(57)【要約】  酸分泌関連疾患を予防又は治療し得る薬剤を提供する。γ-Glu-X-Gly（Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y（Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-oｌ、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）等のカルシウム受容体活性化剤を、消化管の重炭酸分泌促進剤の有効成分とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム受容体活性化剤を有効成分として含有する、消化管の重炭酸分泌促進剤。
【請求項２】
カルシウム受容体活性化剤が、ペプチドである、請求項１に記載の重炭酸分泌促進剤。
【請求項３】
前記ペプチドが、γ-Glu-X-Gly（Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y（Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys(S-Me)からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の重炭酸分泌促進剤。
【請求項４】
前記XがCys、Cys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、AbuまたはSerであり、前記YがGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである、請求項３に記載の重炭酸分泌促進剤。
【請求項５】
カルシウム受容体活性化剤が、下記式（１）もしくは式（２）で示される化合物、又はその塩から選ばれる、請求項１に記載の重炭酸分泌促進剤。
【化１】
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【請求項６】
前記ペプチドが、γ-Glu-Val-Glyである、請求項４に記載の重炭酸分泌促進剤。
【請求項７】
カルシウム受容体活性化剤が、シナカルセットである、請求項１に記載の重炭酸分泌促進剤。
【請求項８】
酸分泌関連疾患の予防又は治療に用いられる医薬である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の重炭酸分泌促進剤。
【請求項９】
前記酸分泌関連疾患が、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、非ステロイド性抗炎症薬潰瘍、逆流性食道炎、及び、非びらん性胃食道逆流症からなる群から選択される、請求項８に記載の重炭酸分泌促進剤。
【請求項１０】
非ステロイド性抗炎症薬潰瘍の予防又は治療に用いられる医薬である、請求項６又は７に記載の重炭酸分泌促進剤。
【請求項１１】
成人１日あたりの投与量が、カルシウム受容体活性化剤の量として、０．００１〜１０ｇ／ｋｇ体重である、請求項８〜１０の何れか一項に記載の重炭酸分泌促進剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の重炭酸分泌促進剤を含有する食品。
【請求項１３】
カルシウム受容体活性化剤を有効成分として含有する、ソマトスタチン分泌促進剤と、食欲刺激剤を構成要素として含み、これらの構成要素が使用に際して択一的に選択される、食欲調節剤。
【請求項１４】
食欲刺激剤がＬ−グルタミン酸ナトリウムである、請求項１３に記載の食欲調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管の重炭酸分泌促進剤に関する。本発明の重炭酸分泌促進剤は、消化管機能障害、例えば酸分泌関連疾患の予防や治療において重炭酸分泌を亢進させる予防もしくは治療剤、又は消化管機能障害の予防、改善に有効な食品として利用できる。
【背景技術】
【０００２】
胃潰瘍、十二指腸潰瘍、非ステロイド性抗炎症薬（Non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAID）潰瘍、逆流性食道炎（Gastro-esophageal reflux disease; GERD）、及び非びらん性胃食道逆流症（non-erosive reflux disease; NERD）などの酸分泌関連疾患は、日常診療において高頻度で認められる消化器疾患である。【０００３】
胃潰瘍や十二指腸潰瘍のような消化性潰瘍は、胃や十二指腸の粘膜が過剰量の酸や消化酵素に曝されて形成される、又は粘膜防御機構の破綻により発症する、疾患である。消化性潰瘍の病因は、１）へリコバクター・ピロリの感染、２）非ステロイド性抗炎症薬やステロイド薬による障害、及び３）ストレス、飲酒や喫煙、などがあると考えられている。消化性潰瘍の治療薬としては、攻撃因子を抑制する薬剤と防御因子を増強する薬剤に大別される。攻撃因子を抑制する薬剤としては、酸分泌を抑制するヒスタミンH2受容体阻害薬やプロトンポンプ阻害薬があり、防御因子を増強する薬剤としては、胃粘膜被覆作用を有するエカベトやL-グルタミンなどがある。またヘリコバクター・ピロリ陽性患者は、除菌による治療効果が高いことが知られている（非特許文献１）。【０００４】
抗血小板療法の治療薬である低用量アスピリンや、変形性骨関節疾患の疼痛治療などの目的として高齢者に処方されているNSAIDにより、消化管障害が誘発されることがある。近年、ダブルバルーン内視鏡やカプセル内視鏡の開発により、小腸におけるNSAID潰瘍の発見が増えてきている。このようなNSAID小腸粘膜障害に対する治療薬はプロスタグランジン製剤やPPI（プロトンポンプ阻害薬）などが用いられているが、治療効果の満足が低いと言われている。また、NSAID潰瘍により腸管出血が誘発され、アメリカでは年間17000人の死亡者がいると報告されている（非特許文献２）。【０００５】
GERDは、下部食道括約筋の逆流防止機構の障害が原因で酸や消化酵素が食道内に逆流することで食道粘膜が障害を受ける疾患である。しかし、消化性潰瘍とは異なり、ヘリコバクター・ピロリの除菌により病態が悪化することが知られている。また胸焼けなどの逆流症状があるにも関わらず、内視鏡的に粘膜傷害を認めないNERDも近年注目されつつある（非特許文献３）。【０００６】
これら酸分泌関連疾患の治療薬として、ヒスタミンH2受容体阻害薬、プロトンポンプ阻害薬などが主に用いられている。ヒスタミンH2受容体阻害薬は夜間の胃酸分泌を抑え、食後の胃酸分泌は抑えない。一方プロトンポンプ阻害薬はヒスタミン、ガストリン及びアセチルコリンによる胃酸分泌を抑え、ヒスタミンH2受容体阻害薬よりも有効性が高い。しかし、これら酸分泌抑制剤を長期間投与すると、胃粘膜の増殖が認められ、さらには投与中止後に酸分泌がリバウンドすることで、潰瘍や炎症が再発する。また、これらの薬物は腎臓または肝機能障害を持つ患者には慎重に投与する必要がある。これらのことから、酸分泌関連疾患に対する薬物として、攻撃因子の減少と防御因子の増強の2つの作用を有し、長期間投与しても副作用が少ない薬物が望まれている。【０００７】
一方、食欲調節剤としては、中枢神経を作用点とするフェンフルラミンとフェンテルミン、シブトラミン、マジンドール等が知られているが、副作用としてのどの渇きや便秘、発汗、心悸亢進等を生じることがあり、より副作用が少ない食欲調節剤が求められている（非特許文献４）。【０００８】
カルシウム受容体は、カルシウムセンシング受容体（Calcium sensing receptor; 以下「CaSR」ともいう）とも呼ばれ、1993年にウシ甲状腺から細胞外カルシウム（Calcium; Ca2+）を知覚するGタンパク共役7回膜貫通型受容体（G-protein coupled receptor; GPCR）としてクローニングされた（非特許文献５）。カルシウム受容体は細胞外のCa2+を知覚して細胞内のCa2+濃度を変化させ、それによって副甲状腺ホルモンに代表されるCa2+代謝調節に関与するホルモンなどの産生を調節する機能を有している。近年、カルシウム受容体作動薬であるシナカルセット（cinacalcet; CCT）が副甲状腺のカルシウム受容体に作用してカルシウム受容体のCa2+感受性を上げることにより、副甲状腺ホルモンの分泌を抑制する作用を有することが明らかとなっている（非特許文献６）。また、カルシウム受容体は腎、脳、甲状腺、骨や消化管に発現することが明らかとなっている（非特許文献７）。カルシウム受容体は胃のG細胞、壁細胞に発現しており、ガストリンおよび胃酸分泌を促進する作用を有することが明らかとなっている（非特許文献８、９）。又、カルシウム受容体は大腸に発現し水分泌を調節している（非特許文献１０）。このことから、カルシウム受容体作動薬は、上部下部消化器疾患に対して有効である可能性が報告されている（特許文献１）。【０００９】
一方、カルシウム受容体作動薬が酸分泌を調節し、ヒスタミン刺激下における壁細胞内のアルカリ化を抑制する作用がプロトンポンプ阻害薬であるオメプラゾールと同程度であることが示されている（非特許文献１１）。
このように、カルシウム受容体作動薬の消化管粘膜の攻撃因子の1つである酸に対する抑制効果は明らかとなりつつあるが、防御因子に対する効果は未だ不明である。
【非特許文献１】The merck manual of medical information second home edition, online version［平成２０年３月１３日検索］、インターネット＜URL：http://mmh.banyu.co.jp/mmhe2j/sec09/ch121/ch121c.html＞
【特許文献１】国際公開パンフレット第WO2006/123725号
【非特許文献２】日本臨床（Nippon Rinsho）2007; 65(10): 1749-1758
【非特許文献３】日本臨床（Nippon Rinsho）2007; 65(5): 797-801, 841-845
【非特許文献４】「今日の治療薬 2001  解説と便覧」、南江堂、水島  裕編著、p.928
【非特許文献５】Brown, E.M. et al. 1993. Nature 366: 575-580
【非特許文献６】Cohen, A. and Silverberg, S.J. 2002. Current Opinion in Pharmacology 2: 734-739
【非特許文献７】McLarnon, S.J. and Riccardi, D. et al. 2002. European Journal of Pharmacology 447: 271-278
【非特許文献８】Ray, J.M. et al. 1997. Journal of Clinical Investigation 99: 2328-2333
【非特許文献９】Cheng, I. et al. 1999. Gastroenterology 1999; 116: 118-126
【非特許文献１０】Cheng, S. X. et al. 2002. The American Journal of Physiology-Gastroinstinal and Liver Physiology 283: G240-G250
【非特許文献１１】Geibel, J.P. et al. 2001. Journal of Biological Chemistry 276: 39549-39552
【発明の開示】
【００１０】
本発明の課題は、消化管機能障害、酸分泌関連疾患に伴う過剰に分泌された酸や薬物誘発粘膜損傷に対し有効な、酸分泌関連疾患を予防又は治療し得る薬剤を提供することである。
【００１１】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、カルシウム受容体活性化剤が胃や十二指腸において重炭酸分泌を促進することを見出した。またカルシウム受容体活性化剤はヒスタミン誘発胃酸分泌を抑制することを確認した。さらに、胃の特定の細胞を単離する技術を開発し、この技術を基にカルシウム受容体が胃のD細胞に発現していることを新たに見出した。さらにはカルシウム受容体活性化剤が胃のD細胞においてソマトスタチン分泌を促進することを見出した。このことから、カルシウム受容体活性化剤を投与又は摂取することにより、胃や十二指腸における防御因子を増強する、各種の酸分泌関連疾患の予防または治療薬としての新規用途が見出され、本発明を完成した。
【００１２】
さらに、本発明者らは、カルシウム受容体活性化剤が胃のD細胞においてソマトスタチンの分泌を促進するのに対し、グルタミン酸はソマトスタチンの分泌を抑制することをも見出した。ソマトスタチンは消化器、胃、小腸、大腸、すい臓などに作用し、食欲調節ホルモンなどの分泌を抑制することから、カルシウム受容体活性化剤、又は、カルシウム受容体活性化剤とグルタミン酸の使用調節によって、適切な食欲調節剤が提供されうることをも見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の内容を含む。
（１）カルシウム受容体活性化剤を有効成分として含有する、消化管の重炭酸分泌促進剤。
（２）カルシウム受容体活性化剤が、ペプチドである、前記重炭酸分泌促進剤。
（３）前記ペプチドが、γ-Glu-X-Gly（Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y（Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me)からなる群から選択される、前記重炭酸分泌促進剤。
（４）前記XがCys、Cys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、AbuまたはSerであり、前記YがGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである、前記重炭酸分泌促進剤。
（５）カルシウム受容体活性化剤が、下記式（１）もしくは式（２）で示される化合物、又はその塩から選ばれる、前記重炭酸分泌促進剤。
【００１４】
【化１】
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【００１５】
（６）前記ペプチドが、γ-Glu-Val-Glyである、前記重炭酸分泌促進剤。
（７）カルシウム受容体活性化剤が、シナカルセットである、前記重炭酸分泌促進剤。
（８）酸分泌関連疾患の予防又は治療に用いられる医薬である、前記重炭酸分泌促進剤。
（９）前記酸分泌関連疾患が、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、非ステロイド性抗炎症薬潰瘍、逆流性食道炎、及び、非びらん性胃食道逆流症からなる群から選択される、前記重炭酸分泌促進剤。
（１０）γ-Glu-Val-Gly又はシナカルセットを有効成分として含有する、非ステロイド性抗炎症薬潰瘍の予防又は治療に用いられる医薬。
（１１）成人１日あたりの投与量が、カルシウム受容体活性化剤の量として、０．００１〜１０ｇ／ｋｇ体重である、前記重炭酸分泌促進剤。
（１２）前記重炭酸分泌促進剤を含有する食品。
（１３）カルシウム受容体活性化剤を有効成分として含有する、ソマトスタチン分泌促進剤と、食欲刺激剤を構成要素として含み、これらの構成要素が使用に際して択一的に選択される、食欲調節剤。
（１４）食欲刺激剤がＬ−グルタミン酸ナトリウムである、前記食欲調節剤。
【００１６】
（１５）消化管の重炭酸分泌促進剤の製造のためのカルシウム受容体活性化剤の使用。
（１６）カルシウム受容体活性化剤が、ペプチドである、前記使用。
（１７）前記ペプチドが、γ-Glu-X-Gly（Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y（Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me)からなる群から選択される、前記使用。
（１８）前記XがCys、Cys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、AbuまたはSerであり、前記YがGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである、前記使用。
（１９）カルシウム受容体活性化剤が、前記式（１）もしくは式（２）で示される化合物、又はその塩から選ばれる、前記使用。
（２０）前記ペプチドが、γ-Glu-Val-Glyである、前記使用。
（２１）カルシウム受容体活性化剤が、シナカルセットである、前記使用。
【００１７】
（２２）酸分泌関連疾患の予防又は治療に用いられる医薬の製造のための前記カルシウム受容体活性化剤の使用。
（２３）前記酸分泌関連疾患が、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、非ステロイド性抗炎症薬潰瘍、逆流性食道炎、及び、非びらん性胃食道逆流症からなる群から選択される、前記使用。
（２４）非ステロイド性抗炎症薬潰瘍の予防又は治療に用いられる医薬の製造のためのγ-Glu-Val-Gly又はシナカルセットの使用。
（２５）食欲調節剤の製造のための前記カルシウム受容体活性化剤及び食欲刺激剤の使用。
（２６）食欲刺激剤がＬ−グルタミン酸ナトリウムである、前記使用。
【００１８】
（２７）カルシウム受容体活性化剤を消化管の重炭酸分泌促進が必要な対象に投与することを含む、消化管の重炭酸分泌促進方法。
（２８）カルシウム受容体活性化剤が、ペプチドである、前記重炭酸分泌促進方法。
（２９）前記ペプチドが、γ-Glu-X-Gly（Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y（Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me)からなる群から選択される、前記重炭酸分泌促進方法。
（３０）前記XがCys、Cys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、AbuまたはSerであり、前記YがGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである、前記重炭酸分泌促進方法。
（３１）カルシウム受容体活性化剤が、前記式（１）もしくは式（２）で示される化合物、又はその塩から選ばれる、前記重炭酸分泌促進方法。
（３２）前記ペプチドが、γ-Glu-Val-Glyである、前記重炭酸分泌促進方法。
（３３）カルシウム受容体活性化剤が、シナカルセットである、前記重炭酸分泌促進方法。
【００１９】
（３４）前記カルシウム受容体活性化剤を酸分泌関連疾患の予防又は治療が必要な対象に投与することを含む、酸分泌関連疾患の予防又は治療方法。
（３５）前記酸分泌関連疾患が、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、非ステロイド性抗炎症薬潰瘍、逆流性食道炎、及び、非びらん性胃食道逆流症からなる群から選択される、前記酸分泌関連疾患の予防又は治療方法。
（３６）γ-Glu-Val-Gly又はシナカルセットを、非ステロイド性抗炎症薬潰瘍の予防又は治療が必要な対象に投与することを含む、非ステロイド性抗炎症薬潰瘍の予防又は治療方法。
（３７）成人１日あたりの投与量が、カルシウム受容体活性化剤の量として、０．００１〜１０ｇ／ｋｇ体重である、前記酸分泌関連疾患の予防又は治療方法。
（３８）前記カルシウム受容体活性化剤と食欲刺激剤を使用に際して択一的に選択し、食欲調節が必要な対象に投与することを含む、食欲調節方法。
（３９）食欲刺激剤がＬ−グルタミン酸ナトリウムである、前記食欲調節方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】胃および十二指腸における重炭酸分泌に対するシナカルセットの影響を示す図。(A)胃、（B）十二指腸。
【図２】ヒスタミン誘発胃酸分泌に対するシナカルセットの影響を示す図。
【図３】ラット胃粘膜の細胞画分におけるソマトスタチンとCaSRの発現量を示す図。
【図４】分画した胃粘膜D細胞にCaSR作動薬を処置した際のソマトスタチン分泌量を示す図。
【図５】ヒスタミン誘発胃酸分泌に対するシナカルセットとソマトスタチン受容体２阻害薬を併用した際の、ヒスタミン誘発胃酸分泌を示す図。
【図６】NSAID誘発小腸炎に対するシナカルセットの効果を示す図。
【図７】NSAID誘発小腸炎に対するγ-EVGの効果を示す図。
【図８】十二指腸における重炭酸分泌量に対するγ-EVGの影響を示す図。
【図９】分画した胃粘膜D細胞にCaSR作動薬およびグルタミン酸ナトリウムを処置した際のソマトスタチン分泌量を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明の消化管の重炭酸分泌促進剤は、カルシウム受容体活性化剤を有効成分として含有する。【００２２】
本明細書中において「カルシウム受容体」とは、カルシウムセンシング受容体、又はCalcium Sensing Receptor（CaSR）と呼ばれる、７回膜貫通型受容体のクラスＣに属するものを指す。本明細書中において「CaSR活性化剤」には、上記CaSRに結合し、CaSRを活性化し、CaSRを発現している細胞の機能を調節する物質（以下、「CaSR作動薬」ともいう）、及び、CaSR活性を拡張する働きをする物質（以下、「CaSRモジュレータ」ともいう）を含む。また、本明細書中において「CaSRの活性化」とは、カルシウム受容体にリガンドが結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化して、シグナルを伝達することを意味する。また、カルシウム受容体がこのシグナルを伝達することを「CaSR活性」という。【００２３】
カルシウム受容体活性化剤は、例えば以下に示すスクリーニング法により取得することかできるが、これらの方法に限定されるものではない。【００２４】
CaSR作動薬及びモジュレータは、CaSRを発現する細胞を用いて、被検物質によるCaSRの活性化の有無を調べることにより、スクリーニングすることができる。
CaSRの活性化の有無は、これに結合する物質（リガンド）、CaSRの活性を調節するシグナルとの反応を阻害する物質、CaSRにリガンドが結合することにより発生するシグナルを伝達する物質（セカンドメッセンジャー等）等の量を測定することで調べることができる。例えば、CaSRにCa2+等のリガンドが結合することによって発生するセカンドメッセンジャーを検出することによって、CaSRの活性化を検出することができる。また、既知のリガンドを標識したものを用い、標識リガンドとCaSRとの結合を測定することによっても、CaSRの活性化を検出することができる。【００２５】
CaSRは、リガンドが結合することによりＧＴＰ結合蛋白質（Ｇ蛋白質ともいう。Ｇｉ、Ｇｑ等）に作用し、ｃＡＭＰ等のセカンドメッセンジャーを介して細胞の諸機能を制御している。このうち、Ｇｑの活性化によっては、細胞内カルシウム濃度が上昇する。また、シグナル伝達における細胞内カルシウム濃度上昇の下流には、カルモジュリンやプロテインキナーゼＣやアデニレートサイクレース等の細胞内酵素の活性化や細胞質・膜蛋白のリン酸化による急性期の機能調節がある。これらの細胞内酵素の活性化は細胞膜に存在するチャネル機能変化を引き起こす。したがって、被検物質を、CaSRを発現する細胞に接触させ、細胞内カルシウム濃度、ｃＡＭＰの細胞内蓄積量、チャネル機能（例えば、細胞外プロトン産生量）、消化管ホルモン分泌量の測定値等を指標にしてＧ蛋白質の活性化をみることによって、被検物質によるCaSRの活性化の有無を検出することができる。【００２６】
スクリーニングに用いられるCaSRを発現する細胞は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類などの動物に由来する細胞であり得る。好ましくは、上記動物に由来する消化管ホルモン産生細胞などを用いる。また、CaSRは、その由来は特に制限されず、上記動物のCaSRが挙げられる。具体的には、GenBank Accession No NM_000388で登録されているヒトCaSR遺伝子によってコードされるヒトCaSRが好ましく例示できる。尚、CaSRは、上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、CaSR機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。GPRC6A受容体や5.24受容体もまたCaSRのサブタイプとして知られており、以下の方法において利用可能である。【００２７】
スクリーニングにおける被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。【００２８】
スクリーニングの第１の方法（以下、「方法Ａ」ともいう。）は、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被検物質とCaSRを発現する細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被検物質に接触させた細胞におけるＧ蛋白質の活性化を測定し、該活性化を被検物質に接触させない対照細胞における活性化と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、CaSRを活性化し得る物質を選択する工程。【００２９】
上記スクリーニング方法の工程（ａ）では、CaSRを発現する細胞が被検物質と接触条件下におかれる。該細胞に対する被検物質の接触は、培養培地中で行われ得る。培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択される。【００３０】
工程（ｂ）では、まず被検物質の存在下、CaSRを発現する細胞におけるＧ蛋白質の活性化が評価される。次いで該活性化を、被検物質の非存在下での活性化と比較する。ここで、Ｇ蛋白質の活性化を測定する指標としては、細胞内カルシウム濃度、細胞内ｃＡＭＰ量、細胞外プロトン量及び細胞内消化管ホルモン（例えばソマトスタチン）分泌量などが挙げられる。【００３１】
工程（ｃ）において、活性化の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。評価の結果、被検物質の非存在下に対して被検物質の存在下で、活性化の上昇・拡張が確認できれば、その被検物質はCaSR作動薬と判定され得る。【００３２】
また、CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、上記工程（ａ）で、被検物質およびCaSR作動薬を、CaSRを発現する細胞と接触させ、（ｂ）において、被検物質の存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合におけるＧ蛋白質の活性化と、被検物質の非存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合におけるＧ蛋白質の活性化とを比較し、（ｃ）において、Ｇ蛋白質の活性化を拡張した物質を、CaSRモジュレータとして選択してもよい。【００３３】
CaSR作動薬又はモジュレータのスクリーニングの第２の方法は、例えば、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）CaSRを発現する細胞に、被検物質及びCaSRに作用するリガンドを接触させる工程、
（ｂ）当該細胞の細胞膜に結合したリガンドの量を測定し、該リガンドの量を被検物質に接触させない対照細胞におけるリガンドの量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、CaSRを活性化し得る物質を選択する工程。【００３４】
上記スクリーニング方法の工程（ａ）では、CaSRを発現する細胞が被検物質及びCaSRに作用するリガンドと接触条件下におかれる。該細胞に対する被検物質及びCaSRに作用するリガンドの接触は、培養培地中で行われ得る。培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択される。【００３５】
工程（ｂ）では、まず被検物質の存在下、CaSRを発現する細胞の細胞膜に結合したリガンドの量が評価される。次いでリガンドの量を、被検物質の非存在下でのリガンドの量と比較する。結合したリガンドの量は、例えば、放射標識リガンド等を用いることで、測定することができる。【００３６】
工程（ｃ）において、リガンドの量の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。評価の結果、被検物質の非存在下に対して被検物質の存在下で、リガンド結合量の減少が確認できれば、その被検物質はCaSR作動薬又はCaSRモジュレータと判定され得る。【００３７】
さらに、リガンド結合量の減少が確認できた物質について、前述のスクリーニング方法Ａにより、CaSR作動薬であることを確認することができる。【００３８】
CaSRに作用するリガンドとしては、特に限定されないが、例えばCa2+やシナカルセット等が挙げられる。【００３９】
以下に、CaSRを発現する細胞（CaSRを機能可能な状態で保持する細胞）を用いた、消化管機能障害を改善し得る物質を検出する具体的な方法（１）〜（６）を例示する。【００４０】
（１）以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む方法：
（ａ）被検物質とCaSRを発現する細胞とを一定期間接触させる工程、
（ｂ）被検物質に接触させた細胞より遊離されるソマトスタチンを測定し、該遊離量を被検物質に接触させない対照細胞における遊離量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、CaSRを活性化し得る物質を選択する工程。【００４１】
（２）以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む方法：
（ａ）被検物質とカルシウム感受性色素（例えば、Ｆｕｒａ−２、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｌｕｏ−３等）を導入したCaSRを発現する細胞とを一定期間接触させる工程、
（ｂ）被検物質に接触させた細胞における蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）を測定し、該強度を被検物質に接触させない対照細胞における強度と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、CaSRを活性化し得る物質を選択する工程。【００４２】
ここで、上記スクリーニング方法の工程（ａ）において、CaSRを発現する細胞は、CaSR受容体を発現する消化管ホルモン産生細胞であることが好ましい。例えば、被検物質と、カルシウム感受性色素を導入した消化管ホルモン産生細胞とを一定期間接触させたときの蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）変化により、目的物質の検索を行う。CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質およびCaSR作動薬を、カルシウム感受性色素（例えば、Ｆｕｒａ−２、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｌｕｏ−３等）を導入したCaSRを発現する細胞と接触させてもよい。【００４３】
上記スクリーニング方法の工程（ｂ）では、被検物質の存在下、CaSRを発現する細胞における蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）が変動するか否かが評価される。これは、該測定された蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）を、被検物質の非存在下での蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）と比較することにより評価され得る。かかる蛍光強度は公知の方法を使用して測定できる。CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質の存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合における蛍光強度と、被検物質の非存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合における蛍光強度とを比較してもよい。【００４４】
上記スクリーニング方法の工程（ｃ）において、蛍光強度の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。蛍光強度の評価の結果、細胞内カルシウム濃度の上昇が確認できれば、その被検物質はCaSR作動薬と判定され得る。CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、蛍光強度の変動幅を拡張した物質を、CaSRモジュレータとして選択してもよい。【００４５】
（３）以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む方法：
（ａ）被検物質とCaSRを発現する細胞とを一定期間接触させる工程、
（ｂ）被検物質に接触させた細胞におけるｃＡＭＰ量を計測し、該ｃＡＭＰ量を被検物質に接触させない対照細胞におけるｃＡＭＰ量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、CaSRを活性化し得る物質を選択する工程。【００４６】
ｃＡＭＰ量は、市販のアッセイキットを用いて測定することができる。
上記スクリーニング方法の工程（ａ）において、CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質およびCaSR作動薬を、CaSRを発現する細胞と接触させてもよい。
上記スクリーニング方法の工程（ｂ）において、CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質の存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合におけるｃＡＭＰ量と、被検物質の非存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合におけるｃＡＭＰ量とを比較してもよい。【００４７】
上記スクリーニング方法の工程（ｃ）において、ｃＡＭＰ量の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。ｃＡＭＰ量の評価の結果、ｃＡＭＰ量の増加が確認できれば、その被検物質はCaSRを活性化し得る物質と判定され得る。CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、ｃＡＭＰ量の増加を拡張した物質を、CaSRモジュレータとして選択してもよい。【００４８】
（４）以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む方法：
（ａ）CaSRを発現する細胞に、被検物質及びCaSRに作用する既知のリガンド（例えばCa2+、シナカルセット等）を一定期間接触させる工程、
（ｂ）当該細胞の細胞膜に結合したリガンドの量を測定し、該リガンドの量を被検物質に接触させない対照細胞におけるリガンドの量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、CaSRを活性化し得る物質を選択する工程。【００４９】
既知リガンドの量は、それらの物質の一部を放射活性ラベルし、細胞膜に結合する放射活性の量により、測定することができる。
上記スクリーニング方法の工程（ｃ）において、リガンドの量の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。リガンドの量の評価の結果、リガンド結合量の減少が確認できれば、その被検物質はCaSR作動薬又はモジュレータと判定され得る。【００５０】
（５）以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む方法：
（ａ）被検物質とｃＡＭＰ感受性蛍光蛋白質（例えばＦｌＣＲｈＲ等）を導入したCaSRを発現する細胞とを一定期間接触させる工程、
（ｂ）被検物質に接触させた細胞における蛍光強度（細胞内ｃＡＭＰ濃度）を測定し、該強度を被検物質に接触させない対照細胞における強度と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、CaSRを活性化し得る物質を選択する工程。【００５１】
ここで、CaSRを発現する細胞はCaSRを発現する消化管ホルモン産生細胞であることが好ましい。【００５２】
上記スクリーニング方法の工程（ａ）において、CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質およびCaSR作動薬を、ｃＡＭＰ感受性蛍光蛋白質（例えばＦｌＣＲｈＲ等）を導入したCaSRを発現する細胞と接触させてもよい。【００５３】
上記スクリーニング方法の工程（ｂ）において、CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質の存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合における蛍光強度（細胞内ｃＡＭＰ濃度）と、被検物質の非存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合における蛍光強度（細胞内ｃＡＭＰ濃度）とを比較してもよい。【００５４】
上記スクリーニング方法の工程（ｃ）において、蛍光強度の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。蛍光強度の評価の結果、蛍光強度の上昇が確認できれば、その被検物質はCaSR作動薬と判定され得る。CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、蛍光強度の上昇を拡張した物質を、CaSRモジュレータとして選択してもよい。【００５５】
（６）以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む方法：
（ａ）被検物質とCaSRを発現する細胞とを一定期間接触させる工程、
（ｂ）被検物質に接触させた細胞における細胞外プロトン産生量を測定し、該プロトン産生量を被検物質に接触させない対照細胞における細胞外プロトン産生量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、CaSRを活性化し得る物質を選択する工程。【００５６】
ここで、CaSRを発現する細胞とはCaSRを発現する消化管ホルモン産生細胞であることが好ましく、例えば、CaSR作動薬と被検物質とCaSRを発現する消化管ホルモン細胞とを一定期間接触させたときの細胞外プロトン産生量を測定し、該プロトン産生量を指標として目的物質を検出してもよい。プロトン産生量はサイトセンサーにより測定する。【００５７】
上記スクリーニング方法の工程（ａ）において、CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質およびCaSR作動薬を、CaSRを発現する細胞と接触させてもよい。【００５８】
上記スクリーニング方法の工程（ｂ）において、CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質の存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合における細胞外プロトン産生量と、被検物質の非存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合における細胞外プロトン産生量とを比較してもよい。【００５９】
上記スクリーニング方法の工程（ｃ）において、プロトン産生量の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。プロトン産生量の評価の結果、細胞外プロトン産生量の増加が確認できれば、その被検物質はCaSR作動薬と判定され得る。CaSＲモジュレータをスクリーニングする場合は、細胞外プロトン産生量の増加を拡張した物質を、CaSRモジュレータとして選択してもよい。【００６０】
（７）以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む方法：
（ａ）被検物質とCaSRを発現する細胞とを一定期間接触させる工程、
（ｂ）被検物質に接触させた細胞における消化管ホルモン分泌量を測定し、該消化管ホルモン分泌量を被検物質に接触させない対照細胞における消化管ホルモン分泌量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、CaSRを活性化し得る物質を選択する工程。【００６１】
ここで、CaSRを発現する細胞とはCaSRを発現する消化管ホルモン産生細胞であることが好ましく、例えば、CaSR作動薬と被検物質とCaSRを発現する消化管ホルモン産生細胞を一定期間接触させたときの消化管ホルモン分泌量を測定し、消化管ホルモン分泌量を指標として目的物質の検索を行ってもよい。消化管ホルモン分泌量は、市販のアッセイキットを用いて測定することができる。【００６２】
上記スクリーニング方法の工程（ａ）において、CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質およびCaSR作動薬を、CaSRを発現する細胞と接触させてもよい。【００６３】
上記スクリーニング方法の工程（ｂ）において、CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、被検物質の存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合における消化管ホルモン分泌量と、被検物質の非存在下でCaSR作動薬を細胞へ接触させた場合における消化管ホルモン分泌量とを比較してもよい。【００６４】
上記スクリーニング方法の工程（ｃ）において、消化管ホルモン分泌量の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行われる。消化管ホルモン分泌量の評価の結果、消化管ホルモン分泌量の変動が確認できれば、その被検物質はCaSR作動薬と判定され得る。CaSRモジュレータをスクリーニングする場合は、消化管ホルモン分泌量の変動幅を拡張した物質を、CaSRモジュレータとして選択してもよい。【００６５】
上記のようにして得られるCaSR活性化剤（CaSR作動薬又はモジュレータ）について、消化管における重炭酸分泌促進剤作用を有することを確認することが好ましい。重炭酸分泌促進作用は、例えば、実施例に記載した、Aiharaら（Aihara, E. et al. 2005. J. Pharmacol. Exp. Ther. 315: 423-432）、及び、Kagawaら（Kagawa, S. et al. 2003. Digestive Diseases and Sciences 48: 1850-1856）の方法に準じて確認することができる。【００６６】
CaSR作動薬として具体的には、カルシウム及びガドリニウムなどの２価又はそれ以上のカチオン、フェニルアラニンやトリプトファンなどのアミノ酸、γ-Glu-X-Gly（Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y（Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-ｔ-Leu、γ-Glu-Cys(S-Me)などの各種ペプチド、ポリリジンなどの塩基性ペプチド、スペルミンやスペルミジンなどのポリアミン、プロタミンなどのタンパク質、シナカルセット、前記化学式（１）で示される化合物（(R)-N-[(4-エトキシ-3-メチルフェニル)メチル]-1-(1-ナフチル)エチルアミン）または化学式（２）で示される化合物（(R)-N-(3-フェニルプロプ-2-エニル)-1-(3-メトキシフェニル)エチルアミン）などの各種低分子化合物が挙げられる。【００６７】
尚、本明細書中においてペプチドを構成するアミノ酸は、特に断わらない限りいずれもＬ−体である。ここで、アミノ酸とは、Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asn, Gln, Pro, Hypなどの中性アミノ酸、Asp, Gluなどの酸性アミノ酸、Lys, Arg, Hisなどの塩基性アミノ酸、Phe, Tyr, Trpなどの芳香族アミノ酸や、ホモセリン、シトルリン、オルニチン、α-アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、タウリンなども含有する。【００６８】
本明細書においてアミノ基残基の略号は以下のアミノ酸を意味する。
（１）Ｇｌｙ：グリシン
（２）Ａｌａ：アラニン
（３）Ｖａｌ：バリン
（４）Ｌｅｕ：ロイシン
（５）Ｉｌｅ：イソロイシン
（６）Ｍｅｔ：メチオニン
（７）Ｐｈｅ：フェニルアラニン
（８）Ｔｙｒ：チロシン
（９）Ｔｒｐ：トリプトファン
（１０）Ｈｉｓ：ヒスチジン
（１１）Ｌｙｓ：リジン
（１２）Ａｒｇ：アルギニン
（１３）Ｓｅｒ：セリン
（１４）Ｔｈｒ：トレオニン
（１５）Ａｓｐ：アスパラギン酸
（１６）Ｇｌｕ：グルタミン酸
（１７）Ａｓｎ：アスパラギン
（１８）Ｇｌｎ：グルタミン
（１９）Ｃｙｓ：システイン
（２０）Ｐｒｏ：プロリン
（２１）Ｏｒｎ：オルニチン
（２２）Ｓａｒ：サルコシン
（２３）Ｃｉｔ：シトルリン
（２４）Ｎ−Ｖａｌ：ノルバリン
（２５）Ｎ−Ｌｅｕ：ノルロイシン
（２６）Ａｂｕ：α−アミノ酪酸
（２７）Ｔａｕ：タウリン
（２８）Ｈｙｐ：ヒドロキシプロリン
（２９）ｔ−Ｌｅｕ：ｔｅｒｔ−ロイシン【００６９】
また、アミノ酸誘導体とは、上記アミノ酸の各種誘導体であって、例えば、特殊アミノ酸や非天然アミノ酸、アミノアルコール、或いは末端カルボニル基やアミノ基、システインのチオール基などのアミノ酸側鎖が各種置換基により置換したものが挙げられる。置換基としては、アルキル基、アシル基、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、スルフォニル基や各種保護基などが挙げられ、例えば、Arg(NO2)：Ｎ−γ−ニトロアルギニン、Cys(SNO)：Ｓ−ニトロシステイン、Cys(S-Me)：Ｓ−メチルシステイン、Cys(S-allyl)：Ｓ−アリルシステイン、Val-NH2：バリンアミド、Val-ol：バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）などが含まれる。【００７０】
尚、前記γ-Glu-Met(O)およびγ-Glu-Cys(S-Me)(O)中の(O)はスルフォキシド構造であることを意味する。γ-Gluの(γ:gamma)とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシ基を介して他のアミノ酸が結合していることを意味する。【００７１】
前記ペブチド中の「X」は、Cys、Cys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、AbuまたはSerであることが好ましく、「Y」は、Gly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnであることが好ましいが、これらに限定されない。前記ペプチドとしては、γ-Glu-Val-Glyが好ましく挙げられる。【００７２】
上記ペプチドは、市販品を用いることが可能である。また、ペプチドは、（１）化学的に合成する方法、又は（２）酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。本発明において用いられるペプチドは、含まれるアミノ酸の残基数が２〜３残基と比較的短いので、化学的に合成する方法が簡便である。化学的に合成する場合は、該オリゴペプチドをペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。化学的に合成する方法としては、例えばペプチド固相合成法が挙げられる。そのようにして合成したペプチドは通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。このようなペプチド固相合成法、およびそれに続くペプチド精製はこの技術分野においてよく知られたものである。【００７３】
また、本発明において用いられるペプチドを、酵素的な反応により生産することも出来る。例えば、国際公開パンフレットWO2004/011653号に記載の方法を用いることが出来る。即ち、一方のアミノ酸又はジペプチドのカルボキシル末端をエステル化又はアミド化したアミノ酸又はジペプチドと、アミノ基がフリーの状態であるアミノ酸（例えばカルボキシル基が保護されたアミノ酸）とを、ペプチド生成酵素の存在下において反応せしめ、生成したジペプチド又はトリペプチドを精製することによっても生産することもできる。
ペプチド生成酵素としては、ペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、又は、該微生物の菌体処理物、又は、該微生物に由来するペプチド生成酵素が挙げられる。【００７４】
尚、上述した様な酵素的な方法や化学的合成法以外にも本発明において用いられるペプチドが、野菜や果物等の植物、酵母等の微生物、酵母エキス等に存在する場合がある。天然に存在する場合には、これらから抽出して用いてもかまわない。【００７５】
また、ペプチドは、単離して用いる必要はなく、本発明のペプチドを多く含んでいる画分を用いてもかまわない。例えば、グルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）を含む酵母エキス又はその分画物が挙げられる。酵母エキス等の調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。酵母エキスの分画物としては、グルタチオンを含む限り、特に制限されない。【００７６】
前記化学式（１）で示される化合物および化学式（２）で示される化合物は、例えば、米国特許第6211244号公報に記載されるような公知の方法により合成することができる。また、市販品を用いることもできる。【００７７】
上記アミノ酸及びペプチドがCaSR活性化作用を有することは、WO2007/055388、WO2007/055388、WO2008/139945、WO2008/139946、WO2008/139947に示されている。【００７８】
その他、CaSR活性化剤としては、米国特許第6211244号、国際公開WO06/123725号、国際公開WO05/115975号、米国特許第6313146号、米国特許第6213146号、米国特許第5688938号、米国特許第5763569号、米国特許第5858684号、米国特許第5962314号、米国特許第6001884号、米国特許第6011068号、米国特許第6031003号明細書、国際公開WO95/11221号、国際公開WO1996/012697号、国際公開第WO2002/059102号、又は特開1999-130737号に記載される化合物が挙げられる。
また、CaSR活性化剤として、シナカルセットが特に好ましく挙げられる。シナカルセットは、公知の方法により合成することができ、市販品を用いることもできる。
また、CaSR活性化剤として、以下の化合物が好ましく挙げられる：
(R)-N-[3-(4-メチルフェニル)プロプ-2-エニル]-1-(3-メトキシフェニル)エチルアミン、
(R)-N-[3-(2-メチルフェニル)プロプ-2-エニル］-1-(3-メトキシフェニル)エチルアミン、
(R)-N-[3-(2,4,6-トリメチルフェニル)プロプ-2-エニル]-1-（3-メトキシフェニル）エチルアミン、
(R)-N-［3-（4-イソプロピルフェニル）プロプ-2-エニル］-1-（3-メトキシフェニル）エチルアミン、
(R)-N-[3-（2,4-ジメチルフェニル）プロプ-2-エニル]-1-（3-メトキシフェニル）エチルアミン、
(R)-N-[3-（3-メチルフェニル）プロプ-2-エニル］-1-（3-メトキシフェニル）エチルアミン、
(R)-N-（2-メチル-3-フェニルプロプ-2-エニル）-1-（3-メトキシフェニル）エチルアミン、
(R,R)-N-（2-メチル-4-フェニルブト-3-エニル）-1-（3-メトキシフェニル）エチルアミン、
(S,R)-N-（2-メチル-4-フェニルブト-3-エニル）-1-（3-メトキシフェニル）エチルアミン、
(R)-N-[3-(3-トリフルオロメトキシフェニル)プロピル]-1-(3-メトキシフェニル)エチルアミン、
(R)-N-[(R)-3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-1-メチルプロピル]-1-(3-メトキシフェニル)エチルアミン、
(R)-N-[(R)-3-(3-トリフルオロメトキフェニル)-1-メチルプロピル]-1-(1-ナフチル)エチルアミン）。【００７９】
本発明の重炭酸分泌促進剤は、CaSR活性化剤を有効成分として含む。CaSR活性化剤は、１種を単独で含んでいてもよく、２種またはそれ以上を含んでいてもよい。【００８０】
上記CaSR活性化剤の複数種を混合して用い、そのうちの１種がペプチド及び低分子化合物である場合は、他の少なくとも１種はカルシウム及びガドリニウムなどのカチオンが好ましく、カルシウムがより好ましい。【００８１】
尚、CaSR活性化剤は、その一部又は全部について、遊離体のみならず、塩の形態で使用することもできる。本明細書において、CaSR活性化剤とは、遊離体及びその塩の両方を含む概念である。塩の形態には、酸付加塩や塩基との塩等を挙げることができ、医薬品又は食品として許容される塩を選択することが好ましい。医薬品又は飲食品として許容される塩を形成するものとしては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸塩等の無機塩、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸又はモノメチル硫酸等の有機塩が挙げられる。【００８２】
本発明の重炭酸分泌促進剤は、消化管における重炭酸分泌を促進する。消化管としては、胃及び小腸（十二指腸、空腸、回腸）が挙げられる。特に、胃及び十二指腸において重炭酸分泌を顕著に促進する。本発明の重炭酸分泌促進剤は、例えば、酸分泌関連疾患の治療又は予防等のための医薬として使用され得る。ここでいう治療とは、病状又は症状の改善、病状又は症状の進展（悪化）防止を含む概念である。【００８３】
本発明において、「酸分泌関連疾患」としては、食道、胃及び小腸（十二指腸、空腸、回腸）において胃酸や消化酵素あるいはNSAIDなどのような薬物に曝されることにより誘発されるものであって、重炭酸分泌を促進することによって治療又は予防が可能な疾患が挙げられる。本発明における酸分泌関連疾患としては、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、NSAID潰瘍、GERD及びNERD等が挙げられる。本発明の重炭酸分泌促進剤は、特に、NSAID潰瘍の治療又は予防に好適である。中でも、γ-Glu-Val-Gly及びシナカルセットは、NSAID潰瘍の治療又は予防に好適である。本発明には例えば以下も含まれる：
γ-Glu-Val-Glyを有効成分として含有するNSAID潰瘍の治療又は予防剤、
シナカルセットを有効成分として含有するNSAID潰瘍の治療又は予防剤。【００８４】
本発明の重炭酸分泌促進剤は、攻撃因子抑制作用を有する各種薬剤、たとえば、ヒスタミンH2受容体拮抗薬（Ｈ２ブロッカー）やプロトンポンプ阻害剤と併用することにより、さらに有効な治療薬となり得る。ヒスタミンH２受容体拮抗薬としては、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、ニザチジン等、プロトンポンプ阻害剤としては、オメプラゾール、ランソプラゾール、ラベプラゾール等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００８５】
また、前述のとおり、本発明者らにより、CaSR活性化剤がソマトスタチン分泌を促進することが初めて見出された。したがって、本発明の別の形態は、CaSR活性化剤を有効成分として含有する、ソマトスタチン分泌促進剤である。ソマトスタチンは例えば胃酸分泌を抑制することが知られている。よって、本発明のソマトスタチン分泌促進剤は、攻撃因子の減弱に有用に用いることが出来る。【００８６】
本発明のソマトスタチン分泌促進剤は、食欲抑制剤として使用することもできる。したがって、本発明のソマトスタチン分泌促進剤と、食欲刺激剤を組合わせることにより、食欲調節剤が提供される。本発明において「食欲調節」とは、食欲不振の人の食欲を増強することや、過食傾向の人を正常な食行動に誘導することをいい、本発明の食欲調節剤はこれらの治療または予防に用いられる。【００８７】
上記食欲調節剤は、本発明のソマトスタチン分泌促進剤と、食欲刺激剤を構成要素として含み、これらの構成要素が使用に際して択一的に選択される。すなわち、食欲抑制を目的とする場合はソマトスタチン分泌促進剤が選択され、食欲刺激を目的とする場合は食欲刺激剤が選択され、投与又は摂取される。食欲刺激剤としては、グルタミン酸ナトリウム等が挙げられる。【００８８】
本発明の重炭酸分泌促進剤又は食欲調節剤は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト等）に対して有用である。【００８９】
本発明の重炭酸分泌促進剤は、CaSR活性化剤を含むこと以外は、剤型及び投与形態には特に制限は無く、経口投与であってもよく、または点滴投与、注射投与（経静脈投与）等の非経口投与（摂取）であってもよい。投与が容易であることから、経口投与が好ましいが、これに制限されない。【００９０】
経口投与剤としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、（マイクロ）カプセル剤、チュアブル剤、シロップ、ジュース、液剤、懸濁剤、乳濁液などが、注射剤としては静脈直接注入用、点滴投与用、活性物質の放出を延長する製剤等などの医薬製剤一般の剤型を採用することができる。【００９１】
経口投与の場合、投与量は投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、治療や予防に有効な量であればよく、患者の年齢、性別、体重、症状などに応じて適宜調節されるが、例えば経口投与の場合、成人１日当たり、CaSR活性化剤の量として通常1kg体重あたり、0.001g〜10gが好ましく、1kg体重あたり、0.1ｇ〜1gがより好ましい。
また、点滴投与、注射投与（経静脈投与）等、非経口投与をする場合の投与量については、前記経口投与についての好ましい投与量（摂取量）範囲の10〜20分の１程度が好ましい。【００９２】
上記経口投与における投与量は、後述の食品についても同様に適用することができるが、食品においてはそれよりも低い摂取量となるような量でCaSR活性化剤を含むことを妨げるものではない。【００９３】
本発明の重炭酸分泌促進剤又は食欲調節剤は、常法により製剤化することができる。製剤上の必要に応じて、薬理学的に許容し得る各種の製剤用物質（補助剤等として）を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤型により適宜選択することができるが、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。更に、製剤用物質を具体的に例示すると、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、牛乳蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、及び溶剤、例えば滅菌水及び一価又は多価アルコール、例えばグリセロール等を挙げることができる。尚、本発明の食欲調節剤においては、ソマトスタチン分泌促進剤と食欲刺激剤は、それぞれ別に製剤化され、別包としてパッケージに収められる。【００９４】
本発明の重炭酸分泌促進剤又は食欲調節剤は、常法以外にも、将来開発される様々な医薬製剤の形態によっても製剤化することができる。その製剤には将来開発される方法を適宜採用することができる。【００９５】
本発明の重炭酸分泌促進剤又は食欲調節剤は、それらを含むパッケージに、使用に関する説明を記載した記載物を含ませることができる。記載物としては、用途・効能や投与方法などに関する説明事項を記載したいわゆる能書などが挙げられる。【００９６】
本発明の重炭酸分泌促進剤は、食品に含有させることができる。食品の形態としては特に制限されず、CaSR活性化剤を配合すること以外は、通常の食品と同様の材料を用いて、同様の製法で製造することができる。食品としては、例えば、調味料；ジュース、牛乳等の飲料；菓子；ゼリー；健康食品；農産物加工品；水産物加工品；牛乳等の畜産物加工品；食品補助剤等が挙げられる。また、このような食品を保健機能食品として提供することも可能であり、この保健機能食品には、酸分泌関連疾患の予防又は治療もしくは改善のために用いるものである旨を表示を付した食品、特に特定健康用食品なども含まれる。【００９７】
本発明の重炭酸分泌促進剤を食品補助剤として使用する場合、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、チュアブル剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。本発明における食品補助剤とは、食品として摂取されるもの以外に栄養を補助する目的で摂取されるものをいい、栄養補助剤、サプリメントなども含む。また、本発明の食品補助剤には一部の保健機能食品も含まれ得る。
【実施例】
【００９８】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。【００９９】
〔製造例１〕γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの合成
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（８．６９  ｇ，  ４０．０  ｍｍｏｌ）とＧｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ（８．０７  ｇ，  ４０．０  ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００  ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（６．１３  ｍｌ，  ４４．０  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，  ６．７４  ｇ，  ４４．０  ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，  ８．４４  ｇ，  ４４．０  ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル（２００  ｍｌ）に溶解した。溶液を水（５０  ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（５０  ｍｌ  ｘ  ２回）、飽和食塩水（５０  ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０  ｍｌ  ｘ  ２回）、飽和食塩水（５０  ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンから再結晶してＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（１３．２  ｇ，  ３６．２  ｍｍｏｌ）を白色結晶として得た。【０１００】
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（５．４７  ｇ，  １５．０  ｍｍｏｌ）を４Ｎ−ＨＣｌ／ジオキサン溶液（４０  ｍｌ）に加え、室温で５０分撹拌した。ジオキサンを減圧濃縮で除き、残渣にｎ−ヘキサン（３０  ｍｌ）を加え減圧濃縮した。この操作を３回繰り返し、Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌを定量的に得た。【０１０１】
上記Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ及びＺ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（５．５７  ｇ，  １５．０  ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５０  ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（２．３０  ｍｌ，  １６．５  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，  ２．５３  ｇ，  １６．５  ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，  ３．１６  ｇ，  １６．５  ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル（１５００  ｍｌ）に溶解した。溶液を水（２００  ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（２００  ｍｌ  ｘ  ２回）、飽和食塩水（１５０  ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２００  ｍｌ  ｘ  ２回）、飽和食塩水（１５０  ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。析出した結晶を濾取、減圧乾燥してＺ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（６．５１  ｇ，１０．５  ｍｍｏｌ）を白色結晶として得た。【０１０２】
上記Ｚ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（６．２０  ｇ，  １０．０３  ｍｍｏｌ）をエタノール（２００  ｍｌ）に懸濁し、１０％パラジウム炭素（１．５０  ｇ）を加え、水素雰囲気下に５５℃で５時間還元反応を行った。この間、全量で１００  ｍｌの水を徐々に加えた。触媒を桐山ロートで濾過して除き、濾液を半分に減圧濃縮した。反応液を更にメンブランフィルターで濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣を少量の水に溶かした後にエタノールを加えて結晶を析出させ、結晶を濾過して集め減圧乾燥してγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの白色粉末（２．８５  ｇ，  ９．４０  ｍｍｏｌ）を得た。以下、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを「γ-EVG」と記載することがある。【０１０３】
ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）+＝３０４．１．【０１０４】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．８７  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．８  Ｈｚ），  ０．８８  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．８  Ｈｚ），  １．９９−２．０９  （３Ｈ，  ｍ），  ２．３８−２．５１  （２Ｈ，  ｍ），  ３．７２  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．３５  Ｈｚ），  ３．８６  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１７．８  Ｈｚ），  ３．８０  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１７．８  Ｈｚ），  ４．０７  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．８  Ｈｚ）．【０１０５】
〔製造例２〕(R)-N-(3-(3-トリフルオロメチルフェニル)プロピル)-1-(1-ナフチル)エチルアミン塩酸塩（シナカルセット塩酸塩）の合成【０１０６】
（工程１）3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-プロピオン酸メチルエステルの合成
3-(トリフルオロメチル)桂皮酸2.20g、パラジウム/炭素（10%, wet）166mg、エタノール40mlの混合物を、1気圧水素雰囲気下で一晩撹拌した。パラジウム/炭素を濾別して、濾液を減圧濃縮した。メタノール20ml、濃硫酸4滴を加えて60℃で2時間撹拌後、放冷した。減圧濃縮後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mlを加え、ジクロロメタン20mlで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して、油状の表題化合物2.40gを得た。【０１０７】
1H-NMR (300MHz, CDCl3) δ 2.66 (2H, t, J=7.5Hz), 3.02 (2H, t, J=7.5Hz), 3.68 (3H, s), 7.37-7.50 (4H, m)【０１０８】
（工程２）3-(3-トリフルオロメチルフェニル)プロパナールの合成
工程１で合成した3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-プロピオン酸メチルエステル2.40gを乾燥ジクロロメタン20mlに溶解し、アルゴン雰囲気下、-78℃で水素化ジイソプロピルアルミニウムのヘキサン溶液（0.91M）13mlを5分かけて滴下し、同じ温度で40分撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液50mlを滴下後撹拌して室温に昇温し、水20ml、濃塩酸5mlを加えて分液した。水層をジクロロメタンで抽出し、分液した有機層とあわせて無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮して、油状の表題化合物2.12gを得た。【０１０９】
1H-NMR (300MHz, CDCl3) δ 2.83 (2H, t-t, J=7.5Hz, 1.2Hz), 3.02 (2H, t, J=7.5Hz), 7.36-7.52 (4H, m), 9.83 (1H, t, J=1.2Hz)【０１１０】
（工程３）(R)-N-(3-(3-トリフルオロメチルフェニル)プロピル)-1-(1-ナフチル)エチルアミン塩酸塩（シナカルセット塩酸塩）の合成
工程２で合成した3-(3-トリフルオロメチルフェニル)プロパナール2.12g、(R)-1-(1-ナフチル)エチルアミン2.0ml、トリアセトキシ水素化ほう素ナトリウム3.42g、乾燥ジクロロメタン150mlの混合物に氷酢酸0.750mlを加えて、室温で5時間撹拌した。水100mlを加えて3時間撹拌後、2M 水酸化ナトリウム水溶液100mlを加えて分液した。水層をジクロロメタンで抽出し、分液した有機層とあわせて無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル／ヘキサン：酢酸エチル４：１〜１：１）で精製後濃縮して、油状の(R)-N-(3-(3-トリフルオロメチルフェニル)プロピル)-1-(1-ナフチル)エチルアミンを3.41g得た。これをジクロロメタン10mlに溶解し、4M 塩酸ジオキサン5ml、トルエン20mlを加えて、減圧濃縮乾固した。これをエタノール40ml、ヘプタン200mlより再結晶して、表題化合物1.71gを得た。【０１１１】
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) δ 1.69(3H, d, J=6.6Hz), 2.00 (2H, quintet, J=7.8Hz), 2.72 (2H, t, J=7.5Hz), 2.65-2.85 (1H, br), 2.90-3.05 (1H, br), 5.24-5.38 (1H, br), 7.44-7.67 (7H, m), 7.96-8.04 (3H, m), 8.23-8.28 (1H, pseud d), 9.20-9.40 (1H, br), 9.80-10.00 (1H, br)
MS (ESI, m/z)  358(MH+)【０１１２】
〔実施例１〕胃および十二指腸における重炭酸分泌に対するシナカルセットの効果
Aiharaら（Aihara, E. et al. 2005. J. Pharmacol. Exp. Ther. 315: 423-432）、及び、Kagawaら（Kagawa, S. et al. 2003. Digestive Diseases and Sciences 48: 1850-1856）の方法に準じて、重炭酸分泌の評価を実施した。【０１１３】
胃での重炭酸分泌は、以下のように測定した。雄性SDラットをウレタン(1.25 g/kg/5 ml, 腹腔内投与)麻酔下において正中線で開腹し、胃を露出させた。胃をex-vivoチャンバー（田村製作所；3.1 cm2）に静置し、100 % O2ガスを飽和させた生理食塩水で還流した。酸分泌を阻害するために60 mg/kgオメプラゾールを腹腔内投与した。重炭酸分泌は灌流液をpH-stat法(TOA, AUT-501) を用いて終点pH 7.0まで2 mM HClを滴下することにより連続的に測定した。【０１１４】
十二指腸での重炭酸分泌は、雄性SDラットを麻酔下において開腹し、十二指腸ループを胃幽門輪から1.7 cmの長さのものを作製した。ループ内に100 % O2ガスを飽和させた生理食塩水で還流（流速：1 ml/min）した。【０１１５】
薬物は、ベースラインの重炭酸分泌を30分間測定した後、胃あるいは十二指腸管腔内に投与し、10分毎に重炭酸分泌量を測定した。
結果を図２に示した。シナカルセット(10 mg/kg)は胃および十二指腸において重炭酸分泌を促進させた。【０１１６】
〔実施例２〕ヒスタミン誘発胃酸分泌に対するシナカルセットの影響
ヒスタミン誘発胃酸分泌のモデルとして、堀江ら（British Journal of Pharmacology 1994; 112: 87-92）が報告している方法に準じて作製したモデルを用いた。即ち、6週齢のｄｄY系雄性マウスを18時間絶食し、ウレタン(1.25 g/kg/10 ml, 腹腔内投与)麻酔下に胃を摘出した。胃の幽門、食道側にポリエチレンカニューレを挿入し、バッファー（118.1 mM NaCl、4.8 mM KCl、1.0 mM KH2PO4、16.0 mM Na2HPO4、1.2 mM MgSO4、0.65 mM CaCl2、31.6 mMグルコース、95 % O2/5 % CO2ガスを飽和させる、37℃）を満たしたオーガンバス中に静置した。胃内圧を15 cmH2Oに保ち、胃内を1 ml/minの流速でバッファー（135.8 mM NaCl、4.8 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.3 mM CaCl2、31.6 mMグルコース、pH 5.4、95 % O2/5 % CO2ガスを飽和させる、37℃）を還流した。【０１１７】
酸分泌量は灌流液をpH-stat法(TOA, AUT-501)を用いて終点pH 5.4まで10 mM NaOHを滴下することにより連続的に測定した。オーガンバス内に静置した摘出胃に、30分間無刺激時の胃内酸分泌量を測定した後、100 μMヒスタミン、シナカルセット（1.26, 12.6, 126 μM）を処置した。90分後まで胃酸分泌量を滴定した。シナカルセットの効果の統計検定は、Dunnett's testを用いた。【０１１８】
結果を図１に示した。無刺激時の酸分泌量が0.5-0.8 μEq/10 minであったのに対し、ヒスタミン刺激により約3.2 μEq/10 minにまで上昇した。シナカルセットはヒスタミン誘発胃酸分泌を用量依存的に抑制し、126 μMの濃度では完全に胃酸分泌を抑制した。【０１１９】
〔実施例３〕ラット胃粘膜D細胞の画分におけるソマトスタチンとCaSRの発現
雄性SDラットを麻酔下に正中線で開腹し、胃を摘出した。胃は噴門部並びに胃体部/幽門境界部を縛り、幽門部を切除後、胃を反転させ、内腔側を外に露出させた。胃の内部に2.5 mg/mlプロテアーゼ（Sigma P6911、Protease, From Streptomyces griseus, 5.5unit/mg solid）含有バッファーAを注入し、バルーンを作成した。そのバルーンをバッファーAにて30分間、バッファーBにて 30分間×3回、37℃にて30分間振とうした。その後、0.5 mg/ml含有DNaseバッファーB中にて3回撹はんし、剥離した細胞を遠心分離後、バッファーCにて懸濁した。その細胞懸濁液をフィルター濾過後、日立製エルートリエーターを用いて分画される細胞を採取した。【０１２０】
前記細胞画分と胃粘膜全体のソマトスタチン及びCaSRのmRNA発現量をReal-time RT-PCR法により測定した。図３に、前記各細胞画分のソマトスタチン並びにCaSRのmRNA発現量の、胃粘膜全体の前記mRNA発現量に対する相対値（遺伝子発現（％））を示した。一部の細胞画分（20ml/min）が他の画分と比較して極めて特異的にソマトスタチン並びにCaSRを高発現していることが判明した。従って、この条件で分画した細胞は主にソマトスタチン産生細胞であるD細胞であり、D細胞はCaSRを発現していると考えられた。【０１２１】
上記各バッファーの組成は以下のとおりである。
バッファーA（70 mM NaCl、5 mM KCl、11 mM グルコース、50 mM HEPES、0.5 mM NaH2PO4、1.0 mM Na2HPO4、20 mM NaHCO3、2 mM Na2EDTA、20 mg/ml BSA）、
バッファーB（70 mM NaCl、5 mM KCl、1.5 mM MgSO4、1.0 mM CaCl2、11 mM グルコース、50 mM HEPES、0.5 mM NaH2PO4、1.0 mM Na2HPO4、20 mM NaHCO3、20 mg/ml BSA）
バッファーC（70 mM NaCl、5 mM KCl、1.5 mM MgSO4、1.0 mM CaCl2、11 mM グルコース、50 mM HEPES、0.5 mM NaH2PO4、1.0 mM Na2HPO4、20 mM NaHCO3、0.5 mM ジチオスライトール、1 mg/ml BSA）【０１２２】
〔実施例４〕分画したD細胞にCaSR作動薬を処置した際のソマトスタチン分泌
エルートリエーターを用いて、実施例３に準じて繰り返し分画して、純度の高いD細胞を採取し、遠心分離後、細胞培養液（10%FBS含有D-MEM/F-12）に懸濁し、CO2インキュベーター（95% O2+5% CO2、37℃）中で培養した（6×105細胞/250μL/ウェル）。培養2日後、PBSにて洗浄したD細胞に対し、培養バッファー（122 mM NaCl、5 mM KCl、25 mM NaHCO3、1.3 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 mM HEPES、20 mM グルコース、pH 7.4）に混合したCaSR作動薬（20μM シナカルセット（CCT）、20μM γ-EVG、10 mM フェニルアラニン（Phe）、10 mM ヒスチジン（His））をそれぞれ添加し、90分間培養した。その後、培養上清を回収し、フィルター濾過後、ソマトスタチンELISAキット（フェニックス社製、カルフォルニア）にてソマトスタチン濃度を測定した。【０１２３】
結果を図４に示した。培養D細胞において、シナカルセット、γ-EVG、Phe、及びHisはソマトスタチンの分泌を顕著に促進した。【０１２４】
〔実施例５〕ヒスタミン誘発胃酸分泌に対するシナカルセットとソマトスタチン受容体２阻害薬を併用した際の胃酸分泌
実施例２の方法に準じ、胃酸分泌測定を行った。結果を図５に示した。100 μMヒスタミンは胃酸分泌を促進し、その効果は12.6 μMシナカルセットにより抑制された。ヒスタミン、シナカルセットおよびソマトスタチン受容体2の選択的阻害薬であるCYN154806（SIGMA社）（10-7-10-5 M）でオーガンバスに静置した摘出胃を処置すると、CYN154806の用量に依存してシナカルセットによる胃酸分泌抑制が解除され、胃酸分泌が亢進した。このことから、シナカルセットはソマトスタチンの分泌に影響することで胃酸分泌を抑制している可能性が考えられた。【０１２５】
〔実施例６〕非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）誘発小腸炎に対するシナカルセット又はγ-EVGの効果
非絶食のラットにシナカルセット（1, 3, 10, 100 mg/kg）若しくはγ-EVG（100 mg/kg）を含む注射用蒸留水、又は注射用蒸留水（コントロール）を経口投与した。30分後にロキソプロフェン（60 mg/kg）を経口投与し24時間放置した。1 % (w/w)エバンスブルー色素1 mlを静脈内投与し、その３０分後にエーテル深麻酔下に致死させた。ラットの小腸（十二指腸から回腸まで）を摘出した後、2%ホルマリン中に10分間浸すことにより漿膜側から小腸を固定し、腸間膜の反対側から切開し、10倍率の解剖顕微鏡下にて小腸傷害面積（mm2）の測定を行った。統計検定はt検定あるいはDunnett検定を用いp<0.05を有意差ありとした。
結果を図６及び７に示した。シナカルセットは用量依存的に傷害面積を縮小した。また、γ-EVGも傷害面積を縮小した。つまり、カルシウム受容体活性化剤であるこれら薬剤による、NSAID小腸炎の予防効果が示された。これらがNSAID潰瘍の予防又は治療に有用であることが理解される。【０１２６】
〔実施例７〕十二指腸における重炭酸分泌に対するγ-EVGの影響
雄性SDラットを麻酔下において開腹し、胃幽門輪から1.7 cmの長さの十二指腸ループを作製した。ループ内に100 % O2ガスを飽和させた生理食塩水で還流（流速：1 ml/min）した。
ベースラインの重炭酸分泌を30分間測定した後、γ-EVG（100mg/kg）を含有する注射用蒸留水、又は注射用蒸留水（ノーマル）を十二指腸管腔内に投与し、10分毎に重炭酸分泌量を測定した。
結果を図８に示した。カルシウム受容体活性化剤であるγ-EVGは十二指腸において重炭酸分泌を促進させた。【０１２７】
以上のことから、CaSR活性化剤が、重炭酸分泌の促進、及び酸分泌関連疾患の治療、予防等に有効であることは明らかである。【０１２８】
〔実施例８〕分画した胃粘膜D細胞にCaSR作動薬およびグルタミン酸ナトリウムを処置した際のソマトスタチン分泌
実施例４の方法に準じ、ソマトスタチン分泌測定を行った。培養2日後、PBSにて洗浄したD細胞に対し、培養バッファー（122 mM NaCl、5 mM KCl、25 mM NaHCO3、1.3 mM MgSO4、2 mM CaCl2、15 mM HEPES、20 mM グルコース、pH 7.4）に混合したCaSR作動薬（20μM γ‐EVG）、グルタミン酸ナトリウム（60 mM MSG）、又はそれらを混合した溶液をそれぞれ添加し、90分間培養した。その後、培養上清を回収し、フィルター濾過後、ソマトスタチンELISAキット（フェニックス社、カルフォルニア）にてソマトスタチン濃度を測定した。【０１２９】
結果を図９に示した。培養D細胞においてγ‐EVGはソマトスタチンの分泌を著明に促進した。一方、MSGはソマトスタチンの分泌を顕著に抑制した。γ-EVGとMSGの混合溶液では、ソマトスタチンの分泌は抑制された。
【産業上の利用の可能性】
【０１３０】
本発明により、消化管の重炭酸分泌促進剤が提供される。本発明の消化管の重炭酸分泌促進剤は、酸分泌関連疾患、特に、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、NSAID潰瘍、GERD及びNERD等に対する予防又は治療もしくは改善用の医薬又は食品として利用することができる。本発明の医薬又は食品は、安全性に優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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