(57)【要約】本発明は、VEGF受容体の細胞外ドメインおよびデスリガンドを含む融合タンパク質を提供する。これらの融合タンパク質は、VEGFおよび腫瘍細胞上のデスレセプターに結合し、それによって、VEGF受容体のVEGF活性化を阻害し、かつ腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する。本発明の融合タンパク質は、細胞においてアポトーシスおよび細胞傷害作用を誘導し、癌、ならびに未制御な血管新生および/または脈管形成に関係した疾患または障害を治療するのに有用である。したがって、本発明はさらに、融合タンパク質、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、融合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物およびキットを用いて、血管新生に関係した疾患を治療するための方法も提供する。2009505989.tif 000014
2009505989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)血管内皮増殖因子(VEGF)ポリペプチドに結合する血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)ポリペプチド;ならびに
(ii)オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含むデスリガンド、
を含む、デスレセプターに結合する融合タンパク質であって、
ここで、該VEGFRポリペプチドのC末端は、該デスリガンドのN末端に連結されている、融合タンパク質。
【請求項２】
デスレセプターがFasであり、かつ、デスリガンドがFasリガンドである、請求項1記載の融合タンパク質。
【請求項３】
VEGFRポリペプチドが、VEGF受容体-1(VEGFR-1)のVEGF結合ドメインを含む、請求項1記載の融合タンパク質。
【請求項４】
VEGFRポリペプチドが、VEGF受容体-2(VEGFR-2)のVEGF結合ドメインを含む、請求項1記載の融合タンパク質。
【請求項５】
VEGF受容体-1がヒトVEGF受容体-1である、請求項3記載の融合タンパク質。
【請求項６】
VEGF受容体-2がヒトVEGF受容体-2である、請求項4記載の融合タンパク質。
【請求項７】
FasリガンドがヒトFasリガンドである、請求項2記載の融合タンパク質。
【請求項８】
VEGFR-2がマウスVEGFR-2であり、かつ、デスリガンドがヒトFasリガンドを含む、請求項4記載の融合タンパク質。
【請求項９】
SEQ ID NO：22またはSEQ ID NO：23に示すアミノ酸配列と少なくとも80％相同なアミノ酸配列を含む、請求項8記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
SEQ ID NO：22またはSEQ ID NO：23に示すアミノ酸配列を含む、請求項8記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
(iii)エピトープタグをさらに含む、請求項1記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
エピトープタグが、FLAG様タグまたはHAタグを含む、請求項11記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
エピトープタグが切断除去され得る、請求項12記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
Fasリガンドが以下からなる群より選択される、請求項2記載の融合タンパク質：
(i)SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(ii)SEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(iii)SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
(iv)(i)〜(iii)のいずれか1つのアミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む、Fas結合活性を有するポリペプチド。
【請求項１５】
VEGFR-1が以下からなる群より選択される、請求項3記載の融合タンパク質：
(i)SEQ ID NO：20のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(ii)SEQ ID NO：19の1番目〜747番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;
(iii)SEQ ID NO：19の32番目〜747番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;
(iv)SEQ ID NO：19の151番目〜214番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;
(v)SEQ ID NO：19の230番目〜327番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;および
(vi)(i)〜(v)のいずれか1つのアミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む、VEGF結合活性を有するポリペプチド。
【請求項１６】
VEGFR-2ポリペプチドが以下からなる群より選択される、請求項4記載の融合タンパク質：
(i)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(ii)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(iii)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(iv)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(v)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(vi)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(iiv)SEQ ID NO：1の141番目〜207番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;
(iix)SEQ ID NO：1の224番目〜320番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;および
(ix)(i)〜(iix)のいずれか1つのアミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む、VEGF結合活性を有するポリペプチド。
【請求項１７】
SEQ ID NO：14に示すヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１８】
請求項17記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
デスレセプターを発現する細胞を、
(i)VEGFタンパク質に結合するVEGFRポリペプチド;
(ii)オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含むデスリガンド
を含む融合タンパク質と接触させる段階を含む、デスレセプターを介した経路を調節する方法であって、
ここで、該VEGFRポリペプチドはVEGFタンパク質に結合しており、かつ、該融合タンパク質の量は、デスレセプターを介した経路を調節するのに有効である、方法。
【請求項２０】
デスレセプターがFasであり、かつ、デスリガンドがFasリガンドである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
Fasを介した経路がアポトーシスである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
融合タンパク質の量が、アポトーシスを誘導するのに有効である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
インビトロで実施される、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
インビボで実施される、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
細胞が癌細胞である、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
癌細胞がVEGFを過剰発現する、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
癌細胞が、乳癌細胞、前立腺癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、神経膠芽腫細胞、および卵巣癌細胞からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
Fasを介した経路が、関節リウマチ、乾癬、および黄斑変性症からなる群より選択される疾患において調節される、請求項19記載の方法。
【請求項２９】
デスレセプターを発現する細胞を化学療法剤と接触させる段階をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項３０】
化学療法剤が、カンプトセシン、エトポシド、ビスインドリルマレイミドVIII、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン、テモゾロミド、ボルテゾミド(bortezomid)、LY294002、およびバルプロ酸からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
以下を含む薬学的組成物：
(i)(1)VEGFタンパク質に結合するVEGFRポリペプチド;
(2)オリゴマー形成ドメインおよびFasリガンドタンパク質の細胞外ドメインのFas受容体認識部分を含むFasリガンド
を含む融合タンパク質;ならびに
(ii)薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または希釈剤。
【請求項３２】
FasリガンドがヒトFasリガンドである、請求項31記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
VEGFRポリペプチドがVEGF受容体のVEGF結合ドメインを含む、請求項31記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
以下を含む組成物：
(i)SEQ ID NO：14に示すようなヌクレオチド配列を有する核酸を含むベクター;ならびに
(ii)薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または希釈剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌を含む、未制御な血管新生および/または脈管形成に関係した疾患および障害を治療するのに有用な組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、癌ならびに関節リウマチ、黄斑変性症、および乾癬などの障害の治療に有用な、VEGF受容体の細胞外ドメインおよびデスリガンドを含む融合タンパク質を提供する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み入れられる2005年8月15日に出願された仮出願第60/708,723号の恩典を主張する。
【０００３】
連邦政府による資金提供を受けた研究および開発のもとで行われた発明に対する権利に関する記載
本研究は、国防省の前立腺癌研究プログラム(Prostate Cancer Research Program)(DAMD17-02-1-0029)および乳癌研究プログラム(W81XWH-04-1-0745 BC032859)からの助成金によって支援されている。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
血管新生は、既存の血管からの毛細血管内皮細胞の増殖、遊走、および組織侵入を含む、新しい血管を発達させるプロセスである。血管新生は、胚発生、卵胞成長、および創傷治癒を含む正常な生理学的プロセスにおいて、ならびに、腫瘍増殖、および異常な新血管新生を伴う非腫瘍性疾患(血管新生緑内障を含む)を含む病理学的状態において、重要である(FolkmanおよびKlagsbrun, Science(1987), 235：442-447)。
【０００５】
血管新生と癌の関連は、十分に確立されている。新血管新生は、過形成から新形成への移行における重要な段階であり、腫瘍が直径2mm〜3mmより大きく成長するため、および腫瘍転移のために存在しなければならない(Folkman, Nat Med(1995), 1：27-30 ;Bouck et al., Adv in Cancer Res(1996), 69：135-174に総説がある)。微小血管密度と疾患重症度との相関は、以下を含む、いくつかの異なる腫瘍タイプにおいて観察されている：悪性神経膠腫(PlateおよびRisau, GLIA(1995), 15：339-347)、ならびに乳癌(Horak et al., Lancet(1992), 340：1120-124)、膀胱癌(Dickinson et al., Br J Urol(1994), 74：762-766)、結腸癌(Takahashi et al., Cancer Res(1995), 55：3964- 3968)、および子宮内膜癌(Kirschner et al., Am J Obstet Gynecol(1996), 174： 1879-1882)。
【０００６】
癌以外に、いくつかの重篤な疾患が、持続的な未制御の血管新生に関連付けられている。これらの疾患は、異常な新血管新生に支配されている。子宮内膜症、眼疾患(例えば黄斑変性症)、乾癬、および関節リウマチが、未制御な血管新生が存在する疾患に含まれる。関節炎は、健康管理の深刻な問題である。ヒトにおける進行性の関節炎状態は、重度の疼痛、関節可動性の低下、および外観の悪化、ならびに生活の質の全般的低下を引き起こす。関節リウマチでは、滑膜が(新しい血管に援助されて)過剰増殖し、かつ、軟骨に侵入して軟骨を破壊する。
【０００７】
血管新生を抑制すれば、新しい血管の形成が阻害され、したがって、腫瘍増殖および転移の発生に影響が及ぼされると考えられる。実際、1個の内皮細胞を消失させることにより、100個の腫瘍細胞の増殖が阻害され得ると推定されている(Thorpe et al., Breast Cancer Research and Treatment(1995), 36：237-251)。新しい毛細血管形成を阻害することにより、関節リウマチにおいて発生する関節破壊を減らし、かつ、疾患の進行を停止させることができる。
【０００８】
これまでに、いくつかの血管新生因子が同定されており(Folkman, Nat Med(1995), 1：27-30; Hanahan et al., Cell(1996), 86：353-364に総説がある)、VPFまたはバスキュロトロピン(vasculotropin)としても公知である特に強力な血管内皮増殖因子(VEGF)が含まれる(Ferrara, Trends Cardiovasc Med(1993), 3：244-250; FerraraおよびDavis-Smyth, Endocrine Rev(1997), 18：4-25に総説がある)。他の血管新生因子と異なり、VEGFは、血管新生の間、内皮細胞特異的なマイトジェンとして作用する(Terman et al., Biochem Biophys Res Commun(1992), 187：1579-1586およびFerrara, Trends Cardiovasc Med(1993), 3：244-250)。VEGFに対して産生させた抗体は、インビボで腫瘍増殖を抑制することが示されており(Kim et al., Nature(1993), 362：841-844)、VEGF拮抗物質は、腫瘍によって誘導される血管新生の阻害物質としての治療的用途を有し得ることが示唆される。
【０００９】
VEGFは、神経膠腫(Tsai et al., J Neurosurg(1995), 82：864-867)、黒色腫(Claffey et al., Cancer Res(1996), 56：172-181)、胃癌細胞(Zhang et al., World J Gastroenterol(2002), 8(6)：994-8)、カポジ肉腫、および類表皮癌細胞(Myoken et al., Proc Natl Acad Sci USA(1991), 88：5819-5823)を含む、培養状態の数種のヒト腫瘍細胞によって分泌される。より重要なことには、VEGF転写物またはVEGFタンパク質は、原発性の神経膠腫(Plate, et al., Lab Invest(1992), 67：529-534; Plate et al., Int J Cancer(1994), 59：520-529)、血管芽細胞腫(Hatva et al., Amer J Pathol(1996), 148：763-775)、ならびに乳房腫瘍(Toi et al., Jpn. J Cancer Res(1994), 85：1045-1049; Anan et al., Surgery(1996), 119：333-339; Yoshiji et al., Cancer Res(1996), 56：2013-2016)、結腸腫瘍(Brown et al., Cancer Res(1993), 53：4727- 4735; Takahashi et al., Cancer Res(1995), 55：3964-3968)、および腎細胞腫瘍(Takahashi et al., Cancer Res(1994), 54：4233-4237)において、インサイチューハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学によって同定された。神経膠芽腫において、VEGFに対するメッセージは、壊死領域に隣接した細胞において見出され、これは、低酸素による上方調節と一致している(Shweiki et al., Nature(1992), 359, 843-845; Plate et al., Lab Invest(1992), 67：529-534)。VEGF mRNAおよびVEGFタンパク質の著しい増加が、脳下垂体腫瘍(McCabe et al., J Clin Endocrinol Metab(2002), 87(9)：4238-44)および黒色腫異種移植片(Graells et al., J Invest Dermatol(2004), 123(6)： 1151 -61 )において報告された。さらに、癌患者は、正常な志願者より有意に高い血清 VEGF レベルを有する。最も高いVEGF濃度は、未治療の転移癌を有する患者において観察された。
【００１０】
VEGFは、濾胞星状細胞の馴化培地、および様々な腫瘍細胞株から最初に精製された(Ferrara et al., Biochem Biophys Res Commun(1989), 161：851-858; Plouet et al., EMBO J(1989), 8：3801-3806)。VEGFは、23kDのサブユニット2つからなるホモ二量体の糖タンパク質であり、かつ、典型的には、二量体ポリペプチドとしてその受容体に結合する。VEGFをコードしているヒト遺伝子は、7つのイントロンによって隔てられた8つのエキソンに組織化されている。VEGF遺伝子のmRNAの選択的スプライシングにより、成熟した単量体中に121個、145個、165個、189個、または206個のアミノ酸残基を有する、5種の異なる分子種が生成する(Tisher et al., J Biol Chem(1991), 266： 11947-11954; Houck et al., Mol Endocrinol(1991), 5：1806-1814)。エキソン6にコードされた残基を欠く、VEGF165のみが、成熟し、かつ活性なVEGFの型である。これは、ヘパリンおよび細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合し、かつ、遊離型または細胞膜結合型として発現され得る(Houck et al., 1992)。VEGF206およびVEGF189は、膜結合型である。また、最近、いくつかのVEGFの構造的ホモログが同定された： VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、および胎盤増殖因子(PlGF)(KlagsbrunおよびD'Amore, Cytokine Growth Factor Rev(1996), 7：259- 270;Ferrara, J Mol Med(1999), 77：527-543に総説がある)。
【００１１】
VEGFが高親和性のリガンドとして作用する、2種のチロシンキナーゼ受容体が同定されている：fims様チロシンキナーゼ- 1(Flt-1またはVEGFR-1)およびキナーゼドメイン受容体(KDR/Flk-1またはVEGFR-2)(Matthews et al., Proc Natl Acad Sci USA(1991), 88：9026-9030; Terman et al., Biochem Biophys Res Commun(1992), 187：1579-1586; De Vries et al., Science(1992), 255：989-991; Millauer et al., Cell(1993), 72：835-846)。Flt-1は、KDRよりも50倍高い親和力でVEGFに結合するが(De Vries et al., Science(1992), 255：989-991)、VEGFの血管新生特性の大半(分裂促進性、走化性、および形態学的変化の際の誘導)は、KDRとの相互作用によって媒介されている(Waltenberger et al., J Biol Chem(1994), 269：26988-26995)。したがって、VEGFとKDRの相互作用は、血管新生を阻害するために妨害するのに最も適している。
【００１２】
VEGF受容体は、典型的には、アミノ末端の細胞外受容体リガンド結合ドメイン中に、数個の、典型的には5個または7個の免疫グロブリン様ループを有することを特徴とする、クラスIII受容体型のチロシンキナーゼである(Kaipainen et al., J Exp Med(1993), 178：2077- 2088)。他の2つの領域には、膜貫通領域、およびキナーゼ挿入ドメインと呼ばれる様々な長さの親水性キナーゼ間配列の挿入によって分断されているカルボキシ末端の細胞内触媒ドメインが含まれる(Terman et al., Oncogene(1991), 6：1677- 1683)。
【００１３】
さらに、VEGFは、第3の受容体であるニューロピリン-1に結合する。ニューロピリン-1(NRP-1)は、セマフォリン/コラプシンファミリーのメンバーに結合する、神経ガイダンスに関係があるとされている補助受容体として最初に説明された。NRP-1は、内皮細胞においても発現され、かつ、VEGFR-2と共に補助受容体として作用することによって、血管新生を促進すると考えられている(Gray et al., Cancer Res,(2005), 65(9)：3664-70)。NRP-1およびVEGFR-2は、直接的には相互作用しないが、1つのVEGF アイソフォームである VEGF165によって橋渡しされる(Mac GabhannおよびPopel, Am J Physiol Heart Circ Physiol,(2005), 288(6)：H2851-60)。
【００１４】
したがって、VEGFは、結腸、直腸、腎細胞(腎臓)、乳房、非小細胞肺、および卵巣の癌を含む、一連の癌において広範な役割を果たし得る。現在、Avastatin(商標)(ベバシズマブ)という、VEGF機能を阻害し、それによって腫瘍への血液供給を妨害するために設計された、Genentech社によって開発された治療的抗体が、結腸または直腸の転移性癌に罹患している患者に対する治療法として認可されている。血管新生を阻止するための他のアプローチは、VEGF受容体に特異的なモノクローナル抗体(例えば米国特許第5,955,331号)、インドリノンのような化合物(米国特許第6,846,839号)、またはVEGFと相互作用し、それによって、同族受容体とのその相互作用を阻止するペプチド(例えば米国特許第6,559,126号)を使用する。
【００１５】
しかしながら、現在臨床試験中であるか、または既に公知である、腫瘍細胞上の同族受容体へのVEGF結合を防止することによって腫瘍関連の新血管新生を阻止する治療オプションのどれもまた、腫瘍細胞を死滅させることを試みない。血管新生における重要な役割に加えて、VEGFは、アポトーシスを妨害することによって細胞生存にも影響を及ぼすため、これは容易な課題ではない可能性がある(Bairey et al., Leuk Res(2004), 28(3)：243-8)。
【００１６】
アポトーシスまたはプログラム細胞死は、発生の進行中、およびホメオスタシスのための両方において、多細胞生物における重要な生理学的プロセスである。アポトーシスは、免疫系の発達および機能において重要な役割を果たしている細胞表面受容体タンパク質であるFasによって、少なくとも部分的に、媒介されている。Fas系の機能不全は、リンパ増殖性障害を引き起こし、かつ自己免疫障害を速めることが示されている(Takahashi et al., Cell(1994), 76：969-976)。
【００１７】
Fasは、腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリーに属する、分子量約45kDのI型膜タンパク質である(Nagata et al., Science, 1995, 267：1449)。Fasは、細胞表面抗原として、細胞にアポトーシスシグナルを伝達する。アポトーシス細胞死は、核および細胞質の収縮、膜突起形成(blebbing)、および特徴的なパターンでの染色体DNAの分解を特徴とし、かつ、急激な細胞損傷によって、壊死性細胞死と区別することができる。
【００１８】
多くの組織および細胞株においてFasの発現は弱いが、心臓、肺、肝臓、卵巣、および胸腺においては大量の発現が見出されている(Watanabe-Fukunaga et al., J Immunol(1992), 148：1274)。Fasは、APO-1(Trauth et al., Science(1989), 245：301)および抗Fas(Yonehara et al., J Exp Med(1989),169：1747)などある種の抗体またはFasに対する天然のリガンドであるFasリガンド(FasL)の結合によって誘発された場合に、アポトーシスまたはプログラム細胞死のためのシグナルを伝達する(Thompson, Science(1995), 267：1456)。Fasは、腫瘍細胞の表面でも発現される。例えば、腫瘍における抗Fas抗体、FasL発現細胞、または組換えFasLによる、Fasを介したアポトーシスの誘導の効率が、マウスに移植された固形腫瘍においてインビボで実証されている(Timmer et al., J Pathol(2002), 196(2)：125-34)。
【００１９】
ヒト、ラット、およびマウスのFasLがクローン化されている(Takahashi et al., Internat Immunol(1994), 6：1567; Suda et al., Cell(1993), 75：1169; Lynch et al., Immunity(1994),1：131; Takahashi et al., Cell(1994), 76：969)。ヒトFasLの細胞外ドメインは、ラットFasLおよびマウスFasLと相同性が高く、ヒトFasLは、ヒトFasだけでなくマウスFasも認識することができ、かつアポトーシスを誘導する。同様に、ラットおよびマウスのFasLも、ヒトFasを認識し、かつアポトーシスを誘導することができる。FasLは、II型膜タンパク質であり、すなわち細胞外のカルボキシル末端ドメインおよび細胞内のアミノ末端ドメインを有し、TNFファミリーのタンパク質に属し、かつ、約40kDの分子量を有する(Suda et al., Cell(1993), 75：1169)。Fasリガンドは、精巣(Suda et al., Cell(1993), 75：1169)および眼(Griffith, et al., Science(1995), 270：1189)において、活性化されたリンパ球上で、ならびに一部の細胞傷害性Tリンパ球(CTL)細胞株上で(Rouvier et al., J Exp Med(1993), 177：195)、強く発現される。
【００２０】
FasLを発現する細胞、ならびに精製されたFasLタンパク質(SudaおよびNagata, J Exp Med(1994), 179：873)は、Fasを発現する細胞に対して細胞傷害性である。すなわち、FasLは、Fasに結合することによって、アポトーシスのためのシグナルを伝達する。また、TNFから類推して、FasLは、三量体として機能すると考えられており、かつ、それぞれのFasLユニットの接触面で1個〜3個のFas分子に結合する可能性が高い。2個またはそれ以上のFas分子がFasL三量体に結合すると、おそらくは、Fasのオリゴマー形成が引き起こされ、これが、Fas発現細胞にアポトーシスシグナルを伝達する。
【００２１】
(i)VEGFRポリペプチドの機能、すなわちVEGFポリペプチドに結合すること、(ii)VEGFを介したVEGFRの活性化を中和し、それによって腫瘍関連の新血管新生を防止すること、ならびに(iii)Fas受容体との相互作用におけるFasリガンドの機能、すなわち受容体結合および/または受容体を介した経路の活性化、を組み合わせる可溶性化合物を作製できることが、一般に望ましいと思われる。このような化合物は、VEGFを分泌し、かつFasを発現する癌細胞を死滅させるのに有用であると思われる。しかしながら、組換えタンパク質技術における大きな課題は、しばしば、膜貫通タンパク質の生物学的に活性なタンパク質を可溶性タンパク質の形態で発現させることであった。本発明はこれらの障害を克服し、かつ、それらおよび他の必要を満たす。
【発明の開示】
【００２２】
発明の概要
本発明は、デスレセプターに結合する新規な融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、(i)血管内皮因子(VEGF)ポリペプチドに結合する血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)ポリペプチド、ならびに(ii)オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含むデスリガンドを含み、その際、VEGFRポリペプチドのC末端は、デスリガンドのN末端に連結されている。
【００２３】
VEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、VEGF受容体のVEGF活性化を中和する方法のために有用である。これらの方法は、アポトーシスを誘導し、細胞における細胞傷害作用を誘導し、癌、ならびに未制御な血管新生および/または脈管形成に関係した疾患または障害を治療するのに、特に有用である。
【００２４】
本発明の好ましい態様において、デスレセプターはFasであり、デスリガンドはFasリガンドである。好ましくは、Fasリガンドは、ヒトFasリガンドである。
【００２５】
本発明の別の好ましい態様において、融合タンパク質のVEGFRポリペプチドは、VEGF受容体-1(VEGFR-1)のVEGF結合ドメインまたはVEGF受容体-2(VEGFR-2)のVEGF結合ドメインを含む。VEGFR-1およびVEGFR-2は、好ましくは、ヒトVEGFR-1およびヒトVEGFR-2である。VEGFR-1およびVEGFR-2は、マウスまたはラットに由来してもよい。
【００２６】
本発明の好ましい融合タンパク質は、マウスのVEGFR-2ポリペプチドおよびヒトFasリガンドを含む。好ましくは、この融合タンパク質は、SEQ ID NO：22またはSEQ ID NO：23に示すアミノ酸配列と少なくとも80％相同なアミノ酸配列を含む。本発明の1つの態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO：22またはSEQ ID NO：23に示すアミノ酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質は、エピトープタグをさらに含む。好ましいエピトープタグは、FLAG様タグまたはHAタグである。好ましくは、エピトープタグは、切断除去され得る。
【００２８】
いくつかのFasリガンドポリペプチドが、VEGFRポリペプチドに連結され得る。好ましい態様において、Fasリガンドは、(i)SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(ii)SEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(iii)SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(iv)(i)〜(iii)のいずれか1つのアミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む、Fas結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【００２９】
いくつかのVEGFR-1ポリペプチドが、Fasリガンドに連結され得る。好ましい態様において、VEGFR-1ポリペプチドは、(i)SEQ ID NO：20のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(ii)SEQ ID NO：19の1番目〜747番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;(iii)SEQ ID NO：19の32番目〜747番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;(iv)SEQ ID NO：19の151番目〜214番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;(v)SEQ ID NO：19の230番目〜327番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;(vi)VEGFR1の129番目〜230番目のアミノ酸(図10に示すSDTG〜NTII;ドメイン2(D2))を含むポリペプチド;および(vii)(i)〜(vi)のいずれか1つのアミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む、VEGF結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【００３０】
いくつかのVEGFR-2ポリペプチドが、Fasリガンドに連結され得る。好ましい態様において、VEGFR-2ポリペプチドは、(i)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(ii)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(iii)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(iv)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(v)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(vi)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(iiv)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列の141番目〜207番目のアミノ酸を含むポリペプチド;(iix)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列の224番目〜320番目のアミノ酸を含むポリペプチド;および(ix)(i)〜(iix)のいずれか1つのアミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む、VEGF結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【００３１】
本発明の別の局面において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸が提供される。好ましい核酸は、SEQ ID NO：14に示される。さらに、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターも提供する。好ましいベクターは、SEQ ID NO：14のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【００３２】
本発明はまた、デスレセプターを介した経路を調節する方法も提供する。この方法は、デスレセプターを発現する細胞を、(i)VEGFタンパク質に結合するVEGFRポリペプチド;ならびに(ii)オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含むデスリガンドを含む融合タンパク質と接触させる段階を含み、その際、VEGFRポリペプチドはVEGFタンパク質に結合しており、かつ、融合タンパク質の量は、デスレセプターを介した経路を調節するのに有効である。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、Fasを介した経路はアポトーシスである。この方法において、融合タンパク質の量は、アポトーシスを誘導するのに有効である。
【００３４】
本発明の方法は、インビトロおよびインビボで実施することができる。
【００３５】
本発明の好ましい態様において、デスレセプターを発現する細胞は、癌細胞、好ましくは、VEGFを過剰発現する癌細胞である。癌細胞は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、神経膠芽腫、および卵巣癌からなる群より選択される。
【００３６】
本発明の別の好ましい態様において、Fasを介した経路は、癌以外の疾患において調節される。好ましい疾患は、関節リウマチ、乾癬、および黄斑変性症からなる群より選択される。
【００３７】
本発明の好ましい態様において、デスレセプターを介した経路を調節する方法は、デスレセプターを発現する細胞を化学療法剤と接触させる段階を含む。好ましい化学療法剤は、カンプトセシン、エトポシド、ビスインドリルマレイミドVIII、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン、テモゾロミド、ボルテゾミド(bortezomid)、LY294002、およびバルプロ酸からなる群より選択される。
【００３８】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または希釈剤を含む薬学的組成物も提供する。
【００３９】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO：14に示すヌクレオチド配列を有する核酸を含むベクターならびに薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００４０】
発明の詳細な説明
I.定義
他に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語のうちの多くの一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版、1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編、1988); The Glossary of Genetics, 第5版、R. Rieger et al.(編), Springer Verlag(1991);ならびにHaleおよびMarham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書において使用される場合、以下の用語は、別段の指定が無い限り、それらに与えられた意味を有する。
【００４１】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を意味する。天然のアミノ酸とは、遺伝コードによってコードされるもの、ならびに、後で修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」とは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合されているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、修飾されたR基を有してよく(例えばノルロイシン)、または修飾されたペプチド主鎖を有してよいが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と同様に機能する、化学的化合物を意味する。
【００４２】
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB生化学命名法委員会により推奨される、一般に公知の3文字記号または1文字記号によって呼ぶことができる。同様に、ヌクレオチドも、一般に認められている1文字記号によって言及することができる。
【００４３】
本明細書において使用される「生物試料」とは、核酸またはポリペプチドを含む生物学的な組織または体液の試料である。このような試料は、典型的にはヒトに由来するが、非ヒト霊長類、またはげっ歯動物、例えば、マウスおよびラットから単離される組織が含まれる。生物試料にはまた、生検試料および剖検試料などの組織切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、毛髪、皮膚なども含まれ得る。生物試料にはまた、患者組織に由来する、移植片、ならびに初代細胞培養物および/または形質転換細胞培養物が含まれる。「生物試料」はまた、1つの細胞もしくは細胞集団、または動物に由来するある量の組織もしくは体液も意味する。ほとんどの場合、生物試料は動物から取り出されるが、「生物試料」という用語は、インビボで、すなわち動物から取り出さずに解析される細胞または組織を意味してもよい。典型的には、「生物試料」は、動物由来の細胞を含むが、この用語は、癌に関連したポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを測定するのに使用され得る、血液、唾液、または尿の非細胞画分のような非細胞性の生物学的材料も意味してよい。限定されるわけではないが、組織生検材料、血液試料、血清試料、または唾液試料を含む、多数のタイプの生物試料を本発明において使用することができる。本明細書において使用される場合、「組織生検材料」とは、診断的解析のために、動物、好ましくはヒトから取り出された、ある量の組織を意味する。癌患者においては、組織を腫瘍から除去して、腫瘍内の細胞の解析を可能にすることができる。「組織生検」は、針生検、細針生検、外科的生検など任意のタイプの生検を意味し得る。
【００４４】
「生物試料を提供すること」とは、本発明において説明する方法で使用するために生物試料を得ることを意味する。ほとんどの場合、これは、患者から細胞試料を取り出すことによって実施するが、(例えば、別の人物によって、別の時点に、および/もしくは別の目的のために単離された)予め単離された細胞を用いることによって、または本発明の方法をインビボで実施することによって、遂行することもできる。治療または転帰の履歴を有する長期保存組織もまた、有用である。
【００４５】
「細胞増殖の変化」という語句は、病巣の形成、足場非依存性、半固体もしくは軟寒天での増殖、増殖の接触阻害および密度限界の変化、増殖因子もしくは血清の要求量の減少、細胞形態の変化、不死化の獲得もしくは喪失、腫瘍特異的マーカーの増加もしくは減少、適切な動物宿主に注入された場合に腫瘍を形成もしくは抑制する能力、および/または細胞の不死化など、インビトロまたはインビボでの細胞増殖および増殖特徴の任意の変化を意味する。例えば、Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique pp. 231-241(第3版 1994)を参照されたい。
【００４６】
「保存的に改変された変種」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変種とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味するか、または、その核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一もしくは関連した配列、例えば、天然に隣接した配列を意味する。遺伝コードには縮重があるため、多数の機能的に同一な核酸が、大半のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはいずれも、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されているすべての位置において、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変更すること無く、記載した対応するコドンのうちの別のものに変更することができる。このような核酸変種は、保存的に改変された変種の1種である、「サイレント変種(silent variation)」である。あるポリペプチドをコードする本明細書における核酸配列はすべて、その核酸のサイレント変種も説明する。当業者は、特定の状況において、核酸中の各コドン(通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGG以外)を改変して、機能的に同一な分子を得ることができることを理解すると考えられる。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸の多くの場合サイレントな変種は、発現産物に関しては、記述する配列に暗黙に含まれるが、実際のプローブ配列に関しては含まれない。
【００４７】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸または低比率のアミノ酸を変更、付加、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加が、その変更により、あるアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換されている「保存的に改変された変種」であることを認識すると考えられる。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。このような保存的に改変された変種は、本発明の多形性変種、種間ホモログ、およびアレルに加えられ、かつ、これらを除外しない。互いに対する典型的な保存的置換は、以下のとおりである：1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リシン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、トレオニン(T);および8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照されたい)。
【００４８】
「癌細胞」「形質転換された」細胞、または組織培養における「形質転換」とは、新しい遺伝物質の取込みを必ずしも伴わない、自然発生的または導入された表現型変化を意味する。形質転換は、形質転換ウイルスの感染および新しいゲノムDNAの組込み、または外来性DNAの取込みによって起こり得るが、自然発生的に、または発癌物質に曝露し、それによって内在性遺伝子が変異させた後にも、起こり得る。形質転換は、細胞の不死化、異常な増殖制御、非形態学的変化、および/または悪性腫瘍などの表現型変化を伴う(Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique(第3版 1994)を参照されたい)。
【００４９】
「デスリガンド」という用語は、デスレセプターに結合し、かつ、結合した際に、細胞死滅を誘導することができる哺乳動物タンパク質のファミリーを意味する。例示的なデスリガンドには、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)、リンホトキシン(LT)、および腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。典型的には、デスリガンドポリペプチドは、オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含む。
【００５０】
「デスレセプター」という用語は、デスリガンドに結合し、かつ、デスリガンドが結合した際にオリゴマーを形成し、細胞死滅を誘導することができる、哺乳動物細胞の表面で発現される哺乳動物タンパク質のファミリーを意味する。典型的には、デスレセプターポリペプチドは、オリゴマー形成ドメインおよびデスリガンド認識部分を含む。8種のデスレセプターおよびデスレセプターシグナル伝達が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Lavrik et al., J Cell Sci,(2005), 118(Pt2)：265-7によって概説されている。例示的なデスレセプターには、腫瘍壊死因子受容体1(TNFR1;DR1、CD120a、p55、およびp60としても公知)、CD95(DR2、APO-1、およびFasとしても公知)、DR3(APO-3、LARD、TRAMP、およびWSL1としても公知)、TNF関連アポトーシス誘導リガンド受容体1(TRAILR1;DR4およびAPO-2としても公知)、TRAILR2(DR5、KILLER、およびTRICK2としても公知)、DR6、エクトジスプラシンA受容体(EDAR)および神経増殖因子受容体(NGFR)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。これらは、デスドメイン(DD)と呼ばれる約80残基の細胞質内領域によって区別される。これらの受容体が、対応するリガンドによって誘発されると、いくつかの分子がDDに動員され、続いて、シグナル伝達カスケードが活性化される。デスリガンドはまた、DDを有しておらず、したがって、シグナル伝達複合体を形成できない、デコイ受容体(DcR)とも相互作用する。これまで、次の4種のデコイ受容体が特徴付けられている：TRAILR3(DcR1としても公知)、TRAILR4(DcR2としても公知)、DcR3、およびオステオプロテグリン(OPG)。
【００５１】
「デスレセプター認識部分」という用語は、デスレセプターに結合するために必要かつ十分なデスリガンドのサブドメインを意味する。
【００５２】
「機能的影響を決定する」とは、間接的または直接的に、VEGFR-FasLのような本発明の融合タンパク質の影響下にあるパラメーター、例えば、機能的影響、酵素学的影響、物理的影響、および化学的影響を増加または減少させる化合物に関して分析することを意味する。このような機能的影響、例えば、タンパク質の分光学的特徴(例えば、蛍光指数、吸光係数、屈折率)、水力学的特性(例えば形状)、クロマトグラフィー特性、または溶解特性の変化は、当業者に公知である任意の手段によって、VEGFR-FasLのような本発明の融合タンパク質の誘導マーカーもしくは転写活性化の測定、結合活性、例えば、デスレセプターへの結合の測定、細胞増殖の測定、またはアポトーシスの測定などにより、測定することができる。癌に対する、ある化合物の機能的影響の決定は、インビトロのアッセイ法のような当業者に公知のアッセイ法を用いて実施することもできる。例えば、軟寒天上での細胞増殖、足場依存性、増殖の接触阻害および密度限界、細胞増殖、細胞形質転換、増殖因子または血清への依存性、腫瘍特異的マーカーのレベル、Matrigel中への浸潤性、インビボでの腫瘍の増殖および転移、転移中の細胞におけるmRNAおよびタンパク質の発現、ならびに癌細胞の他の特徴である。これらの機能的影響は、当業者に公知の多くの手段、例えば、形態学的特徴の変化を定量的または質的に測定するための顕微鏡検査、RNAレベルまたはタンパク質レベルの変化の測定、RNA安定性の測定、例えば、化学発光反応、蛍光反応、比色反応を介した、下流の遺伝子発現またはレポーター遺伝子発現の同定(CAT、ルシフェラーゼ、β-gal、およびGFPなど)、抗体結合、誘導マーカー、ならびにリガンド結合アッセイ法によって、評価することができる。「機能的影響」には、インビトロ、インビボ、およびエクスビボの活性が含まれる。
【００５３】
障害を治療するための化合物の「有効量」とは、症状を改善、もしくは何らかの様式で軽減するか、または病態の進行を停止もしくは逆行させるのに十分な量である。特定の薬学的組成物の投与による特定の障害の症状の改善とは、永久的または一時的、永続的または推移するかを問わず、関連し得る任意の緩和を意味する。
【００５４】
「発現ベクター」とは、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸エレメントを含む、組換えまたは合成によって作製された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部分でよい。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された、転写されるべき核酸を含む。
【００５５】
「FasL」または「Fasリガンド」という用語は、単離された核酸、ポリペプチド、および多形性の変種、対立遺伝子、変異体、ならびにそれらの種間ホモログを意味し、これらは、本明細書においてさらに説明されるように、(1)下記に示すヒトFasL配列に対して、好ましくは、少なくとも約50個、75個、100個、150個、200個、250個、もしくは281個のアミノ酸の領域に渡って、約60％を上回るアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し;(2)下記に示すアミノ酸配列、もしくは保存的に改変されたその変種を含む免疫原に対して産生させた抗体、例えばポリクローナル抗体に結合し;(3)FasL結合タンパク質に結合し;(4)Fasリガンド結合タンパク質に結合する天然のFasリガンドと競合し;(5)膜結合型FasL結合タンパク質を有する細胞においてアポトーシスを誘導し;(6)下記に示す核酸配列、もしくは保存的に改変されたその変種に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし;(7)SEQ ID NO：16(ヒトFasL)に対して、好ましくは、少なくとも約100個、200個、300個、400個、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域に渡って、約90％を上回る、好ましくは約96％、97％、98％、99％を上回るか、もしくはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有し;かつ/または(8)SEQ ID NO：8もしくはSEQ ID NO：11(ヒトFasL)の少なくとも25個、しばしば、50個、75個、100個、125個、もしくは143個の連続的なアミノ酸残基を有する。FasLポリペプチドは、本明細書において説明するように、オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識ドメインを有し得る。
【００５６】
FasLのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、典型的には、ヒトに由来するが、他の哺乳動物、限定されるわけではないが、非ヒト霊長類、げっ歯動物(例えば、ラット、マウス、もしくはハムスター)、雌ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または他の哺乳動物に由来してもよい。したがって、いくつかの態様において、本明細書において説明するFasLポリペプチドおよびFasLサブドメインポリペプチドは、ヒトFasL配列に対応する配列を含んでよい。したがって、例示的なFasLは、本明細書において提供され、かつ、当技術分野において公知である。例えば、ヒトFasLポリペプチドのGenBankアクセッション番号は、P48023である。例えば、マウスFasLポリペプチドのGenBankアクセッション番号はA53062であり、ラットFasLのGenBankアクセッション番号は、A49266である。
【００５７】
「FasL結合タンパク質」という用語は、FasLが結合するポリペプチドを意味する。
【００５８】
FasL「ホモログ」またはVEGFR「ホモログ」とは、FasLまたはVEGFRのものに類似したアミノ酸配列を含むが、FasLまたはVEGFRと同様または同一の機能を必ずしも備えていない、ポリペプチドを意味する。
【００５９】
FasL「アイソフォーム」またはVEGFR「アイソフォーム」とは、それぞれ、同じ遺伝子にコードされているが、pIもしくはMWまたは両方が異なる、FasLまたはVEGFRの変種を意味する。このようなアイソフォームは、(例えば、選択的スプライシングもしくはタンパク質限定分解の結果として)アミノ酸組成が異なってよく、かつ、さらに、または別の方法では、差次的な翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、アシル化、もしくはリン酸化)から生じることもある。
【００６０】
本明細書において使用される、FasL「オルソログ」またはVEGFR「オルソログ」とは、(i)ヒトFasLまたはVEGFRのものに類似したアミノ酸配列を含み、かつ、(ii)ヒトFasLまたはVEGFRのものと同様または同一の機能を有する、非ヒトポリペプチドを意味する。
【００６１】
本明細書において使用される、FasL「関連」ポリペプチドとは、FasLホモログ、FasLアイソフォーム、またはFasLオルソログを意味する。VEGFR「関連」ポリペプチドとは、本明細書において使用される場合、VEGFRホモログ、VEGFRアイソフォーム、またはVEGFRオルソログを意味する。
【００６２】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、かつ、発現ベクターの複製または発現を支援する、天然の細胞または形質転換細胞である。宿主細胞は、培養細胞、移植片、およびインビボの細胞などでよい。宿主細胞は、大腸菌(E.coli)のような原核細胞、または、酵母、昆虫細胞、両生類細胞、もしくは哺乳動物細胞、例えば、Cos細胞(例えばCos-7)、CHO、293、3T3、およびHeLaなどの真核細胞でよい(例えば、米国微生物株保存機関(American Type Culture Collection)を参照されたい)。
【００６３】
2つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列という文脈における、「同一の」または「同一性(identity)」パーセントという用語は、後述の初期設定パラメーターを用いたBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムによって、または、手動アライメントおよび目視検査によって測定した際に(例えば、NCBIウェブサイトhttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/などを参照されたい)、同じであるか、または、特定の比率の同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する(すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域に渡って、最大限一致するように比較およびアラインされた場合、特定の領域に渡って、約60％の同一性、好ましくは、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の同一性)、2つまたはそれ以上の配列または部分配列を意味する。このような配列は、その場合、「実質的に同一」であると称される。この定義はまた、試験配列の相補性(compliment)を意味するか、または適用され得る。この定義はまた、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに、天然の変種、例えば、多形性変種または対立遺伝子変種、および人工変種も含む。後述するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明することができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25個のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域に渡って、またはより好ましくは、長さが50〜100個のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域に渡って、存在する。
【００６４】
配列比較をする場合、典型的には、一方の配列が参照配列の役割を果たし、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、必要な場合には、部分配列座標が指定され、かつ配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。好ましくは、初期設定プログラムのパラメーターが使用され得るか、または、代替のパラメーターが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、そのプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【００６５】
「比較ウィンドウ」とは、本明細書において使用される場合、典型的には約20〜約600、通常は約50〜約200、より普通には約100〜約150からなる群より選択されるある数の隣接位置のセグメントへの言及を含み、その中で、ある配列を、同数の隣接位置の参照配列と、それら2つの配列を最適にアラインした後に比較することができる。比較のために配列をアライメントする方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適アライメントは、例えば、SmithおよびWaterman, Adv Appl Math 2：482(1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch, J Mol Bio. 48：443(1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman, Proc Nat'l Acad Sci USA 85：2444(1988)の類似性探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行(GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)によって、または手動アライメントおよび目視検査によって、実施することができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,編、1995  補遺)。
【００６６】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに適しているアルゴリズムの好ましい例には、Altschul et al., Nucl Acids Res 25：3389-3402(1977)およびAltschul et al., J Mol Biol 215：403-410(1990)に記載されているBLASTアルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズムが含まれる。BLASTおよびBLAST 2.0は、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定するために、本明細書において説明するパラメーターと共に、使用される。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)から公式に入手可能である(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインさせた場合に、何らかの正の値の閾値スコアTに合致するか、またはそれを満たす、クエリ配列中の長さWの短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア(HSP)を最初に同定する段階を含む。Tは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul et al.,前記)。これら初期の近隣ワードのヒットは、それらを含むより長いHSPを発見するための検索を開始する種の役割を果たす。これらのワードヒットを、累積アライメントスコアを増加させ得る限り、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、例えば、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターM(一対の一致残基に対するリワード(reward)スコア、常に0より大きい)およびパラメーターN(不一致残基に対するペナルティスコア、常に0未満)を用いて、算出する。アミノ酸配列の場合は、スコアリングマトリックスを用いて、累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は以下の場合に停止させる：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ減少する場合;累積スコアが、1つもしくは複数の負スコアの残基アライメントの蓄積が原因で、0以下になる場合;または、いずれかの配列の末端に達した場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、およびXは、アライメントの感度および速度を決定する。(ヌクレオチド配列用の)BLASTNプログラムは、初期設定として、ワード長(W)11、期待値(E)10、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、初期設定として、ワード長3、および期待値(E)10、ならびに、BLOSUM62スコアリングマトリックス(HenikoffおよびHenikoff, Proc Natl Acad Sci USA 89：10915(1989)を参照されたい)アライメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。
【００６７】
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計学的解析も実施する(例えば、KarlinおよびAltschul, Proc Natl Acad Sci USA 90：5873-5787(1993)を参照されたい)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの測定値は、最小確率和(P(N))であり、これは、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然によって起こると思われる確率の指標を与える。例えば、核酸は、試験用核酸を参照核酸と比較した際の最小確率和が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。対数値は、大きな負の数値、例えば、5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170などでよい。
【００６８】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、後述するように、第1の核酸にコードされるポリペプチドが、第2の核酸にコードされるポリペプチドに対して産生させた抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的に、第2のポリペプチドに実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、後述するように、それら2つの分子またはそれらの相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、それらの配列を増幅するのに同じプライマーを使用できることである。
【００６９】
「阻害する」、「阻害すること」、または「阻害」という用語は、VEGFおよびVEGF受容体の相互作用、血管新生、血管新生に相関している疾患の症状、またはVEGFが媒介し得る他の任意の活性における、任意の測定可能かつ再現可能な低減を含む。
【００７０】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態で存在する場合に通常は付随する構成要素を実質的または本質的に含まない材料を意味する。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する主な化学種であるタンパク質または核酸は、実質的に精製されている。特に、単離された核酸は、天然に遺伝子に隣接し、かつ、その遺伝子にコードされるタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、いくつかの態様において、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを意味する。好ましくは、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも85％純粋、より好ましくは、少なくとも95％純粋、および最も好ましくは、少なくとも99％純粋であることを意味する。「精製する」または「精製」は、他の態様において、精製しようとする組成物から少なくとも1種の混入物を除去することを意味する。この意味で、精製は、精製された化合物が均一であること、例えば100％純粋であることを要求しない。
【００７１】
「調節する」という用語は、デスレセプターシグナル伝達に関して本明細書において使用される場合、ある化合物が、インビトロおよび/またはインビボでデスレセプターの機能を変更する能力を意味する。化合物は、好ましくは、化合物濃度に応じて、デスレセプターの活性を活性化する。
【００７２】
「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」または本明細書において使用される文法的同義語は、相互に共有結合された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、約5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50、またはそれ以上のヌクレオチド長から、最長で約100ヌクレオチド長までである。核酸およびポリヌクレオチドは、より長い長さ、例えば、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000などを含む、任意の長さのポリマーである。本発明の核酸は、一般に、リン酸ジエステル結合を含むが、いくつかの場合においては、例えば、ホスホルアミダート結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、またはO-メチルホホロアミダイト(methylphophoroamidite)結合を含む代替の主鎖を有してよい核酸類似体(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues： A Practical Approach, Oxford University Pressを参照されたい)、ならびにペプチド核酸の主鎖および結合を有してよい核酸類似体が含まれる。他の類似核酸には、米国特許第5,235,033号および同第5,034,506号、ならびにASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, 第6章および第7章、SanghuiおよびCook編に記載されているものを含む、正電荷の主鎖、非イオン性主鎖、および非リボース主鎖を有するものが含まれる。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の1つの定義内に含まれる。リボース-リン酸骨格の修飾は、様々な理由のため、例えば、生理学的環境における、またはバイオチップ上のプローブとしてのこれらの分子の安定性および半減期を増大させるために、実施してよい。天然の核酸および類似体の混合物を作製してよい。あるいは、様々な核酸類似体の混合物、ならびに天然の核酸および類似体の混合物を作製してよい。
【００７３】
様々な参考文献が、例えば、ホスホルアミダート結合(Beaucage et al., Tetrahedron 49(10)：1925(1993)およびその中の参考文献; Letsinger, J Org Chem 35：3800(1970); Sprinzl et al., Eur J Biochem 81 ：579(1977); Letsinger et al., Nucl Acids Res 14：3487(1986); Sawai et al., Chem Lett 805(1984), Letsinger et al., J Am Chem Soc 110：4470(1988); ならびにPauwels et al., Chemica Scripta 26：141 91986))、ホスホロチオアート結合(Mag et al., Nucl Acids Res 19：1437(1991);および米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオアート結合(Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111 ：2321(1989))、O-メチルホホロアミダイト(methylphophoroamidite)結合(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues： A Practical Approach, Oxford University Pressを参照されたい)、ならびにペプチド核酸の主鎖および結合(Egholm, J Am Chem Soc 114：1895(1992); Meier et al., Chem Int Ed Engl 31：1008(1992); Nielsen, Nature 365：566(1993); Carlsson et al., Nature 380：207(1996)を参照されたい。これらはすべて、参照により組み入れられる)を含む、このような核酸類似体を開示している。他の類似核酸には、正電荷の主鎖(Denpcy et al., Proc Natl Acad Sci USA 92：6097(1995));非イオン性主鎖(米国特許第5,386,023号、同第5,637,684号、同第5,602,240号、同第5,216,141 号、および同第 4,469,863号; Kiedrowshi et al., Angew. Chem Intl Ed English 30：423(1991); Letsinger et al., J Am Chem Soc 110：4470(1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13：1597(1994); ASC Symposium Series 580, 「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、第2章および第3章、Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cook編; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 4：395(1994); Jeffs et al., J Biomolecular NMR 34：17(1994); Tetrahedron Lett 37：743(1996))、ならびに、米国特許第5,235,033号および同第5,034,506号、ならびにASC Symposium Series 580、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」第6章および第7章、Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cook編に記載されているものを含む、非リボース主鎖を有するものが含まれる。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の1つの定義内に含まれる(Jenkins et al., Chem Soc Rev pp 169 176(1995)を参照されたい)。いくつかの核酸類似体が、Rawls, C & E News June 2, 1997 35頁に記載されている。これらの参考文献はすべて、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【００７４】
他の類似体には、ペプチド核酸類似体であるペプチド核酸(PNA)が含まれる。これらの主鎖は、天然の核酸の高度に帯電したリン酸ジエステル主鎖とは対照的に、中性条件下では実質的に非イオン性である。これは、2つの利点をもたらす。第1に、PNA主鎖は、より良いハイブリダイゼーション動態を示す。PNAは、完全にマッチした塩基対に対するミスマッチの塩基対の場合の融解温度(Tm)の変化がより大きい。DNAおよびRNAは、典型的には、内部にミスマッチがある場合、Tmの2℃〜4℃の低下を示す。非イオン性PNA主鎖の場合、この低下は、7℃〜9℃に近い。同様に、非イオン性の性質の寄与により、これらの主鎖に結合した塩基のハイブリダイゼーションは、比較的、塩濃度に非感受性である。さらに、PNAは、細胞酵素によって分解されず、したがって、より安定であることができる。
【００７５】
核酸は、指定されるように、一本鎖もしくは二本鎖でよく、または、二本鎖配列もしくは一本鎖配列の両方の部分を含んでよい。当業者が理解するように、一本鎖の記述はまた、相補鎖の配列も定義し、したがって、本明細書において説明する配列は、その配列の相補物も提供する。核酸は、DNA、ゲノムDNAおよびcDNAの両方、RNA、またはハイブリッドでよく、ハイブリッドでは、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の組合せを含んでよい。「転写物」は、典型的には、天然のRNA、例えば、プレmRNA、hnRNA、またはmRNAを意味する。本明細書において使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドならびにヌクレオチド類似体、ならびにアミノ修飾ヌクレオシドのような修飾ヌクレオシドを含む。さらに、「ヌクレオシド」は、非天然の類似構造物も含む。したがって、例えば、それぞれが塩基を含む、ペプチド核酸の個々の単位は、本明細書においてヌクレオシドと呼ばれる。
【００７６】
「標識」または「検出可能な部分」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて一般に使用される)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに、例えば、放射性標識物質をペプチド中に組み入れることによって検出可能にできるか、またはそのペプチドに特異的に反応する抗体を検出するのに使用できるタンパク質または他の実体が含まれる。これらの標識は、乳癌の核酸、タンパク質、および抗体の任意の位置に組み入れることができる。Hunter et al., Nature 144：945(1962); David et al., Biochemistry 13：1014(1974); Pain et al., J Immunol Meth 40：219(1981);およびNygren, J. Histochem. and Cytochem 30：407(1982)に記載されている方法を含む、抗体を標識に結合させるための当技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。
【００７７】
「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、共有結合的に、リンカーもしくは化学結合を介して、または、非共有結合的に、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電気結合、もしくは水素結合を介して、標識に結合され、その結果、プローブに結合された標識の存在を検出することによって、プローブの存在を検出できるものである。あるいは、高親和性の相互作用を使用する方法によっても同じ結果が達成することができ、この場合、一対の結合相手の一方がもう一方に結合する(例えばビオチンとストレプトアビジン)。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、1つまたは複数のタイプの化学結合を介して、通常、相補的塩基対合を介して、通常、水素結合形成を介して、相補的配列を有する標的核酸に結合することができる核酸と定義される。本明細書において使用される場合、プローブは、天然の塩基(すなわち、A、G、C、もしくはT)または修飾塩基(7-デアザグアノシン、イノシンなど)を含んでよい。さらに、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを機能的に妨害しない限りにおいて、リン酸ジエステル結合以外の結合によって連結されてよい。したがって、例えば、プローブは、構成要素である塩基がリン酸ジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結されているペプチド核酸でよい。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列との完全な相補性を欠いている標的配列に結合し得ることが、当業者によって理解されると考えられる。プローブは、好ましくは、アイソトープ、発色団、発光団(lumiphore)、色素原によって直接的に標識されるか、または、ストレプトアビジン複合体が後で結合できるビオチンによるように、間接的に標識される。プローブの有無を分析することによって、選択配列または選択部分配列の有無を検出することができる。診断または予後は、ゲノムレベル、またはRNAレベルもしくはタンパク質発現レベルに基づいてよい。
【００７９】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質、もしくはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって、改変されていること、または、その細胞がそのように改変された細胞に由来していることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、その細胞の天然(非組換え)型の内部には存在しない遺伝子を発現するか、または、さもなければ、異常に発現されるか、過少発現されるか、もしくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。「組換え核酸」という用語は、本明細書において、一般に、核酸操作によって、例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いて、インビトロで最初から形成させた、天然には通常存在しない形態の核酸を意味する。この様式において、様々な配列の機能的連結が実現される。したがって、直線型の単離された核酸、または通常は連結されていないDNA分子を連結することによってインビトロで形成させた発現ベクターは、どちらも、本発明の目的のための組換え体とみなされる。一度、組換え核酸分子が作製され、宿主細胞または宿主生物中に再導入されると、これは、組換えによらずに、すなわち、インビトロ操作ではなく、宿主細胞のインビボの細胞機構を用いて複製することが理解される。しかしながら、このような核酸は、組換えによって作製された後、続いて組換えによらずに複製されるが、それでもなお、本発明の目的のための組換え体とみなされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち、前述の組換え核酸の発現によって作製されるタンパク質である。
【００８０】
「異種の」という用語は、核酸の一部分に関して使用される場合、その核酸が、天然には、互いに対して同じ関係で通常は存在しない2つまたはそれ以上の配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換えによって作製され、例えば、新しい機能的核酸を生じるように配列した無関係な遺伝子に由来する2つまたはそれ以上の配列、例えば、1つの供給源に由来するプロモーターおよび別の供給源に由来するコード領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、天然には、互いに対して同じ関係で存在しない2つまたはそれ以上の部分配列をしばしば意味する(例えば融合タンパク質)。
【００８１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、使用される場合、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに、天然のアミノ酸ポリマー、修飾残基を含むもの、および非天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。本発明のポリペプチドおよびペプチドには、個々のアミノ酸残基のDイソ型およびLイソ型を有するアミノ酸ポリマー、ならびに他のアミノ酸変種が含まれる。ペプチドは、分子の一次構造を構成するアミノ酸残基の数によって区別される。本発明の目的のために、典型的には、ペプチドは、最大50個のアミノ酸残基を含むアミノ酸ポリマーであり、かつ、ポリペプチドは、50個より多いアミノ酸残基を含む。
【００８２】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する、一連の核酸制御配列と定義される。本明細書において使用される場合、プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーターの場合のTATAエレメントのような、転写開始部位の近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意で、遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含み、これらは、転写開始部位から数千塩基対ほど離れて位置してよい。
【００８３】
「構成的」プロモーターとは、大半の環境条件および発育条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境制御また発育制御下で活性なプロモーターである。「機能的に連結される」という用語は、核酸発現制御配列(プロモーター、または転写因子結合部位の配列など)と第2の核酸配列との機能的な連結を意味し、その際、発現制御配列は、第2の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００８４】
「乾癬」という用語は、本明細書において使用される場合、ポリジーン遺伝性であり、かつ、経過の変動する、一般的な慢性の落屑性皮膚疾患を意味する。診断の方法は、当業者に周知である。これは、表皮の過剰増殖、炎症、および血管新生を特徴とする慢性皮膚障害である。
【００８５】
「関節リウマチ」という用語は、本明細書において使用される場合、滑膜および関節構造中の炎症性変化ならびに筋肉萎縮および骨の希薄化が顕著である、主として関節、通常は多関節の慢性全身性疾患を意味する。関節リウマチの型には、若年性、慢性絨毛性、輪状披裂、変形性、変性性、断節性、および増殖性が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８６】
「選択的に(または特異的に)ハイブリダイズする」という語句は、ある分子が、特定の配列が複合混合物(例えば、全細胞DNAもしくはRNAまたはライブラリーDNAもしくはRNA)中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、その特定のヌクレオチド配列にのみ、結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることを意味する。
【００８７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、あるプローブが、典型的には核酸の複合混合物中で、その標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、かつ、異なる状況においては異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度pHにおける個々の配列の熱融点(Tm)より約5℃〜10℃低くなるように選択される。Tmは、(所定のイオン強度、pH、および核酸(nucleic)濃度下で)標的に相補的なプローブの50％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である(標的配列が過剰に存在するため、Tmでは、50％のプローブが、平衡状態で占有されている)。ストリンジェントな条件は、pH7.0〜pH8.3で、塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01M〜1.0M未満のナトリウムイオン濃度(もしくは他の塩)であり、かつ、温度が、短いプローブ(例えば10〜50ヌクレオチド)の場合は少なくとも約30℃であり、長いプローブ(例えば、50ヌクレオチドより長い)の場合は少なくとも約60℃である条件であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することによって実現してもよい。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のようなものでよい：50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃でインキュベーション、または5×SSC、1％SDS、65℃でインキュベーションし、0.2×SSCおよび0.1％SDS中、65℃で洗浄。PCRの場合、約36℃の温度が、低ストリンジェンシーの増幅には典型的であるが、アニーリング温度は、プライマー長に応じて約32℃〜48℃の間を変動してよい。高ストリンジェンシーのPCR増幅の場合、約62℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマー長および特異性に応じて約50℃〜約65℃までの範囲に渡ってよい。高ストリンジェンシー増幅および低ストリンジェンシー増幅の両方のための典型的なサイクル条件は、90℃〜95℃で30秒〜2分間の変性段階、30秒〜2分間続くアニーリング段階、および約72℃で1分〜2分間の伸長段階を含む。低ストリンジェンシー増幅反応および高ストリンジェンシー増幅反応のためのプロトコールおよびガイドラインは、例えば、Innis et al.(1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.N.Y.)において提供されている。
【００８８】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、やはり実質的に同一である。これは、例えば、遺伝コードによって許容される最大のコドン縮重を用いて核酸のコピーが作製される場合に、起こる。このような場合、それらの核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSの緩衝液中、37℃でハイブリダイゼーション、および1×SSC中、45℃で洗浄を含む。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用して、同様のストリンジェンシーの条件を提供できることを容易に認識すると考えられる。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するためのその他のガイドラインは、多数の参考文献、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.編において提供されている。
【００８９】
本明細書において使用される場合、「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、(1)癌のような疾患を予防すること、すなわち、疾患に罹患しやすい可能性があるが、疾患のいかなる症状もまだ経験していない対象において疾患の臨床症状が発現しないようにさせること;(2)疾患を抑制すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の発達を抑制もしくは低減させること;または(3)疾患を緩和すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の軽減を引き起こすこと、を含む。治療は、病態、障害、または疾患の症状または病状が、改善されるか、またはそうでなければ有利に変更される、任意の様式を意味する。治療は、本明細書における組成物の任意の薬学的使用も包含する。好ましくは、そのような治療を必要とする対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００９０】
「腫瘍細胞」とは、腫瘍中の前癌細胞、癌細胞、および正常細胞を意味する。
【００９１】
「VEGF」とは、血管内皮増殖因子ファミリーの任意のメンバー、ならびにスプライス変種およびアイソフォームを意味する。VEGFは、VEGF121(またはVEGF-121)、VEGF165(またはVEGF-165)、VEGF189(またはVEGF-189)、およびVEGF206(またはVEGF-206;数字は、ポリペプチド中のアミノ酸数を指す)として公知の4種の異なるスプライス変種として発見され得る。4種のアイソフォームはすべて、ジスルフィド結合したホモ二量体として存在する。アイソフォームの分泌パターンは、様々な細胞型において異なっているが、VEGF165が、観察される最も一般的なアイソフォームである。第5の変種であるVEGF145は、女性生殖管に由来する3種のヒト癌細胞株において最近発見された(Poltorak et al., J Biol Chem(1997)272：7157-7158)。5種のアイソフォームは、2つの受容体、すなわちFlt-1およびFlk-1/KDRに高親和性で結合するが、ヘパリンおよび細胞外マトリックスに対する結合親和性は異なる。最近、VEGFファミリーの3種の新しいメンバー、すなわち、VEGF-B、VEGF-C、およびVEGF-Dが同定された(Achen et al., Proc Natl Acad Sci USA(1998), 95(2)：548-53)。内皮細胞の増殖を刺激する、VEGF-Bの2種のスプライス変種が発見された(Olofsson et al., J Biol Chem(1996), 271：19310- 19317; Olofsson et al., Proc Natl Acad Sci USA(1996), 93：2576-2581)。
【００９２】
「VEGF結合活性」という用語は、VEGFRポリペプチドがVEGFポリペプチドに結合する活性を意味する。結合の決定は、本明細書において説明し、かつ当技術分野において公知の結合アッセイ法を用いて実施される。
【００９３】
生物試料中の「VEGF mRNAのレベル」とは、細胞または生物試料中に存在するVEGF遺伝子から転写されるmRNAの量を意味する。mRNAは、一般に、機能的なVEGFポリペプチドをコードするが、コードされるポリペプチドの機能を変化または消失させる変異が存在してもよい。「VEGF mRNAのレベル」は、典型的には、定量され、かつ、対照試料からのレベルまたは対照試料から予測されるレベルと比較される。しかしながら、「VEGF mRNAのレベル」は、比較の有無に関わらず、単に検出することもでき、例えば、ヒトによる主観的な視覚的検出による。
【００９４】
生物試料中の「VEGFポリペプチドのレベル」とは、細胞または生物試料中に存在するVEGF mRNAから翻訳されるVEGFポリペプチドの量を意味する。ポリペプチドは、VEGFポリペプチド活性を有していても有していなくてもよい。「VEGFポリペプチドのレベル」は、典型的には、定量され、かつ、対照試料からのレベルまたは対照試料から予測されるレベルと比較される。しかしながら、「VEGFポリペプチドのレベル」は、比較の有無に関わらず、単に検出することもでき、例えば、ヒトによる主観的な視覚的検出による。
【００９５】
本明細書において使用される場合、「VEGF発現が上方調節される」または「VEGFが過剰発現される」という語句、およびそれらの文法的同義語は、決定された参照レベルを上回るVEGFポリペプチドまたはVEGFポリヌクレオチドを意味する。したがって、例えば、本発明によれば、正常な対象または健常な対象におけるVEGFポリペプチドまたはVEGFポリヌクレオチドの参照レベルがカットオフ値として特定され、この値を上回る場合、VEGFポリペプチドまたはVEGFポリヌクレオチドのレベルと癌の間に有意な相関がある。典型的には、癌患者の血清中のVEGFレベルは、正常な者または健常者におけるVEGFレベルよりも、少なくとも約2倍高く、および、卵巣癌のような特定の癌においては、通常、少なくとも約5倍、およびより普通には少なくとも約10倍高い(例えば、Manenti et al., Eur J Cancer(2003), 39：1948-1956を参照されたい)。「上方調節された」および「過剰発現された」という用語は、本明細書において同義的に使用される。VEGFレベルを決定するための方法は当技術分野において公知であり、RT-PCRおよび抗VEGF抗体の使用が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００９６】
「量の相互関係を示す」とは、ある試料中で決定されたある物質、分子、またはマーカー(例えばVEGF)の量を、別の試料中で決定された同じ物質、分子、またはマーカーの量と比較することを意味する。別の試料中で決定された同じ物質、分子、またはマーカーの量は、所与の疾患または癌に対して特異的であり得る。
【００９７】
「量を決定する」という用語の同義語は、本発明の範囲内に企図され、VEGFのような分子の存在、不在、量、または濃度の検出、測定、試験、または決定が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００９８】
「VEGFR」または「VEGF受容体」という用語は、VEGFまたはVEGFファミリーのメンバー、スプライス変種、およびアイソフォームを結合する受容体を意味する。チロシンキナーゼのVEGF受容体ファミリーは、細胞外ドメイン中の7つの免疫グロブリン様配列および分割されたチロシンキナーゼドメインを特徴とする。VEGFRには、以下のものが含まれる：(i)VEGFR-1としても公知であるFlt-1(fms様チロシンキナーゼ)(Shibuya et al., Oncogene(1990), 5：519-524; De Vries et al., Science(1992), 255：989-991);(ii)Flk-1(胎児肝臓キナーゼ)、マウスRTK(Quinn et al., Proc Natl Acad Sci USA(1993), 90：7533-7537; Millauer et al., Cell(1993), 72：835-846)およびそのヒトホモログ、KDR(キナーゼ挿入ドメインを含む受容体; Terman et al., Biochem Biophys Res Comm(1992), 187： 1579-1586); ならびに(iii)リンパ内皮上で発現されるが、血管内皮上では発現されないFlt-4(Pajusola et al., Cancer Res(1992), 52：5738-43)。
【００９９】
「VEGFR-FasL」という用語は、(i)VEGFR、VEGFR断片、VEGFRドメイン、VEGFR関連ポリペプチド、またはVEGFR関連ポリペプチドの断片のアミノ酸配列、および(ii)FasL、FasL断片、FasL関連ポリペプチド、またはFasL関連ポリペプチドの断片のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を意味する。典型的には、VEGFR、VEGFR断片、VEGFRドメイン、VEGFR関連ポリペプチド、またはVEGFR関連ポリペプチドの断片のアミノ酸配列は、標準的な分子クローニング技術を用いて、FasL、FasL断片、FasL関連ポリペプチド、またはFasL関連ポリペプチドの断片のN末端アミノ酸配列に融合される。
【０１００】
「VEGFRポリペプチド」または「VEGFR核酸」という用語は、単離された核酸、ポリペプチド、および多形性の変種、アレル、変異体、ならびにそれらの種間ホモログを意味し、これらは、本明細書においてさらに説明されるように、(1)(i)下記に示す血管内皮増殖因子(VEGF)受容体-1配列の細胞外ドメイン;(ii)下記に示す血管内皮増殖因子(VEGF)受容体-2配列の細胞外ドメイン;もしくは(iii)下記に示す血管内皮増殖因子(VEGF)受容体-3配列の細胞外ドメインに対して、好ましくは、少なくとも約50個、75個、100個、150個、200個、250個、300個、もしくはそれ以上のアミノ酸の領域に渡って、約60％を上回るアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し;(2)下記に示すアミノ酸配列、もしくは保存的に改変されたその変種を含む免疫原に対して産生させた抗体、例えばポリクローナル抗体に結合し;(3)VEGFポリペプチドに結合し;(4)VEGFポリペプチドに結合する際に、天然のVEGF受容体-1、VEGF受容体-2、またはVEGF受容体-3タンパク質と競合し;(5)VEGF受容体へのVEGFの結合を阻害し;(6)下記に示す核酸配列、もしくは保存的に改変されたその変種に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし;(7)SEQ ID NO：17もしくはSEQ ID NO：18(ヒトVEGFR-2);SEQ ID NO：21(ヒトVEGFR-1)に対して、好ましくは、少なくとも約100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1,000個、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域に渡って、約90％を上回る、好ましくは約96％、97％、98％、99％を上回るか、もしくはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有し;かつ/または(8)SEQ ID NO：1もしくはSEQ ID NO：4(ヒトVEGFR-2)またはSEQ ID NO：19もしくはSEQ ID NO：20(ヒトVEGFR-1)またはSEQ ID NO：24(ヒトニューロピリン(neurphilin)-1)もしくはSEQ ID NO：25(ヒトVEGFR-3)の少なくとも50個、しばしば、75個、100個、115個、150個、175個、200個、250個、もしくは300個の連続的なアミノ酸残基を有する。
【０１０１】
VEGFRのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、典型的には、ヒトに由来するが、他の哺乳動物、限定されるわけではないが、非ヒト霊長類、げっ歯動物(例えば、ラット、マウス、もしくはハムスター)、雌ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または他の哺乳動物に由来してもよい。したがって、いくつかの態様において、本明細書において説明するVEGFRポリペプチドおよびVEGFRサブドメインポリペプチドは、ヒトVEGFR配列に対応する配列を含んでよい。したがって、例示的なVEGFRは、本明細書において提供され、かつ、当技術分野において公知である。例えば、ヒトVEGFR-2ポリペプチドのGenBankアクセッション番号は、NP_002244およびP35968である。例えば、マウスVEGFR-2ポリペプチドのGenBankアクセッション番号はP35918であり、ラットVEGFR-2のGenBankアクセッション番号は、O08775である。ヒトVEGFR-2 cDNA配列は、GenBank NM_002253で確認することができる。ヒトVEGFR-1ポリペプチドのGenBankアクセッション番号は、NP_002010、P17948、AAC16449、CAI17096、およびCAI14846である。例えば、マウスVEGFR-1ポリペプチドのGenBankアクセッション番号はNP_034358であり、ラットVEGFR-1のGenBankアクセッション番号は、NP_062179およびP53767である。ヒトVEGFR-1 cDNA配列は、GenBank NM_002019で確認することができる。
【０１０２】
II.VEGFR-デスリガンド融合タンパク質
本発明は、デスレセプターに結合する新規な融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、(i)血管内皮因子(VEGF)ポリペプチドに結合する血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)ポリペプチド、ならびに(ii)オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含むデスリガンドを含み、その際、VEGFRポリペプチドのC末端は、デスリガンドのN末端に連結されている。
【０１０３】
A.VEGF受容体ポリペプチド
本発明の融合タンパク質を作製するのに有用なVEGFRポリペプチドは、Flt-1(fms様チロシンキナーゼ;VEGFR-1)、Flk-1(胎児肝臓キナーゼ;KDR;VEGFR-2)およびFlt-4など数種のVEGFRから得ることができる。本発明の目的のために、VEGFに結合するVEGFRポリペプチドは、典型的には、VEGFRの細胞外ドメインまたはその一部分を含む。
【０１０４】
好ましいVEGFRポリペプチドは、VEGFR-1の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部分を含む。好ましくは、VEGFR-1は、ヒトVGEFR-1である。ヒトVEGFR-1のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：19に示される。
【０１０５】
いくつかのVEGFR-1ポリペプチドまたはVEGFR-1サブドメインポリペプチドは、Fasリガンドに連結して、本発明の融合タンパク質を作製することができる。好ましい態様において、VEGFR-1ポリペプチドまたはVEGFR-1サブドメインポリペプチドは、(i)SEQ ID NO：20のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(ii)SEQ ID NO：19の1番目〜747番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;(iii)SEQ ID NO：19の32番目〜747番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド;(iv)SEQ ID NO：19のアミノ酸配列の151番目〜214番目のアミノ酸を含むポリペプチド;(v)SEQ ID NO：19のアミノ酸配列の230番目〜327番目のアミノ酸を含むポリペプチド;(vi)VEGFR1の129番目〜230番目のアミノ酸を含むポリペプチド(図10に示すSDTG〜NTII;ドメイン2(D2));および(vii)(i)〜(vi)のいずれか1つのアミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む、VEGF結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【０１０６】
「アミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加された」という語句は、典型的には、25個未満、より典型的には20個未満、さらにより典型的には、15個未満、および最も典型的には、10個未満のアミノ酸残基が、アミノ酸配列において欠失、置換、または付加されていることを意味する。
【０１０７】
VEGFR-1サブドメインポリペプチドはそれぞれ、少なくとも1つのIgG様ドメインを含む。ヒトVEGFR-1のIgG様ドメインは、SEQ ID NO：19の1番目〜747番目のアミノ酸残基、SEQ ID NO：19の32番目〜747番目のアミノ酸残基、SEQ ID NO：19の32番目〜123番目のアミノ酸残基、SEQ ID NO：19の151番目〜214番目のアミノ酸残基、SEQ ID NO：19の230番目〜327番目のアミノ酸残基、SEQ ID NO：19の335番目〜4221番目のアミノ酸残基、SEQ ID NO：19の428番目〜553番目のアミノ酸残基、SEQ ID NO：19の556番目〜654番目のアミノ酸残基、またはSEQ ID NO：19の661番目〜747番目のアミノ酸残基を含む。
【０１０８】
また、他の哺乳動物のVEGFR-1ポリペプチドも好ましく、マウスおよびラットのVEGFR-1ポリペプチドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。他の哺乳動物のVEGFR-1サブドメインポリペプチドは、その哺乳動物VEGFR-1配列をヒトVEGFR-1アミノ酸配列に対してアライメントすることによって、同定することができる。
【０１０９】
別の好ましいVEGFRポリペプチドは、VEGFR-2の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部分を含む。好ましくは、VEGFR-2は、ヒトVGEFR-2である。本発明の好ましい態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含むVEGFR-2ポリペプチドを含む。このVEGFR-2ポリペプチドは、ヒトVEGFR-2のシグナルペプチドを含む。本発明の別の好ましい態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含むVEGFR-2ポリペプチドを含む。このVEGFR-2ポリペプチドは、シグナルペプチドを含まない。
【０１１０】
いくつかのVEGFR-2ポリペプチドまたはVEGFR-2サブドメインポリペプチドは、Fasリガンドに連結して、本発明の融合タンパク質を作製することができる。好ましい態様において、VEGFR-2ポリペプチドまたはVEGFR-2サブドメインポリペプチドは、(i)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(ii)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(iii)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(iv)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(v)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(vi)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(iiv)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列の141番目〜207番目のアミノ酸を含むポリペプチド;(iix)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列の224番目〜320番目のアミノ酸を含むポリペプチド;および(ix)(i)〜(iix)のいずれか1つのアミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む、VEGF結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【０１１１】
VEGFR-2サブドメインポリペプチドはそれぞれ、少なくとも1つのIgG様ドメインを含む。本発明の好ましい態様において、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、SEQ ID NO：1のアミノ酸配列の141番目〜207番目のアミノ酸残基を含む、ヒトVEGFR-2のIgG様ドメインを含む。別の態様において、ヒトVEGFR-2のIgG様ドメインは、SEQ ID NO：1のアミノ酸配列の224番目〜320番目のアミノ酸残基を含む。
【０１１２】
本明細書において説明するVEGFRサブドメインポリペプチドは、交換され得る。したがって、VEGFR-1、好ましくはヒトVEGFR-1の1つまたは複数のIgG様ドメイン、およびヒトVEGFR-2、好ましくはヒトVEGFR-2の1つまたは複数のIgG様ドメインを含むVEGFRポリペプチドを設計することができる。
【０１１３】
本発明の特定の態様において、VEGFRは、VEGFRホモログ、VEGFRアイソフォーム、VEGFRオルソログ、またはVEGFR関連ポリペプチドである。
【０１１４】
B.デスリガンド
本発明は、前述のVEGFRポリペプチド、およびデスレセプターに結合できるデスリガンドを含む新規な融合タンパク質を提供する。VEGFRポリペプチドに連結されるデスリガンドは、オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含む。
【０１１５】
本発明の融合タンパク質を作製するのに有用なデスリガンドは、Lavrik et al., J Cell Sci(2005), 118：265-267(参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)において概説されており、かつ、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、GenBankにおいて入手可能である。本発明の融合タンパク質を作製するのに有用な、オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含むデスリガンドは、Fasリガンド(FasL)、腫瘍壊死因子(TNF)、またはリンホトキシン(LT)など数種のデスリガンドから得ることができる。本発明の目的のために、オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプターに結合するデスレセプター認識部分を含むデスリガンドは、典型的には、デスリガンドの細胞外ドメインまたはその一部分を含む。
【０１１６】
C.FasL
本発明の好ましい態様において、融合タンパク質はFasに結合し、かつ、デスリガンドは、Fasリガンド(FasL)である。したがって、本発明の好ましい融合タンパク質であるVEGFR-FasLは、オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含むFasリガンドを含む。本発明のVEGFR-FasL融合タンパク質の内部のFasLは、Fasタンパク質に結合し、かつアポトーシスシグナルを伝達するのに必要かつ十分な機能的ドメインまたは決定基を少なくとも含む。典型的には、このようなFasL決定基は、細胞外ドメインの一部分のみを含むが、これらは、完全なFasLの結合特異性を保持しており、かつ可溶性である。
【０１１７】
本発明において使用するのに好ましいFasLポリペプチドは、FasLの細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部分を含む。好ましくは、FasLは、ヒトFasLである。三量体形成ドメインおよび受容体であるFasに対する結合ドメインを含むヒトFasLポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：11に示される。したがって、好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、SEQ ID NO：11に示すアミノ酸配列を含むFasLを含む。
【０１１８】
他の好ましい態様において、FasLは哺乳動物FasLであり、マウスまたはラットに由来するFasLが含まれるが、それらに限定されるわけではない。したがって、1つの態様において、本発明の融合タンパク質は、SEQ ID NO：12に示すマウスFasLポリペプチドを含む。別の態様において、本発明の融合タンパク質は、SEQ ID NO：13に示すラットFasLポリペプチドを含む。
【０１１９】
本発明のために有用な別のFasLは、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、またはSEQ ID NO：13のアミノ酸配列において1個〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む、Fas結合活性を有するポリペプチドである。
【０１２０】
デスリガンドは、2つのサブドメイン、すなわちオリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含む。図1は、FasL三量体形成ドメイン(すなわち、オリゴマー形成ドメイン)およびFasL Fas結合ドメイン(すなわち、デスレセプター認識部分)を模式図的に示す。本明細書においてさらに説明するように、TNFは、同様の構造を示す。
【０１２１】
本発明の1つの局面において、本明細書において説明するデスリガンドサブドメインは、交換され得る。したがって、例えば、FasL Fas結合ドメインおよびTNF三量体形成ドメイン、またはその逆を含むFasLポリペプチドを設計することができる。TNFドメインおよび対応するアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、かつ、対応するドメインは、過度に実験をすること無く、当業者が同定することができる(下記も参照されたい)。
【０１２２】
別の局面において、例えば、ヒトFasLのFasL Fas認識部分、およびマウスまたはラットなど別の哺乳動物に由来するFasL三量体形成ドメインを含むキメラFasLポリペプチドを設計することができる。
【０１２３】
ヒト患者において使用する場合、好ましくは、ヒトFasリガンドを使用する。他の種に由来するFasLをインビトロの試験、または、例えばマウスおよびラットにおけるインビボの試験のために使用することができる。
【０１２４】
FasL融合タンパク質またはFasL変種は、例えば、すべて参照により本明細書に明瞭に組み入れられる、米国特許第6,451,759号、同第6,544,523号、同第6,348,334号、同第6,235,878号、同第6,046,310号、同第6,001,962号、米国特許出願公開第2004/0126859号、同第2004/0053249号、および同第2005/0013816号に記載されている。本発明の特定の態様において、FasLは、FasLホモログ、FasLアイソフォーム、FasLオルソログ、またはFasL関連ポリペプチドである。
【０１２５】
D.VEGFR-デスリガンド融合タンパク質
本明細書において詳細に説明するように、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、VEGFまたはその受容体を標的とする、開発された、または開発中の多くの作用物質と異なっている。中和抗体、可溶性VEGF受容体、RNAアプタマー、RNAi、リボザイム、アンチセンス、低分子のキナーゼ阻害物質を含む、これらの作用物質はすべて、VEGFまたはその受容体の発現または活性を阻害するように設計されている。これらのいずれも、アポトーシス活性を生じさせるためにVEGF過剰発現を利用しない。本発明は、この利用、例えば、VEGFの腫瘍での過剰発現を利用して、腫瘍自身の武器をデス因子として使用する、すなわち、デスレセプターを発現している腫瘍にアポトーシスを誘導することを正確に実施する、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質のような組成物を提供する。
【０１２６】
本発明は、新規なVEGFR-デスリガンド融合タンパク質を提供する。本発明の好ましい態様は、図1に図示する。VEGFRポリペプチドがFasLに連結されているこのような態様は、VEGFR-FasLと表示する。この態様において、VEGFRポリペプチドのカルボキシ末端は、FasLのアミノ末端に連結されている。FasLは、好ましくは、VEGFRポリペプチドのカルボキシ末端に結合されるが、別の場所に結合されてもよい。
【０１２７】
VEGFR-デスリガンド融合タンパク質、ならびに、特に、SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：23に示すVEGFR-2-FasLによって本明細書において例示されるようなVEGFR-FasL融合タンパク質は、可溶性タンパク質である。この可溶性タンパク質は、VEGFRの細胞外ドメインに由来するVEGF結合ドメインとデスリガンドの三量体形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を組み合わせている。
【０１２８】
本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質、および特に、VEGFR-FasL融合タンパク質は、VEGF二量体(dimmer)がVEGFR-デスリガンド三量体を統合してクラスターにし、次いで、それらが、デスレセプター、および特にFasに結合し、クラスター形成し、かつ活性化し得るように、設計される。このような態様は、図1に模式図的に示す。
【０１２９】
好ましいVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、図5〜図8に示す。これらの好ましいVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、FlkのD1ドメイン、D2ドメイン、およびD3ドメインを含む。
【０１３０】
本発明の別の好ましいVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、図9および図10に示す。この好ましいVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、VEGFR1のドメイン2(D2)を含む。
【０１３１】
1.シグナルペプチド
本発明は、VEGFRポリペプチドおよびデスリガンドを含む新規な融合タンパク質を提供する。シグナルペプチド配列を含む完全長融合タンパク質(例えば、SEQ ID NO：22を参照されたい)およびシグナルペプチドを含まない成熟した完全長融合タンパク質(例えば、SEQ ID NO：23)は、本発明の方法を実施するために有用であり、かつ、本発明の薬学的組成物およびキット中の組成物として使用される。
【０１３２】
したがって、本発明の融合タンパク質は、それらの所期の用途および作製様式に応じて、シグナルペプチド配列を含んでも含まなくてもよい(さらに本明細書を参照されたい)。シグナルペプチド配列は、同種のシグナルペプチド配列、すなわち、分泌タンパク質のN末端に通常存在するシグナルペプチドでよい(例えば、図3を参照されたい)。あるいは、例えば、マウスのVEGFRシグナル配列が、本発明の融合タンパク質を作製するのに使用される発現系に応じて、ヒトシグナルVEGFR配列を置換してよく、または、逆もまた同様である。
【０１３３】
2.リンカー配列
任意で、VEGFR-FasLは、リンカーを含む。VEGFR C末端とFasL N末端の間のこのようなポリペプチドリンカーは、好ましくは、VEGFポリペプチドのVEGFRポリペプチドへの結合およびFasLの二量体形成または三量体形成ならびにVEGFR-FasLのFasへの結合を可能にするように、作製する。リンカーは、1個〜約100個、好ましくは5個〜50個のアミノ酸残基を含んでよい。好ましい態様において、リンカー配列は、SEQ ID NO：7に示す5個のアミノ酸残基を含む。VEGFRポリペプチドとデスリガンドの間に挿入され得るリンカー配列は、決定的ではない。他の好ましいリンカー配列は、GlyリンカーまたはGly/Serリンカーを含む。
【０１３４】
E.他の増殖因子/デスリガンドタンパク質
本発明の基本的原理、すなわち、本明細書においてVEGFによって例示されるような、増殖因子の増殖因子活性をデス因子に変換する原理は、他の増殖因子にも同様に適用することができる。これらの態様において、VEGFRポリペプチドは、別の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子(PDGF)に対する結合ドメインに交換されると思われる。したがって、過度に実験をすること無く、かつ、成功を合理的に見込んで、当業者は、本開示に従い、かつ、増殖因子もしくは増殖因子受容体の配列に関連する重要な情報を、GenBankのような公的データベースから獲得するか、または、増殖因子もしくは増殖因子受容体をコードするクローン化DNAを米国微生物株保存機関(ATCC)から獲得することができると考えられる。
【０１３５】
F.他のデスレセプター/デスリガンドタンパク質
本発明の融合タンパク質は、デスレセプター、好ましくは、デスレセプターを発現する細胞の表面のデスレセプターに結合する。本発明の方法において標的として有用なデスレセプターは、典型的には、TNFスーパーファミリーの受容体に属し、p55およびp75腫瘍壊死因子受容体(TNFR)ならびにFas(FAS/APO1とも呼ばれる)が含まれる。腫瘍壊死因子(TNF-α)およびリンホトキシン(TNF-β)は、p55およびp75の両方に結合し、それによって、例えば、p55またはp75を発現する腫瘍細胞の死をもたらす事象を開始させる。
【０１３６】
したがって、本発明の別の局面において、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、本明細書において説明するVEGFRポリペプチド、ならびに、オリゴマー形成ドメインおよびTNFRに結合するためのデスレセプター認識部分を含むTNFポリペプチドを含む。別の局面において、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、VEGFRポリペプチド、ならびに、オリゴマー形成ドメインおよびTNFRに結合するためのデスレセプター認識部分を含むLTポリペプチドを含む。
【０１３７】
G.VEGFR-FasL融合タンパク質をコードする核酸
別の局面において、本発明は、VEGFR-FasL融合タンパク質の全体または一部分をコードする組換え核酸分子を対象とする。本発明の好ましい態様において、VEGFR-FasL融合タンパク質の全体または一部分をコードする核酸は、図7に示すヌクレオチド配列を含む。VEGFR-FasL融合タンパク質の全体または一部分をコードする別の好ましい核酸は、図9に示すヌクレオチド配列を含む。VEGFR-FASL融合タンパク質の全体または一部分をコードする他の好ましい核酸は、図7および図9に示されているものである(リンカー配列またはFLAGタグをコードしている配列は含まれない)。このような核酸は、PCRおよび適切に設計されたPCRプライマーを用いて、当業者が作製することができる。
【０１３８】
一般に、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードする核酸配列および関連する核酸配列ホモログは、プローブとのハイブリダイゼーションによってcDNAライブラリーおよびゲノムDNAライブラリーからクローン化されるか、または、オリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅技術を用いて単離される。例えば、配列は、典型的には、核酸プローブとのハイブリダイズによって、哺乳動物核酸の(ゲノムまたはcDNA)ライブラリーから単離される。
【０１３９】
プライマーを用いた増幅技術は、DNAまたはRNAから核酸を増幅し、かつ単離するのに使用することもできる。特定の配列の増幅に適したプライマーは、当技術分野において周知の原理を用いて設計することができる(例えば、DieffenfachおよびDveksler, PCR Primer： A Laboratory Manual(1995)を参照されたい)。これらのプライマーは、例えば、VEGFRポリペプチドまたはデスリガンドの完全長配列または断片のいずれかを増幅するのに使用することができる。
【０１４０】
合成オリゴヌクレオチドもまた、プローブとして使用するため、またはタンパク質発現のために、VEGFR-デスリガンドをコードする遺伝子を構築するのに使用することができる。この方法は、その遺伝子のセンス鎖およびノンセンス鎖の両方に相当する、通常40bp〜120bpの長さのひと続きのオーバーラップしたオリゴヌクレオチドを用いて実施する。その場合、これらのDNA断片をアニールし、連結し、かつクローン化する。あるいは、増幅技術を、厳密なプライマーと共に使用して、核酸の特定の配列を増幅することもできる。次いで、その特定の配列を発現ベクターに連結する。
【０１４１】
VEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードしている核酸は、典型的には、中間ベクター中にクローニングした後に、複製および/または発現のための原核細胞または真核細胞中に形質転換させる。これらの中間ベクターは、典型的には、原核生物ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクターである。
【０１４２】
任意で、VEGFR、デスリガンド、またはそれらのドメインを含むキメラタンパク質をコードする核酸を、標準技術に従って作製することができる。
【０１４３】
H.VEGFR-デスリガンド融合タンパク質の発現
VEGFR-デスリガンド核酸の高レベルの発現を得るために、典型的には、転写を指示する強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、および、タンパク質をコードする核酸の場合には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中に、VEGFR-デスリガンド核酸をサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrookおよび Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(第3版、2001)、Ausubel et al.(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993); ならびにKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)に記載されている。VEGFR-デスリガンドタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌(E. coli)、バチルス種(Bacillus sp.)、およびサルモネラ(Salmonella)において利用可能である(Palva et al., Gene 22：229-235(1983); Mosbach et al., Nature 302：543-545(1983))。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当技術分野において周知であり、かつ、市販もされている。1つの態様において、真核細胞用発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
【０１４４】
異種核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、個々の適用に応じて変わる。プロモーターは、任意で、異種転写開始部位から、天然の設定における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離の位置に配置される。しかしながら、当技術分野において公知であるように、この距離のいくらかの変動は、プロモーター機能を失わずに適応させることができる。
【０１４５】
プロモーターの他に、発現ベクターは、典型的には、宿主細胞におけるVEGFR-デスリガンドをコードする核酸の発現に必要とされる付加的なエレメントすべてを含む、転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、VEGFR-デスリガンドをコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーター、および転写物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、ならびに翻訳終結を含む。VEGFR-デスリガンドをコードする核酸配列は、典型的には、形質転換細胞によるコードされたタンパク質の分泌を促進するために、切断可能なシグナルペプチド配列に連結されてよい。このようなシグナルペプチドには、とりわけ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、および神経成長因子、ならびにオオタバコガ(Heliothis virescens)の幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドが含まれると思われる。カセットの付加的なエレメントにはエンハンサーが含まれてよく、かつ、ゲノムDNAが構造遺伝子として使用される場合には、機能的なスプライス供与部位およびスプライス受容部位を含むイントロンが含まれてよい。
【０１４６】
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結を与えるために、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含むべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てよいか、または、異なる遺伝子から得てもよい。
【０１４７】
細胞中に遺伝情報を輸送するのに使用される具体的な発現ベクターは、特に決定的ではない。真核細胞または原核細胞における発現のために使用される従来のベクターのいずれかを使用してよい。標準的な細菌発現ベクターには、pBR322ベースのプラスミド、pSKF、pET23Dのようなプラスミド、ならびにGSTおよびLacZなどの融合発現系が含まれる。エピトープタグ、例えばc-mycもまた、簡便な単離方法を提供するために、組換えタンパク質に付加することができる。
【０１４８】
真核生物ウイルスに由来する調節エレメントを含む発現ベクターは、典型的には、真核細胞用発現ベクター、例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バー(Epstein-Barr)ウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の例示的な真核生物用ベクターには、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、ならびに、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に対して効果的であることが示された他のプロモーターの指示下でのタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクターが含まれる。
【０１４９】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなど、遺伝子増幅を実現するマーカーを有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下で、VEGFR-デスリガンドのコード配列を用いて、昆虫細胞中でバキュロウイルスベクターを使用するような、遺伝子増幅を伴わない高収率の発現系もまた、適切である。
【０１５０】
発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントには、大腸菌において機能するレプリコン、組換えプラスミドを含む細菌の選択を可能にする、抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能にするための、プラスミドの非必須領域中の独特な制限酵素部位も含まれる。選択される具体的な抗生物質耐性遺伝子は決定的ではなく、当技術分野において公知である多くの耐性遺伝子のいずれかが適している。原核生物配列は、必要な場合には、真核細胞におけるDNAの複製を妨害しないように、任意で選択される。
【０１５１】
標準的なトランスフェクション方法を用いて、大量のVEGFR-デスリガンドタンパク質を発現する、細菌、哺乳動物、酵母、または昆虫の細胞株を作製し、次いで、標準技術を用いてこれらを精製する(例えば、Colley et al., J. Biol. Chem. 264：17619-17622(1989); Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182巻(Deutscher編、1990)を参照されたい)。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準技術に従って実施する(例えば、Morrison, J.Bact. 132：349-351(1977); Clark-CurtissおよびCurtiss, in Methods in Enzymology 101：347-362(Wu et al.編、1983を参照されたい)。
【０１５２】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための周知の手順のいずれかを使用してよい。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、細胞質ベクター(plasma vector)、ウイルスベクター、およびクローン化されたゲノムDNA、cDNA、合成DNA、または他の外来遺伝物質を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が含まれる(例えば、SambrookおよびRussell、前記を参照されたい)。使用される個々の遺伝子工学手順が、VEGFR-デスリガンドを発現できる宿主細胞中に少なくとも1つの遺伝子を成功裡に導入できることのみ必要である。VEGFR-FasL核酸の細胞中への導入は、一過性のトランスフェクションまたは安定なトランスフェクションによって実施することができる(実施例4および図11aおよび11B)。
【０１５３】
発現ベクターを細胞中に導入した後、トランスフェクトされた細胞を、VEGFR-デスリガンドの発現を促進する条件下で培養し、標準技術を用いて、培養物からVEGFR-デスリガンドを回収する(例えば、Scopes, Protein Purification： Principles and Practice(1982)、米国特許第4,673,641号、Ausubel et al.、前記、およびSambrook et al.、前記を参照されたい)。有用なVEGFR-FasL融合タンパク質の作製は、実施例4および図11Aおよび11Bで説明する。
【０１５４】
I.VEGFR-FasL融合タンパク質の精製
本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、当技術分野において周知の方法を用いて精製することができる(例えば、SambrookおよびRussell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(第3版、2001)、Kriegler, Gene Transfer and Expression： A Laboratory Manual(1990)、ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.編、1994-1999))。
【０１５５】
したがって、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、従来のタンパク質精製方法によって精製することができる。あるいは、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質に結合させたタグを、タンパク質精製のために使用する。タグは、当技術分野において公知であり、FLAGタグおよびHAタグが含まれるが、それらに限定されるわけではない。典型的には、これらのタグのコード配列は、VEGFR-デスリガンドのコード配列に連結され、転写されたRNAが翻訳される際に発現される。好ましいタグは、FLAGタグである。FLAGタグ付きVEGFR-デスリガンド融合タンパク質を含む本発明の好ましい態様は、図6および図11に示され、かつ、実施例3および実施例4において詳細に説明される。
【０１５６】
好ましい態様において、切断可能なペプチド配列は、タグとVEGFR-デスリガンド融合タンパク質の中間に挿入される。これは、タンパク質精製後にタグを切断除去するのに特に有利である。
【０１５７】
J.VEGFR-FasLへのVEGFの結合
本発明のVEGFR融合タンパク質は、血管内皮増殖因子(VEGF)に結合する。VEGF受容体の細胞外ドメインへのVEGFの結合をモニターするためのバイオアッセイ法は当技術分野において公知であり、本明細書において説明する。例えば、Achen et al.(参照により本明細書に組み入れられる)は、VEGFR-2の細胞外ドメインへのVEGFリガンドの結合をモニターするためのバイオアッセイ法および可溶性VEGFR細胞外ドメインを用いた結合アッセイ法を説明している。本発明のVEGFR融合タンパク質へのVEGFの結合は、Achen et al.(Proc Natl Acad Sci USA(1998), 95：548-553)のアッセイ法を用いて決定することができる。
【０１５８】
本発明のVEGFR-FasL融合タンパク質へのVEGFの結合は、VEGFR-FasL融合タンパク質を活性化する。本発明のVEGFR-FasL融合タンパク質は、ヒトVEGF、マウスVEGF(実施例11)、または他の任意の哺乳動物VEGFによって活性化され得る。さらに、本発明のVEGFR-FasL融合タンパク質は、VEGF/PlGFヘテロ二量体またはPlGFによっても、活性化され得る(実施例11)。
【０１５９】
K.FasへのVEGFR-FasLの結合
本発明のVEGFR-FasL融合タンパク質は、Fasに結合する。FasL-Fas結合をモニターするためのバイオアッセイ法は、当技術分野において公知であり、本明細書において説明する。例えば、Schneider et al.(参照により本明細書に組み入れられる)は、細胞傷害性アッセイ法、およびFasの細胞外ドメインへのFasL結合をモニターするためのインビトロのFas-FasL結合アッセイ法を説明している。Fasへの本発明のVEGFR-FasLの結合は、Schneider et al. (J Biol Chem(1997), 272(30)： 18827-18833)のアッセイ法を用いて決定することができる。
【０１６０】
好ましい態様において、VEGFR-FasL融合タンパク質は、Fasを発現する癌細胞においてアポトーシスまたは死を誘導するのに、可溶性FasLまたはその細胞外ドメインに比べて高い有効性を有すると考えられる。
【０１６１】
III.VEGFR-デスリガンド融合タンパク質を使用する、VEGF受容体のVEGF活性化を中和するための方法
本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、様々な方法で使用される。例えば、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質、特に、VEGFR-FasL融合タンパク質は、VEGFを過剰発現する腫瘍に対する抗癌剤として使用することができる。本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、癌、関節リウマチ、または増殖性網膜症など、病理学的血管新生を特徴とする疾患において使用するための抗血管新生剤として使用することもできる。
【０１６２】
本発明の好ましい態様において、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質を使用する際に、VEGF受容体のVEGF活性化を中和する方法が提供される。この方法は、VEGFをVEGFR-デスリガンド融合タンパク質と接触させる段階を含む。
【０１６３】
腫瘍細胞のような細胞上のVEGF受容体のVEGF活性化の中和は、インビトロまたはインビボで実施することができる。VEGF受容体のVEGF活性化の中和は、VEGF受容体をその細胞表面で発現する細胞を含む生物試料を、本発明の融合タンパク質と接触させる段階を含む。インビトロでは、VEGFの添加前、同時、または後に、生物試料を融合タンパク質、例えば、VEGFR-FasLと接触させることができる。
【０１６４】
インビボでは、本発明の融合タンパク質を、哺乳動物への投与により、血液のような生物学的液体または腫瘍と接触させる。このインビボでの中和方法は、腫瘍増殖のような病理学的状態を伴う哺乳動物における血管新生を阻害または予防するのに有用である。したがって、VEGFR-FasLのような本発明の融合タンパク質は、抗血管新生治療薬および抗腫瘍治療薬である。
【０１６５】
この方法は、芽細胞腫、癌腫、または肉腫などの悪性の腫瘍および新生物を含む、腫瘍および新生物、ならびに特に富血管性の腫瘍および新生物を有する対象を治療するのに効果的である。本発明の抗体および断片を用いて治療できる腫瘍のいくつかの例には、類表皮腫瘍、頭頸部腫瘍のような扁平上皮腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍(小細胞肺腫瘍および非小細胞肺腫瘍を含む)、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、ならびに肝臓腫瘍が含まれる。
【０１６６】
IV.VEGFR-デスリガンド融合タンパク質を使用する、アポトーシスを誘導するための方法
本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、様々な方法で使用される。本発明の好ましい態様において、VEGFの活性を血管新生因子から細胞死因子に逆転させる方法が提供される。この方法は、VEGFが、多くの癌、および特にヒト癌によって過剰発現されるという観察結果に基づいている。VEGFを過剰発現する癌には、神経膠腫、黒色腫、胃癌、カポジ肉腫、類表皮癌、血管芽細胞腫、乳癌、結腸癌、腎細胞腫瘍、脳下垂体腫瘍、肺癌、および前立腺癌が含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましい癌は、神経膠芽腫である。別の好ましい癌は、前立腺癌である。
【０１６７】
この方法の概念は、腫瘍によって過剰発現されるVEGFを、腫瘍それ自体またはその血管に対するデス因子として作用させることである。要するに、増殖を維持し、かつ転移するのに必要とする腫瘍の武器、すなわち過剰発現されたVEGFを、腫瘍それ自体に対抗するように転じることである。したがって、本発明の組成物は、癌細胞においてアポトーシスを誘導するか、または細胞傷害作用を誘導するのに有用である。
【０１６８】
この方法は、VEGFを本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質と接触させる段階を含む。この方法は、細胞表面上のデスレセプターを、VEGFポリペプチドが結合した本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質と接触させる段階をさらに含む。したがって、この態様において、VEGFポリペプチドを結合しなければ、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質はデスレセプターに結合しないと考えられる。
【０１６９】
本発明の組成物はまた、癌細胞以外の細胞においてアポトーシスを誘導するか、または細胞傷害作用を誘導するのにも有用である。例えば、本発明のVEGFR-FasL融合タンパク質は、副腎皮質内皮細胞のような微小血管内皮細胞においてアポトーシスおよび細胞傷害作用を誘導するのに有用である。
【０１７０】
細胞上のデスレセプターに(VEGFポリペプチドが結合した)VEGFR-デスリガンド融合タンパク質が結合すると、アポトーシス、すなわち、細胞死が誘導される。VEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、本明細書において説明するデスレセプター認識部分を介してデスレセプターに結合する。例えば三量体として形成されるFasLは、Fasに結合し、クラスター形成し、それによって活性化することによって、アポトーシスを誘導する。オリゴマー形成ドメインおよびデスレセプター認識部分を含むFasLポリペプチドを含む本発明のVEGFR-FasL融合タンパク質は、同じ様式でアポトーシスを誘導する。したがって、重要な特徴は、FasLまたはVEGFR-FasL融合タンパク質によるFasクラスター形成が、Fas活性化に必要とされることである。
【０１７１】
好ましくは、本発明のVEGFR-リガンド融合タンパク質は、VEGFの不在下では、アポトーシス活性全く無いか、または最小限である。これは、いくつかのインビトロ実験で実証されており、図11、図13、図14、および図15に例示的に示される。
【０１７２】
好ましくは、本発明のVEGFR-リガンド融合タンパク質は、VEGFの不在下では、増大したアポトーシス活性を有する。これは、いくつかのインビトロ実験で実証されており、図11、図13、図14、および図15に例示的に示される。本文脈において、「増大したアポトーシス活性」とは、この文脈において、VEGF無しと比べて、少なくとも2倍の刺激、好ましくは3倍の刺激、より好ましくは5倍の刺激を意味する。
【０１７３】
好ましい態様において、VEGF発現が上方調節されており、かつ、デスレセプターを発現する細胞においてアポトーシスを誘導するための方法は、本明細書において説明する、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはVEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物に細胞を曝露する段階、または細胞をこの組成物と接触させる段階を含む。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：22またはSEQ ID NO：23のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードする。
【０１７４】
本発明の別の好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：14を含む。
【０１７５】
本発明の1つの局面において、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはポリヌクレオチドは、インビトロで、例えば、培養細胞株においてアポトーシスを誘導するのに使用される。別の好ましい局面において、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはポリヌクレオチドは、インビボで、すなわち、動物、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物において、および好ましくは、癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに使用される。
【０１７６】
V.VEGFを過剰発現し、かつFAS受容体を発現する癌を治療するための方法
A.正常な個体および癌患者中のVEGFの測定
正常な個体および癌患者中のVEGFを測定または決定するためのバイオアッセイ法は、先行技術において説明されており、かつ、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質を投与する前に、個体中の内因性VEGFのレベルを決定するのに有用である。例えば、Cooperらは、卵巣癌患者を良性の付属器腫瘤を有する患者と区別するにあたって血清VEGFレベルの臨床的関連性を評価し、術前VEGFレベルが、良性の付属器腫瘤を悪性腫瘍と区別する際に有用であり得ると結論付けた(Clin Cancer Res,(2002)8(10)：3193-7)。
【０１７７】
B.癌細胞において発現されるFas受容体の測定
癌細胞において発現されるFas受容体を測定または決定するためのバイオアッセイ法は、先行技術において説明されており、かつ、標的とされた癌細胞がFasまたは他の任意のデスレセプターを発現し、したがって、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質によるアポトーシスの誘導に感受性であるかどうかを判定するのに有用である。患者の癌がFasまたは他の任意のデスレセプターを発現するかどうかを判定する段階は、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質を投与する前が望ましい。例えば、Algeciras-Schimnich et al., Proc Natl Acad Sci USA,(2003)100：11445)によって説明されているバイオアッセイ法を使用することができる。
【０１７８】
C.癌を治療するための方法
本発明の方法は、VEGFが上方調節されており、かつ、デスレセプターを発現する癌細胞を治療する段階を含む。この方法は、典型的には、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質を用いてアポトーシスを誘導する段階を含む。好ましい癌細胞は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、神経膠芽腫、および卵巣癌からなる群より選択される。
【０１７９】
この方法は、芽細胞腫、癌腫、または肉腫などの悪性の腫瘍および新生物を含む、腫瘍および新生物、ならびに特に富血管性の腫瘍および新生物を有する対象を治療するのに効果的である。本発明の抗体および断片を用いて治療できる腫瘍のいくつかの例には、類表皮腫瘍、頭頸部腫瘍のような扁平上皮腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍(小細胞肺腫瘍および非小細胞肺腫瘍を含む)、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、ならびに肝臓腫瘍が含まれる。
【０１８０】
本発明は、VEGF発現が上方調節されている癌を治療するための方法を提供する。この方法は、薬学的組成物を患者に投与する段階を含む。このような薬学的組成物は、例えば、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質類似体、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質模倣体、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質関連のポリペプチド;または、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質類似体、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質模倣体、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質関連のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明の薬学的組成物は、単独で、または1種もしくは複数種の付加的な治療的化合物もしくは治療薬と組み合わせて投与される。このような治療的化合物または治療薬の例には、タキソール、シクロホスファミド、タモキシフェン、フルオルラシル(fluoruracil)、およびドキソルビシンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８１】
D.細胞増殖の阻害
本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、様々な方法で使用される。本発明の好ましい態様において、VEGFを過剰発現する細胞の増殖を阻害する方法が提供される。「増殖」とは、細胞の増殖、細胞または病的嚢胞の複製または繁殖を意味する。過剰発現されるVEGFは、VEGFポリペプチドまたはVEGF mRNAのいずれかでよい。この方法は、細胞を、細胞の増殖を阻害するのに有効な量のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質と接触させる段階を含む。
【０１８２】
本発明の好ましい態様において、この方法は、インビトロで実施される。本明細書においてさらに説明するように、本発明の方法は、インビボで実施することもできる。
【０１８３】
VI.VEGFR-FASL融合タンパク質を使用する、未制御な血管新生および/または脈管形成に関係する疾患および障害を治療するための方法
血管新生の予防または阻害は、関節リウマチ、血管新生緑内障、増殖性糖尿病性網膜症を含む増殖性網膜症、黄斑変性症、血管腫、血管線維腫、および乾癬など、未制御な血管新生および/または脈管形成に関係する疾患、障害、および非腫瘍性病理学的状態を治療するのにも有用である。本発明の組成物は、このような疾患を治療するのに有用である。
【０１８４】
本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質は、様々な方法で使用される。本発明の別の好ましい態様において、VEGFの過剰発現または病理学的血管新生に関連する疾患を治療する方法が提供される。この方法は、対象に、好ましくはそのような治療を必要とする対象に、疾患を治療するのに有効な量の、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質活性を有するポリペプチドを投与する段階を含む。好ましくは、対象はヒトである。
【０１８５】
A.関節リウマチ
本発明の好ましい態様において、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはVEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療する疾患は、関節リウマチである。関節リウマチ(RA)は、好中球による滑液、ならびにTリンパ球およびマクロファージによる滑膜の細胞浸潤、パンヌスの形成をもたらす滑膜細胞の過剰増殖、ならびに、軟骨および硬骨の破壊を特徴とする炎症性の関節疾患である(Feldman et al., Ann Rev Immunol(1996), 14：397-440; Paleolog, Br J Rheumatol(1996), 35：917-920)。血管新生は、RAの病因において重要な役割を有していると考えられている(Colville-Nashおよび Scott, Annals Rheumatic Diseases(1992), 51：919-925およびその中の参考文献)。
【０１８６】
RAにおける直接的な血管新生因子としての役割に関する最も強力な証拠が、VEGFに関して存在する。VEGF発現は、他のタイプの関節炎に罹患している患者に由来する滑液および組織よりも、RA患者由来の滑液および組織において、有意に高い(Fava, et al., J.Exp. Med.(1994)180：341-346; Koch et al., J Immunol(1994)152：4149-4156)。このVEGFの供給源は、滑膜表層細胞、滑膜下マクロファージ、微細血管の周囲の線維芽細胞、および血管平滑筋細胞における増大した発現であると思われる(Fava, et al., J.Exp. Med.(1994), 180：341-346; Koch et al., J Immunol(1994), 152：4149-4156; Nagashima et al., J Rheumatol(1995), 22：1624-1630)。他の因子によるVEGFの間接的誘導も、同様に発生し得る。
【０１８７】
B.乾癬
本発明の別の好ましい態様において、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはVEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療する疾患は、乾癬である。乾癬は、表皮の過剰増殖、炎症、および血管新生を特徴とする慢性皮膚障害である。血管新生は、乾癬の病因において非常に重要であると思われ、かつ、微小血管の変化は、発達中の乾癬病変において最も早期に検出可能な事象の1つである(総説については、CreamerおよびBarker, Clin Exp Dermatol(1995), 20：6-9を参照されたい)。いくつかの報告において、表皮が血管新生因子の起源として示唆されている(Nishiokaおよび Ryan, J Invest Dermatol(1972), 58：33-45; WolfおよびHarrison, J Invest Dermatol(1973), 59：40-43; Barnhill et al., Br J Dermatol(1984), 110：273-281; Malhotra et al., Lab Invest(1989), 61：162-165)。
【０１８８】
皮膚中で同定された多くの血管新生因子(Arbiser, Am Acad Derm(1996), 34：486-497)のうちで、VEGFは、血管新生の直接的な誘導物質として最も良く特徴付けられている。VEGFは、乾癬皮膚のケラチノサイトにおいて過剰発現されるが、正常な表皮においては、最小限しか発現されない(Detmar et al., J Exp Med(1994), 180：1141-1146)。VEGFはまた、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、および多形紅斑など他の皮膚疾患において(Brown et al., Invest Dermatol 1995, 104, 744-749)、遅延型皮膚過敏反応において(Brown et al., J Immunol 1995, 154, 2801-2807)、かつ、紫外光への曝露後の、培養ケラチノサイトにおけるVEGF発現の誘導によって示唆されるように(Brauchle et al., J Biol Chem(1996), 271：21793-21797)、おそらくは太陽曝露後にも、過剰発現されている。
【０１８９】
C.黄斑変性症
本発明の好ましい態様において、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはVEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療する疾患は、黄斑変性症である。虚血性網膜からの血管新生因子の放出は、網膜の新血管新生のための中心的刺激であると仮説が立てられている。眼内新血管新生に続発する、緑内障、硝子体出血、および網膜剥離は、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、および糖尿病性網膜症などいくつかの眼疾患において結果として生じる視力低下の原因である。新しい血管増殖を誘導し、かつその領域への酸素供給を増加させるための、虚血性網膜による血管新生因子の放出は、それらの新しい血管が、正常な構造で増殖しないため、結果的に有害になる。浮腫、出血、血管蛇行、および病理学的新血管新生は、次に、網膜剥離をもたらし、かつ、失明を招く。
【０１９０】
VEGFは、正常な眼の血管新生組織において構成的に発現される(Adamis et al., Arch Ophthalmol(1996), 114：66-71)が、眼内のVEGF遺伝子発現は、糖尿病性網膜症と同様の疾患状態において増大している(Adamis et al., Amer J Ophthalmology(1994), 118：445-450; Malecaze et al., Arch Ophthalmology(1994), 112：1476-1482)。
【０１９１】
VII.併用療法
本明細書において詳説するように、本発明は、VEGF受容体のVEGF活性化を中和するためにVEGFR-デスリガンド融合タンパク質を使用するための方法を提供する。これらの方法は、アポトーシスを誘導し、細胞における細胞傷害作用を誘導し、癌、ならびに未制御な血管新生および/または脈管形成に関係した疾患または障害を治療するのに、特に有用である。本発明の好ましい態様において、これらの各方法は、化学療法剤のような第2の治療物質または放射線療法を患者に施す段階をさらに含んでよい。
【０１９２】
化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス-クロロエチルニトロソ尿素(chloroethylnitrosurea)、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロ尿素(methylcyclohexylnitrosurea)、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン(CA)、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、5-フルオロウラシル(5-FU)、5-フルオロデオキシウリジン(5-FUdR)、メトトレキサート(MTX)、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール(DES)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。一般には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、第15版、1987, pp. 1206-1228, Berkow et al.編、Rahway, N.Jを参照されたい。
【０１９３】
本発明の好ましい態様において、化学療法剤は、カンプトセシン、エトポシド、ビスインドリルマレイミドVIII、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン、テモゾロミド、ボルテゾミド(bortezomid)、LY294002、およびバルプロ酸からなる群より選択される。
【０１９４】
VIII.VEGFR-デスリガンド融合タンパク質の投与
本発明の1つの局面において、本明細書において詳細に説明するVEGFR-FasLのようなVEGFR-デスリガンド融合タンパク質を発現する核酸分子は、哺乳動物細胞または標的組織中にその核酸を導入するのに使用することができる。従来のウイルスベースの遺伝子導入法および非ウイルスベースの遺伝子導入法を用いて、哺乳動物細胞または標的組織に、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードする核酸分子を導入することができる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、裸の核酸、および、リポソームのような送達ビヒクルと複合体形成された核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後に、エピソームゲノムまたは統合されたゲノムのいずれかを有する、DNAウイルスおよびRNAウイルスが含まれる。遺伝子療法手順の総説については、Anderson, Science 256：808-813(1992); NabelおよびFelgner, TIBTECH 11：211-217(1993); MitaniおよびCaskey, TIBTECH 11：162-166(1993); Dillon, TIBTECH 11：167-175(1993); Miller, Nature 357：455- 460(1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10)：1149-1154(1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8：35-36(1995); KremerおよびPerricaudet, British Medical Bulletin 51(1)：31-44(1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm(編)(1995); ならびにYu et al., Gene Therapy 1：13-26(1994)を参照されたい。
【０１９５】
A.非ウイルス系送達法
本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス系送達の方法には、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質と核酸の結合体、裸DNA、人工ウイルス粒子、および作用物質によって向上させたDNA取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、米国特許第4,946,787号、および米国特許第4,897,355号に記載されており、かつ、リポフェクション試薬は、市販されている(例えば、トランスフェクタム(Transfectam(商標))およびリポフェクチン(Lipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性脂質および中性脂質には、Felgner, WO 91/17424、WO 91/16024のものが含まれる。送達は、細胞(エクスビボ投与)または標的組織(インビボ投与)に対してでよい。
【０１９６】
免疫脂質(immunolipid)複合体のような標的化されたリポソームを含む、脂質と核酸の複合体の調製は、当業者には周知である(例えば、Crystal, Science 270：404-410(1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2：291-297(1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5：382-389(1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5：647-654(1994); Gao et al., Gene Therapy 2：710-722(1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52：4817-4820(1992);米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、および同第4,946,787号を参照されたい)。
【０１９７】
B.ウイルス系送達法
VEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードする核酸を送達するためのRNAウイルスまたはDNAウイルスベースの系の使用は、当技術分野において公知である。従来のウイルスベースの系には、遺伝子導入するためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。
【０１９８】
多くの遺伝子療法の適用において、遺伝子療法ベクターは、特定の組織型、例えば、肺組織または乳房組織に対する高度の特異性をもって送達されることが望ましい。ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上でウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、関心対象の細胞型上に存在することが公知である受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92：9747-9751(1995)は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、gp70に融合されたヒトヘレグリンを発現させることができ、かつ、その組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスおよび受容体を発現する標的細胞の他のペアに拡張することができる。例えば、繊維状ファージを操作して、事実上任意に選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片(例えばFabまたはFv)を提示させることができる。前述の説明は、ウイルスベクターに主として適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することもできる。このようなベクターを操作して、特定の標的細胞による取込みを促進すると考えられている特定の取込み配列を含ませることができる。
【０１９９】
遺伝子療法ベクターは、後述するように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、真皮下、もしくは頭蓋内への注入)または局所適用によって、インビボで送達することができる。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植された細胞のような細胞にエクスビボで送達することもできる。
【０２００】
診断学、研究、または遺伝子療法(例えば、トランスフェクトされた細胞を宿主生物に注入することによる)のためのエクスビボの細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。いくつかの態様において、細胞は、対象生物から単離され、VEGFR-デスリガンドをコードする核酸でトランスフェクトされ、かつ、対象生物(例えば患者)に再注入される。エクスビボでのトランスフェクションに適した様々な細胞型は、当業者に周知である(患者から細胞を単離し、培養する方法の考察については、例えば、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique(第3版、1994)およびその中で引用される参考文献を参照されたい)。
【０２０１】
治療的核酸を含むベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど)はまた、インビボで細胞に形質導入するために、生物に直接投与することもできる。あるいは、裸DNAを投与してもよい。投与は、分子を導入して、最終的に血液または組織細胞と接触させるために通常使用される経路のうちいずれかによる。このような核酸を投与する適切な方法は、当業者にとって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために複数の経路を使用できるが、特定の経路が、別の経路と比べてより速やかで、かつより効果的な反応をしばしばもたらし得る。
【０２０２】
薬学的に許容される担体は、投与される個々の組成物によって、ならびに、その組成物を投与するのに使用される個々の方法によって、ある程度決定される。したがって、後述するように、本発明の薬学的組成物の多種多様の適切な製剤がある(例えば、Remington 's Pharmaceutical Sciences、第17版、1989を参照されたい)。
【０２０３】
IX.薬学的組成物
本発明は、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。
【０２０４】
本発明の好ましい態様において、薬学的組成物は、(i)(1)VEGFタンパク質に結合するVEGFRポリペプチド、ならびに(2)オリゴマー形成ドメインおよびFasリガンドタンパク質の細胞外ドメインのFas受容体認識部分を含むFasリガンドを含む融合タンパク質、ならびに(ii)薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または希釈剤を含む。
【０２０５】
本発明の別の態様において、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター、ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または希釈剤を含む組成物が提供される。1つの態様において、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードする核酸は、SEQ ID NO：14に示すヌクレオチド配列を有する。
【０２０６】
薬学的組成物は、VEGFを過剰発現し、かつ、Fasのようなデスレセプターを発現している癌を治療するのに有用である。薬学的組成物はまた、本明細書において説明する病理学的血管新生を特徴とする疾患を治療するのにも有用である。
【０２０７】
A.薬学的組成物の投与
VEGFR-デスリガンド融合タンパク質の活性化因子またはVEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物を、癌、例えば、肺癌または乳癌の治療のために患者に投与することができる。下記に詳細に説明するように、これらの化合物は、任意で、薬学的に許容される担体と共に投与される。
【０２０８】
VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはVEGFR-デスリガンド融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌を予防、治療、または制御するための治療的有効量で患者に投与することができる。これらの化合物は、患者において効果的な治療応答を誘発するのに十分な量で患者に投与される。効果的な治療応答とは、疾患の症状または合併症を少なくともある程度、抑制するか、または進行を遅らせる応答である。これを実現するのに適する量が、「治療的有効量」と定義される。この用量は、使用される個々のVEGFR-デスリガンドの有効性および対象の状態、ならびに体重、または治療しようとする領域の表面積によって決定される。用量の多さは、個々の対象において、個々の化合物またはベクターの投与に付随する任意の有害作用の存在、性質、および程度によっても決定される。
【０２０９】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、LD50(集団の50％に対して致死的な用量)およびED50(集団の50％において治療的に有効な用量)を決定することによって、決定することができる。毒性作用と治療的効果の用量比は治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用することはできるが、このような化合物を患部組織の部位に標的化して、正常細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって、副作用を軽減する送達系を設計するように配慮しなければならない。
【０２１０】
例えば、細胞培養アッセイ法および動物試験から得られたデータを用いて、ヒトにおいて使用するための投薬量範囲を公式化することができる。このような化合物の投薬量は、ED50を含み、毒性がほとんどまたは全く無い、循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、使用される剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変動してよい。本発明の方法において使用される任意の化合物の場合、治療的有効量は、細胞培養アッセイ法から最初に概算することができる。用量は、細胞培養において決定されるIC50(症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血中の血漿中濃度範囲を実現するように、動物モデルにおいて公式化することができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって、測定することができる。一般に、調節物質に相当する用量は、典型的な対象に対して、約1ng/kg〜10mg/kgである。
【０２１１】
本発明において使用するための薬学的組成物は、1種または複数種の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用する標準技術によって調剤することができる。化合物ならびにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入、局所的、経鼻的、経口的、非経口的(例えば、静脈内、腹腔内、膀胱内、もしくは、くも膜下腔内)または直腸経由を含む、任意の適切な経路による投与用に、調剤することができる。
【０２１２】
経口投与の場合、薬学的組成物は、結合剤、例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース;増量剤、例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム;滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ;崩壊剤、例えば、バレイショデンプンもしくはグリコール酸デンプンナトリウム;または湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムを含む、薬学的に許容される賦形剤を用いて従来手段によって調製された、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態をとってよい。錠剤は、当技術分野において周知の方法によってコーティングされてよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形態をとってよく、または、それらは、使用前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、薬学的に許容される添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または食用硬化脂;乳化剤、例えば、レシチンまたはアラビアゴム;非水系ビヒクル、例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコール、または、分別された植物油;および保存剤、例えば、メチル-p-ヒドロキシベンゾアートもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸を用いて従来手段によって調製することができる。製剤は、適宜、緩衝塩、矯味剤、着色剤、および/または甘味剤も含んでよい。所望の場合は、経口投与用の製剤は、活性化合物の制御放出を与えるように適切に調剤することができる。
【０２１３】
吸入による投与の場合、化合物は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスを用いて、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー授与の形態で便宜的に送達することができる。加圧したエアロゾルの場合、単位用量は、計量された量を送達するバルブを提供することによって、決定することができる。化合物の粉末混合物および適切な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンを含む、例えば、吸入器または吹入器において使用するためのゼラチン製のカプセル剤およびカートリッジを調剤することができる。
【０２１４】
化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続輸注による非経口投与用に調剤することができる。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル中または多回投与用容器中で、保存剤を加えて提供することができる。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤などの形態をとってよく、かつ、調剤用剤(formulatory agent)、例えば、懸濁化剤、安定化剤、および/または分散剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌済みパイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末形態でもよい。
【０２１５】
化合物は、例えば、従来の坐剤基剤、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドを含む、直腸用組成物、例えば、坐剤または停留浣腸中に調剤することもできる。
【０２１６】
さらに、これらの化合物を、デポ製剤として調剤することもできる。このような長時間作用性の製剤は、埋め込みによって(例えば、皮下もしくは筋肉内)、または、筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料(例えば、許容される油中の乳剤として)またはイオン交換樹脂と共に、または、難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として、調剤することができる。
【０２１７】
組成物は、所望の場合は、活性成分を含む1つまたは複数の単位剤形を含むことができる容器またはディスペンサー器具中で提供することができる。この容器は、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを含んでよい。容器またはディスペンサー器具には、投与用の取扱い説明書を添付することができる。
【０２１８】
B.治療的有効量および投薬
本発明の1つの態様において、薬学的組成物または医薬品は、本明細書において説明する病理学的状態または疾患を予防、治療、または制御するための治療的有効量で、対象、好ましくは、ヒトまたは非ヒト動物に投与される。薬学的組成物または医薬品は、対象において効果的な治療応答を誘発するのに十分な量で対象に投与される。効果的な治療応答とは、病理学的状態、障害、または疾患の症状または合併症を少なくともある程度、抑制するか、または進行を遅らせる応答である。これを実現するのに適する量が、「治療的に有効な量(therapeutically effective amount)」とも呼ばれる「治療的有効量(therapeutically effective dose)」と定義される。
【０２１９】
投与される活性物質の投薬量は、温血動物(哺乳動物)の種類、体重、年齢、個体の状態、治療しようとする領域の表面積または体積、および、投与形態に依存する。用量の多さは、個々の対象において、個々の低分子化合物の投与に付随する任意の有害作用の存在、性質、および程度によっても決定される。約50kg〜70kgの哺乳動物への経口投与用の単位投薬量は、約5mg〜約500mgの間の活性成分を含んでよい。典型的には、本発明の活性化合物の投薬量は、所望の効果を実現するのに十分な投薬量である。最適な投薬スケジュールは、対象の身体における作用物質蓄積の測定値から算出することができる。一般に、投薬量は、毎日、毎週、または毎月、1回または複数回、与えてよい。当業者は、最適投薬量、投薬方法、および反復率を容易に決定することができる。
【０２２０】
投与される活性物質の投薬量はまた、作用物質の性質にも依存する。例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドの治療的に有効な量(すなわち有効投薬量)は、約0.001mg/kg体重〜30mg/kg体重、好ましくは約0.01mg/kg体重〜25mg/kg体重、より好ましくは約0.1mg/kg体重〜20mg/kg体重、およびさらにより好ましくは、約1mg/kg体重〜10mg/kg体重、2mg/kg体重〜9mg/kg体重、3mg/kg体重〜8mg/kg体重、4mg/kg体重〜7mg/kg体重、または5mg/kg体重〜6mg/kg体重の範囲に渡る。タンパク質またはポリペプチドは、約1週〜10週の間、好ましくは、2週〜8週の間、より好ましくは、約3週〜7週の間、およびさらにより好ましくは、約4週間、5週間、または6週間、1週1回、投与することができる。
【０２２１】
さらに、任意の個々の動物対象に対する具体的な用量レベルは、使用される特定のVEGFR-FasL融合タンパク質の活性、対象の年齢、体重、全体的健康状態、性別、および食生活、投与の時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組合せ、ならびに、調節しようとする発現または活性の程度を含む、様々な因子に依存すると考えられる。
【０２２２】
本発明の1つの態様において、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質を含む薬学的組成物または医薬品は、対象の体重1kg当たり各化合物約1mg(1mg/kg)〜約1g/kgの範囲の1日量で、複数日間、投与する。別の態様において、1日量は、約5mg/kg〜約500mg/kgの範囲の用量である。さらに別の態様において、1日量は、約10mg/kg〜約250mg/kgである。別の態様において、1日量は、約25mg/kg〜約150mg/kgである。好ましい用量は、約10mg/kgである。1日量は、1日1回で投与してよく、または、小用量に分割し、かつ、複数回投与で、例えば、1日2回、3回、もしくは4回、投与してよい。しかしながら、当業者には理解されるように、本発明のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質のようなポリペプチドおよびタンパク質は、様々な量で、かつ、別々の時点に投与することができる。当業者はまた、非限定的に、疾患または障害の重傷度、以前の治療、対象の全体的健康状態および/または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む、いくつかの因子が、対象を効果的に治療するのに必要とされる投薬量およびタイミングに影響し得ることも理解すると考えられる。さらに、治療的に有効な量の化合物を用いた対象の治療は、1回の処置を含んでよく、または、好ましくは、一連の処置を含んでよい。
【０２２３】
所望の治療的効果を実現するために、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸を、治療的に有効な1日量で、複数日間、投与することができる。したがって、本明細書において説明する対象の病理学的状態または疾患を治療するための、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸の治療的に有効な投与は、3日〜2週またはそれ以上の範囲に渡る期間続く、定期(例えば毎日)の投与を必要とする。典型的には、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸は、少なくとも3日間連続して、多くの場合、少なくとも5日間連続して、より多くの場合、少なくとも10日間、および、時々は、20日間、30日間、40日間、またはそれ以上連続して、投与される。連続的な1日量が、治療的有効量を実現するために好ましい経路であるが、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸が毎日投与されない場合でも、対象におけるVEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸の治療的に有効な濃度を維持するのに十分な頻度で投与が反復される限り、治療的に有益な効果を実現することができる。例えば、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸を、1日おき、3日おき、または、より高い用領範囲が使用され、かつ対象に耐性がある場合には、1週1回、投与することができる。
【０２２４】
VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸の最適投薬量、毒性、および治療的有効性は、個々のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸の相対的能力に応じて変動する可能性があり、かつ、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、LD50(集団の50％に対して致死的な用量)およびED50(集団の50％において治療的に有効な用量)を決定することによって、決定することができる。毒性作用と治療的効果の用量比は治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。より高い治療指数を示す、VEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸が好ましい。毒性の副作用を示すVEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸を使用することはできるが、このような作用物質を患部組織の部位に標的化して、正常細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって、副作用を軽減する送達系を設計するように配慮しなければならない。
【０２２５】
例えば、細胞培養アッセイ法および動物試験から得られたデータを用いて、ヒトにおいて使用するための投薬量範囲を公式化することができる。このようなVEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸の投薬量は、ED50を含み、毒性がほとんどまたは全く無い、循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、使用される剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変動してよい。本発明の方法において使用される任意のVEGFR-デスリガンド融合タンパク質またはそれらをコードする核酸の場合、治療的有効量は、細胞培養アッセイ法から最初に概算することができる。用量は、細胞培養において決定されるIC50(症状の最大抑制の半分を達成する作用物質の濃度)を含む循環血中の血漿中濃度範囲を実現するように、動物モデルにおいて公式化することができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって、測定することができる。一般に、作用物質に相当する用量は、典型的な対象に対して、約1ng/kg〜100mg/kgである。
【０２２６】
成功裡な治療に続いて、治療した状態または疾患の再発を防止するための維持療法を対象に受けさせることが望ましい場合がある。
【０２２７】
X.診断、研究、および治療への応用において使用するためのキット
上記に示唆した診断、研究、および治療への応用において使用するために、キットもまた、本発明によって提供される。診断および研究への応用において、このようなキットは以下のうちいずれかまたはすべてを含み得る：アッセイ試薬、緩衝剤、VEGFR-デスリガンドポリペプチド、VEGFR-デスリガンドに特異的な核酸または抗体、ハイブリダイゼーション用プローブおよび/またはプライマー、VEGFR-デスリガンド発現構築物、VEGFR-デスリガンドの低分子活性化因子など。治療用製品は、滅菌済み生理食塩水、または別の薬学的に許容される乳液基剤および懸濁液基剤を含んでよい。
【０２２８】
さらに、これらのキットは、本発明の方法を実施するための指導(すなわちプロトコール)を含む取扱い説明資料も含んでよい。これらの取扱い説明は、様々な形態で対象キット中に存在してよく、このうち1つまたは複数が、キット中に存在してよい。取扱い説明資料は、典型的には、文書資料または印刷資料を含むが、それらに限定されるわけではない。そのような取扱い説明を保存し、かつそれらを最終使用者に伝えることができる任意の媒体が、本発明によって企図される。このような媒体には、電子的保管媒体(例えば、磁気ディスク、磁気テープ、磁気カートリッジ、磁気チップ)および光学的媒体(例えばCD ROM)などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。このような媒体には、そのような取扱い説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスが含まれてよい。
【０２２９】
本発明の好ましい態様において、キットは薬学的キットであり、かつ、(i)VEGFR-デスリガンドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および(ii)薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。本発明の別の好ましい態様において、キットは薬学的キットであり、かつ、(i)VEGFR-デスリガンドポリペプチド、および(ii)薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。薬学的キットは、任意で、VEGF発現が上方調節されている癌を治療するために、その薬学的組成物を使用できるか、または使用すべきであることを述べた取扱い説明物を含む。
【０２３０】
本発明によるキットは、質量分析法を実施するための試薬をさらに含み得る。このような試薬は当業者に周知であり、例えば、プローブまたはチップが含まれる。
【０２３１】
本発明のさらなるキットの態様は、当業者が本明細書において説明する変形法のいずれかを実施するのを可能にすると考えられる、任意選択の機能的構成要素を含む。
【０２３２】
前述の本発明は、明確性および理解のために、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、本発明の精神および範囲から必ずしも逸脱すること無く、いくつかの変形、変更、修正、および等価物での置換をそれに施し得ることは、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかになると考えられる。結果として、本明細書において説明する態様は、様々な修正および変更などの対象となり、本発明の範囲は本明細書に添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ、決定される。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすように、変更、改変、または修正することができる、様々な非決定的パラメーターを容易に認識すると考えられる。
【０２３３】
本発明の各要素を、複数の態様を含むものとして本明細書において説明するが、別段の定めが無い限り、本発明の所与の要素の各態様は、本発明の他の要素の各態様と共に使用されることができ、かつ、そのような各使用は、本発明の別の態様を形成すると意図されることが、理解されるべきである。
【０２３４】
上記の開示から理解することができるように、本発明は、多種多様な応用を有する。本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらは、例示に過ぎず、本発明の定義および範囲を制限するものでは決してない。
【０２３５】
XI.実施例
実施例1：材料および方法
1.一般的な組換えDNA法
別段の定めが無い限り、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を作製するため、およびそれらの融合タンパク質を発現させるために、組換え遺伝学の分野のルーチンな技術を使用した。本発明において使用する一般的方法を開示している基本的な教科書には、SambrookおよびRussell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(第3版、2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990);ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.編、1994-1999)が含まれる。
【０２３６】
核酸のサイズは、キロベース(kb)または塩基対(bp)のいずれかで与えられる。これらは、アガロースゲル電気泳動もしくはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、または公開されているDNA配列から導き出された推定値である。タンパク質のサイズは、キロダルトン(kDa)またはアミノ酸残基の数で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、導き出されたアミノ酸配列、または公開されているタンパク質配列から概算する。
【０２３７】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、BeaucageおよびCaruthers, Tetrahedron Letts.22：1859-1862(1981)によって最初に説明された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12：6159-6168(1984)に記載されているように自動合成機を用いて、化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動によるか、または、PearsonおよびReanier, J.Chrom. 255：137-149(1983)に記載されているような陰イオン交換HPLCによる。
【０２３８】
クローン化遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Wallace et al., Gene 16：21-26(1981)の二本鎖鋳型を配列決定するためのチェーンターミネーション法を用いて、クローニング後に確認することができる。
【０２３９】
2.細胞株および組織培養
Cos-7細胞を、UCSF細胞培養施設(UCSF Cell Culture Facility)から入手した。細胞を、37℃、5％CO2の組織培養インキュベーター中、10％ウシ胎児血清、およびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDME-H21培地中で増殖させた。
【０２４０】
T-47Dヒト乳癌細胞を、UCSF細胞培養施設から入手した。細胞を、37℃、5％CO2の組織培養インキュベーター中、インスリン(0.2U/mL)、10％ウシ胎児血清、およびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地中で増殖させた。
【０２４１】
ジャーカットE6.1細胞を、UCSF細胞培養施設から入手した。細胞を、37℃、5％CO2の組織培養インキュベーター中、10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地中で増殖させた。
【０２４２】
U87MGおよびU373は、米国微生物株保存機関(ATCC; Mannassas, VA 20108, USA)から入手した、ヒト神経膠芽腫細胞株である。両方とも、10％ウシ胎児血清および抗生物質を添加した、アールBSS含有イーグルMEM培地中で培養する。U373細胞は、Fas受容体を介したアポトーシスに耐性であるが、U87MG細胞は、感受性である(Rieger et al., 1998, FEBS Lett 427：124-128; Yount et al., 1999, Cancer Res 59：1362-1365)。
【０２４３】
DU145は、ヒト前立腺癌細胞株である。DU145は、ATCCから入手し、かつ、10％ウシ胎児血清および抗生物質を添加した、アールBSS含有イーグルMEM培地中で培養した。
【０２４４】
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、Clonetics社から入手し、かつ、製造業者によって供給された、ウシ胎児血清、ヒドロコルチゾン、hFGF、IGF、およびアスコルビン酸を添加されたEGM-2培地中で培養した。ウシ副腎皮質内皮細胞(微小血管細胞)を、サンフランシスコのカリフォルニア大学のRichard Weiner博士から入手した。これらの細胞を、10％ウシ胎児血清および抗生物質を添加した、1g/Lグルコース含有DME H-16中で培養した(Ferrara et al., 1991, Endocrinology 129：896-900)。
【０２４５】
3.ウェスタンブロット法
VEGFR-2の細胞外ドメインに対する抗体を、Becton-Dickinson/Pharmingen社から購入した(555307番)。ラットモノクローナル抗体を、最終濃度0.5マイクログラム/mLでウェスタンブロット法に使用した。二次抗体は、Santa Cruz Biotechnology社から購入した、HRP結合ヤギ抗ラットIgG抗体(SC-2065番)であり、最終濃度0.4マイクログラム/mLで使用した。バンドは、化学発光を用いて(Amersham社製のECL試薬)、可視化した。
【０２４６】
4.PCR法
PCRを用いて、アミノ酸139〜281をコードしているヒトFasLの断片を増幅させた。センスプライマー(UCSF Biomedical Core社から購入)は、以下のものであった。
2009505989.tif 000003
これは、5'末端にXhoI部位およびSpeI部位を含む。アンチセンスプライマー(UCSF Biomedical Core社から購入)は、以下のものであった。
2009505989.tif 000004
これは、3'末端にBglII部位およびXbaI部位を含む。鋳型はpOTB7/hFasL(ATCCから購入)であり、DNAポリメラーゼはPfu(Stratagene)であり、dNTPはRoche社から入手した。
【０２４７】
PCR条件：鋳型pOTB7/hFasL：2.0マイクログラム、プライマー：100pMol、dNTP：20nMol、Pfu：2.5単位、1回目のサイクル：95℃で5分間、10分間に渡って95℃から35℃まで、72℃で5分間、2〜11回目のサイクル：95℃で45秒間、60℃で45秒間、72℃で60秒間。440bpのPCR断片をアガロースゲルクロマトグラフィーによって精製し、Gel Extractionキット(Qiagen)を用いて精製し、かつ、pBJベクターのXhoI/XbaI制限酵素部位にサブクローニングした。
【０２４８】
5.アポトーシス解析
アポトーシスおよび細胞傷害性を、次の3種のアッセイ法によって分析した：細胞計数、アネキシンV陽性細胞のFACS解析、およびLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)放出。ジャーカット細胞の細胞計数の場合、細胞懸濁液100uLを等体積のトリパンブルー染色剤(0.4％)と混合し、かつ、室温で2分間、保存した。血球計数器を用いて、生細胞をトリプリケートで計数した。細胞数/視野の平均値およびSEMを、InStat統計ソフトウェアを用いて算出した。FACS解析には、Roche社製のAnnexin-V-Fluosキットを製造業者のプロトコールに従って使用した。手短に言えば、FlkFasLまたは対照の馴化培地±VEGF-165(2nM、Peprotech社製)で処理した後、ジャーカット細胞を沈殿させ、かつ、室温で15分間、Annexin-V-Fluos標識溶液(ヨウ化プロピジウムを加えたFITC-Annexin V)100μL中に再懸濁した。FACS解析は、CellQuest Softwareを使用するBecton Dickinson FACSCalibur(商標)において、陰性細胞に対してアネキシンV陽性(アポトーシス性)細胞、および陰性細胞に対してヨウ化プロピジウム陽性細胞(すなわち壊死細胞)を区別するためにゲートをかけて実施した。アポトーシス性(アネキシンV陽性およびヨウ化プロピジウム陰性)の細胞集団のパーセントを決定した。LDH放出アッセイ法では、Roche社製のLDH Cytotoxicity Detectionキットを製造業者のプロトコールに従って使用した。手短に言えば、FlkFasLまたは対照の馴化培地±VEGF-165(2nM)で48時間処理した後、細胞培養上清を500gで3分間遠心分離して細胞片を沈殿させた。トリプリケートの上清25μLをLDH検出試薬と混合し、かつ、492nMでの吸光度を測定することによって、LDH活性を定量した。InStat統計ソフトウェアを用いて、平均値およびSEMを算出した。
【０２４９】
実施例2：キメラのマウス/ヒトVEGFR/FasL融合タンパク質をコードする核酸の構築
FlkFasLをコードするpBJプラスミド、すなわちpBJ/Flk(D1-D3)+FasL(139-281)を、段階的に構築した。最初に、PCRを実施して、5'側のXhoI/SpeI部位および3'側のBgl II/Xba I部位が両側にある、アミノ酸139〜281をコードするヒトFasL配列を増幅させた。PCR断片をXho IおよびXba Iで消化し、かつ、pBJ哺乳動物発現ベクターのXho I部位およびXba I部位中にサブクローニングして、pBJ/hFasL(139-281)を作製した(図6)。次いで、このプラスミドをXho Iで切断し、かつ、Flk-1シグナル配列および免疫グロブリン様ドメイン1〜3を含む、プラスミドLNCX/Flk(1-3)HA由来のXho I/Xho I断片をその中にサブクローニングした。結果として生じるプラスミドpBJ/Flk(D1-D3)+FasL(139-281)(図5)は、図7に示すFlkFasLヌクレオチド配列を含む。
【０２５０】
プラスミドpBJ/Flk(D1-D3)+FasL(139-281)は、図8に示すアミノ酸配列を有するVEGFR-2-FasL融合タンパク質をコードする。
【０２５１】
実施例3：キメラのマウス/ヒトFLAG-VEGFR/FasL融合タンパク質をコードする核酸の構築
FLAGエピトープタグを有するFlkFasLを発現するプラスミド、すなわちpFLAG/FlkhFasL(D1-D3/139-281;図6)を作製するために、pFLAG-CMV-3ベクターをSIGMA社から購入した。図6に示すように、pFLAG-CMV-3ベクターをNot Iで切断し、かつ、クレノウ(Klenow)酵素を用いて末端を充填した。プラスミドpBJ/FlkFasL(D1-D3/139-281)をAva Iで切断し、かつ、マングビーンヌクレアーゼを用いて平滑末端化した。結果として生じる断片は、シグナル配列の末端のアミノ酸Ala-19から、ドメイン3の末端のSer-336までのFlk-1細胞外ドメインをコードする。AvaI/Mung断片をNotI/Klenowで処理したpFLAG-CMV-3中にライゲーションすると、pFLAG-Flk(D1-D3)が生成し、この中で、Flk-1配列は、FLAGエピトープタグをコードするヌクレオチドの下流にインフレームで配置されている。pFLAGベクターにおけるFlkFasL cDNAの組立を完了するために、pBJ/FlkFasL(D1-D3/139-281)由来のBspEI/Bgl II断片をサブクローニングした。最終のプラスミドであるpFLAG-FlkFasLは、N末端にFLAGエピトープタグを有するFlkFasLをコードする。
【０２５２】
R1[D2]FasLタンパク質は、hFasLの三量体形成ドメインおよびFas受容体結合ドメイン(アミノ酸139〜281;図10)に融合された、ヒトVEGFR1の第2ドメイン(アミノ酸129〜230：SDTG〜NTII;図10)からなる。アミノ酸5個のリンカー配列(ARGTS)が、VEGFR1ドメインおよびFasLドメインの間に存在する(図10)。リンカー配列およびFasLドメインは、最初に説明されたR2FasLタンパク質と同一である。さらに、3'末端には、インフレームのプレプロトリプシンリーダー配列およびFLAGエピトープタグがあり、これらは、pFLAG3ベクター中に存在した(図10)。
【０２５３】
手短に言えば、R1[D2]FasL核酸配列を含むプラスミドを以下のようにして構築した。5'プライマーとして
2009505989.tif 000005
、および3'プライマーとして
2009505989.tif 000006
を用いて、VEGFR1を含むプラスミドからVEGFR1ドメイン2のcDNAを増幅させた(deVries et al., 1992, Science 255：989-991)。結果として生じるPCR断片をNotI制限酵素部位およびXhoI制限酵素部位中にサブクローニングして、pFLAG3/R1[D2]FasLプラスミドを得た。FLAGタグ付きr1[D2]FasLの核酸配列を図9に示す。
【０２５４】
実施例4：VEGFR/FasL融合タンパク質を含む馴化培地の作製
Cos-7細胞を用いて、FlkFasLタンパク質を含む馴化培地を作製した。SambrookおよびRussell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(第3版、2001)から改良したDEAE-デキストランプロトコールを用いて、Cos-7細胞をトランスフェクトした。手短に言えば、10cmプレート中で増殖させたCos-7細胞を、血清も抗生物質も含まない培地中で2回洗浄した。血清も抗生物質も含まない培地3mLを各プレートに添加し、かつ、DEAE-デキストラン溶液3mLを、DEAE/デキストランの最終濃度が0.4mg/mLになるように添加した。プラスミドDNA(pBJ/FlkFasLまたはネオマイシン耐性遺伝子のみをコードしている対照プラスミドpBJ/Neoのいずれか1μg〜3μg)を各プレートに添加し、かつ、プレートをインキュベーターに戻した。30分後または3時間後に、DEAE-デキストラン-DNA溶液を吸引し、かつ、各プレートを、血清を含む完全培地で洗浄した。24時間後、培地を無血清培地(Hybridoma-SFM, GIBCO)に交換した。72時間後に、プレートから馴化培地を回収し、0.2μMフィルターに通してろ過し、実験で使用するために4℃で保存した。FlkFasLタンパク質の発現を確認するために、DEAE-デキストラントランスフェクション後48時間目に、グリセロール/TritonX-100溶解緩衝液でCos-7細胞を溶解した。PAGEによって溶解物を分離し、かつ、VEGFR-2の細胞外ドメインに対する抗体(Pharmingen)を用いて免疫ブロットして、単量体、二量体、および三量体と一致する分子量サイズのFlkFasLの発現を確認した(図11A)。
【０２５５】
FLAGタグ付きR2FasLを分泌する安定にトランスフェクトされたCHO細胞も、作製した。手短に言えば、CHO細胞を、pFLAG/R2FasLとネオマイシン耐性を発現するベクターpBSR-αの10：1の比の混合物を用いてエレクトロポレーションした。48時間後、細胞を分割し、ネオマイシン(1mg/mL)を含む完全培地中で増殖させた。ネオマイシン中で増殖するコロニーを継代培養用に選択し、かつ、それらの馴化培地を、VEGFR2の細胞外ドメインに対する抗体(Pharmingen)を使用するウェスタンブロット法により、R2FasLの分泌に関してスクリーニングした。細胞の限界希釈によって陽性クローンを再選択し、かつ、馴化培地中へのR2FasLの分泌を、ウェスタンブロット法によって再確認した。抗FLAG抗体(Sigma)を用いた馴化培地のアフィニティクロマトグラフィーにより、FLAGタグ付きR2FasLタンパク質の発現が実証された(図11B)。
【０２５６】
R1[D2]FasLタンパク質を作製するために、DEAE-デキストランの媒介によるトランスフェクションを用いて、pFLAG3/R1[D2]FasLプラスミドをCos7細胞中にトランスフェクトした。96時間の時点で馴化培地を回収した。R1[D2]FasLを、抗FLAG抗体アフィニティクロマトグラフィー(Sigma社製のM2ゲル)を用いて馴化培地から精製し、かつ、FLAGエピトープペプチドを用いて溶出させた。
【０２５７】
実施例5：VEGFR/FasL融合タンパク質による細胞死滅は用量依存的である
ジャーカット細胞を24ウェルプレート中に播種し(ウェル当たり500μl中細胞500,000個)、かつ、対照プラスミドpSV/NeoまたはプラスミドpBJ/FlkFasLのいずれかでトランスフェクトしたCos-7細胞から得た、体積を漸増させた馴化培地で処理した。ジャーカット細胞を、VEGF-165(2nM、Peprotech社製)で、またはVEGF無しで、さらに処理した。32時間後、トリパンブルー染色後に、生細胞を計数した。代表的な結果を図12に示す。
【０２５８】
実施例6：VEGFR/FasL融合タンパク質による細胞死滅はVEGFの量に依存する
ジャーカット細胞を24ウェルプレート中に播種し(ウェル当たり500μl中細胞500,000個)、かつ、対照プラスミドpSV/NeoまたはプラスミドpBJ/FlkFasLのいずれかでトランスフェクトしたCos-7細胞から得た馴化培地25μL/ウェルで処理した。ジャーカット細胞を、様々な量のVEGF-165でさらに処理した。24時間後、トリパンブルー染色後に、生細胞を計数した。代表的な結果を図13に示す。
【０２５９】
実施例7：FlkFasLは、VEGFに依存的な様式でアポトーシスを誘導する
ジャーカット細胞を24ウェルプレート中に播種し(ウェル当たり500μl中細胞500,000個)、かつ、対照プラスミドpSV/NeoまたはプラスミドpBJ/FlkFasLのいずれかでトランスフェクトしたCos-7細胞から得た馴化培地1μL/ウェルまたは5μL/ウェルのいずれかで処理した。いくつかのウェルを、VEGF-165(2nM)で60分間、さらに処理した。アポトーシスの誘導を、FITC-アネキシンV陽性/ヨウ化プロピジウム陰性細胞のFACS解析によって評価した。代表的な結果を図14に示す。
【０２６０】
実施例8：VEGFR/FasL融合タンパク質は、乳癌細胞においてアポトーシスを誘導する
T-47Dヒト乳癌細胞を24ウェルプレート中に播種し(ウェル当たり500μl中細胞500,000個)、コンフルエントな状態になるまで増殖させた。細胞を、対照プラスミドpSV/NeoまたはプラスミドFlkFasLのいずれかでトランスフェクトしたCos-7細胞に由来する馴化培地25μL/ウェルで処理した。また、2nM VEGF-165で、またはVEGF無しで、細胞を処理した。処理後24時間目に細胞を撮影した。T-47D細胞によって産生された内因性VEGFの存在下で、FlkFasLはアポトーシスを誘導した(図13、中央)。外因性VEGFを添加すると、細胞死の激しい増加が観察され、FlkFasLアポトーシス活性がVEGFによって調節されていることが示唆される。代表的な結果を図15に示す。
【０２６１】
実施例9：VEGFR/FasL融合タンパク質は、乳癌細胞において、VEGFに依存的な様式で細胞傷害性を誘導する
T-47Dヒト乳癌細胞を24ウェルプレート中に播種し(ウェル当たり500μl中細胞500,000個)、コンフルエントな状態になるまで増殖させた。細胞を、対照プラスミドpSV/NeoまたはプラスミドFlkFasLのいずれかでトランスフェクトしたCos-7細胞に由来する馴化培地25μL/ウェルで処理した。また、2nM VEGF-165で、またはVEGF無しで、細胞を処理した。48時間後、LDH Cytotoxicity Detectionキット(Roche)によって、細胞傷害性を分析した。T-47D細胞によって産生された内因性VEGFの存在下で、FlkFasLは細胞傷害性を誘導した(図14、レーンB)。外因性VEGFを添加すると、細胞傷害性の激しい増加が観察され、FlkFasLアポトーシス活性がVEGFによって調節されていることが示唆される(図16、レーンD)。
【０２６２】
図14に示す結果(ジャーカット細胞におけるアポトーシスの誘導)を、図16に示す結果(乳癌細胞における細胞傷害性の刺激)と比較すると、アポトーシス誘導/細胞傷害性刺激のベースレベルが、対照の馴化培地の存在下で、VEGF添加の有無に関わらず、同様に低いことに気付く(図16のレーンAおよびBを図16と比較されたい)。VEGFの不在下で馴化培地を添加しても、ジャーカット細胞におけるアポトーシス誘導は増大しないが(図14)、同様の条件下で乳癌細胞を解析した場合、著しい増大が観察される(図16、レーンC)。乳癌細胞が内因性VEGFを発現および分泌することは公知である。したがって、乳癌細胞における細胞傷害作用の刺激の誘導は、FlkFasLへの内因性VEGFの結合、およびそれに続く、乳癌細胞表面のFasへの(VEGFポリペプチドが結合した)FlkFasL融合タンパク質の結合によって説明することができる。したがって、図16のレーンCにより、癌細胞によって分泌される内因性VEGFに対するアポトーシス応答が説明され、かつ、本発明の融合タンパク質のインビボ投与の卓越性が実証される。特に、外因性VEGFを添加すると、細胞傷害作用はさらに向上する。
【０２６３】
実施例10：R2FasLは、U87MGヒト神経膠芽腫細胞およびDU145ヒト前立腺癌細胞において細胞傷害性またはアポトーシスを誘導するが、U373ヒト神経膠芽腫細胞においては誘導しない
R2FasLがヒト神経膠芽腫において細胞傷害性を誘導するかを調査するために、以下の実験を実施した。U87MGヒト神経膠芽腫細胞を、96ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地100μL中に、25,000細胞/ウェルで播種し、かつ、培地を交換せずに、84時間増殖させた。次いで、FLAGエピトープタグアフィニティクロマトグラフィーによって精製したR2FasL溶液(0μL、0.01μL、0.1μL、1μL、または10μL)を、各ウェルに添加した(図17A)。さらに、各ウェルに、抗VEGF中和抗体、抗FasL中和抗体、または対照のヤギIg(すべてR&S Systems社製)300ngを与えた。24時間後、LDH 放出アッセイ法(Roche)を用いて、これらの細胞を細胞傷害性に関して分析した。このアッセイ法では、反応総体積200μLで、細胞上清10μLをLDH反応混合物100μLと混合する。細胞傷害性は、492nmでの吸光度を測定することにより、分光光度的に分析した。VEGFまたはFasLに対する中和抗体によって細胞傷害性が阻害されることから、R2FasLを媒介とした細胞傷害性のために両方が必要とされることが実証される(図17A)。
【０２６４】
R2FasLがヒト神経膠芽腫においてアポトーシスを誘導するかを調査するために、以下の実験を実施した。U87MGヒト神経膠芽腫細胞を、12ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地500μL中に、約287,500細胞/ウェルで播種した。24時間後に、pFLAG/R2FasLまたは空のpFLAGベクターのいずれかをトランスフェクトしたCos7細胞に由来する馴化培地を添加した(図17B)。R2FasLの濃度を、商業的に製造されているrhsFasL(R&S Systems)を標準物質として使用する定量的イムノブロッティングによって、別々に決定した。36時間以上後に、細胞をトリプシン処理し、トリパンブルーで染色し、かつ、血球計数器上で計数した。図17B中のデータは平均値±SEMとして示される。
【０２６５】
R2FasLがヒト前立腺癌細胞において細胞傷害性を誘導するかを調査するために、以下の実験を実施した。DU145ヒト前立腺癌細胞を、24ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地500μL中に播種し、かつ、培地を交換せずに、54時間増殖させた。pFLAG/R2FasLまたは空のpFLAGベクターのいずれかをトランスフェクトしたCos7細胞に由来する馴化培地を指定の量だけ添加した。34時間以上後に、前述のLDH放出アッセイ法を用いて、細胞傷害性を分析した。代表的なデータ一式を図17Cに示す。
【０２６６】
R2FasL活性のU87MG神経膠芽腫細胞に対する特異性を調査するために、U373神経膠芽腫細胞株に対するR2FasLの細胞傷害作用を分析した。U373細胞は、Fas受容体を介した死滅化に対して耐性であることが公知である。すなわち、U373細胞は、本質的には、R2FasLが構成的に毒性ではないことを示すための陰性対照である。U87MGヒト神経膠芽腫細胞およびU373ヒト神経膠芽腫細胞を、96ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地100μL中に、25,000細胞/ウェルで播種し、かつ、培地を交換せずに、96時間増殖させた。pFLAG/R2FasLベクターをトランスフェクトしたCos7細胞に由来する馴化培地を指定の量で添加した。36時間以上後に、本明細書において説明するLDH放出アッセイ法を用いて、細胞傷害性を分析した(図17D)。
【０２６７】
実施例11：R1[D2]FasLは、VEGFに依存的な様式でアポトーシスを誘導する
R1[D2]FasLが、VEGFに依存的な様式でアポトーシスを誘導するかを調査するために、以下の実験を実施した。ジャーカットE6.1ヒトT細胞を、96ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地100μL中に播種した。pFLAG/R1[D2]FasLベクターをトランスフェクトしたCos7細胞に由来する馴化培地(0.001μL、0.01μL、0.1μL、1μL、または10μL)を、rhVEGF-165の不在下または存在下(最終濃度2nM)で添加した。22時間後に、レサズリンアッセイ法(BioSource社製のAlamarBlue試薬)を用いて、細胞生存率を分析した。生細胞によるAlamarBlue基質から生成物への変換は、各ウェルにAlamarBlue 20 μLを添加し、540nmおよび620nMでの吸光度を測定することによって決定した。基質から生成物への変換率(％)の計算は、製造業者のプロトコールに従って実施した。R1[D2]FasLが、VEGFに依存的な様式でアポトーシスを誘導することを示す代表的なデータ一式を図18Aに示す。
【０２６８】
どの増殖因子がR1[D2]FasLを活性化するかを調査するために、以下の実験を実施した。ジャーカットE6.1ヒトT細胞を、96ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地100μL中に播種した。pFLAG/R1[D2]FasLベクターをトランスフェクトしたCos7細胞に由来する馴化培地を、rhVEGF-165(組換えヒトVEGF-165)、rmVEGF-164(組換えマウスVEGF-164)、rhVEGF-121(組換えヒトVEGF-121)、rhVEGF-165/rhPlGF-129ヘテロ二量体、またはrhPlGF-129の不在下または存在下で添加した(2μL/ウェル)。増殖因子はすべて最終濃度10nMで使用し、Peprotech社またはR&D Systems社から入手した。19時間後、前述のレサズリンアッセイ法を用いて、細胞生存率を分析した。代表的なデータを図18Bに示す。これらの結果は、R1[D2]FasLが、これらの実験において試験された増殖因子すべてによって活性化されることを示す。
【０２６９】
同様の実験において、試験される増殖因子の濃度を変更した。手短に言えば、ジャーカットE6.1ヒトT細胞を、96ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地100μL中に播種した。pFLAG/R2FasLベクターまたは空のpFLAGベクターのいずれかをトランスフェクトしたCos7細胞に由来する馴化培地を、最終濃度0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、および10nMのrhVEGF-165またはrmVEGF-165の不在下または存在下で添加した(1μL/ウェル)。18時間後、本明細書において説明するレサズリンアッセイ法を用いて、細胞生存率を分析した。図21Aに示すデータは、ヒトおよびマウスのVEGF-165が同様にR2FasLを活性化することを実証する。
【０２７０】
R1[D2]FasLに対するhVEGF-165のED50を決定するために、以下の実験を実施した。ジャーカットE6.1ヒトT細胞を、96ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地100μL中に播種した。pFLAG/R1[D2]FasLベクターをトランスフェクトしたCos7細胞に由来する馴化培地を、0nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1,000nM、または10,000nMのrhVEGF-165の不在下または存在下で、添加した(2μL/ウェル)。19時間後、前述のレサズリンアッセイ法を用いて、細胞生存率を分析した。R1[D2]FasLに対するhVEGF-165のED50は、約100pMであることが判明した(図18C)。
【０２７１】
同様の実験において、R2FasLに対するhVEGF-165のED50を決定した。手短に言えば、ジャーカットE6.1ヒトT細胞を、96ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地100μL中に播種した。pFLAG/R2FasLベクターをトランスフェクトしたCos7細胞に由来する馴化培地を、最終濃度0nM、0.02nM、0.02nM、0.2nM、および2nMのrhVEGF-165の不在下または存在下で、指定の量だけ添加した。18時間後、レサズリンアッセイ法を用いて、細胞生存率を分析した。rhVEGF-165のED50は、20pM〜200pMの間であった(図21B)。
【０２７２】
実施例12：R2FasL活性は、化学療法剤によって増強される
R2FasLの活性が化学療法剤によって増強され得るかを決定するために、以下の実験を実施した。U87MGヒト神経膠芽腫細胞を、96ウェルプレート中の10％ウシ胎児血清を含む完全培地100μL中に、25,000細胞/ウェルで播種した。48時間後、ビスインドリルマレイミドVIII(Bis VIII、最終濃度1μM)、カンプトセシン(最終濃度20nM)、エトポシド(最終濃度5μM)、またはDMSO溶媒のいずれかで処理した(1μL/ウェル)。Bis VIII、カンプトセシン、およびエトポシド(すべてBiomol社製)を、DMSO中に溶解し、1μL/ウェルずつ添加した。薬物曝露から72時間後に、FLAG抗体でアフィニティ精製したR2FasL溶液(10μL/ウェル)で細胞を処理し、かつ、さらに40時間、インキュベートした。前述したように、レサズリンアッセイ法およびLDG放出アッセイ法をそれぞれ用いて、細胞生存率および細胞傷害性を分析した。図19Aおよび図19Bに示す結果により、R2FasLの活性が、これらの実験において試験された化学療法剤によって増強されることが実証される。
【０２７３】
実施例13：R2FasLは、大血管内皮細胞において細胞傷害性を誘導しないが、微小血管内皮細胞においては活性を有する
R2FasLが大血管内皮細胞において細胞傷害性を誘導するかを決定するための微小血管および大血管は、デス因子受容体および増殖因子受容体の様々な集団を発現し得る。R2FasLは、腫瘍内皮細胞(微小血管)において差次的に活性であり、かつ、動脈および静脈など正常な大血管内皮細胞に対して毒性が低い場合がある。R2FasLが、大血管内皮細胞において細胞傷害性を誘導するかを判定するために、以下の実験を実施した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(大血管内皮細胞;HUVEC、第4代、Clonetics社製)を96ウェルプレート中の、10％ウシ胎児血清を含むがVEGFを含まない供給培地100μL中に播種した。24時間後に、血清を除去することによって、(デスシグナルに対して細胞を感受性にするために)血清飢餓を開始した。血清飢餓から15時間後に、rhVEGF-165の不在下または存在下(最終濃度2nM)で、R2FasLを含むCos7細胞馴化培地(10μL/ウェル)で細胞を処理した。R2FasL±rhVEGFによる処理から22時間後に、本明細書において説明するレサズリンアッセイ法を用いて、細胞の生存率を分析した。これらの大血管内皮細胞に対してR2FasL+VEGFの効果は全く認められなかった(図20A)。
【０２７４】
R2FasLが、微小血管内皮細胞において細胞傷害性を誘導するかを判定するために、以下の実験を実施した。ウシ副腎皮質内皮細胞(微小血管内皮細胞)を、96ウェルプレート中の、1％ウシ胎児血清を含む完全培地100μL中に播種した。22時間後に、pFLAG/R2FasLベクターまたは空のpFLAGベクターのいずれかをトランスフェクトしたCos7細胞に由来する馴化培地を、rhVEGF-165の不在下または存在下(最終濃度2nM)で添加した(2μL/ウェル)。24時間後に、前述のLDH放出アッセイ法を用いて、細胞傷害性を分析した。図20Bは、R2FasLおよびVEGFが、副腎皮質内皮細胞において細胞傷害性を誘導することを示す。したがって、R2FasLは、大血管内皮細胞(例えばHUVEC)に対する活性を有さないが、微小血管内皮細胞に対する活性は有する。
【０２７５】
実施例14：VEGFR-FasLのインビボ試験
本発明の融合タンパク質の活性はまた、インビボで、例えば、アジュバント関節炎モデルにおいて試験することもできる。「アジュバント関節炎モデル」という用語は、本明細書において、フロイントのアジュバント0.1mLを尾の付け根に注射することによって疾患を誘導した、当業者には一般に公知であるラット、好ましくはウィスター・ルイスラットまたは他のラット系統を意味するのに使用される。このアジュバント関節炎モデルは、本発明の化合物を試験するのに使用できる動物モデルの1例にすぎない。3種の最も一般的な動物モデルの総説については、任意の図面、図、または表を含む、その全体が参照により本明細書に含まれる、OliverおよびBrahn(1996)J.Rheumatol. 23：56-60を参照されたい。
【０２７６】
いくつかの動物モデルが、腫瘍血管新生におけるVEGFの機能を調査するために開発された。例えば、ラットC6神経膠腫細胞およびヒトU87MG神経膠芽腫細胞は、VEGFを分泌し、かつ、無胸腺マウスの皮下で増殖する(Saleh et al., Cancer Res(1996)56：393-401; Cheng et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA(1996), 93：8502-8507)。VEGF mRNAに対するアンチセンス構築物をこれらの細胞株に導入すると、それらのインビボでの増殖、ならびに新血管新生の程度が低減する。VEGFに対するモノクローナル抗体は、無胸腺マウスにおけるヒト横紋筋肉腫、神経膠芽腫、平滑筋肉腫(Kim et al., Nature(1993), 362：841-844)、および線維肉腫(Asano et al., Cancer Res(1995), 55：5296-5301)の皮下増殖を阻害する。線維肉腫(Asano et al., Cancer Res(1995), 55：5296-5301)および結腸癌腫瘍(Warren et al., J Clin Invest(1995), 95：1789-1797)の転移もまた、抗VEGF抗体によって阻止された。したがって、これらの動物モデルは、本発明の融合タンパク質のインビボでの活性を試験するのに有用であると考えられる。
【０２７７】
前述の本発明は、明確性および理解のために、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱すること無く、いくつかの変更および修正を加え得ることは、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかになると考えられる。
【０２７８】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが具体的かつ個別に参照により組み入れられるように示されるかのように、参照により本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１】VEGFR-FasLによって例示されるような、本発明の融合タンパク質の模式図を示す。この図は、(i)単量体の融合タンパク質、(ii)顕著なアポトーシスを誘導することができない非機能的FasLを生成する、VEGFの不在下の三量体融合タンパク質、および(iii)アポトーシスを誘導することができる機能的FasLを生成する、VEGFによって誘導された融合タンパク質のオリゴマー形成を示す。V：Vは、2つのVEGF分子の結合を示す。
【図２】ヒト(H)(GenBankアクセッション番号P48023)、マウス(M)(GenBankアクセッション番号A53062)、およびラット(R)(GenBankアクセッション番号A49266)由来のFasLタンパク質配列のアライメントを示す。ヒトFasLに同一なマウスFasLおよびラットFasLのアミノ酸残基は、アスタリスクによって示す。細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、切断位置、三量体形成ドメイン、および受容体結合ドメインを示す。FasL-Fas結合ドメインのN末端境界は、まだ解明されていない。
【図３】ヒト(GenBankアクセッション番号NP-002244)、マウス(GenBankアクセッション番号P35918)、およびラット(GenBankアクセッション番号NP_037914))由来のVEGFR-2タンパク質配列の細胞外領域および膜貫通領域と、ヒトVEGFR-1(GenBankアクセッション番号NM_002019)とのアライメントを示す。ヒトVEGFR-2に同一なマウスVEGFR-2およびラットVEGFR-2のアミノ酸残基は、アスタリスクによって示す。VEGFR-2配列のシグナル配列、IgG様ドメイン1〜7、および膜貫通ドメインを示す。
【図４】ヒトニューロピリン-1の細胞外ドメイン(Genbank AAC12921の一部分)の注釈付き配列を示す。同定されているドメインを示す。Bドメインは、VEGFの結合に関与している。
【図５】VEGFR/FasL融合タンパク質をコードしている核酸、Flk(D1-D3)+FasL(139-281)の構築を示す。詳細は、実施例2において説明する。
【図６】VEGFR/FasL融合タンパク質をコードしている核酸、FLAG/FlkhFasL(D1-D3/139-281)の構築を示す。詳細は、実施例3において説明する。
【図７】FlkFasLのcDNA配列を示す。Flk-1シグナル配列および細胞外ドメイン配列に対するヌクレオチド配列に下線を引く。リンカーのヌクレオチド配列は、正常なフォントで示し、FasLのヌクレオチド配列は、ボールド体で示す。
【図８】FlkFasLのアミノ酸配列を示す。Flk-1シグナルペプチドのアミノ酸配列は、イタリック体で示す。Flk-1細胞外ドメインのアミノ酸配列には下線を引く。リンカーのアミノ酸配列は、正常なフォントで示し、FasLのアミノ酸配列は、ボールド体で示す。
【図９】FLAGタグ付きR1[D2]FasLの核酸配列を示す。イタリック体はプレプロトリプシンリーダー配列であり、下線の箇所は、FLAGエピトープタグ配列であり、下線かつ太字の箇所は、VEGFR1ドメイン2であり、標準フォントは、ARGTSをコードしているリンカー配列であり、太字は、FasL三量体形成ドメインおよびFas受容体結合ドメインである。詳細は、実施例3において説明する。
【図１０】アミノ酸残基を表す一文字コードを用いて、R1[D2]FasLのアミノ酸配列を示す。詳細は、実施例3において説明する。
【図１１】図11Aは、Cos-7細胞におけるFlkFasL三量体の発現を示す。DEAE-デキストランプロトコールを用いて、対照プラスミドpSV/Neo(レーンA)またはプラスミドpBJ/FlkFasL(レーンB〜D)をCos-7細胞にトランスフェクトした。レーンBでは、プラスミドDNA 1μgを細胞に30分間トランスフェクトし、レーンCでは、プラスミドDNA 3μgを細胞に30分間トランスフェクトし、レーンDでは、プラスミドDNA 3μgを細胞に3時間トランスフェクトした。トランスフェクション後44時間目に、細胞を溶解し、溶解物をPAGEによって電気泳動させ、かつ、VEGFR-2の細胞外ドメインに対する抗体を用いて免疫ブロットした。図11Bは、安定にトランスフェクトされたCHO細胞によるR2FasLの発現を示す。ウェスタンブロットは、抗VEGFR2抗体を用いた、馴化培地中およびFLAGタグ精製後のR2FasLの検出を示す。詳細は、実施例4において説明する。
【図１２】VEGFに依存的な様式での、FlkFasLによるジャーカット細胞の死滅化を示す。FlkFasLを含む様々な量の馴化培地を、ジャーカット細胞に添加した。データは、血球計数器の1区画当たりの平均細胞数±SEMとして示す。一部のデータポイントでは、SEMは使用した記号より小さい。詳細は、実施例5において説明する。
【図１３】FlkFasLによるジャーカット細胞の死滅化が、VEGFの量に依存していることを示す。様々な量のVEGF-165をジャーカット細胞に添加した。データは、血球計数器の1区画当たりの平均細胞数±SEMとして示す。一部のデータポイントでは、SEMは使用した記号より小さい。詳細は、実施例6において説明する。
【図１４】VEGFに依存的な様式での、FlkFasLによるアポトーシスの誘導を示す。ジャーカット細胞を、1μLまたは5μLの指定の体積の、対照の馴化培地(C)またはFlkFasLを含む馴化培地(F)と共に、インキュベートした。2nM VEGF-165(V)で、または無しで(-)、60分間、細胞をさらに処理した。アポトーシスの誘導を、アネキシンV陽性/ヨウ化プロピジウム陰性細胞のFACS解析によって評価した。詳細は、実施例7において説明する。
【図１５】ヒト乳癌細胞株におけるアポトーシスの誘導を示す。T-47Dヒト乳癌細胞を、対照プラスミドpSV/NeoをトランスフェクトしたCos-7細胞由来の馴化培地(対照CM)25μLまたはプラスミドFlkFasLをトランスフェクトしたCos-7細胞由来の馴化培地(FlkFasL CM)25μLで処理した。右のパネルでは、2nM VEGF-165で細胞をさらに処理した。処理後24時間目に、細胞を撮影した。中央のパネルは、FlkFasLによって細胞死がほとんど誘導されていないことを示す。右のパネルにおいて細胞死が大幅に増加していることから、FlkFasLアポトーシス活性がVEGFによって調節されていることが示される。詳細は、実施例8において説明する。
【図１６】ヒト乳癌細胞株におけるFlkFasLによる細胞傷害性の刺激を示す。T-47Dヒト乳癌細胞を、対照プラスミドpSV/Neo(B)またはプラスミドFlkFasL(CおよびD)をトランスフェクトしたCos-7細胞由来の馴化培地25μLで処理した。Dの細胞は、2nM VEGF-165でも処理した。レーンAでは、馴化培地を添加しなかった。処理後24時間目に、細胞を撮影した。48時間後、細胞培養上清中への乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出を定量することによって、細胞傷害性応答を分析した。詳細は、実施例9において説明する。
【図１７】R2FasLが、U87MGヒト神経膠芽腫細胞およびDU145ヒト前立腺癌細胞において細胞傷害性またはアポトーシスを誘導するが、U373ヒト神経膠芽腫細胞においては誘導しないことを示す。図A：R2FasLは、U87MG細胞において細胞傷害性を誘導し、これは、VEGFに対する中和抗体(抗VEGF Ab)またはFasLに対する中和抗体(抗FasL Ab)によって阻害される。図B：R2FasLは、U87MG神経膠芽腫細胞において細胞死を誘導し、これは、VEGFに対する中和抗体(抗VEGF Ab)またはFasLに対する中和抗体(抗FasL Ab)によって阻害される。図C：R2FasLは、DU145ヒト前立腺癌細胞において細胞傷害性を誘導する。CM：馴化培地。D：R2FasLは、U373神経膠芽腫細胞においては、細胞傷害性を誘導しない。詳細は、実施例10において説明する。
【図１８】R1[D2]FasLのアポトーシス活性を示す。図A：R1[D2]FasLは、VEGFに依存的な様式でアポトーシスを誘導する。組換えヒトVEGF(rhV165)を、濃度2nMで添加した。対照には、VEGFを添加しなかった(No V)。図B：R1[D2]FasLは、ヒトおよびマウスのVEGF-165、ヒトVEGF-121、ヒトのVEGFとPlGFのヘテロ二量体、ならびにヒトPlGFによって活性化される。図C：R1[D2]FasLに対するhVEGF-165のED50は、約100pMである。詳細は、実施例11において説明する。
【図１９】化学療法剤によるR2FasL活性の増強を示す。図A：Bis VIII、カンプトセシン、およびエトポシドによる、U87MG神経膠芽腫細胞に対するR2FasLアポトーシス活性の増強。図B：Bis VIII、カンプトセシン、およびエトポシドによる、U87MG神経膠芽腫細胞に対するR2FasL細胞傷害活性の増強。詳細は、実施例12において説明する。
【図２０】図20Aは、R2FasL+VEGFが、ヒト臍帯静脈内皮細胞において細胞傷害性を誘導しないことを示す。図20Bは、R2FasL+VEGFが、ウシ副腎皮質内皮細胞(微小血管内皮細胞)において細胞傷害性を誘導することを示す。詳細は、実施例13において説明する。
【図２１】図21Aは、R2FasLが、ヒトVEGF-165およびマウスVEGF-165(それぞれ、hVEGFおよびmVEGF)の両方によって活性化されることを示す。図21Bは、VEGF-165のED50が、20pM〜200pMの間であることを示す。詳細は、実施例14において説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月18日(2008.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2009505989.tif 000047
2009505989.tif 000048
2009505989.tif 000049