(57)【要約】  １又は複数の試料流体に対してマイクロアレイアッセイを実行する方法が開示されており、前記流体は標的となる生物学的化合物を含んでいる。その方法は、前記標的となる生物学的化合物をラベルで標識するステップを含む。次に続くステップは、前記試料流体を基板と接触させるステップ、及び、前記基板の表面で前記ラベルの存在を検出するステップを含む。その方法は、１つのマイクロアレイにおける、１又は複数の試料流体内の１又は複数の種類の標的となる生物学的化合物の同時分析に適している。この方法の終わりまで、異なる試料流体に属する標的となる生物学的化合物が異なるラベルを有するように、前記種類の生物学的化合物のそれぞれが異なるラベルで標識される。前記異なるラベルは、前記基板の表面で検出された後区別できる。さらに、マイクロアレイアッセイを実行する方法におけるポリマー基板の使用方法も開示されている。
2009520977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的となる生物学的化合物を含んだ１又は複数の試料流体に対してマイクロアレイアッセイを実行する方法であって、当該方法は、前記標的となる生物学的化合物をラベルで標識するステップ、前記試料流体を基板と接触させるステップ、及び、前記基板の表面で前記ラベルの存在を検出するステップを含み、当該方法は、１つのマイクロアレイにおける、１又は複数の試料流体内の１又は複数の種類の標的となる生物学的化合物の同時分析に適しており、さらに：
（ｉ）  異なる試料流体に属する標的となる生物学的化合物が異なるラベルを有するように、前記種類の生物学的化合物のそれぞれが異なるラベルで標識され、
（ｉｉ）  標的となる生物学的化合物の種類の数及び試料流体の数のうち少なくとも１つが、少なくとも２であり、並びに、
（ｉｉｉ）  前記異なるラベルが、前記基板の表面で検出された後区別できる、
方法。
【請求項２】
前記試料流体が前記基板に通して流される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基板が多孔性基板である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記基板がポリマーを含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記基板が、ポリアミドのホモポリマー又はコポリマーを含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリアミドのホモポリマー又はコポリマーが、四級アンモニウムの導入、加溶媒分解、又は、アミド基のアミジン基への誘導体化により修飾される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記基板がセルロース系材料を含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記基板が熱可塑性のフッ化ポリマーを含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記異なるラベルが発光分子を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記異なるラベルが、磁気ビーズ、放射性同位体、酵素、比色分子、及び微小気泡からなる群から選択される、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１又は複数の試料流体を基板と接触させるステップを含む、マイクロアレイアッセイを実行する方法におけるポリマー基板の使用方法であって、前記マイクロアレイアッセイを実行する方法は、１つのマイクロアレイにおける、１又は複数の試料流体内の１又は複数の種類の標的となる生物学的化合物の同時分析を可能にし、標的となる生物学的化合物の種類の数及び試料流体の数のうち少なくとも１つが、少なくとも２である、使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的流体における個々の生物学的化合物の定量分析及び／若しくは定性分析、又は、決定に関する。特に、本発明は、マイクロアレイアッセイを実行するための、改善された、安価で能率的な方法に関する。より明確には、本発明は、マイクロアレイアッセイ内で、１又は複数の試料から生じるいくつかの種類の生物学的化合物の差次標識を実行する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１又は複数の他の分子を含有する生物学的試料内の、それだけに限らないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は蛋白質等、複数の特異的標的となる生物学的化合物の存在及び濃度を、いわゆるマイクロアレイ技術を使用することにより１回の実験中に決定することができる。この技術では、一組の特異的プローブ分子が、１つ特定の標的と特異的に相互作用するためにそれぞれ選ばれ、固体表面の特定の位置で固定化される。一方、標的となる生物学的化合物は、検出可能な分子（例えば、フルオロフォア又は磁気ビーズ）によりラベルされる。前記固体表面を生物学的試料と接触させることにより、標的となる生物学的化合物は、その特異的プローブに対応した位置で固定される。従って、生物学的試料における標的となる生物学的化合物の検出、及び、その濃度の評価は、標的に結合した検出分子により生じる信号の位置測定及び強度の測定によりそれぞれ処理される。
【０００３】
そのような方法は、例えば、表面に３つの異なるオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブが配置され、その表面が３つの異なる相補ＤＮＡ標的の試料プールとハイブリッド形成した、ＷＯ０３／００４１６２号に開示されている。その標的は蛍光ラベル（フルオレセインイソチオシアネート）で修飾され、表面上での直接の検出を可能にしている。試料が表面に接触するに従い、特異的標的はプローブにより溶液から表面上へ捕獲され、検出が落射蛍光顕微鏡により実行される。ＷＯ０３／００４１６２号は、任意選択でポンピングシステムの使用により繰り返し、試料が基板を流れ抜けることによりプローブに接触するのを可能のするための多孔性の基板の使用等、上記の一般的な方法に対するいくつかの改善点を開示している。この方法は、ハイブリッド形成をしっかりと固定するという利点を有している。別の改善点は、試料の温度を調節するためのサーマルチャンバの使用である。ハイブリッド形成は温度依存性の現象であり、温度調節は、例えば核酸分析等に利点を提供する。
【０００４】
しかし、この従来技術の方法は、１を超える試料（例えば、健康な受診者の血液対病気の受診者の血液）に対して、又は、１つの生物学的試料に存在する２種類の異なる生物学的化合物（例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ）に対して、マイクロアレイ技術を１回の実験で同時に実行する方法を提供していない。これらの制限により、いくつかの生物学的流体における、及び／又は、異なる種類の生物学的化合物に属する個々の生物学的化合物の定量分析及び／若しくは定性分析、又は、決定において、必要とされる時間、従って必要とされる費用がかなり増加する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、当技術分野において、１を超える生物学的試料に対して同時に、又は、１つの生物学的試料に存在する２種類以上の異なる生物学的化合物に対して１回の実験でマイクロアレイ技術を行うための、改善され、より時間のかからない、より能率的な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概して、本発明は、第１の態様において、１又は複数の試料から生じるいくつかの種類の生物学的化合物の差次標識を１回のマイクロアレイアッセイで同時に実行する方法に関する。本発明は、第２の態様において、１又は複数の試料から生じるいくつかの種類の生物学的化合物の１回マイクロアレイアッセイでの差次標識を含めた方法における、それだけに限らないが、無機のウエーハ又は有機の膜等の基板の使用にも関する。
【０００７】
そのより広い意味において、本発明は、標的となる生物学的化合物を含んだ１又は複数の試料流体に対してマイクロアレイアッセイを実行する方法に関し、当該方法は、前記標的となる生物学的化合物をラベルで標識するステップ、前記試料流体を基板と接触させるステップ、及び、前記基板の表面で前記ラベルの存在を検出するステップを含み、当該方法は、１つのマイクロアレイにおける、１又は複数の試料流体内の１又は複数の種類の標的となる生物学的化合物の同時分析に適しており、さらに：
（ｉ）  異なる試料流体に属する標的となる生物学的化合物が異なるラベルを有するように、前記種類の生物学的化合物のそれぞれが異なるラベルで標識され、
（ｉｉ）  標的となる生物学的化合物の種類の数及び試料流体の数のうち少なくとも１つが、少なくとも２であり、並びに、
（ｉｉｉ）  前記異なるラベルが、前記基板の表面で検出された後区別できる
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書において使用される「種類」という用語は、標的となる生物学的化合物に使用された場合、他に述べられていない限り、その分子構造により関係のある化合物の群を示している。本発明に関与している標的となる生物学的化合物の典型的な種類は、それだけに限らないが、ＤＮＡ生物学的化合物、ＲＮＡ生物学的化合物、ポリペプチド、酵素、蛋白質、抗体等を含む。
【０００９】
本明細書において使用される「マイクロアレイアッセイ」という用語は、他に述べられていない限り、標的となる生物学的化合物を含んだ試料、好ましくは生物学的流体試料（任意選択で、その中に懸濁した少量の固体又はコロイド状粒子を含有する）が、基板（例えな膜）と（例えば通り抜けて）接触するアッセイを示している。その基板は、多数の別々の及び分離した領域をその表面に渡り含んでおり、前記領域のそれぞれが、（例えばスポッティングにより）そこに与えられた１種類のプローブを有し、さらに、前記１種類のプローブのそれぞれが、一部の特異性、好ましくは厳しい条件下での特異性、好ましくは非常に厳しい条件下での特異性と結合するその能力のため、１種類の生物学的化合物あたり最大１つの標的となる生物学的化合物に対して選ばれる。当業者には周知のように、結合条件の厳しさは、温度、イオン濃度、及びｐＨ等の一連のパラメータを含んでいる。
【００１０】
本明細書において使用される「標的」という用語は、他に述べられていない限り、分析の目的又は要点として定められた分子化合物を示している。標的は、それだけに限らないが、核酸及び関連化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又はその類似体、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体、プラスミド等）、蛋白質及び関連化合物（例えば、ポリペプチド、単クローン抗体、受容体、転写因子等）、抗原、リガンド、ハプテン、炭水化物及び関連化合物（例えば、多糖類、少糖類等）、細胞小器官、無処置の細胞等の分子化合物を含む。
【００１１】
本明細書において使用される「プローブ」という用語は、他に述べられていない限り、基板の表面上及び／又は基板内に固定化され、試料の一部である「標的」と特異的に相互作用することができ、並びに、前記特異的標的の存在を検出するために使用される物質を示している。プローブは、それだけに限らないが、核酸及び関連化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又はその類似体、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体、プラスミド等）、蛋白質及び関連化合物（例えば、ポリペプチド、単クローン抗体、受容体、転写因子等）、抗原、リガンド、ハプテン、炭水化物及び関連化合物（例えば、多糖類、少糖類等）、細胞小器官、無処置の細胞等の分子化合物を含む。
【００１２】
本明細書において使用される「ラベル」という用語は、他に述べられていない限り、その物質の分配、及び／又は、ラベルが送達する信号の強度の検出を可能にするように容易に検出される物質を示している。そのラベルは、それだけに限らないが、発光分子（例えば、蛍光剤、リン光剤、化学発光剤、生物発光剤等）、着色した分子、反応後に色を生じる分子、酵素、磁気ビーズ、放射性同位体、特異的に結合可能なリガンド、音波共鳴により検出可能な微小気泡等である。
【００１３】
本明細書において使用される「標識する」という用語は、他に述べられていない限り、ラベルをプローブに取り込むための措置を示している。
【００１４】
本発明の重要な特徴は、１回の方法の実行中に、少なくとも２つの異なるラベルが同時に使用されることである。本発明の別の重要な特徴は、これらの少なくとも２つの異なるラベルが、標準のラベル検出法のよる検出後に区別できるべきであるということである。この特徴は：
異なる試料からの分析物を同時に測定する（例えば、血液試料及び喀痰試料のＤＮＡ含有量を１回の実験で分析する）ステップ、又は
例えば比較目的のため、複数の試料からの分析物の差次発現を同時に測定する（例えば、健康な受診者から生じる血液試料及び病気の受診者から生じる血液試料両方のＤＮＡ含有量を、１回の方法の実行で分析する）ステップ、又は
同じ試料からの異なる種類の標的となる生物学的化合物を同時に測定又は分析する（例えば、血液試料のＤＮＡ含有量もＲＮＡ含有量も１回の方法の実行で分析する）ステップ、又は
異なる試料からの異なる種類の標的となる生物学的化合物を同時に測定する（例えば、血液試料及び喀痰試料両方のＤＮＡ含有量及びＲＮＡ含有量を１回の方法の実行で分析する）ステップ
による分析方法において、有意な時間の獲得を達成するのを可能にしている。
【００１５】
分析されることになる試料、好ましくは流体試料に存在する標的となる生物学的化合物が、それだけに限らないが、以下の：
約５個のアミノ酸ユニットから５０個のアミノ酸ユニットを有するオリゴペプチド、
５０個を超えるアミノ酸ユニットを有するポリペプチド、
酵素を含めた蛋白質、
オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、
抗体、又はその断片、
ＲＮＡ、並びに、
ＤＮＡ
等の分子である場合に、本発明の方法は特に有用である。
【００１６】
特定の標的となる生物学的化合物には、変性ステップが有益である場合があり、例えば、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に引き離し、膜上にスポットさせた捕獲プローブへのその一本鎖の特異的結合を可能にする。そのような変性ステップを、簡便な方法、例えば基板（ウエーハ又は膜）若しくは試料、又はその両方を加熱することにより、実行することができる。試料がそのような変性ステップで加熱される場合、鎖同士を引き離しておくために任意の冷却ステップを実行することができる。
【００１７】
方法のうち第１ステップにおいて前記標的となる生物学的化合物を標識するために使用され、方法のうち最後のステップにおいてその検出を最終的に可能にするラベルは、発光（蛍光、リン光、化学発光）、放射性、酵素的、比色、音波（例えば、微小気泡の共鳴）、又は磁気性質のラベルであり得る。特異的に結合可能なリガンドを、ラベルの代わりに使用することができる。この最後の場合において、リガンドは次のステップで適合性のあるラベルを含んだ物質に結合する。
【００１８】
適切な蛍光又はリン光ラベルは、それだけに限らないが、例えば、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等である。
【００１９】
適切な化学発光ラベルは、それだけに限らないが、例えば、ルミノール及びサイリューム等である。
【００２０】
適切な放射性ラベルは、それだけに限らないが、例えば、１２５Ｉ又は３２Ｐのような同位体である。
【００２１】
適切な酵素的ラベルは、それだけに限らないが、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等である。
【００２２】
適切な比色ラベルは、それだけに限らないが、例えば、コロイド金等である。
【００２３】
適切な音波ラベル（ｓｏｎｉｃ  ｌａｂｅｌ）は、それだけに限らないが、例えば、微小気泡等である。
【００２４】
適切な磁気ビーズは、それだけに限らないが、例えば、ダイナビーズ等である。
【００２５】
各標的となる生物学的化合物を、感度を増すために、（例えば、最後のＰＣＲ増幅ステップ中に）約３００個までの同一のラベルで標識することができる。任意のステップとして、標的となる生物学的化合物に取り込まれておらず、それでも試料流体に存在する未結合のラベルを、後の測定中のバックグラウンド信号を減少するために、化学的及び／又は物理的処理（例えば、化学的なＰＣＲ精製、透析、又は逆透析）により試料流体から除去することができる。
【００２６】
試料流体は、産業又は自然由来であり得る。本発明の方法を実行するのに適切な試料流体の例は、それだけに限らないが、哺乳動物（特にヒト）、鳥類、及び魚類を含めたいかなる動物からの喀痰、血液、尿、唾液、糞、又は血漿等の体液でもあり得る。他の制限しない例として、植物、線虫、バクテリア等からの生物学的物質を含めた流体が挙げられる。本発明の方法の適切な実行に対する唯一の必要条件は、前記生物学的物質が、例えば、適切な溶解培地内の溶液中等、実質的に流体、好ましくは液体状の流体に存在することである。本発明の方法において使用される試料流体の容積は、約５μｌから１ｍｌ、好ましくは約５０μｌから４００μｌのいかなる値も取ることができる。
【００２７】
多くの場合、緩衝液（例えば、ハイブリッド形成緩衝液）を、分析されることになる試料流体内に直接、又は、（例えば、流体として若しくは凍結乾燥された状態で、基板の上若しくは下に加えられる）検出ユニットの一体部分として組み入れ、このようにして、独立したハイブリッド形成緩衝液用貯蔵所の必要性を除去することが所望される。
【００２８】
プローブが与えられた（例えば、スポットされた）基板は、本発明の限定的な特徴ではなく、従って、当分野において、マイクロアレイアッセイに適切な基板としてすでに記載されている基板を、いかなる材料からも作製することができる。そのような材料の限定的ではない例として、
ポリアミドのホモポリマー若しくはコポリマー（例えばナイロン）、熱可塑性のフッ化ポリマー（例えばＰＶＤＦ）、ポリビニルハライド、ポリスルホン、ニトロセルロース若しくは酢酸セルロース等のセルロース系材料、ポリオレフィン、又は、ポリアクリルアミド等の有機ポリマー、及び
ガラス、石英、シリカ、他のシリコン含有セラミック材料、酸化アルミニウム等の金属酸化物の材料等の無機材料
が典型として挙げられる。
【００２９】
これらの材料には、活性化できるものとできないものがある。活性化できる場合、その活性化は、化学的又は物理的処理により行うことができる。適切な活性化の手段は、それだけに限らないが、プラズマ処理、コロナ処理、ＵＶ処理、火炎処理、及び、化学修飾を含む。材料の種類、特に有機ポリマー材料の種類に応じて、適切な化学修飾は、それだけに限らないが、（例えばポリアミドへの）四級アンモニウムイオンの導入、加溶媒分解（例えば加水分解）、（例えばポリアミドにおける）アミド基のアミジン基への誘導体化、ヒドロキシル化、カルボキシル化、又はシリル化を含む。本発明の方法の適切な実行に活性化を必要としない基板材料の限定的ではない例は、ナイロン（ポリアミドのホモポリマー）であり、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分析に使用される場合、ナイロンはオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドに対して固有の親和性を有しているため、適切な例として挙げられる。
【００３０】
本発明の方法において使用されることになる基板は、多孔性又は非多孔性であり得る。基板が非多孔性の場合、前記非多孔性基板を試料流体に接触させることにより、好ましくはいくらかかき混ぜながら、さらに、ハイブリッド形成が起きるよう十分長く時間をかけ（例えば、約４から２０時間に及ぶ間）、ハイブリッド形成を簡単に行うことができる。
【００３１】
基板が多孔性の場合、ハイブリッド形成は、前記試料流体を前記多孔性基板に通して流すことより行うことが好ましい。これは、例えば、１又は複数回、一方向又は両方向で、多孔性基板に通して試料流体をポンプすることにより行うことができる。これは、試料流体を前記多孔性基板の孔に通して流し込むために、試料流体の中で多孔性の基板自体を１又は複数回動かすことによっても達成することができる。例えば、基板を、該基板の面に対して垂直の方向で、試料流体を含んだチャンバに対して相対的に動かすことができる。
【００３２】
基板が多孔性の場合、種々の形状及び寸法の複数の孔、開口部、及び／又はチャネルを有する網状組織を含むことができる。基板は、ナノポーラス又はマイクロポーラスでありえ、すなわち、孔、開口部、及び／又はチャネルの平均サイズは０．０５μｍから１０．０μｍ、優先的には０．１μｍから１．０μｍ、より優先的には０．３から０．６μｍで構成されることが適切であり得る。気孔径分布は実質的に均一であり得るか、又は、前記基板の製造技術に応じて、約１．１から約４．０までの多分散を有する場合がある。その孔、開口部、又はチャネルに対応する表面は、多孔性基板の上面又は下面の全表面のうち約１から９９％、好ましくは約１０％から９０％、及び、より好ましくは約２０％から８０％に相当し得る。
【００３３】
基板、例えば膜の厚さは、本発明の限定的な特徴ではなく、約１０μｍから１ｍｍ、好ましくは５０μｍから４００μｍ、より好ましくは７０μｍから２００μｍまで変更することができる。基板、例えば膜の形状は、本発明の限定的な特徴ではない。その形状は、直径が約３から１５ｍｍに及ぶ円形であり得るが、本発明の方法は、他のいかなる基板形状及び／又はサイズにも適用することができる。
【００３４】
本発明に使用されるプローブは、標的となる生物学的化合物に対するその親和性、又は、前記標的となる生物学的化合物の関連する修飾に対するその親和性から適切に選ばれるべきである。例えば、標的となる生物学的化合物がＤＮＡである場合、プローブは、それだけに限らないが、合成のオリゴヌクレオチド、その類似体、又は特異的抗体であり得る。標的となる生物学的化合物の適切な修飾の限定的ではない例は、ビオチンで置換された標的となる生物学的化合物であり、その場合、プローブはアビジン官能性を有することができる。
【００３５】
後の検出及び同定をより容易に支えるために、１又は複数の追加のスポット（例えば、強度較正及び／又は位置検出用）も、基板の表面上にスポットすることができる。
【００３６】
スポッティングに続き、プローブは、その基板（例えば、膜）固有の性質、若しくは（例えば活性化により）獲得した性質のため自然に基板の表面上に固体化される、又は、（例えば、それだけに限らないが、乾燥、加熱を介する、又は光源への曝露を介する架橋結合等の）追加の物理的処理ステップを介して、基板の表面上に固定化されるようになる。
【００３７】
基板（例えば、膜）、及び、基板に付着したプローブの有効期間を改善するため、膜が使用されていない時に、膜を乾燥させることは有用であり得る。膜はその後、試料流体と接触し再水和される。
【００３８】
プローブが（例えば、インクジェットスポッティングにより）基板の表面上に与えられると、基板のうちスポットされていない領域を不活性化するための遮断薬を効果的な量追加することは、スポットされていない領域への標的となる生物学的化合物の、又は、未結合のラベルの非特異的な結合（不必要なバックグラウンド信号を生じるであろう）を防ぎ、従って、信号対雑音比を増加するために有用であり得る。適切な遮断物質又は遮断薬の例として、それだけに限らないが、通常は、サケの精液、脱脂乳、又はポリアニオンが挙げられる。
【００３９】
多孔性基板の場合、例えば、各ポンピングサイクルの後等、所定の数のポンピングサイクルの後、又は、例えば、各基板移動サイクル（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｍｏｖｉｎｇ  ｃｙｃｌｅｓ）の後等、所定の数の基板移動サイクルの後、ラベルの存在を定量的に測定することは有用であり得る。そのような定量的測定の結果は、実際の基板の及び／又は試料流体の温度の知識と組み合わせて、標的となる生物学的化合物の動態特徴を決定することを可能にしている。試料流体を規定された温度まで加熱することは、より厳しい結合条件を与えることを介して、結合性質、特に結合特異性のより正確な調節を可能にしている。この加熱ステップは、膜若しくは試料流体、又は、その両方を加熱することによっても達成することができる。所望の温度に達した後、次に試料流体は、基板と接触させられる。
【００４０】
結合特異性及び／又は方法の感度を、それだけに限らないが、以下の適切な手段により増加することができる：
適切な温度特性を使用するステップ（例えば、任意選択で継続的な加熱ステップ間に適切な平衡時間を持った、一連の１又は複数の加熱ステップ）
基板移動サイクルの数を適応させるステップ、及び
連続した測定のために、測定されたラベル信号を信号後処理するステップ（例えば、蛍光画像を画像処理するステップ）、及び
捕獲された標的となる生物学的化合物が最適に結合する、又は、再び離れる温度を決定するステップ。
【００４１】
例えば、温度を上げた場合、測定された信号の激減により、所与の捕獲プローブ−標的となる生物学的化合物複合体の分離（溶解）温度に達したことが示される。この性質を使用して、特異的結合と非特異的結合を区別することができる。特異性をさらにもっと改善するために、溶解温度の許容限界を超えた後にも、測定サイクルを続けることができる。この場合、標的となる生物学的化合物の再結合が、適切な特異的溶解温度よりも下で再び発生することを確かめるために、継続的に温度は下げられる。
【００４２】
次に、方法のうち任意の最終ステップは、未結合のラベル及び／又はラベルされた生物学的化合物によるバックグラウンド信号をさらに減少するために、検出チャンバから残りの試料流体を除去することにある。
【００４３】
検出チャンバの形状は、未結合のラベル及び／又は生物学的化合物が、測定中、例えば、（ラベルが発光分子である場合に）膜の下にある試料流体から放出される光に対する光路長の妨害を介して、又は、光透過性の窓の近くまで膜を動かし、その結果上澄み液をなくすことにより、検出システムから隠れるように設計されるのが好ましい。内蔵のホイッパーにより上澄み液をホイップすることによって、バックグラウンド信号をさらに減少することができる。試料流体の除去並びに検出チャンバの形状の設計により、検出システムに面している基板表面並びに膜の反対側が最小限の量の試料流体を表面層として有することが保証されている。この減少は、未結合のラベル及び／又は未結合のラベルされた生物学的化合物からのバックグラウンド信号を減少する。
【００４４】
適切な時間の間、基板が試料流体と接触した後、例えば、多孔性の基板に通した適切な数の試料ポンピングサイクル、又は、適切な数の膜移動サイクルの後、プローブに結合した標的となる生物学的化合物のラベルが検出及び測定される。さらに、膜の移動の間も、ラベルを測定することができる。
【００４５】
観察された各信号の物理的な位置、性質、及び強度により、どの標的となる生物学的化合物が捕獲されたかを特定するか、どの試料からこの標的となる生物学的化合物は生じているか、及び／又は、どの種類の生物学的化合物に属しているか特定する、並びに、その濃度を評価することが可能である。
【００４６】
本発明の方法の最終ステップにおける基板の分析を、落射蛍光顕微鏡及びＣＣＤ（電荷結合素子）カメラ、又はいかなる他の種類のカメラを含んだ光学機構によっても実行することができる。この光学機構は、蛍光ラベル又はリン光ラベルの場合、そのそれぞれの励起波長でラベルを励起する能力を持つ（好ましくはＵＶ）光源を含んでいることが好ましい。
【００４７】
化学発光ラベルの検出は、例えば、ラベルに適切な反応物質を添加し、その蛍光を顕微鏡の使用により観察することによって実行される。
【００４８】
放射性ラベルの検出は、例えば、医用Ｘ線フィルムを基板に対して直接配置することにより実行される。Ｘ線がラベルに曝露されるに従い現れ、黒い領域をつくりだし、その黒い領域は、関心のあるプローブの位置に合致している。
【００４９】
酵素的ラベルの検出は、例えば、ラベルに適切な基質を添加し、酵素により触媒された反応の結果（例えば、色の変化）を観察することにより実行される。
【００５０】
比色ラベルの検出は、例えば、ラベルに適切な反応物質を添加し、結果として生じる状況又は色の変化を観察することにより実行される。
【００５１】
音波微小気泡ラベルの検出は、例えば、前記ラベルを特定の周波数の音波に曝露し、結果として生じる共鳴を記録することにより実行される。
【００５２】
磁気ビーズの検出は、例えば、磁気センサにより実行される。
【００５３】
本発明の方法は、本明細書において上記のように、相当数の要素への言及により記述されてきた。その要素のそれぞれが、好ましい、若しくは、さらにより好ましい価値基準又は実施形態の可能な選択を含んでいる。要素の特定の組合せに関して、他に説明がない限り、１つのそのような要素に対する各好ましい範囲又は実施形態を、１又は複数の他の要素に対する各好ましい範囲又は実施形態と任意に組み合わせることができるということが理解されたい。
【００５４】
本発明は、次に、以下の実施例において説明される特定の実用的な実施形態に関して、及び、添付の図を参考にして記述される。しかし、これらの実施例は、単に本発明の例証となるものであり、いかなる点においても本発明を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００５５】
本発明の第１の実用的な実施形態が、図１に記述されている。図１の左側では、第１の流体試料（１２）に存在する標的ＤＮＡ分子（１１）が、第１の種類のラベル（１３）で標識され、標識された標的ＤＮＡ分子（１４）を与えている。図１の右側では、第２の流体試料（１６）に存在する標的ＤＮＡ分子（１５）が、第２の種類のラベル（１７）で標識され、標識された標的ＤＮＡ分子（１８）を与えている。図１の真ん中では、両方の試料が共に混合されて混合液（１９）を形成し、次に、その混合液は基板（１１０）に通して流し込まれている。
【実施例２】
【００５６】
本発明の第２の実用的な実施形態が、図２に記述されている。図２の上部では、２つの異なる種類のラベル（２１）及び（２２）が、試料（２３）に存在する２種類の異なる標的分子（ＲＮＡ分子（２４）及びＤＮＡ分子（２５））と混合され、標識された標的ＲＮＡ分子（２７）及び標識された標的ＤＮＡ分子（２６）を前記試料において与えている。前記試料は、次に、基板（１１０）に通して流し込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の第１の実用的な実施形態を示している。
【図２】本発明の第２の実用的な実施形態を示している。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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