(57)【要約】  本発明は、異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを送達するための初回免疫−追加免疫スケジュールを用いて、免疫応答を惹起する方法に関する。特に、本発明は、初回免疫用ポリヌクレオチド組成物がアデノウイルスベクターにより送達され、追加免疫用ポリヌクレオチド組成物が粒子上にコーティングされるか粒子中に組み込まれ、かつ粒子加速デバイスにより投与される、初回免疫−追加免疫スケジュールに関する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの投与、および、続く、第１の異種非自己抗原の少なくとも１つのエピトープを含む第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドの投与により、哺乳動物被験体での免疫応答を惹起する方法であって、第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドが粒子上にコーティングされるかまたは粒子中に組み込まれ、該粒子を粒子加速デバイスにより被験体に投与することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを、第１の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを投与してから少なくとも７日後に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫応答が防御性免疫応答である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
免疫応答が治療上有効な免疫応答である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記エピトープがＴ細胞エピトープである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記異種非自己抗原が、１以上の、Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、またはその免疫原性フラグメントもしくは免疫原性誘導体より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１種以上のアジュバントまたは１種以上のアジュバントをコードするポリヌクレオチドを、前記異種非自己抗原とともに共投与する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アジュバントが、イミキモドおよびＧＭ−ＣＳＦより選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アデノウイルスベクターが、非ヒト霊長類アデノウイルスから誘導されたものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記非ヒト霊長類アデノウイルスが、Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７およびＰａｎ９より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
被験体がヒトである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
以下のもの：
（ｉ）免疫応答を生起することが可能な異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを含む、第１のワクチン
（ｉｉ）第１の異種非自己抗原の少なくとも１つのエピトープを含む異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、第２のワクチン
を含むキットであって、第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドが、粒子上にコーティングされるかまたは粒子中に組み込まれ、かつ粒子加速デバイスによる送達用に製剤化されていることを特徴とする、上記キット。
【請求項１３】
以下のもの：
（ｉ）免疫応答を生起することが可能な異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを含む、第１の組成物
（ｉｉ）第１の異種非自己抗原の少なくとも１つのエピトープを含む異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、第２の組成物
を含むキットであって、第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドが、粒子上にコーティングされるかまたは粒子中に組み込まれ、かつ医療での使用のために粒子加速デバイスによる送達用に製剤化されていることを特徴とする、上記キット。
【請求項１４】
免疫応答を生起することが可能な異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを含む第１の組成物、および第１の異種非自己抗原の少なくとも１つのエピトープを含む異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含む第２の組成物の、ＨＩＶ治療用医薬の製造での使用であって、第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドが、粒子上にコーティングされるかまたは粒子中に組み込まれ、かつ粒子加速デバイスによる送達用に製剤化されていることを特徴とする、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを送達するための初回免疫−追加免疫スケジュールを用いて、免疫応答を惹起する方法に関する。特に、本発明は、初回免疫用ポリヌクレオチド組成物がアデノウイルスベクターによって送達され、追加免疫用ポリヌクレオチド組成物が粒子上にコーティングされるかまたは粒子中に組み込まれ、かつ粒子加速デバイスにより投与される、初回免疫−追加免疫スケジュールに関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種方法は当技術分野において報告されている。例えばPrayaga et al ( (1997) Vaccine 15 (12-13): 1349-1352), Kilpatrick et al (1997) Hybridoma 16: 381-389, Kilpatrick et al (1998) Hybridoma 17: 569-576, Pertmer et al (1995) Vaccine 13; 1427-1430およびOlsen et al (1997) Vaccine 15; 1149-1156を参照されたい。しかし、依然として核酸投与スケジュールを最適化する必要がある。
【０００３】
アデノウイルス（本明細書中で「Ａｄ」または「Ａｄｖ」と称される）は、３つの主要タンパク質、ヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ＩＩＩ）およびノブファイバー（knobbed fibre）（ＩＶ）から、いくつかの他の微量タンパク質、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２とともに、構成される正二十面体の（icosohedral）カプシドを有する特徴的な形態を有する（Russell W.C. 2000, Gen Viriol, 81:2573-2604）。そのウイルスゲノムは、５’末端に末端タンパク質が共有結合している線状二本鎖ＤＮＡであり、逆方向末端反復（ＩＴＲ）を有する。該ウイルスＤＮＡは、非常に塩基性のタンパク質ＶＩＩおよびミュー（mu）と称される小ペプチドと密接に関連している。別のタンパク質ＶはこのＤＮＡ−タンパク質複合体とともにパッケージングされ、タンパク質ＶＩを介するカプシドとの構造的連結をもたらす。該ウイルスはまた、ウイルスによってコードされるプロテアーゼを含有する。該プロテアーゼは、いくつかの構造タンパク質をプロセシングして成熟感染性ウイルスを生産するために必要である。
【０００４】
種々の哺乳動物種に感染する、アデノウイルスについての１００を超える別個の血清型が単離されており、そのうち５１種がヒト起源の血清型である。そのようなヒト起源由来のアデノウイルスの例は、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ３４、Ａｄ３５である。該ヒト血清型は、いくつかの生物学的、化学的、免疫学的および構造的基準に基づいて、６亜群（Ａ〜Ｆ）に分類されている。
【０００５】
Ａｄ５ベースのベクターが多数の遺伝子治療試験において広範に使用されているが、Ａｄ５および他のＣ群のアデノウイルスベクターの使用に関しては制限があり、該制限は天然感染に起因する一般集団中の既存の免疫のせいである。Ａｄ５および他のＣ群のメンバーは最も血清陽性の血清型に含まれる場合が多い。既存のベクターに対する免疫は、処置期間中に該ベクターに曝露された結果として生じうる。血清陽性ベクターに対するこれらのタイプの既存または成熟免疫は、遺伝子治療またはワクチン接種の取組みの有効性を制限しうる。ゆえに、代替のアデノウイルス血清型は、宿主免疫応答を回避することが可能な遺伝子送達系の探究において、非常に重要な標的をなす。
【０００６】
そのような代替の血清型の一領域は非ヒト霊長類、特にチンパンジーアデノウイルスのものである。２種のチンパンジーアデノウイルスのゲノムが記載されている米国特許第６，０８３，７１６号を参照のこと。
【０００７】
チンパンジー（「Ｐａｎ」または「Ｃ」）アデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスベクターと同程度の効率で導入遺伝子産物に対する強い免疫応答を誘導することが示されている（Fitzgerald et al. J. Immunol. 170:1416）。
【０００８】
非ヒト霊長類アデノウイルスはチンパンジーの腸間膜リンパ節から単離することができる。チンパンジーアデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞中でＥ１欠失ウイルスの複製を可能にするほど十分にヒトアデノウイルスサブタイプＣと類似している。しかし、チンパンジーアデノウイルスは、比較的一般的なヒト血清型（Ａｄ２およびＡｄ５）と系統的に異なっている。Ｐａｎ６は、Ｐａｎ５、７および９とあまり密接に関連しておらず、それらと血清学的に異なっている。
【０００９】
アデノウイルスに異種ＤＮＡを挿入することに関連して、一定のサイズ制限が存在する。ヒトアデノウイルスは野生型ゲノム長の１０５％までをパッケージングする能力を有する（Bett et al 1993, J Virol 67 (10), 5911-21）。ヒトアデノウイルスに関するパッケージング下限は野生型ゲノム長の７５％であることが示されている（Parks et al 1995, J Virol 71(4), 3293-8）。
【００１０】
そのようなアデノウイルスベクターを、製薬上許容される賦形剤、担体、希釈剤またはアジュバントとともに製剤化して、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療および／または予防に好適な医薬組成物またはワクチン組成物をはじめとする免疫原性組成物を製造してよい。
【００１１】
アデノウイルスの一例は、Ａｄ２およびＡｄ５等の、ヒト集団中に広く認められる天然に存在する血清型とは異なるものである。これにより、中和抗体によってベクター取り込みをブロックし、かつ毒性に影響することよって同血清型の後の投与の効力を制限する、ベクターに対する強力な免疫応答の誘導が回避される。
【００１２】
ゆえに、該アデノウイルスは、広く認められる天然に存在するヒトウイルス血清型ではないアデノウイルスでありうる。動物から単離されたアデノウイルスは免疫学的に異なるカプシド、ヘキソン、ペントンおよびファイバー成分を有するが、系統的に密接に関連している。特に、該ウイルスは、非ヒトアデノウイルス、例えばサルアデノウイルスおよび、特にチンパンジーアデノウイルス、例えばＰａｎ５、６、７または９であってよい。そのような系統の例はＷＯ０３／０００２８３に記載されていて、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209、および他の供給元から入手可能である。望ましいチンパンジーアデノウイルス系統は、Ｐａｎ５［ＡＴＣＣ  ＶＲ−５９１］、Ｐａｎ６［ＡＴＣＣ  ＶＲ−５９２］、およびＰａｎ７［ＡＴＣＣ  ＶＲ−５９３］である。
【００１３】
チンパンジーアデノウイルスはヒトアデノウイルス血清型より有益だと考えられる。その理由は、標的集団中にアデノウイルスに対する既存の免疫が存在せず、特に交差中和抗体が存在しないからである。既存の中和抗体応答とチンパンジーアデノウイルスの交差反応は、特定のヒトアデノウイルスベクター候補の場合の３５％と比較して、標的集団の２％にしか存在しない。チンパンジーアデノウイルスは、より一般的なヒトサブタイプＡｄ２およびＡｄ５と異なるが、亜群ＥのヒトＡｄ４とより密接に関連している。それは広く認められるサブタイプではない。Ｐａｎ６はＰａｎ５、７および９とあまり密接に関連していない。
【００１４】
粒子加速アプローチを実行する多数の方法が公知である。例えばＷＯ９１／０７４８７を参照されたい。説明に役立つ一例では、Powderject（Chiron Corporation）製のデバイス等のデバイスを用いてガス駆動式粒子加速を達成することができ、そのいくつかの例は米国特許第５，８４６，７９６号；同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；および欧州特許第０５００７９９号に記載されている。これにより、針を使わない送達アプローチが提供される。該アプローチでは、ポリヌクレオチド等の物質でコーティングされた微細粒子の乾燥粉末製剤を、携帯デバイスによって生成されたヘリウムガスジェット内で高速に加速し、目的の標的組織、典型的には皮膚内へ該粒子を推進する。特に、表皮内へ推進する。該粒子は直径約０．４〜約４．０μｍ、例えば直径０．６〜２．０μｍの金ビーズであってよく、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡがこれらのビーズ上にコーティングされ、そして「遺伝子銃」内に配置するためのカートリッジに入れられる。
【００１５】
ＷＯ９８１０７５０では、核酸分子からなる固体粒子を哺乳動物組織に送達するための方法であって、該組織中の細胞を送達核酸で遺伝的に形質転換するための方法がさらに記載されている。慣用の粒子衝突技術から実質的に脱却して、この方法を使用して導入される核酸粒子は、高密度の金属担体を使用して送達されない。さらにまた、該分子は、平均の哺乳動物細胞サイズに等しいかまたはそれより大きい粒子サイズを有する。
【００１６】
選択核酸分子および、場合により、好適な担体または賦形剤からなる高密度化粒子は、マッハ１〜マッハ８の範囲の超音波送達速度で該粒子を発射することが可能な針なしシリンジを介する哺乳動物組織への送達用に調製することができる。該粒子は少なくとも約１０μｍの平均サイズを有し、最適な粒子サイズは、通常、少なくとも約１０μｍ〜約１５μｍである（典型的な哺乳動物細胞のサイズに等しいかまたはそれより大きい）。しかし、該方法を使用して、２５０μｍまたはそれ以上の平均粒子サイズを有する核酸粒子を送達することもできる。
【００１７】
送達粒子が標的組織に貫入する深さは、粒子サイズ（例えば、おおよそ球状の粒子形状を仮定する公称粒子直径）、粒子密度、粒子が組織表面に衝突する初速度、および組織の密度および動粘度（kinematic viscosity）に依存する。この関連で、（例えばバルクの粉末密度とは対照的に）針なし注射で使用するために最適な個々の粒子密度は、概して、約０．１〜２５ｇ／ｃｍの範囲であり、注射速度は、概して、約２００〜３，０００ｍ／ｓｅｃの範囲である。
【００１８】
この方法は、核酸粒子の標的化送達、例えば（例えば遺伝子治療適用に関する）表皮への送達または（例えば核酸免疫化適用に関する）皮膚の基底層への送達を提供することができる。粒子特性および／またはデバイス運転パラメータは、組織特異的送達を提供するように選択することができる。特定の１つのアプローチは、約２〜１０ｋｇ／ｓｅｃ／ｍの範囲、例えば約４〜約７ｋｇ／ｓｅｃ／ｍの範囲の運動量密度（例えば粒子の前面面積によって除算された粒子運動量）を提供するための粒子サイズ、粒子密度および初速度の選択を伴う。そのような運動量密度の制御によって、正確に制御された核酸粒子の組織選択的送達が可能になる。
【００１９】
筋肉内注射および組換えアデノウイルスによって種々の系列（ＤＮＡ／Ａｄｖ、Ａｄｖ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、Ａｄｖ／Ａｄｖおよび単一対照）で送達されるＤＮＡを使用する初回免疫−追加免疫ワクチン投与計画の、ＨＣＶモデル抗原におけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘発に対する効果は、Park et al（Vaccine 21:4555-4564）に記載されている。異種ＤＮＡ初回免疫およびＡｄｖ追加免疫は、ＨＣＶワクチンのワクチン接種計画に関する有望なストラテジーであることが結論された。
【００２０】
マウスマラリアモデルはGilbert et al（Vaccine 20:1039-1045）に記載されており、該文献では、筋肉内注射および組換えアデノウイルスおよび改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）によって、異なるワクチン接種計画（ＤＮＡ／ＤＮＡ、Ａｄｖ／Ａｄｖ、ＭＶＡ／ＭＶＡ、ＤＮＡ／ＭＶＡ、ＤＮＡ／Ａｄｖ、Ａｄｖ／ＤＮＡ、ＭＶＡ／Ａｄｖ、Ａｄｖ／ＭＶＡ）で送達されるＤＮＡの防御効力が調査され、組換え複製欠損アデノウイルスが、強い保護性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に関する追加免疫用物質として有用であると特定された。
【発明の開示】
【００２１】
驚くべきことに、本発明者らは、初回免疫用組成物として第１の抗原をコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの使用およびポリヌクレオチド追加免疫を投与するための粒子加速技術の使用の組み合わせが、単一投与、または別の初回免疫−追加免疫投与計画より向上した免疫応答をもたらすことを発見した。
【００２２】
本発明は、第１の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターの投与、および、続いて、第１の異種非自己抗原の少なくとも１つのエピトープを含む第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドの投与により、哺乳動物被験体での免疫応答を惹起する方法であって、第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドが粒子上にコーティングされるかまたは粒子中に組み込まれ、該粒子を粒子加速デバイスにより被験体に投与することを特徴とする、上記方法を提供する。本発明の一実施形態では、粒子を被験体に投与するために好適な粒子加速デバイスはガス駆動式デバイスである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本明細書中で使用される用語「非自己抗原」とは、該抗原の送達対象であることが意図される哺乳動物中に通常存在しない抗原を意味する。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「ＰＭＥＤ」とは、粒子媒介性表皮送達を意味する。
【００２５】
本発明の一実施形態では、哺乳動物被験体はヒトである。別の実施形態では、１以上の抗原は、非ヒト抗原、すなわちヒトにおいて通常発現されない抗原である。さらに別の実施形態では、第１および第２の両方の抗原は非ヒト抗原である。
【００２６】
本発明の初回免疫用および追加免疫用組成物は同一抗原または同一抗原の異なる形式を含んでよい。初回免疫用組成物および追加免疫用組成物は少なくとも１つのエピトープを共有するが、それは必ずしも同一形式の抗原ではなく、同一抗原の異なる形式であってよい。同一抗原の異なる形式の例は、機能的シグナル配列を欠き、かつ哺乳動物細胞中で実質的に非グリコシル化されているｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチド、およびシグナル配列を有するｇｐ１２０であり、かつグリコシル化されているポリペプチドの場合である。同一タンパク質の全長型および切断型、または同一タンパク質の突然変異型および非突然変異型は、本発明の初回免疫−追加免疫形式の目的で、同一抗原の異なる形式であるとみなしてもよい。
【００２７】
本発明の一実施形態では、該方法は治療上有効な免疫応答を惹起するための方法である。別の実施形態では、該方法は防御性免疫応答を惹起するための方法である。
【００２８】
本発明の一実施形態では、「初回免疫」は、プラスミドベクターに組み込まれていてよい、非自己抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスベクターを含む組成物であり、一方「追加免疫」は、同一ポリヌクレオチド配列または、初回免疫用組成物によってコードされる少なくとも１つの同一エピトープ（例えばこのエピトープはＴ細胞エピトープであってよい）をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の粒子媒介性ＤＮＡ送達を介する。
【００２９】
本発明の代替の実施形態では、該ポリヌクレオチド追加免疫成分を表皮への送達に好適な粒子製剤（particulate formulation）に製剤化する。一実施形態では、これを粒子加速技術、例えばガス駆動式粒子加速技術によって送達する。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、１種以上のアジュバントまたはアジュバントをコードするポリヌクレオチドを１回以上の初回免疫または追加免疫投与と共投与してよい。好適なアジュバントの例には、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＬＲアゴニスト、例えばイミキモド（imiquimod）が含まれる。イミキモドはＡｌｄａｒａＴＭクリーム（３Ｍ）として市販されている。前記アジュバントおよび前記２種のアジュバント成分の組み合わせはＷＯ２００５０２５６１４に記載されている。一実施形態では、１種以上のアジュバントを１回以上のＰＭＥＤ追加免疫投与とのみ共投与する。
【００３１】
本発明において使用するためのアデノウイルスベクターの一例は、非ヒト霊長類アデノウイルス、例えばサルアデノウイルス、例えば本明細書中に記載のチンパンジーアデノウイルス、例えばＰａｎ５、６、７または９である。
【００３２】
本発明のアデノウイルスは複製欠損でありうる。このことは、それが、非補完細胞において複製するための、野生型ウイルスと比較して低減した能力を有することを意味する。これは、例えば複製に関与する遺伝子の欠失、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３またはＥ４遺伝子の欠失によって該ウイルスを突然変異させることによって実現することができる。
【００３３】
本発明のアデノウイルスベクターは、機能的Ｅ１欠失を含む複製欠損アデノウイルスでありうる。ゆえに、本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂを発現する能力の不存在に起因して複製欠損であってよく、すなわちＥ１ａおよびＥ１ｂにおいて機能的に欠失していてよい。組換えアデノウイルスは、他の遺伝子の機能的欠失を有してもよく［ＷＯ０３／０００２８３を参照のこと］、例えばＥ３またはＥ４遺伝子における欠失を有してもよい。該アデノウイルスの遅延初期遺伝子Ｅ３を、組換えウイルスの部分を形成するサルアデノウイルス配列から除去することができる。Ｅ３の機能は組換えアデノウイルス粒子の生産に必要ではない。ゆえに、本発明において有用な組換えサルアデノウイルスをパッケージングするためにこの遺伝子産物の機能を置換することは不要である。特定の一実施形態では、組換え（サル）アデノウイルスは機能的に欠失したＥ１およびＥ３遺伝子を有する。そのようなベクターの構築はRoy et al., Human Gene Therapy 15:519-530, 2004に記載されている。
【００３４】
本発明において有用な他の組換えアデノウイルスには、Ｅ４遺伝子の機能的欠失、例えばＥ４の完全機能的（fucntional）欠失、または部分的欠失、例えばＥ４のＯＲＦ６機能が保持されている欠失を有する組換えアデノウイルスが含まれる。本発明のアデノウイルスベクターは遅延初期遺伝子Ｅ２ａにおける欠失を含有してもよい。欠失は、サルアデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれかにおいて施してもよい。同様に、中間遺伝子（intermediate genes）ＩＸおよびＩＶａにおける欠失も有用でありうる。
【００３５】
他の欠失は他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子において施してもよい。上記欠失は個別に使用してよく、すなわち本発明において使用するためのアデノウイルス配列はＥ１のみの欠失を含有してよい。別法では、遺伝子全体またはその生物学的活性を破壊するために有効なその部分の欠失を任意の組み合わせで使用することができる。例えば典型的な１つのベクターでは、アデノウイルス配列は、Ｅ１遺伝子およびＥ４遺伝子の欠失、またはＥ１、Ｅ２ａおよびＥ３遺伝子の欠失、またはＥ１およびＥ３遺伝子の欠失（例えばＥ１ａおよびＥ１ｂにおける機能的欠失、およびＥ３の少なくとも部分の欠失）、またはＥ３の欠失を伴うかまたは伴わないＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４遺伝子の欠失等を有してよい。そのような欠失は前記遺伝子の部分的または完全欠失であってよく、他の突然変異、例えば温度感受性突然変異と組み合わせて使用して、所望の結果を達成してよい。
【００３６】
本発明のアデノウイルスベクターは、該ウイルスが複製可能な任意の好適な細胞株で生産することができる。特に、ウイルスベクターから欠けていて、その結果、その複製特性を損なわせる因子を提供する補完細胞株を使用することができる。非限定的に、そのような細胞株は、特に、ＨｅＬａ［ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ  ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ  １８５］、ＨＥＫ  ２９３、ＫＢ［ＣＣＬ  １７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ  ５１０，ＣＣＬ  ７２］およびＷＩ−３８［ＣＣＬ  ７５］細胞である。これらの細胞株はすべて、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia  20110-2209から入手可能である。他の好適な親細胞株を他の供給元から入手してよく、例えばCentre for Applied Microbiology and Research（ＣＡＭＲ、英国）のEuropean Collection of Animal Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にＥＣＡＣＣ  ｎｏ．９６０２２９４０の下で寄託されている細胞によって代表されるＰＥＲ．Ｃ６（copyright）細胞である。
【００３７】
初回免疫用組成物および追加免疫用組成物はともに、２回以上の用量で送達してよい。さらにまた、最初の初回免疫および追加免疫投与の後に、例えばアデノウイルス初回免疫／ＰＭＥＤ ＤＮＡ追加免疫／追加のアデノウイルス投与／追加のＰＭＥＤ ＤＮＡ投与になるように交互の追加投与を行ってよい。
【００３８】
アデノウイルス初回免疫とＰＭＥＤ追加免疫の間にＤＮＡの追加投与を行ってよく、例えば、アデノウイルス初回免疫、次いでＤＮＡの皮内、筋肉内または皮下送達、次いでＰＭＥＤ ＤＮＡ追加免疫を行ってよい。また、アデノウイルス初回免疫が行われる前に追加の初回免疫投与、例えばＤＮＡの皮内、筋肉内、または皮下送達を行い、次いでアデノウイルス初回免疫、その後のＰＭＥＤ ＤＮＡ追加免疫を行ってよい。
【００３９】
本発明の処置計画の例には、以下のものが含まれる：
アデノウイルス／ＰＭＥＤ
アデノウイルス／ＰＭＥＤ／ＰＭＥＤ
アデノウイルス／ＰＭＥＤ／ＰＭＥＤ／ＰＭＥＤ
アデノウイルス／アデノウイルス／ＰＭＥＤ／ＰＭＥＤ
アデノウイルス／アデノウイルス／ＰＭＥＤ／ＰＭＥＤ
アデノウイルス／アデノウイルス／ＰＭＥＤ／ＰＭＥＤ／ＰＭＥＤ。
【００４０】
本発明の一実施形態では、１または２回のアデノウイルスの初回免疫量、次いで、その後の何回かのＰＭＥＤ追加免疫量を投与する。例えば１０回まで、または２０回までまたは５０回までのＰＭＥＤ追加免疫量を投与してよい。
【００４１】
追加免疫用組成物は初回免疫投与後の適切な時間の後に投与すべきであろう。適切な時間は、細胞が、最初の初回免疫ワクチン接種から、成熟（Wherry, EJ Nature Im 2003, 225）するために十分な時間を持った時点までの時間である。これにかかる時間量は多数の要因にしたがって変動し、該要因には、送達される異種抗原の性質、初回免疫量、初回免疫が行われる経路および処置対象の動物の種類、年齢および体重が含まれる。好適な時間は、７日以上、１４日以上、２１日以上、２８日以上、４０日以上、１００日以上、１２０日以上または１８０日以上であってよく、例えば７〜４０日の範囲、２１日〜１８０日の範囲、または２８〜１２０日の範囲であってよい。
【００４２】
第１または第２の抗原をコードするポリヌクレオチド中で任意の好適なプロモーターを使用してよい。好適なベクターの一例は、ＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子由来のプロモーターであり、例えば、該プロモーターでは、ＷＯ０２／３６７９２に記載されるように、エキソン１を含むＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子の５’非翻訳領域が含まれ、イントロンＡは部分的または完全に除外されている。
【００４３】
アデノウイルスベクターは、標的細胞に形質導入し、かつ、過度の悪影響を有さないかまたは医学的に許容される生理的影響を有する治療上の利益を提供するために十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供するために十分な量で投与することができ、医療技術分野の当業者はそれを決定することができる。慣用の投与経路および製薬的に許容される投与経路には、非限定的に、網膜への直接送達および他の眼内送達方法、肝臓への直接送達、吸入、鼻腔内、静脈内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、経直腸、経口および他の非経口投与経路が含まれる。投与経路は所望であれば組み合わせてよく、あるいは遺伝子産物または症状に応じて調節してよい。投与経路は処置対象の症状の性質に主に依存する。
【００４４】
ウイルスベクターの用量は、処置対象の症状、患者の年齢、体重および健康等の要因に主に依存し、ゆえに患者間で変動しうる。例えば、治療上有効な、ウイルスベクターの成体ヒトまたは獣医学的用量は、概して、約１×１０６〜約１×１０１５粒子、約１×１０１１〜１×１０１３粒子、または約１×１０９〜１×１０１２粒子の濃度のウイルスを含有する約１００μＬ〜約１００ｍＬの担体の範囲である。用量範囲は動物のサイズおよび投与経路に依存する。例えば、（約８０ｋｇの動物に関する）好適なヒトまたは獣医学的用量は、筋肉内注射では、単一部位で、１ｍＬあたり約１×１０９〜約５×１０１２粒子の範囲である。場合により、複数の投与部位に送達してよい。別の例では、好適なヒトまたは獣医学的用量は、経口製剤では、約１×１０１１〜約１×１０１５粒子の範囲であってよい。当業者は、投与経路、および組換えベクターが使用される目的の治療的適用またはワクチン適用に応じてこれらの用量を調節することができる。治療用産物の発現レベル、すなわち免疫原では、循環抗体のレベル、をモニターして、投与頻度を決定することができる。投与頻度のタイミングを決定するためのさらに他の方法は当業者に自明である。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「ｉ．ｄ．」および「ＩＤ」は皮内送達を表す。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「ｉ．ｍ．」および「ＩＭ」は筋肉内送達を表す。
【００４７】
本発明の方法または組成物は、ウイルス性障害（disoviral disorder）、例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、または単純ヘルペスウイルス；細菌性疾患、例えばＴＢ；乳房、結腸、卵巣、子宮頸部、および前立腺の癌；または喘息、関節リウマチおよびアルツハイマーの自己免疫疾患に対して防御するか、またはそれらを処置するために使用してよい。
【００４８】
これらの具体的な病状は単に一例として参照されていて、本発明の範囲に対して限定的であることが意図されないことが認識されるべきであろう。
【００４９】
そのような投与計画で送達される好適な異種遺伝子には、ヒト病原体に対する免疫応答を惹起することが可能なタンパク質をコードする異種遺伝子が含まれ、該抗原または抗原組成物は、ＨＩＶ−１、（例えばｇａｇ、ｐ１７、ｐ２４、ｐ４１、ｐ４０、ｎｅｆ、ｐｏｌ、ＲＴ、ｐ６６、ｅｎｖ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖ）、ヒトヘルペスウイルス、例えばｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥもしくはｇＤまたはその誘導体あるいは前初期タンパク質、例えばＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６、サイトメガロウイルス、特にヒト、（例えばｇＢまたはその誘導体）、エプスタイン・バーウイルス（例えばｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えばｇｐＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＥ６３）由来、または肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原またはｐｏｌ）、Ｃ型肝炎ウイルス抗原およびＥ型肝炎ウイルス抗原由来、または他のウイルス性病原体、例えばパラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス（例えばＦおよびＧタンパク質またはその誘導体）由来、またはパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えばＨＰＶ６、１１、１６、１８、例えばＬ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、フラビウイルス（例えば黄熱ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス細胞、例えばＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、またはＭタンパク質、またはそれらの組み合わせ）由来の抗原、または細菌性病原体、例えばナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ）、例えばＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、例えばトランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘジン）；Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えばＭタンパク質またはそのフラグメント、Ｃ５Ａプロテアーゼ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ；モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐｐ）、例えばＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとしても知られる）（例えば高分子量および低分子量アドヘジンおよびインベジン）；ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ）、例えばＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えばペルタクチン、百日咳毒素またはその誘導体、線維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛（fimbriae））、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ；マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えばＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、８５Ｂまたは８５Ｃ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ１９ｋＤａ［Ｒｖ３７６３］、ＰＰＤ３８ｋＤａ［Ｒｖ０９３４］）、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ；レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、例えば���．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ；エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）、例えば腸管毒性（enterotoxic）大腸菌（例えばコロニー形成因子、熱不安定性毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌（例えば志賀毒素様毒素またはその誘導体）；ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ）、例えばＶ．ｃｈｏｌｅｒａ（例えばコレラ毒素またはその誘導体）；赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ）、例えばＳ．ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ；エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ）、例えばＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（例えばＹｏｐタンパク質）、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、例えばＣ．ｊｅｊｕｎｉ（例えば毒素、アドヘジンおよびインベジン）およびＣ．ｃｏｌｉ；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、例えばＳ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ；リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、例えばＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、例えばＨ．ｐｙｌｏｒｉ（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、例えばＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、例えばＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ；クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、例えばＣ．ｔｅｔａｎｉ（例えば破傷風毒素およびその誘導体）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（例えばクロストリジウム毒素ＡまたはＢおよびその誘導体）；バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、例えばＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、例えばＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（例えばジフテリア毒素およびその誘導体）；ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．）、例えばＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ；エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、例えばＥ．ｅｑｕｉおよびヒト顆粒球性エーリキア症の物質；リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、例えばＲ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ；クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、例えばＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（例えばＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えばＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ；レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒ��  ｓｐｐ．）、例えばＬ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ；トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、例えばＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ（例えば稀少外膜タンパク質）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ由来の抗原；または寄生虫、例えばプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、例えばＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ；トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、例えばＴ．ｇｏｎｄｉｉ（例えばＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）；アメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ．）、例えばＥ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ；バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．）、例えばＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ；トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．）、例えばＴ．ｃｒｕｚｉ；ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、例えばＧ．ｌａｍｂｌｉａ；リューシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．）、例えばＬ．ｍａｊｏｒ；ニューモシスティス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、例えばＰ．ｃａｒｉｎｉｉ；トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、例えばＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ；スキゾストーマ属（Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ  ｓｐｐ．）、例えばＳ．ｍａｎｓｏｎｉ由来、または酵母、例えばカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、例えばＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ；クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、例えばＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来である。
【００５０】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに関する具体的抗原は、例えばＲｖ２５５７、Ｒｖ２５５８、ＲＰＦ群：Ｒｖ０８３７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４５０、Ｒｖ１００９、ａｃｅＡ（Ｒｖ０４６７）、ＰｓｔＳ１（Ｒｖ０９３２）、ＳｏｄＡ（Ｒｖ３８４６）、Ｒｖ２０３１ｃ  １６ｋＤａｌ．、Ｔｂ  Ｒａ１２、Ｔｂ  Ｈ９、Ｔｂ  Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ  １４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２およびｈＴＣＣ１である（ＷＯ９９／５１７４８）。またＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに関するタンパク質には、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの少なくとも２つ、または例えば、３つのポリペプチドが融合されて、大きいタンパク質になっている融合タンパク質およびその変異体が含まれる。そのような融合物には、Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩが含まれる（ＷＯ９９／５１７４８）。
【００５１】
クラミジアに関する好適な抗原の例には、例えば高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）（ＷＯ９９／１７７４１）、ＯＲＦ３（ＥＰ３６６４１２）、および推定の膜タンパク質（Ｐｍｐ群）が含まれる。ワクチン製剤の他のクラミジア抗原はＷＯ９９／２８４７５に記載の群から選択することができる。
【００５２】
細菌性ワクチンの例には、連鎖球菌属、例えばＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、連鎖球菌溶血素、コリン結合タンパク質）およびタンパク質抗原ニューモリシン（Pneumolysin）（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）、および突然変異によって無毒化されたその誘導体（ＷＯ９０／０６９５１；ＷＯ９９／０３８８４）が含まれる。他の細菌性ワクチンは、ヘモフィルス属、例えばＢ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えばＰＲＰおよびそのコンジュゲート）、分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の抗原、例えばＯＭＰ２６、高分子量アドヘジン、Ｐ５、Ｐ６、プロテインＤおよびリポプロテインＤ、およびフィンブリンおよびフィンブリン由来のペプチド（ＵＳ５，８４３，４６４）またはそのマルチコピー変異体または融合タンパク質を含む。
【００５３】
本発明において使用することができる抗原は、マラリアを引き起こす寄生虫由来の抗原をさらに含んでよい。Ｐｌａｓｍｏｄｉａ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来の抗原には、ＲＴＳ，ＳおよびＴＲＡＰが含まれる。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２部分の４アミノ酸を介してＢ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に連結されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の実質的にすべてのＣ末端部分を含むハイブリッドタンパク質である。その完全構造は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１号（英国特許出願第９１２４３９０．７号の優先権を主張して、公開番号ＷＯ９３／１０１５２の下に公開されている）に開示されている。酵母で発現されると、ＲＴＳはリポタンパク質粒子として生産され、ＨＢＶ由来のＳ抗原と共発現されると、ＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子が生産される。ＴＲＡＰ抗原は国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５号（ＷＯ９０／０１４９６の下に公開されている）に記載されている。本発明の一実施形態は、抗原調製物がＲＴＳ，ＳおよびＴＲＡＰ抗原の組み合わせを含むマラリアワクチンである。マルチステージマラリアワクチンの成分候補である可能性が高い他のプラスモジウム抗原は、Ｐ．ｆａｃｉｐａｒｕｍのＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セクエストリン（Sequestrin）、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびプラスモジウム属におけるそれらのアナログである。
【００５４】
本発明は抗腫瘍抗原の使用を意図し、癌の免疫療法処置に有用でありうる。例えば、癌退縮抗原、例えば前立腺、乳房、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓または黒色腫の癌に関する癌退縮抗原である。典型的な抗原には、ＭＡＧＥ １、３およびＭＡＧＥ ４または他のＭＡＧＥ抗原、例えばＷＯ９９／４０１８８に開示されているＭＡＧＥ抗原、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ Ｅｏｓ １としても知られる）ＳＡＧＥおよびＨＡＧＥ（ＷＯ９９／５３０６１）またはＧＡＧＥ（Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636;  Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997);  Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293）が含まれる。実際、これらの抗原は広範囲の腫瘍タイプ、例えば黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌において発現される。
【００５５】
本発明において使用するためのＭＡＧＥ抗原は、発現エンハンサーまたは免疫学的融合パートナーとの融合タンパク質として発現してよい。特に、Ｍａｇｅタンパク質をＢ型インフルエンザ菌（Heamophilus influenzae B）由来のプロテインＤに融合してよい。特に、該融合パートナーはプロテインＤの最初の１／３を含んでよい。そのような構築物はＷＯ９９／４０１８８に開示されている。癌特異的エピトープを含有してよい融合タンパク質の他の例には、ｂｃｒ／ａｂｌ融合タンパク質が含まれる。
【００５６】
本発明の一実施形態では、前立腺抗原、例えば前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ（PNAS 95(4) 1735-1740 1998）、ＰＳＭＡまたはプロスターゼ（Prostase）として知られる抗原を利用する。
【００５７】
プロスターゼは２５４アミノ酸長の前立腺特異的セリンプロテアーゼ（トリプシン様）であり、保存セリンプロテアーゼ触媒トライアドＨ−Ｄ−Ｓおよびアミノ末端プレプロペプチド配列を有し、潜在的分泌機能を示す（P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, In Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119）。推定グリコシル化部位が報告されている。該予測構造は他の公知のセリンプロテアーゼと非常に類似していて、成熟ポリペプチドが単一ドメインにフォールディングすることを示す。該成熟タンパク質は２２４アミノ酸長であり、１つのＡ２エピトープが天然にプロセシングされることが示される。
【００５８】
プロスターゼヌクレオチド配列および推定ポリペプチド配列およびホモログは、Ferguson, et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119）および国際特許出願第ＷＯ９８／１２３０２号（および、さらに、対応する許可済みの特許ＵＳ５，９５５，３０６）、ＷＯ９８／２０１１７（および、さらに、対応する許可済みの特許ＵＳ５，８４０，８７１およびＵＳ５，７８６，１４８）（前立腺特異的カリクレイン）およびＷＯ００／０４１４９（Ｐ７０３Ｐ）に開示されている。
【００５９】
本発明は、プロスターゼタンパク質ならびにそのフラグメントおよびホモログ（「誘導体」）に基づくプロスターゼタンパク質融合物を含む抗原を提供する。そのような誘導体は前立腺腫瘍の処置に好適な治療用ワクチン製剤中で使用するために好適である。典型的に、上記参照の特許および特許出願に開示されるように、該フラグメントは、少なくとも２０個、例えば５０個または１００個の連続アミノ酸を含有する。
【００６０】
前立腺抗原の別の例はＷＯ９８／３７８１４（参照により本明細書中に組み入れられる）の配列番号１１３のＰ５０１Ｓである。Ｐ５０１Ｓは本発明において使用するための抗原の例である。Ｐ５０１Ｓおよびその構築物はまた、ＵＳ６，３２９，５０５（同様に、参照により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。上記参照の特許出願に開示されている少なくとも２０個、例えば５０個または１００個の連続アミノ酸を含む、その遺伝子によってコードされる免疫原性フラグメントおよび部分が考慮される。具体的フラグメントはＰＳ１０８である（ＷＯ９８／５０５６７（参照により本明細書中に組み入れられる））。
【００６１】
他の前立腺特異的抗原はＷＯ９８／３７４１８、およびＷＯ／００４１４９から公知である。別の前立腺特異的抗原はＳＴＥＡＰ（PNAS 96 14523 14528 7-12 1999）である。
【００６２】
本発明の関連で有用な他の腫瘍関連抗原には、Ｐｌｕ−１（J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999）、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ（Salomon et al Bioessays 199, 21 61-70, 米国特許第５６５４１４０号）Ｃｒｉｐｔｉｎ（米国特許第５９８１２１５号）が含まれる。さらに、癌の治療におけるワクチンに特に適切な抗原はまた、チロシナーゼおよびサバイビン（survivin）を含む。
【００６３】
本発明はまた、乳癌抗原、例えばＭｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、ＥｐＣＡＭ、ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、マンマグロビン（mammaglobin）（米国特許第５６６８２６７号）またはＷＯ／００５２１６５、ＷＯ９９／３３８６９、ＷＯ９９／１９４７９、ＷＯ９８／４５３２８に開示されている乳癌抗原との組み合わせにおいて有用である。Ｈｅｒ２ ｎｅｕ抗原は、特に、米国特許第５，８０１，００５号に開示されている。一例では、Ｈｅｒ２ ｎｅｕは、細胞外ドメイン全体（おおよそアミノ酸１〜６４５を含む）またはそのフラグメントおよび細胞内ドメイン（おおよそＣ末端の５８０アミノ酸）の少なくとも免疫原性部分またはその全体を含んでよい。特に、細胞内部分はリン酸化ドメインまたはそのフラグメントを含むべきであろう。そのような構築物はＷＯ００／４４８９９に開示されている。そのような構築物の１つはＥＣＤ ＰＤとして知られ、第２の構築物はＥＣＤ ΔＰＤとして知られている（ＷＯ／００／４４８９９を参照のこと）。
【００６４】
本明細書中で使用されるｈｅｒ２ ｎｅｕはラット、マウスまたはヒト由来であってよい。
【００６５】
該ワクチンは、腫瘍支援メカニズム（例えば血管新生、腫瘍浸潤）と関連している抗原、例えばｔｉｅ ２、ＶＥＧＦを含有してもよい。
【００６６】
本発明のワクチンは、アレルギー、癌または感染症に加えて慢性障害の予防または治療に使用してもよい。そのような慢性障害は、喘息、アテローム性動脈硬化症、およびアルツハイマーおよび他の自己免疫障害等の疾患である。避妊薬として使用するためのワクチンも考慮されうる。
【００６７】
アルツハイマー神経変性疾患になりやすいかまたはそれに罹患している患者の予防および治療に適切な抗原は、特に、Ｎ末端３９〜４３アミノ酸フラグメント（ＡＢ、アミロイド前駆体タンパク質および、より小さいフラグメントである。この抗原は国際特許出願第ＷＯ９９／２７９４４号（Athena Neurosciences）に開示されている。
【００６８】
自己免疫障害用のワクチンとしてまたは避妊薬ワクチンとして含ませることができる潜在的な自己抗原には、サイトカイン、ホルモン、成長因子または細胞外タンパク質、例えば４−ヘリカルサイトカイン（4-helical cytokine）、例えばＩＬ１３が含まれる。サイトカインには、例えば、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＭＣＳＦおよびＯＳＭが含まれる。４−ヘリカルサイトカインには、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１３、ＧＭＣＳＦおよびＭＣＳＦが含まれる。ホルモンには、例えば、黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、ＶＧＦ、ＧＨｒｅｌｉｎ、アグーチ、アグーチ関連タンパク質およびニューロペプチドＹが含まれる。成長因子には、例えば、ＶＥＧＦが含まれる。
【００６９】
本発明の療法および組成物は、慢性症状および癌等の疾患の免疫療法処置に特に好適であるが、持続感染の治療にも好適である。したがって本発明のワクチンは、結核（ＴＢ）、ＨＩＶ感染、例えばＡＩＤＳおよびＢ型肝炎（ＨｅｐＢ）ウイルス感染等の感染症の免疫療法に特に好適である。
【００７０】
本発明の一実施形態では、異種ヌクレオチド配列は１以上の以下の抗原をコードする：
ＨＢＶ：ＰｒｅＳ１ ＰｒｅＳ２および表面ｅｎｖタンパク質、コアおよびｐｏｌ
ＨＣＶ：コア、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＢ
ＨＩＶ：ｇｐ１２０ ｇｐ４０、ｇｐ１６０、ｐ１７、ｐ２４、ｐ４１、ｇａｇ、ｐｏｌ、ＲＴ、ｐ６６、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ
パピローマ：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｌ１、Ｌ２
ＨＳＶ：ｇＬ、ｇＨ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥ、ｇＤ、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ３６、ＩＣＰ４
インフルエンザ：ヘマグルチン（haemaggluttin）、核タンパク質
ＴＢ：マイコバクテリアスーパーオキシドジスムターゼ、８５Ａ、８５Ｂ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ １９ｋＤａ Ａｇ、ＰＰＤ ３８ｋＤａ Ａｇ。
【００７１】
好適な癌抗原についての追加説明はＷＯ０５／０２５６１４に見出せる。
【００７２】
そのような好適なＨＩＶ抗原についての追加説明はＷＯ０３０２５００３に見出せる。
【００７３】
ＨＰＶ抗原
本発明において有用な抗原は、例えば、尖圭コンジローマ（genital warts）に関与すると考えられるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１等）、および／または子宮頸癌に関与するＨＰＶウイルス（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５２等）由来であってよい。一実施形態では、尖圭コンジローマの予防または治療用組成物の形式は、Ｌ１粒子またはカプソメア（capsomers）、およびＨＰＶタンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ５ Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、およびＬ２から選択される１以上の抗原を含む融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質の形式は、ＷＯ  ９６／２６２７７に開示されるＬ２Ｅ７、およびＰＣＴ／ＥＰ９８／０５２８５に開示されるプロテインＤ（１／３）−Ｅ７である。
【００７４】
一実施形態では、ＨＰＶ子宮頸部感染もしくは癌の予防または治療用組成物に適切な抗原はＨＰＶ１６または１８抗原を含む。例えば、Ｌ１もしくはＬ２抗原単量体、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）として一緒に提供されるＬ１もしくはＬ２抗原またはＶＬＰまたはカプソメア構造中で単独で提供されるＬ１単独タンパク質である。そのような抗原、ウイルス様粒子およびカプソメアはそれ自体公知である。例えばＷＯ９４／００１５２、ＷＯ９４／２０１３７、ＷＯ９４／０５７９２、およびＷＯ９３／０２１８４を参照のこと。追加の初期タンパク質、例えばＥ７、Ｅ２または例えばＥ５を単独でまたは融合タンパク質として含ませてよく；その一実施形態には、Ｌ１Ｅ７融合タンパク質を含むＶＬＰが含まれる（ＷＯ９６／１１２７２）。一実施形態では、ＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６由来の、プロテインＤ担体と融合してプロテインＤ−Ｅ６またはＥ７融合物を形成している初期タンパク質Ｅ６またはＥ７、またはその組み合わせを含み；またはＥ６またはＥ７とＬ２の組み合わせを含む（ＷＯ９６／２６２７７）。別法では、ＨＰＶ１６または１８初期タンパク質Ｅ６およびＥ７は、単一分子中で、例えばプロテインＤ−Ｅ６／Ｅ７融合物として提供してよい。そのような組成物は、場合により、ＨＰＶ １８由来のＥ６およびＥ７タンパク質のいずれかまたは両者を、例えばプロテインＤ−Ｅ６またはプロテインＤ−Ｅ７融合タンパク質またはプロテインＤ Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質の形式で、提供しうる。
【００７５】
ＨＩＶ抗原
本発明の特に好適な実施形態では、第１および第２ポリペプチド抗原がＨＩＶ由来の抗原、特にＨＩＶ−１由来の抗原から選択される。
【００７６】
ＨＩＶ ＴａｔおよびＮｅｆタンパク質は初期タンパク質であり、すなわち、それらは感染の早期に、かつ構造タンパク質の不存在下で発現される。
【００７７】
Ｎｅｆ遺伝子は、いくつかの活性を有することが示されている初期アクセサリーＨＩＶタンパク質をコードする。例えば、Ｎｅｆタンパク質によって、ＨＩＶ受容体であるＣＤ４が細胞表面から除去されることが知られているが、この機能の生物学的重要性は議論されている。さらに、ＮｅｆはＴ細胞のシグナル経路と相互作用し、活性状態を誘導し、その結果として、より効率的な遺伝子発現を促進しうる。いくつかのＨＩＶ単離体はこの領域中に突然変異を有し、その結果、機能的タンパク質をコードしないことになり、それらのｉｎ ｖｉｖｏ複製および病原性が大きく損なわれる。
【００７８】
Ｇａｇ遺伝子は完全長ＲＮＡから翻訳されて前駆体ポリタンパク質を生じさせ、その後、該前駆体ポリタンパク質は切断されて３〜５カプシドタンパク質になる；基質タンパク質、カプシドタンパク質および核酸結合タンパク質およびプロテアーゼである（Fundamental Virology, Fields BN, Knipe DM and Howley M 1996 2.  Fields Virology vol 2 1996）。
【００７９】
Ｇａｇ遺伝子はｐ５５とも称される５５キロダルトン（ｋＤ）Ｇａｇ前駆体タンパク質を生じさせる。該タンパク質は非スプライスウイルスｍＲＮＡから発現される。翻訳中に、ｐ５５のＮ末端はミリストイル化され、細胞膜の細胞質側面との結合が引き起こされる。膜結合型Ｇａｇポリタンパク質は、感染細胞の表面からウイルス粒子を発芽させる他のウイルスタンパク質および細胞タンパク質とともに、２コピーのウイルスゲノムＲＮＡを動員する。発芽後、ｐ５５は、ウイルスの成熟プロセス中に、ウイルスがコードするプロテアーゼ（Ｐｏｌ遺伝子の産物）によって切断され、ＭＡ（基質［ｐ１７］）、ＣＡ（カプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオカプシド［ｐ９］）、およびｐ６．（４）と称される４つの小タンパク質になる。
【００８０】
３つの主なＧａｇタンパク質（ｐ１７、ｐ２４およびｐ９）に加えて、すべてのＧａｇ前駆体は数個の他の領域を含有し、該領域は切除されて、種々のサイズのペプチドとしてビリオン中に残留する。これらのタンパク質は異なる役割を有し、例えばｐ２タンパク質は、該プロテアーゼの活性の調節において、提唱される役割を有し、タンパク質分解によるプロセシングの正確なタイミングに貢献する。
【００８１】
ＭＡポリペプチドは、ｐ５５のミリストイル化末端であるＮ末端由来である。ほとんどのＭＡ分子は、ビリオン脂質二重層の内部表面に結合したままであり、該粒子を安定化する。ＭＡのサブセットはビリオンのより深い層の内側に動員され、そこで、ウイルスＤＮＡを核へ送り届ける複合体の部分になる。これらのＭＡ分子はウイルスゲノムの核輸送を促進する。その理由は、ＭＡ上の親核性（karyophilic）シグナルが細胞の核内移行機構によって認識されるからである。この現象により、ＨＩＶが非分裂細胞に感染することが可能になる。それはレトロウイルスの異常な特性である。
【００８２】
ｐ２４（ＣＡ）タンパク質はウイルス粒子の円錐コアを形成する。サイクロフィリンＡは、ｐ５５のｐ２４領域と相互作用して、そのＨＩＶ粒子内への取り込みを導くことが実証されている。ＧａｇとサイクロフィリンＡ間の相互作用は必須である。その理由は、この相互作用がシクロスポリンＡによって破壊されると、ウイルス複製が阻害されるからである。
【００８３】
ＧａｇのＮＣ領域は、特に、ＨＩＶのいわゆるパッケージングシグナルの認識に関与する。該パッケージングシグナルは、ウイルスＲＮＡの５’末端付近に位置する４つのステムループ構造からなり、ＨＩＶ−１ビリオン内への異種ＲＮＡの取り込みを媒介するために十分である。ＮＣは、２つのジンクフィンガーモチーフによって媒介される相互作用を通して、パッケージングシグナルと結合する。ＮＣはまた、逆転写を促進する。
【００８４】
ｐ６ポリペプチド領域はｐ５５ Ｇａｇとアクセサリータンパク質Ｖｐｒ間の相互作用を媒介し、Ｖｐｒを集合ビリオン内へ取り込ませる。ｐ６領域はまた、感染細胞からの発芽ビリオンの効率的放出に必要とされる、いわゆる後期ドメインを含有する。
【００８５】
Ｐｏｌ遺伝子は、早期の感染中にウイルスによって必要とされる活性を有する３つのタンパク質、逆転写酵素ＲＴ、プロテアーゼ、および細胞ＤＮＡへのウイルスＤＮＡの組み込みに必要とされるインテグラーゼタンパク質をコードする。Ｐｏｌの初期産物はビリオンプロテアーゼによって切断されて、ＤＮＡ合成に必要な活性を含有するアミノ末端ＲＴペプチド（ＲＮＡおよびＤＮＡを標的にするＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ribouclease H））およびカルボキシ末端インテグラーゼタンパク質が生じる。ＨＩＶ ＲＴは完全長ＲＴ（ｐ６６）および、カルボキシ末端ＲＮＡ分解酵素インテグラーゼドメインを欠いている切断産物（ｐ５１）のヘテロ二量体である。
【００８６】
ＲＴは、レトロウイルスゲノムによってコードされる最も高度に保存されているタンパク質の１つである。ＲＴの２つの主要な活性はＤＮＡ ＰｏｌおよびリボヌクレアーゼＨである。ＲＴのＤＮＡ Ｐｏｌ活性はＲＮＡおよびＤＮＡを鋳型として交換可能に使用し、すべての公知のＤＮＡポリメラーゼと同様に、新規にＤＮＡ合成を開始することができず、プライマー（ＲＮＡ）として働く既存の分子を必要とする。
【００８７】
すべてのＲＴタンパク質に備わっているＲＮＡ分解酵素Ｈ活性は、複製の早期に、ＤＮＡ合成の進行に伴ってＲＮＡゲノムを除去する必須の役割を果たす。それはすべてのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子からＲＮＡを選択的に分解する。構造的に、該ポリメラーゼおよびｒｉｂｏ Ｈは、Ｐｏｌのアミノ末端側３分の２のアミノをカバーするＰｏｌ内の離れた重複しないドメインを占める。
【００８８】
ｐ６６触媒サブユニットは５つの別個のサブドメインにフォールディングされる。そのアミノ末端の２３個は、ＲＴ活性を有する部分を有する。そのカルボキシ末端はＲＮＡ分解酵素Ｈドメインである。
【００８９】
宿主細胞に感染した後、レトロウイルスＲＮＡゲノムは、感染粒子中に存在する逆転写酵素によって線状二本鎖ＤＮＡ内にコピーされる。インテグラーゼ（Skalka AM '99 Adv in Virus Res 52 271-273に総説されている）は、ウイルスＤＮＡの末端を認識し、それらを刈り込み、組み込みを触媒するためにウイルスＤＮＡを宿主染色体部位と一緒にする。宿主ＤＮＡ中の多数の部位が組み込みの標的でありうる。インテグラーゼはｉｎ ｖｉｔｒｏで組み込みを触媒するために十分であるが、それはｉｎ ｖｉｖｏでウイルスＤＮＡと関連している唯一のタンパク質ではない。感染細胞から単離された大きいタンパク質−ウイルスＤＮＡ複合体がプレ組み込み複合体として示されている。これは子孫ウイルスゲノムによる宿主細胞遺伝子の獲得を容易にする。
【００９０】
インテグラーゼは、３つの別個のドメイン、Ｎ末端ドメイン、触媒コアおよびＣ末端ドメインからできている。触媒コアドメインはポリヌクレオチド基転移（polynucleotidyl transfer）化学に関するすべての必要条件を含む。
【００９１】
ゆえに本発明において使用するためのＨＩＶ−１由来の抗原は、例えば、Ｇａｇ、Ｔａｔ、ｐ１７（Ｇａｇの一部分）、ｐ２４（Ｇａｇの別の一部分）、ｐ４１、ｐ４０、Ｎｅｆ、Ｐｏｌ、ＲＴ（Ｐｏｌの一部分）、ｐ６６（ＲＴの一部分）、Ｅｎｖ、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖならびにその免疫原性誘導体およびその免疫原性フラグメント、特にＧａｇ、ＮｅｆおよびＰｏｌならびにその免疫原性誘導体およびその免疫原性フラグメント、例えばｐ１７、ｐ２４およびＲＴから選択してよい。ＨＩＶワクチンは、上記リストから選択することができる複数の異なるＨＩＶ抗原、例えば２または３または４またはそれ以上のＨＩＶ抗原に対応するポリペプチドおよび／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでよい。例えば、数個の異なる抗原を単一融合タンパク質中に含ませてよい。
【００９２】
例えば抗原は、Ｇａｇまたはその免疫原性誘導体もしくは免疫原性フラグメントを含んでよく、それはＲＴまたはその免疫原性誘導体もしくは免疫原性フラグメントに融合され、それはＮｅｆまたはその免疫原性誘導体もしくは免疫原性フラグメントに融合されていて、その場合、該融合タンパク質のＧａｇ部分は該ポリペプチドの５’末端に存在する。
【００９３】
本発明で有用なＧａｇ配列では、Ｇａｇ ｐ６ポリペプチドをコードする配列を除外してよい。本発明において使用するためのＧａｇ配列の具体例は、ｐ１７および／またはｐ２４をコードする配列を含む。
【００９４】
ＲＴ配列は、すべての逆転写酵素活性を実質的に不活性化する突然変異を含有してよい。ある特定の不活性化突然変異では、Ｗ（トリプトファン）２２９をＫ（リシン）の代わりに用いることを含む。ＷＯ０３／０２５００３を参照されたい。
【００９５】
ＲＴ配列は、さらにまたは代わりに、Ｍｅｔに相当する５９２位で突然変異を含有してよく、それは例えばＬｙｓへの突然変異である。この突然変異の目的は、原核生物発現系における内部開始部位として働く部位を除去することである。
【００９６】
ＲＴ遺伝子は、ＨＩＶゲノム中のより大きいＰｏｌ遺伝子の成分である。本発明にしたがって用いられるＲＴ配列は、Ｐｏｌと関連して、または少なくともＲＴに相当するＰｏｌのフラグメント中に存在してよいことが理解される。そのようなＰｏｌのフラグメントはＰｏｌの主要ＣＴＬエピトープを保持する。一具体例では、ＲＴは、ＲＴのｐ５１のみまたはｐ６６のみのフラグメントとして含まれる。
【００９７】
本発明の融合タンパク質または組成物のＲＴ成分は、場合により、５９２位の突然変異、またはＨＸＢ２以外の系統における等価の突然変異を含み、メチオニンが別の残基、例えばリシンへの突然変異によって除去されている。この突然変異の目的は、原核生物発現系における内部開始部位として働く部位を除去することである。
【００９８】
場合により、本発明において使用するためのＮｅｆ配列を切断して、Ｎ末端領域をコードする配列を除去し、すなわち３０〜８５アミノ酸、例えば６０〜８５アミノ酸、特にＮ末端の６５アミノ酸を除去する（後者の切断は本明細書中でｔｒＮｅｆと称される）。その代わりにまたはそれに加えて、Ｎｅｆを改変して、１以上のミリスチル化部位を除去してよい。例えばＧｌｙ２ミリスチル化部位を欠失または置換によって除去してよい。その代わりにまたはそれに加えて、Ｎｅｆを改変して、Ｌｅｕ１７４およびＬｅｕ１７５のジロイシンモチーフを、一方または両ロイシンの欠失または置換によって変化させてよい。ＣＤ４ダウンレギュレーションに関するジロイシンモチーフの重要性は、例えば、Bresnahan P.A. et al (1998) Current Biology, 8(22): 1235-8に記載されている。
【００９９】
本発明の抗原は、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆを含んでよく、その場合、これらのネイティブ抗原のＣＴＬエピトープの少なくとも７５％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％、例えば９６％が存在する。
【０１００】
本発明において有用な抗原は、上記で規定したｐ１７／ｐ２４ Ｇａｇ、ｐ６６ ＲＴ、および切断型Ｎｅｆを含んでよく、ネイティブＧａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆ抗原のＣＴＬエピトープの９６％が存在しうる。
【０１０１】
本発明にしたがって使用できる特定のポリヌクレオチド構築物および対応するポリペプチド抗原には、以下の抗原が含まれる：
１．  ｐ１７，ｐ２４（コドン最適化）Ｇａｇ−ｐ６６ ＲＴ（コドン最適化）−切断型Ｎｅｆ；
２．  切断型Ｎｅｆ−ｐ６６ ＲＴ（コドン最適化）−ｐ１７，ｐ２４（コドン最適化）Ｇａｇ；
３．  切断型Ｎｅｆ−ｐ１７，ｐ２４（コドン最適化）Ｇａｇ−ｐ６６ ＲＴ（コドン最適化）；
４．  ｐ６６ ＲＴ（コドン最適化）−ｐ１７，ｐ２４（コドン最適化）Ｇａｇ−切断型Ｎｅｆ；
５．  ｐ６６ ＲＴ（コドン最適化）−切断型Ｎｅｆ−ｐ１７，ｐ２４（コドン最適化）Ｇａｇ；
６．  ｐ１７，ｐ２４（コドン最適化）Ｇａｇ−切断型Ｎｅｆ−ｐ６６ ＲＴ（コドン最適化）。
【０１０２】
本発明は、自己抗原、例えば癌抗原Ｐ５０１Ｓ、またはＭＵＣ−１に対する耐容性（tolerence）の破壊に有効であることが考察される。
【０１０３】
そのような抗原をコードする異種遺伝子は、抗原全体ではなく、その免疫原性誘導体または免疫原性フラグメントをコードしてよい。
【０１０４】
本発明に含まれるすべての異種配列に関して、これらは、必ずしも、完全長またはネイティブタンパク質をコードする配列ではないことが理解される。免疫原性誘導体、例えば切断型または別の様式で改変された、例えば突然変異タンパク質も考慮され、少なくとも１つのエピトープ、例えばＣＴＬエピトープをコードするフラグメント、典型的に少なくとも８アミノ酸のペプチドも同様である。少なくとも８、例えば８〜１０アミノ酸または２０まで、５０まで、６０まで、７０まで、１００まで、１５０までまたは２００までのアミノ酸長のフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、コード対象のオリゴまたはポリペプチドが抗原性を示す限り、換言すると、主要ＣＴＬエピトープが該オリゴまたはポリペプチドによって保持される限り、本発明の範囲内に入るとみなされる。
【０１０５】
本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド分子は、ネイティブタンパク質の例えば５０％の長さのフラグメントであってよく、該フラグメントは突然変異を含有してよいが、少なくとも１つのエピトープを保持し、かつ抗原性を示す。同様に、本発明の免疫原性誘導体は抗原性を示す必要がある。免疫原性誘導体は、ネイティブタンパク質より優れた、なんらかの潜在的利点を提供してよい。該利点は、例えば、ワクチン抗原中で望ましくないネイティブタンパク質の機能、例えば酵素活性（例えばＲＴ）、またはＣＤ４ダウンレギュレーション（例えばＮｅｆ）の低減または除去である。
【０１０６】
該ポリヌクレオチド配列のコドンを哺乳動物細胞に最適化してよい。そのようなコドン最適化はＷＯ０５／０２５６１４に詳細に記載されている。
【０１０７】
本発明の一実施形態では、該構築物はＮ末端リーダー配列を含む。シグナル配列、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、個別に、すべて場合により存在するかまたは欠失される。本発明の一実施形態では、すべてのこれらの領域は存在するが、改変されている。
【０１０８】
本発明は、免疫応答を生起することが可能な異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを含む第１の組成物および、続いて、第１の異種非自己抗原の少なくとも１つのエピトープを含む異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含む第２の組成物の投与により、ＨＩＶを治療するための哺乳動物の被験体を治療する方法であって、第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドが粒子上にコーティングされるかまたは粒子中に組み込まれ、かつ粒子加速デバイスによる送達用に製剤化されていることを特徴とする方法を含む。
【０１０９】
本発明は、免疫応答を生起することが可能な異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを含む第１の組成物、および第１の異種非自己抗原の少なくとも１つのエピトープを含む異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含む第２の組成物を含むキットであって、第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドが粒子上にコーティングされるかまたは粒子中に組み込まれ、かつ医療での使用のために粒子加速デバイスによる送達用に製剤化されていることを特徴とするキットをさらに含む。
【０１１０】
本発明は、免疫応答を生起することが可能な異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを含む第１のワクチン、および第１の異種非自己抗原の少なくとも１つのエピトープを含む異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドを含む第２のワクチンを含むキットであって、第２の異種非自己抗原をコードするポリヌクレオチドが粒子上にコーティングされるかまたは粒子中に組み込まれ、かつ粒子加速デバイスによる送達用に製剤化されていることを特徴とするキットをさらに含む。
【実施例】
【０１１１】
実施例１
オボアルブミン発現ベクターの構築
野生型ニワトリｏｖａ遺伝子の分泌シグナル（ａ．ａ．２０〜１４５）を欠失させることによってニワトリオボアルブミンの非分泌型をコードする遺伝子を構築した。この切断型遺伝子はＯＶＡｃｙｔと称され、それが非分泌の細胞質型のオボアルブミンタンパク質であることを示す。この遺伝子（図１を参照のこと）を、ＤＮＡワクチンベクターｐ７３１３（このプラスミドに関する完全な詳細はＷＯ２００４０４１８５２に記載されている）へのライゲーションを可能にする制限部位を含んでいるプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。
【０１１２】
ｐＣＩプラスミド（promega）に基づく、ＤＮＡワクチン接種に最適化された改変真核生物発現ベクターにオボアルブミン遺伝子（図２を参照のこと）を挿入することによってニワトリオボアルブミンの分泌型をコードする遺伝子を構築した。
【０１１３】
実施例２
Ｇａｇ、ＲＴ、Ｎｅｆプラスミドの構築
プラスミドｐ７３ｉ−Ｔｇｒｎ
１．プラスミド：ｐ７３ｉ−ＧＲＮ２ クローン＃１９（ｐ１７／ｐ２４（ｏｐｔ）／ＲＴ（ｏｐｔ）ｔｒＮｅｆ）−修復型（repaired）
目的の遺伝子：
Ｉｏｗａ ｌｅｎｇｔｈ ＨＣＭＶプロモーター＋エキソン１の下流で、かつウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルの上流のＨＩＶ−１ ｃｌａｄｅ Ｂ系統ＨＸＢ２由来の、コドン最適化Ｇａｇのｐ１７／ｐ２４部分、コドン最適化ＲＴおよび切断型Ｎｅｆ遺伝子。
【０１１４】
プラスミドｐ１７／２４ｔｒＮｅｆ１由来のｔｒＮｅｆ遺伝子を含有するプラスミドは、Ｎｅｆの末端から１９アミノ酸のＲからＨへのアミノ酸変化をもたらすＰＣＲエラーを含有する。ＰＣＲ突然変異誘発によってこれを補正し、補正済みＮｅｆをｐ７０７７−ＲＴ３由来のコドン最適化ＲＴにＰＣＲによってつなぎ、つなぎ合わせた断片をＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐ７３ｉ−ＧＲＮにクローニングした。
【０１１５】
プライマー：
以下のプライマーを使用してｐ７０７７−ＲＴ３からのｃｏＲＴのＰＣＲを行った：
（実験全体を通して、ポリメラーゼはＰＷＯ（Roche）であった。）
センス：Ｕ１
ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴ
ＡＳｃｏＲＴ−Ｎｅｆ
ＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＣＴＡＡＴＣＣＣＣＧＣ
サイクル：９５℃（３０秒）、次いで２０サイクルの９５℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（１８０秒）、次いで７２℃（１２０秒）および４℃で保持
１．７ｋｂのＰＣＲ産物をゲル精製した。
【０１１６】
以下のプライマーを使用してｐ１７／２４ｔｒＮｅｆ１からの５’ＮｅｆのＰＣＲを行った：
センス：Ｓ−Ｎｅｆ
ＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＣ
アンチセンス：ＡＳＮｅｆ−Ｇ：
ＧＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＡＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣ
サイクル：９５℃（３０秒）、次いで１５サイクルの９５℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（６０秒）、次いで７２℃（１２０秒）および４℃で保持。
【０１１７】
以下のプライマーを使用してｐ１７／２４ｔｒＮｅｆ１からの３’ＮｅｆのＰＣＲを行った：
センス：ＳＮＥＦ−Ｇ
ＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣ
アンチセンス：ＡＳｔｒＮｅｆ（アンチセンス）
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣ
サイクル：９５℃（３０秒）、次いで１５サイクルの９５℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（６０秒）、次いで７２℃（１２０秒）および４℃で保持。
【０１１８】
ＰＣＲ産物をゲル精製した。最初に５’（Ｓ−Ｎｅｆ）および３’（ＡｓｔｒＮｅｆ）プライマーを使用して２つのＮｅｆ産物をつなぎ合わせた。
【０１１９】
サイクル：９５℃（３０秒）、次いで１５サイクルの９５℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（６０秒）、次いで７２℃（１８０秒）および４℃で保持。
【０１２０】
ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製し（PCR cleaned）、Ｕ１およびＡｓｔｒＮｅｆプライマーを使用してＲＴ産物につないだ：
サイクル：９５℃（３０秒）、次いで２０サイクルの９５℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（１８０秒）、次いで７２℃（１８０秒）および４℃で保持。
【０１２１】
２．１ｋｂの産物をゲル精製し、ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで切断した。同様にプラスミドｐ７３Ｉ−ＧＲＮをＡｐａ１およびＢａｍＨＩで切断し、ゲル精製し、ＡｐａＩ−Ｂａｍ ＲＴ３ｔｒＮｅｆとライゲーションし、ｐ１７／ｐ２４（ｏｐｔ）／ＲＴ（ｏｐｔ）ｔｒＮｅｆ遺伝子を再生成した。
【０１２２】
２．プラスミド：ｐ７３Ｉ−ＲＴ ｗ２２９ｋ（不活性化ＲＴ）
目的の遺伝子：
Ｉｏｗａ ｌｅｎｇｔｈ ＨＣＭＶプロモーター＋エキソン１の下流で、かつウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルの上流の不活性化ＲＴ遺伝子の作製。
【０１２３】
治療用ワクチンにおける活性なＨＩＶ ＲＴ分子種の使用に対する懸念ゆえに、該遺伝子の不活性化が望ましかった。ＲＴ（Ｐ７３Ｉ−ＧＲＮ２由来）のアミノ酸２２９位をＴｒｐからＬｙｓにするＰＣＲ突然変異誘発によってこれを達成した（Ｒ７２７１ ｐ１−２８）。
【０１２４】
プライマー：
以下のプライマーを使用して５’ ＲＴ＋突然変異のＰＣＲを行った：
（実験全体を通して、ポリメラーゼはＰＷＯ（Roche）であった）
センス：ＲＴ３−ｕ：１
ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴ
アンチセンス：ＡＳｃｏＲＴ−Ｔｒｐ２２９Ｌｙｓ
ＧＧＡＧＣＴＣＧＴＡＧＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴ
サイクル：
１×［９４℃（３０秒）］
１５×［９４℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（６０秒）］
１×［７２℃（１８０秒）］
ＰＣＲゲル精製。
【０１２５】
以下のプライマーを使用して３’ ＲＴ＋突然変異のＰＣＲを行った：
アンチセンス：ＲＴ３−ｌ：１
ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＣＴＡＡＴＣＣＣＣＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＴＣＧＴＴＧＣＣＧＣ
センス：ＳｃｏＲＴ−Ｔｒｐ２２９Ｌｙｓ
ＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＣＴＣＣＡＴＧ
サイクル：
１×［９４℃（３０秒）］
１５×［９４℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（６０秒）］
１×［７２℃（１８０秒）］
ＰＣＲゲル精製。
【０１２６】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、５’（ＲＴ３−Ｕ１）および３’（ＲＴ３−Ｌ１）プライマーを使用してＲＴの５’末端および３’末端をつなぎ合わせた。
【０１２７】
サイクル：
１×［９４℃（３０秒）］
１５×［９４℃（３０秒）／５５℃（３０秒）／７２℃（１２０秒）］
１×［７２℃（１８０秒）］。
【０１２８】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を利用してｐ７３１３ｉｅにクローニングし、ｐ７３Ｉ−ＲＴ ｗ２２９ｋを作製した（図３を参照のこと）。
【０１２９】
３．プラスミド：ｐ７３ｉ−Ｔｇｒｎ
目的の遺伝子：
Ｉｏｗａ ｌｅｎｇｔｈ ＨＣＭＶプロモーター＋エキソン１の下流で、かつウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルの上流のＨＩＶ−１ ｃｌａｄｅ Ｂ系統ＨＸＢ２由来の、コドン最適化ｇａｇのｐ１７／ｐ２４部分、コドン最適化ＲＴおよび切断型Ｎｅｆ遺伝子。
【０１３０】
活性型のＲＴを含有する三者融合構築物は、ヒトでの使用に関する規制当局に許容されないかもしれない。ゆえに、ｐ７３ｉ−ＲＴ ｗ２２９ｋからのＮｈｅＩおよびＡｐａＩ切断断片をＮｈｅＩ／ＡｐａＩ切断ｐ７３ｉ−ＧＲＮ２＃１９に挿入することによってＲＴの不活性化を達成した（図４）。その結果、ＲＴの２２９位がＷからＫに変化する。
【０１３１】
Ｔｇｒｎプラスミドインサートの全配列は図３に示される。この配列は、ｐ１７ ｐ２４（ｏｐｔ）Ｇａｇ、ｐ６６ ＲＴ（ｏｐｔかつ不活性化型）および切断型Ｎｅｆを含有する。
【０１３２】
Ｇａｇ、ＲＴおよびＮｅｆの別の構築物は以下の通りである：
ｔｒＮｅｆ−ｐ６６ ＲＴ（ｏｐｔ）−ｐ１７，ｐ２４（ｏｐｔ）Ｇａｇ、
ｔｒＮｅｆ−ｐ１７，ｐ２４（ｏｐｔ）Ｇａｇ−ｐ６６ ＲＴ（ｏｐｔ）、
ｐ６６ ＲＴ（ｏｐｔ）−ｐ１７，ｐ２４（ｏｐｔ）Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ、
ｐ６６ ＲＴ（ｏｐｔ）−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７，ｐ２４（ｏｐｔ）Ｇａｇ、
ｐ１７，ｐ２４（ｏｐｔ）Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ−ｐ６６ ＲＴ（ｏｐｔ）。
【０１３３】
これらの構築物の全配列は、それぞれ、図４〜８に示される（これはＷＯ０３／０２５００３に完全に記載されている）。
【０１３４】
実施例３
ＧＭ−ＣＳＦプラスミドの構築
マウスＧＭ−ＣＳＦをｃＤＮＡライブラリーからクローニングし、発現ベクターｐＶＡＣｓｓ２にクローニングした。このｃＤＮＡクローンを鋳型として使用し、Ｋｏｚａｃ配列、開始コドンおよび、ＤＮＡワクチンベクターｐ７３１３へのクローニングを可能にする制限酵素部位を含んでいるプライマーを使用するＰＣＲによってｍＧＭ−ＣＳＦオープンリーディングフレームを増幅した。
【０１３５】
これはＷＯ０２／０８４３５およびＷＯ０５／０２５６１４に完全に記載されている。
【０１３６】
実施例４
Ｅ１／Ｅ３欠失Ａｄｖ５−ＯＶＡの構築
以前にVaccine 21 (2002) 231-242に報告されているように、複製欠損の部分欠失（Ｅ１ａ−、Ｅ１ｂ−、部分Ｅ３−）アデノウイルス血清型５ベクターＡｄ−ＯＶＡ（分泌型ＯＶＡのｃＤＮＡを保有）を構築した。
【０１３７】
実施例５
Ｅ１／Ｅ３欠失Ｐａｎアデノウイルスの構築
組換えＥ１欠失ＳＶ−２５ベクターの作製：
Ｅ１が人工的に欠失されていることを除いて完全なＳＶ−２５ゲノムを含有するプラスミドを構築した。Ｅ１欠失部位に、制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩの認識部位を挿入した。それにより、トランスジーン発現カセットにこれらの２酵素の認識部位が隣接しているシャトルプラスミドからトランスジーンを挿入することが可能になる。
【０１３８】
制限部位ＳｗａＩ−ＳｎａＢＩ−ＳｐｅＩ−ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳｗａＩを含有する合成リンカーを、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで切断されたｐＢＲ３２２にクローニングした。２つの合成オリゴマーＳＶ２５Ｔ（５’−ＡＡＴ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＣＧ ＴＡＧ ＣＧＣ ＡＣＴ ＡＧＴ ＣＧＣ ＧＣＴ ＡＡＧ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＡ−３’）およびＳＶ２５Ｂ（５’−ＴＡＴ ＴＴＡ ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＧＣ ＧＣＴ ＴＡＡ ＧＣＧ ＣＧＡ ＣＴＡ ＧＴＧ ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＴＴＴ Ａ−３’）をともにアニーリングし、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化されたｐＢＲ３２２に挿入することによって、前記クローニングを行った。Ａｄ ＳＶ２５の左端（ｂｐ１〜１０５７）を上記リンカーのＳｎａＢＩおよびＳｐｅＩ部位間にクローニングした。Ａｄ ＳＶ２５の右端（ｂｐ２８０５９〜３１０４２）をリンカーのＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＶ部位間にクローニングした。次いでアデノウイルスＥ１を、以下のように、クローニングされた左端からＥｃｏＲＩ部位（ｂｐ５４７）〜ＸｈｏＩ（ｂｐ２０３１）間で切り出した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）からＩ−ＣｅｕＩ−ＰＩ−ＳｃｅＩカセットをＰＣＲによって作製し、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ部位間に挿入した。次いでＡｄ ＳＶ−２５の１０１５４ｂｐ ＸｈｏＩ断片（ｂｐ２０３１〜１２１８５）をＳｐｅＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１８３４４ｂｐ Ａｄ ＳＶ−２５ ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ｂｐ１１９８４〜３０３２８）を挿入することによって構築物（ｐＳＶ２５）を完成し、組換えアデノウイルスの作製に好適なＥ１欠失アデノウイルスＳＶ２５の完全分子クローンを得た。場合により、所望のトランスジーンを、新たに作製されたｐＳＶ２５ベクタープラスミドのＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ部位に挿入する。
【０１３９】
マーカー遺伝子であるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を保有するＡｄＳＶ２５を作製するために、以前にプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）にクローニングされた発現カセットを制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩで切り出し、同酵素で消化されたｐＳＶ２５（または本明細書中に記載の別のＡｄ ｃｈｉｍｐプラスミド）にライゲーションした。得られたプラスミド（ｐＳＶ２５ＧＦＰ）をＳｗａＩで消化して細菌プラスミド主鎖を分離し、Ｅ１補完細胞株ＨＥＫ ２９３にトランスフェクトした。約１０日後、細胞変性効果が観察された。それは複製ウイルスの存在を示す。ＧＦＰを発現するＡｄ ＳＶ２５ベースのアデノウイルスベクターの作製の成功を、トランスフェクトされた培養由来の上清を新たな細胞培養に加えることによって確認した。該細胞集団中の緑色蛍光を観察することによって二次感染細胞の存在を判定した。
【０１４０】
Ｅ３欠失Ｐａｎ−６およびＰａｎ−７ベクターの構築：
アデノウイルスベクターのクローニング能力を向上させるために、Ｅ３領域を欠失させることができる。その理由は、この領域が、培養中のウイルスの増殖に必要とされない遺伝子をコードするからである。この目的を達成するために、Ｐａｎ−５、Ｐａｎ−６、Ｐａｎ−７、およびＣ６８のＥ３欠失型を作製した（Ｅ３１−９を含有する３．５ｋｂ Ｎｒｕ−ＡｖｒＩＩ断片が欠失している）。
【０１４１】
Ｐａｎ６ベースのベクターにおけるＥ３欠失：
Ｅ１欠失ｐＰａｎ６−ｐｋＧＦＰ分子クローンをＳｂｆＩおよびＮｏｔＩで消化して１９．３ｋｂ断片を単離し、ＳｂｆＩ部位にライゲーションして戻した。得られた構築物ｐＰａｎ６−ＳｂｆＩ−Ｅ３をＥｃｏ４７ＩＩＩおよびＳｗａＩで処理し、ｐＰａｎ６−Ｅ３を得た。最後に、ｐＰａｎ６−ｐｋＧＦＰのＳｂｆＩ消化から得られた２１ｋｂ ＳｂｆＩ断片をｐＰａｎ６−Ｅ３にサブクローニングして、Ｅ３中の４ｋｂ欠失を有するｐＰａｎ６−Ｅ３−ｐｋＧＦＰを作製した。
【０１４２】
Ｅ３欠失Ｐａｎ７ベクター：
同じストラテジーを使用して、Ｐａｎ７におけるＥ３欠失を達成した。まず、Ｅ３領域にまたがっている５．８ｋｂのＡｖｒＩＩ断片をｐＳＬ−１１８０にサブクローニングし、次いでＮｒｕＩ消化によってＥ３を欠失させた。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩで処理して４．４ｋｂ断片を取得し、ｐＰａｎ７−ｐｋＧＦＰのＡｖｒＩＩ部位にクローニングして、元のＥ３含有ＡｖｒＩＩ断片をそれぞれ置換した。最終的なｐＰａｎ７−Ｅ３−ｐｋＧＦＰ構築物は３．５ｋｂのＥ３欠失を有した。
【０１４３】
前記および他のＰａｎアデノウイルス血清型におけるＥ１、Ｅ３およびＥ４欠失の構築についての完全な説明はＷＯ０３／００４６１２４に記載されている。追加情報はHuman Gene Therapy 15:519-530においても入手可能である。
【０１４４】
実施例６：
アデノウイルスへのＧａｇ、ＲＴ、Ｎｅｆ配列の挿入
ｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドへのＧＲＮ発現カセットのサブクローニング：
プロモーター、ｃＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルからなる発現カセット全体を、ｐＴ−ＧＲＮ構築物からＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩの二重消化によって単離した。該ＳｐｈＩ／ＥｃｏＲＩ断片のＳｐｈＩ末端をＫｌｅｎｏｗで埋め、ｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドのＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ部位（ＭｌｕＩ末端は平滑末端化した）にクローニングした。
【０１４５】
該クローニングプロセス中に、ＨＩＶ発現カセットに追加のフランキング配列が付随した。この配列はＣｅｒ配列として知られ、既知の機能を有さない。
【０１４６】
Ｐａｎ６およびＰａｎ７ベクターのＥ１／Ｅ３欠失分子クローンへのＧＲＮ発現カセットの導入：
発現カセットをｐＳｈｕｔｔｌｅからＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ消化によって回収し、Ｐａｎ６およびＰａｎ７ベクターの分子クローンの同一部位にクローニングした。組換えクローンを緑色／白色選択によって特定し、広範囲にわたる制限酵素分析によって確認した。
【０１４７】
組換えウイルスの救出および増殖：
Ｃ６およびＣ７ベクターの分子クローンを適切な制限エンドヌクレアーゼ（それぞれＰｍｅＩおよびＰａｃＩ）で処理して、無傷の線状ベクターゲノムを放出させ、リン酸カルシウム法を使用して２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞において完全な細胞変性（cytopathetic）効果が観察されたら、粗製のウイルス溶解物を回収し、２９３細胞での大量感染物（１×１０ｅ９細胞）まで徐々に拡大した。大量感染物由来のウイルスを標準的なＣｓＣｌ沈降法によって精製した。
【０１４８】
さらに、ｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｍｎＩでの切断によってさらにトリミングして、３’リンカー配列を除去し、プラスミドサイズを減少させて、ｐＳｈｕｔｔｌｅＧＲＮｃを得ることができる。この改変プラスミドを使用し、上記方法を使用して追加のＰａｎ７ウイルス（Ｃ７−ＧＲＮｃ）を作製することができる。
【０１４９】
Ｐａｎ６およびＰａｎ７アデノウイルスの両者に他の構築物を同様に挿入した。しかし、ｐ６６ ＲＴ（ｏｐｔ）−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７，ｐ２４（ｏｐｔ）Ｇａｇインサートを有するＰａｎ６の作製は成功しなかった。
【０１５０】
実施例７
混合様式（mixed modality）ワクチン接種ＰＭＥＤ／Ａｄｖ５の免疫原性の評価
ＤＮＡ送達（ＰＭＥＤ）とウイルスベクター（Ａｄｖ５）を組み合わせることによって混合様式ワクチン接種の潜在能力を評価した。ＯＶＡＳｅｃを発現するＤＮＡ（１μｇ）またはアデノウイルス（５×１０６ｐｆｕまたは１×１０８ｐｆｕ）のいずれかで動物を初回免疫した。３週間後、同種の投与計画（ＤＮＡ初回免疫後の追加免疫ＤＮＡまたはＡｄｖ初回免疫後の追加免疫Ａｄｖ）または異種の投与計画（ＤＮＡ初回免疫後の追加免疫ＡｄｖまたはＡｄｖ初回免疫後の追加免疫ＤＮＡ）で動物に追加免疫を施した。追加免疫の６日後に動物を選び取り（culled）、細胞応答をモニターした。ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞についての細胞内染色によってサイトカイン生産をモニターすると、動物をＡｄｖで初回免疫し、次いでＰＭＥＤ追加免疫を施した場合に、応答の明らかな増強が示された（図９を参照のこと）。１０８ｐｆｕまたは５×１０６ｐｆｕのアデノウイルスで初回免疫され、次いでＤＮＡ ＰＭＥＤ追加免疫を施されたマウスの群では、ＯＶＡ特異的ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）での刺激後にＩＦＮγを生産する、より高いパーセンテージ（２．１％〜２．３％の範囲）のＣＤ８特異的Ｔ細胞が存在した。一様式のみで免疫されたマウスの群は、特異的ペプチド刺激に対する、より低い細胞応答を示した（０．９％〜１．２％の範囲）。最低応答は、動物の初回免疫にＰＭＥＤが使用され、次いでアデノウイルス追加免疫が施された場合に観察された。
【０１５１】
混合様式送達後の応答の動態を比較した（図１０を参照のこと）。四量体染色を使用して応答を追跡し、初回免疫および追加免疫間の異なる間隔を試験した。動物を、ＯＶＡＳｅｃを発現するＰＭＥＤ ＤＮＡ（１μｇ）またはＡｄｖ５−ＯＶＡベクター（５×１０６ｐｆｕ）で初回免疫し、２１日目および／または１１０日目に追加免疫した。Ａｄｖ５−ＯＶＡで初回免疫され、次いでＤＮＡ ＰＭＥＤ追加免疫を施されたマウスの群において、第１の追加免疫の８日後に、オボアルブミン抗原に対する、より速い免疫応答の発生が観察された。ＤＮＡで初回免疫され、次いでＡｄｖで免疫されたマウスの群では、応答は遅延し、応答のレベルは単回のＡｄｖ初回免疫後に誘発された応答と同様であった。混合様式の投与計画で免疫された両群のマウスでは、追加免疫後に応答が長期間持続した。
【０１５２】
初回免疫および追加免疫に関する異なる間隔を比較した場合、Ａｄｖで初回免疫され、次いで１１０日目にＤＮＡ追加免疫を施された動物は非常に高い応答を示した（３０．５％までのＯＶＡ特異的ＣＤ８＋細胞）。これらは３回免疫された動物において観察された応答と同様であった。
【０１５３】
Ａｄｖで初回免疫されただけの動物における応答は７０日目まで測定され、より緩やかな勾配が３５日目まで見られた。
【０１５４】
実施例８：
ＤＮＡ／Ａｄｖ混合様式ワクチンにおける送達経路の影響
ニワトリオボアルブミンモデル抗原を使用して、ＤＮＡについていくつかの免疫化の順序および異なる送達経路を比較した。マウスをアデノウイルス（Ａｄｖ５、筋肉内、５×１０６ｐｆｕ）で初回免疫し、ＰＭＥＤ（１μｇ）、筋肉内（ＰＢＳ １×中の１００μｇ ＤＮＡ）、皮内（ＰＢＳ ２×中の１００μｇ ＤＮＡ）によって送達されるＤＮＡで追加免疫（３５日目）した。ＤＮＡ（ＰＭＥＤ、筋肉内、または皮内）で初回免疫され、Ａｄｖ５（筋肉内）で追加免疫された動物とこれらの群を比較した。追加免疫前および追加免疫後の免疫化動物由来の血液中のＯＶＡ特異的四量体を使用して免疫応答をモニターした（図１１を参照のこと）。
【０１５５】
初回免疫後の動物は、追加免疫前に比較的低レベルの特異的四量体を示した（Ａｄｖ免疫化群では、せいぜい５％）。Ａｄｖで初回免疫された動物群（赤色棒グラフ）では、他のＤＮＡ様式（筋肉内および皮内）と比較して、ＰＭＥＤ追加免疫後に応答の程度が増加した。ＤＮＡで初回免疫された動物群（青色棒グラフ）では、アデノウイルスによる、応答に対する追加免疫効果がすべての群で観察され、筋肉内ＤＮＡで初回免疫された動物において応答の程度がより大きかった。
【０１５６】
最後のＤＮＡ追加免疫を施し、ＣＤ８およびＣＤ４応答を細胞内染色によってモニターした（図１２を参照のこと）。Ａｄｖで初回免疫され、ＤＮＡ ＰＭＥＤで２回追加免疫された動物は、すべての他の群と比較して非常に高いＣＤ８応答（３５％まで）ならびにＣＤ４応答（２４％まで）を生じた。
【０１５７】
この実験で、本発明者らは、Ａｄｖ初回免疫、その後のＰＭＥＤ追加免疫の潜在能力に関する以前の知見を確認し、筋肉内ＤＮＡで初回免疫され、次いでＡｄｖ追加免疫を施された動物と、直接比較した。本発明者らの結果は、筋肉内送達ＤＮＡを用いて文献で報告されている結果を再現し、Ａｄｖが、ＤＮＡ ＰＭＥＤ追加免疫の前に免疫応答を引き起こすために使用された場合に、免疫応答（ＣＤ８およびＣＤ４）を増強する潜在能力に関して新しい知見を提供する。
【０１５８】
実施例９：
ＤＮＡ／Ａｄｖ混合様式ワクチンおよび分子アジュバントの潜在能力
ＤＮＡが免疫賦活化された（adjuvantised）場合の混合様式アデノウイルス／ＤＮＡ ＰＭＥＤの潜在能力を評価した。Ａｄｖ５−ＯＶＡで初回免疫されたマウスをＤＮＡ（ＯＶＡ細胞質型または分泌型を発現する）で追加免疫した。該ＤＮＡは、ＯＶＡ抗原のみをコードするＤＮＡプラスミド、またはＯＶＡ抗原およびＧＭ−ＣＳＦを発現する両ＤＮＡの共沈のいずれかである。一方の動物群では、免疫部位へのＰＭＥＤ送達の２４時間後にＡｌｄａｒａＴＭクリームを該免疫部位に塗布し、他方の動物群はイミキモドで処置しなかった。四量体染色およびフローサイトメトリーまたはＩＦＮγおよびＩＬ２サイトカインによって細胞応答をモニターした。ＯＶＡおよびＧＭ−ＣＳＦを発現するＰＭＥＤ ＤＮＡを投与され、次いでイミキモドで処置された動物は、オボアルブミンに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を高度に発生した（図１３の上パネルに示される四量体応答）。Ａｄｖ／ＤＮＡ投与計画後に誘導された高頻度のＯＶＡ特異的細胞は、両アジュバントがＤＮＡ追加免疫で提供された場合に、さらに増強された。ＣＤ４またはＣＤ８特異的ＯＶＡペプチドに応答して特異的にサイトカインを生産するＴ細胞をモニターすることによって同じ観察を行った（図１３の下パネルを参照のこと）。ＣＤ８およびＣＤ４細胞の両集団に関する応答は、アジュバントなしの混合様式の投与計画と比較して、両アジュバントを使用した場合に増加（２〜３倍）し、ＩＦＮγを生産する３３〜４１％の範囲のＣＤ８＋特異的細胞および２９〜３２％の範囲のＣＤ４＋特異的細胞を有した。他のマウス群は、高いが、前者よりは低いパーセンテージのサイトカイン生産ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を示した。
【０１５９】
この実験で、本発明者らは、アデノウイルス初回免疫−ＤＮＡ追加免疫の混合様式が、単独のＤＮＡまたは単独のアデノウイルスより優れた、免疫応答の増強に関する利点を提供することを実証した。これらの応答は、ＤＮＡがＧＭ−ＣＳＦおよびイミキモドのいずれのアジュバントで免疫賦活化された場合でも、さらに増加しうる。
【０１６０】
実施例１０
ＮＨＰアデノウイルスの評価：
ウイルスＮＨＰベクターが、ＰＭＥＤ送達と組み合わせて、ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を増加させる能力を測定し、以前にＡｄｖ５ ＯＶＡモデルにおいて得られたデータと比較した。
【０１６１】
マウスにおける筋肉内送達ＮＨＰアデノウイルスを使用する混合様式送達
同種の初回免疫／追加免疫ＮＨＰ送達および混合様式Ａｄｖ／ＰＭＥＤ後の免疫応答の誘導を測定した。異なる免疫化経路を使用してアデノウイルスを送達した（筋肉内および皮内）。ＨＩＶ抗原を発現する１×１０９粒子のＮＨＰ−Ａｄｖおよび１μｇのＤＮＡ ＰＭＥＤでマウスを免疫化し、初回免疫および追加免疫による免疫化を４２日間隔で施した。混合様式（Ａｄｖ／ＰＭＥＤ）を同種送達（ａｄｖ／ａｄｖおよびＰＭＥＤ／ＰＭＥＤ）と比較すると、すべての３抗原（ＲＴ、ＧａｇおよびＮｅｆ）に対して向上した応答が観察された。混合様式投与計画はＣＤ８応答を４倍まで増強し、ＣＤ４応答を７倍まで増強した。ＲＴ抗原に対する応答を図１４に説明する。ＮＨＰベクターに関して異なる送達経路を使用した場合には、差異は観察されなかった。
【０１６２】
ＮＨＰ ａｄｖベクターおよび筋肉内、皮内またはＰＭＥＤ送達ＤＮＡを使用する混合様式送達を比較した。この研究では、マウス群を１×１０９粒子のＮＨＰ−ＨＩＶアデノウイルスで筋肉内で初回免疫し、４２日後に、ＨＩＶ抗原を発現するＰＭＥＤ ＤＮＡ（１μｇ）、生理食塩水中の筋肉内ＤＮＡ（１００μｇ）または２×生理食塩水中の皮内ＤＮＡ（１００μｇ）によって追加免疫した。
【０１６３】
アデノウイルスで初回免疫され、次いでＰＭＥＤ ＤＮＡ追加免疫を施された動物は高レベルの細胞応答を示した。ＲＴ抗原を用いて観察された典型的な応答を図１５に説明する。該応答は、主にＩＦＮγを生産するＣＤ８ Ｔ細胞（ＩＮＦγを生産する７％〜１２％の範囲のＲＴ特異的ＣＤ８＋細胞）およびＩＦＮγおよびＩＬ２の両者を生産するＣＤ４ Ｔ細胞（ＩＬ２およびＩＦＮγの両者を生産する０．３５〜２．２％の範囲のＲＴ特異的ＣＤ４＋細胞）である。アデノウイルスで初回免疫され、生理食塩水中のＤＮＡで追加免疫された他の動物群は、サイトカインを生産する少ないパーセンテージのＣＤ８細胞（ＩＦＮγを生産する１．５〜３．５％の範囲のＲＴ特異的ＣＤ８＋細胞）を示した。Ａｄｖ／ＤＮＡに関する混合様式は、試験されたすべての他の様式と比較して優れたＣＤ８応答を増強する能力ならびに他の様式で免疫化されたマウス群ではかろうじて検出可能であったＣＤ４応答の誘導を示す。
【０１６４】
実施例１１
ミニブタにおける筋肉内送達ＮＨＰアデノウイルス、次いでＰＭＥＤを使用する混合様式送達
より大型の動物モデルであるミニブタで、混合様式送達を使用する免疫応答の誘導を測定した。５頭のミニブタ群に３×１０１１、３×１０１０、３×１０９または３×１０８粒子のＮＨＰ Ａｄｖ Ｐａｎ６を初回免疫で投与し、１２および２４週間後にＰＭＥＤによって送達されるＲＮＧプラスミドで追加免疫した。ＰＭＥＤでは、各動物の腹側腹部の重複しない部位に送達される４カートリッジを投与した。各カートリッジは約０．８μｇのプラスミドＤＮＡを含有する。初回免疫および追加免疫両方の後に周期的に収集されて、ペプチドライブラリーのプールを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ抗原に対して再刺激された末梢血単核細胞に関するＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによって、免疫応答を評価した。
【０１６５】
２種類の高用量（すなわち３×１０１１および３×１０１０粒子）のＮＨＰ Ａｄｖで初回免疫された後のミニブタおよびＰＭＥＤ追加免疫後のすべての群で応答が検出され、応答強度はＮＨＰ Ａｄｖ初回免疫応答と相関していた（図１６）。２種類の高用量を投与された群の追加免疫後の応答は、単一様式ＰＭＥＤ初回免疫および追加免疫にしたがって得られた応答を大きく超過した。このことは、この大型の動物モデルでの、単一様式より優れたＮＨＰ Ａｄｖ／ＰＭＥＤ混合様式の重要な利点を示す。
【０１６６】
実施例１２
ＣＰＣ−Ｐ５０１Ｓ発現プラスミドの構築
ＣＰＣに融合されたヒトＰ５０１Ｓをコードする遺伝子を、ＤＮＡワクチンベクターｐ７３１３へのライゲーションを可能にする制限部位を組み込むオーバーラップＰＣＲによって構築した（詳細はＷＯ０２／０８４３５およびＷＯ２００３１０４２７２に含まれ、前者の刊行物は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。ＣＰＣ−Ｐ５０１ＳのＤＮＡおよびタンパク質配列はそれぞれ配列番号１５および配列番号１６に記載される（図２０を参照のこと）。
【０１６７】
ＧＭ−ＣＳＦプラスミドは上記実施例３に記載のように調製した。
【０１６８】
２種類のプラスミド：ＣＰＣ−Ｐ５０１Ｓを発現するｐ７３１３（プラスミドＩＤ＝ＪＮＷ７７３）およびｐ７３１３ ＧＭＣＳＦプラスミド（ＧＭ−ＣＳＦをコードするプラスミド）の共送達
塩化カルシウムおよびスペルミジンを使用してプラスミドＤＮＡを２μｍ直径の金ビーズ上に沈殿させた。等量の、抗原ＣＰＣ−Ｐ５０１Ｓをコードするプラスミド（ＪＮＷ７７３）およびｐ７３１３ＧＭＣＳＦプラスミドを混合し、共沈させてすべてのビーズが２種類のプラスミドの混合物でコーティングされるようにし、両プラスミドが同一細胞に確実に送達されるようにした。特に指定しない限り、抗原およびＧＭＣＳＦの両者を１．０μｇ／カートリッジで積載した。例えばEisenbraum, et al. 1993. DNA Cell Biol. 12:791-797; Pertmer et al, 1996 J. Virol. 70:6119-6125に記載のように積載済みビーズをＴｅｆｚｅｌ管にコーティングした。Ａｃｃｅｌｌ遺伝子送達を使用して粒子衝突を実施した（ＰＣＴ  ＷＯ９５／１９７９９；参照により本明細書中に組み入れられる）。結果のセクションで詳しく述べるように、各時点でプラスミドを２回（剪毛後の腹部の各側に１回ずつ）投与してメスＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。各時点のＤＮＡの総量は４μｇであった。イミキモドを送達する場合、免疫化の２４時間後に免疫化部位にクリーム製剤中で局所的に塗布した。２０μＬの５％ＡｌｄａｒａＴＭクリーム（３Ｍ）を各免疫化部位に塗布した。
【０１６９】
Ｐ５０１Ｓ−アデノウイルス
複製欠損のＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルス血清型５ベクター（Ａｄ５−Ｐ５０１Ｓ）はCorixa Corp.が構築した。該アデノウイルスを５０μＬのＰＢＳ中で５×１０６ｐｆｕで筋肉内送達した。
【０１７０】
マウス脾細胞の調製
免疫化の７または１４日後または図で指定される時点で免疫化マウスから脾臓を採取した。脾臓をスライドガラスの間で粉砕することによって処理し、細胞懸濁物を得た。赤血球を塩化アンモニウム処理によって溶解し、残渣を除去して脾細胞の微細懸濁物を残留させた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで使用するためにＲＰＭＩ完全培地中に４×１０６／ｍＬの濃度で細胞を再懸濁した。
【０１７１】
ペプチドまたはタンパク質刺激に応答してのマウスＴ細胞からのＩＦＮγおよびＩＬ−２生産を検出するためのフローサイトメトリー
５×１０６脾細胞を試験管ごとに取り、遠心分離してペレットにした。上清を除去し、サンプルをボルテックスにかけてペレットを分散させた。０．５μｇの抗ＣＤ２８＋０．５μｇの抗ＣＤ４９ｄ（Pharmingen）を各試験管に加え、静置して室温で１０分間インキュベートした。適切な試験管に１ｍＬの培地を加えた。試験管は、培地のみ、または適切な濃度のペプチドまたはタンパク質を含む培地を含有した。次いでサンプルを温水浴中で３７℃で１時間インキュベートした。各試験管に１０μｇ／ｍＬ ブレフェルジンＡを加え、３７℃でのインキュベーションをさらに５時間継続した。そしてプログラム水浴を６℃に戻し、該温度で一晩維持した。
【０１７２】
そして、抗マウスＣＤ４ Ｐｅ−Ｃｙ５（Pharmingen）および抗マウスＣＤ８ ＥＣＤ（Beckman Coulter）でサンプルを染色した。サンプルを洗浄し、「Ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｌｙｓｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ」キット（Beckman Coulter）の固定液１００μＬを室温で１５分間加えた。洗浄後、同キットの透過化試薬１００μＬを抗ＩＦＮγ−ＰＥ（Pharmingen）＋抗ＩＬ−２−ＦＩＴＣ（Immunotech）とともに各サンプルに加えた。サンプルを室温で１５分間インキュベートし、洗浄した。サンプルを１．０ｍＬのバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。サンプルあたりトータルで５００，０００細胞を収集し、その後、ＣＤ４およびＣＤ８細胞をゲートし、刺激に応答してＩＦＮγおよび／またはＩＬ−２を分泌する細胞の集団を決定した。
【０１７３】
実施例１３
ＮＨＰアデノウイルスを筋肉内または皮内で使用する混合様式送達
混合様式アデノウイルス／ＰＭＥＤ後の免疫応答の誘導を測定した。アデノウイルスを送達するための異なる免疫化経路を比較した（筋肉内および皮内）。マウス４群を、初回免疫時点で、皮内または筋肉内経路によって１×１０９粒子のＮＨＰ−Ａｄｖ（Ｐａｎ６ＧＲＮ）で免疫化し、追加免疫時点で、ＰＭＥＤによって、ＨＩＶ ＲＴ、ＮｅｆおよびＧａｇ（ｐ７３ｉＲＮＧ）抗原を発現する１ｇのＤＮＡで免疫化した。免疫化は４２日間隔で施した。筋肉内Ａｄｖ／ＰＭＥＤ混合様式を皮内Ａｄｖ／ＰＭＥＤ送達と比較した場合に、ＲＴおよびＧａｇ抗原に対する向上した応答が観察された。この投与計画におけるＡｄｖの皮内送達は、ＲＴに応答してＩＮＦを生産するＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞を２倍まで増強し、ＲＴまたはＧＡＧに応答してＩＬ２を生産するＣＤ４＋細胞を４倍まで増強した。ＲＴおよびＧａｇ抗原に対する応答を図２１（ＩＮＦ）および図２２（ＩＬ２）に説明する。混合様式Ａｄｖ／ＰＭＥＤ投与計画における皮内経路によるＡｄｖの送達は、この投与計画における筋肉内Ａｄｖ送達と比較して優れたＣＤ８およびＣＤ４応答を達成する能力を示す。
【０１７４】
実施例１４
霊長類における筋肉内送達ＮＨＰアデノウイルス、次いでＰＭＥＤを使用する混合様式送達
実施例１１に記載の混合様式送達を使用する霊長類での免疫応答の誘導を測定した。カニクイザル５群に３×１０１１、３×１０１０、３×１０９または３×１０８粒子のＮＨＰ Ａｄｖ Ｐａｎ６を初回免疫で投与し、１７〜２４週の間にＰＭＥＤによって送達されるＲＮＧプラスミドで追加免疫した。３９週の時点で第２の追加免疫を施した。ＰＭＥＤでは、各動物の腹側腹部の重複しない部位に送達される８カートリッジを投与した。各カートリッジは約０．８μｇのプラスミドＤＮＡを含有していた。初回免疫および追加免疫の両方の後に周期的に収集されて、ペプチドライブラリーのプールを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ抗原に対して再刺激された末梢血単核細胞に関するＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによって免疫応答を評価した。
【０１７５】
２つの高用量（すなわち３×１０１１および３×１０１０粒子）のＮＨＰ Ａｄｖで初回免疫された後の霊長類およびＰＭＥＤ追加免疫後のすべての群で応答が検出された（図２３ａおよび図２３ｂを参照のこと。用量３×１０１０および３×１０９粒子に関するＮＢ結果は示していない）。追加免疫後の応答レベルはこの動物種においてＮＨＰ Ａｄｖ初回免疫量に依存しないように見えたが、該応答はＰＭＥＤ後に、ＰＭＥＤ単一様式の初回免疫および追加免疫後の霊長類において誘導された弱く不安定な応答と比較して、より安定していた（結果は示していない）。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１は、ＯｖａＣｙｔ遺伝子を含有する発現カセットの配列である配列番号１を示し、開始および終止コドンを太字で示す。
【図２】図２は、ＯｖａＳｅｃ遺伝子を含有する発現カセットの配列である配列番号２を示し、開始および終止コドンを太字で示す。
【図３−１】図３は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図３−２】図３は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図３−３】図３は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図４−１】図４は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図４−２】図４は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図４−３】図４は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図４−４】図４は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図５−１】図５は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図５−２】図５は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図５−３】図５は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図６−１】図６は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図６−２】図６は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図６−３】図６は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図７−１】図７は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図７−２】図７は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図７−３】図７は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図８−１】図８は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図８−２】図８は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図８−３】図８は、実施例２に記載の構築物に関するポリヌクレオチド配列、アミノ酸配列および制限地図を示す。
【図９】図９は、追加免疫の６日後に測定されたＯＶＡ抗原に特異的な免疫応答を示す。ＯＶＡ抗原を発現する異なる用量のＡｄｖ５ベクターおよび／またはＰＭＥＤ ＤＮＡで免疫化されたマウス由来の脾細胞を、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）とともに、または該ペプチドなしで、６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＩＦＮγ細胞内染色および表面マーカーに関して細胞を処理した。
【図１０】図１０は、異なる間隔の免疫化を使用する混合様式送達後の応答の動態を示す。免疫化動物の血液中でオボアルブミン四量体特異的応答をモニターした。追加免疫の時点を縦線で示す（２１日目および１１０日目）。
【図１１】図１１は、ＡｄｖでＤＮＡを送達するための異なる経路および順序を使用する応答の動態の比較を示す。免疫化動物由来の血液中でオボアルブミン四量体ＣＤ８＋特異的細胞をモニターした。赤色棒グラフは、Ａｄｖ（５．１０６ｐｆｕ）で初回免疫され、ＤＮＡ（ＰＭＥＤ、筋肉内、皮内）で追加免疫された動物に相当する。青色棒グラフは、ＤＮＡで初回免疫され、Ａｄｖ（中央の３つの棒グラフ）またはＤＮＡ（右側の３つの棒グラフ）で追加免疫された動物に相当する。
【図１２】図１２は、サイトカインの生産によってモニターされた第２の追加免疫後の細胞応答を示す。ＯＶＡ特異的ＣＤ８（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）およびＣＤ４（ＴＷＥＴＳＳＮＶＭＥＥＲＫＩＫＶ）ペプチドを使用して、細胞応答ＣＤ８（左パネル）およびＣＤ４（右パネル）をモニターした。抗マウスＩＦＮγおよびＩＬ２抗体を使用して細胞内サイトカインを検出した。
【図１３】図１３は、分子アジュバントと組み合わせた混合様式送達後に誘導された細胞応答を示す。Ａｄｖ５−ＯＶＡ（Ａｄｅｎｏ）で初回免疫されたマウスを、免疫賦活化（ＤＮＡ ＧＭ−ＣＳＦ＋ＡｌｄａｒａＴＭクリーム）されたかまたは免疫賦活化されていないＤＮＡ ＯＶＡ（Ｏｖａ ｃｙｔまたはＯｖａ ｓｅｃ型）で追加免疫した。追加免疫の７日後に、四量体比（tetramer specifics）によって免疫応答をモニターし（脾臓および血液−上パネル）、サイトカイン特異的細胞内染色によってサイトカイン生産をモニターした（下パネル）。
【図１４−１】図１４は、皮内（ＩＤ．）（図１４（ａ））および筋肉内（ＩＭ）（図１４（ｂ））送達されたＮＨＰアデノウイルスベクターを使用する混合様式送達および同種送達を比較する細胞応答を示す。追加免疫後の細胞性免疫応答をフローサイトメトリーによってモニターした。ＨＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＤ８（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）およびＣＤ４（ＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＩＲ）ペプチドを使用して、細胞応答ＣＤ８（左パネル）およびＣＤ４（右パネル）をモニターした。抗マウスＩＦＮγおよびＩＬ２抗体を使用して細胞内サイトカインを検出した。
【図１４−２】図１４は、皮内（ＩＤ．）（図１４（ａ））および筋肉内（ＩＭ）（図１４（ｂ））送達されたＮＨＰアデノウイルスベクターを使用する混合様式送達および同種送達を比較する細胞応答を示す。追加免疫後の細胞性免疫応答をフローサイトメトリーによってモニターした。ＨＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＤ８（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）およびＣＤ４（ＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＩＲ）ペプチドを使用して、細胞応答ＣＤ８（左パネル）およびＣＤ４（右パネル）をモニターした。抗マウスＩＦＮγおよびＩＬ２抗体を使用して細胞内サイトカインを検出した。
【図１５】図１５は、ＮＨＰアデノウイルスベクター（皮内）を使用する異種の初回免疫／追加免疫送達後に誘導された細胞応答を示す。追加免疫後の免疫応答である。ＨＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＤ８（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）およびＣＤ４（ＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＩＲ）ペプチドを使用して、細胞応答ＣＤ８（左パネル）およびＣＤ４（右パネル）をモニターした。抗マウスＩＦＮγおよびＩＬ２抗体を使用して細胞内サイトカインを検出した。
【図１６−１】図１６は、ミニブタにおいて混合様式ＮＨＰＡｄｖ／ＰＭＥＤ後に誘導された細胞応答を示す。ミニブタをＮＨＰ Ａｄｖで初回免疫し、ＰＭＥＤによってＲＮＧプラスミドで追加免疫し、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによって末梢血リンパ球の免疫応答をモニターした。図１６ａは、初回免疫後および第１の追加免疫後の一連のＮＨＰ Ａｄｖ用量に対する応答を示す。図１６ｂは、初回免疫後ならびに第１および第２のＰＭＥＤ追加免疫後の一連のＮＨＰ Ａｄｖ用量に対する応答を示す。図１６ｃは、混合様式（ＮＨＰ Ａｄｖ初回免疫およびＰＭＥＤ追加免疫）と単一様式（ＰＭＥＤ初回免疫およびＰＭＥＤ追加免疫）の比較を示す。
【図１６−２】図１６は、ミニブタにおいて混合様式ＮＨＰＡｄｖ／ＰＭＥＤ後に誘発された細胞応答を示す。ミニブタをＮＨＰ Ａｄｖで初回免疫し、ＰＭＥＤによってＲＮＧプラスミドで追加免疫し、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによって末梢血リンパ球の免疫応答をモニターした。図１６ａは、初回免疫後および第１の追加免疫後の一連のＮＨＰ Ａｄｖ用量に対する応答を示す。図１６ｂは、初回免疫後ならびに第１および第２のＰＭＥＤ追加免疫後の一連のＮＨＰ Ａｄｖ用量に対する応答を示す。図１６ｃは、混合様式（ＮＨＰ Ａｄｖ初回免疫およびＰＭＥＤ追加免疫）と単一様式（ＰＭＥＤ初回免疫およびＰＭＥＤ追加免疫）の比較を示す。
【図１７】図１７は、ＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色）によって決定された、追加免疫の７日後の時点のＩＦＮ−γを発現するＣＤ８細胞の総パーセンテージを示す。３〜５マウスの群を、Ｐ５０１Ｓを発現する５×１０６ｐｆｕのヒトＡｄ５（Ａ）またはＰＭＥＤによるＰ５０１Ｓ ＤＮＡ（Ｄ）で免疫化した。各ＤＮＡ免疫化（Ｄ）は、ＣＰＣ−Ｐ５０１Ｓを発現するプラスミド（プラスミドＩＤ＝ＪＮＷ７７３）およびマウスＧＭ−ＣＳＦを発現するプラスミドの１：１混合物２×２μｇからなる。すべてのＰＭＥＤによるＤＮＡ免疫化では、免疫化の２４時間後に免疫化の部位に局所的にＡｌｄａｒａＴＭクリームを塗布した。０日目および４２日目にマウスを免疫化した。
【図１８】図１８は、ＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色）によって決定された、３回目の免疫化の７日後の時点のＩＦＮ−γを発現するＣＤ８細胞の総パーセンテージを示す。３〜５マウスの群を、Ｐ５０１Ｓを発現する５×１０６ｐｆｕのヒトＡｄ５（Ａ）またはＰＭＥＤによるＰ５０１Ｓ ＤＮＡ（Ｄ）またはＰＭＥＤによる空のＤＮＡ（Ｅ）で免疫化した。各ＤＮＡ免疫化（Ｄ）は、ＣＰＣ−Ｐ５０１Ｓを発現するプラスミド（プラスミドＩＤ＝ＪＮＷ７７３）およびマウスＧＭ−ＣＳＦを発現するプラスミドの１：１混合物２×２μｇからなる。空のＤＮＡによる各免疫化（Ｅ）は、空のプラスミド（ｐ７３１３−ｉｅ）およびマウスＧＭ−ＣＳＦの１：１混合物２×２μｇからなる。すべてのＰＭＥＤによるＤＮＡ免疫化では、免疫化の２４時間後に免疫化の部位に局所的にＡｌｄａｒａＴＭクリームを塗布した。０日目、４２日目および８４日目にマウスを免疫化した。
【図１９】図１９は、ＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色）によって決定された、４回目の免疫化の７日後および１４日後の時点のＩＦＮ−γを発現するＣＤ８細胞の総パーセンテージを示す。３〜５マウス群を、Ｐ５０１Ｓを発現する５×１０６ｐｆｕのヒトＡｄ５（Ａ）またはＰＭＥＤによるＰ５０１Ｓ ＤＮＡ（Ｄ）またはＰＭＥＤによる空のＤＮＡ（Ｅ）で免疫化した。各ＤＮＡ免疫化（Ｄ）は、ＣＰＣ−Ｐ５０１Ｓを発現するプラスミド（プラスミドＩＤ＝ＪＮＷ７７３）およびマウスＧＭ−ＣＳＦを発現するプラスミドの１：１混合物２×２μｇからなる。空のＤＮＡによる各免疫化（Ｅ）は、空のプラスミド（ｐ７３１３−ｉｅ）およびマウスＧＭ−ＣＳＦの１：１混合物２×２μｇからなる。すべてのＰＭＥＤによるＤＮＡ免疫化では、免疫化の２４時間後に免疫化の部位で局所的にＡｌｄａｒａＴＭクリームを塗布した。０日目、４２日目、８４日目および１２６日目にマウスを免疫化した。
【図２０−１】図２０は、配列番号１５および１６：プラスミドＪＮＷ７７３由来のＣＰＣ−Ｐ５０１ＳのＤＮＡおよびタンパク質コード配列を示す。
【図２０−２】図２０は、配列番号１５および１６：プラスミドＪＮＷ７７３由来のＣＰＣ−Ｐ５０１ＳのＤＮＡおよびタンパク質コード配列を示す。
【図２１】図２１は、アデノウイルス（皮内または筋肉内）で初回免疫され、ＰＭＥＤによって送達されるＤＮＡで追加免疫されたマウスの追加免疫の２１日後の、ＲＴに応答してＩＦＮ−γを発現するＣＤ４およびＣＤ８細胞のレベルを示すｅｌｉｓｐｏｔデータを示す。
【図２２】図２２は、アデノウイルス（皮内または筋肉内）で初回免疫され、ＰＭＥＤによって送達されるＤＮＡで追加免疫されたマウスの追加免疫の２１日後の、ＲＴに応答してＩＬ２を発現するＣＤ４およびＣＤ８細胞のレベルを示すｅｌｉｓｐｏｔデータを示す。
【図２３−１】図２３は、ＮＨＰ Ａｄｖでの初回免疫後および２回のＰＭＥＤ追加免疫後の、ＲＴ、ＧａｇおよびＮｅｆに応答してＩＦＮγを発現する細胞のレベルを示すｅｌｉｓｐｏｔデータを示す。２用量のＮＨＰ Ａｄｖ：３×１０１１（図２３ａ）および３×１０８粒子（図２３ｂ）に関する結果を示す。
【図２３−２】図２３は、ＮＨＰ Ａｄｖでの初回免疫後および２回のＰＭＥＤ追加免疫後の、ＲＴ、ＧａｇおよびＮｅｆに応答してＩＦＮγを発現する細胞のレベルを示すｅｌｉｓｐｏｔデータを示す。２用量のＮＨＰ Ａｄｖ：３×１０１１（図２３ａ）および３×１０８粒子（図２３ｂ）に関する結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【国際調査報告】
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2009520790.tif 000045
2009520790.tif 000046
2009520790.tif 000047
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