(57)【要約】  微粒子測定装置が設置された環境温度あるいは、試料液の温度によって測定結果に変動が無く、必要十分な精度で測定することが可能な微粒子測定装置および微粒子測定方法を提供する。微粒子含有の試料液２を導入するセル１と、セル１内部の試料液２に浸漬される位置に少なくとも一対の電極と、電極間に、交流電界を発生するための電圧を印加する泳動電源部４と、交流電界によって誘起された誘電泳動力によって移動した微粒子による変化を測定する測定部５と、環境温度を検出する温度検出手段８と、測定部５が測定した結果に対し、温度検出手段８が測定した結果に基づいて補正処理を行い、試料液２中の微粒子を測定する制御演算部６と、を備える。
2009093458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子含有の試料液を導入するセルと、
前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に設けられた少なくとも一対の電極と、
前記電極間に、交流電界を発生するための電圧を印加する泳動電源部と、
前記交流電界によって誘起された誘電泳動力によって移動した微粒子による電磁気的な変化を測定する測定部と、
温度を検出する温度検出手段と、
前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が検出した結果に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定する制御演算部と、
を備える微粒子測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記温度検出手段は、前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に設けられ、
前記制御演算部は、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が検出した試料液の温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである微粒子測定装置。
【請求項３】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記温度検出手段は、前記電極が形成された基板上の前記試料液に浸漬される位置に設けられ、
前記制御演算部は、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が測定した試料液の温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである微粒子測定装置。
【請求項４】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記温度検出手段は、前記セルの壁面外側に接する位置に設けられ、
前記制御演算部は、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が測定した前記セルの温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである微粒子測定装置。
【請求項５】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記セルの壁面の一部に端子を備え、
前記端子は、前記セル内部で前記電極に電気的に接続され、前記セル外部で前記泳動電源部および前記測定部に電気的に接続され、かつ、
前記端子は、前記セル内部で前記試料液に接し、前記セル外部では前記温度検出手段に接するものである微粒子測定装置。
【請求項６】
請求項５に記載の微粒子測定装置であって、
前記端子は、低電気抵抗かつ高熱伝導率である微粒子測定装置。
【請求項７】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記温度検出手段は、前記電極間に温度測定電圧が印加された場合に前記測定部が測定した結果から試料液の温度を推定することにより、温度を検出するものである微粒子測定装置。
【請求項８】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記制御演算部は、前記温度検出手段が測定した温度に基づき、前記電極間に印加する交流電圧の振幅あるいは周波数を決定する微粒子測定装置。
【請求項９】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記制御演算部は、前記測定部が測定した結果に対し、前記測定部が当該測定を行った時点における前記温度検出手段による温度検出結果に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである微粒子測定装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の微粒子測定装置であって、
前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に温度検出手段として更に少なくとも１極の温度検出用電極を備え、
温度検出用電極は前記測定部に接続され、
前記測定部は温度検出用電極のインピーダンスを測定し、
前記制御演算部は、温度検出用電極のインピーダンスから前記試料液の温度を測定する微粒子測定装置。
【請求項１１】
微粒子含有の試料液に浸漬した一対の電極間に発生させた交流電界によって誘起された誘電泳動力によって移動した前記微粒子による電磁気的な変化を測定することにより、前記試料液中における微粒子を測定する微粒子測定方法であって、
温度を検出する温度検出ステップと、
前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した温度に基づく補正処理を行う補正処理ステップと、
を有する微粒子測定方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、前記試料液の温度を検出し、
前記補正処理ステップは、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した試料液の温度に基づく補正処理を行うものである微粒子測定方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、前記試料液の温度を、誘電泳動を行う電極基板上で検出するものである微粒子測定方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、前記試料液が貯留された、セルの温度を検出し、
前記補正処理ステップは、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した前記セルの温度に基づく補正処理を行うものである微粒子測定方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、前記試料液が貯留されたセルの壁面の一部に設けられた、端子の温度を検出し、
前記補正処理ステップは、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した前記端子の温度に基づく補正処理を行うものである微粒子測定方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、
前記電極間に、温度測定のための電圧を印加するステップと、
前記電極間のインピーダンスを測定した結果から、試料液温度を推定するステップと、を含み、
前記補正処理ステップは、
前記電極間に、誘電泳動のための電圧を印加するステップと、
誘電泳動によって前記微粒子を所定位置に配置し、電磁気的な変化を測定するステップと、
前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記推定した試料液温度に基づく補正処理を行うステップと、を含む微粒子測定方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップで測定した温度に基づいて前記電極間に印加する誘電泳動のための電圧の振幅あるいは周波数を決定する微粒子測定方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップを実施した時点において、前記電磁気的な変化の測定を行うステップを有し、
前記補正処理ステップは、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、当該測定時点において検出した温度に基づく補正処理を行う微粒子測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘電泳動を用いて試料液中の微粒子数を測定するための微粒子測定装置および微粒子測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、食中毒や感染症などの原因となり、人体に何らかの害を及ぼす可能性がある微生物を、迅速、簡便、高感度に定量測定するニーズは特に高い。食品の製造工程や微生物検査施設を備えない診療所などにおいて、その場で微生物検査を実施することで、食中毒や感染症などの防止、予防が可能になるためである。【０００３】
また、いわゆるバイオセンサにおいて、抗体など、測定対象に特異的に結合する物質を標識したポリスチレンなどの人工微粒子を用いて、検体中の生化学的物質を定量測定する際に、検体中の微粒子数あるいはその結合状態を定量測定する必要がある。このように、昨今、液体中に含まれる微粒子を迅速、簡便、定量的に測定する要求は高い。【０００４】
ここで、本願における微粒子の定義について説明する。本願で言う微粒子とは、ポリスチレンやそれらに何らかのコーティングを施した粒子、カーボンナノチューブ、金コロイドなどの金属粒子、細菌、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、ウイルス、として分類されているいわゆる微生物、原生動物や原虫のうちの小型のもの、生物体の幼生、動植物細胞、精子、血球、核酸、蛋白質等も含む広い意味での生体または生体由来の微粒子である。この他にも、本願で言う微粒子とは、誘電泳動可能な大きさのあらゆる粒子を意味する。本願では特に、微生物の測定を想定している。【０００５】
液体中に懸濁された誘電体微粒子を電気的に操作する方法の一つとして、誘電泳動現象が用いられる。誘電泳動現象の原理は後述するが、液体中に懸濁された誘電体微粒子に不平等電界を印加することによって、微粒子の選別・分離や、誘電特性調査を行うことができる。【０００６】
例えば、特許文献１は、複数種類の微粒子が混合された液体中から、特定の微粒子を選別・回収する装置に関するもので、微粒子の大きさや誘電特性の差異に起因する誘電泳動力の差を利用して、特定の微粒子のみに誘電泳動力を誘起してフローから回収する技術が開示されている。【０００７】
また、特許文献２は、異なる微生物に働く誘電泳動力の周波数スペクトルが、その物性の差異から異なることを利用して、液体中に含まれる微生物の種類を同定する技術が開示されている。【０００８】
更に、本発明者は他の発明者らと共に、誘電泳動を利用して液体中に含まれる微生物濃度を迅速、簡便、高感度に測定する微生物数測定装置および方法として、誘電泳動とインピーダンス計測を組み合わせたＤＥＰＩＭ（Dielectrophoretic Impedance Measurement Method）法を提案した（例えば、特許文献３を参照）。【０００９】
ＤＥＰＩＭ法は、液体中に懸濁された微生物を誘電泳動力によってマイクロ電極に捕集し、同時にマイクロ電極のインピーダンス変化を測定することによって試料液中の微生物数を定量測定する方法である。以下、その測定原理について概説する。【００１０】
微生物は一般に、イオンリッチで誘電率および導電率の高い細胞質および細胞壁が、比較的誘電率および導電率の低い細胞膜に囲まれた構造を有し、誘電体粒子とみなすことができる。ＤＥＰＩＭ法では、電界中で分極した誘電体粒子に一定方向に働く力である誘電泳動力を利用し、誘電体粒子である微生物をマイクロ電極のギャップ間に捕集する。【００１１】
誘電体粒子に働く誘電泳動力ＦＤＥＰは、以下の（数１）で与えられることが公知である（例えば、非特許文献１を参照）。以下、誘電体粒子が、微生物である場合を例として説明する。【００１２】
【数１】
2009093458.tif 000003
【００１３】
ここで、a：球形近似したときの微生物の半径、ε０：真空の誘電率、εｍ：試料液の比誘電率、Ｅ：電界強度であり、▽は演算子で勾配（gradient）を表す。この場合、▽Ｅ２は、電界Ｅ２の勾配なので、その位置でどれだけＥ２が傾斜を持っているか、つまり電界Ｅが空間的にどれだけ急に変化をするかを意味する。また、Ｋはクラウジウス・モソッティ数と呼ばれ、（数２）で表され、Ｒｅ［Ｋ］＞０は正の誘電泳動を表し、微生物は電界勾配と同方向、つまり、電界集中部に向かって泳動される。Ｒｅ［Ｋ］＜０は負の誘電泳動を表し、電解集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部に向かって泳動される。【００１４】
【数２】
2009093458.tif 000004
【００１５】
ここで、εｂ＊およびεｍ＊はそれぞれ、微生物および溶液の複素誘電率を表し、一般に複素誘電率εｒ＊は（数３）で表される。【００１６】
【数３】
2009093458.tif 000005
【００１７】
ここで、εｒ：微生物あるいは試料液の比誘電率、σ：微生物あるいは試料液の導電率、ω：印加電界の角周波数を表す。【００１８】
（数１）（数２）（数３）から、誘電泳動力は、微生物の半径、クラウジウス・モソッティ数の実部（以下、Ｒｅ［Ｋ］と表す）および電界強度に依存することが分かる。また、Ｒｅ［Ｋ］は、試料液および微生物の複素誘電率、電界周波数に依存して変化することが分かる。【００１９】
そのため、ＤＥＰＩＭ法では、これらのパラメータを適切に選択し、微生物に働く誘電泳動力を十分大きくし、微生物を電極ギャップに確実に捕集する必要がある。また、ＤＥＰＩＭ法では、上記誘電泳動による電極への微生物捕集と同時に、電気的計測を行い、試料液中の微生物数を定量測定することを特徴としている。【００２０】
微生物は、前述した構造を有するため、電気的には固有のインピーダンスを持った微粒子と考えることができる。そのため、誘電泳動によりマイクロ電極のギャップ間に捕集される微生物数が増加すると、その捕集数に応じて電極間のインピーダンスが変化する。【００２１】
従って、電極間インピーダンス時間変化の傾きは、単位時間当たりに電極ギャップ間に捕集される微生物数に応じた値となり、傾きの大きさは試料液中の微生物濃度に対応する。よって、電極間インピーダンス時間変化の傾きを測定することで、試料液中の微生物濃度、言い換えれば微生物数を測定することが可能となる。【００２２】
更に、ＤＥＰＩＭ法では、誘電泳動を開始直後のインピーダンス時間変化の傾きから微生物数を定量することで、短時間での微生物測定を実現している。以上、ＤＥＰＩＭ法の測定原理について概説したが、詳しくは非特許文献２を参照されたい。【００２３】
【特許文献１】米国特許出願公開２００６／０１７７８１５号明細書
【特許文献２】特許第２９８７２０１号明細書
【特許文献３】特開２０００−１２５８４６号公報
【非特許文献１】Ｈｙｗｅｌ  Ｍｏｒｇａｎ、他：「ＡＣ  Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、ＲＥＳＥＲＣＨ  ＳＴＵＤＩＥＳ  ＰＲＥＳＳ  ＬＴＤ．２００３年出版、ｐｐ．１５〜６３
【非特許文献２】J.Suehiro, R.Yatsunami, R.Hamada, M,Hara，J.Phys. D: Appl. Phys. 32(1999)2814-2820
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
一般に、測定装置が使用される環境は様々であり、微粒子測定装置も例外ではない。特に、環境温度（室温）は空調の有無などによって大きく変わる因子であり、０℃〜４０℃程度の範囲で変わる可能性は十分にある。【００２５】
一方、液体の粘度は、温度によって変化することが一般に知られており、微粒子が懸濁された液体（以下、試料液と呼ぶ）の粘度が変化することで、微粒子に働く誘電泳動力と粘性力のバランスに変化が生じるため、環境温度によって測定結果に差異が生じ、微粒子測定結果の精度が低下するという問題がある。また、物質の比誘電率および導電率は、温度によって変化することが一般に知られており、この温度変化によって誘電泳動力が変化し、同様に微粒子測定結果の精度が低下するという問題がある。【００２６】
しかしながら、特許文献１〜３においては、これら問題を解決する手段については、開示も示唆もされていない。【００２７】
本発明の目的は、上記事情に鑑みてなされたものであって、微粒子測定装置が設置された環境温度あるいは、試料液の温度によって測定結果に変動が無く、必要十分な精度で測定することが可能な微粒子測定装置および微粒子測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者らは、微粒子を誘電泳動する際に、溶液の温度変化に伴い電極にトラップされる微粒子の量的な変化が生じることを見出した。すなわち、溶液温度の変化に伴い、溶液粘度が変化することによって、微粒子に生じる誘電泳動力と粘性力が相対的に変化する結果、電極へトラップされる微粒子量が変化する。あるいは、溶液温度の変化に伴い、溶液と微粒子の複素誘電率が変化することによって、微粒子に働く誘電泳動力が変化し、電極へトラップされる微粒子量が変化する。トラップされる微粒子量が変わると、測定される応答も変化する。溶液温度とトラップ量の関係を定量化すれば、溶液に含まれる微粒子濃度を正確に推定できることが明らかとなった。本発明は、かかる知見に基づき達成されたものである。【００２９】
本発明に係る微粒子測定装置は、微粒子含有の試料液を導入するセルと、前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に設けられた少なくとも一対の電極と、前記電極間に、交流電界を発生するための電圧を印加する泳動電源部と、前記交流電界によって誘起された誘電泳動力によって移動した微粒子による電磁気的な変化を測定する測定部と、温度を検出する温度検出手段と、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が検出した結果に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定する制御演算部と、を備える。【００３０】
この構成によれば、温度変動によって微粒子に働く誘電泳動力およびその他全ての力のバランスが変化した場合にも、補正によってその影響をキャンセルすることができるため、様々な環境温度でも正しい測定結果を提示することが可能な微粒子測定装置を実現できる。【００３１】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記温度検出手段が、前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に設けられ、前記制御演算部が、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が検出した試料液の温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである。【００３２】
この構成によれば、試料液の温度を直接測定できるので、溶液温度に依存する、微粒子に働く力の変化を正確に補正することができ、高精度な微粒子測定装置を実現することができる。【００３３】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記温度検出手段が、前記電極が形成された基板上の前記試料液に浸漬される位置に設けられ、前記制御演算部が、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が測定した試料液の温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである。【００３４】
この構成によれば、電極チップ上に誘電泳動を行う電極と、温度測定を行う温度検出手段を共存させることができるため、配線を行うためのコネクタを１つにすることができるため、簡易な構造で、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定装置を実現することができる。【００３５】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記温度検出手段が、前記セルの壁面外側に接する位置に設けられ、前記制御演算部が、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が測定した前記セルの温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである。【００３６】
この構成によれば、温度検出手段が直接試料液に接しないため、腐蝕や劣化が防げるし、測定対象が微生物であり、汚染を考慮してセルを使い捨てにする場合であっても、温度検出手段の汚染が防げ、温度検出手段を繰り返し使用することができるため、１回の測定にかかる費用を抑えつつ、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定装置を実現することができる。【００３７】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記セルの壁面の一部に端子を備え、前記端子が、前記セル内部で前記電極に電気的に接続され、前記セル外部で前記泳動電源部および前記測定部に電気的に接続され、かつ、前記端子が、前記セル内部で前記試料液に接し、前記セル外部では前記温度検出手段に接するものである。【００３８】
この構成によれば、電極を電気的に接続する端子と、試料液の温度を検出するための端子を共用としているため、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定装置のセル構造を簡略化できる。【００３９】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記端子が、低電気抵抗かつ高熱伝導率であるものである。【００４０】
この構成によれば、セル外部に設けた温度検出手段を用いて、セル内部の試料液温度をより正確に検出できるため、異なる温度条件においてもより正確な結果を提示可能な粒子測定装置を実現することができる。【００４１】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記温度検出手段が、前記電極間に温度測定電圧が印加された場合に前記測定部が測定した結果から試料液の温度を推定することにより、温度を検出するものである。【００４２】
この構成によれば、誘電泳動を行う電極が温度検出手段を兼ねる構成で実現できるため、装置の構成が簡素化され、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定装置を実現することができる。【００４３】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記制御演算部が、前記温度検出手段が測定した温度に基づき、前記電極間に印加する交流電圧の振幅あるいは周波数を決定するものである。【００４４】
この構成によれば、試料液の温度に応じて十分かつ一定の誘電泳動力を作用させる電圧値を選択することにより、常に高いＳ／Ｎで測定することができるため、より高精度な微粒子測定を実現できる。【００４５】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記制御演算部が、前記測定部が測定した結果に対し、前記測定部が当該測定を行った時点における前記温度検出手段による温度検出結果に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである。【００４６】
この構成によれば、電磁気的な変化の測定時点における温度を測定することによって、リアルタイムの温度変化に基づいた補正を行うことができるため、測定途中で試料液の温度が変化する場合にも、正確な測定結果を提示することが可能な微粒子測定装置を実現できる。【００４７】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に温度検出手段として更に少なくとも１極の温度検出用電極を備え、温度検出用電極は前記測定部に接続され、前記測定部は温度検出用電極のインピーダンスを測定し、前記制御演算部は、温度検出用電極のインピーダンスから前記試料液の温度を測定する。【００４８】
この構成によれば、リアルタイムの温度測定を実現することが可能な微粒子測定装置を実現できる。【００４９】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、微粒子含有の試料液に浸漬した一対の電極間に発生させた交流電界によって誘起された誘電泳動力によって移動した前記微粒子による電磁気的な変化を測定することにより、前記試料液中における微粒子を測定する微粒子測定方法であって、温度を検出する温度検出ステップと、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した温度に基づく補正処理を行う補正処理ステップと、を有する。【００５０】
この構成によれば、温度変動によって微粒子に働く誘電泳動力およびその他全ての力のバランスが変化した場合にも、補正によってその影響をキャンセルすることができるため、様々な環境温度でも正しい測定結果を提示することが可能な微粒子測定方法を実現できる。【００５１】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記試料液の温度を検出し、前記補正処理ステップが、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した試料液の温度に基づく補正処理を行うものである。【００５２】
この構成によれば、試料液の温度を直接測定できるので、溶液温度に依存する、微粒子に働く力の変化を正確に補正することができ、高精度な微粒子測定方法を実現することができる。【００５３】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記試料液の温度を、誘電泳動を行う電極基板上で検出するものである。【００５４】
この構成によれば、電極チップ上に誘電泳動を行う電極と、温度測定を行う温度検出手段を共存させることができるため、配線を行うためのコネクタを１つにすることができるため、簡易な構造で、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定方法を実現することができる。【００５５】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記試料液が貯留された、セルの温度を検出し、前記補正処理ステップが、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した前記セルの温度に基づく補正処理を行うものである。【００５６】
この構成によれば、温度検出手段が直接試料液に接することなく試料液温度を検出できるため、腐蝕や劣化が防げるし、測定対象が微生物であり、汚染を考慮してセルを使い捨てにする場合であっても、温度検出手段の汚染が防げ、温度検出手段を繰り返し使用することができるため、１回の測定にかかる費用を抑えつつ、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定方法を実現することができる。【００５７】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記試料液が貯留されたセルの壁面の一部に設けられた、端子の温度を検出し、前記補正処理ステップが、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した前記端子の温度に基づく補正処理を行うものである。【００５８】
この構成によれば、電極を電気的に接続する端子と、試料液の温度を検出するための端子を共用としているため、簡略なセル構造で、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定方法を実現できる。【００５９】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記電極間に、温度測定のための電圧を印加するステップと、前記電極間のインピーダンスを測定した結果から、試料液温度を推定するステップと、を含み、前記補正処理ステップが、前記電極間に、誘電泳動のための電圧を印加するステップと、誘電泳動によって前記微粒子を所定位置に配置し、電磁気的な変化を測定するステップと、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記推定した試料液温度に基づく補正処理を行うステップと、を含む。【００６０】
この構成によれば、誘電泳動を行う電極が温度検出手段を兼ねる構成で実現できるため、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定方法を簡易な装置で実現することができる。【００６１】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップで測定した温度に基づいて前記電極間に印加する誘電泳動のための電圧の振幅あるいは周波数を決定する。【００６２】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップを実施した時点において、前記電磁気的な変化の測定を行うステップを有し、前記補正処理ステップが、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、当該測定時点において検出した温度に基づく補正処理を行うものである。【００６３】
この構成によれば、電磁気的な変化の測定時点における温度を測定することによって、リアルタイムの温度変化に基づいた補正を行うことができるため、測定途中で試料液の温度が変化する場合にも、正確な測定結果を提示することが可能な微粒子測定方法を実現できる。
【発明の効果】
【００６４】
本発明に係る微粒子測定装置および微粒子測定方法によれば、温度変動によって微粒子に働く誘電泳動力およびその他全ての力のバランスが変化した場合にも、補正によってその影響をキャンセルすることができるため、様々な環境温度でも正しい測定結果を提示することが実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図
【図２】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置の電極チップを説明するための概略図
【図３】本発明の実施形態において測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す図
【図４】本実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図５】本発明の第２の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図
【図６】本発明の第２の実施形態にかかる温度検出手段の概略図
【図７】本発明の第２の実施形態にかかる温度検出手段のもう一つの概略図
【図８】本発明の第３の実施形態にかかる電極チップの概略図
【図９】本発明の第４の実施形態にかかるセルと温度検出手段の第一の概略図
【図１０】本発明の第４の実施形態にかかるセルと温度検出手段の第二の概略図
【図１１】本発明の第５の実施形態にかかるセルと温度検出手段の概略図
【図１２】本発明の第６の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成
【図１３】試料液２の温度に対する電極チップ３上の電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス変化を、試料液２の温度が２５℃の時の値で規格化してプロットしたグラフ
【図１４】本発明の第７の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図１５】本発明の第８の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図１６】本発明の第８の実施形態にかかるキャパシタンスの経時変化を表すグラフ
【図１７】本発明の第８の実施形態にかかる補正後のキャパシタンス経時変化を表すグラフ
【図１８】本発明の第９の実施形態の微粒子測定装置における電極チップ３を示す概略図
【図１９】本発明の実施例１にかかる環境温度とキャパシタンス傾きを表すグラフ
【図２０】本発明の実施例１にかかる環境温度と補正係数を表すグラフ
【図２１】本発明の実施例２にかかる環境温度毎の補正前キャパシタンス傾きを現すグラフ
【図２２】本発明の実施例２にかかる環境温度毎の補正後キャパシタンス傾きを現すグラフ
【図２３】本発明の実施例１にかかる光学的な測定手段を説明するための構成図
【図２４】本発明の第１の実施形態にかかる誘電泳動で配置された微粒子を説明するための図
【符号の説明】
【００６６】
１  セル
２  試料液
３  電極チップ
４  泳動電源部
５  測定部
６  制御演算部
７  攪拌手段
８  温度検出手段
９  表示手段
１０  基板
１１ａ，１１ｂ  電極
１３  ギャップ
１５  電気力線
６０  サーミスタ
６１  接続極
６２  配線
６３  導電体
８０ａ、８０ｂ、８１ａ、８１ｂ  パッド
１００  熱伝達部
１１０  接続端子
１１１  接触端子
２００  微粒子
２０１  光源
２０２  受光部
２０３  カバー
２０４  スペーサ
【発明を実施するための最良の形態】
【００６７】
（第１の実施形態）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。図１は、本実施形態の微粒子測定装置の構成図、図２は、本実施形態の微粒子測定装置の電極チップを表す概略図である。【００６８】
図１において、１は測定対象の微粒子が含まれる試料液２を保持するセル、３は誘電泳動で微粒子を捕集する電極対を含む電極チップ、４は泳動電源部、５は電極間インピーダンスを測定する測定部、６は微粒子測定装置全体の制御やインピーダンス算出などの演算行う制御演算部、７は溶液の攪拌を行う攪拌手段、８は温度を検出するための温度検出手段である。【００６９】
図２において、１０は基板、１１ａ、１１ｂは基板１０上に形成され一対の極をなす電極である。基板１０には、金属などの導電性材料によって電極１１ａ、１１ｂのパターンが形成される。【００７０】
電極１１ａ、１１ｂはその幅に対して十分に薄い薄膜であることが望ましく、例えば１００μmの幅に対して厚さ１０００Å程度である。これにより、厚さ方向で見たエッジ部分に不平等電界が形成され、微粒子を効率的に誘電泳動することが可能となる。【００７１】
図３は、測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す。本実施の形態では測定電極１１ａ，１１ｂの端面で電界集中が最も大きいため、ギャップ１３付近の構成が電界集中部にあたる。従ってギャップ１３部分にもっとも強く微粒子が泳動される。【００７２】
本実施の形態では、基板１０は、セル１とは分離した形態となっているが、基板１０をセル１の壁面の一部として一体にしてもよい。【００７３】
また、電極１１ａ、１１ｂの平面パターンは、そのギャップ１３間に誘電泳動により微粒子を捕集し、捕集した微粒子によるインピーダンス変化を効率よく測定可能な形状でパターニングされる。具体的には、例えば、図２に示すような、電極１１ａ、１１ｂの対向部分が互いに入れ子状になった、いわゆる櫛歯形状が最も好ましい形状の一つである。【００７４】
微粒子を効率よく捕集するためには、ギャップ１３部の面積を広くし、微粒子が電極に捕集される確率を高くする必要がある。ただし、ギャップ１３間の距離を長くすると、電極１１ａ、１１ｂ間に同じ電圧を印加したときの電界強度が低下し、誘電泳動力が弱まる結果、微粒子を効率的に捕集できなくなる。このため、ギャップ１３間距離は、例えば１〜１００μｍ程度に狭くすることが望ましい。【００７５】
微粒子を効率的に捕集するためには、電極１１ａ、１１ｂが対向する対向部の長さ方向に電極パターンを伸ばすのが効果的であり、例えば２０〜１０００ｍｍ程度が望ましい。このとき、電極平面パターンを櫛歯形状にすることにより、対向部を実質的に長くすることができるし、電極パターンを微少領域に集積化が可能なため、電極チップ３を小型化することができるメリットがある。【００７６】
以上は電極の設計を行う際の一例であって、ギャップ１３間の距離、対向部の長さ、電極の厚さやパターンは、電極１１ａ、１１ｂ間に印加する電圧、微粒子の大きさに合わせて最適な組み合わせを選択することが望ましい。【００７７】
次に、電極チップ３の作成方法を説明する。電極チップ３は、ホウ珪酸ガラスの基板１０上に、スパッタリングや蒸着によってクロムを下地とした白金薄膜を作成した後、一般的なフォトリソグラフィーによって電極１１ａ、１１ｂのパターンを形成したものである。【００７８】
本実施の形態における電極チップ３では、基板１０にガラスを用いたが、絶縁性の材料であればいずれも使用可能であり、例えば、ＰＥＴやポリカーボネートなどのプラスチック材料や、セラミックなど基板材料の使用を妨げるものではない。また、薄膜材料は導電性の材料であればいずれも使用可能であり、金、銀、銀などの金属粒子含有の導電性ペースト、カーボンなども選択可能である。【００７９】
また、電極１１ａ、１１ｂのパターニングは、選択した材料で所望のパターンを形成できればフォトリソグラフィー以外も選択可能であり、レーザー加工、スクリーン印刷、インクジェット印刷など、生産性やコストなどを勘案して最も適切な加工法が選択可能である。【００８０】
電極チップ３は、微粒子が含まれた試料液２を保持したセル１内に浸漬され、泳動電源部４および測定部５に電気的に接続される。セル１には、マグネチックスターラなどの攪拌手段７を設けることができる。【００８１】
試料液２をセル１内で攪拌することにより、試料液２内での微粒子濃度を均一にすることができ、かつ、多くの微粒子を電極１１ａ、１１ｂのギャップ１３間に導くことができるため、より効率的に微粒子をギャップ１３間に捕集でき、測定時間の短縮や測定感度の向上が可能である。【００８２】
また、セル１を、電極チップ３上にスペーサと蓋などを設けて作成した微小チャンバーとした場合は、攪拌手段７は微小チャンバーを含む循環流路を持つ閉流路として実現することも可能である。ペリスタポンプなどによって試料液を微小チャンバー内の電極チップ３上に循環することによって、前記マグネチックスターラによる攪拌と同様な効果を得ることが可能である。【００８３】
泳動電源部４は、誘電泳動を行うための交流電圧を、電極１１ａ、１１ｂ間に印加する。これにより電極１１ａ、１１ｂ間に誘起された不平等電界によって微粒子を誘電泳動し、電界集中部である電極エッジを含む電極１１ａ、１１ｂ間のギャップ１３に捕集する。なお、ここで交流電圧というのは、正弦波のほか、ほぼ一定の周期で流れの向きを変える電圧のことであり、かつ両方向の電流の平均値がほぼ等しいものである。【００８４】
測定部５は、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを算出するために必要な測定を行う。測定部５は、具体的には、電極１１ａ、１１ｂ間に流れる電流値と、泳動電源部４が印加した電圧と電流の位相差を測定するための回路等から構成される。測定部５は、誘電泳動によって微粒子が移動し電界集中部近傍であるギャップ１３に濃縮されることに起因する電極１１ａ、１１ｂ間の電流および位相差の変化を測定する。測定部５で測定した電流値と位相差は、制御演算部６に渡される。【００８５】
制御演算部６は、図示しないマイクロプロセッサと、予め設定されたプログラムやデータテーブルなどを保存するためのメモリ、タイマー等から構成され、前記プログラムおよびデータテーブルに従い泳動電源部４を制御する。泳動電源部４は、制御演算部６の制御に従って、電極１１ａ、１１ｂ間に特定の周波数と電圧をもった交流電圧を印加する。【００８６】
さらに制御演算部６は、測定部５と信号の送受信を行ない、測定部５が測定した電流値と位相差のデータを受け取る。制御演算部６は、これら電圧、電流、位相差、周波数のデータから、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを算出し、結果を逐次メモリに格納する。【００８７】
制御演算部６は、これら一連の測定動作を、予め設定されたプログラムに従って一定の時間間隔毎に行い、定められた時間が経過すると、泳動電源部４を制御し、電極１１ａ、１１ｂ間への電圧印加を停止して、測定動作を終了する。【００８８】
次に、制御演算部６は、メモリに格納されたインピーダンス測定結果から、インピーダンス時間変化の傾きを算出する。メモリ中のデータテーブルには、与えられた電圧や周波数、微粒子種など毎に、検量線データが格納されている。制御演算部６は、算出したインピーダンス時間変化の傾きと検量線を比較することで、試料液中に含まれる微粒子濃度を算出し、メモリへの結果格納、あるいはＬＣＤなどの表示手段９に結果表示を行うなどする。【００８９】
本実施の形態では、測定結果を微粒子濃度で表すこととしているが、予め試料液の容量が規定されている場合は、微粒子数に換算して結果表示しても良い。また、使用者は測定された微粒子数を試料１ｍｌあたりの微粒子数として直接知ることができるが、表示手段９には、たとえば多いまたは少ないであるとか、目的に応じてほかの表示方法で結果表示を行っても良い。【００９０】
さらに、試料中の微粒子数を調べて殺菌装置を制御するとか、温度などの培養条件を制御するなど、使用者が直接微粒子数を知る必要が無く、本微粒子測定装置を含む任意の装置の制御を行うために微粒子数が明らかであれば良いような場合には、表示手段は特に設ける必要がないのは言うまでもない。【００９１】
温度検出手段８は、温度による測定結果の差異を補償するための元データとなる、環境温度を測定する。温度を測定する素子としては、必要な温度範囲（０〜５０℃程度）で必要な精度で温度測定できればいずれも使用可能であるが、本実施の形態では、ＮＴＣサーミスタを使用している。ＮＴＣサーミスタは、温度上昇と共に抵抗値が低下する一種の抵抗素子である。本実施の形態では、制御演算部６にサーミスタの抵抗値を測定する回路、および、メモリ内に抵抗値と温度を換算するテーブルを持たせている。すなわち、制御演算部６は、温度検出手段８を介して環境温度を測定する。【００９２】
以下、温度が微粒子の測定結果に与える影響について記述する。誘電泳動を利用した微粒子検出は、誘電泳動力によって電極に微粒子をトラップすることが、直接測定応答値の大きさに影響するものであることは明らかである。ＤＥＰＩＭ法の場合、より大きな誘電泳動力を働かせることにより、より多くの微粒子を電極にトラップできる結果、電極間のインピーダンス変化もトラップされる微粒子数に比例して大きくなる。【００９３】
一方、液体中の微粒子には、誘電泳動力以外に働く力がある。例えば重力、粘性力、抗力、ブラウン運動などである。微粒子検出の際には、誘電泳動力と、その他の力とのバランスによって、電極にトラップされる微粒子数が定まる。一般に、粘性力は液体粘度の温度依存性により温度上昇と共に低下するし、ブラウン運動は温度上昇と共に激しくなる。従って、温度変化によって電極にトラップされる微粒子数が異なり、微粒子検出の結果が変化することになる。【００９４】
また、誘電泳動力に着目すると、前述の（数２）および（数３）から明らかなように、誘電泳動力は、溶液と微粒子の誘電率および導電率に依存することが分かる。一般に、誘電率および導電率は温度依存性を持つことが知られている。そのため、温度によって誘電泳動力も変化することになり、微粒子検出の結果に影響を与える。【００９５】
そこで、本実施の形態では、温度検出手段８が温度を検出した結果に基づき、微粒子測定結果に補正を加えることによって、環境温度が変化しても正確な結果を提示できるようにしている。【００９６】
具体的には、予め演算部６のメモリ内に、温度に対する補正係数を記録したテーブル（以下、補正テーブルと呼ぶ）を保存しておく。温度検出手段８を介して制御演算部６が測定した温度に基づき、制御演算部６が前記補正テーブルを参照して補正係数を決定し、インピーダンス変化の時間傾きあるいは、検量線により算出した微粒子濃度に補正係数を乗じて、最終的な測定結果として提示する。【００９７】
補正テーブルは、微粒子に働く全ての力を含む運動方程式を立ててこれを解き、電極にトラップされる微粒子数を温度の関数として求めることで作成することができる。運動方程式は解析的に解くことは難しいため、各種シミュレーションを使うことができる。誘電泳動に関する運動の数値解析については、例えば、Ｄ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．３１（１９９８）３１６０−３１６７を参照されたい。【００９８】
補正係数は、各温度でトラップされる微粒子数を、温度Ｔｔでトラップされる微粒子数で規格化したものの逆数とする。温度Ｔｔは、制御演算部６のメモリ内に格納された検量線データを取得した際の温度とする。こうすることにより、温度変化による測定結果の変動をキャンセルし、真の微粒子濃度を最終的な測定結果として提示することができる。【００９９】
また、より簡易的には、以下のような実験を行い、実験的に補正テーブルを作成することも可能である。すなわち、想定される範囲の温度条件下で、同一微粒子濃度の検体を測定し、各温度での測定結果を求める。それぞれの測定結果を温度Ｔｔでの測定結果によって規格化したものの逆数を補正係数とすれば良い。【０１００】
表１に、補正テーブルの作成例を示す。【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
αは温度Ｔの関数で、補正係数を表す。温度Ｔは、基準となる温度をＴｔとし、想定温度範囲の最も低い温度をＴｍｉｎ、最も高い温度をＴｍａｘで表す。表１の例では、補正係数を求める温度ステップは１℃としているが、これはより細かいあるいは、より粗いステップでも良い。温度ステップは、求められる測定精度に応じて、決めればよい。【０１０３】
また、補正テーブルの代わりに、補正係数αを温度Ｔの関数として数式化し、制御演算部６がこの数式を元に補正計算を行っても良い。実験的に温度Ｔと補正係数αとの関係を求めた場合には、数式は、温度Ｔと補正係数αのプロットを、線形あるいは多項式でフィッティングした関数を用いることができる。【０１０４】
図４は、本実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、試料の導入からセル１内の微粒子の濃縮、測定、結果提示にいたるまでの一連の流れを説明する。まず、初期状態では、セル１に測定対象の微粒子が含有された試料液を投入する（ステップＳ１１）。【０１０５】
次いで、制御演算部６は、温度検出手段８を介して、環境温度を測定する（ステップＳ１２）。この環境温度測定結果は、制御演算部６内のメモリに一時的に蓄えられ、後に補正を行う際に参照される。【０１０６】
次に、制御演算部６は、測定した温度を、予めメモリ内に記憶された温度範囲（以下、測定温度範囲と呼ぶ）と比較し、測定した温度が測定温度範囲外か、すなわちエラーか、を判断する（ステップＳ１３）。測定温度範囲は、通常測定装置が使用されると思われる温度範囲を設定しておけばよく、例えば、室内での使用を鑑み０℃〜５０℃とする。比較した結果、測定温度範囲を逸脱していれば（ステップＳ１３：Ｙｅｓ）、ステップＳ１４に進み、測定温度範囲外である旨、エラー表示を行い、ステップＳ２３に進み測定動作を終了する。【０１０７】
比較した結果、測定温度範囲内であれば（ステップＳ１３：Ｎｏ）、制御演算部６は、補正テーブルを参照し、電極に印加すべき電圧振幅値および周波数を選択し、電極１１ａ、１１ｂ間へ電圧印加を開始する（ステップＳ１５）。この場合の電圧振幅値および周波数は、微粒子をギャップ１３にトラップするために十分な誘電泳動力が働くような値を選択すればよく、本実施の形態では１０Vｐ−ｐ、１００KHｚとしている。【０１０８】
電極１１ａ、１１ｂ間に所定の電圧が印加されると、測定部５は、直ちに電圧印加直後の初期状態のデータとして、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定し、測定結果は、制御演算部６に渡され、メモリに初期のインピーダンス値として保存される（ステップＳ１６）。【０１０９】
次に、制御演算部６は、図示しない時計手段によって所定の時間が経過するまで待つ（ステップＳ１７）。この時、泳動電源部４は電圧印加を保持したままである。【０１１０】
所定の時間が経過すると、制御演算部６は所定の測定回数が満了したかを判断し（ステップＳ１８）、満了していなければステップＳ１６に戻る。ステップＳ１６に戻り、制御演算部６は、測定部５に命じて、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定させ、その結果をメモリ６ａに所定時間経過後の結果として保存する。【０１１１】
所定の測定回数が満了した場合（ステップＳ１８：Ｙｅｓ）、制御演算部６は泳動電源部４に電圧印加を止めるよう指示する（ステップＳ１９）。【０１１２】
電圧印加を停止後、制御演算部６は、メモリに保存された、電極１１ａ、１１ｂ間インピーダンスの経時変化データから、インピーダンス変化の傾きを算出する（ステップＳ２０）。【０１１３】
次いで、制御演算部６は、補正テーブルより参照して、ステップＳ１２で測定した温度に対応する補正係数を、ステップＳ２０で求めたインピーダンス傾きに乗じる。例えば、温度測定結果がＴｔ＋１（℃）であれば、補正係数はα（Ｔｔ＋１）となる。微粒子濃度の算出は、メモリに予め保存された、検量線から求める（ステップＳ２１）。この検量線としては、微粒子濃度が明らかな校正用試料を、本実施の形態で説明した微粒子測定装置の測定系を用いて予め測定し、その時の微粒子数とインピーダンス変化の相関関係からばらつきを回帰分析して得られる曲線をあらわす関数を使用する。校正用試料の測定の際、温度は、補正係数を求める際に規格化を行う温度Ｔｔの条件にて測定を行う。【０１１４】
制御演算部６は、ステップＳ２１で算出した結果を表示手段９に表示させ（ステップＳ２２）、一連の測定動作を終了する。尚、本実施の形態では、補正係数αをインピーダンス傾きに乗じて補正を行ったが、検量線から微粒子濃度を求めた後に補正を行うことによっても、全く同様な補正効果を得られる。また、温度測定はステップＳ１３で行ったが、温度測定は補正テーブルを参照するステップＳ２１までの任意のタイミングで測定可能である。【０１１５】
本実施の形態では、測定部５は、誘電泳動で電極に微粒子をトラップした場合のインピーダンス変化を測定することで微粒子濃度を測定しているが、測定部５としては、誘電泳動によって微粒子を所定位置に移動したことを、何らかの手段で測定する測定装置および測定方法であればいずれも適用可能である。【０１１６】
例えば、測定部５を電磁気的な手段、代表的には顕微鏡などの光学的な手段で測定することで、電極間にトラップされた微粒子を測定することが可能である。図２３は、測定部５を光学的測定で実現した場合の構成図である。図２３において、２００は測定対象の微粒子で、電極１１ａ，１１ｂによって形成される不平等電界によって、所定の位置に移動する。２０１は光源、２０２は光源２０１が照射した光を受ける受光部である。光源２０１および受光部２０２の光軸は、微粒子２００が誘電泳動によって移動する箇所を横切るように設置される。【０１１７】
セル１は、基板１０と、カバー２０３および、スペーサ２０４から構成され、これらによって形成される空間に試料液２が充填される。また、カバー２０３およびスペーサ２０４は、光源２０１が照射した光を透過し、誘電泳動された微粒子が観察できるよう、ガラスやＰＥＴ樹脂など、透明な材料を用いる。【０１１８】
図２４（ａ）は正の誘電泳動によって電極１１ａ，１１ｂ間に微粒子２００がトラップされる様子、図２４（ｂ）は負の誘電泳動によって電極１１ａ，１１ｂ間のギャップ１３に微粒子２００が配置される様子を示す。正の誘電泳動の場合、電界集中部である電極エッジ部に数珠状に連なった形状（以下、パールチェインと呼ぶ）で配列される。負の誘電泳動の場合、弱電界部であるギャップ１３の中心部にパールチェインで配列される。この時、ギャップ１３にトラップされた微粒子２００を、光源２０１と受光部２０２から構成される光学系で撮像し、制御演算部６が画像解析を行い、ギャップ１３に配列された微粒子２００の個数、投影面積などを算出する。この算出は、電極１１ａ，１１ｂ間の電界印加から一定時間後、あるいは電界印加からの所定時間が経過する毎に行う。このように、試料液２中の微粒子数や微粒子濃度、微粒子同士の結合の度合いを測定する。【０１１９】
誘電泳動によってギャップ１３に配列される微粒子数、あるいは形成されるパールチェイン数は、当然ながら、誘電泳動力と粘性力その他の力のバランスによって決まり、それらの力が温度によって変化するため、温度による補正が必要となる。本実施の形態では、誘電泳動とインピーダンス測定にて微粒子濃度を測定する場合の補正係数の求め方を示したが、それぞれの測定手段に応じて、実験的に補正係数のテーブルや関数を作成することが可能であり、誘電泳動を利用したあらゆる微粒子測定装置、微粒子測定方法に適用が可能である。【０１２０】
以上、本実施の形態によれば、温度変動によって微粒子に働く誘電泳動力およびその他全ての力のバランスが変化した場合にも、補正によってその影響をキャンセルすることができるため、様々な環境温度に設置された微粒子測定装置でも正しい測定結果を提示することができる。【０１２１】
（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１と同様な構成については説明を省略する。【０１２２】
図５は、本実施形態の微粒子測定装置の構成図である。試料液２内の微粒子に働く力の温度による変化は、直接は試料液２の温度に依存する。従って、環境温度よりも試料液２の温度の測定結果に基づいて補正を行った方が、精度良く補正を行うことができる。そこで、本実施の形態では、温度検出手段８がセル１の試料液２内に配置されており、試料液２の温度を測定できる構成となっている。【０１２３】
図６は、セル１内に温度検出手段８として、チップ型のサーミスタ６０を、セル１の試料液２側の表面に配置した模式図である。温度検出手段８は、試料液２内のいずれかに配置されていれば試料液２の温度測定が可能である。しかし、試料液２の流動などによってサーミスタ６０が動揺すると、温度測定にノイズが加わる恐れがあるため、本実施形態では、サーミスタ６０をセル１の壁面に固定している。【０１２４】
６１はサーミスタ６０の電気的な接続極、６２はセル１の壁面に設けられた電気的な配線で、一般的な電子回路配線に用いられる銅箔パターンなどで構成され、セル１外の制御演算部６とサーミスタ６０を電気的に接続している。６３は、サーミスタ６０の接続極６１と配線６２を電気的に接続する導電体であり、電気的な導通とサーミスタ６０の固定が同時にできるため、半田を用いることが望ましい。【０１２５】
サーミスタ６０は、図７のように、セル１の試料液２側の壁面に埋め込まれる構成にしても良い。この場合、配線６２もセル１内に埋め込まれており、サーミスタ６０を挿入したときに電気的な接続および機械的な固定ができるようなスペースをセル１内に有している。【０１２６】
以上、本実施の形態によれば、セル１内の試料液２の温度を直接測定できるので、溶液温度に依存する、微粒子に働く力の変化を正確に補正することができ、高精度な微粒子測定装置を実現することができる。【０１２７】
（実施の形態３）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜２と同様な構成については説明を省略する。【０１２８】
図８は、本実施の形態を示す、電極チップ３の概略図である。電極チップ３の基板１０の表面上、試料液２に電極チップ３を含浸した際に試料液２内に浸かる位置に温度検出手段８が配置される。本実施の形態では、温度検出手段８にサーミスタを用いており、図６と同様な方法で固定および電気的な接続を行っている。温度検出手段８および、電極１１ａ、１１ｂは、配線６２を介してパッド８０ａ、８０ｂ、８１ａ、８１ｂに接続される。パッド８０ａ、８０ｂは、電極１１ａ、１１ｂの電気的接続を担い、パッド８１ａ、８１ｂは、温度検出手段８の電気的接続を担っている。パッド８０ａ、８０ｂ、８１ａ、８１ｂは、電極チップ３を挿入するコネクタ端子のピッチに合うように設計され、パッド８０ａ、８０ｂはそれぞれ泳動電源部４および測定部５へ、パッド８１ａ、８１ｂは制御演算部６に電気的に接続される。【０１２９】
以上、本実施の形態によれば、電極チップ３上に誘電泳動を行う電極と、温度測定を行う温度検出手段を共存させることにより、配線を行うためのコネクタを１つにすることができるため、簡易な構造で粒子測定装置を実現することができる。【０１３０】
（実施の形態４）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜３と同様な構成については説明を省略する。【０１３１】
図９は、本実施の形態を表す微粒子測定装置の概略図である。セル１の外側、試料液２と接しない側の壁面に、温度検出手段８が接する構造を有しており、セル１の温度を測定できる構成になっている。【０１３２】
本実施の形態では、セル１はプラスチック、温度検出手段８はサーミスタを使用している。通常、セル１は、試料液２を内部に貯留した形で保存されているため、試料液２とセル１は等温になっていると考えられる。このため、温度検出手段８をセル１の壁面に接するようにすれば、間接的に試料液２の温度を測定することが可能である。更に、温度検出手段８とセル１の間に熱伝導を助ける、シリコーングリスを塗布することで、より正確に試料液２の温度を検出することが可能になる。【０１３３】
試料液２の温度をより正確に反映する必要があれば、セル１の材料を熱伝導率の高いものにすると良い。例えば、銀や銅などの金属材料などである。セル１のコストや廃棄が問題になるのであれば、図１０に示すように、セル１の壁面の一部に熱伝導率の高い熱伝達部１００を設け、熱伝達部１００と温度検出手段８を接触させることも可能である。【０１３４】
以上、本実施の形態によれば、温度検出手段が直接試料液に接しないため、腐蝕や劣化が防げる。また、測定対象が微生物であり、汚染を考慮してセルを使い捨てにする場合であっても、温度検出手段の汚染が防げ、温度検出手段は繰り返し使用することができるため、１回の測定に掛かる費用を抑えることができる。【０１３５】
（実施の形態５）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜４と同様な構成については説明を省略する。【０１３６】
図１１は、本実施の形態を表す微粒子測定装置の概略図である。セル１の壁面に接続端子１１０が埋め込まれている。接続端子１１０は、セル１の試料液２に接する側（以下、内側と呼ぶ）と、セル１の試料液２に接しない側（以下、外側と呼ぶ）の両方に露出面を持つ。接続端子１１０は、低い抵抗率と高い熱伝導率を持つ材料が望ましく、本実施の形態では銅を用いている。【０１３７】
接続端子１１０は、セル１の内側で、電極基板３上に形成された、誘電泳動を誘起するための電極１０ａ、１０ｂに電気的に接続される。接続端子１１０はセル１の外側で、接触端子１１１を介して、泳動電源部４および測定部５に電気的に接続される。つまり、接続端子１１０は、電気的には、電極基板３上に形成された電極１０ａ、１０ｂと泳動電源部４および測定部５を接続するための中継機能を果たしている。【０１３８】
接続端子１１０のセル１の外側の露出面に、温度検出手段８が接しており、温度検出手段８が接続端子１１０の温度を測定することで、間接的に試料液２の温度を測定出来る構成になっている。つまり、接続端子１１０は、熱的には、試料液２の温度を温度検出手段８に伝える中継機能を果たしている。【０１３９】
以上、本実施の形態によれば、電極を電気的に接続する端子と、試料液の温度を検出するための端子を共用としているため、セルの構造を簡略化できる。【０１４０】
（実施の形態６）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜５と同様な構成については説明を省略する。図１２は、本実施形態の微粒子測定装置の構成図である。【０１４１】
図１２において、１は測定対象の微粒子が含まれる試料液２を保持するセル、３は誘電泳動で微粒子を捕集する電極対を含む電極チップ、４は泳動電源部、５は電極間インピーダンスを測定する測定部、６は微粒子測定装置全体の制御やインピーダンス算出などの演算を行う制御演算部、７は溶液の攪拌を行う攪拌手段である。【０１４２】
本実施の形態では、誘電泳動で微粒子を捕集する電極チップ３が温度検出手段を兼ねる構成となっている。以下、電極チップ３で温度を検知する方法について説明する。【０１４３】
図１３は、試料液２の温度に対する電極チップ３上の電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス変化を、試料液２の温度が２５℃の時の値で規格化してプロットしたグラフである。この時、試料液２中には微粒子は含まれていない。図１３中、１のプロットは電極インピーダンスの抵抗成分の逆数であるコンダクタンスＧＡ、２のプロットは電極インピーダンスの容量成分であるキャパシタンスＣＡの変化を示す。コンダクタンスは温度上昇に対して単調増加、キャパシタンスは温度上昇に対して単調減少している。【０１４４】
このことから、試料液２のインピーダンス測定から、試料液２の温度を推定することが可能である。具体的には、制御演算部６内のメモリにコンダクタンスＧＡまたはキャパシタンスＣＡと、試料液２の温度とを関係付けしたテーブルを設けることにより、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス測定より試料液２の温度測定が可能である。あるいは、試料液２の温度とＧＡあるいはＣＡの関係から、適当な近似式を求めておき、その近似式を用いて計算することも可能である。図１３のプロットから、直線近似でほぼ近似できることが分かる。【０１４５】
電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス測定から温度を測定する際に電極１１ａ、１１ｂ間に印加する電圧（以下、温度測定電圧と呼ぶ）は、誘電泳動を行う際の電圧（以下、誘電泳動電圧と呼ぶ）よりも低く、誘電泳動を生じさせない程度の電圧とすることが望ましい。なぜならば、温度測定電圧を印加することによって微粒子に誘電泳動が生じると、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスに変化が生じるため、正確な温度推定が行えないからである。このため、本実施の形態では、温度測定電圧は誘電泳動電圧の５分の１であることが望ましく、誘電泳動電圧は１０Ｖｐ−ｐ、温度測定電圧は２Ｖｐ−ｐとしている。【０１４６】
また、温度推定を行うためのインピーダンス測定は、キャパシタンスの値を用いるほうが好ましい。なぜならば、電極１１ａ、１１ｂ間のコンダクタンスは、試料液２の導電率によって変化するものであり、試料液２の導電率は測定に供する検体によって異なるため、異なる導電率の試料液２に対してそれぞれテーブルが必要となり、温度推定が困難になるからである。従って、本実施の形態では温度推定に用いるインピーダンス測定値にキャパシタンスを用い、測定結果の補正を行う。【０１４７】
以上、本実施の形態によれば、誘電泳動を行う電極が、温度検出手段を兼ねる構成で実現できるため、微粒子測定装置の構成が簡素化され、低コストな微粒子測定装置を実現することができる。【０１４８】
（実施の形態７）
以下、本発明の実施の形態７の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。本実施の形態７では、誘電泳動を行う前の試料液２の温度測定結果から、誘電泳動を行うための電圧値を設定することで、試料液２の温度に依らず一定の測定結果を得られる構成としている。【０１４９】
図１４は、本実施の形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、一連の測定の流れを説明するが、実施の形態１と重複する部分については説明を省略する。【０１５０】
ステップＳ２４において、制御演算部６は、メモリ内のテーブルあるいは関数を参照し、ステップＳ１２の温度測定結果に対応する電圧振幅値および周波数を決定する。この時制御演算部６が決定する電圧振幅値あるいは周波数は、想定された環境温度の範囲内において、試料液２中の測定対象微粒子に働く誘電泳動力が十分大きくかつ一定になるような条件をテーブルあるいは関数化しておく。【０１５１】
次いで、制御演算部６は、ステップＳ２４で決定した電圧を電極１１ａ、１１ｂ間に印加する（ステップＳ１５）。ステップＳ２０で、インピーダンス傾きを算出するが、測定対象微粒子に働く誘電泳動力が一定になるため、インピーダンス傾きは温度に依存せず、試料液２中に含まれる測定対象微粒子の濃度にのみ依存する。従って、温度に基づく補正を行う必要は無く、ステップＳ２２で制御演算部６はメモリ中に保存されている検量線から試料液２中の微粒子濃度などの結果出力を表示手段９に指示し、測定を完了する。【０１５２】
試料液２の温度によって誘電泳動力が低下した場合、得られるインピーダンス傾きも小さくなるため、小さなインピーダンス傾きを基に補正を行った場合は十分なＳ／Ｎが得られない場合がある。本実施の形態によれば、試料液２の温度に応じて十分かつ一定の誘電泳動力を作用させる電圧値を選択することにより、常に高いＳ／Ｎで測定することができるため、より高精度な微粒子測定を実現することができる。【０１５３】
（実施の形態８）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜７と同様な構成については説明を省略する。【０１５４】
上述した各実施の形態の微粒子測定装置において、誘電泳動で試料液２中の微粒子を電極１１ａ、１１ｂ間に捕捉しながらインピーダンス測定することを考えると、誘電泳動を行っている最中に試料液２の温度が変化することが考えられる。例えば、試料液２を１０℃程度で冷蔵保存しておき、その試料液２を室温２５℃の環境に移して即、測定を開始することを想定すると、試料液２の温度は、１０℃から平衡の約２５℃に達するまで上昇する。【０１５５】
この場合、ある一時点で測定した温度を元に測定結果の補正を行えば、ある一時点での試料液２の温度と、実際に誘電泳動されている時点で試料液２の温度に乖離が生じ、正確な補正ができないという問題がある。【０１５６】
そこで、本実施の形態では、制御演算部６がインピーダンスを測定する際に、ほぼ同時に温度検出手段８から温度情報を取得し、リアルタイムに測定した試料液２の温度情報を元に、より正確な補正を行う。【０１５７】
図１５は本実施の形態を示すフローチャートである。ステップＳ１６とステップＳ１７の間にステップＳ３０として温度測定を行う点、ステップＳ２０でインピーダンス傾きを算出する際に同時に図４のステップＳ２１に相当する補正を行う点以外は、実施の形態１のフローチャート（図４）と同様である。本実施の形態では、ステップＳ１６でインピーダンス測定を行った直後にステップＳ３０で、温度測定を行い、制御演算部６は、インピーダンス測定結果および温度測定結果を、同じ時間タイミングの結果として、メモリに保存する。例えば、表２に示すように、時間とキャパシタンスＣと温度Ｔとを関連付けた形式でデータを保存しておく。【０１５８】
【表２】
2009093458.tif 000007
【０１５９】
本実施の形態では、温度測定はインピーダンス測定の直後であったが、ステップＳ１６とステップＳ３０とを入れ替えて、温度測定の直後にインピーダンス測定を行っても良い。インピーダンスを測定した時点の温度を測定することが肝要である。【０１６０】
表２において、ｔｅは測定時間である。この例では、キャパシタンスを測定しているが、インピーダンスあるいはコンダクタンスでも良く、測定間隔は１秒毎となっているが、任意の測定間隔に設定可能である。【０１６１】
予め設定された測定回数（測定時間に相当する）を完了し、ステップＳ１９で電圧印加停止した後、制御演算部６は、ステップＳ２０でインピーダンスの時間傾きを算出する。この時、保存したインピーダンスと温度のデータとを用いてインピーダンス傾きの補正を行う。以下、補正の方法について説明する。【０１６２】
図１６は、横軸に時間ｔを取り、縦軸にインピーダンスの代表としてキャパシタンスＣを取り、誘電泳動で微粒子を捕捉しながらインピーダンス測定を行った時の、キャパシタンスＣの変化をプロットしたものである。添え字ｎは任意の整数である。グラフ中、時間ｔｎ−１からｔｎになったとき、キャパシタンスＣｎ−１はからＣｎに、温度はＴｎ−１からＴｎに変化している。任意の時間におけるキャパシタンスＣの時間変化の傾きΔＣｎは、（数４）で表される。【０１６３】
【数４】
2009093458.tif 000008
【０１６４】
ΔＣｎは、測定間隔の間に変化した温度の影響を含んでいるため、制御演算部６は、この時の温度変化を元に傾きを補正する。補正係数は、表１に示すようなαを用いる。補正後の傾きをΔＣ‘ｎとすると、傾きの補正は数５で表される。【０１６５】
【数５】
2009093458.tif 000009
【０１６６】
この時、温度Ｔｎは、（数６）のように２点の平均値Ｔ‘ｎを用いることでより正確な補正を行うことができる。【０１６７】
【数６】
2009093458.tif 000010
【０１６８】
求めた補正後の傾きΔＣ‘ｎを用いて、（数７）によって、キャパシタンスの補正値ＣＴｎを得ることができる。【０１６９】
【数７】
2009093458.tif 000011
【０１７０】
ＣＴｎは、時間ゼロ（測定開始直後の時点）でゼロを取り、測定開始時点からのキャパシタンス変動分を示す値である。全ての測定データについてＣＴｎを求め、得られたデータのプロットを示したのが図１７である。得られたプロットから最小二乗法などによって直線１を求め、その傾きを算出し、最終的なインピーダンス傾きとして、微粒子数に換算を行い、ステップＳ２２で結果を出力して測定動作を完了する（ステップＳ２３）。【０１７１】
以上、本実施の形態によれば、インピーダンス測定時点の温度を測定することによってリアルタイムの温度変化に基づいた補正を行うことができるため、測定途中で試料液の温度が変化する場合にも、正確な測定結果を提示することができる。【０１７２】
（実施の形態９）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、既述の実施の形態と同様な構成については説明を省略する。本実施の形態では、測定中の試料液２の温度変化を測定する手段を、電極チップ３上に温度測定用の電極を設け、電極チップ３を簡易な構成にしつつ、リアルタイムの温度測定を実現するものである。【０１７３】
図１８は、本実施形態の微粒子測定装置における電極チップ３を示す概略図である。図２３において、１１ｃは、試料液２に浸漬する位置において１１ａに隣接する位置に配置される第三の電極である。１１ｃの試料液２と反対側の一端には、測定部５に接続されるパッド８０ｃが設けられている。測定部５は、制御演算部６の指示により、第三の電極１１ｃと電極１１ａ間のインピーダンスを測定し、制御演算部６は測定部５のインピーダンス測定値からキャパシタンスを算出する。測定されたキャパシタンスの値は試料液２の誘電率に比例し、誘電率は前述の通り試料液２の温度を反映したものであるから、制御演算部６は第三の電極１１ｃと電極１１間のインピーダンス測定結果から試料液２の温度を測定することができる。【０１７４】
このとき、１１ｃと１１ａ間のインピーダンスを測定するための電圧は、試料液２中の測定対象微粒子が誘電泳動あるいは電気泳動されないような電圧振幅および周波数に設定することが望ましい。これにより、電極間に微粒子が捕集されたことによって生じるインピーダンス変化に起因する温度測定誤差を回避することができる。また、誘電泳動とインピーダンス測定を行う電極１１ａを温度測定用の電極としても共用することで、温度検出手段をサーミスタなど別途も受ける必要が無く、電極チップ３および測定部５の構成を簡易にし、かつ、測定中の試料液温度測定をリアルタイムに行うことで精度の高い補正を実現することができる。【０１７５】
尚、ここでは第三の電極１１ｃと電極１１ａ間のインピーダンスを測定することとしたが、試料液２の誘電率を正確に測定できる限りにおいては、電極１１ａ、１１ｂのどちらを対極として用いても良い。また、電極１１ａあるいは１１ｂのいずれかを温度測定用の電極として共用する構成としたが、温度測定用の電極対を別途設け、誘電泳動とインピーダンス測定を行う電極と共用しない構成とすることを妨げるものではない。
【実施例１】
【０１７６】
（補正係数の算出）
試料液の温度と、インピーダンス時間変化との関係から、補正係数を求めるために、以下の実験を行った。【０１７７】
（１）試料液の調整
標準寒天培地（ＭＢ００１０、栄研器材（株））上で３７℃、１６時間の好気培養を行った大腸菌Ｋ−１２株（ＮＢＲＣ３３０１、製品評価技術基盤機構）をコンラージ棒で採取し、０．１Ｍ  Ｄ−マニトール溶液（導電率、約５μＳ／ｃｍ）に懸濁したものを標準試料とし、適宜希釈して６．８２×１０６ｃｆｕ／ｍｌの懸濁濃度となるように調整した。尚、懸濁濃度は、適宜希釈した標準試料を標準寒天培地状に塗抹し、３７℃、１６時間の好気培養を行った結果生育したコロニー数を計数することによって規定した。【０１７８】
（２）測定装置
図１の測定装置を使用した。印加電圧振幅は５Ｖｐ−ｐ、周波数は１００ＫＨｚで、６０秒間のインピーダンス測定の後、キャパシタンスの傾きを測定応答とした。電極チップ３と試料液２を含むセル１は、恒温層内に静置して恒温層内温度と試料液２の温度が等しくなるようにした。温度は５℃、２５℃、４０℃の３段階とした。【０１７９】
（３）結果
それぞれの温度で得られた測定応答を、２５℃での測定応答の値で規格化してプロットしたのが図１９である。２５℃を基準に、５℃では応答が低下し、４０℃では応答が上昇した。この要因の一つとして、試料液２の温度による粘度の変化が考えられる。試料液２の温度低下と共に粘度は高くなり、低温では微粒子に働く粘性力が大きくなるため、単位時間当たりに誘電泳動力によって電極にトラップされる微粒子数が少なくなる結果、図１9のような応答変化となっている。【０１８０】
図２０は、図１９で示した規格化したキャパシタンス傾きの逆数をプロットしたものである。これが補正係数αに相当する。３点のプロットを多項式近似によってフィッティングしたものが曲線１である。曲線１の多項式の関数から、補正係数αを算出することが可能である。
【実施例２】
【０１８１】
（温度補正の効果確認）
実施例１で求めた補正係数αの関数を用いて、補正によって正確な測定を行えることを確認するため、以下の実験を行った。【０１８２】
（１）試料液の調整
試料液の調整方法は、実施例１と同様である。試料液の大腸菌濃度を６．８２×１０６〜６．８２×１０７ｃｆｕ／ｍｌの懸濁濃度となるように調整を行った。【０１８３】
（２）測定装置
測定装置および温度の条件は実施例１と同様であるため、説明を省略する。【０１８４】
（３）結果
表３は、試料液温度が５℃、２５℃、４０℃の時の、大腸菌濃度６．８２×１０６および６．８２×１０７ｃｆｕ／ｍｌでのキャパシタンス傾きΔＣＴを示す。各大腸菌濃度において、（数８）にて平均値と最大値の比率ＥＲｍａｘを、（数９）にて平均値と最小値の比率ＥＲｍｉｎをそれぞれ求め、その百分率を誤差の大きさとして評価した。【０１８５】
【表３】
2009093458.tif 000012
【０１８６】
【数８】
2009093458.tif 000013
【０１８７】
（数８）において、ΔＣＴmaxは各濃度におけるキャパシタンス傾きの最大値、ΔＣＴavは、各濃度のキャパシタンス傾きの平均値である。【０１８８】
【数９】
2009093458.tif 000014
【０１８９】
（数９）において、ΔＣＴｍｉｎは各濃度におけるキャパシタンス傾きの最小値である。【０１９０】
表３に示したように、補正を行わない場合、試料液の温度が５℃〜４０℃の範囲で変動すると、±５０％程度の大きな測定誤差を生じる。図２１は、横軸に大腸菌濃度、縦軸にキャパシタンス傾きΔＣＴをプロットした。試料液の温度によって、同じ大腸菌濃度におけるΔＣＴの値に乖離が生じているのが分かる。【０１９１】
一方、表４は、上記の測定結果に、実施例１で求めた補正係数αを乗じて算出した、補正後のキャパシタンス傾きを示す。【０１９２】
【表４】
2009093458.tif 000015
【０１９３】
表４に示したように、補正を行うことによって、誤差は±１〜２％程度まで抑えることができ、試料液の温度に依らない、正確な測定を行うことができる。図２２は、補正後のΔＣＴと大腸菌濃度の関係をプロットしたグラフである。図２２のグラフは、試料液温度に依らず、同じ大腸菌濃度では、ほぼ同じキャパシタンス傾きを算出できることを示している。【０１９４】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。【０１９５】
本出願は、２００８年１月２２日出願の日本特許出願（特願２００８−０１１４４５）、に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
本発明は、異なる環境温度や、異なる温度の試料液においても、溶液に含有された微粒子数を正確に測定することができる微粒子測定装置等として有用である。
【図１】
2009093458.tif 000016
【図２】
2009093458.tif 000017
【図３】
2009093458.tif 000018
【図４】
2009093458.tif 000019
【図５】
2009093458.tif 000020
【図６】
2009093458.tif 000021
【図７】
2009093458.tif 000022
【図８】
2009093458.tif 000023
【図９】
2009093458.tif 000024
【図１０】
2009093458.tif 000025
【図１１】
2009093458.tif 000026
【図１２】
2009093458.tif 000027
【図１３】
2009093458.tif 000028
【図１４】
2009093458.tif 000029
【図１５】
2009093458.tif 000030
【図１６】
2009093458.tif 000031
【図１７】
2009093458.tif 000032
【図１８】
2009093458.tif 000033
【図１９】
2009093458.tif 000034
【図２０】
2009093458.tif 000035
【図２１】
2009093458.tif 000036
【図２２】
2009093458.tif 000037
【図２３】
2009093458.tif 000038
【図２４】
2009093458.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月27日(2009.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘電泳動を用いて試料液中の微粒子数を測定するための微粒子測定装置および微粒子測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、食中毒や感染症などの原因となり、人体に何らかの害を及ぼす可能性がある微生物を、迅速、簡便、高感度に定量測定するニーズは特に高い。食品の製造工程や微生物検査施設を備えない診療所などにおいて、その場で微生物検査を実施することで、食中毒や感染症などの防止、予防が可能になるためである。
【０００３】
また、いわゆるバイオセンサにおいて、抗体など、測定対象に特異的に結合する物質を標識したポリスチレンなどの人工微粒子を用いて、検体中の生化学的物質を定量測定する際に、検体中の微粒子数あるいはその結合状態を定量測定する必要がある。このように、昨今、液体中に含まれる微粒子を迅速、簡便、定量的に測定する要求は高い。
【０００４】
ここで、本願における微粒子の定義について説明する。本願で言う微粒子とは、ポリスチレンやそれらに何らかのコーティングを施した粒子、カーボンナノチューブ、金コロイドなどの金属粒子、細菌、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、ウイルス、として分類されているいわゆる微生物、原生動物や原虫のうちの小型のもの、生物体の幼生、動植物細胞、精子、血球、核酸、蛋白質等も含む広い意味での生体または生体由来の微粒子である。この他にも、本願で言う微粒子とは、誘電泳動可能な大きさのあらゆる粒子を意味する。本願では特に、微生物の測定を想定している。
【０００５】
液体中に懸濁された誘電体微粒子を電気的に操作する方法の一つとして、誘電泳動現象が用いられる。誘電泳動現象の原理は後述するが、液体中に懸濁された誘電体微粒子に不平等電界を印加することによって、微粒子の選別・分離や、誘電特性調査を行うことができる。
【０００６】
例えば、特許文献１は、複数種類の微粒子が混合された液体中から、特定の微粒子を選別・回収する装置に関するもので、微粒子の大きさや誘電特性の差異に起因する誘電泳動力の差を利用して、特定の微粒子のみに誘電泳動力を誘起してフローから回収する技術が開示されている。
【０００７】
また、特許文献２は、異なる微生物に働く誘電泳動力の周波数スペクトルが、その物性の差異から異なることを利用して、液体中に含まれる微生物の種類を同定する技術が開示されている。
【０００８】
更に、本発明者は他の発明者らと共に、誘電泳動を利用して液体中に含まれる微生物濃度を迅速、簡便、高感度に測定する微生物数測定装置および方法として、誘電泳動とインピーダンス計測を組み合わせたＤＥＰＩＭ（DielectrophoreticImpedance Measurement Method）法を提案した（例えば、特許文献３を参照）。
【０００９】
ＤＥＰＩＭ法は、液体中に懸濁された微生物を誘電泳動力によってマイクロ電極に捕集し、同時にマイクロ電極のインピーダンス変化を測定することによって試料液中の微生物数を定量測定する方法である。以下、その測定原理について概説する。
【００１０】
微生物は一般に、イオンリッチで誘電率および導電率の高い細胞質および細胞壁が、比較的誘電率および導電率の低い細胞膜に囲まれた構造を有し、誘電体粒子とみなすことができる。ＤＥＰＩＭ法では、電界中で分極した誘電体粒子に一定方向に働く力である誘電泳動力を利用し、誘電体粒子である微生物をマイクロ電極のギャップ間に捕集する。
【００１１】
誘電体粒子に働く誘電泳動力ＦＤＥＰは、以下の（数１）で与えられることが公知である（例えば、非特許文献１を参照）。以下、誘電体粒子が、微生物である場合を例として説明する。
【００１２】
【数１】
2009093458.tif 000040
【００１３】
ここで、a：球形近似したときの微生物の半径、ε０：真空の誘電率、εｍ：試料液の比誘電率、Ｅ：電界強度であり、▽は演算子で勾配（gradient）を表す。この場合、▽Ｅ２は、電界Ｅ２の勾配なので、その位置でどれだけＥ２が傾斜を持っているか、つまり電界Ｅが空間的にどれだけ急に変化をするかを意味する。また、Ｋはクラウジウス・モソッティ数と呼ばれ、（数２）で表され、Ｒｅ［Ｋ］＞０は正の誘電泳動を表し、微生物は電界勾配と同方向、つまり、電界集中部に向かって泳動される。Ｒｅ［Ｋ］＜０は負の誘電泳動を表し、電解集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部に向かって泳動される。
【００１４】
【数２】
2009093458.tif 000041
【００１５】
ここで、εｂ＊およびεｍ＊はそれぞれ、微生物および溶液の複素誘電率を表し、一般に複素誘電率εｒ＊は（数３）で表される。
【００１６】
【数３】
2009093458.tif 000042
【００１７】
ここで、εｒ：微生物あるいは試料液の比誘電率、σ：微生物あるいは試料液の導電率、ω：印加電界の角周波数を表す。
【００１８】
（数１）（数２）（数３）から、誘電泳動力は、微生物の半径、クラウジウス・モソッティ数の実部（以下、Ｒｅ［Ｋ］と表す）および電界強度に依存することが分かる。また、Ｒｅ［Ｋ］は、試料液および微生物の複素誘電率、電界周波数に依存して変化することが分かる。
【００１９】
そのため、ＤＥＰＩＭ法では、これらのパラメータを適切に選択し、微生物に働く誘電泳動力を十分大きくし、微生物を電極ギャップに確実に捕集する必要がある。また、ＤＥＰＩＭ法では、上記誘電泳動による電極への微生物捕集と同時に、電気的計測を行い、試料液中の微生物数を定量測定することを特徴としている。
【００２０】
微生物は、前述した構造を有するため、電気的には固有のインピーダンスを持った微粒子と考えることができる。そのため、誘電泳動によりマイクロ電極のギャップ間に捕集される微生物数が増加すると、その捕集数に応じて電極間のインピーダンスが変化する。
【００２１】
従って、電極間インピーダンス時間変化の傾きは、単位時間当たりに電極ギャップ間に捕集される微生物数に応じた値となり、傾きの大きさは試料液中の微生物濃度に対応する。よって、電極間インピーダンス時間変化の傾きを測定することで、試料液中の微生物濃度、言い換えれば微生物数を測定することが可能となる。
【００２２】
更に、ＤＥＰＩＭ法では、誘電泳動を開始直後のインピーダンス時間変化の傾きから微生物数を定量することで、短時間での微生物測定を実現している。以上、ＤＥＰＩＭ法の測定原理について概説したが、詳しくは非特許文献２を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１７７８１５号明細書
【特許文献２】特許第２９８７２０１号明細書
【特許文献３】特開２０００−１２５８４６号公報
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Hywel Morgan、他：「AC Electrokinetics:colloids and nanoparticles」、RESERCH STUDIES PRESS LTD.2003年出版、pp.15〜63
【非特許文献２】J.Suehiro, R.Yatsunami, R.Hamada, M,Hara，J.Phys. D: Appl. Phys. 32(1999)2814-2820
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
一般に、測定装置が使用される環境は様々であり、微粒子測定装置も例外ではない。特に、環境温度（室温）は空調の有無などによって大きく変わる因子であり、０℃〜４０℃程度の範囲で変わる可能性は十分にある。
【００２６】
一方、液体の粘度は、温度によって変化することが一般に知られており、微粒子が懸濁された液体（以下、試料液と呼ぶ）の粘度が変化することで、微粒子に働く誘電泳動力と粘性力のバランスに変化が生じるため、環境温度によって測定結果に差異が生じ、微粒子測定結果の精度が低下するという問題がある。また、物質の比誘電率および導電率は、温度によって変化することが一般に知られており、この温度変化によって誘電泳動力が変化し、同様に微粒子測定結果の精度が低下するという問題がある。
【００２７】
しかしながら、特許文献１〜３においては、これら問題を解決する手段については、開示も示唆もされていない。
【００２８】
本発明の目的は、上記事情に鑑みてなされたものであって、微粒子測定装置が設置された環境温度あるいは、試料液の温度によって測定結果に変動が無く、必要十分な精度で測定することが可能な微粒子測定装置および微粒子測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明者らは、微粒子を誘電泳動する際に、溶液の温度変化に伴い電極にトラップされる微粒子の量的な変化が生じることを見出した。すなわち、溶液温度の変化に伴い、溶液粘度が変化することによって、微粒子に生じる誘電泳動力と粘性力が相対的に変化する結果、電極へトラップされる微粒子量が変化する。あるいは、溶液温度の変化に伴い、溶液と微粒子の複素誘電率が変化することによって、微粒子に働く誘電泳動力が変化し、電極へトラップされる微粒子量が変化する。トラップされる微粒子量が変わると、測定される応答も変化する。溶液温度とトラップ量の関係を定量化すれば、溶液に含まれる微粒子濃度を正確に推定できることが明らかとなった。本発明は、かかる知見に基づき達成されたものである。
【００３０】
本発明に係る微粒子測定装置は、微粒子含有の試料液を導入するセルと、前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に設けられた少なくとも一対の電極と、前記電極間に、交流電界を発生するための電圧を印加する泳動電源部と、前記交流電界によって誘起された誘電泳動力によって移動した微粒子による電磁気的な変化を測定する測定部と、温度を検出する温度検出手段と、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が検出した結果に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定する制御演算部と、を備える。
【００３１】
この構成によれば、温度変動によって微粒子に働く誘電泳動力およびその他全ての力のバランスが変化した場合にも、補正によってその影響をキャンセルすることができるため、様々な環境温度でも正しい測定結果を提示することが可能な微粒子測定装置を実現できる。
【００３２】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記温度検出手段が、前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に設けられ、前記制御演算部が、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が検出した試料液の温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである。
【００３３】
この構成によれば、試料液の温度を直接測定できるので、溶液温度に依存する、微粒子に働く力の変化を正確に補正することができ、高精度な微粒子測定装置を実現することができる。
【００３４】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記温度検出手段が、前記電極が形成された基板上の前記試料液に浸漬される位置に設けられ、前記制御演算部が、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が測定した試料液の温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである。
【００３５】
この構成によれば、電極チップ上に誘電泳動を行う電極と、温度測定を行う温度検出手段を共存させることができるため、配線を行うためのコネクタを１つにすることができるため、簡易な構造で、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定装置を実現することができる。
【００３６】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記温度検出手段が、前記セルの壁面外側に接する位置に設けられ、前記制御演算部が、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が測定した前記セルの温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである。
【００３７】
この構成によれば、温度検出手段が直接試料液に接しないため、腐蝕や劣化が防げるし、測定対象が微生物であり、汚染を考慮してセルを使い捨てにする場合であっても、温度検出手段の汚染が防げ、温度検出手段を繰り返し使用することができるため、１回の測定にかかる費用を抑えつつ、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定装置を実現することができる。
【００３８】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記セルの壁面の一部に端子を備え、前記端子が、前記セル内部で前記電極に電気的に接続され、前記セル外部で前記泳動電源部および前記測定部に電気的に接続され、かつ、前記端子が、前記セル内部で前記試料液に接し、前記セル外部では前記温度検出手段に接するものである。
【００３９】
この構成によれば、電極を電気的に接続する端子と、試料液の温度を検出するための端子を共用としているため、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定装置のセル構造を簡略化できる。
【００４０】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記端子が、低電気抵抗かつ高熱伝導率であるものである。
【００４１】
この構成によれば、セル外部に設けた温度検出手段を用いて、セル内部の試料液温度をより正確に検出できるため、異なる温度条件においてもより正確な結果を提示可能な粒子測定装置を実現することができる。
【００４２】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記温度検出手段が、前記電極間に温度測定電圧が印加された場合に前記測定部が測定した結果から試料液の温度を推定することにより、温度を検出するものである。
【００４３】
この構成によれば、誘電泳動を行う電極が温度検出手段を兼ねる構成で実現できるため、装置の構成が簡素化され、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定装置を実現することができる。
【００４４】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記制御演算部が、前記温度検出手段が測定した温度に基づき、前記電極間に印加する交流電圧の振幅あるいは周波数を決定するものである。
【００４５】
この構成によれば、試料液の温度に応じて十分かつ一定の誘電泳動力を作用させる電圧値を選択することにより、常に高いＳ／Ｎで測定することができるため、より高精度な微粒子測定を実現できる。
【００４６】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記制御演算部が、前記測定部が測定した結果に対し、前記測定部が当該測定を行った時点における前記温度検出手段による温度検出結果に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである。
【００４７】
この構成によれば、電磁気的な変化の測定時点における温度を測定することによって、リアルタイムの温度変化に基づいた補正を行うことができるため、測定途中で試料液の温度が変化する場合にも、正確な測定結果を提示することが可能な微粒子測定装置を実現できる。
【００４８】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に温度検出手段として更に少なくとも１極の温度検出用電極を備え、温度検出用電極は前記測定部に接続され、前記測定部は温度検出用電極のインピーダンスを測定し、前記制御演算部は、温度検出用電極のインピーダンスから前記試料液の温度を測定する。
【００４９】
この構成によれば、リアルタイムの温度測定を実現することが可能な微粒子測定装置を実現できる。
【００５０】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、微粒子含有の試料液に浸漬した一対の電極間に発生させた交流電界によって誘起された誘電泳動力によって移動した前記微粒子による電磁気的な変化を測定することにより、前記試料液中における微粒子を測定する微粒子測定方法であって、温度を検出する温度検出ステップと、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した温度に基づく補正処理を行う補正処理ステップと、を有する。
【００５１】
この構成によれば、温度変動によって微粒子に働く誘電泳動力およびその他全ての力のバランスが変化した場合にも、補正によってその影響をキャンセルすることができるため、様々な環境温度でも正しい測定結果を提示することが可能な微粒子測定方法を実現できる。
【００５２】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記試料液の温度を検出し、前記補正処理ステップが、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した試料液の温度に基づく補正処理を行うものである。
【００５３】
この構成によれば、試料液の温度を直接測定できるので、溶液温度に依存する、微粒子に働く力の変化を正確に補正することができ、高精度な微粒子測定方法を実現することができる。
【００５４】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記試料液の温度を、誘電泳動を行う電極基板上で検出するものである。
【００５５】
この構成によれば、電極チップ上に誘電泳動を行う電極と、温度測定を行う温度検出手段を共存させることができるため、配線を行うためのコネクタを１つにすることができるため、簡易な構造で、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定方法を実現することができる。
【００５６】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記試料液が貯留された、セルの温度を検出し、前記補正処理ステップが、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した前記セルの温度に基づく補正処理を行うものである。
【００５７】
この構成によれば、温度検出手段が直接試料液に接することなく試料液温度を検出できるため、腐蝕や劣化が防げるし、測定対象が微生物であり、汚染を考慮してセルを使い捨てにする場合であっても、温度検出手段の汚染が防げ、温度検出手段を繰り返し使用することができるため、１回の測定にかかる費用を抑えつつ、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定方法を実現することができる。
【００５８】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記試料液が貯留されたセルの壁面の一部に設けられた、端子の温度を検出し、前記補正処理ステップが、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した前記端子の温度に基づく補正処理を行うものである。
【００５９】
この構成によれば、電極を電気的に接続する端子と、試料液の温度を検出するための端子を共用としているため、簡略なセル構造で、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定方法を実現できる。
【００６０】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップが、前記電極間に、温度測定のための電圧を印加するステップと、前記電極間のインピーダンスを測定した結果から、試料液温度を推定するステップと、を含み、前記補正処理ステップが、前記電極間に、誘電泳動のための電圧を印加するステップと、誘電泳動によって前記微粒子を所定位置に配置し、電磁気的な変化を測定するステップと、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記推定した試料液温度に基づく補正処理を行うステップと、を含む。
【００６１】
この構成によれば、誘電泳動を行う電極が温度検出手段を兼ねる構成で実現できるため、異なる温度条件においても正確な結果を提示可能な粒子測定方法を簡易な装置で実現することができる。
【００６２】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップで測定した温度に基づいて前記電極間に印加する誘電泳動のための電圧の振幅あるいは周波数を決定する。
【００６３】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記温度検出ステップを実施した時点において、前記電磁気的な変化の測定を行うステップを有し、前記補正処理ステップが、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、当該測定時点において検出した温度に基づく補正処理を行うものである。
【００６４】
この構成によれば、電磁気的な変化の測定時点における温度を測定することによって、リアルタイムの温度変化に基づいた補正を行うことができるため、測定途中で試料液の温度が変化する場合にも、正確な測定結果を提示することが可能な微粒子測定方法を実現できる。
【発明の効果】
【００６５】
本発明に係る微粒子測定装置および微粒子測定方法によれば、温度変動によって微粒子に働く誘電泳動力およびその他全ての力のバランスが変化した場合にも、補正によってその影響をキャンセルすることができるため、様々な環境温度でも正しい測定結果を提示することが実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図
【図２】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置の電極チップを説明するための概略図
【図３】本発明の実施形態において測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す図
【図４】本実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図５】本発明の第２の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図
【図６】本発明の第２の実施形態にかかる温度検出手段の概略図
【図７】本発明の第２の実施形態にかかる温度検出手段のもう一つの概略図
【図８】本発明の第３の実施形態にかかる電極チップの概略図
【図９】本発明の第４の実施形態にかかるセルと温度検出手段の第一の概略図
【図１０】本発明の第４の実施形態にかかるセルと温度検出手段の第二の概略図
【図１１】本発明の第５の実施形態にかかるセルと温度検出手段の概略図
【図１２】本発明の第６の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成
【図１３】試料液２の温度に対する電極チップ３上の電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス変化を、試料液２の温度が２５℃の時の値で規格化してプロットしたグラフ
【図１４】本発明の第７の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図１５】本発明の第８の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図１６】本発明の第８の実施形態にかかるキャパシタンスの経時変化を表すグラフ
【図１７】本発明の第８の実施形態にかかる補正後のキャパシタンス経時変化を表すグラフ
【図１８】本発明の第９の実施形態の微粒子測定装置における電極チップ３を示す概略図
【図１９】本発明の実施例１にかかる環境温度とキャパシタンス傾きを表すグラフ
【図２０】本発明の実施例１にかかる環境温度と補正係数を表すグラフ
【図２１】本発明の実施例２にかかる環境温度毎の補正前キャパシタンス傾きを現すグラフ
【図２２】本発明の実施例２にかかる環境温度毎の補正後キャパシタンス傾きを現すグラフ
【図２３】本発明の実施例１にかかる光学的な測定手段を説明するための構成図
【図２４】本発明の第１の実施形態にかかる誘電泳動で配置された微粒子を説明するための図
【発明を実施するための形態】
【００６７】
（第１の実施形態）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。図１は、本実施形態の微粒子測定装置の構成図、図２は、本実施形態の微粒子測定装置の電極チップを表す概略図である。
【００６８】
図１において、１は測定対象の微粒子が含まれる試料液２を保持するセル、３は誘電泳動で微粒子を捕集する電極対を含む電極チップ、４は泳動電源部、５は電極間インピーダンスを測定する測定部、６は微粒子測定装置全体の制御やインピーダンス算出などの演算行う制御演算部、７は溶液の攪拌を行う攪拌手段、８は温度を検出するための温度検出手段である。
【００６９】
図２において、１０は基板、１１ａ、１１ｂは基板１０上に形成され一対の極をなす電極である。基板１０には、金属などの導電性材料によって電極１１ａ、１１ｂのパターンが形成される。
【００７０】
電極１１ａ、１１ｂはその幅に対して十分に薄い薄膜であることが望ましく、例えば１００μmの幅に対して厚さ１０００Å程度である。これにより、厚さ方向で見たエッジ部分に不平等電界が形成され、微粒子を効率的に誘電泳動することが可能となる。
【００７１】
図３は、測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す。本実施の形態では測定電極１１ａ，１１ｂの端面で電界集中が最も大きいため、ギャップ１３付近の構成が電界集中部にあたる。従ってギャップ１３部分にもっとも強く微粒子が泳動される。
【００７２】
本実施の形態では、基板１０は、セル１とは分離した形態となっているが、基板１０をセル１の壁面の一部として一体にしてもよい。
【００７３】
また、電極１１ａ、１１ｂの平面パターンは、そのギャップ１３間に誘電泳動により微粒子を捕集し、捕集した微粒子によるインピーダンス変化を効率よく測定可能な形状でパターニングされる。具体的には、例えば、図２に示すような、電極１１ａ、１１ｂの対向部分が互いに入れ子状になった、いわゆる櫛歯形状が最も好ましい形状の一つである。
【００７４】
微粒子を効率よく捕集するためには、ギャップ１３部の面積を広くし、微粒子が電極に捕集される確率を高くする必要がある。ただし、ギャップ１３間の距離を長くすると、電極１１ａ、１１ｂ間に同じ電圧を印加したときの電界強度が低下し、誘電泳動力が弱まる結果、微粒子を効率的に捕集できなくなる。このため、ギャップ１３間距離は、例えば１〜１００μｍ程度に狭くすることが望ましい。
【００７５】
微粒子を効率的に捕集するためには、電極１１ａ、１１ｂが対向する対向部の長さ方向に電極パターンを伸ばすのが効果的であり、例えば２０〜１０００ｍｍ程度が望ましい。このとき、電極平面パターンを櫛歯形状にすることにより、対向部を実質的に長くすることができるし、電極パターンを微少領域に集積化が可能なため、電極チップ３を小型化することができるメリットがある。
【００７６】
以上は電極の設計を行う際の一例であって、ギャップ１３間の距離、対向部の長さ、電極の厚さやパターンは、電極１１ａ、１１ｂ間に印加する電圧、微粒子の大きさに合わせて最適な組み合わせを選択することが望ましい。
【００７７】
次に、電極チップ３の作成方法を説明する。電極チップ３は、ホウ珪酸ガラスの基板１０上に、スパッタリングや蒸着によってクロムを下地とした白金薄膜を作成した後、一般的なフォトリソグラフィーによって電極１１ａ、１１ｂのパターンを形成したものである。
【００７８】
本実施の形態における電極チップ３では、基板１０にガラスを用いたが、絶縁性の材料であればいずれも使用可能であり、例えば、ＰＥＴやポリカーボネートなどのプラスチック材料や、セラミックなど基板材料の使用を妨げるものではない。また、薄膜材料は導電性の材料であればいずれも使用可能であり、金、銀、銀などの金属粒子含有の導電性ペースト、カーボンなども選択可能である。
【００７９】
また、電極１１ａ、１１ｂのパターニングは、選択した材料で所望のパターンを形成できればフォトリソグラフィー以外も選択可能であり、レーザー加工、スクリーン印刷、インクジェット印刷など、生産性やコストなどを勘案して最も適切な加工法が選択可能である。
【００８０】
電極チップ３は、微粒子が含まれた試料液２を保持したセル１内に浸漬され、泳動電源部４および測定部５に電気的に接続される。セル１には、マグネチックスターラなどの攪拌手段７を設けることができる。
【００８１】
試料液２をセル１内で攪拌することにより、試料液２内での微粒子濃度を均一にすることができ、かつ、多くの微粒子を電極１１ａ、１１ｂのギャップ１３間に導くことができるため、より効率的に微粒子をギャップ１３間に捕集でき、測定時間の短縮や測定感度の向上が可能である。
【００８２】
また、セル１を、電極チップ３上にスペーサと蓋などを設けて作成した微小チャンバーとした場合は、攪拌手段７は微小チャンバーを含む循環流路を持つ閉流路として実現することも可能である。ペリスタポンプなどによって試料液を微小チャンバー内の電極チップ３上に循環することによって、前記マグネチックスターラによる攪拌と同様な効果を得ることが可能である。
【００８３】
泳動電源部４は、誘電泳動を行うための交流電圧を、電極１１ａ、１１ｂ間に印加する。これにより電極１１ａ、１１ｂ間に誘起された不平等電界によって微粒子を誘電泳動し、電界集中部である電極エッジを含む電極１１ａ、１１ｂ間のギャップ１３に捕集する。なお、ここで交流電圧というのは、正弦波のほか、ほぼ一定の周期で流れの向きを変える電圧のことであり、かつ両方向の電流の平均値がほぼ等しいものである。
【００８４】
測定部５は、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを算出するために必要な測定を行う。測定部５は、具体的には、電極１１ａ、１１ｂ間に流れる電流値と、泳動電源部４が印加した電圧と電流の位相差を測定するための回路等から構成される。測定部５は、誘電泳動によって微粒子が移動し電界集中部近傍であるギャップ１３に濃縮されることに起因する電極１１ａ、１１ｂ間の電流および位相差の変化を測定する。測定部５で測定した電流値と位相差は、制御演算部６に渡される。
【００８５】
制御演算部６は、図示しないマイクロプロセッサと、予め設定されたプログラムやデータテーブルなどを保存するためのメモリ、タイマー等から構成され、前記プログラムおよびデータテーブルに従い泳動電源部４を制御する。泳動電源部４は、制御演算部６の制御に従って、電極１１ａ、１１ｂ間に特定の周波数と電圧をもった交流電圧を印加する。
【００８６】
さらに制御演算部６は、測定部５と信号の送受信を行ない、測定部５が測定した電流値と位相差のデータを受け取る。制御演算部６は、これら電圧、電流、位相差、周波数のデータから、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを算出し、結果を逐次メモリに格納する。
【００８７】
制御演算部６は、これら一連の測定動作を、予め設定されたプログラムに従って一定の時間間隔毎に行い、定められた時間が経過すると、泳動電源部４を制御し、電極１１ａ、１１ｂ間への電圧印加を停止して、測定動作を終了する。
【００８８】
次に、制御演算部６は、メモリに格納されたインピーダンス測定結果から、インピーダンス時間変化の傾きを算出する。メモリ中のデータテーブルには、与えられた電圧や周波数、微粒子種など毎に、検量線データが格納されている。制御演算部６は、算出したインピーダンス時間変化の傾きと検量線を比較することで、試料液中に含まれる微粒子濃度を算出し、メモリへの結果格納、あるいはＬＣＤなどの表示手段９に結果表示を行うなどする。
【００８９】
本実施の形態では、測定結果を微粒子濃度で表すこととしているが、予め試料液の容量が規定されている場合は、微粒子数に換算して結果表示しても良い。また、使用者は測定された微粒子数を試料１ｍｌあたりの微粒子数として直接知ることができるが、表示手段９には、たとえば多いまたは少ないであるとか、目的に応じてほかの表示方法で結果表示を行っても良い。
【００９０】
さらに、試料中の微粒子数を調べて殺菌装置を制御するとか、温度などの培養条件を制御するなど、使用者が直接微粒子数を知る必要が無く、本微粒子測定装置を含む任意の装置の制御を行うために微粒子数が明らかであれば良いような場合には、表示手段は特に設ける必要がないのは言うまでもない。
【００９１】
温度検出手段８は、温度による測定結果の差異を補償するための元データとなる、環境温度を測定する。温度を測定する素子としては、必要な温度範囲（０〜５０℃程度）で必要な精度で温度測定できればいずれも使用可能であるが、本実施の形態では、ＮＴＣサーミスタを使用している。ＮＴＣサーミスタは、温度上昇と共に抵抗値が低下する一種の抵抗素子である。本実施の形態では、制御演算部６にサーミスタの抵抗値を測定する回路、および、メモリ内に抵抗値と温度を換算するテーブルを持たせている。すなわち、制御演算部６は、温度検出手段８を介して環境温度を測定する。
【００９２】
以下、温度が微粒子の測定結果に与える影響について記述する。誘電泳動を利用した微粒子検出は、誘電泳動力によって電極に微粒子をトラップすることが、直接測定応答値の大きさに影響するものであることは明らかである。ＤＥＰＩＭ法の場合、より大きな誘電泳動力を働かせることにより、より多くの微粒子を電極にトラップできる結果、電極間のインピーダンス変化もトラップされる微粒子数に比例して大きくなる。
【００９３】
一方、液体中の微粒子には、誘電泳動力以外に働く力がある。例えば重力、粘性力、抗力、ブラウン運動などである。微粒子検出の際には、誘電泳動力と、その他の力とのバランスによって、電極にトラップされる微粒子数が定まる。一般に、粘性力は液体粘度の温度依存性により温度上昇と共に低下するし、ブラウン運動は温度上昇と共に激しくなる。従って、温度変化によって電極にトラップされる微粒子数が異なり、微粒子検出の結果が変化することになる。
【００９４】
また、誘電泳動力に着目すると、前述の（数２）および（数３）から明らかなように、誘電泳動力は、溶液と微粒子の誘電率および導電率に依存することが分かる。一般に、誘電率および導電率は温度依存性を持つことが知られている。そのため、温度によって誘電泳動力も変化することになり、微粒子検出の結果に影響を与える。
【００９５】
そこで、本実施の形態では、温度検出手段８が温度を検出した結果に基づき、微粒子測定結果に補正を加えることによって、環境温度が変化しても正確な結果を提示できるようにしている。
【００９６】
具体的には、予め演算部６のメモリ内に、温度に対する補正係数を記録したテーブル（以下、補正テーブルと呼ぶ）を保存しておく。温度検出手段８を介して制御演算部６が測定した温度に基づき、制御演算部６が前記補正テーブルを参照して補正係数を決定し、インピーダンス変化の時間傾きあるいは、検量線により算出した微粒子濃度に補正係数を乗じて、最終的な測定結果として提示する。
【００９７】
補正テーブルは、微粒子に働く全ての力を含む運動方程式を立ててこれを解き、電極にトラップされる微粒子数を温度の関数として求めることで作成することができる。運動方程式は解析的に解くことは難しいため、各種シミュレーションを使うことができる。誘電泳動に関する運動の数値解析については、例えば、Ｄ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．３１（１９９８）３１６０−３１６７を参照されたい。
【００９８】
補正係数は、各温度でトラップされる微粒子数を、温度Ｔｔでトラップされる微粒子数で規格化したものの逆数とする。温度Ｔｔは、制御演算部６のメモリ内に格納された検量線データを取得した際の温度とする。こうすることにより、温度変化による測定結果の変動をキャンセルし、真の微粒子濃度を最終的な測定結果として提示することができる。
【００９９】
また、より簡易的には、以下のような実験を行い、実験的に補正テーブルを作成することも可能である。すなわち、想定される範囲の温度条件下で、同一微粒子濃度の検体を測定し、各温度での測定結果を求める。それぞれの測定結果を温度Ｔｔでの測定結果によって規格化したものの逆数を補正係数とすれば良い。
【０１００】
表１に、補正テーブルの作成例を示す。
【０１０１】
【表１】
2009093458.tif 000043
【０１０２】
αは温度Ｔの関数で、補正係数を表す。温度Ｔは、基準となる温度をＴｔとし、想定温度範囲の最も低い温度をＴｍｉｎ、最も高い温度をＴｍａｘで表す。表１の例では、補正係数を求める温度ステップは１℃としているが、これはより細かいあるいは、より粗いステップでも良い。温度ステップは、求められる測定精度に応じて、決めればよい。
【０１０３】
また、補正テーブルの代わりに、補正係数αを温度Ｔの関数として数式化し、制御演算部６がこの数式を元に補正計算を行っても良い。実験的に温度Ｔと補正係数αとの関係を求めた場合には、数式は、温度Ｔと補正係数αのプロットを、線形あるいは多項式でフィッティングした関数を用いることができる。
【０１０４】
図４は、本実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、試料の導入からセル１内の微粒子の濃縮、測定、結果提示にいたるまでの一連の流れを説明する。まず、初期状態では、セル１に測定対象の微粒子が含有された試料液を投入する（ステップＳ１１）。
【０１０５】
次いで、制御演算部６は、温度検出手段８を介して、環境温度を測定する（ステップＳ１２）。この環境温度測定結果は、制御演算部６内のメモリに一時的に蓄えられ、後に補正を行う際に参照される。
【０１０６】
次に、制御演算部６は、測定した温度を、予めメモリ内に記憶された温度範囲（以下、測定温度範囲と呼ぶ）と比較し、測定した温度が測定温度範囲外か、すなわちエラーか、を判断する（ステップＳ１３）。測定温度範囲は、通常測定装置が使用されると思われる温度範囲を設定しておけばよく、例えば、室内での使用を鑑み０℃〜５０℃とする。比較した結果、測定温度範囲を逸脱していれば（ステップＳ１３：Ｙｅｓ）、ステップＳ１４に進み、測定温度範囲外である旨、エラー表示を行い、ステップＳ２３に進み測定動作を終了する。
【０１０７】
比較した結果、測定温度範囲内であれば（ステップＳ１３：Ｎｏ）、制御演算部６は、補正テーブルを参照し、電極に印加すべき電圧振幅値および周波数を選択し、電極１１ａ、１１ｂ間へ電圧印加を開始する（ステップＳ１５）。この場合の電圧振幅値および周波数は、微粒子をギャップ１３にトラップするために十分な誘電泳動力が働くような値を選択すればよく、本実施の形態では１０Vｐ−ｐ、１００KHｚとしている。
【０１０８】
電極１１ａ、１１ｂ間に所定の電圧が印加されると、測定部５は、直ちに電圧印加直後の初期状態のデータとして、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定し、測定結果は、制御演算部６に渡され、メモリに初期のインピーダンス値として保存される（ステップＳ１６）。
【０１０９】
次に、制御演算部６は、図示しない時計手段によって所定の時間が経過するまで待つ（ステップＳ１７）。この時、泳動電源部４は電圧印加を保持したままである。
【０１１０】
所定の時間が経過すると、制御演算部６は所定の測定回数が満了したかを判断し（ステップＳ１８）、満了していなければステップＳ１６に戻る。ステップＳ１６に戻り、制御演算部６は、測定部５に命じて、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定させ、その結果をメモリ６ａに所定時間経過後の結果として保存する。
【０１１１】
所定の測定回数が満了した場合（ステップＳ１８：Ｙｅｓ）、制御演算部６は泳動電源部４に電圧印加を止めるよう指示する（ステップＳ１９）。
【０１１２】
電圧印加を停止後、制御演算部６は、メモリに保存された、電極１１ａ、１１ｂ間インピーダンスの経時変化データから、インピーダンス変化の傾きを算出する（ステップＳ２０）。
【０１１３】
次いで、制御演算部６は、補正テーブルより参照して、ステップＳ１２で測定した温度に対応する補正係数を、ステップＳ２０で求めたインピーダンス傾きに乗じる。例えば、温度測定結果がＴｔ＋１（℃）であれば、補正係数はα（Ｔｔ＋１）となる。微粒子濃度の算出は、メモリに予め保存された、検量線から求める（ステップＳ２１）。この検量線としては、微粒子濃度が明らかな校正用試料を、本実施の形態で説明した微粒子測定装置の測定系を用いて予め測定し、その時の微粒子数とインピーダンス変化の相関関係からばらつきを回帰分析して得られる曲線をあらわす関数を使用する。校正用試料の測定の際、温度は、補正係数を求める際に規格化を行う温度Ｔｔの条件にて測定を行う。
【０１１４】
制御演算部６は、ステップＳ２１で算出した結果を表示手段９に表示させ（ステップＳ２２）、一連の測定動作を終了する。尚、本実施の形態では、補正係数αをインピーダンス傾きに乗じて補正を行ったが、検量線から微粒子濃度を求めた後に補正を行うことによっても、全く同様な補正効果を得られる。また、温度測定はステップＳ１３で行ったが、温度測定は補正テーブルを参照するステップＳ２１までの任意のタイミングで測定可能である。
【０１１５】
本実施の形態では、測定部５は、誘電泳動で電極に微粒子をトラップした場合のインピーダンス変化を測定することで微粒子濃度を測定しているが、測定部５としては、誘電泳動によって微粒子を所定位置に移動したことを、何らかの手段で測定する測定装置および測定方法であればいずれも適用可能である。
【０１１６】
例えば、測定部５を電磁気的な手段、代表的には顕微鏡などの光学的な手段で測定することで、電極間にトラップされた微粒子を測定することが可能である。図２３は、測定部５を光学的測定で実現した場合の構成図である。図２３において、２００は測定対象の微粒子で、電極１１ａ，１１ｂによって形成される不平等電界によって、所定の位置に移動する。２０１は光源、２０２は光源２０１が照射した光を受ける受光部である。光源２０１および受光部２０２の光軸は、微粒子２００が誘電泳動によって移動する箇所を横切るように設置される。
【０１１７】
セル１は、基板１０と、カバー２０３および、スペーサ２０４から構成され、これらによって形成される空間に試料液２が充填される。また、カバー２０３およびスペーサ２０４は、光源２０１が照射した光を透過し、誘電泳動された微粒子が観察できるよう、ガラスやＰＥＴ樹脂など、透明な材料を用いる。
【０１１８】
図２４（ａ）は正の誘電泳動によって電極１１ａ，１１ｂ間に微粒子２００がトラップされる様子、図２４（ｂ）は負の誘電泳動によって電極１１ａ，１１ｂ間のギャップ１３に微粒子２００が配置される様子を示す。正の誘電泳動の場合、電界集中部である電極エッジ部に数珠状に連なった形状（以下、パールチェインと呼ぶ）で配列される。負の誘電泳動の場合、弱電界部であるギャップ１３の中心部にパールチェインで配列される。この時、ギャップ１３にトラップされた微粒子２００を、光源２０１と受光部２０２から構成される光学系で撮像し、制御演算部６が画像解析を行い、ギャップ１３に配列された微粒子２００の個数、投影面積などを算出する。この算出は、電極１１ａ，１１ｂ間の電界印加から一定時間後、あるいは電界印加からの所定時間が経過する毎に行う。このように、試料液２中の微粒子数や微粒子濃度、微粒子同士の結合の度合いを測定する。
【０１１９】
誘電泳動によってギャップ１３に配列される微粒子数、あるいは形成されるパールチェイン数は、当然ながら、誘電泳動力と粘性力その他の力のバランスによって決まり、それらの力が温度によって変化するため、温度による補正が必要となる。本実施の形態では、誘電泳動とインピーダンス測定にて微粒子濃度を測定する場合の補正係数の求め方を示したが、それぞれの測定手段に応じて、実験的に補正係数のテーブルや関数を作成することが可能であり、誘電泳動を利用したあらゆる微粒子測定装置、微粒子測定方法に適用が可能である。
【０１２０】
以上、本実施の形態によれば、温度変動によって微粒子に働く誘電泳動力およびその他全ての力のバランスが変化した場合にも、補正によってその影響をキャンセルすることができるため、様々な環境温度に設置された微粒子測定装置でも正しい測定結果を提示することができる。
【０１２１】
（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１と同様な構成については説明を省略する。
【０１２２】
図５は、本実施形態の微粒子測定装置の構成図である。試料液２内の微粒子に働く力の温度による変化は、直接は試料液２の温度に依存する。従って、環境温度よりも試料液２の温度の測定結果に基づいて補正を行った方が、精度良く補正を行うことができる。そこで、本実施の形態では、温度検出手段８がセル１の試料液２内に配置されており、試料液２の温度を測定できる構成となっている。
【０１２３】
図６は、セル１内に温度検出手段８として、チップ型のサーミスタ６０を、セル１の試料液２側の表面に配置した模式図である。温度検出手段８は、試料液２内のいずれかに配置されていれば試料液２の温度測定が可能である。しかし、試料液２の流動などによってサーミスタ６０が動揺すると、温度測定にノイズが加わる恐れがあるため、本実施形態では、サーミスタ６０をセル１の壁面に固定している。
【０１２４】
６１はサーミスタ６０の電気的な接続極、６２はセル１の壁面に設けられた電気的な配線で、一般的な電子回路配線に用いられる銅箔パターンなどで構成され、セル１外の制御演算部６とサーミスタ６０を電気的に接続している。６３は、サーミスタ６０の接続極６１と配線６２を電気的に接続する導電体であり、電気的な導通とサーミスタ６０の固定が同時にできるため、半田を用いることが望ましい。
【０１２５】
サーミスタ６０は、図７のように、セル１の試料液２側の壁面に埋め込まれる構成にしても良い。この場合、配線６２もセル１内に埋め込まれており、サーミスタ６０を挿入したときに電気的な接続および機械的な固定ができるようなスペースをセル１内に有している。
【０１２６】
以上、本実施の形態によれば、セル１内の試料液２の温度を直接測定できるので、溶液温度に依存する、微粒子に働く力の変化を正確に補正することができ、高精度な微粒子測定装置を実現することができる。
【０１２７】
（実施の形態３）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜２と同様な構成については説明を省略する。
【０１２８】
図８は、本実施の形態を示す、電極チップ３の概略図である。電極チップ３の基板１０の表面上、試料液２に電極チップ３を含浸した際に試料液２内に浸かる位置に温度検出手段８が配置される。本実施の形態では、温度検出手段８にサーミスタを用いており、図６と同様な方法で固定および電気的な接続を行っている。温度検出手段８および、電極１１ａ、１１ｂは、配線６２を介してパッド８０ａ、８０ｂ、８１ａ、８１ｂに接続される。パッド８０ａ、８０ｂは、電極１１ａ、１１ｂの電気的接続を担い、パッド８１ａ、８１ｂは、温度検出手段８の電気的接続を担っている。パッド８０ａ、８０ｂ、８１ａ、８１ｂは、電極チップ３を挿入するコネクタ端子のピッチに合うように設計され、パッド８０ａ、８０ｂはそれぞれ泳動電源部４および測定部５へ、パッド８１ａ、８１ｂは制御演算部６に電気的に接続される。
【０１２９】
以上、本実施の形態によれば、電極チップ３上に誘電泳動を行う電極と、温度測定を行う温度検出手段を共存させることにより、配線を行うためのコネクタを１つにすることができるため、簡易な構造で粒子測定装置を実現することができる。
【０１３０】
（実施の形態４）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜３と同様な構成については説明を省略する。
【０１３１】
図９は、本実施の形態を表す微粒子測定装置の概略図である。セル１の外側、試料液２と接しない側の壁面に、温度検出手段８が接する構造を有しており、セル１の温度を測定できる構成になっている。
【０１３２】
本実施の形態では、セル１はプラスチック、温度検出手段８はサーミスタを使用している。通常、セル１は、試料液２を内部に貯留した形で保存されているため、試料液２とセル１は等温になっていると考えられる。このため、温度検出手段８をセル１の壁面に接するようにすれば、間接的に試料液２の温度を測定することが可能である。更に、温度検出手段８とセル１の間に熱伝導を助ける、シリコーングリスを塗布することで、より正確に試料液２の温度を検出することが可能になる。
【０１３３】
試料液２の温度をより正確に反映する必要があれば、セル１の材料を熱伝導率の高いものにすると良い。例えば、銀や銅などの金属材料などである。セル１のコストや廃棄が問題になるのであれば、図１０に示すように、セル１の壁面の一部に熱伝導率の高い熱伝達部１００を設け、熱伝達部１００と温度検出手段８を接触させることも可能である。
【０１３４】
以上、本実施の形態によれば、温度検出手段が直接試料液に接しないため、腐蝕や劣化が防げる。また、測定対象が微生物であり、汚染を考慮してセルを使い捨てにする場合であっても、温度検出手段の汚染が防げ、温度検出手段は繰り返し使用することができるため、１回の測定に掛かる費用を抑えることができる。
【０１３５】
（実施の形態５）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜４と同様な構成については説明を省略する。
【０１３６】
図１１は、本実施の形態を表す微粒子測定装置の概略図である。セル１の壁面に接続端子１１０が埋め込まれている。接続端子１１０は、セル１の試料液２に接する側（以下、内側と呼ぶ）と、セル１の試料液２に接しない側（以下、外側と呼ぶ）の両方に露出面を持つ。接続端子１１０は、低い抵抗率と高い熱伝導率を持つ材料が望ましく、本実施の形態では銅を用いている。
【０１３７】
接続端子１１０は、セル１の内側で、電極チップ３上に形成された、誘電泳動を誘起するための電極１１ａ、１１ｂに電気的に接続される。接続端子１１０はセル１の外側で、接触端子１１１を介して、泳動電源部４および測定部５に電気的に接続される。つまり、接続端子１１０は、電気的には、電極基板３上に形成された電極１１ａ、１１ｂと泳動電源部４および測定部５を接続するための中継機能を果たしている。
【０１３８】
接続端子１１０のセル１の外側の露出面に、温度検出手段８が接しており、温度検出手段８が接続端子１１０の温度を測定することで、間接的に試料液２の温度を測定出来る構成になっている。つまり、接続端子１１０は、熱的には、試料液２の温度を温度検出手段８に伝える中継機能を果たしている。
【０１３９】
以上、本実施の形態によれば、電極を電気的に接続する端子と、試料液の温度を検出するための端子を共用としているため、セルの構造を簡略化できる。
【０１４０】
（実施の形態６）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜５と同様な構成については説明を省略する。図１２は、本実施形態の微粒子測定装置の構成図である。
【０１４１】
図１２において、１は測定対象の微粒子が含まれる試料液２を保持するセル、３は誘電泳動で微粒子を捕集する電極対を含む電極チップ、４は泳動電源部、５は電極間インピーダンスを測定する測定部、６は微粒子測定装置全体の制御やインピーダンス算出などの演算を行う制御演算部、７は溶液の攪拌を行う攪拌手段である。
【０１４２】
本実施の形態では、誘電泳動で微粒子を捕集する電極チップ３が温度検出手段を兼ねる構成となっている。以下、電極チップ３で温度を検知する方法について説明する。
【０１４３】
図１３は、試料液２の温度に対する電極チップ３上の電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス変化を、試料液２の温度が２５℃の時の値で規格化してプロットしたグラフである。この時、試料液２中には微粒子は含まれていない。図１３中、１のプロットは電極インピーダンスの抵抗成分の逆数であるコンダクタンスＧＡ、２のプロットは電極インピーダンスの容量成分であるキャパシタンスＣＡの変化を示す。コンダクタンスは温度上昇に対して単調増加、キャパシタンスは温度上昇に対して単調減少している。
【０１４４】
このことから、試料液２のインピーダンス測定から、試料液２の温度を推定することが可能である。具体的には、制御演算部６内のメモリにコンダクタンスＧＡまたはキャパシタンスＣＡと、試料液２の温度とを関係付けしたテーブルを設けることにより、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス測定より試料液２の温度測定が可能である。あるいは、試料液２の温度とＧＡあるいはＣＡの関係から、適当な近似式を求めておき、その近似式を用いて計算することも可能である。図１３のプロットから、直線近似でほぼ近似できることが分かる。
【０１４５】
電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス測定から温度を測定する際に電極１１ａ、１１ｂ間に印加する電圧（以下、温度測定電圧と呼ぶ）は、誘電泳動を行う際の電圧（以下、誘電泳動電圧と呼ぶ）よりも低く、誘電泳動を生じさせない程度の電圧とすることが望ましい。なぜならば、温度測定電圧を印加することによって微粒子に誘電泳動が生じると、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスに変化が生じるため、正確な温度推定が行えないからである。このため、本実施の形態では、温度測定電圧は誘電泳動電圧の５分の１であることが望ましく、誘電泳動電圧は１０Ｖｐ−ｐ、温度測定電圧は２Ｖｐ−ｐとしている。
【０１４６】
また、温度推定を行うためのインピーダンス測定は、キャパシタンスの値を用いるほうが好ましい。なぜならば、電極１１ａ、１１ｂ間のコンダクタンスは、試料液２の導電率によって変化するものであり、試料液２の導電率は測定に供する検体によって異なるため、異なる導電率の試料液２に対してそれぞれテーブルが必要となり、温度推定が困難になるからである。従って、本実施の形態では温度推定に用いるインピーダンス測定値にキャパシタンスを用い、測定結果の補正を行う。
【０１４７】
以上、本実施の形態によれば、誘電泳動を行う電極が、温度検出手段を兼ねる構成で実現できるため、微粒子測定装置の構成が簡素化され、低コストな微粒子測定装置を実現することができる。
【０１４８】
（実施の形態７）
以下、本発明の実施の形態７の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。本実施の形態７では、誘電泳動を行う前の試料液２の温度測定結果から、誘電泳動を行うための電圧値を設定することで、試料液２の温度に依らず一定の測定結果を得られる構成としている。
【０１４９】
図１４は、本実施の形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、一連の測定の流れを説明するが、実施の形態１と重複する部分については説明を省略する。
【０１５０】
ステップＳ２４において、制御演算部６は、メモリ内のテーブルあるいは関数を参照し、ステップＳ１２の温度測定結果に対応する電圧振幅値および周波数を決定する。この時制御演算部６が決定する電圧振幅値あるいは周波数は、想定された環境温度の範囲内において、試料液２中の測定対象微粒子に働く誘電泳動力が十分大きくかつ一定になるような条件をテーブルあるいは関数化しておく。
【０１５１】
次いで、制御演算部６は、ステップＳ２４で決定した電圧を電極１１ａ、１１ｂ間に印加する（ステップＳ１５）。ステップＳ２０で、インピーダンス傾きを算出するが、測定対象微粒子に働く誘電泳動力が一定になるため、インピーダンス傾きは温度に依存せず、試料液２中に含まれる測定対象微粒子の濃度にのみ依存する。従って、温度に基づく補正を行う必要は無く、ステップＳ２２で制御演算部６はメモリ中に保存されている検量線から試料液２中の微粒子濃度などの結果出力を表示手段９に指示し、測定を完了する。
【０１５２】
試料液２の温度によって誘電泳動力が低下した場合、得られるインピーダンス傾きも小さくなるため、小さなインピーダンス傾きを基に補正を行った場合は十分なＳ／Ｎが得られない場合がある。本実施の形態によれば、試料液２の温度に応じて十分かつ一定の誘電泳動力を作用させる電圧値を選択することにより、常に高いＳ／Ｎで測定することができるため、より高精度な微粒子測定を実現することができる。
【０１５３】
（実施の形態８）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、実施の形態１〜７と同様な構成については説明を省略する。
【０１５４】
上述した各実施の形態の微粒子測定装置において、誘電泳動で試料液２中の微粒子を電極１１ａ、１１ｂ間に捕捉しながらインピーダンス測定することを考えると、誘電泳動を行っている最中に試料液２の温度が変化することが考えられる。例えば、試料液２を１０℃程度で冷蔵保存しておき、その試料液２を室温２５℃の環境に移して即、測定を開始することを想定すると、試料液２の温度は、１０℃から平衡の約２５℃に達するまで上昇する。
【０１５５】
この場合、ある一時点で測定した温度を元に測定結果の補正を行えば、ある一時点での試料液２の温度と、実際に誘電泳動されている時点で試料液２の温度に乖離が生じ、正確な補正ができないという問題がある。
【０１５６】
そこで、本実施の形態では、制御演算部６がインピーダンスを測定する際に、ほぼ同時に温度検出手段８から温度情報を取得し、リアルタイムに測定した試料液２の温度情報を元に、より正確な補正を行う。
【０１５７】
図１５は本実施の形態を示すフローチャートである。ステップＳ１６とステップＳ１７の間にステップＳ３０として温度測定を行う点、ステップＳ２０でインピーダンス傾きを算出する際に同時に図４のステップＳ２１に相当する補正を行う点以外は、実施の形態１のフローチャート（図４）と同様である。本実施の形態では、ステップＳ１６でインピーダンス測定を行った直後にステップＳ３０で、温度測定を行い、制御演算部６は、インピーダンス測定結果および温度測定結果を、同じ時間タイミングの結果として、メモリに保存する。例えば、表２に示すように、時間とキャパシタンスＣと温度Ｔとを関連付けた形式でデータを保存しておく。
【０１５８】
【表２】
2009093458.tif 000044
【０１５９】
本実施の形態では、温度測定はインピーダンス測定の直後であったが、ステップＳ１６とステップＳ３０とを入れ替えて、温度測定の直後にインピーダンス測定を行っても良い。インピーダンスを測定した時点の温度を測定することが肝要である。
【０１６０】
表２において、ｔｅは測定時間である。この例では、キャパシタンスを測定しているが、インピーダンスあるいはコンダクタンスでも良く、測定間隔は１秒毎となっているが、任意の測定間隔に設定可能である。
【０１６１】
予め設定された測定回数（測定時間に相当する）を完了し、ステップＳ１９で電圧印加停止した後、制御演算部６は、ステップＳ２０でインピーダンスの時間傾きを算出する。この時、保存したインピーダンスと温度のデータとを用いてインピーダンス傾きの補正を行う。以下、補正の方法について説明する。
【０１６２】
図１６は、横軸に時間ｔを取り、縦軸にインピーダンスの代表としてキャパシタンスＣを取り、誘電泳動で微粒子を捕捉しながらインピーダンス測定を行った時の、キャパシタンスＣの変化をプロットしたものである。添え字ｎは任意の整数である。グラフ中、時間ｔｎ−１からｔｎになったとき、キャパシタンスＣｎ−１はからＣｎに、温度はＴｎ−１からＴｎに変化している。任意の時間におけるキャパシタンスＣの時間変化の傾きΔＣｎは、（数４）で表される。
【０１６３】
【数４】
2009093458.tif 000045
【０１６４】
ΔＣｎは、測定間隔の間に変化した温度の影響を含んでいるため、制御演算部６は、この時の温度変化を元に傾きを補正する。補正係数は、表１に示すようなαを用いる。補正後の傾きをΔＣ‘ｎとすると、傾きの補正は数５で表される。
【０１６５】
【数５】
2009093458.tif 000046
【０１６６】
この時、温度Ｔｎは、（数６）のように２点の平均値Ｔ‘ｎを用いることでより正確な補正を行うことができる。
【０１６７】
【数６】
2009093458.tif 000047
【０１６８】
求めた補正後の傾きΔＣ‘ｎを用いて、（数７）によって、キャパシタンスの補正値ＣＴｎを得ることができる。
【０１６９】
【数７】
2009093458.tif 000048
【０１７０】
ＣＴｎは、時間ゼロ（測定開始直後の時点）でゼロを取り、測定開始時点からのキャパシタンス変動分を示す値である。全ての測定データについてＣＴｎを求め、得られたデータのプロットを示したのが図１７である。得られたプロットから最小二乗法などによって直線１を求め、その傾きを算出し、最終的なインピーダンス傾きとして、微粒子数に換算を行い、ステップＳ２２で結果を出力して測定動作を完了する（ステップＳ２３）。
【０１７１】
以上、本実施の形態によれば、インピーダンス測定時点の温度を測定することによってリアルタイムの温度変化に基づいた補正を行うことができるため、測定途中で試料液の温度が変化する場合にも、正確な測定結果を提示することができる。
【０１７２】
（実施の形態９）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図表を用いて説明する。尚、既述の実施の形態と同様な構成については説明を省略する。本実施の形態では、測定中の試料液２の温度変化を測定する手段を、電極チップ３上に温度測定用の電極を設け、電極チップ３を簡易な構成にしつつ、リアルタイムの温度測定を実現するものである。
【０１７３】
図１８は、本実施形態の微粒子測定装置における電極チップ３を示す概略図である。図２３において、１１ｃは、試料液２に浸漬する位置において１１ａに隣接する位置に配置される第三の電極である。１１ｃの試料液２と反対側の一端には、測定部５に接続されるパッド８０ｃが設けられている。測定部５は、制御演算部６の指示により、第三の電極１１ｃと電極１１ａ間のインピーダンスを測定し、制御演算部６は測定部５のインピーダンス測定値からキャパシタンスを算出する。測定されたキャパシタンスの値は試料液２の誘電率に比例し、誘電率は前述の通り試料液２の温度を反映したものであるから、制御演算部６は第三の電極１１ｃと電極１１間のインピーダンス測定結果から試料液２の温度を測定することができる。
【０１７４】
このとき、１１ｃと１１ａ間のインピーダンスを測定するための電圧は、試料液２中の測定対象微粒子が誘電泳動あるいは電気泳動されないような電圧振幅および周波数に設定することが望ましい。これにより、電極間に微粒子が捕集されたことによって生じるインピーダンス変化に起因する温度測定誤差を回避することができる。また、誘電泳動とインピーダンス測定を行う電極１１ａを温度測定用の電極としても共用することで、温度検出手段をサーミスタなど別途も受ける必要が無く、電極チップ３および測定部５の構成を簡易にし、かつ、測定中の試料液温度測定をリアルタイムに行うことで精度の高い補正を実現することができる。
【０１７５】
尚、ここでは第三の電極１１ｃと電極１１ａ間のインピーダンスを測定することとしたが、試料液２の誘電率を正確に測定できる限りにおいては、電極１１ａ、１１ｂのどちらを対極として用いても良い。また、電極１１ａあるいは１１ｂのいずれかを温度測定用の電極として共用する構成としたが、温度測定用の電極対を別途設け、誘電泳動とインピーダンス測定を行う電極と共用しない構成とすることを妨げるものではない。
【実施例１】
【０１７６】
（補正係数の算出）
試料液の温度と、インピーダンス時間変化との関係から、補正係数を求めるために、以下の実験を行った。
【０１７７】
（１）試料液の調整
標準寒天培地（ＭＢ００１０、栄研器材（株））上で３７℃、１６時間の好気培養を行った大腸菌Ｋ−１２株（ＮＢＲＣ３３０１、製品評価技術基盤機構）をコンラージ棒で採取し、０．１Ｍ  Ｄ−マニトール溶液（導電率、約５μＳ／ｃｍ）に懸濁したものを標準試料とし、適宜希釈して６．８２×１０６ｃｆｕ／ｍｌの懸濁濃度となるように調整した。尚、懸濁濃度は、適宜希釈した標準試料を標準寒天培地状に塗抹し、３７℃、１６時間の好気培養を行った結果生育したコロニー数を計数することによって規定した。
【０１７８】
（２）測定装置
図１の測定装置を使用した。印加電圧振幅は５Ｖｐ−ｐ、周波数は１００ＫＨｚで、６０秒間のインピーダンス測定の後、キャパシタンスの傾きを測定応答とした。電極チップ３と試料液２を含むセル１は、恒温層内に静置して恒温層内温度と試料液２の温度が等しくなるようにした。温度は５℃、２５℃、４０℃の３段階とした。
【０１７９】
（３）結果
それぞれの温度で得られた測定応答を、２５℃での測定応答の値で規格化してプロットしたのが図１９である。２５℃を基準に、５℃では応答が低下し、４０℃では応答が上昇した。この要因の一つとして、試料液２の温度による粘度の変化が考えられる。試料液２の温度低下と共に粘度は高くなり、低温では微粒子に働く粘性力が大きくなるため、単位時間当たりに誘電泳動力によって電極にトラップされる微粒子数が少なくなる結果、図１９のような応答変化となっている。
【０１８０】
図２０は、図１９で示した規格化したキャパシタンス傾きの逆数をプロットしたものである。これが補正係数αに相当する。３点のプロットを多項式近似によってフィッティングしたものが曲線１である。曲線１の多項式の関数から、補正係数αを算出することが可能である。
【実施例２】
【０１８１】
（温度補正の効果確認）
実施例１で求めた補正係数αの関数を用いて、補正によって正確な測定を行えることを確認するため、以下の実験を行った。
【０１８２】
（１）試料液の調整
試料液の調整方法は、実施例１と同様である。試料液の大腸菌濃度を６．８２×１０６〜６．８２×１０７ｃｆｕ／ｍｌの懸濁濃度となるように調整を行った。
【０１８３】
（２）測定装置
測定装置および温度の条件は実施例１と同様であるため、説明を省略する。
【０１８４】
（３）結果
表３は、試料液温度が５℃、２５℃、４０℃の時の、大腸菌濃度６．８２×１０６および６．８２×１０７ｃｆｕ／ｍｌでのキャパシタンス傾きΔＣＴを示す。各大腸菌濃度において、（数８）にて平均値と最大値の比率ＥＲｍａｘを、（数９）にて平均値と最小値の比率ＥＲｍｉｎをそれぞれ求め、その百分率を誤差の大きさとして評価した。
【０１８５】
【表３】
2009093458.tif 000049
【０１８６】
【数８】
2009093458.tif 000050
【０１８７】
（数８）において、ΔＣＴmaxは各濃度におけるキャパシタンス傾きの最大値、ΔＣＴavは、各濃度のキャパシタンス傾きの平均値である。
【０１８８】
【数９】
2009093458.tif 000051
【０１８９】
（数９）において、ΔＣＴｍｉｎは各濃度におけるキャパシタンス傾きの最小値である。
【０１９０】
表３に示したように、補正を行わない場合、試料液の温度が５℃〜４０℃の範囲で変動すると、±５０％程度の大きな測定誤差を生じる。図２１は、横軸に大腸菌濃度、縦軸にキャパシタンス傾きΔＣＴをプロットした。試料液の温度によって、同じ大腸菌濃度におけるΔＣＴの値に乖離が生じているのが分かる。
【０１９１】
一方、表４は、上記の測定結果に、実施例１で求めた補正係数αを乗じて算出した、補正後のキャパシタンス傾きを示す。
【０１９２】
【表４】
2009093458.tif 000052
【０１９３】
表４に示したように、補正を行うことによって、誤差は±１〜２％程度まで抑えることができ、試料液の温度に依らない、正確な測定を行うことができる。図２２は、補正後のΔＣＴと大腸菌濃度の関係をプロットしたグラフである。図２２のグラフは、試料液温度に依らず、同じ大腸菌濃度では、ほぼ同じキャパシタンス傾きを算出できることを示している。
【０１９４】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
【０１９５】
本出願は、２００８年１月２２日出願の日本特許出願（特願２００８−０１１４４５）、に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
本発明は、異なる環境温度や、異なる温度の試料液においても、溶液に含有された微粒子数を正確に測定することができる微粒子測定装置等として有用である。
【符号の説明】
【０１９７】
１  セル
２  試料液
３  電極チップ
４  泳動電源部
５  測定部
６  制御演算部
７  攪拌手段
８  温度検出手段
９  表示手段
１０  基板
１１ａ，１１ｂ  電極
１３  ギャップ
１５  電気力線
６０  サーミスタ
６１  接続極
６２  配線
６３  導電体
８０ａ、８０ｂ、８１ａ、８１ｂ  パッド
１００  熱伝達部
１１０  接続端子
１１１  接触端子
２００  微粒子
２０１  光源
２０２  受光部
２０３  カバー
２０４  スペーサ
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子含有の試料液を導入するセルと、
前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に設けられた少なくとも一対の電極と、
前記電極間に、交流電界を発生するための電圧を印加する泳動電源部と、
前記交流電界によって誘起された誘電泳動力によって移動した微粒子による電磁気的な変化を測定する測定部と、
温度を検出する温度検出手段と、
前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が検出した結果に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定する制御演算部と、
を備える微粒子測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記温度検出手段は、前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に設けられ、
前記制御演算部は、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が検出した試料液の温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである微粒子測定装置。
【請求項３】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記温度検出手段は、前記電極が形成された基板上の前記試料液に浸漬される位置に設けられ、
前記制御演算部は、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が測定した試料液の温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである微粒子測定装置。
【請求項４】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記温度検出手段は、前記セルの壁面外側に接する位置に設けられ、
前記制御演算部は、前記測定部が測定した結果に対し、前記温度検出手段が測定した前記セルの温度に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである微粒子測定装置。
【請求項５】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記セルの壁面の一部に端子を備え、
前記端子は、前記セル内部で前記電極に電気的に接続され、前記セル外部で前記泳動電源部および前記測定部に電気的に接続され、かつ、
前記端子は、前記セル内部で前記試料液に接し、前記セル外部では前記温度検出手段に接するものである微粒子測定装置。
【請求項６】
請求項５に記載の微粒子測定装置であって、
前記端子は、低電気抵抗かつ高熱伝導率である微粒子測定装置。
【請求項７】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記温度検出手段は、前記電極間に温度測定電圧が印加された場合に前記測定部が測定した結果から試料液の温度を推定することにより、温度を検出するものである微粒子測定装置。
【請求項８】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記制御演算部は、前記温度検出手段が測定した温度に基づき、前記電極間に印加する交流電圧の振幅あるいは周波数を決定する微粒子測定装置。
【請求項９】
請求項１に記載の微粒子測定装置であって、
前記制御演算部は、前記測定部が測定した結果に対し、前記測定部が当該測定を行った時点における前記温度検出手段による温度検出結果に基づいて補正処理を行い、前記試料液中の微粒子を測定するものである微粒子測定装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の微粒子測定装置であって、
前記セル内部の前記試料液に浸漬される位置に温度検出手段として更に少なくとも１極の温度検出用電極を備え、
温度検出用電極は前記測定部に接続され、
前記測定部は温度検出用電極のインピーダンスを測定し、
前記制御演算部は、温度検出用電極のインピーダンスから前記試料液の温度を測定する微粒子測定装置。
【請求項１１】
微粒子含有の試料液に浸漬した一対の電極間に発生させた交流電界によって誘起された誘電泳動力によって移動した前記微粒子による電磁気的な変化を測定することにより、前記試料液中における微粒子を測定する微粒子測定方法であって、
温度を検出する温度検出ステップと、
前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した温度に基づく補正処理を行う補正処理ステップと、
を有する微粒子測定方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、前記試料液の温度を検出し、
前記補正処理ステップは、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した試料液の温度に基づく補正処理を行うものである微粒子測定方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、前記試料液の温度を、誘電泳動を行う電極基板上で検出するものである微粒子測定方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、前記試料液が貯留された、セルの温度を検出し、
前記補正処理ステップは、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した前記セルの温度に基づく補正処理を行うものである微粒子測定方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、前記試料液が貯留されたセルの壁面の一部に設けられた、端子の温度を検出し、
前記補正処理ステップは、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記温度検出ステップで検出した前記端子の温度に基づく補正処理を行うものである微粒子測定方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップは、
前記電極間に、温度測定のための電圧を印加するステップと、
前記電極間のインピーダンスを測定した結果から、試料液温度を推定するステップと、を含み、
前記補正処理ステップは、
前記電極間に、誘電泳動のための電圧を印加するステップと、
誘電泳動によって前記微粒子を所定位置に配置し、電磁気的な変化を測定するステップと、
前記電磁気的な変化の測定結果に対して、前記推定した試料液温度に基づく補正処理を行うステップと、を含む微粒子測定方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップで測定した温度に基づいて前記電極間に印加する誘電泳動のための電圧の振幅あるいは周波数を決定する微粒子測定方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の微粒子測定方法であって、
前記温度検出ステップを実施した時点において、前記電磁気的な変化の測定を行うステップを有し、
前記補正処理ステップは、前記電磁気的な変化の測定結果に対して、当該測定時点において検出した温度に基づく補正処理を行う微粒子測定方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2009093458.tif 000053
【図２】
2009093458.tif 000054
【図３】
2009093458.tif 000055
【図４】
2009093458.tif 000056
【図５】
2009093458.tif 000057
【図６】
2009093458.tif 000058
【図７】
2009093458.tif 000059
【図８】
2009093458.tif 000060
【図９】
2009093458.tif 000061
【図１０】
2009093458.tif 000062
【図１１】
2009093458.tif 000063
【図１２】
2009093458.tif 000064
【図１３】
2009093458.tif 000065
【図１４】
2009093458.tif 000066
【図１５】
2009093458.tif 000067
【図１６】
2009093458.tif 000068
【図１７】
2009093458.tif 000069
【図１８】
2009093458.tif 000070
【図１９】
2009093458.tif 000071
【図２０】
2009093458.tif 000072
【図２１】
2009093458.tif 000073
【図２２】
2009093458.tif 000074
【図２３】
2009093458.tif 000075
【図２４】
2009093458.tif 000076
【国際調査報告】
2009093458.tif 000077
2009093458.tif 000078
2009093458.tif 000079
2009093458.tif 000080