(57)【要約】本発明は、非感染性パラミクソウイルスワクチンを作製および使用する方法を開示する。ウイルス様粒子(VLP)内のパラミクソウイルス構造タンパク質は、そのようなワクチンの一例を含む。基質タンパク質の存在のみが、効率的なVLP放出を提供するのに必要かつ十分であることが見出される。しかし、4つのパラミクソウイルス構造タンパク質の同時発現によって、感染性粒子と同様の密度および放出効率での非感染性VLPの放出が起こる。VLPワクチンが有用であると考えられる代表的な疾患には、これらに限定されないが、ニューカッスル病、麻疹、呼吸器合胞体ウイルス感染症、およびパラインフルエンザ3型ウイルス感染症が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)(i)ニューカッスル病基質タンパク質をコードするDNA配列を含む発現ベクター；
(ii)該ベクターによってトランスフェクションされ得る細胞
を提供する段階；
(b)ニューカッスル病ウイルス様粒子が産生されるような条件下において、該ベクターを該細胞にトランスフェクションする段階
を含む方法。
【請求項２】
(c)粒子の無細胞調製物を作製するためにウイルス様粒子を回収する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
(d)粒子の調製物を含むワクチンをニワトリに投与する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
細胞が細胞培養物の一部であり、回収段階が該培養物の上清から粒子を得る段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項５】
細胞培養物が鳥類細胞を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ベクターが、ヌクレオカプシドタンパク質、融合タンパク質、および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質からなる群より選択されるさらなるニューカッスル病ウイルスタンパク質をコードするDNA配列をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
粒子がニューカッスル病ウイルスDNAを含まない、請求項1記載の方法。
【請求項８】
請求項1記載のトランスフェクションされた細胞。
【請求項９】
請求項2に従って作製された粒子の調製物。
【請求項１０】
(a)(i)ニューカッスル病ウイルス基質タンパク質を含むニューカッスル病ウイルス様粒子を含むワクチン；
(ii)ニューカッスル病に罹患しやすい宿主
を提供する段階；
(b)該ウイルス様粒子に対する抗体が産生されるような条件下において、該宿主を該ワクチンで免疫化する段階
を含む方法。
【請求項１１】
宿主が、鳥類、マウス、およびヒトからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
粒子が、融合タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のさらなるニューカッスル病ウイルスタンパク質をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
ニューカッスル病ウイルス様粒子を含むワクチンであって、該粒子がニューカッスル病ウイルス基質タンパク質を含む、ワクチン。
【請求項１４】
粒子がニューカッスル病ウイルスDNAを含まない、請求項13記載のワクチン。
【請求項１５】
粒子が、融合タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のさらなるウイルスタンパク質をさらに含む、請求項13記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はウイルスワクチンの分野に関する。1つの態様において、本発明は、これらに限定されないが、ニューカッスル病、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、および呼吸器合胞体ウイルスなどの疾患に対して有効なパラミクソウイルスワクチンを意図する。1つの態様において、本発明は、ニューカッスル病ウイルス(NDV)様粒子(VLP)を含むワクチンを意図する。1つの態様において、本発明は、主要NDV構造タンパク質をコードするcDNAを鳥類細胞にトランスフェクションする段階を含む方法を意図する。別の態様において、感染性ビリオンに類似している粒子がほぼ100%の効率で放出される方法。1つの態様において、粒子は非感染性であり、この粒子によって安全かつ有効なNDVワクチンが提供される。
【０００２】
政府支援の陳述
本研究は、米国国立衛生研究所による助成金第AI 3 30572号の支援を受けた。
【背景技術】
【０００３】
背景
この10年間で、パラミクソウイルスワクチンの安全性の問題に関するいくつかの懸念が生じ、人々の信頼に悪影響を与えている。これらの懸念は、小児疾患ワクチンの主要なレシピエントである小児の親ばかりでなく、種々の型のパラミクソウイルスに感染しやすい動物の飼育に従事する農場経営者にも影響を与える。
【０００４】
歴史的に見て、ニューカッスル病は家禽の破壊的疾患であり、多くの国々において、この疾患はなお、養鶏業の存続または発展に影響する大きな問題の1つである。ニューカッスル病が管理されていると見なすことができる国でさえ、ワクチン接種および/または厳重なバイオセキュリティー対策の維持に今もなお経済的負担がかかっている。家禽に対する病原性の点でニューカッスル病ウイルス株が可変性であること、および異なる種の鳥類では感染性が異なることから、管理および取引のためには、ニューカッスル病を注意深く定義づける必要がある。ニューカッスル病の確証診断には、関与したウイルスの単離および特徴づけが必要である。現在、ニューカッスル病対策は、持ち込みおよび伝播の防止、優れたバイオセキュリティーの実践、ならびに/または弱毒生ウイルスワクチン接種に限定されている。ニューカッスル病ウイルスはヒトに感染する可能性があり、通常は一過性の結膜炎を引き起こすが、ヒトからヒトへの伝播はこれまで報告されていない。Alexander D.J., 「Newcastle disease and other avian paramyxoviruses」 Res Sci Tech. 19(2):443-62 (2000)(非特許文献1)。
【０００５】
歴史的に、弱毒生麻疹ウイルス(MV)ワクチン、麻疹・流行性耳下腺炎・風疹(MMR)混合多価ワクチンは、感染症を予防することにより、世界中で小児の健康にプラスとなる影響をもたらした。しかし、これらの弱毒生ウイルスワクチンを用いて有効な抗ウイルス免疫応答を誘導することにより、有害事象(すなわち、例えば自閉症)がかなりの率で起こることが知られている。Kennedy et al., 「Measles virus infection and vaccination: potential role in chronic illness and associated adverse events」 Crit Rev Immunol. 24(2):129-56 (2004)(非特許文献2)。
【０００６】
健常でかつリスクのある小児は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)およびインフルエンザを含むウイルス誘発性呼吸器疾患に罹患しやすく、その疾患によって死亡しやすい。現在、世界保健機構は、主要なウイルス性呼吸器疾患を予防/軽減する有効なワクチンを開発および配布することを試みている。しかし、その進展は遅く、リスク/効果比は高い。ウイルス性呼吸器感染症のワクチン接種プログラムは、下気道感染症の予防、ならびに感染症による罹患、入院、および死亡の予防を含むべきである。現在、2種類のインフルエンザワクチン；(i)三価不活化ワクチン、および(ii)低温馴化弱毒生ワクチンが存在する。しかし、服薬率は比較的低い(すなわち、10〜30%)。服薬率の低さは、汚染されたワクチンの高いリスクが知られていることに関係していると考えられるため、当業者は、小児ウイルス性疾患のすべてに対して、安全かつ有効なワクチンに関する研究を継続すべきであることを提言している。Greenberg et al., 「Immunization against viral respiratory disease: A review」 Pediatr Infect Dis J. 23(11 Suppl):S254-61 (2004)(非特許文献3)。
【０００７】
低コストかつ高生産率という全人口規模での配布販売目標と適合する、低リスクで極めて有効なパラミクソウイルスワクチンが当技術分野において必要である。
【０００８】
【非特許文献１】Alexander D.J., 「Newcastle disease and other avian paramyxoviruses」 Res Sci Tech. 19(2):443-62 (2000)
【非特許文献２】Kennedy et al., 「Measles virus infection and vaccination: potential role in chronic illness and associated adverse events」 Crit Rev Immunol. 24(2):129-56 (2004)
【非特許文献３】Greenberg et al., 「Immunization against viral respiratory disease: A review」 Pediatr Infect Dis J. 23(11 Suppl):S254-61 (2004)
【発明の開示】
【０００９】
概要
本発明はウイルスワクチンの分野に関する。1つの態様において、本発明は、これらに限定されないが、ニューカッスル病、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、および呼吸器合胞体ウイルスなどの疾患に対して有効なパラミクソウイルスワクチンを意図する。1つの態様において、本発明は、ニューカッスル病ウイルス様粒子(VLP)を含むワクチンを意図する。1つの態様において、本発明は、主要NDV構造タンパク質をコードするcDNAを鳥類細胞にトランスフェクションする段階を含む方法を意図する。別の態様において、感染性ビリオンに類似している粒子がほぼ100%の効率で放出される方法。1つの態様において、粒子は非感染性であり、この粒子によって安全かつ有効なNDVワクチンが提供される。
【００１０】
1つの態様において、本発明は、(a)(i)ニューカッスル病基質タンパク質をコードするDNA配列を含む発現ベクター；(ii)該ベクターによってトランスフェクションされ得る細胞を提供する段階；(b)ニューカッスル病ウイルス様粒子が産生されるような条件下において、該ベクターを該細胞にトランスフェクションする段階を含む方法を意図する。1つの態様において、本方法は、(c)粒子の無細胞調製物を作製するためにウイルス様粒子を回収する段階をさらに含む。1つの態様において、本方法は、(d)粒子の調製物を含むワクチンをニワトリに投与する段階をさらに含む。1つの態様において、細胞は細胞培養物の一部であり、回収段階は該培養物の上清から粒子を得る段階を含む。1つの態様において、細胞培養物はサブコンフルエントな鳥類細胞を含む。1つの態様において、ベクターは、ヌクレオカプシドタンパク質、融合タンパク質、および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質からなる群より選択されるさらなるニューカッスル病ウイルスタンパク質をコードするDNA配列をさらに含む。1つの態様において、粒子はニューカッスル病ウイルスDNAを含まない。
【００１１】
1つの態様において、本発明は、ニューカッスル病ウイルス様粒子を産生し得る、ニューカッスル病基質タンパク質をコードするDNA配列を含む発現ベクターを含むトランスフェクション細胞を意図する。
【００１２】
1つの態様において、本発明は、ニューカッスル病ウイルス様粒子を産生し得る、ニューカッスル病基質タンパク質をコードするDNA配列を含む発現ベクターを含むトランスフェクション細胞から回収された、ウイルス様粒子の無細胞調製物を意図する。
【００１３】
1つの態様において、本発明は、(a)(i)ニューカッスル病ウイルス基質タンパク質を含むニューカッスル病ウイルス様粒子を含むワクチン；(ii)ニューカッスル病に罹患しやすい宿主を提供する段階；(b)ウイルス様粒子に対する抗体が産生されるような条件下において、該宿主を該ワクチンで免疫化する段階を含む方法を意図する。1つの態様において、宿主は、鳥類、マウス、およびヒトからなる群より選択される。1つの態様において、粒子は、融合タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のさらなるニューカッスル病ウイルスタンパク質をさらに含む。
【００１４】
1つの態様において、本発明は、ニューカッスル病ウイルス基質タンパク質を含むニューカッスル病ウイルス様粒子を含むワクチンを意図する。1つの態様において、粒子はニューカッスル病ウイルスDNAを含まない。1つの態様において、粒子は、融合タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のさらなるウイルスタンパク質をさらに含む。
【００１５】
1つの態様において、本発明は、ニューカッスル病ウイルス様粒子およびニューカッスル病基質タンパク質を含むワクチンを意図する。1つの態様において、ワクチンは少なくとも2つのウイルス糖タンパク質をさらに含む。1つの態様において、糖タンパク質は、融合タンパク質および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質からなる群より選択される。1つの態様において、ワクチンはヌクレオカプシドタンパク質をさらに含む。1つの態様において、基質タンパク質は後期ドメイン(Late Domain)を含む。1つの態様において、後期ドメインはFPIV配列(配列番号:1)を含む。1つの態様において、後期ドメインはPXXP配列(配列番号:2)を含む。1つの態様において、後期ドメインはYXXL配列(配列番号:3)を含む。1つの態様において、ワクチンは非感染性である。
【００１６】
本発明の1つの態様は、ニューカッスル病ウイルス様粒子およびニューカッスル病基質タンパク質を含む鳥類ワクチンを意図する。1つの態様において、ワクチンは少なくとも2つのウイルス糖タンパク質をさらに含む。1つの態様において、糖タンパク質は、融合タンパク質および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、ワクチンはヌクレオカプシドタンパク質をさらに含む。1つの態様において、ウイルス様粒子はパラミクソウイルス様粒子を含む。1つの態様において、パラミクソウイルス様粒子はニューカッスル病ウイルス様粒子を含む。1つの態様において、基質タンパク質は後期ドメインを含む。1つの態様において、後期ドメインはFPIV配列(配列番号:1)を含む。1つの態様において、後期ドメインはPXXP配列(配列番号:2)を含む。1つの態様において、後期ドメインはYXXL配列(配列番号:3)を含む。1つの態様において、ウイルス様粒子は非感染性である。
【００１７】
1つの態様において、本発明は、(a)(i)ニューカッスル病ウイルス基質タンパク質および少なくとも2つのウイルス糖タンパク質をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；(ii)該ベクターによってトランスフェクションされ得る細胞を提供する段階；(b)基質タンパク質を含むニューカッスル病ウイルス様粒子が産生される条件下において、該ベクターを該細胞にトランスフェクションする段階を含む方法を意図する。1つの態様において、細胞はサブコンフルエントな鳥類細胞を含む。1つの態様において、発現ベクターはpCAGGSを含む。1つの態様において、糖タンパク質は、融合タンパク質および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質からなる群より選択される。1つの態様において、発現ベクターは、ヌクレオカプシドタンパク質をコードするcDNA配列をさらに含む。1つの態様において、本方法は、少なくとも85%の効率でウイルス様粒子が放出される段階を含む。1つの態様において、ウイルス様粒子は、少なくとも2つのウイルス糖タンパク質をさらに含む。
【００１８】
本発明の1つの態様は、(a)(i)ニューカッスル病ウイルス基質タンパク質および少なくとも2つのウイルス糖タンパク質をコードするcDNA配列を含む発現ベクター；(ii)該ベクターによってトランスフェクションされ得る細胞を提供する段階；ならびに(b)ウイルス様粒子を含む鳥類ワクチンが生成される条件下において、該ベクターを該細胞にトランスフェクションする段階を含む方法を意図する。1つの態様において、細胞はサブコンフルエントな鳥類細胞を含む。1つの態様において、細胞はヒト細胞を含む。1つの態様において、発現ベクターはpCAGGSを含む。1つの態様において、糖タンパク質は、融合タンパク質および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、ベクターは、ヌクレオカプシドタンパク質をコードするcDNA配列をさらに含む。1つの態様において、本方法は、少なくとも85%の効率でウイルス様粒子が放出される段階をさらに含む。1つの態様において、ウイルス様粒子は、基質タンパク質および少なくとも2つのウイルス糖タンパク質を含む。
【００１９】
1つの態様において、本発明は、(a)(i)ニューカッスル病ウイルス様粒子ならびにニューカッスル病ウイルス基質タンパク質および少なくとも2つのウイルス糖タンパク質を含むワクチン；(ii)ウイルス様粒子によって免疫化され得る宿主を提供する段階；(b)ウイルス様粒子に対する抗体が産生されるような条件下において、ウイルス様粒子により宿主を免疫化する段階を含む方法を意図する。1つの態様において、宿主は、鳥類、マウス、およびヒトからなる群より選択される。1つの態様において、糖タンパク質は、融合タンパク質および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質からなる群より選択される。1つの態様において、ワクチンはヌクレオカプシドタンパク質をさらに含む。
【００２０】
本発明の1つの態様は、(a)(i)ニューカッスル病ウイルス様粒子、ニューカッスル病ウイルス基質タンパク質、および少なくとも2つのウイルス糖タンパク質を含む鳥類ワクチン；(ii)ウイルス様粒子によって免疫化され得る宿主を提供する段階；(b)ウイルス様粒子に対する抗体が産生されるような条件下において、ワクチンにより宿主を免疫化する段階を含む方法を意図する。1つの態様において、宿主は、鳥類、マウス、およびヒトを含む群より選択される。1つの態様において、ウイルス様粒子はニューカッスル病ウイルス様粒子を含む。1つの態様において、糖タンパク質は、融合タンパク質および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、ワクチンはヌクレオカプシドタンパク質をさらに含む。
【００２１】
1つの態様において、本発明は、第1のニューカッスル病ウイルス株由来の第1のウイルスタンパク質遺伝子をコードする第1のcDNA；第2のニューカッスル病ウイルス株由来の第2のウイルスタンパク質遺伝子をコードする第2のcDNA；および第3の株由来の第3のウイルスタンパク質遺伝子をコードする第3のcDNAを含むVLPワクチン発現系を意図する。1つの態様において、第1のウイルスタンパク質遺伝子は、HNタンパク質、Fタンパク質、NPタンパク質、またはMタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、第1の株は、Hertz株、AV株、またはB1株を含む群より選択される。1つの態様において、第2のウイルスタンパク質遺伝子は、HNタンパク質、Fタンパク質、NPタンパク質、またはMタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、第2の株は、Hertz株、AV株、またはB1株を含む群より選択される。1つの態様において、第3のウイルスタンパク質遺伝子は、HNタンパク質、Fタンパク質、NPタンパク質、またはMタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、第3の株は、Hertz株、AV株、またはB1株を含む群より選択される。1つの態様において、本発明は、VLPワクチンに取り込まれたウイルスタンパク質遺伝子を検出する方法であって、ウイルスタンパク質遺伝子を株特異的抗体または組み入れた配列タグと接触させる段階を含む方法を意図する。
【００２２】
定義
本発明において用いる用語は一般に、以下を例外として、当業者に受け入れられる定義に基づいて使用する。
【００２３】
本明細書で用いる「ウイルス様粒子」という用語は、ウイルスタンパク質を伴うまたは伴わない非感染性ウイルスサブユニットを指す。例えば、ウイルス様粒子は完全にDNAゲノムまたはRNAゲノムを欠いてよい。さらに、ウイルスカプシドタンパク質を含むウイルス様粒子は自発的な自己集合を起こし得る。1つの態様においては、感染性ビリオンを含まずに(または、調製物が感染性となるには十分な数を有さないように、少なくとも実質的に含まずに)精製される、ウイルス様粒子の調製物が意図される。
【００２４】
本明細書で用いる「基質タンパク質」、「膜タンパク質」、または「Mタンパク質」という用語は、エンベロープとヌクレオカプシドコアとの間に局在する任意のタンパク質を意味し、これはビリオン構造および出芽過程の組織化および維持を促進する。
【００２５】
本明細書で用いる「融合タンパク質」または「Fタンパク質」という用語は、エンベロープ表面から突出した任意のタンパク質を意味し、これはウイルスエンベロープと細胞膜との融合を誘導することにより宿主細胞侵入を媒介する。しかし、本発明は機能的Fタンパク質に限定されるものではない。例えば、Fタンパク質は、これに限定されないがF-K115Qなどの変異体F遺伝子によってコードされてもよい。F-K115Qは、融合タンパク質の正常な切断およびその後の活性化を排除すると考えられている。F-K115Qは非病原性NDV株における天然のFタンパク質変異を模倣したものであり、細胞培養において、VLP放出の際の細胞間融合の悪影響の可能性を排除する。
【００２６】
本明細書で用いる「ヌクレオカプシドタンパク質」または「NPタンパク質」という用語は、ゲノムRNAと結合している(すなわち、例えばヘキサマー当たり1分子)任意のタンパク質を意味し、これはRNAをヌクレアーゼ消化から保護する。
【００２７】
本明細書で用いる「赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質」、「HNタンパク質」、またはGタンパク質という用語は、ウイルスエンベロープをまたがり、表面からスパイクのように突出して、細胞の付着および侵入を促進する(すなわち、例えば、細胞表面上のシアル酸に結合することによる)任意のタンパク質を意味する。これらのタンパク質は、赤血球凝集活性およびノイラミニダーゼ活性の両方を有する。
【００２８】
本明細書で用いる「糖タンパク質」という用語は、糖質を含む非タンパク質群に結合している任意のタンパク質を指す。
【００２９】
本明細書で用いる「パラミクソウイルス」いう用語は、いくつものヒト疾患および動物疾患(すなわち、例えばニューカッスル病)の原因であるマイナス鎖一本鎖RNAウイルスである、モノネガウイルス目のパラミクソウイルス科の任意のウイルスを指す。パラミクソウイルスには、これらに限定されないが、例えばセンダイウイルス、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体(RS)ウイルス、牛疫ウイルス、ジステンパーウイルス、サルパラインフルエンザウイルス(SV5)、ヒトパラインフルエンザウイルスI型、II型、およびIII型などが含まれる。センダイウイルスは、野生株、変異株、実験室継代株、人工的構築株などであってよい。DI粒子(J. Virol., 1994, 68, 8413-8417)のような不完全ウイルス、合成オリゴヌクレオチドなどもまた、本発明のワクチンを製造するための材料として利用することができる。
【００３０】
本明細書で用いる「後期ドメイン」という用語は、細胞の原形質膜からのウイルス粒子の出芽に関与する、ウイルスタンパク質における任意の領域を指す。後期ドメインは、細胞タンパク質の間のタンパク質間相互作用を媒介することが知られている高度に保存されたモチーフを含む。例えば、モチーフの少なくとも3つのクラスは、PTAP(配列番号:4)、PPXY(配列番号:5)、またはYXXL(配列番号:3)(すなわち、例えばYANL配列)を含む。
【００３１】
本明細書で用いる「ベクター」という用語は、細胞内で発現し得る外因性機能性遺伝子を含む任意のヌクレオチド配列を指す。例えば、ベクターは、ヒト、鳥類、昆虫細胞培養系において発現するウイルス基質タンパク質および少なくとも2つの糖タンパク質をコードする核酸を含み得る。例えば、種々の鱗翅目種にトランスフェクションするために、バキュロウイルスベクターを用いることができる。
【００３２】
本明細書において用いる「トランスフェクションする」または「トランスフェクションすること」という用語は、ベクターが宿主細胞内に取り込まれ得る任意の機序を指す。トランスフェクションが成功すると、宿主細胞は、ベクターによって運搬された機能性遺伝子を発現できるようになる。トランスフェクションは、安定的または一過性であってよい。一過性トランスフェクションの一例は、ベクターが宿主細胞ゲノム中に組み込まれない、細胞内でのベクター発現を含む。または、安定トランスフェクションは、ベクターが宿主細胞ゲノム中に組み込まれた、細胞内でのベクター発現を含む。
【００３３】
本明細書で用いる「宿主」という用語は、ウイルスに感染し得る、およびウイルス様粒子によって免疫化され得る任意の生物を指す。宿主は、鳥類宿主(すなわち、例えばニワトリ)または哺乳動物宿主(すなわち、例えばヒト、マウス、イヌ、ラット、ウシ、ヒツジなど)であってよい。
【００３４】
本明細書で用いる「配列タグ」という用語は、検出可能な(好ましくは定量化可能な)シグナルを提供するために用いることができ、かつ核酸またはタンパク質に付着させることができる任意の原子または分子を指す。「配列タグ」は、蛍光、放射能、比色分析、重力測定、X線回析または吸収、磁性、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供し得る。「配列タグ」は荷電部分(正または負の電荷)であってよく、または電荷中性であってよい。「配列タグ」は、「配列タグ」を含む配列が検出可能である限り、核酸もしくはタンパク質配列を含み得る、またはそれからなり得る。
【００３５】
本明細書で用いる「アジュバント」という用語は、抗原と共に投与した場合に免疫応答を増強または刺激する任意の化合物を指す。
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明はウイルスワクチンの分野に関する。1つの態様において、本発明は、これらに限定されないが、ニューカッスル病、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、および呼吸器合胞体ウイルスなどの疾患に対して有効なパラミクソウイルスワクチンを意図する。1つの態様において、本発明は、ニューカッスル病ウイルス様粒子(VLP)を含むワクチンを意図する。1つの態様において、本発明は、主要NDV構造タンパク質をコードするcDNAを鳥類細胞にトランスフェクションする段階を含む方法を意図する。別の態様において、感染性ビリオンに類似している粒子がほぼ100%の効率で放出される方法。1つの態様において、粒子は非感染性であり、この粒子によって安全かつ有効なNDVワクチンが提供される。
【００３７】
パラミクソウイルスは、通常は線状であるマイナス一本鎖RNAゲノムを有する。パラミクソウイルスの形態は、直径約150〜350ナノメートル(nm)の比較的球状の形状を含む。一般に、ゲノムは、核タンパク質と共にリボ核タンパク質コア内にパッケージングされている。ポリメラーゼタンパク質もまたこれらのリボ核タンパク質コアと結合してよく、初期感染時の複製および転写過程において役割を果たす。基質タンパク質はパラミクソウイルスの顕著な特徴であり、ウイルス膜の内面を裏打ちしている。膜貫通タンパク質(すなわち、例えば赤血球凝集素、融合、またはノイラミニダーゼタンパク質)はすべてホモオリゴマー複合体を形成し(すなわち、スパイクタンパク質として当技術分野で公知である)、宿主細胞の原形質膜に局在するウイルス集合に役立つ。Garoff et al., 「Virus Maturation By Budding」 Microbiol Mol Biol Rev 62:1171-1190 (1998)。
【００３８】
I. ウイルスの構造および集合
パラミクソウイルスはエンベロープを有し、感染細胞の原形質膜においてビリオン成分を組み立て、次いで出芽の過程によって子孫粒子を放出することが知られている。ニューカッスル病ウイルス(NDV)、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、および呼吸器合胞体ウイルスはすべてパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)に属し、核タンパク質と共にリボ核タンパク質(RNP)コア内にパッケージングされたゲノムマイナス鎖RNA(すなわち、例えば約16 KB)を有するエンベロープをもつウイルスとして特徴づけられる。
【００３９】
パラミクソウイルスRNPはまた、リンタンパク質および大型ポリメラーゼから構成されるポリメラーゼ複合体を含む。RNPコアは、2つの膜貫通糖タンパク質である赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ(HN)および融合(F)タンパク質、ならびに脂質含有ウイルスエンベロープの内面と結合している基質(M)タンパク質を含む膜内に包まれている。Lamb et al., 「Paramyxoviridae: The Viruses and Their Replication」 pp. 1305-1340. Fields Virology, Third Edition, Vol. 1., Eds: D. M. K. &. P. M. Howley, LippincottWilliams & Wilkins, Philadelphia (2001)。
【００４０】
エンベロープを有する多くのRNAウイルスの基質タンパク質は、ウイルスの集合および出芽において役割を果たすと考えられている。Freed, E. O., 「The HIV-TSGIO1 interface: recent advances in a budding field」 Trends Microbiol. 11:56-9 (2003)；Jasenosky et al., 「Filovirus budding」 Virus Res. 106:1B1-8 (2004)；Jayakar et al., 「Rhabdovirus assembly and budding」 Virus Res. 106:117-32 (2004)；Peeples M. E., 「Paramyxovirus M proteins: pulling it all together and taking it on the road」 pp. 427-456. The Paramyxoviruses, Ed: D. W. Kingsbury, Plenum, New York, N.Y (1991)；Pornillos et al., 「Mechanisms of enveloped RNA virus budding」 Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002)；Schmitt et al., 「Escaping from the cell: assembly and budding of negative-strand RNA viruses」 Cuff Top Microbiol Immunol 283:145-96 (2004)；およびTakimoto et al., 「Molecular mechanism of paramyxovirus budding」 Virus Res. 106:133-45 (2004)。しかし、他のウイルス成分の非存在下におけるレトロウイルスgag前駆体タンパク質の発現によっても、gagウイルス様粒子(VLP)の集合および原形質膜からのVLPの放出が起こる。Delchambre et al., 「The GAG precursor of simian immunodeficiency virus assembles into virus-like particles」 EMBO J 8:2653-60 (1989)；Demirov et al., 「Retrovirus budding」 Virus Res 106:87-102 (2004)；Gheysen et al., 「Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells」 Cell 59:103-12 (1989)；およびMorita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004)。したがって、ウイルス粒子の形成および放出を導くのに、どのNDVタンパク質が必要かつ十分であるのかは不明である。
【００４１】
A. Mタンパク質
1つの態様において、本発明は、さらなる糖タンパク質なしにパラミクソウイルス由来のMタンパク質を含む方法であって、VLPが生成される方法を意図する。
【００４２】
以下より単離されたMタンパク質は、単独で発現された場合に、集合してVLPを構築し、VLPとして放出される：
(i)エボラウイルス(Jasenosky et al., 「Filovirus budding」 Virus Res. 106:1B1-8 (2004)；Jasenosky et al., 「Ebola virus VP40-induced particle formation and association with the lipid bilayer」 J. Virol. 75:5205-14 (2001)；およびTimmins et al., 「Vesicular release of Ebola virus matrix protein VP40」 Virology 283: 1-6 (2001))；
(ii)水疱性口内炎ウイルス(Jayakar et al., 「Rhabdovirus assembly and budding」 Virus Res. 106:117-32 (2004)；Li et al., 「Viral liposomes released from insect cells infected with recombinant baculovirus expressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus」 J. Virol. 67:4415-20 (1993)；およびSakaguchi et al., 「Double-layered membrane vesicles released from mammalian cells infected with Sendai virus expressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus」 Virology 263:230-43 (1999))および、
(iii)インフルエンザウイルス(Gomez-Puertas et al., 「Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding」 J. Virol.74:11538-47 (2000))。
【００４３】
逆に、Mタンパク質欠損狂犬病ウイルスは、ビリオン形成が著しく損なわれることが知られている。Mebatsion et al., 「Matrix protein of rabies virus is responsible for the assembly and budding of bullet-shaped particles and interacts with the transmembrane spike glycoprotein G」 J. Virol. 73:242-50 (1999)。
【００４４】
いくつかのパラミクソウイルス系における研究からも、ウイルスの集合および出芽におけるMタンパク質の役割が示唆されている。Mタンパク質遺伝子を欠くように逆遺伝学によって改変された麻疹ウイルス(MV)およびセンダイウイルス(SV)は、出芽が損なわれた。それぞれ、Cathomen et al., 「A matrix-less measles virus is infectious and elicits extensive cell fusion: consequences for propagation in the brain」 EMBO J 17:3899-3908 (1998)；およびInoue et al., 「A new Sendai virus vector deficient in the matrix gene does not form virus particles and shows extensive cell-to-cell spreading」 J. Virol. 77:6419-29 (2003)。さらに、亜急性硬化性全脳炎(SSPE)ウイルス由来の変異体Mタンパク質を含むMVもまた、出芽に欠陥があった。Patterson et al., 「Evidence that the hypermutated M protein of a subacute sclerosing panencephalitis measles virus actively contributes to the chronic progressive CNS disease」 Virology 291:215-25 (2001)。
【００４５】
パラミクソウイルス集合の最近の研究もまた、VLPの集合および出芽に対するウイルスタンパク質必要性の同定に焦点を置いており、Mタンパク質の役割が実証されている。単独で発現されたヒトパラインフルエンザウイルス1型(hPIV1)Mタンパク質およびSV Mタンパク質は、原形質膜からのVLPの出芽を誘導した。Coronel et al., 「Human parainfluenza virus type 1 matrix and nucleoprotein genes transiently expressed in 12 mammalian cells induce the release of virus-like particles containing 13 nucleocapsid-like structures」 J. Virol. 73:7035-8 (1999)；Sakaguchi et al., 「Double-layered membrane vesicles released from mammalian cells infected with Sendai virus expressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus」 Virology 263:230-43 (1999)；Sugahara et al., 「Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by expression of multiple viral proteins and acceleration of its release by C protein」 Virology 325:1-10 (2004)；およびTakimoto et al., 「Role of matrix and fusion proteins in budding of Sendai virus」 J. Virol. 75: 11384-91 (2001)。Mタンパク質の発現はまた、サルウイルス5(SV5)VLP形成に必要であった。Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus virus-like particles」 J Virol 76:3952-64 (2002)。
【００４６】
しかし、PIY1およびSVとは対照的に、SV5 Mタンパク質はVLP放出に十分ではなかった。むしろ、SV5 Mタンパク質のNPおよび糖タンパク質のいずれかとの同時発現が必要であった。既存の報告は、パラミクソウイルス粒子放出における出芽を組織化するものとしてのMタンパク質の役割には合意しているが、ビリオンの集合および出芽に対するタンパク質必要性には相違がある。レトロウイルスgagタンパク質、エボラウイルスMタンパク質、およびインフルエンザM1タンパク質の出芽能は、部分的に後期ドメインに起因する(以下参照)。Demirov et al., 「Retrovirus budding」 Virus Res 106:87 - 102 (2004)；Freed, E. O., 「Viral late domains」 J. Virol. 76:4679-87 (2002)；Jasenosky et al., 「Filovirus budding」 Virus Res. 106:1B1-8 (2004)；Jayakar et al., 「Rhabdovirus assembly and budding」 Virus Res. 106:117-32 (2004)；Morita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004)；Nayak et al., 「Assembly and budding of influenza virus」 Virus Res 106:147-65 (2004)；Pornillos et al., 「Mechanisms of enveloped RNA virus budding」 Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002)；Schmitt et al., 「Escaping from the cell: assembly and budding of negative-strand RNA viruses」 Cuff Top Microbiol Immunol 283:145-96 (2004)；Strack et al., 「A1P 1/ALIX is a binding partner for HIV -1 p6 and EIA V p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-99 (2003)；およびvon Schwedler et al., 「The protein network of HIV budding」 Cell 4:701-13 (2003)。
【００４７】
B. 後期ドメイン
後期ドメインは、液胞タンパク質選別(VPS)経路に関与するクラスEタンパク質のメンバーとの相互作用を媒介する短いペプチドモチーフである。後期ドメインは、多胞体(MVB)への積荷の選別を担う細胞機構の成分と相互作用することによって出芽を促進する。MVB小胞の形成とウイルスの出芽は、位相的に類似した過程である。入手可能な証拠から、エンベロープを有するRNAウイルスが、通常は細胞内でMVBを生成するために用いられる細胞機構を取り込むことによって出芽することが示唆される。Carter, C. A., 「Tsg1O1: HIV-1's ticket to ride」 Trends Microbiol. 10:203-205 (2002)；Demirov et al., 「Retrovirus budding」 Virus Res 106:87 - 102 (2004)；Freed, E. O., 「The HIV-TSGIO1 interface: recent advances in a budding field」 Trends Microbiol. 11 :56-9 (2003)；Freed, E. O., 「Viral late domains」 J. Virol. 76:4679-87 (2002)；Garrus et al., 「Tsg 1-01 and the vacuolar protein sorting pathway are essential for HIV-1 budding」 Cell 107:55-65 (2001)；Morita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004)；Pornillos et al., 「Mechanisms of enveloped RNA virus budding」 Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002)；Pornillos et al., 「HN Gag mimics the TsgIO1-recruiting activity of the human Hrs protein」 J Cell Biol 162:425-34 (2003)；Strack et al., 「A1P 1/ALIX is a binding partner for HIV -1 p6 and EIA V p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-99 (2003)；von Schwedler et al., 「The protein network of HIV budding」 Cell 4:701-13 (2003)；Martindale, D., 「Budding viral hijackers co-opt the endocytic machinery to make a getaway」 J Biol. 3:2 (2003)；およびSimons et al., 「The budding mechanisms of enveloped animal viruses」 J. Gen. Virol. 50:1-21 (1980)。
【００４８】
1つの態様において、本発明は、VPS経路のドミナントネガティブ変異体タンパク質成分もまた粒子の放出を阻害し得ることを意図する。1つの態様において、NDV Mタンパク質中のYXXL(配列番号:3)配列は後期ドメインの特徴を有する。本発明の機序を理解する必要はないが、YXXL変異により粒子放出は消失し、YPDLおよび/またはPTAPなどの後期ドメインの置換により粒子放出は十分に回復すると考えられる。
【００４９】
C. 出芽
パラミクソウイルス科において、VPS経路がSV5の出芽に関与していることが知られている。ドミナントネガティブ変異体VPS4(E228Q)(VPS経路に関与するタンパク質複合体の再利用に必要なATPアーゼ)がSV5ビリオンおよびVLPの出芽を阻害することが示された。Schmitt et al., 「Evidence for a new viral late-domain core sequence, FPIV, necessary for budding of a paramyxovirus」 J. Virol. 79:2988-97 (2005)。VPS4(E228Q)はまたVPS経路を阻害することが知られているため、VPS経路がSV5の出芽に関与していると考えられ得る。加えて、SV5 M中の推定後期ドメインが同定された。しかしSV5 Mタンパク質はVLPの形成および放出に十分ではなく、この結果の解釈を複雑にしている。したがって、パラミクソウイルスの集合および放出の通則はいまだ不明である。Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus virus-like particles」 J Virol 76:3952-64 (2002)。未解決の問題には、(i)ウイルス構造タンパク質におけるパラミクソウイルス後期ドメインのさらなる定義、(ii)ウイルス集合における各ウイルスタンパク質の役割または寄与、ならびに(iii)集合および出芽過程に関与する細胞因子が含まれる。
【００５０】
本発明の種々の態様はこれらの問題に答える。1つの態様において、本発明は、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸をトランスフェクションした細胞からNDV VLPを産生させる方法を意図する。別の態様において、本発明は、脂質含有粒子(すなわち、例えばVLP)の放出に必要かつ十分であるNDV Mタンパク質をコードする核酸をトランスフェクションすることを意図する。別の態様において、本発明は、VLPへの他のウイルスタンパク質の最も効率的な取り込み(すなわち、例えばほぼ100%)が、Mタンパク質と少なくとも2つの他のNDVタンパク質との発現を必要とすることを意図する。例えば、CHMP3およびVps4タンパク質(いずれも宿主VPS系の成分)のドミナントネガティブ変異体がVLPの放出を阻害することが知られている。Morita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004)；Strack et al., 「A1P 1/ALIX is a binding partner for HIV -1 p6 and EIA V p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-99 (2003)；およびvon Schwedler et al., 「The protein network of HIV budding」 Cell 4:701-13 (2003)。AIP1もまたVLP中に取り込まれ、NDV粒子の出芽において役割を果たすことがさらに意図される。
【００５１】
D. ドミナントネガティブ変異体
ドミナントネガティブVps4タンパク質が、SV5ビリオンまたはNP、HN、F、およびMタンパク質から構成されるVLPの放出を阻止し得ることから、VPS系がパラミクソウイルス放出に関連づけられる。Schmitt et al., 「Evidence for a new viral late-domain core sequence, FPIV, necessary for budding of a paramyxovirus」 J. Virol. 79:2988-2997 (2005)。これらの結果を確認するものとして、Vps4のドミナントネガティブ型であるVps4 A-E228QはNDV VLP放出を阻止した。Martin-Serrano et al., 「Role of ESCRT-I in retroviral budding」 J Virol 77:4794-4804 (2003)；Strack et al., 「AIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1 p6 and EIAV p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-699 (2003)；およびvon Schwedler et al., 「The protein network of HIV budding」 Cell 114:701-713 (2003))。
【００５２】
本発明の機序を理解する必要はないが、本明細書に実証する結果から、これらのドミナントネガティブタンパク質がMタンパク質のみを含む粒子の放出を阻止することが示されると考えられる。例えば、ESCRT III複合体のサブユニットであるCHMP3のドミナントネガティブ型(1)、ならびにESCT IおよびIIIタンパク質の両方に結合するタンパク質であるAIP1のドミナントネガティブ変異体は、NDV VLP放出およびMタンパク質のみを含む粒子の放出を阻害した。これらのタンパク質の野生型をトランスフェクションしてもM粒子の放出にほとんど影響しなかったことから、この阻害はタンパク質の過剰発現によるものではなかった。これらの結果から、無傷のVPS経路がNDV VLP出芽を促進することが示される。さらに、これらの結果から、VPS経路がM粒子放出に関与することが示される。
【００５３】
多くの研究から、ウイルスの基質タンパク質中のLドメインが、VPS経路の特定分子との相互作用を媒介することが実証されている。Bieniasz, P. D., 「Late budding domains and host proteins in enveloped virus release」 Virology 344:55-63 (2006)；Freed, E. O., 「Viral late domains」 J. Virol. 76:4679-4687 (2002)；およびMorita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol 20:395-425 (2004)。3つのLドメインモチーフ、PTAP、YPXL、およびPPXY(Pornillos et al., 「Mechanisms of enveloped RNA virus budding」 Trends Cell Biol. 12:569-579 (2002))が、レトロウイルス(Puffer et al., 「Equine infectious anemia virus utilizes a YXXL motif within the late assembly domain of the Gag p9 protein」 J Virol 71:6541-6546 (1997))、ラブドウイルス、およびフィロウイルス(Irie et al., 「Budding of PPxY-containing rhabdoviruses is not dependent on host proteins TGS1O1 and VPS4A」 J Virol 78:2657-2665 (2004))で同定された。YRKL配列は、オルソミクソウイルスにおいて後期ドメインとして同定された(Hui et al., 「YRKL sequence of influenza virus M1 functions as the L domain motif and interacts with VPS28 and Cdc42」 J Virol 80:2291-2308 (2006))。
【００５４】
ESCRT Iの成分であるTSG101(腫瘍感受性遺伝子101)タンパク質へのPTAP配列の結合が報告されている。Huang et al., 「p6Gag is required for particle production from full-length human immunodeficiency virus type 1 molecular clones expressing protease」 J Virol 69:6810-6818 (1995)。さらに、YPXL配列がAP2(アダプタータンパク質2)およびAIP1と相互作用することが示されている。それぞれ、Chen et al., 「Functions of early (AP-2) and late (AIP1/ALIX) endocytic proteins in equine infectious anemia virus budding」 J Biol Chem (2005)；およびStrack et al., 「AIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1 p6 and EIAV p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-699 (2003)。インフルエンザウイルスM1タンパク質中のYRKL配列は、tsg101と結合するESCRT 1タンパク質であるVSP28、およびGTP結合タンパク質のRhoファミリーのメンバーであるCdc42に結合する。PPXYモチーフは、Nedd4様(神経前駆細胞で発現し、発生的に下方制御される遺伝子4(neural precursor cell expressed, developmentally down regulated gene4))ユビキチンリガーゼに結合する。(Vana et al., 「Role of Nedd4 and ubiquitination of Rous sarcoma virus Gag in budding of virus-like particles from cells」 J Virol 78:13943-13953 (2004)；およびXiang et al., 「Fine mapping and characterization of the Rous sarcoma virus Pr76gag late assembly domain」 J Virol 70:5695-5700 (1996))。
【００５５】
パラミクソウイルスMタンパク質は、PTAP、YPXL、YRKL、およびPPXYモチーフを有さない。しかし、SV5 Mタンパク質中の配列FPIVが、パラミクソウイルスにおける後期ドメインである可能性がある。FPIVの変異により粒子の放出が阻害され、レトロウイルスgag構築物へのこの配列の付加により粒子の放出が促進された。しかし、SV5 Mタンパク質はSV5粒子放出に十分ではないため、FPIVはこのパラミクソウイルスMタンパク質という状況において後期ドメインとして独立して機能しないと考えられている。Schmitt et al., 「Evidence for a new viral late-domain core sequence, FPIV, necessary for budding of a paramyxovirus」 J. Virol. 79:2988-2997 (2005)。
【００５６】
したがって、いかにしてSV5がVPS経路を用いるのか、またはいかにしてFPIV配列が後期ドメインとして機能し得るのかは不明である。NDV Mタンパク質の配列解析から、このFPIVモチーフの存在が示される。加えて、NDV Mタンパク質は、SV5 Mタンパク質中には見出されないPKSPおよびYANL配列を含む。1つの態様において、本発明は、Lドメインの特徴を含むYANLモチーフを意図する。1つの態様においては、YANL変異により、Mタンパク質粒子放出が減少する。本発明の機序を理解する必要はないが、YANL変異を他の公知の後期ドメイン(すなわち、例えばPTAPまたはYPDL)で置換すると、粒子放出が完全に回復し得ると考えられる。
【００５７】
YANL配列の変異による粒子放出の阻害は、タンパク質折りたたみに及ぼす影響にのみ起因する可能性は低いとさらに考えられる。本明細書に提供するデータより、NDV Mタンパク質が後期ドメイン、YPDLまたはPTAPドメインのいずれかの型を用いてVPS経路にアクセスし得ること、およびYANL変異体タンパク質M-A232-A235が野生型FPIV配列を有することから、NDV Mタンパク質中のFPIV配列がYANL配列に依存せずに後期ドメインとして機能し得ないことが示唆される。
【００５８】
YPDL後期ドメインは、VPSタンパク質AIP1と相互作用することが示されている。1つの態様において、本発明は、AIP1タンパク質が、Mタンパク質のみを含む放出粒子中に見出されることを意図する。
【００５９】
センダイウイルスのMタンパク質もまた、粒子の放出に十分であることが示されている(Sugahara et al., 「Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by expression of multiple viral proteins and acceleration of its release by C protein」 Virology 325:1-10 (2004)；およびTakimoto et al., 「Role of matrix and fusion proteins in budding of Sendai virus」 J. Virol. 75:11384-11391 (2001))。センダイウイルスMタンパク質は、SV Mタンパク質の後期ドメインとして機能し得るYLDL配列を有する。上記の通り、SV5 Mタンパク質は粒子の放出に十分ではなく、またYXXLモチーフももたない。Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus 5 virus-like particles」 J Virol 76:3952-3964 (2002)。しかし、SV5 NPタンパク質が、YPLL配列を含むいくつかのYXXLモチーフを有する。または、SV5後期ドメインは、Mタンパク質よりもむしろSV5 NPに存在し得る。実際に、SV5 VLP放出が、SV5 NPタンパク質とMタンパク質および糖タンパク質との発現によって有意に増強されることが報告されている。Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus 5 virus-like particles」 J Virol 76:3952-3964 (2002)。その結果、異なるパラミクソウイルス系において粒子の放出に対する異なる必要性が存在し、これは構造タンパク質における後期ドメインの異なる分布に一部起因し得ることが明らかである。それにも関わらず、本発明は、宿主細胞のVPS経路がMタンパク質出芽を促進すること、およびNDV Mタンパク質中のYANLモチーフが後期ドメインの特徴を有することを意図する。
【００６０】
II. ウイルス様粒子(VLP)の形成および放出
1つの態様において、本発明は、トランスフェクション細胞が基質タンパク質を発現し、パラミクソウイルスVLPを生成できるように、パラミクソウイルスMタンパク質のみをコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクションすることを意図する。別の態様において、本発明は、パラミクソウイルスVLPの形成および放出が起こるような条件下において、これらに限定されないが、NP、F-K115Q、および/またはHNタンパク質を含む2つまたはそれ以上のパラミクソウイルス糖タンパク質を(Mタンパク質と共に)同時発現させることを意図する。
【００６１】
本発明は、病原性パラミクソウイルス株のVLPの効率的産生のための条件を意図する。1つの態様において、パラミクソウイルス株は、これらに限定されないが、ニューカッスル病、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルスを含む群を含む。別の態様において、VLPは感染性ウイルスと同じ主要抗原を含む。別の態様において、VLPは感染性ウイルスと同じ比率の主要抗原を含む。1つの態様において、主要抗原は、ヌクレオカプシドタンパク質、膜/基質タンパク質、血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質、および融合タンパク質を含む群より選択される。
【００６２】
本発明の態様によるVLPの製造は、現在入手可能な生ウイルスワクチンまたは弱毒ウイルスワクチンよりもはるかに単純であり、費用効率がより良い可能性が高い。VLPは細胞上清から回収し、ウイルスを精製するのに用いられるのと同じ手順で精製することができる。VLPは免疫応答の範囲を増加させるように操作することができる。VLPはまた、その免疫応答が感染によって誘導されるものと識別できるように操作することも可能である。
【００６３】
A. VLP放出特性
1つの態様において、VLPは、パラミクソウイルスの主要構造タンパク質を同時発現する細胞から放出される。1つの態様において、NDV VLP粒子は、NP、M、F、およびHNタンパク質を同時発現するニワトリ線維芽細胞株から放出され、精製および特徴づけることができる。1つの態様において、非切断型のFタンパク質が、ウイルス放出に及ぼす細胞間融合の潜在的影響を排除する。1つの態様においては、鳥類がNDVの天然宿主であることから、鳥類細胞が用いられる。例えば、以下の実施例に詳述するように、感染細胞に匹敵する発現レベルおよびタンパク質比をもたらすようあらかじめ決定したDNA濃度を用いて、細胞(すなわち、例えば鳥類またはヒト)にNDVウイルスタンパク質をコードするプラスミドを同時トランスフェクションした。次いで細胞を35S-メチオニンおよび35S-システインでパルス標識し、その後8時間(最大の粒子放出をもたらす時間でもある)にわたり追跡した。細胞上清中のVLPを、ショ糖密度超遠心により単離し分画した。
【００６４】
1つの態様において、少なくとも4つのウイルスタンパク質を発現する細胞からのパラミクソウイルスVLP放出の効率(85%)は、パラミクソウイルス感染細胞からの感染性粒子放出の効率(92%)に匹敵した。本発明の機序を理解する必要はないが、この結果から、4つのパラミクソウイルスタンパク質(すなわち、例えばMタンパク質、NPタンパク質、Fタンパク質、またはHNタンパク質)により、粒子の効率的な形成がもたらされ得ることが示唆されると考えられる。ウイルスの大型ポリメラーゼまたはリンタンパク質のタンパク質がウイルス放出に定量的影響をほとんど及ぼさないこともさらに考えられる。
【００６５】
本発明の機序を理解する必要はないが、ショ糖勾配で単離され得るパラミクソウイルスVLPは、真のウイルスの平均密度よりもわずかに低い比較的均一な密度を有すると考えられる。本発明の機序を理解する必要はないが、この結果は、粒子中にウイルスゲノムRNAが存在しないことに起因する可能性が高いと考えられる。したがって、VLPは非感染性であるとさらに考えられる。
【００６６】
本発明の機序を理解する必要はないが、パラミクソウイルスVLPは、真のウイルスと実質的に等しい構造に折りたたまれる可能性が高く、パラミクソウイルス粒子と等しい様式で粒子中にパッケージングされると考えられる。結果として、これらの粒子は真のウイルスと同程度に抗原性であるはずである。しかし、これらの粒子を形成および放出する細胞(すなわち、例えば鳥類またはヒト)はウイルスに感染していないため、VLPはウイルスゲノムを含まない。したがって、VLPは感染性ではあり得ず、疾患を引き起こし得ない。
【００６７】
B. Mタンパク質機能
1つの態様において、パラミクソウイルスMタンパク質は、VLP粒子の放出に必要かつ十分である。1つの態様において、パラミクソウイルスは、これらに限定されないが、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザ3型、および呼吸器合胞体ウイルスを含む群より選択される。すなわち、Mタンパク質の発現のみによって、Mタンパク質を含むパラミクソウイルスVLP粒子の非常に効率的な放出が起こる。例えば、Mタンパク質放出の効率は、少なくとも4つのタンパク質を同時発現させた場合に観察される効率に匹敵する。本発明の機序を理解する必要はないが、この結果から、パラミクソウイルスVLPの出芽を導くものがMタンパク質であることが示唆されると考えられる。さらに、Mタンパク質のみが存在する場合にVLPが放出される。結果として、たとえウイルスタンパク質発現(または、ウイルスタンパク質の組み合わせの同時発現)が存在するとしても、Mタンパク質の非存在下では顕著なVLP粒子放出は起こらない。例えば、HNタンパク質のみを発現する細胞は、密度の非常に低い微量のHNタンパク質含有物質を細胞上清中に放出するにすぎず、この物質がウイルス集合の重要な要素を示す可能性は低い。1つの態様において、本発明は、Mタンパク質以外のいずれのNDVタンパク質も、ウイルス集合を反映する脂質含有粒子の放出において独立して機能し得ないことを意図する。
【００６８】
本発明の機序を理解する必要はないが、この出芽は異なった細胞膜から、または異なった原形質膜ドメインから無差別に起こり、結果として様々なMタンパク質オリゴマー化に起因して異なる脂質対タンパク質比を含むため、Mタンパク質のみを発現する細胞から放出されたVLP粒子は非常に不均一な密度を有すると考えられる。例えば、単量体Mタンパク質から形成された粒子は、オリゴマー状態のMタンパク質から形成された粒子よりも高い脂質対タンパク質比を有し得る。他のマイナス鎖RNAウイルスのMタンパク質がオリゴマー構造を形成し得ることが知られている。Garoff et al., 「Virus maturation by budding」 Microbiol Mol Biol Rev 62:1171-90 (1998)；およびPanch et al., 「In vivo oligomerization and raft localization of Ebola virus protein VP40 during vesicular budding」 Proc Natl Acad Sci USA 100:15936-41 (2003)。
【００６９】
C. 糖タンパク質機能
感染性パラミクソウイルスビリオンの形成は、HNおよびF糖タンパク質の両方の取り込みを伴うと考えられている。1つの態様において、本発明は、Mタンパク質を少なくとも2つの糖タンパク質と共に同時発現させた場合の、パラミクソウイルスVLPへの糖タンパク質取り込みを含む組成物を意図する。単一の糖タンパク質の同時発現(すなわち、例えばHN＋MまたはF＋M)では、VLP粒子への微量のHNまたはF糖タンパク質取り込みが起こるにすぎなかった。さらに、HNおよびF糖タンパク質をMタンパク質と共に同時発現させた場合、糖タンパク質取り込みレベルは、少なくとも4つのタンパク質の同時発現で観察されるレベルに匹敵するものであった。
【００７０】
本発明の機序を理解する必要はないが、これらの結果から、Mタンパク質がHNおよびF糖タンパク質の複合体とより効率的に結合することが示されると考えられる。この可能性はまた、これらの2つの糖タンパク質をMタンパク質と共に同時発現させた場合に、密度がより均一でかつ低いパラミクソウイルスVLPが得られたという知見によって支持される。Mタンパク質VLP粒子は一般に、非常に不均一な密度を有する。Mタンパク質といずれかの糖タンパク質のみを同時発現させても、Mタンパク質含有粒子の全体的な密度に変化はなかった。これらの結果から、Mタンパク質とHN-Fタンパク質複合体との相互作用がVLPのタンパク質対脂質比に影響したか、または粒子が放出される膜に影響したことが示されると考えられる。
【００７１】
Mタンパク質とウイルス糖タンパク質の任意の組み合わせのみでは、本明細書で意図するように良好な収率でパラミクソウイルスVLPが産生されないことに留意されたい。例えば、単一の糖タンパク質およびMタンパク質の同時発現では、(i)4つのタンパク質すべてによる同時発現；(ii)Mタンパク質と少なくとも2つの糖タンパク質の発現；および(iii)Mタンパク質のみの発現の後に観察されるVLP放出と比較して、40〜60%のVLP放出抑制が起こる。実証的研究から、この放出抑制が、Mタンパク質とNPおよび別の糖タンパク質との同時発現によって軽減されることが明らかになった。
【００７２】
本発明の機序を理解する必要はないが、単一の糖タンパク質＋Mタンパク質によるVLP放出抑制は、NP＋Mタンパク質VLP放出が、(i)少なくとも4つのタンパク質を発現する細胞からの放出と比較した場合に70%低い；および(ii)Mタンパク質のみを発現する細胞からの放出と比較した場合に80%低いという知見と一致する。本発明の機序を理解する必要はないが、細胞質中の大量のNPが原形質膜からMタンパク質を引き離す可能性があり、それによってMタンパク質とこの膜との会合、ひいては粒子の出芽が妨げられると考えられる。結果として、1つの仮説により、別の糖タンパク質との同時発現によってNPおよびMタンパク質が細胞膜へ再度方向づけられ、よってVLP放出抑制が軽減されることが示唆される。
【００７３】
D. 液胞タンパク質選別(VPS)系および多胞性芽(Multivesicular Bud；MVB)
本発明の機序を理解する必要はないが、パラミクソウイルスMタンパク質に依存的なVLP放出は、宿主の液胞タンパク質選別(VPS)系を用いると考えられる。VPS系は、エンベロープを有する他のウイルスの出芽を媒介することが報告されている。Morita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004)；およびPornillos et al., 「Mechanisms of enveloped RNA virus budding」 Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002)。
【００７４】
レトロウイルス、フィロウイルス、およびインフルエンザウイルスの出芽は、宿主細胞のVPS経路に依存すると考えられている。VPS経路はまた、MVBを形成する働きをする。Demirov et al., 「Retrovirus budding」 Virus Res 106:87 - 102 (2004)；Jasenosky et al., 「Filovirus budding」 Virus Res. 106:1B1-8 (2004)；Morita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004)；Pornillos et al., 「Mechanisms of enveloped RNA virus budding」 Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002)；Freed, E. O., 「Viral late domains」 J. Virol. 76:4679-87 (2002)；およびSchmitt et al., 「Escaping from the cell: assembly and budding of negative-strand RNA viruses」 Cuff Top Microbiol Immunol 283:145-96 (2004)。MVBは、エンドソーム内腔にエンドソーム膜が陥入し、それによって小胞内に小胞が生成されることによって形成される。Martindale, D., 「Budding viral hijackers co-opt the endocytic machinery to make a getaway」 J Biol. 3:2 (2003)。MVB形成のトポロジーは、形質膜からのウイルスの出芽のものと類似している。
【００７５】
ウイルスタンパク質はこの宿主細胞の機構を奪って、ウイルスの出芽を導くと提唱されている。Demirov et al., 「Retrovirus budding」 Virus Res 106:87 - 102 (2004)；Martindale, D., 「Budding viral hijackers co-opt the endocytic machinery to make a getaway」 J Biol. 3:2 (2003)；およびMorita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004)。現在、研究から、MVBの形成が、最初に酵母で特徴づけられ、まとめてエンドソーム選別輸送複合体(すなわち、例えばESCRT I、II、およびIII)として知られる3つのタンパク質複合体を伴うことが示唆される。Babst et al., 「ESCRT -III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex 4 required for MVB sorting」 Dev Cell 3:271-282 (2002)；Jiang et al., 「Multivesicular bodies: a mechanism to package lytic and storage functions in one organelle?」 Trends Cell Biol. 12:362-7 (2002)；Katzmann et al., 「Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex, ESCRT-I」 Cell 106:145-55 (2001)；およびKatzmann et al., 「Vps27 recruits ESCRT machinery to endosomes during MVB sorting」 J Cell Biol. 162:413-23 (2003)。加えて、Vps4タンパク質(すなわち、例えばATPアーゼ)が全ESCRT複合体の解離に必要とされる。Raiborg et al., 「Protein sorting into multivesicular endosomes」 Cuff Opin Cell Biol 15:446-55 (2003)。
【００７６】
E. VLP放出阻害
いくつかのウイルス型、最も顕著にはレトロウイルスの研究から、MVBの形成に関与する細胞タンパク質が、後期ドメインとVPS経路の成分との相互作用により、レトロウイルスgagタンパク質および他の基質様タンパク質によって動員されることが示されている。Demirov et al., 「Retrovirus budding」 Virus Res 106:87 - 102 (2004)；Morita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004)；Pornillos et al., 「Mechanisms of enveloped RNA virus budding」 Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002)；44。Vps4、CHMP3、およびCHMP2のドミナントネガティブ変異体がレトロウイルス放出を阻止し得ることが見出されている。Strack et al., 「PIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1p6 and EIAV p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-699 (2003)。
【００７７】
本発明の機序を理解する必要はないが、Vps4のドミナントネガティブ変異体またはVps4 A-E228Qは、Mタンパク質パラミクソウイルスVLP放出を阻止し得ると考えられる。CHMP3(すなわち、例えばESCRT III複合体のサブユニット)のドミナントネガティブ変異体は、Mタンパク質パラミクソウイルスVLP放出を阻害するとさらに考えられる。これらの知見から、VPS経路がパラミクソウイルスの出芽(すなわち、例えばVLP放出)に関与していることのみならず、VPS経路と直接相互作用するのがMタンパク質であることが示される。
【００７８】
最近、SV5 VLPおよびビリオンの放出もまた、VSP4のドミナントネガティブ型の発現によって阻害されることが報告され、VPS経路がSV5の集合および放出に関連づけられる。Schmitt et al., 「Evidence for a new viral late-domain core sequence, FPIV, necessary for budding of a paramyxovirus」 J. Virol. 79:2988-97 (2005)。さらに、SV5 Mタンパク質中の配列FPIV(配列番号:1)が後期ドメインであると考えられている。しかし、SV5 Mタンパク質は、粒子放出には十分でないことが知られている。Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus virus-like particles」 J Virol 76:3952-64 (2002)。したがって、いかにしてSV5がVPS経路を用いるのか、またはいかにしてこの配列が後期ドメインとして機能し得るのかは不明である。
【００７９】
1つの態様において、NDV Mタンパク質の配列解析からも、FPIVモチーフ(配列番号:1)の存在が示される。1つの態様において、NDV Mタンパク質は、SV5 Mタンパク質中には見出されないPXXPモチーフ(配列番号:2)およびYXXLモチーフ(配列番号:3)をさらに含む。当技術分野において同定される他のモチーフもまた、他のパラミクソウイルスMタンパク質の候補後期ドメイン、すなわち他のウイルスタンパク質に依存せずに出芽において機能し得るドメインであり得る。Demirov et al., 「Retrovirus budding」 Virus Res 106:87 - 102 (2004)；およびFreed, E. O., 「Viral late domains」 J. Virol. 76:4679-87 (2002)。
【００８０】
F. 宿主特異的VLP発現
18%〜70%の効率での、ヒト293T細胞からのウイルス様粒子発現が、3つの他のパラミクソウイルス系(センダイウイルス(SV)、PIV1、およびSV5)で報告されている。Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus virus-like particles」 J Virol 76:3952-64 (2002)；Sugahara et al., 「Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by expression of multiple viral proteins and acceleration of its release by C protein」 Virology 325:1-10 (2004)；およびTakimoto et al., 「Role of matrix and fusion proteins in budding of Sendai virus」 J. Virol. 75: 11384- 91 (2001)。
【００８１】
1つの態様において、本発明は、ウイルスの天然宿主由来の細胞を用いることにより、パラミクソウイルスVLP放出の効率を改善する段階を含む方法を意図する。1つの態様において、パラミクソウイルスは、これらに限定されないが、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルスを含む群より選択される。1つの態様において、Mタンパク質パラミクソウイルスVLPは、90%の効率で鳥類細胞から放出される。別の態様において、Mタンパク質パラミクソウイルスVLPは、50%の効率でヒト293T細胞から放出される。さらに、Mタンパク質VLPおよび完全VLPのCOS細胞からの放出の効率は、鳥類細胞からの放出よりも有意に低かった；差は、鳥類細胞に対してCOS細胞におけるウイルスタンパク質の発現レベルが低いためではない。本発明の機序を理解する必要はないが、パラミクソウイルスVLP形成における効率の間の差は、宿主細胞特異的依存性に起因し得ると考えられる。
【００８２】
他のパラミクソウイルス系におけるVLP形成に対するタンパク質の必要性もまた異なることが知られている。例えば、SV、hPIV1、およびSV5のMタンパク質を含むパラミクソウイルス系は、ウイルスの集合および出芽の誘導に関与していると見なされるが、実際の粒子形成におけるMタンパク質の役割には差がある。Coronel et al., 「Human parainfluenza virus type 1 matrix and nucleoprotein genes transiently expressed in 12 mammalian cells induce the release of virus-like particles containing 13 nucleocapsid-like structures」 J. Virol. 73:7035-8 (1999)；Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus virus-like particles」 J Virol 76:3952-64 (2002)；Sugahara et al., 「Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by expression of multiple viral proteins and acceleration of its release by C protein」 Virology 325:1-10 (2004)；およびTakimoto et al., 「Role of matrix and fusion proteins in budding of Sendai virus」 J. Virol. 75: 11384- 91 (2001)。NDV Mタンパク質と同様に、SVおよびhPIV1 Mタンパク質は粒子放出に十分であったが、SV5 Mタンパク質は十分ではなかった。SV5 VLPの効率的な形成および放出には、SV5 Mタンパク質のNPおよび少なくとも1つの糖タンパク質との同時発現が必要であった。Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus virus-like particles」 J Virol 76:3952-64 (2002)。
【００８３】
1つの態様において、本発明は、他のパラミクソウイルスタンパク質を伴わずにMタンパク質のみでVLP粒子放出を誘導できることを意図する。以前の研究から、SV Fタンパク質が、Fタンパク質のみを含む小胞の放出により実証される自発的エキソサイトーシス活性を示し得ることが示されている。Sugahara et al., 「Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by expression of multiple viral proteins and acceleration of its release by C protein」 Virology 325:1-10 (2004)；およびTakimoto et al., 「Role of matrix and fusion proteins in budding of Sendai virus」 J. Virol. 75: 11384- 91 (2001)。
【００８４】
対照的に、NDV Fタンパク質のみを発現する本発明によって意図される細胞はFタンパク質含有物質を放出せず、HNタンパク質のみを発現する細胞は、密度の非常に低い微量のHNタンパク質含有物質を細胞上清中に放出するにすぎなかった。これらの知見は、SV5 FまたはHN糖タンパク質のみの発現では、VLP粒子放出が起きなかったことを示す他の報告と類似している。Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus virus-like particles」 J Virol 76:3952-64 (2002)。本発明の機序を理解する必要はないが、SV Fおよびエンベロープを有する他のマイナス鎖ウイルス糖タンパク質が出芽活性を表すことが示されているという知見にも関わらず、いずれのウイルス糖タンパク質中にも後期ドメインが同定されていないと考えられる。Schmitt et al., 「Escaping from the cell: assembly and budding of negative-strand RNA viruses」 Cuff Top Microbiol Immunol 283:145-96 (2004)。
【００８５】
Mタンパク質およびNPの同時発現を含む本発明の態様もまた、SV系で報告されているものと対照的である。例えば、SV MおよびNPの同時発現は、両ウイルスタンパク質を含むVLPの放出をもたらすことが知られている。Sugahara et al., 「Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by expression of multiple viral proteins and acceleration of its release by C protein」 Virology 325:1-10 (2004)。
【００８６】
G. タンパク質間相互作用
本発明は、粒子の集合および放出における各パラミクソウイルスタンパク質の役割を明らかにするために、原型パラミクソウイルスとしてNDVを用いることを意図する。いくつかの態様ではこのモデルを使用して、ウイルスタンパク質の種々の組み合わせによって形成されたVLPにおけるタンパク質間相互作用の特徴づけにより、VLPの集合および放出に対するウイルスタンパク質の必要性の定義をまとめる。
【００８７】
さらに、いくつかの態様において、本発明は、原形質膜におけるMタンパク質とウイルス糖タンパク質との共局在を意図する。本発明の機序を理解する必要はないが、本明細書に提示するデータから、粒子集合が特定のタンパク質間相互作用のネットワークを伴い、またタンパク質の特定の細胞ドメインへの正確な標的化を伴う可能性が高いことが示されると考えられる。
【００８８】
1つの態様において、本発明は、VLPタンパク質相互作用が3つおよび4つのタンパク質のすべての組み合わせにより生じる(すなわち、例えば、共免疫沈降によって明らかにされる場合)ことを意図する。別の態様においては、細胞表面HNおよびFタンパク質は、MおよびNPタンパク質と種々の組み合わせで発現された場合にMタンパク質と共局在する。別の態様においては、2つのウイルスタンパク質とMタンパク質との同時発現によってまた、原形質膜におけるMタンパク質とHNまたはFタンパク質との共局在が有意に増加し、Mタンパク質との相互作用の増加が示される。
【００８９】
これらのタンパク質間相互作用を明らかにするため、3つおよび4つのタンパク質の種々の組み合わせによって形成されたVLPを非イオン性界面活性剤で可溶化し、M、HN、またはFタンパク質に対する単一特異的抗体の混合物でタンパク質を沈降させた。最初に、各抗体混合物によって、M、HN、F、およびNPで形成されたVLPからすべてのタンパク質が沈降したが、各タンパク質の沈降効率は抗体特異性によって異なった。本発明の機序を理解する必要はないが、これらの結果は、1つが沈降することで、沈降したタンパク質にどの程度直接的にタンパク質が結合していたかによって異なる効率で他の3つのタンパク質の沈降が起こるような4つすべてのタンパク質間の相互作用のネットワークと一致すると考えられる。
【００９０】
3つのタンパク質のすべての組み合わせによって形成されたVLPからタンパク質を免疫沈降させることにより、タンパク質間相互作用をより明確に示した。これらの結果から、HNタンパク質とMタンパク質、NPとMタンパク質、およびFタンパク質とNPとの特異的相互作用が示される。(図66を参照されたい)。Fタンパク質とMタンパク質との直接的相互作用は直接観察されなかったが、抗Fタンパク質抗体によって、M、HN、およびFタンパク質を含むVLPからHNタンパク質が沈降したことから、Fタンパク質とHNタンパク質との間に弱い相互作用が存在する可能がある。Fタンパク質とMタンパク質が相互作用できないと思われることにより、Fタンパク質のこれらVLPへの取り込みは、HNタンパク質との相互作用により媒介され得ることが示唆される。または、HNタンパク質とNPとの相互作用も同様に、取り込み過程を促進する可能性がある。
【００９１】
したがって、4つのタンパク質をすべて同時発現させる場合、NPおよびHNタンパク質は、Mタンパク質との直接的相互作用によってVLPに取り込まれる。(図66を参照されたい)。本発明の機序を理解する必要はないが、Fタンパク質は、NPおよびHNタンパク質との相互作用によって間接的に取り込まれる可能性が高いと考えられる。4つのタンパク質の規則正しい複合体は、4つのタンパク質をすべて同時発現させた場合の、原形質膜におけるMタンパク質とFタンパク質およびMタンパク質とHNタンパク質との共局在によって支持されるとさらに考えられる。
【００９２】
しかし、FのみをMタンパク質と共に発現させる場合、これらの2つのタンパク質間に直接的相互作用は見出されないため、Fタンパク質はVLPに顕著に取り込まれない可能性が高かった(図66を参照されたい)。これらの細胞の原形質膜にはFおよびMタンパク質が共局在していなかったという知見がこの結論を支持する。
【００９３】
MとNPは直接結合するにも関わらず、NPおよびMタンパク質を対の組み合わせとして同時発現させた場合、NPタンパク質はVLPにほとんど取り込まれなかった。以前の報告から、センダイウイルスのMタンパク質がウイルスヌクレオカプシドによって細胞質中に動員されることが示されている。Stricker et al., 「The Sendai virus matrix protein appears to be recruited in the cytoplasm by the viral nucleocapsid to function in viral assembly and budding」 J Gen Virol 75 (Pt 5):1031-1042 (1994)。おそらく、NPはMタンパク質のこの区画への再標的化を引き起こす。実際に、Mタンパク質とNPとの同時発現により、Mタンパク質含有VLPの放出は2.5倍抑制され、この結果はまた、NPタンパク質による細胞中でのMタンパク質の保持とも一致する。
【００９４】
M、HN、およびFタンパク質によって形成されたVLPタンパク質の共免疫沈降により、HNタンパク質とMタンパク質との直接的相互作用が示されたが、HNおよびMタンパク質を対の組み合わせとして同時発現させた場合、HNタンパク質のVLPへの取り込みは低レベルにすぎなかった。さらに、原形質膜における2つのタンパク質の共局在はほとんど観察されなかった。おそらく、他のタンパク質の非存在下において、HNおよびMタンパク質は、細胞の同じ領域での最小の共局在を示し、よってそれらの結合が妨げられる。または、HNタンパク質の膜貫通または細胞質尾部の構造が、Fタンパク質またはNPタンパク質の発現の非存在下において異なり、HNタンパク質とMタンパク質との結合が阻害される可能性もある。HNタンパク質とMタンパク質との同時発現においてMタンパク質VLPが50%減少することは、現在説明することはできないが、同様の結果がセンダイウイルス系においても以前に報告されている。Sugahara et al., 「Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by expression of multiple viral proteins and acceleration of its release by C protein」 Virology 325:1-10 (2004)。
【００９５】
精製VLPの製造に免疫沈降が必要ないことが認識されるべきである。1つの態様において、本発明は、純粋なウイルスタンパク質を含むVLP調製物を意図する。精製NDV全ウイルスと、免疫沈降を行わなかったVLPとの間でタンパク質組成を比較した。データから、VLP調製物が、全ウイルス調製物中に存在しないタンパク質を全く含んでいないことが示される。図72を参照されたい。結果として、VLPは全ウイルスと同程度に純粋である。
【００９６】
本発明の機序を理解する必要はないが、NP、M、およびFタンパク質によって形成されたVLPは、MとNPとの相互作用およびFとNPとの相互作用に起因する可能性が高い(図66を参照されたい)。例えば、Fタンパク質はNPを原形質膜に移行させ、Fタンパク質を含む特定ドメインにMを引き付ける可能性がある。実際に、本明細書に提示するデータから、NPの付加によって、原形質膜におけるMタンパク質とFタンパク質の共局在が増加することが示される。NP、M、およびHNタンパク質によって形成されるVLPは、HNタンパク質およびNPとMタンパク質との相互作用によって形成される可能性が高いことがさらに考えられる。本明細書に提示するデータから、NPとHNおよびMタンパク質との発現によって、原形質膜におけるMおよびHNタンパク質の共局在が増加することが示される。考えられ得る1つの仮説から、NP-Mタンパク質相互作用によりMの構造が変化し、それによってMタンパク質とHNタンパク質との相互作用が促進されることが示唆される。実際に、NPの存在下における表面HNタンパク質は、細胞端に沿ってより強調して見える。
【００９７】
上記で提唱した相互作用のこのネットワークは、HNおよびFタンパク質の細胞質ドメイン(CT)が重複した機能を有するという結論を説明し得る。Schmitt et al., 「Requirements for budding of paramyxovirus simian virus 5 virus-like particles」 J Virol 76:3952-3964 (2002)。例えば、Fタンパク質のCTドメインは、NPタンパク質との相互作用によりNP-M複合体を原形質膜に標的化することができ、一方HNタンパク質CTドメインは、Mタンパク質との直接的相互作用によりこれらの複合体を標的化する。
【００９８】
本明細書におけるデータによって示唆されるMタンパク質とNPの相互作用は、センダイウイルスを用いた研究によって支持される。Stricker et al., 「The Sendai virus matrix protein appears to be recruited in the cytoplasm by the viral nucleocapsid to function in viral assembly and budding」 J Gen Virol 75 (Pt 5):1031-1042 (1994)。さらに、HNタンパク質と他のウイルスタンパク質との潜在的相互作用は、パラミクソウイルス感染細胞における、またはパラミクソウイルスcDNAをトランスフェクションした細胞におけるMタンパク質とウイルス糖タンパク質との相互作用を示唆する多くの研究と一致する。Ali et al., 「Assembly of Sendai virus: M protein interacts with F and HN proteins and with the cytoplasmic tail and transmembrane domain of F protein」 Virology 276:289-303 (2000)；Ghildyal et al., 「Interaction between the respiratory syncytial virus G glycoprotein cytoplasmic domain and the matrix protein」 J Gen Virol 86:1879-1884 (2005)；Henderson et al., 「Sorting of the respiratory syncytial virus matrix protein into detergent-resistant structures is dependent on cell-surface expression of the glycoproteins」 Virology 300:244-254 (2002)；Sanderson et al., 「Sendai virus assembly: M protein binds to viral glycoproteins in transit through the secretory pathway」 J Virol 67:651-663 (1993)；およびYoshida et al., 「Membrane (M)protein of HVJ (Sendai virus)- Its role in virus assembly」 Virology 71 : 143-161 (1976)。実際に、呼吸器合胞体ウイルスGタンパク質がMタンパク質と特異的に相互作用することが報告されている。しかし、Fタンパク質とNPとの直接的相互作用は以前に報告されていない。ウイルスタンパク質間の相互作用はパラミクソウイルス内で異なり、VLPの形成に対する必要性はウイルスタンパク質における後期ドメインの分布に依存し得る可能性がある。本明細書において提示する結果は、NDV Mタンパク質が、他のウイルスタンパク質の非存在下において、異なった細胞膜から無差別に出芽し放出されるという提唱と一致する。本発明の機序を理解する必要はないが、糖タンパク質およびMタンパク質の両方が原形質膜に存在する場合、Mタンパク質-原形質膜会合の安定性が改善されると考えられる。NPのFおよびMタンパク質との結合によっても、集合粒子内の相互作用のネットワークがさらに安定化および組織化され得るとさらに考えられる。
【００９９】
全ウイルス(B1)と、Mタンパク質のみから形成されたVLP、ならびにNP、M、F、およびHNタンパク質によって形成されたVLPの電子顕微鏡写真を比較した知見から、タンパク質間相互作用ネットワーク仮説が支持された。図73を参照されたい。4つのウイルスタンパク質がすべて存在する場合、VLPの大きさおよび形状は全ウイルスに非常に類似している。しかし、Mタンパク質のみのVLPの大きさおよび形状は、全ウイルスと比較した場合により不均一であるが、なお顕著に類似している。
【０１００】
1つの態様において、本発明はNDVのVLP産生系を意図する。1つの態様においては、Mタンパク質の非存在下においてNDV VLPの出芽が実質的に存在しないように、Mタンパク質がNDV VLPの出芽を促進する。他の態様においては、粒子の規則正しい集合に関与する特異的タンパク質相互作用がVLPにおいて起こる。1つの態様においては、MとHNまたはFとNPの相互作用によって、原形質膜における集合部位へのMおよびNPの標的化が導かれる。
【０１０１】
III. パラミクソウイルス疾患
本発明は、NDV、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、および呼吸器合胞体パラミクソウイルス疾患に限定されない。多くの他のパラミクソウイルス疾患もまた本発明の範囲内である。例えば、ヒト疾患(表1参照)および動物疾患(表2参照)の両方が意図される。
【０１０２】
(表１）VLPワクチン接種に感受性のあるパラミクソウイルス媒介性ヒト疾患
2009502204.tif 000002
【０１０３】
(表２）VLPワクチン接種に感受性のあるパラミクソウイルス媒介性動物疾患
2009502204.tif 000003
【０１０４】
A. ニューカッスル病
ニューカッスル病ウイルス(NDV)は鳥類病原体である。このウイルスには様々な株が存在し、世界の多くの地域で単離されている。非病原性の株もあり、これは弱毒生ワクチンとして用いられる。その他の株は病原性であり、鳥類に致死率の高い重篤な全身性疾患を引き起こす。養鶏業に対する脅威から、米国政府は愛国者法の下、病原性NDV株を指定病原体として分類した。
【０１０５】
米国のニワトリはほとんどが、非病原性NDV株のワクチン接種を受ける。しかし、現在のワクチンは理想的ではない。弱毒生ウイルスのワクチンはニワトリに感染し、軽度の呼吸器疾患を引き起こす。結果として、ワクチン接種を受けたトリはワクチン接種していないトリよりも体重が軽く、産卵数が少ない。そのため、多くの他の国々ではNDVに対するワクチン接種を行っていない。したがって、これらの国々では疾患が周期的に大発生し、疾患を封じ込めるために大量のトリが処分される。ワクチン接種したニワトリの一群も、いくつかのNDV病原性株に感染しやすい場合がある。その結果、米国ではニューカッスル病ウイルスの大発生が起こっている。例えば、2001〜2002年にカリフォルニア州でNDVの大発生が起こった。
【０１０６】
生産性に悪い結果を招くことなく、現在用いられているワクチンよりも広範囲の防御を誘導し得るNDVワクチンが必要である。
【０１０７】
鳥類におけるNDVの臨床的証拠には、これらに限定されないが、呼吸器系、神経系、および胃腸系が含まれる。ニューカッスル病を示唆する臨床的徴候は、主にひな鳥において観察される。一般的症状には、これらに限定されないが、歩行または飛行不能、円状歩行、麻痺、斜頸、抑欝、および高頻度の突然死が含まれる。哺乳動物におけるニューカッスル病の症状には、これに限定されないが急性結膜炎が含まれ得る。
【０１０８】
現在用いられているNDVワクチンの重大な問題は、すべてのNDV株に対して防御できないことである。現在、鳥類の一群にワクチン接種するのに、不活化NDVワクチン(すなわち、弱毒化)が用いられる場合がある。生ウイルスワクチン接種の有害な影響は排除されるものの、これらのワクチンは広範囲の免疫応答を刺激しないという欠点をなお有している。さらに、不完全な弱毒化のために、ワクチン接種を受けた鳥類の一定の割合がニューカッスル病にかかる。これらのワクチンはまた、不活化に必要な操作の増加および不活化の有効性のモニタリングのために、本発明によって意図される態様よりも高価である。
【０１０９】
現在用いられているワクチン、生ワクチン、または不活化ワクチンの別の問題は、ワクチン接種をした鳥類と、野生型ウイルスに感染した鳥類との識別が困難な点である。本発明は、配列タグを含む、VLP調製物中に取り込まれた抗原を意図する。1つの態様において、配列タグはインビボで検出することができ、それによってワクチン接種した動物が同定され得る。
【０１１０】
B. 麻疹
麻疹は、発熱、咳、鼻感冒(すなわち、例えば上気道の感染症または炎症)、および多くの場合に結膜炎、ならびにその後の斑状丘疹状皮疹を特徴とする小児期感染症であると考えられている。疾患の重症度は、ウイルス株および感染した小児の健康状態によって異なることが観察されている。大部分の小児は完全に回復する。しかし、様々な重症度の神経学的合併症が低い発生率で起こる。さらに、栄養不良状態または根底にある別の疾患により、疾患の重症度が顕著に増加し得る。加えて、感染は免疫抑制性であり、特に第三世界の状況では、小児は生命に関わる他の感染症に罹患しやすくなる。
【０１１１】
現在用いられているワクチンは、防御免疫応答の生成に有効である弱毒生ウイルスである。しかし、免疫化の年齢に問題がある。ワクチン接種が早すぎると、母親由来の抗体のために抗体応答が弱くなる。この影響を克服するために用量を増加させると免疫抑制が起こり、生命に関わる可能性のある他の感染症に罹患しやすくなる。遅い時期でのワクチン接種は、幼児を、免疫化の前であって母親由来の抗体のレベルが減少した後に、疾患にかかるリスクにさらすことになる。したがって、母親由来の抗体に対抗して有効な免疫応答を生じるワクチン、より重要なことには、あらゆる用量で免疫抑制性とならないワクチンの必要性が存在する。1つの態様において、本発明はVLPがそのようなワクチンの候補であることを意図する。
【０１１２】
本発明の特定の態様は、麻疹ウイルスから哺乳動物を防御するための安全で広域性でありかつ有効なワクチンとして、ウイルス様粒子(VLP)を提供する。さらに、これらの態様は、麻疹VLPワクチンの大規模で経済的な生産のための系および手順を提供する(すなわち、例えば、ワクチンとして有用であるために、VLP生産は容易かつ経済的でなければならない)。
【０１１３】
本発明は、麻疹ウイルス株のVLPを生成するための条件を意図する。別の態様において、VLPは感染性ウイルスと同じ主要抗原を含む(しかし、当然のことながら完全なウイルスゲノムを欠いている)。別の態様において、VLPは感染性ウイルスと同じ比率の主要抗原を含む。1つの態様において、主要抗原は、ヌクレオカプシドタンパク質、膜/基質タンパク質、血球凝集素タンパク質、および融合タンパク質を含む群より選択される。
【０１１４】
本発明の他の態様は、単一のVLP調製物中に取り込まれ得る、多くの異なる麻疹株に由来する抗原を提供する。現在用いられている麻疹ワクチンの重大な問題は、すべての麻疹株に対して防御できないことである。
【０１１５】
麻疹は、これらに限定さないが、発熱、咳、結膜炎(すなわち、眼の膜における発赤および炎症)、および発疹の広がりを含む一次症状を有する伝染性の高いウイルス性疾患であると考えられている。ウイルス感染は、感染した人の鼻、口、または咽頭からの飛沫との接触によって伝播し得る。症状が一般に現れるまでの潜伏期間は8〜12日である。
【０１１６】
ワクチン接種または活動性感染後に、疾患に対する免疫が起こる。現在、ワクチン接種は、ワクチン接種を受けた対象に麻疹を引き起こす重大なリスクを有する弱毒生ウイルスに限定されている。さらに、麻疹-流行性耳下腺炎-風疹ワクチンが自閉症を引き起こし得ると考えている人もいる。免疫化が広く普及するまでは、麻疹は小児期によく見られ、人口の大部分が20歳までに感染していた。米国およびカナダでは、免疫化の普及により、麻疹の症例はここ数十年の間に実質的に皆無にまで減少したが、現在その割合は上昇している。したがって、社会不安によりワクチン接種率が下がり、麻疹、流行性耳下腺炎、および風疹の大発生を引き起こし得る--これは重大なことになりかねない。本発明の1つの態様の1つの利点は、VLP非複製性麻疹ワクチンが感染のリスクを伴わないということである。したがって、VLPワクチンは、非常に高い服薬率をもたらすと予測され、それに続いて麻疹の発生率も劇的に減少するはずである。
【０１１７】
1つの態様において、麻疹の症状には、これらに限定されないが、咽頭炎、鼻汁、咳、筋肉痛、発熱、眼の充血、口腔内の小さな白い斑点(コプリック斑と称される)、羞明(光感受性)、通常は頭部から始まり下方に進行して他の部分に広まり、さらには痒みを伴い得る、疾患のおよそ5日目に現れ4〜7日間持続する発疹(発疹は、斑(平らな変色した部分)および丘疹(硬く赤く隆起した部位)として現れ、後に共に融合する(融合性)斑状丘疹状皮疹であり得る)が含まれる。
【０１１８】
麻疹の特定の治療法は存在しないが、小児によってはビタミンAの補給を必要とする場合がある。症状は、安静、アセトアミノフェン、および加湿空気によって軽減され得る。合併症のない症例では、転帰は良好であると考えられる。しかし、肺炎または脳炎が合併症として起こる可能性がある。
【０１１９】
C. 呼吸器合胞体ウイルス
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、世界的に、幼児および低年齢小児の呼吸器感染症による入院の最も一般的な単一の原因であると考えられている。再感染もまたよく起こる。全幼児人口のRSV発病率は100%〜83%と推定され、これらのうちのおよそ50%は生後2年間の間に2回またはそれ以上の感染を経験する(Collins, et al, Respiratory Syncytial Virus, Fields Virology, Ed. Knipe, D. and Howley, P. Lippincott Williams and Wilkins, 2001に概説されている)。RSVはまた、高齢者に対する深刻な病原体として認識が高まっている。
【０１２０】
現在、この病原体に対して利用できるワクチンは存在しない。ホルマリン不活化ウイルス調製物による初期の試みは、生ウイルスに対する曝露時に疾患の重症度を高める破滅的な影響をもたらした。加えて、タンパク質サブユニットワクチンも、実験動物において同様の影響をもたらした。ホルマリン処理により、または個々のタンパク質の発現および精製により誘導された異常な構造をしたタンパク質が、防御免疫応答を刺激するエピトープの欠如をもたらしたと推測される。動物試験から、免疫病理が免疫細胞によるものであることが示唆された(Collins, et al, Respiratory Syncytial Virus, Fields Virology, Ed. Knipe, D. and Howley, P. Lippincott Williams and Wilkins, 2001に概説されている)。RSVタンパク質によって形成されたVLPは、ウイルスタンパク質をそれらの天然構造として取り込む可能性が高い。これらの免疫原は、防御免疫応答を刺激する可能性、および折りたたみ構造がほどけたタンパク質の有害作用を回避する可能性を有する。
【０１２１】
本発明の特定の態様は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)から哺乳動物を防御するための安全で広域性でありかつ有効なワクチンとして、ウイルス様粒子(VLP)を提供する。さらに、これらの態様は、RSV VLPワクチンの大規模で経済的な生産のための系および手順を提供する(すなわち、例えば、ワクチンとして有用であるために、VLP生産は容易かつ経済的でなければならない)。
【０１２２】
本発明は、病原性RSV株のVLPを効率的に生成するための条件を提供する。別の態様において、VLPは感染性ウイルスと同じ主要抗原を含む。別の態様において、VLPは感染性ウイルスと同じ比率の主要抗原を含む。1つの態様において、主要抗原は、ヌクレオカプシドタンパク質、膜/基質タンパク質、Gまたは付着タンパク質、および融合タンパク質を含む群より選択される。
【０１２３】
本発明の他の態様は、単一のVLP調製物中に取り込まれ得る、多くの異なるRSV株に由来する抗原を提供する。現在用いられているRSVワクチンの重大な問題は、すべてのRSV株に対して防御できないことである。
【０１２４】
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、成人および健常な年長児に軽度の感冒様症状を引き起こす非常に一般的なウイルスであると考えられている。RSVは、幼い乳児、特に心疾患もしくは肺疾患を有するまたは免疫障害を有する未熟児で生まれた幼い乳児に重篤な呼吸器感染症を引き起こし得る。
【０１２５】
RSVは、幼児および低年齢小児において最もよく見られる呼吸器病原体であると考えられている。具体的には、RSVは2歳までのほぼすべての幼児に感染すると考えられている。各地域において多少予測可能なスケジュールで、急性呼吸器疾患の季節的な大発生が毎年起こる。季節は典型的に秋に始まり、春まで続く。
【０１２６】
RSVは、これらに限定されないが、感染対象との接触、キス、および握手を含む身体的接触により容易に伝播し得る。本発明の機序を理解する必要はないが、RSVの伝染は通常、極めて小さな飛沫を含み得る汚染分泌物、または飛沫が接触した物体との接触によると考えられている。RSVは、皮膚表面上で30分間またはそれ以上生存し得る。RSVはまた、調理台上で最長5時間、および使用済みティッシュペーパー上で数時間生存することができ、そのためRSVは、込み入った居住場所およびデイケアセンターで非常に急速に伝播する場合が多いとも考えられている。
【０１２７】
1つの態様において、本発明は、これらに限定されないが、肺炎、細気管支炎(肺の末梢気道の炎症)、および気管気管支炎(クループ)などの幼児および若年成人における疾患の発症を予防するVLP RSVワクチンを意図する。1つの態様において、本発明は、健常な成人および年長児における軽度の呼吸器疾患の発症を予防するVLP RSVワクチンを意図する。
【０１２８】
安全かつ有効なRSVワクチンの欠如は、重大な公衆安全衛生のリスクをもたらす。例えば、毎年、最大125,000人の幼児が重篤なRSV疾患のために入院し、これらの幼児のうちの約1〜2%が死亡すると考えられている。さらに、(i)未熟児で生まれた幼児；(ii)慢性肺疾患に罹患している幼児；(iii)免疫障害を有する幼児；または(iv)特定の形態の心疾患に罹患している幼児は、重篤なRSV疾患のリスクが高い。たばこの煙に曝露されている、デイケアに参加している、混雑した状況で暮らしている、または学齢期の兄弟を有する成人でさえもまた、RSVに罹患するリスクが高い。
【０１２９】
1つの態様において、本発明は、これらに限定されないが、鼻づまり、鼻の発赤、呼吸促迫(頻呼吸)、呼吸困難または努力性呼吸、息切れ、チアノーゼ(酸素の欠如によって起こる皮膚の青色変色)、喘鳴、発熱、またはクループ性の咳(「アザラシが鳴くような」咳と称される場合が多い)を含むRSV症状を意図する。症状は様々であり、年齢に応じて異なることが認識されるべきである。例えば、1歳未満の幼児は最も深刻な影響を受け、多くの場合に最も重篤な呼吸困難になる。逆に、年長児は通常、軽度の感冒様症状を有するにすぎない。一般に、症状は曝露後4〜6日で現れる。
【０１３０】
活動性RSV感染症に対する公知の治療法は存在しないため、当業者は予防薬を検討してきた。例えば、Synagis(登録商標)(パリビズマブ)は、重篤なRSV疾患のリスクが高い、24ヵ月齢未満の小児におけるRSV疾患の予防に認可されている。しかし、Synagis(登録商標)は、完全な防御をもたらすためには、処方を受け、月に一度注射しなければならない。
【０１３１】
D. パラインフルエンザ3型(PIV 3)
PIV3は、呼吸器疾患(鼻炎、咽頭炎、喉頭炎、細気管支炎、および肺炎)の一般的原因であると考えられている。このウイルスは、入院している小児患者における呼吸器感染症の原因の第2位である。PIV 3に対するワクチンは存在しない。ワクチン接種に対するいくつかの異なるアプローチが検討されたが、いずれのワクチンも認可されていない(Chanock, et al, Parainfluenza Viruses, Fields Virology, Ed. Knipe, D. and Howley, P. Lippincott Williams and Wilkins, 2001に概説されている)。
【０１３２】
生理学的に、PIV 3は通常、上部および下部呼吸器系に感染する。現在、パラインフルエンザウイルスの5つの血清型が知られており(1、2、3、4a、および4b型)、そのいずれもが疾患の原因と関連している。小児はパラインフルエンザに対する感受性が高いと考えられ、クループの全症例の約40パーセント〜50パーセント、ならびに細気管支炎および気管支炎およびいくつかの肺炎の10パーセント〜15パーセントの原因であり得る。一般集団ではパラインフルエンザの発生率は不明であるが、非常に高いと考えられている。鼻汁および感冒様症状のみをもたらす疾患は、パラインフルエンザというよりもむしろ単純な感冒として経過し得る。リスク因子には幼齢が含まれる。学齢までに、大部分の小児はパラインフルエンザウイルスに曝露されている。大部分の成人はパラインフルエンザに対する抗体を有するが、反復感染する場合がある。
【０１３３】
喉頭気管気管支炎(すなわち、例えばクループ)は、パラインフルエンザウイルス感染症のよく見られる臨床症状であると考えられている。パラインフルエンザウイルスはまれに、気管気管支炎、細気管支炎、および気管支肺炎などの小児における他の気道感染症に伴って観察される。場合により、パラインフルエンザウイルス感染後に軽度の非特異的疾患が見られる。パラインフルエンザウイルスは1年を通じて疾患を引き起こすが、ピーク罹患率は、北半球および南半球の温帯域全体の小児における気道感染症、特にクループの冬期大発生の間に存在する。パラインフルエンザウイルス感染症は主に小児期疾患であり、クループの最も高い年齢別発症率は3歳未満の小児で起こる。血清型3型の感染症が最も早くかつ最も頻繁に起こり、血清疫学的研究によって決定されるように、米国の小児の50%が生後1年の間に感染し、6歳までにほぼ全員が感染する。
【０１３４】
パラインフルエンザウイルスは一般に、感染飛沫核の吸入により宿主に侵入する。ウイルスの増殖は気管気管支樹全体で起こり、粘液の産生を誘導する。喉頭の声帯が著しく腫脹し、空気流入の障害を引き起こすが、これは吸気性喘鳴として現れる。成人では、ウイルスは通常、気道上部に炎症を起こすことに限定される。幼児および低年齢小児では、場合により気管支、細気管支、および肺が罹患し、これは、気道サイズが小さいことおよび免疫学的に比較的未熟であることを反映していると考えられる。ウイルス血症は感染期に必須ではなく、また一般的な段階というわけでもない。
【０１３５】
典型的に、小児は、クループ性の咳、吸気性喘鳴、嗄れた声または鳴き声、および吸気における呼吸困難を示す可能性があり、通常は無熱性である。患者の約80%が、咳、および咳の発症の1〜3日前に鼻汁を呈する。肺野の全域で、呼吸性ラ音が頻繁に聞かれる。放射線検査では通常正常である。場合により、喉頭蓋が著しく腫脹し、発赤する。重度の気道閉塞が後に続いて起こり、救急気管切開を必要とする場合がある。
【０１３６】
IV. VLPワクチン
パラミクソウイルスVLPワクチンは、当技術分野において新規である。ビロソームワクチンが公知であるが、これらのワクチンは、精製ウイルスの破壊、ゲノムの抽出、およびウイルスタンパク質を含む脂質粒子を形成するためのウイルスタンパク質および脂質による粒子の再構築を必要とする。このアプローチは非常に高価である。また、出発材料が生ウイルスであるため、ワクチンに生ウイルスが混入するという危険が存在する。加えて、得られるワクチンは広域性ワクチンでない可能性が高い。さらに、このワクチンに対する免疫応答は、ウイルス感染と識別することができない。
【０１３７】
パラミクソウイルスVLPは、宿主細胞感染をもたらす遺伝物質を含まずに全体的なウイルス構造を模倣する、極めて有効なサブユニットワクチン型であると考えられる。例えば、ウイルス様粒子は、ウイルスカプシドタンパク質の真の構造を維持しつつ、DNAゲノムまたはRNAゲノムを完全に欠くことができる。したがって、VLPは非感染性である。さらに、ウイルスカプシドタンパク質を含むウイルス様粒子は、真のウイルスに類似した自発的自己集合を起こし得る。しかし、ポリオーマウイルスVLP調製物は、当技術分野において最も開発が行われていないものの1つである。Noad et al., 「Virus-like particles as immunogens」 Trends Microbiol 11:438-444 (2003)。
【０１３８】
1つの態様において、本発明はパラミクソウイルスVLPを含むワクチンを意図する。1つの態様において、パラミクソウイルスは、これらに限定されないが、ニューカッスル病、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、および呼吸器合胞体ウイルスを含む群より選択される。1つの態様において、VLPはMタンパク質を含む。別の態様において、VLPは少なくとも2つの糖タンパク質をさらに含む。1つの態様において、糖タンパク質は、Fタンパク質およびHNタンパク質からなる群より選択される。
【０１３９】
A. ニューカッスル病ウイルス
本発明の特定の態様は、ニューカッスル病ウイルスから家禽類を防御するための安全で広域性でありかつ有効なワクチンとして、ウイルス様粒子(VLP)を提供する。さらに、これらの態様は、VLPの大規模で経済的な生産のための系および手順を提供する(すなわち、例えば、ワクチンとして有用であるために、VLPの生産は容易かつ経済的でなければならない)。
【０１４０】
卵で培養した全ウイルス(B1)を大量組織培養で増殖させたVLPと比較した銀染色比較から、VLPがマイクログラム量で産生され得る(すなわち、マウスにおける免疫原性試験に十分である)ことが実証される。図74を参照されたい。大量の培地からVLPを迅速に精製し、大量VLP生産技法を簡便化した。表3を参照されたい。
【０１４１】
(表３）大量VLP調製物
2009502204.tif 000004
【０１４２】
調製物1にはアルブミンが混入し、Fタンパク質と共に移動した。そのため、調製物1におけるFの量は、NPと比較した場合に増大して見える。このアルブミンの混入は、調製物2および3においてはうまく排除された。
【０１４３】
本発明の機序を理解する必要はないが、ウイルス(AV)VLPがHNおよびF糖タンパク質を含むここに開示するVLP生産法とは異なり、卵で培養した(当技術分野における標準法の通り)ウイルス(B1)はHNおよびF糖タンパク質が欠損している(非病原性(AV)ウイルス粒子に典型的である)と考えられる。1つの態様において、本発明は、HNおよびF糖タンパク質を含むNDV VLPを含む改良されたワクチンを意図する。
【０１４４】
NDVサブユニットタンパク質発現が、当技術分野において報告されている。例えば、ニューカッスル病ウイルス(NDV)赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ(HN)を発現する組換えバキュロウイルスを感染させたスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞培養物のネガティブ染色した細胞外液(ECF)の電子顕微鏡検査から、真のNDVのエンベロープに類似したNDV様エンベロープが明らかになった。抗NDV HNモノクローナル抗体による免疫金染色から、NDV様エンベロープ上のスパイクとしてHN抗原が示された。組換え感染培養物によるECFはまた、いくつかがエンベロープの極性突出を示したことを除いては、標準的なバキュロウイルス粒子と類似したバキュロウイルス粒子を含んでいた。本発明において意図される態様と異なり、基質タンパク質(すなわちMタンパク質)の非存在下におけるNDV HNは、真のNDVと形態的に等しいウイルスエンベロープの産生を開始および制御し得ると結論づけられた。Nagy et al., 「Synthesis of Newcastle disease virus (NDV)-like envelopes in insect cells infected with a recombinant baculovirus expressing the haemagglutinin-neuraminidase of NDV」 J Gen Virol. 72:753-756 (1991)。
【０１４５】
1つの態様において、本発明は商業的に使用可能なNDV VLPワクチンを含む方法を意図する。1つの態様において、NDV VLPワクチンの生産は経済的かつ効率的である。別の態様においては、NDV VLPワクチンによる免疫化によって、広範囲の防御抗体の産生が促進される。1つの態様において、鳥類細胞株は少なくとも4つのNDV糖タンパク質を連続して発現する。
【０１４６】
1つの態様において、本発明は、一過性発現系でNDV VLPワクチンを生産する方法を意図する。1つの態様において、この系は、少なくとも1つのNDVウイルス糖タンパク質をコードする核酸(例えば、プラスミド、発現ベクター中など)をトランスフェクションした鳥類細胞を含む。1つの態様において、この系は、鳥類細胞染色体の一部として選択したウイルス遺伝子を有する鳥類細胞株を含み、取り込まれたウイルス遺伝子はワクチンに有用なNDV VLP粒子を連続して放出する。1つの態様において、ウイルス遺伝子はウイルス糖タンパク質を含む。1つの態様において、ウイルス糖タンパク質は、NPタンパク質、Mタンパク質、F-K115Qタンパク質、またはHNタンパク質を含む群より選択される。
【０１４７】
1つの態様において、本発明は、NDVの多くの異なるNDV株に関する抗原を含むVLPを生成する方法を意図する。本発明の機序を理解する必要はないが、統合NDVワクチンにより、現在のワクチンによって得られる範囲よりも広い防御範囲が付与されると考えられる。1つの態様において、本発明は、第1の株由来の第1のウイルスタンパク質遺伝子をコードする第1 cDNA；第2の株由来の第2のウイルスタンパク質遺伝子をコードする第2のcDNA；および第3の株由来の第3のウイルスタンパク質遺伝子をコードする第3のcDNAを含むVLPワクチン発現系を意図する。1つの態様において、第1のウイルスタンパク質遺伝子は、HNタンパク質、Fタンパク質、NPタンパク質、またはMタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、第1の株は、Hertz株、AV株、またはB1株を含む群より選択される。1つの態様において、第2のウイルスタンパク質遺伝子は、HNタンパク質、Fタンパク質、NPタンパク質、またはMタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、第2の株は、Hertz株、AV株、またはB1株を含む群より選択される。1つの態様において、第3のウイルスタンパク質遺伝子は、HNタンパク質、Fタンパク質、NPタンパク質、またはMタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、第3の株は、Hertz株、AV株、またはB1株を含む群より選択される。1つの態様において、本発明は、VLPワクチンに取り込まれたウイルスタンパク質遺伝子を検出する方法であって、ウイルスタンパク質遺伝子を株特異的抗体または組み入れた配列タグと接触させる段階を含む方法を意図する。
【０１４８】
1つの態様において、本発明は、NDV VLPワクチンを産生するバキュロウイルス発現系を含む方法を意図する。本発明の機序を理解する必要はないが、バキュロウイルス発現系は、利用できるすべての発現系のうち最も高いタンパク質発現レベルを可能にすると考えられる。1つの態様において、バキュロウイルス発現系はミリグラム量のVLPワクチンを産生する。1つの態様において、バキュロウイルス発現ベクターはNDV VLPワクチンをコードする。1つの態様では、NDV VLPワクチンをコードするバキュロウイルス発現系を昆虫細胞にトランスフェクションする。1つの態様において、バキュロウイルスベクターは少なくとも4つのNDV構造タンパク質を含む。VLPを現実的なワクチン候補とするためには、これを大量生産に適合する安全な発現系で生産する必要がある。昆虫細胞に基づくタンパク質生産系は、VLP生産に関して多くの利点を有する。第一に、真核細胞の高密度培養条件において大量の組換えタンパク質を生産することができ、正確に折りたたまれた抗原が高収率で回収される。第二に、ワクチン生産に用いられる昆虫細胞は、哺乳動物細胞由来の補充物なしで培養することができるため、日和見病原体の培養のリスクが最小限に抑えられる。第三に、組換えタンパク質発現に用いられるバキュロウイルスは、鱗翅目の数種のみを含む狭い宿主域を有し、そのためワクチン接種を受けた個体の脅威とならない。第四に、バキュロウイルスは単純な化学処理により容易に不活化され、昆虫細胞調製物の核および培養液中に主に局在し、一方、大部分のVLPは細胞質抽出物から精製される。最後に、バキュロウイルス系は、大量ワクチン生産用に拡大することができる。
【０１４９】
B. 麻疹
1つの態様において、本発明は、麻疹基質タンパク質を含む麻疹ウイルス様粒子を含む麻疹ワクチンを意図する。1つの態様において、ワクチンは少なくとも2つの麻疹糖タンパク質をさらに含む。
【０１５０】
麻疹パラミクソウイルスウイルスに関してVLPワクチンの使用が提唱されているが、レトロウイルスHIV VLPの生産のみが酵母細胞で実証された。Morikawa Y., 「Virus-like micrograins and process of producing the same」 米国特許出願公開第20040009193号 (2004)。この提唱された技法は真核生物細菌細胞におけるVLP発現に限定されており、バキュロウイルスおよび哺乳動物細胞の培養技法は示唆されていない。さらに、これらの真核生物VLPワクチンが実際に安全かつ有効であることが示されていない。より重要なことには、MorikawaのVLP麻疹ワクチンは、前記のGaroff et al.によって記載されるIV型の出芽に依存している。本明細書に記載するいくつかの態様から、Garoffらが教示するように、パラミクソウイルスの出芽にリボ核酸コアが必要でないことが明らかに実証される。
【０１５１】
パラミクソウイルス麻疹ワクチンの開発に有用であると示唆された別のアプローチは、DNAワクチンの投与による遺伝子治療技法を伴う。Robinson et al., 「Compositions and methods for generating an immune response」米国特許出願公開第20040105871号 (2004)。この技法は、HIV DNA VLPワクチンを含む発現カセットによる宿主ゲノムの安定トランスフェクションにより実証された。Mazzara et al., 「Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles」米国特許第5,804,196号 (1998)(参照により本明細書に組み入れられる)もまた参照されたい。
【０１５２】
別の遺伝子治療アプローチでは、インビボまたはインビトロにおけるワクチンの生産のための、弱毒生麻疹ウイルスの発現ベクターへの取り込みを示唆している。しかし、麻疹ウイルスワクチンに関してVLPは意図されていない。Herold J., 「SARS-coronavirus virus-like particles and methods of use」米国特許出願公開第20050002953号 (2005)。
【０１５３】
C. 呼吸器合胞体ウイルス
1つの態様において、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス基質タンパク質を含む呼吸器合胞体ウイルス様粒子を含む呼吸器合胞体ウイルスワクチンを意図する。1つの態様において、ワクチンは少なくとも2つの呼吸器合胞体ウイルス糖タンパク質をさらに含む。
【０１５４】
VLPは、HIV関連ワクチンの生産および使用に関して開示されている。ちなみに、多くの他のウイルス(すなわち、呼吸器合胞体ウイルスおよび麻疹ウイルス)もまた、開示された技術と適合し得ることが示唆されている。しかし、これらの推測を支持するための詳細は提示されていない。Barnett et al., 「Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles」 米国特許第6,602,705号 (2003)。
【０１５５】
VP3、VP7、VP2、およびVP5遺伝子を含むブルータングVLPと同じ様式で、呼吸器合胞体ウイルスVLPワクチンを生産することが可能であることもまた示唆されている。Ermak et al., 「Oral immunization with multiple particulate antigen delivery system」 米国特許第5,690,938号 (1997)(参照により本明細書に組み入れられる)。この簡潔な言及を除いて、Ermakは、パラミクソウイルスに関する技術的情報を全く提供しておらず、オルビウイルス属(レトロウイルス科)に限定している。
【０１５６】
微粒子に複合化され、ワクチンとして投与された組換えHIV-1-IIIB gp160エンベロープ糖タンパク質への曝露後に、インビボでのマウス細胞傷害性リンパ球反応(すなわち、免疫反応)が起こると仮定される。Rock, K. L., 「Compositions and methods for inducing cytotoxic T lymphocyte responses by immunization with protein antigens」 米国特許第6,328,972号 (2001)。Rockは、呼吸器合胞体ウイルスまたは麻疹ウイルスに対する抗原を有するVLPもまた、これらの細胞傷害性リンパ球を刺激して免疫応答を起こし得ることを示唆している。しかし、このアプローチに関する技術的詳細も成否の予想も考察されていない。実際、Rockは、任意の抗原のVLPワクチンに関連するいかなるデータも示していない。
【０１５７】
D. パラインフルエンザ3型ウイルス
1つの態様において、本発明は、パラインフルエンザ3型ウイルス基質タンパク質を含むパラインフルエンザ3型ウイルス様粒子を含むパラインフルエンザ3型ウイルスワクチンを意図する。1つの態様において、ワクチンは少なくとも2つのパラインフルエンザ3型糖タンパク質をさらに含む。
【０１５８】
E. VLPワクチンの増強
本発明のワクチンまたは治療組成物は、例えば皮下または筋肉内注射により非経口投与することができる。他の投与方法に適したさらなる製剤には、坐剤、および場合により経口製剤またはエアロゾルでの分配に適した製剤が含まれる。経口製剤は、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤、または散剤の形態をとり、10%〜95%、好ましくは25〜70%の活性成分を含む。
【０１５９】
経口製剤の場合、アジュバント、抗原パッケージング、または種々の製剤への個々のサイトカインの添加を使用するT細胞サブセットの操作により、最適な免疫応答を有する改良された経口ワクチンが得られ得る。
【０１６０】
1. アジュバント
本発明は、アジュバントを用いるまたは用いない免疫化をさらに意図する。1つの態様において、本発明は、パラミクソウイルスVLPワクチンおよびアジュバントの同時投与を意図し、この場合、結果として得られる免疫応答は増強される。アジュバントを用いる場合、本発明が特定の種類のアジュバントに限定されること--すなわち、一度使用した同じアジュバントを常に使用することは意図されない。本発明は、個別に用いるかまたは併用するかに関わらず、あらゆる種類のアジュバントを意図するが、アジュバントの好ましい使用は、フロイント完全アジュバント、そしていくらかの後に不完全フロイントアジュバントを使用することである。アジュバントの別の好ましい使用は、Gerbuアジュバント(GMDP；C.C. Biotech Corp.)の使用である。本発明はまた、RIBI家禽アジュバント(MPL；RIBI Immunochemical Research, Inc.)の使用を意図する。他のアジュバントには、これらに限定されないが、カリウムミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、QS21(Cambridge Biotech)、Titer Maxアジュバント(CytRx)、またはQuil Aアジュバントが含まれる。
【０１６１】
2. サイトカイン
1つの態様において、本発明は、パラミクソウイルスVLPワクチンおよびサイトカインの同時投与を意図し、この場合、結果として得られる免疫応答は増強される。本発明の機序を理解する必要はないが、サイトカインは、最終的にワクチン関連抗体を産生する造血幹細胞の増殖、成長、および分化を調節し得ると考えられる。1つの態様において、サイトカインは、インターロイキン-12(IL-12)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-18(IL-18)、α、β、もしくはγ-インターフェロン(α、β、γ-IFN)、またはケモカイン類を含む群より選択され得る。特に好ましいサイトカインには、IL-12およびGM-CSFが含まれる。抗体応答および細胞傷害性Tリンパ球反応を含む動物の免疫系の反応を微調整するためにサイトカインを種々の組み合わせで用いて、パラミクソウイルス感染を制御または排除するのに必要な特定レベルの反応をもたらすことができる。
【０１６２】
V. VLPワクチン発現系
1つの態様において、本発明は、経済的にかつ高生産率でVLPワクチンを生産する方法を意図する。1つの態様において、本発明は、パラミクソウイルスVLPワクチンカセットを含む核酸発現ベクターを細胞培養物にトランスフェクションする段階を含む方法を意図する。1つの態様において、細胞培養物は鳥類細胞(すなわち、例えばELL-0細胞)を含む。1つの態様において、細胞培養物はウイルス(すなわち、例えばバキュロウイルス)を含む。
【０１６３】
A. 鳥類連続細胞培養発現系
1つの態様において、本発明は、鳥類細胞培養物(すなわち、例えばELL-0細胞培養物)を用いてパラミクソウイルスタンパク質を発現させる段階を含む方法を意図する。1つの態様において、細胞培養物はタンパク質を連続して発現する。1つの態様において、パラミクソウイルスタンパク質は、これらに限定されないが、ニューカッスル病ウイルスタンパク質、麻疹ウイルスタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルスタンパク質を含む群より選択される。1つの態様において、パラミクソウイルスタンパク質は、これらに限定されないが、基質(M)タンパク質、ヌクレオカプシド(NP)タンパク質、融合(F)タンパク質、または赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ(NM)タンパク質(およびそれらの組み合わせ)を含む群より選択される。
【０１６４】
パラミクソウイルスタンパク質を発現する鳥類細胞株を作製するには、ウイルス遺伝子を鳥類細胞染色体に組み込むことが有用である。レトロウイルスベクターの使用は、この組込みを達成するのに有用なアプローチである。パラミクソウイルス遺伝子を含むレトロウイルスを鳥類細胞に感染させることができ、パラミクソウイルス遺伝子を有するレトロウイルスゲノムは、レトロウイルス複製サイクルの一部として、細胞染色体に組み込まれる。4つの鳥類細胞株：(i)M、NP、F、およびHNタンパク質を発現する鳥類細胞；(ii)M、NP、およびFを発現する鳥類細胞；(iii)M、NP、およびHNタンパク質を発現する鳥類細胞；ならびに(iv)M、HN、およびFタンパク質を発現する鳥類細胞が作製されると考えられる。
【０１６５】
レトロウイルスベクターは、ベクターが鳥類細胞中で新たな子孫レトロウイルスの形成を導くことができない(すなわち、複製不可能性)ように構築することができる。そのような研究の一般的アプローチは以下の通りである。パラミクソウイルス遺伝子を、レトロウイルス末端(LTR)およびパッケージングシグナルと共にベクターにクローニングする。しかし、このベクターは、複製過程の必須遺伝子(すなわち、例えばgagまたはpol)を欠いているために、複製する能力がない。
【０１６６】
レトロウイルス構造タンパク質；gag、pol、およびenvを発現する細胞株であるパッケージング細胞株(すなわち、例えばGP-293)に、ベクターDNAをトランスフェクションする。水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードする別のDNAもまた、ベクター(すなわち、例えばpVSV-G)によりトランスフェクションする。次いで、これらの細胞はレトロウイルスベクターを複製し、envタンパク質およびVSV-Gタンパク質を含むエンベロープ(偽型と称される)中にベクターRNAをパッケージングする。これらの細胞は粒子を放出し、次いでこれを精製して、鳥類細胞を感染させるために使用する。VSV-Gタンパク質が存在することで、これらの粒子は鳥類細胞中で感染を開始することが可能となり、レトロウイルスの宿主域が拡大される。
【０１６７】
トランスフェクション後、ベクターRNAはDNAに変換され、次いで鳥類細胞染色体に組み込まれる。鳥類細胞はgagもpolも発現しないため、レトロウイルス感染は進行せず、子孫ウイルスは放出されない。その後、トランスフェクションした鳥類細胞は、組み込まれたパラミクソウイルス遺伝子を連続して発現するが、レトロウイルス遺伝子を発現することはない。
【０１６８】
4つのパラミクソウイルスタンパク質をそれぞれ順次組み込むために、この手順を繰り返す。パラミクソウイルス遺伝子の発現に関して細胞株を特徴づけ、これらの細胞株からのVLPの放出を確認する。
【０１６９】
これらの段階を達成するためのベクターおよびパッケージング細胞株(向汎性レトロウイルス発現系)は、Clontech(BD Biosciences Clontech)から入手することができる。加えて、一旦発現カセットが鳥類細胞ゲノムに組み込まれると、内部プロモーターによって標的遺伝子の転写が駆動されるように操作されるベクター(Qベクター)が入手可能である。Qベクターは、ベクター組込み部位に隣接して位置する細胞配列がパラミクソウイルス遺伝子の発現を妨げる可能性、またはこれらの配列がレトロウイルスLTRと近接しているために異常に発現される可能性を低下させる。
【０１７０】
B. バキュロウイルス発現系
1つの態様において、本発明は、BacVector(登録商標)系(Novagen)を用いて実行し得る。この系は、昆虫細胞株(すなわち、例えばSf9)においてタンパク質を発現させるために、挿入遺伝子を含むバキュロウイルス オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)を用いる。図30を参照されたい。本発明は、標的遺伝子をAcNPVゲノム中に組み込む1つの方法に限定されない。多くの異なるトランスファープラスミドを用いることができる。例えば、AcNPV DNAおよびトランスファープラスミドを細胞に同時トランスフェクションすることにより、相同組換えによってウイルスゲノム中に遺伝子が挿入されたウイルスが単離され得る(すなわち、例えばBacVector(登録商標)Triple Cut Virus DNA、Novagenを用いる)。図28を参照されたい。1つの態様においては、標的遺伝子(すなわち、例えばNDV、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルス粒子タンパク質)をpBACトランスファープラスミドにクローニングして、組換えバキュロウイルスベクターを生成することができる。1つの態様において、組換えは連結非依存的クローニング(LIC)技法を含み得る。図29を参照されたい。例えば、LICトランスファープラスミドpBAC/pBACgus-2cpは、エンテロキナーゼ(ek)切断部位を有する上流HisタグおよびSタグペプチドをコードし得る。組換えは、センス鎖、5'〜ATG：GACGACGACAAG(配列番号:89)；アンチセンス鎖、5'〜TTA：GAGGAGAAGCCCGG(配列番号:90)を含むプライマー配列によって促進される。
【０１７１】
トランスフェクション時に、ウイルスDNAとトランスファープラスミドとの間に組換え事象、すなわち複製に必要な環状ウイルスDNAを修復する組換えが起こらない限り、BacVector(登録商標)DNAはウイルスを産生しない。1つの態様において、トランスファープラスミドはpBAC4x-1(Novagen)を含む。図31を参照されたい。本発明の機序を理解する必要はないが、pBAC4x-1は、最大で4つの遺伝子が単一のプラスミド、ひいては単一のAcNPV中に挿入され得るように構築されていると考えられる。また、各遺伝子は、感染の24〜72時間後から非常に高レベルのタンパク質発現をもたらし得るpolhおよびp10プロモーターのいずれかを用いて発現されると考えられる。pBAC4x-1トランスファーベクターは多サブユニットタンパク質複合体の発現用に設計されたもので、単独でまたは任意の組み合わせでNDV M、NP、HN、およびF遺伝子を発現し得る。
【０１７２】
トランスファープラスミドおよびウイルスDNAを用いた同時形質転換後に、感染細胞(すなわち、例えばSf9)はプラークを形成し、ウイルス粒子を発現する。次いでこれらのプラークを単離し、発現されたウイルス粒子を精製して、挿入されたタンパク質遺伝子の発現に関して特徴づける。1つの態様において、本発明は、NDV、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体タンパク質遺伝子を含むウイルス粒子を発現する感染細胞であって、バキュロウイルストランスファープラスミドで形質転換された細胞を意図する。1つの態様では、大量のVLPの調製を支持するために、最適な条件および発現の時期に関して発現を特徴づける。
【０１７３】
AcNPV感染細胞は、極めて大量の主要超後期遺伝子産物；ポリヘドリン(polh)およびp10を産生することが知られている；感染サイクルの終了時までには、総細胞タンパク質の40〜50%がこれら2つの遺伝子産物からなる。感染の超後期(すなわち、出芽および放出期後に起こる)には、昆虫および組織培養の両方において、細胞の転写活性の大部分がpolhおよびp10プロモーターに費やされ、よってこれらのプロモーターは、これらのウイルス遺伝子と置き換わった導入標的遺伝子の高レベルでの発現を駆動するために用いるのに理想的である。109個細胞当たり最大で100 mgの標的タンパク質という収率を得ることができる。
【０１７４】
バキュロウイルス発現系の利便性は、消化によりウイルス増殖に必要な配列を含む断片が放出されるように、AcNPVポリヘドリン遺伝子の下流の必須遺伝子(すなわち、例えばORF1629)内、および上流ORF 603内にBsu36 I制限部位が位置するウイルスを開発することによって改良された。Kitts et al., BioTechniques 14:810-817 (1993)。適切な組換えトランスファープラスミドおよびBsu36 I切断ウイルスDNAを昆虫細胞に同時トランスフェクションすると、必要なORF 1629配列が相同組換えを介してトランスファープラスミドにより供給される。これらの同時トランスフェクションに由来する子孫ウイルスの大部分は、標的遺伝子を有する修復ウイルスを含み、そのためプラーク精製組換え体をスクリーニングして増殖させる必要性が最小限となる。または、他のバキュロウイルス発現系は他の必須遺伝子を利用する。例えば、そこから同時トランスフェクション用の高効率BacVector-1000および-2000 Triple Cut Virus DNA(登録商標)が調製される前駆BacVector-1000(登録商標)およびBacVector-2000(登録商標)は、AcNPVポリヘドリン遺伝子の代わりにlacZ遺伝子(β-ガラクトシダーゼ)を有する。これらのLacZ陰性組換え体は、X-Galで染色した場合に青いプラークとして可視化される残りの任意の親ウイルスと容易に識別することができる。
【０１７５】
トランスファープラスミドがウイルスゲノムと組換えを起こした場合には、標的遺伝子がlacZと置き換わるため、LacZ組換え体はX-Galによる染色に際して透明なプラークを形成する。lacZ遺伝子内の第3のBsu36 I部位によって、親ウイルスを再編成する可能性はさらに減少する。実際に最適条件下では、市販のバキュロウイルストランスフェクション技術により、約95%超が組換え体であるプラークが生成される。
【０１７６】
133,894 bp AcNPVゲノムの完全な配列が最近解明され、全部で154個もの潜在的遺伝子が明らかになった。図30を参照されたい。これらの遺伝子の多くは、組織培養におけるウイルスの増殖には必要ない。これらの非必須遺伝子は、細胞供給源において標的遺伝子と競合することが知られており、いくつかの遺伝子産物の発現にとって有害であり得る。競合する非必須遺伝子が欠失したバキュロウイルス発現系を用いることが好ましい。
【０１７７】
1つの態様において、本発明は、標的タンパク質(すなわち、例えばNDV、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルスタンパク質)の発現用に設計されたpBACトランスファープラスミドを用いることを意図する。いくつかの潜在的pBACトランスファープラスミドを図31に示す。例えば、2つのベクター骨格(上部に示す)は、p6.9プロモーターによって駆動されるレポーターβ-グルクロニダーゼ(gus)遺伝子の存在(すなわち、例えばpBACgus系)によってのみ異なる。gus遺伝子およびP6.9は標的遺伝子と共にバキュロウイルスゲノム中に運搬されるため、組換え体はβ-グルクロニダーゼを産生し、X-glucによる染色によって同定することができる。gus指標を欠く対応するトランスファープラスミドは、大きさが約2 kbp小さく、いくつかの大きな挿入物でより高いクローニング効率をもたらし得る。
【０１７８】
さらに、これらに限定されないが、pBAC-2cpおよびpBACgus-2cpプラスミドを含むLICベクターは、適切に調製された挿入物とアニーリングできる状態になっている。図31を参照されたい。実際には、標的配列は、所定の配列で伸張されたプライマーを用いてPCRにより作製する。図29を参照されたい。例えば、ベクターの適合性付着末端(それぞれ、N末端およびC末端コード配列における13および14 bp)は、dATPの存在下でT4 DNAポリメラーゼで処理することによって生成される。酵素の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が、相補鎖においてdT残基に遭遇するまで二重鎖の一方の鎖を消化し、そこでポリメラーゼ活性により利用可能なdAを付加する。Aslanidis et al., Nucleic Acids Res. 18:6069-6074 (1990)。処理した挿入物およびpBAC LICトランスファープラスミドを短時間アニールして、混合物をNovaBlueコンピテント細胞に形質転換する。
【０１７９】
調製されたベクターにより、HisタグおよびSタグ融合配列後のエンテロキナーゼ切断部位に対して最も望ましい位置で、標的遺伝子が融合され得る。挿入物は、ベクターコード配列がエンテロキナーゼ切断によって完全に除去され得るように配置され得る。図29を参照されたい。加えて、マルチクローニング領域中の制限部位の配置により、多くのpET細菌ベクター由来の挿入物をpBAC-1系または-2系プラスミドに直接サブクローニングすることが可能になる。Hisタグ配列は例えばpBAC-1または-2ベクターに組み入れることができ、6個のヒスチジンの連続した一続きをコードする。または、Sタグ配列はリボヌクレアーゼAの15 AAドメインをコードし、これは104 AA Sタンパク質に対する強力な親和性を有する。Richards et al., The Enzymes, Vol. IV (Boyer, P.D., Ed), pp. 647-806, Academic Press, New York (1971)。この非常に特異的なタンパク質間相互作用は、Sタンパク質-レポーター分子複合体による融合タンパク質の高感度検出の基礎を成す。Sタグ融合タンパク質の化学発光検出が、Sタンパク質HRP複合体およびSuperSignal(商標)CL-HRP基質を用いて観察され得る。(S-Tag Rapid Assay Kit、Novagen)。
【０１８０】
pBAC4xベクターは、同一細胞における最大で4つの遺伝子の同時発現のために設計されている。これらのベクターは、多サブユニットタンパク質、多コピーの遺伝子、多タンパク質複合体の発現、およびタンパク質間相互作用の研究に極めて有用である。Weyer et al., J. Gen. Virol. 72:2967-2974 (1991)；Belyaev et al., Nucleic Acids Res. 21:1219-1223 (1993)；およびBelyaev et al., Gene 156:229-233 (1995)。
【０１８１】
バキュロウイルス発現技術を真核生物ウイルスディスプレイシステムへと発展させることができることが知られている。Boublik et al., Bio/Technology 13:1079-1084 (1995)。AcNPV主要表面糖タンパク質(すなわち、例えばgp64)を適切に操作することにより、糖タンパク質を含む機能性タンパク質ウイルス表面上に発現させることができる。pBACsurf-1トランスファープラスミドは、polhプロモーターの制御下における、gp64シグナル配列と成熟タンパク質コード配列との間への標的遺伝子のインフレーム挿入のために設計され得る。図31を参照されたい。この系を用いると、複合体タンパク質のウイルスライブラリーを構築し、所望の機能的特性に関してスクリーニングすることが可能である。
【０１８２】
1つの態様において、本発明は、NDV、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルスタンパク質を発現させる目的でSf9昆虫細胞培養物を感染させるために、バキュロウイルス発現技術を用いることを意図する。これらの細胞は、血清もしくは無血清単層、懸濁液、または発酵培養に適合化することができ、直接的感染、トランスフェクション、およびプラークアッセイできる状態であり得る。
【０１８３】
野生型AcNPV感染および非感染Sf9細胞の抽出物は、抗体および他の試薬のウイルスおよび感染細胞タンパク質への非特異的結合をブロッキングするのに有用である。抽出物はまた、細胞溶解物中で標的タンパク質を解析するウェスタンブロット、ELISA、結合アッセイ、または酵素アッセイにおける陰性対照として実行するのに有用である。
【０１８４】
1つの態様において、本発明は、異なるパラミクソウイルス株由来のタンパク質を含むVLPワクチンを意図する。1つの態様において、パラミクソウイルス株は、これらに限定されないが、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルスを含む群より選択される。1つの態様において、NDV株は病原性である。別の態様において、病原性NDV株は、AV株およびHertz株を含む群より選択され得る。1つの態様において、NDV株は非病原性である。別の態様において、非病原性株はB1株を含む。
【０１８５】
1つの態様において、本発明は、少なくとも1つのパラミクソウイルス構造タンパク質をコードするcDNAクローンを含む組成物を意図する。1つの態様において、構造タンパク質はHN糖タンパク質を含む。1つの態様において、パラミクソウイルスは、これらに限定されないが、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルスを含む群より選択される。1つの態様において、クローンは病原性NDV株に由来する。別の態様において、病原性NDV株は、AV株およびHertz株を含む群より選択され得る。別の態様において、クローンは非病原性NDV株に由来する。1つの態様において、非病原性NDV株はB1株を含む。
【０１８６】
VI. VLPワクチン配列タグ
別の態様において、本発明は、これらに限定されないが、ニューカッスル病ウイルスVLPワクチン、麻疹ウイルスVLPワクチン、パラインフルエンザウイルス3型VLPワクチン、または呼吸器合胞体ウイルスVLPワクチンなどのパラミクソウイルスVLPワクチンであって、配列タグを含むワクチンを意図する。1つの態様において、ワクチンは宿主に投与される。1つの態様においては、配列タグが検出される。
【０１８７】
1つの態様において、本発明は、パラミクソウイルスタンパク質をコードする少なくとも1つのcDNAであって、配列タグを含むcDNAを含むベクターを意図する。1つの態様において、cDNAは宿主細胞にトランスフェクションされる。1つの態様において、cDNAは宿主ゲノムに組み入れられる。別の態様において、cDNAは宿主細胞質中に存在する。1つの態様において、配列タグが検出される。
【０１８８】
A. 抗体タグ
本発明は、末端配列タグと共に発現されるパラミクソウイルス糖タンパク質を含むいくつかの態様を意図する。1つの態様において、タグはFLAG、HA、およびMYCタグを含む。
【０１８９】
急速に成長するプロテオミクスの分野に応えて、組換えタンパク質の使用が近年著しく増加した。組換えハイブリッドは、標的ポリペプチドの精製を容易にするための、アフィニティータグと称されるポリペプチド融合パートナー(すなわち、例えば配列タグ)を含む。組換えタンパク質の精製および検出を容易にするために融合タンパク質を用いることの利点は、十分に認識されている。本発明は、これらに限定されないが、Argタグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、DsbA、c-mycタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、FLAGタグ、HATタグ、Hisタグ、マルトース結合タンパク質、NusA、Sタグ、SBPタグ、Strepタグ、およびチオレドキシンを含む種々のアフィニティー配列タグと適合する。Terpe K., 「Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems」 Appl Microbiol Biotechnol. 60:523-33 (2003)。
【０１９０】
FLAG、HA、およびMYCは、市販の抗体(すなわち、例えばELISAキット)が存在する短いアミノ酸配列である。1つの態様において、Fタンパク質は末端FLAGタグを含む。1つの態様において、末端はC末端を含む。別の態様において、末端はN末端を含む。本発明の機序を理解する必要はないが、末端配列タグ(すなわち、例えばFLAGまたはHA)を含むFまたはHNウイルスタンパク質は、完全に機能的であると考えられる。末端タグを含むFタンパク質(または任意の他のウイルスタンパク質)がVLPに取り込まれる場合、免疫化された動物は、Fタンパク質に対してのみならず、末端タグ(すなわち、例えば、FLAGアミノ酸配列)に対する抗体も作製するとさらに考えられる。
【０１９１】
配列タグに特異的な抗体は、エピトープとして知られる特定のタンパク質配列に対する親和性を有する。エピトープは、アクセプター基を含む分子および/または物質と選択的に相互作用するという特性を有する。本発明は、これらに限定されないが、HisX6(HHHHHH)(配列番号:91)(ClonTech)、C-myc(-EQKLISEEDL)(配列番号:92)(Roche-BM)、FLAG(DYKDDDDK)(配列番号:93)(Stratagene)、SteptTag(WSHPQFEK)(配列番号:94)(Sigma-Genosys)、およびHAタグ(YPYDVPDYA)(配列番号:95)(Roche-BM)を含む、文献に報告されている多くのエピトープ配列と適合する。
【０１９２】
FLAGペプチド(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)(配列番号:93)は、種々の細胞種においてエピトープタグとして用いられている。例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター含有ベクター、pCMV5の修飾により、哺乳動物細胞におけるFLAG融合タンパク質の分泌および細胞内発現用に設計された2つの一過性発現ベクターが作製された。機能試験として、細菌アルカリホスファターゼ遺伝子を両ベクターにクローニングし、哺乳動物細胞におけるFLAGエピトープタグ化細菌アルカリホスファターゼの検出に抗FLAGモノクローナル抗体を用いた。加えて、分泌された細菌アルカリホスファターゼが、抗FLAGアフィニティークロマトグラフィーにより細胞外培地から精製した。Chubet et al., 「Vectors for expression and secretion of FLAG epitope-tagged proteins in mammalian cells」 Biotechniques 20:136-41 (1996)。
【０１９３】
赤血球凝集素インフルエンザウイルス由来の負に荷電した正味のHAタグ配列(Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala)(配列番号:95)は、多種多様なプロテオミクス応用に関連したタンパク質のタグ化において有用であることが判明している。1つの態様において、本発明の態様は、改良されたHAエピトープタグを意図する。本発明の機序を理解する必要はないが、タンパク質を35S-メチオニンによって代謝標識する能力により、タンパク質の合成および代謝回転の解析が容易になると考えられる。しかし、インビボでのタンパク質の効率的な標識は、利用できるメチオニン残基の数が少ないことにより、またはタンパク質過剰発現に付随する有害な副作用により、制限される場合が多い。これらの制限を克服するために、HAMと称される、広く用いられているHAタグのメチオニンリッチ変種が、異所的に発現されるタンパク質で有用である可能性がある。1つの態様において、本発明は、HAMタグ化VLPウイルスタンパク質の発現および検出のための一連のベクターおよび対応する抗血清の開発を意図する。これらのHAMタグにより、35S-メチオニン標識の感度が改善され、HAMタグ化Mycが内因性タンパク質に匹敵するレベルで発現される場合でさえ、Myc腫瘍タンパク質代謝回転の解析が可能になる。HAMタグによって感度が改善されるため、本明細書に記載のベクターは、放射標識VLPタンパク質の検出に有用であるはずである。Herbst et al., 「HAM: a new epitope-tag for in vivo protein labeling」Mol Biol Rep. 27:203-8 (2000)。
【０１９４】
または、タンパク質またはオリゴヌクレオチド内の特定配列を認識するために、抗体を作製することができる。そのような抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。例えば、癌胎児性抗原の特定配列は抗体によって検出され得る。Bernett et al., 「Antibody preparations specifically binding to unique determinants of CEA antigens or fragments thereof and use of the antibody preparations in immunoassays」米国特許第6,013,772号 (2000)(参照により本明細書に組み入れられる)。同様に、特定のヌクレオチド配列に対して抗体を作製することもできる。Tchen et al., 「Probe containing a modified nucleic acid recognizable by specific antibodies and use of this probe to detect and characterize a homologous DNA sequence」 米国特許第5,098,823号 (1992)(参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１９５】
本発明に従って、多くの免疫測定法を用いることができる。これらのアッセイ法において用いられ得る読み取り系は数多く、そのような系の非限定的な例には、蛍光および比色酵素系、放射性同位元素標識および検出、ならびに化学発光系が含まれる。例えば、配列タグ化NDVウイルスタンパク質(好ましくはVLP粒子タンパク質)に対する配列特異的親和性を有する抗体調製物を、固相(すなわち、例えばマイクロタイタープレートまたはラテックスビーズ)に付着させる。次いで、この抗体-VLPタンパク質複合体を洗浄して、非結合のVLP粒子タンパク質を除去する。洗浄後、発色または蛍光性基質を添加してVLPタンパク質配列タグを活性化することにより、色または蛍光を生じさせる。生じた色または蛍光の量は、試料中のVLPタンパク質の量と比例する。
【０１９６】
B. 化学タグ
配列タグ(すなわち、ヌクレオチドおよび/またはタンパク質配列)には、立体的干渉も静電気的干渉も伴わず、転写および/または翻訳過程の酵素によって認識される分子もまた含まれる。配列タグの検出は、標識の放出によって起こり得る。そのような標識には、これらに限定されないが、色素、放射標識、ビオチンなどの結合部分、金属イオンまたは化学基などの質量タグ、ポリアミンまたは荷電色素などの電荷タグ、ジゴキシゲニンなどのハプテン、発光部分、リン光部分、または蛍光発生部分、および単独での蛍光色素、または蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)もしくは衝突蛍光エネルギー移動などによる、発光スペクトルを抑制し得るもしくは移動させ得る部分と組み合わせた蛍光色素のうちのいずれか1つまたは複数が含まれ得る。Aizenstein et al., 「Methods and compositions for detecting target sequences」 米国特許第6,913,881号 (2005)(参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１９７】
TdTまたはポリAポリメラーゼを用いる場合、オリゴヌクレオチドは5'末端標識を含み得る。本発明は、5'末端標識の性質によって限定されない；多種多様な適切な5'末端標識が当業者に公知であり、これには、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Cy3アミダイト、Cy5アミダイト、およびジゴキシゲニンが含まれる。放射性同位元素標識(例えば、32Pまたは35S標識ヌクレオチド)は、オリゴヌクレオチドの5'もしくは3'末端に配置してもよく、またはオリゴヌクレオチド全体に分布させてもよい(すなわち、均一に標識されたオリゴヌクレオチド)。ビオチン化オリゴヌクレオチドは、指示薬(例えば、アルカリホスファターゼまたはフルオロフォア)またはジゴキシゲニンなどのハプテンに結合したストレプトアビジン分子でプロービングすることによって検出することができ、また同様の指示薬に結合した特異的抗体を用いて検出することができる。反応基はまた、別の核酸および酵素または抗体などの二次薬剤と結合し得るまたはさもなくば相互作用し得る、ヌクレオチドの特定の配置または配列であってよい。
【０１９８】
配列タグは、有用であるには、特定の物理的および生理化学的特性をもたなければならない。第一に、配列タグは、伸張していくペプチド鎖またはオリゴヌクレオチドへの取り込みに適していなくてはならない。これは、ペプチド結合またはホスホジエステル結合形成に関与する化学基の存在によって決定され得る。第二に、配列タグは、tRNA分子または核酸ポリメラーゼ複合体に付着可能であるべきである。第三に、配列タグは、新生タンパク質またはオリゴヌクレオチドの検出およびおそらくは単離を容易にする1つまたは複数の物理的特性を有するべきである。有用な物理的特性には、発光または吸光、磁性、電子スピン共鳴、電気容量、誘電率、または電気伝導率などの特徴的な電磁スペクトル特性が含まれる。
【０１９９】
有用な配列タグは、検出可能な標識、検出可能な非天然アミノ酸、検出可能なアミノ酸類似体、および検出可能なアミノ酸誘導体と結合した天然アミノ酸を含む。標識および他の検出可能な部分は、強磁性、常磁性、反磁性、発光性、電気化学発光性、蛍光性、リン光性、有色性であってよく、または特有の質量を有してもよい。配列タグとして有用である蛍光部分には、ダンシルフルオロフォア、クマリンおよびクマリン誘導体、蛍光アクリジニウム部分、ならびにベンゾピレンに基づくフルオロフォアが含まれる。好ましくは、蛍光マーカーは、天然アミノ酸と異なる波長において高い蛍光量子収率を有し、より好ましくはスペクトルのUVおよび可視部分の両方で励起し得る高い蛍光量子収率を有する。事前に選択した波長での励起に際して、マーカーは、視覚的にまたは従来の蛍光検出法を用いて低濃度で検出が可能である。ルテニウムキレートおよびその誘導体またはニトロオキシドアミノ酸およびその誘導体のような電気化学発光マーカーは、極めて高い感度が所望される場合に好ましい。DiCesare et al., BioTechniques 15:152-59 (1993)。これらの配列タグは、フェムトモル範囲およびそれ以下で検出可能である。
【０２００】
蛍光に加えて、特性は、電磁場、放射線、光吸収(すなわち、例えばUV、可視、および赤外)、共鳴ラマン分光法、電子スピン共鳴活性、核磁気共鳴、および質量分析に対する配列タグの相互作用および反応に基づく。配列タグの電磁スペクトル特性は、好ましくは天然化合物が所有していないものであり、よって容易に識別可能である。例えば、アミノ酸トリプトファンは290 nm近傍で吸光し、340 nm近傍で蛍光発光を有する。したがって、トリプトファンと十分に異なる吸光および/または蛍光特性を有するトリプトファン類似体を用いることで、タンパク質におけるその検出が促進され得る。
【０２０１】
例えば、配列タグとして使用できる多くの異なる修飾アミノ酸が市販されている(Sigma Chemical；ミズーリ州、セントルイス；Molecular Probes；オレゴン州、ユージーン)。1つのそのような配列タグはN-ε-ダンシルリジンであり、これはtRNA分子に対するダンシルフルオロフォアのミスアミノアシル化によって作製され得る。別のそのような配列タグは、高度に蛍光性の分子クマリンに基づく蛍光アミノ酸類似体である。このフルオロフォアは塩化ダンシルよりもはるかに高い蛍光量子収率を有し、はるかに低いレベルの検出を容易にし得る。Rothschild et al., 「Methods for the detection, analysis and isolation of nascent proteins」 米国特許第6,875,592号 (2005)(参照により本明細書に組み入れられる)。
【０２０２】
タンパク質の配列タグは、天然アミノ酸およびアミノ酸として正常に機能し得ないマーカー特性を有する分子から化学合成され得る。例えば、高度に蛍光性の分子を天然アミノ酸基に化学的に連結することができる。化学修飾はアミノ酸側鎖上で起こり得、カルボキシル官能性およびアミノ官能性は、ペプチド結合形成に自由に関与できるままである。例えば、高度に蛍光性の塩化ダンシルを、リジン、アルギニン、チロシン、システイン、ヒスチジンなどを含む様々なアミノ酸の求核性側鎖に連結して、主にアミノ基のスルホンアミドまたは硫酸結合として、蛍光誘導体を得ることができる。そのような誘導体化は、ペプチド結合を形成する能力を無傷のまま残し、ダンシルリジンのタンパク質中への正常な取り込みを可能とする。
【０２０３】
1つの態様において、本発明は、ジピロメテン二フッ化ホウ素(BODIPY)誘導体を含むフルオロフォアを意図する。すべてのBODIPYフルオロフォアのコア構造は、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンである。米国特許第4,774,339号；第5,187,288号；第5,248,782号；第5,274,113号；第5,433,896号；第5,451,663号(いずれも参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。すべてのBODIPYフルオロフォアは、高い吸光係数、高い蛍光量子収率、溶媒極性およびpHに非感受性であるスペクトル、フルオレセインなどの他の色素と比較してより高いピーク強度を生じる狭い発光バンド幅、イオン電荷の不在、ならびにフルオレセインと比較して強化された光安定性を有する。基本的なBODIPY構造に置換基を付加することでさらなる抱合が起こるが、これを用いて、励起波長または発光波長を検出手段と適合する都合のよい波長に移すことができる。
【０２０４】
様々なBODIPY分子が、アミノアシル化tRNAを誘導体化するために用いることのできるアミン反応型として市販されている。検出可能な配列タグの新生タンパク質中への取り込みに関して優れた特性を示すこの系統の化合物の一例は、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン(BODIPY-FL)である。BODIPY-FLのスルホン化N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)誘導体を用いて大腸菌(E. coli)開始tRNAfmetに配列タグを設置すると、標準的なUVトランスイルミネータおよび写真画像またはCCD画像システムを用いて、電気泳動後にポリアクリルアミドゲル上で標識タンパク質が容易に検出され得る。これは、まずメチオニンでアミノアシル化し、次にNHS-BODIPYを用いてメチオニンのα-アミノ基を特異的に修飾したtRNAfmetを使用して達成し得る。Varshney et al., 「Direct analysis of aminoacylation levels of tRNA in vitro」 J. Biol. Chem. 266:24712-24718 (1991)。
【０２０５】
C. 独特の配列タグ
連続遺伝子発現解析(SAGE)は、何千もの転写産物の迅速で詳細な解析を可能にする技法である。SAGEは2つの原理に基づいている。第一に、短いヌクレオチド配列タグ(すなわち、例えば9〜10塩基対(bp))は、それが転写産物内の所定の位置から単離されるという条件で、転写産物を一意的に同定するのに十分な情報を含む。例えば、タグ部位でのランダムなヌクレオチド分布を仮定すると、9 bp程度の短い配列は262,144個の転写産物を識別することができるが、一方で、現在の推定から、ヒトゲノムでさえ約80,000個の転写産物をコードするにすぎないことが示唆される。第二に、短い配列タグを連結することで、単一クローン内の複数のタグを配列決定することにより、連続した様式で転写産物の効率的な解析が可能となる。情報がデータの連続したつながりとして伝達されるコンピュータによるシリアル通信と同様に、配列タグの連続解析は、各タグの登録(register)および境界を確立するための手段を必要とする。
【０２０６】
次いで、ビオチン化オリゴ(dT)プライマーを用いて、mRNAから二本鎖cDNAを合成し得る。次に、大部分の転写産物を少なくとも一回切断すると予測され得る制限エンドヌクレアーゼ(アンカリング酵素)で、cDNAを切断する。典型的に、4-bp認識部位による制限エンドヌクレアーゼがこの目的のために用いられるが、それは、この制限エンドヌクレアーゼが平均して256 bpごとに切断し、大部分の転写産物はこれよりも大幅に大きいという理由からである。次いで、切断されたcDNAの最も3'側の部分を、ストレプトアビジンビーズに結合させることによって単離する。この過程により、ポリアデニル化[ポリ(A)]尾部に最も近接して位置する制限部位に相当する、各転写産物上の独特な部位が提供される。次いで、cDNAを半分に分け、アンカリング制限部位を介して、IIS型(タギング酵素)を含む2つのリンカーのうちの一方に連結する。IIS型制限エンドヌクレアーゼは、その非対称認識部位から最長20 bp離れた所定の距離で切断する。リンカーは、タギング酵素による連結産物の切断により、cDNAの短い部分を有するリンカーが放出されるように設計されている。
【０２０７】
例えば、9-bpタグをもたらすアンカリング酵素およびタギング酵素の組み合わせをキュアする(cure)ことができる。平滑末端を生成した後、放出されたタグの2つのプールを相互に連結する。次いで、連結されたタグを、各リンカーに特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅の鋳型とする。この段階は、タグ配列の増幅を可能にすることに加えて、いくつかの目的に役立つ。第一に、これは、非常にコンパクトな様式でタグ配列の配向性および句読点を提供する。得られた増幅産物は、アンカリング酵素部位が隣接している、尾部同士が連結した2つのタグ(1つのジタグ)を含む。最終的な配列決定鋳型において、これはジタグ当たり4 bpの句読点をもたらす。第二には最も重要なことに、増幅段階の前に形成されたジタグの解析により、PCRによって導入される潜在的歪みを完全に排除する手段が提供される。豊富な転写産物に関してさえ、任意の2つのタグが同じジタグ中に結合される確率は低いため、偏ったPCRにより潜在的に産生される反復ジタグは、最終的な結果を実質的に変更することなく解析から排除することができる。アンカリング酵素によるPCR産物の切断によって、ジタグの単離が可能となり、次いでこれを連結により濃縮し、クローニングし、配列決定することができる。
【０２０８】
公知の転写産物の存在量に関する定量的情報の提供に加えて、SAGEはNDV発現遺伝子を同定するために用いることができる。SAGEは、遺伝子発現に関する定量的および定性的データの両方を提供し得る。種々の認識部位を有する異なるアンカリング酵素と、その認識エレメントから5〜20 bp離れた切断部位を有するIIS型酵素との組み合わせにより、この戦略に大きな柔軟性が付与される。
【０２０９】
D. 直接検出技術
検出しようとする核酸が十分な量得られる場合には、その標的のコピーを多く作製する(例えば、PCRおよびLCRで)代わりに、その配列を直接検出することに利点がある。最も顕著なことには、シグナルを指数関数的に増幅しない方法は、定量解析により適している。単一のオリゴヌクレオチドに複数の色素を付着させることによってシグナルを強化しても、最終的なシグナル強度と標的の量との相関関係は直接的である。このような系は、反応産物がそれ自体さらなる反応を促進しないという付加的な利点を有するため、産物による実験室面の汚染はそれほど問題にならない。ノーザンおよびサザンブロッティングならびにRNアーゼ保護アッセイ法を含む直接検出の伝統的な方法は、通常は放射能の使用を要し、自動化に適合しない。最近考案された技法は、放射能の使用を排除し、かつ/または自動化可能な形式において感度を向上するよう考えられている。2つの例として、「サイクリングプローブ反応」(CPR)および「分枝DNA」(bDNA)が挙げられる。
【０２１０】
サイクリングプローブ反応(CPR)は、中心部分がRNAで、2つの末端がDNAでできている長いキメラオリゴヌクレオチドを使用する。Duck et al., BioTech., 9:142, (1990)。標的DNAに対するプローブのハイブリダイゼーションおよび熱安定性RNアーゼHへの曝露により、RNA部分が消化される。これによって二重鎖の残りのDNA部分が不安定化し、標的DNAからプローブの残りの部分が放出され、別のプローブ分子がこの過程を繰り返すことが可能となる。シグナルは、切断されたプローブ分子の形態で、線形速度で蓄積される。工程を繰り返すことによりシグナルが増加するが、オリゴヌクレオチドのRNA部分は、試料の調製を通して運ばれ得るRNアーゼに対して脆弱である。
【０２１１】
分枝DNA(bDNA)は、個々のオリゴヌクレオチドがそれぞれ35〜40の標識(例えばアルカリホスファターゼ酵素)を保有できるようにする分枝構造を有するオリゴヌクレオチドを含む。Urdea et al., Gene 61:253-264 (1987)。bDNAがハイブリダイゼーション事象によるシグナルを増強する一方で、非特異的結合によるシグナルも同様に増加する。
【０２１２】
VII. インビボワクチン接種
1つの態様において、本発明は、少なくとも1つのウイルス糖タンパク質を含むパラミクソウイルスVLPワクチンであって、抗原性を有するワクチンを意図する。1つの態様において、ワクチンは、これらに限定されないが、ニューカッスル病、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルス感染症を含む疾患に対する免疫応答を刺激する。1つの態様において、本発明は、免疫応答をもたらす条件下において、精製された抗原性パラミクソウイルスVLPワクチンを宿主(すなわち、例えばマウスまたはニワトリ)に投与する段階を含む方法を意図する。1つの態様において、免疫応答は、血清糖タンパク質抗体レベルを測定することによって特徴づけられる。1つの態様において、ウイルス糖タンパク質はNDV糖タンパク質を含む。1つの態様において、ウイルス糖タンパク質は麻疹ウイルス糖タンパク質を含む。1つの態様において、ウイルス糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルスタンパク質を含む。
【０２１３】
1つの態様において、本発明は、ワクチン接種されたニワトリを生成するために、精製された抗原性NDV、麻疹、パラインフルエンザウイルス3型、または呼吸器合胞体ウイルスVLPワクチンをニワトリに投与する段階を含む方法を意図する。1つの態様において、本方法は、ワクチン接種されたニワトリに生ウイルス投与を行う段階をさらに含む。1つの態様において、本方法は、ワクチン接種されたニワトリに対してNDV感染率を決定する段階をさらに含む。
【０２１４】
実験
以下の実施例は本発明の特定の態様を例証するにすぎず、限定を意図するものではない。
【０２１５】
実施例1：細胞培養物
本実施例は、本発明の特定の態様を構築するために以下の実施例で用いる細胞培養物について記載する。
【０２１６】
ニワトリ胚のイーストランシング株(ELL-O)に由来する自発的形質転換線維芽細胞株(UMNSAH/DF-1)は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、ペニシリン-ストレプトマイシンおよび10%ウシ胎仔血清(FCS)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で維持した。
【０２１７】
SV 40 T抗原を発現するヒト腎上皮細胞(293T)もまた、10% FCS、ペニシリン-ストレプトマイシン、ビタミン類、非必須アミノ酸類、およびグルタミン酸を添加したDMEMで増殖させた。NDV、A V株は、標準的な手順により孵化鶏卵で増殖させた。
【０２１８】
実施例2：プラスミド
本実施例は、本発明の種々の態様を構築するために以下の実施例で用いるプラスミドの種類について記載する。
【０２１９】
NP(すなわち、例えば配列番号:23)、M(すなわち、例えば配列番号:27)、HN(すなわち、例えば配列番号:18)、および非切断F(すなわち、例えば配列番号:20、またはあるいはF-K115Q)タンパク質をコードするNDV cDNA配列を発現ベクターpCAGGSにサブクローニングして、それぞれpCAGGS-NP、pCAGGS-M、pCAGGS-HN、およびpCAGGS-F-KI15Qを作製した。Miyazaki et al., 「Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5」 Gene 79:269-77 (1989)；およびNiwa et al., 「Efficient selection for high-expression transfectants with a NDVe1 eukaryotic vector」 Gene 108:193-9 (1991)。
【０２２０】
Fタンパク質cDNAは切断部位配列内に、フューリン認識部位を除去する点変異、F-KI15Qを含む。Li et al., 「Effect of cleavage mutants on syncytium formation directed by the wild-type fusion protein of Newcastle disease virus」 J. Virol. 72:3789-95 (1998)。
【０２２１】
E228Q変異を有するFlagタグ化Vps4Aをコードする遺伝子を含むpBJ5発現ベクター、およびCHMP3-RFP融合タンパク質をコードする遺伝子を含むpDsRed2-N1ベクター(Clontech)は、以前に記載されている。Strack et al., 「PIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1p6 and EIAV p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-699 (2003)。
【０２２２】
実施例3：トランスフェクション、感染、および代謝標識
本実施例は、本発明の種々の態様を創出するおよび表すために用いる基本的な技法について記載する。
【０２２３】
サブコンフルエントなELL-O細胞および/または293T細胞のトランスフェクションは、製造業者による推奨通りにLipofectamine(Invitrogen)を用いて達成した。35 mmディッシュ当たり、以下の量のプラスミドDNAを使用した：単独でまたは混合物中に、1.0μg pCAGGS-NP、1.0μg pCAGGS-M、0.75μg pCAGGS-F-KI15Q、および1.0μg pCAGGS-HN。これらの量は、感染効率5でNDVを感染させた細胞と同様の発現レベルを生じるようにあらかじめ決定されたものである。
【０２２４】
すべてのトランスフェクション実験において、35 mmプレート当たり全部で3.75μgのプラスミドDNAを使用した。1つのみ、2つ、または3つのcDNAを用いる場合には、ベクターpCAGGS DNAを添加して、トランスフェクションするDNAの全量を一定に保った。各トランスフェクションでは、OptiMEM培地(Gibco/Invitrogen)中のDNAとLipofectamine 5μlの混合物を室温で45分間インキュベートし、前もってOptiMEMで洗浄した細胞に添加した。細胞を5時間インキュベートし、Lipofectamine-DNA複合体を除去し、補充DMEM 2 mlを添加した。
【０２２５】
36時間後、100μCiの35S-メチオニンおよび35S-システイン混合物(NEG-772 EASYTAG(商標)Express Protein Labeling Mix, 35S、Perkin Elmer Life Sciences Inc.)を添加したシステインおよびメチオニン不含DMEM 0.7 mlで培地を置換した。パルス標識の4時間後、トランスフェクションしたプレート一組を溶解する一方、別の一組は、0.1 mM非放射性メチオニン(Nutritional Biochemicals Corporation)を添加した補充DMEM 1.0 mlで培地を置換した。追跡の8時間後、培地を回収し、細胞を、Triton-DOC(1% Triton、1%デオキシコール酸ナトリウム)および25 mg N-エチルマレイミド(NEM)を含む溶解緩衝液0.5 ml中で溶解した。細胞スクレーパーで細胞を回収し、26ゲージ針を10〜15回通してホモジナイズした。
【０２２６】
サブコンフルエントな293T細胞に、pCAGGS-Mおよび種々の濃度のpBJ5-Vps4-E228Q-FlagまたはpDsRed2-NI-CHMP3を同時にトランスフェクションした。対応する空ベクターを対照として用いた。細胞を36時間インキュベートし、上記と同様のパルス-チェイス手順を行った。
【０２２７】
ELL-O細胞をMOI 5 pfuで5時間感染させ、35S-メチオニンおよび35S-システイン混合物で30分間標識し、上記の通り8時間にわたって非放射性培地中で追跡した。細胞上清を回収し、以下に記載する通りにビリオンを精製した。細胞は、上記の通りに溶解しホモジナイズした。
【０２２８】
実施例4：VLPの精製および単離
以前に報告された手順により、細胞上清からウイルスおよびVLPならびにビリオンを精製した。Levinson et al., 「Radiation studies of avian tumor viruses and Newcastle disease virus」 Virology 28:533-542 (1966)。細胞上清を4℃にて5000 rpmで5分間遠心分離し、TNE緩衝液(25 mM Tris- HCI pH 7.4、150 mM NaCI、 5 mM EDTA)中の20%ショ糖溶液3.5 mlおよび65%ショ糖溶液0.5 mlからなるブロック勾配の上に重層し、SW50.1ローター(Beckman)を用いて4℃にて40,000 rpmで12時間再度遠心分離した。ショ糖勾配界面(濃縮粒子を含む)を0.5 ml中に回収し、80%ショ糖2.0 mlと混合し、80%ショ糖クッション1.0 mlの上に重層した。さらなるショ糖層(50%ショ糖1.0 mlおよび10%ショ糖0.5 ml)を試料の上に重層した。この勾配を4℃にて38,000 rpmで20時間遠心分離した。ポリスタルティック(polystaltic)ポンプを用いて、勾配を底から1 ml画分1つおよび0.5 ml画分8つに回収した。各画分の密度を屈折計を用いて決定した。1つの実験において、すべての組み合わせのタンパク質発現に由来するVLPを調製して、結果を直接比較できるようにした。
【０２２９】
実験は3回繰り返した。免疫沈降およびポリアクリルアミドゲル電気泳動。免疫沈降は、1倍量の細胞溶解物またはショ糖勾配画分と2倍量のTNE緩衝液を混合して行った。試料を特異的抗体と共に4℃で16時間インキュベートした。NP、F、およびHNを沈降させるために用いた抗血清は、標準的な手順により、UV不活化NDVに対して作製されたウサギポリクローナル抗体であった；抗HRIおよび抗HR2 McGinnes et al., 「Newcastle disease virus HN protein alters the conformation of the F protein at cell surfaces」 J. Virol. 76:12622-33 (2002)；抗F2-96および抗A。McGinnes et al., 「Role of carbohydrate processing and calnexin binding in the folding and activity of the HN protein of Newcastle disease virus」 Virus Res 53:175-85 (1998)。
【０２３０】
抗F2-96は、アミノ酸96〜117のFタンパク質配列を含むグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質に対して作製されたものであった。Mタンパク質を沈降させるために用いた抗血清は、精製Mタンパク質に対して作製されたマウスモノクローナル抗体であった。Faeberg et al., 「Strain variation and nuclear association of 20 NDV Matrix protein」 J Virol. 62:586-593 (1988)。免疫複合体(IC)をプロテインA(Pansorbin Cells、CALBIOCHEM)に4℃で2時間かけて吸着させ、ペレット化し、次いで免疫沈降(IP)洗浄緩衝液(0.5% 9 Tween-20および0.4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS))で3回洗浄した。1 M J3メルカプトエタノール(BME)を含むSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動試料緩衝液(125 mM Tris-HCI [pH 6.8]、2% SDS、10%グリセロール、0.4%ブロモフェノールブルー)でICを再懸濁し、煮沸した。
【０２３１】
タンパク質を8%ポリアクリルアミド-SDSゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。得られたオートラジオグラフの定量化は、Fluor-S(商標)MultiImager(BioRad)を用いて達成した。
【０２３２】
実施例5：高効率VLP放出
NP、M、F、およびHNタンパク質の同時発現により、1.19〜1.16 g/ccの密度を有するVLPが放出された(図1、パネルA)。NDV、AV株感染細胞から平行して精製されたウイルス粒子は、1.21〜1.19 g/ccの密度を有していた(図1、パネルB)。本発明の機序を理解する必要はないが、真のウイルスと比較してVLPの密度がわずかに低いのは、VLP中にビリオンRNAが存在しないためである可能性が高いと考えられる。VLPおよびウイルス放出の効率は、パルス中のタンパク質量に対する追跡後の細胞抽出物中に残存するMタンパク質の割合として計算した。実験の追跡部分において細胞由来のMタンパク質が消失しているのは、VLPまたはビリオンとして細胞から放出されたためである。この基準によると、VLP放出の効率は85%であり、NDV放出の効率は92%であった(図1、パネルC)。この結果から、VLPの放出がビリオンの放出とほぼ同程度に効率的であることが示される。
【０２３３】
これらの結果から、4つの主要構造タンパク質を発現する鳥類細胞からNDV VLPが効率的に構築され放出されることが実証される。1つの態様において、Mタンパク質はVLP放出に十分である。VLP形成に対する最小限のタンパク質必要性は、粒子放出を導く各タンパク質の能力を個々に評価することによって決定した。各ウイルスタンパク質を個々に発現する細胞をパルス-チェイス手順で放射性標識し、VLPを上記の通りに単離した。
【０２３４】
実施例6：Mタンパク質依存的VLP放出
VLPは、Mタンパク質を発現する細胞からのみ放出される。図2、パネルB。8時間の追跡後、細胞抽出物中にMタンパク質はほとんど検出されない。図2A、右パネル。本発明の機序を理解する必要はないが、このことから、パルス標識タンパク質の大部分が細胞から放出されたことが示されると考えられる。パルス標識抽出物および追跡抽出物中のMタンパク質のレベルを比較することにより、放出効率が90%であると計算されたとさらに考えられる。
【０２３５】
対照的に、パルス標識されたNP、F、およびHNタンパク質の大部分は、追跡後の抽出物中に残存した(図2A)。HNタンパク質発現細胞から放出された非常に低い密度の物質がわずかに存在したものの、対応する細胞上清中にはやはり目立った量のVLPは検出されなかった(図2、パネルB)。図2、パネルCは、各タンパク質を個々に発現する細胞から産生されたVLPの定量化を示す。興味深いことに、Mタンパク質のみを発現する細胞によるMタンパク質含有粒子の量は、4つすべての構造タンパク質を発現させた場合よりも高かった。しかし、Mタンパク質のみのVLPは、1.23〜1.12 g/ccという値の非常に不均一な密度を有していた(図2、パネルB)。これらの結果から、Mタンパク質が粒子の放出に十分であることが明らかになる。
【０２３６】
実施例7：Mタンパク質依存的VLP放出：対の組み合わせ
実施例6に示したように、Mタンパク質はVLP放出に必要である。Mタンパク質駆動性のVLP形成に対するNP、F、またはHNタンパク質の寄与を判定するために、2つのタンパク質のすべての可能な組み合わせを発現する細胞からVLPを単離し、上記の通りに特徴づけした。Mタンパク質を含まずにタンパク質のいずれかの組み合わせを発現する細胞は、VLPを放出しなかった(図3；パネルC)。さらに、Mタンパク質の非存在下で、対の組み合わせで発現されたNP、F、およびHNタンパク質は、8時間の追跡後に細胞抽出物中に保持された(図3A)。この知見から、Mタンパク質が粒子放出に必要であることが示唆される。NP、F、またはHNタンパク質とMタンパク質との対の発現は、両タンパク質を含むVLPの放出をもたらした(図3、パネルB)。しかし興味深いことに、NP、F、またはHNタンパク質は微量存在するにすぎず、Mタンパク質がVLP中の主なタンパク質であった(図3、パネルB)。
【０２３７】
勾配中のNP、F、またはHNタンパク質の分布は、Mタンパク質の分布と同じであった(図3、パネルB)。加えて、VLP密度は非常に不均一であり、Mタンパク質のみのVLPの密度と非常に類似していた。同様に驚くべきことには、Mタンパク質含有VLPの量は、Mタンパク質とNP、F、またはHNタンパク質の同時発現において有意に減少した(約2〜2.5倍)(図3、パネルC)。これらの結果から、NP、F、またはHNタンパク質が個々に、Mタンパク質駆動性のVLP放出を抑制し得ることが示唆される。
【０２３８】
実施例8：Mタンパク質依存的VLPタンパク質取り込み
他のウイルスタンパク質のVLPへの効率的な取り込みは、Mタンパク質および他のタンパク質の少なくとも2つの発現を必要とする。粒子放出に及ぼす3つのウイルスタンパク質の発現の効果を調べるため、3つのcDNAのすべての可能な組み合わせを細胞にトランスフェクションした。この場合もはやり、VLPはMタンパク質を発現する細胞からのみ放出された。Mタンパク質を含まないNP、F、およびHNタンパク質の発現は、粒子の放出を引き起こさなかった(図4、パネルC)。この知見から、Mタンパク質がVLPの放出に必要であるという本発明者らの結論がさらに強化される。
【０２３９】
単一の糖タンパク質とMタンパク質との発現とは対照的に、FおよびHN糖タンパク質の両方とMタンパク質との同時発現は、両糖タンパク質のVLPへの取り込みの有意な増加をもたらした(図4、パネルBおよびC)。FおよびHNタンパク質は、Mタンパク質と同じ勾配画分中に検出された。さらに、VLPの密度は、Mタンパク質のみ(図4、パネルBと図2、パネルBを比較されたい)またはMタンパク質と単一の糖タンパク質を発現する細胞から作製されたVLPと比較してより均一であった。これらの結果から、FおよびHNタンパク質の両方とMタンパク質との発現が、両糖タンパク質の粒子への効率的な取り込みに必要であることが示される。
【０２４０】
Mタンパク質とNPおよびFまたはHNタンパク質のいずれかとの発現により、NPおよび糖タンパク質のVLPへの取り込みが増加した(図4、パネルBおよびC)。NPタンパク質含有粒子の勾配中の分布は、4つすべての構造タンパク質を発現する細胞から放出されたVLPの分布と類似していた(図1、パネルAと図4、パネルBを比較されたい)。重要なことには、これらの粒子の密度は、Mのみを発現する細胞から放出された粒子と比較してより均一であり、真のウイルスまたは完全VLPの密度と類似していた(図4、パネルBと図1、パネルBを比較されたい)。全体として、これらの結果から、Mタンパク質が粒子放出に必要かつ十分であること、およびMタンパク質と他のタンパク質の少なくとも2つの発現が他のタンパク質のVLPへの効率的な取り込みに必要であることが示される。
【０２４１】
実施例9：VLP放出阻害
宿主細胞のVPS経路は、VLPの形成および放出に関与している。以前の研究から、VPS経路が、エンベロープを有する他のRNAウイルスの出芽に関連づけられている。Demirov et al., 「Retrovirus budding」 Virus Res 106:87 - 102 (2004)；Pornillos et al., 「Mechanisms of enveloped RNA virus budding」 Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002)；およびMorita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004)。CHMP3がESCRT III複合体のサブユニットであることから、この経路がMタンパク質駆動性のVLP放出に関与している可能性がある。von Schwedler et al., 「The protein network of HIV budding」 Cell 4:701-13 (2003)。
【０２４２】
CHMP3とRFPの融合はこれをドミナントネガティブタンパク質に変換し、HIV -1 gag VLP放出を阻害する。Strack et al., 「PIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1p6 and EIAV p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-699 (2003)。Mタンパク質とCHMP3-RFPの同時発現により、VLP放出が98.5%阻害された(図5、パネルAおよびC)。VPS経路の別のドミナントネガティブ成分、Vps4A-E228QとMタンパク質との発現によっても同様の結果が得られ、96.2%の阻害が起こった(図5、パネルBおよびD)。ドミナントネガティブCHMP3およびVsp4Aの発現は、Mタンパク質の発現を抑制しなかった(図5、パネルEおよびF)。したがって、無傷の宿主細胞VPS経路がMタンパク質VLP放出に必須である。
【０２４３】
実施例10：ウイルスおよびVLP放出に及ぼす細胞種依存的効果
本実施例は、VLP放出が宿主細胞種に依存することを示す例示的データを提供する。宿主細胞種は、基礎的VLP放出機序および全体的なVLP放出効率に影響を及ぼす。
【０２４４】
基礎的放出機序
鳥類細胞(ELL-0)からのVLP放出を、霊長類細胞(COS-7細胞)からのVLP放出と比較した。これらの細胞からのウイルス粒子放出を比較するため、同数の鳥類細胞およびCOS-7細胞にMOI＝5でNDVを感染させた。細胞をパルスで放射性標識し、次いで非放射性追跡に供した。追跡中の様々な時点で細胞上清からビリオンを回収し、ウイルス粒子中のタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。
【０２４５】
追跡の様々な時点におけるウイルス粒子中のNPおよびFタンパク質のオートラジオグラフを、それぞれ図14Aおよび14Bに示す(上のゲル：鳥類；下のゲル：COS-7)。各タンパク質のレベルの定量化を、それぞれ図15Aおよび図15Bに示す。明らかに、鳥類細胞から放出されたウイルスの量はCOS-7細胞から放出された量よりも高く、鳥類細胞からの放出速度はCOS-7細胞からの放出速度よりも速かった。鳥類細胞と霊長類細胞とのこの差は、2つの細胞種におけるタンパク質発現のレベルの差によるものではなかった。パルス標識中に作製された全ウイルスタンパク質のレベルは、鳥類細胞よりもCOS-7細胞において高く(示していない)、結果から、ウイルスの侵入、複製、および翻訳は、COS-7細胞において少なくとも鳥類細胞と同程度に効率的であったことが示唆される。
【０２４６】
これらのデータから、ウイルス粒子放出の速度は霊長類細胞よりも鳥類細胞において速く、鳥類細胞から放出されるウイルスの量は霊長類細胞から放出される量よりも有意に高いことが示される。
【０２４７】
放出効率
鳥類細胞がVLPの放出においても同様により効率的であるかどうかを決定するため、同数の鳥類細胞およびCOS-7細胞に、NDVのNP、M、HN、およびF-K115Qタンパク質をコードするcDNAをトランスフェクションした。細胞を4時間放射標識し(すなわちパルス)、次いで非放射性インキュベーションに8時間供した(すなわち追跡)。その後、VLPを細胞上清から単離した。上清中のVLPをショ糖勾配への浮遊により精製した。
【０２４８】
鳥類細胞およびCOS-7細胞それぞれから放出されたVLPを含むショ糖勾配を作製した。それぞれ図16Aおよび16Bを参照されたい。データから明らかに、COS-7細胞よりも鳥類細胞からより多くのVLPが放出されたことが示される。
【０２４９】
鳥類細胞およびCOS-7細胞由来の細胞溶解抽出物を、パルス標識後および非放射性追跡後に調製した。それぞれ図17Aおよび図17Bを参照されたい。重要なことには、HN、F、およびMタンパク質は、非放射性追跡後には鳥類細胞抽出物中にもはや存在しなかった。この知見は、より効率的な鳥類細胞からの放出および/またはVLPへの取り込みと一致する。逆に、これらのウイルスタンパク質のかなりのレベルがCOS-7細胞抽出物中に残存した。この知見は、COS-7細胞中でのウイルスタンパク質の保持、および粒子中へのウイルスタンパク質の放出の低さと一致する。データから明らかに、COS-7細胞よりも鳥類細胞からの方が、VLP放出がより効率的であることが実証される。
【０２５０】
実施例11：特定のウイルスタンパク質誘導性VLP放出の比較
本実施例は、Mタンパク質のみを含むNDVをトランスフェクションした場合に、VLPはやはり鳥類細胞からより効率的に放出されることを実証する。
【０２５１】
上記したように、Mタンパク質cDNAのみをトランスフェクションした細胞からVLP粒子放出を決定した。鳥類細胞およびCOS-7霊長類細胞の両方から、Mタンパク質VLPのショ糖密度勾配精製を行った。それぞれ図18Aおよび18Bを参照されたい。明らかに、鳥類細胞から放出されたVLP Mタンパク質の量は、霊長類細胞から放出されたVLP Mタンパク質よりも有意に高く、したがってより効率的であった。
【０２５２】
さらに、同数の細胞にNPタンパク質cDNA、Mタンパク質cDNA、F-K115Qタンパク質cDNA、またはHNタンパク質cDNAのみをトランスフェクションした。または、実験は、4つすべてのウイルスタンパク質cDNAの組み合わせを有するベクターをトランスフェクションした細胞を用いた。続いて、上記の通りVLPを調製した。各トランスフェクションについてショ糖勾配精製を行い、粒子放出を濃度測定により決定した。種々のウイルスタンパク質cDNAを個々にトランスフェクションした場合、Mタンパク質のみが任意のVLPウイルスタンパク質放出(すなわち、Mタンパク質のみ)をもたらした。細胞に4つすべてのタンパク質をトランスフェクションした場合、VLPウイルスタンパク質放出は4つすべてのタンパク質を含んでいた。いずれの場合にも、放出されたVLPは、COS-7細胞よりも鳥類細胞においてより多くの量のウイルスタンパク質を含んでいた。それぞれ図19Aおよび19Bを参照されたい。明らかに、Mタンパク質VLPおよび完全VLPの放出効率は、COS-7細胞よりも鳥類細胞からの方が良好である。
【０２５３】
実施例12：VLPウイルスワクチンに対する抗体の作製
I. モノクローナル抗体
Balb/cマウスを、KLH結合NDVウイルスペプチドの複数回の腹腔内接種により免疫化する。次いで、免疫化動物の脾細胞を、標準的な手順を用いてマウス骨髄腫AG8細胞と融合させる。Wunderlich et al., J. Immunol. Methods 147:1-11 (1992)。次に、当技術分野で公知の標準的なELISA手順を用いて、得られたハイブリドーマの上清を、卵白アルブミン結合NDVウイルスペプチドに対する免疫反応性についてスクリーニングする。免疫反応性MAbの発現に関して陽性であるハイブリドーマを限界希釈により少なくとも2回クローニングし、MAbアイソタイプ解析を行う。精製MAb IgGは、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて腹水から調製される。融合後、スクリーニングによって複数の陽性親シグナル(parent signal)が示され、そこからモノクローナル抗体産生クローンが調製され得る。
【０２５４】
ハイブリドーマスクリーニングのための免疫沈降/シンチレーションアッセイ法
固相に付着させた場合よりもむしろ溶液中でVLPウイルスタンパク質を認識するモノクローナル抗体を開発しスクリーニングするため、35S-メチオニン標識インビトロ翻訳VLPウイルスタンパク質の免疫沈降を測定するアッセイ法が開発される。標準量のインビトロ翻訳VLPウイルスタンパク質を、イオン強度、pH、および界面活性剤組成について最適化され得る溶液中で、抗体/抗原複合体を形成させる。免疫複合体をプロテインG(Omnisorb細胞)で沈降させ、十分に洗浄した後、結合した放射能を液体シンチレーションカウンターでカウントする；バックグラウンドを差し引き、沈降効率を計算する。この免疫沈降/シンチレーションアッセイ法(IPSA)は、抗体の迅速な同定および特徴づけを可能とし、様々なモノクローナルVLPウイルスタンパク質抗体を試験するために用いられる。このアッセイ法は一般にモノクローナルハイブリドーマ上清およびポリクローナル血清に適用して、免疫沈降に使用できる抗体を同定することができる。
【０２５５】
簡潔に説明すると、約1.5x105 DPMの35S-メチオニン標識インビトロ翻訳VLPウイルスタンパク質を、10X免疫沈降緩衝液(150 mM NaCl、10% NP-40、5%デオキシコール酸、1% SDS、500 mM Tris pH 8)10μlに添加する。これに対して、関心対象のモノクローナル融合物由来のモノクローナル細胞上清90μlを添加し、4℃で2時間反応させる。2時間後、1X免疫沈降緩衝液(RIPA緩衝液；150 mM NaCl、1% NP-40、0.5%デオキシコール酸、0.1% SDS、50 mM Tris pH8)で平衡化したOmnisorb細胞(Calbiochem)の10%溶液40μlを添加し、振盪させながら4℃でさらに2時間反応させる。4500gおよび4℃で5分間遠心分離することによって細胞をペレット化し、冷1X免疫沈降緩衝液800μlで3回洗浄する。ペレットを定量的にシンチレーションバイアルに移し、Auto DPMモードにてBeckman LS6000シンチレーションカウンターでカウントした。次いで、免疫沈降したVLPウイルスタンパク質の割合を計算し得る。
【０２５６】
VLPウイルスタンパク質MAbの特徴づけ
最良の細胞株をさらに特徴づけるために、競合免疫沈降/シンチレーションアッセイ(競合IPSA)を行い得る。この変法では、VLPウイルスタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するクローンを、標識インビトロ翻訳VLPウイルスタンパク質と同時に、約200倍モル過剰の非標識競合体ペプチドに添加した。予測通り、推定エピトープ領域に対するペプチドを、エピトープ領域を示さないと考えられるペプチドと比較する。推定エピトープ領域を含むアッセイにおいて競合率が高いことにより、VLPウイルスタンパク質モノクローナル抗体結合特異性が確認される。
【０２５７】
II. 抗血清
ウイルスタンパク質を沈降させるために用いた抗血清は、抗NDV抗体の混合物であった。NPを沈降させるために用いた抗血清は、標準的な手順により、UV不活化NDVに対して作製されたウサギポリクローナル抗体であった。Fタンパク質を沈降させるために用いた抗血清は、アミノ酸配列130〜173(抗HR1)(McGinnes et al., 「Newcastle disease virus HN protein alters the conformation of the F protein at cell surfaces」 J. Virol. 76:12622-12633 (2002))、470〜500(抗HR2)(Dolganiuc et al., 「Role of the cytoplasmic domain of the Newcastle disease virus fusion protein in association with lipid rafts」 J Virol 77:12968-12979 (2003))、または96〜117(抗F2-96)を含むグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質に対して作製されたものであった。HNタンパク質を沈降させるために用いた抗血清は、アミノ酸96〜117のHNタンパク質配列に対して作製されたものであった(抗A)(McGinnes et al., 「Role of carbohydrate processing and calnexin binding in the folding and activity of the HN protein of Newcastle disease virus」 Virus Res 53:175-85 (1998))。Mタンパク質を沈降させるために用いた抗血清は、精製Mタンパク質に対して作製されたマウスモノクローナル抗体であった(Faeberg et al., 「Strain variation and nuclear association of NDV Matrix protein」 J. Virol. 62:586-593 (1988))。HAタグ化タンパク質を沈降させるために用いた抗体は、アガロースビーズに結合されたマウスモノクローナルHA抗体(Sigma)であった。免疫ブロッティングに使用した二次抗体は、ペルオキシダーゼ結合マウスモノクローナル抗HA抗体(Sigma)であった。
【０２５８】
実施例13：組換えバキュロウイルスベクターの構築
本実施例は、組換えバキュロウイルスベクターの構築の一般的方法を記載する。
【０２５９】
バキュロウイルス組換え体を構築するための一般的模式図を図28に示す。第一段階として、PCR由来DNAとして示される標的遺伝子(すなわち、例えばNDV粒子タンパク質)を、適切なプラスミドトランスファーベクター(すなわち、例えばpBAC4x-1)のAcNPVプロモーターのコピーの下流にクローニングする。トランスファーベクターは、プロモーターおよび標的遺伝子に隣接するバキュロウイルスDNAの上流および下流部分を有する。
【０２６０】
導出された組換えトランスファーベクターの選択されたクローンを、細菌細胞培養物(すなわち、例えば大腸菌)、鳥類細胞培養物(すなわち、例えばELL-O)、またはヒト細胞培養物(すなわち、例えば293T)で増殖させ、得られた組換えプラスミドDNAを特徴づけし、精製する。
【０２６１】
第二段階では、精製された組換えトランスファープラスミドを線状化ウイルスDNAと共に昆虫細胞(すなわち、例えばSf9)に同時トランスフェクションして、組換えバキュロウイルスを構築する。トランスファーベクターの隣接領域は、ウイルス複製中にウイルスDNA配列との相同組換えに関与し、標的遺伝子をバキュロウイルスゲノムの特定の遺伝子座(通常はポリヘドリンまたはp10、トランスファープラスミドによる)に導入する。
【０２６２】
トランスフェクションおよび親ウイルスを除去するためのプラーク精製の後に、高力価のウイルス保存液を適切な組換え体から調製する。高力価の保存液が得られたならば、これを用いて標的タンパク質発現の最適な時間を決定する(プロモーターおよび遺伝子産物の特性に依存する)。これらのパラメータが確立された後、大量培養物を調製し、タンパク質生産に用いる。
【０２６３】
実施例14：麻疹VLPワクチンの生産
本実施例は、麻疹ウイルスに特異的なVLPワクチンの生産をもたらす手順を提示する。
【０２６４】
ベクター
NP(すなわち、例えば配列番号:42)、M(すなわち、例えば配列番号:48)、HA(すなわち、例えば配列番号:30)、および非切断F(すなわち、例えば配列番号:36)タンパク質をコードするMV cDNA配列を発現ベクターpCAGGSにサブクローニングして、それぞれpCAGGS-NP、pCAGGS-M、pCAGGS-HA、およびpCAGGS-F-K111Gを作製する。MV Fタンパク質をコードするcDNAは、アミノ酸108〜112位のフューリン認識部位を除去するよう変異させる。変異は、NDV Fタンパク質におけるK115Q変異と類似の位置であるアミノ酸111位にて、リジンの代わりにグリシンを導入する。Fタンパク質の切断の排除は、Fタンパク質が融合する能力を阻害することになる。培養物における細胞間融合の不在により、おそらくVLPの収率が増加すると考えられる。
【０２６５】
細胞株
麻疹ウイルスは、ヒトおよび霊長類細胞株から効率的に放出されるが、マウス細胞株からは放出されない(Vincent, et al Virology 265: 185)。したがって、Hela細胞(ヒト子宮頸癌細胞)、293細胞(ヒト胎児腎細胞)、VERO細胞(アフリカミドリザル腎細胞)、およびCOS-7(霊長類)細胞が用いられる。
【０２６６】
トランスフェクション、感染、および代謝標識
サブコンフルエントな細胞のトランスフェクションは、製造業者による推奨通りにLipofectamine(Invitrogen)を用いて達成する。35 mmディッシュ当たり、以下の量のプラスミドDNAを使用する：1.0μg pCAGGS-NP、1.0μg pCAGGS-M、0.75μg pCAGGS-F-K111G、および1.0μg pCAGGS-HA。すべてのトランスフェクション実験において、35 mmプレート当たり全部で3.75μgのプラスミドDNAを使用する。1つ、2つ、または3つのcDNAのみを用いる場合には、ベクターpCAGGS DNAを添加して、トランスフェクションするDNAの全量を一定に保つ。各トランスフェクションでは、OptiMEM培地(Gibco/Invitrogen)中のDNAとLipofectamine 5μlの混合物を室温で45分間インキュベートし、前もってOptiMEMで洗浄した細胞に添加する。細胞を5時間インキュベートし、Lipofectamine-DNA複合体を除去し、補充DMEM 2 mlを添加する。36時間後、100μCiの35S-メチオニンおよび35S-システイン混合物(NEG-772 EASYTAG(商標)Express Protein Labeling Mix, 35S、Perkin Elmer Life Sciences Inc.)を添加したシステインおよびメチオニン不含DMEM 0.7 mlで培地を置換する。パルス標識の4時間後、トランスフェクションしたプレート一組を溶解する一方、別の一組は、0.1 mM非放射性メチオニン(Nutritional Biochemical Corporation)を添加した補充DMEM 1.0 mlで培地を置換する。追跡の8時間後、細胞上清を回収する。加えて、細胞を超音波処理して細胞会合VLPを放出させる。得られた細胞上清を混合する。細胞を、Triton-DOC(1% Triton、1%デオキシコール酸ナトリウム)および1.25 mg N-エチルマレイミド(NEM)を含む溶解緩衝液(10 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、10 mM Tris-HCl pH 7.4)0.5 ml中で溶解する。細胞スクレーパーで細胞を回収し、26ゲージ針を10〜15回通してホモジナイズする。
【０２６７】
VPS経路がVLPの出芽に関与しているかどうかを決定するため、サブコンフルエントな293T細胞に、pCAGGS-Mおよび種々の濃度のpBJ5-Vps4-E228Q-FlagまたはpDsRed2-N1-CHMP3を同時にトランスフェクションする。対応する空ベクターを対照として用いる。細胞を36時間インキュベートし、上記と同様のパルス-チェイス手順を行った。
【０２６８】
対照用のウイルス粒子を作製するため、霊長類またはヒト細胞をMOI 5 pfuで30時間感染させ、35S-メチオニンおよび35S-システイン混合物で4時間標識し、上記の通り8時間にわたって非放射性培地中で追跡する。細胞上清を回収し、以下に記載する通りにビリオンを精製する。細胞は、上記の通りに溶解しホモジナイズする。
【０２６９】
ウイルスおよびVLPの精製
ウイルス精製に関して以前に開発された手順により、細胞上清からVLPおよびビリオンを精製する。細胞上清を4℃にて5000 rpmで5分間遠心分離して清澄化し、TNE緩衝液(25 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、 5 mM EDTA)中の20%ショ糖溶液3.5 mlおよび65%ショ糖溶液0.5 mlからなる段階的勾配の上に重層し、SW50.1ローター(Beckman)を用いて4℃にて40,000 rpmで12時間遠心分離する。界面(濃縮粒子を含む)を0.5 ml中に回収し、80%ショ糖2.0 mlと混合し、80%ショ糖クッション1.0 mlの上に重層する。さらなるショ糖層(50%ショ糖1.0 mlおよび10%ショ糖0.5 ml)を試料の上に重層する。この勾配を4℃にて38,000 rpmで20時間遠心分離する。ポリスタルティックポンプを用いて、勾配を底から1 ml画分1つおよび0.5 ml画分8つに回収する。各画分の密度を屈折計を用いて決定する。1つの実験において、すべての組み合わせのタンパク質発現に由来するVLPを調製して、結果を直接比較できるようにする。
【０２７０】
免疫沈降およびポリアクリルアミド電気泳動
免疫沈降は、1倍量の細胞溶解物またはショ糖勾配画分と2倍量のTNE緩衝液を混合して行う。試料をMV特異的ポリクローナル抗体と共に4℃で16時間インキュベートした。NP、F、およびHAを沈降させるために用いる抗血清は、標準的な手順により、UV不活化MVに対して作製されたウサギポリクローナル抗体である。免疫複合体(IC)をプロテインA(Pansorbin Cells、CALBIOCHEM)に4℃で2時間かけて吸着させ、ペレット化し、次いで免疫沈降(IP)洗浄緩衝液(0.5% Tween-20および0.4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS))で3回洗浄する。1 M β-メルカプトエタノール(BME)を含むSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動試料緩衝液(125 mM Tris-HCl、pH 6.8、2% SDS、10%グリセロール、0.4%ブロモフェノールブルー)でICを再懸濁し、煮沸する。タンパク質を8%ポリアクリルアミド-SDSゲルで分離し、オートラジオグラフィーに供す。得られたオートラジオグラフの定量化は、Fluor-S(商標)MultiImager(BioRad)を用いて達成する。
【０２７１】
実施例15：呼吸器合胞体ウイルスVLPワクチンの生産
本実施例は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に特異的なVLPワクチンの生産をもたらす手順を提示する。
【０２７２】
ベクター
NP(すなわち、例えば配列番号:70)、M(すなわち、例えば配列番号:66、またはあるいはM2-1)、G(すなわち、例えば配列番号:54)、および非切断F(すなわち、例えば配列番号:60)タンパク質をコードするRSV cDNA配列を発現ベクターpCAGGSにサブクローニングして、それぞれpCAGGS-NP、pCAGGS-M2-1、pCAGGS-G、およびpCAGGS-F-R108N/R109Nを作製する。RSV Fタンパク質をコードするcDNAは、以前に報告されたアミノ酸106〜109位および131〜136位の2つのフューリン認識部位のうちの一方を除去するよう変異させる(Gonzalez-Reyes, et al, PNAS 98: 9859)。切断の排除は、Fタンパク質が融合する能力を阻害することになる。細胞間融合の不在により、おそらくVLPの放出が増加すると考えられる。二重変異、R108N/R109Nは一方の切断を除去し、タンパク質の融合活性を阻害する(Gonzalez-Reyes, et al, PNAS 98: 9859)。他のパラミクソウイルスでは観察されないさらなるRSVタンパク質にNS1、NS2、M2-2、およびSHがあるが、いずれもウイルス集合には非必須であることが示されている(Collins, et al, Respiratory Syncytial Virus, Fields Virology, Ed. Knipe, D. and Howley, P. Lippincott Williams and Wilkins, 2001に概説されている)。Gタンパク質もまた集合に非必須であるが、ウイルスに対する防御免疫応答に寄与する可能性が高い。
【０２７３】
細胞株
RSVは、ヒトおよび動物源由来の種々の細胞株において効率的に増殖する。しかしながら、HEp-2細胞(Hela細胞変種)がウイルスの産生において最も効率的であるため(Collins, et al, Respiratory Syncytial Virus, Fields Virology, Ed. Knipe, D. and Howley, P. Lippincott Williams and Wilkins, 2001に概説されている)、この細胞が用いられる。同様にRSVに許容的であることが報告されているA549細胞(II型肺胞上皮癌細胞)もまた用いられる。
【０２７４】
トランスフェクション、感染、および代謝標識
サブコンフルエントな細胞のトランスフェクションは、製造業者による推奨通りにLipofectamine(Invitrogen)を用いて達成する。35 mmディッシュ当たり、以下の量のプラスミドDNAを使用する：1.0μg pCAGGS-NP、1.0μg pCAGGS-M2-1、0.75μg pCAGGS-F-R108N/R109N、および1.0μg pCAGGS-G。すべてのトランスフェクション実験において、35 mmプレート当たり全部で3.75μgのプラスミドDNAを使用する。1つ、2つ、または3つのcDNAのみを用いる場合には、ベクターpCAGGS DNAを添加して、トランスフェクションするDNAの全量を一定に保つ。各トランスフェクションでは、OptiMEM培地(Gibco/Invitrogen)中のDNAとLipofectamine 5μlの混合物を室温で45分間インキュベートし、前もってOptiMEMで洗浄した細胞に添加する。細胞を5時間インキュベートし、Lipofectamine-DNA複合体を除去し、補充DMEM 2 mlを添加する。36時間後、100μCiの35S-メチオニンおよび35S-システイン混合物(NEG-772 EASYTAG(商標)Express Protein Labeling Mix, 35S、Perkin Elmer Life Sciences Inc.)を添加したシステインおよびメチオニン不含DMEM 0.7 mlで培地を置換する。パルス標識の4時間後、トランスフェクションしたプレート一組を溶解する一方、別の一組は、0.1 mM非放射性メチオニン(Nutritional Biochemical Corporation)を添加した補充DMEM 1.0 mlで培地を置換する。追跡の8時間後、培地を回収する。加えて、細胞を超音波処理して細胞会合VLPを放出させる。得られた細胞上清を混合する。細胞を、Triton-DOC(1% Triton、1%デオキシコール酸ナトリウム)および1.25 mg N-エチルマレイミド(NEM)を含む溶解緩衝液(10 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、10 mM Tris-HCl pH 7.4)0.5 ml中で溶解する。細胞スクレーパーで細胞を回収し、26ゲージ針を10〜15回通してホモジナイズする。
【０２７５】
VPS経路がVLPの出芽に関与しているかどうかを決定するため、サブコンフルエントなHEp-2細胞に、pCAGGS-M2-1および種々の濃度のpBJ5-Vps4-E228Q-FlagまたはpDsRed2-N1-CHMP3を同時にトランスフェクションする。対応する空ベクターを対照として用いる。細胞を36時間インキュベートし、上記と同様のパルス-チェイス手順を行った。
【０２７６】
対照用のウイルス粒子を作製するため、細胞をMOI 10 pfuで30時間感染させ、35S-メチオニンおよび35S-システイン混合物で4時間標識し、上記の通り8時間にわたって非放射性培地中で追跡する。細胞上清を回収し、以下に記載する通りにビリオンを精製する。細胞は、上記の通りに溶解しホモジナイズする。
【０２７７】
ウイルスおよびVLPの精製
ウイルス精製に関して以前に開発された手順により、細胞上清からVLPおよびビリオンを精製する。細胞上清を4℃にて5000 rpmで5分間遠心分離して清澄化し、TNE緩衝液(25 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、 5 mM EDTA)中の20%ショ糖溶液3.5 mlおよび65%ショ糖溶液0.5 mlからなる段階的勾配の上に重層し、SW50.1ローター(Beckman)を用いて4℃にて40,000 rpmで12時間遠心分離する。界面(濃縮粒子を含む)を0.5 ml中に回収し、80%ショ糖2.0 mlと混合し、80%ショ糖クッション1.0 mlの上に重層する。さらなるショ糖層(50%ショ糖1.0 mlおよび10%ショ糖0.5 ml)を試料の上に重層する。この勾配を4℃にて38,000 rpmで20時間遠心分離する。ポリスタルティックポンプを用いて、勾配を底から1 ml画分1つおよび0.5 ml画分8つに回収する。各画分の密度を屈折計を用いて決定する。1つの実験において、すべての組み合わせのタンパク質発現に由来するVLPを調製して、結果を直接比較できるようにする。
【０２７８】
免疫沈降およびポリアクリルアミド電気泳動
免疫沈降は、1倍量の細胞溶解物またはショ糖勾配画分と2倍量のTNE緩衝液を混合して行う。試料をRSV特異的ポリクローナル抗体と共に4℃で16時間インキュベートする。使用する抗血清は、いくつかの供給源から市販されている。免疫複合体(IC)をプロテインA(Pansorbin Cells、CALBIOCHEM)に4℃で2時間かけて吸着させ、ペレット化し、次いで免疫沈降(IP)洗浄緩衝液(0.5% Tween-20および0.4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS))で3回洗浄する。1 M β-メルカプトエタノール(BME)を含むSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動試料緩衝液(125 mM Tris-HCl、pH 6.8、2% SDS、10%グリセロール、0.4%ブロモフェノールブルー)でICを再懸濁し、煮沸する。タンパク質を8%ポリアクリルアミド-SDSゲルで分離し、オートラジオグラフィーに供す。得られたオートラジオグラフの定量化は、Fluor-S(商標)MultiImager(BioRad)を用いて達成する。
【０２７９】
実施例16：パラインフルエンザ3型VLPワクチンの生産
本実施例は、パラインフルエンザ3型(PIV)に特異的なVLPワクチンの生産をもたらす手順を提示する。
【０２８０】
ベクター
NP(すなわち、例えば配列番号:76)、M(すなわち、例えば配列番号:80)、HN(すなわち、例えば配列番号:84)、および非切断F(すなわち、例えば配列番号:78)タンパク質をコードするPIV3 cDNA配列を発現ベクターpCAGGSにサブクローニングして、それぞれpCAGGS-NP、pCAGGS-M、pCAGGS-HN、およびpCAGGS-Fを作製する。PIV3 Fタンパク質をコードするcDNAは、アミノ酸109位のフューリン認識部位を除去するよう変異させる。アミノ酸108位のリジンをグリシンに変更する。切断の排除は、Fタンパク質が融合する能力を阻害することになる。細胞間融合の不在により、おそらくVLPの放出が増加すると考えられる。
【０２８１】
細胞株
PIV 3は、ヒトおよび霊長類源由来の種々の細胞株において効率的に増殖する。したがって、Hela細胞(ヒト子宮頸癌細胞)、293細胞(ヒト胎児腎細胞)、VERO細胞(アフリカミドリザル腎細胞)、およびCOS-7(霊長類)細胞が用いられる。(Chanock, et al, Parainfluenza Viruses, Fields Virology, Ed. Knipe, D. and Howley, P. Lippincott Williams and Wilkins, 2001に概説されている)。LLC-MK2(アカゲザル腎細胞)およびNCI-H292(ヒト肺癌)細胞はウイルスの産生にうまく用いられているため、これらの細胞もまた用いられる。
【０２８２】
トランスフェクション、感染、および代謝標識
サブコンフルエントな細胞のトランスフェクションは、製造業者による推奨通りにLipofectamine(Invitrogen)を用いて達成する。35 mmディッシュ当たり、以下の量のプラスミドDNAを使用する：1.0μg pCAGGS-NP、1.0μg pCAGGS-M、0.75μg pCAGGS-F-K108G、および1.0μg pCAGGS-HN。すべてのトランスフェクション実験において、35 mmプレート当たり全部で3.75μgのプラスミドDNAを使用する。1つ、2つ、または3つのcDNAのみを用いる場合には、ベクターpCAGGS DNAを添加して、トランスフェクションするDNAの全量を一定に保つ。各トランスフェクションでは、OptiMEM培地(Gibco/Invitrogen)中のDNAとLipofectamine 5μlの混合物を室温で45分間インキュベートし、前もってOptiMEMで洗浄した細胞に添加する。細胞を5時間インキュベートし、Lipofectamine-DNA複合体を除去し、補充DMEM 2 mlを添加する。36時間後、100μCiの35S-メチオニンおよび35S-システイン混合物(NEG-772 EASYTAG(商標)Express Protein Labeling Mix, 35S、Perkin Elmer Life Sciences Inc.)を添加したシステインおよびメチオニン不含DMEM 0.7 mlで培地を置換する。パルス標識の4時間後、トランスフェクションしたプレート一組を溶解する一方、別の一組は、0.1 mM非放射性メチオニン(Nutritional Biochemical Corporation)を添加した補充DMEM 1.0 mlで培地を置換する。追跡の8時間後、細胞上清を回収する。細胞を、Triton-DOC(1% Triton、1%デオキシコール酸ナトリウム)および1.25 mg N-エチルマレイミド(NEM)を含む溶解緩衝液(10 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、10 mM Tris-HCl pH 7.4)0.5 ml中で溶解する。細胞スクレーパーで細胞を回収し、26ゲージ針を10〜15回通してホモジナイズする。
【０２８３】
VPS経路がVLPの出芽に関与しているかどうかを決定するため、サブコンフルエントなHEp-2細胞に、pCAGGS-Mおよび種々の濃度のpBJ5-Vps4-E228Q-FlagまたはpDsRed2-N1-CHMP3を同時にトランスフェクションする。対応する空ベクターを対照として用いる。細胞を36時間インキュベートし、上記と同様のパルス-チェイス手順を行った。
【０２８４】
対照用のウイルス粒子を作製するため、細胞をMOI 10 pfuで30時間感染させ、35S-メチオニンおよび35S-システイン混合物で4時間標識し、上記の通り8時間にわたって非放射性培地中で追跡する。細胞上清を回収し、以下に記載する通りにビリオンを精製する。細胞は、上記の通りに溶解しホモジナイズする。
【０２８５】
ウイルスおよびVLPの精製
ウイルス精製に関して以前に開発された手順により、細胞上清からVLPおよびビリオンを精製する。細胞上清を4℃にて5000 rpmで5分間遠心分離して清澄化し、TNE緩衝液(25 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、 5 mM EDTA)中の20%ショ糖溶液3.5 mlおよび65%ショ糖溶液0.5 mlからなる段階的勾配の上に重層し、SW50.1ローター(Beckman)を用いて4℃にて40,000 rpmで12時間遠心分離する。界面(濃縮粒子を含む)を0.5 ml中に回収し、80%ショ糖2.0 mlと混合し、80%ショ糖クッション1.0 mlの上に重層する。さらなるショ糖層(50%ショ糖1.0 mlおよび10%ショ糖0.5 ml)を試料の上に重層する。この勾配を4℃にて38,000 rpmで20時間遠心分離する。ポリスタルティックポンプを用いて、勾配を底から1 ml画分1つおよび0.5 ml画分8つに回収する。各画分の密度を屈折計を用いて決定する。1つの実験において、すべての組み合わせのタンパク質発現に由来するVLPを調製して、結果を直接比較できるようにする。
【０２８６】
免疫沈降およびポリアクリルアミド電気泳動
免疫沈降は、1倍量の細胞溶解物またはショ糖勾配画分と2倍量のTNE緩衝液を混合して行う。試料をPIV3特異的ポリクローナル抗体と共に4℃で16時間インキュベートする。使用する抗血清は、いくつかの供給源から市販されている。免疫複合体(IC)をプロテインA(Pansorbin Cells、CALBIOCHEM)に4℃で2時間かけて吸着させ、ペレット化し、次いで免疫沈降(IP)洗浄緩衝液(0.5% Tween-20および0.4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS))で3回洗浄する。1 M β-メルカプトエタノール(BME)を含むSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動試料緩衝液(125 mM Tris-HCl、pH 6.8、2% SDS、10%グリセロール、0.4%ブロモフェノールブルー)でICを再懸濁し、煮沸する。タンパク質を8%ポリアクリルアミド-SDSゲルで分離し、オートラジオグラフィーに供す。得られたオートラジオグラフの定量化は、Fluor-S(商標)MultiImager(BioRad)を用いて達成する。
【０２８７】
実施例17：後期ドメインの部位特異的突然変異誘発
アミノ酸216位および219位ならびにアミノ酸232位および235位におけるMタンパク質PKSPおよびYANL配列の変異をPCRによって導入し、それぞれM-A216A219およびM-A232A235を得た。216位および219位のプロリン残基ならびに232位および235位のチロシンおよびロイシン残基それぞれをアラニンで置換するため、特異的な部位特異的突然変異誘発プライマーを設計した。アミノ酸232〜235位のYANLをPATPまたはYPDL配列に置換することにより、さらなる変異体M遺伝子を構築した。各Mタンパク質変異体DNAの遺伝子全体を配列決定し、突然変異誘発手順によってさらなる変異が導入されていないことを確認した。作製された変異を図70に示す。
【０２８８】
実施例18：293T細胞からのVLP放出
本実施例は、利用可能なドミナントネガティブ変異体ヒトVPSタンパク質の粒子放出に及ぼす影響、およびヒト腎上皮細胞(293T)がNDV VLPの放出を支持し得るかどうかを評価する。
【０２８９】
Mタンパク質のみを発現する293T細胞(上パネル)またはNP、M、F-K115Q、およびHNタンパク質を同時発現する293T細胞(下パネル)から、VLP粒子が放出された。図67、パネルA。Mタンパク質のみを発現する293T細胞から放出された粒子は、密度に関して非常に不均一であり(図67、パネルA、上パネル)、Mタンパク質のみを発現する鳥類細胞から放出された粒子と類似していた(データは示さず)。対照的に、4つすべての主要構造タンパク質を発現する293T細胞から放出されたVLPは、密度がより均一であった。これらの粒子は、ゲノムRNAが存在しないために、真のウイルス(1.2 g/cc；(Lamb et al., Paramyxoviridae: The Viruses and Their Replication, Third edition ed, vol. 1. LippincottWilliams & Wilkins, Philadelphia (2001)))よりも密度がわずかに低かった(1.18 g/cc)。
【０２９０】
これらを総合した結果から、Mタンパク質VLPおよび完全VLPが293T細胞から放出されたことが示される。しかし、長時間の非放射性追跡後に細胞中に残存するパルス標識Mタンパク質の割合によって測定される、293T細胞からの粒子の放出効率は、鳥類細胞からのVLP放出よりも低かった(それぞれ50%対84%、データは示さず)。
【０２９１】
実施例19：粒子放出を阻害するドミナントネガティブVPSタンパク質変異体
本実施例は、粒子放出の阻害がドミナントネガティブVPSタンパク質の過剰発現にのみ起因するかどうかを決定するために設計した。
【０２９２】
293T細胞に、ベクター対照、野生型CHMP3、野生型Vps4A、野生型AIP1、ドミナントネガティブ(dn)CHMP3、dn Vps4A、およびdn AIP1をトランスフェクションした。
【０２９３】
各VPSタンパク質の野生型は、粒子放出にほとんど影響を及ぼさなかった。Mタンパク質粒子放出は、dn-CHMP3により約90%阻害された(図68、パネルAおよびB)。Vps4A-E228QはMタンパク質VLP放出を約90%阻害し(図68、パネルCおよびD)、AIP-1-RFPも粒子放出を90%阻害した(図68、パネルEおよびF)。ドミナントネガティブ型のCHMP3、Vps4A、およびAIP1は、4つすべてのウイルスタンパク質を含むVLPの放出を阻害したが、野生型は阻害しなかった。図69。
【０２９４】
これらを総合した結果から、VLP放出の阻害はVLPタンパク質の過剰発現に起因したのではなく、むしろdn変異体タンパク質の特定の効果によるものであったことが示される。これらの結果から、無傷のVPS経路がMタンパク質粒子放出を促進するという結論が支持される。
【０２９５】
実施例20：VLP放出を阻害するYANL配列変異
本実施例は、NDV Mタンパク質のLドメインが粒子の出芽において役割を果たすことを示すデータを提示する。例えば、NDV Mタンパク質の配列は、それぞれ古典的LドメインPTAPおよびYPXLに類似している2つの潜在的Lドメイン配列、PKSPおよびYANLを有する(Freed, E. O., 「Mechanisms of enveloped virus release」 Virus Res 106:85-86 (2004))。以下のデータは、これらのLドメイン配列内に変異を誘導することによって、VLP放出が阻害され得ることを示す。
【０２９６】
PKSP配列中のプロリン残基をアラニンで置換し(M-A216A219)；YANL配列中のチロシンおよびロイシンをアラニンで置換した(M-A232A235)(図70、パネルA)。これらの変異体Mタンパク質を、個々に(図70、パネルB、抽出物)、またはNP、F-K115Q、およびHNタンパク質と組み合わせて(図70、パネルD、抽出物)発現させた。野生型Mタンパク質を発現する細胞に匹敵するレベルで、M-A216A219変異体を発現する細胞から粒子が放出された。図5、パネルB〜E。
【０２９７】
対照的に、M-A232A235変異体を発現する細胞から放出される粒子の顕著な減少が見出された(図70、パネルB)。同様に、M-A232A235変異体タンパク質とNP、F-K115Q、およびHNタンパク質の同時発現により、放出される粒子が80%減少した(図70、パネルD(レーン6と8を比較されたい)およびパネルE)。M-A216A219変異体タンパク質とNP、F-K115Q、およびHNタンパク質を同時発現する細胞から放出されたVLPの量は、野生型レベルに匹敵した(図70、パネルD、レーン6および7)。
【０２９８】
YANL配列の変異による粒子放出の阻害が、Lドメイン活性の除去に起因するのか、またはMタンパク質の構造の欠陥に起因するのかを決定するため、YANL配列を2つの公知の古典的Lドメイン配列、YPDLおよびPTAPで個別に置換した(Morita et al., 「Retrovirus budding」 Annu Rev Cell Dev Biol 20:395-425 (2004)；Strack et al., 「AIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1 p6 and EIAV p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-699 (2003))。
【０２９９】
YPDLおよびPTAP配列はいずれもNDV Mタンパク質粒子の放出を支持した。図705、パネルBおよびC。置換されたYPDLおよびPTAPモチーフを含むNDV Mタンパク質から放出された粒子の量は、野生型レベルに匹敵した。これらの結果から、NDV Mタンパク質における232〜235位のYANL配列がLドメインとして機能することが強く示唆される。
【０３００】
YPXL Lドメインを有するgagタンパク質を有するレトロウイルス粒子は、AIP1を含み(Strack et al., 「AIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1 p6 and EIAV p9 functioning in virus budding」 Cell 114:689-699 (2003))、NDV VLPタンパク質またはビリオンタンパク質を含むSDS-PAGEゲルにおいて、およそ100 kDの大きさを有するポリペプチドを示し得る。AIP1はNDV粒子およびVLP中に取り込まれ、したがって、Mタンパク質と、N末端(HA-AIP1)またはC末端(AIP1-HA)でHAタグ化したAIP1またはベクターのみを同時発現させた。Mタンパク質とベクターを発現する細胞およびMタンパク質といずれかのHAタグ化AIP1を発現する細胞から、Mタンパク質粒子が放出された。図71、パネルA。HA-AIP1およびAIP1-HAの発現は匹敵するレベルであった(図71、パネルA、IB抽出物ゲル、レーン2および3)。しかし、AIP1-HAのみがVLP中に取り込まれた(図71、パネルA、IB VLPゲル レーン3)。AIP1-HAはまた、精製された破壊VLPから沈降され得る。図71、パネルB、右側。
【０３０１】
これらの結果から、AIP1がVLP中に取り込まれることが実証され、AIP1が粒子内でMタンパク質と直接またな間接的に相互作用し得ることが示唆される。
【０３０２】
実施例21：共免疫沈降
精製VLPを、1% Triton X-100、2.5 mg/ml N-エチレンマレイミドを含む氷冷TNE緩衝液(25 mM Tris HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、5 mM EDTA)中で15分間インキュベートした。過剰の一次抗体を添加し、VLPを4℃で一晩インキュベートした。1% Triton X-100および5 mgウシ血清アルブミン(BSA)を含むTNE緩衝液中で一晩ブロッキングし、次いで1% Triton X-100および1 mg/ml BSAを含むTNEで前洗浄したPansorbin細胞を、予備実験で決定した過剰量添加し、一定に混合しながら4℃で少なくとも2時間インキュベーションを継続した。免疫複合体を遠心分離(微量遠心機で10,000 rpmの30秒間)により回収し、0.5% Triton X-100を含む氷冷TNEで3回洗浄した。ペレット化した複合体をゲル試料緩衝液で再懸濁した。
【０３０３】
実施例22：プロテアーゼ保護アッセイ法
鳥類細胞抽出物およびVLP由来のMタンパク質のプロテアーゼ消化は、0.25、0.5、1、5、10、および20μgのプロテイナーゼK/ml試料を添加し、氷上で30分間インキュベートすることによって達成した。平行して、VLPはまた、プロテイナーゼKとインキュベートする前に、Triton X-100に関して0.5%にした。消化後、フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)(0.1 M)を添加した。その後の免疫沈降のため、反応混合物をTriton X-100に関して1%およびデオキシコール酸ナトリウムに関して0.5%にした。
【０３０４】
実施例23：免疫蛍光顕微鏡観察
カバーガラスを含む35 mmディッシュで培養した鳥類細胞に、種々の組み合わせのNDV cDNAを上記の通りにトランスフェクションした。40時間後、核を5μg/ml 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)により37℃で30分間染色した。細胞を氷冷免疫蛍光(IF)緩衝液(1%ウシ血清アルブミン、0.02%アジ化ナトリウム、および5 mM CaCl2を含むPBS)で2回洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで固定し、IF緩衝液で2時間ブロッキングし、HNおよびFタンパク質に対するポリクローナル抗体を含むIF緩衝液中で4℃で1時間インキュベートした。
【０３０５】
細胞を氷冷IF緩衝液で2回洗浄し、0.05% Triton X-100で透過処理し、IF緩衝液で少なくとも2時間ブロッキングし、抗Mタンパク質モノクローナル抗体(52-E5)を含む精製腹水を含むIF緩衝液中で4℃で1時間インキュベートした。次いで細胞を氷冷緩衝液で2回洗浄し、その後フルオレセイン結合ヤギ抗ウサギIgG(Alexa(登録商標)488；Molecular Probes)およびローダミン結合ヤギ抗マウスIgG(Alexa(登録商標)568；Molecular Probes)二次抗体を含むIF緩衝液中で4℃で1時間インキュベートした。細胞を氷冷IF緩衝液で洗浄し、封入媒体(Vectashield(登録商標)、Vector Labs, Inc)を用いてスライド上に封入し、免疫蛍光顕微鏡観察を行った。Nikon蛍光顕微鏡およびOpenlab(登録商標)ソフトウェアを用いて蛍光像を獲得し、Adobe Photoshop(登録商標)を用いて加工した。
【０３０６】
実施例24：膜会合Mタンパク質
本実施例は、プロテアーゼとのインキュベーションによりMタンパク質が膜と会合し得ることを示唆する、ショ糖勾配データを確認するデータを提供する。
【０３０７】
VLPおよび細胞抽出物を未処理のままにしておくか(図62、レーン1)、または種々の濃度のプロテイナーゼKで処理した(レーン2〜7)。予測通り、細胞抽出物中のMタンパク質は低濃度のプロテアーゼに感受性があった(図62 上パネル)。Mタンパク質の下のバンドはプロテアーゼ消化産物であり、Mタンパク質がプロテアーゼ耐性コアを有することが示唆される。しかしながら、VLP中のMタンパク質は大部分がプロテアーゼ消化から保護された(図62、中央パネル)。一方、界面活性剤による粒子膜の破壊によって、Mタンパク質の消化が起こった(図62、下パネル)。
【０３０８】
総合してこれらの結果から、Mタンパク質VLPが膜結合粒子であること実証された。
【０３０９】
実施例25：Mタンパク質媒介性VLP放出
本実施例は、Mタンパク質遺伝子の非存在下におけるVLP放出を試験することにより、VLP放出に対するMタンパク質の十分性に関するデータを拡張する。
【０３１０】
細胞に、M遺伝子の非存在下におけるNP、F、およびHN cDNAのすべての可能な組み合わせをトランスフェクションした。Mタンパク質を含まずにタンパク質の任意の組み合わせを発現する細胞は、VLPを放出しなかった。図63。さらに、Mタンパク質の非存在下で、NP、F、およびHNタンパク質(対の組み合わせで発現された)は、8時間の追跡後に細胞抽出物中に保持された(図3；パネルA：レーン2、4、および5、ならびにパネルC)。
【０３１１】
これらの結果から、VLP放出がMタンパク質によって媒介されることが強く示唆される。
【０３１２】
実施例26：Mタンパク質/糖タンパク質共局在
本実施例は、VLP集合において各タンパク質が果たす役割をさらに探索する。具体的には、M、F、およびHNタンパク質の原形質膜共局在を免疫蛍光によって決定した。
【０３１３】
抗体の結合を細胞表面FまたはHNタンパク質に限定するため、細胞透過処理の前に、トランスフェクション細胞を抗Fタンパク質抗体または抗HNタンパク質抗体と共にインキュベートした。次いで細胞を0.05% Tritoin X-100を用いて透過処理し、その後Mタンパク質特異的抗体と共にインキュベートした。
【０３１４】
ベクターをトランスフェクションした対照細胞およびM、F-K115Q、またはHNタンパク質を個々に発現する細胞から、F-K115QおよびHNタンパク質が細胞表面上に散在して分布していることが実証された(図64、パネルA)。Mタンパク質は、散在性の細胞質染色および様々な大きさの点状構造を示した(図64、パネルA；抗M画像および融合画像)。しかし、FまたはHNタンパク質とMタンパク質の同時発現は、Mタンパク質、Fタンパク質、またはHNタンパク質の分布にほとんど影響を及ぼさなかった。さらに、FまたはHN糖タンパク質とMタンパク質の共局在はほとんど観察されなかった。図64、パネルB。これらの知見は、対の同時発現後に、Mタンパク質含有VLP中へのFまたはHNタンパク質の取り込みが非常に低いことと相関する。
【０３１５】
Mタンパク質と少なくとも2つの他のタンパク質の同時発現は、Mタンパク質の分布をわずかに変化させた。例えば、FおよびHNタンパク質とのMタンパク質同時発現では、Mタンパク質とFまたはHNタンパク質との共局在が増加した。図64、パネルC。この結果は、2つのタンパク質をMタンパク質と同時発現させた場合に、HN、F、またはNPタンパク質の取り込みが増加することと一致する。
【０３１６】
4つすべてのタンパク質を同時発現させた場合、Mタンパク質の分布は、主に細胞の末端に沿って分布するより点状の構造へと変化した。さらに、FまたはHNタンパク質シグナルの大部分がMタンパク質と共局在した。図64、パネルD。本発明の機序を理解する必要はないが、この結果は、4つすべてのタンパク質を同時発現させた場合のVLPのより規則正しい集合と一致すると考えられる。
【０３１７】
総合するとこれらの結果から、ウイルスタンパク質の共局在は3つのタンパク質の発現によって検出され、NP、M、F、およびHNタンパク質が同時発現された場合により顕著であることが示唆される。これらの結果から、粒子の集合に関与する特異的タンパク質間相互作用が存在することもまた示唆される。
【０３１８】
実施例27：VLPウイルスタンパク質相互作用
本実施例は、共免疫沈降技法を用いて、VLP集合に関与するいくつかの特異的タンパク質相互作用の同定を提供する。
【０３１９】
タンパク質の種々の組み合わせによって形成された放射性標識VLPを1% Triton X-100中で可溶化し、M、HN、またはFタンパク質に対する単一特異的抗体の混合物で、存在するタンパク質を個別に沈降させた。タンパク質はまた、すべてのVLPタンパク質を沈降させるために、全タンパク質に対する特異性を有する抗体の混合物で沈降させた(レーン6)。
【０３２０】
最初に、各抗体混合物によって、M、HN、F、およびNPで形成されたVLPからすべてのタンパク質が沈降したが、各タンパク質の沈降効率は抗体特異性によって異なった(図65、パネルA)。本発明の機序を理解する必要はないが、これらの結果は、1つが沈降することで他の3つのタンパク質の沈降が起こるような4つすべてのタンパク質間の相互作用のネットワークと一致すると考えられる。
【０３２１】
この結果から、沈降したタンパク質に間接的に結合していたタンパク質は、沈降したタンパク質に直接結合していたタンパク質よりも低い効率で沈降することが示唆された。例えば、抗Fタンパク質抗体はNPを非常に効率的に沈降させたが、Mタンパク質の沈降は非常に非効率的であった(レーン3)。この知見から、Fタンパク質とNPとの間には直接的結合が存在し得るが、Fタンパク質とMタンパク質との間には存在する可能性のないことが示唆される。
【０３２２】
VLPにおけるタンパク質間相互作用は、3つのタンパク質のすべての組み合わせによって形成されたVLPからのタンパク質の沈降によって、より明確に明らかにされた。M、F-K115Q、およびHNタンパク質を発現する細胞から放出されたVLPでは、抗Fタンパク質によって、Fタンパク質および微量のHNタンパク質のみが沈降した(図65、パネルB、レーン3)。この結果から、Fタンパク質がMタンパク質と直接複合化しないことが示される。
【０３２３】
抗HNタンパク質抗体は、Mタンパク質およびHNタンパク質を共沈させた(図65、パネルB、レーン4)。同様に、抗Mタンパク質抗体は、HNタンパク質およびMタンパク質を共沈させた(図65、パネルB、レーン5)。これらの結果から、Mタンパク質はHNタンパク質と相互作用するが、Fタンパク質とは相互作用しないことが強く示唆される。
【０３２４】
NP、M、およびF-K115Qタンパク質を含むVLPもまた放出させた。抗Fタンパク質抗体はNPおよびFタンパク質を共沈させたが、Mタンパク質は共沈させなかった。(図65、パネルC、レーン3)。抗Mタンパク質抗体はNPおよびMタンパク質を共沈させたが、Fタンパク質は共沈させなかった(図65、パネルC、レーン4)。これらの知見から、Mタンパク質がNPと直接相互作用すること、およびFタンパク質がNPと直接相互作用することが示され、FとMタンパク質が相互作用しないことが確認される。
【０３２５】
本発明の機序を理解する必要はないが、NPタンパク質の非効率的な沈降が、沈降するFタンパク質の量を非常に低いレベルにまで減少させ得るため、抗Mタンパク質抗体は検出可能な量のFタンパク質を間接的に沈降させないと考えられる。または、抗Mタンパク質抗体によってFタンパク質を沈降させるために必要なNP間の相互作用が、VLP溶解によって破壊される可能性がある。例えば、NP、M、およびHNを含むVLPを用いた場合、抗HNタンパク質抗体によって形成された複合体は、NPおよびMタンパク質ならびにHNタンパク質を含んでいた(図65、パネルD、レーン3)。加えて、抗Mタンパク質抗体はNPおよびHNタンパク質を沈降させた(図65、パネルD、レーン4)。これらの知見は、Mタンパク質がNPおよびHNタンパク質の両方と相互作用するという結論と一致する。1つの態様において、HNタンパク質とNPタンパク質が相互作用し得ることがさらに意図される。
【０３２６】
全体として、VLPにおけるタンパク質の共免疫沈降の結果および細胞共局在試験の結果から、ウイルスタンパク質のVLPへの取り込みに関する合理的根拠が提供され、特異的タンパク質相互作用がNDVウイルス様粒子の集合に関与することが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０３２７】
以下の図面は本発明の特定の態様を示す例として提示するにすぎず、限定を意図するものではない。
【図１】VLPの形成および放出をもたらすNP、F、HN、およびMタンパク質の同時発現を示す例示的データを提示する。トランスフェクション抽出物中(パネルA)および感染抽出物中(パネルB)の放射性標識タンパク質を、全ウイルスタンパク質に特異的な抗体の混合物で免疫沈降させ、沈降した標識タンパク質を各パネルの左側に示す。細胞上清中のVLP粒子を、実施例4に記載した通りに精製した。ショ糖勾配への浮遊後、各勾配画分を抗体混合物で免疫沈降させた(各パネルの右側)。各画分の密度(g/cc)を下部に示す。パネルA：pCAGGS(-NP)、(-M)、(F-K115Q)、および(-HN)を同時トランスフェクションした鳥類細胞を35S-メチオニンおよび35S-システインで4時間放射性標識し(P)、次いで非放射性培地中で8時間追跡した(C)。パネルB：感染効率(MOI)5 pfuでNDVのAV株を5時間感染させた鳥類細胞を30分間パルス標識し、非放射性培地中で8時間追跡した。パネルC：パルスおよび追跡細胞抽出物中のMタンパク質の量により決定した、ビリオンおよびVLP放出の効率の定量化を示す。3回の別個の実験の結果を平均し、その標準偏差を示す。
【図２】Mタンパク質がVLP放出に十分であることを示す例示的データを提示する。鳥類細胞にpCAGGS-NP、-M、-F-K115Q、および-HNを個別にトランスフェクションした。パネルAは、パルス(左側)および追跡(右側)時点の抽出物中の放射性標識タンパク質を示す。NP、M、F、およびHNを個別に発現する鳥類細胞の上清中の粒子を、図1に上記した通りに濃縮し、ショ糖勾配中へ浮遊させた。パネルBは、各上清由来の放射性標識タンパク質の勾配中での分布を示す。パネルCは、VLP中の各タンパク質の量の定量化を示す。3回の別個の実験の結果を平均し、その標準偏差を示す。
【図３】NP、F、またはHNタンパク質のMタンパク質との同時発現がVLP放出に及ぼす効果を示す例示的データを提示する。2つのNDV構造タンパク質遺伝子のすべての可能な組み合わせ(すなわち、これらに限定されないが、F＋NP、F＋M、F＋HN、HN＋NP、HN＋M、およびNP＋M(式中、FはF-K115Qである)を含む対の組み合わせ)をトランスフェクションした鳥類細胞。パルス-チェイス手順における標識化は図1に記載した通りである。実施例4に記載した通りに、上清中に存在する粒子を濃縮し、次いでショ糖勾配中へ浮遊させた。パネルAは、パルス(上部)および追跡(下部)時点の細胞抽出物中の標識タンパク質を示す。パネルBは、抗体混合物による各画分の免疫沈降後の、各勾配画分中に存在するタンパク質を示す。画分の密度(g/cc)を下部に示す。Mタンパク質を含まないトランスフェクションからの勾配は、そのような勾配中に放射性標識タンパク質が存在しなかったために、示していない。パネルCは、トランスフェクションした鳥類細胞から放出されたVLP中の各タンパク質の定量化を示す。結果は3回の実験の平均値であり、その標準偏差を示す。
【図４】3つのウイルスタンパク質のすべての組み合わせの発現がVLP放出に及ぼす効果を示す例示的データを提示する。3つのNDV構造タンパク質遺伝子のすべての可能な組み合わせをトランスフェクションした鳥類細胞をパルス-チェイス手順で標識し、図1と同様に上清中の粒子を濃縮し、次いでショ糖勾配中へ浮遊させた。細胞抽出物中のタンパク質を、抗体混合物により免疫沈降させた。パネルAは、パルス(上部)および追跡(下部)時点の細胞抽出物中の標識タンパク質を示す。パネルBは、ウイルスタンパク質の組み合わせのいくつかに関する、抗体混合物による各画分の免疫沈降後の、各勾配画分中に存在するタンパク質を示す。画分の密度(g/cc)を下部に示す。パネルCは、VLP中の各タンパク質の量の定量化を示す。パネルDは、追跡抽出物中に残存するパルス標識Mタンパク質の割合に基づくVLP放出の効率を示す。パネルEは、パルス抽出物中のMタンパク質の相対量を示す。
【図５】CHMP3およびVps4-E228Qのドミナントネガティブ変異体がMタンパク質含有粒子の放出を阻止したことを示す例示的データを提示する。パネルAの左は、pCAGGS-M(1.0μg)とpDsRed2-N1ベクター(0.1、0.5、および1.0μg)またはpDsRed2-N1-CHMP3-RFP(0.1、0.5、および1.0μg)とを同時にトランスフェクションしたヒト293T細胞のパルス標識抽出物を示す。パネルAの右は、8時間の追跡後にこれらの細胞から放出されたVLPを示す。パネルBの左は、pCAGGS-MとpBJ5ベクターまたはpBJ5-Vps4A-E228Q-Flagとを同時にトランスフェクションしたパルス標識細胞の抽出物を示す。パネルBの右は、8時間の追跡後にこれらの細胞から放出されたVLPを示す。AおよびBにおけるトランスフェクション293T細胞は、図1に記載した通りにパルス-チェイス手順で標識した。上清からの粒子は、実施例4に記載する通りにショ糖パッド上への遠心分離によって濃縮した。パネルCおよびDは、pCAGGS-Mとベクターのみをトランスフェクションした細胞から放出されたVLPに対する、pCAGGS-MとpDsRed2-N1-CHMP3またはpBJ5-Vsp4A-E228Qとをトランスフェクションした細胞から放出されたVLPの割合を示す。パネルEおよびFは、細胞抽出物中のタンパク質発現(パルス標識)の定量化を示す。2つの別個の実験で同じ結果が得られた。
【図６】代表的なパラミクソウイルスのウイルスタンパク質構造の1つの態様の模式図を提示する。
【図７】代表的なパラミクソウイルスによって起こる感染サイクルの1つの態様の模式図を提示する。
【図８】第1のニューカッスル病ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(AB124608)をコードするアミノ酸配列(配列番号:6)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:7)(パネルB)を提示する。
【図９】第1のニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質(AY288990)をコードするアミノ酸配列(配列番号:8)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:9)(パネルB)を提示する。
【図１０】第1のニューカッスル病ウイルス融合タンパク質(Y18728)をコードする部分アミノ酸配列(配列番号:10)(パネルA)および部分ヌクレオチド配列(配列番号:11)(パネルB)を提示する。
【図１１】第1のニューカッスル病ウイルス基質タンパク質(AY728363)をコードするアミノ酸配列(配列番号:12)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:13)(パネルB)を提示する。
【図１２】バキュロウイルス発現ベクター(DQ003705)のヌクレオチド配列(配列番号:14)を提示する。
【図１３】pCAGGS発現ベクターを含む2つの例示的なプラスミドを提示する。パネルA：pCAGGS/MCS；パネルB：pJW4303(米国特許第5,916,879号、参照により本明細書に組み入れられる)。pCAGGS発現ベクターがハイブリッドサイトメガロウイルス(CMV)βアクチンプロモーター配列を含むことに留意されたい。
【図１４】鳥類細胞およびCOS-7細胞からのウイルス放出を比較するパルス-チェイス実験によって生じたウイルスタンパク質の蓄積を示す例示的なオートラジオグラフデータを提示する。パネルA：Fタンパク質。パネルB：NPタンパク質。
【図１５】図14に示したパルス-チェイスオートラジオグラフィーの定量化を示す例示的データを提示する。パネルA：Fタンパク質。パネルB：NPタンパク質。ダイアモンド：鳥類細胞。四角：COS-7細胞。
【図１６】鳥類細胞(パネルA)およびCOS-7細胞(パネルB)から放出されたVLPのショ糖勾配での精製による例示的なオートラジオグラフデータを提示する。レーン1〜9は、それぞれショ糖密度1.12〜1.26におけるバンド形成パターンを提供する。HN＝赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質。F0＝融合タンパク質；NP＝ヌクレオカプシドタンパク質；M＝基質タンパク質。
【図１７】パルス-チェイス実験後の細胞抽出溶解物中の残存ウイルスタンパク質を示す例示的なオートラジオグラフを提示する。パネルA：鳥類細胞。パネルB；COS-7細胞。
【図１８】Mタンパク質cDNAのみをトランスフェクションした場合の、鳥類細胞(パネルA)のCOS-7霊長類細胞(パネルB)に対するMタンパク質VLP放出効率の向上を実証する例示的データを提示する。各ショ糖勾配密度画分(すなわち、レーン1〜9；1.12〜1.26)中の放射性標識Mタンパク質(M矢印)が示される。
【図１９】NP、M、F-K115Q、およびHNタンパク質cDNAのいずれかを個々にトランスフェクションした後の、またはNP、M、F-K115Q、およびHNタンパク質cDNAを組み合わせた混合物(すべて)を用いてトランスフェクションした後の、鳥類細胞(パネルA)およびCOS-7霊長類細胞(パネルB)からのVLP粒子放出の定量化を比較する例示的な濃度測定データを提示する。
【図２０】第2のニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素-ノイラミニダーゼmRNA(M22110)をコードするアミノ酸配列(配列番号:15)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:16)(パネルB)を提示する。
【図２１】第3のニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質(U37193)をコードするアミノ酸配列(配列番号:17)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:18)(パネルB)を提示する。
【図２２】第2のニューカッスル病ウイルス融合タンパク質(M21881)をコードするアミノ酸配列(配列番号:19)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:20)(パネルB)を提示する。
【図２３】第3のニューカッスル病ウイルスB1融合タンパク質(AAG36978)のアミノ酸配列(配列番号:21)を提示する。
【図２４】第2のニューカッスル病ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(AF060483)をコードするアミノ酸配列(配列番号:22)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:23)(パネルB)を提示する。
【図２５】第2のニューカッスル病ウイルス基質タンパク質(M16622)をコードするアミノ酸配列(配列番号:24)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:25)(パネルB)を提示する。
【図２６】第3のニューカッスル病ウイルス基質タンパク質(U25828)をコードするアミノ酸配列(配列番号:26)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:27)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図２７】ニューカッスル病ウイルスB1完全ゲノム(AF309418)のヌクレオチド配列(配列番号:28)を提示する。
【図２８】バキュロウイルス組換えDNAを構築する1つの方法を図解する。
【図２９】HisタグおよびSタグ配列タグを含むバキュロウイルス組換えDNAを生成するための1つの連結非依存的クローニング技法を図解する。
【図３０】154個の推定オープンリーディングフレームを含む野生型AcNPV C6ゲノムの環状マップを示す。黒矢印で印された遺伝子は公知であり、タンパク質配列データベースで報告されている。hr＝AcNPV反復相同領域位置。
【図３１】バキュロウイルストランスファープラスミド(pBAC)の7つの態様を図解する。
【図３２】第1の麻疹ウイルス赤血球凝集素タンパク質(AY249267)をコードするアミノ酸配列(配列番号:29)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:30)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図３３】第2の麻疹ウイルス赤血球凝集素タンパク質(AY249269)をコードするアミノ酸配列(配列番号:31)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:32)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図３４】第3の麻疹ウイルス赤血球凝集素タンパク質(DQ011611)をコードするアミノ酸配列(配列番号:33)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:34)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図３５】第1の麻疹ウイルス融合タンパク質(AJ133108)をコードするアミノ酸配列(配列番号:35)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:36)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図３６】第2の麻疹ウイルス融合タンパク質(X05597)をコードするアミノ酸配列(配列番号:37)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:38)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図３７】第3の麻疹ウイルス融合タンパク質(Y17840)をコードするアミノ酸配列(配列番号:39)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:40)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図３８】第1の麻疹ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(M89921)をコードするアミノ酸配列(配列番号:41)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:42)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図３９】第2の麻疹ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(AF171232)をコードするアミノ酸配列(配列番号:43)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:44)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４０】第3の麻疹ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(X01999)をコードするアミノ酸配列(配列番号:45)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:46)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４１】第1の麻疹ウイルス基質タンパク質(D12682)をコードするアミノ酸配列(配列番号:47)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:48)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４２】第2の麻疹ウイルス基質タンパク質(D12683)をコードするアミノ酸配列(配列番号:49)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:50)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４３】第3の麻疹ウイルス基質タンパク質(AY124779)をコードするアミノ酸配列(配列番号:51)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:52)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４４】第1の呼吸器合胞体ウイルスGタンパク質(すなわち、例えば糖タンパク質Gタンパク質)(U92104)をコードするアミノ酸配列(配列番号:53)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:54)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４５】第2の呼吸器合胞体ウイルスGタンパク質(AY333361)をコードするアミノ酸配列(配列番号:55)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:56)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４６】第3の呼吸器合胞体ウイルスGタンパク質(AB117522)をコードするアミノ酸配列(配列番号:57)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:58)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４７】第1の呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質(AY198177)をコードするアミノ酸配列(配列番号:59)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:60)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４８】第2の呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質(Z26524)をコードするアミノ酸配列(配列番号:61)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:62)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図４９】第3の呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質(D00850)をコードするアミノ酸配列(配列番号:63)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:64)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５０】第1の呼吸器合胞体ウイルス基質タンパク質(U02470)をコードするアミノ酸配列(配列番号:65)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:66)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５１】第2の呼吸器合胞体ウイルス基質タンパク質(AY198177)をコードするアミノ酸配列(配列番号:67)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:68)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５２】第1の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(U07233)をコードするアミノ酸配列(配列番号:69)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:70)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５３】第2の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(X00001)をコードするアミノ酸配列(配列番号:71)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:72)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５４】第3の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(S40504)をコードするアミノ酸配列(配列番号:73)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:74)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５５】第1のパラインフルエンザウイルス3型ヌクレオカプシドタンパク質(D10025)をコードするアミノ酸配列(配列番号:75)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:76)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５６】第1のパラインフルエンザウイルス3型融合タンパク質(D00016)をコードするアミノ酸配列(配列番号:77)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:78)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５７】第2のパラインフルエンザウイルス3型融合タンパク質(AF394241)をコードするアミノ酸配列(配列番号:79)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:80)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５８】第1のパラインフルエンザウイルス3型基質タンパク質(D00130)をコードするアミノ酸配列(配列番号:81)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:82)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図５９】第1のパラインフルエンザウイルス3型赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質(AB189960)をコードするアミノ酸配列(配列番号:83)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:84)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図６０】第2のパラインフルエンザウイルス3型赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質(AB189961)をコードするアミノ酸配列(配列番号:85)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:86)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図６１】第3のパラインフルエンザウイルス3型赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質(L25350)をコードするアミノ酸配列(配列番号:87)(パネルA)およびヌクレオチド配列(配列番号:88)(パネルB)の1つの態様を提示する。
【図６２】Mタンパク質が膜状粒子中に包まれ得ることを示す例示的データを提示する。鳥類細胞にpCAGGS-Mをトランスフェクションし、放射性標識VLPを単離および精製した。抽出物(上パネル)およびVLP(中央パネル)を、種々の濃度(0.25、0.5、1、5、10および20μg/ml；それぞれレーン2〜7)のプロテイナーゼKで氷上で30分間処理した。平行して、プロテイナーゼK処理の前に、VLPを1% Triton X-100中でインキュベートした(下パネル)。プロテアーゼとのインキュベーション後、0.1 mM PMSFを添加して反応を停止した。次いで、Mタンパク質を免疫沈降させた。
【図６３】Mタンパク質がVLP放出に必要であることを示す例示的データを提示する。鳥類細胞に、M cDNAの非存在下における、NP、F、およびHNタンパク質をコードするpCAGGSベクター中のcDNAのすべての可能な組み合わせ(F-K115Q＋HN、F-K115Q＋NP、HN＋NP、NP＋F-K115Q＋HN)をトランスフェクションした。次いで、細胞上清中の粒子を精製した。パネルは、各勾配画分中に存在するタンパク質を示す。放射性標識感染細胞抽出物をマーカーとして使用した。画分の密度を下部に示す(g/cc)。
【図６４】Mタンパク質とFおよびHNタンパク質との共局在を示す例示的データを提示する。NDV FおよびHNタンパク質の細胞表面局在およびMタンパク質の細胞局在を、免疫蛍光顕微鏡観察により解析した。鳥類細胞に個々に(A)、またはF-K115Q＋MもしくはHN＋Mと共に(B)、NP＋M＋F-K115Q、NP＋M＋HN、もしくはM＋F-K115Q＋HNと共に(C)、および4つすべてのcDNAと共に(D)、トランスフェクションした。トランスフェクションの40時間後に、核をDAPI(青色)で染色した。パネルに表示したように、無傷のトランスフェクション細胞をウサギ抗Fタンパク質抗体または抗HNタンパク質抗体で染色した。細胞を0.05% Triton X-100で透過処理してから、抗Mタンパク質抗体と共にインキュベートした。二次抗体は、抗ウサギAlexa 488コンジュゲート(緑色)および抗マウスAlexa 568コンジュゲート(赤色)であった。Adobe Photoshopを用いて画像を融合した。
【図６５】VLP中のウイルスタンパク質の共免疫沈降を示す例示的データを提示する。NP＋M＋F-K115Q＋HN(A)、M＋F-K115Q＋HN(B)、NP＋M＋F-K115Q(C)、およびNP＋M＋HN(D)を発現する細胞から生成された放射性標識VLPを、1% Triton X-100を含むTNE緩衝液中で溶解した。次いで、溶解したVLPを過剰量の抗Fタンパク質抗体混合物(抗HR1、抗HR2、抗F尾部、抗体F2-96、およびモノクローナル抗F(G5))、抗HNタンパク質抗体(モノクローナル抗体の混合物)、抗Mタンパク質モノクローナル抗体、またはNDV特異的抗体の混合物と共に4℃で一晩インキュベートした。抗体を含まない血清および免疫前血清を陰性対照として使用した。前洗浄したPansorbin Aにより、免疫複合体を一定に浸透させながら4℃で少なくとも2時間沈降させた。0.5% Triton X-100を含む冷TNE中で、試料を3回洗浄した。共免疫沈降の段階はすべて4℃で行った。タンパク質をSDS-PAGEゲル電気泳動により分離した。結果は、すべて同一の結果であった3回の独立した実験の1つを示す。
【図６６】VLPにおけるタンパク質間相互作用を示す例示的データを提示する。挿入図：VLP中のタンパク質の共免疫沈降によって検出されたウイルスタンパク質間相互作用の種々の態様。NP、F、およびHNタンパク質とMタンパク質とのすべての組み合わせの同時発現によって形成されたVLPの集合をもたらし得る例証的な潜在的相互作用もまた示す。
【図６７】293T細胞から放出されたVLPを示す例示的データを提示する。293T細胞にpCAGGS M(パネルA)またはpCAGGS-NP、-M、-F-K115Q、および-HNの混合物(パネルB)をトランスフェクションし、[35S]メチオニンおよび[35S]システインで4時間放射性標識し(P)、次いで非放射性培地中で8時間追跡した(C)。細胞溶解物中に存在するタンパク質を、全ウイルスタンパク質に特異的な抗体の混合物で免疫沈降させ、沈降した標識タンパク質を各パネルの左側に示す。次いで、細胞上清中の粒子を精製した。ショ糖勾配への浮遊後(各パネルの右側)、各勾配画分を抗体混合物で免疫沈降させた。各画分の密度(g/cc)を下部に示す。
【図６８】VPS経路の野生型およびドミナントネガティブ変異体タンパク質がMタンパク質VLP放出に及ぼす影響を示す例示的データを提示する。パネルAは、pCAGGS-MおよびpDsRed2-N1ベクター(レーン1)、pBJ5-WT-CHMP3(レーン2)、またはpDsRed2-N1-CHMP3-RFP(レーン3)を同時トランスフェクションした細胞による293T細胞の細胞抽出物(上部)および対応する放出粒子(下部)を示す。パネルCは、pCAGGS-MおよびpBJ5ベクター(レーン1)、pBJ5-WT-Vps4A(レーン2)、またはpBJ5-Vps4A-E228Q(レーン3)を同時トランスフェクションした細胞による293T細胞の細胞抽出物(上部)および対応する放出粒子(下部)を示す。パネルEは、pCAGGS-MおよびpDsRed2-N1ベクター(レーン1)、pBJ5-AIP1-HA(レーン2)、またはpDsRed2-N1-AIP1-HA-CHMP3-RFP(レーン3)を同時トランスフェクションした細胞による293T細胞の抽出物(上部)および対応するVLP(下部)を示す。抽出物はパルス標識細胞に由来する。VLPは、8時間の非放射性追跡中にパルス標識細胞から放出される。次いで、粒子を精製した。タンパク質をNDVタンパク質特異的抗体を用いて免疫沈降させ、SDS-PAGEで分離した。パネルB、D、およびFは、野生型VPSタンパク質対照から放出された粒子に対する放出粒子の定量化を示す。2回の別個の実験において同じ結果が得られた。
【図６９】CHMP3、Vps4A、およびAIP1のドミナントネガティブ変異体が完全VLPの放出に及ぼす影響を示す例示的データを提示する。パネルAは、NP、M、HN、およびFタンパク質をコードするNDV cDNAならびにpDsRed2-N1ベクター(レーン1および4)、pBJ5-WT-CHMP3(レーン2および5)、またはpDsRed2-N1-CHMP3-RFP(レーン3および6)を同時トランスフェクションした細胞による293T細胞の抽出物(レーン1〜3)および対応する放出VLP(レーン4〜6)を示す。パネルCは、NDV cDNAの混合物およびpBJ5ベクター(レーン1および4)、pBJ5-WT-Vps4A(レーン2および5)、またはpBJ5-Vps4A-E228Q(レーン3および6)を同時トランスフェクションした細胞による293T細胞の抽出物(レーン1〜3)および対応する放出VLPS(レーン4〜6)を示す。パネルEは、4つのNDV cDNAの混合物およびpDsRed2-N1ベクター(レーン1および4)、pBJ5-AIP1-HA(レーン2および5)、またはpDsRed2-N1-AIP1-HA-RFP(レーン3および6)を同時トランスフェクションした細胞による293T細胞の抽出物(レーン1〜3)および対応するVLP(レーン4〜6)を示す。抽出物はパルス標識細胞に由来する。VLPは、8時間の非放射性追跡中にパルス標識細胞から放出される。次いで、粒子を精製した。タンパク質をNDVタンパク質特異的抗体を用いて免疫沈降させ、SDS-PAGEで分離した。パネルB、D、およびFは、ベクターおよび野生型Vpsタンパク質対照に対する放出VLPの定量化を示す。2回の別個の実験において同じ結果が得られた。
【図７０】NDV Mタンパク質中のLドメインの機能性を実証する例示的データを提示する。パネルAは、野生型Mタンパク質、アミノ酸216位および219位(M-A216A219)または232位および235位(M-A232A235)にアラニン置換、ならびに232〜235位にYPDLまたはPTAP置換を有する変異体Mタンパク質を示す。パネルBは、野生型または変異体Mタンパク質を発現する293T細胞による抽出物(上部)および放出VLP(下部)を示す。パネルDは、NP、F、およびHNタンパク質と野生型または変異体Mタンパク質を発現する293T細胞による抽出物(左側)および放出VLP(右側)を示す。次いで、粒子を精製した。タンパク質をNDVタンパク質特異的抗体を用いて免疫沈降させ、SDS-PAGEで分離した。パネルCおよびEは、野生型Mタンパク質に対する放出VLPの定量化を示す。2回の別個の実験において同じ結果が得られた。
【図７１】VLP中へのAIP1の取り込みを示す例示的データを提示する。293T細胞に、pCAGGS Mおよび空ベクターまたはHAタグ化AIP1を有するベクターをトランスフェクションした。パネルAは、Mタンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて細胞抽出物(抗M IP)およびVLPから沈降した放射性標識Mタンパク質を示す。抽出物およびVLP中のHA-AIP1(N末端タグ化)およびAIP1-HA(C末端タグ化)は、ペルオキシダーゼと結合したHA抗体(抗HA-IB)を用いる免疫ブロッティングにより検出した。パネルBは、細胞抽出物(上部)およびVLP(下部)から沈降した放射標識Mタンパク質およびAIP1-HAを示す。
【図７２】精製NDVウイルスおよび前もって免疫沈降していないVLPのタンパク質内容物を比較する例示的データを提示する。
【図７３】ウイルス(B1)(上パネル)、Mタンパク質のみVLP(中央パネル)、ならびにNP、M、F、およびHN VLP(下パネル)を示す例示的な電子顕微鏡写真を提示する。
【図７４】大量組織培養から調製されたVLPと比較した、卵で培養した場合のウイルス(B1)の銀染色を示す例示的データを提示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月9日(2008.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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