(57)【要約】【課題】抗腫瘍活性を有する細胞や、抗腫瘍活性を示し得る細胞を活性化する抗原提示細胞を利用する癌の細胞免疫治療において、抗腫瘍活性を有する細胞を腫瘍組織に効率的に送り込み、そして、より強い抗腫瘍反応を惹起させ得る方法、およびより有効な腫瘍縮小効果を得られる方法を提供すること。【解決手段】ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有する抗癌細胞組成物を腫瘍栄養動脈に投与し、かつ、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有するＮＫＴ細胞刺激剤を上気道粘膜下に投与することを特徴とする、頭頚部癌の治療方法、頭頚部の抗癌治療における、該抗癌細胞組成物および該ＮＫＴ細胞刺激剤の使用、該抗癌細胞組成物と該ＮＫＴ細胞刺激剤とのキット、並びに該抗癌細胞組成物。【選択図】図３【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有する抗癌細胞組成物を頭頚部癌の腫瘍栄養動脈に投与し、かつ、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有するＮＫＴ細胞刺激剤を上気道粘膜下に投与することを特徴とする、頭頚部癌の治療方法。
【請求項２】
α−ガラクトシルセラミドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有する抗癌細胞組成物を頭頚部癌の腫瘍栄養動脈に投与し、かつ、α−ガラクトシルセラミドで処理された抗原提示細胞を含有するＮＫＴ細胞刺激剤を鼻腔粘膜下に投与することを特徴とする、頭頚部癌の治療方法。
【請求項３】
ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする抗癌細胞組成物、および、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有し上気道粘膜下に投与されることを特徴とするＮＫＴ細胞刺激剤の、頭頚部の抗癌治療における使用。
【請求項４】
α−ガラクトシルセラミドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする抗癌細胞組成物、および、α−ガラクトシルセラミドで処理された抗原提示細胞を含有し鼻腔粘膜下に投与されることを特徴とするＮＫＴ細胞刺激剤の、頭頚部癌の治療における使用。
【請求項５】
ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し、腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする、抗癌細胞組成物と、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有し上気道粘膜下に投与されることを特徴とするＮＫＴ細胞刺激剤とのキット。
【請求項６】
α−ガラクトシルセラミドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し、腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする、頭頚部癌の治療剤と、α−ガラクトシルセラミドで処理された抗原提示細胞を含有し鼻腔粘膜下に投与されることを特徴とするＮＫＴ細胞刺激剤とのキット。
【請求項７】
ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し、腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする、頭頚部癌治療用抗癌細胞組成物。
【請求項８】
α−ガラクトシルセラミドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し、腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする、頭頚部癌治療用抗癌細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌細胞組成物を腫瘍栄養動脈に投与し、かつ、ＮＫＴ細胞刺激剤を上気道粘膜下に投与することを特徴とする頭頚部癌の治療方法、腫瘍栄養動脈に投与される抗癌細胞組成物および上気道粘膜下に投与されるＮＫＴ細胞刺激剤の頭頚部癌の治療における使用、該抗癌細胞組成物と該ＮＫＴ細胞刺激剤とのキット、並びに該抗癌細胞組成物に関する。より具体的には本発明は、ＮＫＴ細胞リガンドでインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）にて活性化されたＮＫＴ細胞を含有する抗癌細胞組成物を腫瘍栄養動脈に投与し、かつ、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有するＮＫＴ細胞刺激剤を上気道粘膜下に投与することを特徴とする頭頚部癌の治療方法、腫瘍栄養動脈に投与される該抗癌細胞組成物および上気道粘膜下に投与される該ＮＫＴ細胞刺激剤の頭頚部癌の治療における使用、腫瘍栄養動脈に投与される該抗癌細胞組成物と上気道粘膜下に投与される該ＮＫＴ細胞刺激剤とのキット、並びに腫瘍栄養動脈に投与される該抗癌細胞組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭頚部扁平上皮癌のうち、ＩＩＩ期、ＩＶ期の進行癌に対しては、原則として手術、放射線、化学療法による三者併用療法が行なわれる。手術治療は、特に１９８０年代後半以降、遊離皮弁、腸管、血管柄付骨による自家組織移植が普及し、拡大切除が比較的容易となり、機能や形態の保持にも一定の効果が得られ、局所コントロールは大きく前進した（非特許文献１）。内頚動脈や頭蓋底浸潤癌も絶対切除が可能となった（非特許文献２、非特許文献３）。ただ、切除範囲が広がれば、再建手術による機能や形態の保持にも限界があり、患者の生活の質（ＱＯＬ）も低下が目立つ。また、ＩＶ期では、照射、化学療法併用も治療成績の向上には不可欠であるが、ＩＶ期の中でもＮ２ｃ、Ｎ３症例や、頚動脈浸潤症例では、拡大切除によっても治療成績は不良で５年生存率は５０％を下回った（非特許文献４）。拡大切除を先行しその後に照射・化学療法を併用した治療では生存率が大幅に向上したが、逆に喉頭などの機能保存は困難であった。【０００３】
一方、国内でも１９８５年の白金製剤の導入後、化学療法の高い効果が期待され、ネオアジュバント療法あるいはアジュバント療法として用いられた（非特許文献５、非特許文献６）。しかし、欧米でのランダム化試験の結果、ネオアジュバント治療は機能の保全には一定の効果を示しても、照射単独治療と比較して生存率の改善には寄与しないことが、約１０年前までにほぼ結論付けられている（非特許文献７）。現在、照射療法と化学療法の同時併用療法が３者併用療法の中心治療として注目されており、照射単独療法に比較して機能保持の可能性が高いばかりでなく、生存率の向上にも寄与していることがランダム化試験で報告されている（非特許文献８）。ただ、生存率の向上の程度は０〜８％であり、５年生存率も２０〜４０％程度であり、さらに多くの試験ではＮ２ｃ、Ｎ３、あるいは進行Ｔ４症例を試験対象から除いているものが多い。また、サルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）手術の成績は不良である（非特許文献９）。【０００４】
このように進行頭頚部扁平上皮癌の治療は手術にせよ、放射線、化学療法にせよ大きな問題がある。その成績の向上、さらには患者負担の軽減をはかるためには新たな治療戦略が不可欠である（非特許文献１０）。従来の細胞免疫治療は、安全性は高いが、その効果は非常に限られたものしか得られていなかった。【０００５】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は同一の細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とナチュラルキラー細胞レセプター（ＮＫＲ）をともに発現しているユニークな細胞であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）とは区別される第４のリンパ球として最初に報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、極めて限定されたα鎖（マウスでＶα１４−Ｊα２８１、ヒトではＶα２４−ＪαＱ）およびβ鎖（マウスでＶβ８、Ｖβ７あるいはＶβ２、ヒトではＶβ１１）から構成されており （非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）、また、認識する分子も主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ類似の抗原提示分子であるＣＤ１ｄ分子であることが明らかにされている （非特許文献１９、非特許文献２０）。最近、糖脂質の１つであるα−ガラクトシルセラミドをＣＤ１ｄに提示することによってＮＫＴ細胞を特異的に活性化させることができることが示された （非特許文献２１、非特許文献２２）。リガンドによって活性化されたＮＫＴ細胞は、迅速に大量のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）とインターロイキン４（ＩＬ−４）を産生し、パーフォリン／グランザイムＢを介した強力な細胞傷害活性を発揮する。さらにその後、さまざまな免疫反応が誘起され、その結果として強い抗腫瘍作用が発揮されるというユニークな作用機構を有することが明らかになった。α−ガラクトシルセラミドは、マウスの各種肝転移モデルにおいてＮＫＴ細胞依存的に顕著な抗腫瘍効果を発揮したことが報告されている（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５）。また、α−ガラクトシルセラミドは、マウスＮＫＴ細胞のみならず、ヒトＮＫＴ細胞も特異的に活性化できることが見出された（非特許文献２６）。これらの結果にもとづき、固形癌の患者を対象にしたα−ガラクトシルセラミドの投与による第Ｉ相治験がオランダにて実施されている（非特許文献２７）。また、α−ガラクトシルセラミドで活性化せしめたＮＫＴ細胞を静脈内に注入する療法が肺癌に対して行われてきたが、明らかな腫瘍縮小効果は認められていない（非特許文献２８）。【０００６】
樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ＤＣ）は、Ｔ細胞依存性の免疫応答において最も強力な抗原提示細胞である。癌患者では、腫瘍から分泌されるインターロイキン１０（ＩＬ−１０）や血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）などによって、ＤＣの成熟、活性化および動員が阻害されていると言われている。しかしＤＣの前駆細胞を体外に取り出して成熟過程へと誘導して、さらに腫瘍特異的抗原をパルスして腫瘍抗原特異的免疫能を与えた後に、癌患者に再輸注するならば、前記の生体内でのＤＣの成熟、活性化の抑制状況を打破して、有効な治療となることが期待されている。既に、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、腎細胞癌などに対しＤＣによる癌ワクチン療法（ＤＣ療法）の臨床試験が開始されており、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導や腫瘍縮小効果を認めたという予備的な報告がなされている。ＤＣ療法に伴う副作用としては、悪寒、発熱などが報告されている。世界的には、副作用として自己抗体の出現（抗甲状腺抗体など）や慢性関節リウマチを発症したという報告はあるが、他に重篤な副作用、合併症は報告されておらず、ＤＣ療法は比較的安全な治療法であると考えられる。しかし、腫瘍特異的な分子を利用する一般的なＤＣ療法では、その特異性があるために限られた腫瘍にしか有効性が期待されず、またＭＨＣに拘束されるという点で、異なったＭＨＣの患者や、患者の腫瘍細胞においてＭＨＣクラスＩ分子の発現低下がみられる場合にはＣＴＬの標的とはなり得ないなどの課題を有する。【０００７】
他方、前述のα−ガラクトシルセラミドの抗腫瘍作用機構に基づけば、α−ガラクトシルセラミドをパルスされたＤＣを担癌マウスに移入することにより抗腫瘍効果が得られることが予想された。動物を用いた検討結果より、悪性腫瘍転移モデルにおいてα−ガラクトシルセラミドを投与する時期を遅らせた場合は、転移抑制効果が認められなくなるが、α−ガラクトシルセラミドをパルスされたＤＣを担癌マウスに投与すると、投与時期をある程度遅らせてもほぼ完全に肺または肝転移が抑制されることが示された （非特許文献２９）。このことは、生体内で効率良くＮＫＴ細胞を活性化するためには、α−ガラクトシルセラミドを単に投与するよりも、ＤＣに提示された形で投与した方が良いことを示唆している。しかも、本治療法が利用するＣＤ１ｄ分子−ＮＫＴ細胞抗原受容体の系は万人で共通であるため、誰のＮＫＴ細胞でもα−ガラクトシルセラミドによって活性化することが可能である。また、活性化したＮＫＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の発現とは無関係に細胞傷害活性を起こすことから、癌特異的ペプチドをパルスするようなＤＣ療法の欠点を補完する利点を有すると考えられる。【０００８】
千葉大学倫理委員会にて承認された「肺癌再発例並びに進行肺癌患者を対象にしたα−ガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）パルス細胞を用いた治療法」の安全性試験により、α−ガラクトシルセラミドパルス樹状細胞療法が安全に施行可能であることが判明した。また、「肺癌再発症例並びに進行期肺癌症例を対象とした活性化ＮＫＴ細胞を用いた臨床研究」の安全性試験により活性化ＮＫＴ細胞の静脈投与が安全に施行可能であることが判明した。【０００９】
これまで、肺癌の再発例を中心にα−ガラクトシルセラミドパルス樹状細胞の静脈投与による検討がなされている。第一相試験では移入細胞数をレベル１として５×１０７／ｍ２、レベル２として２．５×１０８／ｍ２、レベル３として１×１０９／ｍ２とエスカレーションして試験が行われた。この結果、試験参加症例全１１例のうち、レベル３の細胞数を投与された一例に末梢血ＮＫＴ細胞の増加が観察された（非特許文献３０）。しかしながら、レベル１およびレベル２のα−ガラクトシルセラミドパルス樹状細胞の数量では末梢血にＮＫＴ細胞の増加する免疫応答は得られていない。【００１０】
上述の様に、α−ガラクトシルセラミドなどのＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を投与することにより、ＮＫＴ細胞リガンドを直接生体内へ投与する場合と比較して、より効率よくＮＫＴ細胞を刺激し、免疫を刺激し、腫瘍などの疾患を処置することが可能である。【００１１】
本発明者らは、抗原をパルスされた樹状細胞を鼻腔粘膜下に投与することにより、樹状細胞が高選択的に頚部リンパ節に移行することを報告している。また、正常非転移頸部リンパ節内にはＮＫＴ細胞は検出されないが、頭頸部癌が転移した頸部リンパ節内には多数のＮＫＴ細胞が検出されたことを確認している（非特許文献３１、非特許文献３２）。【００１２】
さらに本発明者らは、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を上気道粘膜下に投与することにより、通常頸部リンパ節内には存在しないＮＫＴ細胞が選択的に頸部リンパ節に誘導されることを見出し、更に該投与方法を用いれば、頚部リンパ節以外の組織（末梢血など）においても、極めて少量の抗原提示細胞により、効率的にＮＫＴ細胞が刺激され、全身的な免疫応答が刺激され得ることを見出している（特許文献１）。【００１３】
上述のように、抗腫瘍活性を有する細胞や、あるいは抗腫瘍活性を示し得る細胞を活性化する抗原提示細胞などを利用して、癌の細胞免疫治療が開発されている。【００１４】
一方、癌の治療において、抗癌薬の選択的動脈内注入が標準的治療で広く使用されている。選択的動脈内注入療法は、抗癌薬を腫瘍の栄養血管に直接投与することにより高濃度の薬剤を腫瘍に分布させ、抗腫瘍効果を高め治療効果を高めるとともに、全身に循環する薬剤を少なくし、副作用の軽減を図る治療法である。頭頚部癌においても抗癌薬の選択的動脈内注入療法が開発されており、本療法のみでは生存率の改善率は低いが、放射線療法との併用療法で局所制御率とともに生存率も改善するという報告が見られる（非特許文献３３）。【００１５】
しかしながら、活性化せしめた抗腫瘍活性を有する細胞を腫瘍栄養血管へ動脈内投与することにより、それらの細胞を腫瘍組織に効率的に送り込むことができるかどうか、また、より強い抗腫瘍反応を惹起し得るかどうかは知られていない。【００１６】
【特許文献１】国際公開第WO 2007/043630パンフレット
【非特許文献１】岡本美孝、「進行頭頸部癌の治療−対応と問題点」、耳鼻臨床 2001 94:577-85
【非特許文献２】岡本美孝、「内頸動脈浸潤癌への挑戦」、耳鼻展 1999 42:232-9
【非特許文献３】チャゾノ（Chazono H）ら、「Extra-intracranial bypass for reconstruction of internal carotid artery in the management of head and neck cancer」、Ann Vasc Surg 2003 17:260-5
【非特許文献４】オカモト（Okamoto Y）ら、「Carotid artery resection for head and neck cancer」、Surgery 1996 120:54-9
【非特許文献５】オカモト（Okamoto Y）ら、「Arterialchemoembolization with cisplatin microcapsules」、Br J Cancer 1986 53:369-75
【非特許文献６】トムラ（Tomura N）ら、「Chemoembolization of head and neck cancer with carboplatin-microcapsules」、Acta Radiologica 1996 37:52-6
【非特許文献７】リスチン（Rischin D）、「Head and neck cancer debate: Does induction chemotherapy remain a worthy approach?」、Am Soc Clin Oncol 2003 :300-4
【非特許文献８】アデルスタイン（Adelstein DJ）ら、「Mature results of a phase III randomized trial comparing concurrent chemotherapy with radiation alone in patients with stage III and IV squamous cell carcinoma of the head and neck」、cancer 2000 88:876-83
【非特許文献９】フォラスティエール（Forastiere AA）ら、「Concurrent Chemotherapy and radiotherapy for organ preservation in advanced laryngeal cancer」、N Engl J Med 2003 349:2091-8
【非特許文献１０】岡本美孝、「頭頸部癌の治療:問題点と今後の展望」、千葉医学 2003 79:1-5
【非特許文献１１】フォウルクス（Fowlkes BJ）ら、「A novel population of T-cell receptor alphabeta-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V beta gene family」、Nature 1987 Sep 17-23;329(6136):251-4
【非特許文献１２】ブッド（Budd RC）ら、「Developmentally regulated expression of T cell receptor beta chain variable domains in immature thymocytes」、J Exp Med 1987 Aug 1;166(2):577-82
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【非特許文献１９】ベンデラク（Bendelac A）ら、「CD1 recognition by mouse NK1+ T lymphocytes」、Science 1995 May 12;268(5212):863-5
【非特許文献２０】アダチ（Adachi Y）ら、「Positive selection of invariant V alpha 14+ T cells by non-major histocompatibility complex-encoded class I-like molecules expressed on bone marrow-derived cells」、Proc Natl Acad Sci USA 1995 Feb 14;92(4):1200-4
【非特許文献２１】カワノ（Kawano T）ら、「CD1d-restricted and TCR-mediated activation of V alpha14 NKT cells by glycosylceramides」、Science 1997 Nov 28;278(5343):1626-9
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【非特許文献２６】カワノ（Kawano T）ら、「Antitumor cytotoxicity mediated by ligand-activated human V alpha24 NKT cells」、Cancer Res 1999 Oct 15;59(20):5102-5
【非特許文献２７】ジャコーネ（Giaccone G）ら、「A phase I study of the natural killer T-cell ligand alpha-galactosylceramide(KRN7000) in patients with solid tumors」、Clin Cancer Res 2002 Dec;8(12);3702-9
【非特許文献２８】モトハシ（Motohashi S）ら、「A phase I study of in vitro expanded natural killer T cells in patients with advanced and recurrent non-small cell lung cancer」、Clin Cancer Res. 2006 Oct 15;12(20):6079-86
【非特許文献２９】トウラ（Toura I）ら、「Cutting edge: inhibition of experimental tumor metastasis by dendritic cells pulsed with alpha-galactosylceramide」、J Immunol 1999 Sep 1;163(5):2387-91
【非特許文献３０】イシカワ（Ishikawa A）ら、「A phase I study of alpha-galactosylceramide (KRN7000)-pulsed dendritic cells in patients with advanced and recurrent non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2005 Mar 1;11(5):1910-7
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【非特許文献３２】岡本美孝ら、「咽頭癌に対する細胞免疫療法並びに重粒子治療の導入」、千葉大学ＣＯＥ報告書、2005 :116-118
【非特許文献３３】フワ（Fuwa N）ら、「A combination therapy of continuous superselective intraarterial carboplatin infusion and radiation therapy for locally advanced head and neck carcinoma」、Cancer 2000 Nov 15;89(10):2099-105
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記事情に鑑み、本発明は、抗腫瘍活性を有する細胞や、抗腫瘍活性を示し得る細胞を活性化する抗原提示細胞などを利用する癌の細胞免疫治療において、抗腫瘍活性を有する細胞を腫瘍組織に効率的に送り込み、そして、より強い抗腫瘍反応を惹起させ得る方法を提供することを目的とする。また、本発明は、細胞免疫治療においてより有効な腫瘍縮小効果を得られる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、α−ガラクトシルセラミドにより活性化せしめたＮＫＴ細胞を腫瘍栄養動脈に注入し、かつ、α−ガラクトシルセラミドで処理した抗原提示細胞を鼻腔粘膜下に輸注することにより、全身的な免疫応答が刺激されるとともにより強い抗腫瘍反応が惹起され、顕著な腫瘍縮小効果が得られることを見出し、本発明を達成した。【００１９】
即ち、本発明は以下に関する。
（１）ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有する抗癌細胞組成物を頭頚部癌の腫瘍栄養動脈に投与し、かつ、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有するＮＫＴ細胞刺激剤を上気道粘膜下に投与することを特徴とする、頭頚部癌の治療方法。
（２）α−ガラクトシルセラミドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有する抗癌細胞組成物を頭頚部癌の腫瘍栄養動脈に投与し、かつ、α−ガラクトシルセラミドで処理された抗原提示細胞を含有するＮＫＴ細胞刺激剤を鼻腔粘膜下に投与することを特徴とする、頭頚部癌の治療方法。
（３）ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする抗癌細胞組成物、および、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有し上気道粘膜下に投与されることを特徴とするＮＫＴ細胞刺激剤の、頭頚部の抗癌治療における使用。
（４）α−ガラクトシルセラミドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする抗癌細胞組成物、および、α−ガラクトシルセラミドで処理された抗原提示細胞を含有し鼻腔粘膜下に投与されることを特徴とするＮＫＴ細胞刺激剤の、頭頚部癌の治療における使用。
（５）ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し、腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする、抗癌細胞組成物と、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有し上気道粘膜下に投与されることを特徴とするＮＫＴ細胞刺激剤とのキット。
（６）α−ガラクトシルセラミドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し、腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする、頭頚部癌の治療剤と、α−ガラクトシルセラミドで処理された抗原提示細胞を含有し鼻腔粘膜下に投与されることを特徴とするＮＫＴ細胞刺激剤とのキット。
（７）ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し、腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする、頭頚部癌治療用抗癌細胞組成物。
（８）α−ガラクトシルセラミドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し、腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする、頭頚部癌治療用抗癌細胞組成物。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ＮＫＴ細胞リガンドによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化されたＮＫＴ細胞を含有する抗癌細胞組成物を腫瘍栄養動脈に注入し、かつ、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有するＮＫＴ細胞刺激剤を上気道粘膜下に輸注することにより、抗腫瘍活性を有する細胞を腫瘍組織に効率的に送り込むとともに、全身的な免疫応答を刺激できる。また、本発明によれば、強い抗腫瘍反応を惹起させることができ、有効な腫瘍縮小効果を得られる。例えば、頭頚部癌のほとんどにおいて、血液供給は末梢動脈、例えば外頚動脈枝などにより提供されているため、本発明による選択的動脈内注入療法を実施でき、有効な瘍縮小効果を得られる。また、本発明に係る薬剤および該薬剤による治療方法は、その副作用が化学療法や放射線療法で認められる副作用と比較して軽度であり、患者への負担が軽減する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】末梢血中のＮＫＴ細胞数およびＮＫ細胞数の変化を示す図である。ＮＫＴ細胞数（ＮＫＴ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ；実線）およびＮＫ細胞数（ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ；点線）はそれぞれ末梢血１ｍＬ中および１μＬ中の細胞数を示す。ｄａｙ０に成分採血（白色矢頭）を、ｄａｙ７および１３にα−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）パルス抗原提示細胞の鼻腔粘膜下への輸注（灰色矢頭）を、ｄａｙ１４に活性化ＮＫＴ細胞の腫瘍栄養動脈への注入（黒色矢頭）を実施した。図中、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．８はそれぞれ症例１〜症例８に対応する。
【図２】末梢血中のαＧａｌＣｅｒ反応性ＩＦＮ−γ産生細胞数の変化を示す図である。α−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）反応性ＩＦＮ−γ産生細胞数の測定はエリスポットアッセイにより行い、該細胞数は５×１０５細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）数で示した。ｄａｙ０に成分採血（白色矢頭）を、ｄａｙ７および１３にαＧａｌＣｅｒパルス抗原提示細胞の鼻腔粘膜下への輸注（灰色矢頭）を、ｄａｙ１４に活性化ＮＫＴ細胞の腫瘍栄養動脈への注入（黒色矢頭）を実施した。図中、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．８はそれぞれ症例１〜症例８に対応する。
【図３】部分奏功が認められた症例の頸部造影コンピューター断層撮影（頸部造影ＣＴ）画像を示す図である。上段、中段および下段の図はそれぞれ症例１、症例２および症例５の画像である。左図は治療前（ｐｒｅ）に撮影した画像であり、右図は観察期間最終日（Ｄａｙ３５）に撮影した画像である。線で囲った領域は腫瘍部分である。太線は最大腫瘍径を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、抗癌細胞組成物を腫瘍栄養動脈に投与し、かつ、ＮＫＴ細胞刺激剤を上気道粘膜下に投与することを特徴とする頭頚部癌の治療方法、抗癌細胞組成物およびＮＫＴ細胞刺激剤の頭頚部の抗癌治療における使用、抗癌細胞組成物とＮＫＴ細胞刺激剤とのキット、並びに抗癌細胞組成物を提供するものである。【００２３】
「抗癌細胞組成物」とは、抗腫瘍活性を有する細胞を有効成分として含有する組成物をいう。抗腫瘍活性とは、腫瘍増殖抑制作用、腫瘍細胞傷害作用および／または腫瘍縮小作用をいう。抗腫瘍活性を有する細胞は、腫瘍を認識し、ＩＦＮ−γなどのサイトカインの産生や、強力な細胞傷害作用により、抗腫瘍活性を示す。抗腫瘍活性を有する細胞として、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＣＴＬを挙げることができ、活性化されたＮＫＴ細胞をより好ましく挙げることができる。抗癌細胞組成物は、その有効成分である抗腫瘍活性を有する細胞の作用により、腫瘍縮小効果をもたらし得るため、癌治療に使用できる。したがって、抗癌細胞組成物という用語は、癌治療用組成物という用語と置換可能に使用される。【００２４】
本発明に係る抗癌細胞組成物は、ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞を含有し、腫瘍栄養動脈に投与されることを特徴とする。「腫瘍栄養動脈」とは、腫瘍細胞が栄養を得ている腫瘍細胞近くの血管をいう。腫瘍栄養動脈は、腫瘍が増殖するのに必要な酸素や栄養を含んだ血液を運んでいる。本抗癌細胞組成物は、腫瘍栄養動脈に投与されることにより、腫瘍組織に極めて効率的に送り込まれ、そして、腫瘍組織において強い抗腫瘍作用を示し、その結果、腫瘍縮小効果をもたらす。例えば、頭頚部癌は主に終末血行支配であり、選択的動脈内注入が可能であるため、本抗癌細胞組成物の腫瘍栄養動脈投与により得られる治療効果が高い。「頭頚部癌」とは、頭頸部領域の悪性腫瘍、例えば鼻・副鼻腔癌、咽頭癌、口腔癌、喉頭癌、甲状腺癌、唾液腺癌などを意味する。腫瘍栄養動脈への抗癌細胞組成物の投与は、慣用の方法により実施でき、例えばカテーテルを用いて実施できる。【００２５】
「ＮＫＴ細胞」とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示された下記の「ＮＫＴ細胞リガンド」を認識する。通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスＮＫＴ細胞（Ｖα１４ＮＫＴ細胞という場合がある）上のＴ細胞受容体のα鎖は、非多型性のＶα１４およびＪα２８１遺伝子セグメントによりコードされており（非特許文献１３；コセキ（Koseki H）ら、「Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor alpha chain in mice」、Proc Natl Acad Sci USA 1991 Sep 1;88(17):7518-22；ランツ（Lantz O）ら、「An invariant T cell receptor alpha chain is used by a unique subset of major histocompatibility class I-specific CD4+ and CD4-8- T cells in mice and humans」、J Exp Med 1994 Sep 1;180(3):1097-106）、β鎖の９０％以上はＶβ８であり、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーが含まれ得る。また、ヒトＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体は、マウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、およびＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。【００２６】
「ＮＫＴ細胞リガンド」とは、ＣＤ１分子上に提示されたときに、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体により特異的に認識され、ＮＫＴ細胞を特異的に活性化させ得る化合物をいう。本発明において使用される「ＮＫＴ細胞リガンド」としては、例えば、α−グリコシルセラミド、イソグロボトリヘキソシルセラミド（ゾウ（Zhou D）ら、「Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells」、Science 2004 Dec 3;306(5702):1786-9）、ＯＣＨ（ミヤモト（Miyamoto K）ら、「A synthetid glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells」、Nature 2001 Oct 4;413(6855):531-4）などを挙げることができる。α−グリコシルセラミドは、ガラクトース、グルコースなどの糖類とセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、国際公開第WO93/05055パンフレット、国際公開第WO94/02168パンフレット、国際公開第WO94/09020パンフレット、国際公開第WO94/24142パンフレット、および国際公開第WO98/44928パンフレット、Science 1997 Nov 28;278(5343):1626-9（非特許文献２１）などに開示されているものを挙げることができる。中でも、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヘキサコサノイルアミノ−１，３，４−オクタデカントリオール（本明細書中、α−ガラクトシルセラミドまたはα−ＧａｌＣｅｒと称する）が好ましい。【００２７】
本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その塩をも含む意味として用いられる。ＮＫＴ細胞リガンドの塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。【００２８】
また、本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その溶媒和物（水和物など）をも含む意味として用いられる。【００２９】
ＮＫＴ細胞としては、任意の哺乳動物由来のものを用いることができる。哺乳動物としては、ヒトおよびヒトを除く哺乳動物を挙げることができる。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類やウサギなどの実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジなどの家畜、イヌ、ネコなどのペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることができる。【００３０】
本発明に係る抗癌細胞組成物に含有されるＮＫＴ細胞の遺伝子型は、特に限定されないが、通常、本発明に係る抗癌細胞組成物が投与される対象と同種同系、同種異系または異種異系であり、好ましくは同種同系または同種異系である。拒絶反応を回避するために、抗原提示細胞は、本発明に係る抗癌細胞組成物が投与される対象と同種同系であることが好ましく、本発明に係る抗癌細胞組成物が投与される対象由来（即ち、自家ＮＫＴ細胞）であることがより好ましい。【００３１】
ＮＫＴ細胞は自体公知の方法によって、上述の哺乳動物の組織（例えばリンパ節、脾臓、末梢血など）から取得することが可能である。例えば、末梢血から比重遠心法により、ＮＫＴ細胞を含む単核球を回収することができる。また、例えば、ＮＫＴ細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法などによりＮＫＴ細胞を単離することができる。ＮＫＴ細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーとして、例えばヒトの場合、Ｖα２４およびＶβ１１を挙げることができる。【００３２】
「ＮＫＴ細胞リガンドでｉｎ  ｖｉｔｒｏにて活性化されたＮＫＴ細胞」とは、ＮＫＴ細胞リガンドを用いて生体外で処理された結果、活性化されたＮＫＴ細胞をいう。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体によりＮＫＴ細胞リガンドを認識して活性化される。【００３３】
「活性化されたＮＫＴ細胞」とは、活性化される前と比較して、サイトカイン類（ＩＦＮ−γやＩＬ−４など）の産生やパーフォリン／グランザイムＢを介した強力な細胞傷害作用が増強されたＮＫＴ細胞をいう。活性化されたＮＫＴ細胞は強い抗腫瘍活性を示す。【００３４】
ＮＫＴ細胞リガンドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＫＴ細胞の活性化は、ＮＫＴ細胞リガンドをＮＫＴ細胞へ接触させる処理により達成することができる。例えばＮＫＴ細胞リガンドを含有する生理的な培養液中でＮＫＴ細胞が培養される。また、例えばＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞と共に生理的な培養液中でＮＫＴ細胞が培養される。あるいは、例えばＮＫＴ細胞リガンドを含有する生理的な培養液中でＮＫＴ細胞が培養された後に、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞と共に、培養されたＮＫＴ細胞がさらに培養される。ＮＫＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化において用いる抗原提示細胞は、ＮＫＴ細胞リガンドで処理され、さらに放射線照射処理などにより増殖を抑制されたものであることが好ましい。ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞は、後述する方法で調整することができる。培養液中のＮＫＴ細胞リガンドの濃度は、ＮＫＴ細胞リガンドの種類により適宜設定することが可能であるが、例えば、１〜１００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜２００ｎｇ／ｍｌである。培養液としては、例えば、適切な添加物（血清、アルブミン、緩衝剤、アミノ酸など）を含んでいてもよい基礎培地（最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、ＡＩＭ−Ｖ培地）などを挙げることができる。培養液中には、ＮＫＴ細胞の増殖を促進させることを目的としてインターロイキン２（ＩＬ−２）を含ませることが好ましい。培養液中のＩＬ−２の濃度は、適宜設定することが可能であるが、例えば１０〜１０００ＪＲＵ（国内標準単位）／ｍｌ、好ましくは１０〜２００ＪＲＵ／ｍｌ、より好ましくは２０〜２００ＪＲＵ／ｍｌである。培養液のｐＨは通常約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃であり、培養時間は通常４〜１４日間、好ましくは６〜１４日間である。さらに、培養後に活性化ＮＫＴ細胞を、ＮＫＴ細胞リガンドを含まない培養液や生理的な水溶液で洗浄して使用することが好ましい。【００３５】
ＮＫＴ細胞リガンドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＫＴ細胞の活性化は、また、ＮＫＴ細胞リガンドを、ＮＫＴ細胞を含有する複数種類の細胞を含む細胞集団へ接触させる処理により達成することができる。ＮＫＴ細胞を含有する複数種類の細胞を含む細胞集団として、末梢血から調製した単核球を例示できる。末梢血から調製した単核球には、ＮＫＴ細胞の他、Ｔ細胞やＮＫ細胞などが含まれる。ＮＫＴ細胞リガンドをこのような細胞集団に接触させる処理は、ＮＫＴ細胞リガンドをＮＫＴ細胞に接触させる上記処理と同様の方法および条件で実施できる。このようにして得られた活性化ＮＫＴ細胞を含有する複数種類の細胞を含む細胞集団を、活性化ＮＫＴ細胞として本発明において使用することができる。【００３６】
本発明に係る抗癌細胞組成物は、活性化されたＮＫＴ細胞を有効成分として含有する他に、ＮＫＴ細胞以外の細胞、例えばＮＫ細胞やＴ細胞を含有することができる。また、本抗癌細胞組成物は、活性化されたＮＫＴ細胞を任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、本抗癌細胞組成物は、有効量の有効成分を薬理学的に許容される一種若しくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。薬理学的に許容される担体は種々の物質が知られており、それらから適宜選択して使用されるが、緩衝液や、各種塩、血清、アルブミン、アミノ酸などの添加物を例示できる。【００３７】
本発明に係る抗癌細胞組成物は、通常は、注射剤や点滴剤などの剤型で提供される。本抗癌細胞組成物は好ましくは、受容者の体液（血液など）と等張な滅菌水性担体中に活性化ＮＫＴ細胞が懸濁された懸濁液である。該水性担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などを挙げることができる。これらの水性担体には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤などを添加することもできる。【００３８】
本発明に係る抗癌細胞組成物中に含まれる活性化されたＮＫＴ細胞の濃度は、通常、約１×１０５〜１×１０１０個／ｍｌ、好ましくは約２×１０５〜１×１０９個／ｍｌの範囲であるが、特に限定されない。細胞濃度が低すぎると、投与に時間がかかるため患者への負担が増大し、細胞濃度が高すぎると、細胞同士が凝集してしまう可能性がある。【００３９】
本発明に係る抗癌細胞組成物の投与量は、投与形態、患者の年齢、体重、疾患の種類、疾患の重篤度、ＮＫＴ細胞リガンドの種類などにより異なるが、通常、１回の投与につき、活性化されたＮＫＴ細胞の数として、通常１×１０６〜１×１０９個、好ましくは１×１０７〜１×１０９個の用量で投与される。しかしながら、これら投与量に関しては、前述の種々の条件により変動する。【００４０】
一方、「ＮＫＴ細胞刺激剤」とは、ＮＫＴ細胞を刺激して活性化させ、ＮＫＴ細胞からのサイトカイン類（ＩＦＮ−γやＩＬ−４など）の産生や、パーフォリン／グランザイムＢを介したＮＫＴ細胞の細胞傷害作用を増強させる薬剤をいう。【００４１】
本発明に係る「ＮＫＴ細胞刺激剤」は、ＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞を含有し、上気道粘膜下に投与されることを特徴とする。上気道粘膜下に投与することにより、少ない数のＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞により、極めて効率的にＮＫＴ細胞を刺激し、インターフェロンγ産生を誘導し、免疫反応を刺激し得る。また、上気道粘膜下にＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を投与することにより、頸部リンパ節内に選択的にＮＫＴ細胞を誘導することができる。「上気道粘膜」とは、鼻腔から気管に至る上気道（鼻腔、咽頭、扁桃、喉頭、気管など）の表面に存在する粘膜をいう。鼻腔粘膜には免疫担当細胞や血管が豊富に存在するため、本ＮＫＴ細胞刺激剤は、好ましくは鼻腔粘膜下に投与される。鼻腔粘膜は、上・中・下鼻甲介粘膜、上・中・下鼻道粘膜、鼻中隔粘膜などからなるが、免疫担当細胞が豊富に存在し、且つ、投与が容易であることから、本ＮＫＴ細胞刺激剤は、より好ましくは下鼻甲介粘膜下に、更に好ましくは下鼻甲介粘膜前方粘膜下に投与される。ここで「粘膜下投与」とは、有効成分を粘膜上皮下の固有層内に注入することをいう。【００４２】
「抗原提示細胞」とは、抗原をリンパ球に提示してリンパ球の活性化を促す細胞をいう。通常、抗原提示細胞は、Ｔ細胞やＮＫＴ細胞に抗原を提示し得る樹状細胞またはマクロファージである。特に、樹状細胞は、強力な抗原提示能力を有しており、細胞表面上に発現されたＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩ、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩ様分子（ＣＤ１など）、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩＩなどを介して抗原を提示し、Ｔ細胞またはＮＫＴ細胞を活性化させ得るので、本発明に好ましく用いられる。本発明において、抗原提示細胞は、ＮＫＴ細胞リガンドをＮＫＴ細胞に確実に提示し得るように、ＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）発現細胞であることが好ましい。【００４３】
抗原提示細胞としては、任意の哺乳動物由来のものを用いることができる。哺乳動物としては、ヒトおよびヒトを除く哺乳動物を挙げることができる。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類やウサギなどの実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジなどの家畜、イヌ、ネコなどのペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることができる。【００４４】
本発明に係る「ＮＫＴ細胞刺激剤」に含有される抗原提示細胞の遺伝子型は、特に限定されないが、通常、本ＮＫＴ細胞刺激剤が投与される対象と同種同系、同種異系または異種異系であり、好ましくは同種同系または同種異系である。拒絶反応を回避するために、抗原提示細胞は、本ＮＫＴ細胞刺激剤が投与される対象と同種同系であることが好ましく、本ＮＫＴ細胞刺激剤が投与される対象由来（即ち、自家樹状細胞）であることがより好ましい。【００４５】
抗原提示細胞は自体公知の方法によって、上述の哺乳動物の組織（例えばリンパ節、脾臓、末梢血など）から単離することが可能である。例えば抗原提示細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法などにより樹状細胞を単離することができる。抗原提示細胞として樹状細胞を単離する場合には、樹状細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーとして、例えば、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩ、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩ様分子（ＣＤ１など）、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩＩ、ＣＤ８α、ＣＤ８５ｋ、ＣＤ８６、ＦＤＬ−Ｍ１、ＤＥＣ−２０５などを挙げることができる。【００４６】
また、抗原提示細胞は、上述の哺乳動物の骨髄細胞や単核球などを適切な抗原提示細胞分化条件で培養することにより製造することもできる。例えば、骨髄細胞は顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、場合によっては更にＩＬ−４）の存在下で約６日間程度培養されることにより、樹状細胞（骨髄由来樹状細胞：ＢＭＤＣ）へと分化する（ヘンミ（Hemmi H）ら、「A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA」、Nature 2000 Dec 7;408(6813):740-5）。また、末梢血液中の単核球（特に単球、マクロファージなど）をＧＭ−ＣＳＦ（場合によっては更にＩＬ−２および／またはＩＬ−４）の存在下で培養することにより、樹状細胞を得ることができる（モトハシ（Motohasi S）ら、「Preserved IFN-alpha production of circulating Valpha24 NKT cells in primary lung cancer patients」、Int J Cancer 2002 Nov.10;102(2):159-65. Erratum in :Int J Cancer 2003 May 10;104(6):799）。【００４７】
ＮＫＴ細胞リガンドで抗原提示細胞を処理することにより、抗原提示細胞にＮＫＴ細胞リガンドがパルスされる。「抗原提示細胞にＮＫＴ細胞リガンドがパルスされる」とは、ＮＫＴ細胞リガンドが抗原提示細胞表面に、該リガンドがＮＫＴ細胞へ提示され得るように、配置されることをいう。より具体的には、ＮＫＴ細胞リガンドが、抗原提示細胞表面に発現されたＣＤ１分子上に提示されることを意味する。ＮＫＴ細胞リガンドによる抗原提示細胞の処理は、ＮＫＴ細胞リガンドを抗原提示細胞へ接触させることにより達成することができる。例えばＮＫＴ細胞リガンドを含有する生理的な培養液中で抗原提示細胞が培養される。この場合、培養液中のＮＫＴ細胞リガンドの濃度は、ＮＫＴ細胞リガンドの種類により適宜設定することが可能であるが、例えば、１〜１００００ｎｇ／ｍｌ好ましくは１０〜１０００ｎｇ／ｍｌである。また、培養液としては、例えば、適切な添加物（血清、アルブミン、緩衝剤、アミノ酸など）を含んでいてもよい基礎培地（最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、ＡＩＭ−Ｖ培地）などを挙げることができる。培養液のｐＨは通常約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃であり、培養時間は通常４〜１４日間、好ましくは６〜１４日間である。更に、培養後に抗原提示細胞を、ＮＫＴ細胞リガンドを含まない培養液や生理的な水溶液で洗浄し、フリーのＮＫＴ細胞リガンドを除去することにより、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞が単離される。【００４８】
本発明に係るＮＫＴ細胞刺激剤は、有効成分としてＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、本ＮＫＴ細胞刺激剤は、有効量の有効成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。【００４９】
本発明に係るＮＫＴ細胞刺激剤は、通常は、注射剤や点滴剤などの剤型で提供される。本ＮＫＴ細胞刺激剤は、受容者の体液（血液など）と等張な滅菌水性担体中にＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞が懸濁された懸濁液である。該水性担体としては、生理食塩水、ＰＢＳなどを挙げることができる。これらの水性担体には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤などを添加することもできる。【００５０】
本発明に係るＮＫＴ細胞刺激剤中に含まれるＮＫＴ細胞リガンドで処理された抗原提示細胞の濃度は、通常、約１×１０５〜１×１０１０個／ｍｌ、好ましくは約２×１０５〜１×１０９個／ｍｌの範囲であるが、特に限定されない。細胞濃度が低すぎると、投与に時間がかかるため患者への負担が増大し、細胞濃度が高すぎると、細胞同士が凝集してしまう可能性がある。【００５１】
本発明に係るＮＫＴ細胞刺激剤の投与量は、投与形態、患者の年齢、体重、疾患の種類、疾患の重篤度、ＮＫＴ細胞リガンドの種類などにより異なるが、通常、１回の投与につき、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞の数として、通常１×１０６〜１×１０９個／ｍ２、好ましくは１×１０７〜１×１０９個／ｍ２の用量で投与される。しかしながら、これら投与量に関しては、前述の種々の条件により変動する。【００５２】
本発明に係る抗癌細胞組成物およびＮＫＴ細胞刺激剤は副作用が軽度で安全であり、任意の哺乳動物に投与することが出来る。哺乳動物としては、上述の哺乳動物を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはヒトである。【００５３】
本発明に係る抗癌細胞組成物の腫瘍栄養動脈内投与とＮＫＴ細胞刺激剤の上皮粘膜下投与とは、組み合わせて実施される。抗癌細胞組成物の投与とＮＫＴ細胞刺激剤の投与とは、同時または同日に行うことができるし、あるいは、別々の日に行うことができる。好ましくはＮＫＴ細胞刺激剤の単回または複数回の投与後に、抗癌細胞組成物の投与を単回または複数回行うことが適当である。また、抗癌細胞組成物の投与とＮＫＴ細胞刺激剤の投与との組み合わせを治療の１クールとして、このような治療を複数回繰り返して行うことができる。具体的な投与例として、ＮＫＴ細胞刺激剤を投与し、その７日目にＮＫＴ細胞刺激剤を再度投与し、２回目のＮＫＴ細胞刺激剤の投与の翌日に抗癌細胞組成物を投与するといった投与方法が挙げられる。投与回数、投与間隔、治療回数は、患者の年齢、体重、疾患の種類、疾患の重篤度などにより適宜変更することができる。【００５４】
本発明に係る抗癌細胞組成物の腫瘍栄養動脈内投与によれば、腫瘍組織に極めて効率的に活性化ＮＫＴ細胞を送り込み、そして、腫瘍組織において強い抗腫瘍反応を惹起し、その結果、腫瘍縮小効果を得ることができる。また、本発明に係るＮＫＴ細胞刺激剤の上皮粘膜下投与によれば、頸部リンパ節内に選択的にＮＫＴ細胞を誘導することができる。この選択性は厳格であって、樹状細胞が投与される上気道粘膜の部位と同じ側（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ）の頸部リンパ節内に選択的にＮＫＴ細胞が誘導される。例えば、右側の鼻腔粘膜下にＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞を投与すると、右側の頸部リンパ節に選択的にＮＫＴ細胞が誘導される。リガンドによって活性化されたＮＫＴ細胞は、迅速に大量のＩＦＮ−γとＩＬ−４を産生し、パーフォリン／グランザイムＢを介した強力な細胞傷害活性を発揮し、さらにその後さまざまな免疫反応を誘起し、その結果として強い抗腫瘍作用が発揮されるというユニークな作用機構を有することが報告されている（非特許文献２３、非特許文献２４および非特許文献２５）。したがって、本抗癌細胞組成物の腫瘍栄養動脈内投与と本ＮＫＴ細胞刺激剤の上皮粘膜下投与により、抗腫瘍活性を有する細胞を腫瘍組織に効率的に送り込むとともに、全身的な免疫応答を刺激できる。また、本発明によれば、強い抗腫瘍反応を惹起させることができ、有効な腫瘍縮小効果を得られる。例えば、頭頸部癌のほとんどにおいて、血液供給は末梢動脈、例えば外頚動脈枝などにより提供されているため、本発明による選択的動脈内注入療法を実施でき、有効な腫瘍縮小効果を得られる。【００５５】
このように、本発明に係る抗癌細胞組成物の腫瘍栄養動脈内投与とＮＫＴ細胞刺激剤の上皮粘膜下投与とを組み合わせて実施することにより、それぞれ単独で実施した場合よりも、より強力な免疫応答および抗腫瘍反応を誘導することができ、さらには有効な腫瘍縮小効果を得られる。したがって、本発明に係る抗癌細胞組成物の腫瘍栄養動脈内投与とＮＫＴ細胞刺激剤の上皮粘膜下投与とを組み合わせて実施することにより、癌疾患、例えば頭頚部癌を予防および／または治療し得る。【００５６】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。実施例における試験は、試験内容を対象患者に十分説明し、試験への参加について文書による同意を得てから実施した。
【実施例１】
【００５７】
頭頸部癌患者を対象とし、活性化ＮＫＴ細胞の腫瘍栄養動脈内投与およびα−ＧａｌＣｅｒで処理した抗原提示細胞の鼻粘膜下投与を実施した。５週間にわたる試験期間のうち、患者からの採血日をｄａｙ０として、ｄａｙ７およびｄａｙ１３にα−ＧａｌＣｅｒで処理した抗原提示細胞の投与を行い、ｄａｙ１４に活性化ＮＫＴ細胞の投与を行った。【００５８】
（対象症例）
以下の基準を満たす頭頸部癌患者が選択された。【００５９】
選択規準；
１．頭頸部癌局所再発症例既存治療の終了後または治療拒否症例
２．扁平上皮癌の組織学的確定診断が得られた症例で、６ヶ月以上の生存が期待される症例
３．測定可能病変を有する症例
４．年齢：同意取得時の年齢が２０〜８０歳の症例
５．パフォーマンスステータス（東部共同腫瘍学グループ（ＥＣＯＧ）により定義された全身状態の指標）：０〜２
６．以下の検査データを満たす症例（登録前４週間以内の測定結果）
白血球数≧３，０００／μＬ、血小板数≧７５，０００／μＬ、血清クレアチン≦１．５  ｍｇ／ｄＬ、総ビリルビン≦１．５  ｍｇ／ｄＬ、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）  ≦２．５×基準値上限
７．本人からの文書による同意が得られている症例
８．末梢血にＮＫＴ細胞が存在する症例（１０個以上／末梢血１ｍｌ）
９．局所再発症例では、ＮＫＴ細胞増殖試験で１００倍以上増殖可能な症例【００６０】
除外規準；
１．本臨床研究に参加する４週前以内に、手術療法、化学療法あるいは放射線療法を施行している症例
２．コントロール不能の糖尿病、間質性肺炎、治療を要する胸水、腹水、心嚢水貯留
３．肝炎の既往がある症例
４．治療を要する感染症を有する症例
５．ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体またはＨＴＬＶ−１抗体が陽性の症例
６．同時性重複癌症例
７．重篤な心疾患症例、具体的にはＮＹＨＡ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）心機能分類でＣｌａｓｓ  ＩＩＩ以上）
８．アルブミン過敏症の既往を有する症例
９．コルチコステロイドを内服または注射している症例
１０．妊娠あるいは妊娠の可能性のある女性および授乳期の女性
１１．自己免疫疾患を有する症例
１２．成分採血禁忌症例（不安定狭心症、房室ブロック（Ａ−Ｖ  ｂｌｏｃｋ）  ＩＩ度以上、ＷＰＷ（Ｗｏｌｆｆ−Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ）症候群、完全左脚ブロック、収縮期血圧９０以下もしくは１７０ｍｍＨｇ以上）
１３．担当医が本臨床研究への参加を不適当と判断した症例【００６１】
選択された症例の背景を表１に示す。【００６２】
【表１】
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【００６３】
（方法）
活性化ＮＫＴ細胞の調製
患者から成分採血を行い、末梢血単核球を採取した。末梢血からの単核球の回収は、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）溶液を用いて遠心分離処理することにより行った。回収した単核球の一部を培養し、残りの単核球は凍結保存した。分離した単核球に、１００ＪＲＵ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｉｍｕｎａｃｅ、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ社製）および１００ｎｇ／ｍｌ  αＧａｌＣｅｒ（ＫＲＮ７０００、Ｋｉｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａ社製）を添加し、５％  プラズマネートカッター添加ＡＩＭ−Ｖ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中で培養した。１週間培養後、凍結保存しておいた単核球をαＧａｌＣｅｒで処理して放射線照射したものを抗原提示細胞として用いて、上記培養細胞に再刺激を加えた。計１４日間培養し、活性化ＮＫＴ細胞を含む細胞調製品として用いた。培養終了後、培養細胞を回収し、２．５％  アルブミン加生理食塩水により３回洗浄した後、２．５％  アルブミン加生理食塩水１００ｍｌに懸濁した。最終検査（細胞数、生存率、エンドトキシンの測定）を実施し、合格した細胞調製品を同一患者への投与に用いた。【００６４】
α−ＧａｌＣｅｒパルス抗原提示細胞の調製
活性化ＮＫＴ細胞の調製のために採取した末梢血から回収した単核球の一部を、８００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（ＧｅｎｅＴｅｃｈ社製）および１００ＪＲＵ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｉｍｕｎａｃｅ、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ社製）および５％  自己血清を含有するＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で７〜１４日間培養した。投与前日に１００ｎｇ／ｍｌ  α−ＧａｌＣｅｒ（ＫＲＮ７０００、Ｋｉｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａ）を加えて１日間培養しα−ＧａｌＣｅｒパルス抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）とした。細胞を洗浄後、２．５％  アルブミン加生理食塩水に懸濁し同一患者への投与に用いた。【００６５】
活性化ＮＫＴ細胞の投与経路および用量
５週間にわたる試験期間のうち、患者からの採血日をｄａｙ０として、ｄａｙ１４に活性化ＮＫＴ細胞を投与した。投与前日に、培養細胞中のＮＫＴ細胞の割合を、フローサイトメトリーにより算出した。投与する細胞は、ＮＫＴ細胞換算で５×１０７個に調整し、２．５％アルブミン加生理食塩水１００ｍｌに懸濁した。血管造影にて患者の腫瘍栄養動脈を同定し、細胞調製品を注入した。【００６６】
活性化ＮＫＴ細胞を含む細胞調製品中の活性化ＮＫＴ細胞の割合は、細胞表面上のＶα２４およびＶβ１１の発現をフローサイトメトリーで解析することにより算出した。また、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞（ＮＫ細胞）およびＣＤ３＋細胞（ＮＫＴ細胞およびＴ細胞を含む）の割合をフローサイトメトリーによる解析で算出した。その結果を表２に示す。【００６７】
【表２】
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【００６８】
α−ＧａｌＣｅｒパルス抗原提示細胞の投与経路および用量
５週間にわたる試験期間のうち、患者からの採血日をｄａｙ０として、ｄａｙ７およびｄａｙ１３に、α−ＧａｌＣｅｒパルス抗原提示細胞を鼻腔粘膜下に投与した。α−ＧａｌＣｅｒパルス抗原提示細胞は、２．５％  アルブミン加生理食塩水に浮遊し（約０．２ｍｌ）、患者の下鼻甲介の基部粘膜下に輸注した。抗原提示細胞投与量は、１×１０８個／ｍ２とした。【００６９】
（評価項目）
ＮＫＴ細胞数評価
投与前後５週間にわたり毎週採血を行い、末梢血ＮＫＴ細胞の増減を評価した。該評価は下記抗体を用いたフローサイトメトリーにより行った。ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞をＮＫＴ細胞とした。末梢血１ｍｌあたりのＮＫＴ細胞数を測定し、経時的に比較した。また、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞をＮＫ細胞とし、コントロールとしてＮＫ細胞数を経時的に測定した。
抗ヒトＶα２４マウスモノクローナル抗体（Ｃ１５、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）
抗ヒトＶβ１１マウスモノクローナル抗体（Ｃ２１、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）
抗ヒトＣＤ３マウスモノクローナル抗体（ＵＣＴＨ１、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）
抗ヒトＣＤ５６マウスモノクローナル抗体（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）【００７０】
ＮＫＴ細胞機能評価
投与前後５週間にわたり毎週採血を行い、末梢血単核球を分離し凍結保存した。６週目に細胞を解凍し、α−ＧａｌＣｅｒに反応してＩＦＮ−γを産生する細胞（α−ＧａｌＣｅｒ反応性ＩＦＮ−γ産生細胞）の頻度をエリスポット法で測定した。エリスポットアッセイは、キット（ＭＡＢＴＥＣＨ社製）およびニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、製造者の指示書に従い行った。細胞は、１００ｎｇ／ｍｌ  α−ＧａｌＣｅｒを含む無血清ＡＩＭ−Ｖ培地中で１８時間培養することにより刺激した。発色はＢＣＩＰ／ＮＢＴシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。スポットのカウントはコンピューター画像解析によって客観的に計測した。【００７１】
腫瘍縮小効果
治療前と観察期間最終日に頸部造影コンピューター断層撮影（頸部造影ＣＴ）を行い、最大腫瘍径を測定した。両者を比較して、治療に伴う腫瘍縮小効果を判定した。【００７２】
（結果）
末梢血ＮＫＴ細胞の応答
１）数量変化
末梢血１ｍＬ中のＮＫＴ細胞数およびＮＫ細胞数の変化を図１に示す。８症例のうち、４症例（Ｎｏ．２、３、５および７）で末梢血ＮＫＴ細胞の増加（それぞれ１．７倍、２．８倍、１．５倍および１．６倍）が認められ、また３症例（Ｎｏ．４、６および８）で著しい増加（それぞれ６倍、１５倍および３．３倍）が認められた。いずれの症例でも末梢血ＮＫ細胞数の明らかな増加は認められなかった。
２）機能変化
末梢血中のαＧａｌＣｅｒ反応性ＩＦＮ−γ産生細胞数の変化を図２に示す。８症例のうち、２症例（Ｎｏ．２および４）でαＧａｌＣｅｒ反応性ＩＦＮ−γ産生細胞数の増加（それぞれ２．７倍および１．８倍）が認められ、また５症例（Ｎｏ．３、５、６、７および８）で著しい増加（それぞれ６．３倍、４．１倍、３．６倍、３．７倍および４．９倍）が認められた。【００７３】
臨床効果
臨床効果および副作用を表３に示す。８症例のうち、３症例（Ｎｏ．１、２および５）で部分奏功が認められ、また４症例で疾患の安定が認められた。部分奏功が認められた３症例について、治療前と観察期間最終日に撮影した頸部造影ＣＴの画像を図３に示し、また、該画像に基づいて測定した最大腫瘍径の実測値および治療前の最大腫瘍径に対する観察期間最終日の最大腫瘍径の割合を表４に示す。これら３症例においては、最大腫瘍径の著しい減少が認められた。副作用は、ナショナルキャンサーインスティテュート公表の有害事象共通用語基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ：ＣＴＣＡＥ）第３版においてグレード３に相当する有害事象が１症例で認められたが、他の症例では重篤な副作用は認められなかった。【００７４】
【表３】
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【００７５】
【表４】
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【００７６】
部分奏功がみとめられた３症例についてより詳しく説明する。【００７７】
症例１：６１歳  女性  下咽頭癌（Ｔ３Ｎ２ｂＭ０）の再発例
活性化ＮＫＴ細胞のプロファイル
投与した活性化ＮＫＴ細胞のプロファイルとして、細胞表面上のＶα２４およびＶβ１１の発現をフローサイトメトリーにより解析したところ、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞の割合は１０％であった（表２）。
末梢血ＮＫＴ細胞の応答
１）数量変化
末梢血１ｍＬ中のＮＫＴ細胞数およびＮＫ細胞数の明らかな増加は認められなかった（図１のＮｏ．１）。
２）機能変化
末梢血中のαＧａｌＣｅｒ反応性ＩＦＮ−γ産生細胞数の明らかな増加は認められなかった（図２のＮｏ．１）。
腫瘍縮小効果
腫瘍は中心部から壊死を起こし、腫瘍最大径は治療前の４８％に減少した（図３および表４のＮｏ．１）。【００７８】
症例２：６７歳  男性  喉頭癌（Ｔ４Ｎ２ｃＭ０）の再発例
活性化ＮＫＴ細胞のプロファイル
投与した活性化ＮＫＴ細胞のプロファイルとして、細胞表面上のＶα２４およびＶβ１１の発現をフローサイトメトリーにより解析したところ、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞の割合は０．５９％であった（表２）。
末梢血ＮＫＴ細胞の応答
１）数量変化
末梢血１ｍＬ中のＮＫＴ細胞数は１．７倍に増加したが、ＮＫ細胞の増加は認められなかった（図１のＮｏ．２）。
２）機能変化
末梢血中のαＧａｌＣｅｒ反応性ＩＦＮ−γ産生細胞数は２．７倍に増加した（図２のＮｏ．２）。
腫瘍縮小効果
腫瘍は中心部から壊死を起こし、腫瘍最大径は治療前の６５％に減少した（図３および表４のＮｏ．２）。【００７９】
症例５：３８歳  女性  舌癌（Ｔ２Ｎ２ｂＭ０）の再発例
活性化ＮＫＴ細胞のプロファイル
投与した活性化ＮＫＴ細胞のプロファイルとして、細胞表面上のＶα２４およびＶβ１１の発現をフローサイトメトリーにより解析したところ、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞の割合は４４％であった（表２）。
末梢血ＮＫＴ細胞の応答
１）数量変化
末梢血１ｍＬ中のＮＫＴ細胞数は１．５倍に、ＮＫ細胞は１．９倍に増加した（図１のＮｏ．５）。
２）機能変化
末梢血中のαＧａｌＣｅｒ反応性ＩＦＮ−γ産生細胞数は４．１倍に増加した（図２のＮｏ．５）。
腫瘍縮小効果
腫瘍は中心部から壊死を起こし、腫瘍最大径は治療前の６５％に減少した（図３および表４のＮｏ．５）。【００８０】
これまで、肺癌に対して活性化ＮＫＴ細胞の静注療法が行われてきたが、明らかな腫瘍縮小効果は認められなかった（非特許文献２８）。【００８１】
これに対して、今回、頭頸部癌が主に終末血行支配であり、選択的動注が可能である、という特徴を生かし、活性化ＮＫＴ細胞を腫瘍栄養動脈に投与したところ、８例中３例に明らかな腫瘍縮小効果を認めた。【００８２】
以上の結果より、活性化ＮＫＴ細胞を腫瘍栄養動脈に投与し、かつ、ＮＫＴ細胞リガンドパルス抗原提示細胞を上気道粘膜下に投与することにより、腫瘍縮小効果が得られることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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