(57)【要約】卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法が提供される。スクリーニング方法は、身体試料における複数のバイオマーカーの発現の検出を含み、バイオマーカーの過剰発現は、卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。スクリーニング方法はさらに２段階の解析を含み得る。対象のバイオマーカーとしては、例えば、ＤＮＡ複製／細胞周期制御、細胞の増殖、アポトーシスからの逸脱、血管新生もしくはリンパ球新生、または、癌細胞の運動性および浸潤の機構における欠陥に関連する遺伝子およびタンパク質が挙げられる。本発明のいくつかの局面において、バイオマーカーの発現は、バイオマーカー特異的な抗体を用いてタンパク質レベルで、または核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて核酸レベルで検出される。さらに患者において卵巣癌を検出するための方法が本明細書において開示される。さらに本発明の方法を行うためのキットが提供される。
2009524438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法であって、該方法は、以下：
ａ）第一のアッセイ段階を行う工程であって、該第一のアッセイ段階は、身体試料中の第一のバイオマーカーまたは第一のバイオマーカーパネルの発現を検出し、該第一のバイオマーカーまたは該第一のバイオマーカーパネルが過剰発現しているかどうかを決定する工程を含む、工程；ならびに
ｂ）工程ａ）において該第一のバイオマーカーまたは該第一のバイオマーカーパネルが過剰発現していると決定された場合に、第二のアッセイ段階を行う工程であって、該第二のアッセイ段階は、該身体試料中の第二のバイオマーカーまたは第二のバイオマーカーパネルの発現を検出し、該第二のバイオマーカーまたは該第二のバイオマーカーパネルが過剰発現しているかどうかを決定する工程；
を包含し、該第一のバイオマーカーまたは該第一のバイオマーカーパネル、および該第二のバイオマーカーまたは該第二のバイオマーカーパネルの両方の過剰発現は、該患者が卵巣癌を有する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、卵巣癌を有する可能性が高いとして同定された患者をさらなる診断試験に供して、該患者が卵巣癌を有するかどうかを決定し、該さらなる診断試験は、骨盤検査、経膣超音波検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、側腹切開術、腹腔鏡検査および組織および組織試料生検からなる群より選択される、方法。
【請求項３】
現在は卵巣癌を有していないと決定された前記卵巣癌を有する可能性が高いとして同定された患者を、さらに、卵巣癌の発症について、定期ベースでモニターする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
早期段階の卵巣癌を検出するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
各バイオマーカーについての発現の閾値レベルが、各バイオマーカーについての受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットを解析することによって決定され、閾値レベルを超える発現レベルは、特定のバイオマーカーが過剰発現していることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記各バイオマーカーについての発現の閾値レベルが、正常な患者集団における発現レベルに関して決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、請求項１に記載の方法に従ってスクリーニングされた前記患者が、自覚症状がなく、かつ、卵巣癌の家族暦、または、卵巣癌を発症する危険性が高いことを示す臨床危険因子を有する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記スクリーニング方法は、閉経後の女性患者集団において行われる、方法。
【請求項９】
前記身体試料が血液試料または血清試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一および第二のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが、抗体を用いて、タンパク質レベルで検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一および第二のバイオマーカータンパク質またはバイオマーカータンパク質パネルが、ＥＬＩＳＡ形式または多重ビーズベースの免疫学的検定を用いて検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一および第二のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、核酸レベルで検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオマーカーが、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビンＡ、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６、ＳＬＰＩおよびα−１アンチトリプシンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオマーカーが、ＣＡ１２５、ＨＥ４、グリコデリン、ＭＭＰ−７、ＳＬＰＩ、ＰＬＡＵ−Ｒ、Ｍｕｃ−１、インヒビンＡおよびＰＡＩ−１からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一のアッセイ段階の感度が少なくとも約８５％であり、該第一のアッセイ段階の特異性が少なくとも約７５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二のアッセイ段階の感度が少なくとも約８０％であり、該第二のアッセイ段階の特異性が少なくとも約８５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一のアッセイ段階および前記第二のアッセイ段階の組み合わせ感度が少なくとも約７０％であり、該第一のアッセイ段階および該第二のアッセイ段階の組み合わせ特異性が少なくとも約９５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一のアッセイ段階および前記第二のアッセイ段階を含む組み合わせスクリーニング方法の負の予測価（ＮＰＶ）が、少なくとも約９９％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＰＶが少なくとも約８％である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一のアッセイ段階および前記第二のアッセイ段階を含む組み合わせスクリーニング試験が、少なくとも約９０％の感度と、少なくとも約９８％の特異性と、少なくとも約９９．９％のＮＰＶと、少なくとも約１０％のＰＰＶとを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一のバイオマーカーがＨＥ４であり、前記第二のバイオマーカーが、ＣＡ１２５、グリコデリン、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１およびＰＬＡＵ−Ｒを含むパネル、ＣＡ１２５およびＰＡＩ−１を含むパネル、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＰＡＩ−１およびＭＭＰ−７を含むパネル、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＰＡＩ−１およびＰＬＡＵ−Ｒを含むパネル、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＰＡＩ−１およびＰＬＡＵ−Ｒを含むパネル、グリコデリン、Ｍｕｃ−１、ＰＬＡＵ−ＲおよびインヒビンＡを含むパネル、ＣＡ１２５、Ｍｕｃ−１、グリコデリン、ＰＡＩ−１およびＰＬＡＵ−Ｒを含むパネル、ならびにＣＡ１２５、ＭＭＰ−７、グリコデリンおよびＰＬＡＵ−Ｒを含むパネルからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記スクリーニング方法が、自動、半自動または手動の様式で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一のアッセイ段階および前記第二のアッセイ段階が、単一の試験または別個の試験として行われ、該第一のアッセイ段階が第一の試験を包含し、該第二のアッセイ段階が第二の試験を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法であって、該方法は、以下：
ａ）身体試料における複数のバイオマーカーの発現を検出する工程；および
ｂ）数学的モデルを該バイオマーカーの発現レベルのデータに適用して、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記数学的モデルが、最良のバイオマーカーを選択するためのロジスティック段階回帰モデル、およびバイオマーカーについてのベストカットオフポイントを選択するために使用される受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
早期段階の卵巣癌を検出するために使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
スクリーニングされる前記患者は自覚症状がなく、かつ、卵巣癌の家族暦、または、卵巣癌を発症する危険性が高いことを示す臨床危険因子を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記スクリーニング方法が、閉経後の女性患者集団において行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記身体試料が血液試料または血清試料である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数のバイオマーカーが、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビンＡ、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６、ＳＬＰＩ、およびα−１アンチトリプシンからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数のバイオマーカーが、ＨＥ４、ＣＡ１２５およびグリコリデンからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するための、１段階のスクリーニング方法であって、該方法は、身体試料において、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビンＡ、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６、ＳＬＰＩおよびα−１アンチトリプシン、グリコデリン、ＨＥ４およびＣＡ１２５からなる群より選択される少なくとも３つのバイオマーカーの発現を検出する工程を包含し、該バイオマーカーのうちの少なくとも１つの過剰発現は、該患者が卵巣癌を有する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項３３】
ＨＥ４、グリコリデンおよびＣＡ１２５からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーの過剰発現は、前記患者が卵巣癌を有する可能性が高いことを示す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
複数の抗体を含むキットであって、該抗体の各々は、卵巣癌において選択的に過剰発現される別個のバイオマーカータンパク質に特異的に結合し、該バイオマーカータンパク質は、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビンＡ、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６、ＳＬＰＩおよびα−１アンチトリプシンからなる群より選択される、キット。
【請求項３５】
前記バイオマーカータンパク質が、ＣＡ１２５、ＨＥ４、グリコデリン、ＭＭＰ−７、ＳＬＰＩ、ＰＬＡＵ−Ｒ、Ｍｕｃ−１、インヒビンＡおよびＰＡＩ−１からなる群より選択される、請求３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記バイオマーカータンパク質に結合する抗体を検出するための化学物質をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
請求項１に記載のスクリーニング方法を単一の試験として行うためのキットであって、該試験は、前記第一のアッセイ段階および前記第二のアッセイ段階を含む、キット。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法の前記第一のアッセイ段階および前記第二のアッセイ段階を行うための、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、卵巣癌を有する可能性の高い女性を同定するための方法および組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
卵巣癌は、世界規模で女性を冒している雑多な群の疾患に相当する。卵巣癌にはいくつかの形態があり、これらとしては、上皮癌、卵巣の生殖細胞癌、および卵巣基質癌が挙げられる。上皮卵巣癌は、この疾患の最も一般的な形態に相当する。上皮卵巣癌の約５〜１０％が、遺伝性の疾患形態に相当し、そして、以下の３つの一般的なパターンが認識されている：卵巣癌のみ；それぞれ、染色体１７ｑ２１および１３ｑ１２にあるＢＲＡＣ１およびＢＲＣＡ２に関連した卵巣癌および乳癌；ならびに、卵巣癌および結腸癌。卵巣癌についての最も重要な危険因子は、疾患を有する一親等血族（例えば、卵巣癌を有する母親、姉妹、または娘）である。例えば、非特許文献１を参照のこと。２００５年には、推定２２，０００人の卵巣癌の新規症例が診断され、そして、１６，０００人が卵巣癌により死んでいた。概略的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙのウェブサイト（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）を参照のこと。卵巣癌は、主に、閉経後の女性を冒す疾患であり、診断時の中央年齢が６３歳である。しかし、この疾患は、全ての年齢群の女性を冒し得る。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｅｎｄ  結果ｓ（ＳＥＥＲ）Ｐｒｏｇｒａｍ（ｗｗｗ．ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）。
【０００３】
卵巣癌の段階の分類は、卵巣を越えた疾患の拡がりに対する、局在性の程度に基づく。段階１の卵巣癌は、一方または両方の卵巣に限定される。段階２の疾患は、一方または両方の卵巣に腫瘍を含み、骨盤への拡大を伴う。段階３の卵巣癌においては、腫瘍は、一方または両方の卵巣に存在し、骨盤の外側への腹腔内転移および／または局部的なリンパ節転移が顕微鏡により確認される。段階４の卵巣癌は、腹腔を越えた遠隔性の転移により特徴付けられる。卵巣癌は一般に、小さな腫瘍の存在を示す特定の臨床症状がないことから、疾患の進行した段階において診断される。５０歳以下の女性について、腫瘍が一方または両方の卵巣に局在するとき、および、疾患の予後が最良であるとき、卵巣癌の４０％未満が検出される。５０歳以上の女性について、この数値は、１５％未満まで落ちる。卵巣癌を罹患した全ての年齢群の女性の約６８％が、遠隔性の転移が生じるまで診断されない。概略的には、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｅｎｄ  結果ｓ（ＳＥＥＲ）Ｐｒｏｇｒａｍ（ｗｗｗ．ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）を参照のこと。
【０００４】
卵巣癌は、卵巣上皮から腹腔内への局所的な脱殻により拡がり、その後、腹腔への移植性転移と、腸および膀胱への局所的な浸潤が起こる。卵巣癌におけるリンパ節の関与の存在は、診断された卵巣癌の全段階において明白である。陽性のリンパ節の割合は、疾患の進行と共に有意に増加する（すなわち、段階１では２４％；段階２では５０％、段階３では７４％；段階４では７３％）。同著。
【０００５】
卵巣癌を有する患者の生存は、疾患が診断された段階の関数であり、５年の生存は、疾患の進行と共に減少する。段階１で卵巣癌と診断された女性の９０％より多くが、診断後少なくとも５年生存する。疾患が段階４（すなわち、遠隔性の転移）まで診断されないとき、５年生存率は３０％未満まで低下する。同著。
【０００６】
上皮卵巣癌は、この疾患の最も一般的な形態である。上皮卵巣癌には、４つの主要な組織学的分類が認識されており、これらとしては、重篤、類内膜、明細胞および粘液性のサブタイプが挙げられる。卵巣癌の病理は理解が不十分であるが、卵巣表面上皮から生じるものと考えられる。非特許文献２を参照のこと。卵巣癌の危険性を最大限減らす生活上の要因としては、多産、経口避妊薬の使用および授乳が挙げられ、これらは全て、排卵を防ぐものである。排卵は、上皮に損傷と、その後の修復と、炎症性応答の可能性とをもたらすので、女性の生殖寿命を通してこのプロセスを中断なしに繰り返すことは、細胞の損傷につながり、そして、卵巣癌の危険性を増すようである。例えば、非特許文献３を参照のこと。しかし、卵巣癌には、子宮頚部癌および結腸癌の両方に認められるような、明確に定められた前兆となる病変を経た段階的な進行は認められない。したがって、かなりの研究が、卵巣癌についての分子ベースでの理解と、卵巣癌の種々の組織学的サブタイプ間での基本的な差異を理解することに向けられている。これらの研究は、遺伝子発現解析を利用してこの理解をもたらし、そして、診断用途における評価のための一連の強力なバイオマーカーを同定した。例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７を参照のこと。
【０００７】
卵巣癌はしばしば、明白な臨床症状の表出、最も特筆すべきは、腹部疼痛、子宮付属器塊、腹部鼓張および尿意促迫の表出により検出される。したがって、卵巣癌の検出は、しばしば、進行した段階で検出され、この進行した段階では、予後および臨床上の結果は乏しい。早期段階（すなわち段階１）での卵巣癌の検出は、標準的な外科手術および化学療法を用いて、約９０％の治癒率をもたらす；したがって、処置が最も有効な早期段階において卵巣癌を検出する臨床上の必要性が存在する。残念なことに、早期段階の卵巣癌を検出するための現在のスクリーニング方法は不十分である。卵巣癌のスクリーニングのための現在の実務は、ＣＡ１２５および経膣超音波検査（ｔｒａｎｓｖａｇｉｎａｌ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）（超音波検査法）を用いる。ＣＡ１２５血清レベルの上昇は、卵巣癌に関連しており、そして、その後の経膣超音波検査の利用は、卵巣癌の存在を検出する助けとなる。卵巣疾患の確認は、側腹切開術のような侵襲性の処置に基づく。しかし、ＣＡ１２５の使用は、限られた感度、限られた特異性、および３％未満の乏しい正の予測価の問題に起因して、一般集団のスクリーニングには役に立たない。非特許文献８。結果として、自覚症状のない患者集団において卵巣癌について広くスクリーニングすることについての勧告には総意はない。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）を参照のこと。危険性の高い患者については、卵巣癌の検出のための広く容認された処置としては、骨盤検査の使用、ＣＡ１２５血清試験の使用および経膣超音波検査（超音波検査法）が挙げられる。非特許文献９。
【０００８】
ＣＡ１２５は、上皮細胞表面に通常発現される、十分に特徴付けられた腫瘍マーカーであり、そして、しばしば、正常患者の血清において３５Ｕ／ｍＬで検出される。ＣＡ１２５の血清レベルの上昇（＞３５Ｕ／ｍＬ）は、しばしば、卵巣癌患者の約８５％において検出される；卵巣癌患者の残り１５％は、ＣＡ１２５の正常な血清レベルを有する。さらに、ＣＡ１２５は、段階１の卵巣癌患者の５０％のみにおいて上昇し、それによって、卵巣癌の早期検出における臨床上の有用性を制限している。しかし、ＣＡ１２５の血清レベルの上昇は、治療的介入の後に疾患の再発をモニタリングするために使用され、そして、これは、ＦＤＡにより現在承認されているＣＡ１２５の使用に相当する。さらに、ＣＡ１２５の血清レベルの上昇は、将来的に検出され得る卵巣癌の前兆となる。
【０００９】
一般集団における卵巣癌の低い罹患率は、疾患の早期検出を促進するスクリーニング試験の開発にとって、重要な難題をもたらす。卵巣癌のような低い罹患率を有する疾患についてのスクリーニング方法は、しばしば、真の陽性に対する偽陽性の高い割合をもたらし、このようなスクリーニングプログラムの臨床上の有用性を制限する。卵巣癌の可能性についての外科的な調査に関連するかなり大きな危険性を鑑みると、臨床上有用なスクリーニング試験は、実際に卵巣癌を有する全ての女性につき、１０以下の女性に手術を行うこと（すなわち、少なくとも１０％の正の予測価（ＰＰＶ））と解釈すべきである。非特許文献１０。ＰＰＶは、特定の疾患または状態についての罹患率に高度に依存し、そして、疾患の罹患率における差異の結果として劇的に変化する。従って、卵巣癌のような罹患率の低い疾患では、比較的低いＰＰＶのスクリーニング診断試験が、有意な臨床上の有用性を有する。強力な卵巣癌スクリーニングプログラムは、卵巣癌の低い罹患率について調節され、そして、バイオマーカーの性能および臨床上の必要性に対して評価されなければならない。例えば、非特許文献１０;非特許文献１１;および非特許文献１２を参照のこと。卵巣癌の検出（特に、早期検出）のためのバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルを同定しようとする試みにもかかわらず、臨床上の必要性を満たす適切なスクリーニング試験または診断試験は現在のところ存在しない。ＣＡ１２５の検出のような現在利用可能な方法は、容認でいない高い偽陽性率を呈する。
【００１０】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの現在の勧告は、「ＣＡ１２５のような血清マーカー、経膣超音波検査または骨盤検査を用いた卵巣癌のスクリーニングは、卵巣癌からの死亡率の減少をもたらすということを確立する証拠は不十分である」と示している（ＮＣ／Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ（レベル４、５）；２００５年２月付け）。現在利用可能なスクリーニング技術での偽陽性の深刻な危険性に鑑みて、ＮＣＩは、卵巣癌についての一般的なスクリーニング手順の規則を支持していない。したがって、早期の診断が５年生存率を有意に改善するという事実にもかかわらず、卵巣癌についての標準的なスクリーニング試験は存在しない。
【非特許文献１】Ｐａｔｒｉｄｇｅら（１９９９）ＣＡ−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４９：２９７−３２０
【非特許文献２】Ｂｅｌｌ（２００５）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１８（補遺２）：Ｓ１９−３２
【非特許文献３】Ｎｅｓｓら（１９９９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９１：１４５９−１４６７
【非特許文献４】Ｏｎｏら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：５００７−１１
【非特許文献５】Ｗｅｌｓｈら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１７６−１１８１
【非特許文献６】Ｄｏｎｎｉｎｇｅｒら（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：８０６５−８０７７
【非特許文献７】Ｌｅｅら（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ  ２４（４）：８４７−８５１
【非特許文献８】Ｂａｓｔ（２００３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２１（第１０補遺）：２００−２０５
【非特許文献９】Ｐａｔｒｉｄｇｅら（１９９９）ＣＡ−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４９：２９７−３２０
【非特許文献１０】Ｓｋａｔｅｓら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：４０５９−４０６６
【非特許文献１１】Ｂａｓｔら（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  １５：２７４−２８１
【非特許文献１２】Ｒｏｓｅｎら（２００５）Ｇｙｎ．Ｏｎｃｏｌ．９９：２６７−２７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、卵巣癌を有する女性を特異的に同定し得る、信頼性のある方法および組成物に対するかなりの必要性が当該分野において存在する。特に、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法が必要とされる。卵巣癌を有する可能性が高いとして同定された女性が、現在その疾患を有するかどうかを確実に決定するためのより積極的な診断方法について選択され得る。さらに、このようなスクリーニング方法は、一般的な女性患者集団において、定期ベースで行われて、予後および疾患の結果が最良である疾患の早期段階において卵巣癌を検出することを容易にし得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法が提供される。本発明の方法は、一般に、患者の身体試料において、卵巣癌において選択的に過剰発現される複数のバイオマーカーの発現を検出する工程を包含する。これらのバイオマーカーの過剰発現はその患者が卵巣癌を有する可能性が高いということを示す。本発明の方法は、例えば、「２段階」の解析を含み得、ここで、第一のアッセイ段階は、第一のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの発現を検出するために行われる。第一のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが過剰発現される場合、第二のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの発現を検出するために第二のアッセイ段階が行われる。第一および第二のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの過剰発現は、その患者が卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。第一のアッセイ段階は、「真の陰性」の女性の大部分を排除することによって、再検討中の患者集団を富化するために設計され得る。第二のアッセイ段階は、代表的には、富化した集団からさらに真の陰性の患者を排除することによって、富化された集団において、現在は卵巣癌を有さない患者を除外するために意図される。これらのアッセイ段階は、両方のアッセイ段階を包含する単一の試験として、または、各試験が１つのアッセイ段階を包含する２つの別個の試験として行われ得る。各解析段階において単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルを使用して、感度、特異性、負の予測価（ＮＰＶ）および正の予測価（ＰＰＶ）について所望の値が達成され得る。別個のアッセイ段階における特定のバイオマーカーを組み合わせて、所望の感度、特異性、ＮＰＶおよびＰＰＶを達成するためのアルゴリズムが開発され得る。
【００１３】
本発明の他の局面において、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法は、患者の身体試料において、卵巣癌において選択的に過剰発現される複数のバイオマーカーの過剰発現が評価される、「単１段階」または「１段階」アッセイを行う工程を包含する。これらのバイオマーカーの過剰発現は、その患者が卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。上述の２段階のスクリーニング方法とは対照的に、この単１段階のスクリーニングアッセイは、卵巣癌を有する可能性が高い患者を同定するために、特定のバイオマーカーの過剰発現を検出するための第一のアッセイ段階を行った後に、第二のバイオマーカーがまた過剰発現されているかどうかを評価するための第二のアッセイを行う必要がない。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法によって、卵巣癌を有する可能性が高いとして同定された患者は、その患者が卵巣癌を有するかどうかを確実に決定するために、さらなる診断試験に供され得る。本明細書において開示される方法に従って、卵巣癌を有する可能性が高いとして分類されたが、現在は疾患を有さないと決定された患者は、一般に、卵巣癌の発症について定期ベースでモニタリングされる。さらに、本発明の方法は、一般的な女性患者集団を、定期ベースで卵巣癌についてスクリーニングするために使用され得る。したがって、本発明のスクリーニングほほ得は、予後が有意に良好である疾患のより早い段階での卵巣癌の診断を可能にし得る。本発明のスクリーニング方法を行うためのキットもまた提供される。
【００１５】
バイオマーカーの発現は、タンパク質レベルまたは核酸レベルで評価され得る。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの発現は、バイオマーカー特異的な抗体を用いて、タンパク質レベルで検出される。本発明のバイオマーカーの発現はまた、核酸ベースの技術（例えば、ハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲが挙げられる）によっても検出され得る。バイオマーカーの発現は、種々の身体試料において評価され得、その身体試料としては、血液（全血、血清、血小板を除去した血液など）、リンパ液、腹水、尿、婦人科学液（例えば、卵巣分泌物、卵管分泌物および子宮分泌物、経血など）、生検、および腹腔鏡検査の間に得られる流体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
患者において卵巣癌を診断するための方法もまた、本発明によって包含される。この診断方法は、一般に、身体試料において、卵巣癌において選択的に過剰発現される複数のバイオマーカーの発現を検出する工程を包含する。複数のバイオマーカーの過剰発現は、卵巣癌の存在を示す。本発明の診断方法を行うためのキットもまた提供される。
【００１７】
患者において卵巣癌についての特定の治療の効率を評価するための方法もまた本明細書において開示される。本発明はさらに、患者において卵巣癌の退行または進行をモニタリングするための方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、卵巣癌を有する患者を同定するためのスクリーニング方法および組成物を提供する。スクリーニング方法は、一般に、患者からの身体試料（具体的には、血液試料、より具体的には、血清試料）において複数のバイオマーカーの発現を検出する工程を包含する。本発明の実施において使用されるバイオマーカーの過剰発現は、卵巣癌の存在の可能性が高いことを示す。本発明の特定のスクリーニング方法において、卵巣癌を有する可能性が高い患者を同定するために２段階解析が用いられる。第一のアッセイ段階は、患者の身体試料において第一のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの発現を検出するために行われる。第一のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが試料中で過剰発現していると決定される場合、第二のアッセイ段階が、第二のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの発現を検出するために行われる。第一および第二のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの過剰発現は、その患者が卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。特定の実施形態において、バイオマーカータンパク質の発現を検出するために抗体が使用される。本発明の他の局面において、バイオマーカーの発現が検出されるとき、解析されるバイオマーカーのサブセットのみの過剰発現が、その患者が卵巣癌を有する可能性が高いことを示すに十分であり得る。
【００１９】
本発明は、特定の機構に制限されないが、第一のアッセイ段階は、一般に、さらなる試験から、多数の真の陰性を排除することによって、真の陽性の患者集団を富化する（すなわち、割合ベースで）ように設計される。第一のアッセイ段階は、真の陽性患者集団の所望される富化を達成するために、より高い感度および負の予測価（ＮＰＶ）を用い得る。第二のアッセイ段階は、代表的に、富化された集団において現在は卵巣癌を有さない患者を除外するため、すなわち、富化された集団からさらに真の陰性を排除することが意図される。第二のアッセイ段階は、真の陽性患者の富化された集団から、さらに陰性を排除するために、適度な感度は維持したまま、より高い特異性および正の予測価（ＰＰＶ）を用い得る。２段階スクリーニング試験の概念図とこの方法を用いて得られ得る結果を図１に提供する。
【００２０】
当業者は、これらのアッセイ段階が、両方のアッセイ段階を包含する単一のスクリーニング試験として、または、各試験が１つのアッセイ段階を包含する２つの別個の試験として行われ得ることを認識する。感度、特異性、ＮＰＶおよびＰＰＶについて所望の値を達成するために、単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが、各アッセイ段階において使用され得る。各アッセイ段階および両方のアッセイ段階を含む組み合わせのスクリーニング試験について所望の感度、特異性、ＮＰＶおよびＰＰＶを達成するために、特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせを選択するために、アルゴリズムが開発され得る。
【００２１】
本明細書において上述される２段階解析に加え、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法は、「１段階」または「２段階」のスクリーニング方法またはアッセイを行う工程を包含し、ここで、患者の身体試料における、卵巣癌において選択的に過剰発現される複数のバイオマーカーの発現が評価される。少なくとも１つのバイオマーカーの過剰発現は、その患者が卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。本発明の特定の局面において、単１段階または１段階のスクリーニング方法は、身体試料において、複数のバイオマーカー（例えば、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン（ｇｌｙｃｏｄｅｌｉｎ）、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビンＡ、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６、ＳＬＰＩおよびα−１アンチトリプシンが挙げられる）の発現を検出する工程を包含し、ここで、少なくとも１つ、具体的には２つ、より具体的には３つのバイオマーカーの過剰発現は、卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。本発明の単１段階スクリーニング方法の特定の実施形態において、グリコデン、ＨＥ４およびＣＡ１２５の発現が評価され、そして、これらのバイオマーカーのうちの少なくとも１つ、２つまたは３つの過剰発現は、卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。例えば、表５４および実施例４を参照のこと。当業者は、上述の２段階スクリーニング方法とは対照的に、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するために、単１段階のスクリーニングアッセイが、特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの過剰発現を検出するために第一のアッセイ段階を行った後に、第二のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルもまた過剰発現されているかどうかを評価するために第二のアッセイ段階を行うことを必要としないことを理解する。したがって、「真の陽性」の患者について集団を富化するための第一のアッセイ段階と、この富化された集団から実際には卵巣癌を有さない患者（「偽陽性」）を除外するための第二のアッセイ段階とは、本明細書中に記載される単１段階のスクリーニング方法においては必要とされない。
【００２２】
「過剰発現」を構成するに十分な特定のバイオマーカーの発現レベルは、使用される特定のバイオマーカーに依存して変化する。本発明の特定の実施形態において、発現の「閾値レベル」は、特定のバイオマーカーについて確立され、ここで、この値を超える発現レベルは、過剰発現とみなされる。発現の閾値レベルを確立するための種々の統計的方法および数学的方法は当該分野で公知である。特定のバイオマーカーについての閾値発現レベルは、例えば、実施例２および３に記載されるように、受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットからのデータに基づいて、または、正常患者の試料（すなわち、正常な患者集団）からのデータを編集したものに基づいて、選択され得る。例えば、閾値発現レベルは、卵巣癌に冒されていない正常患者からの試料の解析に基づいて、平均発現レベル＋２×標準偏差において確立され得る。当業者は、これらの閾値発現レベルが、例えば、感度、特異性、正の予測価（ＰＰＶ）および負の予測価（ＮＰＶ）について種々の値を得るために特定のバイオマーカーについてのＲＯＣプロットに沿って動かすことによって変えられ得、それによって、アッセイの全体的な性能に影響を及ぼし得ることを理解する。
【００２３】
開示される方法に従って卵巣癌を有する可能性が高いとして同定された患者は、その患者が卵巣癌を有するかどうかを確実に決定するためにさらなる診断試験に供され得る。「さらなる診断試験」としては、骨盤検査、経膣超音波検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、側腹切開術、腹腔鏡検査および生検が挙げられるがこれらに限定されない。このような診断方法は、当該分野で周知である。さらに、このさらなる診断試験により卵巣癌を有する可能性が高いとして決定されたが、現在は卵巣癌を有さないと分類された患者は、卵巣癌の発症について、定期ベースで密にモニタリングされ得る。このような患者のモニタリングとしては、定期的な骨盤検査、経膣超音波検査、ＣＴスキャンおよびＭＲＩが挙げられ得るがこれらに限定されない。当業者たる医師は、卵巣癌の発症について患者をモニタリングするための適切な技術を理解する。卵巣癌を有する可能性が高い患者を同定し、そしてモニタリングすることによって、本発明のスクリーニング方法は、予後および疾患の結果が大いに改善される、疾患の早期段階（特に、段階１または段階２）での卵巣癌の検出を亜可能にし得る。
【００２４】
特定の実施形態において、バイオマーカーの発現をタンパク質レベルで検出するために抗体が使用される。本発明の他の局面においては、バイオマーカーの発現は、核酸レベルで検出される。２段階のスクリーニング方法を含め、本発明のスクリーニング方法を行うためのキットもさらに提供される。
【００２５】
「卵巣癌」により、後期予備（ｐｏｓｔ−ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ）側腹切開術によって、前悪性病理、悪性病理および癌（ＦＩＧＯ段階１〜４）として分類された状態が意図される。卵巣癌の段階分けおよび分類は上に詳細に記載される。「早期段階の卵巣癌」とは、段階１または段階２の癌腫として分類される疾患状態を指す。卵巣癌の早期検出は、５年生存率を有意に増加させる。用語「スクリーニング方法」は、卵巣癌を有する可能性が高い患者を同定し、その結果、このような患者が、その患者が卵巣癌を有するかどうかを確実に決定するためのより積極的な診断方法について選択され得るような戦略をいう。本発明の「スクリーニング方法」または「診断的スクリーニング方法」は、一般に、卵巣癌を有するか、または卵巣癌を有さない患者を確実に診断することは意図されない。むしろ、このような方法は、卵巣癌を有する可能性の高い女性を同定し、その結果、これらの女性が他の方法（例えば、骨盤検査、経膣超音波検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、側腹切開術、腹腔鏡検査および組織試料の生検）を用いて確実に診断され得ることが意図される。本発明の方法により卵巣癌を有する可能性が高いとして同定されたが、現在はその疾患を有すると決定されない患者をモニタリングするためのレジメンもまた設けられ得る。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法は、一件一件ベースで、または、一般の女性集団についての定期的な慣用のスクリーニング試験として行われ得る。いくつかの実施形態において、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法は、卵巣癌を有する可能性の高い患者の同定のためのＰａｐ塗布標本（Ｐａｐ  ｓｍｅａｒ）に匹敵するものとして考えられ得る。本明細書中で使用される場合、「卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定すること」とは、卵巣癌を有する可能性がより高い女性を検出するための方法が意図される。「卵巣癌を有する可能性が高い」とは、本発明の方法に従って、特定のバイオマーカーの過剰発現を示すと決定された患者が、過剰発現を示さない患者よりも卵巣癌を有する可能性が高いことを意味することが意図される。
【００２７】
「卵巣癌と診断すること」とは、例えば、卵巣癌の存在を診断もしくは検出すること、疾患の進行をモニタリングすること、そして、卵巣癌の指標となる細胞もしくは試料を同定もしくは検出することを含むことが意図される。用語  卵巣癌の診断、検出、および同定は、本明細書中で交換可能に使用される。卵巣癌の確実な診断は、一般に、患者からの組織試料について生検を行うことを含む。
【００２８】
本発明の方法は、当該分野で現在公知の推奨されるスクリーニング方法（例えば、ＣＡ１２５レベルの測定）と比較して、卵巣癌を有する可能性のより優れた評価を可能にする。本明細書中で使用される場合、「特異性」とは、予備的な側腹切開術により非悪性であるとして確認された（すなわち、真の陰性の）試料を、本発明の方法が正確に同定し得るレベルをいう。すなわち、特異性は、試験陰性である、疾患の陰性の割合である。臨床研究において、特異性は、真の陰性の数を、真の陰性と偽陽性の合計で割ることによって計算される。「感度」により、側腹切開術によって卵巣癌について陽性と確認された（すなわち、真の陽性の）試料を、本発明の方法が正確に同定し得るレベルが意図される。したがって、感度は、試験陽性である、疾患の陽性の割合である。感度は、臨床研究において、真の陽性の数を、真の陽性と偽陰性の合計で割ることによって計算される。卵巣癌の検出についての開示される方法の感度は、少なくとも約７０％であり、具体的には、少なくとも約８０％であり、より具体的には、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれ以上である。さらに、本発明の方法の特異性は、少なくとも約％であり、具体的には、少なくとも約８０％であり、より具体的には、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれ以上である。
【００２９】
用語「正の予測価」すなわち「ＰＰＶ」は、本発明の方法において陽性の試験結果を有し、実際に卵巣癌を有する患者の割合をいう。ＰＰＶは、臨床研究において、真の陽性の数を、真の陽性と偽陽性の合計で割ることによって計算される。ＰＰＶは、特定の疾患または状態についての罹患率に高度に依存し、そして、疾患の有病率における差の結果として劇的にシフトする。したがって、卵巣癌のような有病率が低い疾患では、比較的低いＰＰＶを持つスクリーニング試験がなお臨床上有意な有用性を有する。対照的に、高い罹患率を持つ疾患では、臨床上有用であるためには、より高いＰＰＶを必要とする。例えば、Ｓｋａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：４０５９−４０６６；Ｂａｓｔ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  １５：２７４−２８１；Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇｙｎ．Ｏｎｃｏｌ．９９：２６７−２７７；およびＰｅｐｅ（２００４）Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと（これらは全て、その全体が本明細書中に参考として援用される）。卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定する本発明の方法についてのＰＰＶは、一般に、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、本発明の方法のＰＰＶは、少なくとも約１０％である。診断用のスクリーニング方法についての少なくとも約１０％のＰＰＶは、当該分野で臨床上有用であるとみなされる。Ｓｋａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ，上掲を参照のこと。試験の「負の予測価」すなわち「ＮＰＶ」は、陰性の試験結果を有し、実際に卵巣癌を有さない患者の割合をいう。ＮＰＶは、臨床研究において、真の陰性の数を、真の陰性と偽陰性の合計で割ることによって計算される。卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定する本発明の方法についてのＮＰＶは、一般に、少なくとも約８０％であり、具体的には少なくとも約９０％であり、より具体的には少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、本発明の方法のＮＰＶは、少なくとも約９９％である。当業者は、本発明の方法についてのＰＰＶおよびＮＰＶの値が、有病率で調整された集団に基づくものであり、そして、米国の女性集団内での卵巣癌の罹患率を反映するものであることを理解する。
【００３０】
「バイオマーカー」は、正常または健康な細胞または組織における発現レベルと比較して、組織または細胞における発現レベルが変化する、任意の遺伝子またはタンパク質である。本発明のバイオマーカーは、卵巣癌選択的である。「卵巣癌において選択的に過剰発現する」により、その関心のあるバイオマーカーが、卵巣癌においては過剰発現するが、非悪性、良性として分類される状態および臨床上の疾患とみなされない他の状態においては過剰発現しないことが意図される。したがって、本発明のバイオマーカーの検出は、卵巣癌を有する可能性が増加したことまたは卵巣癌の存在を示す試料を、正常試料（すなわち、卵巣癌を有さない患者からの試料）および非悪性および良性の増殖を示す試料と区別することを可能にする。本発明のバイオマーカーは、本明細書中で、「卵巣癌バイオマーカー」、「マーカー」または「卵巣癌マーカー」として交換可能に言及され得る。
【００３１】
本発明のバイオマーカーは、遺伝子およびタンパク質を含む。このようなバイオマーカーは、バイオマーカーをコードする核酸配列の全配列もしくは部分配列またはこのような配列の相補体を含むＤＮＡを含む。バイオマーカー核酸はまた、任意の関心のある核酸配列の全配列もしくは部分配列を含むＲＮＡを含む。バイオマーカータンパク質は、本発明のＤＮＡバイオマーカーによってコードされるか、またはこれに対応するタンパク質である。バイオマーカータンパク質は、任意のバイオマーカータンパク質もしくはポリペプチドの全アミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含む。バイオマーカー遺伝子およびバイオマーカータンパク質のフラグメントおよび改変体もまた、本発明により企図される。「フラグメント」により、ポリヌクレオチドの一部、またはアミノ酸配列と、したがって、それらによりコードされるタンパク質の一部が意図される。バイオマーカーヌクレオチド配列のフラグメントであるポリヌクレオチドは、一般に、少なくとも１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００もしくは１４００の連続するヌクレオチド、または、本明細書中に開示される全長バイオマーカーポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド数までのヌクレオチドを含む。バイオマーカーポリヌクレオチドのフラグメントは、一般に、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００もしくは２５０の連続するアミノ酸、または、本発明の全長バイオマーカータンパク質中に存在するアミノ酸の総数までのアミノ酸をコードする。「改変体」は、実質的に同様の配列を意味することが意図される。一般に、本発明の特定のバイオマーカーの改変体は、配列アラインメントプログラムにより決定されるとき、そのバイオマーカーに対して、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００３２】
本発明のバイオマーカーは、本明細書において上に定義されるように、卵巣癌において選択的に過剰発現する任意の遺伝子またはタンパク質を含み、そして、当該分野で公知のバイオマーカーおよび当該分野で公知ではないバイオマーカーを含み得る。特定の実施形態において、バイオマーカーは、分泌タンパク質、または、膜貫通セグメントおよび細胞外ドメインを有する膜タンパク質をコードすると予測されるタンパク質である。関心のあるバイオマーカーとしては、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビン、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６およびＳＬＰＩ、α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、Ｉｍｐ−２、ＦＬＪ１０５４６、ＦＬＪ２３４９９、ＭＧＣ１３０５７、ＳＰＯＮ１、Ｓ１００Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＴＡＣＳＴＤ２、ＭＢＧ２、ＨＥＴＫＬ２７（ＭＡＬ２）、Ｃｏｘ−１、プロテインキナーゼＣ−ι、カドヘリン−６、ＡＤＰＲＴ、マトリプターゼ（ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ）、葉酸レセプター（ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、クラウディン（ｃｌａｕｄｉｎ）４、メゾテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、アクアポリン（ａｑｕａｐｏｒｉｎ）５、コフィリン（ｃｏｆｉｌｉｎ）１、ゲルソリン、クラステリン（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、αテトラネクチン、ビトロネクチン、妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）、およびフォリスタチン（ｆｏｌｉｓｔａｔｉｎ）が挙げられる。特に関心のあるバイオマーカーとしては、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビン、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６、ＳＬＰＩおよびα−１  アンチトリプシン（ＡＡＴ）が挙げられるがこれらに限定されない。より特に関心のあるバイオマーカーとしては、ＨＥ４、グリコデリン、ＭＭＰ−７、ＳＬＰＩ、ＰＬＡＵ−Ｒ、Ｍｕｃ−１、インヒビンＡおよびＰＡＩ−１が挙げられる。
【００３３】
ＨＥ４は、ヒト精巣上体組織において最初に観察されたタンパク質であり、この「ＨＥ４」という名前は、「ヒト精巣上体タンパク質４（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）」の略称である。その後の研究から、ＨＥ４タンパク質はまた、女性の生殖管および他の上皮組織にも存在することが示されている。ＨＥ４遺伝子は、ヒトの染色体２０ｑ１２−１３．１に存在し、そして、２０ｑ１２染色体領域は、卵巣癌腫において頻繁に増幅されているのが見出されている。研究により、ＨＥ４が卵巣癌細胞によって発現されることが示されている。タンパク質は、Ｎ末端グリコシル化されており、そして、細胞外に分泌される。例えば、Ｄｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５（６）：２１６２−９；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：３６９５−３７００；およびＢｉｎｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：２７６８−２７７３を参照のこと。
【００３４】
ＣＡ−１２５は、卵巣上皮癌（ＯＥＣ）を有する患者の大部分の血清中で検出される、高分子量の細胞表面糖タンパク質である。しかし、この疾患の進行した段階においてはその割合は高い（７５〜９０％）が、これは、段階１の疾患を持つ患者では５０％でしか上昇していない。ＯＥＣについてのマーカーとしてＣＡ−１２５を用いることは、不確実である。なぜならば、この分子はまた、多数の正常な状態、ならびに、月経、妊娠、子宮内膜症、炎症性疾患および他のタイプの癌を含む病理学的状態においても発現されるからである。閉経後の女性の間で、ＯＥＣについて改善した感度および特異性が報告されている。例えば、Ｂａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  １３：１７０−１８７；およびＭｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５８：３０８−３１２を参照のこと。
【００３５】
グリコデリンは、主として生殖器軸における細胞の認識および分化において、いくつかの特有の作用を有するリポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）スーパーファミリーのメンバーである。以前に、この糖タンパク質は、プロゲステロン関連子宮内膜タンパク質（ＰＡＥＰ）および骨盤タンパク質１４（ＰＰ−１４）と命名されている。この名称変更は、部分的には、グリコデリンが、子宮内膜または骨盤によって合成されないことに起因する。グリコデリンは、ＳＤＳゲルにおいて２８ｋＤａの分子として羊水から精製され、そして、正常な卵巣によって、および悪性の卵巣腫瘍によって合成されると報告されている。血清においてもその存在が報告されている。一般的には、Ｓｅｐｐａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３：４０１−４３０；Ｐａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  ７０４：２５−３４；Ｍｅｅｒｉｔ  Ｋａｍａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １４８：１４３５−１４４３を参照のこと。
【００３６】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質は、胚発生、生殖、および組織の再構築のような正常な生理学的プロセスにおける、ならびに、関節炎および転移のような疾患のプロセスにおける、細胞外マトリックスの分解に関与している。多くのＭＭＰは、細胞外プロテイナーゼにより切断されるときに活性化される、不活性な前タンパク質として分泌される。ＭＭＰ−７（マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ））遺伝子によりコードされる酵素は、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチンおよびカゼインを分解し、そして、保護されたＣ末端タンパク質ドメインを持たないという点で多くのＭＭＰファミリーと異なる。この酵素は、創傷治癒に関与し、そして、マウスでの研究は、腸粘膜におけるディフェンシンの活性を調節することを示唆している。ＭＭＰ−７遺伝子は、染色体１１ｑ２２．３に局在するＭＭＰ遺伝子のクラスターの一部である。ＭＭＰ−７は、正常組織および疾患組織の上皮細胞において発現される。とりわけ、胸部、結腸および前立腺の腫瘍において発現されることが知られる。この遺伝子は、卵巣癌細胞において豊富であるが、正常な卵巣上皮組織においてはＩＨＣによって検出可能ではない。
【００３７】
Ｍｕｃ−１（ムチン１、ＥＭＡ、ＰＥＭ、エピシアリン（ｅｐｉｓｉａｌｉｎ））は、多くの腺および管の上皮細胞、ならびに、いくつかの造血細胞系統によって発現される、大きな細胞表面ムチン糖タンパク質である。機能的には、Ｍｕｃ−１は、細胞の保護および潤滑に関与していると考えられ、そして、細胞接着および／または細胞のシグナル伝達において役割を担い得る。Ｍｕｃ−１遺伝子は、７つのエクソンを含み、いくつかの異なる選択的スプライシング改変体を生成する。Ｍｕｃ−１から発現される主要な形態は、７つ全てのエクソンを使用し、そして、大きな細胞外縦列反復ドメインを持つ１型膜貫通タンパク質である。この縦列反復ドメインは、高度にＯ−グリコシル化されており、そして、グリコシル化における変化が上皮癌細胞において示されている。Ｍｕｃ−１は、多くのタイプの癌（特に顕著には、進行した乳癌）において上昇していることが見出されている。血清ベースのマーカーとしては無比であるので、特異性はほとんど持たないが、Ｍｕｃ−１は、他のより特異的なマーカーと組み合わせて、診断の補助として利用され得る。
【００３８】
ＰＡＩ−１（すなわち、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター１型）は、セリンまたはシステインプロテイナーゼインヒビターである。ＰＡＩ−１  ｍＲＮＡは、２８７６ｂｐの長さであり、そして、そのコードされるタンパク質は、４０２アミノ酸長である。分子量の計算値は４２，７６９Ｄａであるが、アフィニティー精製したタンパク質は、ＳＤＳゲル電気泳動により決定した場合約５０，０００Ｄａであると報告されている。ＰＡＩ−１は、ＰＬＡＵによる細胞外マトリックスの分解の阻害において役割を担い、そして、推定される非調整ｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子（ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃ−Ｍｙｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）である。ＰＡＩ−１はまた、血液凝固および組織の再構築の制御においても重要な役割を担う。ＰＡＩ−１は、プラスミン生成を制限し、そして、線維素溶解のチェック状態を維持するようにはたらく。ＰＡＩ−１によるプラスミンの阻害を伴ういくつかの生理学的機能としては、排卵、細胞遊走および上皮細胞分化が挙げられる。癌における高いＰＡＩ−１レベルは、乳癌および肺癌を含む多くのヒトの癌の生存について乏しい予後を示す。Ｐａｐｐｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５年１１月２９日）Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ［印刷物より前に電子公開された］；Ｃｈａｚａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６０：２３７−２４６。
【００３９】
三重らせんリピート含有コラーゲン１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｒｅｐｅａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １）（ＣＴＨＲＣ１）は、バルーン損傷した動脈  対  正常な動脈において差次的に発現される配列についてのスクリーニングにおいて同定された。Ｐｙａｇａｙらによる研究において、ＣＴＨＲＣ１の発現は、正常な動脈においては検出できなかった。しかし、損傷時、ＣＴＨＲＣ１は、再構築中の外膜の線維芽細胞によって、および、新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）の平滑筋細胞によって一過性に発現された。ＣＴＨＲＣ１はまた、石灰化しつつあるヒトアテローム硬化プラークのマトリックスにおいても見出されている。ＣＴＨＲＣ１は、グリコシル化され、そして、下等脊索動物から哺乳動物まで高度に保存されている２８ｋＤａの分泌タンパク質である。１２のＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復を持つ短いコラーゲンモチーフは、タンパク質の三量体化を担い、そして、これが、コラゲナーゼによる切断に対し分子を感受性にするようである。Ｃｔｈｒｃ１  ｍＲＮＡの発現レベルは、トランスホーミング増殖因子βおよび骨形態発生タンパク質４に応じて増加する。ＣＴＨＲＣ１を過剰発現する繊維芽細胞および平滑筋細胞を用いて行った細胞遊走アッセイは、ＣＴＨＲＣ１レベルの上昇が、遊走能力の増強と関連していることを実証する。さらに、ＣＴＨＲＣ１の過剰発現は、１型コラーゲンのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルにおける劇的な減少をもたらした。Ｐｙａｇａｙらのデータは、新規分子であるＣＴＨＲＣ１が損傷に応じて動脈壁において一過性に発現され、ここで、コラーゲンマトリックスの蓄積を制限し、そして、細胞の遊走を促進することによって、血管の再構築に寄与し得ることを示す。Ｐｙａｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９６（２）：２６１−８。
【００４０】
インヒビンは、トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーに属するタンパク質ホルモンであり、ジスルフィド結合によって結合されるαサブユニットおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体である。インヒビンの２つの形態（すなわち、ＡおよびＢ）は、αサブユニットに結合されたβサブユニットのタイプ（すなわち、βＡまたはβＢ）が異なる。子を産める年齢の女性において、インヒビンは、卵巣の顆粒膜細胞によって分泌され、血中を循環することが知られる。インヒビンは、月経周期を通じて、および妊娠中に濃度が変化し、そして、下垂体のＦＳＨ生成、配偶子形成および妊娠事象に影響を与える。閉経後の女性において、インヒビンは非常に低いレベルまで低下する。最近の刊行物は、インヒビンが卵巣癌の診断マーカーであることを示している。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９１：９７−１０３；Ｅｌ−Ｓｈａｌａｋａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｒｅｓ．３０：１５５−１６１を参照のこと。
【００４１】
プラスミノーゲンアクチベーターウロキナーゼ−レセプター（ＰＬＡＵ−ＲまたはＵＰＡＲ）は、ＧＰＩ結合により、そのカルボキシ末端で細胞膜に付着した、分子量約６０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質である。ＰＬＡＵ−Ｒは、正常なプロセスおよび病理学的プロセスの両方において、基底膜／細胞外マトリックスの再構築に関与する、セリンプロテアーゼウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）に対する特異的なレセプターとして機能する。細胞表面から放出された可溶性ＰＬＡＵ−Ｒは、結腸直腸癌、乳癌および卵巣癌を含む数種類のヒトの癌において、血清濃度が上昇していると報告されている。例えば、Ｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１８４３−１８４９；およびＢｅｇｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：１９８１−１９８６を参照のこと。
【００４２】
プロラクチンは、かなりの量が下垂体前葉によって分泌される、１９８アミノ酸、２３ｋＤａのタンパク質ホルモンである。エストロゲンと対照的に、プロラクチンは、乳腺の成長と乳分泌の開始において重要な役割を果たす。さらに、プロラクチンは、細胞増殖および免疫機能においても重要な役割を有すると考えられる。市販のＥＬＩＳＡキットを用いた最近の報告は、卵巣癌において血清中のプロラクチンレベルが有意に上昇していたと報告した。一般に、Ｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０２：７６７７−７６８２を参照のこと。
【００４３】
カリクレインは、多様な生理学的機能を持つセリンプロテアーゼの下位集団である。これらは、染色体１９ｑ１３上で一群としてクラスター形成している。多くのカリクレインが、発癌に関与しており、そして、新規の癌および他の疾患のバイオマーカーとしての可能性を有するものもあることを示唆する証拠が増えている。
【００４４】
ＫＬＫ−６は、第１９染色体上のクラスターに位置する１５のカリクレインサブファミリーのメンバーのうちの１つである。コードされる酵素は、ステロイドホルモンにより調節される。組織培養において、この酵素は、アミロイド前駆体タンパク質からアミロイド形成フラグメントを生成することが見出されており、アルツハイマー病への関与の可能性が示唆されている。ＫＬＫ−６は、分泌タンパク質として確認されており、卵巣癌患者において上昇していることが見出されている。したがって、この疾患についての血清学マーカーとしての価値を有するという仮説が立てられている。
【００４５】
ヒトカリクレイン１０遺伝子（ＫＬＫ−１０、正常上皮細胞特異的１遺伝子（ＮＥＳ−１）としても公知）は、カリクレイン遺伝子ファミリーのメンバーである。この遺伝子産物は、その種々の生体液における濃度が、いくつかの疾患状態において変化することが知られる、分泌セリンプロテアーゼである。特に、ＫＬＫ１０は、卵巣の上皮細胞において発現され、その発現は、卵巣癌を有する患者の血清において上昇していると報告されている。したがって、ＫＬＫ１０は、卵巣癌についての血清バイオマーカーとして働き得る。例えば、Ｌｉｕ−Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：８０７−８１１；ＹｏｕｓｅｆおよびＤｉａｍａｎｄｉｓ（２００３）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．９０：７−１６を参照のこと。
【００４６】
分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）は、最初に、ヒトの耳下腺分泌において単離されたタンパク質である。その後の研究から、ＳＬＰＩタンパク質はまた、唾液および多数の粘膜表面（例えば、肺、鼻孔、子宮頚部および精嚢の粘膜表面）にも存在することが示された。
【００４７】
ＳＬＰＩは、好中球エラスターゼ（その存在が慢性炎症性肺疾患において増大しており、肺組織の成分の多くを破壊し得る）の強力なインヒビターであるので、慢性肺疾患に対する防御として作用すると考えられる。ＳＬＰＩはまた、肥満細胞からのヒスタミンの放出も阻害し、したがって、アレルギー反応においても活性である。胎児の膜および子宮頚部組織の保護もまた、ＳＬＰＩの機能であると考えられる。
【００４８】
ＳＬＰＩタンパク質をコードする遺伝子は、卵巣癌においてアップレギュレートされていることが分かっており、良性の卵巣嚢を有する患者または正常患者において診られるレベルに対し、悪性の卵巣癌を有する患者の血清中のＳＬＰＩレベルの上昇には、有意な差があることが分かっている。ＳＬＰＩタンパク質は、１２ｋＤａの質量を有し、グリコシル化されておらず、疎水性かつカチオン性である。一般的には、Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３：１４；Ｈｅｌｍｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．５９（１）：９５−１０１；Ｈｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：３８６９−３８７６；およびＴｓｕｋｉｓｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ９６：５１６−５１９を参照のこと。
【００４９】
α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、肝臓により合成される急性期タンパク質であり、トリプシン、キモトリプシン、プラスミンおよびトロンビンのようなタンパク質分解酵素の主要な血清インヒビターである。炎症反応において、ＡＡＴの血清濃度は、３〜４倍程度まで上昇し得る。分子は、４０〜５０ｋＤａのモノマー分子量を持つ、多数の遺伝子改変体として存在する。平均正常血清濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、２．２１±０．３５および２．１４±０．３７であると報告されている。卵巣癌のバイオマーカーとしてのＡＡＴにおける関心は、社内での２Ｄゲル電気泳動／質量分析、ＡＡＴが卵巣癌患者の血清において上昇したことを示す研究から生じた。例えば、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ａｆｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ３０：２８３−２８８；Ｌｅｄｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．２２３：７３−２８を参照のこと。
【００５０】
上記のバイオマーカーについて詳細に考察してきたが、当該分野で公知のバイオマーカーおよびまだ同定されていないバイオマーカーを含め、過剰発現が卵巣癌について選択的であるあらゆるバイオマーカーが、本発明の実施のために使用され得る。このようなバイオマーカーとしては、例えば、ＤＮＡ複製／細胞周期制御、細胞の成長および増殖、アポトーシスからの逸脱、血管新生もしくはリンパ球新生、または、癌細胞の運動性および浸潤の機構における欠陥に関連する遺伝子およびタンパク質が挙げられる。
【００５１】
特に関心があるのは、早期段階の卵巣癌において選択的に過剰発現されるバイオマーカーである。「早期段階の卵巣癌において選択的に過剰発現される」とは、関心のあるバイオマーカーが、段階１または段階２の卵巣癌の状態では過剰発現されるが、正常試料または非悪性、良性と分類される状態、および、臨床上の疾患とはみなされない他の状態においては過剰発現されないことを意図する。当業者は、早期段階のバイオマーカーとして、段階１または段階２において最初に過剰発現され、その過剰発現が、疾患の進行した段階にわたって一貫するような、卵巣癌に特異的な遺伝子およびタンパク質、ならびに、段階１または段階２の卵巣癌においてのみ過剰発現するバイオマーカーが挙げられることを理解する。早期段階の卵巣癌において選択的に過剰発現するバイオマーカーの発現の検出は、卵巣癌の早期検出および診断を可能にし得、したがって、患者の予後を改善し得る。
【００５２】
本発明の方法は、複数のバイオマーカーの発現を検出する工程を包含する。本明細書中で使用される場合、「複数」のバイオマーカーとは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のバイオマーカーを指す。特に、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するために、本発明の２段階スクリーニング方法を用いる場合、複数のバイオマーカーは、第１のアッセイ段階の間に少なくとも１種のバイオマーカー、そして第２のアッセイ段階の間に少なくとも１種のさらなるバイオマーカーの検出を指し得る。当業者はまた、本発明の方法に従って卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するために、バイオマーカーパネルが使用され得ることを認識する。バイオマーカーパネルは、任意の数または組み合わせの、関心のあるバイオマーカーを含み得る。いくつかの実施形態において、パネルは、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビン、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６およびＳＬＰＩ、α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）からなる群より選択される複数のバイオマーカーを含む。他の実施形態において、ＣＡ１２５、ＨＥ４、グリコデリン、ＭＭＰ−７、ＳＬＰＩ、ＰＬＡＵ−Ｒ、Ｍｕｃ−１、インヒビンＡおよびＰＡＩ−１を含むバイオマーカーのサブセットから選択されるバイオマーカーパネルが提供される。
【００５３】
任意の女性患者または患者集団が、本発明のスクリーニング方法および診断方法を用いて評価され得る。例えば、本明細書において開示される方法は、一般的な女性患者集団について、ならびに、閉経後の女性というより狭い集団について行われ得る。用語「閉経後」は、当業者により理解される。特定の実施形態において、閉経後は一般に、例えば、５５歳より上の女性を指す。特定の実施形態において、スクリーニング方法は、一般女性集団に対して慣習的に（例えば、年に一度、２年毎など）行われる。患者の通常のスクリーニングは、例えば、月経の開始時、３０歳、または、更年期の開始時に開始され得る。本明細書において以下に規定されるような高リスクの患者集団のスクリーニングは、代表的には、患者の年齢に依存して、定期ベースで行われる。自覚症状のある患者および自覚症状のある（すなわち、骨盤もしくは腹部の疼痛または膨張のような卵巣癌に特徴的な症状を呈する）患者の両方が、本発明のスクリーニング方法および診断方法を用いて、卵巣癌を有する可能性の増加について評価され得る。卵巣癌を発症する危険性の少ない女性、ならびに、臨床上および家族暦による危険因子に基づき、高リスクであるとみなされる女性もまた、本発明の方法を用いて評価され得る。このような臨床上および家族暦による危険因子に基づいて「高リスクである」とみなされる患者としては、乳癌、結腸癌または乳／卵巣症候群を持って生きる患者、卵巣癌を有する一親等血族が居る女性（例えば、母親、娘または姉妹）、少なくとも１種の卵巣癌遺伝子（ＢＲＣＡ１または２）について陽性の患者、および、ＨＮＰＣＣ（すなわち、遺伝性非ポリーポーシス性大腸癌）を罹患する女性が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本発明の１つの局面において、スクリーニング方法および診断方法のための標的集団は、例えば、上記の臨床上および家族暦による危険因子に基づいて高リスクであると分類された、自覚症状がない患者の群である。この高リスクで自覚症状がない集団は、米国において８００万人より多い女性に相当する。本発明の方法、組成物およびキットは、卵巣癌を発症する危険性が高い患者、およびその医師に対し、特に有益であることが認識される。当該分野において、卵巣癌を発症する危険性が高いとして認識される患者としては、卵巣癌の家族暦を有する患者および高齢の患者（すなわち、代表的には、５５歳より上の女性）が挙げられる。
【００５５】
卵巣癌には直接関係しない多数の臨床上の状態または特徴が、本発明の方法に従って試験した患者集団に存在し、それによって、本明細書中に開示されるスクリーニング方法および診断方法の結果と干渉し得る。このような臨床上の状態または特徴は、本明細書中で、「干渉性の実体および病理（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ）」と呼び、これらとしては、妊娠（妊娠初期）、乳癌、慢性肝炎、結腸癌、経口避妊薬治療、冠動脈疾患、深静脈血栓症、糖尿病、子宮内膜症、ホルモン補充療法、月経、多発性骨髄腫、卵巣嚢腫／多嚢胞腫、多発性筋痛、多発性筋炎、直腸癌、慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）およびワルファリン治療が挙げられるがこれらに限定されない。干渉性病理のさらなる例としては、子宮の異常（例えば、子宮筋腫、子宮腺筋症および子宮内膜癌）、卵巣の異常（例えば、機能性嚢腫、卵胞膜黄体嚢腫、妊娠黄体腫、硬化嚢胞卵巣、漿液嚢胞腺腫、ムチン嚢胞腺腫、嚢胞性奇形腫、線維芽腫、莢膜腫、およびブレンナー腫のような良性の増殖；新生物；ならびに、嚢胞腺癌および腺癌のような悪性の異常）、卵管の異常（例えば、卵管卵巣膿瘍、卵管水腫、卵巣傍体嚢腫、異所性妊娠および卵管の癌）、腸の異常（例えば、ガスおよび／または便の膨満、憩室炎、回腸炎、虫垂炎および結腸癌）、ならびに他の多岐にわたる異常（例えば、拡大した膀胱、骨盤腎臓、尿膜管嚢胞、腹壁血腫、腹壁膿瘍、および、リンパ腫、肉腫および奇形腫のような腹膜後の新生物が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書中に記載されるスクリーニング方法および診断方法において使用したバイオマーカー、閾値発現レベルおよび数学的モデルは、特許請求される方法の性能（すなわち、特異性、感度、ＰＰＶおよびＮＰＶ）に対する、干渉性の実体および病理の影響を最小限にするように選択される。
【００５６】
「身体試料」とは、患者からの細胞、組織または体液の任意のサンプリングを意図し、この身体試料において、バイオマーカーの発現が検出され得る。このような身体試料の例としては、血液（例えば、全血、血清、血小板を除去した血液など）、リンパ、腹水、尿、婦人科学的な流体（例えば、卵巣、卵管および子宮の分泌物、経血など）、腹腔鏡検査の間に得られた生検および流体が挙げられるがこれらに限定されない。身体試料は、種々の技術によって（例えば、静脈穿刺によって、ある領域を擦過もしくは拭き取ることによって、または、針を用いて体液もしくは組織を吸引することによって、が挙げられる）患者から得られ得る。種々の身体試料を採取するための方法は当該分野で周知である。特定の実施形態において、身体試料は、血液または血清を含む。本発明の発明者らは、採取方法および血液試料、より具体的には血清試料の保管が、本明細書中に開示される方法の性能に影響を及ぼすと認識している。いくつかの研究が、身体試料（特に、血清試料）の採取および保管の方法が、容認可能なアッセイの性能を達成するために重要であることを示唆している。例えば、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ（２００４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９５：３５３−３５６およびＴｈａｖａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５３：１１５−１２４（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。血清の採取および保管の一つの例示的な方法が、実施例１に提供される。
【００５７】
バイオマーカーの発現を検出するための、当該分野で利用可能なあらゆる方法が、本発明の実施のために使用され得る。本発明のバイオマーカーの発現は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで検出され得る。過剰発現を決定するために、試験されるべき身体試料は、健常人に由来する対応する身体試料と比較され得る。すなわち、発現の「正常」レベルとは、卵巣癌を罹患していない患者に由来する身体試料中のバイオマーカーの発現レベルである。このような試料は、基準化された形式で存在し得る。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの過剰発現の決定は、身体試料と、健常人に由来する対応する身体試料との間の比較を必要としない。
【００５８】
本発明の任意のバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせ、ならびに、任意の公知の卵巣癌バイオマーカーが、本発明の方法、組成物およびキットにおいて使用され得る。一般に、卵巣癌を罹患する患者からの身体試料中のバイオマーカーの発現レベルと、「正常な」身体試料（すなわち、卵巣癌を有さない患者からの身体試料）中の同じバイオマーカーの発現レベルとの間の差が可能な限り大きいようなバイオマーカーを使用することが望ましい。この差は、バイオマーカーの発現を評価するための方法の検出限界と同程度まで小さくあり得るが、この差は、少なくとも評価方法の標準誤差よりも大きく、最適には、正常な身体試料中の同じバイオマーカーの発現レベルの、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、またはそれ以上の差であることが好ましい。本発明のバイオマーカーの「正常な」発現レベルは、卵巣癌を罹患していない患者から得られた身体試料中のそのバイオマーカーの発現を評価することによって決定され得る。あるいは、特に、さらなる情報が本明細書中に記載される方法の慣習的な実施の結果として利用可能になる場合、バイオマーカーの発現レベルについての平均値が使用され得る。
【００５９】
上記のように、本発明のいくつかの局面において、特定のバイオマーカーの発現の閾値レベルが確立され得る。この閾値レベルの上では、患者の試料においてバイオマーカーが過剰発現しているとみなされる。閾値を選択するための方法としては、バイオマーカーについてのＲＯＣプロットの解析、または、正常な患者集団についてのバイオマーカーの発現レベルの解析が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な閾値または「カットオフ」値としては、以下が挙げられる：（１）正常患者集団の試料から決定した、平均発現レベル＋２×標準偏差、および（２）感度＋特異性の最高値を表す、ＲＯＣ曲線から選択した発現レベル。特定のバイオマーカーについての発現の閾値レベルは、正常患者集団にこえる発現レベルに関して決定され得る。当業者は、適切な閾値発現値を選択するための他の方法が、本発明の実施のために使用され得ることを理解する。
【００６０】
本発明のバイオマーカーを検出するための方法は、核酸レベルまたはタンパク質レベルのいずれかでバイオマーカーの量または存在を決定する任意の方法を含む。このような方法は当該分野で周知であり、そして、ウェスタンブロット、ノザンブロット、サザンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、免疫組織化学、多重ビーズベースの免疫学的検定、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写法、および核酸増幅法が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、バイオマーカーの過剰発現は、例えば、特定のバイオマーカータンパク質に対する抗体を用いて、タンパク質レベルについて検出される。これらの抗体は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、多重ビーズベースの免疫学的検定、免疫沈降、または免疫組織化学の技術のような種々の方法において使用され得る。本発明の実施のために使用される多重ビーズベースのアッセイとしては、米国特許第６，５９９，３３１号、同第６，５９２，８２２号および同第６，２６８，２２２号（これらは全て、その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示されるＬｕｍｉｎｅｘ技術が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、国際公開番号ＷＯ  ２００５／０１６１２６（この全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＬａｂＭＡＰ（登録商標）システムが利用される。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態において、バイオマーカータンパク質に特異的な抗体は、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するために、身体試料中の複数のバイオマーカータンパク質の発現を検出するために利用される。この方法は、患者から身体試料、特に、血清試料を得る工程、卵巣癌において選択的に過剰発現される複数のバイオマーカーに対する抗体にこの身体試料を接触させる工程、および、抗体結合を検出して、バイオマーカーが患者試料中で過剰発現されているかどうかを決定する工程を包含する。本発明のスクリーニング方法において、バイオマーカーの過剰発現は、卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。本発明のスクリーニング方法によって、卵巣癌を有する可能性が高いとして分類された患者は、卵巣癌の存在する検出するためのさらなる診断試験に供される。卵巣癌についての本発明のスクリーニング方法によって、現在は卵巣癌を罹患していないと決定された女性患者は、潜在的に早期段階で卵巣癌を検出するために、定期的にモニタリングされる。
【００６２】
上記のように、本発明の特定の局面において、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法は、２段階の解析を含み得る。すなわち、この方法は、身体試料中で第１のバイオマーカーまたは第１のバイオマーカーパネルの発現を検出する工程と、第１のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが過剰発現されているかどうかを決定する工程とを包含する第１のアッセイ段階を行う工程を包含する。第１のアッセイ段階において陽性の結果が得られた場合（すなわち、第１のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが身体試料中で過剰発現している場合）、この方法はさらに、第２のバイオマーカーまたは第２のバイオマーカーパネルの発現を検出する工程と、第２のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが過剰発現されているかどうかを決定する工程とを包含する第２のアッセイ段階を行う工程を包含する。第１のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルと第２のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの両方の過剰発現（すなわち、両方のアッセイ段階において陽性の結果）は、卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。特定の実施形態において、第１のアッセイ段階および第２のアッセイ段階におけるバイオマーカーの発現の検出は、タンパク質レベルで行われ、身体試料、より具体的には、血清試料を、関心のある特定のバイオマーカーに特異的な抗体と接触させる工程、および、抗体結合を検出する工程を包含する。特定の方法において、バイオマーカーのタンパク質発現は、ＥＬＩＳＡまたは多重ビーズベースの免疫学的検定の形式を用いて検出される。
【００６３】
本発明の「２段階」スクリーニング方法において、第１の段階において使用されるバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルは、感度およびＮＰＶを最大にするように用いられ得る。すなわち、第１のスクリーニング段階は、本発明の方法によって陰性として分類された真の陰性の数を最大にし、それによって、さらなる解析から真の陰性の有意な割合を排除するように設計され得る。したがって、第１のアッセイ段階によって陽性として分類された患者集団は、真の陽性患者において富化される。２段階方法における第２のスクリーニング段階は、ＰＰＶおよび特異性を最大にしつつ、他方で、卵巣癌を有する可能性が最も高い女性を同定するために妥当な感度を維持するように設計され得る。特異性、感度、ＰＰＶおよびＮＰＶの値は、上記のように、この方法における各個々のアッセイ段階について決定され得る。２段階スクリーニング方法が使用される場合、感度、特異性、ＰＰＶおよびＮＰＶの組み合わせた値が、全体としての方法について決定され得る。特定の実施形態において、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するための２段階の方法は、少なくとも９０％の組み合わせた感度、少なくとも９８％の組み合わせた特異性、少なくとも１０％の組み合わせたＰＰＶ、および少なくとも９９．９％の組み合わせたＮＰＶを有する。当業者はさらに、２段階のスクリーニング方法が詳細に記載されているが、３、４、５またはそれ以上のアッセイ段階を含む同様のスクリーニング方法もまた本発明により包含されることを理解する。このような後続のアッセイ段階は、卵巣癌の存在から、心臓血管の異常のような他の疾患を除き得る。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態において、患者の試料が「陽性」であることを決定する（すなわち、卵巣癌を有する可能性が高いことを示す）ための「試験の規則」を練るために、アルゴリズムまたは数学的モデルが適用され得る。例えば、ＨＥ４、ＣＡ１２５、ＰＬＡＵ−Ｒ、グリコリデン、Ｍｕｃ−１およびＰＡＩ−１の発現が検出される場合、スクリーニング試験は、（１）ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコリデン、ＰＡＩ−１およびＰＬＡＵ−Ｒのうちいずれか３つが陽性である（すなわち、過剰発現している）場合、または、（２）ＨＥ４およびＣＡ１２５が両方とも過剰発現している場合、陽性であるとみなされる；その他の場合、試験は陰性であるとみなされる。さらなる例において、（１）ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコリデン、ＭＭＰ−７およびＰＬＡＵ−Ｒのうちいずれか３つが陽性である（すなわち、過剰発現している）場合、または、（２）ＨＥ４が過剰発現しており、そしてまた、ＣＡ１２５、グリコリデン、ＭＭＰ−７もしくはＰＬＡＵ−Ｒのうちいずれか１つが陽性である場合、試験は陽性であるとみなされ；その他の場合、試験は陰性であるとみなされる。当業者は、種々のこのような試験の規則が練られ得、そして、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するための本発明の方法（例えば、ロジスティック回帰）において適用され得ることを理解する。適用され得る他の数学的モデルは、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００６５】
本発明の他の局面において、患者において卵巣癌を診断するための方法は、患者から身体試料を得る工程、この身体試料を、卵巣癌において選択的に過剰発現される複数のバイオマーカーに対する抗体に接触させる工程、および、抗体結合を検出してバイオマーカーが患者の試料中で過剰発現されているかどうかを決定する工程を包含する。本発明の診断方法において、バイオマーカーの過剰発現は、卵巣癌の存在を示す。
【００６６】
本発明のなお他の実施形態において、患者において卵巣癌を処置するための治療の効果を評価するための方法が提供される。このような方法は、代表的に、治療の開始前に得た第１の患者の身体試料中での複数の本発明のバイオマーカーの発現レベルと、少なくとも部分的に治療を施した後に得た第２の試料中の発現レベルとを比較する工程を包含する。第２の患者の試料中のバイオマーカーの発現レベルが、治療の開始前に得た第１の試料中の発現レベルよりも有意に低い場合、患者における卵巣癌を処置するための治療の効果が陽性であることを示すが、第２の試料中のバイオマーカーの発現レベルが有意により高い場合、治療の効果が陰性であることを示す。本明細書中で使用される場合、「治療の効果が陽性であることを示す」とは、治療が、卵巣癌の処置において有益な結果（例えば、腫瘍の退行など）をもたらすことを意味する。「治療の効果が陰性であることを示す」とは、治療が、卵巣癌の処置に関して有益な作用を持たないことを意味する。特定の処置の効果が陰性であることの表示は、例えば、投薬量に関連し得る。投薬量が高ければ高いほど、治療はより効果的となり得る。
【００６７】
当業者は、これらの方法において、用語「治療」が、卵巣癌を治療するための任意の治療を含み、化学療法、放射線療法、腫瘍組織の外科的除去、遺伝子治療および生物学的治療が挙げられるがこれらに限定されないことを認識する。本発明の方法は、例えば、腫瘍重量の減少を評価するために、治療の前、間および後に、患者を評価するために使用され得る。
【００６８】
本発明はさらに、患者において卵巣癌の退行または進行を評価するためのモニタリング方法を提供し、この方法は、第１の時点で第１の患者試料において、本発明の複数のバイオマーカーの発現レベルを検出する工程、後の時点に得られた第２の患者試料を用いてこの解析を繰り返す工程、および、第２の時点でバイオマーカーの発現レベルを比較する工程を包含する。後の時点での患者の身体試料中のバイオマーカーの発現レベルが有意により高い場合、卵巣癌が進行していることを示し、一方、発現レベルが有意により低い場合、卵巣癌が退行していることを示す。本明細書中で使用される場合、「卵巣癌の退行」とは、卵巣癌に関する患者の状態が、例えば、腫瘍サイズの減少によって特徴付けられるように、改善したことを意味することが意図される。「卵巣癌の進行」とは、卵巣癌に関する患者の状態が、例えば、腫瘍サイズの増加、転移などによって特徴付けられるように、悪化したことを意味する。疾患状態に関する用語「退行」および「進行」の意味は、当業者に理解される。
【００６９】
本発明の特定の局面において、バイオマーカーの発現は、抗体を用いてタンパク質レベルで検出される。用語「抗体」は、広く、天然に存在する形状の抗体、ならびに、単鎖抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体のような組換え抗体、および多重特異性抗体、ならびに、上述の全てのフラグメントおよび誘導体（このフラグメントおよび誘導体は、少なくとも抗原結合部位を有する）を包含する。抗体の誘導体は、抗体に結合体化されたタンパク質または化合物部分を含み得る。
【００７０】
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を持つ糖タンパク質である。抗体は抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低いレベルで、そして、骨髄腫によって増加したレベルで生成される。
【００７１】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして、完全に組み立てられた抗体、抗原に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ’（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ））、および、上述のものを含めた組換えペプチドを網羅する。
【００７２】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいう。すなわち、少量存在し得る天然に存在する変異の可能性を覗き、個々の抗体を含む集団は同一である。
【００７３】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）；単鎖抗体分子；ならびに、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれ、各々が、単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りの「Ｆｃ」フラグメント（この名称は、３５を容易に結晶化するその能力を反映するものである）が生じる。ペプシン処理では、２つの抗原結合部位を有し、なおも抗原を架橋し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００７４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合の部位を含む最小の抗体フラグメントである。２本鎖Ｆｃ種において、この領域は、１本の重鎖可変ドメインと１本の軽鎖可変ドメインとがしっかりとした非共有結合でつながった二量体から構成される。１本鎖Ｆｖ種において、１本の重鎖可変ドメインと１本の軽鎖可変ドメインとは、柔軟性のあるペプチド結合によって共有結合され得、その結果、軽鎖と重鎖とは、２本鎖Ｆｖ種における構造と相同な「二量体」構造で会合し得る。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。まとめると、６つのＣＤＲが、抗体に抗原特異性を与える。しかし、結合部位全体よりは低い親和性ではあるが、１本鎖の可変ドメイン（または、抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても抗原を認識して抗原に結合する能力を有する。
【００７５】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂフラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ領域からの１以上のシステインを含む数個の残基を加えることにより、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書における、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’についての呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは元々、間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’フラグメントとして生成された。
【００７６】
ポリクローナル抗体は、バイオマーカータンパク質の免疫源を用いて適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）を免疫することにより調製され得る。免疫した被験体における抗体の力価は、固定化したバイオマーカータンパク質を用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のような標準的な技術によって、経時的にモニタリングされ得る。免疫後の適切な時点で、例えば、抗体の力価が最高になるとき、抗体産生細胞を被験体から得て、そして、これらの細胞を用いて、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７により最初に記載された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＲｅｉｓｆｅｌｄおよびＳｅｌｌ編（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），  ｐｐ．  ７７−９６）、またはトリオーマ技術のような標準的な技術によってモノクローナル抗体を調製し得る。ハイブリドーマを生成するための技術は周知である｛一般には、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．編（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）；Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２；Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ＮＹ）；およびＬｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２を参照のこと｝。
【００７７】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマに代えて、モノクローナル抗体は、バイオマーカータンパク質を用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングし、それによって、バイオマーカータンパク質に結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することによって、同定および単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ９  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングする際に使用するために特に適した方法および試薬の例は、例えば、以下に見出され得る：米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９１／１７２７１；ＷＯ  ９２／２０７９１；ＷＯ  ９２／１５６７９；９３／０１２８８；ＷＯ  ９２／０１０４７；９２／０９６９０；および９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４。
【００７８】
本発明の組成物は、さらに、関心のバイオマーカータンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体、ならびにその改変体およびフラグメントを含む。モノクローナル抗体は、試料中でのバイオマーカータンパク質の検出を容易にするために、以下に記載されるような検出可能な物質で標識され得る。このような抗体は、本発明の方法を行う際に用途を見出す。本明細書中に開示される抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体もまた、本発明により包含される。組成物は、さらに、モノクローナル抗体の抗原結合改変体およびフラグメント、これらの抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、ならびに、これらのモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子を含む。
【００７９】
本発明のモノクローナル抗体の結合特性を有する抗体もまた提供される。「結合特性」または「結合特異性」は、抗体に関して使用される場合、抗体が、比較抗体と同じまたは同様の抗原エピトープを認識することを意味する。このような抗体の例としては、例えば、競合結合アッセイにおいて本発明のモノクローナル抗体と競合する抗体が挙げられる。当業者は、標準的な方法を用いて、抗体が別の抗体と競合的に干渉するかどうかを決定し得る。
【００８０】
「エピトープ」により、抗体が生成され、その抗体が結合される、抗原性分子の一部分が意図される。エピトープは、直鎖状アミノ酸残基（すなわち、エピトープ内の残基が互い違いに直鎖状の様式で連続的に配列される）、非直鎖状アミノ酸残基（本明細書中で「非直鎖状エピトープ」と称される；これらのエピトープは連続的に配列されない）、または、直鎖状および非直鎖状の両方のアミノ酸残基を含み得る。代表的には、エピトープは、短いアミノ酸配列、例えば、約５アミノ酸長である。エピトープを同定するための体系的な技術は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号に記載される。簡単に述べると、抗原由来の１セットの重複オリゴペプチドが合成され、そして、各ピンに独特のオリゴペプチドを持つピンの固相アレイへと結合され得る。このピンのアレイは、９６ウェルのマイクロタイタープレートを含み得、全９６のオリゴペプチドを、例えば、バイオマーカー特異的なモノクローナル抗体への結合について、同時にアッセイすることを可能にする。あるいは、ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）が現在エピトープマッピングのために市販されている。これらの方法を用いると、所定の抗体が結合するエピトープを同定するために、連続アミノ酸の可能なサブセットごとについての結合親和性が決定され得る。エピトープはまた、推論ではあるが、抗体が得られる動物を免疫するためにエピトープの長さのペプチド配列が使用されるときに同定され得る。エピトープはまた、糖タンパク質上に存在するＮ結合またはＯ結合のいずれかのオリゴサッカリドとして存在する炭化水素側鎖によっても規定され得る。
【００８１】
本明細書中に開示されるモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントおよび改変体がさらに提供される。このような改変体は、親抗体の所望の結合特性を保持する。抗体フラグメントおよび改変体を作製するための方法は、当該分野で一般に利用可能である。例えば、本明細書中に記載されるモノクローナル抗体のアミノ酸配列改変体は、関心のある抗体をコードするクローニングされたＤＮＡ配列中に変異を入れることによって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野で周知である。例えば、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号；およびこの特許における引用文献（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。関心のポリペプチドの生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換のためのガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）のモデルにおいて見出され得る（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、本明細書中に参考として援用される）。１つのアミノ酸を、同様の特性を持つ別のアミノ酸と交換するような、保存的置換が好ましくあり得る。保存的置換の例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔ＧｌｎおよびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒ。
【００８２】
関心のある抗体ポリペプチドの改変体を構築する際、改変は、改変体が、所望の活性（すなわち、バイオマーカーに対する同様の結合親和性）を保有し続けるようになされる。明らかに、改変体ポリペプチドをコードするＤＮＡにおいてなされた任意の変異は、リーディングフレームから外れる配列を配置すべきではないし、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造を生成し得る相補性領域を生じない。欧州特許出願第７５，４４４号を参照のこと。
【００８３】
好ましくは、参照バイオマーカー抗体の改変体は、参照抗体分子のアミノ酸配列に対し、または、参照抗体分子のより短い部分に対して、少なくとも７０％または７５％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８０％または８５％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。より好ましくは、分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。本発明の目的のために、配列同一性％は、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを用いた擬似ギャップ検索を使用した、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを用いて決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９において教示される。改変体は、例えば、１〜１５程度のアミノ酸残基、１〜１０程度のアミノ酸残基（例えば、６〜１０、５程度、４程度、３程度、２程度、またはなお１のアミノ酸残基が、参照抗体と異なり得る。
【００８４】
２つのアミノ酸配列の最適なアラインメントに関して、改変体アミノ酸配列の連続セグメントは、参照アミノ酸配列に関し、追加のアミノ酸残基を有しても、アミノ酸残基を欠失していてもよい。参照アミノ酸配列との比較のために使用される連続セグメントは、少なくとも２０の連続アミノ酸残基を含み、そして、３０、４０、５０またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。保存的残基置換またはギャップを伴って配列同一性の補正がなされ得る（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性検索アルゴリズムを参照のこと）。
【００８５】
当業者は、試薬または条件（例えば、抗体の力価および抗原−抗体結合の検出のためのパラメータ）の最適化が、特定の抗体についての信号対雑音比を最大にするために必要とされることを認識する。本発明のバイオマーカーの特異的結合を最大にし、かつ、非特異的な結合（すなわち、「バックグラウンド」）を最小にする抗体の濃度が決定される。特定の実施形態において、適切な抗体力価は、まず、患者の血清試料において、種々の抗体希釈を試すことによって決定される。抗体の力価および検出条件を最適にするためのアッセイの設計は、標準的なものであり、十分に当業者の慣用的な能力の範囲内である。いくつかの抗体は、バックグラウンドを減らし、そして／または、特異性および感度を増加させるために、さらなる最適化を必要とする。
【００８６】
さらに、当業者は、本発明の方法の実施のために使用される特定の抗体の濃度が、結合のための時間、バイオマーカータンパク質に対する抗体の特異性のレベル、および身体試料の調製方法などの要因に依存して変化することを認識する。さらに、単一の試料において複数の抗体を使用する場合、必要とされる濃度は、抗体が試料に適用される順序（すなわち、カクテルとして同時に、または、個々の抗体試薬として連続的に）によって影響され得る。さらに、関心のあるバイオマーカーへの抗体の結合を可視化するために使用される検出化学もまた、所望の信号対雑音比を生じるように最適化されなければならない。
【００８７】
抗体結合の検出は、抗体を検出可能な物質に結合することによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、アンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリスリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【００８８】
本発明の実施のために使用される抗体は、関心のあるバイオマーカータンパク質に対し高い特異性を有するように選択される。抗体の作製方法および適切な抗体の選択方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｅｌｉｓ，編（印刷中）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第３版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。いくつかの実施形態において、特定のバイオマーカータンパク質に対する市販の抗体が、本発明の実施のために使用され得る。本発明の抗体は、組織学試料ではなく、細胞学試料の所望の染色に基づいて選択され得る。すなわち、特定の実施形態において、抗体は、最終的な試料のタイプ（すなわち、血清試料）を考慮し、そして、結合特異性について選択される。
【００８９】
他の実施形態において、関心のあるバイオマーカーの発現は、核酸レベルで検出される。発現を評価するための核酸ベースの技術は、当該分野で周知であり、そして、例えば、身体試料中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを決定することが挙げられる。多くの発現検出法は、単離されたＲＮＡを用いる。ｍＲＮＡの単離に対して選択を行わない任意のＲＮＡ単離技術が、血清試料からのＲＮＡの精製のために利用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編（１９８７−１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。さらに、多数の血液、血清または組織試料が、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの１段階ＲＮＡ単離プロセス（１９８９，米国特許第４，８４３，１５５号）のような、当業者に周知の技術を用いて容易に処理され得る。
【００９０】
用語「プローブ」は、特に意図される標的生体分子（例えば、バイオマーカーによりコードされるか、またはバイオマーカーに対応するヌクレオチド転写体またはタンパク質）に選択的に結合し得る任意の分子を指す。プローブは、当業者により合成され得、または、適切な生物学的調製物から誘導され得る。プローブは、特に、標識されるように設計され得る。プローブとして利用され得る分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９１】
単離されたｍＲＮＡが、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイ（サザン解析またはノザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析およびプローブアレイが挙げられるがこれらに限定されない）において使用され得る。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡを、検出される遺伝子によりコードされるｍＲＮＡへとハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡまたはその一部分（例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長）であり得、そして、ストリンジェントな条件下で、本発明のバイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分であり得る。ｍＲＮＡのプローブとのハイブリダイゼーションは、当該バイオマーカーが発現されることを示す。
【００９２】
１つの実施形態において、ｍＲＮＡは、固体表面上に固定化され、そして、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動し、ゲルからニトロセルロースなどの膜へとｍＲＮＡを移すことによって、プローブと接触させられる。代替的な実施形態において、プローブは、固体表面上に固定化され、そして、ｍＲＮＡが、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイ中でプローブと接触させられる。当業者は、本発明のバイオマーカーによりコードされるｍＲＮＡのレベルの検出において使用するために、公知のｍＲＮＡ検出法を容易に適合させ得る。
【００９３】
試料中のバイオマーカーｍＲＮＡレベルの決定のための代替的な方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に示される実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９４９３）、自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅法による核酸増幅プロセスと、その後の、増幅された分子の当業者に周知の技術を用いた検出を伴う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に低い数で存在する場合のこのような分子の検出に特に有用である。本発明の特定の局面において、バイオマーカーの発現は、定量的蛍光発生（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）ＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム）により評価される。このような方法は、代表的に、関心のあるバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対を利用する。公知の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを診断するための方法は、当該分野で周知である。
【００９４】
ＲＮＡのバイオマーカーの発現レベルは、メンブランブロット（例えば、ノザン、サザン、ドットなどのようなハイブリダイゼーション解析において用いられる）、または、マイクロウェル、試験管、ゲル、ビーズまたはファイバ（または、核酸を結合させた任意の固体支持体）を用いてモニタリングされ得る。米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号および同第５，４４５，９３４号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。バイオマーカーの発現の検出はまた、溶液中の核酸プローブを用いることを含み得る。
【００９５】
本発明の１つの実施形態において、マイクロアレイが、バイオマーカーの発現を検出するために使用される。マイクロアレイは、種々の実験間での再現性の理由から、この目的に特によく適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定するための１つの方法を提供する。各アレイは、再現性のあるパターンの固体支持体に付着された捕捉プローブから構成される。標識されたＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補的なプローブとハイブリダイズし、次いで、レーザ走査により検出される。アレイ上の各プローブへのハイブリダイゼーション強度が決定され、そして、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量的な値へと変換される。米国特許第６，０４０，１３８号、同第５，８００，９９２号および同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号および同第６，３４４，３１６号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のＲＮＡについての遺伝子発現プロフィールを決定するために特に有用である。
【００９６】
機械的合成法を用いたこれらのアレイの合成のための技術は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号（あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。平面状のアレイ表面が好ましいが、アレイは、実質的にあらゆる形状の表面で、または多数の表面でさえも製造され得る。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、ファイバ（例えば、光ファイバ）、ガラス、または任意の他の適切な基材上のペプチドまたは核酸であり得る。米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号および同第５，８００，９９２号（この各々は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書により参考として援用される）を参照のこと。アレイは、全てを包含するデバイスの診断または他の操作を可能にするような様式で組み合され得る。例えば、米国特許第５，８５６，１７４号および同第５，９２２，５９１号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００９７】
１つのアプローチにおいて、試料から単離された総ｍＲＮＡは、標識されたｃＲＮＡへと変換され、次いで、オリゴヌクレオチドアレイへとハイブリダイズされる。各試料は、別々のアレイへとハイブリダイズされる。相対的な転写体のレベルは、アレイ上および試料中に存在する適切な対照を参照することによって計算され得る。
【００９８】
本発明のスクリーニング方法および診断方法を実施するためのキットがさらに提供される。「キット」により、本発明のバイオマーカーの発現を特異的に検出するための、少なくとも１種の試薬（例えば、抗体、核酸プローブなど）を含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）が意図される。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして、販売促進、配給または販売され得る。さらに、キットは、キットおよびその使用方法を説明するパッケージ挿入物を含み得る。
【００９９】
特定の実施形態において、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するためのスクリーニング方法において使用するためのキットは、関心のあるバイオマーカータンパク質に対する複数の抗体を含み、ここで、バイオマーカーは、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビンＡ、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６、ＳＬＰＩおよびα−１アンチトリプシンからなる群より選択される。バイオマーカーに結合する抗体の検出のための化学物質もまた、キット中に含められ得る。ＥＬＩＳＡまたは多重ビーズベースの免疫学的検定の形式で抗体を使用する、バイオマーカーの発現を検出するための他の試薬がさらに、本発明のキット中に含められ得る。他の実施形態において、本明細書中に開示されるスクリーニング方法において使用するためのキットは、身体試料中の複数の関心のあるバイオマーカーの発現を検出するための核酸プローブを含み、特にここで、バイオマーカーは、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビンＡ、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６、ＳＬＰＩおよびα−１アンチトリプシンからなる群より選択される。
【０１００】
本発明の特定の局面において、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するための２段階スクリーニング方法を実施するためのキットが提供される。キットは、２つの別個の試験として２段階スクリーニング方法を実施するように設計され得る。このようなキットは、単一のアッセイ段階（すなわち、第１または第２のアッセイ段階）を実施するための試薬を含む。他の実施形態において、キットは、２段階の方法が、単一の試験として実施され得るような試薬を含む（すなわち、第１のアッセイ段階および第２のアッセイ段階の両方のための試薬を含む）。本発明により包含されるさらなるキットは、本明細書中で上記される１段階スクリーニング方法を実施する際に用途を見出す。キットはさらに、１段階または２段階のスクリーニング方法に適用されるべきアルゴリズムまたは数学的モデルの説明と、人間の介入をほとんど伴わないか、または全く伴わずに、このアルゴリズム／数学的モデルを実行する自動プラットフォームとを含み得る。キットはさらに、２段階の方法における各段階が、自動、半自動または手動の様式で実施されるように提供され得る。
【０１０１】
卵巣癌を診断するためのキットもまた提供される。このようなキットは、卵巣癌において選択的に過剰発現される複数のバイオマーカー（より具体的には、ＨＥ４、ＣＡ１２５、グリコデリン、ＭＭＰ−７、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＣＴＨＲＣ１、インヒビンＡ、ＰＬＡＵ−Ｒ、プロラクチン、ＫＬＫ−１０、ＫＬＫ−６、ＳＬＰＩおよびα−１アンチトリプシン）の検出のために特異的である、抗体または核酸プローブを含み得る。
【０１０２】
当業者はさらに、本発明のスクリーニング方法および診断方法における任意または全ての段階が、職員によって実行され得るか、あるいは、自動様式で実施され得ることを理解する。すなわち、方法は、自動、半自動、または手動の様式で実施され得る。さらに、本明細書中に開示される方法はまた、卵巣癌を有する可能性の高い患者のより正確な同定、または、卵巣癌のより信頼性のある診断を可能にするために、他の公知であるか、または後に開発される方法と組み合され得る。
【０１０３】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、その冠詞の文法上の対象の１またはそれ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１またはそれ以上の要素を意味する。
【０１０４】
明細書全体を通じて、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、一定の要素、整数もしくは段階、または、要素、整数もしくは段階の群を含むが、任意の他の要素、整数もしくは段階、または、要素、整数もしくは段階の群は排除しないことを含意するものと理解される。
【０１０５】
以下の実施例は、限定するものとしてではなく、例示として提供される：
【実施例】
【０１０６】
（実施例１：採血、血清への血液の処理、血清の保存条件および血清の輸送条件についての例示的な方法）
採血
添加物を含まないＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製の蓋が赤色のＶａｃｕｔａｉｎｅｒ採血管（カタログ番号３６６４３０）に、静脈穿刺により十分な量の血液を採血した。採血管のロット番号を記録した。全血は冷蔵も冷凍もしなかった。全血の血清への処理は、採血後直ちに開始した。
【０１０７】
血清の処理手順
採血管を、ラック中に真っ直ぐ置き、室温で保管した。血液を、採血時間から、最小で６０分間、最大で９０分間、凝血させた。血液は、遠心前に完全に凝血していた。各試料について完全に凝血させるために要した時間を記録した。
【０１０８】
血液が完全に凝血した後、スイングヘッド型または固定角度型の遠心ローターのいずれかを用いて、試料を１３００×ｇで１０分間遠心分離した。底にある赤血球を乱さないように、管を遠心分離機から注意深く取り出した。
【０１０９】
細胞ペレットを乱すことなく、各管から栓を取り外した。各ドナーからの血清を、細胞層を乱すことも、ピペット内にいかなる細胞を入れることもなく、使い捨てのトランスファーピペットを用いてラベルを付けた管内に合わせた。移す際に細胞が乱された場合、試料を上記のように再度遠心分離した。
【０１１０】
管を５回穏やかに反転させることにより、各ドナーからの血清試料を混合した。１ｍＬのアリコートをラベルを付けた管内に入れ、そして、−２０℃〜−８０℃で冷凍した。血清は、冷凍前に、２時間より長く室温で、または、８時間より長く２〜８℃で保管しなかった。
【０１１１】
（実施例２：卵巣バイオマーカー選択研究−個々のバイオマーカーの解析）
バイオマーカー選択研究の目的は、１４の候補卵巣癌バイオマーカーのセットの最初の臨床上の有用性を評価することであった。この研究の前提は、患者血清中の各バイオマーカーの量を同定および定量することができるということであった。血清試料中のバイオマーカータンパク質の発現を、ＥＬＩＳＡ形式で、市販または新規のバイオマーカー特異的抗体を用いて検出した。以下の表１に記載するように、１４の標的バイオマーカーを解析した。
【０１１２】
【表１】
2009524438.tif 000003
。
【０１１３】
（研究の標的集団および実態的人口統計）
このタイプの評価において、試験される標本は、標的臨床集団を代表するものであり、そして、正常な対照が人口学上適合されているということがきわめて重要である。合計９００の患者血清標本をこの研究において解析した。２００の標本は、疾患の種々の段階にある卵巣癌患者に由来するものであった（すなわち、２００の標本は、段階１、段階２、段階３の卵巣癌標本の間で均等に分配した）。合計５００の正常血清をこの試験において使用した。１０４の正常血清標本は、各バイオマーカーの基線レベルを確立するため、そして、適切な閾値カットオフ値を計算するために、閉経後の女性（本研究では、５５歳より上の女性と設定）に由来するものであった。残りの３９６の正常血清標本は、５５歳より下の閉経前の女性と、５５歳より上の閉経後の女性に均等に分配した。この分配は、あらゆる年齢またはホルモンに関連する患者の分配の検討を可能にした。この研究における残りの２００の標本は、本明細書中で上記したように、種々の状態／疾患（すなわち、「干渉性の実体」または「干渉性の病理」）を有するドナーから集めた。これらの標本を含めることで、個々のバイオマーカーの性能に影響を与え得るあらゆる干渉性の病理の解析を可能にした。解析した患者集団および研究の実態的人口統計のまとめを表２〜４に提供する。
【０１１４】
【表２】
2009524438.tif 000004
【０１１５】
【表３】
2009524438.tif 000005
【０１１６】
【表４】
2009524438.tif 000006
。
【０１１７】
（研究についての自動化および確認解析の一般的な説明）
全９００の血清標本を１４のマーカーの各々について二連で処理した。マーカー選択データの作製に、バーコード追跡を備える自動アッセイシステムを利用した。このマーカー選択研究におけるアッセイの実行は全て、Ｔｅｃａｎ  Ｅｖｏ自動機械式液体ハンドラー（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｒｏｂｏｔｉｃ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｅｒ）を用いて完了させた。このプラットフォームの使用は、全９００の標本を、各マーカーについて１回の実験の実行（１日１回の実行）で処理することを可能にした。自動プラットフォームの正確さは、あらゆる研究標本を処理する前に確認した。
【０１１８】
この研究のために、全てのＥＬＩＳＡアッセイを、標準曲線のための希釈液として緩衝溶液を用いて処理した。これは、可能な限り、各アッセイのプロトコールを標準化するために行った。
【０１１９】
この研究において使用した正常血清は、支部（ｌｏｃａｌ）ＩＲＢの慣習に則った地域の採血センターから得た。これらの血清は、「正常」と考えられ得るが、これらのドナーが、疾患を有さないか、または正常なである状態を確認するために、医療の専門家によってスクリーニングされていなかったことに注意すべきである。
【０１２０】
（血清試料中のＨＥ４発現の検出（代表的実施例））
材料および方法
Ａ．アッセイプレートのコーティング：
ＥＬＩＳＡの９６ウェルプレートを、１００μｌ／ウェルの一次抗体、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの抗ＨＥ４モノクローナル抗体９０．１  ＃６でコーティングし、次いで、このプレートを、４℃で一晩インキュベートした。次の日、これらのプレートをＰＢＳで１度洗浄し、次いで、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−３％ＢＳＡを全ウェルに加え、そして、プレートを３０℃にて２時間インキュベートした。次いで、これらのプレートを空にし、そして、真空オーブン内で室温にて２時間乾燥させた。次いで、これらを、乾燥剤パックと共にマイラーフォイルバッグ（ｍｙｌａｒ  ｆｏｉｌ  ｂａｇ）の内側にヒートシールし、アッセイで使用するまで、４℃に保管した。
【０１２１】
Ｂ．アッセイ方法
アッセイプレートを含むフォイルバッグをアッセイの使用直前に室温まで温めた。血清試料を、ＰＢＳ−１％ウシ血清−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−１ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧ中に１：４で希釈した。ＨＥ４抗原タンパク質を１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、次いで、ＰＢＳ−１％ウシ血清−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−１ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧ中に２倍で段階希釈し、次いで、血清試料と同じに希釈されるように、全ての個々の標準曲線用試料をさらに緩衝液中１：４に希釈した。
【０１２２】
希釈した血清試料と標準曲線用試料を、抗ＨＥ４コーティングしたアッセイプレートに、１００μｌ／ウェルの容量で加えた。次いで、これらのプレートを、３０℃にて２時間インキュベートした。これらのプレートを、次に、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で５回洗浄した。
【０１２３】
二次抗体である抗ＨＥ４モノクローナル抗体７１．１＃１．１３−ＨＲＰを、ＰＢＳ−１％ウシＩｇＧ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−１ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧ中に１：１６，０００で希釈した。次いで、この二次抗体溶液を、吸引したプレートに１００μｌ／ウェルの容量で加えた。これらのプレートを３０℃にて１時間インキュベートした。
【０１２４】
これらのプレートを、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で５回洗浄した。発色溶液ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を使用前に室温まで温め、次いで、このＴＭＢを吸引したプレートに１００μｌ／ウェルの容量で加えた。
【０１２５】
これらのプレートを室温で１０分間インキュベートし、次いで、停止溶液である２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４をプレート（ＴＭＢを含む）に１００μｌ／ウェルの容量で加えた。
【０１２６】
これらのプレートを室温で１０分間インキュベートし、次いで、これらを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー上で、４５０ｎｍにて読み取った（６５０ｎｍの参照波長、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用）。
【０１２７】
データをＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏファイルとして保存し、そしてまた、ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）で使用するためのテキストファイルとしてエクスポートした。
【０１２８】
対照：高対照として使用した血清：Ｕｎｉｇｌｏｂｅ  ＃７２３７２
低対照として使用した血清：Ｕｎｉｇｌｏｂｅ  ＃７２４０４
使用した緩衝液対照は、ＰＢＳ−１％ウシ血清−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０
−１ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧであった。
【０１２９】
全２５プレートにわたる対照についての変動係数（ＣＶ）を表５にまとめる。
【０１３０】
【表５】
2009524438.tif 000007
。
【０１３１】
結果（標準曲線）
ＨＥ４についての標準曲線を、ＰＢＳ／１％ウシ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０−１ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ中にＨＥ４タンパク質を希釈することによって調製した。このような標準曲線の調製は、当該分野で周知である。本質的には、ＨＥ４について上述したようにして（変更が当業者により理解および実行され得る）、残りのバイオマーカーについて全ての血清試料中のバイオマーカーの標準曲線およびレベルまたは濃度を得た。解析したバイオマーカー（すなわち、ＨＥ４、グリコデリン、ＳＬＰＩ、ＰＬＡＵ−Ｒ、ＭＵＣ−１、ＰＡＩ−１、ＭＭＰ−７、インヒビン、ＣＡ１２５、ＣＴＨＲＣ１、ＫＬＫ−６、ＫＬＫ−１０、α−１アンチトリプシンおよびプロラクチン）についての標準曲線の範囲および曲線の当てはめの等式を以下に示す。
【０１３２】
ＨＥ４
＊標準曲線の実験範囲＝０．７８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝三次多項式、
【０１３３】
【数１】
2009524438.tif 000008
＊次いで、標準曲線の試料および血清試料を共に１：４希釈して、アッセイを行った；血清試料および標準曲線の試料の両方を同じ様式で希釈したので、未知血清試料の濃度を決定するためのデータ解析の間に希釈係数を使用する必要はなかった。
【０１３４】
グリコデリン
＊標準曲線の実験範囲＝３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝二次方程式、
【０１３５】
【数２】
2009524438.tif 000009
＊血清試料を希釈せずにアッセイを行ったので、データ解析において希釈係数を使用しなかった。
【０１３６】
ＳＬＰＩ
＊標準曲線の実験範囲＝２．３８ｎｇ／ｍｌ〜３０５ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝三次多項式、
【０１３７】
【数３】
2009524438.tif 000010
＊自動試料調製技術の早い段階で血清試料を１：６．１に希釈した。次いで、これらの希釈した血清試料を、全体として１：４０の希釈を達成するために、別の自動化段階でさらに１：６．６希釈した。次いで、これらの１：４０希釈した試料のアッセイを行った。
＊標準曲線の試料を上述の濃度（実験範囲）で調製し、次いで、これらの標準曲線の試料を全て、さらに１：６．１希釈し、次いで、この１：６．１希釈した試料のアッセイを行った。
＊標準曲線の試料の希釈（１：６．１）と比べ、血清試料の希釈（１：４０）との間に相違が存在するので、標準曲線から得られた全ての血清試料濃度の値を、「６．６」の希釈係数で乗じて、この相違を補正した（１：４０＝１：６．１×１：６．６）。
【０１３８】
ｕＰａｒ（ＰＬＡＵ−Ｒ）
＊標準曲線の実験範囲＝６２．５ｐｇ／ｍｌ〜４０００ｐｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝線形、
【０１３９】
【数４】
2009524438.tif 000011
＊自動試料調製技術の早い段階で血清試料を１：６に希釈した。次いで、これらの希釈した血清試料を、全体として１：１８の希釈を達成するために、別の自動化段階でさらに１：３希釈した。次いで、これらの１：１８希釈した試料のアッセイを行った。
＊標準曲線の試料を上述の濃度（実験範囲）で調製し、次いで、これらの標準曲線の試料を全て、さらに１：３希釈し、次いで、この１：３希釈した試料のアッセイを行った。
＊標準曲線の試料の希釈（１：３）と比べ、血清試料の希釈（１：１８）との間に相違が存在するので、標準曲線から得られた全ての血清試料濃度の値を、「６」の希釈係数で乗じて、この相違を補正した（１：１８＝１：３×１：６）。
【０１４０】
ＭＵＣ−Ｉ
＊標準曲線の実験範囲＝０．３Ｕ／ｍｌ〜６００Ｕ／ｍｌ、段階３倍希釈
＊曲線の当てはめ＝三次多項式、
【０１４１】
【数５】
2009524438.tif 000012
＊次いで、標準曲線の試料および血清試料を共に１：２希釈して、アッセイを行った；血清試料および標準曲線の試料の両方を同じ様式で希釈したので、未知血清試料の濃度を決定するためのデータ解析の間に希釈係数を使用する必要はなかった。
【０１４２】
ＰＡＩ−１
＊標準曲線の実験範囲＝０．７８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝線形、
【０１４３】
【数６】
2009524438.tif 000013
＊次いで、標準曲線の試料および血清試料を共に１：４希釈して、アッセイを行った；血清試料および標準曲線の試料の両方を同じ様式で希釈したので、未知血清試料の濃度を決定するためのデータ解析の間に希釈係数を使用する必要はなかった。
【０１４４】
ＭＭＰ−７
＊標準曲線の実験範囲＝０．１６ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝三次多項式、
【０１４５】
【数７】
2009524438.tif 000014
＊次いで、標準曲線の試料および血清試料を共に１：２希釈して、アッセイを行った；血清試料および標準曲線の試料の両方を同じ様式で希釈したので、未知血清試料の濃度を決定するためのデータ解析の間に希釈係数を使用する必要はなかった。
【０１４６】
インヒビン
＊標準曲線の実験範囲＝１０ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｐｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝線形、
【０１４７】
【数８】
2009524438.tif 000015
＊次いで、標準曲線の試料および血清試料を共に１：３希釈して、アッセイを行った；血清試料および標準曲線の試料の両方を同じ様式で希釈したので、未知血清試料の濃度を決定するためのデータ解析の間に希釈係数を使用する必要はなかった。
【０１４８】
ＣＡ１２５
＊標準曲線の実験範囲＝１５Ｕ／ｍｌ〜４００Ｕ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝線形、
【０１４９】
【数９】
2009524438.tif 000016
＊血清試料を希釈せずにアッセイを行ったので、データ解析において希釈係数を使用しなかった。
【０１５０】
ＣＴＨＲＣ１
＊標準曲線の実験範囲＝０．７８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝線形、
【０１５１】
【数１０】
2009524438.tif 000017
＊次いで、標準曲線の試料および血清試料を共に１：２希釈して、アッセイを行った；血清試料および標準曲線の試料の両方を同じ様式で希釈したので、未知血清試料の濃度を決定するためのデータ解析の間に希釈係数を使用する必要はなかった。
【０１５２】
ＫＬＫ−６
＊標準曲線の実験範囲＝０．７８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝三次多項式、
【０１５３】
【数１１】
2009524438.tif 000018
＊次いで、標準曲線の試料および血清試料を共に１：２希釈して、アッセイを行った；血清試料および標準曲線の試料の両方を同じ様式で希釈したので、未知血清試料の濃度を決定するためのデータ解析の間に希釈係数を使用する必要はなかった。
【０１５４】
ＫＬＫ−１０
＊標準曲線の実験範囲＝１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝線形、
【０１５５】
【数１２】
2009524438.tif 000019
＊次いで、標準曲線の試料および血清試料を共に１：４希釈して、アッセイを行った；血清試料および標準曲線の試料の両方を同じ様式で希釈したので、未知血清試料の濃度を決定するためのデータ解析の間に希釈係数を使用する必要はなかった。
【０１５６】
α１  アンチトリプシン
＊標準曲線の実験範囲＝３．３ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝二次方程式、
【０１５７】
【数１３】
2009524438.tif 000020
＊血清試料を１：２５００００希釈し、次いで、これらの希釈した試料のアッセイを行った。標準曲線の試料を上述のように（実験範囲）段階希釈し、次いで、これらの試料のアッセイを行った。
＊標準曲線の試料の希釈（段階希釈以上には希釈していない）と比べ、血清試料の希釈（１：２５００００）との間に相違が存在するので、標準曲線から得られた全ての血清試料濃度の値を、「２５００００」の希釈係数で乗じて、この相違を補正した。
【０１５８】
プロラクチン
＊標準曲線の実験範囲＝２ｎｇ／ｍｌ〜２４０ｎｇ／ｍｌ、段階２倍希釈
＊曲線の当てはめ＝線形、
【０１５９】
【数１４】
2009524438.tif 000021
＊次いで、標準曲線の試料および血清試料を共に１：５希釈して、アッセイを行った；血清試料および標準曲線の試料の両方を同じ様式で希釈したので、未知血清試料の濃度を決定するためのデータ解析の間に希釈係数を使用する必要はなかった。
【０１６０】
結果−個々のマーカーの性能
本研究に用いた５００の正常症例の中で、１０４の正常症例を対照群として用いて、閾値カットオフポイントを選択した。表６は、各マーカーについてのこれらの１０４の閾値正常症例に基づいた、平均、標準偏差、範囲、平均＋２＊ｓｔｄ、平均＋３＊ｓｔｄを提供する。表７は、全ての正常研究症例（３９６症例）における平均標準偏差、範囲、平均＋２＊ｓｔｄを提供する。表８は、５５歳より上の患者からの正常研究症例（１９５症例以下）における平均標準偏差、範囲、平均＋２＊ｓｔｄを提供する。マーカーＨＥ４およびインヒビンの除く各バイオマーカーについて、平均および標準偏差は、正常閾値対照症例と５５歳より上の患者についての正常研究症例との間で非常に類似していた。表６および８を参照のこと。
【０１６１】
【表６】
2009524438.tif 000022
【０１６２】
【表７】
2009524438.tif 000023
【０１６３】
【表８】
2009524438.tif 000024
各個々のマーカーについて、ＲＯＣ曲線を得た。ＲＯＣ曲線は、３９６の正常症例と２００の卵巣癌症例とのみから構成される。対照としての１０４の正常症例と、２００の干渉物質／病理の症例は、この解析には含めなかった。ＨＥ４、インヒビンＡ、プロラクチン、ＰＬＡＵ−Ｒ、グリコデリン、ＳＬＰＩ、ＣＴＨＲＣ１、ＰＡＩ−１、ＫＬＫ−１０、ＣＡ１２５、ＫＬＫ−６、ＭＵＣ−１、ＭＭＰ−７についてのＲＯＣ曲線を、それぞれ、図２〜１４に示す。
【０１６４】
また、陽性および陰性の試料の割合を、年齢群、癌の段階、および、干渉物質／病理の分類によって、各マーカーについて決定した。これらの決定は、以下の２種類のカットオフポイントに基づいた：（１）平均＋２＊ｓｔｄおよび（２）ＲＯＣ曲線からのベストカットオフ（ｂｅｓｔ  ｃｕｔｏｆｆ  ｐｏｉｎｔ）。ベストカットオフポイントは、感度＋特異性の最高値を有するＲＯＣ曲線から選択した。ベストカットオフポイントを表６に列挙する。年齢群、癌の段階、および、干渉物質／病理の分類による各バイオマーカーについての陽性の結果のまとめを、表９〜４７に示す。
【０１６５】
（バイオマーカー：ＨＥ４）
【０１６６】
【表９】
2009524438.tif 000025
【０１６７】
【表１０】
2009524438.tif 000026
【０１６８】
【表１１】
2009524438.tif 000027
（バイオマーカーＭｕｃ−１）
【０１６９】
【表１２】
2009524438.tif 000028
【０１７０】
【表１３】
2009524438.tif 000029
【０１７１】
【表１４】
2009524438.tif 000030
（バイオマーカー：ＫＬＫ−６）
【０１７２】
【表１５】
2009524438.tif 000031
【０１７３】
【表１６】
2009524438.tif 000032
【０１７４】
【表１７】
2009524438.tif 000033
（バイオマーカー：ＫＬＫ−１０）
【０１７５】
【表１８】
2009524438.tif 000034
【０１７６】
【表１９】
2009524438.tif 000035
【０１７７】
【表２０】
2009524438.tif 000036
（バイオマーカー：ＰＡＩ−１）
【０１７８】
【表２１】
2009524438.tif 000037
【０１７９】
【表２２】
2009524438.tif 000038
【０１８０】
【表２３】
2009524438.tif 000039
（バイオマーカー：ＣＴＨＲＣ１）
【０１８１】
【表２４】
2009524438.tif 000040
【０１８２】
【表２５】
2009524438.tif 000041
【０１８３】
【表２６】
2009524438.tif 000042
（バイオマーカー：ＳＬＰＩ）
【０１８４】
【表２７】
2009524438.tif 000043
【０１８５】
【表２８】
2009524438.tif 000044
【０１８６】
【表２９】
2009524438.tif 000045
（バイオマーカー：インヒビンＡ）
【０１８７】
【表３０】
2009524438.tif 000046
【０１８８】
【表３１】
2009524438.tif 000047
【０１８９】
【表３２】
2009524438.tif 000048
（バイオマーカー：グリコデリン）
【０１９０】
【表３３】
2009524438.tif 000049
【０１９１】
【表３４】
2009524438.tif 000050
【０１９２】
【表３５】
2009524438.tif 000051
（バイオマーカー：ＭＭＰ−７）
【０１９３】
【表３６】
2009524438.tif 000052
【０１９４】
【表３７】
2009524438.tif 000053
【０１９５】
【表３８】
2009524438.tif 000054
（バイオマーカー：ＰＬＡＵ−Ｒ）
【０１９６】
【表３９】
2009524438.tif 000055
【０１９７】
【表４０】
2009524438.tif 000056
【０１９８】
【表４１】
2009524438.tif 000057
（バイオマーカー：プロラクチン）
【０１９９】
【表４２】
2009524438.tif 000058
【０２００】
【表４３】
2009524438.tif 000059
【０２０１】
【表４４】
2009524438.tif 000060
（バイオマーカー：ＣＡ１２５（Ｌａｂ  Ｃｏｒｐデータ））
【０２０２】
【表４５】
2009524438.tif 000061
【０２０３】
【表４６】
2009524438.tif 000062
【０２０４】
【表４７】
2009524438.tif 000063
。
【０２０５】
それぞれ、腫瘍の段階、正常な２−標準偏差限界（ｎｏｒｍａｌ  ２−ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ）、または「ベストフィット」に基づいた、解析した１３のバイオマーカーの感度のまとめを表４８〜５０に示す。
【０２０６】
【表４８】
2009524438.tif 000064
【０２０７】
【表４９】
2009524438.tif 000065
【０２０８】
【表５０】
2009524438.tif 000066
。
【０２０９】
（実施例３：卵巣バイオマーカー選択研究−複数のバイオマーカーの解析）
この研究のための最適なバイオマーカーを選択するために、ロジスティック回帰法を用いた。ロジスティック回帰法を用いると、段階的な選択は、従属変数に関して最大のＲ２値を生じるバイオマーカーを見出すことによって開始する。次いで、「最良の」バイオマーカーがこのモデル中にあると仮定すると、ロジスティック回帰により、Ｒ２に足すことによって、次の最良のバイオマーカーが見出される。Ｒ２に足すという、バイオマーカーのセットを見出すこのプロセスは、特定の統計的基準に従って、バイオマーカーがもはやＲ２に足すことができない場合に停止される。これらのバイオマーカーのセットは、バイオマーカーのうちのいくつかが同じ予測性能を有することから、唯一のものではない。
【０２１０】
１つの選択したモデルに基づいて、ＲＯＣプロットが生成され得、これは、感度と特異性の割合との間の関係性を提供する。従って、容認される感度を有する、ＰＰＶの期待値を得るために、適切な特異性および感度が選択され得る。
【０２１１】
表５１および５２は、集団が８，０００，０００であり、疾患の有病率が０．２５％であるという仮定の下、約１０％のＰＰＶおよび約７０％〜８０％の組み合わせの感度の割合と共に、より高い特異性と、適切な感度とを有するバイオマーカーのセットを選択することを含む、いくつかの例を提供する。感度、特異性、ＮＰＶおよびＰＰＶについての異なる標的値が、異なるアッセイカットオフ、異なるバイオマーカーの組み合わせ、および、バイオマーカーを組み合わせるための異なる規則を選択することによって得られ得る。バイオマーカーの値を、連続変数として（表５１）およびカテゴリー的変数（ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ）として（表５２）使用して、バイオマーカーの性能を解析した。
【０２１２】
定義する目的で、２つのアッセイ段階が実施されるとき、最初のアッセイ段階は「スクリーニング試験」と称され得、そして、２番目の段階は、「反射試験（ｒｅｆｌｅｘ  ｔｅｓｔ）」と称され得る。「ベストカットオフポイント（ｂｅｓｔ  ｃｕｔｏｆｆ  ｐｏｉｎｔ）」は、最良の感度および特異性を生じる、特定のバイオマーカーについてＲＯＣプロットから得られる値を指す。「平均＋２＊ｓｔｄ」は、発現レベルの平均に、卵巣癌を罹患していない患者からの正常な試料の解析に基づいた標準偏差の２倍を加えたものを指す。
【０２１３】
連続変数としてのバイオマーカーの性能
【０２１４】
【表５１】
2009524438.tif 000067
カテゴリー的変数としてのバイオマーカーの性能
【０２１５】
【表５２−１】
2009524438.tif 000068
【０２１６】
【表５２−２】
2009524438.tif 000069
。
【０２１７】
「試験の規則」を適用して得られた感度、特異性、ＰＰＶおよびＮＰＶの結果
現在の研究において、バイオマーカーＨＥ４、ＣＡ１２５、ＰＬＡＵ−Ｒ、グリコデリン、Ｍｕｃ−１、ＰＡＩ−１、ＭＭＰ−７およびインヒビンは、マーカー性能に基づいて、連続変数またはカテゴリー的変数のいずれかとして最も頻繁に選択されるマーカーであった。上記の統計的手法とは対照的に、表５３は、以下の２つの試験の規則に基づいて、推定の感度、特異性、ＰＰＶおよびＮＰＶ（疾患の有病率により調整）を提供する：（１）上記バイオマーカーのうちのいずれか２つが陽性である（すなわち、過剰発現される）場合、試験は陽性であることを示す、または、（２）上記バイオマーカーのうちいずれか３つが陽性である（すなわち、過剰発現される）場合、試験は陽性であることを示す。表５１および５２において上に提示される結果とは対照的ではあるが、卵巣癌の低い罹患率について調整した場合、いずれの試験の規則の適用も、高い特異性の割合を生じず、今度は、容認でいないほど低いＰＰＶ（＜１．５％）をもたらした。本明細書中に記載されるもののような「試験の規則」の適用は、卵巣癌を有する可能性の高い患者の同定における当該分野の現在の技術水準を代表するものである。
【０２１８】
【表５３】
2009524438.tif 000070
。
【０２１９】
（実施例４：卵巣バイオマーカー選択研究−１段階スクリーニング方法を用いた多重バイオマーカー解析）
全患者および５５歳より上の患者について、バイオマーカーＨＥ４、ＣＡ１２５およびグリコリデン、ならびにこれらの組み合わせの発現を、本明細書において上記したような、１段階スクリーニング方法を用いて評価した。特に、表５４は、５５歳より上の患者についての１段階アルゴリズムの結果を提供する。この試験アルゴリズムは、線形ロジスティック回帰モデルに基づくものであり、このモデルにおいて、各マーカーの実際の値を用いた。線形ロジスティック回帰モデル（および他のアルゴリズム）は、当該分野で慣習的かつ周知である。例えば、Ｆｌｅｉｓｓ（２００３）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ（第３版）（その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。このアルゴリズムは、９６．４％の特異性において７６．８％の感度を与えた。陽性と規定される試験結果は、以下の線形ロジスティック回帰モデルに基づくものであった：ｌｎ（Ｐ／（１−Ｐ））＝−４．２３９１＋０．０８８８＊ＣＡ１２５＋０．１７９０＊ＨＥ４＋０．２３４９＊ＧＬＹ（ここで、Ｐは、卵巣癌の条件付き確率であり、ＣＡ１２５、ＨＥ４およびグリコリデンが患者の身体試料において過剰発現されているものと仮定する）。≧３５ｕ／ｍｌという製造業者の推奨するカットオフ値を用いて決定したＣＡ１２５についても同様の結果が得られた。
【０２２０】
【表５４】
2009524438.tif 000071
。
【０２２１】
（実施例５：解析のブートストラップ法）
研究方法の確認
また、解析のブートストラップ法を、癌の血清の個々の独特のセットがこのモデルを確認するために利用可能でないと仮定して、上記研究についての感度および特異性の大まかな推定を確実なものとするために行った。このブートストラップ法は、研究標本セットから補充選択して、１０００のランダムなデータセットを人工的に作製することから構成される。最適な性能に基づき、研究において最も頻繁に選択されたマーカーのセットを選択した：ＨＥ４、ＣＡ１２５、ＰＬＡＵ−Ｒ、グリコデリン、ＭＵＣ１およびＰＡＩ−１。「試験」を以下のように規定した：（１）ＨＥ４が陽性でありかつＣＡ１２５、グリコリデン、ＭＭＰ−７、ＰＬＡＵ−Ｒのいずれか１つが陽性である場合、または（２）ＨＥ４が陰性であるが、ＣＡ１２５、グリコリデン、ＭＭＰ−７、ＰＡＬＵ−Ｒが全て陽性である場合のいずれかを、試験が陽性であるとし；それ以外の場合は、「試験」は陰性である。１０００のランダムな標本から、この規定された試験の感度／特異性の平均／標準偏差および９５％信頼区間を得た。
【０２２２】
【表５５】
2009524438.tif 000072
。
【０２２３】
明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、本発明の属する分野の当業者の水準を示す。全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が、具体的かつ個々に参考として援用されると示されるのと同程度まで、本明細書中に参考として援用される。
【０２２４】
上記発明は、理解を明瞭にする目的で、説明および例証として幾分詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正がなされ得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】図１は、卵巣癌を有する可能性の高い患者を同定するための例示的な「２段階」スクリーニング試験の概念図を提供する。この例においてスクリーニングされた８００万人の女性患者は、本明細書において規定されたような、高リスクで自覚症状のない米国患者集団に相当する。第一のアッセイ段階において、かなりの数の真の陰性がさらなる試験から排除され、それによって、第二のアッセイ段階におけるさらなる解析のために、富化された集団が残る。第二のアッセイ段階は、さらに、卵巣癌を有する危険性が最も高い女性を同定するために、真の陰性であるさらなる患者を除外する。２段階スクリーニング方法に関するさらなる詳細は、本文中に提供される。
【図２】図２は、５５歳より上の患者からの試料（Ａ）および全ての患者試料から得られる、ＨＥ４についての受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図３】図３は、５５歳より上の患者からの試料（Ａ）および全ての患者試料から得られる、インヒビンＡ（ＩＮＨ）についてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図４】図４は、全ての患者試料から得られる、プロラクチンについてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図５】図５は、全ての患者試料から得られる、ＰＬＡＵ−ＲについてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図６】図６は、５５歳より上の患者からの試料（Ａ）および全ての患者試料から得られる、グリコデリデン（ＧＬＹ）についてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図７】図７は、全ての患者試料から得られる、ＳＬＰＩについてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図８】図８は、全ての患者試料から得られる、ＣＴＨＲＣ１についてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図９】図９は、全ての患者試料から得られる、ＰＡＩ−１についてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図１０】図１０は、全ての患者試料から得られる、ＫＬＫ−１０についてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図１１】図１１は、５５歳より上の患者からの試料（Ａ）および全ての患者試料から得られる、ＣＡ１２５についてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図１２】図１２は、全ての患者試料から得られる、ＫＬＫ−６についてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図１３】図１３は、全ての患者試料から得られる、Ｍｕｃ−１（ＭＵ）についてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図１４】図１４は、全ての患者試料から得られる、ＭＭＰ−７（ＭＭ）についてのＲＯＣプロットを提供する。さらなる実験の詳細については、実施例２に提供される。
【図１】
2009524438.tif 000073
【図２】
2009524438.tif 000074
【図３】
2009524438.tif 000075
【図４】
2009524438.tif 000076
【図５】
2009524438.tif 000077
【図６】
2009524438.tif 000078
【図７】
2009524438.tif 000079
【図８】
2009524438.tif 000080
【図９】
2009524438.tif 000081
【図１０】
2009524438.tif 000082
【図１１】
2009524438.tif 000083
【図１２】
2009524438.tif 000084
【図１３】
2009524438.tif 000085
【図１４】
2009524438.tif 000086
【国際調査報告】
2009524438.tif 000087
2009524438.tif 000088
2009524438.tif 000089
2009524438.tif 000090