(57)【要約】  免疫系を刺激する場合か、免疫系を間接的に増強する場合か、他の場合には免疫抑制効果を有する場合かがある免疫調節剤を利用する新規な組成物及び方法を提供することが本発明の目的である。本明細書で開示されるＴＮＦＲ２５のアゴニストは、抗炎症効果及び治癒効果を有する。中でも前記ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、例えば喘息と、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患のような慢性炎症とにより引き起こされる疾病を治療するために使用される場合がある。本明細書で開示されるＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、ＣＤ８Ｔ細胞に仲介される細胞性免疫応答を阻害する能力を有し、例えば組織移植後の臓器又は組織の拒絶反応を軽減する場合がある。本明細書で開示されるＴＮＦＲ２５のアゴニストは、腫瘍ワクチンといっしょに与えられるときに癌と戦うための身体能力を高める目的か、方向づける目的か、回復させる目的かのために、身体の細胞性免疫防御と癌細胞との間の相互作用を変化させる生物学的応答調節剤を提供する。本明細書で開示されるＴＮＦＲ２５特異的免疫毒素は、癌患者から自然発生の免疫抑制細胞を除去することにより化学療法剤の投与計画の有効性を増大させる能力を有する。【選択図】図１
2009505678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）のアゴニストとして働く能力を有することを特徴とする、ＴＮＦＲ２５抗原に結合する単離抗体。
【請求項２】
ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を対照抗体と比較して増大させる能力を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）抗原はヒト又はマウス由来であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）受容体に結合するポリペプチドと結合した毒性物質を含むことを特徴とする、ＴＮＦＲ２５−特異的毒素。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、モノクローナル抗体４Ｃ１２か、該抗体の免疫特異的部分かを含むことを特徴とする、請求項４に記載の毒素。
【請求項６】
前記毒性物質は、放射性同位体、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素及び金属イオンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の毒素。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、ＴＬ１Ａタンパク質か、該タンパク質のＴＮＦＲ２５結合部分かを含むことを特徴とする、請求項４に記載の毒素。
【請求項８】
細胞において発現される腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）受容体を活性化する方法であって、（ａ）前記細胞をＴＮＦＲ２５のアゴニストと接触させるステップと、（ｂ）ＴＮＦＲ２５受容体のシグナル伝達の増大を観察するステップとを含み、前記ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、（ｉ）モノクローナル抗体４Ｃ１２と、（ｉｉ）ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を対照抗体と比較して増大させる能力を有する、腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）と結合する抗体と、（ｉｉｉ）可溶性ＴＬ１Ａと、（ｉｖ）ＴＮＦＲ２５のアゴニスト抗体の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｖ）可溶性ＴＬ１Ａの遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｖｉ）ＴＮＦＲ２５の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターとからなる群から選択されることを特徴とする、細胞において発現される腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）受容体を活性化する方法。
【請求項９】
腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）のアンタゴニストとして働く能力を有することを特徴とする、ＴＮＦＲ２５抗原に結合する単離抗体。
【請求項１０】
ＴＬ１Ａ抗原と結合すること、及び、ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を対照抗体と比較して減少させる能力を有することを特徴とする、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）抗原はヒト又はマウス由来であることを特徴とする、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
細胞内での腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）受容体のシグナル伝達を阻害する方法であって、（ａ）該細胞をＴＮＦＲ２５のアンタゴニストと接触させるステップと、（ｂ）ＴＮＦＲ２５受容体のシグナル伝達の減少を観察するステップとを含み、該ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、（ｉ）モノクローナル抗体Ｌ４Ｇ６と、（ｉｉ）ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を対照抗体と比較して減少させる能力を有する、腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）と結合する抗体と、（ｉｉｉ）可溶性ＴＬ１Ａに対して特異的な抗体と、（ｉｖ）ＴＮＦＲ２５の細胞外部分を含む融合タンパク質と、（ｖ）ＴＮＦＲ２５の細胞外部分の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｖｉ）可溶性ＴＬ１Ａに対して特異的な抗体の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｖｉｉ）Ｌ４Ｇ６の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターとからなる群から選択されることを特徴とする、細胞内での腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）受容体のシグナル伝達を阻害する方法。
【請求項１３】
腫瘍抗原と、生物学的応答調節剤としてのＴＮＦＲ２５のアゴニストとを含むことを特徴とする、腫瘍ワクチン。
【請求項１４】
前記ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、（ａ）モノクローナル抗体４Ｃ１２と、（ｂ）ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を対照抗体と比較して増大させる能力を有する、腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）と結合する抗体と、（ｃ）可溶性ＴＬ１Ａと、（ｄ）ＴＮＦＲ２５のアゴニスト抗体の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｅ）可溶性ＴＬ１Ａの遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｆ）ＴＮＦＲ２５の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターとからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１５】
アジュバント剤を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１６】
腫瘍に対する免疫を患者に付与する方法であって、前記腫瘍から腫瘍特異的抗原を単離するステップと、請求項１４に記載の腫瘍ワクチンを前記患者に投与するステップとを含むことを特徴とする、腫瘍に対する免疫を患者に付与する方法。
【請求項１７】
請求項４に記載の毒素を含む組成物を患者に提供することにより該患者からＣＤ４＋／ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を除去するステップと、前記患者に化学療法剤を提供するステップとを含むことを特徴とする、患者の癌を治療する方法。
【請求項１８】
消化管の炎症の治療及び／又は予防を必要とする患者にＴＮＦＲ２５のアゴニストを含む治療用組成物の有効量を提供するステップを含むことを特徴とする、消化管の炎症を治療及び／又は予防する方法。
【請求項１９】
前記消化管の炎症の症状は、炎症性腸疾患、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、（ａ）可溶性ＴＬ１Ａと、（ｂ）モノクローナル抗体４Ｃ１２と、（ｃ）ＴＮＦＲ２５のアゴニスト抗体の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｄ）可溶性ＴＬ１Ａの遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｅ）ＴＮＦＲ２５の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターとからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストと免疫抑制剤とを含むことを特徴とする、臓器移植の円滑化のための治療用組成物。
【請求項２２】
前記免疫抑制剤は、グルココルチコイド、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、シクロホスファミド、メルカプトプリン、タクロリムス及びミコフェノール酸モフェチルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、（ａ）モノクローナル抗体Ｌ４Ｇ６と、（ｂ）ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を対照抗体と比較して減少させる能力を有する、腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）と結合する抗体と、（ｃ）可溶性ＴＬ１Ａに対して特異的な抗体と、（ｄ）ＴＮＦＲ２５の細胞外部分を含む融合タンパク質と、（ｅ）ＴＮＦＲ２５の細胞外部分の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｆ）可溶性ＴＬ１Ａに対して特異的な抗体の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｇ）Ｌ４Ｇ６の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターとからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
（ａ）ドナーから組織を取得するステップと、（ｂ）請求項２１に記載の組成物を宿主に提供するステップと、（ｃ）前記組織を前記宿主に移植するステップとを含むことを特徴とする、ドナーから宿主へ組織を移植する方法。
【請求項２５】
（ａ）ＣＤ８Ｔ細胞を該細胞のコグネイト抗原に曝露するステップと、（ｂ）前記ＣＤ８Ｔ細胞をＴＮＦＲ２５のアンタゴニストに曝露するステップとを含むことを特徴とする、コグネイトＣＤ８Ｔ細胞集団のクローン性増殖を阻害する方法。
【請求項２６】
前記ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、（ａ）モノクローナル抗体Ｌ４Ｇ６と、（ｂ）ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を対照抗体と比較して減少させる能力を有する、腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）と結合する抗体と、（ｃ）可溶性ＴＬ１Ａに対して特異的な抗体と、（ｄ）ＴＮＦＲ２５の細胞外部分を含む融合タンパク質と、（ｅ）ＴＮＦＲ２５の細胞外部分の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｆ）可溶性ＴＬ１Ａに対して特異的な抗体の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｇ）Ｌ４Ｇ６の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターとからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記コグネイト抗原は、ドナーから宿主へ移植される組織と関連することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
肺の炎症の治療及び／又は予防を必要とする患者にＴＮＦＲ２５のアンタゴニストを含む治療用組成物の有効量を提供するステップを含むことを特徴とする、肺の炎症を治療及び／又は予防する方法。
【請求項２９】
前記炎症の症状は喘息の結果発生する症状であることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、（ａ）モノクローナル抗体Ｌ４Ｇ６と、（ｂ）ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を対照抗体と比較して減少させる能力を有する、腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）と結合する抗体と、（ｃ）可溶性ＴＬ１Ａに対して特異的な抗体と、（ｄ）ＴＮＦＲ２５の細胞外部分を含む融合タンパク質と、（ｅ）ＴＮＦＲ２５の細胞外部分の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｆ）可溶性ＴＬ１Ａに対して特異的な抗体の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターと、（ｇ）Ｌ４Ｇ６の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターとからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
配列番号４、５、６及び／又は１６と厳密な条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸によりエンコードされるポリペプチドを含み、前記配列はＴＬ１Ａタンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、単離されたＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト。
【請求項３２】
前記配列は配列番号４と厳密な条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、請求項３１に記載の単離されたＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト。
【請求項３３】
前記配列は配列番号５と厳密な条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、請求項３１に記載の単離されたＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト。
【請求項３４】
前記配列は配列番号６と厳密な条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、請求項３１に記載の単離されたＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト。
【請求項３５】
前記ＴＬ１ＡはヒトＴＬ１Ａであることを特徴とする、請求項３１に記載の単離されたＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト。
【請求項３６】
前記ＴＬ１ＡはマウスＴＬ１Ａであることを特徴とする、請求項３１に記載の単離されたＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト。
【請求項３７】
肺の炎症の治療及び／又は予防を必要とする患者に、請求項３１に記載のＴＮＦＲ２５のアンタゴニストを含む治療用組成物の有効量を提供するステップを含むことを特徴とする、肺の炎症を治療及び／又は予防する方法。
【請求項３８】
（ａ）ドナーから組織を取得するステップと、（ｂ）請求項３１に記載のＴＮＦＲ２５のアンタゴニストを宿主に提供するステップと、（ｃ）前記組織を前記宿主に移植するステップとを含むことを特徴とする、ドナーから宿主へ組織を移植する方法。
【請求項３９】
配列番号３及び／又は７と厳密な条件下でハイブリダイズする配列によりエンコードされるポリペプチドと、毒性物質とを含み、前記配列はＴＮＦＲ２５受容体タンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、組成物。
【請求項４０】
前記毒性物質は、放射性同位体、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素及び金属イオンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項３９に記載の毒素を含む組成物を患者に提供することにより該患者からＣＤ４＋／ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を除去するステップと、前記患者に化学療法剤を提供するステップとを含むことを特徴とする、患者の癌を治療する方法。
【請求項４２】
配列番号３及び／又は７と厳密な条件下でハイブリダイズする配列によりエンコードされるポリペプチドを含む組成物の有効量を、消化管の炎症の治療及び／又は予防を必要とする患者に提供するステップを含み、前記配列はＴＮＦＲ２５受容体タンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、消化管の炎症を治療及び／又は予防する方法。
【請求項４３】
前記消化管の炎症は過敏性腸症候群に関連することを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記消化管の炎症はクローン病に関連することを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍抗原と、配列番号３及び／又は７と厳密な条件下でハイブリダイズする配列によりエンコードされる生物学的応答調節剤としてのポリペプチドとを含み、前記配列はＴＮＦＲ２５受容体タンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、腫瘍ワクチン。
【請求項４６】
配列番号３及び／又は７と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む発現ベクターであって、前記配列はＴＮＦＲ２５受容体タンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項４７】
配列番号４、５、６及び／又は１６と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む発現ベクターであって、前記配列はＴＬ１Ａタンパク質と結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー２５（ＴＮＦＲ２５）のアゴニストと、免疫毒素と、アンタゴニストと、癌及び炎症を治療すること、並びに、免疫抑制をもたらすことのそれぞれにおけるそれらの使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
優先権
本出願は、その全体が引用により本明細書に取り込まれる２００５年８月３０日出願の特許文献１に係る出願を基礎とする優先権を主張する。
【特許文献１】米国特許出願６０／７１２，０８４号明細書
【０００３】
背景
ヒト免疫系に係る多くの疾患は、免疫応答の減衰を特徴とするカテゴリーと、免疫応答の過剰を特徴とするカテゴリーとの２種類の広範なカテゴリーに分類される。免疫不全は、免疫応答の減衰を特徴とする。先天的な（生まれつきの）免疫不全の形態と、後天的な免疫不全の形態とがある。貪食細胞が病原体を破壊する能力に問題を有する慢性肉芽腫症は、前者の例である。ＣＤ４＋Ｔ細胞を破壊するＨＩＶウイルスにより引き起こされる感染症であるＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）は、後者の例である。免疫応答の減衰を特徴とする場合がある付加的な疾病は、癌である。健康な個体とは対照的に癌患者の免疫系は、腫瘍細胞を効果的に認識及び／又は破壊する能力をもはや有さない。
【０００４】
強い期待にも関わらず、免疫系の活性を直接増大させる薬物療法は今まで存在しない。しかし癌のような疾病と戦うために直接的又は間接的に免疫系を動員する目的で、生物学的療法が最近使用されている。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が生物学的療法として現在使用されることが多い。例えばモノクローナル抗体は特定の型の癌細胞と反応する場合があり、直接的又は間接的な抗腫瘍効果を有する。
【０００５】
腫瘍ワクチンが、治療か、一次治療後の予防かのために使用される場合がある。抗腫瘍ワクチンは、ＣＤ４表現型又はＣＤ８表現型の腫瘍特異的な細胞障害性Ｔ細胞の形態で細胞性免疫を誘導することを必要とする場合がある。有効な抗腫瘍免疫は、かかる細胞障害性細胞の長期間にわたる産生及び維持を必要とすると考えられる。加えて証拠は、有効な抗腫瘍ワクチンを産生するために免疫系の生まれつきの武器（ｉｎｎａｔｅ  ａｒｍ）が活性化されなければならないことを示す。液性応答を促進又は産生するワクチンは、比較的長期間にわたり検出される場合がある抗体を産生する。有効であるためにこれらの抗体は、生細胞アッセイにおいて細胞表面抗原を標的とする能力を有する必要がある。抗原のエピトープに対する特異的な細胞性免疫応答を維持すること（獲得免疫）はより頻繁な免疫を必要とする場合があるが、免疫記憶細胞は前記免疫エピトープに応答及び再攻撃する能力を持続する場合がある。それにより腫瘍ワクチンに対する癌特異的細胞性免疫応答を高める能力を有する治療方法を手に入れることは、実質的な利点がある。
【０００６】
物差しの対極では、過活動な免疫系が、他の多数の疾患、特にエリテマトーデスと、（ときに「若年性糖尿病」と呼ばれる）Ｉ型糖尿病と、多発性硬化症と、乾癬と、リウマチ様関節炎と、クローン病及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のような炎症性腸疾患とのような自己免疫疾患を提示する。これらの疾患においては免疫系は自己と非自己とを適切に識別することができず、患者自身の身体の一部を攻撃する。疾病における免疫応答の過剰の他の例は、アレルギー及び喘息のような過敏症を含む。
【０００７】
自己免疫疾患又は炎症が過度の組織損傷を引き起こすとき、免疫系の抑制が自己免疫疾患又は炎症を制御するために使用されることが多い。免疫抑制薬は、移植される臓器の拒絶反応を予防するために免疫不全を意図的に誘発する。慣用される免疫抑制剤は、グルココルチコイド、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、シクロホスファミド及びメルカプトプリンを含む。臓器移植においては選択的なＴ細胞阻害が臓器の拒絶反応を予防し、シクロスポリンと、タクロリムスと、ミコフェノール酸モフェチルと、他のさまざまな薬物が使用される。
【０００８】
Ｔリンパ球は、免疫応答を調節する際に中心的な役割を果たす。ヘルパーＴ細胞はＣＤ４表面マーカーを発現し、抗体産生のためのＢ細胞に助けを提供し、ＣＤ８Ｔ細胞が細胞障害活性を発現するのを助ける。他のＣＤ４Ｔ細胞は、抗体産生及び細胞障害性を阻害する。Ｔ細胞は、感染細胞又は腫瘍原性細胞の攻撃と、体細胞への寛容との間の平衡を調節する。免疫応答性の減弱は慢性感染症及び癌を引き起こすのに対して、無調節な免疫攻撃は自己免疫を引き起こす場合がある。
【０００９】
本明細書では交換可能な用語としてデスレセプター３（ＤＲ３）とも呼ばれる腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）は、本明細書で論じられるように、Ｔ細胞の機能の調節因子である。デスレセプター３（ＤＲ３、非特許文献１）は、ＴＮＦ受容体ファミリーの一員である。デスレセプター３は、ＴＲＡＭＰ（非特許文献２）、ｗｓｌ−１（非特許文献３）、Ａｐｏ−３（非特許文献４）及びＬＡＲＤ（非特許文献５）としても知られ、典型的なデスドメインを含む。ヒトＤＲ３（ｈＤＲ３）での２９３個の細胞の形質移入は、アポトーシスを誘発し、ＮＦ−κＢを活性化した。ＤＲ３に対する同種リガンドが最近ＴＬ１Ａとして同定され（非特許文献６）、ＮＦ−κＢの誘導とｃＩＡＰ２の発現によるアポトーシスの抑制とを通じたＴ細胞上のＤＲ３に対する同時刺激活性を有することが示された（非特許文献７）。ＴＬ１Ａはおとり受容体３（ＤｃＲ３／ＴＲ−６）にも結合し、生物学的なＴＬ１Ａの到達性の微調整が非常に重要であることを示す。ヒトＤＲ３のｍＲＮＡに係る多数のスプライシングされた形態が観察されており、転写後レベルでの調節を示す（非特許文献８）。
【非特許文献１】Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９９０，１９９６
【非特許文献２】Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：７９，１９９７
【非特許文献３】Ｋｉｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：３７２，１９９６
【非特許文献４】Ｍａｒｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ６：１６６９，１９９６
【非特許文献５】Ｓｃｒｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４６１５，１９９７
【非特許文献６】Ｍｉｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：４７９，２００２
【非特許文献７】Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５：２５，２００３
【非特許文献８】Ｓｃｒｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４６１５，１９９７
【００１０】
多くのＴＮＦ−受容体ファミリーのメンバーが、アポトーシスにより細胞死を誘発する能力か、Ｔ細胞の機能のための同時刺激シグナルを誘発する能力かを有する。これらの反対の経路の調節が最近、受容体陽性Ｔ細胞のアポトーシス又は増殖を引き起こす場合がある原型的なデスドメイン含有受容体であるＴＮＦ−Ｒ１について明らかになっている（非特許文献９）。ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２及びＲＩＰを介しＴＮＦ−Ｒ１からなるシグナル伝達複合体によるＮＦ−κＢの活性化は、ＴＮＦＲＩ、ＴＲＡＤＤ及びＦＡＤＤからなるからなる第二のシグナル伝達複合体とのＦＬＩＰＬの会合を誘発し、ＮＦ−κＢのシグナル伝達が持続する限りにおいてカスパーゼ８の活性化を妨げる。ＤＲ３は、形質移入された細胞においてアポトーシスを誘発することができること、及び、ＮＦ−κＢと３種類全てのＭＡＰ−キナーゼ経路とを誘導することができることが示される（非特許文献１０−１５）。ＮＦ−κＢを阻害するがＭＡＰ−キナーゼは阻害しないこととタンパク質合成の阻害とがＤＲ３に仲介される細胞死を引き起こし、ＮＦ−κＢのシグナルが抗アポトーシスタンパク質の合成を通じて抗アポトーシス効果を仲介することを示した。
【非特許文献９】Ｍｉｃｈｅａｕ  ａｎｄ  Ｔｓｃｈｏｐｐ．Ｃｅｌｌ  １１４：１８１，２００３
【非特許文献１０】Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９９０，１９９６
【非特許文献１１】Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：７９，１９９７
【非特許文献１２】Ｋｉｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：３７２，１９９６
【非特許文献１３】Ｍａｒｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ６：１６６９，１９９６
【非特許文献１４】Ｓｃｒｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４６１５，１９９７
【非特許文献１５】Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５：２５，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ヒトＤＲ３のｍＲＮＡの発現は、主に脾臓、リンパ節、胸腺及び小腸のようなリンパ組織で顕著であり、リンパ球におけるＤＲ３の重要な役割を示す。マウスのＤＲ３は、胚性幹細胞の相同組換えにより除去された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：３４５１，２００１）。ＤＲ３−／−マウスは胸腺中において抗ＣＤ３抗体によるネガティブ選択の減少を示すが、スーパー抗原による通常のネガティブ選択と、胸腺細胞の未障害のポジティブ選択とを示す。成熟した抹消Ｔ細胞は、ＤＲ３の欠損により影響を受けなかった。顕著な量の予備的研究に関わらずＤＲ３の生理学的機能の特徴づけは不十分なままである。
【００１２】
本明細書で引用される特許文献を含む全ての科学出版物は、全ての目的のためにその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明のある局面は、腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）抗原と結合し、ＴＮＦＲ２５のアゴニストとして働く場合がある抗体に関する。ある実施態様では前記抗体は、ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を、対照抗体と比較して増大させる能力を有する。さらなる実施態様では前記抗体は、精製モノクローナル抗体４Ｃ１２である。
【００１４】
本発明の別の局面は、前記ＴＮＲＦ２５受容体に結合するポリペプチドと結合した毒性物質を含むＴＮＦＲ２５特異的毒素に関する。本局面のある実施態様では前記毒素を含む部分は、前記モノクローナル抗体４Ｃ１２か、４Ｃ１２の免疫特異的部分かを含む。別の実施態様では前記毒性物質は、放射性同位体、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素又は金属イオンから選択される。さらなる実施態様では前記ＴＮＲＦ２５受容体に結合するポリペプチドは、前記ＴＬ１Ａタンパク質又はフラグメントか、それらの変異体かである。
【００１５】
本発明の別の局面では前記ＴＮＦＲ２５特異的毒素は、患者の癌を治療する方法で使用される。具体的には前記方法は、患者に前記ＴＮＦＲ２５特異的毒素を提供することにより該患者からＣＤ４＋／ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を除去するステップと、また該患者に化学療法剤を提供するステップとを含む。
【００１６】
本発明のさらに別の局面は、細胞をＴＮＦＲ２５のアゴニストと接触させるステップを含む、該細胞上で発現したＴＮＦＲ２５受容体を活性化させる方法に関する。前記アゴニストは、モノクローナル抗体４Ｃ１２か、ＴＮＦＲ２５と結合しｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を対照抗体と比較して増大させる場合がある抗体か、可溶性ＴＬ１Ａタンパク質か、ＴＮＦＲ２５のアゴニスト抗体の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターか、可溶性ＴＬ１Ａの遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターか、ＴＮＦＲ２５の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターかから選択される場合がある。本方法は、ＴＮＦＲ２５受容体のシグナル伝達の増大を観察するステップをさらに含む。
【００１７】
本発明の付加的な局面は、ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストとして働く能力を有する抗体に関する。ある実施態様では前記抗体はＴＬ１Ａと結合し、ｇｐ９６−Ｉｇ−オボアルブミンによりクロスプライミングされたときのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞の増殖を、対照抗体と比較して減少させる能力を有する。さらなる実施態様では前記抗体は、精製モノクローナル抗体Ｌ４Ｇ６である。
【００１８】
本発明のさらなる局面は、細胞内でのＴＮＦＲ２５受容体のシグナル伝達を阻害する方法に関する。前記方法は、前記細胞をＴＮＦＲ２５のアンタゴニストと接触させるステップを含む。前記方法は、ＴＮＦＲ２５受容体のシグナル伝達の減少を観察するステップをさらに含む。
【００１９】
本発明の別の局面は、腫瘍抗原と、生物学的応答調節剤としてのＴＮＦＲ２５のアゴニストとを含む腫瘍ワクチンに関する。前記ワクチンのさらなる実施態様は、アジュバント剤も含む。
【００２０】
本発明のさらに別の局面では、腫瘍特異的抗原を単離した後、腫瘍特異的抗原とＴＮＦＲ２５のアゴニストとを含むワクチンが、前記腫瘍に対する免疫を患者に付与するために使用される。
【００２１】
本発明のさらなる局面は、消化管の炎症の治療及び／又は予防を必要とする患者にＴＮＦＲ２５のアゴニストを含む治療用組成物の有効量を提供するステップを含む、消化管の炎症を治療及び／又は予防する方法に関する。
【００２２】
本発明のさらなる局面は、ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストと免疫抑制剤とを含む臓器移植の円滑化のための治療用組成物に関する。本局面に係るある実施態様では前記免疫抑制剤は、グルココルチコイド、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、シクロホスファミド、メルカプトプリン、タクロリムス又はミコフェノール酸モフェチルである。
【００２３】
本発明の別の局面ではＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト組成物は、ドナーから宿主へ組織を移植する方法において使用される。前記方法は、ドナーから組織を取得するステップと、宿主にＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト組成物を提供するステップと、該組織を該宿主に移植するステップとを含む。
【００２４】
本発明の別の局面は、同種ＣＤ８Ｔ細胞集団のクローン性増殖を阻害する方法に関する。前記方法は、前記ＣＤ８Ｔ細胞を該細胞のコグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原に曝露するステップと、前記ＣＤ８Ｔ細胞をＴＮＦＲ２５のアンタゴニストに曝露するステップとを含む。さらなる実施態様では前記コグネイト抗原は、ドナーから宿主へ移植される組織と関連する。
【００２５】
本発明の別の局面は、配列番号４、５、６及び／又は１６と厳密な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリダイズする配列含む核酸によりエンコードされるポリペプチドを含み、前記配列はＴＬ１Ａタンパク質と結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードする、単離されたＴＮＦＲ２５のアンタゴニストに関する。ある実施態様では前記配列は、配列番号４と厳密な条件下でハイブリダイズする。別の実施態様では前記配列は、配列番号５と厳密な条件下でハイブリダイズする。さらなる実施態様では前記配列は、配列番号６と厳密な条件下でハイブリダイズする。さらなる実施態様では前記配列は、配列番号１６と厳密な条件下でハイブリダイズする。さらに別の実施態様では前記ＴＬ１Ａは、ヒト又はマウスのＴＬ１Ａである。
【００２６】
本発明の別の局面は、配列番号４、５、６及び／又は１６と厳密な条件下でハイブリダイズする配列であって、ＴＬ１Ａタンパク質と結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードする配列を含む核酸によりエンコードされるポリペプチドを含むＴＮＦＲ２５のアンタゴニストを含む治療用組成物の有効量を、肺の炎症の治療及び／又は予防を必要とする患者に提供するステップを含む、肺の炎症を治療及び／又は予防する方法に関する。
【００２７】
本発明の別の局面は、組織をドナーから取得するステップと、配列番号４、５、６及び／又は１６と厳密な条件下でハイブリダイズする配列であってＴＬ１Ａタンパク質と結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードする配列を含む核酸によりエンコードされるポリペプチドを含むＴＮＦＲ２５のアンタゴニストを宿主に提供するステップと、前記組織を該宿主へ移植するステップとを含む、ドナーから宿主へ組織を移植する方法に関する。
【００２８】
本発明の別の局面は、配列番号３及び／又は７と厳密な条件下でハイブリダイズする配列によりエンコードされるポリペプチドと、毒性物質とを含み、前記配列はＴＮＦＲ２５受容体タンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードする、組成物に関する。ある実施態様では前記毒性物質は、放射性同位体、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素及び金属イオンからなる群から選択される。
【００２９】
本発明の別の局面は、請求項３９に記載の毒素を含む組成物を患者に提供することにより該患者からＣＤ４＋／ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を除去するステップと、患者に化学療法剤を提供するステップとを含む、患者の癌を治療する方法に関する。
【００３０】
本発明のさらなる局面は、配列番号３及び／又は７と厳密な条件下でハイブリダイズする配列によりエンコードされるポリペプチドを含む組成物の有効量を消化管の炎症の治療及び／又は予防を必要とする患者に提供するステップを含み、前記配列はＴＮＦＲ２５受容体タンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードする、消化管の炎症を治療及び／又は予防する方法に関する。ある実施態様では前記炎症は、過敏性腸症候群の結果発生する症状である。別の実施態様では前記消化管の炎症は、クローン病の結果発生する症状である。
【００３１】
本発明のさらなる局面は、腫瘍抗原と、配列番号３及び／又は７と厳密な条件下でハイブリダイズする配列によりエンコードされる生物学的応答調節剤としてのポリペプチドとを含み、前記配列はＴＮＦＲ２５受容体タンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードする、腫瘍ワクチンに関する。
【００３２】
本発明のさらに別の局面は、配列番号３及び／又は７と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む発現ベクターであって、前記配列はＴＮＦＲ２５受容体タンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードする、発現ベクターに関する。
【００３３】
本発明のさらなる局面は、配列番号４、５、６及び／又は１６と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸を含む発現ベクターであって、前記配列はＴＬ１Ａタンパク質と結合する能力を有するアミノ酸配列をエンコードする、発現ベクターに関する。
【００３４】
本発明の付加的な利点は、本発明の実施に係る意図される最良の様式を単に例示する目的で本発明の好ましい実施態様のみが示され説明される以下の詳細な説明から、当業者には容易に明らかとなるだろう。当然のことながら本発明は他の異なる実施態様を有する可能性があり、その複数の詳細は、本発明から全く逸脱することなくさまざまな明らかな観点で修正することが可能である。本発明は、これらの具体的な詳細な説明の幾つか又は全てがなくとも実施される場合がある。他の例では、本発明を不必要に不明瞭にしない目的で、周知のプロセス操作は詳細に説明されない。したがって図面及び説明は、実際上例示目的とみなされるべきであり、限定目的とみなされるべきではない。
【００３５】
図面の簡単な説明
図１Ａは、リンパ節細胞内でのマウスＴＮＦＲ２５の発現を示すグラフである。ＭＦＩは、一次抗体としてのアイソタイプ対照抗体については黒数字により、抗ＴＮＦＲ２５抗体に対しては影付き数字で、示される。ＴＮＦＲ２５の検出は、一次ハムスター抗ＴＮＦＲ２５モノクローナル抗体と、その後ヤギ抗ハムスタービオチンと、ＰＥ標識ストレプトアビジンとの三重サンドイッチ法を必要とした。図１Ｂは、活性化リンパ球でのＴＮＦＲ２５の発現を示すグラフである。脾細胞の活性化が、固定化抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍＬ）及び固定化ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）か、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）かで２４時間実施された。細胞は、ＣＤ４陽性若しくはＣＤ８陽性又はＢ２２０陽性でありかつ７−ＡＡＤ陰性である細胞に対してゲートをかけられた。（下付きのａは、活性化ＣＤ４細胞、活性化ＣＤ８細胞又は活性化Ｂ細胞を表す。）ヒストグラムでは、休止脾細胞及び活性化脾細胞内でのＴＮＦＲ２５の発現についてのＭＦＩが示される。図１Ｃは、胸腺細胞でのＴＮＦＲ２５の発現を示すグラフである。胸腺細胞は、ＣＤ４／ＣＤ８ダブル陰性細胞か、ダブル陽性細胞か、シングル陽性細胞かに対してゲートをかけられ、抗ＴＮＦＲ２５に係る蛍光について評価された。
【００３６】
図２Ａは、マウスＴＮＦＲ２５のスプライシング形態を示す図である。スプライシング形態は、マウスの休止脾細胞と、マウスの株細胞とから取得されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより取得された。ＣＲＤはシステインリッチドメインであり、ＴＭは膜貫通ドメインであり、ＤＤはデスドメインであり、アスタリスクはインフレームの終止コドンである。スプライシング形態１−４では、エキソン２とエキソン３との間のイントロンはスプライシングされず中途終止コドンを含む。スプライシング形態１−４は、非機能性タンパク質のようである。（ヒトのΔ６及びΔ６，７に対応する）マウスのΔ５及びΔ６は、完全な膜貫通ドメインを欠き、ＴＬ１Ａに対する可溶性おとり受容体として働く場合がある分泌形態であると予想される。（ヒトＡ３に対応する可能性がある）Δ５，６スプライシング形態及びＦＬスプライシング形態は、本報告で導入遺伝子として研究される。（ヒトでのホモログは存在しない）Δ５，６，８及びΔ５，６，９は、膜に固定されているが前記デスドメインを欠くと予想され、変化したシグナル伝達特性を有する場合か、ドミナントネガティブなスプライシング形態として働く場合かがある。本明細書で開示される好ましいＤＮ  ＴＮＦＲ２５は、ＴＭドメインの後ろで切断された。図２Ｂは、ＴＮＦＲ２５の活性化誘発性オルタナティブスプライシングを示す図である。マウス及びヒトの両方のＴＮＦＲ２５が活性化後にスプライシングされる。ヒトのＴＮＦＲ２５のスプライシング形態はマウスのスプライシング形態よりも、ゲル電気泳動後においてサイズでよく分離されるので、ヒトのスプライシングがここで示される。スプライシング形態はシーケンシングにより確認された。ＰＢＬが、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離により単離された。各々の試料において５百万個の細胞が使用され、ｍＲＮＡｓが抽出され、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔを使用してｃＤＮＡに変換された。ＰＨＡ（５μｇ／ｍＬ）か、固定化抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍＬ）及び可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）か、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（４００ｎｇ／ｍＬ）かによるＰＢＬの活性化が、表示されたように行われた。前記細胞は表示された時間で回収され、ＲＴ−ＰＣＲｓが実施された。β−アクチンが内部標準として使用された。図２Ｃは、活性化誘発性スプライシングがＰＫＣ依存性でありタンパク質合成非依存性であることを示す図である。新たに単離されたＰＢＬ細胞が、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）単体か、イオノマイシン（４００ｎｇ／ｍＬ）単体か、その組合せかで刺激された。ＰＢＬはＨ７（５０μＭ）かシクロヘキシミド（１０μｇ／ｍＬ）かで３０分間前処理され、その後ＰＭＡ及びイオノマイシンが前記細胞培養液中に添加された。前記細胞は、１２時間後にＲＴ−ＰＣＲ分析のために回収された。
【００３７】
図３は、ＣＤ２プロモーター及びエンハンサーの存在下でのＴＮＦＲ２５導入遺伝子の発現及び機能を例示する。図３Ａは、Ｂ６野生型マウス及びアイソタイプ対照と比較した遺伝子導入マウスでのＴＮＦＲ２５の発現を示すグラフである。鼠径部のリンパ節細胞が、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｃ陽性細胞か、ＮＫ１．１陽性かつＣＤ３陰性な細胞か、ＮＫ１．１／ＣＤ３ダブル陽性細胞かに対してゲートをかけられた。対応するＭＦＩが表示される。ＦＬ  ＴＮＦＲ２５と、Δ５，６  ＴＮＦＲ２５と、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５とについての発現プロファイルは同一であった。図３Ｂは、オルタナティブスプライシングを受けたＴＮＦＲ２５を導入された腫瘍細胞のウェスタンブロットを示す図である。ＴＮＦＲ２５の３種類のスプライシング形態を形質移入されたＰ８１５細胞可溶化液由来のタンパク質５０μｇが装荷され、抗ＴＮＦＲ２５抗体１ＯＤ１でブロッティングされた。レーン１はＤＮ  ＴＮＦＲ２５であり、レーン２はΔ５，６  ＴＮＦＲ２５であり、レーン３はＦＬ  ＴＮＦＲ２５である。前記抗体は、ウェスタンブロッティングにおいてΔ５，６  ＴＮＦＲ２５を検出しない。図３Ｃは、同腹の野生型細胞と比較したＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入リンパ節細胞及び胸腺細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の細胞性の減少を例示するグラフである（ｎ＝５）。*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１。図３Ｄは、ＦＬ及びΔ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞の活性化誘発性増殖の障害を示すグラフである。精製ＣＤ４又はＣＤ８細胞の増殖が、刺激の３日後に、最後の６時間に係るチミジンの取り込みにより測定された。細胞はマイクロタイタープレート中で、可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）といっしょに又は単体で使用する固定化抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）か、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（４００ｎｇ／ｍＬ）かで活性化された。組換えマウスＩＬ−２が１０００Ｕ／ｍＬで使用された。図３Ｅは、ＦＬ  ＴＮＦＲ２５及びΔ５，６  ＴＮＦＲ２５がＮＦ−κＢを活性化することを例示する図である。ＮＦ−κＢ活性化は、ＴＮＦＲ２５のトリガリングに応答するＦＬ  ＴＮＦＲ２５（上側のパネル）又はΔ５，６  ＴＮＦＲ２５（下側のパネル）が形質移入されたＥＬ４細胞において測定された。細胞は、アゴニストのＴＮＦＲ２５抗体４Ｃ１２（５μｇ／ｍＬ）で５０分間処理された。可溶性ＴＬ１Ａは、ＴＬ１Ａが形質移入されたＥＬ４細胞由来の上清を２５％含む溶液という形態で、表示されたように２５分間、５０分間又は７５分間与えられた。膜結合性ＴＬ１Ａ（ＭＴＬ１Ａ）は、ＴＬ１Ａを形質移入されたＥＬ４細胞を、ＴＮＦＲ２５を発現しているＥＬ４細胞に直接添加することにより、５０分間与えられた。対照は、（形質移入されない）ＥＬ４細胞の上清を５０分間受け入れた。核抽出物が調製され、ＥＭＳＡにより分析された。矢印は活性化ＮＦ−κＢを指し示す。図３Ｆは、野生型ＣＤ４Ｔ細胞、ＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞、Δ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞によるＴｈ２に偏った主要なサイトカイン産生を示すグラフである。脾臓由来のＣＤ４Ｔ細胞がネガティブ選択により精製され、固定化抗ＣＤ３��体（２μｇ／ｍＬ）及び可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）で３日間活性化された。上清がサイトカインのＥＬＩＳＡ分析のために収集された。図は、３回の独立した実験を代表する。ｎ．ｓ．：有意差無し。*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１。図３Ｇは、ＴＮＦＲ２５がＴｈ１又はＴｈ２のサイトカイン産生を同時刺激する場合があることを例示するグラフである。再刺激されたＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞のサイトカイン産生が、非分極条件（Ｔｈ中性条件）、Ｔｈ１分極条件又はＴｈ２分極条件下で決定された。ＣＤ４細胞は、Ｔｈ１分極のためにＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍＬ）及び抗ＩＬ−４抗体（２０μｇ／ｍＬ）と組み合せて、Ｔｈ２分極条件のためにＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＦＮ−γ抗体（１０μｇ／ｍＬ）及び抗ＩＬ−１２抗体（１０μｇ／ｍＬ）と組み合せて、又は、単体で（Ｔｈ中性）使用する固定化抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）及び可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）で４日間活性化された。前記細胞は回収され、洗浄され、再度抗ＣＤ３抗体プレート上に２４時間播かれ、上清がサイトカインのＥＬＩＳＡ分析のために収集された。
【００３８】
図４は、ＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞の増殖の減少がアポトーシスのためではなく、ＩＬ−２又はＩＬ−２受容体の発現の欠損のためであることを示す。図４Ａは、遺伝子導入ＣＤ４及びＣＤ８細胞において、活性化によるＩＬ−２−Ｒａ（ＣＤ２５）に係る正常な上向き調節を例示するグラフである。固定化抗ＣＤ３抗体及び可溶性抗ＣＤ２８抗体での７２時間の活性化後、脾細胞は回収され、洗浄され、抗ＣＤ２５抗体−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ８抗体−ＰＥ及び抗ＣＤ４抗体−ＣＹで染色された。上側のパネルは野生型を、下側のパネルはΔ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞を示す。図４Ｂは、遺伝子導入細胞が活性化によりアポトーシスの増大を被らないことを示すグラフである。ＣＤ４細胞が、可溶性抗ｍＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）と固定化抗マウスＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）とで３日間活性化され、アネキシンＶ−ＰＥ及び７−ＡＡＤで染色された。アネキシンＶ−ＰＥ陽性かつ７−ＡＡＤ陰性の細胞がアポトーシス細胞を表した。図４Ｃは、Δ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生の減少を例示する図である。Ｔ細胞がネガティブ選択により精製され、固定化抗ＣＤ３抗体及び可溶性抗ＣＤ２８抗体で３日間活性化された。上清が、ＥＬＩＳＡ分析によりＩＬ−２産生について分析された。**ｐ＝０．００７８。図４Ｄは、ドミナントネガティブなＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞が一次応答においてＴｈ２分極していないことを例示するグラフである。脾臓由来のＣＤ４Ｔ細胞がネガティブ選択により精製され、固定化抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）及び可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）で３日間活性化された。上清が、サイトカインのＥＬＩＳＡ分析のために収集された。図は、３回の独立した実験を代表する。図４Ｅは、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウス及び野生型マウスの同じ抗体アイソタイプの応答を示すグラフである。マウスが無菌ＰＢＳ中の１００μｇのＤＮＰ−ＫＬＨで腹腔内免疫され、血清中のＤＮＰ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体が免疫の３週間後にＥＬＩＳＡにより評価された。抗ＤＮＰ特異的抗体を検出するために、高結合９６ウェルプレートが０．８μｇ／ｍＬのＤＮＰ−ＢＳＡでコーティングされた。図は、３回の独立した実験のうちの１回を表す。
【００３９】
図５は、ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスがｉｎ  ｖｉｖｏでの負荷後にＴｈ２に偏った応答を行うことを例示する。図５Ａは、免疫されたＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスでは抗体アイソタイプがＴｈ２に偏っていることを示すグラフである。マウスが、アジュバント剤を含まない無菌ＰＢＳ中の１００μｇのＤＮＰ−ＫＬＨで腹腔内免疫された。血清中のＤＮＰ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体が、免疫の１週間後にＥＬＩＳＡにより評価された。抗ＤＮＰ特異的抗体を検出するために、高結合９６ウェルプレートが０．８μｇ／ｍＬのＤＮＰ−ＢＳＡでコーティングされた。データは、３回の独立した実験のうちの１回を表す。**：ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．：有意差無し。図５Ｂは、ＴＮＦＲ２５のシグナルが気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球増加症を調節することを例示するグラフである。野生型マウス及びΔ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスの免疫及び気道負荷が、実施例１０−１５で説明されるように実施された。気道は洗浄され、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色サイトスピン標本から細胞数差が取得された。*：ｐ＜０．０５。ｎ．ｓ．：有意差無し。図５Ｃは、ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおける肺の炎症の増大を示す図である。オボアルブミンで腹腔内感作され気道負荷されたマウスの肺の組織学的検査結果。気管支洗浄後、肺が除去され１０％中性緩衝ホルマリン中で固定された。前記肺はその後パラフィン中に包埋され、５μｍ厚に切断され、粘液産生を検出するためにＨ＆Ｅ（左側のパネル）又は過ヨウ素酸シッフ試薬（右側のパネル）で染色された。上側の２枚のパネルは野生型Ｂ６マウスについて、下側の２枚のパネルはΔ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスについての結果を示す。図５Ｄは、ＴＮＦＲ２５のシグナルが血清ＩｇＥレベルを制御することを例示するグラフである。マウスは、０日目と噴霧負荷の３日後（１５日目）とに採血された。血清は分離され、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりオボアルブミン特異的ＩｇＥについて分析された。オボアルブミン特異的ＩｇＥに対して利用可能な標準タンパク質がないため、結果はＯ．Ｄ．単位で表される。図は、３回の独立した実験のうちの１回を表す。**：ｐ＜０．０１。図５Ｅは、ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスでの気管支リンパ節細胞によるＴｈ２サイトカインの産生の増大を示すグラフである。気管支リンパ節細胞が空路負荷の１日後（１３日目）に回収され、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで１００μｇ／ｍＬのオボアルブミンで４日間再刺激された。上清はその後ＥＬＩＳＡによりサイトカイン産生について分析された。図は２回の独立した実験を代表する。*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１。
【００４０】
図６は、ドミナントネガティブなＴＮＦＲ２５がＴｈ２分極と肺の炎症とを抑制することを例示する。図６Ａは、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５導入遺伝子が内在のＴＮＦＲ２５によるサイトカインの同時刺激を阻害することを例示するグラフである。野生型及びＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞が、抗ＣＤ３抗体か、アゴニストの抗ＴＮＦＲ２５抗体４Ｃ１２と抗ＣＤ３抗体との組合せかで３日間刺激され、上清がＥＬＩＳＡによりサイトカインについて分析された。図６Ｂは、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５が内在のＴＮＦＲ２５による増殖の同時刺激を阻害することを例示するグラフである。増殖アッセイでは野生型及びＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞が、抗ＣＤ３抗体か、４Ｃ１２か、抗ＣＤ３抗体及び４Ｃ１２の組合せかで３日間活性化され、最後の８時間に係るチミジンの取り込みが測定された。図６Ｃは、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞が二次活性化におけるＴｈ２サイトカインの減少を引き起こすことを例示するグラフである。野生型及び遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞がネガティブ選択により精製され、固定化抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）及び可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）で３日間活性化された。細胞はその後回収され、洗浄され、再度プレート上に播かれ、固定化抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍＬ）で２日間再刺激された。上清はサイトカインのＥＬＩＳＡ分析のために収集された。ｎ．ｓ．：有意差無し。***：ｐ＜０．００１。図６Ｄは、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴｈ２分極に耐性を示すことを示すグラフである。野生型及びＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞が精製され、中性条件（ＴｈＮ）又は（ＩＬ−４を添加すること、及び、ＩＦＮ−γを抗体で阻害することによる）Ｔｈ２分極条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で４日間活性化された。細胞は回収され、洗浄され、再度抗ＣＤ３抗体プレート上に２４時間播かれ、上清が回収され、サイトカインがＥＬＩＳＡにより分析された。図６Ｅは、野生型マウスと比較したＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおけるＢＡＬＦ中での細胞の浸出の減少を例示するグラフである。マウスは、標準的プロトコールに従いオボアルブミンで一次刺激され、その後噴霧負荷された。ｎ＝５。*：ｐ＜０．０５。図６Ｆは、免疫及び気道負荷の後でのＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおける肺の炎症の抑制を示す図である。上側のパネル：抗原の噴霧曝露後のＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスでは血管周囲の浸潤物がない。下側のパネル：ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスでは粘液の過剰産生と、杯細胞の過剰形成とがない。肺の炎症は、図５で説明されるようにオボアルブミン免疫と、その後の噴霧曝露とにより誘発された。野生型対照マウスは、図５で示されるように典型的な炎症を有した。図６Ｇは、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおけるオボアルブミン特異的ＩｇＥ産生の抑制を例示するグラフである。血清中のオボアルブミン特異的ＩｇＥは、ＥＬＩＳＡにより決定された。**：ｐ＜０．０１。図６Ｈは、気管支リンパ節におけるＤＮ  ＴＮＦＲ２５によるＴｈ１サイトカインではなくＴｈ２サイトカインの産生抑制を示すグラフである。気管支リンパ節は、噴霧負荷の１日後に回収され、細胞は１００１ｔｇ／ｍＬのオボアルブミンで４日間再刺激された。上清はその後ＥＬＩＳＡによりサイトカインの産生について分析された。図は２回の独立した実験の代表である。ｎ．ｄ．：検出されなかった。ｎ．ｓ．：有意差無し。*：ｐ＜０．０５。
【００４１】
図７は、ＴＬ１Ａ阻害抗体が肺の炎症を抑制し、肺でのＴｈ２サイトカイン産生を減少させることを例示する。図７Ａ−Ｄは、抗ＴＬ１Ａ抗体Ｌ４Ｇ６がＴＬ１Ａの機能的アンタゴニストであることを示すグラフである。図７Ａは、適当な抗体で染色されたＦＬ  ＴＮＦＲ２５形質移入Ｐ８１５細胞のフローサイトメトリー結果である。図７Ｂは、適当な抗体で染色されたΔ５，６  ＴＮＦＲ２５形質移入Ｐ８１５細胞のフローサイトメトリー結果である。図７Ｃは、適当な抗体で染色されたＴＬ１Ａ形質移入Ｐ８１５細胞のフローサイトメトリー結果である。図７Ｄは、ＴＮＦＲ２５を形質移入された細胞に係るＴＬ１Ａに仲介される細胞障害性をＬ４Ｇ６が阻害することを示すグラフである。ＴＬ１Ａ形質移入Ｐ８１５細胞の上清から回収され段階希釈された可溶性ＴＬ１Ａが、５１Ｃｒ標識ＴＮＦＲ２５形質移入Ｐ８１５標的細胞と混合された。さまざまな抗マウスＴＬ１Ａモノクローナル抗体がアッセイに添加され、５１Ｃｒの放出が５時間後に分析された。図７Ｅは、ＴＬ１Ａ阻害抗体Ｌ４Ｇ６が野生型Ｃ５７Ｂ１６マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで粘液産生と肺の炎症とを抑制することを例示する図である。模式図：オボアルブミンでの一次刺激及び噴霧負荷と、阻害抗体（Ｌ４Ｇ６）又は対照抗体の投与とのスケジュール。対照ＩｇＧ（左）及びＬ４Ｇ６−ＩｇＧ（右）でのＰＡＳ染色後の肺の組織学的検査結果。Ｌ４Ｇ６処理マウスにおける粘液産生の欠如に留意せよ。（矢印は対照ＩｇＧで処理されたマウスにおける粘液を指す。）図７Ｆは、対照ＩｇＧ処理マウスと比較したＬ４Ｇ６処理マウスにおけるＢＡＬＦ中での細胞の浸出の減少を示すグラフである。*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．：有意差無し。図７Ｇは、Ｌ４Ｇ６でのＴＬ１Ａ阻害後の、オボアルブミンで再刺激された気管支リンパ節細胞によるＩＬ−５及びＩＬ−１３の産生の減少を例示するグラフである。**：ｐ＜０．０１。***：ｐ＜０．００１。詳細な実験方法は図５で説明されたのと同様である。図７Ｈは、肺におけるＣＤ１１ｃ陽性細胞の亜集団（矢印）に対する噴霧負荷後のＴＬ１Ａの発現を示すグラフである。気管支リンパ節がＯＶＡ噴霧負荷の前後に回収され、ＣＤ１１ｃ細胞はＴＬ１Ａ発現について分析された。他の全ての気管支リンパ節細胞は、ＴＬ１Ａ陰性であった。図７Ｉは、気道負荷後のオボアルブミン免疫マウスの気管支リンパ節細胞由来のリンパ球におけるＴＬ１Ａ発現の欠如を例示するグラフである。単一細胞懸濁液が、抗ＴＬ１Ａ抗体を一次モノクローナル抗体として使用する三重サンドイッチ法で染色された。細胞は、集団マーカーとしてそれぞれの標識抗体を使用してゲートをかけられ、ＴＬ１Ａヒストグラムが表示された。抗ＴＬ１Ａ抗体は、アイソタイプ対照である。図７Ｊは、ＴＬ１Ａがｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化Ｔリンパ球において発現されることを例示するグラフである。脾細胞が、プレートに結合した抗ＣＤ３抗体かＬＰＳかで２４時間活性化され、その後図１に示されるように、また表示される集団マーカーを使用して、抗ＴＬ１Ａ抗体を使用する三重サンドイッチ法で染色された。Ｂ細胞は、ＬＰＳ活性化の後でさえもＴＬ１Ａ陰性である。前記集団マーカーでゲートをかけ、活性化細胞でのＴＬ１Ａ発現が示される。
【００４２】
図８は、ＮＫＴ細胞における肺の炎症の誘発のためにＴＮＦＲ２５のシグナルが必要とされることを示すグラフである。ＮＫＴ欠損Ｊα１８ノックアウトマウス（Ｃｕｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，１６２３−６（１９９７））が、材料及び方法における標準的プロトコールに示されるようにオボアルブミン及びミョウバンで一次刺激された。１１日目に前記マウスは、静脈内養子移植により、３１０万個の部分的に精製された野生型ＮＫＴ細胞又はＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＮＫＴ細胞か、ＰＢＳかを表示されるように受け入れた。前記マウスは１２日目にオボアルブミンを噴霧され、１４日目に分析された。野生型マウスは肺の炎症の誘発についての陽性対照の役割を果たし、Ｊα１８ノックアウトマウスは陰性対照として細胞養子移植を受けずに免疫されオボアルブミン噴霧を受けた。データは、２回の独立した実験における各群４匹のマウスについてのものである。Ｊαは、ＮＫＴ欠損マウスである（Ｃｕｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，１６２３−６（１９９７））。
【００４３】
図９は、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＲ２５に仲介される、肺におけるＮＫＴ細胞のトリガリングと、ＣＤ４細胞のＴｈ２分極とについてのモデルを例示する図である。前記モデルは、ＩＬ−１３産生とＡＨＲの誘発とに寄与する場合があるＴＬ１Ａ及びＴＮＦＲ２５の間の相互作用の可能性を示す。ＮＫＴ細胞によるＩＬ−１３産生の必要性についての証拠は、過去に提供された（Ａｋｂａｒｉ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，５８２−８（２００３））。現在の情報は、肺の炎症についてのＮＫＴ細胞へのＴＮＦＲ２５のシグナルの必要性と、ＣＤ１１ｃ＋細胞によるＴＬ１Ａの発現と、ＴＮＦＲ２５によるＣＤ４  Ｔｈ２エフェクターの同時刺激とを示す。ＣＤ４エフェクターはＴＬ１Ａを発現する場合があるので、ＣＤ４細胞及びＮＫＴ細胞の間のＴＬ１Ａ／ＴＮＦＲ２５相互作用が喘息における相乗効果のための分子結合を提供する可能性がある。加えて他の肺関連細胞がＴＬ１Ａを発現し、肺の炎症のトリガリングを助ける場合がある。
【００４４】
図１０は、マウスが１００万個のＯＴ−Ｉ−ｇｆｐを静脈内投与された実験の結果を示す図である。２日後にマウスは、ＰＢＳ中の表示される用量のオボアルブミン（青色の曲線）か、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ又は３Ｔ３−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ（前記細胞数の注射された細胞により２４時間以内に分泌されたｇｐ９６−Ｉｇの量（単位：ｎｇ）は横軸に表示される。）か、３Ｔ３−ｏｖａ（前記細胞数の注射された細胞により２４時間以内に分泌されたオボアルブミンの量は横軸に表示される。）かで、腹腔内免疫された。５日後、腹膜腔（ＰＥＣ）及び脾臓におけるＯＴ−Ｉの増殖がフローサイトメトリーにより決定された。３Ｔ３−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫によるＣＤ８細胞におけるＯＴ−Ｉの出現頻度は、ＰＥＣでは５０％までであり、脾臓では８％までであった。
【００４５】
図１１Ａは、抗ＴＮＦＲ２５モノクローナル抗体４Ｃ１２がＴＮＦＲ２５を形質移入されたＥＬ４細胞に対してはアゴニストとして作用し殺すが、野生型ＥＬ４細胞に対してはそのように作用しない実験の結果を示す図である。図１１Ｂでは、５０μｇのアゴニストの４Ｃ１２か、アンタゴニストの抗ＴＬ１Ａ抗体Ｌ４Ｇ６か、対照ＩｇＧかが、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫の２４時間後及び７２時間後に腹腔内投与された。４Ｃ１２はＯＴ−Ｉ増殖の８−１０倍の増加と、腹膜浸出細胞の倍増とを引き起こした（１群当たりのマウス数は、ｎ＝４である。）。抗ＴＬ１Ａ抗体はＣＤ８の増殖を阻害した。
【００４６】
図１２は、熱ショックタンパク質ｇｐ９６によるＣＤ８細胞のクロスプライミングを示す図である。（同種又は同系の）ワクチン細胞がｇｐ９６−Ｉｇ及びオボアルブミンを形質移入されるとすぐに、オボアルブミンペプチドと結合したｇｐ９６−Ｉｇを分泌した。Ｇｐ９６は、その結合ペプチドといっしょにｇｐ９６−Ｉｇの活性化及び貪食をもたらすＤＣ上でＣＤ９１及びＴＬＲ２／４により検出された。活性化ＤＣは、（ＣＤ４０−Ｌと関係なく）Ｂ７を上向き調節し、（Ｂ６マウスでは）ｇｐ９６結合ペプチドをＫｂを介して交差提示（ｃｒｏｓｓ−ｒｅｓｅｎｔ）する。ＯＴ−Ｉは、Ｋｂ−ＯＶＡに特異的なＢ６マウスに養子移植されるｇｆｐを発現するＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ８細胞である。前記細胞の増殖は、緑色蛍光タンパク質により容易に測定される場合がある。
【００４７】
図１３は、ＴＮＦＲ２５を発現するＦｏｘＰ３陽性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇｓを示すグラフである。ＣＤ４細胞がＢ細胞、ＣＤ８細胞及び単球を除去することにより精製され、その後ＣＤ２５に対する磁気選別によりポジティブ選択され、その後活性化された。
【００４８】
図１４は、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスがＤＳＳ誘発性大腸炎から回復できないことを示すグラフである。各群につき５匹のマウスが、飲料水中の２％ＤＳＳを８日間受け入れ、その後通常の水に交換された。
【００４９】
図１５は、ＴＮＦＲ２５のシグナルがＴｒｅｇ阻害を消失させることを示すグラフである。
【００５０】
図１６は、ｇｐ９６−Ｉｇの腹腔内免疫後に粘膜に位置するＧｆｐ−ＯＴ−Ｉを示すグラフである。マウスは、１００万個のｇｆｐ−ＯＴ−Ｉを養子移植により静脈内投与された。２日後前記マウスは、４００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ（左側のパネル）か、４００万個のＥＧ７（右側のパネル）かを刺激として腹腔内投与された。４日後、ＰＥＣ、脾臓及びリンパ節における細胞の通常の分析に加えて、ＩＥＬ、パイエル板及びＬＰＬにおけるｇｆｐ−ＯＴ−Ｉの出現頻度が分析された。
【００５１】
図１７は、配列番号１−７及び配列番号１６と、選択される公開データベースのアクセッション番号とを示す。
【００５２】
発明の詳細な説明
免疫系を刺激する場合か、免疫系を間接的に増強する場合か、他の場合には免疫抑制効果を有する場合かがある免疫調節剤を利用する新規な組成物及び方法を提供することが本発明の目的である。本明細書で開示されるＴＮＦＲ２５のアゴニストは、腫瘍ワクチンといっしょに与えられるときに癌と戦うための身体能力を高める目的か、方向づける目的か、回復させる目的かのために、身体の細胞性免疫防御と癌細胞との間の相互作用を変化させる生物学的応答調節剤を提供する。本明細書で開示されるＴＮＦＲ２５特異的毒性物質は、癌患者から自然発生の免疫抑制細胞を除去することにより化学療法の投与計画の有効性を増大させる能力を有する。本明細書で開示されるＴＮＦＲ２５のアゴニストは、治癒効果を有する場合もある。中でも前記ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、炎症性腸疾患のような慢性炎症により引き起こされる疾病を治療するために使用される場合がある。本明細書で開示されるＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、ＣＤ８Ｔ細胞に仲介される細胞性免疫応答を阻害する能力を有し、例えば喘息を治療する場合と、組織移植後の臓器又は組織の拒絶反応を軽減する場合とがある。
【００５３】
１．定義
本発明の説明に際し以下の用語が使用され、以下に示されるように定義されることが意図される。
【００５４】
「抗原」は、抗体分子により特異的に結合される場合があるいずれかの物質を含む。したがって「抗原」という用語は、単純な中間代謝産物、糖、脂質、オータコイド（ａｕｔｏａｃｉｄｓ）及びホルモンと、複雑な炭水化物、リン脂質、核酸及びタンパク質のような高分子とを含むがこれらに限定されない生体分子を包含する。
【００５５】
「抗原組成物」は、（例えばペプチド又はポリペプチドのような）抗原か、（例えば抗原発現ベクターのような）抗原をエンコードする核酸か、抗原を発現又は提示する細胞かを含む場合がある。その全体が引用により本明細書に取り込まれる米国特許出願公開公報第２００３／０１８５８４０号明細書を参照せよ。
【００５６】
「免疫原」は、抗原特異的免疫応答をもたらすリンパ球活性化を開始する能力を有する高分子の抗原である。したがって免疫原は、宿主の免疫系を刺激して分泌性、液性及び／又は細胞性の抗原特異的応答を開始する１個又は２個以上のエピトープを含むいずれかの分子を含む。
【００５７】
「抗体」という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製物を包含する。本発明の抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ及びヒトを含むいずれかの哺乳類において調製される場合がある。前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥと、それらのサブクラスとのような免疫グロブリンのクラスの１つのメンバーの場合があり、好ましくはＩｇＧ１抗体である。
【００５８】
「抗体」という用語は、本明細書で説明される抗体の機能的等価物も指す。機能的等価物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性を有し、例えばキメラ抗体、ハイブリッド抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体と、それらのフラグメントとを含む。かかる機能的等価物を作成する方法は、ＰＣＴ出願国際公開公報第９３／２１３１９号明細書、欧州特許出願第２３９，４００号明細書、ＰＣＴ出願国際公開公報第８９／０９６２２号明細書、欧州特許出願第３３８，７４５号明細書及び欧州特許出願第３３２，４２４号明細書に開示される。機能的等価物は、本発明の抗体の可変領域又は超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本明細書では「実質的に同じ」アミノ酸配列は、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４−２４４８（１９８８）に従うＦＡＳＴＡ検索法により決定される相同性であって、別のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列と定義される。
【００５９】
本明細書で用いられるところの「モノクローナル抗体」という用語は、均一な抗体集団を有する抗体組成物を指す。前記用語は前記抗体の種又は出所に関して限定されず、作成方法により限定されることも意図されない。前記用語は、全部の免疫グロブリンを包含する。
【００６０】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作成する方法は当業者に既知である。ポリクローナル抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギのような適切な動物を目的の抗原で免疫することにより産生される。免疫原性を亢進させるために前記抗原は、免疫の前にキャリアーと結合させられる場合がある。適切なキャリアーは典型的には、大きく緩徐に代謝されるタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸共重合体、（油滴又はリポソームのような）脂質凝集体及び不活性ウィルス粒子のような高分子である。かかるキャリアーは当業者に周知である。さらに前記抗原は、その免疫原性を亢進させるためにジフテリア、テタヌス、コレラ等由来のトキソイドのような細菌性トキソイドと結合させられる場合がある。
【００６１】
ウサギ、ヒツジ及びヤギは、大量の血清が必要とされる場合におけるポリクローナル血清の調製にとって好ましい。これらの動物は、標識抗ウサギ抗体、標識抗ヒツジ抗体、標識抗ヤギ抗体の利用可能性のためにも良好な設計上の選択である。一般的には免疫は、生理食塩水中で、好ましくはフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）のようなアジュバント剤中で前記抗原を混合又は乳化するステップと、前記混合液又は乳化液を非経口で（一般的には皮下又は筋肉内に）注射するステップとにより実施される。一般的には前記動物は２−６週間後に、好ましくはフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を使用して、生理食塩水中の抗原の１回又は２回以上の注射により追加免疫される。抗体は、当業者に既知の方法を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫により産生される場合もある。ポリクローナル抗血清は、その後前記免疫された動物から取得される。
【００６２】
モノクローナル抗体は、一般的にはＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７に記載の方法、その修正された方法、又は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”ｉｎ  Ｂｕｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５）に記載の方法と、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６，１２７５−１２８１（１９８９）に記載の組換えＤＮＡ法とを使用して調製される。
【００６３】
典型的にはマウス又はラットは、上述のように免疫される。しかし血清を抽出するために前記動物から採血するというよりも、脾臓（と任意に複数の大きなリンパ節と）が除去され、単一細胞にまで分離される。必要に応じて前記脾臓細胞は、前記抗原でコーティングされたプレート又はウェルに細胞懸濁液を適用することにより（非特異的接着細胞の除去後）スクリーニングされる場合がある。前記抗原に特異的な膜結合性免疫グロブリンを発現するＢ細胞は前記プレートに結合し、前記懸濁液の残りといっしょに洗浄除去されない。結果として得られるＢ細胞か、全ての分離された脾臓細胞かは、その後ハイブリドーマを形成するために骨髄腫細胞との融合を誘発され、（例えばヒポキサンチン  アミノプテリン  チミジン培地、「ＨＡＴ」のような）選択培地で培養される。結果として得られるハイブリドーマは、限界希釈によりプレートに播かれ、免疫抗原に特異的に結合する（また、関係のない抗原には結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。選択されたモノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマは、その後（例えば組織培養ボトル又は中空糸型反応器においてというように）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は（例えばマウスの腹水においてというように）ｉｎ  ｖｉｖｏで培養される。
【００６４】
「抗原結合部位」又は「結合部分」は、抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の一部を指す。前記抗原結合部位は、重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）のＮ末端の可変領域（Ｖ領域）のアミノ酸残基により形成される。前記重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３箇所の高度に変化する配列は、「フレームワーク領域」又は「ＦＲｓ」として知られるより保存性の高い隣接配列の間に挿入される「超可変領域」と呼ばれる。したがって「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにおける超可変領域の間に自然に見出され、該超可変領域に隣接するアミノ酸配列を指す。抗体分子では、抗原結合表面を形成するために、軽鎖の３箇所の超可変領域と重鎖の３箇所の超可変領域とがお互いに対して３次元空間に配置される。前記抗原結合表面は、結合する抗原の３次元表面に対して相補的であり、前記重鎖及び軽鎖の各々の３箇所の超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲｓ」と呼ばれる。
【００６５】
本明細書で用いられるところの「免疫特異的な」、「免疫学的結合」及び「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と該免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じるタイプの非共有型相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、該相互作用の解離定数（Ｋd）という用語で表現される場合があり、より小さいＫdはより大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当業者に周知の方法を使用して定量される場合がある。かかる方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成速度及び解離速度を測定するステップを含み、これらの速度は該複合体形成パートナーの濃度と、前記相互作用の親和性と、両方向の速度に等しく影響を与える幾何学パラメーターとに依存する。したがって「正方向の速度定数（ｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋon）及び「逆方向の速度定数（ｏｆｆ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ」（Ｋoff）の両方が、前記濃度と、実際の結合速度及び解離速度との計算により決定される場合がある。Ｋoff／Ｋonの比が親和性に関係のない全てのパラメーターの削除を可能にし、したがってＫoff／Ｋonの比は解離定数Ｋdに等しい。概説としてはＤａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照せよ。
【００６６】
抗体分子の免疫学的結合特性を示す能力を有する、抗原結合部位を含む多数の治療上有用な分子が、当業者に周知である。タンパク質分解酵素パパインは複数のフラグメントを生成するためにＩｇＧ分子を選択的に切断し、該複数のフラグメントのうちの２本（「Ｆ（ａｂ）」フラグメント）は各々がインタクトな抗原結合部位を含む共有型ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む複数のフラグメントを提供するためにＩｇＧ分子を切断することができる。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ免疫グロブリン分子の、まれな場合ではＩｇＧ又はＩｇＡ免疫グロブリン分子の選択的なタンパク質切断により生成される場合がある。しかしＦｖフラグメントは、当業者に既知の組換え技術を使用して誘導されるのがより一般的である。前記Ｆｖフラグメントは、ネイティブの抗体分子に係る抗原の認識及び結合の容量の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有型ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２と、Ｈｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０と、Ｅｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６とを参照せよ。
【００６７】
一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドをエンコードするリンカーにより連結されるＶＨ領域及びＶＬ領域をエンコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現される共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３を参照せよ。もともと凝集しているが化学的には別個のものである抗体Ｖ領域由来の軽鎖及び重鎖ポリペプチドを抗原結合部位の構造と実質的に類似する３次元構造に折り畳めるｓＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するために、多数の方法が説明される。例えばＨｕｓｔｏｎらの米国特許公報第５，０９１，５１３号及び第５，１３２，４０５号明細書と、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許公報第４，９４６，７７８号明細書とを参照せよ。
【００６８】
本明細書で用いられるところの「コグネイト抗原(ｃｏｇｎａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ)」は、ＣＤ８Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が免疫特異的である抗原を指す。例えば病原体と、移植された組織（アロ抗原）と、腫瘍細胞とから一般的に導かれるかかる抗原は、前記免疫系により非自己として認識される。前記コグネイト抗原のＣＤ８Ｔ細胞受容体への結合は、かかるＴ細胞のクローン性増殖をもたらす。増殖する同種ＣＤ８Ｔ細胞集団は、その後有害なコグネイト抗原の源に対して細胞性免疫学的応答を開始することができる。
【００６９】
本発明の抗体は、「免疫毒素」を作成するために使用される場合もある。前記ハイブリッド分子は、抗体又は抗原の特異性を前記毒素の毒性と組み合わせる。それにより免疫毒素分子は、抗原結合部分と毒性物質部分とを有する。免疫毒素は、好ましくは例えばＴＮＦＲ２５のような細胞表面分子に対して特異的であり、該細胞表面分子を発現する細胞への毒性物質の送達を促進する。
【００７０】
好ましくは前記「毒性物質」は、該毒性物質が送達される細胞に対する細胞増殖抑制効果及び／又は細胞障害効果を有する。好ましい毒性物質は例えば、放射性同位体、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素及び金属イオンである。毒性物質は、ヨウ素１３１、インジウム１１１及びテクネチウム９９ｍと、テクネチウム９９ｍと、インジウム１１１と、イットリウム９０と、ドキソルビシン（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：１１８９−１１９３）と、ダウノルビシン（Ｄｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：１４８−１５０；Ｄｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：６０９７−６１０２）と、メトトレキサート（Ｕａｄｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ  Ｎａｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７４：２９−３５；Ｄｅｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：３７５１−３７５５）と、クロラムブシル（Ｓｙｍｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３３６１−３３６６）とを含むがこれらに限定されない。他の毒性物質は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素及び緑膿菌外毒素か、それらの酵素活性部分（Ａ鎖）かを含む。例えばＦｒａｎｋｅｌらの米国特許公報第４，７５３，８９４号明細書と、Ｎｅｖｅｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ６２：７５−９１と、Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０４と、Ｖｉｔｔｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ６２：１５８−１８３と、Ｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４２：４５７−４６４と、Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：１７１−１７３とを参照せよ。モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、アルファ−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）及び／又はエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）のような酵素活性毒素及びそれらのフラグメントも含まれる。
【００７１】
「毒性物質」は化学療法剤の場合もある。本明細書で用いられるところの「化学療法剤」という用語は総じて、不要な細胞増殖を停止、遅延又は逆行させるために投与される化合物に関する。好ましくはかかる化学療法剤は、抗増殖効果を有する。
【００７２】
化学療法剤は、例えば５−ＦＵのような抗代謝剤の場合がある。５−ＦＵに基づく化学療法は、ロイコボリンのような他の化学療法剤、又は、ウラシル、５−エチニルウラシル、ブロモビニルウラシル、チミン、ベンジルオキシベンジルウラシル（ＢＢＵ）若しくは５−クロロ−２，４−ジヒドロキシピリジンのようなＤＰＤ阻害剤といっしょに行う５−ＦＵ又はその誘導体の投与か、単体で行う５−ＦＵ又はその誘導体の投与かを含む。さらに、化学式（Ｉ）の５’−デオキシ−シチジン誘導体と、５−ＦＵ又はその誘導体との同時投与が、５−ＦＵ又はその誘導体とＤＰＤ阻害剤５−エチニルウラシルとの組合せと比較して、化学療法剤の腫瘍組織への選択的な送達を有意に向上させることが見出された。
【００７３】
代替的に遺伝毒性物質は、持続的なゲノムの病変を形成する物質であり、不要な細胞増殖の臨床的管理においては化学療法剤としての使用が好まれる。遺伝毒性物質に誘発されるＤＮＡ損傷の細胞修復の速度と、細胞分裂周期を介する細胞増殖の速度とは、遺伝毒性物質両方の成果に影響を及ぼす。多くの癌を治療するために使用される遺伝毒性化合物の一般的なクラスは、ＤＮＡアルキル化剤及びＤＮＡ挿入剤である。ソラレンは、乾癬、白斑症、真菌感染症及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫のような皮膚疾患の光化学療法での治療において有用であることが知られる遺伝毒性化合物である。Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐａｒｔ  ２  Ｃａｒｄｉｎａｌ  Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｈ．６０（１２ｔｈ  ｅｄ．１９９１）を参照せよ。そのメンバーがＤＮＡをアルキル化する場合か、ＤＮＡの間に介入する場合かがある遺伝毒性化合物の別の一般的なクラスは、合成及び天然の抗生物質を含む。アムサクリンと、アクチノマイシンＡ、Ｃ、（別名ダクチノマイシンとして知られる）Ｄ又は（別名ＫＳ４として知られる）Ｆと、アザセリンと、ブレオマイシンと、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ、カルビシン）、ダウノマイシン（ダウノルビシン）又は１４−ヒドロキシダウノマイシン（アドリアマイシン又はドキソルビシン）と、マイトマイシンＡ、Ｂ又はＣと、ミトキサントロンと、プリカマイシン（ミトラマイシン）と、これらに類するものとに代表される化合物のクラスを含むがこれらに限定されない抗腫瘍性抗生物質は、本明細書では特に関心がある。ＤＮＡをアルキル化する慣用される遺伝毒性物質のさらに別の一般的なクラスは、ハロエチルニトロソ尿素、特にクロロエチルニトロソ尿素を含むクラスである。この広範なクラスの代表的なメンバーは、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン及びストレプトゾトシンを含む。ハロエチルニトロソ尿素の第一薬剤（ｆｉｒｓｔ  ａｇｅｎｔｓ）は、前述の代表的な化合物のいずれかに係る類縁体又は誘導体の場合がある。
【００７４】
シスプラチン又はオキサリプラチンのような白金配位化合物により現在対処可能となっている腫瘍は、髄芽細胞腫及び神経芽細胞腫に加えて、精巣癌、子宮内膜癌、頸部癌、胃癌、扁平上皮癌、副腎皮質癌及び小細胞性肺癌を含む。他の細胞障害性抗癌治療薬は、例えば精巣癌治療のためのＢＥＰ（ブレオマイシン、エトポシド、シスプラチン）、膀胱癌治療のためのＭＶＡＣ（メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シスプラチン）、非小細胞肺癌治療のためのＭＶＰ（ミトマイシンＣ、ビンブラスチン、シスプラチン）を含む。
【００７５】
そのメンバーがＤＮＡをアルキル化する場合がある遺伝毒性物質のさらに別の一般的なクラスは、硫黄マスタード及びナイトロジェンマスタードを含む。これらの化合物は、主にグアニンの７位の窒素原子に共有結合付加体を形成することによりＤＮＡを損傷する。この広範なクラスの代表的なメンバーは、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｉｎ）、トロホスファミド及びこれらに類するものを含む。ゲノムの病変の位置として１種類又は２種類以上の所定のゲノム標的を選択することが望まれる場合には、選択された細胞のゲノムの特定の配列と共有的又は非共有的に相互作用するオリゴヌクレオチド又はその類縁体が、遺伝毒性物質として使用される場合もある。
【００７６】
そのメンバーがＤＮＡをアルキル化する場合がある遺伝毒性物質の別のクラスは、エチレンイミン及びメチルメラミンを含む。これらのクラスは、例えばアルトレタミン（ヘキサメチルメラミン）、トリエチレンホスホラミド（ＴＥＰＡ）、トリエチレンチオホスホラミド（ＴｈｉｏＴＥＰＡ）及びトリエチレンメラミンを含む。
【００７７】
ＤＮＡアルキル化剤の付加的なクラスは、ブスルファンに代表されるスルホン酸アルキルと、ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）に代表されるアジニジン（ａｚｉｎｉｄｉｎｅｓ）と、例えばミトグアゾン、ミトキサントロン及びプロカルバジンに代表されるその他とを含む。各々のこれらのクラスは、それぞれのクラスに代表的な化合物の類縁体及び誘導体を含む。
【００７８】
１つの実施態様では化学療法剤は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２−ｎｅｕのような受容体チロシンキナーゼの阻害剤であり、細胞増殖の選択的阻害剤として使用される。例えばＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるアーブスタチン（ｅｒｂｓｔａｔｉｎ）は、ＥＧＦＲを発現するヒト癌細胞の増殖を低減する。スチレンのさまざまな誘導体も、チロシンキナーゼ阻害特性を有すること、及び、抗腫瘍剤として有用であることが説明される。２種類のかかるスチレン誘導体は、ヌードマウスに注射されたヒト扁平上皮癌の増殖を減少させることによりその有効性が示されるＣｌａｓｓ  Ｉ  ＲＴＫ阻害剤である。特定の４−アニリノキナゾリン誘導体が受容体チロシンキナーゼの阻害剤として有用である。これらの化合物により示される非常に緊密な構造−活性の関係は、特徴の明確な結合様式を表示し、前記キナゾリン環はアデニンポケットにおいて結合し、前記アニリノ環は隣接する独特の親油性ポケットにおいて結合する。（２種類は可逆的阻害剤であり１種類は不可逆阻害剤である）３種類の４−アニリノキナゾリン類縁体は、抗癌薬として臨床的に評価されている。加えて、ＨＥＲ２−ｎｅｕ過剰発現転移性乳癌の治療のためのモノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））。Ｓｃｈｅｕｒｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０：２０９１−２０９６，２０００を参照せよ。
【００７９】
「発現ベクター」は、該発現ベクターが含む別のポリヌクレオチドセグメントの複製及び／又は発現をもたらすために、（例えば自己制御下で複製する能力を有する）細胞内のポリヌクレオチド複製の自律的単位として振舞う、又は、宿主細胞クロモソームへの挿入により複製能力を与えられる、前記別のポリヌクレオチドセグメントを含む例えばプラスミド、クロモソーム、ウィルスのようないずれかの遺伝因子である。適切なベクターは、ウイルス、プラスミド及びコスミドを含むがこれらに限定されない。
【００８０】
発現ベクターは、該ベクターの目的の宿主細胞への連結又は挿入をもたらすために、また、発現されるポリヌクレオチドの転写をもたらすために必要なポリヌクレオチド配列と、操作可能なように結合させられる、転写されるポリヌクレオチド配列を含む「発現カセット」を含む。かかる配列は、転写をもたらすプロモーター配列と、転写を増大させるエンハンサー配列と、リボソーム結合部位配列と、転写及び翻訳終結配列とを含む。代替的に発現ベクターは、該ベクターの宿主細胞ＤＮＡ配列への連結又は組み込みなしに、そこにエンコードされる核酸配列産物を直接的に発現する能力を有する場合がある。
【００８１】
「操作可能なように結合させられる」という用語は、ＤＮＡセグメントが意図されたように機能することを可能にするようになされる、該ＤＮＡセグメントの別のＤＮＡセグメントへの結合を指す。遺伝子産物をエンコードするＤＮＡ配列は、直接的又は間接的に該ＤＮＡ配列の転写の変調を可能にするように例えばプロモーター、エンハンサー及び／又はサイレンサーのような調節配列と結合させられるときには、該調節配列と操作可能なように結合させられる。例えばＤＮＡ配列は、プロモーターの転写開始部位に関して下流で該プロモーターと結合させられるときには、該転写開始部位に関して正しい読み枠で該プロモーターと操作可能なように結合させられ、転写伸長が前記ＤＮＡ配列を通じて進行することを可能にする。エンハンサー又はサイレンサーは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列と結合させられるときには、該ＤＮＡ配列の転写をそれぞれ増大又は減少させるように該ＤＮＡ配列と操作可能なように結合させられる。エンハンサー及びサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流に位置する場合か、下流に位置する場合か、該領域内に包埋される場合かがある。シグナル配列についてのＤＮＡは、該シグナル配列がポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡと操作可能なように結合させられる。ＤＮＡ配列の調節配列との結合は典型的には、当業者に既知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な制限部位での結合により、又は、前記ＤＮＡ配列に挿入されるアダプター若しくはリンカーを介して、達成される。
【００８２】
本明細書で用いられるところの「小分子」は、一定の疾病の症状に関与することが知られる特定のタンパク質と相互作用するように設計された分子量の合成化合物を指す。かかる化合物のライブラリーは、例えばコンビナトリアルケミストリーにより容易に合成される場合があり、従来技術を使用してＴＮＦＲ２５のアゴニスト／アンタゴニスト活性に対してスクリーニングされる場合がある。
【００８３】
「ＴＮＦＲ−ＳＦ２５」、「ＴＮＦＲ２５」又は「ＤＲ３」という用語は、本明細書では全てが、その完全な生物学的機能は過去に知られていなかったＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーに対する交換可能な用語として使用される。その全体が引用により本明細書に取り込まれる米国特許公報第６，７１３，０６１号明細書と、Ｂｏｒｙｓｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００５  Ｍａｒ  １８；３２８（３）：７９４−９と、Ｓｈｅｉｋｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．２００４  Ｆｅｂ；４（１）：９７−１０４とを参照せよ。しかし本発明者らは、多数の重要な発見をした。マウスＴＮＦＲ２５をエンコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号１として示される。ヒトＴＮＦＲ２５をエンコードするｃＤＮＡは、配列番号２として示される。
【００８４】
ＴＮＦＲファミリーの他のいずれかのメンバーの発現と異なり、ＤＲ３の発現は、ｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングにより制御されることが見出された。休止Ｔ細胞は、ＤＲ３タンパク質をほとんど又は全く発現しないが、高いレベルの、ランダムにスプライシングされたＤＲ３  ｍＲＮＡを含んだ。Ｔ細胞受容体を介するＴ細胞活性化により、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）が活性化される。ＰＫＣ活性化は全長のＤＲ３の正しいスプライシングと、前記タンパク質の表面活性化とを次々に仲介する。ＤＲ３の発現に係るこの独特の調節は、Ｔ細胞上における迅速なＤＲ３タンパク質の発現を可能にし、ＤＲ３のスプライシング及び発現の原因となるＰＫＣレベルに影響を与えることを介してＤＲ３の発現の環境調節を可能とする。
【００８５】
ＤＲ３は、Ｔ細胞の分極を同時刺激すること、及び、Ｔｈ２分極細胞におけるＩＬ−１３及びＩＬ−１０の産生を刺激することに関与する場合もある。中でもＩＬ−１０産生は炎症性腸疾患を抑制するときに重要な役割を果たすので、これは重要な観察結果である。
【００８６】
Ｔ細胞におけるＴＮＦＲ２５の遺伝子導入による発現は、サイトカインのＴｈ２分極と、Ｔ細胞活性化及び抗原曝露による抗体産生とを仲介する。加えて遺伝子導入によるＴＮＦＲ２５は、ＴＣＲに促進されるＣＤ４及びＣＤ８細胞の増殖を部分的に阻害し、リンパ器官におけるＴ細胞の総数をアポトーシスを誘発することなく低減する。ＣＤ８細胞は、ＣＤ４細胞よりもより強くＴＮＦＲ２５により影響される。それによりＴＮＦＲ２５のシグナルは、Ｔｈ２又は混合Ｔｈ１／Ｔｈ２応答に向うその後の分極を形成することによる病原体に対するエフェクター応答において重要である。
【００８７】
ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスは、マウスでの喘息モデルにおいて抗原誘発性気道炎症に非常になりやすく、吸入による抗原曝露で肺中のＩＬ−１３及び好酸球の量の増大をもたらした。ＴＮＦＲ２５のドミナントネガティブ形態を発現する遺伝子導入マウスは、野生型マウスと比較して気道過敏性への耐性の増大を示した。
【００８８】
「ＴＬ１Ａ」は本明細書では、デスドメイン含有受容体であるＤＲ３への結合を通じてＩＦＮ−γ分泌の同時刺激剤として働くＴＮＦ様因子を指す。ＴＮＦと類似するＴＬ１Ａは、ホモ三量体の可溶性形態として循環することも推定される。それにより本明細書で用いられるところの「可溶性ＴＬ１Ａ」は、ホモ三量体ＴＬ１Ａを指す。前記用語は、いずれかの種特異的形態に限定されない。しかしヒトＴＬ１Ａ単量体に対するｃＤＮＡ配列は配列番号７として、マウスＴＬ１Ａ単量体に対するｃＤＮＡ配列は配列番号３として提供される。
【００８９】
ＴＬ１Ａは、Ｔｈ１分極サイトカインとして機能することにより炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において一定の役割を果たすことが示唆されている。ＴＬ１Ａタンパク質量及びＴＬ１Ａ陽性細胞数は、最も顕著にはクローン病（ＣＤ）のような炎症の重篤度と相関することが示されている。ＣＤ患者由来のＰＨＡ刺激された単核細胞固有層の培養液への組換えヒトＴＬ１Ａの添加が、ＩＦＮ−γ産生を４倍まで有意に増大させたが、対照患者では最小の効果が観察されたことも示されている。付加的に、抗ＴＬ１Ａ抗体の阻害が野生型マウスにおいて喘息を改善することができ、ＴＮＦＲ２５及びＴＬ１Ａが喘息の発病に関与することが示された。
【００９０】
人体に係る受容体は、（ホルモン、サイトカイン及び神経伝達物質のような）天然又は（例えば抗体又は小分子のような薬剤のような）合成のアゴニストにより刺激又は阻害されることにより機能する。
【００９１】
本明細書では「ＴＮＦＲ２５のアゴニスト」は、該ＴＮＦＲ２５受容体に結合し、該ＴＮＦＲ２５受容体が発現される細胞において例えばＴＬ１Ａのような天然のＴＮＦＲ２５リガンドに該細胞を曝露することにより観察される応答と同様の応答をトリガリングする物質を指す。アゴニストは、アンタゴニストは前記受容体に結合する場合もあるが該受容体を活性化することはできず実際上完全又は部分的に該受容体の内在又は外来のアゴニストによる活性化を阻害するという意味で、アンタゴニストの正反対である。部分アゴニストは受容体を活性化するが、完全アゴニストがもたらすような生理学的変化をもたらさない。
【００９２】
可溶性ＴＬ１Ａは、ＴＮＦＲ２５のアゴニストとして一定の細胞集団における前記ＴＮＦＲ２５受容体の活性を増大させるために、患者に治療用形態で与えられる場合がある。代替的にＴＮＦＲ２５のアゴニストの別の例は、ＴＮＦＲ２５に結合し活性化させる能力を有する抗体である。例えば前記モノクローナル抗体４Ｃ１２は、ＴＮＦＲ２５に結合しＴＮＦＲ２５のシグナル伝達を活性化させる。別の実施態様では、また、本発明との関連では、ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、選択された場所か選択された時間かにおけるＴＮＦＲ２５のアゴニスト抗体及び／又はＴＬ１Ａタンパク質の遺伝子導入による発現を異所的に促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターから誘導される場合がある。さらに別の実施態様では、組織におけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の増大をもたらすＴＮＦＲ２５のアゴニストは、ＴＮＦＲ２５自身の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターにより提供される。これは、受容体と比較して過剰量の外来又は内在のＴＮＦＲ２５のアゴニストが存在する組織においてＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の増大が必要とされる状況で有用である。
【００９３】
本明細書では「ＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト」は、ＴＮＦＲ２５受容体の正常な生理学的機能を阻害する物質を指す。かかる薬剤は、ＴＬ１Ａのような内在の受容体に係るアゴニスト／リガンドのＴＮＦＲ２５受容体との結合を妨害することにより機能する。ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストの一例は、ドミナントネガティブなＴＮＦＲ２５受容体である。好ましくは本明細書で使用される前記ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、ＴＬ１Ａの前記ＴＮＦＲ２５受容体を活性化する能力を妨げるＴＬ１Ａに特異的な抗体である。最も好ましくは前記抗体は、モノクローナル抗体Ｌ４Ｇ６である。別の実施態様では前記ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ２５の細胞外部分又はオルタナティブスプライシング形態と、免疫グロブリンのＦｃ部分、又は、他のいずれかの適切な融合パートナーとの融合タンパク質である。別の実施態様では前記ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、オルタナティブスプライシング形態又は人工構成体として、膜貫通結合ドメイン上での切断により作成されるＴＮＦＲ２５の可溶性形態である。別の実施態様では前記ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ２５に特異的に結合し、ＴＮＦＲ２５の天然のリガンドへの結合を妨害する抗体である。別の実施態様ではＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、選択された場所か選択された時間かにおける内在のＴＮＦＲ２５及び／又はＴＬ１ＡのｍＲＮＡの転写及び／又は翻訳をノックダウンする能力を有するアンチセンスｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ又はリボザイムの遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターの場合がある。さらに別の実施態様ではあるＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、ドミナントネガティブなＴＮＦＲ２５の遺伝子導入による発現を促進する能力を有する発現カセットを有する発現ベクターを提供することにより、組織におけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達を減少させる場合がある。
【００９４】
ＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト又はアゴニストは、アプタマーの形態の場合がある。「アプタマー」は、他の分子に結合するその能力に基づく無作為のプールから選択されるＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。ある実施態様ではアプタマーは、例えばＴＬ１Ａのような天然のリガンドの結合を阻害するためにＴＮＦＲ２５に特異的に結合し、又は、ＴＬ１Ａ自身に結合してＴＮＦＲ２５に結合するのを妨害する。別の実施態様ではアプタマーは、前記ＴＮＦＲ２５受容体に特異的に結合しそれを活性化する。
【００９５】
本明細書で用いられるところの「ドミナントネガティブ」又は「ＤＮ」は、内在のＴＮＦＲ２５を阻害するために働く、外から提供されるＴＮＦＲ２５の構造変異体を指す。例えばモル過剰量のＤＮは、例えばＴＬ１ＡのようなＴＮＦＲ２５のリガンドの結合について内在のＴＮＦＲ２５を打ち負かす。好ましくは前記ＤＮは、細胞内ドメインを欠損している以外は野生型ＴＮＦＲ２５と同じである。代替的に前記ＤＮは、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを欠損している以外は野生型ＴＮＦＲ２５と同じである。マウスＤＮ  ＴＮＦＲ２５についてのコード配列は、配列番号４に提供される。ヒトＤＮ  ＴＮＦＲ２５についてのコード配列は、配列番号５に提供される。細胞外ドメインのみを含むヒトＤＮ  ＴＮＦＲ２５についてのコード配列は、配列番号６に提供される。
【００９６】
本発明は、配列番号３−７と実質的に同一のコード配列も含む。当業者は、少なくとも１個のヌクレオチド塩基の同一性に関して、配列番号３−７と実質的に同一のオリゴヌクレオチド配列が配列番号３−７とそれぞれ異なる場合があることも認識するだろう。しかし配列番号３−７と実質的に同一の全てのオリゴヌクレオチド配列が、配列番号３−６（すなわち標的配列）の相補配列の全て又は一部分と、それぞれ（本明細書で定義されるところの）厳密な条件下でハイブリダイズする。「特異的にハイブリダイズする」という用語は、（例えばプライマー又は標識プローブのような）オリゴヌクレオチド及び標的配列の間の相補的ハイブリダイゼーションを指す。前記用語は、ＰＣＲポリメラーゼのための望ましいプライマー設定か、ハイブリダイゼーションシグナルの望ましい検出かを実現するために、ハイブリダイゼーション培地の厳密性を低減することにより調整される場合がある少数のミスマッチを特異的に包含する。
【００９７】
厳密なハイブリダーゼーション条件下では、高度に相補的な、換言すれば実質的に同一の、核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくはかかる条件は、２０個の隣接するヌクレオチドのうち３個又は４個以上のミスマッチ、より好ましくは２０個の隣接するヌクレオチドのうち２個又は３個以上のミスマッチ、最も好ましくは２０個の隣接するヌクレオチドのうち１個又は２個以上のミスマッチを有する核酸のハイブリダーゼーションを妨げる。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、標的配列又はその相補配列と少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％同一である。
【００９８】
厳密な条件下での核酸の核酸試料へのハイブリダイゼーションは、下に定義される。核酸の二本鎖又はハイブリッドの安定性は、前記プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である融解温度（Ｔm）として表現される。前記融解温度は、必要とされる厳密な条件を定義するために使用される。配列が前記プローブと同一というよりもむしろ実質的に同一であると特定される場合には、そのときは（例えばＳＳＣ又はＳＳＰＥを使用する）特定の塩濃度で相同ハイブリダイゼーションのみが起こる最も低い温度を最初に設定するのが有用である。それから１％のミスマッチが１°ＣのＴmの減少をもたらすと仮定すると、ハイブリダイゼーション反応における最終洗浄温度は相応に低減される。（例えば前記プローブと＞９５％の同一性を有する配列が探索される場合、前記最終洗浄温度は５°Ｃ減少される。）実際上はＴmの変化は、１％のミスマッチ当たり０．５°Ｃ及び１．５°Ｃの間の場合がある。
【００９９】
最も厳密な条件は、５ｘＳＳＣ／５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液／１．０％ＳＤＳ中において６８°Ｃでハイブリダイズするステップと、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において室温で洗浄するステップとを含む。中程度に厳密な条件は、３ｘＳＳＣ中において４２°Ｃで洗浄するステップを含む。塩濃度及び温度のパラメーターは、前記プライマー及び前記標的核酸の間の同一性に係る最適レベルを実現するために変更される場合がある。かかる条件に関する付加的なガイダンスは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）と、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）とのように、当業者が容易に利用可能である。
【０１００】
本明細書で用いられる用語としての「免疫抑制剤」は、炎症性疾患の治療と臓器移植の円滑化とに必要な重要な薬剤である。例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、相当な免疫抑制活性を有する。それは臓器移植に革命をもたらし、自己免疫疾患の治療に慣用されている。ＣｓＡの使用とその作用機序との最近のレビューについては、Ｗｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ；Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２，１７６（１９８６）を参照せよ。しかしＣｓＡは、腎不全、骨髄抑制及び不妊症のような重度の副作用を有する場合がある強力な薬物である。
【０１０１】
副腎皮質ステロイドもその抗炎症効果のために炎症の症状において使用される。副腎皮質ステロイドは作用開始が迅速であり、他のほとんどの身体組織と同様に免疫系の多くの部分に大いに影響を及ぼす。副腎皮質ステロイドはほとんどの型の血管炎の治療の基礎であり、他の免疫抑制剤と組み合わせて使用されることが多い。しかし副腎皮質ステロイドの長期間の使用は、高血圧と、体重増加と、挫瘡と、顔の腫れとを含む重度の副作用を有する場合もある。他の免疫抑制剤は、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、メルカプトプリン、タクロリムス及びミコフェノール酸モフェチルを含む。
【０１０２】
一般的な方法として、前記アゴニスト及びアンタゴニストは、嚥下、注射若しくは吸入される、又は、座薬を経由して提供される組成物として患者に提供される場合がある。代替的に前記組成物は点耳薬又は点眼薬中に処方される場合がある。
【０１０３】
本明細書で用いられるところの「喘息」という用語は、気管支の痙攣性収縮（いわゆる「気管支痙攣」）のために喘嗚を伴う発作性呼吸困難（すなわち「可逆性閉塞性気道通過障害」）の再発性発作に特徴づけられるいずれかの喘息の症状を含む。本発明に従い治療又は予防される場合がある喘息の症状は、特に激しい運動のような運動（「運動誘発性気管支痙攣」）と、刺激性粒子（花粉、埃、綿、ネコのふけ）と、軽度から中程度の喘息と、慢性喘息と、重度の慢性喘息と、重度かつ不安定な喘息と、夜間喘息と、精神的ストレスとを含むさまざまな因子により引き起こされる、感作された人における症状を特徴とするアレルギー性喘息及び気管支アレルギーを含む。本発明の方法は、例えば下気道通過及び肺に係る可逆性閉塞性障害と、運動誘発性気管支痙攣とに苦しむヒトのような哺乳類における喘息の開始を予防する際に特に有用な場合がある。本明細書で開示される喘息を治療するための方法において、本発明のアンタゴニストを送達する好ましい方法は、吸入による。
【０１０４】
吸入用噴霧剤を生産するために総合的にさまざまな機構及び方法論を使用する複数のさまざまなタイプの装置が存在する。最も慣用される装置は、低沸点の噴霧剤を含む製剤を有する製剤容器を含む定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）である。前記製剤は加圧下で前記容器中に保持され、前記容器上のバルブが開けられると定量の製剤が噴霧剤として放出される。前記製剤が前記容器の外側で大気圧に曝されると、前記低沸点の噴霧剤は迅速に蒸発又は「フラッシュ（ｆｌａｓｈｅｓ）」する。前記噴霧剤を有さず前記薬剤を含む製剤の粒子が、患者の肺に吸入され、その後該患者の循環系に移動する。多数のさまざまなタイプのＭＤＩ装置が存在する。このタイプの装置は１９９５年４月１１日に発行された米国特許公報第５，４０４，８７１号明細書と、１９９４年１１月１５日に発行された米国特許公報第５，３６４，８３８号明細書とに開示される。
【０１０５】
別のタイプの装置は、乾燥粉末吸入（ＤＰＩ）装置である。その名が示すとおりかかる装置は、ガスの爆発により吹き飛ばされ噴霧化した雲となる乾燥粉末の剤形を使用する。典型的なＤＰＩ装置は、１９９８年７月７日に発行された米国特許公報第５，７７５，３２０号明細書と、１９９８年４月２１日に発行された米国特許公報第５，７４０，７９４号明細書とに開示される。
【０１０６】
さらに別のタイプの噴霧剤送達装置は、強制的に剤形を多孔質膜に通過させる。前記孔を通過する剤形は、前記患者により吸入される小粒子を形成するために破壊される。このタイプの装置は、１９９６年８月１３日に発行された米国特許公報第５，５５４，６４６号明細書と、１９９６年６月４日に発行された米国特許公報第５，５２２，３８５号明細書とに開示される。
【０１０７】
吸入用組成物に関して、適切なキャリアー物質は、非晶質粉末か、結晶粉末か、非晶質粉末及び結晶粉末の組合せかの形態の場合がある。適切な物質は、例えばフルクトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース及びこれらに類するもののような単糖類と、ラクトース、トレハロース、セロビオース及びこれらに類するもののような二糖類と、２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリンと、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン及びこれらに類するもののような多糖類とのような炭水化物と、（ｂ）グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、リシン及びこれらに類するもののようなアミノ酸と、（ｃ）クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸ナトリウム、塩酸トロメタミン及びこれらに類するもののような、有機酸及び塩基から調製される有機酸塩と、（ｄ）アスパルテーム、ヒト血清アルブミン、ゼラチン及びこれらに類するもののようなペプチド及びタンパク質と、（ｅ）マンニトール、キシリトール及びこれらに類するもののようなアルジトールとを含む。キャリアーの好ましい群は、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、グリシン、クエン酸ナトリウム、塩酸トロメタミン、ヒト血清アルブミン及びマンニトールを含む。
【０１０８】
かかるキャリアー物質は、噴霧乾燥の前に、すなわち、噴霧乾燥のために調製される緩衝液に該キャリアー物質を添加することにより、本発明のアゴニスト又はアンタゴニストと組み合わされる場合がある。そのようにして前記キャリアー物質は、本発明のアゴニスト又はアンタゴニスト粒子といっしょに、又は、該粒子の一部として、同時に形成される。典型的には前記キャリアーが本発明のアゴニスト又はアンタゴニストといっしょに噴霧乾燥により形成されるときには、本発明のアゴニスト又はアンタゴニストは、個々の粒子中に５重量％から９５重量％まで、好ましくは２０重量％から８０重量％までの範囲で存在する。前記粒子の残りは、基本的には（典型的には５重量％から９５重量％まで、通常は２０重量％から８０重量％までの）キャリアー物質であるが緩衝液も含み、上述の他の成分を含む場合がある。肺の肺胞領域に送達される粒子中（すなわち１０μｍ未満の必要サイズ範囲の粒子）におけるキャリアー物質の存在は、本発明のアゴニスト又はアンタゴニストに係る全身の吸収を有意には妨害しないことが見出されている。
【０１０９】
代替的に前記キャリアーは、乾燥粉末形態で別々に調製され、乾燥粉末状の本発明のアゴニスト又はアンタゴニストと混合することにより組み合わされる場合がある。前記別々に調製された粉末キャリアーは、（水吸収を避けるために）通常は結晶であるが、ある場合には非晶質か、結晶及び非晶質の混合物かの場合がある。前記キャリアー粒子のサイズは、本発明のアゴニスト又はアンタゴニスト粉末の流動性を向上させるために選択される場合があり、典型的には２５μｍから１００μｍまでの範囲にある。このサイズ範囲のキャリアー粒子は、一般的には肺の肺胞領域に浸透せず吸入前に送達装置中の本発明のアゴニスト又はアンタゴニストから分離することが多い。したがって肺の肺胞領域に浸透する粒子は、本質的には本発明のアゴニスト又はアンタゴニストと緩衝液とからなる。好ましいキャリアー物質は、上述の範囲のサイズを有する結晶マンニトールである。
【０１１０】
本発明の乾燥粉末組成物は、好ましくは従来の方法で流動する空気か他の生理学的に許容可能な気体の蒸気かへの分散により噴霧剤とされる。かかる分散に適するあるシステムが、その全ての開示が引用により本明細書に取り込まれる国際公開公報第９３／００９５１号として公開される同時係属出願第０７／９１０，０４８号に係る明細書に記載される。
【０１１１】
無菌注射溶液は、必要量の本発明の組成物及び剤形を、濾過滅菌されたリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水のような適当な溶媒中に取り込むことにより調製される。本明細書で用いられるところの「生理学的に許容可能なキャリアー」は、いずれか及び全ての溶媒と、分散媒と、ヒトには無毒の抗細菌剤及び抗真菌剤と、これらに類するものとを含む。医薬品として活性な物質に対するかかる培地及び薬品の使用は、当業者に周知である。前記培地又は薬品は、本発明のタンパク質鎖の適切なな立体構造の維持と、治療用組成物における該タンパク質鎖の使用とに対して適合的でなければならない。補助的な活性成分が前記組成物に取り込まれる場合もある。代表的な医薬品として許容可能なキャリアー及び希釈剤と、医薬品の剤形との記載は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの本分野の標準的なテキストと、ＵＳＰ／ＮＦとに見出される場合がある。
【０１１２】
特許請求の範囲に記載の組成物の投与量及び投与様式は、投与の特性、剤形及び径路と、当業者に既知の、又は、当業者が容易に識別可能な他の関連する特性とにしたがい調整されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１３】
２．Ｔ細胞分極と肺の炎症との直接の増強剤としてのＴＮＦＲ２５のアゴニスト
ＴＮＦＲ２５とそのリガンドＴＬ１Ａとが、Ｔ細胞分極と肺の炎症との直接の増強剤であることが発見された。肺疾患におけるＴＬ１Ａ及びＴＮＦＲ２５の重要な役割は、アゴニストのＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおいて観察される肺の炎症の肥大化により支持される。ＴＮＦＲ２５の過剰発現は、活性化によるＣＤ４細胞のＴｈ２への強い偏りをもたらす。この偏りはすなわち、オボアルブミンモデルにおける肺の炎症の増大の原因のようである。
【０１１４】
本発明者らは、喘息マウスモデルにおけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の阻害が、肺の炎症を抑制するＴｈ２サイトカイン産生の低減をもたらすことを観察した。ＣＤ４細胞におけるＴＮＦＲ２５がＴｈ１分極細胞及びＴｈ２分極細胞の両方におけるＩＬ−１３の分泌をトリガリングし、肺の炎症を開始及び促進するＮＫＴ−細胞においてＴＮＦＲ２５のシグナルが必要とされる。ＴＮＦＲ２５によりトリガリングされる慢性ＩＬ−１３産生は、気道リモデリング及び繊維症につながる慢性喘息を含むがこれに限定されない肺の慢性炎症の後遺症の原因にもなる。養子移植実験における、ドミナントネガティブなＴＮＦＲ２５変異体によるＮＫＴ細胞内でのＴＮＦＲ２５のシグナルの阻害は、肺の炎症を抑制する。このようなＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の阻害は、急性喘息及び慢性喘息と、他の肺疾患との治療において有用であろう。
【０１１５】
肺の炎症をもたらす一連の事象において、ＮＫＴ細胞によるＩＬ−１３産生は初期のステップである（Ａｋｂａｒｉ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，５８２−８（２００３））。肺の炎症を誘発するためにＮＫＴ細胞により使用される主要な分子スイッチの１つはＴＮＦＲ２５であることを前記養子移植実験は示したので、喘息におけるＮＫＴ細胞の重要な役割は本研究により支持される。ＴＮＦＲ２５は、ＰＫＣに仲介されるＴＣＲ活性化細胞でのＴＮＦＲ２５のスプライシングを通じて抗原特異的ＣＤ４記憶細胞により初期のエフェクター応答を変調する付加的な能力を有する。したがってＴＮＦＲ２５は、肺における記憶応答の開始に係る非常に初期段階で働く。したがって抗ＴＬ１Ａ抗体か他の手順かによるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の阻害は、喘息性発作の原因であると考えられる肺の急性炎症を引き起こす事象のカスケードを阻害する。
【０１１６】
ＴＮＦＲ２５の阻害が遺伝的に、及び、抗体阻害により野生型マウスで実現され、２種類の独立した方法が同様の結果を与えた。Ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＮＦＲ２５のシグナルの阻害が、抗原に再刺激された気管支流入領域リンパ節によるＩＬ−１３、ＩＬ−５及びＩＬ−４産生の減少と、肺の炎症の抑制とを引き起こす。重要なことに一次刺激されＴｈ２分極したマウスの気道抗原負荷の段階における抗ＴＬ１Ａ抗体の阻害が肺の炎症の抑制に有効であり、肺におけるエフェクター段階でのＴＮＦＲ２５の直接的な役割を示した。
【０１１７】
３．ＮＫＴ細胞におけるＴＮＦＲ２５の構成的発現、及び、活性化Ｔ細胞における誘導性発現
ＴＮＦＲ２５とその同種リガンドＴＬ１Ａの生物学的機能的を研究するために、ハムスター抗マウスモノクローナル抗体が標準的プロトコールにより作成された。フローサイトメトリーにより初代細胞における低レベルのＴＮＦＲ２５の発現を確実に検出するために、三層サンドイッチ分析法を開発することが必要であった。細胞を活性化せずともＴＮＦＲ２５は、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞においては低いレベルで、ＣＤ８Ｔ細胞においてもさらに低いレベルで検出されたが、Ｂ細胞においては検出されなかった（図１ａ）。加えてＣＤ１１ｃ＋細胞の亜集団がＴＮＦＲ２５を発現した。僅かな割合のＣＤ３陰性ＮＫ１１＋細胞のみがＴＮＦＲ２５の発現を示したのに対して、ＮＫＴ細胞は相対的に高いレベルのＴＮＦＲ２５を構成的に発現した（図１ａ）。胸腺ではシングル陽性のＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞が抹消Ｔ細胞と同様のＴＮＦＲ２５を発現した。ＣＤ４、ＣＤ８に係るダブル陽性胸腺細胞及びダブル陰性胸腺細胞はＴＮＦＲ２５を発現しなかった（図１ｃ）。
【０１１８】
抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体での抹消Ｔ細胞の活性化によりＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方でＴＮＦＲ２５の発現は上向き調節された（図１ｂ）。一方でＢ細胞のＬＰＳ活性化は、ＴＮＦＲ２５の発現をもたらさなかった。マウスＴＮＦＲ２５ｍＲＮＡはＴ細胞において構成的に発現されるが、ヒトＴＮＦＲ２５と同様にランダムにスプライシングされる（Ｓｃｒｅａｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，４６１５−９．（１９９７）、図２）。活性化Ｔ細胞でのＴＮＦＲ２５タンパク質の発現の増大は、ランダムにスプライシングされたＴＮＦＲ２５のｍＲＮＡ由来の全長ＴＮＦＲ２５に係る活性化誘発性スプライシングと関連した。Ｔ細胞内でのＴＮＦＲ２５の活性化誘発性スプライシングは化学的阻害剤Ｈ７により阻害され、スプライシングにおけるＰＫＣの役割を表示した（図２）。
【０１１９】
ＮＫＴ細胞及び活性化Ｔ細胞でのＴＮＦＲ２５の優先的発現と、その活性化とは全長ＴＮＦＲ２５のスプライシングを誘発し、表面発現における迅速な増大は免疫系におけるＴＮＦＲ２５の生物学的機能に係る問題を提起した。マウスにおけるＴＮＦＲ２５遺伝子の切断は、胸腺でのネガティブ選択における軽度の欠損以外にはＴＮＦＲ２５欠損についての明確な表現型を明らかにしなかった。したがってＣＤ２プロモーター及びエンハンサーにより促進されるＴ細胞で発現されるＴＮＦＲ２５導入遺伝子の生物学的効果が分析された。
【０１２０】
全長ＴＮＦＲ２５（図２におけるＦＬ  ＴＮＦＲ２５）と、エキソン５及びエキソン６を欠くＴＮＦＲ２５のオルタナティブスプライシング産物（図２におけるΔ５，６  ＴＮＦＲ２５）とが、遺伝子導入による発現のために使用された。Δ５，６  ＴＮＦＲ２５は、第４のシステインリッチな細胞外ドメインの部分をエンコードするエキソン５及びエキソン６を欠く。しかしΔ５，６  ＴＮＦＲ２５は膜に固定されており、ＦＬ  ＴＮＦＲ２５様の完全な細胞内シグナル伝達ドメインを有し、ＴＬ１Ａとアゴニストの抗ＴＮＦＲ２５抗体（４Ｃ１２）とに結合する。加えてドミナントネガティブな変異体であり膜貫通ドメインの直ぐ後ろで切断されるＤＮ  ＴＮＦＲ２５は、導入遺伝子として発現され、以下で説明される。
【０１２１】
４．ＴＮＦＲ２５の遺伝子導入による過剰発現が、ＣＤ４細胞のＴｈ２分極を促進し、ＡＨＲのオボアルブミンモデルにおいて肺の炎症の増大を仲介する。
各々のＴＮＦＲ２５導入遺伝子に対する４種類の独立した初代遺伝子（ｆｏｕｎｄｅｒ）が、取得及び分析された。初代遺伝子Δ５，６  ＴＮＦＲ２５、ＦＬ  ＴＮＦＲ２５及びＤＮ  ＴＮＦＲ２５の全てにおける、前記ＣＤ２プロモーター及びエンハンサーに支持される位置に無関係な導入遺伝子発現は、休止Ｔ細胞と、ＮＫＴ細胞と、ＮＫ細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞の亜集団とにおける高レベルの発現を明らかにした。Ｂ細胞は前記導入遺伝子を発現しなかった（図３ａ）。フローサイトメトリーによる抗体検出の信頼性は、形質移入された腫瘍細胞のウェスタンブロットにより確認され（図３ｂ）、遺伝子導入脾細胞で同一のウェスタンブロットのバンドが検出されたが、内在の分子はウェスタンブロットによる検出のレベルに満たなかった。Δ５，６のスプライシング形態は、ウェスタンブロットにおいて前記抗体１０Ｄ１により検出されず（図３ｂ）、前記抗体がエキソン５又はエキソン６に結合を表示した。ＦＬ  ＴＮＦＲ２５の遺伝子導入による過剰発現は、遺伝子を導入しない同腹細胞と比較した一次及び二次リンパ器官におけるＴ細胞数の減少と関係がある（図３ｃ）。細胞性に及ぼすΔ５，６導入遺伝子の効果は、胸腺では中程度であり、二次リンパ器官では顕著でなかった。遺伝子導入マウスにおけるＴ細胞数の減少は、同数の精製遺伝子導入ＣＤ４及びＣＤ８細胞と遺伝子を導入しない同腹細胞とを比較すると、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の刺激に応答する増殖の減少と同時に起こった（図３ｄ）。増殖の減少は、２４時間から７２時間までの全ての時間において見られた。しかしホルボールエステルであるＰＭＡとＣａ−イオノフォアであるイオノマイシンとでのＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞又はＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ８細胞の刺激は正常な増殖を回復させ、遺伝子導入細胞が固有の性質として増殖能力を欠損しているのではないことを示した。ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ＴＮＦＲ２５遺伝子導入Ｔ細胞はＣＤ２５を正常に上向き調節したが、同腹の対照細胞と比較して約半分の量のＩＬ−２しか産生しなかった（図４）。過剰量のＩＬ−２の外からの添加は、増殖を回復させなかった（図３ｄ）。ＴＮＦＲ２５遺伝子導入Ｔ細胞は、アネキシンＶ染色により測定されるアポトーシスの増大を被らず（図４）、増殖性の欠陥は細胞死のためのＴＮＦＲ２５のシグナルのためではないことを示した。
【０１２２】
ＦＬ  ＴＮＦＲ２５及びΔ５，６  ＴＮＦＲ２５を形質移入されたＥＬ４細胞が、可溶性ＴＬ１Ａか、膜結合性ＴＬ１Ａ（ＥＬ４−ＴＬ１Ａ）か、アゴニストの抗ＴＮＦＲ２５抗体（４Ｃ１２）かでトリガリングされるスプライシング変異体のシグナル伝達特性を比較するために使用された。３種類全てのリガンドが、ＥＭＳＡにより検出される２５分以内のＮＦ−κＢ活性化を迅速に誘発した（図３ｅ）。
【０１２３】
プレートに結合した抗ＣＤ３抗体と可溶性抗ＣＤ２８抗体とによる一次活性化の後、ＦＬ  ＴＮＦＲ２５及びΔ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞は、遺伝子を導入しない同腹細胞と比較してＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を含むＴｈ２サイトカインの産生量を有意に増加させた（図３ｆ）。ＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞が活性化されたときはＩＦＮ−γは減少したが、Δ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞では減少せず、スプライシング変異体の機能における僅かな差異を示した。ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞の増殖は減少したが、Ｔｈ２サイトカイン産生の増大は活性化２４時間以内で既に検出可能であり後日増加し続け、活性化の前にＴｈ２の偏りが存在することを示した。
【０１２４】
次にＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞のＴｈ２への偏りが、Ｔｈ１分極条件下で覆される場合があるかどうかについて決定された。Ｔｈ中性条件下でＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞は、Ｔｈ２分極条件下での野生型ＣＤ４細胞と同程度の量のＩＬ−４を産生した（図３ｇ）。Ｔｈ２分極条件下でのＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞のインキュベーションは、ＩＬ−４又はＩＬ−１３産生に対して付加的な影響を有さず、Ｔｈ中性条件下での一次活性化の間に該細胞が既に最大限にＴｈ２分極していることを示した。しかしＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞は、ＩＬ−４に対する抗体を培養液に含めること、及び、外からＩＬ−１２を添加することにより、Ｔｈ１に分極する場合がある。これらの条件下でＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞は、Ｔｈ１分極野生型細胞よりも高いレベルのＩＦＮ−γを産生し（図３ｇ）、該ＴＮＦＲ２５導入遺伝子がＴｈ１サイトカインを同時刺激する場合もあることを示した。Ｔｈ１分極ＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞は、野生型Ｔｈ１細胞と異なり、ＩＬ−１３も産生したがＩＬ−４は最小限の量しか産生しなかった。ＴＮＦＲ２５の遺伝子導入による過剰発現は、自発的にＴｈ２へ偏っているときにもなお、適当な分極条件下でＴｈ１又はＴｈ２のタイプのサイトカイン産生を同時刺激する場合がある。加えてＴＮＦＲ２５のシグナルは、Ｔｈ１又はＴｈ２分極条件下でＩＬ−１３産生を同時刺激する。
【０１２５】
免疫と抗体アイソタイプ産生の分析とにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスの自発的なＴｈ２への偏りが見出された。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、Δ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスで実施された。Δ５，６  ＴＮＦＲ２５は、ＮＦ−κＢ誘導（図３ｅ）とアポトーシスの誘発とに関してはＦＬ  ＴＮＦＲ２５と同じシグナル伝達特性を示し、同様のＴｈ２に偏ったサイトカインプロファイルをもたらす。しかしＦＬ遺伝子導入マウスと異なりΔ５，６遺伝子導入マウスは、リンパ節（図３ｃ）及び脾臓において正常なＣＤ４Ｔ細胞に係る細胞性を有し、したがってｉｎ  ｖｉｖｏ実験についてより正確にＴＮＦＲ２５機能を表現する場合がある。
【０１２６】
ＤＮＰ−ＫＬＨで免疫されたＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスは、遺伝子を導入しない同腹細胞と比較して抗原特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体の比率を増大させ、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｈ２型の抗体比率の増大を示した（図５ａ）。免疫しないときは、野生型マウス及び遺伝子導入マウスに係るＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのレベルは同一であり、Ｔｈ２への偏りを明らかにするためには活性化が必要であることの証拠を示した。
【０１２７】
ＩＬ−１３は肺のアレルギー性炎症の状態に特徴的なサイトカインである（Ｅｌｉａｓ，Ｊ．  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８，４０１−４（２００３））ので、ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞のＴｈ２への偏りとＩＬ−１３産生の増大とは、ＴＮＦＲ２５の過剰発現が喘息に特徴的な肺のアレルギー性炎症を増大させやすくする場合があることを示唆した。この仮説が、マウスにおける実験的な肺の炎症の古典的なオボアルブミンモデルを使用して試験された。ＴＮＦＲ２５遺伝子導入Ｂ６マウス及び野生型対照マウスが、０日目及び５日目にオボアルブミン及びミョウバンで腹腔内を一次刺激された。１２日目に前記マウスは、噴霧剤化オボアルブミンで気道負荷され、１ないし３日後に分析された。ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスは、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球数を劇的に増加させており（図５ｂ）、血清中のオボアルブミン特異的ＩｇＥレベルの増大（図５ｄ）と、気管支リンパ節細胞のオボアルブミン再刺激によるＴｈ２サイトカイン産生の増大（図５ｅ）とに関連した。ＩＦＮ−γ産生は、野生型細胞と比較して遺伝子導入気管支リンパ節細胞で減少した。ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスの肺に係る組織病理学的分析は、好酸球による血管周囲性肺浸潤の異常な増大と、気管支の粘液産生の増大と、ＰＡＳで染色された杯細胞の過剰形成（図５ｃ）とを示したが、これらの結果はＴ細胞でのＴＮＦＲ２５の過剰発現による肺の炎症の悪化に矛盾しない。
【０１２８】
５．一次刺激されたマウスの気道負荷の間におけるＴＮＦＲ２５の遺伝的阻害又は抗体阻害は、肺の炎症を抑制する。
ＴＮＦＲ２５のドミナントネガティブな変異体であるＤＮ  ＴＮＦＲ２５が、気道負荷の間のＴＮＦＲ２５のシグナル伝達を阻害するために作成され、ＣＤ２プロモーター及びエンハンサーの存在下で導入遺伝子としてその構成体を発現した。前記ＤＮ  ＴＮＦＲ２５導入遺伝子は細胞内シグナル伝達ドメインの全体を欠くが、その膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインにおいてはＦＬ  ＴＮＦＲ２５と同一である。
【０１２９】
ＤＮ  ＴＮＦＲ２５導入遺伝子は、フローサイトメトリーにより決定されるアゴニストのＴＮＦＲ２５導入遺伝子として同一のレベルで発現された（図３ａ）。発現された分子の数に対する測定値として表面蛍光強度を使用して、内在のＴＮＦＲ２５に対して３倍ないし４倍モル過剰量のＴＮＦＲ２５導入遺伝子の発現量が決定された。ＤＮ  ＴＮＦＲ２５に係るこのレベルの過剰発現が、内在のＴＮＦＲ２５の活性を沈静化した。野生型ＣＤ４細胞及びＤＮ遺伝子導入ＣＤ４細胞に係る抗ＣＤ３抗体での一次活性化が、Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカインの両方の分泌を刺激する（図４、パネルｄ）。野生型細胞に係る抗ＣＤ３抗体での一次活性化の間におけるアゴニスト抗体（４Ｃ１２）でのＴＮＦＲ２５のトリガリングがＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの両方の産生を同時刺激するが、このＴＮＦＲ２５の同時刺激効果はＤＮ  ＴＮＦＲ２５導入遺伝子により阻害され（図６ａ）、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５導入遺伝子が内在のＴＮＦＲ２５遺伝子の機能を阻害することを示す。同様に４Ｃ１２のアゴニスト効果は、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞では阻害された野生型ＣＤ４細胞の増殖を同時刺激し（図６ｂ）、内在のＴＮＦＲ２５は沈静化されることを示す。重要なことにはＣＤ４細胞におけるＤＮ  ＴＮＦＲ２５の発現は、Ｔｈ中性条件下で一次刺激された細胞の二次活性化による通常観察されるＴｈ２サイトカイン産生の上向き調節を著しく減弱させ（図６ｃ）、ＴＮＦＲ２５のシグナルがＴｈ２分極を強く促進する、又は、Ｔｈ２分極に必要とされること、並びに、これらのシグナルがＤＮ導入遺伝子により阻害されることを示した。さらに重要なことにはＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞は、ＩＬ−４と、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２に対する阻害抗体との添加により提供されるＴｈ２分極条件下でさえもＴｈ２分極する場合がなかった（図６ｄ）。一方でＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４細胞のＴｈ１分極は、非分極（Ｔｈ中性、ＴｈＮ）条件下でさえも影響を受けなかった。したがってＴＮＦＲ２５はＣＤ４細胞の一次活性化のときにＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの両方の産生を刺激するが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴｈ２分極を促進するためにはＴＮＦＲ２５のシグナルが必要なようである。Ｔｈ１分極はＴＮＦＲ２５に依存しないが、Ｔｈ１細胞内でのＴＮＦＲ２５のシグナルはＩＬ−１３産生を促進する（図３ｇ）。ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＮＦＲ２５のシグナルの消失は、ＤＮＰ−ＫＬＨでのＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスの免疫後、野生型マウスで見出される通常のＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａ抗体の比率に影響を及ぼさない（図４）。
【０１３０】
次にＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスが、肺炎症モデルにおいて応答を変化させるかどうかについて決定された。気道負荷されたＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスは、組織病理学及びＰＡＳ染色により試験されたとき、野生型マウスと比較してＢＡＬＦ中における好酸球浸潤の有意な減少と、肺の炎症の消失と、血清中のＩｇＥ産生の減少とを示した（図６ｅ−ｇ）。オボアルブミンを気道負荷されたＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウス由来の気管支流入領域リンパ節に係る再刺激は、Ｔｈ２サイトカイン産生の減少と、正常なＩＦＮ−γ産生とを示した（図６ｈ）。前記データは、肺の免疫応答においてＴＮＦＲ２５が重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１３１】
野生型マウスにおけるＴＮＦＲ２５阻害の遺伝的データを有効にするために、マウスＴＬ１Ａに対するモノクローナル抗体が開発された。ＴＮＦＲ２５及びＴＬ１Ａを形質移入された細胞（図７ａ、ｂ）を使用して、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達を抑制するＴＬ１Ａ阻害抗体が特定された。ＴＬ１Ａを形質移入された細胞は、その表面にＴＬ１Ａを発現（図７ｃ）し、他のＴＮＦスーパーファミリーのメンバーと同様にＴＬ１Ａを上清中に分泌する。ＴＬ１Ａを含む上清は、過去に報告された（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，９９０−２．（１９９６）；Ｋｉｔｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８４，３７２−５．（１９９６）；Ｓｃｒｅａｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，４６１５−９．（１９９７）；Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６，７９−８８．（１９９７）；Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ６，１６６９−７６．（１９９６）；Ｔａｎ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２０４，３５−４６（１９９７））ようにアポトーシスを通じて、ＦＬ  ＴＮＦＲ２５又はΔ５，６  ＴＮＦＲ２５を形質移入された腫瘍細胞からの５１Ｃｒの迅速な放出を引き起こした（図７ｄ）。抗ＴＬ１Ａ抗体の１つであるＬ４Ｇ６はＴＬ１Ａに仲介されるＴＮＦＲ２５を形質移入された細胞の溶解を完全に阻害したが、他の複数の抗ＴＬ１Ａ抗体は溶解阻害効果を有さないか、不完全な溶解阻害を仲介するにすぎなかった（図７ｄ）。したがってＬ４Ｇ６抗体は、遺伝的に変更されていない野生型マウスにおけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達を阻害するために、ＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害に係る使用のために選択された。マウスは通常のとおりミョウバン及びオボアルブミンで２度免疫された。気道負荷の１日前と気道負荷後の３日間とに、５０μｇのＬ４Ｇ６が腹腔内注射され、その後前記マウスは分析された（図７ｅ）。対照マウスは、ハムスターのＩｇＧを同量及び同スケジュールで受け入れた。噴霧負荷期間の間及び後にこのように投与されたＬ４Ｇ６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのオボアルブミンでの再負荷によるＢＡＬＦ中への好酸球の浸出を阻害し、過剰な粘液産生を阻害し、気管支リンパ節細胞のＴｈ２サイトカイン産生を減少させた（図７ｅ−ｇ）。
【０１３２】
噴霧負荷の間の抗ＴＬ１Ａ抗体による肺の炎症の抑制は、気道におけるＴＬ１Ａ発現の証拠である。中程度のレベルのＴＬ１Ａが、気道負荷後の気管支流入領域リンパ節におけるＣＤ１１ｃ＋細胞の亜集団で発現されるが気道負荷前には発現されないことが見出された（図７ｈ）。気管支リンパ節における他の全ての細胞集団は、噴霧負荷の前後でＴＬ１Ａ陰性であった（図７ｉ）。鼠径部のリンパ節は、オボアルブミンでの一次刺激又は気道負荷の前後のいずれかの時間で、ＣＤ１１ｃ＋細胞か他のいずれかの細胞タイプかにおいてＴＬ１Ａを発現しなかった。しかしＴＬ１Ａ発現は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体での活性化により、精製ＣＤ４＋脾臓細胞又はリンパ節細胞と、精製ＣＤ８＋脾臓細胞又はリンパ節細胞とにおいて２４時間以内にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導される場合がある（図７ｊ）。ＬＰＳにより活性化される増殖中のＢ細胞はＴＬ１Ａを発現しない（図７ｊ）。
【０１３３】
６．ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＮＫＴ細胞は、抗原一次刺激及び噴霧負荷されたＮＫＴ欠損マウスにおいて肺の炎症を支持できない。
野生型ＮＫＴ細胞のＮＫＴ欠損マウスへの養子移植がオボアルブミンモデルにおいて肺の炎症と気道過敏性とを回復させること、及び、ＮＫＴ細胞によるＩＬ−１３産生が必要とされることが示されている（Ａｋｂａｒｉ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，５８２−８（２００３）；Ｌｉｓｂｏｎｎｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１，１６３７−４１（２００３）；Ｍｅｙｅｒ，Ｅ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３，２７８２−７（２００６））。ＮＫＴ細胞は、喘息患者の病態生理学にも関与する（Ｓｅｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５，４９１４−２６（２００５）．Ａｋｂａｒｉ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４，１１１７−２９（２００６））。ＮＫＴ細胞で構成的に発現する（図１ａ）ＴＮＦＲ２５が肺の炎症のトリガリングに関与するかどうかについて決定するために、野生型ＮＫＴ細胞及びＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＮＫＴ細胞が、オボアルブミンで一次刺激されたＮＫＴ欠損マウス（Ｃｕｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，１６２３−６（１９９７）、Ｊα１８ｋ．ｏ．）に養子移植された（図８）。養子移植された野生型ＮＫＴ細胞は気道抗原負荷による肺の炎症を回復させたが、同数のＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＮＫＴ細胞は肺の炎症を回復させることができなかった。前記データは、ＮＫＴ細胞内でのＴＮＦＲ２５のシグナルが、感作されたマウスに係る気道抗原曝露の間の肺の炎症のトリガリングに重要であることを実証する。
【０１３４】
７．抗腫瘍免疫応答の直接の増強剤としてのＴＮＦＲ２５のアゴニスト
成熟樹状細胞は、腫瘍特異的ペプチドに対して特異的なＴ−細胞障害性細胞を効果的に一次刺激することを可能にする「交差提示」と呼ばれる重要なプロセスを実行する。腫瘍抗原は分解され、ＭＨＣクラスＩタンパク質上で循環ＣＤ８Ｔ細胞に対して提示される。
【０１３５】
ＴＮＦＲ２５のアゴニストが有効な腫瘍ワクチンＢＲＭｓであることを実証するために、マウスは、ＥＧ７腫瘍細胞及びＯＴ−Ｉ細胞といっしょに注射された。ＯＴ−Ｉ細胞はその後、クローン性増殖について観察された。ＥＧ７は、ニワトリの卵白の主要なタンパク質構成要素であるオボアルブミンを発現するために遺伝的に変更されたＥＬ４マウス腹水リンパ腫リンパ芽球細胞である。マウスはＥＧ７細胞を接種され、オボアルブミン特異的Ｔ細胞受容体遺伝子導入細胞（ＯＴ−Ｉ）の養子移植を受け入れた。ＯＴ−Ｉ細胞は、前記腫瘍特異的オボアルブミン抗原に応答することによりｉｎ  ｖｉｖｏで指標細胞として働く。理論上はマウスの樹状細胞は、前記オボアルブミン特異的（ＯＴ−Ｉ）Ｔ細胞に腫瘍特異的オボアルブミンを提示し、活性化する。しかしこれらの環境下では、また、ヒト腫瘍ワクチン試験で頻繁に観察されるように、ＯＴ−Ｉ細胞は前記ＥＧ７腫瘍細胞と活発に反応する。
【０１３６】
対照的に、分泌型熱ショックタンパク質ｇｐ９６（ｇｐ−９６−Ｉｇ）をエンコードする構成体のＥＧ７細胞への同時形質移入は、ｇｐ９６Ｉｇを分泌し代理抗原（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）としてオボアルブミンを含む腫瘍を提供した。前記腫瘍特異的オボアルブミンと組合せた分泌シャペロン熱ショックタンパク質へのＣＤ８  ＯＴ−Ｉ細胞の曝露は、一次注射と、分泌されたｇｐ９６Ｉｇによる１回の追加免疫との後で、全ＣＤ８細胞の０．５％から５０％超までの初期出現頻度でのＯＴ−Ｉの増殖をもたらした。したがってインタクトなオボアルブミンタンパク質によるクロスプライミングと比較して、ｇｐ９６−Ｉｇ−ＯＶＡによるＣＤ８細胞のクロスプライミングは、１０，０００ないし１，０００，０００倍増強される。実施例１９と図１０及び図１２とを参照せよ。Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｏｃｔｏｂｅｒ；４８（４）：２２０−５も参照せよ。
【０１３７】
ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞がＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体４Ｃ１２の存在下でｇｐ９６−Ｉｇ−ＯＶＡによりクロスプライミングされるとき、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８増殖は、対照抗体と比較して付加的に１０倍に増大した。しかしＯＴ−Ｉ  ＣＤ８細胞がＴＬ１Ａ阻害抗体Ｌ４Ｇ６の存在下でｇｐ９６−Ｉｇ−ＯＶＡによりクロスプライミングされるとき、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８増殖は対照抗体と比較して１０分の１に減少した。図１１を参照せよ。
【０１３８】
それにより、ＴＮＦＲ２５のアンタゴニストがＴ細胞活性化を阻害又は抑制するのに対して、ＴＮＦＲ２５のアゴニストはＴ細胞の活性化と、腫瘍特異的抗原への細胞性免疫応答とを高めるので、腫瘍ワクチンに対する有効な生物学的応答調節剤である。したがって本発明の別の局面は、腫瘍ワクチンの有効性を増大させる方法及び治療薬に関する。
【０１３９】
腫瘍ワクチンは、癌と戦うために身体の天然の免疫系の要素を使用することを試みる。腫瘍ワクチンは、１種類又は２種類以上の腫瘍特異的抗原を含み、また、アジュバント剤及び生物学的応答調節剤を含む場合がある。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞内又は腫瘍細胞上における発現に実質的に限定されるポリペプチドであって、前記腫瘍細胞を標的とすることが意図される免疫応答を刺激するために使用される場合があるポリペプチドである。さまざまなタイプの癌を治療するためにさまざまなタイプのワクチンが使用される。抗原組成物がワクチンとして有用であるために、抗原組成物は細胞又は組織中で抗原に対する免疫応答を誘発しなければならない。本明細書で用いられるところの「抗原組成物」は、（例えばペプチド又はポリペプチドのような）抗原か、（例えば抗原発現ベクターのような）抗原をエンコードする核酸か、抗原を発現又は提示する細胞かを含む場合がある。その全体が引用により本明細書に取り込まれる米国特許出願公開公報第２００３／０１８５８４０号明細書を参照せよ。
【０１４０】
Ｔ細胞免疫を上向き調節することか、サプレッサー細胞の活性を下向き調節することかが示されている生物学的応答調節剤（ＢＲＭ）。かかるＢＲＭｓは、シメチジン（ＣＩＭ、１２００ｍｇ／ｄ、Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ、ＰＡ）か、低用量シクロホスファミド（ＣＹＰ、３００ｍｇ／ｍ２、Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ、ＮＪ）か、ｇ−インターフェロン、ＩＬ−２又はＩＬ−１２のようなサイトカインか、Ｂ−７のような免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をエンコードする遺伝子かを含むがこれらに限定されない。
【０１４１】
本発明のこの局面のある実施態様では、前記腫瘍ワクチン組成物は、腫瘍抗原組成物とＴＮＦＲ２５のアゴニストとを含む。別の実施態様では前記ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、前記抗体４Ｃ１２である。好ましい実施態様ではＴＮＦＲ２５のアゴニストは、生物学的応答調節剤として腫瘍ワクチンに添加される。さらにより好ましくは前記ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、前記抗体４Ｃ１２である。別の実施態様では前記腫瘍ワクチンは、アジュバント剤を含む。
【０１４２】
腫瘍ワクチンアジュバント剤は、ＩＬ−１と、ＩＬ−２と、ＩＬ−４と、ＩＬ−７と、ＩＬ−１２と、γ−インターフェロンと、ＧＭＣＳＰと、ＢＣＧと、水酸化アルミニウムと、ｔｈｕｒ−ＭＤＰ及びｎｏｒ−ＭＤＰのようなＭＤＰ化合物と、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）と、脂質Ａと、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）とを含む場合がある。２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中の、ＭＰＬ、トレハロースジマイコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ、ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）という細菌から抽出された３種類の成分を含むＲＩＢＩも意図される。ＭＨＣ抗原組成物が使用される場合すらある。代表的にはよく好まれるアジュバント剤は、フロイント完全アジュバント（殺菌されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異的刺激剤）、フロイント不完全アジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバントを含む。
【０１４３】
活性成分としてペプチド配列を含むワクチンの調製物は概して当業者によく理解され、その全てが引用により本明細書に取り込まれる米国特許公報第４，６０８，２５１号、第４，６０１，９０３号、第４，５９９，２３１号、第４，５９９，２３０号、第４，５９６，７９２号及び第４，５７８，７７０号明細書により例示される。典型的にはかかるワクチンは注射可能なように調製される。液体溶液又は懸濁液か、注射前に液体中の溶液又は懸濁液にするのに適した固体形態かが調製される場合もある。前記調製物は乳化される場合もある。前記活性免疫原性成分は、医薬品として許容可能であり該活性成分と適合する賦形剤と混合されることが多い。適切な賦形剤は例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール又はこれらに類するものか、それらの組合せかである。加えて、必要に応じて前記ワクチンは、湿潤剤又は乳化剤か、ｐＨ緩衝剤か、該ワクチンの有効性を増強するアジュバント剤かのような補助剤かを少量含む場合がある。
【０１４４】
８．生来の抗腫瘍免疫応答の間接的な増強剤としてのＴＮＦＲ２５の免疫毒素
多くの疾病の治療に及ぼすその莫大なインパクトの可能性のために、多くの科学者及び企業がＣＤ４＋／ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）について研究する。多くの人々が同じ環境アレルゲンに曝され、アレルゲンへの感作が日常的であるのに、ごく僅かの割合の人々だけが喘息のようなアレルギー性疾患を発症する。この理由は現在は明らかではないが、アレルゲンに曝された健康な個体における気道炎症を抑制する効率的な制御性Ｔｒｅｇｓの存在に関連する場合がある。それによりＴｒｅｇｓは、自己及び非自己に対する抹消寛容の維持に寄与することが知られる。しかしＴｒｅｇｓは、癌と戦うための身体能力を妨害することも実証されている。そのような場合にはＴｒｅｇｓは前記身体の腫瘍殺傷免疫細胞を妨害する。それによりＴｒｅｇｓは、献身的なサプレッサー細胞として機能し、例えば頭頸部扁平上皮癌のような腫瘍が免疫系により認識されるのを妨げるのに一定の役割を果たす場合がある。Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００５  Ｍａｒ．１４；９２（５）：９１３−２０を参照せよ。
【０１４５】
本発明者らは、Ｔｒｅｇｓが活性化されることを示唆する特性をＴｒｅｇｓが有するのを観察した。他のＴＮＦ受容体がＴｒｅｇｓにおいて発現されることが報告されている。ＧＩＴＲは活性化Ｔｒｅｇｓにより発現される。その結合がＴｒｅｇｓの阻害活性を消失させることが見出されている（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５  Ａｐｒｉｌ；３５（４）：１０１６−２２）。ＴＮＦＲ２５は、自身をＴｒｅｇｓ細胞の多用途な調節因子にする多くの特性を有する。ａ）ＴＮＦＲ２５タンパク質の発現は、ＰＫＣ誘発性ｍＲＮＡスプライシングにより迅速に上向き調節される。ｂ）おとり受容体とドミナントネガティブ形態とを含む複数の機能的スプライシング種が調節に係る微調整を可能にする。ｃ）ＴＬ１Ａの発現が、クローン病において高度に調節されるようである。加えて活性化リンパ球におけるＴＬ１Ａの発現は、リンパ球密度の検知を可能にする。結局それらは、ＴＮＦＲ２５のシグナルによりトリガリングされるサイトカインであるＩＬ−１０及びＩＬ−１３を分泌することにより、少なくとも部分的にその調節機能を発揮する。本発明者らは、ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇｓ培養細胞が異常に高いレベルのＴＮＦＲ２５を発現することを最初に指摘した者である。それにより本発明者らは、ＴＮＦＲ２５がＴｒｅｇの機能を変調させること、及び、ＴＮＦＲ２５がＴｒｅｇｓをｉｎ  ｖｉｖｏで除去するための分子タグとして使用される場合があることを結論した。実施例２０を参照せよ。さらにＴＮＦＲ２５のアゴニストはＴｒｅｇ阻害を消失させる。図１５を参照せよ。
【０１４６】
したがって本発明の別の局面は、患者からＣＤ４＋／ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を除去することにより抗癌療法の効力を増大させるのに有用な方法及び治療薬に関する。本発明のこの局面のある実施態様ではＴｒｅｇｓを除去するために免疫毒素が使用される。この実施態様では前記免疫毒素はＴＮＦＲ２５に特異的な抗原結合部分を有し、毒性物質に結合させられる。代わりの実施態様では前記患者は、毒性物質に結合した可溶性ＴＬ１Ａを提供される。さらに別の実施態様は、化学療法剤及びＴＮＦＲ２５特異的免疫毒素を有する化学療法組成物に関する。さらに別の実施態様は、化学療法剤と毒性物質に結合したＴＬ１Ａとを有する化学療法組成物に関する。
【０１４７】
本発明の別の局面は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）により仲介される阻害を低減するＴＮＦＲ２５のアゴニストを患者に提供することにより抗癌療法の効力を増大させるのに有用な方法及び治療薬に関する。
【０１４８】
９．抗炎症剤としてのＴＮＦＲ２５のアゴニスト
細胞内デスドメインを欠くＴＮＦＲ２５のドミナントネガティブ形態（ＤＮ−ＴＮＦＲ２５）と、第４の細胞外システインリッチドメインをエンコードするエキソン５及びエキソン６を欠くＴＮＦＲ２５のオルタナティブスプライシング形態（Δ５，６−ＴＮＦＲ２５）とを使用して、本発明者らは、粘膜の傷害後に恒常性バランスを回復させるためにＴＮＦＲ２５の機能が必要とされることを見出した。具体的には本発明者らは、マウスにおいてＣＤ２プロモーターの存在下で、ＴＮＦＲ２５のドミナントネガティブ形態（ＤＮ−ＴＮＦＲ２５）を遺伝子導入により発現させた。前記マウスは、ヒトクローン病についてのモデルとしての大腸炎を誘発させるために、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を与えられた。野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、２％ＤＳＳを含む水の飲用の５日後に大腸炎及び下痢を発症し、体重が減少した。しかし通常の水に交換すると１週間以内に野生型マウスは回復し体重を回復したのに対して、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５導入遺伝子発現マウスは野生型マウスと同様に疾病を発症したが下痢はより重篤なようであった。加えて通常の水への交換はＤＮ  ＴＮＦＲ２５導入遺伝子発現マウスの回復をもたらさなかった。それどころか全てのＤＮ  ＴＮＦＲ２５導入遺伝子発現マウスは体重を減少させ続け、２週間以内に死亡した。（全長ＴＮＦＲ２５か、スプライシング形態であるΔ５，６  ＴＮＦＲ２５かのような）ＴＮＦＲ２５の機能的な導入遺伝子を発現するマウスは、野生型マウスと同様に回復した。実施例２１及び２２と、図１４とを参照せよ。
【０１４９】
クローン病の現在の治療は、抗炎症剤、免疫抑制剤及びＴＮＦ阻害剤を使用する。これらの全ては対症的である。ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達を刺激することは、病原性連鎖の事象における１つの段階を動かす。活性化ＴＮＦＲ２５は、恒常性の回復をもたらすＴＧＦ−β産生を次々と刺激するＩＬ−１０及びＩＬ−１３の産生を刺激する。かかる治療は治癒的である、又は、治癒に向わせる。
【０１５０】
したがって本発明の別の局面は、ＴＮＦＲ２５のアゴニストの治療量を患者に投与することにより患者の炎症性腸疾患を治療する方法に関する。別の実施態様は、腸内の粘膜領域におけるＩＬ−１０レベルを上昇させることにより患者の炎症性腸疾患を治療する方法に関する。別の実施態様では前記ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、抗体４Ｃ１２である。さらなる実施態様では前記ＴＮＦＲ２５のアゴニストは、ＴＬ１Ａの可溶性形態である。好ましい実施態様では炎症性腸疾患はクローン病である。
【０１５１】
ＴＮＦＲ２５のアゴニストの抗炎症活性を考慮すると、炎症の低減を必要とする患者に方法及び治療薬を提供することは本発明の別の局面である。ある実施態様では患者は、炎症を減少させ治癒を促進するために、ＴＮＦＲ２５のアゴニストを含む組成物を提供される。ある実施態様では患者は、ＴＮＦＲ２５のアゴニスト４Ｃ１２を含む組成物を提供される。かかる実施態様は、（例えばアテローム性動脈硬化症のような）循環器系疾患と、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、（特にＩ型糖尿病のような）糖尿病、強直性脊椎炎、（特にリウマチ様関節炎のような）関節炎、喘息及びアレルギーを含む自己免疫疾患と、骨吸収疾患と、網膜症を含む眼科疾患と、繊維症とを含む、細胞レベルでの慢性炎症反応に仲介される疾患の症状を軽減するのに有用である。
【０１５２】
１０．免疫抑制剤としてのＴＮＦＲ２５のアンタゴニスト
現在では多くの臓器及び組織が、あるヒトから別のヒトへごく普通に移植される。ドナーとレシピエントとが一卵性の「同一な」双子であるまれな場合を除いて、かかる移植は同種移植と呼ばれる。組織のレシピエントは全ての非自己タンパク質に対して強力な液性及び細胞性免疫反応を開始するため、ある個体から別の個体への組織の移植についての組織の適合は重要である。組織適合検査は、ドナー及びレシピエントの細胞の両方についてのＭＨＣ抗原を特定するステップと、レシピエントのＭＨＣ対立遺伝子と同一なＭＨＣ対立遺伝子をできる限り多く有するドナーの細胞を使用するステップとを含む。（特にＨＬＡ−Ｂのような）ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子とクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子とを適合させることは、移植の成功のためには、他のＭＨＣ抗原を適合させることよりも重要である。またＭＨＣを適合させることは、マイナー組織適合抗原を適合させることよりも重要である。
【０１５３】
ＨＬＡ適合は移植片の生残性を向上させるが、（一卵性双生児を除く）ＭＨＣが同一の兄弟においてさえも拒絶反応を防止しない。同種ＭＨＣはＣＤ８Ｔ細胞（クラスＩ）又はＣＤ４Ｔ細胞（クラスＩＩ）により認識される。一定の同種ＭＨＣは自己のＭＨＣ＋外来ペプチドに類似するために、１０％までのＴ細胞が一定の同種ＭＨＣを認識する場合がある。
【０１５４】
移植の成功の増加は、技術的専門知識の増加と、ＨＬＡ適合の実施と臓器送達時間の最小化とのための移植センターの利用可能性の増大と、アロ抗原に対するＴ細胞活性化を阻害する（シクロスポリン及びタクロリムスのような）免疫抑制剤の利用可能性の増大とのためである。さらなる問題は、臓器不足と、移植後の臓器を破壊する現存する疾病（糖尿病及びＨＢＶ感染は２つの例である。）の能力と、免疫抑制剤の副作用と、高い費用とである。
【０１５５】
Ｔ細胞活性化を阻害する現在の免疫抑制剤に関連する主要な副作用と、ＴＬ１Ａ阻害抗体Ｌ４Ｇ６のようなＴＮＦＲ２５のアンタゴニストが同種ＣＤ８Ｔ細胞のクローン性増殖の有効な阻害剤となるという観察結果（図１１、実施例１９を参照せよ。）とを考慮すると、本発明の別の局面は、組織の拒絶反応を防止し組織移植を円滑化するためのＴＮＦＲ２５のアンタゴニストの使用を含む。ある実施態様ではＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、アロ抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲｓ）を有するＣＤ８Ｔ細胞のクローン性増殖を抑制するために、また、ＴＮＦＲ２５によるＴｒｅｇｓの抑制を取り除くために、移植片のレシピエントに提供される。別の実施態様ではＴＮＦＲ２５のアンタゴニストは、免疫抑制剤と組み合わせて移植片のレシピエントに提供される。
【実施例１】
【０１５６】
培地及び試薬
細胞は、１０％の熱不活性化ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、５０μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養された。モノクローナル抗マウスＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ３抗体は、それぞれ２Ｃ１１株細胞及びＯＫＴ３株細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）の培養上清から精製された。モノクローナル抗マウスＣＤ２８抗体及び抗ヒトＣＤ２８抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から購入された。ＣｏｎＡ、ＰＨＡ及びＬＰＳは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から購入された。組換えマウスＩＬ−２は、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、Ｃａｌｉｆ．）から購入された。ＰＭＡ，イオノマイシン、Ｈ７及びシクロヘキシミドはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から購入された。
【０１５７】
ＦＩＴＣ−ＣＤ４、Ｃｙｃｈｒｏｍｅ−ＣＤ４、ＰＥ−ＣＤ８ａ、Ｃｙｃｈｒｏｍｅ−ＣＤ８ａ、ＦＩＴＣ−Ｂ２２０、ＰＥ−Ｂ２２０、ＦＩＴＣ−ＣＤ２５、ＰＥ−ＣＤ１１ｃ、ＰＥＤＸ５、ＦＩＴＣ−ＣＤ３、ＰＥ−ＮＫ１．１、ＰＥ−アネキシンＶ及び７−ＡＡＤを含む直接結合型のモノクローナル抗体はＢＤ／ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から購入された。ハムスターＩｇＧ対照抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入された。
【実施例２】
【０１５８】
ｍＴＮＦＲ２５及びｍＴＬ１Ａに対するモノクローナル抗体の作成
アルメニアハムスターが、フロイントアジュバント中の５０μｇのｍＴＮＦＲ２５−Ｉｇ又はｍＴＬ１Ａ−ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）で、隔週で（ｂｉｗｅｅｋｌｙ）３回腹腔内免疫された。融合の３日前にハムスターは、５０μｇのそれぞれのタンパク質で、静脈内に追加免疫された。ハムスターの脾細胞がマウス骨髄腫ＳＰ２０細胞とＰＥＧで融合され、その後ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用して２週間メチルセルロース培地中でプレート培養された。１千個のコロニーがピックアップされ、免疫用の融合タンパク質か、対照タンパク質−Ｉｇ融合タンパク質かでコーティングされたプレート中でＥＬＩＳＡにより分析された。陽性クローン由来の上清が、フローサイトメトリー及びウェスタンブロッティングにより形質移入された細胞におけるｍＴＮＦＲ２５アイソフォームを検出する能力について試験された。抗体はプロテインＧカラム上のＮｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）上清から精製され、ＰＢＳ中で透析され、濾過滅菌された。
【実施例３】
【０１５９】
ｍＴＮＦＲ２５及びｍＴＬ１Ａの発現についてのフローサイトメトリー分析
単一細胞懸濁液が、個別の実験において表示されるリンパ器官から調製された。染色の前に細胞は、ＦｃＲｓへの非特異的結合を阻害するために、精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃ−γＩＩＩ／ＩＩ受容体；ＢＤ）と、精製ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐａ．）とで処理された。細胞は、アルメニアハムスター抗マウスＴＮＦＲ２５抗体又は抗マウスＴＬ１Ａ抗体で３０分間、４°Ｃで染色された。細胞はＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のＢＳＡと２ｍＭのＥＤＴＡとを含むＰＢＳ）で洗浄され、その後ビオチン標識ヤギ抗アルメニアハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で３０分間、４°Ｃで染色された。細胞は洗浄され、その後ストレプトアビジン−ＰＥ又はストレプトアビジン−Ｃｙｃｈｒｏｍｅ（ＢＤ）で３０分間、４°Ｃで染色された。細胞は洗浄され、その後相異なる細胞集団について直接結合型の細胞表面マーカーで染色された。試料は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔとＣＥＬＬＱｕｅｓｔ．ＴＭ．ｓｏｆｔｗａｒｅとを使用して分析された。
【実施例４】
【０１６０】
ＲＴ−ＰＣＲ
ｍＴＮＦＲ２５のスプライシング形態の同定。メッセンジャーＲＮＡはＭｉｃｒｏ  Ｆａｓｔ−Ｔｒａｃｋ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）でマウス株細胞又は組織から抽出され、ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写された。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ  ＩＩベクターにサブクローニングされ、ＤＮＡシーケンシングによりｍＴＮＦＲ２５のスプライシング形態として確認された。マウスＴＮＦＲ２５のスプライシング分析のために、上流プライマーであるエキソン２（ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＧＴ、配列番号８）と、下流プライマーであるエキソン７（ＧＧＡ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＣ、配列番号９）と、上流プライマーであるエキソン７（ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＴＧ、配列番号１０）と、下流プライマーであるエキソン１０（ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＣＧＣ  ＴＴ、配列番号１１）とのようなプライマーが使用された。
【０１６１】
マウスではさまざまなスプライシング形態のＰＣＲ産物がアガロースゲル上で識別し難かったがヒトでのスプライシング形態と類似しているようであったため、ヒトＴＮＦＲ２５の活性化誘発性オルタナティブスプライシングが分析された。上流プライマーであるエキソン４（ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＡＣ、配列番号１２）と、下流プライマーであるエキソン７（ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＧＣ、配列番号１３）とのようなＰＣＲプライマーが使用された。ヒト抹消血単核細胞が、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により、健康なドナーから単離された。１試料当たり５百万個の細胞が、ＰＨＡ（５μｇ／ｍＬ）か、固定化抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、５μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）か、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（４００ｎｇ／ｍＬ）かで活性化された。前記細胞は表示された時間で回収され、ｍＲＮＡが抽出され前記Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのキットを使用してｃＤＮＡに返還された。ヒトβ−アクチンが内部標準として使用された。ＰＣＲ産物の定量は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して実施された。
【実施例５】
【０１６２】
遺伝子導入マウスの作成
マウスＴＮＦＲ２５構成体が、（ＮＩＨのＡ．Ｓｉｎｇｅｒ博士から供与を受けた）ヒトＣＤ２プロモーター及び局在制御領域の存在下で、制限エンドヌクレアーゼ部位ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを使用してクローニングされた。３種類のｍＴＮＦＲ２５構成体が、校正酵素を使用するＰＣＲにより作成された。前記構成体は、マウスＴＮＦＲ２５の全長分子（ＦＬ  ＴＮＦＲ２５）と、第５及び第６のエキソンを欠くＴＮＦＲ２５のスプライシング変異体（Δ５，６  ＴＮＦＲ２５）と、膜貫通ドメインの終点で終結し細胞内ドメイン全体を欠くＴＮＦＲ２５のドミナントネガティブ形態（１−２３４に示される（ａｓ  １−２３４）ＤＮ  ＴＮＦＲ２５）とである。前記ＰＣＲ産物の配列はシーケンシングにより確認された。受精卵へのＤＮＡの微量注入が、マイアミ大学医学部の遺伝子導入設備により実施された。有望な初代遺伝子が、尾部バイオプシー（ｔａｉｌ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ）由来のＤＮＡのＰＣＲによりスクリーニングされた。前記プライマー対がクローニング部位の上流及び下流に位置づけられたので、全てのｍＴＮＦＲ２５導入遺伝子に対して同じプライマー対が使用された。前記上流プライマーは５’ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＡＴＧ  ３’（配列番号１４）であり、前記下流プライマーは５’ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  Ｃ  ３’（配列番号１５）である。遺伝子導入マウスは、半接合性遺伝子導入マウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍｅ．）と順次交配させることにより、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有する状態まで繁殖させられた。全てのマウスは６−１２週齢で使用され、病原体のいない施設で維持された。マイアミ大学動物管理使用委員会が、全ての動物使用手順を承認した。
【実施例６】
【０１６３】
ＮＦκＢ活性化のための核抽出物調製及び電気泳動移動度シフト解析
１０７個のΔ５，６  ＴＮＦＲ２５  ＥＬ４細胞又はＦＬ  ＴＮＦＲ２５  ＥＬ４細胞が、図の説明文に表示されたように可溶性又は膜結合性ＴＬ１Ａか、ＴＮＦＲ２５のアゴニスト抗体４Ｃ１２かで処理され、その後８００ｇ、５分間の遠心分離により収集された。核抽出物はミニプレパレーションプロトコールを使用して単離され、Ｈａｒｈａｊ，Ｅ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３３，１４５−５８（２００５）で説明されるＥＭＳＡに供された。核抽出物（６μｇ）は３２Ｐ標識高親和性κＢプローブといっしょに室温で２０分間インキュベーションされ、その後ネイティブの５％のポリアクリルアミドゲル上で前記ＤＮＡ−複合体が分離された。
【実施例７】
【０１６４】
Ｔ細胞増殖アッセイ
脾細胞は、９６ウェルの平底プレートに、１ウェル当たり１ｘ１０5個の細胞数かつ三重で（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）播かれた。細胞は、可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）といっしょに又は単体で使用する固定化抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）か、ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍＬ）か、ＰＭＡ（１μｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（４００ｎｇ／ｍＬ）かで活性化された。Ｔ細胞増殖に対しては、１ウェル当たり１ｘ１０5個の細胞数の精製ＣＤ４Ｔ細胞か、１ウェル当たり５ｘ１０4個の細胞数の精製ＣＤ８Ｔ細胞かが、コーティングされた抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）と可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）とで刺激された。組換えｍＩＬ−２が、表示される実験において１０００Ｕ／ｍＬで前記培養液に添加された。細胞は７２時間培養され、培養の最後の６時間は１ウェル当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）といっしょに振とうされ、チミジンの取り込みがシンチレーションカウンターを使用して定量された。
【０１６５】
マウスＣＤ４Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞は、製造業者のプロトコールに従うＳｐｉｎＳｅｐ  ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を使用するネガティブ選択により脾細胞及び／又はリンパ節から精製された。前記純度はＦＡＣＳ分析により検査され、常に約９０−９６％であった。
【実施例８】
【０１６６】
ＤＮＰ−ＫＬＨでのマウスの免疫、抗体アイソタイプ決定、サイトカインＥＬＩＳＡ
成体（６−１０週齢）の遺伝子導入マウス及び野生型マウスが、１００μｇのＤＮＰ結合型スカシ貝ヘモシアニン（ＤＮＰ−ＫＬＨ、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）で腹腔内免疫された。免疫の１週間後及び３週間後にマウスは採血され、製造業者のプロトコール（ＢＤ）に従うＥＬＩＳＡによる抗ＤＮＰ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＥ及びＩｇＧ２ａ抗体の分析のために、血清が分離された。個々のマウス由来の血清は、０．８μｇ／ｍＬのＤＮＰ−アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）でコーティングされた９６ウェルプレートに吸収され、結合した抗体のアイソタイプがＥＬＩＳＡにより決定された。
【０１６７】
細胞培養上清におけるサイトカイン産生を試験するために、製造業者の説明書によるサンドイッチＥＬＩＳＡ法が実施された。ＢＤから入手された抗体の対が、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の分析のために使用された。ＩＬ−１３に係るＥＬＩＳＡのための試薬はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）から購入され、ＩＬ−５及びＩＬ−１０に係るＥＬＩＳＡのための試薬はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入された。
【実施例９】
【０１６８】
ＣＤ４Ｔ細胞のＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分極
ＣＤ４Ｔ細胞は、上述のネガティブ選択により精製された。ＣＤ４Ｔ細胞は、Ｔｈ１分化についてはＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）及び抗ｍＩＬ−４抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、Ｔｈ２分化についてはＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）、抗ｍＩＦＮ−γ抗体（１０μｇ／ｍＬ）及び抗ｍＩＬ−１２抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で、又は、単体で使用する固定化抗ｍＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）及び可溶性抗ｍＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）で７日間活性化された。前記細胞は回収され、洗浄され、１ウェル当たり１ｘ１０5個の細胞数となるように再びプレートに播かれ、固定化抗ＣＤ３抗体で再刺激された。２４時間後前記上清は回収され、ＥＬＩＳＡによりサイトカイン産生について評価された。
【実施例１０】
【０１６９】
アレルギー性喘息のマウスモデルに対する免疫プロトコール
上述のように作成され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのバックグラウンドを有する状態まで少なくとも７世代にわたり戻し交配された（配列番号１６に係るヌクレオチド配列によりエンコードされる）ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスと、Δ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスと、ＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスとは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍｄ．）から購入された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較された。マウスは０日目に、２００μＬのＰＢＳ中における６．６ｍｇの硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン、Ｓｉｇｍａ）に吸収された６６μｇのオボアルブミン（結晶化ニワトリ卵白アルブミン、ｇｒａｄｅ  Ｖ、Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射により感作された。５日目にマウスは、ミョウバン中の同用量のオボアルブミンで腹腔内に追加免疫された。１２日目にマウスは、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ（ＭＡＢＩＳ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ．）を使用してＰＢＳ中の０．５％のオボアルブミンで、１時間噴霧負荷された。マウスは、前記単回噴霧曝露の３日後に肺のアレルギー性炎症について評価された。マウスはＣＯ２の吸入により屠殺された。気管のカニューレ挿入後、肺は１ｍＬのＰＢＳで４回洗浄された。気管支肺胞洗浄液から回収された細胞は計数され、（スライド１枚当たり５０，０００個以下の細胞数の）サイトスピン標本として使用された。マクロファージ、好酸球、リンパ球及び好中球についての細胞数差を決定するために、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ  ｓｔａｉｎ（Ｓｉｇｍａ）で染色された各々のサイトスピンスライドについて、＞２００個の細胞が計数された。
【実施例１１】
【０１７０】
肺の組織学的検査
肺は、前記気管支洗浄手順の後にマウスから除去され、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定された。試料は、マイアミ大学医学部Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＨｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅへ提出され、包埋され、切断され、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された。切片は、粘液産生を決定するために過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）でも染色された。
【実施例１２】
【０１７１】
血清総ＩｇＥ及びオボアルブミン特異的ＩｇについてのＥＬＩＳＡ
マウスは感作前（０日目）と、噴霧負荷の３日後（１５日目）と、幾つかの実験では噴霧負荷の１日前（１１日目）とに採血された。前記総ＩｇＥレベルは製造業者のプロトコール（ＢＤ）に従うＥＬＩＳＡにより定量された。オボアルブミン特異的ＩｇＥは、最初にプレートをＰＢＳ中の０．０１％のＯＶＡでコーティングすること、その後希釈された血清試料を装荷すること、及び、その後ビオチン標識抗ＩｇＥ２次抗体（ＢＤ）を装荷することによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で決定された。
【実施例１３】
【０１７２】
気管支リンパ節細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再刺激、及び、サイトカイン産生
噴霧負荷の１日後又は３日後に気管支リンパ節は回収され、単一細胞懸濁液が調製された。細胞は１ウェル当たり１ｘ１０6個の細胞数となるように丸底９６ウェルプレートに播かれ、１００μｇ／ｍＬのオボアルブミンといっしょに４日間培養された。その後上清が、上述のようにサイトカインＥＬＩＳＡ分析のために収集された。
【実施例１４】
【０１７３】
細胞障害性アッセイ
ＴＬ１Ａ形質移入Ｐ８１５細胞から回収され段階希釈された可溶性ｍＴＬ１Ａ上清が、51Ｃｒ標識ＴＮＦＲ２５形質移入Ｐ８１５標的細胞に添加された。ＴＬ１Ａ阻害活性について試験するために、さまざまな抗ＴＬ１Ａモノクローナル抗体が前記培養液中に添加され、４時間後に三重の試料中のＣｒ放出が決定された。自発的放出が、51Ｃｒ標識標的細胞のみを含むウェルから算出された。１００％の放出（陽性対照）は、５１Ｃｒ標識標的細胞と１％のＳＤＳとを含むウェルから算出された。細胞障害性活性の百分率は、（試料の読みの平均値  −  自発的放出の読みの平均値）／陽性対照の読みの平均値  として算出された。同様のデータがＥＬ−４形質移入体でも取得された。
【実施例１５】
【０１７４】
アンタゴニストの抗ｍＴＬ１Ａ抗体による肺の炎症の抑制
マウスは、０日目及び５日目にミョウバン中のオボアルブミンで腹腔内感作され、その後１２日目にＰＢＳ中の０．５％のオボアルブミンで１時間噴霧負荷された。マウスは、Ｌ４Ｇ６か、当量の対照ハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）かを、１１日目から１４日目までの各日に、マウス１匹当たり５０μｇの腹腔内注射により与えられた。肺のアレルギー性炎症は１５日目に評価された。
【実施例１６】
【０１７５】
ＮＫＴ細胞の養子移植
Ｊα１８ｋ．ｏ．マウス（Ｃｕｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，１６２３−６（１９９７））は、Ｍ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ（Ｃｉｂａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｊａｐａｎ）から親切な許可を得てＭｉｃｈａｅｌ  Ｌｏｔｚｅ（Ｕ．Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）から供与を受けたものである。野生型マウス及びＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウス由来のＮＫＴ細胞が、製造業者のプロトコールに従うＥａｓｙＳｅｐ  ｍｏｕｓｅ  Ｐａｎ  ＮＫ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を使用するポジティブ選択により１０匹のマウス由来のプールされた脾臓細胞から単離された。
【実施例１７】
【０１７６】
統計解析
両側スチューデントｔ検定を使用する統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）により実施された。ｐ＜０．０５は有意であると考えられる。文中のデータは平均値±ＳＥＭとして表される。
【実施例１８】
【０１７７】
ＤＲ３及びＴＬ１Ａ抗体の作成
ＤＲ３−Ｉｇ融合タンパク質が作成され、精製され、ハムスターを免疫するために使用された。ハイブリドーマ上清が取得され、スクリーニング剤としてＤＲ３−Ｉｇ融合タンパク質を使用するＥＬＩＳＡによりスクリーニングされた。前記ハイブリドーマの性質は、ＤＲ３を形質移入された腫瘍細胞のフローサイトメトリーと、ウェスタンブロットと、機能的研究とにより、確認された。ＦＡＣＳにより前記抗体の全てが、形質移入された細胞上の全長ＤＲ３と、オルタナティブスプライシングされたＤＲ３とを検出し、該抗体のうち１つはウェスタンブロットでＤＲ３を検出し、前記抗体（４Ｃ１２）はアゴニスト活性を示し、ＴＬ１Ａの不在下でＤＲ３のシグナル伝達を仲介した。
【０１７８】
ＴＬ１Ａモノクローナル抗体は、ＴＬ１Ａ−マルトース結合タンパク質に係る融合タンパク質でハムスターを免疫することにより取得された。前記ＴＬ１Ａ抗体は、形質移入されたＴＬ１Ａをフローサイトメトリーにより検出した。前記抗体（Ｌ４Ｇ６）はアンタゴニスト活性を示し、ＴＬ１ＡのＤＲ３への結合を阻害した。
【実施例１９】
【０１７９】
ＴＮＦＲ２５を通じたシグナル伝達がＣＤ８のクロスプライミングを増強する。
新規な熱ショックタンパク質ｇｐ９６に基づく、強力な抗原特異的ＣＤ８−ＣＴＬ増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで仲介する系が、Ｓｔｒｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｏｃｔｏｂｅｒ；４８（４）：２２０−５で最近説明された。このモデル系では、（分泌されるように設計され）放出されたｇｐ９６−Ｉｇは、樹状細胞を活性化し、ＣＤ８細胞への交差提示とＣＤ８細胞のクロスプライミングとのための結合型ペプチドを提供する（図１２）。前記系はＣＤ４の助けに依存しないため非常に有用である。分泌されたｇｐ９６は、ＣＤ４細胞上でＣＤ４０−Ｌにより提供されることもあるＣＤ９１及びＴＬＲ２／４を通じてＤＣに活性化シグナルを提供する。したがってこの系でのＣＤ８（ＯＴ−Ｉ）の増殖は、ＣＤ４０−Ｌ欠損マウスにおいて十分に機能する。これは、粘膜免疫を研究するために、また、ＣＤ８増殖におけるＴＮＦＲ２５の役割を決定するために使用される。
【０１８０】
ＥＧ７−ｇｐ９６は、オボアルブミン及びｇｐ９６−Ｉｇでの形質移入によりＥＬ４リンパ腫から誘導された株細胞である。前記細胞は、オボアルブミンペプチドと結合したｇｐ９６−Ｉｇを分泌する。ｇｐ９６−Ｉｇと結合したオボアルブミンペプチドは、ＣＤ８細胞のクロスプライミングを、オボアルブミン単体と比較して約１０，０００倍増強する（図１０）。１００ｎｇのｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇは、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫後の脾臓において移動後のＣＤ８細胞の０．５％から２０％までの出現頻度で、Ｂ６マウス中のＯＴ−Ｉを増殖させる。
【０１８１】
ＣＤ８増殖に及ぼすＴＮＦＲ２５のシグナルの影響を決定するために、上述のＴＣＲ遺伝子導入ＯＴ−Ｉモデルが、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇに仲介される刺激といっしょに使用された。ＴＮＦＲ２５のシグナルの影響を決定するために前記マウスは、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫の２４ｈ及び７２ｈ後に、アゴニストの抗ＴＮＦＲ２５抗体（４Ｃ１２）か、ＴＮＦＲ２５に結合するがアゴニストではない抗体（Ｌ４Ｇ６）か、対照ＩｇＧかを受け入れた。ＯＴ−Ｉ増殖は、免疫後５日目に腹膜腔中で監視された。４Ｃ１２は、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによる腹膜腔中への細胞動員数の増大を引き起こし、細胞数の倍増をもたらした。加えて４Ｃ１２は特に、ＯＴ−Ｉの増殖の８倍以上の増大を引き起こした。前記Ｌ４Ｇ６抗ＴＮＦＲ２５抗体は、腹膜腔への細胞動員数の増大を誘発せず、ＯＴ−Ｉ増殖を阻害した。
【０１８２】
これらのデータは、アゴニストの抗ＴＮＦＲ２５抗体がＣＤ８細胞を同時刺激すること、及び／又は、該抗体がＴＮＦＲ２５を介してＴｒｅｇｓの抑制効果を阻害することを示す。ＴＮＦＲ２５によるナイーブＴ細胞の同時刺激は、二次活性化による増殖の増大とＴｈ２分極とをもたらす。加えて制御性Ｔ細胞に及ぼすＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、抑制の一時的阻害をもたらす。前記組合せの効果は、その後図１１に見られるＣＤ８増殖及び細胞動員の増大の原因となる。
【実施例２０】
【０１８３】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は高レベルのＴＮＦＲ２５を発現する。
ＴＮＦＲ２５の発現を決定するために、ＣＤ４＋ＣＤ２５ＴｒｅｇｓがＣＤ４細胞のネガティブ選択により脾臓から精製され、その後抗ＣＤ２５抗体で磁気選別された。前記細胞は、ビーズ対細胞比率が３対１の抗ＣＤ３抗体ビーズ、抗ＣＤ２８抗体ビーズといっしょに培養され、２０００ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２が添加された。これらの条件下で前記細胞は３−４日後に増殖し始め、約３週間増殖し続ける。培養された細胞は、ＣＤ４及びＣＤ２５についてはＦＡＣＳ分析により、ＦｏｘＰ３の発現とＴＮＦＲ２５の表面解析とについては細胞内蛍光定量（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）により、分析された。図１３は、このようにして取得されたＴｒｅｇｓが本質的に純粋でありＦｏｘＰ３及びＴＮＦＲ２５の両方を発現することを示す。
【実施例２１】
【０１８４】
ＴＮＦＲ２５の阻害は、デキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎に係る死を引き起こす。
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルは、幾つかの点でクローン病と類似する大腸炎モデルとして広範に使用されている。最初の傷害は、通常腸上皮により提供される透過性障壁に及ぼすＤＳＳの損傷効果である。このＤＳＳの効果は、結腸クローン病と類似する炎症性免疫学的反応を引き起こす粘膜免疫系における部位への正常な腸内菌叢の接近を可能にする。２％のＤＳＳを含む飲料水への８日間の曝露過程の間に、野生型Ｂ６マウスは下痢を発症し、体重を減少させた。通常の水への交換によりＢ６マウスは回復し正常な体重を取り戻した。ＴＮＦＲ２５は、大腸炎における疾病の過程にも影響を及ぼす。今回の実験では野生型マウス及び遺伝子導入マウスは、２％のＤＳＳを含む水に７日間曝された。図１４に示されるようにＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスは、野生型マウスと同様の疾病を発症したが、通常の水に交換されたときＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスは野生型マウスと同様には回復しなかった。それどころかＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスは体重を減少させ続け、１２日目及び１６日目の間に死亡した。Δ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスは野生型マウスと類似したが、１匹のマウスの死亡は免疫応答の阻害も示唆する場合があった。２つの結論が導かれた。ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスでは後に続く免疫応答が野生型マウスよりずっと強く死をもたらし、野生型マウスにおける正常な健康及び恒常性の回復は正常に機能する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞に依存する。Ｔｒｅｇの機能は、ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスでは阻害される。栄養及び正常腸内菌叢とへの寛容と、腸内病原体への正常な免疫応答との間の適正なバランスを維持することにより粘膜免疫系の恒常性を維持するためにＴｒｅｇの機能が非常に重要であることは既知であるので、後者の結論には実現可能性がある。
【実施例２２】
【０１８５】
ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇでの免疫は、ＯＴ−Ｉ細胞を粘膜部のパイエル板、固有層リンパ球（ＬＰＬ）及び上皮内リンパ球（ＩＥＬ）に移動させるように誘導する。
図１６の右の列に示されるようにＥＧ−７細胞は、ＯＴ−Ｉのクローン性増殖か、粘膜部への移動かを引き起こすことができない。一方でｇｐ９６−Ｉｇを分泌するＥＧ−７細胞は、脾臓、リンパ節及び腹膜腔におけるＯＴ−Ｉのクローン性増殖（データは示されない。）と、それらの粘膜部への移動（図１６）とを引き起こす。パイエル板では前記細胞の８％がＣＤ８＋であり、ＣＤ８細胞の６．７％がＯＴ−Ｉ細胞である。ＩＥＬでは前記細胞の６１％がＣＤ８＋であり、ＣＤ８細胞の９％がＯＴ−Ｉ細胞である。ＬＰＬではＣＤ８細胞の２９％がＯＴ−Ｉ細胞である。その大部分がＣＤ８ααと５０％のＴＣＲγδとである常在ＣＤ８  ＩＥＬと異なり、免疫後にＩＥＬに移動するＯＴ−Ｉ細胞は、αＥｂ７＋及びα４β７＋であるがＣＤ８αβ及びＴＣＲαβの状態を維持する。
【０１８６】
本開示では、多用途な２，３の実施例を除き本発明の好ましい実施態様のみが説明される。本発明が他のさまざまな組合せ及び環境において使用され得ること、及び、本明細書で説明される本発明の概念の範囲内で本発明が変更又は修正され得ることが理解されるべきである。したがって当業者は例えば、定型的な実験のみを使用して、本明細書で説明される特定の物質及び手順との多数の均等物を認識又は確認することができるだろう。かかる均等物は本発明の範囲内であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】（Ａ）リンパ節細胞におけるマウスＴＮＦＲ２５の発現を示すグラフ。（Ｂ）活性化リンパ球でのＴＮＦＲ２５の発現を示すグラフ。（Ｃ）胸腺細胞でのＴＮＦＲ２５の発現を示すグラフ。
【図２−Ａ】マウスＴＮＦＲ２５のスプライシング形態を示す図。
【図２−Ｂ】ＴＮＦＲ２５の活性化誘発性オルタナティブスプライシングを示す図。
【図２−Ｃ】活性化誘発性スプライシングがＰＫＣ依存性でありタンパク質合成非依存性であることを示す図。
【図３−Ａ】Ｂ６野生型マウス及びアイソタイプ対照と比較した遺伝子導入マウスでのＴＮＦＲ２５の発現を示すグラフ。
【図３−Ｂ】オルタナティブスプライシングを受けたＴＮＦＲ２５を導入された腫瘍細胞のウェスタンブロットを示す図。
【図３−Ｃ】同腹の野生型細胞と比較したＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入リンパ節細胞及び胸腺細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の細胞性の減少を例示するグラフ。
【図３−Ｄ】ＦＬ及びΔ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞の活性化誘発性増殖の障害を示すグラフ。
【図３−Ｅ】ＦＬ  ＴＮＦＲ２５及びΔ５，６  ＴＮＦＲ２５がＮＦ−κＢを活性化することを例示する図。
【図３−Ｆ】野生型ＣＤ４Ｔ細胞、ＦＬ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞、Δ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞によるＴｈ２に偏った主要なサイトカイン産生を示すグラフ。
【図３−Ｇ】ＴＮＦＲ２５がＴｈ１又はＴｈ２のサイトカイン産生を同時刺激する場合があることを例示するグラフ。
【図４−Ａ】遺伝子導入ＣＤ４及びＣＤ８細胞において、活性化によるＩＬ−２−Ｒａ（ＣＤ２５）に係る正常な上向き調節を例示するグラフ。
【図４−Ｂ】遺伝子導入細胞が活性化によりアポトーシスの増大を被らないことを示すグラフ。
【図４−Ｃ】Δ５，６  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生の減少を例示する図。
【図４−Ｄ】ドミナントネガティブなＴＮＦＲ２５遺伝子導入細胞が一次応答においてＴｈ２分極していないことを例示するグラフ。
【図４−Ｅ】ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウス及び野生型マウスの同じ抗体アイソタイプの応答を示すグラフ。
【図５−Ａ】免疫されたＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスでは抗体アイソタイプがＴｈ２に偏っていることを示すグラフ。
【図５−Ｂ】ＴＮＦＲ２５のシグナルが気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球増加症を調節することを例示するグラフ。
【図５−Ｃ】ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおける肺の炎症の増大を示す図。
【図５−Ｄ】ＴＮＦＲ２５のシグナルが血清ＩｇＥレベルを制御することを例示するグラフ。
【図５−Ｅ】ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスでの気管支リンパ節細胞によるＴｈ２サイトカインの産生の増大を示すグラフ。
【図６−Ａ】ＤＮ  ＴＮＦＲ２５導入遺伝子が内在のＴＮＦＲ２５によるサイトカインの同時刺激を阻害することを例示するグラフ。
【図６−Ｂ】ＤＮ  ＴＮＦＲ２５が内在のＴＮＦＲ２５による増殖の同時刺激を阻害することを例示するグラフ。
【図６−Ｃ】ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞が二次活性化におけるＴｈ２サイトカインの減少を引き起こすことを例示するグラフ。
【図６−Ｄ】ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入ＣＤ４Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴｈ２分極に耐性を示すことを示すグラフ。
【図６−Ｅ】野生型マウスと比較したＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおけるＢＡＬＦ中での細胞の浸出の減少を例示するグラフ。
【図６−Ｆ】免疫及び気道負荷の後でのＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおける肺の炎症の抑制を示す図。
【図６−Ｇ】ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスにおけるオボアルブミン特異的ＩｇＥ産生の抑制を例示するグラフ。
【図６−Ｈ】気管支リンパ節におけるＤＮ  ＴＮＦＲ２５によるＴｈ１サイトカインではなくＴｈ２サイトカインの産生抑制を示すグラフ。
【図７−Ａ−Ｃ】適当な抗体で染色されたＦＬ  ＴＮＦＲ２５形質移入Ｐ８１５細胞、Δ５，６  ＴＮＦＲ２５形質移入Ｐ８１５細胞及びＴＬ１Ａ形質移入Ｐ８１５細胞のフローサイトメトリー結果。
【図７−Ｄ】ＴＮＦＲ２５を形質移入された細胞に係るＴＬ１Ａに仲介される細胞障害性をＬ４Ｇ６が阻害することを示すグラフ。
【図７−Ｅ】ＴＬ１Ａ阻害抗体Ｌ４Ｇ６が野生型Ｃ５７Ｂ１６マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで粘液産生と肺の炎症とを抑制することを例示する図。
【図７−Ｆ】対照ＩｇＧ処理マウスと比較したＬ４Ｇ６処理マウスにおけるＢＡＬＦ中での細胞の浸出の減少を示すグラフ。
【図７−Ｇ】Ｌ４Ｇ６でのＴＬ１Ａ阻害後の、オボアルブミンで再刺激された気管支リンパ節細胞によるＩＬ−５及びＩＬ−１３の産生の減少を例示するグラフ。
【図７−Ｈ】肺におけるＣＤ１１ｃ陽性細胞の亜集団に対する噴霧負荷後のＴＬ１Ａの発現を示すグラフ。
【図７−Ｉ】気道負荷後のオボアルブミン免疫マウスの気管支リンパ節細胞由来のリンパ球におけるＴＬ１Ａ発現の欠如を例示するグラフ。
【図７−Ｊ】ＴＬ１Ａがｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化Ｔリンパ球において発現されることを例示するグラフ。
【図８】ＮＫＴ細胞における肺の炎症の誘発のためにＴＮＦＲ２５のシグナルが必要とされることを示すグラフ。
【図９】ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＲ２５に仲介される、肺におけるＮＫＴ細胞のトリガリングと、ＣＤ４細胞のＴｈ２分極とについてのモデルを例示する図。
【図１０】マウスが１００万個のＯＴ−Ｉ−ｇｆｐを静脈内投与された実験の手順及び結果を示す図。
【図１１】ＴＮＦＲ２５の同時刺激によるＯＴ−Ｉ細胞の増殖の増強を示すグラフ。
【図１２】熱ショックタンパク質ｇｐ９６によるＣＤ８細胞のクロスプライミングを示す図。
【図１３】ＴＮＦＲ２５を発現するＦｏｘＰ３陽性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇｓを示すグラフ。
【図１４】ＤＮ  ＴＮＦＲ２５遺伝子導入マウスがＤＳＳ誘発性大腸炎から回復できないことを示すグラフ。
【図１５】ＴＮＦＲ２５のシグナルがＴｒｅｇ阻害を消失させることを示すグラフ。
【図１６】ｇｐ９６−Ｉｇの腹腔内免疫後に粘膜に位置するＧｆｐ−ＯＴ−Ｉを示すグラフ。
【図１７−Ａ】配列番号１−２に係るヌクレオチド配列、並びに、選択される公開データベースのアクセッション番号。
【図１７−Ｂ】配列番号２（続き）−５に係るヌクレオチド配列、並びに、選択される公開データベースのアクセッション番号。
【図１７−Ｃ】配列番号６−１６に係るヌクレオチド配列、並びに、選択される公開データベースのアクセッション番号。
【図１７−Ｄ】配列番号１６（続き）に係るヌクレオチド配列、並びに、選択される公開データベースのアクセッション番号。
【図１７−Ａ】
2009505678.tif 000003
【図１７−Ｂ】
2009505678.tif 000004
【図１７−Ｃ】
2009505678.tif 000005
【図１７−Ｄ】
2009505678.tif 000006
【図１】
2009505678.tif 000007
【図２−Ａ】
2009505678.tif 000008
【図２−Ｂ】
2009505678.tif 000009
【図２−Ｃ】
2009505678.tif 000010
【図３−Ａ】
2009505678.tif 000011
【図３−Ｂ】
2009505678.tif 000012
【図３−Ｃ】
2009505678.tif 000013
【図３−Ｄ】
2009505678.tif 000014
【図３−Ｅ】
2009505678.tif 000015
【図３−Ｆ】
2009505678.tif 000016
【図３−Ｇ】
2009505678.tif 000017
【図４−Ａ】
2009505678.tif 000018
【図４−Ｂ】
2009505678.tif 000019
【図４−Ｃ】
2009505678.tif 000020
【図４−Ｄ】
2009505678.tif 000021
【図４−Ｅ】
2009505678.tif 000022
【図５−Ａ】
2009505678.tif 000023
【図５−Ｂ】
2009505678.tif 000024
【図５−Ｃ】
2009505678.tif 000025
【図５−Ｄ】
2009505678.tif 000026
【図５−Ｅ】
2009505678.tif 000027
【図６−Ａ】
2009505678.tif 000028
【図６−Ｂ】
2009505678.tif 000029
【図６−Ｃ】
2009505678.tif 000030
【図６−Ｄ】
2009505678.tif 000031
【図６−Ｅ】
2009505678.tif 000032
【図６−Ｆ】
2009505678.tif 000033
【図６−Ｇ】
2009505678.tif 000034
【図６−Ｈ】
2009505678.tif 000035
【図７−Ａ−Ｃ】
2009505678.tif 000036
【図７−Ｄ】
2009505678.tif 000037
【図７−Ｅ】
2009505678.tif 000038
【図７−Ｆ】
2009505678.tif 000039
【図７−Ｇ】
2009505678.tif 000040
【図７−Ｈ】
2009505678.tif 000041
【図７−Ｉ】
2009505678.tif 000042
【図７−Ｊ】
2009505678.tif 000043
【図８】
2009505678.tif 000044
【図９】
2009505678.tif 000045
【図１０】
2009505678.tif 000046
【図１１】
2009505678.tif 000047
【図１２】
2009505678.tif 000048
【図１３】
2009505678.tif 000049
【図１４】
2009505678.tif 000050
【図１５】
2009505678.tif 000051
【図１６】
2009505678.tif 000052
【配列表】
2009505678000001.app
【国際調査報告】
2009505678.tif 000053
2009505678.tif 000054
2009505678.tif 000055
2009505678.tif 000056
2009505678.tif 000057
2009505678.tif 000058