(57)【要約】  本発明は、活性化された生体適合性ポリマーが２：１以下、好ましくは１：１のモル比でｈＧＨのカルボキシル基に結合する、生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体、特にＰＥＧ−ｈＧＨ、調製の方法、及び関連する薬学的組成物に関する。ＰＥＧ−ｈＧＨ複合体は、天然ｈＧＨの最大２０％の活性を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏの半減期は１０倍増加する。ＰＥＧ−ｈＧＨ複合体は、成長遅延又は成長阻害、特に子供の低身長、及び老化に関連する状態を処置するために治療的に使用されてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性ポリマーが、２：１以下のモル比でｈＧＨのカルボキシル基に結合する、生体適合性ポリマー−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）複合体。
【請求項２】
前記生体適合性ポリマーが、ＰＥＧ−２００００及びＰＥＧ−３００００から成る群から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
薬学的に許容可能な量の請求項１に記載の複合体、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
【請求項４】
前記カルボキシル基がｈＧＨのＣ末端である、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
複合体の活性が、複合体を形成していないｈＧＨタンパク質の活性の１０〜２０％である、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記生体適合性ポリマーが、１：１のモル比でｈＧＨのカルボキシル基に結合する、請求項１に記載の生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体。
【請求項７】
前記生体適合性ポリマーがＰＥＧである、請求項６の複合体。
【請求項８】
請求項１に記載の生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体を調製する方法であって、
（ａ）精製ｈＧＨタンパク質を提供する工程、
（ｂ）結合試薬を段階的に追加することによって生体適合性ポリマーを活性化する工程、及び、
（ｃ）活性化された生体適合性ポリマーとｈＧＨのカルボキシル基とを２：１以下のモル比で結合する工程
を含み、活性化された生体適合性ポリマーに対するｈＧＨのモル比が１：１〜１：２０であり、結合試薬に対するｈＧＨの比が１：１〜１：５０であり、ｐＨが２〜５の範囲内である方法。
【請求項９】
前記生体適合性ポリマーが、カルボン酸及び／又は反応性カルボニル基と反応することができる反応性官能基により活性化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体適合性ポリマーが、ＰＥＧ−２００００及びＰＥＧ−３００００から成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記カルボキシル基がｈＧＨのＣ末端である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）組換え型宿主においてｈＧＨを産生する工程、
（ｉｉ）硫酸アンモニウムを使用してｈＧＨを濃縮する工程、及び、
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィーによって、濃縮されたｈＧＨを精製する工程
によって精製されたｈＧＨを提供することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記クロマトグラフィーが単一ステップとして実行される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
効果的な量の請求項１の複合体を、必要とする患者に投与することによって、成長阻害又は成長遅延を治療する方法。
【請求項１５】
前記生体適合性ポリマーがＰＥＧである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＥＧ−ｈＧＨが１：１のモル比で結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合体が、複合体を形成していないｈＧＨタンパク質の１０〜２０％の活性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
成長阻害又は成長遅延が、ホルモン欠損症、慢性腎疾患、ターナー症候群、悪液質又はＡＩＤＳ消耗に起因する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記複合体が、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与が注射によって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与が経口投与である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、必要とする患者に１週間当たり２回以下投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
効果的な量の請求項２に記載のＰＥＧ−ｈＧＨを含む組成物を、必要とする患者に２回以下／週の頻度で投与することによって、子供の低身長を治療する方法であって、前記ＰＥＧが１：１のモル比でｈＧＨのＣ末端カルボキシル基に結合し、ＰＥＧ−ｈＧＨが、複合体を形成していないｈＧＨの１０〜２０％の活性を有する方法。
【請求項２４】
効果的な量の請求項２に記載のＰＥＧ−ｈＧＨを含む組成物を、必要とする患者に投与することによって、除脂肪筋肉の減少、血圧の上昇、コレステロールの増加、体脂肪の増加、皮膚の張りの消失及び骨密度の低下から成る群から選択される老化と関連する悪影響を治療する方法であって、前記ＰＥＧが１：１のモル比でｈＧＨのカルボキシル基に結合する方法。
【請求項２５】
凍結乾燥された形態の請求項１に記載の複合体、
前記複合体を再構成するための薬学的に許容可能な担体、及び、
前記再構成された複合体を、必要とする患者に送達するための送達装置
を含むキット。
【請求項２６】
皮膚消毒薬、及び
手順書
をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記手順書が、生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体を１週間当たり２回以下、必要とする患者に投与することを指示する、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
注射器中にあらかじめ充填されている請求項１の複合体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施の形態は、１：１のモル比で生体適合性ポリマーと結合するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、その調製方法並びに当該ヒト成長ホルモンを含む薬学的組成物及びキットに関する。治療方法も開示される。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００５年７月２２日に出願された米国特許出願第１１／１８７，５２２号の一部継続出願である。
【０００３】
［配列表、表又はコンピュータープログラムリストへの参照］
配列表は２４ページとして含まれる。
【背景技術】
【０００４】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は１９１アミノ酸から成る単一のポリペプチド鎖である（Goeddel DV, et al., 1979, Nature, 231:542-548; Pearlman R, et al., 1993, YJ Wang
and R Pearlman編, Plenum Press, New York, 「タンパク質及びペプチド薬剤の安定性及び特性評価:事例歴」中の「ヒト成長ホルモンの安定性及び特性評価」）。内因性成長ホルモンは、子供及び青年の正常な骨格、結合組織、筋肉及び器官の成長を刺激する役割を有する。それは成人の代謝においても重要な役割を果たす。ソマトロピン（組換え型ヒト成長ホルモン）は、成長ホルモン（ｈＧＨ）受容体に結合し、成長を促進する様々な生理的な効果をもたらす。成長ホルモンの生物学的作用の多くは、反応組織に対して直接作用するインスリン様成長因子−１によって媒介される（Clark R., 1997, Endocrine Reviews, 18:157-179）。
【０００５】
ヒト成長ホルモンの一次構造を下記図１に示す。内因性ｈＧＨは脳下垂体前葉において産生される。ヒト成長ホルモンは１９５６年に最初に単離され、その構造は１９７２年に同定された（Pearlman R, et al., 1993, YJ Wang and R Pearlman編, Plenum Press, New York, 「タンパク質及びペプチド薬剤の安定性及び特性評価:事例歴」中の「ヒト成長ホルモンの安定性及び特性評価」）。１９８５年以前には、成長ホルモンはヒト死体から得ていたが、１９７０年代の終わりに、ヒト成長ホルモンのクローニング及び発現により、内因性ｈＧＨの正常機能を全て模倣するいくつかのｈＧＨ産物が市場に出まわり入手可能となった（Drake WM, et al., 2001, Endocrine Reviews, 22:425-450）。Genentechのプロトロピン（登録商標）は、元々成長ホルモン欠損による成長阻害を治療するために１９８０年代中頃にＦＤＡによって承認された。それ以来、ｈＧＨの使用に対する他の適用は、慢性腎疾患で見られる発育不全、又はターナー症候群並びに悪液質及びＡＩＤＳ消耗の治療目的を含めて承認された（Drake WM, et al., ibid.）。
【０００６】
成長ホルモン治療における重要な進歩は、長時間作用性のｈＧＨ産物が利用可能になったことであるだろう。現在、ｈＧＨは子供に１週間当たり６回注射しなくてはならず、週一度の注射は市場に多大な影響を与えるだろう。Genentechは、ｈＧＨの長時間作用性製剤（ニュートロピン−デポー）を市場へ出したが、売上げ不振のために市場から撤退した。これは、ｈＧＨのデポー形態は、子供の成長率を上昇するのには効果的ではないと小児内分泌学者の間で広く信じられているためであった。本発明の実施の形態は、タンパク質のＰＥＧ付加による長時間作用性の成長ホルモンについてより好ましい手法に関する。
【０００７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで注入される場合、生体適合性ポリマーに結合させたｈＧＨのような、タンパク質又は薬学的活性分子の複合体は大きな利点をもたらす。
生体適合性ポリマーに共有結合で結合された場合、生物学的活性物質は改変された表面特性及び可溶性を示し、それにより水又は有機溶媒への可溶性が増加する。さらに、生体適合性ポリマーの存在は、それらに結合したタンパク質及び／又はポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏでより安定させ、タンパク質の生体適合性を増加させると共に免疫反応を減少させ、腸、腎臓、脾臓又は肝臓によるタンパク質のクリアランス率を減少させることができる。
【０００８】
GenentechによるｈＧＨのＰＥＧ付加に関する以前の試みは、天然のｈＧＨタンパク質と比較して１／４００しか活性がないｈＧＨ調製物をもたらした。これは、これらの初期のＰＥＧ−成長ホルモンの臨床開発を妨げた。目的の比率でのポリマーとの結合後に、ｈＧＨのような生物学的活性分子の生物活性を維持することができ、部位特異的な複合体のホモログを得ることができれば、ｈＧＨのような分子の臨床有用性は著しく増加するだろう。本発明はこの問題に対処する。
【０００９】
生体適合性ポリマー／ｈＧＨの比率を２：１未満、好ましくは１：１に保つことにより、安定性が改善された活性ｈＧＨが、本明細書において記述されるような方法によって得られた。ＰＥＧ付加されていないタンパク質の比活性の最大２０％を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が増加した、ＰＥＧ付加ｈＧＨが提供される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の実施形態は、生体適合性ポリマーが２：１以下のモル比でｈＧＨのカルボキシル基に結合する、生体適合性ポリマー−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）複合体に関する。好ましくは、生体適合性ポリマーがＰＥＧ−２００００又はＰＥＧ−３００００である。
【００１１】
好ましくは、ｈＧＨのカルボキシル基がｈＧＨのＣ末端である。好ましくは、複合体の活性が、複合体を形成していないｈＧＨタンパク質の活性の１０〜２０％である。より好ましくは、生体適合性ポリマーが１：１のモル比でｈＧＨのカルボキシル基に結合する。さらに好ましくは、生体適合性ポリマーがＰＥＧである。
【００１２】
本発明の実施形態は、薬学的に許容可能な量の生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物に関する。
【００１３】
本発明の実施形態は、生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体の調製方法であって、
（ａ）精製ｈＧＨタンパク質を提供する工程、
（ｂ）結合試薬を段階的に追加することによって生体適合性ポリマーを活性化する工程、及び、
（ｃ）活性化された生体適合性ポリマーとｈＧＨのカルボキシル基とを２：１以下のモル比で結合する工程
のうちの１つ又は複数の工程を含む方法に関する。好ましくは、活性化された生体適合性ポリマーに対するｈＧＨのモル比は１：１〜１：２０であり、結合試薬に対するｈＧＨの比は１：１〜１：５０であり、ｐＨは２〜５の範囲内にある。好ましくは、生体適合性ポリマーが、カルボン酸及び／又は反応性カルボニル基と反応することができる反応性官能基により活性化される。好ましくは、生体適合性ポリマーがＰＥＧ−２００００又はＰＥＧ−３００００である。好ましくは、カルボキシル基がｈＧＨのＣ末端である。
【００１４】
好ましい実施形態では、精製されたｈＧＨは
（ｉ）組換え型宿主においてｈＧＨを産生する工程、
（ｉｉ）硫酸アンモニウムを使用してｈＧＨを濃縮する工程、及び、
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィーによって、濃縮されたｈＧＨを精製する工
程
のうちの１つ又は複数の工程を含む方法によって提供される。好ましい実施形態では、クロマトグラフィーが、単一ステップとして実行される。
【００１５】
好ましい実施形態は、効果的な量の生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体を、必要とする患者に投与することによって、成長阻害又は成長遅延を治療する方法に関する。好ましくは、生体適合性ポリマーがＰＥＧである。より好ましくは、ＰＥＧ−ｈＧＨが１：１のモル比で結合する。好ましくは、複合体が、複合体を形成していないｈＧＨタンパク質の１０〜２０％の活性を有する。好ましい実施形態では、成長阻害又は成長遅延が、ホルモン欠損症、慢性腎疾患、ターナー症候群、悪液質又はＡＩＤＳ消耗に起因する。好ましくは、複合体が、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて投与される。いくつかの好ましい実施形態では、投与が注射によって行われる。他の好ましい実施の形態では、投与が経口である。好ましくは、組成物が、必要とする患者に１週間当たり２回以下投与される。
【００１６】
好ましい実施形態は、２回以下／週の頻度で、ＰＥＧ−ｈＧＨを含む効果的な量の組成物を、必要とする患者に投与することによって、子供の低身長を治療する方法に関する。より好ましくは、ＰＥＧが１：１のモル比でｈＧＨのＣ末端カルボキシル基に結合し、ＰＥＧ−ｈＧＨが、複合体を形成していないｈＧＨの１０〜２０％の活性を有する。
【００１７】
好ましい実施の形態は、効果的な量のＰＥＧ−ｈＧＨを含む組成物を、必要とする患者に投与することによって、除脂肪筋肉の減少、血圧の上昇、コレステロールの増加、体脂肪の増加、皮膚の張りの消失及び骨密度の低下といった、老化と関連する悪影響を治療する方法に関する。好ましくは、ＰＥＧが１：１のモル比でｈＧＨのカルボキシル基に結合する。
【００１８】
本発明の実施形態は、好ましくは凍結乾燥された形態の生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体と、複合体を再構成するための薬学的に許容可能な担体と、再構成された複合体を必要とする患者に送達するための送達装置とを含むキットに関する。
【００１９】
好ましくは、キットはまた、皮膚消毒薬及び手順書を含む。好ましくは、手順書が、１週間当たり２回以下、好ましくは１週間当たり１回、生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体組成物を、必要とする患者に投与することを指示する。いくつかの実施形態では、キットは、注射器中にあらかじめ充填されている生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体を含む。
【００２０】
本発明のさらなる態様、特徴及び利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかとなろう。
【００２１】
本発明のこれらの特徴及び他の特徴は、発明を実施するための好ましい形態の図面に関連して記載され、これらは例示を意図し、本発明の限定を意図しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
記載される実施形態は本発明の好ましい実施形態を表しているが、変更が本発明の精神から逸脱することなく、当業者に想起されるであろうことが理解される。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって規定される。
【００２３】
本発明の実施形態は、生体適合性ポリマー、特にＰＥＧとｈＧＨの複合体に関し、活性化された生体適合性ポリマーが２：１以下、好ましくは１：１のモル比で生物学的活性ｈＧＨのカルボキシル基へ結合する。好ましい実施形態では、参照によって本明細書に援用される米国特許出願第１０／９４７，５１３号に記述されているように、ＰＥＧ付加が行われる。簡潔には、ＥＤＡＣのような結合剤はｐＨ２〜５、好ましくは≦３．０でｈＧＨ
及び生体適合性ポリマーに段階的に加えられる。
【００２４】
別の態様では、本発明の実施形態は、生体適合性ポリマーが生物学的活性ｈＧＨのＣ末端に２：１以下、好ましくは１：１のモル比で結合される、薬学的に許容可能な量の複合体、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物に関する。
【００２５】
本発明の実施形態は、生体適合性ポリマー−生物学的活性ｈＧＨ複合体であって、生物学的活性ｈＧＨのＣ末端において、２：１以下、好ましくは１：１のモル比で結合させる方法に関する。生物学的活性ｈＧＨを組換え法によって産生し、硫酸アンモニウム沈澱及びクロマトグラフィーを使用して精製する。活性化された生体適合性ポリマーに対する生物学的活性ｈＧＨのモル比が１：１〜１：２０であり、結合試薬に対する生物学的活性ｈＧＨの比が１：１〜１：５０であり、ｐＨが２〜５の範囲内にあるという条件下で、結合試薬を段階的に追加することにより、精製されたｈＧＨを活性化された生体適合性ポリマーに結合する。
【００２６】
生体適合性ポリマー
生物学的活性分子の結合に対して使用される「複合体物質」という用語は、天然ポリマー又は合成ポリマーのような生物学的活性分子へ連結することができる任意の生体適合性ポリマーを意味する。
【００２７】
「生体適合性」という用語は、身体において傷害、炎症、免疫反応及び／又は発癌を引き起こすことなく、生物組織又は生物系に生体適合性があり、無毒、非炎症性、及び非発癌性であることを意味する。
【００２８】
生体適合性ポリマーは、ｈＧＨのような生物学的活性物質と結合される。本発明における有用なポリマーは様々な溶媒中に容易に可溶性であり、約３００〜約１０００００Ｄａ、及び好ましくは約２０００〜約４００００Ｄａの分子量を有する。生体適合性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリトリメチレングリコール、ポリ乳酸及びその誘導体、ポリアクリル酸及びその誘導体、ポリアミノ酸、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、多糖、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、それらのコポリマー及び他の非免疫原性のポリマーを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の生体適合性ポリマーは直鎖状ポリマーだけでなく、以下のようなポリマーも含むと意図される。本発明の生体適合性ポリマーは、脂肪族リンカー残基によって求核的に置換される、活性化された官能基に連結された可溶性で非抗原性のポリマーを含む（米国特許第５，６４３，５７５号及び同第５，９１９，４５５号）。また、本発明の生体適合性ポリマーは、中心炭素原子の周囲にポリマーの結合手を有する２つのリンカー断片、タンパク質のような生物学的活性物質に付着するために活性化できる残基、及び水素又はメチル基である側鎖、又は他のリンカー断片を有する、多結合手で単機能性の、加水分解に対して安定したポリマーを含む（米国特許第５，９３２，４６２号）。さらに、本発明の生体適合性ポリマーは、ポリマーの官能基がレポーター残基を有するリンカーの結合手を介して生物学的活性物質へ付着している分岐ＰＥＧのポリマーを含む（国際公開ＷＯ００／３３８８１）。
【００３０】
これらの中で、ＰＥＧは本発明の最も一般的な生体適合性ポリマーの１つである。一般に、ＰＥＧは反復単位、ＨＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈを有する無毒な親水性ポリマーである。様々なタンパク質が、ＰＥＧに結合させた場合、半減期の延長、可溶性の増大、安定性の増大、及び血漿中における免疫原性の減少を示すことが報告される。
【００３１】
タンパク質又はペプチドのような生物学的活性物質へ結合したＰＥＧ分子の分子量の範囲は、約１０００〜１０００００Ｄａであり、１０００Ｄａを超えるＰＥＧの毒性は非常に低いことが既知である。１０００〜６０００Ｄａの範囲内のＰＥＧは全身へ送達され、腎臓で取り除かれる。４００００Ｄａの分子量を有する分岐状ＰＥＧは、血液又は肝臓を含む器官に送達され、肝臓で代謝される。
【００３２】
ＰＥＧは様々な分子量範囲において市販されており、各々のオキシエチレン単位は２〜３の水分子を結合するために接近できるように親水性であり、メトキシポリエチレングリコール由来の１つの末端官能基を持ったＰＥＧ誘導体は合成が容易であり、ＰＥＧは抗原−抗体反応についての危険性が非常に低く、関連する技術が十分に開発されているので、ＰＥＧは最も好ましい生体適合性ポリマーである。
【００３３】
生物学的活性物質
「生物学的活性分子」又は「生物学的活性物質」という用語は、活性化された生体適合性ポリマーに結合した全ての求核分子を意味し、それは結合後に生物活性のうちの少なくともいくつかを保持する。好ましい実施形態は、ｈＧＨを含む生物学的活性分子に関する。本明細書において使用される「生物活性」という用語は、生理的活性又は薬理学的活性に限定されない。一般的に、生物学的活性分子は天然物質から単離されるか、又は組換えにより若しくは化学的に合成することができ、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、バイオ医薬、遺伝子、プラスミド又は有機残渣を含む。
【００３４】
ヒト成長ホルモン
本明細書において使用される「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）」という用語は、ヒト成長ホルモン、及び天然に存在するポリペプチドと同じ機能を有するｈＧＨのアナログ、断片、ホモログ、誘導体又は対立遺伝子多型のような、ｈＧＨのバリアントも包含する。本発明による成長ホルモンは、ヒト又は動物のソースから精製されても、化学的又は組換えにより産生されてもよい。ｈＧＨの調製物は市販されている。組換えにより生産されたｈＧＨはシントロピン（商標）と呼ばれる。
【００３５】
組換え型ｈＧＨ種の製品は既知であり、参照により本明細書に援用される米国特許第６，５６６，３２８号、同第５，９６２，４１１号及び同第５，３３４，５３１号に教示されている。少なくとも１つのＰＥＧが付着しているｈＧＨは、本明細書において「ＰＥＧ付加ｈＧＨ」、「ＰＥＧ−ｈＧＨ」、「ＰＥＧ付加シントロピン（商標）」又は「ＰＥＧ−シントロピン」と呼ばれる。
【００３６】
好ましい実施形態では、組換え型ｈＧＨは細菌の宿主細胞を使用して産生される。より好ましくは、細菌の宿主細胞は、溶菌及び組換え型ｈＧＨの放出を引き起こすバクテリオファージλによりトランスフェクションされる。さらにより好ましくは、バクテリオファージλは、参照によって本明細書に援用される米国特許第６，７７３，８９９号により教示されるように、溶菌を遅延させることが可能である。
【００３７】
組換え又はヒト組織ソースからの単離のいずれかにより産生されたｈＧＨタンパク質は、続いて、非限定的に硫酸アンモニウム沈澱、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィー、ゲル排除等を含む、当該技術分野において既知の任意の手段によって精製することができる。好ましい実施形態では、硫酸アンモニウムを使用する濃縮工程の後に、イオン交換クロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーとの組合せを使用する精製が続く。最も好ましい実施形態では、硫酸アンモニウムによる濃縮の後に、陰イオン交換カラム、好ましくはＱセファロースＦＦカラムによる単一ステップカラムクロマトグラフイーが行われる。精製された
ｈＧＨタンパク質は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、及びさらにより好ましくは９０％を超える純度を有する。
【００３８】
生体適合性ポリマー−生物学的活性ｈＧＨ複合体の調製
生体適合性ポリマーと生物学的活性ｈＧＨとを結合するために、ポリマーの末端基のうちの１つは反応性官能基に変換される。この過程は「活性化」と呼ばれ、産物は「活性化された」ポリマーと呼ばれる。例えば、ポリ（アルキレンオキシド）（ＰＡＯ）を結合するために、ポリマーのヒドロキシル末端基のうちの１つは炭酸のような反応性官能基に変換することができ、室温で可溶性である活性化されたＰＡＯが産生される。この基は、Ｃ１〜４末端基を含むｍＰＥＧ又は他の適切なアルキル置換ＰＡＯ誘導体のような一置換のポリ（アルキレンオキシド）誘導体を含む。
【００３９】
当該技術分野及び本明細書において使用される「反応性官能基」という用語は、生物学的活性ｈＧＨに結合するように生体適合性ポリマーを活性化する基又は残基である。
【００４０】
本発明の反応性官能基は、カルボン酸及び反応性カルボニル基、例えば第一級アミン、又はヒドラジン官能基及びヒドラジド官能基（アシルヒドラジド、カルバジン酸、セミカルバジン酸、チオカルバジン酸等のような）と反応することができる官能基から選択される。
【００４１】
当該技術分野及び本明細書において使用される「カルボキシル基の結合試薬」（以下、結合試薬と呼ぶ）という用語は、ｈＧＨのような生物学的活性物質のカルボキシル基と、上記の反応性官能基において活性化された生体適合性ポリマーとを結合するための任意の試薬を意味する。
【００４２】
対象となる本発明中のカルボキシル基の結合試薬は、カルボジイミドイル結合試薬、例えばＥＤＡＣ［Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩］、ＤＩＣ［１，３−ジイソプロピルカルボジイミド］、ＤＣＣ［ジシクロヘキシルカルボジイミド］、及びＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド］を含むが、これらに限定されない。カルボキシル基のための好ましい結合試薬はＥＤＡＣである。
【００４３】
本発明の複合体を調製する方法は、少なくとも生物学的活性分子の内因性生物活性の一部を保持している間に十分な結合が可能という条件下で、活性化された生体適合性ポリマーによる置換反応を実行できる、求核分子を含む生物学的活性ｈＧＨを反応させる工程を含んでいる。
【００４４】
２：１以下、好ましくは１：１の比の生物学的活性ｈＧＨ−生体適合性ポリマー複合体は、生物学的活性物質と化学量的に過剰量のポリマーとを反応させることにより得られる。例えば、ｈＧＨ−ＰＥＧの調製では、ＰＥＧに対する生物学的活性ｈＧＨのモル比は、約１：１〜１：２０、より好ましくは１：１〜１：１０の範囲内にある。生物学的活性物質のカルボキシル基を活性化する試薬は以下の群から選択されるが、これらに限定されない。例えば、Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、３−［２−モルホリニル−（４）−エチル］のような水溶性カルボジイミド基、及びｐ−トルエンスルホネート、ウッドワード試薬Ｋのような５−置換イソキサゾリニウム塩が挙げられる。
【００４５】
本発明で使用されるＥＤＡＣに対する生物学的活性ｈＧＨのモル比は、約１：１〜１：５０、より好ましくは約１：１〜１：３０、及び最も好ましくは約１：１〜１：２０の範囲内にある。好ましくは、ＥＤＡＣが水溶液中で容易に加水分解されるので、２０倍モル
過剰のＥＤＡＣを１回で加えるのではなく、ＥＤＡＣの追加は６回以上に、好ましくは５回又は６回に分けられる。
【００４６】
ｈＧＨと活性化されたポリマーとの共役結合反応は、緩衝液として機能する水溶性溶媒のｐＨに依存する。一般的に、反応緩衝液のｐＨは２〜５、好ましくは２．５〜４．５の範囲内にある。これらの物質の安定化及び反応収率に対する最適の反応条件は、当該技術分野において既知である。共役結合反応に対する適切な温度は、０〜６０℃の範囲、及び好ましくは４〜３０℃の範囲内にある。溶媒の温度は、タンパク質又はペプチドの変性温度を上回るべきでない。反応時間は１０分〜５時間が好ましい。調製されたｈＧＨ複合体は、硫酸アンモニウム沈澱、カラムクロマトグラフィー、膜分離精製又はこれらの過程の組合せによって回収及び精製することができる。
【００４７】
薬学的組成物
本発明は、治療上効果的な用量の活性化された生体適合性ポリマー−ｈＧＨ複合体を有効成分として含む薬学的組成物にも関する。
【００４８】
当該技術分野及び本明細書において使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、ヒトに投与された場合にアレルギー反応又は同様の反応を引き起こさないことを意味する。
【００４９】
薬学的組成物の有効成分としての、生体適合性ポリマー−生物学的活性ｈＧＨ複合体は、それ自体を使用するか、又は疾患の予防及び治療のための薬学的に許容可能な担体と組み合わせて配合することができる。
【００５０】
当該技術分野及び本明細書において使用される、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、生物学的活性ｈＧＨをある器官又は組織から他の器官又は組織へ運ぶ、薬学的に許容可能な分子、組成物、又は溶液、希釈剤、賦形剤若しくは溶媒のような媒質を意味する。本発明の薬学的組成物は、経口、局所、注射又は非経口経路によって投与することができ、その製剤は有効成分として治療上有効な量の生体適合性ポリマー−生物学的活性ｈＧＨ複合体を含む。経口投与のための本発明の製剤は、丸剤、錠剤、コーティング錠剤、顆粒、トローチ、ウエハース、エリキシル剤、ハード及びソフトゼラチンカプセル剤、溶液、シロップ剤、エマルジョン、懸濁液又はスプレー等を含み、非経口投与のためには、注射可能な溶液、マイクロカプセル及び貼付剤等が含まれる。
【００５１】
薬学的製剤は、薬学的に許容可能な不活性の無機又は有機添加剤の使用によって、既知の方法に従って調製することができる。例えば、ラクトース、トウモロコシデンプン及びその誘導体、タルク、又はステアリン酸及びその塩は、丸剤、錠剤及びハードゼラチンカプセル剤を調製するために使用することができる。ソフトゼラチンカプセル剤及び坐剤の添加剤は、例えば、油、ワックス、半固形又は液状のポリオール、及び天然又は凝固油である。溶液又はシロップ剤の調製のために適切な添加剤は、例えば、水、ショ糖、インベルターゼ、グルコース及びポリオールである。注射可能な溶液の調製のために適切な添加剤は、水、アルコール、グリセロール、ポリオール及び植物油等である。注射可能な溶液は、防腐剤、不活性薬剤、溶解剤及び安定剤の組合せとして使用することができる。局所投与のための製剤も、ガス、希釈剤、滑沢剤及び防腐剤と組み合わせて使用することができる。マイクロカプセル又は移植のために適切な添加剤は、コポリマー又はグリコール酸及び乳酸である。
【００５２】
本発明の生体適合性ポリマー−生物学的活性ｈＧＨ複合体の用量は、当該技術分野において既知であるように、ｈＧＨの吸収率、可溶性、患者の年齢、性別、疾患の状態及び重症度等によって変化する。以下で示される実施例４において、天然ｈＧＨの最大２０％の
活性を保持し、動物の循環において有意に長い（１０倍以上長い）半減期を有するＰＥＧ付加ｈＧＨタンパク質（ｈＧＨ）が示される。好ましい実施形態では、ＰＥＧ−ｈＧＨは、天然活性の少なくとも１％、より好ましくは５％、さらにより好ましくは１０％、及びさらにより好ましくは１５％を保持する。好ましい実施形態は、天然ｈＧＨの活性の１０〜２０％を保持する。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明によるＰＥＧ付加ｈＧＨは、ｉｎ  ｖｉｖｏの循環において、天然ｈＧＨと比較して、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍、さらに好ましくは少なくとも７倍、及びより好ましくは少なくとも１０倍長い半減期を有する。
【００５４】
ＰＥＧ−ｈＧＨは、非常に容易な投与形態と組み合わせて臨床的有用性を示す潜在能力を明確に有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧ付加ｈＧＨの投与は、毎日よりは少ない回数、好ましくは１週間当たり５回以下、より好ましくは１週間当たり４回以下、さらに好ましくは１週間当たり３回以下、さらに好ましくは１週間当たり２回以下、及びさらに好ましくは１週間当たり１回以下である。図１０中の動物体重増加アッセイに示されるように、ＰＥＧ付加ｈＧＨ又はシントロピン（商標）（組換え型ｈＧＨ）の毎週の注射は、現在の市場の全てのブランドの構成している天然のｈＧＨを毎日注射した場合の効能に等しい。ヒト成長財団によれば、米国の１００００〜１５０００人の子供が成長ホルモン欠損に起因する成長阻害を抱えていると推測される。このことはｈＧＨの持続放出製剤の必要性を明確に実証している。
【００５５】
特に、本発明の生体適合性ポリマー−生物学的活性ｈＧＨ複合体の投与により、注射間隔が、毎日又は２日につき１回から、毎週又は２週に１回に減少する。したがって、頻繁な投与による薬剤の毒性及び副作用は大幅に減少する。
【００５６】
治療上の用途
未改変成長ホルモン（ＧＨ）による治療に適している任意の条件も、本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨにより治療することができる。特に、本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、より広範囲な試験で成長ホルモン欠損を確認するが、１年当たり２インチ未満の身長の伸びとして一般に定義される、成長ホルモン（ＧＨ）欠損を有する子供を治療するために使用することができる。このＧＨ欠損は、先天性の問題、腫瘍、感染又は頭頸部の腫瘍のためのような放射線処理に起因する。
【００５７】
本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、子宮内成長制限の結果の治療のためにも使用することができる。場合によっては、乳児は、母性栄養、感染症、環境、過剰な母体のアルコール消費又は他の要因に起因して、妊娠時の間に小さくなる可能性がある。ＰＥＧ−ｈＧＨの投与は、この障害を患う子供が成長中に同年代の子供に追いつくことを可能にする。
【００５８】
本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、ｈＧＨが成長を刺激するのに効果的であるように、子供の慢性腎機能不全の治療に使用されてもよい。
【００５９】
本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、ターナー症候群を治療するために使用されてもよい。ターナー症候群はＧＨ欠損によって引き起こされないが、ＧＨの投与はターナー症候群を罹患している女児が正常な身長に達することを可能にする。本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、成長及び除脂肪体重を増加すると共に体脂肪を減少させるために、プラダー−ウィリ症候群の症状の治療に使用されてもよい。
【００６０】
本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、特発性の低身長、すなわち子供の年齢及び性別の平均よりかなり下にある身長を治療するために使用されてもよい。成長ホルモン欠
損症を示さず肉体的に正常であるが、正常な身長の２標準偏差よりも低い身長である子供について、本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、この子供たちの身長を増加させるために使用することができる。
【００６１】
子供の頃成長ホルモン治療を受けている子供は、成人となってもしばしばこの治療から同様に利益を受ける。成人となっても身長が高くなる必要はないであろうが、過剰な脂肪、筋肉質量の減少及び低い体力をもたらす成長ホルモンの不足がまだあるかもしれない。さらに、子供の頃成長ホルモン治療を受けていなかった成人の中には、成人となっても十分な量の成長ホルモンを産生することができないものもいるだろう。ＧＨ欠損の症状は、顔面及び腹部付近の脂肪の増加、除脂肪体重レベルの低下、骨損失、縮緬皺をともなう皮膚菲薄化、発汗又は体温調節の不全、性欲低下、睡眠障害、筋力低下、運動能力低下、コレステロール値上昇、インシュリン産生過多及び抑鬱を含む。本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、これらの患者ための治療計画に使用することができる。
【００６２】
ＧＨは、ＡＩＤＳ、熱傷又は外傷による消耗症候群の治療のための成人における使用についてＦＤＡで承認されている。本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、これらの症状を治療するために使用することができる。
【００６３】
ＧＨは老化の影響と戦うのにも有用なことが示されている。老化過程の一部として、ＧＨの産生は減退する。ＧＨの枯渇は、体脂肪の増加（特にウエストのまわりで）、体力の低下、筋肉質量の減少、血圧及びコレステロールの増加並びに健康状態の低下を含む、老化の通常の兆候によって特徴づけられる。本発明の実施形態によるＰＥＧ−ｈＧＨは、これらの症状を治療するために使用することができる。
【００６４】
上述されるような複合体を形成したｈＧＨは、患者又は医療関係者に便利であるように、キットとして提供することができる。キットは、好ましくはあらかじめ測定された用量のｈＧＨ複合体を含む。キットは、好ましくは、あらかじめ測定された用量のｈＧＨ複合体の１つ又は複数の容器を含む。
【００６５】
ｈＧＨ複合体は、凍結乾燥された形態又は薬学的に許容可能な担体で提供される。ｈＧＨ複合体が凍結乾燥された形態において提供される場合、好ましくはキットは複合体の再構成のために薬学的に許容可能な担体も含む。
【００６６】
好ましい実施形態では、キットは、ｈＧＨを治療される個体に送達するための送達装置を含む。送達装置は好ましくは注射器である。いくつかの実施形態では、キットはあらかじめ測定された用量のｈＧＨ複合体があらかじめ充填された注射器を含んでもよい。
【００６７】
いくつかの好ましい実施形態では、キットはまた、送達装置又は注射器を使用する送達前の皮膚処理のための皮膚消毒薬、包帯及び手順書のうちのいずれかを含んでもよい。
【００６８】
以下の実施例は、本発明の範囲内の実施形態をさらに記載及び例示する。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく実施例の多数のバリエーションが可能であるので、実施例は例示目的のみのために示され、本発明を限定するようには意図されない。
【実施例】
【００６９】
実施例１  ファージ依存的方法によるヒト成長ホルモンの産生
基本的に、参照によって本明細書に援用される米国特許第６，７７３，８９９号で教示されているように、組換え型ｈＧＨを調製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（NOVAGEN）の培養物を、ヒト成長ホルモン（配列番号４）をコードする化学的に合成された遺伝子の１コピーを含むプラスミドによって形質転換した。翻訳されたアミノ酸配列を、配列番号
５として示す。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中の誘導可能なｌａｃ  ＵＶ５プロモーターの制御下に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の単一コピーを含む（Studier et al. (1986) J. Mol. Biol., 189:113-130）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（NOVAGEN）に、Ｔ７プロモーターの制御下にヒト成長ホルモン遺伝子を挿入した。ヒト成長ホルモン遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃ  ＵＶ５プロモーターの誘導によって媒介される細胞中のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの合成後にのみ始まる。
【００７０】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体の培養物を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で３７℃で振盪し、２×１０8細胞／ｍｌの密度まで増殖させた。次に細胞を、１細菌細胞当たり約１０ファージ体の多重度でファージλｃＩ857  Ｑａｍ117  Ｒａｍ54に感染させ、約１４時間２３℃で振盪により培養した。ファージと同時に、１  ｍＭ
ＩＰＴＧを培地へ加えた。
【００７１】
ファージλｃｌ857  Ｑａｍ117  Ｒａｍ54を、好気条件下２８℃でＬＢ培地中でおよそ１×１０8細胞／ｍｌの密度まで増殖させた大腸菌ＲＬＭＩの溶原性培養物から調製した。溶原性培養物を４３℃まで温め、ｃＩリプレッサーを不活性化するために２０分間インキュベートした。次に温度を３７℃まで低下させ、６０〜７０分後に細菌細胞を１〜２×１０10ＰＦＵ／ｍｌで形成されたファージで溶菌した。
【００７２】
ファージ感染細胞を１４時間インキュベーションした後に、遠心分離によって培養培地から残屑を取り除き、調製培地を産生した。
【００７３】
実施例２  天然のｈＧＨの精製−３工程法
実施例１からの調製培地（放出されたタンパク質を含む細菌溶菌後の細菌増殖培地）を硫酸アンモニウム沈澱により精製し、その後、Ｑセファロースカラム及びフェニルセファロースカラムで精製した。図２は、各々の一連の精製工程後に得られた製剤原料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。調製培地中の可溶性の生物学的活性成長ホルモン産物は、レーン２（図２）に示される。次に製剤原料に対して３工程の硫酸アンモニウム沈澱による精製手順が行われ、その後、Ｑセファロース及びフェニルセファロースでの連続したクロマトグラフィー工程が行われる。図２のレーン５に示される、精製された最終的な製剤原料は、図３に示されるようなこのレーンのデンシトメーターのスキャンによって、９９％より高い純度であると判断された。この過程は、国際的な成長ホルモン基準と同等の生物活性を有する高純度のヒト成長ホルモン産物を産生する。その後のＰＥＧ付加研究に使用した。
【００７４】
実施例３  天然のｈＧＨの調製−１カラム法
いくつかの研究では１カラム精製法を用いた。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に対するこのタンパク質精製手順は、単一カラムクロマトグラフィー工程を必要とする。第１の硫酸アンモニウム沈澱工程はカラムクロマトグラフィーを実行する前の濃縮工程である。
【００７５】
硫酸アンモニウム沈殿工程
実施例１に記載された方法により産生されたｈＧＨの３リットルの発酵物を冷凍し、溶解した細菌培養物を４℃で溶かし、１６０００ｇの遠心分離によって清澄にして調製培地を得た。等容積の飽和硫酸アンモニウム溶液を、撹拌しながら５０％飽和の最終濃度まで調製培地に送り込み、混合物をさらに１時間撹拌した。沈殿を１時間１６０００ｇの遠心分離によって回収した。ペレットを、容積が調製培地の１／１０のｐＨ８．０の２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌに溶解した。溶液をｐＨ８．０の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌに対して透析した。緩衝液交換溶液を遠心分離により清澄にした、すなわち任意の沈殿を除去するためにろ過した。
【００７６】
ＱセファロースＦＦカラムクロマトグラフィー工程
緩衝液交換サンプルを、ｐＨ８の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌにより平衡化したＱセファロースＦＦカラムへかけた。Ａ２８０ｎｍの吸収がベースラインに達するまで、カラムを
ｐＨ８．０の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌにより洗浄した。次に、Ａ２８０ｎｍでの吸収がベースラインに達するまで、カラムをｐＨ８．０の７０ｍＭ  ＮａＣｌ−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌにより洗浄した。ｈＧＨをｐＨ８．０の１２０ｍＭ  ＮａＣｌ−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌにより溶出し、溶出ピークを回収した。溶出液の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣによって求めた。典型的には、９５％を超える純度のｈＧＨを得た。
【００７７】
図４Ａは、精製の様々な工程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるｈＧＨ調製物の純度を示す。図４Ａは、分子量基準を表すレーン１を有する実際のゲル画像を示し、レーン２〜４は精製工程を通じてのｈＧＨ調製物の相対的な純度を示す。レーン２は、発酵過程の後に得られた調製培地又はファージ溶解物のアリコートであり；レーン３は、硫酸アンモニウムによる調製培地の沈殿後であり；及びレーン４は、単一のＱセファロースクロマトグラフィー工程後のｈＧＨの一部分である。
【００７８】
図４Ｂは、ｈＧＨの相対的な純度を計算する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン４のデンシトメーター分析を示す。これから分かるように、ｈＧＨは単一カラムクロマトグラフィー工程後に９９．４パーセント純粋であると判断された。
【００７９】
実施例４  ＰＥＧ付加ｈＧＨの調製
上記の方法のうちの１つによって精製されたヒト成長ホルモンは、参照によって本明細書に援用される米国特許出願第１０／９４７，５１３号に記載されているような方法を使用してＰＥＧ付加された。代替的に、ｈＧＨは市販のソースから得てもよい。簡潔には、１ｍｇのｈＧＨを、２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ３．０）に対して透析した（Centricon-10、アミコン、アメリカ）。このタンパク質溶液に、ｍＰＥＧ−ヒドラジド（Ｈｚ）（ISU Chemical、韓国、０．０００５  ｍｍｏｌ）を添加し、その後２０μｌのｄＨ2Ｏ中に２ｍｇのＥＤＡＣの溶解によって調製された溶液中の２０倍モル過剰のＥＤＡＣを添加した。ＰＥＧを活性化するために、ＥＤＡＣを１５倍モル過剰で使用した。反応は、ＰＥＧ（２００００）又はＰＥＧ（３００００）のいずれかを使用して行った。反応は撹拌しながら室温（２０〜２５℃）で１時間行った。１時間後に、未反応ｈＧＨ及び過剰の試薬をサイズ排除カラム又はイオン交換カラムによって除去した。好ましい実施形態では、ＥＤＡＣの量は２０〜５０倍モル過剰、及びｍＰＥＧ−Ｈｚは１０〜２０倍モル過剰の範囲にわたる。モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ（１つのＰＥＧが１つのｈＧＨ分子に付着する、ロット番号ＢＰＭ＃０４−００３）及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ（２つのＰＥＧが１つのｈＧＨ分子に付着する、ロット番号ＢＰＭ＃０４−００４）を、サイズ排除カラムを使用して、ＨＰＬＣによって分離した。精製されたＰＥＧ−ｈＧＨ画分をさらなる分析まで４〜８℃でＰＢＳ溶液中で保存し、ラットにおけるＰＥＧ−ｈＧＨのｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物活性及び半減期を評価するために使用した。
【００８０】
ｈＧＨと活性化されたＰＥＧ誘導体との反応を、図５に示されるように２２０ｎｍでモニターされるサイズ排除カラムを使用したＨＰＬＣによって確認した。ＰＥＧ−ｈＧＨの濃度を、紫外線−可視光線分光測光器を使用して、２８０ｎｍにおける光学的濃度によって求めた。およそ４８％、３１％及び２１％のモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ、ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ、及び未反応ｈＧＨがそれぞれ産生された。次に各々の画分をサイズ排除カラムによって精製し、図６Ａ（モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ）及び図６Ｂ（ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ）に示されるようにＨＰＬＣで確認した。各ＰＥＧ−ｈＧＨサンプルの純度は９５％より高いと判断された。
【００８１】
ＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性：ラットにおけるＰＥＧ−ｈＧＨのＰＫ研究
モノ−及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性を、細胞増殖アッセイによって測定し、天然ｈＧＨ（Phage Biotech製品）と比較した。モノ−及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨを、体重２２０〜２４０ｇの７週齢スプレーグ・ドーリーラット（各群当たり少なくとも５匹のラット）に皮下注射によって用量２００μｇ／ｋｇでそれぞれ投与した。天然ｈＧＨを対照として使用した。注射後０、ｌ０分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間の時間間隔で血液を採取した。血清サンプルを１２０００ｒｐｍで遠心分離することによって得て、さらなる分析のために−２０Ｃで保存した。
【００８２】
図７は、細胞増殖アッセイによって測定されたモノ−及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ並びに天然ｈＧＨの生物活性を示す。バイオアッセイは細胞増殖アッセイであり、ｈＧＨが全長ヒト成長ホルモン受容体を安定的にトランスフェクションしたＢａＦ３細胞の増殖を刺激する。Ｂａｆ−Ｂ０３  Ｂ２Ｂ２と呼ばれるこの細胞株は、ｈＧＨに対する反応の点から広く特徴づけられた（Behncken SN, et al., 1997, J Biol Chem, 272:27077-27083）。モノ−及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨの活性は、それぞれ１５±５％及び８±２％であると判断された。
【００８３】
ＰＥＧ−ｈＧＨの薬物動態学の（ＰＫ）研究は、天然ｈＧＨ（Phage Biotech）と比較するＥＬＩＳＡアッセイを使用して、血清サンプル中のｈＧＨの量を測定することによって実行された。図８は、天然ｈＧＨと比較してのＰＥＧ−ｈＧＨのＰＫ研究を示す。天然ｈＧＨは注射後５時間以内に血液から除去されたことが示されたが、注射後７２時間ではモノ−及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨの両方が検出された。
【００８４】
天然ｈＧＨと比較してモノ−及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨは、それぞれ１５±５％及び８±２％の生物活性を保持することが観察された。しかしながらＰＫ研究によって、ラットにおいて天然ｈＧＨよりもＰＥＧ−ｈＧＨが非常に遅く除去されることが示された。したがって、この研究のＰＥＧ−ｈＧＨサンプルはｈＧＨの新しい徐放性薬剤を提供することができる。
【００８５】
実施例５  バイオアッセイ
上記の調製物の活性は、ＢａＦ３細胞による細胞増殖アッセイによって試験され、市販のｈＧＨと比較された。シントロピン（商標）、ニュートロピン（登録商標）、及びヒューマトロープ（登録商標）は、市販のｈＧＨ製剤である。代表的な標準曲線は図９に示され、同様の用量応答曲線が４つの市販ｈＧＨで見られる。上記のように調製されたｈＧＨの比活性は、市販のｈＧＨと比較して遜色がない。予想通り、天然シントロピン（商標）のＰＥＧ付加は生物活性の消失をもたらし、より多くのＰＥＧ基が天然ｈＧＨと付着するにつれてより大きな活性消失が起こる。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
実施例６  オスの下垂体切除ラットにおける身体発育に対するＰＥＧ−ｈＧＨの効果
使用した第２のバイオアッセイは、古典的なラット体重増加アッセイ（Roswall EC, et
al., 1996, Biologicals, 24:25-39）であり、最初の７日間の毎日１回のｈＧＨの皮下注射、又はモノ−若しくはジ−ＰＥＧ−シントロピンの１日目の１回の注射の後に、４〜５週齢の下垂体切除ラット（Orient, Inc., 143-1, Sangdaewon-dong, Sung-Nam, Kyunggi-do）の重量を２８日の期間にわたりモニターした。際立ってそして予想外に、細胞に基づいたバイオアッセイにおけるＰＥＧ−シントロピンがむしろ低い効能であったことを考慮して（表１）、天然ｈＧＨの毎日の注射に対して週に一度のみ注射された場合、ＰＥＧ付加シントロピンは天然のｈＧＨと同等の活性を示した（図１０を参照）。天然ｈＧＨを毎日注射されたラットは、モノＰＥＧ−シントロピン−又はジ−ＰＥＧ−シントロピンのいずれかの単回注射を行ったラットと、７日目でほぼ同じ重量であることが図１０から分かる。また予想外であったことは、天然シントロピンを投与された動物に対する、ＰＥＧ−シントロピンを投与された動物における体重増加の速度である。図１０において、天然ｈＧＨを毎日の注射により投与された動物よりも、モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ又はジ−ＰＥＧ−ｈＧＨのいずれかを単回用量で投与されたラットで、最初の４日にわたり有意に大きな速度で体重が増加することが分かる。ＰＥＧ付加成長ホルモンが投与された動物の体重に、天然ｈＧＨを投与された動物が「追いつく」ことができたのは７日目であった。
【００８８】
オスの下垂体切除ラットの身体発育に対するＰＥＧ−ｈＧＨの効果を、異なる用量でさらに研究した。４〜５週齢の下垂体切除ラットを購入し、５日間飼育し、皮下にＰＥＧ−ｈＧＨ（Ｇ６〜Ｇ８）を１回投与し、１１日間体重を毎日測定した。陰性対照（媒質対照、Ｇｌ）として生理食塩水、及び天然ｈＧＨ（陽性対照、Ｇ２〜Ｇ４）を、６日間毎日（１日目〜６日目）皮下に投与し、各ラットの体重を１１日間測定した。また、高用量（１８０μｇ）のｈＧＨ（Ｇ５）を皮下に１回投与し、体重を測定して他の群と比較した。
【００８９】
異常な症状はどの処理の結果としても観察されず、体重の有意な変化は生理食塩水の対照（Ｇ１、図１１Ａ〜Ｃ）又はｈＧＨ投与群（Ｇ５、図１１Ａ及び図１１Ｃ）において観察されなかった。
【００９０】
この研究から、陽性対照のラットの体重であるＧ２、Ｇ３及びＧ４は、毎日のｈＧＨ投与の間に、それぞれ７．３７％、９．０３％、及び１０．７９％増加した（図１１Ａ及び図１１Ｂ）が、ＰＥＧ−ｈＧＨのラットの体重であるＧ６、Ｇ７及びＧ８は、ＰＥＧ−ｈＧＨの単回投与後に、それぞれ８．４２％、１２．４８％、及び１８．３７％増加した（図１１Ａ及び図１１Ｃ）ことが見出された。この結果は、体重の増加が投与されたｈＧＨの量又は投与されたＰＥＧ−ｈＧＨの量に比例することを示す。しかしながら、１回のｈ
ＧＨ（１８０μｇ／ラット）の高用量ボーラス投与は、わずかな一時的な反応のみを引き起こした（Ｇ５、図１１Ａ及び図１１Ｃ）が、ＰＥＧ−ｈＧＨの単回投与は非常に大きなより持続的な反応をもたらした。
【００９１】
下垂体切除ラットへのＰＥＧ−ｈＧＨの単回注射は体重を顕著に増加させ、少なくとも６日間は増加した体重を十分に維持することが観察された。ｈＧＨの毎日の注射は体重を増加させたが、ｈＧＨの投与が中止されるとすぐに体重は減少し始めた。ｈＧＨ（Ｇ５）の単回ボーラス高用量注射は、投与の翌日の体重を４％未満増加させ、その後陰性対照と同程度まで体重を減少させることも観察されたが、これは、ＰＥＧ付加されていないｈＧＨサンプルにより体重を継続的に増加させるには、天然ｈＧＨの継続的な注射が必要であることを示している。
【００９２】
用量依存的な体重増加はＰＥＧ−ｈＧＨと同様にｈＧＨについても観察された。換言すれば、体重増加は、下垂体切除ラットに投与されたｈＧＨ又はＰＥＧ−ｈＧＨの量に比例した。
【００９３】
この研究は、ＰＥＧ−ｈＧＨの単回注射が、下垂体切除ラットにおいて少なくとも６日間の身体成長の促進及び十分な体重の維持を促すが、ＰＥＧ付加されていないｈＧＨを毎日６日間注射することが、ラットの体重増加を継続的に維持するのには必要であることを示している。週に１回の注射可能な薬剤としてのＰＥＧ−ｈＧＨは、ｈＧＨの毎日の注射に対する有望な代替物である。
【００９４】
このように、本発明の好ましい実施形態を記載したが、当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、本明細書において説明された特許請求の範囲の意味、真の範囲をさらに修正及び変更した全ての物、並びにそれと同等な物を含む他の実施形態を行なうことができることを理解するだろう。上記の実施例は、本発明の範囲内の実施形態をさらに記載及び実証する。それらの実施例は例示のみのために挙げられ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その多くの変更が可能なように、本発明の限定として解釈することはできない。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の一次構造を示す図である。
【図２】連続した精製工程を経たシントロピン製剤原料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：ｈＧＨ調製培地；レーン３：硫酸アンモニウム沈殿ｈＧＨ培地；レーン４：Ｑセファロースカラムによって精製されたｈＧＨ；レーン５：Ｑ−セファロース及びフェニル−セファロースカラムによって精製されたｈＧＨ。
【図３】精製されたシントロピン薬剤原料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメータースキャンを示す図である。物質の９９．９％はピーク２番にある。
【図４Ａ】１工程のカラムクロマトグラフィー後のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。図４ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図４Ｂはレーン４のデンシトメーターのスキャンを示す。
【図４Ｂ】１工程のカラムクロマトグラフィー後のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。図４ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図４Ｂはレーン４のデンシトメーターのスキャンを示す。
【図５】サイズ排除カラムでの、ｈＧＨのＰＥＧ化のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図６Ａ】サイズ排除カラムで精製されたモノ−及びジ−ＰＥＴ−ｈＧＨのＨＰＬＣプロファイルを示す図である。図６Ａはモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨについてプロファイルを示す。図６Ｂはジ−ＰＥＧ−ｈＧＨについてプロファイルを示す。
【図６Ｂ】サイズ排除カラムで精製されたモノ−及びジ−ＰＥＴ−ｈＧＨのＨＰＬＣプロファイルを示す図である。図６Ａはモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨについてプロファイルを示す。図６Ｂはジ−ＰＥＧ−ｈＧＨについてプロファイルを示す。
【図７】細胞増殖アッセイによるＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性を示す。
【図８】ラット（用量＝２００μｇ／ｋｇ、皮下注射）におけるＰＥＧ−ｈＧＨのＰＫ研究を示す。
【図９】全長ｈＧＨ受容体を発現する細胞におけるｈＧＨのバイオアッセイをした図である。
【図１０】動物体重増加の２８日間モニターによる、ｈＧＨ及びＰＥＧ−ｈＧＨを下垂体切除ラットに注射する動物研究を示す図である。
【図１１Ａ】異なる投薬量におけるｈＧＨ及びＰＥＧ−ｈＧＨの、下垂体切除ラットの体重に対する効果を示す図である。データは平均＋／−標準誤差として表示される。陽性対照（Ｇ５）及び試験サンプルを皮下注射によって単回用量として投与した。賦形剤対照（Ｇｌ）及び陽性対照を、皮下注射によって６日間毎日投与した。Ｇ１：賦形剤対照（ｎ＝６）；Ｇ２：陽性対照ｈＧＨ、５μｇ／頭、毎日の注射（ｎ＝９）；Ｇ３：陽性対照ｈＧＨ、１０μｇ／頭、毎日の注射（ｎ＝９）；Ｇ４：陽性対照ｈＧＨ、３０μｇ／頭、毎日の注射（ｎ＝９）；Ｇ５：陽性対照ｈＧＨ、１８０μｇ／頭、単回投与（ｎ＝９）；Ｇ６：試験サンプルＰＥＧ−ｈＧＨ、３０μｇ／頭、単回投与（ｎ＝９）；Ｇ７：試験サンプルＰＥＧ−ｈＧＨ、６０μｇ／頭、単回投与（ｎ＝９）；Ｇ８：試験サンプルＰＥＧ−ｈＧＨ、１８０μｇ／頭、単回投与（ｎ＝９）。図１１Ａは、単一のグラフ上にＧ１〜Ｇ８を示す。図１１ＢはＧ１〜Ｇ４のみを示す。図１１ＣはＧｌ及びＧ５〜Ｇ８のみを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａの続き。図１１ＢはＧ１〜Ｇ４のみを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａの続き。図１１ＣはＧ１及びＧ５〜Ｇ８のみを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【国際調査報告】
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