(57)【要約】  生体試料及び核酸抽出液中に含まれる核酸の増幅を阻害する物質を取り除き、生体試料に含まれる標的核酸の有無及び標的遺伝子の発現量を、酵素を用いた核酸の増幅手段によって簡易かつ正確に評価できるようにすること。本発明は、生体試料に含まれる核酸の増幅に使用する核酸増幅用サンプルの調製方法であって、生体試料に核酸抽出試薬を加えて核酸抽出液を得る抽出ステップと、核酸抽出液をゼオライトに接触させることにより、より高感度の核酸検出を可能とする核酸増幅に適した核酸増幅用サンプルを得る精製ステップと、を備える調製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料に含まれる核酸の増幅に使用する核酸増幅用サンプルの調製方法であって、
前記生体試料に核酸抽出試薬を加えて核酸抽出液を得る抽出ステップと、
前記核酸抽出液をゼオライトに接触させることにより、より高感度の核酸検出を可能とする核酸増幅に適した前記核酸増幅用サンプルを得る精製ステップと、
を備える、調製方法。
【請求項２】
前記核酸抽出試薬は、界面活性剤及び／又はアルカリを含む、請求項１記載の調製方法。
【請求項３】
前記界面活性剤は、アニオン性界面活性剤である、請求項２記載の調製方法。
【請求項４】
前記アニオン性界面活性剤は、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩及びアルキルベンゼン硫酸塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、請求項３記載の調製方法。
【請求項５】
前記アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムである、請求項３記載の調製方法。
【請求項６】
前記抽出ステップは、無機塩添加条件において、前記生体試料に核酸抽出試薬を加えて核酸抽出液を得るステップである、請求項１〜５のいずれか一項記載の調製方法。
【請求項７】
前記精製ステップは、前記核酸抽出液にゼオライトを加えて混合し、遠心分離又は濾過することによってゼオライトを隔離し、前記核酸増幅用サンプルを得るステップである、請求項１〜６のいずれか一項記載の調製方法。
【請求項８】
前記精製ステップは、前記核酸抽出液を前記ゼオライトが充填された除去カラムに通すことによって前記ゼオライトに吸着する物質を除き、前記核酸増幅用サンプルを得るステップである、請求項１〜６のいずれか一項記載の調製方法。
【請求項９】
前記生体試料は、血液、髄液、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻汁又はぬぐい液である、請求項１〜８のいずれか一項記載の調製方法。
【請求項１０】
前記ゼオライトは、プロトン型ゼオライトである、請求項１〜９のいずれか一項記載の調製方法。
【請求項１１】
前記ゼオライトは、結晶構造がモルデナイト型である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の調製方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の調製方法で使用する核酸増幅用サンプルの調製キットであって、
核酸抽出試薬と、ゼオライトと、を備える調製キット。
【請求項１３】
前記核酸抽出試薬は、界面活性剤及び／又はアルカリを含む、請求項１２記載の調製キット。
【請求項１４】
前記界面活性剤は、アニオン性界面活性剤である、請求項１３記載の調製キット。
【請求項１５】
前記ゼオライトは、プロトン型であり、結晶構造がモルデナイト型である、請求項１２〜１４のいずれか一項記載の調製キット。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか一項記載の調製キットを含む、核酸増幅検出用キット。
【請求項１７】
請求項１６記載の核酸増幅検出用キットに含まれる試薬の一部又は全てが乾燥試薬である、核酸増幅検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅用サンプルの調製方法及び調製キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法に代表される核酸増幅技術は、分子生物学や医学を始めとする生物学のあらゆる分野にまで浸透し、例えば、ＤＮＡ鑑定、食品検査、環境衛生検査、動植物検査等においても汎用されている。【０００３】
被検試料が液体の場合は、被検試料をそのまま核酸増幅用サンプルとして標的核酸の増幅に使用される場合があるが、生体試料の場合は、標的とする核酸が細胞内に存在するため、生体試料を細胞溶解液（例えば、アルカリ溶液、界面活性剤）で溶解し、核酸を細胞外に溶出させて、核酸増幅用サンプルを調製する必要がある。【０００４】
例えば、生体試料にドデシル硫酸ナトリウムを含む溶液を加えて加熱することによりタンパク質を変性させたり、水酸化ナトリウム水溶液を加えたりして、細胞膜を破壊して核酸を溶出させ、核酸増幅用サンプルとして使用することとなる。【０００５】
一方、生体試料の中でも、喀痰や唾液は、結核などの肺疾患の診断のために非常に重要な標本であるとされている。【０００６】
しかしながら、喀痰や唾液中に含まれる核酸を安定的に増幅させることは困難な場合が多く、喀痰や唾液中のマイコバクテリウム属菌を検出するには、採取した喀痰や唾液を、水酸化ナトリウム等で液化し、遠心分離してマイコバクテリウム属菌を沈殿として回収し、培養して診断することが一般的である（特許文献１）。【０００７】
また、喀痰や唾液以外であっても、生体試料から核酸増幅用サンプルを調製する場合には、細胞から核酸と共に溶出されたタンパク質、多糖類、脂質等の物質が核酸の増幅反応を部分的又は完全に阻害するため、再現性のない結果が出たり、標的核酸の有無又は発現量を正確に評価できない場合があるのが現状である。【０００８】
さらに、生体試料から核酸増幅用サンプルを調製する際に使用する界面活性剤は、核酸増幅用サンプル中に一定濃度以上含まれていると核酸の増幅反応を部分的又は完全に阻害することがあるため、核酸増幅反応時には、核酸増幅用サンプルを希釈して使用する必要がある。【０００９】
これらのことは、標的核酸を増幅することによって患者を診断し、食品、環境衛生及び動植物等を正しく検査することを著しく困難にするものである。【００１０】
【特許文献１】特開平９−１７３０６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで本発明の目的は、生体試料及び核酸抽出液中に含まれる核酸の増幅を阻害する物質を取り除き、生体試料に含まれる標的核酸の有無及び標的遺伝子の発現量を、酵素を用いた核酸の増幅手段によって簡易かつ正確に評価できるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、生体試料に含まれる核酸の増幅に使用する核酸増幅用サンプルの調製方法であって、生体試料に核酸抽出試薬を加えて核酸抽出液を得る抽出ステップと、核酸抽出液をゼオライトに接触させることにより、より高感度の核酸検出を可能とする核酸増幅に適した核酸増幅用サンプルを得る精製ステップと、を備える調製方法を提供する。【００１３】
ここで「ゼオライト」とは、結晶中に微細孔を有するアルミノ珪酸塩の総称であり、ＳｉＯ４及びＡｌＯ４の正四面体が酸素を共有して結合した三次元網状構造を基本骨格とするものである。ゼオライトは、結晶中に、陽イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、水素イオン等を含んでおり、「プロトン型ゼオライト」とは、結晶中に水素イオンを含むゼオライトのことをいう。また、「結晶構造がモルデナイト型」のゼオライトとは、六角柱状の骨格構造を反影した結晶構造を有するゼオライトのことをいう。なお、上記ゼオライトは、Ｓ／Ａ比（珪素とアルミニウムの存在比）が２０以上のゼオライトが好ましく、Ｓ／Ａ比が３９以上のゼオライトがさらに好ましい。【００１４】
本発明者らは、生体試料及び核酸抽出液に含まれる核酸の増幅を阻害する物質がゼオライトに効果的に吸着するが、核酸の増幅反応の鋳型となる標的核酸自身はゼオライトに吸着しないことを見出した。ここで「吸着」とは、ゼオライトの表面あるいは細孔の中に物質を結合したり包合した状態のことをいう。【００１５】
上記の調製方法によれば、生体試料及び核酸抽出液中に含まれる核酸の増幅を阻害する物質を核酸増幅用サンプルから除去できるため、核酸の増幅が困難とされる生体試料からであっても、標的核酸を再現性よく検出できる核酸増幅用サンプルを調製できる。【００１６】
上記核酸抽出試薬は、界面活性剤及び／又はアルカリを含むことが好ましく、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤であることがさらに好ましい。【００１７】
上記アニオン性界面活性剤は、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩及びアルキルベンゼン硫酸塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であることが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウムであることがさらに好ましい。【００１８】
アニオン性界面活性剤の中でも、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩及びアルキルベンゼン硫酸塩は、生体試料から核酸の抽出効率を高めることができ、ゼオライトによって核酸増幅用サンプルから効率的に除去できる。【００１９】
上記抽出ステップは、無機塩添加条件において、上記生体試料に核酸抽出試薬を加えて核酸抽出液を得るステップであることが好ましい。【００２０】
上記精製ステップは、上記核酸抽出液にゼオライトを加えて混合し、遠心分離又は濾過することによってゼオライトを隔離し、核酸増幅用サンプルを得るステップであることが好ましい。【００２１】
また、上記精製ステップは、上記核酸抽出液をゼオライトが充填された除去カラムに通すことによってゼオライトに吸着する物質、すなわち、より高感度の核酸検出を阻害する物質を除き、核酸増幅用サンプルを得るステップであることが好ましい。より高感度の核酸検出を阻害する物質としては、検体由来の塩、タンパク質等の阻害成分や、抽出試薬由来のアルカリ、界面活性剤、水等が含まれる。【００２２】
ゼオライトが充填された除去カラムを使用すれば、遠心分離によって核酸増幅用サンプルからゼオライトを取り除く工程が不要となるため、核酸増幅用サンプルの調製工程が短縮されると同時に、核酸増幅用サンプルの損失を防ぐことができる。【００２３】
また、上記の核酸増幅用サンプルの調製方法によれば、生体試料が血液、髄液、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻汁又はぬぐい液であっても、粘性を取り除いたり、核酸の増幅を阻害する物質を希釈したりすることなく、核酸の増幅を好適に行える核酸増幅用サンプルを調製できる。【００２４】
上記ゼオライトは、プロトン型ゼオライトであることが好ましく、結晶構造がモルデナイト型であることが好ましい。【００２５】
プロトン型ゼオライトであれば、核酸増幅用サンプルからアニオン性界面活性剤を好適に除去でき、結晶構造がモルデナイト型であれば、核酸増幅用サンプルの脱塩と中和を同時に行うことができる。【００２６】
また本発明は、上記の調製方法で使用する核酸増幅用サンプルの調製キットであって、核酸抽出試薬と、ゼオライトとを備える調製キットを提供する。【００２７】
上記の調製キットによれば、生体試料及び核酸抽出液中に含まれる核酸の増幅を阻害する物質を除去できるため、核酸の増幅が困難な生体試料からであっても、標的核酸を再現性よく検出可能な核酸増幅用サンプルを簡易に調製できる。【００２８】
上記調製キットに含まれる核酸抽出試薬は、界面活性剤及び／又はアルカリを含むことが好ましく、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤であることがさらに好ましい。ゼオライトは、プロトン型のゼオライトであり、結晶構造がモルデナイト型であることが好ましい。【００２９】
ゼオライトがプロトン型であり、かつ、その結晶構造がモルデナイト型であれば、核酸増幅用サンプルからアニオン性界面活性剤を効率的に除去することができ、脱塩と中和も同時に行うことができる。【００３０】
なお、上述した本発明の調整キットは、高感度の核酸検出を可能とする核酸増幅用サンプルを調製できることから、核酸増幅検出用キットの構成試薬として好適に利用でき、核酸増幅検出用キットに含まれる試薬の一部又は全てが乾燥試薬であれば、より高い検出感度を実現でき、遺伝子検査の操作性についても大幅に向上できる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、生体試料及び核酸抽出液中に含まれる核酸の増幅を阻害する物質を核酸増幅用サンプルから除去でき、核酸の増幅が困難とされる生体試料からであっても、標的核酸を再現性よく検出できる核酸増幅用サンプルを調製できる。また本発明によれば、生体試料が血液、髄液、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻汁又はぬぐい液であっても、粘性を取り除いたり、核酸の増幅を阻害する物質を希釈したりすることなく、核酸の増幅を好適に行える核酸増幅用サンプルを調製できる。さらに本発明によれば、核酸増幅用サンプルからアニオン性界面活性剤を好適に除去でき、核酸増幅用サンプルの脱塩と中和を同時に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ゼオライトが充填された除去カラムを示す斜視図である。
【図２】ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）への標的核酸の吸着の有無について調べた結果を示すグラフである。
【図３】ゼオライトによる水酸化ナトリウムの中和作用について調べた結果を示すグラフである。
【図４】ゼオライトによるＳＤＳの除去作用について調べた結果を示すグラフである。
【図５】ゼオライトによる脱塩作用について調べた結果を示すグラフである。
【図６】生体試料の調製及び核酸抽出液の組成が標的核酸の増幅に及ぼす影響について調べた結果を示すグラフである。
【図７】血液からゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）と、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）とを使用して、ＬＡＭＰ法で標的核酸の増幅を行った結果である。
【図８】ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプルのＬＡＭＰ反応液（２５μＬ）への持込量が核酸の増幅反応に及ぼす影響について試験した結果（１）である。
【図９】ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプルのＬＡＭＰ反応液（２５μＬ）への持込量が核酸の増幅反応に及ぼす影響について試験した結果（２）である。
【図１０】ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）と、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）とを使用して、ＰＣＲ法で標的核酸の増幅を行った結果である。
【図１１】ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）と、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）とを使用して、ＲＴ−ＬＡＭＰ法で標的核酸の増幅を行った結果である。
【符号の説明】
【００３３】
１・・・遠心チューブ、３・・・ゼオライト、５・・・カセット、７・・・メンブレン、１０・・・除去カラム。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。【００３５】
本発明の調製方法は、生体試料に含まれる核酸の増幅に使用する核酸増幅用サンプルの調製方法であって、生体試料に核酸抽出試薬を加えて核酸抽出液を得る抽出ステップと、核酸抽出液をゼオライトに接触させることにより、より高感度の核酸検出を可能とする核酸増幅に適した核酸増幅用サンプルを得る精製ステップと、を備えることを特徴としている。【００３６】
ここで「ゼオライト」とは、結晶中に微細孔を有するアルミノ珪酸塩の総称であり、ＳｉＯ４及びＡｌＯ４の正四面体が酸素を共有して結合した三次元網状構造を基本骨格とするものである。ゼオライトは、結晶中に、陽イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、水素イオン等を含んでおり、「プロトン型ゼオライト」とは、結晶中に水素イオンを含むゼオライトのことをいう。また、「結晶構造がモルデナイト型」のゼオライトとは、六角柱状の骨格構造を反影した結晶構造を有するゼオライトのことをいう。なお、上記ゼオライトは、Ｓ／Ａ比（珪素とアルミニウムの存在比）が２０以上のゼオライトが好ましく、Ｓ／Ａ比が３９以上のゼオライトがさらに好ましい。【００３７】
本明細書における「生体試料」とは、生物の細胞、組織又は器官の一部又は全部であって、核酸増幅用サンプルの調製に供される検体のことをいい、生体から直接採取するものの他、水中、土壌中、空気中等の環境から得られるものも含む。また、「核酸増幅用サンプル」とは、標的核酸の増幅反応に使用するために調製されたサンプルであって、標的核酸を含む溶液のことをいう。【００３８】
生体試料としては、例えば、血液、髄液、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻汁又はぬぐい液を挙げることができる。【００３９】
上記抽出ステップでは、生体試料にアニオン性界面活性剤及び／又はアルカリを含む核酸抽出試薬を加えて核酸を抽出することが好ましいが、アニオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩及びアルキルベンゼン硫酸塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であることが好ましい。【００４０】
アルキル硫酸塩としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムを例示でき、アルキルエーテル硫酸塩としては、例えば、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル硫酸ナトリウムを例示でき、アルキルベンゼン硫酸塩としては、例えば、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム、エチルベンゼン硫酸ナトリウム、ブチルベンゼン硫酸ナトリウムを例示でき、ドデシル硫酸ナトリウムであることが好ましい。【００４１】
アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、アンモニア水を挙げることができ、水酸化ナトリウムであることが特に好ましい。【００４２】
上記抽出ステップの手順は、当業者であれば容易に実施することができるボイリング法又はアルカリ溶解法に準じて行えばよい。【００４３】
具体的には、ボイリング法では、生体試料をマイクロチューブに入れ、生体試料が液体（血液、髄液、尿、糞便懸濁液、喀痰、唾液、鼻汁又はぬぐい液等））の場合には、直接、アニオン性界面活性剤を含む核酸抽出試薬を加えて１５分間煮沸するか、９５℃のヒーティングブロック中で１０〜１５分間静置（以下、加熱処理）をすればよい。生体試料が固体（組織又は臓器等）の場合には、例えば、生体試料の入ったマイクロチューブに等量の滅菌水を加え、凍結融解を迅速に数回繰り返したり、ピペットやスパーテルで物理的にほぐしたりした後に、アニオン性界面活性剤を含む核酸抽出試薬を加えて、そのまま加熱処理をすればよい。また、生体試料を滅菌水、緩衝液等に懸濁した懸濁液に核酸抽出試薬を加えて、後の処理に呈してもよい。【００４４】
なお、抽出が容易な生体試料の場合には、アニオン性界面活性剤を含む核酸抽出試薬を加えることなく、滅菌水を加えて加熱処理をすればよい。【００４５】
一方、アルカリ溶解法では、生体試料をマイクロチューブに入れ、生体試料が液体の場合には、直接、アルカリを含む核酸抽出試薬を加えて、細胞が溶解するまで、ボルテックスを使用して攪拌し、引き続き、加熱処理をすればよい。【００４６】
生体試料が固体の場合には、上記と同様に、生体試料の入ったマイクロチューブに等量の滅菌水を加え、凍結融解を迅速に数回繰り返したり、ピペットやスパーテルで物理的にほぐしたりした後に、アルカリを含む核酸抽出試薬を加えて、組織又は臓器が溶解するまでボルテックスを使用して攪拌し、その後、加熱処理をすればよい。【００４７】
その際、抽出効率を上げるために、アルカリを含む核酸抽出試薬にアニオン性界面活性剤を加えて、生体試料から核酸の抽出を行ってもよい。【００４８】
上記抽出ステップでは、無機塩添加条件において、生体試料に核酸抽出試薬を加えて核酸抽出液を得ることが好ましい。無機塩添加条件とは、無機塩を含む緩衝液等の溶液を用いて生体試料を希釈したり、無機塩を含む核酸抽出試薬を用いたり、又は、これら両方の操作を組み合わせることにより、核酸を抽出するための生体試料−核酸抽出試薬の混合液に無機塩が添加された条件を指す。生体試料から核酸を抽出する手順としては、上記の方法を、無機塩を添加した条件にて行うことができる。【００４９】
無機塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩が例示でき、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が特に好ましい。また、無機塩の添加量は、生体試料−核酸抽出試薬の混合液中の終濃度として５〜１００ｍＭが好ましく、１５〜３０ｍＭがより好ましい。【００５０】
上記精製ステップでは、上記核酸抽出液をゼオライトに接触させ、核酸抽出液からゼオライトに吸着する物質を除去するが、ゼオライトは、プロトン型ゼオライトであることが好ましく、結晶構造がモルデナイト型であることがさらに好ましい。ここで「吸着」とは、ゼオライトの表面あるいは細孔の中に物質を結合したり包合した状態のことをいう。【００５１】
ここで「ゼオライト」とは、結晶中に微細孔を有するアルミノ珪酸塩の総称であり、ＳｉＯ４及びＡｌＯ４の正四面体が酸素を共有して結合した三次元網状構造を基本骨格とするものである。ゼオライトは、結晶中に、陽イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、水素イオン等を含んでおり、「プロトン型ゼオライト」とは、結晶中に水素イオンを含むゼオライトのことをいう。また、「結晶構造がモルデナイト型」のゼオライトとは、六角柱状の骨格構造を反影した結晶構造を有するゼオライトのことをいう。なお、上記ゼオライトは、Ｓ／Ａ比（珪素とアルミニウムの存在比）が２０以上のゼオライトが好ましく、Ｓ／Ａ比が３９以上のゼオライトがさらに好ましい。【００５２】
上記精製ステップでは、第一の実施形態として、上記核酸抽出液にゼオライトを加えて混合し、遠心分離又は濾過することによってゼオライトを隔離し、核酸増幅用サンプルを得るステップを例示できる。この操作により、ゼオライトに吸着する物質を核酸抽出液から除去でき、得られた溶液を核酸増幅用サンプルとして使用できる。【００５３】
また、上記精製ステップでは、第二の実施形態として、上記核酸抽出液をゼオライトが充填された除去カラムに通すことによってゼオライトに吸着する物質を除き、核酸増幅用サンプルを得るステップを例示できる。この操作により、より高感度の核酸検出を阻害する物質を核酸抽出液から除去でき、除去カラムから溶出された溶液を核酸増幅用サンプルとして使用できる。【００５４】
より高感度の核酸検出を阻害する物質としては、検体由来の塩等の阻害成分や、抽出試薬由来のアルカリ、界面活性剤、水等が含まれる。【００５５】
図１は、ゼオライトが充填された除去カラムを示す斜視図である。【００５６】
除去カラム１０は、遠心チューブ１にゼオライト３を充填したカセット５が装着されたものである。カセット５は、遠心チューブの開口部と底部の間の中央付近に、遠心チューブ１に密着するように固定されており、遠心チューブ１の開口部からアプライされた上記核酸抽出液は、カセット５に充填されたゼオライトに必ず接触するような構造となっている。【００５７】
カセット５の底部には、メンブレン７があり、除去カラム１０を遠心分離機で遠心した場合であっても、ゼオライト３はカセット５の中に止まり、遠心チューブ１の底部に落下することはないように設計されている。メンブレン７としては、例えば、濾紙、ガラスファイバー、パルプ製不織布、レーヨン、合成繊維、フッ素樹脂等を例示できる。ゼオライト３の充填量は、生体試料が１００μＬ以下の場合には約３００ｍｇでよく、生体試料の種類や量に応じて適宜調整すればよい。【００５８】
除去カラム１０を使用して、ゼオライト３に吸着する物質を上記核酸抽出液から除去するには、上記核酸抽出液を除去カラム１０にアプライして、自然落下するのを待つ方法と、除去カラムを遠心分離機にかけて遠心する方法を例示でき、いずれの方法であっても、ゼオライト３に吸着する物質が除去された核酸増幅用サンプルを、除去カラム１０の底部に得ることができる。【００５９】
本発明の核酸増幅用サンプルの調製方法に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングして、核酸増幅用サンプルの調製キット又は核酸増幅検出用キットとして利用できる。すなわち、アニオン性界面活性剤及び／又はアルカリを含む核酸抽出試薬と、ゼオライトとを備えることを特徴とした核酸増幅用サンプルの調製キット又は核酸増幅検出用キットを提供できる。【００６０】
アニオン性界面活性剤、アルカリ及びゼオライトの具体例については、上記の通りである。【００６１】
また、上記ゼオライトは、プロトン型であり、結晶構造がモルデナイト型であることが好ましく、ゼオライトの代わりに上記の除去カラム１０をパッケージングしたキットとすることもできる。【００６２】
さらに、各キットに含まれる試薬の一部又は全てをその必要量だけ凍結乾燥して乾燥試薬として提供すれば、より高い検出感度を実現でき、遺伝子検査の操作性についても大幅に向上させることができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６４】
（実施例１）：ゼオライトへの標的核酸の吸着の有無について
生体試料から調製した核酸抽出液に含まれる核酸の増幅反応を阻害する物質（核酸増幅阻害物質）をゼオライトで除去するためには、鋳型となる標的核酸がゼオライトに吸着しないことが前提となる。そこで、鋳型となる標的核酸がゼオライトに吸着するか否かについて３種類のゼオライトを用いて試験した。【００６５】
まず、マイクロチューブに８０μＬの滅菌水と１００μＬの２×核酸抽出試薬（０．４Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ）を加えて９５℃で１５分間加熱し、室温に５分間放置することにより冷却し、そこに２０μＬの標的核酸溶液を加えた。標的核酸溶液には、培養した結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ株）から抽出したゲノムＤＮＡ溶液（１００コピー／μＬ）を用いた。【００６６】
その後、標的核酸溶液が加えられたマイクロチューブに、３００ｍｇの水懸濁ゼオライトを添加して転倒混和し、室温で５分間静置後、スピンダウンして得られた上清を核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）とし、その１０μＬを用いてＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。使用したゼオライトは、ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ（プロトン型、モルデナイト型；東ソー社）、ＨＳＺ−９４０ＨＯＡ（プロトン型、ベータ型；東ソー社）及びＨＳＺ−９８０ＨＯＡ（プロトン型、ベータ型；東ソー社）の３種類であり、それぞれのゼオライトについて試験した。【００６７】
その際、標的核酸溶液の代わりに等量の滅菌水を添加して調製した核酸増幅用サンプル（ネガティブコントロール）及び１μＬの標的核酸溶液に９μＬの滅菌水を加えたのみの核酸増幅用サンプル（１００コピーのゲノムＤＮＡ含有；ポジティブコントロール）についても、同様にＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【００６８】
ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅には、以下のプライマーセットを用い、以下の組成からなるＬＡＭＰ反応液中で、６７℃で６０分間静置することにより行い、標的核酸の増幅に伴って増加する濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）をリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ−２００；Ｔｅｒａｍｅｃｓ社）で測定した。【００６９】
＜Ｍ.  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＧｙｒａｓｅ  Ｂ遺伝子を標的核酸とするＬＡＭＰ法用のプライマーセット＞
Ｇｙｒａｓｅ  Ｂ  ＦＩＰプライマー：５’−ｇｃｇｇｔｔｇａｔｇｔｇｔｔｔｃａｃｇｃａｃａａａｇｔｔａａｇａｇｃｃｇ−３’（配列番号１）
Ｇｙｒａｓｅ  Ｂ  ＢＩＰプライマー：５’−ｇｃｇａｔｔｃａｔａｇｃａｇｃａｔｃｇｔｔｃｃａｔｔｇｃａｔｃｇｃｇａｔｃｔｃｃａｃ−３’（配列番号２）
Ｇｙｒａｓｅ  Ｂ  Ｆ３プライマー：５’−ｃｇｃａｇｃｃｇａａｔｃｃａｃｔ−３’（配列番号３）
Ｇｙｒａｓｅ  Ｂ  Ｂ３プライマー：５’−ｃｇａｃｔｃｃｇａａｔａｃｃｃｇｇ−３’（配列番号４）
Ｇｙｒａｓｅ  Ｂ  ＬＦプライマー：５’−ｇａａｇｔｃｃａｃｃａｇｇｃｃ−３’（配列番号５）
Ｇｙｒａｓｅ  Ｂ  ＬＢプライマー：５’−ｔｔｔｃｃｇｇｃａａｇｇｇｃａｃｃ−３’（配列番号６）【００７０】
＜ＬＡＭＰ反応液の組成（２５μＬ）＞
所定量の核酸増幅用サンプル
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）
１０ｍＭ  ＫＣｌ
１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
５．６ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
１．６μＭ  ＦＩＰプライマー
１．６μＭ  ＢＩＰプライマー
０．４μＭ  Ｆ３プライマー
０．４μＭ  Ｂ３プライマー
０．８μＭ  ＬＦプライマー
０．８μＭ  ＬＢプライマー
１６Ｕ  Ｂｓｔポリメラーゼ
１μＬ  ＦＤ（カルセイン）
１．６％  デキストランＴ４０【００７１】
図２は、ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）への標的核酸の吸着の有無について調べた結果を示すグラフである。縦軸は、ＬＡＭＰ反応液の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）、横軸は反応時間を示している。【００７２】
その結果、ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）を添加して調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）における標的核酸の増幅の開始時間は、ポジティブコントロールと同じであり、ゼオライトで処理することによって、標的核酸の増幅の開始時間が影響を受けることはなかった。なお、この結果は、ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ（プロトン型、モルデナイト型；東ソー社）、ＨＳＺ−９４０ＨＯＡ（プロトン型、ベータ型；東ソー社）及びＨＳＺ−９８０ＨＯＡ（プロトン型、ベータ型；東ソー社）のいずれのゼオライトを使用した場合であってもほとんど同じであり、使用したゼオライトの種類によって標的核酸の増幅の開始時間が影響を受けることはなかった。【００７３】
一方、標的核酸溶液の代わりに等量の滅菌水を添加して調製した核酸増幅用サンプル（ネガティブコントロール）を使用した場合には、反応時間の６０分間を通し、標的核酸の増幅は認められなかった。【００７４】
以上の結果より、核酸増幅用サンプル中の核酸はゼオライトにほとんど吸着しないことが明らかとなった。【００７５】
（実施例２）：ゼオライトによる核酸抽出試薬のアルカリ中和作用及びアニオン性界面活性剤の除去作用
次に、ゼオライト処理によって核酸抽出試薬由来の核酸増幅阻害物質を除去できるかどうかについて調べた。【００７６】
まず、ゼオライト処理によって核酸抽出試薬に含まれるアルカリを中和できるかどうかについて調べるため、０．２〜０．４Ｍの水酸化ナトリウムを含む以下の６種類の溶液（サンプルＮｏ．１〜６）に３００ｍｇの水懸濁ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）を添加して転倒混和し、スピンダウンして得られる上清のｐＨ（ゼオライト処理後のｐＨ）を測定し、ゼオライト処理をする前のｐＨ（ゼオライト処理前のｐＨ）と比較した。【００７７】
＜０．２〜０．４Ｍの水酸化ナトリウムを含む以下の６種類の溶液の組成＞
サンプルＮｏ．１：０．４Ｍ  ＮａＯＨ
サンプルＮｏ．２：０．４Ｍ  ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳ
サンプルＮｏ．３：０．４Ｍ  ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ
サンプルＮｏ．４：０．２Ｍ  ＮａＯＨ
サンプルＮｏ．５：０．２Ｍ  ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳ
サンプルＮｏ．６：０．２Ｍ  ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ【００７８】
図３は、ゼオライトによる水酸化ナトリウムの中和作用について調べた結果を示すグラフである。縦軸はｐＨ、横軸はサンプルＮｏ．を示し、白丸はゼオライト処理前のｐＨ、黒丸はゼオライト処理後のｐＨを示している。【００７９】
その結果、ゼオライト処理により、０．２〜０．４Ｍの水酸化ナトリウムを含む６種類の溶液のｐＨは中性付近（ｐＨ７〜８）まで低下することが明らかとなり、このｐＨの低下には、０．５％ＳＤＳや７５ｍＭ  ＮａＣｌによる影響をほとんど受けないことが判明した。【００８０】
以上の結果より、ゼオライトには、核酸抽出試薬に含まれるアルカリを中和する作用があることが示唆された。【００８１】
次に、ゼオライト処理によって核酸抽出試薬に含まれるドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）を除去できるかどうかについて調べるため、マイクロチューブに８０μＬの滅菌水と、１００μＬの０．２％ＳＤＳ溶液又は７５ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．２％ＳＤＳ溶液を加えて９５℃で１５分間加熱し、室温に５分間放置することにより冷却し、そこに２０μＬの標的核酸溶液を加えた。標的核酸溶液には、培養した結核菌（Ｍ.  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ株）から抽出したゲノムＤＮＡ溶液（１００コピー／μＬ）を用いた。【００８２】
その後、標的核酸溶液が加えられたマイクロチューブに、３００ｍｇの水懸濁ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）を添加して転倒混和し、室温で５分間静置後、スピンダウンして得られた上清を核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）とし、その１２．５μＬを用いてＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【００８３】
その際、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）、標的核酸溶液の代わりに等量の滅菌水を添加して調製した核酸増幅用サンプル（ネガティブコントロール）及び１μＬの標的核酸溶液に９μＬの滅菌水を加えたのみの核酸増幅用サンプル（１００コピーのゲノムＤＮＡ含有；ポジティブコントロール）についても、同様にＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【００８４】
ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅は、実施例１で使用した配列表の配列番号１〜６の塩基配列からなるプライマーのセットを用い、実施例１で示した組成のＬＡＭＰ反応液中で、６７℃で９０分間静置することにより行い、標的核酸の増幅に伴って増加する濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）をリアルタイムで測定した。【００８５】
図４は、ゼオライトによるＳＤＳの除去作用について調べた結果を示すグラフである。
図４（ａ）は、０．１％ＳＤＳを含む溶液に標的核酸溶液を加えて標的核酸の増幅を行った結果であり、図４（ｂ）は、７５ｍＭ  ＮａＣｌと０．１％ＳＤＳを含む溶液に標的核酸溶液を加えて標的核酸の増幅を行った結果である。縦軸は、ＬＡＭＰ反応液の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）、横軸は反応時間を示している。【００８６】
その結果、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）を使用した場合には、標的核酸の増幅は認められないものの、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）を使用した場合には標的核酸の増幅が認められ、標的核酸の増幅の開始時間は、ポジティブコントロールと同じ時間であった。なお、この結果は、７５ｍＭ  ＮａＣｌと０．１％ＳＤＳを含む溶液に標的核酸溶液を加えて標的核酸の増幅を行った場合もほとんど同じであった。【００８７】
一方、標的核酸溶液の代わりに等量の滅菌水を添加して調製した核酸増幅用サンプル（ネガティブコントロール）を使用した場合には、反応時間の９０分間を通し、標的核酸の増幅は認められなかった。【００８８】
以上の結果より、ゼオライトには核酸抽出試薬に含まれるＳＤＳを除去する作用があり、アニオン性界面活性剤を除去する作用があることが示唆された。【００８９】
（実施例３）：ゼオライトによる脱塩作用
ゼオライト処理によって生体試料から抽出した核酸抽出液に含まれるＮａＣｌを除去できるかどうかについて検討した。【００９０】
まず、マイクロチューブに５００μＬの生理食塩水を加えて９５℃で１５分間加熱し、室温に５分間放置することにより冷却し、そこに２０μＬの標的核酸溶液を加えた。標的核酸溶液には、培養した結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ株）から抽出したゲノムＤＮＡ溶液（１００コピー／μＬ）を用いた。【００９１】
その後、標的核酸溶液が加えられたマイクロチューブに、３００ｍｇの水懸濁ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）を添加して転倒混和し、室温で５分間静置後、スピンダウンして得られた上清を核酸増幅用サンプルとし、その１２．５μＬを用いてＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【００９２】
その際、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）、標的核酸溶液の代わりに等量の滅菌水を添加して調製した核酸増幅用サンプル（ネガティブコントロール）及び１μＬの標的核酸溶液に９μＬの滅菌水を加えたのみの核酸増幅用サンプル（１００コピーのゲノムＤＮＡ含有；ポジティブコントロール）についても、同様にＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【００９３】
ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅は、実施例１で使用した配列表の配列番号１〜６の塩基配列からなるプライマーのセットを用い、実施例１で示した組成のＬＡＭＰ反応液中で、６７℃で６０分間静置することにより行い、標的核酸の増幅に伴って増加する濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）をリアルタイムで測定した。【００９４】
図５は、ゼオライトによる脱塩作用について調べた結果を示すグラフである。縦軸は、ＬＡＭＰ反応液の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）、横軸は反応時間を示している。【００９５】
その結果、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）を使用した場合には、ポジティブコントロールと比べて、標的核酸の増幅の開始時間が２０分遅れたのに対し、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）を使用した場合には、標的核酸の増幅の開始時間の遅れは１０分以内に止まった。【００９６】
一方、標的核酸溶液の代わりに等量の滅菌水を添加して調製した核酸増幅用サンプル（ネガティブコントロール）を使用した場合には、反応時間の６０分間を通し、標的核酸の増幅は認められなかった。【００９７】
以上の結果より、ゼオライトには、核酸抽出試薬及び生体試料に含まれるＮａＣｌを除去する作用、すなわち脱塩作用があることが明らかとなった。このことは、生体試料に由来するＮａＣｌが核酸の増幅反応を阻害することを理由に、核酸の増幅反応液中に持ち込める量に制限のあった核酸増幅用サンプルであっても、その制限を越えて核酸増幅反応に持ち込めることを示唆している。【００９８】
（実施例４）：生体試料の調製及び核酸抽出処理が標的核酸の増幅に及ぼす影響
血液を含む生体試料から核酸増幅用サンプルを調製して標的核酸を増幅させる場合におけるゼオライト処理の前処理の効果について試験した。具体的には、ゼオライト処理の前処理として、生体試料の調製及び核酸抽出処理の条件を検討した。生体試料及び核酸抽出液としては、以下に示す１２種類の生体試料及び３種類の核酸抽出液を用い、これらの組み合わせ３６通りについてＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【００９９】
＜生体試料の懸濁液＞
３種類のベース、すなわち、滅菌水、３倍希釈生理食塩水（１／３生理食塩水）及び生理食塩水に全血０〜３０％をそれぞれ懸濁し、以下の組成の１２種類の生体試料の懸濁液、及び、全血を含まないコントロールサンプルを調製した。
全血を含まない滅菌水
全血１０％を含む滅菌水
全血２０％を含む滅菌水
全血３０％を含む滅菌水
全血を含まない１／３生理食塩水
全血１０％を含む１／３生理食塩水
全血２０％を含む１／３生理食塩水
全血３０％を含む１／３生理食塩水
全血を含まない生理食塩水
全血１０％を含む生理食塩水
全血２０％を含む生理食塩水
全血３０％を含む生理食塩水【０１００】
＜核酸抽出試薬＞
核酸抽出試薬として、塩化ナトリウム濃度の異なる以下の３種類（核酸抽出試薬Ａ〜Ｃ）を作製した。ｐＨ指示薬としてチモールブルーを添加した。
核酸抽出試薬Ａ：１７４ｍＭ  ＮａＯＨ、  ０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０００４６％  チモールブルー
核酸抽出試薬Ｂ：１７４ｍＭ  ＮａＯＨ、  ５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０００４６％  チモールブルー
核酸抽出試薬Ｃ：１７４ｍＭ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０００４６％  チモールブルー【０１０１】
まず、マイクロチューブに１００μＬの各種生体試料の懸濁液と９００μＬの各種核酸抽出試薬を加えて９５℃で１５分間加熱し、室温に５分間放置することにより冷却し、そこに１μＬの標的核酸溶液を加えた。標的核酸溶液には、培養した結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ株）から抽出したゲノムＤＮＡ溶液（１００コピー／μＬ）を用いた。【０１０２】
その後、標的核酸溶液が加えられたマイクロチューブに、４００ｍｇ／ｍＬとなるように水懸濁ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）を添加して転倒混和し、室温で５分間静置後、スピンダウンして得られた上清を核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）とし、その３０μＬを用いてＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【０１０３】
その際、標的核酸溶液の代わりに等量の滅菌水を添加して調製した核酸増幅用サンプル（ネガティブコントロール）及び１μＬの標的核酸溶液に９μＬの滅菌水を加えたのみの核酸増幅用サンプル（１００コピーのゲノムＤＮＡ含有；ポジティブコントロール）についても、同様にＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【０１０４】
ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅は、実施例１で使用した配列表の配列番号１〜６の塩基配列からなるプライマーのセットを用い、実施例１で示した組成のＬＡＭＰ反応液中で、６７℃で６０分間静置することにより行い、標的核酸の増幅に伴って増加する濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）をリアルタイムで測定した。【０１０５】
図６は、生体試料の調製及び核酸抽出液の組成が標的核酸の増幅に及ぼす影響について調べた結果を示すグラフである。縦軸は、ＬＡＭＰ反応液の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）が０．１に到達するまでの時間（分）（Ｔｔ値）を示している。ＮＤは、濁度の増加が検出されなかったことを意味している。横軸は、生体試料中の血液添加量（％）を示している。【０１０６】
その結果、核酸抽出試薬Ａを用いた条件において、生体試料として全血１０〜３０％を含む滅菌水を用いた場合、ポジティブコントロールと比べて、標的核酸の増幅の開始時間が１０〜５０分遅れ、血液添加量依存的に標的核酸の増幅が阻害された。一方、生体試料のベースとして生理食塩水を用いた場合には、滅菌水を用いた場合に比べ、標的核酸の増幅の開始時間の遅れが低減された。【０１０７】
また、いずれの全血を含む生体試料においても、ＮａＣｌ濃度が５ｍＭの核酸抽出液（Ｂ）、又は、１０ｍＭの核酸抽出液（Ｃ）を用いた場合、ＮａＣｌ濃度が０ｍＭの核酸抽出液（Ａ）を用いた場合に比べて、標的核酸の増幅の開始時間の遅れが低減された。標的核酸の増幅の開始時間の遅れを低減する効果は、核酸抽出液Ｂよりも核酸抽出液Ｃが顕著であった。【０１０８】
ＬＡＭＰ反応液後の反応溶液の蛍光強度を比較したところ、核酸抽出液Ａを用いた場合では、生体試料として全血１０％を含む生理食塩水を用いた場合に全血を含まないものと同等の蛍光強度を検出することができた。また、生体試料として全血２０％を含む生理食塩水を用いた場合に全血を含まないものよりも蛍光強度が弱いものの陽性と判定することができた。【０１０９】
核酸抽出液Ｂを用いた場合では、生体試料として全血１０％を含む生理食塩水、及び、全血２０％を含む生理食塩水を用いた場合に全血を含まないものと同等の蛍光強度を検出することができた。また、生体試料として全血１０％を含む滅菌水、及び、全血１０％を含む１／３生理食塩水を用いた場合に全血を含まないものよりも蛍光強度が弱いものの陽性と判定することができた。【０１１０】
核酸抽出液Ｃを用いた場合では、生体試料として全血１０％を含む滅菌水、全血１０％を含む１／３生理食塩水、全血１０％を含む生理食塩水、及び、全血２０％を含む生理食塩水を用いた場合に全血を含まないものと同等の蛍光強度を検出することができた。また、生体試料として全血２０％を含む１／３生理食塩水、及び、全血３０％を含む生理食塩水を用いた場合に全血を含まないものよりも蛍光強度が弱いものの陽性と判定することができた。【０１１１】
また、ゼオライト処理後の核酸増幅用サンプル、及び、ゼオライト処理前の核酸増幅用サンプル（生体試料のベース：滅菌水、核酸抽出液Ａ）について、タンパク質量を測定した結果を表１に示す。【０１１２】
【表１】
2009060847.tif 000002
【０１１３】
その結果、ゼオライトには、生体試料中のタンパク質を除去する作用、すなわち、除タンパク質作用があることが明らかとなった。用いた生体試料のベースを比較した場合、滅菌水よりも、１／３生理食塩水を用いた方が、除タンパク質作用が強く、また、生理食塩水を用いた場合に最も強い除タンパク質効果を示した。また、用いた核酸抽出液を比較した場合、ＮａＣｌ濃度が０ｍＭの核酸抽出液（Ａ）よりも、ＮａＣｌ濃度が５ｍＭの核酸抽出液（Ｂ）を用いた方が、除タンパク質作用が強く、また、ＮａＣｌ濃度が１０ｍＭの核酸抽出液（Ｃ）を用いた場合に最も強い除タンパク質効果を示した。【０１１４】
以上の結果より、ＮａＣｌ濃度が生理食塩水の１／３〜１／１である生体試料（又は生体試料の懸濁液）を用いる場合、ＮａＣｌ存在下において核酸抽出処理を行い、その後ゼオライト処理することによって血液由来の核酸増幅阻害作用を低減できることが明らかとなった。また、ゼオライトには、除タンパク質作用があることが明らかとなった。この除タンパク質作用に関し、ゼオライト処理の前処理、つまり、生体試料の調整及び／又は核酸抽出処理においてＮａＣｌを含む溶液を用いた場合に、より高い効果が得られることがわかった。さらに、実施例３においても明らかなように、ゼオライトには脱塩作用があるため、核酸抽出試薬及び生体試料に含まれるＮａＣｌの核酸増幅阻害作用を低減できる。【０１１５】
これらの結果は、血液由来の核酸増幅阻害物質により、核酸の増幅反応液中に持ち込める量に制限のあった血液を含む生体試料であっても、その制限を越えて核酸増幅反応に使用できることを示唆している。【０１１６】
（実施例５）：ＬＡＭＰ法による加熱処理血液中の標的核酸の増幅に及ぼすゼオライト処理の効果
ゼオライトには、生体試料から調製された核酸増幅用サンプルに含まれる核酸増幅阻害物質を除去する作用のあることが明らかとなったので、血液から核酸増幅用サンプルを調製して標的核酸を増幅させる場合におけるゼオライト処理の効果について試験した。【０１１７】
まず、マイクロチューブに被験者から採取した血液（７５μＬ）と７５μＬの０．０２５％  ＳＤＳを加えて９５℃で５分間加熱し、氷中で冷却後、小型卓上遠心機（商品名：プチはち；和研薬社）で１分間遠心分離して上清を回収した。その後、得られた上清の２０μＬに２０ｍｇの水懸濁ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）を添加して転倒混和し、室温で５分間静置後、スピンダウンして得られた上清の１０μＬに１０４コピーのλＤＮＡ（タカラバイオ社）を加え、この溶液を核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）として、ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【０１１８】
その際、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）及び滅菌水に１０４コピーのλＤＮＡを加えたのみの核酸増幅用サンプル（ポジティブコントロール）についても、同様にＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【０１１９】
ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅には、以下のプライマーセットを用い、以下の組成からなるＬＡＭＰ反応液中で、６７℃で６０分間静置することにより行い、標的核酸の増幅に伴って増加する蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）をリアルタイムで測定した。【０１２０】
＜λＤＮＡを標的核酸とするＬＡＭＰ法用のプライマーセット＞
λＤＮＡ  ＦＩＰプライマー：５’−ａｇｇｃｃａａｇｃｔｇｃｔｔｇｃｇｇｔａｇｃｃｇｇａｃｇｃｔａｃｃａｇｃｔｔｃｔ−３’（配列番号７）
λＤＮＡ  ＢＩＰプライマー：５’−ｃａｇｇａｃｇｃｔｇｔｇｇｃａｔｔｇｃａｇａｔｃａｔａｇｇｔａａａｇｃｇｃｃａｃｇｃ−３’（配列番号８）
λＤＮＡ  Ｆ３プライマー：５’−ａａａａｃｔｃａａａｔｃａａｃａｇｇｃｇ−３’（配列番号９）
λＤＮＡ  Ｂ３プライマー：５’−ｇａｃｇｇａｔａｔｃａｃｃａｃｇａｔｃａ−３’（配列番号１０）
λＤＮＡ  ＬＦプライマー：５’−ａｇｇｃａｔｃｃｃａｃｃａａｃｇｇｇａａ−３’（配列番号１１）【０１２１】
＜ＬＡＭＰ反応液の組成（２５μＬ）＞
所定量の核酸増幅用サンプル
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）
１０ｍＭ  ＫＣｌ
１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
５．６ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
１．６μＭ  ＦＩＰプライマー
１．６μＭ  ＢＩＰプライマー
０．４μＭ  Ｆ３プライマー
０．４μＭ  Ｂ３プライマー
０．８μＭ  ＬＦプライマー
８Ｕ  Ｂｓｔポリメラーゼ
０．２５μｇ／ｍＬ  オキサゾールイエロー【０１２２】
図７は、血液からゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）と、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）とを使用して、ＬＡＭＰ法で標的核酸の増幅を行った結果である。縦軸は、標的核酸の増幅に伴って増加するＬＡＭＰ反応液中の蛍光強度を、横軸は反応時間を示している。【０１２３】
その結果、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）では、標的核酸の増幅は認められるものの、ポジティブコントロールと比較して、標的核酸の増幅開始時間が約５分遅れ、標的核酸の増幅が顕著に阻害されていた。【０１２４】
一方、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）では、標的核酸の増幅の開始時間は、ポジティブコントロールと同じであり、標的核酸の増幅が阻害されることはなかった。【０１２５】
以上の結果より、血液から核酸増幅用サンプルを調製する際にゼオライトで処理すれば、血液由来の核酸増幅阻害物質及び核酸の抽出のために添加したＳＤＳが除去され、これらの物質による標的核酸の増幅を阻害する作用を取り除けることが明らかとなった。【０１２６】
（実施例６）：核酸増幅反応液への核酸増幅用サンプルの持込量の検討
ゼオライトには、生体試料から調製された核酸増幅用サンプルに含まれる核酸増幅阻害物質を除去する作用のあることが明らかとなったので、喀痰から調製した核酸増幅用サンプルを核酸増幅反応液の体積に対してどの程度まで持ち込めるかについて試験した。【０１２７】
まず、マイクロチューブに被験者から採取した喀痰（１００μＬ）と１００μＬの２×核酸抽出試薬（０．４Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ）を加えて９５℃で１５分間加熱し、室温に５分間放置することにより冷却し、そこに２０μＬの標的核酸溶液を加えた。標的核酸溶液には、培養した結核菌（Ｍ.  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ株）から抽出したゲノムＤＮＡ溶液（１００コピー／μＬ）を用いた。【０１２８】
その後、標的核酸溶液が加えられたマイクロチューブに、３００ｍｇの水懸濁ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）を添加して転倒混和し、室温で５分間静置後、スピンダウンして得られた上清を核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）とし、その１０、１２．５、１５、１７．５又は２０μＬを用いてトータルで２５μＬのＬＡＭＰ反応液として、ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【０１２９】
その際、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）の１０μＬ及び１μＬの標的核酸溶液に９μＬの滅菌水を加えたのみの核酸増幅用サンプル（１００コピーのゲノムＤＮＡ含有；ポジティブコントロール）の１０μＬについても、同様にＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【０１３０】
ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅は、実施例１で使用した配列表の配列番号１〜６の塩基配列からなるプライマーのセットを用い、実施例１で示した組成のＬＡＭＰ反応液中で６０分間静置することにより行い、標的核酸の増幅に伴って増加する濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）をリアルタイムで測定した。【０１３１】
図８は、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプルのＬＡＭＰ反応液（２５μＬ）への持込量が核酸の増幅反応に及ぼす影響について試験した結果（１）である。縦軸は、ＬＡＭＰ反応液の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）が０．１に到達するまでの時間（分）（Ｔｔ値）を示している。ＮＤは、濁度の増加が検出されなかったことを意味している。【０１３２】
その結果、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）を１０μＬ使用した場合には、標的核酸の増幅は認められなかったが、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）の場合には、２５μＬのＬＡＭＰ反応液中に２０μＬの核酸増幅用サンプルを持ち込んだ場合であっても標的核酸の増幅は認められ、ポジティブコントロールのＴｔ値が約１２分であるのに対し、ゼオライト処理サンプルのＴｔ値は約１８分程度であり、両者に大きな差は認められなかった。【０１３３】
そこで次に、核酸増幅用サンプルと硫酸アンモニウム以外のＬＡＭＰ反応液に含まれる成分のすべてを凍結乾燥し、そこに上記のゼオライト処理サンプルを２５μＬ添加してＬＡＭＰ反応を行い、標的核酸の増幅に伴って増加する濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）をリアルタイムで測定した。【０１３４】
その際、標的核酸溶液の代わりに等量の滅菌水を添加して調製した２５μＬの核酸増幅用サンプル（ネガティブコントロール）又は１μＬの標的核酸溶液に２４μＬの滅菌水を加えたのみの核酸増幅用サンプル（１００コピーのゲノムＤＮＡ含有；ポジティブコントロール）についても、それぞれ凍結乾燥したＬＡＭＰ反応液に含まれる成分に添加し、同様にＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【０１３５】
図９は、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプルのＬＡＭＰ反応液（２５μＬ）への持込量が核酸の増幅反応に及ぼす影響について試験した結果（２）である。縦軸は、ＬＡＭＰ反応液の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）が０．１に到達するまでの時間（分）（Ｔｔ値）を示している。ＮＤは、濁度の増加が検出されなかったことを意味している。【０１３６】
その結果、２５μＬのＬＡＭＰ反応液中に、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）を２５μＬ持ち込んだ場合であっても標的核酸の増幅は認められ、ポジティブコントロールのＴｔ値が約１２分であるのに対し、ゼオライト処理サンプルのＴｔ値は約１４〜１８分であり、両者に大きな差は認められなかった。【０１３７】
以上の結果より、ゼオライト処理をして生体試料から核酸増幅用サンプルを調製すれば、核酸増幅阻害物質を大幅に取り除くことができると同時に、核酸増幅用サンプルをＬＡＭＰ反応液の最大体積まで持ち込めることが明らかとなった。このことは、ゼオライト処理をして生体試料から核酸増幅用サンプルを調製する方法は、生体試料に核酸増幅阻害物質が多く含まれるために核酸を精製するステップが必要とされていた検体からの標的核酸の検出や、発現量が非常に低い遺伝子の検出において、非常に有用であることを示唆している。また、本方法を乾燥化された増幅試薬とともに用いた場合、乾燥化増幅試薬の再溶解操作をサンプル添加操作と同一化することができ、結果的に遺伝子検査の操作性を大幅に向上させることができる。【０１３８】
（実施例７）：ＰＣＲ法による標的核酸の増幅反応に及ぼすゼオライト処理の効果
核酸増幅用サンプルの調製時にゼオライト処理することによって核酸増幅阻害物質を除去できることが明らかとなり、その効果がＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅反応で認められたので、ＰＣＲ法で標的核酸を増幅させる場合におけるゼオライト処理の効果について試験した。【０１３９】
まず、マイクロチューブに被験者から採取した血漿（２５０μＬ）と２５０μＬの０．５％  ＳＤＳを加えて９５℃で１５分間加熱し、室温に５分間放置することにより冷却し、そこに３００ｍｇの水懸濁ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）を添加して転倒混和し、室温で５分間静置後、スピンダウンして得られた上清の３μＬに１０５コピーのλＤＮＡ（タカラバイオ社）を加え、この溶液を核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）として、ＰＣＲ法による標的核酸の増幅を行った。【０１４０】
その際、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）及び滅菌水に１０５コピーのλＤＮＡを加えたのみの核酸増幅用サンプル（ポジティブコントロール）についても、同様にＰＣＲ法による標的核酸の増幅を行った。【０１４１】
ＰＣＲ法による標的核酸の増幅は、以下のプライマーセットを用い、以下の組成からなるＰＣＲ反応液中で行い、標的核酸の増幅に伴って増加する蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）をリアルタイムで測定した。【０１４２】
＜λＤＮＡを標的核酸とするＰＣＲ法用のプライマーセット＞
λセンス・プライマー：５’−ａａａａｃｔｃａａａｔｃａａｃａｇｇｃｇ−３’（配列番号１２）
λアンチセンス・プライマー：５’−ｇａｃｇｇａｔａｔｃａｃｃａｃｇａｔｃａ−３’（配列番号１３）【０１４３】
＜ＰＣＲ反応液の組成（５０μＬ）＞
核酸増幅用サンプル
１Ｕ  Ｚ−ｔａｑ（タカラバイオ社）
１×  Ｚ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）
０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ
０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ
０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ
０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ
０．２μＭ  λセンス・プライマー
０．２μＭ  λアンチセンス・プライマー
０．２５μｇ／ｍＬ  オキサゾールイエロー【０１４４】
図１０は、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）と、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）とを使用して、ＰＣＲ法で標的核酸の増幅を行った結果である。縦軸は、標的核酸の増幅に伴って増加するＰＣＲ反応液中の蛍光強度を、横軸は反応時間を示している。【０１４５】
その結果、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）では、標的核酸の増幅は認められなかったが、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）では、ポジティブコントロールと比較して、標的核酸の増幅開始時間が約５分遅れたものの、十分な感度の増幅反応が認められた。【０１４６】
（実施例８）：ＲＴ−ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅反応に及ぼすゼオライト処理の効果
核酸増幅用サンプルの調製時にゼオライト処理することによって核酸増幅阻害物質を除去できることが明らかとなり、その効果がＬＡＭＰ法及びＰＣＲ法による標的核酸の増幅反応で認められたので、ＲＴ−ＬＡＭＰ法で標的核酸の増幅させる場合におけるゼオライト処理の効果について試験した。【０１４７】
まず、マイクロチューブに被験者から採取した血漿（２５０μＬ）と２５０μＬの０．５％  ＳＤＳを加えて９５℃で１５分間加熱し、室温に５分間放置することにより冷却し、そこに３００ｍｇの水懸濁ゼオライト（ＨＳＺ−６９０ＨＯＡ；東ソー社）を添加して転倒混和し、室温で５分間静置後、スピンダウンして得られた上清の４μＬに８０コピーのＳＡＲＳコロナウイルス・ゲノムＲＮＡ（栄研化学社）を加え、この溶液を核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）として、ＲＴ−ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【０１４８】
その際、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）及びＲＮａｓｅフリーの滅菌水に８０コピーのＳＡＲＳコロナウイルス・ゲノムＲＮＡを加えたのみの核酸増幅用サンプル（ポジティブコントロール）についても、同様にＲＴ−ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅を行った。【０１４９】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅は、以下のプライマーセットを用い、以下の組成のからなるＲＴ−ＬＡＭＰ反応液中で行い、標的核酸の増幅に伴って増加する濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）をリアルタイムで測定した。【０１５０】
＜ＳＡＲＳコロナウイルス・ゲノムＲＮＡを標的核酸とするＲＴ−ＬＡＭＰ法用のプライマーセット＞
ＳＡＲＳ  ＦＩＰプライマー：５’−ｔｇｃａｔｇａｃａｇｃｃｃｔｃｇａａｇａａｇｃｔａｔｔｃｇｔｃａｃ−３’（配列番号１４）
ＳＡＲＳ  ＢＩＰプライマー：５’−ｇｃｔｇｔｇｇｇｔａｃｔａａｃｃｔａｃｃｔｇｔｃａａｃａｔａａｃｃａｇｔｃｇｇ−３’（配列番号１５）
ＳＡＲＳ  Ｆ３プライマー：５’−ｃｔａａｔａｔｇｔｔｔａｔｃａｃｃｃｇｃ−３’（配列番号１６）
ＳＡＲＳ  Ｂ３プライマー：５’−ｃｔｃｔｇｇｔｇａａｔｔｃｔｇｔｇｔｔ−３’（配列番号１７）
ＳＡＲＳ  ＬＦプライマー：５’−ａａａｇｃｃａａｔｃｃａｃｇｃ−３’（配列番号１８）
ＳＡＲＳ  ＬＢプライマー：５’−ｃｃａｇｃｔａｇｇａｔｔｔｔｃｔａｃａｇｇ−３’（配列番号１９）【０１５１】
＜ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液の組成（２５μＬ）＞
所定量の核酸増幅用サンプル
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）
１０ｍＭ  ＫＣｌ
１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
５．６ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
３．２μＭ  ＦＩＰプライマー
３．２μＭ  ＢＩＰプライマー
０．８μＭ  Ｆ３プライマー
０．８μＭ  Ｂ３プライマー
１．６μＭ  ＬＦプライマー
１．６μＭ  ＬＢプライマー
１６Ｕ  Ｂｓｔポリメラーゼ
２Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１μＬ  ＦＤ（カルセイン）【０１５２】
図１１は、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）と、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）とを使用して、ＲＴ−ＬＡＭＰ法で標的核酸の増幅を行った結果である。縦軸は、標的核酸の増幅に伴って増加するＲＴ−ＬＡＭＰ反応液中の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）、横軸は反応時間を示している。【０１５３】
その結果、ゼオライト処理をせずに調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト無処理サンプル）では、標的核酸の増幅は認められなかったが、ゼオライト処理をして調製した核酸増幅用サンプル（ゼオライト処理サンプル）では、ポジティブコントロールと比較して、標的核酸の増幅開始時間が約１０分早く、十分な感度の増幅反応が認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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