(57)【要約】  本発明は包括的に、テロメラーゼ活性と関連する状態に関する診断アッセイのような診断及び予後アッセイの分野に関する。さらに詳細には、本発明は、癌、炎症性障害及び／又は胚形成を包含し且つ／又は幹細胞増殖を要する状態の指標としてテロメラーゼ活性を測定するためのアッセイ、そのために有用な作用物質及びキットを提供する。ハイスループットスクリーニングを可能にする自動化されたアッセイ及び部分的に自動化されたアッセイも本発明の一部を構成する。本発明はさらに、本発明のアッセイにより同定される作用物質を用いる治療方法、あるいは治療プロトコールが当該アッセイによりモニタリングされる方法をさらに意図する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメラーゼ活性を示す被験体から細胞を検出する方法であって、
ｉ）前記被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を前記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、前記磁気粒子及び前記細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）前記磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、該ビーズを洗浄し、且つ、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄した該ビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、前記ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、検出されるべき前記細胞を含有しない対照と又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及び細胞数を提示する、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが以下の配列：
（ＸｎＴＴＡＧＧＹｍ）ｏ
（式中、Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択されるヌクレオチドであり、
Ｙは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択されるヌクレオチドであり、
ｎは、０又は１であり、
ｍは、０又は１であり、且つ
ｏは、約１〜約４００である）
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号１で記述されるヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号３で記述されるヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体がヒトである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が非ヒト又は脊椎動物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体が植物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体からの前記細胞が癌細胞を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体からの前記細胞が炎症細胞を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体からの前記細胞が幹細胞を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドプライマーがチオール結合を介して磁気粒子に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ルミノール、エンハンサー及び／又はＨ２Ｏ２の添加が自動又は半自動である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が、任意の癌性又は悪性症状、前癌症状、骨髄腫、或いは任意のリンパ腫又は悪性症状、或いは新生物細胞を包含する任意のその他の増殖性障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、腺癌、中皮腫、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、生殖細胞腫瘍、肝癌／胆管癌、神経内分泌腫瘍、下垂体新生物、小円形細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌、黒色腫、非定型的繊維黄色腫、精上皮腫、非精上皮腫、間質性ライディッヒ細胞腫、セルトリ細胞腫、皮膚腫瘍、腎臓腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、胃腫瘍、口腔腫瘍、膀胱腫瘍、骨腫瘍、子宮頚腫瘍、食道腫瘍、喉頭腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、膣腫瘍及びウィルムス腫瘍を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が、腺癌、腺腫、腺繊維腫、腺リンパ腫、歯牙腫（adontoma）、ＡＩＤＳ関連癌、聴神経腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢胞癌、副腎皮質癌、原因不明骨髄様化生、脱毛症、胞状軟部肉腫、エナメル上皮腫、角化血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、アプドーマ、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調、基底細胞癌（皮膚）、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹神経膠腫、脳及びＣＮＳ腫瘍、乳癌、鰓腫、ＣＮＳ腫瘍、類癌腫、子宮頸癌、小児期脳腫瘍、小児期癌、小児期白血病、小児期柔組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、癌腫（例えばウォーカー癌、基底細胞癌、基底扁平上皮細胞癌、ブラウン・ペアス癌、腺管癌、エーリッヒ腫瘍、クレブス２癌、メルケル細胞癌、ムチン様癌、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭様癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮細胞癌及び移行性細胞癌）、癌肉腫、子宮頚部異形成、葉状嚢肉腫、セメント腫、脊索腫、分離腫、軟骨肉腫（chondrosarcoma）、軟骨芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腫、隆起性皮膚繊維肉腫、繊維形成性小円形細胞腫、腺管癌、未分化胚細胞腫、内分泌癌、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、眼：黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、ファンコーニ貧血、繊維腫、繊維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、消化管カルチノイド腫瘍、尿生殖器癌、生殖細胞腫瘍、妊娠−栄養膜性疾患、神経膠腫、婦人科癌、巨細胞腫、神経節神経腫、神経膠腫、グロムス血管腫、顆粒層細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、血液学的悪性疾患、毛様細胞性白血病、頭及び首の癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球増殖症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、過誤腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血管肉腫、組織球障害、組織球増殖性悪性疾患、組織球腫、肝細胞癌、汗腺腫、軟骨肉腫（hondrosarcoma）、免疫増殖性小（immunoproliferative small）、オポーマ（opoma）、眼球内黒色腫（ontraocular melanoma）、島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リ・フラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ水腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、平滑筋肉腫（leigomyosarcoma）、白血病（例えばｂ細胞、混合細胞、ヌル細胞、ｔ細胞、ｔ細胞慢性、ｈｔｌｖ−ｉｉ関連、リンパ管肉腫、リンパ球性急性、リンパ球性慢性、肥満細胞及び骨髄様）、白血肉腫、ライディッヒ細胞腫瘍、脂肪肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、リンパ管腫、リンパ管細胞腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、男性乳癌、悪性腎臓桿状体腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口腔癌、多重内分泌新生物、菌状息肉腫、脊髄形成異常性症候群、骨髄腫、骨髄増殖性障害、悪性カルチノイド症候群カルチノイド心疾患、髄芽細胞腫、髄膜腫、黒色腫、間葉細胞腫、中腎腫、中皮腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、粘液腫、粘液肉腫、鼻癌、鼻咽頭癌、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経繊維腫症、ナイメーヘン��色体不安定症候群、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫症、神経繊維腫、神経腫、新生物（例えば骨、乳房、消化系、結腸直腸、肝臓）、眼癌、食道癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、造瘻術卵巣癌、膵臓癌、鼻傍癌、上皮小体癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、一次性赤血球増加、前立腺癌、骨腫、骨肉腫、卵巣癌、乳頭腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、松果体腫、形質細胞腫、癌原遺伝子、稀な癌及び関連障害、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロートムント・トムソン症候群、細網組織症、横紋筋腫、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（ｓｃｌｃ）、小腸癌、柔組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮細胞癌（皮膚）、胃癌、滑膜肉腫、肉腫（例えばユーイング実験的肉腫、カポジ肉腫及び肥満細胞肉腫）、セルトリ細胞腫、滑膜腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌（膀胱）、移行上皮癌（腎臓−腎盂／尿管）、栄養膜癌、奇形腫、卵胞膜細胞腫、胸腺腫、栄養膜腫瘍、尿道癌、尿路系癌、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰部癌、ワルデンストレームのマクログロブリン血症及びウィルムス腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記炎症細胞が、座瘡、狭心症、関節炎、嚥下性肺炎、疾患、蓄膿、胃腸炎、炎症、腸のインフルエンザ、ｎｅｃ（壊死性腸炎）、骨盤内炎症性疾患、咽頭炎、骨盤内炎症性疾患（ｐｉｄ）、胸膜炎、ヒリヒリとした咽喉痛、潮紅、発赤、咽頭痛、胃のインフルエンザ及び尿路感染、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、慢性炎症性脱髄性多発神経根神経障害、慢性炎症性脱髄性神経障害又は慢性炎症性脱髄性神経根神経障害に関与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
テロメラーゼ活性のレベルを検出する前に、前記細胞が選択的に精製されるか又は富化される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞特異的抗体を配置させた前記磁気ビーズ中で細胞をインキュベートし、その後洗浄して潜在的妨害物質を除去することにより前記細胞が精製されるか又は富化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞障害性作用物質の活性を評価する方法であって、
ｉ）推定細胞障害作用物質を癌細胞の培養物に添加すること、
ｉｉ）テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を前記癌細胞からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じそれにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、前記磁気粒子及び前記細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉｉ）前記磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｖ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、該ビーズを洗浄し、洗浄した該（he）ビーズをルミノール及びエンハンサー並びに外因的添加Ｈ２Ｏ２と接触させて、ルミネッセンスを生成させること、及び
ｖ）その結果生じた混合物を検出手段に付して、前記ルミネッセンスの強度を読み取る、検出手段に付すこと、
を包含し、細胞障害性作用物質を含有しないような対照と比較した場合の前記細胞障害性作用物質の存在下でのルミネッセンスの強度レベルが作用物質の細胞障害性のレベルを提示する、方法。
【請求項２０】
アッセイの使用であって、被験体における癌を検出するための診断プロトコールの生成における、
ｉ）前記被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を前記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じそれにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、前記磁気粒子及び前記細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）前記磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、該ビーズを洗浄し、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄した該ビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付し前記ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含する、アッセイの使用。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドプライマーがチオール結合を介して磁気粒子に固定される、請求項１９又は請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ルミノール、エンハンサー及び／又はＨ２Ｏ２の添加が自動又は半自動である、請求項１９又は請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
テロメラーゼ活性のレベルを検出する前に、前記細胞が選択的に精製されるか又は富化される、請求項１９又は請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
細胞特異的抗体を配置させた磁気ビーズ中で細胞をインキュベートし、その後洗浄して潜在的妨害基質を除去することにより前記細胞が精製されるか又は富化される、請求項２３に記載の方法又は使用。
【請求項２５】
癌を検出するための、或いは抗癌剤の細胞障害可能性を評価するためのキットであって、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を含む第一区画、過酸化水素を含めた試薬を含む第二区画、並びにｄＮＴＰ及び／又はビオチン化ｄＮＴＰを含む第三区画といった区画形態で含み、
ｉ）被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を前記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じそれにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、前記磁気粒子及び前記細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）前記磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、該ビーズを洗浄し、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄した該ビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付し前記ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、検出されるべき前記細胞を含有しない対照と又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及び細胞数を提示する、使用のための使用説明書をさらに含む、キット。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが以下の配列：
（ＸｎＴＴＡＧＧＹｍ）ｏ
（式中、Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択されるヌクレオチドであり、
Ｙは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択されるヌクレオチドであり、
ｎは、０又は１であり、
ｍは、０又は１であり、且つ
ｏは、約１〜約４００である）
を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号１で記述されるヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号３で記述されるヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドプライマーがチオール結合を介して磁気粒子に固定される、請求項２５又は２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記ルミノール、エンハンサー及び／又はＨ２Ｏ２の添加が自動又は半自動である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
前記癌が、任意の癌性又は悪性症状、前癌症状、骨髄腫、或いは任意のリンパ腫又は悪性症状、或いは新生物細胞を包含する任意のその他の増殖性障害である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３２】
前記癌が、乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、腺癌、中皮腫、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、生殖細胞腫瘍、肝癌／胆管癌、神経内分泌腫瘍、下垂体新生物、小円形細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌、黒色腫、非定型的繊維黄色腫、精上皮腫、非精上皮腫、間質性ライディッヒ細胞腫、セルトリ細胞腫、皮膚腫瘍、腎臓腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、胃腫瘍、口腔腫瘍、膀胱腫瘍、骨腫瘍、子宮頚腫瘍、食道腫瘍、喉頭腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、膣腫瘍及びウィルムス腫瘍を包含する、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記癌が、腺癌、腺腫、腺繊維腫、腺リンパ腫、歯牙腫、ＡＩＤＳ関連癌、聴神経腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢胞癌、副腎皮質癌、原因不明骨髄様化生、脱毛症、胞状軟部肉腫、エナメル上皮腫、角化血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、アプドーマ、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調、基底細胞癌（皮膚）、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹神経膠腫、脳及びＣＮＳ腫瘍、乳癌、鰓腫、ＣＮＳ腫瘍、類癌腫、子宮頸癌、小児期脳腫瘍、小児期癌、小児期白血病、小児期柔組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、癌腫（例えばウォーカー癌、基底細胞癌、基底扁平上皮細胞癌、ブラウン・ペアス癌、腺管癌、エーリッヒ腫瘍、クレブス２癌、メルケル細胞癌、ムチン様癌、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭様癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮細胞癌及び移行性細胞癌）、癌肉腫、子宮頚部異形成、葉状嚢肉腫、セメント腫、脊索腫、分離腫、軟骨肉腫（chondrosarcoma）、軟骨芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腫、隆起性皮膚繊維肉腫、繊維形成性小円形細胞腫、腺管癌、未分化胚細胞腫、内分泌癌、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、眼：黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、ファンコーニ貧血、繊維腫、繊維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、消化管カルチノイド腫瘍、尿生殖器癌、生殖細胞腫瘍、妊娠−栄養膜性疾患、神経膠腫、婦人科癌、巨細胞腫、神経節神経腫、神経膠腫、グロムス血管腫、顆粒層細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、血液学的悪性疾患、毛様細胞性白血病、頭及び首の癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球増殖症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、過誤腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血管肉腫、組織球障害、組織球増殖性悪性疾患、組織球腫、肝細胞癌、汗腺腫、軟骨肉腫（hondrosarcoma）、免疫増殖性小、オポーマ、眼球内黒色腫、島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リ・フラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ水腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、平滑筋肉腫、白血病（例えばｂ細胞、混合細胞、ヌル細胞、ｔ細胞、ｔ細胞慢性、ｈｔｌｖ−ｉｉ関連、リンパ管肉腫、リンパ球性急性、リンパ球性慢性、肥満細胞及び骨髄様）、白血肉腫、ライディッヒ細胞腫瘍、脂肪肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、リンパ管腫、リンパ管細胞腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、男性乳癌、悪性腎臓桿状体腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口腔癌、多重内分泌新生物、菌状息肉腫、脊髄形成異常性症候群、骨髄腫、骨髄増殖性障害、悪性カルチノイド症候群カルチノイド心疾患、髄芽細胞腫、髄膜腫、黒色腫、間葉細胞腫、中腎腫、中皮腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、粘液腫、粘液肉腫、鼻癌、鼻咽頭癌、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経繊維腫症、ナイメーヘン染色体不安定症候群、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経繊維腫症、神経繊維腫、神経腫、新生物（例えば骨、乳房、消化系、結腸直腸、肝臓）、眼癌、食道癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、造瘻術卵巣癌、膵臓癌、鼻傍癌、上皮小体癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、一次性赤血球増加、前立腺癌、骨腫、骨肉腫、卵巣癌、乳頭腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、松果体腫、形質細胞腫、癌原遺伝子、稀な癌及び関連障害、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロートムント・トムソン症候群、細網組織症、横紋筋腫、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（ｓｃｌｃ）、小腸癌、柔組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮細胞癌（皮膚）、胃癌、滑膜肉腫、肉腫（例えばユーイング実験的肉腫、カポジ肉腫及び肥満細胞肉腫）、セルトリ細胞腫、滑膜腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌（膀胱）、移行上皮癌（腎臓−腎盂／尿管）、栄養膜癌、奇形腫、卵胞膜細胞腫、胸腺腫、栄養膜腫瘍、尿道癌、尿路系癌、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰部癌、ワルデンストレームのマクログロブリン血症及びウィルムス腫瘍である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
癌又は白血病或いは炎症性又は幹細胞に固定される抗体を有する磁気粒子をさらに含む、請求項２５に記載のキット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は包括的に、テロメラーゼ活性と関連する状態に関する診断アッセイのような診断及び予後アッセイの分野に関する。さらに詳細には、本発明は、癌、炎症性障害及び／又は胚形成を包含し且つ／又は幹細胞増殖を要する状態の指標としてテロメラーゼ活性を測定するためのアッセイ、そのために有用な作用物質及びキットを提供する。ハイスループットスクリーニングを可能にする自動化されたアッセイ及び部分的に自動化されたアッセイも本発明の一部を構成する。本発明はさらに、本発明のアッセイにより同定される作用物質を用いる治療方法、或いは治療プロトコールが当該アッセイによりモニタリングされる方法をさらに意図する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における任意の従来技術の参照は、従来技術があらゆる国における共通の一般的知識の一部を構成するということを承認するものでも、何らかの形態で示唆するものでもなく、そしてそのように解釈されるものでもない。
【０００３】
テロメアは、染色体ＤＮＡの３’末端に位置する（ＴＴＡＧＧＧ）ｎとして表わされるタンデム富ＧＴ反復配列からなる反復ＤＮＡ配列である。一細胞分裂当たりテロメア配列の約５０〜２００ヌクレオチドが損失されて、最終的に細胞老化を生じるため、漸進的テロメア侵食が正常有糸分裂過程中に起こる。テロメアは、テロメア（telomeric）ＤＮＡを伸長する独特の逆転写酵素であるテロメラーゼの作用により融合及び分解から染色体を保護する（Shay et al., Hum. Mole. Gen. 10: 667-685, 2001）。テロメラーゼは、相対的に、生殖系列及び胚性組織、炎症細胞、再生組織の増殖細胞、並びに癌細胞中に豊富である。これに対比して、テロメラーゼ活性は、正常体細胞性ヒト組織中で検出することが困難である。テロメラーゼ活性及び細胞複製の相関は、テロメラーゼ及び癌の関連を促す。テロメラーゼ活性は、ほとんどすべてのヒト腫瘍において見出されるが、隣接正常細胞では見出されない（Kim et al., Science 266: 2011-2015, 1994）。実際、テロメラーゼは、ヒト癌の約８５％で活性化される（Hiyama et al., Cancer Lett. 194: 221-223, 2003）。したがって、テロメラーゼの上向き調節又は再発現は継続的な腫瘍細胞増殖に関与する重要事象であり得る、ということが提示されている。
【０００４】
テロメラーゼ活性が細胞性増殖の疾患、例えば癌と関連があるとすると、テロメラーゼ活性の検出は、診断価値を有する。テロメラーゼ活性の定量のためのいくつかの分析手法が報告されている。最も頻繁に利用されるアッセイは、テロメア反復増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）であり、これは、２段階ＰＣＲに基づくアッセイである。第一段階では、テロメラーゼは５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’反復配列を合成プライマーの末端に添加する。第二段階では、逆プライマーを用いて、延長オリゴヌクレオチド産物が増幅される。オートラジオグラフィーにより可視化される場合、ＴＲＡＰによる陽性試験は帯域のラダーを示す。次に帯域容積が定量され得る（Hess et al., Clin. Chem. 48: 18-24, 2002）。ＴＲＡＰは、時間を要し、労働集約的で、ＰＣＲ依存性であり、そして臨床試料の抽出物による阻害を受けやすい。さらに、ＰＣＲ増幅ステップにおけるテロメラーゼ産物の対数的増幅のため、テロメラーゼ活性を定量化することは難しい。Ｔａｑ−ポリメラーゼ阻害剤に対するＴＲＡＰアッセイの感度によって、しばしば、擬陽性及び擬陰性結果が生じる（Weizmann et al., Chem. Bio. 5: 943-948, 2004）。
【０００５】
ＴＲＡＰアッセイの電気泳動ステップをＥＬＩＳＡ検出系と取り替える類似のテロメラーゼアッセイが開発されてきた。この系はＰＣＲ依存性でもあるが、ＥＬＩＳＡ検出法は、伝統的ＴＲＡＰを上回る明らかな利点を提供するようには思われない。ＴＲＡＰに関連した技術的問題を排除するための努力に際して、ヒトテロメラーゼ（ｈＴＲ）ＲＮＡ及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）ｍＲＮＡの定量に関するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイが開発された。しかしながらｈＴＲ及びｈＴＥＲＴ発現は、テロメラーゼ活性と必ずしも同等でない（Hess et al., 2002、上記）。
【０００６】
別のテロメラーゼアッセイは、ＰＣＴ／ＩＬ０１／００８０８（ＷＯ  ０２／２０８３８）に開示されている。このアッセイは、回転キノン官能化磁気ビーズを用いて、アッセイ内でＨ２Ｏ２を生成させる。Ｈ２Ｏ２の内在的な生成は、おそらくは、水性緩衝溶液中で貧可溶性であるルミノールの問題を克服すると思われる。しかしながら回転磁気ビーズは、ハイスループットスクリーニングプロトコールを発現させる能力を低減し、用いられるオリゴヌクレオチドプライマーの長さによって感度に影響を及ぼし得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって癌、炎症性障害、並びに胚形成に関与する状態に関する診断、予後及び治療価値を有する、臨床試料において、且つ／又は増殖する幹細胞の可能性をモニタリングする際の、テロメラーゼ活性の検出のための信頼ができ、感度が良く、そして費用効率の高いアッセイに対する必要性が存在する。本発明のアッセイは、ヒト及び哺乳類脊椎動物又は非哺乳類脊椎動物並びに植物に適用可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書全体を通して、別記しない限り、「含む(comprise)」又はその変形、例えば「含む（単数）(comprises)」又は「含んでいる(comprising)」という語は、記述される要素又は整数或いは要素又は整数の群を包含することを意味するが、任意の他の要素又は整数或いは要素又は整数の群の排除を意味するものではないと理解される。
【０００９】
ヌクレオチド配列は、配列識別子番号［配列番号］により示される。配列番号は、配列識別子＜４００＞１［配列番号１］、＜４００＞２［配列番号２］のように数字に対応する。配列識別子のまとめは、表１に提示されている。特許請求の範囲の後に配列表を提示する。
【００１０】
本発明は、癌細胞の存在、並びに炎症性障害及び胚形成に関与する状態の診断的及び予後的指標を提供する細胞中のテロメラーゼ活性のアッセイに関し、且つ／又は幹細胞が増殖する能力をモニタリングするためのアッセイを意図する。このアッセイは、ヒトに関する医学的治療プロトコールを評価するためにも、またテロメラーゼ活性又はレベルを調整する作用物質に関するスクリーニングのためにも有用である。非哺乳類脊椎動物及び植物におけるテロメラーゼ活性は、診断価値も有し得るし、或いはリサーチツールとしても有用であり得る。脊椎動物に関して、テロメラーゼ活性のレベルは、癌細胞のようなある型の細胞の存在、並びに年齢に伴い且つ／又は治療プロトコールに応じる細胞生理学又は増殖能力における変化と相関する。同様に、テロメラーゼ活性のレベル又はその変化は、増殖を含めた炎症に、並びに胚形成に関与する状態に関する情報を提供する。このアッセイは、自動化されるか又は半自動化されて、ハイスループットスクリーニングを可能にする。それは、上皮細胞捕獲及び溶解に基づいて、テロメラーゼ活性を検出する。読取りはルミネッセンスである。他のテロメラーゼアッセイと異なり、それはＰＣＲに基づくアッセイではない。
【００１１】
したがって本発明は、テロメラーゼ触媒性伸長ヌクレオチド配列中への標識の組込みにより、テロメラーゼ活性のレベルを測定する。
【００１２】
したがって、本発明の一態様は、テロメラーゼ活性を示す被験体からの細胞を検出する方法であって、
ｉ）上記被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を上記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じそれにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、対照と又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及びテロメラーゼを産生する推定細胞数を提示する方法を意図する。
【００１３】
自動化に関して、ステップ（ｉｉｉ）、そして特にルミノール、エンハンサー及び／又はＨ２Ｏ２は、ルミネッセンス読取機により自動的に添加され得る。
【００１４】
本発明の別の態様は、テロメラーゼ活性を示す被験体からの細胞を検出する方法であって、
ｉ）上記被験体から細胞の試料を入手し、以下の配列：
（ＸｎＴＴＡＧＧＹｍ）ｏ
（式中、Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択されるヌクレオチドであり、
Ｙは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択されるヌクレオチドであり、
ｎは、０又は１であり、
ｍは、０又は１であり、且つ
ｏは、約１〜約４００である）
を含むオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を上記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じそれにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、対照と又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及びテロメラーゼを産生する推定細胞数を提示する方法を提供する。
【００１５】
一般的に、脊椎動物では、ｎは０であり、ＹはＧであり、且つｏは約５〜約３０である。節足動物では、ｎは０であり、ｍは０であり、且つｏは約１〜約３０である。植物では、ＸはＴであり、ｎは１であり、ＹはＧであり、ｍは１であり、且つｏは約１〜約３０である。
【００１６】
陰性又は既知のデータセットと比較した場合のテロメラーゼ活性の存在又はテロメラーゼ活性のレベルは、テロメラーゼ活性を保有する細胞の数を示す。このような細胞としては、癌細胞、炎症又は増殖性細胞、或いは幹細胞を含めた胚形成に関与する細胞が挙げられる。「陰性対照」は、テロメラーゼ活性の基礎レベルを示し得る。アッセイは感度が良く、約１個といった少数から１０６個より多い細胞、例えば１〜１０６個の細胞におけるテロメラーゼ活性の検出を可能にする。
【００１７】
したがって本発明は、被験体からの試料中の癌細胞、炎症又は増殖性細胞及び幹細胞を含めた胚形成細胞から選択される細胞の検出方法であって、
ｉ）上記被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を上記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じそれにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、対照、例えば癌、炎症又は胚形成細胞を含有しないような対照と又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベルを、それにより細胞の数を提示する方法を提供する。
【００１８】
「被験体」は、ヒト又は他の哺乳類、非哺乳類脊椎動物又は植物、或いはテロメラーゼを含む他の存在物であり得る。
【００１９】
上記のように、本発明のアッセイは、自動化され得るか、或いは単一アッセイ又はアッセイのバッチとして用いられ得る。ルミノール、エンハンサー及び／又はＨ２Ｏ２を添加するステップは、好都合に自動化される。したがって本発明は、アッセイを実施するのに必要とされる試薬、並びに使用のための使用説明書を含むキットを提供する。さらにアッセイは、多数の標識を用いた複合条件化で実行され得る。さらにアッセイは、細胞同定を手助けするか又は治療プロトコールをモニタリングするための多数のアッセイ（即ち２以上のアッセイ）の一部となり得る。
【００２０】
本発明は、シグナルの程度の測定により、細胞中のテロメラーゼ活性の定量的検出を可能にする。しかしながら本発明は、テロメラーゼ活性の存在又は非存在又は相対レベルの定量的検出を提供するための本発明のアッセイの使用に及ぶ。「判定」、「判定すること」、「検出」、「診断」、「予後」及び「同定」といった用語は、互換的に用いられて、細胞又は細胞の試料中のテロメラーゼの定性的、半定性的及び定性的検出を示す。
【００２１】
特定の実施形態では、テロメラーゼアッセイは、癌細胞の存在を検出するために、或いは化学療法薬の存在下で癌をモニタリングすることを含めて被験体における癌の進行をモニタリングするために用いられる。「化学療法薬」とは、この状況においては、化学作用物質、並びに免疫学的作用物質又は抗生物質を包含する。「癌」は、本発明に関する限り、腫瘍と同一であるとみなされる。
【００２２】
したがって、本発明は、被験体からの試料中の癌細胞を検出する方法であって、
ｉ）上記被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を上記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じそれにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、癌細胞を含有しないような対照と又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及び推定癌細胞数の存在又は数を提示する方法を意図する。
【００２３】
本発明はさらに、細胞障害性作用物質、例えば抗癌化学療法薬の効能を評価するためのアッセイの使用に及ぶ。それは、癌患者、例えば白血病患者のリスク層別化のためにも用いられ得る。
【００２４】
一実施の形態では、「細胞の試料を入手すること」は、細胞を収集して部分的に精製すること、或いは少なくとも試料中の不必要な構成成分を除去することを包含する。本発明の一態様は、腫瘍細胞の選択的精製並びに潜在的妨害物質からのそれらの細胞の除去のための方法を提供する。腫瘍細胞の精製は、腫瘍細胞特異的抗体で被覆される磁気ビーズと共に細胞を含有する体液をインキュベートすることにより達成される。当該腫瘍細胞は広範に洗浄され、したがって他の細胞型、体液マトリックス（例えば尿、血液）及び妨害物質から分離される。これは、アッセイによる妨害のための擬陰性の可能性を、そして非腫瘍細胞、例えば感染に際して存在し得る活性化Ｔリンパ球により引き起こされる擬陽性の可能性も減らす。試料ワークアップ手法は、したがって、高い臨床的感受性値及び特異性値を得るのに有用であると考えられる。
【００２５】
したがって、本発明の別の態様は、細胞障害性作用物質の活性を評価する方法であって、
ｉ）推定細胞障害作用物質を癌細胞の培養物に添加すること、
ｉｉ）テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を癌細胞からの細胞抽出物と接触させ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じそれにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｖ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサー及び外因的添加Ｈ２Ｏ２と接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｖ）その結果生じた混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、細胞障害性作用物質を含有しないような対照と比較した場合の細胞障害性作用物質の存在下でのルミネッセンスの強度レベルが作用物質の細胞障害性のレベルを提示する方法に関する。
【００２６】
本発明はさらに、上記の方法を用いて同定される細胞障害性作用物質を用いる治療方法を意図する。治療方法は、本発明のアッセイを用いて臨床プロトコールを評価することも包含する。プロトコールは、テロメラーゼレベルがそのプロトコールの時間にわたって如何に変化するかによって、変更され得る。
【００２７】
ＴＢＴはさらにまた、加齢を評価するために、そして高齢被験体における健康の悪化又は程度をモニタリングするために用いられ得る。
【００２８】
オリゴヌクレオチドプライマーは、任意のカップリング化学作用により、例えばチオール、アミン及びアルデヒドカップリング化学作用により、ビーズに固定され得る。
【００２９】
一実施形態では、テロメラーゼの基質であるオリゴヌクレオチドプライマーは、チオール結合によりビーズに固定される。例えば適切なリンカーは、配列番号５で表わされる。
【００３０】
本発明のテロメラーゼアッセイは、「ＴＢＴ」又は「テロメラーゼバイオセンサー技術」として本明細書中で言及される。
【００３１】
本発明の方法は、テロメラーゼ基質オリゴヌクレオチドプライマーの伸長がＰＣＲを介さない、という条件を包含する。
【００３２】
本発明の明細書全体を通して用いられる配列識別子の要約を、表１に提示する。
【００３３】
【表１】
2009520464.tif 000002
【００３４】
本発明の明細書全体を通して用いられる略号の要約を、表２に提示する。
【００３５】
【表２】
2009520464.tif 000003
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は、細胞又は細胞の試料中のテロメラーゼに関する感受性アッセイを提供する。試験は、「ＴＢＴ」又は「テロメラーゼバイオセンサー技法」と呼ばれる。アッセイを実行するために有用な試薬も、本発明の一部を構成する。試薬は、アッセイを実施するための使用説明書と共に包装されるキットの一部であってもよく、又は別々に提供されてもよい。テロメラーゼの検出は、定量的、半定量的又は定性的であり、これらはすべて、「判定」、「判定すること」、「検出」、「診断」、「予後」及び「同定」という用語に包含される。アッセイは、自動化又は半自動化されて、迅速、ハイスループットスクリーニングを可能にし得る。テロメラーゼ活性のレベルを含めたテロメラーゼ活性の存在の解明は、癌細胞、或いは炎症、増殖及び／又は胚形成に関連する細胞の存在又は相対レベルを測定するために有用である。本発明は原則的にヒトに主眼をおいているが、アッセイはすべての脊椎動物、植物及び節足動物において実行され得る。
【００３７】
本発明に従って用いられる方法及び試薬に関して、アッセイがある範囲の研究及び診断的用途を有する、ということは明らかである。アッセイは、迅速、精確、且つ単一管反応、多重プロトコール、自動化及びｉｎ  ｓｉｔｕ検出に応じやすい。磁気ビーズの使用は、高い感受性及び臨床的継続性を保持しながら、低コストでのルーチン臨床使用を可能にする。他のテロメラーゼアッセイは経費がかかり、ハイスループットスクリーニングのために改質され得ないし、臨床実験室でルーチンに用いられ得ない。ＴＢＴの用途としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
ｉ）潜在的癌細胞の同定のための癌生検における不死細胞の検出、
ｉｉ）テロメラーゼを活性化、抑制、阻害又は抑止し得る作用物質、例えば不死化剤（例えば癌遺伝子）、又はテロメラーゼを活性化し、且つ、テロメア及び細胞の複製的寿命を伸長し得る化合物の細胞ベースの又は無細胞スクリーニングにおける同定、
ｉｉｉ）テロメラーゼ活性を保有する培養系又はｉｎ  ｖｉｖｏの幹細胞又は早期始原細胞における同定、
ｉｖ）分化及び生成中のテロメラーゼ調節の検査、
ｖ）テロメラーゼの精製中に生成されるテロメラーゼ陽性分画の同定、
ｖｉ）原生動物感染又は真菌感染の同定、並びに
ｖｉｉ）テロメラーゼ活性の非存在により特性化される或る特定の型の不妊症の診断。
【００３８】
ＴＢＴは、ハイスループット、非常に高い感度で安価であり、そして臨床実験室でルーチンに用いられ得る。
【００３９】
したがって、本発明の一態様は、テロメラーゼ活性を示す被験体からの細胞を検出する方法であって、
ｉ）上記被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を上記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、陰性対照と又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及びテロメラーゼを産生する推定細胞数を提示する、方法を意図する。
【００４０】
関連実施形態において、本発明は、テロメラーゼ活性を示す被験体からの細胞を検出する方法であって、
ｉ）上記被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を上記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること（この場合、上記エンハンサー及びＨ２Ｏ２はルミネッセンス強度を測定する機械において自動的に添加される）、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、陰性対照と又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及びテロメラーゼを産生する推定細胞数を提示する、方法を意図する。
【００４１】
一実施形態では、「細胞の試料を入手すること」は、細胞を収集し、部分的に精製するか或いは少なくとも試料中の不必要な構成成分を除去することを包含する。本発明の一態様は、腫瘍細胞の選択的精製並びに潜在的妨害物質からのそれらの細胞の除去のための方法を提供する。腫瘍細胞の精製は、腫瘍細胞特異的抗体で被覆される磁気ビーズと共に細胞を含有する体液をインキュベートすることにより達成される。当該腫瘍細胞は広範に洗浄され、したがって他の細胞型、体液マトリックス（例えば尿、血液）及び妨害物質から分離される。これは、アッセイによる妨害のための擬陰性の可能性を、そして非腫瘍細胞、例えば感染に際して存在し得る活性化Ｔリンパ球により引き起こされる擬陽性の可能性も減らす。試料ワークアップ手法は、したがって、高い臨床的感受性値及び特異性値を得るのに有用であると考えられる。
【００４２】
例として、尿が、モノクローナル抗体と結合された磁気ビーズ、Ｂｅｒ−ＥＰ４（CELLection［商標］Epithelial Enrich Dynabeads）（これは上皮細胞を選択的に捕捉する）と共にインキュベートされる。付着された腫瘍細胞を伴うビーズは数回洗浄され、そしてＣＨＡＰＳベースの溶解緩衝液の添加により上皮細胞の溶解が達成される。この方法の利点は、それが潜在的妨害物質からそして活性化リンパ球（これは増大されたテロメラーゼ活性を含有し得る）からも腫瘍細胞を分離する点である。
【００４３】
試料ワークアップ手法は、臨床アッセイを一般的に妨害し得る多数の化学物質から当該細胞を除去する。血液からの上皮細胞の単離は、ヘモグロビン、尿中の分解酵素、又は治療用化合物、例えば化学療法又はその他の治療のために用いられるものからの妨害の任意の可能性を除去する。
【００４４】
活性化リンパ球の存在は、これらの細胞が検出可能レベルのテロメラーゼ活性を発現し得るため、テロメラーゼ活性の他のアッセイに関して問題があることを立証している。ＴＢＴ試験における試料ワークアップ手法は、抗体結合磁気ビーズ上での選択的捕捉により活性化リンパ球から腫瘍上皮細胞を除去する。活性化リンパ球からの腫瘍細胞の除去は、より高い感受性並びに擬陽性のより低い確率をもたらす。有用ではあるが、これは、本発明の必須の特徴とみなされるべきではない。
【００４５】
「被験体」という用語は、脊椎動物、例えばヒト又は非ヒト哺乳類、非哺乳類脊椎動物、植物或いはテロメラーゼを含む他の存在物を包含する。
【００４６】
上記のように、脊椎動物に関して、細胞は、癌細胞、或いは炎症、増殖又は胚形成に関連した細胞であり得る。したがって本発明の別の態様は、被験体からの試料中の癌細胞、炎症細胞又は増殖性細胞、及び胚形成細胞、例えば幹細胞から選択される細胞を検出する方法であって、
ｉ）上記被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を上記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、癌、炎症又は胚形成細胞を含有しない対照のような対照と比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベルを、それにより細胞数を提示する、方法を提供する。
【００４７】
関連実施形態において、本発明は、被験体からの試料中の癌細胞、炎症又は増殖性細胞、及び胚形成細胞、例えば幹細胞から選択される細胞を検出する方法であって、
ｉ）上記被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を上記細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること（この場合、上記エンハンサー及びＨ２Ｏ２はルミネッセンス強度を測定する機械において自動的に添加される）、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、癌、炎症又は胚形成細胞を含有しない対照のような対照と比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベルを、それにより細胞の数を提示する方法を提供する。
【００４８】
上記のように、「癌」、「腫瘍」及び「癌性の」という用語は、本発明の明細書全体を通して互換的に用いられ、そして任意の癌性又は悪性症状、前癌性症状、骨髄腫、或いは任意のリンパ腫又は悪性症状、或いは新生物性細胞を包含する任意の他の増殖性障害を意味する。「癌」又は「腫瘍」という用語は、乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、腺癌、中皮腫、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、生殖細胞腫瘍、肝癌／胆管癌、神経内分泌腫瘍、下垂体新生物、小円形細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌、黒色腫、非定型的繊維黄色腫、精上皮腫、非精上皮腫、間質性ライディッヒ細胞腫、セルトリ細胞腫、皮膚腫瘍、腎臓腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、胃腫瘍、口腔腫瘍、膀胱腫瘍、骨腫瘍、子宮頚腫瘍、食道腫瘍、喉頭腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、膣腫瘍及びウィルムス腫瘍を包含する。
【００４９】
特定の癌の例としては、腺癌、腺腫、腺繊維腫、腺リンパ腫、歯牙腫（adontoma）、ＡＩＤＳ関連癌、聴神経腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢胞癌、副腎皮質癌、原因不明骨髄様化生、脱毛症、胞状軟部肉腫、エナメル上皮腫、角化血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、アプドーマ、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調、基底細胞癌（皮膚）、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹神経膠腫、脳及びＣＮＳ腫瘍、乳癌、鰓腫、ＣＮＳ腫瘍、類癌腫、子宮頸癌、小児期脳腫瘍、小児期癌、小児期白血病、小児期柔組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、癌腫（例えばウォーカー癌、基底細胞癌、基底扁平上皮細胞癌、ブラウン・ペアス癌、腺管癌、エーリッヒ腫瘍、クレブス２癌、メルケル細胞癌、ムチン様癌、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭様癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮細胞癌及び移行性細胞癌）、癌肉腫、子宮頚部異形成、葉状嚢肉腫、セメント腫、脊索腫、分離腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腫、隆起性皮膚繊維肉腫、繊維形成性小円形細胞腫、腺管癌、未分化胚細胞腫、内分泌癌、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、眼：黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、ファンコーニ貧血、繊維腫、繊維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、消化管カルチノイド腫瘍、尿生殖器癌、生殖細胞腫瘍、妊娠−栄養膜性疾患、神経膠腫、婦人科癌、巨細胞腫、神経節神経腫、神経膠腫、グロムス血管腫、顆粒層細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、血液学的悪性疾患、毛様細胞性白血病、頭及び首の癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球増殖症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、過誤腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血管肉腫、組織球障害、組織球増殖性悪性疾患、組織球腫、肝細胞癌、汗腺腫、軟骨肉腫（hondrosarcoma）、免疫増殖性小（immunoproliferative small）、オポーマ（opoma）、眼球内黒色腫（ontraocular melanoma）、島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リ・フラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ水腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、平滑筋肉腫（leigomyosarcoma）、白血病（例えばｂ細胞、混合細胞、ヌル細胞、ｔ細胞、ｔ細胞慢性、ｈｔｌｖ−ｉｉ関連、リンパ管肉腫、リンパ球性急性、リンパ球性、慢性肥満細胞及び骨髄様）、白血肉腫、ライディッヒ細胞腫瘍、脂肪肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、リンパ管腫、リンパ管細胞腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、男性乳癌、悪性腎臓桿状体腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口腔癌、多重内分泌新生物、菌状息肉腫、脊髄形成異常性症候群、骨髄腫、骨髄増殖性障害、悪性カルチノイド症候群カルチノイド心疾患、髄芽細胞腫、髄膜腫、黒色腫、間葉細胞腫、中腎腫、中皮腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、粘液腫、粘液肉腫、鼻癌、鼻咽頭癌、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経繊維腫症、ナイメーヘン染���体不安定症候群、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫症、神経繊維腫、神経腫、新生物（例えば骨、乳房、消化系、結腸直腸、肝臓）、眼癌、食道癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、造瘻術卵巣癌、膵臓癌、鼻傍癌、上皮小体癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、一次性赤血球増加、前立腺癌、骨腫、骨肉腫、卵巣癌、乳頭腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、松果体腫、形質細胞腫、癌原遺伝子、稀な癌及び関連障害、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロートムント・トムソン症候群、細網組織症、横紋筋腫、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（ｓｃｌｃ）、小腸癌、柔組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮細胞癌（皮膚）、胃癌、滑膜肉腫、肉腫（例えばユーイング実験的肉腫、カポジ肉腫及び肥満細胞肉腫）、セルトリ細胞腫、滑膜腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌（膀胱）、移行上皮癌（腎臓−腎盂／尿管）、栄養膜癌、奇形腫、卵胞膜細胞腫、胸腺腫、栄養膜腫瘍、尿道癌、尿路系癌、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰部癌、ワルデンストレームのマクログロブリン血症及びウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
ＴＢＴは、癌患者のリスク層化に関する、例えば寛解又は癌伝播のリスクに関する有用なアッセイである。
【００５１】
炎症性又は増殖性状態は、座瘡、狭心症、関節炎、嚥下性肺炎、疾患、蓄膿、胃腸炎、炎症、腸のインフルエンザ、ｎｅｃ（壊死性腸炎）、骨盤内炎症性疾患、咽頭炎、骨盤内炎症性疾患（ｐｉｄ）、胸膜炎、ｒａｗ咽喉、潮紅、発赤、咽頭痛、胃のインフルエンザ及び尿路感染、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、慢性炎症性脱髄性多発神経根神経障害、慢性炎症性脱髄性神経障害又は慢性炎症性脱髄性神経根神経障害に関連する細胞を包含する。
【００５２】
好ましい実施形態では、テロメラーゼ活性は、癌細胞の存在又はレベルを定量し、半定量し、又は定性するために用いられる。「癌」への言及は、腫瘍及び白血病、並びに癌腫及び肉腫を包含する。
【００５３】
したがって、本発明の別の態様は、被験体からの試料中の癌細胞を検出する方法であって、
ｉ）被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、癌細胞を含有しないような対照と及び／又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及び推定癌細胞数を提示する、方法を提供する。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明は、被験体からの試料中の癌細胞を検出する方法であって、
ｉ）被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること（この場合、上記エンハンサー及びＨ２Ｏ２はルミネッセンス強度を測定する機械において自動的に添加される）、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、癌細胞を含有しないような対照と及び／又は既知のデータセットと比較した場合のルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及び推定癌細胞数を提示する、方法を提供する。
【００５５】
細胞抽出物は、任意数の手段、例えば音波処理、溶解及び凍結−解凍法により生成され得る。一実施形態では、細胞は、生検により収集され、或いは血液又は組織試料中に存在し、非イオン性及び／又は両イオン性洗剤を用いて溶解される。細胞破砕屑は一般に、遠心分離又は濾過により除去される。次に上清が収集され、そしてアッセイに用いられる。適切な洗剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ２０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、テシット、ＮＰ−４０、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）及びイソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎが挙げられ、そして好ましい両イオン性洗剤としては、ＣＨＡＰＳ（３−｛（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ｝−１−プロパン−スルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−｛（３−コルアミドプロピル）ジメチル−アンモニオ｝−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホネート）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン−スルホネート及びＣＨＡＰＳを伴うジギトニンが挙げられる。
【００５６】
好ましい実施形態では、細胞は、ＣＨＡＰＳ緩衝液［０．５％  ｖ／ｖ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ及び１０％  ｖ／ｖ  グリセロール、１０ｍｌ当たり１個のプロテアーゼ阻害剤錠剤（Compete Mini, Roche）を伴う］で溶解される。
【００５７】
細胞収集は任意の手段により可能であり、そしてアッセイされるべき試料中の細胞の数は変わり得る。一般的に、約１個〜約１０６個又はそれ以上の細胞が一度にアッセイされ得る。それゆえ、本発明は、１〜１０１０個の細胞、例えば５〜１０６個の細胞、１０〜１０５個の細胞等をアッセイし得る。特に有用な細胞数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、１５０個、１５１個、１５２個、１５３個、１５４個、１５５個、１５６個、１５７個、１５８個、１５９個、１６０個、１６１個、１６２個、１６３個、１６４個、１６５個、１６６個、１６７個、１６８個、１６９個、１７０個、１７１個、１７２個、１７３個、１７４個、１７５個、１７６個、１７７個、１７８個、１７９個、１８０個、１８１個、１８２個、１８３個、１８４個、１８５個、１８６個、１８７個、１８８個、１８９個、１９０個、１９１個、１９２個、１９３個、１９４個、１９５個、１９６個、１９７個、１９８個、１９９個、２００個、２０１個、２０２個、２０３個、２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、２０９個、２１０個、２１１個、２１２個、２１３個、２１４個、２１５個、２１６個、２１７個、２１８個、２１９個、２２０個、２２１個、２２２個、２２３個、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、２５１個、２５２個、２５３個、２５４個、２５５個、２５６個、２５７個、２５８個、２５９個、２６０個、２６１個、２６２個、２６３個、２６４個、２６５個、２６６個、２６７個、２６８個、２６９個、２７０個、２７１個、２７２個、２７３個、２７４個、２７５個、２７６個、２７７個、２７８個、２７９個、２８０個、２８１個、２８２個、２８３個、２８４個、２８５個、２８６個、２８７個、２８８個、２８９個、２９０個、２９１個、２９２個、２９３個、２９４個、２９５個、２９６個、２９７個、２９８個、２９９個、３００個、３０１個、３０２個、３０３個、３０４個、３０５個、３０６個、３０７個、３０８個、３０９個、３１０個、３１１個、３１２個、３１３個、３１４個、３１５個、３１６個、３１７個、３１８個、３１９個、３２０個、３２１個、３２２個、３２３個、３２４個、３２５個、３２６個、３２７個、３２８個、３２９個、３３０個、３３１個、３３２個、３３３個、３３４個、３３５個、３３６個、３３７個、３３８個、３３９個、３４０個、３４１個、３４２個、３４３個、３４４個、３４５個、３４６個、３４７個、３４８個、３４９個、３５０個、３５１個、３５２個、３５３個、３５４個、３５５個、３５６個、３５７個、３５８個、３５９個、３６０個、３６１個、３６２個、３６３個、３６４個、３６５個、３６６個、３６７個、３６８個、３６９個、３７０個、３７１個、３７２個、３７３個、３７４個、３７５個、３７６個、３７７個、３７８個、３７９個、３８０個、３８１個、３８２個、３８３個、３８４個、３８５個、３８６個、３８７個、３８８個、３８９個、３９０個、３９１個、３９２個、３９３個、３９４個、３９５個、３９６個、３９７個、３９８個、３９９個、４００個、４０１個、４０２個、４０３個、４０４個、４０５個、４０６個、４０７個、４０８個、４０９個、４１０個、４１１個、４１２個、４１３個、４１４個、４１５個、４１６個、４１７個、４１８個、４１９個、４２０個、４２１個、４２２個、４２３個、４２４個、４２５個、４２６個、４２７個、４２８個、４２９個、４３０個、４３１個、４３２個、４３３個、４３４個、４３５個、４３６個、４３７個、４３８個、４３９個、４４０個、４４１個、４４２個、４４３個、４４４個、４４５個、４４６個、４４７個、４４８個、４４９個、４５０個、４５１個、４５２個、４５３個、４５４個、４５５個、４５６個、４５７個、４５８個、４５９個、４６０個、４６１個、４６２個、４６３個、４６４個、４６５個、４６６個、４６７個、４６８個、４６９個、４７０個、４７１個、４７２個、４７３個、４７４個、４７５個、４７６個、４７７個、４７８個、４７９個、４８０個、４８１個、４８２個、４８３個、４８４個、４８５個、４８６個、４８７個、４８８個、４８９個、４９０個、４９１個、４９２個、４９３個、４９４個、４９５個、４９６個、４９７個、４９８個、４９９個、５００個、５０１個、５０２個、５０３個、５０４個、５０５個、５０６個、５０７個、５０８個、５０９個、５１０個、５１１個、５１２個、５１３個、５１４個、５１５個、５１６個、５１７個、５１８個、５１９個、５２０個、５２１個、５２２個、５２３個、５２４個、５２５個、５２６個、５２７個、５２８個、５２９個、５３０個、５３１個、５３２個、５３３個、５３４個、５３５個、５３６個、５３７個、５３８個、５３９個、５４０個、５４１個、５４２個、５４３個、５４４個、５４５個、５４６個、５４７個、５４８個、５４９個、５５０個、５５１個、５５２個、５５３個、５５４個、５５５個、５５６個、５５７個、５５８個、５５９個、５６０個、５６１個、５６２個、５６３個、５６４個、５６５個、５６６個、５６７個、５６８個、５６９個、５７０個、５７１個、５７２個、５７３個、５７４個、５７５個、５７６個、５７７個、５７８個、５７９個、５８０個、５８１個、５８２個、５８３個、５８４個、５８５個、５８６個、５８７個、５８８個、５８９個、５９０個、５９１個、５９２個、５９３個、５９４個、５９５個、５９６個、５９７個、５９８個、５９９個、６００個、６０１個、６０２個、６０３個、６０４個、６０５個、６０６個、６０７個、６０８個、６０９個、６１０個、６１１個、６１２個、６１３個、６１４個、６１５個、６１６個、６１７個、６１８個、６１９個、６２０個、６２１個、６２２個、６２３個、６２４個、６２５個、６２６個、６２７個、６２８個、６２９個、６３０個、６３１個、６３２個、６３３個、６３４個、６３５個、６３６個、６３７個、６３８個、６３９個、６４０個、６４１個、６４２個、６４３個、６４４個、６４５個、６４６個、６４７個、６４８個、６４９個、６５０個、６５１個、６５２個、６５３個、６５４個、６５５個、６５６個、６５７個、６５８個、６５９個、６６０個、６６１個、６６２個、６６３個、６６４個、６６５個、６６６個、６６７個、６６８個、６６９個、６７０個、６７１個、６７２個、６７３個、６７４個、６７５個、６７６個、６７７個、６７８個、６７９個、６８０個、６８１個、６８２個、６８３個、６８４個、６８５個、６８６個、６８７個、６８８個、６８９個、６９０個、６９１個、６９２個、６９３個、６９４個、６９５個、６９６個、６９７個、６９８個、６９９個、７００個、７０１個、７０２個、７０３個、７０４個、７０５個、７０６個、７０７個、７０８個、７０９個、７１０個、７１１個、７１２個、７１３個、７１４個、７１５個、７１６個、７１７個、７１８個、７１９個、７２０個、７２１個、７２２個、７２３個、７２４個、７２５個、７２６個、７２７個、７２８個、７２９個、７３０個、７３１個、７３２個、７３３個、７３４個、７３５個、７３６個、７３７個、７３８個、７３９個、７４０個、７４１個、７４２個、７４３個、７４４個、７４５個、７４６個、７４７個、７４８個、７４９個、７５０個、７５１個、７５２個、７５３個、７５４個、７５５個、７５６個、７５７個、７５８個、７５９個、７６０個、７６１個、７６２個、７６３個、７６４個、７６５個、７６６個、７６７個、７６８個、７６９個、７７０個、７７１個、７７２個、７７３個、７７４個、７７５個、７７６個、７７７個、７７８個、７７９個、７８０個、７８１個、７８２個、７８３個、７８４個、７８５個、７８６個、７８７個、７８８個、７８９個、７９０個、７９１個、７９２個、７９３個、７９４個、７９５個、７９６個、７９７個、７９８個、７９９個、８００個、８０１個、８０２個、８０３個、８０４個、８０５個、８０６個、８０７個、８０８個、８０９個、８１０個、８１１個、８１２個、８１３個、８１４個、８１５個、８１６個、８１７個、８１８個、８１９個、８２０個、８２１個、８２２個、８２３個、８２４個、８２５個、８２６個、８２７個、８２８個、８２９個、８３０個、８３１個、８３２個、８３３個、８３４個、８３５個、８３６個、８３７個、８３８個、８３９個、８４０個、８４１個、８４２個、８４３個、８４４個、８４５個、８４６個、８４７個、８４８個、８４９個、８５０個、８５１個、８５２個、８５３個、８５４個、８５５個、８５６個、８５７個、８５８個、８５９個、８６０個、８６１個、８６２個、８６３個、８６４個、８６５個、８６６個、８６７個、８６８個、８６９個、８７０個、８７１個、８７２個、８７３個、８７４個、８７５個、８７６個、８７７個、８７８個、８７９個、８８０個、８８１個、８８２個、８８３個、８８４個、８８５個、８８６個、８８７個、８８８個、８８９個、８９０個、８９１個、８９２個、８９３個、８９４個、８９５個、８９６個、８９７個、８９８個、８９９個、９００個、９０１個、９０２個、９０３個、９０４個、９０５個、９０６個、９０７個、９０８個、９０９個、９１０個、９１１個、９１２個、９１３個、９１４個、９１５個、９１６個、９１７個、９１８個、９１９個、９２０個、９２１個、９２２個、９２３個、９２４個、９２５個、９２６個、９２７個、９２８個、９２９個、９３０個、９３１個、９３２個、９３３個、９３４個、９３５個、９３６個、９３７個、９３８個、９３９個、９４０個、９４１個、９４２個、９４３個、９４４個、９４５個、９４６個、９４７個、９４８個、９４９個、９５０個、９５１個、９５２個、９５３個、９５４個、９５５個、９５６個、９５７個、９５８個、９５９個、９６０個、９６１個、９６２個、９６３個、９６４個、９６５個、９６６個、９６７個、９６８個、９６９個、９７０個、９７１個、９７２個、９７３個、９７４個、９７５個、９７６個、９７７個、９７８個、９７９個、９８０個、９８１個、９８２個、９８３個、９８４個、９８５個、９８６個、９８７個、９８８個、９８９個、９９０個、９９１個、９９２個、９９３個、９９４個、９９５個、９９６個、９９７個、９９８個、９９９個、又は１０００個、又は５×１０３個、１０４個、５×１０４個、１０５個、５×１０５
個、１０６個、５×１０６個、及び１０７個の細胞である。アッセイの感度は、図２から判別され得る。当該方法の特に便利な態様では、細胞試料はアッセイ前に希釈されないが、かなりの容量の細胞が除去されて、約１個〜１０６個又はそれより多くの細胞を提供する。
【００５８】
したがって、１つのサンプル当たり、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６１個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、１５０個、１５１個、１５２個、１５３個、１５４個、１５５個、１５６個、１５７個、１５８個、１５９個、１６０個、１６１個、１６２個、１６３個、１６４個、１６５個、１６６個、１６７個、１６８個、１６９個、１７０個、１７１個、１７２個、１７３個、１７４個、１７５個、１７６個、１７７個、１７８個、１７９個、１８０個、１８１個、１８２個、１８３個、１８４個、１８５個、１８６個、１８７個、１８８個、１８９個、１９０個、１９１個、１９２個、１９３個、１９４個、１９５個、１９６個、１９７個、１９８個、１９９個、２００個、２０１個、２０２個、２０３個、２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、２０９個、２１０個、２１１個、２１２個、２１３個、２１４個、２１５個、２１６個、２１７個、２１８個、２１９個、２２０個、２２１個、２２２個、２２３個、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、２５１個、２５２個、２５３個、２５４個、２５５個、２５６個、２５７個、２５８個、２５９個、２６０個、２６１個、２６２個、２６３個、２６４個、２６５個、２６６個、２６７個、２６８個、２６９個、２７０個、２７１個、２７２個、２７３個、２７４個、２７５個、２７６個、２７７個、２７８個、２７９個、２８０個、２８１個、２８２個、２８３個、２８４個、２８５個、２８６個、２８７個、２８８個、２８９個、２９０個、２９１個、２９２個、２９３個、２９４個、２９５個、２９６個、２９７個、２９８個、２９９個、３００個、３０１個、３０２個、３０３個、３０４個、３０５個、３０６個、３０７個、３０８個、３０９個、３１０個、３１１個、３１２個、３１３個、３１４個、３１５個、３１６個、３１７個、３１８個、３１９個、３２０個、３２１個、３２２個、３２３個、３２４個、３２５個、３２６個、３２７個、３２８個、３２９個、３３０個、３３１個、３３２個、３３３個、３３４個、３３５個、３３６個、３３７個、３３８個、３３９個、３４０個、３４１個、３４２個、３４３個、３４４個、３４５個、３４６個、３４７個、３４８個、３４９個、３５０個、３５１個、３５２個、３５３個、３５４個、３５５個、３５６個、３５７個、３５８個、３５９個、３６０個、３６１個、３６２個、３６３個、３６４個、３６５個、３６６個、３６７個、３６８個、３６９個、３７０個、３７１個、３７２個、３７３個、３７４個、３７５個、３７６個、３７７個、３７８個、３７９個、３８０個、３８１個、３８２個、３８３個、３８４個、３８５個、３８６個、３８７個、３８８個、３８９個、３９０個、３９１個、３９２個、３９３個、３９４個、３９５個、３９６個、３９７個、３９８個、３９９個、４００個、４０１個、４０２個、４０３個、４０４個、４０５個、４０６個、４０７個、４０８個、４０９個、４１０個、４１１個、４１２個、４１３個、４１４個、４１５個、４１６個、４１７個、４１８個、４１９個、４２０個、４２１個、４２２個、４２３個、４２４個、４２５個、４２６個、４２７個、４２８個、４２９個、４３０個、４３１個、４３２個、４３３個、４３４個、４３５個、４３６個、４３７個、４３８個、４３９個、４４０個、４４１個、４４２個、４４３個、４４４個、４４５個、４４６個、４４７個、４４８個、４４９個、４５０個、４５１個、４５２個、４５３個、４５４個、４５５個、４５６個、４５７個、４５８個、４５９個、４６０個、４６１個、４６２個、４６３個、４６４個、４６５個、４６６個、４６７個、４６８個、４６９個、４７０個、４７１個、４７２個、４７３個、４７４個、４７５個、４７６個、４７７個、４７８個、４７９個、４８０個、４８１個、４８２個、４８３個、４８４個、４８５個、４８６個、４８７個、４８８個、４８９個、４９０個、４９１個、４９２個、４９３個、４９４個、４９５個、４９６個、４９７個、４９８個、４９９個、５００個、５０１個、５０２個、５０３個、５０４個、５０５個、５０６個、５０７個、５０８個、５０９個、５１０個、５１１個、５１２個、５１３個、５１４個、５１５個、５１６個、５１７個、５１８個、５１９個、５２０個、５２１個、５２２個、５２３個、５２４個、５２５個、５２６個、５２７個、５２８個、５２９個、５３０個、５３１個、５３２個、５３３個、５３４個、５３５個、５３６個、５３７個、５３８個、５３９個、５４０個、５４１個、５４２個、５４３個、５４４個、５４５個、５４６個、５４７個、５４８個、５４９個、５５０個、５５１個、５５２個、５５３個、５５４個、５５５個、５５６個、５５７個、５５８個、５５９個、５６０個、５６１個、５６２個、５６３個、５６４個、５６５個、５６６個、５６７個、５６８個、５６９個、５７０個、５７１個、５７２個、５７３個、５７４個、５７５個、５７６個、５７７個、５７８個、５７９個、５８０個、５８１個、５８２個、５８３個、５８４個、５８５個、５８６個、５８７個、５８８個、５８９個、５９０個、５９１個、５９２個、５９３個、５９４個、５９５個、５９６個、５９７個、５９８個、５９９個、６００個、６０１個、６０２個、６０３個、６０４個、６０５個、６０６個、６０７個、６０８個、６０９個、６１０個、６１１個、６１２個、６１３個、６１４個、６１５個、６１６個、６１７個、６１８個、６１９個、６２０個、６２１個、６２２個、６２３個、６２４個、６２５個、６２６個、６２７個、６２８個、６２９個、６３０個、６３１個、６３２個、６３３個、６３４個、６３５個、６３６個、６３７個、６３８個、６３９個、６４０個、６４１個、６４２個、６４３個、６４４個、６４５個、６４６個、６４７個、６４８個、６４９個、６５０個、６５１個、６５２個、６５３個、６５４個、６５５個、６５６個、６５７個、６５８個、６５９個、６６０個、６６１個、６６２個、６６３個、６６４個、６６５個、６６６個、６６１個、６６８個、６６９個、６７０個、６７１個、６７２個、６７３個、６７４個、６７５個、６７６個、６７７個、６７８個、６７９個、６８０個、６８１個、６８２個、６８３個、６８４個、６８５個、６８６個、６８７個、６８８個、６８９個、６９０個、６９１個、６９２個、６９３個、６９４個、６９５個、６９６個、６９７個、６９８個、６９９個、７００個、７０１個、７０２個、７０３個、７０４個、７０５個、７０６個、７０７個、７０８個、７０９個、７１０個、７１１個、７１２個、７１３個、７１４個、７１５個、７１６個、７１７個、７１８個、７１９個、７２０個、７２１個、７２２個、７２３個、７２４個、７２５個、７２６個、７２７個、７２８個、７２９個、７３０個、７３１個、７３２個、７３３個、７３４個、７３５個、７３６個、７３７個、７３８個、７３９個、７４０個、７４１個、７４２個、７４３個、７４４個、７４５個、７４６個、７４７個、７４８個、７４９個、７５０個、７５１個、７５２個、７５３個、７５４個、７５５個、７５６個、７５７個、７５８個、７５９個、７６０個、７６１個、７６２個、７６３個、７６４個、７６５個、７６６個、７６７個、７６８個、７６９個、７７０個、７７１個、７７２個、７７３個、７７４個、７７５個、７７６個、７７７個、７７８個、７７９個、７８０個、７８１個、７８２個、７８３個、７８４個、７８５個、７８６個、７８７個、７８８個、７８９個、７９０個、７９１個、７９２個、７９３個、７９４個、７９５個、７９６個、７９７個、７９８個、７９９個、８００個、８０１個、８０２個、８０３個、８０４個、８０５個、８０６個、８０７個、８０８個、８０９個、８１０個、８１１個、８１２個、８１３個、８１４個、８１５個、８１６個、８１７個、８１８個、８１９個、８２０個、８２１個、８２２個、８２３個、８２４個、８２５個、８２６個、８２７個、８２８個、８２９個、８３０個、８３１個、８３２個、８３３個、８３４個、８３５個、８３６個、８３７個、８３８個、８３９個、８４０個、８４１個、８４２個、８４３個、８４４個、８４５個、８４６個、８４７個、８４８個、８４９個、８５０個、８５１個、８５２個、８５３個、８５４個、８５５個、８５６個、８５７個、８５８個、８５９個、８６０個、８６１個、８６２個、８６３個、８６４個、８６５個、８６６個、８６７個、８６８個、８６９個、８７０個、８７１個、８７２個、８７３個、８７４個、８７５個、８７６個、８７７個、８７８個、８７９個、８８０個、８８１個、８８２個、８８３個、８８４個、８８５個、８８６個、８８７個、８８８個、８８９個、８９０個、８９１個、８９２個、８９３個、８９４個、８９５個、８９６個、８９７個、８９８個、８９９個、９００個、９０１個、９０２個、９０３個、９０４個、９０５個、９０６個、９０７個、９０８個、９０９個、９１０個、９１１個、９１２個、９１３個、９１４個、９１５個、９１６個、９１７個、９１８個、９１９個、９２０個、９２１個、９２２個、９２３個、９２４個、９２５個、９２６個、９２７個、９２８個、９２９個、９３０個、９３１個、９３２個、９３３個、９３４個、９３５個、９３６個、９３７個、９３８個、９３９個、９４０個、９４１個、９４２個、９４３個、９４４個、９４５個、９４６個、９４７個、９４８個、９４９個、９５０個、９５１個、９５２個、９５３個、９５４個、９５５個、９５６個、９５７個、９５８個、９５９個、９６０個、９６１個、９６２個、９６３個、９６４個、９６５個、９６６個、９６７個、９６８個、９６９個、９７０個、９７１個、９７２個、９７３個、９７４個、９７５個、９７６個、９７７個、９７８個、９７９個、９８０個、９８１個、９８２個、９８３個、９８４個、９８５個、９８６個、９８７個、９８８個、９８９個、９９０個、９９１個、９９２個、９９３個、９９４個、９９５個、９９６個、９９７個、９９８個、９９９個、又は１０００個の細胞を測定するような、１個〜１０００個の細胞の感受性が特に好ましい。
【００５９】
任意の型の磁気粒子が、本発明のアッセイの実行に用いられ得る。典型的には、粒子は、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、それらの合金、並びに他の強磁性物質から製造される。本発明を任意の型のビーズに限定したくはないが、Ｄｙｎａｌ（商標−Dynal Invitrogen Corporation, 9099 North Deerbrook Trial, Brown Deer, WI, USA 53223）又はBioclone（San Diego, CA 92126, USA）ビーズ或いはＣＰＧペクチン酸カルシウムゲル磁気ビーズ（CPG Inc, Lincoln Pk, NJ 07035, USA）が用いられ得る。Lode Starポリマーベースのビーズ（Polymer Labs, UK and USA）も用いられ得る。
【００６０】
テロメラーゼの基質、即ち、オリゴヌクレオチドプライマーが以下の配列：
（ＸｎＴＴＡＧＧＹｍ）ｏ
（式中、Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択され、
Ｙは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣから選択され、
ｎは、０又は１であり、
ｍは、０又は１であり、且つ
ｏは、１〜約４００である）、
を含む。
【００６１】
一般的に、脊椎動物では、ｎは０であり、ＹはＧであり、そしてｏは約５〜約３０である。節足動物では、ｎは０であり、ｍは、０であり、そしてｏは約１〜３０である。植物では、ＸはＴであり、ｎは１であり、ＹはＧであり、ｍは１であり、そしてｏは１〜約３０である。
【００６２】
特定の一実施形態では、磁気ビーズは、それらの表面に固定されたヒトテロメラーゼ標的ヌクレオチド配列［配列番号１］を含む。ヒトテロメア標的配列は、５’−ＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ−３’［配列番号１］であり、これは反復（ＴＴＡＧＧＧ）［配列番号４］を組込んでいる。
【００６３】
テロメラーゼ標的配列［配列番号１］は、その５’末端で、
５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’［配列番号２］
を含む表面結合スペーサー（又はアンカー）配列［配列番号２］と融合されることが好都合である。
【００６４】
併合テロメラーゼ認識配列［配列番号１］及び表面結合スペーサー配列［配列番号２］は、スペーサー−テロメラーゼ認識配列［配列番号３］：
５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ−３’［配列番号３］
として言及される。
【００６５】
テロメラーゼ認識配列は、チオール結合を介して固定されるのが好都合である。例えば適切なリンカーは、以下の配列番号５で表わされる：
５’ＳＨ（ＳＣＨ２）６−ＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ［配列番号５］。
【００６６】
ヒトテロメラーゼ認識配列は磁気ビーズに固定されるべき最も好ましいものであるが、本発明は、ヒトテロメラーゼに関する基質である任意の非ヒトテロメラーゼ認識配列に及ぶ。非ヒトテロメラーゼ配列の例としては、非ヒト霊長類、家畜動物及び実験室試験動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ又はサルからのものが挙げられる。
【００６７】
ＴＢＴは、他の固体支持体、例えばマイクロパターン化表面、ガラス表面及び支持体、液晶マイクロバランス支持体、マイクロアレイ、多孔性アルミナ支持体、シリカ表面支持体、ナノ粒子、パターン化ポリマーブラシ、ポリ（エチレングリコール）ブラシ、膜も用い得る。ＴＢＴは、代替的系、例えばナノ粒子増幅表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及びＢＩＡコア系上でも実行され得る。
【００６８】
本発明は特に、ＤＮＡのビオチンラベルの使用に関して例証される。ｄＵＴＰ上のビオチン部分は、テロメラーゼ伸長配列中に組込まれる。ビオチンは、Ｈ２Ｏ２の存在下で生体触媒性標識として作用するストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アビジン−ＨＲＰ又はニュートロアビジン−ＨＲＰのような試薬との特異的結合部位として役立つ。
【００６９】
しかしながら、標識を可視化するために、又は検出可能なシグナルを得るために、外因性作用物質が添加される限り、他の標識も用いられ得る。それゆえ、例えば蛍光、燐光、化学発光又は放射性標識が伸長テロメラーゼ認識配列中に組込まれ得るが、但し、その結果生じるシグナルを最大にするために、外因性エンハンサー及び／又はシグナル伝達促進剤が添加される。代替的標識としては、ビオチン−ｄＵＴＰ、フィコエリトリン−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ及び［α−３２Ｐ］−ｄＵＴＰ（そのすべての考え得る異性体を含めて）が挙げられるが、これらに限定されない。ｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰが挙げられる。酵素ベースの並びに化学的検出アッセイも、用いられ得る。
【００７０】
したがって、本態様は、テロメラーゼ活性を示す被験体からの細胞の検出方法であって、
ｉ）被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、標識されたｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内に標識を組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、標識から生じるシグナルを最大にするために洗浄したビーズをシグナル伝達促進物質と接触させること、及び、
ｉｉｉ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、シグナルの強度を読み取ること、
を包含し、テロメラーゼを含む細胞を含有しないような対照と又は既知のデータセットと比較した場合のシグナルの強度レベルがテロメラーゼ活性レベル及び推定テロメラーゼ提示細胞数を提示する方法を意図する。
【００７１】
ステップ（ｉｉ）又はその一部は、自動的に又は半自動的に、例えばルミネッセンス強度を読み取る機械で、実行されるのが好都合である。
【００７２】
対照は一般的に特定細胞抽出物を含有しない試料であるが、それは同様に、テロメラーゼ活性を含有しない、又は標識されたｄＮＴＰ若しくはアッセイの操作のために必要とされる他の構成成分を含有しない試料であり得る。対照は、細胞数に相関する値の既知のデータセットでもあり得る。
【００７３】
細胞を入手することそしてこれらの抽出物を、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子と接触させ、ｄＮＴＰの存在下で粒子をインキュベートしてテロメラーゼ媒介性プライマー伸長を可能にする態様は、ビーズの任意の回転の非存在下で起こる、ということに留意することは重要である。ビーズの回転は反応の速度論の促進のために必要とされないか、反応の速度論を促進しない、と考えられる。それゆえ、ＴＢＴアッセイの感度は、分析物又はアッセイに関与する他の物質の運搬速度によらない。
【００７４】
本発明のアッセイは、研究目的のための細胞中のテロメラーゼの検出に、細胞の健康状態を判定するために、又はテロメラーゼ活性を阻害するか若しくは増強する化合物の能力を評価するためにも適用可能である。これは、すべての脊椎動物、非脊椎動物及び植物において適用可能である。脊椎動物に関して、及び癌又は炎症性状態の場合、癌細胞又は炎症性細胞の存在に関してスクリーニングするために、被験体、例えばヒトから組織を取り出すことにより、当該状態は診断され得る。さらに、幹細胞、例えば造血幹細胞の増殖のためには、特定長のテロメアの存在が必要とされ得る。これは、例えば白血病被験体における輸血のために重要である。血液試料は、幹細胞が増殖し、白血球及び造血系列の他の細胞に分化する能力を示す特定のテロメラーゼ活性を有する幹細胞に関してスクリーニングされ得る。例えばこの方法は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ又は他の薬剤のようなサイトカインによる幹細胞動員の成功をモニタリングするために用いられ得る。したがってこの方法を用いて、末梢血又は骨髄中の幹細胞をモニタリングするために用いられる他の方法論を強化及び／又は代替し得る。
【００７５】
代替的には、治療プロトコール又は療法レジメンの成功又は進行又はその他を評価するために、組織試料は、既知の癌又は炎症性状態の治療中に採取され得る。このようなレジメンは次に、必要に応じて調整され得る。
【００７６】
したがって本発明の別の態様は、治療を受けている被験体からの癌又は炎症に関するような治療プロトコールをモニタリングするための方法であって、
ｉ）被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、陰性又は陽性対照と比較した場合にルミネッセンスの強度レベルがテロメラーゼ活性のレベルを提示する（この場合、テロメラーゼ活性の増大又はテロメラーゼ活性の安定化は、治療プロトコールが被験体に悪影響を及ぼしていないことの指標である）方法を提供する。
【００７７】
さらにまた、上記のステップのいずれか、しかしながら特にステップ（ｉｉｉ）は、自動的に実行され得る。
【００７８】
アッセイは、テロメラーゼ活性を低減する化学療法薬に関してスクリーニングするためにも用いられ得る。「化学療法薬」への言及は、化合物、免疫学的化合物、天然産物若しくはｓＲＮＡｉ複合体、又は導入ウイルスベクターの生成物を包含する。
【００７９】
したがって、本発明の別の態様は、細胞障害性作用物質の活性の評価方法であって、
ｉ）推定細胞障害性作用物質を癌細胞の培養物に添加すること、
ｉｉ）テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を癌細胞からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｖ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、洗浄したビーズをルミノール及びエンハンサー及び外因的Ｈ２Ｏ２と接触させてルミネッセンスを生成させること、及び、
ｖ）その結果生じた混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含し、細胞障害性作用物質を含有しない対照と比較した場合の細胞障害性作用物質の存在下でのルミネッセンスの強度レベルが作用物質の細胞障害性のレベルを提示する方法を意図する。
【００８０】
本発明はさらに、本発明の方法により同定される化学療法薬、及びそれを含む薬学的組成物を提供する。
【００８１】
一般的に、試験されている被験体は、ヒトである。しかしながら本発明は、任意の動物被験体、特に哺乳類被験体、例えば霊長類（例えばゴリラ、マーモセット、チンパンジー、サル）、家畜動物（例えばヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ）、実験室試験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター）、ペット（例えばネコ、イヌ）、並びに野生動物に及ぶ。非脊椎動物哺乳類及び植物も、本発明により意図される。
【００８２】
本発明の方法において、組込まれる標識の存在は、シグナル、例えば電気的シグナル、色シグナル又は光放射の情報により判定される。センシングメンバーは、一般的に化学的又は電気的シグナル後に、それがシグナルを感知し得るようなものである。シグナルが光の放射である場合、検出器は光検出器である。
【００８３】
シグナルが電気的である場合、それは電極及び電子伝達鎖間の電子の移動に起因し、この場合、標識は電子伝達鎖の１つのメンバーである。
【００８４】
本発明の方法に用いるのに適した電極は、伝導性又は半伝導性物質、例えば金、白金、パラジウム、銀、炭素、銅及びインジウム・スズ酸化物で製造されるか又は被覆される。
【００８５】
本明細書中での「ルミネッセンス」への言及は、ケミルミネッセンス、バイオルミネッセンス、結晶ルミネッセンス、エレクトロルミネッセンス、カソードルミネッセンス、フォトルミネッセンス、燐光、蛍光、ソノルミネッセンス、サーモルミネッセンス又はトリボルミネッセンスを包含する。
【００８６】
本発明のアッセイは、複合アッセイ中に生じるような二つ以上の標識の同時又は逐次的検出にも適用可能である。一例では、異なる患者試料、又は異なる時点の若しくは異なる処置後の同一患者からの試料に関して、多標識が用いられ得る。このような場合、磁気粒子は、（同一磁気粒子上に又は異なる磁気粒子上のいずれかに）二つ以上の標識を保有する。同時検出が生じるためには、アッセイ条件は、各標識に関して区別可能である反応シグナルの同時形成を可能にするものである。したがって１つの標識の存在は、１つの型（例えば光放射）の反応シグナルをもたらすが、一方、別の標識の存在は別の型（例えば異なるスペクトルでの光の放射）の反応シグナルをもたらす。代替的には、二つ以上の標識の検出は、１つのアッセイが実施された後、磁気粒子が収集され、洗浄され、そして別の標識の検出のための異なるアッセイ条件を提供されるよう、次から次に達成される。このような場合、反応シグナルは同一であり得るが、但し、各アッセイにおいて、反応シグナルは専らシグナル標識の存在に関連して得られる。
【００８７】
本発明の診断方法において、アッセイは、テロメラーゼのレベル増大が認められるか否かを判定するために実行される。「レベル増大」という語句は、特定細胞中のテロメラーゼ活性の絶対レベルが、その個体中の正常体細胞と比較して、又は疾患状態に罹患していない他の個体中の正常体細胞と比較して、増大される、ということを意味する。一般的に、テロメラーゼ活性の任意の検出可能レベルは、正常出生後ヒト体細胞組織からの細胞中で増大されると考えられる。テロメラーゼ活性は生殖系列細胞中で認められ、そして低レベルのテロメラーゼ活性が幹細胞及び或る特定の造血幹細胞中で検出され得るが、このような細胞は、これらの細胞が移植された血液又は組織の一部でない限り、本発明の方法の実践者に問題を提示しない。その場合（例えば輸血中）、テロメラーゼ活性を有する幹細胞は、分化し、増殖する能力を確実にすることが望ましい。生殖系列細胞は、ヒト体細胞組織試料から容易に区別、及び／又は分離され得るし、幹細胞及び或る特定の造血細胞中に存在するテロメラーゼ活性は、体細胞組織試料中に存在するこのような少数の細胞がテロメラーゼ活性アッセイから擬陽性シグナルを生じないほど低レベルで存在する。体細胞中のテロメラーゼ活性の検出は、不死細胞、例えば或る特定の型の癌細胞又は炎症性細胞の存在を示し、それを用いて、細胞が非癌性又は非炎症性病態として分類される場合でも、その判定を下し得る。したがって本発明の方法は、細胞が可視的に癌性になる前に、高い信頼度で癌性状態を検出することができる。
【００８８】
本発明の診断試験はまた、他の診断試験と共に実行され得る。いくつかの場合、このような組合せ試験は疾患の進行に関する有用な情報を提供し得るが、テロメラーゼ活性に関して試験するための本発明の方法は、この点で非常に有用な情報を提供する。例えば患者試料中の癌細胞の存在を検出するために本発明の方法が用いられる場合、テロメラーゼ活性の存在を用いて、患者が疾患の進行過程にある場合、特定腫瘍が隣接組織に侵入しているか又は遠位の位置に転移しているか否かを、そして癌の発生が再発しているか否かを判定し得る。本発明の方法とともに追加的情報を提供し得る試験としては、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＤＮＡ倍数性、Ｓ期における細胞の分画、結節状態、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子産物、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ｒａｓ、ＥＧＦ受容体、Ａ３３（結腸特異的抗原）（Catimel et al., J. Biol. Chem 271(41): 25664-25670, 1996）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（癌精巣抗原）（Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(5): 1914-1918, 1997）又は他の癌遺伝子に関する診断試験が挙げられる。
【００８９】
上記のように、本発明のＴＢＴは、幹細胞、例えば胚性幹細胞に関してアッセイするためにも有用である。特にＴＢＴを用いて、パーキンソン病、心疾患、糖尿病、関節炎、血液疾患、骨粗鬆症、臓器移植及び脊髄損傷のような疾患状態における幹細胞の治療的関与を評価し得る。ＴＢＴは、幹細胞又は幹細胞由来組織の移植をモニタリングするために、そして幹細胞の寿命又は分化の状態をモニタリングするために有用である。
【００９０】
本発明は、本発明の診断方法を実施するためのキットも提供する。このようなキットは、容易に入手可能な材料及び試薬から調製することが可能で、種々の実施形態を生じ得る。例えばこのようなキットは、任意の１つ又は複数の下記の物質を含み得る：反応管、緩衝液、洗剤、オリゴヌクレオチド・テロメラーゼ基質、対照試薬、過酸化水素、及び使用説明書。本発明の特に好ましいキットは、テロメラーゼ基質及びｄＮＴＰ及びビオチン化ｄＵＴＰを入れる反応管を包含する。キットの意図されたユーザー及びユーザーの特定の必要性によって、広範な種々のキット及び構成成分が、本発明に従って調製され得る。
【００９１】
本発明の方法は、被験体における癌を検出するための診断プロトコールの生成における、
ｉ）被験体から細胞の試料を入手し、テロメラーゼに関する基質であるオリゴヌクレオチドプライマーを保有する磁気粒子を細胞試料からの細胞抽出物と接触させ、且つ、オリゴヌクレオチドプライマーのテロメラーゼ媒介性伸長が、ＮＴＰ及びビオチン化ＵＴＰの存在下で生じ、それにより伸長プライマー内にビオチンを組込むのに十分な時間の間、十分な条件下で、磁気粒子及び細胞抽出物を共にインキュベートすること、
ｉｉ）磁気粒子をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼと接触させること、
ｉｉｉ）非回転磁石を用いてビーズを収集し、ビーズを洗浄し、且つ、外因的添加Ｈ２Ｏ２の存在下で洗浄したビーズを必要に応じて自動的にルミノール及びエンハンサーと接触させてルミネッセンスを生成させること、及び、
ｉｖ）その結果生じる混合物を検出手段に付して、ルミネッセンスの強度を読み取ること、
を包含するアッセイの使用をさらに意図する。
【００９２】
以下の非限定実施例により、本発明をさらに説明する。
［実施例］
【実施例１】
【００９３】
テロメラーゼルミネッセンスアッセイ
本実施例は、膀胱癌患者の尿又は結腸癌患者からの糞便中の剥離腫瘍細胞中のテロメラーゼを定量的に測定するための読出しとしてルミネッセンスを用いて、高感度及び選択的バイオセンサーアッセイのための実験プロトコールを記載する。簡潔にいうと、このアッセイは、テロメラーゼに関する認識配列を含有するヌクレオチドプライマーとのチオール結合を用いて官能化された超常磁性ビーズを用いる。これらのビーズ（バイオビーズ）を、ビオチン化ｄＵＴＰを含むヌクレオチド混合物の存在下で、テロメラーゼを含有する腫瘍細胞抽出物とともにインキュベートする。プライマーのテロメラーゼ誘導性伸長が、ビオチンラベルの組込みを伴って進行する。多数のビオチン分子が組込まれて、シグナル増幅を生じる。アビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加するが、これは、高親和性（１０−１５Ｍ）で組込まれたビオチンと結合する。次にバイオビーズを十分に洗浄し（これにより、大半の生物学的試料の中の他の潜在的妨害物質による汚染が最小限にされる）（磁気粒子は磁気を用いて効率的にトラップされ得る）、ＢＭＧルミノメーター中の９６ウエルプレートに移す。過酸化水素、ルミノール及び化学エンハンサーを必要に応じて自動的に添加し、ルミネッセンスシグナルを検出する。
【００９４】
このプロトコールは、Kingfisher磁気粒子プロセッサーを用いてアッセイ自動化を手助けするのが好都合である。ＢＭＧルミノメーター（BMG, Lattech, Germany）も用いられる。ケミルミネッセンス読取機はまた、エンハンサー、ルミノール及び／又はＨ２Ｏ２の添加といったような自動化を可能にするように修正され得る。それは、多重プレートフォーマットで設定され得る。
【００９５】
磁気粒子の使用は、自動化を促進するよう設計される。粒子それ自体は、磁気を用いて拾い集められ、操作することが可能であり、例えばKingfisher磁気粒子プロセッサー（Thermo Corporation, USA）は、交差汚染を防止する使い捨てチップにより被覆される磁気粒子を電磁石棒により混合および移動する。Kingfisherソフトウエアは、あつらえプロトコールを特定用途のために意図される。初期ステップ中、ビーズを収集し、緩衝液、反応混合物及び試料を添加し、混合する。プレートをLabnet振盪インキュベータに移して、温度を上げて（３７℃、３０分）、テロメラーゼ伸長反応を駆動するために、手動的介入が必要とされる。温度制御で構築したKingfisher９６の使用は、この要件を省く。インキュベート後、プレートを次に、ストレプトアビジンＨＲＰの最終的添加のためにKingfisherに戻して、その後、十分に洗浄するが、これはアッセイで観察される一貫した低バックグラウンドを保持するために不可欠である。最終的には、伸長オリゴヌクレオチドを保有する磁気ビーズをNunc９６ウエルLumiNuncプレートに移す（これらのプレートは、最小自動ルミネッセンスを有する）。プレートを次に、手動でＢＭＧ Fluorostarルミノメーター（BMG Labtech, Germany）に移す（この完全自動化マイクロプレートベースの多重検出読取機（測定点に試薬を送達する注入器を装備する）は、ルミノール（Pierce SuperSignal ELISA Femto Substrate）及び過酸化物の添加のためにプログラムされ得る）。蛍光検出のために、同一機器を用い得る。ワークステーション（Kingfisher and BMG）間の移動はさらに、ロボット移動手段（例えばZymark Twister、Beckman Sagian）を用いて自動化され得る。同様に、代替的技術が、Kingfisher（例えばBeckman Biomek、Bruker Daltronics ClinProt Robot）又はBMG Fluorostar（例えばMolecular Devices LMax II）の代わりに用いられ得る。
【００９６】
Kingfisher磁気粒子プロセッサーのための実験プロトコール
プレートＡ１（及び２つのプレートを用いる場合にはＢ１）に以下のものを添加する：
・  列Ａ  -  １００μｌの伸長緩衝液
・  列Ｂ  −  特定容量の反応混合物（添加されるテロメラーゼの１回総容量は５０μｌである）
・  列Ｂ  −  テロメラーゼ酵素抽出物を添加する
・  列Ａ  -  各ウエル中の１００μｌの伸長緩衝液に１０μｌのオリゴ結合ｄｙｎａｌビーズ（３０ｍｇ／ｍｌのビーズストック）を最終的に添加する（十分な混合を確実にする）。
【００９７】
プレート（単数又は複数）をKingfisher機器中に入れて、コーム（単数又は複数）中でカバースリップをスライドさせて、磁石を保護する。
【００９８】
プログラム（「テロメラーゼアッセイ」）を選択する
「スタート」を２回叩く。
【００９９】
Kingfisherが中断する場合、それは、「３７℃でインキュベートする」ことを指示する
・  プレート（単数又は複数）を取り出し、列Ａ＆ＢをNescofilm（登録商標）でカバーして、プレートが十分に密封されたことを確実にする。
【０１００】
・  プレート（単数又は複数）をLabnet振盪インキュベータ中に入れる（設定：温度＝３７℃、時間＝３０分、ＲＰＭ＝１２）。
【０１０１】
３０分のインキュベート後、Nescofilm（登録商標）を取り出し、残りの列を以下のように充填する：
ＲｏｗＣ−１００μｌ  １％ｗ／ｖＳＤＳ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
ＲｏｗＤ−１００μｌ  １％ｗ／ｖＳＤＳ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
ＲｏｗｅＥ−１００μｌワーキング緩衝液／Ｔｗｅｅｎ
ＲｏｗＦ−１００μｌワーキング緩衝液／Ｔｗｅｅｎ
ＲｏｗＧ−１００μｌワーキング緩衝液／Ｔｗｅｅｎ
ＲｏｗＨ−１００μｌワーキング緩衝液／Ｔｗｅｅｎ
プレート（単数又は複数）をKingfisher中に入れ戻して、「スタート」を押す（方法が継続する）。
【０１０２】
プレートＡ２（及び２つのプレートを用いる場合にはＢ２）を設定する。
【０１０３】
プレートＡ２（Ｂ２）に以下のものを添加する：
ＲｏｗＡ−１００μｌワーキング緩衝液／Ｔｗｅｅｎ
ＲｏｗＢ−ワーキング緩衝液／Ｔｗｅｅｎにおける０．５ｕｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔ  ＨＲＰ（ＫＰＬ）の５００μｌ）
ＲｏｗＣ−１００μｌワーキング緩衝液
ＲｏｗＤ−１００μｌワーキング緩衝液
ＲｏｗＥ−１００μｌワーキング緩衝液
ＲｏｗＦ−１００μｌワーキング緩衝液
ＲｏｗＧ−１００μｌワーキング緩衝液
ＲｏｗＨ−５０μｌワーキング緩衝液
Kingfisherが中断する場合、それは、「プレートを変更する」ことを指示する
・  プレートを取り替える
「スタート」を押すと、当該方法は再開する。
【０１０４】
ポンプＡ中のルミノール及びポンプＢ中の過酸化物をBMG FluoroStarルミノメーターに準備する（プレート鋳型（ＡＰＬアッセイ−良好モード）及び容量（各々５０μｌ）を設定する）。ルミノメーター増分は２０００に設定される。
【０１０５】
方法終了時に、機械は継続的にビーという音を出すので、終了を押す。
【０１０６】
Kingfisherからプレート（単数又は複数）を取り、列ＨをNUNCホワイト９６ウエルプレート中に移して、読取りのためにBMG FluoroStarルミノメーター中に入れる。
緩衝液
伸長緩衝液
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
６３ｍＭ  ＫＣｌ
１ｍＭ  ＥＧＴＡ
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＳＤＳ緩衝液
０．１％ｗ／ｗ  ＳＤＳ
１０ｍｍ  ＨＥＰＥＳ
ワーキング緩衝液
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４
０．１Ｍ  ＫＣｌ
（０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）
反応ミックス
１×伸長緩衝液
０．２５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ
１２．５ｕＭ  Ｂ−ｄＵＴＰ
１８．７５ｕＭ  ｄＡｄＧ
テロメラーゼ（又はテロメラーゼ活性を含有する抽出物）
ミリＱ水
・  アッセイされるべき試料の２つのアリコートを取り出す（典型的には１〜５μｌ）。
【０１０７】
・  １つのアリコートを９５℃で２０分間加熱して、熱不活性化し、次に試料を氷上に載せる。
【０１０８】
・  ９６ウエルKingfisherプレート中に試薬を分取し、Kingfisher粒子プロセッサー中に入れる（別の文書中のプロトコール参照）。
【０１０９】
・  特定テロメラーゼオリゴヌクレオチド配列と結合したＤｙｎａｌ磁気ビーズ（オリゴビーズ）を１００μＬの伸長緩衝液（１×）中で２分間洗浄する。
【０１１０】
・  ビーズを５０μＬの反応ミックス（伸長緩衝液、１２．５μＭのビオチン−ｄＵＴＰ、０．２５％ｗ／ｖＢＳＡ、１８．７５μＭのｄＡｄＧ）及び試料中に移す。
【０１１１】
・  手動でプレートをヒーター／振盪機器に移す。
【０１１２】
・  オリゴビーズを、反応ミックスとともに３７℃で３０分間インキュベートして、試料中の酵素によりオリゴの伸長を可能にする。
【０１１３】
・  手動で、プレートをKingfisher機器に移し戻す。
【０１１４】
・  １００μＬの１％ｗ／ｖＳＤＳ／１ｍＭのＨＥＰＥＳで室温で２分間、オリゴビーズを２回洗浄する。
【０１１５】
・  １００μＬの伸長緩衝液（１×）で室温で２分間、オリゴビーズを５回洗浄する。
【０１１６】
・  ５０μＬの１ｕｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＨＲＰで室温で３０分間、オリゴビーズをインキュベートする。
【０１１７】
・  １００μＬのワーキング緩衝液（１Ｍのトリス−ＨＣｌ、１ＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）で室温で２分間、オリゴビーズを５回洗浄する。
【０１１８】
・  最終容量５０μＬのワーキング緩衝液中にオリゴビーズを再懸濁し、試料を白色ルミネッセンスプレート中に移す。
【０１１９】
・  ルミネッセンス結果のために白色プレートをルミノメーター中に入れる（５０μＬのルミノール及び５０ｕＬの過酸化物を機器により自動的に添加する）。
【実施例２】
【０１２０】
標的配列とビーズとのチオール結合
チオール結合のための５’’システインを伴うテロメラーゼに関する標的配列（５’ＳＨ（ＣＨ２）６−ＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ［配列番号５］）を、ヘテロ二機能性クロスリンカーＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Pierce）を用いて、磁気ビーズと結合した。５０ｍＭのトリアルキルホスフィン（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（ＴＣＥＰ）を用いて室温で２時間、オリゴを還元する。Superpose１２ＨＰＬＣカラム（Amersham）上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、還元オリゴをＴＣＥＰから精製する。次にスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ修飾磁気ビーズとともに４℃で一晩、還元オリゴをインキュベートする。３４３ｎｍ吸光度読取における増大により、結合をモニタリングする（図１参照）。
【実施例３】
【０１２１】
テロメラーゼ・バイオセンサー試験（ＴＢＴ）
テロメラーゼアッセイを、以下のように実行した：
ビーズ表面結合オリゴヌクレオチド［配列番号２］並びにＤｙｎａｌ（Dynal Invitrogen Corporation, 9099 North Deerbrook Trail, Brown Deer, WI, USA 53223）に固定された併合配列［配列番号３］を用いて、テロメラーゼ標的配列［配列番号１］を合成した。固定化は、配列番号３の５’末端と結合するシステイン残基を介した。
【０１２２】
推定癌細胞を含有する細胞を採取し、ＣＨＡＰＳ緩衝液（０．５％ｖ／ｖＣＨＡＰＳ、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ及び１０％ｖ／ｖグリセロール：１０ｍｌ当たり１個のプロテアーゼ阻害剤錠剤（Compete Mini, Roche）を有する）で溶解した。次に溶解細胞抽出物を、ｄＮＴＰ及びビオチン化ｄＵＴＰとともに磁気ビーズに添加した。次にストレプトアビジン−ＨＲＰを添加した。インキュベート後、回転なしに磁石を用いてビーズを収集し、洗浄した。次にビーズを、９６ウエルプレートに転換した。ルミノール及びエンハンサーを、過酸化水素と共に添加した。次にルミネッセンスを読み取った。
【実施例４】
【０１２３】
アッセイの感度
ＬＩＭ１２１５癌腫細胞（Whitehead et al., J Natl Cancer Inst 74(4): 749-765, 1985）を計数し、１００〜１０００個の細胞を含有するアリコートを取り出して、テロメラーゼに関してアッセイした。結果を、図２に示す。グラフは、感受性が１細胞という低さであることを示す。１０６個又はそれより多くの細胞を含む試料もアッセイし、テロメラーゼ活性の良好な検出を示した。
【実施例５】
【０１２４】
試料調製
癌のリスト及び試料採取技法を以下に示す。リストは、検出され得る癌の型の例示に過ぎない。
【０１２５】
これらのうちのいくつかに関する試料ワークアップは、項目１１下に含まれる。ＴＢＴが用いられる臨床試料の型の例を、各癌に関して示す。
【０１２６】
膀胱癌：尿中の沈殿細胞、膀胱洗浄液、
尿生殖路癌：腎盂洗浄液、膀胱洗浄液、
腎癌：腎盂洗浄液、膀胱洗浄液、
結腸癌：剥離糞便上皮細胞、内視鏡生検検体、
白血病：骨髄及び末梢血、
黒色腫：末梢血、微細針吸引液、
皮膚癌：生検、末梢血、微細針吸引液、
肺癌：気管支肺胞洗浄液、気管支擦過物及び洗浄液、痰、掻爬物及び塗抹物、微細針吸引液、生検及び組織切片、
前立腺癌：微細針吸引液、尿中の沈殿細胞、
頭及び首の癌：掻爬物及び塗抹物、
リンパ節：微細針吸引液、
膵臓：微細針吸引液、
唾液腺：微細針吸引液、
乳房：微細針吸引液、乳頭分泌物、
肝臓：微細針吸引液、
甲状腺：微細針吸引液、
脳癌：脳脊髄液、並びに
子宮頚部、膣及び卵巣癌：塗抹物、腹膜洗浄液。
【実施例６】
【０１２７】
表在性膀胱癌試料
細胞を含む試料５μｌをアッセイした。
【０１２８】
ＬＩＭ１２１５結腸癌細胞株（Whitehead et al., 1985、上記）は、陽性対照である。熱不活性化（ＨＩ）後のシグナルの低減に留意されたい。Ｅｐ−ＣＡＭビーズを用いて、試料ワークアップ中の活性化リンパ球から癌細胞を分離した。結果を、図３に示す。
【実施例７】
【０１２９】
浸潤性膀胱癌試料
細胞を含む試料１μｌをアッセイした。結果を図４に示す。
【実施例８】
【０１３０】
テロメラーゼアッセイとＴＲＡＰ法との比較
実施例３に記載したようにテロメラーゼアッセイを用いて、ＴＲＡＰアッセイとの比較を行なった（Hess et al., 2002、上記）。結果を表３に示す。テロメラーゼアッセイは、ＴＲＡＰアッセイよりも明らかに高感度である。実施例１８も参照。
【０１３１】
【表３】
2009520464.tif 000004
【実施例９】
【０１３２】
糞便試料からの結腸細胞の単離
・  糞便試料の重量を測定する。
【０１３３】
・  添加剤を含有する５０ｍＬ／ｇのＰＵＣＫの分散緩衝液（Puck緩衝液レシピ参照）中で試料を激しくかき混ぜる。
【０１３４】
・  １００μｍ膜を通してスラリーを濾過し、フロースルーを収集する。
【０１３５】
・  ６０μｍ膜を通して収集液を濾過し、フロースルーを収集する。
【０１３６】
・  ４℃で１０００ｇで１０分間、フロースルーを遠心分離する。
【０１３７】
・  抗生物質を含有するＰＵＣＫの分散緩衝液２．５ｍＬ中に細胞ペレットを再懸濁する。
【０１３８】
・  ７．５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌの不連続勾配上に層を成し、４℃で２０分間、２００００×ｇで遠心分離する（固定角ローター）。
【０１３９】
・  細胞分画を収集し、１％ｖ／ｖＦＣＳ及び０．６％ｗ／ｖクエン酸ナトリウムを含有するＰＢＳで１０ｍＬとする。
【０１４０】
・  ４℃で１０００ｇで１０分間、遠心分離する。
【０１４１】
・  １％ｖ／ｖＦＣＳ及び０．６％ｗ／ｖクエン酸ナトリウムを含有するＰＢＳ（２ｍｌ）中に再懸濁する。
【０１４２】
・  ４０μｌ（１×１０７）のＤｙｎａｌ  ＥｐＣＡＭビーズを２つの試験管中に分取し、ＰＢＳ／０．１％ｗ／ｖＢＳＡ中で２回洗浄する。
【０１４３】
・  ４０μｌのＥｐＣＡＭビーズを含有する２つの試験管（各々１ｍＬ）中に２ｍＬの試料を分取し、回転しながら４℃で３０インキュベートする。
【０１４４】
・  試験管を磁石中に置いて、Ｓ／Ｎを除去する（サイトスピンのために保持）。
【０１４５】
・  ＰＢＳ／０．１％ｗ／ｖＢＳＡ（２００μＬ）中に再懸濁する（両試験管を１つにプールして、磁石中に置いて、４００μｌの上清を取り出す）。
【０１４６】
・  ２００ｕＬのＰＢＳ／０．１％ｗ／ｖＢＳＡ洗浄を２回反復する。
【０１４７】
・  ２００ｕＬのＣＨＡＰＳ溶解緩衝液を添加する。
【０１４８】
・  微細針を通過させることにより、細胞を溶解する。
【０１４９】
・  溶解物を氷上で３０分間インキュベートする。
【０１５０】
・  ４℃で２０分間、１００００ｇで回転させる。
【０１５１】
・  Ｓ／Ｎを分取し、ＬＮ２中で急速凍結させる。
【０１５２】
・  残りの細胞ペレットを急速凍結させる。
【０１５３】
アッセイ結果を、図５に示す。
【実施例１０】
【０１５４】
ＴＢＴの感度
ＨＥＫ２９３Ｔ（Graham et al., J Gen Virol 36: 59-74, 1977）腫瘍細胞溶解物を、１０〜１２５０細胞等価物（ＣＥ）から、広範囲の溶解物濃度にわたってテロメラーゼに関してアッセイした。ＴＢＴ結果（ルミネッセンスシグナル）及び溶解物濃度間の関係は、約１２５０ＣＥまでは直線であり、その後、ＴＢＴシグナルはプラトーになり始める。ＴＢＴ応答関係は、膀胱癌患者の尿中で予測される細胞の濃度で、直線である。結果を、図６及び図７に示す。
【０１５５】
ＴＢＴアッセイは、非常に低い細胞濃度で実施する。検出の下限の統計学的評価は、ＴＢＴアッセイで検出可能な最小の細胞数が２０ＣＥという少ない数であることを明示する。結果を、図８に示す。ＴＢＴ試験は、非常に少ない数のテロメラーゼ発現細胞からの陽性シグナルを検出し得る。したがってそれは、尿中の極少の剥離腫瘍細胞数を検出する能力を有する。
【実施例１１】
【０１５６】
アッセイ内再現性
ＨＥＫ２９３Ｔ腫瘍細胞の２つの異なる濃度、即ち１００ＣＥ及び１０００ＣＥのテロメラーゼ活性を測定することにより、ＴＢＴ試験のアッセイ内再現性を評価した。ＴＢＴアッセイ内の、各濃度での６つの二重反復実験試料間の、変動性のレベルは、約５％であった。結果を、図９に示す。
【実施例１２】
【０１５７】
アッセイ間再現性
ＨＥＫ２９３Ｔ腫瘍細胞の２つの異なる濃度、即ち５０ＣＥ及び５０００ＣＥのテロメラーゼ活性を測定することにより、ＴＢＴ試験のアッセイ間再現性を評価した。異なる日に、４つの別個の事象に関して、アッセイを実施した。各濃度に関するアッセイ間変動性のレベルは、６〜９％の範囲であった。結果を、図１０に示す。
【実施例１３】
【０１５８】
アッセイの特異性
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を過剰発現する腫瘍細胞のテロメラーゼ活性を測定することにより、ＴＢＴ試験の特異性を測定した。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を発現するレトロウイルスベクター（Li et al., Leukemia 20: 1270-1278, 2006）を含有するＴＦ−１ヒト赤白血病細胞株（Kitamura et al., Blood 73(2): 375-380, 1989）で、テロメラーゼ活性を測定した。結果を、図１１に示す。
【実施例１４】
【０１５９】
尿試料中のテロメラーゼ活性の測定
ＴＢＴ試験を用いて、溶解物の０μｌ〜２．５μｌの範囲の細胞溶解物濃度で、膀胱癌患者の尿から単離された細胞中のテロメラーゼ活性を測定した。陽性ＴＢＴ結果を予め示している３名の患者からの尿細胞溶解物中で、テロメラーゼ活性を測定したが、このうちの２名は高ＴＢＴ結果を有し（患者＃３、ＴＢＴ比率６．７０及び患者＃１２、ＴＢＴ比率６．３８）、そして１名は低ＴＢＴ結果を有した（患者＃３１、ＴＢＴ比率１．５９）。結果を、図１２に示す。
【実施例１５】
【０１６０】
膀胱癌モニタリング
ＴＢＴ試験を用いて、膀胱癌患者及び正常被験体の尿から単離された細胞中のテロメラーゼ活性を測定した。陽性ＴＢＴ試験シグナルは、バックグラウンドシグナルより大きさが＞１．５倍高いシグナルと定義される。結果を、図１３及び表４に示す。
【０１６１】
【表４】
2009520464.tif 000005
【０１６２】
ＴＢＴデータ
上記の平均データは、平均ＴＢＴ結果を表わす。「カットオフ」値との関連のほかに、ＴＢＴ結果の大きさと膀胱癌の段階及び重症度との間にはほとんど相関が認められないと思われる。
【実施例１６】
【０１６３】
白血病
ＴＢＴ試験を用いて、ヒト白血病細胞株Ｋ５６２（Lozzio and Lozzio, Blood 45: 321-334, 1975）中のテロメラーゼ活性を測定した。ＴＢＴアッセイは、白血病細胞中のテロメラーゼを測定するための現行方法と比較した場合、白血病細胞中のテロメラーゼ活性の検出に関して高感度であり、そして実施するのに定量的且つ相対的に簡単である。結果を、図１４に示す。
【実施例１７】
【０１６４】
臍帯血幹細胞
ＴＢＴ試験を用いて、臍帯血幹細胞中のテロメラーゼ活性を測定した。ＴＢＴアッセイは、１０００ＣＥを用いて、３つの臍帯血試料すべてにおける臍帯血幹細胞中のテロメラーゼ活性の検出に関して高感度であった。結果を、図１５に示す。
【実施例１８】
【０１６５】
比較アッセイ
本発明及び標準ＴＲＡＰアッセイのアッセイ特徴を比較する。比較特徴の要約を、表５に提示する。比較は、ＴＲＡＰアッセイと比較した場合のＴＢＴの改良された効能を際立たせる。
【０１６６】
【表５】
2009520464.tif 000006
【実施例１９】
【０１６７】
テロメラーゼ治療薬と関連したテロメラーゼ活性のモニタリング
ＴＢＴは、テロメラーゼ活性及びテロメラーゼ複合体の構成成分を標的にする療法を受けている患者を選択し、モニタリングするのに有益である。このような用途は、癌又は自己免疫障害若しくは過増殖性障害の治療に用いられ得るようなテロメラーゼ構成成分に対するワクチンを包含する。
【０１６８】
同様に、ＴＢＴは、皮膚又は他の器官のような組織再生、置換、修復及び再建における幹細胞活性化のような療法の一部としてのテロメラーゼ活性の再活性化をモニタリングするために用いられ得る。他の状況としては、骨髄、成人脳の神経原性域における幹細胞活性の活性化、並びにＨＩＶ患者におけるＴリンパ球の再活性化が挙げられる。他の状況としては、化学療法又は放射線療法により生じるような損傷後の消化管及び気道回復が挙げられる。
【０１６９】
同様に、ＴＢＴは、実験室設定での、動物モデル及び患者における、薬剤開発の状況でのテロメラーゼ阻害薬の効能をモニタリングするために適用可能である。
【０１７０】
同様に、ＴＢＴは、胚性幹細胞由来細胞及び組織で再構築された組織における幹細胞及び始原細胞活性の保持をモニタリングするために有用であり、この場合、短期又は長期組織置換を達成する必要がある。
【実施例２０】
【０１７１】
テロメラーゼ反復配列の繰返し
磁気ビーズに付着するテロメラーゼ特異的オリゴヌクレオチド鋳型の設計は、ＴＢＴアッセイの感度を最大にするために重要である。テロメラーゼのＲＮＡ構成成分とテロメア末端の間の塩基対合のための最小認識ＤＮＡ配列は、９塩基（ＴＡＧＧＧＴＴＡＧ）であるが、この配列の多重反復は、染色体テロメア末端の性質及び正確な塩基対認識を達成するために用いられる酵素の走査性をより正確に表わす。テロメラーゼ鋳型は、１．５〜３の範囲の六量体反復のものを包含する。
【０１７２】
オリゴヌクレオチドの３つの形態を試験した。部分（０．５）反復を含有する短いバージョン、２．５反復を含有するわずかに長いバージョン、及び３．５反復を有するより長いバージョンの３つであった。より長いバージョンは、バックグラウンドシグナル（テロメラーゼ抽出物なし）に比して、より良好な絶対シグナルを提示した。この増大動的範囲は、アッセイの感度増大に形を変えると思われる。結果を、図１６に示す。
【０１７３】
試験したオリゴヌクレオチドを、以下に示す：
Ｓｈｏｒｔ：５’ＳＨ−（ＣＨ２）６−ＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ（配列番号６）
Ｍｅｄｉｕｍ：５’ＳＨ−（ＣＨ２）６−ＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号７）
Ｌｏｎｇ：５’ＳＨ−（ＣＨ２）６−ＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号８）
オリゴヌクレオチドの長さも、保存寿命安定性にとって重要であり得る。遊離金属イオンを結合／封鎖するＥＤＴＡ及びＥＧＴＡの存在下で、反応ビーズを保存する。金属イオンは、核酸を分解する酵素のための不可欠な補因子であり、したがってそれらの除去は、オリゴヌクレオチドを分解から保護する。
【実施例２１】
【０１７４】
自動化
ＴＢＴアッセイは、標準磁気ビーズ技法を用いるため、自動化が非常に容易である。種々の用途のためのルーチン病理学実験室では、磁気ビーズベースの液体取扱いロボットシステムが一般的に用いられる。ＴＢＴアッセイは、種々のこのようなシステムに容易に適合され得るし、機械依存性でない。
【０１７５】
ＴＢＴアッセイの自動化は、他の技法、例えばＴＲＡＰ及びＰＣＴ／ＩＬ０１／００８０８（ＷＯ  ０２／２０８３８）に記載されたアッセイと比較して、それを異なる長所にする。後者は、回転電磁石を用いるが、容易に自動化され得ない。それは、ルーチン病理学実験室での使用に適さない。ＴＲＡＰはその本来の形態では、ＰＣＲ産物が電気泳動ゲル上を泳動され、その後、画像診断により分析されることを必要とするので、ハイスループット自動化に適していない。
【実施例２２】
【０１７６】
細胞捕捉ビーズ
テロメラーゼ活性測定のための対象となる細胞の精製のために、任意の細胞特異的抗体、受容体又は模倣物が用いられ得る。これらの例を以下に挙げる：
Ａｎｔｉ−ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（腫瘍細胞用）、
Ａｎｔｉ−ＣＤ３４（幹細胞）、
Ａｎｔｉ−ＣＤ４５（共通白血球抗原）、
Ａｎｔｉ−ＣＤ１９（ｐａｎ−Ｂ−細胞抗原）ＣＤ４、及びＣＤ８（リンパ球）、
Ａｎｔｉ−ＢｅｒＥＰ４（ｐａｎ−上皮細胞表面抗原）、並びに
Ａｎｔｉ−Ａ３３（結腸上皮細胞）
細胞は、他の方法、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離のための連続又は非連続フィコール勾配によっても精製又は単離され得る。
【実施例２３】
【０１７７】
試料調製方法及びワークアップ
ＴＢＴ試験は、多数の異なる癌に関連した悪性細胞の検出のために用いられ得る。ＴＢＴ試験を用いて分析され得る典型的臨床試料としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
気管支樹における新生物、肺癌、頭及び首の癌の検出のための気管支肺胞洗浄液、気管支擦過物及び洗浄液、痰、掻爬物、塗抹物、
肺、リンパ節、膵臓、唾液腺、乳房、肝臓、甲状腺、及び前立腺癌における悪性細胞の検出のための微細針吸引液、生検及び組織切片、
前立腺癌、膀胱癌、尿生殖路癌及び腎臓癌の検出のための尿、腎盂洗浄液、膀胱洗浄液中の沈殿細胞、
黒色腫及び造血系の癌の検出のための血液、
悪性新生物の検出のための体腔液（胸水、腹水、囲心腔液、腹膜洗浄液、溝(gutter)洗浄液）、
ＣＳＦ中の悪性細胞の検出のための脳脊髄液、
消化管の癌の検出のための内視鏡生検検体、
結腸癌及び消化管の他の癌における悪性細胞の検出のための糞便検体、
乳癌及び乳頭漏出を引き起こす癌の検出のための乳頭分泌物、
子宮頚部、膣及び卵巣癌の検出のためのＰＡＰ試験ＴＭ／ＰＡＰ塗抹物（子宮頚部／膣スクリーニング）。或る種の感染性及び炎症性状態の検出のためにも用いられ得る。
【０１７８】
ヘルペスウイルス感染（単純ヘルペスウイルス及び水痘ウイルス）に派生する水疱性疾患のための皮膚（TZanckスメア）。
【０１７９】
膀胱癌の場合、磁気ビーズに付着した上皮細胞特異的抗体を用いて、尿からの選択的捕捉により、腫瘍上皮細胞を単離する。
【実施例２４】
【０１８０】
尿処理手順−試料ワークアップ
Ｄｙｎａｌビーズに対する細胞の非特異的付着を防止するために、氷上で全ステップを実施する。
【０１８１】
１．  尿を収集し（少なくとも５０ｍｌ）、氷上に保持する。尿を５０ｍｌ試験管に移す。５０ｍｌより多い場合、尿を２つに分けて５０ｍｌ試験管中に等容積にして、以下のように各々を処理する。
【０１８２】
２．  試料を、４℃で５分間、７５０ｇで遠心分離する。上清を、ＨａｚＴａｂを含有するビーカー中に捨てる。
【０１８３】
３．  ０．１％ｗ／ｖＢＳＡ及びプロテアーゼ阻害薬錠剤を補足した１０ｍｌＰＢＳ（ｐＨ７．４）（以後、洗浄緩衝液と呼ぶ）中にペレットを再懸濁する。
【０１８４】
４．  試料を、４℃で５分間、７５０ｇで遠心分離する。上清を、ＨａｚＴａｂを有するビーカー中に捨てる。
【０１８５】
５．  洗浄ステップを反復する（ステップ４〜５）。
【０１８６】
６．  ステップ５の間、上皮富化収集Ｄｙｎａｌビーズを１００μｌの洗浄緩衝液で１回洗浄する（Ｄｙｎａｌ磁気トラップを使用）。
【０１８７】
７．  遠心分離後、ペレットを１ｍｌの洗浄緩衝液中に再懸濁し、１．５ｍｌエッペンドルフ管に移す。
【０１８８】
８．  洗浄したビーズを、ステップ５からの洗浄尿細胞に添加する。直径１ｍｍ未満であるペレットに関しては、２５μｌのビーズを用いる。１〜２ｍｍのペレットに関しては、３０μｌのビーズを用いる。２ｍｍより大きいものに関してはいずれも、４０μｌのビーズを用いる。
【０１８９】
９．  ビーズ及び尿細胞を、回転（６０ｒ．ｐ．ｍ．）しながら４℃で３０分間、静かに混合する。
【０１９０】
１０．  試料を３０秒間遠心分離（Capsule Tomy HF120）して、エッペンドルフ管の蓋にビーズ又は緩衝液が残っていないことを確実にする。
【０１９１】
１１．  試験管をＤｙｎａｌ磁気トラップ（Dynal MPC-S）中に入れて、上清を、GilsonＰ１０００ピペットを用いて注意深く新たな１．５ｍｌエッペンドルフ管に移す（上清を、４℃で５分間、Hereaus Biofuge中で１３０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離する）。上清を除去し、ペレット中の細胞を溶解する（これは、上皮富化収集Ｄｙｎａｌビーズと結合しなかった細胞を含有する）。この分画は活性化リンパ球を含有し、必要な場合、その後の分析のために凍結細胞ペレット（−７０℃）として別々に保存されるべきである。
【０１９２】
１２．  ステップ１１からのビーズを、１ｍｌの洗浄緩衝液中に再懸濁することにより洗浄し、次に上記のようにＤｙｎａｌ磁気トラップを用いて上清を除去する。この上清を捨てる。
【０１９３】
１３．  ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（１００μｌ）を、上皮癌細胞と結合したＤｙｎａｌビーズに添加する。
【０１９４】
１４．  GilsonＰ２００ピペットを用いて、少なくとも１０回、上下にピペッティングすることにより、細胞を溶解する。
【０１９５】
１５．  溶解物を氷上で３０分間インキュベートする。
【０１９６】
１６．  溶解物を、４℃で５分間、Hereaus Biofuge中で１３０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離する。
【０１９７】
１７．  磁気トラップ中に試験管を入れることにより、ビーズを除去する。
【０１９８】
１８．  上清（〜３０μｌ）を３つの試験管の各々に分取して、ペレットを捨てる。
【０１９９】
１９．  溶解物をドライアイス上で５分間急速凍結させて、−７０℃の冷凍庫に移す。
【実施例２５】
【０２００】
結腸癌患者の糞便試料からの剥離結腸細胞に関する試料ワークアップ
臨床的に立証された結腸直腸癌を有する患者からのインフォームドコンセント下で、糞便試料を収集する。試料を家庭で収集し、直ちに実験室に運搬して（２時間未満）、そこで、アリコート（２ｇ）を、抗生物質（５００Ｕ／Ｌのペニシリン、５００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン硫酸塩、１．２５ｍｇ／ＬのアンフォテリシンＢ及び５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン）を含有するPuckの生理食塩水中に分散させる。糞便スラリーを、１００μｍ及び６０μｍ膜（ナイロン／ネット膜フィルター、Millipore, Australia）に順次通して濾過して、大きな破砕屑を除去した後に、４℃で１０分間、４００ｇで遠心分離する。１％ｖ／ｖＦＣＳ及び０．６％ｗ／ｖクエン酸ナトリウムを含有するＰＢＳでペレットを２回洗浄し、その後、４０μｌの上皮富化CELLection（商標）Dynabeadsを用いて、上皮細胞を回収する。細胞を、４℃で３０分間、Dynabeadsとともにインキュベートし、次に、Ｄｙｎａｌ磁気粒子プロセッサーを用いて上清を除去する。磁気ビーズに付着した細胞を、０．１％ｗ／ｖＢＳＡを含有するＰＢＳで３回洗浄した後、２００μｌのＣＨＡＰＳ溶解緩衝液で溶解する。その結果生じた上清を、液体窒素中で急速凍結指せて、−７０℃で保存する。
【実施例２６】
【０２０１】
臍帯幹細胞に関する試料ワークアップ：（系列−陰性細胞の富化）
ヒト臍帯血（ＵＣＢ）を、抗凝固剤クエン酸塩緩衝液を含有する滅菌ボトル中に収集し、収集の１８時間以内に処理する。赤血球を枯渇させるために、ＵＣＢを、ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水で１：２に希釈して、１％ｗ／ｖヘスパン（DuPont Pharma, Wilmington, DE）を用いて、赤血球を室温で凝集させる。残留赤血球を、０．１７ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．２、０．２５ｍＭのＥＤＴＡで溶解する。キットの使用説明書に従って、StemSepキット（Stem Cell Technologies, Vancouver, British Columbia, Canada）を用いて、グリコフォリンＡ、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５６、ＣＤ２４、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１４及びＣＤ１６を発現する細胞の枯渇により、系列−陰性（Ｌｉｎ−）細胞を単離する。その結果生じたＬｉｎ−分画中のＣＤ３４＋細胞の割合は、６３％〜８２％の範囲である。
【実施例２７】
【０２０２】
白血病細胞に関する試料ワークアップ
白血病患者の診断及び分析のための細胞を、骨髄又は末梢血から単離する。正常ドナーの腸骨稜から採取した１０ｍｌのヒト骨髄吸引液を、リン酸塩緩衝生理食塩水で１：１に希釈して、室温で１０分間、９００ｇで遠心分離する。洗浄細胞をＰＢＳ中に再懸濁して、最終容積を１０ｍｌとして、等容積の１．０７３ｇ／ｍｌのパーコール溶液上に層化する。３０分間９００ｇで遠心分離後、単核球（ＭＮＣ）を勾配界面から回収し、ＰＢＳで洗浄する。パーコール分別ＭＮＣ又は非分別骨髄細胞を、分析のためにＰＢＳ中に懸濁する。Ficoll−Paque密度勾配遠心分離により末梢血のバフィー・コートからＭＮＣを単離し、ＰＢＳ中で洗浄する。
【実施例２８】
【０２０３】
受診者動作特性曲線
図１７は、膀胱癌の検出におけるＴＢＴ試験の感度を立証する「受診者動作特性」曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。
【０２０４】
ＲＯＣ曲線は、ＴＢＴ試験の性能が異なる診断閾値で評価される場合、臨床試験で観察される感受性及び特異性のパターンを示す。ＲＯＣ線の位置により、ＴＢＴ試験の全体的診断性能を判定する。不十分な試験は、漸増斜線に近い線を有し、一方、完全試験に関する線は、急勾配に上昇して、上部左手角近くを通過し、この場合、感受性及び特異性はともに１である。ＴＢＴに関するＲＯＣ線は、完全診断試験に関する線に密接に近づく。
【０２０５】
本明細書中に記載された本発明は、特記されたもの以外の変形形態及び修正形態が可能である、と当業者は理解する。本発明は、すべてのこのような変形形態及び修正形態を包含する、と理解されるべきである。本発明は、本明細書中で、独立して又は総合的に、言及され、あるいは示されたステップ、特徴、組成物及び化合物のすべて、そして任意の２以上の上記ステップ又は特徴の任意の及びすべての組合せも包含する。
参考文献
【０２０６】
【表６】
2009520464.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
いくつかの図面は、色の表示又は実体を含有する。カラー写真は、求めに応じて特許権者から、あるいは適切な特許庁から入手可能である。特許庁から得られる場合、手数料が課せられ得る。
【図１】ビーズへのテロメラーゼに関する標的配列の結合をモニタリングする方法を示すグラフである。磁気又は他の手段による収集に付され得るビーズへのテロメラーゼ活性による伸長に適したオリゴヌクレオチドの結合をモニタリングするための分光光度分析方法。遊離オリゴヌクレオチドは、波長２６０ｎｍ辺りでピーク吸光度を有するが、結合オリゴヌクレオチドは３４３ｎｍ辺りでピーク吸光度を有する。
【図２】ＬＩＭ１２１５細胞に関するテロメラーゼアッセイの感度を示すグラフである。これは、溶解ＬＩＭ１２１５ヒト結腸癌細胞から放出されるテロメラーゼ活性が組込まれたフルオレセイン結合ヌクレオチドにより放射される蛍光により測定され得ることを示す。１００〜１０００個の溶解細胞を用いることにより測定した場合、検出の直線範囲が明白に認められる。
【図３】表在性膀胱癌試料に関するテロメラーゼアッセイの結果を示すグラフである。これは、１０００個の溶解ＬＩＭ１２１５細胞及び病理学的に確認された表在性膀胱癌を有する患者から収集された細胞から放出されるテロメラーゼ活性を示す。膀胱癌細胞は、ＥｐＣＡＭビーズを用いて捕捉した。テロメラーゼ酵素活性を不活性化するために熱で前処理された溶解物を用いて、対応反応を実施した（ＨＩ）。これらのデータは、ルミノールと反応してルミネッセンスを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いてテロメラーゼ活性を実証する。ストレプトアビジン単独により生成される低バックグラウンドシグナルも示す。
【図４】浸潤性膀胱癌試料に関するテロメラーゼアッセイの結果を示すグラフである。これは、１０００個の溶解ＬＩＭ１２１５細胞及び病理学的に確認された浸潤性膀胱癌を有する患者から収集された細胞から放出されるテロメラーゼ活性を示す。膀胱癌細胞は、ＥｐＣＡＭビーズを用いて捕捉した。テロメラーゼ酵素活性を不活性化するために熱で前処理された溶解物を用いて、対応反応を実施した（ＨＩ）。これらのデータは、ルミノールと反応してルミネッセンスを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いてテロメラーゼ活性を実証する。ストレプトアビジン単独により生成される低バックグラウンドシグナルも示す。
【図５】糞便試料から単離された細胞中のテロメラーゼ活性を示すグラフである。これらのデータは、ＥｐＣＡＭビーズを用いて糞便試料から既知及び予め決められた結腸癌細胞を単離する能力と、その後のテロメラーゼ活性の放出及びルミネッセンスを用いた測定を実証する。
【図６】本発明の一実施形態によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に関するアッセイの感度を示すグラフである。これらのデータは、ルミノールと反応してルミネッセンスを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いてテロメラーゼ活性を実証する。平均データは、３つの異なる溶解調製物内の異なる日に手動アッセイフォーマットを用いて実施された１０例の実験からである。これは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のストック細胞溶解物のテロメラーゼ活性が再現性を伴って測定され得る、ということを示す。２０〜１２５０個の溶解細胞の等価物を用いることにより測定した場合、検出の直線範囲が明白に認められる。
【図７】本発明の一実施形態による低レベルのＨＥＫ２９３Ｔ細胞に関するアッセイの感度を示すグラフである。平均データは、３つの異なる溶解調製物で異なる日に手動アッセイフォーマットを用いて実施された１０例の実験からである。これは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のストック細胞溶解物のテロメラーゼ活性が再現性を伴って測定され得ることを示す。１〜５００個の溶解細胞の全範囲にわたって、検出の直線範囲が明白に認められる。これらのデータは、ルミノールと反応してルミネッセンスを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いてテロメラーゼ活性を実証する。これらのデータは、ＴＢＴアッセイが低細胞濃度で高感度である、ということを実証する。
【図８】本発明の一実施形態によるＴＢＴアッセイの検出の下限の統計学的評価の結果を示すグラフである。３つの異なる溶解調製物で異なる日に１０例の別個の実験に関するＴＢＴアッセイで、ＨＥＫ２９３Ｔのストック細胞溶解物のテロメラーゼ活性を測定した。破線は、２０回測定された平均バックグラウンドレベル（０ＣＥ）を上回る１（１×ＳＤ）及び２（２×ＳＤ）標準偏差（ＳＤ）を示す。ヒストグラム上の各バー内に示した上部の数は、バックグラウンドを上回るＳＤの実数である。「ｎ」は、平均を生じるために用いられる個体測定の数である。これらのデータは、ルミノールと反応してルミネッセンスを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いてテロメラーゼ活性を実証する。
【図９】本発明の一実施形態によるＴＢＴアッセイのアッセイ内再現性を示すグラフである。２つの異なる濃度のＨＥＫ２９３Ｔ腫瘍細胞のテロメラーゼ活性を測定した。ＴＢＴアッセイ内での各濃度、１００ＣＥ及び１０００ＣＥでの６つの別個の測定間の変動のレベルは、それぞれ総シグナルの５．７％及び４．９％であった。これらのデータは、ルミノールと反応してルミネッセンスを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いてテロメラーゼ活性を実証する。平均データ（平均±標準偏差）は、各濃度での６つの二重反復実験試料からである。
【図１０】本発明の一実施形態によるＴＢＴアッセイのアッセイ間再現性を示すグラフである。２つの異なる濃度のＨＥＫ２９３Ｔ腫瘍細胞のテロメラーゼ活性を、１０例の別個の場合に測定した。各濃度、５０ＣＥ及び５０００ＣＥでのアッセイ変動間のレベルは、それぞれ総シグナルの６．４％及び８．８％であった。これらのデータは、ルミノールと反応してルミネッセンスを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いてテロメラーゼ活性を実証する。平均データ（平均±標準誤差）は、異なる日に実施した各濃度に関する４つの別個の測定からである。
【図１１】本発明の一実施形態によるＴＢＴアッセイの酵素特異性の特異性を示すグラフである。ヒト白血病細胞株ＴＦ−１細胞及び広範囲の濃度にわたってｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を過剰発現するＴＦ−１細胞において、テロメラーゼ活性を測定した。これらのデータは、ルミノールと反応してルミネッセンスを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いてテロメラーゼ活性を実証する。ｈＴＥＲＴを過剰発現するＴＦ−１細胞中に見出されるより大きなテロメラーゼ活性により、アッセイの特異性は実証される。
【図１２】本発明の一実施形態による尿試料中のテロメラーゼ活性の検出に関するＴＢＴアッセイの感度を示すグラフである。溶解物の０μｌ〜２．５μｌの範囲の細胞溶解物濃度で、患者の尿から単離された細胞中のテロメラーゼ活性を測定するために、ＴＢＴ試験を用いた。予め陽性ＴＢＴ結果を示している３名の患者（このうちの２名（患者＃３及び＃１２）は高ＴＢＴ結果を有し、１名（患者＃３１）は低ＴＢＴ結果を有した）からの尿細胞溶解物において、テロメラーゼ活性を測定した。これらのデータは、各患者試料中の腫瘍上皮細胞の総数の１００分の１未満を表わす１μｌ未満の細胞溶解物は、陽性シグナルを生じるのに十分であることを示す。
【図１３】本発明の一実施形態による尿試料中のテロメラーゼ活性の検出に関するＴＢＴアッセイの感度及び特異性を示すグラフである。膀胱癌患者（ｎ＝２９）及び正常被験体（ｎ＝１２）の尿から単離された細胞中のテロメラーゼ活性を測定するために、ＴＢＴ試験を用いた。１．５（無テロメラーゼ対照と比較した場合の倍変化）という「カットオフ」値が用いられる場合、アッセイは感度９６．６％及び特異性１００％を有する。「カットオフ」閾値が１．２（破線）である場合、アッセイの感度は１００％であり、擬陽性の小さな増大が認められる。
【図１４】本発明の一実施形態によるＫ５６２ヒト白血病細胞中のテロメラーゼ活性の検出に関するＴＢＴアッセイの感度を示すグラフである。２５００ＣＥまでの広範囲の細胞溶解物濃度にわたってテロメラーゼ活性を測定するために、ＴＢＴ試験を用いた。これらのデータは、ルミノールと反応してルミネッセンスを生成するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いてテロメラーゼ活性を実証する。ＴＢＴアッセイは、白血病細胞中のテロメラーゼ活性の分析における高レベルの感度を示す。
【図１５】本発明の一実施形態による臍帯血幹細胞中のテロメラーゼ活性の検出に関するＴＢＴアッセイの感度を示すグラフである。３名の患者の臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞を単離し、１０００個のＣＤ３４陽性細胞に関してＴＢＴアッセイを実施した。３例すべての臍帯血試料で、テロメラーゼ活性を検出した。
【図１６】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物におけるＴＢＴオリゴヌクレオチド長の作用を示すグラフである。
【図１７】膀胱癌の検出におけるＴＢＴ試験の診断力を示す受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月4日(2008.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が腫瘍を有するか否かを判定する方法であって、
腫瘍の存在を判定しようとする個体から得られる細胞の試料を準備すること、
前記試料を抗体と接触させて非腫瘍細胞から腫瘍細胞を分離するための条件を前記試料に与えること、
前記試料を腫瘍細胞からテロメラーゼを放出させる作用物質と接触させること、
テロメラーゼによる前記プライマーの伸長のための条件で、前記試料をプライマー及び標識と接触させて、前記標識を内部に組込んだ核酸を生成すること、
前記試料が、前記標識を内部に組込んだ核酸を含有するか否かを判定すること、
を包含し、その中に組込まれた前記標識を有する核酸の検出が前記個体が腫瘍を有することを判定することである、方法。
【請求項２】
前記試料を洗浄して、治療用化合物、ヘモグロビン、酵素又は体液マトリックスを前記試料から除去することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が磁気ビーズ上に配置され、磁場が前記試料に印加されて、非腫瘍細胞からの腫瘍細胞の分離のための条件を該試料に与える、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識がビオチン化ｄＮＴＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料をストレプトアビジンと接触させる工程、及び
前記試料が、ストレプトアビジンを結合した核酸を含有するか否かを検出し、それにより前記試料が前記標識を内部に組込んだ核酸を含有するか否かを判定する工程、
を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ストレプトアビジンがホースラディッシュペルオキシダーゼに結合される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料に過酸化水素の溶液を添加することをさらに包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料を洗浄して、前記試料から非結合ストレプトアビジンを除去することをさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
過酸化水素の溶液を添加する前に非結合ストレプトアビジンを除去するために前記試料が洗浄される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が膀胱癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が抗上皮細胞抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
個体における膀胱癌をモニタリングするための請求項１に記載の方法の使用。
【請求項１４】
前記個体が腫瘍に関する治療を受けている者である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
個体が腫瘍を有するか否かを判定するための手段の製造における、
非腫瘍細胞から腫瘍細胞を分離する抗体、及び
テロメラーゼにより伸長可能なプライマー、及び／又は
核酸中へ組込まれる標識
の使用。
【請求項１６】
前記抗体が磁気ビーズ上に配置される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記標識がビオチン化ｄＮＴＰである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
腫瘍細胞からテロメラーゼを放出させる作用物質、及び／又は
テロメラーゼによってプライマーを伸長させる、ｄＮＴＰを含む組成物、及び／又は
ビオチン化ｄＮＴＰと結合するストレプトアビジン
をさらに包含する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
前記抗体が抗上皮細胞抗体である、請求項１５に記載の使用。
【請求項２０】
非腫瘍細胞から腫瘍細胞を分離させる抗体、及び
テロメラーゼにより伸長可能なプライマー、及び／又は
核酸中へ組込まれる標識
を含む個体が腫瘍を有するか否かを判定するためのキットであって、請求項１に記載の方法における前記キットの使用のための使用説明書をさらに包含する、キット。
【請求項２１】
前記抗体が磁気ビーズ上に配置される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記標識がビオチン化ｄＮＴＰである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
腫瘍細胞からテロメラーゼを放出させる作用物質、及び／又は
テロメラーゼによってプライマーを伸長させる、ｄＮＴＰを含む組成物、及び／又は
ビオチン化ｄＮＴＰと結合するストレプトアビジン
をさらに包含する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
前記抗体が抗上皮細胞抗体である、請求項２０に記載のキット。
【国際調査報告】
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