(57)【要約】  グルコース量のより正確な測定を可能とする新規なFAD-GDHを高効率で大量に生産することを課題とする。（ａ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードするDNA；（ｂ）配列番号１９で示される塩基配列からなるDNA；（ｃ）配列番号１９で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするDNA；（ｄ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列をコードするDNA；（ｅ）配列番号３３で示される塩基配列からなるDNA；（ｆ）配列番号３３で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするDNA、からなる群より選択される、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素をコードするDNAが導入されている形質転換体が提供される。また、当該形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素をコードするDNAが導入されている形質転換体：
（ａ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードするDNA；
（ｂ）配列番号１９で示される塩基配列からなるDNA；
（ｃ）配列番号１９で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするDNA；
（ｄ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列をコードするDNA；
（ｅ）配列番号３３で示される塩基配列からなるDNA；
（ｆ）配列番号３３で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
アスペルギルス属又はサッカロミセス属に属する宿主微生物を形質転換したものである、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
アスペルギルス・オリゼを形質転換したものである、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項４】
サッカロミセス・セレビシエを形質転換したものである、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項５】
以下のステップ（１）及び（２）を含んでなる、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法：
（１）請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換体を、前記DNAがコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（２）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
【請求項６】
請求項５に記載の製造法で製造されたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
【請求項７】
請求項５に記載の製造法で製造されたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を含むことを特徴とする、グルコース測定用試薬。
【請求項８】
請求項７に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素（本明細書において「FAD-GDH」ともいう）遺伝子が導入された形質転換体、及び該形質転換体を用いたFAD-GDHの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極、酵素反応層を形成したものである。ここで用いられる酵素としては、グルコース脱水素酵素（GDH）、グルコースオキシダーゼ（GO）などが挙げられる。GOを用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。【０００３】
一方、溶存酸素の影響を受けず且つNAD（P）非存在下でグルコースに作用する酵素としてピロロキノリンキノン（PQQ）を補酵素とするGDH（PQQ-GDH）が知られている（例えば特許文献１〜３を参照）。しかしながらPQQ-GDHには、（１）PQQが酵素から解離しやすいこと、（２）グルコースに対する選択性が低いこと、及び（３）一般に膜画分に存在していることからその抽出・単離操作に困難を伴うことなどの問題がある。【０００４】
ところで近年、病院で簡易血糖自己測定器を使用した患者において低血糖等を発症した例が報告された。その後の調査・分析の結果、PQQ-GDHが輸液成分として含まれるマルトースに反応し、実際の血糖値より高値を示したことが、このような発症例の原因であることが判明した（医薬品・医療用具等安全性情報206号（Pharmaceuticals and Medical Devices Safety Information No.206）、平成16年（2004年）10月、厚生労働省医薬食品局）。このような事情もあって、グルコースに特異的に作用し、特にマルトースへの作用性が低い血糖測定用酵素の開発が切望されている。
尚、PQQ-GDHの他、溶存酸素の影響を受けず且つNAD（P）非存在下でグルコースに作用する酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素（即ち、FAD-GDH）が知られている。これまでに、Aspergillus oryzae（非特許文献１〜４）及びAspergillus terreus（特許文献４）からそれぞれFAD-GDHが取得されている。しかしながら、これらのFAD-GDHの生産量は工業的利用に供するには十分な生産量とは言い難い。
【特許文献１】特開２０００−３５０５８８号公報
【特許文献２】特開２００１−１９７８８８号公報
【特許文献３】特開２００１−３４６５８７号公報
【特許文献４】国際公開第２００４／０５８９５８号パンフレット
【非特許文献１】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 139, 265-276 (1967).
【非特許文献２】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 139, 277-293 (1967).
【非特許文献３】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. General enzymatic properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967).
【非特許文献４】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 328-335 (1967).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者の研究グループは、グルコース量のより正確な測定を可能とする新規なFAD-GDH及びその生産菌を取得することを目的として、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするFAD-GDHに注目した。そして、広く微生物を対象としてスクリーニングした結果、FAD-GDHの生産性に優れたアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）を取得した。また、当該菌株が生産するFAD-GDHを精製することに成功し、その諸性状を決定することにも成功した。決定された諸性状より、当該FAD-GDHが新規な酵素であることを明らかにした。また、当該FAD-GDHがグルコースに対する選択性に優れ、しかも反応系に存在する溶存酸素の影響を受けにくく、試料中のグルコース量のより正確な測定を可能にするものであることを明らかにした。更に検討を進めた結果、上記菌株が保有するFAD-GDHのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の配列を決定することに成功した。これらの研究成果は、既に国際出願されている（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０６０６９４）。【０００６】
本発明は、以上の背景の下、グルコース量のより正確な測定を可能とする新規なFAD-GDHを高効率で大量に生産することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。即ち、アスペルギルス・オリゼBB-56由来のFAD-GDHをコードする遺伝子を解析し、塩基配列の特定の部分がFAD-GDH酵素の至適pH、pH安定性、温度安定性、基質特異性、及び微生物のFAD-GDH生産能、言い換えれば、酵素の機能面及び生産性に影響を及ぼすこと突き止めた。該知見に基づいて微生物の形質転換体を作製した結果、FAD-GDHの生産性が極めて高い形質転換体を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は次の通りである。
［１］以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素をコードするDNAが導入されている形質転換体：
（ａ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードするDNA；
（ｂ）配列番号１９で示される塩基配列からなるDNA；
（ｃ）配列番号１９で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするDNA；
（ｄ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列をコードするDNA；
（ｅ）配列番号３３で示される塩基配列からなるDNA；
（ｆ）配列番号３３で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするDNA。
［２］アスペルギルス属又はサッカロミセス属に属する宿主微生物を形質転換したものである、［１］に記載の形質転換体。
［３］アスペルギルス・オリゼを形質転換したものである、［１］に記載の形質転換体。
［４］サッカロミセス・セレビシエを形質転換したものである、［１］に記載の形質転換体。
［５］以下のステップ（１）及び（２）を含んでなる、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法：
（１）［１］〜［４］のいずれかに記載の形質転換体を、前記DNAがコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（２）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
［６］［５］に記載の製造法で製造されたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
［７］［５］に記載の製造法で製造されたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素を含むことを特徴とする、グルコース測定用試薬。
［８］［７］に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】pFG2の構成。
【図２】pFGP2の構築フロー。
【図３】培養ろ液中のFAD-GDH活性の比較。
【図４】アスペルギルス・オリゼに属する各菌株のFAD-GDH生産能の比較。ＮＤは検出限界以下（No Detectable）。
【図５】アスペルギルス・オリゼBB-56及びRIB40由来のFAD-GDHをコードするDNA配列のアライメント図。
【図６】アスペルギルス・オリゼBB-56及びRIB40由来のFAD-GDHのアミノ酸配列のアライメント図。
【図７】アスペルギルス・オリゼに属する9菌株由来のFAD-GDHをコードするDNA配列のアライメント図。
【図８】アスペルギルス・オリゼに属する9菌株由来のFAD-GDHのアミノ酸配列のアライメント図。
【図９】FAD-GDHの至適pHの比較。（Ａ）アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH、（Ｂ）アスペルギルス・オリゼRIB40由来の組換えFAD-GDH。
【図１０】FAD-GDHのpH安定性の比較。（Ａ）アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH、（Ｂ）アスペルギルス・オリゼRIB40由来の組換えFAD-GDH。
【図１１】FAD-GDHの温度安定性の比較。（Ａ）アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH、（Ｂ）アスペルギルス・オリゼRIB40由来の組換えFAD-GDH。
【図１２】FAD-GDHの基質特異性の比較。表中の数値は、相対活性（％）を表す。
【図１３】形質転換体（酵母）のFAD-GDH生産能の比較。RIB40由来FAD-GDHのcDNAで形質転換した酵母からは菌体外及び菌体内のいずれにおいてもFAD-GDH活性は検出されなかった。。
【図１４】アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHをコードするcDNAで形質転換した酵母の培養上清に含まれるFAD-GDHのSP Sepharoseにおける溶出結果。
【図１５】アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDHをコードするcDNAで形質転換した酵母の培養上清に含まれるFAD-GDHのSP Sepharoseにおける溶出結果。
【図１６】SP Sepharose画分、及び野生型アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDHの糖鎖除去後の電気泳動パターンの比較。レーン1：アスペルギルス・オリゼBB-56精製FAD-GDH（無処理）、レーン2：アスペルギルス・オリゼBB-56精製FAD-GDH（エンドグリコシダーゼＨ処理）、レーン3：アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH（形質転換した酵母で発現、無処理）、レーン4：アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH（形質転換した酵母で発現、エンドグリコシダーゼＨ処理）、レーン5：アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDH（形質転換した酵母で発現、無処理）、レーン6：アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDH（形質転換した酵母で発現、エンドグリコシダーゼＨ処理）
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（用語）
本発明において「タンパク質をコードするDNA」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるDNA、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するDNAのことをいう。従ってコドンの縮重も考慮される。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。本発明の酵素（FAD-GDH）に関して使用する場合の「単離された」とは、本発明の酵素が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該酵素以外の成分を実質的に含まない（特に夾雑タンパク質を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。一方、本発明の酵素が遺伝子工学的手法によって調製されたものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素」と記載した場合は「単離された状態のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素」を意味する。フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の代わりに使用される用語「FAD-GDH」及び「酵素」についても同様である。【００１０】
DNAについて使用する場合の「単離された」とは、もともと天然に存在しているDNAの場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態において共存する他のDNA成分を実質的に含まない。一方、cDNA分子など遺伝子工学的手法によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、dNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「DNA」と記載した場合には単離された状態のDNAを意味する。【００１１】
（FAD-GDHをコードするDNAが導入された形質転換体）
本発明の第１の局面は新規なFAD-GDHをコードするDNAが導入された形質転換体を提供する。本発明の形質転換体では、（ａ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードするDNA、（ｂ）配列番号１９で示される塩基配列からなるDNA、（ｃ）配列番号１９で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするDNA、（ｄ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列をコードするDNA、（ｅ）配列番号３３で示される塩基配列からなるDNA、又は（ｆ）配列番号３３で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードするDNAが外来性の分子として存在することになる。【００１２】
配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、本発明者が同定に成功した、アスペルギルス・オリゼBB-56が保有するFAD-GDHのアミノ酸配列である。配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードするDNAの具体例は、配列番号１９で示される塩基配列からなるDNAである。ここで、一般に、あるタンパク質をコードするDNAの一部に改変を施した場合において、改変後のDNAがコードするタンパク質が、改変前のDNAがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちDNA配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明の一態様では、配列番号１９で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、FAD-GDH活性をもつタンパク質をコードするDNA（（ｃ））が導入されている。ここでの「相同な塩基配列」とは、配列番号１９で示される核酸と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードするタンパク質の機能（ここではFAD-GDH活性）が実質的な影響を受けていない塩基配列のことをいう。【００１３】
相同DNAの具体例は、配列番号１９で示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50%ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1% SDS、10% デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1% SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50%ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1%SDS、10%デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。【００１４】
相同DNAの他の具体例として、配列番号１９で示される塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、FAD-GDH活性をもつタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該DNAがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような相同DNAは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及び／又は逆位を含むように配列番号１９で示される塩基配列を有するDNAを改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同DNAを得ることができる。
相同DNAの更に他の例として、SNP（一塩基多型）に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるDNAを挙げることができる。【００１５】
本発明の形質転換体に導入されるDNAは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって単離された状態に調製することができる。具体的には、適当な糸状菌類、酵母菌類のゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリー、或は糸状菌類、酵母菌類の菌体内抽出液から、本発明の遺伝子に対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ・プライマーを適宜利用して調製することができる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーは、市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。尚、本発明の遺伝子を調製するために用いるライブラリーの作製方法については、例えばMolecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる。【００１６】
例えば、配列番号１９で示される塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばPCR）を利用して増幅及び単離することができる。【００１７】
ところで、本発明者らが同定に成功したFAD-GDH（配列番号２０のアミノ酸配列を有する酵素。以下、「本酵素」という）は以下の性状を備える（詳しくは前出の国際出願PCT／JP２００７／０６０６９４を参照されたい）。まず、本酵素は次の反応、即ち、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ-δ-ラクトンを生成する反応を触媒する。また、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による本酵素の分子量は約100 kDaであり、ゲルろ過による本酵素の分子量は約400 kDa（４量体）である。【００１８】
一方、本酵素は基質特異性に優れ、D-グルコースに対して選択的に作用する。詳しくは、本発明のFAD-GDHはマルトースに対する反応性が極めて低く、D-フルクトースやD-マンノース、D-ガラクトースなどに対する反応性も非常に低い。具体的にはD-グルコースに対する反応性を１００%としたときの、これらの基質に対する反応性はいずれも５%以下である。本発明の好ましい態様ではマルトースに対する反応性は１%以下又は実質的に認められない。更に好ましい態様では、D-フルクトースに対する反応性及びD-ガラクトースに対する反応性のいずれについても１%以下又は実質的に認められない。以上のような優れた基質特異性を有する本酵素は、試料中のグルコース量を正確に測定するための酵素として好ましい。即ち、本酵素によれば試料中にマルトースやガラクトースなどの夾雑物が存在していた場合であっても目的のグルコース量をより正確に測定することが可能である。従って本酵素は、試料中にこのような夾雑物の存在が予想又は懸念される用途（典型的には血液中のグルコース量の測定）に適したものであるといえ、しかも当該用途も含め様々な用途に適用可能であること、即ち汎用性が高いともいえる。【００１９】
上記の通り、本酵素はアスペルギルス・オリゼBB-56株から取得された。尚、当該菌株は以下の通り所定の寄託機関に寄託されており、容易に入手可能である。
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）
寄託日：2006年5月17日
受託番号：NITE  BP-236【００２０】
アスペルギルス・オリゼBB-56から取得された本酵素は、以下の性状を更に備えることが明らかにされた（詳しくは前出の国際出願PCT／JP２００７／０６０６９４を参照されたい）。
(4)至適pH：  7付近
(5)至適温度：  60℃付近
(6)pH安定性：  pH3.0〜7.0の範囲で安定
(7)温度安定性：  40℃以下で安定
(8)Km値：  D-グルコースについてのKm値が約8mM
(9)等電点(pI)：  6.4付近【００２１】
以上のように、本酵素がグルコースに対して選択的且つ高親和性であり、しかも安定性に優れ、グルコースセンサなどへの応用・実用化に適したものであることが判明している。【００２２】
本発明の形質転換体は、典型的には、導入するDNA、又は当該DNAを含むDNAコンストラクト（ベクターの形態を含む）を用いた形質転換（トランスフォーメーション）によって調製される。ベクターによる形質転換の場合、好ましくは発現ベクターを用いる。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列を含む。また、発現を促進させるエンハンサー配列を含むことが好ましい。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。【００２３】
本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。【００２４】
トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann, M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))、Hanahanの方法(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983))、酢酸リチウム法(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989))、プロトプラスト-ポリエチレングリコール法(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984))等によって実施することができる。【００２５】
宿主細胞としては大腸菌などの細菌細胞、糸状菌細胞（例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe））を例示することができる。【００２６】
好ましくは、アスペルギルス属に属する微生物、又はサッカロミセス属に属する微生物を宿主として用いる。アスペルギルス属に属する微生物としてアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）を例示することができるが、酵素タンパク質の正しい発現に必要な機構を有すると考えられる遺伝子供給種であるアスペルギルス・オリゼが最も好ましい。一方、サッカロミセス属に属する微生物として、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、シゾサッカロミセス・ポンベを例示することができるが、サッカロミセス・セレビシエが最も好ましい。【００２７】
（FAD-GDHの製造法）
本発明の第２の局面は、上記の形質転換体を用いてFAD-GDHを製造する方法を提供する。本発明の製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する（ステップ（１））。培養法及び培養条件は、目的の酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、本酵素が生産されることを条件として、使用する形質転換体の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。以下、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。【００２８】
培地としては、使用する形質転換体が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する形質転換体の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のpHは例えば約３〜８、好ましくは約５〜７程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは３〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。【００２９】
培養ステップに続き、産生されたタンパク質（即ち、FAD-GDH）を回収する（ステップ（２））。培養液からFAD-GDHを回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより目的のFAD-GDHを得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的のFAD-GDHを得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。【００３０】
尚、各精製工程では原則としてFAD-GDH活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を既に設定可能な場合にはこの限りでない。【００３１】
FAD-GDHの精製度は特に限定されないが、例えば比活性が50〜160（U/mg）、好ましくは比活性が100〜160（U/mg）の状態に精製することができる。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。【００３２】
（FAD-GDHの用途）
本発明の更なる局面は、上記の製造法で製造されたFAD-GDHの用途に関する。この局面ではまず、FAD-GDHを用いたグルコース測定法が提供される。本発明のグルコース測定法ではFAD-GDHによる酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。本発明は例えば血糖値の測定、食品（調味料や飲料など）中のグルコース濃度の測定などに利用される。また、発酵食品（例えば食酢）又は発酵飲料（例えばビールや酒）の製造工程において発酵度を調べるために本発明を利用してもよい。FAD-GDHでは補酵素であるFADが常にGDHに結合していることから測定に際して補酵素の添加が不要であり、簡便な測定系を構築できる。【００３３】
本発明はまた、上記の製造法で製造されたFAD-GDHを含むグルコース測定用試薬を提供する。当該試薬は上記の本発明のグルコース測定法に使用される。【００３４】
本発明は更に、本発明のグルコース測定法を実施するためのキット（グルコース測定用キット）を提供する。本発明のキットは、上記の製造法で製造されたFAD-GDH含むグルコース測定用試薬の他、反応用試薬、緩衝液、グルコース標準液などを任意の要素として含む。また、本発明のグルコース測定キットには通常、使用説明書が添付される。【００３５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。本実施例では、特に記載しない限り制限酵素およびその他の遺伝子操作用酵素としてタカラバイオ株式会社又は東洋紡績株式会社の製品を用いた。尚、酵素の反応条件等は添付の取り扱い説明書に従った。また、塩基配列の決定はABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）、PCR反応はGeneAmp PCR System 9600（パーキンエルマージャパン社）を用いて行った。また、これらの装置及び本実施例に用いた装置、遺伝子操作用製品について、特に記載しない限りそれぞれの製品に添付の取り扱い説明書の推奨条件に従って操作を実施した。
【実施例１】
【００３６】
＜アスペルギルス・オリゼBB-56の培養＞
以下の手順に従い、アスペルギルス・オリゼBB-56を培養し、FAD-GDHを生産した。以下の組成からなる前培養の培地50mLを300mL容の三角フラスコに分注し、121℃、0.12MPaで20分間殺菌した。当該培地を室温まで冷ました後、アスペルギルス・オリゼBB-56を接種し、30℃、200rpmで3日間培養した。【００３７】
（前培養の培地組成）
酵母エキス（Becton， Dickinson Company）0.2%（w/v）
大豆ペプトン（DMV社）1.0%（w/v）
グルコース（和光純薬工業株式会社）2.0%（w/v）
KH2PO4（和光純薬工業株式会社）0.1%（w/v）
MgSO4・7H2O（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社）0.05%（w/v）
培地pH 5.7【００３８】
FAD-GDHの生産は、以下の組成からなる本培養の培地で行った。当該本培地50mLを300mL容の三角フラスコに分注し、121℃、0.12 MPaで20分間殺菌した。当該培地を室温まで冷ました後、上記前培養の培養液1mLを接種し、30℃、200rpmで4日間本培養を行ってFAD-GDHを生産させた。【００３９】
（本培養の培地組成）
グルコース 15.0%（w/v）
Meast P1G（アサヒフードアンドヘルスケア株式会社）3.0%（w/v）
大豆ペプトン 6.0%（w/v）
KH2PO4 0.3%（w/v）
K2HPO4（和光純薬工業株式会社）0.2%（w/v）
4mM Hydroquinone（和光純薬工業株式会社）
培地pH 6.0
【実施例２】
【００４０】
＜アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHの精製＞
FAD-GDHの精製を以下の条件で行った。上記のようにして得られた培養液を珪藻土ろ過により培養液中の菌体及びその他の固形分を除去した。該操作によって得られた清澄液を限外ろ過膜で脱塩・濃縮した。該濃縮液を90%飽和硫安で塩析処理し、遠心上清を限外ろ過膜により脱塩・濃縮した。該脱塩・濃縮液を10mMマッキルバイン（Mcllvaine）緩衝液pH 5.5で平行化したCM Sepharose Fast Flow（アマシャムバイオサイエンス）にアプライし、FAD-GDHをカラムに吸着させた。10mMマッキルバイン緩衝液pH 5.5でカラムを洗浄後、0.1M NaClを含む10 mMマッキルバイン緩衝液pH 5.5でFAD-GDHを溶出させ、FAD-GDH活性画分を回収した。回収した活性画分を限外ろ過膜で濃縮し、該濃縮液を2.5M硫酸アンモニウムを含む10mM K2HPO4-NaOH緩衝液pH 6.5で平衡化したOctyl-Sepharoseにアプライし、FAD-GDHをカラムに吸着させた。2.5M硫酸アンモニウムを含む10 mM K2HPO4-NaOH緩衝液pH 6.5でカラムを洗浄後、同緩衝液中の硫酸アンモニウムの濃度を段階的に2.0、1.5、1.0、0.5Mに変更することにより、FAD-GDHを溶出させた。FAD-GDHの活性画分を回収し、限外ろ過膜で脱塩・濃縮した。該脱塩・濃縮液を20 mM K2HPO4-NaOH緩衝液pH 6.5で平衡化したDEAE SepharoseTM CL-6Bにアプライし、20 mM K2HPO4-NaOH緩衝液pH 6.5でFAD-GDHを溶出させた。この画分を限外ろ過膜により脱塩・濃縮することにより、FAD-GDHの精製酵素表品を得た。
【実施例３】
【００４１】
＜アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHの部分アミノ酸配列の同定＞
アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHの部分アミノ酸配列を以下のようにして同定した。
（１）FAD-GDHの等電点分画
実施例２で得られた精製FAD-GDH溶液3 mLを透析チューブに入れ、精製水に浸漬し、4℃で一晩、透析を行った。この透析サンプルをグリセロール密度勾配電気泳動に供した。カラム容量110 mL、両性担体（Pharmalyte 3-10 for IEF（アマシャムバイオサイエンス））を使用し、5℃で400 Vの低電圧で48時間通電を行った。通電後、サンプルを回収し、各フラクションのpH及びFAD-GDH活性を測定し、活性画分を集めた。【００４２】
（２）部分アミノ酸配列解析用サンプルの調製
上記（１）で得られた精製FAD-GDHをゲルPAG Mini ”DAIICHI”7.5（第一化学薬品株式会社）を用いたSDS-PAGEに供した。転写緩衝液1（0.3Mトリス（pH10.4）、20%メタノール）、転写緩衝液2（30mMトリス（pH 10.4）、20%メタノール）、転写緩衝液3（40 mM 6-aminohexanoic acid（pH 7.6）、20%メタノール）を転写緩衝液として用い、泳動後のゲルをPVDF膜に転写した。転写後の転写膜をクマシーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue）R-250で染色し、FAD-GDHに相当するバンドを検出し、切り出した。切り出した膜をN末端アミノ酸配列の解析用サンプルとした。同様にSDS-PAGE後のゲルをクマシーブリリアントブルーR250で染色し、FAD-GDHに相当するバンドを検出し、切り出した。該切り出したゲルを内部アミノ酸配列の解析用サンプルとした。解析の結果、N末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列が明らかとなった。
【実施例４】
【００４３】
＜相同性検索＞
N末端アミノ酸配列による相同性検索を以下のようにして行った。特開２００５−１７６６０２により公開されたアスペルギルス・オリゼ RIB40の遺伝子情報のうち全CDS配列を特開２００５−１７６６０２の出願人より入手し、実施例３で明らかになったN末端アミノ酸配列による相同性検索をデータベースソフトウェアKiroku Ver.3（株式会社ワールドフュージョン）を用いて実施した。その結果、グルコースオキシダーゼ前駆体（Glucose Oxidase Precursor）と相同性のあるアミノ酸配列（特開２００５−１７６６０２の配列表における配列番号20494）との間に高い相同性が認められた。この配列（特開２００５−１７６６０２の配列表における配列番号20494）には実施例３で同定したFAD-GDHの内部アミノ酸配列解析と一致する領域も存在していた。これらの事実より、特開２００５−１７６６０２の配列表における配列番号20494（配列番号１）がFAD-GDHのアミノ酸配列に対応することが明らかになった。
【実施例５】
【００４４】
＜アスペルギルス・オリゼBB-56由来の染色体DNAの抽出＞
アスペルギルス・オリゼ BB-56を、YPD培地（1%イースト・エキストラクト、2%ペプトン、2%グルコース、pH 6.5）100 mlを入れた坂口フラスコを用いて30℃で一晩培養した後、培養液をろ過し、菌体を得た。該菌体を凍結乾燥し、該乾燥菌体約0.3gを薬匙1杯の海砂とともに乳鉢を用いて破砕し、抽出バッファー（Extraction buffer（1% hexadecyltrimethylammonium bromide、0.7 M NaCl、50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、10 mM EDTA、1% β−メルカプトエタノール））12mlに懸濁した。室温で30分回転撹拌した後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1, v/v）溶液を添加し、攪拌後、遠心分離（1,500g、5分、室温）して上清を得た。この上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1, v/v）溶液を添加し、攪拌後、遠心分離（1,500 g、5分、室温）して上清を得た。この上清に等量のイソプロパノールを穏やかに添加して遠心分離（20,000 g、10分、4℃）を行った。得られた沈殿（析出した染色体DNA）を70%エタノールで洗浄し、真空乾燥して染色体DNAを得た。該染色体DNAをTE（組成）4 mlに溶解し、10 mg/ml RNase A（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社）200μlを添加し、37℃、30分間インキュベートした。次いで、20 mg/ml Proteinase K,recombinant,PCR Grade（ロシュダイアグノスティックス株式会社）溶液40μlを添加して37℃、30分間インキュベート後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1, v/v）溶液を添加した。攪拌後、遠心分離（1,500 g、5分、室温）し、上清を得た。この洗浄操作を2回行った後、上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1, v／v）溶液を添加して攪拌し、遠心分離（1,500 g、5分、室温）を行った。得られた上清に1/10容量の3M NaOAc(pH 4.8)及び2倍容量のエタノールを添加し、-80℃で染色体DNAを析出させた。析出した染色体DNAを遠心処理（20,000 g、20分、4℃）により沈殿として回収した。回収した染色体DNAを70%エタノールで洗浄後、真空乾燥した。乾燥させた染色体DNAをTE溶液400μlに溶解し、約1 mg/mlの染色体DNA溶液を得た。
【実施例６】
【００４５】
＜合成プライマーの設計＞
特開２００５−１７６６０２の配列表中の配列番号20494で示されるアミノ酸配列（配列番号１）をコードする全鎖長3226 bpのアルペルギルス・オリゼRIB40由来の遺伝子配列（配列番号２）の5'、3'両末端の配列に相当する合成プライマーFG-F、FG-R（配列番号３、４）を合成した。
【実施例７】
【００４６】
＜PCR法によるFAD-GDH遺伝子の増幅＞
実施例５で調製したアスペルギルス・オリゼBB-56由来の染色体DNAを鋳型としてPCR反応を実施した。反応はTAKARA LA Taqを用い、反応液の組成は添付の使用説明書に記載された定法に従った。プライマー（FG-F、FG-R）をそれぞれ0.4μM、鋳型ゲノムを10ng/μlの濃度になるように添加し、PCR反応を実施した。反応サイクルは次の通りとした。94℃で2分反応後、(i)94℃で30秒、(ii)60℃で30秒、(iii)72℃で3.5分からなる(i)-(iii)の反応を35回繰り返し、最後に72℃で10分の反応を行った。反応終了後の反応液を4℃で保存した。
【実施例８】
【００４７】
＜アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH遺伝子の塩基配列解析＞
実施例７のPCR反応液をアガロース電気泳動に供して増幅断片（3241 bp）とプライマーを分離し、GENECLEAN III Kitを（Q-BIOgene社）用いてアガロースゲルから抽出した。抽出した増幅断片をベクターpUC19（タカラバイオ株式会社）のSmaIサイトにサブクローンしてpFG2（図１）を得た。pFG2中のPCR増幅断片、即ち、アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH遺伝子の塩基配列を解析した。上記遺伝子の塩基配列を解析するために、合成プライマーFG-1（配列番号５）、FG-2（配列番号６）、FG-3（配列番号７）、FG-4（配列番号８）、FG-5（配列番号９）、FG-6（配列番号１０）、FG-7（配列番号１１）、FG-8（配列番号１２）、FG-9（配列番号１３）、FG-10（配列番号１４）、FG-11（配列番号１５）、FG-12（配列番号１６）、M13-M5（配列番号１７）、及びM13-RV2（配列番号１８）を作成した。塩基配列を解析した結果、全鎖長3241bpのアスペルギルス・オリゼ BB-56由来FAD-GDH遺伝子の塩基配列が明らかとなった（配列番号１９）。該遺伝子配列より予測したアミノ酸配列を配列番号２０に示した。
【実施例９】
【００４８】
＜アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHの高生産株の取得＞
アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHの高生産株を以下のようにして取得した。
（１）PCR法によるオロチジル酸デカルボキシラーゼ（pyrG）遺伝子の増幅
特開２００５−１７６６０２によりアスペルギルス・オリゼRIB40のpyrG遺伝子の配列情報を入手し、該配列の5'、3'両末端に相当する合成プライマーPYR-F、PYR-R（配列番号２１、２２）を作成した。実施例５で調製したアスペルギルス・オリゼBB-56由来の染色体DNAを鋳型としたPCR反応を実施した。反応はTAKARA LA Taqを用いて反応液組成は添付の使用説明書に記載された方法に従った。プライマーPYR-F及びPYR-Rがそれぞれ0.4μM、鋳型の染色体DNAが10ng/μlとなるように反応液を調製し、PCR反応を実施した。PCR反応条件は、94℃で2分反応後、(i)94℃で30秒、(ii)58℃で30秒、(iii)72℃で2分からなる(i)-(iii)の反応を35回繰り返し、最後に72℃10分の反応を行った。反応終了後の反応液を4℃で保存した。【００４９】
（２）発現ベクターの構築
上記のPCR反応液をアガロース電気泳動に供して増幅されたpyrG遺伝子断片（1884 bp）とプライマーを分離し、GENECLEAN III Kitを（Q-BIOgene社）用いてアガロースゲルから抽出した。抽出したpyrG遺伝子断片の両末端を制限酵素SalI及びHindIIIにより消化した。該制限酵素処理したDNA断片とSalI、HindIIIで処理したpFG2をDNA Ligation Kit Ver.2.1を用いて連結し、pFGP2を作製した（図２）。pFGP2を大腸菌DH5コンピテントセル導入し、大腸菌の形質転換体を得た。【００５０】
（３）遺伝子断片の調製
上記大腸菌の形質転換体を培養し、菌体からプラスミドpFGP2を抽出した。抽出したpFGP2を制限酵素HpaI、HindIIIにより消化後、アガロース電気泳動に供して約5 kbpのDNA断片を分離させ、GENECLEAN III Kitを（Q-BIOgene社）用いてアガロースゲルから抽出した。予想通り、該5kbpのDNA断片は、アスペルギルス・オリゼBB-56由来のFAD-GDH遺伝子とpyrGが連結したDNA断片であることが確認された。【００５１】
（４）アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）BB-56由来のウリジン要求株の取得
アスペルギルス・オリゼBB-56を、YPD培地（1%イースト・エキストラクト、2%ペプトン、2%グルコース、2%寒天、pH 6.5）上で培養し、胞子を着生させた。着生した胞子を0.01%Tween80を含む0.9%NaCl水溶液で懸濁し、胞子懸濁液を得た。胞子懸濁液に紫外線を照射して突然変異を誘発した後、胞子懸濁液を5-フルオロオロチン酸（5-FOA）を含む最少培地（0.052%KCl、0.152%KH2PO4、0.6%NaNO3、0.1%微量元素溶液（0.004%  Na2B4O7・10H2O、0.04%  CuSO4・5H2O、0.08%  FePO4・nH2O、0.103%  MnSO4・5H2O、0.08%  Na2MoO4・2H2O、0.8%  ZnSO4・7H2O）、0.2%ウリジン、1%グルコース、0.052%  MgSO4・7H2O、0.1%  5-FOA、2%  寒天、pH 6.5）上に撒き、5-FOA耐性株を得た。5-FOA耐性株のオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性とオロチジル酸デカルボキシラーゼ活性の有無をBelserらの方法（Methods in Enzymology Vol.51 P.135）により確認し、オロチジル酸デカルボキシラーゼ活性を欠損したウリジン要求性を示す変異株を得た。【００５２】
（５）ウリジン要求株への形質転換
上記で得たアスペルギルス・オリゼBB-56由来のウリジン要求株を、ウリジンを含むYPD培地（1%イースト・エキストラクト、2%ペプトン、2%グルコース、0.2%ウリジン、pH6.5）で30℃、一晩培養後、培養液をガラスフィルターに通して菌体を得、該菌体をプロトプラスト調製液（0.8M NaCl、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 6.0、3 mg/ml YatalaseTM、0.3 mg/ml Novozymes 234（ノボノルディスクファーマ株式会社））に懸濁し、30℃、78rpmで1時間30分処理し、プロトプラスト化処理を行った。該プロトプラスト懸濁液をフィルターでろ過し、ろ液を遠心分離（780g、5分、室温）して沈殿を得た。該沈殿を10mLの0.8M NaClに懸濁し、遠心分離（780g、5分、室温）して得られた沈殿を10mlの0.8M NaClで懸濁した。該懸濁液のプロトプラスト数を顕微鏡観察により計測後、遠心分離（780g、5分、室温）し、沈殿をSol I（0.8M NaCl、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl pH 8.0）に懸濁し、約2x108/mlのプロトプラスト溶液を調製した。該プロトプラスト溶液に1／5容量のポリエチレングリコール（PEG）溶液（25% PEG 6000、50mM CaCl2、10mM Tris-HCl pH 8.0）を添加、混合した。該混合液200μlを分注し、上記で作製したFAD-GDH遺伝子とpyrG遺伝子が連結した5kbpの遺伝子断片の溶液（19μg/μl）13μl を添加、懸濁後、氷中で30分静置した。該懸濁液にPEG溶液（25% PEG6000、50mM CaCl2、10mM Tris-HCl pH 8.0）1mLを添加、懸濁し、室温で15分静置した。更にSolI 8.5mLを添加加、懸濁し、遠心分離（780g、5分、室温）により得られた沈殿をSolI 1.2mLに懸濁し、プロトプラスト懸濁液を得た。該懸濁液0.2mLをシャーレに移した後、再生培地（0.052% KCl、0.152% KH2PO4、0.6% NaNO3、0.1%微量元素溶液、21.86%ソルビトール、1%グルコース、0.052%MgSO4・7H2O、2%寒天、pH 6.5）を注ぎ固化させた。30℃で5日間から7日間培養後、生育した形質転換体を最少培地（0.052% KCl、0.152% KH2PO4、0.6% NaNO3、0.1% 微量元素溶液、1%グルコース、0.052% MgSO4・7H2O、2%寒天、pH 6.5）で単菌分離し、アスペルギルス・オリゼBB-56由来のFAD-GDH遺伝子とpyrGからなる約5 kbpの連結DNA断片が導入されたアスペルギルス・オリゼの形質転換体を得た。
【実施例１０】
【００５３】
＜FAD-GDHの生産性の確認＞
実施例９で得られた形質転換体を培養し、FAD-GDHの生産性を確認した。
（１）形質転換体の培養
以下の組成からなる前培養の培地を三角フラスコに分注し、殺菌した。アスペルギルス・オリゼBB-56、実施例９で得た形質転換体のそれぞれを前記培地に接種し、30℃、200rpmで3日間、前培養を行った。【００５４】
（前培養の培地組成）
酵母エキス（Becton， Dickinson Company）0.2%（w/v）
大豆ペプトン（DMV社）1.0%（w/v）
グルコース（和光純薬工業株式会社）2.0%（w/v）
KH2PO4（和光純薬工業株式会社）0.1%（w/v）
MgSO4・7H2O（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社）0.05%（w/v）
pH 5.7【００５５】
以下の組成からなる本培養の培地を三角フラスコに分注し、殺菌した。冷却後、上記の前培養後の培養液1mLを接種し、30℃、200rpmで4日間本培養を行った。培養終了後、培養液をろ過し、各ろ液のFAD-GDH活性を測定した。【００５６】
（本培養の培地組成）
グルコース15.0%（w/v）
Meast P1G（アサヒフードアンドヘルスケア株式会社）3.0%（w/v）
大豆ペプトン6.0%（w/v）
KH2PO4  0.3%（w/v）
K2HPO4（和光純薬工業株式会社）0.2%（w/v）
4 mM Hydroquinone（和光純薬工業株式会社）
pH 6.0【００５７】
（２）FAD-GDH活性の測定
FAD-GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してD-グルコノ-δ-ラクトンを生成する反応を触媒する。FAD-GDH活性の測定は、下記の反応系で行った。
【数１】
2009069381.tif 000002
【００５８】
尚、式中のPMSはフェナジンメタンスルフェート（Phenazine methanesulfate）を表し、NTBはニトロテトラゾリウムブルー（Nitrotetrazorium blue）を表す。
反応（１）において、グルコースの酸化に伴って還元型PMSが生成し、更に反応（２）において還元型PMSによるNTBの還元により生成したDiformazanを570nmの波長で測定する。
酵素活性は、以下の計算式によって算出される。
【数２】
2009069381.tif 000003
【００５９】
尚、式中のVtは総液量を、Vsはサンプル量を、20.1はDiformazanの0.5μmoleあたりの吸光度係数（cm2／0.5μ mole）を、1.0は光路長（cm）を、Dfは希釈倍数をそれぞれ表す。
0.22%（w/v）トリトンX-100を含む50mM PIPES-NaOH緩衝液pH6.5 2.55mL、1M D-グルコース溶液0.09mL、3mM PMS溶液0.2mL、及び6.6mM NTB溶液0.1mLを混合し、37℃で5分間保温後、上記培養ろ液0.1mLを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行と共に570nmに吸収を持つDiformazanが生成される。1分間あたりの570nmにおける吸光度の増加を測定し、FAD-GDH活性を測定した（図３）。その結果、FAD-GDH活性はアスペルギルス・オリゼBB-56由来の培養ろ液で1.97u／mL、形質転換体由来の培養ろ液では38.8u／mLであった。形質転換により、酵素の生産性は約20倍と大幅に向上した。当該形質転換体をアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）56-Tと命名した。該形質転換体は、以下の通り所定の寄託機関に寄託されており、容易に入手可能である。
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）
寄託日：2007年10月22日
受託番号：NITE  BP-438
【実施例１１】
【００６０】
＜アスペルギルス・オリゼに属する各菌株のFAD-GDH生産能の比較＞
アスペルギルス・オリゼBB-56を含む9種のアスペルギルス・オリゼ、即ち、アスペルギルス・オリゼBB-56、アスペルギルス・オリゼRIB40、アスペルギルス・オリゼIAM2603、アスペルギルス・オリゼIAM2609、アスペルギルス・オリゼIAM2628、アスペルギルス・オリゼIAM2683、アスペルギルス・オリゼIAM2736、アスペルギルス・オリゼIAM2706、及びアスペルギルス・オリゼNBRC30113、のFAD-GDHの生産能を比較した。培養及びFAD-GDH活性の測定は、実施例１及び実施例１０の方法に従った。その結果、アスペルギルス・オリゼRIB40、及びアスペルギルス・オリゼIAM2609由来の培養液では、極微弱にFAD-GDH活性を有しているようであるが、活性は検出限界以下であった（図４）。
【実施例１２】
【００６１】
＜アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH遺伝子とその他のアスペルギルス・オリゼ由来FAD-GDH遺伝子の比較＞
実施例８で明らかとなったアスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHの塩基配列と特開２００５−１７６６０２の配列表中の配列番号20494で示されるアミノ酸配列（配列番号１）をコードする全鎖長3226 bpのアスペルギルス・オリゼRIB40由来の遺伝子配列（配列番号２）とを比較する事によりイントロンを含まないアミノ酸をコードする領域において両者の間には18塩基（6アミノ酸）の非相同な領域があることが明らかとなった（図５、６）。アスペルギルス・オリゼに属する8種の菌株、即ち、アスペルギルス・オリゼRIB40、アスペルギルス・オリゼIAM2603、アスペルギルス・オリゼIAM2609、アスペルギルス・オリゼIAM2628、アスペルギルス・オリゼIAM2683、アスペルギルス・オリゼIAM2736、アスペルギルス・オリゼIAM2706、及びアスペルギルス・オリゼNBRC30113、それぞれの染色体DNAを実施例５の方法に従って調製し、これら染色体DNAを鋳型として、実施例７の方法に従ってPCR反応を実施した。これらPCR反応液を実施例８の方法に従って回収し、合成プライマーFG-1（配列番号５）を用いてアスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH遺伝子とアスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDH遺伝子の18塩基（6アミノ酸）の非相同領域の塩基配列を決定した。これらの遺伝子配列を実施例８で決定したアスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDH遺伝子配列（配列番号１９）と比較した。その結果、配列番号３１に示す塩基配列の部分（対応するアミノ酸配列を配列番号３２に示す）において、実施例１１において活性が検出限界以下であったアスペルギルス・オリゼRIB40とアスペルギルス・オリゼIAM2609のみ18塩基（6アミノ酸）が異なることが示された（図７、８）。
このことより、明らかになった上記18塩基（6アミノ酸残基）は、FAD-GDHの生産及び酵素の安定性に何らかの影響を及ぼしていることが示唆された。
【実施例１３】
【００６２】
＜アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDH遺伝子の形質転換体によるFAD-GDH生産能の検討＞
（１）アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDH遺伝子の増幅
特開２００５−１７６６０２により公開された遺伝子情報からアスペルギルス・オリゼRIB40由来のFAD-GDH遺伝子の配列情報を入手し、その5’、3’両末端の配列に相当する合成プライマーFG-E22（配列番号２３）、FG-R-Sal（配列番号２４）を作製した。FG-E22は制限酵素EcoT22Iの認識部位を有し、FG-R-Salは制限酵素SalIの認識部位を有している。実施例１１で調製したアスペルギルス・オリゼRIB40由来の染色体DNAを鋳型としてPCR反応を実施した。反応はTAKARA LA Taqを用いた。プライマーFG-E22、FG-R-Salをそれぞれ0.4μM、鋳型ゲノムは10ng/μlになるようにPCR反応を調製した。反応は、96℃で2分反応後、(i)94℃で30秒、(ii)53℃で30秒、(iii)72℃で3分30秒からなる(i)-(iii)の反応を35回繰り返し、最後に72℃で10分の反応を行った。反応終了後、反応液を4℃で保存した。PCR増幅断片を制限酵素EcoT22I及びSalIにより消化した後、アガロース電気泳動に供してPCR増幅断片とプライマーを分離し、GENECLEAN III Kitを（Q-BIOgene社）用いてアガロースゲルからPCR増幅断片、即ちアスペルギルス・オリゼRIB40株由来のFAD-GDH遺伝子断片を抽出した。【００６３】
（２）高発現プロモーター断片の調製
特開２００３−３１９７８６で開示している高発現プロモーター遺伝子断片を含むpKF-PCSPbを鋳型としたPCR反応を実施した。反応はTAKARA LA Taqを用いた。プライマーは合成したtaaPf（配列番号２５）、taaEcoT22R（配列番号２６）をそれぞれ1μM、鋳型プラスミドは0.5ng/μlの濃度になるように加えPCR反応を実施した。反応サイクルは94℃で2分の後、(i)94℃で30秒、(ii)60℃で30秒、(iii)72℃で2分からなる反応を30回繰り返し、最後に72℃で10分の反応を行った。反応終了後、サンプルを4℃で保存した。PCR増幅断片を制限酵素EcoRI及びEcoT22Iで消化し、アガロース電気泳動に供してPCR増幅断片とプライマーを分離し、GENECLEAN III Kitを（Q-BIOgene社）用いてアガロースゲルからPCR増幅断片、即ち高発現プロモーター遺伝子断片を抽出した。【００６４】
（３）プラスミドpCS-FGの調製
上記のように調製したアスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDH遺伝子、高発現プロモーター遺伝子断片、及びEcoRI及びSalI処理したプラスミドpUC118（タカラバイオ株式会社）をDNA Ligation Kit Ver.2.1を用いて連結し、プラスミドpCS-FGを構築したpCS-FGを大腸菌DH5株コンピテントセルに導入し、大腸菌の形質転換体を得た。該形質転換体を培養し、GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社）を用いてプラスミドpCS-FGを得た。【００６５】
（４）プラスミドpCFPTの調製
上記のように調製したpCS-FGを鋳型としたPCR反応を実施した。反応はKOD-plusを用いた。合成プライマーFGH-F（配列番号２７）、及びFGH-R（配列番号２８）をそれぞれ0.4μM、pCS-FG鋳型プラスミドを0.5ng/μlの濃度になるようにPCR反応液を調製した。反応サイクルは96℃で2分の後、(i)94℃で30秒、(ii)54℃で30秒、(iii)68℃で3分30秒からなる(i)-(iii)を30回繰り返し、最後に68℃で10分の反応を行った。反応終了後、サンプルを4℃で保存した。PCR増幅断片を制限酵素HindIIIで消化後、アガロース電気泳動に供してPCR増幅断片とプライマーを分離し、GENECLEAN III Kitを（Q-BIOgene社）用いて該増幅断片をアガロースゲルから抽出した。一方、ベクターpPTRI（タカラバイオ株式会社）をHindIIIで消化した後、アルカリホスファターゼ(E. coli C75)で5'脱リン酸化処理した。該5'リン酸化ベクターと上記PCR増幅断片をDNA Ligation Kit Ver.2.1を用いて連結し、プラスミドpCFPTを構築した。該pCFPTを大腸菌DH5コンピテントセルに導入し、大腸菌の形質転換体を得た。該形質転換体を培養し、QIAfilterTM Plasmid Maxi Kit（株式会社キアゲン）を用いてプラスミドpCFPTを抽出した。【００６６】
（５）アスペルギルス・オリゼRIB40株への形質転換
アスペルギルス・オリゼRIB40のプロトプラスト溶液の調製は実施例９の方法に従った。また、プロトプラスへの遺伝子の導入は、導入する遺伝子が1.8μg/μlのpCFPT溶液10μlであること以外は、実施例９の方法に従った。遺伝子導入後のプロトプラストの再生は次のように行った。遺伝子導入後のプロトプラスト懸濁液0.2mLをシャーレに移し、再生培地（0.052% KCl、0.152% KH2PO4、0.6% NaNO3、0.1%微量元素溶液、21.86%ソルビトール、1%グルコース、0.052% MgSO4・7H2O、0.5μg/ml ピリチアミン、2%寒天、pH 6.5）を注ぎプレートとして固化させた。30℃で5日間から7日間培養後、生育したピリチアミン耐性株を0.5μg/mlピリチアミンを含む最少培地（0.052% KCl、KH2PO4 0.152%、0.6% NaNO3、0.1%微量元素溶液、1%グルコース、0.052% MgSO4・7H2O、0.5μg/mlピリチアミン、2%寒天、pH 6.5）で単菌分離し、アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDH遺伝子を染色体上に複数持つ形質転換体＃75を得た。
【実施例１４】
【００６７】
＜アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDHの精製＞
実施例１３で調製した形質転換体＃75を実施例１０の方法に従って培養し、培養液を得た。該培養液5.0Lを用いた珪藻土ろ過により培養液中の菌体及びその他の固形成分を除去した。該操作によって得られた清澄液5.4 Lを限外ろ過膜で脱塩・濃縮すると共に、10mMマッキルバイン緩衝液pH5.0にバッファー交換し、pH 4.7、電導度1.34mS/cmの溶液600mLを調製した。該濃縮液を10mMマッキルバイン緩衝液pH 5.0で平衡化したSP SepharoseTM Fast Flowにアプライし、FAD-GDHをカラムに吸着させた。10mMマッキルバイン緩衝液pH5.0でカラムを洗浄後、0.1M NaClを含む10mMマッキルバイン緩衝液pH 5.0でFAD-GDHを溶出させ、FAD-GDHの活性画分を回収した。FAD-GDHの活性画分を一つに併せ、限外ろ過膜で脱塩・濃縮すると共に、20mM KH2PO4-NaOH緩衝液pH 6.5にバッファー交換し、pH 6.3、電導度2.80mS/cmの濃縮液300mLを調製した。該濃縮液を20mM KH2PO4-NaOH緩衝液pH 6.5で平衡化したDEAE SepharoseTM CL-6Bにアプライし、20mM KH2PO4-NaOH緩衝液pH6.5でカラムを洗浄した。カラムパススルー、洗浄液を全て回収し、カラム未吸着画分を回収した。この画分を限外ろ過膜により濃縮することにより、アルペルギルス・オリゼRIB40由来のFAD-GDHの精製酵素溶液を得た。形質転換による酵素の生産性向上、及び大量の培養液から精製を行うことにより、辛うじて0.01u／mLの精製FAD-GDH溶液を得ることに成功した。
【実施例１５】
【００６８】
＜FAD-GDHの至適pHの比較＞
実施例２で調製したアスペルギルス・オリゼBB-56由来のFAD-GDHと実施例１４で調製したアスペルギルス・オリゼRIB40由来のFAD-GDHの至適pHを比較した。
0.22%（w/v）トリトンX-100を含む100mM マッキルバイン緩衝液（pHを4.5、5.0、6.0、7.0、又は8.0に調整）2.55mL、1M D-グルコース溶液0.1mL、3mM PMS溶液0.2mL、及び6.6mM NTB溶液0.1mLを混合し、37℃で5分間保温後、この混合溶液を150μlずつ96穴マイクロプレートウェルに分注し、アルペルギルス・オリゼBB-56由来又はアスペルギルス・オリゼRIB40由来の精製FAD-GDH溶液5μlを添加して反応を開始した。酵素反応によって生成するDiformazanを570nmの吸光度で測定し、1分間当たりのDiformazanの生成量を測定することにより、酵素活性を測定した。測定はPOWERSCAN HT（大日本製薬株式会社）を用いた。アスペルギルス・オリゼBB-56由来の精製FAD-GDHの至適pHは7付近であり（図９Ａ）、アスペルギルス・オリゼRIB40由来の精製FAD-GDHの至適pHは6.0であった（図９Ｂ）。該結果から、両酵素の至適pHは異なることが示された。
【実施例１６】
【００６９】
＜FAD-GDHのpH安定性の比較＞
アスペルギルス・オリゼBB-56由来又はアスペルギルス・オリゼRIB40由来の精製FAD-GDH溶液をそれぞれ0.1M酢酸緩衝液pH 3、同緩衝液pH 4、0.1Mマッキルバイン緩衝液pH4.5、同緩衝液pH 5.0、同緩衝液pH 6.0、同緩衝液pH 7.0、同緩衝液pH 8.0、又は0.1M Na2CO3-NaHCO3緩衝液pH 9.5で希釈し、各pHにおいて37℃で30分間処理した。各処理液を0.2M KH2PO4-NaOH緩衝液pH 6.5で希釈し、実施例１５と同様の方法でFAD-GDH活性を測定した。コントロールとして0.1M KH2PO4-NaOH緩衝液pH 6.5で希釈した氷冷保存した精製FAD-GDHの活性も測定し、該活性を100%とした相対活性を算出した。その結果、アスペルギルス・オリゼBB-56由来の精製FAD-GDHはpH 3.0-7.0の範囲で80%以上の活性を維持していた（図１０Ａ）。一方、アスペルギルス・オリゼRIB40由来の精製FAD-GDHのpH安定性は、pH 4.0-5.0の範囲でのみ安定であり、安定なpHの幅が狭いことが示された（図１０Ｂ）。
【実施例１７】
【００７０】
＜FAD-GDHの温度安定性の比較＞
アスペルギルス・オリゼBB-56由来又はアスペルギルス・オリゼRIB40由来の精製FAD-GDHを0.22%（w/v）トリトンX-100を含む50mM PIPES-NaOH緩衝液pH6.5で希釈し、各指定温度、即ち4、30、40、50、又は60℃、で20分間処理した。氷中で冷却後、各処理液を実施例１５と同様の方法でFAD-GDH活性を測定した。コントロールとして、熱処理していない酵素のFAD-GDH活性も測定し、該活性を100%とした相対活性を算出した。その結果、アスペルギルス・オリゼBB-56由来の精製FAD-GDHは40℃までほぼ100%の活性を維持していた（図１１Ａ）。一方、アスペルギルス・オリゼRIB40由来の精製FAD-GDHは、30℃以上で活性が急激に低下した（図１１Ｂ）。
【実施例１８】
【００７１】
＜FAD-GDHの基質特異性の比較＞
0.22%（w/v）トリトンX-100を含む50mM PIPES-NaOH緩衝液（pH6.5）2.55mL、1M 基質（D-グルコース、マルトース、ガラクトース、キシロース、マルトトリオース、マルトヘキサオース、又はマルトペンタオース）溶液0.09mL、3mM PMS溶液0.2mL、及び6.6mM NTB溶液0.1mLを混合し、37℃で5分間保温後、この混合溶液を150μlずつ96穴マイクロプレートウェルに分注し、アスペルギルス・オリゼBB-56由来又はアスペルギルス・オリゼRIB40由来の精製FAD-GDH溶液5μl（活性）を添加して反応を開始した。酵素反応によって生成するDiformazanを570nmの吸光度で測定し、1分間当たりのDiformazanの生成量を測定することにより酵素活性を測定した。測定はPOWERSCAN HT（大日本製薬株式会社）を用いた。D-グルコースに対する反応速度を100%とした各基質に対する相対活性を算出した。その結果、アスペルギルス・オリゼRIB40由来の精製FAD-GDHは、グルコースだけでなくマルトース、ガラクトース、マルトヘキサオースに対しても作用することから、アスペルギルス・オリゼBB-56由来のFAD-GDHより基質特異性が低いことが示された（図１２）。【００７２】
以上、実施例１５〜１８の結果より、アスペルギルス・オリゼBB-56由来のFAD-GDH遺伝子配列とアスペルギルス・オリゼRIB40由来のFAD-GDH遺伝子配列の間で一致しない18塩基配列（6アミノ酸）は、酵素のpH安定性、熱安定性、基質特異性に影響を及ぼすことが明らかとなった。
【実施例１９】
【００７３】
＜FAD-GDHのcDNAを導入した酵母の形質転換体の調製＞
（１）アスペルギルス・オリゼBB-56、又はアスペルギルス・オリゼRIB40由来のcDNA調製
以下の組成からなる培地50mLを300mL容の三角フラスコに分注し、121℃で20分間殺菌した。冷却後、アスペルギルス・オリゼBB-56、又はアスペルギルス・オリゼRIB40をそれぞれ接種し、30℃、200rpmで3日間培養を行った。【００７４】
（培地組成）
グルコース15.0%（w/v）
Meast P1G（アサヒフードアンドヘルスケア株式会社）3.0%（w/v）
大豆ペプトン6.0%（w/v）
KH2PO4 0.3%（w/v）
K2HPO4（和光純薬工業株式会社）0.2%（w/v）
4mM Hydroquinone（和光純薬工業株式会社）
pH 6.0【００７５】
培養後の培養液をろ過により回収した菌体を液体窒素で急速凍結し、粉砕した。該粉砕菌体にTRIzol試薬（インビトロジェン株式会社）2mlを加え、更に粉砕した。粉砕菌体を室温に戻し、粉砕菌体の懸濁液を1.5ml容量のチューブに集め、添付の使用説明書に記載された方法に従い、全RNAを得た。次いで、Micro FastTrack 2.0 Kit（インビトロジェン株式会社）を用いて添付の使用説明書に記載された方法に従い、mRNAを精製した。Takara RNA LA PCRTM kit (AMV) ver.1.1を用い該mRNAを逆転写し、cDNA溶液を得た。【００７６】
（２）FAD-GDHのcDNA調製
上記のように調製した2種のcDNAを鋳型としてFAD-GDHのcDNAをPCR反応により増幅させた。反応はKOD-Plusを用い、反応液組成は添付の使用説明書に記載された方法に従った。プライマーはFADGDH-1（配列番号２９）、FADGDH-2（配列番号３０）をそれぞれ1μM、鋳型cDNAとして上記cDNA溶液1μlを反応系に加えPCR反応を実施した。反応サイクルは94℃で2分反応後、(i)94℃で30秒、(ii)60℃で30秒、(iii)68℃で2分からなる(i)-(iii)の反応を35回繰り返した。反応終了後、反応液を4℃で保存した。【００７７】
（３）酵母形質転換体の調製
上記のようにして得られた2種類のFAD-GDHのcDNA断片をそれぞれ制限酵素HindIII及びBamHIにより消化した。制限酵素反応後の反応液をアガロース電気泳動に供して目的断片を分離し、GENECLEAN III Kitを（Q-BIOgene社）用いてアガロースゲルから抽出した。これらDNA断片のそれぞれを、前もって制限酵素HindIII及びBamHIで処理した酵母発現ベクターpYES2（インビトロジェン株式会社）と連結することにより、アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHのcDNAを有するpYESGDHとアスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDHのcDNAを有するpYES2-RFGCを作製した。前記連結は、DNA Ligation Kit Ver.2.1を用いて行った。pYESGDH及びpYES2-RFGCをそれぞれサッカロマイセス・セレビシエINVSc株（インビトロジェン株式会社）に導入し、形質転換体を得た。前記形質転換は、添付の使用説明書に記載された酢酸リチウム法により行った。【００７８】
（４）形質導入されたｃDNA断片の塩基配列の確認
上記2種の形質転換体に目的のｃDNA断片が正しく導入されていることを確認した。上記（３）において得られた制限酵素HindIII及びBamHIで消化した 2種類のFAD-GDHのcDNA断片を制限酵素HindIII及びBamHIで処理したベクターpBR322（東洋紡績株式会社）と連結することにより、(i)アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHのcDNAを有するpGDH、及び(ii)アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDHのcDNAを有するpRFGCを構築した。前記連結は、DNA Ligation Kit Ver.2.1を用いて行った。pGDHとpRFGCをそれぞれ、大腸菌DH5株コンピテントセルに導入し、大腸菌の形質転換体を得た。これら2種の形質転換体をそれぞれ培養し、GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社）を用いてプラスミドpGDH、及びpRFGCを得た。実施例８の方法に従ってpGDH及びpRFGCの塩基配列を決定した。その結果、ｐGDHは、配列番号19のプロモーター配列、ターミネーター配列、及びイントロン配列が抜けた配列（図５上段のｃDNA配列）であって、かつ４番目の塩基配列CがGに置換されたｃDNA断片（配列番号３３）を有していることが確認できた。前記塩基の置換は、制限酵素NcoI認識部位の導入により生じたものである。配列番号３３に対応するアミノ酸配列（配列番号３４）は、配列番号20と2番目のアミノ酸がValに置換されていることのみが異なる。一方、ｐRFGCは、配列番号２のプロモーター配列、ターミネーター配列、及びイントロン配列が抜けた配列（図５下段のｃDNA配列）であって、かつ４番目の塩基配列CがGに置換されたｃDNA断片を有していることが確認できた。前記塩基の置換は、制限酵素NcoI認識配列の導入により生じたものである。以上の結果より、上記（４）で得た酵母の形質転換体は、それぞれ、(i)アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHのcDNA、及び(ii)アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDHのcDNA、が正しく導入されていることが確認された。
【実施例２０】
【００７９】
＜酵母の形質転換体によるFAD-GDHの生産及び酵素生産能の比較＞
実施例１９で得られた2種の形質転換体を培養し、FAD-GDHを生産させた。培養は、添付の使用説明書で推奨されているGalactoseによる誘導培養法により行った。培養後の菌体外及び菌体内におけるFAD-GDHの生産を確認するため、培養上清及び菌体破砕液のFAD-GDH活性を測定した。FAD-GDH活性の測定は、以下のように行った。【００８０】
（FAD-GDH活性の測定）
0.22%（w/v）トリトンX-100を含む50mM PIPES-NaOH緩衝液（pH 6.5）2.55mL、1M D-グルコース溶液0.09mL、3mM PMS溶液0.2mL、及び6.6mM NTB溶液0.1mLを混合し、37℃で5分間保温後、この混合溶液150μlを96穴マイクロプレートウェルに分注し、上記培養上清又は菌体破砕液、即ちアスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHのcDNAで形質転換した酵母又はアスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDHのcDNAで形質転換した酵母の培養上清又は菌体破砕液、5μlを添加して反応を開始した。酵素反応によって生成するDiformazanを570nmの吸光度で測定し、1分間当たりのDiformazanの生成量を測定することにより、FAD-GDH活性を測定した。測定はPOWERSCAN HT（大日本製薬株式会社）を用いた。【００８１】
その結果、アスペルギルス・オリゼBB-56由来のcDNAで形質転換した酵母では、菌体外及び菌体内のいずれにおいてもFAD-GDH活性が検出された。一方、アスペルギルス・オリゼRIB40由来のcDNAで形質転換した酵母では、菌体外及び菌体内のいずれにおいてもFAD-GDH活性は検出されなかった。（図１３）。
【実施例２１】
【００８２】
＜FAD-GDHの精製＞
実施例２０で得られた2種類の培養上清からFAD-GDHの精製を試みた。それぞれの培養上清を、10mM酢酸Na緩衝液pH 5.0を透析外液とした透析に供した。透析後の溶液を10mM酢酸Na緩衝液pH 5.0で平衡化したHiTrapTM SP Sepharose Fast Flow（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）にアプライし、FAD-GDHをカラムに吸着させた。10mM酢酸Na緩衝液pH 5.0でカラムを洗浄後、0.1M NaClを含む10mM酢酸Na緩衝液pH 5.0でFAD-GDHを溶出させ、FAD-GDH活性を示す画分を回収した。FAD-GDH活性の測定は、実施例２０の方法に従った。
その結果、アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHは、その殆どがカラム吸着溶離画分から検出されることが示された（図１４）。一方、アスペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDHは、カラム未吸着画分及びカラム吸着画分のいずれにおいても活性が検出されないことが示された（図１５）。
【実施例２２】
【００８３】
＜FAD-GDHの糖鎖除去＞
実施例２１の精製操作で得られた精製酵素画分のうち、アスペルギルス・オリゼBB-56由来のFAD-GDH活性の比活性が最も高い画分NO.18（図１４）、アスペルギルス・オリゼRIB40由来のFAD-GDHの精製画分NO.18（図１５）、及び実施例２で調製した野生型アスペルギルス・オリゼBB-56由来の培養上清から精製したFAD-GDHを糖鎖除去のサンプルに用いた。各サンプルを0.1Mβ−メルカプトエタノール及び0.02%SDSを含む50mM酢酸緩衝液pH 5.5中で5分間煮沸し、エンドグリコシダーゼH（ロシュダイアグノスティックス株式会社）0.05Uを添加し、37℃で一晩反応させた。反応後、反応液をPhastSystem（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いたSDS-PAGEに供し、使用説明書に添付の方法に従ってゲルを銀染色した。その結果、アスペルギルス・オリゼBB-56由来FAD-GDHをコードするcDNAを導入した酵母は、野生型のアルペルギルス・オリゼBB-56由来のFAD-GDHと同一のタンパク質を生産していることが示された（図１６のレーン1〜4）。一方、アルペルギルス・オリゼRIB40由来FAD-GDHをコードするcDNAを導入した酵母は、FAD-GDHを発現していないことが示された（図１６のレーン5及び6）。【００８４】
以上、各実施例の結果から、アスペルギルス・オリゼBB-56由来のFAD-GDHをコードする遺伝子とアスペルギルス・オリゼRIB40由来のFAD-GDHをコードする遺伝子間で一致しない18核酸塩基（6アミノ酸）は、FAD-GDHの至適pH、pH安定性、温度安定性、基質特異性、及び野生型・形質転換体による酵素の生産能に影響することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の形質転換体によれば、基質特異性に優れたFAD-GDHを高効率で且つ大量に生産することができる。本発明の形質転換体によって生産されるFAD-GDHは、グルコース量をより正確に測定することを可能にし、血糖値の測定や食品（調味料や飲料など）中のグルコース濃度の測定などに好適である。【００８６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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