(57)【要約】  本発明は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から誘導した血小板の機能を安定に保持する方法の提供を目的とする。  以下の（ａ）〜（ｃ）を含む血小板を調製する方法。（ａ）ヒト由来のｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞である巨核球前駆細胞をフィーダー細胞上で、巨核球の分化誘導に適した条件で培養する工程、（ｂ）工程（ａ）の培養後の巨核球前駆細胞に存在するＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導する工程、（ｃ）工程（ｂ）のＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失誘導後の巨核球前駆細胞をさらに培養して、血小板を放出させる工程
2009119105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）を含む血小板を調製する方法。
（ａ）ヒト由来のｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞である巨核球前駆細胞をフィーダー細胞上で、巨核球の分化誘導に適した条件で培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）の培養後の巨核球前駆細胞に存在するＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失誘導後の巨核球前駆細胞をさらに培養して、血小板を放出させる工程
【請求項２】
前記工程（ａ）の培養をＧＰＩｂα陽性の多核細胞が出現するまで６〜１０日間行った後、前記工程（ｂ）の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞が、ヒト由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を培養して得られたネット様構造物から調製されたものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養をＧＰＩα陽性の多核細胞が出現するまで２０〜２３日間行った後、前記工程（ｂ）の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）の培養が、ＴＰＯ、ＳＣＦ及び／又はＨｅｐａｒｉｎの存在下で行われることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）を含む血小板を調製する方法。
（ａ）マウス由来のｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞である巨核球前駆細胞をフィーダー細胞上で、巨核球の分化誘導に適した条件で培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）の培養後の巨核球前駆細胞に存在するＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失誘導後の巨核球前駆細胞をさらに培養して、血小板を放出させる工程
【請求項７】
前記工程（ａ）の培養を、ＧＰＩｂα陽性の多核細胞が出現するまで１８〜２４時間行った後に、前記工程（ｂ）の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞が、マウス由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を培養して得られたｃ−Ｋｉｔ陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性細胞を経て誘導されたものである請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
マウス由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養をＧＰＩα陽性の多核細胞の出現するまで９〜１１日間行った後、前記工程（ｂ）の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする上記（８）に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ａ）の培養が、ＴＰＯ、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−１１の存在下で行われることを特徴とする請求項６乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、該ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子中に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、該ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の阻害剤の添加により達成されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤が、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３又はｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤からなるグループより選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記フィーダー細胞に存在するＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子中に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の阻害剤の添加により達成されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記阻害剤が、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３又はｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤からなるグループより選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９のいずれかの方法により調製された血小板。
【請求項２１】
請求項２０に記載の血小板を含む血小板製剤。
【請求項２２】
ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の活性阻害剤又はアンタゴニストを含むＧＰＩｂα＋ＧＰＶ＋ＧＰＶＩ＋血小板を調製するためのキット。
【請求項２３】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の活性阻害剤が、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３又はｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤からなるグループより選択される１又は複数である請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロにおける血小板の調製法に関する。より詳細には、本発明は、インビトロにおいて、インビボの機能を保持した血小板を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病に代表される血液関連疾患の治療に対し、治療に必要な量の血球細胞を安定に増幅し、供給することは極めて重要なことであるため、これまでにも多くの研究者によって、造血幹細胞又は造血前駆細胞の効率的な増幅が試みられてきた。血球細胞の中でも、巨核球は血小板前駆細胞（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）さらには血小板を産生せしめる細胞であり、治療的な応用において重要な位置を占めている。血球細胞のなかでも血小板は血液凝固（止血）において必須の細胞であるため、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおける、血小板の需要は極めて高い。これまでに、血小板は、ドナーからの献血により採取する方法の他、ＴＰＯを投与する方法、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球を分化させる方法などが試みられた。さらに、最近では、造血幹細胞又は造血前駆細胞を生体外において増幅させ、これらの前駆細胞から血小板を調製する方法なども試みられており、例えば、マウスＥＳ細胞から、自己複製可能で、リンパ球へも分化可能な造血幹細胞株を樹立する方法（特許文献１）、霊長類動物のＥＳ細胞を生体外で分化誘導した後、得られた細胞をヒツジの子宮内の胎仔に移植し出生したヒツジ胎仔から霊長類の造血系細胞を取得する方法（特許文献２）、あるいは、造血幹細胞の未分化性を維持したＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を生体外で簡便かつ安定的に増幅させる方法（特許文献３）などが報告されている。【０００３】
このように、血小板自体を細胞外において調製する方法に関しては、研究も進みつつあり、今後の発展がさらに期待されるところではあるが、このように調製された血小板の機能は安定性に乏しく、長期保存に耐えうる機能的血小板を大量に調製する方法がさらに必要とされてきた。現在のところ、生体から調製した血小板は、２０℃から２４℃において攪拌しながら保存する以外に有効な方法が存在せず、また、日本国においては、供給後４日すぎれば廃棄処分することが国の通達によって決められているため、この方法でも数日間しか保存することができない。また、血小板は、３７℃において２４時間以内にアポトーシスを起こすことも知られている（非特許文献２）。そのため、通常約３７℃において行われる培養系などを利用して血小板を調製するためには、培養温度下における血小板の機能維持が不可欠となる。
血小板と細胞外マトリックスとの結合は、血液凝固（止血、血栓形成など）が誘導される上で重要な過程である。この過程は、血小板受容体ＧＰＩｂが、αサブユニット（ＧＰＩｂα）を介してフォン・ウィルブランド因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＷＦ）と結合することよって、開始されると考えられているが、メタロプロテアーゼのＡＤＡＭ１７がＧＰＩαの細胞外領域を切断して除去してしまうことで、ＧＰＩｂαとＶＷＦとの会合が阻害され、血小板の血液凝固機能が失われてしまうことが報告されている（非特許文献１及び非特許文献２）。さらに、血小板受容体ＧＰＶＩとコラーゲンとの結合も血液凝固に重要とされているが、ＧＰＶＩはＡＤＡＭ１０によって切断されることでコラーゲンとの結合ができなくなり、この場合にも、血小板の血液凝固機能が失われてしまうと考えられている（非特許文献３）。【０００４】
これらの知見から、インビトロにおいて調製した血小板の機能を保持するためには、少なくともＡＤＡＭ１０及び／又はＡＤＡＭ１７の活性を抑制する必要があることが予想される。しかしながら、ＡＤＡＭ１０及び／又はＡＤＡＭ１７の活性を阻害した状態では、インビトロの培養系において血小板の産生を誘導し得ないことを間接的に示唆するような報告（非特許文献４、非特許文献５）や、ＡＤＡＭ１０を介したシグナルが巨核球の誘導をむしろ阻害するといった報告（非特許文献６）もあり、単純にＡＤＡＭ１０及び／又はＡＤＡＭ１７の機能を抑制するだけで、機能を安定に保持した血小板を取得できるわけではないと考えられる。
以上のように、機能的に安定した血小板をインビトロにおいて取得するための方法論が確立されてはいないのが現状である。【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１４１３５６号公報
【特許文献２】特開２００４−３５０６０１号公報
【特許文献３】特開２００６−  ６１１０６号公報
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ９５：６７７−６８３  ２００４．
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら，Ｂｌｏｏｄ  １０２：４２２９−４２３５  ２００３．
【非特許文献３】Ｇａｒｄｉｎｅｒら，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ５：１５３０−１５３７  ２００７
【非特許文献４】Ｍａｎｉｌａｙら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：６７３２−６７４１  ２００５
【非特許文献５】Ｃｒｕｚら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７９：５６１２−６５２０  ２００４
【非特許文献６】Ｉｓｈｉｋｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０：４９２９−４９３９  ２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、インビトロにおいて血小板を調製する上で、該血小板の血液凝固機能を長期間保持させるための調製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述のごとく、血小板の止血（血液凝固）機能を保持する上で、ＡＤＡＭ１０及び／又はＡＤＡＭ１７の活性を阻害する必要がある。一方で、血小板の誘導には、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の活性が必要であることから、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の活性を血小板の誘導過程のどの時点で抑制的調節を行うべきか明らかにする必要があった。そこで、本発明者らは、ＥＳ細胞から血小板を誘導する過程において、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７の活性を抑制すべきタイミングを詳細に検討し、本発明を完成させた。
また、本発明者らは、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７などのメタロプロテアーゼ活性を直接阻害する阻害剤以外にも、間接的にこれらのメタロプロテアーゼ活性の活性化を阻害するｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を添加することにより、血小板表面上のＧＰＩｂα、ＧＰＶ、ＧＰＶＩの切断除去を抑制し、血小板の止血（血液凝固）機能を保持することができることを見出した。【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２３）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「以下の（ａ）〜（ｃ）を含む血小板を調製する方法。
（ａ）ヒト由来のｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞である巨核球前駆細胞をフィーダー細胞上で、巨核球の分化誘導に適した条件で培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）の培養後の巨核球前駆細胞に存在するＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失誘導後の巨核球前駆細胞をさらに培養して、血小板を放出させる工程」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記工程（ａ）の培養をＧＰＩｂα陽性の多核細胞が出現するまで６〜１０日間行った後、前記工程（ｂ）の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記ｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞が、ヒト由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を培養して得られたネット様構造物から調製されたものである上記（１）又は（２）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「ヒト由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養をＧＰＩα陽性の多核細胞が出現するまで２０〜２３日間行った後、前記工程（ｂ）の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする上記（３）に記載の方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記工程（ａ）の培養が、ＴＰＯ、ＳＣＦ及び／又はＨｅｐａｒｉｎの存在下で行われることを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「以下の（ａ）〜（ｃ）を含む血小板を調製する方法。
（ａ）マウス由来のｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞である巨核球前駆細胞をフィーダー細胞上で、巨核球の分化誘導に適した条件で培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）の培養後の巨核球前駆細胞に存在するＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失誘導後の巨核球前駆細胞をさらに培養して、血小板を放出させる工程」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記工程（ａ）の培養をＧＰＩｂα陽性の多核細胞が出現するまで１８〜２４時間行った後、前記工程（ｂ）の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする上記（６）に記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記ｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞が、マウス由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を培養して得られたｃ−Ｋｉｔ陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性細胞を経て誘導されたものである上記（６）又は（７）に記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「マウス由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養をＧＰＩα陽性の多核細胞が出現するまで９〜１１日間行った後、前記工程（ｂ）の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする上記（８）に記載の方法」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「前記工程（ａ）の培養が、ＴＰＯ、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−１１の存在下で行われることを特徴とする上記（６）乃至（９）のいずれかに記載の方法」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、該ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子中に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の方法」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、該ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の方法」である。
（１３）本発明の第１３の態様は、「前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の阻害剤の添加により達成されることを特徴とする上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の方法」である。
（１４）本発明の第１４の態様は、「前記阻害剤が、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３又はｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤からなるグループより選択されることを特徴とする上記（１３）に記載の方法」である。
（１５）本発明の第１５の態様は、「前記フィーダー細胞に存在するＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする上記（１）乃至（１４）のいずれかに記載の方法」である。
（１６）本発明の第１６の態様は、「前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子中に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする上記（１５）に記載の方法」である。
（１７）本発明の第１７の態様は、「前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする上記（１５）に記載の方法」である。
（１８）本発明の第１８の態様は、「前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の阻害剤の添加により達成されることを特徴とする上記（１５）に記載の方法」である。
（１９）本発明の第１９の態様は、「前記阻害剤が、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３又はｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤からなるグループより選択されることを特徴とする上記（１８）に記載の方法」である。
（２０）本発明の第２０の態様は、「上記（１）乃至（１９）のいずれかの方法により調製された血小板」である。
（２１）本発明の第２１の態様は、「上記（２０）に記載の血小板を含む血小板製剤」である。
（２２）本発明の第２２の態様は、「ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の活性阻害剤又はアンタゴニストを含むＧＰＩｂα＋ＧＰＶ＋ＧＰＶＩ＋血小板を調製するためのキット」である。
（２３）本発明の第２３の態様は、「前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の活性阻害剤が、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３又はｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤からなるグループより選択される１又は複数である上記（２２）に記載のキット」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、インビトロの培養系において調製される血小板の機能を安定に維持することが可能となる。特に、２５℃〜３７℃程度の温度において行われる培養系において血小板を調製する場合、本発明の方法は、血小板の機能維持のために必要不可欠な効果を発揮する。【００１０】
本発明によれば、血小板を有効成分とする血液製剤の安定的な供給の実現が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＥＳ細胞からの培養６日目にＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の活性阻害剤を添加し、さらに培養した場合における、巨核球の成熟に対する影響を検討した。培養６日目の培養液に、ＤＭＳＯ（コントロール）、ＧＭ６００１を１０μＭ又は１００μＭ添加し、培養１０日目におけるＣＤ４１（αＩＩｂ）＋細胞の数を計測した。縦軸は、ＣＤ４１（αＩＩｂ）＋細胞数を示す。培養６日目の巨核球前駆細胞集団にＧＭ６００１を添加すると、巨核球の成熟を阻害することが明らかとなった。
【図２】ＧＭ６００１又はＴＡＰＩ−１により、血小板上のＧＰＩｂαが維持されることを示す結果である。ＧＭ６００１又はＴＡＰＩ−１は、マウスＥＳ細胞の培養後１０日目に添加した。結果は、４回の異なる実験の平均値±標準誤差で示した。（Ａ）マウスＥＳ細胞の培養後１０日目に、１％ＤＭＳＯ（ｖｅｈｉｃｌｅ）又は１％ＤＭＳＯに溶解させた１００μＭ  ＧＭ６００１を、各々、培養液に添加した。マウスＥＳ細胞の培養後１２日目における、フローサイトメトリーの結果を示す。ＥＳＣ−ＭＫｓは、成熟巨核球の結果を示し（ＧＭ６００１非添加）、ＥＳＰｓはＥＳ細胞由来の血小板（以下、ＥＳＰｓ）の結果を示す（ｖｅｈｉｃｌｅ：ＧＭ６００１非添加、ＧＭ−６００１：ＧＭ６００１添加）。（Ｂ）培養１２日後における、１プレート（６−ｗｅｌｌプレート）あたりのαＩＩｂ＋ＥＳＰｓの総数を示す。培養１０日目に阻害剤を添加した場合には、産生される血小板の総数に影響は与えなかった。（Ｃ）１μＭ若しくは１０μＭ  ＴＡＰＩ−１又は１００μＭ  ＧＭ６００１を培養１０日後に添加した場合、培養１２日後におけるαＩＩｂ＋ＥＳＰｓ中のＧＰＩｂα＋細胞の割合を示すグラフである。機能性の指標であるＧＰＩｂａ陽性の血小板はＧＭ６００１の添加により保持されていることが示された。（Ｄ）培養１２日後におけるαＩＩｂ＋ＥＳＰｓ中のＧＰＶ又はＧＰＶＩ表面発現細胞に対するＧＭ６００１の効果を示す。
【図３】ＧＭ６００１処理を行ったＥＳＰｓの血栓形成能が改善することを示す結果である。（Ａ）実験の流れを模式的に示した図である。（Ｂ）フローチャンバーへ試料を注入後６分後に観察した蛍光イメージを示す。タイプＩのコラーゲンでコートしたスライドグラス上に、ＥＳＰｓ（ＧＭ６００１を培養１０日後に添加（ＧＭ６００１）した試料と非添加の試料（ｖｅｈｉｃｌｅ））とマウスから得た全血とを混合した試料（ＥＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）、又はＰＥで標識した新鮮なマウス血小板とマウスから得た全血とを混合した試料（Ｍｏｕｓｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を注入し（１，５００ｓ−１）、観察を行った。（Ｃ）６分後の血栓形成をＮＩＨイメージソフトウェアにより定量化した（平均値±標準誤差）。なお、ＧＰＩｂαが切断されるように、採血後時間を経たマウス血小板（２４時間経過したマウス血小板では機能は５５％程に低下することを確認済みである）をコントロールに使用した場合は、ＥＳＰ／ＧＭ６００１処理群よりも止血血栓機能は低下してしまうことも確認している。
【図４】ＧＭ６００１処理を行ったＥＳＰｓの生体内における寿命が延長されることを示す結果である。（Ａ）実験の流れを模式的に示した図である。（Ｂ）放射線照射（実験１０日前、６５０ｃＧｙ照射）により血小板が減少したマウス（１２９Ｏｌａ系統）を使用し、３×１０６細胞数でＥＳＰｓを輸血した２時間後、眼窩静脈叢から採血した血液試料を３．８％  クエン酸ナトリウムで処理し、全αＩＩｂ＋血小板中におけるＧＦＰ＋血小板（ＥＳＰｓ）数を測定するためにフローサイトメトリーを行った。同様に、輸血後２４時間、４８時間及び７２時間の血液試料についても測定を行った。結果は３回の異なる実験結果の平均値±標準誤差として示した。
【図５】人為的な損傷を与えたヒト血小板の細胞伸展機能に対するＧＭ６００１の影響について検討した結果を示す。（Ａ）洗浄ヒト血小板（Ｆｒｅｓｈ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）と、ＧＭ６００１の存在下又は非存在において３７℃、２４時間インキュベートしたヒト血小板（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｇｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）のフローサイトメトリーの結果を示す。（Ｂ）洗浄ヒト血小板（Ｆｒｅｓｈ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）と、ＧＭ６００１の存在下（ＧＭ６００１）又は非存在下（ｖｅｈｉｃｌｅ）にて３７℃、２４時間インキュベートしたヒト血小板（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｇｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）による、細胞伸展機能を比較した結果を示す。（Ｃ）洗浄ヒト血小板（Ｆｒｅｓｈ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）と、ＧＭ６００１の存在下（ＧＭ６００１）又は非存在下（ｖｅｈｉｃｌｅ）にて３７℃、２４時間インキュベートしたヒト血小板により伸展した細胞の面積を、洗浄ヒト血小板を１００％として示した結果である。
【図６】マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（ＧＭ６００１）による、ヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞由来血小板表面上のＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）切断抑制効果を検討した。ｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４−Ｍ）及びＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３）の培養後２２日目、血小板回収２日前にＧＭ６００１を、最終濃度０μＭ、２０μＭ、５０μＭ（ＴｋＤｎ４−Ｍ）、あるいは、０μＭ、１００μＭ（ＫｈＥＳ−３）となるように添加し、血小板を回収して、フローサイトメーターで測定した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から血小板を調製する過程において、ＡＤＡＭ１０及び／又はＡＤＡＭ１７の活性を適切に調節して、血栓形成機能（又は血液凝固機能）などを安定に維持した血小板を提供するものである。なお、本明細書中においては、ＡＤＡＭ１０（又はＡＤＡＭ１７）の蛋白質及び遺伝子の両方を指す場合には、単に、ＡＤＡＭ１０（又はＡＤＡＭ１７）と記載し、特に、蛋白質を指す場合には、ＡＤＡＭ１０蛋白質（又はＡＤＡＭ１７蛋白質）、遺伝子を指す場合には、ＡＤＡＭ１０遺伝子（又はＡＤＡＭ１７遺伝子）と記載することとする。
マウスＥＳ細胞から、人工的な培養により血小板を誘導する場合、ｃ−Ｋｉｔ陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性細胞（「陽性」とは、細胞表面に存在することを意味し、「＋」と標記する場合もある。以下同様）からなる造血前駆細胞集団を誘導する必要があるが、この過程において、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７のいずれもが必須であることが示唆される。この点については、ｃ−Ｋｉｔ陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎαＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性細胞が出現する以前からＡＤＡＭ１０蛋白質及びＡＤＡＭ１７蛋白質の活性を阻害した場合には、ｃ−Ｋｉｔ陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性細胞が誘導されないとの発明者らの知見によっても裏付けられている（図１を参照のこと）。そのため、少なくとも、ｃ−Ｋｉｔ陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性細胞からなる造血前駆細胞集団を誘導するまでは、ＡＤＡＭ１０蛋白質及びＡＤＡＭ１７蛋白質のいずれの活性をも維持し、その後、血小板が誘導されるまでの特定の時期に、ＡＤＡＭ１０蛋白質及びＡＤＡＭ１７蛋白質の活性を抑制的に調節する必要がある。【００１３】
そこで、本発明の実施形態の１つは、マウス由来ｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞（以下、ｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα±細胞とも記載する）又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞（以下、ｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα−細胞とも記載する）をある一定期間培養したのち、ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の活性の抑制的な調節を開始し、さらなる培養により、血小板の放出を促進するものである。
なお、「陽性」とは、細胞表面マーカー（例えば、ｃ−Ｋｉｔ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）、ＧＰＩαなど）が細胞表面上に発現し、当該発現が抗体等により確認できる状態のことであり（前出と同義）、「弱陽性」とは、細胞表面マーカーの発現を抗体等により確認することはできるが、発現量が少ない状態（例えば、フローサイトメーターなどで測定した場合、１ｌｏｇ以下の発現を示す非常に少ない発現状態）のことであり、「陰性」とは、細胞表面マーカーが細胞表面上に発現しておらず、当該発現が抗体等により確認できない状態のことである。【００１４】
ここで、「マウス由来ｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα±細胞」又は「マウス由来ｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα−細胞」は、マウス由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から分化させたｃ−Ｋｉｔ＋／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋細胞から、例えば、フィーダー細胞上、ＴＰＯ（例えば、１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは１０〜３０ｎｇ／ｍｌ程度）などの分化促進因子を添加して誘導することができる。マウス由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からｃ−Ｋｉｔ＋／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋細胞を誘導させるのに必要な培養期間は、培養の方法あるいは細胞種によって異なるが、例えば、６日程度（あるいは、５〜７日程度）である。また、マウス由来ｃ−Ｋｉｔ＋／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋細胞から、ｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα±細胞又はｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα−細胞を誘導するための培養期間は、特に限定はしないが、例えば、１日〜５日、好ましくは、２日〜３日程度（マウスのＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からの培養期間としては、８〜９日程度）である。ｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα±細胞又はｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα−細胞の特定は、細胞表面上にｃ−ｋｉｔが存在せず、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂが存在する細胞を、抗体等を使用した、例えば、セルソーターシステムを用いることにより行うことができる。
なお、ｃ−Ｋｉｔ＋／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋細胞の誘導も当業者の選択し得るいかなる方法でも良く、該細胞の特定も、上述の如く行うことができる。【００１５】
次に、マウス由来ｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα±細胞又はｃ−Ｋｉｔ−／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα−細胞から血小板を放出させるために、マウス由来の細胞の場合には、ＴＰＯ（１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度）、ＩＬ−６（１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度）、ＩＬ−１１（１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度）などを添加し、さらに培養を行う。この培養のある時期にＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の活性を抑制する必要があるが、抑制を開始する時期としては、例えば、マウス由来の細胞の場合、当該培養開始後、ＧＰＩα陽性の多核細胞の出現を確認した後、例えば、１８〜２４時間後程度（マウスのＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からは、培養１０日目程度（例えば、９〜１１日目程度）である。【００１６】
本発明の他の実施形態は、ヒト由来ｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞（以下、ｃ−Ｋｉｔ−／ＣＤ３４＋／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα±細胞とも記載する）又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞（以下、ｃ−Ｋｉｔ−／ＣＤ３４＋／αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋／ＧＰＩα−細胞とも記載する）をある一定期間培養したのち、ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の活性の抑制的な調節を開始し、さらなる培養により、血小板の放出を促進するものである。
なお、「陽性」とは、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３４、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）、ＧＰＩαなど）が細胞表面上に発現し、当該発現が抗体等により確認できる状態のことであり（前出と同義）、「弱陽性」とは、細胞表面マーカーの発現を抗体等により確認することはできるが、発現量が少ない状態（例えば、フローサイトメーターなどで測定した場合、１ｌｏｇ以下の発現を示す非常に少ない発現状態）のことであり、「陰性」とは、細胞表面マーカーが細胞表面上に発現しておらず、当該発現が抗体等により確認できない状態のことである。【００１７】
ここで、ヒト由来ｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞は、ヒト由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から調製されるネット様構造物（ＥＳ−ｓａｃ、後述）から調製することができる。
次に、ヒト由来ｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞から血小板を放出させるために、ＴＰＯ（１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度）、ＳＣＦ（１０〜２００ｎｇ程度）、Ｈｅｐａｒｉｎ（１０〜５０Ｕ／ｍｌ程度）などを添加し、さらに培養を行う。この培養のある時期にＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の活性を抑制する必要があるが、抑制を開始する時期としては、例えば、ＧＰＩα陽性の多核細胞の出現を確認した後、例えば、ｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞の培養開始時から、６〜１０日間の培養後、好ましくは、７〜９日間の培養後、あるいは、ヒト由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からの培養後２２目程度（例えば、２０〜２３日目程度）である。【００１８】
本発明の方法は、いかなる動物種の血小板を調製する場合にも適用することができ、限定はしないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどに由来する細胞などであっても、使用可能であり、好ましくは、マウス、ラット、ヒト由来の細胞であり、より好ましくはマウス又はヒト由来の細胞であり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞である
また、本発明の血小板を誘導するため出発細胞は、「ＥＳ細胞」の他、「ｉＰＳ細胞」なども使用することができる。「ＥＳ細胞」又は「ｉＰＳ細胞」のソースとしては如何なる動物であってもよいが、限定はしないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどに由来する細胞であっても、使用可能であり、好ましくは、マウス、ラット、ヒト由来の細胞であり、より好ましくはマウス又はヒト由来の細胞であり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞である。【００１９】
インビトロ培養系において血小板を誘導する場合、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞、あるいは、これらの細胞から血小板に分化する途中の分化段階の細胞を培養する際（特に、成熟巨核球を誘導する過程において）、フィーダー細胞と共培養することが好ましい。ここで使用する「フィーダー細胞」としては、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の分化誘導に寄与するものであればいかなる細胞も使用可能であるが、例えば、マウス胚線維芽細胞、好ましくは、１０Ｔ１／２細胞株、ＯＰ９細胞などを用いることができる。あるいは、不死化した株化細胞以外でも、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ヒト骨髄から直接調製し培養して得た細胞）をフィーダー細胞とした場合においても、ヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からの巨核球成熟、血小板産生が可能である。加えて、マトリゲルなどの細胞外基質上で培養した場合にも効率は下がるが、血小板を誘導可能である。
「フィーダー細胞」を用いる際には、放射線を照射するなどして、細胞の増殖を抑止しておくのがよい。【００２０】
インビトロ培養系における血小板の誘導方法としては、当業者により容易に選択し得る如何なる方法であってもよく、例えば、血小板に至る途中の段階で、胚様体（分化誘導した中胚葉系未分化細胞を含む細胞集団）を形成させる方法（Ｅｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２；９９：１２８１９−１２８２４など）、造血前駆細胞を内包するネット様構造物（ＥＳ−ｓａｃ）を形成させる方法などを利用することができる（その他、Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，Ｂｌｏｏｄ  ２００３  １０２；４０４４−４０５１：Ｈｉｒｏｙａｍａら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２００６  ３４；７６０−７６９：Ｇａｕｒら，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２００５  ４；４３６−４４２などを参照のこと）。これらの方法により血小板を誘導する過程において、上記マウス由来ｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞、あるいは、ヒト由来ｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞などが出現するため、適宜、これらを取得し、本発明の方法に使用することができる。
以下に、ネット様構造物（ＥＳ−ｓａｃ）を形成させる方法について概説する。
ヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から誘導する血小板産生の場合、ＥＳ−ｓａｃから誘導する巨核球は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養から１４日〜１６日目頃にＴＰＯ／ＳＣＦ／Ｈｅｐａｒｉｎを添加した培養条件にまき直し、培養を維持する。
その後、ヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の場合には、培養開始後２０日〜２３日目（ＥＳ−ｓａｃのまき直しから６日〜１０目目）にＧＭ６００１など、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７活性の阻害剤を添加し、２４日から２６日目で最大になる血小板産生においてＧＰＩｂαやＧＰＶ、ＧＰＶＩの切断を防ぐことが可能となる。【００２１】
ネット様構造物を調製するために適した培養条件は、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭを用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、ネット様構造物を効率的に形成させるために、ＶＥＧＦを０〜１００ｎｇ／ｍｌ、０〜３００ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ程度加えるのがよい。培養の環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、例えば、５％  ＣＯ２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、フィーダー細胞上に播いてから、１４〜１６日後くらいにその存在を確認することができる。
形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、造血前駆細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する造血前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。この造血前駆細胞を更に培養し、ｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα弱陽性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩα陰性細胞、さらには血小板を調製することができる。【００２２】
本発明の実施形態において、ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導する必要がある。
ここで、ＡＤＡＭ１０遺伝子は、ショウジョウバエの神経発生に重要な遺伝子として同定されたものである。その遺伝子産物であるＡＤＡＭ１０蛋白質は構造上ディスインテグリンドメインを有し、また、メタロプロテアーゼ活性を有する膜蛋白であり、様々な膜蛋白の細胞外ドメインの切断を介して細胞分化に関わると考えられている。
ＡＤＡＭ１０蛋白質をアミノ酸の１次配列上の特徴から定義すると、限定はしないが、例えば、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなる蛋白質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列からなる蛋白質」とは、配列番号２又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメタロプロテアーゼ活性を有する蛋白質のことである。あるいは、配列番号２又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる蛋白質としては、配列番号２又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつメタロプロテアーゼ活性を有する蛋白質のことである。【００２３】
一方、ＡＤＡＭ１７（又はＴＡＣＥとも称される）蛋白質は、細胞分化や細胞死に関わるＴＮＦ−αを切断する膜蛋白として同定された。ＡＤＡＭ１７蛋白質は構造上ディスインテグリンドメインを有し、また、メタロプロテアーゼ活性を持つ。
ＡＤＡＭ１７蛋白質をアミノ酸の１次配列上の特徴から定義すると、限定はしないが、例えば、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなる蛋白質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列からなる蛋白質」とは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメタロプロテアーゼ活性を有する蛋白質のことである。あるいは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる蛋白質としては、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつメタロプロテアーゼ活性を有する蛋白質のことである。【００２４】
本発明において、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７の機能喪失又は機能低下を誘導する方法として、これの遺伝子に突然変異（置換、挿入又は欠失、あるいは、改変又は修飾）を導入することで該遺伝子産物の生産を阻害する方法、該遺伝子産物である蛋白質の活性（例えば、メタロプロテアーゼ活性）を直接阻害する方法を挙げることができる。遺伝子に突然変異（置換、挿入又は欠失、あるいは、改変又は修飾）を導入する方法としては、適切な遺伝子ターゲティングベクターを利用してＡＤＡＭ１０遺伝子、ＡＤＡＭ１７遺伝子の全体を相同組換えにより破壊する方法、Ｃｒｅ−ｌｏＸシステムなどを利用して、該遺伝子産物の活性に重要な領域に変異を導入する方法、アンチセンスヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどを導入し、ＡＤＡＭ１０遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子の転写を抑制する方法（例えば、レンチウィルスベクターを利用したＲＮＡｉ法など）などを挙げることができる。
さらに、ＲＮＡｉ法によるＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７の機能喪失又は機能低下する場合に、所望のタイミングにおいてｓｉＲＮＡによるＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７遺伝子発現阻害を誘導する方法も好適に実施することができる。例えば、薬剤や栄養因子等に応答して機能する誘導的プロモーターを連結したｓｉＲＮＡ発現遺伝子をＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に発現可能に導入し、所望のタイミングにおいて、プロモーターを活性化することで、適切な時期にＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７遺伝子発現を抑制することができる。【００２５】
一方、ＡＤＡＭ１０蛋白質又はＡＤＡＭ１７蛋白質の活性（機能）を直接又は間接的に阻害する方法としては、該遺伝子産物のメタロプロテアーゼ活性に対する阻害剤を使用する方法の他、ＡＤＡＭ１０蛋白質又はＡＤＡＭ１７蛋白質の活性を阻害するアンタゴニストを使用する方法などが考えられる。メタロプロテアーゼ活性に対する阻害剤としては、限定はしないが、例えば、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３などを使用することができる。さらに、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７などのメタロプロテアーゼ活性を直接阻害する阻害剤以外にも、間接的にこれらの活性化を阻害する阻害剤の利用も可能である。例えば、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７の活性を制御することが知られている、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ(Bandyopadhyayら, J Neurosci Res. 2006 84:106-118等参照のこと)などの活性を阻害することにより、本発明の目的を達成することができる。ここで、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤としては、例えば、製品番号ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０（Calbiochem社）などが使用可能であるが、これらに限定されることなく、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのキナーゼ活性を阻害するものであればいずれの化合物も使用可能である。その他、３８ＭＡＰキナーゼのように、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７の活性化経路において機能する因子の活性阻害によっても、本発明の目的を達成され得る。
これらの阻害剤は、単独又は組み合わせて使用することができる。阻害剤の至適濃度は、用いる阻害剤及び培養条件によっても異なるが、当業者であれば、予備的実験により至適濃度を容易に決定することができ、例えば、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２又はＴＡＰＩ−３であれば、５０〜２００μＭ程度、好ましくは、１００μＭ程度、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤であれば、例えば、１〜１００μＭ程度、好ましくは、１〜５０μＭ程度、より好ましくは５〜２０μＭ程度である。
また、アンタゴニストとしては、ＡＤＡＭ１０蛋白質又はＡＤＡＭ１７蛋白質の活性を阻害する物質であれば如何なるものも使用可能であり、限定はしないが、例えば、ＡＤＡＭ１０蛋白質又はＡＤＡＭ１７蛋白質各々に特異的に結合しその活性を阻害するアプタマー分子、又は抗体などを挙げることができる。
ここに記載した、ＡＤＡＭ１０遺伝子やＡＤＡＭ１７遺伝子に突然変異（置換、挿入又は欠失、あるいは、改変又は修飾）を導入する方法や、ＡＤＡＭ１０蛋白質やＡＤＡＭ１７蛋白質のメタロプロテアーゼ活性を阻害するためのアプタマー分子若しくは抗体の調製方法は、ここで記載した方法に限定されるものではなく、当該技術分野において周知の方法から当業者が任意に選択した方法により容易に実施することができる。【００２６】
さらに、本発明の実施形態には、ＧＰＩｂα＋ＧＰＶ＋ＧＰＶＩ＋血小板を調製するためのキットが含まれる。当該キットは、ＡＤＡＭ１０タンパク質及び／又はＡＤＡＭ１７タンパク質のプロテアーゼ活性を直接阻害する阻害剤（例えば、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２又はＴＡＰＩ−３）、該プロテアーゼの活性を間接的に阻害する阻害剤（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤）、該プロテアーゼ活性を阻害するアンタゴニスト（活性を阻害するアプタマー分子、抗体など）などを含む他、阻害剤の希釈溶液、抗生物質、細胞の洗浄試薬等を適宜含むことができる。本キットに含まれる阻害剤等は、溶液状態でも粉末状態であってもよく、キット中に含まれる試薬等は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。
また、キットには使用説明書も添付される。キットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。【００２７】
さらに本発明には、本発明の方法によって調製した血小板を含む血液製剤（血小板製剤）が含まれる。血小板を含む血液製剤の製剤化は、当業者によって容易に行うことができる。例えば、血小板の機能を保持するために必要な溶液中（例えば、ＡＣＤ−Ａ液（クエン酸ナトリウム／クエン酸／ブドウ糖から調製される）など、場合によっては、ｆｒｅｓｈ  ｆｒｏｚｅｎ  ｐｌａｓｍａ（献血で得られた全血から調製）などを適宜添加する）に、適当な濃度（例えば、１×１０８〜１×１０１０程度、好ましくは、１×１０９程度）で懸濁し製剤化することができる。なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けるのが好ましい。【００２８】
以下に示す実施例は、本発明の実施形態の１つを示すに過ぎず、本発明が以下の実施例に限定されることを意図するものではない。
【実施例】
【００２９】
１．マウスＥＳ細胞からの血小板の調製
１−１．マウスＥＳ細胞の維持
フィーダー細胞非依存性ＥＳ細胞株、Ｅ１４ＴＧ２Ａ株の他、対照として、その変異株であるＥＢ３株、フィーダー細胞依存性のマウスＥＳ細胞株であるＥ１４．１株・Ｒ１株・ＴＴ２株を使用した。
フィーダー細胞非依存性のＥＳ細胞は１０％  ＦＢＳ（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、米国）、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）、０．１１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ）、１ｍＭ  ピルビン酸（ＧＩＢＣＯ）、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いて培養した。培地は１日おきに交換し、２日おきに継代した。継代に際してはＰＢＳで２回洗浄後、０．２５％  トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収した後に、０．１％  ゼラチンで１０分間コーティングした新しい細胞培養プレート上に１ｍＬあたり１×１０４個の細胞濃度で播種した。
１−２．マウスストロマ細胞株ＯＰ９細胞の培養
ＯＰ９細胞は１５％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加した、α−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）で継代培養した。培地は一日ごとに交換し、細胞の形質を変化させない為に、初代培養から継代培養数３０回以内の細胞を実験に用いた。
１−３．胚様体形成（培養第１日目〜６日目）
継代培養しているマウスＥＳ細胞を０．２５％  トリプシン−ＥＤＴＡで処理し、１５％  ＦＢＳ、３００μｇ／ｍＬ  ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、４．５ｍＭ  モノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）を用いてペトリ皿（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）で培養した。１０ｃｍペトリ皿に１０ｍＬの培養液に対して２×１０５個の細胞数で培養を開始し、胚様体形成を試みる。培養４日目に培養液を新鮮なものと交換した。培養６日目産生された胚様体は０．２５％  トリプシンで処理した後、抗ＣＤ４１抗体及び抗ｃ−Ｋｉｔ抗体と反応させてソーティングした後、ＯＰ９細胞との共培養を行なった（巨核球前駆細胞集団は、ｃ−Ｋｉｔ＋αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋細胞集団に濃縮される）。【００３０】
１−４．ＯＰ９共培養法（培養第６日目以降）
ＯＰ−９細胞は、培養６日以前に準備し６−ｗｅｌｌプレートにおいて、当日（ＥＳ細胞分化開始６日目）ほぼ９０−１００％のコンフルエントな状態に調製しておく。分化用培地（１５％  ＦＢＳ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＰＯ（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）を添加したαＭＥＭ）２ｍＬに対して、胚様体から調製した−Ｋｉｔ＋αＩＩｂ（ＣＤ４１）＋細胞集団、２×１０４個を加え、培養を継続した。培養９日目に巨核球の成熟を促す為に、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＰＯ、５ｎｇ／ｍｌ  ヒトＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、１０  ｎｇ／ｍｌ  ヒトＩＬ−１１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）を添加した。
以下に示すように、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７の活性阻害（阻害剤の添加、あるいは、ＡＤＡＭ１０及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子の機能低下若しくは喪失）は、培養１０日目に実施した。培養１２日目以降に、連続的に血小板が産生された。【００３１】
２．マウスＥＳ細胞から誘導された血小板表面のＧＰＩｂα減少に対する、ＡＤＡＭ１７（及びＡＤＡＭ１０）のメタロプロテアーゼ活性の阻害効果の検討
ＡＤＡＭ１７蛋白質は、ヒト及びマウス血小板上のＧＰＩｂαの細胞外ドメインを切除し、血小板としての機能を消失させることが報告されている。そこで、ＡＤＡＭ１７（及びＡＤＡＭ１０）蛋白質のメタロプロテアーゼ活性の阻害剤であるＧＭ６００１又はＴＡＰＩ−１を、血小板を誘導する培養系に添加し、誘導される血小板の機能について検討した。
まず、胚様体を構成する細胞集団（ｃ−ｋｉｔ＋αＩＩｂ＋細胞集団）をＯＰ９ストロマ細胞と共培養するときに（マウスＥＳ細胞からの培養後６日目）、ＧＭ６００１を添加し、さらに培養を行ったところ、ＧＭ６００１を添加しないコントロール（ＤＭＳＯ）と比較して、ＣＤ４１＋（αＩＩｂ＋）細胞の数が顕著に減少していた（図１）。この結果は、ＧＭ６００１を培養の早い段階で添加すると、巨核球の成熟を阻害することになり、血小板の誘導効率も低減することを示すものである。従って、ＡＤＭ１０蛋白質及びＡＤＡＭ１７蛋白質の活性を阻害するタイミングを厳密に確定する必要がある。【００３２】
そこで、ＧＭ６００１又はＴＡＰＩ−１を添加するタイミングを適宜検討した結果、マウスＥＳ細胞からの培養後１０日目に、これらの阻害剤を添加することにした。
ＧＭ６００１又はＴＡＰＩ−１を、マウスＥＳ細胞からの培養後１０日目に血小板の培養系に添加すると、ＥＳ細胞から誘導された血小板（以下、ＥＳＰｓ：ＥＳＣ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ）上のＧＰＩｂαの存在量が増大する結果となった（図２Ａ、ＥＳＰｓのＶｅｈｉｃｌｅとＧＭ−６００１とを比較のこと、及び図２Ｃ）。この場合、αＩＩｂβ３を発現するＥＳＰｓの総数には、ＧＭ６００１又はＴＡＰＩ−１の有無による有意差は認められず（図２Ｂ）、ＧＭ６００１又はＴＡＰＩ−１の有無は、血小板産生そのものを促進あるいは阻害する事はないことが明らかとなった。また、巨核球表面上のＧＰＩｂαの存在量に対する、ＧＭ６００１の影響は見られなかった（図２Ａ、ＥＳＣ−ＭＫｓ）。同様に、ＡＤＡＭ１７蛋白質による制御が予想されるＧＰＶ、さらに、ＡＤＡＭ１０蛋白質によって切断されることが報告されているＧＰＶＩについても、ＧＭ６００１の培養系への添加により、αＩＩｂ＋ＥＳＰｓ上における発現回復が観察された（図２Ｄ）。
以上のことから、培養１０日目にＧＭ６００１又はＴＡＰＩ−１を添加してＡＤＡＭ１７蛋白質及びＡＤＡＭ１０蛋白質の活性を阻害することにより、血小板の血栓形成（血液凝固）作用に重要な役割を担っているＧＰＩｂα、ＧＰＶ及びＧＰＶＩの血小板表面上における発現が維持されることが明らかとなった。
なお、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（製品番号ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、Calbiochem社）を使用した場合（５〜２０μＭ）にも、同様の結果が得られることを確認した（データは示さず）。【００３３】
３．ＥＳＰｓの機能（止血・血栓形成機能）に対する、ＡＤＡＭ１７（及びＡＤＡＭ１０）のメタロプロテアーゼ活性の阻害効果の検討
次に、止血・血栓形成の経過を観察することができるフローチャンバーを使用して、ＥＳＰｓの止血・血栓形成効果に対するＧＭ６００１の影響を検討した。フローチャンバーは、２色の蛍光による血栓形成の経時変化を落射蛍光顕微鏡により観察し、血小板による止血・血栓形成能を定量することができる装置である。具体的には、赤色標識したＥＳＰｓと緑色標識したマウス全血の混合物によって生じる血小板凝集物中のＥＳＰｓ（赤色蛍光を発するので定量可能である）の数を定量することで、ＥＳＰｓの止血・血栓形成能を調べることができる。
ＣＡＧプロモーターのコントロール下においてＤｓＲｅｄ（赤色蛍光標識）を発現するＥＳ細胞からは（ＥＳ細胞は、理化学研究所（神戸）、丹羽  仁史博士から供与を受けた）、赤色蛍光を発するＥＳＰｓを調製することができる（図３Ａ）。調製したＥＳＰｓは、メパクリン（緑色蛍光標識）で血小板を標識したマウス全血と、１：１０００の割合で混合した。このように調製した血液を一定の速度（例えば、１，５００ｓ−１）で、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐｒａｔｕｓ）によりチャンバー内へ注入した。コラーゲン表面上での血小板による血栓形成の過程は、ビデオシステムを備えた倒立落射蛍光顕微鏡（ＤＭＩＲＢ，Ｌｅｉｃａ）によって可視化した。なお、コントロールとして、１０−１２週齢のマウスから調製した洗浄血小板（４μｇ／ｍｌのＰＥ標識抗αＩＩｂ抗体で赤く染色した）を使用した。
観察の結果、１％  ＤＭＳＯで前処理したＥＳＰｓ（ｖｅｈｉｃｌｅ）は、コラーゲン−ＶＷＦマトリックスと接着することができなかったが、ＧＭ６００１で前処理すると接着能力が改善した（図３Ｂ及び３Ｃ、ｖｅｈｉｃｌｅとＧＭ６００１を比較）。
このように、ＥＳ細胞からの培養１０日後にＧＭ６００１で処理を行ったＥＳＰｓにおいては、血小板表面上に存在するＧＰＩｂα、ＧＰＶ、ＧＰＶＩの切断除去が阻止され、血栓形成に寄与し得るＥＳＰｓの量が有意に上昇することが明らかとなった。【００３４】
４．ＥＳＰｓの生体内寿命に対する、ＡＤＡＭ１７（及びＡＤＡＭ１０）のメタロプロテアーゼ活性の阻害効果の検討
ＥＳＰｓの生体内における寿命について検討を行った。
ＣＡＧプロモーターのコントロール下においてＧＦＰ（緑色蛍光標識）を発現するＥＳ細胞からは（ＥＳ細胞は、理化学研究所（神戸）、丹羽  仁史博士から供与を受けた）、緑色蛍光を発するＥＳＰｓを調製することができる（図４Ａ）。培養１０日後にＧＭ６００１添加又は非添加条件で調製した緑色蛍光ＥＳＰｓ（３×１０６細胞数）を、培養１２日後に、放射線照射（実験１０日前、６５０ｃＧｙ照射）により血小板が減少したマウス（１２９Ｏｌａ系統；使用したマウスＥＳ細胞が樹立された同系統マウス）に輸血した。ＧＦＰ発現ＥＳＰｓを経時的（輸血後、２時間、２４時間、４８時間、７２時間）に検出するために、血液試料を眼窩静脈叢からマイクロキャピラリーで採血し、ＡＰＣ結合抗αＩＩｂ抗体で染色した。ＧＦＰ＋ＥＳＰｓの割合は、フローサイトメトリーで測定した。ＧＭ６００１で処理したＥＳＰｓの寿命は無処理のものに比べて、明らかに延長されており（図４Ｂ）、通常のマウス末梢血から調製した血小板の寿命に匹敵するものであった。【００３５】
５．ヒト末梢血由来のヒト血小板に対する、ＡＤＡＭ１７（及びＡＤＡＭ１０）のメタロプロテアーゼ活性の阻害効果の検討
次に、ヒトから採取した血小板を、ＧＰＩｂαが人為的に切断される条件（３７℃で２４時間インキュベーション）で処理する場合にも、ＥＳＰｓの場合と同様にＧＭ６００１の効果が見られるか検討した。ヒト血小板を３７℃で２４時間インキュベートすると細胞表面に存在するＧＰＩｂαの量が減少するのに対し（図５Ａ、ｖｅｈｉｃｌｅ：ＤＭＳＯ添加）、１００μＭのＧＭ６００１存在下で同じ処理をした場合には（図５Ａ、ＧＭ６００１：ＧＭ６００１添加）、無処理のヒト血小板（図５Ａ、Ｆｒｅｓｈ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）とほぼ同じ量のＧＰＩｂαの存在が確認できた。さらに、最終的な血栓形成に必須の役割を果たしているインテグリンαＩＩｂβ３の機能が保持されるかどうかについても検討を行った。インテグリンαＩＩｂβ３は、リガンドであるフィブリノーゲンと結合すると血小板凝集を引き起こすが、この凝集状態が維持されると、インテグリンαＩＩｂβ３により細胞内部へシグナルが伝達され、細胞の形状が変化し細胞伸展が誘導されることが知られている。
１Ｕ／ｍｌ  トロンビンの存在下、フィブリノーゲンでコートしたカバーグラス上に、１％  ＤＭＳＯ処理又は１００μＭ  ＧＭ６００１処理を行ったヒト血小板を添加した。全てのサンプルは、Ａｌｅｘａ−４８８ファロイジン（Ｆ−アクチンマーカー）とＡｌｅｘａ−５６７結合抗αＩＩｂ抗体で染色した。
観察の結果、ＧＭ６００１で処理したヒト血小板の場合には、無処理のヒト血小板と同様に、伸展した細胞形状が観察され（図５Ｂ、ＧＭ６００１）、細胞が伸展した面積を定量したところ、ＧＭ６００１で処理したヒト血小板においては、無処理の場合の細胞伸展面積の一部が回復していることが明らかとなった（図５Ｃ）。
以上のことから、ＧＭ６００１によりＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の活性を阻害すると、３７℃において障害を与えた人体から調製した血小板に対しても、その血小板凝集に必須の機能を維持する効果を示すことが明らかとなった。【００３６】
６．ヒトＥＳ細胞及びヒト由来血小板表面のＧＰＩｂα切断抑制の効果
６−１．ヒトＥＳ細胞
ＫｈＥＳ細胞株（ＫｈＥＳ−３；ｐａｓｓａｇｅ２０−４０、京都大学再医科学研究所  所長  中辻憲夫博士より御供与頂いた）を用いて、血小板の誘導を行った（詳細については、ＷＯ２００８／０４１３７０等を参照のこと）。また、フィーダー細胞は、マウス胎児由来細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株およびＯＰ９細胞株をつくば理研ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  ｃｅｎｔｅｒより購入して使用した。分化実験を行う前日に、０．１％  ゼラチンコート化ディッシュに１０Ｔ１／２細胞を６×１０５／１０ｃｍ  ディッシュの密度となるように播き、分化実験の当日に、１０Ｔ１／２細胞の増殖を止めるため５０Ｇｙの放射線照射を行い、フィーダー細胞として用いた。また、ＯＰ９細胞株をフィーダー細胞として使用する場合には、分化実験の前日に５０Ｇｙの放射線照射を行い、播き直しを行った後に使用した。【００３７】
ＫｈＥＳ細胞は、０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて解離し、Ｐ−１０００ピペットを用いて小さいコロニーに砕き、１５％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４５ｍＭ  ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＩＭＤＭ（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）中、１０Ｔ１／２細胞上に播いた。
その後、培養１４−１５日前後に内部に血球様細胞を含んだネット様構造物を回収し、７０μｍ  セルストレイナーを用いて、血球細胞とネット様構造物を分離した。新たに、６ウェルプレートに用意した放射線照射済みの１０Ｔ１／２細胞（６×１０５／６ウェルプレート１枚）上に血球細胞を２〜３×１０４／ウェルで播き、１５％  ＦＢＳ（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、米国）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４５ｍＭ  ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ及び２５Ｕ／ｍｌ  Ｈｅｐａｒｉｎを添加したＩＭＤＭ（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）中でさらに培養し、巨核球／血小板を誘導した。【００３８】
６−２．ヒトｉＰＳ細胞
ＴｋＤＮ４−Ｍ（皮膚細胞にＯｃｔ４，Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２を導入したもの；東京大学樹立）を使用した。また、フィーダー細胞は、マウス胎児由来細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株およびＯＰ９細胞株はつくば理研ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  ｃｅｎｔｅｒから購入して使用した。分化実験を行う前日に、０．１％  ゼラチンコート化ディッシュに１０Ｔ１／２細胞を６×１０５／１０ｃｍ  ディッシュの密度となるように播き、分化実験の当日に、１０Ｔ１／２細胞の増殖を止めるため５０Ｇｙの放射線照射を行い、フィーダー細胞として用いた。また、ＯＰ９細胞株をフィーダー細胞として使用する場合には、分化実験の前日に５０Ｇｙの放射線照射を行い、播き直しを行った後に使用した。【００３９】
ヒトｉＰＳ細胞は、１５％  ＦＢＳ（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、米国）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ  ヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４５ｍＭ  ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＩＭＤＭ（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）中、ＯＰ９細胞又は１０Ｔ１／２細胞上に播いて培養した。  培養後、１４〜１７日前後に内部に血球様細胞を含んだネット様構造物が多数確認された。【００４０】
次に、Ｐ−１０００  ピペットを用いて、位相差顕微鏡下でネット様構造物をピックアップし、７０μｍ  セルストレイナーを用いて、血球細胞とネット様構造物を分離した。新たに、６ウェルプレートに用意した放射線照射済みの１０Ｔ１／２細胞（６×１０５／６ウェルプレート１枚）上に血球細胞を２〜３×１０４／ウェルで播き、１５％  ＦＢＳ（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、米国）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４５ｍＭ  ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ及び２５Ｕ／ｍｌ  Ｈｅｐａｒｉｎを添加したＩＭＤＭ（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）中でさらに培養し、巨核球／血小板を誘導した。【００４１】
６−３．ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７タンパク質活性阻害剤の効果
次に、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（ＧＭ６００１）による、血小板表面上のＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）の切断抑制効果について検討した。ヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞の培養後２２日目（２０〜２３日程度）（血小板回収の２日前）に、ＧＰＩｂα陽性の多核細胞の出現を確認した後、ＧＭ６００１（１００μＭ）を加えて培養した。その結果、ヒトｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４−Ｍ）及びヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３）由来のＧＰＩα＋血小板の比率が増大していることが確認され（図６、０μＭと５０μＭ又は１００μＭを比較のこと）、血小板表面上の機能分子の一つであるＧＰＩｂαの切断が抑制されることが明らかとなった。これらのＧＰＩｂα＋血小板では、ＧＰＩｂαが切断された血小板に比し、血小板凝集に必須の機能が良好であることを確認している（データは示さず）。
また、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（製品番号ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、Calbiochem社）を使用した場合（５〜２０μＭ）にも、同様の結果が得られることを確認した（データは示さず）。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、ＥＳ細胞などからインビトロで長期間に亘って培養した結果誘導する血小板の機能を安定化することが可能となるため、血小板の安定供給を可能ならしめ、治療上、有益な効果をもたらす。
【図１】
2009119105.tif 000003
【図２】
2009119105.tif 000004
【図３】
2009119105.tif 000005
【図４】
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【図５】
2009119105.tif 000007
【図６】
2009119105.tif 000008
【配列表】
2009119105000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月14日(2010.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）を含む血小板を調製する方法。
（ａ）ヒト由来のｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩｂα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩｂα弱陽性細胞である巨核球前駆細胞をフィーダー細胞上で、巨核球の分化誘導に適した条件で培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）の培養後の巨核球前駆細胞に存在するＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失誘導後の巨核球前駆細胞をさらに培養して、血小板を放出させる工程
【請求項２】
前記工程（ａ）の培養をＧＰＩｂα陽性の多核細胞が出現するまで６〜１０日間行った後、前記工程（ｂ）の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩｂα陰性細胞又はｃ−Ｋｉｔ陰性／ＣＤ３４陽性／ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ（ＣＤ４１）陽性／ＧＰＩｂα弱陽性細胞が、ヒト由来ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を培養して得られたネット様構造物から調製されたものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）の培養が、ＴＰＯ、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−１１の存在下で行われることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、該ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子中に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、該ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の阻害剤の添加により達成されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記阻害剤が、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３又はｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤からなるグループより選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記フィーダー細胞に存在するＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失を誘導することを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子中に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０遺伝子及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の機能低下又は機能喪失が、ＡＤＡＭ１０蛋白質及び／又はＡＤＡＭ１７蛋白質の阻害剤の添加により達成されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記阻害剤が、ＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３又はｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤からなるグループより選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞から誘導し、製造されたＧＰＩｂα陽性血小板組成物であって、血小板回収時点において、９１％以上の血小板がＧＰＩｂαを保持している、血小板組成物。
【請求項１５】
ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞から誘導し、製造されたＧＰＩｂα陽性血小板であって、３７℃下においてもＧＰＩｂαの切断が抑制されている、ＧＰＩｂα陽性血小板。
【国際調査報告】
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