(57)【要約】  本発明は、ペプチドホルモンおよび薬剤の投与のためのｐＨ感受性ナノ粒子送達システムを提供する。特に、経口インスリン投与のためのｐＨ感受性ナノ粒子を提供する。この方法によって得られるナノ粒子は脂肪酸ナノ粒子であり、ポリマーは安定剤として使用され、またｐＨ感受性取り込むために使用される。これによって、これらの粒子は胃酸性のｐＨで縮み、取り込まれたインスリンを保護する。これらの粒子が本来疎水性であることおよびその小さなサイズにより、これらの粒子は腸管細胞壁およびパイエル板を通して吸収される。ポリマー含有量はわずか０．０３−０．０６ｇ／ｇ生成物であり、ポリマーは本来親水性であるという点で、これらのナノ粒子は新規で独特である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものを含む、新規のｐＨ感受性ナノ粒子製剤：
ａ）ポリマー  ４−６％（ｗ／ｗ）；
ｂ）脂肪酸  ２５−５０％（ｗ／ｗ）；
ｃ）界面活性剤  ０．５−５．０％（ｗ／ｗ）；
ｄ）タンパク質  ０．５−２．５％（ｗ／ｗ）（１ｍｇのタンパク質は２５ＩＵを含む）；
ｅ）架橋結合剤  ０．０２−０．３％（ｗ／ｗ）；
ｆ）含水量  ５０−７５％（ｗ／ｗ）。
【請求項２】
以下の特徴を有する、請求項１に記載の新規のｐＨ感受性ナノ粒子製剤：
ａ）３０−１００ｎｍの範囲の粒子サイズ分布を有する；
ｂ）前記製剤に充填されたインスリンの活性は１００％であり、および約４℃の温度で５−７ヶ月の間安定である；
ｃ）前記製剤は、糖尿病ラットにおいて、６ＩＵ／２００ｍｇ体重の用量で投与した場合、５０％を越えるまで血糖値を下げることが可能である；
ｄ）前記製剤を前記モデルに投与した場合、タンパク質の生物学的利用能／吸収は、ラットモデルにおいて約２７％である。
【請求項３】
請求項１に記載の製剤であって、使用される前記ポリマーが、キトシン、アルギナート、プルラン、キトサン、ゲラン、キサンタン、ポリメタクリル酸およびそれらの誘導体から選択される製剤。
【請求項４】
請求項１に記載の製剤であって、使用される前記タンパク質が、インスリンおよびホルモンから選択される製剤。
【請求項５】
請求項１に記載の製剤であって、使用される前記架橋結合剤が、ＺｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、グルタルアルデヒドおよびそれらの混合物から成る群から選択される製剤。
【請求項６】
請求項１に記載の製剤であって、使用される前記脂肪酸が、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸およびリノール酸から成る群から選択される製剤。
【請求項７】
請求項１に記載の製剤であって、使用される前記油が、食用等級の油、落花生油、米ぬか油、オリーブ油、パームナッツ油、パーム油およびそれらの混合物から成る群から選択される製剤。
【請求項８】
請求項１に記載の製剤であって、ペプチドホルモンおよび薬剤の投与のための体内における経口的送達システムに有用である製剤。
【請求項９】
請求項１に記載の製剤であって、糖尿病性ラットにおいて、６ＩＵ／２００ｍｇ体重の用量で投与した場合、５０％を越えるまで血糖値を減少させる製剤。
【請求項１０】
以下のものを含む新規のｐＨ感受性ナノ粒子製剤の製造方法であって：
ａ）ポリマー  ４−６％（ｗ／ｗ）；
ｂ）脂肪酸  ２５−５０％（ｗ／ｗ）；
ｃ）界面活性剤  ０．５−２．０％（ｗ／ｗ）；
ｄ）タンパク質  ０．５−２．５％（ｗ／ｗ）（１ｍｇのタンパク質は２５ＩＵを含む）；
ｅ）架橋結合剤  ０．０２−０．３％（ｗ／ｗ）；
ｆ）含水量  ５０−７５％（ｗ／ｗ）；
以下の工程を含む方法：
ａ）緩衝液に０．１−０．９％のポリマーおよび４０−４００ＩＵ／ｍＬのタンパク質（２０％のｖ／ｖ）を含む溶液を作製し、その後、約１時間、前記溶液混合物を撹拌すること；
ｂ）３０−３５℃の温度で、１０−２０分間にわたり、６０００−７０００ｒｐｍで撹拌しながら、油または脂肪酸に０．２−１．０％界面活性物質および０．５−２．０％ＨＣｌ（０．１Ｎ）を含む油懸濁液を作製すること；
ｃ）約１時間にわたり激しく撹拌しながら、油または脂肪酸に０．００５−０．３％（ｗ／ｗ）架橋結合剤を含む架橋結合溶液を作製すること；
ｄ）約２時間撹拌しながら、工程（ａ）で得られた可溶性ポリマー−タンパク質溶液混合物を、工程（ｂ）で得られた油懸濁液に添加すること；
ｅ）撹拌しながら、工程（ｃ）で得られた架橋結合溶液を工程（ｄ）で得られた溶液混合物に滴下し、３０−３５℃の温度で約２時間、６００−７００ｒｐｍで撹拌を続けること；
ｆ）前記溶液混合物を１００ｎｍマイクロフィルターに通して濾過し、その後２０−３０分間、約１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去して所望のナノ粒子製剤を得ること。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、使用される前記ポリマーが、キトシン、アルギナート、プルラン、キトサン、ゲラン、キサンタン、ポリメタクリル酸およびそれらの誘導体から成る群から選択される方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、使用される前記タンパク質が、インスリンおよびホルモンから選択される方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、使用される前記架橋結合剤が、ＺｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、グルタルアルデヒドおよびそれらの混合物から成る群から選択される方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、使用される前記脂肪酸が、ラウリン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびリノール酸から成る群から選択される方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法であって、使用される前記油が、食用等級の油、落花生油、米ぬか油、オリーブ油、パームナッツ油、パーム油およびそれらの混合物から成る群から選択される方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法であって、得られる前記ｐＨ感受性ナノ粒子製剤が以下の特徴を有す方法：
ａ）ＴＥＭ分析によると、製造される粒子サイズが３０−１００ｎｍ（＞９０％）の粒子サイズ分布を有する；
ｂ）前記製剤に充填されたインスリンの活性は１００％であり、および約４℃の温度で５−７ヶ月の期間安定である；
ｃ）前記製剤は、糖尿病性ラットにおいて、６ＩＵ／２００ｍｇ体重の用量で投与した場合、５０％を越えるまで血糖値を下げることが可能である；
ｄ）前記製剤を前記モデルに投与した場合、タンパク質の生物学的利用能/吸収は、ラットモデルにおいて約２７％である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドホルモンおよび薬剤の投与のための、ｐＨ感受性ナノ粒子送達システムに関する。特に、本発明は、経口インスリン投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は一般的な内分泌障害であり、保健医療の重篤な問題をもたらす。糖尿病の世界的な罹患率は、２０２５年までに１９９５年の４％から５．４％に増加すると推定される。ＷＨＯは、発展途上国において主要な負担が生じることを予測している。先進国では５１００万から７２００万への４２％の増加、発展途上国では８４００万から２億２８００万への１７０％の増加となるだろう。糖尿病の人々の最も多い国は、インド、中国およびアメリカであり、２０２５年においても同様であると予想される（Ｋｉｎｇ  Ｈ，  Ａｕｂｅｒｔ  ＲＥ  ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎ  ＷＨ．，  Ｄｉａｂ．  Ｃａｒｅ  １９９８：  ２１，  １４１４−１４３１）。
【０００３】
糖尿病は、インスリン抵抗性およびインスリン欠乏の程度を変化させ、グルコース恒常性における障害をもたらすことが特徴付けられる異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）の障害である。疾病は、抑制されない場合、高い血糖値、多飲症、多尿症、多食症、疲労感、かすみ目および体重増加または体重減少によって特徴づけられる。糖尿病は、２の主な形態に分類される；Ｉ型（ＩＤＤＭ）は、自己免疫異常によって仲介される膵臓β−細胞の破壊に起因するインスリン欠乏によって特徴づけられ、ＩＩ型（ＮＩＤＤＭ）は、一般に末梢性のインスリン抵抗性および相対的なインスリン欠乏によって特徴づけられ、それは支配的なインスリン分泌欠損からインスリン耐性におよぶ可能性がある。
【０００４】
インスリンは糖尿病治療において最も重要な薬剤であり、インスリンの投与は、全てのＩ型糖尿病患者および多くのＩＩ型糖尿病患者に対しての治療となる。Ｉ型糖尿病患者には特に、外来性インスリン注射を受けることは、現在利用できる唯一の治療法である。
【０００５】
経口インスリン送達システムを開発する試みは、過去多くの歳月にわたり最も活発に研究が行われている分野である。現在、通常の生活においてインスリンに依存している糖尿病患者は、１日に複数の皮下注射を打たねばならず、それは苦痛を伴う経験である。さらに、日々の注射は感染をもたらし、それによるその他の関連した合併症を発生させる可能性がある。非経口的経路以外の代替となるインスリン送達経路を実現するため、非常に多くの試みが世界中で行われている。インスリンはタンパク質であるため、薬剤摂取の最も受け入れられる経路である経口的経路によって摂取することはできない。経口的にインスリンを体循環に取り込む際の主要な障害は、消化性の酸、酵素および腸管の壁を介す吸収が乏しいことである。薬剤をプロテアーゼ阻害剤とともに充填することまたは保護性のコーティングを付与することは、タンパク質ベースの薬剤が腸管の条件下で残存することを可能とするが、腸の裏打ちの通過を助けることはできない。これらの障害を克服するため、経口ペプチドキャリアとしてマイクロおよびナノ粒子を開発するために様々なポリマーが試みられている。ナノ粒子は、パイエル板を介して腸管から体循環へ容易に到達し得ることが報告されている。
【０００６】
上記事実の観点から、我々は、脂肪酸−ポリマー性ナノ粒子に基づく経口インスリン製剤を開発し、当該製剤は、経口的タンパク質送達が直面する障害の両方を対処する。インスリンを封入するポリマーはｐＨ感受性である。脂質−ポリマー複合体は苛酷な消化管の環境からインスリンを保護し、そのナノレベル（ｎａｎｏｍｅｒｉｃ）のサイズは腸管の障壁を効率的に通過することを助ける。このナノ粒子は持続性の放出特性を有することがわかっている。ナノ粒子は、油中水エマルジョン機構（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によって製造される。ナノ粒子製剤に使用されるポリマーは、アルギン酸塩、誘導体化キトサン、誘導体化プルラン、ゲラン（ｇｅｌｌａｎ）、キサンタンを含む。製造培地は油である。使用される油は、食用等級のやし油、落花生油、米ぬか油、オリーブ油、パームナッツ油、パーム油等のそれぞれ、ならびにこれらの油のさまざまな比率の混合物、または、油（すなわち、脂肪酸）の必要な含有量の混合物である。
【発明の目的】
【０００７】
本発明の主な目的は、ペプチドホルモンおよび薬剤の投与のための送達システムのためのナノ粒子製剤を提供することである。
【０００８】
さらに別の目的は、経口的インスリン投与のためのナノ粒子製剤を提供することである。
【０００９】
さらに別の目的は、ペプチドホルモンおよび薬剤の投与のための送達システムのためのナノ粒子製剤の製造のための方法を提供することである。
【００１０】
また別の目的は、脂肪酸−ポリマーナノ粒子に基づくインスリン製剤であって、経口的タンパク質送達において直面する障害を対処し得る製剤を提供することである。
【発明の開示】
【００１１】
従って、本発明は、以下のものを含む、新規のｐＨ感受性ナノ粒子製剤を提供する：
ａ）ポリマー  ４−６％（ｗ／ｗ）；
ｂ）脂肪酸  ２５−５０％（ｗ／ｗ）；
ｃ）界面活性剤  ０．５−２．０％（ｗ／ｗ）；
ｄ）タンパク質  ０．５−２．５％（ｗ／ｗ）（１ｍｇのタンパク質は２５ＩＵを含む）；
ｅ）架橋結合剤  ０．０２−０．５５％（ｗ／ｗ）；
ｆ）含水量  ５０−７５％（ｗ／ｗ）。
【００１２】
本発明の実施態様において、ｐＨ感受性ナノ粒子製剤は以下の特徴を有する：
ａ）ＴＥＭ分析によると、製造される粒子サイズが３０−１００ｎｍ（＞９０％）の粒子サイズ分布を有すること；
ｂ）前記製剤に充填されたインスリンの活性は１００％であり、および約４℃の温度で５−７ヶ月の間安定である；
ｃ）前記製剤は、糖尿病ラットにおいて、６ＩＵ／２００ｍｇ体重の用量で投与した場合、５０％を越えるまで血糖値を下げることが可能である；
ｄ）前記製剤を前記モデルに投与した場合、タンパク質の生物学的利用能／吸収は、ラットモデルにおいて約２７％である。
【００１３】
本発明のさらに別の実施態様において、使用されるポリマーは、キトシン（ｃｈｉｔｏｓｉｎ）、アルギン酸塩、プルラン、キトサン、ゲラン、キサンタン、ポリメタクリル酸およびそれらの誘導体から成る群から選択される。
【００１４】
さらに別の実施態様において、使用されるタンパク質は、インスリンおよびホルモンから選択される。
【００１５】
さらに別の実施態様において、使用される架橋結合剤は、ＺｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、グルタルアルデヒドおよびそれらの混合物から成る群から選択される。
【００１６】
さらに別の実施態様において、使用される脂肪酸は、ラウリン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびリノール酸から成る群から選択される。
【００１７】
別の実施態様において、使用される油は、食用等級の油、落花生油、米ぬか油、オリーブ油、パームナッツ油、パーム油およびそれらの混合物から選択される。
【００１８】
さらに別の実施態様において、ナノ粒子製剤は、ペプチドホルモンおよび薬剤の投与のための体内における経口的送達システムに有用である。
【００１９】
さらに別の実施態様において、前記ナノ粒子製剤は、糖尿病性ラットにおいて、６ＩＵ／２００ｍｇ体重の用量で投与した場合、５０％を越えるまで血糖値を減少させる。
【００２０】
本発明はさらに、以下のものを含む新規のｐＨ感受性ナノ粒子製剤の製造の方法であって：
ａ）ポリマー  ４−６％（ｗ／ｗ）；
ｂ）脂肪酸  ２５−５０％（ｗ／ｗ）；
ｃ）界面活性剤  ０．５−２．０％（ｗ／ｗ）；
ｄ）タンパク質  １．０−２．５％（ｗ／ｗ）（１ｍｇのタンパク質は２５ＩＵを含む）；
ｅ）架橋結合剤  ０．０２−０．３％（ｗ／ｗ）；
ｆ）含水量  ５０−７５％（ｗ／ｗ）；
以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）水に０．１−０．９％のポリマーおよび４０−４００ＩＵ／ｍＬのタンパク質（２０％のｖ／ｖ）を含む溶液を作製し、その後、約１時間、前記溶液混合物を撹拌すること；
ｂ）２０−２５℃の温度で、１０−２０分間にわたり、６００−７００ｒｐｍで撹拌しながら、油または脂肪酸に０．２−１．０％界面活性物質および０．５−２．０％ＨＣｌ（０．１Ｎ）を含む油懸濁液を作製すること；
ｃ）約１時間にわたり激しく撹拌しながら、油または脂肪酸に０．０３−０．３％（ｗ／ｗ）架橋結合剤を含む架橋結合溶液を作製すること；
ｄ）約１時間撹拌しながら、工程（ａ）で得られた可溶性ポリマー−タンパク質溶液混合物を、工程（ｂ）で得られた油懸濁液に添加すること；
ｅ）撹拌しながら、工程（ｃ）で得られた架橋結合溶液を工程（ｄ）で得られた溶液混合物に滴下し、３０−３５℃の温度で約３０分間、６０００−７０００ｒｐｍで撹拌を続けること；
ｆ）前記溶液混合物を１００ｎｍマイクロフィルターに通して濾過し、その後２０−３０分間、約１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去して所望のナノ粒子製剤を得ること。
【００２１】
別の実施態様において、使用されるポリマーは、キトシン、アルギナート（ａｌｇｅｎａｔｅ）、プルラン、キトサン、ゲラン、キサンタン、ポリメタクリル酸およびそれらの誘導体から選択される。
【００２２】
別の実施態様において、使用されるタンパク質は、インスリンおよびホルモンから選択される。
【００２３】
別の実施態様において、使用される架橋結合剤は、ＺｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、グルタルアルデヒドおよびそれらの混合物から成る群から選択される。
【００２４】
別の実施態様において、使用される脂肪酸は、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸およびリノール酸から成る群から選択される。
【００２５】
別の実施態様において、使用される油は、食用等級の油、落花生油、米ぬか油、オリーブ油、パームナッツ油、パーム油およびそれらの混合物から選択される。
【００２６】
また別の実施態様において、得られる前記ｐＨ感受性ナノ粒子製剤は、以下の特徴を有している：
ａ）ＴＥＭ分析によると、製造される粒子サイズが３０−１００ｎｍ（＞９０％）の粒子サイズ分布を有すること；
ｂ）前記製剤に充填されたインスリンの活性は１００％であり、および約４℃の温度で５−７ヶ月の期間安定である；
ｃ）前記製剤は、糖尿病性ラットにおいて、６ＩＵ／２００ｍｇ体重の用量で投与した場合、５０％を越えるまで血糖値を下げることが可能である；
ｄ）前記製剤を前記モデルに投与した場合、タンパク質の生物学的利用能/吸収は、ラットモデルにおいて約２７％である。
【発明の詳細な説明】
【００２７】
この方法によって開発されるナノ粒子は、脂肪酸ナノ粒子であり、ポリマーは、安定剤として使用され、更にｐＨ感受性を組み込むために使用される。このｐＨ感受性により、これらの粒子は胃酸性のｐＨで縮み、組み込まれたインスリンは保護される。また、これらの粒子が本来疎水性であることおよびその小さなサイズにより、腸管細胞壁およびパイエル板を通して吸収される。これらのナノ粒子は、ポリマー含有量は０．０３−０．０６ｇ／ｇ生成物のみであり、ポリマーは本来親水性であるという点で、新規でありおよび独特である。その親水性の性質のために、薬剤は製造過程の際に組み込まれ、脂肪酸の疎水性コーティングもまた開発される。その疎水性の性質のために、粒子は絨毛およびパイエル板を通して腸から容易に体循環に吸収される。我々の研究室において同様の脂肪酸組成を有するその他の油の使用による試行が行われた結果、この製剤で使われる特異的な油のみがこの性質を示す。ポリマー成分は、最終生成物のわずか０．０６ｇ／ｇ未満である。
【００２８】
脂肪酸成分およびポリマー部分は、架橋結合剤を用いて架橋結合され、これにより、疎水性および親水性の双方を有した安定なナノ粒子の製剤がもたらされる。
【００２９】
開発されたインスリン充填ナノ粒子は非常に効果的であるようであった。充填効率は、粒子の製造に使用したインスリン溶液の性質に依存して５０から８０％にわたる。
【００３０】
粒子サイズは、透過型電子顕微鏡写真によって決定し、３０−１００ｎｍの範囲であり、大部分は１００ｎｍ未満のサイズを有している（図を添付した）。
【００３１】
粒子はｐＨ感受性を示す；胃のｐＨにおいて、粒子は縮むと考えられ、このことがインスリンを酸性環境および消化性酵素から保護する。
【００３２】
腸において、ナノ粒子であるために、それらは、回腸領域におけるパイエル板から容易に吸収される（図を添付した）。それらは絨毛にもよって吸収される。
【００３３】
装填したインスリンの活性は、ＥＬＩＳＡによって決定し、充填したインスリンが１００％の活性を保持することがわかった。この製剤の効能を、ラットモデルをもちいて生体内で研究した。製剤は、６ＩＵ／２００ｇｍ体重の用量にて、糖尿病性ラットにおいて、５０％を越えるまで血糖値を低下させることができた。効果は開始から約１１−１３時間維持された。
【００３４】
このことは、ブタモデルにおいても、インスリン充填ナノ粒子が経口的に摂取された場合、血糖値を下げることができるとして実証された。
【００３５】
安定性：ナノ粒子に充填されたインスリンの生物活性の安定性研究を６月まで行い、１００％の生理活性であることが認められた。文献における安定性データは、検索によって我々が知る限り、その他の研究室によるものは存在しない。より長い持続時間による、さらなる研究が行われるだろう。
【００３６】
吸収：様々な群が、様々な種で４％から２１％まで異なる結果（Ｒｅｆ：１−３）で、経口的インスリン送達システムからのインスリンの生物吸収を示している。ラットモデルにおける我々の予備的研究は、最高２７％の吸収を示唆しており、より高等の種で改良されることが推測される。我々の製剤は、ナノ粒子の吸収により、改良されたインスリンの吸収を提供するようである。
【表１】
2009512631.tif 000002
【００３７】
本発明に従って、脂肪酸およびポリマーを含む新規で独特なナノ粒子キャリアに封入されたインスリンを含む医薬組成物が提供される。主成分は、油である製造培地に由来する脂肪酸、およびインスリンが封入されるポリマー成分である。ポリマーの長所は、封入されるインスリンの保護および安定性を提供することである。これは、ナノ粒子に充填されるインスリンの１００％の生物活性を保障する。例えばキサンタン、アルギン酸、ゲランならびにキトサンといったポリマーの陰イオン性のクラスおよびプルラン等の陰イオンの誘導体が使用できる。
【００３８】
製剤の成分は、ポリマー０．１−０．９％（ｗ／ｖ）、インスリン溶液４０−４００ＩＵ／ｍｌ ２０．０％（ｖ／ｖ）、油７０−８０％、界面活性剤０．２−１．０％（ｖ／ｖ）、Ｎ／１０ ＨＣｌ ０．５−２．０％（ｖ／ｖ）、ＣａＣｌ２ ２Ｈ２Ｏ（０．０２−０．２％）、ＺｎＣｌ２（０．０１０−０．１％）である。
【００３９】
ポリマーは、マグネティックスターラーで低速に撹拌しながら、インスリンに溶解する。撹拌は１時間行った。７０％の油または脂肪酸成分に、界面活性剤およびＨＣｌを添加し、半月パドル撹拌装置（ｈａｌｆ−ｍｏｏｎ  ｐａｄｄｌｅ  ｓｔｉｒｒｅｒ）を用いた高速な撹拌により、適切な製造容器中で、６０００ｒｐｍで撹拌した。１５分間の撹拌の後、インスリン−ポリマー溶液を、撹拌を止めずにゆっくりと添加した。撹拌は、同じｒｐｍで２時間続けた。ＣａＣｌ２ ２Ｈ２ＯおよびＺｎＣｌ２は、マグネティックスターラーで激しく撹拌して、残りの油または脂肪酸成分中に分散させた。この分散液を２時間後、撹拌を停止させずに非常にゆっくりと油−インスリン−ポリマー混合物に添加し、その後同じ速度で３０分から１時間撹拌を続けた。システムの温度は、３５から３６℃に維持すべきである。懸濁液を、その後、１００ｎｍのマイクロフィルターで濾過し、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清を除去し、得られたペレットを４−８℃で保存した。
【００４０】
以下の例は例証として示されるものであり、それゆえ発明の範囲を制限するものとして解釈すべきでない。
【００４１】
[例１]
【表２】
2009512631.tif 000003
【００４２】
誘導体化キトサンを、マグネティックスターラーで低速に撹拌しながら、インスリンに溶解した。撹拌は１時間行った。７０％の油または脂肪酸成分に、界面活性剤およびＨＣｌを添加し、半月パドル撹拌装置を用いた高速な撹拌により、適切な製造容器中で、６０００ｒｐｍで撹拌した。１５分間の撹拌の後、インスリン−ポリマー溶液を、撹拌を止めずにゆっくりと添加した。撹拌は、同じｒｐｍで２時間続けた。ＣａＣｌ２ ２Ｈ２Ｏを、次に、マグネティックスターラーで激しく撹拌して、残りの油または脂肪酸成分中に分散させた。この分散物を２時間後、撹拌を停止させずに非常にゆっくりと油−インスリン−ポリマー混合物に添加し、その後同じ速度で２時間撹拌を続けた。システムの温度は、３５から３６℃に維持すべきである。懸濁液を、その後、１００ｎｍのマイクロフィルターで濾過し、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清を除去し、得られたペレットを４−８℃で保存した。
【００４３】
[例２]
【表３】
2009512631.tif 000004
【００４４】
アルギン酸ナトリウム塩は、マグネティックスターラーで低速に撹拌しながら、インスリンおよびリン酸緩衝液に溶解した。撹拌は１時間行った。３５ｍｌのココナッツ油に、界面活性剤およびＨＣｌを添加し、半月パドル撹拌装置を装着した高速な撹拌により、適切な製造容器中で、６０００−７０００ｒｐｍで撹拌した。１５分間の撹拌の後、インスリン−ポリマー溶液を、撹拌を止めずにゆっくりと添加した。撹拌は、同じｒｐｍで１−２時間続けた。ＣａＣｌ２ ２Ｈ２ＯおよびＺｎＣｌ２は、マグネティックスターラーで激しく撹拌して、ココナッツ油：落花生油（７：３）に分散させた。この分散物を１−２時間後、撹拌を停止させずに非常にゆっくりと油−インスリン−ポリマー混合物に添加し、その後同じ速度で３０分から２時間撹拌を続けた。システムの温度は、３５から３６℃に維持すべきである。懸濁液を、その後、１００ｎｍのマイクロフィルターで濾過し、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清を除去し、得られたペレットを４−８℃で保存した。
【００４５】
[例３]
【表４】
2009512631.tif 000005
【００４６】
[例４]
【表５】
2009512631.tif 000006
【００４７】
脂肪酸成分は、脂肪酸の混合物である。脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸およびラウリン酸である。
【表６】
2009512631.tif 000007
【００４８】
脂肪酸は、本方法に必要な量が得られるやり方で使用される。脂肪酸を溶解し、成分を混合し、均一な脂肪酸溶液を得る。脂肪酸溶液の一定分量（１０−３０％）を、架橋結合剤の分散のために別にする。残りの脂肪酸溶液に、界面活性剤およびＨＣｌを添加し、１０００−１００００ｒｐｍで高速に撹拌して分散させる。１０−３０分後、同じ速度で撹拌しながら、インスリン−ポリマー溶液を、非常にゆっくりと油分散に添加した。撹拌を１．５時間続けた。一方、架橋結合剤を脂肪酸溶液中に分散した。微細に分散した架橋結合剤の脂肪酸溶液を、その後、撹拌を止めずに、脂肪酸−インスリン−ポリマー分散物にゆっくりと添加した。撹拌は、３０分間から２時間続けた。懸濁液を、次に、１００ｎｍ濾紙で濾過する；ナノ粒子ペレットを、１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離して収集する。ナノ粒子の収率は、約１７〜１９ｇ％（ｗ／ｖ）である。ポリマー物質は形成される全ナノ粒子のわずか約４−６％である点に注目される。ここにおいて、脂肪酸は、ナノ粒子の主要成分（＞９０％）を形成し、ポリマーの役割は安定性を組み込むことであり結合剤として作用しおよびｐＨ感受性をナノ粒子に与える。このナノ粒子は、このように新規であり、独特であり、および１００ｎｍ未満のサイズの範囲である。
【００４９】
[例５]
糖尿病性ラットモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験
ｉｎ  ｖｉｖｏの実験をオスのウィスターラットで行った。ラットは、５０ｍｇ／ｋｇラット体重の用量の腹腔内注射でストレプトゾトシンを投与して糖尿病の状態にした。
【００５０】
糖尿病性ラットに、ナノ粒子プラセボおよびインスリン充填ナノ粒子（３および６ＩＵ／２００ｍｇラットの用量）を経口投与した。実験の際に、糖尿病性の対照群も設定した。
【００５１】
結果を図１に示す。図１は、糖尿病対照、プラセボおよび経口インスリン製剤（３および６ＩＵ／２００ｍｇ糖尿病ラット体重の用量）を示す図である。
【００５２】
[図６]
正常なブタにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験
正常なブタにおいてもｉｎ  ｖｉｖｏの実験を行った。製剤の効果を正常条件において経口的に試験し、また静脈内グルコース注入においても試験した。余分なグルコースの存在下における製剤の効果を評価するために、最初にブタにインスリン製剤を経口投与した。次に、正確に４５分後、静脈内グルコース投与（０．５ｇ／Ｋｇ体重）を行った。以前の実験において、静脈内投与後のグルコース値のピークはグルコース注入から１５分後に生じることがわかった。そのため、サンプルを１５分、３０分、６０分、１時間、２時間および３時間の時点において採取した。ブタに経口投与すると、１５分後のグルコースのピークは、製剤を投与しないブタの場合に比べて低くなることがわかった。
【００５３】
この結果は、インスリン充填ナノ粒子は、経口投与した場合、血糖値を下げることができることを示している。
【００５４】
[例７]
糖尿病性ブタモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験
・糖尿病性ブタモデルを得るために、オスの大きな白いヨークシャーブタを用いた。連続的な血液標本抽出のために、常習的なカテーテル法（頚静脈内、Ｃｅｒｔｏｆｉｘ心静脈カテーテル）を採用した。  
・ストレプトゾトシンは、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、全用量が１９０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）は、空腹条件下で、ブタに静脈内投与した。  
・低血糖症を予防するために連続的に血糖値をモニターした。  
・ＳＴＺは、４８時間の間隔で、２回の用量（１００＋９０ｍｇ／ｋｇ体重）で投与した。  
・安定した糖尿病の症状が確立された。  
・インスリンナノ粒子を、空腹条件の下、２回の用量（９および１１ＩＵ／ｋｇ体重）で、経口投与した（図３）。  
・経口インスリン製剤の効果を、給餌条件下においても、糖尿病性ブタにて実験した。ブタは２０ＩＵ／ｋｇ体重の経口用量が与えられ、その後飼料が与えられた。血糖値をモニターした（図４）。データは、給餌条件下で経口インスリン製剤を投与された条件（ＯＩ−１０３３０）および経口インスリン製剤なしの条件（Ｃ−１０３３０）における、血糖値のパーセンテージ変化を示す。
【００５５】
結果は、図２−４に示される。図２は、正常なブタにおける製剤の効果およびグルコース注入（ｉ．ｖ．）の際の製剤の効果を示す図である。図３は、空腹時糖尿病ブタにおける経口インスリン製剤（用量は９および１１ＩＵ／ｋｇ体重）の効果を示す図である。図４は、給餌条件における糖尿病ブタのＢＧＬに対する経口インスリン製剤（用量は２０ＩＵ／ｋｇ体重）の効果を示す図である。
【００５６】
[図８]
パイエル板実験
色素充填ナノ粒子を、パイエル板を介したナノ粒子の吸収の機構の研究のために使用した。実験は、ナノ粒子の胃腸の取込みを理解するために行った。フルオレッセイン色素充填ナノ粒子を実験に使用した。実験は、正常なアルビノウィスターラットにおいて行った。ラットは、自由に水を摂取できる状態で、２０時間絶食させた。ラットは、キシラジン（６ｍｇ／ｋｇ体重）の筋肉注射で麻酔した。麻酔を効かせた状態で、ラットの腹部領域を清潔にし、体毛を除去した。次に、正中切開により腹部を開き、腸を露出させた。小腸の始まりの部分を小さく切開し、カテーテルを挿入し、その後、綿臍帯テープ（ｃｏｔｔｏｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｔａｐｅ）を使用して腸を固定した。小腸の終わりの部分も小さく切開し、上記のようにカテーテルを挿入した。生理食塩水点滴セットを一端に取り付け、腸管部分の全体を、通常の生理食塩水で洗い流した。腸を洗浄した後に、色素装填ナノ粒子懸濁液の２０ｍｌの一定分量を注入した。次に、動脈鉗子を用いてカテーテルを固定して、腸管部分の両端を塞いだ。２時間後、色素溶液を排出した。その後、小腸部分を２００ｍｌの通常の生理食塩水で洗浄した。
【００５７】
ラットを、その後、後頭部の環椎を脱臼させることで殺処分した。次に、パイエル板を含む腸管組織切片を生理食塩水中に回収した。組織は、クリオスタットミクロトームを使用して切断し、ＵＶフィルタを装着した蛍光顕微鏡を使用して観察した。光学顕微鏡法の撮影による実験によって、ナノ粒子は、パイエル板にならびに絨毛によって吸収されることが示された。
【００５８】
結果は図５に示される。図５は、パイエル板および絨毛におけるナノ粒子を示す図である。図６は、サイズ計算機に沿った、インスリン充填ポリマーナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、糖尿病対照、プラセボおよび経口インスリン製剤（３および６ＩＵ／２００ｍｇ糖尿病ラット体重の用量）を示す図である。
【図２】図２は、正常なブタにおける製剤の効果およびグルコース注入（ｉ．ｖ．）の際の製剤の効果を示す図である。
【図３】図３は、空腹時糖尿病ブタにおける経口インスリン製剤（用量は９および１１ＩＵ／ｋｇ体重）の効果を示す図である。
【図４】図４は、給餌条件における糖尿病ブタのＢＧＬに対する経口インスリン製剤（用量は２０ＩＵ／ｋｇ体重）の効果を示す図である。
【図５】図５は、パイエル板および絨毛におけるナノ粒子を示す図である。
【図６】図６は、サイズ計算機に沿った、インスリン充填ポリマーナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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