(57)【要約】  本発明は、タンパク質の工業的生産に関する。さらに詳しくは本発明は、好ましくは目的のタンパク質（ＰＯＩ）を生産するための、抗生物質に対する耐性を付与するペプチド、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインと、配列番号１、２もしくは３を有する少なくとも１つの配列とを含んでなる、新規キメラ選択マーカーとしての融合タンパク質に関する。本キメラ選択マーカーは、（ｉ）抗生物質に対する耐性と；（ii）配列番号１、２もしくは３を有する配列にリガンドが結合した時に蛍光活性とを示す。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸、及び本発明の融合タンパク質を含む発現ベクター、及びさらに目的のタンパク質（ＰＯＩ）に関する。最後に、目的のタンパク質（ＰＯＩ）の高発現について細胞をスクリーニングするための本発明のキメラ選択マーカーの使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２もしくは３を含む少なくとも１つの配列に融合した、抗生物質に対する耐性を付与するペプチド配列、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインを含む融合タンパク質であって、
（ｉ）該抗生物質に対する耐性；及び
（ii）配列番号１、２もしくは３を含む該配列に対するリガンドの結合における蛍光活性、を示すことを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、ネオマイシン、カナマイシン、ネオマイシン−カナマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、プロマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシンのいずれかから選択される抗生物質に対する耐性を示す、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記抗生物質に対する耐性を付与するペプチドが、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１の配列のいずれかと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記抗生物質に対する耐性を付与するペプチドが、配列番号４、６、８，１０、１２、１４、１６、１８又は２０の配列のいずれかと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列によりコードされる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗生物質に対する耐性を付与するペプチドが、ストレプトミセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）から得られるプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）が、配列番号５のアミノ酸２〜１９９を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記配列番号１、２もしくは３の３’末端が、抗生物質に対する耐性を付与する該ペプチドの５’末端に融合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記抗生物質に対する耐性を付与するペプチドの３’末端が、該配列番号１、２もしくは３の５’末端に融合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、配列番号２３の配列を含むか、又は配列番号２２の配列によりコードされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、目的のタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項６の核酸と目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸が、ＩＲＥＳ配列により分離される、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記ベクターが、請求項１〜９のいずれか１項の融合タンパク質の発現と目的のタンパク質（ＰＯＩ）の発現とを制御する、１つのプロモーター又はプロモーターアセンブリーを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１６】
前記ベクターが、１つのプロモーターが請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質の発現を制御し、他のプロモーターが目的のタンパク質（ＰＯＩ）の発現を制御する、少なくとも２つのプロモーターを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
前記プロモーターがマウスＣＭＶ前初期領域のプロモーターである、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１８】
前記プロモーターがＩＥ１及び／又はＩＥ２プロモーターである、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１９】
前記ベクターが、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）よりなる群から選択される増幅マーカーをさらに含む、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１０の核酸又は請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、非ヒト哺乳動物細胞又はヒト細胞よりなる群から選択される、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
目的のタンパク質の発現のために細胞をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）請求項１１〜１９のいずれか１項のベクターで細胞をトランスフェクトする工程；
（ii）抗生物質ネオマイシン、カナマイシン、ネオマイシン−カナマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、プロマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシンのいずれかから選択される抗生物質に耐性である細胞クローンを選択する工程；
（iii）工程（ii）で選択された細胞を、配列番号１、２もしくは３を有する配列に対する結合親和性を有し、結合すると蛍光性となるリガンドを含有する溶液とともにインキュベートする工程；そして
（iv）リガンドの蛍光により工程（ii）で選択された細胞クローンの蛍光活性を検出する工程、
を含んでなる上記方法。
【請求項２３】
前記リガンドがフルオレセイン誘導体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リガンドが膜透過性過性の重ヒ素化フルオレセイン誘導体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リガンドが４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン又はその誘導体を含む群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記蛍光活性は工程（iv）でＦＡＣＳにより検出される、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも２０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、又は１，０００，０００細胞の蛍光活性が工程（iv）で検出される、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）工程（iv）で測定される細胞の約５％〜約２０％を選択する工程をさらに含み、選択される細胞は工程（iv）で最も高い蛍光活性を示す細胞である、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
（ｉ）選択される細胞中の目的のタンパク質の発現レベルを工程（ｖ）の最後に測定する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
目的のタンパク質を発現する細胞株を得る方法であって、
（ｉ）請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法により細胞をスクリーニングする工程；
（ii）該目的のタンパク質の最も高い発現を示す細胞を選択する工程；そして
（iii）該細胞から細胞株を樹立する工程、
を含んでなる方法。
【請求項３１】
目的のタンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）請求項３０の方法で得られる細胞株を、該目的のタンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程；及び
（ii）該目的のタンパク質を単離する工程、
を含んでなる方法。
【請求項３２】
目的のタンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
目的のタンパク質を医薬組成物に調製する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の細胞を、融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程；及び
（ii）該融合タンパク質を単離する工程、
を含んでなる方法。
【請求項３５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の該融合タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
目的のタンパク質の発現のために細胞をスクリーニングするための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０に記載の核酸、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項２０又は２１のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の工業的生産に関する。さらに詳しくは本発明は、好ましくは目的のタンパク質（ＰＯＩ）を生産するための、抗生物質に対する耐性を付与するペプチド、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインと、配列番号１、２もしくは３を有する少なくとも１つの配列とを含んでなる、新規キメラ選択マーカーとしての融合タンパク質に関する。本キメラ選択マーカーは、（ｉ）抗生物質に対する耐性と；（ii）配列番号１、２もしくは３を有する配列にリガンドが結合した時に蛍光活性とを示す。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸、及び本発明の融合タンパク質を含む発現ベクター、及びさらに目的のタンパク質（ＰＯＩ）に関する。最後に、目的のタンパク質（ＰＯＩ）の高発現について細胞をスクリーニングするための本発明のキメラ選択マーカーの使用が開示される。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞へのＤＮＡのトランスフェクションは一般的方法であり、一過性タンパク質発現の作用を研究するために、又は安定な細胞株を開発するためにしばしば使用される。このような方法は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）の構造−機能関係を研究することを可能にする。しかし、反応の終点に達するまでは、これらの実験の成功を追跡することは困難である。特に一過性発現の場合は、トランスフェクション効率又は発現速度を測定することが好ましい。しかしトランスフェクション効率又は発現速度の制御に使用されるレポーター分子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ）は典型的には、細胞を固定し、外因性基質（例えば異種遺伝子）とともにインキュベートすることが必要である。異種遺伝子を動物宿主細胞に導入し、低下した遺伝子の発現についてスクリーニングすることは、時間のかかる複雑な工程である。克服すべきいくつかの主要な問題は、例えば（ｉ）大きな発現ベクターの構築；（ii）最終的には選択圧の非存在下での、安定な長期発現を有するクローンのトランスフェクションと選択；及び（iii）目的の異種タンパク質の高発現速度についてのスクリーニングである。
【０００３】
目的の遺伝子を組み込み及び／又は目的のタンパク質を高発現するクローンの選択は典型的には、当業者が単純な選択系によりクローンをプレ選択することを可能にする１つのマーカー系を使用して行われる。
【０００４】
１つの典型的なアプローチは、選択圧に対する耐性を付与する選択マーカーの使用である。これらの選択マーカーのほとんどは、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、プロマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシン）に対する耐性を付与する。発現ベクターから目的の遺伝子を発現する細胞クローンを作成する時、宿主細胞は典型的には、同じベクター上で目的のタンパク質と上記選択マーカーとをコードするプラスミドＤＮＡベクターでトランスフェクトされる。しかし、遺伝子配列を取り込むプラスミド能力は通常限定されており、従って選択マーカーは第２のプラスミドにより発現する必要があり、これは目的の遺伝子を含むプラスミドと同時トランスフェクトされる。
【０００５】
安定なトランスフェクションは典型的には、宿主細胞のゲノムへの発現ベクターのランダム組み込みを引き起こす。選択圧の使用（例えば、培地に抗生物質を加える）は、各抗生物質又は一般に選択圧に対する耐性を付与する選択マーカーを含有するベクターを組み込まなかったすべての細胞を排除する。選択マーカーが目的の遺伝子と同じベクター上に位置する場合、又は選択マーカーが目的の遺伝子を含むベクターと同時トランスフェクトされた第２のベクター上に位置する場合、細胞は選択マーカーと目的の遺伝子の両方を発現するであろう。しかし目的の遺伝子の発現レベルが、組み込み部位により大きく変化することがしばしば観察される。
【０００６】
さらに、系から選択圧を除去すると、発現が不安定になったり消滅したりすることがしばしば観察される。従ってほんの少数の初期トランスフェクタントのみが高い安定な長期発現を与え、大きな候補集団からこれらのクローンを同定することは極めて単調である。従って、大きな候補集団を得るために、安定なトランスフェクションについての初期選択後、第１の工程で選択圧の非存在下で候補クローンを培養することがこれらの系では有益であろう。次に第２の工程で、目的の遺伝子の発現について候補クローンをスクリーニングする。しかし、先行技術の方法で公知のように、選択圧を適用すると選択を行うことができない。
【０００７】
別のアプローチでは、高タンパク質量の存在を直接証明する方法により、目的のタンパク質を高発現するクローンのスクリーニングを行うことができる。典型的には細胞内又は細胞培養物上清中で組み込み生成物を検出するために、免疫学的方法（例えばＥＬＩＳＡ又は免疫組織化学染色）が適用される。これらの方法は、しばしば単調であり、高価で、時間がかかり、典型的には大量処理スクリーニング（ＨＴＳ）測定法に適用できないことが多い。さらに、発現タンパク質の検出を可能にするために、発現されたタンパク質に特異的な抗体を利用しなければならない。
【０００８】
また蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）によりタンパク質量を定量する試みも行われるが、特に分泌されたタンパク質の場合はあまり成功していない（例えば、Ｂｏｒｔｈら（２０００）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７１，２６６−２７３を参照）。ＦＡＣＳ技術は、細胞の亜集団を検出可能なマーカーで標識し、このマーカーで励起されたシグナルにより好適な細胞を分類する工程に基づく。
【０００９】
当該分野では多くの容易に検出可能なマーカーが利用できる。これらは通常、発色もしくは発光基質に作用する酵素（例えば、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ノパリンシンターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及び分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ））に対応する。例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質又はＧｒｉｆｆｉｎら（「生きた細胞内の組換えタンパク質分子の特異的共有結合標識」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，Ｊｕｌ  １０；２８１（５３７４）：２６９−７２）が記載した合成ペプチドは、ＦＡＣＳの検出可能マーカーとして使用される。これらのすべてのタンパク質やペプチドの活性は、大量処理スクリーニング（ＨＴＳ）フォーマットで樹立される標準的測定法により測定することができる。
【００１０】
目的のタンパク質の高発現速度のスクリーニングのための１つの一般的アプローチは、それぞれが選択性を有する２つの検出可能な選択マーカーの使用である。２つの別のマーカーを有するかかる選択マーカー系は、目的の遺伝子と同じベクターから発現される検出可能マーカー及び追加のマーカーを利用する（例えば、Ｃｈｅｓｎｕｔら（１９９６）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９３，１７−２７を参照）。そのような検出可能な選択マーカー系を使用する概念の基礎となる考えは、同じベクター上の２つの異なる遺伝子の同時発現により、目的の遺伝子の発現と追加のマーカーの相関を確立することである。
【００１１】
この方法の欠点は、追加の選択マーカーのためのさらに別の発現カセットの使用である。これは、プロモーター、ｃＤＮＡ、及び少なくとも３つのタンパク質のポリアデニル化シグナル（すなわち、目的の遺伝子、選択マーカー、及び追加のマーカー）を含む発現単位を有することにより、発現ベクターがかなり大きくなる。複数鎖タンパク質については、状況はさらに複雑になる。あるいは、それぞれ（ａ）目的のタンパク質、（ｂ）選択マーカー、及び（ｃ）追加の選択マーカーをコードする３つの遺伝子を発現する個々のプラスミドベクターを、同時トランスフェクトすることができるであろう。しかしベクターは、異なる遺伝子座に組み込まれるか、又は変動する無関係のかつ追加的に非常に低い発現速度を示す可能性がある。さらに非常に低い発現速度で発現されるタンパク質は、無効な又は欠陥のある翻訳のために不活性で誤って折り畳まれる可能性がある。その結果、かかる構築体では、少なくともある程度は有効な翻訳を可能にするために、かさの大きな検出可能なマーカーを使用する時は、目的のタンパク質はある分子量（これは、使用される発現系に依存する）を超えてはならない。しかしこれは、上記方法の適用可能性を大きく低下させる。
【００１２】
上記制限を克服するための別のアプローチは、選択マーカーと検出可能マーカーの機能性を組合せたキメラマーカーの使用である。一部のキメラマーカーは当該分野で記載されている。
【００１３】
例えばＢｅｎｎｅｔｔら（１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４，４７８−４８２）は、ＧＦＰ−Ｚｅｏ（登録商標）マーカーを開示し、これはゼオシン抗生物質に対する耐性を付与し、その発現は蛍光顕微鏡により追跡することができる。この論文は、ＧＦＰ−Ｚｅｏ（登録商標）マーカーが目的のタンパク質の発現のスクリーニングに有用であることを示唆する。しかし目的のタンパク質の発現がＧＦＰ−Ｚｅｏ（登録商標）マーカーの発現と実際に相関していることを証明する実験データは無い。
【００１４】
ＵＳ２００４／０１１５７０４は、プロ−ＧＦＰキメラマーカーと、転写制御要素の活性を測定するためのその使用を開示する。ＵＳ２００４／０１１５７０４は、目的のタンパク質の発現について細胞をスクリーニングするためのそのようなマーカーの使用を教示も示唆もしていない。
【００１５】
ＷＯ２００６／０５８９００は、ルシフェラーゼとプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼを含む融合タンパク質を開示し、特に、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼとフレーム内融合したホタル［例えばホチヌス・ピラリル（ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）、ルシオラ・クルシアータ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）、ルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、又はホチヌス・ペンシルバニカ（ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）、レニラ・レインホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ウミシイタケ）又はバルグラ・ヒルゲンドルフィイ（ウミホタル）］由来のルシフェラーゼの使用を開示する。この融合タンパク質は、選択マーカー（プロマイシン）と検出可能マーカー（ルシフェラーゼ活性）の機能性を組合せることを可能にする。
【００１６】
ＷＯ０１／５３３２５は、Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９９８）が記載した合成ペプチド（さらにＬｕｍｉｏ−Ｔａｇと呼ぶ）を使用する方法に関する。特にＷＯ０１／５３３２５は、固体支持体に固定化した修飾蛍光化合物を使用して目的のタンパク質をアフィニティ精製する方法を教示する。かかる方法において目的のタンパク質はＬｕｍｉｏ−Ｔａｇに融合される。ＷＯ０１／５３３２５はさらに、（ｉ）Ｌｕｍｉｏ−Ｔａｇに融合した目的のタンパク質；及び（ii）選択マーカーを含むＤＮＡ構築体を教示し、該選択マーカーは抗生物質に対する耐性を与える遺伝子に対応する。しかしこれらのＤＮＡ構築体では、Ｌｕｍｉｏ−Ｔａｇに融合した目的のタンパク質をコードする遺伝子は、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子とは異なる。すなわちＷＯ０１／５３３２５はＬｕｍｉｏ−Ｔａｇを含むキメラマーカーを開示せず、目的のキメラタンパク質のみを開示する。
【００１７】
すなわち、最先端のマーカーの使用による問題はまだ解決されていない。効率的なキメラマーカーを提供するニーズがまだ存在する。新規の代替的かつ強力なキメラマーカーの提供は、治療用タンパク質の工業的生産および高発現クローンのスクリーニングの分野で極めて有用であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って本発明の目的は、目的のタンパク質の厳密なサイズ制限により制限されることなく、細胞の選択と目的のタンパク質の発現の追跡の両方を可能にするキメラマーカー系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記目的は、抗生物質に対する耐性を付与するペプチド、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインと、配列番号１、２もしくは３を有する少なくとも１つの配列とを含んでなる融合タンパク質として与えられ、ここで本キメラ選択マーカーは、（ｉ）抗生物質に対する耐性と；（ii）配列番号１、２もしくは３を有する配列にリガンドが結合した時に蛍光活性とを示す。本キメラ選択マーカーは、対応する抗生物質の添加でも細胞が生存し、適切なリガンドが加えられた時蛍光を発することを特徴とする細胞に取り込む。
【００２０】
本発明の融合タンパク質は、抗生物質に対する耐性を与えるペプチドを第１成分として含有する。この抗生物質は、好ましくはネオマイシン、カナマイシン、ネオマイシン−カナマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、プロマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシンから選択される。
【００２１】
第１成分として使用されるこれらの抗生物質に対する耐性を与えるペプチドは、好ましくは対応する耐性遺伝子によりコードされる。好ましくは耐性遺伝子は、上記抗生物質の耐性遺伝子、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼII型をコードする遺伝子、ネオマイシン−カナマイシンホスホトランスフェラーゼII型をコードする遺伝子、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）をコードする遺伝子、ゼオシン耐性タンパク質をコードする遺伝子、又はブレオマイシン耐性タンパク質をコードする遺伝子、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインから選択される。これらの耐性遺伝子によりコードされるペプチドの（生物）活性は、上記抗生物質に対する耐性を付与する能力である。
【００２２】
さらに好ましくは本発明の融合タンパク質は、
（ｉ）配列番号４のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ耐性遺伝子によりコードされる配列番号５のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ；
（ii）配列番号６のネオマイシン耐性遺伝子によりコードされる配列番号７のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII型；
（iii）配列番号８のカナマイシン耐性遺伝子によりコードされる配列番号９のカナマイシンホスホトランスフェラーゼII型；
（iv）配列番号１０のネオマイシン−カナマイシン耐性遺伝子によりコードされる配列番号１１のネオマイシン−カナマイシンホスホトランスフェラーゼII型；
（ｖ）配列番号１２のヒグロマイシン耐性遺伝子によりコードされる配列番号１３のヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ；
（vi）配列番号１４のゲンタマイシン耐性遺伝子によりコードされる配列番号１５のゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ；
（vii）配列番号１６のクロラムフェニコール耐性遺伝子によりコードされる配列番号１７のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；
（viii）配列番号１８のゼオシン耐性遺伝子によりコードされる配列番号１９のゼオシン再狭窄タンパク質；及び／又は
（ix）配列番号２０のブレオマイシン耐性遺伝子によりコードされる配列番号２１のブレオマイシン耐性タンパク質
から選択される抗生物質の耐性を付与するペプチドを含む。
【００２３】
さらに好ましくは、本発明の融合タンパク質は、第１成分として、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼを含む。上記したように本発明のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼの（生物）活性は、プロマイシンに対する耐性を付与するその能力である。プロマイシン（二塩化プロマイシン［３’（α−アミノ−ｐ−メトキシヒドロシンナムアミド）−３’−デオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアデノシン・２ＨＣｌ］、Ｃ22Ｈ29Ｎ7Ｏ5・２ＨＣｌ、分子量：５４４．４３（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））は、ストレプトミセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）からのアミノヌクレオシド抗生物質である。これはアミノアシル−ｔＲＮＡのアナロゴン（ａｎａｌｏｇｏｎ）であり、原核生物と真核生物のリボゾームでのペプチド輸送を停止させることによりタンパク質合成を阻害する。この抗生物質はグラム陽性細菌及び異なる動物細胞の増殖を阻害する。真菌とグラム陰性菌は、プロマイシンが細胞壁を通過できないため、耐性である。プロマイシンのストック濃度は、典型的には５〜５０ｍｇ／ｍｌ２回蒸留水であり、−２０℃で保存され、使用濃度は典型的には１〜３０μｇ／ｍｌ（哺乳動物細胞）である。
【００２４】
さらに好ましくは、本発明の融合タンパク質の第１成分として使用されるプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）は、微生物、好ましくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばストレプトミセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）又はストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）から得られる本来の配列である。好ましくは本発明の融合タンパク質のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）は、本来の完全長配列、さらに好ましくはストレプトミセス・アルボニガー・パック（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ  ｐａｃ）から得られる本来の完全長配列である。さらに好適な実施態様において、本発明の融合タンパク質のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）は、配列番号５のペプチド配列を含むか、又は配列番号４によりコードされるペプチド配列である。さらに好ましくは本発明の融合タンパク質のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）は、配列番号５のアミノ酸２〜１９９を含むか、又は配列番号４のヌクレオチド３〜５９７によりコードされる。未変性のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼはまた、すべての天然に存在するスプライス変異体を包含する。上記のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）の「スプライス変異体」は、上記の未変性のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）の非スプライスペプチドの異なる非標準的スプライシングにより得られるプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼであると理解される。さらに好ましくはプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）のかかるスプライス変異体は、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）活性を示す。
【００２５】
別の実施態様において本発明の融合タンパク質は、上記の抗生物質に対する耐性を与えるペプチドの断片を第１成分として含む。本発明においてかかるペプチドの断片は、その対応する未変性のペプチドと少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、そしてさらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列であると定義され、これらの断片は対応する抗生物質に対する耐性を与える（機能活性）。
【００２６】
あるいは又はさらに、本発明の融合タンパク質の第１成分（又は本発明の融合タンパク質、又は後述の目的のタンパク質）は、未変性の完全長型、すなわち上記の抗生物質に対する耐性を与えるペプチド（又は本発明の融合タンパク質、又は後述の目的のタンパク質）の未変性の完全長型の少なくとも５０、１００、又は１５０個のアミノ酸の生物活性断片に対応する。この断片は、なお生物活性があり、上記の抗生物質に対する耐性を与えることが重要である。第１成分の（生物）活性は、例えば当業者に公知の慣習的な方法により測定することができる。
【００２７】
さらに別の実施態様において本発明の融合タンパク質の第１成分は、上記の抗生物質に耐性を与えるペプチドの対立遺伝子変異体を含む。本発明において「対立遺伝子変異体」は、上記の第１成分の未変性型の未変性の配列の変化として理解され、ここで変化した配列は対応する抗生物質に耐性を付与する。さらに好ましくは上記の第１成分の対立遺伝子変異体は、第１成分の未変性型と、さらに好ましくは上記の配列、例えば配列番号５、さらに好ましくは配列番号５のアミノ酸２〜１９９と、又は配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１の配列と、少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。第１成分の対立遺伝子変異体、すなわち抗生物質に耐性を付与するペプチドの対立遺伝子変異体はまだ、その対応する抗生物質、すなわち、ネオマイシン、カナマイシン、ネオマイシン−カナマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、プロマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシンに耐性を付与する。
【００２８】
第１成分の（生物）活性（すなわち対応する抗生物質に耐性を付与する）はまた、第１成分のムテインによっても与えられる。本明細書において用語「ムテイン」は、天然に存在するポリペプチドの類似体、例えば上記の第１成分の未変性型の類似体、特に配列５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１（すなわち後述の本発明の融合タンパク質又は目的のタンパク質）の類似体であり、ここで天然に存在するポリペプチドの１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、天然に存在するポリペプチドと比較して生じた生成物の活性を大きく低下させることなく、ポリペプチドの天然に存在する配列に、異なるアミノ酸残基で置換されるか、又は欠失されるか、又は１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基が付加される。これらのムテインは、公知の合成法及び／又は部位特異的突然変異誘発法、又はこれらに適した他の公知の方法により調製される。本発明で使用できる上記の第１成分のムテイン（又は後述の本発明の融合タンパク質又は目的のタンパク質）又はこれらのムテインをコードする核酸は、好ましくはある限定されたセットの実質的に対応する配列を、過剰の実験をすることなく、本明細書に記載の教示や指針に基づいて、当業者により慣習的に得られる置換ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドとして含む。
【００２９】
本発明の上記の第１成分のムテイン（又は後述の本発明の融合タンパク質又は目的のタンパク質）は、好ましくは核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）によりコードされるタンパク質を含み、これは中程度又は高度ストリンジェント条件下で、ＤＮＡ又はＲＮＡ（上記の第１成分（の未変性型）をコードする）にハイブリダイズする。用語「ストリンジェント条件」はハイブリダイゼーションと以後の洗浄条件を意味し、これを当業者は「ストリンジェント」であると呼ぶ。Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（前述の）、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．、６．３と６．４（１９８７、１９９２）、及びＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．とＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照。
【００３０】
特に限定されないが、ストリンジェント条件の例として、試験中のハイブリッドの計算されるＴｍより低い１２〜２０℃での、例えば２×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳ中で５分間、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳ中で１５分間の洗浄条件；０．１×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳ中で３７℃で３０〜６０分間、次に０．１×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳ中で６８℃で３０〜６０分間の洗浄条件を含む。当業者は、ストリンジェント条件がＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば１０〜４０塩基）、又はこの混合オリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存することを理解するであろう。混合プローブを使用する場合は、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。
【００３１】
上記の第１成分のムテイン（後述の本発明の融合タンパク質又は目的のタンパク質）は、その未変性型、例えば第１成分の未変性型と、少なくとも５０％同一、さらに好ましくは少なくとも６０％同一、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ここで第１成分のこれらのムテインは上記の抗生物質に対する耐性を付与する。
【００３２】
本発明のクエリーなアミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象のポリペプチド配列が、クエリーなアミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸について最大５つのアミノ酸の変化を含んでよいこと以外は、対象のポリペプチドのアミノ酸配列はクエリーな配列と同一である。すなわちクエリーなアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中のアミノ酸残基の最大５％（１００のうちの５）が、挿入、欠失されるか、又は他のアミノ酸で置換されてよい。
【００３３】
正確な対応の無い配列について、第１配列の「％同一性」が第２配列に関して決定される。一般に、比較されるこれらの２つの配列は、配列間の最大相関を与えるように整列される。これは、整列の程度を上昇させるために、１つの配列又は両方の配列に「ギャップ」を挿入することを含む。％同一性は、比較される配列のそれぞれの全長にわたって決定され（いわゆる全体整列）、これは、同じ長さ又は似た長さの配列、又はより短い特定の長さ（いわゆる局所的整列）にわたって特に適しており、これは等しくない長さの配列により適している。
【００３４】
２つまたはそれ以上の配列の同一性と相同性を比較する方法は当該分野で公知である。すなわち例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５）で入手できるプログラム、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴとＧＡＰを使用して、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、及び２つのポリペプチド配列間の％同一性と％相同性を決定することができ（ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７，１９５−１９７）、２つの配列間の類似性の最適の単一の領域が見つかる。配列間の同一性及び／又は類似性を決定するための他のプログラムも当該分野で公知であり、例えばＢＬＡＳＴファミリのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅ  ｎｃｂｉ．ｍｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでＮＣＢＩのホームページからアクセスできる）やＦＡＳＴＡ（Ｐｅｒｓｏｎ（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３，６３−９８；ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４−２４４８）がある。
【００３５】
本発明の融合タンパク質のムテインの好適な変化は、「保存的」置換である。上記の第１成分（後述の本発明の融合タンパク質又は目的のタンパク質）の保存的アミノ酸置換には、グループのメンバー間の置換でも分子の生物学的機能が保存されるように、十分に似ている生理化学的性質を有する群内の同義のアミノ酸を含む（例えば、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．（１９７４），Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８５，８６２−８６４）。特に挿入及び／又は欠失が数個のアミノ酸（例えば３０未満、好ましくは１０未満）のみを含み、かつ機能活性に決定的に重要なアミノ酸（例えばシステイン残基）を除去したり排除したりしないなら、その機能を変化させることなく、（上記で）定義した配列にアミノ酸を挿入及び／又は欠失させてもよいことは当業者に明らかであろう。
【００３６】
好ましくは、同じグループに分類され典型的には交換可能な同義のアミノ酸は、表Ｉで定義される。さらに好ましくは同義のアミノ酸は表IIで定義され、さらに好ましくは表IIIで定義される。
【００３７】
表Ｉ
同義のアミノ酸の好適な群
アミノ酸      同義の群
Ser           Ser, Thr, Gly, Asn
Arg           Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu           Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro           Gly, Ala, Thr, Pro
Thr           Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala           Gly, Thr, Pro, Ala
Val           Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly           Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile           Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe           Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr           Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys           Ser, Thr, Cys
His           Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln           Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn           Gln, Asp, Ser, Asn
Lys           Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp           Glu, Asn, Asp
Glu           Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met           Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp           Trp
【００３８】
表II
同義のアミノ酸のより好適な群
アミノ酸      同義の群
Ser           Ser
Arg           His, Lys, Arg
Leu           Leu, Ile, Phe, Met
Pro           Ala, Pro
Thr           Thr
Ala           Pro, Ala
Val           Val, Met, Ile
Gly           Gly
Ile           Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe           Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr           Phe, Tyr
Cys           Cys, Ser
His           His, Gln, Arg
Gln           Glu, Gln, His
Asn           Asp, Asn
Lys           Lys, Arg
Asp           Asp, Asn
Glu           Glu, Gln
Met           Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp           Trp
【００３９】
表III
同義のアミノ酸の最も好適な群
アミノ酸      同義の群
Ser           Ser
Arg           Arg
Leu           Leu, Ile, Met
Pro           Pro
Thr           Thr
Ala           Ala
Val           Val
Gly           Gly
Ile           Ile, Met, Leu
Phe           Phe
Tyr           Tyr
Cys           Cys, Ser
His           His
Gln           Gln
Asn           Asn
Lys           Lys
Asp           Asp
Glu           Glu
Met           Met, Ile, Leu
Trp           Met
【００４０】
本発明で使用される上記の第１成分（又は後述の本発明の融合タンパク質又は目的のタンパク質）のムテインを得るために使用できるタンパク質のアミノ酸置換の作成例には、公知の方法、例えばＭａｒｋらの米国特許第４，９５９，３１４号、４，５８８，５８５号、及び４，７３７，４６２号；Ｋｏｔｈｓらの５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎらの４，９６５，１９５号；Ｃｈｏｎｇらの４，８７９，１１１号；及びＬｅｅらの５，０１７，６９１号に記載のもの；及び米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗら）又はＳａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、に記載のリジン置換タンパク質がある。
【００４１】
好ましくは本発明のムテインは、対応する天然に存在するポリペプチドと実質的に同じ生物活性を示す。
【００４２】
第２成分として本発明の融合タンパク質は、アミノ酸位置１、２、５、及び６に４つのシステインのセットを有する配列番号１の少なくとも１つのコア配列（Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ）を含む。配列番号１の３位と４位のアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択されるアミノ酸、又は天然に存在しないこれらの変異体（例えば、セレノシステイン）から選択されるアミノ酸を含む。さらに好ましくは、配列番号１の３位と４位のアミノ酸はプロリン又はグリシンを含む（配列番号２）。従って本発明の融合タンパク質は、第２成分として配列番号２を含む少なくとも１つの配列を含む。さらに好ましくは配列番号２においてプロリンはアミノ酸３位に位置し、グリシンはアミノ酸４位に位置する。さらに配列番号１と２のいずれも、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、好ましくはグリシンから選択されるさらなるアミノ酸を含む。本発明の融合タンパク質中に少なくとも１回存在する好適な配列の例は、配列番号３で示される。
【００４３】
本発明の融合タンパク質に含有される第２成分は、好ましくは６〜５０個のアミノ酸の長さ、さらに好ましくは６〜３０個のアミノ酸の長さ、さらに好ましくは６〜２０個のアミノ酸の長さを含む。
【００４４】
上記の抗生物質に対する耐性を付与するペプチド、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインと、配列番号１、２もしくは３を有する少なくとも１つの配列とを含有する融合タンパク質は、配列番号１、２もしくは３を有する配列のリガンドに結合することができる。
【００４５】
本発明において「リガンド」は、好ましくは配列番号１、２もしくは３を有する配列に結合することができる化合物である。さらに好ましくはかかるリガンドは、フルオレセイン又はその誘導体であり、最も好ましくはリガンドは、膜透過性重ヒ素化フルオレセイン誘導体、例えば膜透過性フルオレセイン誘導体４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン、又は同じ結合性と蛍光性を示すその任意の誘導体である。
【００４６】
リガンド自体は、その非結合状態では非蛍光性であるが、配列番号１、２もしくは３に結合すると蛍光性となる。配列番号１は、リガンドが結合に必要とする一般的コア配列である。しかし配列番号１のコア配列は、種々の特異的変異体となり易く、これらは上記したようにコア配列に包含される。結合状態のリガンドの蛍光は、蛍光シグナルを検出するのに適した公知の蛍光検出法を使用して検出される。好適な方法は、蛍光シグナルの特異的生成、すなわち規定の波長によるリガンドの蛍光の励起と、次に生成されるシグナルの検出とを含む。リガンドの蛍光シグナルの同時又は時差的生成と検出も同様に、本発明に含まれる。好ましくは蛍光検出は、レーザー誘導蛍光検出（ＬＩＦ）、レーザー誘導時差的蛍光検出（ＬＩ２Ｆ）、蛍光寿命イメージング顕微鏡（ＦＬＩＭ）、分光光学的方法、フローサイトメトリー、白色液体蛍光分光法、又は蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）を用いて行われる。
【００４７】
第１成分として、上記の抗生物質に耐性を付与するペプチドを、配列番号１、２もしくは３の少なくとも１つの配列、又は配列番号１、２もしくは３のさらに多くの配列に融合すると融合タンパク質が得られ、これは、配列番号１、２もしくは３の１つのみの配列を有する融合タンパク質より、リガンドに結合するとより強い蛍光シグナルを示す。上記リガンド結合配列の２つ以上のタグ付けは、例えば低蛍光シグナルが予測される時（例えば、プローブ中に他の蛍光成分も存在する時）はシグナル対ノイズ比を上昇させるために使用される。
【００４８】
本発明の融合タンパク質又はその変異体の第１成分が、本発明の融合タンパク質の第２成分としての配列番号１、２もしくは３を含む１つのみのリガンド結合配列に融合すると、第１成分、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインの３’末端は、配列番号１、２もしくは３を含むリガンド結合配列の５’末端に結合するか、又は好ましくは配列番号１、２もしくは３を含むリガンド結合配列の３’末端は、第１成分、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインの５’末端に融合する。
【００４９】
あるいは、上記第１成分又はその変異体、及び配列番号１、２もしくは３を含む２つ以上のリガンド結合配列が本発明の融合タンパク質に含有される場合、配列番号１、２もしくは３を含むリガンド結合配列は、配列番号１、２もしくは３のリガンド結合配列の５’末端を介して、第１成分、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインの３’末端にブロックとして配置されるか、又はその逆でもよい。別の態様において配列番号１、２もしくは３を含む２つまたはそれ以上のリガンド結合配列が、第１成分の配列のいずれかの末端に存在してもよい。
【００５０】
本発明の融合タンパク質は、上記第１成分と第２成分とを空間的に分離するリンカーを含有してもよい。あるいは（又はさらに）かかるリンカーは、本発明の融合タンパク質中に複数のリガンド結合配列が存在する場合は、配列番号１、２もしくは３を含むリガンド結合配列を空間的に分離するのに使用される。典型的にはかかるリンカーは、オリゴペプチド又はポリペプチドである。好ましくはリンカーは、１〜２０個のアミノ酸の長さ、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸の長さ、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸の長さを有する。本発明の融合体は、２次構造形成性を持たない（すなわち、らせん又はシート構造形成傾向が無い）リンカーを有利に含む。さらに好ましくはリンカーは、少なくとも５０％のグリシン及び／又はプロリン残基からなる。最も好ましくはリンカーは、もっぱらグリシン残基からなる。
【００５１】
上記の本発明の融合タンパク質又はその成分（又は後述の目的のタンパク質）は、さらなる検出のために標識してもよい。かかる標識物は、好ましくは：
（ｉ）放射性標識、すなわちイオウ、水素、炭素、窒素などを用いる放射性リン酸化又は放射性標識
（ii）着色色素（例えば、ジゴキシゲニンなど）
（iii）蛍光グループ（例えばフルオレセインなど）
（iv）化学発光グループ
（ｖ）固相への固定化用グループ（例えば、Ｈｉｓタグ、ビオチン、ｓｔｒｅｐタグ、ｆｌａｇタグ、抗体、抗原など）、及び
（vi）（ｉ）〜（ｖ）の標識物の２つまたはそれ以上の標識物の組合せ、
を含む標識物よりなる群から選択される。
【００５２】
特に好適な実施態様において本発明の融合タンパク質は、配列番号２３の配列を含むか、又は配列番号２２の配列によりコードされる。
【００５３】
本発明の第２の態様は、上記の融合タンパク質をコードする核酸に関する。本発明の融合タンパク質をコードする本発明の核酸は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、サブゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び／又はこれらの組合せを含む。本発明の核酸はまた、（遺伝暗号の縮重のために）本発明の融合タンパク質の所望のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列変異体を含む。例えばこれらの代替核酸配列は、選択された宿主生物中のコードされた融合タンパク質の改良された発現につながる。核酸配列を適切に調整するための表は、当業者に公知である。かかる核酸及び／又は誘導体の調製と精製は通常、標準的方法を使用して行われる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照）。好ましくは該核酸は、配列番号２３を含む融合タンパク質をコードする。最も好ましくは該核酸は、配列番号２２を含む。
【００５４】
本発明の第３の態様は、（発現）ベクターに関する。用語「ベクター」は本明細書において、環状又は線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ（これは２本鎖又は１本鎖であり、かつ細胞宿主又は単細胞もしくは多細胞宿主生物に伝達される少なくとも１つの本発明の核酸を含む）を示す。本発明のベクターは、上記の本発明の融合タンパク質をコードする本発明の核酸、および目的のタンパク質（ＰＯＩ）又はそのムテインをコードする核酸を含む。
【００５５】
本発明の目的のタンパク質は、その産生が望ましい任意のポリペプチドである。目的のタンパク質は、医薬、農業関連産業、又は研究室の装備の分野で応用される。好適な目的のタンパク質は医薬分野で使用される。例えば目的のタンパク質は、例えば天然に分泌されるタンパク質、細胞質タンパク質、膜貫通タンパク質、又はヒトもしくはヒト化抗体でもよい。目的のタンパク質が細胞質タンパク質又は膜貫通タンパク質である時、このタンパク質は好ましくは可溶性になるように改変される。そのような改変は、当業者に公知の任意の方法により行われる。好ましくはそのような改変は、例えばコード核酸配列中の親水性アミノ酸をコードするコドンの数を増やすことにより、例えば親油性及び／又は両新媒性アミノ酸をコードするコドンのヌクレオチドを（保存的に）置換し及び／又は欠失させることにより行われる。コード核酸中の置換は、好ましくは表Ｉ〜IIIのいずれかに記載のアミノ酸置換を引き起こす。
【００５６】
目的のタンパク質の起源は任意である。好適な目的のタンパク質はヒト起源であり、例えば血液凝固系に関与する（ポリ）ペプチドホルモン、サイトカイン、タンパク質や、造血系に関与する成長因子から選択される。
【００５７】
好ましくは目的のタンパク質は、絨毛性性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンベータ−１ｂ）、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンガンマ受容体）、ＴＮＦ受容体ｐ５５とｐ７５、インターロイキン（例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−１１）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン−１８結合タンパク質）、抗ＣＤ１１ａ抗体、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、下垂体ペプチドホルモン、更年期性腺刺激ホルモン、インスリン様増殖因子（例えば、ソマトスタチン−Ｃ）、ケラチン細胞成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性繊維芽細胞増殖因子、インスリン、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、ソマトロピン、骨形成蛋白質−２、タンパク質−３、タンパク質−４、タンパク質−５、タンパク質−６、タンパク質−８、タンパク質−９、タンパク質−１０、血小板由来増殖因子、ヒルジン、エリスロポエチン、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、及びムテイン、これらの断片、可溶性型、機能性誘導体、融合タンパク質よりなる群から選択され、ここで本発明の目的のタンパク質の「ムテイン」は、「ムテイン」の一般的定義で上記で定義される。
【００５８】
さらなる好適な実施態様において目的のタンパク質は、さらなる検出のために、上記の任意の標識物を使用して標識される。かかる標識物を目的のタンパク質に導入する方法は当業者に公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載されている。
【００５９】
好ましくは本発明のベクターは発現ベクターである。本発明の「発現ベクター」は、好ましくは上記のベクターを含み、宿主細胞中の挿入されたポリヌクレオチドの発現を駆動するウイルス、細菌、植物、哺乳動物、及び他の真核生物源からのエンハンサー／プロモーター、例えばインシュレーター、境界要素、ＬＣＲ（例えば、ＢｌａｃｋｗｏｏｄとＫａｄｏｎａｇａ（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，６１−６３）、又はマトリックス／足場結合領域（例えば、Ｌｉ，Ｈａｒｊｕ、及びＰｅｔｅｒｓｏｎ，（１９９９）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５，４０３−４０８に記載されている）のような適切な要素を、発現支持体としてさらに含む。
【００６０】
本明細書において使用される用語「プロモーター」は、１つまたはそれ以上のＤＮＡ配列の転写を制御するように機能し、かつ他のＤＮＡ配列（これはプロモーター機能を制御するように相互作用する）のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位の存在により構造的に同定される、ＤＮＡの領域を意味する。プロモーターの機能性発現促進断片は、プロモーターとしての活性を保持する短縮されたか又は末端切断されたプロモーター配列である。プロモーター活性は当該分野で公知の任意の測定法により測定され、例えばレポーター遺伝子としてルシフェラーゼを使用するレポーターアッセイにより測定される（Ｗｏｏｄ，ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｄｅｗｊｉ，及びＤｅＬｕｃａ，（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２４，５９２−５９６；ＳｅｌｉｇｅｒとＭｃＥｌｒｏｙ，（１９６０）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８８，１３６−１４１）、又はＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）から販売されている）。
【００６１】
好適な実施態様において本発明の発現ベクターは、マウスＣＭＶ前初期領域の少なくとも１つのプロモーターを含む。プロモーターは例えば、ＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子のプロモーター（「ＩＥ１プロモーター」）でもよく、これは例えばＷＯ８７／０３９０５により公知である。プロモーターはまた、ｍＣＭＶ  ＩＥ２遺伝子のプロモーター（「ＩＥ２プロモーター」）でもよく、ｍＣＭＶ  ＩＥ２遺伝子自体は、例えばＭｅｓｓｅｒｌｅ，Ｋｅｉｌ，及びＫｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，１６３８−１６４３から公知である。ＩＥ２プロモーターとＩＥ２エンハンサー領域は、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５０２８０に詳細に記載されている。
【００６２】
本発明の発現ベクターで使用される「エンハンサー領域」は、典型的には１つまたはそれ以上の遺伝子の転写を上昇させるように機能するＤＮＡの領域を意味する。さらに詳しくは本明細書において用語「エンハンサー」は、発現される遺伝子の位置や配向に無関係に遺伝子の発現を上昇、増強、改良、又は改善するＤＮＡ制御要素であり、２つ以上のプロモーターの発現を上昇、増強、改良、又は改善してもよい。
【００６３】
さらに本発明の発現ベクターは増幅マーカーを含んでよい。この増幅マーカーは、例えばアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）よりなる群から選択される。上記タンパク質、すなわち目的のタンパク質（ＰＯＩ）及び／又は本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子の増幅は、ベクターが細胞に組み込まれるとこれらのタンパク質の発現レベルが上昇することを可能にする（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，１７５０−１７５９）。
【００６４】
ある実施態様において本発明の発現ベクターは、１つのプロモーター又はプロモーターアセンブリーを含み、このプロモーター又はプロモーターアセンブリーは、目的のタンパク質（ＰＯＩ）又はそのムテインと本発明の融合タンパク質の両方の発現を指令する。従って目的のタンパク質と本発明の融合タンパク質は好ましくは、本発明の発現ベクター中の１つの発現カセット中に「フレーム内」で含有され、両方のコード領域は内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により分離され、こうして本発明のベクター中で２シストロン性核酸配列を形成する。かかる（内部リボゾーム侵入部位）配列は、リボゾーム機構が単一の転写体内の２次部位から翻訳を開始することを可能にし、こうして１つのみのプロモーター／プロモーターアセンブリーを使用する時、目的のタンパク質と本発明の融合タンパク質の両方を２つの別のタンパク質として発現することを可能にする。この実施態様は、本発明の融合タンパク質の発現とＰＯＩの発現との最適な相関を確実にする。ＰＯＩの高発現について細胞をスクリーニングするための本発明の融合タンパク質を使用する時、このような相関は必須である。
【００６５】
あるいは本発明の発現ベクターは少なくとも２つのプロモーター又はプロモーターアセンブリーを含み、ここでこれらのプロモーターの１つは本発明の融合タンパク質の発現を指令し、他の１つは目的のタンパク質（ＰＯＩ）の発現を指令する。この実施態様において発現ベクターは好ましくは２つの発現カセットを有し、第１のカセットは本発明の融合タンパク質を運搬し、第２のカセットは目的のタンパク質を運搬し、ここで各発現カセットは、上記のプロモーター及び／又はエンハンサー配列に機能的に結合している。従って本実施態様は、ＩＲＥＳ配列により連結された目的のタンパク質と本発明の融合タンパク質の両方を含む１つのみの転写体は産生しない。その代わり、２つの転写体が提供される。このような系は、目的のタンパク質の分子量が決定的に重要な値を超えると有利に使用される。この代替の好適な実施態様において、マウスＣＭＶ前早期領域のプロモーターは、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御し、本発明の融合タンパク質はベクター骨格中に挿入された追加の発現カセットから発現される。ｍＣＭＶ（ＩＥ１）及びｍＣＭＶ（ＩＥ２）プロモーターは、目的のタンパク質をコードする遺伝子の２つの同一のコピー、又は抗体やペプチドホルモンのようなマルチマー性の目的のタンパク質の２つのサブユニットの２つの同一のコピーのいずれかの発現を制御する。
【００６６】
本発明の第４の態様は、本発明の（発現）ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。多くの細胞が本発明のこのようなトランスフェクションに適しており、例えば多種類の真核生物（植物、酵母、ヒト、及び動物細胞を含む）ならびに原核生物、ウイルス、もしくは細菌細胞からの初代細胞又は樹立細胞株がある。好ましくは本発明の宿主細胞は、例えばサッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような真核細胞微生物から得られる真核細胞である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９，（１９９７））。さらに好ましくは多細胞生物からの細胞は、本発明の核酸配列の発現のための宿主細胞として選択される。コードされるタンパク質の翻訳後修飾（例えばグリコシル化）が必要な場合（Ｎ及び／又はＯ結合）、多細胞生物からの細胞は特に好適である。原核細胞と比較して、高等真核細胞は、これらの修飾を可能にする。この目的に適した複数の樹立された細胞株、例えば２９３Ｔ（胚腎臓細胞株）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌細胞）、及び別の細胞株、特に実験室用途で樹立された細胞株ＨＥＫ２９３−、Ｓｆ９−、又はＣＯＳ細胞、又は免疫系の細胞、又は成体幹細胞、例えば造血系の幹細胞（骨髄由来）を、当業者は周知している。さらに好ましくは細胞は哺乳動物細胞である。最も好ましくは該細胞は、チャイニーズハムスター細胞又はヒト細胞である。例えば適切な細胞には、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ｒＣＨＯ−ｔＰＡ細胞、ｒＣＨＯ−ＨｅｐＢ表面抗原細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ｒＨＥＫ２９３細胞、ｒＣ１２７−ＨｅｐＢ表面抗原細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＬＭ細胞、ＹＩ細胞、ＮＳ０及びＳＰ２／０マウスハイブリドーマ細胞など、ＲＰＭＩ−８２２６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、正常ヒト繊維芽細胞、ヒト間質細胞、ヒト肝細胞、ヒト骨肉腫細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ヒト網膜芽細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、及び他の不死化及び／又は形質転換哺乳動物細胞がある。好ましくは該ベクターは、配列番号２３を含む融合タンパク質をコードする配列を含む。最も好ましくは該ベクターは、配列番号２２の配列を含む。
【００６７】
本発明の第５の態様は、目的のタンパク質の発現又は高発現について細胞をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）細胞を本発明の発現ベクターでトランスフェクトする工程；
（ii）上記の抗生物質に耐性の細胞クローンを選択する工程；
（iii）工程（ii）で選択された細胞をリガンド含有溶液とインキュベートする工程；そして
（iv）工程（ii）で選択された細胞クローンの蛍光活性をリガンドの蛍光により検出する工程、
を含んでなる方法に関する。
【００６８】
本発明の細胞スクリーニング法の工程（ｉ）において、細胞は上記本発明の発現ベクターでトランスフェクトされる。すなわち工程（ｉ）でトランスフェクトされる細胞は、好ましくは、成功的なトランスフェクトにおいて、本発明の融合タンパク質と目的のタンパク質（ＰＯＩ）の両方を発現する細胞である。さらに好ましくはトランスフェクトされる細胞は、上記細胞株から選択される。トランスフェクションは、当業者に公知の先行技術に記載の方法により行われ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、該ベクターは、配列番号２３を含む融合タンパク質をコードする配列を含む。最も好ましくは該ベクターは配列番号２２の配列を含む。
【００６９】
本発明の細胞スクリーニング法の工程（ii）において、上記の抗生物質に対して耐性の細胞が選択され、すなわち工程（ｉ）で成功的にトランスフェクトされ、上記の抗生物質（すなわちネオマイシン、カナマイシン、ネオマイシン−カナマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、プロマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシン）の耐性を付与するペプチドを発現する細胞が選択される。従って細胞は、好ましくは培養培地中で選択条件下で、すなわち培養の最初から選択圧を及ぼすための対応する抗生物質の存在下で、１時間〜最大３週間増殖される。あるいは細胞は、典型的には培養培地中で非選択条件下で１時間〜最大３週間増殖され、対応する抗生物質は好ましくは所定の時点に、例えば特定の光学密度（ＯＤ値）を示す時、加えられる。適切な培養条件は、好ましくは当業者に公知であり、先行技術に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。最も好ましくは成功的にトランスフェクトされた細胞は、配列番号２３を含む融合タンパク質を発現し、プロマイシンの耐性を付与する。
【００７０】
次の工程（iii）において、工程（ii）で選択された細胞は典型的には、膜透過性フルオレセイン誘導体４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン又は同じ結合性を示すその誘導体を含有する溶液でインキュベートされる。従って本発明の融合タンパク質は、その成分（配列番号１、２もしくは３の少なくとも１つの配列を含む）に結合するリガンド（又はその誘導体）で標識される。リガンドによる標識は、実施例２（後述）の標識プロトコールを使用して行われる。あるいはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＬｕｍｉｏ（登録商標）Ｉｎ−Ｃｅｌｌ標識キットを製造業者の説明書に従って使用してもよい。同様にリガンドの誘導体による標識は、これらのプロトコールに従って行われる。
【００７１】
最終工程（iv）では、リガンド又はその誘導体の獲得蛍光を介して、標識細胞の蛍光が励起される。本発明の融合タンパク質の配列番号１、２もしくは３のいずれに結合した時のリガンドの蛍光は、励起後に誘発される。放射された蛍光スペクトルは、蛍光を検出するための任意の上記方法（最も好ましくはＦＡＣＳ）を使用して検出することができる。励起波長は典型的には、４５０〜６５０ｎｍであり、蛍光の発光は典型的には４５０〜７００ｎｍの範囲で観察される。
【００７２】
このような方法により、任意の数の細胞がスクリーニングされる。好ましくは少なくとも２０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、又は１，０００，０００細胞の蛍光活性が、工程（iv）で検出される。最も好ましくは、抗生物質に耐性の少なくとも１，０００〜１０，０００，０００の独立したトランスフェクタントを得るのに十分な細胞集団が、スクリーニングされる。これらのうちの抗生物質に耐性の少なくとも１０〜１，０００，０００の候補クローンが、これらの細胞の蛍光活性を評価することによりソーティングされる。好ましくは工程（iv）で最も高い蛍光を示す約２０％の細胞が、該目的のタンパク質の最も高い発現を示す細胞として選択される。さらに好ましくは工程（iv）で最も高い蛍光を示す約１０％の細胞は、該目的のタンパク質の最も高い発現を示す細胞を含む。さらに好ましくは工程（iv）で最も高い蛍光を示す約５％の細胞は、該目的のタンパク質の最も高い発現を示す細胞を含む。好ましくは細胞はＦＡＣＳを使用して細胞毎にスクリーニングされる。
【００７３】
本発明において「高発現」は、スクリーニングされる他の細胞より高い発現レベルである、細胞の発現レベルを意味する。例えば商業的に生産される組換えタンパク質の最終発現レベルは、タンパク質、必要な年間の量、及び投与量に依存して、１〜２，０００ｍｇ／ｌ（細胞培養物）の範囲である。スクリーニングの間、目的のタンパク質の発現レベルは典型的には最終発現レベルより低い。
【００７４】
上記スクリーニング法の最後に得られる細胞は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）の発現レベルについて互いにランク付けされる。特に、上記スクリーニング法の最後に最も高い蛍光を示す細胞が選択される。例えば本発明のエクスプレッサーの上位５〜２０％に対応する蛍光活性を示す個々の細胞は、以後の工程で目的の遺伝子の発現のさらなる解析のために選択される。
【００７５】
好適な実施態様において上記スクリーニング法は、工程（iv）で測定される細胞の約５％〜２０％を選択することを含み、ここで選択される細胞は工程（iv）で最も高い蛍光活性を示すものである。あるいは工程（iv）で測定される細胞の約５％〜約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％が、目的のタンパク質の最も高い活性に基づいて選択される。次に、最も高い蛍光活性を示す細胞の選択により、該選択された細胞中の目的のタンパク質の発現レベルがさらに測定される。
【００７６】
別の実施態様において上記スクリーニング法は、マルチウェルマイクロタイタープレート又は同様のものを使用して行われる。
【００７７】
本発明の第６の態様は、目的のタンパク質を発現する細胞株を得る方法であって、
（ｉ）上記の本発明の細胞スクリーニング法のいずれかにより細胞をスクリーニングする工程；
（ii）好ましくは上記の本発明の方法のいずれかにより、該目的のタンパク質の最も高い発現を示す細胞を選択する工程；そして
（iii）該細胞から細胞株を樹立する工程、
とを含んでなる方法に関する。
【００７８】
本明細書において用語「細胞株」は、実験室で増殖できるある特定のタイプの細胞、すなわち上記の細胞からの細胞株を意味する。細胞株は通常、永久樹立された細胞培養物中で増殖させることができ、適切な新鮮な培地と空間が与えられれば無期限に増殖するであろう。単離された細胞から細胞株を樹立する方法は当業者に公知である。好ましくは細胞株は上記したように細胞から調製される。
【００７９】
第７の態様は、目的のタンパク質を生産する方法であって、
（ｉ）得られた細胞株を、上記の本発明の方法により該目的のタンパク質の発現を（選択的に）可能にする条件下で培養する工程；及び
（ii）該目的のタンパク質を単離する工程、
を含んでなる方法に関する。
【００８０】
目的のタンパク質の発現を（選択的に）可能にする条件は、標準的方法により当業者が容易に樹立することができる。あるいは発現される目的のタンパク質に適しており当業者に公知の任意の条件を使用することができる。かかる方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに開示されている。
【００８１】
本発明において「単離する」は典型的には、目的のタンパク質を精製することを含む。精製は当業者に公知の任意の方法、例えば親和性クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ，・・・）、サイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーのような従来の生化学的方法、ならびに細胞ソーティング測定法、抗体検出など、又はＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１，前述）に開示の任意の方法により行われる。目的のタンパク質が医薬として応用される場合、これは好ましくは医薬組成物に調製される。好ましくはかかる医薬組成物は、上記の目的のタンパク質を含む。さらにかかる医薬組成物は、本発明の医薬的に許容される担体、補助剤、又はビヒクル（これらは、一緒に調製される目的のタンパク質の薬理活性を破壊しない非毒性の担体、補助剤、又はビヒクルである）を含有してもよい。本発明の組成物で使用される医薬的に許容される担体、補助剤、又はビヒクルには、特に限定されないが、交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えばヒト血清アルブミン）、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピルブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂がある。
【００８２】
さらに本発明の第８の態様は、本発明の融合タンパク質を生産する方法であって、
（ｉ）本発明の融合タンパク質の発現を（選択的に）可能にする条件下で、上記細胞（例えば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む）を培養する工程；及び
（ii）本発明の融合タンパク質を単離する工程、
を含んでなる方法に関する。
【００８３】
好適な実施態様において核酸は、配列番号２３の配列を含む融合タンパク質をコードするか、又は配列番号２２の配列を含む。
【００８４】
本発明において「単離する」はまた、必要であれば本発明の融合タンパク質を精製することを含む。精製は、上記の任意の方法により行われる。さらにかかる方法は、例えば実施例１に記載のように行われる。
【００８５】
本発明の融合タンパク質を生産するためのかかる上記方法は、例えば特に限定されないが、本発明の融合タンパク質のインビトロの性質（例えば、膜透過性フルオレセイン誘導体、結合により示されるシグナル強度、生理学的条件下での融合タンパク質の溶解度）を発見するのに適している。
【００８６】
本発明の第９の態様は、目的のタンパク質を生産するための上記の本発明の核酸を含む上記細胞の使用に関する。好ましくは該本発明の核酸は、ベクター又は発現ベクター、好ましくは上記の本発明の（発現）ベクター中に含有される。
【００８７】
本発明の第１０の態様は、目的のタンパク質の発現もしくは高発現について細胞をスクリーニングするための、上記本発明の融合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の（発現）ベクターの使用に関する。好ましくは細胞は、まず高蛍光活性について１次スクリーニングでスクリーニングされる。次に蛍光活性は、干渉により目的のタンパク質の発現と相関付けられる。これは、低蛍光活性に基づいて試験した細胞の８０〜９５％の迅速な除去と、目的の遺伝子の発現の分析について残りの５〜２０％の保持とを、１つの工程で行うことを可能にする。最も好ましくは本発明の融合タンパク質は配列番号２３の配列を含み、及び／又は配列番号２２の配列によりコードされる。
【００８８】
本発明を十分に説明したが、当業者は、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、かつ過度の実験をすることなく、広範囲の同等のパラメータ、濃度、及び条件内で本発明を実施できることを理解するであろう。
【００８９】
本発明は具体例に関連して説明されているが、さらなる修飾が可能であることは理解されるであろう。本出願は、一般に、本発明の原理に従って、及び本発明が関係する分野内の公知の又は習慣的実施内で、及び請求の範囲に記載したような前記の基本的特徴に適用される、本発明の開示内容からの発展を含んで、本発明の任意の変更態様、用途、又は適用を包含する。
【００９０】
雑誌の論文又は抄録、公開もしくは非公開の特許出願、発行された特許又は任意の他の文献を含む本明細書で引用されるすべての文献は、引用文献中で提示されたすべてのデータ、表、図、及び本文を含んで、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに本明細書の引用文献内で引用された文献の全内容も、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。公知の方法の工程、従来法の工程、公知の方法、又は従来法への参照は、本発明のいかなる態様、説明、又は実施態様も、関連分野で教示又は示唆されていることを認めるものではない。
【００９１】
具体例の上記説明は、本発明の一般的性質を十分に明らかにするものであり、他の研究者は、当該分野の知識（引用された文献の内容を含む）を応用することにより、過度の実験をすることなく、本発明の一般的概念を逸脱することなく、かかる具体例を種々の応用のために、容易に修飾及び／又は改変できるであろう。従ってかかる改変及び修飾は、本明細書の教示と指針に基づき、開示された状態の同等物の意味と範囲内にあると企図される。本明細書の表現又は用語は、説明のためであって限定のためではなく、本明細書の用語又は表現は、本明細書の教示と指針を当業者の知識と組合せて理解されるものである。
【００９２】
配列表の配列の簡単な説明
配列番号１は、配列番号１、２もしくは３のリガンドの一般的結合配列に対応する。
配列番号２は、配列番号１、２もしくは３のリガンドのより多くの特異的結合配列に対応し、ここで配列番号２の３位と４位のアミノ酸はそれぞれプロリンとグリシンとして定義される。
配列番号３は、配列番号１、２もしくは３のリガンドのより多くの特異的結合配列に対応し、これは配列番号２についてＮ末端とＣ末端が延長される。
配列番号４、５は、抗生物質プロマイシンの耐性遺伝子と、ストレプトミセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）のコードされるプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼに対応する。
配列番号６、７は、抗生物質ネオマイシンの耐性遺伝子と、コードされるネオマイシンホスホトランスフェラーゼII型に対応する。
配列番号８、９は、抗生物質カナマイシンの耐性遺伝子と、コードされるカナマイシンホスホトランスフェラーゼII型に対応する。
配列番号１０、１１は、抗生物質ネオマイシン−カナマイシンの耐性遺伝子と、コードされるネオマイシン−カナマイシンホスホトランスフェラーゼII型に対応する。
【００９３】
配列番号１２、１３は、抗生物質ヒグロマイシンの耐性遺伝子と、コードされるヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼに対応する。
配列番号１４、１５は、抗生物質ゲンタマイシンの耐性遺伝子と、コードされるゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼに対応する。
配列番号１６、１７は、抗生物質クロラムフェニコールの耐性遺伝子と、コードされるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに対応する。
配列番号１８、１９は、抗生物質ゼオシンの耐性遺伝子と、コードされるゼオシン耐性タンパク質に対応する。
配列番号２０、２１は、抗生物質ブレオマイシンの耐性遺伝子と、コードされるブレオマイシン耐性タンパク質に対応する。
配列番号２２、２３は、本発明のキメラ選択マーカー例をコードする核酸配列と、本発明のキメラ選択マーカーに対応する。
配列番号２４、２５は、本発明の融合タンパク質例を構築するのに使用されるプライマーｏＳｅｒｏｎｏ１２０６とｏＳｅｒｏｎｏ１２３９に対応する。
【実施例】
【００９４】
１．実施例１：ＰＣＲによる本発明の融合タンパク質例の構築
プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）の読みとり枠を配列番号３に融合させ、ＳＥＡＰをコードする第１の読みとり枠と次にポリオウイルスＩＲＥＳを含む発現ベクターにＰＣＲクローニングすることにより、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）と配列番号３、及び目的のタンパク質（ここではＳＥＡＰ、分泌型アルカリホスファターゼ）を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を構築した。ポリオウイルスＩＲＥＳは、２つの読みとり枠を分離することを可能にし、これらは同じプロモーターであるが２つの別のタンパク質として発現される。
【００９５】
１．１．ｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏＬＴ−２６０の核酸のクローニング
従って、プロマイシン耐性遺伝子のＣ末端へのペプチド（−ＧＣＣＰＧＣＣＧＧＧ、配列番号３）の融合体をコードする遺伝子を、オリゴｏＳｅｒｏｎｏ１２０６（５’−ＧＴＧＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＣ−３’、配列番号２４）とｏＳｅｒｏｎｏ１２３９（５’−ＣＧＣＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＡＣＴＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧＣＧＧＧＴＣ−３’、配列番号２５）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作成した。得られた遺伝子（ＰｕｒｏＬＴと呼ぶ）をｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２２７ベクター中にクローン化し、これはプロマイシンに対する耐性を付与し、ＳＶ４０プロモーターの制御下でＳＥＡＰ読みとり枠を含む。生じたプラスミドをｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２６０と呼んだ。挿入された断片を配列決定により確認した。
【００９６】
ｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２２７とｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２６０のＳＶ４０プロモーターをマウスＣＭＶＩＥ１プロモーター（ｍＣＭＶ（ＩＥ１）、例えばＷＯ８７／０３９０５に記載されている）で置換して、それぞれｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２７９とｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０を得た。
【００９７】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった：
・ｐａｃの増幅：配列番号２４と２５のプライマー２５ｐｍｏｌを、ｐａｃ読みとり枠を含むベクターからの約２０ｎｇのＸｂａＩ／Ｍｆｅｌ断片、２００Ｍの各ｄＮＴＰ、１×ＫＯＤ、２単位のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、カタログ番号７１０８６−３、Ｎｏｖａｇｅｎ）と混合した。最終容量は１００μｌであった。
【００９８】
・サイクリング：
−  第１工程：９４℃で３分
−  １２サイクル：（ｉ）９４℃で１５秒の変性；（ii）５５℃で１５秒のハイブリダイゼーション；及び（iii）７２℃で１分の重合；
−  最終工程：７２℃で７分。
【００９９】
ＰｕｒｏＬＴについて得られたＰＣＲ産物をまずＰＡＧＥ解析により解析した。各ＰＣＲ反応物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造業者のプロトコールに従って精製した。
ｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２２７ベクターへのクローニングのために、ＰＣＲ断片をＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（カタログ番号２８６０６，Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造業者のプロトコールに従って精製した。
【０１００】
１．２．ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０の核酸のクローニング
ｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏＬＴ−２６０ベクター配列（１．１を参照）を証明した後に、ＳＶ４０プロモーター配列をマウスＣＭＶプロモーターで置換してｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０を作成した。
【０１０１】
１．３．ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２７９の核酸のクローニング
ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２７９の核酸のクローニングを、ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０について上記したように行い、本発明の融合タンパク質をコードする核酸の代わりにプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ）をコードする核酸をベクター中にクローン化した。
【０１０２】
２．実施例２：リガンドを用いる標識プロトコール
以下のプロトコールを使用して、本発明の融合タンパク質をリガンドで標識した。
【０１０３】
・細胞をまずＨＢＳＳ（ハンクス液、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１４０２５−０５０）で１回洗浄した。細胞をＰｒｏＣＨＯ５で増殖させた場合、最終濃度０．０５％のプルロニック酸を含めた。
【０１０４】
・細胞は、１×標識溶液中で室温で暗所で３０分インキュベートした細胞である。１×標識溶液は、ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１４０２５−０５０）を含む。１μＭの４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン、及び５０μＭのＥＤＴ（１，２−エタンジチオール、Ｓｉｇｍａカタログ番号３９，８０２−０）。ＰｒｏＣＨＯ５で増殖させた細胞を使用した場合、最終濃度０．１％のプルロニック酸を加えた。
【０１０５】
・標識溶液を除去した（そして適切に廃棄した）。次に細胞をＨＢＳＳ＋５０μＭ  ＥＤＴ中で１回洗浄した。ＰｒｏＣＨＯ５で増殖させた細胞を使用した場合、最終濃度０．１％のプルロニック酸を使用した。
【０１０６】
・次に細胞を、ＨＢＳＳ＋２０μＭ  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｂｌｕｅ３（ＬｕｍｉｏＧｒｅｅｎ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号４５−７５１０とともに供給される）に加えたか又は再懸濁した。ＰｒｏＣＨＯ５で増殖させた細胞を使用した場合、最終濃度０．１％のプルロニック酸を含めた。
【０１０７】
本発明の融合タンパク質を発現する細胞中の配列番号１、２もしくは３に対するリガンドの蛍光を検出するために、細胞を２９℃でｏ／ｎ〜２４時間プレインキュベート後、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインで標識した。
【０１０８】
４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインで標識後、細胞を蛍光顕微鏡（ＤＰ５０デジタルカメラを取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１顕微鏡）下で標準的ＦＩＴＣフィルターセットを使用して観察した。
【０１０９】
３．実施例３：ベクターのトランスフェクション
３．１．本発明の融合タンパク質をコードするベクターのトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に、ＰｒｏＣＨＯ５培地で増殖させた細胞を０．７５×１０6 細胞／ｍｌで継代した。トランスフェクションの直前に８〜１０×１０6 個の細胞を遠心分離し、ＲＰＭＩ１６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘで洗浄し、１５ｍｌの同じ培地に再懸濁し、６ウェルプレート（２．５ｍｌ／ウェル）又は２４ウェルプレート（０．５ｍｌ／ウェル）に分注した。
【０１１０】
トランスフェクション剤として線状ＰＥ１２５（分子量２５０００，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号２３９６６）を、１μｇのＤＮＡ当たり３〜３．５μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＰＥ１２５溶液で使用した。ＰＥ１２５の１ｍｇ／ｍｌ溶液をろ過滅菌し、１ｍｌ画分でアリコートし、−７０℃で保存した。
【０１１１】
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中のプラスミドＤＮＡをＰＥ１２５と混合し、室温で１０分インキュベートし、細胞に加えた。３７℃で２時間後、トランスフェクション培地を除去し、４ｍＭグルタミンと１×ＨＴを補足した３ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５で置換した。プレートを６０ｒｐｍで振盪してｏ／ｎ  ３７℃でインキュベートした。すべてのウェルからの細胞をプールし、Ｐ１５０シャーレ中の０．５×１０6 細胞／ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５（４ｍＭグルタミンと１×ＨＴを補足）で蒔いた。トランスフェクションの４８時間後、細胞を計測し、使用した培地を遠心分離して除去し、次に細胞を選択培地（４．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ＨＴ、及び１０μｇ／ｍｌのプロマイシンを補足したＰｒｏＣＨＯ５）で１．０×１０6 生存細胞／ｍｌに希釈した。培地を１日置きに交換した。細胞密度を経時的に追跡し、生存細胞の数が０．１×１０6 細胞／ｍｌより小さくなった時、細胞をより少量に濃縮した。そうでない場合は生存細胞の数を増加させ、細胞を０．４〜０．５×１０6 細胞／ｍｌに希釈した。プールの生存活性が９０％に達するまで、この操作を繰り返した。
【０１１２】
プラスミドｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０で選択しトランスフェクトしたプールを、４つの３８４ウェルプレートで、４ｍＭグルタミン、１×ＨＴ、及び１０μｇ／ｍｌプロマイシンを補足したＰｒｏＣＨＯ５培地中に１細胞／ウェルで接種した。９６ウェルプレートに１７６個のクローンを回収した。
【０１１３】
３．２．プロマイシンに対する耐性についての選択
細胞を１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、遠心分離し、細胞ペレットを６ウェルプレート中で５％胎児牛血清（ＦＢＳ）を含有する２ｍｌの培地に再懸濁した。培地を１０μｇ／ｍｌのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｐ−８８３３）を含有するＰｒｏＣＨＯ５／ＨＴ／グルタミン／５％ＦＢＳで交換することにより、トランスフェクションの４８時間後に選択を行った。１日置きに、古い培地を捨て、１×ＰＢＳで洗浄し、新鮮な選択培地を加えることにより、培地交換を行った。２週間の選択後、細胞をトリプシン処理し、計測し、６ウェルフォーマットの１０００、５００、１００、５０、２０、１０細胞／ウェルに対応する一連の希釈を行った。１０日後、すべての希釈物で増殖しているコロニーを計測し、そのすべてを取り上げ、クローン解析のために血清無しで懸濁増殖させた。
【０１１４】
結果から、融合タンパク質により付与されるプロマイシン耐性は、野生型のプロマイシン耐性遺伝子により付与されるプロマイシン耐性に匹敵すると結論付けられた。結論として、本発明の融合体は、ＳＥＡＰとｐａｃ含有融合タンパク質の活性と機能の組合せを示す。
【０１１５】
４．実施例４：ＳＥＡＰ発現レベルの測定と細胞力価アッセイ
４．１．ＳＥＡＰアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅホスファターゼ基質キット、カタログ番号３７６２０）
１００μｌの１×ホスファターゼ基質溶液を、ＳＥＡＰを含有する１０μｌの希釈細胞培養培地（ＨＢＳＳ  Ｇｉｂｃｏカタログ番号１４０２５−０５０で１／１０希釈した）に加えた。
【０１１６】
１×ホスファターゼ基質溶液：
（Ｐｉｅｒｃｅホスファターゼ基質キット、カタログ番号３７６２０）
４ｍｌ  Ｈ2Ｏ
１ｍｌ  ５×濃縮ジエタノールアミン基質緩衝液
１  ＰＮＰＰ基質錠剤
【０１１７】
次に溶液を３７℃で１０〜２０分インキュベートした。分光光度計マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍでＯＤを読んだ。
【０１１８】
４．２．細胞力価アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９８  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ増殖アッセイ、カタログ番号Ｇ３５８０）
２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ３５８０）を、５０μｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号６１８７０−０１０）を含有する９６ウェルプレート中の５０μｌの細胞懸濁物に加えた。溶液を混合し、３７℃で２０〜３０分インキュベートし、分光光度計マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍでＯＤを読んだ。
【０１１９】
５．実施例５：ＳＥＡＰ  ＨＴスクリーニング
解析すべき細胞を９６ウェルプレート（ウェル当たり５０００〜２００００細胞）のＰｒｏＣＨＯ５／４．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン／１０％胎児牛血清に移し、３７℃で一晩インキュベートして、細胞をウェルの底に付着させた。
【０１２０】
翌日、細胞をＰｒｏＣＨＯ５／４．５ｍＭ  Ｌ−グルタミンで２回洗浄し、１５０μｌの同じ培地中で３７℃で２４時間パルスし、次に上清を採取した。
【０１２１】
５．１．ＳＥＡＰ発現レベルの測定
１０μｌの希釈上清（ＨＢＳＳ中１／１０）を９６ウェルプレート中の１００μｌのホスファターゼ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３７６２０）に加えた。プレートを３７℃で１０〜１５分インキュベートし、ＯＤを４９０ｎｍで読んだ。
【０１２２】
５．２．細胞力価アッセイ
パルス後、１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号６１８７０−０１０）＋２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ３５８０）の混合物で交換し、３７℃で３０分インキュベートした。４９０ｎｍでＯＤを読んだ。
４９０ｎｍでのＳＥＡＰ  ＯＤ／４９０ｎｍでのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ＯＤの比に従って、クローンをランク付けした。
【０１２３】
６．実施例６：本発明のＰｕｒｏＬｔ融合タンパク質の２重機能
ＣＨＯ細胞を、実施例３．１．に記載したようにｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２７９又はｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０でトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞を対照として使用した。
【０１２４】
プロマイシンで選択すると、ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２７９又はｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０でトランスフェクトされた細胞から生存細胞のプールが得られた（図２、５、及び６を参照）。反対に、非トランスフェクト細胞からは生存細胞は得られなかった。これは、ｐｕｒｏＬＴがプロマイシンに対する耐性を付与したことを示す。
【０１２５】
ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２７９又はｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０でトランスフェクトした細胞を、実施例２に記載のように４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインで標識した。細胞を３７℃又は２９℃でプレートインキュベートした後、標識した。
【０１２６】
結果を図８に示す。ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２７９でトランスフェクトした細胞では、細胞を２９℃でプレインキュベートした時も３７℃でプレインキュベートした時も、蛍光は検出されなかった。反対にｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２７９でトランスフェクトした細胞では、細胞を２９℃でプレインキュベートした時、蛍光が検出された。これは、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインに結合するとｐｕｒｏＬＴが蛍光性になることを示す。
【０１２７】
結論として、ｐｕｒｏＬＴが、ｐａｃの機能と、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインに結合した時の蛍光性を組合せていることが証明された。従って本発明の「ＰｕｒｏＬＴ」マーカーは、そのｐａｃ活性によりトランスフェクションの選択マーカーとして使用でき、その蛍光活性により容易に検出可能なマーカーとして使用できる。
【０１２８】
７．実施例７：目的のタンパク質の高発現についての細胞のスクリーニング用の２官能性マーカーとしてのＰｕｒｏＬＴの使用
作成した融合タンパク質の２重機能は、これが２重の影響を有することを示唆する。本発明の融合タンパク質は、まずプロマイシンに対する耐性により、安定にトランスフェクトされたクローンの単離を可能にし、次に該融合体の発現レベルは、蛍光活性の測定により、物理的に結合した目的の遺伝子の発現レベルを反映する。この仮説を検証するために、本発明のベクターで安定にトランスフェクトした細胞のプールから一連のクローンを作成した。コードされたタンパク質の蛍光活性と発現レベルを測定した。
【０１２９】
ＣＨＯ細胞を実施例３．１．に記載したように、ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０でトランスフェクトした。クローンを実施例５に記載のように古典的大量処理スクリーニングを使用してスクリーニングしたか、又は４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインで標識して、蛍光顕微鏡下で蛍光強度を視覚的にスクリーニングした。
【０１３０】
古典的大量処理スクリーニングを使用して、高レベルのＳＥＡＰを発現する８つのクローンが選択された（「ＨＴスクリーン」と呼ぶ）。４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインによる標識の蛍光強度に基づいて、１２個の高蛍光性クローンと１０個の中程度蛍光性クローンが視覚的に選択された（それぞれ「高Ｌｕｍｉｏ−Ｔａｇ」と「低Ｌｕｍｉｏ−Ｔａｇ」と呼ぶ）。
【０１３１】
高Ｌｕｍｉｏ−Ｔａｇと低Ｌｕｍｉｏ−Ｔａｇクローンを、実施例４に記載のようにＳＥＡＰ発現についてさらに試験した。
ＨＴスクリーンクローンは、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインでさらに標識し、蛍光顕微鏡下で観察した。
【０１３２】
古典的大量処理スクリーニングを使用して選択されたクローンについて得られたＳＥＡＰ発現レベルと蛍光強度、又は４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインで標識した蛍光強度について比較した。結果を図３に示す。
【０１３３】
実験は、高ＳＥＡＰ発現レベルがたえず高蛍光と相関することを示す。例えば、高Ｌｕｍｉｏ−ＴａｇクローンＮｏ．１０とＨＴスクリーンクローンＮｏ．３はいずれも、他のクローンより高い蛍光と高いＳＥＡＰ発現レベルを示す。
【０１３４】
実験は、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインで標識して本発明の融合タンパク質を使用するスクリーニングは、ＳＥＡＰ発現レベルについての標準的大量処理スクリーニングを使用して単離されるものより良好なＳＥＡＰエクスプレッサーであるクローンを単離することを可能にすることを、さらに示す。
【０１３５】
８．実施例８：ＦＡＣＳを使用する高蛍光発現のスクリーニング
実施例７では、高蛍光性クローンのスクリーニングを蛍光顕微鏡を使用して用手法で行った。本実験は、高蛍光性クローンのスクリーニングを蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）を使用して自動で行うことができることを示す。
【０１３６】
ＣＨＯ細胞を実施例３．１に記載のようにｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０でトランスフェクトし、「ｎｂ５０７」と呼ぶ細胞のプールが得た。プロマイシン遺伝子がＬｕｍｉｏ−Ｔａｇに融合していない対照（プラスミドｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−２７９）を使用して、対照プール（「ｎｂ５０５」と呼ぶ）を作成した。
【０１３７】
高蛍光性の細胞亜集団を選択するために、２つのプールを実施例２に記載のように標識し、１回目の解析を行い、次に最終的にＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）細胞ソーティングシステム）を使用して高蛍光レベルについて連続的に濃縮した。当業者は、高蛍光性クローンが、自動単細胞設置装置（ＡＣＤＵ）を取り付けたＦＡＣＳを使用して直接選択できることを周知している。
【０１３８】
図８に示すように、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインで標識後に、高い平均蛍光強度レベル（ＭＦＩ）を示す細胞集団をフローサイトメトリーにより観察することができる。より高いＭＦＩを示す細胞集団を、ソーティングによりさらに濃縮することができる。濃縮集団の平均蛍光は、連続ソーティング後に上昇する。
【０１３９】
本実験は、高蛍光に基づく濃縮操作とＦＡＣＳを使用する自動ソーティングが、キメラマーカーの高平均プール発現レベルと相関することを示す。この実験では、キメラマーカーの高発現レベルが、実施例７の実験と同様に、ＰＯＩの高発現レベルにより反映されることが予測される。
【０１４０】
利点
本発明は、配列番号１、２もしくは３を含む少なくとも１つの配列に融合した、抗生物質に対する耐性を付与するペプチド、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインを含む融合タンパク質に対応する新規キメラ選択マーカーであって、該融合タンパク質は、（ｉ）該抗生物質に対する耐性と；（ii）配列番号１、２もしくは３のリガンドに結合すると蛍光活性とを示すことを特徴とする、キメラ選択マーカーに関する。
【０１４１】
本発明の融合体は、蛍光測定の機能性と抗生物質選択とを組合せていることが証明された（例えば、ｐａｃ、実施例２参照）。従って本発明のマーカーは、その抗生物質耐性のために安定なトランスフェクションの選択マーカーとして、かつその蛍光性のために容易に検出可能なマーカーとして使用することができる。
【０１４２】
ＨＴＳにおいて本発明の融合タンパク質を使用することはさらに、例えば標識抗体のようなＰＯＩの発現を直接検出することを可能にする低処理能力法を使用してスクリーニングする時のように、高発現クローンを選択するための少なくとも同じ確率を維持することを可能にする。すなわちＨＴＳにおいて本発明の融合タンパク質は、時間と資源を減少させる。古典的ＨＴＳクローン作成アプローチでは最適クローンは典型的には、２，０００を超えるクローンのスクリーニングにより、分泌されたタンパク質の高力価に基づいて選択される。本発明の融合タンパク質を使用することは特に、試料サイズを低下させる。この低下は、本アプローチの使用の容易さと、ＥＬＩＳＡ大量処理スクリーニングに関連するサンプリングエラーとアッセイ変動の関連する低下に関連する。さらにプレート当たり５〜１０個の最適クローンを選択することにより、プレート当たり最適なクローンが選択されると予測される。すなわち１，０００クローンをスクリーニングするために本発明の融合タンパク質を使用することは、解析されるクローンの数を５０〜１００に低下させ、従って第２のＨＴＳを避けることを可能にする。
【０１４３】
さらに、配列番号１、２もしくは３を有する配列への、抗生物質に対する耐性を付与するペプチド、又はその断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、もしくはムテインの融合は、小さな従って効率的な発現カセットにつながるため、本発明の融合タンパク質との関連で発現されるＰＯＩはそのサイズを限定されない。さらに活性と起源が大きく異なる２つの酵素は、本明細書に記載のように本発明の融合タンパク質中では驚くべきことにその機能を保持している。本発明の融合タンパク質は安定なトランスフェクションで選択性を与えるために真に使用することができ、目的の遺伝子の高発現について候補クローンをスクリーニングするためのキメラ選択マーカーとして作用するため、保持された２重機能は、明らか２重の影響を与える。
【０１４４】
上記を要約すると、目的のタンパク質（ＰＯＩ）、例えば治療用タンパク質の高発現クローンの単離のための、本発明の追加の選択マーカーの有用性が証明された。これは、（ｉ）標準化された生成物非依存性の簡便な解析が行われ；そして（ii）蛍光活性の測定が安価な測定法であるため、時間、コスト、及び資源を減少させる。従って本発明は、安定なトランスフェクションで選択性を与えるために使用することができ、目的の遺伝子の高発現について候補クローンをスクリーニングするための検出マーカーとして作用する、強力なマーカーを提供する。
【０１４５】
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１５．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．とＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）；
１６．ＳｅｌｉｇｅｒとＭｃＥｌｒｏｙ，（１９６０），Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８８，１３６−１４１）；
１７．ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ，（１９８１），Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１４７，１９５−１９７
１８．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９；
１９．米国特許第４，９５９，３１４号（Ｍａｒｋら）；
２０．米国特許第４，５８８，５８５号（Ｍａｒｋら）；
２１．米国特許第４，７３７，４６２号（Ｍａｒｋら）；
２２．米国特許第５，１１６，９４３号（Ｋｏｔｈｓら）；
２３．米国特許第４，９６５，１９５号（Ｎａｍｅｎら）；
２４．米国特許第４，８７９，１１１号（Ｃｈｏｎｇら）；
２５．米国特許第５，０１７，６９１号（Ｌｅｅら）；
２６．米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗら）；
２７．米国特許公報２００４／０１１５７０４号；
２８．ＷＯ  ８７／０３９０５；
２９．ＷＯ  ０１／５３３２５；
３０．ＷＯ  ２００６／０５８９００；及び
３１．Ｗｏｏｄ，ｄｅ  Ｗｅｔ，ＤｅｗｊｉとＤｅＬｕｃａ，（１９８４），Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２４，５９２−５９６
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】本発明の融合タンパク質の配列番号１、２もしくは３（１Ａ）へのリガンドの結合の原理を示す。配列番号１、２もしくは３のいずれかに結合すると、リガンドは蛍光性になり、一般的な蛍光検出法を使用して検出される。  図１Ｂでは、本発明の融合タンパク質と目的のタンパク質とをコードする２シストロン性ｍＲＮＡが開示され、両方のコード配列はＩＲＥＳ配列により分離される。２シストロン性ｍＲＮＡ上の融合タンパク質への目的の遺伝子（例えばＳＥＡＰ）の発現の連結は、両方のタンパク質の相関した発現を可能にする。従って本発明の融合タンパク質の高発現は、強い蛍光と相関し、これは高ＳＥＡＰ生産を示す。
【図２】プラスミドｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ−２７９（さらなる詳細は図６に開示される）とｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０（さらなる詳細は図５に開示される）のＣＨＯ−Ｓ細胞（ＰＥ１２５／懸濁物）へのトランスフェクションを示す。第１成分としてプロマイシンを使用する安定なトランスフェクタントの選択により、２又は３週間後に生存能力が最大１００％まで回復する。細胞がプロマイシン耐性ではないプラスミドを含む対照では、すべての細胞が消滅した。
【図３】３０個の異なるクローンについてＳＥＡＰ発現レベル（上の列）と４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン（下の列）で標識した後の蛍光強度との相関を示す。左の欄（「低Ｌｕｍｉｏ−Ｔａｇ」）と真ん中の欄（「高Ｌｕｍｉｏ−Ｔａｇ」）は、実施例７に詳述されるように、２官能性マーカーとして本発明の融合タンパク質を使用してスクリーニングされたクローンを示す。右の欄（「ＨＴスクリーン」）は、古典的大量処理スクリーニングアプローチを使用してスクリーニングされたクローンを示す。
【図４】６３０３ｂｐを有するｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２６０のプラスミド地図を示す。ｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２６０は、ＳＶ４０プロモーター、ＳＥＡＰコード配列、及び本発明の融合タンパク質例（ここではｐｕｒｏＬＴを呼ぶ）をコードする配列を含む。両方のコード配列は、ポリオウイルスＩＲＥＳ配列により分離される。
【図５】６６３８ｂｐを有するｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０のプラスミド地図を示す。ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０は、ＳＶ４０プロモーターの代わりにｍＣＭＶ（ＩＥ１）を使用した点で、ｐＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２６０（図４）とは異なる。
【図６】６６１３ｂｐを有するｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ−２７９のプラスミド地図を示す。ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ−２７９は、本発明の融合タンパク質の配列の代わりにプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼを使用した点で、ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０とは異なる。ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ−２７９は好ましくは、実験の陰性対照として作用する。
【図７】４４３５ｂｐを有するｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＰｕｒｏＲ−ＬＴ−２７３のプラスミド地図を示す。ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＰｕｒｏＲ−ＬＴ−２７３は、ＳＥＡＰのコード配列とＩＲＥＳ配列が欠失している点で、ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ−２７９とは異なる。ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ−２７９も好ましくは、実験の陰性対照として作用する。
【図８】リガンド（ここでは４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン）による標識とＣＨＯ細胞中の一過性トランスフェクションを示す。実験から明らかなように、染色の前に温度が変化される。さらに本発明の融合タンパク質は、発現レベルが十分高い場合に検出される。以下の結果は本発明の構築体について得られた：                                          37℃          29℃      pmCMV(IE1)-SEAP-IRES-PuroLT-279      +++          +++      pmCMV(IE1)-SEAP-IRES-PuroLT-280       -           ++  ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２７９の発現レベルは、温度変化を示さなかった。しかし、ＳＥＡＰ配列とＩＲＥＳ配列との本発明の融合タンパク質を含むｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０の発現については、温度変化が観察された。この点で２９℃でのより高いＰｕｒｏＬＴレベルは、転写又はＩＲＥＳ活性、ｍＲＮＡ又はタンパク質安定性の上昇に起因するかも知れない。結論としてｏ／ｎ〜２４ｈｒの誘導時間は十分であった。
【図９】ｐｍＣＭＶ（ＩＥ１）−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏＬＴ−２８０プラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセインで標識後の、ＦＡＣＳで測定した平均蛍光強度レベル（ＭＦＩ）を示す。高蛍光に基づきベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＦＡＣＳを使用して細胞の連続ソーティングにより、ＭＦＩが上昇した細胞集団が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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