＣ２（残基２１７３−２３３２）。分泌後、ＦＶＩＩＩは、フォン・ビルブラント因子（Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  Ｆａｃｔｏｒ；ＷＦ）と相互作用し、これは、ＦＶＩＩＩを血漿プロテアーゼから保護する。ＦＶＩＩＩは、この形態で血液中を循環する。ＦＶＩＩＩは、トロンビンによる切断時に、ＷＦから解離する。この切断は、ドメインＢの排除、およびドメインＡ１、ドメインＡ２および軽鎖Ａ３‐Ｃ１‐Ｃ２からなるヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形態でＦＶＩＩＩの活性化を生じさせる。ＦＶＩＩＩは、この形態で血漿中を循環する。このヘテロダイマーは、重鎖（Ａ１、Ａ２）および軽鎖（Ａ３、Ｃ１、Ｃ２）からなる。
【０００６】
ＦＶＩＩＩが血友病患者へ注入されると、それは、患者の血流中のフォン・ビルブラント因子へ結合する。活性化第ＶＩＩＩ因子は、活性化第ＩＸ因子の補因子として作用し、第Ｘ因子の活性化第Ｘ因子への変換を促進する。活性化第Ｘ因子は、プロトロンビンをトロンビンへ変換する。次いで、トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンへ変換し、続いて血餅が形成される。
【０００７】
ＦＶＩＩＩの投与で遭遇する主な問題は、≪阻害抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）≫と呼ばれる、患者におけるＦＶＩＩＩに対する抗体の出現である。これらの抗体は、ＦＶＩＩＩのプロ凝固活性（ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を中和し、これは、注入されるとすぐに不活性化される。従って、投与された凝固因子は、出血が停止し得る前に破壊され、これは、血友病の重大な合併症であり、治療を無効にしてしまう。更に、ある遺伝的に非血友病性の患者は、内因ＦＶＩＩＩに対するインヒビターを発現し得る：これは、後天性血友病である。
【０００８】
ＦＶＩＩＩの作用に対する抗ＦＶＩＩＩ抗体干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）には、ＦＶＩＩＩの蛋白分解性切断およびＦＶＩＩＩと種々のパートナー、例えばフォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、リン脂質（ＰＬ）、第ＩＸ因子、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）またはＡＰＣ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ；活性化プロテインＣ）との相互作用における干渉など多数の機構が存在する。
【０００９】
ＦＶＩＩＩに対する特定の免疫応答の開始の第１段階は、抗原提示細胞によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスである。樹状細胞（ＤＣ）は最も効力のある抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、一次ナイーブＴ細胞を活性化することができる希少なタイプのＡＰＣの一つである。従ってＤＣは、抗原（１，２）に対する特定の免疫応答を開始することができる。これらのＤＣは、受容体を介して、あるいはマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込み、従って、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスがイン・ビボでのＤＣにとって好適である。
【００１０】
ＤＣの表面は無数のエンドサイトーシス受容体を有しており、それら受容体の大部分は、二価イオン、主にカルシウムに強く依存している（図１）。無数のエンドサイトーシス受容体は、それらの糖認識ドメイン（ＣＲＤ）のために、抗原上に存在する糖残基に特異的であり、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）と呼ばれる。従って、抗原上のマンノース残基は、マンノース受容体（ＭＲ、ＣＤ２０６）、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体（ＣＤ２０９）、デクチン、ＤＥＣ‐２０５（ＣＤ２０５）を包含する樹状細胞の表面上の一連のマンノース感作性ＣＬＲによって認識される。マンナンは、マンノースに対して感作性があるこれらマンノース感作性ＣＬＲ用の、特にＭＲおよびＤＣ‐ＳＩＧＮ（３‐５）用のリガンドである。樹状細胞のＤＣ‐ＳＩＧＮ分子はＴリンパ球のＩＣＡＭ‐３分子と結合する。この特定の相互作用は、樹状細胞およびＴＬ間の免疫シナプスの開始において重要な役割を果たす。リンパ球の活性化は、抗ＤＣ‐ＳＩＧＮ阻止抗体によって阻害される。
【００１１】
ＦＶＩＩＩ分子は、Ｎに結合した潜在的グリコシル化部位である２５のコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）を含み、その内の２０がグリコシル化することが実証されている（６）。Ｎ結合型グリコシル化の中には、ＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤ（Ｂドメイン欠失組換えＦＶＩＩＩ、ＲｅＦａｃｔｏ、Ｗｙｅｔｈ）上で保たれるものもある。血液由来ＦＶＩＩＩおよび遺伝子組換えＦＶＩＩＩの両ＦＶＩＩＩは同様のグリコシル化特性を示し、残基がガラクトースまたはマンノースで終端している（８、９）。
【００１２】
故に、ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤは、樹状細胞の表面上のＣＬＲに対するリガンドの候補である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
例えば、ＦＶＩＩＩの産生を刺激する合成ホルモンであるデスモプレシン、プロトロンビン複合体濃縮物または活性化プロトロンビン複合体濃縮物などの凝固を促進する作用物質、組換えＶＩＩａ因子を含む処理、および多量のまたは中間量のＦＶＩＩＩを潅流培養して寛容性を誘発する方法を含む処理など、抗ＦＶＩＩＩ免疫応答が招く結果を減衰させることのできる処理が幾つか存在する。しかし、これらの方法はコストが非常に高く、あまり有用ではない。
【００１４】
ＦＶＩＩＩのインヒビター抗体に対すさらにより最近の戦略的努力は、該インヒビター抗体を中和する抗イディオタイプ抗体（他の抗体の可変領域と相互作用する能力を有する抗体）の投与を考慮に入れている（Ｓａｉｎｔ−Ｒｅｍｙ  ＪＭら、（１９９９）Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ；７７（ｓｕｐｐｌ１）２１?２４）。この免疫ポリクローナル応答のインビボ分析の複雑性のために、ＦＶＩＩＩの特定ドメインに対するモノクローナル抗体が、研究チームによって単離された。従って、ＩｇＧ４κタイプのヒトモノクローナル抗体（ＬＥ２Ｅ９）が単離された。この抗体は、ＦＶＩＩＩのドメインＣ１に対するものであり、そしてＦＶＩＩＩの補因子活性およびｖＷＦへのその結合を阻害する（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎら、（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５：１５６‐１６３）。同一の様式で、インヒビターを有する血友病Ａに苦しむ患者のメモリーＢ細胞のレパートリーから産生された、ＢＯ２Ｃ１１と呼ばれる（ＩｇＧ４κ）ＦＶＩＩＩのドメインＣ２に対するヒトモノクローナル抗体が、単離された（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎら、  Ｂｌｏｏｄ  １９９８  Ｊｕｌ  １５；９２（２）：４９６‐５０６）。ＢＯ２Ｃ１１は、ＦＶＩＩＩのドメインＣ２を認識し、そしてＶＷＦおよびリン脂質へのその結合を阻害する。それは、天然および活性化ＦＶＩＩＩのプロ凝固活性（ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を完全に阻害する。モノクローナル抗体の更なる例は、ＦＶＩＩＩのドメインＡ２に対するＢＯＩＩＢ２抗体である。ＢＯＩＩＢ２抗体は、ＦＶＩＩＩ活性の９９％を阻害する。ドメインＡ２へ結合することによって、それは、ＦＩＸａ（これは、ＦＶＩＩＩのこの領域内に低親和性結合部位を含有する）の結合に干渉しそして阻害し得、そして、その瞬間から、ＦＩＸａの酵素活性を阻害する。第二の考えられる作用様式は、ＦＶＩＩＩのヘテロダイマー形態（Ａ２：Ａ１およびＡ３：Ｃ１：Ｃ２）とＦＶＩＩＩのヘテロトリマー形態（Ａ２およびＡ１およびＡ３：Ｃ１：Ｃ２）との間の平衡におけるその干渉であり、これらの複合体からのドメインＡ２の分離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を促進し、それらを非機能性にする（Ａｎａｎｙｅｖａ  ＮＭら、（２００４）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．Ｍａｒ．１５（２）：１０９−２４．Ｒｅｖｉｅｗ）。
【００１５】
しかし、抗ＦＶＩＩＩ免疫応答はポリクローナルであり、そして患者中で発現されるＦＶＩＩＩインヒビター抗体は、必ずしも、ＦＶＩＩＩの単一のドメインに対するわけではない。
【００１６】
ＦＶＩＩＩの単一ドメインに対する抗ＦＶＩＩＩ抗体に対する抗イディオタイプ抗体の投与からなる処理は、患者中で発現される抗ＦＶＩＩＩ免疫応答を部分的にしか中和することができない。
【００１７】
抗ＦＶＩＩＩ免疫応答が出現する前の作用に対して利用可能な処理は存在せず、そのためそれを回避する処理も存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、抗原を取り込むことができる細胞と反応する能力及びその細胞に取り込まれることができる能力が天然の因子ＶＩＩＩによって低下あるいは阻害される脱グリコシル化因子ＶＩＩＩあるいはその断片である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントが提供され、この脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子においては、天然の第ＶＩＩＩ因子に比して、相互作用の能力および抗原をエンドサイトーシスすることが可能な細胞によってエンドサイトーシスされる能力が減少または阻害される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
［発明の概要］
従来技術における上述のような不利点を解消するために、出願人は、抗原をエンドサイトーシスし、その結果として抗ＦＶＩＩＩインヒビター抗体の形成を阻害することができる免疫系の細胞によって、ＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスをブロックし、またＦＶＩＩＩの半減期を増加させることができることを発見した。
【００２１】
本発明の一態様によれば、脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントが提供され、この脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子においては、天然の第ＶＩＩＩ因子に比して、相互作用の能力および抗原をエンドサイトーシスすることが可能な細胞によってエンドサイトーシスされる能力が減少または阻害される。
【００２２】
もう１つの特定の好適な実施の形態によれば、この脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントにおいては、抗原をエンドサイトーシスすることが可能な該細胞の表面上に存在する受容体、特にマンノースに特異的な受容体、より特にマンノース受容体ＣＤ２０６またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体ＣＤ２０９（非‐インテグリンを取り込む樹状細胞特異的細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ‐３））との相互作用の能力が低減または阻害される。
【００２３】
本発明の好ましい１つの実施の形態によれば、抗原をエンドサイトーシスすることができる該細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に樹状細胞またはＢリンパ球である。本発明のもう１つの好ましい形態によれば、抗原をエンドサイトーシスすることができる別の細胞は、マクロファージ、内皮細胞、肝類洞内皮細胞、肝クッパー細胞の内から選択される。
【００２４】
本発明の好ましい１つの実施の形態によれば、第ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントは、ノイラミニダーゼ、β‐ガラクトシダーゼおよびα‐マンノシダーゼから成る群より選択される１種またはそれ以上の酵素を用いることなく脱グリコシル化される。
【００２５】
本発明の特殊な１つの実施の形態によれば、第ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントは、エンドグルコシダーゼ型、特にエンド‐β‐Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ型の単一の酵素の作用によって脱グリコシル化される。本発明の好ましい１つの実施の形態において、用いられる酵素は、オリゴマンノース型およびハイブリッド型の炭水化物構造を切断する能力を有しているが、複合型の炭水化物構造を切断する能力を有していない。
【００２６】
本発明の特定の実施の形態において、エンド‐β‐Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ型の該酵素は、エンド‐β‐Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼＦ１およびエンド‐β‐Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼＨ、例えばクリセオバクテリウム（フラボバクテリウム）・メニンゴセプティカムのエンド‐β‐Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼＦ１またはストレプトミセス・プリカタスのエンド‐β‐Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼＨから成る群より選択される。
【００２７】
本発明のもう１つの実施の形態によれば、本発明の脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントは、薬物として、具体的には血友病患者の治療のため、特にタイプＡまたはタイプＢの血友病の治療のために用いられる。本発明のもう１つの実施の形態によれば、本発明の脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントは、血友病患者の治療を意図した薬剤の調製のため、あるいはタイプＡまたはタイプＢの血友病の治療のためにも用いられ、外因性第ＶＩＩＩ因子と組み合わせて好適に用いられる。
【００２８】
本発明のさらにもう１つの目的によれば、本発明の脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントは、外因性ＶＩＩＩ因子の半減期を増加させることを目的とした、または外因性ＶＩＩＩ因子の免疫原性を低減させることを目的とした医薬の調製に用いることができる。
【００２９】
また本発明のもう１つの態様は、少なくとも本発明の脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメント、および医薬的に許容可能な一つ以上の補助剤および／または賦形剤を含有する医薬組成物にも関係している。
【００３０】
本発明の最後の目的は、血友病患者の治療を目的とした、またはタイプＡまたはタイプＢの血友病の治療を目的とした医薬の調製のための、マンナンを含有する組成物の使用に関するものである。特定の１つの実施の形態によれば、このマンナンを含有する組成物は、外因性ＶＩＩＩ因子の半減期を増加させること、または血友病患者の外因性ＶＩＩＩ因子の免疫原性を低減させることを目的とした医薬の調製に用いられる。好適な１つの実施の形態によれば、該マンナン組成物は、天然型の外因性ＶＩＩＩ因子および／または本発明による脱グリコシル化ＶＩＩＩ因子またはそのフラグメントをも含有する。
【００３１】
全体として、明細書本文および要約書、また請求項において用いられている以下の用語は、特に指定がない限り以下の意味で用いられる。
【００３２】
概括的に述べると、明細書本文および要約書、また請求項において、アスパラギン残基（Ｎ）に結合した炭水化物鎖（この残基は、例えば天然または脱グリコシル化ＦＶＩＩＩなどの、ポリペプチドに含有され得る）の定義は、当業者にはよく知られており、２つのＮ‐アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）および３つのマンノースから成る塩基構造を有しており、またその他の単糖類がこの構造上にグラフト結合していてもよい。この塩基構造は、位置β１、４で結合した２つのＮ‐アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を一緒にして結合させることにより形成される。その一方は、蛋白質とのＮ‐グリコシド結合を形成する（アスパラギンによって）。他方は位置β１、４のマンノース残基と結合し、それ自体は、例えば位置α１、６およびα１，３の２つのマンノース残基と結合する。
【００３３】
【化１】
2009520775.tif 000002
【００３４】
本願において示されるアスパラギンに結合した炭水化物鎖は、単なる１例である。したがって、いかなる態様においても本発明がこれらに限定されるわけではない。
【００３５】
“分岐”は単糖を末端マンノースに付加することによって形成される。糖の性質によって、このように３つの型のグリカン構造で区別する。
【００３６】
‐マンノース残基の塩基構造への付加に相当する“オリゴマンノース”型構造；例えば：
【００３７】
【化２】
2009520775.tif 000003
【００３８】
‐Ｎ‐アセチルラクトサミン残基（ＬａｃＮａｃ：  Ｇａｌ  β１，４  ＧｌｃＮＡｃ）の塩基構造の末端マンノース（ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌの添加は順次であり、ＧｌｃＮＡｃＴ‐１，２，３，４，５続いてＧａｌＴの活性の結果生じる）への結合の結果生じる“複合”型構造；例えば：
【００３９】
【化３】
2009520775.tif 000004
【００４０】
‐その名が示す通り、前記２つの形態の混合である“ハイブリッド”型構造。以下に示す実施例において、α１，６分枝のマンノースはマンノース残基によってのみ置換され、一方α１，３分枝は１つまたは２つのＮ‐アセチルラクトサミン残基によって置換される：
【００４１】
【化４】
2009520775.tif 000005
【００４２】
［発明の詳細な説明］
本発明は、主として第ＶＩＩＩ因子と抗原をエンドサイトーシスすることが可能な細胞との相互作用、および該細胞による第ＶＩＩＩ因子のエンドサイトーシスを阻害することができる化合物に関する。
【００４３】
実際に、出願人はマンナンおよび脱マンノシル化ＦＶＩＩＩなどの特定の化合物が樹状細胞によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスを阻害することができることを証明した。
【００４４】
また、出願人は、このようにマンナンが、ＦＶＩＩＩのプロ凝固活性またはＦＶＩＩＩとＶＷＦとの相互作用を阻むことなくＦＶＩＩＩに特異的なＴ細胞の増殖を阻害することをも証明した。
【００４５】
具体的に述べると、この化合物は、第ＶＩＩＩ因子と、抗原をエンドサイトーシスすることが可能な細胞上に存在し、該細胞による第ＶＩＩＩ因子のエンドサイトーシスの原因ともなる受容体との相互作用を阻害することができる。
【００４６】
このように本発明には、ＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスの原因となる細胞上の受容体を阻害するＦＶＩＩＩ以外の化合物、そしてエンドサイトーシスの原因となる細胞との結合能力が天然のＦＶＩＩＩに比して低い修飾ＦＶＩＩＩ分子その全体またはそのフラグメントも含まれる。これら２つのタイプの化合物はそれぞれ、抗原をエンドサイトーシスすることが可能な免疫系の細胞によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスを阻害する。
【００４７】
修飾ＦＶＩＩＩ分子またはそのフラグメントの場合、該ＦＶＩＩＩ化合物は、それをエンドサイトーシスすることが可能な細胞とのそれ自体の相互作用および該細胞によるそれ自体のエンドサイトーシスを阻害する。それゆえ修飾ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントのエンドサイトーシスは天然のＦＶＩＩＩに比して低減される。このＦＶＩＩＩは、天然のＦＶＩＩＩに対して、そのグリコシル化のレベルに修飾されるのが好ましい。
【００４８】
本発明の好ましい実施の形態において、上記受容体はマンノースに対して特異的であり、特に好ましくは、マンノースに対して特異的な上記受容体はマンノース受容体ＣＤ２０６またはＤＣ−ＳＩＧＮ（非‐インテグリンを取り込む樹状細胞特異的細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ‐３））受容体ＣＤ２０９である。
【００４９】
本発明の特定の実施の形態において、抗原をエンドサイトーシスすることが可能な上記細胞は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞またはＢリンパ球である。
【００５０】
このように、本発明による化合物は抗原提示細胞によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスを阻害することができ、それゆえに免疫応答を惹起するＦＶＩＩＩペプチドの提示を阻害することができる。その結果として、本発明による化合物は、抗ＦＶＩＩＩ抗体の産生を阻害し、ＦＶＩＩＩの免疫原性を低減させる。
【００５１】
本発明の特定の一実施の形態において、抗原をエンドサイトーシスすることが可能な上記細胞は、マクロファージ、内皮細胞、肝類洞内皮細胞、肝クッパー細胞の内から選択される。
【００５２】
これらの細胞は、ＦＶＩＩＩを排除するためにこのＦＶＩＩＩをエンドサイトーシスする。これらの細胞によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスを阻害することによって、本発明による化合物は、ＦＶＩＩＩの排除経路を減少させ、ＦＶＩＩＩの循環量を増加させ、そしてそれによりＦＶＩＩＩの半減期を増加させる。
【００５３】
また本発明は、外因性ＦＶＩＩＩと組み合わせた血友病の治療を目的とした医薬の調製での本発明による化合物の使用にも関する。
【００５４】
具体的に述べると、この医薬は、血友病患者における外因性ＦＶＩＩＩの免疫原性を低減させ、および／または血友病患者における外因性ＦＶＩＩＩの半減期を増加させることを目的としている。
【００５５】
この場合、この医薬は、そのプロ凝固活性を目的とした外因性ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントと共に投与される。
【００５６】
具体的に述べると、マンナンは、外因性ＦＶＩＩＩと組み合わせ、血友病患者における外因性ＦＶＩＩＩの免疫原性を低減させ、および／または血友病患者における外因性ＦＶＩＩＩの半減期を増加させることによって血友病を治療することを目的とした医薬の調製のために使用される。
【００５７】
さらに本発明は、血友病の治療を目的とした医薬の調製のための、修飾ＦＶＩＩＩまたはそのフラグメントの使用に関し、抗原をエンドサイトーシスすることが可能な細胞によるこの修飾ＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスは、天然のＦＶＩＩＩに比して低減される。
【００５８】
具体的に述べると、このＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩのフラグメントは脱マンノシル化される。
【００５９】
この場合、上記医薬は、天然のＦＶＩＩＩに比して免疫原性が低く、またその半減期が天然のＦＶＩＩＩに比して増加してはいるが、そのプロ凝固活性は十分に維持しているＦＶＩＩＩを含む。
【００６０】
さらに本発明は、本発明による少なくとも１つの化合物、および１つまたはそれ以上の医薬的に許容可能な補助剤および／または賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００６１】
［実施例］
以下の実施例は、本発明の範囲に制限を加えることなく、本発明を例示するものである。
【実施例１】
【００６２】
実施例１：ヒト単球由来ＤＣの調製
ＤＣを単球から、既報の手順（２９）を用いて培養用培地内で変化させて調製した。簡単に述べると、単核になった細胞を、１０％ヒトＡＢ型血清、グルタミンおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、プラスチック細胞培養皿上に接着させることによって、６０分かけて健常な成人ドナー由来のヘパリン化白血球−血小板層（バフィーコート）から単離した。この培地で３回軽く洗浄することで、非接着性細胞を除去した。接着性単球を、１％ヒトＡＢ型血清および抗生物質を補充したＸ‐ＶＩＶＯ１５培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）内で、５００ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトインターロイキン‐４（ｒｈＩＬ‐４）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）および１，０００ＩＵ／ｍｌの組み換えヒト顆粒求マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ（Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下で培養した。全ての補充物質を含む培地の半分を２日毎に交換した。５日間培養した後、ＤＣを富化させた画分に相当する非接着性細胞および僅かに接着性を有する細胞を、回収、洗浄し、その後の実験に使用した。
【実施例２】
【００６３】
実施例２：全組み換えヒトＦＶＩＩＩおよびＢドメイン欠失組み換えヒトＦＶＩＩＩとフルオレセインとの結合
全組み換えヒトＦＶＩＩＩ（１，０００ＩＵ，Ｋｏｇｅｎａｔｅ，Ｂａｙｅｒ）またはＢドメイン欠失組み換えヒトＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤ）（１，０００ＩＵ，Ｒｅｆａｃｔｏ，Ｗｙｅｔｈ）を、水中で可溶化し、５ｍＭ、４℃でＣａＣｌ２を含む重炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）に対して透析し、次に４℃で７〜８時間かけてフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ｉｓｏｍｅｒ  Ｉ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）に結合させた。続いてこの標識ＦＶＩＩＩをＲＰＭＩ１６４０培地に対して透析し、非結合ＦＩＴＣを除去した。このＦＶＩＩＩ‐ＦＩＴＣを、標準としてウシ血清アルブミンを用い、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法により定量した。
【実施例３】
【００６４】
実施例３：ＥＬＩＳＡを用いたマンノース受容体の構築物のＦＶＩＩＩへの結合
英国ノッチンガム大学、王室医学センター、分子医療科学科（Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｕｅｅｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）のＬｕｉｓａ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｏｍａｒｅｓ教授に、マンノース受容体の構築物、ＣＴＬＤ（４‐７）‐ＦＣおよびＣＲ‐ＦＮＩＩ‐ＣＴＬＤ（１‐３）‐ＣＲ‐Ｆｃを提供して頂いた。この構築物の全組み換えヒトＦＶＩＩＩへの結合およびＢドメイン欠失組み換えヒトＦＶＩＩＩへの結合を、直接リガンドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートへの結合を測定することによって（マンナンを正のコントロールとして用いた）、または間接的に阻害試験を行うことによって試験した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ；ＭＡＸＩＳＯＲＤ）を、１５４ｍＭのＮａＣｌ中でＦＶＩＩＩの希釈系列（開始時は５０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。洗浄には全てＴＴＢＳ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ，ｐＨ  ７．５，Ｃａ２＋  １０ｍＭ，ＮａＣｌ  １５４ｍＭおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いた。非反応部位は３％ＢＳＡを含んだＴＢＳ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ−２０を含まないＴＴＢＳ）によってブロックした。続いて、このプレートを、３％ＢＳＡを含んだＴＴＢＳ緩衝液中で、上記構築物２または１０μｇ／ｍｌによって室温で２時間培養した。ＭＲ構築物の結合を、ＨＲＰ（ｃｌｏｎｅ  ＪＤＣ−１０，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ  ＡＬ，ＵＳＡ）に結合したヒトＩｇＧのＦｃ部分に特異的なマウス抗体を用いて検出した。ＨＲＰの活性を、基質ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン，Ｓｉｇｍａ）によって示した。４９２ｎｍでの吸収度を測定した。阻害試験のため、プレートを各形態のＦＶＩＩＩ（５．５６μｇ／ｍｌ）でコーティングした。種々の濃度のマンナンを、ＦＶＩＩＩでコーティングしたプレートの培養の前に、１０μｇ／ｍｌの構築物ＣＴＬＤ（４‐７）‐Ｆｃで、室温で３０分間培養した。上述の方法で吸収度を測定した。
【００６５】
結果：
図３ｃおよび図３ｄ
マンノース受容体は８個のＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含有する。：ＣＴＬＤ４〜７はマンノシル化構造に対して結合性を有しているが、ＣＴＬＤ１〜３は有していない。
図３ｃに示すように、マンナンはＣＴＬＤ（４‐７）‐Ｆｃに対して特異的な結合を示す。ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤの両方は、構築物ＣＴＬＤ（１‐３）には結合しないが、その一方で、特にＣＴＬＤ（４‐７）‐Ｆｃに対して量依存性の相互作用を示す。これは、ＦＶＩＩＩのドメインＢ外のグリコシル化（おそらくマンノシル化を示す）によって分子がＭＲと相互作用することを示している。
ＣＴＬＤ（４‐７）‐Ｆｃで前培養したマンナンは、２つの形態のＦＶＩＩＩのＣＴＬＤ（４‐７）‐Ｆｃへの結合を量依存的に阻害する。これは、ＤＣ上のＭＲがマンナンで飽和し、それによってＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスが阻害されるというＤＣの状態を反映している。
【実施例４】
【００６６】
実施例４：ヒト単球由来ＤＣによるＦＶＩＩＩの取り込みのイン・ビトロ試験物質および方法
実施例１で得たＤＣ（９６−ウェルプレートに０．４ｘ１０５細胞／ウェル、１００μｌ／ウェル）を、Ｘ‐ＶＩＶＯ培地中で、実施例２で得た種々の量（０．０２９、０．０５７、０１４３、０．３５８μＭ）のフルオレセント結合リガンド（ＦＶＩＩＩ−ＦＩＴＣ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ−ＦＩＴＣ）によって４℃または３７℃で０、１５、６０、１２０分かけて培養した。培養終了後、この細胞を冷ＰＢＳで洗浄して、フローサイトメトリー法によって分析した。受容体の取り込みへの関与を調べるため、この細胞を、フルオレセインに結合したリガンドを添加する前に、０、０．００１、０．０１、０．１、１ｍｇ／ｍｌのマンナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）によって３７℃で３０分間培養した。ＦＶＩＩＩ−ＦＩＴＣおよびＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤ‐ＦＩＴＣに加えて、Ｂｉｏｍａｃ（Ｌｅｉｐｚｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のＦＩＴＣに結合したヒトα２‐マクログロブリン‐ＭＡ（α２Ｍ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）社製のデキストラン‐ＦＩＴＣ（分子量４０，０００）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＬｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ（ＬＹ‐ＣＨ）を使用した。またＦＶＩＩＩの取り込みの検査を、２０μｇ／ｍｌの抗マンノース受容体モノクローナル抗体（ＰＡＭ−１，ｉｓｏｔｙｐｅ  ＩｇＧ１）または抗ＤＣ‐ＳＩＧＮモノクローナル抗体（ＡＺＮ−Ｄ１，ｉｓｏｔｙｐｅ  ＩｇＧ１）またはＰＥ‐Ｃｙ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｃｅ）に結合したマウスＩｇＧλ，κの存在下で行った。ＤＣ‐ＳＩＧＮがＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスに関与しているのかどうかを調べるため、野生型のＥＢＶによって形質転換した、またＤＣ‐ＳＩＧＮでトランスフェクトしたまたはトランスフェクトしないＢリンパ球系ＨＤ‐４２０を、１０％ＦＣＳ（ｆｏｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：牛の胎児の血清）および抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、種々の濃度のＦＶＩＩＩ‐ＦＩＴＣ（０、０．０３６、０．０７２および０．１４３μＭ）によって２時間培養した。分析はＤＣに関して行われた。
【００６７】
結果：
図２ａ、図２ｂ
ＤＣは、全ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤを量および時間に比例して取り込む。求められたΔＭＦＩの値は、３７℃および４℃で２時間培養した後のＦＶＩＩＩに対して陽性の反応を示すＤＣの異なる標識を表す。その結果はＦＶＩＩＩの取り込みが活性プロセスであることを示している。その後の実験のために、２時間の培養時間および０．１４３μＭの濃度が選択された。
【００６８】
図２ｃ
未熟ＤＣによるＦＶＩＩＩの取り込みを、５ｍＭのＥＤＴＡでこの細胞を前培養することによって大幅に低下させた（全ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ−ＢＤＤに対して、それぞれ５８．１±１１．１％  、６２．４±１１．４％の阻害）。これにより受容体の役割が二価イオンに依存していることが示された。ＤＣ上の可能性のあるＦＶＩＩＩ受容体（即ちＣＤ９１／ＬＲＰ、ＡＳＧＰＲ、マンノース受容体）を特定の競合リガンドを使用して検査した。３８ｋＤの受容体関連蛋白質（ＲＡＰ）は、ＣＤ９１／ＬＲＰなどのＬＤＬ受容体ファミリーのメンバーによるリガンドのエンドサイトーシスをブロックする。ＲＡＰが過剰になると、ＤＣによるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスの阻害の妨げとなった。さらに、Ｄ‐ガラクトース、Ｃ型レクチン受容体ＡＳＧＰＲの競合リガンドは、ドメインＢの有無とは無関係に、ＦＶＩＩＩの取り込みを大幅には低減しなかった。対照的に、マンナンの添加（１ｍｇ／ｍｌ）は、ＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスを大幅に低減させた（全ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤに対して、それぞれ３５．０±１０．０％、４１．３±１７．２％；ｐ＜０．０５）。この結果は、マンノース感作性ＣＬＲがＦＶＩＩＩの取り込みに直接的または間接的に関与していることを示している。
【００６９】
図２ｄ
マンノース感作性ＣＬＲに対するマンナンの特異性を、マンノース感作性ＣＬＲの標準的リガンドであるデキストラン、およびＬｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ（ｌｙ）を用いて確認した。この取り込みはいずれの受容体とも関係なく、マクロピノサイトーシスのみによって進行する。デキストランの取り込みは、マンナンの存在下で８０％までブロックされたが、一方ｌｙの取り込みは影響を受けなかった。
【００７０】
図２ｅ
抗原の取り込みに対するマンナンの中和作用は、抗原の濃度とは無関係に、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤおよびデキストランの量に比例する。興味深いことに、種々の抗原（１００μｇ／ｍｌ）について、マンナンの同じ飽和濃度に到達した。この結果は、これらの抗原のマンナン感作性エンドサイトーシスが類似のマンノース感作性受容体を経由して進行することを示している。
【００７１】
図２ｆ
ＦＶＩＩＩは種々の細胞内受容体と相互作用することができる。
細胞ナ受容体であるＣＤ９１／ＬＲＰを固有に標的とするマンノシル化蛋白質である活性化されたα２Ｍをモデル抗体として用いた。α２Ｍ上でのマンノシル化  された残基の発現は、他の受容体が関与している限り、上記抗原の取り込みにはまったく影響を及ぼさない。従って、α２Ｍの取り込みは過剰なＲＡＰが存在していれば完全に阻害されるが、マンナンは影響を示さない。
これらの結果は、ＦＶＩＩＩ上に存在するマンノシル化された部分が独特な作用を示し、ＦＶＩＩＩを他のマンノシル化された抗原より抗原が散在している細胞（ＡＰＣ）により引きつけられ易くすることを示している。
【００７２】
図３ａおよび図３ｂ
マンノース受容体ＭＲ（ＣＤ２０６）及びＤＣ−ＳＩＧＮ受容体（ＤＣ２０９）を含むＤＣ及び他のＡＰＣの表面のいくつかの受容体はマンナンに対して感作性を示す。抗体ＰＭＡ−１（抗ＭＲ）は２０．２２％のＦＶＩＩＩの取り込みを、３７．３５％のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの取り込みを示したので、ＭＲがＶＦＩＩＩのエンドサイトーシスに関与していることを示している。ＦＶＩＩＩのエンドサイトートシスに対するマンナンの影響が抗ＭＲモノクローナル抗体のそれより強よかったという事実は、ＤＣによるＦＶＩＩＩの取り込みが未だその特徴が把握されていないマンナンに対して感作性を示すいくつかの受容体が関与しているということによって説明できる。一方、マンナンによる阻害が増大することは、ＭＲがいくつかの炭化水素領域（ＣＲＤ）を有しており、従って、ＭＲの４番目のＣＲＤに対してだけ指向される抗体ＰＡＭ−１によるよりも高炭水化されたマンナンの方が阻害がより効果的に行われるという事実の結果であるかもしれない。
抗体ＡＺＮ−Ｄ１（抗ＤＣ−ＳＩＧＮ）は未成熟なＤＣによるＦＶＩＩＩの取り込みを阻害しなかったが、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤによる取り込みは１７．６％阻害された。Ｂ細胞によってトランスフェクトされた細胞によるＤＣ−ＳＩＧＮの発現はＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスの増大をもたらさなかった。  
これらのデータはＤＣ−ＳＩＧＮがヒトＤＣによるＦＶＩＩＩの取り込みにおいて主要な役割を果たしていることを示唆している。
【実施例５】
【００７３】
実施例５：自己ＣＤ４＋細胞の増殖に関するイン・ビトロ・テスト
実施例１のＤＣを３７  度Ｃの温度で３０分間マンナン（１ｍｇ／ｍｌ）を培養した。ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂａｙｅｒ社製、コグネート（Ｋｏｇｎａｔｅ））で透析したＦＶＩＩＩを２時間かけて加えた（４０ｇ／ｍｌ）加えた。この細胞を洗浄して、完全培地内でＬＰＳ（１μｇ／５０万細胞）で培養した。これらの細胞を洗浄して、ＭＡＣＳ単離キット（ドイツ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｓｂａｃｈ社製）を用いて対応するドナーのＰＢＭＣから得た自己ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて培養した（ＰＲＭＩ  １６４０培地。１０％ヒト男性ＡＢ血清で補強。９６ウェル。１ウェルあたり２００μｌ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は各ウェルで一定にし（１ウェルあたり１００，０００細胞）、ＤＣの数は変えた（３ウェル毎に５，０００、１０，０００及び１５，０００個とした）ので、Ｔ：ＤＣ細胞比は、２０：１、１０：１、及び６．６：１であった。
４日間培養した後、トリチウムを取り込んだチミジンを０．５μＣｉ、それぞれのウェルに加えた。これらの細胞を１６時間後に取り出して、内部に組み込まれた放射性活性をカウントした。
【００７４】
結果： 
図４ａ
マンナンはヒトＤＣによるＦＶＩＩＩのエンドサートシス（細胞内への取り込み）を４０％減少させる。
図４ａ：ＦＶＩＩＩを加える前に、実施例のＤＣをそれらだけ、及びマンナンを用いて培養した。ＬＰＳの存在下で成熟させてから、ＤＣを自己ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞で培養した。マンナンはＴ細胞の増殖をネガティブな比較対象例の場合によるものとほぼ同等のレベルに減少させた。
【実施例６】
【００７５】
実施例６：ＦＶＩＩＩに固有なＴ細胞の活性化に関するイン・ビトロ・テスト
洗浄後、実施例１のＤＣを１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）培地に再懸濁させ、円形基盤の９６ウェル培養プレートの各ウェルに１０，０００個のＤＣを入れた。各ウェルにマンナン（１ｍｇ／ｍｌ）を加えて３０分間培養した後、それらのＤＣｗｏ５，０００個のＤ９Ｅ９細胞（ＦＶＩＩＩに固有性を示すＴ細胞クローン）を用いて、１０％のＥＣＳと２０Ｕ／ｍｌのｒｈＬ−２を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）培地で、ＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの量を変えて（１０、８、６、４、２μｇ／ｍｌ）、３７度Ｃの温度で２０時間培養した。Ｄ９Ｅ９細胞の場合と同様、ＥＢＶで形質変換されたＢ細胞のＬＥ２Ｅ９及びＢＯ２Ｃ１１系を全ＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの存在下で培養した。この管理条件は、ＦＶＩＩＩ、Ｄ９ＥＰあるいはＤＣが存在しない場合でも維持した。ネガティブな比較対象例として、ＦＶＩＩＩの等モル濃度で、それらの細胞を用いて培養した。培養期が終了した時点で上澄み液を取り出して、ヒトＩＦＮ−γ  Ｄｕｏセット（Ｒ＆Ｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＤＹ２８５）を用いて、メーカーの指示に従って、ＩＦＮγの生産に関するテストを行った。
【００７６】
結果：
図４ｂ
ＦＶＩＩＩはＤ９Ｅ９細胞を投与量に応じて誘発し、その誘発はマンナンの存在で細大８４％まで阻害される（Ｂ）。Ｔ細胞の増殖は、ＦＩＸの存在下で増殖が行われないことで示されるように、固有なものである。（Ａ）
マンナンはＦＶＩＩＩ、ＬＥ２Ｅ９細胞を加えた自己Ｂ細胞によるＤ９Ｅ９細胞の活性化を阻止しない（Ｃ）。このことは、ＦＶＩＩＩの免疫源性の低下におけるマンナンの影響力が、ＦＶＩＩＩに固有性を示すＢ細胞に対して未だ刺激が与えられていない（つまり、これまで処置を受けていない患者の場合）か、あるいは治療後に阻害因子がまだ形成されていない場合だけ、薬学的に開発可能であることを示している。
【００７７】
結論：
マンナンの存在下で誘発されるＦＶＩＩＩの取り込みの減少は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対してＦＶＩＩＩから誘導されるペプチドの提示を減らし、その結果として、Ｔリンパ球の活性化を弱めることになる。
【実施例７】
【００７８】
実施例７：凝固テスト
正常なヒト血漿を同じ量のマンナン（０−４，０００ｍｇ／ｍｌ）を用いて、３７度Ｃの温度で２時間培養した。活性剤としてヒト胎盤プロトロンビン（Ｄａｔｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｇｍｂｈ）を用い、さらに、基質として、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿（Ｄａｔｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｇｍｂｈ）を、そしてフィブリン・タイマー（Ｓｙｓｍｅｘ  ＣＡ５００，Ｄａｔｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を用いて１段階凝固テストで、残留ＦＶＩＩＩ活性を測定した。希釈はＯｗｒｅｎ−Ｋｏｌｌｅｒ緩衝液（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて行った。
【００７９】
結果：
図５ａ
マンナンはＶＦＶＩＩＩの凝固促進活性を阻止しない。
【実施例８】
【００８０】
実施例８：ＦＶＩＩＩのＶＷＦに対するＥＬＩＳＡ法検査
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をＶＷＦ（ＶＷＦ，Ｗｉｌｌｅｆｅｃｔｉｎ，ＬＦＢ，Ｌｅｓ  Ｕｌｉｔ，Ｆｒａｍｎｃｅ）で１ウェルあたり２μｇ／ｍｌの割合で被覆して、ＰＢＳ（ｐＨ：７．４）内で３７℃の温度で１時間培養した。これらのプレートを１％脱脂粉乳と０．１％Ｔｗｅｅｎ液を含むＰＢＳで飽和させて３７℃の温度で１時間培養した。ＦＶＩＩＩ（０．３μｇ／ｍｌ）をそれだけ、マンナン（０．０１−４μｇ／ｍｌ）と共に、あるいは、ＢＯ２Ｃ１１（ヒト・モノクローナル抗ＦＶＩＩＩ  ＩｇＧ）と共に予備培養してから、ＶＷＦで被覆したウェルに加えて、３７℃の温度で１時間培養した。マウス・モノクローナル抗ＦＶＩＩＩ  ＩｇＧ反応性が、ストレプトアビジン・ペロキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びそれらの基質に結合したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で示された。結合値はＶＦＷだけを含むウェル内の非固有結合によって補正し、ＦＶＩＩＩの残留結合によって示した。被覆しないウェルではＦＶＩＩＩが結合しない場合も観察された。
【００８１】
結論：
図５ｂ
マンナンはＶＷＦによるＦＶＩＩＩの取り込みに干渉しない。
【実施例９】
【００８２】
実施例９：脱マンノシル化されたＦＶＩＩＩの取り込みの検査
第１の段階で、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤを３つの異なったエンドグリコシダーゼ、つまりＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、及びＥｎｄｏＦ３（Ｓｉｇｍａ社）を用いて培養した。未処理のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤとＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、及びＥｎｄｏＦ３で処理したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ニトロセルロース膜状に移した。糖類は糖たんぱく質検出キット（Ｓｉｇｍａ社）を用い、ＨＲＰをネガティブ比較対象として用いて検出した。ＥｎｄｏＦ１はＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ上の糖残基を効果的に切断することができる唯一のエンドグロコシダーゼであった（図６参照）。
第２の段階で、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤをＥｎｄｏＦ１を用いて、製造者の指示に従って脱グリコシル化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ウェスターン・ブロッティングで顕在化した。３７μのＦＶＩＩＩ−ＢＤＤを７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを入れた各ウェルに負荷し、ニトロセルロース膜上に移した。これらを、１０μｇ／ｍｌのコンストラクＣＴＬＤ（４−７）−Ｆｃとアルカリ性ホスファターゼ（左）あるいはプロトゴールド（右）に結合させた抗ヒトＩｇＧを用いて顕在化させた。ＥｎｄｏＦ１を用いた培養後のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの分子量の変動は、ＥｎｄｏＦ１の効果的な脱ゴルコシル化を裏付けている。ＥｎｄｏＦ１を用いたＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの培養はコンストラクトＣＴＬＤ（４−７）−ＦｃによるＦＶＩＩＩの認識のロスをもたらし、このことはマンノシルかされた残基がなくなったことを示している。
最後に、ＦＩＴＣでラベルした脱マンノシル化ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの取り込みの阻害を測定した。ＦＩＴＣに結合し、ＥＮｄｏＦ１（０．１４３μＭ）で処理したＦＶＩＩＩ−ＢＤＤと処理しなかったＦＶＩＩＩ−ＢＤＤを、血清を含まないＸ−ＶＩＶＯ培地内で実施例１と同様に（４ｘ１０５細胞／１０μｌウェル）で、３７度Ｃあるいは４度Ｃで培養した。予め、それらの細胞を、適切な場合、マンノン（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、３０度Ｃの温度で３０分間予備培養した。２時間培養した後、それらの細胞を洗浄して、ＦＡＣＳで中間郷土（ｍｆｉ）を測定した。ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの取り込みは、未処理のＦＶＩＩＩだけが存在している場合で計算されたｍｆｉを基準として示した（図８参照）。ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの取り込みの阻害は脱グリコシルかしない場合、マンナンで当初４５＋７％の割合で阻害された。ＥｎｄｏＦ１で培養したあとは、阻害率は２３．５＋１４．４％であった。さらに、マンナンが存在するとその割合がさらに３２％も低下し、このことはＥｎｄｏＦ１で処理されたＦＶＩＩＩがマンノース受容体に依存する状態で部分的に取り込まれることを示している。
このことは、
−ＥｎｄｏＦ１だけでＦＶＩＩＩ−ＢＤＤを処理した場合に、マンノシル化された残基を部分的に除去されるという事実、あるいは
−ＥｎｄｏＦ１がこれもマンノース受容体のリガンドデアルＮ−アセチルグリコサミン残基を残すという事実によって、説明することができる。
【実施例１０】
【００８３】
実施例１０：マンノース受容体によるＦＶＩＩＩの認識に関するＶＷＦの影響の調査
ＥＬＩＳＡプレートをＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（５．５６μｇ／ｍｌ、０．０３３μＭ）で被覆した。ＶＷＦ（０−１μＭ）を１０μｇ／ｍｌのコンストラクトＣＴＬＤ（４−７）−Ｆｃを用いて室温で３０分培養し、不動体化したＦＶＩＩＩ−ＢＤＤに加えた。ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤに対するコンストラクトの結合はＨＲＰに結合させたマウス抗ヒトＦｃ抗体と基質ＯＰＤを用いて顕在化させた（図９参照）。
可溶性ＶＷＦを加えると、ＣＴＬＤ（４−７）の不動体化されたＦＶＩＩＩとの相互作用をある程度阻止し（ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩ比が過剰の場合、４３％）し、従って、ＶＷＦがマンノース受容体によるＦＶＩＩＩ上の糖残基の認識に部分的にしか影響を及ぼさないことを示している。
【００８４】
［文献リスト］
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２．  Ｔｒｏｎｂｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．，及びＩ．Ｍｅｌｌｍａｎ，２００５、イン・ビトロ及びイン・ビボでの抗原処理の細胞生物学
３．  Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．，Ｍ．Ｃｅｌｌａ及びＡ．Ｌａｎｚａｅｃｃｈｉａ，１９９５、樹状細胞は大型組織適合性複合体クラスＩＩコンパートメントに巨大分子を濃縮するためにマクロピノサイトーシスとマンノース受容体を利用する：サイトカイン及びバクテリア生成物による下方制御、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２：３８９
４．  Ｇｅｉｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．Ｔｏｒｅｎｓｍａ，Ｓ．Ｊ．ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ，Ｇ．Ｃ．ｖａｎ  Ｄｕｉｊｎｈｏｖｅｎ，Ｇ．Ｊ．Ａｄｅｍａ，Ｙ．ｖａｎ  Ｋｏｏｙｋ及びＶ．Ｇ．Ｆｉｇｄｏｒ，２０００、一次免疫応答を促進する新しい樹状細胞固有ＩＣＡＭ−３受容体、Ｃｅｌｌ  １００：５７５
５．  Ｋｅｌｅｒ，Ｔ．，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ及びＭ．Ｗ．Ｆａｎｇｅｒ，２００４、マンノース受容体指向性ワクチン、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ４：１９５３
６．  Ｌｅｎｔｉｎｇ  Ｐ．Ｊ．，Ｎｅｅｌｓ  Ｊ．Ｇ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  Ｂ．Ｍ．，Ｃｌｉｊｓｔｅｒｓ  Ｐ．Ｐ．，Ｎｅｉｊｅｒｍａｎ  Ｄ．Ｗ．，Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ  Ｈ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ  Ｊ．Ａ．，Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｋ．，ｖａｎ  Ｚｏｎｎｅｖｅｒｌｄ  Ａ．Ｊ．，１９９９、ファクターＶＩＩＩのＬ鎖は低密度リポタンパク質受容体関連蛋白質、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４−２３７３４
７．  Ｓａｎｂｅｒｇ  Ｈ．，Ａｌｍｓｔｅｄｔ  Ａ．，Ｂｒａｎｄｔ  Ｊ．，Ｇｒａｙ  Ｅ．，Ｈｏｌｍｇｕｉｓｔ  Ｌ．，Ｏｓｗａｌｄｓｓｏｎ  Ｕ．，Ｍｉｋａｅｌｓｓｏｎ  Ｍ．，Ｂ領域決失遺伝子組み換えファクターＶＩＩＩ蛋白質、ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ，２００１，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｏｅｍｏｓｔ．８５：９３
８．  Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．，Ｗａｓｌｅｙ  Ｌ．Ｃ．，Ｄｏｒｎｅｒ  Ａ．Ｊ．，哺乳動物細胞で発現される組み換えヒトインシＶＩＩＩの合成、処理、及び分泌、１９８８，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：６３５２
９．  Ｈｉｒｏｎａｋａ  Ｔ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｋ．，Ｅｓｍｏｎ  Ｐ．Ｃ．，Ｆｏｕｒｎｅｌ  Ｍ．Ａ．，Ｓａｗａｄａ  Ｓ．，Ｋａｔｏ  Ｍ．，ＭＩｎａｇａ  Ｔ．，Ｋｏｂａｔａ  Ａ．，ヒトの血漿及び遺伝子組み換えベビー・ハムスターの腎臓細胞の培地から精製された因子ＶＩＩＩの糖鎖の比較研究、１９９２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：８０１２
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、血友病（タイプＡまたはＢ）の治療に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＦＶＩＩＩおよびＤＣ膜の受容体の表示図である。
【図２ａ】ＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤ（‐○‐）およびＦＶＩＩＩ全体（‐●‐）の取り込みの、３７℃および４℃での各状態間の差分を測定したグラフである。
【図２ｂ】ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤの取り込みを、４℃または３７℃での時間の関数として測定したグラフである。
【図２ｃ】培地、ＥＤＴＡ、マンナンまたはガラクトースの存在下におけるＦＶＩＩＩの相対的取り込み（％）を測定したグラフである。
【図２ｄ】マンナンの存在下またはマンナンが存在しない条件下におけるＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤ、デキストランおよびｌｙの相対的取り込み（％）を測定したグラフである。
【図２ｅ】ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤおよびデキストランの取り込みの阻害率（％）を、マンナンの増加する濃度の関数として測定したグラフである。
【図２ｆ】ＲＡＰまたはマンナンの存在下または不存在下におけるα２Ｍの取り込みを測定したグラフである。
【図３ａ】抗ＭＲおよび抗ＤＣ‐ＳＩＧＮ抗体の存在下におけるＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤの相対的取り込み（％）を測定したグラフである。
【図３ｂ】ＨＤ４２０細胞によるＦＶＩＩＩの取り込み（％）をＦＶＩＩＩの濃度（μＭ）の関数として測定したグラフである。
【図３ｃ】構築物ＣＴＬＤ１‐３およびＣＴＬＤ４‐７への結合の強度を、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤおよびマンナンの濃度（ｕｇ／ｍｌ）の関数として測定したグラフである。
【図３ｄ】ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤの構築物ＣＴＬＤ１‐３およびＣＴＬＤ４‐７への結合の阻害率（％）を、マンナンの濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として測定したグラフである。
【図４ａ】ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（ｃｐｍ）を、ＣＤ４＋Ｔ：ＤＣの比率の関数として測定したグラフである。
【図４ｂ】ＩＦＮ‐γの産生を測定することによって、ヒト型抗ＦＶＩＩＩ  ＴＣＤ４＋クローンＤ９Ｅ９の活性を測定したグラフである。
【図５ａ】ＦＶＩＩＩのプロ凝固活性の阻害率（％）を測定したグラフである。
【図５ｂ】マンナンによるＦＶＩＩＩのＶＷＦへの結合の阻害率（％）を測定したグラフである。
【図６】ＦＶＩＩＩ上の糖をウェスタン・ブロット法によって検出した結果を示した図である。
【図７】ウェスタン・ブロット法により、ＦＶＩＩＩ  をＣＴＬＤ４‐７‐Ｆｃによって検出した結果を示す図である。
【図８】Ｅｎｄｏ‐Ｆ１での処理後または処理なしの場合のＦＶＩＩＩの取り込みの阻害率（％）を測定したグラフである。
【図９】ＣＴＬＤ（４‐７）‐ＦｃのＦＶＩＩＩ‐ＢＤＤへの結合（ＯＤ  ４９２ｎｍ）を、ＶＷＦの濃度の関数として測定したグラフである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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