(57)【要約】  本発明は、新規なカルボシランデンドリマー、その調製方法及びその使用に関する。本発明のデンドリマーの分岐端は、第１級、第２級、第３級及び第４級アミノ基を含む。前述のデンドリマーは、例えば、ＯＤＮ及びＲＮＡｉ分子を含む核酸分子並びに他のアニオン性医薬等の、血液におけるアニオン性分子を運搬するビヒクルとして使用でき、デンドリマーはこれらと相互作用して、血漿中のタンパク質との相互作用から保護し、及び／又はその標的細胞透過率を上昇させる。長く持続する結合の場合、アニオン性分子を表面に結合させるためにデンドリマーを使用することができる。本発明のデンドリマーはまた、微生物によって引き起こされる疾患の予防又は治療のための有効成分として、そのライフサイクル及び／又は構造に干渉させるために投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１世代である場合、
式：
【化１】
2009502765.tif 000091
第２世代である場合、
式：
【化２】
2009502765.tif 000092
第３世代である場合、
式：
【化３】
2009502765.tif 000093
のいずれか１つ、又はその後の世代の場合は対応する類似の式に対応する、第１級、第２級、第３級、又は第４級アミノ基を含む末端部分を分岐鎖の端に有する分岐鎖カルボシランデンドリマーであって、各世代ｉに対応する式は、新しいタイプのブロック：
【化４】
2009502765.tif 000094
によって前の世代に対応する式中のＸｐを置換することから生じ、この置換ブロックと同じシリコン原子に結合した基は（Ｒｉ−１）３−ｐによる表示から（Ｒｉ−１）３−ｚによる表示に移行し；
式中、Ａｌｑ１、Ａｌｑ２、Ａｌｑ３、・・・、Ａｌｑｉは、各世代における分岐鎖長に従って互いに独立に選択される炭素２から４個のアルキレン部分を表し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、・・・、Ｒｉ−１、Ｒｉは、メチル及びフェニルの中から互いに独立に選択される部分を表し；
Ｘは、少なくとも１つの第１級、第２級、第３級、又は第４級アミノ基を含む部分を表し；
ｐは、１と３の間で変化する自然数であり；
ｍ、ｎ、・・・、ｚは、１と３の間で独立に変化する自然数である、分岐鎖カルボシランデンドリマー。
【請求項２】
部分Ａｌｑ１、Ａｌｑ２、Ａｌｑ３、・・・、Ａｌｑｉが、エチレン及びプロピレンの中から独立に選択される、請求項１に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３】
部分Ａｌｑ１、Ａｌｑ２、Ａｌｑ３、・・・、Ａｌｑｉが、総て同一であり、プロピレン部分に対応する、請求項２に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４】
自然数ｍ、ｎ、・・・、ｚが、互いに同一であり、値２である、請求項１に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項５】
部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、・・・、Ｒｉ−１、Ｒｉが、総て同一であり、メチル部分に対応する、請求項１に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項６】
部分Ａｌｑ１、Ａｌｑ２、Ａｌｑ３、・・・、Ａｌｑｉが、互いに同一であり、プロピレン部分に対応し、自然数ｍ、ｎ、・・・、ｊが、互いに同一であり、値２であり、かつ部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、・・・、Ｒｉ−１、Ｒｉが、総て同一であり、メチル部分に対応する、請求項１から５までに記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項７】
少なくとも１つのアミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、アルコール−アミンの−ＯＨ基から形成した−Ｏ−基によってデンドリマーに結合している、請求項６に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項８】
少なくとも１つのアミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２）２及び−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２の中から選択される、請求項７に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項９】
少なくとも１つのアミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項８に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１０】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２部分で終わる、請求項９に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１１】
第１、第２又は第３世代である、請求項１０に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１２】
「ｐ」表記が値２を取り、各分岐鎖が２つの−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２部分で終わる、請求項９に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１３】
第１、第２又は第３世代である、請求項１２に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１４】
少なくとも１つのアミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２）である、請求項８に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１５】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２）２部分で終わる、請求項１４に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１６】
第１、第２又は第３世代である、請求項１５に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１７】
「ｐ」表記が値２を取り、各分岐鎖が２つの−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２）２部分で終わる、請求項１４に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１８】
第１、第２又は第３世代である、請求項１７に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１９】
少なくとも１つのアミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項８に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２０】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２部分で終わる、請求項１９に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２１】
第１、第２又は第３世代である、請求項２０に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２２】
「ｐ」表記が値２を取り、各分岐鎖が２つの−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２部分で終わる、請求項１９に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２３】
第１、第２又は第３世代である、請求項２２に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２４】
少なくとも１つのアミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、分岐鎖の末端部分を生成するためにデンドリマーと反応させる少なくとも１つのアミノ基を含む化合物の炭素−炭素二重結合の一部を形成していた末端炭素から形成した−ＣＨ２−基によってデンドリマーに結合している、請求項６に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２５】
分岐鎖の末端部分が、式−ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ２に対応し、ここで「ｅ」が０と２の間の数である、請求項２４に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２６】
「ｅ」が値１を取り、少なくとも１つのアミノ基を含む分岐鎖の末端部分が式−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２に対応する、請求項２５に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２７】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２部分で終わる、請求項２６に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２８】
カルボシランデンドリマーが、第１、第２又は第３世代である、請求項２７に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項２９】
分岐鎖の末端部分に存在するアミノ基の一部又は全部が四級化されている、請求項６に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３０】
少なくとも１つの四級化アミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−、−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）Ｉ−）２及び−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−の中から選択される、請求項２９に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３１】
少なくとも１つの四級化アミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−である、請求項３０に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３２】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−部分で終わる、請求項３１に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３３】
第１、第２又は第３世代である、請求項３２に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３４】
「ｐ」表記が値２を取り、各分岐鎖が２つの−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−部分で終わる、請求項３１に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３５】
第１、第２又は第３世代である、請求項３４に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３６】
少なくとも１つの四級化アミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）Ｉ−）２である、請求項３０に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３７】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）Ｉ−）２部分で終わる、請求項３６に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３８】
第１、第２又は第３世代である、請求項３７に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項３９】
「ｐ」表記が値２を取り、各分岐鎖が２つの−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）Ｉ−）２部分で終わる、請求項３６に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４０】
第１、第２又は第３世代である、請求項３９に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４１】
少なくとも１つの四級化アミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−である、請求項３０に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４２】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−部分で終わる、請求項４１に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４３】
第１、第２又は第３世代である、請求項４２に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４４】
「ｐ」表記が値２を取り、各分岐鎖が２つの−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−部分で終わる、請求項４１に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４５】
第１、第２又は第３世代である、請求項４４に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４６】
少なくとも１つの四級化アミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、式−ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）ｅ−Ｎ＋Ｈ３Ｃｌ−に対応し、ここで「ｅ」が０と２の間の自然数である、請求項２９に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４７】
「ｅ」が値１を取り、少なくとも１つの四級化アミノ基を含む分岐鎖の末端部分が式−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＋Ｈ３Ｃｌ−に対応する、請求項４６に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４８】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＋Ｈ３Ｃｌ−部分で終わる、請求項４７に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項４９】
カルボシランデンドリマーが、第１、第２又は第３世代である、請求項４８に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項５０】
少なくとも１つのアミノ基を含む末端部分が、抗原部分の一部を形成する、請求項６に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項５１】
アミン部分が、ペプチドの一部を形成する、請求項５０に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項５２】
ａ）
ａ１）ＳｉＣｌ４をＢｒＭｇ（ＣＨ２）ａＣＨ＝ＣＨ２と反応させて、式：
Ｓｉ［（ＣＨ２）ａＣＨ＝ＣＨ２］４
（式中、ａは、分岐鎖に対する所望の長さによって、０と２の間で変化する）
の基本開始カルボシランデンドリマーを生成するステップと；
ａ２）ａ１）の基本開始カルボシランデンドリマーをＨＳｉ（Ｒ１）３−ｍＣｌｍと反応させ、その結果、下記式：
【化５】
2009502765.tif 000095
（式中、ｍは、１と３の間で変化し、次世代に達成することができる分岐鎖の数又はＣｌ基を置換することができる末端官能基の数と等しく；Ｒ１は、フェニル又はメチル部分を表す）
のデンドリマーを生成して、後世代のデンドリマーの第１世代カルボシランデンドリマー前駆体を生成するステップと；
ａ３）場合によって、段階ａ２）において生成されたＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する誘導体に段階ａ１）及びａ２）、すなわち
ｉ）Ｓｉ−Ｃｌ末端結合を有する対応する誘導体を、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｂＣＨ＝ＣＨ２（式中、「ｂ」はこれらの分岐鎖に求められる長さに従って、０と２の間で変化し、「ａ」表記と同一であっても異なってもよい）と反応させて、新しい分岐鎖を生成するステップ；及び
ｉｉ）ｉ）において生成された新世代のカルボシランデンドリマー骨格を、ＨＳｉ（Ｒ２）３−ｎＣｌｎ（式中、「ｎ」は１と３の間で変化し、前世代の「ｍ」表記と同一であってもよく、Ｒ２はフェニル又はメチル部分を表す）と反応させるステップ
の繰り返しを受けさせて、後世代のデンドリマーの第２世代カルボシランデンドリマー前駆体を生成するステップと；
ａ４）場合によって、前世代に対応するＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する誘導体を、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｃＣＨ＝ＣＨ２反応剤を使用する段階ａ３）ｉ）の繰り返し及びＨＳｉ（Ｒ３）３−ｚＣｌｚ反応剤を使用する段階ａ３）ｉｉ）の繰り返し（ここで、「ｃ」は０と２の間で変化し、「ｚ」は１と３の間で変化する）で求められるものに供し、後世代デンドリマーの次に続く世代の前駆体のカルボシランデンドリマーを生成するステップと；
ａ５）デンドリマーが、それぞれ、第１、第２又は世代ｉであるかに依存して、段階ａ２）、ａ３）又は段階ａ４）の繰り返しｉ−１において、ＨＳｉ（Ｒｉ）３−ｐＣｌｐ反応剤（ここで、「ｐ」は１と３の間で変化し、Ｒｉはフェニル又はメチル部分を表す）を使用して、少なくとも１つのアミノ基を含む部分が段階ｂ）において加えられる最終カルボシランデンドリマー骨格を生成するステップと
に従ってカルボシランデンドリマー骨格を生成する段階と、
ｂ）
ｂ１）過剰のアルカリの存在下で第１級、第２級又は第３級アルコール−アミンと反応させて、段階ａ５）において生成されたカルボシランデンドリマーのＳｉ−Ｃｌ末端結合のアルコール分解を引き起こす経路；
ｂ２）少なくとも１つの第１級、第２級又は第３級アミノ基を含む部分が後で結合されるＳｉ−Ｈ末端結合を有するカルボシランデンドリマーを予め生成する経路であって、
ｉ）Ｃｌ原子の一部又は全部をＨ原子で置換するように、Ｓｉ−Ｃｌ結合を有する対応するカルボシランデンドリマーを、ヒドリド基を引き渡すことができる反応剤と反応させて、任意の世代のカルボシランデンドリマーのＳｉ−Ｈ末端結合を有する誘導体を生成する段階と；
ｉｉ）Ｓｉ−Ｈ結合を有するカルボシランデンドリマーを、ヒドロシリル化触媒の存在下で、第１級、第２級又は第３級アミノ基を含み、１つの末端に炭素−炭素二重結合を有する化合物と反応させて、該化合物が、該二重結合が見られる末端によってデンドリマーに結合するようにさせる段階と
を通過させる経路
の１つに従って、第１級、第２級又は第３級アミノ基を有する末端部分を有するカルボシランデンドリマーを生成する段階と、
ｃ）場合によって、段階ｂ）において生成されたデンドリマーとＡ−Ｈａｌ反応剤（ここで、Ａは水素、１から１０個の炭素のアルキル又はアリール原子を表し、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、Ｉを表す）とを反応させることによって、四級化アミノ基を有する末端部分を有するカルボシランデンドリマーを生成する段階と
を含む、カルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項５３】
開始反応剤の「ａ」表記が１に等しく、したがってＢｒＭｇＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項５２に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項５４】
任意の段階ａ３）ｉ）における新たな分岐鎖を生成するために使用されるＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｂＣＨ＝ＣＨ２反応剤の「ｂ」表記及び段階ａ４）の任意の繰り返しの各１つにおいて新たな分岐鎖を生成するために使用されるＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｃＣＨ＝ＣＨ２反応剤の異なる「ｃ」表記が１に等しく、したがって反応剤がＢｒＭｇＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項５２に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項５５】
ＢｒＭｇＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２反応剤が、開始段階ａ１）における場合及び新たな分岐鎖が任意の段階ａ３）ｉ）を介して又は任意の段階ａ４）の繰り返しによって生成される総ての場合の双方で使用される、請求項５３及び５４に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項５６】
任意の段階ａ３）ｉｉ）におけるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する誘導体を生成するために使用されるＨＳｉ（Ｒ２）３−ｎＣｌｎ反応剤の部分Ｒ２のような段階ａ２）のＨＳｉ（Ｒ１）３−ｍＣｌｍ反応剤の部分Ｒ１、及び段階ａ４）の任意の繰り返しのＨＳｉ（Ｒｉ）３−ｚＣｌｚ反応剤の連続したＲｉ部分の双方は互いに全く同じであり、メチル部分に対応する、請求項５２から５５までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項５７】
段階ａ２）の反応剤ＨＳｉ（Ｒ１）３−ｍＣｌｍの「ｍ」表記及び任意の段階ａ３）ｉｉ）の反応剤ＨＳｉ（Ｒ２）３−ｎＣｌｎの「ｎ」表記の双方並びに段階ａ４）の任意の繰り返しの反応剤ＨＳｉ（Ｒｉ）３−ｚＣｌｚの「ｚ」表記が、反応剤ＨＳｉ（Ｒｉ）１Ｃｌ２を使用する総ての場合において、互いに総て同一であり、２に等しい、請求項５２から５６までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項５８】
段階ａ２）の反応剤ＨＳｉ（Ｒ１）３−ｍＣｌｍの部分Ｒ１及び任意の段階ａ３）ｉｉ）においてＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する誘導体を生成するために使用される反応剤ＨＳｉ（Ｒ２）３−ｎＣｌｎの部分Ｒ２の双方並びに段階ａ４）の任意の繰り返しにおいて使用される反応剤ＨＳｉ（Ｒｉ）３−ｚＣｌｚの連続したＲｉ部分が、互いに総て同一であり、メチル部分に対応し；
段階ａ２）の反応剤ＨＳｉ（Ｒ１）３−ｍＣｌｍの「ｍ」表記及び任意の段階ａ３）ｉｉ）の反応剤ＨＳｉ（Ｒ２）３−ｎＣｌｎの「ｎ」表記の双方及び段階ａ４）の任意の繰り返しの反応剤ＨＳｉ（Ｒｉ）３−ｚＣｌｚの「ｚ」表記が、互いに総て同一であり、２に等しく；
それにより、Ｓｉ−Ｃｌ末端結合が、新たな分岐鎖によるＣｌ部分の各１つの置換によって、後世代の誘導体の生成を可能にするように意図されて生成される総てのステップにおいて、使用されるのは反応剤ＨＳｉＣＨ３Ｃｌ２である、請求項５６及び５７に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項５９】
反応剤ＢｒＭｇＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２が、開始段階ａ１）における場合及び新たな分岐鎖が任意の段階ａ３）ｉ）又は段階ａ４）の任意の繰り返しによって得られるそれら総ての場合の双方で使用され；
新たな分岐鎖によるＣｌ部分の各１つの置換によって後世代の誘導体の生成を可能とするように意図してＳｉ−Ｃｌ末端結合が生成される総てのステップにおいて、使用されるのは反応剤ＨＳｉＣＨ３Ｃｌ２である、請求項５５及び５８に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６０】
段階ｂ）においてアミノ基を有する部分が加えられることになる最終カルボシランデンドリマー骨格において末端Ｓｉ−Ｃｌ結合を生成するために使用される反応剤ＨＳｉ（Ｒｉ）３−ｐＣｌｐが、ＨＳｉ（ＣＨ３）２Ｃｌである、請求項５９に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６１】
段階ｂ）において、アルコール−アミンとの反応の経路ｂ１）に従って、Ｓｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格に、少なくとも１つのアミノ基を含む部分が結合する、請求項６０に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６２】
Ｓｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）、２−［（２−（ジメチルアミノエチル）メチル］アミノエタノール（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）又は３，５−ビス（ジメチルアミノエトキシ）ベンジルアルコール（ＣＨ２ＯＨ−（Ｃ６Ｈ３）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）２）から選択されるアルコール−アミンを用いて段階ｂ１）において処理される、請求項６１に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６３】
好ましくは、選択されるアルコール−アミンが、段階ａ）において生成される最終カルボシランデンドリマー骨格に存在するＳｉ−Ｃｌ末端結合の数に対して化学量論量で使用される、請求項６２に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６４】
任意の段階ｃ）が、過剰のＣＨ３Ｉで処理して、段階ｂ１）において生成されるカルボシランデンドリマーのアミノ基の四級化について行われる、請求項６２又は６３のいずれかに記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６５】
段階ｂ１）においてアルコール−アミンで処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ２）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第１世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項６２から６４までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６６】
段階ｂ１）においてアルコール−アミンで処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ３）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第２世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項６２から６４までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６７】
段階ｂ１）においてアルコール−アミンで処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ４）の第１番目の実施をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第３世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項６２から６４までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６８】
段階ｂ）においてアミノ基を有する部分が加えられることになる最終カルボシランデンドリマー骨格におけるＳｉ−Ｃｌ末端結合を生成するために使用される反応剤ＨＳｉ（Ｒｉ）３−ｐＣｌｐが、ＨＳｉＣＨ３Ｃｌ２である、請求項５９に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項６９】
段階ｂ）において、アルコール−アミンとの反応の経路ｂ１）に従って、Ｓｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格に、少なくとも１つのアミノ基を含む部分が結合する、請求項６８に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７０】
Ｓｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）、２−［（２−（ジメチルアミノエチル）メチル］アミノエタノール（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）又は３，５−ビス（ジメチルアミノエトキシ）ベンジルアルコール（ＣＨ２ＯＨ−（Ｃ６Ｈ３）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）２）から選択されるアルコール−アミンを用いて段階ｂ１）において処理される、請求項６９に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７１】
好ましくは、選択されるアルコール−アミンが、段階ａ）において生成される最終カルボシランデンドリマー骨格に存在するＳｉ−Ｃｌ末端結合の数に対して化学量論量で使用される、請求項７０に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７２】
任意の段階ｃ）が、過剰のＣＨ３Ｉで処理する段階ｂ１）において生成されるカルボシランデンドリマーのアミノ基の四級化について行われる、請求項７０又は７１のいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７３】
段階ｂ１）においてアルコール−アミンで処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ２）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第１世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項７０から７２までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７４】
段階ｂ１）においてアルコール−アミンで処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ３）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第２世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項７０から７２までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７５】
段階ｂ１）においてアルコール−アミンで処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ４）の第１番目の実施をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第３世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項７０から７２までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７６】
Ｓｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格に、１つの末端に炭素−炭素二重結合を有し、少なくとも１つのアミノ基を含む化合物との反応の経路ｂ２）に従って段階ｂ）において少なくとも１つのアミノ基を含む部分が結合する、請求項６０又は６８のいずれかに記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７７】
Ｓｉ−Ｈ結合におけるＳｉ−Ｃｌ結合の一部又は全部を転換するためにヒドリド基を引き渡すことができる反応剤がＬｉＡｌＨ４であり、Ｓｉ−Ｈ結合を有するカルボシランデンドリマーに結合させるために使用されるヒドロシリル化触媒が、末端付近に第１級、第２級又は第３級アミノ基を含む化合物であり、ここで前記化合物が炭素−炭素二重結合を有し、Ｋａｒｓｔｅｄｔ触媒である、請求項７６に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７８】
１つの末端に炭素−炭素二重結合を有する化合物が、式ＣＨ２＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ２（式中、「ｅ」表記は、０と２の間で変化する）の第１級アルキレンアミンである、請求項７７に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項７９】
式ＣＨ２＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ２の「ｅ」表記が値１であり、段階ｂ２）に使用されるアリルアミンがアルキレンアミン、ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ２である、請求項７８に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項８０】
好ましくは、アリルアミンが、カルボシランデンドリマー骨格に存在するＳｉ−Ｈ結合の数に対して化学量論量で使用される、請求項７９に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項８１】
任意の段階ｃ）が、ＨＣｌで処理して、段階ｂ２）において生成されたカルボシランデンドリマーのアミノ基の四級化について行われた、請求項７９又は８０のいずれかに記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項８２】
段階ｂ２）ｉ）においてＬｉＡｌＨ４を用いて処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ２）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第１世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項７９から８１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項８３】
段階ｂ２）ｉ）においてＬｉＡｌＨ４で処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ３）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第２世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項７９から８１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項８４】
段階ｂ２）ｉ）においてＬｉＡｌＨ４で処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ４）の第１番目の実施をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第３世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項７９から８１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項８５】
請求項１から５１までのいずれか一項に記載の少なくとも１つのカルボシランデンドリマーを含む組成物。
【請求項８６】
少なくとも１つのアニオン性又はポリアニオン性の分子をさらに含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
ポリアニオン性の分子が、核酸又はその誘導体の配列である、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
核酸又はその誘導体の配列が、アンチセンスＤＮＡである、請求項８７に記載の組成物。
【請求項８９】
存在するカルボシランデンドリマーの少なくとも１つが、アンチセンスＤＮＡと血漿タンパク質又は細胞表面との相互作用の可能性を減少させるために、アンチセンスＤＮＡ又はその誘導体のビヒクルとして作用する目的を有する、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
存在するカルボシランデンドリマーの少なくとも１つが、そこに存在する少なくとも１つのアンチセンスＤＮＡ又はその誘導体の制御された放出を容易にする目的を有する、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
存在するカルボシランデンドリマーの少なくとも１つが、ＮＮ、ＩＭ８及び／又はＩＭ１６から選択されるデンドリマーである、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
アンチセンスＤＮＡが、配列番号１の配列を有する、請求項８８から９１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
アンチセンスＤＮＡが、配列番号２の配列を有する、請求項８８から９１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
アンチセンスＤＮＡが、配列番号３の配列を有する、請求項８８から９１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９５】
アンチセンスＤＮＡが、配列番号４の配列を有する、請求項８８から９１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９６】
アンチセンスＤＮＡが、配列番号５の配列を有する、請求項８８から９１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９７】
核酸又はその誘導体の配列が、二本鎖ＤＮＡ配列である、請求項８７に記載の組成物。
【請求項９８】
核酸又はその誘導体の配列が、プラスミド又はウイルスのＤＮＡ誘導体である、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
ポリアニオン性の分子が、干渉ＲＮＡ又はその誘導体である、請求項８６に記載の組成物。
【請求項１００】
干渉ＲＮＡの分子が、配列番号６の配列を含む、請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０１】
アニオン性の分子が、生理学的ｐＨで負電荷を有する薬剤である、請求項８６に記載の組成物。
【請求項１０２】
負電荷を有する薬剤が、アセチルサリチル酸、インドメタシン、フロセミド、ペニシリン、フェニトイン、トルブタミド、ワーファリン、ナリジクス酸又はクロロチアジドである、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
存在するカルボシランデンドリマーの少なくとも１つが、そのライフサイクルにおいて干渉することができるウイルス又はプリオンによって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するために設計される活性成分として作用する目的を有する、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１０４】
予防又は治療することを試みる疾患が、ＨＩＶウイルスによって引き起こされる、請求項１０３に記載の組成物。
【請求項１０５】
ＮＮデンドリマーが最も少なく存在する、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
存在するカルボシランデンドリマーの少なくとも１つが、その細胞膜又は細胞壁が前記デンドリマーによって変化されやすい細菌又は真菌によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するために設計される活性成分として作用する目的を有する、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１０７】
存在するカルボシランデンドリマーの少なくとも１つが、アルツハイマー病又はプリオンによって引き起こされる脳症において出現するもの等のタンパク質凝集体の形成に干渉する又は溶解を容易にするように設計される活性物質として作用する目的を有する、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１０８】
デンドリマーに結合したペプチド部分又は抗原部分を含む微生物によって引き起こされる疾患に対して供給される個体を予防し又は保護する、免疫応答を起こすように設計される、請求項５０又は５１のいずれかに記載の少なくとも１つのカルボシランデンドリマーを含む組成物。
【請求項１０９】
イオントフォレーゼ、経皮経路又は吸入によって投与されるように設計される、請求項８６から１０８までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１０】
注射されるように設計される、請求項８６から１０８までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１１】
制御された放出が、本発明の少なくとも１つのデンドリマー又は前記組成物中に存在する少なくとも１つの物質からなるフィルムから生じるように、補てつ構造又はＳＴＥＮＴメッシュを被覆する前記フィルムを一緒に形成するように設計される、請求項８６から１０８までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１２】
ヌクレオチド配列のマイクロチップの基体等の表面への核酸分子の固定に使用されるように設計される、請求項８５に記載の少なくとも１つのカルボシランデンドリマーを含む組成物。
【請求項１１３】
デンドリマーが、フェニルアラニン及び／又はＣｌＮＨ４である、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
症状がアンチセンスＤＮＡの使用によって緩和又は根絶され得る、ウイルス又は遺伝子の変化によって引き起こされる疾患の予防又は治療のための薬剤の製造における、請求項１から５１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの使用、又は請求項８５から９６までのいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１１５】
予防又は治療することを試みようとする疾患が、ＨＩＶウイルスによって発症する、請求項１１４に記載の使用。
【請求項１１６】
症状が細胞における二本鎖ＤＮＡの導入によって緩和又は根絶され得る障害又は疾患の
予防又は治療のための薬剤の製造における、請求項１から５１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの使用、又は請求項８５又は９７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１１７】
二本鎖ＤＮＡが、向けられる細胞において少なくとも１つのタンパク質を発現することができる、請求項１１６に記載の使用。
【請求項１１８】
症状が１つ又は複数の干渉ＲＮＡを使用して緩和又は根絶され得る、ウイルス又は遺伝子の変化によって引き起こされる障害又は疾患の予防又は治療のための薬剤の製造における、請求項１から５１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの使用、又は請求項８５、９９又は１００のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１１９】
症状が生理学的ｐＨで負電荷を有する薬剤の投与によって緩和又は根絶され得る障害又は疾患の予防又は治療のための薬剤の製造における、請求項１から５１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの使用、或いは請求項８５、１０１又は１０２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２０】
そのライフサイクルにデンドリマーが干渉することができるウイルス又はプリオンによって引き起こされる障害又は疾患の予防又は治療の薬剤の製造における、請求項１から５１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの使用、或いは請求項８５、１０３、１０４又は１０５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２１】
細胞膜若しくは細胞壁がデンドリマーによって変化させられやすい細菌又は真菌によって引き起こされる障害又は疾患の予防又は治療のための薬剤の製造における、請求項１から５１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの使用、或いは請求項８５又は１０６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２２】
アルツハイマー病又はプリオンによって引き起こされる脳症に出現するもの等のタンパク質の凝集体の形成に干渉する又は溶解を容易にするように設計される薬剤の製造における、請求項１から５１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの使用、或いは請求項８５又は１０７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２３】
デンドリマー中に存在するペプチド又は抗原部分を含む微生物によって引き起こされる疾患に対して予防又は防御する免疫応答を起こすように設計される薬剤の製造における、請求項５０又は５１のいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの使用、或いは請求項８５又は１０８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２４】
分岐鎖の末端部分が、式−（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＣＨ３）Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２に対応する、請求項２４に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１２５】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＣＨ３）Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２部分で終わる、請求項１２４に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１２６】
第１又は第２世代である、請求項１２５に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１２７】
少なくとも１つの四級化アミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＣＨ３）Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−である、請求項２９に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１２８】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＣＨ３）Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ＋（ＣＨ３）Ｉ−部分で終わる、請求項１２７に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１２９】
第１又は第２世代である、請求項１２８に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１３０】
少なくとも１つの四級化アミノ基を含む分岐鎖の末端部分が、部分−Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋２Ｉ−である、請求項２９に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１３１】
「ｐ」表記が値１を取り、各分岐鎖が１つの−Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋２Ｉ−部分で終わる、請求項１３０に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１３２】
第１又は第２世代である、請求項１３１に記載のカルボシランデンドリマー。
【請求項１３３】
１つの末端で炭素−炭素二重結合を有する化合物が、（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２）Ｃ６Ｈ３（ＯＣＨ３）Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項７７に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１３４】
好ましくは、（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２）Ｃ６Ｈ３（ＯＣＨ３）Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２が、カルボシランデンドリマー骨格に存在するＳｉ−Ｈ結合の数に対して、化学量論量で使用される、請求項１３３に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１３５】
任意の段階ｃ）が、ＣＨ３Ｉで処理して、段階ｂ２）において生成されるカルボシランデンドリマーのアミノ基の四級化について行われる、請求項１３３又は１３４のいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１３６】
段階ｂ２）ｉ）においてＬｉＡｌＨ４で処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ２）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第１世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項１３３から１３５までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１３７】
段階ｂ２）ｉ）においてＬｉＡｌＨ４で処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ３）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）において第２世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項１３３から１３５までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１３８】
段階ｂ１）において、Ｓｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、２−［（２−ジメチルアミノエチル）メチル］アミノエタノール（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）で処理される、請求項６２に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１３９】
好ましくは、２−［（２−ジメチルアミノエチル）メチル］アミノエタノール（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）が段階ａ）において生成される最終カルボシランデンドリマー骨格に存在するＳｉ−Ｃｌ末端結合の数に対して、化学量論量で使用される、請求項１３８に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１４０】
任意の段階ｃ）が、分岐鎖の末端アミノ基に存在する窒素原子及びカルボシランデンドリマー骨格の分岐鎖の末端を構成するアルコール−アミン由来部分の一部をまた形成する残存内部アミノ基に存在する窒素原子の双方の完全四級化のために必要な化学量論量に関して計算される、過剰のＣＨ３Ｉで処理して、段階ｂ１）において生成されるカルボシランデンドリマーの過剰のＭｅＩによる四級化について行われる、請求項１３９に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１４１】
段階ｂ１）において２−［（２−ジメチルアミノエチル）メチル］アミノエタノール（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）で処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ２）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）における第１世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項１４０に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１４２】
段階ｂ１）において２−［（２−ジメチルアミノエチル）メチル］アミノエタノール（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）で処理されるＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する最終カルボシランデンドリマー骨格が、段階ａ３）をカルボシランデンドリマー骨格の生成の完了の段階ａ５）と一致させて生成され、段階ｂ）における第２世代カルボシランデンドリマーを生成する、請求項１４０に記載のカルボシランデンドリマーの調製方法。
【請求項１４３】
負電荷を有する薬剤が、メトトレキサート、ヘパリン又はインシュリンである、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１４４】
存在するカルボシランデンドリマーが、ＮＮ、ＮＮ１６又はＩＭ１６から選択される、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
存在するカルボシランデンドリマーが、ＮＮ１６であり、薬剤がインシュリンである、請求項１４４に記載の組成物。
【請求項１４６】
製造のためにカルボシランデンドリマーが使用される薬剤が、メトトレキサート、ヘパリン又はインシュリンを含む、請求項１１９に記載の使用。
【請求項１４７】
薬剤がインシュリンを含む、請求項１４６に記載の使用。
【請求項１４８】
薬剤の製造において使用されるカルボシランデンドリマーが、ＮＮ、ＮＮ１６又はＩＭ１６から選択される、請求項１４６又は１４７に記載の使用。
【請求項１４９】
薬剤の製造において使用されるカルボシランデンドリマーが、ＮＮ１６であり、薬剤がインシュリンを含む、請求項１４８に記載の使用。
【請求項１５０】
カルボシランデンドリマーが生理学的ｐＨで複合体を形成する前記ｐＨでアニオン性又はポリアニオン性の分子のトランスフェクション率を増加させる、請求項１から５１までのいずれか一項に記載のカルボシランデンドリマーの使用。
【請求項１５１】
アニオン性又はポリアニオン性の分子が、核酸又はその誘導体である、請求項１５０に記載の使用。
【請求項１５２】
核酸がアンチセンスＤＮＡ又は干渉ＲＮＡである、請求項１５１に記載の使用。
【請求項１５３】
トランスフェクトする細胞が、神経系の細胞又は神経系由来の細胞系の細胞である、請求項１５１又は１５２に記載の使用。
【請求項１５４】
トランスフェクション率を高めたい核酸が、アンチセンスＤＮＡである、請求項１５３に記載の使用。
【請求項１５５】
デンドリマーが、１：１と１：８の間で変化する負電荷：正電荷比でアンチセンスＤＮＡと複合体を形成する、請求項１５４に記載の使用。
【請求項１５６】
デンドリマーが、ＮＮ及びＮＮ１６から選択される、請求項１５５に記載の使用。
【請求項１５７】
トランスフェクトする細胞が、系Ｕ８７−ＭＧの細胞である、請求項１５３から１５６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５８】
デンドリマーが、１：８の負電荷：正電荷比でアンチセンスＤＮＡと複合体を形成する、請求項１５７に記載の使用。
【請求項１５９】
デンドリマーがＮＮである、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６０】
デンドリマーがＮＮ１６である、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６１】
トランスフェクトする細胞が、系ＳＫ−Ｎ−ＭＣの細胞である、請求項１５３から１５６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６２】
デンドリマーが、１：４の負電荷：正電荷比でアンチセンスＤＮＡと複合体を形成する、請求項１６１に記載の使用。
【請求項１６３】
デンドリマーがＮＮ１６である、請求項１６２に記載の使用。
【請求項１６４】
アニオン性又はポリアニオン性の分子が生理学的ｐＨで複合体を形成することができる請求項１から５１までのいずれか一項に記載の少なくとも１つのカルボシランデンドリマーを含む生理学的ｐＨでアニオン性又はポリアニオン性の分子のトランスフェクション率を増加させるためのキット。
【請求項１６５】
トランスフェクトする細胞が、神経系の細胞又は神経系由来の細胞系の細胞である、請求項１６４に記載のキット。
【請求項１６６】
トランスフェクション率を増加させたい、生理学的ｐＨでアニオン性又はポリアニオン性の分子が核酸又はその誘導体である、請求項１６５に記載のキット。
【請求項１６７】
核酸がアンチセンスＤＮＡ又は干渉ＲＮＡである、請求項１６６に記載のキット。
【請求項１６８】
核酸がまた、キットに含まれる、請求項１６６又は１６７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６９】
核酸が、カルボシランデンドリマーが一部を形成する組成物と別個の組成物においてキットに含まれる、請求項１６８に記載のキット。
【請求項１７０】
核酸が、カルボシランデンドリマーが一部を形成する同じ組成物においてキットに含まれる、請求項１６８に記載のキット。
【請求項１７１】
核酸が、デンドリマーが１：１と１：８の間で変化する負電荷：正電荷比において一部を形成する同じ組成物においてキット中に含まれる、請求項１７０に記載のキット。
【請求項１７２】
カルボシランデンドリマーが、ＮＮ及びＮＮ１６から選択される、請求項１６４から１７１までのいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンドリマーと呼ばれる３次元分子、特に第１級、第２級、第３級又は第４級アミノ基を含む末端部分を有するカルボシランタイプのデンドリマー、その調製のための方法及びその使用に関する。それらの使用が可能な分野の中で、核酸及び負電荷を有する薬理学的活性をもつ他の分子のためのビヒクルとしての使用が強調される。該薬剤の半減期及びそれらの生物学的利用能を増加させ、所望の生物学的効果を得るのに必要な用量を減少させることができるからである。これらが干渉する構造及び／又はライフサイクルを有する微生物によって引き起こされる疾患の予防又は治療は、本発明のデンドリマーの利用のもう１つである。
【背景技術】
【０００２】
デンドリマーは、ナノスケールでの触媒作用、化学センサー、単分子ミセル、酵素機能の模倣、分子カプセル化、分子認識、診断薬等のさまざまな用途並びに遺伝子及び薬剤の運搬のためのビヒクルとしての潜在的利用のために、近年大きな注目を受けてきた。これら総ての用途を含む優れた概説が参考文献一覧［１、３１〜３８］において発表されている。
【０００３】
デンドリマーが最も研究されてきた領域の１つは、遺伝子療法（治療目的をもつ細胞における遺伝子物質の導入）である。現在まで、核酸を運搬するために最も広範に使用されたベクターは、ウイルスベクターである。しかし、ウイルスベクターの使用は、有害な免疫作用、ヒトゲノムにおける癌遺伝子の脱制御に関連するリンパ増殖作用［２］等のいくつかの問題の出現に関連付けられてきた。これらの問題の解決を試みて、カチオン性リポソーム、ポリマー及びまた述べられてきたようなデンドリマー等の他の種類の非ウイルスビヒクルが開発されてきた。これらのカチオン系の各々は、それぞれ、リポプレックス、ポリプレックス又はデンドリプレックスと呼ばれる、核酸との静電的複合体を形成する。
【０００４】
トラスフェクション剤としてのリポソームの使用は、１９８７年に最初に記載された［３］。遺伝子を分配させるために最も使用される方法は、カチオン性脂質におけるカプセル化であって、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（商標）又はＬｙｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）等のこれら誘導体の一部が市販されるまでになっている。しかし、これらの誘導体はまた、肺の炎症反応等の二次的作用及び血清の存在下でのトランスフェクションの欠如等の問題を示した［４］。
【０００５】
従来の分解性ポリマーに関して、ビヒクルとしてのそれらの使用は、熱力学的に不安定であるという主な欠点があり、これは活性種を非常に短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有するものとする［５］。
【０００６】
非ウイルスビヒクルの部分でデンドリマーの最大の利点は、均質な構造、及びさまざまな仕方で骨格及びその表面を修飾する可能性にあり、これは、複合体（核酸／ベクター）の正確な特徴付け及びトランスフェクションプロセスの系統的な研究を可能なものにする。樹状分子をトランスフェクション剤として使用することについて記載した最初の刊行物は１９９３年に現れ、ＰＡＭＡＭ［６］（ポリアミドアミン）と呼ばれるデンドリマーの使用について記載しており、それ以来非常に多くの研究が実施されてきた［７、３９、４０］。ビヒクルとしてのこれらデンドリマーの使用は、一部のアミノ基が非プロトン化のままであるが、生理学的ｐＨで末端基の一部がプロトン化され、ＰＡＭＡＭデンドリマーに正味の正電荷を付与するという事実に基づく。良好なトランスフェクションの結果も、これらのデンドリマー、特に第６及び第７世代のデンドリマーを用いて達成されてきたが、このプロセスの効果は、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）又はＰｏｌｙｆｅｃｔ（商標）の場合のように、熱処理によって活性化したＰＡＭＡＭデンドリマーを使用する場合、２又は３オーダーの大きさで増加される可能性がある。
【０００７】
潜在的なトランスフェクション剤のもう１つのクラスは、Ｍａｊｏｒａｌらによって１２世代まで合成された、リン原子を含むデンドリマーである［８］。この場合、デンドリマーの表面は、プロトン化又はメチル化第３級アミンを用いて官能化され、３Ｔ３細胞のルシフェラーゼ遺伝子のトランスフェクション剤として試験された。この効果は、世代３と５の間で一定値に達するまでデンドリマー世代が増加するにつれ増加する。さらに、本発明者らは、これらのデンドリマーが血清の存在下でより良いトランスフェクション効果を示すことを強調しなければならない。
【０００８】
最後に、他の巨大分子としては、ＤＮＡ又はオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の輸送のための系としてのポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー［９］又はポリリジンデンドリマー［１０，４１］等があった。例えば、毒性の増加のためにより高い世代を使用することはできなかったが、ＰＰＩの低世代由来のデンドリマーは低毒性を有するｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションについてある一定の能力を示した。
【０００９】
これらとしては、オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）が異なる分野の医療用途において研究されている。したがって、例えば、アンチセンスＯＤＮは、標的配列（ＲＮＡを転写できる配列に対して相補的なＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列）に対して相補的（又はアンチセンス）であるＤＮＡ又は類似物の短い合成配列（１５〜３０塩基長）であり、転写、翻訳、又は切断及びスプライス現象等の生物学的事象に干渉するように設計される［１１］。これらの分子は、標的ｍＲＮＡの相補的配列として相互作用するように設計され、ＲＮａｓｅの活性によるｍＲＮＡの分解又はリボソームによる読み取りに干渉することによって、タンパク質への翻訳を抑制する。これは「アンチセンス療法」と呼ばれる。アンチセンスＯＤＮは、１９７８年以来、疑いの期間の後に、特にＦｏｒｍｉｖｉｒｓｅｎ［１２］のＨＩＶ感染に伴うＣＭＶによる眼感染において適用されるアンチセンスＯＤＮの米国ＦＤＡによる認可から、アンチセンスＯＤＮが分子生物学の強力なツールとしてその役割を回復した今日まで多くの分野（なかんずく抗腫瘍療法及び感染性疾患）において使用されてきた。もう１つのアンチセンスＯＤＮであるＧＥＭ２３１は、異なる新生組織形成に対する適用可能性をもつ分子として仮定されている［１３］。この手法はまた、ポジトロン放出断層撮影法を使用する腫瘍の同位体標識における使用可能性について研究されているところである［１４］。さらに、細胞ＤＮＡのレベルで作用すると仮定されるアンチセンスＯＤＮの一種があるが、これらは三重らせんを形成するＯＤＮであり、その一部はＨＩＶ分野内でその利用が計画されている［１５］。
【００１０】
もう１つの全く異なる分野は、免疫調整剤としての非メチル化ＣｐＧ配列に富むＯＤＮの利用の分野である。これらの配列は、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン２、並びにウイルス及び細菌等の病原体を根絶する免疫系の能力を高める他の因子の分泌増加を特徴とするＴｈ１プロファイルに対する免疫応答をもたらす。これらのＯＤＮは、Ｔｏｌｌ様レセプターファミリー等のリンパ球表面のレセプターと相互作用する。これらは、このプロファイルをＴｈ１に持っていく目的で、免疫不全患者及びＴｈ２バランスを特徴とするアレルギー疾患の関連において免疫応答を高めるために研究されているところである［１６］。
【００１１】
ＯＤＮを用いた療法の主な問題の１つは、治療効果を獲得するための十分なレベルを達成することである。ＯＤＮはアルブミン等の血漿タンパク質に大きな親和性を有して結合するので、生物学的効果を達成するために非常に多量のＯＤＮを投与することが必要である［１７］。血漿タンパク質及び他の細胞表面タンパク質への結合はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏＯＤＮの中毒作用（補体のカスケード活性化、溶血、血小板減少等）の一部の原因と考えられている［１８］。したがって、タンパク質への該結合を防止するビヒクルの使用は、活性ＯＤＮのより大きなレベルでの生成に変換することができ、さらに、その半減期を長くし、その毒性を低減させると考えられる。
【００１２】
一般にタンパク質（特に血漿タンパク質：アルブミン、糖タンパク質、リポタンパク質）は、潜在的に投与薬剤を含む媒体中に存在する物質と相互作用することが可能な官能基を示すので、タンパク質との相互作用及びそれらへの結合の問題はまた、薬剤として使用される多くの他の物質にも存在している。この結合は該薬剤の分布の決定要因であるが、薬剤の結合部分は、移送される能力がないので、脈管−組織平衡（「貯蔵器」（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ））の一部を形成せず、代謝されず、排泄されず、効果を示さない（該結合によって決定される場合を除いて）。
【００１３】
血漿タンパク質結合（ＰＰＢ）は、明らかに最も重要であり、薬剤分布の決定要因である。なぜなら、通常組織タンパク質への結合が非常に低下するからである。これは、中でも、タンパク質の血漿濃度が、組織の組織内濃度より非常に大きく、さらにそのタンパク質が、移動性が非常に少なく、物質に結合する能力が少なく、この後者の特性が特に、通常条件の血漿中の優勢なタンパク質であり、酸性薬剤が主に結合する（一部はアルカリ性でもあるが）アルブミンの場合に特に顕著であり、一方酸性糖タンパク質がこれらのアルカリ性物に結合するという事実による。
【００１４】
【表１】
2009502765.tif 000002
【００１５】
薬剤結合の観点からアルブミン構造は極めて複雑で、２つの主な結合点又は部位（ｌｏｃｕｓ）を定義することができる：
【表２】
2009502765.tif 000003
【００１６】
したがって、血漿タンパク質への結合の問題は、ＯＤＮに影響するだけでなく、ほとんど総ての一般に使用される薬剤に影響する。これらの問題の多くはまた、ビヒクルの使用によって回避することもできる。この目的のために開発するビヒクルは、一連の特性：
非毒性、
非免疫原性（ワクチン接種で使用される場合を除く）、
生体適合性、
化学的固定を可能とするのに適した官能基の所持、
限定的身体蓄積、
作用部位に到達するまでの薬剤／ＯＤＮ活性の維持
等を有さなければならないことは明らかと思われる。
【００１７】
さらに、開発すべきビヒクルは、その作用を達成できるように、輸送されるＯＤＮ又は薬剤を時間をかけて放出しなければならないことは明らかと思われる。このような面で、生物における活性物質のレベル維持及び緩やかな効果発現を達成するために、ＯＤＮ又は所定の薬剤の制御された放出を可能としたビヒクルの開発が非常に望ましい。これらの総ての理由のために、デンドリマーを使用すると、血漿酵素による分解や結合し得るタンパク質との相互作用から活性物質を保護する活性物質のビヒクルとして作用し得、活性物質の血中濃度を増加し、より高い及び／又はより長い活性を可能にするので、所望の要件を満たす可能性があると思われる。特にＯＤＮは、重要な多くの薬剤と同様に、アニオン性分子（負電荷を有する）であるため、これらの相互作用を容易にする基を有するデンドリマー、特に、生理学的ｐＨで本来カチオン性であるデンドリマーの活性物質そのビヒクルとしての使用は、その輸送中に複合体の安定性を保証するための極めて適切な選択肢である。したがって、本発明は、特にカルボシラン型の新規のデンドリマーを開発し、その使用、特に、ＯＤＮや他の目的とするアニオン性分子を血中及び／又は他の体液中に運搬するビヒクルとしての使用を提供する。これは新しい分野を包含する。何故なら、エチレンポリオキシドに構築されたカルボシランデンドリマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体適合性についての報告は発表されているが［２１］、ビヒクルとして水に溶解する、カルボシラン構造を有するデンドリマーの使用に関する研究は今日まで発表されていないからである。さらに、今日までカチオン性カルボシランデンドリマーについて３件の合成研究が発表されたのみであり［２２〜２４］、それらのいずれも本発明によって提供されるものとは一致していない。
【００１８】
デンドリマーがビヒクルとして作用することができる薬剤の中で、興味があるグループは、腫瘍細胞のために設計された細胞傷害性薬剤によって構成される［７３、７４］。この目的を追求する場合、デンドリマーを、腫瘍細胞において過剰発現される葉酸を有する腫瘍細胞に向けることができ、その理由として、これらのデンドリマーは正常細胞に対して腫瘍細胞による取込みに優先傾向を有する。最近、表面を葉酸塩で修飾されたＰＡＭＡＭデンドリマーが、癌のニューロン捕獲療法におけるｂｏｔｏ同位体のビヒクルとして使用された［７５］。さらに、シスプラチンと共役したＰＡＭＡＭデンドリマーは、抗腫瘍剤である高分子プラチンビヒクルとして作用し、これは制御形態におけるデンドリマー−プラチン複合体から放出され、遊離のシスプラチンよりも少ない毒性で、固形腫瘍においてその蓄積増大をもたらす［７６］。制御された放出に対するもう１つの代替は、生理学的ｐＨにおいて生分解性結合によってデンドリマー及び薬剤間の共有結合を確立することであり、これは表面に第１級アミンを有するとともに、部分的に１−ブロモアセチル−５−フルオロウラシルで修飾され、生理学的ｐＨにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで加水分解され、制御された仕方で強力な抗腫瘍剤である５−フルオロウラシルを放出する不安定なアミド結合を形成するデンドリマーについて証明されている。
【００１９】
輸送デンドリマーが役立ち得る重要な他の物質は、有害な生理学的影響を示す一重項状態の少量の酸素をｉｎ  ｓｉｔｕで形成するために、照射後有害になるものである［６９］。例えば、末梢に５−アミノレブリン酸を有する感光性薬剤を運ぶデンドリマーについての論文が発表され、これらのデンドリマー薬剤がケラチン生成細胞腫瘍の治療において有望であるとしている［７０］。固形腫瘍の治療のための候補として、光感受性物質としてのプロトポルフィリンを運ぶポリアリールエーテルデンドリマーに基づいて、デンドリマーが評価された［７１］。
【００２０】
デンドリマーが興味あるビヒクルと考えられる薬剤のさらなる群は、非ステロイド系抗炎症性薬等の薬剤によって構成され、これらの薬剤は胃腸変化又は腎臓毒性等の副次作用を示すが、旧来の経口又は非経口経路による代りに、経皮経路によって供給されるので、それらを回避することができる。データは、投与する薬剤に結合したデンドリマーの存在が、その透過性を増加させる皮膚変化をもたらし［７２］、デンドリマーが薬剤の経皮投与に使用される有力な候補となることを示す。
【００２１】
デンドリマー表面の官能基の多価は、デンドリマーが輸送できる多種多様な分子を意味し、それは異なる官能性を有するデンドリマー［これらはテクトデンドリマー（ｔｅｃｔｏｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）であり、生物医学的な利用可能性の大きな潜在的可能性のために研究されている］さえも含むことを意味する。
【００２２】
薬剤輸送に対するデンドリマーの潜在的可能性は、外部の多価デンドリマー表面との相互作用可能性を利用することだけでなく、デンドリマーの構造が、輸送したい分子を収容するために使用できるという事実に基づく。デンドリマー構造の空洞の使用の例としては、いわゆる「樹枝状箱」［６８］であり、この例においてはＰＰＩデンドリマーがフェニルアラニン基で表面を修飾されており、これはデンドリマーを濃密化する外側フレームを保護する。デンドリマーの成長プロセスの間に、異なる大きさの分子がその内部に被包化される。デンドリマーは、その大きさによって異なる数の分子を運搬することができる。デンドリマーをギ酸で処理すると、外側フレームは開き、その中に収容されている分子の放出を可能とする。
【００２３】
デンドリマーが好適なビヒクルと考えられる分子の他の群は、対象において免疫応答を引き起こすことが所望されるが、その大きさが小さいために、ほとんど免疫原性ではなく、又は治療を所望される個人に注射後弱い応答をもたらす低分子量（ペプチド等）の分子である。この問題は、重合又は高分子量ビヒクルへの（従来はタンパク質への）カップリングのいずれかによって、これらの分子量を増加させることによって解決できる。非常に明確な構造及び外周に抗原を結合できる多くの官能基を有するデンドリマーは、非常に明確な免疫原を有し、高度に再現可能なワクチンを製造するための良い代替物となる。この線に沿って、ＭＡＰ（多重抗原ペプチド）デンドリマー［５７、５８］が開発されており、これはリシン残基の継次的世代によって形成される楔状の構造である。これらのデンドリマーは、免疫原性を増加させ、ビヒクルタンパク質を使用する必要性を回避することを意図する、低分子量抗原にカップリングすることができる多数の第１級アミンを有し、熱帯性マラリヤ原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ペプチドを刺激するＴ細胞及びＢ細胞を含むＭＡＰ構造は、この寄生生物に対する免疫応答を引き起こすために使用されてきた［５９］。さらに、ＭＡＰ構造は、細胞内構造（例えば、ウイルス等）の抗原誘導体と同じように抗原提示細胞を介して処理され、細胞傷害性Ｔ細胞の産生を含む、免疫応答能をもたらすことが示されてきた［６０］。分岐鎖の末端にアミノ基を含む部分を有する本発明のデンドリマーはまた、分岐鎖の末端部分に存在するアミンを利用して低分子量抗原にカップリングするか又はそれ自体少なくとも１つのアミノ基を含む部分がペプチドの性質を有するもの等の低分子量抗原を構成する、のいずれかの理由で、ワクチン接種においても有用であり得る。
【００２４】
ＭＡＰ構造はまた、ワクチンの関連において、炭水化物、ハプテン等の非ペプチド性抗原を輸送するために使用されてきた。特に炭水化物は、生物学的認識における重要な分子のクラスである。ＰＡＭＡＭデンドリマー又はリシンデンドリマーの末端アミンに結合するマンノース−イソチオシアネート、シアル酸又はラクトースによって調製されるグリコデンドリマーは、ワクチンに対する抗原として使用されてきた［６４、６５］。Ｔ−関連ベータＧａｌ１−３アルファＧａｌＮＡｃ二糖抗原を有するグリコデンドリマーにおいて、レクチンへのその結合能をまた、Ｔ抗原レセプターを発現する腫瘍を検出し、それに薬剤を運ぶために使用する意図をもって、特にガラクトースについて（タンパク質を炭水化物に結合する）試験をした［６６］。さらに、グリコデンドリマーを、それが結合する炭水化物に結合したレクチンに対する親和性を増加させるために使用することができ［６７］、これは、炭素のレクチン−炭水化物相互作用が、免疫系（細胞活性化をもたらす事象）において、ウイルス及び細菌感染において、癌及び細胞増殖等に関連して、多くの症例に記載されてきたので、微生物抗接着、毒素抑制因子、又は抗炎症、抗ウイルス及び抗癌剤としてこれらグリコシル化デンドリマーを使用することについて興味をもつことができる。要約すれば、グリコシル化デンドリマーは、天然のグリコ共役体を模倣し、炭水化物の天然レセプターと効率的に相互作用し、それとの相互作用の特徴的効果をもたらすことができる。
【００２５】
ビヒクルとしてそれらを使用するためにその特性を利用する可能性に加えて、現在多くの注目が払われている核酸に関するもう１つの分野はＤＮＡ又はＲＮＡ配列が順に並べられた集合を含むマイクロチップの製造である。これらのマイクロチップが製造される場合、ガラス表面をコーティングし、核酸との相互作用能を利用してマイクロチップの表面に該分子を固定する代替物の１つとしてデンドリマーが提起されている［６３］。ヌクレオチド配列と本発明のデンドリマーとの結合の耐久性は、このようなＤＮＡ又はＲＮＡマイクロチップを製造するための基体として寄与させる目的において、核酸を固定する能力を利用することについてデンドリマーを適切なものとする。
【００２６】
最後に、異なる病原体に対して戦い、それらのライフサイクルに干渉するための他の方法を見出すニーズもあり、デンドリマーそれ自体が興味ある代替物であることを示している分野である。一部の前述のデンドリマーは、異なるウイルスによって引き起こされる感染を阻止し、細胞におけるウイルスの侵入及びその後のウイルス複製のステップに干渉することができることを示した。例えば、単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ）の場合がそれであり、その感染は修飾ポリリシンデンドリマーの影響によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻止される［５０、５１］。ＨＩＶの複製もまた、細胞取込みのレベル及びその後のステップにおいての双方で達成されており、この場合、共有結合的修飾ＰＡＭＡＭデンドリマーが使用されてこれはウイルスのレトロトランスクリプターゼ及びインテグラーゼに干渉することができることを示した［１９、５２］。その活性成分がウイルス表面の糖タンパク質ｇｐ１２０と結合する能力のために、ＨＩＶの予防に有効と思われるナフタレン二硫酸塩部分で官能化されたポリリシンデンドリマーであるＶｉｖａＧｅｌ（商標）（Ｓｔａｒｐｈａｒｍａ）の場合のように、これらの性質を利用して、デンドリマーベースの製剤を用いて性感染症の予防のために膣ゲルが開発された。抗ウイルスデンドリマーの設計において、細胞表面に存在する基を模倣する基を表面に有し、したがって、ウイルスと結合するための細胞と拮抗することができるデンドリマーに優先性が存在するが、呼吸器合胞体ウイルス阻害剤として機能する表面アミド基を有する、デンドリマーもまた設計されている。これはデンドリマーの外周基とウイルス融合タンパク質との水素架橋の形成によると考えられ、このために細胞表面の相互作用に関与するウイルスタンパク質と水素架橋を形成することができる他の基で官能化されたデンドリマーも、異なるウイルスに干渉し、これらによって引き起こされる感染を阻止することができることが期待される。
【００２７】
他の場合において、デンドリマーは抗菌剤として、又は一部の真菌の細胞膜の構造を破壊するために使用された。この目的のために設計される場合、細菌膜へのデンドリマーの付着を容易にし、細菌溶解を起こすアミン又はテトラアルキルアンモニウム基等のカチオン性基を表面に有するデンドリマーが優先される。これは、表面に３級アルキルアンモニウム基を有するポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマーの場合であり、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の双方に対して広範な細菌活性を示した［５３、５４］。これらのデンドリマーは、他の高分岐鎖ポリマーより大きな殺菌能を有する。本発明のデンドリマーはまた、アミノ基を含む部分で官能化されて、細菌又は真菌の細胞膜の構造を破壊するためにも使用される選択肢を提示する。
【００２８】
また、デンドリマーが、それらをタンパク質変性剤として作用させる特性を有することも伝えられている。ある種のデンドリマーは、デンドリマー表面の水分子を再編成することにより、誘電定数及び水の粘度を低下させ、その規則構造の秩序を乱すことによって作用する。これは疎水性相互作用にダメージをもたらし、大部分のタンパク質の３次元構造を非常に不安定にし、その変性を生じる：これは、尿素又は塩化グアニジン等の変性剤が有するいわゆる「カオトロピック」効果である。タンパク質のこの変性能を適用することを意図する非常に興味深い分野は、ＰｒＰＳｃ等のプリオンタンパク質を溶解するための使用である［２０］。プリオンタンパク質は、海綿状脳症（クロイツフェルト−ヤコブ病、狂牛病、ヒツジスクラピー等）と呼ばれる致死性ニューロパチーを引き起こす病原性構造体形成に適合させることができる。これらのタンパク質は、羅患した固体の脳に局在する凝集体を形成し、カオトロピック剤として洗浄剤（通常６Ｍ塩化グアニジン）を含む溶媒に可溶であるのみである。しかし、これらの凝集体は、ＰＰＩ及びＰＡＭＡＭ等のカチオン性デンドリマーによって可溶化でき、表面により多くのアミンを有するより大きい世代のものが最も有効である。したがって、アミノ基を含む部分を用いて官能化されている本発明の新規なデンドリマーはまた、プリオン凝集体を溶解するために、並びにその進行において病原タンパク質凝集体、例えば、アルツハイマー病において出現するアミロイドタンパク質の凝集体を形成する他の疾患の治療においての双方で使用される新規な化合物を提供する［５５、５６］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
要約すると、デンドリマーは、生物学的利用における使用に良好な特性を有する合成ポリマーであり、これらは溶液中で予想通りに応答し、生物活性を有する複数のリガンドを運ぶように大きく修飾でき、生物学的障害を乗り越えられ、ほとんど構造欠陥がなく製造される。したがって、これらの利用は、異なる薬剤を運ぶための使用、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド分子のトランスフェクション、ワクチンの設計、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤等の投与又はその進行においてプリオンに起源を発するもの若しくはアルツハイマー病で特徴的なアミロイドタンパク質の堆積等のタンパク質凝集体の形成といった種々病因による疾患の症状緩和を含む異なる予防的及び治療的戦略において研究されている。本発明のデンドリマーとしては、生体臨床医学の領域について興味深い代替物等が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、第１世代である場合、式：
【化１】
2009502765.tif 000004
第２世代である場合、式
【化２】
2009502765.tif 000005
第３世代である場合、式
【化３】
2009502765.tif 000006
いずれか１つ、又はその後の世代の場合は対応する類似の式に対応する、第１級、第２級、第３級又は第４級アミノ基を含む末端部分を分岐鎖の末端に有する新規な分岐鎖カルボシランデンドリマーであって、各世代ｉに対応する式は、新しいタイプのブロック：
【化４】
2009502765.tif 000007
によって前の世代に対応する式中のＸｐを置換することから生じ、この置換ブロックと同じシリコン原子に結合した基は（Ｒｉ−１）３−ｐによる表示から（Ｒｉ−１）３−ｚによる表示に移行し；
式中、Ａｌｑ１、Ａｌｑ２、Ａｌｑ３、・・・、Ａｌｑｉは、各世代における分岐鎖長さに従って互いに独立に選択される炭素２から４個のアルキレン部分を表し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、・・・、Ｒｉ−１、Ｒｉは、メチル及びフェニルの中から互いに独立に選択される部分を表し；
Ｘは、少なくとも１つの第１級、第２級、第３級、又は第４級アミノ基を含む部分を表し；
ｐは、１と３の間で変化する自然数であり；
ｍ、ｎ、・・・、ｚは、１と３の間で独立に変化する自然数である、新規な分岐鎖カルボシランデンドリマーについて記載する。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、・・・、Ｒｉ−１、Ｒｉは総て同一であり、メチル部分に対応する。
【００３２】
本発明のもう１つの好ましい実施形態において、部分Ａｌｑ１、Ａｌｑ２、Ａｌｑ３、・・・、Ａｌｑｉは、エチレン及びプロピレンから選択される。本発明のもう１つのより好ましい実施形態において、この部分は総て同一であり、プロピレン部分に対応する。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施形態において、自然数ｍ、ｎ、・・・、ｚは互いに同一であり、値２である。
【００３４】
本発明の最も好ましい実施形態において、部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、・・・、Ｒｉ−１、Ｒｉは総て同一であり、メチル部分に対応し、部分Ａｌｑ１、Ａｌｑ２、Ａｌｑ３、・・・、Ａｌｑｉは互いに総て同一であり、プロピレン部分に対応し、自然数ｍ、ｎ、・・・、ｊは互いに同一であり、値２である。
【００３５】
Ｘは、第１級、第２級、第３級又は第４級アミンを含む任意の部分を表す。それらの中で、Ｘが、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（（ＣＨ３）２）２又は−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、或いは−ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＮＨ２基（ここで、「ｅ」は０と２の間の自然数であり、この場合値１を取ることが好ましい）のいずれかを表す部分が好ましい。本発明の好ましい実施形態はまた、Ｘが、前述の−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−、−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−）２、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−又は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＋Ｈ３Ｃｌ−の四級化形態を表すものである。
【００３６】
Ｘが、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２）２、又は−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、或いはそれらの四級化形態の−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−、−ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）Ｉ−）２及び−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３Ｉ−を表す場合、総ての分岐鎖が、アミノ基を含む末端部分を有し、各分岐鎖が、それぞれ、１つの末端部分又は２つの末端部分で終わるように「ｐ」表記が値１又は２を取ることが特に好ましい。Ｘが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２又はその四級化形態−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＋Ｈ３Ｃｌ−を表す場合、総ての分岐鎖が、アミノ基を含む末端部分を有し、各分岐鎖が１つのアミン部分で終わるように「ｐ」は値１を取ることが特に好ましい。
【００３７】
本発明の範囲にはまた、Ｘが、少なくとも１つのアミノ基を含む抗原部分を表す場合が含まれる。前述の具体的な場合は、抗原部分がペプチドである場合である。
【００３８】
本発明はまた、
ａ）以下のステップ：
ａ１）ＳｉＣｌ４をＢｒＭｇ（ＣＨ２）ａＣＨ＝ＣＨ２と反応させて、式：
Ｓｉ［（ＣＨ２）ａＣＨ＝ＣＨ２］４
（式中、ａは、分岐鎖にとっての所望の長さによって、０と２の間で変化する）
の基本開始カルボシランデンドリマーを生成するステップと；
ａ２）ａ１）の基本開始カルボシランデンドリマーをＨＳｉ（Ｒ１）３−ｍＣｌｍと反応させ、その結果、下記式：
【化５】
2009502765.tif 000008
（式中、ｍは、１と３の間で変化し、次世代に達成することができる分岐鎖の数又はＣｌ基を置換することができる末端官能基の数と等しく；Ｒ１は、フェニル又はメチル部分を表す）
のデンドリマーが生成して、後世代のデンドリマーの第１世代カルボシランデンドリマー前駆体を生成するステップと；
ａ３）場合によって、段階ａ２）において生成されたＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する誘導体に、段階ａ１）及びａ２）、すなわち
ｉ）Ｓｉ−Ｃｌ末端結合を有する対応する誘導体を、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｂＣＨ＝ＣＨ２（式中、「ｂ」はこれらの分岐鎖に対する所望の長さによって、０と２の間で変化し、「ａ」表記と同一であるか又は異なることができる）と反応させて、新しい分岐鎖を生成するステップと；
ｉｉ）ｉ）において生成された新世代のカルボシランデンドリマー骨格を、ＨＳｉ（Ｒ２）３−ｎＣｌｎ（式中、「ｎ」は１と３の間で変化し、前世代の「ｍ」表記と同一であるか又は異なることができ、Ｒ２はフェニル又はメチル部分を表す）と反応させるステップと；の繰り返しを受けさせて、後世代のデンドリマーの第２世代カルボシランデンドリマー前駆体を生成するステップと；
ａ４）場合によって、前世代に対応するＳｉ−Ｃｌ末端結合を有する誘導体に、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｃＣＨ＝ＣＨ２反応剤を使用する段階ａ３）ｉ）の繰り返し及びＨＳｉ（Ｒ３）３−ｚＣｌｚ反応剤を使用する段階ａ３）ｉｉ）の繰り返し（ここで、「ｃ」は０と２の間で変化し、「ｚ」は１と３の間で変化する）で求められるものを受けさせて、後世代デンドリマーの次に続く世代の前駆体のカルボシランデンドリマーを生成するステップと；
ａ５）デンドリマーが、それぞれ、第１、第２又は世代ｉであるかに依存して、段階ａ２）、ａ３）又は段階ａ４）の繰り返しｉ−１において、ＨＳｉ（Ｒｉ）３−ｐＣｌｐ反応剤（ここで、「ｐ」は１と３の間で変化し、Ｒｉはフェニル又はメチル部分を表す）を使用して、少なくとも１つのアミノ基を含む部分が段階ｂ）において加えられる最終カルボシランデンドリマー骨格を生成するステップと；
に従ってカルボシランデンドリマー骨格を生成する段階と、
ｂ）
ｂ１）過剰のアルカリの存在下で、第１級、第２級又は第３級アルコール−アミンと反応させて、段階ａ５）において生成されたカルボシランデンドリマーのＳｉ−Ｃｌ末端結合のアルコール分解を引き起こす経路；
ｂ２）少なくとも１つの第１級、第２級又は第３級アミノ基を含む部分が後で結合するＳｉ−Ｈ末端結合を有するカルボシランデンドリマーを予め生成する経路であって、
ｉ）Ｓｉ−Ｃｌ結合を有する対応するカルボシランデンドリマーを、ヒドリド基を引き渡すことができる反応剤と反応させ、その結果Ｃｌ原子の一部又は全部をＨ原子で置換して、任意の世代のカルボシランデンドリマーのＳｉ−Ｈ末端結合を有する誘導体を生成する段階と；
ｉｉ）Ｓｉ−Ｈ結合を有するカルボシランデンドリマーを、ヒドロシリル化触媒の存在下で、第１級、第２級又は第３級アミノ基を含み、１つの末端に炭素−炭素二重結合を有する化合物と反応させて、この化合物を、二重結合が見られる末端によってデンドリマーに結合させる段階と
を通過させる経路；
の１つに従って第１級、第２級又は第３級アミノ基を有する末端部分を有するカルボシランデンドリマーを生成する段階と、
ｃ）場合によって、段階ｂ）において生成されたデンドリマーとＡ−Ｈａｌ反応剤（ここで、Ａは水素、１から１０個の炭素のアルキル又はアリール原子を表し、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、Ｉを表す）とを反応させることによって、四級化アミノ基を有する末端部分を有するカルボシランデンドリマーを生成する段階と
を含む、該カルボシランデンドリマーの調製方法に関する。
【００３９】
本発明の方法の好ましい実施形態において、反応剤ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ａＣＨ＝ＣＨ２、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｂＣＨ＝ＣＨ２、・・・、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｋＣＨ＝ＣＨ２に対応する表記ａ、ｂ、・・・、ｋは互いに同一であって、値０であり、この目的のために使用される反応剤は、ビニル誘導体ＢｒＭｇ−ＣＨ＝ＣＨ２であり、分岐鎖は２炭素長を有する。
【００４０】
本発明の方法のもう１つの好ましい実施形態において、反応剤ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ａＣＨ＝ＣＨ２、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｂＣＨ＝ＣＨ２、・・・、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｋＣＨ＝ＣＨ２に対応する表記ａ、ｂ、・・・、ｋは、互いに同一であって、値１であり、この目的のために使用される反応剤は、ビニル誘導体ＢｒＭｇ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２であり、分岐鎖は３個の炭素長である。
【００４１】
本発明の方法のもう１つの好ましい実施形態において、部分Ｒ１、Ｒ２、・・・、Ｒｉは、総て同一であり、メチル部分に対応する。
【００４２】
本発明のもう１つの好ましい実施形態において、一般式ＨＳｉ（Ｒ２）３−ｎＣｌｎの反応剤に対応する表記ｎ、ｍ、・・・、ｊは、好ましくは１と２から選択される。前述の具体的実施形態において、各世代に形成される分岐鎖の数は、常に同じであって、２に等しく、このために反応剤ＨＳｉ（Ｒ２）３−ｎＣｌｎは、新たな世代デンドリマーを生じる前駆体を生成するために使用される場合、総ての場合で、ＨＳｉ（Ｒ２）２Ｃｌ、好ましくはＨＳｉ（ＣＨ３）２Ｃｌであり、これらは「ｎ」の値が１に対応する。
【００４３】
本発明の最も好ましい実施形態において、部分Ｒ１、Ｒ２、・・・、Ｒｉは総て同一であり、メチル部分に対応し、一方反応剤ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ａＣＨ＝ＣＨ２、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｂＣＨ＝ＣＨ２、・・・、ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ｋＣＨ＝ＣＨ２に対応する表記ａ、ｂ、・・・、ｋは、互いに同一であり、値１であり、このためにカルボシランデンドリマーの分岐鎖は３炭素長であり、各新たな世代において生成される分岐鎖は２であり、このためにＨＳｉ（ＣＨ３）２Ｃｌは、常に新たな世代の前駆体を生成するために使用される。対照的に、反応剤ＨＳｉ（Ｒ２）３−ｎＣｌｎが、分岐鎖にアミノ基を有する本発明のカルボシランデンドリマーを生成するためのＳｉ−Ｃｌ末端結合を有するカルボシランデンドリマーを生じさせるために使用される場合は、値「ｎ」が１と２から選択されるのが好ましく、したがって、分岐鎖当たり存在する末端基の数がそれぞれ１又は２であることが所望されるか否かに依存して、Ｓｉ（ＣＨ３）Ｃｌ２又はＨＳｉ（ＣＨ３）２Ｃｌを使用することが可能である。
【００４４】
本発明の実施形態において、Ｓｉ−Ｃｌ末端結合を有する対応する誘導体から本発明のカルボシランデンドリマーを生成するために使用されるアルコール−アミンは、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）、２−［（２−ジメチルアミノエチル）メチル］アミノエタノール（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）又は３，５−ビス（ジメチルアミノエトキシ）ベンジルアルコール（ＣＨ２ＯＨ−（Ｃ６Ｈ３）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）２）の中から選択される。前述の好ましい実施形態において、Ｓｉ−Ｃｌ結合を有するカルボシランデンドリマーは、Ｓｉ−Ｃｌ結合の各々がＳｉ−Ｏ結合に移行し、それによって使用されるアルコール−アミンに対応する部分に結合するように、ジエチレンエーテル中及び過剰のトリエチルアミンの存在下で、選択されるアルコール−アミンの対応する化学量論量で処理される。本発明の他の実施形態において、前述のアルコール−アミンのいずれか１つから生成されるカルボシランデンドリマーは、その後にジエチレンエーテル中でＣＨ３Ｉで処理することによって四級化される。
【００４５】
本発明の他の実施形態において、第１級、第２級又は第３級のアミノ基を含み、１つの末端に炭素−炭素二重結合を有し、Ｓｉ−Ｈ結合を有するカルボシランデンドリマーと反応させられる化合物は、式ＣＨ２＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ２の第１級アルキレンアミンであり、ここで、「ｅ」表記は、１と２の間で変化する。前述の好ましい実施形態において、第１級アルキレンアミンは、「ｅ」表記が値１であるもの、すなわち、アリルアミン、ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ２である。本発明の他の実施形態において、アリルアミンとの反応で生成される末端部分−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２を有するカルボシランデンドリマーは、ジエチレンエーテル中でＨＣｌの付加によって四級化される。
【００４６】
本発明の他の実施形態において、第１級、第２級又は第３級アミノ基を含み、１つの末端に炭素−炭素二重結合を有し、Ｓｉ−Ｈ結合を有するカルボシランデンドリマーと反応させられる化合物は、１つの末端にアルケニル部分（ＣＨ２＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｅ−（ここで「ｅ」は、この場合も先と同様に０と２の間で変化する）及びもう１つの別の末端にアミノ基（第１級、第２級又は第３級）を含む化合物であり、この化合物はアルキニル部分ＣＨ２＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｅ−とアミノ基の間に−Ｒａ−部分をさらに含む。その好ましい実施形態において、使用される化合物は、４−アリル−２−メトキシ−１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）ベンゼン、（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２）Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）｛Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２｝である。
【００４７】
本発明の方法の好ましい実施形態において、少なくとも１つの第１級、第２級又は第３級アミノ基を含み、１つの末端に炭素−炭素二重結合を有する化合物が反応させられる、末端にＳｉ−Ｈ結合を有するカルボシランデンドリマーが、ヒドリド基を引き渡すことができる反応剤としてＬｉＡｌＨ４を使用する段階ｂ２）ｉ）において生成され、これは、Ｓｉ−Ｃｌ結合の一部又は全部をＳｉ−Ｈ結合に転換させることができる。但し、類似の反応剤の使用が本発明の方法の範囲内に含まれ、これらの中でＮａＨ又はＮａＢＨ４を挙げることができる。この好ましい実施形態において、炭素−炭素二重結合を有する、末端に少なくとも１つの第１級、第２級又は第３級アミノ基を含む化合物の結合が、反応を触媒するＫａｒｓｔｅｄｔ触媒［２８］を使用して行われるが、他のヒドロシリル化触媒の使用が本発明の方法の範囲内に含まれ、これはＳｐｉｅｒｓ触媒等で所望の結合を達成することを可能とする［６１、６２］。
【００４８】
もう１つの態様において、本発明は、本発明のカルボシランデンドリマーを含む医薬組成物に関する。本発明の実施形態において、この組成物は、少なくとも１つの別の分子、アニオン又はポリアニオンと一緒に本発明の少なくとも１つのカルボシランデンドリマーを含む。前述の具体的な実施形態において、ポリアニオン分子は、オリゴデオキシリボヌクレトチド（ＯＤＮ）又は二本鎖ＤＮＡ分子である。前述のもう１つの具体的な実施形態において、ポリアニオン分子は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ分子であり、好ましくはこのＲＮＡを干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）として使用することを可能にする互いに関連する相補的領域を含む。さらなる実施形態において、アニオン分子は、それと接触する血漿タンパク質又は細胞膜に結合する傾向を有するか、アニオン分子或いは、これらのタンパク質による分解を受けやすい薬剤である。
【００４９】
前述とは異なる実施形態において、カルボシランデンドリマーは、病原微生物のライフサイクルに干渉する能力を有する活性物質として本発明中に存在する。その具体的な実施形態において、該病原体はウイルスであり、それは、ＨＩＶであり得る。もう１つの具体的な実施形態において、病原微生物は、細胞壁又は膜がデンドリマーによって変化しやすい細菌又は真菌である。
【００５０】
もう１つのさらなる実施形態において、カルボシランデンドリマーは、プリオンによって引き起こされる脳症等の病理学的プロセス又はアルツハイマー病等の退行変性プロセスの進行に関与するタンパク質凝集体の形成に干渉する又は溶解を容易化する能力を有する活性物質として本発明において存在する。
【００５１】
前述のものと異なる、さらなる実施形態において、医薬組成物中に存在する本発明のカルボシランデンドリマーでは、ペプチド又は任意の抗原部分がそれに結合され、該ペプチド又は抗原部分が存在する生物によって引き起こされる疾患に対して、医薬組成物が供給される個体を予防又は保護する免疫応答を引き起こすように設計される。
【００５２】
本発明のデンドリマー及びそれを含む組成物は、一般的な投与経路、イオントフォレーゼ、経皮経路、注射又は吸入によって投与することができる。これらはまた、本発明の少なくとも１つのデンドリマー又は該デンドリマーと同じ組成物中に存在する少なくとも１つの物質の制御放出を生じるように、人工構造物又はＳＴＥＮＴメッシュをコーティングするフィルムを形成するために好適である。
【００５３】
本発明のもう１つの態様において、カルボシランデンドリマーは、アニオン又はポリアニオン性の分子を表面に固定するために使用される。本発明の実施形態において、このような分子は一連の核酸及びそれらが固定される表面であり、それは、一連の核酸が固定される、マイクロチップに使用される基材である。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、アニオン物質と接触して、該アニオン物質に結合する若しくはそれらを分解することができる血漿タンパク質又は細胞膜との相互作用から該物質を保護する、血液中のアニオン物質を運ぶためのビヒクルとしての本発明のカルボシランデンドリマーの使用に関する。これの具体的場合では、血液ｐＨでアニオン特性を有する物質が薬剤であることである。
【００５５】
なおさらなる態様において、本発明は、本発明のデンドリマーが干渉することができるライフサイクルを有する微生物によって引き起こされる疾患の症状を軽減又はなくすための薬剤としての本発明のカルボシランデンドリマーの使用に関する。
【００５６】
もう１つのさらなる態様において、本発明は、カルボシランデンドリマーが結合したアニオン又はポリアニオン性の分子のトランスフェクションビヒクルとしての本発明のカルボシランデンドリマーの使用に関する。これの具体的場合は、ポリアニオン分子が、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）又は、ＲＮＡを干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）として使用させる、好ましくは互いに関連する相補的領域を含む一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ分子である。トランスフェクトする細胞は、神経系細胞又はそれ由来の細胞系からであるのが特に好ましい。
【００５７】
これから本発明を、以下の図及び本発明の詳細な説明の項で記載される実施例を参照してより詳細に述べる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
本発明は、第１世代である場合、式：
【化６】
2009502765.tif 000009
第２世代である場合、式
【化７】
2009502765.tif 000010
第３世代である場合、式
【化８】
2009502765.tif 000011
又は、その後の世代の場合は対応する類似の式に対応する、第１級、第２級、第３級、又は第４級アミノ基を含む分枝の端部に末端部分を有する新規な分岐鎖カルボシランデンドリマーであって、各世代ｉに対応する式は、新しいタイプのブロック：
【化９】
2009502765.tif 000012
によって前の世代に対応する式中のＸｐを置換することから生じ、この置換ブロックと同じシリコン原子に結合する基は（Ｒｉ−１）３−ｐによる表示から（Ｒｉ−１）３−ｚによる表示にわたる
（式中、Ａｌｑ１、Ａｌｑ２、Ａｌｑ３、・・・、Ａｌｑｉは、各世代における分岐鎖長に従って互いに独立に選択される２から４個の炭素のアルキレン部分を表し；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、・・・、Ｒｉ−１、Ｒｉは、メチル及びフェニル部分を表し；Ｘは、少なくとも１つの第１級、第２級、第３級、又は第４級アミノ基を含む部分を表し；ｐは、１と３の間で変化する自然数であり；ｍ、ｎ、・・・、ｚは、１と３の間で独立に変化する自然数である）新規な分岐鎖カルボシランデンドリマーについて記載する。
【００５９】
本発明の最も好ましい実施形態において、部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、・・・、Ｒｉ−１、Ｒｉは、総て同一であり、メチル部分に対応し；部分Ａｌｑ１、Ａｌｑ２、Ａｌｑ３、・・・、Ａｌｑｉは、互いに同一であり、プロピレン部分に対応し；自然数ｍ、ｎ、・・・、ｊは、互いに同一であり、値２である。これらの条件において、本発明の実施形態に対応するデンドリマーはまた、一般式ｉＧ−（Ｘｐ）ｍ、式中：
ｉ：デンドリマー世代の数を示す、
Ｘ：デンドリマーの外表面に位置する官能基の物性を示す、
ｐ：各分岐鎖における官能基の数を示す、
ｍ：デンドリマー中の末端官能基の数を示す、
Ｇ：世代によって、以下の式：
【化１０】
2009502765.tif 000013
（骨格中、ＳｉＭｅ３（Ｍｅ＝ＣＨ３）最終末端は、デンドリマーの一般式において、「ｐ」が１に等しい場合、ＳｉＭｅ２Ｘに変換され、「ｐ」が２に等しい場合、ＳｉＭｅＸ２に変換される）に対応するデンドリマーカルボシラン骨格を表す、
によって表すことができる。
【００６０】
Ｘは、第１級、第２級、第３級又は第４級アミンを含む任意の部分を示す。
【００６１】
本発明において使用される用語デンドリマーは、ツリー状の構造の３次元の巨大分子に関する。
【００６２】
用語「世代」は、デンドリマーの調製に必要な反復段階の数について言う。
【００６３】
用語「カルボシランデンドリマー」は、カルボシラン骨格を有する樹状分子に関する。
【００６４】
用語「ヒドロシリル化」は、炭素−炭素二重結合へのＳｉ−Ｈ結合の付加に関する。
【００６５】
本発明において使用される用語「抗原部分」は、分子に結合し、結合したその部分を有する分子を供給された個体に免疫応答を引き起こすことができる部分に関する。
【００６６】
本発明において使用される用語「ペプチド」は、アミノ酸のカルボキシル基及び隣接するアミノ酸のアミノ基間のアミド型連鎖の形成によって結合される２つ以上のアミノ酸の線状鎖に関する。
【００６７】
先に示されたように、本発明はまた、本発明のデンドリマーの調製のための方法に関する。異なる世代のこれらオルガノシランデンドリマーは、異なる方法によって、周知の反応を使用して高収率で調製することができる［２５、４２、４３、４４、４５、４６］。これらのデンドリマーは、他の誘導体に対して利点を与える大きな多能を示す：ｉ）メタセシス工程においてビニル又はアリルのグリニャール誘導体を使用して分岐鎖長を変更することができる；ｉｉ）例えば、ＨＳｉＣｌ３をＨＳｉＣＨ３Ｃｌ２で置換して、各世代の分岐鎖の数を変化させることができる；ｉｉｉ）デンドリマーの外周に非常にさまざまな官能基を組み入れることができる。さらに、カルボシランデンドリマーは、大きな化学的慣性（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｔｉａ）を有し、これは、血液中でのアニオン性分子（ＯＤＮ及び異なるアニオン性薬剤等）の運搬、血漿タンパク質との相互作用に対するその保護、及びその作用を働かせる細胞におけるその取込みのためのビヒクルとして使用する、本発明のさらなる目的のために極めて有用である。
【００６８】
解説されたように、本発明の好ましい実施形態において、異なる世代の分岐鎖は全く等しく、アリル誘導体ＢｒＭｇ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２を使用した結果であり、一方各世代において生成される分岐鎖はまた、ＨＳｉＣＨ３Ｃｌ２の使用によって総ての場合において同じであり、２に等しい。これらの条件において、異なるカルボシランデンドリマーを生成するために使用される通常とは異なる合成方法は、以下の方法で第２世代まで図式化することができる。
【化１１】
2009502765.tif 000014
【００６９】
所望の世代のデンドリマー前駆体に対応する骨格が生成されると、本発明のアミノ基を含む末端部分を有するカルボシランデンドリマーを生成するためにＳｉ−Ｃｌ又はＳｉ−Ｈ末端結合を有する誘導体が、生成される。この方法を以下に詳述する。
【００７０】
末端アミノ基を用いたカルボシランデンドリマーの生成
これらの誘導体の合成における第１のステップは、Ｓｉ−Ｃｌ又はＳｉ−Ｈ末端結合を含む前駆体デンドリマーの調製である。これらのデンドリマーの合成については、既に発表されており［２５、４２、４３、４４、４５、４６］、高収率で実施されている。本明細書の下記に述べる実施例において、デンドリマーは第３世代に成長したが、より大きい世代のデンドリマーを生成するための方法は、類似のものであり、この目的で、後世代の該デンドリマー及びその調製もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態の場合において、各世代の分岐鎖は等しい大きさであり、３−炭素鎖に対応し、新たな分岐鎖が各世代において形成され、飽和状態にある価のＳｉ原子に結合するメチルを脱離し、Ｓｉ−Ｃｌ及びＳｉ−Ｈ末端結合を有する異なる前駆体カルボシランデンドリマーの生成をもたらす反応スキームをスキーム１：
【化１２】
2009502765.tif 000015
によって示す。
【００７２】
第２のステップは、Ｓｉ−Ｃｌ及びＳｉ−Ｈ結合の知られた反応性を利用してこれらデンドリマーの表面に異なるアミノ基を結合することからなる。この目的に関して、カルボシランデンドリマーに存在する末端基の性質に依存して、２つの択一的合成経路をたどることができる。
【００７３】
１．Ｓｉ−Ｃｌ結合のアルコール分解経路
このプロセスは、この反応で放出される塩化水素を除くために加えられるトリエチルアミン等のアルカリの存在下で種々のアルコール−アミンを使用した。用語「アルコール−アミン」は、以下の式：
【化１３】
2009502765.tif 000016
【化１４】
2009502765.tif 000017
によって記載される例と同様なアルコール官能基を含む種々のアミンに関する。
【００７４】
本発明において、これらの３つのアミンの使用が好ましいが、本発明のこのプロセスは、本明細書において記載されるアルコール分解プロセスを実施することができるアルコール官能基を有する任意の他のアミンを用いてデンドリマーの周囲を官能化させることができ、これらのアミン及び生成されるアミン機能を有するカルボシランデンドリマーの任意の官能化はまた、本発明の範囲に含まれる。
【００７５】
過剰のトリエチルアミンの存在下で、ジエチレンエーテル中の化学量論量のＮ，Ｎ−ジメチルエタノールアミンによりＳｉ−Ｃｌ末端結合を含むカルボシランデンドリマーを処理すると、末端アミノ基を有するカルボシランデンドリマーの形成をもたらす。一般論として、この段階はスキーム２：
【化１５】
2009502765.tif 000018
において、再現される。
【００７６】
この反応スキームの使用は、化合物１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）］４（１）、１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２］４（２）、２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）］８（３）、２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２］８（４）、３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）］１６（５）、３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２］１６（６）を生じさせ、その合成プロセスは下記される実施例１〜６においてより詳細に説明される。
【００７７】
Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミンの３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２−（Ｃ６Ｈ３）ＣＨ２ＯＨ又はＭｅ２ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ等の他のアルコールアミン誘導体による置換は、デンドリマーの調製のために上記されたものと同様の反応をもたらす。この反応はスキーム３：
【化１６】
2009502765.tif 000019
において、再現される。
【００７８】
この反応スキームの使用は、化合物１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２］４（７）、２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２］８（８）、３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２］１６（９）、１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）］４（１０）、２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）］８（１１）、３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）］１６（１２）を生じさせ、その合成プロセスは下記される実施例１〜６においてより詳細に説明される。
【００７９】
ＭｅＩを用いた四級化
化学量論量又は少し過剰のＨＣｌを用いてデンドリマー１〜１２の末端アミノ基を四級化するためになされた試みは、Ｓｉ−Ｏ結合が徐々に加水分解され予期された結果をもたらさなかった。しかし、これらのデンドリマーをジエチレンエーテルにおいて量的に過剰なＭｅＩで処理すると、数時間でアミノ基の四級化をもたらし、高収率で白色吸湿性固形物としてアンモニウムカチオンのヨウ素塩の沈殿を生じる。この反応は、スキーム４：
【化１７】
2009502765.tif 000020
において示される。
【００８０】
このようにして、下記のデンドリマーが単離され、特徴付けされた：１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］４（１６）、１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］４（１７）、２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］８（１８）、２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］８（１９）、３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］１６（２０）、３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］１６（２１）、１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］４（２２）、２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２）］８（２３）、３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２）］１６（２４）、１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］４（２５）、２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］８（２６）、３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｍｅ）ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］１６（２７）。
【００８１】
これらの合成及び特徴付けのプロセスは、後記される実施例１６〜２７において以下に詳述される。本明細書で提供される詳細により、ジメチルアミノ基の四級化は、第３世代デンドリマーの一部、特に２１、２４及び２７について不完全であり：これらの複合体の末端基の約９０％しか四級化されなかったことが示される。これは、過剰のＭｅＩの存在下で、より長期間反応させたまま置いた場合である。
【００８２】
それぞれ第１及び第２世代である、デンドリマー１０及び１１の場合、巨大分子に存在する総ての窒素原子の四級化に必要な化学量論量に対して過剰なＭｅＩの添加は、デンドリマー３５（１Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ＋（Ｍｅ）２（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋２Ｉ−）］４及び３６（２Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ＋（Ｍｅ）２（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋２Ｉ−）］８）の形成をもたらし、この合成及び特徴付けのプロセスは、それぞれ、実施例４８及び４９において記載される。
【００８３】
２．Ｓｉ−Ｈ末端結合のヒドロシル化経路
Ｓｉ−Ｈ端末結合を含むカルボシランデンドリマーをＫａｒｓｔｅｄｔ触媒［２８］の存在下でアリルアミン（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ２）で処理すると、実用的な収率で、末端アミノ基１Ｇ−［ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２］４（１３）、２Ｇ−［ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２］８（１４）、３Ｇ−［ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２］１６（１５）を有するカルボシランデンドリマーの形成をもたらす。これらが生成される反応は、スキーム５：
【化１８】
2009502765.tif 000021
に示される。
【００８４】
これらのデンドリマーは、熱的に安定であり、有機溶媒に可溶である。これらの特徴付け及び純度は、元素分析（Ｈ、Ｃ、Ｎ）、ＮＭＲ分光法（１Ｈ、１３Ｃ及び２９Ｓｉ）及び質量分析（エレクトロスプレー又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって実証した。これらの合成及び特徴付けは、下記される実施例１３〜１５において詳述される。
【００８５】
このプロセスはまた、化合物の末端の１つが、−ＣＨ２−基によってデンドリマー骨格に結合される化合物をもたらすＣＨ２＝ＣＨ−末端部分を有するように、反応においてアリルアミンを、アミノ基を含み、隣接する炭素を有する二重結合を形成する末端炭素をも含むもう１つの化合物に置換して、これらの分岐鎖末端で他の異なる末端部分を有し、アミノ基も含むカルボシランデンドリマーの合成に利用できる。このような化合物は、単純に、式ＣＨ２＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｅ−ＮＨ２［式中、「ｅ」表記は０と２の間で変化する（ｅ＝１である場合は特にアリルアミンに対応する）］の、例えば第１級のアルキレンアミン、又は一端にアルケニル部分（ＣＨ２＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｅ−）、他端にアミノ基（第１級、第２級、第３級又は第４級）も含むより複雑な化合物であることができ、このような化合物はさらに、ＣＨ２＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｅ−アルケニル部分及びアミノ基間に−Ｒａ−部分を含むことができる。実施例４４及び４５において、このような化合物の１つの部分誘導体を分岐鎖端に含む、デンドリマー３１（１Ｇ−［Ｓｉ（（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）（Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２））］４）及び３２（２Ｇ−［Ｓｉ（（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）（Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２））］８）、特に、非市販製品（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２）Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）｛Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２｝の合成及び特徴付けが詳細に述べられ、その前の合成は実施例４４において記載される。
【００８６】
ＨＣｌを用いた四級化
−ＮＨ２末端基を有するデンドリマー１３〜１５の四級化は、溶媒としてジエチレンエーテル中ＨＣｌ（Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ溶液）の添加によって行うことができる（スキーム６）。
【化１９】
2009502765.tif 000022
【００８７】
イオン誘導体１Ｇ−［ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋Ｃｌ−］４（２８）、２Ｇ−［ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋Ｃｌ−］８（２９）、３Ｇ−［ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋Ｃｌ−］１６（３０）を該反応スキーム６に従って生成した。該化合物は白色固形物として沈殿し、溶媒及び反応に使用された過剰のＨＣｌを真空除去することによって容易に精製される。
【００８８】
これらのデンドリマーは、熱的に安定であり、ＤＭＳＯ、ＭｅＯＨ及び水に可溶である。これらの特徴付け及び純度は、前述のデンドリマーと同様に、元素分析（Ｈ、Ｃ、Ｎ）、ＮＭＲ分光法（１Ｈ、１３Ｃ及び２９Ｓｉ）及び質量分析（エレクトロスプレー又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって実証した。
【００８９】
ＭｅＩを用いた四級化
−ＮＭｅ２端末基を有するデンドリマー３１及び３２の四級化をスキーム４に従って実施し、ここで、デンドリマー３１及び３２の場合、Ｒは部分−［（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）（Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２）］に対応する。したがって、デンドリマー３１及び３２を、実施例４６及び４７に記載されるように、ジエチレンエーテル（Ｅｔ２Ｏ）中ヨウ化メチル（ＭｅＩと省略）で処理し、デンドリマー３３及び３４を生成した。
【００９０】
末端アミノ基を有するカルボシランデンドリマーの合成の実施例
下記に示す実施例は、本発明の目的を説明するためのみのものであり、いかなる限定も含むものではないことを理解されたい。
【００９１】
記載されるデンドリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの積分の値は、水素原子の総数の４分の１を示すのみである。
【００９２】
下記に見られる実施例１〜３０には、スキーム１において示される既知のプロセスに従って前に合成された前駆体デンドリマー（１Ｇ−Ｃｌ４、１Ｇ−Ｃｌ８、１Ｇ−Ｈ４、２Ｇ−Ｃｌ８、２Ｇ−Ｃｌ１６、１Ｇ−Ｈ８、３Ｇ−Ｃｌ４、１Ｇ−Ｃｌ８、１Ｇ−Ｈ４）から出発する末端アミノ基を有するカルボシランデンドリマーの合成が記載される。解説されたように、該前駆体デンドリマーは、本発明のカルボシランデンドリマーがデンドリマー分岐鎖の末端で変換されるリガンドを生じる化合物と反応させることによって、末端アミノ基を有して、形成される「骨格」として機能する。実施例１〜３０に記載されるデンドリマーの合成に使用する化合物は、：アリルアミン（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ２）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手）、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手）又は２−［（２−（ジメチルアミノエチル）メチル］アミノエタノール（ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手）又は３，５−ビス（ジメチルアミノエトキシ）ベンジルアルコール（ＣＨ２ＯＨ−（Ｃ６Ｈ３）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）２）であり、この最後の化合物はいかなる商業施設からも得られず、実施例７に記載したように、前もって合成する必要があった。これらの化合物が、本発明のカルボシランデンドリマーを生じるために使用される反応、並びに本発明のさらなるデンドリマーを生じるためのその四級化の詳細は、実施例１〜３０において下記される。
【実施例】
【００９３】
（実施例１〜１２）
（実施例１）１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）］４（１）の合成
僅かに過剰のＮＥｔ３（０．８６ｍｌ、６．２ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（０．６ｍｌ、５．９７ｍｍｏｌ）を、エーテル（５０ｍｌ）中１Ｇ−Ｃｌ４デンドリマー溶液（０．８５ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）に添加した。この反応混合物を周囲温度で１時間一定に攪拌しながら維持し、過剰のＮＥｔ３及び溶媒を真空除去して生じた残渣をエーテル（３０ｍｌ）で抽出した。得られた懸濁液をセライトでろ過し、反応中に生成したアンモニウム塩ＮＥｔ３・ＨＣｌを除去し、ろ過液を乾燥し、浅黄色油（０．９８ｇ、８４％）として化合物１を得た。
【化２０】
2009502765.tif 000023
【００９４】
（実施例２）１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２］４（２）の合成
第１世代デンドリマー２を、１について記載されたものと同様のプロセスに従って、１Ｇ−Ｃｌ８（０．５４ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（０．７ｍｌ、６．９４ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（１．０ｍｌ、７．２ｍｍｏｌ）から出発して調製した。このように、２を無色の油（０．７５ｇ、８０％）として生成した。
【化２１】
2009502765.tif 000024
【００９５】
（実施例３）２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）］８（３）の合成
第２世代デンドリマー３を、１について記載されたものと同様のプロセスに従って、２Ｇ−Ｃｌ８（０．２７ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（０．１５ｍｌ、１．４７ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（０．２５ｍｌ、１．７９ｍｍｏｌ）から出発して調製した。このように、３を無色の油（０．３１ｇ、９０％）として生成した。
【化２２】
2009502765.tif 000025
【００９６】
（実施例４）２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２］８（４）の合成
第２世代デンドリマー４を、１について記載されたものと同様のプロセスに従って、２Ｇ−Ｃｌ１６（０．４８ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（０．４８ｍｌ、４．７７ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（０．７ｍｌ、５．０２ｍｍｏｌ）から出発して調製した。このように、４を無色の油（０．６６ｇ、９０％）として生成した。
【化２３】
2009502765.tif 000026
【００９７】
（実施例５）３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）］１６（５）の合成
第３世代デンドリマー５を、１について記載されたものと同様のプロセスに従って、３Ｇ−Ｃｌ１６（０．２０ｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（０．１０ｍｌ、０．９９ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（０．１６ｍｌ、１．１４ｍｍｏｌ）から出発して調製した。このように、５を浅黄色の油（０．１８ｇ、７４％）として生成した。
【化２４】
2009502765.tif 000027
【００９８】
（実施例６）３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２］１６（６）の合成
第３世代デンドリマー６を、１について記載されたものと同様のプロセスに従って、３Ｇ−Ｃｌ３２（０．１９ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（０．１７ｍｌ、１．６８ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（０．２４ｍｌ、１．７９ｍｍｏｌ）から出発して調製した。このように、６を浅黄色の油（０．２０ｇ、７２％）として生成した。
【化２５】
2009502765.tif 000028
【００９９】
（実施例７）１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２）］４（７）の合成
７．１  ３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２−（Ｃ６Ｈ３）−ＣＨ２ＯＨの合成
デンドリマー７，８及び９（言い換えると、デンドリマー２２、２３及び２４を生成するための出発デンドリマー）を合成するという目的で、リガンド３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２−（Ｃ６Ｈ３）−ＣＨ２として後に使用する化合物を前もって合成することが必要である。このために、溶媒としてアセトン中３，５−ジヒドロキシベンジルアルコール（１．４７ｇ、１０．３９ｍｍｏｌ）の溶液中に、２当量の２−クロロ−Ｎ，Ｎジメチルアミノエタン塩酸（２．９８ｇ、２０．７８ｍｍｏｌ）、４．５当量のＫ２ＣＯ３（６．４３ｇ、４６．７５ｍｍｏｌ）、１８−Ｃｏｒｏｎａ−６エーテルコロナ（０．５４ｇ、２ｍｍｏｌ）及びスパチュラ先端量のＫＩを添加した。この反応を還流で４８時間維持した。溶媒の真空除去後、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ（２×５０ｍｌ）で抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で１時間乾燥した。次いで、ろ過し、溶媒を真空除去し、浅黄色の油を生じてヘキサン（２×１０ｍｌ）で洗浄し、１８−Ｃｏｒｏｎａ−６エーテルコロナを除去した。この結果、目的の化合物を浅黄色の油（１．５３ｇ、５０％）として生成した。
【化２６】
2009502765.tif 000029
【０１００】
この化合物を下記するデンドリマー７，８及び９の合成に使用した。
【０１０１】
７．２  デンドリマー７の合成
僅かに過剰のＮＥｔ３（０．１２ｍｌ、０．８７ｍｍｏｌ）及び３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２−（Ｃ６Ｈ３）−ＣＨ２ＯＨ（０．２２ｇ、０．３７８ｍｍｏｌ）を、エーテル（３０ｍｌ）中１Ｇ−Ｃｌ４（０．１１ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）デンドリマー溶液に添加する。この反応混合物を周囲温度で１時間一定に攪拌しながら維持し、過剰のＮＥｔ３及び溶媒を真空除去後して生じた残渣をエーテル（２×２０ｍｌ）で抽出した。得られた懸濁液をセライトでろ過し、反応中に生成したアンモニウム塩ＮＥｔ３・ＨＣｌを除去し、ろ過液を乾燥し、浅黄色油（０．２３ｇ、８０％）として化合物７を得た。
【化２７】
2009502765.tif 000030
【０１０２】
（実施例８）２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２）］８（８）の合成
第２世代デンドリマー８を、７について記載されたものと同様のプロセスに従って、２Ｇ−Ｃｌ８（０．２７ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）；ＮＥｔ３（０．２２ｍＬ、１．６２ｍｍｏｌ）及び３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２−（Ｃ６Ｈ３）−ＣＨ２ＯＨ（０．４３ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）から出発して調製した。このように、８を浅黄色の油として生成した（０．５４ｇ；８２％）。
【化２８】
2009502765.tif 000031
【０１０３】
（実施例９）３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２）］１６（９）の合成
第３世代デンドリマー９を、７について記載されたものと同様のプロセスに従って、３Ｇ−Ｃｌ１６（０．０７２ｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）；ＮＥｔ３（０．０６０ｍｌ、０．４３ｍｍｏｌ）及び３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２−（Ｃ６Ｈ３）−ＣＨ２ＯＨ（０．１０１ｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）から出発して生成した。このように、９を浅黄色の油として生成した（０．１１０ｇ；６９％）。
【化２９】
2009502765.tif 000032
【０１０４】
（実施例１０）１Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２）］４（１０）の合成
僅かに過剰のＮＥｔ３（０．５ｍｌ、３．５８ｍｍｏｌ）及び２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］メチルアミノ｝エタノール（０．３５ｍｌ、２．１９ｍｍｏｌ）を、エーテル（３０ｍｌ）中１Ｇ−Ｃｌ４（０．３１ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）デンドリマー溶液に添加した。この反応混合物を周囲温度で１２時間一定に攪拌しながら維持し、過剰のＮＥｔ３及び溶媒を真空除去後生じた残渣をエーテル（２×２０ｍＬ）で抽出した。得られた懸濁液をセライトでろ過し、反応中に生成したアンモニウム塩ＮＥｔ３・ＨＣｌを除去し、ろ過液を乾燥し、無色の油として化合物１０を得た（０．３ｇ、５７％）。
【化３０】
2009502765.tif 000033
【０１０５】
（実施例１１）２Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２）］８（１１）の合成
第３世代デンドリマー１１を、１０について記載されたものと同様のプロセスに従って、２Ｇ−Ｃｌ８（１．１２ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）、ＮＥｔ３（１ｍｌ、７．１７ｍｍｏｌ）及び２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］メチルアミノ｝エタノール（１ｍｌ、６．１６ｍｍｏｌ）から出発して生成した。このように、１１を浅黄色の油として生成した（１．３ｇ、７２％）。
【化３１】
2009502765.tif 000034
【０１０６】
（実施例１２）３Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２）］１６（１２）の合成
第３世代デンドリマー１２を、１０について記載されたものと同様のプロセスに従って、３Ｇ−Ｃｌ１６（０．４９ｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）、ＮＥｔ３（０．４０ｍｌ、２．８６ｍｍｏｌ）及び２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］メチルアミノ｝エタノール（０．３９ｍｌ、２．４３ｍｍｏｌ）から出発して生成した。このように、１２を浅黄色の油として生成した（０．５１ｇ、６７％）。
【化３２】
2009502765.tif 000035
【０１０７】
これらのデンドリマーは、高収率で、透明な茶色の油状生成物として生成される。これら総ては、普通の水に可溶で、有機溶媒に不溶である。
【０１０８】
誘導体１〜１２の分光及び分析の詳細は、図１ａに示す提案構造と一致する。したがって、前のデンドリマーの１Ｈ−ＮＭＲにおけるカルボシラン骨格に対応するシグナルは、異なる世代において類似の核について化学変位を示すが、シグナルはデンドリマー世代が増すにつれてより広く、より崩れたものになる。これらの特性は主に、２つの要因に起因し、それは、異なる世代の核に化学環境の極めて僅かな相違を与えるこれらの誘導体のポリマータイプ構造、及び世代を増すと最も外側の層においてそれぞれのプロトンの移動性が制限されることである［２６］。
【０１０９】
これらのスペクトルは、メチレン基に割り当てられる３つのシグナル群を示す。ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ分岐鎖において、中央のメチレン基は１．３０ｐｐｍに見られるが、ケイ素原子に直接結合したメチレン基は０．６１及び０．５１ｐｐｍに局在する。０．６１ｐｐｍにある中心シグナルはＣＨ２ＳｉＯ−基に割り当てられたが、０．５１ｐｐｍにある中心シグナルはメチレン基部分に起因し、これは、１Ｄ１Ｈ−ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹ実験において、デンドリマー世代を増加させるとこの最後のシグナルの積分強度が増加することに基づく。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルにおいて、内部のＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ分岐鎖のメチレン基は、２１．３〜１７．４ｐｐｍの範囲にシグナルを有する。これらシグナルの完全な割り当ては、ＨＭＱＣ実験の助けでなされた。最後に、−ＳｉＭｅ２−及び−ＳｉＭｅ−断片は、総ての誘導体及び世代において容易に区別できる。２９Ｓｉ  ＮＭＲスペクトルも提案された式に従うが、これらのスペクトルにおいて最も内部のケイ素原子は、第１世代デンドリマーにおいて見られるのみである。
【０１１０】
これらのデンドリマーの末端基の特徴付けに関して、ここで、実施例によって、これらの基の特徴付けは、誘導体１〜６において記載される。化合物の部分の特徴付けは、同様に行われ、これらの各々に対する詳細は、本研究の実験部分に反映される。
【０１１１】
デンドリマー１〜６において、１つの三重項が、３．６４（デンドリマー１，３及び５に対して）並びに３．７４（デンドリマー２，４及び６に対して）に局在する外側断片−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２について見られ、−ＯＣＨ２−基に割り当てられ、もう１つの２．４３ｐｐｍに中心がある三重項が、いかなる場合においても−ＣＨ２Ｎ−基に対応する。デンドリマー２、４及び６における−ＯＣＨ２−に対応するシグナルに見られる低いフィールド変位は、これらの誘導体のケイ素原子に結合した２つの酸素原子の存在と一致するが、この効果は−ＣＨ２Ｎ−基について感知できない。窒素に結合したメチル基は、１Ｈ及び１３Ｃそれぞれに対応するＮＭＲにおいて、総ての場合に２．２３及び４６．１ｐｐｍに現れる。
【０１１２】
これらの化合物の特徴付けは、マトリックスとして１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（ジトラノール）を使用する質量分析（エレクトロスプレー又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて完了した。しかし、分子ピークは、第２及び第３世代について見ることができず、他の多くの高分子量デンドリマーについて記載されている事実である［２７、４６〜４９］。
【０１１３】
（実施例１３〜１５）
（実施例１３）１Ｇ−［Ｓｉ（ＣＨ２）３ＮＨ２］４（１３）の合成
アリルアミン（１．５ｍｌ、１９．９９ｍｍｏｌ）及び２滴のＫａｒｓｔｅｄｔ触媒（３〜３．５％Ｐｔ）を、最小量のＴＨＦ（１ｍｌ）中１Ｇ−Ｈ４（０．５４ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）デンドリマー溶液に加えた。この反応混合物を真空アンプル中で４時間の間に１２０℃に加熱し、反応混合物を乾燥して、溶媒及び過剰のアルリアミンを除去し、得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、セライト及び活性炭でろ過した。生成した溶液を溶媒を真空除去して乾燥し、無色の油（０．９０ｇ、８３％）として化合物１３を生じた。このデンドリマーの構造を図１ｂに示す。
【化３３】
2009502765.tif 000036
【０１１４】
（実施例１４）２Ｇ−［Ｓｉ（ＣＨ２）３ＮＨ２］８（１４）の合成
第２世代デンドリマー１４を、１３について記載されたものと同様のプロセスに従って、２Ｇ−Ｈ８（０．４２ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、アリルアミン（２ｍｌ、２６．７ｍｍｏｌ）、１ｍｌのＴＨＦ及び２滴のＫａｒｓｔｅｄｔ触媒から出発して調製した。このように、１４を無色の油（０．３２ｇ、５５％）として生成した。このデンドリマーの構造を図１ｂに示す。
【化３４】
2009502765.tif 000037
【０１１５】
（実施例１５）３Ｇ−［Ｓｉ（ＣＨ２）３ＮＨ２］１６（１５）の合成
第３世代デンドリマー１５を、１３について記載されたものと同様のプロセスに従って、３Ｇ−Ｈ１６（０．１００ｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）、アリルアミン（２ｍｌ、２６．７ｍｍｏｌ）、１ｍｌのＴＨＦ及び２滴のＫａｒｓｔｅｄｔ触媒から出発して調製した。このように、１５を無色の油（０．０８５ｇ、６４％）として生成した。
【化３５】
2009502765.tif 000038
【０１１６】
（実施例１６〜２７）
（実施例１６）１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］４（１６）の合成
エーテル（０．８ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．４ｍｌを、エーテル（１０ｍｌ）中１（０．１２ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。この反応混合物を、周囲温度で４８時間一定の攪拌で維持し、次いで、乾燥して過剰のＭｅＩを除去した。得られた残渣をＥｔ２Ｏ（２×５ｍｌ）で洗浄し、真空乾燥して、化合物１６を白色の固形物（０．２０ｇ、９６％）として生成した。
【化３６】
2009502765.tif 000039
【０１１７】
（実施例１７）１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］４（１７）の合成
第１世代デンドリマー１７を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、２（０．１７ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及びエーテル（１．６ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．８０ｍｌから出発して、調製した。このように、１７を白色の固形物（０．２９ｇ、８６％）として生成した。
【化３７】
2009502765.tif 000040
【０１１８】
（実施例１８）２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］８（１８）の合成
第２世代デンドリマー１８を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、３（０．２５ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びエーテル（１．２ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．６ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物１８を白色の固形物（０．３５ｇ、８７％）として生成した。
【化３８】
2009502765.tif 000041
【０１１９】
（実施例１９）２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］８（１９）の合成
第２世代デンドリマー１９を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、４（０．１０ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）及びエーテル（１．０ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．５ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物１９を白色の固形物（０．１７ｇ、８７％）として生成した。
【化３９】
2009502765.tif 000042
【０１２０】
（実施例２０）３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］１６（２０）の合成
第３世代デンドリマー２０を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、５（０．１２ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）及びエーテル（０．８ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．４ｍｌから出発して、調製した。このように、２０を白色の固形物（０．１６ｇ、８３％）として生成した。
【化４０】
2009502765.tif 000043
【０１２１】
（実施例２１）３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］１６（２１）の同定
第３世代デンドリマー２１を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、６（０．０６０ｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びエーテル（０．４ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．２ｍｌから出発して、調製した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ブロードなシグナルを示し、末端アミノ基の約９０％が四級化されたことを示し、このため化合物２１は純粋に単離されなかった。
【化４１】
2009502765.tif 000044
【０１２２】
（実施例２２）１Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］４（２２）の合成
第１世代デンドリマー２２を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、７（０．１ｇ、０．０６ｍｍｏｌ）及びエーテル（０．７ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．３５ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物２２を白色の固形物（０．１４ｇ、９０％）として生成した。
【化４２】
2009502765.tif 000045
【０１２３】
（実施例２３）２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２）］８（２３）の合成
第２世代デンドリマー２３を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、８（０．０８ｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）及びエーテル（０．４ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．２０ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物２３を白色の固形物（０．１１ｇ、８５％）として生成した。
【化４３】
2009502765.tif 000046
【０１２４】
（実施例２４）３Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２−（Ｃ６Ｈ３）−３，５−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２）］１６（２４）の合成
第３世代デンドリマー２４を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、９（０．０８４ｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びエーテル（０．５ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．２５ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物２４を白色の固形物（０．０８０ｇ、７２％）として生成した。
【化４４】
2009502765.tif 000047
【０１２５】
（実施例２５）１Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］４（２５）の同定
第１世代デンドリマー２５を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、１０（０．０４３ｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）及びエーテル（０．１８８ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．０９４ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物２５を白色の固形物として生成した。この化合物は純粋に単離されず、双方の窒素原子が参加することができる非選択的四級化プロセスのために混合物が見られたが、化合物２５はこの混合物の主成分である。
【化４５】
2009502765.tif 000048
【０１２６】
（実施例２６）２Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］８（２６）の同定
第２世代デンドリマー２６を、１６について記載されたものと同様のプロセスに従って、１１（０．１９ｇ、０．０８ｍｍｏｌ）及びエーテル（０．６８ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．３４ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物２６を浅黄色の固形物として生成した。この化合物は純粋に単離されず、双方の窒素原子が参加することができる非選択的四級化プロセスのために混合物が見られたが、化合物２６はこの混合物の主成分である。
【化４６】
2009502765.tif 000049
【０１２７】
（実施例２７）３Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］１６（２７）の同定
第３世代デンドリマー２７を、１６について記載されたものと同様の処理プロセスに従って、２０（０．０８４ｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）及びエーテル（０．２７ｍｍｏｌ）中２Ｍ  ＭｅＩ溶液０．１３ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物２７を浅黄色の固形物として生成した。この化合物は純粋に単離されず、双方の窒素原子が参加することができる非選択的四級化プロセスのために混合物が見られたが、化合物２７はこの混合物の主成分である。
【化４７】
2009502765.tif 000050
【０１２８】
第３世代デンドリマー２１、２４及び２７の場合、ジメチルアミノ基の四級化は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって示されるように完全ではなく、これから、過剰のＭｅＩの存在下で、より長期間反応させたままにしても、これらの複合体の末端ジメチルアミノ基の約９０％が四級化されたことが推定できる。
【０１２９】
これら総てのイオン性誘導体は、通常の有機溶媒に不溶であるが、ＤＭＳＯ、ＭｅＯＨ及び水に可溶である。
【０１３０】
誘導体１６〜２７の分光及び分析情報は、図２ａに示される提案構造と一致している。溶媒としてＤＭＳＯ中、周囲温度で作られたこれらの誘導体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルに現れるシグナルは、普通の有機溶媒中のこれらの前駆体のものよりブロードである。この事実は、以前に他の水溶性カルボシランデンドリマーについて記載され、これらの優勢に疎水性のデンドリマーの一部の移動性の減少の結果として広がる双極子の効果として説明された［２９］。
【０１３１】
デンドリマー１６〜２７の１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、カルボシラン骨格について、その前駆体１〜１２と同一の共鳴パターンを示すが、世代を増加させるとシグナルの広がりの増加が見られる。
【０１３２】
末端アミノ基を有するデンドリマーと同様に、これらの誘導体について、ここで詳細に誘導体１６〜２１についてのみ外部の基のシグナルの割り当てについて詳細に記載し、同様に誘導体の部分における割り当てをした。
【０１３３】
外部基ＳｉＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−は、−ＯＣＨ２−基のメチレンのプロトンに割り当て可能な３．９４（デンドリマー１６、１８及び２０に対し）又は４．１２（デンドリマー１７、１９及び２１に対し）、及び断片−ＣＨ２Ｎ−のプロトンに割り当てられる３．４５（デンドリマー１６，１８及び２０に対し）又は３．５６（デンドリマー１７，１９及び２１に対し）に中心を置くブロードな多重線を生じる。アミノ基の四級化は、−ＯＣＨ２−シグナルにおける０．３〜０．４ｐｐｍの低いフィールド変位を生ずるが、−ＣＨ２Ｎ−基のメチレンのプロトンは、約１ｐｐｍ変位する。窒素に直接結合するメチル基は、それぞれ３．１８及び５２．６ｐｐｍに中心を置く１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲシグナルを示すが、これはアミノ基で終わるデンドリマー１〜６に見られるシグナルに関する低いフィールド変位と考えられる。これらの変化は、アンモニウム基で終わるデンドリマー１６〜２１における窒素原子上の正電荷の存在に従う。
【０１３４】
（実施例２８〜３０）
（実施例２８）Ｇ１［Ｓｉ（ＣＨ２）３ＮＨ３＋Ｃｌ−］４（２８）の合成
Ｅｔ２Ｏ中ＨＣｌの１Ｍ溶液１．２ｍｌ（１．２ｍｍｏｌ）をＥｔ２Ｏ４０ｍｌ中化合物１３（０．１７ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。この反応を周囲温度で２時間一定の攪拌状態で維持し、その後白色の沈殿物の出現が見られた。溶媒及び過剰のＨＣｌを真空で除去し、このように、２８を定量的収量で白色の固形物として生成した。このデンドリマーの構造を図２ｂに示す。
【化４８】
2009502765.tif 000051
【０１３５】
（実施例２９）２Ｇ−［Ｓｉ（ＣＨ２）３ＮＨ３＋Ｃｌ−］８（２９）の合成
第２世代デンドリマー２９を、２８について記載されたものと同様のプロセスに従って、１４（０．０９ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びエーテル中ＨＣｌ（０．０６ｍｍｏｌ）の１Ｍ溶液０．６ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物２９を浅黄色固形物（０．０６ｇ、５５％）として生成した。このデンドリマーの構造を図２ｂに示す。
【化４９】
2009502765.tif 000052
【０１３６】
（実施例３０）３Ｇ−［Ｓｉ（ＣＨ２）３ＮＨ３＋Ｃｌ−］１６（３０）の合成
第３世代デンドリマー３０を、２８について記載されたものと同様のプロセスに従って、１５（０．０６０ｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）及びエーテル中ＨＣｌ（０．３０ｍｍｏｌ）の１Ｍ溶液０．３０ｍｌから出発して、調製した。このように、化合物３０を浅黄色固形物（０．０５４ｇ、７８％）として生成した。
【化５０】
2009502765.tif 000053
【０１３７】
新規デンドリマーの生体適合性研究、ポリアニオン及び血漿タンパク質への結合並びにデンドリプレックスの生物学的挙動の特徴付け
前に示されたように、本発明の態様の１つは、本発明の少なくとも１つのデンドリマーを含む医薬組成物によって構成され、アニオン性を有し、且つ、影響を受け、結合し得る又はその安定性に影響を受け得る血漿タンパク質との相互作用から保護する必要がある医薬的目的を有する他の物質を一緒に含み、デンドリマーがこの物質の標的細胞への血流中の運搬を容易にするビヒクルとして含むものであるか、本発明のデンドリマーの１つ又は複数によって、その作用を予防し、緩和し、又は排除することを目的とする疾患を引き起こす微生物のライフサイクルと相互作用する能力を有する活性物質としてデンドリマーが含まれる医薬組成物である。本発明のこの態様の好ましい実施形態の１つにおいて、本発明の１つ又は複数のデンドリマーがビヒクルとして役立つアニオン特性を有する分子は、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）、好ましくはアンチセンスＯＤＮ、又は比較的長い二本鎖ＤＮＡ分子若しくは干渉ＲＮＡである。本発明のデンドリマー又は病原体若しくは遺伝子欠陥によって引き起こされる疾患を予防又は治療するためにこれらを含む組成物の使用はまた、本発明の態様である。
【０１３８】
したがって、新規に提案されるデンドリマーの生体適合性を試験し、ポリアニオン及び血漿タンパク質への結合を特徴付け、本発明のデンドリマーと選択されたポリアニオンとの間に形成されるデンドリプレックス型複合体の生物学的挙動を分析することを決定した。
【０１３９】
これらの試験を行うために選択したデンドリマーは、以下の通りである。
デンドリマー：
【化５１】
2009502765.tif 000054
【化５２】
2009502765.tif 000055
【化５３】
2009502765.tif 000056
【化５４】
2009502765.tif 000057
Ｇ４：（第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）
１４０末端アミノ基
分子量＝１４．２１５
【０１４０】
最後の２つ、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ及びＧ４は、本発明のカルボシランデンドリマーに関して比較として使用される市販のＰＡＭＡＭデンドリマーである。
【０１４１】
ＣＢＳの物理化学的特性：水溶解度
本発明の総てのカルボシランデンドリマーは、加熱を必要とすることなく、穏やかな攪拌によって開始溶液（２ｍｇ／ｍｌ）のために使用する濃度で水溶性である。
【０１４２】
実験を行うために、使用する総てのＣＢＳを開始濃度（２μｇ／μｌ≡２ｍｇ／ｍｌ）で再懸濁した。
【０１４３】
（実施例３１）ＣＢＳ及びＯＤＮ間の複合体形成
使用するＯＤＮ
使用するオリゴヌクレオチド配列は、ＨＩＶ  ＲＮＡに対して向けられたアンチセンス配列（相補的）であった。その長さは、１５〜２８塩基で変化し、ホスホロチオエートの性質を有していた。使用する具体的ＯＤＮ及びその配列を以下の表１に示す。
【０１４４】
【表３】
2009502765.tif 000058
【０１４５】
ＯＤＮのいくつかを５’末端において蛍光性で使用し、これは、文字Ｆをその表記に付加することによって示す。したがって、「ＧＦ」は、末端５’における蛍光抗ｇａｇＯＤＮについて言い、「ＲＦ」は、末端５’における蛍光抗ＲｅｖＯＤＮについて言う。
【０１４６】
使用する総てのＯＤＮを１μｇ／μｌの濃度で再懸濁した。
【０１４７】
アガロースゲルにおける複合体の表示
ＰＡＭＡＭ型デンドリマーと血漿ＤＮＡとの複合体形成又はその同位体標識によるＯＤＮの形態における複合体形成の研究についてのアガロースゲルの使用は、知られている。この種の手法に基づいて、もし可能であるならば放射性同位体を使用することなく、この特性を研究することを可能にさせるゲルを作製することを試みた。
【０１４８】
使用するＯＤＮの大きさが小さいことに留意して、ＯＤＮ及びデンドリプレックスの移動を示すために様々なアガロース濃度を使用した。最終的に、１×ＴＡＥ中の３％アガロース濃度を最良のものとして選択した。非蛍光ＯＤＮの移動を蛍光のものと比較し、両者は同じ高さで移動したが、後者は感知されるシグナルを著しく増加させた。これらを使用して、ＯＤＮの同位体標識を回避した。二重ウェルを製造し、これらのゲルを調製し、６０μｌの容量を入れることを可能とし、その５０μｌはＲＰＭＩにおける試料の混合容量であり、１０μｌは、グリセロールと一緒に緩衝剤を入れた。サイズマーカーとして、１００塩基対のラダーを使用した（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（登録商標））。
【０１４９】
複合体形成
行った総ての試験における複合体形成について、ゲル上及び細胞上の該複合体における正及び負の電荷数間の比を取った。ＰＡＭＡＭデンドリマーに関する研究において異なる著者により発表されたように、形成される複合体は、負に荷電した細胞膜糖タンパク質との結合を容易にするために過剰の正電荷を有することが必要であり、その結果エンドサイトーシスプロセスを開始する。同様に、過剰の正電荷を付加し、デンドリマー−ＤＮＡ複合体の形成を確実にする。したがって、ＣＢＳデンドリマーと様々な核酸との複合体は、負電荷（ＯＤＮによって与えられる）に比べて過剰な数の正電荷（ＣＢＳによって与えられる）の中で形成される。それにもかかわらず、異なる電荷比について試験し、デンドリマーの電荷の数（固定）及びＯＤＮの負電荷の数（やはり固定）に基づいて計算した。全体として正電荷を有する複合体を形成するのに総てのデンドリマーにおいて十分なように、正／負電荷を２／１比に固定したが、一部の実験において正電荷と等しい数の負電荷又は過剰の負電荷のバランスとした。
【０１５０】
ＳＦについて、メーカーにより提案された電荷比を使用し、Ｇ４  ＰＡＭＡＭについて、Ｓａｔｏら（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００１  Ｎｏｖ；７（１１）：３６０６〜１２）によって提案されたものに従って、ＰＡＭＡＭ型デンドリマーに優位に１００対１の過剰モルを使用した。
【０１５１】
総ての試験において、６０μｌの複合体形成容量を使用し、支持培地としてＲＰＭＩ血清を有さないフェノールレッドを使用した。
【０１５２】
形成される複合体の電気泳動
複合体形成の試験を、本発明のＩＭ８、ＣｌＮＨ４、ＮＮ、Ｐｈｅ及びＩＭ１６のデンドリマーに関して使用した。
【０１５３】
異なるＯＤＮ及び異なるデンドリマーの混合物から生じる試料に関して実施した電気泳動の結果を図３に示す。これらに現れる異なるゲルに入れた試料は以下である：
ＩＭ８：
図３ａ  ＩＭ８及びＯＤＮ  ＧＦ間の複合体形成。電気泳動に供した試料は以下であった：
レーン１：１００ｂｐラダー
レーン２：４μｌ  ＧＦ＋４．５２μｌ  ＩＭ８＋９１．４８μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝２／１
レーン３：４μｌ  ＧＦ＋９．０３μｌ  ＩＭ８＋８６．９７μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝４／１
レーン４：４μｌ  ＧＦ＋４５．２μｌ  ＩＭ８＋５０．８μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝２０／１
レーン５：４μｌ  ＧＦ＋９０．４μｌ  ＩＭ８＋５．６μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝４０／１
レーン６：４μｌ  ＧＦ＋９６ＲＰＭＩ
レーン７：４．５２μｌ  ＩＭ８＋９５．４８μｌ  ＲＰＭＩ
レーン８：９．０３μｌ  ＩＭ８＋９０．９７μｌ  ＲＰＭＩ
レーン９：４５．２μｌ  ＩＭ８＋５４．８μｌ  ＲＰＭＩ
レーン１０：９０．４μｌ  ＩＭ８＋９．６μｌ  ＲＰＭＩ
【０１５４】
電気泳動の結果は、ＩＭ８がＤＮＡを保持することができることを示す。正電荷の増加の大きさ（デンドリマー量）にかかわらず、もはや上方に移動しない限界に達するまで、電荷が増えるほど、複合体はより負極に向かって移動する（恐らく、総てのＤＮＡ分子は既にＣＢＳ−ＩＭ８と複合体を形成しており、ゲルの孔の大きさがそれを許容しないために）。
【０１５５】
図３ｂ  ＩＭ８及び異なる大きさのＯＤＮ（電荷比２／１）を有する試料の電気泳動。電気泳動に供した試料は以下であった：
レーン１：１００ｂｐラダー
レーン２：ＲＦ：４．５μｌ＋５６μｌ  ＲＰＭＩ
レーン３：ＲＦ：４．５μｌ＋５．３μｌ  ＩＭ８＋５０μｌ  ＲＰＭＩ
レーン４：ＰＰＴ３μｌ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ
レーン５：ＰＰＴ３μｌ＋３．４μｌ  ＩＭ８＋５４μｌ  ＲＰＭＩ
レーン６：ＰＰＴ−ＴＦＯ２．５μｌ＋５８μｌ  ＲＰＭＩ
レーン７：ＰＰＴ−ＴＦＯ２．５μｌ＋２．８μｌ  ＩＭ８＋５５μｌ  ＲＰＭＩ
レーン８：ＴＡＲ２．６μｌ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ
レーン９：ＴＡＲ２．６μｌ＋３μｌ  ＩＭ８＋５５μｌ  ＲＰＭＩ
【０１５６】
電気泳動の結果は、ＩＭ８が総てのＯＤＮの移動を保持できることを示す。これは、ＯＤＮの長さが複合体形成の決定因子ではないことを最初に示すものである。
【０１５７】
ＣｌＮＨ４
図３ｃ  ＣｌＮＨ４及びＯＤＮ  ＲＦ間の複合体形成。電気泳動に供した試料は以下であった：
レーン１：ＲＰＭＩ対照
レーン２：ＲＦ４．５μｌ＋３．３μｌ  ＣｌＮＨ４＋５２μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝２
レーン３：ＲＦ４．５μｌ＋５５μｌ  ＲＰＭＩ
レーン４：ＲＦ２．２５μｌ＋３．３μｌ  ＣｌＮＨ４＋５５μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝４
レーン５：ＲＦ２．２５μｌ＋５８μｌ  ＲＰＭＩ
レーン６：ＲＦ１．２８μｌ＋３．３μｌ  ＣｌＮＨ４＋５６μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝７
レーン７：ＲＦ１．２８μｌ＋５８μｌ  ＲＰＭＩ
レーン８：３．３μｌ  ＣｌＮＨ４＋５７μｌ  ＲＰＭＩ
レーン９：１００ｂｐラダー
【０１５８】
得られた結果によると、ＣｌＮＨ４は、また評価する総ての電荷比を有するＤＮＡを保持することができる。
【０１５９】
ＮＮ及びＰｈｅ
図３ｄ  ＯＤＮ  ＲＦ及びＮＮ若しくはＰｈｅデンドリマー間の複合体形成。電気泳動に供した試料は以下であった：
レーン１：４．５μｌＲＦ＋６μｌ  Ｇ２ＮＮ＋５０μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝２
レーン２：４．５μｌＲＦ＋２１μｌ  Ｇ２ＮＮ＋３５μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝７
レーン３：１．３μｌＲＦ＋６μｌ  Ｇ２ＮＮ＋５３μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝７
レーン４：２．２５μｌＲＦ＋３μｌ  Ｇ２ＮＮ＋５５μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝２
レーン５：２．２５μｌＲＦ＋１０．５μｌ  Ｇ２ＮＮ＋４８μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝７
レーン６：０．６４μｌＲＦ＋３μｌ  Ｇ２ＮＮ＋５６μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝７
レーン７：２．２５μｌＲＦ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ
レーン８：４．５μｌＲＦ＋５μｌ  Ｇ２Ｐｈｅ＋５５μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝２
レーン９：４．５μｌＲＦ＋１７．５μｌ  Ｇ２Ｐｈｅ＋３８μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝７
レーン１０：１．３μｌＲＦ＋５μｌ  Ｇ２Ｐｈｅ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝７
レーン１１：２．２５μｌＲＦ＋２．５μｌ  Ｇ２Ｐｈｅ＋５５μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝２
レーン１２：２．２５μｌＲＦ＋８．７５μｌ  Ｇ２Ｐｈｅ＋５０μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝７
レーン１３：０．６４μｌＲＦ＋２．５μｌ  Ｇ２Ｐｈｅ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝７
【０１６０】
この電気泳動の結果はまた、ＮＮ及びＰｈｅ双方がＯＤＮと複合体を形成することもできることを示す。
【０１６１】
ＩＭ１６
図３ｅ  ＯＤＮ  ＰＰＴ、ＩＭ８デンドリマー、ＩＭ１６デンドリマー及びデンドリマーがそれから形成される対応するモノマー間の複合体形成。電気泳動に供した試料は以下である：
レーン１：１００ｂｐラダー
レーン２：ＰＰＴ２．５７μｌ＋３μｌ  ＩＭ８＋５４μｌ  ＲＰＭＩ
レーン３：ＰＰＴ２．５７μｌ＋２．３５μｌ  ＩＭ１６＋５５μｌ  ＲＰＭＩ
レーン４：ＰＰＴ２．５７μｌ＋１．８μｌモノマー＋５５μｌ  ＲＰＭＩ
レーン５：ＰＰＴ２．５７μｌ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ
【０１６２】
ＯＤＮ及びＩＭ１６デンドリマーを含む試料が流されるレーンにおいて、後者はまた、ＤＮＡを保持することができる。
【０１６３】
したがって、試験した第２世代ＣＢＳは、正極に向かうＤＮＡの移動を保持することができ、これは総ての場合においてＣＢＳ及びＯＤＮ間の静電的形成体の形成を反映していた：試験したＣＢＳの小さい世代は、ＤＮＡを保持するための障害ではない。ＤＮＡを有しないデンドリマーは、その部分について、弱い、ほとんど感知できないシグナルを発する。
【０１６４】
形成される複合体におけるデンドリマーの完全性の研究
本研究において使用するＣＢＳの合成工程は、共通の構造の初期の核から始まり、デンドリマーに正電荷を与え、無極の性質であるデンドリマーの核自体間の相違を決定する様々な官能基の使用によるその外周における官能化で終わる。使用する官能基とデンドリマーの核との結合の一部は、水性溶液において不安定であるので、アガロースゲルにおけるＤＮＡ保持、及び、したがって、ＣＢＳ及びＤＮＡ間の複合体形成が、保存されている全体的なデンドリマーの構造により得るのか、対照的に、ＤＮＡ保持の原因となるデンドリマーの核の部分から離れた末端官能基により得るのかを決定するために試験を行った。このために、ゲルを使用して、複合体をＯＤＮ及び完全ＣＢＳ間並びに恐らくはＯＤＮ及びカルボシラン骨格が官能化した末端官能基間（この場合は四級化ジメチルエタノールアミン）で形成した。先に解説を付けたように、末端官能基としてデンドリマーに結合する正に荷電した分子は、デンドリマーにその電荷を与える。対照として、ＯＤＮ−デンドリマー混合物、ＯＤＮ−モノマー混合物及びＯＤＮ単独を比較した。対応するゲルを図３ｅに示し、これについて既に言及をしており、ここで比較され、電気泳動に供した試料は以下である：
レーン１：１００ｂｐラダー
レーン２：デンドリマー又はオリゴヌクレオチドを含まないＲＰＭＩ培地を有する対照
レーン３：ＰＰＴ２．５７μｌ＋３μｌ  ＩＭ８＋５４μｌ  ＲＰＭＩ
レーン４：ＰＰＴ２．５７μｌ＋２．３５μｌ  ＩＭ１６＋５５μｌ  ＲＰＭＩ
レーン５：ＰＰＴ２．５７μｌ＋１．８μｌモノマー＋５５μｌ  ＲＰＭＩ
レーン６：ＰＰＴ２．５７μｌ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ
【０１６５】
この試験の結果は、完全なデンドリマー構造がＤＮＡを保持するために必要であり、その正電荷にもかかわらず、モノマーはＤＮＡを保持することができないことを明らかに示す。したがって、これらの濃度で、デンドリマー構造は全体として維持されたであろう。
【０１６６】
（実施例３２）異なるｐＨにおけるデンドリプレックスの安定性
ｐＨが酸性化又はアルカリ化する異なる解剖学的な組織又は細胞局在が存在するので、ｐＨの変化がどのように複合体に影響するかを決定するために、異なるｐＨにおける複合体について安定性研究を実施した。実施例は、胃環境の酸、小腸の脾臓分泌のアルカリ、又は生理学的ｐＨ（７．３５〜７．４５）から約４の酸性ｐＨで変化する細胞レベルにおけるエンドソーム−リソソーム挙動である。したがって、どのｐＨ範囲でＤＮＡ複合体が、使用する異なるＣＢＳで維持され得るか知ることは興味深い。複合体は常習的なプロセスに従って形成し、容量を、異なるｐＨにおける過剰な異なる溶液に加えた。
【０１６７】
したがって、実施例３１によるデンドリマーＰｈｅ、ＣｌＮＨ４、ＮＮ、ＩＭ８及びＩＭ１６の各々１つに対して、２／１電荷比及び以下のｐＨ：２．８；２．７；４．７；５．７；６．４；７．４；８を有し、ＰＰＴと形成したデンドリプレックスの７つの溶液を調製した。
【０１６８】
得られた結果を、図４に見られる電気泳動ゲルにおいて示し、ここで、正常ＯＤＮ移動バンドの高さは、ゲルの低い方の部分において矢印を用いて示す。ｐＨ増加順に、試料を左から右に入れた。Ｘで示すウェル中で形成された試料はなかった。
【０１６９】
得られた結果に従って、図４ｂに対応するゲルにおける矢印で示したウェル中のＯＤＮの移動領域におけるシグナルの出現によって示されるように、デンドリマーＣｌＮＨ４及びＰｈｅとＯＤＮとの間に形成された複合体は、総ての試験ｐＨで安定であり、ＮＮ及びＯＤＮ間に形成された複合体は、酸性ｐＨ（５．７未満）で不安定であった。ＩＭ８及びＩＭ１６の場合、幾分同様のことが生じた：ＩＭ８−ＯＤＮ複合体はｐＨ＜４．７で解離し；ＩＭ１６と形成したものはｐＨ＜５．７で解離する。しかし、アルカリｐＨで、ｐＨ７．４及びｐＨ８に対応するレーンにシグナルが出現しないので、総ての複合体は安定であった。
【０１７０】
これは、酸性環境（胃、エンドソーム−リソソーム）において、ＣＢＳ  ＮＮ、ＣＢＳ  ＩＭ８及びＣＢＳ  ＩＭ１６とＯＤＮとの複合体は、後者を徐々に放出することを意味する。この事実は、ｐＨ依存性のＯＤＮの制御された放出を要する用途には良いであろう。これは、デンドリマーが依然として細胞内でＯＤＮに結合していた場合、それがエンドソーム−リソソーム区画に入ると、その結合が切れるであろうということも意味する。その一方、アルカリ性環境（小腸液）において、それは安定に保たれるであろう。
【０１７１】
（実施例３３）時間による水溶液中のデンドリプレックスの安定性
実施例３１に従って２／１電荷比で、ＯＤＮ  ＰＰＴとデンドリマーＩＭ８、ＩＭ１６及びＮＮとの間で形成されるデンドリプレックスの異なる試料を水溶液中で調製し、電気泳動を、試料の調製から、特に０時間、６時間及び２４時間の異なる時間後行った。この時間の間、デンドリプレックスを生理学的条件：３７℃、５％二酸化炭素雰囲気を模倣する条件で維持した。結果を図５に示し、ここで、図５ａのゲルは、０時間の試料に対応し、図５ｂのゲルは６時間後に、及び図５ｃのゲルは２４時間後の試料に対応する。これらａ、ｂ及びｃの３つの場合に、試料は以下の順のレーンに出現する：
レーン１：１００ｂｐラダー
レーン２：ＩＭ８＋ＰＰＴ
レーン３：ＩＭ１６＋ＰＰＴ
レーン４：ＮＮ＋ＰＰＴ
レーン５：ＰＰＴ
【０１７２】
ゲルは、検討する３つのデンドリマーの任意で形成するデンドリプレックスから時間経過とともにＯＤＮの徐々の放出があることを示す。これは、ポリアニオンの遅延放出における使用に良いことを示す。
【０１７３】
（実施例３４）タンパク質及び洗浄剤の存在下でデンドリプレックスの安定性
血漿タンパク質への結合は、ＯＤＮを用いた療法が直面する障害の１つである。この結合はＯＤＮの生物利用能を低下させ、所望の生物学的影響を及ぼすことができるためにより多くの用量を必要とさせる。本項は、複合体の安定性に対する培地中のタンパク質の存在の影響を分析することを目的とし、これが多少なりともＯＤＮが血漿タンパク質へ結合することから保護できればと考える。これらの研究を、ＣＢＳ  ＮＮを用いて行い、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びアニオン洗浄剤ＰＢＳの存在下で形成されたデンドリプレックスの挙動を分析した。
【０１７４】
デンドリマー／ＯＤＮ比２／１にするのに必要な計算をして、ウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清を有する完全培地又はＡＢ完全ヒト血清の異なる濃度の存在にデンドリプレックスを曝す目的で以下の試料を調製した。生成された異なる混合物を、その組成が同じ３％アガロースゲルエチジウムブロマイド上のＤＮＡ及びタンパク質の移動度について試験した。まず、紫外線に曝したゲルの写真を撮り、次いで０．５％パラゴンブルー着色溶液［（８−アミノ−７−（３−ニトロフェニルアゾ）−２−（フェナシル）−１−ナフトール−３，６−ジスルホン酸ナトリウム塩、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標））］（タンパク質の存在を示すための染料）を用いて２０分間染色し、最後にそのゲルを１０％氷酢酸で洗浄して脱染色し、その後デジタルカメラで写真を撮った。結果を図６に示すが、ここで、ａ部分はパラゴンブルーを用いた染色に対応し、ｂ部分は紫外線で撮ったゲルの写真に対応する。試料は以下の順序で現れる：
レーン：１００ｂｐラダー
レーン１：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋３．４７μｌ  ＮＮ＋２５μｌ  ＲＰＭＩ
レーン２：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋３．４７μｌ  ＮＮ＋２５μｌ  ＲＰＭＩ＋３０μｌＰＢＳ−ＢＳＡ２％
レーン３：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋３．４７μｌ  ＮＮ＋２５μｌ  ＲＰＭＩ＋３０μｌＰＢＳ−ＢＳＡ５％
レーン４：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋３．４７μｌ  ＮＮ＋２５μｌ  ＲＰＭＩ＋３０μｌＰＢＳ−ＢＳＡ１０％
レーン５：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋３．４７μｌ  ＮＮ＋２５μｌ  ＲＰＭＩ＋３０μｌＳＤＳ０．５％
レーン６：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋３．４７μｌ  ＮＮ＋２５μｌ  ＲＰＭＩ＋３０μｌＳＤＳ１％
レーン７：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋３．４７μｌ  ＮＮ＋２５μｌ  ＲＰＭＩ＋３０μｌＳＤＳ２％
レーン８：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋３．４７μｌ  ＮＮ＋２５μｌ  ＲＰＭＩ＋３０μｌ完全培地
レーン９：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋２７μｌ  ＲＰＭＩ＋３０μｌＰＢＳ−ＢＳＡ１０％
レーン１０：２．６０μｌ  ＴＡＲ＋２７μｌ  ＲＰＭＩ
【０１７５】
まず初めの段階で、総てのウェル（ＳＤＳで処理されたものを除く）において暗いバンドが遊離ＯＤＮとウェルとの中間に現れ：これらは入れた緩衝剤中に存在するブロモフェノールブルーと一緒のＰａｒａｇｏｎ  Ｂｌｕｅの複合体である。さらに、アルブミンが存在する総てのレーンにおいて、その染色に対応するスポットが現れる。
【０１７６】
ゲルにおいて示された結果に従って、以下の結論を引き出すことができる：
ａ）ＯＤＮはアルブミンと複合体を形成し、これにエチジウムブロマイドで染色されたゲルのバンドが対応し、それを囲んで印をした。
ｂ）アルブミンの濃度増加は、複合体（２，３，４）を解離させることができない。さらに、アルブミンはデンドリマー−ＤＮＡ複合体からＯＤＮを封鎖していないに違いなく、その理由は、もしそうでなければ、その円の高さまで移動しているであろうからである。
ｃ）複合体は試験した総ての濃度でアニオン性洗浄剤（ＳＤＳ）の存在下で解離する。
【０１７７】
（実施例３５）血清存在下でＮＮ−ＯＤＮデンドリプレックスの安定性
血清の存在下で経時的なデンドリプレックスの安定性を調べる意図で、試料に１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含む完全培地を添加する試験を行った。以下の試料をＯＤＮとしてＴＡＲを用いて調製した：
【化５５】
2009502765.tif 000059
【０１７８】
示されるように、その調製後２０分に１００μｌの完全培地を試料１、２及び３に添加した。試料の各々１つから、４５μｌのアリコートを４０分、４時間及び１７時間後に採取し、アガロースゲル中の電気泳動に供した。予め１００塩基対ラダーマーカーを位置させて、左から右へ番号付けの順序に従って、ゲルに試料を入れた。最後の時点（１７時間）において、２／１比の複合体のみをＮＮを有しないＯＤＮに対して試験した。結果を図７に示すが、ここで２／１比のＴＡＲ＋ＮＮを有する試料に対応するウェルの各々１つについて日付が見られる。
【０１７９】
前に説明された詳細から、以下の観察を引き出すことができる：
ａ）４０分後、２／１電荷比のみがＯＤＮを完全に保持することができ、１／１又は勿論０．５／１比もできないことが観察される。
ｂ）１７時間後、ＮＮデンドリマーは陽極の方向に移動するＯＤＮを放出する。
ｃ）完全培地のタンパク質は複合体の安定性に干渉しない。一方、放出されたＯＤＮはＯＤＮ単独と同じレベルで移動し、これは、ＯＤＮが培地（１０％胎児ウシ血清、抗生物質及びＬ−グルタミン）に存在するいずれのタンパク質ともいかなる複合体も形成しないことを示す。
【０１８０】
要約すれば、１０％ＦＣＳの存在下で、複合体及びＯＤＮは混合物に使用された培地があたかもＲＰＭＩのみを含むように挙動し、血漿タンパク質と複合体を形成せず、ＮＮは１７時間後にＯＤＮを放出する。
【０１８１】
次いで、複合体及びＯＤＮがヒト血清の存在下でどのように挙動するか調べた。このために、研究をヒト血清ＡＢを用いて行った。
【０１８２】
始めに、デンドリマーを有しないＯＤＮの挙動をヒト血清の存在下で調べた。これを行うために、以下の組成の試料を電気泳動に供した：
レーン０：１００ｂｐラダー
レーン１：対照（血清ＡＢ）
レーン２：２．６μＬ  ＴＡＲ＋１７μＬ  ＲＰＭＩ＋４０μＬ血清ＡＢ
レーン３：２．６μＬ  ＴＡＲ＋３７μＬ  ＲＰＭＩ＋２０μＬ血清ＡＢ
レーン４：２．６μＬ  ＴＡＲ＋４７μＬ  ＲＰＭＩ＋１０μＬ血清ＡＢ
レーン５：２．６μＬ  ＴＡＲ＋５７μＬ  ＲＰＭＩ
【０１８３】
ゲルに試料を入れる前にＯＤＮと血清タンパク質との良好な相互作用のために２０分待った後に作製した電気泳動ゲルを図８に示す。ここで、部分ａは紫外光を用いて作製した、エチジウムブロマイドで染色することによるバンドの出現の写真を示し、部分ｂはＰａｒａｇｏｎ  Ｂｌｕｅ（登録商標）で処理した同じゲルを示す。部分ｂのタンパク質バンドと同じ高さにある部分ａのＯＤＮに対応するバンドの局在は、ＯＤＮのヒト血清タンパク質への結合を示した。
【０１８４】
二番目に、ＯＤＮ−ＮＮデンドリプレックスに対するヒト血清タンパク質の存在の影響を検証した。デンドリマーが、ＯＤＮがタンパク質へ結合することから保護するかどうかを調べることを試み；これを行うために、３つの濃度のヒト血清ＡＢを有する、デンドリプレックス、ＯＤＮ及びＤＮＡを有しないデンドリマーをインキュベートした：ＯＤＮ、デンドリマー及び血清を有しないＲＰＭＩの混合を行った後２０分に、１００μＬのＲＰＭＩを、純粋で、又は５％、１０％若しくは２０％における血清ＡＢと一緒にのいずれかで、この混合物に添加した。試料を以下の方法で入れて、デンドリマー及びＯＤＮ混合の０時間、４時間及び２４時間後に電気泳動を行った：
０時間
２０分⇒１００μｌ  ＲＰＭＩ
レーン１：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  純粋
レーン２：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  ５％
レーン３：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  １０％
レーン４：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  ２０％
レーン５：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ５％
レーン６：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  １０％
レーン７：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ２０％
レーン８：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  純粋
４時間
２０分⇒１００μｌ  ＲＰＭＩ
レーン１：対照（６０μｌ  ＲＰＭＩ）２０％
レーン２：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  純粋
レーン３：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  ５％
レーン４：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  １０％
レーン５：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  ２０％
レーン６：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ５％
レーン７：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  １０％
レーン８：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ２０％
レーン９：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  純粋
レーン１０：３．２５μｌ  ＮＮ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ５％
レーン１１：３．２５μｌ  ＮＮ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  １０％
レーン１２：３．２５μｌ  ＮＮ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ２０％
２４時間
２０分⇒１００μｌ  ＲＰＭＩ
レーン１：対照（６０μｌ  ＲＰＭＩ）２０％
レーン２：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  純粋
レーン３：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  ５％
レーン４：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  １０％
レーン５：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋３．２５μｌ  ＮＮ＋５４μｌ  ＲＰＭＩ  ２０％
レーン６：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ５％
レーン７：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  １０％
レーン８：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ２０％
レーン９：２．４３μｌ  ＰＰＴ−ＴＦＯ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  純粋
レーン１０：３．２５μｌ  ＮＮ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ５％
レーン１１：３．２５μｌ  ＮＮ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  １０％
レーン１２：３．２５μｌ  ＮＮ＋５７μｌ  ＲＰＭＩ  ２０％
【０１８５】
紫外光下のゲルを写真撮影した結果を図９ａに示す。図９ｂは、その一部について、４時間試料に対応するゲルのＰａｒａｇｏｎ  Ｂｌｕｅを用いた染色を示す。
【０１８６】
結果は、血清を有しないＮＮ＋ＰＰＴ−ＴＦＯデンドリプレックスは常習的に挙動し、２４時間後にＯＤＮを放出することを示す。０時間及び４時間後、血清存在下のＮＮ＋ＰＰＴ−ＴＦＯは、血清存在下のＰＰＴ−ＴＦＯに対して異なる電気泳動パターンを生ずる。後者は長くて広がったシグナルを生じ、一方デンドリプレックスはウェル中にＯＤＮを残す（僅かなＯＤＮの漏出を生じ、タンパク質に結合する、血清が２０％である場合を除く）。タンパク質ゲルが観察され、（その中で、４時間試料に対応するものは実施例として示したが、結果は０時間及び２４時間ゲルと同様であった）これらは正極の方向に流れ、（ウェルから分離する染色）；しかし、デンドリマーなしで単独の場合にタンパク質がＯＤＮと複合体を形成することをＢＥゲルにおいて観察することは興味深い。タンパク質は、デンドリマー（ウェルにタンパク質を保持しようとせず、タンパク質と複合体を形成しない）の存在にかかわらず、総ての実験環境において同じ高さで流出する。タンパク質の存在は、ＯＤＮをＯＤＮ−デンドリマー複合体から除去しようとせず；２４時間後、複合体はＯＤＮを放出し始めるが、これは、血清を有しないＯＤＮ対照にように下方に移動せず、その代りに、タンパク質によってその移動中に直ちに保持され、血清を有し、ＮＮを有しないＯＤＮと同じ長くて広がったシグナルを与える。
【０１８７】
したがって、デンドリマーがＯＤＮをタンパク質への結合から保護する４時間から２４時間の時間帯があるように見える。この時間後、デンドリマーはＯＤＮを放出する。これは、血管内から血管外空間に移行した際、デンドリマーと結合する時間をＯＤＮに与えると思われ、確実にデンドリマーは制御された仕方で時間経過とともにＯＤＮを後に放出し、その作用を実施する機会を与える。血清の主なタンパク質はアルブミンであり、これは全体の負電荷を与える２つの負のドメインを有するが、これはまた、ＯＤＮにそれを結合させる正電荷も有する。ＣＢＳの疎水性部位は恐らくは、アルブミンの疎水性部位と相互作用しない。この相互作用はデンドリマー及びタンパク質間の安定な結合を達成するために必要であり、このためにこれらは複合体を形成せず；しかし、デンドリマー及びＯＤＮ間の静電的結合は、後者をアルブミンの正部位と結合することから保護する。
【０１８８】
（実施例３６）大きいサイズのＤＮＡと複合体を形成する能力
使用するプラスミド、Ｎｆ−ｋａｐｐａＢ−ｌｕｃと複合体を形成することができるＣＢＳ  ＩＭ８を有するプラスミドを用いて予備的試験を実施した。前の実験と同様の形態において、電気泳動に先立ってウェルにおいて５０００ｐｂまで測定するラダー型マーカーを置き、異なる試料を用いて電気泳動を実施した。試料は以下であった：
レーン１：１μｌ  ｐ＋０．５８μｌ  ＩＭ８（＋／−）＝２／１＋２８μｌ  ＲＰＭＩ
レーン２：１μｌ  ｐ＋１．７４μｌ  ＩＭ８（＋／−）＝６／１＋２８μｌ  ＲＰＭＩ
レーン３：１μｌ  ｐ＋２．９μｌ  ＩＭ８（＋／−）＝１０／１＋２７μｌ  ＲＰＭＩ
レーン４：１μｌ  ｐ＋２９μｌ  ＩＭ８（＋／−）＝１００／１＋０μｌ  ＲＰＭＩ
レーン５：１μｌ  ｐ（０．４３μｇｐ）
レーン６：２μｌ  ｐ
ここで、ｐ＝プラスミド。
【０１８９】
電気泳動写真を図１０に示す。これは、電荷比Ａ（＋／−）＝６／１が今ＤＮＡ移動を保持しようとすることを示す。
【０１９０】
（実施例３７）ｓｉＲＮＡと複合体を形成する能力
予備試験をまた、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の保持能力を評価するために行った。この目的で以下の抗ＣＤ４ｓｉＲＮＡを使用した：Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．から供給される  ５’−ＧＡＵＣＡＡＧＡＧＡＣＵＣＣＵＣＡＧＵｄＧｄＡ−３’（配列番号６）。使用するゲルはマトリックスゲルであり、加熱し、その後エチジウムブロマイドで試料を標識後生じた２５又は５０％アガロース及び線状アクリルアミド混合物を用いて調製したゲルである。この場合特に、５０％マトリックス、０．７％アガロース及び５０％ＴＡＥ２Ｘゲルを使用した。
【０１９１】
電気泳動に供した試料は以下であった：
レーン１：ＲＰＭＩ
レーン２：１μｌｓｉＲＮＡ＋１．５８μｌ  ＩＭ８＋４８μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝２
レーン３：１μｌｓｉＲＮＡ＋４．７４μｌ  ＩＭ８＋４４μｌ  ＲＰＭＩ（＋／−）＝６
レーン４：１μｌｓｉＲＮＡ＋４９μｌ  ＲＰＭＩ
【０１９２】
図１１に示す電気泳動ゲルの写真は、複合形成体が正であることを再度示す。
【０１９３】
毒性試験
異なるデンドリマーの毒性試験を異なるが相補的な５つの処理によって調べ、これは細胞機能、膜透過性及び細胞外観について詳細を提供した。
【０１９４】
異なる態様における生存可能性を評価するために異なる技術を使用した：膜統合性（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅを用いた染色）、アポトーシス（アネクシン−Ｖ−ＰＥ及びＤＡＰＩを用いた標識）、壊死（７−ＡＡＤを用いた標識）、ＭＴＴ反応剤（ミトコンドリア毒性を評価する）、フローサイトメトリーによる細胞の大きさ及び複雑度の評価、細胞運動性を評価するためのｉｎ  ｖｉｖｏ顕微鏡検査。これらの技術を、抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＯＤＮ、デンドリマー及びデンドリプレックスの毒性の調査のために利用した。さらに、赤血球上のデンドリマーの毒性を溶血性試験によって評価した。
【０１９５】
実施例３８  ＰＢＭＣについての試験
試験デンドリマー
デンドリマーＩＭ８、ＩＭ１６、ＣｌＮＨ４、ＮＮ、Ｐｈｅ並びに市販の対照ＳＦ（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）及びＧ４の毒性を試験した。細胞をインキュベートする最終濃度が１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ及び１００μＭになるようにこれらの各１つの異なる量を採取した。
【０１９６】
抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の作製
血液は成人提供者又は健常新生児の臍帯から得た。この血液をＰＢＳで１／２に希釈し、フィコール勾配において遠心分離した。遠心分離後、ＰＢＭＣハロを回収し、その後２回の洗浄−遠心分離サイクルを実施した。得られたＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ、抗生物質及びグルタミンを有する完全培地に再懸濁した。
【０１９７】
細胞と一緒のインキュベーション
胎児ウシ血清、抗生物質及びグルタミンからなる１０％完全培地１００μｌを、対応する試験デンドリマーを有するＲＰＭＩ６０μｌ容量に添加した。次いで、１６０μｌを３４０μｌの播種細胞に添加し、５００μｌの最終容量に満たした。細胞をこのように４８時間インキュベートし、次いで、デンドリマーと一緒のインキュベーションの効果を目視検査及びミトコンドリア活性の評価によって評価した。
【０１９８】
目視検査の結果
目視検査から得られた観察結果を以下表２に示す。
【０１９９】
【表４】
2009502765.tif 000060
【０２００】
目視観察結果から、リンパ球に対する毒性の最も少ないデンドリマーは、ＣＢＳ  ＮＮ及びＰｈｅであり、２つの試験ＰＡＭＡＭデンドリマーは毒性が最も少なかったことが集約される。
【０２０１】
ミトコンドリア活性：ＭＴＴ
４８時間後のデンドリマー濃度についてミトコンドリア活性の曲線を完成し、この技術を使用して、細胞内部への細胞内有害作用を実証した。これは、不溶性ホルマザン結晶中の３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイドを減少させることに対して生存可能な細胞の選択能に基づく熱量測定試験である。９６−ウェルプレート（１００，０００／ウェル）における異なる濃度のデンドリマーと一緒のＰＢＭＣのインキュベーション４８時間後、デンドリマーを含む上清を除去し、血清又はフェノールレッド（Ｏｐｔｉｍｅｍ）を有しない培地２００μｌで置換した。このステップにおける細胞及びその後のホルマザンの損失を避けるために、プロトコルの変更を行って、４時間のインキュベーションの間にウェルの底部に固定するように、濃度５〜１０μｇ／ｍｌで全ヒト血漿フィブロネクチン［Ｓｉｇｍａ（登録商標）］中にＰＢＭＣを播種した。Ｏｐｔｉｍｅｍ２００μｌに加えて、０．５ｍｇ  ＭＴＴ／ｍｌのウェル当たり最終濃度を得るべく５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ  ｐＨ７．４におけるその無菌［チアゾリルブルー、Ｓｉｇｍａ（登録商標）］を達成するために、ろ過されたＭＴＴ２０μｌを添加した。５％ＣＯ２雰囲気で３７℃におけるインキュベーション４時間後、プレートを２０００ｒｐｍで遠心分離し、反応しなかった過剰のＭＴＴを有する上清を除去した。位相差顕微鏡下でホルマザン結晶を観察し、その後ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２００μｌで溶解した。プレートをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）攪拌器−加熱器中で７００ｒｐｍで攪拌し、この結晶の適正な溶解を確保した。ホルマザン（［Ａ］）の濃度を６９０ｎｍの基準に対して５７０ｎｍの波長でプレートリーダーを使用して分光法によって測定した。分光測光を細胞を含まないＯｐｔｉｍｅｍを使用してゼロに校正した。ミトコンドリア活性に基づく、対照（未処理細胞）に関する相対細胞生存可能性（％）を本式：［Ａ］試験／［Ａ］対照×１００に基づいて計算した。各デンドリマー濃度を、ＡＴＣＣの指針に従って３連で試験した。生じた結果を以下表３に示す。
【０２０２】
【表５】
2009502765.tif 000061
【０２０３】
ＭＴＴを用いた試験から、ＣＢＳ又はＳＦの増加する濃度で処理後に、より大きなミトコンドリア生存可能性を示した細胞は、ＣＢＳ  ＩＭ１６、ＣＢＳ  ＮＮ及びＣＢＳ  Ｐｈｅで処理されたものであったことが集約される。しかし、データを目視観察のものと一緒に全体として取ると、ＩＭ１６が細胞凝集体の形成をもたらす一方、ＮＮ及びＰｈｅはそうではなく、後者はリンパ球に対してより適合性があることが推察される。
【０２０４】
（実施例３９）赤血球についての試験
血球凝集の有無を検出する目視検査及び分光測光法によるヘモグロビン放出（溶血性試験）の定量化を実施した。結果がリンパ球に対してより毒性であったので、前の実施例３８のデンドリマーからＣｌＮＨ４を除外した。結果をＰＡＭＡＮ型第４世代デンドリマーについて生成されたものと比較した。
【０２０５】
前の実施例に引用した同じフィコール勾配を使用してＰＢＭＣから分離後赤血球を得た。これを個々に見ることができるようにＰＢＳ中で希釈した。細胞をＰＢＳ５００μｌ中で再懸濁し、２４−ウェルプレート（３００，０００／ウェル）において播種した。正の対照として、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した細胞を使用した。負の対照はＰＢＳ（ブランク）であった。赤血球を異なるデンドリマー濃度でインキュベートした。血球凝集の存在、細胞数及び時間単位のヘモグロビン放出を、上清１００μｌを収集し、６９０ｎｍを基準として５５０ｎｍの波長でプレートリーダーを使用して分光測光法によって吸光度を測定して評価した。
【０２０６】
目視検査
目視検査から得られる観察結果を表４に下に示す。
【０２０７】
【表６】
2009502765.tif 000062
【０２０８】
１時間後ヘモグロビン放出の定量化
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎで処理された細胞は総て死んで、破壊された）の対照中１００％赤血球溶血。未処理細胞の負対照中７％赤血球溶血。各ウェルを１００％と考えられるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のＯ．Ｄ．（光学密度）に関して割合（％）として表し、；この割合（％）にさらに、対照の７％を引く。このようにして、以下表５に示される結果を得た：
【表７】
2009502765.tif 000063
【０２０９】
５μＭで、ＮＮ及びＰｈｅは１０％毒性を僅かに超え、これは赤血球−毒性に対するカットオフポイントとして考えられるものである。起きたことは、Ｐｈｅは血球凝集を誘導するが、ＮＮはしないことである。興味のある詳細として、ＩＭ１６はＩＭ８に比べて溶血性をあまり誘発せず、ウェル中により多くの細胞を残す（リンパ球中ＭＴＴに対して観察されるものと一致する）が、凝集を誘導する。ＮＮを除いて総て血球凝集を誘導する。ＰＡＭＡＭ  Ｇ４は、凝集及び赤血球中の形成変化を誘導するが、溶血性は誘導しない。
【０２１０】
多い方から少ない方に血球凝集の順は：
Ｇ４＞Ｐｈｅ＞ＩＭ１６＞ＩＭ８＞ＮＮ
【０２１１】
全体として、細胞の外観が良好で、また溶血性がほとんど認められないウェルは、ＮＮデンドリマーであった。
【０２１２】
リンパ球及び赤血球についての毒性結果を一緒にして考えると、より良好な生体適合性プロファイルを示したデンドリマーは、ＮＮであった。
【０２１３】
（実施例４０）デンドリマー単独と比較したＯＤＮ＋デンドリマー複合体の毒性
ＰＡＭＡＭ等の他のデンドリマーの毒性は、ＤＮＡと複合体を形成する場合、変更される（低下する）。以下の実験で、ＯＤＮに結合した場合、毒性の点でＣＢＳに起こることを明らかにすることを試みた。
【０２１４】
この場合の評価時間は、７２時間であった。毒性を、実施例３８に記載された方法で作製したＰＢＭＣについて評価した。
【０２１５】
総ての場合に次の電荷比を使用した：（＋／−）＝２／１
【０２１６】
２／１の電荷用量（＋／−）を達成するためにこれらの実験で使用したデンドリマー濃度は：
ＩＭ８：２．９６μｇ＝３．９３μＭ
ＩＭ１６：２．３５μｇ＝１．９９μＭ
ＣｌＮＨ４：１．９２μｇ＝３．９８μＭ
Ｐｈｅ：２．８μｇ＝１．９６μＭ
ＮＮ：３．４２μｇ＝３．９４μＭ
ＳＦ：０．６８μＭ
Ｇ４：１００μＭ
であった。
【０２１７】
使用したＯＤＮは、以下のようにＰＰＴであった：
ＣＢＳとの複合体における［ＯＤＮ  ＰＰＴ］：２．５７（０．８８μＭ）
ＳＦとの複合体における［ＯＤＮ  ＰＰＴ］：０．３４μＭ
Ｇ４との複合体における［ＯＤＮ  ＰＰＴ］：１μＭ
【０２１８】
複合体形成
支持培地として血清を有さずフェノールレッドを有するＲＰＭＩを使用して、総ての試験において６０μｌの複合体形成容量を使用した。正電荷をデンドリマーによって、負電荷をＯＤＮによって供給し、電荷比（＋／−）＝２になるようにＯＤＮ又はデンドリマーの対応量を使用した。デンドリマーの電荷数（固定）及びＯＤＮの負電荷数（また固定）に基づいて計算した。
【０２１９】
ＯＤＮ及びＣＢＳをＲＰＭＩに添加して直ちに、２０分の時間待って複合体形成を確実にした。
【０２２０】
ＳＦの場合、メーカーの指示書に従って複合体を形成した。
【０２２１】
細胞と一緒のインキュベーション
複合体形成を確実にするために必要な時間後、１０％ＦＣＳ完全培地、抗生物質及びグルタミンの１００μｌを、ＯＤＮ及びデンドリマーを有するＲＰＭＩ６０μｌに添加した。次いで、１６０μｌを３４０μｌ中に播種した細胞に添加し、最終容量５００μｌに満たした。該複合体、ＣＢＳを有しないＯＤＮを含む等容量の混合物、デンドリマー単独を含む混合物、又は負対照として使用したＲＰＭＩ＋完全培地のみを含む混合物のいずれかと一緒にこの細胞をインキュベートした。次いで、細胞及び／又は上清を収集し、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡法又は細胞ＤＮＡ抽出によって分析した。
【０２２２】
免疫蛍光検査法及び共焦点顕微鏡法
蛍光ＯＤＮ、デンドリプレックス、デンドリマー又はＲＰＭＩを含む混合物と一緒にインキュベーション後、従来の共焦点又は蛍光顕微鏡の像をその後得るために細胞を処理した。細胞を、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ、（ＰＬＬ）［Ｓｉｇｍａ（登録商標）］によって直径３０ｍｍのウェルを備えたガラススライドに付着させた。これを行うために、スライドを３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベータ中２時間ＰＬＬ３０μｌと一緒に予備インキュベートした。このインキュベーション後、過剰のＰＬＬをＰＢＳで洗浄した。ＰＬＬにおいて付着させられることになった各処理由来の細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、０．８％Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ［Ｓｉｇｍａ（登録商標）］で１分間標識し、次いで、生存細胞を示した。これらを再度ＰＢＳで２回洗浄した。この時点で、細胞をウェル（１００，０００／ウェル）に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベータ中１時間ＰＬＬ上に置いた。この時間後、過剰の容量をＰＢＳで洗浄し、細胞を最近調製した３％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（その使用から２週以内）で１０分間処理した。この１０分後、過剰のＰＦＡをＰＢＳで洗浄し、細胞を蛍光色素及びＤＡＰＩで標識した抗生物質で標識した。細胞膜をまず染色し、次いで核を染色した。発明者らの試験のために使用する最良の濃度を決定するために使用する抗体の予備的滴定を実施した。始めに、マウス抗ヒト抗ＣＤ４５  ＩｇＧｌ、カッパ一次抗体を使用し［ＢＤ（登録商標）］；抗体３０μｌを各ウェルに１μｇ／ｍｌの希釈液で添加し；３０分間インキュベートし、次いで過剰をＰＢＳで洗浄した。次いで、原液（原液濃度１．４ｍｇ／ｍｌ）の１／１３０希釈における３０μｌ／ウェルのＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ［Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（登録商標）］において（重鎖及び軽鎖）結合したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＩｇＭの二次抗体を使用した。細胞をさらに３０分インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。最後に、細胞核をＤＡＰＩ［Ｖｙｓｙｓ（登録商標）］１０μｌ／ウェルを使用して１０分間染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。抗体及びＤＡＰＩと一緒のインキュベーションを周囲温度で行った。抗体を、時間の経過に伴う劣化を避けるため使用同日に希釈し、凝集体の存在をなくすために使用前に１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。各抗体の希釈を、培地が非特異的標識（１％ウシ血清アルブミンを有するＰＢＳ）を減少させることを阻止して行った。最後に、（試料をレーザによって引き起こされる劣化から保護するように設計された）抗退色剤を有する蛍光［ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）］のための特別な培地を使用して調製物を顕微鏡のスライドガラスにのせた。次いで、観察し、異なる励起線：４０５，４８８及び５１４ｎｍを使用し、焦点の光学差分コントラスト顕微鏡用のレンズを使用して、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して像を取り込んだ。像を取り込んだ後、Ｌｅｉｃａ（登録商標）ソフトウェアを使用して分析した。
【０２２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点顕微鏡検査
ＰＢＭＣが曝されたＯＤＮ、デンドリプレックス及びデンドリマーを用いた異なる処理後の細胞生存可能性を調べ、それにより蛍光ＯＤＮの捕捉等の現象を研究し、又はトランスフェクトされた細胞の運動を評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点顕微鏡検査法を使用した。したがって、フィブロネクチンと一緒に３７℃で１時間インキュベートした使用濃度５〜１０μｇ／ｍｌで全ヒト血漿フィブロネクチン［Ｓｉｇｍａ（登録商標）］と一緒に２．５ｃｍ結晶を播種した。結晶上の過剰のフィブロネクチンをＰＢＳで洗浄後、前もってＰＢＳで洗浄したＰＢＭＣを使用し、これらを５％ＣＯ２雰囲気で３７℃において３０分間インキュベートした。付着しなかった過剰の細胞をＰＢＳで洗浄して除去した。結晶に関する総ての作業は、これを無菌ペトリ皿及び層流キャビンの中で非付着性表面（無菌化金属ペーパー）上に置いて行った。最後に、結晶を共焦点のｉｎ  ｖｉｖｏ顕微鏡検査のためにチャンバー内に入れ、ここで細胞は５％ＣＯ２雰囲気で３７℃のままであった。任意のｉｎ  ｖｉｖｏ実験を始める前に、細胞を、チャンバー内で３０分間の操作から回復させるためにそのままとした。この期間後、細胞を異なって処理した：
１．蛍光ＯＤＮ又は蛍光ＯＤＮを有するデンドリプレックスを添加し、その細胞の内部化を評価する。
２．デンドリマー、デンドリプレックス又はＯＤＮに関して異なる課題後の細胞の運動能を評価する。
【０２２４】
これを行うために、核を含むその中央平面の切断を選択する細胞の連続的画像取込みを時間（３０秒、１分又は２分毎）にわたってした。取得後、画像を画像作成工程に載せた。
【０２２５】
Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅを用いた染色
この技術により、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ（略称ＴＢ）に対する細胞膜の透過性を評価した。生細胞は、この染色を受け付けない。
【０２２６】
これを行うために、０．８％Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ）を含む溶液を調製し、１分間遠心分離後生じた細胞小粒を処理し、その後細胞の遠心分離−洗浄をＰＢＳで２回行った。細胞を光学顕微鏡下で観察し、陽性細胞を、陰性細胞（生細胞）の割合（％）に関連してＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ（青色細胞、死）の存在についてカウントした。これを行うために、少なくとも１００細胞を有する広い領域を選択した。得られた結果を以下表６に示す。
【０２２７】
【表８】
2009502765.tif 000064
【０２２８】
比較的大きな死亡率は、ＯＤＮと複合体形成及び単独双方のＰＡＭＡＭに対応した。ＣＢＳは、未処理対照細胞に関連してＴＢ陽性細胞の割合（％）増加を示さず、細胞をＣＢＳ−ＯＤＮ又はＣＢＳ単独で処理した場合、ほとんど違いは見られなかった。
【０２２９】
フローサイトメトリー試験
アポトーシス−壊死細胞に対応する大きさ及び複雑度を有する細胞の割合（％）を生細胞と比較した。このために、大きさ（ＦＷ）及び複雑度（ＳＤ）をフローサイトメトリーによって評価した。これを行うために、アポトーシス−壊死細胞に対応するＦＷ及びＳＤを有する細胞の周囲の領域に線を引き、生細胞に対応するＦＷ及びＳＤを有する細胞の周囲にもう１つの線を引いた。各スライドに存在する細胞の割合（％）を比較した。得られたグラフを図１５に示し、ここでＸ軸は大きさ（ＦＷ）及びＹ軸は複雑度（ＳＤ）を表す。
【０２３０】
部分ＡはＣＢＳデンドリマーで処理されたＰＢＭＣ型細胞集団を示し、部分ＢはＰＡＭＡＮ型デンドリマーで処理された集団を示す。暗い細胞の影は、アポトーシス−壊死細胞に対応する。生細胞は、灰色で表す。細胞型の各１つに対応する数値割合（％）を得て、表７に示す値を生じた。
【０２３１】
【表９】
2009502765.tif 000065
【０２３２】
これらの結果を図１４にグラフとして示し、これは黒色の死細胞の割合（％）を黒色及び生細胞の割合（％）を灰色で示す。最初の棒（Ｃ）は、対照に対応する。
【０２３３】
最も大きい死亡率割合（％）は、ＯＤＮと複合体を形成する及び単独双方のＰＡＭＡＭに対応した。一方、ＣＢＳは、未処理対照細胞に関してアポトーシス−壊死の割合（％）増加を示さず、細胞をＣＢＳ−ＯＤＮ又はＣＢＳ単独で処理した場合、ほとんど違いは見られなかった。
【０２３４】
ＤＡＰＩを用いた染色
細胞生存可能性を調べるさらなる試験として、ＤＡＰＩ［Ｖｙｓｙｓ（登録商標）］生体染色法を使用し、１０分間ウェル当たり１０μｌを使用して、その後ＰＢＳで２回洗浄した。アポトーシス又は壊死の細胞核は、核の大きさの減少、クロマチンの濃縮及び核の断片化を示す。
【０２３５】
図１７は、以下の試料：１：対照；２：ＯＤＮ＋ＩＭ８；３：ＯＤＮ＋ＩＭ１６；４：ＯＤＮ＋ＳＦ；５：ＯＤＮ；６：ＩＭ８；７：ＩＭ１６；８：ＳＦで得られた結果を示す。
【０２３６】
ＣＢＳ−ＯＤＮ複合体又はＣＢＳ単独のいずれかで処理した細胞は、未処理の対照細胞の核と同様の外観を有する、均一に分布したクロマチンを有する丸い核を示した。ＳＦ（４及び８）で処理したウェルは、著しい細胞減少を示し、分析を困難にした。
【０２３７】
ビデオ
細胞が生きている最も明らかな証拠は、細胞が動くことである。生細胞は、フィブロネクチンと一緒に播種した結晶表面上を動く一過性の細胞突出を示す。ＣＢＳで処理した細胞は、未処理の細胞と同様の運動パターンを示した。
【０２３８】
実施例として、図１８は、ＣＢＳ  ＩＭ８−ＯＤＮと一緒に細胞の７２時間インキュベーション後に撮った一連の写真を示す。一部の運動の詳細を、矢印で強調する。
【０２３９】
結論として、複合体形成におけるデンドリマーの使用濃度は、複合体がかなり生体適合性であることを示し、細胞はＣＢＳ−ＯＤＮ複合体で処理した場合に単独で処理した場合と同様な生存可能性を示した。
【０２４０】
抗原能
新しい分子の生体適合性プロファイルを知りたい場合、非特異性抗原刺激を構成する可能性があるかどうかを知ることが極めて重要である。恐らくは生物に有害である応答を引き起こす外部要素としてこの分子を免疫系細胞が認識する可能性があるので、これは障害になるであろう。これを行うために、デンドリマーが有するであろうリンパ球刺激能をフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）等の従来の強い刺激と比較して比べる目的で、リンパ球増殖性研究を異なるＣＢＳの存在下で実施した。
【０２４１】
（実施例４１）
増殖性試験
ＣＢＳデンドリマーの抗原能を評価するために、リンパ球増殖性試験を行った。実験を、９６ウェル平坦底部プレート（抗生物質、グルタミン及び１０％ＡＢ血清を有する完全ヒトＡＢ培地２００μｌにおいてウェル当たり１００，０００細胞）において３連で準備した。実験は、試験する各デンドリマーの習慣的用法の用量（２μＭ）で処理したウェル、及び細胞毒性に極めて近いより多い用量（５μＭ）で処理したウェルである陰性対照増殖ウェル（未処理細胞）、並びにフィトヘムアグルチニン１μｇ／ｍＬで処理したもう１つの陽性増殖対照を有した。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーション５日後、上清１００μｌを除去し、次いでＤＮＡの同位体挿入剤、トリチウム化チミジン（１０％ＡＢ培地及びチミジン１／１００で調製）を有する培地１００μｌを添加した。次いで、その内容物をフィルターを通すＨａｒｖｅｓｔｅｒを使用してプレートをろ過し、これをそのまま一夜（約１６時間）乾燥させた。この期間後、シンチレーション培地を含むＭｅｔｈｙｌｅｘ（登録商標）のシートを熱溶融し、カウント数を評価するためにガンマ線カメラで読み取った（カウント数が多いほど、より増殖）。以下表８に示すこの結果を、分当たりトリチウム化チミジンカウントとして表した（ｃｐｍ）。各濃度の各結果は、３連で行い、表に現れる値は３つの平均であった。ＰＨＡ及び対照を１２回試験した。
【０２４２】
【表１０】
2009502765.tif 000066
【０２４３】
図１９は、この情報をグラフで示したものを示す。
【０２４４】
この試験から集約できるように、ＣＢＳデンドリマーは、試験した任意の濃度でＰＢＭＣに対して抗原刺激を構成しなかった。
【０２４５】
トランスフェクション試験
ＰＢＭＣの原形質及び核膜を横切るＯＤＮの能力を評価し、この能力を異なるＣＢＳと複合体を形成して、該ＯＤＮが提示した能力と比較した。本発明のデンドリマーを、共焦点顕微鏡検査を使用して、ＰＡＭＡＭ型のものと比較した。
【０２４６】
（実施例４２）
トランスフェクション試験
ＰＢＭＣ細胞の作製及びその試料と一緒のインキュベーション
前の実施例において説明された同じプロセスを使用した。
【０２４７】
細胞の前処理
ＯＤＮ又はデンドリプレックスで処理する２日前に、ＰＢＭＣを、１〜２μｇ／ｍｌの用量でフィトヘムアグルチニン及び１００ＩＵ／ｍｌの用量でインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いて刺激し、細胞濃度は３００万から５００万／ｍｌであった。処理の日に、細胞を３４０μｌ当たり３００，０００から５００，０００細胞の濃度で再懸濁した。しかし、それぞれのその後の処理後の最終容量が５００μｌということから考えて、最終容量を構成する５００μｌに基づいて計算した５０ＩＵ／ｍｌの用量で実験のプロセスの間に細胞活性化を維持するためにＩＬ−２を添加した。
【０２４８】
共焦点顕微鏡検査
他の実施例において前述されたプロセスを使用した。
【０２４９】
ＯＤＮを用いた得られた結果
配列番号１から配列番号５の配列のＯＤＮの各１つを用いて試験を行った。以前に発表されたものに反して、ＯＤＮは、核膜のみならず、原形質膜を横切る驚くべき能力を示した。このプロセスは時間依存性である。したがって、３時間後、ＯＤＮは細胞質の中に、２４時間後に核の中に見出された。この実施例は図２０において見ることができ、ここでＯＤＮ  ＲＦを用いたトランスフェクションの開始から１、３又は２４時間後に撮られた写真を観察することができる。
【０２５０】
蛍光パターンは、凝集体を形成することなく、広がっていた。
【０２５１】
核局在は、細胞のＸＹ切断をして、存在する蛍光を分析する場合に、さらに鮮明である。この種の試験は、図２１に見ることができる。中央平面の線を通して存在する蛍光を観察する場合（図２１Ａ）、上部グラフ（核）に示される青色蛍光及び中央グラフ（ＯＤＮ）に示される緑色蛍光は、底部グラフ（膜）に示される赤色シグナルの下に共局在する。Ｚ軸上のさまざまな断面にわたって核の周囲に引いた目的の領域（ＲＯＩ）（図２１Ｂ）を取る以外、同様の分析をした場合、どのように緑色（下部グラフ）が青色（上部グラフ）と共局在し、膜に到達するまで原形質を越えて存在するかわかる。
【０２５２】
結果は、試験したＯＤＮの長さ（１５から２８塩基）にかかわらず同じであった。
【０２５３】
ＯＤＮ＋ＣＢＳデンドリプレックスを用いて得られた結果
本発明の異なるデンドリマーを有するデンドリプレックスを形成するためにＯＤＮ  ＰＰＴを使用して、トランスフェクション試験を行った。具体的には、以下の試料をトランスフェクトするために使用した：１：対照；２：ＰＰＴ；３：ＰＰＴ＋ＩＭ８；４：ＰＰＴ＋ＮＮ；５：ＰＰＴ＋Ｐｈｅ；ＰＰＴ＋ＩＭ１６。
【０２５４】
４８時間後に得られた結果を図２２に示す。
【０２５５】
ＣｌＮＨ４を除いた総てのデンドリマーは、ＣＢＳを有しないＯＤＮと同様のパターン、すなわち広がった、核及び原形質のパターンを得た。複合体の一部は、蛍光の任意の単位において、行った実験の一部においてＣＢＳを有しないＯＤＮ（ＮＮ及びＰｈｅを有するもの）より高い結果を得たが、これは、複合体及びＯＤＮ単独間の７つまでの比較シリーズの繰り返しの異なる実験において統計的有意性をもって再現されなかった。しかし、ＣｌＮＨ４を有するＰＰＴの試料は、図２３に示される凝集体の蛍光パターンを生じた。
【０２５６】
効果的にこれが、細胞質及び核の蛍光パターンであることを示すために、ＣＢＳを有しないＯＤＮに関して行われたものと同様な、ヒストグラムをＸＹの中央平面に単一細胞について作成した。例えば、図２３は、ＰＰＴ＋ＮＮを有する細胞についての分析の１つを示す。
【０２５７】
これらのデータから、ＣｌＮＨ４を除く、ＣＢＳデンドリマーは細胞中のＯＤＮの分布に全く干渉しないと結論付けることができる。
【０２５８】
デンドリマーによるウイルス又は他の生物剤の抑制
前の実験において示される生体適合性のために、本発明のデンドリマーは、ＨＩＶウイルス若しくはＣ型肝炎等の他のウイルス等の生物媒体又はプリオン等の他の生物媒体の予防及び／或いは治療のための薬剤組成物（非経口又は経口）又は干渉デバイス（膣ゲル、殺菌剤）の調製に好適である。この目的をもって、この能力を調査するＨＩＶウイルス抑制試験を計画した。
【０２５９】
（実施例４３）ＨＩＶ抑制試験
ウイルス調製
ＭＴ−２細胞を使用した（ヒトリンパ球向性ウイルスＩ型で不死化したヒトＴリンパ球）。２０×１０６個のＭＴ−２を１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、１０％ＦＣＳを有するＲＰＭＩ培地中２×１０６細胞／ｍｌの濃度で２５ｍｌに移した。次いで、ＨＩＶＮＬ４．３ウイルス系を細胞当たり１粒子（１ＭＯＩ）の濃度で加えた。ＭＴ−２及びウイルスを３７℃で少なくとも２時間培養し、培養液を１５〜３０分毎に攪拌した。最後に、この培養液（細胞−ウイルス）を２回洗浄し、細胞ゲノムに統合されなかったウイルスを除去した。細胞を同じ培地の２５ｃｍ２瓶に移し、培養した。
【０２６０】
７２〜９６時間毎に、上清の半分を細胞も採集しないように注意して採集した。４０×１０６個のＭＴ−２を、１０％ＦＣＳを有するＲＰＭＩ培地に同じ濃度で加えた。この上清をアリコートし、液体窒素中に保存し、その後滴定した。
【０２６１】
ウイルス滴定
確立された実験室ウイルス系である、単離したウイルスＨＩＶＮＬ４．３を、ＭＴ−２細胞系において滴定した。２×１０４個ＭＴ−２細胞を、９６−ウェルプレート中の完全培地を用いて培養し、ウイルス調製物４０μｌを、対応する希釈液が作られる異なる濃度で加えた。これら総てを全く同じ８つのものに入れ、ＣＯ２雰囲気中３７℃で１週間維持した。この時間後、滴定を細胞変性効果及び合胞体形成の表示によって読み取った。この滴定をＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ’ｓ式［３０］を適用して計算し、これは、滴定するウイルスの濃度の連続的希釈液が８つの同じものに播種された培養液中の培地１ｍｌ当たりのウイルス粒子数を定量化するのに役立つ。
【０２６２】
Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染
ＰＢＭＣを、２μｇ／ｍｌのＰＨＡ及び１００ＩＵのＩＬ−２で４８時間刺激し、ポリクローナル活性化を引き起こし；２４時間後にこの細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞の所望濃度を、１０％ＦＣＳを有するＲＰＭＩ培地において、計算された細胞当たりのＨＩＶＮＬ４．３の粒子数と一緒に、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で４時間インキュベートした。この時間後、培養細胞を採集し、３回洗浄して細胞表面に付着したウイルスを除去し、１０％ＦＣＳ及び５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ２を有するＲＰＭＩ培地の２４−ウェルプレート中に再度入れ、異なるデンドリマーで処理する。この培養液を３７℃でインキュベートし、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で維持した。
【０２６３】
ＣＢＳによるＨＩＶの抑制
２４プレートの４００，０００ＰＢＭＣ／ウェルを播種し、感染前の場合及び０．４ＭＯＩの感染の多重度で感染後のもう１つの場合に、１、３及び５μｌのＮＮで処理した。細胞を２４時間後に採集し、ＤＮＡを抽出し、その後細胞当たりのウイルス複製の定量をした（本国特許庁の特許番号２，４０１，９８６号で登録された感染細胞のＨＩＶ  ＤＮＡの検出及び定量化のための方法に従って）。
【０２６４】
細胞数及びウイルス複製量に対するデンドリマーの毒性可能性の影響をなくすために、異なるデンドリマー濃度間の比較ができるようにウイルス複製数を生細胞の割合（％）に調整した。それにもかかわらず、デンドリマーは使用濃度で有意な死亡率を誘導しなかった（フローサイトメトリーにおいてＦＷ及びＳＤによって定量化）。
【０２６５】
したがって、以下の調整を行った：図２５に示す以下のグラフを生ずる、生細胞％当たり、ＤＮＡ  ＨＩＶ複製数／１０６個の細胞、ここで接頭辞「ｐｒｅ」又は「ｐｏｓｔ」は、感染前後の１、３又は５μＭのＮＮの投与について言い、「Ｃ」と印した棒は、対照に対応する。
【０２６６】
得られた結果は、本発明に前及び後に適用される双方で、デンドリマーがＨＩＶによるＰＢＭＣの感染の明らかな障害となることを示す。したがって、同化前及び同化後のステップ双方に作用するはずである。
【０２６７】
実施例３１から４３の実験の結論
試験したＣＢＳデンドリマーは、ＯＤＮを運ぶために使用した用量でＰＢＭＣに対し良好な生体適合性を示した。
リンパ球及び赤血球の毒性データを全体としてみた場合、比較的良好な生体適合性プロファイルを有するデンドリマーはＣＢＳ−ＮＮである。
ＣＢＳ  ＮＮ、ＩＭ８及びＩＭ１６は、時間経過とともにＯＤＮを放出し、２４時間後に実質的に１００％のＯＤＮを放出した。これらのデンドリマーはまた、酸性ｐＨ（＜５）でＯＤＮを放出する。
試験したＯＤＮは、それ自体細胞における高い取込み能を示し、１０％ＦＣＳの存在下で、細胞培養液に添加された１７時間後に、ほぼ１００％の生細胞において原形質膜及び核膜双方を横切った。
試験した総てのＣＢＳ−ＯＤＮデンドリプレックス（ＣｌＮＨ４を除く）は、ＯＤＮの内部化並びにその細胞質及び核分布に干渉しなかった。
ＣＢＳ  ＮＮは、ＯＤＮが血漿タンパク質に結合することから保護し、この保護は該タンパク質の存在下で水媒体における時間経過に伴うＯＤＮのその後の徐々の放出に干渉しなかった。この及び前の理由のために、本発明のデンドリマーは、腫瘍若しくはウイルスの型にかかわらず、一部の障害に関与し、又は異なるヒト若しくは動物疾患の任意の他の形態に関与する際に、一般にそのレベルを低減させることが好都合であるタンパク質合成の抑制のためのアンチセンス療法における使用に好適であると思われる。
ＮＮデンドリマーは、示された良好な生体適合性と一緒に、プリオン等の他の生物剤を含む、ＨＩＶ等の生物剤又はＣ型肝炎等の他のウイルスによって生じる障害の予防及び／又は治療のために使用することができることを示す、ＨＩＶウイルスによるリンパ球感染を予防するための良好な能力を示す。
ＣＢＳ  Ｐｈｅ及びＣｌＮＨ４は、核酸を効率的に、長く続けて固定する良好な能力を示し、このために、さらに、ＤＮＡ固定（ＤＮＡのリン酸基と静電的）の形態のために、本明細書において記載されるＣＢＳは、ヌクレオチド配列を他の核酸の相補的配列との相互作用に曝したままにするので、核酸の固定を必要とするＲＮＡの生成若しくはＤＮＡマイクロチップ又は他の装置に好適であることができる。
【０２６８】
新規なデンドリマーの合成
本発明のカルボシランデンドリマーの汎用性を高めるために、分岐鎖の末端部分を生じるために使用する出発化合物を変化させるとともに（実施例４４から４７）、末端部分の末端がこのようなものとして構成できるアミノ基の四級化のみでなく、この端末部分に含まれ得る他のアミノ基の四級化も確実にするように、その合成について前の実施例で既に記載されたデンドリマーのアミノ基の四級化剤四級化プロセスの濃度を増加させて（実施例４８及び４９）、その合成が実施例１から３０に記載されるものに対してさらなるデンドリマーを合成した。
【０２６９】
これらのデンドリマーの合成を以下に記載する。
【０２７０】
（実施例４４から４７）
（実施例４４）１Ｇ−［Ｓｉ（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）（Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２）］４（３１）の合成
以下の実施例において記載される、このデンドリマー及びデンドリマー３２の合成のために、対応するヒドロシリル化反応の前に合成することが必要な非市販化合物である４−アリル−２−メトキシ−１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンゼン（（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２）Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）｛Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２｝）を使用した。
【０２７１】
（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２）Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）｛Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２｝の合成
１等量のＣｌＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２Ｈ＋Ｃｌ−（７．０２ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）、４等量のＫ２ＣＯ３（２６．９３ｇ、１９５ｍｍｏｌ）及び１８−コロナ−６エーテルコロナ（２．５７ｇ、９．７４ｍｍｏｌ）を、アセトン中４−アリル−２−メトキシフェノール（８．０ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応を還流で４８時間維持した。溶媒を真空除去後、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ（２×５０ｍｌ）中で抽出した。有機相をＭｇＳＯ４で２時間乾燥した。次いで、ろ過し、溶媒を除去し、浅黄色の油を生成し、これをヘキサン（２×１０ｍｌ）で洗浄し、１８−コロナ−６エーテルコロナを除去した。化合物を、このように浅黄色の油（５．４９ｇ、４８％）として生成した。
【化５６】
2009502765.tif 000067
【０２７２】
デンドリマー３１の合成
（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２）Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）｛Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２｝（０．９ｇ、４．６４ｍｍｏｌ）及び一滴のＫａｒｓｔｅｄｔ触媒（３〜３．５％Ｐｔ）を、ＴＨＦ（３ｍｌ）の最小量中１Ｇ−Ｈ４デンドリマー溶液（０．５０ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）に加えた。反応混合物を真空アンプル中で１２時間の間に４５℃まで加熱した。得られた溶液を溶媒を真空除去することによって乾燥し、黄色の油（１．６０ｇ、１００％）として化合物３１を得た。
【化５７】
2009502765.tif 000068
【０２７３】
（実施例４５）２Ｇ−［Ｓｉ（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）（Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２］８（３２）の合成
第２世代デンドリマー３２を、デンドリマー２Ｇ−Ｈ８（０．３２ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２）Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）｛Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２｝］（０．５１ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）、３ｍｌのＴＨＦ及び一滴のＫａｒｓｔｅｄｔ触媒から出発して、３１について記載されたものと同様のプロセスに従って調製した。このようにして、３２を茶色の油（０．３８ｇ、５０％）として生成した。
【化５８】
2009502765.tif 000069
【０２７４】
（実施例４６）１Ｇ−［Ｓｉ（（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）（Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ＋３Ｉ−））］４（３３）の合成
ジエチレンエーテル中ＭｅＩ（０．２７ｍｍｏｌ）の２Ｍ溶液０．０２ｍｌを、エーテル（３ｍｌ）中３１デンドリマー溶液（０．０９４ｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）に加えた。反応混合物を一定の攪拌をしながら周囲温度で４８時間維持し、次いで乾燥して過剰のＭｅＩを除去した。得られた残渣をＨｅｘａｎｅ（２×５ｍｌ）で洗浄し、真空乾燥して、白色の固形物（０．１０ｇ、８３％）としてデンドリマー３３を生成した。
【化５９】
2009502765.tif 000070
【０２７５】
（実施例４７）２Ｇ−［Ｓｉ（（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３（ＯＭｅ）（Ｏ（ＣＨ２）２ＮＭｅ＋３Ｉ−））］８（３４）の合成
第２世代デンドリマー３４を、３２（０．３８ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びエーテル中２Ｍ  ＭｅＩ（１．０４ｍｍｏｌ）溶液０．０７ｍｌから出発して、３３について記載されたものと同じプロセスに従って調製した。このように、化合物３４を白色固形物（０．４５ｇ、８５％）として生成した。
【化６０】
2009502765.tif 000071
【０２７６】
（実施例４８及び４９）
（実施例４８）１Ｇ−［（Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋２Ｉ−）］４（３５）の合成
四級化した構造の総ての窒素原子を有するデンドリマー３５を、第１世代デンドリマー２５（０．２４ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）及び溶媒としてジエチレンエーテル中ＭｅＩ（２．４ｍｍｏｌ）１．２ｍｌから調製した。このようにして、デンドリマー３５をジエチレンエーテルに不溶性の白色の固形物（０．４９ｇ、９５％）として生成した。
【化６１】
2009502765.tif 000072
【０２７７】
（実施例４９）２Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ＋（Ｍｅ）２（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋２Ｉ−）］８（３６）の合成
第２世代デンドリマー３６を、２６（０．１１ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）及び０．０６ｍｌのＭｅＩ（０．９１ｍｍｏｌ）から出発して、３５について記載されたものと同様のプロセスに従って調製した。このようにして、化合物３６を白色の固形物（０．１８ｇ、８６％）として生成した。
【化６２】
2009502765.tif 000073
【０２７８】
以下の実施例において記載する試験に使用するこのデンドリマーは、略称ＮＮ１６とし、以後この名称で呼ぶ。この構造式、分子量（Ｍｗ）及び正電荷の数は、以下に示すものである：
【化６３】
2009502765.tif 000074
【０２７９】
デンドリマーの薬剤への結合試験
生理学的ｐＨで負電荷を有する薬剤ビヒクルとして本発明のデンドリマーの利用性を試験するために、第１段階で、本発明の異なるデンドリマーがさまざまな薬剤と複合体を形成することができるかどうか調べる試験を行い、次いで、培地のｐＨの変化がデンドリマー−薬剤複合体の解離をもたらすかどうか調べて、結合が可逆性であるかどうか検証した。これは、一方で、デンドリマーが、血液を介する輸送中に血漿タンパク質又は細胞膜と相互作用することから保護する、薬剤との複合体を形成することができることを調べ、生理学的条件で起こることを模倣することを意図し、他方で、ｐＨの変化に関する解離試験に関して、デンドリマーが過剰のプロトンの一部を捕捉し、その作用を実施することを可能にさせる輸送分子を放出するべき環境で、一旦細胞質に入ると、内部がＨ＋型ＡＴＰ加水分解酵素輸送ポンプの作用によって酸性化されるエンドソームによって、デンドリマー−薬剤複合体が貫通する、又は貫通することができると考えられる細胞内にデンドリマー−薬剤複合体が見出す条件を再現することを試みた。
【０２８０】
デンドリマー−薬剤結合を測定する試験
試験を行うために選択したデンドリマーは：
ＮＮ（２Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］８（２６））
ＮＮ１６（２Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ＋（Ｍｅ）２（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋２Ｉ−）］８（３６））
ＩＭ１６（２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］８（１９）
【０２８１】
総て、生理学的ｐＨで少なくとも１つの負電荷を有する、試験を行うために選択した薬剤は：
メトトレキサート（ナトリウム塩）：
１電荷（−）
供給実験室：Ａｌｍｉｒａｌｌ
提示：２５ｍｇ／ｍｌ溶液
賦形剤：ＮａＣｌ、ＮａＯＨ、ＨＣｌ、再蒸留水
ヘパリン（ナトリウム塩）
数電荷（−）
供給実験室：Ｒｏｖｉ
提示：１０ｍｇ／ｍｌ溶液（１０００Ｕ）
賦形剤：ｐ−オキシ安息香酸メチル、ｐ−オキシ安息香酸プロピル、ＮａＣｌ、再蒸留水
インシュリン（組換えヒトインシュリン）
４電荷（−）
供給実験室：Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ
製品商標名：Ａｃｔｒａｐｉｄ
提示：３．５ｍｇ／ｍｌ溶液（１００Ｕ）
賦形剤：ＺｎＣｌ２、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、再蒸留水
【０２８２】
デンドリマー及び薬剤間の結合及び複合体形成の測定は、遊離のデンドリマーに関し薬剤と結合したデンドリマーのポリアクリルアミドゲル中の遅延を評価することによって行った。
【０２８３】
複合体形成：ゲル中に入れる最大容量である、３０μｌの混合物の最終容量中で行う。これを行うために、電気泳動を実施すると、ゲル中の硝酸銀による染色によって完全に同定できるバンドを与えるデンドリマーの必要量から出発する：２０μｌの１００μＭ溶液、これは１．２×１０１５分子に対応する。選択した（＋）及び（−）電荷比を作るために、この薬剤を異なる濃度における１０μｌに加え、また混合物中に存在する薬剤分子の量を測定した。この混合物のインキュベーションを３７℃で１時間行い、熱力学的により安定な複合体が形成する時間を与えたが、より多くの時間がその形成に必要とされることもある。各複合体について二重で行う。
【０２８４】
電気泳動及びゲル染色：使用したゲルは、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．８と一緒に調製した７．５％ポリアクリルアミド／ビスアクリルアミドであった。各電気泳動を９０ボルトで４時間実施し、その後ゲルを硝酸銀で染色し、写真を撮った。特に特定のデンドリマー及び薬剤間の複合体形成に関連する各試験について、その状態を調べるために、異なる濃度でデンドリマー単独で入れ、各１つの濃度を二重に置いたゲルにおいて前の電気泳動を行い、その後、前もってインキュベートしたデンドリマー−薬剤複合体を入れ、デンドリマー及び薬剤混合物に対応するレーンにおいて生じるバンドの遅延の存在を検証することができるために、薬剤以外のデンドリマーが加えられたインキュベーション対照混合物を１対のウェルに入れたもう１つのゲルにおいて、もう１つの電気泳動を行った。
【０２８５】
試験したデンドリマー及び薬剤の各１つに関して得られた結果を実施例５０から５２に記載する。
【０２８６】
（実施例５０）薬剤のＮＮデンドリマーへの結合試験
ＮＮデンドリマーを初期濃度５７６μＭで蒸留水に溶解し、これから１００μＭ、１０μＭ及び１μＭの濃度を得るために希釈液を作製した。これらの濃度の各１つに対応する溶液のアリコートで実施した前の電気泳動は、デンドリマーがそれらの総てにおいて良好な状態にあることを示した。染色後ゲル中のデンドリマーを見ること及び遊離の形態ではなく、薬剤と複合体を形成して、電気泳動に供した後得られるバンド中の起こり得る遅延を検出することを可能にする濃度として１００μＭの濃度を選択した。
【０２８７】
以下、異なる薬剤に関する結合試験を以下の方法で実施する。
【０２８８】
ａ）メトトレキサート
解説を付けたように、本試験で使用するメトトレキサートは、分子量Ｍｗ＝４７６．４２７ｇ／ｍｏｌ及び分子当たり１（−）電荷を有し、２５ｍｇ／ｍｌにおける水溶液の形態で存在する。デンドリマー−メトトレキサート混合物を調製して、インキュベートし、これは以下表９に示す特性に対応した：
【表１１】
2009502765.tif 000075
【０２８９】
これらの混合物、並びに薬剤を有しないデンドリマー対照を電気泳動に供した結果を、「ＮＮ＋Ｍｅｔ」として印して、表２６ｂに示す。ここで、総ての複合体比において遊離のものに対して、結合したデンドリマーの遅延が生じた程度を見ることができる。したがって、ＮＮ−メトトレキサート複合体が形成されていると言うことができる。遅延は、比較的多くの薬剤分子（１）を入れた場合あまり大きくなく、これに対し、比較的少ない（４）ところでより少ない。これは、メトトレキサート分子によるデンドリマーの（＋）電荷の接近性が自由でない、すなわち、培地中の多数のメトトレキサート分子の存在において、結合が安定されず、この結果が、時間単位当たり理論的に付与されるものより結合したより少ない薬剤分子が存在する複合体であるように、これらが（＋）電荷と結合することによってこれら自体間で競合するように、これらの間に立体的に干渉することができるので、総ての（＋）電荷をメトトキサート分子によって占めることができないという事実のためであり得る。動的平衡が形成された。
【０２９０】
ｂ）ヘパリン
本試験に使用するヘパリンは、１０ｍｇ／ｍｌ（１０００Ｕ）の水溶液において提示される。その分子量も、負電荷の数もいくつかが存在することは知られているが、わかっていないので、デンドリマーとの結合をヘパリン単位によって行った。このようにして、デンドリマー−ヘパリン混合物を調製し、インキュベートし、これは、以下表１０に示す特性に対応した。
【０２９１】
【表１２】
2009502765.tif 000076
【０２９２】
これらの混合物、並びに薬剤を有しないデンドリマー対照を電気泳動に供した結果を、「ＮＮ＋Ｈｅｐ」として印して、図２６ｃに示す。この図に見ることができるように、総てのデンドリマー／薬剤比において、対照に対して、ヘパリンと一緒にインキュベートしたデンドリマーの遅延が生じ；実際、０．１Ｕのヘパリンに結合している場合デンドリマーは少し移動するだけである。したがって、ＮＮ−ヘパリン複合体が形成されているということができる。
【０２９３】
ｃ）インシュリン
本試験で使用するインシュリンは、３．５ｍｇ／ｍｌ（１００Ｕ）の濃度の水溶液において提示される。その分子量（５８２５ｇ／ｍｏｌ）が分かり、平均４（−）電荷を確立しているが、結果を標準的治療法で使用する遊離のインシュリンの用量と比較する目的で有用であり得ると考えて、インシュリン単位によって計算してデンドリマーとの結合を設計した。このようにして、デンドリマー−インシュリン混合物を調製し、インキュベートし、これは以下表１１に示す特性に対応した。
【０２９４】
【表１３】
2009502765.tif 000077
【０２９５】
これらの混合物、並びに薬剤を有しないデンドリマー対照を電気泳動に供した結果を、「ＮＮ＋Ｉｎｓ」として印して、図２６ｄに示す。この図において、総てのデンドリマー／薬剤比において、対照に対して、インシュリンと一緒にインキュベートしたデンドリマーの遅延が生じることを見ることができ；実際、０．１Ｕ又は０．０５Ｕのインシュリンに結合している場合デンドリマーは少し移動するだけである。したがって、ＮＮ−インシュリン複合体が形成されているということができる。
【０２９６】
（実施例５１）薬剤のＮＮ１６デンドリマーへの結合試験
ＮＮ１６デンドリマーを、４３４μＭの初期濃度で蒸留水に溶解し、これから、１００μＭ、１０μＭ及び１μＭの濃度を作るために希釈液を作製した。図２７ａに示すゲルが対応する、これらの濃度の各１つに対応する溶液のアリコートに関して行った前の電気泳動は、デンドリマーがこれら総てにおいて良好な状態にあること、並びに１００μＭの濃度が、染色後ゲル中のデンドリマーを容易に見、及び遊離の形態ではなく、薬剤と複合体を形成して、電気泳動に供した後生じたバンド中の起こり得る遅延を検出するために好適であることを示した。
【０２９７】
以下、異なる薬剤を用いた結合試験を以下の方法で実施する。
【０２９８】
ａ）メトトレキサート
解説を付けたように、本試験において使用するメトトレキサートは、分子量Ｍｗ＝４７６．４２７ｇ／ｍｏｌ及び分子当たり１（−）電荷を有する、２５ｍｇ／ｍｌ水溶液の形態で提示される。デンドリマー−メトトレキサート混合物を調製し、インキュベートし、これは、以下表１２に示す特性に対応した：
【表１４】
2009502765.tif 000078
【０２９９】
これらの混合物、並びに薬剤を有さないデンドリマー対照を電気泳動に供した結果を、「ＮＮ１６＋Ｍｅｔ」として印して、図２７ａに示す。この図において、あまり顕著ではないが、総てのデンドリマー／薬剤比において対照に対して、メトトレキサートと一緒にインキュベートしたデンドリマーの遅延が生じることを見ることができる。したがって、ＮＮ１６−メトトレキサート複合体が形成されていると言うことができる。
【０３００】
ｂ）ヘパリン
前の実施例におけるように、本試験で使用するヘパリンは、１０ｍｇ／ｍｌ（１０００Ｕ）で水溶液において提示される。その分子量も、負電荷の数もいくつかが存在することは知られているが、わかっていないので、デンドリマーとの結合をヘパリン単位によって行った。このようにして、デンドリマー−ヘパリン混合物を調製し、インキュベートし、これは、以下表１３に示す特性に対応した。
【０３０１】
【表１５】
2009502765.tif 000079
【０３０２】
これらの混合物、並びに薬剤を有しないデンドリマー対照を電気泳動に供した結果を、「ＮＮ１６＋Ｈｅｐ」として印して、図２７ｃに示す。この図において見ることができるように、総てのデンドリマー／薬剤比における対照に対して、ヘパリンと一緒にインキュベートしたデンドリマーの遅延が生じ；実際、ヘパリンを有するデンドリマーのウェルに移動は見られなかった。したがって、ＮＮ１６−ヘパリン複合体が形成されていると言うことができる。
【０３０３】
ｃ）インシュリン
前の実施例におけるように、本試験で使用するインシュリンは、３．５ｍｇ／ｍｌ（１００Ｕ）の濃度で水溶液において提示される。その分子量（５８２５ｇ／ｍｏｌ）が分かり、平均４（−）電荷を確立しているが、結果を標準的治療法で使用する遊離のインシュリンの用量と比較する目的で有用であり得ると考えて、インシュリン単位によって計算してデンドリマーとの結合を設計した。このようにして、デンドリマー−インシュリン混合物を調製し、インキュベートし、これは以下表１４に示す特性に対応した。
【０３０４】
【表１６】
2009502765.tif 000080
【０３０５】
これらの混合物、並びに薬剤を有しないデンドリマー対照を電気泳動に供した結果を、「ＮＮ１６＋Ｉｎｓ」として印して、図２７ｄに示す。この図において、総てのデンドリマー／薬剤比において、対照に対して、インシュリンと一緒にインキュベートしたデンドリマーの遅延が生じることを見ることができ；実際、０．１Ｕ又は０．０５Ｕのインシュリンに結合している場合デンドリマーは少し移動するのみである。したがって、ＮＮ１６−インシュリン複合体が形成されているということができる。
【０３０６】
（実施例５２）薬剤のＩＭ１６デンドリマーへの結合試験
ＩＭ１６デンドリマーを初期濃度４４２μＭで蒸留水に溶解し、これから１００μＭ、１０μＭ及び１μＭの濃度を作るために希釈を行った。図２８ａに示すゲルが対応する、これらの濃度の各１つに対応する溶液のアリコートを用いて行った前の電気泳動は、デンドリマーがそれらの総てにおいて良好な状態にあることを示した。
【０３０７】
以下、異なる薬剤を用いた結合試験を以下の方法で実施する。
【０３０８】
ａ）メトトレキサート
解説を付けたように、本試験で使用するメトトレキサートは、分子量Ｍｗ＝４７６．４２７ｇ／ｍｏｌ及び分子当たり１（−）電荷を有する、２５ｍｇ／ｍｌにおける水溶液の形態で提示される。デンドリマー−メトトレキサート混合物を調製して、インキュベートし、これは以下表１５に示す特性に対応した：
【表１７】
2009502765.tif 000081
【０３０９】
これらの混合物、並びに薬剤を有さないデンドリマー対照を電気泳動に供した結果を、「ＩＭ１６＋Ｍｅｔ」として印して、表２８ｂに示す。ここで、任意のデンドリマー／薬剤比において対照に対して、メトトレキサートと一緒にインキュベートしたデンドリマーの遅延は全く生じないことを見ることができる。したがって、ＩＭ１６−メトトレキサート複合体が形成されていないと言うことができる。
【０３１０】
ｂ）ヘパリン
実施例５０及び５１におけるように、本試験に使用するヘパリンは、１０ｍｇ／ｍｌ（１０００Ｕ）で、水溶液において提示される。その分子量も、負電荷の数もいくつかが存在することは知られているが、わかっていないので、デンドリマーとの結合をヘパリン単位によって行った。このようにして、デンドリマー−ヘパリン混合物を調製し、インキュベートし、これは、以下表１６に示す特性に対応した。
【０３１１】
【表１８】
2009502765.tif 000082
【０３１２】
これらの混合物、並びに薬剤を有しないデンドリマー対照を電気泳動に供した結果を、「ＩＭ１６＋Ｈｅｐ」として印して、図２８ｃに示す。この図に見ることができるように、タイプ４（ヘパリン０．１Ｕ）の混合物に対応するレーンに現れるバンドは、対照について生じるものより弱く、ヘパリンがデンドリマーのはるかに少数に結合していることを示す。他のデンドリマー／薬剤比において、ヘパリンはデンドリマーの移動を抑制する。したがって、ＩＭ１６−ヘパリン複合体が形成されているということができる。
【０３１３】
ｃ）インシュリン
実施例５０及び５１におけるように、本試験で使用するインシュリンは、３．５ｍｇ／ｍｌ（１００Ｕ）の濃度で水溶液で提示される。その分子量（５８２５ｇ／ｍｏｌ）が分かり、平均４（−）電荷を確立しているが、結果を標準的治療法で使用する遊離のインシュリンの用量と比較する目的で有用であり得ると考えて、インシュリン単位によって計算してデンドリマーとの結合を設計した。このようにして、デンドリマー−インシュリン混合物を調製し、インキュベートし、これは以下表１７に示す特性に対応した。
【０３１４】
【表１９】
2009502765.tif 000083
【０３１５】
これらの混合物、並びに薬剤を有さないデンドリマー対照を電気泳動に供した結果を、「ＩＭ１６＋Ｉｎｓ」として印して、図２８ｄに示す。この図において、総てのデンドリマー／薬剤比において、対照に対して、インシュリンと一緒にインキュベートしたデンドリマーの遅延が生じるが、インシュリンの０．０５Ｕ又は０．０１Ｕを含む混合物に対応するレーンにおいて遅延は一部のデンドリマー分子において起こるのみであり：バンドは対照におけるように移動するが、より弱いことを見ることができる。その代わり、０．５Ｕのインシュリンと一緒にインキュベーションした場合、遅延は顕著であり、１Ｕのインシュリンと一緒のデンドリマーインキュベーション混合物に対応するレーンにおいて、バンドは現れず、これは、ゲルに入って行かない複合体が形成したことを示す。したがって、ＩＭ１６−インシュリン複合体が形成されているということができる。
【０３１６】
デンドリマー−薬剤複合体のｐＨ安定性の測定
さまざまな薬剤のデンドリマーへの結合が検証された後、デンドリマー−薬剤複合体の解離が培地のｐＨの変化により起こるかどうか調べ、結合が可逆性であるかどうか調べることを試み、プロトン過剰の部分を捕捉した後デンドリマー薬剤の放出を引き起こす、内部がＨ＋ポンプの作用によって原形質に到達した後酸性化されるエンドソームによって、デンドリマー−薬剤複合体が細胞内で貫通すると考えられる生理学的条件において起こることをそれとともに再現することを試みた。
【０３１７】
エンドソームにおいて到達するｐＨは、４．５と６．５の間であり得ることが知られている［７７、７８，７９］。したがって、この試験を行うために選択したｐＨは：５、６、７．４、９、１０であった。
【０３１８】
デンドリマー−薬剤結合を測定する試験において使用したものと同様のプロセスに従って、遊離のデンドリマーに関して薬剤に結合したデンドリマーのポリアクリルアミドゲルにおける遅延を評価することによって、培地のｐＨを変化させた後、前に形成したデンドリマー−薬剤複合体の挙動についての試験を再度行ったが、電気泳動前の複合体形成プロセスにおけるｐＨの変化の段階を導入し、プロセスは以下の方法で行った。
【０３１９】
複合体形成：ゲル中に入れるための最大容量である３０μｌの最終混合物容量中で行った。これを行うために、電気泳動が行われたら直ちにゲル中で硝酸銀によって染色によって完全に同定可能なバンドを与えるデンドリマーの必要量から出発した：１００μＭ溶液２０μｌ、これは１．２×１０１５分子に対応する。薬剤を残存する１０μｌに加え、前に行った複合体形成試験によって、遊離のデンドリマーに対応するバンドに関するデンドリマー−薬剤複合体バンドの明らかな遅延を引き起こすことができる最大濃度を選択し；この濃度の選択は、デンドリマー−薬剤複合体が形成されることを確実にする。デンドリマー及び薬剤混合物のインキュベーションを３７℃で１時間行い、熱力学的により安定な複合体を形成するための時間を与えたが、より多くの時間がその形成に必要とされることもある。試験する各ｐＨについて、２つの混合物をインキュベートした。次に、１０μｌの０．１Ｍ緩衝剤を加え、これはそこで達成される０．０２５Ｍの最終濃度で各試料において求められたｐＨを維持することができ、次いで、各試料を３７℃でさらなる１５分間維持した。
【０３２０】
電気泳動及びゲル染色：これらは、デンドリマー−薬剤結合測定試験において記載された同じ条件で行った。
【０３２１】
デンドリマー：試験をＩＭ１６デンドリマーを用いて行った：
（２Ｇ−［Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ３＋Ｉ−）２］８（１９）。
【０３２２】
薬剤：インシュリンを試験を行うために選択し、各反応混合物に０．５単位（０．５Ｕ）を加えた。
【０３２３】
緩衝剤溶液：異なるリン酸塩を用いて調製した溶液を緩衝剤溶液として選択した。これを行うために、表１８に示される０．２Ｍ溶液（所望のｐＨの各１つについて、緩衝剤溶液が調製される、Ｈ２ＰＯ４Ｎａ、ＨＰＯ４Ｎａ２及びＰＯ４Ｎａ３種の各１つの０．２Ｍ溶液）の容量を、総て０．１Ｍで混合し、Ｈ２Ｏで１００ｍｌに満たした。
【０３２４】
【表２０】
2009502765.tif 000084
【０３２５】
本試験及び結果の詳細を以下に記載する。
【０３２６】
（実施例５３）ＩＭ１６デンドリマー−薬剤複合体のｐＨ安定性試験
各々１つに、１００μＭ濃度を有するデンドリマー溶液２０μｌ及び０．５単位を含むインシュリン溶液１０μｌを加えて、デンドリマー薬剤複合体の形成のために１０の反応混合物（「Ｃ」試料：複合体）を調製した。薬剤以外のデンドリマーを加えた反応混合物（「Ｄ」：遊離デンドリマー）の各１つについて対照試料を調製した。インキュベーション１時間後、２０の試料が以下表１９に示す組成及び特性を有するように、緩衝剤溶液１０μｌを各試料に加えた：
【表２１】
2009502765.tif 000085
【０３２７】
緩衝剤の添加後の待ち時間（１５分）後、試料は電気泳動及びゲルの染色を経て、図２９に示すバンド分布を生じ、ここで試料は２つの異なるゲル間に分布したように見える。この図において、酸性ｐＨで遊離デンドリマーは安定のままであり、一方複合体に関するレーンにおいてバンドの出現が見られることを観察することができ、このために複合体の部分的解離が生じ、薬剤はデンドリマーから放出され、後者を遊離状態に置くことが集約される。アルカリ性ｐＨで、デンドリマーは不安定であるが、劣化せず、これは複合体の解離をもたらす。
【０３２８】
結論は、ＩＭ１６デンドリマー−インシュリン複合体は、酸性ｐＨで解離していることであり、これは他のデンドリマー−薬剤複合体も同様の挙動を示す可能性があると考えられるものとする。
【０３２９】
したがって、実施例５０から５３に記載される試験は、血液中で負電荷を有する薬剤ビヒクルとしてのデンドリマーの有用性及び、さらに、結合が可逆性であり、薬剤の放出が取込みエンドソーム内で達せられる酸性ｐＨにおける細胞内で可能であることを支持する。
【０３３０】
デンドリマーによって輸送されるオリゴヌクレオチドを有する神経系由来細胞のトランスフェクション
ＰＢＭＣを用いて行った試験は、デンドリマー−ＯＤＮ複合体が細胞中に浸透し、その中で解離した状態になり得ることを示すので、分子が低トランスフェクション率をもたらす細胞においてＯＤＮ又はＲＮＡｉ等のポリアニオン性の他の分子のトランスフェクションビヒクルとしてデンドリマーが機能することができ、トランスフェクション率を増加させるかどうか調べるために試験を行った。したがってＳＫ−Ｎ−ＭＣ（神経芽細胞腫：ＡＴＣＣ  ＨＴＢ１０）及びＵ８７−ＭＧ（星細胞腫：ＩＣＬＣ  ＨＴＬ０００１３）の神経系由来の２つの系を選択し、始めに、本発明のカルボシランデンドリマーが毒性でなく、したがって、増殖をもたらさないことが証明され、その後、本発明のデンドリマーとの複合体を形成して、同じ細胞を浸透した後、これらの細胞におけるＯＤＮのトランスフェクション率が増加し得るかどうか試験した。試験を、デンドリマーＮＮ（２Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋Ｉ−）］８（２６））及びＮＮ１６（２Ｇ−［Ｓｉ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ＋（Ｍｅ）２（ＣＨ２）２ＮＭｅ３＋２Ｉ−）］８（３６））に関して行った。トランスフェクション試験を抗ｒｅｖＲＦ  ＯＤＮ（配列番号２）を用いて行った。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清であった。
【０３３１】
（実施例５４）デンドリマーと一緒にインキュベートしたＳＫ−Ｎ−ＭＣ及びＵ−８７−ＭＧ細胞の増殖
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に関して１つ及びＵ−８７−ＭＧ細胞に関してもう１つの異なる実験を行い、この系の増殖に対するデンドリマーの影響を調査した。このために、９６−ウェル皿において対応するものについて７，０００細胞／ウェルを塗布した。細胞を、異なる濃度（１μＭ、５μＭ及び１０μＭ）のＮＮデンドリマー又はＮＮ１６デンドリマーと一緒に３日間インキュベートした。陽性増殖対照として、細胞を２０μｇ／ｍｌのＬＰＳと一緒にインキュベートし、陽性死誘導対照として、細胞を７％ＤＭＳＯと一緒にインキュベートした。陰性対照として、未処理細胞を使用した。インキュベーション３日後、細胞増殖をＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔを使用して測定した。これは、電子カップリング剤ＰＥＳ（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）と併用するＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムの生物還元によって引き起こされる熱量変化から決定した細胞還元能の評価から細胞増殖を定量化することを可能とする。陰性対照に対して４９０ｎｍで得られた吸光度値で、値１とし、生じた吸光度の部分を使用してそれを基準とした。
【０３３２】
「Ａ」として印した、図３０の上部は、Ｕ８７−ＭＧ細胞において得られた結果に関するグラフを示す。デンドリマーと一緒にインキュベートした試料に対応する棒が、陰性対照（Ｃ−）のものと非常に似たその中の細胞の増殖を示すことが見られ、このために、デンドリマーＮＮ及びＮＮ１６は、Ｕ８７−ＭＧ細胞系と一緒に３日間インキュベートした後、増殖も細胞死も誘導しないと言うことができる。
【０３３３】
「Ｂ」として印した、図３０の下部は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において得られた結果に関するグラフを示す。ここで、デンドリマーＮＮ及びＮＮ１６の双方は１０μＭの濃度でＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系に対して毒性であることを見ることができる。一方、１μＭ及び５μＭの濃度は、毒性も細胞増殖も引き起こさない。
【０３３４】
（実施例５５）Ｕ−８７−ＭＧ細胞におけるデンドリマーの毒性研究
ＭＴＴを用いた試験
Ｕ−８７−ＭＧ細胞に関する試験を行い、この系の生存可能性に対するデンドリマーの影響を異なる時間で調査した。これを行うために、ウェル当たり１５０００（２４時間インキュベーション）、７０００（３日間インキュベーション）又は１５００（７日間インキュベーション）の細胞を９６−ウェルプレートに塗布した。細胞をＮＮデンドリマー又はＮＮ１６デンドリマーのいずれかの異なる濃度（１μＭ、５μＭ及び１０μＭ）と一緒に、２４時間、３日間及び７日間インキュベートした。２つの異なる陰性対照を使用した：未処理細胞（Ｃ−）及びさらに、新しい生物材料試験において通常、細胞毒性の陰性対照として使用する巨大分子であるデキストランの異なる濃度（１μＭ、５μＭ及び１０μＭ）と一緒にインキュベートした細胞である。２つの異なる陽性対照も使用した：７％ＤＭＳＯで処理した細胞及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した細胞である。
【０３３５】
他の参照調査を有することを可能とするために、市販のデンドリマーＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）及びＰｏｌｙｆｅｃｔ（登録商標）（いずれもＱｉａｇｅｎから入手）の毒性も、２４時間、３日間及び７日間後に調査した。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔの場合、製造業者から推奨された最適用量（２．５μｌ）、それより低い用量（１．２５μｌ）及びもう１つのより高い容量（５μｌ）の３用量について試験した。特に付着性細胞として設計されたＰｏｌｙｆｅｃｔに関して、試験した３用量は：最適用量（０．６μｌ）、より低い用量（０．３μｌ）及びより高い用量（１．２μｌ）であった。
【０３３６】
各対応するインキュベーション時間後、実施例３８に記載されたものと類似のＭＴＴを用いて試験を行った。未処理細胞（Ｃ−）において得られた吸光度値において、１の値とし、生じた吸光度の部分を使用してそれを基準とした。
【０３３７】
図３１は、Ｕ８７−ＭＧ細胞で得られた結果を観察可能とする。「Ａ」として印した、上部のグラフは、インキュベーション２４時間後得られた値に対応し；「Ｂ」として印した、真中の領域にあるグラフは、インキュベーション３日後に得られた値に対応し；最後に、「Ｃ」として印した、下部にある図は、インキュベーション７日後に得られた値に対応する。
【０３３８】
このグラフにおいて、デキストランで処理された細胞は、２４時間後並びに３日後及び７日後の双方で、０．８に等しい又はより大きい生存可能値を有した。
【０３３９】
インキュベーション２４時間後の市販デンドリマーＳｕｐｅｒｆｅｃｔは、任意の濃度において、０．７に等しい細胞の同様の生存可能性を生じた。この値は、低い用量（１．２５μｌ）においてさえ３日後に減少し、０．４までの値を有するようになった。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔと一緒のインキュベーション７日後に、細胞は使用した３つの用量のいずれにおいても死亡した。
【０３４０】
Ｐｏｌｙｆｅｃｔデンドリマーは、試験した３つの用量のいずれにおいてもＳｕｐｅｒｆｅｃｔよりも毒性が少なかった。
【０３４１】
本発明のＮＮ及びＮＮ１６のデンドリマーに関して、２４時間後に得られた生存可能性は、互いに同じであり、陰性対照に関して０．６と０．７５との間の範囲に見出される。ＮＮデンドリマーの場合、３日後の細胞生存可能性は、濃度を増加させる１μＭの濃度で０．９５の値から１０μＭで０．５の値に移行して減少する。ＮＮ１６デンドリマーに関して、調査した３つの濃度のいずれにおいても０．８に近い値を示す。カルボシランデンドリマーと一緒のインキュベーション７日後に、Ｕ８７−ＭＧは、その生存可能性が０．７である１０μＭの濃度におけるＮＮ１６の場合を除いて、陰性対照のものに近い、又はそれを超える生存可能性を示す。
【０３４２】
上清における乳酸脱水素酵素濃度（ＬＤＨ）の測定
デンドリマーによって誘導され得る細胞毒性を評価するもう１つの形態は、細胞培養液上清におけるＬＤＨの濃度の定量化によるものであり、これは特定の化合物又は分子の細胞毒性の直接測定と考えられ、膜において細胞が受けた損傷についての考えを与える。したがって、ＭＴＴによる測定のものと同様のＵ８７−ＭＧ細胞における生存可能性試験を行ったが、この場合、市販デンドリマーＳｕｐｅｒｆｅｃｔ又はＰｏｌｙｆｅｃｔ、本発明のデンドリマーＮＮ若しくはＮＮ１６、ＤＭＳＯ又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と一緒に、デキストランが添加された培地におけるインキュベーション２４時間後に細胞上清培養液中のＬＤＨの濃度を測定することによって生存可能性を決定した。これらの化合物の各１つの濃度及び容量は、ＭＴＴに関して行われた試験において使用したものと同じであった。Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ販売の市販のキットＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＫｉｔＰＬＵＳ（ＬＤＨ）を使用して、メーカーの説明書に従って、乳酸脱水素酵素を測定した。
【０３４３】
結果を評価するために、１の値を陰性対照（未処理細胞）に割り当て、細胞が一緒にインキュベートされた化合物の各１つの細胞毒性の値をそれから計算した。
【０３４４】
図３２に示す得られた結果は、ＭＴＴに関して行われた試験で見られたように、Ｐｏｌｙｆｅｃｔは、任意の濃度で毒性が最も少ない市販デンドリマーであり、一方、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔは、濃度が増加すると膜における損傷増大を生じ、最大用量（５μｌ）で陰性対照より５倍までのより大きい細胞毒性を生じることとなった。
【０３４５】
ＮＮ及びＮＮ１６デンドリマーは、その濃度が増加すると細胞毒性が増大する。互いに比較すると、ＮＮ１６はＮＮより毒性が少ない。
【０３４６】
（実施例５６）ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞におけるデンドリマーの毒性研究
実施例５５に記載されたものと類似の試験を、Ｕ８７−ＭＧ細胞の代りにＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において行った（ＭＴＴに関して行った試験による細胞生存可能性の評価及び細胞上清におけるＬＤＨの定量化）：細胞を同じ濃度で同じ化合物と一緒にインキュベートしたが、この場合、ＭＴＴ単独に関する測定は、インキュベーション２４時間後に行った。
【０３４７】
実施例５５におけるように、ＭＴＴに関する試験において得られた吸光度値は、陰性対照に対して指数化して、図３３（Ａ）の上部に示す結果を得た。
【０３４８】
これらの結果によって、デキストランと一緒にインキュベートした細胞は、使用した任意の濃度で陰性対照のものに等しい又はより大きい生存可能性値を示した。
【０３４９】
細胞をＳｕｐｅｒｆｅｃｔで処理した場合、約０．５の生存可能性を生じたのに対して、Ｐｏｌｙｆｅｃｔで処理した細胞は、使用した３つの任意の濃度において０．７を超える生存可能性を示した。
【０３５０】
本発明のデンドリマーに関し、Ｕ８７−ＭＧ系において起こることに対して、デンドリマー濃度の変化は、細胞生存可能性に非常に急激な変化をもたらした。試験した本発明の２つのデンドリマー（ＮＮ及びＮＮ１６）の中で、ＮＮ１６が、毒性が最も少ないものであった。
【０３５１】
ＬＤＨ定量化試験において、１の値を陰性対照に割り当て、この値から他の細胞毒性値を計算し、図３３（Ｂ）の下部に示す結果を得た。得られた結果は、ＭＴＴに関する試験に関してなされた観察結果を確認するものである。
【０３５２】
（実施例５７）デンドリマーに仲介されるＵ８７−ＭＧ細胞及びＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞のトランスフェクション
対応する細胞系の１０００００細胞／ウェルを、培地５００μｌを有する２４−ウェルプレートに塗布した。
【０３５３】
デンドリプレックスを、血清を含まない培地７５μｌの全容量においてデンドリマーＮＮ及びＮＮ１６並びに蛍光抗ｒｅｖアンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒に形成し、ここで、抗ｒｅｖオリゴヌクレオチド及び異なる−電荷／＋電荷比：１：１、１：２、１：４及び１：８が得られるように、異なる比率の対応するデンドリマーを、濃度２５０ｎＭで混合した。混合物を周囲温度で３０分間インキュベートし、次いで、対応するウェルに加え、細胞をデンドリプレックスと一緒にインキュベートした。
【０３５４】
インキュベーション２４時間後、細胞をウェルから除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、酸性グリシンと一緒に１分間インキュベートし、細胞膜に付着したままであり得るデンドリプレックスの可能性のある部分を除去し、最終の洗浄をＰＢＳで行った。最後に、細胞を５００μｌのＰＢＳに再懸濁し、細胞内の蛍光オリゴヌクレオチドの量をフローサイトメトリーによって定量化した。
【０３５５】
図３４ａ及び図３４ｂは、Ｕ８７−ＭＧ細胞系に関して得られた結果を示す。グラフは、デンドリマー（対照）を有しないオリゴヌクレオチド、又は各グラフに示す−電荷／＋電荷比：１：１、１：２、１：４及び１：８をもたらす比におけるデンドリマーの１つと抗ｒｅｖオリゴヌクレオチドとで形成された複合体と一緒にインキュベートした細胞に関して得られた結果に対応する。図３４ａは、ＮＮデンドリマーを用いて行った試験に対応し、一方、図３４ｂは、ＮＮ１６デンドリマーを用いて行った試験に対応する。双方の場合において、グラフから、より多量のデンドリマーと形成された複合体と一緒のＵ８７−ＭＧ細胞のインキュベーションは、トランスフェクションの増加をもたらし、オリゴヌクレオチドと一緒のみの細胞（対照）のインキュベーションの場合に得られた１９％から、−電荷／＋電荷比１：８で形成したデンドリプレックスと一緒にインキュベートした場合９５％、及び−電荷／＋電荷比１：８をまた有するＮＮ１６デンドリマーと形成したデンドリプレックスと一緒にインキュベートした場合９７．８％に移行したことを観察することができる。したがって、この結果は、オリゴヌクレオチドに関してデンドリマーの増加が、トランスフェクトされた細胞の割合（％）の増加をもたらすことを示し、−電荷／＋電荷比が１：８の場合に最大のトランスフェクション点に達することになった。
【０３５６】
図３５は、ＮＮ１６デンドリマーを有するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に関して得られた結果を示す。この場合、最大トランスフェクションは、−電荷／＋電荷比１：４で形成したデンドリプレックスに関して得られる（８２．３％）。
【０３５７】
１つの細胞系及び他の細胞系においての双方で、ヌクレオチド単独と一緒にインキュベートした場合に得られるトランスフェクション率に関し細胞をデンドリプレックスと一緒にインキュベートした後起こるトランスフェクション率の増加を生じ、特に−電荷／＋電荷比が１：４又は１：８、すなわち、リボヌクレオチドから構成される又はデオキシリボヌクレオチドによって構成される任意の他のオリゴヌクレオチドに関しデンドリマー比率が増加する場合、同様の結果をもたらしたが、最適−電荷／＋電荷比は、トランスフェクトする細胞のタイプ並びにデンドリプレックスを形成する具体的デンドリマー及びオリゴヌクレオチドによって異なり得る。いずれの場合でも、記載された試験は、オリゴヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）又は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）等のポリアニオン分子のトランスフェクションを増加させるビヒクルとしての本発明のカルボシランデンドリマーの有用性を支持する。
【０３５８】
（参考文献）
2009502765.tif 000086
2009502765.tif 000087
2009502765.tif 000088
2009502765.tif 000089
2009502765.tif 000090
【図面の簡単な説明】
【０３５９】
【図１ａ】非四級化アミン部分を有する本発明のいくつかのカルボシランデンドリマーの構造であって、実施例７、１１、２及び５において合成された構造を示す図である。
【図１ｂ】非四級化アミン部分を有する本発明のいくつかのカルボシランデンドリマーの構造であって、実施例１３及び１４において合成された構造を示す図である。
【図２ａ】四級化アミン部分を有する本発明のいくつかのカルボシランデンドリマーの構造であって、実施例２２、２６、１９及び２７において合成された構造を示す図である。
【図２ｂ】四級化アミン部分を有する本発明のいくつかのカルボシランデンドリマーの構造であって、実施例２８及び２９において合成された構造を示す図である。
【図３】ＯＤＮとＩＭ８デンドリマー（ゲルａではＧＦ）及び（ゲルｂでは異なるＯＤＮ）、ＣｌＮＨ４（ゲルｃ）、ＮＮ及びＰｈｅ（ゲルｄ）並びにＩＭ１６（ゲルｅ、ＩＭ８試料も含む）との間の複合体形成の電気泳動ゲルを示す図である。
【図４】異なるｐＨ値における、ＯＤＮとデンドリマーＰｈｅ、ＣｌＨＮ４（ゲルＡ）、ＮＮ（ゲルＢ）並びにＩＭ８及びＩＭ１６（ゲルＣ）と間で形成された複合体の電気泳動ゲルを示す図である。
【図５】０、６又は２４時間水溶液中に残存する本発明のデンドリマー複合体及びＯＤＮ  ＰＰＴの進展を示す図である。
【図６】アルブミン及びＳＤＳの存在下で、デンドリマー複合体及びＯＤＮ  ＴＡＲからなる試料の電気泳動ゲルを示す図である。左部分は、パラゴンブルー（Ｐａｒａｇｏｎ  Ｂｌｕｅ）を用いたタンパク質の染色であり、右部分は臭化エチジウムを用いたＤＮＡ試料の染色の写真である。
【図７】４０分、４時間及び１７時間、完全培地の存在下でインキュベートされた、本発明のデンドリマー及びＯＤＮからなる試料の進展を示す図である。
【図８】ヒト血清の存在下で、デンドリマー及びＯＤＮの試料の電気泳動ゲルを示す図である。左部分は、ＤＮＡ試料の紫外線光を用いて作製された写真を示し、右部分はパラゴンブルーを用いたゲルのタンパク質の染色を示す。
【図９ａ】０時間、４時間及び２４時間後の、デンドリマー及びＯＤＮの混合物に対応する電気泳動ゲルの臭化エチジウムを用いた染色を示す図である。
【図９ｂ】臭化エチジウムを用いた染色が図９ａに示される、４時間に対応するゲルのタンパク質染色を示す図である。
【図１０】プラスミドＮｆ−ｋａｐｐａＢ−ｌｕｃとＩＭ８デンドリマーとの複合体の試料の電気泳動ゲルを示す図である。
【図１１】ＲＮＡｉと本発明のデンドリマー（ＩＭ８）との複合体形成の試験の電気泳動ゲルを示す図である。
【図１２】細胞をデンドリマーＩＭ８、ＩＭ１６、ＣＬＮＨ４、ＮＮ、Ｐｈｅ及びＳＦとインキューベーション後、濃度１、５、１０、２０及び１００μＭに対するミトコンドリア活性の結果に関するグラフを示す図であり、前の番号付与において占める位置に配置された各濃度に対する対応する棒を有する。
【図１３】濃度１、５、１０及び２０μＭで、赤血球をデンドリマーＩＭ８、ＩＭ１６、ＮＮ、Ｐｈｅ及びＳと一緒にインキュベーション後のヘモグロビン放出の結果に関するグラフを示す図である。各棒は、前回の番号付けに対応する順に置かれたデンドリマーに対応し、棒の各群は、昇り順に並べられた濃度に対応する。
【図１４】本発明の異なるデンドリプレックス及びデンドリマーと一緒にインキュベートされ、トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）で染色された細胞の死亡率の割合に関するグラフを示す図である。
【図１５】細胞の割合を、アポトーシス−壊死細胞と生細胞とに対応する大きさ及び複雑度に関して比較するフローサイトメトリー試験の結果を示す図である。Ｘ軸は大きさを、Ｙ軸は複雑度を示し、暗細胞の暗い影はアポトーシス−壊死細胞に対応する。Ａ部分はＣＢＳデンドリマーで処理されたＰＢＭＣ細胞、及びＢ部分はＰＡＭＡＮタイプデンドリマーで処理されたＰＢＭＣ細胞に対応する。
【図１６】ＣＭＳデンドリマー（Ａ）又はＰＡＭＡＮタイプデンドリマー（Ｂ）で処理されたＰＢＭＣ細胞において、フローサイトメトリー試験後に生じた生細胞及びアポトーシス細胞の割合の表示を示す図である。
【図１７】１：対照、２：ＯＤＮ＋ＩＭ８、３：ＯＤＮ＋ＩＭ１６、４：ＯＤＮ＋ＳＦ、５：ＯＤＮ、６：ＩＭ８、７：ＩＭ１６、８：ＳＦと一緒にインキュベートされた細胞についてＤＡＰＩ生細胞染料を用いた染色を示す図である。
【図１８】ＩＭ８−ＯＤＮと一緒の細胞のインキュベーション７２時間後、０、３０、６０、９０、１２０及び１５０秒後に撮られた写真を示す図である。
【図１９】ＰＨＡ及び対照（Ｃ）とともに、異なるＣＢＳデンドリマーを用いて細胞を刺激するリンパ球増殖試験のシンチレーション計数器に生じた結果に関するグラフを示す図である。
【図２０】ＰＢＭＣがＡ：１時間、Ｂ：３時間、Ｃ：２４時間後に一緒にトランスフェクトされたＯＤＮの細胞局在を示す図である。
【図２１Ａ】ＯＤＮを用いてトランスフェクトされた細胞に存在する蛍光分析を示す図であり、上部グラフは青色蛍光、真中は緑色及び下部は赤色に対応する、ＸＹにおける平均切断を示す線にわたって各点で生じた蛍光値を縦座標に示す。
【図２１Ｂ】ＯＤＮを用いてトランスフェクトされた細胞に存在する蛍光分析を示す図であり、青色蛍光（上部グラフ）及び緑色蛍光（下部グラフ）が分析される核の周辺を目的領域（ＲＯＩ）とした蛍光の同様の分析を示す図である。
【図２２】ＰＰＴ又は本発明のデンドリプレックスを用いたトランスフェクション後に生じた蛍光パターンを示す図であり、１：対照；２：ＰＰＴ；３：ＰＰＴ＋ＩＭ８；４：ＰＰＴ＋ＮＮ；５：ＰＰＴ＋Ｐｈｅ；６：ＰＰＴ＋ＩＭ１６である。
【図２３】ＣｌＮＨ４及びＰＰＴデンドリプレックスを用いたトランスフェクション後に生じた蛍光パターンを示す図である。
【図２４】ＰＰＴ＋ＮＮで処理された細胞のＸＹの中央平面における蛍光のヒストグラムを示す図であり、上部のグラフは平面にわたって見られる緑色蛍光の強度を縦軸で示し、真中のグラフは赤色蛍光に対応する類似分析、及び下部のグラフは青色蛍光に対応する類似分析を示す。
【図２５】感染前後のＮＮデンドリマーの異なる濃度を有する細胞数によってＨＩＶのＤＮＡ複写数を計算して生じたグラフィックを示す図である。
【図２６ａ】レーン上に示されるＮＮデンドリマーのミクロモル濃度（μＭ）をアクリルアミド／ビスアクリルアミドの電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２６ｂ】非薬剤（対照）と一緒にインキュベートされたＮＮデンドリマーの試料又はデンドリマー／薬剤分子の比が１／８（「１」と印したレーン）、１／４（「２」と印したレーン）、１／２（「３」と印したレーン）又は１／１（「４」と印したレーン）のメトトレキサートと一緒にインキュベートした該デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２６ｃ】非薬剤（対照）と一緒にインキュベートされたＮＮデンドリマーの試料又は異なるヘパリン単位：１０Ｕ（「１」と印したレーン）、１Ｕ（「２」と印したレーン）、０．５Ｕ（「３」と印したレーン）又は０．１Ｕ（「４」と印したレーン）と一緒にインキュベートした該デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２６ｄ】非薬剤（対照）と一緒にインキュベートされたＮＮデンドリマーの試料又はデンドリマー／薬剤分子の比が１／３（「１」と印したレーン）、１／１．５（「２」と印したレーン）、４／１（「３」と印したレーン）又は１０／１（「４」と印したレーン）のインシュリンと一緒にインキュベートした該デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２７ａ】レーン上に示されるＮＮ１６デンドリマーのミクロモル濃度（μＭ）をアクリルアミド／ビスアクリルアミドゲルの電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２７ｂ】非薬剤（対照）と一緒にインキュベートされたＮＮ１６デンドリマーの試料又はデンドリマー／薬剤分子の比が１／１６（「１」と印したレーン）、１／８（「２」と印したレーン）、１／４（「３」と印したレーン）又は１／２（「４」と印したレーン）のメトトレキサートと一緒にインキュベートした該デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２７ｃ】非薬剤（対照）と一緒にインキュベートされたＮＮ１６デンドリマーの試料又は異なるヘパリン単位：１０Ｕ（「１」と印したレーン）、１Ｕ（「２」と印したレーン）、０．５Ｕ（「３」と印したレーン）又は０．１Ｕ（「４」と印したレーン）と一緒にインキュベートした該デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２７ｄ】非薬剤（対照）一緒にインキュベートされたＮＮ１６デンドリマーの試料又はデンドリマー／薬剤分子の比が１／３（「１」と印したレーン）、１／１．５（「２」と印したレーン）、４／１（「３」と印したレーン）又は１０／１（「４」と印したレーン）のインシュリンと一緒にインキュベートした該デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２８ａ】レーン上に示されるＩＭ１６デンドリマーのミクロモル濃度（μＭ）をアクリルアミド／ビスアクリルアミドゲルの電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２８ｂ】非薬剤（対照）一緒にインキュベートされたＩＭ１６デンドリマーの試料又はデンドリマー／薬剤分子の比が１／１６（「１」と印したレーン）、１／８（「２」と印したレーン）、１／４（「３」と印したレーン）又は１／２（「４」と印したレーン）のメトトレキサートと一緒にインキュベートした該デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２８ｃ】非薬剤（対照）と一緒にインキュベートされたＩＭ１６デンドリマーの試料又は異なるヘパリン単位：１０Ｕ（「１」と印したレーン）、１Ｕ（「２」と印したレーン）、０．５Ｕ（「３」と印したレーン）又は０．１Ｕ（「４」と印したレーン）と一緒にインキュベートした該デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２８ｄ】非薬剤（対照）一緒にインキュベートされたＩＭ１６デンドリマーの試料又はデンドリマー／薬剤分子の比が１／３（「１」と印したレーン）、１／１．５（「２」と印したレーン）、４／１（「３」と印したレーン）又は１０／１（「４」と印したレーン）のインシュリンと一緒にインキュベートした該デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。
【図２９】非薬剤（「Ｄ」と印したレーン）と一緒にインキュベートした又はｐＨがレーン上に示された数値を取ったインシュリン（「Ｃ」と印したレーン）と一緒にインキュベートしたＩＭ１６デンドリマーの試料を電気泳動した後生じるバンドのパターンを示す図である。図の右側及び左側に現れる２つの写真の各々は、同じ電気泳動条件において生じる、異なるゲルに対応する。
【図３０】示された濃度で、各棒下に示された化合物と一緒にＵ８７−ＭＧ細胞（「Ａ」と印した上のグラフ）又はＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（「Ｂ」と印した下のグラフ）をインキュベートした後生じる対照（「Ｃ−」）について言う増殖因子の値を縦軸に示す棒グラフ示す図である。Ｃ−：負の制御、さらなる化合物を有さない培養地でインキュベートされたのみの試料に対応する。
【図３１】示された濃度及び容量で、２４時間（「Ａ」と印した上のグラフ）、３日間（「Ｂ」と印した真中のグラフ）又は７日間（「Ｃ」と印した下のグラフ）、棒下に示される化合物と一緒にインキュベートしたＵ８７−ＭＧ細胞中でＭＴＴと一緒に試験を行った後生じる対照（「Ｃ−」）の生存可能因子に関する割合として計算される、生存可能因子の値を縦軸に示す棒グラフを示す図である。Ｄｅｘｔｒ：Ｄｅｘｔｒａｎ；Ｓｐｆｅｃｔ：Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ。
【図３２】示された濃度及び容量で、棒下に示される化合物と一緒に２４時間インキュベートされたＵ８７−ＭＧ細胞培養液上清においてラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の定量後生じる対照（「Ｃ−」）の細胞毒性因子に関する割合として表される、細胞毒性因子の値を縦軸に示す棒グラフを示す図である。Ｄｅｘｔｒ：Ｄｅｘｔｒａｎ；Ｓｐｆｅｃｔ：Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ。ＤＭＥＭ：細胞を有しない培養地に対応する値。
【図３３】ＭＴＴ（「Ａ」と印した上のグラフ）を用いた試験を実施後生ずる結果に対応する対照（「Ｃ」）に関する割合、又は示される濃度及び容量において、棒下に示される化合物と一緒に２４時間インキュベートしたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞における培養液上清中のラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（「Ｂ」と印した下のグラフ）の定量の値を縦軸に示す棒グラフを示す図である。Ｄｅｘｔｒ：Ｄｅｘｔｒａｎ；Ｓｐｆｅｃｔ：Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ。ＤＭＥＭ：細胞を有しない培養地に対応する値。
【図３４ａ】デンドリマー（「Ｃｔｒｌ」と印したグラフ、対照）不在下で、フルオレセイン（オリゴ−ＦＩＴＣ）で標識された抗ｒｅｖオリゴヌクレオチドと一緒に、又は各グラフに示される−電荷／＋電荷比：１：１、１：２、１：４及び１：８をもたらす比率におけるオリゴヌクレオチドとＮＮデンドリマーとの間に形成される複合体と一緒にインキュベートしたＵ８７−ＭＧ細胞を分析後フローサイトメトリーにおいて生じるグラフを示す図である。
【図３４ｂ】デンドリマー（「Ｃｔｒｌ」と印したグラフ、対照）不在下で、フルオレセイン（オリゴ−ＦＩＴＣ）で標識された抗ｒｅｖオリゴヌクレオチドと一緒に、又は各グラフに示される−電荷／＋電荷比：１：１、１：２、１：４及び１：８をもたらす比率におけるオリゴヌクレオチドとＮＮ１６デンドリマーとの間に形成される複合体と一緒にインキュベートしたＵ８７−ＭＧ細胞を分析後フローサイトメトリーにおいて生じるグラフを示す図である。
【図３５】デンドリマー（「Ｃｔｒｌ」と印したグラフ、対照）不在下で、フルオレセイン（オリゴ−ＦＩＴＣ）で標識された抗ｒｅｖオリゴヌクレオチドと一緒に、又は各グラフに示される−電荷／＋電荷比：１：１、１：２、１：４及び１：８をもたらす比率におけるオリゴヌクレオチドとＮＮ１６デンドリマーとの間に形成される複合体と一緒にインキュベートしたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を分析後フローサイトメトリーにおいて生じるグラフを示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２６ｄ】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２７ｃ】
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【図２７ｄ】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２８ｃ】
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【図２８ｄ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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