(57)【要約】  本発明は、プロテアソーム活性調節剤の細胞内スクリーニング方法に関し、該方法は、下記の工程を含むことを特徴とする：  (a) 試験すべき候補薬を、核心において下記を含む融合タンパク質を発現する組換え酵母細胞と接触させる工程：    (i) p21WAF1/Cip1ポリペプチドおよびp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドから選ばれるp21ポリペプチド；および、    (ii) 少なくとも１種の検出可能なタンパク質；  (b) 前記酵母細胞内の前記第１の検出可能なタンパク質を、前記候補薬を前記細胞と接触させた後の少なくとも１回の所定時間間隔の終了時に定量する工程；  (c) 工程(b)において得られた値を、工程(a)を前記候補薬の不存在下に実施するときに得られる対照値と比較する工程。
2009512432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含むことを特徴とする、プロテアソーム活性調節剤の細胞内スクリーニング方法：
(a) 試験すべき候補薬を、核心において下記を含む融合タンパク質を発現する組換え酵母細胞と接触させる工程：
(i) p21WAF1/Cip1ポリペプチドおよびp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドから選ばれるp21ポリペプチド；および、
(ii) 少なくとも１種の検出可能なタンパク質；
(b) 前記酵母細胞内の前記第１の検出可能なタンパク質を、前記候補薬を前記細胞と接触させた後の少なくとも１回の所定時間間隔の終了時に定量する工程；
(c) 工程(b)において得られた値を、工程(a)を前記候補薬の不存在下に実施するときに得られる対照値と比較する工程。
【請求項２】
工程(a)が下記の工程を含む、請求項１記載の方法：
(a1) 核心において前記p21ポリペプチドと少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質を発現する前記酵母細胞を培養する工程；
(a2) 前記p21ポリペプチドと少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質の前記酵母細胞による発現を停止する工程；
(a3) 工程(a2)の終了時に得られた酵母細胞を前記試験すべき候補薬と接触させる工程。
【請求項３】
前記p21ポリペプチド含有融合タンパク質中に含ませる検出可能なタンパク質が、抗原、蛍光タンパク質、および酵素活性を有するタンパク質から選ばれる、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記検出可能なタンパク質が、mAGタンパク質またはその誘導体、およびGFPタンパク質またはその誘導体から選ばれる蛍光タンパク質からなる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記検出可能なタンパク質が、ルシフェラーゼおよびβ-ラクタマーゼから選ばれる酵素活性を有するタンパク質からなる、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記検出可能なタンパク質が、HaペプチドおよびFlagペプチドから選ばれる抗原からなる、請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記p21WAF1/Cip1ポリペプチドを含むタンパク質が、SEQ ID No 3のタンパク質からなる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記p21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドを含むタンパク質が、SEQ ID No 4のタンパク質からなる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程(b)において、前記第１の検出可能なタンパク質が抗原である場合、該第１の検出可能なタンパク質を、該タンパク質と該タンパク質を認識する抗体間で形成された複合体を検出することによって定量する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程(b)において、前記第１の検出可能なタンパク質が蛍光タンパク質である場合、該検出可能なタンパク質を、該タンパク質が発出する蛍光シグナルを測定することによって定量する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
工程(b)において、前記第１の検出可能なタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合、該検出可能なタンパク質を、該タンパク質によって形質転換された基質量を測定することによって定量する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記組換え酵母細胞を、下記を含むポリヌクレオチドによって形質転換する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法：
(a) (i) p21ポリペプチド(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)および(ii) 検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質をコード化する読取り枠；および、
(b) 酵母細胞内で官能性であり、前記読取り枠の発現を制御する調節配列。
【請求項１３】
前記第１のポリヌクレオチド中に含ませた調節配列が、前記酵母細胞内で官能性であり、誘発剤の作用に対して感受性であるプロモーターを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
誘発剤の作用に対して感受性である前記プロモーターが、酵母サッカロミセス セレビジエ(Saccharomyces cerevisae)のCUP1、GAL1、GAL10、MET3、MET25、PHO5およびTHI4から選ばれる、酵母細胞内で官能性である抑制プロモーターからなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記融合タンパク質をコード化する前記ポリヌクレオチドが、前記融合タンパク質をコード化する読取り枠の発現を活性化させるGAL1調節配列を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記組換え酵母細胞が、そのゲノム内に組込んだ形のポリヌクレオチドを有する、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記組換え酵母細胞が、そのゲノム内に、原形質膜内に組込んだトランスポータータンパク質の発現を制御する不活化形の１種以上の遺伝子を有する、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記不活化遺伝子を、PDR1およびPDR3遺伝子から選択する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記p21ポリペプチドおよび少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む前記融合タンパク質をコード化する読取り枠と、酵母細胞内で官能性であり且つ前記読取り枠の発現を制御する調節配列とを含むコード化ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、酵母細胞内で官能性の発現カセット。
【請求項２０】
前記p21ポリペプチドが、p21WAF1/Cip1ポリペプチドおよびp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドから選ばれる、請求項１９記載の官能性発現カセット。
【請求項２１】
前記p21ポリペプチドが、SEQ ID No 1のp21WAF1/Cip1ポリペプチドおよびSEQ ID No2のp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドから選ばれる、請求項２０記載の官能性発現カセット。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチド中に含ませた調節配列が、前記酵母細胞内で官能性であり、誘発剤の作用に対して感受性であるプロモーターを含む、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の発現カセット。
【請求項２３】
前記酵母細胞内で官能性である前記誘発性プロモーターが、酵母サッカロミセス セレビジエのCUP1、GAL1、GAL10、MET3、MET25、PHO5およびTHI4から選ばれる、請求項２２記載の発現カセット。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれか１項記載の発現カセットを含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項２５】
pCSYAQ6-p21 [wt]ベクターである、請求項２４記載の発現ベクター。
【請求項２６】
pCSYAQ6-p21 [6KR]ベクターである、請求項２４記載の発現ベクター。
【請求項２７】
そのゲノム内に組込んだ形で、(a) p21ポリペプチドおよび少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質をコード化する読取り枠と、(b) 酵母細胞内で官能性であり且つ前記読取り枠の発現を制御する調節配列とを含むポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組換え酵母株。
【請求項２８】
前記p21ポリペプチドが、p21WAF1/Cip1ポリペプチドおよびp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドから選ばれる、請求項２７記載の組換え酵母株。
【請求項２９】
前記p21ポリペプチドが、SEQ ID No 1のp21WAF1/Cip1ポリペプチドおよびSEQ ID No2のp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドから選ばれる、請求項２８記載の組換え酵母株。
【請求項３０】
請求項１９〜２３のいずれか１項記載の発現カセットを含有する発現ベクターを含むことを特徴とする、プロテアソーム活性調節剤のスクリーニング用キット。
【請求項３１】
請求項１９〜２３のいずれか１項記載の発現カセットをゲノム内に組込んだ形で含有する組換え酵母細胞を含むことを特徴とする、プロテアソーム活性調節剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、プロテアソームタンパク質分解活性を調節することのできる生物学的に活性な薬物の、とりわけ、癌、炎症性疾患、細菌または真菌感染症、筋肉悪液質(muscular cachexia)または神経変性疾患の予防または治療を意図する治療上興味ある薬物のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチン-プロテアソーム経路
ヒト細胞内のいずれのタンパク質の濃度もその合成速度と分解速度との均衡に依存している。ユビキチン-プロテアソーム経路は、ヒト細胞内の主要タンパク質分解メカニズムを代表する。ユビキチン-プロテアソーム経路介在タンパク質分解は、経時的に極めて精確に調節され制御されている生物学的プロセスである。そのようなプロセスは、大多数の例において、２つの主要連続段階を含む：(i) ユビキチンポリマーを共有的に付加することによる、分解さるべきタンパク質のラベル化、および(ii) そのようにしてラベル化されたタンパク質のプロテアソームによる破壊(タンパク質は小不活性ペプチドに開裂する) (GlickmanおよびCiechanover、2002年)。ユビキチンポリマーを付加することによって変性されることなしに、プロテアソームにより破壊される多くのタンパク質が知られている。同様に、ユビキチンの関与なしにプロテアソームを含有するタンパク質のプロテアソームによる分解に至るペプチド配列も同定されている(FAT10ペプチド単位同様に、Hipp等、2005年)。
ユビキチン-プロテアソーム経路は、極めて多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。プロテアソーム介在タンパク質分解メカニズムは、事実、DNA修復、遺伝子発現の制御、細胞周期進行の調節、新合成タンパク質特性の制御、アポトーシスまたは免疫応答のような本質的な細胞メカニズムに関与している(GlickmanおよびCiechanover、2002年)。
調節タンパク質の異常分解を生じるユビキチン-プロテアソーム経路の機能不全は、数種の遺伝子疾患並びに癌(結腸直腸癌、リンパ腫等)、炎症性症候群、パ−キンソン病のような神経変性疾患または筋萎縮症(悪液質)のような多くの病変の原因であるかまたは密接に関与していることが知られている。病原性ウイルスおよび細菌によるユビキチン-プロテアソーム経路の傍流(ヒトタンパク質の病変的分解のような)は、多くの感染症戦略の基礎となる。
従って、ユビキチン-プロテアソーム分野は、新薬開発における有意の可能性を提供している。
【０００３】
プロテアソーム
ヒト細胞プロテアソームは、極めて大サイズ(> 2.4MDa)の多タンパク質複合体であり、ヒト細胞原形質および核心において見出されている。ヒト細胞中に存在するプロテアソームの生化学的精製並びに酵母のような他の真核生物種由来のプロテアソームの精製により、全ての真核生物体において、プロテアソーム精製形は、２つの主要サブユニット、即ち、20Sプロテアソームと称するタンパク質分解性コア、および該20Sプロテアソームの両端の各々に結合している調節複合体19Sを有することが明らかになっている(Coux等、1996年；GlickmanおよびCoux、2001年)。20Sプロテアソームは、中空円筒形状を有する粒子であり、４個のヘプタマー環上に分布する28のサブユニットからなる。ペプチダーゼ活性は、円筒内表面上に存在し、アロステリックな形で互いに影響し合っている。３種の20Sプロテアソーム関連タンパク質分解活性(“トリプシン-、キモトリプシン-またはカスパーゼ様”)が存在し、これらは、一緒になって、タンパク質を3〜20個のアミノ酸長の不活性ペプチドに分解するのに寄与している。20Sプロテアソーム以外に、26Sプロテアソームは、調節複合体19Sを含む。0.7MDaを有するこの調節複合体19Sは、およそ20のサブユニットを含み、２つの主要サブドメイン、即ち、ユビキチン化タンパク質を認識するのに必要な“被覆部”および20Sプロテアソームへの結合を確保する基部に区分化し得る。この基部は、集合して環を形成する6個のATPアーゼを含む；ATP加水分解は、ユビキチン化タンパク質の活発な分解においてのみならず、そのようなタンパク質の開鎖および線状化工程(これらの工程は、これらのタンパク質のタンパク質分解前に起る)においても実際に必要とする。キャップ調節サブユニットは、多ユビキチン化タンパク質認識に関与し、また、他のサブユニットは、分解さるべきタンパク質を開鎖するのに必要である脱ユビキチン化段階に参与する。
例えば免疫精製法を使用するより最近の研究は、細胞プロテアソームが、20Sおよび19Sプロテアソームに密接に関連する多くのタンパク質を含むことを証明しており、従って、細胞プロテアソームの構造的複雑性は、26Sプロテアソームの構造的複雑性よりも高いことを大いに示唆している。そのようなタンパク質としては、例えば、PA200ヒトタンパク質がある(その酵母ホモログは、240kDaのBlm10タンパク質(Schmidt等、2005年)、またはPA28αβまたはPA28αγアクチベーター(Wojcik等、1998年；Ustrell、2002年)である)。そのようなタンパク質の機能的役割は十分には解明されていないが、これらのタンパク質は、ユビキチン化タンパク質の、プロテアソーム、即ち、ポリユビキチン鎖延長に関与し且つ上記タンパク質のペプチダーゼ部位への転移速度を増大させるように作用するプロテアソームまたはHul5のような酵素(Leggett等、2002年)によるユビキチン化タンパク質認識を調節するタンパク質への転移を確実にするものと信じられている。細胞プロテアソームは、80％よりも多くの細胞タンパク質の分解に関与していると信じられている。
【０００４】
プロテアソームおよび癌
最近、プロテアソーム介在タンパク質分解は、腫瘍細胞生存において不可欠である生物学的プロセスを代表することが証明されている。事実、多くの研究において、多くのタイプの悪性細胞が正常細胞よりもプロテアソームインヒビターに対して感受性であることが明白に示唆されている。種々の癌性細胞モデルに対して行ったプロテアソームインヒビターによる生体外および生体内アッセイにおいては、この群の分子が、これら分子を癌に対する新たな治療手段を開発するための魅力的な候補とする特定の性質を有することが証明されている。最後に、プロテアソーム活性を抑制することにより、アポトーシスが誘発され、癌性細胞の伝統的な化学療法および放射線療法に対する感受性は増強される。同様に、プロテアソームの抑制は、化学療法および放射線療法抵抗性を実質的に低下させることも観察されている(Adams、2004年；BurgerおよびSeth、2004年)。
P21、p27およびp53タンパク質のような、細胞周期および恒常性において重要であるレギュレーターの分解の抑制は、プロテアソーム抑制が腫瘍細胞の増殖および生存に影響を与えるメカニズムとして関与する。重要なことに、プロテアソームの抑制は、細胞レギュレーターNF-kBの活性化(その異常活性化は、多くの血液癌における特徴である)を阻止することも証明されている。プロテアソームインヒビターの特性決定により、これらのインヒビターがアポトーシスを誘発し(Pei等、2003年)、腫瘍細胞を死滅させ(Beverly等、1999年)、放射線に対する感受性を増大させ(AdamsおよびAnderson、2001年)、薬物耐性に対抗し得る(Hideshima等、2001年)ことが明らかになっている。さらに、プロテアソームの抑制は、化学療法または放射線療法中に誘発される抗アポトーシスシグナルを遮断することも実証されている。
また、悪性細胞のプロテアソームインヒビターに対する特異的感受性は、１以上のチェックポイントメカニズムの機能不全に関連する悪性細胞の急速な増殖に由来し得ることも強調しなければならない。結果として、これらの欠陥は、悪性細胞内に極めて多くの欠陥タンパク質の急速な集積をもたらし、この集積は、正常細胞と比較したとき、はるかに強く著しい形で生じる。変異体および/または不正確な折畳みタンパク質のそのような急速且つ有意の集積は、確実に、悪性細胞の活性プロテアソームに対する依存性を増大させ、従って、悪性細胞をプロテアソームインヒビターに対して高度に感受性にするようである(Adams、2004年)。
【０００５】
プロテアソームインヒビターは、合成または天然のインヒビターであり得る。今日まで、次の５種類の主要インヒビター群が開示されている：ペプチドアルデヒド類、ペプチドビニルスルホン類、ペプチドホウ素誘導体類、ペプチドエポキシケトン誘導体類およびβ-ラクトン類。しかしながら、現在のところ、その抗癌性が実証された後に臨床段階まで開発されたのは、次の２つの化合物だけである：Millennium社(米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)により開発されたボルテゾミブ(bortezomib) (以前のPS-341)、およびNereus社(米国カリフォルニア州サンディエゴ)により開発されたNPI-0052化合物。
ジペプチドのホウ素誘導体であるボルテゾミブは、結腸直腸癌系、中枢神経系に由来する悪性系、前立腺および乳癌系のような広範囲の癌系に対する実際の有効性を立証した。ボルテゾミブは、臨床試験において試験された最初のプロテアソームインヒビターである。骨髄腫を患っており、２回の上記最初の治療が不成功であった患者に対して行った第II相および第III相試験における肯定的な結果は、ボルテゾミブの有効性を実証し、伝統的治療に対して耐性の骨髄腫の治療用として、2003年にFDAによりボルテゾミブ販売承認に至っている。ボルテゾミブは、品名VelcadeRとして販売されている。
【０００６】
ボルテゾミブは、20Sプロテアソームの３種のタンパク質分解活性の１つ(いわゆる“キモトリプシン様活性)を極めて特異的に抑制する。その作用はアポトーシスを誘発し、その効果は、アポトーシス促進(proapoptotic)経路活性化によるのと同様に、さらにまた、抗アポトーシス経路抑制によるのと同様に適応するようである(Hideshima等、2001年；Beverly等、1999年)。
VelcadeR耐性細胞の出現およびこの化合物がその高毒性故に限られた適用しか有していないという事実は、新たなプロテアソームインヒビター開発の必要性を発生させている。とりわけ、既知のプロテアソームインヒビターは、その毒性について説明することのできる触媒性プロテアソームインヒビターであるので、非触媒性プロテアソームインヒビターを開発し得ることに興味を有するであろう。そのような非触媒性インヒビターは、19S調節複合体および細胞プロテアソームが機能するのを必要とする関連タンパク質（即ち、細胞中に存在するような）の活性を抑制することによって活性であり得る。重要なことには、現在までの既知の開発されたインヒビターは、20S触媒性円筒体内で自由に拡散するペプチドのような非天然基質に対する精製プロテアソームタンパク質分解活性を報告している生体外生化学試験によって同定されていることに注目すべきである。従って、そのような試験は、例えば20Sプロテアソームと関連する調節複合体の機能を組み入れていないことから、細胞プロテアソーム活性を報告していない。従って、一般的に、悪性細胞の破壊を誘発することのできる治療用化合物を同定することが求められている。
【発明の開示】
【０００７】
本発明によれば、細胞プロテアソームに対する作用のその選択性について選定する興味ある治療薬のスクリーニング方法を開発した。このスクリーニング方法は、細胞内で実施し、現存の生化学試験とは異なり、細胞プロテアソームの触媒性および非触媒性インヒビターを同定することを可能にする。
本出願人は、驚くべきことに、ヒト細胞における自然発生性のプロセスである、プロテアソームによるヒト細胞レギュレーターp21WAF1/Cip1のプロテアソーム依存性であるが前以ってのユビキチン化には依存しない分解プロセスを擬態させることが酵母細胞内で可能であることを証明した。
p21WAF1/Cip1タンパク質は、サイクリン依存性キナーゼ(Cdk)インヒビター群に属するヒト細胞の分裂周期のレギュレーターである。p21WAF1/Cip1タンパク質の主たる機能は、Cdk2/サイクリン複合体の活性を調節することであり、その活性化は、細胞周期進行を制御する。また、p21WAF1/Cip1タンパク質は、PCNA因子(増殖性細胞核抗原因子)、即ち、染色体複製に不可欠なDNAポリメラーゼδのサブユニットと相互作用することによってDNA合成を調節するものとしても知られている。p21WAF1/Cip1タンパク質は、極めて不安定で、あまり構造的でないタンパク質である(Kriwacki等、1996年)。p21WAF1/Cip1タンパク質においては２つの分解経路が存在する。第１の経路は、ユビキチン化依存性であり、SCFSkp2ユビキチンリガーゼに関連する。この経路は、とりわけ、UV照射細胞において誘発される(Bendjennat等、2003年；Bornstein等、2003年)。第２の経路は、p21WAF1/Cip1のユビキチン化を何ら必要としないが、プロテアソーム活性依存性である。p21WAF1/Cip1のユビキチン化を何ら必要としないこの第２の分解経路は、哺乳類細胞内のMdm2タンパク質に関連しているようであり、このタンパク質は、このタンパク質のプロテアソームとの物理的相互作用を促進させることにより、p21WAF1/Cip1の分解を活性化させる(Zhang等、2004年)。Mdm2のユビキチンリガーゼ機能は、このメカニズムには関与しない。
酵母細胞は、如何なるオーソロガスタンパク質も或いはMdm2ヒトタンパク質に類似する如何なるタンパク質も発現しないので、本出願人が、にもかかわらず、酵母細胞内で、分解前にp21WAF1/Cip1タンパク質のユビキチン化段階を何ら必要としないプロテアソーム依存性分解経路を介してのプロテアソームによるp21WAF1/Cip1ヒトタンパク質の分解を擬態させるのが可能であることを証明したことは、絶対に予想外のことであった。
【０００８】
本発明の目的は、プロテアソーム活性調節剤の細胞内スクリーニング方法を提供することであり、該方法は、下記の工程を含むことを特徴とする：
(a) 試験すべき候補薬を、核心において下記を含む融合タンパク質を発現する組換え酵母細胞と接触させる工程：
(i) p21WAF1/Cip1ポリペプチドおよびp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドから選ばれるp21ポリペプチド；および、
(ii) 少なくとも１種の検出可能なタンパク質；
(b) 前記酵母細胞内の前記第１の検出可能なタンパク質を、前記候補薬を前記細胞と接触させた後の少なくとも１回の所定時間間隔の終了時に定量する工程；
(c) 工程(b)において得られた値を、工程(a)を前記候補薬の不存在下に実施するときに得られる対照値と比較する工程。
本発明の方法は、p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1ターゲットタンパク質の分解を酵母細胞内で実施し可視化することを考慮しての細胞内方法からなり、無細胞系内で実施する反応にはよらない。
上記のスクリーニング方法の幾つかの実施態様においては、p21野生タイプタンパク質の6個のリシン残基をアルギニン残基で置換したp21WAF1/Cip1タンパク質の変異体形を含む融合タンパク質を発現する酵母細胞を使用する。このp21WAF1/Cip1タンパク質の変異体形は、p21[6KR]WAF1/Cip1と称する。これらのアミノ酸置換により、タンパク質上の全ての潜在的ユビキチン化部位を欠落させる。従って、p21[6KR]WAF1/Cip1誘導体の分解は、そのアミノ酸配列内でのユビキチン化部位の欠落により、プロテアソームタンパク質分解活性に専ら且つ直接依存しており、何らユビキチン化段階に依存していない。
【０００９】
また、最終的には、酵母細胞内で、p21ポリペプチド(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)のプロテアソーム介在分解は、p21ポリペプチド(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)を検出可能なタンパク質、とりわけ、自己蛍光タンパク質に融合させた場合でさえも生じることも証明した。驚くべきことに、上記酵母細胞内で、上記融合タンパク質は100％分解し、p21タンパク質(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)および検出可能なタンパク質に相応する各ポリペプチドも全て分解する。これらの結果は、過去に行われた生体外生化学試験が、自己蛍光タンパク質と融合させたp21WAF1/Cip1からなる融合タンパク質を26Sまたは20Sプロテアソームと接触させたとき、p21WAF1/Cip1成分のみが分解し、一方、自己蛍光成分に相応する成分は分解していない安定な形で放出されることを実証していることから(Lui等、2003年)、なお一層驚くべきことである。
酵母細胞内で観察されるp21融合タンパク質(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)の全体的分解は、酵母細胞内の融合タンパク質の量を上記融合タンパク質中に含ませた検出可能なタンパク質によって発生したシグナルを定量することより、測定可能である。
上記の方法は、試験し得る候補薬が、プロテアソームによるp21ポリタンパク質(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)分解速度または分解度合を、ヒト正常または変異体化p21タンパク質(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)を発現する酵母細胞内で改変し得るかどうかを当業者が判断するのを可能にする。
上記の細胞内スクリーニング方法は、人工のヒト化した分解系を酵母細胞内のターゲット融合タンパク質に対して使用するので、細胞プロテアソーム活性に対して特異的に作用する薬物を、細胞内のプロテアソーム活性の複雑性に打ち勝つようにして、さらにまた、細胞内のターゲットタンパク質の前以ってのユビキチン化段階なしでスクリーニングするのを可能にする。
さらに、上記の方法により、プロテアソームに対して作用する薬物をスクリーニングする生理学的試験法を、p21WAF1/Cip1ヒト調節因子のプロテアソームによる分解経路を擬態するタンパク質分解代謝経路を酵母内に創生することによって開発した。従って、上記タンパク質分解代謝経路に関する限り、本発明の方法は、ヒトプロテアソーム介在タンパク質分解の生理条件に極めて類似した生理条件下で実施する。
【００１０】
本説明の目的においては、プロテアソーム活性“調節剤”は、(i) プロテアソーム活性を抑制または阻害する、とりわけ、ターゲットタンパク質を分解する前のユビキチン化段階に依存しないプロテアソーム活性を抑制または阻害する薬物、および(ii) プロテアソーム活性を活性化または増強する、とりわけ、ターゲットタンパク質を分解する前のユビキチン化段階に依存しないプロテアソーム活性を活性化または増強する薬物をそれぞれ包含する。
上記の方法により、p21WAF1/Cip1ポリペプチドまたはp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドの上記酵母細胞のプロテアソームによる細胞内分解速度または度合を抑制し得る薬物を同定することができる。本発明の方法により同定することのできるインヒビター薬は、ヒト細胞におけるプロテアソーム活性も抑制するので、腫瘍細胞増殖を抑制または阻害し得る、炎症、自己免疫疾患または癌に関与する種々の遺伝子の発現活性化を抑制または阻害し得る、或いは細胞死制御メカニズム(アポトーシス)を阻害し得る治療上興味ある薬物である。
従って、上記の細胞内スクリーニング方法は、工程(b)で測定したときの検出可能なタンパク質の量が比較対照値よりも高いインヒビター候補薬を明確に選定することからなるさらなる工程(d)を含み得る。
【００１１】
また、本発明の方法は、p21WAF1/Cip1ポリペプチドまたはp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドの上記酵母細胞のプロテアソームによる細胞内分解速度または度合を増大し得る薬物を同定するのを可能にする。そのような活性化剤は、ヒト細胞におけるプロテアソーム活性も活性化するので、炎症、自己免疫疾患または癌に関与する種々の遺伝子の発現活性化を誘発または増強し得る興味ある治療薬である。従って、この第２の局面によれば、本発明の細胞内スクリーニング方法は、炎症促進剤(proinflammatory agent)をスクリーニングするのを可能にする。本発明方法に従って選定したある種の促進炎症剤は、例えば、感染非特異性耐性反応を誘発させるためのような早期免疫応答を誘発させるための、或いは抗原提示細胞を活性化させるための、体液性または細胞介在性応答いずれかの抗原特異性免疫応答を開始させるための薬物として少投与量で使用したときまたは短期間投与したときに、治療上の興味を有し得る。本発明の生体外スクリーニング方法に従って選定したある種の他の炎症促進剤は、既知の活性剤、例えば、望ましくない炎症促進作用を同定するため、さらに、ヒトの健康に特別の注意を払わなければならないための薬物用の活性剤からなり得る。同様に、本発明方法に従って選定したある種の薬物は、アポトーシス促進活性を有し得る。
従って、もう１つの局面によれば、本発明のスクリーニング方法は、工程(b)で測定したときの検出可能なタンパク質の量が比較対照値よりも低い候補活性薬を明確に選定することからなるさらなる工程(d)を含み得る。
【００１２】
良く理解されているように、プロテアソーム活性調節剤は、任意の性質を有し得る。上記薬物は、任意の有機または無機化合物であり得、天然産生薬物、或いは化学または生物学的合成により少なくとも部分的に調製した薬物であり得る。上記薬物は、とりわけ、ペプチドまたはタンパク質であり得る。また、上記薬物としては、生物学的作用、とりわけ、治療作用或いは逆に生物体に対し証明されたまたは疑いのある毒性作用を有することが既に知られている任意の分子がある。
本発明の方法においては、検出可能なタンパク質に融合させるp21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドを含有する融合タンパク質が上記酵母細胞内で発現した時点で、該融合タンパク質は、プロテアソームによって認識され、プロテアソームが果たすタンパク質分解を受ける。酵母細胞中に含まれる検出可能なタンパク質の所定時点での定量により、この所定時点において、p21WAF1/Cip1と検出可能なタンパク質またはp21[6KR]WAF1/Cip1と検出可能なタンパク質を含む上記融合タンパク質の分解度合を判定することが可能になる。
本発明のp21WAF1/Cip1ポリペプチドは、SEQ ID No 1のp21WAF1/Cip1ポリペプチドと少なくとも90％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドからなる。本発明のp21WAF1/Cip1ポリペプチドは、SEQ ID No 1のp21WAF1/Cip1ポリペプチドであり得る。
本発明のp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドは、SEQ ID No 2のp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドと少なくとも90％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドからなる。本発明のp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドは、SEQ ID No 2のp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドからなり得る。
【００１３】
本説明の目的においては、本明細書において使用するとき“ヌクレオチド配列”とは、ポリヌクレオチドまたは核酸のいずれかを意味する。“ヌクレオチド配列”は、遺伝子物質それ自体を含み、従って、配列目録のみに限定されない。
“核酸”、“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”または“ヌクレオチド配列”としては、一本鎖または二本鎖構造いずれかのRNA、DNA、cDNAまたは２以上のヌクレオチドのRNA/DNAハイブリッド配列がある。
本明細書において使用するとき、“ヌクレオチド”は、天然ヌクレオチド(A、T、G、CおよびU)を意味する。
本発明の目的においては、第１のポリヌクレオチドは、第１ヌクレオチドの各塩基が配向が逆である第２のポリヌクレオチドに対して相補性の塩基と対をなしているときは、第２のポリヌクレオチドに対して“相補性”であるとみなす。相補性“塩基”は、AとT(またはAとU)、およびCとGである。
本発明によれば、第２の参照核酸と少なくとも90％の同一性を示す第１の核酸は、上記第２の参照核酸と、少なくとも90％、好ましくは少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97.5%、98%、98.3%、98.6%、99%、99.6%のヌクレオチド同一性を有する。
本発明によれば、第２の参照ポリペプチドと少なくとも90％の同一性を示す第１のポリペプチドは、上記第２の参照ポリペプチドと、少なくとも90％、好ましくは少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97.5%、98%、98.3%、98.6%、99%、99.6%のアミノ酸同一性を有する。
【００１４】
本明細書において使用するとき、２つの核酸配列間または２つのポリペプチド配列間の“同一性百分率”は、２つの最適位置合せ配列を比較窓により比較することによって判定する。
即ち、比較窓内のヌクレオチド配列部分またはアミノ酸配列部分は、付加または欠落(例えば、間隙)を、参照配列(これらの付加または欠落を含まない)と対比したときに含み、２つの配列間に最適の配列アラインメントを得ることができる。
同一性百分率は、同じ核塩基または同じアミノ酸残基が２つの比較配列において観察される位置数を判定し、次いで、２つの核塩基間または２つのアミノ酸残基間に同一性が存在する位置数を比較窓中の総位置数で割り、次に、結果に100を乗じて２つの配列間のヌクレオチド同一性百分率または２つの配列間のアミノ酸同一性百分率を得ることによって算出する。
比較用の最適配列アラインメントは、既知のアルゴリズムを使用するコンピュータによって得ることができる。
最も好ましくは、配列同一性百分率は、各パラメーターを下記のように設定するCLUSTAL Wソフトウェア(バージョン 1.82)を使用して判定する：
(1) CPU MODE = ClustalW mp；(2) ALIGNMENT = “full”；(3) OUTPUT FORMAT = “aln w/numbers”；(4) OUTPUT ORDER = “aligned”；(5) COLOR ALIGNMENT = “no”；(6) KTUP (word size) = “default”；(7) WINDOW LENGTH = “default”；(8) SCORE TYPE = “percent”；(9) TOPDIAG = “default”；(10) PAIRGAP = “default”；(11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = “none”；(12) MATRIX = “default”；(13) GAP OPEN = “default”；(14) END GAPS = “default”；(15) GAP EXTENSION = “default”；(16) GAP DISTANCES = “default”；(17) TREE TYPE = “cladogram”；および、(18) TREE GRAP DISTANCES = “hide”。
【００１５】
本発明によれば、上述のスクリーニング方法の感度は、上記酵母細胞を試験すべき候補薬と接触させる前に、p21ターゲットタンパク質、即ち、p21WAF1/Cip1-検出可能タンパク質融合タンパク質またはp21[6KR]WAF1/Cip1-検出可能タンパク質融合タンパク質の発現を上記酵母細胞内で停止させたときに増強されることを証明した。
従って、上記方法の第１の好ましい実施態様によれば、工程(a)自体が、下記の工程を含む：
(a1) 核心において上記p21ポリペプチドと少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質を発現する上記酵母細胞を培養する工程；
(a2) 上記p21ポリペプチドと少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質の上記酵母細胞による発現を停止する工程；
(a3) 工程(a2)の終了時に得られた酵母細胞を上記試験すべき候補薬と接触させる工程。
選定した時点での上記p21WAF1/Cip1-検出可能タンパク質融合タンパク質の発現停止は、当業者であれば、上記酵母細胞を形質転換するのに、上記融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドが、上記酵母細胞内で官能性であり、その活性化または逆に抑制を誘発剤によって誘発させるプロモーターの制御下にある発現カセットを使用することによって容易になし得るであろう。酵母細胞内で活性である多くの誘発性プロモーターは、当業者にとっては既知であり、その幾つかは、以下の説明および実施例において説明する。
実際に、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質は、上記酵母細胞内のプロテアソームによって迅速に認識され、分解される。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法を実施するための最適条件は、上記酵母細胞内で発現させるp21-検出可能タンパク質融合タンパク質の細胞内集積を大量に誘発させる条件である。上記方法の工程(a)の開始におけるp21-検出可能タンパク質融合タンパク質細胞内量が多いほど、上記検出可能なタンパク質が発生するシグナル値は高く、これを、上記方法の工程(b)において極めて精確に測定し得る。従って、工程(a)の開始時のp21-検出可能タンパク質融合タンパク質の細胞内量が最大であるほど、融合タンパク質量の変化を上記方法の工程(b)においてより正確に測定し得る。
多い細胞内量のp21-検出可能タンパク質融合タンパク質を上記酵母細胞内で集積させるためには、上記融合タンパク質をコード化する配列を、有利には、強抑制性プロモーターの制御下にセットし、(i) 強抑制性プロモーター、(ii) p21-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化する核酸を含む数個のポリヌクレオチドコピーを有する酵母株を使用する。興味あるコードポリヌクレオチドの複数のコピーの存在は、上記方法の工程(a)において、検出可能なタンパク質の強い検出シグナルを得るのを可能にする。これらの強いシグナル条件は、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質がプロテアソームによって分解されるので、検出可能なタンパク質の極めて感度のある定量を上記方法の過程全体に亘って実施することを可能にする。明らかに、検出し得る初期シグナルが強いほど、上記方法を実施するとき、測定の感度は高い。
本発明のスクリーニング方法の有利な実施態様によれば、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの単数または複数のコピーを染色体に組込んだ酵母細胞を使用する。この有利な実施態様は、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質を、本発明方法を実施するために培養した酵母細胞の全てにおいて高レベルで細胞内に集積させるのを可能にする。本発明のスクリーニング方法のこの実施態様は、各々においてp21-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの１以上のコピーを挿入したプラスミド形質転換酵母細胞を使用するのと比較したときに有利である。事実、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質を発現する酵母細胞が、１種以上の組換えベクター、とりわけ、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも１個のコピーを挿入した１種以上の組換えプラスミドを含む細胞からなる場合、上記興味ある組換えベクターの均質でない伝播が、連続の酵母細胞継代によって起り得る。ある場合には、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質の細胞内発現レベルは、培養した酵母細胞の全てにおいて不均質であり、本発明のスクリーニング方法の感度を低下させ得るであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
上記スクリーニング方法の好ましい実施態様の説明
本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様を、とりわけ、この方法を実施する種々の手段の機能的および構成的局面の説明に関して以下に説明する。
一般に、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質中に含ませる検出可能なタンパク質は、その存在を上記酵母細胞内でそのタンパク質分解前に特異的に検出し得ること並びに検出可能なタンパク質のタンパク質分解形、とりわけ、この検出可能なタンパク質のタンパク質分解に由来するペプチドフラグメントの存在が選定した特異的検出手段によって検出されないことを条件として、任意の性質を有し得る。
容易に理解し得るように、本発明の方法によれば、プロテアソームタンパク質分解活性を、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質安定性に対するその効果を測定することによってモニターする。上記酵母細胞内でp21因子を融合タンパク質の形で発現させることにより、p21含有融合タンパク質の分解を、タンパク質分解されていない検出可能なタンパク質を検出することによりリアルタイムで追求し得る。
好ましくは、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質は、p21タンパク質の6個のリシン残基をアルギニン残基で置換した、p21[6KR]WAF1/Cip1と称するp21WAF1/Cip1ポリペプチドの変異体形を含む。p21[6KR]WAF1/Cip1-検出可能タンパク質融合タンパク質の安定性は、専らプロテアソームタンパク質分解活性に依存し、その前以ってのユビキチン化には何ら関与しない。P21融合検出可能タンパク質(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)の性質により、上記融合タンパク質の分解を、それ自体既知の手段により、例えば、フローサイトメーター、マイクロプレートリーダー、フルオリメーターまたは蛍光顕微鏡のいずれかを使用する蛍光測定装置、或いは比色分析、酵素法または免疫法によりモニターし得る。例えば、検出可能なタンパク質は、抗原、蛍光タンパク質、または酵素活性を有するタンパク質から選択し得る。
【００１８】
検出可能なタンパク質が抗原からなる場合、該タンパク質は、任意のタイプの抗原であり得るが、この抗原に対する特異性抗体が既に入手し得るか或いは抗体、とりわけポリクローナルまたはモノクローナル抗体を製造するのに適する、当業者により周知の任意の方法によって調製し得ることを条件とする。好ましくは、この場合、検出可能なタンパク質は、プロテアソームによるp21タンパク質(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)認識を干渉し得ない小サイズ抗原である。従って、好ましくは7〜100個のアミノ酸鎖長のペプチド、より好ましくは7〜50個のアミノ酸鎖長のペプチド、さらにより好ましくは7〜30個のアミノ酸鎖長のペプチド、例えば、10個のアミノ酸鎖長のペプチドを、抗原として使用する。例えば、配列：[NH2-YPYDVPDYA-COOH]
SEQ ID No 7のHA抗原、或いは配列： [NH2-DYKDDDDK-COOH] SEQ ID No 8 (FLAGモノマー)または配列：[NH2-MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-COOH]
SEQ ID No 9 (FLAGトリマー)のFLAG抗原。この場合、検出可能なタンパク質を上記方法の工程(b)において定量するには、上記融合タンパク質中に含ませた抗原を特異的に認識する抗体を使用し、この抗体を直接または間接的にラベル化する。その後、定量を、上記酵母細胞内でラベル化抗体とp21-抗原融合タンパク質間で形成させた複合体が発生する検出可能なシグナルを測定することによって実施する。従って、工程(b)においては、第１の検出可能なタンパク質が抗原からなる場合、この第１の検出可能なタンパク質を、このタンパク質とこのタンパク質を認識する抗体間で形成させた複合体を検出することによって定量する。
【００１９】
検出可能なタンパク質が内部蛍光タンパク質である場合、このタンパク質は、とりわけ、mAGタンパク質、GFPタンパク質またはその誘導体、YFPタンパク質またはその誘導体、およびdsREDタンパク質から選択する。GFPタンパク質から誘導されるタンパク質のうちでは、名称GFPMut3 (Cormack等(Gene (1996) 173:
33-38))、Venus (Nagai等(Nat. Biotechnol. (2002) 20:87-90))またはSapphire
(Zapata-HommerおよびGriesbeck、BMC Biotechnol. (2003) 3:5)として知られているタンパク質のいずれかを使用し得る。
また、内部蛍光タンパク質は、オワンクラゲ(Aequorea victria)以外の種々の生物体に由来する自己蛍光タンパク質からも選択し得る。内部蛍光タンパク質は、例えば、下記のタンパク質から選択し得る：
‐ポンテリーナ プルマタ(Pontellina plumata)に由来し、D.A. Shagin等によって開示されたCopGFPタンパク質 (2004, Mol.
Biol. Evol. 21:841-850)；
‐D.A. Shagin等によって開示されたTurboGFPタンパク質、CopGFP変異体 (2004, Mol.
Biol. Evol. 21:841-850)；
‐コザラクラゲ(Phialidium sp.)に由来し、D.A. Shagin等によって開示されたPhiYFPタンパク質(2004, Mol.
Biol. Evol. 21:841-850)；
‐オワンクラゲ(Aequorea coerulescens)に由来し、N.G. Gurskayaにより開示されたAcGFPタンパク質、およびその変異体 (2003,
Biochem. J. 373:403-408)；および、
‐ディスコソマ(Discosoms
sp.)に由来し、M.V. Matz等により開示されたdsREDタンパク質(1999, Nature
Biotech. 17:969-973)。
好ましくは、“単量体Azami-Green”とも称され、アザミサンゴ(Galaxeidae
coral)に由来し、Karasawa等により開示されたmAGタンパク質 (Karasawa and al., J. Biol. Chem. 2003
278:34167-34171)を、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質において使用する。
検出可能なタンパク質が内部蛍光タンパク質からなる場合、この検出可能なタンパク質を、上記方法の工程(b)において、p21-蛍光タンパク質融合タンパク質が発出する蛍光シグナルを任意の適切な装置を使用して測定することによって定量する。従って、工程(b)においては、検出可能なタンパク質が蛍光タンパク質である場合、この検出可能なタンパク質を、このタンパク質が発出する蛍光シグナルを測定することによって定量する。
【００２０】
検出可能なタンパク質が、酵素活性を有するタンパク質からなる場合、この検出可能なタンパク質は、例えば、ルシフェラーゼおよびβ-ラクタマーゼから選択する。この場合、検出可能なタンパク質を、上記方法の工程(b)において、酵素介在基質形質転換に由来する生成物(１種以上)の量を測定することによって定量する。酵素活性の生成物が着色している場合、測定は、比色測定法によって実施し得る。酵素活性の生成物が蛍光性である場合、この生成物が発出する蛍光シグナルの強度を、任意の適切な蛍光測定装置により測定する。従って、工程(b)においては、第１の検出可能なタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合、この検出可能なタンパク質を、このタンパク質により形質転換された基質の量を測定することによって定量する。
【００２１】
好ましい実施態様によれば、p21WAF1/Cip1ポリペプチド含有タンパク質は、SEQ ID No 5の核酸によってコード化され得るSEQ ID No 3のアミノ酸配列を有するタンパク質である。SEQ ID No 3のタンパク質は、NH2-末端からCOOH-末端までに、(i) 位置1のアミノ酸から始まり位置226のアミノ酸までの検出可能なmAGタンパク質、(ii) 位置227のアミノ酸から始まり位置228のアミノ酸までの第１のスペーサーペプチドおよび(iii) 位置229のアミノ酸から始まり位置392のアミノ酸までのp21WAF1/Cip1ポリペプチドをそれぞれ含有する。SEQ ID No 5の核酸は、5’末端から3’末端までに、(i) 位置1のヌクレオチドから始まり位置678のヌクレオチドまでの、検出可能なmAGタンパク質をコード化する配列、(ii) 位置679のヌクレオチドから始まり位置684のヌクレオチドまでの、スペーサーペプチドをコード化する配列および(iii) 位置685のヌクレオチドから始まり位置1179のヌクレオチド(含ませたコドン停止)までの、p21WAF1/Cip1ポリペプチドをコード化する配列をそれぞれ含有する。
もう１つの好ましい実施態様によれば、p21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチド含有タンパク質は、SEQ ID No 6の核酸によってコード化され得るSEQ ID No 4のタンパク質である。SEQ ID No 4のタンパク質は、NH2-末端からCOOH-末端までに、(i) 位置1のアミノ酸から始まり位置226のアミノ酸までの検出可能なmAGタンパク質、(ii) 位置227のアミノ酸から始まり位置228のアミノ酸までの第１のスペーサーペプチドおよび(iii) 位置229のアミノ酸から始まり位置392のアミノ酸までのp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドをそれぞれ含有する。SEQ ID No 6の核酸は、5’末端から3’末端までに、(i) 位置1のヌクレオチドから始まり位置678のヌクレオチドまでの、検出可能なmAGタンパク質をコード化する配列、(ii) 位置679のヌクレオチドから始まり位置684のヌクレオチドまでの、スペーサーペプチドをコード化する配列および(iii) 位置685のヌクレオチドから始まり位置1179のヌクレオチド(含ませたコドン停止)までの、p21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドをコード化する配列をそれぞれ含有する。
p21WAF1/Cip1含有融合タンパク質をコード化するSEQ ID No 5およびp21[6KR]WAF1/Cip1含有融合タンパク質をコード化するSEQ ID No 6の各ポリヌクレオチドにおいては、核塩基の同一性を、これらの核酸配列内に上記酵母細胞において好ましく使用するコドンを含ませるように適応させる。
さらなる局面によれば、本発明のスクリーニング方法は、上記組換え酵母細胞を、下記を含むポリヌクレオチドによって形質転換することを特徴とする：
(a) p21ポリペプチド(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)および(ii) 検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質をコード化する読取り枠；および、
(b) 酵母細胞内で官能性であり、上記読取り枠の発現を制御する調節配列。
上記のポリヌクレオチドは、SEQ ID No 5の核酸またはSEQ ID No 6の核酸であり得る。
【００２２】
本発明に従う好ましい核酸、発現ベクターおよび形質転換酵母細胞
本発明に従い、酵母細胞に導入したときp21-検出可能タンパク質融合タンパク質の発現を誘発させる核酸、即ち、p21WAF1/Cip1-検出可能タンパク質融合タンパク質およびp21[6KR]WAF1/Cip1-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化する核酸を合成した。
合成した核酸の各々は、“読取り枠”または“ORF”とも称し、興味あるp21-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化するコード配列を含む。本発明の核酸の具体的な例としては、SEQ ID No 5 (p21WAF1/Cip1-検出可能タンパク質)およびSEQ ID No 6 (p21[6KR]WAF1/Cip1-検出可能タンパク質)の核酸があり、その構造は、上記の説明において先に説明している。
また、上記核酸の各々は、上記酵母細胞内で官能性であるプロモーターを含む調節配列も含む。
好ましい実施態様においては、上記酵母細胞内で官能性であるプロモーターは、抑制性プロモーター、即ち、上記酵母細胞内で官能性であり、誘発剤の作用に対して感受性であるプロモーターである。誘発剤は、上記酵母細胞培養培地に添加したとき、その制御下に興味あるタンパク質をコード化する配列の発現の抑制または阻害を誘発する。そのような抑制性プロモーターは、酵母サッカロミセス セレビジエ(Saccharomyces
cerevisiae)由来のCUP1、GAL1、GAL10、MET3、MET25、PHO5、PHO87およびTHI4から選択する。
本発明に従って使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のGAL1遺伝子プロモーターの配列としては、JohnstonおよびDavisによって開示された配列がある(Mol. Cell. Biol. (1984) 4 : 1440-1448)。
本発明に従って使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のMET3遺伝子プロモーターの配列としては、Cherest等によって開示された配列がある(Mol. Gen. Genet.
(1987) 210 (2): 307-313)。
本発明に従って使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のMET25遺伝子プロモーターの配列としては、Kerjan等によって開示された配列がある(Nucleic Acids
Res.(1986) 14(20): 7861-7871)。
本発明に従って使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のPHO5遺伝子プロモーターの配列としては、Feldmann等によって開示された配列がある(EMBO J. (1994)
13(24): 5795-5809)。
本発明に従って使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のTHI4遺伝子プロモーターの配列としては、Skala等によって開示された配列がある(Yeast (1995)
14:1421-1427)。
本発明に従って使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のCUP1遺伝子プロモーターの配列としては、Karin等によって開示された配列がある(PNAS (1984) 81(2):
337-341)。
【００２３】
好ましい実施態様においては、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化する核酸またはポリヌクレオチドは、GAL1調節配列を含む。この配列は、上記酵母細胞をガラクトースの存在下に培養するときに、p21ポリペプチド含有融合タンパク質をコード化する読取り枠の発現を活性化する。逆に、この配列は、上記酵母細胞をグルコースの存在下に培養するときに、p21ポリペプチド含有融合タンパク質をコード化する読取り枠の発現を抑制する。
従って、本発明のスクリーニング方法の有利な実施態様においては、p21ポリペプチド含有融合タンパク質の発現は、スクリーニング試験の時間中に実施する。20分〜24時間の範囲であり得る所定時間誘発させた後、p21-含有タンパク質の発現を、細胞をスクリーニングすべき分子に暴露させる前に特異的に停止させる(名称“プロモーター遮断”として当業者に知られている処理において)。そのような発現の停止は、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質の発現を制御するプロモーターの活性を抑制することのできる分子を培養培地に添加することによって或いは培養培地中で上記プロモーターを活性化するのに必要な薬剤または分子を除去することによって得られる。
従って、p21-検出可能タンパク質融合タンパク質をGAL1遺伝子プロモーターの制御下に発現させる場合、このプロモーターの発現は、グルコースを2％の最終濃度まで培養培地に添加することによって抑制する。P21含有融合タンパク質の新合成の停止は、その安定性の測定を、例えば、上記融合タンパク質がmAGまたはGFP由来のタンパク質のような検出可能な内部蛍光タンパク質を含有する実施態様においては、酵母細胞蛍光を合成遮断後に経時的に測定することによってリアルタイムで可能にする。
【００２４】
従って、本発明の目的は、p21ポリペプチドおよび少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質コード化する読取り枠を有するポリヌクレオチドと、酵母細胞内で官能性であり且つ上記読取り枠の発現を制御する調節配列とを含む酵母細胞内で官能性である発現カセットを提供することでもある。
そのような発現カセットは、p21ポリペプチドが、p21WAF1/Cip1ポリペプチドおよびp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドから選ばれることに特徴を有し得る。
そのような発現カセットは、とりわけ、p21ポリペプチドが、SEQ ID No 1のp21WAF1/Cip1ポリペプチドおよびSEQ ID No 2のp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドから選ばれることに特徴を有し得る。
そのような発現カセットは、とりわけ、SEQ
ID No 3のmAG-p21WAF1/Cip1融合タンパク質をコード化する本発明のSEQ ID No 5の核酸を含み得またはこの核酸からなり得る。
また、そのような発現カセットは、SEQ
ID No 4のmAG- p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質をコード化する本発明のSEQ ID No 6の核酸を含み得またはこの核酸からなり得る。
そのような発現カセットの好ましい実施態様によれば、上記調節配列は、上記酵母細胞内で官能性で且つ誘発剤の作用に対して感受性であり、酵母サッカロミセス セレビジエ由来のCUP1、GAL1、GAL10、MET3、MET25、PHO5およびTHI4プロモーターから選ばれるプロモーターのような抑制性プロモーターを含む。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法のさらに有利な実施態様によれば、組換え酵母細胞は、実施例において例示するような、そのゲノムに組込んだ形のp21-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化する配列を含む核酸またはポリヌクレオチドを含む。
本発明のスクリーニング方法のさらにもう１つの実施態様においては、上記酵母細胞を、染色体に組込んでない形、例えば、酵母細胞内で官能性であり且つ酵母細胞内で官能性である少なくとも１つの複製起源を担持するベクターの形にあるp21-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化する配列を含む核酸またはポリヌクレオチドによって形質転換する。
一般に、本発明のスクリーニング方法を実施するに当っては、有利には、良好な膜透過性、とりわけ、本発明方法によって試験すべき薬物に対する良好な膜透過性を有する酵母細胞を使用する。
上記融合タンパク質の発現を抑制性プロモーターの制御下に実施する本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様を実施するに当っては、この場合も有利には、上記抑制性プロモーターが感受性である“誘発性”化合物に対して良好な膜透過性を有する酵母細胞を使用する。
従って、本発明のスクリーニング方法のもう１つの好ましい実施態様によれば、ゲノムが、試験すべき薬物に対する透過性を増大させる１以上の変異、例えば、PDR1およびPDR3遺伝子、即ち、原形質膜中に挿入したトランスポーターの発現を酵母内で制御する転写因子をコード化する２つの遺伝子を不活化する変異(Vidal等、1999年；Nourani等、1997年)を含む酵母株を使用する。
好ましくは、Bailis等(1990年)によって開示された酵母サッカロミセス セレビジエのW303株または上記酵母サッカロミセス セレビジエの他の任意の特性決定株の遺伝子背景を有する酵母株を使用する。
【００２６】
外来DNAによる酵母細胞の形質転換は、好ましくは、当業者に知られている方法、とりわけ、Schiestl等(1989年)によって開示された方法を使用することによって実施する。種々の酵母株を、既知の、とりわけSherman等(1979年)により開示された遺伝子法(育種、胞子形成、子嚢切開および胞子表現型分析)、および、例えばRothstein (1991年)により開示された逆遺伝子学方法を使用して調製した。
本発明によれば、酵母は、好ましくは、伝統的な分子生物学法、例えば、Sambrook等(1989年)およびAusubel等(1990〜2004年)によって開示されたプロトコールを使用して構築したプラスミドにより形質転換する。
従って、本発明のさらなる目的は、本説明において定義するような発現カセットを含むことを特徴とする発現ベクターを提供することである。
本発明に従う第１のベクターは、実施例において説明しており、CYS343酵母株を調製するのに寄与するpCSYAQ6-p21wtベクターである。
本発明に従う第２のベクターは、実施例において説明しており、CYS344酵母株を調製するのに寄与するpCSYAQ6-p21[6KR]ベクターである。
【００２７】
また、本発明は、そのゲノム内に組込んだ形で、(a) p21ポリペプチド(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)と少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質をコード化する読取り枠、および(b) 酵母細胞内で官能性であり且つ上記読取り枠の発現を制御する調節配列を含むポリヌクレオチドを含む組換え酵母株にも関する。
本発明に従う組換え酵母株は、そのゲノム内に組込んだ形で、(a) SEQ ID No 1のp21WAF1/Cip1ポリペプチドと少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質をコード化する読取り枠、および(b) 酵母細胞内で官能性であり且つ上記読取り枠の発現を制御する調節配列を含むポリヌクレオチドを含む組換え酵母株からなり得る。
本発明に従う組換え酵母株は、そのゲノム内に組込んだ形で、(a) SEQ ID No 2のp21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドと少なくとも１種の検出可能なタンパク質を含む融合タンパク質をコード化する読取り枠、および(b) 酵母細胞内で官能性であり且つ上記読取り枠の発現を制御する調節配列を含むポリヌクレオチドを含む組換え酵母株からなり得る。
とりわけ、本発明は、上記p21WAF1/Cip1ポリペプチドと上記検出可能なmAGタンパク質を含む融合タンパク質、即ち、SEQ ID No 3の融合タンパク質を発現するCYS343からなる、上記で定義したような組換え酵母株に関する。
とりわけ、本発明は、上記p21[6KR]WAF1/Cip1ポリペプチドと上記検出可能なmAGタンパク質を含む融合タンパク質、即ち、SEQ ID No 4の融合タンパク質を発現するCYS344酵母株からなる、上記で定義したような組換え酵母株に関する。
また、本発明は、上記で定義したようなp21ポリペプチド(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)を含有する融合タンパク質コード化する発現カセットを含む発現ベクターを含むことを特徴とするプロテアソーム活性調節剤のスクリーニング用キットにも関する。
また、本発明は、そのゲノム内に組込んだ形で、上記で定義したようなp21ポリペプチド(p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1)を含有する融合タンパク質コード化する発現カセットを含む組換え酵母細胞を含むことを特徴とするプロテアソーム活性調節剤のスクリーニング用キットにも関する。
好ましくは、上記のキットは、CYS343酵母株の組換え酵母細胞またはCYS344酵母株の組換え酵母細胞を含む。
【００２８】
本発明のスクリーニング方法は、酵母細胞内のヒトターゲットタンパク質、さらに正確には、検出可能なタンパク質に融合させた上記p21WAF1/Cip1ヒトタンパク質または検出可能なタンパク質に融合させた上記p21[6KR]WAF1/Cip1変異体化タンパク質を含む融合タンパク質からなるターゲットタンパク質のいずれかに対するプロテアソーム活性を可視化するのを可能にする。
この方法は、とりわけ、ある種の癌；炎症性および免疫症候群；真菌、最近およびウイルス感染症または中枢神経系のある種の疾患のような、細胞タンパク質の過剰または不十分な分解に関連する疾患に対して作用し得る分子または薬物をスクリーニングするのに有利である。
本発明のスクリーニング方法の主な利点としては、とりわけ、下記の利点がある：
‐実施の容易性：細胞中に存在したままのプロテアソーム活性が、p21WAF1/Cip1野生タイプまたは変異体ヒト因子の酵母細胞内での制御された発現のために、極めて簡単に可視化される。さらに、p21WAF1/Cip1因子を、mAGまたはGFPのような内部蛍光タンパク質と融合させたハイブリッドタンパク質として発現させる場合、p21WAF1/Cip1因子またはp21[6KR]WAF1/Cip1因子に対するプロテアソーム活性は、上記ハイブリッドタンパク質が発出する蛍光を測定することにより、直接測定し得る。同様に、p21WAF1/Cip1因子またはp21[6KR]WAF1/Cip1因子を、ルシフェラーゼのようなタンパク質と融合させたハイブリッドタンパク質として発現させる場合、p21WAF1/Cip1因子またはp21[6KR]WAF1/Cip1因子に対するプロテアソーム活性は、フルオレセインのような基質の存在下に上記ハイブリッドタンパク質が発出する発光を測定することにより、直接測定し得る。
‐治療上の背景との滴性：プロテアソーム活性を、完全細胞内で構築した機能的アッセイを実施することにより追跡する。従って、本発明の細胞内スクリーニング方法は、プロテアソーム活性を最終の治療的使用の背景と同様な背景において活性化または抑制することのできる分子を選定することを可能にする。
【００２９】
‐特異性：細胞内で細胞内実施するとは言え、本発明のスクリーニング方法は、人体と対比したとき異質の生物体中でのp21ヒトタンパク質の発現に依存しているので特異的である。本発明のスクリーニング方法によって選定する分子は、プロテアソーム活性に対して特異性であり、従って、例えば、ヒト細胞内でp21WAF1/Cip1因子の分解を誘発させる多くの情報伝達経路の１つを干渉するその能力について選定した分子ではない。事実、本発明のスクリーニング方法を実施する場合、プロテアソームによるp21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1の分解は、例えば、p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1をGAL1プロモーターの制御下に発現させるときにグルコースを添加してこのプロモーターを阻害することによるような完全に人工的で絶対的に再現性のある代謝経路によって誘発させている。
‐p21WAF1/Cip1天然タンパク質の6個のリシン残基をアルギニン残基で置換し、従って、内部ユビキチン化部位を抑制したp21[6KR]WAF1/Cip1タンパク質の使用は、本発明の選定分子が、ユビキチンリガーゼ、ユビキチン接合酵素およびユビキチン活性化酵素のようなユビキチン-プロテアソーム経路の他の成分を干渉しないことをさらに担保している。
‐組換え酵母株の安定性：酵母染色体の選定した部位での取込みおよびターゲッティングした形での遺伝子の置換方法により、p21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1のいずれかを含有する融合タンパク質を酵母染色体から発現させる組換え酵母株の製造を可能にしている。従って、これらの組換え酵母株は、遺伝子的に安定であり、無限に複製し、保存し得る。
‐増殖およびスクリーニング速度：酵母は、高速度で増殖し、高収量を与える微生物である。とりわけ、本発明のスクリーニング方法は、好ましくは、上記酵母細胞を酵母細胞増殖が特段に早くその収量が特段に高い完全培養培地において培養することによって実施する、従って、複数のスクリーニング試験を同時に実施するための大量の組換え酵母細胞を得るのを可能にしている。
‐低コスト：酵母は、培養、保存および特性決定が費用高でない微生物である。
‐本発明のスクリーニング方法の自動化：酵母は、小容量の培地中で、低温で、通常の雰囲気下に、空気中で行う培養が本スクリーニング方法の自動化(ロボット化)に極めて特段の適応性のある微生物である。
本発明のスクリーニング方法は、抗新生物薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、真菌および細菌感染症に対する薬物、または中枢神経系の疾患に対する薬物のような活性薬を選択し特性決定するのにとりわけ有用である。
【実施例】
【００３０】
以下、限定することなしに、本発明を、添付図面および実施例によって具体的に説明する。
実施例１〜３
A. 材料および方法
A.1. 使用するポリヌクレオチド配列の要約
以下の説明において、
p21WAF1/Cip1タンパク質の配列は、EMBLデータベースに受託番号BC001935.1として預託された配列である。
p21[6KR]WAF1/Cip1タンパク質の配列は、EMBLデータベースに受託番号BC001935.1として預託された配列であり、その6個のリシン残基は、アルギニン残基に転換している。
蛍光タンパク質をコード化するアザミサンゴに由来するmAG (単量体Azami-Green)遺伝子(以下、mAGと称する)の配列は、受託番号AB108447としてGenBankTM/EBI Date Bankに預託された配列である。
pRS306プラスミドの配列は、EMBLデータベースに預託された配列である；識別表示“PRS306”、受託番号U03438。
以下の説明において使用する酵母サッカロミセス セレビジエ由来のGAL1遺伝子プロモーターの配列は、EMBLデータベースに預託された配列に完全に含まれている；識別表示“SCGAL10”、受託番号K02115。
本発明において使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のGAL1遺伝子プロモーターの配列は、JohnstonおよびDavisによって開示された配列を含む(Mol. Cell. Biol. (1984) 4
(8): 1440-1448)。
本発明において使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のMET3遺伝子プロモーターの配列は、Cherest等によって開示された配列を含む(Mol. Gen. Genet.
(1987) 210 (2): 307-313)。
本発明において使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のMET25遺伝子プロモーターの配列は、Kerjan等によって開示された配列を含む(Nucleic Acids
Res.(1986) 14(20): 7861-7871)。
本発明において使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のPHO5遺伝子プロモーターの配列は、Feldmann等によって開示された配列を含む(EMBO J. (1994)
13(24): 5795-5809)。
本発明において使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のTHI4遺伝子プロモーターの配列は、Skala等によって開示された配列を含む(Yeast (1995)
14:1421-1427)。
本発明において使用し得る酵母サッカロミセス セレビジエ由来のCUP1遺伝子プロモーターの配列は、Karin等によって開示された配列を含む(PNAS(1984) 81(2):
337-341)。
【００３１】
A.2.
使用する慣例
説明は、酵母サッカロミセス
セレビジエ専門の生物学者社会において一般的に使用される命名法および活字規約を使用して行う。
‐遺伝子の野生タイプ名は、大文字イタリック体で示す；例えば、GAL1。
‐遺伝子の変異体名は小文字イタリック体で示し、対立遺伝子数は、知られていれば、ダッシュの後に示す；例えば、cup1-1。
遺伝子の不活化対立遺伝子名は、小文字で示し、２点×２の後、不活化用遺伝子名と続く；例えば、ppr1::TRP1 (この例においては、ppr1不活化遺伝子は、TRP1活性遺伝子により遮断されている)。
また、不活化遺伝子名は、“デルタ”符号によっても示し得る；例えば、gal4Δ。
‐タンパク質名は、冒頭の最初の文字を除いて小文字で示す同じタンパク質をコード化する遺伝子の名称である；例えば、Gal4 (また、pと続く同じ符合を使用し得る；例えば、Gal4p)。
A.3. プラスミド構築についての冒頭説明
全プラスミドは、Sambrook等(Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd edition, (1989),
Cold Spring Harbor, N. Y.)およびAusubel等(Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2004),
John Wiley and Sons Inc, N.Y.)によって開示されたプロトコールに従う伝統的分子生物学法を使用して構築した。分子クローニング、DNAプラスミド増殖および産生は、大腸菌DH10B株において行った。
【００３２】
実施例１：mAG-p21WAF1/Cip1およびmAG-p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質の酵母内での発現を可能にするプラスミドの構築
下記のプラスミドは、アザミサンゴ由来のmAG蛍光タンパク質に融合させたp21WAF1/Cip1ヒトタンパク質またはヒト変異体タンパク質p21[6KR]WAF1/Cip1の誘導体の酵母サッカロミセス セレビジエ内での発現を可能にする。
酵母サッカロミセス セレビジエ由来のGAL1遺伝子プロモーター(pCAL1)に相応する614-塩基対フラグメント(bp)を、サッカロミセス セレビジエ野生株X2180-1AのゲノムDNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、下記のオリゴヌクレオチドを使用することによって増幅させた：
(i) 配列5’-GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-3’ [SEQ ID No 10]の“pGAL1(Asp)Forw”；および、
(ii) 配列5’-CGACCTCGAGTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3’ [SEQ ID No 11]の“pGAL1(Xho)Rev”。
得られたフラグメントを、Asp718IおよびXhoI制限酵素により消化し、Asp718IおよびXhoI酵素により前以って消化したサッカロミセス セレビジエ-大腸菌pRS306シャトルプラスミド中に挿入して、pRS306-pGAL1ベクターを得た。
アザミサンゴに由来し、その配列を酵母発現用に最適化した単量体蛍光タンパク質Azami Green (mAG)をコード化する遺伝子の変異体に相応する678-塩基対フラグメント(bp)を、pPCR-Script-mAGベクターからのXhoIおよびEcoRI制限酵素による酵素消化によって得た。得られたフラグメントを、XhoIおよびEcoRI酵素により前以って消化したpRS306-pGAL1プラスミドに挿入して、pRS306-pGAL1-mAGベクターを得た。
【００３３】
酵母サッカロミセス セレビジエ由来のADH1遺伝子(tADH1)のターミネーターに相応する340-塩基対フラグメント(bp)を、サッカロミセス セレビジエX2180-1Aの野生株のゲノムDNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、下記のオリゴヌクレオチドを使用することによって増幅させた：
(i) 配列5’-GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3’
[SEQ ID No 12]の“TermADH1(NotIBstXI)5’”；および、
(ii) 配列5’-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-3’
[SEQ ID No 13]の“TermADH1(SacI)3’”。
得られたフラグメントを、SacIおよびNotI制限酵素により消化し、SacIおよびNotI酵素により前以って消化したpRS306-pGAL1-mAGプラスミド中に挿入して、pCYSAQ6ベクターを得た。
配列を酵母発現用に最適化したp21WAF1/Cip1タンパク質をコード化する遺伝子を、pPCR-Script-p21WAF1/Cip1[wt]プラスミドから、EcoRIおよびNotI制限酵素による消化によって精製した。フラグメントを、EcoRIおよびNotI制限酵素による消化によって調製したpCSYAQ6プラスミド中でクローニングした。得られたベクターをpCSYAQ6-p21[wt]と称し、そのダイアグラムは、図１Aに示している。
配列を酵母発現用に最適化したp21[6RK]WAF1/Cip1タンパク質をコード化する遺伝子を、pPCR-Script-p21WAF1/Cip1[6RK]プラスミドから、EcoRIおよびNotI制限酵素による消化によって精製した。フラグメントを、EcoRIおよびNotI制限酵素による消化によって調製したpCSYAQ6プラスミド中でクローニングした。得られたベクターをpCSYAQ6-p21[6KR]と称し、そのダイアグラムは、図１Bに示している。
【００３４】
酵母CYS343およびCYS344株の構築
CYS343酵母株を得るために、上記のpCSYAQ6-p21[wt]プラスミドを、Stu1酵素を使用することにより線状化した。Stu1酵素は、pCSYAQ6-p21[wt]プラスミドをURA3遺伝子の配列中に位置した特異な位置で開裂させた。線状化pCSYAQ6-p21[wt]プラスミドは、酵母サッカロミセス セレビジエの染色体５左アーム上に位置するURA3座に統合しなかった。
CYS344酵母株を得るために、上記のpCSYAQ6-p21[6KR]プラスミドを、Stu1酵素を使用することにより線状化した。Stu1酵素は、pCSYAQ6-p21[6KR]プラスミドをURA3遺伝子の配列中に位置した特異な位置で開裂させた。線状化pCSYAQ6-p21[6KR]プラスミドは、酵母サッカロミセス セレビジエの染色体５左アーム上に位置するURA3座に統合した。
CYS343およびCYS344酵母株は、Rohthstein (1991年)によって開示された一般的なプロトコールに従い、上述のようにして得られた。
本発明の酵母株のそれぞれの遺伝子型を、下記の表１に示す：
2009512432.tif 000003
【００３５】
実施例２〜６：本発明のスクリーニング方法の開発
実施例２：酵母細胞内で発現させたp21[6RK]WAF1/Cip1ヒト因子変異体形のヌクレオチドおよびタンパク質配列
タンパク質p21[6RK]WAF1/Cip1を含む融合タンパク質をコード化するアミノ酸配列は、SEQ ID N0 6のポリヌクレオチドによってコード化されているSEQ ID No 4のポリペプチドからなり、そのコドン同一性を酵母細胞内での最適発現に特異的に適応させた。
p21[6RK]WAF1/Cip1タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図２に示している。
図２においては、アルギニン残基(R)で置換した6個のリシン残基(K)並びに相応するコドンは、黒色で強調している。酵母サッカロミセス セレビジエ内でのp21[6RK]WAF1/Cip1因子の発現のために最適化したコドンは、灰色で強調している。
【００３６】
実施例３：酵母細胞内で発現させたp21WAF1/Cip1およびp21[6RK]WAF1/Cip1ヒト因子の細胞プロテアソーム介在分解(イムノブロッティングの結果)
mAGと融合させたp21WAF1/Cip1またはp21[6RK]WAF1/Cip1を含む融合タンパク質の、CYS344およびCYS343株の組換え酵母細胞のプロテアソームによる分解は、イムノブロッティング法によれば、プロテアソームインヒビター、Mg132化合物の存在下または不存在下に制御されていた。
A. 材料および方法
使用した酵母株は、全て培養し、同様な方法で分析した。
各細胞を、最小培地中で炭素源としてのガラクトースの存在下に120分間培養した。
この120分の終了時に、2％のグルコースを、50μMの既知のプロテアソームインヒビター、Mg132の存在下または不存在下の培養物に添加した。
結果は、図３(図３Aおよび図３B)に示している。図３Aは、CYS344組換え酵母株によって得られた結果を示している。
全タンパク質を、ガラクトースを添加する前(0)、ガラクトースの添加後の60分および120分(＋ガラクトース0、60、120)、およびグルコースの添加後30分、60分および120分(＋グルコース30、60、120)で調製した。
図３Bは、CYS343組換え酵母株によって得られた結果を示している。全タンパク質を、ガラクトースを添加する前(0)、ガラクトースの添加後の60分および120分(＋ガラクトース0、60、120)、およびグルコースの添加後30分、60分、120分および150分(＋グルコース30、60、120、150)で調製した。
これらのタンパク質を、融合タンパク質のp21WAF1/Cip1成分を認識する抗体を使用して、イムノブロッティング法(“ウェスタンブロッティング”)により分析した(図３においては、“mAG-p21WAF1/Cip1またはmAG-p21[6KR]WAF1/Cip1と記している)。
培養物中のMG132の存在は、図３において“＋MG132”で示している。各ウェル中で付着した対照のタンパク質量は、同じタンパク質を酵母Lysyl-RNAt-シンターゼ(図３においては“LysRS”と記している)を認識する抗体により分析することによって実施した。ゲルイムノブロット(“ウェスタンブロッティング”)は、抗-p21抗体および抗-Lys-p21抗体により明らかになった。
【００３７】
B.結果
結果は、次の組換え酵母株について示している：CYS343 (図３A)およびCYS344 (図３B)。
図３Aに示す結果は、ウェスタンブロッティングを使用する生化学分析により、p21WAF1/Cip1因子の6個のリシン残基をアルギニン残基で置換したmAG-p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質の分解を証明している。
図３Bに示す結果は、ウェスタンブロッティングを使用する生化学分析により、酵母細胞内でのmAG-p21[wt]WAF1/Cip1融合タンパク質の分解を証明している。
図３Aおよび３Bにおいては、全培養期間におけるガラクトースの存在(図３では“＋ガラクトース”と記している)が、p21[6KR]WAF1/Cip1含有(図３A)またはp21[wt]WAF1/Cip1含有(図３B)融合タンパク質産生の連続誘発を生じており、酵母細胞内で同時に起るプロテアソーム介在融合タンパク質分解と反対作用していることが理解できる。
図３Aおよび３Bにおいては、グルコースの存在下(図３では“＋グルコース”と記している)での細胞培養は、融合タンパク質の産生がそれ以上誘発されないので、プロテアソームによる融合タンパク質の分解を可視化可能にすることが観察できる。
図３Aおよび３Bにおいては、グルコースとプロテアソームインヒビター、MG132化合物の存在下(図３では“＋グルコース＋50μM MG132”と記している)での細胞培養は、MG132化合物の不存在下で観察される融合タンパク質の分解を抑制するのを可能にしていることも観察できる。
【００３８】
実施例４：mAG-p21[6KR]WAF1/Cip1タンパク質の分解(落射蛍光顕微鏡分析)
実施例４は、CYS344組換え株の酵母細胞内でのmAG-p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質分解の落射蛍光顕微鏡分析の結果を示す。
A. 材料および方法
CYS344株の酵母細胞を、最小培地中で炭素源としてのガラクトースの存在下に120分間培養した。
この120分の終了時に、2％のグルコースを、50μMの既知のプロテアソームインヒビター、Mg132の存在下または不存在下の培養物に添加した。
細胞を、落射蛍光顕微鏡(Omega XF116フィルターを装着させた蛍光顕微鏡Nikon Eclipse)を使用して観察した。全ての画像を、同様な設定を使用するHamamastuRカメラで記録し、次いで、グルコース添加直前(0分)、グルコース添加後60分、120分および180分(60分、120分および180分)において、LUCIA Gソフトウェアにより分析した。培養物中のMG132の存在は、“＋MG132”で示している。
B. 結果
結果は、図４(図４Aおよび図４B)に示している。図４Aは、グルコースの存在下に培養し、融合タンパク質発現誘発停止後の0分、60分、120分および180分の時点(図の上から下へ)でのCYS344株の細胞により得られた落射蛍光結果を示す。図４Bは、グルコースの存在下に培養し、融合タンパク質発現誘発停止後の0分、60分、120分および180分の時点(図の上から下へ)でのCYS344株の細胞により得られた落射蛍光結果を示す。
図４Aおよび４Bにおいては、左側のカラムは、mAG-p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質の発現を細胞内に局在化させるのを可能にしている蛍光顕微鏡写真を示している。
図４Aおよび４Bにおいては、右側のカラムは、可視光線下で、同じ細胞の可視化を提供している。
図４Aにおいては、蛍光シグナルの連続的低下が、プロテアソーム介在融合タンパク質分解が進行するにつれ、培養時間に対して観察されており(左側のカラム)、一方、観察した視野における細胞密度は変化しないままであった(右側のカラム)。
図４Bにおいては、培養時間に対する蛍光シグナル強度は維持されており(左側のカラム)、一方、観察した視野における細胞密度は変化しないままであり(右側のカラム)、これはプロテアソームの融合タンパク質分解活性を抑制していることを示し、その抑制はMG132インヒビターにより誘発されていることを観察できた。
【００３９】
実施例５：mAG-p21[6KR]WAF1/Cip1タンパク質の分解(フローサイトメトリー定量)
実施例５は、CYS343およびCYS344株各々の酵母細胞のフローサイトメトリー分析による、これらの細胞が、それぞれ、(i) ガラクトースの存在下での融合タンパク質の産生誘発中、および(ii) 融合タンパク質産生停止後グルコースの存在下での培養期間中に発出した蛍光シグナルの定量を示す。酵母細胞は、MG132プロテアソームインヒビターの存在下または不存在下に培養した。
結果は、図５に示す曲線によって例示している。
図５Aは、MG132プロテアソームインヒビターの存在下または不存在下にCYS343株により産生させたmAG- p21WAF1/Cip1融合タンパク質が発出した蛍光のフローサイトメトリー定量(FACS)を示す。
図５Bは、MG132プロテアソームインヒビターの存在下または不存在下にCYS344株により産生させたmAG- p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質が発出した蛍光のフローサイトメトリー定量(FACS)を示す。
A. 材料および方法
全ての細胞を、最小培地中で炭素源としてのガラクトースの存在下に120分間培養した。
この120分の終了時に、2％のグルコースを、50μMの既知のプロテアソームインヒビター、Mg132の存在下または不存在下の培養物に添加した。
細胞が発出した蛍光を、ガラクトース添加直前(I0)、ガラクトースの添加後1時間および2時間(I1およびI2)、グルコースの添加後1時間、2時間および3時間(D1、D2およびD3)で、FacsCaliburフローサイトメーター(Beckton-Dickinson社)を使用して定量した。培養物中のMg132の存在は、“＋MG132”で示している。蛍光は、任意単位で示している。
B. 結果
図５Aおよび５Bの結果は、融合タンパク質が、細胞をガラクトースの存在下に培養したとき、酵母CYA343およびCYS344株によって活発に産生されていることを示している(時間I0、I1h、I2h/D0)。
図５Aおよび５Bの結果は、融合タンパク質が、ガラクトースの存在下では細胞内に集積し、ガラクトースの不存在下およびグルコースの存在下で、MG132化合物の不存在下での培養期間中に次第に分解されていることを示している(時間D1h、D2h、D3h)。
図５Aおよび５Bの結果は、MG132プロテアソームインヒビターの存在下では、融合タンパク質の分解は、強く抑制されていることを示している(時間D1h、D2h、D3h)。
【００４０】
実施例６：mAG-p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質の酵母細胞中での局在化
実施例６においては、mAG-p21[6KR]WAF1/Cip1タンパク質のCYS344株酵母細胞中での局在化を測定した。
mAG-p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質の発現をGAL1プロモーターの制御下に可能にするポリヌクレオチドを含むCYS344株の酵母細胞を、2％のガラクトースの存在下に2時間培養し、次いで、蛍光顕微鏡を使用して観察した。
核心位置を、核心特異性着色指示薬のHoechst 333-42染料を使用して明らかにした。
細胞核DNAをHoechst 333-42染料で染色した光学顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真を撮った(写真は示していない)。
光学顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真を重ね合わせた(図示していない)。
細胞核心とmAG-p21[6KR]融合タンパク質WAF1/Cip1との共局在化を観察した。
【００４１】
文献目録
Adams (Nature Reviews Cancer (2004) 4:349-360)；
Adams and Anderson (Cancer Res.
(2001) 61:3071-3076)；
Ausubel and al. (in Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2004),
John Wiley and Sons Inc, N.Y.)；
Bailis and al., (Genetics (1990), 126:535-547)；
Bendjennat and al. (Cell (2003) 114: 599-610)；
Bennetzen and Hall. (J. Biol. Chem. (1982) 257: 3018-3025)；
Beverly and al., (Clin.
Cancer Res. (1999) 5:2638-2645)；
Bornstein and al., (J. Biol. Chem. (2003) 278:25752-25757)；
Burger and Seth (Eur J Cancer. (2004) 40:2217-2229)；
Coux and al., (Annu Rev Biochem. (1996) 65:801-47)；
Johnston and Davis (Mol. Cell. Biol. (1984) 4: 1440-1448).；
Glickman and Ciechanover 
(Physiol Rev. (2002) 82:373-428)；
Glickman and Coux (Curr.Protoc.Prot Sci (2001) p21.5.1-21.5.17)；
Glickman and al. (Mol. Cell. Biol. (1998) 18: 3149-3162；
Glickman and al. (In: Proteasomes: The World of Regulatory Proteolysis,
edited by Hilt W and Wolf DH. Georgetown, TX: Landes
Bioscience, (2000), p. 71−90)；
Gurskaya and al., (Biochem. J. (2003) 373:403-408)；
Hideshima and al. (Cancer Res. (2001) 61:3071-3076)；
Hipp and al. (Mol Cell Biol. (2005) 25:3483-3491；
Holzl and al. (J. Cell Biol. (2000) 150: 119-130)；
Karasawa and al. (J. Biol. Chem. (2003) 278:34167-34171)；
Karin and al. (PNAS (1984) 81: 337-341)；
Kerjan and al. (Nucleic Acids Res.(1986) 14: 7861-7871)；
Kriwacki and al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. (1996) 93:11504-11509)
Leggett and al. (Mol. Cell. (2002) 10:495-507)；
Liu and al. (Science (2003) 299:408-411)；
Matz and al. (Nature Biotech. (1999) 17:969-973)；
Pei and al. (Leukemia (2003)
17:2036-2045)；
Rothstein, in Methods in Enzymology, (1991), 194:281-301；
Sambrook and al. (in Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd edition,
(1989), Cold Spring Harbor, N. Y.)；
Schiestl and al. (Curr. Genet. (1989), 16:339-346
Schmidt and al., (Nature Struc. Mol. Biol. (2005) 12:294-303)；
Shagin and al. (Mol. Biol. Evol. (2004) 21:841-850)；
Sherman and al., in
Methods in Yeast Genetics: a Laboratory Manual, (1979), Cold Spring Harbor, N. Y.；
Sikorski and Hieter (Genetics (1989) 122: 19-27)；
Ustrell and al. (Embo J. (2002) 21:3516-3525)；
Wojcik and al. (Eur. J. Cell. Biol. (1998) 77:151-160)；
Zhang and al., (J. Biol. Chem. (2004) 279: 16000-16006)。
【００４２】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】p21-検出可能タンパク質融合タンパク質をコード化する組換えプラスミドのマップである。図１Aは、mAG-p21融合タンパク質をコード化する発現カセットを含有するpCSYAQ6-p21プラスミドの概要を示す。図１Bは、mAG-p21[6KR]融合タンパク質をコード化する発現カセットを含有するpCSYAQ6-p21-6KRプラスミドの概要を示す。
【図２】p21[6KR]WAF1/Cip1タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３】mAGと融合させたp21WAF1/Cip1またはp21[6KR]WAF1/Cip1を含む融合タンパク質の、プロテアソームインヒビター、MG132化合物の存在下または不存在下での分解を例証しているイムノブロット写真(“ウェスタンブロッティング”)である。結果は、次の組換え酵母株について示している：CYS343 (図２A)およびCYS344 (図２B)。
【図４】CYS344組換え株の酵母細胞内でのmAG- p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質分解の落射蛍光顕微鏡分析の結果を示す。図３Aは、グルコースの存在下に培養し、融合タンパク質発現誘発停止後の0分、60分、120分および180分の時点(図の上から下へ)でのCYS344株の細胞により得られた落射蛍光結果を示す。図３Bは、グルコースの存在下に培養し、融合タンパク質発現誘発停止後の0分、60分、120分および180分の時点(図の上から下へ)でのCYS344株の細胞により得られた落射蛍光結果を示す。
【図５】CYS343およびCYS344株各々の酵母細胞のフローサイトメトリー分析による、これらの細胞が、それぞれ、(i) ガラクトースの存在下での融合タンパク質の産生誘発中、および(ii) 融合タンパク質産生停止後グルコースの存在下での培養期間中に発出した蛍光シグナルの定量を示す。酵母細胞は、MG132プロテアソームインヒビターの存在下または不存在下に培養した。図４Aは、MG132プロテアソームインヒビターの存在下または不存在下にCYS343株により産生させたmAG- p21WAF1/Cip1融合タンパク質が発出した蛍光のフローサイトメトリー定量(FACS)を示す。図４Bは、MG132プロテアソームインヒビターの存在下または不存在下にCYS344株により産生させたmAG- p21[6KR]WAF1/Cip1融合タンパク質が発出した蛍光のフローサイトメトリー定量(FACS)を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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