(57)【要約】  本特許出願は、固定端と自由端とを有するカンチレバー本体を含み、該自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、該デンドロンの分岐領域の複数の末端が該表面に結合しており、該デンドロンの直鎖領域の末端が官能基化されている、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）用のカンチレバーについて記載している。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定端と自由端とを有するカンチレバー本体を含み、該自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、該デンドロンの分岐領域の複数の末端が該表面に結合しており、該デンドロンの直鎖領域の末端が官能基化されている、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）用のカンチレバー。
【請求項２】
該自由端の近傍に少なくとも１つの先細の突起を形成している、請求項１記載のカンチレバー。
【請求項３】
該突起がピラミッド状または円錐状である、請求項２記載のカンチレバー。
【請求項４】
該デンドロンが、直鎖状の官能性の基の間で約０．１nmから約１００nmの一定の間隔となるように配置している、請求項１記載のカンチレバー。
【請求項５】
該デンドロンが約１０nmの一定の間隔で配置している、請求項４記載のカンチレバー。
【請求項６】
分岐領域の該末端が、−ＣＯＺ、−ＮＨＲ、−ＯＲ'、または−ＰＲ"３で官能基化されており、式中、Ｚは脱離基であり、Ｒはアルキルであり、Ｒ'はアルキル、アリール、またはエーテルであり、Ｒ"はＨ、アルキル、またはアルコキシである、請求項１記載のカンチレバー。
【請求項７】
ＣＯＺが、酸、エステル、活性エステル、酸ハロゲン化物、活性アミド、またはＣＯ−イミダゾイルである、請求項６記載のカンチレバー。
【請求項８】
直鎖領域がスペーサ領域を含む、請求項１記載のカンチレバー。
【請求項９】
該スペーサ領域が第１の官能基を介して分岐領域に結合している、請求項８記載のカンチレバー。
【請求項１０】
該官能基が、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＰＨ３、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯまたは−ＳＨである、請求項９記載のカンチレバー。
【請求項１１】
該スペーサ領域が、該第１の官能基に共有結合したリンカー領域を含む、請求項８記載のカンチレバー。
【請求項１２】
該リンカー領域が、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、またはアミノアルキル基を含む、請求項１１記載のカンチレバー。
【請求項１３】
該スペーサ領域が第２の官能基を含む、請求項８記載のカンチレバー。
【請求項１４】
該第２の官能基が、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＰＨ３、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯまたは−ＳＨである、請求項１３記載のカンチレバー。
【請求項１５】
該第２の官能基が直鎖領域の末端に位置している、請求項１３記載のカンチレバー。
【請求項１６】
保護基が直鎖領域の末端に結合している、請求項１記載のカンチレバー。
【請求項１７】
該保護基が酸反応性または塩基反応性である、請求項１６記載のカンチレバー。
【請求項１８】
プローブヌクレオチドまたはリガンドが該デンドロン直鎖領域の末端に結合している、請求項１記載のカンチレバー。
【請求項１９】
該プローブヌクレオチドまたはリガンドが、約０．０１プローブ/nm2から約０．５プローブ/nm2の範囲の低密度を有する、請求項１８記載のカンチレバー。
【請求項２０】
該プローブヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ヌクレオチドアナローグ、またはこれらの組み合わせである、請求項１８記載のカンチレバー。
【請求項２１】
該デンドロンの直鎖領域に結合した該プローブヌクレオチド間の距離が約０．１から約１００nmである、請求項１８記載のカンチレバー。
【請求項２２】
請求項１記載のカンチレバーを製造する方法であって、（i）該カンチレバーが該デンドロンの末端と反応するように、該カンチレバーの該表面領域を官能基化する工程と、（ii）末端と表面とが結合を形成するように、該デンドロンを該表面領域と接触させる工程とを含む、方法。
【請求項２３】
請求項２２記載のカンチレバーを製造する方法であって、プローブヌクレオチドまたはリガンドが、デンドロンの直鎖領域の末端に固定され、i）該表面領域上の該デンドロンの直鎖領域の末端から保護基を除去する工程と、ii）リンカー分子が、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性リンカーであって、該プローブヌクレオチド、リガンド、またはリンカー分子及びその末端が結合を形成するように、該プローブヌクレオチド、リガンド、または該プローブヌクレオチドもしくはリガンドに結合した該リンカー分子を、該基材上のデンドロンの直鎖領域の末端と接触させる工程とを含む方法。
【請求項２４】
１分子のプローブヌクレオチドと１分子の標的ヌクレオチドとの間の相互作用をＡＦＭによって測定するための装置であって、
固定端と自由端とを有し、該自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、該デンドロンの分岐領域の複数の末端が該表面に結合しており、該デンドロンの直鎖領域の末端が請求項１記載のプローブヌクレオチドに結合しているカンチレバー；
該標的ヌクレオチドが固定化された基材；
カンチレバーと該標的ヌクレオチド基材との相対位置および配向を調整し、該デンドロンで修飾されたカンチレバーの表面領域上に固定化された該プローブヌクレオチドと基材上に固定化された該標的ヌクレオチドとの間に相互作用を起こさせるためのコントローラ；および
該プローブヌクレオチドと該標的ヌクレオチドとの相互作用に関連する物理パラメータを測定するための検出器とを備える、装置。
【請求項２５】
該基材が、該標的ヌクレオチドが固定化されたデンドロンによって修飾されている、請求項２４記載の装置。
【請求項２６】
プローブヌクレオチドとの相互作用について標的ヌクレオチドを分析する方法であって、
（ａ）固定端と自由端とを有し、該自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、該デンドロンの分岐領域の複数の末端が請求項１記載の表面に結合するカンチレバーを供与する工程と、
（ｂ）標的ヌクレオチドを基材に固定化する工程；
（ｃ）プローブヌクレオチドを固定化するために、該カンチレバーのデンドロンで修飾された表面領域を化学修飾する工程；
（ｄ）該カンチレバーの該デンドロンで修飾された表面領域上に固定化された該プローブヌクレオチドと試料支持部材の該基材上に固定化された該標的ヌクレオチドとの間に相互作用を起こさせるために、該基材と該カンチレバーとの相対位置および配向を調整するためのコントローラを備える装置に、該基材および該カンチレバーを連結する工程；
（ｅ）プローブヌクレオチドと該標的ヌクレオチドとの間に相互作用を起こさせるために、該カンチレバーと該基材との相対位置および配向を調整する工程；および
（ｆ）該プローブヌクレオチドと該標的ヌクレオチドとの相互作用に関連する物理パラメータを測定する工程とを含む、
方法。
【請求項２７】
該プローブヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡの１本鎖であり、標的ヌクレオチドが相補的な、または塩基のミスマッチを含むＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｂ）において、該基材が、標的ヌクレオチドをその上に固定化するためにデンドロンによって化学修飾されている、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
１分子のリガンドと１分子の標的受容体との間の相互作用をＡＦＭによって測定するための装置であって、
固定端と自由端とを有し、該自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、該デンドロンの分岐領域の複数の末端が該表面に結合しており、該デンドロンの直鎖領域の末端が請求項１記載のリガンドに結合しているカンチレバー；
該標的受容体が固定化された基材；
該カンチレバーと該標的受容体基材との相対位置および配向を調整し、該カンチレバーの該デンドロンで修飾された表面領域上に固定化された該リガンドと該基材上に固定化された該標的受容体との間に相互作用を起こさせるためのコントローラ；および
該リガンドと該標的受容体との相互作用に関連する物理パラメータを測定するための検出器とを備える、
装置。
【請求項３０】
リガンドとの相互作用について標的受容体を分析する方法であって、
（ａ）固定端と自由端とを有し、該自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、該デンドロンの分岐領域の複数の末端が請求項１記載の表面に結合しているカンチレバーを供与する工程；
（ｂ）リガンドを基材に固定化する工程；
（ｃ）リガンドを固定化するために、該カンチレバーの該デンドロンで修飾された表面領域を化学修飾する工程；
（ｄ）該カンチレバーの該デンドロンで修飾された表面領域上に固定化された該リガンドと試料支持部材の基材上に固定化された該標的受容体との間に相互作用を起こさせるために、該基材と該カンチレバーとの相対位置および配向を調整するためのコントローラを備える装置に、該基材および該カンチレバーを連結する工程；
（ｅ）リガンドと該標的受容体との間に相互作用を起こさせるために、該カンチレバーと該基材との相対位置および配向を調整する工程；および
（ｆ）リガンドと該標的受容体との相互作用に関連する物理パラメータを測定する工程とを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
継続に関する情報
本出願は、２００５年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／７０７，８９２号、および２００６年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８１７，６０８号を基礎とする優先権の主張を伴うものであり、これらの内容は、参照によりその全文が本明細書に援用される。
【０００２】
発明の背景
（ａ）発明の分野
本発明は、一般的には、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、ＡＦＭ用カンチレバーおよび装置、ならびにこれらを用いて生体分子間の相互作用を測定する方法に関する。本発明は、生体分子間の相互作用力の測定における、デンドロンでコーティングしたバイオＡＦＭチップの使用に関する。また、本発明は、制御されたメゾ空間を有する表面を用いた、細胞受容体のバイオＡＦＭフォースマッピングに関する詳細を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（ｂ）関連技術の説明
ポストゲノム時代において、薬剤発見、ならびに疾患の診断および予防のための、定量的かつ包括的なゲノムの研究は、急速に発展しつつある研究開発分野である。これらの分野における発展により、高い感度および優れた特異性を有する、高度な生体分子認識プローブが強く求められている（K. Wangら、Anal. Chem. 76, 5721 2004、非特許文献１）。
【０００４】
ＤＮＡの転写、遺伝子の発現および制御、ならびにＤＮＡの複製等の種々の重要な生物学的プロセスの深い理解のためには、多くの生体分子の認識に関する研究のうち、相補的なＤＮＡ鎖の機械的安定性（または認識特性）に対する理解が不可欠である。このような観点において、光ピンセット法、マイクロピペット吸引法、およびＡＦＭ法等の種々の手法を用いて、ＤＮＡの伸長および力によって誘起される溶融が検討された（H. Clausen-Schaumann, M.Seitz, R.Krautbauer, H.E.Gaub, Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 524 , 2000、非特許文献２；R. Merkel, Physics Reports 346, 343, 2001、非特許文献３；G. U. Lee, L. A. Chris, R. J. Colton, Science 266, 771, 1994、非特許文献４）。
【０００５】
個々の分子間の相互作用を、短い長さのスケールおよび数ピコニュートン程度の力を高感度で測定することが可能であるため、ＡＦＭは、親和性および認識特性を分子レベルで検知するための急速に発達しつつある手法となっている（R. Krautbauer, M. Rief, H. E. Gaub, Nano Lett.3, 493, 2003、非特許文献５）。力を測定するための他の高感度な方法と比較すると、ＡＦＭは、高い力の分解能および高い空間分解能を有し、静電相互作用（J. Wang, A. J. Bard, Anal. Chem. 73, 2207, 2001、非特許文献６）、リガンド−受容体相互作用（S. M. Rigby- Singletonら、J. Chem. Soc, Perkin Trans.2 1722, 2002、非特許文献７）、抗原−抗体相互作用（F. Schwesingerら、Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A. 97, 9972, 2000、非特許文献８）、アプタマー−タンパク質相互作用（C. Bai et al, Anal. Chem. 75, 2112, 2003、非特許文献９）、タンパク質の折り畳み／展開（P. M. Williamsら、Nature 422, 446, 2003、非特許文献１０; M.S.Z.Kellermayer, S. B. Smith, H.L. Granzier, C. Bustamante, Science 276,1112, 1997、非特許文献１１）、細胞−細胞接着（M. Benoit, D. Gabriel, G. Gerisch, H. E. Gaub, Nature Cell Biol. 2, 313, 2000、非特許文献１２）、およびＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（C. W. Frank, Biophys. J. 76, 2922, 1999、非特許文献１３）等の、生物学的プロセスにおける特異的な相互作用を検討するための生理的条件下で動作可能であるという利点を有している。
【０００６】
相補的なＤＮＡ鎖間の解離力の測定について多くの研究がなされてきたが（H. Clausen-Schaumann, M.Seitz, R.Krautbauer, H.E.Gaub, Curr.Opin.Chem. Biol 4, 524, 2000、非特許文献２; R. Merkel, Physics Reports 346, 343 , 2001、非特許文献３; G. U. Lee, L. A. Chris, R. J. Colton, Science 266, 771.1994、非特許文献４; R.Krautbauer, M. Rief, H.E. Gaub, Nano Lett. 3, 493, 2003、非特許文献５）、単分子レベルでの測定の間でのＤＮＡ鎖間の認識が問題となる。典型的な固定化の手法では多点相互作用の問題が生じ、単一分子の相互作用を分離するのは容易ではない。望ましくない相互作用を回避するために、不活性な界面活性剤を混合することにより表面密度を低下させたが、この手法においては、認識効率が低下し、結果的に分析結果の信頼性が低下した。したがって、一般に行われている、酸化物−シランおよび金−チオールの化学反応（T. Hugel, M. Seitz, Macromol.Rapid.Commun. 22, 989, 2001、非特許文献１４；W. K. Zhang, X. Zhang, Prog. Polym. Sci. 28, 1271, 2003、非特許文献１５）等の、このような固定化のための表面化学反応は、ＡＦＭを用いた測定中に、単分子のＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用に関する貴重な基本的な情報を得るためには、未だ最適化の余地を有している。
【０００７】
原子間力顕微鏡観察は、生体内に存在する生体分子間における種々の相互作用を理解する上で、古くから重要な役割を果たしてきた。相互作用力を分析する能力により、分子レベルでのより多くの研究が行われることから、ナノテクノロジーおよびバイオテクノロジーにおけるその重要性は、将来にわたり増加することが期待される。
【０００８】
この技術を利用して、異なる表面上に位置する生体分子間の相互作用のメカニズムを検討するために多くの努力がなされた。しかし、液体と異なり、表面上の生体物質の観測には、意図しない吸着および立体障害等の特有の問題が存在する。このような問題に対処するための多くの対策のうち最も一般的なものには、表面に複合自己組織膜を塗布することにより単一分子の相互作用を測定することが含まれる。ＡＦＭを用いて２つの分子間に働く相互作用力のみを観測する場合、２つの問題が生じる。第１の問題は、表面上において、生体分子が体内と異なる活性を示す点に関するものである。第２の問題は、このような条件下においては、単一分子の相互作用が保証されないという事実に関するものである。これまでの研究により、自己組織性単分子膜法およびメゾ空間制御法を用いることにより、いずれの問題も解決できることが示されている（Langmuir 2005, 21, 4257、非特許文献１６；国際公開第２００６／０１６７８７号、特許文献１）。この技術は、分子が導入されうる官能基の数を制限することにより、生体分子の間隔および数を制御することによって、分子間相互作用を単分子レベルで観測することを含んでいる。この方法の最も一般的な問題は、相分離を引き起こす同一の官能基を有する分子間の意図しない引力、および生体分子が互いに等間隔に配置されていることに対する確実な証拠が存在しない点である。
【特許文献１】国際公開第２００６／０１６７８７号公報
【非特許文献１】K. Wangら、Anal. Chem. 76, 5721 2004
【非特許文献２】H. Clausen-Schaumann, M.Seitz, R.Krautbauer, H.E.Gaub, Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 524 , 2000
【非特許文献３】R. Merkel, Physics Reports 346, 343, 2001
【非特許文献４】G. U. Lee, L. A. Chris, R. J. Colton, Science 266, 771, 1994
【非特許文献５】R. Krautbauer, M. Rief, H. E. Gaub, Nano Lett.3, 493, 2003
【非特許文献６】J. Wang, A. J. Bard, Anal. Chem. 73, 2207, 2001
【非特許文献７】S. M. Rigby- Singletonら、J. Chem. Soc, Perkin Trans.2 1722, 2002
【非特許文献８】F. Schwesingerら、Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A. 97, 9972, 2000
【非特許文献９】C. Bai et al, Anal. Chem. 75, 2112, 2003
【非特許文献１０】P. M. Williamsら、Nature 422, 446, 2003
【非特許文献１１】M.S.Z.Kellermayer, S. B. Smith, H.L. Granzier, C. Bustamante, Science 276,1112, 1997
【非特許文献１２】M. Benoit, D. Gabriel, G. Gerisch, H. E. Gaub, Nature Cell Biol. 2, 313, 2000
【非特許文献１３】C. W. Frank, Biophys. J. 76, 2922, 1999
【非特許文献１４】T. Hugel, M. Seitz, Macromol.Rapid.Commun. 22, 989, 2001
【非特許文献１５】W. K. Zhang, X. Zhang, Prog. Polym. Sci. 28, 1271, 2003
【非特許文献１６】Langmuir 2005, 21, 4257
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
バイオＡＦＭ技術を用いる生体分子研究の重要性は急速に増加している。生体活性を補助する液体環境下において、生体分子等の非導電性物質をナノメートルレベルで観測することができる能力により、バイオＡＦＭは、生体分子の構造および部分構造の研究のための重要なツールとなっている。さらに、バイオＡＦＭチップによって、バイオＡＦＭを用いた分子相互作用の近接測定が可能になるとともに、バイオＡＦＭチップ上には、生体分子を結合させることができる。重要な用途としては、相補的なＤＮＡ分子間の相互作用、タンパク質間の相互作用、リガンド−受容体相互作用の測定が挙げられ、後者は、薬剤に対する免疫応答を研究する上で重要性を有している。単分子レベルで生体分子間の相互作用力を研究する上で、感度が高いことは極めて重要である。単分子の観測は、バイオＡＦＭ、光ピンセットおよび磁気ピンセット等の方法により行うことができる。それぞれの方法には、磁気ピンセットにおける精度の低下、および光ピンセット下に置かれた分子が被る可能性のある損傷等の、それぞれに固有の短所が伴う。
【００１０】
バイオＡＦＭを用いてリガンド−受容体相互作用を研究するためには、リガンドをチップの先端に結合させる必要がある。通常、これはビオチン−ストレプトアビジン相互作用の使用、または自己組織性化合物の薄膜を用いることにより達成される。しかし、このような方法においては、分子間距離を直接制御することができず、リガンドが特定の領域に集中し、リガンド−受容体相互作用の高精度な観測に対して問題を引き起こすおそれがある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要約
本発明の目的は、固定端と自由端とを有するカンチレバー本体を含み、該自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、該デンドロンの分岐領域の複数の末端が該表面に結合しており、該デンドロンの直鎖領域の末端が官能基化されている、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）用のカンチレバーを提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、直鎖状の官能基の間隔が約０．１nmから約１００nmである一定の間隔でデンドロンが配置された、ＡＦＭ用のカンチレバーを提供することである。特に、デンドロンは、約１０nmの一定の間隔でデンドロンが配置されていてもよい。
【００１３】
本発明の他の目的は、（i）デンドロンの末端と反応するように、カンチレバーの表面領域を官能基化する工程と、（ii）該末端と該表面とが結合を形成するように、デンドロンを該表面領域と接触させる工程とを有する、カンチレバーを製造する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の目的の１つは、プローブヌクレオチド、受容体に対するリガンドまたはプローブヌクレオチドもしくはリガンドに結合するリンカー分子が、デンドロンの直鎖領域の末端に固定されており、i）表面領域上のデンドロンの直鎖領域の末端から保護基を除去する工程と、ii）リンカー分子が、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性リンカーであって、プローブヌクレオチド、リガンド、またはリンカー分子と末端とが結合を形成するように、プローブヌクレオチド、受容体に対するリガンド、またはプローブヌクレオチドもしくはリガンドに結合したリンカー分子を、基材上のデンドロンの直鎖領域の末端と接触させる工程を含む、カンチレバーを製造する方法を提供することである。
【００１５】
また、本発明は、
固定端と自由端とを有し、該自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、該デンドロンの分岐領域の複数の末端が該表面に結合しており、該デンドロンの直鎖領域の末端がプローブヌクレオチドもしくはリガンドに結合しているカンチレバーと、
標的ヌクレオチドもしくはリガンドと結合する分子が固定化された基材と、
カンチレバー及び基材上の標的ヌクレオチド又はリガンドと結合する分子との相対位置および配向を調整し、デンドロンで修飾されたカンチレバーの表面領域上に固定化されたプローブヌクレオチドもしくはリガンドと、基材上に固定化された標的ヌクレオチドもしくはリガンドと結合する分子との間に相互作用を起こさせるためのコントローラと、
プローブヌクレオチドもしくはリガンドと試料核酸もしくはリガンドと結合する分子との相互作用に関連する物理パラメータを測定するための検出器とを備える、１分子のプローブヌクレオチドもしくはリガンドと１分子の標的ヌクレオチドもしくはリガンドと結合する分子（例えばその受容体）との間の相互作用をＡＦＭによって測定するための装置を提供する。
【００１６】
ある実施態様では、標的ヌクレオチドまたはリガンドに対する結合性を有する分子が固定化される基材には、任意の公知の表面修飾方法を適用することができる。好ましくは、基材は、デンドロンによって修飾された表面を有している。
【００１７】
本発明の他の目的は、
（ａ）固定端と自由端とを有し、該自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、該デンドロンの分岐領域の複数の末端が該表面、および基材に結合しているカンチレバーを供与する工程と、
（ｂ）標的ヌクレオチド、またはリガンドと結合する分子を固定化するために基材を化学修飾する工程と、
（ｃ）プローブヌクレオチドまたはリガンドを固定化するために、デンドロンで修飾されたカンチレバーの表面領域を化学修飾する工程と、
（ｄ）デンドロンで修飾されたカンチレバーの表面領域上に固定化されたプローブヌクレオチドまたはリガンドと、試料支持部材の基材上に固定化された標的ヌクレオチドまたはリガンドと結合する分子、との間に相互作用を起こさせるために、基材とカンチレバーとの相対位置および配向を調整するためのコントローラを備える装置に、基材およびカンチレバーを連結する工程と、
（ｅ）プローブヌクレオチドまたはリガンドと標的ヌクレオチドまたはリガンドと結合する分子との間に相互作用を起こさせるために、カンチレバーと基材との相対位置および配向を調整する工程と、
（ｆ）プローブヌクレオチドまたはリガンドと、標的ヌクレオチドまたはリガンドと結合する分子との相互作用に関連する物理パラメータを測定する工程とを含む、プローブヌクレオチドまたはリガンドとの相互作用について標的ヌクレオチドまたはリガンドと結合する分子を分析する方法を提供することである。
【００１８】
上記において、分岐領域の末端は、−ＣＯＺ、−ＮＨＲ、−ＯＲ'、または−ＰＲ"３によって官能基化されていてもよく、式中、Ｚは、脱離基であってよく、Ｒはアルキルであってよく、Ｒ'はアルキル、アリール、またはエーテルであってよく、Ｒ"はＨ、アルキル、アルコキシ、またはＯであってよい。具体的には、ＣＯＺは、エステル、活性エステル、酸ハロゲン化物、活性アミド、またはＣＯ−イミダゾイルであってよく、ＲはＣ１〜Ｃ４アルキルであってよく、Ｒ'はＣ１〜Ｃ４アルキルであってよい。さらに、上述の基材において、ポリマーはデンドロンであってよい。さらに、ポリマーの直鎖領域は、スペーサ領域を含んでいてもよい。また、スペーサ領域は、第１の官能基を介して分岐領域に結合していてもよい。このような第１の官能基は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＰＨ３、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯまたは−ＳＨであってよいが、これらに限定されない。さらに、スペーサ領域は、第１の官能基に共有結合したリンカー領域を含んでいてもよい。
【００１９】
基材およびＡＦＭ用のカンチレバー、好ましくはＡＦＭチップにおいて、リンカー領域は、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、またはアミノアルキル基を含んでいてもよい。さらに、スペーサ領域は、第２の官能基を含んでいてもよい。第２の官能基は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＰＨ３、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯまたは−ＳＨであってよいが、これらに限定されない。第２の官能基は、直鎖領域の末端に位置していてもよい。また、保護基が直鎖領域の末端に結合していてもよい。このような保護基は、酸反応性または塩基反応性であってもよい。
【００２０】
本発明の他の実施態様では、上述のＡＦＭ用のカンチレバーにおいて、プローブリガンドもしくはヌクレオチド、および／または標的リガンドに結合する分子もしくはヌクレオチドは、デンドロンの直鎖領域の末端に結合していてもよい。具体的には、標的ヌクレオチドおよびプローブヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アプタマー、ヌクレオチドアナローグ、またはこれらの組み合わせであってもよい。標的に特異的なリガンドとしてはヌクレオチドが挙げられるが、より一般的に、化合物、ポリペプチド、炭水化物、抗体、抗原、バイオミメティック、ヌクレオチドアナローグ、またはこれらの組み合わせと考えてもよい。
【００２１】
さらに、デンドロンの直鎖領域に結合したリガンドまたはヌクレオチド間の距離は、約０．１〜約１００nmであってもよい。
【００２２】
本発明のさらに他の実施態様では、上述の基材は、半導体製、合成有機金属製、合成半導体製、金属製、合金製、プラスチック製、シリコン製、ケイ酸塩製、ガラス製、またはセラミックス製であってもよい。具体的には、基材は、スライド、粒子、ビーズ、マイクロウェル、または多孔質材料であってよいが、これらに限定されない。
【００２３】
これらの本発明の目的および他の目的は、本発明についての以下の説明、参照された添付図面、および添付された特許請求の範囲より、さらに明確に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
詳細な説明
本出願において、「ａ」および「ａｎ」は、単数および複数の対象のいずれを表す場合にも用いる。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「アプタマー」とは、選択された非オリゴヌクレオチド分子または分子群を、Watson-Click塩基対形成または３本鎖形成以外のメカニズムによって特異的に認識することができる、１本鎖、部分的に１本鎖、部分的に２本鎖、または２本鎖の核酸配列であり、有利には複製可能な核酸配列を意味する。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「バイオミメティック」とは、生体分子、分子群、構造を模倣する分子、分子群、多分子構造または方法を意味する。
【００２７】
「デンドリマー」という用語は、コア、少なくとも１層の分岐層、および表面の分岐層によって特徴づけられる（Petarらによる、In Chem. in Britain、１９９４年８月、６４１〜６４５ページを参照されたい）。「デンドロン」は、中心点から放射状に分岐を有するデンドリマーの一種であり、直接、またはリンカー残基を介してコアに結合して、デンドリマーを形成しており、または形成していてもよい。多くのデンドリマーは、共通のコアに結合した２つ以上のデンドロンを含んでいる。しかし、「デンドリマー」という用語は、単一のデンドロンを含むように広義に用いることができる。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「超分岐」または「分岐」という用語は、高分子またはデンドロンの構造を説明するために用いられている場合、基材と共有結合またはイオン結合することができる複数の末端を有する複数のポリマーを意味することが意図されている。ある実施態様では、分岐または超分岐構造を含む高分子を「予め製造」し、次いで基材に結合させる。
【００２９】
本明細書で用いる場合、「固定化された」とは、不溶化され、または不溶性、部分的に不溶性、コロイド状、粒子状、分散、懸濁、および／または脱水された基材または分子、または固体担体に含まれ、または結合した固相に含まれ、結合し、または動作可能に結合されていることを意味する。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「ライブラリー」とは、分子、物質、表面、構造形態、表面特性、または場合によっては、これらに限定されない種々の化学種、モノマー、ポリマー、構造、前躯体、生成物、修飾物、誘導体、基質、コンホメーション、形状、または構造の、不規則な、または不規則でない混合物、収集物、または組み合わせを意味する。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「リガンド」とは、相補的塩基対形成を含む親和性に基づく吸引力により、他の分子と特異的に結合することができる選択された分子を意味する。リガンドとしては、核酸、種々の合成化合物、受容体アゴニスト、部分アゴニスト、混合アゴニスト、アンタゴニスト、応答誘導分子または応答刺激分子、薬剤、ホルモン、フェロモン、伝達物質、オータコイド、増殖因子、サイトカイン、補欠分子族、補酵素、補欠因子、基質、前躯体、ビタミン、トキシン、調節因子、抗原、ハプテン、炭水化物、分子擬態、構造分子、エフェクター分子、選択可能分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、交差反応源、アナローグ、拮抗因子、またはこれらの分子の誘導体、さらには、選択された標的に結合することができる、ライブラリーより選択された非オリゴヌクレオチド分子、およびこれらの分子のうち任意のものが第２の分子に結合した複合体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「リガンドに結合する分子」とは、リガンドに特異的に結合する分子を意味する。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「リンカー分子」および「リンカー」は、分岐／直鎖高分子等のサイズが制御された分岐領域と、保護基またはリガンドとを結合させる分子について用いられる。リンカーとしては、例えば、リガンドをデンドロンに結合させることができる、選択された分子等のスペーサ分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「低密度」とは、約０．０１〜約０．５プローブ/nm2、好ましくは約０．０５〜約０．２、より好ましくは約０．０７５〜約０．１５、最も好ましくは約０．１プローブ/nm2を指す。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「分子擬態」および「模倣体」は、例えば天然の生体分子もしくは選択可能分子と同様または等価な構造あるいは機能を有するようにデザイン、選択、製造、修飾、または設計された、天然もしくは合成のヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子あるいは分子群である。分子擬態としては、天然、合成、選択可能、または生体分子の置換物、代替物、改善物、改良物、構造アナローグまたは機能アナローグとして機能することができる分子または多分子構造が挙げられる。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「プローブヌクレオチド」または「標的ヌクレオチド」には、オリゴヌクレオチド等のヌクレオチド配列が含まれ、単一のヌクレオチドに限定されない。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「ヌクレオチドアナローグ」とは、核酸の合成および加工、好ましくは酵素および化学合成において天然の塩基の代わりに用いることができる分子を指し、特に、塩基対を形成することができる修飾ヌクレオチドであり、場合によっては、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシルまたは微量塩基を含まない合成塩基である。この用語には、修飾プリンおよびピリミジン、微量塩基、交換可能なヌクレオシド、プリンおよびピリミジンの構造アナローグ、標識、誘導体化および修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド、複合ヌクレオシドおよびヌクレオチド、配列変更因子、末端変更因子、スペーサ変更因子が含まれるがこれらに限定されず、およびリボース修飾ヌクレオチド、ホスホロアミダート、ホスホロチオエート、ホスホンアミダイト、ホスホン酸メチル、メチルホスホロアミダイト、メチルホスホンアミダイト、５'−β−シアノエチルホスホロアミダイト、ホスホン酸メチレン、ホスホロジチオネート、ペプチド核酸、アキラルおよび天然核酸間結合、ならびにポリエチレングリコール、芳香族ポリアミド、および脂質等の非ヌクレオチド架橋等、骨格の修飾を伴うヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においてアミノ酸残基の重合体を指すために交換可能に用いられる。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学的アナローグであるアミノ酸重合体とともに、天然アミノ酸の重合体に適用される。この用語には、ポリペプチドを形成するアミノ酸を結合させる従来のペプチド結合の変異体も含まれる。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「保護基」とは、分子上の反応性基（ヒドロキシル基またはアミノ基等）に結合した基を指す。保護基は、化学反応の１つまたは複数の工程の間、特定の基が反応するのを防ぐために選択される。後で、分子中に存在する他の反応性基を変化させることなく除去し、元の反応性基に戻すことができるように、特定の保護基を選択する。保護基は、保護される特定の基、および接触させる化合物に応じて選択される。保護基の選択は、当業者に周知である。その全文が参照により本明細書に援用されるGreeneら、Protective Groups in Organic Synthesis、第２版、John Wiley & Sons, Inc. Somerset, NJ. （1991）を参照されたい。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「保護されたアミン」とは、アミノ保護基と反応したアミンを指す。アミノ保護基は、直鎖の末端官能基がアミノ基である場合において、分岐の末端を固体担体に結合させる間にアミド官能基が反応するのを防ぐ。アミノ保護基は、後で、分子中に存在する他の反応性基を変化させることなく除去し、元のアミノ基に戻すことができる。例えば、環外アミノ基はジメチルホルムアミドジエチルアセタールと反応し、ジメチルアミノメチレンアミノ官能基を形成することができる。アミノ保護基としては、通常、カルバメート、ベンジル基、イミデート、および他の公知のものが挙げられる。好ましいアミノ保護基としては、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルまたはジメチルアミノメチレンアミノが挙げられる。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「一定の間隔」とは、サイズが制御された高分子の先端の間隔を指し、標的に対し特異的なリガンドと標的との間の相互作用が、殆ど立体障害を伴わずに起こるように、約１nm〜約１００nmの距離である。したがって、基材上に形成された高分子の層では、特異的な分子間相互作用を起こすには密度が高すぎる。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「固体担体」とは、不溶化物質、固相、表面、基材、層、コーティング、布帛または不織布、マトリックス、結晶、膜、不溶性ポリマー、プラスチックまたはガラス、生体、生体適合性、生侵食性もしくは生分解性高分子またはマトリックス、微粒子またはナノ粒子等が挙げられるがこれらに限定されない、固定化マトリックスを形成する組成物を指す。固体担体としては、例えば、単分子膜、多層膜、市販の膜、樹脂、マトリックス、繊維、分離媒体、クロマトグラフィー担体、ポリマー、プラスチック、ガラス、マイカ、金、ビーズ、マイクロスフェア、ナノスフェア、シリコン、ガリウムヒ素、有機および無機金属、半導体、絶縁体、マイクロ構造体およびナノ構造体が挙げられるがこれらに限定されない。マイクロ構造体およびナノ構造体としては、超小型、ナノメートルスケール、および超分子プローブ、チップ、バー、糸巻状体、栓状体、棒状体、筒状体、線状体、フィラメント、および管が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「スペーサ分子」とは、２つのヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを結合させ、好ましくは２つのヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド間の距離を変化させ、または調節するために選択されもしくは設計された、１つまたは複数のヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド分子、基、またはスペーサアームを指す。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「特異的な結合」という用語は、リガンドとこれに特異的に結合する分子との間の、または一定の配列を有するセグメントと選択された分子または選択されたヌクレオチド配列との間の、測定可能かつ再現性を有する程度の引力を指す。引力の程度は、最適化のために最大である必要は必ずしもない。弱い、中程度の、または強い引力が、種々の用途において有用である場合もある。これらの相互作用において起こる特異的な結合は、当業者に周知である。合成した一定の配列を有するセグメント、合成アプタマー、合成ヘテロポリマー、ヌクレオチドリガンド、ヌクレオチド受容体、形状認識要素、および特異的な引力を有する表面に関して用いる場合。「特異的な結合」には、構造的な形状および表面特性の特異的な認識が含まれていてよい。あるいは、特異的な結合は、特異的な結合痙性の相手方と化学的な同一性（１つまたは複数の同一の化学基）または分子認識特性（分子の結合特異性）を共有する第３の分子（拮抗剤）によって拮抗的に阻害されうる、２つの分子（特異的な結合形成の相手方）間の特異的かつ飽和可能な非共有結合による相互作用を指す。拮抗剤は、例えば、交差反応体、または抗体のアナローグもしくはその抗原、リガンドまたはその受容体、またはアプタマーもしくはその標的であってよい。抗体とその抗原との間の特異的な結合は、例えば、交差反応性抗体または交差反応性抗原によって競合的に阻害することができる。「特異的な結合」という用語は、特異的な結合および構造形状認識の両者を含む特異的な認識の下位集合を近似または略称するために便宜上用いることができる。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「基材」を物質、構造、表面、または材料に関して使用すると、従来、特異的結合部位、ハイブリダイゼーション部位もしくは触媒認識部位、または複数の異なる認識部位、または表面、構造または材料を構成する分子種の数よりも多数の異なる認識部位を構成する、非生体、合成、非生物、平面、球状または平坦な表面を構成する組成物を意味する。基材としては、例えば、半導体、合成（有機）金属、合成半導体、絶縁体およびドーパント、金属、合金、元素、化合物および無機物、分解加工、エッチング加工、リソグラフィー加工、プリント加工、および微細加工されたスライド、装置、構造および表面、工業用ポリマー、プラスチック、膜、シリコン、ケイ酸塩、ガラス、金属、およびセラミックス、木、紙、ボール紙、綿、毛、衣類、布帛および不織布、材料および繊維、分岐／直鎖ポリマーを介した固定化プローブ分子により修飾を受けていないナノ構造およびミクロ構造が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「標的−プローブ結合」とは、少なくとも１つが選択された分子である２つ以上の分子が互いに特異的に結合することを意味する。通常、第１の選択された分子は、例えば、介在するスペーサアーム、基、分子、架橋、担体、または特異的な認識の相手方を介して間接的に、あるいは介在するスペーサアーム、基、分子、架橋、担体、または特異的な認識の相手方を介さずに直接、有利には直接結合により第２の分子に結合することができる。選択された分子は、ハイブリダイゼーションを介してヌクレオチドに特異的に結合することができる。ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドの結合のための共有結合によらない手段としては、例えば、イオン結合、疎水性相互作用、リガンド−ヌクレオチド結合、キレート剤／金属イオン対形成、またはアビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、抗フルオレセイン抗体／フルオレセイン、抗−２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）抗体／ＤＮＰ、抗−ペルオキシダーゼ抗体／ペルオキシダーゼ、抗−ジゴキシゲニン抗体／ジゴキシゲニン、あるいはより一般的には受容体／リガンド等が挙げられる。例えば、標識のために、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、抗−フルオレセイン抗体／フルオレセイン、抗−ペルオキシダーゼ抗体／ペルオキシダーゼ、抗−ＤＮＰ抗体／ＤＮＰ、抗−ジゴキシゲニン抗体／ジゴキシゲニン、または（直接共有結合する代りに）受容体／リガンドを用いて選択された分子または選択された核酸配列に結合した、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、ローダミン、フルオレセイン、フィコエリスリン、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステルまたは蛍光微粒子等のリポーター分子は、特異的な結合対により選択された分子または選択された核酸配列に結合してもよい。
【００４７】
ＡＦＭチップおよび基材の両者の表面上に固定化されたＤＮＡ鎖間の間隔を制御することにより、単一のオリゴヌクレオチドの解離および結合力が測定された。認識効率を向上させることができるとともに、適当な間隔を選択することにより、多点相互作用および／または二次的な相互作用が消去されることが観測された。具体的には、２０、３０、４０、および５０塩基対を有するＤＮＡ二本鎖の解離力のヒストグラムはシャープになり、単一分子の二本鎖の力を示した。驚くべきことに、結合現象も観測され、対応する力は解離力と一致した。また、ＤＮＡ鎖長の増加に伴う両方の力の直線的な増加も観測され、力の測定は、一塩基の変異を識別するために十分な感度を有していた。
【００４８】
本発明は、固定端と自由端とを有するカンチレバー本体を含み、自由端はデンドロンによって化学的に修飾された表面領域を有し、デンドロンの分岐領域の複数の末端が該表面に結合しており、該デンドロンの直鎖領域の末端が官能基化されている、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）用のカンチレバーを提供する。
【００４９】
本発明のある実施態様では、カンチレバーの自由端の近傍に少なくとも１つの先細の突起が形成されており、突起はピラミッド状または円錐状である。プローブチップの多数の類似の構造を図２Ｃに示す。このように、カンチレバーの自由端の表面領域は、参照化合物の分子との間の相互作用を測定することができるように、特定の突起と接触し、または近接している。
【００５０】
本発明において、任意のタイプのＡＦＭ用のカンチレバーを用いることができ、これらは特に制限されない。本発明のカンチレバーは、図１Ｂおよび図１Ｃに示した装置等の全てのタイプのＡＦＭにおいて用いることができる。図１Ａは一般的な原子間力顕微鏡の例を示し、図２ＡはＡＦＭ用のカンチレバーである。本発明のＡＦＭは、図１Ａを参照して説明することができる。ＡＦＭシステム１０は、基台１５、基台１５に固定され、中央部に開口を有するフレーム２０、および基台１５に固定された管状の圧電アクチュエータ５５を含んでいる。管状の圧電アクチュエータ５５は、コントローラＣＯより配線を介して電圧を印可することにより、矢印Ｖ２で示される垂直方向、すなわち、カンチレバーの厚さ方向に偏向させることができる。
【００５１】
図２Ａを参照すると、カンチレバー５０は、圧電アクチュエータ２５が基材９５の片側に形成されているような構造を有している。カンチレバーの実施態様の一例において、カンチレバー５０は、矩形の基材９５上に積層された絶縁層１１０の上に形成されたカンチレバー基体９０を含んでいる。
【００５２】
カンチレバーは、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、Ｓｉ３Ｎ４Ｏｘ、Ａｌ、または圧電材料等のＡＦＭ用のカンチレバーに用いられる任意の公知の材料で構成されていてよい。カンチレバーの化学組成は重要ではなく、好ましくは容易に微細加工することができ、ＡＦＭ測定に用いるために必要とされる機械的性質を有する材料である。同様に、カンチレバーは、ＡＦＭ用のカンチレバーについて公知の任意のサイズおよび形状を有していてよい。カンチレバーのサイズは、好ましくは、長さが約５ミクロン〜約１０００ミクロン、幅が約１ミクロン〜約１００ミクロン、厚さが約０．０４ミクロン〜約５ミクロンである。通常のＡＦＭ用のカンチレバーは、長さが約１００ミクロン、幅が約２０ミクロン、厚さが約０．３ミクロンである。カンチレバーの固定端は、カンチレバーが従来のＡＦＭのカンチレバー保持部に適合しまたは連動するように適合させることができる。
【００５３】
カンチレバーの自由端の表面領域は、デンドロンによる処理のために、例えば、ＧＰＤＥＳまたはＴＰＵ等のシラン剤を用いて修飾されていてもよい。
【００５４】
本発明の装置および方法は、カンチレバーに基づくＡＦＭ装置とともに用いることに限定されない。
【００５５】
本発明のポリマーの説明において、化学式１に示すようなポリマー等を挙げることができる。
化学式１
【化１】
2009505057.tif 000003
【００５６】
種々の構造変数Ｒ、Ｔ、Ｗ、ＬおよびＸが化学式１に記載されている。ポリマーは、任意の分岐または超分岐ポリマー、対称または非対称ポリマーを含んでいてよい。ポリマーの分岐した末端は、好ましくは複数の末端によって基材に結合している。ポリマーの直鎖末端は、保護基または標的ヌクレオチドが結合している官能基を末端に有していてよい。基材上の複数のポリマー中のプローブ間の距離は、約０．１nm〜約１００nm、好ましくは約１nm〜約１００nm、より好ましくは約２nm〜約７０nm、さらにより好ましくは約２nm〜約６０nm、最も好ましくは約２nm〜約５０nmであってよい。
【００５７】
Ｒ−基
式１において、ポリマーは、通常、分岐部分を有しており、その末端は、基材と結合するために官能基化されている。分岐部分の中において、分岐の第１世代の基Ｒｘ（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）は、官能基Ｗによって分岐の第２世代の基Ｒｘｘ（Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３）に結合している。分岐の第２世代の基は、官能基Ｗによって分岐の第３世代の基Ｒｘｘｘ（Ｒ１１１、Ｒ１１２、Ｒ１１３、Ｒ１２１、Ｒ１２２、Ｒ１２３、Ｒ１３１、Ｒ１３２、Ｒ１３３、Ｒ２１１、Ｒ２１２、Ｒ２１３、Ｒ２２１、Ｒ２２２、Ｒ２２３、Ｒ２３１、Ｒ２３２、Ｒ２３３、Ｒ３１１、Ｒ３１２、Ｒ３１３、Ｒ３２１、Ｒ３２２、Ｒ３２３、Ｒ３３１、Ｒ３３２、Ｒ３３３）に結合している。さらに、第４世代が、同様にして第３世代の基に結合していてよい。末端のＲ基は、基材に結合することができるように官能基化されていてよい。
【００５８】
全ての世代のＲ基は同一であっても異なっていてもよい。通常、Ｒ基は繰り返し単位であってよく、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、アミノアルキル等の直鎖または分岐鎖状有機残基であってよいがこれらに限定されない。しかし、全てのＲ基が同一の繰り返し単位である必要はないことも理解される。また、Ｒ基の原子価の位置も、全てが繰り返し単位によって満たされている必要はない。例えば、第１世代の分岐Ｒｘにおいて、この分岐レベルにおける全てのＲ基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は同一の繰り返し単位であってよい。あるいは、Ｒ１は繰り返し単位であってよく、Ｒ２およびＲ３は、Ｈまたは他の任意の化学種であってよい。あるいは、Ｒ２は繰り返し単位であってよく、Ｒ１およびＲ３は、Ｈまたは他の任意の化学種であってよい。同様に、第２世代および第３世代の分岐についても、任意のＲ基は繰り返し単位、Ｈまたは他の任意の化学種であってよい。
【００５９】
したがって、このような方法により、種々の形状のポリマーを製造することができ、例えば、Ｒ１、Ｒ１１、Ｒ１１１、Ｒ１１２、およびＲ１１３が同一の繰り返し単位であり、他のＲ基がＨまたは他の任意の数の低分子量の中性の分子または原子である場合、Ｒ１１１、Ｒ１１２、およびＲ１１３に対する３つの官能基の末端を有する分岐を有し、かなり長く薄いポリマーが製造される。種々の他の任意の化学配置が可能である。したがって、基材に結合することができる官能基を有する約３〜約８１個の末端を得ることができる。好ましい末端の数は、約３〜約７５、約３〜約７０、約３〜約６５、約３〜約６０、約３〜約５５、約３〜約５０、約３〜約４５、約３〜約４０、約３〜約３５、約３〜約３０、約３〜約２７、約３〜約２５、約３〜約２１、約３〜約１８、約３〜約１５、約３〜約１２、約３〜約９、または約３〜約６であってよい。
【００６０】
Ｔ−末端基
末端基Ｔは、付加または置換反応を起こすために適当な反応性を有する官能基である。このような官能基の例としては、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシル、アルケニル、アリル、ビニル、アミド、ハロ、尿素、オキシラニル、アジリジニル、オキサゾリニル、イミダゾリニル、スルホン酸、リン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、シラニル、およびハロゲニルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６１】
Ｗ−官能基
式１において、Ｗは、エーテル、エステル、アミド、ケトン、尿素、ウレタン、イミド、炭酸エステル、カルボン酸無水物、カルボジイミド、イミン、アゾ基、アミジン、チオカルボニル、有機スルフィド、ジスルフィド、ポリスルフィド、有機スルホキシド、スルフィット、有機スルフォン、スルフォンアミド、スルフォネート、有機スルフェート、アミン、有機リン基、アルキレン、アルキレンオキシド、アルキレンアミン等の、ポリマーを他の（または他の２価の有機）残基と結合させることができる任意の官能基であってよい。
【００６２】
Ｌ−スペーサまたはリンカー基
化学式１において、ポリマーの直鎖部分は、リンカー部分よりなり、官能基が場合によっては点在していてもよいスペーサ領域を含んでいてよい。リンカー領域は、種々のポリマーにより構成されていてよい。リンカーの長さは、基材に結合する分岐官能基の数、基材に対する結合の強さ、用いられるＲ基のタイプ、特に用いられる繰り返し単位のタイプ、およびポリマーの直鎖部分の頂点に結合させる保護基または標的ヌクレオチドのタイプ等の種々の要因より決定することができる。このように、リンカーは、特定のタイプのポリマーまたは特定の長さのものに限定されないことが理解される。
【００６３】
しかし、一般的な目安として、リンカーの長さは、約０．５nm〜約２０nm、好ましくは約０．５nm〜約１０nm、最も好ましくは約０．５nm〜約５nmであってよい。
【００６４】
リンカーの化学的構成としては、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、アミノアルキル、ポリアルキレングリコール等の直鎖または分岐鎖状有機残基が挙げられるがこれらに限定されない。リンカーは、さらに、あらゆる特定の構造に限定されない上述の官能基を含んでいてもよい。末端が官能性のリンカー基は、保護基を含んでいてもよい。
【００６５】
Ｘ−保護基
保護基の選択は、酸または塩基に対する反応性の望ましさ等の多くの因子に依存する。したがって、本発明は、官能基と他の化学種との反応を防ぐ機能を提供し、所望の特定の条件下で除去することができる限りにおいて、あらゆる特定の保護基に限定されない。市販されている保護基の一覧は、Sigma-Aldrich社のカタログ（２００３年）に記載されており、その内容が本発明の保護基に関連する場合には、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００６６】
ポリマーは、順次、または単一工程の操作のいずれによっても脱保護することができる。ポリペプチドの除去および脱保護は、基材に結合したポリペプチドを、例えば、チオアニソール、水、エタンジチオール、およびトリフルオロ酢酸等の解離剤により、一段階の操作で行うことができる。
【００６７】
一般に、本発明の一態様において、本発明で用いる保護基は、ペプチド鎖を延長するために、１種類または複数種類のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸を順次加える場合に用いられる保護基であってよい。
【００６８】
通常、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基は、適当な保護基によって保護されている。
【００６９】
特に好ましい方法において、アミノ基は、酸または塩基に対する反応性を有する基によって保護されている。このような保護基は、結合形成の条件に対して安定であるが、成長している分岐鎖／直鎖状ポリマーを破壊することなく容易に除去できるものである必要がある。このような好適な保護基としては、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、（ａ，ａ）−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニル等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７０】
また、特に好ましい保護基としては、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼンスルホニル、アダマンチルオキシカルボニル、ベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジル、イソプロピル、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、シクロヘキシル、シクロフェニル、およびアセチル（Ａｃ）、１−ブチル、ベンジルおよびテトラヒドロピラニル、ベンジル、ｐ−トルエンスルホニル、および２，４−ジニトロフェニルを挙げることもできる。
【００７１】
添加する方法において、分岐鎖／直鎖状ポリマーの分岐した末端は、適当な固体担体に結合している。上述の合成において有用である、適当な固体担体は、段階的な縮合−脱保護反応の試薬および反応条件に対して不活性であるとともに、用いられる溶媒に不溶である物質である。
【００７２】
分岐鎖／直鎖状ポリマーの直鎖末端からのＦｍｏｃ等の保護基の除去は、第２級アミン、好ましくはピペリジンを用いた処理により達成される。保護成分は３倍モル過剰量導入することができ、カップリングは、好ましくはＤＭＦ中で行われる。カップリング剤は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）および１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）であってよく、これらに限定されない。
【００７３】
ポリマーは、順次、または単一工程の操作のいずれによっても脱保護することができる。ポリペプチドの除去および脱保護は、基材に結合したポリペプチドを、例えば、シアニソール（ｔｈｉａｎｉｓｏｌｅ）、水、エタンジチオール、およびトリフルオロ酢酸等の解離剤により、一段階の操作で行うことができる。
【００７４】
基材は、共有結合またはイオン結合のいずれかを介して分岐鎖／直鎖状ポリマーが結合することができる任意の固体表面であってよい。基材は、分岐鎖／直鎖状ポリマーの分岐した末端との間で結合することができるように官能基化されていてよい。基材の表面は、当業者の要求に応じて種々の表面であってよい。好ましくは、基材はガラススライドであってよい。他の基材としては、ニトロセルロースまたはナイロン（登録商標）等であるがこれらに限定されないメンブレンフィルターが挙げられる。基材は親水性または極性であってよく、コーティングの前または後に負電荷または正電荷を有していてもよい。
【００７５】
デンドロンのタイプおよびその調製方法は、国際公開第２００５／０２６１９１号に具体的に開示されており、参照により本明細書に援用される。
【００７６】
反応スキーム１は、デンドロンの合成を示すスキームである。種々の出発物質、中間体化合物、およびデンドロン化合物を用いることができ、式中、「Ｘ」は、アントラセンメチル（Ａ）、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｎｓ等の任意の保護基であってよい。
反応スキーム１
【化２】
2009505057.tif 000004
【００７７】
分岐の末端に表面反応性官能基を有する第２世代の分岐デンドロンを用いることができ、自己集合し、これら自身の間に適当な間隔をもたらす。これまでの研究より、ガラス基材上の陽イオンと、デンドロンの末端のアニオン性のカルボン酸との間の多点イオン性引力により、良好な挙動を示す単分子膜が生成し、２４Å以上のリガンド間隔が保証されることが示された（Hongら、Langmuir 19,2357-2365 （2003））。脱保護を促進し、脱保護された頂点のアミンの反応性を増加させるために、構造を改変した。また、デンドロンのカルボン酸基と、表面のヒドロキシル基との間の共有結合の形成も、イオン性の引力と同様に効果的であるとともに、熱安定性の増加をもたらす。さらに、オリゴエーテルの中間層が、非特異的なオリゴヌクレオチドの結合を抑制する上で効果的であった。
【００７８】
ヒドロキシル化された表面は、以前報告された方法を用いて調製された（Maskisら、Nucleic Acids Res. 20,1679-1684 （1992））。酸化シリコンウェーハ、溶融シリカ、およびガラススライド等の基材は、（３−グリシドキシプロピル）メチルジエトキシシラン（ＧＰＤＥＳ）およびエチレングリコール（ＥＧ）により修飾された。４−ジメチルアミノピリジンの存在下で、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）または１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いた、デンドロンのカルボン酸と基材のヒドロキシル基とのカップリング反応により、デンドロンを上述の基材に導入した（Bodenら、J. Org. Chem. 50, 2394-2395 （1985）、Dhaonら、J. Org. Chem. 47,1962-1965 （1982））。デンドロンの導入後の厚さの増加は、１１±２Åであり、イオン結合について以前測定された値と同程度であった（Hongら、Langmuir 19,2357-2365 （2003））。
【００７９】
すでに確立した方法（Beierら、Nucleic Acids Res. 27, 1970-1977 （1999））により、炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（ＤＳＣ）で修飾した後、クラス１０，０００のクリーンルーム中で、Microsys 5100 Microarrayer （Cartesian Technologies, Inc.）を用いて、適当なアミン連結オリゴヌクレオチド（２０μM）の５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（１０%ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ｐＨ８．５）をスポットすることにより、ガラススライドの活性化された表面上にプローブオリゴヌクレオチドを固定化した。通常、反応性のアミン表面基を有する基材については、チオール連結オリゴヌクレオチドおよび４−マレイミド酪酸スクシンイミジル（ＳＭＢ）またはシクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）（ＳＳＭＣＣ）等のヘテロ二官能性リンカーが用いられる（Ohら、Langmuir 18,1764-1769 （2002）、Frutosら、Langmuir 16,2192-2197 （2000））。対照的に、デンドロンで修飾された表面においては、アミン官能基同士が所定の距離をとることが保証されているため、ＤＳＣ等のホモ二官能性リンカーを用いても問題が生じない。そのため、アミン連結オリゴヌクレオチドをスポッティングに用いることができる。チオール連結オリゴヌクレオチドは、ある条件下では有用であるかもしれないが、コスト効率が重要でないならば、容易に酸化されるチオール連結オリゴヌクレオチドの使用は避けるべきである。
【００８０】
相補的なＤＮＡ鎖間の認識効率を単分子レベルで向上させるために、ＤＮＡオリゴマーを、ナノスケールで制御されたデンドロンの表面に固定化した。デンドロン中に存在するメゾ空間により、固定化されたＤＮＡは立体障害を受けないため、表面は、効率を向上させる上で理想的であると思われた（B. J. Hong, S. J. Oh, T. O. Youn, S. H. Kwon, J. W. Park, Langmuir 21, 4257, 2005）。下部層を形成するために、グリシジルプロピルジエトキシメチルシラン（ＧＰＤＥＳ）またはＮ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＴＰＵ）のいずれかを用い、デンドロン（９−アンスリルメチルＮ−（｛［トリス（｛２−［（｛トリス［（２−カルボエトキシ）メチル］メチル｝アミノ）カルボニル］エトキシ｝メチル）メチル］アミノ｝カルボニル）プロピルカルバメート）（または、９−酸）を、その上に固定化した。これまでに測定された、ＧＰＤＥＳで修飾された表面上のデンドロン間のメゾ空間は、平均３２Åであった（B. J. Hong, S. J. Oh, T. O. Youn, S. H. Kwon, J. W. Park, Langmuir 21, 4257, 2005）。ＴＰＵの場合、元のデンドロンのアントラセン残基に由来する、２５７nmに観測される吸収ピークは、ＧＰＤＥＳの場合の約１／２であった。したがって、ＴＰＵの場合において、デンドロン間の間隔が３２Åよりも大きいことが示唆される。アントラセン保護基の脱保護後、アミン官能基を炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）で活性化すると、最終的にはアミン連結オリゴヌクレオチドが固定化された。
【００８１】
間隔の効果を理解するために、基材について２種類の修飾を用いたが、ＡＦＭチップ上の間隔については、９−酸／ＴＰＵの使用により固定した。バネ定数の推定値は、通常１０〜２０%の誤差を与えると信じられたため、力は、同一のチップ（図３）を用いて種々の条件下で測定した。例えば、９−酸／ＧＰＤＥＳ基材上に固定化された相補的な３０塩基ＤＮＡ（表１）について、１１０nm/s〜５４０nm/sの種々の負荷速度において、力曲線が得られた。完全にマッチングしたオリゴマー配列および内部にミスマッチを含むオリゴマー配列を表１に示し、下線が付された部分がミスマッチ部位である。
【００８２】
【表１】
2009505057.tif 000005
【００８３】
デンドロンによって制御されたメゾ空間を有する固体基材は、単分子間の均一な間隔を保持しており、そのため、研究用途を、薬剤のスクリーニング、タンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質−低分子相互作用の検討へ効果的に拡大する。バイオＡＦＭは、分子へのダメージを最低限にとどめつつ、高精度の測定を可能にする。
【００８４】
本発明では、調節されたメゾ空間構造を有する固体基材デンドロンの表面に固定された生体分子の均一な間隔を保持している。望ましくない立体障害は最低限に抑えられ、単分子間の相互作用を観測するために理想的な環境が提供される。生体分子という用語には、タンパク質、抗原、抗体、シグナル伝達タンパク質、ペプチド、内在性膜タンパク質、低分子、ステロイド、グルコース、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が含まれる。
【００８５】
具体的には、実施例８および９、図１１〜１５により、本発明が、特異的に結合するＰＬＤ１−ＰＸとＭｕｎｃ−１８−１との間に均一な力が生じることを示した。本発明は、バイオＡＦＭを用いて相互作用力を測定することにより薬剤のスクリーニングに応用することができる。環境の変化による生体分子間の相互作用力の変化を観測することにより、生物学的組成の変化により発症すると言われている広範な疾患について因果関係をより明確にすることができる。さらに、本発明のデンドロンは、ビオチン分子の間隔を調節することにより、単一のビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用力の測定を可能にする。
【００８６】
本発明に用いることができるデンドロンのタイプについては、米国特許出願第１０／９１７，６０１号および国際公開第２００５／０２６１９１号に詳細に示しており、これらの内容は、参照によりその全文が本明細書に援用される。
【００８７】
以下の実施例に示すように、本発明では、メゾ空間を制御することができるデンドロンを用いてリガンドをＡＦＭチップ上に固定することにより、リガンド分子間の十分な間隔を確保している。これにより、望ましくない立体障害およびリガンドと受容体との間の立体相互作用を最小限にし、結合のための理想的な環境を提供する。このような環境により、多分子間結合が最小限に抑えられるため、リガンド−受容体相互作用を単分子レベルで精密に観測することが可能になる。
【００８８】
（細胞表面の受容体と特異的な結合を形成する）特異的なリガンドを結合させたＡＦＭチップを導入する際に、制御されたメゾ空間構造を有する表面を用いることにより、本発明では、リガンド間の均一な間隔が保持され、受容体の分布の正確なマッピングが可能になる。しかし、メゾ空間が調節されていないＡＦＭチップを用いる場合、リガンドの分布が不均一になり、受容体との多分子間結合がマッピングの精度を低下させる。したがって、本発明は、リガンド−受容体相互作用の研究における広範な用途を示す。
【００８９】
細胞受容体としては、低分子、ペプチド、タンパク質、ステロイドホルモン受容体、炭水化物、脂質、膜タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、レクチン、ニューロトロフィン受容体、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。細胞表面に存在し、ＡＦＭチップ上に固定されたリガンドと相互作用することができる任意の物質を、受容体として用いることができる。
【００９０】
さらに、ＡＦＭチップ上に固定されるリガンドのタイプとしては、低分子、ペプチド、タンパク質、ステロイド、炭水化物、脂質、膜タンパク質、ニューロトロフィン、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび錯体化合物が挙げられるがこれらに限定されない。換言すると、ＡＦＭチップ上に結合させることができ、受容体との相互作用を観測可能である任意の物質を、リガンドとして用いることができる。
【００９１】
本発明の実施例１１〜１５および図１６〜１８において、ペプチド−タンパク質相互作用、炭水化物−糖脂質相互作用、レクチン−糖タンパク質相互作用、炭水化物−糖タンパク質相互作用、およびニューロトロフィン−ニューロトロフィン受容体相互作用を検討した。
【００９２】
以下の実施例を参照しながら、本発明をさらに説明する。しかし、これらの実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【００９３】
調製例
実施例全体において、化合物１、化合物２、I、II、III、IV、V等の番号体系を用いる。しかし、化合物の番号体系は、それらが列挙された特定の実施例に一致し、かつ限定されることは理解されるべきである。例えば、実施例２に示された化合物１は、実施例３における化合物１と必ずしも同一である必要はない。
【実施例１】
【００９４】
実施例１−サイズが制御された高分子を用いたマイクロアレイの製造方法
実施例１において、記号I、II、III、IV、およびVは、図２に示すような種々の化合物および中間体を指す。
【００９５】
実施例１．１−材料
シランカップリング剤である、（３−グリシドキシプロピル）メチルジエトキシシラン（ＧＰＤＥＳ）、および（３−アミノプロピル）ジエトキシメチルシラン（ＡＰＤＥＳ）は、Gelest社より購入し、他の化合物は全て、Sigma-Aldrich社の試薬用グレードのものであった。基材用の洗浄溶媒は、Mallinckrodt Laboratory Chemicals社製のＨＰＬＣグレードのものである。ＵＶ用グレードの溶融シリカ板（３０mm×１０mm×１．５mm）は、CVI Laser Corporationより購入した。研磨したＳｉ（１００）プライムウェーハ（ドーパント：リン、抵抗：１．５〜２．１Ω・cm）は、MEMC Electronic Materials, Incより購入した。ガラススライド（２．５×７．５cm）は、Corning Coより購入した。全てのオリゴヌクレオチドは、Metabionより購入した。超純水（１８MΩ/cm）を、Milli-Q purification system （Millipore）より得た。
【００９６】
実施例１．２−器具
膜厚は、分光エリプソメーター（J. A. Woollam Co. Model M-44）を用いて測定した。紫外可視スペクトルは、Hewlett-Packardダイオードアレイ８４５３分光光度計を用いて記録した。タッピングモードＡＦＭ実験は、「Ｅ」型スキャナを備えたNanoscope IIIa AFM （Digital Instruments）を用いて行った。
【００９７】
実施例１．３−基材の洗浄
酸化シリコンウェーハ、溶融シリカ、およびガラススライド等の基材を、ピラニア溶液（濃Ｈ２ＳＯ４：３０%Ｈ２Ｏ２＝７：３（ｖ／ｖ））に浸漬し、溶液および基材を含む反応ビンを、１時間超音波照射した（注意：ピラニア溶液は、有機物を爆発的に酸化する場合がある。酸化性物質との接触を避けること）。超音波照射後、基材を大量の脱イオン水でよく洗浄およびすすぎ洗いした。洗浄した基材を、次の工程のために減圧室（３０〜４０mTorr）中で乾燥した。
【００９８】
実施例１．４−ヒドロキシル化された基材の調製
上述の洗浄した基材を、１．０mlの（３−グリシドキシプロピル）メチルジエトキシシラン（ＧＰＤＥＳ）を含む１６０mlのトルエン溶液中に１０時間浸漬した。自己組織化させた後、基材をトルエンで短時間洗浄し、オーブン中に入れ、１１０℃で３０分間加熱した。プレートをトルエン、トルエン−メタノール（１：１（ｖ／ｖ））、およびメタノール中で、それぞれの洗浄工程ごとに３分間ずつ、順次超音波照射した。洗浄したプレートを、減圧室（３０〜４０mTorr）中で乾燥した。ＧＰＤＥＳで修飾された基材を、２〜３滴の９５%硫酸を含むエチレングリコール（ＥＧ）溶液中に、８０〜１００℃で８時間浸漬した。冷却後、基材を、メタノールおよびエタノール中で、それぞれ３分間ずつ順次超音波照射した。洗浄したプレートを、減圧室（３０〜４０mTorr）中で乾燥した。
【００９９】
実施例１．５−デンドロンで修飾された基材の調製
上述のヒドロキシル化された基材を、４−ジメチルアミノピリジン  （ＤＭＡＰ）  （０．８２mM）の存在下、デンドロン（１．２mM）およびカップリング剤、１−［−３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）またはｌ，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１１mM）を溶解した塩化メチレン溶液中に浸漬した。室温で３日後、プレートを、メタノール、水、およびメタノール中で、３分間ずつ順次超音波照射した。洗浄したプレートを、次の工程のために減圧室（３０〜４０mTorr）中で乾燥した。
【０１００】
実施例１．６−ＮＨＳで修飾された基材の調製
デンドロンで修飾された基材を、１．０Mトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の塩化メチレン溶液中に浸漬した。３時間後、２０%（ｖ／ｖ）ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の塩化メチレン溶液に１０分間浸漬した。プレートを、塩化メチレンおよびメタノール中で、それぞれ３分間ずつ順次超音波照射した。減圧室中で乾燥後、脱保護された基材を、炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（ＤＳＣ）（２５mM）およびＤＩＰＥＡ（１．０mM）のアセトニトリル溶液中でインキュベートした。窒素雰囲気下で４時間反応後、プレートをジメチルホルムアミド溶液中に撹拌しながら３０分間入れ、メタノールで短時間洗浄した。洗浄したプレートを、次の工程のために減圧室（３０〜４０mTorr）中で乾燥した。
【０１０１】
実施例１．７−ＮＨＳで修飾された基材上へのオリゴヌクレオチドアレイの形成
５０mM  ＮａＨＣＯ３緩衝溶液（ｐＨ８．５）に溶解したプローブオリゴヌクレオチドを、ＮＨＳで修飾された基材上に、横４列×縦４列に並べてスポットした。アミン連結ＤＮＡの反応時間を十分確保するために、マイクロアレイを、高湿度（湿度８０%）のチャンバー中で１２時間インキュベートした。非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去するために、スライドを、ハイブリダイゼーション用緩衝溶液（７．０mMドデシル硫酸ナトリウムを含む２×ＳＳＰＥ緩衝溶液（ｐＨ７．４））中、３７℃で１時間、沸騰水中で５分間撹拌した。最後に、ＤＮＡにより官能性のマイクロアレイを、次の工程のために窒素気流下で乾燥した。偏りのない比較のために、１枚のプレート上に複数種類のプローブをスポットした。
【０１０２】
実施例１．８−ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、Ｃｙ３蛍光色素で標識化した標的オリゴヌクレオチド（１．０nM）を含むハイブリダイゼーション緩衝溶液中、GeneTAC（商標） HybStation（Genomic Solutions, Inc.）を用いて５０℃で１時間行った。過剰な標的オリゴヌクレオチドを除去するために、マイクロアレイをハイブリダイゼーション緩衝溶液で洗浄し、窒素で乾燥した。ScanArray Lite（GSI Lumonics）を用いて、それぞれのスポット上の蛍光シグナルを測定し、Imagene 4.0（Biodiscovery）により解析した。
【０１０３】
実施例１．９−デンドロンの合成
実施例１．９．１‐炭酸９−アンスリルメチルＮ−（３−カルボキシルプロピル）カルバメート（I）−化合物Iの調製
４−アミノ酪酸（０．５０g、４．８mmol、１．０当量）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）（１．０ml、７．３mmol、１．５当量）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、５０℃で撹拌した。炭酸９−アンスリルメチルｐ−ニトロフェニル（１．８１g、４．８mmol、１．０当量）を、撹拌しながらゆっくり加えた。５０℃で２時間撹拌後、溶液を蒸発乾固し、０．５０N水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を用いて溶液を塩基性にした。水溶液を酢酸エチル（ＥＡ）で洗浄し、氷浴中で撹拌後、希塩酸（ＨＣｌ）で酸性にした。生成物をＥＡで抽出後、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過後濃縮した。得た黄色粉末の全重量は１．０６gであり、収率は６５%であった。
【０１０４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ  １１．００−９．００（ｂｒ，ＣＨ２ＣＯＯＨ，１Ｈ），８．４１（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，１Ｈ），８．３１（ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．９７（ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．５１（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．４６（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），６．０８（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２Ｏ，２Ｈ），５．０１（ｔ，ＯＣＯＮＨＣＨ２，１Ｈ），３．２３（ｑ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ），２．３４（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ，２Ｈ），１．７７（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ）。
【０１０５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ  １７８．５（ＣＨ２ＣＯＯＨ），１５７．９（ＯＣＯＮＨ），１３２．１（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１３１．７（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２９．７（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２９．７（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２７．３（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２６．８（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２５．８（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２４．６（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），６０．２（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），４１．０（ＮＨＣＨ２ＣＨ２），３１．７（ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ），２５．６（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）。
【０１０６】
実施例１．９．２‐９−アンスリルメチルＮ−｛［（トリス｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチル）アミノ］カルボニル｝プロピルカルバメート（II）−化合物IIの調製
９−アンスリルメチルＮ−（３−カルボキシルプロピル）カルバメート（０．６５g、１．９３mmol、１．５当量）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（０．３７g、１．９３mmol、１．５当量）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）（０．２６１g、１．９３mmol、１．５当量）をアセトニトリルに溶解し、室温で撹拌した。トリス｛［（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝アミノメタン（０．４９g、１．２９mmol、１．０当量）をアセトニトリルに溶解し、撹拌しながら加えた。室温で１２時間撹拌後、アセトニトリルを留去した。粗生成物をＥＡに溶解し、１．０N塩酸および飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過、濃縮後、シリカゲルを充填したカラムに粗生成物を吸着させた。カラムクロマトグラフィーによる精製（溶出液：酢酸エチル：ヘキサン＝５：１（ｖ／ｖ））により、粘稠な黄色油状物を得た。黄色液体の全重量は０．６７ｇで、収率は７４%であった。
【０１０７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ  ８．４３（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，１Ｈ），８．３６（ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．９９  （ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．５３（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．４７（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），６．１５（ｓ，ＣＯＮＨＣ，１Ｈ），６．０８（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２Ｏ，２Ｈ），５．４４（ｔ，ＯＣＯＮＨＣＨ２，１Ｈ），３．６３−３．５５（ｍ，ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３，２１Ｈ），３．２７（ｑ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ），２．４６（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３，６Ｈ），２．４６（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ，２Ｈ），１．８１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ）。
【０１０８】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ  １７３．２（ＣＨ２ＣＯＮＨ），１７２．７（ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３），１５７．４（ＯＣＯＮＨ），１３２．９（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１３１．５（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２９．５（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２９．４（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２７．５（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２７．０（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２５．６（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２４．７（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），６９．６（ＮＨＣＣＨ２Ｏ），６７．２（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），６０．１（ＯＣＨ２ＣＨ２），５９．４（ＮＨＣＣＨ２），５２．１（ＯＣＨ３），４０．８（ＮＨＣＨ２ＣＨ２），３５．１（ＯＣＨ２ＣＨ２），３４．７（ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），２６．３（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）。
【０１０９】
元素分析  Ｃ３６Ｈ４６Ｎ２Ｏ１２・０．５Ｈ２Ｏに対する計算値：Ｃ  ６１．１８、Ｈ  ６．６５、Ｎ  ４．０３；測定値：Ｃ  ６１．０９、Ｈ  ６．６９、Ｎ  ３．９６
【０１１０】
実施例１．９．３‐９−アンスリルメチルＮ−［（｛トリス［（２−カルボキシエトキシ）メチル］メチル｝アミノ）カルボニル］プロピルカルバメート（ＩＩＩ）−化合物ＩＩＩの調製
炭酸９−アンスリルメチルＮ−｛［（トリス｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチル）アミノ］カルボニル｝プロピル（０．６７g、０．９３mmol）を、アセトン（３０ml）および０．２０N  ＮａＯＨ（３０ml、６mmol）に溶解した。室温で１日撹拌した後、アセトンを留去した。水溶液をＥＡで洗浄し、氷浴中で撹拌後、希ＨＣｌで酸性にした。生成物をＥＡで抽出後、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過後濃縮した。アセトンおよびエーテル溶液中、−２０℃で固化させ、黄色粉末を得た。最終的な黄白色固体の全重量は０．５４gで、収率は８８%であった。
【０１１１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ  １１．００−９．００（ｂｒ，ＣＨ２ＣＯＯＨ，３Ｈ），８．６１（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，１Ｈ），８．４７（ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），８．１１（ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．６０（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．５２（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），６．６３（ｓ，ＣＯＮＨＣ，１Ｈ），６．３６（ｔ，ＯＣＯＮＨＣＨ２，１Ｈ），６．１２（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２Ｏ，２Ｈ），３．４０−３６３（ｍ，ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ，１２Ｈ），３．２０（ｑ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ），２．５２（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ，６Ｈ），２．１７（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ，２Ｈ），１．７５（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ）。
【０１１２】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ  １７２．２（ＣＨ２ＣＯＯＨ），１７２．０（ＣＨ２ＣＯＮＨ），１５６．７（ＯＣＯＮＨ），１３１．２（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１３０．７（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２８．６（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２８．４（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２７．３（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２６．２（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２４．８（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２４．０（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），６８．６（ＮＨＣＣＨ２Ｏ），６６．５（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），５９．５（ＯＣＨ２ＣＨ２），５８．０（ＮＨＣＣＨ２），４０．０（ＮＨＣＨ２ＣＨ２），３４．０（ＯＣＨ２ＣＨ２），３３．５（ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），２５．８（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）。
【０１１３】
元素分析  Ｃ３３Ｈ４０Ｎ２Ｏ１２・１．５Ｈ２Ｏに対する計算値：Ｃ  ５７．９７、Ｈ  ６．３４、Ｎ  ４．１０；測定値：Ｃ  ５７．８９、Ｈ  ６．２１、Ｎ  ４．０９．
【０１１４】
実施例１．９．４‐９−アンスリルメチルＮ−［（｛トリス［（２−｛［（トリス｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝（メチル）アミノ］カルボニル｝エトキシ）メチル］メチル｝アミノ）カルボニル］プロピルカルバメート（IV）−化合物IVの調製
９−アンスリルメチルＮ−［（｛トリス［（２−カルボキシエトキシ）メチル］メチル｝アミノ）カルボニル］プロピルカルバメート（０．５４g、０．８２mmol、１．０当量）、ＥＤＣ（０．５５g、２．８７mmol、３．５当量）、およびＨＯＢＴ（０．３９g、２．８９mmol、３．５当量）をアセトニトリルに溶解し、室温で１日撹拌した。トリス｛［（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝アミノメタン（０．９６g、２．５３mmol、３．１当量）をアセトニトリルに溶解し、撹拌しながら加えた。室温で３６時間撹拌後、アセトニトリルを留去した。粗生成物をＥＡに溶解し、１．０N  ＨＣｌおよび飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４上で乾燥後、ろ過、濃縮し、シリカゲルを充填したカラムに粗生成物を吸着させた。カラムクロマトグラフィーによる精製（溶出液：酢酸エチル：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ））により、粘稠な黄色液体を得た。黄色液体の全重量は１．２６ｇで、収率は８８%であった。
【０１１５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ  ８．４７（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，１Ｈ），８．３９（ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），８．０２  （ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．５３（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．４７（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），６．６０（ｓ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣ，１Ｈ），６．１３（ｓ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣ，３Ｈ），６．１１（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２Ｏ，２Ｈ），５．７９（ｔ，ＯＣＯＮＨＣＨ２，１Ｈ），３．６５−３．６０（ｍ，ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ，ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３，７５Ｈ），３．２９（ｑ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ），２．５０（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３，１８Ｈ），２．３６（ｔ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ，６Ｈ），２．２７（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ，２Ｈ），１．８５（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ）。
【０１１６】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ  １７３．３（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），１７２．５（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），１７１．６（ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３），１５７．２（ＯＣＯＮＨ），１３１．８（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１３１．５（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２９．４（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２９．３（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２７．６（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２７．０（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２５．６（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２４．７（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），６９．５（ＮＨＣＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３），６７．９（ＮＨＣＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），６７．２（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），６０．３（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），６０．２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３），５９．２（ＮＨＣＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３，ＮＨＣＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），５２．１（ＯＣＨ３），４１．０（ＮＨＣＨ２ＣＨ２），３７．６（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），３５．１（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３），３４．７（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），２６．３（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）。
【０１１７】
元素分析  Ｃ８１Ｈ１２１Ｎ５Ｏ３６・Ｈ２Ｏに対する計算値：Ｃ  ５５．３１、Ｈ  ７．０５、Ｎ  ３．９８；測定値：Ｃ  ５５．０５、Ｈ  ７．０８、Ｎ  ４．０４．
【０１１８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：１７６３．２（ＭＮａ＋），１７７９．２（ＭＫ＋）．
【０１１９】
実施例１．９．５‐９−アンスリルメチルＮ−（｛［トリス（｛２−［（｛トリス［（２−カルボキシエトキシ）メチル］メチル｝アミノ）カルボニル］エトキシ｝メチル）メチル］アミノ｝カルボニル）プロピルカルバメート（V）−化合物Vの調製
９−アンスリルメチルＮ−[（{トリス[（２−{[（トリス{[2-（メトキシカルボニル）エトキシ]メチル}メチル）アミノ]カルボニル } エトキシ）メチル]メチル}アミノ）カルボニル]プロピルカルバメート（０．６０g、０．３４mmol）を、アセトン（３０ml）および０．２０N  ＮａＯＨ（３０ml）に溶解した。室温で１日撹拌した後、アセトンを留去した。水溶液をＥＡで洗浄し、氷浴中で撹拌後、希ＨＣｌで酸性にした。生成物をＥＡで抽出後、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過後濃縮した。最終的な黄白色固体の全重量は０．３７gで、収率は６８%であった。
【０１２０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）
δ  １３．００−１１．００（ｂｒ，ＣＨ２ＣＯＯＨ，９Ｈ），８．６６（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，１Ｈ），８．４２（ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），８．１３（ｄ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．６２（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．５４（ｔ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２，２Ｈ），７．１２（ｔ，ＯＣＯＮＨＣＨ２，１Ｈ），７．１０（ｓ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣ，３Ｈ），７．０６（ｓ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣ，１Ｈ），６．０６（ｓ，Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２Ｏ，２Ｈ），３．５７−３．５５（ｍ，ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ，ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ，４８Ｈ），３．０２（ｑ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ），２．４２（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ，１８Ｈ），２．３２（ｔ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ，６Ｈ），２．１１（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ，２Ｈ），１．６０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，２Ｈ）。
【０１２１】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）
δ  １７２．８（ＣＨ２ＣＯＯＨ），１７２．２（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），１７０．５（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），１５６．５（ＯＣＯＮＨ），１３１．０（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１３０．６（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２９．０（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２８．７（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２７．６（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２６．７（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２５．４（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），１２４．３（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），６８．３（ＮＨＣＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ），６７．４（ＮＨＣＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），６６．８（Ｃ１４Ｈ９ＣＨ２），５９．８（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ），５９．６（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），５７．９（ＮＨＣＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），５５．９（ＮＨＣＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ），３６．４（ＮＨＣＨ２ＣＨ２），３４．６（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ），３０．８（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），２９．７（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），２５．９（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）。
【実施例２】
【０１２２】
調製実施例２−デンドロン高分子の出発物質−Ｆｍｏｃ−スペーサ−［９］酸の他の調製方法
実施例２において示される種々の化合物は、化合物１、２等と呼ばれる。
【０１２３】
まず、スペーサである６−アジドヘキシルアミン（１）を、Lee, J. W.; Jun, S. I.; Kim, K. Tetrahedron Lett, 2001, 42, 2709にしたがい、１，６−ジブロモヘキサンより合成した。
【化３】
2009505057.tif 000006
【０１２４】
このスペーサは、非対称な尿素の形成により、繰り返し単位（２）に結合し、Ｎ３−スペーサ−［３］エステル（３）を形成した。繰り返し単位は、Cardona, C M.; Gawley, R. E. J. Org. Chem. 2002, 67, 141において報告された、ＴＲＩＳとアクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルとの縮合により合成した。
【化４】
2009505057.tif 000007
【０１２５】
このトリエステルを、加水分解により、Ｎ３−スペーサ−［３］酸（４）に変換し、ペプチドカップリングの条件下でのトリエステル（２）とカップリングして、Ｎ３−スペーサ−［９］エステルを形成した。アジドを還元してアミンとし、アミンをＦｍｏｃ基で保護した後、ノナエステルを加水分解して、Ｆｍｏｃ−スペーサ−［９］酸（５）を得た。
【化５】
2009505057.tif 000008
【０１２６】
Ｎ−（６−アジドヘキシル）−Ｎ'−トリス｛［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝−メチル尿素（３）
トリホスゲン（１．３g、４．３mmol）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ml）に溶解した。６−アジドヘキシルアミン（１）（１．６g、１２mmol）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２．４ml、１３．８mmol）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（３５ml）に溶解した混合物を、撹拌したトリホスゲンの溶液に、シリンジポンプを用い、７時間かけて滴下した。さらに２時間撹拌後、（２）（６．４g、１３mmol）およびＤＩＥＡ（２．７ml、１５．２mmol）の無水ＣＨ２Ｃｌ２溶液（２０ml）を加えた。反応混合物を、窒素下、室温で４時間撹拌後、０．５M  ＨＣｌおよび鹹水で洗浄した。次いで、有機層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、溶媒を減圧下除去した。カラムクロマトグラフィー（シリカ、１：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製し、無色油状物を得た（３．０g、４０%）。
【０１２７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００MHz）：δ  １．４５（ｓ，（ＣＨ３）３Ｃ，２７Ｈ）；１．３６−１．５８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，８Ｈ）；２．４６（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ），３．１３（ｍ，ＣＯＮＨＣＨ２，２Ｈ），３．２６（ｔ，Ｎ３ＣＨ２，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．６４−３．７６（ｍ，ＣＣＨ２ＯおよびＣＨ２ＣＨ２Ｏ，１２Ｈ）；５．００（ｔ，ＣＨ２ＮＨＣＯ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），５．２９（ｓ，ＣＯＮＨＣ，１Ｈ）．
【０１２８】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５MHz）：δ  ２６．５２，２６．５４，２８．８１，３０．２６（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）；２８．１４（（ＣＨ３）３Ｃ）；３６．２０（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）；３９．８６（ＣＯＮＨＣＨ２）；５１．４０（Ｎ３ＣＨ２）；５８．８１（ＣＣＨ２Ｏ）；６７．１６（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）；６９．２３（ＣＣＨ２Ｏ）；８０．５８（（ＣＨ３）３Ｃ；１５７．９６（ＮＨＣＯＮＨ）；１７１．２６（ＣＯＯｔ−Ｂｕ）．
【０１２９】
ＦＡＢ−ＭＳ：６７４．２６（Ｍ＋）
【０１３０】
Ｎ−（６−アジドヘキシル）−Ｎ'−トリス｛［２−カルボキシエトキシ］メチル｝メチル尿素（４）
Ｎ３−スペーサ−［３］エステル（３）（０．３６g、０．５６mmol）を６．６ｍＬの９６%ギ酸中で２４時間撹拌した。ギ酸を減圧下５０℃で除去し、無色油状物を定量的に得た。
【０１３１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＯＣＤ３，３００MHz）：δ  １．３４−１．６０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，８Ｈ）；２．５３（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ），３．０７（ｔ，ＣＯＮＨＣＨ２，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．３２（ｔ，Ｎ３ＣＨ２，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．６７−３．７３（ｍ，ＣＣＨ２ＯおよびＣＨ２ＣＨ２Ｏ，１２Ｈ）。
【０１３２】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＯＣＤ３，７５MHz）：δ  ２７．２１，２９．５４，３１．０２  （ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）；３５．４２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）；４０．２７（ＣＯＮＨＣＨ２）；５２．００（Ｎ３ＣＨ２）；５９．７４（ＣＣＨ２Ｏ）；６７．８５（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）；７０．９６（ＣＣＨ２Ｏ）；１５８．９６（ＮＨＣＯＮＨ）；１７３．４２（ＣＯＯＨ）。
【０１３３】
ＦＡＢ−ＭＳ：５０６．１９（ＭＨ＋）
【０１３４】
Ｎ−（６−アジドヘキシル）−Ｎ'−トリス［（２−｛［（トリス｛［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ］−メチル｝メチル）アミノ］カルボニル｝エトキシ）メチル］メチル尿素（４．１）
ＨＯＢｔ（０．２０g、１．５mmol）、ＤＩＥＡ（０．３０ml、１．８mmol）、およびＥＤＣ（０．３３g、１．８mmol）を、（４）（０．２５g、０．５０mmol）の、５．０ml乾燥アセトニトリル溶液に加えた。次いで、２．５mlの乾燥アセトニトリルに溶解したアミン（２）（１．１４g、２．３mmol）を加え、反応混合物を、Ｎ２下で４８時間撹拌した。溶媒を減圧下除去後、残渣をＭＣに溶解し、０．５M  ＨＣｌおよび鹹水で洗浄した。次いで、有機層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥後、溶媒を減圧下除去し、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、無色油状物を得た（０．６７g、７０%）。
【０１３５】
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，３００MHz）：δ  １．４５（ｓ，（ＣＨ３）３Ｃ，８１Ｈ）；１．３６−１．５８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，８Ｈ）；２．４０−２．４７（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１および第２世代，２４Ｈ），３．１３（ｍ，ＣＯＮＨＣＨ２，２Ｈ），３．２６（ｔ，Ｎ３ＣＨ２，６．９  Ｈｚ，２Ｈ），３．６２−３．６９（ｍ，ＣＣＨ２Ｏ  第１および第２世代，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１および第２世代，４８Ｈ）；５．３６（ｔ，ＣＨ２ＮＨＣＯ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｂｒ，ＣＯＮＨＣ，１Ｈ），６．２８（ｂｒ，アミドＮＨ，３Ｈ）。
【０１３６】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５MHz）：δ  ２６．５９，２６．６９，２８．９１，３０．５４（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）；２８．２２（（ＣＨ３）３Ｃ）；３６．２０（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第２世代）；３７．４３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１世代）；３９．８１（ＣＯＮＨＣＨ２）；５１．４７（Ｎ３ＣＨ２）；５８．９３（ＣＣＨ２Ｏ  第１世代）；５９．８９（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第２世代）；６７．１５（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第２世代）；６７．６８（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１世代）；６９．２３（ＣＣＨ２Ｏ  第２世代）；７０．１２（ＣＣＨ２Ｏ  第１世代）；８０．５７（（ＣＨ３）３Ｃ）；１５８．２５（ＮＨＣＯＮＨ）；１７１．０１（ＣＯＯｔ−Ｂｕ）；１７１．４１（ＣＯＮＨアミド）。
【０１３７】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：１９８９．８（ＭＮａ＋）、２００５．８（ＭＫ＋）
【０１３８】
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ'−トリス［（２−｛［（トリス｛［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ］−メチル｝メチル）アミノ］カルボニル｝エトキシ）メチル］メチル尿素（４．２）
ノナ−ｔｅｒｔ−エステル（４．１）（０．３７g、０．２０mmol）を、１０%Ｐｄ／Ｃ（３７．０mg）とともに、Ｈ２雰囲気下、エタノール（２０．０ml）中で１２時間撹拌した。ＴＬＣにより、反応が完結したことをチェックした後、０．２μmのMilliporeフィルターで混合物をろ過した。ろ紙をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄後、ひとまとめにした溶媒を減圧下除去し、無色油状物を回収した。
【０１３９】
Ｎ−｛６−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノヘキシル｝−Ｎ'−トリス［（２−｛［（トリス｛［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチル）アミノ］カルボニル｝エトキシ）メチル］メチル尿素（４．３）
アミン（４．２）（０．３３g、０．１７mmol）およびＤＩＥＡ（３３μL、０．１９mmol）を５．０mlのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。クロロギ酸９−フルオレニルメチル（４８mg、０．１９mmol）の２．０mlのＣＨ２Ｃｌ２溶液を加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧下除去し、０．５M  ＨＣｌおよび鹹水で洗浄した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ）で精製し、無色油状物を得た（０．１８g、６４%）。
【０１４０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００MHz）：δ  １．４５（ｓ，（ＣＨ３）３Ｃ，８１Ｈ）；１．２３−１．５８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，８Ｈ）；２．３７−２．４７  （ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１および第２世代，２４Ｈ）；３．１０−３．２２（ｍ，ＣＯＮＨＣＨ２，４Ｈ）；３．６２−３．７０（ｍ，ＣＣＨ２Ｏ  第１および第２世代，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１および第２世代，４８Ｈ）；４．２２（ｔ，ＣＨ（フルオレニル）−ＣＨ２，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ）；４．３６（ｄ，フルオレニル−ＣＨ２，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）；５．２７−５．３５（ｍ，ＣＨ２ＮＨＣＯ，２Ｈ）；５．６７（ｂｒ，ＣＯＮＨＣ，１Ｈ）；６．２５（ｂｒ，アミド，３Ｈ）；７．２８−７．７７（フルオレニル，８Ｈ）。
【０１４１】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５MHz）：δ  ２６．８５，２７．０２，３０．２７，３０．８８（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）；２８．４９（（ＣＨ３）３Ｃ）；３６．４８（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第２世代）；３７．７３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１世代）；４０．０３，４１．３４（ＣＯＮＨＣＨ２）；４７．６８（ＣＨ（フルオレニル）−ＣＨ２）；５９．２２（ＣＣＨ２Ｏ  第１世代）；６０．１６（ＣＣＨ２Ｏ  第２世代）；６６．８７（フルオレニル−ＣＨ２）；６７．４３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第２世代）；６７．９８（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１世代）；６９．５２（ＣＣＨ２Ｏ  第２世代）；７０．４２（ＣＣＨ２Ｏ  第１世代）；８０．８４（（ＣＨ３）３Ｃ）；１２０．２８，１２５．５２，１２７．３８，１２７．９８，１４１．６５，１４４．４８（フルオレニル）；１５６．８８（ＯＣＯＮＨ）；１５８．５２（ＮＨＣＯＮＨ）；１７１．２７（ＣＯＯｔ−Ｂｕ）；１７１．６５（アミドＣＯＮＨ）。
【０１４２】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：２１８６．８（ＭＮａ＋）、２００２．８（ＭＫ＋）
【０１４３】
Ｎ−｛６−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノヘキシル｝−Ｎ'−トリス［（２−｛［（トリス｛［２−カルボキシエトキシ］メチル｝メチル）アミノ］カルボニル｝エトキシ）メチル］−メチル尿素（５）
保護基を有するノナ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（4.3）（0.12 g, 72 mmol）を１０mlの９６%ギ酸中で２４時間撹拌した。ギ酸を減圧下５０℃で除去し、無色油状物を定量的に得た。
【０１４４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＯＣＤ３，３００MHz）：δ  １．２３−１．５１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２，８Ｈ）；２．４４−２．５８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１および第２世代，２４Ｈ）；３．１５−３．１８（ｍ，ＣＯＮＨＣＨ２，４Ｈ）；３．６１−３．７５（ｍ，ＣＣＨ２Ｏ  第１および第２世代，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１および第２世代，４８Ｈ）；４．２３（ｔ，ＣＨ（フルオレニル）−ＣＨ２，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．３５（ｄ，フルオレニル−ＣＨ２，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；５．８５，６．０９（ｂｒ，ＣＨ２ＮＨＣＯ，２Ｈ）；６．５７（ｂｒ，ＣＯＮＨＣ，１Ｈ）；６．８８（ｂｒ，アミドＮＨ，３Ｈ）；７．３１−７．８８（フルオレニル，８Ｈ）。
【０１４５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＯＣＤ３，７５MHz）：δ  ２７．２１，２７．３３，３０．６９，３０．９８（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）；３５．３１（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第２世代）；３７．８３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１世代）；４０．５６，４１．５４（ＣＯＮＨＣＨ２）；４８．１０（ＣＨ（フルオレニル）−ＣＨ２）；５９．９３（ＣＣＨ２Ｏ  第１世代）；６１．１０（ＣＣＨ２Ｏ  第２世代）；６６．８６（フルオレニル−  ＣＨ２）；６７．８１（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第２世代）；６８．３７（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ  第１世代）；６９．８０（ＣＣＨ２Ｏ  第２世代）；７０．８３（ＣＣＨ２Ｏ  第１世代）；１２０．８４，１２６．１３，１２７．９８，１２８．５６，１４２．１０，１４５．１６（フルオレニル）；１５７．５０（ＯＣＯＮＨ）；１５９．８２（ＮＨＣＯＮＨ）；１７３．２０（アミドＣＯＮＨ）；１７３．９３（ＣＯＯＨ）。
【実施例３】
【０１４６】
実施例３−他のデンドロン化合物
高分子とともに特定の保護基を示すことができるが、化合物は、示した特定の保護基に限定されないことに留意すべきである。さらに、正確な分子構造を示して種々の分子鎖およびスペーサを表しているが、密度が、好ましくは低い密度に制御され、基材表面上に配列した官能基を得るために、許容される化学修飾方法による修飾が可能である。化合物の簡潔な表記のための基準として、最も左側の文字は保護基を示し、角カッコ中の数字は分岐した末端の数を示し、最も右側の化学種は、分岐した末端の化学種を示す。例えば、「Ａ−［２７］−酸」は、保護基がアンスリルメチルであり、２７個の末端を有し、末端に存在する酸基を示す。
Ａ−［２７］−酸
【化６】
2009505057.tif 000009
Ｂｏｃ−［１］−酸
【化７】
2009505057.tif 000010
Ｂｏｃ−［３］−エステル
【化８】
2009505057.tif 000011
Ｂｏｃ−［３］−酸
【化９】
2009505057.tif 000012
Ｂｏｃ−［９］−エステル
【化１０】
2009505057.tif 000013
Ｂｏｃ−［９］−酸
【化１１】
2009505057.tif 000014
Ｎｓ−［９］−エステル
【化１２】
2009505057.tif 000015
Ｎｓ−［９］−酸
【化１３】
2009505057.tif 000016
Ｆｍｏｃ−［９］−エステル（Ｒ＝ｔ−ブチル）
【化１４】
2009505057.tif 000017
Ｆｍｏｃ−［９］−酸
【化１５】
2009505057.tif 000018
ＡＥ−［１］−酸
【化１６】
2009505057.tif 000019
ＡＥ−［３］−酸
【化１７】
2009505057.tif 000020
ＡＥ−［９］−酸
【化１８】
2009505057.tif 000021
Ａ−［６］−酸
【化１９】
2009505057.tif 000022
Ａ−［８］−酸
【化２０】
2009505057.tif 000023
Ａ−［１２］−酸
【化２１】
2009505057.tif 000024
Ａ−［１６］−酸
【化２２】
2009505057.tif 000025
Ａ−［１８］−酸
【化２３】
2009505057.tif 000026
G. R. Newkome J Org. Chem. 1985, 50, 2003
【化２４】
2009505057.tif 000027
J. -J.Lee Macromolecules 1994, 27, 4632
【化２５】
2009505057.tif 000028
L.J.Twyman Tetrahedron Lett. 1994, 55, 4423
【化２６】
2009505057.tif 000029
D. A. Tomalia Polym. J 1985, 17, 117
【化２７】
2009505057.tif 000030
E. Buhleier. Synthesis 1978, 155
【化２８】
2009505057.tif 000031
A. W. van der Made J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1992, 1400 
【化２９】
2009505057.tif 000032
G. R. Newkome Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 1176
【化３０】
2009505057.tif 000033
G. R. Newkome Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 1176
【化３１】
2009505057.tif 000034
【化３２】
2009505057.tif 000035
K. L. WooleyJ Chem. Soc, Perkin Trans.1 1991, 1059
【化３３】
2009505057.tif 000036
【０１４７】
実施例３．１−調製方法
１．Ａ−［３］−ＯＥｔ（３）
【化３４】
2009505057.tif 000037
化合物１はＣ６Ｈ６／ＤＭＦ中８０℃で、ＮａＣ（ＣＯ２Ｅｔ）３（２）と反応した。
【０１４８】
２．Ａ−［３］−ＯＭｅ（５）
【化３５】
2009505057.tif 000038
Ａ−［３］−ＯＥｔ（３）を、エーテル中でＬｉＡｌＨ４またはＬｉＢＨ４によって還元し、ｔ−ＢｕＯＫ／ｔ−ＢｕＯＨの存在下でクロロ酢酸と反応させ、ＭｅＯＨによってエステル化した。
【０１４９】
３．  Ａ−［３］−ＯＴｓ（７）
【化３６】
2009505057.tif 000039
Ａ−［３］−ＯＭｅ（５）を、エーテル中でＬｉＡｌＨ４によって還元すると、トリオール化合物６が得られ、これをトシル化して化合物７とした。
【０１５０】
４．Ａ−［９］−ＯＥｔ（８）
【化３７】
2009505057.tif 000040
Ａ−［３］−ＯＴｓ（７）を、Ｃ６Ｈ６−ＤＭＦ中でＮａＣ（ＣＯ２Ｅｔ）３を用いて処理し、所望のノナエステル（化合物８）を得た。
【０１５１】
５．Ａ−［２７］−ＯＨ（９）
【化３８】
2009505057.tif 000041
Ａ−［９］−ＯＥｔ（８）を、ＤＭＳＯ中、７０℃で、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびＫ２ＣＯ３で処理した。
【０１５２】
実施例３．２
１．Ｂｏｃ−［２］−ＯＭｅ（３）
【化３９】
2009505057.tif 000042
化合物１を、メタノール溶媒中、５０℃未満の温度でアクリル酸メチル（２）と反応させた。過剰の試薬および溶媒を、高真空下５５℃未満の温度で除去した。
【０１５３】
２．Ｂｏｃ−［４］−ＮＨ２（５）
【化４０】
2009505057.tif 000043
Ｂｏｃ−［２］−ＯＭｅ（３）を、メタノール溶媒中、５０℃未満の温度で大過剰のエチレンジアミン（ＥＤＡ）４と反応させた。過剰の試薬および溶媒を、高真空下５５℃未満の温度で除去した。
【０１５４】
３．Ｂｏｃ−［８］−ＯＭｅ（６）
【化４１】
2009505057.tif 000044
Ｂｏｃ−［４］−ＮＨ２（５）を、メタノール溶媒中、５０℃未満の温度でアクリル酸メチル（２）と反応させた。過剰の試薬および溶媒を、高真空下５５℃未満の温度で除去した。
【０１５５】
実施例３．３
１．Ｂｏｃ−［２］−ＯＨ（３）
【化４２】
2009505057.tif 000045
化合物１、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）をアセトニトリルに溶解し、室温で撹拌した。アセトニトリルに溶解したＬ−グルタミン酸−ジエチルエステル（Ｈ２ＮＣＨ（ＣＯ２Ｅｔ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ）を撹拌しながら加えた。室温で１２時間撹拌後、アセトニトリルを留去した。粗生成物をＥＡに溶解し、１．０N  ＨＣｌおよび飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過、濃縮後、シリカゲルを充填したカラムに粗生成物を吸着させた。カラムクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル：ヘキサン）で精製し、粘稠な黄色液体を得た。
【０１５６】
化合物２をＮａＯＨ溶液により加水分解した。室温で１日撹拌後、有機液体を濃縮した。水溶液をＥＡで洗浄し、氷浴中で撹拌後、希ＨＣｌで酸性にした。生成物をＥＡで抽出後、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過後濃縮した。
【０１５７】
２．Ｂｏｃ−［４］−ＯＨ（３）
【化４３】
2009505057.tif 000046
化合物３、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）をアセトニトリルに溶解し、室温で撹拌した。アセトニトリルに溶解したＬ−グルタミン酸ジエチルエステル（Ｈ２ＮＣＨ（ＣＯ２Ｅｔ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ）を撹拌しながら加えた。室温で１２時間撹拌後、アセトニトリルを留去した。粗生成物をＥＡに溶解し、１．０N  ＨＣｌおよび飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過、濃縮後、シリカゲルを充填したカラムに粗生成物を吸着させた。カラムクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル：ヘキサン）で精製し、粘稠な黄色液体を得た。
【０１５８】
化合物４をＮａＯＨ溶液により加水分解した。室温で１日撹拌後、有機液体を濃縮した。水溶液をＥＡで洗浄し、氷浴中で撹拌後、希ＨＣｌで酸性にした。生成物をＥＡで抽出後、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過後濃縮した。
【０１５９】
３．Ｂｏｃ−［８］−ＯＨ（３）
【化４４】
2009505057.tif 000047
化合物５、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）をアセトニトリルに溶解し、室温で撹拌した。アセトニトリルに溶解したＬ−グルタミン酸−ジエチルエステル（Ｈ２ＮＣＨ（ＣＯ２Ｅｔ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ）を撹拌しながら加えた。室温で１２時間撹拌後、アセトニトリルを留去した。粗生成物をＥＡに溶解し、１．０N  ＨＣｌおよび飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過、濃縮後、シリカゲルを充填したカラムに粗生成物を吸着させた。カラムクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル：ヘキサン）で精製し、粘稠な黄色液体を得た。
【０１６０】
化合物６をＮａＯＨ溶液により加水分解した。室温で１日撹拌後、有機液体を濃縮した。水溶液をＥＡで洗浄し、氷浴中で撹拌後、希ＨＣｌで酸性にした。生成物をＥＡで抽出後、有機溶液を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過後濃縮した。
【０１６１】
実施例３．４
１．Ｂｏｃ−［２］−ＣＮ（３）
【化４５】
2009505057.tif 000048
化合物１を室温でアクリロニトリルに溶解した。氷酢酸を加え、溶液を２４時間加熱環流した。過剰のアクリロニトリルを減圧下除去後、残渣をクロロホルムで抽出し、濃アンモニア溶液を加えた。有機相を分離し、水洗後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。
【０１６２】
２．Ｂｏｃ−［２］−ＮＨ２（４）
【化４６】
2009505057.tif 000049
Ｂｏｃ−［２］−ＣＮ（３）をメタノールに溶解し、塩化コバルト（II）六水和物を加えた。水素化ホウ素ナトリウムを少しずつ加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、濃塩酸で注意深く酸性にした。溶媒を減圧下除去後濃縮した。有機相を分離後水洗し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。
【０１６３】
３．Ｂｏｃ−［４］−ＣＮ（５）
【化４７】
2009505057.tif 000050
Ｂｏｃ−［２］−ＮＨ２（４）を室温でアクリロニトリルに溶解した。氷酢酸を加え、溶液を２４時間加熱環流した。過剰のアクリロニトリルを減圧下除去後、残渣をクロロホルムで抽出し、濃アンモニア溶液を加えた。有機相を分離し、水洗後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。
【０１６４】
４．Ｂｏｃ−［４］−ＮＨ２（６）
【化４８】
2009505057.tif 000051
Ｂｏｃ−［４］−ＣＮ（５）をメタノールに溶解し、塩化コバルト（II）六水和物を加えた。水素化ホウ素ナトリウムを少しずつ加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、濃塩酸で注意深く酸性にした。溶媒を減圧下除去後濃縮した。有機相を分離後水洗し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。
【０１６５】
５．Ｂｏｃ−［８］−ＣＮ（７）
【化４９】
2009505057.tif 000052
Ｂｏｃ−［４］−ＮＨ２（６）を室温でアクリロニトリルに溶解した。氷酢酸を加え、溶液を２４時間加熱環流した。過剰のアクリロニトリルを減圧下除去後、残渣をクロロホルムで抽出し、濃アンモニア溶液を加えた。有機相を分離し、水洗後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。
【０１６６】
６．Ｂｏｃ−［８］−ＮＨ２（８）
【化５０】
2009505057.tif 000053
Ｂｏｃ−［８］−ＣＮ（７）をメタノールに溶解し、塩化コバルト（II）六水和物を加えた。水素化ホウ素ナトリウムを少しずつ加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、濃塩酸で注意深く酸性にした。溶媒を減圧下除去後濃縮した。有機相を分離後水洗し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。
【０１６７】
７．Ｂｏｃ−［１６］−ＣＮ（９）
【化５１】
2009505057.tif 000054
Ｂｏｃ−［８］−ＮＨ２（８）を室温でアクリロニトリルに溶解した。氷酢酸を加え、溶液を２４時間加熱環流した。過剰のアクリロニトリルを減圧下除去後、残渣をクロロホルムで抽出し、濃アンモニア溶液を加えた。有機相を分離し、水洗後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。
【０１６８】
７．Ｂｏｃ−［１６］−ＮＨ２（１０）
【化５２】
2009505057.tif 000055
Ｂｏｃ−［１６］−ＣＮ（９）をメタノールに溶解し、塩化コバルト（II）六水和物を加えた。水素化ホウ素ナトリウムを少しずつ加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、濃塩酸で注意深く酸性にした。溶媒を減圧下除去後濃縮した。有機相を分離後水洗し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。
【０１６９】
実施例３．５
１．Ａ−［３］−アルケン（３）
【化５３】
2009505057.tif 000056
Ａ−［１］−ＳｉＣｌ３（１）を、ジエチルエーテル中で、１０%過剰の臭化アリルマグネシウムで４時間環流後、０℃に冷却し、１０%ＮＨ４Ｃｌ水溶液で加水分解した。有機層を水洗し、ＭｇＳＯ４上で乾燥後濃縮した。
【０１７０】
２．Ａ−［３］−ＳｉＣｌ３（４）
【化５４】
2009505057.tif 000057
Ａ−［３］−アルケン（３）、ＨＳｉＣｌ３、およびＨ２ＰｔＣｌ６のプロパン−２−オール溶液（スピアー触媒）等の、白金を用いた通常のヒドロシリル化触媒、または白金ジビニルシロキサン錯体（カールシュテット錯体）の混合物を、室温で２４時間撹拌した。反応終了後、過剰のＨＳｉＣｌ３を減圧下除去した。
【０１７１】
３．Ａ−［９］−アルケン（５）
【化５５】
2009505057.tif 000058
Ａ−［３］−ＳｉＣｌ３（４）を、ジエチルエーテル中で、１０%過剰の臭化アリルマグネシウムで４時間環流後、０℃に冷却し、１０%ＮＨ４Ｃｌ水溶液で加水分解した。有機層を水洗し、ＭｇＳＯ４上で乾燥後濃縮した。
【０１７２】
４．Ａ−［９］−ＳｉＣｌ３（６）
【化５６】
2009505057.tif 000059
Ａ−［９］−アルケン（５）、ＨＳｉＣｌ３、およびＨ２ＰｔＣｌ６のプロパン−２−オール溶液（スピアー触媒）等の、白金を用いた通常のヒドロシリル化触媒、または白金ジビニルシロキサン錯体（カールシュテット錯体）の混合物を、室温で２４時間撹拌した。反応終了後、過剰のＨＳｉＣｌ３を減圧下除去した。
【０１７３】
実施例３．６
１．［１］−酸−［３］−トリオール（３）
【化５７】
2009505057.tif 000060
（a）トリオール１をシアノエチル化して、ニトリル化合物２を得た。アクリロニトリル、ｎＢｕ３ＳｎＨ、およびアゾビスイソブチロニトリルを、化合物１を含むＰｈＣＨ３に、１１０℃で加えた。（ｂ）ニトリル化合物２を、ＫＯＨ、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ、Ｈ２Ｏ２、加熱等の条件下で加水分解して、カルボン酸を有する化合物３を高純度で得た。
【０１７４】
２．Ａ−［３］−トリオール（５）
【化５８】
2009505057.tif 000061
（ｃ）１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）を用いたアミドカップリング反応により、［１］−酸−［３］−トリオールを、化合物４と結合させた。
【０１７５】
３．Ａ−［３］−トリブロミド（６）
【化５９】
2009505057.tif 000062
（ｄ）アルコールを用いて、ＨＢｒ／Ｈ２ＳＯ４による１００℃での臭素化により、トリブロミドを合成した。
【０１７６】
４．［１］−ＣＮ−［３］−ＯＢｚｌ（８）
【化６０】
2009505057.tif 000063
（ｅ）Ｍｅ２ＳＯおよびＫＯＨを用いて、トリオール１を塩化ベンジルで処理し、トリスエーテルを得た。（ｆ）トリスエーテル８をシアノエチル化して、ニトリル化合物９を得た。アクリロニトリル、ｎＢｕ３ＳｎＨ、およびアゾビスイソブチロニトリルを、化合物８を含むＰｈＣＨ３に、１１０℃で加えた。
【０１７７】
５．［１］−ＯＨ−［３］−ＯＢｚｌ（１１）
【化６１】
2009505057.tif 000064
（ｇ）ニトリル化合物９を、ＫＯＨ、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ、Ｈ２Ｏ２、加熱等の条件下で加水分解して、カルボン酸を有する化合物１０を高純度で得た。（ｈ）カルボン酸を有する化合物１０を、過剰の１．０M  ＢＨ３−ＴＨＦ溶液で処理し、酸をアルコールに変換した。
【０１７８】
６．［１］−アルキン−［３］−ＯＢｚｌ（１３）
【化６２】
2009505057.tif 000065
（ｉ）過剰のＳＯＣｌ２および触媒量のピリジンにより、アルコールをクロリドに変換し（ＣＨ２Ｃｌ２）、（ｊ）クロリドを、ジメチルスルホキシド中、４０℃でリチウムアセチリドエチレンジアミン錯体と反応させた。
【０１７９】
７．Ａ−［３］−アルキン−［９］−ＯＢｚｌ（１４）
【化６３】
2009505057.tif 000066
（ｋ）Ａ−［３］−ＯＢｚｌ（６）を、４当量の末端アルキンビルディングブロック１３、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）、およびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤ）を用いて、０〜４０℃で１．５時間アルキル化した。
【０１８０】
実施例３．７
１．Ａ−［９］−ＯＨ（１５）
【化６４】
2009505057.tif 000067
１０%のＰｄ−Ｃ／Ｈを含むＥｔＯＨおよびＴＨＦ溶液中、６０℃で４日間、Ａ−［３］−アルキン−［９］−ＯＢｚｌ（１４）を、Ｐｄ−Ｃ／Ｈにより還元および脱保護した。
【０１８１】
２．Ａ−［２７］−ＣＯＯＨ（１７）
【化６５】
2009505057.tif 000068
ＳＯＢｒ２を用い、ＣＨ２Ｃｌ２中４０℃で１２時間かけて、アルコールを円滑にノナブロミドに変換した。その後、ノナブロミド化合物を１２当量の［１］−アルキン−［３］−ＯＢｚｌ（１３）を用いてアルキル化し、Ａ−［９］−アルキン−［２７］−ＯＢｚｌ（１６）を４９%の収率で得た。１０%のＰｄ−Ｃ／Ｈを含むＥｔＯＨおよびＴＨＦ溶液中、６０℃で４日間、１段階でＡ−［９］−アルキン−［２７］−ＯＢｚｌ（１６）を還元および脱保護し、Ａ−［２７］−ＯＨを８９%の収率で得た。ＲｕＯ４を用い、ＮＨ４ＯＨまたは（ＣＨ３）４ＮＯＨで処理することにより、Ａ−［２７］−ＯＨを酸化すると、Ａ−［２７］−ＣＯＯＨ（１７）を収率８５%で得た。
【０１８２】
実施例３．８
１）［Ｇ１］−（ＯＭｅ）２（３）
【化６６】
2009505057.tif 000069
乾燥アセトンに溶解した化合物１（１．０５モル当量）、３，５−ジメトキシ臭化ベンジル（１．００モル当量（２））、炭酸カリウム（１．１モル当量）および１８−Ｃ−６（０．２モル当量）の混合物を、窒素下で４８時間環流した。混合物を冷却後、乾固するまで濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分配させた。水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し（３×）、ひとまとめにした有機相を乾燥し、乾固するまで濃縮した。溶出液としてＥｔＯＡｃ−ＣＨ２Ｃｌ２を用い、フラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、化合物３を得た。
【０１８３】
２）［Ｇ１］−（ＯＨ）２（４）
【化６７】
2009505057.tif 000070
化合物３のメチルエーテル基を、ＢＢｒ３により、ＥｔＯＡｃ溶液中１時間かけて脱保護し、溶出液としてＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃを用い、フラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、化合物４を得た。
【０１８４】
３）［Ｇ２］−（ＯＭｅ）４（５）
【化６８】
2009505057.tif 000071
乾燥アセトンに溶解した［Ｇ１］−（ＯＨ）２（１．００モル当量（４））、３，５−ジメトキシ臭化ベンジル（２．００モル当量（２））、炭酸カリウム（２．１モル当量）および１８−Ｃ−６（０．２モル当量）を、窒素下で４８時間環流した。混合物を冷却後、乾固するまで濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分配させた。水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し（３×）、ひとまとめにした有機相を乾燥し、乾固するまで濃縮した。溶出液としてＥｔＯＡｃ−ＣＨ２Ｃｌ２を用い、フラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、化合物５を得た。
【０１８５】
４）［Ｇ２］−（ＯＨ）４（６）
【化６９】
2009505057.tif 000072
化合物５のメチルエーテル基を、ＢＢｒ３により、ＥｔＯＡｃ溶液中１時間かけて脱保護し、溶出液としてＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃを用い、フラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、化合物４を得た。
【０１８６】
５）［Ｇ３］−（ＯＭｅ）８（７）
【化７０】
2009505057.tif 000073
乾燥アセトンに溶解した［Ｇ２］−（ＯＨ）４（１．００モル当量（６））、３，５−ジメトキシ臭化ベンジル（４．００モル当量（２））、炭酸カリウム（４．１モル当量）および１８−Ｃ−６（０．２モル当量）を、窒素下で４８時間環流加熱した。混合物を冷却後、乾固するまで濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分配させた。水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し（３×）、ひとまとめにした有機相を乾燥し、乾固するまで濃縮した。溶出液としてＥｔＯＡｃ−ＣＨ２Ｃｌ２を用い、フラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、化合物７を得た。
【０１８７】
６）［Ｇ３］−（ＯＨ）８（８）
【化７１】
2009505057.tif 000074
化合物７のメチルエーテル基を、ＢＢｒ３により、ＥｔＯＡｃ溶液中１時間かけて脱保護し、溶出液としてＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃを用い、フラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、化合物８を得た。
【実施例４】
【０１８８】
実施例４−基材上へのデンドロンの集積
ＡＰＤＥＳの代わりに、ＴＭＡＣ（塩化Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）を酸化物ガラス上に集積した。ＴＭＡＣ層上のデンドリマー層について、残留したアミンをキャッピングする必要はなかった。
【０１８９】
ＴＭＡＣによるアミノシリル化
清浄な基材（スライドガラス）を、ＴＭＡＣ（２mL）およびアセトン（１００mL）からなる溶液中に５時間置いた。自己組織化後、基材をフラスコから取り出し、アセトンで洗浄した。基材をオーブンに入れ、１１０℃で４０分間加熱した。アセトンに浸漬後、基材を３分間超音波照射した。洗浄した基材をテフロン（登録商標）ビンに入れ、裏にＯ−リングを有する大きなネジ止め式のキャップを有するガラス容器中に入れ、次いで、基材を乾燥するために容器を減圧（３０〜４０mTorr）した。
【化７２】
2009505057.tif 000075
ＴＭＡＣ（塩化Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）の構造
【０１９０】
Ｆｍｏｃ−スペーサ−［９］酸の自己組織化は、残留したアミンを無水酢酸によりキャッピングした以外は、Ｃｂｚ−［９］酸の場合と同様の条件下で行った。
【０１９１】
Ｆｍｏｃ−スペーサ−［９］酸（５）の自己組織化
所定量のＦｍｏｃ−スペーサ−［９］酸（５）を混合溶媒（ＤＭＦ：脱イオン水＝１：１（ｖ／ｖ））に溶解し、２０mLの溶液を調製した。溶液をテフロン（登録商標）容器に入れ、上述のように調製したアミノシリル化スライドガラスを溶液中に入れた。フラスコを室温で放置して自己組織化させ、１日後、各基材を溶液から取り出した。取り出した直後に、板を大量の脱イオン水で洗浄した。各基材を、脱イオン水、脱イオン水−メタノール混合物（１：１（ｖ／ｖ））、およびメタノール中で、各３分間順次超音波照射した。超音波照射後、基材をテフロン（登録商標）ビンに入れ、裏にＯ−リングを有する大きなネジ止め式のキャップを有するガラス容器中に入れ、次いで、基材を乾燥するために容器を減圧（３０〜４０mTorr）した。
【０１９２】
自己組織化したＦｍｏｃ−スペーサ−［９］酸（５）からのＦｍｏｃの脱保護
５%ピペリジンのＤＭＦ溶液を含むテフロン（登録商標）容器を用意した。自己組織化基材を容器中に浸漬し、２０分間撹拌した。各基材を、減圧室（３０〜４０mTorr）中で、アセトンおよびＭｅＯＨ中で３分間順次超音波照射した。
【実施例５】
【０１９３】
実施例５：デンドロンで修飾したＡＦＭチップおよび基材材料の調製
シランカップリング剤である、Ｎ−（３−トリエトキシシリル）プロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシド  ウレタン（ＴＰＵ）は、Gelest社より購入し、他の化合物は全て、Sigma-Aldrich社の試薬用グレードのものであった。ＵＶ用グレードの溶融シリカ板（３０mm×１０mm×１．５mm）は、CVI Laser Corporationより購入した。研磨したＳｉ（１００）プライムウェーハ（ドーパント：リン、抵抗：１．５〜２．１Ω・cm）は、MEMC Electronic Materials, Incより購入した。超純水（１８MΩ・cm）は、Barnstead E-pure 3 -Module systemに蒸留水を通過させることにより得られた。膜厚は、J. A. Woollam Co.製の角度可変エリプソメーター（Model M-44）を用いて測定した。紫外可視スペクトルは、Hewlett-Packardダイオードアレイ８４５３分光光度計を用いて記録した。
【０１９４】
１）基材の洗浄
溶融シリカ板、シリコンウェーハをピラニア溶液（濃Ｈ２ＳＯ４：３０%Ｈ２Ｏ２＝７：３（ｖ／ｖ））中で４時間超音波照射した（注意：ピラニア溶液は、有機物を爆発的に酸化する場合がある。酸化性物質との接触を避けること）。超音波照射後、板とウェーハを大量の脱イオン水でよく洗浄およびすすぎ洗いした。次いで、テフロン（登録商標）ビーカー中に入れた脱イオン水、濃アンモニア溶液、および３０%過酸化水素（５：１：１（ｖ／ｖ／ｖ））の混合物に基材を浸漬した。ビーカーを水浴中に入れ、８０℃で１０分間加熱した。基材を溶液から取り出し、脱イオン水で十分に洗浄した。再び、脱イオン水、濃アンモニア溶液、および３０%過酸化水素（６：１：１（ｖ／ｖ／ｖ））の混合物を有するテフロン（登録商標）ビーカー中に入れた。ビーカーを８０℃で１０分間加熱した。基材を溶液から取り出し、大量の脱イオン水ですすぎ洗いした。洗浄した基材を減圧室（３０〜４０mTorr）中で２０分間乾燥後、速やかに次の工程で使用した。
【０１９５】
２）チップの洗浄
まず、ピラミッド状のチップ（Veeco Instrument、ｋ＝１０pN/nm）を有する通常のＶ字型窒化ケイ素製カンチレバー（MLCT- AUNM）を、１０%硝酸中に８０℃で２０分間浸漬することにより活性化した。カンチレバーを溶液から取り出し、大量の脱イオン水で十分にすすぎ洗いした。洗浄したカンチレバーを減圧室（３０〜４０mTorr）中で２０分間乾燥後、速やかに次の工程で使用した。
【０１９６】
３）アミノシリル化
洗浄した溶融シリカ、シリコンウェーハ、およびカンチレバーを、窒素雰囲気下でカップリング剤（０．２０mL）を含む無水トルエン（２０mL）中に浸漬し、溶液中に６時間置いた。シリル化後、基材およびカンチレバーをトルエンで洗浄し、１１０℃で３０分間ベークした。基材を、トルエン、トルエン−メタノール（１：１（ｖ／ｖ））、およびメタノール中に順次浸漬し、各洗浄溶液中で３分間ずつ超音波照射した。カンチレバーを、トルエン、およびメタノールを順次用いて洗浄した。最後に、カンチレバーを減圧室（３０〜４０mTorr）中で乾燥した。
【０１９７】
４）デンドロンで修飾された表面の調製
上述のヒドロキシル化された基材およびカンチレバーを、デンドロン（１．０mM）およびカップリング剤である１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（９．９mM）を溶解した、少量のＤＭＦを含む塩化メチレン溶液中に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．９０mM）の存在下で１２〜２４時間浸漬した。用いたデンドロン（９−アンスリルメチルＮ−（{[トリス（{２−[（{トリス[（２−カルボキシエトキシ）メチル]メチル}アミノ）カルボニル]エトキシ}メチル）メチル]アミノ}カルボニル）プロピルカルバメート）を、本グループにより調製した。反応後、基材を、塩化メチレン、メタノール、および水中に順次浸漬し、各洗浄工程において、３分間ずつ超音波照射した。カンチレバーを、塩化メチレン、メタノール、および水を順次用いて十分に洗浄した。最後に、基材およびカンチレバーをメタノールで洗浄し、減圧室（３０〜４０mTorr）中で乾燥した。
【実施例６】
【０１９８】
実施例６：オリゴヌクレオチドの固定化
１）デンドロンの表面からのカルボアンスリルメトキシ基の脱保護
デンドロンで修飾した基材およびカンチレバーを、１．０Mのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む塩化メチレン溶液中に浸漬し、３時間撹拌した。反応後、２０%（ｖ／ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含む塩化メチレン溶液中にそれらを１０分間浸漬した。基材を、塩化メチレンおよびメタノール中でそれぞれ３分間ずつ順次超音波照射し、塩化メチレンおよびメタノールを順次用いてよく洗浄した。基材およびカンチレバーを減圧下（３０〜４０mTorr）で乾燥した。
【０１９９】
２）ＮＨＳで修飾された基材の調製
上述の脱保護された基材およびカンチレバーを、炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（ＤＳＣ）（２５mM）およびＤＩＰＥＡ（１．０mM）を含むアセトニトリル溶液中に、窒素雰囲気下で４時間浸漬した。反応後、基材およびカンチレバーをジメチルホルムアミド中に撹拌しながら３０分間浸漬し、メタノールで洗浄した。基材およびカンチレバーを減圧下（３０〜４０mTorr）で乾燥した。
【０２００】
３）デンドロンで修飾した基材へのオリゴヌクレオチドの固定化
上述のＮＨＳで修飾された基材およびカンチレバーを、５．０mM  ＭｇＣｌ２を含む２５mMＮａＨＣＯ３緩衝溶液に溶解したオリゴヌクレオチド（２０μM）中に１２時間浸漬した。反応後、基材およびカンチレバーをハイブリダイゼーション緩衝溶液（７．０mMドデシル硫酸ナトリウムを含む２×ＳＳＰＥ緩衝溶液（ｐＨ７．４））中、３７℃で１時間撹拌し、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去するために、沸騰水中で５分間撹拌した。基材およびカンチレバーを減圧下（３０〜４０mTorr）で乾燥した。固定化されるオリゴヌクレオチドは、表１に示すとおりである。
【実施例７】
【０２０１】
実施例７：ＡＦＭによる力測定
７−１：サンプルの調製
間隔の効果を理解するために、基材に対して、ＧＰＤＥＳおよびＴＰＵ等の２種類のシラン剤を用いた２種類の修飾（９−酸／ＧＰＤＥＳ基材、および９−酸／ＴＰＵ基材）を用い、ＡＦＭチップ上の間隔は、９−酸／ＴＰＵを用いることにより固定した。基材の修飾は実施例１により行った。配列番号１〜４に示したオリゴヌクレオチドを、それぞれ実施例２の方法により９−酸／ＴＰＵ基材上に固定化した。配列番号２で示される３０塩基対の相補的なＤＮＡを、９−酸／ＧＰＤＥＳ基材上に固定化した。配列番号５〜２０で示されたオリゴヌクレオチドを、それぞれ、９−酸／ＴＰＵ型のカンチレバー上に固定化した。
【０２０２】
【表２】
2009505057.tif 000076
【０２０３】
例えば、９−酸デンドロンは、（９−アンスリルメチルＮ−（｛［トリス（｛２−［（｛トリス［（２−カルボキシエトキシ）メチル］メチル｝アミノ）カルボニル］エトキシ｝メチル）メチル］アミノ｝カルボニル）プロピルカルバメート）であり、２７−酸デンドロンは、実施例３に記載のものである。
【０２０４】
７−２：ＡＦＭによる力測定
全ての力測定は、Nano Wizard AFM（JPK Instrument）を用いて行われた。個々のＡＦＭチップのバネ定数ｋｃは、Nano Wizardソフトウェアにより実行可能な熱ゆらぎ法により、それぞれの実験の前に溶液中で校正された。バネ定数は、１２〜１５pN/nmの間で変動した。全ての実験は、新規に調製されたＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）中、室温で行われた。力測定の負荷速度は、１１０nm/s〜５４０nm/sの間で変動させた。個々の実験条件下で、１つのスポット当たり１００回以上荷重曲線を記録し、少なくとも５つ以上のスポットについて検定を行った。これらの実験において、結合力および解離力の双方について記録した。チップが実際に移動した距離を計算するために、ピエゾ変位からカンチレバーの変位を差し引いた。カンチレバーの変位は、力をカンチレバーのバネ定数で除することにより得られた。
【０２０５】
７−３：相補的な３０塩基対ＤＮＡにより固定化された９−酸／ＧＰＤＥＳ基材の解離力
９−酸／ＧＰＤＥＳ基材上に固定化された配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド、および９−酸／ＴＰＵ  ＡＦＭチップ上に固定化された配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドを用いて、１１０nm/s〜５４０nm/sの間の種々の負荷速度において、実施例３−２の方法によりＡＦＭによる力測定を行い、後退速度１１０nm/sにおける解離力の分布（図４Ａ）、後退速度５４０nm/sにおける力−距離曲線（図４Ｂ）および解離力の分布（図４Ｃ）を得た。
【０２０６】
複数のオリゴヌクレオチドの相互作用に起因する大きな解離力が、後退速度５４０nm/sにおいて観測された（図４Ｂ）。また、ヒストグラムは比較的ブロード（最大半値幅は１５pNである）であり、分離していない（図４Ｃ）。しかし、後退速度１１０nm/sにおいて、ヒストグラム（図４Ａ）は３つのピークに分離し、それぞれのピークはシャープである（第１のピークについて最大半値幅は３pNである）。このような挙動に対する正確な解釈は単純ではないが、３７pNにおける第１のピークは、単一のＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用（下記参照）に起因し、他の２つのピーク（４６pNおよび５５pN）は、単一の相互作用以外に２次的な相互作用を有する場合の解離現象を示すと可能性が高い。
【０２０７】
図４Ａは、（ＧＰＤＥＳ基材上のデンドロンによって実現された）比較的狭い間隔を有する場合における相補的な３０塩基対の力の分布を示すヒストグラムである。図４Ｂは、後退速度５４０nm/sにおける単一の相補的な３０塩基対の解離力の直接測定の結果である。図４Ｂは、後退速度５４０nm/sにおける相補的な３０塩基対間の力−距離曲線である。複数のオリゴヌクレオチドの相互作用に起因するはるかに大きな力（青の曲線）が、後退速度５４０nm/sにおいて観測されうる（比較のために、後退速度１１０nm/sにおいて測定された解離力（赤の曲線）を示す）。図４Ｃは、後退速度５４０nm/sにおける解離力の確率分布を示す。ヒストグラムは、（ＧＰＤＥＳ基材上のデンドロンによって実現された）比較的狭い間隔において観測された力の分布を示す。Ｇａｕｓｓ関数を用いたフィッティングにより、分布の最大値が６８±１３pNであり、分布曲線が単一の相互作用を示すように分離することができないことがわかる。
【０２０８】
７−４：相補的な３０塩基対ＤＮＡにより固定化された９−酸／ＴＰＵ基材の結合力および解離
９−酸／ＴＰＵ基材上に固定化された配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド、および９−酸／ＴＰＵ  ＡＦＭチップ上に固定化された配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドを用いて、１１０nm/sの負荷速度において、実施例３−２のＡＦＭ測定方法によりＡＦＭによる力測定を行い、後退速度１１０nm/sにおける解離力の分布（図５Ａ）、後退速度５４０nm/sにおける結合力−距離曲線（図５Ｂ）および結合力の分布（図５Ｃ）を得た。
【０２０９】
ＤＮＡが９−酸／ＴＰＵ表面上に固定化されている場合、解離力ヒストグラム（図５Ａ）は、３７±２pNに１本のピークのみを示し、ピークの狭さは損なわれなかった。４６pNおよび５５pNの小さなピークが消失したことより、これらのピークが２次的な相互作用に関連するものであることが立証される。上記の２つの場合の解析のために、異常な曲線のみを切り捨て、測定値の９０%以上をプロットに含めた。９−酸／ＧＰＤＥＳの場合には、曲線がギザギザになる場合が多いが、９−酸／ＴＰＵの場合には、ギザギザを示す曲線は存在しなかった。したがって、シラン剤としてＴＰＵを用いて基材の表面を修飾すると、十分な間隔を有するために単一のＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用を測定することができる。
【０２１０】
結合力曲線は、デンドロンで修飾された表面にチップが接近する際に毎回測定された（図５Ｂ）。
【０２１１】
このような特定の過程においても、９−酸／ＴＰＵで修飾された基材により、単一のディップ力曲線が与えられたが、９−酸／ＧＰＤＥＳの場合には、２つまたは複数のディップ力曲線を示した。挙動が一貫しており再現性を有するため、ヒストグラムの生成のためにいかなるデータも切り捨てる必要がなかった。解離現象に対するヒストグラムと同様、ピークは狭く（最大半値幅は３pNである）、３９pNという値は、解離の場合における値にかなり近似している。ＤＮＡの間隔を適切に制御すると、このような先例のない結合過程を観測できることは興味深い。
【０２１２】
さらに、結合力の挙動の負荷速度に対する依存性は低いことがわかった。換言すると、７０nm/s〜５４０nm/sの任意の負荷速度において同一のヒストグラム（図５Ｃ）が得られた。種々のチップおよびサンプルを用いて、個々の実験を多数回繰り返し行ったところ、上述の結合挙動およびヒストグラムが、一貫して再現可能であった。
【０２１３】
７−５：２７−酸に対する解離力および１本鎖の相互作用を検討するためのＴＰＵで修飾された基材
相補的な３０塩基を有する他のＤＮＡに対して、より遅い後退速度においても４８pNという解離力が以前に報告されている（T. Strunz, K. Oroszlan, R. Schaefer, H.- J. Guentherodt, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 96, 11211, 1999）。ＧＣ含有率の等しいＤＮＡを用いても、より低い解離力が測定されていることは興味深い。
【０２１４】
これらの相互作用が単一の分子鎖に由来するものであるか複数の分子鎖に由来するものであるか検討するために、より高世代のデンドロンである２７−酸を用いた。第３世代デンドロンは、約１０nmの間隔を与えることが期待される。２７−酸とＴＰＵを組み合わせることにより基材上における間隔を増加させたが、ＡＦＭチップは、９−酸／ＴＰＵを用いて修飾した。９−酸／ＴＰＵの場合とヒストグラムが同一であったことが興味深い。ＡＦＭチップを２７−酸／ＴＰＵを用いて修飾した場合にも、同一のヒストグラムが観測された。唯一の違いは、解離が観測される機会が減少したことであった。最後の場合、後退現象のうち約５０%は、解離現象を示さなかった。オリゴヌクレオチド間の間隔が大きすぎると、ハイブリダイゼーションを起こす確率が減少するため、このような変化は妥当であると思われる。このような挙動から、９−酸／ＴＰＵにより生成される間隔は、単一の分子鎖の相互作用を認識するための十分な大きさをすでに有していることが示された。
【０２１５】
７−６：相補的なＤＮＡ２本鎖に対する結合力および解離力
他のオリゴヌクレオチドの試験に先立ち、上述の条件における力測定の精度を検討した。異なるバッチよりサンプルを調製し、カンチレバーを校正した。本発明者らは、変動が１０〜１５%以内であることを見出した。この数値は、再現可能であり、かつ正確な表面の制御により誤差を最小化することができることを示唆しており、この数値はバネ定数校正に関連する誤差を上回ることはない。９−酸／ＴＰＵにより修飾された表面を用い、負荷速度１１０nm/sで、２０、３０、４０および５０塩基対を有するＤＮＡ２本鎖（表１）の結合および解離現象を行わせた。接近および後退のサイクルの間に、個々の２本鎖について力−距離曲線を得た。
【０２１６】
上述したように、結合および解離のヒストグラムはほぼ同一であり、力の平均値は同一であった。２０、３０、４０および５０塩基対を有する相補的なＤＮＡ２本鎖の結合力のヒストグラムおよび解離力のヒストグラムを、それぞれ、図６Ａおよび図６Ｃに示す。
【０２１７】
図６Ａに示したヒストグラムにおいて、重なり合わないピークおよびＤＮＡの長さの増加に伴う明らかな増加が観測された。２０、３０、４０および５０塩基対について、２９pN、３９pN、５０pN、および５９pNという数値が得られた。同時に、力の増加量は、１０個のＤＮＡ塩基のそれぞれの増加当たりほぼ１０pNである。検証のために、非相補的なＤＮＡの力を測定したところ、全ての場合において、力曲線を殆ど観測せず、１０pNの小さな力を低い確率で記録した。
【０２１８】
図６Ｂにおいて、２０、３０、４０および５０塩基対を有するＤＮＡ２本鎖の力−ピエゾ変位曲線は、図４の結合力の分布より計算することにより得られた。結合現象により生じた歪みを緩和するためにチップが表面に向かって移動した距離の測定値を、力−ピエゾ変位曲線より抽出し、数値をプロットした。特定の状況下において、２０量体、３０量体、４０量体、および５０量体の場合において、２．４nm、３．２nm、３．６nm、および４．２nmという距離を記録した。ピークが非常に狭いため、距離の増加は、ＤＮＡの距離に対して殆ど線形であり、このパラメータは、サンプルにおける長さが未知のＤＮＡの相互作用を解析するための判断基準となりうる。
【０２１９】
７−７：ミスマッチを有するＤＮＡ２本鎖の結合力の分布
この認識現象についてさらに精査するために、単一のまたは二重のミスマッチ塩基対（表１）について相互作用力曲線を記録した。単一の塩基のミスマッチを有するＤＮＡについては、９−酸／ＴＰＵ基材上に固定化された配列番号５〜８で示されるオリゴヌクレオチドを、二重の塩基のミスマッチを有するＤＮＡについては、９−酸／ＴＰＵ基材上に固定化された配列番号９〜１２で示されたオリゴヌクレオチドを用い、９−酸／ＴＰＵ  ＡＦＭチップ上に固定化された配列番号１〜４で示されるオリゴヌクレオチドを用いて、実施例３−２のＡＦＭ測定の方法により後退速度１１０nm/sにおけるＡＦＭによる力測定を行い、単一の塩基のミスマッチを有するＤＮＡ２本鎖に対する結合力の分布（図７）、および二重の塩基のミスマッチを有するＤＮＡ２本鎖に対する結合力の分布（図８）を得た。
【０２２０】
予想どおり、ミスマッチの導入により、結合力および解離力が減少した。図７に示すように、単一のミスマッチを有するＤＮＡ２本鎖について、２０、３０、４０および５０塩基対について、２７pN、３７pN、４３pN、および５０pNという結合力を得た。図８に示すように、二重のミスマッチを有するＤＮＡ２本鎖について、２０、３０、４０および５０塩基対について、２４pN、３２pN、４０pN、および４５pNという結合力を得た。
【０２２１】
相補的なＤＮＡ２本鎖についての上述の場合と同様に、結合力と解離力とは同一であった。しかし、単一のミスマッチを有する場合について、２０量体および３０量体の両者に対しては、わずかな減少（２pN）を観測した。一方、４０量体および５０量体に対しては、実質的な減少（＞７pN）を観測した。この結果は、４０量体よりも長いＤＮＡを用いると、単一の点変異を確実に検出できることが保証されることを示している。予想どおり、二重のミスマッチ対について、より大きな力の減少を観測した。例えば、２０量体について５pNの減少を観測したが、５０量体については１４pNの減少を観測した。単一分子レベルで単一の点変異を検出することができるピコフォース（ｐｉｃｏ  ｆｏｒｃｅ）ＡＦＭの能力は注目に値する。
【実施例８】
【０２２２】
実施例８−シグナル伝達タンパク質間の生体分子相互作用
以前の研究により、デンドロンで修飾された表面は、デンドロン分子のサイズを制御することにより、表面に結合した生体分子間の距離を十分に確保することができることが示された。この研究において、単一分子レベルでタンパク質間の認識効率を増加させるために、ＡＦＭチップおよびＳｉウェーハ等の固体基材も、以前に報告された報文（Langmuir 2005, 21, 4257）、および米国特許出願第１０／９１７，６０１号に記載の方法により、デンドロン分子により官能基化した（図１１）。ここで用いたデンドロンは、以前用いられたもの（Langmuir 2005, 21, 4257）と同一であるが、米国特許出願第１０／９１７，６０１号において参照されたデンドロンも、全て本研究に用いることができる。
【０２２３】
保護基を脱保護した後、４−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジル（ＧＭＢＳ）（１６mM）を溶解した、少量のＤＭＦを含む５０mM  ＮａＨＣＯ３緩衝溶液（ｐＨ８．５）中でデンドロン修飾基材をインキュベートした。室温で３時間インキュベートした後、脱イオン水で十分に洗浄した。ＧＭＢＳでコーティングした基材を、グルタチオン（ＧＳＨ）（１６mM）を含むＰＢＳ緩衝溶液（１０mMリン酸緩衝溶液、２．７mM  ＫＣｌ、１３７mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に１２時間浸漬し、次いで脱イオン水中で３分間超音波照射した。残留した活性ＧＭＢＳ官能基をクエンチするために、２−メルカプトエタノール（１．６M）を含むＰＢＳ緩衝溶液中に２時間浸漬後、脱イオン水中で３分間超音波照射した。次いで、ＧＳＨでコーティングした基材を、０．４３μg/mlのＧＳＴ標識させたＰＬＤ1−ＰＸを含むＰＢＳ緩衝溶液中、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴ緩衝溶液（１０mMリン酸緩衝溶液、２．７mM  ＫＣｌ、１３７mM  ＮａＣｌ、０．１%tween（登録商標）２０、ｐＨ７．４）で洗浄した。最後に、以下の試験のために、ＰＢＳ緩衝溶液中４℃で保存した。
【０２２４】
窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）製のＡＦＭチップを、ＨＮＯ３：Ｈ２Ｏ（３：１（ｖ／ｖ））溶液中に浸漬し、８０℃で２０分間加熱後、チップを脱イオン水で洗浄した。洗浄したチップの修飾は、ＧＳＴ標識させたＭｕｎｃ−１８−１を導入することを除き、Ｓｉウェーハ基材の場合と同様であった。ＧＳＨでコーティングしたチップを、０．９７μg/mlのＧＳＴ標識化したＭｕｎｃ−１８−１を含むＰＢＳ緩衝溶液中、４℃で３０分間インキュベートした。最終的なコーティングしたチップをＰＢＳＴ緩衝溶液で洗浄し、以下の試験のために、４℃で保存した。
【０２２５】
Ｍｕｎｃ−１８−１およびＰＬＤ1−ＰＸは、いずれもシグナル伝達タンパク質であり、脳細胞の細胞質中に含まれるＭｕｎｃ−１８−１は、インビボにおいて、ＰＬＤ1−ＰＸのＰＸドメインを介してホスホリパーゼＤ１（ＰＬＤ1−ＰＸ）と複合体を形成することが知られている。
【０２２６】
Ｍｕｎｃ−１８−１でコーティングしたＡＦＭチップを、ＰＬＤ1−ＰＸでコーティングした基材上に接近させ、後退させると、両者のタンパク質間の結合力を測定することができる（図１２）。測定された力は、約５０pNの一定の力である（図１４（ａ））。さらに、Ａ−［９］−酸の代わりにＡ−［２７］−酸をデンドロンとして用いた場合、単一分子の相互作用の複数分子の相互作用に対する割合が、１．５：１から３：１に増加した。この結果は、特異的な単一分子の相互作用のためには、大きなサイズの生体分子が、表面上においてより大きな間隔を必要とし、この要求は、サイズの制御が可能なデンドロン分子を用いることにより、容易に満足できることを示している。さらなる検討のために、測定した力がＭｕｎｃ−１８−１とＰＬＤ1−ＰＸとの間の特異的な相互作用に起因するもので、非特異的な相互作用に起因するものではないことを立証するために、過剰量の遊離のＭｕｎｃ−１８−１を溶解した溶液を加え、力測定の間、ＰＬＤ1−ＰＸの結合部位をブロックした（図１３（ａ））。その結果、チップ上のＭｕｎｃ−１８−１と基材上のＰＬＤ1−ＰＸとの間の相互作用力を観測しなかった（図１４（ｂ））。したがって、上述のこれらの結果は、Ｍｕｎｃ−１８−１がＰＬＤ1−ＰＸに一定の力で特異的に結合しており、デンドロンで修飾された表面が、表面上における生体分子間の間隔を制御し、単一分子の特異的な相互作用をもたらすことを示している。
【実施例９】
【０２２７】
実施例９−３つの異なる生体分子間の生体分子相互作用および薬剤のスクリーニングへの応用
ヒトの疾患には、体内におけるタンパク質間の望ましくない相互作用に起因し、これらの疾患に対する最良の候補薬剤を発見するために、いくつかの薬剤のスクリーニング方法が用いられている。近年、バイオＡＦＭが、薬剤のスクリーニングアッセイにも応用されている。この方法においては、候補薬剤の添加の前後における２つの異なるタンパク質間の相互作用を測定することにより、薬剤の有効性を決定する。さらに、薬剤濃度を制御することにより、薬剤治療のための最適な薬剤濃度を、その場で容易に検知することができる。ここで、我々は、デンドロンで修飾された表面が、バイオＡＦＭを用いた薬剤のスクリーニングに適用できることを示す。
【０２２８】
本研究において、実施例８の記載にしたがい、Ｍｕｎｃ−１８−１およびＰＬＤ1−ＰＸを、それぞれ、ＡＦＭチップ、およびＳｉウェーハ等の基材上に導入した。候補薬剤は、固体基材上でＰＬＤ1−ＰＸに結合し、チップ上のＭｕｎｃ−１８−１と競合するＰＬＣ−γ１である（図１３（ｂ））。いくつかの異なる濃度のＰＬＣ−γ１において試験を行うと、高濃度のＰＬＣ−γ１が、ＰＬＤ1−ＰＸのＭｕｎｃ−１８−１への結合を完全に阻害するのに対し、低濃度では阻害が起こらなかった（図１５）。したがって、本研究は、ＰＬＣ−γ１がＭｕｎｃ−１８−１の拮抗剤であり、ＰＬＤ1−ＰＸとＭｕｎｃ−１８−１との間の相互作用力はＰＬＣ−γ１の濃度に依存することを示唆している。したがって、このバイオＡＦＭアッセイは、薬剤探索および薬剤治療を研究するために拡張することができる。
【実施例１０】
【０２２９】
実施例１０−ストレプトアビジンとビオチンとの間の生体分子相互作用
ストレプトアビジンおよびビオチンは、簡単な生体分子相互作用のモデルとして広く用いられている。ここで、この簡単なモデルを、バイオＡＦＭを用いて測定される力測定の研究分野に適用した。ストレプトアビジンは、分子の片側に２つの結合部位を有しているため、バイオＡＦＭによって測定された力が、１分子のストレプトアビジンと１分子のビオチンとの間の相互作用に由来するものであることを立証することが困難である。しかし、デンドロン分子を用いて生体分子間の間隔を制御することにより、我々は、１分子−１分子間の相互作用力をより容易に観測することができる。
【０２３０】
実施例８の記載にしたがい、ＡＦＭチップおよびＳｉウェーハ等の固体基材をデンドロン分子で官能基化した。ＤＳＣ（炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル））リンカー分子を介して、ストレプトアビジンを基材上に、ビオチンをチップ上に結合させた。測定された力は一定であり、１分子のストレプトアビジンと１分子のビオチンとの相互作用によるものであると信じられている報告されている数値とほぼ同一であった。この結果は、デンドロンで修飾された表面上において、ビオチン分子が、単一分子の相互作用を介してストレプトアビジン分子に特異的に結合することを示唆している。
【０２３１】
さらに、Ａ−［９］−酸でコーティングした表面における単一分子の相互作用の複数分子の相互作用に対する割合が、Ａ−［３］−酸の場合よりも高いことが観測された。すなわち、Ａ−［３］−酸のサイズが小さいため、表面上における生体分子間の間隔が単一分子の相互作用のためには不十分であった。したがって、デンドロンで修飾された表面においては、表面上における生体分子間の間隔を制御することができるため、特異的な単一分子の生体分子相互作用を確保することができる。
【実施例１１】
【０２３２】
実施例１１−ペプチドとタンパク質との間の生体分子相互作用を介した、細胞表面上における特異的リガンドのマッピング
細胞表面上の受容体とリガンドとの間の相互作用は、共焦点顕微鏡を用いて詳細に検討されたが、この方法は、細胞上の個々の受容体をナノメートルスケールの高分解能で特定することができないという解決不能な問題を有している。近年、この制限を克服するためにバイオＡＦＭ装置が製造された。しかし、個々の受容体を個別に特定することができる可能性が示されたにも関わらず、この方法にも、ＡＦＭチップの細胞表面上への非特異的な結合、およびチップ上のリガンドと細胞上の受容体との間の多重結合という満足できない点が存在する。これらの問題により、細胞上における受容体の分布に関する誤った情報がもたらされるおそれがある。以前の研究により、デンドロンで修飾された表面は、生体分子との非特異的な結合性が低く、表面上に結合された生体分子間に十分な間隔を提供することにより、単一分子の生体分子相互作用が確保されるという特徴を有している。したがって、デンドロンで修飾された表面を用いると、バイオＡＦＭにより、個々の受容体を、容易に高分解能で個別に検知することができる。
【０２３３】
本研究において用いられたＲＢＬ２Ｈ３細胞においては、炎症に関連するＦＰＲ１（ホルミルペプチド受容体１）が過剰発現している。ＤＭＥＭ（１０%ＦＢＳ、１%ペニシリン／ストレプトマイシン）中、５%ＣＯ２条件下において、３７℃で４８時間インキュベートした後、５%マトリゲル溶液を用いて、５×１０４細胞/mlの細胞をカバーガラス上に固定した。ＦＰＲ１に結合するリガンドは、炎症を起こす６個のアミノ酸からなり、後述するようなＧＭＢＳリンカー分子と結合させるために、Ｎ末端にシステインを有する合成ペプチドである。さらに、該ペプチドは、Ｎ末端におけるアセチル化およびＣ末端におけるアミド化によって電荷が中和されている。
Ａｃ−システイン−リンカー−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ２
【０２３４】
実施例８の記載にしたがい、ＡＦＭチップをデンドロンで修飾した。ＧＭＢＳおよびペプチドリガンドで官能基化後、細胞のある領域における受容体とリガンドとの間の力を測定しながら、チップにより細胞表面をスキャンした（図１６（ａ））。実験は、Nano Wizard（登録商標）原子間力顕微鏡（JPK Instruments, Inc）をバイオＡＦＭとして用い、１×ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）中、室温で行った。
【０２３５】
図１６は、測定された力のグラフのいくつかを示し、青色の線は、チップを後退させた際の後退力曲線を意味する。この曲線より、それぞれの力を計算し、最終的にまとめて、細胞表面上の受容体の分布を示すための力マップを作成することができる。図１７は、ＦＰＲ１とそのリガンドとの間の相互作用に関する力マップおよび力ヒストグラムを示す。明るいピクセルは、マップ上において強い力を意味し、一方暗いピクセルは弱い力を意味する（図１７および１８）。力ヒストグラムより、２つの顕著な力が３１pNおよび５５pNに観測された（図１７）。さらなる研究のために、測定された力が、間違いなくＦＰＲ１とそのリガンドとペプチドとの間の特異的な相互作用に由来するものであることを立証するために、拮抗剤である遊離のＷＫＹＭＶｍを含む溶液を用いて追加実験を行った（図１８）。その結果、遊離のペプチドＷＫＹＭＶｍ（配列番号１７）とともに１時間インキュベートした後、約６０pNの力の分布が減少したことが見出された。この結果は、約６０pNの力が受容体とリガンドとの間の特異的な相互作用に由来するものであるが、約３０pNの力は、非特異的な相互作用に由来するバックグラウンドの力であることを示唆している。
【実施例１２】
【０２３６】
実施例１２−タンパク質と糖脂質との間の生体分子相互作用
コレラ毒素Ｂは、糖脂質、およびヒトの内臓上皮細胞の表面に存在し、疼痛を引き起こすガングリオシドＧＭ１に選択的に結合することが知られている。ここで、我々は、細胞表面上におけるガングリオシドＧＭ１の分布を、そのリガンドであるコレラ毒素Ｂとの間の力を測定することにより検討する。
【０２３７】
供試細胞は、ガングリオシドＧＭ１を過剰発現したヒト上皮細胞である。ＤＭＥＭ（１０%ＦＢＳ、１%ペニシリン／ストレプトマイシン）中、５%ＣＯ２条件下において、３７℃で４８時間インキュベートした後、５%マトリゲル溶液を用いて、５×１０４細胞/mlの細胞をカバーガラス上に固定した。実施例８の記載にしたがい、ＡＦＭチップをデンドロン分子で修飾後、脱保護した。リンカー分子およびコレラ毒素Ｂで官能基化後、細胞のある領域における受容体とリガンドとの間の力を測定しながら、チップにより細胞表面をスキャンした。実験は、Nano Wizard（登録商標）原子間力顕微鏡（JPK Instruments, Inc）をバイオＡＦＭとして用い、１×ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）中、室温で行った。
【実施例１３】
【０２３８】
実施例１３−レクチンと糖タンパク質との間の生体分子相互作用
レクチンタンパク質の一種であるコンカナバリンＡは、糖タンパク質に強く結合するため、糖タンパク質の特性の研究に広く用いられている。ここで我々は、コンカナバリンＡをリガンドとして用い、末端部位にマンノースを有する糖タンパク質の分布を検討した。本実験において用いた細胞は、表面に糖タンパク質を有する線維芽細胞である。
【０２３９】
ＲＰＭＩ（１０%ＦＢＳ、１%ペニシリン／ストレプトマイシン）中、５%ＣＯ２条件下において、３７℃で４８時間培養後、５%マトリゲル溶液を用いて、５×１０４細胞/mlの細胞をカバーガラス上に固定した。実施例８の記載にしたがい、ＡＦＭチップをデンドロン分子で修飾後、脱保護した。リンカー分子およびコンカナバリンＡで官能基化後、細胞表面領域における受容体とリガンドとの間の力を測定しながら、チップによりカバーグラス上に付着した細胞表面をスキャンした。実験は、Nano Wizard（登録商標）原子間力顕微鏡（JPK Instruments, Inc）をバイオＡＦＭとして用い、１×ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）中、室温で行った。
【実施例１４】
【０２４０】
実施例１４−炭水化物と糖タンパク質との間の生体分子相互作用
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）は、肺の上皮細胞のヘパリンに結合するＨＢＨＡ（ヘパリン結合性ヘマグルチニン接着因子）をその表面に有しているため、肺結核を引き起こす。ここで我々は、ヘパリンをリガンドとして用い、結核菌の表面におけるＨＢＨＡの分布を検討する。本実験で用いる細胞は、表面にＨＢＨＡを有するウシ結核菌ＢＣＧ細胞である。
【０２４１】
ソートン培地中、５%ＣＯ２条件下において、３７℃で４８時間培養後、５%マトリゲル溶液を用いて、５×１０４細胞/mlの細胞をカバーガラス上に固定した。実施例８の記載にしたがい、ＡＦＭチップをデンドロン分子で修飾後、脱保護した。リンカー分子およびヘパリンで官能基化後、細胞のある領域における受容体とリガンドとの間の力を測定しながら、チップによりカバーグラス上に付着した細胞表面をスキャンした。実験は、Nano Wizard（登録商標）原子間力顕微鏡（JPK Instruments, Inc）をバイオＡＦＭとして用い、１×ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）中、室温で行った。
【実施例１５】
【０２４２】
実施例１５−神経増殖因子（ＮＧＦ）とチロシンキナーゼＡとの間の生体分子相互作用
ＮＧＦは、神経細胞表面のＴｒｋＡ（チロシンキナーゼＡ）に結合し、その生存機能を制御することが知られている。本研究において、我々は、ＮＧＦをリガンドとして用い、褐色細胞腫ＰＣ１２細胞の表面上に発現したＴｒｋＡの分布を検討する。
【０２４３】
ＲＰＭＩ（５%ＦＣＳ、１%ペニシリン／ストレプトマイシン）中、５%ＣＯ２条件下において、３７℃で４８時間培養後、５%マトリゲル溶液を用いて、５×１０４細胞/mlの細胞をカバーガラス上に固定した。実施例８の記載にしたがい、ＡＦＭチップをデンドロン分子で修飾後、脱保護した。リンカー分子およびリガンドであるＮＧＦで官能基化後、細胞のある領域における受容体とリガンドとの間の力を測定しながら、チップによりカバーグラス上に付着した細胞表面をスキャンした。実験は、Nano Wizard（登録商標）原子間力顕微鏡（JPK Instruments, Inc）をバイオＡＦＭとして用い、１×ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）中、室温で行った。
【０２４４】
現在において実用的な実施態様例であると考えられるものとの関連で本発明を説明したが、本発明は開示した実施態様に限定されず、逆に、添付請求項の精神と範囲内に包含される種々の改変および同等な構成を含むことを意図していることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１Ａ】バイオＡＦＭの概略図である。
【図１Ｂ】バイオＡＦＭの写真である。
【図１Ｃ】バイオＡＦＭの写真である。
【図２Ａ】ＡＦＭ用のカンチレバーの概略図である。
【図２Ｂ】本発明の実施態様の一例に係るＡＦＭ用のカンチレバーのチップの拡大図である。
【図２Ｃ】種々の市販のＡＦＭチップを示す図である。
【図３】ＡＦＭ法を用いた結合および解離力を測定するための、ＡＦＭのプローブチップと基材の標的との接触部分の概略図である。
【図４Ａ】比較的狭い間隔を有する相補的な３０塩基対についての、後退速度１１０nm/sにおける力の分布を示すヒストグラムである。
【図４Ｂ】相補的な３０塩基対についての、後退速度５４０nm/sにおける単分子の結合力の直接測定結果である。
【図４Ｃ】相補的な３０塩基対についての、後退速度５４０nm/sにおける単分子の結合力の直接測定結果である。
【図５Ａ】比較的広い間隔を有する相補的な３０塩基対についての、後退速度１１０nm/sにおける力の分布を示すヒストグラムである。
【図５Ｂ】相補的な３０塩基対についての、後退速度１１０nm/sにおける単分子の結合力の直接測定結果である。
【図５Ｃ】相補的な３０塩基対についての、後退速度１１０nm/sにおける単分子の結合力の直接測定結果である。
【図６Ａ】相補的なＤＮＡ２本鎖についての結合力の分布を示すヒストグラムである。
【図６Ｂ】相補的なＤＮＡ２本鎖についての結合力の分布を示すヒストグラムである。
【図６Ｃ】相補的なＤＮＡ２本鎖についての解離力の分布を示すヒストグラムである。
【図７】単一のミスマッチを有するＤＮＡ２本鎖についての結合力の分布を示すヒストグラムである。
【図８】二重のミスマッチを有するＤＮＡ２本鎖についての結合力の分布を示すヒストグラムである。
【図９】ＡＦＭ用のカンチレバーの概略図およびＡＦＭ用のカンチレバーのチップの拡大図である。
【図１０】（ａ）は、十分な間隔を有するリガンドが連結されたデンドロンで修飾されたＡＦＭチップの概略図であり、（ｂ）は、緊密に充填されたリガンドが連結されたデンドロンで修飾されたＡＦＭチップの概略図である。
【図１１】（ａ）は、デンドロンで修飾されたＡＦＭチップ上にタンパク質を固定化する方法の概略図であり、（ｂ）は、デンドロンで修飾された基材上にタンパク質を固定化する方法の概略図である。
【図１２】ＡＦＭを用いる力測定の方法の概略図である。
【図１３】（ａ）は、ブロッキングタンパク質を用いた、ＡＦＭを用いる力測定のスキームを示す図であり、（ｂ）は、拮抗タンパク質を用いた、ＡＦＭを用いる力測定のスキームを示す図である。
【図１４】（ａ）は、Ｍｕｎｃ−１８−１とＰＬＤ1−ＰＸとの間の相互作用に対する力の分布を示すヒストグラムであり、（ｂ）は、溶液中に含まれる過剰量の遊離のＭｕｎｃ−１８−１の添加後における力の分布を示すヒストグラムである。
【図１５】拮抗タンパク質であるＰＬＣ−γ１の濃度に依存する力を示すグラフである。
【図１６】（ａ）は、リガンドでコーティングしたＡＦＭチップを用い、細胞上の受容体をスクリーニングする方法の概略図であり、（ｂ）〜（ｄ）は、ＦＰＲ１とそれに結合するペプチドとの間の相互作用に対する力曲線を示す図である。
【図１７】（ａ）〜（ｂ）は、細胞上のそれぞれの異なる領域におけるＦＰＲ１とそれに結合するペプチドとの間の相互作用に対する力のマップおよびヒストグラムを示す図である。
【図１８】遊離のＷＫＹＭＶｍ（配列番号１７）を用いてブロッキングする前後における、ＦＰＲ１とそれに結合するペプチドとの間の相互作用に対する力のマップおよびヒストグラムを示す図である。
【符号の説明】
【０２４６】
１５    基台
２０    フレーム
２５    圧電アクチュエータ
５５    管状の圧電アクチュエータ
６０    コントローラ
７５    光源
８０    光源位置検出器
８５    ディスプレイ
９０    カンチレバー基体
９５    基材
１１０    絶縁層
【図１Ａ】
2009505057.tif 000077
【図１Ｂ】
2009505057.tif 000078
【図１Ｃ】
2009505057.tif 000079
【図２Ａ】
2009505057.tif 000080
【図２Ｂ】
2009505057.tif 000081
【図２Ｃ】
2009505057.tif 000082
【図３】
2009505057.tif 000083
【図４Ａ】
2009505057.tif 000084
【図４Ｂ】
2009505057.tif 000085
【図４Ｃ】
2009505057.tif 000086
【図５Ａ】
2009505057.tif 000087
【図５Ｂ】
2009505057.tif 000088
【図５Ｃ】
2009505057.tif 000089
【図６Ａ】
2009505057.tif 000090
【図６Ｂ】
2009505057.tif 000091
【図６Ｃ】
2009505057.tif 000092
【図７】
2009505057.tif 000093
【図８】
2009505057.tif 000094
【図９】
2009505057.tif 000095
【図１０】
2009505057.tif 000096
【図１１】
2009505057.tif 000097
【図１２】
2009505057.tif 000098
【図１３】
2009505057.tif 000099
【図１４】
2009505057.tif 000100
【図１５】
2009505057.tif 000101
【図１６】
2009505057.tif 000102
【図１７】
2009505057.tif 000103
【図１８】
2009505057.tif 000104
【国際調査報告】
2009505057.tif 000105
2009505057.tif 000106