(57)【要約】肺腺がん患者において特異的に発現量が変化するタンパク質を同定することで、感度及び／又は特異度に優れた肺腺がん患者への手術後の予後を推定する。  肺腺がん患者から採取した生体由来試料における、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量を測定するステップａと、測定の結果、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量に基づいて予後を予測又は判定するステップｂとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺腺がん患者から採取した生体由来試料における、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量を測定するステップａと、
測定の結果、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量に基づいて予後を予測又は判定するステップｂと、
を含む手術後の予後を推定する方法。
【請求項２】
前記ステップａでは、表１のＰＥＰＴＩＤＥ＿ＳＥＱの欄に挙げたアミノ酸配列を有するペプチド群から選ばれる少なくとも１以上のペプチドの発現量を測定することを特徴とする請求項１記載の予後を推定する方法。
【表１】
2009051277.tif 000009
【請求項３】
前記ステップａでは、モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的染色法によって、上記ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量を測定することを特徴とする請求項１記載の予後を推定する方法。
【請求項４】
前記ステップａでは、モノクローナル抗体を固定した支持体に、前記肺腺がん患者から採取した生体由来試料からの抽出物を接触させることによって、上記ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量を測定することを特徴とする請求項１記載の予後を推定する方法。
【請求項５】
肺腺がん患者が病理組織診断にてＩ期と診断された早期肺腺がん患者である請求項１乃至４いずれか一項記載の予後を推定する方法。
【請求項６】
ミオシンＩＩＡと特異的に結合する抗体及び／又はビメンチンと特異的に結合する抗体を少なくとも１以上含む、肺腺がん患者の予後を推定する検査キット。
【請求項７】
上記抗体は、表２のＰＥＰＴＩＤＥ＿ＳＥＱの欄に挙げたアミノ酸配列を有するペプチド群から選ばれるペプチドと特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項６記載の検査キット。
【表２】
2009051277.tif 000010
【請求項８】
上記抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６記載の検査キット。
【請求項９】
上記抗体は支持体に固定されていることを特徴とする請求項６記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺腺がん患者の手術後の予後を推定する方法と、これらの診断を行うための診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、様々な治療法の改良にもかかわらず、日本を含む殆どの先進諸国において、肺がんによる死亡はがん死の第１位を占めている。さらに、肺癌の早期発見の機会が増えているにも拘わらず、日本において毎年約６０，０００人の肺がん患者が死亡している。手術療法施行後の肺癌患者の主な死亡原因は遠隔転移である。非小細胞肺癌患者における肺内転移を含む遠隔転移は、しばしば、外科的切除だけを行った患者に起こる。なぜならば、このような患者の場合、微小転移巣が、外科的切除の時点で既に存在するからである。微小転移再発を抑える目的で行う術後補助化学療法は、非小細胞肺癌患者における予後の改善を妨げるものではないにも拘わらず、根治手術をおこなった非小細胞肺癌患者に対する術後補助化学療法の効果については、１９８０年代からよく議論されてきた。２００３年においても、術後補助化学療法の効果は、有効性が証明されていなかった（Ｓｃａｇｌｉｏｔｔｉ  ＧＶ，Ｆｒｏｓｓａｔｉ  Ｒ，Ｔｏｒｒｉ  Ｖ，Ｃｒｉｎｏ  Ｌ，Ｇｉａｃｃｏｎｅ  Ｇ，Ｓｉｌｖａｎｏ  Ｇ，Ｍａｒｔｅｌｌｉ  Ｍ，Ｃｌｅｒｉｃｉ  Ｍ，Ｃｏｇｎｅｔｔｉ  Ｆ，Ｔｏｎａｔｏ  Ｍ．，Ｊ  Ｎａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（２００３）９５：１４５３−１４６１）。２００４年になり、術後補助化学療法の効果について幾つかの報告がなされ、その有効性を示すデータが示された（Ｗｉｎｔｏｎ  Ｔ，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  Ｒ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｄ，Ｒｉｇａｓ  Ｊ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｍ，Ｂｕｔｔｓ  Ｃ，Ｃｏｒｍｉｅｒ  Ｙ，（２００５）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５２：２５８９−２５９７，Ｓｔｒａｕｓｓ  ＧＭ，Ｈｅｒｎｄｏｎ  Ｊ，Ｍａｄｄａｕｓ  ＭＡ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ＤＷ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＥＡ，Ｗａｔｓｏｎ  ＤＭ，Ｓｕｇａｒｂａｋｅｒ  ＤＪ，Ｓｃｈｉｌｓｋｙ  ＲＬ，Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ．，（２００４）Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：６２１，Ａｒｒｉａｇａｄａ  Ｒ，Ｂｅｒｇｍａｎ  Ｂ，Ｄｕｎａｎｔ  Ａ，Ｌｅ  Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  Ｔ，Ｐｉｇｎｏｎ  ＪＰ，Ｖａｎｓｔｅｅｎｋｉｓｔｅ  Ｊ．，（２００４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：３５１−３６０）。
Ｉ期の原発性肺腺がん患者においても２００４年に、経口テガフール・ウラシル（モル比４：１の合剤、以下ＵＦＴ）による術後補助化学療法によって、手術単独の患者よりも予後の改善が認められたことが報告された（Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  Ｙ，Ｏｈｔａ  Ｍ，Ｈａｔａ  Ｅ，Ｔｓｕｂｏｔａ  Ｎ，Ｔａｄａ  Ｈ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｙ，Ｗａｄａ  Ｈ，Ｔｓｕｂｏｉ  Ｍ，Ｈａｍａｊｉｍａ  Ｎ，Ｏｈｔａ  Ｍ．，（２００４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：１７１３−１７２１）。しかしながら、経口テガフール・ウラシルによる術後補助化学療法によって予後の改善が見込まれるのは、わずか１５％のＩＢ期の原発性肺腺がん患者である。したがって、分子生物学的な観点に基づいて、術後化学療法の患者予後を合理的・客観的に予測・判定できるバイオマーカーが見出されれば、その有用性は大きいと考えられる。
従来、薬効関連マーカーを同定する手法としては、免疫生化学的同定法と呼ばれる方法が知れている。近年、ポストゲノム研究の一環として、病態プロテオミクスと呼ばれるアプローチ、すなわち実際に発現しているタンパク質を一斉に包括的に分析し、そこから疾患のマーカータンパク質を探索する方法が注目されている。この病態プロテオミクス・アプローチとしては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いる方法や液体クロマトグラフィーイオントラップ型質量分析計を用いる方法を挙げることができる。
しかしながら、健常者由来の生体試料と患者由来の生体試料とにおけるタンパク質の発現パターンを比較するといった疾患病態解析のように、多くの因子の変動が予想され、しかもそれぞれの変動量が微細で、個体差や測定誤差などに紛れそうな場合には、上述した従来の病態プロテオミクス・アプローチでは十分な分析能を発揮できない。
そこで、本発明者らは、下記特許文献１にて病態プロテオミクス解析を可能とする、優れた分析能を達成する試料解析方法及び試料解析プログラムを報告し、またそれを利用して完成させた「肺腺癌リンパ節転移診断方法及び診断キット」（特許文献２）をも報告している。
非筋型ミオシンＩＩＡは、アクトミオシン細胞骨格の主要構成要素であり、通常、細胞遊走の間、細胞の後側の収縮に関与することが知られている。細胞の突起は、ミオシンＩＩＡとは独立し、フィラメントアクチンの重合によって調節されていると考えられていたが、近年、非がん細胞において、細胞遊走に関連した細胞の突起にミオシンＩＩＡが関与することが報告された。しかしながら、細胞遊走におけるミオシンＩＩＡの正確な機能は分かっていない。ミオシンＩＩＡは、細胞遊走に明らかに関与するが、これまでの研究は、がん細胞の細胞遊走の間の蛋白質の発現レベルでのプロファイルあるいは複数のミオシンＩＩＡのアイソタイプを評価するだけであった。
近年、非小細胞肺がんの臨床研究において、ミオシンＩＩを活性化するミオシンライトチェーンキナーゼの発現レベルと転移、再発の相関関係が示され、さらにミオシンＩＩＡの活性化が転移の要因であることが示された（非特許文献１）。転移性がん細胞におけるミオシンＩＩＡの重要な役割は、小カルシウム結合蛋白メタスタチン−１に注目した間接的な研究によって示唆された。メタスタチン−１は、多くの転移性培養細胞株において、発現が増加し、培養細胞へのメタスタチン−１の導入によって、転移性は増強する（非特許文献２）。さらに、メタスタチン−１の主要な標的分子は、ミオシンＩＩＡであると見られている（非特許文献３）。また、遊走しているがん細胞の先端部分においては、メタスタチン−１とミオシンＩＩＡが同一部位に局在し（非特許文献４）、メタスタチン−１が、ミオシンＩＩＡとフィラメントの重合を調節していると考えられているプロテインキナーゼによるリン酸化に影響することが示されている（非特許文献５、６）。
分子量５７ｋＤａのビメンチンは、細胞分化の間、初期の段階で発現し、広範に分布する中間系フィラメントの蛋白質である。全ての最初の細胞型は、ビメンチンを発現するが、多くの非間葉細胞において、ビメンチンは、分化の過程で他の中間系フィラメントの蛋白質に置き換わってゆく。ビメンチンは、線維芽細胞、内皮細胞など、多種多様な間葉細胞において発現し、中胚葉、中皮と卵巣のｇｒａｎｕｌｏｓｅ  ｃｅｌｌに由来するいくつかの細胞タイプがある。この過程において、上皮細胞は、器官形成に不可欠な可逆的あるいは非可逆的な間葉系の形質を獲得する。形態形成における上皮−間質の移行（相互作用）は、甲状腺、肝臓、腎臓、前立腺、乳腺、肺を含む種々の上皮性がんにおいて、腫瘍形成の間、異常な発現をする（非特許文献７、８）。腫瘍形成過程における一般的な特徴は、正常上皮の形質の欠失、分極化する上皮の形態学的な欠失、部分的あるいは全体的な運動性と浸潤性という形質の段階的な獲得を伴った間質としての形質の獲得を含んでいる（非特許文献９）。
さらに上皮の形態の崩壊には、接着分子の調節異常とＮ−カドヘリンの異常発現、上皮細胞におけるフィブロネクチン、ビメンチンのような本来間質に発現する分子が発現する上皮−間質移行（相互作用）が起こる。腫瘍や形質転換細胞におけるビメンチンの異常発現は、運動性の増大、浸潤性、予後の不良と相関する（非特許文献１０、１１）。肺においてビメンチンは、線維芽細胞、平滑筋、内皮、リンパ球系細胞に認められるが、正常の気管支上皮細胞には発現していない。近年の研究において、主に線維化部分のビメンチン陽性腫瘍細胞は、上皮−間質移行（相互作用）を伴う腫瘍の線維化と関連することが報告され、このことは他の研究と一致した結果である（非特許文献１２）。実際、間葉系形質の獲得は、間葉系のマーカーである蛋白質の発現と細胞外基質の異常な沈着と関連する。同様の知見は、ビメンチン陽性の上皮細胞の存在が線維化組織の程度の増大が関連する進行性の腎線維症のような他のモデルにおいても報告されている（非特許文献１３、１４）。
マーカーとしては、ミオシンは横紋筋肉腫の鑑別診断マーカーとして、ビメンチンは、悪性黒色腫を始め、さまざまな良性腫瘍および悪性腫瘍のマーカータンパク質であることが知られている（特許文献３）。特に最近は上皮型悪性中皮腫と肺腺癌の鑑別のための免疫組織化学マーカーとして研究されている（非特許文献１５、１６）。
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ  ２００４／０９０５２６
【特許文献２】公開特許公報第２００６−５３１１３号
【特許文献３】公表特許公報２００６−５１８９８２号
【非特許文献１】Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ  ２６  １５３−１５７，２００５
【非特許文献２】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８  ９９９−１００８，１９９３
【非特許文献３】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１  ６７７−６８０，２００６
【非特許文献４】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８  ３００６３−３００７３，２００３
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４  ６８６７−６８７６，２００５
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２  １４２５８−１４２６６，２００３
【非特許文献７】Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２  ４４２−４５４，２００２
【非特許文献８】Ｃｅｌｌ  １０５  ４２５−４３１，２００１
【非特許文献９】Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３５  １６４３−１６５４，１９９６
【非特許文献１０】Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １８０  １７５−１８０，１９９６
【非特許文献１１】Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５０  ４８３−４９５，１９９７
【非特許文献１２】Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８４  ９９９−１０１２，２００４
【非特許文献１３】Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  ４３３  ３５９−３６７，１９９８
【非特許文献１４】Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５８  ５８７−５９７，２０００
【非特許文献１５】Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２７（８）１０３１−１０５１，２００３
【非特許文献１６】Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ５７  １９０−１９９，２００７
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、現在のところ肺腺がん患者において特異的に発現量が変化するタンパク質についての知見はなく、当然のことながらミオシンＩＩＡやビメンチンの発現プロファイルと肺腺がん患者の予後との間の相関関係は知られていなかった。そこで、本発明者らは、特許文献１に記載の解析方法又は解析プログラムを使用することによって、肺腺がん患者において特異的に発現量が変化するタンパク質を同定することで、感度及び／又は特異度に優れた肺腺がん患者への手術後の予後を判定するための方法及び検査キットを提供することを目的としている。
上述した目的を達成するため、本発明者は、先に出願した病態プロテオミクス解析を可能とする、優れた分析能を達成する試料解析方法及び試料解析プログラム（特許文献１）を適用して、肺腺がんの手術後の予後に関連し、奏効とも密接に関連したマーカーを同定し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）肺腺がん患者から採取した生体由来試料における、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量を測定するステップａと、測定の結果、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量に基づいて予後を予測又は判定するステップｂとを含む手術後の予後を推定する方法。
（２）前記ステップａでは、表１のＰＥＰＴＩＤＥ＿ＳＥＱの欄に挙げたアミノ酸配列を有するペプチド群から選ばれる少なくとも１以上のペプチドの発現量を測定することを特徴とする（１）記載の予後を推定する方法。
【表１】
2009051277.tif 000002
（３）前記ステップａでは、モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的染色法によって、上記ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量を測定することを特徴とする（１）記載の予後を推定する方法。
（４）前記ステップａでは、モノクローナル抗体を固定した支持体に、前記肺腺がん患者から採取した生体由来試料からの抽出物を接触させることによって、上記ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量を測定することを特徴とする（１）記載の予後を推定する方法。
（５）肺腺がん患者が病理組織診断にてＩ期と診断された早期肺腺がん患者である（１）乃至（４）いずれか一つ記載の予後を推定する方法。
（６）ミオシンＩＩＡと特異的に結合する抗体及び／又はビメンチンと特異的に結合する抗体を少なくとも１以上含む、肺腺がん患者の予後を推定する検査キット。
（７）上記抗体は、上記表１のＰＥＰＴＩＤＥ＿ＳＥＱの欄に挙げたアミノ酸配列を有するペプチド群から選ばれるペプチドと特異的に結合する抗体であることを特徴とする（６）記載の検査キット。
（８）上記抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする（６）記載の検査キット。
（９）上記抗体は支持体に固定されていることを特徴とする（６）記載の検査キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−２７１１３９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって検出された同一の蛋白質由来のペプチド群のシグナルの強度の比較を示す。比較はそれぞれの群（Ｕ０Ｒ０、Ｕ０Ｒ１、Ｕ１Ｒ０、Ｕ１Ｒ１）で行った。縦軸はＬＣ−ＭＳで測定されたシグナル強度を正規化した値を示す。それぞれのボックスプロット（箱ひげ図）において、箱の上と下はそれぞれ上位四分位点と下位四分位点を表し、箱の外に出ている水平線は、それぞれ上位隣接値と下位隣接値を表す。ここでいう上位隣接値は、Ｑ３＋１．５×（Ｑ３−Ｑ１）以下で最大値となるもの、下位隣接値は、Ｑ１−１．５×（Ｑ３−Ｑ１）以上で最小値となるものを採用している。黒三角は中央値、黒四角は外れ値を表す。Ｕ０Ｒ０：手術後補助化学療法非施行非転移再発症例Ｕ０Ｒ１：手術後補助化学療法非施行転移再発症例Ｕ１Ｒ０：手術後補助化学療法施行非転移再発症例Ｕ１Ｒ１：手術後補助化学療法施行転移再発症例  ＡはミオシンＩＩＡに由来する各症例群のシグナル強度の分布を示す。
図１Ｂは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって検出された同一の蛋白質由来のペプチド群のシグナルの強度の比較を示す。比較はそれぞれの群（Ｕ０Ｒ０、Ｕ０Ｒ１、Ｕ１Ｒ０、Ｕ１Ｒ１）で行った。縦軸はＬＣ−ＭＳで測定されたシグナル強度を正規化した値を示す。それぞれのボックスプロット（箱ひげ図）において、箱の上と下はそれぞれ上位四分位点と下位四分位点を表し、箱の外に出ている水平線は、それぞれ上位隣接値と下位隣接値を表す。ここでいう上位隣接値は、Ｑ１＋１．５×（Ｑ３−Ｑ１）以下で最大値となるもの、下位隣接値は、Ｑ３−１．５×（Ｑ３−Ｑ１）以上で最小値となるものを採用している。黒三角は中央値、黒四角は外れ値を表す。Ｕ０Ｒ０：手術後補助化学療法非施行非転移再発症例Ｕ０Ｒ１：手術後補助化学療法非施行転移再発症例Ｕ１Ｒ０：手術後補助化学療法施行非転移再発症例Ｕ１Ｒ１：手術後補助化学療法施行転移再発症例  Ｂはビメンチンに由来する各症例群のシグナル強度の分布を示す。
図２は、抗ミオシンＩＩＡ抗体と抗ビメンチン抗体を用いて行った典型的な免疫組織化学染色の結果を示し、Ａは免疫組織化学的染色結果がミオシンＩＩＡ及びビメンチンのいずれも陽性である例の写真を示し、Ｂは免疫組織化学的染色結果がミオシンＩＩＡ陽性、ビメンチン陰性である例の写真を示し、Ｃは免疫組織化学的染色結果がミオシンＩＩＡ陰性、ビメンチン陽性である例の写真を示し、Ｄは免疫組織化学的染色結果がミオシンＩＩＡ及びビメンチンのいずれも陰性である例の写真を示す。
図３は、ＵＦＴによる術後補助化学療法非施行例（Ａ）と術後補助化学療法施行例（Ｂ）におけるミオシンＩＩＡ及びビメンチンの免疫組織化学的染色結果別の生存曲線を示す。免疫組織化学染色を施行した全症例（Ｃ）における非再発生存曲線を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明に係る肺腺がん患者の手術後の予後を推定する方法及び／又は検査キットを詳細に説明する。
肺腺がん患者の手術後の予後を予測・判定する本方法は、患者から採取した組織、血液、尿等の生体由来試料における、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量を測定するステップａと、測定の結果、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量に基づいて予後を予測・判定するステップｂとを含んでいる。なお、ステップａにおいては、ミオシンＩＩＡ及びビメンチンのいずれか一方の発現量を測定しても良いが、好ましくは両方の発現量を測定する。また、ステップｂでは、ステップａで測定されたミオシンＩＩＡの発現量及びビメンチンの発現量の両方に基づいて予後を予測又は判定することが好ましいが、ステップａで測定されたミオシンＩＩＡの発現量及びビメンチンの発現量のうち一方の発現量に基づいて予後を予測又は判定してもよい。
また、ミオシンＩＩＡ及びビメンチンの発現量を測定する際には、特に限定されないが、例えば、表２のＰＥＰＴＩＤＥ＿ＳＥＱの欄に挙げたアミノ酸配列を有するペプチド群から選ばれる少なくとも１以上のペプチドの発現量を測定すればよい。
【表２】
2009051277.tif 000003
2009051277.tif 000004
表２において「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎａｍｅ」の欄は一般的なタンパク質の名称を意味している。また、「Ｎａｍｅ」の欄はＮＣＢＩのＥｎＴｒｅｚ  ＧｅｎｅのＳｙｍｂｏｌ名、「Ｐｅｐｔｉｄｅ」は同定されたペプチドの番号、「Ｆｒａｃｔｉｏｎ」はタンパク抽出後に分画した画分である。さらに「ＰＥＰＴＩＤＥ＿ＳＥＱ」はＭＳ／ＭＳスペクトルから同定されたペプチド部分配列を示す。なお、ＭＹＨ９＿１に示したペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に示し、ＭＹＨ９＿２に示したペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示し、ＭＹＨ９＿３に示したペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に示した。ＶＩＭ＿１に示したペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示し、ＶＩＭ＿２に示したペプチドのアミノ酸配列を配列番号５に示し、ＶＩＭ＿３に示したペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に示し、ＶＩＭ＿４に示したペプチドのアミノ酸配列を配列番号７に示した。
表２に挙げたタンパク質は、本発明者らが先に開発した試料中に含まれる成分を解析する解析方法によって、予後と関連していることが新たに同定されたものである。したがって、本発明にかかる予後を推定する方法では、先ず、肺腺がん患者から採取した組織、血液、尿等の生体由来試料における、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチンの発現量を測定する。
ここで、肺腺がん患者としては、手術後の肺腺がん患者であれば特に限定されず、補助化学療法を検討している患者、補助化学療法を施行されている患者、及び補助化学療法を実施しない患者のいずれであっても良い。特に肺腺がん患者としては、病理組織診断にてＩ期と診断された早期肺腺がん患者であるのが好ましい。また、本発明に係る予後を推定する方法は、肺腺がん患者に対して直接何らかの処置を施すものではなく、患者から採取した組織、血液、尿等の生体由来試料を用いて実施する。
本発明に係る予後を推定する方法において生体由来試料としては、以下のものに限定されないものの、次のようなものを含む。即ち、補助化学療法を検討している患者、補助化学療法を施行されている患者、及び補助化学療法を実施しない患者から採取された、全血、血漿、血清、血球等の細胞成分のいずれかを使用することができる。また、これら患者から採取された組織や尿を使用することができる。
具体的に、肺腺がん患者から採取した生体由来試料における、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチン（以下、これらをまとめて「測定対象のタンパク質」と称する場合もある）の発現量を測定するには、例えば、測定対象のタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用することができる。
なお、測定対象のタンパク質を抗原とし、当該抗原に結合する限り、前記抗体としては特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。
ここで、モノクローナル抗体を作製する際には、測定対象のタンパク質若しくは当該タンパク質の断片（例えば、表２におけるＰＥＰＴＩＤＥ＿ＳＥＱの欄に挙げたアミノ酸配列を有するペプチド）を抗原として使用することができ、また、測定対象のタンパク質若しくは当該タンパク質の断片を発現する細胞を抗原として使用することができる。なお、測定対象のタンパク質若しくは当該タンパク質の断片や断片を発現する細胞は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版第１−３巻Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１９８９年に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得することができる。
なお、測定対象のタンパク質のアミノ酸配列及び当該タンパク質をコードする塩基配列は、表中「Ｎａｍｅ」の欄に記載したＮＣＢＩのＥｎＴｒｅｚ  ＧｅｎｅのＳｙｍｂｏｌ名及び／或いは「ＰＥＰＴＩＤＥ＿ＳＥＱ」に記載したアミノ酸部分配列に基づいて取得することができる。そして、当業者であれば、取得したアミノ酸配列及び塩基配列に基づいて、測定対象のタンパク質若しくはその断片を定法に従って容易に取得することができる。
得られたモノクローナル抗体は、測定対象のタンパク質の定量用に、エンザイム−リンクイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づいたアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノアッセイ法で検査試薬として用いることができる。また、モノクローナル抗体は標識化されることが好ましい。標識化を行う際、標識化合物としては例えば当分野で公知の酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、染色物質などを使用することができる。
一方、本発明に係る予後を推定する診断用検査キットは、ミオシンＩＩＡと特異的に結合する抗体及び／又はビメンチンと特異的に結合する抗体を含むものである。ここで、当該検査キットは、例えばミオシンＩＩＡと特異的に結合する複数の抗体を備えるものであっても良い。複数の抗体とは、それぞれの抗体が異なる部位をエピトープとする抗体であることが好ましい。同様に、当該検査キットは、ビメンチンと特異的に結合する複数の抗体を備えるものであっても良い。なお、抗体としては、好ましくはモノクローナル抗体を使用する。
例えば、当該検査キットは、支持体（例えばマイクロタイターウェルの内壁）に上述したモノクローナル抗体（又はそのフラグメント）を被覆したものを挙げることができる。支持体としてはポリスチレンやポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニール製のマイクロタイタープレート、試験管、キャピラリー、ビーズ、膜、フィルターなどが挙げられる。
また、当該検査キットは、抗体群のなかから選ばれた１以上、より好ましくはミオシンＩＩＡ及びビメンチンそれぞれに由来する２つの抗体を備える。
以上のようにして、肺腺がん患者から採取した組織、血液、尿等の生体由来試料における、測定対象のタンパク質の発現量を測定した後、本発明にかかる予後を推定する方法では、当該発現量に基づいて肺腺がん患者の手術後の予後の事前予測あるいは治療効果の予測を行う。ミオシンＩＩＡの発現量が高いか、ビメンチンの発現量が高い場合には、肺腺がん患者の術後の予後は不良であると判断することができる。
より具体的には、測定対象のタンパク質の発現量を、生体試料中においても構成的に発現しているタンパク質の発現量、あるいはこれ以外の血清アルブミン等一般的な血清学的検査で測定されるタンパク質の量で除算した比（相対値）を用いて、この値が基準値を有意に上回る場合に予後不良と診断することができる。ここで、基準値とは、例えば５年以内に再発が認められた肺腺がん患者群における測定対象のタンパク質の発現量（相対値）の平均値と設定することができる。また、基準値としては、例えば５年以内に無再発（５年生存）であった肺腺がん患者群における測定対象のタンパク質の発現量（相対値）の平均値と設定することもできる。なお、基準値は、測定対象のタンパク質のそれぞれについて設定することができる。
ここで、「有意に上回る」とは、統計上の有意差をもって発現量が基準値を超える場合を指す。すなわち、かかる用語は、上記「ステップａで測定したタンパク質の発現量から算出した比（相対値）」が、測定対象のタンパク質について予め算出した基準値±標準偏差の範囲外であることを指す。
また、本発明に係る予後を推定する方法は、対象患者から採取した組織を用いた免疫組織化学的染色によって測定対象のタンパク質の発現量を測定してもよい。この場合、発現量の測定の結果としては、免疫組織化学的染色を行った組織全体に含まれる測定対象タンパク質の発現が認められた細胞数割合を算出する。そして、ミオシンＩＩＡ陽性細胞が５０％以上である場合に予後不良と推定することができ、また、ビメンチン陽性細胞が２５％以上である場合に予後不良と推定することができる。
本発明に係る予後を予測・判定する方法及び検査キットによれば、非常に優れた感度及び／又は優れた特異度で肺腺がん患者の手術後の予後の事前予測を行うことができる。ここで、感度とは、予後不良群における陽性率を意味する。特異度とは、予後良好群における陰性率を意味する。
これによって、予後を事前に予測することで、予後不良が予測される患者に選択的に抗がん剤を投与することが可能となる。また、免疫組織化学染色法により、ミオシンＩＩＡ陰性かつビメンチン陰性の肺腺がん患者では術後のＵＦＴ投与にかかわらず、再発を全く認めなかったことから、術後のＵＦＴ投与を回避できる患者群と推測することができる。たとえ抗がん剤に関する安全性に問題がない場合でも、無駄な投薬を抑制することは、医療経済的な効果も極めて大きい。
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明に係る技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。本実施例では、上記特許文献１に記載の方法を実際の臨床検体に適用して、早期肺腺がんにおける手術後補助化学療法施行患者において、予後を予測することができるタンパク質群を探索、同定し、診断マーカーとして使用できることを検証した。
【実施例１】
【０００６】
病理組織診断によって、Ｉ期と診断された早期肺腺がん患者外科的切除組織を用い、後述する手法で蛋白質を抽出・消化し、ＬＣ−ＭＳ装置を用いて測定した。得られたプロファイルを、後日、手術後補助化学療法施行転移再発群、手術後補助化学療法施行非転移再発群、手術後補助化学療法非施行転移再発群、手術後補助化学療法非施行非転移再発群に分け、群間で有意に変動しているシグナルを拾い出し、それらについてＭＳ／ＭＳ解析を行って蛋白質を同定した。
試料
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定・解析に用いた試料は、１９９５年から２００１年の間に、外科的切除をされた早期肺腺がん組織、２４症例を用いた。これら試料は、病理組織診断によってＩ期と診断され、外科的切除後直ちに−８０℃保存されていた。早期肺腺がん２４症例のうち１１症例は、手術後ＵＦＴ（テガフール＋ウラシル）による術後補助化学療法を施行され、手術後２年以内に転移再発をした「手術後補助化学療法施行転移再発（Ｕ１Ｒ１）」５症例、手術後５年間転移再発をしていない「手術後補助化学療法施行非転移再発（Ｕ１Ｒ０）」６症例である。さらに早期肺腺がん２４症例のうち１３症例は、ＵＦＴを含め手術後一切の補助化学療法を施行せず、手術後２年以内に転移再発をした「手術後補助化学療法非施行転移再発（Ｕ０Ｒ１）」６症例、手術後５年間転移再発をしていない「手術後補助化学療法非施行非転移再発（Ｕ０Ｒ０）」７症例である。
試料の調製
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定・解析に用いた試料は、分析対象の凍結保存組織切片を、ＰＢＳ溶液中で４℃にて破砕した。プロテアーゼによる非特異的な分解を抑えるため、ＰＢＳ溶液にはあらかじめプロテアーゼ活性阻害剤の混合物（コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠：ロシュ・ダイアグノスティックス（株）社製）を溶解しておいた。破砕懸濁液を１０分間振とう攪拌した後、懸濁液を遠心分離にかけた（条件：５２０００×ｇ、４℃にて２０分間、この操作によって生じた上清を以下、可溶画分と称する）。可溶画分を−８０℃にて保存した。一方、沈殿に対しては、ＰＢＳ溶液への懸濁と上記条件の遠心分離を３回繰り返し、最後にＳＤＳを含む溶液に溶解した。その組成はＰＢＳ（プロテアーゼ活性阻害剤混合物を含む）、５％  ｗ／ｖ  ＳＤＳであった（この溶液を以下、不溶画分と称する）。
総蛋白質濃度の測定
Ｌｏｗｒｙの方法の変法によって、両画分の蛋白質濃度を測定した。検量線のための標準蛋白質として、ウシ血清アルブミンを用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
可溶・不溶の両画分から、正味７５μｇ総蛋白質に相当する容積の溶液を取り、これに対して１５０ｐｍｏｌ分の卵白リゾチーム水溶液を混合した。つづいて、減圧留去によって混合液を乾固し、乾固した試料を、７０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、５％ｖ／ｖ２−メルカプトエタノール、１０％ｖ／ｖグリセリン、０．００２５％ｗ／ｖブロモフェノールブルー）に溶解した。この溶解液を３７℃にて６０分間振とうしたのち、５０μＬ分をＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。このときに用いたポリアクリルアミドゲルは不連続の緩衝液系、すなわち上部の濃縮ゲル（ｐＨ６．８）と下部の分離ゲル（ｐＨ８．８）から成っていた。ポリアクリルアミドゲルの濃度は各々４％と１２．５％であり、全体の大きさは幅１４ｃｍ、高さ１４ｃｍ、および厚さ１ｍｍであった。電気泳動時の電流は一定の２０ｍＡであった。色素ブロモフェノールの泳動フロントが、濃縮ゲルと分離ゲルの境界面から分離ゲルの約２ｍｍまで達したところで泳動を停止した。各試料について、濃縮ゲルと分離ゲルの境界面から泳動フロントまでの間の範囲を切り出した。ゲル切片のおよその大きさは４×１０×１ｍｍであった。
ゲル内トリプシン消化
上記ゲル切片を約１ｍＬの４０％メタノール、１０％酢酸水溶液中に浸して振とうし、ゲル内に含まれる蛋白質を固定した。ゲル切片をさらに一辺約１ｍｍのサイコロ状に分割し、以下の手順にしたがって、ゲル中の蛋白質を処理した。システイン残基のＳＨ基の修飾のため、ジチオトレイトールによる還元反応、つづくヨードアセトアミドによるアルキル化反応を行った。つぎにゲル片を十分量の水で洗浄してからアセトニトリルで脱水した。ゲル片に残った水とアセトニトリルを減圧留去してからトリプシン溶液を加え、３７℃にて１６時間保温し消化反応を行った。ゲル片に含まれるペプチド断片の抽出は、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム／５０％アセトニトリル水溶液で１回、続いて５％ギ酸／５０％アセトニトリル水溶液で２回行い、抽出溶液は１個の容器にまとめて減圧濃縮した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
各ペプチド試料の三次元プロファイルを得るために、以下に示す装置と操作によってペプチド試料を分析した（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（２００５）８５６−８６４）。まず、プロテアーゼ消化後のペプチド試料を、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液１００μＬに溶解した溶液を測定試料とした。
測定試料１０μｌ分をＰｅｐｔｉｄｅ  ＣａｐＴｒａｐカートリッジ（内径０．５ｍｍ，長さ２ｍｍ，Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社製）で脱塩・濃縮後、ＭＡＧＩＣ  ＭＳＴＭＣ１８キャピラリーカラム（内径０．２ｍｍ，長さ５０ｍｍ，粒径３μｍ，孔径２００Å）に導入した。各ペプチドの溶出はＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ−４ＴＭＨＰＬＣシステム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社）を用いて行った。このときのＨＰＬＣ移動相Ａはギ酸、アセトニトリルおよび水を０．１：２：９８の容積比で混合した溶媒とし、これに対して移動相Ｂの混合比は０．１：９０：１０とした。そして移動相Ｂの濃度上昇を５％から９５％までの直線勾配に設定し、ペプチド断片を連続的に溶出した。このときの流速は約１μＬ／ｍｉｎとした。
ＬＣの溶出液は、ＡＭＲ社製のＦｒｏｔｉｓＴＭニードル（内径２０μｍ）を介し、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱＴＭイオントラップ型質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ社）のイオン源に直接導入した。ＥＳＩニードルの位置は加熱キャピラリーとの距離を微調整できるようになっている。スプレー電圧はニードルではなく、溶離液に直接荷電するようにした。分析ノイズを下げるために窒素ガスを２ａｒｂの流速でイオン源に導入し、スプレー電圧は２．０ｋＶとした。
データ解析
データ解析は、いずれも上記特許文献１に記載のｉ−ＯＰＡＬプログラムを用いて行った。具体的な手順は以下のとおりである。
解析手順
全てのｆｕｌｌ  ＭＳデータは、ｉ−ＯＰＡＬ半定量ＬＣ−ＭＳデータ解析システム（ｉ−ＯＰＡＬ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて解析した。最初にｆｕｌｌ  ＭＳスキャンのシグナル強度をノーマライズし、各々のサンプルの総シグナル強度を同じ値にした。内部標準物質として注入された卵白リゾチーム由来あるいはサンプルに内在性の共通蛋白質由来の複数の標準シグナルをｉ−ＯＰＡＬのアライメント（整列化）マーカーとして選択した。ｉ−ＯＰＡＬアライメント（整列化）プログラムは、非線形的に揺らぐ各々のＬＣ−ＭＳデータのＬＣの溶出時間軸を整列化し、最終的には、可溶画分と不溶画分の各々について、一つのＬＣ−ＭＳデータに重ね合わせをするために用いた。分散解析（ＡＮＯＶＡ）は、最終的に重ね合わせたＬＣ−ＭＳデータの中から、特定の症例群において明らかに異なる強度のマーカー候補のシグナルを選択するように用いた。ＡＮＯＶＡは、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅパッケージを用いた。
データベース検索
全てのＭＳ／ＭＳデータは、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ．［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ］）を用いて、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔヒトサブセット、ＲｅｆＳｅｑ蛋白質配列データベースを検索した。データベース検索は、システイン残基（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，＋５７Ｄａ）の固定修飾、メチオニン残基（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，＋１６Ｄａ）の可変修飾、ペプチド質量の許容誤差±２．０Ｄａ、断片質量の許容誤差±０．８Ｄａとした。
結果
ｉ−ＯＰＡＬを用いたアライメントの後、可溶画分において１３，１３６ピーク、不溶画分において１４，９８４ピークが検出された。Ｓｐｏｔｆｉｒｅを用いて、以下の条件によって候補シグナルを絞り込んだ。
（１）Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンによる検索結果のスコアが５０以上であること
（２）ＡＮＯＶＡ分析によるＰ値が、可溶画分において１×１０−５以下、不溶画分において１×１０−６以下あるいは等しいこと
以上の条件によって、可溶画分において２３ピーク、不溶画分において２８ピークの候補ピークを絞り込んだ。さらに、これらの複数の候補ピークの中から、複数の異なるアミノ酸配列が検出され、同様のシグナル強度のパターンを示したミオシンＩＩＡおよびビメンチンを最終的なバイオマーカー候補として選択し、それらのペプチド配列を上述した表２に示した。また、本実施例のＬＣ−ＭＳ分析によるペプチドシグナル強度の比較の結果を図１Ａおよび図１Ｂに示す。図１Ａは、ミオシンＩＩＡから生じた複数のペプチドイオンのシグナル強度の分布を示している。図１Ａにおけるこれらの３つのペプチド信号は、タンデム質量分析によって、ミオシンＩＩＡに帰属することが示された。Ｕ１Ｒ１グループと他のグループ間には有意差が認められた（ｐ＜９．７×１０−７）。また、図１Ｂは、ビメンチンから生じた複数のペプチドイオンのシグナル強度の分布を示す。図１Ｂにおけるこれらの４つのペプチド信号は、タンデム質量分析によって、ビメンチンに帰属することが示された。Ｕ１Ｒ１グループと他のグループ間には有意差が認められた（ｐ＜３．８×１０−７）。
全てのシグナルにおいて、手術後補助化学療法施行転移再発患者群（Ｕ１Ｒ１）のシグナル強度は、他の患者群とは明らかに異なるパターン（著しく高い）を示した。
【実施例２】
【０００７】
上記実施例によって予後因子として同定されたタンパク質を実施例１で使用した症例とは全く異なる症例において、病理組織診断によってＩ期と診断された早期肺腺がん患者外科的切除組織を用い、後述する手法で検証した。
試料
実施例１において同定された早期肺腺がんにおける予後因子蛋白質の検証のために用いた試料は、１９９５年から２００１年の間に、外科的切除をされた早期肺腺がん組織のホルマリン固定パラフィン包埋標本９０症例を用いた。これら全ての症例は、肺がんの根治手術が施行され、手術後病理組織診断によってＩ期と診断された。手術後３ヶ月ごとに胸部レントゲン写真、血清腫瘍マーカー（ＣＥＡ，ＣＡ１９−９，ＳＬＸ）、６ヶ月ごとに頭部と胸腹部のＣＴ、骨シンチグラフィーによって再発の有無が評価された。これらの検査によって再発の判定が困難な場合は、細胞化学的あるいは病理学的な検査によって確定診断が成された。Ｉ期肺腺がん９０症例のうち５１症例は、手術後ＵＦＴによる術後補助化学療法を施行され、手術後２年以内に転移再発をした「手術後補助化学療法施行転移再発」２４症例、手術後５年間転移再発をしていない「手術後補助化学療法施行非転移再発」２７症例である。さらに早期肺腺がん９０症例のうち３９症例は、ＵＦＴを含め手術後一切の補助化学療法を施行せず、手術後転移再発をした「手術後補助化学療法非施行転移再発」１７症例、手術後転移再発をしていない「手術後補助化学療法非施行非転移再発」２２症例である。
免疫組織化学的染色
ホルマリン固定パラフィン包埋早期肺腺がん症例標本を４μｍの厚さに薄切し、スライドガラスに採取した。組織標本は、メタノール、キシレンによって脱パラフィン後、０．０１％トリプシン処理、１００℃で１０分間オートクレープ処理した。さらに０．５％メタノール・１００％過酸化水素処理、２％正常血清・ＰＢＳによって内因性ペルオキシダーゼを不活化した。続いて、各々の標本に抗ミオシンＩＩＡマウスモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製、ｃｌｏｎｅ  ａｂ２４７６２）及び抗ビメンチンマウスモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を４℃で一晩反応させた。抗マウスＩｇＧ抗体、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ抗体と反応後、顕微鏡下において、０．０３％過酸化水素を含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ溶液中で０．０６％の３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅとＤＡＢ反応をさせた。核染色は、Ｍｅｙｅｒ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで行った。
免疫組織化学的染色の判定
がん細胞におけるミオシンＩＩＡ、ビメンチンの発現は、各々同一症例の同一標本の正常気管支上皮部分を内部コントロールとして比較し、がん細胞の細胞質の染色性の有無を判定した。
免疫組織化学的染色の統計学的解析
免疫組織化学的染色の統計学的解析は、ＳＰＳＳ  ｖｅｒ．１５（臨床統計ソフトウェア；エス．ピー．エス．エス（株）社製）を用いた。無再発生存期間は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用い、患者群間の生存率は、ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを用いた。ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０５を統計学的に有意であると判定した。
結果
予後不良な早期肺線がんで有意に発現が検証されたタンパク質であるミオシンＩＩＡ及びビメンチンの典型的な免疫組織化学的染色を図２に、及びそれぞれのタンパク質の染色結果を表３に示す。
【表３】
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ミオシンＩＩＡとビメンチンの発現は、細胞質に認められた。ミオシンＩＩＡは５０％以上の細胞において発現が認められた場合、陽性と判定した。ビメンチンは、２５％以上の細胞において発現が詔められた場合、陽性と判定した。９０例中、ミオシンＩＩＡ陽性は７５例（８３．３％）、陰性は１５例（１６．７％）であり、ビメンチン陽性は４８例（５３．３％）、陰性は４２例（４．７％）であった。また、両方とも陽性は４２例（４６．７％）、両方陰性は９例（１０％）であった。ミオシンＩＩＡとビメンチンの免疫組織化学反応性には、関連性は認められなかった。
免疫組織化学的染色結果別のＵＦＴによる術後補助化学療法非施行例（Ａ）と術後補助化学療法施行例（Ｂ）における生存曲線を図３に示す。図３Ａ、Ｂ及びＣにおいてａ線はミオシンＩＩＡとビメンチンがともに陰性の症例であり、ｂ線はミオシンＩＩＡ陰性、ビメンチン陽性の症例又はミオシンＩＩＡ陽性、ビメンチン陰性の症例であり、ｃ線はミオシンＩＩＡとビメンチンがともに陽性の症例である。
術後補助化学療法の施行の有無に関わらず、いずれも陰性例であった患者は５年後の生存率は１００％であった。術後補助化学療法の非施行患者において、ミオシンＩＩＡとビメンチンの発現が陰性であった症例（ａ群）とミオシンＩＩＡとビメンチンの発現が陽性であった症例（ｃ群）の間には、統計学的に有意な差が認められた（ｐ＝０．０１１）（図３Ａ）。術後補助化学療法施行患者において、統計学的に有意な差は認められなかった（図３Ｂ）。ミオシンＩＩＡとビメンチンの発現が陽性であった症例（ｃ群）において、ＵＦＴによる術後補助化学療法を施行した患者では約１９％の５年生存率の上乗せが認められたが、術後補助化学療法の施行患者と非施行患者の間には統計学的に有意な差は認められなかった。
全症例における非再発生存曲線において、ミオシンＩＩＡとビメンチンの発現の両方が陰性であった症例（ａ群）とミオシンＩＩＡとビメンチンの発現の両方が陽性であった症例（ｃ群）の間には、統計学的に有意な差が認められ（ｐ＝０．００６）（図３Ｃ）、ミオシンＩＩＡとビメンチンの発現のいずれか一方が陽性であった症例（ｂ群）とミオシンＩＩＡとビメンチンの発現の両方が陰性であった症例（ｃ群）の間にも、統計学的に有意な差が認められた（ｐ＝０．０２９）（図３Ｃ）。
手術後補助化学療法の施行の有無にかかわらず、ミオシンＩＩＡとビメンチンの発現が陰性の患者は、予後が良好（５年生存率１００％）であった。したがって、この２種類の蛋白質は、患者の予後を予測する因子であると同時に術後補助化学療法を必要としない患者の選抜のために極めて有用なバイオマーカーであることが検証された。さらに統計学的な有意差こそ認められなかったが、ミオシンＩＩＡとビメンチンの発現が陽性であった症例において、ＵＦＴによる術後補助化学療法を施行した患者では約１９％の５年生存率の上乗せが認められたことから、本来予後不良である患者群の中に術後補助化学療法によって予後が改善される患者群が存在することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明によれば、肺腺がん患者の手術後の予後を事前に予測し、あるいは治療中に優れた信頼度をもって診断できる手術後の予後を推定するための方法及び検査キットを提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３】
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【図２】
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【国際調査報告】
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