(57)【要約】本発明は、緑内障および患者の眼の高眼圧に関連する他の症状の治療における、プロスタグランジンＥ２受容体のＥＰ４サブタイプの強力な選択的アゴニスト、これらの使用またはこれらの製剤に関する。本発明はさらに、骨芽細胞および破骨細胞の骨のモデリングおよびリモデリングの過程を仲介するための本発明の化合物の使用に関する。2009502977.tif 000033
2009502977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式Ｉ：
【化１】
2009502977.tif 000032
（式中、
ＲおよびＲ４は、独立してＨ、またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ１は、独立して水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、ＣＦ３、アリールを表し、前記アリールは、場合により、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、またはＮ（Ｒ４）２の１〜３個の基で置換されていてもよく；
Ｒ２は、Ｈ、またはハロゲンを表し；
Ｒ３は、ＣＯＯＲまたはカルボン酸アイソスターを表し；
ｎは、０〜３を表し；および
−−−は、二重結合または単結合を表す）
を有する化合物、またはそれらの医薬的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、プロドラッグもしくは混合物。
【請求項２】
Ｒ３がＣＯＯＲまたはテトラゾールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３がＣＯＯＲである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＲがＨ、イソプロピル、エチルまたはメチルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１がハロゲン、Ｃ１−６アルキルはまたＣＦ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ＲがＨまたはイソプロピルであり、Ｒ１が臭素であり、およびＲ２が水素である、請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
ｎが０、１または２である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−オキソブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−［３−（（４Ｒ）−４−｛（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブタ−１−エン−１−イル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−（（４Ｒ）−４−｛（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブタ−１−エン−１−イル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−（（４Ｓ）−４−｛（３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブチル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−（（４Ｓ）−４−｛（３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブチル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−（３−イソプロピルフェニル）ブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−（３−イソプロピルフェニル）ブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
メチル４−ブロモ−５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
４−ブロモ−５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）−３−フルオロチオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）−３−フルオロチオフェン−２−カルボン酸；および
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−３−（４’−クロロ−２’−メチルビフェニル−３−イル）−３−ヒドロキシプロピル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモ−５−ヨードフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；および
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモ−５−ヨードフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
である化合物、またはそれらの医薬的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、プロドラッグもしくは混合物。
【請求項９】
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−オキソブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
である請求項７に記載の化合物、またはそれらの医薬的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、プロドラッグもしくは混合物。
【請求項１０】
医薬的に許容される担体および請求項１に記載の式Ｉの化合物を含む医薬組成物。
【請求項１１】
高眼圧症または緑内障の治療のための医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
β−アドレナリン遮断薬、副交感神経興奮薬、交感神経興奮薬、炭酸脱水酵素阻害薬、マキシＫチャネル遮断薬、並びにプロスタグランジン、降圧脂質、神経保護薬、および５−ＨＴ２受容体アゴニストからなる群に属する１つ以上の有効成分が場合により添加されてもよい、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
β−アドレナリン遮断薬が、チモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、またはレボブノロールであり；副交感神経興奮薬が、ピロカルピンであり；交感神経興奮薬が、エピネフリン、ブリモニジン、アイオピジン、クロニジン、またはパラ−アミノクロニジンであり；炭酸脱水酵素阻害薬が、ドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミド、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）であり；マキシＫが、ペニトレムＡ、パスパリシン、カリブドトキシン、イベリオトキシン、パキシラン、アフリトラム、ベロクロゲン、１−（１−イソブチル−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−２−メチルプロパン−１−オン；１−［１−（２，２−ジメチルプロピル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロパン−１−オン；１−［１−（シクロヘキシルメチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロパン−１−オン；１−（１−ヘキシル−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−２−メチルプロパン−１−オン；１−［１−（２−エチルヘキシル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロパン−１−オン；１−（３−イソブチリル−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）ブタン−２−オン；１−（３−イソブチリル−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）−３，３−ジメチルブタン−２−オン；１−（３−シクロペンチルカルボニル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）−３，３−ジメチルブタン−２−オン；１−（３，３−ジメチル−２−オキソブチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸；および１−［３−（３−ヒドロキシプロパノイル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−１−イル］−３，３−ジメチルブタン−２−オンであり；プロスタグランジンが、ラタノプロスト、トラバプロスト、ウノプロストン、レスキュラ、またはＳ１０３３であり；抗高血圧脂質が、ルミガンであり；神経保護薬が、エリプロディル、Ｒ−エリプロディルまたはメマンチンであり；および５−ＨＴ２受容体アゴニストが、１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−イミダゾール−６−オールフマル酸塩または２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾール−１−イル）−１−メチル−エチルアミンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
場合によりキサンタンガムまたはゲランガムを含んでもよい、溶液または懸濁液の形態の局所製剤である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
黄斑浮腫または黄斑変性の治療、ドライアイの治療、網膜および視神経乳頭の血流速度の増加、網膜および視神経酸素分圧の増加、または神経保護を提供するための医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
骨形成の刺激、異常な骨吸収に関連した病状もしくは症状の治療または罹患するリスクの減少を必要とする哺乳類における、骨形成の刺激、異常な骨吸収に関連した病状もしくは症状の治療または罹患するリスクを減少するための医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緑内障は、眼圧が高すぎるために正常に眼が機能できない眼の変性疾患である。この結果、視神経乳頭に障害が生じ、視覚機能が非可逆的に失われる可能性がある。治療しないと、緑内障は最終的に失明に至る可能性がある。高眼圧、すなわち視神経乳頭の障害または緑内障に特徴的な視野欠損が見られない眼圧が高い状態は、緑内障発症の最も早い段階に過ぎないと大多数の眼科医により現在考えられている。
【０００２】
緑内障の治療に以前から使用されている薬剤の多くは、満足のいくものではないことが示されている。緑内障の現在の治療方法には、ピロカルピン、炭酸脱水素酵素阻害剤、β遮断薬、プロスタグランジン類などの治療剤の使用が含まれる。しかし、これらの治療は、しばしば望ましくない局所的作用をもたらす。以上のように、現在のところ緑内障および高眼圧を治療する方法は幾つかあるが、これらの薬剤の効果および副作用の特徴は理想的とは言えない。従って、副作用が殆どないか、または全くない新規で効果的な治療が依然として必要とされている。
【背景技術】
【０００３】
ヒトおよびその他の哺乳類における様々な疾患は、異常な、または過剰な骨量減少が伴うか、またはこれに関連する。このような疾患には、骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、パジェット病、異常増加骨代謝、歯周病、歯牙損失、骨折、関節リウマチ、プロテーゼ周囲骨溶解、骨形成不全、転移性骨疾患、悪性の高カルシウム血症および多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されない。最も一般的なこれらの疾患の１つは、骨粗鬆症で、閉経後の女性に最も頻繁に発症する。ＰＧＥ２系列などのプロスタグランジン類は、骨形成を刺激し、男性を含めた哺乳類の骨量を増加させることが知られている。ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４と呼ばれる４種類の異なる受容体サブタイプが、骨芽細胞および破骨細胞の骨モデリングおよびリモデリング過程の仲介に関わっていると考えられている。骨における主要なプロスタグランジン受容体は、ＥＰ４であり、これは環状ＡＭＰを介した信号伝達によって効果をもたらすものと考えられている。本発明では、ＥＰ４サブタイプ受容体の式Ｉのアゴニストが、骨形成の刺激に有用であることが見出された。ＷＯ０２／２４６４７、ＷＯ０２／４２２６８、ＥＰ１１１４８１６、ＷＯ０１／４６１４０およびＷＯ０１／７２２６８は、ＥＰ４アゴニストを開示している。しかし、これらは本発明の化合物を開示していない。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、プロスタグランジンＥ２受容体のＥＰ４サブタイプのアゴニストおよび緑内障および患者の眼の眼圧上昇に関連するその他の症状の治療におけるこれらの使用またはこれらの製剤に関する。特に、本発明は、一連の３，４−ジ置換１，３−オキサジナン−２−オン、誘導体ならびに哺乳類種、特にヒトの眼疾患を治療したり、眼に神経保護効果をもたらしたりするためのこれらの使用に関する。本発明はさらに、骨芽細胞および破骨細胞の骨モデリングおよび骨リモデリング過程を仲介するための本発明の化合物の使用に関する。
より具体的には、本発明は、構造式Ｉ：
【０００５】
【化２】
2009502977.tif 000003
（式中、
ＲおよびＲ４は、独立してＨ、またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ１は独立して水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、ＣＦ３、アリールを表し、前記アリールは、場合により、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、またはＮ（Ｒ４）２の１〜３個の基で置換されていてもよく；
Ｒ２は、Ｈ、またはハロゲンを表し；
Ｒ３は、ＣＯＯＲまたはカルボン酸アイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）を表し；
ｎは、０〜３を表し；および
−−−は、二重結合または単結合を表す）を有する新規ＥＰ４アゴニスト、またはそれらの医薬的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、プロドラッグもしくは混合物に関する。
【０００６】
本発明のこの局面およびその他の局面は、本発明を全体として検証することにより認識される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、他に特に断りのない限り以下に定義した用語を使用して、本明細書に詳細に記載される。
【０００８】
本明細書で使用される「治療有効量」の用語は、所望の治療レジメに従って投与したとき、所望する治療効果または応答を惹起するか、または所望する利益をもたらす式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストの量または本発明のその他の活性物質の量を意味する。異常な骨吸収の治療に関連する好ましい治療有効量は、骨形成を刺激する量である。同様に、高眼圧症または緑内障の治療に関連する好ましい治療有効量は、眼圧を低下させ、および／または高眼圧症および／または緑内障を治療するために有効な量である。
【０００９】
本明細書で使用される「医薬的に許容される」とは、一般的に、毒性または安全性の観点からヒトを含む哺乳動物に投与するのに適切であることを意味する。
【００１０】
用語「プロドラッグ」は、投与吸収後、幾つかの代謝過程を経由して、インビボで注目を引く薬剤を放出する薬剤前駆体である化合物を意味する。本発明の化合物のプロドラッグの非限定的な例としては、カルボン酸基のエステルが挙げられ、このものは患者に投与後、エステル官能基が容易に活性な酸に加水分解される。プロドラッグの具体例には、遊離のＣＨ２ＣＯＯＨ基（場合により医薬的に許容される塩、例えば、−ＣＨ２ＣＯＯ−Ｎａ＋の形態であることができる）を有し、典型的には環系、好ましくは芳香族環系または芳香族複素環系に結合した非麻薬性・鎮痛性／非ステロイド性抗炎症薬である酢酸誘導体が含まれる。
【００１１】
用語「アルキル」は、特に他に定義しない限り、１個〜６個の炭素原子を含有する１価のアルカン（炭化水素）由来のラジカルを指す。これは、直鎖状、分枝状または環状であってもよい。好ましいアルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが含まれる。アルキル基がアルキル基で置換されているというときは、これは、「分枝状アルキル基」と交互に用いられる。
【００１２】
シクロアルキルは、炭素原子間が交互に、または共鳴して二重結合でない、３個〜６個の炭素原子を含有するアルキル種である。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルである。
【００１３】
ハロゲン（ハロ）とは、塩素、フッ素、ヨウ素または臭素を指す。
【００１４】
カルボン酸アイソスターは、テトラゾール、アシルスルホンアミド、スルホン酸、ホスホン酸またはＣ１−６アルデヒドもしくはＣ１−６アルコールなどのプロドラッグを表す。
【００１５】
アリールとは、例えば、フェニル、置換フェニルなどの芳香環並びに、例えば、ナフチル、フェナントレニルなどの縮合環を指す。従って、アリール基は、少なくとも６個の原子を有する少なくとも１個の環を含有し、このような環は最大５個まで存在し、これらには原子が最大２２個まで含有されるが、隣接する炭素原子または適切なヘテロ原子との間に交互（共鳴）の二重結合を有する。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントリルまたはアセナフチルおよびフェナントレニルであり、好ましくは、フェニル、ナフチルまたはフェナントレニルである。アリール基は、定義したように同様に置換されてもよい。好ましい置換アリールには、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００１６】
本明細書で使用される用語「アゴニスト」は、ＥＰ４受容体と相互作用し、天然アゴニストＰＧＥ２に比較して最大、超最大またはほとんど最大の効果を生じる式ＩのＥＰ４サブタイプ化合物を意味する。Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６，ｃｈａｐｔｅｒ  ２を参照のこと。
【００１７】
本発明の１実施形態は、Ｒ３がＣＯＯＲであり、他の全ての変数が最初に定義した通りである場合に実現される。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、Ｒ３がカルボン酸アイソスターであり、他の全ての変数が最初に定義した通りである場合に実現される。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、ＲがＨであり、他の全ての変数が最初に定義した通りである場合に実現される。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、ＲがＣ１−６アルキルであり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。本発明の下位実施形態は、Ｒがイソプロピル、エチルまたはメチル、好ましくはイソプロピルである場合に実現される。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、Ｒ２が水素であり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、Ｒ２がハロゲンであり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。本発明の下位実施形態は、ハロゲンがフッ素または臭素である場合に実現される。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態は、Ｒ１がハロゲンであり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。下位実施形態は、Ｒ１が臭素または塩素、好ましくは臭素である場合に実現される。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態は、Ｒ１がＣ１−６アルキルであり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態は、Ｒ１がＣＦ３であり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、Ｒ３がＣＯＯＲであり、ＲがＨまたはイソプロピルであり、Ｒ１が臭素であり、およびＲ２が水素である場合に実現される。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、Ｒ３がテトラゾールであり、Ｒ１が臭素であり、およびＲ２が水素である場合に実現される。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、ｎが０、１または２であり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。
【００２９】
本発明のさらに別の実施形態は、ｎが０であり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、ｎが１であり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。本発明の下位実施形態は、Ｒ１が臭素であり、Ｒ２が水素である場合に実現される。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、ｎが２であり、他の変数が全て最初に定義した通りである場合に実現される。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、−−−が２重結合を表す場合に実現される。
【００３３】
本発明の化合物は、
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−オキソブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−（（４Ｒ）−４−｛（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブタ−１−エン−１−イル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−（（４Ｒ）−４−｛（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブタ−１−エン−１−イル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−［３−（（４Ｓ）−４−｛（３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブチル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボキシラート；
５−（３−（（４Ｓ）−４−｛（３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブチル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−（３−イソプロピルフェニル）ブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−（３−イソプロピルフェニル）ブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
メチル４−ブロモ−５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；
４−ブロモ−５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）−３−フルオロチオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）−３−フルオロチオフェン−２−カルボン酸；
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−３−（４’−クロロ−２’−メチルビフェニル−３−イル）−３−ヒドロキシプロピル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモ−５−ヨードフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート；および
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモ−５−ヨードフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸；
またはこれらの医薬的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、プロドラッグもしくは混合物である。
【００３４】
本発明の他の実施形態は、式ＩのＥＰ４アゴニストおよび場合により医薬的に許容される担体を含有する組成物に向けられている。
【００３５】
本発明のさらに他の実施形態は、式ＩのＥＰ４アゴニストおよび場合により医薬的に許容される担体を含有する組成物を投与、好ましくは局所的または前房内投与することによって、高眼圧を減少させるか、または緑内障を治療するための方法に向けられている。高眼圧もしくは緑内障またはこれらの組み合わせを治療するための医薬を製造するために式Ｉの化合物を使用することもまた、本発明に含まれる。
【００３６】
本発明はさらに、式Ｉの化合物を含む医薬組成物の製造方法に関する。
【００３７】
本発明はさらに、式Ｉの化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物の製造方法に関する。
【００３８】
特許請求された化合物は、ＰＧＥ２受容体、特にＥＰ４サブタイプ受容体に強く結合して作用し、従って、緑内障および高眼圧症を予防および／または治療するために有用である。
【００３９】
ドライアイは、何百万もの人々を悩ます一般的な眼の表面の疾患である。ドライアイは、無関係の多数の病因から生じる可能性があるようにみえるが、いずれも最終的には涙液膜が破壊され、この結果、眼の露出した外面が脱水状態になる（Ｌｅｍｐ，Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅｓ，Ｔｈｅ  ＣＬＡＯ  Ｊｏｕｒｎｅｌ，２１（４）：２２１−２３１（１９９５））。機能的ＥＰ４受容体はヒト結膜上皮細胞内に見出され（その全体が本明細書中に参考として援用されている米国特許第６，３４４，４７７号参照）、およびヒト角膜上皮細胞（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：８１−９８（１９９７））および結膜細胞（Ｄａｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｒｖｅｓ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ  ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｏｎｊｕｃｎｔｉｖａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：９９３−１０００（１９９５））の両方が、ムチンを分泌することが可能であることが理解される。従って、式Ｉの化合物は、ドライアイの治療に有用である。
【００４０】
黄斑浮腫は、眼の後極にある極めて重要な中心視覚帯内の網膜内で肥大する。ＩＯＰを低下させるＥＰ４アゴニストは、黄斑浮腫や黄斑変性などの黄斑疾患を治療するのに有用と考えられる。従って、本発明の別の局面は、黄斑浮腫または黄斑変性を治療する方法である。
【００４１】
緑内障は、視神経の進行性萎縮症を特徴とし、眼圧（ＩＯＰ）上昇をしばしば伴うものである。しかしながら、神経保護作用を付与する薬物を使用することにより、ＩＯＰに必ずしも影響を与えることなく、緑内障を治療することが可能である。Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｏｌ．１１２，１９９４年１月、３７−４４頁；Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２，５，１９９１年４月，１５９３−９９頁を参照されたい。ＩＯＰを低下させるＥＰ４アゴニストは、神経保護作用をもたらすのに有用であると考えられる。またこのアゴニストは、ＩＯＰを低下させることによって、網膜および視神経乳頭の血流速度を増大させ、および網膜および視神経の酸素を増大させるのに効果的であると考えられ、これらが一緒になった場合に視神経の健康に有益なものとなる。この結果、本発明はさらに、式ＩのＥＰ４アゴニストを使用することによって、網膜および視神経乳頭の血流速度を増大させる、または網膜および視神経の酸素分圧を増大させる、または神経保護作用またはこれらの組み合わせを提供する方法に関する。
【００４２】
本発明で製造される化合物は、適切な公知の医薬的に許容される賦形剤と容易に配合されて、ヒトを含む哺乳類に投与することができる組成物を生成して効果的なＩＯＰ低下を達成する。従って、本発明はまた、網膜および視神経乳頭の血流速度を増加させるため、網膜および視神経酸素分圧を増加させるため、神経保護効果をもたらすため、またはこれらの組み合わせのために、式Ｉの化合物の１つを単独で、または１つ以上の以下の活性成分：β−アドレナリン遮断薬、例えばチモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール（ｌｅｖｏｂｅｔａｘｏｌｏｌ）、カルテオロール、レボブノロールなど；副交感神経興奮薬、例えばピロカルピンなど；交感神経興奮薬、例えばエピネフリン、アイオピジン（ｉｏｐｉｄｉｎｅ）、ブリモニジン、クロニジン、パラ−アミノクロニジンなど；炭酸脱水素酵素阻害剤、例えばドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミド（ｍｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ）またはブリンゾラミド、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）など；マキシＫチャネル遮断薬、例えばペニトレムＡ（Ｐｅｎｉｔｒｅｍ  Ａ）、パスパリシン（ｐａｓｐａｌｉｃｉｎｅ）、カリブドトキシン、イベリオトキシン、パキシラン（Ｐａｘｉｃｉｌｌａｎ）、アフリトラム（Ａｆｌｉｔｒａｍ）、ベロクロゲン（Ｖｅｒｒｏｃｕｌｏｇｅｎ）など；およびその全体が本明細書中に参考として援用されている、ＷＯ０３／１０５８６８（ＵＳＳＮ６０／３８９，２０５）、ＷＯ０３／１０５７２４（６０／３８９，２２２）、ＷＯ０３／１０５８４７（６０／４５８，９８１）、２００２年１１月８日出願の６０／４２４７９０（代理人整理番号２１２６０ＰＶ）、２００２年１１月８日出願の６０／４２４８０８（代理人整理番号２１２８１ＰＶ）、２００１年１月１７日出願の０９／７６５７１６、２００１年１月１７日出願の０９／７６４７３８およびＰＣＴ公開ＷＯ０２／０７７１６８およびＷＯ０２／０２０６０８６３に記載されているように、特に、マキシＫチャンネル遮断薬、例えば１−（１−イソブチル−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−２−メチルプロパン−１−オン；１−［１−（２，２−ジメチルプロピル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロパン−１−オン；１−［１−（シクロヘキシルメチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロパン−１−オン；１−（１−ヘキシル−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−２−メチルプロパン−１−オン；１−［１−（２−エチルヘキシル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−メチルプロパン−１−オン；１−（３−イソブチリル−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）ブタン−２−オン；１−（３−イソブチリル−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）−３，３−ジメチルブタン−２−オン；１−（３−シクロペンチルカルボニル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）−３，３−ジメチルブタン−２−オン；１−（３，３−ジメチル−２−オキソブチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸および１−［３−（３−ヒドロキシプロパノイル）−６−メトキシ−１Ｈ−インダゾール−１−イル］��３，３−ジメチルブタン−２−オンなど；プロスタグランジン、例えばラタノプロスト、トラバプロスト（ｔｒａｖａｐｒｏｓｔ）、ウノプロストン、レスキュラ（ｒｅｓｃｕｌａ）、Ｓ１０３３（米国特許第５，８８９，０５２号、５，２９６，５０４号、５，４２２，３６８号および５，１５１，４４４号に記載された化合物）など；抗高血圧脂質、例えばルミガン（ｌｕｍｉｇａｎ）および米国特許第５，３５２，７０８号に記載された化合物など；米国特許第４，６９０，９３１号で開示された神経保護薬、特にメマンチンを含むＷＯ９４／１３２７５で記載されたエリプロディルおよびＲ−エリプロディル；および／またはＰＣＴ／ＵＳ００／３１２４７に記載されたような５−ＨＴ２受容体のアゴニスト、特に１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−イミダゾール−６−オールフマラートおよび２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾール−１−イル）−１−メチル−エチルアミン；と組み合わせて式Ｉの化合物を、その処理を必要とする患者に投与することによって、高眼圧症、緑内障、黄斑浮腫、黄斑変性を治療する組成物および方法に関する。
【００４３】
式Ｉの化合物を高眼圧症、緑内障、黄斑浮腫、黄斑変性を治療するため、網膜および視神経乳頭の血流速度を増加させるため、網膜および視神経酸素分圧を増加させるため、神経保護効果をもたらすため、またはこれらの組み合わせのための薬剤を製造するために使用することもまた、本発明に含まれる。
【００４４】
本発明で使用されるＥＰ４アゴニストは、静脈内、皮下、局所的、経皮的、非経口的または当業者が公知のその他の任意の方法で治療上有効量を投与することができる。眼科用医薬組成物は、液剤、懸濁剤、軟膏、クリームの形態で、または固形挿入物として眼に局所投与できるように適合させることが好ましい。この化合物の眼科用製剤は、薬剤を０．００００１％から５％、特に０．００００１％から０．１％含有することができる。用量が眼圧を減少させ、緑内障を治療し、血流速度または酸素分圧を増加させるために有効であれば、例えば、約１０％までのより高用量、またはより低用量を使用することができる。単回用量としては、０．００００００１ｍｇから０．０５ｍｇ、好ましくは０．００００００５ｍｇから０．０２ｍｇ、特に０．０００００５ｍｇから０．０１ｍｇの化合物をヒトの眼に適用することができる。
【００４５】
化合物を含有する医薬製剤は、非毒性の医薬用有機担体または非毒性の医薬用無機担体と都合良く混合することができる。医薬的に許容される代表的な担体は、例えば、水、水と低級アルカノールまたはアラルカノールなどの水混和性溶媒との混合物、植物油、落花生油、ポリアルキレングリコール、石油系ゼリー、エチルセルロース、オレイン酸エチル、カルボキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドン、ミリスチン酸イソプロピルおよびその他の従来の許容可能な担体である。医薬製剤はまた、乳化剤、保存剤、湿潤剤、増粘剤などの非毒性補助物質、例えば、ポリエチレングリコール２００、３００、４００および６００；カーボワックス１，０００、１，５００、４，０００、６，０００および１０，０００；抗菌成分、例えば四級アンモニウム化合物、冷滅菌性を有することが知られており、使用しても有害ではないフェニル水銀塩、チメロサール、メチルおよびプロピルパラベン、ベンジルアルコール、フェニルエタノールなど；緩衝成分、例えばホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸塩緩衝液など；およびその他の従来の成分、例えばモノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン、オレアート、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、モノチオグリセロール、チオソルビトール、エチレンジアミン四酢酸などを含有することができる。さらに、適切な眼科用ビヒクル、例えば従来のリン酸緩衝ビヒクル系、等張性ホウ酸ビヒクル、等張性塩化ナトリウムビヒクル、等張性ホウ酸ナトリウムビヒクルなどを含む担体媒体が、本発明の目的のために使用することができる。医薬製剤はまた、微粒子製剤の形態であることが可能である。医薬製剤はまた、固形挿入物の形態であることが可能である。例えば、薬剤用の担体として固形水溶性ポリマーを使用することができる。挿入物を形成するために使用するポリマーは、任意の水溶性非毒性ポリマー、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、（ヒドロキシ低級アルキルセルロース）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；アクリラート類、例えばポリアクリル酸塩、アクリル酸エチル、ポリアクリルアミドなど；天然産物、例えばゼラチン、アルギン酸塩、ペクチン、トラガカント、カラヤゴム、ツノマタ、寒天、アカシアゴムなど；酢酸デンプン、ヒドロキシメチルデンプンエーテル、ヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン誘導体並びにその他の合成誘導体、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレンオキシド、中和カルボポール、およびキサンタンゴム、ゲランガムおよび前記ポリマーの混合物であり得る。
【００４６】
本発明の製剤を投与するために適した対象は、霊長類、ヒトおよびその他の動物、特にヒト並びにネコ、ウサギおよびイヌなどの飼い慣らされた動物を含む。
【００４７】
医薬製剤は、使用する際に非毒性補助物質、例えば、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、メチルおよびプロピルパラベン、臭化ベンジルドデシニウム、ベンジルアルコールまたはフェニルエタノールなどの抗菌成分；塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたはグルコン酸塩緩衝液などの緩衝成分；およびモノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、エチレンジアミン四酢酸などのその他の従来の成分などを含有することができる。
【００４８】
眼科用液剤または懸濁剤は、眼に許容可能なＩＯＰレベルを維持するために必要な回数を投与することができる。哺乳類の眼に対する投与は、１日１回〜３回までとすると考えられる。
【００４９】
眼に局所投与するために、本発明の新規製剤は、単位用量が治療有効量の活性成分を含むように、または併用治療の場合はこの何倍かの量を含むように調合された液剤、ゲル剤、軟膏、懸濁剤または固形挿入物の形態を採ることができる。
【００５０】
本発明の化合物はまた、骨芽細胞および破骨細胞の骨モデリングおよびリモデリング過程を仲介するために有用である。その全体が本明細書中に参考として援用されている１９９９年１０月１２日出願のＰＣＴ  ＵＳ９９／２３７５７を参照のこと。骨における主要なプロスタグランジン受容体はＥＰ４であり、これは環状ＡＭＰを介した信号伝達によってこの効果をもたらすものと考えられている。その全体が本明細書中に参考として援用されているＩｋｅｄａ  Ｔ，Ｍｉｙａｕｒａ  Ｃ，Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ａ，Ｎａｒｕｍｉｙａ  Ｓ，Ｙｏｓｈｉｋｉ  Ｓ  ａｎｄ  Ｓｕｄａ  Ｔ  １９９５，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ（ＥＰ１，ＥＰ３  ａｎｄ  ＥＰ４）  ｏｆ  ｐｒａｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｍｉｃｅ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １０（ｓｕｐｌ）：Ｓ１７２を参照のこと。骨モデリングおよびリモデリング過程を仲介する医薬を製造するための式Ｉの化合物の使用もまた、本発明に含まれる。
【００５１】
従って、本発明の他の目的は、骨の形成、すなわち骨形成を刺激する方法を必要とする哺乳類に、式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストの治療有効量を投与することを含む、哺乳類における骨の形成、すなわち骨形成を刺激する方法を提供することである。
【００５２】
本発明のさらに他の目的は、骨の形成の刺激方法を必要とする哺乳類に、式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストの治療有効量およびビスホスホナート活性物質を投与することを含む、哺乳類における骨の形成の刺激方法を提供することである。骨の形成を刺激するための薬剤を製造するための式Ｉの化合物の使用もまた、本発明に含まれる。
【００５３】
本発明のさらに他の目的は、式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストの治療有効量およびビスホスホナート活性物質を含む医薬組成物を提供することである。
【００５４】
本発明のさらに他の目的は、このような治療または予防を必要とする哺乳類の異常な骨吸収に関連した病状または症状を治療するか、または罹患するリスクを減少させる方法であって、治療有効量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストを前記哺乳類に投与することを含む方法を提供することである。異常な骨吸収に関連した病状または症状を治療するか、または罹患するリスクを減少させる薬剤を製造するための式Ｉの化合物の使用もまた、本発明に含まれる。
【００５５】
異常な骨吸収に関連した疾患状態および状態には、骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、パジェット病、異常に増進した骨代謝、歯周病、歯牙の喪失、骨折、関節リウマチ、プロテーゼ周囲骨溶解、骨形成不全、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症および多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストの治療有効量およびビスホスホナート活性物質を投与することを含む方法においては、式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストおよびビスホスホナート活性物質の同時投与および逐次投与はいずれも本発明の範囲内であると見なされる。一般的に、ビスホスホン酸活性物質をベースとして、ビスホスホン酸活性物質を５ｍｇまたは１０ｍｇ含有する製剤が調製される。逐次投与では、アゴニストおよびビスホスホナートはどちらからの順番でも投与されることができる。逐次投与のサブクラスでは、アゴニストおよびビスホスホナートは、典型的には、同じ２４時間以内に投与される。さらに別のサブクラスでは、アゴニストおよびビスホスホナートは、典型的には互いに約４時間以内に投与される。
【００５７】
本発明に有用なビスホスホナート活性物質の非限定的な種類は、アレンドロネート、シマドロネート（ｃｉｍａｄｒｏｎａｔｅ）、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート（ｎｅｒｉｄｒｏｎａｔｅ）、オルパンドロネート（ｏｌｐａｎｄｒｏｎａｔｅ）、リセドロネート、ピリドロネート（ｐｉｒｉｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロネート、ゾレンドロネート（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、医薬的に許容されるこれらの塩およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００５８】
この場合、前記の種類の非限定的なサブクラスは、アレンドロネート、この医薬的に許容される塩およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００５９】
該サブクラスの非限定的な例は、アレンドロ酸モノナトリウム三水和物である。
【００６０】
本発明では、骨刺激に関連するので、アゴニストは一般的に、所望する治療効果が実現するまで十分な期間に亘り投与される。本明細書で使用される「所望する治療効果が実現されるまで」の用語は、治療剤が、選択された投与スケジュールに従って、介在する疾患または状態に求められる臨床上または医療上の効果がもたらされたことが、臨床医または研究者によって認められる時まで、継続的に投与されることを意味する。本発明の治療方法では、骨量または骨構造において所望する変化が認められるまで、該化合物は継続的に投与される。このような場合、骨量の増加または異常な骨構造と正常な骨構造との置換の実現が所望する目標である。病状または症状の危険性を減少する方法では、望ましくない状態を予防する必要性がある限り、該化合物は継続的に投与される。このような場合、骨密度の維持がしばしば目標となる。
【００６１】
投与期間の非限定的な例は、約２週間から哺乳類の残存寿命までの範囲に亘ることができる。ヒトの場合、投与期間は約２週間からヒトの残存寿命まで、好ましくは約２週間から約２０年まで、より好ましくは約１ヶ月から約２０年まで、より好ましくは約６ヶ月から約１０年まで、最も好ましくは約１年から約１０年までの範囲である。
【００６２】
本発明の化合物はまた、骨量減少、骨折、骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、パジェット病、骨代謝の異常増加、歯周病、歯牙の喪失、骨関節炎、関節リウマチ、プロテーゼ周囲骨溶解、骨形成不全、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症および多発性骨髄腫の治療または予防に有用な公知の薬剤との組み合わせに有用である。本発明で開示された化合物と骨粗鬆症またはその他の骨疾患の治療または予防に有用なその他の薬剤との組み合わせは、本発明の範囲内である。当業者であれば、どの薬剤の組み合わせが薬剤の特性および関連する疾患を基にして有用であるかを見分けることができる。このような薬剤としては、以下に述べる、有機ビスホスホナート；カテプシンＫ阻害剤、エストロゲンまたはエストロゲン受容体調節因子；アンドロゲン受容体調節因子；破骨細胞プロトンＡＴＰａｓｅ阻害剤；ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤；インテグリン受容体拮抗剤；ＰＴＨなどの骨芽細胞蛋白質同化剤；カルシトニン；ビタミンＤまたは合成ビタミンＤ類縁体；並びにこれらの医薬的に許容される塩およびこれらの混合物が含まれる。好ましい組み合わせは、本発明の化合物および有機ビスホスホナートである。他の好ましい組み合わせは、本発明の化合物およびエストロゲン受容体調節因子である。他の好ましい組み合わせは、本発明の化合物およびエストロゲンである。他の好ましい組み合わせは、本発明の化合物およびアンドロゲン受容体調節因子である。他の好ましい組み合わせは、本発明の化合物および骨芽細胞蛋白質同化剤である。
【００６３】
異常な骨吸収および眼の疾患の治療に関して、式Ｉのアゴニストは、一般的に、約０．００１ｎＭから約１００マイクロＭのＥＣ５０値を有するが、投与量および投与経路に応じて、この範囲外の活性を有するアゴニストが有用となり得る。本発明のサブクラスでは、アゴニストは、約０．０００１マイクロＭから約１０マイクロＭのＥＣ５０値を有する。本発明のさらなるサブクラスにおいて、アゴニストは約０．０００１マイクロＭから約１マイクロＭのＥＣ５０値を有する。ＥＣ５０とは、当業者に周知のアゴニスト活性の共通の基準であり、最大効果の半分、すなわち、５０％を示すのに必要なアゴニストの濃度または用量として定義される。その全体が本明細書中に参考として援用されている、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６，ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｅ．Ｍ．Ｒｏｓｓ，Ｐｈａｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔおよび１９９９年１０月１２日に出願されたＰＣＴ  ＵＳ９９／２３７５７もまた参照されたい。
【００６４】
本明細書の実施例は、特許請求した本発明を例示するものであるが、限定するものではない。特許請求の範囲に記載された化合物の各々は、ＥＰ４アゴニストであり、多くの生理学的な眼疾患および骨疾患に有用である。
【００６５】
本発明の化合物は、米国特許第６，０４３，２７５号、ＥＰ０８５５３８９、ＷＯ０３／０４７４１７（ＵＳＳＮ６０／３３７２２８）、ＷＯ０３／０４７５１３（ＵＳＳＮ６０／３３８，１１７）、ＵＳＳＮ６０／４０６，５３０（メルク文書番号ＭＣ０６０）、ＷＯ２００４／０８５４３０およびＷＯ０１／４６１４０に従い、若干の修正を加えて製造することができ、これらはその全体が本明細書中に参考として援用されている。例示として記載する以下の非限定的なスキームおよび実施例は、本発明を例証するものである。
【００６６】
本発明からの化合物の調製は、一般的なスキーム１および２に従って達成され得、実験の項でさらに説明する。
【００６７】
スキーム１：高次中間体１を使用する一般的な合成スキーム
【００６８】
【化３】
2009502977.tif 000004
【００６９】
（４Ｒ）−４−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１，３−オキサジナン−２−オン（１）（ＷＯ２００４／０８５４３０）は、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）のいずれかの中で、カリウムヘキサメチルジシラジド（ＫＨＭＤＳ）またはＮａＨのような強塩基で最初に処理し、次いで試薬２（Ｌ＝Ｉ、ＭｅＳＯ２ＯまたはＢｒなど）で処理して、アルキル化された生成物３を得た。ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基を１ＮのＨＣｌ（塩酸）水溶液またはＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド）で脱保護し、次いで、得られたアルコールを適切な酸化剤で酸化してアルデヒド４を得た。次に、４を塩基としてＮａＨおよびルイス酸としてＺｎＣｌ２を使用して試薬５と反応させてケトン６を得た。６を適切な還元試薬で還元してＩを得た。
【００７０】
スキーム２：アミノアルコール（３Ｒ）−３−アミノ−４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝ブタン−１−オール（７）を使用する一般的な合成スキーム
【００７１】
【化４】
2009502977.tif 000005
【００７２】
アミノアルコール７（ＷＯ２００４／０８５４３０）を、適切なアルデヒド８で還元的アミノ化し、次いで塩基としてピリジンを用いてホスゲンによる環化を行って、１，３−オキサジナン中間体３を得た。この中間体は、スキーム１に従って所望の生成物へ処理することができる。
【００７３】
スキーム３：実施例１、２および３で示される化合物の調製
【００７４】
【化５】
2009502977.tif 000006
【００７５】
工程１：イソプロピル５−｛３−［（４Ｒ）−４−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル］プロピル｝チオフェン−２−カルボキシラート；
（４Ｒ）−４−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１，３−オキサジナン−２−オン（１）（ＷＯ２００４／０８５４３０）（１１ｇ、４４．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４００ｍＬ）溶液に、ｒｔ（室温）で窒素雰囲気下、ＫＨＭＤＳ（９９ｍＬ、トルエン中０．５Ｍ）を滴下して加え（ゲル状沈澱物が生成）、混合物を室温で０．５ｈ（時間）攪拌した。その後、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中、メシラート１２（２０ｇ、６５．３ｍｍｏｌ）をカニューレから添加し、混合物を６０℃で一晩加熱し、室温に冷却した。混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、次に、酢酸エチルで抽出した。粗製の生成物は、フラッシュ（１０〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製し黄色のオイルを得た。
工程２：イソプロピル５−｛３−［（４Ｒ）−４−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル］プロピル｝チオフェン−２−カルボキシラート
上記で得たアルキル化生成物（２０ｇ、４３．９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）溶液に、ＨＣｌ（５０ｍＬ、１Ｎ）を加え、混合物を室温で４時間撹拌した。揮発性物質を減圧除去し、残渣をフラッシュ（３０〜５０％アセトン／トルエンまたは５０〜１００％ＥＡ（酢酸エチル）／ヘキサン）によって精製し、所望の生成物１０を淡黄色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）：δ  ７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），４．３９−４．３１（１Ｈ，ｍ），４．１６−４．１２（２Ｈ，ｍ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．７２−３．７０（２Ｈ，ｍ），３．６０−３．５０（２Ｈ，ｍ），３．２９−３．２１（１Ｈ，ｍ），２．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），２．１５−１．９９（４Ｈ，ｍ）。
工程３：イソプロピル５−｛３−［（４Ｒ）−４−ホルミル−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル］プロピル｝チオフェン−２−カルボキシラート
ＤＣＭ（ジクロロメタン）中、ＤＭＳＯ（ジメチスルホキシド）溶液に、−７８℃で塩化オキサリル（１４１ｕＬ、１．６１５ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下して加え、混合物を３０分間攪拌した。この溶液にＤＣＭ（８ｍＬ）中、アルコール１０（４６０ｍｇ、１．４６８ｍｍｏｌ）をカニューレから加え、混合物を１５分間攪拌し、次いで、トリエチルアミン（４９５ｕＬ、３．５２ｍｍｏｌ、２．４当量）を加えた。混合物を−７８℃で３０ｍｉｎ（分）攪拌し、室温に加温した。ＤＣＭを減圧蒸発し、残渣をＥｔＯＡｃ中に再懸濁し、濾過した。固体をＥｔＯＡｃで十分に洗浄し、濾液と洗浄液を濃縮して所望の生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ｐｐｍ）（ＣＤＣｌ３）：９．６５（１Ｈ，ｓ），７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），４．３４−４．２２（１Ｈ，ｍ），４．０９−４．０１（２Ｈ，ｍ），３．８７（３Ｈ，ｓ），３．８２−３．７４（１Ｈ，ｍ），３．１３−３．０３（１Ｈ，ｍ），２．９４−２．８６（２Ｈ，ｍ），２．３１−２．１９（２Ｈ，ｍ），２．０７−１．９９（２Ｈ，ｍ）。この反応は、三酸化硫黄／ピリジン錯体を用いても同様に良好に進行する。
工程４：イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−オキソブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート（１１）
上記で得たアルデヒドイソプロピル５−｛３−［（４Ｒ）−４−ホルミル−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル］プロピル｝チオフェン−２−カルボキシラート（２６５ｍｇ、０．８０２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍｌ）溶液に、０．５Ｍ塩化亜鉛／ＴＨＦ（１．９ｍＬ、０．９３６ｍｍｏｌ、１．１当量）、次いで固形の試薬１３ａ（ジメチル［３−（３−ブロモフェニル）−３，３−ジフルオロ−２−オキソプロピル］ホスホナートのナトリウム塩（４２０ｍｇ、１．１０６ｍｍｏｌ、１．３当量）を加え、混合物を７０℃で一晩加熱し、次いで室温に冷却した。濁った溶液を１ＮのＨＣｌ／水で希釈し、酢酸エチル（ＥＡ）（２×）で抽出した。ＥＡ層を水洗し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。粗製物を、フラッシュ（５０〜８０％ＥＡ／ヘキサン）により精製して所望の生成物１１を得たが、このものは、ホスホナート試薬で汚染されていることがＮＭＲによって分かった。１Ｈ  ＮＭＲ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）：７．８１（２Ｈ，ｓ），７．７５−７．５３（２Ｈ，ｍ），７．２０−７．１２（１Ｈ，ｍ），６．８９−６．８１（１Ｈ，ｍ），４．９９−４．９１（１Ｈ，ｍ），４．４６（１Ｈ，ｍ），３．８０−３．７２（３Ｈ，ｍ），３．６１−３．４９（１Ｈ，ｍ），２．８４−２．７６（１Ｈ，ｍ），２．３６−２．２２（３Ｈ，ｍ），１．６０−１．４８（４Ｈ，ｍ），１．３７−１．２３（４Ｈ，ｍ），１．２０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）。
工程５：触媒１４の調製
触媒は、［ＲｕＣｌ２（ｐ−シメン）２］のｌｍｏｌ当量、（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−トシル−１，２−ジフェニルエチレン−１，２−ジアミンの２ｍｏｌ当量およびＥｔ３Ｎの４．２ｍｏｌ当量をｉＰｒＯＨ中、８０℃で１時間混合することにより調製された。溶媒を除去した後、固体を冷水で洗浄し、ＭｅＯＨから再結晶して触媒をオレンジ色の固体として得た。
【００７６】
触媒はまた、［ＲｕＣｌ２（ｐ−シメン）２］の０．０２ｍｏｌ当量および（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−トシル−１，２−ジフェニルエチレン−１，２−ジアミンの０．０４ｍｏｌ当量を、ＴＨＦ中のＫＯｔＢｕの１Ｍ溶液０．０４ｍｏｌ当量の存在下、ＤＣＭ（ジクロロメタン）中で混合することによってもインサイチューで生成できた。ＲＴ（室温）で１０分間熟成した後、Ｅｔ３Ｎを加えた後、ＨＣＯ２ＨおよびエノンのＤＣＭ溶液を添加した。
【実施例１】
【００７７】
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート
ケトン１１（５００ｍｇ、０．８７７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５ｍｌ）溶液に、ギ酸（５２μｌ、１．３１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１４８μｌ、１．０５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１０分攪拌した。次いで、これにＲｕ触媒１４（２８ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を加え、ＴＬＣ分析により出発原料が全て消費されるまで、混合物を室温で攪拌した。混合物をＥＡで希釈し、１ＮのＨＣｌで洗浄した。有機層を乾燥し、濾過し、減圧濃縮し、粗製物をフラッシュクロマトグラフィ（２５〜７５％ＥＡ／ヘキサン）により精製して、所望の異性体を優先的に１０〜４０／Ｌのジアステレオマー割合で所望の生成物を得た。ジアステレオマー混合物は、キラルＡＤ（３０％ｉ−ＰｒＯＨ／ヘキサン）によってさらに精製して表題化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）：７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），７．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．７，１５．５Ｈｚ），５．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１５．５Ｈｚ），５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），５．１８−５．１０（１Ｈ，ｍ），４．７６−４．６８（１Ｈ，ｍ），４．１９−４．０４（３Ｈ，ｍ），３．６５−３．５７（１Ｈ，ｍ），２．９０−２．８４（１Ｈ，ｍ），２．２２−２．１４（１Ｈ，ｍ），２．０２−１．９４（２Ｈ，ｍ），１．８４−１．７８（１Ｈ，ｍ），１．３２（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）。ＭＳ（＋ＡＰＣＩ）：５７２．０，５７４．０。
【実施例２】
【００７８】
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
実施例１のイソプロピルエステルを、メタノール／水中、ＬｉＯＨで処理して対応する酸を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）：δ  ７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），７．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），５．９１−５．８３（１Ｈ，ｍ），５．７６−５．６８（１Ｈ，ｍ），５．２３（１Ｈ，ｓ），４．７５−４．６９（１Ｈ，ｍ），４．１９−４．０４（４Ｈ，ｍ），３．６６−３．５８（１Ｈ，ｍ），２．９１−２．８３（３Ｈ，ｍ），２．２２−２．１４（１Ｈ，ｍ），２．０３−１．９５（３Ｈ，ｍ），１．８６−１．７８（１Ｈ，ｍ）；ＭＳ（−ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５２７．９，５２９．９。
【実施例３】
【００７９】
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
実施例１（１１０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）およびアセトン（１０ｍＬ）中、ＰｔＯ２（５ｍｇ）を加えた。得られた黒色の反応混合物を、Ｈ２（１気圧（大気））に１８時間供した。反応液をセライトパッドで濾過し、有機溶媒を減圧除去した。粗製物をフラッシュカラムクロマトグラフィで精製してエステルを得、これを通常の方法で表題化合物に加水分解した。ＭＳ（＋ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５３２．２，５３４．２。
【００８０】
スキーム４：ホーナー−ワーズワース−エモン（Ｈｏｒｎｅｒ−Ｗｏｒｄｓｗｏｒｔｈ−Ｅｍｍｏｎｓ）試薬１３の製造
【００８１】
【化６】
2009502977.tif 000007
【００８２】
試薬１３ａの調製
工程１：３−ブロモ−ヨードベンゼン（１４．１ｇ、５０ｍｍｏｌ）およびエチルブロモ−α，α−ジフルオロアセタート（１０．１ｇ、５０ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（４０ｍＬ）溶液に、銅ブロンズ（７ｇ、１１０ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を５５℃に２．５時間加熱し、次いで室温にまで冷却した。混合物をＫＨ２ＰＯ４でクエンチし、濾過した。固体を酢酸エチル／水で洗浄し、濾液を分離した。水層をエーテル（２×）で抽出し、有機相を合わせ、水および食塩水で洗浄した。粗製物をフラッシュクロマトグラフィ（５〜１０％の酢酸エチル／ヘキサン）により精製して１０．７ｇの所望の生成物を無色のオイルとして得た。ジメチルメチルホスホナート（４．１ｇ、３３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（１２．６ｍＬ、ヘキサン中２．５Ｍ）を−７８℃で滴下して加え、混合物を−７８℃で１時間攪拌した。次いでこの溶液に、ＴＨＦ中、エチルα、α−ジフルオロ−３−ブロモフェニルアセタート（８．３７ｇ、３０ｍｍｏｌ）をカニューレから添加し、混合物を−７８℃で２時間攪拌し、２．２ｍＬのＡｃＯＨおよび水でクエンチした。室温にまで加温し、混合物を酢酸エチル（３×）で抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮して所望の生成物ジメチル［３−（３−ブロモフェニル）−３，３−ジフルオロ−２−オキソプロピル］ホスホナートを無色のオイルとして得た。このオイル（８．２８ｇ、２３．１９ｍｍｏｌ）のエーテル溶液に、水素化ナトリウム６０％（９７４ｍｇ、２４．３５ｍｍｏｌ、１．０５当量）を室温で少しずつ加え、白色懸濁液を室温で１時間攪拌した。混合物を濾過し、白色固体をエーテル／ヘキサンで洗浄した。このようにして得られた固体を高減圧下で乾燥して１３ａ（白色粉末）を得た。試薬１３ｂ〜１３ｄも同様にして調製した。
【００８３】
スキーム５：メシラート１２の調製
【００８４】
【化７】
2009502977.tif 000008
【００８５】
工程１：５−［（１Ｅ）−３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−３−オキソプロパ−１−エン−１−イル］チオフェン−２−カルボン酸（１６）
１００ｍＬのＣＨ３ＣＮ中、ＰＰｈ３（３．２ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）、ＮＥｔ３（１７１  ｍＬ、１２１８ｍｍｏｌ））、アクリル酸ｔ−ブチル（１１８ｍＬ、８１２ｍｍｏｌ）および酸１５（４２ｇ、２０３ｍｍｏｌ）の脱気した溶液に、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（９１１ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１２時間加熱還流した。溶液を室温に冷却し、希ＨＣｌを加え、生成物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮して粗製物を得たが、このものは直ちに固化した。得られた固体を集め、ヘキサンで洗浄して１６を得た。
工程２：イソプロピル５−［（１Ｅ）−３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−３−オキソプロパ−１−エン−１−イル］チオフェン−２−カルボキシラート（１７）
酸１６（４４ｇ、１７３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジイソプロピルアセタール（６０ｇ、３４２ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン５００ｍＬ溶液を１２時間、加熱還流した。溶液を室温にまで冷却し、濃縮して粗製物を得、これをカラムクロマトグラフィで精製して１７を得た。
工程３：（２Ｅ）−３−［５−（イソプロポキシカルボニル）−２−チエニル］アクリル酸（１８）
エステル１７（４５ｇ、１５２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン５００ｍＬ溶液に、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）４５ｍＬをゆっくりと加え、溶液を室温で１２時間攪拌した。この溶液に、ＰｈＭｅ３００ｍＬを加え、次いで減圧濃縮した。得られた固体を集め、ヘキサンで洗浄して１８を得た。
工程４：３−［５−（イソプロポキシカルボニル）−２−チエニル］プロパン酸（１９）
酸１８（４５ｇ、１５２ｍｍｏｌ）のイソプロパノール２００ｍＬ溶液に、１０％炭素担持Ｐｄ５．３２ｇを加え、混合物を水素４０ｐｓｉに１２時間供した。溶液をセライトで濾過し、減圧濃縮した。得られた固体を集め、ヘキサンで洗浄して１９を得た。
工程５：イソプロピル５−（３−ヒドロキシプロピル）チオフェン−２−カルボキシラート（２０）
酸１９（１７．３ｇ、７１．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ２００ｍＬ溶液に、ボランジメチルスルフィド錯体（ＴＨＦ中、２Ｍ溶液７１．５ｍＬ，１４３ｍｍｏｌ）を−１０℃でゆっくりと加えた。溶液を３時間攪拌し、メタノール１０ｍＬでゆっくりとクエンチした。溶液をさらに２時間攪拌し、濃縮した。さらにメタノール１００ｍＬの添加、次いで濃縮を２回繰り返して粗製アルコールを得、これをカラムクロマトグラフィで精製して２０を得た。
工程６：メシラートイソプロピル５−｛３−［（メチルスルホニル）オキシ］プロピル｝チオフェン−２−カルボキシラート（１２）
アルコール２０（１５ｇ、６５．７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン２００ｍＬ溶液に、−２０℃で、トリエチルアミン（１８．４  ｍＬ、１３１ｍｍｏｌ）、次いで塩化メシル（６．２ｍＬ、７９ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。溶液を３時間攪拌し、次いで水でクエンチした。生成物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮して粗製物を得た。粗製のメシラートをカラムクロマトグラフィで精製して１２を得た。
【実施例４】
【００８６】
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
【００８７】
【化８】
2009502977.tif 000009
【００８８】
本化合物は、中間体１０およびジメチル（３−フェニル−３，３−ジフルオロ−２−オキソプロピル）ホスホナート（ＷＯ２００４／０８５４３０）からスキーム３に従って調製した。１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）：７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５５−７．５１（２Ｈ，ｍ），７．４７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），６．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，１５．５Ｈｚ），５．７３−５．６７（１Ｈ，ｍ），５．１０（１Ｈ，ｓ），４．７２−４．６６（１Ｈ，ｍ），４．１６−４．０４（４Ｈ，ｍ），３．６５−３．５５（１Ｈ，ｍ），２．９０−２．８２（１Ｈ，ｍ），２．２０−２．１２（１Ｈ，ｍ），１．９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．８２−１．７６（１Ｈ，ｍ）。ＭＳ（−ＡＰＣＩ）：ｍ／ｚ  ４５０．３（Ｍ−１）−。
【実施例５】
【００８９】
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート
【００９０】
【化９】
2009502977.tif 000010
【００９１】
１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）：７．６３−７．６１（２Ｈ，ｍ），７．５２（２Ｈ，ｓ），６．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），５．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），５．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），５．１７−５．１１（１Ｈ，ｍ），４．７９−４．７１（１Ｈ，ｍ），４．１５−４．１９（３Ｈ，ｍ），３．６７−３．６０（１Ｈ，ｍ），２．８７−２．９５（３Ｈ，ｍ），２．２４−２．１５（１Ｈ，ｍ），２．０２−１．８０（２Ｈ，ｍ），１．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），１．３２（９Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）。
【実施例６】
【００９２】
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
【００９３】
【化１０】
2009502977.tif 000011
【００９４】
上記で得たイソプロピルエステルをメタノール／水中、ＬｉＯＨで処理して対応する酸を得た。ＭＳ（＋ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５２０．２（Ｍ＋１）＋。
【実施例７】
【００９５】
イソプロピル５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート
【００９６】
【化１１】
2009502977.tif 000012
【００９７】
実施例４における二重結合は、酢酸エチル／アセトン中、水素雰囲気下（１気圧）、ＰｔＯ２で表題化合物へ還元処理して、スキーム１に記述した飽和化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）：７．６６（１Ｈ，ｓ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５４（２Ｈ，ｄ，１．７Ｈｚ），６．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１７−５．１２（ｍ，１Ｈ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），４．２７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），４．１７−４．０６（２Ｈ，ｍ），３．６４−３．５５（２Ｈ，ｍ），３．１８−３．１２（１Ｈ，ｍ），２．９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．１２−１．９１（５Ｈ，ｍ），１．８７−１．８０（１Ｈ，ｍ），１．７５−１．６９（１Ｈ，ｍ），１．５０−１．４２（１Ｈ，ｍ），１３．３（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）。
【実施例８】
【００９８】
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジクロロフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
【００９９】
【化１２】
2009502977.tif 000013
【０１００】
上記で得たイソプロピルエステルをメタノール／水中、ＬｉＯＨで処理して対応する酸を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）：７．６５（１Ｈ，ｓ），７．６３（１Ｈ，ｄ，３．７Ｈｚ），７．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），６．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），４．２７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．９Ｈｚ），４．１７−４．１１（２Ｈ，ｍ），３．６４−３．５１（２Ｈ，ｍ），３．１９−３．１３（１Ｈ，ｍ），２．９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．１２−１．９１（３Ｈ，ｍ），１．８７−１．８１（１Ｈ，ｍ），１．８０−１．６９（１Ｈ，ｍ），１．５０−１．４２（１Ｈ，ｍ），１．３９−１．３１（１Ｈ，ｍ）。
【実施例９】
【０１０１】
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート
【０１０２】
【化１３】
2009502977.tif 000014
【０１０３】
本化合物は、中間体１０および試薬１３ｃからスキーム３に従って調製した。１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣｌ３）：７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．０７（３Ｈ，ｓ），６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），５．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，５．９Ｈｚ），５．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，５．０Ｈｚ），５．２２−５．１６（１Ｈ，ｍ），４．５９−４．５３（１Ｈ，ｍ），４．１５−４．１０（２Ｈ，ｍ），３．９７−３．９６（１Ｈ，ｍ），３．６９−３．６１（１Ｈ，ｍ），２．９０−２．８０（３Ｈ，ｍ），２．３５（６Ｈ，ｓ），２．１９−２．０８（１Ｈ，ｍ），２．００−１．９３（２Ｈ，ｍ），１．７９−１．７５（１Ｈ，ｍ），１．３５（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）。
【実施例１０】
【０１０４】
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
【０１０５】
【化１４】
2009502977.tif 000015
【０１０６】
上記で得たイソプロピルエステルをメタノール／水中、ＬｉＯＨで処理して対応する酸を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣｌ３）：７．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），７．０７（３Ｈ，ｓ），６．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），５．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，５．９Ｈｚ），５．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，５．０Ｈｚ），４．６０−４．５４（１Ｈ，ｍ），４．１５−４．１３（２Ｈ，ｍ），４．００−３．９５（１Ｈ，ｍ），３．７０−３．６３（１Ｈ，ｍ），２．８９−２．８１（３Ｈ，ｍ），２．３５（６Ｈ，ｓ），２．２２−１．９４（３Ｈ，ｍ），１．８０−１．７７（１Ｈ，ｍ）。
【実施例１１】
【０１０７】
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３，５−ジメチルフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
【０１０８】
【化１５】
2009502977.tif 000016
【０１０９】
上記で得た酸を、酢酸エチル／アセトン中、水素雰囲気下（１気圧）、ＰｔＯ２で処理して対応する酸を得た。ＭＳ（−ＥＳＩ）：４８０．２（Ｍ−１）−。
【実施例１２】
【０１１０】
イソプロピル５−［３−（（４Ｒ）−４−｛（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブタ−１−エン−１−イル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボキシラート
【０１１１】
【化１６】
2009502977.tif 000017
【０１１２】
本化合物は、中間体１０および試薬１３ｄからスキーム３に記載されるように調製した。１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）：７．８８−７．８４（３Ｈ，ｍ），７．７７−７．７３（１Ｈ，ｍ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，６．６Ｈｚ），５．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，５．４Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．８  Ｈｚ），５．１９−５．０９（１Ｈ，ｍ），４．８１−４．７４（１Ｈ，ｍ），４．２０−４．１２（３Ｈ，ｍ），３．６５−３．５８（１Ｈ，ｍ），２．９３−２．８５（３Ｈ，ｍ），２．２２−２．１３（１Ｈ，ｍ），２．０８−１．２１（２Ｈ，ｍ），１．８３−１．７６（１Ｈ，ｍ），１．３２（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）。
【実施例１３】
【０１１３】
５−［３−（（４Ｒ）−４−｛（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブタ−１−エン−１−イル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボン酸
【０１１４】
【化１７】
2009502977.tif 000018
【０１１５】
上記で得たイソプロピルエステルをメタノール／水中、ＬｉＯＨで処理して対応する酸を得た。ＭＳ（−ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５１８．５（Ｍ−Ｈ）−。
【実施例１４】
【０１１６】
イソプロピル５−［３−（（４Ｓ）−４−｛（３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブチル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボキシラート
【０１１７】
【化１８】
2009502977.tif 000019
【０１１８】
上記中間体を、スキーム３で述べたように、酢酸エチル／アセトン中、水素雰囲気下（１気圧）、ＰｔＯ２で表題化合物へ還元処理した。
【０１１９】
１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）７．９０−７．８５（３Ｈ，ｍ），７．８０−７．７３（１Ｈ，ｍ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１７−５．１１（１Ｈ，ｍ），４．９５（１Ｈ，ｄ，７．３Ｈｚ），４．３１−４．２３（１Ｈ，ｍ），４．１８−４．１０（２Ｈ，ｍ），３．６５−３．５１（２Ｈ，ｍ），３．１８−３．１２（１Ｈ，ｍ），２，８９−２．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），２．１４−１．６８（７Ｈ，ｍ），１．５１−１．４０（１Ｈ，ｍ），１．３３（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）。
【実施例１５】
【０１２０】
５−［３−（（４Ｓ）−４−｛（３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブチル｝−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル）プロピル］チオフェン−２−カルボン酸
【０１２１】
【化１９】
2009502977.tif 000020
【０１２２】
上記で得たイソプロピルエステルをメタノール／水中、ＬｉＯＨで処理して対応する酸を得た。ＭＳ（−ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５２０．０（Ｍ−Ｈ）−。
【０１２３】
スキーム６：ホーナー−ワーズワース−エモン試薬１３ｅの調製
【０１２４】
【化２０】
2009502977.tif 000021
【０１２５】
工程１：２−（３−ヨードフェニル）プロパン−２−オール
３−ヨード−アセトフェノン（１５ｇ、６１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１００ｍＬ溶液に、−７８℃でＭｅＭｇＢｒ（ＴＨＦ中、１．４Ｍ溶液６０ｍＬ、８４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、溶液を０℃に加温しながら１時間攪拌した。反応を飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、粗製物をエーテル（２×）で抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。粗製物をフラッシュ（５〜１０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して所望の生成物を得た。
工程２：エチルジフルオロ［３−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニル］アセタート
２−（３−ヨードフェニル）プロパン−２−オール（１０ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ５０ｍＬ溶液に、エチルブロモ−α，α−ジフルオロアセタート（７．７５ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）および銅ブロンズ（５．３４ｇ、８４ｍｍｏｌ）を加え、この懸濁液を５５℃で２．５日間加熱し、次いで室温に冷却した。混合物をＫＨ２ＰＯ４でクエンチし、濾過した。固体を酢酸エチル／水で洗浄し、濾液を分離した。水層をエーテル（２×）で抽出し、有機相を合わせ、水および食塩水で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。粗製物をフラッシュ（５〜１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して所望の生成物を得た。
工程３：エチルα，α−ジフルオロ（３−イソプロピルフェニル）アセタート
第三級アルコールエチルジフルオロ［３−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチルフェニル］アセタート（７ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン５０ｍＬ溶液に、−７８℃でトリエチルシラン（２１．７ｍＬ、１３６ｍｍｏｌ）、次いで三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（１６．７ｍＬ、１３６ｍｍｏｌ）を加え、溶液を３０分間攪拌した。混合物を固形のＮａＨＣＯ３でクエンチし、室温にまで加温した。水を加え、水層をエーテル（２×）で抽出し、有機層を合わせ、水および食塩水で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。粗製物をフラッシュ（５〜１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して所望の生成物を得た。
工程４：ジメチル［３，３−ジフルオロ−３−（３−イソプロピルフェニル）−２−オキソプロピル］ホスホナート
ジメチルメチルホスホナート（３．１ｇ、２５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液に、−７８℃でｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中、１．６Ｍ溶液１４．２ｍＬ、２２．７ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を同温度で１時間攪拌した。次にこの溶液に、ＴＨＦ中、エチルα，α−ジフルオロ（３−イソプロピルフェニル）アセタート（５．５ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）をカニューレから加え、混合物を−７８℃で２時間攪拌し、２．２ｍＬの酢酸および水でクエンチした。室温に加温した後、混合物を酢酸エチル（３×）で抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮して所望の生成物を無色のオイルとして得た。
工程５：１３ｅの調製
このオイル（３ｇ、９．４ｍｍｏｌ）のエーテル／ヘキサン（１：１、４０ｍＬ）溶液に、０℃で水素化ナトリウム６０％（３７５ｍｇ、９．３７ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、白色の懸濁液を室温で１時間攪拌した。混合物を濾過し、白色固体をエーテル／ヘキサンで洗浄した。このようにして得られた固体を高減圧下、乾燥して１３ｅ（白色粉末）を得た。
【実施例１６】
【０１２６】
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−（３−イソプロピルフェニル）ブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
【０１２７】
【化２１】
2009502977.tif 000022
【０１２８】
表題化合物は、中間体１０および試薬１３ｅを用いてスキーム３に従って調製した。ＭＳ（＋ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ４９４．０（Ｍ＋１）＋。
【実施例１７】
【０１２９】
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−（３−イソプロピルフェニル）ブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
【０１３０】
【化２２】
2009502977.tif 000023
【０１３１】
表題化合物は、触媒としてＰｔＯ２を用いる水素化により調製した。ＭＳ（＋ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ４９６．１（Ｍ＋１）＋。
【０１３２】
実施例１８および１９に示された化合物の調製は、スキーム７に示される。
【０１３３】
【化２３】
2009502977.tif 000024
【０１３４】
工程１：イソプロピル４−ブロモ−５−｛３−［（４Ｒ）−４−（ブロモメチル）−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル］プロピル｝チオフェン−２−カルボキシラート（２１）
チオフェン１０（０．７００ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）のＡｃＯＨ（２ｍＬ）溶液に、臭素（０．１４０ｍＬ、２．６７ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。溶液を１８時間攪拌した。反応混合物を１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液で希釈し、水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、有機溶媒を減圧蒸発した。粗製物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して２１を黄色オイルとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ｐｐｍ）（アセトン−ｄ６）：７．６１（１Ｈ，ｓ），５．２０−５．１１（１Ｈ，ｍ），４．３７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，３．１Ｈｚ），４．２９−４．１８（３Ｈ，ｍ），３．８２−３．７７（１Ｈ，ｍ），３．６８−３．６１（１Ｈ，ｍ），３．３３−３．２７（１Ｈ，ｍ），２．８９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．２５−２．１６（１Ｈ，ｍ），２．１０−１．８２（３Ｈ，ｍ），１．３４（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）。
工程２：イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（アセチルオキシ）メチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）−４−ブロモチオフェン−２−カルボキシラート（２２）
１８−クラウン−６（２．１０ｇ）および酢酸カリウム（１．１９ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（７５ｍＬ）の攪拌懸濁液に、１０５℃で臭化物２１（０．７８２ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を１０５℃で１８時間加熱した。反応物を室温にまで冷却し、水で希釈した。水層を１：１のＥｔＯＡｃ／エーテル（３×）で抽出し、合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。有機溶媒を減圧濃縮した。粗製の生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して２２を黄色オイルとして得た。ＭＳ（＋ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ４６２．１，４６４．１。
工程３：イソプロピル４−ブロモ−５−｛３−［（４Ｒ）−４−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル］プロピル｝チオフェン−２−カルボキシラート（２３）
アセタート２２（０．７２９ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）の乾燥メタノール（１０ｍＬ）溶液に固形のＮａＯＭｅ（３４０ｍｇ、６．３１ｍｍｏｌ）を加えた。２時間攪拌した後、反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチし、水層をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗製の生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（１００％ＥｔＯＡｃ）により精製して２３を黄色オイルとして得た。ＭＳ（＋ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ３９２．２，３９４．２。
【実施例１８】
【０１３５】
メチル４−ブロモ−５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート
【０１３６】
【化２４】
2009502977.tif 000025
【０１３７】
上記の中間体２３を、記述したように表題化合物へと処理した。ＭＳ（＋ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ６２２．１，６２４．１，６２６．１。
【実施例１９】
【０１３８】
４−ブロモ−５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
【０１３９】
【化２５】
2009502977.tif 000026
【０１４０】
上記で得たメチルエステルをメタノール／水中、ＬｉＯＨで処理して対応する酸を得た。ＭＳ（＋ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ６１０．２，６１２．２。
【実施例２０】
【０１４１】
５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）−３−フルオロチオフェン−２−カルボン酸
【０１４２】
【化２６】
2009502977.tif 000027
【０１４３】
本化合物は、スキーム３および４に従って調製した。１Ｈ  ＮＭＲ  δ（ｐｐｍ）（アセトン）：７．７０（２Ｈ，ｍ），７．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．４９−７．４３（１Ｈ，ｍ），６．９０（１Ｈ，ｓ），５．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，１５．６Ｈｚ），５．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１５．５Ｈｚ），５．２３（１Ｈ，ｓ），４．７４（１Ｈ，ｓ），４．２０−４．１３（３Ｈ，ｍ），３．６５−３．５７（１Ｈ，ｍ），２．９３−２．８１（３Ｈ，ｍ），２．２３−２．１６（１Ｈ，ｍ），２．０１−１．９５（２Ｈ，ｍ），１．８５−１．７９（１Ｈ，ｍ）。
【実施例２１】
【０１４４】
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−４−（３−ブロモフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブチル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）−３−フルオロチオフェン−２−カルボン酸
【０１４５】
【化２７】
2009502977.tif 000028
【０１４６】
ＭＳ（−ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５５０．１，５４８．１。
【実施例２２】
【０１４７】
５−（３−｛（４Ｓ）−４−［（３Ｒ）−３−（４’−クロロ−２’−メチルビフェニル−３−イル）−３−ヒドロキシプロピル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）−チオフェン−２−カルボン酸
【０１４８】
【化２８】
2009502977.tif 000029
【０１４９】
スキーム８：ホーナー−ワーズワース−エモン試薬２４の調製
【０１５０】
【化２９】
2009502977.tif 000030
【０１５１】
ボロン酸２５（８ｇ、４７ｍｍｏｌ）、３−ヨード−エチルベンゾアート（７ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）の窒素パージした１００ｍＬジメトキシエタン溶液に、室温でテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１ｇ、０．８６５ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、この溶液に炭酸ナトリウム（水中、１Ｍ溶液４７ｍＬ、４７ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を８５℃で３時間加熱した。反応物を室温に冷却し、水を加えた。粗製の生成物を酢酸エチル（２×）で抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。粗製物をフラッシュクロマトグラフィ（５〜１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して所望の生成物２６を得た。
【０１５２】
ジメチルメチルホスホナート（３．７３ｍＬ、３５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液に、−７８℃でＬＨＭＤＳ（ＴＨＦ中、１Ｍ溶液７６ｍＬ、７６ｍｍｏｌ）を滴下して加え、混合物を−７８℃で１時間攪拌した。次に、この溶液に、ＴＨＦ中、エチルエステル２６（８ｇ、２９．１ｍｍｏｌ）をカニューレから加え、混合物を０℃に加温しながら２時間攪拌し、１ＮのＨＣｌ（８０ｍＬ）でクエンチした。室温にまで加温した後、混合物を酢酸エチル（３×）で抽出した。有機層は食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮して粗製物を得、このものをフラッシュクロマトグラフィ（５〜１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して所望の生成物２７を得た。
【０１５３】
ホスホナート２７（８．９６ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）のエーテル／ヘキサン（１：１、２００ｍＬ）溶液に、０℃で水素化ナトリウム６０％（１０４０ｍｇ、２６ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、白色の懸濁液を室温で１時間攪拌した。混合物を濾過し、白色固体をエーテル／ヘキサンで洗浄した。得られた固体を高減圧下で乾燥して所望のナトリウム塩２４を淡黄色粉末として得た。
【０１５４】
表題化合物は、スキーム３に記載した手順を使用してアルコール１０および試薬２４から調製した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５２８．１（Ｍ）＋。
【実施例２３】
【０１５５】
イソプロピル５−（３−｛（４Ｒ）−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−４−（３−ブロモ−５−ヨードフェニル）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタ−１−エン−１−イル］−２−オキソ−１，３−オキサジナン−３−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボキシラート
【０１５６】
【化３０】
2009502977.tif 000031
【０１５７】
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６９７．９（Ｍ＋１）＋，７００．１（Ｍ＋２）＋。
【０１５８】
Ｉ．家兎およびサルにおける眼圧（ＩＯＰ）に対するＥＰ４アゴニストの効果
動物
薬剤未投与の雄のダッチ・ベルテッド（Ｄｕｔｃｈ  Ｂｅｌｔｅｄ）家兎および雌のカニクイザルをこの研究で使用した。この研究の動物の世話および処置は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の指針および米国視覚眼科学研究協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）（ＡＲＶＯ）のガイドラインに従う。実験方法は全て、メルク社の動物管理使用機関の委員会によって厳重に承認された。
【０１５９】
薬剤の調製および投与
薬剤濃度は、活性成分（ベース）により表記される。本発明の化合物を、家兎用試験には０．０００６３％、０．０００１３％、サル用試験には０．００６３％、０．００１９％、０．０００６３％および０．００００６３％の濃度で適切な点眼液（例えば、ｐＨ５〜７の５ｍＭクエン酸塩緩衝液中、０．５％ポリソルベート−８０、０．１％ＥＤＴＡ、０．０２％塩化ベンザルコニウム、４．５％マンニトール）に溶解する。薬剤またはビヒクルの一定分量（２５ｕｌ）を局所的に、片側または両側の眼に投与する。片側に適用する場合、反対側の眼には同量のビヒクル（ｐＨ５〜７の５ｍＭクエン酸塩緩衝液中、０．５％ポリソルベート−８０、０．１％ＥＤＴＡ、０．０２％塩化ベンザルコニウム、４．５％マンニトール）を投与する。プロパラカイン（０．５％）を眼圧測定前に角膜に適用して、不快感を最小限に抑える。眼圧（ＩＯＰ）は、気動眼圧計（Ａｌｃｏｎ  Ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ  Ｐｎｅｕｍａｔｏｎｏｇｒａｐｈ）または同等物を使用して記録する。
【０１６０】
分析
結果を、薬剤またはビヒクルを投与する直前に測定した基準レベルからのＩＯＰ変化として表し、平均±標準偏差を示す。統計的な比較は、薬物処理動物の応答とビヒクル処理動物の応答との非対データ、および比較可能な時間間隔での同じ側の眼と反対側の眼との対データに関するステューデントｔ検定を使用して行う。日付の有意性は、ダネット（Ｄｕｎｎｅｔ）の「ｔ」検定を使用して、「ｔ−０」値からの差としても決定される。星印は、ｐ＜０．０５の有意水準を表す。
【０１６１】
Ａ．家兎の眼圧測定
体重２．５ｋｇ〜４．０ｋｇの雄のダッチ・ベルテッド家兎を、１２時間の明／暗サイクルで維持し、食餌を与える。全ての実験は、日内リズムに関係した変動を最小限に抑えるため、１日のうちの同じ時間で実施する。ＩＯＰを、処置前に測定し、次いで本発明の化合物またはビヒクルを、片眼または両眼に点眼し（１滴２５ｕｌ）、点眼後３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、および３６０分にＩＯＰを測定する。場合により、ビヒクルのみで両眼を処置した同じ数の動物について評価し、並行対照として薬剤処置した動物と比較する。
【０１６２】
Ｂ．サルの眼圧測定
右眼の片側高眼圧症を、体重２ｋｇ〜３ｋｇの雌のカニクイザルでＬｅｅらの方法（１９８５）を使用するアルゴンレーザシステム（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ＮＯＶＵＳ  ２０００、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）による線維柱帯の光凝固により誘発する。眼圧（ＩＯＰ）の増加が長引くことによって、緑内障患者に見られるものと同様の変化が視神経乳頭に生じる。
【０１６３】
ＩＯＰ測定では、サルは実験期間中、拘束イスに座位で維持される。動物は、各ＩＯＰ測定の約５分前に、塩酸ケタミンを筋肉内注射（３から５ｍｇ／ｋｇ）によって軽く麻酔され、０．５％プロパラカインの１滴を点眼した後に、ＩＯＰを記録した。ＩＯＰは、気動眼圧計（Ａｌｃｏｎ  Ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ  Ｔｏｎｏｍｅｔｅｒ）またはＤｉｇｉｌａｂ気動眼圧計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して測定する。
【０１６４】
ＩＯＰは、処置前と、一般的に処置後の３０、６０、１２４、１８０、３００および３６０分に測定する。基準値は、一般的に処置の２日または３日前のこれらの時点でも得られる。処置は、本発明の化合物２５ｕｌの１滴（０．００００６３〜０．００６３％）またはビヒクルを点眼することからなる。少なくとも１週間の休薬期間が、同じ動物について試験をする前に設けられる。正常圧（高眼圧とは反対側）の眼を、高眼圧の眼と全く同じ手法で処置する。両眼に関するＩＯＰ測定値を、同じ時点での対応する基準値と比較する。結果を、平均±標準偏差としてｍｍＨｇで表す。眼に対して使用する本発明の化合物の活性範囲は、０．０１ｎＭ〜１００，０００ｎＭの間である。
【０１６５】
本発明からの化合物（即ち、実施例１）は、ＷＯ２００４／０８５４３０（即ち、実施例２）に開示された化合物と比較して、家兎およびカニクイザルなどの動物種において、改善された眼に対する耐容性を示した。例えば、実施例１の点眼液の２．２μＭ（２５μＬ）またはビヒクル（５ｍＭクエン酸塩中、０．５％ポリソルベート−８０、０．０２％塩化ベンザルコニウム、０．１％ＥＤＴＡ、４．５％マンニトール）による、５日間のダッチ−ベルテッド（Ｄｕｔｃｈ−Ｂｅｌｔｅｄ）家兎のビヒクルパネル比較試験（局所投与、両眼、１日２回）では、薬剤処置関連所見が本化合物では示されなかった。これに比べて、ＷＯ２００４／０８５４３０の実施例２は、同じ服用量で非常にわずかな両眼の充血、非常にわずかな結膜浮腫およびわずかな眼漏の処置関連所見が示された。同様に、閉眼における５倍の改善が、本発明の化合物を眼に投与した後のニュージーランド白色家兎で観察された。また、本発明の化合物は、カニクイザルにおける眼の副作用（結膜充血、部分的な閉眼など）について３〜５倍の改善を証明した。
【０１６６】
ＩＩ．放射性リガンド結合アッセイ：
これらの化合物を試験するのに使用されるアッセイは、Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ  Ｍ、Ａｄａｍ  Ｍ、Ｂｏｉｅ  Ｙ、Ｃａｒｒｉｅｒｅ  Ｍ、Ｄｅｎｉｓ  Ｄ、Ｇｏｄｂｏｕｔ  Ｃ、Ｌａｍｏｎｔａｇｎｅ  Ｓ、Ｒｏｃｈｅｔｔｅ  Ｃ、Ｓａｗｙｅｒ  Ｎ、Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ＮＭ、Ｂｅｌｌｅｙ  Ｍ、Ｇａｌｌａｎｔ  Ｍ、Ｄｕｆｒｅｓｎｅ  Ｃ、Ｇａｒｅａｕ  Ｙ、Ｒｕｅｌ  Ｒ、Ｊｕｔｅａｕ  Ｈ、Ｌａｂｅｌｌｅ  Ｍ、Ｏｕｉｍｅｔ  Ｎ、Ｍｅｔｔｅｒｓ  ＫＭ、「Ｔｈｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎａｌｏｇｓ．」、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２０００年１月１７日；１４８３（２）：２８５−２９３に記載されるように、また以下に論じるように、実質的に遂行した。
【０１６７】
ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３（ＥＢＮＡ）細胞系におけるプロスタノイド受容体の安定発現
完全長コード配列に対応するプロスタノイド受容体（ＰＧ）ｃＤＮＡを、哺乳動物の発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の適切な部位にサブクローニングし、ｐＣＥＰ４ＰＧプラスミドＤＮＡを、製造業者の指示書に従い、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して調製し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ＠（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用してＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞にトランスフェクトした。ハイグロマイシン耐性遺伝子と共にｃＤＮＡを発現するＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−Ｇ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、活性ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（商標）（Ｇ４１８）２５０μｇ／ｍｌ（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．／ＢＲＬから入取）、および２００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補ったダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で選択した。個々のコロニーを、クローニングリング法を使用して選択した状態で２〜３週間増殖させた後に単離し、その後、クローン細胞系内で増殖させた。受容体ｃＤＮＡの発現を、受容体結合アッセイによって評価した。
【０１６８】
ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を、空気中６％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で、補足ＤＭＥＭ完全培地で増殖させ、次いで収集し、様々な遠心分離（１０００×ｇ、１０分間、次いで１６０，０００×ｇ、３０分間、全て４℃で）の後に、プロテアーゼ阻害剤（２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０μＭのＥ−６４、１００μＭのロイペプチンおよび０．０５ｍｇ／ｍｌのペプスタチン）の存在下、氷上で３０分間、８００ｐｓｉで窒素キャビテーションを行い細胞溶解することにより膜を調製した。１６０，０００×ｇペレットを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイゼーション（Ｄｏｕｎｃｅ  Ａ；１０ストローク）によって、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）にタンパク質約５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０１６９】
プロスタノイド受容体結合アッセイ
プロスタノイド受容体結合アッセイは、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２（ＥＰサブタイプ）または１０ｍＭのＭｎＣｌ２（ＤＰ、ＦＰ、ＩＰおよびＴＰ）および放射性リガンド［ＥＰサブタイプでは０．５〜１．０ｎＭ［３Ｈ］ＰＧＥ２（１８１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＤＰでは０．７ｎＭ［３Ｈ］ＰＧＤ２（１１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＦＰでは０．９５ｎＭ［３Ｈ］ＰＧＦ２α（１７０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＩＰでは５ｎＭ［３Ｈ］イロプロスト（１６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＴＰでは１．８ｎＭ［３Ｈ］ＳＱ２９５４８（４６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）］を含有する、１０ｍＭ  ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．０）（ＥＰサブタイプ、ＦＰおよびＴＰ）または１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）（ＤＰおよびＩＰ）中、０．２ｍｌの最終インキュベーション容量で行った。ＥＰ３アッセイはまた、１００μＭのＧＴＰγＳを含有していた。反応は、１６０，０００×ｇ画分からの膜タンパク質（ＥＰ１では約３０μｇ、ＥＰ２では約２０μｇ、ＥＰ３では約２μｇ、ＥＰ４では約１０μｇ、ＦＰでは約６０μｇ、ＤＰでは約３０μｇ、ＩＰでは約１０μｇ、およびＴＰでは約１０μｇ）を添加することによって開始した。リガンドをジメチルスルホキシド（Ｍｅ２ＳＯ）に添加し、これを全インキュベーションにおいて１％（ｖ／ｖ）の一定に保った。非特異的結合を対応する非放射性プロスタノイド１μＭの存在下で測定した。インキュベーションを６０分間（ＥＰサブタイプ、ＦＰおよびＩＰ）または３０分間（ＤＰおよびＴＰ）、３０℃（ＥＰサブタイプ、ＤＰ、ＦＰおよびＴＰ）または室温（ＩＰ）で実施し、Ｔｏｍｔｅｃ  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ  ９６ウェル半自動化細胞収集機を使用して、ＥＤＴＡを含まないアッセイインキュベーション緩衝液で事前に湿潤させた９６ウェルＵｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｃ（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）に通して急速濾過して（４℃で）終了させた。フィルターを、同じ緩衝液３ｍｌ〜４ｍｌで洗浄し、５５℃で９０分間乾燥し、個々のフィルターに結合した残留放射能を、１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（Ｗａｌｌａｃ）を使用してＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ  Ｆ（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）５０μｌを添加してシンチレーションカウントすることにより測定した。全結合から非特異的結合を差し引くことによって、特異的結合を算出した。特異的結合は全結合の９０％〜９５％を表し、使用した放射性リガンドおよびタンパク質の濃度に対して直線的であった。全結合は、インキュベーション培地に加えられた放射性リガンドの５〜１０％を表した。
【０１７０】
本発明化合物の骨に使用する活性範囲は、０．０１ｎＭ〜１００，０００ｎＭである。
【０１７１】
骨吸収アッセイ：
１．動物の処置：
ｍＲＮＡ局在化の実験では、５週齢のスプラーグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）をＣＯ２で安楽死させ、この脛骨および頭蓋冠を切除し、軟組織を取り除いてすぐに液体窒素で凍結させる。ＥＰ４調節実験では、６週齢のラットに対し、ビヒクル（エタノールの７％滅菌水溶液）またはＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）のタンパク質同化用量（同じビヒクル中３から６ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内に１回注射する。動物を、注射後の幾つかの時点で安楽死させ、この脛骨および頭蓋冠、並びに肺および腎臓組織の試料を液体窒素中で凍結させる。
【０１７２】
２．細胞培養
ＲＰ−１骨膜細胞を４週齢のスプラーグ−ドーリーラットの脛骨の骨膜細胞の初代培養から自然突然変異により不死化させ、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を含むＤＭＥＭ（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で培養する。これらの細胞は、初期の培養では骨芽細胞表現型マーカーを発現しないが集密状態になると、Ｉ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、およびオステオカルシンを発現し、ミネラル化した細胞外マトリックスを生成する。
【０１７３】
ＲＣＴ−１およびＲＣＴ−３は、コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ消化の組み合わせによってラット胎児頭蓋冠から放出された細胞のＳＶ−４０ラージＴ抗原によって不死化されたクローン細胞系である。消化の最初の１０分間で放出された細胞に由来するＲＣＴ−１細胞（画分Ｉ）を、１０％ウシ胎児血清および０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＢＲＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＢＲＬ）で培養する。これらの細胞は、レチノイン酸処理によって分化し、骨芽細胞としての特徴を発現する。骨芽細胞に富む画分ＩＩＩの細胞から不死化されたＲＣＴ−３細胞は、５％ウシ胎児血清および０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ−１２培地（ＢＲＬ）で培養する。ＴＲＡＢ−１１細胞もまた、成体ラット脛骨のＳＶ４０ラージＴ抗原によって不死化し、１０％ＦＢＳおよび０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養する。ＲＯＳ１７／２．８ラットの骨肉腫細胞は、５％ＦＢＳを含有するＦ−１２で培養する。骨芽細胞に富む（画分ＩＩＩ）初代ラット胎児頭蓋冠細胞は、１９日齢ラット胎児の頭蓋冠をコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼで消化することによって得られる。その全体が本明細書中に参考として援用されている、Ｒｏｄａｎらの「Ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｃａｌｖａｒｉａ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｃｉｄｉｃ  ＦＧＦ」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２１，１９１９−１９２３（１９８７）を参照されたい。細胞を、３０〜５０分の消化で放出させ（画分ＩＩＩ）、５％ＦＢＳを含有するＦ−１２培地で培養する。
【０１７４】
１０％ＦＢＳを含むイーグルＭＥＭで培養したＰ８１５（マウス肥満細胞腫）細胞および１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養したＮＲＫ（正常なラットの腎線維芽細胞）細胞は、ＥＰ４発現の陽性対照および陰性対照としてそれぞれ使用する。その全体が本明細書中に参考として援用されている、Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．「Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎ」：Ｓａｍｕｌｅｓｓｏｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．編）「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ」，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｚｎｅｓ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．４９９−５０４（１９９５）およびｄｅ  Ｌａｒｃｏ  ｅｔ  ａｌ．「Ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ：ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９４、３３５−３４２（１９７８）を参照されたい。
【０１７５】
３．ノーザンブロット分析
凍結した骨試料を組織ホモジナイザによって微粉砕した後、イソチオシアン酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法を使用して、脛骨の骨幹端または骨幹および頭蓋冠から全ＲＮＡを抽出する。その全体が本明細書中に参考として援用されている、Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．の「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．」，Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６２，１５６−１５９（１９８７）を参照されたい。ＲＮＡ試料（２０ｍｇ）を、０．９％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離し、ナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）に移す。膜を、Ｈｙｂｒｉｓｏｌ  Ｉ（Ｏｎｃｏｒ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）および超音波処理したサケの精液ＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）０．５ｍｇ／ｍｌ中において４２℃で３時間予備ハイブリダイズさせ、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用したランダムプライミングによって［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で標識したラットＥＰ２およびマウスＥＰ４ｃＤＮＡプローブと４２℃でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、膜を、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで４回、合わせて１時間室温で洗浄し、０．２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１回、５５℃で１時間洗浄し、次いで増感スクリーンを使用して、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ２フィルムに−７０℃で露光する。フィルム現像後、結合したプローブを、８０℃で０．１％ＳＤＳにより２回除去し、膜をヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）ｃＤＮＡプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから購入）とローディングコントロール用にハイブリダイズさせる。
【０１７６】
４．インサイチューハイブリダイゼーション：
凍結した脛骨を７ｍｍの厚さで冠状に切り取り、この切片を荷電したスライド（Ｐｒｏｂｅ  Ｏｎ  Ｐｌｕｓ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＮＪ）に載せ、ハイブリダイゼーションまで−７０℃に保つ。ｃＲＮＡプローブを、ＲｉｂｏｐｒｏｂｅＩＩキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して３５Ｓ−ＵＴＰｇＳ（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）で標識する。ハイブリダイゼーションは５０℃で一晩実施する。その全体が本明細書中に参考として援用されている、Ｍ．Ｗｅｉｎｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｒａｔ  ｂｏｎｅ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ｉｎ−ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．，５，８３１−８４２（１９９０）およびＤ．Ｓｈｉｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａｖ  ａｎｄ  ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ」，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，８，４０３−４１４（１９９３）を参照されたい。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、グリセロールの６％水溶液で２：１に希釈したＩｌｆｏｒｄ  Ｋ５エマルジョンに４２℃で切片を浸漬し、１２日〜１４日の間、４℃で暗闇に曝す。水で１：１に希釈したＫｏｄａｋ  Ｄ−１９を用いて１５℃でスライドを現像し、定着させ、蒸留水で洗浄し、ヘマトキシリン染色後にグリセロール−ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でマウントする。染色した切片を、明視野または暗視野光学部品を使用して、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）で観察する。
【０１７７】
５．骨芽細胞系および骨組織におけるＥＰ４の発現
ＥＰ４およびＥＰ２  ｍＲＮＡの発現を、骨芽細胞に富む初代ラット頭蓋冠細胞、ラット胎児頭蓋冠または成体ラット脛骨からの不死化骨芽細胞系および骨芽細胞骨肉腫細胞系を含む様々な骨由来細胞で検討する。骨芽細胞および細胞系の殆どは、ラット骨肉腫細胞系ＲＯＳ１７／２．８を除いて、有意な量の３．８ｋｂのＥＰ４  ｍＲＮＡを示す。この知見と一致して、ＰＧＥ２はＲＯＳ１７／２．８細胞においては、細胞内ｃＡＭＰに影響を及ぼさないが、ＲＣＴ−３およびＴＲＡＢ−１１細胞では顕著に誘発される。レチノイン酸でＲＣＴ−１細胞を処理すると、この分化を促進するが、ＥＰ４ｍＲＮＡのレベルを低下させる。ＮＲＫ線維芽細胞は、ＥＰ４ｍＲＮＡを発現しないが、陽性対照として使用したＰ８１５肥満細胞腫細胞は大量のＥＰ４ｍＲＮＡを発現する。ＥＰ４ｍＲＮＡとは対照的に、骨芽細胞および細胞系のどれもが、検出可能な量のＥＰ２  ｍＲＡを全ＲＮＡ試料中に発現しない。ＥＰ４ｍＲＮＡは骨芽細胞で発現され、ＥＰ４はまた、５週齢のラットの脛骨および頭蓋冠から単離された全ＲＮＡで発現する。これとは対照的に、脛骨幹のＲＮＡにはＥＰ２ｍＲＮＡは見られない。
【０１７８】
６．ＰＧＥ２は、ＲＰ−１骨膜細胞および成体ラットの脛骨で、ＥＰ４  ｍＲＮＡの発現を誘発する
ＰＧＥ２は、骨芽細胞および骨組織においてシクロオキシゲナーゼ２の発現を上方制御することによってそれ自体の生成を増強し、従ってそれ自体の効果が自動増幅する。ＰＧＥ２はまた、ＥＰ４ｍＲＮＡレベルを増大させる。ＲＰ−１細胞を、成体ラット脛骨膜の初代培養から不死化させ、検査する。これらの細胞は、集密化すると骨芽細胞表現型マーカーを発現し、ヌードマウスに移植すると、ミネラル化骨マトリックスを形成する。試験したその他の骨芽細胞と同様に、ＲＰ−１骨膜細胞は、３．８ｋｂのＥＰ４転写物を発現する。ＰＧＥ２（１０−６Ｍ）で処理することにより、ＥＰ４ｍＲＮＡレベルが急速に増大し、処理後２時間でピークに達する。ＰＧＥ２は、より分化したＲＣＴ−３細胞においてＥＰ４ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさず、ＰＧＥ２によるＥＰ４発現は細胞型特異的調節であることを示している。ＥＰ２ｍＲＮＡは、ＰＧＥ２処理の前または後でＲＰ−１細胞において発現されない。
【０１７９】
ＰＧＥ２が、骨組織内でＥＰ４ｍＲＮＡレベルをインビボ調節するかどうか調べるため、５週齢の雄ラットにＰＧＥ２を注射する（３から６ｍｇ／Ｋｇ）。ＰＧＥ２を全身投与することにより、脛骨幹のＥＰ４ｍＲＮＡレベルが急速に増大し、注射後２時間でピークに達する。ＥＰ４ｍＲＮＡに対するＰＧＥ２の同様の効果が、脛骨幹端および頭蓋冠で観察される。ＰＧＥ２は、細胞型特異的および組織特異的な様式で、骨原性骨膜細胞ではインビトロで、また骨組織ではインビボで、ＥＰ４ｍＲＮＡのレベルを誘発する。ＰＧＥ２は、ＲＰ−１細胞においても骨組織においても、ＥＰ２ｍＲＮＡを誘発しない。
【０１８０】
７．骨組織におけるＥＰ４ｍＲＮＡ発現の局在化
インサイチューハイブリダイゼーションは、骨中でＥＰ４を発現する細胞を局在化させるために使用される。対照実験（ビヒクル注射）のラットでは、ＥＰ４の低い発現が骨髄細胞で検出される。ＰＧＥ２の単回タンパク同化用量を投与することにより、骨髄細胞内でのＥＰ４の発現が増加した。骨髄全体の銀粒子の分布は均一ではなく、骨幹端の多くの領域で塊や斑が生じる。脛骨の骨幹端では、ＥＰ４発現は二次海綿質領域に限定され、一次海綿質では見られない。同様の切片とセンスプローブとのハイブリダイゼーション（陰性対照）は、いかなるシグナルも示さない。
【０１８１】
ＥＰ４は、骨芽細胞ではインビトロで、また骨髄細胞ではインビボで発現し、そのリガンドであるＰＧＥ２により上方制御される。
【０１８２】
８．本発明のアゴニスト
アゴニスト活性を測定するための標準的方法を使用して、以下の化合物を細胞培養およびＥＰ４受容体無細胞系で評価し、化合物のアゴニスト活性をこのＥＣ５０値により測定する。
【国際調査報告】
2009502977.tif 000034
2009502977.tif 000035