(57)【要約】【課題】撮像のための組成物、方法、及び装置、特に、Ｘ線顕微鏡コンピュータ断層撮影法から得られた試料画像の調製、収集、及び処理の改善を提供する。【解決手段】コンピュータ断層撮像を用いて表現型に関してエキソビボ胎芽を選別するための高速かつ廉価で高処理量の高解像度撮像の方法のための処理と共に、Ｘ線顕微鏡コンピュータ断層撮影法を用いて仮想組織像のためのマイクロＣＴ画像を生成する方法を説明する。高品質画像生成及び解剖学的構造の識別、並びに分子ターゲットの位置確認に寄与する、試料の特定の構成要素を１つ又はそれよりも多くの染色剤で染色することを説明する。生成した画像の撮像後処理の低減を考慮する革新的な動物及び試料ホルダを詳細に説明する。特に、透過性の低い構造から動物又は試料を分離する透過性の高いベッド又はライナを含む動物及び試料ホルダを提供する。動物の身体に適合するベッドを含む、撮像手順又は複数の撮像手順の間に動物を望ましい位置に配置及び／又は維持するための更に別の動物ホルダを提供する。【選択図】図９Ａ
2009524826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色された試料のマイクロＣＴ画像を生成する方法であって、
（ａ）第１の染色剤を含む第１の染色組成物中で試料を培養し、染色された試料を生成する段階、
（ｂ）前記染色された試料を該染色された試料よりも電子密度が低い液体に懸濁する段階、及び
（ｃ）前記染色された試料をＸ線コンピュータ断層撮影スキャナで走査し、該染色された試料のマイクロＣＴ画像を生成する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試料は、エキソビボ胎芽、エキソビボ胎仔、及び組織切片から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料を第２の染色剤に露出して二重染色試料を生成する段階を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の染色剤は、前記第１の染色組成物中に存在することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の染色剤は、第２の染色組成物中に存在することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の染色剤は、０．１から１．８４重量パーセントの四酸化オスミウム、又は４．５から５．５重量パーセントのリンタングステン酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１又は第２の染色組成物は、カコジラート緩衝液を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の染色組成物又は第２の染色組成物は、有機固定剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記有機固定剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、及びその組合せから成る群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の染色剤は、エチジウムブロマイド、シスプラチン、及びその組合せから成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の染色剤は、細胞又は細胞小器官膜マーカであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の染色剤は、核マーカであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料は、レポーター遺伝子産物を含み、前記第１の染色組成物中で試料を培養する段階は、該レポーター遺伝子産物の存在を示す染色を生成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーター遺伝子産物は、ベータ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料は、個々の動物から１回目に得られる試料であり、
前記個々の動物から２回目に第２の試料を得る段階と、
前記第２の試料を染色組成物中で培養し、染色した第２の試料を生成する段階と、
前記染色した第２の試料をＸ線コンピュータ断層撮影スキャナで走査し、マイクロＣＴ画像を生成する段階と、
を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
治療的又は調査的手順が、前記１回目の後でかつ前記２回目の前に実行されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
表現型に関してエキソビボ胎芽を選別する方法であって、
エキソビボ胎芽を第１の染色組成物中で培養し、染色エキソビボ胎芽を生成する段階と、
前記染色エキソビボ胎芽をＸ線コンピュータ断層撮影スキャナで走査し、該染色エキソビボ胎芽のマイクロＣＴ画像を生成する段階と、
前記染色エキソビボ胎芽の前記画像を対照エキソビボ胎芽の統計的平均かつ年齢適合アトラスと比較して該画像間の差を判断し、それによって表現型に関して前記エキソビボ胎芽を選別する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記エキソビボ胎芽の前記コンピュータ断層撮影画像は、該エキソビボ胎芽の等値面又は半透明レンダリングを含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エキソビボ胎芽の前記コンピュータ断層撮影画像は、該エキソビボ胎芽の仮想切片を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
複数の試料のマイクロＣＴ画像を生成する方法に用いるための市販パッケージであって、
各チャンバが壁を有する多重チャンバ試料ホルダと、
前記試料ホルダのチャンバに置かれた試料に接触し、チャンバの前記壁に接触しないように該試料を分離し、かつマイクロＣＴ画像を生成するのに用いられる電磁放射線に対して該試料に接触する少なくとも一部分が高度に透過性であるライナと、
を含むことを特徴とするパッケージ。
【請求項２１】
コンピュータ断層撮影法に用いるための多重チャンバ試料ホルダであって、
各チャンバが該チャンバに置かれた試料の支持のための支持部分を有する壁を有する多重チャンバ試料ホルダと、
前記試料と接触して該試料が前記壁に接触することを防ぎ、かつマイクロＣＴ画像を生成するのに用いられる電磁放射線に対して該試料に接触する少なくとも一部分が高度に透過性であるライナと、
を含むことを特徴とするホルダ。
【請求項２２】
前記壁の少なくとも一部分は、マイクロＣＴ画像を生成するのに用いられる電磁放射線に対して実質的に透過性であることを特徴とする請求項２０に記載の多重チャンバ試料ホルダ。
【請求項２３】
マイクロコンピュータ断層撮影画像を収集し、記憶し、かつ検索するためのコンピュータベースの方法であって、
デジタルコンピュータ断層撮影画像を生成する段階と、
コンピュータに付随する集中型データ記憶場所に前記画像を電子的に送信する段階と、
要求に応答して前記画像を前記記憶場所から検索する段階と、
前記要求に応答して前記画像を電子的に表示するか又は第２の場所に電子的に送信する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
撮像処理に用いるための動物ホルダであって、
支持部分を有する壁と、
前記壁の前記支持部分上に配置され、動物接触部分を有する上部側と、底部側と、該上部側と該底部側の間に延びる厚みとを有し、かつ該上部側の該動物接触部分及び該上部側に隣接する該厚みの部分が、撮像処理に用いる電磁放射線に対して高度に透過性である、撮像される動物のためのベッドと、
を含むことを特徴とするホルダ。
【請求項２５】
前記壁は、内部容積及び外部を形成し、かつ動物を該外部から該内部容積に入れるための通路を有することを特徴とする請求項２４に記載の動物ホルダ。
【請求項２６】
前記通路を閉鎖するために前記壁に接触する蓋を更に含むことを特徴とする請求項２４に記載の動物ホルダ。
【請求項２７】
ガス制御システムを更に含むことを特徴とする請求項２４に記載の動物ホルダ。
【請求項２８】
前記壁の少なくとも一部分は、前記撮像処理に用いる電磁放射線に対して実質的に透過性であることを特徴とする請求項２４に記載の動物ホルダ。
【請求項２９】
前記ガス制御システムは、ガスのための通路を形成する前記壁内の閉鎖可能ポート、ガスケット、フィルタ、ガスポンプ、麻酔送出装置、及びその組合せから成る群から選択された構成要素を含むことを特徴とする請求項２８に記載の動物ホルダ。
【請求項３０】
撮像装置内の所定位置に置かれた時に撮像視野に存在する動物ホルダの構成要素と接触する基準又は相互レジストレーションマーカを更に含むことを特徴とする請求項２４に記載の動物ホルダ。
【請求項３１】
前記ベッドの密度は、立方フィートあたり１．８から８ポンドの範囲内であることを特徴とする請求項２４に記載の動物ホルダ。
【請求項３２】
動物を支持し、かつ撮像手順の間に該動物を望ましい位置に維持するための動物ホルダであって、
支持部分を有する壁と、
前記壁の前記支持部分上に配置され、かつ前記動物の少なくとも一部に適合するようになったベッドと、
を含むことを特徴とするホルダ。
【請求項３３】
試料からの複数の撮像データセットを組み合わせる方法であって、
ある一定の位置に固定された試料から撮像データセット１を生成する段階と、
前記位置に再現可能に固定された前記試料から前記撮像データセット１と異なる撮像データセット２を生成する段階と、
前記撮像データセット１及び前記撮像データセット２の相互レジストレーションを行う段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記撮像データセット１又は前記撮像データセット２は、マイクロＭＲＩ、マイクロＣＴ、マイクロＰＥＴ、マイクロＳＰＥＣＴ、発光光学撮像、及び蛍光光学撮像から成る群から生成されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の方法によって取得可能なマイクロＣＴ走査。
【請求項３６】
活性原料として請求項１に記載の染剤を、マイクロＣＴ撮像のための試料染剤としてそれを使用するための指示書と共に含むことを特徴とする市販パッケージ。
【請求項３７】
動物を支持し、かつ撮像手順の間に該動物を望ましい位置に維持するための動物ホルダであって、
支持部分を有する壁と、
前記壁の前記支持部分上に配置され、かつ前記動物の少なくとも一部に適合するようになったベッドと、
を含むことを特徴とするホルダ。
【請求項３８】
実質的に実施例のいずれかにおいて本明細書に説明するような請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
実質的に添付図面を参照して本明細書に説明し、及び／又は添付図面に例示するような請求項２４に記載の動物ホルダ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、内容が引用により本明細書に組み込まれている、２００６年１月２６日出願の米国特許仮出願出願番号第６０／７６２、３２７号の優先権の恩典を請求する非仮出願である。
本発明は、一般的に、撮像のための組成物、方法、及び装置に関し、より詳細には、試料画像、特にＸ線顕微鏡コンピュータ断層撮影法から得られたものの調製、収集、及び処理の改善に関する。
【背景技術】
【０００２】
撮像技術の発展は、従来的に科学的理解の急速な進歩に寄与している。最も初期の撮像ツールは、主に、肉眼解剖学的構造を解像することに関するが、現代の撮像技術は、非常に微細な構造的詳細、並びに場合によっては分子情報の視覚化を可能にする。
いくつかの新しい撮像モダリティの開発、並びに分子及び細胞生物学技術の進化は、これらの技術によって得られる利点を最大にするための改良方法及び装置の必要性をもたらしている。例えば、遺伝子改変動物は、分子生物学的方法により容易に生成される。遺伝子改変動物の系統的な撮像は、特定の遺伝子の機能に対する理解を深める好機を提供する。更に、現在では、遺伝子改変動物、並びに他の動物及び試料から更に別の情報を集めるために、様々な撮像モダリティからのデータを空間的に相関させることも実現可能である。相関に適する撮像技術は、例示的に、共焦点光学顕微鏡法（ＣＯＭ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、及び単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を含む。しかし、呈示された好機にも関わらず、撮像技術には限界が残っている。
【０００３】
遺伝子標的法は、潜在的に、哺乳類の胎芽のパターン化における遺伝子の機能及びその役割の前例のない洞察を可能にするが（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．、「Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ」、第６巻、５０７〜１２頁、２００５年）、このようなプロジェクトにおいて撮像すべき動物の数は多い。〜２５、０００又はそれよりも多くのマウス遺伝子の各々に対して遺伝子標的法手法を用いるこの手段によって哺乳類の発現を完全に理解することは、手強いタスクのように思える場合がある。それにも関わらず、１０パーセントを超える公知のマウス遺伝子が遺伝子標的法により既に破壊されており、一方、国立衛生研究所は、あらゆる公知の遺伝子が破壊されたマウス系統の集合を率先して作成している（Ａｕｓｔｉｎ、ＣＰ．他、「Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ」、第３６巻、９２１〜４頁、２００４年）。発生生物学者の前に敷かれた問題は、形態学的表現型を系統的に分析し、可能な場合には、胎芽のパターン化に対する各遺伝子の寄与を定量的に判断することになる。この種類の表現分析のための撮像ツールに関連する属性には、高解像度解剖学的撮像の高速の走査速度、低価格、及び利用し易い高処理方法、並びに突然変異体表現型から正常変異を識別するのに用いることができる発生時期特異的統計平均野生型形態アトラスが含まれる（Ｊａｃｏｂｓ、Ｒ．Ｅ．他、「Ｃｏｍｐｕｔ  Ｍｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｇｒａｐｈ」、第２３巻、１５〜２４頁、１９９９年）。胎芽動物又は他の試料を解剖学的及び／又は分子変異に関して選別する従来的な組織検査方法は、時間集約的であり、従って、多数の試料の処理及び分析は、ほぼ非現実的である。
【０００４】
前臨床研究もまた、突然変異のような様々な侵襲要因からもたらされる表現型、腫瘍の大きさ及び成長速度、薬物又は他の治療の効果、及び薬物の局在性を正確に殆ど非侵襲的に判断し、及び／又はモニタすることを可能にするために、様々なパラメータを精巧に評価するための複数の撮像モダリティに益々依存してきている。この努力は、位置決めの不一致により画像レジストレーションを得ることが困難であるために、多重モード撮像によって妨げられている。現時点では、動物は、時間の経過と共にホルダ内で移動する傾向があり、多くの場合に、動物は、様々な撮像技術の特殊性に適合させるために異なるホルダに移動させる必要がある。
【０００５】
既存の動物ホルダの限界は、動物と動物ホルダが、得られる画像内で近くに接触しているのが見え、画像後処理を面倒にすることである。ホルダに近接する動物組織の画像は、不明瞭で解像度が悪いことが多い。ホルダは、その後の画像処理で識別して差し引くことが必要であるために、画像品質及び効率には不利になる。今日まで、既存のホルダの欠点を緩和し、試料をホルダから明瞭に区別することができるマイクロＣＴ画像を取得するための動物ホルダは見つかっていない。
【０００６】
Ｘ線顕微鏡コンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）は、半自動又は全自動的に分析する方法の技術に適合性があるために、単独で又は撮像器具群の一部として撮像法の魅力的な選択肢である。この属性は、高処理表現研究又は臨床病理学的結果を達成するのに重要である。ＣＴ及び磁気共鳴方法、用途、及び費用を比較すると、マイクロＣＴに基づく仮想組織検査は、胎芽解剖学的構造の表現型を示す相応な方法よりも実施が簡単で比較的廉価であり、かつ迅速な形態測定の潜在的に高い解像モードを提供することを示している。
【０００７】
マイクロＣＴの仮想組織検査は、試料の染色及び装着に関連する限界を克服することができれば、更に魅力的な撮像技術であろう。現在の染色処理は、Ｍ．Ｄ．Ｂｅｎｔｌｅｙ他、「Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｃｈｏｔｒｏｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｐｏｒｔ  １９９８」、Ｂｅａｍｌｉｎｅ、Ｘ２Ｂに説明されているように、解剖学的構造を高解像度にする適切なＳＮ比をもたらすのに苦労している。マイクロＣＴ仮想組織検査処理機能は、複数の試料を収容することができる試料ホルダがないことによっても妨げられている。更に、全胎芽のマイクロＣＴ仮想組織額検査では、多量のデータがもたらされる。このようなデータの真の価値は、データを検索可能に記憶して分析するためのシステム及び方法が開発される場合にだけ達成されることになる。
すなわち、これらの好機を利用するために、マイクロＣＴ画像を生成するための染色方法、このような画像データを検索可能に記憶して分析するためのシステム及び方法、及び１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティを用いて撮像される染色された試料又は生きている動物を保持するための特殊な装置の改良の必要性が依然として存在する。
【０００８】
【特許文献１】米国特許仮出願出願番号第６０／７６２、３２７号
【非特許文献１】Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．、「Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ」、第６巻、５０７〜１２頁、２００５年
【非特許文献２】Ａｕｓｔｉｎ、ＣＰ．他、「Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ」、第３６巻、９２１〜４頁、２００４年
【非特許文献３】Ｊａｃｏｂｓ、Ｒ．Ｅ．他、「Ｃｏｍｐｕｔ  Ｍｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｇｒａｐｈ」、第２３巻、１５〜２４頁、１９９９年
【非特許文献４】Ｍ．Ｄ．Ｂｅｎｔｌｅｙ他、「Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｃｈｏｔｒｏｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｐｏｒｔ  １９９８」、Ｂｅａｍｌｉｎｅ、Ｘ２Ｂ
【非特許文献５】Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃ．他、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」、第１８巻、２６０８〜１３頁、２００４年
【非特許文献６】Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃ．他、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」、第１８巻、２６１４〜２６頁、２００４年
【非特許文献７】Ｋｉｎｄｌｍａｎｎ、Ｇ．、「Ｔｅｅｍ．１．８．０版」、ＳｏｕｒｃｅＦｏｒｇｅ．ｎｅｔ、２００５年
【非特許文献８】（ＳＣＩ）、Ｓ．Ｃ．ａ．Ｉ．Ｉ．、「ＢｉｏＰＳＥ：生物医学コンピュータ用途のモデル化、シミュレーション、画像処理、及び視覚化のための問題処理環境」、２００２年
【非特許文献９】Ｍａｎｇａｎ、Ａ．Ｐ．及びＷｈｉｔａｋｅｒ、Ｒ．Ｔ．、「ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｖｉｓ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｇｒａｐｈ」、第５巻、３０８〜３２１頁、１９９９年、国立医学図書館、「Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｔｏｏｌｋｉｔ」（ＩＴＫ、ｗｗｗ．ｉｔｋ．ｏｒｇ）
【非特許文献１０】Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｔ．Ｎ．、（２００５）Ｎｅｎｎｅｒｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｒ．Ｃ．及びＷｏｏｄｓ、Ｒ．Ｃ．、「Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．」、第１９７巻、２００２年
【非特許文献１１】Ｋｉｎｄｌｍａｎｎ、Ｇ．Ｌ．、Ｗｈｉｔａｋｅｒ、Ｒ．、Ｔａｓｄｉｚｅｎ、Ｔ．、及びＭｏｅｌｌｅｒ、「Ｔの直接容積レンダリングのための曲率に基づく伝達関数：方法及び応用」、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ＩＥＥＥ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ」、５１３〜５２０頁、２００３年
【非特許文献１２】Ｌｅｖｏｙ、Ｍ．、「容積データからの表面の表示」、「ＩＥＥＥ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第８巻、２９〜３７頁、１９８８年
【非特許文献１３】Ｋｎｉｓｓ、Ｊ．Ｍ．、Ｋｉｎｄｌｍａｎｎ、Ｇ．Ｌ．、及びＨａｎｓｅｎ、Ｃ．Ｄ．、「視覚化ハンドブック」、Ｈａｎｓｅｎ、Ｃ．Ｄ．及びＪｏｈｎｓｏｎ、Ｃ．Ｒ．編、１８９〜２１０頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００５年
【非特許文献１４】Ｇｏｏｃｈ、Ａ．他、「自動テクニカルイラストレーションのための非写真的現実性照明モデル」、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＡＣＭ  Ｓｉｇｇｒａｐｈ」、４４７〜４５２頁、１９９８年
【発明の開示】
【０００９】
選択的に染色されたサンプルの撮像を用いる仮想組織検査は、自然発生的及び定方向突然変異を含む組織の変化、突然変異、損傷、又は他の擾乱を検出するための従来の組織像の魅力的な代替物又は補足物を提供する。
本発明は、仮想組織像及び他の用途で画像取得するための試料、例えば生物学的試料を調製するための改良染色剤及び染色方法を提供する。更に、染色試料から得られる画像データを検索可能に記憶して分析するための改良システム及び方法も提供する。撮像される染色試料又は生きている動物を保持するための専用装置は、本発明の実施形態によって提供される。
【００１０】
第１の染色剤を含有する第１の染色組成物中で試料を培養し、染色試料を生成する段階を含むマイクロＣＴ画像を生成する方法を提供する。染色試料は、次に、Ｘ線コンピュータ断層撮影スキャナで走査し、マイクロＣＴ画像を生成する。染色後、染色試料は、組織の密度よりも小さい密度の液体媒体中に移されることが一般的に好ましい。組織は、低密度の液体媒体により完全に又は部分的に取り囲まれ、任意的にこの媒体中に懸濁されている。
【００１１】
革新的な方法は、任意的に、染色試料を第２の染色剤に露出し、二重染色試料を生成する段階を更に含む。第２の染色剤は、第１の染色組成物中に存在することも第２の染色組成物中に存在することもできる。
染色組成物は、任意的に、グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドのような有機固定剤及び／又は緩衝液を含む。
第１の染色剤又は第２の染色剤は、約０．１〜１．２５重量パーセントの四酸化オスミウムを含むことが好ましい。更に、第１の又は第２の染色組成物の成分として大きな効果を与えるようにカコジラート緩衝液も用いる。別の例示的な染色剤には、エチジウムブロマイド酸、シスプラチン、酢酸ウラニル、リンタングステン酸、リンモリブデン酸、モリブデン酸アンモニウム、銀塩、及びウラン酸ナトリウムが含まれる。
【００１２】
染色剤は、細胞及び／又は細胞小器官膜のような様々な細胞及び／又は組織成分、核、レポーター遺伝子産物のような特定の分子、又はタンパク質、脂質又は炭水化物のような特定の分子の種類の１つ又はそれよりも多くを染色し、又はそれを示すものである。
詳細な方法では、走査される試料は、１回目に個々の動物から得られた試料である。後に、２回目に同じ個々の動物から第２の試料を得る。第１及び第２の試料の両方は、染色して走査し、マイクロＣＴ画像を生成する。一般的に、１回目の試料を得た後で第２の試料を得る前にある一定の手順を行う。このようにして、この手順は、有効性又は他の効果に関して評価することができる。
【００１３】
本発明により、エキソビボ胎芽を第１の染色組成物に入れて培養し、染色エキソビボ胎芽を生成する段階を含むエキソビボ胎芽の表現型を選別するための革新的な方法を説明する。染色エキソビボ胎芽は、Ｘ線コンピュータ断層撮影スキャナで走査し、染色エキソビボ胎芽のマイクロＣＴ画像を生成する。染色エキソビボ胎芽の１つ又は複数のマイクロＣＴ画像は、対照のエキソビボ胎芽の統計的に平均して年齢を適合させたアトラスの１つ又は複数のコンピュータ断層撮影画像に比較した画像間の差を判断し、エキソビボ胎芽の表現型を判断する。エキソビボ胎芽のマイクロＣＴ画像は、エキソビボ胎芽をレンダリングする等値面を含むことができる。更に、エキソビボ胎芽のマイクロＣＴ画像は、エキソビボ胎芽の仮想切片を含むことができる。
【００１４】
複数の胎芽のような複数の試料は、革新的な方法で走査することができる。
エキソビボ胎仔の脱色、皮膚剥離、及び切開を含むエキソビボ胎仔の表現型を選別するための方法を提供する。処理した胎仔は、次に、第１の染色組成物に入れて培養し、染色エキソビボ胎仔を形成する。染色エキソビボ胎仔は、Ｘ線コンピュータ断層撮影スキャナで走査し、染色エキソビボ胎仔のマイクロＣＴ画像を生成する。あらゆる下流の画像解析手順は、エキソビボ胎芽の選別の画像解析手順と同様である。
【００１５】
本発明により、組織を正確に切断してある一定の厚みの組織切片を形成する段階を含む組織切片を選別するための革新的な方法を説明する。組織切片は、次に、組織切片の厚みに特別に合わせて作られた濃度の染色剤で染色される。この走査及び画像解析は、エキソビボ胎芽を選別するものに類似する。
各チャンバがチャンバに置いた試料を支持するための支持部分を有する壁を有する多重チャンバ試料ホルダを含む、Ｘ線コンピュータ断層撮影法に用いるための試料ホルダを詳細に説明する。試料に接触して試料が壁に接触するのを防ぐライナを設ける。少なくとも試料に接触するライナの部分は、マイクロＣＴ画像を生成するのに用いられる電磁放射線に高度に透過性である。例示的な試料ホルダは、多重チャンバ試料ホルダである。
【００１６】
チャンバの各々が壁により分離された多重チャンバ試料ホルダを含む複数の試料のマイクロＣＴ画像を生成する方法に用いるための市販のパッケージを提供する。試料ホルダのチャンバに置かれた試料に接触し、試料がチャンバの壁に接触しないように分離するためのライナが設けられる。少なくとも試料に接触するライナの部分は、マイクロＣＴ画像を生成するのに用いられる電磁放射線に高度に透過性である。
【００１７】
デジタルマイクロＣＴ画像を生成する段階と、コンピュータに付随する集中型データ記憶場所に画像を電子的に送信する段階と、要求に応答して記憶場所から画像を検索する段階と、要求に応答して画像を電子的に表示するか又は第２の場所に電子的に送信する段階とを含む、マイクロＣＴ画像を収集し、記憶し、かつ検索するためのコンピュータに基づく方法を詳細に説明する。
更に、動物を支持するための支持部分を有する壁を含む撮像処理に用いるための動物ホルダを提供する。撮像される動物のためのベッドは、壁の支持部分に置かれる。少なくとも動物に接触するベッド表面の部分、及び任意的に動物に接触するベッド表面の部分に隣接する厚みの部分は、撮像処理に用いられる電磁放射線に高度に透過性で無反射性である。
【００１８】
また、動物を支持し、かつ人間工学的で再現可能であって結果重視の位置に吸入麻酔下に動物を維持するための動物ホルダも提供する。このような動物ホルダは、動物を支持するための支持部分を有する壁を含む。壁の支持部分に置かれたベッドは、動物を支持して撮像手順の間に望ましい再現可能位置に動物を維持するために、少なくとも動物の一部に適合するようになった部分を含む。
好ましくは、少なくとも動物ホルダの一部分は、放射が最小限しか減衰されずにホルダを通過してホルダ自体の画像を最小限しか又は全く生成しないように、撮像処理で用いられる電磁放射線に実質的に透過性である。
本発明の他の目的、態様、及び利点は、以下の詳細説明から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、撮像のためのサンプルとそれらの試料の画像の取得とに用いる組成物、装置、処理、及び方法を提供する。例示的な試料は、生物学的試料（例えば、組織、胎芽）を含む。例示的な実施形態では、試料の画像は、Ｘ線撮像モダリティ、例えば、マイクロＣＴを用いて得られる。
一実施形態では、本発明の撮像モダリティ、例えば、マイクロＣＴは、様々な動物モデル及び疾病の状態での生物学的組織の状態、統合、及び発生の高解像度非破壊分析を可能にする。マイクロＣＴに基づく分析の感受性及び特異性により、疾病の状態及び動物モデルの巨視的変化及び微視的変化の両方が正確に検出して査定される。この新しい技術は、複雑で大域的な３次元組織の視覚化及び分析を改善する迅速で廉価な方法を提供する。細部まで正確にスライスし、個々に検査することが必要な従来的な組織検査と異なり、この新しい技術は、組織（例えば、無傷胎芽）を特定の色素で染色する段階と、それを微視的コンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）で走査する段階とを含む。
【００２０】
本方法は、いくつかの測定値、例えば、距離、面積、及び容積を得ることができるデジタルで視覚化した全試料のデータセットを生成する。この本質的にデジタルな方法は、繁殖毒性学及び「ノックアウト」又は「遺伝子導入」動物表現型検査のような様々な分野で実用的なツールを提供する。
従って、本発明は、画像を取得するための試料の調製、及び試料画像の収集及び処理に有用性がある。より詳細には、画像は、Ｘ線顕微鏡コンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）で収集される。
【００２１】
撮像する試料を処理するための改良染色及び染色処理を提供する。従って、本発明は、光電子密度染色剤を含み、任意的に緩衝液及び／又は固定剤及び／又は架橋剤及び／又はレポーター遺伝子産物のためのレポーター基質と組み合わせた染色組成物を提供する。
また、本発明の染剤及び他の染剤で試料を処理し、現在認知されている染剤及び／又は染色技術を用いて生成されたものよりも優れた試料の画像を生成する方法も提供する。
【００２２】
本発明はまた、マイクロＣＴ画像を生成する方法、このようなＣＴ画像データを検索可能に記憶して分析するためのシステム及び方法も提供し、本発明の実施形態により、１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティを用いて撮像される染色試料又は生きている動物を保持するための特殊な装置を提供する。
また、マイクロＣＴを用いて仮想組織像画像を得る方法も提供する。この技術により、試料、例えば、動物及び組織は、磁気共鳴顕微鏡の何分の１かの費用、かつ同程度以下の時間によって高解像度で走査することができる。高解像度画像は、マイクロＣＴに対して開示した方法を用いて得ることができる。例示的な実施形態では、本方法では、少なくとも約６〜２００ミクロンの解像度が得られる。
【００２３】
革新的な方法を用いて、動物全体及びこれらの動物から単離された組織を含む遺伝子導入又は他の種類の突然変異体試料の表現型を示すことができる。臨床応用には、生検試料の評価及び特定の医学的治療又はインターベンションの有効性の査定が含まれる。更に、革新的な方法は、提案されている新しい薬物又は他の物質の動物、特に胎芽動物に及ぼす毒性の査定にも用途が見出されている。更に、革新的な方法は、例えば、薬剤の催奇形性作用高処理評価、成体動物の組織の評価、及び抗血管形成療法を受けている患者の腫瘍生検のための新生毛細管マッピングにも有用とすることができる。
この種の研究の処理量の増大に対して、任意的に、複数の試料は、同じ視野で同時又はほぼ同時に走査される。
本発明により、試料を染色組成物に入れて培養し、染色試料を生成する段階と、Ｘ線コンピュータ断層撮影スキャナで試料を走査し、マイクロＣＴ画像を生成する段階とを含むマイクロＣＴ画像を生成する方法を提供する。
【００２４】
染剤
例示的な実施形態では、本発明は、マイクロＣＴ画像のような画像の取得の試料を調製するのに用いる染剤を提供する。例示的な染色組成物は、動物細胞又は組織の１つ又はそれよりも多くの構成要素を光電子密度染色する光電子密度染色剤を含む。現在好ましい光電子密度染色剤は、金属原子又はイオンを含む化学種である。
例示的な染色剤には、オスミウム（例えば、四酸化オスミウム）、タングステン（例えば、リンタングステン酸、タングステン酸ナトリウム）、モリブデン（例えば、モリブデン酸アンモニウム、リンモリブデン酸）、貴金属、例えば、（プラチナ（例えば、シスプラチン）、金（例えば、塩化金酸ナトリウム））、ビスマス（例えば、次硝酸ビスマス）、カドミウム（例えば、ヨウ化カドミウム）、鉄（例えば、塩化第二鉄、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム）、インジウム（例えば、三塩化インジウム）、ランタン（例えば、三塩化ランタン）、鉛（例えば、酢酸鉛、クエン酸鉛、硝酸鉛）、ルテニウム（例えば、ルテニウムレッド）、銀（硝酸銀、銀タンパク質化合物、銀テトラフェニルポルフィリン）、タリウム（例えば、硝酸タリウム）、ウラニウム（例えば、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル）、及びバナジウム（硫酸バナジル）のような金属が含まれる。革新的な方法に利用される他の適切な金属は、当業者には明らかであろう。
【００２５】
また、有機染料も本発明の染色組成物に利用される。例示的な有機染料は、エチジウムブロマイドである。
染色剤は、試料の画像に望ましいレベルのコントラストを生成するのに有用な染色組成物中にあらゆる濃度で存在する。選択した染色剤の適切な濃度は、過度の実験に頼ることなく当業者は容易に決定可能である。例えば、単一の染色剤を含む一連の染色組成物を調製する。各組成物を用いて試料を染色する。各染色組成物による各試料の染色のレベルは、各染色試料のマイクロＣＴ画像を取得することによって判断される。
【００２６】
例示的な実施形態では、染色剤は、染色組成物中に約０．０１重量パーセント〜約１０重量パーセント、好ましくは約０．１重量パーセント〜約５重量パーセント、より好ましくは約１重量パーセント〜約３重量パーセントの量で存在する。
任意的に、染色剤は、染色組成物に含まれ、これは、更に、緩衝液を含む。緩衝液は、一実施形態では、染色組織のマイクロＣＴ画像に望ましいレベルのコントラストを得ることからも明らかなように、試料を望ましいレベルで染色するのに有用なあらゆる濃度で存在する。染剤透過処理には、任意的に、組織と異なる浸透圧濃度を有する緩衝液を用い、染剤分子が組織、例えば、組織細胞の構成要素に移行するのを加速する。
【００２７】
本発明の染色組成物に対する例示的な緩衝液濃度は、約０．０１Ｍ〜約１Ｍの範囲である。一般的に、好ましい緩衝液濃度の範囲は、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍである。
好ましい緩衝液は、カコジラート緩衝液、例えば、ナトリウム、カコジラート三水和物である。
更に任意的に、染色組成物は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、アルコール、又はその組合せのような固定剤又は架橋剤を含む。代表的な染色組成物では、固定剤又は架橋剤は、約０．０５％〜約５％、好ましくは約０．１％〜約３％、及びより好ましくは約１％〜約１．５％の濃度範囲で存在する。
また、染色組成物は、組織透過促進剤を含むことができる。代表的な組織透過促進剤は、ＤＭＳＯである。
【００２８】
別の例示的な実施形態では、染色組成物は、レポーター遺伝子の存在をその遺伝子又はレポーター遺伝子の産物との直接相互作用により示すか又は確認する染色剤及び化学種の両方を含む。好ましい実施形態では、レポーター遺伝子産物は、上述の化学種及び染色剤と錯体を形成する。得られる試剤は、撮像モダリティ、例えば、マイクロＣＴのようなＸ線撮像モダリティで検出可能である。
好ましい実施形態では、染色剤は、四酸化オスミウムを含み、好ましくは約０．１〜４重量パーセントの四酸化オスミウムを含む。より好ましくは、約０．１から１．８４重量パーセント四酸化オスミウムの濃度である。更に、約０．５〜１重量パーセント四酸化オスミウムの範囲の濃度も好ましい。好ましい濃度の四酸化オスミウムでは、少なくとも部分的に、背景が減少して信号強度の範囲が大きくなるために、高品質画像が生成される。
【００２９】
染色剤が四酸化オスミウムである好ましい実施形態では、染色組成物は、固定剤又は架橋剤を更に含む。固定剤又は架橋剤の好ましい濃度は、約０．０１％〜約３％、より好ましくは約０．１％〜約１％である。現在好ましい固定剤又は架橋剤は、グルタルアルデヒドである。この同じ好ましい実施形態は、約０．０５Ｍ〜約０．５Ｍ、より好ましくは約０．０８Ｍ〜約０．２Ｍの濃度で緩衝液を含む。現在好ましい緩衝液は、ヒ素、例えば、カコジラートを含む。
【００３０】
別の好ましい染色剤は、リンタングステン酸（ＰＴＡ）であり、好ましくは、約３〜約１０重量パーセントのＰＴＡを含む。より好ましくは、約４〜約６重量パーセントＰＴＡの範囲の濃度である。更に、約４．８〜約５．２重量パーセントＰＴＡの範囲の濃度も好ましい。ＰＴＡの好ましい濃度では、少なくとも部分的に、信号／背景比が増大し、従って、動的信号強度が大きくなるために、高品質画像が生成される。
【００３１】
方法
上述のように、本発明は、試料を染色し、染色試料の画像を取得して処理する方法も提供する。以下の節は、本発明のこれらの方法の選択した例示的な実施形態を詳細に説明する。
例示的な実施形態では、試料は、任意的に本発明の染色組成物である染色組成物中で選択した期間培養する。試料を染色組成物で培養する期間は、当業者により容易に決定され、染色試料から得られる画像に望ましいコントラストのレベルにより通知される。
【００３２】
一般的に、試料は、少なくとも約１時間染色組成物に接触したままであることが好ましい。更に、革新的な方法では、少なくとも約３時間、少なくとも約６時間、及び少なくとも約１２時間も有用である。
染色組成物と接触させた後、試料（この時点では染色試料）は、任意的に、組織と異なる重量オスモル濃度の緩衝液と接触させ、染料分子を試料、例えば、組織細胞の構成要素に移行させるのを加速又はそうでなければ促進する。例示的な緩衝液は、緩衝生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水である。この事後の重量オスモル濃度差を適用する時、染色組成物は、染色試料が次に受ける緩衝液の重量オスモル濃度よりも大きいか又は小さくすることができる。
【００３３】
更に別の好ましい実施形態では、染色試料は、有機溶媒又は有機溶媒を水に入れた混合物で更に処理される。例示的な有機溶媒は、少なくとも部分的に水に可溶なものであり、これには、例えば、アルコール、エーテル、エステル等が含まれる。試料を懸濁する媒体は、単一の段階で第１の混合物（例えば、染色組成物）から最終的な混合物（例えば、１００％有機溶媒）に変化させることができ、又は試料環境の変化は、第１の混合物から最終的な混合物まで段階的又は連続的に移動する勾配のある媒体組成物を染色試料に受けさせることによって達成することができる。
【００３４】
革新的な方法は、好ましくは、染色の密度が、本質的に試料の１つの境界から試料の正反対の境界まで不変である染色試料を提供する。本明細書で用いる場合、「本質的に不変」という用語は、試料の染色の均一性を意味する。好ましい実施形態では、本質的に不変の染色を示す試料の染色密度は、試料の１つの境界上の点から試料の対向する境界の対蹠点まで試料を通る線を横切って約２０％を超えて変化することになり、より好ましくは約１０％以下変化し、より好ましくは約５％を超えて変化する。
【００３５】
本発明の例示的な方法では、「固形組織」が染色される。本明細書で用いる場合、「固形組織」とは、実質が少なくとも約５０％の量で存在する組織を意味する。固形組織は、肺組織のような組織とは異なる。
特に好ましい実施形態では、革新的な方法は、染色の密度が本質的に不変な固形組織である染色試料を提供する。好ましい試料は、生物全体、例えば、胎芽又は胎仔である。
別の好ましい実施形態では、試料は、薄切されるか又はミクロトームで切断され、厚み約４ｍｍ〜約６０ｍｍ、より好ましくは約７ｍｍ〜約４０ｍｍのスライスにされる。このような組織切片は、固形組織であることが一般的に好ましい。更に、このような試料の染色の密度は、本質的に不変量であることを特徴とすることが好ましい。
【００３６】
別の例示的な実施形態では、染料の試料への透過は、試料を染料で処理する前又は処理中に高められる。例示的な方法では、試料の空隙率は、化学的又は物理的方法により高められる。例示的な化学的方法には、試料構造の一体性の浸透圧的破壊及び組織を透過促進物質、例えばＤＭＳＯで処理することが含まれる。物理的手段には、以下に限定されるものではないが、試料を穿刺して試料にチャンネルを形成し、それを通して染料が試料の対応する非破壊領域より容易に流れるようにすることが含まれる。チャンネルは、物体で穿孔することによるか又はレーザからの光のような集束させたエネルギを当てることによって試料に形成することができる。
【００３７】
本発明の染色処理の一般的な例では、試料、例えば、細胞、組織、胎芽、又は胎仔は、０．１Ｍ緩衝液（ｐＨ７．２）、１％固定剤又は架橋剤、及び１％染色剤の溶液中で、室温で揺動させながら飽和するまで選択した期間染色する。染色試料は、次に、洗浄して脱水する。例えば、試料は、０．１Ｍ緩衝液中で３０分間洗浄し、第２の緩衝液中で更に２回３０分間洗浄し、染色溶液及び／又は染色溶液の後の洗浄緩衝液と異なる重量オスモル濃度の環境を生成する。次に、試料は、撮像する前に１００％有機溶媒までの段階的な一連の有機溶媒濃度で培養される。有機溶媒は、懸濁液媒体と染色組織の間の明らかな密度差を増大させる媒体の例である。
【００３８】
本発明の例示的な染色処理では、試料例えば、細胞、組織、胎芽、又は胎仔は、室温で揺動しながら０．１Ｍナトリウムカコジラート（ｐＨ７．２）、１％グルタルアルデヒド、及び１％四酸化オスミウム溶液中で飽和するまで一晩染色する。次に、試料である染色試料は、洗浄して脱水する。例えば、試料は、０．１Ｍナトリウムカコジラート緩衝液で３０分間洗浄し、更に、リン酸緩衝生理食塩水で３０分間２回洗浄する。次に、試料は、走査する前に、１００％エタノールまでの段階的な一連のエタノール濃度中で培養する。エタノールは、懸濁液媒体と染色組織の間の明らかな密度差を増大させる媒体の例である。
【００３９】
例示的な実施形態では、試料は、胎仔全体とされる。胎仔の染色では、胎仔は、任意的に、最初に脱色して皮をむいてから染色する。胎仔は、切開して羊膜及び内側の薄い漿膜を除去する。沸騰水で満たしたビーカーに切断胎仔を入れる前に、胎仔の腹面側及び背面側を浅く切断する。次に、脱色した胎仔の表皮／真皮を除去する。更に、皮を剥いた胎仔にいくつかの切開を行い、染料の透過を高める。切開は、好ましくは横方向、肋骨上、及び垂直方向に胎仔の外部に行う。切断する領域には、以下に限定されるものではないが、胸郭肋膜、腹膜、及び硬膜が含まれる。
【００４０】
例示的な実施形態では、胎芽又は胎仔以外の組織を染色するために、組織は、最初に確実にある一定の厚みになるように切断する。四酸化オスミウムを染色剤として用いる場合には、切片厚みに染料が透過する速度を速めるか又はそうでなければ促進するために、厚み＜２ｍｍの組織切片を染色するには、０．８〜１．５重量パーセントの範囲で四酸化オスミウムを含む染色溶液が好ましく、厚み＞２ｍｍの組織切片を染色するには、１．５〜２．２パーセント溶液重量の範囲で四酸化オスミウムを含む染色溶液が好ましい。
【００４１】
本発明による方法は、試料を第２の染色剤に露出して二重染色試料を生成する段階を更に含むことができる。有利な態様においては、第２の染色剤は、第１の染色剤と異なる細胞又は組織構成要素を染色することができる。このような第２の染色剤は、染色組成物に第１の染色剤と共に含めることができ、又は第２の染色組成物に別に含めることもできる。第２の染色剤は、第１の染色剤と同じでも異なってもよい。
【００４２】
第２の染色剤は、電子密度の高い生成物を生成する金属染料及び／又は非金属染料を含むことができる。従って、例示的な第２の染色剤は、一例として上述のあらゆる染色剤を含む。好ましい第２の染色剤は、エチジウムブロマイド及び／又はシスプラチンを含む。好ましい染色処理では、第１及び第２の染色剤は、異なる染色剤である。好ましくは、異なる染色剤を用いると、試料の構成要素を区別することができる。例示的な染色剤の組合せは、第１の染剤として四酸化オスミウム、及び第２の染剤としてシスプラチン又はエチジウムブロマイドを含み、それぞれ細胞膜及び核の染色を区別することを可能にするために、臓器及び組織の染色の特徴を更に区別することができる。
【００４３】
染色剤は、細胞及び／又は細胞小器官膜マーカ、核マーカ、細胞質マーカ、生理学的血管又は間質腔の構成成分のためのマーカ、及び／又は特定の分子又は分子の種類のためのマーカとすることができる。
【００４４】
第２の染剤を含むか又は含まない染色試料は、真の組織検査切片を切断することができる。例えば、オスミウム染色細胞、組織、及び／又は胎芽は、組織学的検査のために切断することができる。従って、本明細書に開示する方法は、胎芽の欠陥の選別（例えば、第１次選別）として有用であり、そこから、本明細書に開示する方法によって関連があると識別された領域に対して、研究者は、真のパラフィン切片組織検査を行うことができる。染色試料を複数回使用すると、マイクロＣＴに基づく選別から疑わしい形態学的表現型の組織学的検定に移行する速度が速くなる。
【００４５】
染色試料は、任意的に、１つ又は一連の緩衝溶液に移し、組織から得られる画像で組織をその境界を接する環境から区別するのを容易にするように、余分な染色剤を除去して試料とその境界を接する環境との間に密度コントラストを生成する。緩衝溶液は、濃度が０．０５Ｍ〜０．２Ｍの範囲のナトリウムカコジラート緩衝液、リン酸緩衝液生理食塩水、及び濃度が２０％〜１００％の範囲のエタノール溶液である。
【００４６】
更に別の実施形態では、試料は、レポーター遺伝子産物を含み、染色剤と共に試料を培養すると、染色試料中にレポーター遺伝子産物が存在することを示す染色パターンが生じる。レポーター遺伝子、遺伝子の産物及びレポーター遺伝子の産物と検出可能に相互作用する薬剤は、当業技術で公知である。レポーター遺伝子（及びその産物）は、その野生型で試料に固有とすることができ、又は試料の１つ又はそれよりも多くの構成要素の化学的又は組換え突然変異により試料に導入することができる。レポーター遺伝子は、酵素、抗体、又は他の機能的又は構造的タンパク質、又は生物学的活性剤を符号化することができる。例示的なレポーター遺伝子（及びその産物）は、遺伝子導入哺乳類に見られる。
【００４７】
例えば、試料中のレポーター遺伝子産物は、βガラクトシダーゼであり、これは、この酵素に対する基質、例えば、「Ｓ−Ｇａｌ」（３、４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、及び染色剤、例えば、クエン酸第二鉄アンモニウムを含む染色剤と反応して試料中に電子密度の高い生成物を生成する。このような実施形態では、試料は、最初に、レポーター遺伝子産物、例えば、「Ｓ−Ｇａｌ」（３、４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を生成する染色剤、及び染色剤、例えばクエン酸第二鉄アンモニウムと共に培養し、その後又は同時に第２の染色剤及び／又は第２の化学種と共に培養することができる。代替的に、試料は、最初に第１の染色剤で染色し、次に、レポーター遺伝子産物を示す産物を生成する第２の染色剤で染色することができる。
【００４８】
例示的な実施形態では、レポーター遺伝子は、自動及び／又はアプリケーションを用いる色選択のための適切な基質である遺伝子産物を生成する。上述のように、例示的なレポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼを符号化する。ＤＮＡ断片をｌａｃＺ遺伝子のα−補体に組み込まれたベクターの複数のクローン化領域に挿入すると、宿主のβ−ガラクトシダーゼ活性が乱され、宿主細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性が減少し、これらの細胞の染色レベルが、β−ガラクトシダーゼ活性が本質的に正常な宿主細胞に見られることになる染色レベルよりも低くなることになる。その結果、組換えを示す試料は、親ベクターを含むもの（例えば、野生型）から区別することができる。
【００４９】
革新的な方法に含まれる試料は、細胞、臓器、組織、胎芽、動物、又はこれらのいずれかの一部とすることができる。試料は、あらゆる種類の生物から得ることができ、かつ培養細胞、臓器、又は組織とすることもできる。
上述のように、革新的な方法は、様々な臨床及び研究用途に有用である可能性がある。特定的な実施形態では、革新的な方法を用いて、毒素、薬物、及び／又は治療が動物に及ぼす影響をモニタすることができる。従って、一実施形態では、第１の試料は、１回目に個々の動物から得られ、第２の試料は、２回目に同じ動物から得られる。研究、治療、及び／又は研究手順は、第１の試料を得た後で第２の試料を得る前に行うことができる。例えば、薬物又は毒素を動物又は組織に投与し、その後、薬物（又は毒素）を投与する前に得られる試料及びそのような投与の後に得られた対応する試料を撮像することによってターゲット組織の変化を測定する。
【００５０】
試料の環境因子（例えば、薬物、毒素）により引き起こされる変化又は遺伝子型又は表現型の変化を撮像するための例示的な方法は、第１の試料を染色組成物中で培養して第１の染色試料を生成する段階と、第１の染色試料を走査して第１の染色試料の画像を生成する段階と、第１の染色試料の画像を一般的に、組織学的に、形態学的に、遺伝子型的に、及び／又は表現型的に第１の染色試料に対応して染色、非染色、又は異なって染色した試料である第２の試料の基準走査に比較して、第１及び第２の染色試料間に異なる画像を生成する段階とを含む。
【００５１】
好ましい実施形態では、試料は、エキソビボ胎芽である。革新的な方法は、天然由来及び／又はターゲット突然変異を有する胎芽の表現型を判断するのに用いられる。例えば、革新的な方法を用いて遺伝子導入胎芽の表現型を判断する。更に、革新的な方法の一実施形態では、子宮内で特定の薬物、毒素、又は他の化学又は生物製剤に露出された胎芽は、このような露出のあらゆる表現型に対する影響を判断するために選別することができる。
【００５２】
本発明により、胎芽を染色組成物中で培養して染色胎芽を生成する段階と、染色胎芽を走査し、染色胎芽の画像を生成する段階と、染色胎芽の画像を染色、非染色、又は異なって染色した胎芽の基準走査と比較して異なる画像を生成する段階とを含む胎芽の表現型を選別するための方法を説明する。
例示的な実施形態では、Ｘ線コンピュータ断層撮影スキャナを用いて突然変異動物のマイクロＣＴ画像を生成し、胎芽の画像を基準に比較して画像間の差を判断し、それによって胎芽の表現型を選別する。より詳細には、１つ又はそれよりも多くの無傷胎芽全体を撮像する。基準は、年齢適合対照胎芽の画像とすることができる。更に、基準は、ステージ適合統計平均対照画像とすることができる。突然変異体動物に対する対照は、典型的には、野生型胎芽画像又は野生型ステージ適合胎芽の統計平均画像とされることになる。薬物、治療、化学及び／又は生物製剤のような試剤に露出された胎芽に対する対照は、典型的には、露出されていない胎芽の画像又は未処理ステージ適合胎芽の統計平均画像である。
【００５３】
一実施形態では、遺伝子導入哺乳類（例えば、マウス）胎芽の高解像度仮想組織像を得るための迅速で廉価な方法を提供する。染色組成物を用いて差次的に組織を染色し、次に、容積測定Ｘ線コンピュータ断層撮影法を行い、胎芽全体を撮像すると、高品質のデータが生成される。解像度３ミクロン又はそれよりも高い試料走査は、１２時間未満で得られる。例えば、等尺解像度２７ミクロン又は８ミクロンは、妊娠中期（Ｅ９．５〜Ｅ１２．５）胎芽を用いると、それぞれ走査時間２時間又は１２時間で達成される。更に、妊娠初期及び後期の胎芽を用いることができる。例えば、本発明によれば、マイクロＣＴ処理でＥ７〜Ｅｌ９胎芽が用いられる。この技術は、天然由来及び遺伝子導入突然変異に起因する発生パターン欠陥の定量的な３次元分析に対して、解像度、時間、及び費用点で有意に改良されている。
【００５４】
マイクロＣＴに基づく仮想組織像は、長時間で費用集約的な磁気共鳴顕微鏡法で達成される組織コントラストに一致するか又はそれを超え、一方、マイクロＣＴに対して２倍より高く８ミクロンまで（Ｊａｃｏｂｓ、Ｒ．Ｅ．他、「Ｃｏｍｐｕｔ  Ｍｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｇｒａｐｈ」、第２３巻、１５〜２４頁（１９９９））、又は場合によっては６ミクロンまでの解像度をもたらす。この種類の研究の処理量を増大させるために、任意的に、同じ視野で複数の試料を同時に走査する。例えば、低いマイクロＣＴ解像度（２７ミクロン）では、１２０ほどの試料、例えば胎芽、又は１０の胎仔／新生児マウス又はラット又はそれよりも多くを巨視的及び微視的突然変異表現型を認識することができる後撮像分割分析に適切な品質でほぼ２時間で同時に走査することができる。低価格の２７ミクロンの走査で疑われる異常の更なる詳細を得るために、同じ染色試料は、臓器のサブコンパートメント及び微細な組織構造の先例のない詳細を得るために８ミクロン解像度で後に走査することができる。
突然変異動物のコンピュータ断層撮影画像には、正常動物に比較した動物の外部の解剖学的又は分子的差を検査するために、突然変異動物を描画する等値面を含むことができる。
更に別の実施形態では、突然変異動物のコンピュータ断層撮影画像には、突然変異動物の仮想切片を含むことができる。
【００５５】
試料及び／又は胎芽全体を撮像するためにマイクロコンピュータ断層撮影法を用いて多数の画像及び関連データを生成することができる。このような仮想組織検査データセットは、生体内遺伝子破壊又は過剰発現のような遺伝子操作の効果を調査するための貴重なリソースを意味する。しかし、特定の胎芽ステージでの１つの突然変異又は他の変異に関する生成されたデータセットは、第２のステージでの第２の突然変異に比較する時に更に有用とすることができる。本発明により、このような比較データへのアクセスを容易にし、それを生成するのを助けるために、マイクロコンピュータ断層撮影画像及び／又は画像データを収集し、記憶し、かつ検索するためのコンピュータに基づく方法を提供する。
【００５６】
図１は、デジタルコンピュータ断層撮影画像を生成する段階１２と、画像及び／又はデータをコンピュータに関連する集中型データ記憶場所に電子的に送信する段階１４と、要求に応答して記憶場所から画像及び／又はデータを検索する段階１６と、要求に応答して画像及び／又はデータ及び／又は画像及び／又はデータの分析を電子的に表示するか又は第２の場所に電子的に送信する段階１８とを含む革新的な方法の実施形態を示している。
【００５７】
コンピュータ断層撮影画像は、例えば、本明細書に説明する方法により生成される。試料の高解像度容積測定コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）は、「ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＳＰ」マイクロＣＴ試料スキャナ（オンタリオ州ロンドン所在の「ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ」）、又は「ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＲＳ」小動物マイクロＣＴスキャナ（オンタリオ州ロンドン所在の「ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ」）のような市販のスキャナを用いて行うことができる。更に迅速な試料の容積測定ＣＴ走査は、２７ミクロン３等尺ボクセル解像度のような低解像度で行うことができ、同時に、望ましい費用、時間の制約、及び必要な解像度に応じて、８ミクロン３等尺ボクセル解像度のような長時間の高解像度走査も行うことができる。
【００５８】
電流、電圧、及び露出時間のようなパラメータは、必要に応じて調節し、比較される画像に対して一定に保つ。各走査に対して、いくつかの均等に離間した図を平均することができる。例えば、走査は、検出器の飽和を避けるために、０．２ｍｍアルミニウムのような適切なフィルタを用いてフィルタに掛けることができる。
画像は、「ＥＶＳＢｅａｍ（Ｃ）」ソフトウエアのような適切なソフトウエアを用いて再構成される。予備的な視覚化及び仮想組織像断面は、公的に入手可能な「ＭｉｃｒｏＶｉｅｗ（Ｃ）」プログラムで生成することができる。例えば、ＣＴデータセットの等値面描画及び容積描画は、実施例１に示すように画像として生成される。
【００５９】
生成したコンピュータ断層撮影画像及び／又はそのような画像を生成するためのデータは、データベースのようなメモリ回路に、及び／又はコンピュータ可読保存媒体に電子的に記憶させることができる。生成したコンピュータ断層撮影画像は、コンピュータに関連するそのような画像の保管庫、中央集中型画像、及び／又は画像データ記憶場所と通信する。従って、例えば、遺伝子導入及び野生型マウス胎芽の３次元の再構成が生成され、画像及び／又は画像生成のためのデータは、コンピュータに付随する中央集中型記憶場所に送られる。このような画像及び画像を生成するためのデータは、中央集中型記憶装置の複数の場所から生成して通信することができる。
【００６０】
生成した画像及び／又は画像データの通信は、複数の場所の複数の使用者がアクセス可能なサーバ又はコンピュータネットワークとして構成された装置又はシステムに有線又は無線で接続されることが好ましい。サーバ又はコンピュータネットワークは、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、又はメインフレームコンピュータのようなあらゆる種類の１つ又は複数のコンピュータ装置を含むことができる。
【００６１】
処理及びメモリ回路は、画像及び／又は画像データをメモリ回路に通信して記憶することができるように、サーバ又はコンピュータネットワークに含めることができる。更に、記憶された情報は、メモリ回路から検索することができる。任意的に、撮像した試料の解剖学的及び／又は分子的差に関する画像間の差の特徴を示すために、１つの画像又は画像の組を別の組の画像と比較する回路により実行可能な比較プログラムが含まれる。このような比較プログラムは、記憶画像及び／又は画像データも含むサーバ又はコンピュータネットワークに記憶して実行することができる。更に、比較プログラムは、サーバ又はコンピュータネットワークのメモリ回路から検索された画像及び／又は画像データがダウンロードされる別々の装置に記憶して実行することができる。
【００６２】
画像及び／又は画像を生成するためのデータは、要求に応答して中央集中型記憶場所から検索することができる。例えば、使用者は、画像及び／又は画像データをサーバ又はコンピュータネットワーク記憶場所から検索する要求を通信するために、データ入力及び出力機能を有する装置に情報を入力する。画像及び／又はデータは、使用者に表示することができ、及び／又は使用者の装置にダウンロードすることができる。更に、検索する画像及び／又はデータは、分析のために検索することができ、分析の結果は、使用者に表示するか又はダウンロードすることができる。
【００６３】
小動物の研究団体が直面する難問は、高解像度の解剖学的撮像データを高感受性の低解像度分子（生理学的）撮像情報と組み合わせることである。生きている動物のコンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）により、２７μｍ等尺解像度ほどの低さの空間的解像度が得られるが、一般的に、このモダリティは、動物の生理機能に関する有用な情報を提供しない。これと対照的に、発光及び蛍光撮像は、細胞の移動を追跡し、並びに遺伝子発現及びタンパク質機能を問い合わせるが、空間的解像度が１ｍｍであることによって制限される。小動物ポジトロン放出断層撮影（マイクロＰＥＴ）の解像度は、光学的方法と同様であるが、マイクロＰＥＴは、高感受性で信号の深度が大きいことが有利である。小動物磁気共鳴（マイクロＭＲＩ）機器では、マイクロＣＴと同様の解剖学的撮像解像度が得られ、中等度感受性の分子的撮像のための技術としても浮上している。しかし、いずれの信号モダリティも、前臨床マウスモデルを研究するための必要事項を完全には満たさず、従って、２つ又はそれよりも多くのモダリティからのデータを組み合わせる必要があることが多い。
【００６４】
解剖学的及び機能的画像の相互レジストレーションを行い、ヒト疾患のマウスモデルに対する解剖学的関連での病態生理を取り調べることができる。単純固定又は統計誘導相互レジストレーション法により、あらゆる単一のモダリティの限界を克服し、定性的及び定量的情報を改善する。更に近年の二重モダリティ機器は、マイクロＰＥＴ及びマイクロＣＴ、マイクロＳＰＥＣＴ及びマイクロＣＴ、又はマイクロＰＥＴ及び小動物ＭＲＩを組み合わせる。しかし、更に一般的なパラダイムは、学問的医療センターが異なる部位に個々のモダリティの機器を有し、異なる機器から異なる時間に取ったデータセットの相互レジストレーションを行う方法を必要とすることである。
【００６５】
解剖学的及び機能的画像の相互レジストレーションを容易にするために、広く入手可能なマイクロＣＴ、小動物ＭＲＩ、マイクロＰＥＴ、及び光学撮像機器と共に用いることができるマルチモダリティ小動物チャンバを設計する。このチャンバの鍵になる特徴は、（１）Ｘ線、ルミネセンス、及び蛍光を最小限しか減衰しない非金属性材料での構成、（２）一連の研究のために動物を再位置決めする正確なシステム、（３）単純で廉価な認識マーカ、（４）吸入麻酔薬の利用を可能にする気密性密封、（５）健康／感染状態に関わりなく動物を走査することを可能にする吸気及び呼気のためのインラインマイクロフィルタ、及び（６）画像解析段階でホルダを「不可視」にする空気と同様に減衰する硬質発泡体マウスベッドを含む。
【００６６】
本発明により、一般的に撮像方法、及び詳細には本明細書に記載の撮像方法（例えば、コンピュータ断層撮影法）に用いるための試料ホルダ、例えば、多重チャンバ試料ホルダを提供する。例示的な実施形態では、各チャンバが試料を収容するための内部空間を定める壁を有する複数のチャンバを含む革新的な多重チャンバ試料ホルダを提供する。革新的なホルダは、約２〜２００の範囲の多数のチャンバを含む。好ましい実施形態では、革新的なホルダは、約５０〜１５０の範囲の多数のチャンバを含む。含まれた試料チャンバは、側壁及び底壁を含み、底壁は、チャンバに入れた試料を支持するための支持部分を含む。一実施形態では、壁の少なくとも支持部分は、試料に行われる撮像手順に用いる放射線に高度に透過性である、試料に接触する表面を有する。別の実施形態では、壁の大部分又は全壁が、試料に行われる撮像手順に用いる放射線に高度に透過性である。
【００６７】
チャンバは、一般的に、形状及び大きさがほぼ均一である。適切な形状は、矩形であるが、他の形状を用いることもできる。
革新的なホルダのチャンバは、単一の撮像視野にいくつかの試料が撮像されるように配列される。一実施形態では、チャンバは、その間の間隔が最小になるように配列される。例えば、チャンバの少なくとも一部は、複数の隣接して横方向に配列されたチャンバとして構成することができる。任意的に、チャンバの少なくとも一部は、側壁を共有するように構成することができる。
【００６８】
更に別の実施形態では、革新的なホルダは、２つ又はそれよりも多くの複数の隣接して横方向に配列されたチャンバを含むように構成することができる。２つ又はそれよりも多くの複数のチャンバを互いに関して積層するように配列することもできる。
複数の隣接して横方向に配列されたチャンバは、底面を共有するように構成することができる。このような底面は、チャンバの側壁に接触し、チャンバの支持部分を形成する連続部分とすることができる。このような構成では、複数のチャンバ及び底面は、単一のユニットとして移動することができる層状構成要素を形成する。一実施形態では、複数の層状構成要素が革新的なホルダに含まれる。
【００６９】
好ましいオプションでは、撮像手順の間に１つ又はそれよりも多くの層状構成要素の配列を支持して維持するための１つ又はそれよりも多くの層状構成要素のためのレセプタクルが設けられる。好ましい実施形態では、設けられたレセプタクルは、レセプタクルの形状が円筒形又は実質的に円筒形であり、１つ又はそれよりも多くの層状構成要素を収容するための内部容積を定めるように形成された壁を有する。内部容積に１つ又はそれよりも多くの層状構成要素を更に収容するために、１つ又は２つの端部構成要素が任意的に設けられる。端部構成要素は、レセプタクルと一体化させることができ、レセプタクルに可逆的に取り付けることができ、又はレセプタクルに固定的に取り付けることができる。２つの端部構成要素が設けられる場合には、端部構成要素の少なくとも一方は、１つ又はそれよりも多くの層状構成要素が撮像のためのレセプタクルに挿入して取り除くことができるように構成される。
【００７０】
設けられたレセプタクルは、好ましくは、撮像視野に存在するレセプタクルの少なくとも一部がそれに収容された試料を撮像するのに用いられる撮像処理に用いる放射線に実質的に透過性であるように構成される。「実質的に透過性」という用語は、撮像手順で画像を生成するのに用いられる電磁放射線の大部分が、減衰されずにレセプタクルを通過することを意味するものとする。好ましい実施形態では、画像を得るのに用いられる電磁放射線の約８５〜１００％が、実質的に透過性のレセプタクル又はその実質的に透過性の部分により減衰されない。別の好ましい実施形態では、画像を得るのに用いられる電磁放射線の約９０％〜１００％が、レセプタクル又はその実質的に透過性の部分により減衰されない。一実施形態では、レセプタクルは、撮像中に撮像処理に用いられる放射線に実質的に透過性の撮像視野に存在するレセプタクル壁を含む。
【００７１】
革新的なホルダのレセプタクル又は他の部分に用いるための実質的に透過性の壁又は他の構成要素を形成するのに用いられる材料には、壁又は他の構成要素の望ましい厚みで撮像に用いる放射線に実質的に透過性のプラスチック、エーロゲル、及びガラスが含まれる。一般的に、レセプタクル壁の厚みは、包含的に約０．１ミリメートルと１０センチメートルの間の範囲である。適切なプラスチックには、例示的に、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリウレタン樹脂、ポリエーテルスルホン、又はこれらのいずれかの組合せが含まれる。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態によるホルダに含まれるチャンバの壁又は壁の一部は、チャンバ内の試料を撮像するのに用いる放射線に高度に透過性である。従って、撮像視野に存在する壁又はその一部は、好ましくは、チャンバ内の試料を撮像するのに用いる放射線に高度に透過性である。「高度に透過性」という用語は、壁又は壁の一部を放射線の９０％を超える部分が減衰せずに通過することを意味するものとする。好ましい実施形態では、画像を得るのに用いる電磁放射線の約９８％〜１００％の流れは、高度に透過性の壁又はその一部により減衰されない。別の好ましい実施形態では、画像を得るのに用いられる電磁放射線の少なくとも約９９％が、高度に透過性の壁又はその一部により減衰されない。高度に透過性の壁又はその一部を形成するのに用いられる材料には、チャンバ壁の望ましい厚みで撮像に用いられる放射線に実質的に透過性のプラスチック、エーロゲル、及びガラスが含まれる。一般的に、チャンバ壁の厚みは、包含的に約０．１ミリメートルと１センチメートルの間の範囲である。チャンバ壁又はその一部を形成するのに好ましい材料は、（フロリダ州ウエストパームビーチ所在の「Ｕ．Ｓ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ」）から市販されているような独立気泡ポリウレタン発泡体である。革新的な多重チャンバホルダを形成するのに用いるのに特に適切な発泡体は、硬化されると密度が約２ポンド／立方フィートの発泡体である。代替的な鋳造ポリウレタン発泡体は、コンピュータ切断（ＣＮＣ）「Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ」である。
一実施形態では、複数のチャンバは、成形鋳造のような鋳造工程によって形成される。
【００７３】
図２は、革新的な装置の一実施形態の多重チャンバ試料ホルダ２００のアセンブリを示している。ホルダ２００は、複数のチャンバ２０２を含み、各チャンバは、チャンバを別のチャンバから分離する壁２０４を有する。チャンバに含まれた壁の支持部分２０６が示されている。
図２は、複数の隣接して横方向に配列されたチャンバ２０８を示している。層状構成要素２１２を定める複数の隣接して横方向に配列されたチャンバ２０８に付随する底面２１０が示されている。図示の一実施形態では、底面２１０は、チャンバ壁の支持部分も形成する。更に、層状構成要素２１２を収容するためのレセプタクル２１３と共に、いくつかの層状構成要素２１２が含まれた実施形態が示されている。
【００７４】
特定的な実施形態に２００で示されるような革新的なホルダにより、使用者は、円筒形の内部容積を利用することができる。従って、図示の実施形態では、層状構成要素２１４の１つは、層状構成要素２１４のチャンバの壁の「上部」部分２１６がレセプタクル２１８の「上部」の方向に向くように最初にレセプタクル２１３に挿入される。レセプタクルは、次に、「上部」部分２１６及びレセプタクルの壁２１８の「上部」が下向きに位置決めされるように回転し、チャンバ内のあらゆる試料がレセプタクルの壁２１８に向って落ちるようにする。このような一実施形態では、チャンバ２１６の上部部分は、レセプタクルの壁に接触するように構成され、試料が乱れないようになっている。他の層状構成要素２１２は、試料が撮像処理中にチャンバ壁の支持部分２０６により支持される方向にレセプタクル内に配置することができる。
【００７５】
レセプタクルの壁が撮像処理に用いる放射線を減衰し、壁の画像が生じる実施形態では、ライナ２２０を用いることができる。ライナ２２０は、層状構成要素２１４の「上部」部分２１６とレセプタクルの壁２１８の「上部」との間に挟み、試料の画像を撮像処理中に生じることがあるレセプタクルの壁のあらゆる画像から分離することができる。ライナ２２０は、上部側２３０、底部側２３４、及びその間の厚み２２２を有する。典型的には、底部側２３４は、レセプタクルの壁２１８の「上部」と接触する。好ましい実施形態では、試料に接触する上部側２３０の少なくとも一部及び上部側２３０に隣接する厚み２２２の部分２３８は、画像を得るのに用いられる電磁放射線に高度に透過性である。この部分２３８の厚みは、約０．１ミリメートル〜約５センチメートルの範囲である。このような実施形態によるホルダは、従って、ライナに隣接する画像が減少するか又は存在しない状態で動物の画像を生成し、従って、分離された動物の画像を得るための画像の処理を回避又は低減することができる。
【００７６】
適切なライナは、例示的には、密度が約２ポンド／立方フィートの１つのポリウレタン発泡体である。このようなライナは、層状構成要素２１４の「上部」部分２１６とレセプタクルの壁２１８の「上部」との間に適合するように形成することができ、更に、湾曲するレセプタクルの壁２１８の湾曲に適合するように形成することができる。望ましい厚みで高度に透過性のプラスチック、エーロゲル、及びガラスを含む他の材料を用いて、望ましい程度の透過性を達成することができる。
【００７７】
マイクロＣＴ撮像により、染色試料及びエキソビボ胎芽の高解像度撮像が可能になるが、生きている動物を撮像するのに用いることを対象にした用途に大きな関心が寄せられており、それは益々大きくなっている。例えば、薬物の安全性及び有効性に対する前臨床モデルの分析は、特定の実験から得られる情報を最大にするために複数の撮像方式を用いることから利益を得ることができる。例えば、研究に用いる動物の数を低減することができるように、ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＣＴ、光学撮像、及びＳＰＥＣＴのような２つ又はそれよりも多くの撮像技術を用いて動物を調べることができる。
【００７８】
しかし、マルチモダリティ撮像の利点を達成するためには、動物の位置決めの一貫性が重要である。更に、撮像手順で動物の画像に非常に近く可視的部分を含む動物ホルダは、次の画像処理でホルダを識別して差し引く必要があるために望ましくない。従って、一実施形態では、本発明により、動物を支持して再現可能に位置決めすることができ、単一のセッションで及び／又は異なる時間に１つ又はそれよりも多くの撮像方式で撮像を行うことができるようにした撮像に用いるための動物ホルダを提供する。更に別の実施形態では、ホルダの少なくとも動物に接触する表面が画像生成信号に透過性又はほぼ透過性であり、動物又は試料の画像にぴったり近接するホルダの画像を除去するための次の画像処理が軽減されるか又は排除されるようにした動物又は試料ホルダを提供する。
【００７９】
本発明によれば、動物を支持するための支持部分と、内部容積と、装置の外面とを定める壁を有するホルダ本体を含む撮像手順に用いるための動物ホルダを提供する。壁は、更に、撮像される動物を装置の外部から装置の内部容積まで移動するための通路も含む。
革新的なホルダの壁は、好ましくは、撮像する動物を収容するのに適切な大きさの内部容積を定める形状にされる。更に、革新的なホルダの全体的な形状は、撮像装置のガントリに適合するように構成される。好ましい実施形態では、革新的なホルダの全体的な形状は、２つ又はそれよりも多くの撮像モダリティを用いることができるように２つ又はそれよりも多くの撮像装置のガントリに適合するように構成される。
【００８０】
一実施形態では、革新的なホルダは、本体に対して実質的に円筒形の形状である。円筒形の形状は、図５〜図７に示すように一実施形態では、縦方向に先端を切り取ることができる。
ホルダ本体は、単一の壁又はホルダの壁を形成するように取り付けられた複数の壁構成要素で形成することができる。
革新的な装置は、通路を閉鎖するために直接的又は間接的に壁に接触し、それによって内部容積を外部から分離する蓋を更に含むことができる。蓋は、任意的に、本体に取り付けられる。更に、本発明の装置は、動きアーチファクトを避けるために２つのガスポートを通して供給される吸入麻酔下に動物を維持することにより、生きている動物の撮像に用いることができる。更に、付加的なポートを用いて動物にアクセスし、任意的なモニタリング、ゲート開閉、及び挿管の要件を達成することができる。
【００８１】
好ましい実施形態は、実質的に平坦な表面を含む。このような平坦な表面は、発光及び／又は蛍光撮像のような光学撮像に役立つ。このような実質的に平坦な表面は、動物の位置に対して革新的なホルダのあらゆる位置に含めることができる。例えば、平坦な表面は、縦方向で先を切り落とした円筒形の切頭部分に含まれる。含まれた平坦な表面は、オプションの１つではホルダの蓋を形成するので有利である。このような平坦な表面は、ＭＲＩ表面コイルに適合するという点で更に有利である。
また、内部容積を定める壁は、内部容積と外部の間に１つ又はそれよりも多くのガスの通路を定めるガスポートを含むこともできる。
【００８２】
図３は、壁３０２及び蓋３０４を有する革新的なホルダ３００の上面図を示している。この実施形態では、蓋が透過性であり、蓋を通して内部容積３０８を見ることができる。ガスポートは、３０６で示している。
図４は、壁４０２、蓋４０４、及び２つのガスポート４０６を有する本体を示す革新的なホルダ４００の切取内部図を示している。蓋４０４は、蝶番４１０により本体に取り付けられて示されている。壁４０２と蓋４０４の間に位置決めされてガスケット４１２が示されている。
【００８３】
図５は、壁５０２及び蓋５０４を有するホルダ本体を示す革新的なホルダ５００の第１の端面図を示している。壁の端部部分５０８を通るポートを定める２つのガスポート５０６が示されている。革新的なホルダの内部容積を定める壁は、単一の部分とすることができ、又はこの図に示すように複数の取り付けられた部分で構成することができる。ここでは、壁の端部部分５０８は、壁５０２によって形成される中空の切頭円筒形中心本体に取り付けられる。第２の端部部分は、壁５０２によって形成される切頭円筒形中心本体の対向する端部で壁５０２に取り付けられる。
図６は、革新的なホルダ６００の実施形態の第２の端面図を示している。壁６０２及び蓋６０４を有するホルダ本体が示されている。任意的な蝶番６１０は、蓋６０４を本体の壁６０８の端部部分に取り付けられて示されている。
【００８４】
本発明によるホルダは、最高の画像品質を得るために、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、及び光学撮像のような１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティに適合する材料を含むように構成された壁及び／又は蓋のような構成要素を含む。特定的な実施形態では、革新的なホルダは、Ｘ線、ルミネセンス、及び／又は蛍光に減衰が限られるか又は減衰しないことを特徴とする材料から成る構成要素を含む。特定的な実施形態では、非金属性材料を用いて、ＭＲＩのようなある一定の撮像モダリティに干渉しないようにする。
【００８５】
革新的なホルダの好ましい実施形態は、１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティの画像を得るのに用いられる電磁放射線に望ましい厚みで実質的に透過性である材料で作られた構成要素を含む。「実質的に透過性」という用語は、１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティの画像を得るのに用いる電磁放射線の大部分の流れが減衰せずに構成要素を通過することを意味するものとする。好ましい実施形態では、１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティの画像を得るのに用いられる電磁放射線の約８５〜１００％は、ホルダの実質的に透過性の構成要素により減衰されない。別の好ましい実施形態では、空気伝染性細菌又は他の感染性微生物は、撮像分析のために動物試料を閉じ込めた革新的なホルダに入らないようになっている。その結果、動物組織の劣化又はそれに伴う２次感染が減少及び／又は排除される。別の好ましい実施形態では、１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティの画像を得るのに用いる電磁放射線の約９０〜１００％が、ホルダの実質的に透過性の構成要素により減衰されない。任意的に、２つが酸素及び吸入麻酔薬の吸気口／排気口であり、１つが挿管又は他のモニタリング装置アクセスのためである３つのホースバーブ１／４”〜５／１６”（ペンシルベニア州ウエストチェスター所在の「ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．」）がチャンバの端部に固定される。
【００８６】
ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、及び光学撮像を含む撮像モダリティに用いるために実質的に透過性である壁、蓋、及び／又は他の構成要素を形成するのに用いられる材料には、プラスチック、エーロゲル、及びガラスが含まれる。一般的に、壁又は他の構成要素の厚みは、包含的に約０．１ミリメートルと１０センチメートルとの間である。適切なプラスチックは、例示的に、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリウレタン樹脂、ポリエーテルスルホン、及びこれらのいずれかの組合せを含む。
【００８７】
好ましい実施形態では、革新的なホルダには、動物を支持するためのベッドが含まれる。図７は、壁７０２、蓋７０４、及び内部容積７０８を有する本体を含む革新的なホルダ７００の実施形態を示している。内部容積には、壁の支持部分７１４に配置されたベッド７１２が示されている。ベッド７１２は、マウスの身体に適合する形状にされた部分７１６を含む。ガスポート７０６も示されている。
図示のようなベッドは、動物に接触する領域７１６を有する上部側７１５及び底部側７１９を有する。典型的には、底部側は、壁７１４の支持部分に接触する。一部の実施形態では、ベッドは、絶縁層又は他の要素が壁７１４の支持部分とベッド７１９の底部側との間に位置決めされる場合のように、支持部分と間接的に接触することができる。厚み７２１は、ベッドの上部側７１５と底部側７１９の間に延びている。好ましい実施形態では、ベッドの上部側の動物接触領域７１６の少なくとも一部及び上部側７１５に隣接する厚みの部分７２３は、１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティの画像を得るのに用いられる電磁放射線に高度に透過性である。「高度に透過性」という用語は、１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティの画像を得るのに用いられる電磁放射線の９０％を超える流れが、減衰することなくベッドの上部側の動物接触領域の部分及び上部側に隣接する厚みの部分を通過することを意味するものとする。好ましい実施形態では、１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティの画像を得るのに用いられる電磁放射線の約９８〜１００％は、高度に透過性の部分により減衰されない。別の好ましい実施形態では、１つ又はそれよりも多くの撮像モダリティの画像を得るのに用いられる電磁放射線の少なくとも約９９％が、高度に透過性の部分により減衰されない。この部分７２３の厚みは、約０．１ミリメートル〜約５センチメートルの範囲である。それによって隣接するベッドの画像を軽減するか又は排除し、隔離した動物の画像を得るための画像の処理が回避又は軽減された動物画像を生成することができる。
【００８８】
一実施形態では、動物接触領域の高度に透過性の部分及び隣接するベッド厚みの高度に透過性の部分は、画像後処理を容易に行うことを可能にするように、撮像に用いる電磁放射線を空気と同様の範囲まで減衰させる。例えば、独立気泡ポリウレタン発泡体は、革新的な装置に含まれるベッドの動物接触領域に用いることができる電磁放射線を空気と同様の範囲まで減衰させることを特徴とする材料である。
【００８９】
更に別の実施形態では、革新的なホルダに動物を位置決めする正確なシステムが含まれる。好ましい実施形態では、動物位置決めシステムは、動物を支持し、その位置を維持するために壁の支持部分に配置されたベッドを含む。図７は、ベッド７１２がマウスのような動物の身体に適合する形状にした部分７１６を含む革新的なホルダの実施形態を示している。ベッドは、撮像される動物の少なくとも一部に適合する形状にされた部分を含む。好ましい実施形態では、ベッドは、ベッドに接触する動物の一部に適合する。例えば、ベッドは、動物が仰向けに配置される場合には、背部、頭、四肢、及び足を含む動物の背側部分に適合し、動物がうつ伏せに寝かされる場合には、腹部、胸部、頭、四肢、及び足を含む動物の腹側部分に適合する。このようなベッドにより、腹部の運動よりも胸部の運動を最大にすることができる。革新的なホルダに含まれるベッドは、撮像される動物の少なくとも一部に適合する形状にされた予備成形部分を含む。例えば、ベッドは、動物の身体の全体的な形状を有する部分を含むように成形することができる。更に、ベッドは、使い捨て及び／又は容易に殺菌される材料で作られる。
【００９０】
任意的に、革新的なホルダに含まれる壁は、モニタリング装置又はその一部のためのポートを有し、これは、壁の中に及び／又はそれを通って延び、動物又はホルダの内部容積をモニタする。別のオプションでは、モニタリング装置ポートは、ベッドに含まれ、モニタリング装置が動物に接触することを可能にする。例えば、好ましい実施形態では、動物の身体状態と最適な画像記録条件を調和させるために動物呼吸モニタが用いられる。例えば、圧力変換器は、呼吸ゲート開閉を可能にすることができ、それによってコンピュータ断層撮影スキャナがトリガされて呼吸サイクルの単一の相の間のみ画像を摂り、動きアーチファクトを最小限にする。従って、革新的なホルダの任意的な特徴は、圧力変換器のようなモニタリング装置のためのポートである。
【００９１】
図７は、壁７０２及び動物モニタリング装置７２０のための壁７０２のポート７１８を有する本発明によるホルダ７００を示している。図示のベッド７１２は、動物モニタリング装置７２０のためのポート７２２を更に含み、装置が、動物の身体に適合する形状にされた部分７１６に位置決めされた動物に接触することを可能にする。
任意的に、ベッド表面の少なくとも一部は、光学撮像システムを用いる間に表面反射又は蛍光を避けるために着色される。例えば、ベッドの少なくとも一部は、表面反射を避けるために黒又は青に着色される。
【００９２】
更に別の実施形態では、革新的なホルダに付随して、特定の手順で用いられる撮像モダリティで見える１つ又はそれよりも多くの基準マーカが存在し、相互レジストレーション工程を助ける。例えば、発光性アクリル（オレゴン州ビーバートン所在の「ＰｒｏＡｒｔ」）は、ＣＴ及び蛍光光学撮像の基準マーカとして用いられる例示的な材料である。トリチウムビーズ（ジョージア州アトランタ所在の「ＡｍｅｒｉＧｌｏ」）は、発光光学撮像の基準マーカとして用いられる例示的な材料である。脱イオン水は、ＭＲＩの基準マーカとして用いられる例示的な材料であり、ＦＤＧ（［２−１８Ｆ］２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース）は、ＰＥＴ撮像の基準マーカとして用いられる例示的な材料である。基準マーカは、動物撮像中に撮像視野に入ることになるホルダの構成要素に配置するか又は取り付けることができる。例えば、基準マーカは、ホルダの壁、蓋、及び／又はベッドに取り付けることができる。任意的に、望ましいこれらの溶液を容積に貯留して送出するように特注の毛細管が設計される。基準マーカの濃度は、その信号が画像に干渉するのを軽減及び回避するように調節される。
【００９３】
好ましい実施形態では、革新的なホルダは、動物又は撮像機器を汚染することなく研究を行うのを助けるために、ホルダの内部容積とホルダの外部環境との間の空気又は他の材料を交換するのを制御するように構成されたガス制御装置を含む。例えば、ガス交換を阻害し、ホルダ内部の環境を制御するために、特に接続部で、かつ可動部品に付随してシールを用いることができる。図５は、５１２で例示的なガスケットを示している。ガス流のこのような制御装置により、例えば、ガスポートを通してホルダに導入される吸入麻酔薬の利用が可能になる。
【００９４】
１つ又はそれよりも多くのガスポートを通して交換されるガスは、動物が健康／感染状況に関わりなく撮像されるように、吸入及び排出ガスのＨＥＰＡ濾過などにより精製することができる。
すなわち、ガス制御システムは、例示的に、ガスの通路を定める壁の閉鎖可能ポート、ガスケット、フィルタ、ガスポンプ、麻酔送出装置、又はその組合せから成る群から選択される構成要素を含む。
革新的な組成物及び方法の実施形態を以下の実施例に示す。これらの実施例は、説明のために挙げたものであり、革新的な組成物及び方法の範囲を制限するとは見なされない。
【実施例１】
【００９５】
本発明によれば、マイクロＣＴ画像を生成するのに用いられる染色方法は、マウス胎芽を用いて従来の組織切片生成及び染色に比較される。
試料調製
革新的な方法の例では、Ｐａｘ３：Ｆｋｈｒ遺伝子導入マウス（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃ．他、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」、第１８巻、２６０８〜１３頁、２００４年；Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃ．他、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」、第１８巻、２６１４〜２６頁、２００４年）、並びに野生型マウスを用いる。胎芽は、Ｅ９．５〜Ｅ１２．５在胎齢で採取し、その後、４℃の１０％緩衝ホルマリンに一晩入れて固定する。確立した方法（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃ．他、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」、第１８巻、２６０８〜１３頁、２００４年）を用いてヘマトキシリン及びエオシン染色パラフィン切片を調製し、その後、「Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ」顕微鏡で２ｘ倍率で視覚化する。上述のように（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃ．他、前出）、Ｐａｘ７モノクローナル抗体（アイオワ州アイオワシティ所在の「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｂａｎｋ」）を用いる免疫編成学検査を行う。マイクロＣＴに基づく仮想組織像では、胎芽は、次に、革新的な方法により染色される。胎芽は、０．１Ｍナトリウムカコジラート（ｐＨ７．２）、１％グルタルアルデヒド、及び１％四酸化オスミウム溶液に入れ、室温で揺動しながら飽和するまで一晩染色する。次に、胎芽は、０．１Ｍナトリウムカコジラート緩衝液に入れて３０分間洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で更に２回３０分間洗浄する。試料は、走査する前に、１００％エタノールまでの段階的な一連のエタノール濃度で培養する。
【００９６】
撮像
胎芽の高解像度容積測定コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）は、ＳＰマイクロＣＴ試料スキャナ（オンタリオ州ロンドン所在の「ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ」）を用い、８ミクロン３等尺ボクセル解像度で行う。この容積測定スキャナは、「Ｆｅｌｄｋａｍｐ」円錐ビーム再構成のために３５００ｘ１７５０のＣＣＤ検出装置を用いており、その性能は、地域コア施設として一般的に作動される＄３００、０００未満の他の市販のインビトロスキャナに類似する（ｈｔｔｐ：／／ｖｉｒｔｕａｌｈｉｓｔｏｌｏｇｙ．ｃｏｍ）。この研究では、電流、電圧、及び露出時間のプラットフォームに無関係なパラメータは、それぞれ、１００μＡ、８０ｋＶＰ、及び４０００ミリ秒で一定に保たれる。各走査で、９００の均等に離間した視野を８フレーム／視野から平均し、０．２ｍｍアルミニウムでフィルタリングする。８ミクロンの解像度では、この計器の視野は、１５ｘ１５ｘ１５ｍｍである。各走査には、ほぼ１２時間かかった。本方法の費用は、ほぼ＄４０／時（＄４８０／走査）である。画像は、製造業者の所有権付きの「ＥＶＳＢｅａｍ（Ｃ）」ソフトウエアで再構成される。胎芽の更に急速な容積測定ＣＴ走査は、「ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＲＳ」小動物マイクロＣＴスキャナ（オンタリオ州ロンドン所在の「ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ」）を用い、２７ミクロン３等尺ボクセル解像度で行った。試料スキャナのように、この生きている動物の容積測定スキャナは、「Ｆｅｌｄｋａｍｐ」円錐ビームを再構成するために３５００ｘ１７５０のＣＣＤ検出装置を用い、その性能は、地域コア施設として一般的に作動される＄３００、０００未満の他の市販のインビボスキャナと同様である（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｒｉ．ｕｔｈｓｃｓａ．ｅｄｕ）。この研究では、電流、電圧、及び露出時間のプラットフォームに無関係なパラメータは、それぞれ、４５０ｍＡ、８０ｋＶＰ、及び２０００ミリ秒で一定に保たれる。各走査で、４５０の均等に離間した視野を６フレーム／視野から平均した。８ミクロンの解像度では、この計器の視野は、４５ｘ４５ｘ４５ｍｍである。各走査には、ほぼ２時間４分かかった。本方法の費用も、ほぼ＄４０／時（＄８０／走査）である。画像は、製造業者の所有権付きの「ＥＶＳＢｅａｍ（Ｃ）」ソフトウエアで再構成される。市販の「ＭｉｃｒｏＶｉｅｗ（Ｃ）」プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｖｉｅｗ．ｓｆ．ｎｅｔ）で予備視覚化及び仮想組織像切片が生成される。
【００９７】
等値面生成
ＣＴデータセットの等値面描画は、オープンソースの「Ｔｅｅｍ」ユーティリティ（Ｋｉｎｄｌｍａｎｎ、Ｇ．、「Ｔｅｅｍ．１．８．０版」、ＳｏｕｒｃｅＦｏｒｇｅ．ｎｅｔ、２００５年）及びオープンソースでプラットフォームに無関係の「ＢｉｏＩｍａｇｅ」描画プログラム（（ＳＣＩ）、Ｓ．Ｃ．ａ．Ｉ．Ｉ．、「ＢｉｏＰＳＥ：生物医学コンピュータ用途のモデル化、シミュレーション、画像処理、及び視覚化のための問題処理環境」、２００２年）の組合せを用いて生成される。両方の組のソフトウエアは、オンラインで入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｓｃｉ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ）。更に、「Ｔｅｅｍ」ライブラリを用いて、現在のグラフィックカードの利用可能なメモリよりも相当大きいマイクロＣＴ容積の二段抽出も行われる。最終的な二段抽出容積は、２５５ｘ２５５ｘ２５５であり、最近傍手法を用いて等しく離間している。更に、「Ｔｅｅｍ」ライブラリを用いて勾配及びヘッシアンデータの事前計算も行われる。２次抽出と、勾配及びヘッシアンデータの生成とを組み合わせた処理は、２つのデータ容積を生成し、これは、元のＣＴ値と共に「ＶＧＨ」容積に記憶される（値、勾配、ヘッシアン）。次に、ＶＧＨ容積を用い、「ＢｉｏＩｍａｇｅ」ソフトウエアパッケージにより実時間で等値面を生成する。分割画像容積の分割は、国立医学図書館の「Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｔｏｏｌｋｉｔ」（ＩＴＫ、ｗｗｗ．ｉｔｋ．ｏｒｇ）で得られる「Ｗａｔｅｒｓｈｅｄ」アルゴリズム（Ｍａｎｇａｎ、Ａ．Ｐ．及びＷｈｉｔａｋｅｒ、Ｒ．Ｔ．、「ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｖｉｓ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｇｒａｐｈ」、第５巻、３０８〜３２１頁、１９９９年）を用いて行われる。流域分割は、使用者が定めたシード点が関連の領域に位置決めされ、局所近傍の勾配のマグニチュードの統計的分析を行い、標準偏差を判断する領域拡張アルゴリズムである。次に、その構造は、勾配のマグニチュードが平均の１標準偏差を超える点を交差することなく、シード点の周囲が連続周囲領域を通って延びる時に見出される。得られる構造は、別々の容積としてディスクに保存される。分割は、２．５ＧＨｚの「Ｉｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）  ＩＩＩ」プロセッサ及び２ＧＢのＲＡＭを搭載したコンピュータで行われる。得られる容積は、次に、各分割に固有の値として印を付け、次に、分割が存在するところは、その元の値が新しく印を付けられた値で上書きされるように、それを再び元の容積に併合することによって１つの容積に組み合わせる。
【００９８】
容積レンダリング
内部ソフトウエアパッケージ「Ｎｅｎｎｅｒｓ」（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｔ．Ｎ．、（２００５）Ｎｅｎｎｅｒｓ）を用いる直接容積レンダリング技術を用いて野生型及びＰａｘ３：Ｆｋｈｒ突然変異胎芽データセットの容積レンダリングを生成する。「Ｎｅｎｎｅｒｓ」は、容積を読み、容積を通して幾何学的光線を放つ。幾何学的光線は、全てのピクセルから放たれ、ボクセル間で２度抽出され、従って、ｘ／２又はそれ未満である（式中ｘは、試料を走査する単位である）。試料は、分離可能カーネルを用いる畳み込みによって得られる（Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｒ．Ｃ．及びＷｏｏｄｓ、Ｒ．Ｃ．、「Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．」、第１９７巻、２００２年）。３次式Ｂスプラインを用いてＣＴ値及び勾配の両方を内挿する（Ｋｉｎｄｌｍａｎｎ、Ｇ．Ｌ．、Ｗｈｉｔａｋｅｒ、Ｒ．、Ｔａｓｄｉｚｅｎ、Ｔ．、及びＭｏｅｌｌｅｒ、「Ｔの直接容積レンダリングのための曲率に基づく伝達関数：方法及び応用」、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ＩＥＥＥ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ」、５１３〜５２０頁、２００３年）。色及び不透明度は、領域を定める２次元伝達関数、勾配のマグニチュード、及びＸ線密度を用いて各試料点で定められる（Ｌｅｖｏｙ、Ｍ．、「容積データからの表面の表示」、「ＩＥＥＥ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第８巻、２９〜３７頁、１９８８年；Ｋｎｉｓｓ、Ｊ．Ｍ．、Ｋｉｎｄｌｍａｎｎ、Ｇ．Ｌ．、及びＨａｎｓｅｎ、Ｃ．Ｄ．、「視覚化ハンドブック」、Ｈａｎｓｅｎ、Ｃ．Ｄ．及びＪｏｈｎｓｏｎ、Ｃ．Ｒ．編、１８９〜２１０頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００５年）。これは、光線の不透明度が１に等しいか又はそれよりも大きくなると、光線が早期に中止され、次の光線が計算されるように、前から後に向う方式で行われる。更に、境界容積を用いて、この容積にまだ衝突しないか又は衝突しない光線が抽出されないようにこの処理を高速化する。更に、勾配を用いて、用いる「Ｐｈｏｎｇ」陰影モデルを近似する（Ｇｏｏｃｈ、Ａ．他、「自動テクニカルイラストレーションのための非写真的現実性照明モデル」、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＡＣＭ  Ｓｉｇｇｒａｐｈ」、４４７〜４５２頁、１９９８年）。更に、容積レンダリングには、曲率に基づく伝達関数（Ｇｏｏｃｈ、Ａ．他、前出）及びデプスキューイングを用いることもできる。伝達関数は、入射光線の角度と表面法線とのドット積に基づいている。ドット積が、何らかの定数ｋ（０＜ｋ＜１）よりも小さい場合には、表面は、黒色で印を付け、視線方向に垂直な表面を強調する。更に、内挿試料に陰影を付けるためのデプスキューを用いて、深さの感覚を大きくし、前景を背景から分離する。更に、試料に比較したカメラ位置、視線方向、及び照明のパラメータも渡され、描画の視野を定める。ソフトウエアを「ＳＧＩ  Ｏｎｙｘ  ３８００」で８０秒／描画で行い、ピクセルの各列は、速く結果を得るためにハイパースレデッド又は複数の処理装置にわたって分配することができる。
【００９９】
上述の処理を用いて、細胞膜を四酸化オスミウムの１％溶液で染色したホルマリン固定野生型Ｅ１１．５胎芽は、８ミクロン等尺解像度で容積測定コンピュータ断層撮影法により撮像される。走査した胎芽の外面の特徴は、解剖顕微鏡に同等のレベルの詳細を示す等値面で表すことができる。内部構造は、胎芽全体の半透明「最大強度投影（ＭＩＰ）」により視覚化される。
従来的な光学組織像の空間解像度をマイクロＣＴに基づく仮想組織像に比較するために、パラフィン包埋４．５ミクロン切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、２ｘ倍率で視覚化する。マイクロＣＴに基づく仮想組織像による矢状方向、冠状、及び軸線方向切片は、内部特徴（臓器及び組織）の描写を同じ倍率のパラフィン切片に比較可能である。後根神経節、神経管、及び前主静脈ほどの小ささの解剖学的目印は、容易に識別することができる。オスミウム染色は、組織の脂質含量に伴い改善するために、この例では、最も染色されていない組織から最も染色されている組織まで密度に６倍の差が見られる。組織のＣＴ密度値は、５７８５〜３２７６７ハウンスフィールド単位の範囲であった。
【実施例２】
【０１００】
革新的な方法の特定の実施例では、表皮層が限定された在胎月齢の全胎芽を用いる。例えば、有意に表皮が発達していない妊娠中期全胎芽（Ｅ８−Ｅ１３．５）を用いることができ、Ｅ１９までの除膜胎芽も満足に染色することができる。胎芽は、実施例１に説明するように染色される。時系列のＥ９．５、Ｅ１０．５、Ｅ１１．５、及びＥ１２．５の胎芽の等値面及び矢状横断面を設け、８ミクロン等尺解像度で走査する。これらの解像度では、発達している脳胞、神経管、心室、及び肝臓のような特徴を明確に描写することができる。肝臓の脂質含量が増大するために、オスミウム染色肝組織が希薄化し、不透明度及び輝度が最高になる。
【実施例３】
【０１０１】
高速２７ミクロン解像度走査
「ＧＥ  ｅＸｐｌｏｒｅ  ＲＳ」小動物スキャナを用いて、２７ミクロン等尺解像度でほぼ２時間で野生型Ｅ１２．５胎芽の走査を行う。胎芽は、実施例１に説明されているように染色する。同じ胎芽の８ミクロン及び２７ミクロン走査を比較すると、８ミクロン切片は、大幅に空間解像度が高いが、それにも関わらず、２７ミクロン切片は、半規管、神経管中心管、及び心室のような特徴を区別するのに適切である。高処理表現型検査の観点からすれば、これらの２７ミクロンマイクロＣＴ走査の解像度は、磁気共鳴顕微鏡法の範囲であるが、ほぼ６倍の時間の節約である。更に、これらの２時間で２７ミクロン解像度の走査は、主要臓器区画の高品質分割分析を行うのに適切であり、コンピュータに基づく自動表現型検査に有利である。注意すべきことは、右心房のような一部の臓器内の小管腔は、高解像度走査よりも分割が不良であることである。しかし、２７ミクロン解像度で走査された同じオスミウム染色胎芽は、小さな構造の鮮明度を改善することが望ましい場合は８ミクロン解像度で走査することができる。
【実施例４】
【０１０２】
幼弱胎芽の主要臓器区間及び組織構造の高処理表現型検査のためのマイクロＣＴ仮想組織像の値を試験するために、複雑な吻側神経管形成異常を有することが公知のＰａｘ３：Ｆｋｈｒ遺伝子導入マウス胎芽が用いられる（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃ．他、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」、第１８巻、２６０８〜１３頁、２００４年、Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃ．他、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」、第１８巻、２６１４〜２６頁、２００４年）。これらの胎芽は、背側神経管及び皮筋板にＰａｘ３遺伝子の代わりにＰａｘ３：Ｆｋｈｒ融合ガン遺伝子を発現し、神経管閉鎖が部分的に不全になることになる。野生型及びＰａｘ３：Ｆｋｈｒ突然変異体Ｅ１１．５胎芽は、実施例１のように染色され、２７ミクロン解像度で走査され、次に、分割を伴うレンダリングを行い、頭部前脳、中脳、及び後脳胞、心臓壁及び心室、及び肝臓を視覚化する。このようなレンダリングを行うと、後脳及び中脳レベルの神経管閉鎖の不全、中脳間葉組織の過成長以外に、終脳小胞の発育不全を識別することができる。これらの所見は、パラフィン包埋試料からの実際の組織像で明らかになるが、突然変異前脳、中脳、及び後脳の複雑な大域的な３次元構成は、明らかとならないことになる。心室壁は、本質的に、野生型及びこの月齢での突然変異体で同じであり、共通心室の容積又はパターン化に感知することができる差がない。更に、肝臓も野生型及び突然変異体の両方で正常にパターン化されるように見える。個々の２７ミクロン平面を用い、背側神経管の重篤な平滑末端化及び組織崩壊を伴う後肢レベルでの付加的な微細欠損が神経管に検出される。発生に関するパターン形成異常に対する半又は完全自動高処理選別の観点から、高速２７ミクロン走査は、複雑で全体的な特徴及び微細な特徴の両方を形態学的に分類する実行可能な方法を示している。
【実施例５】
【０１０３】
マウス胎芽を用いてマイクロＣＴ走査に用いるための染色方法を比較する。
胎芽収集：胎芽は、妊娠１２日目（Ｅ１２．５）に収集し、その後、４℃の１０％緩衝配合剤に一晩入れて固定する。
室温で揺動しながら０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に２％四酸化オスミウムを加えた溶液中で１時間胎芽を染色する第１の染色方法を行う。胎芽は、次に、０．１Ｍリン酸緩衝液で３０分間洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で更に２回３０分間洗浄する。次に、試料は、走査の前に一連の勾配で１００％エタノールまで移行させる。
【０１０４】
本発明による好ましい染色方法を上述の「第１の染色方法」に比較する。革新的な方法では、胎芽は、室温で揺動しながら、０．１Ｍナトリウムカコジラート（ｐＨ７．２）、１％グルタルアルデヒド、及び１％四酸化オスミウムの溶液中で飽和するまで一晩染色される。胎芽は、次に、０．１Ｍナトリウムカコジラート緩衝液で３０分間洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で更に２回３０分間洗浄する。次に、試料は、走査の前に一連の勾配で１００％エタノールまで移行させる。
【０１０５】
同じ走査方法を用いて、第１の方法及び革新的な方法で処理された試料を比較する。２つの異なる方法で染色されたＥ１２．５胎芽を同じ管に入れて共に同時に走査する。胎芽のＣＴ走査は、「ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＲＳ」小動物マイクロＣＴスキャナ（オンタリオ州ロンドン所在の「ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ」）を用いて２７ミクロン３等尺ボクセル解像度で行った。この生きている動物容積測定スキャナは、「Ｆｅｌｄｋａｍｐ」円錐ビーム再構成のための３５００ｘ１７５０のＣＣＤ検出装置を用いており、その性能は、地域コア施設として一般的に作動される＄３００、０００未満の他の市販のインビボスキャナに類似する。この研究では、電流、電圧、及び露出時間のプラットフォームに無関係なパラメータは、それぞれ、４５０ｍＡ、８０ｋＶＰ、及び２０００ミリ秒で一定に保たれる。各走査で、４５０の均等に離間した視野を６フレーム／視野から平均する。走査には、ほぼ２時間４分かかった。本方法の費用は、ほぼ＄４０／時（＄４８０／走査）である。３次元容積は、製造業者の所有権付きの「ＥＶＳＢｅａｍ（Ｃ）」ソフトウエアで再構成される。視覚化は、製造業者の「ＭｉｃｒｏＶｉｅｗ（Ｃ）」プログラムで行われる。
【０１０６】
この研究の結果は、「第１の方法」により処理された材料の信号範囲と重なるエタノールによる背景ノイズを示している。これと対照的に、上述の革新的な方法で処理した組織の信号の範囲は、エタノールによる背景ノイズの範囲から良好に隔離されている。更に、革新的な方法により染色された組織は、上述の「第１の方法」により染色した組織に比較して、広い範囲の「Ｃｔ値」を有する信号を生成する。従って、革新的な方法を用いて生成された画像は、上述の「第１の方法」により生成した画像よりも広い範囲の信号強度及び良好なＳＮ比を示している。
【実施例６】
【０１０７】
胎仔は、最初にメスで臍帯をきれいに切断した後に（ハサミも用いず、引き裂くこともしない。これは、血管の撮像を最適にするのに重要である）、冷ＰＢＳ中で解剖する。次に、羊膜及び内側の薄い漿膜（できるだけ余分な胎芽／余分な胎生組織を持たない）の両方を注意深く除去する。清浄にした胎仔を氷上のＰＢＳに入れる。遺伝子導入動物からの胎仔に対しては、羊膜又は内膜の小片（１．５ｘ１．５ｍｍ）を１．５ｍｌ管に入れる。管は、胎仔に対する固有の識別番号でラベル付けする。解剖顕微鏡下で胎仔の写真を撮る。全ての胎芽／胎仔は、固有の識別番号で個々にラベル付けされる。０．１ＮのＨＣｌで予め酸処理し、その後、大量のｄｄＨ２Ｏで洗浄した各胎仔は、予めラベル付けしたガラスネジ固定式管に貯蔵する。胎仔／仔に対しては、固定及び染色する前に皮膚を除去すべきである。皮膚の除去を容易に除去されるように皮膚を緩めるために、皮膚を剥ぐ前に脱色する。これを行うために、小さなビーカーを水で満たし、ホットプレート上で水を沸騰させる。水を沸騰させる間に、マイクロシザーを用いてマウス胎仔／仔の腹側部及び背側部に小さく浅く「Ｘ」を切断する。図８は、上述のように、新しく安楽死させた直後（Ａ）、次に脱色した後（Ｂ）、次に皮膚を剥いだ後（Ｃ）の胎仔の形態学的変化を示している。
【実施例７】
【０１０８】
脱色する段階及び皮膚を剥ぐ段階の後、胎仔に切開を行って胸郭肋膜、腹部腹膜、及び硬膜を開き、染色液の透過が更に改善するようにする。
胸郭肋膜を開くために、図９Ａに示すように．身体の左側方部の第１０肋骨の上にメスで小さな肋骨上切開を行う。神経及び血管は各肋骨の下を延びるために、肋骨の上を切開しても、望まない大出血に到る可能性がある血管への損傷が起きにくいことになる。更に、第１０肋骨は、肺と隔膜の間の間隙の前側方に位置するために、第１０肋骨上を切開しても、内部構造に損傷を引き起こす可能性は小さい。次に、繊細なハサミを先端を上に向けて用い、肺及び心臓のような内部構造に損傷を与えることなく、長さほぼ２〜４ｍｍまで第１０肋骨の上部縁に沿って切開を延ばす。次に、図９Ｂに示すように、身体の右側方部の肋骨上切開／切断を繰り返す。切断は、胸郭肋膜のみを開け、内部臓器を損傷しないように表面から１ｍｍよりも深くない。
【０１０９】
同様に、腹膜を開けるために、臍の１ｍｍ上を腹腔の正中線に沿ってメスで小さな垂直切開を行い、次に、先端を上にして微細なハサミを用い、図９Ｃに示すように、剣状突起の方向にほぼ長さ１．３ｍｍまで切断を延ばし、内部臓器に損傷を与えることなく腹膜のみを切断する。切開の長さを１．３ｍｍ未満にすると、切断が肝臓よりも確実に下になり、それによって肝臓に損傷を与える可能性が少なくなる。切断は、腸に損傷を与えないように、表面から０．３ｍｍよりも深くない。
【０１１０】
硬膜を開けるために、図９Ｄに示すように、頭蓋骨の縫合に沿って２〜３ｍｍ長さの切開をメスで行う。切断は、硬膜のみを開け、脳の他の構造に損傷を与えないように、表面から０．５ｍｍより深くしないことが必要であることに注意されたい。
切開後、各胎仔は、固定する前に、５０ｍｌ円錐形管に移して２〜１０分間３回ＰＢＳで揺動することによって洗浄し、全てのアーチファクトを防ぐために全ての付着した膜及び組織小片を除去する。胎仔は、胎仔自体の容積の約１０倍の固定剤容積を用い、１０％緩衝ホルマリン又は固定溶液のいずれかで室温で一晩揺動しながら培養する。固定溶液は、０．１Ｍカコジラート緩衝液及び１〜３重量％のグルタルアルデヒドを含有する。胎仔は、最低、室温で一晩（１２時間）固定する。このような良好に固定された胎仔は、次の染色方法に悪影響を及ぼすことなく６ヶ月歩存される。
【実施例８】
【０１１１】
以下に、肝臓、心臓、肺のような非胎芽組織を調製して固定する方法を提供する。
ガラスバイアルを０．１ＮのＨＣｌで酸処理し、その後、大量のｄｄＨ２Ｏで濯ぐ。組織を測定して切断し、処理したガラスバイアルに入れる。次に、組織は、室温で一晩、１０％緩衝ホルマリン又は固定溶液のいずれかで培養する。固定剤の容積は、組織自体の容積の１０倍であることが好ましい。
【０１１２】
固定後、固定液は、組織から除去する。次に、組織は、０．１Ｍカコジラート緩衝液及び１重量％グルタルアルデヒドも含有する０．８〜２％のＯｓＯ４染色溶液で染色する。薄い組織切片＜２ｍｍに対しては、４ｍｌの酸洗浄したガラスバイアルに入れた１％ＯｓＯ４染色溶液を用い、厚い組織切片＞２ｍｍに対しては、４ｍｌの酸洗浄したガラスバイアルに入れた１．８４％ＯｓＯ４染色溶液を用いる。組織切片は、揺動することによって４℃で６〜１２時間培養する。この染色及び培養する段階は、新しく調製したＯｓＯ４染色溶液を用いて繰り返すことができる。
四酸化オスミウム及びその溶液は、固定の目的には無効な黒色化合物である二酸化オスミウムの生成を防止するために、光、熱、又は有機材料に露出しないで貯蔵することに注意されたい。
【実施例９】
【０１１３】
組織をリンタングステン酸（ＰＴＡ）で染色する方法を以下に明らかにする。
組織は、室温で揺動することによって１０％緩衝ホルマリンで一晩固定する。組織は、１ｘＰＢＳで３回、各々１時間濯ぐ。次に、組織は、室温で揺動することによって５％リンタングステン酸（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で一晩染色する。組織は、再び、各々１時間揺動することによって１ｘＰＢＳで３回濯ぐ。次に、組織は、段階的エタノール、より詳細には、２５％エタノールの１ｘＰＢＳ溶液に入れて１５〜３０分間、５０％エタノールの１ｘＰＢＳ溶液に入れて１５〜３０分間、７５％エタノールの１ｘＰＢＳ溶液に入れて１５〜３０分間、１００％エタノールの１ｘＰＢＳ溶液に入れて１５〜３０分間、かつ別の１００％エタノールの１ｘＰＢＳ溶液に入れて１５〜３０分間揺動することによって脱水する。脱水後、組織は、微小遠心管に入れた１００％エタノール中の粗スポンジに包装されると、走査の準備ができる。
【実施例１０】
【０１１４】
一例では、革新的なホルダ本体は、壁厚みが３ｍｍのプレキシガラス（テキサス州サンアントニオ所在の「Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｐｐｌｙ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｉｎｃ」）製の３”ＯＤシリンダから構成される。
この実施形態の円筒形デザインは、多くのＣＴ／ＭＲＩ／ＰＥＴ機械のガントリで利用可能な空間を最大にする。シリンダの上面は、ホルダの蓋に対する接触点を設けるために外面から１ｃｍ切断される。蓋は、３ｍｍ厚の平坦なセル注型「Ａｃｒｙｌｉｔｅ（登録商標）ＦＦ」シート（ペンシルベニア州フィラデルフィア所在の「Ａｔｏｇｌａｓ」）で作られる。このシートは、任意的に透明で９０％の可視光を透過させると考えられている。シリンダ壁の一端に２つの穴が切断され、酸素／イソフルランの吸気及び廃棄のために穴に２つのホースバーブ１／４”〜５／１６”（テキサス州サンアントニオ所在の「Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｐｐｌｙ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｉｎｃ」）を入れ、吸入麻酔及び／又は空気交換を可能にする。ホルダ蓋とホルダ本体の間の接合部は、正確に機械加工して接合部を気密性にする。任意的に、この処理は、接合部でホルダ蓋及びホルダ本体の両方に接触するように置かれた独立気泡スポンジゴムガスケット（カリフォルニア州サンタアナ所在の「Ｒｕｂｂｅｒ  Ｃａｌ」）を更に利用することができる。蓋は、透明なプラスチック蝶番及び留め金（カリフォルニア州サンタローザ所在の「Ｔａｐ  ｐｌａｓｔｉｃ」）で本体に固定される。
【実施例１１】
【０１１５】
「Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−２００」計器で「Ａｃｒｙｌｉｔｅ  ＦＦ」蓋を含む本発明によるホルダのルミネセンス及び蛍光透過性試験を行う。ＦＩＴＣ及びＣｙ５．５の１０マイクロモル溶液を用いて蛍光の透過性を検査し、トリチウムガン照準材料を用いてルミネセンスの透過性を検査する。組織内の信号減衰の効果を検査するために、マウス腹部内部にトリチウム源を配置し、「Ａｃｒｙｌｉｔｅ  ＦＦ」蓋がある場合とない場合の信号を記録する。結果は、ホルダの蓋があると９３％の透過性を示している。このホルダ蓋表面による光学信号の減衰は、最小であることが観察される。蛍光及びルミネセンス透過性試験は、溶液を用いるか又は動物内で、蓋がある場合及びない場合で行う。ＦＩＴＣは、ホルダを通る透過性が８９％である。Ｃｙ５．５のホルダを通る透過性も８９％である。トリチウムルミネセンスは、ホルダを通る透過性が高く、９２％である。マウス腹部内のトリチウムのホルダを通る透過性は、９３％である。
【実施例１２】
【０１１６】
トリチウム源をマウス腹部内に置き、発光画像を位置合わせする。この実施例で生成される強度マップ内で可視であるように、基準点も発光する。マウスは、マイクロＣＴで走査し、相互レジストレーションのために、その「２Ｄ最大強度投影（ＭＩＰ）」画像を用いる。基準点は、画像を重ねるための基準マーカとして用いられる。重ねた画像から、トリチウム活性がＣＴ画像内の解剖学的位置に対応することが明確に見える。
【０１１７】
マイクロＣＴと発光光学撮像データベースの良好な相互レジストレーションは、本発明による動物ホルダを用いて達成される。マイクロＣＴ／光学及びマイクロＰＥＴ／ＭＲＩの相互レジストレーションの結果は、２つの位置合わせした画像の相関関係が良好であることを示している。これらの試験では、マウスは、イソフルランを用いて麻酔し、トリチウム源をその腹部内に入れる。この動物は、いくつかの基準点マーカを含む革新的なホルダの内部の特注の発泡体ベッドに位置決めされる。基準点は、二重蒸留Ｈ２Ｏで希釈することによって望ましい濃度まで下げ、鉛粒子汚染を避ける。「Ａｃｒｙｌｉｔｅ  ＦＦ」で作られたホルダの蓋は、ゴムガスケットを用いてホルダの本体に対して密封し、蓋とホルダ本体との接合部でのガス交換を阻害する。発光画像は、４秒の露出時間、高解像度、１２．７ｃｍ視野、ｆ／ストップが２／８、及び３ｃｍ試料高さで得られる。次に、ホルダは、マイクロＣＴ機器まで移され、９３ミクロン解像度、平均に４フレーム、７２０視野、１００ミリ秒露出時間、８０ｋＶｐ  Ｘ線源力、及び２５分以内で４５０ｕＡ線源電流でＣＴ画像が得られる。画像は、補正して再構成し、軸線方向、矢状方向、及び冠状平面のスライスの３Ｄ画像を得る。２ＤのＭＩＰ画像を生成し、「Ｍｉｃｒｏｖｉｅｗ」を用いる相互レジストレーションに使用する。このモダリティの画像は、「Ｐｏｗｅｒ  Ｐｏｉｎｔ」を用いて互いに融合される。腹部内のトリチウム源の高さは、両方のモダリティで測定され、ＣＴの軸線方向像から得られる測定値は、５．１５±０．５ｍｍであり、光学撮像の３Ｄ再構成から得られる測定値は、５．００±０．５ｍｍである。
【０１１８】
更に別の実施例では、革新的なホルダは、小動物ＭＲ及びマイクロＰＥＴデータセットの良好な相互レジストレーションを行うのに用いられる。
この実施例に用いたマイクロＣＴ撮像パラメータは、本明細書に説明されている。この研究に用いた全ての動物は、ＩＡＣＵＣ承認プロトコルに従って処理される。マウスは、２．５リットル／分の流れで、１００％酸素中の１％イソフルランを用いて麻酔する。発光アクリル（オレゴン州ビーバートン所在の「ＰｒｏＡｒｔ」）を基準マーカとして用い、これは、その発光特性のために光学／ＰＥＴ撮像で見ることができ、そのアクリル特性のためにＣＴ／ＭＲＩで見ることができる。液体の濃度は、マウスからの実際の信号に影響を及ぼさないように望ましいレベルまで下げ、試料の周りの３つの部位の単一ストリップの管に入れる。麻酔マウスの容積測定コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）は、「ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＲＳ」小動物マイクロＣＴスキャナ（オンタリオ州ロンドン所在の「ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ」）を用いて９３ｕｍ３ボクセル解像度で行う。この容積測定スキャナは、「Ｆｅｌｄｋａｍｐ」円錐ビーム再構成のために３５００ｘ１７５０のＣＣＤ検出装置を用いており、そのデザインは、地域コア施設（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｒｉ．ｕｔｈｓｃｓａ．ｅｄｕ）として一般的に作動される＄３００、０００未満の他の市販のインビボスキャナに類似する。この研究では、電流、電圧、及び露出時間のプラットフォームに無関係なパラメータは、それぞれ、４５０μＡ、８０ｋＶＰ、及び１００ミリ秒で一定に保たれる。７２０の均等に離間した視野角及び４フレームを含む走査パラメータは、視野毎に平均する。画像は、製造業者の所有権付きの「ＥＶＳＢｅａｍ（Ｃ）」ソフトウエアで再構成され、視覚化は、オープンソース「ＭｉｃｒｏＶｉｅｗ（Ｃ）」プログラムで行われる。
【０１１９】
この実施例の発光及び蛍光撮像は、「Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００」システム（カリフォルニア州アラメダ所在の「Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．」）を用いて行われる。この撮像装置は、低ノイズ１６ビットデジタル電子読み出しを有する科学等級の極低温冷却ＣＣＤカメラを用いる。この研究では、用いるパラメータは、４秒の露出時間、高解像度ビニング、１２．６ｃｍ視野、及びｆ／ストップ２／４である。データは、製造業者の所有権付きの「Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．５（Ｃ）」ソフトウエアを用いて得られ、３Ｄ画像は、「Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３Ｄ（Ｃ）」ソフトウエアを用いて再構成される。
【実施例１３】
【０１２０】
マイクロＣＴ及び発光光学撮像データセットの良好な相互レジストレーションを以下に明らかにする。
マイクロＣＴ及び光学撮像の相互レジストレーションのためにチャンバを有効に利用することを明らかにするために、２組の走査を行う。マイクロＣＴ／発光に対しては、右大腿部から発現されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する動物を用いる。ルシフェラーゼを発現する動物は、イソフルランを用いて麻酔にかけられ、ルシフェリンを注入され、特注の発泡体ベッドに位置決めされる。３つの基準マーカ（短い毛細管）を発泡体ベッドのマウスの側部に沿って置き、これを、次に、マルチモダリティチャンバの内部に入れる。光学及びマイクロＣＴ画像の取得、再構成、及び相互レジストレーションは、上に詳細に説明したように行う。図１ＯＡに示すような相互レジストレーション画像から、動物の右大腿部に信号が局在化しているのを認めることができる。総計信号強度は、１．３８ｘ１０７ｐ／ｓであった。
【実施例１４】
【０１２１】
マイクロＣＴ及び発光光学撮像データセットの別の良好な相互レジストレーションを以下に明らかにする。マイクロＣＴ及び光学撮像の相互レジストレーションに対してチャンバを有効に利用することを明らかにするために、２組の走査を行う。マイクロＣＴ／近赤外線蛍光に対しては、腫瘍選択的近赤外線コントラスト剤を投与した腫瘍を有する動物を用いる。同様に、改質インドシアニングリーンコントラスト剤を尾静脈注入後、子宮に自然発生的平滑筋腫を有するマウスを撮像する。注入して１５分後に近赤外線撮像を行う。腫瘍領域からの信号は、４．１４９ｘ１０１０パルス／秒であると定量される。動物は、次に、マイクロＣＴに移されて、９３立方ミクロン走査を行う。図１０Ｂに示すような基準マーカの助けを借りて、光学（２Ｄ）データのマイクロＣＴ（３Ｄ）データとの相互レジストレーションを行う。次に、動物を剖検する（差込図）。相互レジストレーションデータセットから、信号は、明瞭な境界を有し、信号の大部分は、生存可能な固体腫瘍領域に集中することが認められる。これらの２つのデータセットは、チャンバとＣＴ及び光学システムが適合すること、及び２つのモダリティからのデータセットに容易に相互レジストレーションを行うことができることを明らかにしている。
【実施例１５】
【０１２２】
小動物ＭＲ及びマイクロＰＥＴデータセットの良好な相互レジストレーションを以下に示す。
ＭＲＩ及びＰＥＴシステムと共に用いる実現可能性を明らかにするために、健康な野生型マウスを撮像し、解剖学的構造及び正常グルコース代謝の相互レジストレーションを行う。マウスは、その基準マーカと共に発泡体ベッドに位置決めされ、マルチモダリティチャンバ内部に入れる。３ＤＭＲＩ画像は、０．３８ｍｍ等方ボクセル解像度及び総取得時間２０分で得られる。ＭＲＩ撮像セッションの直後に、マウスは、隣接する部屋のマイクロＰＥＴスキャナに運ばれる。０．２５ｍＣｉ１８ＦのＦＤＧを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で動物に投与し、その後、動物は、チャンバに戻す。特注の発泡体ベッドにより、マウスは、ｉ．ｐ．注射後に再現可能に位置決めすることができる。１５分血液循環時間を取った後に、２５分にわたって一連のマイクロＰＥＴ画像を取得する。マイクロＰＥＴ画像の３Ｄ再構成により、マウスの中枢神経系でのグルコース代謝活性が示される。データは、図１０Ｃ、Ｄ、Ｅに示すようなマイクロＭＲＩにより生成された３Ｄ最大強度投影画像との相互レジストレーションが行われる。相互レジストレーションデータは、心筋、中枢神経系、及び唾液腺のグルコース代謝を解剖学的に位置確認するのに役立ち、嗅球から最も強い信号が出される。
このデータは、チャンバがマイクロＭＲＩ及びマイクロＰＥＴシステムに適合性があり、発泡体ベッドへの位置決めが再現可能であることを明らかにしている。
【実施例１６】
【０１２３】
位置決めシステムとして用いられる発泡体成形ベッドを作る例示的なプロトコルを詳細に説明する。発泡体ベッドは、発泡ウレタン（フロリダ州ウエストパームビーチ所在の「Ｕ．Ｓ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ」）で成形され、これは、組み合わされると膨脹して硬質の独立気泡ポリウレタン発泡体になることになる２部構成の所定位置注入液体である。本明細書で用いる発泡体は、１．８〜８ポンド／立方フィートの密度であり、これは、空気と同様の密度である。
【０１２４】
発泡体の２つの部分は、最初に計量し、プラスチック容器に入れて互いに混合する。液体は、２５秒間激しく混合し、次に、マウスの身体の型穴を有する特別なプラスチック鋳型に移す。小、中、及び大の大きさのマウスを収容するために３つの異なる大きさを有するいくつかのプラスチック鋳型を作る。更に、プラスチック鋳型は、発泡体が容易に外れるのを助け、プラスチック鋳型の損傷を避ける市販の離型ワックス（フロリダ州ウエストパームビーチ所在の「Ｕ．Ｓ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ」）でも覆う。４５秒以内に発泡工程が始まり、発泡体は、５分以内に完全に発泡し、１５分以内にほぼ完全に固まることになる。低密度であるが、この発泡体は、非常に硬質であり、動物を拘束し、走査の時系列にわたって動物を再現可能に位置決めするための良好な「ポケット」として働く。
【実施例１７】
【０１２５】
多重チャンバ胎芽ホルダを作るためのプロトコル
この実施形態では、胎芽ホルダは、発泡ウレタン（フロリダ州ウエストパームビーチ所在の「Ｕ．Ｓ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ」）で作られ、これは、組み合わされると膨脹して硬質の独立気泡ポリウレタン発泡体になることになる２部構成の「所定位置注入」液体である。この実施形態に用いられる発泡体の密度は、硬化すると２ポンド／立方フィートであり、これは、この種では最も軽い。発泡体の密度とは、硬化時の発泡体の重量／立方フィートを意味する。密度が高ければ重くて高強度の発泡体になるが、本発明の用途では、硬化時に密度が２ポンド／立方フィートの発泡体が適切である。
【０１２６】
発泡体の２つの部分は、最初に計量し、プラスチック容器に入れて互いに混合する。液体は、２５秒間激しく混合し、次に、特別なプラスチック鋳型に移す。更に、プラスチック鋳型は、発泡体が容易に外れるのを助け、プラスチック鋳型の損傷を避ける市販の離型ワックス（フロリダ州ウエストパームビーチ所在の「Ｕ．Ｓ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ」）でも覆う。４５秒以内に発泡工程が始まり、発泡体は、５分以内に完全に発泡し、１５分以内にかなり固くなることになる。
【０１２７】
例示的な胎芽ホルダは、直径４０ｍｍ、長さ４０ｍｍのシリンダに含まれることになる４つの層を含み、一度に９０までの胎芽を保持することができる。例えば、上部及び底部層は、各々１５のチャンバを含むことができ、中間層は、各々寸法が５ｘ６ｘ８ｍｍの３０のチャンバを含み、総計で９０チャンバを含むことができる。他の構成では、同じか又は異なる寸法のこれよりも多いか又は少ないチャンバ及び／又は層を用いることができる。
【０１２８】
本明細書で言及したあらゆる特許又は文献は、各個々の文献が、引用により組み込まれることが具体的かつ個々に示される場合と同じ程度まで引用により本明細書に組み込まれている。
本明細書に説明した方法、装置、システム、及び組成物は、現在の代表的な好ましい実施形態であり、例示的なものであり、かつ本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者は、本発明の変更及び他の使用を想起するであろう。このような変更及び他の使用は、特許請求の範囲で示した本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】マイクロＣＴ画像を収集、記憶、かつ検索するための革新的なコンピュータに基づく方法を示す図である。
【図２】多重チャンバ試料ホルダの革新的なアセンブリを示す図である。
【図３】革新的な動物ホルダを示す上面図である。
【図４】図３の革新的な動物ホルダを示す切取内部図である。
【図５】図３の革新的な動物ホルダを示す第１の端面図である。
【図６】図３の革新的な動物ホルダを示す第２の端面図である。
【図７】撮像に最適な特徴を有するベッドと、動物モニタリング計器のためのポートとを含む革新的なホルダを示す図である。
【図８Ａ】本発明により新しく安楽死させた直後の胎仔の形態学的変化を示す図である。
【図８Ｂ】本発明により新しく安楽死させ、次に脱色した後の胎仔の形態学的変化を示す図である。
【図８Ｃ】本発明により新しく安楽死させ、次に脱色し、次に皮膚を剥いた後の胎仔の形態学的変化を示す図である。
【図９Ａ】染色の透過を改善するために切開が行われる胎仔の身体の部位を示す、胸郭肋膜が交互に切開される図の一方である。
【図９Ｂ】染色の透過を改善するために切開が行われる胎仔の身体の部位を示す、胸郭肋膜が交互に切開される図の一方である。
【図９Ｃ】染色の透過を改善するために切開が行われる胎仔の身体の部位を示す、腹膜が切開された図である。
【図９Ｄ】染色の透過を改善するために切開が行われる胎仔の身体の部位を示す、硬膜が切開された図である。
【図１０Ａ】マイクロＣＴ及び発光光学撮像データセットという２つのデータセットの例示的な良好な相互レジストレーションを示す図である。
【図１０Ｂ】マイクロＣＴ及び近赤外線蛍光光学撮像データセットという２つのデータセットの例示的な良好な相互レジストレーションを示す図である。
【図１０Ｃ】ＭＲＩ及びＰＥＴシステムという２つのデータセットの例示的な良好な相互レジストレーションを示す図である。
【図１１Ａ】３つのホースバーブ（１／４”〜５／１６”）を備える革新的な動物ホルダを示す正投影図の上面図である。
【図１１Ｂ】３つのホースバーブ（１／４”〜５／１６”）を備える革新的な動物ホルダを示す正投影図の側面図である。
【図１１Ｃ】３つのホースバーブ（１／４”〜５／１６”）を備える革新的な動物ホルダを示す正投影図の正面図である。
【図１１Ａ】３つのホースバーブ（１／４”〜５／１６”）を備える革新的な動物ホルダを示す正投影図の後面図である。
【図１２Ａ】撮像手順の間に動物を再現可能に位置決めするのを助ける低密度であるが硬質の形態で作られた特注の使い捨てベッドを示す図である。
【図１２Ｂ】異なるモダリティからのデータの相互レジストレーションのための基準点として用いられるマイクロＰＥＴ／マイクロＭＲＩ／マイクロＣＴ／光学モダリティで見える基準マーカの図である。
【図１２Ｃ】本発明による革新的な動物ホルダと共に位置決めされた発泡体ベッドの図である。
【図１２Ｄ】ベッド及びホルダを分離することができない従来の動物ホルダの図である。
【図１２Ｅ】ベッド及びホルダを分離することができない従来のホルダに比べて、動物ベッドがホルダから取外し可能であり、これがベッド及びホルダの分離を可能にする革新的なホルダの図である。
【図１】
2009524826.tif 000003
【図２】
2009524826.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009524826.tif 000009
【図８（Ａ−Ｃ）】
2009524826.tif 000010
【図９（Ａ−Ｂ）】
2009524826.tif 000011
【図９（Ｃ−Ｄ）】
2009524826.tif 000012
【図１０（Ａ−Ｅ）】
2009524826.tif 000013
【図１１（Ａ−Ｄ）】
2009524826.tif 000014
【図１２（Ａ−Ｅ）】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月30日(2008.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全生物体である染色された試料のマイクロＣＴ画像を生成する方法であって、
（ａ）第１の染色剤を含む第１の染色組成物中で試料を培養し、染色された試料を生成する段階、
（ｂ）前記染色された試料を該染色された試料よりも電子密度が低い液体に懸濁する段階、及び
（ｃ）前記染色された試料のマイクロＣＴ画像を生成するために、該染色された試料をＸ線コンピュータ断層撮影スキャナで走査する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試料は、エキソビボ胎芽及びエキソビボ胎仔から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料を第２の染色剤に露出して二重染色試料を生成する段階を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の染色剤は、前記第１の染色組成物中に存在することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の染色剤は、第２の染色組成物中に存在することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の染色剤は、０．１から１．８４重量パーセントの四酸化オスミウム、又は４．５から５．５重量パーセントのリンタングステン酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１又は第２の染色組成物は、カコジラート緩衝液を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の染色組成物又は第２の染色組成物は、有機固定剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記有機固定剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、及びその組合せから成る群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の染色剤は、エチジウムブロマイド、シスプラチン、及びその組合せから成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の染色剤は、細胞又は細胞小器官膜マーカであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の染色剤は、核マーカであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料は、レポーター遺伝子産物を含み、前記第１の染色組成物中で試料を培養する段階は、該レポーター遺伝子産物の存在を示す染色を生成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーター遺伝子産物は、ベータ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料から第２のマイクロＣＴ画像を取得する段階を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
治療的又は調査的手順が、第１のマイクロＣＴ画像を取得した後でかつ前記第２のマイクロＣＴ画像を取得する段階の前に実行されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記エキソビボ胎芽を表現型に関して選別する段階を更に含み、
前記選別する段階は、前記染色エキソビボ胎芽の前記マイクロＣＴ画像を対照エキソビボ胎芽の統計的平均かつ年齢適合アトラスに比較して該画像間の差を判断し、それによって前記エキソビボ胎芽を表現型に関して選別する段階を含む、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記エキソビボ胎芽の前記コンピュータ断層撮影画像は、該エキソビボ胎芽の等値面又は半透明レンダリングを含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エキソビボ胎芽の前記コンピュータ断層撮影画像は、該エキソビボ胎芽の仮想切片を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
複数の試料のマイクロＣＴ画像を生成する方法に用いるための市販パッケージであって、
各チャンバが壁を有する多重チャンバ試料ホルダと、
前記試料ホルダのチャンバに置かれた試料に接触し、チャンバの前記壁に接触しないように該試料を分離し、かつマイクロＣＴ画像を生成するのに用いられる電磁放射線に対して該試料に接触する少なくとも一部分が高度に透過性であるライナと、
を含むことを特徴とするパッケージ。
【請求項２１】
段階（ｃ）の前に、前記試料は、試料ホルダに置かれ、該ホルダは、各チャンバが該チャンバに置かれた該試料を支持するための支持部分を有する壁を有する複数のチャンバと、該試料と接触して該試料が該壁と接触することを防ぎ、かつ該試料と接触する少なくとも一部分が、前記マイクロＣＴ画像を生成するのに用いられる電磁放射線に対して高度に透過性であるライナとを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記壁の少なくとも一部分は、前記マイクロＣＴ画像を生成するのに用いられる電磁放射線に対して実質的に透過性であることを特徴とする請求項２０に記載の多重チャンバ試料ホルダ。
【請求項２３】
マイクロコンピュータ断層撮影画像を収集し、記憶し、かつ検索するためのコンピュータベースの方法であって、
デジタルコンピュータ断層撮影画像を生成する段階と、
コンピュータに付随する集中型データ記憶場所に前記画像を電子的に送信する段階と、
要求に応答して前記画像を前記記憶場所から検索する段階と、
前記要求に応答して前記画像を電子的に表示するか又は第２の場所に電子的に送信する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
段階（ｃ）の前に、前記試料は、試料ホルダに置かれ、該試料ホルダは、支持部分を有する壁と、該壁の該支持部分上に配置され、試料接触部分を有する上部側と、底部側と、該上部側と該底部側の間に延びる厚みとを有し、かつ該上部側の該試料接触部分及び該上部側に隣接する該厚みの部分が、前記走査する段階（ｃ）に用いる電磁放射線に対して高度に透過性である、該試料のためのベッドとを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記壁は、内部容積及び外部を形成し、かつ前記試料を該内部容積に入れるための通路を有することを特徴とする請求項２４に記載の試料ホルダ。
【請求項２６】
前記通路を閉鎖するために前記壁に接触する蓋を更に含むことを特徴とする請求項２４に記載の試料ホルダ。
【請求項２７】
ガス制御システムを更に含むことを特徴とする請求項２４に記載の試料ホルダ。
【請求項２８】
前記壁の少なくとも一部分は、前記走査する段階（ｃ）に用いる電磁放射線に対して実質的に透過性であることを特徴とする請求項２４に記載の試料ホルダ。
【請求項２９】
前記ガス制御システムは、ガスのための通路を形成する前記壁内の閉鎖可能ポート、ガスケット、フィルタ、ガスポンプ、麻酔送出装置、及びその組合せから成る群から選択された構成要素を含むことを特徴とする請求項２８に記載の試料ホルダ。
【請求項３０】
撮像装置内の所定位置に置かれた時に撮像視野に存在する動物ホルダの構成要素と接触する基準又は相互レジストレーションマーカを更に含むことを特徴とする請求項２４に記載の試料ホルダ。
【請求項３１】
前記ベッドの密度は、立方フィートあたり１．８から８ポンドの範囲内であることを特徴とする請求項２４に記載の試料ホルダ。
【請求項３２】
段階（ｃ）の前に、前記試料は、試料ホルダに置かれ、
前記試料ホルダは、前記試料を支持して、前記走査する段階（ｃ）の間それを維持し、かつ支持部分を有する壁と、該壁の該支持部分上に配置され、該試料の少なくとも一部に適合するようになったベッドとを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
第１の撮像データセット及び第２の撮像データセットを該第１及び第２の撮像データセットの両方に対して同じ位置に固定された前記試料から発生させるために段階（ｃ）を繰返す段階と、
前記第１の撮像データセット及び前記第２の撮像データセットの相互レジストレーションを行って複合撮像データセットを生成する段階と、
を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の方法によって取得可能なマイクロＣＴ走査。
【請求項３５】
活性原料として請求項１に記載の染剤を、マイクロＣＴ撮像のための試料染剤としてそれを使用するための指示書と共に含むことを特徴とする市販パッケージ。
【請求項３６】
段階（ｃ）の前に、前記試料は、該試料を支持し、かつ該試料を該走査する段階（ｃ）の間望ましい位置に維持するための試料ホルダに置かれ、該試料ホルダは、支持部分を有する壁と、該壁の該支持部分上に配置され、かつ該試料の少なくとも一部に適合するようになったベッドとを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
実質的に実施例のいずれかにおいて本明細書に説明するような請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
実質的に添付図面を参照して本明細書に説明し、及び／又は添付図面に例示するような請求項２４に記載の試料ホルダ。
【国際調査報告】
2009524826.tif 000016
2009524826.tif 000017
2009524826.tif 000018
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