(57)【要約】  分析物質である生物サンプルでクロマチン免疫沈降を実施することを含む分析物質生物サンプル上で後成発現分析を実施する方法で、前記方法が、前記分析物質生物サンプルを担体クロマチンと接触させる段階を含むことを特徴とする。分析物質生物サンプルが１００万個未満の細胞を含む本発明の方法。分析物質生物サンプルが約６μｇ未満のＤＮＡおよび／または約１２μｇ未満のクロマチンを含む本発明の方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物質である生物サンプルでクロマチン免疫沈降を実施することを含む分析物質生物サンプル上で後成発現分析を実施する方法で、前記方法が、前記分析物質である生物サンプルを担体クロマチンと接触させる段階を含むことを特徴とする。
【請求項２】
さらに、前記分析物質生物サンプルにおける１種以上の後成発現マーク類を分析するかまたは検出することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記後成発現マークがヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾および／またはＤＮＡメチル化である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記分析物質である生物サンプルが１００万個未満の細胞を含む先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記分析物質である生物サンプルが哺乳類細胞を含む先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞類がヒトまたはマウス細胞である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記分析物質である生物サンプルが、約６μｇ未満のＤＮＡおよび／または約１２μｇ未満のクロマチンを含む先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記分析物質である生物サンプルを担体クロマチンに接触させる段階を、分析物質である生物サンプル上でクロマチン免疫沈降を実施する段階の前に実施する先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記分析物質である生物サンプルを担体クロマチンに接触させる段階が、担体クロマチンを分析物質である生物サンプルに由来するクロマチンと混合することを含む先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
担体クロマチンの量が、前記分析物質である生物サンプル中のクロマチンの量の少なくとも１０倍である先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析物質である生物サンプルのクロマチンのＤＮＡが、前記担体クロマチンのＤＮＡと識別可能である先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析物質である生物サンプルがドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）に由来していない場合、前記担体クロマチンがドロソフィア細胞に由来する先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ドロソフィア細胞がＳＬ２細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記クロマチン免疫沈降がＮ−ＣｈＩＰである先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記クロマチン免疫沈降がＸ−ＣｈＩＰである請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
（Ｉ）細胞を含む分析物質である生物サンプルと担体クロマチンを混合すること；（ＩＩ）段階（Ｉ）の細胞を破壊しそこから核を放出させること；（ＩＩＩ）前記核を破壊して、そこからクロマチンを放出させること；（ＩＶ）段階（ＩＩＩ）から得られたクロマチンを、問題のタンパク質に特異的な抗体を用いて免疫沈降させること；（Ｖ）次に、前記単離したタンパク質／ＤＮＡ分画からＤＮＡを精製すること；（ＶＩ）問題の前記タンパク質に関連して単離したＤＮＡ断片類を分析することの段階を含む先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
分析物質である生物サンプル中においてヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、および／またはＤＮＡメチル化、またはそのパターンを同定する方法で、分析物質である生物サンプル上でクロマチン免疫沈降を実施することを含み、前記方法は、前記分析物質である生物サンプルを担体クロマチンに接触させる段階を含むことを特徴とする。
【請求項１８】
先行請求項のいずれか１項に記載の方法を実施することを含む疾患状態の診断または予後を補助する方法。
【請求項１９】
前記疾患が癌または自己免疫疾患である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、検討下の組織または細胞を含む分析物質である生物サンプルに対して正常分析物質生物サンプルのヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、および／またはＤＮＡメチル化、またはそのパターンの比較後成発現分析または比較研究を実施することを含む請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分析物質である生物サンプルが腫瘍性および／または非腫瘍性組織からの細胞を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記分析物質である生物サンプルが、ホルムアルデヒド固定またはエタノール固定組織切片からの細胞を含む請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２３】
幹細胞または幹細胞前駆体のサンプル上でクロマチン免疫沈降を実施することを含む幹細胞または幹細胞前駆体のサンプルについて後成発現分析を実施する方法で、前記方法が、前記幹細胞または幹細胞前駆体を担体クロマチンと接触させる段階を含むことを特徴とする。
【請求項２４】
前記幹細胞前駆体が、トロフェクトデルムまたはトロフォプラストのようなＩＣＭからの１種以上の細胞を含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記後成発現分析が、前記幹細胞または前駆体類中における１種以上の制御遺伝子類の分析を含む請求項２３または２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記分析した制御遺伝子類が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＣｄｘ２から独立して選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
クロマチン免疫沈降を実施するための１種以上の材料類を含む後成発現分析キットで、前記キットがさらに担体クロマチンを含むことを特徴とする。
【請求項２８】
前記担体クロマチンが、ドロソフィア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＳＬ２細胞を含む請求項２７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は後成発現分析類に関し、必ずというわけではないが特に、少数の細胞を含むサンプル中における後成発現マーク（すなわちマーカー類）を分析する方法類に関する。特に、本発明は、内細胞塊および胚幹細胞の後成発現比較分析を新規でかつ感度の高いクロマチン免疫沈降技術を用いて実行する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
後成発現学とは、遺伝子の活性（発現）を制御する機構の研究である。発現および沈黙（サイレンシング）における変化は、ＤＮＡ状態に対する変化が原因であり、それらは、塩基配列に全く変化を起こすことなく、機能上の遺伝性変化を起こす。体中の多くの遺伝子が、正常発生の一部として永久に停止される（沈黙させられる）。しかし、時には、そのプロセスが予測しなかった状態に逸れて、活性のままであるべき遺伝子類を停止させるなどのことがある。したがって、学問の一分野である後成発現学およびその関連治療は、これらの遺伝子類のスイッチを症例に応じて再度入れなおすかまたは停止させることによって上記欠陥を直すことを目的としている。これは、加齢、遺伝的疾患および癌のような疾患の治療に新しい手法を提供する。
【０００３】
培養胚幹細胞（ＥＳ細胞）は、未分化胚盤胞（早期胚）の内細胞塊（ＩＣＭ）に由来する。それらは最初マウスで誘導され、分化および発生研究のために非常に貴重な資源を提供してきた。ＩＣＭそれ自体と同様、ＥＳ細胞は多能性であり、形質転換マウス系統の出発物質を提供するばかりでなく培養で分化でき複数の細胞系統を含む胚様体を形成する。ＩＣＭおよびＥＳ細胞の両者を特徴づけるこの多能性状態とは、比較的少数の非常に重要な制御遺伝子類によって維持されていると考えられている。両者ともにホメオドメインタンパク質をコードする２種の制御剤類ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の発現は、多能性によって必要である。それらの沈黙は分化を誘発し、一方、Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞は、分化の阻止に必須とこれまで考えられてきた成長因子を欠損している培地においてさえ自己再生を継続する。
【０００４】
クロマチン免疫沈降（下記に説明）およびＤＮＡミクロアレイ（ＣｈＩＰ−チップ）によるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４および関連因子であるＳＯＸ２のヒトＥＳ細胞中プロモータ領域への結合についての最近の総括的分析は、これらのタンパク質が数百の遺伝子類にしばしば協調的に結合することおよびこれらの遺伝子類が転写上活性であるかまたは沈黙することができることを明らかにしている。これらの重要制御遺伝子類が両者ともに、多能性のために必要な遺伝子類（それら自身も含めて）を活性化したり分化を進める遺伝子類を抑制したりする。
【０００５】
多能性を維持するかまたは特異的な分化経路に細胞を駆動する遺伝子活性化および沈黙のプログラムには、転写因子結合以上の複数の後成発現変化すなわちＤＮＡ状態の変化を伴い、それらが、塩基配列に変化を起こすことなく機能的な遺伝可能な変化を起こす。これらの変化には、核内部におけるＤＮＡメチル化、クロマチン濃縮、複製タイミングと位置を含む。これらの変化の中心には、ヌクレオゾームコア粒子のヒストン類の酵素触媒翻訳後修飾があり、それらは、あるものに対してはおそらくその原因になっているのであろう。多くの異なるシステムにおける研究は、特異的修飾がクロマチンの特異的機能状態にしばしば関連していることを明らかにしている。アセチル化の上昇（通常、数個のまたは４種全てのコアヒストン類を伴う）は、転写上昇または転写能力の一貫したマーカーであり、一方、ヒストンリシンのメチル化は、リシン残基の関与ばかりでなくメチル化程度すなわち、リシンε−アミノ基に１個、２個または３個のメチル基が結合していることにも依存して、転写活性化または沈黙のいずれかに関連している。少なくともいくつかの場合において、前記修飾は、非ヒストンタンパク質の選択的結合を介して転写状態に影響を及ぼす。
【０００６】
ＥＳ細胞分化中における重要な遺伝子類の発現または沈黙に関連しているヒストン修飾は、クロマチン免疫沈降ＣｈＩＰにより広く研究されてきており、これは、規定のゲノム領域との特異的タンパク質またはそれらの修飾イソ型タンパク質類の会合を分析するために使用する技術である。既存のＣｈＩＰ技術と従来使用されてきた方法についてのレビューは、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、Ｌ．Ｐ．＆Ｔｕｒｎｅｒ、Ｂ．Ｍ．（２００３）“イムノプレシピテーション・オブ・ネーティブクロマチン、ＮＣｈＩＰ、メソッズ：ア・コンパリズン・ツ・メソッズ・イン・エンザイモロジー｛（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ、ＮＣｈＩＰ）”、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ｝  ３１、７６−８２に見られる。ＣｈＩＰの目的は、転写因子および修飾ヒストン類を含む（がそれらに限定されない）タンパク質類が生細胞または組織の内因性クロマチン上の特定領域に結合するかを決定することである。この技術のインビボにおける性質は、インビトロアッセイによってＤＮＡ−タンパク質相互作用を調べるために伝統的に使用されてきた他の手法と明確な対比をなしている。
【０００７】
ＣｈＩＰを支える原理は、生細胞中にＤＮＡをパッケージするＤＮＡ―タンパク質複合体（すなわち、クロマチン）の断片が、各生細胞を特徴付ける特異的ＤＮＡ―タンパク質相互作用を保持するように（下記で述べるように）調製できることにある。これらのクロマチン（すなわち、タンパク質−ＤＮＡ）断片類を次に、問題のタンパク質に対する抗体を用いて免疫沈降させることができる。次に、単離したクロマチン分画を処理して、ＤＮＡとタンパク質成分類を分離し、特定タンパク質（すなわち、免疫沈降に用いた抗体を誘導したタンパク質）と関連して単離したＤＮＡ断片類の本体を、次に、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）または明確な配列を有するＤＮＡ断片類の同定に使用される他の手法によって決定できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、クロマチン免疫沈降は、必然的に、下記の重要な３種の段階を必要とする：（ｉ）分析するクロマチンを細胞から単離すること；（ｉｉ）抗体を用いてクロマチンを免疫沈降させること；および（ｉｉｉ）ＤＮＡ分析。ＣｈＩＰ技術には、出発（インプット）クロマチンをどのように調製するかにおいて主に異なる２種の主要バリエーションがある。第１のバリエーション（ＮＣｈＩＰと称する）は、標準的操作により細胞核のミクロコッカスヌクレアーゼ消化により調製した天然のクロマチンを用いる。しかし、ＮＣｈＩＰに関連した問題は、それが、非ヒストンタンパク質類分析のために常に有用であるとは限らないこと；選択的ヌクレアーゼ消化が、インプットクロマチンを偏向させることがあること；およびヌクレオゾーム類が消化中に再配置されるかもしれないことである。  
【０００９】
第２のバリエーション（ＸＣｈＩＰと称する）は、クロマチンの断片化の前に通常音波破砕により増殖細胞にホルムアルデヒドを添加することで架橋させたクロマチンを用いる。数名の研究者らは、温和なホルムアルデヒド架橋後にヌクレアーゼ消化を用いており、ＵＶ照射が代替架橋技術として使用され、成功した。しかし、ＸＣｈＩＰに関連する問題は、それがしばしば極めて非効率的であり、架橋がタンパク質類とゲノムＤＮＡの過渡的相互作用を固定（それによって増幅させる）ことがあること、およびまた、抗体特異性が、それが認識するタンパク質中における架橋操作誘発化学的変化により妥協されることがあること、それらがしばしば試験可能でないことである。
【００１０】
さらに、ＣｈＩＰのおのおののバリエーションについての大きな問題は、それが、前記技術が作用するために少なくとも１００万個の細胞を要して十分量のクロマチンを産生できることである。このような多数の細胞は、培養細胞では達成可能であるが、例えば早期胚のような典型的ＩＣＭが６０個未満の細胞（ヒト）または２０個未満の細胞（マウス）を含む少数の細胞源からの材料では不可能である。この深刻な理由のため、今日まで、細胞数が余りにも少なくてＣｈＩＰが効率的ではないサンプル中例えばＩＣＭ中であるいは早期胚中の他の細胞タイプ中において、重要な制御遺伝子類の沈黙および活性化に関連したヒストン修飾、非ヒストン修飾またはＤＮＡメチル化を研究する後成発現分析を実施できない。このため、培養ＥＳ細胞がインビボで分化を進める後成発現メカニズムの優れたモデルを提供するかという重大な問題を、直接的に解明できていない。
【００１１】
ＭａｇｅｒおよびＢａｒｔｏｌｏｍｅｉ（ネーチャー・ジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２００５、３７、１１９４−１２００）は、マウスにおける後成発現メカニズムを詳細に分析するためのさまざまな戦略を述べている。彼らは、“現在のプロトコールでも適正数の細胞（＞１×１０６）でＣｈＩＰを実施可能であるものの、多くの後成発現プロセスは数個の細胞のみが単一の胚を含む初期発生時に起こり、現在では、ＣｈＩＰを妥当な手法として排除している”と述べている。
【００１２】
従って、本発明の目的は、本文または他所で述べられた先行技術の問題の１個以上を解決するかまたは緩和することであり、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を用いて少数の細胞中における後成発現分析を実施するための改良方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を用いて遺伝子の発現または沈黙に関連しているＤＮＡ修飾が研究されてきたことを認識していた。しかし、現在では、このような研究では多数の細胞を必要とするので、現在では、少数すなわち約１００万個未満の細胞源からの遺伝的材料を用いて、後成発現分析においてクロマチン免疫沈降技術をうまく用いることが不可能である。本発明者らは、従って、感度の向上した後成発現分析のための改良方法を工夫しようとこの問題の解決に乗り出し、それらは、従って、現在可能であるよりもはるかに少数の細胞で使用することができた。
【００１４】
従って、本発明の第１によれば、分析物質である生物サンプルでクロマチン免疫沈降を実施することを含む分析物質である生物サンプル上で後成発現分析を実施する方法を提供し、前記方法は、前記分析物質である生物サンプルを担体クロマチンと接触させる段階を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明者らは、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）の使用に基づく後成発現分析の新規方法の開発に成功し、それは、極めて少量の生物材料に適用可能である。本発明者らは、驚くべきことに、１０−１５個ほどのわずかの分析物質細胞しか本発明の方法が作用するために必要でないことを実証した；しかし、好適には、少なくとも５０個位の分析物質細胞を用いる。従って、本発明の方法は、細胞数が少なすぎて正常なクロマチン免疫沈降が効率的でないサンプル中すなわち内細胞塊（ＩＣＭ）中または早期胚中の他の細胞タイプ中において、重要制御遺伝子類の沈黙と活性化に関連しているヒストン修飾、非ヒストンタンパク質修飾またはＤＮＡメチル化を研究する後成発現分析を可能とする。さらに、本発明者らは、培養胚幹（ＥＳ）細胞がインビボで分化を駆動する後成発現メカニズムのための優れたモデルを実際に提供することを見出した。
【００１６】
担体クロマチンに分析物質生物サンプルを接触させる段階は、有益かつ驚くべきことに、担体クロマチン不在下において標準的クロマチン免疫沈降を用いることに比べて、少なくとも４桁、本発明の方法の感度を非常に向上させる。本発明者らは、既存のＣｈＩＰ技術を超えた感度のこうした大幅な上昇に信じられないほど驚き、この効果が先行技術に鑑みて全く予測できなかったと考えている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
用語“後成発現”は、当業者に公知であろうが、明確にするために、本文では、塩基配列には全く変化なく機能上の遺伝可能な変化に関するＤＮＡの状態すなわち状況を称する。このような変化は、当該技術で後成発現マーク（またはマーカー類）と称され、遺伝子の発現または沈黙を結果として起こす傾向がある。サンプル中におけるＤＮＡまたはそれに関連したタンパク質類の修飾が原因であるかも知れずかつ本発明の方法を用いて分析できそうな後成発現変化またはマークの例は、ヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾およびＤＮＡメチル化を含む。
【００１８】
従って、用語“後成発現分析”とは、分析物質サンプル中におけるＤＮＡの状態または状況および特異的タンパク質およびそれらの修飾イソ型形態とのその相互作用を決定することを意味し、分析物質である生物サンプル中における後成発現マークを分析しまたは検出することを必要とする。従って、第１の方法は、好適には、分析物質である生物サンプル中における１種以上の後成発現マークを分析または検出することを含む。本発明の方法を用いて、幹細胞中または幹細胞前駆体中または下記でさらに説明するような他のいかなる適切な分析物質である生物サンプル中におけるゲノムのいかなる遺伝子または領域上のいかなる種類の後成発現マークをもアッセイすることができる。付属の実施例に明らかにしたように、本発明者らは、本発明の方法を用いて、幹細胞制御遺伝子類すなわちＮａｎｏｇ；Ｏｃｔ４；およびＣｄｘ２遺伝子類に存在する後成発現マーク類を研究した。
【００１９】
用語“クロマチン免疫沈降”もまた、当業者に公知であり、好適には、下記の段階を含む：（ｉ）分析するクロマチンを細胞から単離すること；（ｉｉ）抗体を用いてクロマチンを免疫沈降させること；および（ｉｉｉ）ＤＮＡ分析。従って、クロマチン免疫沈降に供される分析物質である生物サンプルは、クロマチンを含むことが好適である。クロマチンは１染色体の物質であり、真核細胞中においてＤＮＡとタンパク質（主にヒストン）の複合体から構成され、遺伝される遺伝子類の担体である。クロマチンは真正染色質と異質染色質の２種の状態で出現し、それらは異なる染色性質を有しており、細胞分割時においてそれはコイル状になり折り畳まれ、中期染色体を形成する。従って、好適には、分析物質である生物サンプルは、核酸好適にはＤＮＡ、および全ての関連タンパク質類を含む。
【００２０】
分析するクロマチンは、好適には、少なくとも１個の細胞から入手できる。従って、好適には、分析物質である生物サンプルは、少なくとも１個の細胞を含む。前記細胞は、組織サンプルから誘導できる。本発明の方法のための分析物質である生物サンプルとして使用できる細胞の例は、例えばマウス胚盤胞のような胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）；培養マウスＥＳ細胞のような胚幹細胞（ＥＳ細胞）；例えば、ホルムアルデヒド固定またはエタノール固定組織切片を含む癌性組織切片からの組織生検および切片に由来する細胞を含む。好適には、分析物質である生物サンプルは、好適にはヒトまたはマウス細胞である哺乳類細胞を含む。
【００２１】
上記にも述べたように、現在、非常に多数の細胞により、すなわち少なくとも１００万個の細胞、通常１０倍以上の細胞によるＣｈＩＰを用いて後成発現分析を実施することが可能であるだけである。しかし、第１の方法を用いて、はるかに少数の細胞で後成発現を実施して成功できるのは、有益である。
【００２２】
従って、本方法は、分析物質である生物サンプルとして１００万個未満の細胞を用いてクロマチン免疫沈降を実施することを含むのが適切であり、さらに適切には、９０万個未満の細胞、はるかに適切には８０万個未満の細胞、さらにはるかに適切には７０万個未満の細胞、さらにより適切には６０万個未満の細胞を用いて、実施することを含む。本発明者らは、このような少数の細胞で後成発現分析を実施可能であろうとは考えていなかった。好適には、前記方法は、５０万個未満の細胞、さらに好適には４０万個未満の細胞、さらにより好適には３０万個未満の細胞、さらにはるかに好適には２０万個未満の細胞、そしてよりはるかに好適には１０万個未満の細胞でクロマチン免疫沈降を実施することを含む。本発明者らは、このような少数の細胞で後成発現分析を実施可能であろうとは考えていなかった。このような少数の細胞は、すでに、現在の当該技術状態よりも数桁も小さいことがわかるであろうし、従って、本発明者らを驚かした。
【００２３】
しかし、本発明のより好適な態様において、前記方法は、５００００個未満の細胞、好適には２５０００個未満の細胞、２００００個未満の細胞、１５０００個未満の細胞、１００００個未満の細胞、５０００個または４０００個または３０００個または２０００個未満の細胞、さらに好適には１０００個未満の細胞、さらにより好適には５００個未満の細胞、さらに好適には２５０個未満の細胞でクロマチン免疫沈降を実施することを含む。驚くべきことにかつ最も好適には、前記方法は、１５０個未満の細胞、適切には１００個未満の細胞、さらにより好適には７５個未満の細胞、さらに好適には４０個未満の細胞、さらにより好適には２０個未満の細胞でクロマチン免疫沈降を実施することを含む。上記にも述べたように、後成発現分析における現在のクロマチン免疫沈降使用は、最低でも少なくとも１００万個の細胞、通常それよりもはるかに多くを必要とし、それによって、培養細胞モデルへのその実験的または診断用途を制限しまたは多数の細胞（すなわち、少なくとも１００万個の細胞）しか利用できない状況への使用を制限している。したがって、本発明の発明者らが１０−２０個程度のわずかの細胞で彼らの方法が満足できるものであることを明らかにしたという事実は、極めて驚くべきことであった。本発明の方法は、従って、ＩＣＭまたはＥＳ細胞の分析に有用であり、それらは、非常に少数の細胞しか必要としない。しかし、本方法が分析物質である生物サンプル中で少なくとも約５０個の細胞を用いてクロマチン免疫沈降を実施することを含むのが好適である。
【００２４】
細胞１個は、細胞当たり約６×１０−３ｎｇのＤＮＡを含み、かつクロマチン中において等量のＤＮＡおよびタンパク質を含む。従って、本発明による方法は、好適には、約６μｇ未満のＤＮＡまたは約１２μｇ未満のクロマチン（これは、約１００万個細胞中におけるＤＮＡまたはクロマチン塊に等しい）などでＣｈＩＰを実施することを含む。当業者は、上記で述べた好適な細胞数内にどれだけのＤＮＡとクロマチンが含まれるかを計算できるであろう。例えば３μｇのＤＮＡまたは約６μｇのクロマチンは細胞５０万個に匹敵する；１．５μｇのＤＮＡ、または３μｇのクロマチンは、細胞２５万個に匹敵し；および１２０ｐｇのＤＮＡ、または２４０ｐｇのクロマチンは、細胞２０個に匹敵するなどである。
【００２５】
分析物質である生物サンプルは、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）に供される。当業者は、実施する分析タイプに応じて利用可能なＣｈＩＰ技術にはさまざまな種類があることを理解するであろうし、それらについては下記で述べるであろう。従って、本発明の方法で使用した好適なＣｈＩＰ技術は、ＮＣｈＩＰまたはＸＣｈＩＰであることができる。付属の実施例では、ＣｈＩＰの実施方法に関して詳細な説明を示す。要約すると、前記方法は、生物サンプルからクロマチンを単離する段階を含む。細胞を最初に標準的手法を用いて採取し、次に、そこから核を得ることができる。例えば、前記細胞を破壊し（例  音波処理）、その結果、そこから核が放出される結果となる。
【００２６】
核放出後、前記方法は、好適には、クロマチンをそこから放出させるため、核を消化する段階を含む。前記方法がＮＣｈＩＰの使用を含む態様において、前記クロマチンは、好適には、標準的手法により細胞核をヌクレアーゼ消化することを用いて、単離される。好適には、ミクロコッカスヌクレアーゼを前記消化中に添加する。前記方法がＸＣｈＩＰの使用を含む態様において、前記方法は、クロマチンを架橋させる段階を含む。このことは、好適には、クロマチン断片化の前に、例えばホルムアルデヒドのような適切な架橋剤を添加することによってのようにいかなる適切な手段によっても、達成できる。断片化は、音波処理によって実施できる。しかし、ホルムアルデヒドは、断片化後に添加することもでき、次にヌクレアーゼ消化を行う。これとは別に、ＵＶ照射を、代替架橋技術として使用することもできる。
【００２７】
クロマチン単離段階の結果、タンパク質類がそれに固定されるであろう。一旦タンパク質類がクロマチン上に固定化されると、次に、タンパク質−ＤＮＡ複合体全体が免疫沈降される。従って、クロマチンを単離した後、前記方法は、好適には、クロマチンを免疫沈降させる段階を含む。免疫沈降段階のための適切な技術もまた、当業者に公知であろうし、実施例は、これを達成するための方法を記載している。しかし、好適には、免疫沈降は、問題のタンパク質に対する適切な抗体を添加し実施される。適切な抗体が、どの種の後成発現分析を実施しようとしているのかに（すなわち、どのマークを分析しようとしているのかに）よるであろうということがわかるであろう。
【００２８】
後成発現分析は、細胞ＤＮＡに対するさまざまな変化（後成発現マークとして公知）の研究であり、それらは、遺伝子類の発現または沈黙という結果となる傾向がある。本発明の方法を用いて、前記分析物質中のゲノムのいかなる遺伝子または領域上のいかなる種類の後成発現マークもアッセイできることがわかるはずである。サンプル中におけるＤＮＡ修飾が原因である後成発現マークの例は、ヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、およびＤＮＡメチル化を含む。従って、本発明の方法は、生物サンプル中におけるヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾およびＤＮＡメチル化、またはそのパターンの分析または検出を含むのが好適である。
【００２９】
従って、免疫沈降段階で用いた抗体は、転写因子、または他のＤＮＡ結合タンパク質類のような非ヒストンタンパク質類に免疫特異的であることができる。これとは別に、前記抗体は、ヒストン類Ｈ１，Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、およびそれらのさまざまな翻訳後修飾イソ型形態および変異体類（例  Ｈ２ＡＺ）のいずれに対しても免疫特異的であることもできる。これとは別に、前記抗体は、ヒストンアセチラーゼ類またはデアセチラーゼ類またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼのようなクロマチン修飾に関与する酵素類に対して免疫特異的であることもできる。さらに、ヒストン類は、例えばアセチル化、メチル化、リン酸化、ＡＤＰリボシル化、規定のアミノ酸残基類のスモイル化およびユビキチン化によって、規定の酵素類によりインビボで翻訳後修飾されることもできることがわかるであろう。従って、前記抗体は、これらの翻訳後修飾のいかなるものについても免疫特異的であることができる。
【００３０】
付属の実施例は、免疫沈降達成のために使用できる最も好適な抗体類、すなわちＨ４Ｋ１６ａｃ（Ｒ２５２）、Ｈ３Ｋ４ｍｅｌ（Ｒ２０４）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ｒ１４８）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｒ１８３）Ｈ３Ｋ９ｍｅ２およびＨ４Ｋ８ａｃに対する免疫特異性を有する抗体類の詳細を示している。好適には、前記クロマチンは、上記ヒストン修飾物に対するポリクローナル抗血清（抗体類含有血清）と混合し、免疫沈降させる。
【００３１】
免疫沈降段階の後、前記方法は、好適には、単離したタンパク質／ＤＮＡ分画からＤＮＡを精製する段階を含む。このことは、フェノール−クロロホルム抽出という標準的技術により、達成することもできる。
【００３２】
精製段階の後、タンパク質と関連させて単離したＤＮＡ断片類を次に分析し、それらの本体を決定する。このことは、好適には、ＰＣＲによって達成できる。例えば、分析段階は、適切なプライマー類の使用を含み、それらは、ＰＣＲ中に、ある長さの核酸を増幅させる結果となるであろう。当業者は、本発明の方法を適用して、特異的ＰＣＲプライマー類を調製できるゲノムのいかなる遺伝子類またはいかなる領域における後成発現マークも分析できることを理解するであろう。しかし、例示のためのみに示すと、分析できる好適な遺伝子類には、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＣｄｘ２が含まれる。従って、これらの遺伝子類の領域を増幅するための好適なプライマー類を、付属実施例の表１に列挙した。このＰＣＲ結果は、適切に染色した電気泳動ゲル上で見ることができる。バンドサイズの差を次に見て、比較できる。実施例および図１−４は、例示的データを示している。
【００３３】
当業者は、“適切なプライマー”について、選択したプライマー類が種特異的ＰＣＲのために使用できること、すなわち、前記プライマーを、担体クロマチンからのものではなく分析物質である生物サンプルのみからのある長さの核酸を増幅させる結果となるＰＣＲで使用できることを理解するであろう。適切なプライマー類の設計に関するさらなる情報は、付属の実施例で示す。
【００３４】
本発明の方法が分析物質である生物サンプルを担体クロマチンと接触させる段階を含むことがわかるであろう。用語“担体クロマチン”をクロマチン定義のために用い、それは、増量剤として作用するように適応させてある。本発明で使用できる担体クロマチンについての考察は、下記で述べる。担体クロマチンを分析物質クロマチンと混合することによって、分析物質／担体ハイブリッド懸濁液が、好適には、産生される。
【００３５】
分析物質である生物サンプル（および好適には、そのクロマチン）を、サンプルから核を単離する段階、あるいは核を消化する段階の後でさえも、担体クロマチンと接触させることができる。しかし、分析物質である生物サンプルを担体クロマチンと接触させる段階は、本発明の方法の始めに実施され、好適には、生物サンプルから核を単離する段階の前にすなわち分析物質である生物サンプルにおけるクロマチン免疫沈降を実施する段階の前に実施するのが最も好適である。従って、本方法の第１段階は、分析物質細胞を担体細胞と好適にはその過剰量と混合することを含む。従って、担体細胞は増量剤として作用し、非常に少数すなわち１００個未満、好適には８０個をはるかに下回る分析物質細胞でＣｈＩＰを実行可能とする。
【００３６】
分析するクロマチンを担体クロマチンと混合することで、クロマチン調製に必要な操作、すなわちヌクレアーゼ消化、または架橋および音波処理のような操作を、取り扱い可能な容量で確実に実施できるようにできるのは有益である。例えば、１００万個の細胞は、典型的には、容量１ｍｌで処理されるであろう。条件を匹敵するものにするため、細胞１０００個には容量１μｌを必要とし、それは、特別に適応させた技術でのみ可能であり、細胞１００個は、０．１μｌを必要とするであろう。これとは別に、少数の細胞を高容量で用いると、表面付着と取り扱いにより材料がロスする結果となり、それらは、回収を実質的に低下させ本技術を無効にするであろう。従って、担体クロマチンは増量剤として作用し、これは、ＣｈＩＰ操作を含む数段階における分析物質サンプルの損失を防止する。好適には、前記接触段階は、担体クロマチンを分析物質である生物サンプル由来のクロマチンと混合することを含む。
【００３７】
担体クロマチンは、本文で担体細胞と称する複数の細胞から得られることが望ましい。従って、前記方法が、分析物質である生物サンプルの細胞を大過剰の担体細胞と混合することを含むのが望ましい。従って、本発明の方法は前記分析物質細胞を最初に、大過剰の担体細胞群と混合する点で、既存のＣｈＩＰ方法と異なっている。適切には、過剰の担体クロマチン／細胞（クロマチンマスまたは細胞数として計算）は、分析物質クロマチン／細胞の少なくとも１０倍であるべきである。さらに適切には、過剰の担体クロマチン／細胞は、分析物質クロマチン／細胞の少なくとも１００倍、さらに適切には少なくとも５００倍、さらにより適切には少なくとも１０００倍であるべきである。しかし、好適には、過剰の担体クロマチン／細胞は、分析物質クロマチン／細胞の少なくとも１万倍、さらに適切には少なくとも１０万倍、さらにより適切には少なくとも１００万倍であるべきである。実際には、本発明者らは、１５個乃至１万個の分析物質細胞を約５０００万担体細胞と混合すべきであることを見出した。
【００３８】
本発明者らは、注意深く、さまざまな担体クロマチンタイプを本発明において考察した。本発明者らはいかなる仮説に縛られることも望んでいないが、彼らは、本発明の方法の成功に寄与した二つの要件があると信じている。第１に、分析物質細胞と担体細胞を均質化に供してそれらの対応する核を調製する際におよびミクロコッカスヌクレアーゼ消化に供してそれからクロマチンを調製する際に、類似の挙動を有することが好適である。前記方法は、担体細胞および分析物質から実質的に等しい効率でクロマチンを調製するのが望ましい。本発明者らは、もしこのことが達成されないならば、前記方法が効率的でないと判断した。第２に、分析物質クロマチンのＤＮＡが、担体クロマチンと識別できることが要件である。従って、分析物質細胞からの配列（例  遺伝子）が大過剰（例  ６桁まで）の担体ＤＮＡの存在下においてさえもポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）のような適切なアッセイによって正確にかつ特異的にアッセイできるように、好適には、担体クロマチン（および、従って担体細胞）および分析物質クロマチン（および、従って、分析物質細胞）が遺伝的に互いに十分に異なっている。例えば、生物の分類学的分類によれば、担体クロマチンと分析物質である生物サンプルは、異なる種、異なる属、異なる科、異なる目、異なる綱、異なる門、または異なる界に由来できる。
【００３９】
付属の実施例において、本発明者らは、適切な担体として長く樹立されている細胞系ドロソフィアＳＬ２の効果的使用を記載しており、それは、分析物質である生物サンプルがマウス由来である時、上記基準の両者、すなわち、担体クロマチンと分析物質である生物サンプルが異なる門に由来するという基準を満たしていることが明らかになった。しかし、本発明者らは、多くの他の細胞タイプもまた、これらの基準両者を満たし用いることができると信じている。ゆえに、担体クロマチンは、いかなる適切な真核細胞または原核細胞からも得られることが好適であるが、ただし、前記選択は、核およびクロマチンの単離時における匹敵する挙動（上記参照）およびＤＮＡ配列の明確性により、ＰＣＲにより単離したＤＮＡを識別できることという重要要件によって制限されている。担体クロマチンのために特に好適なソースはドロソフィアであり、特にドロソフィラＳＬ２細胞系である。すなわち、分析物質である生物サンプルがドロソフィラに由来していないと、その際には、担体クロマチンがドロソフィア細胞、好適にはドロソフィアＳＬ２細胞に由来する。担体クロマチンの他の適切なソースも同定でき、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のもののような植物細胞である。
【００４０】
本発明者らは、本発明の方法において担体クロマチンの使用がなぜ作用しないのかについていくつかの有効な理由があり、それらは、従って、本発明の方法が自明でないという主張を裏付けると信じている。例えば、本発明者らは、分析物質―担体ハイブリッド懸濁液中におけるクロマチンが過剰の担体存在下において消化されないであろうと予測していた。彼らはまた、前記抗体類が過剰の担体存在下において分析物質―細胞ハイブリッド懸濁液中のクロマチンには結合しないであろうと予測した。さらに、本発明者らは、ＰＣＲ反応が過剰の担体クロマチン存在下において分析物質細胞ＤＮＡを検出できないであろうと予測した。従って、本発明者らは、分析物質核酸を担体クロマチンと混合することが有効であろうということは決して自明でなかったと信じており、従って、それが実際に作用すること、しかもこのような効力を有していることは極めて驚くべきことである。
【００４１】
従って、好適な態様において、本方法は、担体細胞を分析物質細胞と混合する段階；前記細胞を破壊しそこから核を放出させる段階；前記核を消化しそこからクロマチンを放出させる段階；クロマチンを免疫沈降させる段階；単離タンパク質／ＤＮＡ分画からＤＮＡを精製する段階；および前記タンパク質と関連して単離したＤＮＡ断片類を分析する段階を含む一連の段階を含む。
【００４２】
本文にも述べたように、後成発現分析は、細胞ＤＮＡに対するさまざまな変化（後成発現マークとして公知）の研究であり、それらは、遺伝子類の発現または沈黙という結果となる傾向がある。第１の態様の方法を用いて分析できる後成発現マークの例は、ヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、およびＤＮＡメチル化を含む。
【００４３】
従って、第２の態様によれば、分析物質生物サンプル中においてヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、および／またはＤＮＡメチル化、またはそのパターン類を同定する方法が提供され、この方法は、分析物質生物サンプル上でクロマチン免疫沈降を実施することを含み、前記方法は、前記分析物質生物サンプルを担体クロマチンと接触させることを含むことを特徴とする。
【００４４】
第２の態様の方法を用いて、分析物質中ゲノムのいかなる遺伝子または領域のいかなる種類の後成発現マークもアッセイできることが当然理解でき、それらは、ヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、および／またはＤＮＡメチル化、またはそのパターン類を含む。第２の態様による方法は、従って、ヒストン修飾およびその変異体類の分布の分析にも有用である。ヒストンタンパク質の４種のタイプには、Ｈ１（‘リシン高含量’）、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂ（‘わずかにリシン高含量’）およびＨ３およびＨ４（‘アルギニン高含量’）を含み、それらのいずれも、本発明の方法を用いて分析できる。
【００４５】
第２の態様の方法におけるクロマチン免疫沈降段階は、従って、適切な抗体の使用を含み、それは、転写因子類または他のＤＮＡ結合タンパク質類のような非ヒストンタンパク質類に対して誘導できる。本発明の方法を非ヒストンタンパク質類の分析に適用するため、好適には、細胞（またはそこからの核）を典型的にはホルムアルデヒドである架橋剤で処理する。しかし、グルタルアルデヒドまたはＵＶ照射のような他の架橋剤も使用できる。これは、クロマチン調製時にタンパク質類がＤＮＡから離脱するのを防止する。  
【００４６】
これとは別に、前記免疫沈降段階は、適切な抗体の使用を含み、それは、ヒストン類Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４およびそれらのさまざまな翻訳後修飾イソ型形態および変異体類（例  Ｈ２ＡＺ）のいずれに対しても誘導できる。これとは別に、前記免疫沈降段階は、適切な抗体の使用を含み、それは、ヒストンアセチラーゼまたはデアセチラーゼまたはＤＮＡメチルトランスフェラーゼのようなクロマチン修飾に関与する酵素類に対して誘導できる。
【００４７】
上記にも述べたように、ヒストン類は、例えばアセチル化、メチル化、リン酸化、ＡＤＰリボシル化、規定のアミノ酸残基類のスモイル化およびユビキチン化によって、規定の酵素類によりインビボで翻訳後修飾されることもでき、これらの修飾の全てが、適切な特異性を有する抗体類の使用によって十分に研究できる。従って、第２の態様の方法を用いて、タンパク質アセチル化、タンパク質メチル化、タンパク質リン酸化、タンパク質ＡＤＰリボシル化、タンパク質スモイル化またはタンパク質ユビキチン化（すなわち、ヒストンまたは非ヒストンタンパク質修飾）のパターンまたはレベルを同定できる。好適には、第２の方法を用いて、それぞれの遺伝子類に関連するＤＮＡメチル化（５−メチルシトシン）のパターン、分布またはレベルを同定できる。これを行うため、ＤＮＡ断片は、好適には、抗５ｍｅＣ抗体とインキュベーションする前に、標準的操作により消化クロマチンから調製される。
【００４８】
アセチル化上昇（通常、数種または全ての４種コアヒストン類を伴う）は、転写上昇または転写能力の一貫したマーカーであり、一方、ヒストンリシンメチル化は、どのリシン残基が関与しているかばかりでなくメチル化の程度すなわち前記リシンε−アミノ基にメチル基１、２または３個が結合しているかに応じて、転写活性化または沈黙に関連している。従って、本発明の方法で分析できる好適なヒストン修飾には、付属の実施例で述べたように、Ｈ４Ｋ１６ａｃ；Ｈ３Ｋ４ｍｅ３；Ｈ３Ｋ９ｍｅ２；Ｈ３Ｋ４ｍｅ１；およびＨ４Ｋ８ａｃを含む。
【００４９】
本発明者らは、第１または第２の態様の方法が多くの応用を有しており、広範囲の分析物質生物サンプルに適用できると信じている。さらに、本発明者らは、バリエーション（ヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、および／またはＤＮＡメチル化）のそれぞれが遺伝子発現の重要な制御剤であることおよびそれらの変化が細胞機能変化または非機能化および従って疾患に関連していることを認識した。従って、後成発現マーカーは、適切な処置法に対するますます貴重な診断および予後指標および指針となろう。
【００５０】
従って、第３の態様によれば、疾患状態の診断または予後のために第１または第２の態様の方法を用いることが提供される。
【００５１】
第３の方法を用いて、分析物質中ゲノムのいかなる遺伝子または領域のいかなる種類の後成発現マークもアッセイできることが当然理解できる。第１または第２の態様の方法を用いて診断できるかまたは予後を確立できる疾患の例には、前立腺、頸部癌またはホジキンリンパ腫のような全ての種類の癌、および関節リウマチのような自己免疫疾患を含む。好適には、前記診断方法は、インビトロで行われる。
【００５２】
例えば、第３の態様の方法は、第１および第２サンプルを採取すること、これを担体細胞（クロマチン）と混合すること、本文に述べたようなＣｈＩＰを実施しそれについての後成発現比較を行うことを含む。例えば、第１サンプルには、正常（対照）細胞を含み、第２サンプルには疾患細胞を含み、第１または第２の態様の方法を用いてその中の後成発現マークを比較できる。後成発現比較によって、本発明の方法を用いて分析物質生物サンプルが疾患状態にあるかまたはそうでないかを分類できる。
【００５３】
前記サンプル類は、健常および疾患組織から得ることができる。前記生物サンプルは、術時採取したかまたは針生検により採取した腫瘍および隣接正常組織からの材料を含むことができる。固形組織または腫瘍からのサンプルは、担体細胞と混合する前に処理して、担体クロマチンと混合するために適した細胞懸濁液を調製する。例えば、前記処理は、タンパク分解酵素類による温和な消化により細胞−細胞接触を破壊することを含む。前記担体細胞を次にそれに添加し、ＣｈＩＰを行う。
【００５４】
従って、第３の方法は、好適には、調べる組織および対照組織から細胞サンプルを採取することを含む。調べる組織の例には、骨髄が含まれる。前記方法は、第１または第２の態様の方法を実施し、次に、移植のために主要サンプルを使用する前に、サンプルを分析することを含む。分析物質細胞は、“淡黄褐色の被覆”物質すなわち遠心分離後の表層細胞から誘導でき（標準的臨床検査技術）；または抗体標識およびクロマトグラフィ（例  免疫アフィニティ精製）により選択細胞をさらに精製した後の表層細胞から誘導できる。
【００５５】
生物サンプルはまた、フローサイトメトリ；レーザー切開顕微鏡法；差分遠心分離；または他の標準的分画技術により調製したタイプ（系統）の明確な細胞を含むことができる。付属の実施例は、蛍光活性化セルソーティングを用いてまたは組織サンプルからどのようにして分析物質サンプル細胞群を調製できるかを示した。
【００５６】
本発明の方法を同様に用いて、エタノール固定またはホルムアルデヒド固定組織切片から細胞を分析でき、それらは、正常または頸部癌のような病理組織保存切片の後成発現分析を可能とするであろう。
【００５７】
本発明者らは、早期胚自体からの材料を用いて後成発現分析においてクロマチン免疫沈降を用いることが現在不可能であることを理解していたが、その理由は、典型的内細胞塊（ＩＣＭ）が２０個未満の細胞、すなわち少なくとも１００万個の細胞を現行のＣｈＩＰが必要としているよりもはるかに少ない細胞しか含まないからである。さらにまた、培養ＥＳ細胞がインビボで分化を進める後成発現メカニズムのための優れたモデルを提供するかどうかという重大な疑問をこれまで直接解明できなかった。従って、本発明者らは、前記疑問に答えるためにＩＣＭおよび培養ＥＳ細胞中において重要制御遺伝子類上のヒストン修飾の分布を定量的に比較することが可能であるかどうか、研究を行った。従って、本発明者らは、ＩＣＭおよびＥＳ細胞中における制御遺伝子類Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＣｄｘ２を研究した。本発明者らは、付属の実施例において、驚くべきことにＩＣＭおよび培養ＥＳ細胞中におけるこれらの制御遺伝子類のそれぞれにおいてヒストン修飾の分布を定量的に比較できること、および従って、培養ＥＳ細胞がインビボで分化を進める後成発現メカニズムの優れたモデルを現実に提供することを明らかにした。
【００５８】
従って、第４の態様において、幹細胞または幹細胞前駆体のサンプル上で後成発現分析を実施する方法が提供され、前記方法は、幹細胞または幹細胞前駆体サンプルでクロマチン免疫沈降を実施することを含み、前記方法が、幹細胞または幹細胞前駆体を担体クロマチンと接触させる段階を含むことを特徴とする。
【００５９】
当業者は、胚幹細胞が内細胞塊（ＩＣＭ）に由来することを理解するであろうが、それは、胚盤胞の内部成分である。ＩＣＭは、外側のトロフェクトデルム（それは、トロホブラストから構成される）に取り囲まれている。従って、本発明の方法を用いて分析する細胞は、これらの成分のいずれかに由来する幹細胞であることができる。従って、幹細胞前駆体は、ＩＣＭまたはトロフェクトデルムまたはトロホブラストのようなＩＣＭ由来細胞のいずれかを含むことができる。
【００６０】
好適には、前記方法は、個体から幹細胞または幹細胞前駆体サンプルを採取すること、次に、本発明の方法を用いてそれについて後成発現分析を実施することを含む。付属の実施例は、トロホサージャリを行って適切な分析物質細胞を採取する詳細を示している。第４の態様の方法を用いて、分析物質中ゲノムのいかなる遺伝子または領域のいかなる種類の後成発現マークもアッセイできることが当然理解できる。しかし、好適な分析は、幹細胞または前駆体中において制御遺伝子を分析することを含む。分析できる好適な制御遺伝子類は、それぞれ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４；およびＣｄｘ２から選択できる。さらに、より好適には、ヒストン修飾を問題の遺伝子について分析することもできる。分析できる好適なヒストン修飾は、付属の実施例に述べるように。Ｈ４Ｋ１６ａｃ；Ｈ３Ｋ４ｍｅ３；Ｈ３Ｋ９ｍｅ２；およびＨ３Ｋ４ｍｅ１を含む。
【００６１】
好適には、幹細胞または幹細胞前駆体を担体クロマチンに接触させる段階は、本方法の第１段階であり、幹細胞または幹細胞前駆体由来細胞を担体細胞、好適にはその過剰量と混合する。従って、前記担体細胞は増量剤として作用し、極めて少数のすなわち１００個未満、好適には８０個よりはるかに少ない幹細胞またはその前駆体においてＣｈＩＰを実施可能とする。前記ＣｈＩＰ方法におけるＰＣＲ分析で用いた好適なプライマー類は、表１でわかる。
【００６２】
要約すると、本発明者らは、ドロソフィラ担体クロマチンの使用に基づき新規ＣｈＩＰ操作（本文でＣＣｈＩＰと称する）を開発し、それは、１００個未満の細胞におけるヒストン修飾パターンの明確化と定量を可能とする。本発明者らは、Ｈ４アセチル化、Ｈ３Ｋ４トリメチル化およびＨ３Ｋ９ジアセチル化のような確立された活性化および沈黙後成発現マーク類が同様に、ＩＣＭおよびＥＳ細胞中においてＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４のような制御遺伝子を横断して分布していること、一方、他の修飾は、わずかの後成発現差の証拠を提供することを明らかにした。
【００６３】
従って、本発明の方法類のそれぞれの第１段階は、分析物質細胞を大過剰の担体細胞と混合する段階を含む。本発明者らは、本発明の方法のそれぞれが少数細胞（すなわち、１０００万個未満の細胞）での有意な感度上昇によりクロマチン免疫沈降を用いる後成発現分析分野において顕著な進歩を示していると考えている。担体クロマチンと分析物質サンプルを接触させる代わりに少数細胞のクロマチン免疫（ＣｈＩＰ）分析の唯一の代替手法は、前記方法の各段階を小規模化することであろう。従って、必要細胞数をちょうど１０００倍にする（５０００万個よりもむしろ５万個の細胞を分析可能とするため）には、反応容量を１０００倍にする必要がある。従って、反応容量１ｍｌで現在行われている消化およびインキュベーションを、反応容量１μｌに低下しなければならないであろう。ラボテクニシャンは、標準的ラボ装置を用いてこれらの少ない容量で仕事ができないことを理解するであろう。従って、精密測定装置および液体取り扱い技術に大幅な投資が必要となるであろう。さらに、本発明の方法において反応に必要な細胞数が細胞１０−１５個よりも３桁以上多くなる結果となるであろう。従って、ＣｈＩＰ方法の各段階を小規模化することは重大な欠陥を有しており、本発明の方法の感度に近いとはとてもいえないであろう。
【００６４】
本発明の第５によれば、クロマチン免疫沈降実施のための１種以上の材料を含む後成発現分析キットが提供され、前記キットはさらに、担体クロマチンを含むことを特徴とする。
【００６５】
上記にも述べたように、本発明の方法における担体クロマチンの使用は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析が非常に少ない分析物質生物サンプル類で行うことができるように本発明の方法類の感度を非常に向上させる。本発明のこの面によるキットは、ある量の上記担体クロマチンを含み、本発明の方法類の実施に際して用いることができる。これまで担体クロマチンがＣｈＩＰを用いた後成発現分析の感度を非常に向上させるとは考えられてこなかったので、本発明のこの面のキットは、ＣｈＩＰ実施のための既存のキット類に対して重要な利点を有している。
【００６６】
用語“後成発現分析”については、上記に述べた本発明の第１においてさらに説明されている。従って、本キットを用いて分析物質生物サンプルにおけるヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾およびＤＮＡメチル化のような後成発現マークを分析または検出できる。
【００６７】
我々は、“クロマチン免疫沈降を実施するための材料”について、分析物質生物サンプルでＣｈＩＰ分析を実施するために必要な試薬類および任意に１種以上の陽性または陰性対照を含む。クロマチン免疫沈降を実施する際に必要な試薬類は、付属の実施例に記載されており、本発明のこの面に含まれる。このような試薬類には、ＮＢ緩衝液（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ  ７．４，６０ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）；消化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４，０．３２Ｍショ糖、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）；溶解緩衝液（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ酪酸Ｎａ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．４ｍＭグリシン）が含まれる。Ｘ−ＣｈＩＰに用いた固定緩衝液のような他の試薬類もまた、付属の実施例で示され、本発明のこの面に含まれる。
【００６８】
本キットは、これらの材料類と同様、通常研究されるタンパク質類の免疫沈降に適した１種以上の抗体類を含有する。後成発現分析がヒストン類またはそれらのさまざまな翻訳後修飾イソ型形態および変異体類に対する１種以上の抗体類を用いてクロマチンの免疫沈降を必要とする場合、前記キットは、また、上記および付属の実施例に述べたヒストンに対する抗体類の１種以上、すなわち、Ｈ４Ｋ１６ａｃ（Ｒ２５２）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（Ｒ２０４）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ｒ１４８）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｒ１８３）、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２またはＨ４Ｋ８ａｃに対する免疫特異性を有する抗体類を含む。
【００６９】
前記キットは、また、ＤＮＡの特定領域のポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）分析に適した１種以上のプライマー類を含む。例えば、付属の実施例に示したように、本発明の後成発現分析方法類を用いて、ＩＣＭおよびＥＳ細胞中の制御遺伝子類Ｎａｎｏｇ，Ｏｃｔ４およびＣｄｘ２に関連した後成発現マークを決定できる。従って、前記キットはまた、実施例１に記載のプライマー類またはプライマー対の１種以上を含む。
【００７０】
用語“担体クロマチン”については、上記に述べた本発明の第１にさらに記載してある。担体クロマチンの要件は、それが、本発明の方法類の実施に際して分析物質生物サンプル中に存在するクロマチンと類似の性質を有していること、しかし、分析物質クロマチンのＤＮＡは、担体クロマチンと識別できることであることが理解されるであろう。従って、担体クロマチンの性質は、本発明のキットで調べる分析物質生物サンプルにより、必然的に異なる。しかし、付属の実施例で述べたように、本発明者らは、適切な担体として長く確立されている細胞系ドロソフィアＳＬ２の有効な使用を記載しており、それは、分析物質生物サンプルがマウス由来である時上記基準の両者すなわち担体クロマチンおよび分析物質生物サンプルが異なる門に由来している生物に由来していることという基準を満たしていることが明らかとなっている。従って、本発明のこの面の好適な態様において、担体クロマチンはドロソフィアＳＬ２細胞由来である。本発明の別の態様には、担体クロマチンがアラビドプシス細胞のような植物細胞に由来する場合も含まれる。
【００７１】
本文（付属の請求の範囲、アブストラクトおよび図面全てを含む）に述べた特徴の全ておよび／またはこれまで開示した全ての方法またはプロセスの段階の全てを、いかなる組み合わせでも上記面のいずれかとも組み合わせることができるが、ただし、上記特徴および／または段階の少なくともいくつかが互いに排他性である場合の組み合わせを除く。
実施例
【実施例１】
【００７２】
ＣＣｈＩＰ分析の使用
本発明者らは、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）の方法を用いて遺伝子の発現または沈黙に関連している核酸修飾（ヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、およびＤＮＡメチル化）が研究されてきたことを理解している。しかし、それらの研究では少なくとも１０００万個の細胞を必要とするので、彼らは、典型的ＩＣＭが２０個未満の細胞を含み早期胚それ自体からの材料を用いてクロマチン免疫沈降を用いるのは不可能であることを認識していた。本発明者らは、従って、この問題の解決に乗り出し、クロマチン免疫沈降方法（本文で“ＣＣｈＩＰ”と称する）に基づき感度が非常に向上した本発明の方法を開発した。本発明者らはまた、ＩＣＭおよび培養ＥＳ細胞中の重要制御遺伝子類におけるヒストン修飾分布の定量的比較を行うことが可能かどうかを調べたいと思った。従って、本発明者らは、ＩＣＭおよびＥＳ細胞中において制御剤類Ｎａｎｏｇ，Ｏｃｔ４およびＣｄｘ２を研究した。
【００７３】
材料および方法
細胞
ドロソフィアＳＬ２細胞を、８％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）および抗生物質類（ペニシリン／ストレプトマイシン）添加シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）の培地（Ｇｉｂｃｏ）中２６℃において増殖させた（Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．２７、３５３−３６５（１９７２））。マウスＥＳ細胞系ＰＧＫ１２．１を単層培養で、先に述べたように、成長因子ＬＩＦ添加培地中で増殖させたが、ただし、フィーダー細胞はなかった（Ｃｅｌｌ  ７７、４１−５１（１９９４）、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８、２８９７−２９０７）。細胞をＬＩＦ不在下非粘着プラスチックに再度接種して分化を誘導した（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １７：４３５−６２（２００１））。
【００７４】
抗体類
Ｈ４Ｋ１６ａｃ（Ｒ２５２）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（Ｒ２０４）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ｒ１４８）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｒ１８３）およびＨ３Ｋ９ｍｅ２（Ｕｐｓｔａｔｅ）に対するウサギポリクローナル抗血清（抗体類を含有する血清）を、先に記載されているように卵白アルブミンに結合させた合成ペプチドで免疫することによって、作製した（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９、１３１−１３９（１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９、４１７−４２４（１９９９））。特異性は、用いた全ての所内および市販の抗血清のための阻害ＥＬＩＳＡによってアッセイし（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１８、１２６３−１２７１（２００４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９、４１７−４２４（１９９９））、ウェスタンブロッティングによって検査した。全ての抗血清について、抗血清を作製したものに対するもの以外のエピトープとの交差反応は、無視できた。
【００７５】
トロホサージャリ
凍結保存した２−細胞Ｂａｌｂ／ｃマウス胚（Ｅｍｂｒｙｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を溶解させ、Ｍ１６培地（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中で培養し、拡張胚盤胞期とした。内細胞塊（ＩＣＭ）の単離は、ＳｏｌｔｅｒおよびＫｎｏｗｌｅｓにより開発された方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２、１４９６７−１４９７２（１９７５））をわずかに改変して用い、イムノサージャリによって行った。簡単に述べると、培養胚盤胞から０．５％プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて透明帯を除去し、ウサギ抗マウス血清（Ｓｉｇｍａ）の１：１００希釈物に晒した。胚盤胞をＰＢＳで洗浄し、モルモット補体（Ｓｉｇｍａ）に移した。死滅トロフェクトデルム細胞を除去し、各ＩＣＭをトリプシンーＥＤＴＡ溶液の一滴に移し、インキュベーションし、細胞を脱凝集させた。
【００７６】
トロフェクトデルム細胞を単離するため、ＩＣＭに対して反対側の極にある透明帯の小領域を、ミクロピペット（Ｔｈｅ  Ｐｉｐｅｔｔｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．）により酸性にしたタイロード溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて透明帯ドリリングによって溶解させた。トロフェクトデルム（ＴＥ）単離は、透明帯ドリリング後ある期間（３時間まで）培養することで達成でき、その間、胚盤胞空洞の拡張によりＴＥを透明帯中の小開口部から脱漏させる。脱漏したＴＥ小胞を、脱漏点において非常に鋭いミクロスプリッティング刃（ＡＢ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によるミクロ操作により、ＩＣＭから切片として取り出し、透明帯中に保持した。
【００７７】
クロマチン免疫沈降
ＣＣｈＩＰ操作のため、ドロソフィラＳＬ２細胞をペレットとし、氷冷ＰＢＳ，５ｍＭ酪酸ナトリウム中で３回洗浄した。細胞を、５×１０７細胞／ｍｌまで再懸濁させ、アリコット１ｍｌを少数（通常、１００−１０００）のマウス細胞（ＥＳ細胞、ＩＣＭまたはトロフェクトデルム）と混合した。細胞混合物を、５ｍＭ酪酸ナトリウム添加ＮＢ緩衝液（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ  ７．４，６０ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で２回、洗浄した。最終ペレットをＮＢ緩衝液２ｍｌに再懸濁させ、ＮＢ緩衝液中１％Ｔｗｅｅｎ４０  ２ｍｌと混合し、氷上で１時間撹拌した。核を、“きっちりと固定された”乳棒を有するＤｏｕｎｃｅ全ガラスホモゲナイザー中でストローク１０回のサイクルを４回行い均質化させ放出させたが、各サイクルの間では１０−１５分（氷上）休ませ、過剰の発泡を抑えた。この結果、未改変核の収率７５−８０％となるはずである。核をペレットとし（２５００ｒｐｍ，ＭＳＥ３０００、１５分  ４℃）、ＮＢ緩衝液２０ｍｌ、５％（ｖ／ｖ）ショ糖に再懸濁させ、ペレットにした（３０００ｒｐｍ，ＭＳＥ３０００、２５分  ４℃）。核を再度、消化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４，０．３２Ｍショ糖、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）５ｍｌ中で懸濁させた。Ａ２６０を測定し、ＤＮＡ濃度のおよその推定値を得て、サンプルを２５０μｇ／ｍｌに調整した。アリコット１ｍｌをミクロコッカスヌクレアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）５０単位と混合し、２８℃で５分間、インキュベーションした。
【００７８】
消化したサンプルを３０００ｒｐｍで５分間回転させ、上清を除去した（分画Ｓ１）。ペレットを、溶解緩衝液１ｍｌ（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，５ｍＭ酪酸ナトリウム、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．４ｍＭグリシン）中に再懸濁させ、分画Ｓ２を得た。両方の分画を溶解緩衝液に対して４℃において透析し、遠心分離し（３０００ｒｐｍ、１０分  ＭＳＥ３０００）、上清（分画Ｓ１およびＳ２）をアガロースゲル電気泳動で分析した。クロマチンが満足いくものであるならば（すなわち、最小のサブヌクレオゾーム断片を有するモノクレオゾーム類が主であるが、それだけではない）、Ｓ１およびＳ２をまとめてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）のために用いたが、それは、先に記載されているのと全く同様に行い（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２、１７８３−１７９０（２００３）、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４、３９４６−３９５７（１９９５））、ただし、誘導ＤＮＡ分画はＰＣＲにより分析したことを除く。
【００７９】
ポリメラーゼチェーン反応
全てのＰＣＲ反応は、マウスとドロソフィアＤＮＡ対照により二重に実施し、それらは平行して実施し、交差ハイブリッド形成をモニタリングした。レッディ・ミックス（Ｒｅｄｄｙ  Ｍｉｘ）ＰＣＲマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（ＡＢ  Ｇｅｎｅ，ＵＫ）４５μｌを３μｌのインプットＤＮＡ（約２５ｎｇ）および２μｌプライマー混合物に添加した。α−３２Ｐ放射標識ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）の１μｌ（１μＣｉ）を、サイクル前に各ＰＣＲに添加した。標準的プロトコールにおいて、アリコットを３８および４１サイクル後に除去し、５％ポリアクリルアミドゲルに載せ、４００ボルト、３０ｍＡで１５分間、電気泳動した。ゲルを最低２時間、ろ紙（ＳｐｅｅｄＧｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ、ＵＫ）上で乾燥させた。ろ紙を一晩ホルホルスクリーンに暴露し、ホスホルイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（Ｔｙｐｈｏｏｎ９２００、Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）でスキャンした。各ＰＣＲ産物についての強度値を、‘イメージクアント（Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ）５．２’ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で分析した。用いたプライマー対を表１に示した。
【００８０】
【表１】
2009524810.tif 000002
【００８１】
結果
１）ＣＣｈＩＰ操作
図１Ａでは、本発明の方法に関与する重要段階（すなわち、ＣＣｈＩＰ）を概説する略フローダイアグラムを示した。
【００８２】
本発明の方法（すなわち、本文でＣＣｈＩＰ操作と称する）は、担体クロマチンソースとしてドロソフィラＳＬ２細胞の使用に基づいている。ＳＬ２細胞および少数の哺乳類細胞を、核およびクロマチン調製前に混合する。天然のクロマチン断片類（大きさが１−５のヌクレオゾーム類）を修飾ヒストン類に対する抗血清で免疫沈降させ、バウンド（Ｂ）とアンバウンド（ＵＢ）クロマチン分画類を得たが、それらは、それぞれ修飾ヌクレオゾーム類を多く含むかあるいは欠損している（図１Ａに示した）。沈降クロマチン（ドロソフィア細胞から主に由来する）の量と品質は、アガロースゲル電気泳動で（図１Ｂに示したように）日常的に検査した。本発明者らは、ホットＰＣＲ（〔３２Ｐ〕αｄＣＴＰを用いる）、電気泳動、および増幅特異性を産生されたＤＮＡ断片の大きさを測定することによって各アッセイについてモニタリングする技術であるホスホルイメージング（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｉｎｇ）によって、哺乳類ＤＮＡ断片類を検出することを選択した。
【００８３】
用いた全てのプライマー対が予測された大きさの単一バンドを産生し、ドロソフィラＤＮＡとは交差反応しなかったことがわかる（図１Ｃに示した）。本発明者らは、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）も用いて、沈降ＤＮＡをアッセイできると信じている。しかし、ＲＴＱ−ＰＣＲは、電気泳動段階の付加的特異性検査を提供しないであろう。当初の実験において、本発明者らは、ＳＬ２細胞に１０００または１０，０００個のマウスＥＳ細胞を添加し、さまざまなプロモータ領域のアセチル化（Ｈ４Ｋ８ａｃ）をアッセイした。Ｎａｎｏｇ（多能性細胞で活性な遺伝子）およびＧａｐｄｈ（ハウスキーピング遺伝子）のプロモータ領域についての典型的結果を、図１Ｄに示した。Ｇａｐｄｈプロモータは中等度のアセチル化を示した（Ｂ／ＵＢ比が約１）が、Ｎａｎｏｇプロモータは、非常にアセチル化された（Ｂ／ＵＢ比が＞２）。同一の結果が、５×１０７細胞からクロマチンによる標準的ＮＣｈＩＰで得られた（図１Ｄに示した）。ＣＣｈＩＰ後のバウンド（アセチル化）分画における高含量のＮａｎｏｇは、広範囲のＰＣＲサイクル数で明らか（示さず）で、本文に述べた定量的分析について、Ｂ／ＵＢ値は、それぞれ２種の異なるサイクル数（通常３８と４１）で行った二重ＰＣＲ反応から計算した。
【００８４】
前記ＣＣｈＩＰ操作を検証するため、本発明者らは、７個の異なる遺伝子領域における５種の異なるヒストン修飾について標準的ＮＣｈＩＰ（５×１０７ｍＥＳＣ）とＣＣｈＩＰ（１０００ｍＥＳＣ）により決定したＢ／ＵＢ比を比較した。図１Ｅに示したように、前記２種の技術で得られた値には緊密な相関がある（ｒ＝０．７４３、ｐ＜＜０．０１）。
【００８５】
２）Ｎａｎｏｇを横断するヒストン修飾における分化関連変化
さまざまなモデルシステムにおいて、Ｈ４アセチル化とＨ３Ｋ４トリメチル化は転写活性遺伝子類の一貫したマークであり、一方、沈黙遺伝子類は、Ｈ３Ｋ９ジメチル化のレベル上昇によってマークされる（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６，７３−７７（２００３）、ＥＭＢＯ  Ｊ．７、１３９５−１４０２（１９８８）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１８、１２６３−１２７１（２００４）、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１６、２１１７−２１２４（２００３））。これらのマークもまたＥＳ細胞中において重要制御遺伝子類の制御に関与しているかどうかに答えるため、本発明者らは、従来のＮＣｈＩＰを用いて未分化細胞（Ｎａｎｏｇが活性）および培養７日間で分化させた細胞（Ｎａｎｏｇが沈黙）中におけるＮａｎｏｇ遺伝子上のそれらの分布をアッセイした。未分化細胞中において、前記プロモータに隣接した領域（図２中Ａ−Ｃで示した）は、Ｈ４Ｋ１６ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の高レベルによりマークされ、一方、予測外のことであったが、４位のリシンでモノメチル化されたＨ３（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）高レベルによってマークされる。前記プロモータは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２および沈黙マークであるＨ３Ｋ９ｍｅ２の両者で中度または低レベルを示し、一方下流領域Ｆは、低乃至中レベルの全マークを有していた（図２に示した）。
【００８６】
分化細胞において、前記プロモータにおけるＨ４Ｋ１６ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ１の高レベルが消失し、一方、プロモータ領域Ａ−Ｃばかりでなく下流領域ＦにおいてもＨ３Ｋ９メチル化が数倍も上昇していた（図２）。沈黙Ｃｄｘ２遺伝子およびハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈの変化ははるかに温和で、Ｎａｎｏｇにおける変化に対して時には反対方向となることもあり（例  図２Ａ）、細胞調製物間における免疫沈降効率差を反映しているのであろう。示した結果は、Ｇａｐｄｈまたは他のいかなる遺伝子に対しても正規化していなかったが、その理由は、このことが発生時の後成発現マークの変化または一定性について恣意的な仮定を必要とすることによる。
【００８７】
３）胚盤胞における制御遺伝子類の後成発現マーキング
本発明者らは、ＣＣｈＩＰ操作を用いて１個または数個の早期胚盤胞から入手できる少数の細胞における特定遺伝子に関連したヒストン修飾をアッセイできるか疑問を呈した。孵化段階において、培養しているマウス胚盤胞は約５０個の細胞を含み、その約２／３がトロホブタストであり残りがＩＣＭである。本発明者は、胚盤胞をマニュアルで切開しＩＣＭを含まないトロフェクトデルム(図3Ａに示したように)を調製し、また、トロフェクトデルムを含まないＩＣＭは、イムノサージャリによって調製した。３個のＩＣＭと３個のトロフェクトデルム調製物を別々に組み合わせ、ジスパーゼ消化により解離させた。単一細胞懸濁液のそれぞれは細胞１００個以下であり、これを、担体としての５×１０７個のＳＬ２細胞に添加し、免疫沈降させた。
【００８８】
典型的結果を図３Ｂに示した。これらは、全て、ＩＣＭ／トロフェクトデルム調製物１対からのものであるが、示した実験の全ては少なくとも２回行い、一貫した結果が得られた。ＩＣＭ中で活性の遺伝子類ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４のプロモータ類は両者ともに、高レベルのＨ４アセチル化、中レベルのＨ３Ｋ４ｍｅ３および沈黙マークである低レベルのＨ３Ｋ９ｍｅ２を示した。両遺伝子が沈黙しているトロフェクトデルムにおいて、前記状況が逆転し、高レベルのＨ３Ｋ９ｍｅ２と低レベルのＨ４アセチル化となった。逆に、Ｃｄｘ２遺伝子は、それが沈黙しているＩＣＭ中において低Ｈ４アセチル化と高Ｈ３Ｋ９ｍｅ２を示し、それが活性となるトロフェクトデルム中において高Ｈ４アセチル化と低Ｈ３Ｋ９ｍｅ２を示した（図３Ｂに示したように）。ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈは、前記２種の細胞タイプで同一のヒストン修飾のプロフィールを示した。ＩＣＭおよびトロフェクトデルム中Ｇａｐｄｈプロモータ上における比較的低レベルのＨ３Ｋ４ｍｅ３はＣＣｈＩＰにより明確となったが、それは、従来のＮＣｈＩＰによりアッセイしたＥＳ細胞中でも明らかである（図２Ｂに示したように）。
【００８９】
我々は、ＣＣｈＩＰ操作を用いて、ただ１個のＩＣＭからの細胞における後成発現マークをアッセイした。Ｎａｎｏｇのような遺伝子類は、このようないくつかの実験からの抗体結合分画中で検出できるが（図１Ｄに示したように）、本発明者らは、他の実験においてそれらがＰＣＲサイクル数を多くしてさえも検出可能でないことを見出した（図示せず）。下記にも述べたように、本発明者らはいかなる仮説に拘束されることも望んでいないものの、彼らは、この変動が、関与した細胞が少数（イムノサージャリからの収率に応じて１０−１５個）であったことの結果であるかも知れないと考えている。以下の実験全てについて、本発明者らは、ＣｈＩＰ当たり３個のＩＣＭを用いた。
【００９０】
４）ＩＣＭと胚幹細胞の後成発現比較
ＩＣＭおよびマウスＥＳ細胞中における規定の遺伝子類に関連した後成発現マークを比較するため、本発明者らは、ＣＣｈＩＰを用いて、両方の細胞タイプにおけるＮａｎｏｇおよび他の系統特異的遺伝子類上の規定領域における５種の異なるヒストン修飾をアッセイした。
【００９１】
例示的結果を図４に示した。上記と同様、実験は全て少なくとも１回は繰り返し、一貫した結果を得た。全般的には、このような遺伝子類と関連したアセチル化Ｈ４（Ｈ４Ｋ１６ａｃ）、Ｋ４でトリメチル化したＨ３（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）およびＫ９でジメチル化したＨ３（Ｈ３Ｋ９ｍｅ２）は、ＩＣＭおよびＥＳ細胞でそれぞれ、極めて類似していた。ＩＣＭおよびＥＳ細胞の両者において、Ｈ４アセチル化は、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４遺伝子のプロモータ中においてそれらのコードまたは３´領域においてよりも高く、Ｎｋｘ２．５のような沈黙遺伝子類のプロモータにおいてはるかに高い（図４Ｂに示したように）。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３は、活性ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４遺伝子類上でより均一に増加しており、プロモータおよびコード領域の間でほとんど差がなかったが、Ｎａｎｏｇの下流領域Ｆで欠損し、かつ沈黙遺伝子Ｎｋｘ２．５（図４Ｃに示した）、Ｃｄｘ２およびＨｈｅｘのプロモータにおいて欠損している（結果を示さず）。これとは逆に、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２は、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４のプロモータ近位領域で欠損していたが、Ｎａｎｏｇの３´コードおよび下流領域および沈黙遺伝子類Ｎｋｘ２．５、Ｃｄｘ２およびＨｈｅｘ上で中程度に増加している（図４Ｄに示したようにおよび示していないように）。
【００９２】
対比的に、２種の修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ２およびＨ３Ｋ４ｍｅ１は、ＩＣＭおよびＥＳ細胞で一致不良を示した。例えば、ＥＳ細胞では、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２のレベルが、Ｎａｎｏｇのプロモータ近位領域でさらに下流よりも高く、一方、ＩＣＭにおいては、前記マークは、前記遺伝子を横断して分布していた。このマークのレベルは、沈黙遺伝子類Ｎｋｘ２．５、Ｃｄｘ２およびＨｈｅｘのプロモータ上とＮａｎｏｇ上でほとんど異ならず、それにもし転写活性化または沈黙において何らかの役割があるとしても、その役割は不明のままである（図４Ｅに示したように）。ＩＣＭおよびＥＳ細胞間での最も驚くべき差異は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１で見られ、ＥＳ細胞中Ｎａｎｏｇの５´領域Ａとプロモータ領域Ｃにおいて、特に高いレベルを示した（図４Ｆで示したように）。この結果は、従来のＮＣｈＩＰにより未分化ＥＳ細胞中で得られたものと完全に一致している（図２Ｄに示したように）。本発明者らはまた、ＩＣＭではなくＥＳ細胞中でＮｋｘ２．５のプロモータにおいて高レベルのＨ３Ｋ４ｍｅ１を見い出だした（図４Ｆに示したように）。Ｃｄｘ２およびＨｈｅｘの２種の他の沈黙遺伝子ではこのような上昇は見られなかった（図４Ｆに示したように）。
【００９３】
これらの結果は、この遺伝子が沈黙している分化ＥＳ細胞中でそれがＮａｎｏｇプロモータから消失しているにもかかわらず、このヒストン修飾が転写活性それ自体のマークではないことを示唆している（図２Ｄに示したように）。
【００９４】
ＩＣＭとＥＳ細胞の間における後成発現類似性の度合いの客観的でかつ定量的な測定値を得るため、本発明者らは、６種の系統特異的遺伝子類上での特異的ヒストン修飾のためのＢ／ＵＢ値が前記２種の細胞タイプ間で相関を示すか疑問を抱いた。本発明者らは驚くべきことに、表２にも示したように、顕著な活性化および沈黙マークであるＨ４Ｋ１６ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ９ｍｅ２が、それぞれ別々にしてもまたまとめても、ＩＣＭおよびＥＳ細胞で高い相関を示すことを見出した。  
【００９５】
【表２】
2009524810.tif 000003
【００９６】
示したヒストン修飾レベルは、ＩＣＭおよびＥＳ細胞中の系統特異的遺伝子類Ｎａｎｏｇ，Ｏｃｔ４、Ｃｄｘ２、Ｈｈｅｘ，Ｎｋｘ２およびＣｆｃｌ内部の領域１５箇所において、本発明の方法により（ＣＣｈＩＰ）アッセイした。前記２種の細胞タイプにおける定義した遺伝子領域における特定修飾の値を用いて、ピアソンプロダクトモーメント相関係数（ｒ）と確率（Ｐ）値を計算した。
【００９７】
従って、これらのマークについておよび試験した遺伝子について、本発明者らは、驚くべきことに、ＥＳ細胞がＩＣＭそれ自体の優れた後成発現モデルを付与することを見出した。対比して、それほど明確になっていない機能の２種のマークＨ３Ｋ４ｍｅ１およびＨ３Ｋ４ｍｅ２について、ＥＳ細胞とＩＣＭでは全く相関がない（表２に示したように）。
【００９８】
考察
極めて少数の細胞（１００個以下）に本発明の方法（すなわち、ＣＣｈＩＰ操作）を適用することが、天然の非固定クロマチン（ＮＣｈＩＰ）についての高いＣｈＩＰ効率のゆえに可能となる。その成功には、前記操作の各段階における損失が最低に維持されることが必要である。最適条件下では、全細胞から調製した核の収率が少なくとも８０％であり、一方、ミクロコッカスヌクレアーゼ消化後の可溶性分画（Ｓ１／Ｓ２）におけるクロマチンの収率は通常、＞９０％である。免疫沈降段階もまた、天然クロマチンについて驚くほど効率的であり、特にヌクレアーゼ消化を制御し、モノヌクレオゾームよりもより効率的に沈降するオリゴヌクレオゾーム類を多量に含むクロマチンを得るならば、効率的である。これらの条件下において、高アフィニティ抗血清により、前記抗体が標的とする修飾ヒストン中におけるアンバウンド分画の欠損を、ほとんど完璧とすることができる。
【００９９】
しかし、前記効率は、抗血清の間でもおよびクロマチン調製物によっても変わるであろうし、下記の計算目的のため、本発明者らは、試験中のヒストン修飾を有するクロマチンの４０％がバウンド分画中に実際に回収されるであろうと想定した。取り扱い時の損失は、典型的には、免疫沈降段階後の全回収率測定値（バウンドおよびアンバウンド分画）を５０％近くにする。したがって、本発明者らは、通常の実験で全回収率は０．８×０．９×０．４×０．５＝０．１４であろうと考えている。もし（混合）インプットクロマチンが試験中のヒストン修飾を含む特定クロマチン断片のコピー４０個（２０細胞から）を含むならば、バウンド分画で５−６（すなわち、４０×０．１４）が回収され、ＰＣＲにより検出されるであろう。前記計算は、通常、イムノサージャリ後に約１５個程度のわずかの細胞を産生するＩＣＭにおける特定遺伝子に関連したヒストン修飾の検出が、理論的に可能であることを明らかにしている。驚くべきことに、本発明者らは、本文で、実際にそれができることを明らかにした。しかし、本発明者らは、このレベルにおいて、全収率の中度の低下でも検出を妨害できると考えている。本発明者らは、収率低下は技術的要因によるのであるが、また、標的ゲノム領域上で修飾ヌクレオゾームが分布する頻度を反映できるのであろうと考えている。例えばもしある時点で１０個中唯一のヌクレオゾームのみが修飾されると、全収率が従って低下するであろう。
【０１００】
本発明者らは、本発明の方法（ＣＣｈＩＰ）をホルムアルデヒド架橋クロマチンに適用して（ＸＣｈＩＰ）、それによって、同様に少数の細胞群において非ヒストンタンパク質のゲノム上の位置が効果的にはアッセイできないということには理論的理由がないと信じている（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２５：９９−１０４（２０００））。このようなタンパク質類は通常、天然の非固定クロマチンのヌクレアーゼ消化中に損失する。ＸＣｈＩＰの効率は、非ヒストンタンパク質類に対する抗血清を用いると高くなるが、修飾ヒストンに対する抗血清では低くなり、それはおそらく、隣接ＤＮＡに対してリシン高含量のヒストンテイルを架橋させると、抗血清を誘導したエピトープを改変するかあるいは覆い隠すからであろう。１％未満の収率が通常であり、極めて少数の細胞群においてヒストン修飾分析のためにＸＣｈＩＰを用いることの効率を低下させることがある。これにもかかわらず、本発明の方法は、例えば、正常および疾患組織の生検サンプルから得られた一次細胞サンプルまたはこれまでは細胞数が限定されていたフローソーティングによって得られた一次細胞サンプルの後成発現分析に広く適用できるはずである。
【０１０１】
ＩＣＭおよびＥＳ細胞の後成発現挙動分析
本発明者らは、本発明の方法を用いてＩＣＭおよびトロフェクトデルム細胞中における重要制御遺伝子類Ｎａｎｏｇ，Ｏｃｔ４およびＣｄｘ２のプロモータにおけるヒストン修飾を明らかにし、成功した。本文に示した結果は、重要制御遺伝子類ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４のプロモータ領域は、それらが活性であるＩＣＭ中でアセチル化Ｈ４（Ｈ４Ｋ１６ａｃ）を選択的に多量に含むが、それらが沈黙しているトロフェクトデルム中でアセチル化Ｈ４を欠損しＨ３Ｋ９ｍｅ２を豊富に含むことを直接的に明示している。トロフェクトデルム遺伝子Ｃｄｘ２．５について逆のことが真実であり、そのプロモータはトロフェクトデルム中で非常にアセチル化されているが、ＩＣＭ中においてはＨ３Ｋ９ｍｅ２を豊富に含んでいる。従って、この結果は、Ｈ４Ｋ１６アセチル化およびＨ３Ｋ９ジメチル化が他のシステムにおけると同様に早期胚細胞において活性および沈黙遺伝子類の優れた後成発現マークであることを示唆している。Ｈ３Ｋ４トリメチル化の分布は、また、活性クロマチンとの関係と全般的に一致している。ＩＣＭ、トロフェクトデルム中およびＥＳ細胞中において、この修飾レベルは、活性遺伝子のプロモータ領域で全般的に増加し沈黙遺伝子で低下しているが、この差は、Ｈ４アセチル化についてほどは顕著でなく、高含量はそれほどプロモータ領域に緊密に限定されていない。本発明者らは、このことが、高等真核生物におけるＨ３Ｋ４ジ−およびトリメチル化が転写伸長に役割を果たしているかもしれないという最近の示唆と一致していると考えている。
【０１０２】
本発明の方法（すなわち、本文に述べたＣＣｈＩＰプロトコール）の利点は、ＩＣＭとＥＳ細胞の類似性と差を測定するために用いることができる修飾レベルの定量的測定値（Ｂ／ＵＢ比）をもたらすということである。従って、数種の系統特異的遺伝子類または遺伝子領域類において特異的修飾のレベルを相関させることによって、驚くべきことに、前記２種の細胞タイプの類似性度を定量的に評価できるようになる。このような後成発現挙動分析は、ＩＣＭ，トロホブラストおよびＥＳ細胞中のｍＲＮＡのＰＣＲに基づくアッセイによって可能となった遺伝子発現挙動分析を補完し、さらに、潜在的には少数細胞における規定の座におけるクロマチン構造のヌクレアーゼ感度による分析を補完する（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７、ｅ３２（１９９９））。早期胚における後成発現マークのこれまでの比較分析は、（メチル化ＤＮＡを検出するための）５ｍｅＣおよび修飾ヒストン類に対する抗血清による免疫蛍光顕微鏡法に依存していた。この手法は、５ｍｅＣおよびメチル化Ｈ３Ｋ９レベルにおいて、ＩＣＭとトロフェクトデルムの間、クローンおよび正常胚のＩＣＭ間で顕著な差を検出した（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１３、１１１６−１１２１（２００３））。免疫蛍光顕微鏡法は、単一細胞レベルで後成発現マークの量と分布を明確にできる強力な手法を提供するが、残念ながら、本発明の方法（ＣＣｈＩＰ）により可能となった遺伝子類および遺伝子領域の詳細な分析ができない。
【０１０３】
驚くべきことに、本文に述べた結果は、ＩＣＭおよびＥＳ細胞中における系統特異的遺伝子類上におけるＨ４Ｋ１６ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨｅＫ９ｍｅ２の分布の緊密かつ有意な相関を示している。活性および沈黙遺伝子類のこれらの十分に確立されたマークに関する限り、培養ＥＳ細胞はＩＣＭの優れた後成発現モデルを提供する。
【０１０４】
要約
本発明者らは、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）の方法を用いて、遺伝子類の発現または沈黙に関連したヒストン修飾、非ヒストンタンパク質類およびそれらの修飾物類、およびＤＮＡメチル化が研究されていることを理解した。しかし、このような研究では少なくとも１００万個の細胞を必要としているので、彼らは、早期胚自体のような実験的におよび臨床的に重要な組織源からの材料を用いるクロマチン免疫沈降を用いることが不可能であること、典型的な内細胞塊（ＩＣＭ）は６０個未満の細胞を含むことを認識した。本発明者らは、ヒストン修飾、非ヒストンタンパク質類およびそれらの修飾物類およびＤＮＡメチル化を、１００個未満いや１５個ほどのわずかの細胞中での規定ゲノム領域でアッセイできる新規クロマチン免疫沈降法（本文で“ＣＣｈＩＰ”と称する）を工夫することによって、この問題を解決した。従って、これは、先行技術に対して少なくとも４桁の感度の上昇である。
【０１０５】
さらに、本発明者らは、ＩＣＭおよび培養ＥＳ細胞中における重要制御遺伝子類（例  Ｎａｎｏｇ，Ｏｃｔ４およびＣｄｘ２）上のヒストン修飾の分布を定量的に比較した。彼らは、転写活性と沈黙に先に緊密に関連させたヒストン修飾（すなわち、Ｈ４アセチル化、Ｈ３Ｋ４トリメチル化およびＨ３Ｋ９ジメチル化）が前記２種の細胞集団で緊密に匹敵する分布を示し、一方、それほど確立されていない機能の他の２種のマーク（Ｈ３Ｋ４モノ−およびジメチル化）は異なっていることを明らかにした。
【実施例２】
【０１０６】
ＣＣｈＩＰのプロトコール
我々は、下記に、分析物質生物サンプルの後成発現分析の方法を示すが、この方法では、生物サンプルを天然の固定されていないクロマチン免疫沈降（Ｎ−ＣｈＩＰ）に供する。
【０１０７】
パート１：担体（ＳＬ２）および標的細胞からのクロマチン調製
全般的ポイント
ｉ）後の段階でクロマチン収率をモニターできるようにするためおよびＰＣＲ実施において正確性を期すため、我々は、通常、３Ｈ−チミジンで担体（ドロソフィラＳＬ２）細胞を一晩標識し、バルクＤＮＡのための正確かつ感度のよいマーカーを得る。このことは必須というわけではない。免疫沈降後の未結合および結合サンプルにおいてＤＮＡ量を決定するための代替方法として、我々はまた、同様に非常に感度のよいピコ−グリーンアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いる。
ｉｉ）全ての溶液は氷冷されていなければならず、従って、細胞採取前に氷に置く。ショ糖を含む全ての溶液は、当日に新鮮に調製しなければならない。
ｉｉｉ）使用直前に全溶液に対して（読者のラボでどのようなものを使っているにしても）プロテアーゼ阻害剤を添加することを忘れないこと。我々は、０．１Ｍ  ＰＭＳＦと完全最小プロテアーゼ阻害剤類（Ｒｏｃｈｅ）を用いる。
【０１０８】
細胞および採取
１．  ２００×ｇで７分間回転させ、ＳＬ２細胞を採取し（ノートＡ）、４０ｍｌの氷冷ＰＢＳ＋５ｍＭ酪酸Ｎａで３回洗浄する（ノートＢ）。一定の単一細胞懸濁液を作製するため、さらに溶液を添加する前に遠心管の底をトントンすることで細胞ペレットを忘れずに再懸濁させる。細胞を計数し、アリコット５×１０７細胞に分け、１．５ｍｌのエッペンドルフに移す。
２．ＳＬ２細胞（５×１０７）の各アリコットに対して、選択した“標的”細胞を添加する（ノートＣ）。
３．上記のように回転させ、氷冷ＮＢ緩衝液１ｍｌ＋５ｍＭ酪酸Ｎａでペレットを２回洗浄する。
４．細胞ペレットをＮＢ緩衝液２ｍｌに再懸濁させる。ビジョウ（ポリエチレン）７ｍｌに移し、等量のＮＢ／１％Ｔｗｅｅｎ４０を添加する。小型のプラスチック磁気“フリー”を添加し、氷上で静かに１時間、撹拌する。
５．サンプルを、“しっかりと固定された”乳棒を有するマニュアル駆動、ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）全ガラスホモゲナイザーを用いて均質にする。なめらかに１０回ストロークした後、懸濁液が透明になるまで（通常、２−４分）このホモゲナイザーを氷に載せておく。冷却／安定化期間中、標準的計数チェンバー中の顕微鏡で少量のアリコットを調べることによって、核の放出を検査する。全細胞および核は、倍率４０倍で簡単に識別できる。理想的には、細胞の７５−８５％が未改変の核をもたらし、これには通常、均質化／冷却を４サイクル行うことが必要になる（ノートＤ）。
６．均質化後、核を５０ｍｌの遠心管に移し、核を８００×ｇで１５分間、４℃で回転させる。
７．５％ショ糖／ＮＢ  ２０ｍｌに核を再懸濁させ、同一容量で一回洗浄する（４℃で８００×ｇ、１５分間）。（いかなる溶液でも添加する前において、忘れずに遠心管をすばやく動かして最初にペレットを再懸濁させること。）
８．消化緩衝液５ｍｌに核を再懸濁させる。０．１％ＳＤＳで２０倍に希釈したアリコットのＡ２６０を測定することによって、クロマチン量を調べる。例えば、サンプル２０μｌ＋０．１％ＳＤＳを３８０μｌ。
９．（光路長１ｃｍのキュベット中）Ａ２６０の読み取り値が１ということは、約５０μｇ／ｍｌのクロマチンＤＮＡに対応する。従って、クロマチンの収率（μｇで）はＡ２６０×希釈率×容量×５０で得られる。
１０．サンプルを遠心分離し（４℃において１０分間、８００×ｇ）、クロマチンＤＮＡ濃度０．５ｍｇ／ｍｌになるようにペレットを再懸濁させる。エッペンドルフ管にアリコット１ｍｌを分ける（ノートＥ）。
１１．クロマチンをミクロコッカスヌクレアーゼで消化する。我々は、２８℃においてクロマチン２５０μｇ当たり５０Ｕを５分間使用する。最終濃度５ｍＭになるように０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加し消化を停止させ、氷上に５分間置く（ノートＦ）。
１２．１２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清（Ｓ１）を除去し氷上に置く。
１３．最終容量１ｍｌの溶解緩衝液にペレットを再懸濁させ、（もし複数のミクロコッカスヌクレアーゼ消化を行ったならば）まとめる（分画Ｓ２）。Ｓ１およびＳ２を一晩、４℃で溶解緩衝液２リットルに対して透析させる（ノートＧ）。
１４．透析クロマチンを４℃で１０分間、１８００×ｇで遠心分離する。上清を除去し氷上に置く（分画Ｓ１およびＳ２）。
１５．Ｓ２の遠心分離から結果として生じたペレットを溶解緩衝液２５０μｌに再懸濁させる（分画Ｐ１）。
【０１０９】
クロマチン分析（分画Ｓ１，Ｓ２およびＰ）
１６．全サンプルのＡ２６０と３Ｈ−チミジンｄｐｍを調べる。前記３種の分画のクロマチン分布を計算する。
１７．全サンプルを、１．２％アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）で分析する。
アガロースまたは電気泳動緩衝液にエチジウムブロマイドを入れないこと。サンプル中にＳＤＳが存在するため、ゲルがその後に染色されるに違いない。
【０１１０】
１８．ＡＧＥのためにサンプルを調製する。
ｘ  μｌ  クロマチン分画（ＤＮＡ  ２μｇを与える）
ｙ  μｌ  ｄｄＨ２Ｏ（ｘ＋ｙ＝２５μｌ）  
３  μｌ  １％ＳＤＳ（最終濃度０．１％）
２  μｌ  充填緩衝液
１９．Ｓ１およびＳ２分画をまとめる。濃度を調べた後、Ｎ−ＣｈＩＰを行う。
【０１１１】
クロマチン調製に必要な溶液類
ＮＢ緩衝液〔５００ｍｌにし、４℃で保存する〕
１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４），６０ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ
ＮＢ／１％Ｔｗｅｅｎ４０〔１０ｍｌ〕
Ｔｗｅｅｎ４０が完全に溶けるようにすること。我々は通常、とんとんたたきながら温め、室温に維持する。もし長期にわたって氷上に維持するならば、Ｔｗｅｅｎ４０が溶液から白色沈殿として出てくる。
２５％ショ糖／ＮＢ〔１００ｍｌ〕
ショ糖２５ｇをＮＢ緩衝液に溶解させ、最終容量１００ｍｌにする。
消化緩衝液〔１００ｍｌ〕
０．３２Ｍショ糖、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ
溶解緩衝液〔２リットル〕
２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４），０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ酪酸Ｎａ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．４Ｍグリシン
追加のプロテアーゼ阻害剤類をプラス（コンプリートミニ、Ｒｏｃｈｅまたは読者の装置）
【０１１２】
パート２：クロマチン沈殿（ＮＣｈＩＰ）
１．非固定クロマチン１００−２００μｇに対してアフィニティ−精製抗体５０−２００μｌ（イムノグロブリン５０−１００μｇ）を添加し、インキュベーション緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５，２０ｍＭ酪酸Ｎａ，５ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を添加し、最終容量１ｍｌとする。〔ノートＩ〕
２．４℃で一晩（非常に遅く回転するプラットホーム上で）インキュベーションした後、前膨潤させたタンパク質Ａ−セファロース（５０ｖ／ｖ％スラリー、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２００μｌを添加し、さらに室温で３時間、インキュベーションを継続する。〔ノートＪ〕
３．１１，６００ｇで１０分間、この抗体−クロマチン混合物を遠心分離する。上清を注意して除去し、氷上に維持する。これは非結合分画であり、標的タンパク質を欠損しているはずである。
４．前記タンパク質Ａ−セファロースペレットを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファＡ  １ｍｌ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ酪酸Ｎａ）に再懸濁させ、同一バッファ９ｍｌ上に層状に載せる。
５．１２００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した後、吸引して上清を除き、ペレットを１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有バッファＡ１０ｍｌで洗浄し、最終的に１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファＡ１０ｍｌで洗浄する。〔ノートＫ〕
６．インキュベーション緩衝液に１２５μｌの１％ＳＤＳを添加して、タンパク質Ａ−セファロースから結合物を溶出させ、室温で１５分間、転倒を繰り返しながらインキュベーションする。１１，６００ｇで１０分間遠心分離後、上清（バウンド１）を除去し氷上に維持し保存する。
７．この段階を繰り返し、上清をバウンド１とまとめて、最終結合分画を得る。等量のインキュベーション緩衝液を結合分画に添加し、ＳＤＳ濃度を０．５％に低下させる。
【０１１３】
ＤＮＡ単離
８．１／３容量のフェノール：クロロホルム（１：１）を、インプットした未結合および結合分画に添加する。
９．４℃、６００ｇで１０分間、撹拌し遠心分離し、相を分離させる。
１０．上清を除去し、等量のフェノール：クロロホルムを添加する。遠心分離を繰り返す。
１１．等量のクロロホルムを添加し、前と同様に遠心分離し、上清を６ｍｌの遠心管に移す。
１２．最後に、１／１００容量の４Ｍ  ＬｉＣｌ，２５μｌのグリコーゲン（２ｍｇ／ｍｌ）および２容量の氷冷エタノールを用いて、ＤＮＡを−２０℃で沈殿させる。〔ノートＬ〕
【０１１４】
ＮＣｈＩＰ後のＤＮＡ分析
１３．全サンプルの３Ｈ−チミジンｄｐｍを調べる。各抗体についてプルダウン百分率を計算する。免疫前対照と比較する。〔ノートＬ〕
１４．全サンプルを１．２％アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）で分析し、プルダウンが作動したかどうかを検査する。〔ノートＬ〕
１５．  未結合および結合サンプルからの等量のＤＮＡで種特異的ＰＣＲを行う。〔ノートＭ〕
【０１１５】
タンパク質類の単離
１６．ＢＳＡ（担体）５μｇ、１／１００容量の１０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４、および１２容量のアセトンを添加することによって、最初のフェノール：クロロホルム相から前記タンパク質を沈殿させる。
１７．−２０℃で一晩沈殿させた後、タンパク質ペレットを酸性にしたアセトン（１：６  １００ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４：アセトン）中で１回、乾燥アセトン中で３回洗浄する。〔ノートＮ〕
【０１１６】
免疫沈降実験に必要な溶液類
インキュベーション緩衝液
５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ７．５），２０ｍＭ酪酸Ｎａ，５ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ
バッファＡ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ７．５），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ酪酸Ｎａ
バッファＢ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ７．５），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ酪酸Ｎａ
バッファＣ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ７．５），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ酪酸Ｎａ
タンパク質Ａセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
バッファＡ中４℃でタンパク質Ａセファロースを一晩前膨潤させる。遠心分離後（２０００ｒｐｍ、１０分  ＭＳＥチルスピン（Ｃｈｉｌｓｐｉｎ））、等量（５０ｗ／ｖ％）のバッファＡにペレットを再懸濁させる。
【０１１７】
ＣＣｈＩＰプロトコールについてのノート
ノートＡ
ドロソフィラＳＬ２細胞を、８％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）および抗体類（ペニシリン１ｍｌ当たり５０単位、ストレプトマイシン１ｍｌ当たり５０μｇ）を添加したシュナイダー培地（Ｇｉｂｃｏ）中２６℃で増殖させる。我々は通常、平面に置き密封栓を付した標準的７５ｃｍ２容量の組織培養フラスコ中でこれらの細胞を増殖させる（通気は必要ない）。細胞は、遊離した凝集塊として懸濁液として増殖し、通常、２週ごとに１乃至４個に分割する。ＳＬ２細胞のペレット（理想的には、５×１０７細胞）は、ＣＣｈＩＰで使用する前２ヶ月以上−８０℃で安全に保存できる。しかし、凍結ＳＬ２細胞を使用するならば、１回のみ均質化（すなわち、ストローク１０回）を行い、核を放出させる（下記の段階４）。核：細胞比を調べ、もし必要ならばさらにストローク５回を行う。凍結核は、新鮮核よりももろく、簡単に溶解される。
【０１１８】
ノートＢ
我々は、単離操作時に脱アセチル化を防止するために酪酸Ｎａを添加し、これは、プロテアーゼ阻害剤類とともに、我々の全ての溶液中に存在する。
【０１１９】
ノートＣ
これは、通常、１００乃至１０，０００個の細胞の間にある。我々がうまくＣＣｈＩＰを実施できた最小数の細胞は、５０−１００個であるが、このような少数細胞では、バウンドおよびアンバウンド分画で行うことができるＰＣＲ反応の回数は必然的に少ない。標的細胞ＤＮＡの検出は極めて高い免疫沈降効率と最小の実験的ロスを必要とする。
【０１２０】
ノートＤ
段階４および５を迅速に実施することおよび細胞溶解と核放出が効率的であることが重要である。多数（＞２０％）の未改変細胞が存在することは、ミクロコッカスヌクレアーゼ消化後のクロマチン品質に有害な影響を有している。
【０１２１】
ノートＥ
我々は、もしミクロコッカスヌクレアーゼ段階を高容量よりもアリコット１ｍｌで行うとにより再現性のよい消化が達成されることを見出した。  
【０１２２】
ノートＦ
この段階は注意深く時間を計り制御する必要がある。過剰消化は、サブミクロゾーム粒子を生じ、標的配列が分解する可能性が生じる。消化不足は、クロマチンの全収率低下とゲノムのより濃縮された領域からのクロマチン表示がおそらく十分でなくなるであろう。ＮＣｈＩＰ操作は一貫して、モノクレオゾームに比較してオリゴヌクレオゾームの優先的沈降を示すことに注意すること。効率的沈降のため、主にオリゴヌクレオゾ−ム（３−５量体が中心）から構成されるクロマチン調製物が理想的である。
【０１２３】
ノートＧ
我々は、この時点でＳ１を透析する必要がないことがわかった。しかし、Ｓ１をもし透析しないならば、グリシンをＳ１に最終濃度０．４Ｍで確実に添加し、Ｓ２分画と同等にする。もしこれを行わないと、Ｓ１、Ｓ２およびＰ分画は、アガロースゲルで異なる電気泳動をするであろう。
【０１２４】
ノートＨ
もしＳ１とＳ２をまとめた後にサンプルが希釈され過ぎておりＣｈＩＰに必要な濃度（理想的には２００μｇ／ｍｌ）を得られないならば、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）濃縮器を用いてサンプルを濃縮すること。
【０１２５】
ノートＩ
我々は、アフィニティ精製抗体類の使用が非特異的結合の量を低下させることを見出した。添加する抗体の最適量は、その力価とクロマチン中に存在する標的タンパク質の量に依存する。市販の抗血清を、極めて少量（５−５０μｌ）を用いるＸＣｈＩＰでうまく用い、その後、ＰＣＲにより分析した。我々は常に、ＣｈＩＰのためにアフィニティ精製抗血清を用い、ウェスタンブロッティングのためには全血清または５０％飽和アミニウムサルフェートカットを用いる。
【０１２６】
ノートＪ
タンパク質Ａ−セファロースは凍結乾燥粉末として市販されており、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ  Ｎａ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で前膨潤させなければならない。ＮａＣｌの濃度は、標的タンパク質のための抗体のアフィニティに依存して、増加できる。ＮａＣｌ濃度を高めると、非特異的結合の量が減少するが、標的タンパク質に対する抗体の結合アフィニティも低下するであろう。ＮａＣｌ濃度を変化させる予備実験を用いて、使用した抗体のための最適条件を決定しなければならない。
【０１２７】
ノートＫ
ＮａＣｌの濃度を高めて、非特異的結合を低下させることができる。我々は、１５ｍｌ容量のシリコン遠心管中で大量洗浄を行うと、非特異的結合が大きく低下することを見出した。
【０１２８】
ノートＬ
我々は日常的に、担体としてグリコーゲン（５μｇ）を添加し、結合分画からのＤＮＡ沈殿を最大にする。沈殿に用いたエタノールは、分子生物学等級のものであらねばならず（例  Ａｎａｌａｒ−ＢＤＨ）、−２０℃で保存し、迅速な沈殿を確保する。
【０１２９】
ペレットを次の免疫沈降で再懸濁させる容量は、ＣＣｈＩＰで非常に重要である。アンバウンドおよびバウンドサンプル両者ともにそれらの中に少量の‘標的’ＤＮＡを含むであろうということを記憶にとどめられたい。もし非常に少数の細胞で（例えば１００個）でスパイクしたならば、特定ＤＮＡ断片の分子２００個しか有していないことを記録されたい。全収率４０％とすると、バウンドおよびアンバウンド分画をまとめたものに分子８０個を有することになるであろう。ＰＣＲ反応１回当たりどれだけの断片を必要とし再懸濁させるか決定すること。各分画中のＤＮＡ総量は、存在する〔３Ｈ〕チミジンの量により（シンチレーション計数を用いて）決定され、‘担体’および標的の回収は同等であろう。  
【０１３０】
次のタンパク質単離のため最初のフェノール：クロロホルム相を忘れずに保持しておくこと。我々は、日常的に、アガロースゲル１．２％での電気泳動とエチジウムブロマイドによる染色で、ＤＮＡサンプルを分析する。
【０１３１】
ノートＭ
読者の‘標的’ＤＮＡを検出するため、種特異的ＰＣＲを実施しなければならない。全‘標的’プライマー類については、ＢＬＡＳＴサーチならびに試験ＰＣＲの後に視覚化することの両者によって‘担体ＤＮＡ’に対する交差反応性を検査する。我々は、ＢＬＡＳＴサーチによりマウス特異的であるべきＰＣＲプライマー対は、放射性ＰＣＲにより試験すると未だドロソフィアと交差反応でき、通常、高分子量産物を得ることを見出した。我々は、日常的分析のため、放射性ＰＣＲの後にＤＮＡ  ＰＡＧＥによる分析を行い、ゲルを乾燥させホスホルイメージャースクリーンに暴露することを選択した。最初の分析で各プライマー対の線状範囲を確立する。このことが、アッセイした産物が妥当な大きさであることおよび‘担体’ＤＮＡとの交差反応性がないことの両者を確実にする再現性のある定量的方法であることを証明した。これとは別に、サンプル分析をリアルタイム定量的ＰＣＲにより行うことができるが、ただし、我々は、Ｔａｑｍａｎプローブの使用をその付加された特異性のために推奨する。
【０１３２】
ノートＮ
我々は日常的に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によるタンパク質分析を行う。もしタンパク質を酸／尿素／トリトン（ＡＵＴ）ゲルで分析しなければならない場合、アセトンペレットを５００μｌの二回精製Ｈ２Ｏ中に再懸濁させ、１１，６００×ｇで３０分間、ミクロコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ）中で遠心分離し、容量を減少させる。この希釈：濃縮段階を繰り返し（残渣ＳＤＳを減少させる）、ＡＵＴ充填バッファ（８Ｍ尿素、５％  ２−メルカプトエタノール、１Ｍ氷酢酸、プラス数滴の追跡色素（パイロニンＹ）２容量を最終濃縮サンプルに添加する。ウェスタンブロッティングおよび免疫染色を、標準的方法を用いて、実施する。
【０１３３】
参考文献
Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ＬＰ＆Ｔｕｒｎｅｒ  ＢＭ（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１（１）７６−８２
Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ＬＰ，ＶｅｒＭｉｌｙｅａ  ＭＤ、Ｔｕｒｎｅｒ  ＢＭ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３８（７）８３５−８４１
【実施例３】
【０１３４】
ＣＣｈＩＰによる使用のためのＸ−ＣｈＩＰプロトコール
上記実施例２において、本発明の後成発現分析のための方法は、分析物質生物サンプルで天然の非固定クロマチン（ＮＣｈＩＰ）を用いる。しかし、上記でもさらに詳しく述べたように、後成発現分析方法では、Ｘ−ＣｈＩＰ操作を使用できる。我々は、下記で、本発明の方法で使用できるＸ−ＣｈＩＰプロトコールを述べる。さらに、Ｘ−ＣｈＩＰは周知のラボラトリ操作であり、ラボラトリプロトコールは容易に同定でき、本発明の方法で使用するために適応させることができる。
【０１３５】
第１段階において、分析物質生物サンプル（例  分析物質細胞）を、上記実施例２で述べたようなドロソフィアＳＬ２細胞のような担体クロマチンと混合する。次に、この混合物を３７℃で８分間、“固定化緩衝液”（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８，１％パラホルムアルデヒド）中に再懸濁させる。固体化緩衝液中で用いたホルムアルデヒドの量は、タンパク質類のクロマチンへの最適架橋を得るために必要な量を決定するために、変動させることができる。次に、この混合物を氷冷ＰＢＳ（標準的分子生物学試薬）で２回、洗浄し、細胞溶解緩衝液（５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、８５ｍＭ  ＫＣｌ、０．５％ノニデットＰ４０、ｉｍＭ  ＰＭＳＦ＋プロテアーゼ阻害剤類）中に濃度４×１０７細胞／ｍｌに再懸濁させる。
【０１３６】
氷上で１０分間インキュベーションした後、核を、ダウンス均質化（標準操作におけるように）により調製し、遠心分離し、核溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．１、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ，５ｍＭ酪酸Ｎａ、＋プロテアーゼ阻害剤類）に濃度１×１０８細胞／ｍｌで再懸濁させる。氷上で１０分間撹拌した後、抽出物を音波処理し、ＤＮＡを断片化させる。これは、ＸＣｈＩＰのための材料調製に特に設計したダイアゲノード（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）バイオラプター（ＢｉｏＲｕｐｔｏｒ）音波処理水浴を用いて行うことができる。
【０１３７】
この時点で、プロトコールは、上記実施例２で述べた操作に従うが、ただし、沈殿／非沈殿クロマチンサンプルを６５℃で一晩、加熱し、架橋を逆に戻してから、ＤＮＡ精製とＰＣＲ分析を行う。
【実施例４】
【０１３８】
異なる分析物質サンプルの調製
上記実施例で、分析物質サンプルとして用いた細胞は、マウスＩＣＭおよび培養ＥＳ細胞である。しかし、本発明の後成発現分析方法は、多くの異なる分析物質集団に適用できる。
【０１３９】
例えば、本発明者らは、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて細胞サイクルにおける位置に基づいた集団に１００００個のマウス胚線維芽細胞をソーティングした（細胞は、それらが細胞サイクルのＧ１，Ｓ，Ｇ２またはＭ期にあるかどうかに従って、選別する）。ＦＡＣＳに用いた色素は、バイブラント・ダイサイクル（Ｖｙｂｒａｎｔ  ＤｙｅＣｙｃｌｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、それは、二重鎖ＤＮＡに結合する細胞透過性色素である。しかし、理解できるように、ＦＡＣＳにより細胞表面抗原類により選別した細胞の他の集団も、本発明の後成発現分析のための方法に容易に使用できることがわかるであろう。ＦＡＣＳ後、選別細胞５０００個を８位のリシンでアセチル化したＨ４（Ｈ４Ｋ８ａｃ）および４位のリシンでジメチル化したＨ３（Ｈ３Ｋ４ｍｅ２）に対する抗体類を用いる本発明の後成発現分析方法で使用した。
【０１４０】
これとは別に、本発明の方法は、腫瘍生検材料から得た分析物質サンプルに適応できる。例えば、エタノール固定癌組織（例  頸部癌、ホジキンリンパ腫）の凍結切片を用いて、Ｎ−ＣｈＩＰプロトコール使用に適したクロマチンを調製できる。従って、このような切片類を分析物質サンプルとして本発明の方法で用いることができる。
【０１４１】
さらに本発明の理解のためおよびそれがいかに実効されるかの態様を示すため、例示のために付属の略図面において説明した。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】（ａ）は、本発明の方法の要約すなわちＣＣｈＩＰプロトコールを示している；（ｂ）は、１０７個のＳＬ２細胞をマウスＥＳ細胞１０００個（トラック１，２，５、６）または１００００個（トラック３，４，７，８）と混合した２種の典型的ＣＣｈＩＰ実験からの沈殿（バウンド）および非沈殿（アンバウンド）クロマチン分画由来ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動を示す。トラック１，３，５および７におけるＤＮＡは、抗Ｈ４Ｋ８ａｃで処理したクロマチン由来であり、トラック２，４，６および８におけるそれは、無抗体対照である；（ｃ）は、１０００個のマウスＥＳ細胞とＨ４Ｋ８ａｃに対する抗体によりＣＣｈＩＰ実験からの抗体結合分画におけるホットＰＣＲ、電気泳動およびホスホルイメージングによる特定マウス遺伝子類の検出を示す。各増幅ＤＮＡサンプルは、ドロソフィアＤＮＡのみを含むトラック（トラック３，６，９，１２）のそばに、二重に充填した（トラック１／２、４／５、７／８、１０／１１）。データは、示したように、もしＰＣＲの結果適切な大きさの放射性標識バンドが得られて全く検出可能なドロソフィアＤＮＡ増幅物を有していないならば、採用した；（ｄ）は、示した数のマウスＥＳ細胞（ＥＳＣ）、またはイムノサージャリで調製した３種のＩＣＭ類（約５０個）（ＩＣＭ）によるＣＣｈＩＰ実験の典型的結果を、５×１０７未分化マウスＥＳ細胞を用いた従来のＮＣｈＩＰ実験結果と比較して示した。添加抗体なしあるいは前免疫（ＰＩ）ＩｇＧを有する対照試験管中で非特異的に沈殿させた材料は、検出可能なＰＣＲシグナルを産生しなかった；（ｅ）マウスＥＳ細胞１０００個を用いた従来のＮＣｈＩＰ（５×１０７マウスＥＳ細胞で出発）およびＣＣｈＩＰによりアッセイした特定遺伝子領域におけるヒストン修飾レベル（Ｂ／ＵＢ比）の比較である。データは、５種の異なるヒストン修飾（Ｈ４Ｋ８ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、およびＨ３Ｋ９ｍｅ２）に対する抗体により沈殿させた後の７系統特異的遺伝子類から得られた。前記５種の異なる抗血清の沈殿効率が異なることによる偽相関の可能性をなくすため、各抗体についてのそれぞれのＢ／ＵＢ比を、その抗体についての平均Ｂ／ＵＢ比により割ることによって、正規化した。最小二乗回帰直線およびピアソンプロダクトモーメント相関係数（ｒ）を示した；
【図２】未分化ＥＳ細胞（黒）または分化７日後に形成された培養胚様体（淡色）中におけるＮａｎｏｇの選択領域およびＣｄｘ２およびＧａｐｄｈのプロモータ領域におけるヒストン修飾レベル（Ｂ／ＵＢ比）の従来ＮＣｈＩＰによる定量化を示す。Ｎａｎｏｇの領域Ａ，Ｂ，ＣおよびＦを、図４Ａに示した。免疫沈降は、示したように、Ｈ４Ｋ１６ａｃ（Ａ）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｂ）、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２（Ｃ）およびＨ３Ｋ４ｍｅ１（Ｄ）に対する抗体によって得た；
【図３】（Ａ）は、マニュアル切開によりＩＣＭとトロフェクトデルムの分離を示す。ふ化胚盤胞は、吸引ピペットにより保持し、トロフェクトデルムの一部は、ＩＣＭ夾雑を避けるために切除し捨てた。これを次に、ＣＣｈＩＰのために用いた。まだ結合した残渣トロフェクトデルムを有するＩＣＭを捨てた。トロフェクトデルムを含まないＣＣｈＩＰのためのＩＣＭは、イムノサージャリで調製した；（Ｂ）内細胞塊およびトロフェクトデルム中における特定遺伝子類のプロモータ領域に関連したヒストン修飾レベル（Ｂ／ＵＢ比）のＣＣｈＩＰによる定量；
【図４】（Ａ）は、Ｎａｎｏｇ遺伝子上プライマーペアＡ−ＦとＯｃｔ４上プライマーペアＡおよびＢの位置を示し；（Ｂ−Ｆ）は、内細胞塊（黒）および培養ＥＳ細胞（淡色）中におけるＮａｎｏｇの選択領域および他の遺伝子類のプロモータ領域におけるヒストン修飾レベル（Ｂ／ＵＢ比）のＣＣｈＩＰによる定量を示す。免疫沈降は、示したように、Ｈ４Ｋ１６ａｃ（Ｂ）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｃ）、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２（Ｄ）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ｅ）およびＨ３Ｋ４ｍｅ１（Ｆ）に対する抗体によって得た。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月30日(2008.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物質である生物サンプルでクロマチン免疫沈降を実施することを含む分析物質生物サンプル上で後成発現分析を実施する方法で、前記方法が、前記分析物質生物サンプルでクロマチン免疫沈降を実施する段階の前に前記分析物質生物サンプルを担体クロマチンと接触させる段階を含むことを特徴とする。
【請求項２】
さらに、前記分析物質生物サンプルにおける１種以上の後成発現マーク類を分析するかまたは検出することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記後成発現マークがヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾および／またはＤＮＡメチル化である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記分析物質生物サンプルが１００万個未満の細胞を含む先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記分析物質生物サンプルが哺乳類細胞を含む先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記分析物質生物サンプルを担体クロマチンに接触させる段階が、分析物質生物サンプルに由来するクロマチンと担体クロマチンを混合させることを含む先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記分析物質生物サンプルのクロマチンのＤＮＡが、前記担体クロマチンのＤＮＡと識別可能である先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記分析物質生物サンプルがドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）に由来していない場合、前記担体クロマチンがドロソフィア細胞に由来する先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記クロマチン免疫沈降がＮ−ＣｈＩＰである先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記クロマチン免疫沈降がＸ−ＣｈＩＰである請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（Ｉ）細胞を含む分析物質生物サンプルと担体クロマチンを混合すること；（ＩＩ）段階（Ｉ）の細胞を破壊しそこから核を放出させること；（ＩＩＩ）前記核を破壊して、そこからクロマチンを放出させること；（ＩＶ）段階（ＩＩＩ）から得られたクロマチンを、問題のタンパク質に特異的な抗体を用いて免疫沈降させること；（Ｖ）次に、前記単離したタンパク質／ＤＮＡ分画からＤＮＡを精製すること；（ＶＩ）問題の前記タンパク質に関連して単離したＤＮＡ断片類を分析することの段階を含む先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析物質生物サンプルが幹細胞または幹細胞前駆体のサンプルである先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞前駆体が、トロフェクトデルムまたはトロフォプラストのようなＩＣＭからの１種以上の細胞を含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記後成発現分析が、前記幹細胞または前駆体類中における１種以上の制御遺伝子類の分析を含む請求項１２または１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
クロマチン免疫沈降を実施するための１種以上の材料類を含む後成発現分析キットで、前記キットがさらに担体クロマチンを含むことを特徴とする。
【請求項１６】
前記担体クロマチンが、ドロソフィアＳＬ２細胞を含む請求項１５記載のキット。
【国際調査報告】
2009524810.tif 000008
2009524810.tif 000009