(57)【要約】  試料流体を分析するためのセンサの調製方法が開示されており、前記試料流体は、1又は複数の標的分子を含有している。当該方法は、プローブ位置の配列の形でプローブを有する非活性化の多孔性有機ポリマー膜を適用するステップを含み、前記プローブは前記１又は複数の標的分子に特異的に結合することができる。さらに、当該方法は、１又は複数の遮断物質で、前記多孔性有機ポリマー膜のうちプローブがないままの領域を遮断するステップ、及び、前記試料流体を、前記多孔性有機ポリマー膜の孔に通して、１又は２つの方向で繰り返し流し込むステップを含む。試料流体を分析するためのセンサも開示されている。
2009520978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1又は複数の標的分子を含有する試料流体を分析するためのセンサの調製及び使用方法であって、当該方法は：
（ａ）  プローブ位置の配列の形でプローブを有する非活性化の多孔性有機ポリマー膜を適用するステップであって、前記プローブが前記１又は複数の標的分子に特異的に結合することができるステップ、
（ｂ）  １又は複数の遮断物質で、前記多孔性有機ポリマー膜のうちプローブがないままの領域を遮断するステップ、及び
（ｃ）  前記試料流体を、前記多孔性有機ポリマー膜の孔に通して、１又は２つの方向で繰り返し流し込むステップ、
を含む方法。
【請求項２】
前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜が、ポリアミドのホモポリマー又はコポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜が、熱可塑性のフッ化ポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜が、セルロース系材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜が、ステップ（ａ）の後、及び／又は、ステップ（ｂ）の後に乾燥させられる、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料流体を、前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜の孔に通して流し込むステップが、ポンピングにより実行される、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポンピングが、一方向のみで繰り返し実行される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記膜を前記試料流体の中で移動させることにより、前記試料流体が前記膜に通して流し込まれる、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記１又は複数の標的分子が、１又は複数の検出可能なラベルで標識される、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ラベルが、発光ラベル、酵素的ラベル、磁気ラベル、放射性ラベル、及び微小気泡の群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１又は複数の標的分子の存在及び／又は濃度を決定するように、前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜を分析するステップをさらに含む、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
非活性化の多孔性有機ポリマー膜を含むチャンバ、
１又は複数の標的分子を含有する試料流体を前記チャンバ内に導入する手段、及び、
前記試料流体を前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜に通して繰り返し循環させる手段、
を含むセンサ。
【請求項１３】
前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜が、ポリアミドのホモポリマー又はコポリマーを含む、請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１４】
前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜が、熱可塑性のフッ化ポリマーを含む、請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１５】
前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜が、セルロース系材料を含む、請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１６】
前記１又は複数の標的分子の存在及び／又は濃度を決定するように、前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜を分析する手段をさらに含む、請求項１２乃至１５のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１７】
前記膜がプローブ位置の配列を含み、さらに、プローブがないままの領域が１又は複数の遮断物質で遮断される、請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載のセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分子を含有する生物学的試料を多孔性有機ポリマー膜に通して１又は複数回流すことにより、高速で非常に特異的なマイクロアレイアッセイを実行する方法に関する。特に、本発明は、マイクロアレイアッセイを実行するための、安価で能率的な改善された方法に関する。そのようなマイクロアレイアッセイは、ヒト及び獣医学の分野、その他の間で、分析方法として有用である。特に、その方法は、感染症の病原体及び抵抗性遺伝子の存在を測定するための分子診断テストに使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
１又は複数の他の分子を含有する生物学的試料内の、それだけに限らないが、蛋白質、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子等の、特異的標的分子の存在及び濃度を、これらの標的分子のプローブとの複合結合を使用することにより決定することができる。伝統的なウエスタン／サザン／ノーザンブロット法の場合、標的分子がブロット表面上に固定化され、後に溶性のプローブにより検出される。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、又は、マイクロアレイベースの検査では、プローブが代わりに固定化されている。マイクロアレイ技術では、特異的プローブが、１つ特定の標的分子と特異的に相互作用するためにそれぞれ選ばれ、固体表面の特定の位置で固定化される。一方、標的分子は、検出可能なラベル分子（例えば、フルオロフォア又は磁気ビーズ）によりラベルされる。前記固体表面を生物学的試料と接触させることにより、標的分子は、その特異的プローブに対応した位置で固定される。従って、生物学的試料における標的分子の検出、及び、その濃度の評価は、標的分子に結合した検出可能なラベルにより生じる信号の位置測定及び強度の測定によりそれぞれ処理される。標準的なマイクロアレイの平面表面のため、生物学的試料内の分子輸送は、拡散法により主に支配されている。これらのアレイはかなりの表面領域を有しているので、十分な結合を得るために、数時間のハイブリッド形成時間を必要とする場合がある。拡散の制限による影響は、撹拌又は表面弾性波によりいくらか減少することができる。しかし、より小さな生物学的試料容積を使用することの必要性、及び、結果として膜の上面に生じる液体の薄膜のため、そのような撹拌の能率は低く、表面上での直接的な乱流混合を可能にしていない。さらに、標準的なマイクロアレイは、測定に先立ち、アレイの上部からこの残りの液体層を除去するために、洗浄ステップを必要としている。これは、異なる時点（測定のダイナミックレンジを改善するため）、及び／又は、温度（非特異的結合の影響を減少することにより特異性を改善するため）での一連の継続的な測定が価値の高い追加の情報を提供する動態測定のために、そのようなマイクロアレイを使用する可能性を事実上制限又は除去してしまう。
【０００３】
ＦＴＣ（フロースルーチップ）、すなわち、第１及び第2の側面又は表面を含んだ膜が、第１の側面から第2の側面まで膜を通り延びる分離したチャネルを多数の有し、異なるオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブが配置され、異なる相補ＤＮＡ標的の生物学的試料プールとハイブリッド形成したＷＯ／０３００４１６２号に、上記の方法に対する改善点は開示されている。その標的はフルオレセインイソチオシアネート蛍光レポーター群で修飾され、チップ上での直接の検出を可能にしている。生物学的試料が表面を抜けて流れるに従い、特異的標的はプローブにより溶液から表面上へ捕獲され、検出が落射蛍光顕微鏡により実行される。ＦＴＣの使用は、任意選択でポンピングシステムの使用により繰り返し、生物学的試料が表面を流れ抜けることによりプローブに接触するのを可能のするための多孔性膜の使用等、上記の方法に対するいくつかの改善点をもたらす。この方法は、ハイブリッド形成をしっかりと固定するという利点を有している。しかし、この従来技術の方法は、微細加工されたガラス又は多孔性のシリカ等、高価で壊れやすい無機の膜（ウエーハ）を必要とする。さらに、この無機の膜は、オルガノヌクレオチド（ｏｒｇａｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブをガラス表面へ付着させるために、前記ガラスの表面をエポキシシランで誘導体化する必要がある。オルガノヌクレオチドプロ―ブは、その一末端に一級アミンを導入することにより、及び、任意選択で１又は複数のトリエチレングリコールユニットをスペーサユニットとしてその間に導入することにより、予め修飾されている。これらの制限により、マイクロアレイアッセイを実行するために必要な費用がかなり増加する。
【０００４】
一方、多孔性有機ポリマー膜の活性化又は官能化を必要とする技術は、材料の調製及び品質管理という点で追加の費用を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、当分野において、マイクロアレイ技術を実行するための、より簡単で費用のかからない改善された方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概して、本発明は、多孔性有機ポリマー膜のうちスポットされていない領域が、方法の実行中、好ましくは試料流体を前記膜の孔に通して流し込む前に遮断されている場合、前記膜は活性化又は官能化を必要としないという思いがけない発見に基づいている。特に、本発明は、第1の態様において、1又は複数の標的分子を含有する生物学的試料の分析を実行する方法に関する。この方法は：
（ａ）  プローブ位置の配列の形でプローブを有する非活性化の多孔性有機ポリマー膜を適用するステップ、
（ｂ）  １又は複数の遮断物質で、前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜のうちプローブがないままの領域を遮断するステップ、及び
（ｃ）  前記試料流体を、前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜の孔に通して、１又は２つの方向で繰り返し流し込むステップ、
を含む。
【０００７】
本発明は、第2の態様において、前記方法に適切なセンサにも関し、当該センサは：
非活性化の多孔性有機ポリマー膜を含むチャンバ、
１又は複数の標的分子を含有する試料流体を前記チャンバ内に導入する手段、及び、
前記試料流体を前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜に通して繰り返し循環させる手段、
を含む。
【０００８】
本発明のこの方法を実行することにより、高速で非常に特異的な標的分子化合物の測定を、微細加工された高価な無機膜に依拠することなく、又は、有機ポリマー膜の官能化若しくは活性化を実行することなく達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のこれらの及び他の態様は、以下に記述される実施形態から明らかになり、その実施形態を参考にして説明される。
【００１０】
本明細書において使用される「種類」という用語は、標的となる生物学的化合物に使用された場合、他に述べられていない限り、その分子構造により関係のある化合物の群を示している。本発明に関与している標的となる生物学的化合物の典型的な種類は、それだけに限らないが、ＤＮＡ生物学的化合物、ＲＮＡ生物学的化合物、ポリペプチド、酵素、蛋白質、抗体等を含む。
【００１１】
本明細書において使用される「マイクロアレイアッセイ」という用語は、他に述べられていない限り、標的となる生物学的化合物を含んだ試料、好ましくは生物学的流体試料（任意選択で、その中に懸濁した少量の固体又はコロイド状粒子を含有する）が、膜と（例えば流れ抜けて）接触するアッセイを示している。その膜は、多数の別々の及び分離した領域をその表面に渡り含んでおり、前記領域のそれぞれが、（例えば、スポッティングにより）そこに与えられた１種類のプローブを有し、さらに、前記1種類のプローブのそれぞれが、一部の特異性、好ましくは厳しい条件下での特異性、好ましくは非常に厳しい条件下での特異性と結合するその能力のため、１種類の生物学的化合物あたり最大１つの標的となる生物学的化合物に対して選ばれる。当業者には周知のように、結合条件の厳しさは、温度、イオン濃度、及びｐＨ等の一連のパラメータを含んでいる。
【００１２】
本明細書において使用される「標的」という用語は、他に述べられていない限り、分析の目的又は要点として定められた生物学的分子化合物を示している。標的は、それだけに限らないが、核酸及び関連化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又はその類似体、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体、プラスミド等）、蛋白質及び関連化合物（例えば、ポリペプチド、単クローン抗体、受容体、転写因子等）、抗原、リガンド、ハプテン、炭水化物及び関連化合物（例えば、多糖類、少糖類等）、細胞小器官、無処理の細胞等の分子化合物を含む。
【００１３】
本明細書において使用される「プローブ」という用語は、他に述べられていない限り、有機ポリマー膜の表面上及び／又は前記膜内に固定化される能力があり、生物学的試料の一部である「標的」（本明細書において上記に定義されているもの等）と特異的に相互作用することができ、並びに、前記特異的標的の存在を検出するために使用される生物学的物質を示している。そのような生物学的物質の適切な例は、それだけに限らないが、核酸及び関連化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又はその類似体、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体、プラスミド等）、蛋白質及び関連化合物（例えば、ポリペプチド、単クローン抗体、受容体、転写因子等）、抗原、リガンド、ハプテン、炭水化物及び関連化合物（例えば、多糖類、少糖類等）、細胞小器官、無処理の細胞等の分子化合物を含む。
【００１４】
本明細書において使用される「ラベル」という用語は、他に述べられていない限り、その物質の分配、及び／又は、物質が送達する信号の強度に関して検出可能である物質を示している。そのラベルは、それだけに限らないが、発光分子（例えば、蛍光剤、リン光剤、化学発光剤、生物発光剤等）、着色した分子、反応後に色を生じる分子、酵素、磁気ビーズ、放射性同位体、特異的に結合可能なリガンド、音波共鳴により検出可能な微小気泡等である。
【００１５】
本明細書において使用される「標識する」という用語は、他に述べられていない限り、ラベルをプローブに取り込むための措置を示している。
【００１６】
そのより広い意味において、本発明は、１又は複数の標的分子を含有する試料流体を分析するためのセンサを調製及び使用する方法に関し、当該方法は：
（ｄ）  プローブ位置の配列の形でプローブを有する非活性化の多孔性有機ポリマー膜を適用するステップ、
（ｅ）  １又は複数の遮断物質で、前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜のうちプローブがないままの領域を遮断するステップ、及び
（ｆ）  前記試料流体を、前記非活性化の多孔性有機ポリマー膜の孔に通して、１又は２つの方向で繰り返し流し込むステップ、
を含む。
【００１７】
分析されることになる試料、好ましくは流体試料に存在する前記１又は複数の標的分子が、それだけに限らないが、以下の：
約５個のアミノ酸ユニットから５０個のアミノ酸ユニットを有するオリゴペプチド、
５０個を超えるアミノ酸ユニットを有するポリペプチド、
酵素を含めた蛋白質、
オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、
抗体、又はその断片、
ＲＮＡ、並びに、
ＤＮＡ
等の分子である場合に、本発明の方法は特に有用である。
【００１８】
特定の標的分子には、変性ステップが有益である場合があり、例えば、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に引き離し、膜上にスポットさせた捕獲プローブへのその一本鎖の特異的結合を可能にする。そのような変性ステップを、簡便な方法、例えば膜（ウエーハ又は膜）若しくは試料、又はその両方を加熱することにより、実行することができる。試料がそのような変性ステップで加熱される場合、鎖同士を引き離しておくために任意の冷却ステップを実行することができる。方法のうち第１ステップにおいて前記１又は複数の標的となる生物学的化合物を標識するために使用され、方法のうち最後のステップにおいてその検出を最終的に可能にするラベルは、発光（例えば、蛍光、リン光、化学発光）、放射性、酵素的、比色、音波（例えば、微小気泡の共鳴）、又は磁気性質のラベル又は微小気泡であり得る。特異的に結合可能なリガンドを、ラベルの代わりに使用することができる。この最後の場合において、リガンドは次のステップで適合性のあるラベルを含んだ物質に結合する。
【００１９】
適切な蛍光又はリン光ラベルは、それだけに限らないが、例えば、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等を含む。
【００２０】
適切な化学発光ラベルは、それだけに限らないが、例えば、ルミノール及びサイリューム等である。
【００２１】
適切な放射性ラベルは、それだけに限らないが、例えば、１２５Ｉ又は３２Ｐのような同位体である。
【００２２】
適切な酵素的ラベルは、それだけに限らないが、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等である。
【００２３】
適切な比色ラベルは、それだけに限らないが、例えば、コロイド金等である。
【００２４】
適切な音波ラベル（ｓｏｎｉｃ  ｌａｂｅｌ）は、それだけに限らないが、例えば、微小気泡等である。
【００２５】
適切な磁気ビーズは、それだけに限らないが、例えば、ダイナビーズ等である。
【００２６】
各前記１又は複数の標的分子を、感度を増すために、（例えば、最後のＰＣＲ増幅ステップ中に）約３００個までの同一のラベルで標識することができる。任意のステップとして、標的分子に取り込まれておらず、それでも試料流体に存在する未結合のラベルを、後の測定中のバックグラウンド信号を減少するために、化学的及び／又は物理的処理（例えば、化学的なＰＣＲ精製、透析、又は逆透析）により試料流体から除去することができる。
【００２７】
試料流体は、産業又は自然由来であり得る。本発明の方法を実行するのに適切な試料流体の例は、それだけに限らないが、哺乳動物（特にヒト）、鳥類、及び魚類を含めたいかなる動物からの喀痰、血液、尿、唾液、糞、又は血漿等の体液であり得る。他の制限しない例として、植物、線虫、バクテリア等からの生物学的物質を含めた流体が挙げられる。本発明の方法の適切な実行に対する唯一の必要条件は、前記生物学的物質が、例えば、適切な溶解培地内の溶液中等、実質的に流体、好ましくは液体状の流体に存在することである。本発明の方法において使用されることになる試料流体の容積は、約５μｌから１ｍｌ、好ましくは約５０μｌから４００μｌのいかなる値も取ることができる。
【００２８】
多くの場合、緩衝液（例えば、ハイブリッド形成緩衝液）を、分析されることになる試料流体内に直接、又は、（例えば、流体として若しくは凍結乾燥された状態で、膜の上若しくは下に加えられる）検出ユニットの一体部分として組み入れ、このようにして、独立したハイブリッド形成緩衝液用貯蔵所の必要性を除去することが所望される。
【００２９】
本発明のセンサのテストチャンバに存在する多孔性有機ポリマー膜は、上面及び下面を有している。前記膜は多孔性であり、試料流体を前記膜の上面から下面に、及び／又は、下面から上面に通して流し込むことを可能にしている。
【００３０】
本発明に使用される多孔性有機ポリマー膜は、いかなる非活性化の多孔性ポリマー膜でもあり得る。非活性化の多孔性有機ポリマー膜とは、生物学的分子のためにその固有の親和性を変更するよう化学的又は物理的に処理されていない多孔性有機ポリマー膜のことである。多孔性有機ポリマー膜は、種々の形状及び寸法の複数の孔、開口部、及び／又はチャネルを有する網状組織を含むことができる。有機ポリマー膜は、ナノポーラス又はマイクロポーラスでありえ、すなわち、孔、開口部、及び／又はチャネルの平均サイズは０．０５μｍから１０．０μｍ、優先的には０．１μｍから１．０μｍ、より優先的には０．３から０．６μｍで構成されることが適切であり得る。気孔径分布は実質的に均一であり得るか、又は、前記有機ポリマー膜の製造技術に応じて、約１．１から約４．０までの多分散を有する場合がある。その孔、開口部、又はチャネルに対応する表面は、多孔性膜の上面又は下面の全表面のうち約１から９９％、好ましくは約１０％から９０％、及び、より好ましくは約２０％から８０％に相当することができる。
【００３１】
有機ポリマー膜の厚さは、本発明の限定的な特徴ではなく、約１０μｍから１ｍｍ、好ましくは５０μｍから４００μｍ、より好ましくは７０μｍから２００μｍまで変更することができる。有機ポリマー膜の形状は、本発明の限定的な特徴ではない。その形状は、例えば、直径が約３から１５ｍｍに及ぶ円形であり得るが、本発明の方法は、他のいかなる膜形状及び／又はサイズにも適用することができる。
【００３２】
プローブが与えられた（例えば、スポットされた）多孔性有機ポリマー膜は、本発明の限定的な特徴ではなく、従って、多孔性膜上での生体分子固定化のために適切な膜として当分野においてすでに記載されているいかなる材料からも作製することができる。そのような材料の限定的ではない例として：
ポリアミドのホモポリマー若しくはコポリマー（例えばナイロン）、熱可塑性のフッ化ポリマー（例えばＰＶＤＦ）、ポリビニルハライド、ポリスルホン、ニトロセルロース若しくは酢酸セルロース等のセルロース系材料、ポリオレフィン、又は、ポリアクリルアミド等の有機ポリマー、及び
ガラス、石英、シリカ、他のシリコン含有セラミック材料、酸化アルミニウム等の金属酸化物の材料等の無機材料
が典型として挙げられる。
【００３３】
本発明に使用されるプローブは、標的となる生物学的化合物に対するその親和性、又は、前記標的となる生物学的化合物の関連する修飾に対するその親和性から適切に選ばれるべきである。例えば、標的となる生物学的化合物がＤＮＡである場合、プローブは、それだけに限らないが、合成のオリゴヌクレオチド、その類似体、又は特異的抗体であり得る。標的となる生物学的化合物の適切な修飾の限定的ではない例は、ビオチンで置換された標的となる生物学的化合物であり、その場合、プローブはアビジン官能性を有することができる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、１を超える異なるプローブが膜上に与えられ、さらにより好ましい実施形態において、複数の異なるプローブが、異なる標的の平行の測定を可能にするために、アレイ方法で、前記膜の一表面に沿って物理的に異なる位置でスポットされる。
【００３５】
後の検出及び特定をより容易に支えるために、１又は複数の追加のスポット（例えば、強度較正及び／又は位置検出用）も、膜の表面上にスポットすることができる。
【００３６】
スポッティングに続き、プローブは、その膜固有の、若しくは（例えば活性化により）獲得した性質のため自然に、又は、（例えば、それだけに限らないが、乾燥、加熱を介する、又は光源への曝露を介する架橋結合等、）追加の物理的処理ステップを介して、膜の表面上に固定化されるようになる。
【００３７】
膜、及び、膜に付着したプローブの有効期間を改善するため、膜が使用されていない時に、膜を乾燥させることは有用であり得る。膜はその後、試料流体と接触し再水和される。
【００３８】
プローブが（例えば、インクジェットスポッティングにより）膜の表面上に与えられると、膜のうちスポットされていない領域を不活性化するための遮断薬を効果的な量追加することは、スポットされていない領域への標的となる生物学的化合物の、又は、未結合ラベルの非特異的な結合（不必要なバックグラウンド信号を生じるであろう）を防ぎ、従って、信号対雑音比を増加するために有用であり得る。適切な遮断物質又は遮断薬の例として、それだけに限らないが、サケの精液、脱脂乳、又はポリアニオンが通常挙げられる。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、異なるラベルを同時に使用して：
（ｉ）異なる試料流体（例えば、血液及び喀痰のような異なる試料流体、若しくは、異なる位置から生じる異なる試料流体）からの１又は複数の標的分子、又は
（ｉｉ）  複数の試料流体からの分析物の差次発現（例えば、処理対未処理、病的対病的等）、又は
（ｉｉｉ）同じ試料流体からの異なる種類の標的分子（例えば、血液試料流体のＤＮＡ及びＲＮＡ含有量の分析）
を同時に測定することができる。
【００４０】
実際の感知ステップ中、生物学的試料は膜表面に通して流し込まれる。これは、前記表面に通して流体をポンプすることにより、及び／又は、前記生物学的試料の中で多孔性膜を移動させることにより達成することができる。この後者の場合、生物学的試料を前記多孔性膜に通して流し込んでいる間、多孔性膜の移動は、前記多孔性膜の表面に対して垂直の方向で実行することが好ましい。従って、感度及び特異性を上げるために、前記のポンピング又は膜移動ステップを同じ又は異なる温度で繰り返すことができる。
【００４１】
多孔性膜を通したポンピング、及び／又は、多孔性膜の移動は、一方向又は両方向であり得る。各ポンピングステップ又は各多孔性膜の移動と共に、新たな標的分子が、スポットされた捕獲プローブに結合する機会を有する。
【００４２】
例えば、各ポンプピング及び／又は膜移動ステップ又はサイクル（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍｏｖｉｎｇ  ｓｔｅｐｓ  ｏｒ  ｃｙｃｌｅｓ）の後等、所定の数のポンピングステップ及び／又は膜移動ステップ若しくはサイクルの後、ラベルの存在を定量的に測定することは有用であり得る。そのような定量的測定の結果は、実際の膜の及び／又は試料流体の温度の知識と組み合わせて、標的となる生物学的化合物の動態特徴を決定することを可能にしている。試料流体を規定された温度まで加熱することは、より厳しい結合条件を与えることを介して、結合性質、特に結合特異性のより正確な調節を可能にしている。この加熱ステップは、膜若しくは試料流体、又は、その両方を加熱することによっても達成することができる。所望の温度に達した後、次に試料流体は、膜と接触させられる。
【００４３】
結合特異性及び／又は方法の感度を、それだけに限らないが、以下の1又は複数の適切な手段によっても増加することができる：
適切な温度特性を使用するステップ（例えば、任意選択で継続的な加熱ステップ間に適切な平衡時間を持った、一連の１又は複数の加熱ステップ）
膜移動サイクルの数を適応させるステップ、及び
連続した測定のために、測定されたラベル信号を信号後処理するステップ（例えば、蛍光画像を画像処理するステップ）、及び
捕獲された標的となる生物学的化合物が最適に結合する、又は、再び離れる温度を決定するステップ。
【００４４】
例えば、温度を上げた場合、測定された信号の激減により、所与の捕獲プローブ−標的となる生物学的化合物複合体の分離（溶解）温度に達したことが示される。この性質を使用して、特異的結合と非特異的結合を区別することができる。特異性をさらにもっと改善するために、溶解温度の許容限界を超えた後にも、測定サイクルを続けることができる。この場合、標的となる生物学的化合物の再結合が、適切な特異的溶解温度よりも下で再び発生することを確かめるために、継続的に温度は下げられる。
【００４５】
次に、方法のうちの任意の最終ステップは、未結合のラベル及び／又は分子によるバックグラウンド信号をさらに減少するために、検出チャンバから残りの試料流体を除去することにある。
【００４６】
検出チャンバの形状は、未結合のラベル及び／又は分子が、測定中、例えば、（ラベルが発光分子である場合に）膜の下にある試料流体から放出される光に対する光路長の妨害を介して、又は、光透過性の窓の近くまで膜を動かし、それによって上澄み液をなくすことにより、検出システムから隠れるように設計されるのが好ましい。内蔵のホイッパーにより上澄み液をホイップすることによって、バックグラウンド信号をさらに減少することができる。試料流体の除去並びに検出チャンバの形状の設計により、検出システムに面している膜表面並びに膜の反対側が最小限の量の試料流体を表面層として有することが保証されている。これは、未結合ラベル及び／又は未結合分子からのバックグラウンド信号を減少する。
【００４７】
膜が試料流体と適切な時間の間接触した後、例えば、適切なポンピング／膜移動サイクルの後、プローブに結合した標的となる生物学的化合物のラベルが検出及び測定される。さらに、膜の移動の間も、ラベルを測定することができる。
【００４８】
観察された各信号の物理的な位置、性質、及び強度により、どの標的となる生物学的化合物が捕獲されたかを特定する、どの試料からこの標的となる生物学的化合物は生じているか、及び／又は、どの種類の生物学的化合物に属しているか特定する、並びに、その濃度を評価することが可能である。
【００４９】
本発明の方法の最終ステップにおける膜の分析を、落射蛍光顕微鏡及びＣＣＤ（電荷結合素子）カメラ、又はいかなる他の種類のカメラを含んだ光学機構により実行することができる。この光学機構は、蛍光ラベル又はリン光ラベルの場合、そのそれぞれの励起波長でラベルを励起する能力を持つ（好ましくはＵＶ）光源を含んでいることが好ましい。
【００５０】
化学発光ラベルの検出は、例えば、ラベルに適切な反応物質を添加し、その蛍光を顕微鏡の使用により観察することによって実行することができる。
【００５１】
放射性ラベルの検出は、例えば、医用Ｘ線フィルムを膜に対して直接配置することにより実行することができる。Ｘ線がラベルに曝露されるに従い現れ、黒い領域をつくりだし、その黒い領域は、関心のあるプローブの位置に合致している。
【００５２】
酵素的ラベルの検出は、例えば、ラベルに適切な基質を添加し、酵素により触媒された反応の結果（例えば、色の変化）を観察することにより実行することができる。
【００５３】
比色ラベルの検出は、例えば、ラベルに適切な反応物質を添加し、結果として生じる状況又は色の変化を観察することにより実行することができる。
【００５４】
音波微小気泡ラベルの検出は、例えば、前記ラベルを特定の周波数の音波に曝露し、結果として生じる共鳴を記録することにより実行することができる。
【００５５】
磁気ビーズの検出は、例えば、磁気センサにより実行することができる。
【００５６】
本発明の方法は、本明細書において上記のように、相当数の要素への言及により記述されてきた。その要素のそれぞれが、好ましい、若しくは、さらにより好ましい価値基準又は実施形態の可能な選択を含んでいる。要素の特定の組合せに関して、他に説明がない限り、１つのそのような要素に対する各好ましい範囲又は実施形態を、１又は複数の他の要素に対する各好ましい範囲又は実施形態と任意に組み合わせることができるということが理解されたい。
【００５７】
本発明は、次に、以下の実施例において説明される特定の実用的な実施形態に関して、及び、添付の図を参考にして記述される。しかし、この実施例は、単に本発明の例証となるものであり、いかなる点においても本発明を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５８】
本発明の実用的な実施形態が、図１、２、３、及び４に描かれている。図1は、プローブ（１３）がその特定の位置（１１）に与えられている多孔性ポリマー膜（１２）の概略図を示している。図２は、膜（１２）のうちプローブ（１３）がないままの領域が、遮断物質（２１）の添加により遮断される概略図を示している。
【００５９】
図４は、本発明の方法に使用できる特定の機構の概略図を示している。この概略図において、加熱器（４７）により調節される温度での試料流体（４４）は、チャンバ（４２）内に描かれ、逆止め弁（４９）が閉じている間、圧力が入口（４３）で印加されている。この圧力は、試料流体（４４）を多孔性膜（１２）に通して下に流し込んでいる。
【００６０】
図３は、この時点で標的分子（３２）が特定の位置（１１）内でプローブ（１３）に結合する概略図、及び、膜（１２）の遮断された領域内で、標的分子（３２）が未結合である概略図を示している。図４により、多孔性膜（１２）の分析が、検出システム（４１）によりこのステップで行われていることが示されている。入口（４６）の圧力の施用により、試料流体が測管（４８）に沿って、この時点で開かれる逆止め弁（４９）を通り移送され、その試料流体（４４）をチャンバ（４２）内に戻している。全体のプロセスは、何度か繰り返すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】プローブ（１３）がその特定の位置（１１）に与えられている多孔性ポリマー膜（１２）の概略図を示している。
【図２】膜（１２）のうちプローブ（１３）がないままの領域が、遮断物質（２１）の添加により遮断される概略図を示している。
【図３】特定の位置（１１）内で、標的分子（３２）がプローブ（１３）に結合する概略図、及び、膜（１２）の遮断された領域内で、標的分子（３２）が未結合である概略図を示している。
【図４】本発明の方法に使用できる特定の機構の概略図を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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