(57)【要約】  本発明は、ヒストン修飾制御剤と、標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとの複合体を含む、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤を提供する。これにより、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤が提供される。
2010001933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン修飾制御剤と、標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとの複合体を含む、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤。
【請求項２】
ヒストン修飾制御剤が、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、プロリンイソメル化、脱イミノ化およびＡＤＰリボシル化からなる群から選択される少なくとも１つのヒストン修飾をゲノム上の部位特異的に制御するものである、請求項１に記載の制御剤。
【請求項３】
ヒストン修飾制御剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である、請求項２に記載の制御剤。
【請求項４】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、ヒドロキサム誘導体、環状テトラペプチド、ベンズアミド誘導体、または脂肪族酸である、請求項３に記載の制御剤。
【請求項５】
ヒドロキサム誘導体が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スロベイルビスヒドロキサミン酸またはトリコスタチンＡである、請求項４に記載の制御剤。
【請求項６】
環状テトラペプチドが、トラポキシンＡ、またはトラポキシンＢである、請求項４に記載の制御剤。
【請求項７】
ベンズアミド誘導体が、ＭＳ-２７５である、請求項４に記載の制御剤。
【請求項８】
脂肪族酸が、ブチラートまたはＮａＢである、請求項４に記載の制御剤。
【請求項９】
ヒストン修飾制御剤がヒストンメチルトランスフェレース阻害剤である、請求項２に記載の制御剤。
【請求項１０】
ヒストンメチルトランスフェレース阻害剤が、芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体である、請求項９に記載の制御剤。
【請求項１１】
芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体が、ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物、アゾ化合物を基本骨格に有する化合物、またはその誘導体である、請求項１０に記載の制御剤。
【請求項１２】
ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物が、ＡＭＩ-１、スラミンまたは7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 (J酸)である、請求項１１に記載の制御剤。
【請求項１３】
アゾ化合物を基本骨格に有する化合物が、Direct Yellow 26、 Direct Yellow 50、またはDirect Red 75である、請求項１１に記載の制御剤。
【請求項１４】
標的遺伝子が細胞制御に関わる遺伝子である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の制御剤。
【請求項１５】
細胞制御に関わる遺伝子が、癌遺伝子、または癌抑制遺伝子である、請求項１４に記載の制御剤。
【請求項１６】
細胞制御に関わる遺伝子が、幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子である、請求項１４に記載の制御剤。
【請求項１７】
癌遺伝子が、Cytoplasmic tyrosine kinases 遺伝子、調節性GTPases遺伝子、チロシンキナーゼ型受容体遺伝子、細胞内セリンもしくはスレオニンキナーゼ遺伝子もしくはそれらの調節サブユニット遺伝子、シグナル伝達系のアダプタータンパク質遺伝子、または転写因子(Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ)遺伝子である請求項１５に記載の制御剤。
【請求項１８】
癌抑制遺伝子が、p16ＩＮＫ4a(ＣＤＫＮ2Ａ)遺伝子、ｐ21(ＣＤＫＮ1Ａ)遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＲＡＳＳＦ1遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＮＦ1遺伝子、ＮＦ2遺伝子、ｐ19(ＣＤＫＮ2Ｄ) 遺伝子、ＷＴ1遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ＢＲＣＡ1遺伝子、ＢＲＣＡ2遺伝子、ＣＨＥＫ2遺伝子、Ｍａｓｐｉｎ 遺伝子、ｐ73遺伝子、ＤＰＣ4(ＳＭＡＤ4) 遺伝子 、ＭＳＨ2遺伝子、ＭＬＨ1遺伝子、ＰＭＳ2遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ｐ57ＫＩＰ2(ＣＤＫＮ1Ｃ) 遺伝子、ＰＴＣ遺伝子、ＴＳＣ1遺伝子、ＴＳＣ2遺伝子、ＥＸＴ1遺伝子、ＥＸＴ2遺伝子、またはｐ53遺伝子である、請求項１５に記載の制御剤。
【請求項１９】
幹細胞または前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子が、ＬＩＦ  (leukaemia inhibitory factor)遺伝子、ＯＣＴ3/4遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ2遺伝子、ＫＬＦ4遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、または ｐ１６ＩＮＫ4ａ(ＣＤＫＮ2Ａ) 遺伝子である、請求項１６に記載の制御剤。
【請求項２０】
複合体が、下記式(1)、(2)、(3)、(4)または(5)で表されるものである、請求項１に記載の制御剤。
【化２８】
2010001933.tif 000030
【請求項２１】
請求項１〜請求項20のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストン修飾制御剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒストンは真核生物染色体の主要なタンパク質であり、大きく２つのグループに大別できる。１つは、ヌクレオソーム・ヒストンであり、もう１つはヒストンＨ１である。ヌクレオソーム・ヒストンにはＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の４種類がある。Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４はヒストンコアを構成する要素である。ヒストンコアは、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４を各２分子ずつ含む八量体構造である。この八量体構造のヒストンコアと１分子のヒストンＨ１に約２００塩基対のＤＮＡにより、ひとつのクロマチンの基本構造単位であるヌクレオソームを形成する。約２００塩基対のＤＮＡは、ヒストンコアを芯としてその周りを１．７５回巻きつけて、さらにヌクレオソーム同士を連結する。ヌクレオソーム同士を連結する部分をリンカーＤＮＡと呼ぶ。ヒストンＨ１はこのようなヌクレオソームをまとめて高次の規則的構造を作る。ヒストンは、リシンやアルギニン等の正に荷電したアミノ酸の含量が非常に多い。ＤＮＡは負の電荷を帯びているので正電荷を帯びたヒストンはＤＮＡと強く結合する。【０００３】
ヒストンは、真核生物染色体の遺伝子の転写制御に深く関わっている。例えばアセチル化、リン酸化、メチル化およびユビキチン化などの種々の修飾をヒストンが受けるとＤＮＡとヒストンとの結合状態が変化したりＤＮＡの修飾状態が変化したりし、その結果、遺伝子の転写が促進され、または抑制される。そこで、ヒストン修飾制御剤を利用して癌遺伝子や癌抑制遺伝子などの疾患に関連する遺伝子の転写を制御することで、癌などの疾患を治療しようとする試みが進められている。【０００４】
例えば、特許文献１には、ヒストン修飾制御剤の１つであるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(ＨＤＡＣ阻害剤)を用いて、癌を予防・治療することが記載されている。【０００５】
特許文献２には、ＨＤＡＣ阻害剤を用いて関節疾患を予防・治療することが記載されている。【０００６】
非特許文献１には、ＨＤＡＣ阻害剤の神経変性疾患への適応の可能性があることが記載されている。【０００７】
また、特許文献3には、ＨＤＡＣ１阻害剤の一つであるValproic acid（VPA）とそのアナログは、精神安定剤および抗癲癇剤として使用されることが記され、一方で、Valproic acid（VPA）とそのアナログについて、現在、抗HIV（エイズ）薬としての承認を受けるための臨床試験がおこなわれている（特許文献４）。【０００８】
さらに、HDAC阻害剤の一つであるスベロイルアニリドヒドロキサム酸(ＳＡＨＡ)は、Vorinostatとしてメルクから販売されており、cutaneous T cell lymphoma (ＣＴＣＬ)に対する治療薬として使用されている（特許文献５）。【０００９】
ヒストンのメチル化については、例えばヒストンアルギニンメチル化酵素ＰＲＭＴの阻害剤ＡＭＩ−１は、ヒストンのリシンのメチル化にはほとんど影響せず、がん細胞で核内レセプター遺伝子の発現を制御するということが報告されている（非特許文献２）。
さらにヒストンアルギニンのメチル化は幹細胞の多能性に関与していることも報告されており（非特許文献３）、ヒストンアルギニンメチル化酵素阻害剤は、幹細胞の多能性の機序解明にも利用できる（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００８−５０５９７０
【特許文献２】特開２００６−３３５６６６
【特許文献３】ＷＯ １９９９/０６６９２０
【特許文献４】ＷＯ ２００７/１２１４２９
【特許文献５】ＷＯ ２００８/００２９１４
【特許文献６】ＷＯ ２００８/０１７０２４
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Hahnen E, Hauke J, Trankle C, Eyupoglu IY, Wirth B, Blumcke I (2008), Histone deacetylase inhibitors: possible implications for neurodegenerative disorders. Expert Opin Investig Drugs 17(2):169-84
【非特許文献２】Donghang Cheng, Neelu Yadav, Randall W. King, Maurice S. Swanson,Edward J. Weinstein_, and Mark T. Bedford（2004) Small Molecule Regulators of Protein Arginine Methyltransferases  ＪＢＣ 279（23）：23892-23899
【非特許文献３】Maria-Elena Torres-Padilla1, David-Emlyn Parfitt1, Tony Kouzarides1 & Magdalena Zernicka-Goetz（2007) Histone arginine methylation regulates pluripotency in the early mouse embryo  Nature 445, 214-218
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このような状況の下、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ヒストン修飾制御剤と、標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとの複合体を合成できたこと、この複合体が標的遺伝子の発現を調節し、ヒストンの修飾をゲノム上の特異的部位で制御できると考えられること、等の知見に基づき完成された。
すなわち、本発明は、以下の標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤等を提供する。【００１４】
(1)ヒストン修飾制御剤と、標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとの複合体を含む、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤。
(2)ヒストン修飾制御剤が、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、プロリンイソメル化、脱イミノ化およびＡＤＰリボシル化からなる群から選択される少なくとも１つのヒストン修飾をゲノム上の部位特異的に制御するものである、上記(1)に記載の制御剤。
(3)ヒストン修飾制御剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である、上記(2)に記載の制御剤。
(4)ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、ヒドロキサム誘導体、環状テトラペプチド、ベンズアミド誘導体、または脂肪族酸である、上記(3)に記載の制御剤。
(5)ヒドロキサム誘導体が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スロベイルビスヒドロキサミン酸またはトリコスタチンAである、上記(4)に記載の制御剤。
(6)環状テトラペプチドが、トラポキシンＡ、またはトラポキシンＢである、上記(4)に記載の制御剤。
(7)ベンズアミド誘導体が、ＭＳ-２７５である、上記(4)に記載の制御剤。
(8)脂肪族酸が、ブチラートまたはＮａＢである、上記(4)に記載の制御剤。
(9)ヒストン修飾制御剤がヒストンメチルトランスフェレース阻害剤である、上記(2)に記載の制御剤。
(10)ヒストンメチルトランスフェレース阻害剤が、芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体である、上記(9)に記載の制御剤。
(11)芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体が、ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物、アゾ化合物を基本骨格に有する化合物、またはその誘導体である、上記(10)に記載の制御剤。
(12)ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物が、ＡＭＩ-１、スラミンまたは7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 (J酸)である、上記(11)に記載の制御剤。
(13)アゾ化合物を基本骨格に有する化合物が、Direct Yellow 26、 Direct Yellow 50、またはDirect Red 75である、上記(11)に記載の制御剤。
(14)標的遺伝子が細胞制御に関わる遺伝子である、上記(1)〜(13)のいずれか一項に記載の制御剤。
(15)細胞制御に関わる遺伝子が、癌遺伝子、または癌抑制遺伝子である、上記(14)に記載の制御剤。
(16)細胞制御に関わる遺伝子が、幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子である、上記(14)に記載の制御剤。
(17)癌遺伝子が、Cytoplasmic tyrosine kinases 遺伝子、調節性GTPases遺伝子、チロシンキナーゼ型受容体遺伝子、細胞内セリンもしくはスレオニンキナーゼ遺伝子もしくはそれらの調節サブユニット遺伝子、シグナル伝達系のアダプタータンパク質遺伝子、または転写因子(Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ)遺伝子である上記(１５)に記載の制御剤。
(18)癌抑制遺伝子が、p16ＩＮＫ4a(ＣＤＫＮ2Ａ)遺伝子、ｐ21(ＣＤＫＮ1Ａ)遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＲＡＳＳＦ1遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＮＦ1遺伝子、ＮＦ2遺伝子、ｐ19(ＣＤＫＮ2Ｄ) 遺伝子、ＷＴ1遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ＢＲＣＡ1遺伝子、ＢＲＣＡ2遺伝子、ＣＨＥＫ2遺伝子、Ｍａｓｐｉｎ 遺伝子、ｐ73遺伝子、ＤＰＣ4(ＳＭＡＤ4) 遺伝子 、ＭＳＨ2遺伝子、ＭＬＨ1遺伝子、ＰＭＳ2遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ｐ57ＫＩＰ2(ＣＤＫＮ1Ｃ) 遺伝子、ＰＴＣ遺伝子、ＴＳＣ1遺伝子、ＴＳＣ2遺伝子、ＥＸＴ1遺伝子、ＥＸＴ2遺伝子、またはｐ53遺伝子である、上記(15)に記載の制御剤。
(19)幹細胞または前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子が、ＬＩＦ  (leukaemia inhibitory factor)遺伝子、ＯＣＴ3/4遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ2遺伝子、ＫＬＦ4遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、または ｐ１６ＩＮＫ4ａ(ＣＤＫＮ2Ａ) 遺伝子である、上記(16)に記載の制御剤。
(20)複合体が、下記式(1)、(2)、(3)、(4)または（5）で表されるものである、上記(1)に記載の制御剤。
【化１】
2010001933.tif 000003
【００１５】
(21)ヒストン修飾制御剤と、標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとの複合体を用いる、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御方法。
(22)ヒストン修飾制御剤が、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、プロリンイソメル化、脱イミノ化およびＡＤＰリボシル化からなる群から選択される少なくとも１つのヒストン修飾をゲノム上の部位特異的に制御するものである、上記(21)に記載の方法。
(23)ヒストン修飾制御剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である、上記(22)に記載の方法。
(24)ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、ヒドロキサム誘導体、環状テトラペプチド、ベンズアミド誘導体、または脂肪族酸である、上記(23)に記載の方法。
(25)ヒドロキサム誘導体が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スロベイルビスヒドロキサミン酸またはトリコスタチンAである、上記(24)に記載の方法。
(26)環状テトラペプチドが、トラポキシンＡ、またはトラポキシンＢである、上記(24)に記載の方法。
(27)ベンズアミド誘導体が、ＭＳ-２７５である、上記(24)に記載の方法。
(28)脂肪族酸が、ブチラートまたはＮａＢである、上記(24)に記載の方法。
(29)ヒストン修飾制御剤がヒストンメチルトランスフェレース阻害剤である、上記(22)に記載の方法。
(30)ヒストンメチルトランスフェレース阻害剤が、芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体である、上記(29)に記載の方法。
(31)芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体が、ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物、アゾ化合物を基本骨格に有する化合物、またはその誘導体である、上記(30)に記載の方法。
(32)ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物が、ＡＭＩ-１、スラミンまたは7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 (J酸)である、上記(31)に記載の方法。
(33)アゾ化合物を基本骨格に有する化合物が、Direct Yellow 26、 Direct Yellow 50、またはDirect Red 75である、上記(31)に記載の方法。
(34)標的遺伝子が細胞制御に関わる遺伝子である、上記(21)〜(33)のいずれか一項に記載の方法。
(35)細胞制御に関わる遺伝子が、癌遺伝子、または癌抑制遺伝子である、上記(34)に記載の方法。
(36)細胞制御に関わる遺伝子が、幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子である、上記(34)に記載の方法。
(37)癌遺伝子が、Cytoplasmic tyrosine kinases 遺伝子、調節性GTPases遺伝子、チロシンキナーゼ型受容体遺伝子、細胞内セリンもしくはスレオニンキナーゼ遺伝子もしくはそれらの調節サブユニット遺伝子、シグナル伝達系のアダプタータンパク質遺伝子、または転写因子(Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ)遺伝子である上記(35)に記載の方法。
(38)癌抑制遺伝子が、p16ＩＮＫ4a(ＣＤＫＮ2Ａ)遺伝子、ｐ21(ＣＤＫＮ1Ａ)遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＲＡＳＳＦ1遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＮＦ1遺伝子、ＮＦ2遺伝子、ｐ19(ＣＤＫＮ2Ｄ) 遺伝子、ＷＴ1遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ＢＲＣＡ1遺伝子、ＢＲＣＡ2遺伝子、ＣＨＥＫ2遺伝子、Ｍａｓｐｉｎ 遺伝子、ｐ73遺伝子、ＤＰＣ4(ＳＭＡＤ4) 遺伝子 、ＭＳＨ2遺伝子、ＭＬＨ1遺伝子、ＰＭＳ2遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ｐ57ＫＩＰ2(ＣＤＫＮ1Ｃ) 遺伝子、ＰＴＣ遺伝子、ＴＳＣ1遺伝子、ＴＳＣ2遺伝子、ＥＸＴ1遺伝子、ＥＸＴ2遺伝子、またはｐ53遺伝子である、上記(35)に記載の方法。
(39)幹細胞または前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子が、ＬＩＦ  (leukaemia inhibitory factor)遺伝子、ＯＣＴ3/4遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ2遺伝子、ＫＬＦ4遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、または ｐ１６ＩＮＫ4ａ(ＣＤＫＮ2Ａ) 遺伝子である、上記(36)に記載の方法。
(40)複合体が、下記式(1)、(2)、(3)、(4)または（5）で表されるものである、上記(21)に記載の方法。
【化２】
2010001933.tif 000004
【００１６】
(41)上記(1)〜(20)のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
(42)癌治療のための、上記(41)に記載の医薬組成物。
(43)上記(1)〜(20)のいずれか１項に記載の複合体を投与することを含む、癌の治療方法。
(44)上記(1)〜(20)のいずれか１項に記載の複合体を含む、細胞機能研究用試薬。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤等が提供される。本発明の好ましい態様によれば、制御剤は癌などの疾患の予防・治療などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐ１６遺伝子のプロモータ領域の配列を示す図である。
【図２】ＨＤＡＣ活性測定の結果を示すグラフである。
【図３】Hela細胞増殖アッセイの結果を示すグラフである。
【図４】４種類のがん細胞増殖アッセイの結果を示すグラフである。
【図５】Ｈｅｌａ細胞株を光学顕微鏡で観察した写真である。（左）細胞増殖アッセイ前、(右)細胞増殖アッセイ後。
【図６】リアルタイムRT-PCRの結果を示すグラフである。
【図７】ウエスタンブロッティングの結果を示すグラフである。
【図８】p５３遺伝子のプロモータ領域の配列を示す図である。
【図９】ＭＹＣＮ遺伝子のプロモータ領域の配列を示す図である。
【図１０】ゲノム領域特異的ヒストンアセチル化の解析結果を示すグラフである。
【図１１】定量的ＰＣＲによるＬＡＲＰ１遺伝子の発現解析の結果を示すグラフである。
【図１２】乳がん細胞の増殖アッセイの結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００１９】
配列番号２：合成ＤＮＡ、
配列番号３：合成ＤＮＡ、
配列番号４：合成ＤＮＡ、
配列番号５：合成ＤＮＡ、
配列番号８：合成ＤＮＡ、
配列番号９：合成ＤＮＡ、
配列番号１０：合成ＤＮＡ、
配列番号１１：合成ＤＮＡ、
配列番号１２：合成ＤＮＡ、
配列番号１３：合成ＤＮＡ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願２００８−１７２７９５号に記載の明細書、請求の範囲及び／又は図面の内容を包含する。
【００２１】
１．本発明の概要
前述のように、ヒストンは真核生物染色体の遺伝子の転写制御に深く関わっている。ヒストンが修飾を受けるとＤＮＡとヒストンとの結合状態が変化したりＤＮＡの修飾状態が変化したりし、その結果、遺伝子の転写が促進され、または抑制される。ヒストンの修飾としては、例えばヒストンのアセチル化が挙げられる。ヒストンのアセチル化は、細胞内では、ヒストンアセチル化酵素(ＨＡＴ: Ｈｉｓｔｏｎｅ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)とヒストン脱アセチル化酵素(ＨＤＡＣ: Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ)によって制御されていることが知られており、近年、いくつかのHATおよびHDACが同定されている。このヒストンのアセチル化は、ヒストン蛋白に負の電荷をもつアセチル基を付加し、ヒストンを負に荷電し、ヒストン間およびＤＮＡヒストン間の乖離を促す。このことでヒストンのアセチル化は遺伝子の転写調節に深く関わっていると考えられる。例えば、ヒストンのアセチル化が進むとヌクレオソームの縮合が緩んでＤＮＡの脱メチル化が促される。遺伝子調節領域で縮合が緩み、ＤＮＡの脱メチル化がすすむとその調節領域に転写因子が結合できるようになり遺伝子の発現が促されると考えられている。そこで、ヒストンのアセチル化を促し、例えば、癌抑制遺伝子ｐ１６の調節領域の脱メチル化を促すことができれば、p16の発現が促されるので、癌を予防・治療することも可能になる。このような目的でヒストンのアセチル化を促す試薬としてＨＤＡＣ阻害剤が知られている。HDAC阻害剤は、細胞内のHDACの働きを阻害することでヒストンのアセチル化を促すものである。しかし、従来のHDAC阻害剤は細胞中でランダムに働くため、目的の遺伝子をほとんど発現させることができなかったり、目的以外の遺伝子の発現の方をより促してしまったりするということがあった。
【００２２】
これに対して、本発明は、標的特異的にヒストンの修飾を制御することができる標的特異的ヒストン修飾制御剤などに関するものである。具体的には、本発明の標的特異的ヒストン修飾制御剤は、ヒストン修飾制御剤と標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとの複合体を含む。複合体中のヒストン修飾制御剤としては、例えばヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(ＨＤＡＣ阻害剤)などが挙げられる。また、ポリアミドとしては、例えばピロールイミダゾールアミド(ＰＩＰ)などが挙げられる。
【００２３】
本発明は、ヒストン修飾制御剤と標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとの複合体を合成できたこと、この複合体が標的遺伝子の発現に関与するヒストンの修飾にゲノム上の部位特異的に作用し標的遺伝子の発現を調節したこと、等の知見から完成された。
【００２４】
例えば複合体が、癌抑制遺伝子ｐ１６の調節領域を認識するポリアミドとＨＤＡＣ阻害剤との複合体であれば、この複合体を含む標的特異的ヒストン修飾制御剤を癌細胞に適用することによって、複合体中のポリアミドが標的特異的にＨＤＡＣ酵素活性部位と結合すると考えられ、さらに、複合体中のＨＤＡＣ阻害剤がヒストン修飾に作用し、このヒストン修飾への作用が癌抑制遺伝子ｐ１６の遺伝子調節領域に影響を与え、次に、遺伝子調節領域に転写因子が結合し転写が正に制御されるようになり、ｐ１６の発現が促される。さらに、ｐ１６の発現が促されることにより、癌細胞の増殖抑制や幹細胞等への老化シグナルの調節ができる(ＷＯ２００４/０２６１０９)。また、標的特異的にヒストンの脱アセチル化を阻害するので、目的以外の遺伝子の発現をより促してしまうという問題を最小限に抑えることができ、このため、複合体は副作用等も少ない。
【００２５】
２．複合体
本発明の複合体は、ヒストン修飾制御剤と標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとを有する。
複合体を構成するヒストン修飾制御剤としては、ヒストンのアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、プロリンイソメル化、脱イミノ化およびＡＤＰリボシル化からなる群から選択される少なくとも１つの修飾を制御するもの、またはヌクレオソームに働きかけるヒストンシャペロンを阻害もしくは活性化するものであるのが好ましい。より好ましくは、ヒストン修飾制御剤はヒストンのアセチル化、リン酸化、またはメチル化を制御するものであり、さらに好ましくは、ヒストンのアセチル化もしくはメチル化を制御するものである。アセチル化、リン酸化、メチル化、およびユビキチン化などの種々の修飾をヒストンが受けるとＤＮＡとヒストンの結合状態が変化したりＤＮＡの修飾状態が変化するなどし、その結果、遺伝子の転写が促されたり抑えられたりする。そこで、ヒストン修飾制御剤を利用して癌遺伝子や癌抑制遺伝子などの疾患に関連する遺伝子の転写を制御することで癌などの疾患を予防・治療することができる。
【００２６】
例えば、ヒストンのアセチル化はヌクレオソームの縮合を緩めてＤＮＡの脱メチル化を促す。遺伝子調節領域でＤＮＡの脱メチル化が進むと調節領域に転写因子が結合できるようになり遺伝子の発現が促されると考えられている。一方、ヒストンの脱アセチル化はヌクレオソームの縮合を促し、ＤＮＡのメチル化を促す。遺伝子調節領域でＤＮＡのメチル化が進むと調節領域に転写因子が結合できなくなり遺伝子の発現が抑制されると考えられている。よって、例えば癌抑制遺伝子の調節領域を認識する本発明の一態様の複合体を癌細胞に適用して、ゲノム上の部位特異的に、ヒストンのアセチル化を促し癌抑制遺伝子の調節領域の脱メチル化を促すことで、癌抑制遺伝子の発現を促したり、あるいは、癌遺伝子の調節領域を認識する本発明の別の態様の複合体を癌細胞に適用して、ゲノム上の部位特異的に、ヒストンのアセチル化を抑えて癌遺伝子の調節領域のメチル化を促すことで、癌遺伝子の発現を抑えたりすることにより癌を予防・治療することができる。
【００２７】
ヒストンのリン酸化は、そのリン酸化の部位により様々な機能を示すと考えられ、その制御するリン酸化酵素も多種に及ぶ。例えばＨ２Ａのリン酸化はＤＮＡの障害に対する反応に関与し、ヒストンＨ２Ｂ、およびヒストンＨ３（特に、１０番目、２８番目のセリン）のリン酸化は、ｃ‐ｆｏｓなどの遺伝子の発現、および細胞分裂時または細胞死誘導時の染色体の凝集などに関係すると考えられている。よって、本発明の別の態様の複合体を癌細胞に適用して、ゲノム上の部位特異的に、例えば、ヒストンＨ３のセリン１０番をリン酸化することにより、癌細胞の細胞周期を制御し癌細胞の増殖の進行を停止させることができ、これにより、癌を予防・治療することができる。さらに、松果体ではヒストンＨ３のセリン１０番のリン酸化がarylalkylamine -N- acetyltransferase 遺伝子の発現を制御し、動物の日周期活動に関与することが示唆されている（Endocrinology 148 (4):1465-1472 (2007)。よって、本発明のさらに別の態様の複合体を適用することにより、ゲノム上の部位特異的にヒストンＨ３のリン酸化、脱リン酸化を促し、人間の生活リズムの解明、不眠症などの改善に応用することも期待される。また、ヒストンのリン酸化は、遺伝子領域によっては、ヒストンのアセチル化を誘導し、細胞の遺伝子発現、細胞活動、または細胞増殖に影響をあたえる。例えば、ヒストン脱アセチル化酵素HDAC1遺伝子領域において、ヒストンH３のセリン１０番がリン酸化されると、そのリン酸化ヒストンH３に14-3-3蛋白質が結合し、さらにヒストンＨ３のリジン９番およびリジン１４番のアセチル化を誘導し、HDAC1遺伝子の発現を上昇させる。（EMBO J. 27(1): 88-99 (2007)）。
【００２８】
ヒストンのメチル化はメチル化の場所（メチル化部位とメチル化の数）に応じて転写の活性化が生じたり遺伝子座のサイレンシングが生じたりすると考えられておりエピジェネティックな遺伝子の発現調節に関与している。例えば、ヒストンＨ３の４番目のリシンのメチル化は、遺伝子発現を正に制御し、ヒストンＨ３の9番目、27番目、79番目のリシンのトリメチル化は、ひとつのメチル基付加では正に、3つのメチル基付加では負に制御することが知られている。メチル化されたヒストンＨ３はヘテロクロマチンプロテイン１(HP1)と結合し、その結合の有無によりクロマチン構造の制御、遺伝子発現の制御がおこなわれている。上述のヒストンＨ３のセリン１０番のリン酸化はAURKB(オーロラカイネースB)によりリン酸化を受けると考えられ、隣のリジン９番のメチル化を抑制することが報告されており、ヒストンＨ３のリン酸化とメチル化の相互作用による、クロマチン構造制御や遺伝子発現制御が明らかにされており、癌細胞の増殖抑制にむけた応用が期待される。ヒストンＨ４の１番目のセリンのリン酸化は精子の形成に関与していることが示唆されている。
【００２９】
ヒストンのユビキチン化はＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ３におこることが報告されている。詳細な機能は未だ解明されていないが、例えば遺伝子の転写抑制を起こすポリコーム複合体の中にＨ２Ａヒストンユビキチン化活性酵素が含まれていることが解ったことよりＨ２Ａのユビキチン化は遺伝子の発現抑制に関与し（Nature 2004  431 873-878）、Ｈ２Ｂのユビキチン化は、ヒストンのメチル化を制御することが示唆され、遺伝子の発現を制御すると考えられる。
【００３０】
ヒストンのＳＵＭＯ化は、ヒストンＨ４、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂの特異的残基に起こり、アセチル化やユビキチン化が起こるリジン残基と同じリジン残基をＳＵＭＯ化する。ＳＵＭＯ化は、分子量の大きなユビキチン系蛋白がヒストンテイルの部分を占拠することにより、他のヒストン修飾酵素がヒストンテイルに到達できなくなることで、アセチル化やユビキチン化が抑制されると考えられており、このことで遺伝子の発現制御に関与していると考えられている。
【００３１】
プロリンイソメル化は、ヒストンＨ３の３８番目のプロリンにFPR4という酵素で誘導されることが報告されている。このＨ３Ｐ３８のイソメル化により、ヒストンH3のテイルの構造が変わり、Ｈ３Ｋ３６のメチル化がＪＭＪＤ２などのヒストンメチル化酵素により行われるようになると考えられ、このことで遺伝子発現の制御をしていると考えられる。
【００３２】
脱イミノ化はＰＡＤＩ４などの酵素によりヒストンＨ３とＨ４のアルギニン残基がシトルリン残基に変換する反応であり、このことでアルギニンのメチル化が阻害されることより、ヒストンのアルギニンメチル化による遺伝子の発現を妨げ、遺伝子発現抑制に働くと考えられている。
【００３３】
ＡＤＰリボシル化は、ＭＡＲＴ(単ＡＤＰリボシル基置換酵素)、ＰＡＲＴ(ＡＤＰリボシル基転写酵素)という酵素により制御され、その酵素がDNAの２本鎖傷害時に発現することより、遺伝子損傷の修復に関与すると考えられる。
【００３４】
ヒストン蛋白に巻きついたDNAは、さらに、遺伝情報が読まれないようにヌクレオソーム構造を形成する。逆にＤＮＡ上にある遺伝情報が必要になると、ヒストンからDNAをはがすようにいろいろな蛋白質がヌクレオソームに働きかける。このような蛋白質をヒストンシャペロンと呼び、ＴＦＩＩＤ、ＮＡＰ１、およびＴＡＦＩβ等のヒストンシャペロンが知られている。ヒストンシャペロンは、ヌクレオソームの形成や破壊に関与している。
ヒストンの修飾によるヌクレオソーム構造の形成と崩壊の制御機構の詳細は不明な点はあるものの、ヒストンの修飾が、遺伝子の発現や転写因子、細胞分裂、減数分裂、細胞死、染色体の複製、および遺伝子の修復などに関与していることが徐々に解明されている。このように遺伝子の制御や様々な細胞の制御機構にヒストンの修飾が関わることより、様々な病態と関わっていると考えられる。前述した癌化、脳神経系の疾患（自閉症、双極性障害、統合失調症、癲癇など）、あるいは様々な生活習慣病の発症、幹細胞を利用した再生医療にヒストンの修飾が関与することが判明しており、ヒストンの修飾を遺伝子部位特異的に制御することは、細胞機能の詳細な解析を可能にし、難知性の疾患の機序解明、治療法の開発のための試薬としても使用可能となる。
【００３５】
ヒストンをアセチル化する酵素はＨＡＴであり、ヒストンを脱アセチル化する酵素はＨＤＡＣである。ＨＤＡＣは、酵母のＨＤＡＣの構造解析により得られた知見から3つのクラス(クラスI〜III)に分けることができる。クラスIとしてはＨＤＡＣ１, ＨＤＡＣ２, ＨＤＡＣ３, ＨＤＡＣ８、およびＨＤＡＣ１１が知られており、クラスIのＨＤＡＣはいたるところで発現が見られる。クラスIIとしてはクラスIIaのＨＤＡＣ４, ＨＤＡＣ５, ＨＤＡＣ７、およびＨＤＡＣ９、ならびにクラスIIｂとしてはＨＤＡＣ６、およびＨＤＡＣ１０が知られている。さらにクラスIIIとしてはＳＩＲＴ１から７が知られている。このようなＨＤＡＣは細胞内に豊富に存在しているため、一般的にゲノムは脱アセチル化の方向に制御される。そして、ゲノムの脱アセチル化によりヌクレオソームは縮合している。また、必要に応じてゲノムはＨＡＴによるアセチル化を受ける。ゲノムのアセチル化によりヌクレオソームの縮合が緩みＤＮＡ結合蛋白等の蛋白がＤＮＡやヒストンに接触できるようになると考えられている。このようなＨＡＴやＨＤＡＣなどの酵素を阻害することなどで、ヒストンのアセチル化を促したり、ヒストンの脱アセチル化を促し、ヒストンのアセチル化を制御することができる。ヒストンのアセチル化を促すものとしては、ＨＤＡＣ阻害剤または間接的にDNAメチル化を阻害しヒストンアセチル化を促すhydralazine、 5-Aza-2'-deoxycytidine、 zebularine、 もしくはmagnesium valporateなどが挙げられる。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤である。ＨＤＡＣ阻害剤としては、ヒドロキサム誘導体、環状テトラペプチド、ベンズアミド誘導体または脂肪族酸などが挙げられる。好ましくは、ヒドロキサム酸誘導体である。ヒドロキサム酸誘導体としては、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(ＳＡＨＡ)、スベロイルビスヒドロキサミン酸、またはトリコスタチンＡなどが挙げられる。環状テトラペプチドとしては、トラポキシンＡ(ＴＰＸ)、またはトラポキシンBなどが挙げられる。ベンズアミド誘導体としては、ＭＳ‐２７５などが挙げられる。脂肪族酸としては、ブチラート、またはＮａＢなどが挙げられる。一方、ヒストンの脱アセチル化を促すものとしては、Ｈ３‐ＣｏＡ‐２０、またはＬｙｓ‐ＣｏＡなどが挙げられる。
【００３６】
ここで、ヒストンアセチル化制御剤は、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することができる。例えば、ＳＡＨＡはｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ (Ｚｏｌｉｎｚａ)としてＭｅｒｃｋ& Ｃｏ., Ｉｎｃ.から入手可能である。ＴＰＸは、Ｎｏｖａｒｔｉｓ, Ｂａｓａｌ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。ＭＳ‐２７５は、ALEXIS Biochemicals (Lausen, Switzerland)から入手可能である。ＮａＢは、Ｂｉｏｍｏｌ (Ｈａｍｂｕｒｇ, Ｇｅｒｍａｎｙ)より入手可能である。
【００３７】
ヒストンをリン酸化する酵素はカイネースであり、ヒストンを脱リン酸化する酵素は脱リン酸化酵素である。カイネースや脱リン酸化酵素などの酵素を阻害することなどで、ヒストンのリン酸化を促したり、ヒストンの脱リン酸化を促したりすることができる。ヒストンのリン酸化を促すものとしては、ヒストンアセチル化酵素阻害剤、またはCantharidinなどが知られ、一方、ヒストンの脱リン酸化を促すものとしては、オーロラカイネース阻害剤等のカイネース阻害剤が知られている。オーロラカイネース阻害剤としては、例えば４‐(４‘‐Ｂｅｎｚａｍｉｄｏａｎｉｌｉｎｏ)‐６,７‐ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ、またはＶＸ‐６８０などが知られている。
【００３８】
ここで、ヒストンリン酸化制御剤は、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することもできる。例えば、４‐(４‘‐Ｂｅｎｚａｍｉｄｏａｎｉｌｉｎｏ)‐６,７‐ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅは、Ｍｅｒｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である。ＶＸ‐６８０は、Ｖｅｒｔｅｘから入手可能である。
【００３９】
ヒストンをメチル化する酵素はヒストンメチルトランスフェレース(ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)であり、ヒストンを脱メチル化する酵素はヒストン脱メチル化酵素(ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ)である。ヒストンメチルトランスフェレースとしてはｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅおよびａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅなどが知られている。ヒストン脱メチル化酵素としてはＪＨＭＤ１, ＪＨＭＤ２Ａ, ＧＡＳＣ１, ＪＭＪＤ２Ａ, ＪＭＪＤ２Ｂ, ＪＭＪＤ２Ｃ, およびＪＭＪＤ２Ｄなどが知られている。このようなヒストンメチルトランスフェレースやヒストン脱メチル化酵素などを阻害することなどで、ヒストンのメチル化を促したり、ヒストンの脱メチル化を促したりして、ヒストンのメチル化を制御することができる。ヒストンのメチル化を促すものとしては、ＭＡＯ阻害剤のＰｈｅｎｅｌｚｉｎｅ等がある。一方、ヒストンの脱メチル化を促すものとしては、ヒストンメチルトランスフェレース阻害剤、ヒストン脱メチル化酵素およびその賦活剤、ヒストンシトリル化酵素が挙げられる。好ましくは、ヒストンメチルトランスフェレース阻害剤である。ヒストンメチルトランスフェレース阻害剤（例えば、Ｃｈａｅｔｏｃｉｎ阻害剤、ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ (LSD) ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、またはｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＰＲＭＴ） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓなど）としては、芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体などが挙げられる。芳香環を有する化合物、複素環を有する化合物、またはその誘導体は、例えば、ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物、アゾ化合物を基本骨格に有する化合物、またはその誘導体である。ナフタレン化合物を基本骨格に有する化合物としては、ＡＭＩ-１、スラミンまたは7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 (J酸)を挙げることができる。アゾ化合物を基本骨格に有する化合物としては、Direct Yellow 26、 Direct Yellow 50、またはDirect Red 75を挙げることができる。さらに、芳香環を有する化合物として、ＬＳＤ阻害剤であるｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅを挙げることができる。また、ＰＲＭＴ阻害剤として、AMI-1を挙げることができる。
【００４０】
ここで、ヒストンメチル化制御剤は、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することもできる。例えば、Ｐａｒｇｙｌｉｎｅ（ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ）はGlaxoSmithKlineから入手可能である。ＡＭＩ‐１は、Ｍｅｒｋから入手可能である。スラミン（Ｓｕｒａｍｉｎ）はＳｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。Ｐｈｅｎｅｌｚｉｎｅは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能である。
【００４１】
ヒストンをユビキチン化する酵素は、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、またはユビキチン転移酵素（ユビキチンライゲース）であり、ヒストンを脱ユビキチン化する酵素は、脱ユビキチン化酵素(ＤＵＢ)である。ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチン転移酵素、または脱ユビキチン化酵素を阻害することなどで、ヒストンのユビキチン化を促したりヒストンの脱ユビキチン化を促したりして、ヒストンのユビキチン化を制御することができる。ヒストンのユビキチン化を促すものとしては、ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅがある。一方、ヒストンの脱ユビキチン化を促すものとしては、ＵＢＥＩ‐４１などがある。
【００４２】
ここで、ヒストンユビキチン化制御剤は、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することもできる。例えば、ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅは、ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。ＵＢＥＩ‐４１はＢｉｏｇｅｎｏｖａ Ｃｏｒｐから入手可能である。
【００４３】
ヒストンのＳＵＭＯ化を促すものはａｒｓｅｎｉｃ ｔｒｉｏｘｉｄｅ （Ａｓ２Ｏ３）などであり、ヒストンの脱ＳＵＭＯ化を促すものは、ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎなどがある。
【００４４】
ここで、ヒストンＳＵＭＯ化制御剤は、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することもできる。例えば、Ａｓ２Ｏ３およびｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎはＳｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
【００４５】
ヒストンの脱イミノ化を阻害するものとしては、ヒストンのアルギニンの脱イムノ化を阻害するＰＡＤ４阻害剤（ＷＯ２００７/０５６３８９ 、およびＷＯ２００７/０５１８参照）などがある。
ここで、ヒストン脱イミノ化制御剤は、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することもできる。
【００４６】
ヒストンのＡＤＰリボシル化を阻害するものとしては、ｄｉａｄｅｎｏｓｉｎｅ 5',5"-ｐｌ,ｐ４‐ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ （Ａｐ４Ａ）（Molecular and Cellular Biochemistry 74:17-20 (1987)）などがある。
【００４７】
ここで、ヒストンＡＤＰリボシル化制御剤は、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することもできる。例えば、Ａｐ４Ａの合成法は、Biophosphates and Their  Analogues-Synthesis, Structure, Metal and Activity, eds.  Bruzik, K. S. & Stec, W. J. (Elsevier, Amsterdam), pp. 451-464. (1986)に記載されている。
【００４８】
ヒストンのプロリンイソメル化を阻害するものとしてはＪｕｇｌｏｎｅとその誘導体があげられる。
【００４９】
ここで、ヒストンプロリンイソメル化制御剤は、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することもできる。例えば、Ｊｕｇｌｏｎｅは、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈより入手することができる。
【００５０】
ヌクレオソームに働きかけるヒストンシャペロンを阻害するものとしては、ヌクレオフォスミン阻害剤ＮＳＣ３４８８８４が挙げられる。
【００５１】
ここで、ヌクレオソームに働きかけるヒストンシャペロンを阻害もしくは活性化するものは、公知の方法で合成することができるし、あるいは、市販のものを入手することもできる。例えば、ＮＳＣ３４８８８４は  ＮＣＩ （ＮＣＩ, Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ, ＬｅａｄＱｕｅｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ）より入手することができる。
【００５２】
複合体の構成要素であるポリアミド(標的認識ポリアミド)は、標的遺伝子の調節領域を認識するように設計される。標的認識ポリアミドを含まない従来のヒストン修飾制御剤を用いると細胞内でヒストンの修飾がランダムに制御されるため、標的遺伝子以外の遺伝子の発現のみが調節されて標的遺伝子の発現が調節できなかったりすることがある。本発明の複合体は標的認識ポリアミドを含むので、従来の制御剤単独よりも特異的に標的遺伝子の発現を調節することができる。ここで、「調節領域を認識する」とは、標的遺伝子の調節領域および／またはその近傍に標的認識ポリアミドが結合等(例えば水素結合または架橋形成（クロスリンキング)による結合など)することを意味する。DNAは、146塩基のコアヒストン結合部位と５０塩基程度のコアヒストン非結合部位（リンカーヒストン結合部位およびリンカーヒストン非結合部位）が交互に存在し約200塩基ごとにヌクレオソーム構造を形成する。リンカーヒストン結合部位とコアヒストン結合部位は、ＤＮＡ結合蛋白がＤＮＡを認識しづらい領域である。このため、リンカーヒストン結合部位とコアヒストン結合部位は、核酸分解酵素に抵抗性もしくはバイサルファイト処理に抵抗性の領域となる。本発明の好ましい態様では、DNAがメチル化された（一般にヌクレオソーム構造を有する）遺伝子調節領域でバイサルファイト処理に感受性の高い領域（ヒストン蛋白が結合していない領域）を探索し、調節領域に近いバイサルファイト処理高感受性領域（調節領域からの距離がヌクレオソーム一個分の２００塩基以内、好ましくは１００塩基以内の感受性領域）に標的認識ポリアミドが結合（例えば水素結合または架橋形成（クロスリンキング）による結合など）等するように、標的認識ポリアミドを設計する。標的認識ポリアミドが認識する「調節領域」は、例えば、プロモータ、エンハンサー、リプレッサー、またはインスレータであり、好ましくは、プロモータである。標的認識ポリアミドが結合する遺伝子調節領域および／またはその近傍は、リンカーＤＮＡ(ヌクレオソームにおけるヒストン非結合DNA領域)であるのが好ましい。標的認識ポリアミドとしては、ピロールイミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）またはＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）などを挙げることができる。
【００５３】
ＰＩＰは、N-メチルピロール単位（Ｐｙ）とN-メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）とγ-アミノ酪酸部分を含むポリアミドであり、ＰｙとＩｍとγ-アミノ酪酸部分とは互いにアミド結合(-C(=O)-NH-)で連結される(Trauger et al, Nature, 382, 559-61(1996); White et al, Chem Biol., 4, 569-78(1997);およびDervan, Bioorg Med Chem., 9, 2215-35(2001))。ＰＩＰは、γ-アミノ酪酸部分がリンカー（γ−リンカー）となって全体が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。Ｕ字型のコンフォメーションにおいては、リンカーを挟んでＰｙとＩｍとを含む２本の鎖が並列に並ぶ。この２本の鎖の間のＰｙとＩｍの対が特定の組み合わせ（Ｐｙ／Ｉｍ対、Ｉｍ／Ｐｙ対、Ｐｙ／Ｐｙ対、またはＩｍ／Ｉｍ対）のときに、ＤＮＡ中の特定の塩基対に高い親和性で結合することができる。例えば、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ‐Ｇ塩基対に結合することができ、Ｉｍ／Ｐｙ対はＧ‐Ｃ塩基対に結合することができる。また、Ｐｙ／Ｐｙ対はＡ‐Ｔ塩基対およびＴ‐Ａ塩基対の両方に結合することができる(White et al, Chem Biol., 4, 569-78(1997); Dervan: Bioorg Med Chem., 9, 2215-35(2001))。また、ＰＩＰには、他に3-ヒドロキシピロール(Hp)、またはβアラニンが含まれていても良い。Hpについては、Hp/Py対はT-A塩基対に結合することができる(White at al, Nature, 391, 468-71(1998))。βアラニン/βアラニンについては、Ｔ‐Ａ塩基対もしくはA-T塩基対に結合することができる。よって、標的のDNA配列に合わせてPyとImの対の組み合わせ等を変更することにより、標的遺伝子の調節領域を認識するＰＩＰを設計することができる。ＰＩＰの設計方法及び製造方法は公知である（特許第3045706号、特開2001-136974およびWO03/000683）。具体的には標的遺伝子の調節領域を認識するようにＰＩＰを次のように設計および合成する。すなわち、ｐ１６遺伝子のプロモータ領域を認識するＰＩＰの設計方法は、後述の実施例に具体的に記載した。
ｐ５３遺伝子のプロモータ領域付近のヒストンおよび転写因子非結合部を認識するＰＩＰの設計は、後述の設計例に具体的に記載した。ＭＹＣＮ遺伝子のプロモータ領域付近のヒストンおよび転写因子非結合部を認識するPIPの設計は、後述の設計例に具体的に記載した。そして、このように設計したPIPは、例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって簡便に製造することができる。ここで、固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、PIPとFITC（フルオレセインイソチオシアネート）などの標識物質との共役体を合成することもできる。得られる共役体は、PIPが特定のＤＮＡ配列を認識することを確認するために用いることができる。
【００５４】
Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）またはＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）は標的遺伝子の調節領域を認識するように配列認識させ、ＲＮＡの  ２’位酸素原子と４’位炭素原子間をメチレン鎖にて架橋した２’、４’−ＢＮＡまたはＲＮＡの  ２’位酸素原子と４’位炭素原子間をエチレン鎖にて架橋した２’、４’−ＥＮＡ （Ｅｔｈｙｌｅｎｅ‐Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）として合成することができる。ＬＮＡはProligo社からも入手可能である。
【００５５】
本発明の複合体は、上記ヒストン修飾制御剤と上記標的認識ポリアミドとを結合することなどにより合成することができる。上記ヒストン修飾制御剤と上記標的認識ポリアミドとの結合は公知の方法で行うことができる（J. Am. Chem. SOC. 1995,117, 2479-2490）。
「結合」は、直接でもよいし、リンカーを介してもよい。リンカーとしては、ヒストン修飾制御剤の作用を妨げず、かつ標的認識ポリアミドの遺伝子領域の認識を妨げないものであれば特に限定されず、例えば、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、エーテル結合などを例示することができる。
【００５６】
以上のようにして得られる本発明の複合体としては次のものを例示できる。
＜ｐ１６遺伝子特異的複合体(1)(2)(5)、ｐ５３遺伝子特異的複合体(3)、およびMYCN遺伝子特異的複合体(4)＞
【００５７】
【化３】
2010001933.tif 000005
【００５８】
３．標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤
本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤は上記本発明の複合体を含む。また、本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾方法は、上記本発明の複合体を用いる方法である。ここで、「標的遺伝子特異的」とは、標的とする１つ以上（ヒトでは、ゲノム領域としては約100000個の遺伝子があるとされており、遺伝子発現に関与する配列としてはひとつの転写因子が数千個から数百個の領域で特異的配列を認識し発現調節するとされている。このため、例えば、このうちの１〜数千個（例、１〜５０００、１〜４０００、１〜３０００、１〜２０００または１〜１０００）、１〜数百個（例、１〜５００、１〜４００、１〜３００、１〜２００または１〜１００）、または１〜５０個、好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個（５個、４個、３個、２個または１個））の遺伝子に特異的であることを意味する。例えば、転写因子によっては、５塩基の認識配列で、数百〜数千個の遺伝子群の発現を調節することで生物現象を調節する場合もあるため（例えば、MYC遺伝子は、３０００〜４０００個の下流遺伝子群をもつ。）、本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤が特異性の低い配列（数千個〜数百個の遺伝子に共通する配列）を認識する場合でも、生物現象を調節し、例えば、疾患治療や再生治療に有効である場合がある。尚、本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤は、例えば、ポリアミドが認識する配列の塩基数を増やすこと、ポリアミドが認識する配列として特異性の高い配列を選択することなどによって、標的とする遺伝子の数を減らすことができる。
「本発明の複合体を用いる」とは、例えば、本発明の複合体をin vitroで細胞に接触させて用いることのほか、哺乳動物（例えば、ヒトを除く）や実験生物（例えば、ヒトを除く）などに投与して用いること（in vivoで用いること）などを含む。「接触」とは、本発明の複合体と細胞とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、細胞培養容器に本発明の複合体を添加すること、細胞と本発明の複合体とを混合すること、細胞を本発明の複合体の存在下で培養することなどを含む。
本発明の修飾剤または修飾方法の標的遺伝子としては、細胞制御に関わる遺伝子を例示することができる。細胞制御に関わる遺伝子としては、癌抑制遺伝子、癌遺伝子、神経細胞制御物質をコードする遺伝子、および幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を挙げることができる。好ましくは、癌抑制遺伝子、癌遺伝子、および幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である。
【００５９】
癌抑制遺伝子としては、p16ＩＮＫ4a(ＣＤＫＮ2Ａ)遺伝子、ｐ21(ＣＤＫＮ1Ａ)遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＲＡＳＳＦ1遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＮＦ1遺伝子、 ＮＦ2遺伝子、 ｐ19(ＣＤＫＮ2Ｄ) 遺伝子、ＷＴ1遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ＢＲＣＡ1遺伝子、ＢＲＣＡ2遺伝子、ＣＨＥＫ2遺伝子、Ｍａｓｐｉｎ遺伝子、ｐ73遺伝子、ＤＰＣ4(ＳＭＡＤ4) 遺伝子、ＭＳＨ2遺伝子、ＭＬＨ1遺伝子、ＰＭＳ2遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ｐ57ＫＩＰ2(ＣＤＫＮ1Ｃ) 遺伝子、ＰＴＣ遺伝子、ＴＳＣ1遺伝子、ＴＳＣ2遺伝子、ＥＸＴ1遺伝子、ＥＸＴ2遺伝子、またはｐ53遺伝子などである。好ましくは、癌抑制遺伝子は、ｐ１６遺伝子、ｐ２１遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＲＡＳＳＦ１遺伝子、ＲＢ遺伝子、またはｐ５３遺伝子などである。
【００６０】
癌遺伝子としては、Cytoplasmic tyrosine kinases 遺伝子（例えばSrc-family、Syk-ZAP-70 family 、またはBTK family など）、調節性GTPases遺伝子（例えばラス遺伝子（例、ＨＲａｓ 遺伝子）など）、チロシンキナーゼ型受容体遺伝子（例えばＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、またはＶＥＧＦＲ遺伝子など）、細胞内セリンもしくはスレオニンキナーゼ遺伝子もしくはそれらの調節サブユニット遺伝子（例えばＲＡＦ１遺伝子、またはオーロラカイネース遺伝子など）、シグナル伝達系のアダプタータンパク質遺伝子（例えばＧＲＢ２遺伝子またはＳＨＣ遺伝子など）、または転写因子(Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ)遺伝子（例えばＭＹＣ（ｃ−Ｍｙｃ）遺伝子またはＭＹＣＮ遺伝子など）などが挙げられる。好ましくは、癌遺伝子は、ＭＹＣＮ遺伝子、 ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、オーロラカイネース遺伝子、ラス遺伝子、またはＥＧＦＲ遺伝子などである。
【００６１】
神経細胞制御物質をコードする遺伝子としては、ＳＨＣ３遺伝子、ＮＭＤＡ  receptor遺伝子（例えばＮＲ2Ａ遺伝子もしくはＮＲ2Ｃ遺伝子など）、またはＤｏｐａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ遺伝子（例えばＤＲＤ１もしくはＤＲＤ２など）などが挙げられる。
【００６２】
幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子としては、ＬＩＦ  (leukaemia inhibitory factor)遺伝子、ＯＣＴ3/4遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ2遺伝子、ＫＬＦ4遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、またはｐ１６ＩＮＫ4ａ(ＣＤＫＮ2Ａ) 遺伝子が挙げられ、好ましくはＭＹＣ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＯＣＴ３/４遺伝子、またはＫＬＦ４遺伝子などである。本発明の別の好ましい態様では、幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子は、ＭＹＣ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＯＣＴ３/４遺伝子、またはＫＬＦ４遺伝子などである。
【００６３】
本発明の修飾剤または修飾方法の標的遺伝子が、癌抑制遺伝子または癌遺伝子である場合、本発明の修飾剤または修飾方法は、例えば癌の予防・治療などに利用することができる。
【００６４】
本発明の修飾剤または修飾方法の標的遺伝子が、神経細胞制御物質をコードする遺伝子である場合、本発明の修飾剤または修飾方法は、例えば神経疾患の治療などに利用することができる。
【００６５】
本発明の修飾剤または修飾方法の標的遺伝子が、幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子である場合、本発明の修飾剤または修飾方法は、例えば、iPS細胞の作製などに利用することができる。
【００６６】
また、本発明の修飾剤は、使用目的に応じ、本発明の複合体に加えて、担体や添加物を含むものであってもよい。さらに、本発明の修飾方法では、目的に応じ、複合体を担体や添加物と組み合わせて用いてもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。
【００６７】
本発明の修飾剤および修飾方法における本発明の複合体の使用量は、使用目的によって異なる。当業者であれば、使用目的に応じて、本発明の複合体の使用量を適宜選択することができる。
【００６８】
また、本発明は、本発明の標的遺伝子特異的ヒストン修飾剤製造のための前記本発明の複合体の使用を含む。さらに、本発明は、標的遺伝子特異的にヒストンを修飾するための前記本発明の複合体を含む。
また、本発明は、本発明の複合体を含む、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御用キットを含む。本発明のキットは、本発明の複合体の他、上記修飾剤で説明した、担体や添加物を含んでも良い。さらに、本発明のキットは、必要に応じて、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書などを含んでもよい。
さらに、本発明は、本発明の複合体を含む、細胞機能研究用試薬を提供する。また、本発明の細胞機能研究方法は、上記本発明の複合体を用いる方法である。ここで、「本発明の複合体を用いる」とは、例えば、本発明の複合体をin vitroで細胞に接触させて用いることのほか、哺乳動物（例えば、ヒトを除く。例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）や実験生物（例えば、ヒトを除く。例えば、ショウジョウバエ、線虫、大腸菌、酵母、アフリカツメガエル、メダカ、トラウト、フグ、白色ナズナ、稲など）などに投与して用いること（in vivoで用いること）などを含む。「接触」とは、本発明の複合体と細胞とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、細胞培養容器に本発明の複合体を添加すること、細胞と本発明の複合体とを混合すること、細胞を本発明の複合体の存在下で培養することなどを含む。本発明のある態様では、本発明の複合体により、ヒストン修飾を遺伝子部位特異的に制御することで、細胞機能の詳細な解析が可能となり、難知性の疾患の機序解明、または治療法の開発などに役立つ。本発明の研究試薬および／または研究方法は、哺乳動物（例えば、ヒトを除く。例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）やその他の実験生物（例えば、ヒトを除く。例えば、ショウジョウバエ、線虫、大腸菌、酵母、アフリカツメガエル、メダカ、トラウト、フグ、白色ナズナ、稲など）などを対象とすることができる。本発明の研究用試薬および／または研究方法では、本発明の複合体の他、上記修飾剤で説明した、担体や添加物を含んでも良い。本発明の研究試薬および／または研究方法における本発明の複合体の使用量は、使用目的によって異なる。当業者であれば、使用目的に応じて、本発明の複合体の使用量を適宜選択することができる。
【００６９】
４．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、上記本発明の複合体を含む。当該医薬組成物を生体内に投与することにより、種々の疾患を予防・治療することができる。本発明の医薬組成物の対象疾患としては、癌、神経疾患/精神性疾患、生活習慣病、睡眠障害、皮膚科、眼科、または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患および感染症、アレルギー性疾患、細胞老化が関与する疾患、甲状腺ホルモン不応症、老化、嚢胞性線維症、ならびに消化器疾患等が挙げられる。対象疾患のうち癌としては、例えば、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸または十二指腸の癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫など）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（CML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）及び急性リンパ性白血病（ALL）、リンパ腫、多発性骨髄腫（MM）など）、小児固形腫瘍（神経芽細胞腫、肝芽腫、腎芽腫、ユーイング肉腫など）、網膜芽細胞腫およびメラノーマなどを挙げることができる。生活習慣病としては、特に限定されず、例えば、高血圧、糖尿病などを挙げることができる。皮膚科、眼科、または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患および感染症としては、例えば、乾癬、慢性皮膚炎、副鼻腔炎、緑内障、網膜変性症などを挙げることができる。アレルギー性疾患としては、アトピー性皮膚炎、花粉症などを挙げることができる。細胞老化が関与する疾患としては、例えば、皮膚の皺、たるみ、色素沈着などを挙げることができる。神経疾患／精神性疾患としては、例えば、そう、うつ、統合失調、自閉症、双極性障害、アルツハイマー病、睡眠障害、痴呆などを挙げることができる。
【００７０】
癌は、本発明の複合体により、ヒストンのアセチル化および／またはメチル化を制御し、癌抑制遺伝子(例えば、ｐ１６遺伝子、ｐ２１遺伝子、ＡＰＣ１遺伝子、ＲＡＳＳＦ１遺伝子、ＲＢ遺伝子、またはｐ５３遺伝子)の発現を促したり、癌遺伝子(例えば、MYCN遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、オーロラカイネース遺伝子、ラス遺伝子遺伝子、またはＥＧＦＲ遺伝子)の発現を抑えたりすることにより、予防・治療することができる。
【００７１】
神経変性疾患は、本発明の複合体により、ヒストンのアセチル化および／またはメチル化を制御し、ＧＤＮＦやｎｅｕｒｔｕｒｉｎ遺伝子の発現を促したり、遺伝子ＡＰＰ; ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎの発現を抑制したりすることにより、予防・治療することができる。
【００７２】
嚢胞性線維症や消化器疾患は、本発明の複合体により、ヒストンのアセチル化および／またはメチル化を制御し、遺伝子ＣＦＴＲの発現を促したり、発現を抑制したりすることにより、予防・治療することができる。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、経口投与および非経口投与のいずれの剤形でもよい。
これらの剤形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００７４】
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、噴霧剤、塗布剤、点眼剤、外用剤等として、または適当な剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
【００７５】
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤(例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、0.1％酢酸等)に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン等）を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００７６】
本発明の医薬組成物または本発明の複合体の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与量は、例えば成人(６０ｋｇ)の場合、1日当たり０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜３０ｍｇである。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投与は、例えば１日当たり、１回または2〜４回に分けてもよい。
【００７７】
また、本発明は、癌治療用医薬組成物製造のための、前記本発明の複合体の使用を含む。さらに、本発明は、前記本発明の複合体を投与することを含む、癌の治療方法を含む。本発明の医薬組成物および／または治療方法は、哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）を対象にすることができる。本発明のある態様の医薬組成物および／または治療方法は、対象からヒトを除く場合があり得る。
また、本発明は、本発明の複合体を含む、癌治療用キットを含む。本発明のキットは、本発明の複合体の他、上記医薬組成物で説明した、医薬的に許容される担体や添加物を含でも良い。さらに、本発明のキットは、必要に応じて、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書などを含んでもよい。
【００７８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
１．概要：
ｐ１６は、細胞周期調節因子であるＣＤＫを阻害して細胞周期を停止する働きをもつ腫瘍抑制因子である。癌細胞中ではｐ１６遺伝子の調節領域のＤＮＡがメチル化しｐ１６遺伝子の発現が抑制されている。本実施例では、ｐ１６遺伝子の調節領域を認識するＰＩＰにＳＡＨＡを結合した化合物（複合体）を作製した。この複合体を用いて、ＨＤＡＣ活性測定、細胞増殖アッセイ等を行ったところ、合成した複合体が、癌細胞においてｐ１６遺伝子の発現を促すこと、および癌細胞の増殖抑制効果があること等が認められた。ここでＳＡＨＡによりヒストンのアセチル化が誘導され、遺伝子調節領域に脱メチル化が誘導されること、および抗がん作用があることが報告されているが、ＳＡＨＡによるＰ１６遺伝子の再発現は起きないことは一般的に知られている。【００８０】
２．複合体等の設計および合成：
【化４】
2010001933.tif 000006
【００８１】
上記４つの複合体（ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰ;  ＳＡＨＡ‐ｅｔｈｅｒ ｌｉｎｋｅｒ＋ｐ１６ＰＩＰ; ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡ ＋ｐ１６ＰＩＰ;およびＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰ）を設計および合成した。ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰは、ｐ１６遺伝子のプロモータ領域を認識するＰＩＰ（ｐ１６ＰＩＰ）とＳＡＨＡとの複合体である。ＳＡＨＡ‐ｅｔｈｅｒ ｌｉｎｋｅｒ＋ｐ１６ＰＩＰは、ｐ１６ＰＩＰとＳＡＨＡとをエーテルを介して連結した複合体である。ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡ ＋ｐ１６ＰＩＰは、ｐ１６ＰＩＰとエステル化したＳＡＨＡ（ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡ）とを含む複合体である。ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡにはＨＤＡＣ阻害能がない。ＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰは、ｐ１６遺伝子のプロモータ領域を認識しないＰＩＰ（ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰ）とＳＡＨＡとの複合体である。【００８２】
上記４つの複合体は次のようにして設計した。
ｐ１６遺伝子のプロモータ領域のＧＣＢｏｘに近いＣＧＣＡＣＴＣＡＡＡＣＡＣＧＣＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧのシークエンスをＰＩポリアミド合成のターゲットとした。すなわち、上記配列下線部のＴＧＣＴＧＧＣＡ配列(−４３６〜−４２９)を認識するようにポリアミドを設計した。ｐ１６遺伝子は癌抑制遺伝子であり、ｐ１６遺伝子のプロモータ領域はがん細胞では高頻度にメチル化している。ｐ１６遺伝子のプロモータ領域が高頻度にメチル化しているとき、プロモータ部位にはヌクレオソーム構造が見られヒストン蛋白が結合している。この状態ではヒストンが脱アセチル化しており、DNAが縮合してプロモータ領域に転写因子が結合できない状態を生み、ｐ１６遺伝子の転写が抑制される。ｐ１６遺伝子のプロモータ領域のヒストンの結合状態は、Ｍ.ＳｓｓＩフットプリンティング法で同定可能である（Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20 e176）。図１にｐ１６遺伝子のプロモータ領域（−４５０ 〜＋１１０）の配列を示す（配列番号１）。図１の配列中、アンダーラインボールドの配列は癌細胞ではヒストン蛋白と結合しないリンカー部分と考えられる配列である。リンカー部分ではＰＩポリアミドがDNAに結合することができるが、ヒストン結合部分では既にヒストン蛋白がDNAと結合しているためポリアミドがDNAに結合できない可能性が高い。また、ＧＣＢｏｘは転写因子の結合する領域であると考えられることから、図１の配列中、四角で囲んだ二つのＧＣＢｏｘに近いＣＧＣＡＣＴＣＡＡＡＣＡＣＧＣＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧのリンカーシークエンスは、転写因子が結合する領域に近いと考えられる。よって、この領域でヒストンのアセチル化を導くことが出来ればヒストン間が開き、プロモータへの転写因子の結合が促されると考えられる。このため図１中で中央灰色で覆った配列ＴＧＣＴＧＧＣＡをターゲットにして、この配列を認識するようにポリアミドを設計した。この配列を認識するポリアミドとＨＤＡＣ阻害剤との複合体であれば、標的特異的にヒストンのアセチル化を促すことができ、より効果的にヌクレオソーム構造の変化を誘導できると期待された。このようにしてヌクレオソームの構造の変化を誘導することでｐ１６癌抑制遺伝子を癌細胞で再発現させることができると考えられる。そして、p１６癌抑制遺伝子を再発現させることにより、がん細胞の増殖抑制、がん細胞の老化細胞死を導くことができると予想された。このように設計したＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰの構造式を下記に示す。【００８３】
【化５】
2010001933.tif 000007
【００８４】
ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰは、上記ｐ１６プロモータのヒストンが結合しないリンカー領域の配列を認識しないように設計した。具体的には、non-targeting PIP の認識配列がWGWCCになるようにした。図１のプロモータの下線リンカー領域にはこの認識配列が存在しない。【００８５】
上記４つの複合体は次のようにして合成した。
尚、下記合成において、使用した測定装置は次の通りである。
測定装置
NMR specrometer    : JEOL JNM-AL400、
ESI-MS               : PESCIEX API165、
UV-Vis spectrometer       : Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer、
HPLC unit            : JASCO PU-2080 Plus、
HPLC detector        : JASCO 807-IT、
HPLC column          : Chemcobond 5- ODS-H column (4.6 × 150 mm)(解析用)、
: Chemcobond 5-ODS-H coloumn (10 × 150 mm)(分取用)、
Column chromatograph      : Merck Silica gel 60、
TLC plate            : Merck Silica gel 60 F254 。【００８６】
methyl 4-aminobenzoate 1：
methyl 4-aminobenzoate 1は、Sigma-Aldrichで入手した。【００８７】
methyl 4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoate 2の合成：
【化６】
2010001933.tif 000008
【００８８】
30mlナス型フラスコにmethyl 4-aminobenzoate 1(1.2 g, 8.0 mmol)を加え、三方コックを用いて充分に脱気し、内部をAr置換した。次に溶媒として脱水したTHF (15 ml)をシリンジを用いて加え、試薬を溶解させた後に塩基としてDIEA(2.1 ml)を加え、氷冷後methyl 8-chloro-8-oxooctanoate(1.2 ml, 8.2 mmol )を加えた。徐々に室温まで昇温させながら8時間撹拌させた。TLC(10% MeOH/AcOEt)および HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。methyl 4-aminobenzoateが完全に消費されたのを確認した後に、H2O(10 ml)を加えてクエンチし、CH2Cl2(25 ml)を加えて飽和NaHCO3水溶液(30 ml)で3回、10%クエン酸水溶液(30 ml)で３回有機層を洗った。回収した有機層をMgSO4で乾燥させ、吸引ろ過を行って固体を除去した。有機層の回収後に減圧条件で溶媒溜去を行い、乾燥させて白色固体 2を得た。
Yield： 2.4 g(94%),1H NMR (CDCl3, 400 MHz, δ  ): 7.93(d, J= 8.4 Hz, 2 H; CH), 7.53(d, J = 8.4 Hz,2 H; CH), 7.31(brs,1 H; NH), 3.83(s,3 H; CH3), 3.60(s,3 H; CH3), 2.39-2.22(m, 4 H; CH2), 1.72-1.61(m,2 H; CH2), 1.59- 1.55(m,2 H; CH2), 1.37-1.30(m,4 H; CH2).【００８９】
methyl 4-(8-(hydroxyamino)-8-oxooctanamido)benzoate 3の合成：
【化７】
2010001933.tif 000009
【００９０】
20 mlのナス型フラスコにmethyl 4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoate 2 (212.3 mg, 0.68 mmol)を加え、THF(4 ml)、DMF (4 ml)の混合溶媒に溶解させ、50% NH2OH/H2O(8 ml, 121 mmol)を加えて、大気圧下、室温で８時間撹拌した。TLC(10% MeOH/AcOEt)およびHPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。methyl 4-(8-methoxy-8-oxooctanamido) benzoate 2が完全に消費されたのを確認した後に、氷冷中で酢酸を用いてヒドロキシルアミンのクエンチを行った。一度、反応混合物をH2O(10 ml)に溶解させ、酢酸エチル(20 ml)で３回抽出し、回収した有機層をMgSO4で乾燥させた。吸引ろ過により固体を除き、減圧蒸留により溶媒を溜去し、白色固体 3 を得た。
Yield：59.8 mg ( 28%)．1H NMR ( CDCl3, 400 MHz, δ)：10.3(brs,1 H; NH), 7.96(d, J = 8.8 Hz ,2 H; CH), 7.79(d, J = 8.8 Hz,2 H; CH), 3.88(s,3 H; CH3), 2.39-2.22(m,4 H; CH2), 1.72-1.61(m,2 H; CH2), 1.59-1.55(m,2 H; CH2), 1.40-1.33(m,4 H; CH2).【００９１】
4-aminobenzoic acid 4：
4-aminobenzoic acid 4は、東京化成工業より得た。【００９２】
4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoic acid 5の合成：
【化８】
2010001933.tif 000010
【００９３】
100 mlナス型フラスコに4-aminobenzoic acid 4(2.1 g, 15.3 mmol) を加え、充分に脱気乾燥し、三方コックを用いてAr置換した。次に脱水したTHF (20 ml)をシリンジを用いて加え、試薬を溶解させた後に塩基としてDIEA(1.2 ml)を加えた。氷冷後methyl 8-chloro- 8-oxooctanoate(3.0ml，20.3 mmol ) を加えた。徐々に室温まで昇温しながら８時間撹拌させた。TLC(10% MeOH/AcOEt)およびHPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。4-aminobenzoic acid 4が完全に消費されたのを確認した後に、水(2 ml)を加えてクエンチした。つづいて減圧蒸留により溶媒溜去を行い、乾燥させた。次にシリカゲルカラムを用いて精製を行った( eluent：AcOEt : MeOH = 9:1)。目的物を含む画分を回収し、溶媒を溜去し減圧乾燥させ、白色固体5を得た。
Yield： 3.79 g （80%）, 1H NMR ( DMSO-D6, 400 MHz, δ )：10.2 (s,1 H; NH) , 7.85(d, J= 8.8 Hz ,2 H; CH), 7.69(d, J = 8.8 Hz,2 H; CH), 3.60(s, 3 H; CH3), 2.34-2.18(m,4 H; CH2), 1.57-1.50(m, 4 H; CH2), 1.28-1.09(m,4 H; CH2). ESI-MS m/z calcd for C16H22NO5;+［M＋H］+ 308.1, found 308.2.【００９４】
H2NββImPyPyγImImPyβDp polyamide 6の合成：
【化９】
2010001933.tif 000011
【００９５】
Libra Tubeにβ-clear Resin(185 mg, 0.094 mmol)を入れ、9本のエッペンドルフチュ-ブそれぞれに1-[bis(dimethylamino)methylene]-5-chloro-1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophos phate(HCTU 160 mg, 0.39 mmol)を加え、内3本に4-(Fmoc-amino)-1-metyl-1H-pyrrole- 2-carboxylic acid(145 mg, 0.4 mmol)、3本に4-(Fmoc-amino)-1-metyl-1H-imidazole- 2-carboxylic acid(145 mg, 0.4 mmol)、2本にN -β-Fmoc-β-alanine(130 mg, 0.42 mmol)、１本にN-γ-Fmoc-γ-aminobutyric acid(150 mg, 0.46 mmol)を加え、全試料の減圧乾燥を行った。充分に乾燥した後にLibra tubeにDMF(2 ml)を加えて膨潤させ、すぐにDMFを溜去した。20%ピペリジン/DMF溶液(3 ml)を加えて、Fmoc基の脱保護を行った。Fmocの脱離はUV-Vis吸光を測定することで確認した。脱保護の後、固相をCH2Cl2(5 ml)、methanol(5 ml)、DMF(5 ml)で洗った。次に、上記で調整した反応試薬-HCTUの混合物をLibra Tubeに加え、DMF(5 ml)、塩基としてDIEA(70 μl)を加えて溶解させ、室温で１時間撹拌させながら反応させた。１時間経過した後、無水酢酸(0.2 ml)を加えて10分間反応させて未反応のアミノ末端をアセチル基で保護し、それ以上の伸長反応がおこらないようにした。つづいて、溶液を溜去し固相をCH2Cl2(5 ml)、methanol(5 ml)、DMF(5 ml)で洗った。その後、20%ピペリジン/DMF溶液(3 ml)でのFmocの脱保護を行った。これ以後、配列に従って同様の処置を繰り返した。最後の試薬を反応に用い、Fmocの脱保護を行い、乾燥させた後に固相をすべて10 mlのナス型フラスコに移し、N,N-dimethyl-1,3-propanediamine(1 ml)を加えて、55 ℃で8時間撹拌して、固相上からのポリアミドの切り出しを行った。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)およびESI-MSより目的のpolyamide 6の生成を確認した。N,N-dimethyl-1,3- propanediamineを溜去し、Et2Oでポリアミドを洗浄し、黄褐色の固体6を得た。未精製の状態で43.9 mg(41%)を得た。
ESI-MS m/z calcd for C51H70N21O10+［M＋H］+1136.5,  found 1137.0.【００９６】
H2NββImPyPyβImPyγImPyβImImPyββDp polyamide 7の合成：
【化１０】
2010001933.tif 000012
【００９７】
Libra Tubeにβ-clear Resin(241.4 mg, 0.122 mmol)を入れ、15本のエッペンドルフチュ-ブそれぞれに1-[bis(dimethylamino)methylene]-5-chloro-1H-benzotriazolium 3-oxidehexafluoro phosphate(160 mg, 0.39 mmol)を加え、内5本に4-(Fmoc-amino)-1-metyl-1H-pyrrole-2-carbo xylic acid(145 mg, 0.4 mmol)、5本に4-(Fmoc-amino)-1-metyl-1H-imidazole-2-carbo xylic acid(145 mg, 0.4 mmol )、4本にN-β-Fmoc-β-alanine(130 mg, 0.42 mmol)、１本にN-γ-Fmoc-γ-aminobutyric acid(150 mg, 0.46 mmol)を加え、全試料の減圧乾燥を行った。充分に乾燥した後にLibra tubeにDMF(2 ml)を加えて膨潤させ、すぐにDMFを溜去した。20%ピペリジン/DMF溶液(3 ml)を加えて、保護基のFmocの脱保護を行った。Fmocの脱離はUV-Vis吸光を測定することで確認した。脱保護の後、固相をCH2Cl2(5 ml)、methanol(5 ml)、DMF(5 ml)で洗った。次に、上記で調整した反応試薬-HCTUの混合物をLibra Tubeに加え、DMF(5 ml)、塩基としてDIEA(70μl)を加えて溶解させ、室温で１時間撹拌させながら反応させた。１時間経過した後、無水酢酸(0.2 ml)を加えて１０分間反応させて未反応のアミノ末端をアセチル基で保護し、それ以上の伸長反応がおこらないようにした。つづいて、溶液を溜去し固相をCH2Cl2(5 ml)、methanol(5 ml)、DMF(5 ml)で洗った。その後、20%ピペリジン/DMF溶液(3 ml)でのFmocの脱保護を行った。これ以後、配列に従って同様の処置を繰り返した。最後の試薬を反応に用い、Fmocの脱保護を行い、乾燥させた後に固相をすべて10 mlのナス型フラスコに移し、N,N-dimethyl-1,3-propane diamine(1 ml)を加えて、55 ℃で8時間撹拌して、固相上からのポリアミドの切り出しを行った。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)およびESI-MSより目的のpolyamide 7 の生成を確認した。N,N-dimethyl- 1,3-propanediamineを溜去し、Et2Oでポリアミドを洗浄し、黄褐色の固体7を得た。未精製の状態で50.4 mg(25%)を得た。
ESI-MS m/z calcd for C79H102N33O16+［M＋H］+1768.9, found 1769.2.【００９８】
H2N(PEG)ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyββDp polyamide 8の合成：
【化１１】
2010001933.tif 000013
【００９９】
Libra Tubeにβ-clear Resin(218.2 mg, 0.110mmol)を入れ、16本のエッペンドルフチュ-ブそれぞれに1-[bis(dimethylamino)methylene]-5-chloro-1H-benzotriazolium -3-oxide hexafluorophos phate(160 mg, 0.39 mmol)を加え、内5本に4-(Fmoc-amino)-1-metyl-1H-pyrrole- 2-carboxylic acid(145 mg, 0.4 mmol)、5本に4- (Fmoc-amino)-1-metyl-1H-imidazole-2-carboxylic acid(145 mg, 0.4 mmol)、4本にN-β-Fmoc-β-alanine(130 mg,0.42 mmol)、１本にN-γ-Fmoc-γ-aminobutyric acid(150 mg, 0.46 mmol)、1本にFmoc-8-amino-3,6-Dioxa octanoic Acid(150 mg, 0.39 mmol)を加え、全試料の減圧乾燥を行った。充分に乾燥した後にLibra tubeにDMF(2 ml)を加えて膨潤させ、すぐにDMFを溜去した。20%ピペリジン/DMF溶液(3 ml)を加えて、保護基のFmocの脱保護を行った。Fmocの脱離はUV-Vis吸光を測定することで確認した。脱保護の後、固相をCH2Cl2(5 ml)、methanol(5 ml)、DMF(5 ml)で洗った。次に、上記で調整した反応試薬-HCTUの混合物をLibra Tubeに加え、DMF(5 ml)、塩基としてDIEA(70μl)を加えて溶解させ、室温で１時間撹拌させながら反応させた。１時間経過した後、無水酢酸(0.2 ml)を加えて１０分間反応させて未反応のアミノ末端をアセチル基で保護し、それ以上の伸長反応がおこらないようにした。つづいて、溶液を溜去し固相をCH2Cl2(5 ml)、methanol(5 ml)、DMF(5 ml)で洗った。その後、20%ピペリジン/DMF溶液(3 ml)でのFmocの脱保護を行った。これ以後、配列に従って同様の処置を繰り返した。最後の試薬を反応に用い、Fmocの脱保護を行い、乾燥させた後に固相をすべて10 mlのナス型フラスコに移し、N,N-dimethyl-1,3-propanediamine(1 ml)を加えて、55 ℃で8時間撹拌して、固相上からのポリアミドの切り出しを行った。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)およびESI-MSより目的のpolyamide 8の生成を確認した。N,N-dimethyl-1,3-propanediamineを溜去し、Et2Oでポリアミドを洗浄し、黄褐色の固体8を得た。未精製の状態で53.0 g(22%)を得た。
ESI-MS m/z calcd for C85H113N34O19+［M＋H］+1913.9, found 1914.2.【０１００】
4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoyl-ββImPyPyγImImPyβDp 9の合成：
【化１２】
2010001933.tif 000014
【０１０１】
10 mlのナス型フラスコに、4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoic acid 5( 68.3 mg, 0.22 mmol)、H2N-ββImPyPyγImImPyβDp 6(57.2 mg, 0.05 mmol), FDPP(67.5 mg，0.21 mmol)を加え、三方コックを用いて脱気乾燥した後にAr置換した。次に脱水したDMF(4 ml)、塩基としてDIEA( 0.2ml)を加え、室温で６時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。H2N-ββImPyPyγImImPyβDp 6が完全に消費されたのを確認した後に、一度溶媒を減圧溜去し、Et2O(3 ml)を加えて可溶分を溶解させろ過により不溶分のみを回収した。回収した不溶分をDMF(1 ml)に溶解させ、Chemcobond 5-ODS-H coloumn (0.1% AcOH/CH3CN 0-100%, 20 min, 360 nm)を用いたHPLC精製により白色固体9を得た。【０１０２】
Yield:14.6 mg (19%). 1H NMR ( DMSO-D6, 400 MHz, δ)：10.4(s,1 H; NH), 10.3(s,2 H; NH), 10.1(s,1 H; NH), 9.97(s,1 H; NH), 9.92(s,1 H; NH), 9.33(s,1 H; NH), 8.42-8.22(m,1 H; CH), 8.16(d, J = 8.0 Hz,1 H; CH), 8.10-7.99(m,2 H; CH), 7.94(s,2 H; CH), 7.76-7.74(m,2 H; CH), 7.64(d, J = 8.8 Hz,1 H; CH), 7.56(s,1 H; CH), 7.50(s,1 H, CH), 7.45(s,1 H; CH), 7.27(d, J = 8.8 Hz,2 H; CH), 7.20(s,1 H; CH), 7.18(s,1 H;CH). 7.13(s,1 H: CH), 7.00(s,1 H; CH), 6.85(s,1 H, CH), 4.00-3.84(m,8 H; CH2), 3.80-3.56(m,8 H; CH2), 3.49(s,3 H; CH3), 3,20-3,16(m,4 H; CH2), 3.10-3.00(m,4 H; CH2), 2.87(d, J= 4.8 Hz,6 H; CH2), 2.71(d, J = 4.8 Hz,6 H; CH2), 2.34-2.18 (m,4 H; CH2), 1.78-1.66(m,2 H; CH2), 1.57-1.50(m,4 H; CH2), 1.28-1.09(m,4 H; CH2). ESI-MS m/z calcd for C67H89N22O14+［M＋H］+ 1425.7,  found 1426.0.【０１０３】
4-(8-(benzyloxyamino)-8-oxooctanamido)phenylamido-ββPyPyImγImImPyβDp 14の合成：
【化１３】
2010001933.tif 000015
【０１０４】
10 mlのナス型フラスコに4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoyl-ββImPyPyγImImPyβDp 9 (3.4 mg, 2.4μmol)、LiOH・H2O(3.5 mg, 0.084 mol)を加え、DMF(300μl)、H2O(50 ml)の混合溶媒に溶解させ、室温で12時間撹拌させた。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。4-(8-methoxy-8-oxooctan amido)benzoyl-ββImPyPyγImImPyβDp 9 が加水分解し、polyamide 13の生成をESI-MS (positive)で確認した後に、O-benzylhydroxylamine hydrochloride (11.2 mg, 0.070 mmol)とFDPP(23.4 mg, 0.073 mmol), DMF(200μl)、H2O(50μl)、塩基としてDIEA(100μl)を加え、室温で12時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。Polyamide 13が完全に消費されたのを確認した後に、氷冷しながら酢酸でクエンチし、次に減圧蒸留で溶媒を溜去した。得られた残渣をDMF（1 ml）に溶解させ、Chemcobond 5-ODS-H coloumn ( 0.1% AcOH/CH3CN 0-100%, 20 min, 360 nm)を用いたHPLC精製により白色固体14を得た。【０１０５】
Yield: 2.1 mg(56%), 1H NMR ( DMSO-D6, 400 MHz, δ)：11.1(s,1 H, NH), 11.0(s,1 H, NH), 11.9(s,1 H, NH), 10.4(s,1 H; NH), 10.3(s,2 H; NH), 10.1(s,1 H; NH), 9.95(s,1 H; NH), 9.92(s,1 H; NH), 9.35(s,1 H; NH), 8.42-8.30(m,1 H; CH), 8.23(s,1 H; CH), 8.1-8.02(m,1 H; CH), 8.00-7.96(m,2 H; CH), 7.94(s,2 H; CH), 7.84(brs,2 H; NH) 7.76(s,1 H; CH), 7.76(m,2 H; CH), 7.74(s,1 H; CH), 7.70-7.60(m,5H; CH), 7.55(s,1 H; CH), 7.50(s,1 H; CH), 7.44(s,1 H; CH), 7.38-7.34 (m,4 H; CH), 7.33-7.26(m,8 H; CH), 7.20(s,1 H;CH). 7.13(s,1 H: CH), 7.17(s,1 H, CH), 7.00(s,1 H; CH), 6.86(s,1 H, CH), 4.00-3.84(m,8 H; CH2), 3.80-3.56(m,8 H; CH2), 3,20-3.00(m, 12 H; CH2), 2.91(s,6 H; CH2), 2.72(s,6 H; CH2), 2.34-2.18(m,4 H; CH2), 1.78- 1.66(m,2 H; CH2), 1.57-1.50(m,4 H; CH2), 1.22-1.12(m,4 H; CH2). ESI-MS m/z calcd for C73H94N23O14+［M＋H］+ 1516.7,  found 1517.0.【０１０６】
SAHA-ββImPyPyγImImPyβ Dp 12 (SAHA+non-targeting PIP)の合成：
【化１４】
2010001933.tif 000016
【０１０７】
10 mlのナ ス型フラスコ中で4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoyl-ββImPyPyγImImPyβDp 9 (14.8 mg, 10.0μmol)をDMF(3.0 ml)に溶解させ、50% NH2OH/H2O ( 1.5ml,  22.6 mmol)を加えて室温で10時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡し、原料9と比べると非常にブロードニングしたチャートを得た。4-(8-methoxy-8-oxosoctanamido)benzoyl-ββImPyPyγImImPyβDp 9が完全に消費されたのを確認した後に、氷冷しながら酢酸でクエンチし、次に減圧蒸留で溶媒を溜去した。得られた残渣をDMF(1 ml)に溶解させ、Chemcobond 5-ODS-H coloumn (50 mmol AF/CH3CN 0-100%, 20 min, 360 nm)を用いたHPLC精製により白色固体 12を得た。【０１０８】
Yield: 3.8 mg(26%). 1H NMR ( DMSO-D6, 400 MHz, δ)：10.4(s,1 H; NH), 10.3(s,2 H; NH), 10.1(s,1 H;NH), 10.2(s,1 H; NH), 10.1(s,1 H; NH), 9.93(s,1 H; NH), 9.92(s,1 H,NH), 9.88(s,1 H; NH), 9.33(s,1 H; NH), 8.42-8.22(m,4 H, CH), 8.10-7.94(m,4 H, CH), 7.86-7.79(m,2 H; CH), 7.76-7.73(m,2 H; CH), 7.64 (d, J= 8.8 Hz,1 H; CH), 7.56 (s,1H; CH), 7.50(s,1 H, CH), 7.45(s,1 H; CH), 7.27(d, J = 8.8 Hz,2 H; CH), 7.20(s,1 H; CH), 7.17(s,1 H; CH). 7.11(s,1 H: CH), 7.00(s,1 H; CH), 6.80(s,1 H, CH), 4.00-3.84(m,8 H; CH2), 3.80-3.56(m, 8 H; CH2), 3.49(s,3 H; CH3), 3,20-3,16(m,4 H; CH2), 3.10-3.00(m,4 H; CH2), 2.87(d, J= 4.8 Hz,6 H, CH2), 2.71(d, J = 4.8 Hz,6 H; CH2), 2.34-2.18 (m,4 H; CH2), 1.78-1.66(m,2 H; CH2), 1.57-1.50(m,4 H; CH2), 1.28-1.09(m,4 H; CH2). ESI-MS m/z calcd for C67H89N22O14+［M＋H］+ 1426.7, found 1427.0【０１０９】
4-(8-(benzyloxyamino)-8-oxo octanamido)phenylamido-ββPyPyImγImIm PyβDp 14からのSAHA-ββImPyPyγImImPyβDp12 (SAHA+non-targeting PIP)の合成：
【化１５】
2010001933.tif 000017
【０１１０】
10 mlのナス型フラスコに4-(8-(benzyloxyamino)-8-oxooctanamido)phenylamidoββPyPy ImγImImPyβDp 14 (3.2 mg，2.1μmol)、10% Pd/C(1.1 mg)を加え、充分脱気乾燥させ、三方コックを用いてH2ガスに置換した。脱水methanol(0.5 ml)を加え、室温で風船圧下、16時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡し、非常にブロードニングした混合物のチャートを得た。吸引ろ過により固体を除き、溶媒流去により混合物の白色固体を1.4 mg得た。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)分析と、ESI-MSより、追跡量のSAHA-ββImPyPyγImImPyβDp 12を確認したが主生成物ではなかった。ESI-MS m/z calcd for C67H89N22O14+［M＋H］+ 1426.7, found 1427.0【０１１１】
4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoyl-ββImPyPyβImPyγImPyβImIm PyβDp 10 (ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡ ＋ｐ１６ＰＩＰ)の合成：
【化１６】
2010001933.tif 000018
【０１１２】
10 mlのナス型フラスコに4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoic acid 5 (16.9 mg, 0.054 mmol)、H2N-ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 7 (20.2 mg 11.0μmol), FDPP (68.4 mg，0.22 mmol)を加え、三方コックを用いて脱気乾燥した後にAr置換した。次に脱水したDMF(1.5 ml)、塩基としてDIEA(0.15 ml)を加え、室温で６時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。H2N-ββIm PyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 7が完全に消費されたのを確認した後に、一度溶媒を減圧溜去した。Et2O(3 ml)を加えて可溶分を溶解させて除去し、不溶分のみを回収した。回収した不溶分をDMF(1 ml)に溶解させ、Chemcobond 5-ODS-H coloumn (0.1% AcOH/CH3CN 0-100%, 20 min, 360 nm)を用いたHPLC精製により白色固体 10を得た。
Yield:8.0 mg (38%).  ESI-MS m/z calcd for C95H121N34O20+,［M＋H］+2058.9,  found 2059.2.【０１１３】
SAHA-ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 15(SAHA+p16PIP)の合成：
【化１７】
2010001933.tif 000019
【０１１４】
10 mlのナス型フラスコ中で4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoyl-ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 10 (8.0 mg, 4.0μmol)をDMF(2.0 ml)に溶解させ、50% NH2OH/H2O (1.0 ml, 15.1 mmol)を加えて室温で10時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH/CH3CN 0-100%, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。4-(8-methoxy-8-oxo octanamido)benzoyl-ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 10が完全に消費されたのを確認した後に、氷冷しながら酢酸でクエンチし、次に減圧蒸留で溶媒を溜去した。得られた残渣をDMF（1 ml）に溶解させ、Chemcobond 5-ODS-H coloumn (50 mmol AF-CH3CN, 20 min, 360 nm)を用いたHPLC精製により白色固体15を得た。
Yield: 5.0 mg(61%). 1H NMR ( DMSO-D6, 400 MHz, δ)： ESI-MS m/z calcd for  C94H120N35O20+. ［M＋H］+ 2059.9, found 2060.2.【０１１５】
4-(8-methoxy-8-oxooctanamido) benzoyl-(PEG) ββImPyPyβImPyγImPyβImIm PyβDp 11の合成：
【化１８】
2010001933.tif 000020
【０１１６】
10 mlのナス型フラスコに4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoic acid 5 (67.1 mg, 0.22 mmol)、H2N-ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 8 (47.8 mg 25.0μmol), FDPP (50.0 mg，0.16 mmol)を加え、三方コックを用いて脱気乾燥した後にAr置換した。次に脱水したDMF(4.0 ml)、塩基としてDIEA( 0.20 ml)を加え、室温で12時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。H2N-(PEG) ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 8が完全に消費されたのを確認した後に、一度溶媒を減圧溜去した。Et2O(3 ml)を加えて可溶分を溶解させて除去し、不溶分のみを回収した。回収した不溶分をDMF(1 ml)に溶解させ、Chemcobond 5-ODS-H coloumn ( 0.1% AcOH/CH3CN 0-100%, 20 min, 360 nm)を用いたHPLC精製により白色固体11を得た。
Yield:6.8 mg (12%). ESI-MS m/z calcd for C101H131N35O24+,［M＋H］+2203.0,  found 2204.2.【０１１７】
SAHA-(PEG) ββImPyPyβImPyγImPyβImIm PyβDp 16 (ＳＡＨＡ‐ｅｔｈｅｒ ｌｉｎｋｅｒ＋ｐ１６ＰＩＰ)の合成：
【化１９】
2010001933.tif 000021
【０１１８】
10 mlのナス型フラスコ中で4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoyl-(PEG) ββImPy PyβImPyγImPyβImImPyβDp 11 (6.8 mg, 3.0μmol)をDMF(3.0 ml)に溶解させ、50%NH2OH/H2O ( 3.0 ml 45.3 mmol)を加えて室温で10時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。4-(8-methoxy-8-oxooctan amido)benzoyl-(PEG) ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 11が完全に消費されたのを確認した後に、氷冷しながら酢酸でクエンチし、次に減圧蒸留で溶媒を溜去した。得られた残渣をDMF（1 ml）に溶解させ、Chemcobond 5-ODS-H coloumn ( 50 mmol AF-CH3CN 0-100%, 20 min, 360 nm)を用いたHPLC精製により白色固体16を得た。
Yield: 0.8 mg(7.6%). ESI-MS m/z calcd for C100H1301N36O23+. ［M＋H］+ 2204.0, found 2205.4.【０１１９】
３．ＨＤＡＣ活性測定：
合成されたＳＡＨＡ誘導体とポリアミドを結合させた化合物によりヒストン脱アセチル化酵素(ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ: ＨＤＡＣ)の活性が阻害されるかどうかを確認するため、ＨＤＡＣ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ／Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ(ＢＩＯＭＯＬ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ)を用いて実験を行った。詳細はキット作成者の指示に従い、種々の濃度の合成された化合物またはポジティブコントロールとして用いたトリコスタチンＡ(以下ＴＳＡ)存在下でアセチル化基質に対してＨＤＡＣを含むＨｅＬａ細胞(ヒト子宮頸癌細胞株)核画分を添加、３７℃で1時間培養後付属のデベロッパーを添加してＨＤＡＣの触媒反応を停止した。その後９６ウェルの測定用プレートに移し３６０ｎｍの励起光により４６０ｎｍで呈色する反応生成物の発光をＡＲＶＯ ＥＸ (Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ)により測定した。結果を図２に示す。【０１２０】
図２から、合成されたＳＡＨＡ誘導体はいずれもＨＤＡＣ阻害能を有し、この活性はポリアミドの結合による影響を受けない事が示された。また、ネガティブコントロールとして使用する為作製したｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡとｐ１６ＰＩＰの複合体はＨＤＡＣ活性を阻害しない事が分かった。【０１２１】
以上のように、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰ、ＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰおよびＳＡＨＡ＋ｅｔｈｅｒ ｌｉｎｋｅｒ＋ｐ１６ＰＩＰにＨＤＡＣ阻害能があることが確認できた。一方、ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰには、ＨＤＡＣ活性が認められなかった。【０１２２】
４．細胞増殖アッセイ（Ｉ）：
次に、合成された化合物の癌細胞に対する増殖抑制能をWST-8アッセイにより検証した。
ＨｅＬａ(ヒト子宮頸癌細胞株)、ＬＯＶＯ、 ＲＫＯそしてＳＷ４８０(いずれもヒト大腸癌細胞株)の各細胞株は全て１０％ 牛胎児血清(ＦＢＳ: ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ＵＳＡ)と抗生剤(５０Ｕ／ｍｌ:Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０ ｕｇ／ｍｌ: Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ)、そして1mMピルビン酸ナトリウムを添加したダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ、ナカライテスク)を用いて３７℃、５％ 二酸化炭素条件下で培養し、１０ｃｍの細胞培養皿上で８０-９０％コンフルエントに達した単層細胞をＤ‐ＰＢＳ(‐)(ナカライテスク)で洗浄後、フェノールレッド含有２．５ｇ／Ｌ‐Ｔｒｙｐｓｉｎｅ／１ｍ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ (ナカライテスク)で処理し、剥離させた後、新しい培地で調整、維持した。【０１２３】
３×１０３細胞/1ウェルでＭＩＣＲＯＴＥＳＴ Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ， ９６ ｗｅｌｌ(ＦＡＬＣＯＮ)に播種した細胞株を３７℃、５％二酸化炭素条件下で２４時間培養し、その後種々の濃度のPIポリアミド存在下で更に72時間培養した。培養終了後各ウェルに１０ ｕｌの生細胞数測定試薬ＳＦ(ナカライテスク)を添加しＡＲＶＯ ＥＸ(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ)により４５０ｎｍでの吸光度を測定した。この際、試薬添加から測定まで、細胞に５０％ ＤＭＳＯのみを加えたコントロールサンプルの吸光度が１．２から２．０程度になるまで３７℃、５％ ＣＯ２存在下でインキュベーションを行った。結果を図３に示す。【０１２４】
図３から、ＳＡＨＡ誘導体を結合したｐ１６ ＰＩＰはポジティブコントロールとして使用したＴＳＡ同様にＨｅｌａ細胞の増殖阻害を示す事がわかった。またＨｅＬａ細胞に対してｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ ＰＩＰやｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡ＋ｐ１６ ＰＩＰを作用させたところ増殖は抑制されなかった。このことから、ｐ１６ＰＩＰの作用単独による増殖抑制は認められないこと、ｐ１６の遺伝子調節領域を認識しないＰＩＰによるＳＡＨＡのＤＮＡ配列への誘導でも増殖抑制が認められないこと、ＳＡＨＡ誘導体とｐ１６ ＰＩＰの共同作用で細胞増殖抑制がえられることが分かる。さらにＴＳＡはＨＤＡＣ活性が低濃度でも高いが、このＴＳＡと同様の細胞増殖抑制能が、ほぼ同じ濃度からＳＡＨＡ誘導体とｐ１６ ＰＩＰ複合体で観察されたことより、ゲノム上の標的部位を限定することでＨＤＡＣ阻害剤の濃度を低下させることが出来る可能性も示唆された。【０１２５】
図４に各種がん細胞での細胞増殖アッセイの結果をしめす。ＳＡＨＡ誘導体を結合したｐ１６ ＰＩＰは、実験に使用した４種類のがん細胞、Ｈｅｌａ、ＬＯＶＯ、 ＲＫＯそしてＳＷ４８０全てで増殖阻害を示す事がわかった。その増殖抑制は、Ｈｅｌａ，ＲＫＯで強く、ＬＯＶＯ、ＲＫＯでは１００ｎＭで増殖抑制が認められず。ＲＫＯでもっとも弱かった。【０１２６】
また培養終了後のＨｅＬａ細胞株を２０倍の倒立型光学顕微鏡で観察したところ、図５に示すように、その細胞形態に顕著な変化が見られた。すなわち、細胞密度の低下と扁平になった細胞が多数観察された。【０１２７】
以上のように、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰに高い抗腫瘍効果があることが確認できた。【０１２８】
５．リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ：
ｐ１６遺伝子の発現に対する作用を確認するため、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを行った。１ウェルあたり１．５×１０４細胞となるよう２４ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を種々の濃度のポリアミド存在下で４８時間培養した後、ＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン、東京)を用いてＲＮＡを回収した。その際の手順は作成者の指示に従った。単離されたｔｏｔａｌ ＲＮＡはＮａｎｏｄｒｏｐ(ＮａｎｏＤｒｏｐ、アメリカ)にてその濃度を測定しＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ(ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ 滋賀)を用いたｃＤＮＡ合成に使用した。作製されたｃＤＮＡはＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ(ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ、 滋賀)を用いてＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ‐８００(ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ、 滋賀)により、ｐ１６ ＲＮＡ発現量を確認した。この時ｐ１６の増幅には次のプライマーを使用して、ＰＣＲ反応を行った。【０１２９】
フォワード：
5’-GGCACCAGAGGCAGTAACCA-3’（配列番号２）、
リバース：
5’-GGACCTTCGGTGACTGATGATCTAA-3’（配列番号３）。【０１３０】
また、内部標準として使用したヒト内在性グリセルアルデヒド-３-ホスフェート  ジヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)の増幅には次のプライマーを使用して、ＰＣＲ反応を行った。
フォワード：
5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’（配列番号４）、
リバース：
5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’（配列番号５）。【０１３１】
結果を図６に示す。図６から、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ ＰＩＰは転写レベルでp16の発現量を１０ｎＭから有意に上昇させている事がわかった。またネガティブコントロールに使用した他の2つの薬剤では有意差は確認されなかった事から、ｐ１６ ｍＲＮＡの発現促進にはSAHA誘導体とp16 PIPの結合物を使用する必要がある事がわかる。【０１３２】
６．ウエスタンブロッティング：
種々の濃度のポリアミド存在下で４８時間培養されたＨｅＬａ細胞を回収した後２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、そして１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ‐４０とＣｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ(Ｒｏｃｈｅ)を含む抽出バッファーに再溶解し、13,500xg、４℃で１５分遠心分離した後上清にＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ (２ＭＥ＋，×４)(和光純薬)を加えてサンプル化した。このサンプルを15% ポリアクリルアミドゲルで展開しポリビニリデンジフルオライド膜(ミリポア  アメリカ)に電気的に移した後に非特異的な結合を抑える目的で５％のスキムミルクを用いてブロッキングした。目的タンパク質検出のため一次抗体はｐ１６にはＰＵＲＩＦＩＥＤ ＡＮＴＩ‐ＨＵＭＡＮ ｐ１６ＩＮＫ４ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ(ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)を、内部標準に使用したα-チューブリンにはα‐ｔｕｂｕｌｉｎ(ＴＵ‐０２) (ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ)を用いた。また二次抗体は双方とも、Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ‐Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ) Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ(ＢＩＯ ＲＡＤ)を使用した。抗体標識後はＩｍｍｏｂｉｌｏｎ ｗｅｓｔｅｒｎ(ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ)を用いて発色させた後Ｌａｓ‐４０００ ｍｉｎｉ(フジフィルム)で検出し、各バンドの面積と強度をＭｕｌｔｉｇａｕｇｅ(フジフィルム)で測定、５０％ＤＭＳＯで処理したコントロールを１００％として比較定量を行った。【０１３３】
結果を図７に示す。図７から、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ ＰＩＰによりｐ１６はｍＲＮＡだけでなくタンパク質レベルでも発現促進されていることが認められた。【０１３４】
７．ヒストンアセチル化抗体沈降によるゲノム領域特異的定量的アセチル化の解析：
合成した化合物（ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰ、若しくはＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰ）又はＳＡＨＡの最終濃度が150 nMとなるよう調整した１０％牛胎児血清を含むDMEM培地で、HeLa細胞を、37℃、５％CO2存在下で７日間培養した後、直径100 mm 細胞培養皿コーニング430167にコンフルエントの５ｘ１０６〜１ｘ１０7細胞を回収した。そして、MILIPORE  17-295  Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay kitを用いてクロマチン免疫沈降実験をおこなった。【０１３５】
具体的な手順は次の通りである。回収した７日間培養細胞に最終濃度が１％になるようにホルマリンを加え、３７℃で１０分間静置して細胞を固定した。これにより、細胞内でタンパク質・ＤＮＡがクロスリンクされる。次に、最終濃度が0.25Mとなるようグリシンを添加し、上清を取り除き、細胞層を洗浄した。次に、細胞層に220μlのlysis Bufferを添加し、スクレーパーを用いて細胞溶解液を回収した。得られた細胞溶解液を４℃の水中にひたしながら、BIORUPTOR (SANYO)を用いて細胞溶解液中の細胞を破砕した（強度をHとし、３０秒のソニケーションと１分間の停止を１サイクルとし、これを１０回繰り返した）。次に、１５０００xgで４℃にて１０分間の冷却遠心を行い、その上清200 μlに、1800μlのDilution Bufferと25μlのProtein A sepharoseを加え、４℃で３０分間の回転混和を行い、非特異的な結合を取り除いた。次に、１０００xgで１分間の遠心を行った後、その上清400μlに抗体anti histone H3 (Abcam, Cat. No. ab1971, Lot517069)２μgまたは抗体anti histone H3K9 acetyl (Abcam, Cat. No. ab10812, Lot522309)２μgを混和し、４℃で１２時間の回転混和を行った。その後、40μlのprotein sepharoseを加え、４℃で１時間の回転混和を行い、１０００xgにて１分間の遠心を行うことでsepharoseを沈殿させた。沈殿物を添付のLOW bufferで洗浄後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを沈降させた。沈降sepharoseをHigh Bufferで洗浄後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを再び沈降させた。沈降sepharoseをLiCl2 Bufferで洗浄後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを再び沈降させた。沈降sepharoseをＴＥで洗浄後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを再び沈降させた。次に、sepharoseを250μlの0.1M NaHCO3−1% SDS溶液に懸濁し、その１５分後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを再び沈降させた。上清を分取した後、再度、沈降したsepharoseを250μlの0.1M NaHCO3−1% SDS溶液に懸濁し、その１５分後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを沈降させた。合計500μlの溶出液を回収し、最終濃度が200mMとなるようにNaClを加えて、６５℃にて４時間の処理を行った。次に、最終濃度20ng/μlのプロテアーゼKにより、４５℃にて１時間の処理を行った。さらに、フェノール・クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿法を行うことによりDNAを精製した。次に精製したDNAを用いて、ＰＣＲ法により目的のゲノム領域の増幅を行った。ＰＣＲ法は前記「５．リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ」に記載の方法と同様に行った。具体的には、精製ＤＮＡを、ＳＹＢＲｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ(ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ、滋賀)を用いて、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＳｙｓｔｅｍＴＰ‐８００(ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ、滋賀)により、定量的に解析した。この時、ｐ１６遺伝子又はＬＡＲＰ１遺伝子のクロマチン免疫沈降の確認のためのプライマーとして、以下のプライマーセットを用いた。
尚、ｐ１６遺伝子に加えてＬＡＲＰ１遺伝子についても解析したのは、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰが認識するｐ１６遺伝子の調節領域の配列と同様の配列が、ＬＡＲＰ１遺伝子領域にも存在したためである。【０１３６】
ｐ１６フォワード：5'-TTGCCAACGCTGGCTCTGG-3'（配列番号８）
ｐ１６リバース： 5'-CAAATCCTCTGGAGGGACCGC-3'（配列番号９）
ＬＡＲＰ１フォワード：5'-TACCAACCACTGTCCCAGAG-3'（配列番号１０）
ＬＡＲＰ１リバース：5'-TGGGTTTGAACTGTGTCTTG-3'（配列番号１１）【０１３７】
また、内部標準として使用したヒト内在性グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子領域の増幅には次のプライマーを使用して、ＰＣＲ反応を行った。
フォワード：  
5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG -3’（配列番号１２）
リバース：  
5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA -3’（配列番号１３）【０１３８】
結果を図１０に示す。図１０に示したように、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰは、ｐ１６のゲノム領域のヒストンＨ３のリシン９番のアセチル化を亢進し、ＳＡＨＡ単独またはｐ１６領域を認識しないポリアミドとＳＡＨＡとの複合体（ＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰ）と比較しても、約２倍の有意な亢進を示した。さらにｐ１６遺伝子の調節領域の配列と同様のＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰ認識配列を有するＬＡＲＰ１遺伝子においても、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰは、ＬＡＲＰ１遺伝子のゲノム領域のヒストンＨ３のリシン９番のアセチル化を亢進し、ＳＡＨＡ単独またはＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰと比較しても、約２．５倍の有意な亢進を示した。このことは、特に転写誘導とよく相関するアセチル化として、ヒストンヒストンＨ３のリシン９番と１４番のアセチル化が知られていることより、ＳＡＨＡ＋ｐ１６が、その認識配列を持つゲノム領域において特異的にヒストンＨ３のリシン９番のアセチル化を誘導することが出来ることを意味すると考えられた。【０１３９】
８．定量ＰＣＲによるＬＡＲＰ１遺伝子の発現解析：
HEK293細胞を用いてＬＡＲＰ１遺伝子の発現解析を行った。HEK293細胞は、ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのE1遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株である。ＬＡＲＰ１遺伝子は、前記のように、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰが認識するｐ１６遺伝子の調節領域の配列と同様の配列を、その遺伝子領域に有する。
具体的には、次のようにして発現解析を行った。HEK293細胞を、DMEM 10% 牛胎児血清（FCS）含有増殖培地にて培養した。このとき、最終濃度150 nMの合成化合物（ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰ;ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡ ＋ｐ１６ＰＩＰ;又はＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰ）を添加した培養液で２日毎に培地交換を行い、一週間、上記合成化合物を含む培地にて細胞の培養を続けた。一週間後、細胞を1mlのTRIzolに溶解させ、これに200μlのクロロホルムを混合し、１２０００xgにて、４℃で１０分間の遠心を行った。次に、上清を等量のイソプロパノールに混和し、１２０００xgにて、４℃で１０分間の遠心を行った。次に、ペレットを７０％エタノール液にて洗浄し、５０００xgにて５分間の遠心を行った後、上清を除去した。次に、ペレットを１００μlの水に溶解させ、得られたＲＮＡ溶液をRNeasy kit（QIAGEN）のカラムにかけて、ＲＮＡを精製した。１μgのＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成し、定量PCRを実施した。この時、増幅には、以下のプライマーを使用した。【０１４０】
ＬＡＲＰ１遺伝子発現検定プライマー
ＬＡＲＰ１フォワード：5'-TACCAACCACTGTCCCAGAG-3'（配列番号１０）
ＬＡＲＰ１リバース：5'-TGGGTTTGAACTGTGTCTTG-3'（配列番号１１）【０１４１】
また、内部標準として使用したヒト内在性グリセルアルデヒド-３-ホスフェート  ジヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)の増幅には次のプライマーを使用して、ＰＣＲ反応を行った。
フォワード：
5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’（配列番号４）、
リバース：
5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’（配列番号５）。【０１４２】
結果を図１１に示す。図１１に示すとおり、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰ処理群では、HEK293細胞においてＬＡＲＰ１遺伝子の発現が上昇しており、ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ＳＡＨＡ ＋ｐ１６ＰＩＰ;又はＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰと比較しても、ＬＡＲＰ１遺伝子の発現が有意に上昇していた。
また、図１０に示したように、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰは、ＬＡＲＰ１遺伝子のゲノム領域のヒストンＨ３のリシン９番のアセチル化を亢進する。ヒストンＨ３のリシン９番のアセチル化は特に遺伝子発現誘導と相関することが知られている。
これら図１０および図１１の結果を考慮すると、ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＰＩＰは、ＬＡＲＰ１遺伝子領域においてもヒストン脱アセチル化酵素を阻害し、ヒストンのアセチル化を促し、このことにより遺伝子の発現を上昇させたものと類推された。よって標的ゲノム領域でヒストン脱アセチル化酵素阻害を導き、遺伝子発現を活性化させたものと考えられる。
【０１４３】
９．複合体の設計および合成（ＩＩ）：
【化２０】
2010001933.tif 000022
【０１４４】
上記複合体（ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＮＵ  ＰＩＰ）は、ｐ１６遺伝子のプロモータ領域を認識するＰＩＰ（ｐ１６ＮＵ  ＰＩＰ）とＳＡＨＡとの複合体である。
上記複合体は次のように設計した。
図１のｐ１６遺伝子のプロモーター領域の配列中、最上段のボールドの配列（AGGGTTGAGGGGGTAGGGGGACACTTTCTAGT）のリンカーシークエンスの領域は、転写因子結合部位に近く、ヒストンのアセチル化を導くことが出来ると考えられる。このため、図１中の配列中、最上段の灰色で覆った配列ＡＧＧＧＴＴＧＡをターゲットにして、この配列を認識するようにポリアミドを設計した。【０１４５】
上記複合体は、次のように合成した。
H2NββPyPyβPyPyPyγImImImβPyImβDp polyamide ８の合成：
【化２１】
2010001933.tif 000023
【０１４６】
Libra Tubeにβ-clear Resin(241.4 mg, 0.122 mmol)を入れ、15本のエッペンドルフチュ-ブそれぞれに1-[bis(dimethylamino)methylene]-5-chloro-1H-benzotriazolium 3-oxidehexafluoro phosphate(160 mg, 0.39 mmol)を加え、内6本に4-(Fmoc-amino)-1-metyl-1H-pyrrole-2-carbo xylic acid(145 mg, 0.4 mmol)、4本に4-(Fmoc-amino)-1-metyl-1H-imidazole-2-carbo xylic acid(145 mg, 0.4 mmol )、4本にN-β-Fmoc-β-alanine(130 mg, 0.42 mmol)、１本にN-γ-Fmoc-γ-aminobutyric acid(150 mg, 0.46 mmol)を加え、全試料の減圧乾燥を行った。充分に乾燥した後にLibra tubeにDMF(2 ml)を加えて膨潤させ、すぐにDMFを溜去した。20%ピペリジン/DMF溶液(3 ml)を加えて、保護基のFmocの脱保護を行った。Fmocの脱離はUV-Vis吸光を測定することで確認した。脱保護の後、固相をCH2Cl2(5 ml)、methanol(5 ml)、DMF(5 ml)で洗った。次に、上記で調整した反応試薬-HCTUの混合物をLibra Tubeに加え、DMF(5 ml)、塩基としてDIEA(70μl)を加えて溶解させ、室温で１時間撹拌させながら反応させた。１時間経過した後、無水酢酸(0.2 ml)を加えて１０分間反応させて未反応のアミノ末端をアセチル基で保護し、それ以上の伸長反応がおこらないようにした。つづいて、溶液を溜去し固相をCH2Cl2(5 ml)、methanol(5 ml)、DMF(5 ml)で洗った。その後、20%ピペリジン/DMF溶液(3 ml)でのFmocの脱保護を行った。これ以後、配列に従って同様の処置を繰り返した。最後の試薬を反応に用い、Fmocの脱保護を行い、乾燥させた後に固相をすべて10 mlのナス型フラスコに移し、N,N-dimethyl-1,3-propane diamine(1 ml)を加えて、55 ℃で8時間撹拌して、固相上からのポリアミドの切り出しを行った。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)およびESI-MSより目的のpolyamide ８の生成を確認した。N,N-dimethyl- 1,3-propanediamineを溜去し、Et2Oでポリアミドを洗浄し、黄褐色の固体7を得た。未精製の状態で48．0 mg(23%)を得た。
ESI-MS m/z calcd for C80H102N32O16+［M＋H］+1767.9, found 1768.0【０１４７】
4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoyl-H2NββPyPyβPyPyPyγImImImβPyImβDp polyamide 22の合成
【化２２】
2010001933.tif 000024
【０１４８】
10 mlのナス型フラスコに4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoic acid 5 (16.9 mg, 0.054 mmol)、H2N-ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp ８ (20.2 mg 11.0μmol), FDPP (68.4 mg，0.22 mmol)を加え、三方コックを用いて脱気乾燥した後にAr置換した。次に脱水したDMF(1.5 ml)、塩基としてDIEA(0.15 ml)を加え、室温で６時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH-CH3CN, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。H2N-ββIm PyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 8が完全に消費されたのを確認した後に、一度溶媒を減圧溜去した。Et2O(3 ml)を加えて可溶分を溶解させて除去し、不溶分のみを回収した。回収した不溶分をDMF(1 ml)に溶解させ、Chemcobond 5-ODS-H coloumn (0.1% AcOH/CH3CN 0-100%, 20 min, 360 nm)を用いたHPLC精製により白色固体 22を得た。
Yield:7.0 mg (33%).  ESI-MS m/z calcd for C96H121N33O20+,［M＋H］+2057.2,  found 2057.1.【０１４９】
SAHA- H2NββPyPyβPyPyPyγImImImβPyImβDp 20(SAHA+p16Nu  PIP)の合成：
【化２３】
2010001933.tif 000025
【０１５０】
10 mlのナス型フラスコ中で4-(8-methoxy-8-oxooctanamido)benzoyl-ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 22 (7.0 mg, 3.5μmol)をDMF(2.0 ml)に溶解させ、50% NH2OH/H2O (1.0 ml, 15.1 mmol)を加えて室温で10時間撹拌した。HPLC(0.1% AcOH/CH3CN 0-100%, 0-100％, 20 min, 254 nm)で反応を追跡した。4-(8-methoxy-8-oxo octanamido)benzoyl-ββImPyPyβImPyγImPyβImImPyβDp 22が完全に消費されたのを確認した後に、氷冷しながら酢酸でクエンチし、次に減圧蒸留で溶媒を溜去した。得られた残渣をDMF（1 ml）に溶解させ、Chemcobond 5-ODS-H coloumn (50 mmol AF-CH3CN, 20 min, 360 nm)を用いたHPLC精製により白色固体15を得た。
Yield: 4.0 mg(49%). 1H NMR ( DMSO-D6, 400 MHz, δ)： ESI-MS m/z calcd for  C95H120N34O20+. ［M＋H］+ 2058.9, found 2059.2.【０１５１】
１０．細胞増殖アッセイ（ＩＩ）：
１x１０５細胞のMDA-MB231乳癌細胞を、最終濃度１０％の牛胎児血清含有RPMI-1640 培地を用いて、直径６センチメートルディッシュにて培養した。このとき、以下に示した最終濃度の各ポリアミド（ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＮＵ  ＰＩＰ;又はＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰ）を培地に添加して、又はポリアミドを添加せずに培養をおこなった。【０１５２】
no treat：未処理
1μM ＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰ
1μM ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＮＵ  ＰＩＰ
2μM ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＮＵ  ＰＩＰ【０１５３】
培養開始から始めて、２４時間ごとに以下の作業を行った。すなわち、細胞を顕微鏡下で観察した後、細胞を回収し、細胞数を計測して、トリパンブルー染色陽性生細胞とトリパンブルー染色陰性死細胞数を求めた。これにより、細胞の増殖および細胞の生存率を明らかにした。【０１５４】
結果を図１２に示す。図１２中、縦軸は、細胞数（ｘ（１０４））を示す。図１２に示すとおり、培養７２時間後では、未処理群や1μM ＳＡＨＡ＋ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰ処理群と比較して、1μM ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＮＵ  ＰＩＰ処理群では８３％の、2μM ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＮＵ  ＰＩＰ処理群では約６０％の有意な細胞増殖抑制が認められた。また、前記図３で示したようにＳＡＨＡ単独では腫瘍増殖抑制が認められなかったことを考慮すると、ｐ１６遺伝子の調節領域を認識するポリアミド（ＳＡＨＡ＋ｐ１６ＮＵ  ＰＩＰ）が、ＳＡＨＡを標的ゲノム領域に導き、さらに、標的ゲノム領域でヒストン脱アセチル化酵素阻害を導き、その結果として、細胞増殖が抑制されるものと考えられる。Ｐ１６のプロモータ領域に作製したポリアミドｐ１６  ＰＩＰおよびｐ１６ＮＵ  ＰＩＰのそれぞれにＳＡＨＡとの複合体を合成し、細胞増殖抑制実験を行い、その両方で、ＳＡＨＡ単独では誘導されない、がん細胞株の増殖を誘導できた。【０１５５】
（複合体合成例１）
ＳＡＨＡ＋ｐ５３PIP：
ｐ５３は、癌抑制遺伝子として最もよく知られる遺伝子で、高頻度にヒトがん腫で変異やＤＮＡメチル化が認められる。ｐ１６癌抑制遺伝子同様に内因性のｐ５３遺伝子の再発現によるがん治療を目的に本化合物が合成できる。【０１５６】
図８にｐ５３遺伝子のプロモータ部分、遺伝子発現調節領域を示す（配列番号６）。Ｐ５３遺伝子のプロモータ領域の転写因子ＭｙｃＭａｘ、ＭＺＦ１、ＮＦＫＢ、ＧＦＩ１の結合領域より最短の転写開始上流の配列で、転写因子結合領域に入らない、同結合領域に最も近い配列でヒストンの結合が見られない配列、ＴＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＴＧＣＣＣＴＣＡのシークエンスをＰＩポリアミド合成のターゲットとした。すなわち、上記配列下線部のTCCTCCAもしくはTCCACCA配列(−１６１〜−１６７および−１５２〜−１４６)を認識するようなポリアミドを設計した。P５３遺伝子は癌抑制遺伝子であり、p５３遺伝子のプロモータ領域はがん細胞では高頻度にメチル化している。P５３遺伝子のプロモータ領域が高頻度にメチル化しているとき、プロモータ部位にはヌクレオソーム構造が見られヒストン蛋白が結合している。この状態ではヒストンが脱アセチル化しており、DNAが縮合してプロモータ領域に転写因子が結合できない状態を生み、p５３遺伝子の転写が抑制される。P５３遺伝子のプロモータ領域のヒストンの結合状態は、抗ヒストン抗体免疫沈降とDNAオリゴアレイへのハイブリダイゼーション法で同定可能である。図８にｐ５３遺伝子のプロモータ領域（−２５０〜+１４１）の配列を示す。図８の配列中、アンダーラインボールドの配列は癌細胞ではヒストン蛋白と結合しないリンカー部分と考えられる配列である。リンカー部分ではＰＩポリアミドがＤＮＡに結合することができるが、ヒストン結合部分では既にヒストン蛋白がDNAと結合しているためポリアミドがDNAに結合できない可能性が高い。また、四角で囲んだ領域が、転写因子の結合部位であると考えられる（ＭｙｃＭａｘ、ＭＺＦ１、ＮＦＫＢ、ＧＦＩ１との結合が予測される）こと、灰色覆った領域が調節領域として強く保存されている部分であること、またこの領域が転写開始点の下流でエクソンに位置することより、転写開始点より上流で最も転写因子結合部位に近い、太字下線で示すＴＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＴＧＣＣＣＴＣＡのリンカーシークエンスがポリアミドの認識配列とするに最も適していると考えられた。尚、図８中、太字で転写因子結合部下流に位置する配列は転写領域内であるためRNAポリメレースの伸長に影響し、ｐ５３の発現を抑制する可能性もあるためポリアミドの合成領域に定めていないがこの領域でも同様のｐ５３のヒストン修飾に影響する化合物が合成可能と考えられる。よって、太字下線領域でヒストンのアセチル化を導くことが出来れば直下のヒストンがアセチル化されヒストン間が開き、プロモータへの転写因子の結合が促されると考えられる。このため太字下線領域配列内のＴＣＣＴＣＣＡおよびＴＣＣＡＣＣＡを標的にして、この配列を認識するようにポリアミドを設計した。この配列を認識するポリアミドとＨＤＡＣ阻害剤との複合体であれば、標的特異的にヒストンのアセチル化を促すことができ、より効果的にヌクレオソーム構造の変化を誘導できると期待された。このようにしてヌクレオソームの構造の変化を誘導することでｐ５３癌抑制遺伝子を癌細胞で再発現さ��ることができると考えられる。このように設計したＳＡＨＡ+p５３PIPの構造式を下記に示す。【０１５７】
【化２４】
2010001933.tif 000026
【０１５８】
（複合体合成例２）
ＡＭＩ-１＋ＭＹＣＮPIP：
ＭＹＣＮ遺伝子は、癌遺伝子として知られ特に予後の不良な小児固形腫瘍、神経芽細胞腫で高頻度に増幅が認められる遺伝子であり、この発現抑制による神経芽細胞腫の治療の試みがなされている。この発現を、ヒストンのメチル化により調節することは治療法の開発研究に結びつくとともに治療法に利用できる可能性がある。【０１５９】
図９にＭＹＣＮ遺伝子のプロモータ部分、遺伝子発現調節領域を示す（配列番号７）。MYCN遺伝子のプロモータ領域の転写因子Ｅ２ＦおよびＭＺＦ１の結合領域は、ヒストンの結合が弱いと考えられ、最短の転写因子の結合に影響を与えない領域でヒストンH3K9メチル化抗体での免疫沈降物でプローブとの結合が弱い配列（−４００〜−３８７）、ＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＣＣＧＴＡＡＴのシークエンスをＰＩポリアミド合成のターゲットとした。すなわち、上記配列下線部のTCCGTAAT配列(−３８０〜−３８７)を認識するようなポリアミドを設計した。MYCN遺伝子は癌遺伝子であり、MYCN遺伝子はがん細胞では増幅、転写活性化され高頻度に高発現が見られる。MYCN遺伝子のプロモータ領域が活性化しているとき、プロモータ転写因子結合部位にはヒストンが結合しにくいと考えられる。この状態ではヒストンのアルギニン残基がメチル化される傾向にあり、プロモータ領域に転写因子が結合し活性化された状態が生じ、ＭＹＣＮ遺伝子の転写が亢進されている。ＭＹＣＮ遺伝子のプロモータ領域のヒストンの結合状態は、抗ヒストン抗体免疫沈降とＤＮＡオリゴアレイへのハイブリダイゼーション法で同定可能である。図９にＭＹＣＮ遺伝子のプロモータ領域（−５４０〜+１８０）の配列を示す。図９の配列中、アンダーラインボールドの配列はヒストン蛋白と結合しないリンカー部分と考えられる配列であり、その上流にはヒストンの結合が期待される。リンカー部分ではＰＩポリアミドがDNAに結合することができるが、ヒストン結合部分では既にヒストン蛋白がDNAと結合しているためポリアミドがDNAに結合できない可能性が高い。また、四角で囲んだ領域が、転写因子が結合すると考えられる(Ｅ２Ｆ結合部の上流２箇所とその下流にＭＺＦ１の結合が予測される）領域であること、灰色で覆った領域が調節領域として強く保存されている部分であることより、転写因子結合部位に近い太字下線で示すＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＡＡＴのヒストン非結合と考える領域付近にはヒストン蛋白も存在しない可能性がある。このため上流のＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＣＣＧＴＡＡＴのリンカーシークエンスがポリアミドの認識配列とするに最も適していると考えられた。よって、太字下線領域でヒストンのメチル化を阻害することが出来れば直上のヒストンの脱メチル化が誘導され、転写非活性型ヒストンが誘導される。アルギニン残基メチル化酵素(ＰＲＭＴ) 阻害剤の ＡＭＩ−１は、ヒストンのアルギニン残基メチル化を阻害すること、MCF-7乳癌細胞における核内受容体レポーター遺伝子の活性化を抑制し，HIV-1 RT ポリメラーゼを阻害すると報告されている。このことより、ＡＭＩ−１によりヒストンの修飾が変化することで癌遺伝子の不活化誘導ができる可能性があると考えられる。このため太字下線領域配列内のＴＣＣＧＴＡＡＴを標的にして、この配列を認識するようにポリアミドを設計した。この配列を認識するポリアミドとPRMT阻害剤AMI-1との複合体であれば、標的特異的にヒストンの脱メチル化を促すことができ、より効果的にヌクレオソーム構造の変化を誘導できると期待された。このようにしてヌクレオソームの構造の変化を誘導することでMYCN癌遺伝子の発現を癌細胞で抑制できると考えられる。【０１６０】
このように設計したMYCN-AMI-1（下記構造式）は、公知の方法で合成する（文献Dyes and Pigments, 1996, 32, 193.）。【０１６１】
【化２５】
2010001933.tif 000027
【０１６２】
具体的には、ＡＭＩ-１＋ＭＹＣＮPIPは、ヒストン修飾制御剤であるJ酸（2-Amino-5-naphthol-7-sulfonic Acid、下記a）と上記MYCN標的ポリアミドから次のように合成する。J酸とAlkyl linker となるBrCH(CH2)n-1COOHを反応させJ酸誘導体（下記b）を合成し、このJ酸誘導体とJ酸をbis(trichloromethyl)carbonateを用いて縮合することでAMI1誘導体（下記c）を合成する。合成したAMI1誘導体とMYCN標的PIP(下記d)をHCTUにより縮合させ目的化合物であるＡＭＩ-１＋ＭＹＣＮPIP（下記e）を合成する。【０１６３】
【化２６】
2010001933.tif 000028
【０１６４】
ｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰは、上記ｐ５３プロモータのヒストンが結合しないリンカー領域の配列を認識しない、ｐ１６で使用したｎｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩＰ（認識配列がＷＧＷＣＣＷ）を使用する。図９のプロモータの下線リンカー領域にはこの認識配列が存在しない。【０１６５】
またＡＭＩ−１以外にも、ＰＲＭＴ阻害剤として知られるJ 酸（下記a）、Direct Yellow 26 (下記b)、 Direct Yellow 50 (下記c)、Direct Red 75 (下記d)またはスラミン(下記e)を基本骨格に有する化合物及びその誘導体とＰＩＰの複合体も同様に標的特異的なアルギニンのメチル化を抑制し、ＭＹＣＮ癌遺伝子の発現を抑えられると考えられる。【０１６６】
【化２７】
2010001933.tif 000029
【図２】
2010001933.tif 000031
【図３】
2010001933.tif 000032
【図４】
2010001933.tif 000033
【図１２】
2010001933.tif 000034
【図１】
2010001933.tif 000035
【図５】
2010001933.tif 000036
【図６】
2010001933.tif 000037
【図７】
2010001933.tif 000038
【図８】
2010001933.tif 000039
【図９】
2010001933.tif 000040
【図１０】
2010001933.tif 000041
【図１１】
2010001933.tif 000042
【配列表】
2010001933000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月4日(2011.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スロベイルビスヒドロキサミン、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＭＳ-２７５、ブチラート、ＮａＢ、ＡＭＩ-１、スラミン、7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 (J酸)、Direct Yellow 26、 Direct Yellow 50、及びDirect Red 75からなる群から選択されるヒストン修飾制御剤と、標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとを結合した複合体を含み、ヒストン修飾制御剤と標的遺伝子の調節領域を認識するポリアミドとの結合がアミド結合を介したものである、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤。
【請求項２】
ヒストン修飾制御剤が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸である、請求項１に記載の制御剤。
【請求項３】
標的遺伝子が細胞制御に関わる遺伝子である、請求項１又は２に記載の制御剤。
【請求項４】
細胞制御に関わる遺伝子が、癌遺伝子、または癌抑制遺伝子である、請求項３に記載の制御剤。
【請求項５】
細胞制御に関わる遺伝子が、幹細胞または先駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子である、請求項３に記載の制御剤。
【請求項６】
癌遺伝子が、Cytoplasmic tyrosine kinases 遺伝子、調節性GTPases遺伝子、チロシンキナーゼ型受容体遺伝子、細胞内セリンもしくはスレオニンキナーゼ遺伝子もしくはそれらの調節サブユニット遺伝子、シグナル伝達系のアダプタータンパク質遺伝子、または転写因子(Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ)遺伝子である請求項４に記載の制御剤。
【請求項７】
癌抑制遺伝子が、p16ＩＮＫ4a(ＣＤＫＮ2Ａ)遺伝子、ｐ21(ＣＤＫＮ1Ａ)遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＲＡＳＳＦ1遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＮＦ1遺伝子、ＮＦ2遺伝子、ｐ19(ＣＤＫＮ2Ｄ) 遺伝子、ＷＴ1遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ＢＲＣＡ1遺伝子、ＢＲＣＡ2遺伝子、ＣＨＥＫ2遺伝子、Ｍａｓｐｉｎ 遺伝子、ｐ73遺伝子、ＤＰＣ4(ＳＭＡＤ4) 遺伝子 、ＭＳＨ2遺伝子、ＭＬＨ1遺伝子、ＰＭＳ2遺伝子、ＤＣＣ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ｐ57ＫＩＰ2(ＣＤＫＮ1Ｃ) 遺伝子、ＰＴＣ遺伝子、ＴＳＣ1遺伝子、ＴＳＣ2遺伝子、ＥＸＴ1遺伝子、ＥＸＴ2遺伝子、またはｐ53遺伝子である、請求項４に記載の制御剤。
【請求項８】
幹細胞または前駆細胞の維持および／または分化に関わる遺伝子が、ＬＩＦ  (leukaemia inhibitory factor)遺伝子、ＯＣＴ3/4遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ2遺伝子、ＫＬＦ4遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、または ｐ１６ＩＮＫ4ａ(ＣＤＫＮ2Ａ) 遺伝子である、請求項５に記載の制御剤。
【請求項９】
複合体が、下記式(1)、(2)、(3)、(4)または(5)で表されるものである、請求項１に記載の制御剤。
【化２８】
2010001933.tif 000043
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
2010001933.tif 000044
2010001933.tif 000045
2010001933.tif 000046
2010001933.tif 000047
2010001933.tif 000048
2010001933.tif 000049
2010001933.tif 000050
2010001933.tif 000051
2010001933.tif 000052
2010001933.tif 000053