(57)【要約】  本発明は、プロモーターに機能的に結合した異種抗原をコードする核酸配列（プラスモディウム属の核酸配列など）を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターを提供する。本発明はさらに、哺乳動物に該アデノウイルスベクターを投与することを含む、該哺乳動物でのマラリアに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。【選択図】図１
2009505680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つ以上の異種抗原をコードする核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、３つ以上の核酸配列が少なくとも２つの異なる異種プロモーターに機能的に結合したアデノウイルスベクター。
【請求項２】
３つ以上の異種抗原をコードする核酸配列の各々がプラスモディウム属抗原をコードする、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３】
３つ以上の異種抗原をコードする核酸配列の各々がプラスモディウム属血液ステージ抗原、プラスモディウム属前赤血球ステージ抗原、またはそのエピトープをコードする、請求項１または２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４】
異種抗原をコードする各核酸配列がプラスモディウム属前赤血球ステージ抗原またはそのエピトープをコードする、請求項３に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５】
前赤血球ステージ抗原がスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）、スポロゾイト表面タンパク質２（ＳＳＰ２）、肝臓ステージ抗原１（ＬＳＡ−１）、Ｐｆ ｅｘｐｏｒｔｅｄタンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）／Ｐｙ肝細胞赤血球タンパク質１７（ＰｙＨＥＰ１７）、およびそれらのエピトープからなる群より選ばれる、請求項４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６】
異種抗原をコードする各核酸配列がプラスモディウム属よりも哺乳動物においてより高頻度に発現するコドンを含む、請求項２〜５の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
３つ以上の異種抗原をコードする核酸配列の各々が異なるプロモーターに機能的に結合する、請求項１〜６の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項８】
プロモーターがヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーター、マウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）プロモーター、ヒトＣＭＶ増強トリβアクチンキメラプロモーター（ＣＣＢＡ）、ｈβＡプロモーター、ＥＦ−ｌαプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ユビキチンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、および熱ショックタンパク質７０Ｂ（ＨＳＰ７０Ｂ）プロモーターからなる群より選ばれる、請求項７に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項９】
アデノウイルスベクターが複製欠損であり、増殖のためにＥ１領域とＥ４領域の両方の相補を必要とする、請求項１〜８の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
アデノウイルスゲノムがＥ１領域全体とＥ４領域の少なくとも一部とを欠く、請求項９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
異種抗原をコードする核酸配列の少なくとも２つが、アデノウイルスゲノムの欠失したＥ１領域に挿入され、かつ異種抗原をコードする核酸配列の少なくとも１つが、アデノウイルスゲノムの欠失したＥ４領域に挿入される、請求項１０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
アデノウイルスベクターが、欠失したＥ１領域に挿入されたスポロゾイト周囲タンパク質２をコードする核酸配列、欠失したＥ１領域に挿入された肝臓ステージ抗原をコードする核酸配列、および欠失したＥ４領域に挿入されたスポロゾイト表面タンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
２つ以上の核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、各核酸配列がプラスモディウム属抗原をコードし、かつ少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合する、アデノウイルスベクター。
【請求項１４】
２つ以上の、抗原をコードする核酸配列の各々が、プラスモディウム属前赤血球ステージ抗原またはそのエピトープをコードする、請求項１３に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
２つ以上の、抗原をコードする核酸配列の各々が、プラスモディウム属血液ステージ抗原またはそのエピトープをコードする、請求項１３に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
血液ステージ抗原がメロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）、メロゾイト表面タンパク質２（ＭＳＰ−２）、赤血球結合抗原１７５（ＥＢＡ−１７５）、リング状感染赤血球表面抗原（ＲＥＳＡ）、セリン反復抗原（ＳＥＲＡ）、グリコホリン結合タンパク質（ＧＢＰ−１３０）、ヒスチジンリッチタンパク質２（ＨＲＰ−２）、ロプトリー関連タンパク質１および２（ＲＡＰ−１およびＲＡＰ−２）、赤血球膜タンパク質１（ＰｆＥＭＰｌ）、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、およびそれらのエピトープからなる群より選ばれる、請求項１５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
各抗原をコードする核酸（nucleic）によりコードされる抗原がシグナルペプチドを含む、請求項１３〜１６の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
各抗原をコードする核酸配列によりコードされる抗原がＮ−グリコシル化されていない、請求項１３〜１７の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１９】
各抗原をコードする核酸配列がプラスモディウム属よりも哺乳動物においてより高頻度で発現するコドンを含む、請求項１３〜１８の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２０】
各抗原をコードする核酸配列が異なるプロモーターに機能的に結合する、請求項１３〜１９の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２１】
各抗原をコードする核酸配列が同一プロモーターに機能的に結合する、請求項１３〜１９の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２２】
該プロモーターがヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーター、マウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）プロモーター、ＣＣＢＡプロモーター、ｈβＡプロモーター、ＥＦ−ｌαプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびユビキチンプロモーターからなる群より選択される、請求項２０または２１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２３】
アデノウイルスベクターが複製欠損であり、増殖のためにＥ１領域とＥ４領域の両方の相補を必要とする、請求項１３〜２２の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２４】
アデノウイルスゲノムがＥ１領域全体とＥ４領域の少なくとも一部とを欠く、請求項２３に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２５】
抗原をコードする核酸配列の少なくとも１つが、アデノウイルスゲノムの欠失したＥ１領域に挿入され、かつ抗原をコードする核酸配列の少なくとも１つが、アデノウイルスゲノムの欠失したＥ４領域に挿入される、請求項２４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２６】
２つ以上の、抗原をコードする核酸配列が、アデノウイルスゲノムの欠失したＥ１領域に挿入される、請求項２４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２７】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの欠失したＥ１領域に挿入された、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）をコードする核酸配列およびメロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）をコードする核酸配列、またはそれらのエピトープを含む、請求項２６に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２８】
２つ以上の、抗原をコードする核酸配列が、アデノウイルスゲノムの欠失したＥ４領域に挿入される、請求項２４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２９】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの欠失したＥ４領域に挿入された、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）をコードする核酸配列およびメロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）をコードする核酸配列、またはそれらのエピトープを含む、請求項２８に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３０】
アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス特異的抗体により中和されない、請求項１〜２９の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３１】
アデノウイルスベクターが、宿主免疫系による認識が減少した改変コートタンパク質を含む、請求項３０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
改変コートタンパク質がファイバータンパク質、ペントンタンパク質、およびヘキソンタンパク質からなる群より選択される、請求項３１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３３】
アデノウイルスベクターが、天然のＣＡＲ結合部位が突然変異したファイバータンパク質を含む、請求項１〜３２の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
アデノウイルスベクターが非天然のアミノ酸配列を含むファイバータンパク質を含む、請求項３２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３５】
非天然のアミノ酸配列がＲＧＤ配列を含む、請求項３４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３６】
非天然のアミノ酸配列がプラスモディウム属エピトープ配列を含む、請求項３４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３７】
抗原をコードする核酸配列がプラスモディウム  ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）から得られる、請求項１〜３６の何れかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３８】
請求項１〜３７の何れかに記載のアデノウイルスベクターを哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物においてマラリアに対する免疫応答を誘導する方法であって、該抗原が該哺乳動物で発現してマラリアに対する免疫応答を誘導する、方法。
【請求項３９】
哺乳動物でマラリアに対する免疫応答を誘導する方法であって、該方法は哺乳動物に：
（ａ）３つ以上の核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、各核酸配列はプラスモディウム属前赤血球ステージ抗原またはそのエピトープをコードし、かつ少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合するベクター、および
（ｂ）２つ以上の核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、各核酸配列はプラスモディウム属血液ステージ抗原またはそのエピトープをコードし、かつ少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合するベクター
を投与することを含み、該抗原が該哺乳動物で発現してマラリアに対する免疫応答を誘導する、方法。
【請求項４０】
アデノウイルスベクターが複製欠損であり、増殖のためにＥ１領域とＥ４領域の両方の相補を必要とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
アデノウイルスゲノムがＥ１領域全体とＥ４領域の少なくとも一部とを欠く、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前赤血球ステージ抗原がスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）、スポロゾイト表面タンパク質２（ＳＳＰ２）、肝臓ステージ抗原１（ＬＳＡ−１）、Ｐｆ  ｅｘｐｏｒｔｅｄタンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）／Ｐｙ肝細胞赤血球タンパク質１７（ＰｙＨＥＰ１７）、およびそれらのエピトープからなる群より選択される、請求項３９〜４１の何れかに記載の方法。
【請求項４３】
血液ステージ抗原がメロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）、メロゾイト表面タンパク質２（ＭＳＰ−２）、赤血球結合抗原１７５（ＥＢＡ−１７５）、リング状感染赤血球表面抗原（ＲＥＳＡ）、セリン反復抗原（ＳＥＲＡ）、グリコホリン結合タンパク質（ＧＢＰ−１３０）、ヒスチジンリッチタンパク質２（ＨＲＰ−２）、ロプトリー関連タンパク質１および２（ＲＡＰ−１およびＲＡＰ−２）、赤血球膜タンパク質１（ＰｆＥＭＰ１）、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、ならびにそれらのエピトープからなる群より選択される、請求項３９〜４１の何れかに記載の方法。
【請求項４４】
各核酸配列がプラスモディウム属よりも哺乳動物においてより高頻度に発現するコドンを含む、請求項３９〜４３の何れかに記載の方法。
【請求項４５】
各核酸配列が異なるプロモーターに機能的に結合する、請求項３９〜４４の何れかに記載の方法。
【請求項４６】
各核酸配列が同一のプロモーターに機能的に結合する、請求項３９〜４４の何れかに記載の方法。
【請求項４７】
該方法が、哺乳動物にアデノウイルスベクターを投与する前に、呼び水となる遺伝子導入ベクターを投与することを含み、該呼び水となる遺伝子導入ベクターが抗原をコードする核酸配列を含む、請求項３９〜４５の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦支援の研究開発に関する陳述）
本発明は、GenVec, Inc. と Naval Medical Research Center (NMRC) との間で締結されたCooperative Research and Development Agreement (CRADA) Number NMR-04-1869およびその修正に基づく政府の援助により部分的になされた。政府はこの発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、ヒトで発症する最も破壊的な寄生虫性疾患の１つである。実際、世界の人口の４１％が、マラリアが伝染する地域（例えば、アフリカ、アジア、中東、中央アメリカおよび南アメリカ、イスパニョーラならびにオセアニアの一部）に居住している。世界保健機関（ＷＨＯ）および疾病対策センター（ＣＤＣ）は、年に３億〜５億人がマラリアに感染し、７０万〜３００万人が死亡し、死者の大半はサハラ以南のアフリカの子供であると見積もっている。マラリアはまた、世界の熱帯地域に配置された米国軍兵士にとっても健康に関する主要な懸案事項である。例えば、２００３年８月に、リベリアのモンロビアに一時的に配備された第２６海兵隊進攻部隊および統合機動部隊の２８％が、マラリア原虫であるプラスモディウム  ファルシパラム（Plasmodium falciparum）に感染した。さらに、１５７名の海兵隊進攻部隊は、モンロビアのロバート国際空港に駐屯した１２日間にわたって、４４％のマラリアによる死傷者を被った。マラリア流行地域で行われた前世紀中の全ての紛争で、マラリアは死傷原因の第1位であり、任務から失われる「人日」に及ぼすその影響において、敵によって負わされた死傷者数を上回ってきた。
【０００３】
米国の軍事作戦の間、マラリアと闘うために、予防薬、虫除け、およびバリアの使用はいくらか成果を挙げてきたが、マラリア原虫による薬剤耐性や蚊媒体による殺虫剤耐性の発生により、これらの薬剤の有効性は制限されてきた。その上、これらの薬剤の使用に伴う補給上の負担や副作用は、遵守されない割合が高いこととしばしば関連する。ワクチンは、感染症に対して最も費用対効果が優れており、かつ最も効率的な治療的介入である。この点で、ワクチン接種は軍の配備に先立って投与するという利点があり、遵守されないリスクをおそらくは減少させるだろう。しかしながら、数十年に及ぶマラリアワクチンに関する研究開発は成功していない。最近は、数種の特定のマラリア遺伝子に対するワクチンおよび送達ベクターシステム（アデノウイルス、ポックスウイルス、プラスミドを含む）の開発に集中した取り組みがなされてきた。マラリアワクチンの開発および臨床試験の現状は、例えばGraves and Gelband, Cochrane Database Syst. Rev., 1: CD000129 (2003)、Moore et al, Lancet Infect. Dis., 2: 737-743 (2002)、Carvalho et al., Scand. J. Immunol, 56: 327-343 (2002)、Moorthy and Hill, Br. Med. Bull, 62: 59-72 (2002)、Greenwood and Alonso, Chem. Immunol, 80: 366-395 (2002)、およびRichie and Saul, Nature, 415: 694-701 (2002) で概観されている。
【０００４】
過去１５〜２０年にわたって、マラリア抗原に基づく合成ペプチドまたは組換えタンパク質を用いた、一連のフェーズ１／２ワクチン試験が報告されてきた。１９９８年現在で、およそ４０の試験が報告された（Engers and Godal, Parisitology Today, 14: 56-64 (1998)参照）。これらの試験のほとんどは、プラスモディウム属の生活環のスポロゾイトステージまたは肝臓ステージに対して行われており、そこでは、実験的な蚊によるチャレンジを使用することにより、フェーズ１からフェーズ２a予備的効能研究への迅速な進行が可能となる。試験した抗スポロゾイトワクチンには、完全な合成ペプチド、（Ｔ細胞の助けを提供するための）破傷風トキソイドのような合成ペプチドのタンパク質との複合体、組換えマラリアタンパク質、粒子形成組換えキメラ構築物、組換えウイルス、ならびにバクテリアおよびＤＮＡワクチンが含まれる。無性血液ステージワクチンのいくつかの試験では、合成ペプチド複合体か組換えタンパク質のどちらかが使用されてきた。伝播阻止ワクチン（組換えＰｆｓ２５）の単一の試験もある。これらのワクチン接種戦略の全てにおいて多発する問題は、動物モデルでは強い免疫原性応答があるにもかかわらず、ヒトにおいては十分に強力かつ長期持続的な免疫応答を得ることが難しいということである。
【０００５】
これらの制限を克服するために、主要なスポロゾイトコートタンパク質であるスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）に対するワクチンの開発に加えて、強力な免疫刺激複合体またはヒトの応答を増強するアジュバントを開発することが探索されてきた。組換えタンパク質、ペプチド複合体、組換えタンパク質複合体およびキメラタンパク質を使用した抗ＣＳＰワクチンは、抗ＣＳＰ抗体を導くことが示されている。かなりの取り組みが依然としてタンパク質に基づくワクチンの開発に対して行われているが、ＤＮＡやウイルスに基づくワクチンなどの代替技術は、少なくとも動物モデルにおいて免疫原性および防御効果の点でいくらか展望が見られた。
【０００６】
これに関しては、プラスモディウム属抗原をコードするＤＮＡワクチンが開発され、かつマウス（Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91: 9866-9870 (1994)、およびDoolan et al., J. Exp. Med., 183: 1739-1746 (1996)参照)ならびにサル (Wang et al., Science, 282: 476-480 (1998)、Rogers et al., Infect. Immun., 69: 5565-5572 (2001)、およびRogers et al., Infect. Immun., 70: 4329-4335 (2002)参照）において、ＣＤ８＋  ＣＴＬおよびＩＦＮ−γ応答、ならびにスポロゾイトチャレンジに対する防御を誘導することができた。さらに、フェーズＩとフェーズ２aの臨床試験により、正常な健常人における、マラリア抗原をコードするＤＮＡワクチンの安全性、耐容性および免疫原性が立証された（例えば、Wang et al., Infect Immun., 66: 4193-41202 (1998)、Le et al., Vaccine, 18: 1893-1901 (2000)、およびEpstein et al., Hum. Gene Ther., 13: 1551-1560 (2002)参照）。しかしながら、非ヒト霊長類およびヒトにおける、第１および第２世代のＤＮＡワクチンの免疫原性は次善のものであった。マウスモデルにおいてでさえも、ＤＮＡワクチンは免疫システムの両腕を活性化するのには効果的でなかった（例えば、Doolan et al., supra、Sedegah et al., supra、Sedegah et al., Proc. NatlAcad. Sci USA, 95: 7648-7653 (1998)、Zavala et al., Virology, 280: 155-159 (2001)、およびPardoll, Nat. Rev. Immunol, 2: 227-238 (2002)参照）。
【０００７】
したがって、ヒト宿主にマラリア抗原を効率よく送達して、病気の発症を予防する及び／又は更なる感染からヒト宿主を防御する、改良された構築物が依然として必要である。本発明は、かかる構築物を提供する。本発明のこの利点および他の利点は、本明細書中で提供される詳細な記載により明らかになるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（本発明の簡単な要旨）
本発明は、３つ以上の異種抗原をコードする核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターを提供する。３つ以上の核酸配列は、少なくとも２つの異なるプロモーターに機能的に結合する。
【０００９】
本発明は、２つ以上の核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターも提供する。各核酸配列は、プラスモディウム属抗原をコードし、少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合する。
【００１０】
本発明は、さらに、哺乳動物においてマラリアに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。該方法は、哺乳動物に対して（a）３つ以上の核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、各核酸配列がプラスモディウム属の前赤血球ステージ抗原をコードし、かつ少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合したもの、および（ｂ）２つ以上の核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、各核酸配列がプラスモディウム属血液ステージ抗原をコードし、かつ少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合したもの、を投与し、該抗原を該哺乳動物で発現させてマラリアに対する免疫応答を誘導することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
１つの病原体の複数の抗原に対して宿主を免疫し、病原体のチャレンジに対して防御する１つのワクチン（すなわち、「多価」ワクチン）を開発することは、現在のワクチン方法論を超えるたくさんの利点を提供する。特に、多価ワクチンは、所定の病原体に対するより強力で幅広い宿主の応答を誘導し、かつ１つの病原体を標的にする複数のワクチンを調製して投与するよりも費用対効果に優れた代替手段である。したがって、本発明は、マラリアに対するアデノウイルスベクターに基づく多価ワクチンを提供する。この点において、本発明は、３つ以上の異種抗原をコードする核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターを提供する。３つ以上の核酸配列は、少なくとも２つの異なるプロモーターに機能的に結合する。本発明は、２つ以上の核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターも提供する。該各核酸配列は、プラスモディウム属抗原をコードし、少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合する。
【００１２】
アデノウイルス（Ａｄ）は、３６ｋｂの２本鎖ＤＮＡウイルスであり、多種多様な異なる標的細胞タイプに、インビボでＤＮＡを効率よく導入する。本発明における使用のために、ウイルスの複製に必要な選り抜きの遺伝子を全部または部分的に欠失させることにより、アデノウイルスを複製欠損にすることが好ましい。より大きなＤＮＡ挿入物のためのさらなるスペースを割り当てるために、犠牲にできるＥ３領域もまた、しばしば欠失させる。該ベクターは、高力価で製造することができ、かつ複製する細胞および複製しない細胞にＤＮＡを効率よく導入することができる。新たに導入された遺伝情報は、染色体外にとどまるので、ランダム挿入変異や標的細胞の遺伝子型の永久的な変化のリスクをなくす。しかしながら、所望すれば、ＡＡＶ−Ａｄキメラベクターを構築することによって、ＡＡＶのインテグレーション特性をアデノウイルスに与えることができる。例えば、ＡＡＶのＩＴＲおよびＲｅｐタンパク質をコードする核酸をアデノウイルスベクターに組み入れることで、アデノウイルスベクターを哺乳動物細胞ゲノムに組み込むことができる。それゆえ、ＡＡＶ−Ａｄキメラベクターは、本発明における使用にとって望ましい選択肢の１つであり得る。
【００１３】
多様な起源、サブタイプ、またはサブタイプの混成物に由来するアデノウイルスが、アデノウイルスベクターのためのウイルスゲノム源として使用され得る。非ヒトアデノウイルス（例えば、サル、トリ、イヌ、ヒツジまたはウシアデノウイルス）がアデノウイルスベクターを作成するのに使用され得るが、好ましくはヒトのアデノウイルスがアデノウイルスベクターのためのウイルスゲノム源として使用される。例えば、アデノウイルスは亜群Ａ（例えば、血清型１２、１８および３１）、亜群Ｂ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５および５０）、亜群Ｃ（例えば、血清型１、２、５および６）、亜群Ｄ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９および４２〜４８）、亜群Ｅ（例えば、血清型４）、亜群Ｆ（例えば、血清型４０および４１）、未分類の血清型群（例えば、血清型４９および５１）または任意の他のアデノウイルスの血清型であり得る。アデノウイルス血清型１から５１（すなわち、Ａｄ１からＡｄ５１）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。本発明おいては、好ましくは、アデノウイルスベクターはヒトの亜群Ｃ、特に血清型２、またはいっそう望ましくは血清型５である。しかしながら、非Ｃ群アデノウイルスを、宿主細胞に遺伝子産物を送達するためのアデノウイルス遺伝子導入ベクターを調製するために使用することができる。非Ｃ群アデノウイルス遺伝子導入ベクターを構築するのに使用される好ましいアデノウイルスは、Ａｄ１２（Ａ群）、Ａｄ７およびＡｄ３５（Ｂ群）、Ａｄ３０およびＡｄ３６（Ｄ群）、Ａｄ４（Ｅ群）、ならびにＡｄ４１（Ｆ群）を含む。非Ｃ群アデノウイルスベクター、非Ｃ群アデノウイルスベクターの作製方法、および非Ｃ群アデノウイルスベクターの使用方法は、例えば、米国特許５，８０１，０３０、５，８３７，５１１および５，８４９，５６１ならびに国際特許出願公開ＷＯ９７／１２９８６およびＷＯ９８／５３０８７に開示されている。
【００１４】
アデノウイルスベクターはサブタイプの混成物を含み得、したがって、「キメラ」アデノウイルスベクターであり得る。キメラアデノウイルスベクターは、２つ以上（例えば２、３、４など）の異なるアデノウイルス血清型に由来するアデノウイルスゲノムを含み得る。本発明において、キメラアデノウイルスベクターは、２つ以上の異なるアデノウイルスの血清型の各々のゲノムを、ほぼ異なる、またはほぼ等しい量含み得る。キメラアデノウイルスベクターゲノムが２つの異なるアデノウイルス血清型のゲノムで構成される場合、キメラアデノウイルスベクターゲノムは、好ましくは１つのアデノウイルス血清型のゲノムを約７０％以下（例えば、約６５％、約５０％、または約４０％以下）を含み、その残りは他のアデノウイルス血清型のゲノムに由来する。１つの実施態様において、キメラアデノウイルスベクターは血清型２ゲノムの一部と血清型５ゲノムの一部とを含むアデノウイルスゲノムを含有し得る。例えば、かかるアデノウイルスベクターのヌクレオチド１−４５６は、血清型２ゲノム由来であり得、アデノウイルスゲノムの残りは血清型５ゲノム由来であり得る。
【００１５】
本発明のアデノウイルスベクターは、複製能力を有し得る。例えば、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノム中に、宿主細胞中でのウイルス複製を阻害しない変異（例えば、欠失、挿入、または置換）を有し得る。アデノウイルスベクターはまた、条件付き複製可能でもあり得る。しかしながら、アデノウイルスベクターは、好ましくは宿主細胞内で複製欠損である。
【００１６】
「複製欠損」とは、アデノウイルスベクターが、例えば少なくとも１つの複製に不可欠な遺伝子機能を欠損した結果として、複製に必要なアデノウイルスゲノムの１つ以上の領域が相補されることを必要とすることを意味する（すなわち、アデノウイルスベクターが、通常の典型的な宿主細胞中、特に本発明の方法の過程でアデノウイルスベクターに感染し得るであろうヒト患者の細胞中で複製しないように）。本明細書中で使用される、遺伝子、遺伝子機能、遺伝子またはゲノム領域の欠損とは、核酸配列が全部または部分的に変異または欠失した、ウイルスゲノムの十分な遺伝物質の変異または欠失により、遺伝子の機能を完全になくしたり損傷させたりする（例えば、遺伝子産物の機能が少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、または５０倍減少するように）こととして定義される。全遺伝子領域の欠失は、複製に必須な遺伝子機能の破壊には必要でないことが多い。しかしながら、アデノウイルスゲノムに１つ以上の導入遺伝子のための十分な余地を提供するために、遺伝子領域の大半を取り除くことが望ましいこともある。遺伝物質の欠失は好ましいが、付加や置換による遺伝物質の変異もまた遺伝子機能の破壊に適している。複製に必須な遺伝子機能は、複製（例えば、増殖）に必要であり、かつ例えばアデノウイルスの初期領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１−Ｌ５領域）、ウイルスパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶa２遺伝子）、ならびにウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ−ＲＫＡ１および／またはＶＡ−ＲＮＡ−２）にコードされている遺伝子機能である。
【００１７】
複製欠損アデノウイルスベクターは、望ましくは、ウイルスの複製のために、アデノウイルスゲノムの１つ以上の領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能の相補を必要とする。好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルスの複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、またはＥ４領域の、少なくとも１つの遺伝子機能の相補を必要とする（Ｅ１欠損またはＥ４欠損ウイルスベクターとよぶ）。Ｅ１領域の欠損に加えて、組換えアデノウイルスはまた、国際特許出願公開ＷＯ００／００６２８号で論じられるように、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に変異を有し得る。最も好ましくは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能（望ましくは全ての複製に必須な遺伝子機能）および必須ではないＥ３領域の少なくとも１つの遺伝子機能が欠損している（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩの欠失）（Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターとよぶ）。Ｅ１領域に関して、アデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａ領域の一部もしくは全ておよび／またはＥ１Ｂ領域の一部もしくは全てを欠損し得る（例えば、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の各々の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能であり、したがって、複製には、アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域の相補を必要とする）。アデノウイルスベクターはまた、例えばＥ４領域の１つ以上の複製に必須な遺伝子機能の欠損により、複製に、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の相補を必要とし得る。
【００１８】
アデノウイルスベクターがＥ１欠損である場合、該アデノウイルスベクターゲノムは、ヌクレオチド３３５から３７５の間の任意のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド３５６）で始まり、ヌクレオチド３３１０から３３５０の間の任意のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド３３２９）で終わる、あるいは３４９０から３５３０の間の任意のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド３５１０）で終わりさえする欠失を含み得る（アデノウイルス血清型５ゲノムに基づく）。Ｅ２Ａ欠損である場合、アデノウイルスベクターゲノムは、ヌクレオチド２２４２５から２２４６５の間の任意のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド２２４４３）で始まり、ヌクレオチド２４０１０から２４０５０の間の任意のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド２４０３２）で終わる欠失を含み得る（アデノウイルス血清型５ゲノムに基づく）。Ｅ３欠損である場合、アデノウイルスベクターゲノムは、ヌクレオチド２８５７５から２９６１５の間の任意のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド２８５９３）で始まり、ヌクレオチド３０４５０から３０４９０の間の任意のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド３０４７０）で終わる欠失を含み得る（アデノウイルス血清型５ゲノムに基づく）。Ｅ４欠損である場合、アデノウイルスベクターゲノムは、例えば、ヌクレオチド３２８０５から３２８４５の間の任意のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド３２８２６）で始まり、ヌクレオチド３５５４０から３５５８０の間の任意のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド３５５６１）で終わる欠失を含み得る（アデノウイルス血清型５ゲノムに基づく）。欠失したヌクレオチド部分を規定する端点は正確に決定することが困難であり得、また、通常はアデノウイルスベクターの性質に大して影響を与えないであろう（すなわち、前記ヌクレオチド番号はそれぞれ、＋／−１、２、３、４、５ヌクレオチドであり得、あるいは１０または２０ヌクレオチドでさえあり得る）。
【００１９】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの１つの領域内の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能を欠損する場合（例えば、Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクター）、該アデノウイルスベクターは「単一複製欠損」という。特に好ましい単一複製欠損アデノウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクターを増殖させるために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、せいぜいアデノウイルスゲノムのＥ１領域の相補を必要とする複製欠損アデノウイルスベクターである。
【００２０】
アデノウイルスベクターは、「多重複製欠損」であり得る。多重複製欠損とは、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域の各々で１つ以上の複製に必須な遺伝子機能を欠損しており、複製のためにそれらの機能の相補を必要とすることを意味する。例えば、前記Ｅ１欠損またはＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能（Ｅ１／Ｅ４またはＥ１／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターと表す）、および／またはＥ２領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能（Ｅ１／Ｅ２またはＥ１／Ｅ２／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表す）、好ましくは、Ｅ２Ａ領域（Ｅ１／Ｅ２ＡまたはＥ１／Ｅ２Ａ／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表す）をさらに欠損し得る。アデノウイルスベクターが多重複製欠損である場合、該欠損は個々の領域に関して前記したヌクレオチドの欠失の組合せであり得る。
【００２１】
本発明のアデノウイルスベクターがＥ２Ａ領域の複製に必須の遺伝子機能を欠損する場合、該ベクターは好ましくはＥ２Ａ領域を完全には欠失しない。欠失は、好ましくは約２３０塩基対未満の長さである。一般的に、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）、すなわちＤＮＡ複製に必要なポリペプチドをコードする。ＤＢＰは、ウイルスの血清型により４７３個から５２９個のアミノ酸からなる。ＤＢＰは、延長されたＮｔドメインを有する球形のＣｔからなる長楕円として存在する非対称タンパク質であると信じられている。Ｃｔドメインは、核酸に結合し、亜鉛に結合して、ＤＮＡ鎖伸長のレベルでＤＮＡ合成に機能するというＤＢＰの能力を担っていることを研究は示している。しかしながら、Ｎｔドメインは転写および転写後レベルの両方で後期遺伝子発現に機能していると信じられており、タンパク質の効率的な核局在化性を担い、かつそれ自身の発現の増大にも関与し得る。アミノ酸２から３８の間のＮｔドメインにおける欠失は、この領域がＤＢＰ機能にとって重要であることを示している（Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993)）。ＤＢＰのＣｔ領域をコードするＥ２Ａ領域における欠失がウイルスの複製に影響しないのに対して、ＤＢＰのＮｔドメインのアミノ酸２から３８をコードするＥ２Ａ領域の欠失はウイルスの複製機能を損なう。いかなる多重複製欠損性アデノウイルスベクターも、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の当該部分を含んでいることが好ましい。詳しくは、例えば、保持されるべきＥ２Ａ領域の所望の部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端で定義されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の一部であり、特にアデノウイルス血清型５ゲノムのＥ２Ａ領域のＡｄ５（２３８１６）位からＡｄ５（２４０３２）位である。アデノウイルスゲノムのこの部分は、現在のＥ２Ａ相補細胞株内では、所望のレベルのウイルス増殖を提供するようには相補されないので、当該部分はアデノウイルスベクター中に含まれることが望ましい。
【００２２】
上記の欠失はアデノウイルス血清型５ゲノムに関して記載されているが、多様なアデノウイルス血清型（特にアデノウイルス血清型２と５）間のゲノムの類似性に基づいて、当業者は必要以上の実験をせずに他のアデノウイルス血清型（例えば、アデノウイルス血清型２ゲノムなど）の同じ領域のヌクレオチド座標を確定させることができる。
【００２３】
本発明の１つの実施態様において、アデノウイルスベクターはＥ１およびＥ４領域のそれぞれの１つ以上の複製に必須な遺伝子機能を欠損したアデノウイルスゲノムを含むことができ（すなわち、アデノウイルスベクターはＥ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターである）、好ましくはアデノウイルスゲノムからＥ４領域の全コーディング領域が欠失している。言い換えると、Ｅ４領域の全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が取り除かれている。最も好ましくは、アデノウイルスベクターは全Ｅ１領域欠失とＥ４領域の一部の欠失により複製欠損の状態にする。アデノウイルスベクターのＥ４領域は天然のＥ４プロモーター、ポリアデニル化配列、および／または右側逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を保持し得る。
【００２４】
アデノウイルスベクターの様々な領域の欠失が哺乳動物の免疫応答を変化させ得ることを理解すべきである。詳細には、様々な領域の欠失は、アデノウイルスベクターによって生じる炎症性応答を減少させ得る。全Ｅ４領域を欠失したアデノウイルスベクターは、宿主の免疫応答の低下を導き得る。さらに、国際特許出願ＷＯ９８／４０５０９に記載のように、アデノウイルスベクターのコートタンパク質を改変して、野生型コートタンパク質に対する中性抗体によって、アデノウイルスベクターが認識されにくくするか、認識されないようにすることができる。かかる改変は、持続性疾患の長期治療に有用である。
【００２５】
多重複製欠損（特にＥ１およびＥ４領域の複製に必須な遺伝子機能において）である場合、アデノウイルスベクターは単一複製欠損アデノウイルスベクター（特にＥ１欠損アデノウイルスベクター）により達成されるのと同様の、相補細胞株でのウイルス増殖をもたらすスペーサー配列を含み得る。Ｌ５ファイバー領域が保持された本発明の好ましいＥ４欠損アデノウイルスベクターでは、スペーサーは望ましくはＬ５ファイバー領域と右側ＩＴＲとの間に位置する。かかるアデノウイルスベクターにおいて、より好ましくは、Ｅ４ポリアデニル化配列は単独で、または最も好ましくは他の配列と組み合わさって、Ｌ５ファイバー領域と右側ＩＴＲとの間に存在して、保持された右側ＩＴＲからＬ５ファイバー領域を十分に分離するようにし、そうしてかかるベクターのウイルス産生が単一複製欠損アデノウイルスベクター（特に単一複製欠損Ｅ１欠損アデノウイルスベクター）のウイルス産生に近付くようにする。
【００２６】
スペーサー配列は、任意の所望の長さの１つまたは複数のヌクレオチド配列、例えば少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５塩基対から１２，０００塩基対の間）、好ましくは約１００塩基対から１０，０００塩基対、より好ましくは約５００塩基対から約８,０００塩基対、いっそう好ましくは約１，５００塩基対から約６，０００塩基対、および最も好ましくは約２，０００から約３，０００塩基対の長さの配列を含むことができる。。スペーサー配列は、アデノウイルスゲノムに関してコーディングまたは非コーディングおよび天然または非天然であり得るが、欠損領域の複製に必須な機能は回復させない。スペーサーは、プロモーター可変発現カセットも含有し得る。より好ましくは、スペーサーは追加のポリアデニル化配列および／またはパッセンジャー遺伝子を含む。好ましくは、スペーサーがＥ４を欠損した領域に挿入された場合、アデノウイルスゲノムのＥ４ポリアデニル化配列とＥ４プロモーターとの両方またはいずれか他の（細胞またはウイルスの）プロモーターがベクター内に残される。スペーサーは、Ｅ４ポリアデニル化部位とＥ４プロモーターとの間に位置し、もしくは、Ｅ４プロモーターがベクター内に存在しないときには、スペーサーは右側ＩＴＲに近接する。スペーサーはいかなる適切なポリアデニル化配列も含み得る。適切なポリアデニル化配列の例は、合成最適化配列、ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）およびパピローマウイルス（ヒトパピローマウイルスおよびＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含む）を含む。好ましくは、特にＥ４欠失領域では、スペーサーはＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、多重複製欠損アデノウイルスベクターのウイルス産生レベルをより高くできる。スペーサーがない場合、多重複製欠損アデノウイルスベクターのファイバータンパク質の産生および／またはウイルス増殖は、単一複製欠損アデノウイルスベクターのファイバータンパク質の産生および／またはウイルス増殖に比べて減少する。しかしながら、少なくとも１つの欠損アデノウイルス領域（好ましくはＥ４領域）にスペーサーを含むと、ファイバータンパク質産生およびウイルス増殖の該減少を弱めることができる。理想的には、スペーサーはグルクロニダーゼ遺伝子からなる。アデノウイルスベクターでスペーサーを使用することは、例えば米国特許５，８５１，８０６および国際特許出願公開ＷＯ９７／２１８２６にさらに記載されている。
【００２７】
例えば米国特許６，２２５，１１３、６，６４９，３７３および６，６６０，５２１ならびに国際特許出願公開ＷＯ００／３４４９６に記載されるように、少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターは限られた時間内にインビボで導入遺伝子を高レベルで発現すること、少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現の持続がトランス作用因子（例えばＨＳＶ  ＩＣＰ０、Ａｄ  ｐＴＰ、ＣＭＶ−ＩＥ２、ＣＭＶ−ＩＥ８６、ＨＩＶ  ｔａｔ、ＨＴＬＶ−ｔａｘ、ＨＢＶ−Ｘ、ＡＡＶ  Ｒｅｐ  ７８、ＨＳＶ  ＩＣＰ０のような機能を有するＵ２０５骨肉腫細胞株から得た細胞性因子、または神経成長因子により誘導されるＰＣ１２細胞中の細胞性因子など）の作用により調節可能であることが観察されている。前述を考慮して、複製欠損アデノウイルスベクター（例えば、少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクター）または第２の発現ベクターは、核酸配列の発現の持続性を調節するトランス作用因子をコードする核酸配列を含み得る。
【００２８】
望ましくは、アデノウイルスベクターは、複製（すなわち増殖）のために、せいぜいアデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａおよび／またはＥ４領域の複製に必須な遺伝子機能の相補を必要とするものである。しかしながら、アデノウイルスベクターが欠損のままであり、例えば相補細胞および／または壊された複製に必須な遺伝子機能をコードする外来ＤＮＡ（例えば、ヘルパーアデノウイルス）を使用することにより増殖可能である限り、アデノウイルスゲノムは、実施者が望むように１つ以上の複製に必須な遺伝子機能を壊すように改変され得る。これに関し、アデノウイルスベクターはアデノウイルスゲノムの初期領域のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域のみ、アデノウイルスゲノムの初期と後期領域の両方、または全てのアデノウイルス遺伝子の複製に必須な遺伝子機能を欠損させることができる（すなわち、高容量アデノベクター（ＨＣ−Ａｄ）、Morsy et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95: 965-976 (1998)、Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94: 1645-1650 (1997)、およびKochanek et al., Hum. Gene Ther., 10: 2451-2459 (1999)参照）。適切な複製欠損アデノウイルスベクター（単一および多重複製欠損アデノウイルスベクターを含む）は、米国特許5,837,511、5,851,806、5,994,106、6,127,175、および6,482,616；米国特許出願公開2001/0043922 Al、2002/0004040 Al、2002/0031831 Al、2002/0110545 Al、および2004/0161848 Al；ならびに国際特許出願公開WO 94/28152、WO 95/02697、WO 95/16772、WO 95/34671、WO 96/22378、WO 97/12986、WO 97/21826、およびWO 03/022311に開示されている。
【００２９】
例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３およびＥ４領域の全てまたは一部を取り除くことにより、生じたアデノウイルスベクターはアデノウイルスキャプシド中にパッケージングされる能力を残しつつ、外来核酸配列の挿入を受け入れ可能である。該核酸配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ３領域またはＥ４領域中に配置され得る。実際、核酸配列は、配置が核酸配列の発現を妨げたりアデノウイルスベクターのパッケージングの邪魔をしない限り、アデノウイルスゲノム中のどこにでも挿入可能である。
【００３０】
複製欠損アデノウイルスベクターは、通常、高力価のウイルスベクターストックを生み出すために適切なレベルで、複製欠損アデノウイルスベクター中に存在しないがウイルス増殖にとって必要な遺伝子機能を提供する相補細胞中で生産される。望ましくは、相補細胞株は、アデノウイルス増殖に必要な遺伝子機能をコードするアデノウイルス核酸配列を、細胞ゲノム中に組み込まれた状態で含む。好ましい細胞株は、複製欠損アデノウイルス中に存在しない少なくとも１つ、好ましくは全ての複製に必須な遺伝子機能を相補する。相補細胞株は、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連ＲＮＡ領域またはそれらの組合せによりコードされる少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能（全てのアデノウイルス機能（例えば、アデノウイルスアンプリコンの増殖を可能にする）を含む）の欠損を相補することができる。最も好ましくは、相補細胞株はアデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能（例えば、２つ以上の複製に必須な遺伝子機能）、特に、Ｅ１ＡとＥ１Ｂ領域の各々の複製に必須な遺伝子機能の欠損を相補する。さらに、相補細胞株はアデノウイルスゲノムのＥ２（特にアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質に関して）および／またはＥ４領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能の欠損を相補できる。望ましくは、Ｅ４領域の欠損を相補する細胞は、Ｅ４−ＯＲＦ６遺伝子配列を含み、Ｅ４−ＯＲＦ６タンパク質を生産する。かかる細胞は、アデノウイルスゲノムの少なくともＯＲＦ６を含み、かつＥ４領域のその他のＯＲＦを含まない。この細胞株は、好ましくは、アデノウイルスベクターと重複しないように相補遺伝子を含有するということでさらに特徴付けられる。このことは、ベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組み換わる可能性を最小化し、実質的に排除する。したがって、ベクターストック中に複製可能なアデノウイルス（ＲＣＡ）が存在することを避けられないとしても最小化する。このことはある治療目的（特にワクチン接種目的）に適している。ベクターのストックでのＲＣＡの欠如が、非相補細胞でのアデノウイルスベクターの複製を回避する。かかる相補細胞株の構築は標準的な分子生物学および細胞培養技術（例えばSambrook et al., supra、およびAusubel et al., supraに記載）を含む。
【００３１】
アデノウイルスベクターを生産するための相補細胞株は、２９３細胞（例えば、Graham et al., J Gen. Virol, 36, 59-72 (1977)に記載）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、国際特許出願公開WO 97/00326ならびに米国特許5,994,128および6,033,908に記載）、２９３−ＯＲＦ６細胞（例えば、国際特許出願公開 WO 95/34671およびBrough et al, J Virol, 71: 9206-9213 (1997)に記載）を含むが、これに限定されない。さらなる相補細胞は、例えば、米国特許6,677,156および6,682,929ならびに国際特許出願公開WO 03/20879に記載されている。いくつかの例では、細胞ゲノムは複製欠損アデノウイルスベクターの欠損の全てを相補する核酸配列、遺伝子産物を含む必要がない。複製欠損アデノウイルスベクターで欠如している１つ以上の複製に必須な遺伝子機能は、ヘルパーウイルス、例えば、所望のアデノウイルスベクターの複製に必要である１つ以上の不可欠な遺伝子機能をトランスに供給するアデノウイルスベクターによって供給することができる。ヘルパーウイルスは、しばしば感染性のヘルパーウイルスのパッケージングを妨げるように設計される。例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の１つ以上の複製に必須な遺伝子機能が相補細胞によって提供され、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の１つ以上の複製に必須な遺伝子機能がヘルパーウイルスによって提供される。
【００３２】
アデノウイルスベクターが複製欠損でないならば、理想的には、アデノウイルスベクターは標的組織内でのベクターの複製を限定するように操作される。アデノウイルスベクターは、条件付複製アデノウイルスベクターであり得、実施者が前もって決定した条件下で複製するように設計される。例えば、複製に必須な遺伝子機能（例えばアデノウイルス初期領域にコードされた遺伝子機能）は、誘導可能であり、抑制可能でありまたは組織特異的な転写制御配列（例えばプロモーター）に機能的に結合することができる。この実施態様において、複製には、転写制御配列に相互作用する特定の因子の存在または不在が必要である。例えば、自己免疫疾患の治療において、継続的な抗原産生を得、かつ免疫細胞産生を制御するために例えばリンパ節でのアデノウイルスベクターの複製を制御することは好都合であり得る。条件付複製アデノウイルスベクターは、さらに米国特許 5,998,205に記載されている。
【００３３】
複製に必須な遺伝子機能をコードするアデノウイルス配列の改変（例えば、欠失、変異、または置換）に加えて、アデノウイルスゲノムは良性または非致死性の改変、すなわち、かかる改変がさもなくば複製に必須な遺伝子機能を含有するアデノウイルスゲノムの領域で行われたとしても、アデノウイルス複製欠損にしない、または望ましくは、ウイルス機能および／またはウイルスタンパク質の産生に悪影響を与えない改変を含有することができる。かかる改変は、一般的には、ＤＮＡ操作の結果として生じ、または発現ベクター構築を容易にするように作用する。例えば、アデノウイルスゲノム中の制限酵素部位を取り除いたり導入したりすることは好都合であり得る。かかる良性の突然変異は、しばしばウイルス機能において検知できる副作用を有さない。例えば、アデノウイルスベクターは、ＶＡ−ＲＮＡ−１の転写に関連するヌクレオチド１０，５９４と１０，５９５（アデノウイルス血清型５ゲノムに基づく）との欠失を含み得るが、該ヌクレオチドの欠失はＶＡ−ＲＮＡ−１の産生を妨げない。
【００３４】
同様に、アデノウイルスベクターのコートタンパク質を操作して、可能性のある宿主細胞のウイルスレセプターに対するウイルスの結合特異性または認識を変化させることができる。アデノウイルスにとって、かかる操作はファイバー、ペントン、またはヘキソンの領域の欠失、コートタンパク質の部分への多様な天然または非天然のリガンドの挿入などを含み得る。コートタンパク質の操作は、アデノウイルスベクターに感染する細胞の範囲を広げることができ、または特定の細胞タイプへのアデノウイルスベクターの標的化を可能にする。
【００３５】
宿主細胞への天然の結合（例えば、細胞のコクサッキーウイルスおよびアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）へのファイバータンパク質の天然の結合）を変化させるいかなる適当な技術も用いることができる。例えば、細胞に対する天然の結合が除去されるようにファイバー長を変えることを利用し得る。これは、ペントンベースまたはファイバーノブへの結合配列の付加を介して任意に達成されることができる。この結合配列の付加は、直接にあるいは二重特異性または多重特異性結合配列を介して間接になされ得る。代わりの実施態様において、アデノウイルスファイバータンパク質はファイバーシャフト中のアミノ酸の数を減少するように改変し、それによって「短シャフト化」ファイバーを生み出すことができる(例えば、米国特許5,962,311に記載のように)。短シャフト化アデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用は、アデノウイルスファイバーのその細胞表面レセプターへの結合のレベルまたは効率を減少させ、かつアデノウイルスペントンベースのその細胞表面レセプターへの結合を増加させ、それによって、所定の細胞へのアデノウイルスの結合特異性を増大させる。あるいは、短シャフト化ファイバーを含むアデノウイルスの使用が、ペントンベースまたはファイバーノブに非天然アミノ酸配列を導入することによる所望の細胞表面レセプターへのアデノウイルスの標的化を可能にする。
【００３６】
さらに別の実施態様において、変異した核酸残基を組み込んだ（またはそれによりコードされるファイバータンパク質を有する）アデノウイルスベクターがその天然の基質に結合する能力を低下させるように、天然の基質結合に関連するアミノ酸残基をコードする核酸残基の変換、追加、または欠失が可能である（例えば、国際特許出願公開 WO 00/15823, Einfeld et al., J. Virol., 75(23): 11284-11291 (2001)、およびvan Beusechem et al., J Virol, 76(6): 2753-2762 (2002)参照）。この点において、アデノウイルスベクターの天然のＣＡＲおよびインテグリン結合部位（例えばそれぞれ、アデノウイルスファイバータンパク質のノブドメインおよびアデノウイルスペントンベースに位置するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列など）は除去または破壊され得る。ファイバータンパク質が三量体化されることができる限り、ノブとＣＡＲとの間の相互作用を媒介または援助するファイバータンパク質のいかなる適切な１もしくは複数のアミノ酸残基も変異または除去され得る。同様に、ファイバータンパク質が三量体化する能力を保持する限り、アミノ酸をファイバーノブに付加し得る。適切な残基は、血清型５ファイバーノブドメインの外側に曝されたループ（例えばＡＢループ、ＤＥループ、ＦＧループ、およびＨＩループなど）内のアミノ酸を含む（例えば、Roelvink et al., Science, 286, 1568-1571 (1999)、および米国特許6,455,314にさらに記載されている）。ペントンベースとインテグリンとの相互作用を媒介または援助するペントンベースタンパク質のいかなる適切な１もしくは複数のアミノ酸残基も変異または除去され得る。例えば、適切な残基はＡｄ５ペントンベースタンパク質の超可変領域に位置する５つのＲＧＤアミノ酸配列モチーフの１つ以上を含む（例えば、米国特許5,731,190に記載）。ペントンベースタンパク質の天然のインテグリン結合部位はまた、天然のＲＧＤアミノ酸配列がαｖインテグリンレセプターと結合するために立体構造的に近づけないように天然のＲＧＤモチーフをコードする核酸配列を改変することによっても破壊され得る（例えば、アデノウイルスペントンベースタンパク質をコードする核酸配列内にまたはそれに隣接させてＤＮＡ配列を挿入することによる）。好ましくは、アデノウイルスベクターは、それぞれＣＡＲおよびインテグリンに結合しないファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質を含む。あるいは、アデノウイルスベクターは、それぞれＣＡＲおよびインテグリンと結合するが、対応する野生型コートタンパク質よりも低いアフィニティを有するファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質を含む。もし改変されたアデノウイルスファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質が同じ血清型の無改変アデノウイルスファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質よりも少なくとも約５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、または１００倍低いアフィニティでＣＡＲおよびインテグリンとそれぞれ結合するならば、アデノウイルスベクターはＣＡＲおよびインテグリンへの結合性が低下している。
【００３７】
アデノウイルスベクターはまた、基質（すなわち、リガンド）（例えば、ＣＡＲ、αｖインテグリンレセプター以外の細胞性レセプター）に結合する非天然のアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質も含み得る。かかるキメラコートタンパク質は、天然の細胞表面レセプターに結合する能力を保持している対応のアデノウイルスが自然感染しない宿主細胞にアデノウイルスベクターが結合し、望ましくは感染することを可能にする。それによって、さらにアデノウイルスベクターに感染する細胞タイプのレパートリーが広がる。キメラアデノウイルスコートタンパク質の非天然アミノ酸配列は、非天然アミノ酸配列を持たない対応するアデノウイルスが自然感染しない宿主細胞（すなわち、対応する野生型アデノウイルスに感染しない宿主細胞）にキメラコートタンパク質を含むアデノウイルスベクターが結合し、望ましくは感染することを可能にし、対応するアデノウイルスが自然感染する宿主細胞に非天然アミノ酸配列を持たない対応するアデノウイルスよりも強いアフィニティで結合することを可能にし、または標的でない細胞よりも強いアフィニティで特定の標的細胞に結合することを可能にする。「非天然の」アミノ酸配列は、アデノウイルスコートタンパク質中に自然には存在しないアミノ酸配列、またはアデノウイルスコート中には見られるがキャプシド内の非天然の位置に存在しているアミノ酸配列を含み得る。「選択的に結合する」とは、非天然のアミノ酸配列が、１つのレセプター（例えば、αｖβ３インテグリンなど）に対して、非天然のリガンドが異なるレセプター（例えば、αｖβ１インテグリンなど）に結合するよりも少なくとも約３倍の強いアフィニティ（例えば、少なくとも約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３５倍、４５倍、または５０倍強いアフィニティ）で結合することを意味する。
【００３８】
望ましくは、アデノウイルスベクターは、野生型アデノウイルスコートタンパク質よりも効率よく免疫細胞に結合する能力をキメラコートタンパク質に与える非天然のアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質を含んでいる。詳しくは、アデノウイルスベクターは、非天然のアミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバータンパク質を含み得、該アミノ酸配列は免疫細胞による、好ましくは抗原提示細胞（樹状細胞、単球、およびマクロファージなど）によるアデノウイルスベクターの取込みを促進する。好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターは、ＣＲＧＤＣ(配列番号１)、ＣＸＣＲＧＤＣＸＣ(配列番号２)（ここでＸは任意のアミノ酸を意味する）およびＣＤＣＲＧＤＣＦＣ(配列番号３)を含むが、これに限定されないＲＧＤモチーフを含むアミノ酸配列（例えば、非天然のアミノ酸配列）を含むキメラファイバータンパク質を含み、該ファイバータンパク質は樹状細胞へのアデノウイルスベクターの形質導入効率を高める。ＲＧＤモチーフ、またはいかなる非天然のアミノ酸配列も、好ましくはアデノウイルスファイバーノブ領域、理想的にはアデノウイルスノブの外側に曝されたループ（ＨＩループなど）に挿入される。非天然のアミノ酸配列はまた、アデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に（任意にスペーサー配列を介して）付加され得る。スペーサー配列は好ましくは１００から２００の間のアミノ酸を含み、意図した機能をもち得る（が、必ずしも必要ではない）。
【００３９】
樹状細胞が所望の標的細胞である場合、非天然のアミノ酸配列は樹状細胞表面に典型的に見られるタンパク質（例えば、接着タンパク質、ケモカインレセプター、補体レセプター、共刺激タンパク質、サイトカインレセプター、高レベル抗原提示分子、ホーミングタンパク質、マーカータンパク質、抗原取り込みレセプター、シグナル伝達タンパク質、ウイルスレセプターなど）を任意に認識してもよい。樹状細胞でのかかる可能性のあるリガンド結合部位の例は、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、２Ａ１、７−ＴＭレセプター、ＣＤ１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３２、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４変異体、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ６４、ＡＳＧＰＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、Ｅ−カドヘリン、インテグリン、Ｍ３４２、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＩＤＣ−８、ＭＭＲ、ＯＸ６２、ｐ２００−ＭＲ６、ｐ５５、Ｓ１００、ＴＮＦ−Ｒなどを含む。樹状細胞が標的にされている場合、リガンドが好ましくはＣＤ４０細胞表面タンパク質を認識する（例えば、ＣＤ４０に（二重）特異的な抗体断片により、またはＣＤ４０Ｌポリペプチド由来のドメインによる）。
【００４０】
マクロファージが所望の標的である場合、非天然のアミノ酸配列がマクロファージの細胞表面で典型的に見られるタンパク質（例えば、ホスファチジルセリンレセプター、ビトロネクチンレセプター、インテグリン、接着レセプター、シグナル伝達および／または炎症に関与するレセプター、マーカー、サイトカインを誘導するレセプター、または病原体によるチャレンジでアップレギュレートされるレセプター、Ｂ群スカベンジャーレセプターのシステインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバー、シアル酸結合レセプター、Ｆｃレセプターファミリーのメンバー、Ｂ７−１およびＢ７−２表面分子、リンパ球レセプター、白血球レセプター、抗原提示分子、など）を任意に認識してもよい。適切なマクロファージ表面の標的タンパク質の例は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１６３、ＣＤ１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２９、Ｃｄ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ７１、ＣＤ８７、ＣＤ９、ＣＤ９８、Ｉｇレセプター、Ｆｃレセプタータンパク質(例えば、Ｆｃα、Ｆｃγ、Ｆｃεのサブタイプなど)、葉酸レセプターｂ、ＨＬＡクラスＩ、シアロアドヘリン、ｓｉｇｌｅｃ−５、ならびにＴｏｌｌ様レセプター−２（ＴＬＲ２）を含むが、これに限定されない。
【００４１】
Ｂ細胞が所望の標的である場合、非天然のアミノ酸配列がＢ細胞表面に典型的に見られるタンパク質（例えばインテグリンおよび他の接着分子、補体レセプター、インターロイキンレセプター、食細胞レセプター、免疫グロブリンレセプター、活性マーカー、トランスフェリンレセプター、スカベンジャーレセプターのシステインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバー、成長因子レセプター、セレクチン、ＭＨＣ分子、ＴＮＦ−レセプター、ならびにＴＮＦ−Ｒ関連因子）を認識することが可能である。典型的なＢ細胞表面タンパク質の例は、β−グリカン、Ｂ細胞抗原レセプター（ＢＡＣ）、Ｂ７−２、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）、Ｃ３ｄレセプター、ＣＤ１、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ６９、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ二量体、ＣＤ９５、エンドグリン、Ｆａｓ抗原、ヒトＩｇレセプター、Ｆｃレセプタータンパク質（例えば、Ｆｃａ、Ｆｃｇ、Ｆｃεのサブタイプなど）、ＩｇＭ、ｇｐ２００−ＭＲ６、成長ホルモンレセプター（ＧＨ−Ｒ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＬＴ２、ＣＤ８５、ＭＨＣクラスIおよびII分子、トランスフォーミング成長因子レセプター（ＴＧＦ−Ｒ）、α４β７インテグリン、ならびにαｖβ３インテグリンを含む。
【００４２】
別の実施態様において、アデノウイルスベクターは、真核細胞の特異的なタイプに選択的でないキメラウイルスコートタンパク質を含み得る。キメラコートタンパク質は、内部コートタンパク質配列の中にもしくは代わりに非天然のアミノ酸配列を挿入することで、またはコートタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に非天然のアミノ酸配列が付着することで、野生型のコートタンパク質とは異なる。例えば、約５から約９のリジン残基（好ましくは７リジン残基）を含むリガンドを、機能をもたないスペーサー配列を介してアデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に付着させる。この実施態様において、キメラウイルスコートタンパク質は野生型のウイルスコートよりも幅広い範囲の真核細胞に効率的に結合する（例えば、米国特許６，４６５，２５３および国際特許出願公開ＷＯ９７／２００５１に記載）。かかるアデノウイルスベクターは抗原の幅広い産生を確実にし得る。
【００４３】
可能性のある宿主細胞を認識するアデノウイルスベクターの能力は、コートタンパク質の遺伝的操作なしに（すなわち、二重特異性分子の使用を通じて）改変することができる。例えば、アデノウイルスとペントンベース結合ドメインおよび特定の細胞表面結合部位に選択的に結合するドメインを含む二重特異性分子とを複合体にすることが、特定の細胞タイプに対するアデノウイルスベクターの標的化を可能にする。同じように、非遺伝的手段により、抗原をアデノウイルス粒子の表面に結合することができる。
【００４４】
非天然のアミノ酸配列を、何れのアデノウイルスコートタンパク質にも結合させてもキメラアデノウイルスコートタンパク質を形成することが可能である。それゆえ、例えば、非天然のアミノ酸配列をファイバータンパク質、ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質、タンパク質ＩＸ、ＶＩ、またはＩＩＩaなどと結合、挿入、または付加することができる。かかるタンパク質の配列および該タンパク質を組換えタンパク質に用いる方法は当該分野でよく知られている（例えば、米国特許５，５４３，３２８；５，５５９，０９９；５，７１２，１３6；５，７３１，１９０；５，７５６，０８６；５，７７０，４４２；５，８４６，７８２；５，９６２，３１１；５，９６５，５４１；５，８４６，７８２；６，０５７，１５５；６，１２７，５２５；６，１５３，４３５；６，３２９，１９０；６，４５５，３１４；６，４６５，２５３；６，５７６，４５６；６，６４９，４０７；６，７４０，５２５、ならびに国際特許出願公開ＷＯ９６／０７７３４、ＷＯ９６／２６２８１、ＷＯ９７／２００５１、ＷＯ９８／０７８７７、ＷＯ９８／０７８６５、ＷＯ９８／４０５０９、ＷＯ９８／５４３４６、ＷＯ００／１５８２３、ＷＯ０１／５８９４０、およびＷＯ０１／９２５４９参照）。キメラアデノウイルスコートタンパク質は当該分野で知られた標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して産出することができる。好ましくは、キメラアデノウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルスゲノム中に位置し、かつ野生型アデノウイルスにおいてコートタンパク質の発現を制御するプロモーターに機能的に結合される。あるいは、キメラアデノウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルスゲノム中に位置し、かつキメラコートタンパク質の効率的発現に必要とされる遺伝的エレメントを含む発現カセットの一部である。
【００４５】
キメラアデノウイルスコートタンパク質のコートタンパク質部分は、リガンドドメインが付加された完全長のアデノウイルスコートタンパク質であってもよく、例えば、内部で、またはＣ末端および／またはＮ末端で切り取られていてもよい。修飾（非天然アミノ酸の存在を含む）がなされているが、キメラコートタンパク質は、好ましくはアデノウイルスキャプシド中に組み込まれ得る。非天然のアミノ酸配列がファイバータンパク質に付加される場合、好ましくは該アミノ酸配列は、ウイルスのタンパク質間またはファイバー単量体間の相互作用を邪魔しない。したがって、非天然のアミノ酸配列は好ましくは、それ自体オリゴマー化ドメインではない（そのようなものは、アデノウイルスファイバーの三量体化ドメインと不利に相互作用し得るので）。好ましくは、非天然のアミノ酸配列は、ビリオンタンパク質に付加され、基質、細胞表面レセプターまたは免疫細胞に容易に曝されるような様式で（例えば、アデノウイルスタンパク質のＮまたはＣ末端で、基質に面する残基に付加されて、ペプチドスペーサー上に位置するなどして）組み込まれ、非天然アミノ酸配列が最大限に曝される。理想的には、非天然のアミノ酸配列は、ファイバータンパク質のＣ末端でアデノウイルスファイバータンパク質中に組み込まれ（およびスペーサーを介して付加され）、またはファイバーの露出したループ（例えばＨＩループ）中に組み込まれ、キメラコートタンパク質を生じる。非天然のアミノ酸配列がペントンベースの部分に付加または置換される場合、好ましくは該アミノ酸配列は基質、細胞表面レセプター、または免疫細胞と接触することを確実にするための超可変領域内にある。非天然のアミノ酸配列がヘキソンに付加される場合、好ましくは該アミノ酸配列は超可変領域内にある（Miksza et al., J. Virol., 70(3), 1836-44 (1996)）。非天然のアミノ酸がｐＩＸの部分に付加または置換される場合、好ましくは該アミノ酸配列はｐＩＸのＣ末端内にある。アデノウイルス粒子の表面から離れて非天然アミノ酸配列を外へ伸ばすためにスペーサー配列を用いることは、非天然アミノ酸配列をレセプターに結合させるのにより利用可能である点、および非天然アミノ酸配列とアデノウイルスファイバーモノマーとの間のいかなる立体的相互作用も低下させ得るという点で有利であり得る。
【００４６】
細胞性レセプターに対する非天然のアミノ酸配列の結合アフィニティは、いかなる適切なアッセイによっても決定され得る。多くの該アッセイは既知であり、かつアデノウイルスコートタンパク質中に組み込まれる非天然のアミノ酸配列を選択するのに有用である。望ましくは、宿主細胞の形質導入レベルが相対的結合効率の決定に利用される。すなわち、例えば、細胞表面上にαｖβ３インテグリンを提示している宿主細胞（例えば、ＭＤＡＭＢ４３５細胞）を、キメラコートタンパク質を含むアデノウイルスベクターおよび非天然のアミノ酸配列を持たない対応するアデノウイルスに曝露した後、形質導入効率を比較して相対的結合アフィニティを決定し得る。同様に、細胞表面にαｖβ３インテグリンを提示している宿主細胞（例えば、ＭＤＡＭＢ４３５細胞）および細胞表面に主にαｖβ１を提示している宿主細胞（例えば、２９３細胞）の両方をキメラコートタンパク質を含むアデノウイルスベクターに曝露した後、形質導入効率を比較して結合アフィニティを決定し得る。
【００４７】
別の実施態様において（例えば、特定の操作された細胞タイプ中での精製または増殖を容易にするための）、非天然のアミノ酸（例えば、リガンド）は細胞表面のタンパク質以外の化合物と結合することができる。すなわち、リガンドは、血液および／またはリンパ球由来タンパク質（例えば、アルブミン）、ポリアミノ酸のような合成ペプチド配列（例えば、ポリリジン、ポリヒスチジンなど）、人工ペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ）、ならびにＲＧＤペプチド断片と結合することができる（Pasqualini et al., J. Cell. Biol., 130, 1189 (1995)）。リガンドは非ペプチド基質（例えば、プラスチック（例えば、Adey et al., Gene, 156: 27 (1995)）、ビオチン（Saggioet al., Biochem. J., 293: 613 (1993)）、ＤＮＡ配列（Cheng et al., Gene, 171: 1 (1996)、およびKrook et al., Biochem. Biophys., Res. Commun., 204: 849 (1994)）、ストレプトアビジン（Geibelet al., Biochemistry, 34: 15430 (1995)、およびKatz, Biochemistry, 34: 15421 (1995)）、ニトロストレプトアビジン（Balass et al., Anal, Biochem., 243: 264 (1996)）、ヘパリン（Wickham et al., Nature Biotechnol., 14, 1570-73 (1996)）、または他の基質）にさえも結合可能である。
【００４８】
細胞表面レセプターへのアデノウイルスコートタンパク質の天然の結合を破壊することは、該タンパク質が自然または獲得宿主免疫システムと相互作用することがあまりできないようにもし得る。既存の免疫に加えて、アデノウイルスベクター投与は炎症を誘導し、自然免疫および獲得免疫のメカニズムの両方を活性化させる。アデノウイルスベクターは、抗原特異的（例えば、Ｔ細胞依存的）免疫応答を活性化し、そのことがベクターの初期投与後に導入遺伝子の発現の持続期間を限定する。さらに、アデノウイルスベクターに曝されることがＢ細胞による中和抗体の産生を刺激し、アデノウイルスベクターのその後の投与による遺伝子発現を妨げ得る（Wilson & Kay, Nat. Med., 3(9), 887-889 (1995)）。実際、ベクターの反復投与の効果は宿主の免疫によってひどく限定され得る。体液性免疫の刺激に加えて、細胞媒介免疫機能が生体からのウイルスのクリアランスに関与している。ウイルスの急速なクリアランスは自然免疫メカニズムが貢献し（例えば、Worgall et al., Human Gene Therapy, 8, 37-44 (1997)参照）、肝臓中で見られるクッパー細胞が関与しているようである。したがって、アデノウイルスファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質の天然の結合を除くことにより、免疫システムによるアデノウイルスベクターの認識が損なわれ、それにより、宿主によるベクターの寛容性が増す。
【００４９】
アデノウイルス（特に血清型５アデノウイルス）に対して先在する宿主の免疫を逃れる他の方法は、宿主免疫系に認識されにくいようにアデノウイルスコートタンパク質を改変することを含む。したがって、本発明のアデノウイルスベクターは好ましくは、かかる改変されたコートタンパク質を含む。改変されたコートタンパク質は好ましくはペントン、ファイバー、またはヘキソンタンパク質である。最も好ましくは、改変されたコートタンパク質はヘキソンタンパク質である。コートタンパク質は、いかなる適切な方法でも改変することができるが、好ましくはコートタンパク質に多様性を生じさせることによって改変する。好ましくは、かかるコートタンパク質の変異体は、先在する宿主（例えば、ヒト）のアデノウイルス特異的中和抗体に認識されない。多様性は、当該分野で既知のいずれの適切な方法を用いても生じさせることができ、例えば定向進化（すなわちポリヌクレオチドシャッフリング）および変異性ＰＣＲ（例えば、Cadwell, PCR Meth. Appl, 2: 28-33 (1991), Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)、およびPritchard et al., J Theoretical Biol, 234: 497-509 (2005)参照）を含むことができる。好ましくは、例えばStemmer, Nature, 370: 389-91 (1994), Cherry et al., Nat. Biotechnol, 17: 379-84 (1999)、およびSchmidt- Dannert et al., Nat Biotechnol, 18(7): 750-53 (2000)に開示されているような方法で、コートタンパク質の多様性は定向進化技術を通して得ることができる。一般的に、定向進化は、３つの反復された操作：突然変異、選択、および複製を含む。定向進化で行われる主な工程は（１）目的の遺伝子の突然変異または組換え、（２）突然変異または組み換えた遺伝子のライブラリー構築、（３）適切な宿主細胞におけるライブラリーの発現、（４）所望の機能または活性を有する変異体を発現する細胞の選択、および（５）所望の変異体をコードする遺伝子の単離を典型的には含む。この過程は、所望の数の変異体が産生されるまで繰り返される。
【００５０】
本発明において、コートタンパク質の多様性は、例えばポリヌクレオチドシャッフリングまたは変異性ＰＣＲを用いてコートタンパク質をコードしている遺伝子のランダムな突然変異を最初に作ることによって生じる。突然変異を起こしたコートタンパク質の遺伝子はＥ１欠損Ａｄ５アデノウイルスベクターのライブラリーに組み込まれる。各Ａｄ５ベクターは、Ａｄ３５ファイバータンパク質とＥ１領域に挿入された２つのマーカー遺伝子（例えば、ルシフェラーゼと緑蛍光タンパク質）を発現する二重発現カセットとを含む。ライブラリーのベクターは、適切な宿主細胞（例えば、E. coli）中で増殖し、目的の潜在的なコートタンパク質変異体をコードするベクターをヒト抗Ａｄ５中和抗体の存在する競争条件下でレスキューする。レスキューされたベクターは、抗Ａｄ５中和抗体の存在下で増やされ、精製され、またはクローン化され、コートタンパク質変異体は核酸配列決定に供される。
【００５１】
一度同定されれば、前記戦略で生産されたコートタンパク質変異体にコードされるタンパク質の生物活性を選別しなければならない。コートタンパク質変異体の所望の生物学的活性を測定するいずれの適切なアッセイも使用することができる。例えば、変異コートタンパク質を含むＡｄ５ベクターの増殖特性を評価する重要性は、当業者にとって自明であるだろう。さらに、変異したコートタンパク質を含み、かつ異種抗原（例えばプラスモディウム属抗原）をコードするＡｄ５ベクターの免疫原性を、野生型コートタンパク質を含む同様のＡｄ５ベクターと比べることができる。さらに、理想的なコートタンパク質変異体は先在するアデノウイルス特異的中和抗体に認識されないため、コートタンパク質変異体に対するヒト血清の潜在的な中和効果を評価する必要がある。
【００５２】
アデノウイルスコートタンパク質はまた、コートタンパク質のある領域を欠失させ、他のアデノウイルス血清型（特にヒトに対して免疫原性がより小さい血清型）のコートタンパク質由来の対応する領域に置換することにより、先在する宿主の免疫を逃れるように改変することができる。これに関しては、ファイバータンパク質、ペントンベースタンパク質、および／またはヘキソンタンパク質内のアミノ酸配列を取り除き、異なるアデノウイルス血清型由来の対応する配列に置換することができる。前述のように、本発明で使用される好ましいアデノウイルス血清型は、血清型５である。したがって、例えば、ファイバータンパク質を先在する宿主の免疫を逃れるように改変する場合、血清型５ファイバータンパク質のノブ領域由来のアミノ酸残基を欠失させ、異なる血清型（例えば本明細書中で記載した血清型）のアデノウイルス由来の対応するアミノ酸残基に置換することができる。同様に、ペントンベースタンパク質を先在する宿主の免疫を逃れるように改変する場合、血清型５ペントンベースタンパク質の超可変領域内のアミノ酸残基を欠失させ、異なる血清型（例えば本明細書中で記載した血清型）のアデノウイルス由来の対応するアミノ酸残基と置換することができる。好ましくは、アデノウイルスベクターのヘキソンタンパク質が先在する宿主の免疫を逃れるためのこのような方法で改変される。これに関しては、アデノウイルスベクターが血清型５のものである場合、超可変領域（ヘキソンタンパク質のループで生じる）の１つ以上にあるアミノ酸残基が取り除かれ、かつ異なる血清型のアデノウイルス由来の対応するアミノ酸残基に置換される。好ましくは、血清型５ヘキソンタンパク質のＦＧ１、ＦＧ２またはＤＥ１ループ中のアミノ酸残基を欠失させ、異なるアデノウイルス血清型のヘキソンタンパク質由来の対応するアミノ酸残基に置換させる。完全なループ領域を血清型５ヘキソンタンパク質から取り除き、他のアデノウイルス血清型の対応するループ領域に置換することができる。あるいは、ループ領域の一部を、血清型５ヘキソンタンパク質から取り除き、他のアデノウイルスの血清型のヘキソンループの対応する部分に置換することができる。血清型５アデノウイルスベクターの１つ以上のヘキソンループまたはその一部が、例えば本明細書中で記載されたように、取り除かれ、任意の他のアデノウイルス血清型由来の対応する配列と置換できる。好ましくは、Ａｄ５ベクターの１つ以上のヘキソンループまたはその一部が取り除かれ、血清型２、３４、または４３のアデノウイルス由来の対応するアミノ酸配列に置換される。Ａｄ２およびＡｄ５のヘキソンタンパク質の構造ならびにヘキソンタンパク質の改変方法は、例えば、Rux et al., J Virol, 77: 9553-9566 (2003)および米国特許 6,127,525に開示されている。ヘキソンタンパク質の超可変領域はまた、ランダムなペプチド配列または疾患を引き起こす病原体（例えば、プラスモディウム  ファルシパラム（Plasmodium falciparum））由来のペプチド配列に置換することができる。
【００５３】
アデノウイルスベクターに対する適切な改変は、米国特許５，５４３，３２８；５，５５９，０９９；５，７１２，１３６；５，７３１，１９０；５，７５６，０８６；５，７７０，４４２；５，８４６，７８２；５，８７１，７２７；５，８８５，８０８；５，９２２，３１５；５，９６２，３１１；５，９６５，５４１；６，０５７，１５５；６，１２７，５２５；６，１５３，４３５；６，３２９，１９０；６，４５５，３１４；６，４６５，２５３；６，５７６，４５６；６，６４９，４０７；および６，７４０，５２５；米国特許出願公開２００１／００４７０８１  Ａ１、２００２／００９９０２４ Ａ１、２００２／０１５１０２７  Ａ１、２００３／００２２３５５  Ａ１、および２００３／００９９６１９  Ａ１、ならびに国際特許出願ＷＯ９６／０７７３４、ＷＯ９６／２６２８１、ＷＯ９７／２００５１、ＷＯ９８／０７８６５、ＷＯ９８／０７８７７、ＷＯ９８／４０５０９、ＷＯ  ９８／５４３４６、ＷＯ００／１５８２３、ＷＯ０１／５８９４０、およびＷＯ０１／９２５４９に記載されている。
【００５４】
本発明の１つの実施態様において、アデノウイルスベクターは３つ以上の異種核酸配列を含む。「異種核酸配列」は、アデノウイルスベクターの天然の核酸配列から得られず、由来せず、または基づかない任意の核酸配列である。「天然の」とは、核酸配列が天然に見出され、合成的に改変されていないことを意味する。例えば、異種核酸配列はウイルス、細菌、植物または動物の核酸配列であり得る。配列が起源から単離されたとき、配列は起源から「得られ」る。配列が起源から単離されるが、起源遺伝子の正常な機能を破壊しないような任意の適切な方法（例えば、配列に対する欠失、置換（突然変異）、挿入または他の改変）で改変されるとき、該配列は起源に「由来」する。配列が起源と約７０％より高い同一性を有する配列である（好ましくは約８０％より同一性が高く、より好ましくは約９０％より同一性が高く、および最も好ましくは約９５％より同一性が高い）が、合成的手法（例えば、ポリヌクレオチド合成、定向進化など）により得られたとき、該配列は起源に「基づ」く。（ギャップの可能性も含めて）同一性の程度を決定することは、任意の適切な方法（例えば、GenBank提供のBLASTnr）を使用して達成することができる。前述のことにも関わらず、異種核酸配列はアデノウイルスベクター中に天然に見ることができるがアデノウイルスゲノム中の非天然の場所に位置し、および／または非天然のプロモーターと機能的に結合し得る。アデノウイルスベクターは３つ以上の異種核酸配列（例えば、３，４，５，６，７，８，９，１０またはそれ以上の異種核酸配列）を含むことができるが、アデノウイルスベクターは好ましくは３つの異種核酸配列を含む。
【００５５】
アデノウイルスベクターに挿入することができるいずれのタイプの核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ）も、本発明に関して使用することができる。好ましくは、各異種核酸配列はＤＮＡであり、好ましくはタンパク質をコードしている（すなわち、１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列）。特に好ましい実施態様において、３つ以上の異種核酸配列の各々は、抗原をコードする。「抗原」は、哺乳動物において免疫応答を誘導する分子である。例えば、「免疫応答」は、抗体産生および／または免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）の活性化を伴うことができる。本発明における抗原は、いかなるタンパク質分子（ウイルス、微生物、寄生虫、菌類、原虫、プリオン、細胞、または細胞外起源のタンパク質またはペプチドを含む）のいかなるサブユニット、断片、またはエピトープも含み得る。該抗原は理想的には哺乳動物に免疫応答を誘発し、好ましくは防御免疫を導く。「エピトープ」は、抗体または抗原レセプターにより認識される抗原の配列を意味する。エピトープはまた、当該分野で「抗原決定基」ともよばれる。
【００５６】
１つの実施態様において、抗原は腫瘍抗原である。「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞で発現するが正常細胞では発現しない抗原、または正常細胞では発現するが腫瘍細胞では過剰に発現する抗原を意味する。適切な腫瘍抗原の例は、β-カテニン、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＰＴＰＲＫ、ＮＹ−ＥＳＯ−ｌ／ＬＡＧＥ−２、ＳＳＸ−２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、ＣＥＡ、ｇｐ１００、カリクレイン4、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＴＲＰ−ｌ／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ３、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣｌ、ｐ５３、ｍｄｍ−２、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、生存、テロメラーゼ、およびＷＴ１を含むが、これに限定されない。他の腫瘍抗原が当該分野では既知であり、例えばラドウィッグ癌研究所により保守されているＴ細胞により定義された腫瘍抗原のペプチドデータベース（The Peptide Database of T-Cell Defined Tumor Antigens）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃｓ／ｄａｔａｂａｓｅｓ．ｈｔｍ）、Van den Eynde et al., Curr. Opin. Immunol, 9: 684-93 (1997)、Houghton et al., Curr. Opin. Immunol., 13: 134-140 (2001)、およびvan derBruggen et al., Immunol. Rev., 188: 51-64 (2002)に記載されている。
【００５７】
１つの実施態様では、抗原はウイルスの抗原でありうる。ウイルス抗原は以下のウイルス科のいずれか由来のウイルスを含むがこれに限定されないいかなるウイルスからも単離できる：アレナウイルス科、アルテリウイルス属、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス属、バルナウイルス科、ビルナウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カルシウイルス科、カピロウイルス属、カーラウイルス属、カリモウイルス属、サーコウイルス科、クロステロウイルス属、コモウイルス科、コロナウイルス科（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスのようなコロナウイルス）、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス属、ダイアントウイルス属、エナモウイルス属、フィロウイルス科（例えば、マールブルグウイルスおよびエボラウイルス（例えば、ザイール、レストン、アイボリーコースト、またはスーダン系統））、フラビウイルス科、（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス１、デング熱ウイルス２、デング熱ウイルス３、およびデング熱ウイルス４）、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、ヒトヘルペスウイルス1、３、４、５、および６、ならびにサイトメガロウイルス）、ハイポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス）、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹、ムンプスおよびヒト呼吸器合胞体ウイルス）、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルスおよびアフトウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、ワクシニアウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１およびＨＩＶ２のようなレンチウイルス）、ラブドウイルス科、およびトティウイルス科。特に好ましいレトロウイルス科（レトロウイルス）の抗原は、例えば、ｇａｇ、ｅｎｖ、またはｐｏｌタンパク質の全部または一部などのＨＩＶ抗原、あるいはｇａｇ、ｅｎｖ、またはｐｏｌタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質を含む。ＨＩＶのいかなるクレード（クレードＡ、Ｂ、Ｃ、ＭＮなどを含む）も抗原選択に適合する。特に好ましいコロナウイルス抗原は、例えばＳＡＲＳウイルス抗原を含む。本発明に適したＳＡＲＳウイルス抗原は、例えば、ＳＡＲＳウイルスのＥタンパク質、Ｍタンパク質、およびスパイクタンパク質の全部または一部を含む。適したウイルス抗原はデング熱Ｍタンパク質、デング熱Ｅタンパク質、デング熱Ｄ１ＮＳ１、デング熱Ｄ１ＮＳ２、およびデング熱Ｄ１ＮＳ３の全部または一部も含む。本明細書中で具体的に列挙される抗原性のペプチドは、本発明においてあらゆるウイルスタンパク質が使用され得ることの単なる例示にすぎない。
【００５８】
あるいは、または追加して、アデノウイルスベクターにコードされた少なくとも1つの抗原はバクテリアの抗原である。該抗原は以下に含まれるが、これらに限られないいかなるバクテリアに起源することもできる：アクチノミセス属、アナベナ属、バシラス属、バクテロイデス属、ブデロビブリオ属、カウロバクター属、クラミジア属、クロロビウム科、クロマチウム属、クロストリジウム属、サイトファーガ属、デイノコックス属、エシェリキア属、好塩菌属、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ）、ヒポミクロビウム属、メタン細菌属、ミクロコッカス属、ミオバクテリウム属（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属、ミクソコッカス属、ナイセリア属、硝酸菌属、ユレモ属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属、ロドスピリラム属（Ｐｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、リケッチア属、サルモネラ属、シゲラ属、スピリルム属、スピロヘータ属、スタフィロコッカス属、連鎖球菌属、ストレプトミセス属、スルホロブス属、サーモプラズマ属、硫黄菌属、およびトリポネーマ属。
【００５９】
望ましくは、抗原は寄生虫抗原（例えば胞子虫門（またはアピコンプレクサ門ともいう）、繊毛虫、根足上網または動物性鞭毛虫網の寄生虫であるが、これに限られない）であり得る。好ましくは、該抗原は胞子虫門およびプラスモディウム属の寄生虫である。抗原は、いずれの適切なプラスモディウム属の種類に由来するものであってもよいが、好ましくはヒトに感染してマラリアを発症させるプラスモディウム属の種に由来する。ヒトに感染するプラスモディウム属の種は、Ｐ．マラリエ（P. malariae）、Ｐ．オバーレ（P. ovale）、Ｐ．バイバックス（P. vivax）およびＰ．ファアルシパラム（P. falciparum）を含む。Ｐ．バイバックスとＰ．ファルシパラムとが最も一般的であり、Ｐ．ファルシパラムが最も致命的なヒトのプラスモディウム属の種である。あるいは、抗原は、非ヒト動物に感染するプラスモディウム属の種由来であり得る。例えば、Ｐ．ビンケイ（P. vinckei）、Ｐ．チャバウディ（P. chabaudi）、Ｐ．ヨエリイ（P. yoelii）およびＰ．ゲルグヘイ（P. berghei）はげっ歯類に感染し、Ｐ．ノウレシ（P. knowlesi）、Ｐ．シノモルギ（P. cynomolgi）、Ｐ．シミオバーレ（P. simiovale）、Ｐ．フィエルディ（P. fieldi）、Ｐ．イヌイ（P. inui）およびＰ．バラシリアヌム（P. brasilianum）は非ヒト霊長類に感染する。Ｐ．ガリナセウム（P. gallinaceum）は鳥類に感染する。ワクチンの開発を進展させるために、多くのプラスモディウム属の種のゲノム配列が決定された。例えば、完全なＰ．ファルシパラムゲノムの配列が決定され、Gardner et al, Nature, 419: 498-511 (2002)で開示されている。さらに、完全なＰ．ヨエリイゲノム配列がCarlton et al., Nature, 419: 512-9 (2002)で開示されている。それにより、当業者は、当該分野で既知の通常の方法を用いて適当なプラスモディウム属抗原を同定して単離することができる。
【００６０】
天然では、マラリア原虫は２タイプの宿主（ヒトおよびメスのハマダラカ）に順次感染することにより広がる。これに関し、マラリア原虫はメスのハマダラカの唾液腺で「スポロゾイト」として存在する。ハマダラカが他のヒトを吸血するとき、スポロゾイトが蚊の唾液とともに注入されて、循環系に入り、接種から数分以内にヒトの肝臓細胞（肝細胞）に侵入するだろう。肝細胞に侵入した後、寄生虫は無性複製を経験する。スポロゾイトおよび肝臓ステージを含むこの寄生虫の生活環のステージは、当該分野で通常「前赤血球ステージ」、「肝臓ステージ」、または「赤血球外ステージ」とよばれる。「メロゾイト」とよばれる子孫が、宿主の肝細胞を壊した後、循環系に放出される。
【００６１】
感染した肝臓細胞から放出されたメロゾイトは、赤血球（赤色血液細胞）に侵入する。メロゾイトは赤血球表面の特異的なタンパク質を認識して、蚊が保有する他の寄生虫と同様の方法で細胞に能動的に侵入する。赤血球に入った後、寄生虫は、栄養期を経験した後、無性複製してメロゾイトを連続的に増やす。子孫のメロゾイト寄生虫は赤血球中で成長し、赤血球を壊し、それから放出されて感染の別のラウンドが始まる。感染のこのステージは、当該分野で通常「血液ステージ」または「赤血球ステージ」とよばれる。血液ステージの寄生虫は、マラリアの症状を引き起こすものである。特定の形状の血液ステージ寄生虫（すなわち「ガメトサイト」）が吸血中にメスのハマダラカに吸い上げられると、寄生虫は蚊の中で成長および複製の別の異なるサイクルを始める。プラスモディウム属の生活環は、例えばRamasamy et al., Med. Vet. Entomol, 11(3): 290-6 (1997)、Hall et al., Science, 307(5706): 82-6 (2005)、およびLW. Sherman, ed., Malaria: Parasite Biology, Pathogenesis, and Protection, American Society of Microbiology (1998)に記載されている。
【００６２】
本発明のいくつかの実施態様では３つ以上の異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターが好ましいが、本発明の別の実施態様ではアデノウイルスベクターは３つ未満の異種核酸配列を含んでいてもよい。したがって、本発明はまた、２つ以上（例えば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０またはそれ以上）の異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターを提供する。この実施態様において、各核酸配列は好ましくはプラスモディウム属抗原をコードし、少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合する。いずれにしても、プラスモディウム属抗原は好ましくはＰ．ファルシパラム抗原である。異種核酸配列は、いずれの適切なＰ．ファルシパラム抗原をコードしていてもよいが、好ましくは感染の血液ステージの間に発現する抗原（「血液ステージ抗原」）および／または感染の前赤血球ステージの間に発現する抗原（「前赤血球ステージ抗原」）をコードする。血液ステージ抗原は免疫系の体液性（すなわち、抗体介在性）の部分を活性化することが当該分野で既知であり、一方、前赤血球ステージ抗原は免疫系の細胞性（すなわち、Ｔ細胞応答）の部分を活性化する。適切な前赤血球ステージ抗原は、スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）、スポロゾイト表面タンパク質２（ＳＳＰ２）、肝臓ステージ抗原１（ＬＳＡ−Ｉ）、Pf exported タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）／Ｐｙ肝細胞赤血球タンパク質１７（ＰｙＨＥＰ１７）、およびＰｆ抗原２を含むが、それに限定されない。適切な血液ステージ抗原は、メロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）、メロゾイト表面タンパク質２（ＭＳＰ−２）、赤血球結合抗原１７５（ＥＢＡ−１７５）、リング状感染赤血球表面抗原（ＲＥＳＡ）、セリン反復抗原（ＳＥＲＡ）、グリコホリン結合タンパク質（ＧＢＰ−１３０）、ヒスチジンリッチタンパク質２（ＨＲＰ−２）、ロプトリー関連タンパク質１および２（ＲＡＰ−１およびＲＡＰ−２）、赤血球膜タンパク質１（ＰｆＥＭＰ１）、および頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）を含むが、これに限定されない。
【００６３】
アデノウイルスベクターが３つ以上の異種核酸配列を含む実施態様において、各異種核酸配列は好ましくは前赤血球ステージ抗原、血液ステージ抗原、またはその組合せをコードする。例えば、アデノウイルスベクターは、（i）各異種核酸配列が前赤血球ステージ抗原をコードする、（ii）各異種核酸が血液ステージ抗原をコードする、（iii）１つの異種核酸配列が血液ステージ抗原をコードし、２つの異種核酸配列が各々前赤血球ステージ抗原をコードする、または（iv）１つの異種核酸配列が前赤血球ステージ抗原をコードし、２つの異種核酸配列が各々血液ステージ抗原をコードする３つの異種核酸配列を含み得る。本発明のより好ましい実施態様において、好ましくは３つ以上の各異種核酸配列の各々が前赤血球ステージ抗原をコードする。より好ましくは、アデノウイルスベクターはＣＳＰ、ＳＳＰ２、ＬＳＡ−１または抗原２をコードする３つの異種核酸配列を含む。
【００６４】
同様に、アデノウイルスベクターがプラスモディウム属抗原をコードする２つ以上の異種核酸配列を含む実施態様において、各異種核酸配列は好ましくは前赤血球ステージ抗原、血液ステージ抗原、またはその組合せをコードする。例えば、アデノウイルスベクターは、（i）各異種核酸配列が血液ステージ抗原をコードする、（ii）各核酸配列が前赤血球ステージ抗原をコードする、または（iii）１つの異種核酸配列が血液ステージ抗原をコードし、１つの異種核酸配列が前赤血球ステージ抗原をコードする２つの異種核酸配列を含み得る。本発明の好ましい実施態様において、各核酸配列は好ましくは血液ステージ抗原をコードする。より好ましくは、アデノウイルスベクターはＭＳＰ−１とＡＭＡ−１とをそれぞれコードする２つの異種核酸配列を含む。
【００６５】
完全な無傷の、ウイルス、微生物または寄生虫のタンパク質が免疫応答を生じさせるのに必要ないことは理解されるであろう。実際、ほとんどの抗原エピトープは比較的サイズが小さく、それゆえにタンパク質断片は哺乳動物の免疫系に曝露するのに十分である。さらに、１つ以上の抗原の２つ以上の抗原エピトープの間で融合タンパク質を生じさせることもできる。哺乳動物に対するアデノウイルスベクターを介した融合タンパク質の送達は、複数の抗原に免疫系を曝すことを可能にし、したがって、単独ワクチン組成物が複数の病原体に対する免疫を提供することを可能にする。さらに、特定の抗原をコードする異種核酸配列を、哺乳動物宿主による抗原の認識を増強するように改変することができる。これに関し、シグナル配列と糖鎖付加の存在は、アデノウイルスベクターにより発現したプラスモディウム属抗原の免疫原性に影響し得る。シグナル配列を含む血液ステージ抗原は、頑強な免疫応答を誘導することが示されているが、シグナル配列はＰ．ファルシパラムタンパク質の効率的な分泌または輸送のために必ずしも十分ではない（例えば、Yang et al., Vaccine, 15: 1303-13 (1997)参照）。同様に、糖鎖付加はＰ．ファルシパラムのＭＳＰ−１抗原（ＭＳＰ１４２）のＣ末端４２ｋＤ断片に基づくワクチン候補の効能を減少させることが示されている（例えば、Stowers et al., Proc. Natl. Acad. SciUSA, 99: 339-44 (2002)参照）。しかしながら、他のＰ．ファルシパラムのＤＮＡやタンパク質のワクチンを調査した研究により得られた結果は、糖鎖付加がワクチンの効能に影響しないかもしれないことを実証している（例えば、Stowers et al., Infect. Immun., 69: 1536-46 (2001)参照）。
【００６６】
したがって、本明細書に記載された異種核酸配列は、シグナル配列を含み得る、または含まなくてもよい抗原をコードする。本発明の好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターに存在する少なくとも１つの異種核酸配列は、シグナル配列をコードする。本明細書で使用される用語「シグナル配列」は、典型的にはタンパク質のアミノ末端に位置し、該タンパク質を特定の細胞内小区画（小胞体など）にターゲッティングし、該タンパク質を産生する細胞から成熟タンパク質を分泌させるアミノ酸配列をいう。シグナル配列は典型的には前駆体ポリペプチドから取り除かれ、したがって、成熟タンパク質には存在しない。異種核酸配列にコードされたタンパク質の分泌を指示するいずれのシグナル配列も、本発明のアデノウイルスベクターへの使用に適している。好ましくは、シグナル配列は異種シグナル配列である。より好ましくは、シグナル配列はヒト分解促進因子（ＤＡＦ）タンパク質由来であり、該タンパク質はＰ．ファルシパラム ＭＳＰ−１タンパク質の細胞表面での発現と分泌を増強することが示されている（例えば、Burghaus et al., MoI. Biochem. Parasitol., 104: 171-83 (1999)参照）。本発明のアデノウイルスベクター中の異種核酸配列は、望ましくは、発現した際に、シグナル配列が１つの異種核酸配列によってコードされるタンパク質のＮ末端に位置するように構築される。例えば、異種シグナル配列を含むＭＳＰ１４２Ｐ．ファルシパラム抗原をコードする核酸配列は、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４を含む。あるいは、異種核酸配列にコードされる抗原の非分泌（ＮＳ）バージョンは、いかなる適切な方法で生産されてもよいが、好ましくは異種核酸配列からシグナル配列を欠失させることによって生産される。シグナル配列を欠くＰ．ファルシパラム抗原をコードする核酸配列は、例えば、配列番号１４（ＡＭＡ−１）および配列番号１８（ＭＳＰ１４２）を含む。特定の抗原はまた、抗原のアミノ酸配列中のアンカーアミノ酸配列の存在によっても細胞表面に導かれうる。かかるアンカー配列は当該分野で既知であり、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinisotol）（ＧＰＩ）アンカーを含む。ＧＰＩで固定されたタンパク質は動物界を通じて見出される膜結合タンパク質である。ＧＰＩで固定されたタンパク質は、ホスホエタノールアミンのホスホジエステル結合により、それらのカスボキシ末端で、トリマンノシル非アセチル化グルコサミン（Ｍａｎ３−ＧｌｃＮ）コアに結合する。ＧｌｃＮの還元末端は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に結合する。ＰＩは、次いで、疎水性領域（例えば、Sigma-Aldrich websiteおよびTakeda et al., Trends. Biochem. Sci, 20(9): 367-71 (1995)参照）による別のホスホジエステル結合により細胞膜に固定される。ＧＰＩアンカーを欠失させるかまたはそうでなければ阻害すること（例えば、ＧＰＩアンカーを阻害するテールを介して）により、細胞から抗原が分泌される。
【００６７】
さらに、本明細書に記載された異種核酸配列は、糖鎖付加（例えば、Ｎ結合糖鎖付加またはＯ結合糖鎖付加）されても、またはされなくてもよい抗原をコードする。本発明の好ましい実施態様において、アデノウイルスベクター中に存在する少なくとも１つの異種核酸配列は、糖鎖付加（Ｎグリコシル化またはＯグリコシル化）されない抗原をコードする。より好ましくは、該異種核酸配列は、Ｎグリコシル化されない抗原をコードする。Ｐ．ファルシパラムのタンパク質が有意な量のＮ結合糖およびＯ結合糖を含有しないということを最近の研究（Gowda et al., Parisitol. Today, 15: 147-52 (1999)）が示しているが、可能性のある糖鎖付加部位を含有するＰ．ファルシパラムタンパク質もある（Yang et al., Glycobiology, 9: 1347-56 (1999)）。本発明のアデノウイルスベクター中の異種核酸配列によってコードされる抗原の糖鎖付加は、いずれの適切な方法でも阻害することができる。好ましくは、糖鎖付加は、異種核酸配列に存在する糖鎖付加部位に突然変異を生じさせることにより阻害される。かかる突然変異は、抗原中のアミノ酸の欠失、置換、および／または挿入を生じさせることを含む。好ましくは、糖鎖付加は、プラスモディウム属抗原をコードする異種核酸配列を、糖鎖付加部位の少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されるように突然変異させることによって阻害される。典型的な置換は、Ｐ．ファルシパラム MSP-１タンパク質の321位のアスパラギン残基をグルタミン残基で置換することを含む。加えて、Ｐ．ファルシパラム AMA-１タンパク質の特定のアスパラギン残基もまた、糖鎖付加を阻害するために置換することができる。例えば、１６２位のアスパラギン残基を、リジン残基に置換することができ、２６６位、３７１位、４２１位、４２２位および４９９位のアスパラギン残基をグルタミン残基に置換することができる。これらの突然変異は典型的な例であり、決して限定するものではない。実際、天然の糖鎖付加部位を破壊するいかなる突然変異も利用可能である。突然変異した糖鎖付加部位を含むＰ．ファルシパラム抗原をコードする核酸配列は、例えば、配列番号１２、配列番号１６および配列番号２２を含む。
【００６８】
異種核酸配列が抗原（好ましくはプラスモディウム属の抗原）をコードする場合、該異種核酸配列は、異種核酸配列が由来する病原体におけるよりもヒトでより頻繁に発現されるコドンを含む。遺伝的コードは一般的に種を越えて普遍的であるが、同義コドンの間での選択はしばしば種依存的である。生物が特定のコドンを稀にしか利用しないことは、おそらく、その生物において対応するトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のレベルが低いことを反映している。したがって、生物が頻繁に利用しないコドンを含む核酸配列を該生物中に導入すると、該核酸配列の発現が限定的になるかもしれない。プラスモディウム属の感染に対する最大限の防御を達成するために、本発明のアデノウイルスベクターは哺乳動物（好ましくはヒト）宿主においてプラスモディウム属抗原を高レベルで発現することができなければならないということを、当業者であれば理解するであろう。これに関し、異種核酸配列は好ましくはプラスモディウム属抗原の天然のアミノ酸をコードするが、プラスモディウム属よりも哺乳動物（例えばヒト）においてより頻繁に発現するコドンを含む。かかる改変された核酸配列は、当該分野で「ヒト化した」、「コドンを最適化した」、または「哺乳動物に好ましい」もしくは「ヒトに好ましい」コドンの利用として一般的には記載される。
【００６９】
本発明において、核酸配列中の野生型コドンの少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％）が哺乳動物に好ましいコドンをコードするように改変される場合、プラスモディウム属の核酸配列は「コドンを最適化した」という。すなわち、その中にコードされたコドンの少なくとも約６０％が哺乳動物に好ましいコドンである場合、プラスモディウム属の核酸配列はコドンを最適化したものである。Ｐ．ファルシパラム ＣＳＰ抗原をコードする好ましいコドンを最適化した核酸配列は、例えば、配列番号４、配列番号６、および配列番号８を含む。Ｐ．ファルシパラム ＳＳＰ−２抗原をコードする好ましいコドンを最適化した核酸配列は、例えば、配列番号２８および配列番号３０を含む。Ｐ．ファルシパラム ＡＭＡ−１抗原およびＬＳＡ−１抗原をコードする好ましいコドンを最適化した核酸配列は、それぞれ配列番号１０と配列番号２６を含む。しかしながら、本発明はこれらの典型的な配列に限定されない。実際、遺伝的配列は異なる株の間で変わり得、この天然の対立遺伝子変異の範囲は本発明の範囲に含まれる。さらに、また、代わりに、Ｐ．ファルシパラム抗原をコードするコドンを最適化した核酸配列は、前述の配列と少なくとも中程度の（好ましくは高い）ストリンジェンシー条件（例えばSambrook et al., supraに記載された条件など）下でハイブリダイズするいずれの配列でもあり得る。相同性の程度の決定は、任意の適切な方法（例えば、GenBank提供のBLASTnr）を使用して行うことができる。
【００７０】
本発明のアデノウイルスベクターにおける各異種核酸配列は、望ましくは発現カセット（すなわち、核酸配列のサブクローニングと回収（例えば、１つ以上の制限酵素認識部位）または核酸配列の発現（例えば、ポリアデニル化またはスプライス部位）を促進する機能を有する特定のヌクレオチド配列）の一部として存在する。各異種核酸は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域（例えばＥ１領域の全体または一部と置換する）および／またはＥ４領域に位置することが好ましい。例えばＥ１領域を、異種核酸を含む１つ以上のプロモーター可変発現カセットに置換することができる。あるいは、アデノウイルスベクターがＥ１領域を含むがＥ４領域を欠損する実施態様においては、Ｅ４領域を１つ以上の発現カセットに置換することができる。この方法において、アデノウイルスゲノムのＥ４領域中に発現カセットを挿入することは、「復帰突然変異体Ｅ１アデノベクター」（ＲＥＡ）の形成を阻害する。なぜなら、Ｅ１領域と相補細胞株（例えば２９３細胞）またはヘルパーウイルスのＥ１ＤＮＡとの相同組換えにより、アデノウイルスキャプシド内にパッケージングするには大きすぎるＥ１含有アデノウイルスゲノムが生じるからである。各発現カセットは３’−５’の方向に挿入することができる。例えば、発現カセットの転写の方向が周囲の隣接したアデノウイルスゲノムの転写の方向と反対であるように配向する。しかしながら、発現カセットを、周囲のゲノムの転写方向に関して５’−３’の方向に挿入することもまた適当である。これに関し、本発明のアデノウイルスベクターは、例えば３’−５’方向でＥ１領域に挿入された少なくとも１つの異種核酸配列、および５’−３’の方向でＥ４領域に挿入された少なくとも１つの異種核酸配列を含むことが可能である。Ｅ１および／またはＥ４領域が２つ以上の発現カセット（例えば、二重発現カセット）に置換された実施態様において、各発現カセットは互いにいずれの方向にも配置することができる。例えば、２つの発現カセットは、それぞれのプロモーターが互いに隣接するように配置することができる。この方法において、１つの発現カセットはアデノウイルスゲノムの転写方向に関して５’−３’方向であり、もう１つの発現カセットは３’−５’の方向である。２つのプロモーターを互いに隣接して配置することにより、１つのプロモーターの活性を隣接したプロモーターの活性により増強することができる。
【００７１】
本発明によると、少なくとも１つの異種核酸配列（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の異種核酸配列）がアデノウイルスゲノムのＥ１領域に配置され、少なくとも１つの異種核酸配列（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の異種核酸配列）がアデノウイルスゲノムのＥ４領域に配置される。アデノウイルスベクターが３つ以上の核酸配列を含む実施態様においては、少なくとも１つの異種核酸配列が好ましくはアデノウイルスゲノムのＥ１領域に配置され、少なくとも２つの異種核酸配列が好ましくはアデノウイルスゲノムのＥ４領域に配置される。あるいは、少なくとも２つの異種核酸配列がアデノウイルスゲノムのＥ１領域に配置され、少なくとも１つの異種核酸配列がアデノウイルスゲノムのＥ４領域に配置され得る。好ましくはないが、全ての異種核酸配列をアデノウイルスゲノムのＥ１領域またはＥ４領域のどちらかに配置することができる。アデノウイルスベクターがプラスモディウム属抗原をコードする２つ以上の核酸配列を含む実施態様において、２つ以上の核酸配列の各々は好ましくはアデノウイルスゲノムのＥ１領域またはＥ４領域に配置される。最も好ましくは、２つ以上の異種核酸配列の各々はアデノウイルスゲノムのＥ４領域に配置される。アデノウイルスゲノムへの（例えばゲノムのＥ１領域中への）発現カセットの挿入は、既知の方法、例えば、アデノウイルスゲノムの所定の場所にユニークな制限酵素認識部位を導入することによって促進することができる。前記のように、好ましくはアデノウイルスベクターのＥ３領域の全部または一部もまた欠失している。
【００７２】
好ましくは、各異種核酸配列は１つ以上のプロモーターおよび／またはエンハンサー要素と（例えば、プロモーター可変発現カセットの一部として）機能的に（すなわち、その転写制御下で）結合する。配列を一緒に機能的に結合する技術は、当該分野で周知である。異種核酸配列の十分な発現が達成されて、かつコードされた抗原に対する頑強な免疫応答が生じる限り、いずれのプロモーターまたはエンハンサー配列も、本発明で使用することができる。好ましくは、プロモーターは、アデノウイルスベクターの天然のプロモーターから得られず、由来せず、または基づかないという点で、異種プロモーターである。これに関して、該プロモーターはウイルスのプロモーターであり得る。適切なウイルスのプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、マウスＣＭＶ前初期プロモーター（ｍＣＭＶ）またはヒトＣＭＶ前初期プロモーター（ｈＣＭＶ））（例えば、米国特許５，１６８，０６２および５，３８５，８３９に記載）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター（例えば、ＨＩＶロングターミナルリピートプロモーター）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（例えば、ＲＳＶロングターミナルリピートまたは配列番号４のプロモーター）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＳＶプロモーター（例えば、Ｌａｐ２プロモーターまたはヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 78: 144-145 (1981)））、ＳＶ４０またはエプスタイン・バーウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（例えば、ｐ５プロモーター）などを含む。好ましくは、該プロモーターはＣＭＶ前初期プロモーター（マウスまたはヒト）またはＲＳＶプロモーターである。
【００７３】
あるいは、該プロモーターは細胞性のプロモーター（すなわち、真核生物細胞、好ましくは動物細胞に天然にあるプロモーター）であり得る。１つの局面において、細胞性プロモーターは、好ましくは多様な細胞タイプ（例えば、免疫系に関する細胞）で働く構成的プロモーターである。適切な構成的プロモーターは真核生物細胞に共通の転写因子、ハウスキーピング遺伝子、または構造遺伝子をコードする遺伝子の発現を駆動することができる。適切な細胞性プロモーターは、例えば、ユビキチンプロモーター（例えばＵｂＣプロモーター）（例えば、Marinovic et al., J. Biol. Chem., 277(19): 16673-16681 (2002)参照）、ヒトβアクチンプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＹＹ１プロモーター、塩基性ロイシンジッパー核因子ー１（ＢＬＺＦ−１）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、熱ショックタンパク質７０Ｂ（ＨＳＰ７０Ｂ）プロモーター、およびＪＥＭ−Ｉプロモーターを含む。好ましくは、細胞性プロモーターはユビキチンプロモーターである。
【００７４】
前記プロモーターの多くは構成的プロモーターである。構成的プロモーターの代わりに、該プロモーターは誘導可能なプロモーター（すなわち、適当なシグナルに反応してアップレギュレートおよび／またはダウンレギュレートされるプロモーター）であり得る。レギュレート可能なプロモーターまたは発現制御配列の使用は、抗原タンパク質（ウイルス抗原および寄生虫抗原を含む）が相補細胞株ににとってしばしば毒性を有するため、特にＤＮＡワクチンの開発に適用できる。プロモーターは放射エネルギー源または細胞にストレスを与える物質によりアップレギュレートすることが可能である。例えば、発現制御配列は薬剤、ホルモン、超音波、光活性化化合物、無線周波数、化学療法および低温凍結（cyofreezing）によってアップレギュレートすることができる。したがって、異種核酸配列の発現をレギュレートするプロモーター配列は、外因性因子による調整に応答する少なくとも１つの異種調節配列を含有することができる。適切な誘導可能なプロモーターシステムはＩＬ−８プロモーター、メタロチオニン誘導可能プロモーターシステム、細菌のｌａｃＺＹＡ発現システム、テトラサイクリン発現システム、およびＴ７ポリメラーゼシステムを含むが、それに限定されない。さらに、異なる発生ステージで選択的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は胚と成体とではグロビン関連プロモーターから示差的に転写される）を使用することができる。
【００７５】
該プロモーターは組織特異的プロモーター、すなわち、好ましくは所定の組織で活性化されて、活性化された組織での遺伝子産物の発現を結果として生じるプロモーターであることができる。本発明の使用に適した組織特異的プロモーターは、標的組織または細胞タイプに基づいて当業者が選択することができる。本発明の方法に使用する好ましい組織特異的プロモーターは、免疫細胞に特異的である（例えば、Morita et al., Gene Ther., 8: 1729-37 (2001)に記載の樹状細胞特異的Ｄｅｃｔｉｎ−２プロモーターなど）。
【００７６】
さらに別の実施態様において、該プロモーターはキメラプロモーターであり得る。少なくとも２つの異なる起源（例えば、１つの生物ゲノムの２つの異なる領域、２つの異なる生物または合成配列を組み合わせた生物）から得られ、由来し、または基づく少なくとも２つの核酸配列部分を含むという点で、プロモーターは「キメラ」である。好ましくは２つの異なる核酸配列部分は、互いに約４０％未満、より好ましくは約２５％未満、一層好ましくは約１０％未満の核酸配列の同一性を示す（該相同性は本明細書の他の箇所に記載される方法によって決定することができる）。キメラのプロモーターは標準的な分子生物学的技術、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)、およびAusubelet al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y.(1994)に記載された技術を用いて生産することができる。
【００７７】
プロモーターは、その特定の活性パターンを抗原（複数の抗原）の発現の所望のパターンとレベルに一致させることによって、本発明の方法に使用するために選択することができる。これに関して、アデノウイルスベクターは好ましくは異なる抗原をコードし、かつはっきりと区別できる発現プロファイルを示す異なるプロモーターに機能的に結合した、２つ以上の異種核酸配列を含む。例えば、第１のプロモーターは抗原産生の最初のピークを媒介するために選択され、それによって、コードされた抗原に対する免疫系をプライミングする。第２のプロモーターは、第１のプロモーターによって駆動される抗原産生の最初のピークから数日後に発現がピークになるように、同じまたは異なる抗原の産生を駆動するために選択され、それによって抗原に対する免疫系を「後押し」する。あるいは、キメラプロモーターは、複数のプロモーターの望ましい面を組み合わせるように構築することができる。例えば、ＣＭＶプロモーターの活性を最初に急増させる点にＲＳＶプロモーターの活性を高いレベルで維持する点を組み合わせたＣＭＶ−ＲＳＶハイブリッドプロモーターは、本発明の方法の多くの実施態様に使用するのに特に好ましい。さらに、プロモーターは、活性を増強する異種要素を含むように改変することができる。例えば、ヒトＣＭＶプロモーター配列は、合成スプライスシグナルを含み得、それに機能的に結合した核酸配列の発現を増強する。抗原が真核生物細胞にとって毒性であり得るという点では、アデノウイルスベクターを増殖させるために使用する相補細胞株における活性を減少させるようにプロモーターを改変することは有利であり得る。
【００７８】
複数の異種核酸配列は、同じまたは異なるプロモーターに機能的に結合することができる。本発明の好ましい実施態様において、各異種核酸配列は別個のプロモーターに機能的に結合する。各プロモーターが異なることが好ましいが、当業者（one or ordinary skill in the art）はアデノウイルスベクターに存在する各異種核酸配列の発現を制御するのに１つの特に効率的なプロモーターを使用する利点を理解するであろう。したがって、各異種核酸配列は同じプロモーターに機能的に結合することができる。アデノウイルスベクターが３つ以上の異種核酸配列を含む場合、３つ以上の異種核酸配列は２つ以上の異なるプロモーターに操作可能に結合する（例えば、２つの異種核酸配列は同じプロモーターにそれぞれ機能的に結合し、１つの異種核酸配列は異なるプロモーターに機能的に結合する）。最も好ましくは、３つ以上の異種核酸配列の各々は異なるプロモーターに操作可能に結合する。所定の異種核酸配列に適切なプロモーターを選択することは、たくさんの要因（プロモーターの強さとアデノウイルスゲノム中の発現カセットの位置を含む）に依存するであろうし、当該分野で既知の慣用の方法を用いて行うことができる。
【００７９】
タンパク質の産生を最適化するために、好ましくは各異種核酸配列はコード配列の３’にさらにポリアデニル化部位を含む。いずれの適切なポリアデニル化配列（合成最適化配列ならびにＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、マウスグロビンＤ（ＭＧＤ）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、およびパピローマウイルス（ヒトパピローマウイルスおよびＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）のポリアデニル化配列を含む）を含む）も使用可能である。好ましいポリアデニル化配列はＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス４０）ポリアデニル化配列である。また、好ましくは、核酸配列が導入された細胞内で適切に発現するように、全ての適切な転写シグナル（および必要に応じて翻訳シグナル）が正確に配置される。必要に応じて、異種核酸配列はまた、ｍＲＮＡ産生を促進するスプライス部位（すなわち、スプライスアクセプターとスプライスドナー部位）を組み込むことができる。
【００８０】
本発明はまた、哺乳動物におけるマラリアに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。該方法は哺乳動物に（ａ）３つ以上の核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、各核酸配列はプラスモディウム属前赤血球ステージ抗原をコードし、少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合しているベクター、および（ｂ）２つ以上の核酸配列を含むアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、各核酸配列はプラスモディウム属血液ステージ抗原をコードし、少なくとも１つのプロモーターに機能的に結合しているベクターを投与することを含む。本発明の他の実施態様と関連して前で述べたアデノウイルスベクター、プラスモディウム属抗原、およびプロモーターの記載が、前記方法の同じ局面にも当てはまる。
【００８１】
本発明の方法において、アデノウイルスベクターは好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト）に投与され、プラスモディウム属抗原をコードする核酸配列が発現して抗原に対する免疫応答を誘導する。該アデノウイルスベクターは別々に製剤化され、同時または任意の順序で順次投与することができる。あるいは、これらのアデノウイルスベクターは同じ医薬組成物の一部であり得る。免疫応答は、体液性免疫応答、細胞介在性免疫応答、または望ましくは、体液性免疫と細胞介在性免疫の組合せであり得る。理想的には、免疫応答は、抗原を含む感染性因子によるその後のチャレンジの際に防御を提供する。しかしながら、防御免疫は本発明においては必要ではない。本発明の方法は、さらに抗体の産生と採取に使用することができる。
【００８２】
プラスモディウム属抗原をコードするアデノウイルスベクターの投与は、哺乳動物に免疫応答を誘導するための複数ステップのあるレジメンの１つの構成要素であり得る。具体的には、本発明の方法は、プライムブースト免疫レジメンの１つの部分を代表することができる。本発明の方法は、したがって、アデノウイルスベクターを投与する前に少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む呼び水となる遺伝子導入ベクターを、哺乳動物に投与することを含み得る。呼び水となる遺伝子導入ベクターによりコードされる抗原は、アデノウイルスベクターの抗原と同じまたは異なるものであり得る。次いで本発明のアデノウイルスベクターが、所定の病原体に対する免疫応答を増強するために投与される。アデノウイルスベクターを含む組成物の２回以上の追加免疫が、免疫を維持するための任意の適切な時間枠（例えば少なくとも約１週間、２週間、４週間、８週間、１２週間、１６週間また初回免疫後はそれ以上で提供され得る。
【００８３】
いずれの遺伝子導入ベクターも、呼び水となる遺伝子導入ベクターとして用いることができ、プラスミド、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、またはアデノウイルスを含むが、これに限定されない。理想的には、呼び水となる遺伝子導入ベクターは、プラスミド、アルファウイルス、またはアデノウイルスのベクターである。プライミングレジメンの効果を最大化するため、該呼び水となる遺伝子導入ベクターは抗原をコードする２つ以上の異種核酸配列を含むことができる。好ましくは、該呼び水となる遺伝子導入ベクターは２つ以上（例えば、２，３，５、またはそれ以上）の、または３つ以上（例えば、３，５，７，９、またはそれ以上）の異種核酸配列を含み、該異種核酸配列はそれぞれ１つの抗原をコードしている。あるいは、免疫応答は、抗原それ自体（例えば、抗原性タンパク質、無傷の病原体（例えば、プラスモディウム属スポロゾイト）、寄生された赤血球、不活化された病原体など）を投与することによってプライミングされ、または増強され得る。
【００８４】
いかなる投与経路も、哺乳動物にアデノウイルスベクターを送達するために使用することができる。実際、２つ以上の経路がアデノウイルスベクターを投与するために使用できるが、ある特定の経路が他の経路よりもより即時的でより効果的な応答を提供することができる。好ましくは、該アデノウイルスベクターは筋肉内注射を介して投与される。１回量のアデノウイルスベクターはまた、体腔中に適用または注入され、皮膚から吸収され（例えば経皮パッチ）、吸入され、経口摂取され、組織に局所的に適用され、または非経口的に（例えば、静脈内、腹膜、または動脈内投与により）投与される。
【００８５】
該アデノウイルスベクターは制御または持続した放出を可能にする手段（例えばスポンジ、生体適合性網目構造、機械的容器、または機械的インプラント）の中または表面に存在させて投与することができる。インプラント（例えば、米国特許５，４４３，５０５参照）、機具（例えば、米国特許４，８６３，４５７参照）（例えば、インプラント可能な機具（例えば、機械的容器またはインプラント）または高分子組成物で構成される機具）が、特にアデノウイルスベクターの投与に有用である。該アデノウイルスベクターはまた、例えばゲル発泡体、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリリン酸エステル（例えば、ビス−２−ヒドロキシエチル-テレフタレート（ＢＨＥＴ））、および／またはポリ乳酸−グリコール酸を含む徐放性製剤（例えば、米国特許5,378,475参照）の形状で投与することができる。
【００８６】
哺乳動物に投与するアデノウイルスベクターの用量は、多数の要因（標的組織の大きさ、全ての副作用の程度、特定の投与経路などを含む）に左右されるであろう。該用量は理想的には、アデノウイルスベクターの「有効量」、すなわち、哺乳動物に所望の免疫応答を誘発するアデノウイルスベクターの用量を含む。所望の免疫応答は、抗体の産生、その後チャレンジの際の防御、免疫寛容、免疫細胞活性化などを伴い得る。望ましくは、１回用量のアデノウイルスベクターは少なくとも約１×１０５粒子（粒子ユニットともよばれる）のアデノウイルスベクターを含む。該用量は好ましくは、少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１粒子）、および最も好ましくは少なくとも約１×１０９粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０粒子）のアデノウイルスベクターである。該用量は、望ましくは約１×１０１４粒子未満、好ましくは約１０１３粒子未満、さらにより好ましくは約１×１０１２粒子未満、さらにより好ましくは約１×１０１１粒子未満、および最も好ましくは約１×１０１０粒子未満（例えば、約１×１０９粒子未満）を含む。言い換えると、１回用量のアデノウイルスベクターは、例えば約１×１０６粒子ユニット（ｐｕ）、２×１０６ｐｕ、４×１０６ｐｕ、１×１０７ｐｕ、２×１０７ｐｕ、４×１０７ｐｕ、１×１０８ｐｕ、２×１０８ｐｕ、４×１０８ｐｕ、１×１０９ｐｕ、２×１０９ｐｕ、４×１０９ｐｕ、１×１０１０ｐｕ、２×１０１０ｐｕ、4×１０１０ｐｕ、１×１０１１ｐｕ、２×１０１１ ｐｕ、４×１０１１ｐｕ、１×１０１２ｐｕ、２×１０１２ｐｕ、または４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含むことができる。
【００８７】
該アデノウイルスベクターは望ましくは、組成物、好ましくは医薬上許容可能な（例えば、生理学的に許容可能な）組成物で投与される。該組成物は、担体、好ましくは医薬上（例えば、生理学的に許容可能な）担体およびアデノウイルスベクター（複数のアデノウイルスベクター）を含む。本発明においては、いかなる適切な担体も使用可能であり、かかる担体は当該分野において周知である。該担体の選択は、組成物が投与されると特定の部位に組成物を投与するために使用される特定の方法と、部分的には決定されるであろう。理想的には、アデノウイルスベクターとの関連で、組成物は好ましくは複製可能なアデノウイルスを含まない。該組成物は任意に滅菌または本発明のアデノウイルスベクターを除いて滅菌することができる。
【００８８】
組成物の適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、および静菌剤を含有し得る水性および非水性溶液、等張滅菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。製剤は単回用量または複数回用量の密封容器（例えば、アンプルおよびバイアル）で提供され得、滅菌した液体担体例えば、水を使用直前に追加するだけでよい凍結乾燥した（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態で保存され得る。即席の溶液および懸濁液が前記の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。好ましくは、担体は緩衝生理食塩水である。より好ましくは、本発明の方法に使用されるアデノウイルスベクターは、投与に先立つダメージから発現ベクターを保護するために製剤化された組成物で投与される。例えば、発現ベクターを調製、保存、または投与するために使用される手段（例えば、ガラス製品、シリンジ、または針）での、アデノウイルスベクターの損失を減らすために該組成物は製剤化され得る。該組成物は、発現ベクターの光感受性および／または温度感受性を減らすために製剤化され得る。この目的のため、該組成物は、好ましくは医薬上許容可能な液体担体（例えば、前記の担体、ならびにポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびそれらの組合せよりなる群から選択される安定化剤）を含む。かかる組成物の使用は、ベクターの貯蔵寿命を延長し、投与を容易にし、かつ本発明の方法の効率を良くするであろう。アデノウイルスベクターを含有する組成物の製剤は、例えば、米国特許６，２２５，２８９、米国特許６，５１４，９４３、米国特許出願公開Ｎｏ．２００３／０１５３０６５  Ａ１、および国際特許出願公開ＷＯ００／３４４４４にさらに記載されている。組成物はまた、形質導入効率を増大させるためにも製剤化され得る。加えて、当業者はアデノウイルスベクターが別の治療的なまたは生物学的に活性な因子とともに、組成物中に存在し得ることを理解するであろう。例えば、炎症を制御する因子（例えば、イブプロフェンまたはステロイド）は、ウイルスベクターの生体内投与に伴う腫れおよび炎症を減少させるため、組成物の一部とすることができる。本明細書に記載のように、免疫系刺激因子または賦活剤（例えば、インターロイキン類、リポ多糖および２本鎖ＲＮＡ）は、抗原に対するいかなる免疫応答も増大または改変させるために投与され得る。抗生物質（すなわち、殺菌剤および防カビ剤）は、既存の感染の治療のため、および／または将来の感染、例えば遺伝子導入手順と付随した感染のリスクを減らすため存在させ得る。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例は本発明をさらに説明するものであるが、もちろん、その範囲を何ら限定するものと解すべきではない。
【００９０】
（実施例１）
この実施例は、Ｐ．ファルシパラム血液ステージ抗原をコードする異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターの調製を示す。
【００９１】
欠失したＥ１領域の代わりに、Ｐ．ファルシパラムのＡＭＡ−Ｉ（ＰｆＡＭＡ１）およびＭＳＰ−１４２（ＰｆＭＳＰ１４２）タンパク質の非分泌（ＮＳ）、分泌かつ糖鎖付加化（ＳＧ）、および分泌かつ非糖鎖付加化（ＳＮＧ）バージョンをコードする核酸配列を含有する１０の血清型５Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターが生み出された。ＰｆＭＳＰ１４２のＳＧバージョンは、分解促進因子（ＤＡＦ）シグナル配列をＰｆＭＳＰ１４２遺伝子の５’末端と融合させることによって生み出された。ＰｆＭＳＰ１４２のＳＮＧバージョンは、ＤＡＦシグナル配列とアミノ酸の位置が３２１でアスパラギンから置換されたグルタミンを含む。ＰｆＡＭＡ１のＳＧバージョンはＰｆＡＭＡ１遺伝子の完全長である。ＰｆＡＭＡ１のＳＮＧバージョンはアミノ酸の位置２８６、３７１、４２１、４２２および４９９がアスパラギンから置換されたグルタミンおよびアミノ酸の位置１６２がアスパラギンから置換されたリジンを含有する。ＰｆＡＭＡ１のＮＳバージョンは、天然のシグナル配列の欠失を含有する。
【００９２】
各アデノウイルスベクター構造において、ＰｆＭＳＰ１４２遺伝子はアデノウイルスベクターの転写に関して反対の方向にＥ１欠失の部位中に挿入された発現カセットから発現した。発現カセットは、５’から３’に向けて、合成スプライスシグナルを有するヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ）、ＰｆＭＳＰ１４２遺伝子、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。各アデノウイルスベクターの構造において、ＰｆＡＭＡ１遺伝子はＥ４欠失部位に挿入された発現カセットでマウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）から発現した。
【００９３】
Ｅ４領域に配置されたｍＣＭＶ発現カセットがＥ１領域のｈＣＭＶ発現カセットと同等であることを確かめるために、３つの追加のベクターがコントロールとして生み出された：（１）Ｅ１領域のｈＣＭＶプロモーターと機能的に結合したＰｆＡＭＡ１のＳＧバージョンを含むＡｄＰｆＡＭＡ１（ＳＧ）、（２）Ｅ１領域のｍＣＭＶプロモーターと機能的に結合したＰｆＡＭＡ１のＳＧバージョンを含むＡｄｍＣＭＶＰｆＡＭＡ１（ＳＧ）、および（３）Ｅ４領域のｈＣＭＶプロモーターと機能的に結合したＰｆＡＭＡ１のＳＧバージョンを含むＡｄａ．Ｅ４ｔ．ＰｆＡＭＡ１（ＳＧ）。
【００９４】
ＰｆＡＭＡｌ遺伝子とＰｆＭＳＰ１４２遺伝子のＳＧ、ＳＮＧおよびＮＳバージョンを含むベクターは、糖鎖付加の状態と抗原の細胞局在性を評価した。免疫ブロット解析は、ＰｆＡＭＡｌのＳＧバージョンの見た目の分子量がＮＳやＳバージョンの分子量よりも重いということを示した。これは、ＳＧバージョンが翻訳後に改変されたことを示唆している。免疫ブロット解析はまた、ＭＳＰ１４２のＳＧバージョンの見た目の分子量がＮＳやＳＮＧバージョンの分子量よりも重いということを示した。これは、ＳＧバージョンが翻訳後に改変されたことを示唆している。糖鎖付加の状態は、ＰｆＭＳＰ１４２ベクターのＰｆＡＭＡ１にＡ５４９細胞を感染させ、その後に、感染２４時間後に採取された細胞溶解物をＥｎｄｏ  ＨまたはＰＮＧａｓｅ  Ｆのどちらかで処理することによって確認することができる。ＰＮＧａｓｅ  Ｆは複合体、ハイブリッド、高マンノースタイプＮ−グリカンを加水分解し、Ｅｎｄｏ  Ｈは高マンノースタイプ構造のみを開裂させる。両酵素の処理の結果として、ＰｆＡＭＡ１（ＳＧ）産物とＭＳＰ−１４２（ＳＧ）産物の見た目の分子量が減少することは、ＰｆＡＭＡｌ（ＳＧ）とＭＳＰｌ４２（ＳＧ）とが両方ともＮ−糖化することを示している。ＰｆＡＭＡ１のＮＳまたはＳＮＧバージョンの見た目の分子量における変化は観察されなかった。ＰｆＭＳＰ１４２のＮＳバージョンの分子量における変化がなく、ＳＮＧバージョンの分子量における変化が少ないことが観察された。これは、おそらく、酵素分解緩衝液におけるイオン強度の違いによるものである。ＰｆＡＭＡ１（ＮＳ）抗原の発現は、ＳＧ抗原とＳＮＧ抗原に比べてはるかに減少した；しかしながら、異なる抗体を使用した別の免疫ブロットはＮＳ抗原が効率的に発現したことを示した。
【００９５】
全てのアデノベクター構築物の免疫ブロット解析により、培養培地中に抗原を分泌したＡＭＡ１ベクターがなかったこと、大半のＭＳＰタンパク質は培養培地中に分泌されなかったことが示された。免疫蛍光分析（ＩＦＡ）により、同様のレベルのＰｆＡＭＡ１が非透過性細胞対透過性細胞において観察されたように、ＰｆＡＭＡ１（ＳＧ）抗原が細胞表面に位置することが示された。ＡＭＡ１のＳＮＧバージョンは、透過化はＩＦＡによって抗原を検出する必要があるので、細胞外には存在しなかった。生存している感染細胞をプロテアーゼで分解することによりこれらの発見が確認され、ＰｆＡＭＡ１（ＳＧ）がトリプシンにより開裂し、ＰｆＡＭＡ１（ＳＮＧ）およびＰｆＡＭＡ１（ＮＳ）抗原はトリプシンにより開裂しないことが明らかになった。該解析は、ＰｆＡＭＡ１（ＳＧ）抗原が４Ｇ２抗体に認識され、トリプシン分解に感受性のある構造で、抗原が細胞表面に存在することを示唆する。
【００９６】
ＩＦＡはまた、ＩＦＡによりＰｆＭＳＰ１抗原を検出するために細胞の透過性が必要であるので、ＭＳＰ１４２抗原は細胞表面に関与しないことを示した。しかしながら、生存している感染細胞のプロテアーゼ分解は、Ｐｆ−ＭＳＰ１４２（ＳＧ）がトリプシンにより開裂すること、ＰｆＭＳＰ１４２（ＳＮＧ）およびＰｆＭＳＰ１４２（ＮＳ）抗原がトリプシンにより開裂しないことを明らかにした。この解析は、トリプシン分解に感受性があるがＩＦＡアッセイに使用されたポリクローナル抗血清に認識されない構造で、ＰｆＭＳＰ１４２（ＳＧ）抗原が細胞表面に存在することを示唆している。これらの実験結果は表１に要約する。
【００９７】
【表１】
2009505680.tif 000003
【００９８】
この実施例の結果は、Ｐ．ファルシパラムの血液ステージ抗原の分泌、非分泌、糖鎖付加（glcosylated）、および非糖鎖付加バージョンを含むアデノウイルスベクターの産生を示す。
【００９９】
（実施例２）
この実施例は、Ｐ．ファルシパラムの血液ステージ抗原をコードする異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターの免疫原性を示す。
【０１００】
４つの血清型５Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクター（欠失したＥ１領域の代わりに、Ｐ．ファルシパラムＭＳＰ１４２（ＰｆＭＳＰ１４２）またはＡＭＡ−１（ＰｆＡＭＡ１）タンパク質の非分泌（ＮＳ）、分泌かつ糖鎖付加（ＳＧ）、分泌かつ非糖鎖付加（ＳＮＧ）、および野生型バージョンをコードする核酸配列）を含有する）は、実施例１に記載のように産生された。細胞膜にＭＳＰ１４２タンパク質を固定するために、ＰｆＭＳＰ１４２のＮＳ、ＳＧ、およびＳＮＧバージョンをコードする核酸配列もまた、グリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinisotol）（ＧＰＩ）アンカー配列を含有する。同様に、野生型ＭＳＰ１４２核酸配列は、ＤＡＦアンカー配列とＤＡＦシグナル配列（すなわち、Ａｄ．ＰｆＭＳＰ１４２（ＤＳＡ））とを含む。実施例１に記載のＰｆＡＭＡ１の分泌かつ非糖鎖付加（ＳＮＧ）バージョンに加えて、２つ目のＳＮＧ  ＰｆＡＭＡ１アデノベクター構築物（ＳＮＧ２）が産生された。ＰｆＡＭＡ１のＳＮＧ２バージョンは次のアミノ酸置換体を含む：Ａｓｎｌ６２Ｌｙｓ、Ｔｙｒ２８７Ｌｅｕ、Ｔｈｒ２８８Ｖａｌ、Ａｌａ３７２Ａｒｇ、Ｓｅｒ３７３Ｖａｌ、Ｓｅｒ４２３Ｌｙｓ、Ａｓｎ４２２Ａｓｐ、Ｓｅｒ４２４Ａｓｎ、およびＡｓｎ４９９Ｇｌｎ。
【０１０１】
実施例１に記載のように、アデノウイルスベクターを糖鎖付加の状態と抗原の細胞局在性で評価した。前記組換えアデノウイルスベクターにより誘導されたＴ細胞免疫応答は、マウスモデルで評価した。具体的には、前記のＰｆＭＳＰ１４２またはＰｆＡＭＡ１発現アデノベクターを、全容積１００μｌ中１×１０８ｐｕの用量で、２つの筋肉間で分割して３〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの前脛骨筋の筋肉内に免疫した。ＣＤ８＋とＣＤ４＋のＴ細胞応答は、ＰｆＭＳＰ１４２またはＰｆＡＭＡ１由来の合成ペプチドのプールを用いたインビトロでの再刺激に続いて、細胞間サイトカイン染色（ＩＣＳ）またはＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔにより測定された。免疫化されていない未使用のマウスを同時に評価した。抗体応答は、アデノベクターを発現するＰｆＡＭＡ１の各ＰｆＭＳＰ１４２を用いて免疫されたマウス由来の抗血清の連続的な希釈物を利用したＥＬＩＳＡアッセイにより評価された。これらの実験結果は表２に示される。
【０１０２】
【表２】
2009505680.tif 000004
【０１０３】
この実施例の結果は、Ｐ．ファルシパラム血液ステージ抗原の分泌、非分泌、糖鎖付加（glcosylated）、および非糖鎖付加バージョンを含むアデノウイルスベクターの産生およびインビボでの関連する免疫原性を示す。
【０１０４】
（実施例３）
この実施例は、インビボおよびインビトロでのアデノウイルスベクターによりコードされるプラスモディウム属抗原の発現におけるプロモータータイプ、さらにプロモーターの配置および方向の効果を示す。
【０１０５】
多価ベクターにおいて異なる抗原を発現する１つの強いプロモーターの複数のコピーを使用することにより、プロモーター間で相同組換えすることによりベクターを不安定にすることが予期される。したがって、多価アデノウイルスベクターに基づくマラリアワクチンのための適切なプロモーターを同定するため、多様なプロモーター由来のルシフェラーゼを発現する一連のアデノウイルスベクターを、プラスモディウム属遺伝子の発現を制御するのに適切なプロモーターを同定するために、マウスにおいてスクリーニングした。特に、５匹のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの集団に、Ｅ１欠失部位にルシフェラーゼ発現カセットを含有するＥ１／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターの１×１０１０粒子ユニット（ｐｕ）を注射した。ルシフェラーゼ遺伝子は、次の各プロモーターに操作可能に結合した：ヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ)、ヒトＣＭＶ増強トリβアクチンキメラプロモーター（ＣＣＢＡ）、ヒトβアクチン（ｈβＡ）プロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、伸長因子α（Ｅｆ１α）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、Ｙｉｎｇ  Ｙａｎｇ  １（ＹＹ１）プロモーター、塩基性ロイシンジッパー核因子−１（ＢＬＺＦ１）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、および熱ショック特異的７ＯＢ（ＨＳＰ７０Ｂ）プロモーター。各マウスの脛骨筋への注射２４時間後、筋肉組織が採取され、相対照度ユニット（ＲＬＵ）／μｇのタンパク質におけるルシフェラーゼレベルが測定された。反応緩衝液を注射したマウスをネガティブコントロールとして使用した。
【０１０６】
プロモーターの３つの分類：高発現、中発現、および低発現を示す。高発現は、ｍＣＭＶプロモーターと活性が等量か、より高いものとして定義される。高発現グループは、ｈＣＭＶ、ＣＣＢＡ、ｈＢＡ、Ｅｆ１αおよびｍＣＭＶプロモーターを含む。中発現グループはユビキチン（Ｕｂ）プロモーターを含み、低発現グループはＲＳＶ、ＹＹｌ、ＢＬＺＦ−１、ＮＳＥおよびＨＳＰ７０Ｂプロモーターを含む。
【０１０７】
アデノベクターゲノム内の発現カセットの配置と方向の効果をまた、インビボでルシフェラーゼマーカー遺伝子を用いて評価した。Ｅ１領域およびＥ４領域は、ｈＣＭＶおよびｍＣＭＶプロモーターを用いて試験したとき、同様の高レベルの発現を提供することが見られた。同様に、Ｅ４領域内の発現カセットの方向は発現レベルにまで影響しなかった。しかしながら、ｈＢＡ発現カセットがアデノベクターの欠失したＥ３領域中に挿入されたとき、欠失したＥ１領域に同一カセットが挿入されたときに見られる発現に比べて１００分の１に減少した発現が見られた。
【０１０８】
この結果より、高レベルのアデノベクター中のプラスモディウム属遺伝子発現により高発現プロモーター（例えばｈＣＭＶプロモーター）の使用を達成することができ、かつＥ１および／またはＥ４欠失の部位中に発現カセットを挿入できることが示唆された。
【０１０９】
（実施例４）
この実施例は、Ｐ．ファルシパラムの血液ステージ抗原をコードする２つの異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターの調製を示す。
【０１１０】
前記実験に基づいて、ＰｆＡＭＡ１およびＰｆＭＳＰ１４２の両方のＳＮＧのＳＧバージョンをコードするアデノウイルスベクターが結果として効果的なワクチン構築物である可能性が最も高いことを決定した。この目的のために、Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターが、欠失したＥ１領域に配置する発現カセット中のＰｆＭＳＰ１４２（ＳＮＧ）遺伝子およびウイルスの欠失したＥ４領域に配置する発現カセット中のＰｆＡＭＡ１（ＳＮＧ）遺伝子を含んで構築された。特に、ｈＣＭＶプロモーター由来のＰｆＭＳＦ１４２（ＳＮＧ）抗原を発現するＥ１シャトルベクターが構築された（ｐＡｄＣＭＶ．ＰｆＭＳＰ１４２(ＳＮＧ))。ｍＣＭＶプロモーター由来ＰｆＡＭＡ１（ＳＮＧ）抗原を発現するＥ４シャトルベクター（ｐＡｄＥ４ｍＣＭＶ．ＰｆＡＭＡ１（ＳＮＧ））はまた、例えば、国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９９／１５６８６および米国特許６，３２９，２００に記載の方法を用いて生産した。これらのシャトルベクターは、ｐＡｄ（ｔ．ＰｆＭＳＰｌ４２ＳＮＧ）Ｅ３（１０）Ｅ４（ｍＣＭＶ．ＰｆＡＭＡｌＳＮＧ）ｐｋｇとよばれる新規なアデノベクタープラスミドを産生するために、ＡｄＦａｓｔ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＧｅｎＶｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって生産されたプラスミドに組み換えられた（国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９９／１５６８６および米国特許６，３２９，２００参照）。このプラスミドは、ウイルス中で変換されて、Ａｄｔ．ＰｆＭＳＰｌ４２（ＳＮＧ）Ｅ４ｍＣＭＶ．ＰｆＡＭＡ１（ＳＮＧ）アデノウイルスベクターの高力価ベクターストックを産生するために拡大された。同様の方法で、２つ目のＥ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターが、Ｅ１領域が２つの発現カセットに置換されて構築された：１つはＰｆＭＳＰ１４２（ＳＧ）遺伝子を含み、もう１つはＰｆＡＭＡ１（ＳＧ）遺伝子を含む（ＡｄＥ１（ＭＳＰ１４２ＳＳＧ／ｍＣＭＶＡＭＡＳＧ））。両方のベクターの高力価ストックは十分に証明され、遺伝的構造の同一性がＰＣＲに基づくアッセイにより確認された。
【０１１１】
組換えアデノウイルスベクターＡｄＥ１（ＭＳＰｌ４２ＳＳＧ／ｍＣＭＶＡＭＡＳＧ）により誘導されるＴ細胞免疫応答は、実施例２に記載のようにして評価した。詳細には、マウスを１６グループに分け、１〜５グループはプライミング免疫をせず、６〜１０グループはコントロールＤＮＡ、ＰｆＡＭＡ１  ＤＮＡ、ＰｆＭＳＰ１  ＤＮＡまたはＰｆＡＭＡ１  ＤＮＡとＰｆＭＳＰ１  ＤＮＡとの混合物のプライミング免疫をし、１１〜１５グループにはＡｄＮｕｌｌ、ＰｆＡＭＡ１（ＳＧ）（ＡｄＰｆＡＭＡ１（ＳＧ））、またはＰｆＭＳＰ１４２（ＳＧ）（ＡｄＰｆＭＳＰ１４２（ＳＧ））、ＡｄＰ／ＡＭＡｌ（ＳＧ）とＡｄＰｆＭＳＰ１４２（ＳＧ）との混合物またはＡｄＥ１（ＭＳＰ１４２ＳＳＧ／ｍＣＭＶＡＭＡＳＧ）のみをコードするＥ１／Ｅ４欠損ベクター、のいずれかのプライミング免疫をした。マウスは４週間でブースト免疫を投与した。これに関し、１〜１５グループはＡｄＮｕｌｌ、ＡｄＰＺＡＭＡ１（ＳＧ）、ＡｄＰｆＭＳＰ１４２（ＳＧ）、ＡｄＰ／ＡＭＡ１（ＳＧ）とＡｄＰｆＭＳＰ１４２（ＳＧ）との混合物、またはＡｄＥｌ（ＭＳＰ１４２ＳＳＧ／ｍＣＭＶＡＭＡＳＧ）のいずれかを用いて免疫した。１６グループのマウスは未処理のマウスであった。マウスは免疫付与後２週間または６週間で屠殺した。１１〜１６グループのマウスの抗体応答は、実施例２に記載のようにＥＬＩＳＡ分析により評価した。
【０１１２】
これらの実験結果は、図１〜４に示す。図１は、免疫付与後２週間の処置されたマウスのＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔ解析の結果を示す。図２は、免疫付与後６週間の処置されたマウスのＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔ解析の結果を示す。図３と４は、それぞれ、ＡＭＡ１タンパク質とＭＳＰ１４２タンパク質に対するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【０１１３】
この実施例の結果は、２つの異種核酸配列を含む本発明のアデノウイルスベクターの産生と免疫原性を示す。ここで、各核酸配列はプラスモディウム属抗原をコードし、少なくとも１つのプロモーターと機能的に結合している。
【０１１４】
（実施例５）
この実施例は、Ｐ．ファルシパラム前赤血球ステージ抗原をコードする異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターの調製を示す。
【０１１５】
血清型５Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクター（欠失したＥ１領域の代わりに、Ｐ．ファルシパラムのＣＳＰ遺伝子またはＳＳＰ−２遺伝子をコードする核酸配列を含有する）は、例えば国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９９／１５６８６および米国特許６，３２９，２００に記載の方法を用いて産生した。ＣＳＰ遺伝子またはＳＳＰ−２遺伝子は、次のプロモーターの１つ（ｈＣＭＶ、ｍＣＭＶ、ＲＳＶ、またはＵｂ）に機能的に結合した。各アデノウイルスベクター構築物は、そこにコードされるプラスモディウム属遺伝子にしたがって命名し、プロモーターはプラスモディウム属遺伝子を制御するために使用した。
【０１１６】
インビトロでの抗原発現レベルがプロモーターの使用によって影響を受ける範囲を決定するために、ヒト胎児胚（ＨＥＬ）細胞を、ベクターの欠失したＥ１領域に挿入されたＰｆＳＳＰ２発現カセットを含む６つのアデノウイルスベクターの１つに感染させた。全発現カセットは、天然のＳＳＰ−２配列を含有するコドン最適化ＰｆＳＳＰ２遺伝子（ベクターＡｄＣＭＶ．ＰｆＳＳＰ２ｎを除く）を利用した。ベクターＡｄＣＭＶ．ＰｆＳＳＰ２ｄｌＴＭＣＴは、ＰｆＳＳＰ２アミノ酸配列のカルボキシ末端の欠失をコードする核酸配列を含み、該配列はタンパク質の膜貫通ドメインを取り除かれる。ベクターＡｄＣＭＶ．ＰｆＳＳＰ２、ＡｄＲＳＶ．ＰｆＳＳＰ２、ＡｄＵｂ．ＰｆＳＳＰ２、およびＡｄｍＣＭＶ．ＰｆＳＳＰ２は、ｈＣＭＶプロモーター（合成スプライシングシグナルを含有する）、ＲＳＶプロモーター、Ｕｂプロモーター、またはｍＣＭＶプロモーターをそれぞれ機能的に結合したＰｆＳＳＰ２をコードする核酸配列を含む。
【０１１７】
免疫ブロット分析は、ｈＣＭＶおよびｍＣＭＶプロモーターがコドン最適化ＰｆＳＳＰ２抗原の発現を制御するために使用されるとき、高レベルのＰｆＳＳＰ２発現が見られることを示した。ＡｄＣＭＶ．ＰｆＳＳＰ２とＡｄＣＭＶ．ＰｆＳＳＰ２ｎとの比較は、コドン最適化ＰｆＳＳＰ２配列の使用が天然の配列に関しておよそ１００倍ＰｆＳＳＰ２発現を増強することを示す。ＲＳＶおよびＵｂプロモーター由来のＰｆＳＳＰ２発現は、ｈＣＭＶプロモーターに関して約２０〜１００分の１に減少した。
【０１１８】
この実施例の結果は、多様な異なるプロモーターに機能的に結合したＰ．ファルシパラム前赤血球ステージ抗原をコードする異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターの産生を示す。
【０１１９】
（実施例６）
この実施例は、インビボで、Ｐ．ファルシパラム前赤血球ステージ抗原をコードするアデノウイルスベクターの免疫原性を示す。
【０１２０】
実施例４に記載の組換えアデノウイルスベクターにより誘導された免疫原性は、マウスモデルで評価した。詳細には、３〜６週齢の６匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの集団（各グループｎ＝６）を、全容量１００μｌ中１×１０８ｐｕの用量で、ＲＳＶプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ｍＣＭＶプロモーター、またはＵｂプロモーター由来の哺乳動物コドン最適化ＰｆＳＳＰ２、もしくはｈＣＭＶプロモーター由来で発現した非コドン最適化（すなわち天然の）ＰｆＳＳＰ２を発現するベクターを２つの筋肉間で分割して前脛骨筋内の筋肉内に免疫した。マウスは１０グループに分けた。２〜４グループは各ＰｆＳＳＰ２アデノベクターでブースト免疫される４週間前にＰｆＳＳＰ２  ＤＮＡのプライミング免疫を受けた。５〜７グループは、４週間の間隔で、ＰｆＳＳＰ２アデノベクターの２回用量で免疫した。８〜１０グループは、アデノベクターの１回用量で免疫した。マウスは免疫付与後２週間または６週間で屠殺した。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋のＴ細胞応答は、ＰｆＳＳＰ２由来でＡ２０／２Ｊ標的細胞に存在する合成ペプチドのプールを用い、インビトロでの再刺激に続く細胞間サイトカイン染色（ＩＣＳ）またはＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔにより測定した。１グループの免疫していない未処理マウスを同時に評価した。
【０１２１】
ＰｆＳＳＰ２はｈＣＭＶまたはｍＣＭＶプロモーターからの発現であってＲＳＶプロモーターからでないとき、強力な免疫応答が観察された。さらに、インビトロでのＩＦＮ−γ応答とインビボでの防御免疫の間の高い関係が指摘され（ｒ２＝０．９０３）、ＲＳＶプロモーターを使用した構築物は短期（免疫付与後２週間、６週間、または１２週間）または長期（６ヵ月）のどちらの病原体のチャレンジに対しても滅菌防御を誘導するほど効果的でなかった。ＲＳＶプロモーターを含むベクターに誘導された場合に比較して、頻度および強さまたは応答では、ｈＣＭＶプロモーターから発現した天然のＰｆＳＳＰ２アデノベクターにより誘導されたインビボでの免疫応答は乏しい。これらのデータは、候補となるアデノベクターマラリアワクチンが天然の遺伝子配列よりもむしろ哺乳動物コドン最適化遺伝子を利用すべきであることを確かにする。
【０１２２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は細胞内サイトカイン染色によって検出されたが、アデノベクターにより誘導されたＴ細胞応答は、主にＣＤ８＋表現型であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導するためのプロモーターの相対的な免疫原性のプロファイルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のプロファイルと同じであった。これらのデータは、Ｐ．ヨエリイマウスモデルにおいてＰｙＣＳＰを使用する他の研究結果と一致する。前赤血球ステージマラリアに対する防御が主にＣＤ８＋Ｔ細胞（２番目の役割をするＣＤ４＋Ｔ細胞とともに）によって媒介されるので、本明細書に記載の組換えアデノウイルスベクターによって誘導された免疫応答のプロファイルおよび表現型が、プラスモディウム属のチャレンジに対する防御にとって望ましい。
【０１２３】
外挿によると、これらのデータもまた、ＲＳＶプロモーターではなくｈＣＭＶおよびｍＣＭＶプロモーターがＰ．ファルシパラムに対する防御免疫を誘導するのに効率的であり得ることを示唆する。同様に該データと一致して、試験された用量では、ｈＣＭＶまたはｍＣＭＶプロモーターに誘導されたＰｆＳＳＰ２抗原特異的応答間は顕著には異ならなかった。該データによっても有効用量として１×１０８ｐｕが確立され、該有効用量は続く研究のための標準用量として選択された。
【０１２４】
実施例５に記載のアデノウイルスベクターもまた、抗原特異的抗体応答を誘導する能力を評価した。詳細には、高発現、中発現または低発現プロモーター由来のＰｆＳＳＰ２を発現する構築物により促進された抗体応答を比較した。この解析結果は表3に示す。該抗体応答は、試験したアデノウイルスベクターにより促進されたＴ細胞応答と比較した。これに関し、ＲＳＶプロモーター構築物は免疫原性が乏しく、かつヒトおよびマウスのＣＭＶプロモーターは抗原特異的抗体応答を誘導するのに効率が良かった。
【０１２５】
【表３】
2009505680.tif 000005
【０１２６】
この実施例の結果は、インビボでのｈＣＭＶ、ｍＣＭＶ、またはＲＳＶプロモーターと操作可能に結合するＰ．ファルシパラム前赤血球ステージ抗原をコードするアデノウイルスベクターの免疫原性を示す。
【０１２７】
（実施例７）
この実施例は、Ｐ．ファルシパラム前赤血球ステージ抗原をコードする２つの異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターの調製を示す。
【０１２８】
Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスの欠失したＥ１領域に配置される発現カセット中のテール（ＰｆＣＳＰｔ）および欠失したＥ４領域に配置される発現カセット中のＰｆＬＳＡ遺伝子を抑制するＧＰＩアンカーを含有するように改変されたＰｆＣＳＰ遺伝子を含むように構築された。詳細には、Ｅ１シャトルベクターは、ｈＣＭＶプロモーター由来のＰｆＣＳＰｔ抗原を発現するように構築された。Ｅ４シャトルベクターは、ｍＣＭＶプロモーター由来のＰｆＬＳＡ抗原を発現し、例えば国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９９／１５６８６および米国特許６，３２９，２００に記載の方法を使用しても生産された。これらのシャトルベクターを、ＡｄＦａｓｔ（登録商標）技術（ＧｅｎＶｅｃ，Ｉｎｃ．，ゲイサーズバーグ，メリーランド州)によって生産されたプラスミド(国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９９／１５６８６および米国特許６，３２９，２００参照)で組み換え、新規アデノベクタープラスミドを生産した。このプラスミドはアデノウイルスに変換され、ＡｄＥｌ(ＣＳＰｔ)Ｅ４（ｍＣＭＶ．ＬＳＡ）とよばれるアデノベクターの高力価のベクターストックを産生するために拡張された。アデノウイルスベクターの高力価ストックは十分に証明され、その遺伝的構造の同一性はＰＣＲに基づくアッセイによって確認された。免疫ブロットアッセイは、インビトロで、この二価のベクターが結果的にＰｆＣＳＰｔとＰｆＬＳＡとの抗原の両方で効率的に発現されることを確認した。
【０１２９】
組換えアデノウイルスベクターに誘導されたＴ細胞免疫応答は、実施例２に記載のようにして評価した。詳細には、マウスは、いずれのＰ．ファルシパラム抗原(ＡｄＮｕｌｌ)も欠くコントロールベクター、ＣＳＰｔ抗原のみをコードするＥ１／Ｅ４欠損アデノベクター(ＡｄＰｆＣＳＰｔ)、ＬＳＡ抗原のみをコードするＥＬ／Ｅ４欠損アデノベクター(ＡｄＰｆＬＳＡ)、ＡｄＰｆＣＳＰｔおよびＡｄＰｆＬＳＡの混合物、またはＡｄＥｌ(ＣＳＰｔ)Ｅ４(ｍＣＭＶ．ＬＳＡ)のどれかの１回用量または２回用量で免疫した。マウスは、免疫付与後２週間および６週間で屠殺した。処理したマウスの各グループの抗原応答を、実施例２に記載のＥＬＩＳＡアッセイで評価した。
【０１３０】
これらの実験結果は図５および６に示す。図５は、免疫付与後６週間の処理されたマウスのＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔ解析の結果を示す。図６は、前記記載のアデノウイルスベクターの1回用量または２回用量を受けたマウスのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。これらの結果は、２つの前赤血球ステージマラリア抗原をコードする二価のアデノウイルスベクターが、両方の抗原に対して強いＴ細胞応答および抗体応答をインビボで誘導することを示す。
【０１３１】
（実施例８）
この実施例は、それぞれが少なくとも２つの異なるプロモーターに機能的に結合した３つの異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターの調製を示す。
【０１３２】
マーカー遺伝子をコードする３つの核酸配列を含む三価Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠失アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の場所に挿入された一重発現カセット、およびＥ４領域の場所に挿入された二重発現カセットを組み込むことにより生産された。試験された該マーカー遺伝子はルシフェラーゼを含み、アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を分泌した。試験された該プロモーターは、ＲＳＶプロモーター、合成スプライシングシグナルを有するヒトＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ）、マウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）、ＣＣＢＡプロモーター、およびＥＦ−ｌαプロモーターを含む。生産された三価の構築物は図７に図式化して示す。
【０１３３】
国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９９／１５６８６および米国特許６，３２９，２００に記載の方法を用いて、全ての三価の構築物が、コントロールプラスミドとして同様の効率で、アデノベクタープラスミドから救出された。２つのアデノウイルスベクター構築物（ＡｄＥｌ(ＥＦ．Ｓ)Ｅ４(ｆ．ＣＣＢＡ＿ｍＣＭＶ．Ｌ)およびＡｄＥｌ(ｍＣＭＶ．Ｌ)Ｅ４(Ｓ．Ｒ＿ＣＭＶ．ｆ)）の精製されたベクターストックの全収量は、他の試験されたアデノウイルスよりも高かった。これは、１つのベクター設計が他のベクター設計を超える成長利点を有し得ることを示唆する。
【０１３４】
これらのベクターの成長特性を決定するために、成長曲線実験を行った。２９３−ＯＲＦ６細胞（Brough et al, J Virology, 70: 6497-6501 (1996)参照）は、生産における最も少ない収量の２つを含む三価ベクターの３つの溶解物を感染させた。細胞は感染４８時間後および７２時間後に得て、焦点形成ユニット（ｆｆｕ）アッセイを用いて活性化したベクター粒子を解析した。感染効率（ＭＯＩ）が２０ｆｆｕ／ｃｅｌｌである感染は、全ての三価ベクターに対して結果として顕著なベクターを生じる。三価ベクターの収量は、ただ１つの発現カセット（ＡｄＬ．１１Ｄ）のみを保有するコントロールアデノベクターで得られた収量と同じであった。
【０１３５】
ＰｆＣＳＰとＰｆＳＳＰ２との両方を発現するアデノウイルスベクターの産生は、証明することが難しい。なぜなら、これらの抗原はアデノウイルス粒子にアデノベクタープラスミドが変換することを抑制するからであり、精製されたＰｆＳＳＰ２発現アデノベクターの収量はほとんどの別のアデノベクターストックのおよそ１０分の１であった。この問題に取り組むために、ＰｆＳＳＰ２突然変異を発現しているアデノベクターが生産された。これに関し、ＰｆＳＳＰ２−４は、膜貫通ドメインを取り除いたもののＣ末端欠失およびＳＳＰ２タンパク質のＣ末端を含有する。ＰｆＳＳＰ２−６は、ＰｆＳＳＰ２のトロンボスポンジンドメイン中に欠失を含む。これらの突然変異ＳＳＰ２遺伝子それぞれを発現するＥ１／Ｅ３／Ｅ４欠失血清型５アデノウイルスベクターは、前記野生型ＰｆＳＳＰ２発現アデノウイルスベクターと同時に成長曲線実験において解析した。
【０１３６】
ＰｆＳＳＰ２−６をコードするアデノベクターは、野生型のＰｆＳＳＰ２をコードするアデノベクターまたはＰｆＳＳＰ２−４をコードするアデノベクターよりも顕著に低い力価になり、それゆえ、さらに解析しなかった。最もよい成長パフォーマンスは、天然のＰｆＳＳＰ２ヌクレオチド配列を含むアデノベクターで見られた。ｍＣＭＶプロモーター由来のコドン最適化ＳＳＰ２抗原を発現するアデノベクターは、このアッセイでよく増大し、かつ強力な免疫応答をマウスにおいて誘導した。
【０１３７】
この実施例の結果は、３つの異種核酸配列を含む本発明のアデノウイルスベクターの産生を示す。各核酸配列は少なくとも２つの異なるプロモーターに対して機能的に結合する。
【０１３８】
（実施例９）
この実施例は、３つの異種核酸配列を含む１つのアデノウイルスベクターの調製を示す。各異種核酸配列はプラスモディウム属抗原をコードする。
【０１３９】
Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠失血清型５アデノウイルスベクターは、ウイルスゲノムのＥ１およびＥ４領域に配置された二重発現カセットからＰｆＬＳＡとＰｆＣＳＰとの両方を発現するように生産された。予備試験の結果は、Ｅ１発現ベクターがよく成長することを示す。さらに、３つの前赤血球ステージプラスモディウム属抗原を発現する１つの三価のアデノベクターの発現カセットが構築された。これらの発現カセットは、Ｅ１欠失部位に挿入されたＰｆＳＳＰ２遺伝子およびＥ４欠失部位に挿入された二重発現カセットの一部としてＰｆＬＳＡおよびＰｆＣＳＰ遺伝子を含む。
【０１４０】
（実施例１０）
この実施例は、宿主免疫系による認識が減じることを示す改変されたヘキソンタンパク質を含むアデノウイルスベクターの調製を示す。
【０１４１】
アデノウイルスのヘキソンタンパク質の輸送は、例えばStemmer, supra、Cherry et al., supra、およびSchmidt-Dannertet al., supraに記載の方法を用いた例えばポリヌクレオチドシャッフリングまたは変異性ＰＣＲによって、ヘキソンにコードされる遺伝子にランダム突然変異が最初に生じることにより生産される。突然変異を起こしたヘキソン遺伝子は、Ｅ１欠損Ａｄ５アデノウイルスベクターのライブラリー中に組み込まれ、各Ａｄ５ベクターはＡｄ３５ファイバータンパク質および二重発現カセットを含む。該カセットは、Ｅ１領域に挿入された２つのマーカー遺伝子（例えば、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質）を発現する。ライブラリーベクターは適切な宿主細胞で増殖され、目的の見込みのあるヘキソン変異体をコードするベクターをヒト抗Ａｄ５中和抗体の存在する競合条件化で救出する。救出されたベクターは、抗Ａｄ５中和抗体の存在下で増殖、精製、またはのいずれかが行われ、ヘキソン変異体の配列が決定される。
【０１４２】
改変されたヘキソンタンパク質は、それから、インビボでヒト中和抗体を避ける能力を試験する。詳細には、前記変異体核酸配列によりコードされ、かつＰ．ヨエリ（P. yoelli）ＣＳＰタンパク質（Ａｄ（ｍｏｄ）−ＰｙＣＳＰ）をコードする改変ヘキソンタンパク質を含むアデノウイルスベクターが産生される。ＢＡＬＢ／ｃマウス（各グループｎ＝２０）は、Ａｄ（ｍｏｄ）−ＰｙＣＳＰまたは無改変ＰｙＣＳＰアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＰｙＣＳＰ）の１×１０８ｐｕ用量で、６週間の間隔をあけて２回または３回、免疫される。数グループでは、マウスは野生型アデノウイルス（血清型５）で、ワクチン接種の前に先在する抗Ａｄ５中和抗体を産生するために、前免疫される。前免疫付与および免疫付与後１４日の血清が集められる。３回目の免疫付与後１４日では、各グループ６匹のマウスがＴ細胞研究のために屠殺され、各グループ１４匹のマウスが防御効果の評価のためにチャレンジされた。寄生虫のチャレンジに対して防御したマウスは、アッセイされ、ワクチン誘導免疫応答および防御免疫の期間を評価するために促進後６ヵ月で再チャレンジされる。
【０１４３】
これらの実験の結果に基づいて、ヘキソン改変アデノウイルスの潜在能力がワクチン接種過程の間に産生された中和抗体により限定されないことを確認するために、アデノウイルスベクターの用量（例えば、１×１０１０ｐｕまで）は増加させ得る。代わりに、免疫付与の間隔は強力な抗原特異的免疫応答をより最適に産むために増加させ得る。しかし、別の選択肢において、プライミングのときに潜在する中和抗体のレベルが増加され得る。
【０１４４】
（実施例１１）
この実施例は、改変されたヘキソンタンパク質を含むアデノウイルスベクターの調製を示す。
【０１４５】
血清型５のアデノウイルスベクターは、ヘキソンタンパク質中にＡｄ５−Ａｄ２キメラループを含有して産生される。詳細には、２つのＥ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターが産生され、該ベクターの１つはルシフェラーゼ遺伝子をコードし、別のものはＰｙＣＳＰ抗原をコードする。Ａｄ５−Ａ２キメラヘキソンタンパク質はＡｄ５の超可変領域１〜６を含有するヘキソンＤＥ１ループ（すなわち、Ａｄ５ヘキソンアミノ酸１３２〜３１５）、およびＡｄ５の超可変領域７〜９を含有するＦＧループ（すなわち、Ａｄ５ヘキソンアミノ酸４２０〜４４９）に位置して産生される。該対応するループは血清型２アデノウイルス（すなわち、Ａｄ２ヘキソンアミノ酸１３２〜３２７、およびＡｄ２ヘキソンアミノ酸４３２〜４６５）に由来する。各ベクターは、高力価で成長し、明細書中に記載の方法に従ったインビボでの実験のために生産および精製された。
【０１４６】
同様のアプローチは、ヘキソンタンパク質におけるＡｄ５−Ａｄ４３キメラループを含む血清型５アデノウイルスベクターを生産するために使用された。これに関し、Ａｄ５−Ａｄ４３キメラヘキソンタンパク質は、ＦＧ１ループ（Ａｄ４３ヘキソンアミノ酸４１０〜４４０に対応）をＡｄ４３のＦＧ１ループ（Ａｄ４３ヘキソンアミノ酸４１０〜４４０に対応）に置換することによって産生された。さらに、Ａｄ５ＤＥ１ループ（Ａｄ５ヘキソンアミノ酸１２３〜３１６に対応）を、Ａｄ４３のＤＥ１ループ（Ａｄ４３ヘキソンアミノ酸１２３〜３０８に対応）に置換した。Ａｄ５−Ａｄ４３  ＤＥ１ループ交換を保有するアデノウイルスベクターは救出されなかった。これは、交換された配列のいくつかはＡｄ５ヘキソンの構造的特徴が必要であることを示唆する。ＤＥ１ループは、血清型を横断してより保存されている６つの超可変領域および介在配列からなる。介在配列は、２つのグループＣヘキソン（Ａｄ２とＡｄ５）の間で、Ａｄ５とグループＤのヘキソン（Ａｄ４３）との間よりも、より良く保存される。
【０１４７】
Ａｄ５ヘキソン（Ａｄ５中和抗体には感受性でないが、高度に構築されたアデノウイルスキャプシド中に保持されることができる）を生産させるために、Ａｄ５由来超可変領域間の介在配列を有するＡｄ５ヘキソン中に挿入されたＡｄ４３の超可変領域からなるキメラのＤＥ１ループが合成された。Ａｄ５超可変領域に生じた特定のアミノ酸置換は、表４に示す。
【０１４８】
【表４】
2009505680.tif 000006
【０１４９】
キメラで生産された特定のＡｄ５−Ａｄ４３ヘキソンループの１つの例は、Ａｄ４３由来の対応するＨＶＲからＨＶＲ１（Ａｄ５ヘキソンアミノ酸１３６−１６５）、ＨＶＲ２（Ａｄ５ヘキソンアミノ酸１８８−１９４）、ＨＶＲ３（Ａｄ５ヘキソンアミノ酸２１２−２２０）、ＨＶＲ４（Ａｄ５ヘキソンアミノ酸２５２−２６０）、ＨＶＲ５（Ａｄ５ヘキソンアミノ酸２６８−２８１）、およびＨＶＲ６（Ａｄ５ヘキソンアミノ酸３０３−３１０）への置換体を含む。
【０１５０】
この実施例は、Ａｄ５ベクターに対する先在する宿主免疫を避けるように設計されたキメラヘキソンタンパク質を含む血清型５アデノウイルスベクターの産生を示す。
【０１５１】
（実施例１２）
先在する宿主Ａｄ５中和抗体の潜在的な副作用を回避する、実施例１１で産生されたアデノウイルスベクターの能力を測定するために、これらのベクターを用いた主要なブースト免疫戦略は、マウスモデルで行われるだろう。
【０１５２】
実施例１１に記載のキメラヘキソンタンパク質を含むアデノウイルスベクターを中和するため、マウスにおいて産生されたＡｄ５、Ａｄ２およびＡｄ４３に対する中和抗体の能力が測定されるだろう。詳しくは、Ｂａｌｂ／ｃマウスの７つの異なるグループが以下のアデノウイルス構築物の１つの１×１０１０粒子ユニット（ｐｕ）を含有するプライミング免疫付与を受けることができるだろう：（１）Ａｄ３５ファイバータンパク質を含有するＥ１欠損Ａｄ５ベクター（Ａｄ５Ｅ１（Ｌ）Ｆ３５）、（２）Ｅ１／Ｅ４欠損Ａｄ５ベクター（ＡｄＥ１（Ｌ）１１Ｄ）、（３）野生型Ａｄ２、（４）野生型Ａｄ３４、（５）野生型Ａｄ４３、（６）野生型Ａｄ５、および（７）野生型Ａｄ３５。プライミング免疫付与２１日後、中和抗体解析のための血清を得るために全血液が採取されるだろう。２２日では、マウスは、実施例１１に記載のヘキソン改変アデノウイルスベクターの１つの１×１０１０ｐｕを含有するブースト免疫付与を受けるだろう。４３日（すなわち促進後２１日）で、中和抗体応答を測定するために、処理されたマウスから全血液が再度採取されるだろう。
【０１５３】
２つめの実験は、Ａｄ５中和抗体を回避する実施例１１のヘキソン改変アデノウイルスベクターの能力を測定するだろう。詳しくは、Ａｄ５中和抗体の存在するとき、または存在しないときに、試験した抗原ＰｆＣＳＰに対する応答により生み出されたＴ細胞と抗体応答が評価されるだろう。Ｂａｌｂ／ｃマウスは１２の処理グループに分けられる。免疫付与２１日前に、４つのグループのマウスが野生型Ａｄに曝露され、１つのグループが導入遺伝子を欠くＥ１／Ｅ４欠損Ａｄ５ベクター（ＡｄＮｕｌｌ）に曝露される。１８日後、Ａｄ５曝露マウスは、中和抗体レベルを測定するために採血される。次の日、全ての１２グループが、次のアデノウイルスベクター構築物の１つの１×１０８ｐｕ／ｍＬを含有する主要な免疫付与を投与される：（１）Ａｄ５−ＰｙＣＳＰ、すなわちＥ１領域に挿入されたＰｙＣＳＰ遺伝子を含むＥ１／Ｅ４欠損Ａｄ５ベクター、（２）Ａｄ５ＰｙＣＳＰ（Ｈ）２−２、すなわちＥ１領域とＡｄ２  ＤＥ１ループおよびＡｄ２  ＦＧ１ループを含むキメラヘキソンとを挿入したＰｙＣＳＰ遺伝子を含むＥ１欠損Ａｄ５ベクター、（３）Ａｄ３５−ＰｙＣＳＰ、すなわちＥ１領域に挿入されたＰｙＣＳＰ遺伝子を含むＥ１欠損Ａｄ３５ベクター、ならびに（４）Ａｄ３５ＰｙＣＳＰ．Ｆ（５Ｓ）、すなわちＡｄ３５−ＰｙＣＳＰ（Ａｄ３５ファイバータンパク質の場所にＡｄ５ファイバータンパク質を含むものを除く）と同様もの。ＡｄＮｕｌｌに曝露されたマウスは、ＡｄＮｕｌｌの用量で準備され、免疫されていない天然のマウスもまたコントロールとして供された。
【０１５４】
プライミング免疫付与の投与６週間後、各グループのマウスは、Ａｄ５−ＰｙＣＳＰ、Ａｄ５ＰｙＣＳＰ（Ｈ）２−２、Ａｄ３５−ＰｙＣＳＰ、またはＡｄ３５ＰｙＣＳＰ．Ｆ（５Ｓ）の１×１０８ｐｕ／ｍＬを含有するブースト免疫付与を受ける。詳細でプライミング／ブースト免疫付与は表５に示す。
【０１５５】
【表５】
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【０１５６】
促進免疫付与の投与２週間後、マウスは採血され、Ｔ細胞と抗体応答が本明細書に記載の方法を用いて測定されるだろう。
【０１５７】
本明細書中で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、本明細書中で参考として援用されることが個別におよび具体的に示され、かつその全体が記載されているのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【０１５８】
本発明を記載する文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本明細書中で他に特に明記がない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、他に特に明記がない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むが、限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の記載は、本明細書中で他に特に明記がない限り、その範囲内にある各々の別々の値を個々に言及する略記方法として働くことが単に意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのように本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に特に明記がない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される任意及び全ての例、又は例示的な言葉（例えば、「などの」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、そして他に特に主張されない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中の如何なる言葉も、本発明の実施に不可欠なものとして主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１５９】
本発明の実施に関して、本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書中に記載する。もちろん、それらの好適な実施態様のバリエーションは、上記の説明を読むと、当業者に明白となるであろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予想し、そして本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されたものとは別の状態で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変物及び均等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組合わせは、本明細書中で他に特に明記がない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、実施例４に示すプライムブーストレジメンに従ってマウスを免疫した２週間後に行ったＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔのアッセイの結果を示すグラフである。
【０１６１】
【図２】図２は、実施例４で示されたプライムブーストレジメンに従ってマウスを免疫した６週間後に行ったＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔアッセイの結果を示すグラフである。
【０１６２】
【図３】図３は、実施例４に示すプライムブーストレジメンに従ってマウスを免疫した後に行ったＰｆＡＭＡ１特異的ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。上のパネルは、初回免疫を受けなかったマウスに対応する。真ん中のパネルは、初回免疫としてＤＮＡ構築物および追加免疫としてアデノウイルスベクターの感作を受けたマウスに対応する。下のパネルは、初回免疫としてアデノウイルスベクターおよび追加免疫としてアデノウイルスベクターの感作を受けたマウスに対応する。
【０１６３】
【図４】図４は、実施例４に示すプライムブーストレジメンに従ってマウスを免疫した後に行ったＰｆＭＳＰ１４２特異的ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。上のパネルは、初回免疫付与を受けなかったマウスに対応する。真ん中のパネルは、初回免疫としてＤＮＡ構築物および追加免疫としてアデノウイルスベクターの感作を受けたマウスに対応する。下のパネルは、初回免疫としてアデノウイルスベクターおよび追加免疫としてアデノウイルスベクターの感作を受けたマウスに対応する。
【０１６４】
【図５】図５は、実施例７に示すレジメンに従ってマウスを免疫した後に行ったＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔアッセイの結果を示すグラフである。上のパネルは、ＬＳＡ１特異的Ｔ細胞応答を示し、一方、下のパネルはＣＳＰ特異的Ｔ細胞応答を示す。
【０１６５】
【図６】図６は、実施例７に示すレジメンに従ってマウスをした後に行ったＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。上のパネルは、１回用量の各アデノウイルスベクターを受けたマウスに対応する。下のパネルは、２回用量の各アデノウイルスベクターを受けたマウスに対応する。
【０１６６】
【図７】図７は、３つの異なるマーカー遺伝子（すなわち、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ））を発現する三価Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠失アデノウイルスベクター構築物の略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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