(57)【要約】  試験流体中の目標の検体、リガンド又は分子の存在を検出するためのセンサは、光透過性基板と、その上に取り付けられた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子のアレイと、ＳＰＲ素子に光を導くように構成された光源と、ＳＰＲ素子を介して伝達された光を検出するように構成された検出器とを具備する。ＳＰＲ素子は、厚さ約１５０ｎｍの金被覆層で約７７０ｎｍの球面直径を有する誘電ポリスチレン球体を含んでもよい。ＳＰＲ素子と基板との間のインターフェースは当該要素に導かれる光の波長より小さい直径をもつピンホールを形成して、マイクロサイズのＳＰＲ素子内で近接場結合モードを生じる。特定の実施例において、ピンホール直径は、１５０−２００ｎｍの間の範囲にある。ＳＰＲ素子全体で試験流体の流れを制御するために、ＳＰＲ素子は、ポンプ及び弁などのマイクロ流体構成要素を取り入れて成型されたＰＤＭＳチップ内に含まれてもよい。マルチチャネルセンサは、単一のマイクロチップセンサでいくつかの目標の存在を検出するために提供されてもよい。マルチチャネルセンサにおいて、ＳＰＲ素子の集合は、いくつかの目標のうちの一つに対して、共通に機能化される。検出器は、目標と結合することを示すＳＰＲ素子の共鳴反応の変化を感知する。
2009520188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験流体中の目標の検体、リガンド又は分子の存在を検出するためのセンサであって、
光透過性基板と、
前記基板の表面に取り付けられた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子であって、前記前記ＳＰＲ素子の露出面は、検出すべき前記目標と結合することができる材料の表面被覆を有する、ＳＰＲ素子と、
前記ＳＰＲ素子へ光を導くように構成された光源と、
前記ＳＰＲ素子に対して、前記ＳＰＲ素子を介して伝達される光を検出するように構成された検出器と
を具備するセンサ。 
【請求項２】
前記ＳＰＲ素子は、外側表面にわたって伝わる定常プラズモン共鳴波のための周期的境界条件を維持することができる幾何学的形状で形成された光透過性ビーズを含む請求項１記載のセンサ。 
【請求項３】
前記ビーズは誘電材料から形成される請求項２記載のセンサ。 
【請求項４】
前記ビーズは１μｍ未満の最大の外側寸法を有する請求項３記載のセンサ。 
【請求項５】
前記幾何学的形状は球状である請求項２記載のセンサ。 
【請求項６】
前記ビーズはＳＰＲ支持材料の層で被覆される請求項２記載のセンサ。 
【請求項７】
前記基板は同じＳＰＲ支持材料の層で被覆される請求項６記載のセンサ。
【請求項８】
前記ＳＰＲ支持材料は金である請求項６記載のセンサ。 
【請求項９】
前記金層は厚さ約１５０ｎｍである請求項８記載のセンサ。 
【請求項１０】
前記ＳＰＲ支持材料は、金並びに前記ビーズおよび前記基板の材料の両方に対して親和性を有する材料の層を含む請求項８記載のセンサ。 
【請求項１１】
前記光源は、前記ＳＰＲ素子へ、前記基板に対して実質的に垂直に光を導くように構成される請求項１記載のセンサ。 
【請求項１２】
光透過性材料で形成され、前記露出面のまわりの流体キャビティ及び前記流体キャビティと連通する流体注入口及び流体排出口を画定するハウジングをさらに具備する請求項１記載のセンサ。
【請求項１３】
前記光源および前記検出器は前記ハウジングに接続される請求項１２記載のセンサ。 
【請求項１４】
前記ハウジングは実質的に透明な成型されたポリマーから形成される請求項１２記載のセンサ。 
【請求項１５】
前記ＳＰＲ素子と前記基板との間のインタフェースにおいてピンホールが画定される請求項１記載のセンサ。 
【請求項１６】
前記光源は、前記ＳＰＲ素子へ、前記ピンホールを介して光を導くように構成される請求項１５記載のセンサ。 
【請求項１７】
前記光源は、前記ピンホールに対向する前記ＳＰＲ素子へ光を導くように構成される請求項１５記載のセンサ。 
【請求項１８】
前記ＳＰＲ素子および前記基板はＳＰＲ支持材料の層で被覆され、前記層は前記ＳＰＲ素子と前記基板との間の前記インタフェースにおいて前記ピンホールを画定する請求項１５記載のセンサ。
【請求項１９】
前記光源からの光は所定の波長で提供され、前記ピンホールは、前記所定の波長未満の直径を有する請求項１５記載のセンサ。 
【請求項２０】
前記光源からの光の前記所定の波長は、前記ＳＰＲ素子の幾何学的形状共鳴特性に依存する請求項１９記載のセンサ。
【請求項２１】
前記光源からの光の前記所定の波長は、前記露出面における前記ＳＰＲ素子の最大寸法に依存する請求項２０記載のセンサ。
【請求項２２】
前記ＳＰＲ素子はＳＰＲ支持材料の前記露出面上の被覆を含み、前記光源からの光の前記所定の波長は、前記ＳＰＲ支持材料の共振波長に依存する請求項２１記載のセンサ。 
【請求項２３】
前記光源からの光の前記所定の波長は前記ＳＰＲ支持材料の前記被覆の厚さに依存する請求項２２記載のセンサ。
【請求項２４】
前記光源からの光の前記所定の波長は前記ＳＰＲ素子の材料の光学的特性に依存する請求項２２記載のセンサ。
【請求項２５】
前記光源からの光の前記所定の波長は前記ＳＰＲ素子の材料の屈折率に依存する請求項２４記載のセンサ。
【請求項２６】
前記基板上に取り付けられた複数の前記ＳＰＲ素子をさらに含む請求項１のセンサ。
【請求項２７】
前記複数のＳＰＲ素子の第１のグループは互いに近接して配置されて第１の機能化されたスポットを形成し、前記第１の機能化されたスポットにおける各ＳＰＲ素子は、検出すべき第１の分子と結合することができる第１の表面被覆を有する請求項２６記載のセンサ。
【請求項２８】
前記複数のＳＰＲ素子の第２のグループは互いに近接して配置されて第２の機能化されたスポットを形成し、前記第２の機能化されたスポットにおける各ＳＰＲ素子は、前記第１の分子とは異なる検出すべき第２の分子と結合することができる第２の表面被覆を有する請求項２７記載のセンサ。
【請求項２９】
前記複数のＳＰＲ素子は素子の複数のグループを含み、各グループは機能化されたスポットを画定し、各々の機能化されたスポットにおけるＳＰＲ素子は、他の機能化されたスポットにより検出されるべき目標とは異なる検出されるべき対応する目標と結合することができる同一の表面被覆を有する請求項２６記載のセンサ。
【請求項３０】
試験流体中の複数の目標の検体、リガンド又は分子の存在を検出するための、光源及び検出器の間に取り付けるためのセンサチップであって
光透過性材料で形成され、試験液体を受けるための流体注入口及び流体排出口と連通する流体キャビティを画定するハウジングと、
前記複数の目標に対応する、別個に機能化された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子のアレイとを具備し、前記アレイは前記流体キャビティ内に配置される共通基板上に取り付けられて前記キャビティ内で試験流体と接触するセンサチップ。
【請求項３１】
前記キャビティを通じて流体を送り込むために前記ハウジング内に取り付けられたマイクロ流体ポンプをさらに具備する請求項３０記載のセンサチップ。
【請求項３２】
前記流体注入口はマイクロ流体弁を含む請求項３１記載のセンサチップ。
【請求項３３】
前記ハウジングは、前記キャビティと連通する少なくとも１つの追加の流体注入口をさらに画定する請求項３０記載のセンサチップ。 
【請求項３４】
前記別個に機能化されたＳＰＲ素子のうち同種のものが、複数の縦列に配置され、
前記ハウジングは、前記縦列において前記ＳＰＲ素子を前記複数の目標のうちの１つと結合するように機能化することができる化学物質を流すために、前記複数の縦列の各々の上に流れチャネルを画定する請求項３０記載のセンサチップ。
【請求項３５】
試験流体中の目標の検体、リガンド又は分子の存在を検出するためのセンサであって、
光透過性基板と、
前記基板上に取り付けられた少なくとも１つのビーズであって、光透過性材料で形成され、前記ビーズの露出面にわたって伝わる定常表面プラズモン波のための周期的境界条件を維持するように構成された形状を有する、少なくとも１つのビーズと、
前記ビーズの露出面及び前記基板を覆う表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）支持材料被覆とを具備し、前記基板と前記ビーズとの間のインターフェースは前記ＳＰＲ支持材料のないピンホールを画定するセンサ。
【請求項３６】
前記ビーズは、前記露光面において前記ＳＰＲ支持材料の共振波長と厳密に等しい最大寸法を有する請求項３５記載のセンサ。 
【請求項３７】
前記ビーズは１μｍ未満の最大寸法を有する請求項３５記載のセンサ。 
【請求項３８】
前記ビーズは誘電材料から形成される請求項３５記載のセンサ。 
【請求項３９】
前記ＳＰＲ支持材料は金、銀又は銅から選択される請求項３５記載のセンサ。 
【請求項４０】
前記ＳＰＲ支持材料は金であり、前記被覆は厚さ約１５０ｎｍである請求項３９記載のセンサ。 
【請求項４１】
前記ピンホールは前記ＳＰＲ支持材料の共振波長未満の直径を有する請求項３５記載のセンサ。 
【請求項４２】
試験流体中の目標の検体、リガンド又は分子の存在を検出するための、光源と検出器の間に取り付けるセンサチップであって、
光透過性基板と、
前記基板上に取り付けられ、前記目標と結合するように機能化される、機能化された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子と、
光透過性材料で形成され、前記ＳＰＲ素子を介して試験流体を流すために流体キャビティを画定し、さらに、前記キャビティと連通する流体注入口及び流体排出口を画定する、ハウジングと、
前記ハウジングと関連付けられ、前記キャビティを介した流体の流れを制御するように作用する少なくとも１つのマイクロ流体構成要素とを具備するセンサチップ。
【請求項４３】
前記マイクロ流体構成要素はマイクロ流体ポンプである請求項４２記載のセンサチップ。 
【請求項４４】
前記流体注入口はマイクロ流体バルブを含む請求項４３記載のセンサチップ。
【請求項４５】
前記ハウジングは、前記キャビティと連通する少なくとも１つの追加の流体注入口をさらに画定する請求項４２記載のセンサチップ。 
【請求項４６】
前記追加の流体注入口はマイクロ流体バルブを含む請求項４５記載のセンサチップ。 
【請求項４７】
前記マイクロ流体構成要素はフィルタを含む請求項４２記載のセンサチップ。 
【請求項４８】
前記マイクロ流体構成要素は予備濃縮モジュールを含む請求項４２記載のセンサチップ。 
【請求項４９】
試験流体中の２つ以上の異なる目標の検体、リガンド又は分子の存在を検出するために機能化されたマイクロセンサを提供する方法であって、
前記目標の各々に対応する２つ以上の帯域において、共通の光透過性基板上に取り付けられた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子を用意するステップと、
前記ＳＰＲ素子の前記２つ以上の帯域の各々に対応する流体チャネルを画定するステップと、
各々の流体チャネルを介して、前記対応する帯域における前記ＳＰＲ素子を前記対応する目標と結合するように機能化することができる機能化化学物質を流すステップとを具備する方法。
【請求項５０】
試験流体中の２つ以上の異なる目標の検体、リガンド又は分子の存在を検出するために機能化されたマイクロセンサを提供する方法であって、
共通の光透過性基板上に取り付けられた複数の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子を用意するステップと、
各々のＳＰＲ素子を、前記ＳＰＲ素子を対応する目標と結合するように機能化することができる化学物質にそれぞれ露出するステップとを具備する方法。
【請求項５１】
各々のＳＰＲ素子を露出する前記ステップは、前記機能化化学物質を適用するためにマイクロスポッタを使用するステップを含む請求項５０記載の方法。 
【請求項５２】
各々のＳＰＲ素子を露出する前記ステップは、複数のＳＰＲ素子上にマスクを提供するステップを含む請求項５０記載の方法。 
【請求項５３】
各々のＳＰＲ素子を露出する前記ステップは、複数の近接するＳＰＲ素子を含むスポットを形成するステップを含み、前記スポット内の全てのＳＰＲ素子が共通に機能化される請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
患者の敗血症を検出する方法であって、
光透過性基板上に取り付けられた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子のアレイを有するマイクロセンサを用意するステップであって、１つ又は複数のＳＰＲ素子の少なくとも１つのグループが敗血症を示す少なくとも１つの対応する分子を検出するように機能化され、前記マイクロセンサはさらに、前記ＳＰＲ素子のアレイを通過する光を検知するように構成された光源及び検出器と、前記ＳＰＲ素子のアレイにわたって流体キャビティを画定するハウジングとを有する、マイクロセンサを用意するステップと、
前記機能化されたＳＰＲ素子のアレイにわたって、前記流体キャビティを介して患者の血液を流すステップと、
前記ＳＰＲ素子のアレイ及び検出器を使用して、前記血液中の前記少なくとも１つの対応する分子の存在を検出するステップとを具備する方法。
【請求項５５】
前記流体キャビティは患者内に配置されたカテーテルチューブに接続される請求項５４記載の方法。 
【請求項５６】
ＳＰＲ素子の２つ以上のグループは、敗血症を示す２つ以上の対応する異なる分子を検出するために機能化され、
前記検出するステップは前記異なる分子のうち１つ又は複数の存在を検出するステップを含む請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
前記検出するステップは、前記対応する分子を定量的に検出するステップを含む請求項５４記載の方法。 
【請求項５８】
試験流体中の複数の目標の検体、リガンド又は分子の存在を検出するためのセンサであって、
光透過性基板と、
前記基板の表面にランダムに分散された、複数の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子であって、前記ＳＰＲ素子の各々の露出面は検出すべき前記目標のうち対応する１つと結合することができる材料の表面被覆を有する、複数のＳＰＲ素子と、
前記ＳＰＲ素子へ光を導くように構成された光源と、
前記ＳＰＲ素子に対し、前記ＳＰＲ素子を介して伝達された光を検出するように構成された検出器とを具備するセンサ。
【請求項５９】
前記検出器はピクセルのアレイを含み、各々のピクセルは、前記ピクセルにおける光の検出に応答して出力を生成するように動作可能である請求項５８記載のセンサ。 
【請求項６０】
前記複数のＳＰＲ素子のうち２つ以上のグループは２つ以上のスポットを画定し、あるグループ内の各ＳＰＲ素子は、前記目標のうち共通の１つと結合することができる共通の表面被覆で共通に機能化されている請求項５８記載のセンサ。 
【請求項６１】
前記検出器はピクセルのアレイを含み、各ピクセルは、前記ピクセルにおける光の検出に応答して出力を生成するように動作可能であり、
前記検出器は、前記基板に対して、少なくとも１つのピクセルが前記２つ以上のスポットの各々と整列されるように配置される請求項６０記載のセンサ。 
【請求項６２】
試験流体中の２つ以上の異なる目標の検体、リガンド又は分子の存在を検出するために機能化されたマイクロセンサを提供する方法であって、
複数の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子を、共通の光透過性基板上にランダムに分散させるステップと、
前記２つ以上の目標の各々に対応する前記基板上の２つ以上のスポットを画定し、前記２つ以上のスポットの各々における各ＳＰＲ素子を、対応する目標を検出するために機能化するステップと、
前記基板上の前記複数のＳＰＲ素子と整列されたピクセルのアレイを有する検出器を提供するステップと、
前記２つ以上のスポットの各々と整列され、その出力が前記対応する目標の検出を示す、１つ以上のピクセルを選択するステップとを具備する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブミクロン表面プラズモン共鳴センサシステムに関する。
関連出願の相互参照
本出願は、「サブミクロンキャビティ表面プラズモンセンサ及びそのマイクロ流体応用」と題する２００５年１２月１６日付けで出願された同時係属の米国仮出願第６０／７５０，８７２号の優先権を主張し、その開示全体を参照により本明細書に組み込む。
政府の利害関係
本発明の開発中における業務の一部は、認可番号ＩＢＭ−００８３６５３による国立科学財団からの政府支援及び認可番号ＮＡＧ２−１６１９によるＮＡＳＡからの政府支援を受けてなされたものである。これらの認可に従って、米国政府は本明細書に開示される発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
医学における大きな傾向は、迅速な臨床診断のためのポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）装置の導入である。これら装置は、患者が心臓症状を示しているか否かを指示するためなどの、スピードが重視される診断のために第一応答者又は医療スタッフによる迅速な診断を可能にする。従来の社内研究所での分析に伴う長期にわたる処理時間及び高額な費用を回避することを意図して、感染症、乱用薬物、脳血管疾患などのその他の適応症のために検査が開発されてきた。現状のＰＯＣデバイスは使い捨て用途のみである。これは多くの用途に適するが、継続した監視デバイスの需要が満たされていない。
【０００３】
初期臨床において必要とされるのは、集中治療患者における感染症の存在を監視し検出することのできるデバイスである。現在、多くの集中治療患者が、すぐには検出されずしばしば敗血症やショックにつながり、結果的に高い死亡率をもたらす感染症を発症している。例えば感染症を示すような患者の血流中の特定のタンパク質標識（マーカー）の濃度を継続的に追跡できるデバイスに対する大きな要求がある。
【０００４】
選択された化学物質や生物学的物質の存在を検出できるデバイスには、サンプル分子と直接的に相互作用して試験分子を示す信号をもたらすバイオセンサが含まれる。バイオセンサは、しばしば、化学的に機能化されて（functionalized）自らを選択可能にする。読み出しは、小さな分子（例えば、グルコース）の場合と同じように電気化学的であってもよいし、タンパク質又やＤＮＡなどの分子に対して蛍光発光又はその他の光学技術を利用してもよい。典型的なバイオセンサは、しばしば連続的な読み出しモードにおいて機能することができ、また、複数回使用することができ、大量の試薬の取り扱いを必要とし通常１回のみの試験結果をもたらす従来の実験室での分析とは異なる。
【０００５】
従来の実験室での分析と比較したバイオセンサによりもたらされる小型化の可能性は、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）試験が、劇的に改善された診断能力を提供し得ることを示唆する。ＰＯＣ試験は次のような利益を有する：治療決定の助けとなる迅速な転換；患者への試験結果の迅速な配布と、それによる医師の作業負荷軽減及び患者満足度の向上；事務処理の軽減とサンプル追跡の簡略化；及び専門技術者の必要性の軽減。パネルとして管理されるＰＯＣ試験はさらなる大きな利益をもたらす。例えば、幾つかの心臓マーカを同時にスクリーニングすることにより、時間が節約され、有用なさらなるデータがもたらされる。様々な種類のインフルエンザのスクリーニングはたった一つの菌株（strains）に対するさらに限定された試験と比較して診断の助けとなる。
【０００６】
少し例を挙げれば、バイオセンサの新たな用途は、食物と水の試験、乱用薬物、生体防御及び「白い粉」の検出並びに獣医学的試験を含む。これらの用途の幾つかは、生体防御措置に関連した超高速の応答時間や、非常に少ない数の大腸菌コロニー形成単位を検出するための食物又は水の検査に必要な高感度などの独特のニーズを有する。典型的な水試験製品は、病原体の存在を示すために１８−２４時間又はそれ以上の間フラスコ内で培養して、色を変化させる必要のある試薬を用いる。これらの製品は非常に効果的であるが２４時間もの長時間の培養時間が問題となり得る。汚染された水が公共上飲用に供給されている場合、病原体の問題が検出されるまで、より長い時間の間その水が使用されることになり得る。水質を継続的に監視する製品であれば、数分間の実際の汚染の間に警告を発することができる。
【０００７】
政府及び軍の機関は、迅速且つインタラクティブに炭疽菌、ボツリヌス中毒症、マラリア、エボラウイルス、リシン及び他の潜在的なテロリスト物質を検出する方法を探求しているので、生体防御は独特の問題を提示する。小包及び封筒において空気または疑わしい「白い粉」から得られる粗いサンプルを拡大して分析するためにリアルタイムＰＣＲを取り入れた高価な試験キットが、米国郵政公社によって現在使用されている。
【０００８】
新しい種類のバイオセンサは、光の金属表面との相互作用から生じる現象を利用する。この現象は「表面プラズモン共鳴」と呼ばれ、異なる誘電率又は反対の符号の誘電率を有する2つの媒体のインターフェースにおいて存在し得る電荷密度（電子雲）の振動を表す。この条件は、通常、誘電体（ガラス）と金属（典型的に金又は銀）との間のインターフェースにおいて満たされる。電荷密度の波（電子雲）が電磁波（入射光子）に関連付けられ、この結合は当該インターフェースにおいて最大に達し、両方の媒体内に向かって指数関数的に減衰する。この結合は、実質的に、表面境界プラズマ波（surface bound plasma wave、ＳＰＷ）である。
【０００９】
ＳＰＷの伝搬定数が誘電体内を伝わる波のそれより常に高いので、この結合は、平面金属−誘電体インターフェースにおいて、入射する光学光子によって直接励起することはできない。したがって、この結合を強化するために、減衰した全反射（ＡＴＲ）、プリズム結合器及び光学導波路、あるいは、回折格子の表面における回折が使用される。光学光子によるＳＰＷの励起が結果としてＳＰＷへのエネルギーの共鳴移動をもたらすので、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が光学光子のエネルギーの共鳴吸収によって現れる。（誘電導波路を使用する典型的なエバネセント場センサより一桁高い）誘電体における電磁場の強い濃度のために、ＳＰＷの伝搬定数、及び結果としてＳＰＲ形成は、ＳＰＷを支持している金属層に隣接する誘電体の光学特性、すなわち光学的にＳＰＲを調べることによって決定され得る誘電媒体の屈折率、の変化に非常に敏感である。感度の領域の厚さは、印加されるエネルギーの波長によって異なるが、一般的に可視光範囲の波長に対しておよそ５００ｎｍである。屈折率は、表面における物質または不純物の存在によって修正される。これは、物質または不純物を高い精度で識別するのに利用できる基本的な効果である。
【００１０】
金属は、負の符号の誘電率を提供することができる物質である。金属は、適切な波長を持つ電磁放射によって励起される場合に構成電子が共鳴する共鳴モードを有する。金は、特に、５１０ｎｍ付近の可視波長で共鳴を持つスペクトルを有する。プリズム結合器における減衰された全反射の場合、エバネセント波は表面のおよそ２００−４００ｎｍの範囲内で媒体と接触する金属面に対して敏感であり、表面プラズモン波の存在によって強化される。そのような物質は、屈折率を、したがって臨界的な減衰された全反射の正確な角度を、効果的に修正する。境界基板とサンプルとの間の相互作用はこうして精査することができ、最大のＳＰＲ生成における反射角度の小さな変化を測定する。
【００１１】
この効果は、分子間、例えばタンパク質間、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ間、またはタンパク質とウイルスもしくはバクテリアとの間の結合を研究するために利用することができる。たとえば、特定の抗体で官能化された（functionalized）表面は、一つの抗原（例えば抗原Ａ）だけを調べて、特異の結合を非特異の結合と区別する。つまり、抗原Ａは検出されるが、表面に結合した官能化されたタンパク質と例えば抗原Ｂなど別の抗原との間のより弱い相互作用は区別することができる。一般的に、数ミリ度（millidegree）の角度分解能が、選択的な結合と選択的でない結合とを区別するのに必要とされる。したがって、１ｐｇ／ｍｌ程度の分解能でのタンパク質Ａの検出を達成し得る。そのうえ、表面のタンパク質と抗原Ａとの間の結合の反応速度論（reaction kinetics）を解明することができる。
【００１２】
大部分の商用ＳＰＲ機器は、金又は銀などの貴金属の薄い層（５０ｎｍ）で覆われている半球状の誘電プリズムを含むサンプル導入装置またはセンサから成る。この金属被覆は、次に、特に目標の検体を結合する分子で被覆される。図１において一般に示されるように、これらの商用デバイスは、測角的に取り付けられた（goniometric mount）光源、アレイ検出器及び様々なコリメーション及びフィルタリングの光学系をさらに含む。
【００１３】
半球状のプリズムを使用すると、誘電体／空気インターフェースにおける入射角は、光源からの光線がプリズムに入る最初の空気／誘電体インターフェースにおけるものと同じである。金属膜において光が非放射性エバネセント波（表面プラズモン）に結合する正確な入射角にて、当該膜の反射率はおよそ９０％減少し、ガラスから離れた金属表面において局在するエバネセントプラズモン場を生成する。エバネセント波の特性は、センサの遊離金属（free metal）表面と接触する媒体（例えば生体分子）の特性に依存する。当該表面上の分子吸収と関連するものなど、媒体の屈折率の微妙な変化は、表面のプラズモン共鳴角度φの検出可能な変化を生じさせる。その後、ＳＰＲ機器は、この新しい角度を検出するために検出器の位置を調節して、ＳＰＲ角度の変化を測定する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
この種のＳＰＲ装置には、感度、サンプルサイズ、複雑さ及びコストを含む幾つかの固有の限界がある。既存の商用機器は、入射ビームと検出器位置を最適化するために、大きくて、複雑で、精巧な可動部分を必要とする。たとえば、光源のための測角的なマウントは、比較的大きくて重いが、精巧である。さらに、光源自体は偏光を提供しなければならない。典型的な感度限度は、１０−６のオーダーの屈折率単位であり、これは１ｐｇ／ｍｍ2の濃度の吸収された分子と少なくとも２００Ｄａの大きさの目標を検出するのには通常十分であるが、特定の政府標準により要求されるような０．０１ｐｐｂ（parts per billion）の濃度のバイオテロ物質（bio terrorism agent）に対する有用な検出を行うためには十分敏感でない。典型的な平面センサのフットプリントは、数ｍｍ２（Biacore Flexichipにおいて１／１６ｍｍ２及びBiacore3000において２．２ｍｍ２）の範囲にあり、これはこれらのセンサを小型化する能力に対する技術的な制約となる。より大きなセンサ領域は、より多くの試験流体が平面センサ上を流れるように供給されなければならないことを意味する。さらに、正確さに対する制約も、検出されるのに十分な分子または微粒子を提供するためにより多くの試験流体を必要とする。ＳＰＲセンサの肉眼で見えるサイズのため、多重化された分析のための検知素子のアレイは、解析積分に使用される大部分の技術にとってあまりに大きなサンプル量を必要とする。従来の平面センサのこれらの制限の全ては、センサのスループット能力を低減する。
【００１５】
その上、大部分の現在のＳＰＲセンサは、ｐ偏光（すなわち、電気ベクトル成分が入射面と平行）と光学部品の正確な位置合わせを必要とし、これは複雑さにおいて卓上用の分光計に匹敵する。これは、典型的には数十万ドルのオーダーの高いコストをもたらす。 
【課題を解決するための手段】
【００１６】
たとえば、生体分子相互作用の分析のためにＳＰＲ技術を使用しているエバネセント波センサは、非侵入性、目標検体、リガンド（ligand）または分子の結合のリアルタイム監視並びに無標識状態（label-free conditions）を含む幾つかの利点を提供する。特に医学診断法、薬剤スクリーニング、生医学的研究及びバイオ分析.の分野において、センサの寸法を減らしつつＳＰＲセンサの感度を増す機構は、非常に望ましい。もう一つの望ましい目標は、センサの寸法を大きくし、応答時間を増加させ、感度を減少させるしばしば壊れやすい機械式の光学部品を取り除くことである。本発明の一態様によれば、伝播しているプラズモン波は定常波で置き換えられ、あるいは、換言すると、ＳＰＲセンサの感度は形状共鳴（shape resonance）を加えることによって高められる。そのような定常波は、共鳴の線質係数（quality factor）に比例する回数だけ活性表面を伝わり、波と結合剤（binding agent）との相互作用の可能性を増加させる。
【００１７】
高度に対称な微細構造の中の光の循環は、しばしばそのような形状共鳴を含む。１０−１００μｍの大きさの誘電体球に対して、ウィスパリングギャラリーモード（whispering gallery mode）として知られる特定の種類の共鳴が起こる。この用語は、ロンドンのセントポール大聖堂のギャラリーの壁に沿ってかすかな音が周方向に導かれる現象との類似に由来する。バイオ分析及び分光への応用は、誘電微小球体と液滴におけるウィスパリングギャラリーモードの強い表面局在化及び高い線質係数の特性を利用することができる。しかし、微小球体のサイズが減少するとウィスパリングギャラリーモードは表面局在性を徐々に失い、一般にウィスパリングギャラリーモードは微小球体環境において無効になる。
【００１８】
サブミクロンのサイズ（すなわち直径が１μｍ未満）について、光の閉じ込めを維持する一つの方法は、球を、表面プラズモン（ＳＰ）を支持する金属膜で被覆することである。金属膜で覆われているそのような微小球体（マイクロスフィア）の一つの特徴は、特定の直径で、キャビティモードと関連した全反射角度が金属膜についてのＳＰＲ角と一致し得ることで、幾何学的に対称な表面上でのより効率的な形式のＳＰ励起をもたらすということである。この特徴は、従来のセンサでみられる偏光光源、光学的位置合わせ及び機械的なスキャンの必要を取り除き、平面センサに課される厳しい幾何学的条件の緩和を可能にする。
【００１９】
本発明は、好ましくはマイクロ流体システムと組み合わせて使用される新規なセンサから成る。マイクロ流体デバイスのような限られたスペースの内部の（バイオ）化学的濃度及び反応速度の測定は非常に困難である。本発明は、金、銀、銅などの表面プラズモンを支持する金属で覆われているサブミクロンの誘電ビーズを検討する。このＳＰＲは、金属シェルにおいて生じる表面プラズモンに結合するセンサ素子の形状（geometry）によって生成される周期的境界条件のために、特定の波長の伝送において、強い増進を示す。本発明のセンサはセンサのまさしくその表面（すなわち、およそ３００ｎｍ以内に）で物質の屈折率の小さな変化に敏感であり、従来の非近接場のセンサ及び検出技術よりはるかに敏感である。
【００２０】
このように、本発明は、幾何学的または形状共鳴によって強化される表面プラズモン共鳴を利用するマイクロキャビティデバイスに関する。本明細書における開示の目的のために、このデバイスは、ここではマイクロキャビティ表面プラズモン共鳴（MＳＰＲ）センサと呼ばれる。以下の説明では、球面キャビティ共振器が選択されるが、定常プラズモン共鳴波が活性表面上を伝わるように境界条件を維持することができる他の対称な幾何学的形状が使用され得ることが理解される。
【００２１】
このように、本発明の一態様では、MＳＰＲは従来のＳＰＲセンサに関連した伝播しているプラズモン波をセンサ素子の活性表面上を伝わる定常波で置き換える。この近接場の結合を達成すべく、誘電キャビティ共振器は、特定の厚みのＳＰＲ支持金属で被覆されている。この金属層は、キャビティ共振器材料の屈折率と共に、キャビティ共振器センサ素子のために一つ（または複数）の共振周波数を確立する。その後、センサ素子の寸法が、この共振周波数に関して決定される。特に、一態様においては、センサ素子は、共振周波数の波長程度の大きさを設定される。
【００２２】
本発明によれば、センサ素子またはビーズ（bead）は、ガラスなどの光透過性基板に取り付けられる。基板とビーズは、金などのＳＰＲを支持する物質で被覆されている。本発明の更なる特徴において、ビーズと基板の間のインターフェースにおいて、コーティング物質のないピンホールが画定される。このピンホールのサイズはセンサの共振波長に対しても調整され、その結果、ピンホール直径はその波長より小さくなる。MＳＰＲセンサは、ＳＰＲ反応を引き起こすように使用可能であるセンサビーズに向けられる光源を更に含む。光源はセンサの共振波長で光を提供し、好ましくは所望の波長において単色である。MＳＰＲセンサビーズを通して送られる光を受けるための検出器を配置して、当該光はビーズの被覆表面に対して、または、ピンホールに対して向けてもよい。
【００２３】
その小さいサイズのために、本発明のMＳＰＲセンサは、マイクロ流体チャネル内部で起こっている（バイオ）化学に関する情報を得るためにマイクロ流体デバイスに組み込まれてもよい。これらデバイスは、少量のサンプルを使用して複数の（バイオ）薬物、ウイルス及びバクテリア並びにその濃度を迅速に検出して定量化できるコンパクトな使い捨てのセンサの製造を可能にする。このように、本発明のMＳＰＲセンサは、医学診断法と治療学（特に敗血症の診断と治療）、化学反応をモニターするための研究所測定器、及び生化学及びバイオ・ハザード（例えばバイオテロリズムや汚染）の検出において重要な用途を有する。
【００２４】
一般に、本発明のMＳＰＲセンサは、（バイオ）薬物との相互作用が、センサの表面と接触するバルク媒体の屈折率を変化させるような用途に適用することができる。機能化された検出器の場合、本発明は、化学的相互作用により、センサビーズの表面を覆い検体又はリガンドと化学的に相互作用することができる自己集合した単分子層の厚み又は小型性の変化が引き起こされるような用途に使用することができる。本発明のMＳＰＲセンサの幾つかの一般的な（制限しない）用途は、以下を含む：
【００２５】
１．マイクロ流体デバイスの内部で検出器を機能化する方法。
２．マイクロ流体チャネル内で分子種相互作用を検出する用途。
３．.小さな分子種を検出する用途。
４．分子間の特定の結合の決定。
５．特定の分子対、例えばリガンド−レセプタ対、リガンド−抗体対、の親和定数と解離定数の測定。
６．マイクロ流体デバイス内の検体の化学濃度の決定。
７．制限された形状の薬物の拡散係数の決定。
８．リアルタイムの、血漿や尿などの体液の分子種の検出と量子化。
９．リアルタイムの、空気と水における（バイオ）薬物またはバイオハザードの検出と量子化。
１０．例えば病状を制御するために、リアルタイムに治療剤の放出を制御する分子種の検出
１１．リアルタイムでの空気または水の中の有害廃棄物または工業用化学薬品の検出。
１２．血漿及び他の体液内のウイルスのリアルタイム検出。
１３．人間及び獣医学的応用における血液化学の決定。
１４．爆薬または爆薬／銃器の残留物の検出。
１５．ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの検出、または、単細胞もしくは多くても数個の細胞のオーダーで、特定のタンパク質との結合またはＤＮＡ／ＲＮＡの検出。
１６．化学又は生化学産業のプロセスの間のプロセス分析及び／又は制御。
【００２６】
本発明の一つの利点は、従来の平面センサに必要な複雑な光学の除去である。たとえば、本発明のMＳＰＲセンサは、低コスト光源からの拡散光を使うことができる。当該光は、偏光させたり、フィルタリングしたり、方向付けしたりする必要がない。本発明は、従来のシステムにおける測角的な取り付けなどの、壊れやすいが大きな光学的位置合わせコンポーネントを必要としない。
【００２７】
本発明のMＳＰＲセンサの更なる利点は、小さなパッケージまたはチップに集積されるその能力にある。本発明のMＳＰＲセンサは、光源と光検出器とをセンサビーズアレイの非常に近くに配置することを可能とし、それによって従来の平面センサに対して本発明のMＳＰＲセンサのプロファイルをかなり低減させる。
【００２８】
本発明の一つの目的は、流体における目標の検体、リガンドまたは分子の存在を検出することができるマイクロセンサを提供することである。更なる目的は、マイクロセンサの検出の感度と速度を高めることである。
【００２９】
本発明のさらにもう一つの目的は、マイクロ環境で高いスループット検出を提供できるセンサを提供することである。本発明の他の目的及び利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の原理の理解を促進する目的のために、図面に示され、以下の詳細な説明に記載される実施例が参照される。本発明の範囲をこれによって制限することは意図されないものと理解される。本発明が関連する分野の当業者であれば理解するように、本発明は、図示した実施例に対する如何なる変更と修正をも含み、本発明の原理の更なる応用例をさらに含む。
【００３１】
本発明の一実施例によれば、図２に示されるように、共鳴マイクロキャビティセンサ（MＳＰＲ）は基板１２上で支持される球状誘電微粒子１０から成る。微粒子は、微粒子と基板の間で定められる近接場ピンホール１６を通じて励起される、ＳＰＲを支持している金などの物質の層１４で覆われている。被覆微粒子から拡散される光は、表面プラズモンモードの結合と関連した強いスペクトル共鳴を呈する。これらの共鳴が、平面表面プラズモンセンサ上の分子結合の研究のために使用される表面プラズモン共鳴などを検知するのに使用することができるが、微小球体共振器のサブミクロンのフットプリント及び高い線質係数という利点を有し、光学位置合わせを必要とする従来のセンサに対して１００倍の改善を与える。
【００３２】
一つには、本発明のセンサが反射よりむしろ光透過によるので、従来の平面センサに対するこれらの重要な改善が達成される。ナノ状態（nano-contexts）の反射光が反射性の基板の表面の反対側で近接場エバネセント波光を与えることが知られている。微粒子１０と基板１２との間のインターフェースにおけるピンホール１６は、基板の表面に向けられた光の波長より小さい直径を有し、そのため、近接場エバネセント波光だけがピンホールを通過する。しかし、ピンホールを通過している光自体は、センサを機能させるのには不十分である。したがって、本発明によれば、ピンホールより上の球面共鳴キャビティを追加することにより、この近接場光を、容易に検知又は観察できる遠距離場の光に変換する。ピンホールの上の対称的な形状をもつ微粒子は、ピンホールを通した共鳴キャビティへの光の伝送を可能にし、微粒子より上に、容易に観察される光透過をもたらす。特定の実施例において、レーザーダイオードは５９０ｎｍの波長で光を提供するので、ピンホール１６は波長より小さい直径、より好ましくは３００ｎｍ未満の直径を持つ。ここに記述される特定の実施例において、ＳＰＲビーズとガラス基板との接触で確立されるピンホールの直径は、７７１ｎｍの直径の誘電微粒子に対して、１５０−２００ｎｍの範囲にある。より小さなピンホール直径がより小さな誘電微粒子の直径に対して生成されると考えられる。
【００３３】
上述のように、本発明のMＳＰＲセンサは、平らな基板面に沿って伝播する表面プラズモン波に依存する従来のＳＰＲデバイスに関連した複雑な光学を必要としない。特に、図２に示されるMＳＰＲセンサは、図１に示されるデバイスのような従来技術のデバイスと関連したＳＰＲ角度の変化を評価するための測角的なマウントの光源またはコリメーション及びフィルタリング用の光学系を必要としない。その代わりに、本発明のMＳＰＲセンサは、基板１２に対して実質的に垂直な、MＳＰＲセンサビーズに送信される光によって照射され得る。さらに、図１の従来技術のデバイスとは異なり、本明細書にて更に詳細に説明されるように、光源は基板のどちらの側に位置してもよい。
【００３４】
さらにまた、従来のデバイスの光学的な制約からこのように解放されることで、本発明のMＳＰＲセンサは、広範囲にわたる周波数において広範囲にわたる光源を利用することができる。本明細書における開示の目的のために、「光」という場合は、可視光波長に限られない。このように、光源（またはより広くはエネルギー源）は、紫外、可視及び赤外のスペクトル範囲において、光を提供する。ＵＶ及びＩＲの範囲外の波長は表面プラズモンセンサで使われることが現在知られていないが、本発明は、本発明のプラズモン共鳴特性が観測される、後に発見される如何なるエネルギー波長も除外しない。
例1：MＳＰＲビーズセンサの製作
以下は、図２に示されるMＳＰＲセンサの研究所製作のための方法の説明である。他の製造技術が特定の応用例にとって可能であるものと理解される。以下の説明は、市販用途のためというよりはむしろ、主に研究使用に適するセンサ向けであるが、同じ原理が商業的に実現可能なセンサを生産するために適用され得ることが理解されよう。
【００３５】
Ｎｏ．１、３０×２４ｍｍ、厚さ１５６μｍの顕微鏡カバーガラスは、ダイヤモンドで分割されて、4つの等しい断片に分けられる。また、２５ｍｍ×７５ｍｍの顕微鏡スライドは、分割されて、2つの等しい断片に分けられる。スライドとカバーガラス（それぞれ図２及び４における１２、６２及び６４）は、周知のＲＣＡクリーニングプロトコル（Ｈ２Ｏ２：Ｈ２Ｏ：ＮＨ４ＯＨ−２：１：２、７０℃まで暖められる）の修正されたバージョンを使ってクリーニングされ、その後、Ｄｌ水の中ですすがれ、Ｎ２で乾かされる。クリーニングされたカバーガラスは、内部に低い真空をつくるために機械式ポンプに接続され得るベル瓶（bell jar）において、乾いた空気中に置かれる。約１０４ビーズ／μＬの、３６０ｎｍ，４８０ｎｍ及び７７０ｎｍの直径を有するポリスチレン微小球体の希釈された液体が前もって準備され、５０μｌの各々の液体が、カバーガラスの各々の断片上に分配される。洗浄液のために、ガラスの表面は、親水性になる。ベル瓶（〜１トール）の真空へ２−３時間露出した後、液体は乾燥し、ビーズはカバーガラスに固定されたままとなり、ビーズのランダムな、単分散層（mono-dispersed layer）を形成する。隣接ビーズの間の平均距離が光学クロストークを回避するために十分に大きい（少なくとも２０−５０μｍ）ように、濃度が選択される。これらのサンプルは、8分間これらをアルゴンプラズマにさらすことによって１５０ｎｍの金層でスパッタ被覆される。
【００３６】
ガラス基板上で１５０ｎｍの金でスパッタ被覆された７７１ｎｍのポリスチレンビーズの電子顕微鏡画像が、図３に示される。スパッタ被覆がビーズ１０とガラス基板１２の間のピンホールインターフェースを生成することができるものと理解される。換言すれば、ピンホールはコーティング物質を実質的に含まない。ビーズセンサの下からの白色光で照射される場合の本発明のＭＳＰＲセンサにより発光される光は、同じ厚みの平らな金層を通して送られる光より１００倍強い。
【００３７】
例２：MＳＰＲセンサを有するマイクロ流体工学チップの製造
本発明の別の実施例によれば、図４に示すチップ５０のようなマイクロ流体チップ内に本発明のセンサを製作するためのプロセスが提供される。同じプロトコルのバリエーションにより、さらに複雑なセンサの製造が可能になる。このプロセスにおいて、MＳＰＲセンサは、好ましい実施例においてはマイクロチップの形式であるハウジングの中に取り付けられる。ＭＳＰＲセンサ用のマイクロチップフォーマットによれば、本明細書に記載されるマイクロ流体工学チップのようなマイクロシステム内にセンサを容易に集積することが可能になる。
【００３８】
この実施例によれば、流体工学チップは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）でのフォトリソグラフィック技術とチップ複製成形を使用して作られる。流体工学デバイスは、ＰＤＭＳチャネル構造を成型するマスターとして、負のトーン（negative tone）のフォトレジストＳＵ−８を使って製造される。マスター基板は、５０ｍｍ×５０ｍｍのガラススライドである。基板はＨＣＩ：ＨＮＯ３（３：１）でクリーニングされ、イオン除去水ですすがれ、Ｎ２で乾燥され、メタノールとアセトン（２：１）で超音波分解され、Ｎ２で再び乾燥される。マスターは、厚さ約１００μｍの一つのＳＵ−８２０７０フォトレジスト層で製造される。フォトレジストは、３０秒の間３０００ｒｐｍでガラス基板上でスピン被覆され、１２０ｒｐｍ／秒でランプ（ramp）される。６５℃で１５分間、そして９５℃で９０分間、ホットプレート上でプリベーク（pre-baking）した後に、フォトレジストは３６５ｎｍの波長の紫外線にさらされる。UV露出システムは、３６０±４５ｎｍを通過させるようにフィルタリングされた高圧Ｈｇアーク灯を備えており、照射線量は３００ｍＪ／ｃｍ２である。露出されたフォトレジストは、６５℃で１０分間、そして９５℃で３０分間同じホットプレート上でポストベークされ、室温に冷やされる。マスターは、その後１０分間現像され、２−プロパノールですすがれ、Ｎ２で乾燥される。
【００３９】
流体のパターンは、ＡｕｔｏＣＡＤ２００４ＬＴを利用して描かれるフォトマスクを通してフォトレジストへ転写され、透明フィルム（transparency）に印刷される。図示した実施例の流体パターンは、2つの同一のチャネル、入力チャネル５６及び出力チャネル５８（幅５ｍｍ、長さ１０ｍｍ）を有する長方形の流体チャンバ５４（１５ｍｍｘ１０ｍｍ）を表す。流体チャンバの深さは、センサを分析するのに使用される６０Ｘ液侵油顕微鏡対物レンズの被写界深度によって制限される。流体チャンバは、図2に示される金層１４で覆われているビーズ１０を保持する基板１２（本例では厚さ１５６μｍ）を収容しなければならない。およそ３００μｍの深さを持っている流体チャンバを提供するために、マスターの流体チャンバ部は、ビーズを保持する基板と同一の一片のガラス基板６２を結合することによって修正される。好ましくは、基板１２と６２は実質的に同じ光学特性と厚さを持つ。
【００４０】
シリコンエラストマーキットは、5分間、１０：１の割合で混合されるポリマーベースと硬化剤を含む。エラストマー混合物を保持するために型のまわりにテープバリアが配置され、エラストマーはマスター上に注がれる。型におけるＰＤＭＳは、流体パターン複製を強化するために1時間の間低い真空（〜１トール）下に置かれ、２０分の間１２０℃で熱することにより硬化される。ＰＤＭＳ基板はそれからマスターから分離され、チャネルへの流体接続のためのアクセスホールが１６Ｇの針でエラストマーを通して開けられる。
【００４１】
ＰＤＭＳチップ５０の流体チャンバの底で、金で覆われているビーズを保持する基板１２は、ＰＤＭＳの滴下（５０μＬ）で、ＰＤＭＳチップ５０の流体チャンバ５４の天井に取り付けられる。基板がＰＤＭＳの型から向きがそれているセンサとともに配置され、流体工学チャンバの内部にさらされる。結合は、９０℃で１０分間ベークされて完了する。
【００４２】
製造されたＰＤＭＳ基板と２５ｍｍ×５０ｍｍのＮｏ．.1カバーガラス６２は、その後、接触の前に４０秒間空気プラズマにさらされた後に、永久に結合される。チップ５０の剛性を増して、流れにおける機械的な摂動を除くために、半分の顕微鏡スライド６４（２５ｍｍ×３８ｍｍ）が、同じ空気プラズマ技術を使用してチップの上に永久に結合される。この例では、センサが２００μｍの作動距離をもつ６０Ｘ油浸液系対物レンズの焦点に持ってこられるように、流体チャンバの深さは一つの特定の実施例で５０μｍよりも小さいと推定される。
【００４３】
例３：マイクロ流体工学MＳＰＲセンサチップの動作
マイクロ流体工学チップ５０（図４）を使う一つの方法では、流体工学チップから注射器または流体ポンプなどの流体液溜（fluid reservoirs）への流体接続は、１．６ｍｍの外径（ＯＤ）ポリプロピレン管を使って作られる。流れは、出力チャネル５８に接続している液溜の高さに対して入力チャネル５６に接続している液溜の高さを調節することによって制御されるか、流体ポンプで制御され、その結果、およそ1μＬ／ｓの安定した流れが達成される。チップが液溜に接続された後、それは、１０ｎｍの精度でセンサチップをスペースに置くことができる全３方向（3D）に運動可能な圧力駆動ステージに置かれる。全体の集合は倒立顕微鏡の下に置かれ、４０Ｘ及び６０Ｘの顕微鏡対物レンズが単一のセンサから来ている信号を集めて分析するのに用いられる。
【００４４】
MＳＰＲセンサ５０の機能と感度は、図５に示される実験設備を使って評価されてもよい。一つの実験では、蒸気に対するセンサの感度が試験される。センサを保持する基板は、１０ｎｍの精度でセンサをスペースに置くことができる３Ｄ圧力駆動ステージに置かれる。全体の集合は倒立顕微鏡のステージに置かれ、４０Ｘの顕微鏡対物レンズが単一のセンサから来ている信号を集めて分析するのに用いられる。センサから来る光は、データ取得インターフェース部によって駆動されるモノクロメータに、パラレルポートを通して供給される。４００ｎｍから８００ｎｍまでの可視範囲のスペクトルは、２ｎｍの分解能及び１秒の検出器集積時間で、ＰＣ上で記録することができる。
【００４５】
一つの実施例によれば、実験設備はセンサの近くに置かれるバブラー（bubbler）に接続しているチューブを含み、Ｎ２は水と２００プルーフ（proof）のエタノールの溶液（２：１）を通して取り除かれる。蒸気は、刺激に対するセンサの反応をチェックするために、定期的にオン／オフされる。
【００４６】
図６ａで示すように、ドライセンサ（dry sensor）とウェットセンサ（wet sensor）により発光される光のスペクトルが記録される。図６ｂで示すように、好ましくは、蒸気濃度に最も敏感なピークが、透過光の時系列を記録するために選択される。(両方のグラフの中の横座標は、ＳＰＲビーズとビーズを囲んでいる平面膜の間での光強度の比率に対応する。)図６ａのグラフは、水（周囲の空気における５０％の湿気に対応する連続線）とエタノール蒸気吸収（蒸気アクセスが開かれた状態での７５−８０％の湿気に対応する点線）のために、７７１ｎｍの金コーティングされたビーズを通して送られる光のスペクトルシフトを示す。図６ｂのグラフは、５０％と８０％の間での周期的な湿気変化に対する測定されたセンサ応答（波長=７１５ｎｍ）を示す。矢印は、蒸気アクセスが開かれた瞬間（下）又は閉じられた瞬間（上）を表す。
【００４７】
センサが実際に表面の修正に敏感なことをさらに確かめるために、エタノールからのアルカンチオール吸着が、プローブとして使用されてもよい。単一の単分子層の形成が１０ｍＭの濃度で約１００分間生じることが知られている。図７ａにおいて、スペクトルの比較が、同じ状況に対して平面の金の膜のスペクトル透過とともに提供される。平らな膜を通してのスペクトル透過のシフトは、球面キャビティＳＰＲセンサが記録することになっている信号より小さい。本発明の球面キャビティセンサは、このように、従来技術の平面膜センサより敏感である。ドデカンチオール溶液がまじりけのないエタノールで流された（flushed）後に図７ａのスペクトルシフトが持続し、アルカンチオールの不可逆の吸着が起こったことを示す。当該シフトは、このように、金の表面における単分子層の形成による。吸収動態（absorption kinetics）の測定と一次の指数関数的な減衰によるフィッティング（図７ｂ）のもとで、１００ｍＭのドデカンチオール濃度における３８２±７ｓのフィルム形成に対して時定数が見出される。図７ｂの信号が厚さおよそ１．５ｎｍの単一の単分子層に対応するが、信号対雑音比は単分子層の一部の結合を見つけるのに十分なほどよいことに留意すべきである。
【００４８】
例４−代替的なMＳＰＲセンサ構成
上述した例１において、センサはピンホール１６（図２）を通じた刺激に応答した。代替的な実施例においては、図８に示されるように、センサはセンサレイのヘッドを介した励起用に構成される。この実施例では、２４ｍｍ×５０ｍｍ及び厚さ１６０μｍのＮｏ．  １のカバーガラスが、基板として使用される。ＮＩＳＴ標準ポリスチレンの７８０±５ｎｍの直径のビーズが、メタノール内におよそ１０４ビーズ／μｌの濃度で提供された。(メタノールは、水と比較して非常に低い表面張力係数を持ち、したがって適当なランダムに単分散された（mono-dispersed）ビーズのアレイを生産するので、メタノールはこの例で選択された。)本例において、７０μｌのビーズ溶液が各々のカバーガラス上に分配され、およそ５０００ビーズ／ｍｍ２のビーズ密度が提供される。１時間の間1トールの真空で乾燥した後に、基板は長さおよそ１０ｍｍで幅３ｍｍのマスクされた領域において１４０−１５０ｎｍの金の層でスパッタ被覆された。基板は、センサがクリーンであることを確実にするために、およそ３分間空気プラズマで焼かれた。基板とＰＤＭＳ型（モールド）の両方は、接触の前に空気プラズマに４５秒間露出された。
【００４９】
図8に反映されるように、この実施例では、MＳＰＲセンサは、ランダムなビーズアレイにわたって流体を流れさせるマイクロ流体工学構造内に配置される。当該構造は、幅１００μｍで深さ２０μｍの共通チャネルに接続された幅５０μｍ、深さ２０μｍの2つのマイクロ流体工学チャネルをもつＴ字形として構成されてもよい。MＳＰＲセンサは、共通チャネル内に配置される。このマイクロ流体工学構造は、ＰＤＭＳエラストマーに形作られ、2つの流れチャネルにアクセスするためにエラストマー内に穴が形成される。流れチャネルは、異なる高さに配置された2つの対応する液溜に接続している。この例では、チャネルを通しての流れは、このように静水圧によって単純に達成され、１００μｍ／秒のオーダーにある。もちろん、他の実施例または商業的な変形において、マイクロ流体工学構造を介した流体の流れは、任意の方法、例えば流体ポンプにより、達成され得る。
【００５０】
この例では、再び図８で示すように、いくつかのMＳＰＲセンサが、マイクロ流体工学デバイスの共通チャネルのフロアに取り付けられる。（前例の場合のように）ピンホールを通してセンサを照射するよりはむしろ、センサはデバイスのヘッド、すなわち、ビーズの球面を介して照射される。図８の実施例がより大きな信号対雑音比を経験したことを除き、この例のセンサは図２で示される例におけるそれに類似した共鳴応答を示した。
【００５１】
図８の実施例の一つの利点は、マイクロ流体工学チップの封入が容易になるということである。本発明のマイクロ流体工学チップを封入するために、ガラス基板とＰＤＭＳ型の両方は、2つの媒体を結合するために化学構造を修正する空気プラズマにさらされる。MＳＰＲセンサが非常に小さく、ビーズの間の間隔が１０−１００μｍの範囲にあるので、スパッタ被覆などにより金の層を適用することは問題がある。特に、金の層をガラス基板にでなくビーズだけに適用することは難しい。他方、金はガラス基板に接着しにくい。本例の実施例によれば、連続的でコンパクトな金層をセンサビーズとセンサの底のガラス基板上へ被覆することが可能である。ガラスと金の両方に対して親和性を有する物質の層が、ガラス基板に加えられてもよい。特定の実施例において、当該物質はおよそ１−５ｎｍの厚さで塗布されるクロミウムであってもよい。あるいは、基板が金と基板の間の接着を改善するために化学的な処理を受けてもよい。その後、ＰＤＭＳを適用することができ、センサ間のマイクロチャネル中をよく流れる。一晩中８０−１００℃でＰＤＭＳ型をポストベークすることにより、ポリマーを硬化させて、ガラス基板上にスパッタされた金層を浸透し得る如何なる揮発性物質又はルーズなポリマー鎖（loose polymer chain）でも除去する。
【００５２】
例５−MＳＰＲセンサの機能化
図２と図８に示されるセンサの金表面上の共有結合機能化により、センサを異なる目標検体、リガンドまたは分子、特に関心の高い生体分子で覆うことが可能となる。以下の開示の目的のために、用語「目標」は、一般的に、センサで検知されることを意図された目標検体、リガンドまたは分子に言及するのに用いられる。これらの「目標」が、ウイルス、バクテリア、非生物学的薬物などの生体分子以外の要素だけでなく、タンパク質、ＲＮＳ、ＤＮＡと酵素のような生体分子を含むものと理解される。しかし、これら「目標」は、本発明のMＳＰＲセンサで提供される他の分子と結合して、センサの共鳴特性に効果を及ぼす方法でそのようにする能力があるものと理解される。
【００５３】
本発明の特定の実施例によれば、金層の機能化（functionalization）は、タンパク質に対して共有結合的に反応するそれぞれの単分子層の形で、2つの異なる化学的性質によって本例で達成される。最初の化学的性質はジチオビス（Dithiobis、N−スクシンイミジル（succinimidyl）プロピオン酸塩）（ＤＳＰ、ＤＴＳＰ）であり、Lomantの試薬として知られ、また、ジスルフィド基を介して金表面上で吸着する両端の（homobifunctional）チオール開裂可能な架橋剤である。ＤＰＳは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶ける非常に疎水性の化合物である。水溶性架橋剤スルホＤＰＳ（ＤＴＳＳＰ）は、ＤＭＳＯまたはＤＭＦと金表面との間の相互作用を回避するのに用いられる。機能化反応は、図９に示される。特に、ジスルフィド結合は壊れて、金表面と反応する。
【００５４】
ＤＴＳＳＰは、タンパク質反応性の半安定したアミン反応性ＮＨＳ−エステル（NHS-ester）である。この例では、反応は、2つの異なる機能バッファ−リン酸塩バッファｐＨ５．８とＤｌ水−を使って評価される。この反応速度は、１０５±８秒の時定数及び５．５の信号対雑音比における２８１．５２Ｄａ且つ厚さ約０．６ｎｍの単分子層分子をもたらす。
【００５５】
MＳＰＲセンサの機能化のために使われる第２の化学的性質は、試薬を結合するカルボジイミド（carbodiimide）を含む。この化学物質と関係している反応は、３つのステップで生じる。.図１０ａで示すように、第１ステップは、金表面とのゼロ架橋剤の反応である。第１ステップにおいて、架橋剤は、金の存在で簡単に壊れるジスルフィド結合を持つ3,3'-ジチオジプロピオン（Dithiodipropionic）酸（ＤＴＤＰＡ）である。この架橋剤は、カルボジイミド結合を許容するカルボキシル基で終わる。ＤＴＤＰＡ反応速度は、センサの表面で、１０４Ｄａと０．５ｎｍの単分子層のみの分子を生じる。カルボジイミドメディエータ（mediator）1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）は、求核試薬（nucleophiles）と容易に反応するために使用される。ＥＤＣが非常に速く加水分解することができるので、ＥＤＣ溶液はエタノールで用意される。同じ溶液はまた、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Hydroxysuccinimide）エステル（ＮＨＳ）のようなアミン反応性エステルを含む。図１０ｂで例示される複雑な反応において、ＥＤＣとＮＨＳは、カルボン酸をアミンによる攻撃の影響を受けやすい反応性中間体に変換するカルボジイミド結合反応を促進する。したがって、最終的な生成物は、タンパク質をMＳＰＲセンサの表面に結合するように反応し準備されているアミンである。
【００５６】
この第２の化学反応の反応速度は、１６．２の信号対雑音比において２８．５±０．９秒の推定された時定数でゼロ架橋剤上に９８．１Ｄａ及び厚さ約０．５ｎｍの単分子層を形成することが分かった。
【００５７】
例６ − 機能化されたＳＰＲセンサと結合するタンパク質
本発明のセンサの一つの重要な応用例はバイオセンサとしてのものである。したがって、例５において記述される方法で機能化されたセンサは、機能化された化学的性質（chemistries）に結合することができる特定のタンパク質分子を検出するのに用いることができる。2つの重要な生体分子は、グルコースオキシダーゼ（Ｇｏｘ）とグルコース（Ｇｌｕ）である。
【００５８】
Ｇｏｘは、１６０，０００Ｄａの総ＭＷを有する２つの同一のサブユニットからなる非常に大きな分子である。したがって、Ｇｏｘは大きな分子の結合に反応するＭＳＰＲセンサとマイクロ流体デバイスの能力を評価するために、良い試験を提供する。Ｇｏｘは、特定の配向において金に結合し、異なる配向において、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化された金表面に結合することが知られている。この例では、上述のように、ＭＳＰＲセンサの金表面がアミン反応性ＮＨＳ−エステル基で一旦活性化されると、タンパク質に対する反応は簡易になるが、反応時定数はタンパク質の寸法に依存する。ＤＴＳＳＰ機能化されたセンサに対して、反応時定数は、３．８５の信号対雑音比で５６２±３５秒であると分かった。この反応により、約１０ｎｍの厚さの単分子層でセンサ面が覆われた。この反応において、本発明のＭＳＰＲセンサが一つのＳＰＲセンサあたり４２ゼプトモルの感度を示し、又は一つのＭＳＰＲセンサあたり６．７フェムトグラムの検出能でセンサをカバーするＧｏｘ質量として表されることが決定された。この手順のバリエーションは、ＰＢＳ１Ｘにおけるβ−Ｄ＋グルコース１００ｍＭの流れ、（人の血液中の通常のグルコース濃度をシミュレートするための）ＰＢＳ１ＸにおけるＧｌｕ１ｍＭの流れ、Ｌ形グルコースの流れ、又は２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤｘＧｌｕ）の流れの影響下でＧｏｘの活動を監視するために実施された。本例のデバイスは、β−Ｄ＋グルコース１００ｍＭ及び１ｍＭの存在下でＧｏｘの酵素活性を検出することができた（後者については反応がより遅かったこと以外は）が、Ｌ形グルコース又は２−ＤｘＧｌｕにさらされたＧｏｘについては、酵素活性反応は記録されなかった。
【００５９】
上記の例は、重要なタンパク質のような生体分子を含む大小の目標を検出する際における本発明のＭＳＰＲセンサ及びマイクロ流体工学の特性の有効性を示す。特に、本発明のＭＳＰＲセンサは、１μｍ未満のフットプリントをもつように構成することができ、標識されていない目標のゼプトモルの特定の結合を検出することができる。本発明によれば、光学設定における光源はレーザーダイオードであってもよい。一例において、選択されたレーザーダイオードは５９０ｎｍの波長で共鳴した。しかし、他の小さなレーザーダイオードが他の波長で使用することができると考えられる。６３２．８ｎｍの波長におけるレーザーダイオード共鳴が本発明のＳＰＲセンサの性能を最適化するのに役立ち得ると考えられる。
【００６０】
上記のレーザーダイオード以外の光源が使用されてもよい。たとえば、特定の代替的な実施例において、光源は、透過光を望ましい波長に制限するように動作可能な光学フィルタを含んでもよい。光学フィルタは、ＭＳＰＲセンサの設置の時点で特定の共振周波数に調整されてもよい。あるいは、光学フィルタはセンサの検出器側に配置されてもよい。
【００６１】
光学検出器の選択により、本発明のＭＳＰＲセンサの機能と効率を強化することができる。一つの特定の実施例において、検出器は、低暗電流シリコン・アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）光子計数（photon counting）検出器であってもよい。あるいは、同時に複数の目標を検出するために、ＣＣＤカメラまたは他のピクセル指向装置が使用されてもよい。検出器及び関連する電子機器は、センサを調整するために、ＭＳＰＲセンサについて基準となる共鳴ピークを決定することができる。使用中、検出器は、共鳴ピークが（赤方又は青方に）シフトされたかどうかを決定してもよい。そして、それは目標がＭＳＰＲセンサの共鳴表面と結合したことを直接的に示す。
【００６２】
発明は、定性的な−すなわち、特定の目標の存在を単に検出する、又は定量的な−すなわち、目標のレベルまたはレベルの変化を検出する検出器を意図する。後者の場合、定量分析は、時間とともに検体濃度の変化を測定するために特に有益となり得る。たとえば、患者の血液中の特定の毒素について、単に別個の瞬間的なレベルではなく、その変化をモニターすることができ、それによって有害な病状の早めの診断が容易になる。敗血症の発見に関してここでの例は、この定量的アプローチから利益を得ることができる。同様に、自宅において血糖値の定量的監視が、糖尿病状態の早期発見のために使用されてもよい。
【００６３】
上述の実施例において、ＭＳＰＲビーズ及びガラス基板上へ金層がスパッタ被覆される。金とガラスの間の接着力が弱く、クロミウムはガラスとよく結合し金はクロミウムとよく結合するので、製造プロセスは、金層を付加する前にガラス上へクロミウムの薄い層をスパッタすることを含んでもよい。高スループットの製造のために、両方の層は、基板のまわりで真空を打破する必要を回避するために、双頭のスパッタ被覆器によって塗布されてもよい。
【００６４】
上記の例において、マイクロ流体デバイスを介する流体の流れは、静水圧のみによって達成された。代替的に、マイクロ流体工学センサチップは、流体の流れとサンプル送出を制御するために、マイクロ弁と蠕動ポンプ（peristaltic pump）を取り入れてもよい。このマイクロ流体工学技術の使用は本発明のマイクロ流体工学センサが２μｌのオーダーの少ないサンプル量を処理することを可能にする。したがって、本発明の一つの実施例によるマイクロ流体工学ＭＳＰＲセンサは、図１１で示すように構成されてもよい。センサ７０は、その上にＴ字状のマイクロ流体工学構造７４を取り付けられたＭＳＰＲ基板７２を含む。Ｔ字状構造７４は、当該構造のチャネル７５ａ、７５ｂから共通チャネル７６へ、ＭＳＰＲセンサ上で流体を方向付けるために、上述の方法で動作する。マイクロセンサ７０の第2のレベルは、流体制御構成要素を含む。特に、マイクロ流体ポンプ７８は、共通チャネル７６の放電端において提供される。特定の実施例において、ポンプは、蠕動性であってもよく、熱的であってもよく、圧電駆動型であってもよい。各々のチャネル７５ａ、７５ｂには、対応するマイクロ弁７９ａ、７９ｂが備えられ、それぞれのチャネルを通じた共通チャネル７６への流体の流れを制御する。他のチャネル７５ｂと弁７９ｂが機能化溶液の流れを制御する一方、例えば図１１に示されるマイクロセンサ７０などの単一の検体検出センサにおいて、一つのチャネル７５ａと弁７９ａは共通チャネルへのサンプルの流れを制御する。
【００６５】
マイクロ流体工学構成要素は、ＭＳＰＲセンサアレイを機能化して流体サンプルを分析するために所定のシーケンスで動作するように電子的に制御されてもよいと考えられる。特に、上述した機能化構成要素などの機能化溶液をチャネル７５ｂを介して導入することができるよう、弁７９ａは閉じられてもよいし、弁７９ｂは開かれてもよい。ＳＰＲセンサが一旦機能化されると、バッファ溶液がチャネル７５ｂを通して導入されてもよい。その後、チャネル７５ａを介してサンプル流体を受け入れて完全に機能化されたＳＰＲセンサアレイに接触するために、弁７９ｂは閉じられてもよいし、弁７９ａは開かれてもよい。もちろん、サンプル分析−すなわち、予めパッケージされた生物学的マイクロセンサの用意−とかけ離れた機能化ステップが起こり得る。
【００６６】
そのうえ、ポンプとマイクロ弁は、機能化されたＭＳＰＲセンサ上での目標の単分子層の十分な形成を確実にするために、必要に応じて制御されてもよい。たとえば、上述のＧｏｘの例において、約１０ｎｍの厚さをもつ１６０，０００Ｄａの単分子層の形成は、およそ５６２秒の時定数で検出された。このように、マイクロ流体工学チャンバを介した試験流体の流れは、目標の重要且つ検出可能な単分子層の形成を確実にするのに十分でなければならない。
【００６７】
本発明のセンサの流体工学要素のもう一つの側面は、評価されている流体サンプルの性質に依存している。特に、複合試料は、正確な検出結果を保証するために分析の前にクリーニング及び予備濃縮（pre-concentration）を要する。そのような複合試料は、ヒト血液を含み、これは上記の機能化の例で記述されたように特定のタンパク質について評価されてもよく、また、危険な病原体の存在につき評価されている川からの水など自然の水を含む。生体試料の事前のクリーニング及び予備濃縮は、ＭＳＰＲセンサシステムへの導入の前に行ってもよい。たとえば、遠心分離は流体サンプルをクリーニングするのに用いられてもよいが、遠心分離機はマイクロ流体工学環境には適さない。飲用水の純度監視などの大規模なサンプル試験は、事前クリーニング及び予備濃縮についてのこの規模に対して修正することができる。しかし、本発明の一つの特徴は、センサ全体と関連するサンプル流体工学とが単一の小さなチップ上に存在するマイクロ流体工学の応用例に非常に適したものである。
【００６８】
したがって、本発明は、ＭＳＰＲセンサチップ上へ集積されるマイクロ流体の濾過モジュール及び予備濃縮モジュールの追加を意図する。したがって、図１２に示されるシステム８０は、図１１で示されるチップ７０などのＭＳＰＲセンサチップの上流に、マイクロ流体フィルタモジュール８２と予備濃縮モジュール８４を取り入れてもよい。この実施例では、上流のモジュールは、流体サンプルチャネル７５ａと弁７９ａに接続される。
【００６９】
特定の実施例のマイクロ流体フィルタ８２は、対向するＰＤＭＳモールドの間に挟まれる多孔質膜を含む。フィルタの流れ領域は、テストされている流体サンプルに依存する。例えば、およそ２．５ｃｍ２のフィルタ面積は、１ｍｌまでの血液などの少量のフィルタリングに十分である。より多量の又はより高い流速のサンプリングに対してはより大きなフィルタ領域が必要となり得る。
【００７０】
一般に、濾過によって、検出が望まれる目標のいくつかが取り除かれる。たとえば、多くのタンパク質は、フィルタ膜に非特異的に（non-specifically）結合する。このように、場合によっては、予備濃縮モジュール８４は、マイクロ流体工学センサチップのフィルタモジュール８２とサンプルチャネル７５ａとの間に挿入されてもよい。電気泳動、毛細管分離、機能化された磁気ビーズ、等速電気泳動（isotachophoresis）、コラム分離（column separation）または光活性化ポリカーボネート（ＰＰＣ）マイクロ流体工学チップのような、いろいろな予備濃縮アプローチが許容され得る。
【００７１】
本発明のＭＳＰＲセンサチップの小さなサイズと正確さにより、現状のセンサ及びバイオセンサの能力をはるかに凌駕するスループットと大規模並列処理能力とをもつセンサの製造を可能にする。特に、本発明のＭＳＰＲセンサは、数千ないし数百万もの目標を、すべて単一の小さなセンサチップ上で検出するように構成することができる。図１３で示すように、センサチップは、ランダムに単分散されたアレイ又は規則的なアレイに配置される単一のチップ上の複数のＭＳＰＲビーズを含む。ＭＳＰＲセンサのアレイは、フォトリソグラフィー及び／又はホログラフィック光学ピンセット法（optical tweezing）、又は、ガラス基板上に微視的に小さな物を配置するのに適した他の任意の技術を使って生成されてもよい。しかし、本発明の一つの特徴は、数百万のマイクロサイズのＭＳＰＲビーズを、現在利用できる技術を使用して基板上に完全にランダムに分散できるということである。後述のように、ＭＳＰＲビーズのこのランダムな分散にもかかわらず、本発明のこの実施例によって製造されるセンサは、非常に多くの目標を検出するために完全に機能化されてもよい。
【００７２】
複数の目標を検出する必要に対応するために、現状の平面ＳＰＲセンサ技術は、複数の目標に対する十分な検出能力を確保すべく、一様に分散されたＳＰＲ素子を必要とする。これらの電流センサは比較的低い感度を有し、十分な数のＳＰＲ素子を、すべての素子が特定の目標に対して機能化される所定の「スポット」に関連付けることを決定する。しかし、一様に分散されたＳＰＲ素子を正確に配置する能力は非常に制限され、通常、素子の１００×１００のグリッドを上回らない。現状の平面センサの精度限界と結びついたこの制限は、最終的には検出可能な別個の目標の数を１０００未満に制限し、最終的にはこれらセンサの応用範囲を厳しく制限する。たとえば、遺伝子治療とヒトゲノムマッピングプロジェクトは、検出のために何百万もの目標を生成する。現状の平面技術を使用して、何百という大きなセンサが、この種のプロジェクトのために必要である。
【００７３】
他方、本発明のセンサで利用されるマイクロビーズをランダムに分散させるための能力が存在する。しかし、本発明の前には、各々が個別に又は一群のスポットにおいて機能化できる何百万ものＳＰＲ素子をセンサ基板に搭載するこの能力を利用する方法はなかった。本発明によれば、この別々の機能化を達成する一つの方法は、マイクロ流体工学を使ってセンサチップの特定のバンド上に試薬を流すことよって一群のセンサに作用させることである。言い換えると、図１３に見られるように、チップ７２は4つの縦のバンド８６ａ−ｄなどの複数のバンドに分割されてもよい。マイクロ流体工学システムは、それから、バンドに沿って共通に各々のＭＳＰＲセンサを機能化するために、各々のバンドに沿って特定の試薬を流してもよい。この手法は、いろいろな試薬が正確に流れるチップ上で、機能化の程度をバンドの数に制限する。一つの特定の実施例において、ＭＳＰＲチップは、同様の数の目標が検出のために割り当てられるように各々が異なる機能化を有する、約２０のバンドに分割されてもよい。
【００７４】
もう一つの手法において、個々のＭＳＰＲセンサは、特定の機能化のために正確に選択されてもよい。この個々の機能化を達成する一つの方法は、フォトビオチン（photo-biotin）などの光活性化境界架橋剤の使用によるものであってもよい。しかし、ほんの少しのＳＰＲセンサだけが一度に機能化されるので、この方法は本質的に遅い。別のより多用途の手法は、従来のインクジェット式プリンタに類似した方法で、ＳＰＲビーズセンサのマイクロアレイを作るためにマイクロスポッタ（micro-spotter）を利用することである。幾つかのマイクロスポッタプリンターは、６００×６００ｄｐｉの解像度で、３０μｍの範囲のドットサイズで、間隔４５μｍ及びたった１０μｌの量において、インク滴を配置することができる。さらに精密なインクジェット式プリンタは、各々のインクドットがたった５μｍの直径をもつように４８００×４８００ｄｐｉの解像度を可能にする。この印刷技術は選択されたＭＳＰＲセンサまたはセンサのグループを機能化するように構成されてもよく、結果として図１３に示すスポット８８のような機能化されたスポットを生じる。各々のスポットは、異なる目標に関係してもよい。
【００７５】
さらに別の手法において、別々の複数の目標の機能化は、マルチピン（multi-pin）スポッタを使用して達成されてもよい。当該マルチピンスポッタは、架橋剤または試薬を、ＭＳＰＲビーズに対して又はＭＳＰＲビーズのみの上に直接的に正確に塗布することができる。特に機能化されたビーズは、ＭＳＰＲビーズの全領域にわたって、塊になっていてもよいし、ランダムに分散されてもよい。.
大規模並列処理処理によく適している機能化に対する更なる手法において、ＭＳＰＲビーズは、マスクを使って機能化されてもよい。マスクは、基板上のスポット８８内に配置されたＭＳＰＲビーズに対する架橋剤又は試薬の塗布を制限する。機能化されたスポットは、ビーズ自体よりかなり大きい領域にわたってアレイ上でランダムに分散したランダムな数のＭＳＰＲビーズを含むことが考えられる。このように、特定の実施例において、機能化されたスポットは直径約３０μｍの地域を占めてもよく、一方、ＭＳＰＲビーズはおよそ７７０ｎｍの直径を持つ。１０ｐｌと低い量の試薬を供給することができるマイクロスポッタは、各々のスポットにおいてビーズを機能化するのに使用されてもよい。センサチップは、バーコード８６または様々な機能化を識別する幾つかの他の読み込み可能な特性（signature）のほか、各々の機能化に対応するスポットを含んでもよい。下記のように、バーコード８６は、検出器９０（図１４）により生成される応答信号に対応する較正情報も含み得る。
【００７６】
ここまで説明したようなセンサ構成によれば、複数のランダムに分散したＭＳＰＲビーズは、共通に機能化されたビーズの集合を基板に配置させて、スポット８８を形成する。図１３に示される特定の例において、１８個のそのようなスポットが表されている；しかし、数百、数千、数百万というそのようなスポットは所与のセンサチップ上で規程され得ると考えられる。使用可能なセンサチップは、各々のスポットに共鳴応答を検知することを光源及び何らかの形式の検出器に要求する。このように、本発明の一実施例によれば、マイクロセンサを形成するスタックは、ＣＣＤアレイであってもよい検出器９０とＬＥＤであってもよい光源９６との間に挟まれるＭＳＰＲセンサチップ７２とともに図１４で示すように現れてもよい。信号対雑音比を改善する光学フィルタなどの様々な光学的条件付け要素が、光源及び／又は検出器と集積されてもよいと理解される。光学的条件付け要素は、特定のスポット８８または個々のＭＳＰＲビーズに対応する波長フィルタまたは異なる別々の波長フィルタを含んでもよい。一つの特徴によれば、検出器またはＣＣＤアレイは、格子９２の各々のピクセル９３が、ＭＳＰＲセンサチップ７２を介した光透過を検知することができ、以降の処理のためにその光透過を示す信号を生成するように構成されるＣＣＤを含むように、格子９２にマッピングされてもよい。図１４で示すように、マッピングされた格子９２はセンサチップに重ね合わさり、あるいは代替的に、図１３に図示されるように、スポット８８はマッピングされた格子上に投影されるものと見なされてもよい。好ましくは、各々のスポット８８が格子の複数のピクセル９３に投影され得るように、検出器の格子は十分に微細である。各々のピクセルがいくつかのＭＳＰＲビーズと重なり得ると予測されるが、各々のピクセルと対応するビーズの数は基板上のビーズのランダムな分布のために異なる。
【００７７】
検出器の較正は、各々のスポット８８から伝達データを読み込む最適の１つ又は複数のピクセルを特定することによって、最初に進行する。このように、特定の例において、特定のスポットは、４つのピクセル９３を完全に含んでもよく、部分的にさらに５つのピクセルを含んでもよい。ＭＳＰＲチップは光源９６によって照射され、当該スポットに対応するピクセルの各々において測定される強度が評価される。最も大きな反応を登録しているピクセルが、次に特定の機能化に対応する特定のスポットに対応するピクセルとして選択される。その選択されたピクセルは、他のピクセルと比較して、最大の数のＭＳＰＲビーズ、それゆえ他のピクセルと比較して最大の反応の上に位置し得る。この選択されたピクセル内のＣＣＤからの出力は、それから光源９６の強度及び／又は波長に関して調整されてもよい。この同じプロセスは、他の機能化されたすべてのスポット８８に対して繰り返される。したがって、特定の例において、１８個の機能化されたスポット（図１３）につき、各々のピクセルの調整された出力が評価されるように、検出器９０のマッピングされたグリッド９２上の１８個のピクセル９３が評価されてもよい。この調整された出力は、オンボードメモリ上に書き込まれてもよいし、周辺メモリデバイス及び／又はプロセッサに送られてもよい。マッピングされたピクセルの各々に対する較正データをもつ較正テーブルが、メモリ内に保持されて周辺プロセッサによりアクセスされてもよい。したがってバーコード８６は、適当な較正テーブルをメモリに記憶される複数のテーブルから抽出するために識別子を提供してもよい。較正テーブルは、検出器からどのピクセルを読み出すべきか、そして、どのように各々のピクセルからの出力信号を解釈するべきかを特定してもよい。較正データを適用する周辺装置は、インターネットリンクを介するなどして、グローバルなデータベースから必要なデータを得るように構成されてもよい。
【００７８】
対応する出力応答の調整に対する適切な修正をもって、さらなるピクセルが特定のスポットと関連付けられてもよいと考えられる。当然のことながら、別のピクセルについて光透過がいくつかのＭＳＰＲビーズを介して測定され得る一方、場合によっては、所与のピクセルについての出力応答が、所与のスポット内に存在し所与のピクセルと整列した一つのＭＳＰＲビーズのみを介して光透過から生じてもよい。ビーズのランダムな分布は、各々の機能化されたスポットに対応する出力信号を生成するのに用いられるＭＳＰＲビーズの数もまたランダムであることを意味する。しかし、上述の較正ステップにより、目標が迅速且つ正確に検出され得ることが保証される。本発明のＭＳＰＲセンサの各々のＭＳＰＲビーズの高感度は、単一のＭＳＰＲビーズでさえ、特定の機能化されたスポット及び検出器アレイピクセルにとって十分となり得ることを意味する。
【００７９】
図１４に図示されるデバイスは従来のセンサデバイスで利用できない目標検出の領域を広げることができると理解される。上述のように、小さなパッケージ内の何千もの目標に対して単一のＭＳＰＲセンサチップを機能化することができる。本発明のセンサの小さなサイズにより、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の検出のための大規模並列処理センサのアレイを形成することが可能となる。センサチップをもつマイクロ流体工学の使用により、センサチップ７０にわたって試験流体を連続的に流すことが可能になる。このマイクロ流体工学機能は大規模並列処理センサアレイを容易にし、化学的及び生化学的状況のリアルタイムの正確な検知のための手段を提供する。
【００８０】
特に有益な利用法は、血流中の目標のリアルタイム検出におけるものである。本発明の多チャネルの実施例の１つの重要な応用例は、敗血症の検出におけるものである。敗血症は、術後の回復において、及び精神的外傷の被害者において、死亡の主な原因である。敗血症の治療は、心臓、肺及び腎機能を支えるための抗生物質及び苦痛緩和処置に主に限られている。２００１年に収集されたデータによると、敗血症症候群は毎年米国で約７５１，０００人の患者を侵しており、そのうち３８３，０００人（５１．１％）は集中治療を受けた。２１５，０００の死因について全国的に死亡率が推定され、子供の場合に１０％であり８５才以上では３８．４％と、年齢と共に増加した。事例ごとのコストは平均でおよそ２２，０００ドルであり、これは毎年ほぼ１７０億ドルのコストを意味する。敗血症の早期発見と迅速な診療（発病から２〜４時間の範囲内）により、死亡率と生存者の衰弱は大きく低減される。しかし、敗血症の発症について患者を監視するための従来の方法は存在しない。多くの場合、敗血症治療のために生成される薬物は、患者の血液中のサイトカイン値を連続的に監視することが可能な器具がないことにより失敗した。
【００８１】
敗血症症候群は、伝染性の刺激に対する身体の全身の炎症反応である。グラム陰性菌からのリポ多糖類（ＬＰＳ）、グラム陰性菌及びグラム陽性菌からのペプチドグリカン及び鞭毛（flagellan）、グラム陽性菌からのリポタイコ酸（lipotechoic acid）、菌類からのマンナン、及び病原菌からの他の抗原などのエンドトキシンは、大食細胞（マクロファージ）と単球（monocytes）を刺激して、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を放出し、サイトカイン放出の連鎖がこれに続く。敗血症（特に最初の８時間）の第一期の間に、特に腎臓と心臓に対して、しかし、また、血圧と換気の人工的なサポートを要する肝臓、肺及び脳にまで、過度の炎症反応が大きい臓器障害を引き起こすことがあり得る。この臓器障害は、敗血症の急性期（acute phase）から何ヶ月あるいは何年か後に、しばしば虚弱または死亡率を引き起こす。
【００８２】
炎症性メディエータ（pro-inflammatory mediators）の放出は、当初、概して抑えられないと考えられていた。しかし、その後の調査により、ＴＮＦ−αもまた白血球を刺激して、ＩＬ−１０、ＩＬ−１及び形質転換（トランスフォーミング）成長因子β（ＴＧＦ−β）を含み、炎症性（pro-inflammatory）サイトカインの合成を抑制して、単球、大食細胞及び内皮細胞に対する直接的な抗炎症性効果を及ぼす、抗炎症性サイトカインを放出することが証明された。この代償性抗炎症性反応症候群（ＣＡＲＳ）は、さもなければ全身にわたる感染症への抑制されていない炎症性反応となるものを局所化することを意図している。残念なことに、抗炎症性反応はしばしば敗血症の後の段階において炎症性反応を上回り、結果として免疫抑制状態（immunoparalysis）になる−すなわち、更なる伝染性発作に対して効果的な免疫反応を開始することができなくなる。
【００８３】
したがって、侵襲の少ない（minimally-invasive）デバイスは、すべての手術後の患者及び心的外傷後患者に取り付けることができ、敗血症の発病及び進展を監視することができ、非常に初期のより誘導された診療を可能にし、最終的に生存者の死亡率及び衰弱をともに低減する。特定の実施例によれば、図１５に示す、敗血症で重要な役割を演ずる一組の6つの化学物質を同時に分析するのに用いることができるマイクロ流体デバイス１００が提供される。(しかし、マイクロ流体構造は、同時により多くの又はより少ない化学物質の分析に対応するように修正されてもよいし、異なる駆動流、流速又は分析設定について修正されてもよい)。敗血症の発病とその進展の診断の一つの方法は、同時に且つリアルタイムに、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦ−βといった化学物質を監視することを含む。したがって、図１５に示すように、マイクロ流体工学センサ１００は、一緒にマイクロ流体チャンバ１１０（長さ２ｍｍ及び幅６００μｍ）に入り、各チャネルが特定の監視された化学物質に対応する、一組の６つのチャネル１０２−１０７（特定の実施例においては、各々が、幅５０μｍで、１００μｍ離れており、長さ１１ｍｍである）を含む。およそ２０ｋＤａの分子の拡散が近隣のチャネル内の分子に干渉しないように、当該間隔が選択される。これら６つのチャネルは、上記の化学物質に対して、特定の抗体でセンサアレイ１２０を機能化するのに使用される。マイクロ流体チャンバを介した異なる抗体の流れは、一連の６本の平行抗体ストライプ１１２を生成し、チップを機能化する。この特定の実施例のチップ１００は、最低で４００μｍ／ｓの抗体の流れに対して設計される。この処理と特定の較正は、サンプルを評価するために、このチップの使用前に行うことができる。
【００８４】
２００μｍの幅の横チャネル１１６は、マイクロ流体チャンバ１１０を横切る。このチャネルは、血漿のようなより粘性が高くより速く凝固する流体が通過できるよう、より広くなっている。交差の領域は、２００μｍ×６００μｍの領域をカバーしている。横チャネル１１６は、血液が導入される注入口１１７と廃棄物排出口１１８を含む。同様に、マイクロ流体チャンバ１１０は、廃棄物排出口１１１を含む。
【００８５】
このセンサアレイ１２０は、好ましくは、チャンバ１１０と横チャネル１１６との交差部において方向付けられ、好ましくは当該チャネルと整列される。一つの特定の実施例において、センサ１２０は、個々のセンサまたはセンサスポットが特定の機能化に対応し、対応する抗体片（antibody strip）１１２と整列される、６つのＳＰＲビーズセンサ１２４またはセンサスポットの線形アレイを含んでもよい。  
【００８６】
図１４に示されたマイクロ流体デバイス１００は、以下に述べる方法で、ポリ−ジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ)基板及びカバーガラスを使用して製造されてもよい。当該デバイスは、ＰＤＭＳチャネル構造を成型するためにマスターとして負のトーンのフォトレジストＳＵ−８を使用して作られる。マスター基板は５０ｍｍ×５０ｍｍのスライドガラスである。基板はＨＣＩ：ＨＮＯ３（３：１）の中でクリーニングされ、ナノピュア水ですすがれ、窒素で乾かされ、メタノール及びアセトン（１：１）中で超音波分解され、再び窒素で乾かされた。マスターは２つのＳＵ−８フォトレジスト層で生成される。第１の下層（ＳＵ−８  ２０１０の１８−２０μｍの厚さの層）は、基板に対するチャネル構造の接着を促進するために使用され、フォトレジストの第２のより厚い層（ＳＵ−８  ２０７０の６０−８０μｍの厚さの層）は、チャネル構造を生成するために使用される。第１の層がフォトマスクなしで露光されるという点を除いて、両方の層は同一に処理される。フォトレジストは、３０秒間１０００ｒｐｍで基板上でスピンコートされ、４０ｒｐｍ／秒でランプされた。６５℃で１分間及び９５℃で２分間、ホットプレート上でプリベークした後、フォトレジストはＵＶ光に露出される。提案されたチャネル設計は、ＡｕｔｏＣＡＤ  ２００４ＬＴを使用して描かれて８０００ｄｐｉで高解像度レーザープリンタを使用して透明板上にプリントされたフォトマスクによってフォトレジストに転写される。ＵＶ露光システムは、３６０±２３ｎｍを通過させるようにフィルタリングされた高圧力Ｈｇアークランプを備え、照射線量は３００ｍＪ／ｃｍ２である。露光したフォトレジストは、６５℃で１分間及び９５℃で３分間、同じホットプレート上でポストベークされる。その後、マスターは５分間現像され、２−プロパノールですすがれて、窒素で乾かされる。
【００８７】
シリコン・エラストマー・キットは、５分間、１０：１の比率で混合されるポリマーベース及び硬化剤を含んでいる。テープ障壁（tape barrier）がエラストマー混合物を保持するために型のまわりに配置され、エラストマーはマスター上に注がれる。型上のＰＤＭＳは、チャネル複製を向上させるために１時間低い真空（〜１トール）の下に置かれ、２０分間、１２０℃で加熱することにより硬化される。その後、ＰＤＭＳ基板はマスターから分離され、チャネルへの流体接続のためのアクセス穴が、１６Ｇの針を用いて、エラストマーを通じて開けられる。
【００８８】
ＰＤＭＳ型の底において、横チャネル１１６との交差におけるマイクロ流体チャンバ１１０にわたって、ＭＳＰＲビーズ１２０の線形アレイがフォトリソグラフィー及び／又はホログラフィー光学ピンセット法（holographic optical tweezing）、あるいは、マイクロマニピュレータ及びレーザー・ピンセット・システム（laser tweezers system）の使用など、ガラス基板上に微視的に小さな物を配置するのに適した技術を使用して、生成されてもよい。マイクロマニピュレータには、１０３−１０２ビーズ／μＬの精度サイズ標準（precision-size-standard）ビーズが搭載される。アレイ１２０のＭＳＰＲビーズが約５０−１００μｍの間隔で分配されるように、この濃度が選択される。光学レーザー・ピンセットは、液体が乾くまで、適所にビーズを保持するために使用することができ、次のビーズは、マイクロマニピュレータにより分配され、液体が乾くなどするまで、ピンセットにより保持される。一旦ビーズ１２４が配置されれば、ＰＤＭＳ基板は、交差の上に配置された１ｍｍ×１ｍｍのウィンドウを介してスパッタ被覆される。ビーズは１５０ｎｍの金で覆われる。その後、ＰＤＭＳ基板及びカバーガラスは、接触の前に４０秒間空気プラズマに露出された後に、永久的に連結される。
【００８９】
１つの実施例では、敗血症検出器デバイスは、周期的にセンサ素子１００に少量の血液を引き込むために、静脈で患者に接続され、ポンプシステムに接続されたカテーテルチューブ（catheterization tube）を含んでもよい。血液は、血漿（plasma）を抽出するために使い捨てフィルタを通り抜け、血漿はチャネル１１６を通って使い捨てセンサ１００に供給される。センサからの出力は、血漿中のサイトカイン濃度の測定値を提供する。不用な血液はチャネル１１８を通過して、使い捨てのバイオハザードラベルが付けられた廃棄チューブに集められる。本発明のＭＳＰＲセンサ及びセンサチップは小さいので、患者が診療中にあるのと同じくらい長い期間、センサデバイス１００及びカテーテルチューブを適所に配置することを可能にする。センサチップに血液を引き込むための蠕動ポンプの制御は、所定のインターバルであるいは他の病状センサに応じて生じるように電子的に制御されてもよい。特定の物質（agent）が検出される場合に警告を生成するために、センサの検出器は同じ制御器に接続されてもよい。
【００９０】
ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦ−βの高い水準は初期の敗血症を示す一方、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦ−βの高い水準は免疫抑制状態を示す。センサの各々についての検知時間が長すぎる場合、単一のチャネルはリアルタイムでサイトカイン水準を検出することができないかもしれない。その場合、チャネル検出器のアレイは単一の使い捨てチップ上に作られてもよく、血液供給が５分間のインターバルでチャネル間で切り替えられてもよい。制御可能なマイクロ弁を使用して、血液及び清潔な無菌媒体をセンサに交互に供給し、次の測定のためにそれらをリセットしてもよい。
【００９１】
作動薬と拮抗薬のクラスは敗血症に含まれる様々なサイトカインをコントロールするために開発されてきている。しかし、それらの効果は患者によって、また、時間とともに大きく変わり、医師がこれらの効果を監視する方法を持っていないため、これらの薬のどれも広く使用されていない。結果として、現在の最適の治療は、不十分なもしくは過度の線量中で与えられる、炎症サプレッサ及びエンハンサを含み、それらの両方は患者にとって致命的となることがあり得る。本発明のＭＳＰＲセンサは、常に最適水準でサイトカインを維持しつつ、感染症の初期に免疫反応を抑え、感染症の末期にそれを高める作動薬及び拮抗薬の特別仕立てのカクテルを医師が供給することを可能にする。
【００９２】
敗血症状態を検出するための同じ原理は、付随的な治療用装置へのインタフェースにも他の病状の対話型の（インタラクティブな）検出にも適用されてもよい。適切な機能化により、単一センサデバイス又はマルチセンサデバイスは、長期治療中に患者の状態を監視するために使用されてもよい。例えば、ＭＳＰＲセンサチップ、及び本明細書に記述された実施例に従うマイクロ流体システムは、治療のために患者から連続的に血液あるいは他の液体を引き出す透析システム、あるいは他の装置に組み入れられてもよい。ＭＳＰＲセンサチップは、心臓発作、卒中、腎不全及びその他の迫り来る問題を示す目標をリアルタイムで検出するための連続的な血液監視システムへ統合されてもよい。
【００９３】
マルチセンサレイ装置の第２の実施例は、サイトカイン調整薬を含み且つ上記所定のサイトカイン検出器の出力によって制御される１組の注射器チューブを含むように用意されてもよい。この装置は、最終的には、静脈内の（ＩＶ）点滴を介して患者に複数のサイトカイン調節薬の制御された線量を供給して、作動薬と拮抗薬の供給を連続的に変更し、最適な水準で患者のサイトカインを維持する。上記の血液監視例において、心臓発作の発病を示す目標のリアルタイム検出は、例えば、その状態の発病に応じて即時のリアルタイムな投薬を提供するために使用されてもよい。
【００９４】
この同じ介入療法は、上述のように検出された際に敗血症を回避するために使用されてもよい。この例では、ある目標分子の生成を抑制するために、ある抗敗血症治療は特定のタンパク質の作用に依存する。しかしながら、治療はそれ自体免疫抑制的であるので、注意深くその治療を処理しなければならない。本発明のＭＳＰＲ及びマイクロ流体センサによる目標のレベルのリアルタイム検出は、抗敗血症治療の迅速で正確な管理を可能にする。同様の手法は、望ましくない副作用の発現又は存在を示す目標の血液感染性のマーカーを作成する化学療法またはＨＩＶ治療の毒性を低減するためや、あるいは他の治療のために実施されてもよい。
【００９５】
上述の使い捨てのＭＳＰＲセンサデバイスは、他の多くの応用に適している。例えば、本発明は、公共及び個人の飲料水試験に適しているかもしれない。ＭＳＰＲセンサは様々な有機及び無機の汚染物質、毒素、細胞生物及びウィルスを検出するために機能化されてもよい。選択された目標について水流を連続的に監視するために、センサは給水内に配置してもよい。本発明のデバイスは、上述のＣＣＤアレイ９０のような光検出素子に依存するので、知覚可能な警告のような所定の応答を開始するために評価されて使用され得る電気信号が生成される。
【００９６】
これらのセンサに基づいたデバイスを、血液、血漿又は他の体液中のバイオハザード、有害化学物質、神経毒、爆発物あるいはＨＩＶ又は他のウィルスもしくはバクテリアの検出用に開発することができる。本発明は、センサを、携帯可能且つ容易に使い捨て可能になるほど十分に小さくすることを可能にする。図示された実施例では、センサチップは５０ｍｍ×５０ｍｍの面積内に適合する。特定の装置は、空港又は国土防衛使用、あるいは水処理設備もしくは工場での使用に適し得る。使用によっては、チップの入力液溜へ接続するための自動化システムを含むことができ、また、追加の化学物質を、同時に同じチップ上で分析することができる。
【００９７】
本発明のＭＳＰＲセンサ及びマイクロ流体工学はまた、化学反応あるいはバイオ反応（bioreactions）を監視するのに適しているかもしれない。反応による特定の目標生成物を検出するかあるいは反応に影響を及ぼし得るリアクタ内の化学的条件を検出するために、本発明のマイクロチップは、流量ラインへ、あるいは直接的に化学リアクタかバイオリアクタ内に統合されてもよい。ＭＳＰＲセンサは反応条件を最適化するためあるいは反応がいつ完了するかを決定するために使用されてもよい。この特定の実施例は、特に、得られた生成物の純度を制御するために、薬製造又は化学物質製造のためのプロセス制御の一部として有益に適用されてもよい。
【００９８】
本発明のサブミクロン・キャビティ表面プラズモン・バイオセンサを与えられたマイクロ流体デバイスは、従来の検知技術及びデバイスのいくつかの欠陥を克服する。マイクロ流体工学の特性を、ＭＳＰＲビーズ・センサの感度と組み合わせることにより、マイクロ流体工学チップ内部あるいは密閉された空間内部の検出能力を増加させて、ラボ・オン・チップ（lab-on-a-chip）の理想の限界が拡張される。
【００９９】
現状の装置は、平面ＳＰＲ又はより古いＥＬＩＺＡキットを使用して、分子の相互作用及び分子の反応速度（kinetics）を監視する。平面金属表面上の表面プラズモンを励起するために、特定の制限に従わなければならない。特に、光源はｐ偏光化されなければならず、また、入射光子及び表面ポラリトンの間の最大の結合を生成するために、入射の正確な臨界角が得られなければならない。本発明のセンサは、球状のセンサの共鳴特性と表面プラズモンの感度を組み合わせる。感度の上昇に加えて、本発明は、光源の配置及び偏光への制約を緩和する。さらに、センサは平方ミクロンあるいはより小さいフットプリントを有し、これにより、感度を増加させてマイクロ流体構造への統合能力を高めつつ、（現在の最先端技術のＳＰＲ平面センサの約１０００分の１の大きさの作用面積を有する）小型化により適するようにする。更に、反射で動作する従来のＳＰＲセンサと比較して、本発明のＭＳＰＲセンサは透過で動作する。この違いにより、本発明のＭＳＰＲセンサを組込む検知マイクロ流体工学チップは、光源と検出器の検知ウィンドウとの間で非常に接近して配置することができ、非常にコンパクトで頑丈で安価な手持ちの（ハンドヘルドの）装置が得られる。  
【０１００】
マイクロ流体工学デバイスは、現在、（ピコリットルからマイクロリットルまでの）少量の検体を取り扱うための、並びに流れ及び勾配（gradients）の非常に正確な制御のための、最も洗練された技術である。それらは複数の複製成形及びチャネルの新たな構成にとって適切であり、設定を非常に低コストで生成でき、それらを使い捨てのデバイスに適するようにすることができる。この特性により、特に医学的応用にとって、それらは多くの研究領域において便利なものとなる。それらは、特に、例えば血漿、体液、有毒廃棄物、食物などだがこれらに限定されない非常に複雑なサンプルを分析する際に多大な時間を節約することができる、化学物質の超並列処理に適している。ただ一つの時間的な制約は、機能化されたＭＳＰＲ検出器の表面へ束縛されたサンプル中の特定の分子種とレセプタとの間の反応時間である。
【０１０１】
本発明のＭＳＰＲセンサは、マイクロ流体工学デバイスのこれらの特性を利用する。それは、センサの形状との表面プラズモンの結合により、従来のデバイスよりよい感度を有する。現状のＳＰＲセンサは大きな分子を検出できるに過ぎないが、本発明のＳＰＲセンサは、良好な感度で大きな分子及び小さな分子を検知することができる。センサが小さいため、制御、検出及び解析を単一チップ上で達成することが可能であり、且つ、マイクロ流体工学デバイスを利用して複数の並列分析を実行して、分析時間を短くすることができる。さらに、これらのデバイスは使い捨てとすることができ、安価に生産することができる。
【０１０２】
図示された実施例では、微小球体は金で覆われる。球体が銀、銅あるいは金合金のような他の金属で覆われ得ることが考えられる。しかしながら、現状の実験は、金で被覆した球体あるいはビーズに対してのみ、透過光中のスペクトル共鳴が生じることを示唆しており、これは表面プラズモン結合によると考えられる。金被覆の膜厚は、特定のＭＳＰＲセンサの応用例に依存して調節されてもよい。しかしながら、膜厚を増加させると、少なくとも対称な（低周波）モードに対して、観察された共鳴の青方シフトを引き起こすことが分かっている。反対に、高周波非対称モードの周波数が膜厚の増加につれて赤方シフトされることも分かっている。さらに、本発明で実施される球面形状は、対称なＳＰモードを選択的に励起して、それによって、赤方シフト効果を最小化する。実験はさらに、１５０ｎｍの金層で覆われた７７０ｎｍのビーズに対する６２３ｎｍにおけるピークのようないくつかのピークが、金属膜厚に対して、他のピークより非常に小さい感度を示すことを示唆している。
【０１０３】
図面及び上記の説明において本発明が詳細に図示され説明されているが、これらは例示的なものであり、文字どおりに限定的でないものとして考慮されるべきである。好ましい実施例だけが示されており、発明の精神に含まれるすべての変更、修正及びさらなる応用を保護すべきものと望まれることが理解される。
【０１０４】
図示された実施例では、ＭＳＰＲセンサを形成するマイクロ微粒子は、球状の共鳴キャビティを形成するために球状の形状である。しかしながら、他の対称な幾何学的形状をビーズ形状に利用してもよい。例えば、ビーズの表面にわたって伝播する定常プラズモン波の周期的境界条件を維持することができる形状であれば、ビーズは楕円形であってもよいし、あるいは十二面体のように多面的であってもよい。
【０１０５】
図示された実施例に対して述べられた様々な材料及び寸法も、本発明のＭＳＰＲセンサ及びマイクロ流体工学システムによって達成される機能を維持する限り修正されてもよい。ＭＳＰＲセンサの材料及び寸法に対する修正は、本発明のＭＳＰＲセンサの主な目的、すなわち目標の検出を果たすものでなければならない。さらに、修正は、マイクロキャビティセンサのＳＰＲ共鳴特性を向上させるために使用される形状あるいは幾何学的な共鳴特性と干渉してはならない。本発明のＭＳＰＲセンサの検出能力は、それ自身がＳＰＲ支持（SPR-supporting）コーティングに接するカップリング試薬層に目標を結合することに依存し、最終的には光学応答の変化に依存する。
【０１０６】
ほとんどの目標及びカップリング試薬については、適用される光の波長は決定的に重要ではないと考えられる。他方、表面プラズモン共鳴がその層に生じるので、ＳＰＲ支持層は、定義によれば波長依存である。したがって、ＭＳＰＲセンサの材料及び寸法に対する修正は、ＳＰＲ支持層材料及びその特徴的な波長の選択に集中すると考えられる。図示された実施例では、その材料は５１０ｎｍの波長をもつ金である。本発明の特定の態様によれば、この波長は、微粒子もしくはビーズ１０及びピンホール１６の直径を決定する。ビーズ直径はまた、誘電材料の屈折率に依存する。
【０１０７】
代替的な構成において、ＳＰＲ支持被覆材料は、被覆厚の適切な変化と共に、銀、銅あるいは他の非金のＳＰＲ支持材料であってもよい。銀及び銅はそれぞれ異なるＳＰＲ特性波長を有するので、いずれかの金属を被覆１４の材料として選択すると、微粒子１０及びピンホール１６の直径の変化を結果的にもたらす。本発明の特定の実施例によれば、ピンホール直径がその波長未満で固定される一方、微粒子の直径は、銀被覆又は銅被膜の特有の波長に関して寸法を合わせされるだろう。同様に、被覆厚は、微粒子及びピンホールの直径の釣り合った変化で修正されてもよい。
【０１０８】
従って、ＭＳＰＲセンサが特有の波長を指示する程度まで、（図１４の光源９６及び検出器９０のような）光源及び透過光検出器は、従って選択されてもよい。ある実施例では、白色光が許容されるかもしれないが、他の実施例では、ＭＳＰＲセンサの特有の波長において中心となる単色光源を選択することが望ましいかもしれない。好ましくは、光検出器は特有の波長に較正される。
【０１０９】
本発明のＭＳＰＲセンサ及びマイクロ流体工学チップのための材料選定に関して、上記の実施例における材料及び実施例が説明される。ＭＳＰＲビーズはポリスチレンから作られると記載されているが、ガラスまたは酸化アルミニウムなどの他の光透過性材料を使用してもよい。選択された材料は、最も好適には誘電性であり、ポリスチレンに類似した屈折率を有する。当然のことながら、上述のように、ビーズ材料の屈折率は、ＳＰＲ支持コーティングとともに、ＭＳＰＲの光学応答及び共鳴モードに影響する。
【０１１０】
同様に、ＭＳＰＲビーズ及び基板の周りのハウジング又はチップを形成する材料は、図示された例及び実施例において識別されたＰＤＭＳ材料とは異なってもよい。好ましくは、当該材料は、実質的に光透過性で、ＭＳＰＲセンサの光学及び共鳴特性に及ぼす影響を最小にするものである。
【０１１１】
本発明のＭＳＰＲセンサ及びマイクロ流体センサの応用及び使用に関して、上述の例及び実施例は限定を意図したものではない。当然のことであるが、本発明は、少量のサンプルにおいても、連続流システムにおいても、広範囲の目標の迅速で正確な検出を可能とする。本発明は、１００、何千、及び何百万もの目標の同時検出を、単一のマイクロセンサ、あるいは超並列センサアレイにおいて可能とする。したがって、本発明は現状の検出技術を大きく向上させるとともに、まだ予期されていない新しい技術及び分析につながり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】従来技術の平面基板ＳＰＲセンサの動作の略図である。
【図２】本発明の一実施例によるＳＰＲセンサの拡大した略図である。
【図３】本発明により製造されたＳＰＲビーズセンサの電子顕微鏡画像である。
【図４】本発明によるＳＰＲセンサを利用したマイクロ流体チップの概略図である。
【図５】本発明によるＳＰＲセンサの性能を評価するための実験構成の略図である。
【図６ａ】図５に示す実験構成におけるＳＰＲセンサのスペクトル性能のグラフである。
【図６ｂ】図５に示す実験構成におけるＳＰＲセンサのスペクトル性能のグラフである。
【図７ａ】さらなる実験条件下での本発明のＳＰＲ千なのスペクトル性能のグラフである。
【図７ｂ】さらなる実験条件下での本発明のＳＰＲ千なのスペクトル性能のグラフである。
【図８】本発明のさらなる実施例によるマイクロ流体ＳＰＲセンサの略図である。
【図９】ＳＰＲセンサを機能化するための本発明のＳＰＲセンサの金層とのスルホＤＳＰ反応の図である。
【図１０ａ】カルボジイミド結合試薬を使用した機能化反応の図である。
【図１０ｂ】カルボジイミド結合試薬を使用した機能化反応の図である。
【図１１】本発明のマイクロ流体ＳＰＲセンサに取り付けられるマイクロ流体構成要素の図である。
【図１２】マイクロ流体フィルタリングモジュール及び予備濃縮モジュールをもつ本発明のマイクロ流体ＳＰＲセンサの図である。
【図１３】複数の分子、リガンド又は検体を検出するための、マッピングされた機能化を有する本発明のマイクロ流体ＳＰＲセンサの図である。
【図１４】本発明によるマイクロ流体ＳＰＲセンサシステムの構成要素の図である。
【図１５】複数の化学物質を同時に評価することのできる本発明によるセンサの略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
2009520188.tif 000021
2009520188.tif 000022
2009520188.tif 000023