(57)【要約】【課題】標的遺伝子の発現を制御するための遺伝子発現制御方法であって、標的遺伝子産物の発現を正にも制御し得る方法の提供。【解決手段】mRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの５´側及び／又は３´側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列と、を有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得るポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体を提供する。このポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体は、前記シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害することにより、前記mRNAを選択的に安定化して遺伝子産物の翻訳を促進、又は不安定化して遺伝子産物の翻訳を阻害する。【選択図】図９
2009093384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
mRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの５´側及び／又は３´側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列と、を有し、
前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、
該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得ることを特徴とするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体。
【請求項２】
前記シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害することにより、
前記mRNAを選択的に安定化して遺伝子産物の翻訳を促進すること、又は不安定化して遺伝子産物の翻訳を阻害する請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体。
【請求項３】
AUリッチエレメントへのAUリッチエレメント結合因子の結合を阻害する請求の範囲第２項記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体。
【請求項４】
前記mRNAがLDLR mRNAであって、前記AUリッチエレメントへのZFP36L1及び／又はZFP36L2の結合を阻害する請求の範囲第３項記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体。
【請求項５】
前記mRNAがLDLR mRNAであって、ARE1（配列番号4に示すLDLR mRNA塩基配列の５´末端側から２７９０〜２７９７塩基）へのシスエレメント結合因子の結合を阻害する請求の範囲第３項又は第４項記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体。
【請求項６】
配列番号１〜３、６〜１４のいずれかに示す塩基配列、又は該塩基配列と実質的に同一の塩基配列、を含むことを特徴とする請求の範囲第４項又は第５項記載のポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体。
【請求項７】
請求の範囲第４項〜第６項記載のいずれか一以上のポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体を含有する、若しくはいずれか一以上の該ポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターを含有するLDLR発現増強剤。
【請求項８】
請求の範囲第７項記載のLDLR発現増強剤を有効成分として含有する、高脂血症あるいは高脂血症関連疾患を予防、改善又は治療するための医薬組成物。
【請求項９】
前記疾患が、動脈硬化症、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、糖尿病、肥満症、癌からなる群より選択される一以上の疾患である請求の範囲第８項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求の範囲第７項記載のLDLR発現増強剤を有効成分として含有する、アルツハイマー病を予防、改善又は治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
請求の範囲第６項記載のポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクター。
【請求項１２】
請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体を含有する、若しくは該ポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターを含有する遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤。
【請求項１３】
請求の範囲第１２項記載の遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１４】
遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤製造のための請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体、若しくは該ポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターの使用。
【請求項１５】
請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクター。
【請求項１６】
LNAを含んでなることを特徴とする請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド類似体。
【請求項１７】
mRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの５´側及び／又は３´側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列と、を有するポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体を用い、
前記シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害することにより、
標的遺伝子産物の発現を制御することを特徴とする遺伝子発現制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体などに関する。より詳しくは、mRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列を有し、遺伝子産物の発現制御が可能なポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体と、このポリヌクレオチド等を用いた遺伝子発現制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の恒常性は、細胞の分化増殖や神経伝達、免疫反応等の種々の生体反応に関連する多様な遺伝子が生体内外からの刺激に応じて適切にその発現を変化させ機能することによって維持されている。各遺伝子の発現部位や発現量、発現時間等は精緻に制御されることが必要であり、いずれかの遺伝子が正常な制御を逸脱し、過剰に若しくは過小に発現するとホメオスタシスは崩壊し、生体は癌や慢性炎症、自己免疫疾患などの病的状態に至る。従って、癌や慢性炎症、自己免疫疾患等の疾病を予防、改善又は治療するためには、病態に関連している遺伝子の発現を阻害又は促進することで適切に制御し、望ましい発現状態に誘導することが必要となる。【０００３】
また、近年、再生医療分野において、細胞の遺伝子発現を制御することにより、幹細胞を所望の細胞に分化させたり、逆に分化状態の細胞から全分化能を有する万能細胞を作出する試みがなされてきている。遺伝子の発現を適切に制御することは、疾患の治療等に加え、このように細胞の分化増殖能や免疫応答性などを人為的に改変・適化するためにも重要となっている。【０００４】
細胞内の遺伝子発現の制御は、ｍRNAの転写及び翻訳のそれぞれの段階において、ｍRNAの転写量や、転写されたmRNAの安定性及びタンパクへの翻訳量、タンパクそのものの安定性を制御することにより行われている。現在までに、これら各制御段階をターゲットとした様々な遺伝子発現制御方法が開発されている。【０００５】
一例として、標的遺伝子mRNA（センス鎖）に相補的な一本鎖RNA又はDNA（アンチセンス鎖）を細胞内へ導入し、センス鎖のタンパクへの翻訳を選択的に阻害する「アンチセンス法」がある。アンチセンス法は、遺伝子選択性が高く、標的遺伝子mRNAに直接作用するので、低毒性で高い効果を得られるものと期待されている。【０００６】
アンチセンス法と並び期待される遺伝子発現制御方法に、「RNA干渉（RNA interference; RNAi）」がある。RNAiは、標的遺伝子mRNAに相補的な二本鎖RNA（dsRNA）又はこのdsRNAがRNaseIIIファミリーに属するDicerと呼ばれる酵素によって分解されて生成する低分子干渉性RNA（short interfering RNA; siRNA）を細胞内に導入することで、siRNAと複数のタンパク質から形成されるRISC（RNA Induced Silencing Complex）によって標的遺伝子mRNAを特異的に分解させるものである。アンチセンス法では自然に存在しないアンチセンス鎖を用いるのに対して、RNAiは細胞内の既存の遺伝子発現制御系を利用したものであるため、より安全性が高いものと期待されている。【０００７】
アンチセンス法やRNAiといったmRNAを介した遺伝子発現制御機構の発見に伴い、近年、mRNAの安定性やタンパクへの翻訳量を介した発現制御機構の重要性に大きな注目が集まっている。【０００８】
mRNAの安定性や翻訳量は、mRNAの「シスエレメント（cis-element）」と呼ばれる特定配列とこれに結合する「シスエレメント結合因子」により制御されている。【０００９】
シスエレメントは、DNA及びRNAの5´及び3´非翻訳領域に存在し、そのDNA鎖又はRNA鎖にコードされる遺伝子の発現制御に関与する領域として定義される。「シスエレメント結合因子」は、遺伝子のシスエレメントに結合してその遺伝子の発現を正負に制御するtrans-acting factorとして機能する。【００１０】
DNAに存在するシスエレメントとしては、従来、プロモーターやエンハンサーなどがよく知られている。代表的なプロモーターには、TATAボックス、CATボックス、Sp1などがあり、これらには普遍的な転写因子がシスエレメント結合因子として結合し、転写レベルで遺伝子発現の制御を行っている。【００１１】
一方、mRNAに存在するシスエレメントは、mRNAの安定性やタンパクへの翻訳量の制御に関与し、mRNA にコードされた遺伝子産物（タンパク）の発現量を決定する重要な要素となっている。【００１２】
代表的なシスエレメントの一つに、「AUリッチエレメント（AU-Rich Element; ARE）」がある。AREは、アデノシンとウリジンに富む10〜150bps程度の塩基配列であり、mRNAの3´非翻訳領域（3´UTR）に多く存在する。AREは、当初、サイトカインやリンフォカインの3´UTRにおいて「AUUUA」の塩基配列が頻繁に重複して存在する領域として見つかった。AREは、現在では全遺伝子の5〜8％に存在すると推定されており、ホメオスタシスの維持に関与する多くの遺伝子にAREが存在しているものと考えられている（非特許文献１参照）。【００１３】
AREには、trans-acting factor としてARE結合タンパクが結合し、mRNAの安定性や翻訳量を正負（主として負）に制御している（非特許文献２及び非特許文献３参照）。さらに、AREには、microRNA（miRNA）も結合し、同様の制御を行っている（非特許文献４及び非特許文献５参照）。【００１４】
ここで、本発明に関連して「LNA（Locked Nucleic Acid）」について説明する。天然の核酸（DNA及びRNA）中のヌクレオシドは、N型とS型の2種類のコンフォメーションを取り得る。このコンフォメーション間の「ゆらぎ」により、DNA-DNA間，RNA-RNA 間及びDNA-RNA間で形成される二本鎖は、熱力学的に必ずしも安定した状態とはなっていない。2’, 4’ -LNA（Bridged Nucleic Acid; BNAと同義）は、リボース（糖）の2’位と4’位を「- O - CH2-」で架橋し、コンフォメーションをN型に固定した人工核酸である。これまでに、 2’, 4’ - LNA以外にも約10種類のLNAが開発されている（特許文献１〜３参照）。LNAにより合成されたオリゴヌクレオチド類似体は、従来の天然の核酸で合成されたオリゴヌクレオチドにみられる「ゆらぎ」がないため、RNAやDNAへの結合力が極めて高く、配列特異性にも優れている。また、従来のオリゴヌクレオチドに比べ、高い耐熱性と優れたヌクレアーゼ耐性を示す。【００１５】
【特許文献１】特表２００２−５２１３１０号公報
【特許文献２】特開平１０−３０４８８９号公報
【特許文献３】特開平１０−１９５０９８号公報
【非特許文献１】“ARED: human AU-rich element-containing mRNA database reveals an unexpectedly diverse functional repertoire of encoded proteins.” Nucleic Acids Research, 2001, Vol.29, No.1, p.246-254.
【非特許文献２】“AU-rich elements and associated factors: are there unifying principles？” Nucleic Acids Research, 2005, Vol.33, No.22, p.7138-7150
【非特許文献３】“AU-rich element-mediated translational control: complexity and multiple activities of trans-activating factors.” Biochemical Society Transactions, 2002, Vol.30, part 6, p.952-958
【非特許文献４】“Involvement of microRNA in AU-rich element-mediated mRNA instability.” Cell, 2005, Vol.120, No.5, p.623-634
【非特許文献５】“Mechanisms of translational control by the 3´ UTR in development and differentiation.” Seminars in Cell and Developmental Biology, 2005, Vol.16, No.1, p.49-58
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述のアンチセンス法やRNAiといった遺伝子発現制御方法は、アンチセンス鎖やdsRNA、siRNAの配列特異性に基づいて、標的遺伝子ｍRNAの翻訳を阻害したり、該ｍRNAを分解したりすることで、標的遺伝子産物の発現を負に制御するものである。すなわち、これらの方法では、標的遺伝子産物の発現を正に制御して発現量を増強させることはできない。【００１７】
しかしながら、疾病を予防、改善又は治療するためには、病態に関連している遺伝子の発現を阻害するのみならず、必要に応じ発現を促進することで適切に制御し、望ましい発現状態に誘導することが必要である。また、細胞の分化増殖能や免疫応答性等を人為的に改変・適化するためにも、各遺伝子の発現を適切なタイミングで誘導していくことが求められる。【００１８】
そこで、本発明は、標的遺伝子の発現を制御するための遺伝子発現制御方法であって、標的遺伝子産物の発現を正にも制御し得る新規な方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題解決のため、本発明は、mRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの５´側及び／又は３´側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列と、を有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得るポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体を提供する。
このポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体は、前記シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害することにより、前記mRNAを選択的に安定化して遺伝子産物の翻訳を促進、又は不安定化して遺伝子産物の翻訳を阻害する。
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体が結合阻害の対象とするシスエレメント及びシスエレメント結合因子は、特にAUリッチエレメント及びAUリッチエレメント結合因子とすることができる。
本発明において、上記のポリヌクレオチド類似体は、特にLNAを含んでなることが好適である。【００２０】
また、本発明は、上記ポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体を含有する、若しくは該ポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターを含有する遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤、さらにこの遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
併せて、本発明は、標的遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤製造のための上記ポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体、若しくは該ポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターの使用と、特にポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターをも提供する。【００２１】
さらに、本発明は、前記ｍRNAがLDLR mRNAであって、前記AUリッチエレメントへのZFP36L1及び／又はZFP36L2の結合を阻害するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体を提供する。
このポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体は、ARE1（配列番号4に示すLDLR mRNA塩基配列の５´末端側から２７９０〜２７９７塩基）へのシスエレメント結合因子の結合を阻害するものである。
このポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体は、配列番号１〜３、６〜１４のいずれかに示す塩基配列、又は該塩基配列と実質的に同一の塩基配列、を含むものとすることができる。【００２２】
また、本発明は、上記のいずれか一以上のポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体を含有する、若しくは一以上の該ポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターを含有するLDLR発現増強剤を提供する。さらに、このLDLR発現増強剤を有効成分として含有する、高脂血症あるいは高脂血症関連疾患、もしくはアルツハイマー病を予防、改善又は治療するための医薬組成物を提供する。高脂血症関連疾患は、動脈硬化症、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、糖尿病、肥満症、癌からなる群より選択される一以上の疾患とすることができる。
併せて、本発明は、上記ポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターをも提供する。【００２３】
以上に加え、mRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの５´側及び／又は３´側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列と、を有するポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体を用い、前記シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害することにより、標的遺伝子産物の発現を制御することを特徴とする遺伝子発現制御方法を提供する。【００２４】
ここで、本発明における用語の定義を説明する。【００２５】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドがリン酸を介しフォスフォジエステル結合で鎖状に結合したものをいう。より具体的には、従来の核酸（DNA又はRNA）からなる核酸鎖（DNA鎖又はRNA鎖）を意味する。なお、ヌクレオチドとはヌクレオシドがリン酸と結合したものであり、ヌクレオシドとはアデニン、グアニンなどのプリン塩基やチミン、シトシン、ウラシルなどのピリミジン塩基と、糖（リボース）とが結合した化合物をいう。塩基は、いわゆる相補性を備え、アデニン／チミン（ウラシル）間及びグアニン／シトシン間で水素結合による塩基対を形成する。従って、相補的な塩基配列を有する２つのポリヌクレオチド（DNA/DNA, DNA/RNA, RNA/RNA）は、塩基対間の水素結合によって高い親和性をもって結合し二本鎖を形成する。なお、ポリヌクレオチドのうち、数ヌクレオチド〜数十ヌクレオチドのものを特にオリゴヌクレオチドと呼ぶものとする。【００２６】
「ポリヌクレオチド類似体」とは、ポリヌクレオチドが有する塩基配列、すなわち糖鎖がなす基本分子鎖に塩基が結合して配列した構造、を模擬する「塩基配列様構造」を有するポリマーを意味するものとする。ここで、ポリヌクレオチド類似体の「塩基配列様構造」は、塩基そのものが配列した構造である必要はなく、塩基に替わって、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルの各塩基を区別して認識し相補的に結合し得る化合物が基本分子鎖に結合して配列した構造であってもよい。本発明において「塩基配列」の用語には、ポリヌクレオチドが有する塩基配列に併せて、このポリヌクレオチド類似体が有する「塩基配列様構造」が含まれるものとする。また、本発明において「長さ（塩基数）」の概念には、ポリヌクレオチドの塩基数に加えて、ポリヌクレオチド類似体の基本分子鎖に配列した上記化合物の「化合物数」が含まれるものとする。【００２７】
ポリヌクレオチド類似体の基本分子鎖は、リボースのフォスフォジエステル結合によって形成されている必要はなく、例えば上述のLNAのように構造を改変したリボースや、リボース以外の糖が結合したもの、またこれらがフォスフォジエステル結合以外の化学結合により結合したものであってもよい。基本分子鎖は、上記の塩基配列様構造を支持し得る分子鎖であれば特に限定されないものとする。ポリヌクレオチド類似体は、この基本分子鎖によって上記の塩基配列様構造が支持された構造を有するものであり、塩基配列様構造によってこれに相補的な塩基配列を有するmRNAに高い親和性をもって結合し、二本鎖を形成し得るものである。【００２８】
「シスエレメント」とは、mRNAの5´及び3´非翻訳領域に存在し、そのmRNA鎖にコードされる遺伝子の発現制御に関与する領域を意味し、具体的には、AUリッチエレメント、Histone mRNA 3´ UTR stem loop element、Internal ribosome entry site (IRES)、A2RE element、ZIPCODE element、Iron response element(IRE)、Cytoplasmic polyadenylation  (CPE)、Nanos translational control、Amyloid precursor protein element (APP)、Translational regulation element (TGE)/direct repeat element (DRE)、Bruno element (BRE)、15-lipoxygenase differentiation control element (15-LOX-DICE)、G-quartet element、Adh mRNA down-regulation element、Barley yellow dwarf virus、GLUT1 mRNA-stability control element、Msl-2 3 UTR control element、Msl-2 5 UTR control element、Ribosomal S12 mRNA translational control element、Selenocysteine insertion sequence type 1 (SECIS-1)、Selenocysteine insertion sequence type 2 (SECIS-2)、TNF-mRNA stability control element、Terminal oligopyrimidine tract (TOP)、 Vimentin mRNA 3 UTR control elementなどが少なくとも含まれるものとする（”Untranslated regions of mRNAs.” Genome Biology. 2002, Vol.3, No.3, reviews0004.1-0004.10参照）。また、「シスエレメント結合因子」には、このシスエレメントに結合して、遺伝子の発現を正負に制御するタンパク及びmiRNAが広く包含されるものとする。【００２９】
「AUリッチエレメント」とは、mRNAの3´UTRに多く存在するアデノシンとウリジンに富む10〜150bps程度の塩基配列であって、mRNAの安定性や翻訳量の制御に関与する配列を意味する。AREは、現在、暫定的に以下の３グループに分類されており、本発明においてもこれら３グループのAREが少なくとも含まれるものとする（上記非特許文献２参照）。（１）ウリジンに富む配列中に数コピーの「AUUUAペンタマー」を含む領域（ARE I）、（２）少なくとも2以上の重複する「UUAUUUA(U/A)(U/A)ノナマー」を含む領域（ARE II）、（３）「AUUUAペンタマー」を含まないがウリジンに富む領域（ARE III）。【００３０】
「AUリッチエレメント結合因子」には、上記AREに結合して、mRNA鎖にコードされる遺伝子の発現を正負に制御するタンパク及びmiRNAが広く包含されるものとする。具体的には、タンパクとしてAUF1, HuR, Hel-N1, HuD, TTP, BRF1, TIA-1, KSRP, GUG-BP2, Nucleotin, TINO, PAIP2, ZFP36L1及びZFP36L2など（上記非特許文献２参照）、またmiRNAとしてmiＲ16（上記非特許文献４参照）などが少なくとも含まれる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、標的遺伝子の発現を制御するための遺伝子発現制御方法であって、標的遺伝子産物の発現を正にも制御し得る方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。  【００３３】
１．シスエレメント及びシスエレメント結合因子の機能
図１は、シスエレメント及びシスエレメント結合因子によるmRNAの安定性及びタンパクへの翻訳量の制御メカニズムを説明する模式図である。【００３４】
シスエレメント結合因子は、mRNAの5´及び3´非翻訳領域（5´UTR/3´UTR）に存在するシスエレメントに対し、単一因子として又は複数因子からなる複合体として結合し、そのmRNAにコードされる遺伝子の発現を正負に制御している。正の制御では、シスエレメント結合因子は、mRNAの分解を抑制して安定化させ、タンパクへの翻訳を促進して遺伝子発現を増強させる。逆に、負の制御においては、mRNAの分解を促進して不安定化し、タンパクへの翻訳を阻害して遺伝子発現を抑制する。例えば、AUリッチエレメント結合因子であるAUF1（AU binding factor 1）は、3´-5´エクソリボヌクレアーゼを含む複合体としてAREに結合し、mRNAの分解を促進している（上記非特許文献３参照）。【００３５】
２．ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体
本発明に係るポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体は、mRNAのシスエレメントに相補的な塩基配列を有し、シスエレメントの少なくとも一部に結合することによって、このシスエレメント結合因子による正負の発現制御機能を阻害するものである。以下、本発明に係るポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体の構成と機能について具体的に説明する。【００３６】
図2は、本発明に係るポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体の実施形態を説明する模式図である。【００３７】
図2(A)中、符号P1で示すポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体（以下、単に「ポリヌクレオチド等」ともいう）は、mRNAの5´及び3´非翻訳領域に存在するシスエレメントの一部に相補的な塩基配列を有する領域「cCIS」と、このシスエレメントの3´側の非翻訳領域（3´側UTR）に相補的な塩基配列を有する領域「cUTR」と、の連続する２つの領域から構成されている。【００３８】
cCIS及びcUTRは、ポリヌクレオチド等P1がポリヌクレオチドである場合、それぞれシスエレメント及び3´側UTRの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNA又はRNAからなる領域である。【００３９】
また、ポリヌクレオチド等P1がポリヌクレオチド類似体である場合、cCIS及びcUTRは、それぞれ（１）シスエレメント及び3´側UTRの塩基配列に相補的な塩基配列、又は（２）この塩基配列を模擬し、シスエレメント及び3´側UTRの塩基配列中のアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルの各塩基を区別して認識し、相補的に結合し得る化合物が配列する塩基配列様構造、のいずれか又は両方を有する領域である。【００４０】
ポリヌクレオチド等P1のcUTRは、ポリヌクレオチド等P1を、特定の遺伝子mRNA上の特定のシスエレメントに結合させるために機能する。以下、ポリヌクレオチド等P1が結合する特定遺伝子mRNA及び特定シスエレメントをそれぞれ「標的遺伝子ｍRNA」及び「ターゲットシスエレメント」というものとする。なお、ここでは、cUTRをターゲットシスエレメントの3´側UTRに相補的な塩基配列として設ける場合を説明するが、ポリヌクレオチド等P1においてcUTRはターゲットシスエレメントの5´側UTRに相補的な塩基配列として設計することも可能である。【００４１】
AUリッチエレメント（ARE）やHistone mRNA 3´ UTR stem loop elementなどの各シスエレメントは、それぞれに特徴的な塩基配列を有している。例えばAREの一グループ（ARE I）は「AUUUA」の6塩基によって特徴付けられる塩基配列を有する。各シスエレメントは、このような特定の塩基配列として、複数の遺伝子のmRNA上に存在し、かつ同一mRNA上の異なる位置にも複数存在することがある。このため、ポリヌクレオチド等P1のcCISは、標的遺伝子mRNAのターゲットシスエレメント以外に、同様の特定塩基配列を有する複数の遺伝子mRNA上の複数のシスエレメントにも、その相補性に基づき結合し得る。【００４２】
一方、ターゲットシスエレメントの3´側UTRは、ターゲットシスエレメントによって特異的な塩基配列となっている。すなわち、ターゲットシスエレメントの3´側UTRは、同一mRNA上の異なる位置に存在し、かつ、ターゲットシスエレメントと同様の特定塩基配列を有するターゲット以外のシスエレメントの3´側UTRとは、異なる塩基配列となっている。そして、このターゲットシスエレメントの3´側UTRは、当然に、標的遺伝子以外の遺伝子mRNA上に存在するターゲットシスエレメントと同様の特定塩基配列を有するシスエレメントの3´側UTRとも異なる塩基配列である。【００４３】
従って、ポリヌクレオチド等P1のcUTRは、そのターゲットシスエレメントの3´側UTRに対する相補性（配列特異性）に基づいてターゲットシスエレメントの3´側UTRのみに特異的に結合し得ることとなる。そして、このcUTRの特異的結合によって、ポリヌクレオチド等P1においては、cUTRに連続するcCISを、ターゲットシスエレメントのみに特異的に結合させることが可能となる。【００４４】
ポリヌクレオチド等P１のcUTRの長さ（塩基数）は、ターゲットシスエレメントの3´側UTRとの間で、塩基対間の水素結合による親和性又はこれに類する親和性による二本鎖を形成するために十分な結合力を発揮し得る長さとする。さらに、ポリヌクレオチド等P１のcUTRの長さは、ターゲットシスエレメントの3´側UTRの塩基配列に対する配列特異性を発揮し得る長さとする。【００４５】
従来、ＰＣＲやＤＮＡチップ等の核酸関連技術分野では、所定の二本鎖形成条件（ハイブリダイゼーション条件）下において、目的とする核酸塩基配列を含む核酸鎖のみと特異的に二本鎖を形成し、他の核酸への非特異的な結合を抑制したポリヌクレオチドを設計することが行われている。本発明におけるポリヌクレオチド等P1のcUTRについても、このような従来公知のポリヌクレオチド設計方法に基づいて、十分な結合力と配列特異性を発揮するために最適な長さを決定することができる。【００４６】
具体的には、ポリヌクレオチド等P１のcUTRの長さは、少なくとも１塩基以上であって、好ましくは２塩基以上、より好ましくは３塩基以上、さらに好ましくは４塩基以上とされる。ただし、ポリヌクレオチド等P１がDNA又はRNAからなるポリヌクレオチドである場合と、LNA等からなるポリヌクレオチド類似体である場合とでは、ポリヌクレオチド等P１のcUTRの好適な長さは相違し得る。例えば、ポリヌクレオチド等P１が結合力及び配列特性が高いLNAを含んでなる場合には、DNA又はRNAからなる場合に比べて、cUTRの長さはより短くてよい。なお、ポリヌクレオチド等P1のcUTRの結合力及び配列特異性は、ポリヌクレオチド等P1の全長の長さによっても影響されるものである。【００４７】
説明したように、ポリヌクレオチド等P1では標的遺伝子mRNAのターゲットシスエレメントにcCISを特異的に結合させることができる。このため、このポリヌクレオチド等P1を用いれば、ターゲットシスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を競合的に阻害することできる。そして、ターゲットシスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害することにより、シスエレメント結合因子のmRNA発現制御機能を阻害して、標的遺伝子の発現を増強又は抑制することが可能となる。【００４８】
ポリヌクレオチド等P1のcCISの長さは、ターゲットシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基を有し、ターゲットシスエレメントへ結合してシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る長さとする。【００４９】
具体的には、ポリヌクレオチド等P1のcCISの長さは、少なくとも１塩基以上であって、好ましくは２塩基以上、より好ましくは３塩基以上、さらに好ましくは４塩基以上とされる。cCISは、その長さが長いほど、シスエレメント結合因子の結合を効果的に阻害することができると考えられる。しかし、cCISの長さが長いと、ポリヌクレオチド等P１の非特異的な結合が増す可能性があり、合成コスト上の問題も生じる。【００５０】
なお、ポリヌクレオチド等P１がDNA又はRNAからなるポリヌクレオチドである場合と、LNA等からなるポリヌクレオチド類似体である場合とでは、ポリヌクレオチド等P１のcCISの好適な長さが相違する点、及び、ポリヌクレオチド等P1のcCISの結合力はポリヌクレオチド等P1の全長の長さによっても影響される点は、上述した通りである。【００５１】
「表1」に、ターゲットシスエレメント及びこれに結合するシスエレメント結合因子の機能と、ポリヌクレオチド等P1によってこれらの結合を阻害した際の効果をまとめる。（i）ターゲットシスエレメント及びこれに結合するシスエレメント結合因子が標的遺伝子を負に制御する場合には、ポリヌクレオチド等P1によってこれらの結合を阻害することで、標的遺伝子mRNAを選択的に安定化して標的遺伝子産物の翻訳を促進し、標的遺伝子の発現を増強することができる。また、逆に、（ii）ターゲットシスエレメント及びこれに結合するシスエレメント結合因子が標的遺伝子を正に制御している場合、ポリヌクレオチド等P1によってこれらの結合を阻害することで、標的遺伝子mRNAを選択的に不安定化して標的遺伝子産物の翻訳を阻害し、標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。【００５２】
【表１】
2009093384.tif 000003
【００５３】
この遺伝子発現増強又は抑制効果は、ポリヌクレオチド等P1のcCIS及びcUTRの塩基配列を任意に設計することにより、所望の遺伝子を標的遺伝子として得ることができる。すなわち、まず発現制御の対象とする遺伝子mRNA中の特定のシスエレメントを決定し、このシスエレメントをターゲットシスエレメントとしてその塩基配列に相補的なcCISを設計する。そして、このターゲットシスエレメントの3´側UTRの塩基配列に相補的なcUTRを設計し、ポリヌクレオチド等P1を構成する。これにより、発現制御の対象とする標的遺伝子mRNAのターゲットシスエレメントのみにポリヌクレオチド等P1を結合させて、その標的遺伝子について「表1」に示したような遺伝子発現増強又は抑制効果を得ることができる。  【００５４】
ポリヌクレオチド等P1中、cCIS及びcUTRの塩基配列は、それぞれターゲットシスエレメント及びその3´UTRの塩基配列に対し、完全に相補的である必要はなく、ターゲットシスエレメント及びその3´UTRに対し高い親和性をもって結合し二本鎖を形成し、ターゲットシスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る限りにおいて、ターゲットシスエレメント及びその3´UTRの塩基配列中の1塩基又は2塩基以上と非相補的な塩基（又は化合物）を含んでいてもよい。本発明において、このような塩基配列は「実質的に同一な塩基配列」と呼ぶものとする。【００５５】
すなわち、本発明において「実質的に同一な塩基配列」とは、ターゲットシスエレメント及びその3´UTRに対し高い親和性をもって結合し二本鎖を形成して、ターゲットシスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る機能を備えるポリヌクレオチド等の塩基配列について、同機能を維持させたまま、1又は2以上（好ましくは数個以内）の塩基を欠失、付加、置換、挿入して得られる改変塩基配列を意味するものとする。【００５６】
ポリヌクレオチド等P1の全長は、上述のcUTR及びcCISの長さの合計によって決定される。cUTRの長さは、ターゲットシスエレメントの3´側UTRに対する十分な結合力と配列特異性を発揮し得る長さとされ、cCISの長さは、ターゲットシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基を有し、これに結合してシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る長さとされる。【００５７】
具体的には、ポリヌクレオチド等P１のcUTR及びcCISの長さは、それぞれ少なくとも１塩基以上であって、好ましくは２塩基以上、より好ましくは３塩基以上、さらに好ましくは４塩基以上である。従って、ポリヌクレオチド等P1の全長は、少なくとも２塩基以上であって、好ましくは４塩基以上、より好ましくは６塩基以上、さらに好ましくは８塩基以上である。【００５８】
ポリヌクレオチド等P1の全長は、その長さが長いほど、ターゲットシスエレメント及びその3´UTRに対する結合力を高めることができる。しかし、全長が長いと、ポリヌクレオチド等P１の非特異的な結合が増す可能性があり、合成コスト上の問題も生じる。【００５９】
ＰＣＲやＤＮＡチップ等の核酸関連技術分野におけるポリヌクレオチド設計では、このような非特異的な結合や合成コスト上の問題を回避するため、ポリヌクレオチドの望ましい長さは数塩基〜数十塩基、より望ましくは１０〜３０塩基前後とされている。本発明におけるポリヌクレオチド等P1の全長についても、このような従来公知のポリヌクレオチド設計基準も勘案し、適宜最適な長さを決定することができる。なお、ポリヌクレオチド等P１が結合力及び配列特性が高いLNAを含んでなる場合には、全長の長さは上記範囲より短くてもよい。【００６０】
以下、本発明に係るポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体について、図2(B)及び(C)を参照して、他の実施形態を説明する。【００６１】
本発明に係るポリヌクレオチド等は、図2(B)中、符号P2で示すポリヌクレオチド等のように、標的遺伝子mRNAのターゲットシスエレメントの全長に相補的な塩基配列を有する領域cCISを有する構成であってもよい。また、ポリヌクレオチド等P2のように、ターゲットシスエレメントの3´側UTRに相補的な塩基配列を有するcUTRに加え、5´側UTRに相補的なcUTR2を有していてもよい。【００６２】
ポリヌクレオチド等P2のcUTR2の長さは、ターゲットシスエレメントの5´側UTRとの間で、塩基対間の水素結合による親和性又はこれに類する親和性による二本鎖を形成するために十分な結合力を発揮し得る長さとする。さらに、ポリヌクレオチド等P2のcUTR2の長さは、ターゲットシスエレメントの5´側UTRの塩基配列に対する配列特異性を発揮し得る長さとする。【００６３】
具体的には、上述したポリヌクレオチド等P１のcUTRの長さと同様に、少なくとも１塩基以上であって、好ましくは２塩基以上、より好ましくは３塩基以上、さらに好ましくは４塩基以上とされる。ただし、ポリヌクレオチド等P2では、cUTRとcUTR2とによって、ターゲットシスエレメントに対する配列特異性を確保すればよい。そのため、ポリヌクレオチド等P2のcUTR及びcUTR2の長さは、ポリヌクレオチド等P１のcUTRの長さに比べて短く設計できる場合がある。【００６４】
さらに、本発明に係るポリヌクレオチド等は、図2(C)中、符号P3で示すポリヌクレオチド等のように、標的遺伝子mRNAに存在する2つのシスエレメント1, 2に相補的な塩基配列を有する領域cCIS1, cCIS2を有する構成であってもよい。この場合、cCIS1及びcCIS2はcUTRによって連結される。このcUTRは、シスエレメント1の5´側UTRであって、かつ、シスエレメント2の3´側UTRであるUTRの全長に相補的な塩基配列を有する。シスエレメント1及びシスエレメント2は、一種類のシスエレメント（例えば、ともにARE）であってよく、また異なる種類のシスエレメント（例えば、一方がAREで、他方がIRES）であってもよい。【００６５】
ポリヌクレオチド等P3のcCIS1, cCIS2の長さは、ターゲットシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基を有し、ターゲットシスエレメントへ結合してシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る長さとする。【００６６】
具体的には、ポリヌクレオチド等P3のcCIS1, cCIS2の長さは、ポリヌクレオチド等P1のcCISの長さと同様に、少なくとも１塩基以上であって、好ましくは２塩基以上、より好ましくは３塩基以上、さらに好ましくは４塩基以上とされる。【００６７】
このように、本発明に係るポリヌクレオチド等は、ターゲットシスエレメントの少なくとも一部に相補的なcCISを有し、ターゲットシスエレメントの5´側又は3´側、もしくは両側のUTRに相補的なcUTRを有している（図2(A)〜（C）参照）。また、本発明に係るポリヌクレオチド等は、標的遺伝子mRNAの2以上のシスエレメントをターゲットとすることができる（図2（C）参照）。【００６８】
３．ポリヌクレオチド類似体の具体例
本発明に係るポリヌクレオチド等を、ポリヌクレオチド類似体とする場合、cCIS及びcUTRは、シスエレメント及び3´側UTRの塩基配列中のアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルの各塩基を区別して認識し、相補的に結合し得る化合物が配列させた塩基配列様構造を有する領域とすることができることは既に述べた通りである。加えて、本発明に係るポリヌクレオチド類似体は、ポリヌクレオチドにおいてはリボースのフォスフォジエステル結合により形成されている基本分子鎖を、リボースを改変した基本分子鎖や、リボース以外の糖を結合させた基本分子鎖、またこれらがフォスフォジエステル結合以外の化学結合により結合させた基本分子鎖とすることができる。【００６９】
リボースを改変した基本分子鎖や、リボース以外の糖を結合させた基本分子鎖、またこれらがフォスフォジエステル結合以外の化学結合により結合させた基本分子鎖の合成には、例えば、PNAやMorpholino、2'-O-methyl-RNA、チオDNA、チオRNA、LNAなどを用いることができる。【００７０】
図3に、PNA(B)及びMorpholino（C）の結合構造を示す。なお、（A）はDNAの結合構造を示している。図3（B）に示すPNAは、ポリヌクレオチド類似体の基本分子鎖を糖以外により合成し、「-C(O)-NH-」（アミド結合）により結合させた基本分子鎖の一例である。また、（C）に示すMorpholinoは、基本分子鎖を糖以外により合成し、「−P(O)-O-」（フォスフォモノエステル結合）結合させた基本分子鎖の一例である。【００７１】
本発明に係るポリヌクレオチド類似体は、これらの2以上を用いたり、これらとRNA又はDNAとからなるハイブリッド鎖として合成することができる。特に、リボースの構造を改変したLNAを好適に採用することができる。【００７２】
LNAにより合成されたオリゴヌクレオチド類似体は、従来の天然の核酸で合成されたオリゴヌクレオチドにみられるN型とS型の2種類のコンフォメーション間の「ゆらぎ」がないため、mRNAへの結合力が極めて高い。従って、例えば、図2(A)に示したオリゴヌクレオチド類似体P1において、cCISをより強固にターゲットシスエレメントに結合させることができ、ターゲットシスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を効果的に阻害することが可能となる。【００７３】
また、LNAにより合成されたオリゴヌクレオチド類似体は、配列特異性にも優れている。従って、例えばオリゴヌクレオチド類似体P1において、cUTRをより特異性高くターゲットシスエレメントの3´側UTRへ結合させることができ、オリゴヌクレオチド類似体P1のターゲットエレメントに対する選択性を高めることが可能となる。【００７４】
さらに、LNAにより合成されたオリゴヌクレオチド類似体は、高い耐熱性と優れたヌクレアーゼ耐性を備えるため、オリゴヌクレオチド類似体を以下に説明する遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤として使用する場合、高い安定性を得ることができ、遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤の効果を高めることが可能となる。【００７５】
LNAとしては、リボースの2’位と4’位を「- O - CH2-」で架橋し、コンフォメーションをN型に固定した2’, 4’ -LNAの他、種々の架橋方法によってコンフォメーションを固定したLNAを使用することができる。【００７６】
４．シスエレメント及びシスエレメント結合因子の具体例
本発明に係るポリヌクレオチド等が対象とするターゲットシスエレメントは、例えばAUリッチエレメント、Histone mRNA 3´ UTR stem loop element、Internal ribosome entry site (IRES)、A2RE element、ZIPCODE element、Iron response element(IRE)、Cytoplasmic polyadenylation  (CPE)、Nanos translational control、Amyloid precursor protein element (APP)、Translational regulation element (TGE)/direct repeat element (DRE)、Bruno element (BRE)、15-lipoxygenase differentiation control element (15-LOX-DICE)、G-quartet element、Adh mRNA down-regulation element、Barley yellow dwarf virus、GLUT1 mRNA-stability control element、Msl-2 3 UTR control element、Msl-2 5 UTR control element、Ribosomal S12 mRNA translational control element、Selenocysteine insertion sequence type 1 (SECIS-1)、Selenocysteine insertion sequence type 2 (SECIS-2)、TNF-mRNA stability control element、Terminal oligopyrimidine tract (TOP)、 Vimentin mRNA 3 UTR control elementなどとすることができる。【００７７】
このうち、ターゲットシスエレメントは、特にAUリッチエレメント（ARE）とすることができる。ARE及びARE結合タンパクは、mRNAの安定性や翻訳量を主として負に制御している。従って、本発明に係るポリヌクレオチド等によってAREへのARE結合タンパクの結合を阻害し、この負の制御機能を阻害すれば、mRNAを安定性し翻訳を促進させて標的遺伝子の発現を増強することが可能となる（「表1」参照）。【００７８】
この際、ポリヌクレオチド等が結合を阻害するシスエレメント結合因子としては、AUF1, HuR, Hel-N1, HuD, TTP, BRF1, TIA-1, KSRP, GUG-BP2, Nucleotin, TINO, PAIP2, ZFP36L1及びZFP36L2などのタンパクやmiＲ16などのmiRNAとできる。【００７９】
AREは、IL-2, IL-3, TNF-αなどのサイトカインや,転写因子、細胞周期関連タンパクを含む全遺伝子の5〜8％に存在すると推定されているため、AREをターゲットシスエレメントとすることにより、本発明に係るポリヌクレオチド等を用いてホメオスタシスの維持に重要な役割を担う多くの遺伝子の発現を制御することが可能である。【００８０】
５．ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体の製造方法
本発明に係るポリヌクレオチドは公知の核酸合成方法によって得ることができる。また、ポリヌクレオチド類似体についても、例えばLNAにより合成する場合には、上記特許文献１〜３に記載された公知の方法に従って得ることが可能である。【００８１】
６．遺伝子発現制御方法
本発明に係るポリヌクレオチド等を用いた遺伝子発現制御方法において、制御対象を細胞とする場合、ポリヌクレオチド等は、細胞培養液に添加し細胞内へ取り込ませることによって、細胞内の標的遺伝子mRNAのターゲットシスエレメントへ結合させることができる。また、ポリヌクレオチド等をリポフェクションやマイクロインジェクションによって細胞内へ導入することにより、ターゲットシスエレメントへ結合させてもよい。また、遺伝子発現の制御対象が生体臓器又は生体である場合には、経口経路、直腸経路、鼻腔経路、血管経路などの投与経路によって、又は対象臓器への直接局所投与によって、ポリヌクレオチド等を生体内又は生体臓器内へ導入し、細胞内へ取り込ませる。【００８２】
さらに、ポリヌクレオチドを発現可能なベクターのトランスフェクトにより、ポリヌクレオチドを細胞内で発現させ、標的遺伝子mRNAのターゲットシスエレメントへ結合させることもできる。ベクターには、大腸菌由来や枯草菌由来、酵母由来のプラスミドや、バクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス又はこれらをリポソームと融合させたものなどが用いることができる。特に、ポリヌクレオチドをRNAとする場合には、レトロウイルスベクター又はこれらをリポソームと融合させたものが好適に選択される。発現ベクターの構築は、公知の遺伝子工学的手法により行うことができる。【００８３】
７．標的遺伝子産物の発現増強剤又は抑制剤と医薬組成物
以下、本発明に係る標的遺伝子産物の発現増強剤又は抑制剤、及びこれを有効成分として含有する医薬組成物について説明する。【００８４】
本発明に係るポリヌクレオチド等は、標的遺伝子産物の発現増強剤又は抑制剤として使用することができる。この遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤は、ポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体そのもの、若しくはポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターを有効成分とするものである。【００８５】
発現増強剤又は抑制剤を制御対象とする細胞や生体臓器等へ処置するための方法は、上述したポリヌクレオチド等の細胞培養液への添加やリポフェクション等による細胞内への導入、経口投与等による生体臓器内への導入、発現ベクターを用いた細胞内での発現などの方法から、適宜最適な方法を選択して用いることができる。【００８６】
本発明に係る医薬組成物は、この遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤を、理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造できる。この医薬組成物は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。本発明に係る遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤を、生錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。【００８７】
医薬組成物の投与量や剤型の種類、投与方法は、投与対象（動物を含む）の年齢や体重、症状等を考慮して決定されるものである。投与方法は、経口経路、直腸経路、鼻腔経路、血管経路などによる投与、又は対象臓器への局所投与を適宜選択し得る。【００８８】
８．LDLRの発現制御
本発明者らは、実施例において詳しく後述するように、「表2」に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド類似体（LNA1〜3, 6~14）が、LDLR（low- density lipoprotein receptor）の発現を顕著に増強し得ることを見出した。そして、LNA1〜3, 6~14が、ARE1（配列番号4に示すLDLR mRNA塩基配列の５´末端側から２７９０〜２７９７塩基）に結合して、LDLR mRNAの不安定化・分解促進に機能するZFP36L1及びZFP36L2のAREへの結合を阻害し、LDLR mRNAを選択的に安定化して翻訳を促進することにより、LDLR mRNAの発現を増強させていることを明らかにした。【００８９】
【表２】
2009093384.tif 000004
【００９０】
従って、配列番号1〜3, 6〜14のいずれかに示す塩基配列、又は該塩基配列と実質的に同一の塩基配列、を含むポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体、若しくはこのポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターは、LDLR発現増強剤として使用することができる。  【００９１】
ここで、「実質的に同一の塩基配列を含むポリヌクレオチド」とは、配列番号1〜3, 6〜14のいずれかに示す塩基配列中の1又は2以上（好ましくは数個以内）の塩基を欠失、付加、置換、挿入した改変配列を有するポリヌクレオチドであって、配列番号1〜3, 6~14のいずれかに示す塩基配列を含むポリヌクレオチドと同等のLDLR発現増強効果を発揮し得るポリヌクレオチドを意味する。また、「実質的に同一の塩基配列を含むポリヌクレオチド類似体」とは、配列番号1〜3, 6〜14のいずれかに示す塩基配列と同様にこれらに相補的な塩基配列に結合し得る配列であって、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルの各塩基を区別して認識し得る化合物が配列した塩基配列様構造において、1又は2以上（好ましくは数個以内）の化合物を欠失、付加、置換、挿入した改変配列を有するポリヌクレオチド類似体であって、配列番号1〜3, 6〜14のいずれかに示す塩基配列を含むポリヌクレオチド類似体と同等のLDLR発現増強効果を発揮し得るポリヌクレオチド類似体を意味する。【００９２】
ポリヌクレオチド等の塩基配列は、配列番号1〜3, 6〜14のいずれかに示す塩基配列と完全に一致していることが高いLDLR発現増強効果を得るために望ましいが、必ずしも完全一致である必要はなく、LDLR mRNAのターゲットAREに対し高い親和性をもって結合し二本鎖を形成し得る塩基配列であれば、配列番号1〜3, 6〜14に示す塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含んでいればよい。このような改変配列を有するポリヌクレオチド等は、例えば、他の遺伝子のmRNAへの結合による副作用の防止や、ポリヌクレオチド等の細胞膜透過性や生体内安定性を向上させることを目的として設計され得る。【００９３】
LDLRは、レセプターを介したエンドサイトーシスによって血漿中のLDLコレステロールを細胞内に取り込む機能を有している。特に、肝臓に発現するLDLRによるLDLコレステロールの細胞内取り込みは、血漿LDLコレステロールのクリアランスに重要な役割を果たしている。【００９４】
LDLコレステロールは、肝臓から末梢組織へのコレステロール運搬を担っている。しかし、血中のLDLコレステロールが正常値を超えて増加した高脂血症の状態では、LDLコレステロールは血管内壁への沈着によって血管傷害を引き起こし、動脈硬化や高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症の原因となる。【００９５】
本発明に係るLDLR発現増強剤はLDLRの発現を選択的に増強することが可能であるため、このLDLR発現増強剤を有効成分とする医薬組成物によれば、特に肝臓へ適用してLDLR発現を増強させることで、血漿LDLコレステロールのクリアランスを高め、高脂血症及び高脂血症関連疾患を予防、改善又は治療することが可能となる。【００９６】
LDLRに関しては、その遺伝子多型がアルツハイマー病の発症リスクに関係していることが報告されている（”Function of beta-amyloid in cholesterol transport: a lead to neurotoxicity.” FASEB J., 2002, Oct;16(12):1677-9. Epub 2002 Aug 21.参照）。また、コレステロールレベルの上昇がアルツハイマー病の病態に関与していることも示唆されている（”Genetic study evaluating LDLR polymorphisms and Alzheimer's disease.” Neurobiol Aging., 2008, Jun;29(6):848-55. Epub 2007 Jan 18.参照）。【００９７】
これらのことから、本発明に係るLDLR発現増強剤及び医薬組成物は、LDLRの発現を選択的に増強し、血漿LDLコレステロールのレベルをコントロールすることで、アルツハイマー病を予防、改善又は治療に適用できる可能性もある。【００９８】
なお、「予防」には、疾患を罹患する前段階の予防だけではなく、疾患治療後の再発に対する予防も含まれるものとする。また、高脂血症関連疾患としては、上記の動脈硬化や高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症に加え、糖尿病や肥満症、癌が含まれるが、この他の疾患への適用を除外するものではない。
【実施例】
【００９９】
＜実施例１＞
１．LDLRの発現制御実験I（ARE1）
LDLRを標的遺伝子として、本発明に係るポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体、並びにこれらを用いた遺伝子発現制御方法について検証を行った。  【０１００】
（１）ポリヌクレオチド類似体の設計
AREのデータベース（AU-RICH ELEMENT-CONTAINING mRNA DATABASE :http://brp.kfshrc.edu.sa/ARED/）を参照し、LDLR mRNA上のAREの一部に相補的なポリヌクレオチド類似体を設計した。【０１０１】
これまでにLDLR mRNAの3’UTRには、少なくとも３つのAREが存在することが明らかとなっている（”Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins.” Nat Med., 2004, Dec;10(12):1344-51. Epub 2004 Nov 7.参照）。「図4」は、LDLR mRNAの3’UTRにおけるこれら３つのAREの位置を示す模式図である。ここでは、３つのAREを形式的に「ARE1」、「ARE2」、「ARE3」と表記する（なお、「ARE1~3」は、先に説明したAREの３つのグループ「ARE I~III」とは別異である）。図中、「UCAU」は、「UCAU」の4塩基が4回重複して配列する「UCAUリピート」を示す。【０１０２】
ARE1〜3は、配列番号4に示すLDLR mRNA  5175bp（GenBank Accession No.NM_000527）のうち、5’末端から2677-3585bpの領域に位置している。ARE1は5’末端から2790〜2797bpの領域、ARE2は5’末端から3350〜3363bpの領域、ARE3は5’末端から3538〜3547bpの領域に対応する。  【０１０３】
図5に、ARE1をターゲットシスエレメントとして設計したポリヌクレオチド類似体の塩基配列と、ARE1を含むLDLR mRNAの部分塩基配列と、を示す。【０１０４】
図5(A)は、LDLR mRNA（配列番号4参照）の全長5175bpsうち、ARE1を含む部分（5´側末端から2767-2816bps）の塩基配列を示す。塩基配列中の太字（ボールドレター）はARE1を示し、下線部は「AUUUAペンタマー」を示す。【０１０５】
図5(B)〜(D)は、ARE1の一部に相補的なポリヌクレオチド類似体の塩基配列を有するポリヌクレオチド類似体を示す。塩基配列中、大文字で示す塩基はLNAを、小文字で示す塩基はRNAを表している。図5(B)〜(D)に示すポリヌクレオチド類似体は、LNAとRNAとから合成されたハイブリッド核酸である。以下、それぞれLNA1〜LNA3と称するものとする。LNA1〜LNA3は委託合成（ジーンデザイン）により得た。【０１０６】
図5(B)に示すLNA1は、「AUUUAペンタマー」を含むARE1の全部に相補的な塩基配列と、LDLR mRNAのARE1に連続する5´UTR及び3´UTRの一部に相補的な塩基配列とからなる（配列番号1参照）。LNA1の長さは11bpsであり、5´側から1〜10番目の塩基はLNA、11番目の塩基はRNAにより合成されている。5´側から1番目及び3´側から1〜2番目の塩基配列は、LDLR遺伝子のARE1に特異的な塩基配列（Gene specific region: GSR）に対応する。GSRについては、図2で説明したUTRを参照。【０１０７】
図5(C)に示すLNA2は、「AUUUAペンタマー」を含むARE1の全部に相補的な塩基配列と、LDLR mRNAのARE1に連続する3´UTRの一部に相補的な塩基配列とからなる（配列番号2参照）。LNA2の長さは19bpsであり、5´側から1〜8番目及び17〜18番目の塩基はLNA、9〜16番目及び19番目の塩基はRNAにより合成されている。5´側から1〜9番目の塩基配列は、LDLR遺伝子のARE1の GSRに対応する。【０１０８】
図5(D)に示すLNA3は、ARE1の一部に相補的な塩基配列と、LDLR mRNAのARE1に連続する3´UTRの一部に相補的な塩基配列とからなる（配列番号3参照）。LNA3の長さは11bpsであり、5´側から1〜10番目の塩基はLNA、11番目の塩基はRNAにより合成されている。5´側から1〜5番目の塩基配列は、LDLR遺伝子のARE1の GSRに対応する。【０１０９】
（２）ポリヌクレオチド類似体のトランスフェクション
Hela細胞を、6-well プレートに4.0×105 cells / wellで播種し、10%FBS 含有DMEM培地を用いて培養した。培養24時間後、ポリヌクレオチド類似体をリポフェクション（Lipofectamine 2000, Cat.No.11668-019, Invitrogen）によって細胞にトランスフェクトした。ポリヌクレオチド類似体それぞれ200pmolを100μlのOpti-MEMで希釈した。また、10μlのLipofectamine2000を100μlのOpti-MEMで希釈した。希釈後室温にて5分間静置し、リヌクレオチド類似体希釈液とLipofectamine希釈液を混合し、さらに20分静置後、全量を6-well プレートの各ウェルに加えた。【０１１０】
ポリヌクレオチド類似体には、上記LNA1〜3に加え、コントロールとして以下の「表3」に示すLNA4, LNA5を使用した。これらは、LDLmRNAに対し全く相補性を示さない塩基配列を有するポリヌクレオチド類似体である。【０１１１】
【表３】
2009093384.tif 000005
なお、表中、大文字で示す塩基はLNAを、小文字で示す塩基はRNAを表している。  【０１１２】
（３）LDLR発現量の評価
トランスフェクション24時間後の細胞を回収し、定法によりタンパク抽出を行った。抽出したタンパク5μgをSDS-PAGEにより分離し、メンブレンにブロットした。定法によりウェスタンブロットを行い、LDLRの発現量を評価した。抗LDLR抗体には、Abcam社の抗体（Cat.No.ab52818）を使用した。【０１１３】
（４）結果
ウェスタンブロットの結果を「図6」に示す。図（A）上段にはLDLRの検出バンド、下段には比較のためβ-actinの検出バンドを示す。なお、抗β-actinには、Cell Signaling社の抗体（Cat.No.4970）を用いた。また、図（B）には、検出バンド濃度の定量値を、トランスフェクションを行わなかった細胞（図（A）中レーン1）を１とした相対比によって示す。【０１１４】
ポリヌクレオチド類似体のトランスフェクトを行わなかった細胞（図（A）中レーン1）及びコントロールとしてLNA4, LNA5をトランスフェクトした細胞（レーン2, 3）に比べ、LNA1〜3をトランスフェクトした細胞（レーン4〜6）では、LDLR発現量の増加が確認された。【０１１５】
また、このLDL発現量の増強効果は、LNA3, LNA2, LNA1の順に大きかった。これは以下の理由によるものと推定された。【０１１６】
LNA1はLDLR遺伝子のGSRに対応する塩基配列の長さが短いため、ARE1と同じ塩基配列を有する他の遺伝子mRNAのAREにも結合し得る。このため、LNA1では、LDLR mRNAに選択的に結合したポリヌクレオチド類似体の量が少なく、LNA2及びLNA3に比してLDLRの発現増強効果が小さかったものと考えられる。【０１１７】
これに対して、LNA2では、5´側から1〜9番目の塩基配列をLDLR遺伝子のARE1のGSRに対応する塩基配列としたことにより、その配列特異性に基づいてLDL mRNAのARE1に特異的に結合し得る。このため、LNA2では、LDLR選択的に遺伝子発現増強が起こり、LNA1に比して高い効果が得られたものと考えられる。【０１１８】
さらに、LNA2は、5´側から10〜16番目のARE1に相補的な塩基配列をRNAにより合成しているのに対して、LNA3は、全長をLNAにより合成している（ただし3´末端除く）。このため、LNA3は、LNA2に比べて高いヌクレアーゼ耐性を示す。さらに、LNAにより合成したLNA3のARE1に相補的な塩基配列は、RNAにより合成したLNA2の同配列に比べて、ARE1への結合力が高く、配列特異性にも優れている。このため、LNA3は、LNA2に比してより効率良くかつ強固にARE1に結合し、高いLDLR発現増強効果を発揮したものと考えられる。【０１１９】
一方、β-actinについては、トランフェクトの有無及びトランスフェクトしたLNAの種類によらず、全ての細胞で有意な発現量の変化は認められなかった。【０１２０】
以上の結果から、LNA1〜3によって、標的遺伝子としたLDLRの発現量を特異的に増強し得ることが示された。【０１２１】
＜実施例２＞
２．ARE結合因子の同定
実施例１の結果により、LNA1〜3が、LDLR遺伝子のARE1に特異的に結合してARE結合因子のARE1への結合を阻害し、ARE結合因子の負の発現制御機能を阻害することで、LDLRの発現量を選択的に増強していることが示唆された。そこで、次に、LNA1〜3によってARE1への結合を阻害されるARE結合因子を同定し、その機能を解析することを試みた。初めに、ARE1に結合するARE結合因子を同定することを目的として、LDL mRNA をベイトとした免疫沈降とマススペクトロメーターを用いたプロテオーム解析により、LDL mRNAのシスエレメントに結合するシスエレメント結合タンパクについて網羅的解析を行った。【０１２２】
（１）LDL mRNAベイトの合成
LDL mRNAをin vitro translationにより合成した。5´末端にT7 promoter 配列を持つプライマーを用いてPCRによりLDLR mRNA (配列番号4、GenBank Accession No.NM_000527)の2677-3585bp領域の増幅を行い、MEGAscript T7 キット(Cat.No.1333, Ambion)を用い、添付プロトコールに従ってRNAの合成を行った。合成されたLDL mRNAの3´末端にFlag-hydrazideを共有結合させる反応を行い、LDLR mRNAの3´末端をFlag標識した。標識mRNAをQiagen社のRNeasy Mini Kit（Cat.No.74106）を用いて精製した。なお、mRNAのFlag標識は、公知の手法（”Programmable ribozymes for mischarging tRNA with nonnatural amino acids and their applications to translation.” Methods, 2005, Vol,36, No.3, p.239-244参照）に従って行った。【０１２３】
（２）免疫沈降・タンパク同定
精製後のFlag標識LDL mRNA 10pmolを抗Flag抗体ビーズ（Cat.No.F2426, Sigma）と混合、4℃で１時間反応を行った。その後、10%FBS 含有DMEM培地で培養した293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク3mgを加えさらに、4℃で１時間反応を行った。非結合タンパク質を洗い流した後、RNA及びRNA結合タンパクをFlagペプチドで溶出させた。溶出させて得た試料を、リジルエンドペプチダーゼ処理し、公知の手法であるLC-MS/MS法を用い（”A direct nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry system for interaction proteomics.” Analytical Chemistry, 2002, Vol.74, No.18, p.4725-4733参照)に従って、解析を行った。マススペクトロメーターには、QSTAR XL（アプライドバイオシステム）を用いた。【０１２４】
（３）結果
LC-MS/MSにより「ZFP36L1」及び「ZFP36L2」が同定された。ZFP36L1及びZFP36L2は、ZFP36（別名TTP）とともにARE結合因子の１ファミリー（以下、「ZFP36ファミリー」という）を形成している。ZFP36ファミリーは、AREに結合してmRNAを不安定化し、分解促進に機能していることが報告されている（”Tristetraprolin and its family members can promote the cell-free deadenylation of AU-rich element-containing mRNAs by poly(A) ribonuclease.” Molecular Cell Biology, 2003, Vol.23, No.11, p.3798-812参照）。従って、実施例１で想定された負の発現制御機能を有し、LNA1〜3によってARE1への結合を阻害され得るARE結合因子が、ZFP36L1及びZFP36L2である可能性が強く示唆された。【０１２５】
＜実施例３＞
３．ZFP36L1及びZFP36L2のLDLR mRNAへの結合能及びLNA1〜3による結合阻害能評価
ZFP36L1及びZFP36L2がLDLR mRNAの3´UTR に結合し得るか、またLNA1〜3がこのZFPファミリーの3´UTRへの結合を阻害し得るかについて検討を行った。【０１２６】
実施例２中「（１）LDLR mRNAベイトの合成」で説明した方法に従い、ARE1を含むLDLR mRNAの3´UTRをin vitro translationにより合成し、Flagペプチドによる標識を行った。3´UTRには、LDLR mRNA（配列番号4参照）のうち、5´側末端から2677-3585bpsを用いた。また、比較のため、beta-Actin mRNA（配列番号5, GenBank Accession No.NM_001101）の3´UTR（5´側末端から1199-1770bps）についても同様に合成を行った。【０１２７】
実施例２中「（２）免疫沈降」で説明した方法に従い、精製後のFlag標識LDLR 3´UTR（以下「LDLR 3´UTR-Flag」という）又はActin 3´UTR（以下「Actin 3´UTR-Flag」）を、MycタンパクをフューズしたZFP36L1及びZFP36L2（Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2）を強制発現させた293T細胞から抽出した細胞抽出タンパクと混合し、さらにLNA1~5（図3及び表2参照）を終濃度0, 30,100μMで加えて反応を行った。免疫沈降後、溶出させた試料について、抗Myc抗体(Cat.No.1667149, Roche)を用いてウエスタンブロッティングを行った。【０１２８】
ウェスタンブロットの結果を「図7」に示す。上段は抗Myc抗体検出のMyc-tagged-ZFP36L2バンド、下段はMyc-tagged-ZFP36L1バンドを示す。【０１２９】
Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2が含まれる細胞抽出タンパクをLDLR 3´UTR-Flagと混合し、抗Flag抗体で免疫沈降させて得た試料（図中レーン3）では、ZFP36L1及び多量のZFP36L2が検出された。一方、Actin 3´UTR-Flagとの反応により得られた試料（レーン2）ではZFP36L1及びZFP36L2の検出シグナルは極めて低かった。【０１３０】
これは、Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2がLDLR 3´UTR-Flag に結合し得ることを示すものであり、ZFP36L1及び ZFP36L2がLDLR の3´UTRに対する結合能を有することを示すものである。【０１３１】
LDLR mRNAのARE1に相補的な塩基配列を含むLNA1〜3の存在下で、細胞抽出タンパクとLDLR 3´UTR-Flagとを反応させたレーン8-13では、ZFP36L1及びZFP36L2の検出シグナルは顕著に低下した。レーン8-13における検出バンドの強度は、レーン2に示したActin 3´UTR-Flagとの反応により得られた検出バンドの強度と同程度以下であった。一方、コントロールLNA4,5を加えて反応を行ったレーン4-7では、ZFP36L1及びZFP36L2の検出シグナルの低下は認められなかった。【０１３２】
このことから、ZFP36L1及びZFP36L2がLDLR mRNA 3´UTR中の特にARE1に結合すること、そしてLNA1〜3がZFP36L1及びZFP36L2のターゲットAREへの結合を顕著に阻害し得ることが明らかになった。【０１３３】
＜実施例４＞
４．ZFP36L1及びZFP36L2の機能解析  ZFP36L1及びZFP36L2のLDLR発現制御における機能を明らかにするため、RNAiを用いてZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制した場合のLDLR発現量の変化について検討を行った。【０１３４】
Hela細胞を、6-well プレートに4.0×105 cells / wellで播種し、10%FBS 含有DMEM培地を用いて培養した。培養24時間後、siRNAをリポフェクション（Lipofectamine 2000, Cat.No.11668-019, Invitrogen）によって細胞にトランスフェクトした。ポリヌクレオチド類似体それぞれ200pmolを100μlをOpti-MEMで希釈した。また、10μlのLipofectamine2000を100μlのOpti-MEMで希釈した。希釈後室温にて5分間静置し、リヌクレオチド類似体希釈液とLipofectamine希釈液を混合し、さらに20分静置後、全量を6-well プレートの各ウェルに加えた。【０１３５】
使用したsiRNAはInvitrogen社から購入した。ZFP36L1及びZFP36L2のそれぞれについて、使用した3種類のsiRNAのCat.No.を「表4」に示す。のあ、コントロールのsiRNA7-9には、Stealth RNAi Negative Control  （Cat.No.12935-100, Invitrogen）を使用した。【０１３６】
【表４】
2009093384.tif 000006
【０１３７】
トランスフェクション60時間後の細胞を回収し抽出したタンパクを用いてウェスタンブロットを行い、LDLRの発現量を評価した。【０１３８】
ウェスタンブロットの結果を「図8」に示す。図（A）上段にはLDLRの検出バンド、下段には比較のためβ-actinの検出バンドを示す。また、図（B）には、検出バンド濃度の定量値を、コントロールsiRNA7をトランスフェクトした細胞（図（A）中レーン1）を１とした相対比によって示す。【０１３９】
コントロールsiRNA7〜9をトランスフェクトした細胞に比べて、siRNA1〜3のいずれかとsiRNA4〜6のいずれかを組み合わせてトランスフェクトし、ZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制した細胞では、LDLRの発現量が顕著に増強された。【０１４０】
一方、β-actinについては、siRNA1〜6をトランスフェクトしても、その発現量に有意な変化は認められなかった。【０１４１】
以上のように、ZFP36L1及びZFP36L2の発現を阻害するsiRNAのトランスフェクトによって、LDLR発現量が顕著に増強されたことは、ZFP36L1及びZFP36L2が、LDLR mRNAの不安定化、分解促進に機能し、LDLR発現を負に制御していることを示すものである。【０１４２】
以上、本実施例１〜４の結果から、LNA1〜3が、LDLR mRNAのARE1に結合して、ZFP36L1及びZFP36L2のARE1への結合を阻害すること、そしてARE1への結合により、ZFP36L1及びZFP36L2の負の遺伝子発現制御機能を阻害して、LDLR mRNAを安定化し翻訳を促進することで、LDLR mRNAの発現を選択的に増強させることが示された（図9参照）。【０１４３】
＜実施例５＞
５．LDLRの発現制御実験II（ARE2・ARE3）  次に、LDLR mRNAの3’UTRに存在する３つのARE（図4参照）のうち、ARE2及びARE3をターゲットシスエレメントとして、実施例1と同様のLDLR発現制御実験を行った。 【０１４４】
（１）ポリヌクレオチド類似体の設計
「表5」に、ARE2又はARE3をターゲットシスエレメントとして設計したポリヌクレオチド類似体の塩基配列を示す。LNA26は、LDLR mRNA（配列番号4参照）の全長5175bpsうち、ARE2（5´側末端から3350〜3363bps）に相補的な塩基配列を有する。また、LNA27は、ARE3（5´側末端から3538-3547bps）に相補的な塩基配列を有する。【０１４５】
【表５】
2009093384.tif 000007
【０１４６】
実施例１と同様にして、Hela細胞に、LNA26又はLNA27をリポフェクションによってトランスフェクトした。トランスフェクション24時間後の細胞を回収し、タンパク抽出及びウェスタンブロットを行い、LDLRの発現量を評価した。【０１４７】
（２）結果
ウェスタンブロットの結果を「図10」に示す。図中、上段にはLDLRの検出バンド、下段には比較のためβ-actinの検出バンドを示す。【０１４８】
実施例１で用いたLNA3をトランスフェクトした細胞（レーン2）では、ポリヌクレオチド類似体のトランスフェクトを行わなかった細胞（レーン1）に比べて、顕著なLDLR発現量の増加が確認されている。これに対し、LNA26, LNA27をトランスフェクトした細胞（レーン3, 4）では、LDLR発現量の増加は認められなかった。なお、β-actinについては、トランフェクトの有無及びトランスフェクトしたLNAの種類によらず、全ての細胞で有意な発現量の変化は認められなかった。
＜実施例６＞
６．ZFP36L1及びZFP36L2のARE2又はARE3への結合能評価
本実施例では、ARE2又はARE3に対してZFPファミリーが結合し得るかについて検討を行った。【０１４９】
（１）LDL mRNAベイトの合成
ARE1〜3を欠失させたベイトを合成し、ZFP36L1及びZFP36L2のARE1〜3への結合能を評価した。「図11」に合成したmRNAベイトの構造を示す。図11（A）は、LDLR mRNAの2677-3585bp領域を含むmRNAベイトLDLR 3’UTR-(WT)-Flag）である。また（B）及び（C）は、それぞれARE1部分を欠失させたmRNAベイト（LDLR 3’UTR-(Δ-ARE1)-Flag）とARE2及びARE3を欠失させたmRNAベイト（LDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)-Flag）である。各mRNAベイトの合成は、実施例２中「（１）LDLR mRNAベイトの合成」で説明した方法に従って行った。【０１５０】
（２）免疫沈降
実施例３で説明した方法に従い、精製後のFlag標識mRNAを抗Flag抗体ビーズと混合・反応を行った後、Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2を強制発現させた293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク質3mgと混合し反応を行なった。免疫沈降後、溶出させた試料について、抗Myc抗体(Cat.No.1667149, Roche)を用いてウエスタンブロッティングを行った。【０１５１】
（３）結果
ウェスタンブロットの結果を「図12」に示す。上段は抗Myc抗体検出のMyc-tagged-ZFP36L2バンド、下段はMyc-tagged-ZFP36L1バンドを示す。【０１５２】
ARE1を欠失させたLDLR 3’UTR-(Δ-ARE1)-Flagとの反応により得られた試料（レーン4）ではZFP36L1及びZFP36L2はほとんど検出されなかった。これは、ZFP36L1及びZFP36L2が特にARE1に結合し、ARE2及びARE3には結合しないことを示している。【０１５３】
さらに、ARE2及びARE3を欠失させたLDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)-Flagを、Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2が含まれる細胞抽出タンパク質と混合し、抗Flag抗体で免疫沈降させて得た試料（図中レーン3）では、全領域を含むLDLR 3’UTR-(WT)-Flagとほぼ同量のZFP36L1及びZFP36L2が検出された。これは、ZFP36L1及びZFP36L2が、ARE1に結合していることを支持するものである。【０１５４】
＜実施例７＞
７． LDLRの発現制御実験III（ARE1）
本実施例では、ARE1をターゲットシスエレメントとして数種類のポリヌクレオチド類似体を設計し、LDLRの発現増強（図9参照）を試みた。【０１５５】
「表6」に新たに設計したポリヌクレオチド類似体（LNA6〜25）の塩基配列を示す。塩基配列中、下線部はARE1に相補的な塩基配列を示す（図５も参照）。【０１５６】
【表６】
2009093384.tif 000008
【０１５７】
実施例１中「（２）ポリヌクレオチド類似体のトランスフェクション」及び「（３）LDLR発現量の評価」で説明した方法に従い、各ポリヌクレオチド類似体をトランスフェクトした細胞におけるLDLRの発現量を評価した。ウェスタンブロットの結果を「図13」に示す。【０１５８】
ポリヌクレオチド類似体のトランスフェクトを行わなかった細胞（コントロール）に比べ、LNA6〜14をトランスフェクトした細胞では、LDLR発現量の増加が確認された。一方、LNA15〜25については、有意な発現量の上昇は認められなかった。【０１５９】
続いて、LNA6〜14が、ARE1へのZFPファミリーの結合を阻害し得るかについて検討を行った。【０１６０】
実施例３で説明した方法に従って、Flag標識LDLR 3´UTRを、MycタンパクをフューズしたZFP36L2（Myc-tagged- ZFP36L2）を強制発現させた293T細胞から抽出した細胞抽出タンパクと混合し、LNA3及びLNA6〜25を加えて反応を行った。免疫沈降後、溶出させた試料について、抗Myc抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロットの結果を「図14」に示す。【０１６１】
Myc-tagged-ZFP36L2が含まれる細胞抽出タンパクをLDLR 3´UTR-Flagと混合し、抗Flag抗体で免疫沈降させて得た試料（図中「Blank」）では、多量のZFP36L2が検出された。これに対し、上記でLDLR発現量の増強効果を示したLNA6〜14の存在下で、細胞抽出タンパクとLDLR 3´UTR-Flagとを反応させた試料では、ZFP36L2の検出シグナルは顕著に低下した。これにより、LNA6〜14が、ZFP36L2のARE1への結合を阻害することが確認された。【０１６２】
以上、実施例１〜７においてLDLR mRNA上の特定のAREに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド類似体を用いてLDLRの発現を正に制御できたことは、本発明に係るポリヌクレオチド等の塩基配列を、標的とする遺伝子やターゲットするシスエレメントに応じて適宜設定することにより、様々な遺伝子について同様の遺伝子発現制御を行い得る可能性を示すものである。また、LDLRの発現は、今回対象としたARE1〜3以外のARE又はARE以外のシスエレメントに結合し得るポリヌクレオチド等を設計し、ZFP36L1及びZFP36L2以外のシスエレメント結合因子の機能を阻害することで、正のみでなく負にも制御できるものと考えられる。従って、本発明に係る遺伝子発現制御方法によれば、様々な遺伝子の発現を正負に制御できるものと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】シスエレメント及びシスエレメント結合因子によるmRNAの安定性及びタンパクへの翻訳量の制御メカニズムを説明する模式図である。
【図２】本発明に係るポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体の実施形態を説明する模式図である。
【図３】DNA(A)、PNA(B)及びMorpholino（C）の結合構造を示す図である。
【図４】LDLR mRNAの3’UTRに存在する３つのAREの位置を示す模式図である。
【図５】実施例１において、ARE1をターゲットシスエレメントとして設計したポリヌクレオチド類似体LNA1〜3の塩基配列と、ARE1を含むLDLR mRNAの部分塩基配列を示す図である。
【図６】実施例１において、ウェスタンブロットによりLDLR発現量の評価を行った結果を示す図である。（A）上段はLDLRの検出バンド、下段はβ-actinの検出バンドを示す。（B）は検出バンド濃度の定量値を相対比によって示す。
【図７】実施例３において、ウェスタンブロットによりZFP36L1及びZFP36L2のLDLR mRNA 3´UTRへの結合能と、LNA1〜3による結合阻害能の評価を行った結果を示す図である。
【図８】実施例４において、RNAiを用いてZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制した場合のLDLR発現量の変化を検討したウェスタンブロットの結果を示す図である。（A）上段はLDLRの検出バンド、下段はβ-actinの検出バンドを示す。（B）は検出バンド濃度の定量値を相対比によって示す。
【図９】本発明に係るポリヌクレオチド等によるLDLRの発現増強メカニズムを説明する模式図である。
【図１０】実施例５において、ウェスタンブロットによりLDLR発現量の評価を行った結果を示す図である。（A）上段はLDLRの検出バンド、下段はβ-actinの検出バンドを示す。
【図１１】実施例６において、ARE1〜3を欠失させて合成したmRNAベイトの構造を示す模式図である。
【図１２】実施例６において、ウェスタンブロットによりZFP36L1及びZFP36L2のARE1〜3への結合能の評価を行った結果を示す図である。
【図１３】実施例７において、ウェスタンブロットによりLDLR発現量の評価を行った結果を示す図である。
【図１４】実施例７において、ウェスタンブロットによりLNA6〜25のZFP36L2に対する結合阻害能の評価を行った結果を示す図である。
【図１】
2009093384.tif 000009
【図２】
2009093384.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
2009093384.tif 000013
【図６】
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【図７】
2009093384.tif 000015
【図８】
2009093384.tif 000016
【図９】
2009093384.tif 000017
【図１０】
2009093384.tif 000018
【図１１】
2009093384.tif 000019
【図１２】
2009093384.tif 000020
【図１３】
2009093384.tif 000021
【図１４】
2009093384.tif 000022
【配列表】
2009093384000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月30日(2009.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡのＡＲＥ１（配列番号４に示すＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ塩基配列の５´末端側から２７９０〜２７９７塩基）の少なくとも一部に相補的な塩基配列と、ＡＲＥ１の５´側及び／又は３´側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列と、を有し、
前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、ＡＲＥ１の少なくとも一部に特異的に結合することにより、
ＡＲＥ１へのＺＦＰ３６Ｌ１及び／又はＺＦＰ３６Ｌ２の結合を阻害し得ることを特徴とするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体。
【請求項２】
ＡＲＥ１へのＺＦＰ３６Ｌ１及び／又はＺＦＰ３６Ｌ２の結合を阻害することにより、
前記ｍＲＮＡを選択的に安定化して遺伝子産物の翻訳を促進する請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
配列番号１〜３、６〜１４のいずれかに示す塩基配列、又は該塩基配列と実質的に同一の塩基配列、を含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載のポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド類似体。
【請求項７】
請求の範囲第１，２，６項記載のいずれか一以上のポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体を含有する、若しくはいずれか一以上の該ポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターを含有するＬＤＬＲ発現増強剤。
【請求項８】
請求の範囲第７項記載のＬＤＬＲ発現増強剤を有効成分として含有する、高脂血症あるいは高脂血症関連疾患を予防、改善又は治療するための医薬組成物。
【請求項９】
前記疾患が、動脈硬化症、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、糖尿病、肥満症、癌からなる群より選択される一以上の疾患である請求の範囲第８項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求の範囲第７項記載のＬＤＬＲ発現増強剤を有効成分として含有する、アルツハイマー病を予防、改善又は治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
請求の範囲第６項記載のポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクター。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
ＬＤＬＲ発現増強剤製造のための請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体、若しくは該ポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクターの使用。
【請求項１５】
請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチドを発現可能な発現ベクター。
【請求項１６】
ＬＮＡを含んでなることを特徴とする請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド類似体。
【請求項１７】
ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡのＡＲＥ１（配列番号４に示すＬＤＬＲ  ｍＲＮＡ塩基配列の５´末端側から２７９０〜２７９７塩基）の少なくとも一部に相補的な塩基配列と、ＡＲＥ１の５´側及び／又は３´側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列と、を有するポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド類似体を用い、
ＡＲＥ１へのＺＦＰ３６Ｌ１及び／又はＺＦＰ３６Ｌ２の結合を阻害することにより、前記ｍＲＮＡを選択的に安定化して遺伝子産物の翻訳を促進することを特徴とする遺伝子発現制御方法。
【国際調査報告】
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