(57)【要約】ヒト腸管内に共生する腸内細菌であるプロバイオティクスに由来し、化学的に容易に合成が可能である短鎖ペプチドを有効成分とする安全、安価で効果的な新規抗腫瘍効果を有する新しい薬剤や健康食品などを提供するものである。ラクトバチルス・プランタルム（Lactobasillus plantarum）が分泌するバクテリオシンの一種である２６アミノ酸残基からなるプランタリシンＡや、枯草菌（Bacillus subtilis）が分泌する５アミノ酸残基からなるＣＳＦ（Competence and Sporulation Factor）を有効成分とするインスリン様成長因子結合タンパク質の活性化剤や、大腸癌などの消化器癌に対する抗腫瘍剤を調製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのペプチドを有効成分とする消化器癌に対する抗腫瘍剤。
（Ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｄ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項２】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのペプチドを、消化器癌に対する抗腫瘍剤を調製するために使用する方法。
（Ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｄ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項４】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とする消化器癌に対する抗腫瘍剤。
（Ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｄ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項６】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項５記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのペプチドを添加したことを特徴とし、消化器癌の予防・治療のために用いられるものである旨の表示が付された食品又は食品素材。
（Ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｄ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項８】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項７記載の食品又は食品素材。
【請求項９】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのペプチドを有効成分とするインスリン様成長因子結合タンパク質の活性化剤。
（Ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｄ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項１０】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項９記載の活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化器癌に対する抗腫瘍剤、より詳しくはプロバイオティクスが産生するＣＳＦ（Competence and Sporulation Factor又はCompetence and sporulation stimulating factor）やプランタリシンＡ（plantaricin A）を有効成分とする消化器癌に対する抗腫瘍剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌は、ヒトなどの宿主の生涯にわたって腸管内に生息し、腸管の恒常性の維持や免疫システムの構築、病原性微生物からの防御など多くの役割を担う共生生物である。ヒト腸管内には８００種類を超える腸内細菌が共生し、様々な生理活性物質を分泌することで、宿主−腸内細菌の密接な関係を維持している（非特許文献１〜３参照）。腸内細菌の中でも、枯草菌（Bacillus Subtilis）やラクトバチルス（Lactobacillus）菌のように生体に有用な作用を示す細菌群はプロバイオティクスと呼ばれ、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）やヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）などの病原菌に対する抗菌作用や腸管上皮保護作用を有することが知られており、消化管の炎症性疾患治療に広く応用されている(非特許文献４及び５参照)。また、消化管腫瘍の病因として腸内細菌叢の異常の関与が指摘されており、プロバイオティクスによる予防効果が期待されている(非特許文献６参照)。プロバイオティクスの癌抑制に関して、菌自体やその培養上清が、ヒト由来癌細胞株の発育を抑制すること(非特許文献７参照)、化学発癌動物モデルにおける腫瘍の発生率を減少させること(非特許文献８参照)、腫瘍移植マウスにおいて抗腫瘍効果と転移抑制効果を示すこと(非特許文献９参照)などが知られている。また、その癌抑制メカニズムについては、ＩＦＮ-γ、ＩＬ-１β、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを誘導し、宿主の免疫機能を修飾すること(非特許文献９参照)、遺伝子毒性を抑制すること(非特許文献１０参照)、プロバイオティクスの菌体そのものが化学発癌物質・変異原物質を吸着すること(非特許文献１１参照)、プロバイオティクスが腸内腐敗菌による発癌プロモーターや発癌物質の産生を抑制すること（非特許文献１２参照）などが明らかにされている。【０００３】
一方、近年、クオラムセンシングという概念に基づき細菌の様々な現象が説明されてきている。クオラムセンシングとは、細胞密度依存的制御機構と訳されることもあり、細菌が菌密度を感知してある特定の遺伝子発現を調節する現象と定義され、細菌間のコミュニケーションや集団行動を制御するシステムとされている（例えば、非特許文献１３〜１５など参照）。かかる細菌間のコミュニケーションや集団行動には、生物発光、集団移動、接合伝達、他種細菌に対するバクテリオシン産生、宿主に対する病原因子の発現、胞子形成、バイオフィルム形成、コンピタンスなどが含まれ、そのためのシグナル分子が最小閾値に達すると遺伝子発現の変化が起こると考えられている（例えば、非特許文献１５及び１６参照）。【０００４】
例えば、乳酸菌では、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）Ｃ１１株において、０．１％以下の低い菌密度で植菌するとバクテリオシンの１つであるプランタリシン産生が行われなくなるが、同株のプランタリシン産生時の培養液を１％程度培地に添加することによりプランタリシン産生が回復することが観察されたことから、培養液中に含まれるプランタリシン産生誘導因子としてプランタリシンＡが同定された（非特許文献１７及び非特許文献１９参照）。プランタリシンＡについては農業家畜飼育用飼料への添加物としてのバクテリオシン含有調製物（特許文献１参照）において、プランタリシンについては腐敗病原微生物の増殖に安定な風味成分調製法（特許文献２参照）においてバクテリオシンとしての使用が提案されている。【０００５】
また、枯草菌（Bacillus subtilis）においては、培地中のグルコースが枯渇した場合に胞子形成が行われることが知られているが、胞子形成やコンピタンスは、細胞外シグナル分子により制御されており、そのうちの一つが、ＣＳＦとよばれるものである。ＣＳＦは、ＳｐｏＯＫオリゴペプチドパーミアーゼにより細胞内に輸送され、ＲａｐＣホスファターゼを抑制することによりコンピタンス遺伝子発現を刺激すると考えられている（非特許文献１８参照）。【０００６】
【特許文献１】特開２００２−２６２７８０号公報
【特許文献２】特開２００７−２６７７３６号公報
【非特許文献１】Eckburg PB, et al. Nature, 1635-1638,2005
【非特許文献２】Sonnenburg JL, et al. Nature Immunol, 569-573,2004
【非特許文献３】Hooper LV, et al. Nature Immunol, 269-273, 2003
【非特許文献４】Steidler L, Hans W, Schotte L, et al. Science 289; 1352-1355, 2000
【非特許文献５】Abbott A. Nature 427; 284-286, 2004.
【非特許文献６】Chu FF, EsworthvRS, ChuPG, et al. Cancer Res. 64(3); 962-8,2004.
【非特許文献７】L.Baricault et al. Carcinogenesis,16; 245-252, 1995
【非特許文献８】B.R.Goldin and S.L. Gorbach, J. Natl. Cancer Inst.,64; 263-265, 198
【非特許文献９】T.Matsuzaki, Int.J.Immunother.,9; 23-28, 1993
【非特許文献１０】H.Horie et al. Eur.J.Cancer Prev.,12; 101-107, 2003
【非特許文献１１】X.B.Zhang and T.Ohta, Can.J.Microbiol.,39; 841-845, 1993
【非特許文献１２】I.R.Rowland et al. Carcinogenesis,19; 281-285,1998
【非特許文献１３】Hardman et al, Antonievan Leeuvenhoek, 74,199-210 (1998)
【非特許文献１４】Gray, K.M. Trends Microbiol., 5 184-188(1997)
【非特許文献１５】Miller et al., Annual Review of Microbiology Vol.55 165-199 (2001)
【非特許文献１６】Bassler et al., Cell,125, 237-246,(2006)
【非特許文献１７】Diep et al., Mol. Microbiol., 18, 631-639,(1995)
【非特許文献１８】Solomon et al., Genes and Development 10:2014-2024,（1996）
【非特許文献１９】J.Nakayama, Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria,2-13,2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
プロバイオティクスが産生する特異的癌抑制物質は同定されておらず、また、その作用機序の詳細については知られていない。また、上記プロバイオティクスが有効性を発揮する前提として、菌自体が腸管上皮に生着すること、さらに生着した菌が十分に活動できる環境にあることが必要であるが、実際には、腸内細菌叢のバリエーション、病原菌の存在、他の薬剤の影響などにより、各個人の腸内環境は千差万別であり、現在行われている生菌を直接投与する方法では、プロバイオティクス療法の効果は安定しないのが現状である（MacFarlan LV. Am J Gastroenterology, 2006）。また、現在行われているプロバイオティクス治療では、生菌の精製や保存に多額の費用や特別な施設が必要な場合があった。【０００８】
本発明の課題は、ヒト腸管内に共生する腸内細菌に由来し、化学的に容易に合成が可能である短鎖ペプチドを有効成分とする安全、安価で効果的な新規抗腫瘍効果を有する新しい薬剤や健康食品などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、プロバイオティクスとよばれる腸内細菌が分泌するペプチドなどの特異的活性物質が、ヒト及びマウス腸管上皮細胞の細胞膜トランスポーターにより腸管上皮細胞内に吸収されて、腸管保護作用を発揮することを発見し、様々な活性物質の同定を進めてきた。そして、同定された活性物質の腸内における諸機能について検討する過程において、本発明者らは、ラクトバチルス・プランタルム菌が分泌するプランタリシンＡと枯草菌が分泌するＣＳＦとがたまたまヒト消化器癌に対する抗腫瘍効果を有することを見い出し、さらにはこれらの物質に抗腫瘍因子であるインスリン様成長因子結合タンパク質の活性化が関与することを確認し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち本発明は、（Ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｄ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；のいずれかのペプチドを有効成分とする大腸癌などの消化器癌に対する抗腫瘍剤に関する。以下、上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか記載のペプチドを「本件ペプチド」ということがある。上記、「消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド」は、「インスリン様成長因子結合タンパク質の誘導活性を有するペプチド」とすることもできる。【００１１】
また本発明は、本件ペプチドを大腸癌などの消化器癌に対する抗腫瘍剤を調製するために使用する方法や、本件ペプチドを大腸癌などの消化器癌の患者に投与する方法や、本件ペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とする大腸癌などの消化器癌に対する抗腫瘍剤や、本件ペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを大腸癌などの消化器癌の患者に投与する方法や、本件ペプチドを有効成分とするインスリン様成長因子結合タンパク質の活性化剤や、本件ペプチドを添加したことを特徴とし、大腸癌などの消化器癌の予防・治療のために用いられるものである旨の表示が付された食品又は食品素材に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒト大腸癌由来ＳＫＣＯ−１細胞を移植したヌードマウスに対するＣＳＦ及びＰＢＳ（コントロール）の効果を示す写真、並びにｃａｓｅ１及びｃａｓｅ２における腫瘍部分の腫瘍径と腫瘍の質量とを示す図である。ＣＳＦを投与した群における腫瘍径及び腫瘍の質量は、それぞれコントロールにおける値よりも低い値を示しており、ＣＳＦが大腸癌の増殖抑制効果を有することを確認した。
【図２】ヒト大腸癌由来ＳＫＣＯ−１細胞を移植したヌードマウスに対するプランタリシンＡ及びＰＢＳ（コントロール）の効果を示す写真、並びにｃａｓｅ１及びｃａｓｅ２における腫瘍部分の腫瘍径と腫瘍の質量とを示す図である。ＣＳＦを投与した群における腫瘍径及び腫瘍の質量は、それぞれコントロールにおける値よりも低い値を示しており、プランタリシンＡが大腸癌の増殖抑制効果を有することを確認した。
【図３】ヒト大腸癌由来Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞にＣＳＦ及びプランタリシンＡを添加しそれぞれの培養上清を採取して、プロテインアレイ解析し結果を図３に示す。その結果、ＣＳＦ（図３Ａ参照）及びプランタリシンＡ（図３Ｂ参照）がそれぞれ、抗腫瘍因子であるインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ；Insulin-like growth factor binding proteins）を特異的に誘導していることを確認した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の消化器癌に対する抗腫瘍剤としては、本件ペプチドを有効成分とするものや、本件ペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とするものであれば特に制限されず、本発明の方法としては、本件ペプチドを大腸癌などの消化器癌に対する抗腫瘍剤を調製するために使用方法であれば特に制限されず、本発明のインスリン様成長因子結合タンパク質の活性化剤としては、本件ペプチドを有効成分とするものであれば特に制限されず、本発明の食品又は食品素材としては、本件ペプチドを添加したことを特徴とし、消化器癌の予防・治療のために用いられるものであれば特に制限されず、上記消化器癌としては、食道癌、胃癌、胆道癌、膵臓癌、大腸癌などを挙げることができ、中でも大腸癌を好適に例示することができる。【００１４】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、２６アミノ酸残基からなるラクトバチルス・プランタルムＣ１１ｐｌｎＡによりコードされるプランタリシンＡであり（非特許文献１７参照）、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、枯草菌ｐｈｒＣによりコードされる４０アミノ酸長のペプチドのＣ末端の５アミノ酸残基からなるペプチドである（非特許文献１８参照）。本発明において「配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味し、具体的には、２６アミノ酸残基からなるプランタリシンＡのＮ末端が３個又は４個欠失した２３-merや２２-merのペプチドを例示することができる（例えばAnderssen et al.Appliedand Environmental Microbiology Vol64, No6 2269-2272参照）。また、本発明において「配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２個、好ましくは１個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、特に１〜２個、好ましくは１個の任意の数のアミノ酸が置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。さらに、本発明において「消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド」とは、インスリン様成長因子結合タンパク質を活性化し、局所投与したときに大腸癌などの消化器癌を減少させるペプチドをいう。【００１５】
本件ペプチドの取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のペプチドとして、化学合成したペプチドとして、又は遺伝子組換え技術により作製した組み換えペプチドとして調製することができる。天然由来のペプチドとして取得する場合には、かかるペプチドを発現している微生物細胞からペプチドの単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本件ペプチドを取得することができる。化学合成により本件ペプチドを調製する場合には、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法)などの化学合成法に従って本件ペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本件ペプチドを合成することもできる。遺伝子組換え技術により本件ペプチドを調製する場合には、該ペプチドをコードするＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本件ペプチドを調製することができる。これらの中でも、本発明による比較的短いペプチドを容易な操作でかつ大量に調製することが可能な化学合成法に従って本件ペプチドを合成することが好ましく、市販のペプチド合成機を利用した調製を特に好適に挙げることができる。【００１６】
本件ペプチドを有効成分とする消化器癌に対する抗腫瘍組成物を医薬品として用いる場合（投与する場合）は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、可溶化剤、溶解補助剤、などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、投与形態としては、例えば、懸濁液、粉末、顆粒、カプセル剤などを挙げることができ、その投与方法としては、腫瘍組織に直接接種することにより投与してもよく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内などに注射することもできる他、経口投与及び鼻咽頭経由で投与してもよい。投与量は、予防又は治療であるかの投与目的、投与方法、重篤度、患者の年齢などの諸条件に応じて適宜選定することができる。【００１７】
また、本件ペプチドをコードするＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。本件ペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターとしては、本件ペプチドを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、かかる組換えベクターは、本件ペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、ヒト細胞において自立複製可能であるものや、あるいはヒト細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本件ペプチドをコードするＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。本件ペプチドをコードするＤＮＡは、通常の遺伝子治療によるドラッグデリバリーシステムを利用することができる。【００１８】
本発明の食品又は食品素材の種類としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができ、便宜上飼料・餌料も含まれ、本発明の食品又は食品素材は本件ペプチドを含有する上記食品又は食品素材を対象とする。したがって、本発明の食品又は食品素材に関する発明には、本件ペプチドを添加した食品又は食品素材を、消化器癌に対する抗腫瘍用の食品又は食品素材として使用する方法や、本件ペプチドを、消化器癌に対する抗腫瘍用の食品又は食品素材の配合剤として使用する方法や、本件ペプチドを食品又は食品素材に添加することを特徴とする消化器癌に対する抗腫瘍用の食品又は食品素材の製造方法の態様も実質的に含まれる。【００１９】
本発明の本件ペプチドを有効成分とするインスリン様成長因子結合タンパク質の活性化剤とは、例えば、大腸癌細胞などの消化器癌細胞と水性媒体中で接触させた場合に、インスリン様成長因子結合タンパク質を水性媒体中に誘導しうる物質をいい、インスリン様成長因子結合タンパク質の検出には市販のプロテインアレイを用いることができる。本発明のインスリン様成長因子結合タンパク質の活性化剤は、本発明の消化器癌に対する抗腫瘍剤として有利に用いることができる。【００２０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
［ヒト大腸癌由来ＳＫＣＯ−１細胞に対するＣＳＦの抗腫瘍活性］
供試ＣＳＦとしては、北海道システムサイエンス株式会社に合成させた５アミノ酸残基からなるペプチド（ＥＲＧＭＴ；配列番号２）を用いた。１２−１６週齢のヌードマウスを麻酔後、１×１０６個／１００μＬ大腸癌由来ＳＫＣＯ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−３９）をヌードマウスの背中の皮下２箇所に移植した。そのうち１箇所には４８時間ごとに、１００ｎＭの上記ＣＳＦ２００μＬを移植した部位に直接注射した。コントロールとして、残りの１箇所には４８時間ごとに、２００μＬのＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製、商品番号２００１２−０２７）を注射した。４週間後に、それぞれの腫瘍部分を摘出して、腫瘍径及び腫瘍の質量を計測し、組織学的変化の比較検討を行った。図１に示すように、２回行われたいずれの実験（図１、ｃａｓｅ１及びｃａｓｅ２参照）においても、ＣＳＦを投与した群における腫瘍径及び腫瘍の質量は、それぞれコントロールにおける値よりも低い値を示しており、ＣＳＦが大腸癌の増殖抑制効果を有することを確認した。
【実施例２】
【００２２】
［ヒト大腸癌由来ＳＫＣＯ−１細胞に対するプランタリシンＡの抗腫瘍活性］
プランタリシンＡは、配列番号１に示される２６アミノ酸残基からなるペプチドを合成させ、供試プランタリシンＡとした。実施例１の方法と同様にヌードマウスの背中の皮下２箇所に、ヒト大腸癌由来ＳＫＣＯ−１細胞を移植し、１箇所には４８時間ごとに、２００μＬの１００ｎＭの上記プランタリシンＡを移植した部位に直接注射した。４週間後に、腫瘍を摘出して、コントロールとの比較検討を行った。2回行われたいずれの実験（図２、ｃａｓｅ１びｃａｓｅ２参照）においても、プランタリシンＡを投与した群における腫瘍径及び腫瘍の質量は、それぞれコントロールにおける値よりも低い値を示しており、プランタリシンＡが大腸癌の増殖抑制効果を有することを確認した。
【実施例３】
【００２３】
［Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞を用いたＣＳＦの抗腫瘍物質誘導能の検討］
ヒト大腸癌由来Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２１０２）に上記１００ｎＭのＣＳＦ（細胞培養液１ｍＬで希釈）を添加した。同様にコントロールとして、前記Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞に１００ｎＭのＰＢＳ（細胞培養液１ｍＬで希釈）を添加した。室温にて２４時間反応させた後に、それぞれの培養上清を採取し、培養上清中に含まれるペプチドを、プロテインアレイキット（RayBio（登録商標） Human Cytokine Antibody Array V，RayBiotech社製）を説明書の指示通りに用いて解析し、ＣＳＦによって特異的に誘導された物質を同定した。その結果を図３Ａに示す。その結果、ＣＳＦが抗腫瘍因子であるインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ；Insulin-like growth factor binding proteins）を特異的に誘導していることを確認した。
【実施例４】
【００２４】
［Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞を用いたプランタリシンＡの抗腫瘍物質誘導能の検討］
実施例３同様、ヒト大腸癌由来Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞に１００ｎＭのプランタリシンＡ（細胞培養液１ｍＬで希釈）を添加し、２４時間後に、培養上清を採取し、培養上清中に含まれるペプチドを、上記プロテインアレイキットを用いて解析した。その結果を図３Ｂに示す。その結果、プランタリシンＡがＩＧＦＢＰｓを特異的に誘導していることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
ラクトバチルス・プランタルム菌が分泌するプランタリシンＡや枯草菌が分泌するＣＳＦなどの本件ペプチドを有効成分とする本発明のインスリン様成長因子結合タンパク質の活性化組成物は、消化器癌に対する抗腫瘍組成物として有用である。
【図１】
2009093447.tif 000002
【図２】
2009093447.tif 000003
【図３】
2009093447.tif 000004
【配列表】
2009093447000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月22日(2009.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｂ）のいずれかのペプチドを有効成分とする消化器癌に対する抗腫瘍剤。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項２】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｂ）のいずれかのペプチドを、消化器癌に対する抗腫瘍剤を調製するために使用する方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項４】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
以下の（Ａ）〜（Ｂ）のいずれかのペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とする消化器癌に対する抗腫瘍剤。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項６】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項５記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
以下の（Ａ）〜（Ｂ）のいずれかのペプチドを添加したことを特徴とし、消化器癌の予防・治療のために用いられるものである旨の表示が付された食品又は食品素材。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項８】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項７記載の食品又は食品素材。
【請求項９】
以下の（Ａ）〜（Ｂ）のいずれかのペプチドを有効成分とするインスリン様成長因子結合タンパク質の活性化剤。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ消化器癌に対して抗腫瘍活性を有するペプチド；
【請求項１０】
消化器癌が大腸癌であることを特徴とする請求項９記載の活性化剤。
【国際調査報告】
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