(57)【要約】  本発明は、免疫グロブリンポリペプチド鎖末端の少なくとも２つと、１個のペプチドとが結合し、その際、それらのペプチドが異なるか、類似しているか、または同一でありうるペプチド−免疫グロブリン−複合体に関する。結合は核酸レベルで行われる。
2009512655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド−免疫グロブリン−複合体であって、
ａ）前記免疫グロブリンが、２本の重鎖、または２本の重鎖と２本の軽鎖からなり、
ｂ）前記免疫グロブリンが、非機能性免疫グロブリンであり、
ｃ）前記複合体が次式
免疫グロブリン−［ペプチド］ｎ
を有し、式中、ｎは２〜８の整数であり、
ｄ）ペプチド結合によって、ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸と免疫グロブリン鎖のアミノ末端アミノ酸とが結合し、または免疫グロブリン鎖のカルボキシ末端アミノ酸とペプチドのアミノ末端アミノ酸とが結合する
ことを特徴とする複合体。
【請求項２】
前記ペプチドが、生物活性ペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ペプチドが、ペプチドリンカーと生物活性ペプチドからなることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記ペプチドが、互いに９０％以上のアミノ酸配列同一性を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
該免疫グロブリンが、Ｇクラス（ＩｇＧ）またはＥクラス（ＩｇＥ）の免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記生物活性ペプチドが、抗融合誘導ペプチドであることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記非機能性免疫グロブリンが、ＫＤ値（結合親和性）１０−５mol/l以上でヒト抗原に結合する免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記非機能性免疫グロブリンが、
ａ）両重鎖および／または軽鎖が、１つ以上のフレームワークまたは／および超可変領域の一部または全てを欠く免疫グロブリンであるか、あるいは
ｂ）両重鎖および／または軽鎖が、可変領域を有しない免疫グロブリンであるか、あるいは
ｃ）ヒト抗原に対して１０−５mol/l以上の結合親和性を有する免疫グロブリンであるか、あるいは
ｄ）ヒト抗原に対して１０−５mol/l以上の結合親和性を有し、かつ非ヒト抗原に対して１０−７mol/l以下の結合親和性を有する免疫グロブリンである
ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
請求項１に記載の複合体を生成する方法であって、
該方法が以下の工程：
ａ）該複合体の発現に好適な条件下で、請求項１に記載の複合体をコードする、１個以上の核酸分子を含む、１個以上のプラスミドを含む細胞を培養する工程、
ｂ）該細胞またはその培地から該複合体を回収する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
医薬的に許容され得る賦形剤または担体とともに、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体または医薬的に許容され得るその塩を含む医薬組成物。
【請求項１１】
ウイルス感染症を処置する薬剤を製造するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項１２】
該ウイルス感染症が、ＨＩＶ感染症であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
抗ウイルス処置を必要とする患者を処置するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項１４】
前記ペプチドが、９０％から１００％未満の範囲のアミノ酸配列同一性を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１５】
前記非機能性免疫グロブリンが、重鎖および／または軽鎖の両方が、１つ以上のフレームワークまたは／および超可変領域の一部または全てを欠く免疫グロブリン、および／または重鎖および／または軽鎖の両方が可変領域を有しない免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１〜８および１４のいずれか一項に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２個以上のペプチドが、それぞれ、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の一末端に結合しているペプチド−免疫グロブリン−複合体に関する。ペプチドは、アミノ酸レベルで異なり、類似し、または同一でありうる。ペプチドが結合する免疫グロブリンは機能的な免疫グロブリンではない。
【０００２】
背景技術
細胞のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染は、感染する細胞膜とウイルス膜が融合する過程によって行われる。この過程の一般的スキームを示す：ウイルスエンベロープ糖タンパク複合体（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）が、感染する細胞膜上にある細胞表面受容体と相互作用する。ｇｐ１２０が、ＣＣＲ−５またはＣＸＣＲ−４などのコレセプターと組み合わさって、例えばＣＤ４受容体に結合すると、ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体の立体配座に変化が生じる。この立体配座変化の結果、ｇｐ４１タンパク質は標的細胞の膜内に挿入することができる。この挿入が膜融合過程の開始である。
【０００３】
ｇｐ４１タンパク質のアミノ酸配列は、天然の多型のために、異なるＨＩＶ株間で異なることが分かっている。しかし、（Ｎ末端からＣ末端方向に）融合シグナル、２個のヘプタッドリピートドメイン（ＨＲ１、ＨＲ２）、および膜貫通ドメインという同じドメイン構造は正確に認識することができる。融合（または融合誘導）ドメインは、細胞膜への挿入およびその分解に関与していることが示唆されている。ＨＲ領域は、７アミノ酸（「ヘプタッド（heptad）」）を含む複数のストレッチから構築されている（例えば、Shu, W.ら, Biochemistry 38 (1999) 5378−5385を参照されたい）。ヘプタッド以外にも、１つ以上のロイシンジッパー様モチーフが存在する。この組成物は、ｇｐ４１タンパク質のコイルドコイル構造の形成、および同様にこれらのドメインに由来するペプチドの形成を担う。コイルドコイルは、一般的に、２個以上の相互作用へリックスからなるオリゴマーである。
【０００４】
ｇｐ４１のＨＲ１またはＨＲ２ドメインから推定されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＩＶ阻害薬の細胞へのインビトロおよびインビボ取込みに有効である（例えば、ペプチド、例えば、ＵＳ５，４６４，９３３、ＵＳ５，６５６，４８０、ＵＳ６，２５８，７８２、ＵＳ６，３４８，５６８、またはＵＳ６，６５６，９０６を参照されたい）。例えば、Ｔ２０［ＤＰ１７８としても知られる、Fuzeon（登録商標）、ＨＲ２ペプチド］およびＴ６５１（ＵＳ６，４７９，０５５）は、非常に強力なＨＩＶ感染の阻害薬である。
【０００５】
例えば、アミノ酸置換または化学的架橋により、ＨＲ２由来のペプチドの効力を増強することが試されてきた（Sia, S. K.ら, PNAS USA 99 (2002) 14664-14669；Otaka, A.ら, Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937-2940）。
【０００６】
ある分子にペプチドが結合すると、それらの薬物動態特性が変化することがあり、例えば、該ペプチド複合体の血清半減期を増大させることができる。結合は、例えば、ペグ化インターロイキン−６（ＥＰ０４４２７２４）、ペグ化エリスロポエチン（ＷＯ  ０１／０２０１７）、エンドスタチンおよび免疫グロブリン含有キメラ分子（ＵＳ２００５／００８６４９）、融合タンパク質を基に分泌された抗体（ＵＳ２００２／１４７３１１）、アルブミン含有融合ポリペプチド（ＵＳ２００５／０１００９９１；ヒト血清アルブミンＵＳ５，８７６，９６９）、ペグ化ポリペプチド（ＵＳ２００５／０１１４０３７）、およびインターフェロン融合体について報告している。
【０００７】
該手法の意図は、例えば、ポリペプチド類と免疫グロブリン類を融合して、免疫グロブリンの抗原決定特性とポリペプチドの生物活性とを組み合わせることである。すなわち、複合体の免疫グロブリン部分は標的化機能を示し、ポリペプチド部分は生物活性を提供する。これは、例えば、ゲロニンを含む免疫毒素と抗体（ＷＯ  ９４／２６９１０）について、改変トランスフェリン抗体融合タンパク質（ＵＳ２００３／０２２６１５５）について、抗体サイトカイン融合タンパク質（ＵＳ２００３／００４９２２７）について、および免疫刺激活性、膜輸送活性または同種親和性活性を有するペプチドと抗体からなる融合タンパク質（ＵＳ２００３／０１０３９８４）について報告している。
【０００８】
ＷＯ  ２００４／０８５５０５では、巨大分子に化学的に結合している、生物活性化合物からなる長時間作用性生物活性複合体について報告している。
【０００９】
発明の概要
本発明の目的は、１個を超えるペプチドと前記免疫グロブリンとが結合しているペプチド−免疫グロブリン−複合体を提供することである。
【００１０】
本発明は、ペプチド−免疫グロブリン−複合体であって、免疫グロブリンが、２本の重鎖、または２本の重鎖と２本の軽鎖からなり、免疫グロブリンが、非機能性免疫グロブリンであり、ペプチド結合によって、免疫グロブリン鎖のカルボキシ末端アミノ酸とペプチドのアミノ末端アミノ酸とが結合するか、あるいはペプチドのカルボキシ末端アミノ酸と免疫グロブリン鎖のアミノ末端アミノ酸とが結合し、かつ複合体が以下の一般式を有し、
免疫グロブリン−［ペプチド］ｎ
式中、ｎは２〜８の整数である、複合体を含む。
【００１１】
一実施態様では、ペプチドは生物活性ペプチドである。
【００１２】
別の実施態様では、ペプチドはペプチドリンカーと生物活性ペプチドからなる。
【００１３】
一実施態様では、複合体のペプチドは、互いに９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１４】
さらに別の実施態様では、免疫グロブリンは、Ｇクラス（ＩｇＧ）またはＥクラス（ＩｇＥ）のいずれかの免疫グロブリンである。
【００１５】
別の実施態様では、生物活性ポリペプチドは抗融合誘導ペプチドである。
【００１６】
別の実施態様では、非機能性免疫グロブリンは、ＫＤ値１０−５mol/l以上でヒト抗原に結合する免疫グロブリンである。
【００１７】
別の実施態様では、非機能性免疫グロブリンは、ａ）重鎖および／または軽鎖の両方が、１つ以上のフレームワークまたは／および超可変領域の一部または全てを欠く免疫グロブリン、またはｂ）重鎖および／または軽鎖の両方が可変領域を有しない免疫グロブリン、またはｃ）ヒト抗原に対して１０−５mol/l以上の結合親和性を有する免疫グロブリン、またはｄ）ヒト抗原に対して１０−５mol/l以上の結合親和性を有し、かつ非ヒト抗原に対して１０−７mol/l以下の結合親和性を有する免疫グロブリンである。
【００１８】
本発明がさらに包含するものは、本発明による複合体を生成する方法であって、該方法は複合体の発現に好適な条件下で、本発明による複合体をコードする１個以上の核酸分子を含む、１つ以上の発現ベクターを含有する細胞を培養する工程、およびその細胞またはその培地からその複合体を回収する工程を含む。
【００１９】
本発明は、医薬的に許容され得る賦形剤または担体とともに、本発明による複合体、または医薬的に許容され得るその塩を含有する医薬組成物も含む。
【００２０】
本発明がさらに包含するものは、ウイルス感染症を処置する薬剤を製造するための本発明による複合体の使用である。
【００２１】
一実施態様では、ウイルス感染症はＨＩＶ感染症である。
【００２２】
本発明は、さらに、抗ウイルス処置を必要とする患者を処置するために、本発明による複合体を使用する方法を含む。
【００２３】
発明の説明
本発明は、ペプチド−免疫グロブリン−複合体において、免疫グロブリンが、２本の重鎖、または２本の重鎖と２本の軽鎖からなり、免疫グロブリンが、非機能性免疫グロブリンであり、ペプチド結合によって、免疫グロブリン鎖のカルボキシ末端アミノ酸とペプチドのアミノ末端アミノ酸とが結合するか、あるいはペプチドのカルボキシ末端アミノ酸と免疫グロブリン鎖のアミノ末端アミノ酸とが結合し、かつ複合体が以下の一般式を有し、ここで、この一般式の［ペプチド］−部分の位置は結合を示さず、すなわちアミノ酸、そのペプチドが免疫グロブリンと結合する位置を示さない、ペプチド−免疫グロブリン−複合体を含む。
免疫グロブリン−［ペプチド］ｎ
（式中、ｎは２〜８の整数である）
【００２４】
本発明の範囲内で、用いる用語のいくつかは以下のように定義する。
【００２５】
「遺伝子」は、例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な、染色体またはプラスミド上のセグメントを意味する。遺伝子には、コード領域以外に、プロモーター、イントロンおよびターミネーターを含む他の機能性成分も含まれる。
【００２６】
「構造遺伝子」は、シグナル配列を持たない遺伝子のコード領域を意味する。
【００２７】
「抗融合誘導ペプチド」は、膜融合に関連する事象または膜融合事象自体を阻害するペプチドであり、なかでも、膜融合によってウイルスが未感染細胞を感染することを阻害するペプチドを含む。これらの抗融合誘導ペプチドは、直鎖ペプチドであることが好ましい。例えば、それらは、ｇｐ４１細胞外ドメイン、例えばＤＰ１０７またはＤＰ１７８などから派生することができる。該ペプチドの例は、ＵＳ５，４６４，９３３、ＵＳ５，６５６，４８０、ＵＳ６，０１３，２６３、ＵＳ６，０１７，５３６、ＵＳ６，０２０，４５９、ＵＳ６，０９３，７９４、ＵＳ６，０６０，０６５、ＵＳ６，２５８，７８２、ＵＳ６，３４８，５６８、ＵＳ６，４７９，０５５、ＵＳ６，６５６，９０６、ＷＯ  １９９６／１９４９５、ＷＯ  １９９６／４０１９１、ＷＯ  １９９９／５９６１５、ＷＯ  ２０００／６９９０２、およびＷＯ  ２００５／０６７９６０に見ることができる。例えば、該ペプチドのアミノ酸配列は、ＵＳ５，４６４，９３３の配列番号１〜１０、ＵＳ５，６５６，４８０の配列番号１〜１５、ＵＳ６，０１３，２６３の配列番号１〜１０および１６〜８３、ＵＳ６，０１７，５３６の配列番号１〜１０、２０〜８３、および１３９〜１４９、ＵＳ６，０９３，７９４の配列番号１〜１０、１７〜８３、および２１０〜２１４、ＵＳ６，０６０，０６５の配列番号１〜１０、１６〜８３、および２１０〜２１１；ＵＳ６，２５８，７８２の配列番号１２８６および１３１０、ＵＳ６，３４８，５６８の配列番号１１２９、１２７８〜１３０９、１３１１、および１４３３、ＵＳ６，４７９，０５５の配列番号１〜１０、および２１０〜２３８、ＵＳ６，６５６，９０６の配列番号１〜１７１、１７３〜２１６、２１８〜２１９、２２２〜２２８、２３１、２３３〜３６６、３７２〜３９８、４００〜４５６、４５８〜４９８、５００〜５７０、５７２〜６２０、６２２〜６５１、６５３〜７３６、７３９〜７８５、７８７〜８１１、８１３〜８１５、８１６〜８２３、８２５、８２７〜８６３、８６５〜８７５、８７７〜８８３、８８５、８８７〜８９０、８９２〜９８１、９８６〜９９９、１００１〜１００３、１００６〜１０１８、１０２２〜１０２４、１０２６〜１０２８、１０３０〜１０３２、１０３７〜１０７６、１０７８〜１０７９、１０８２〜１１１７、１１２０〜１１７６、１１７９〜１２１３、１２１８〜１２２３、１２２７〜１２３７、１２４４〜１２４５、１２５６〜１２６８、１２７１〜１２７５、１２７７、１３４５〜１３４８、１３５０〜１３６２、１３６４、１３６６、１３６８、１３７０、１３７２、１３７４〜１３７６、１３７８〜１３７９、１３８１〜１３８５、１４１２〜１４１７、１４２１〜１４２６、１４２８〜１４３０、１４３２、１４３９〜１５４２、１６７０〜１６８２、１６８４〜１７０９、１７１２〜１７１９、１７２１〜１７５３、および１７５５〜１７５７、またはＷＯ  ２００５／０６７９６０の配列番号５〜９５の群を含み、またはそれらの群から選択することができる。抗融合誘導ペプチドは、５〜１００個のアミノ酸、好ましくは１０〜７５個のアミノ酸、より好ましくは１５〜５０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。
【００２８】
本明細書で使用する「生物活性分子」という用語は、有機分子、例えば生物学的巨大分子（ペプチド、タンパク質、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチド、または合成タンパク質など）を指し、例えば細胞系およびウイルスを使用するバイオアッセイなどの人工的生物系に投与した場合、あるいは鳥類、およびヒトを含む哺乳動物を含むがそれだけに限定されない、動物にインビボで投与した場合、生物学的効果を引き起こす。この生物学的効果は、酵素阻害、活性化、もしくはアロステリック修飾、結合部位あるいは周辺での受容体との結合、受容体のブロックあるいは受容体の活性化、もしくはシグナル誘発でありうるが限定されない。
【００２９】
「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現させるタンパク質をコードする核酸分子である。通常は、発現ベクターは原核プラスミド増殖単位を含み、例えば、大腸菌では、複製起点、および選択可能なマーカー、真核生物の選択可能なマーカー、および対象となる遺伝子を発現させるための１つ以上の発現カセットを含み、各発現カセットはプロモーターと、構造遺伝子と、ポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターとを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下におかれ、該核酸はプロモーターに「作動可能に結合」していると言われている。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、調節エレメントとコアプロモーターは作動可能に結合している。
【００３０】
「ポリシストロン性転写ユニット」は、１個を超える構造遺伝子が同じプロモーターの制御下にある転写ユニットである。
【００３１】
「単離したペプチド」は、混入する細胞成分、例えば炭水化物、脂質、または事実上ペプチドに関連する他のタンパク質不純物、を本質的に含まないポリペプチドである。通常は、単離したペプチドの調製物には、高度に精製された形で、すなわち少なくとも約８０％純粋な、少なくとも約９０％純粋な、少なくとも約９５％純粋な、９５％を超えて純粋な、または９９％超えて純粋なペプチドが含まれる。特定のタンパク質の調製物が単離したペプチドを含むことを示す一方法は、タンパク質調製物をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、そのゲルをクマシーブリリアントブルー染色した後に、単一バンドが出現することによる。しかし、「単離した」という用語は、二量体などの代替の物理的形状を有する同じペプチド、または別法としてグリコシル化した形または誘導体化した形の同じペプチドの存在を除外するものではない。
【００３２】
本明細書で使用する「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子およびその変異体もしくはフラグメントによって実質的にコードされている、１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質をさす。免疫グロブリンを構成する異なるポリペプチドは、それらの重量に応じて軽鎖および重鎖と呼ばれる。存在を認められている免疫グロブリン遺伝子には、異なる定常領域遺伝子および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンは、様々な型で存在しうる。重鎖および軽鎖のそれぞれには、可変ドメイン（領域）（一般的に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）が含まれる。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインには、異なるセグメント、すなわち４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＣＤＲ）が含まれる。重鎖および軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、定常領域（一般的に、そのポリペプチド鎖のカルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常ドメイン／領域は、抗体と、ｉ）Ｆｃ−γ受容体（ＦｃγＲ）を有する細胞、例えば食細胞、またはｉｉ）ブランベル（Brambell）受容体としても知られる、新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を有する細胞との結合を媒介する。また、その領域は、成分（Ｃ１ｑ）など、従来の補体系因子を含む数種の因子への結合を媒介する。
【００３３】
本発明による免疫グロブリンは、少なくとも２本の重鎖ポリペプチドを含む。場合により、２本の軽鎖ポリペプチドが存在しうる。本発明による免疫グロブリンは、非機能性免疫グロブリンである。
【００３４】
本願内で使用する「非機能性免疫グロブリン」という用語は、ＫＤ値（結合親和性）１０−５mol/l以上で（例えば１０−３mol/l）、好ましくはＫＤ値１０−４mol/l以上で、ヒト抗原と結合する免疫グロブリンを意味する。結合親和性は、標準的結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴技術（Biacore（登録商標））によって定量する。この結合親和値は、正確な値として取り扱ってはならず、それは単に参照にすぎない。ヒト標的／抗原に対して免疫グロブリン典型的特異的標的結合性を示さず、それゆえヒト治療活性を有しない、免疫グロブリンを決定し、かつ／または選択するために結合親和性を用いる。すなわち、例えば、非機能性免疫グロブリンは、配列特異的抗原／エピトープ結合性を有しない免疫グロブリンである。同時に、例えば、イオン相互作用に基づく非特異的相互作用も、ともかく存在しうる。これは、免疫グロブリンが非ヒト標的／抗原に対して特異的標的結合を示すということを除外するものではない。この非ヒト抗原の特異的標的結合は、ＫＤ値１０−７mol/l以下（例えば、１０−１０mol/l）、好ましくはＫＤ値１０−８mol/l以下に関連する。
【００３５】
本願内で使用する「リンカー」または「ペプチドリンカー」という用語は、天然起源および／または合成起源ペプチドリンカーを意味する。リンカーは、２０個の天然のアミノ酸が単量体構成単位である直鎖アミノ酸鎖を構築している。その鎖の長さは、１〜５０個アミノ酸、好ましくは３〜２５個アミノ酸である。リンカーは、反復アミノ酸配列または天然のポリペプチド配列、例えば、ヒンジ機能を有するポリペプチドを含むこともあり得る。ペプチドが正確に折り畳み、適切に提示できることにより、免疫グロブリンに結合したペプチドがその生物活性を確実に実施できるようにする機能を、リンカーは有する。
【００３６】
好ましくは、リンカーは、グリシン残基、グルタミン残基、および／またはセリン残基が豊富であるといわれる「合成ペプチドリンカー」である。これらの残基は、例えば、アミノ酸５個まで、例えば、ＧＧＧＧＳ、ＱＱＱＱＧまたはＳＳＳＳＧの小さな反復単位に整列する。この小さな反復単位を２回から５回繰り返して多量体単位を形成しうる。多量体単位のアミノ末端および／またはカルボキシ末端に、追加で任意の天然のアミノ酸を６個まで加えてよい。他の合成ペプチドリンカーは、例えば、リンカーＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳのセリンなど、１０〜２０回繰り返される単一アミノ酸から構成される。アミノ末端および／またはカルボキシ末端のそれぞれには、追加で任意の天然のアミノ酸は６個まで存在することができる。
【００３７】
本出願内で使用する「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然のカルボキシα−アミノ酸群を意味する。
【００３８】
本発明を実施するのに有用である当業者に周知の方法や技術は、例えば、Ausubel, F.M.編, Current Protocols in Molecular Biology, I〜III巻(1997), Wiley and Sons；Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載している。
【００３９】
本発明は、免疫グロブリン末端の少なくとも２つが、ペプチドに結合している免疫グロブリン複合体を含む。免疫グロブリンは、異なる５クラス：ＩｇＡ（クラスＡ免疫グロブリン）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てられる。これらのクラスの間で、免疫グロブリンはその全体的構造が異なる。その構成単位を見れば類似性が見てとれる。免疫グロブリンは全て、いわゆる免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド（短鎖：軽鎖）と、いわゆる免疫グロブリン重鎖ポリペプチド（短鎖：重鎖）とを含むポリペプチド鎖の対から構築されている。ＩｇＧクラス免疫グロブリンの一般的構造を図１に示す。
【００４０】
免疫グロブリンなど、異なるサブユニットから構成される複合体タンパク質では、それは、モジュール構造により、１つを超えるアミノ末端と、１つを超えるカルボキシ末端が得られる。例えば、クラスＧおよびＥの免疫グロブリンは、各２対の重鎖および軽鎖を有する。この構成により、これらの免疫グロブリン、すなわち、免疫グロブリン一分子中には、４つのアミノ末端と４つのカルボキシ末端が存在する。これにより、最多８個のペプチドが、ＩｇＧまたはＩｇＥに結合できるようになり、すなわち、アミノ末端（Ｎ末端）とカルボキシ末端（Ｃ末端）を組み合わせた数まで可能になる。
【００４１】
本発明の免疫グロブリンは、非機能性免疫グロブリンである。ＫＤ値１０−５mol/l以上を有する（ヒト抗原に対して）機能的な可変ドメインが存在しないために、たとえあったとしても免疫グロブリンはヒト抗原に結合する。これは、非ヒト抗原が、ＫＤ値１０−７mol/l以下で特異的に結合しているということを除外するものではない。
【００４２】
免疫グロブリンは、ペプチドが遺伝子的手段によって結合する骨格を提供する。従って、機能的な可変ドメインを持たず、あるいは１つ以上の可変ドメイン領域の全てまたは一部が欠けており、従って任意の抗原結合能力を有しない、免疫グロブリンもまた、非機能性免疫グロブリンとして本発明に使用することができる。
【００４３】
免疫グロブリン鎖の末端に導入するペプチドは、免疫グロブリン全体と比較すると小さいサイズのものである。例えば、最小の免疫グロブリンであるクラスＧ免疫グロブリンの分子量は約１５０kDaであり、改変したもののサイズは、約１００個のアミノ酸に等しい１２．５kDa未満であり、一般的には、約６０個のアミノ酸に等しい７．５kDa未満である。
【００４４】
ペプチドは、分子生物学的技術により核酸レベルで免疫グロブリンに導入する。
【００４５】
免疫グロブリンに結合したペプチドは、５〜１００のアミノ酸残基、好ましくは１０〜７５のアミノ酸残基、より好ましくは１５〜５０のアミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。免疫グロブリンに結合したポリペプチドは、生物活性分子／ペプチドを含む群から選択される。これらの分子は、人工生物系、生細胞または生きている生物、例えば、鳥類またはヒトを含む哺乳動物に投与した場合、生物学的効果を引き起こす。これらの生物活性化合物は、それだけには限定されないが、アゴニスト、および酵素、受容体、免疫グロブリンなどのアンタゴニスト；細胞障害活性、抗ウイルス活性、抗菌活性、または抗癌活性を示す標的薬剤、および抗原も含まれる。生物活性ペプチドは、抗融合誘導ペプチドの群から選択するのが好ましい。本発明の免疫グロブリン複合体は、医薬的、治療的、または診断的適用に有用である。
【００４６】
生物活性ペプチドは、それらに限定されないが、例えば、ハリネズミタンパク質、骨形成タンパク質、増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン、およびインターフェロン、タンパク質ホルモン、抗ウイルス性ペプチド、抗融合誘導ペプチド、抗血管新生ペプチド、細胞障害性ペプチドなどからなる群から選択することができる。
【００４７】
１個を超えるペプチドと免疫グロブリンとの末端結合には、異なる分配が存在する。免疫グロブリンに結合できるペプチドの数は、１から免疫グロブリンポリペプチド鎖のアノ末端とカルボキシ末端を組み合わせた数までである。
【００４８】
１個のペプチドが免疫グロブリンと結合する場合、そのペプチドは免疫グロブリン末端のいずれか１つを占有することができる。同様に、できる限り多くのペプチドが免疫グロブリンと結合する場合、１個のペプチドによって全末端が占有される。免疫グロブリンと結合するペプチドの数が、１よりも大きいが最多可能数よりも小さい場合、免疫グロブリン末端でペプチドの異なる分配が可能である。
【００４９】
例えば、４個のペプチドがＧまたはＥクラスの免疫グロブリンと結合する場合、異なる５個の組合せが可能である（表１を参照されたい）。２つの組合せでは、１種類の末端全て、すなわち免疫グロブリン鎖の、４つ全てのアミノ末端または４つ全てのカルボキシ末端が（それぞれ）１個のペプチドと結合している。他方の末端は結合しない。これによって、免疫グロブリンの一領域での改変／結合の配分により一実施態様ができる。他の事例では、ポリペプチドはいくつかの両末端と結合している。これらの組合せの中では、結合したペプチドは、免疫グロブリンの異なる領域に配分される。いずれの場合でも、結合する末端の合計は４である。
【００５０】
表１：４個のペプチドと、４つのポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン末端との結合の可能な組合せ。
【表１】
2009512655.tif 000003
【００５１】
本発明は、少なくとも２つの末端が、ペプチドと結合する免疫グロブリンを含む。結合するペプチド自体（１つ以上）は免疫グロブリンに由来しない。結合するペプチドのアミノ酸配列は、異なっているか、類似しているか、または同一であってよい。一般に、それらのアミノ酸配列は、異なり、すなわち、それらのアミノ酸同一性は９０％未満である。一実施態様では、アミノ酸配列同一性が９０％から１００％未満の範囲であると、これらのアミノ酸配列とその対応するペプチドは類似すると定義される。別の実施態様では、ペプチドが同一性１００％のアミノ酸配列を有すると、それらは同一であるとみなされる。
【００５２】
結合するペプチドは、ある程度の相同性または同一性を示しうるが、それらはアミノ酸配列の全長で異なることもありうる。
【００５３】
ペプチドと免疫グロブリン間の結合は核酸レベルで実施される。従って、２個のアミノ酸間のペプチド結合がペプチドと免疫グロブリンを結合させる。このように、ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、免疫グロブリン鎖のアミノ末端アミノ酸と結合しているか、または免疫グロブリン鎖のカルボキシ末端アミノ酸はペプチドのアミノ末端アミノ酸と結合している。
【００５４】
本発明によるペプチド−免疫グロブリン−複合体のさらなる特徴は、完全な複合体が、１つ以上の核酸分子、好ましくは２個の〜８個の核酸分子によってコードされることである。これにより、免疫グロブリン複合体を組換え産生できるようになる。
【００５５】
本発明によるペプチド−免疫グロブリン−複合体を組換え産生するためには、異なるポリペプチドをコードする２個以上の核酸分子が必要であり、２個〜８個の核酸分子が好ましい。これらの核酸分子は、複合体の、異なる免疫グロブリンポリペプチド鎖をコードし、以下、これらの核酸分子を構造遺伝子と称する。それらは、同じ発現カセットの一部であっても、あるいは異なる発現カセット中にあってもよい。複合体の組み立ては、複合体が分泌される前に、およびそれゆえ発現する細胞内で行われるのが好ましい。従って、複合体のポリペプチド鎖をコードする核酸は、同じ宿主細胞中で発現されるのが好ましい。
【００５６】
一般に、非抱合型免疫グロブリンを産生するためには、１つは軽鎖をコードし、１つは重鎖をコードする２個の構造遺伝子が必要である。ペプチド−免疫グロブリン−複合体を生成するためには、結合する免疫グロブリンの軽鎖および／または重鎖をコードする、追加の構造遺伝子が必要である。一例を図１２に示す。そこには、免疫グロブリンと、異なる２個のペプチドのペプチド−免疫グロブリン−複合体すべてが示してある。
【００５７】
同一のペプチドに結合している２本の重鎖から構成される本発明による免疫グロブリンは、１または２個の構造遺伝子によってコードされる。両ペプチドが重鎖の同じ末端アミノ酸と結合している場合、１個の構造遺伝子を使用する。１個のペプチドが第一の重鎖のアミノ末端アミノ酸に結合しており、他方のペプチドが第二の重鎖のカルボキシ末端アミノ酸に結合している場合、２個の構造遺伝子を使用する。
【００５８】
別の例は、軽鎖の両アミノ末端が異なる、または類似のペプチドと結合している複合体である。この場合は、３個の構造遺伝子を使用しなければならない（図１１）。１個の構造遺伝子は、非抱合型重鎖をコードし（構造遺伝子２）、１個の構造遺伝子は、ペプチド１と結合している第一の軽鎖をコードし（構造遺伝子１）、１個の構造遺伝子は、ペプチド２と結合している第二の軽鎖をコードする（構造遺伝子３）。それらの構造遺伝子用に、１つ以上の発現ベクター（プラスミド）に乗せる１つ以上の発現カセットを設計する。前記の例で抱合型ペプチドが同一である場合には、２個のみ構造遺伝子を必要とし、結合するペプチドは同一である。すなわち、１個が非抱合型重鎖をコードし、１個がアミノ抱合型軽鎖をコードする（図１１を参照されたい：構造遺伝子１と３が同一である）。ペプチド−免疫グロブリン−複合体の３個の全ての構成単位は同じ細胞中で発現するのが好ましい。免疫グロブリン鎖の統計的組立てを仮定すると、異なる４個の免疫グロブリン複合体が実施可能である。これらのうち、免疫グロブリン２と免疫グロブリン２ａは同一であり、従って異なる３個の免疫グロブリン複合体を培地に分泌する。３個の全て構造遺伝子が化学量論的に発現すると、免疫グロブリン１、免疫グロブリン２、および免疫グロブリン３の割合は１：２：１である。これらの構造遺伝子の１つ以上の発現を増加、または減少させることによって、組み立てられた複合体の割合を好ましい複合体（１、２、または３）にシフトさせることができる。従って、例えば、異なるプロモーター強度を有するプロモーターを使用する方法が当業者に周知である。ペプチドが同一である場合には、唯一の免疫グロブリン複合体が形成され培地に分泌される。
【００５９】
得られる免疫グロブリン複合体の混合物は、当業者に周知の方法によって分離し、精製することができる。免疫グロブリンを精製するためのこれらの方法は、定評があり、広範に使用されており、単独でまたは組み合わせて使用されている。該方法には、例えば、微生物由来タンパク質を使用するアフィニティークロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー〔例えば、カチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）および混合モードの交換クロマトグラフィー］、親チオ性（thiophilic）吸着法（例えば、β−メルカプトエタノールおよび他のＳＨリガンドによる）、疎水的相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー［例えば、フェニル−セファロース、アザ親アレノ（arenophilic）樹脂、またはｍ−アミノフェニルボロン酸による］、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）親和性物質による）、サイズ排除クロマトグラフィー、および調製用電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）がある。
【００６０】
図１３および１４は、軽鎖アミノ末端と結合している第一のペプチドと、重鎖カルボキシ末端に結合している第二のペプチドを使用し、得ることができる様々な複合体を示す。この場合、異なる４個の構造遺伝子から出発して、異なる１０個の免疫グロブリン複合体が生成される。
【００６１】
非抱合型ペプチドと比較して、ペプチド−免疫グロブリン−複合体は、半減期（すなわち、元のペプチド量の半分が血流から排出され、かつ／または代謝される時間）など、薬物動態の改善が見られる。同時に、本発明によるペプチド−免疫グロブリン−複合体によって、抱合型ペプチドの局所濃度を増大させることができる。抱合型ペプチドは、結合している免疫グロブリンに極めて近接して存在し、かつ固定されるからである。同じ免疫グロブリンに結合する１個を超える、すなわち、２個以上の異なるペプチドを提供することも可能である。
【００６２】
本発明の免疫グロブリン複合体の先に概説した特性は、抱合型ペプチドの生物活性に依存する。従って、ペプチドは、それらの標的と相互作用できるように、それらの天然立体構造を取り入れ、そしてアクセス制限なく適切に存在させなければならない。立体障害を防止するために、抱合型ペプチドは、ペプチドリンカーと生物活性ペプチドからなりうる（ペプチドリンカーについては表２を参照されたい）。
【００６３】
表２：ペプチドリンカー
【表２】
2009512655.tif 000004
【００６４】
全てのペプチドリンカーは、核酸分子によってコードし、従って組換えによって発現することができる。リンカーはそれ自体ペプチドなので、生物活性ペプチドは、２個のアミノ酸間に形成するペプチド結合を通じてリンカーに結合する。ペプチドリンカーは、生物活性ペプチドと、生物活性ペプチドが結合する免疫グロブリン鎖との間に導入する。従って、アミノ末端からカルボキシ末端方向に様々な可能な配列：ａ）生物活性ペプチド−ペプチドリンカー−免疫グロブリンポリペプチド鎖、またはｂ）免疫グロブリンポリペプチド鎖−ペプチドリンカー−生物活性ペプチド、またはｃ）生物活性ペプチド−ペプチドリンカー−免疫グロブリンポリペプチド鎖−ペプチドリンカー−生物活性ペプチドが存在し、その際、生物活性ペプチドは、同じでも、または異なっていてもよく、かつペプチドリンカーは存在しまたは存在しなくてもよく、すなわち、Ｃ末端からＮ末端方向に可能な配列には、ｄ）生物活性ペプチド−免疫グロブリンポリペプチド鎖、またはｅ）免疫グロブリンポリペプチド鎖−生物活性ペプチド、またはｆ）生物活性ペプチド−免疫グロブリンポリペプチド鎖−生物活性ペプチドが含まれる。
【００６５】
当業者に周知の組換え工学法により、免疫グロブリン複合体は、核酸／遺伝子レベルでオーダーメイドすることができる。免疫グロブリンをコードする核酸配列は公知であり、例えば、ゲノムデータベースから入手することができる。同様に、生物活性ペプチドの核酸配列も公知であるが、または生物活性ペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸をコードするヌクレオチドの三つ組コドンを基にして、そのアミノ酸配列から容易に推定することができる。
【００６６】
本発明の複合体を発現させるための発現ベクター（プラスミド）の構築に必要な成分は、その天然型および／または改変型および／または抱合型バージョンの免疫グロブリン軽鎖用発現カセット、その天然型および／または改変型および／または抱合型バージョンの免疫グロブリン重鎖用発現カセット、選択可能なマーカー、および大腸菌複製物、さらに選択単位である。これらのカセットは、プロモーター、構造遺伝子、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメント、およびターミネーターを含む。免疫グロブリン複合体の全ての鎖をコードする１つの発現ベクター（プラスミド）、あるいはそれぞれが、免疫グロブリン複合体の一本以上の鎖をコードする２つ以上の発現ベクター（プラスミド）上に、これらの成分を作動的に結合した形で組み立てる。
【００６７】
コードされたポリペプチドを発現させるためには、（１つ以上の）発現ベクター（プラスミド）を好適な宿主細胞に導入する。タンパク質は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０、細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｋ５６２細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞などで産生するのが好ましい。ベクターの調節エレメントは、選択した宿主細胞中で機能的であるように選択しなければならない。
【００６８】
発現させるためには、鎖の発現に適切な条件下で、免疫グロブリン複合体の一本以上の鎖をコードする（１つ以上の）ベクター（プラスミド）を含む宿主細胞を培養する。発現された免疫グロブリン鎖は機能的に組み立てられる。十分に処理したペプチド−免疫グロブリン−複合体は培地に分泌する。
【００６９】
複合体の免疫グロブリン部分は、ペプチドが結合する骨格を提供する。その免疫グロブリンは、非機能性免疫グロブリンであり、すなわち、それは、ＫＤ値（結合親和性）１０−５mol/l以上（例えば１０−３mol/l）でヒト抗原に結合する。この定義内に収まる免疫グロブリンは、例えば、重鎖および／または軽鎖の両方が、１つ以上のフレームワークまたは／および超可変領域の一部または全てを欠く免疫グロブリン、重鎖および／または軽鎖の両方が可変ドメイン（領域）を有しない免疫グロブリン、非ヒト抗原に対してＫＤ値１０−７mol/l以下（例えば、１０−１０mol/l）の免疫グロブリンである。
【００７０】
本発明の理解に役立てるために、以下の実施例、配列表および図を提供し、その真の範囲を添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の趣旨から逸脱することなしに、記載の手順に手直しを加えることが可能なことは理解されよう。
【００７１】
実施例
物質および方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A.ら, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版, NIH Publication No 91-3242に示している。
【００７２】
ＥＵナンバーリング（Edelman, G.M.ら, PNAS 63 (1969) 78-85；Kabat, E.A.ら, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版, NIH Publication No 91-3242）に従って、抗体鎖のアミノ酸に番号を付す。
【００７３】
組換えＤＮＡ技術
ＤＮＡを操作するために、Sambrook, J.ら, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載している標準的方法を使用した。製造業者の使用説明書に従って、分子生物学的試薬を使用した。
【００７４】
タンパク質の定量
ペプチド−免疫グロブリン−複合体のタンパク質の濃度は、アミノ酸配列を基準として算出したモル減衰係数を使用し、２８０nmで光学密度（ＯＤ）を定量することによって定量した。
【００７５】
ＤＮＡ配列決定
MediGenomix GmbH（Martinsried, Germany）で実施した二本鎖シークエンシングによってＤＮＡ配列を決定した。
【００７６】
ＤＮＡおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
配列作成、マッピング、分析、注釈、および作図には、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）社製ソフトウェアパッケージ10.2版およびInfomax社製Vector NTI Advance 8.0版を使用した。
【００７７】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、化学合成し作成したオリゴヌクレオチドから、Medigenomix GmbH (Martinsried, Germany)により調製した。ＰＣＲ増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによって、唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を隣接する１００〜６００bp長の遺伝子セグメントを組み立て、続いてＡ−オーバーハングを通じてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Invitrogen）中にクローン化した。サブクローン化した遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【００７８】
免疫グロブリン複合体のアフィニティー精製
公知の方法に従って、タンパク質A-Sepharose（商標）CL-4B（Amersham Bioscience）を使用し、アフィニティークロマトグラフィーによって、発現し分泌されたペプチド−免疫グロブリン−複合体を精製した。手短に言えば、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間）および０．４５μmフィルターによるろ過の後、ＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌおよび２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したタンパク質A-Sepharose（商標）CL-4Bカラムに、免疫グロブリン複合体を含む清澄な培養上清をのせた。ＰＢＳ平衡化緩衝液と０．１Mクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて、未結合タンパク質を洗い流した。免疫グロブリン複合体を０．１Mクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させ、画分を含有する免疫グロブリン複合体を１M Tris-Baseで中和した。次いで、４℃でＰＢＳ緩衝液に対して免疫グロブリン複合体を徹底的に透析し、Biomax-SK膜（Millipore）を備えたUltrafree遠心式フィルター器具を用いて濃縮し、０℃の氷水浴に貯蔵した。
【００７９】
実施例１
発現プラスミドの作製
抗ＩＧＦ−１Ｒ重鎖可変領域（ＶＨ）の遺伝子セグメントと、ヒトγ１−重鎖定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の遺伝子セグメントと同様に、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）抗体（以下、抗ＩＧＦ−１ＲまたはＩＲともいう）の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする遺伝子セグメントと、ヒトκ−軽鎖定常領域（ＣＬ）（配列についてはＵＳ２００５／０００８６４２を参照されたい）をコードする遺伝子セグメントとを連結した。
【００８０】
ａ）ベクター４８１８
ベクター４８１８は、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞中で、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の重鎖（ゲノム的に組織化された発現カセット、エクソン−イントロン組織化）を一時的に発現させるための発現プラスミドである。それは以下の機能性エレメントを含む：
【００８１】
抗ＩＧＦ−１Ｒ γ１−重鎖発現カセットの他に、このベクターは以下：
−  選択可能なマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子、
−  エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−  大腸菌でこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８の複製起点、および
−  大腸菌にアンピシリン耐性を授けるβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【００８２】
抗ＩＧＦ−１Ｒ γ１−重鎖遺伝子の転写ユニットは、以下のエレメント：
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  合成５’非翻訳領域（ＵＴ）、
−  シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌｌ−イントロン−Ｌ２］）、
−  特有のＢｓｍＩ制限部位を５’末端に、そしてスプライスドナー部位と特有のＮｏｔＩ制限部位を３’末端に置くセグメント配列をコードする、クローン化した抗ＩＧＦ−１Ｒ可変重鎖（Ｌ２シグナル配列）、
−  マウス重鎖エンハンサーエレメントを含むマウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン２（部分ＪＨ３、ＪＨ４）（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、
−  ゲノムヒトγ１−重鎖遺伝子定常領域、
−  ヒトγ１−免疫グロブリンのポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
−  ５’末端および３’末端に、それぞれ特有の制限部位ＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ
から構成される。
【００８３】
抗ＩＧＦ−１Ｒ γ１−重鎖発現ベクター４８１８のプラスミドマップを図２に示す。
【００８４】
ｂ）ベクター４８０２
ベクター４８０２は、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞中で、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖（ｃＤＮＡ）を一時的に発現させるための発現プラスミドである。それは以下の機能性エレメントを含む。
【００８５】
抗ＩＧＦ−１Ｒ κ−軽鎖発現カセットの他に、このベクターは以下：
−  選択可能なマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子、
−  エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−  大腸菌でこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８の複製起点、および
−  大腸菌にアンピシリン耐性を授けるβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【００８６】
抗ＩＧＦ−１Ｒ κ−軽鎖遺伝子の転写ユニットは、以下のエレメント：
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  クローン化した抗ＩＧＦ−１Ｒ可変軽鎖ｃＤＮＡであり、以下を含む：
−  未変性５’ＵＴ、および
−  特有のＢｇＩＩＩ制限部位を５’末端に置くヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子の未変性軽鎖シグナル配列、
−  ヒトκ−軽鎖遺伝子定常領域、
−  ヒト免疫グロブリンκ−ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
−  ５’末端および３’末端に、それぞれ特有の制限部位ＡｓｃＩおよびＦｓｅＩ
から構成される。
【００８７】
抗ＩＧＦ−１Ｒ κ−軽鎖発現ベクター４８０２のプラスミドマップを図３に示す。
【００８８】
ｃ）プラスミド４９６２
ベクター４９６２は、発現プラスミド４９６５、４９６６および４９６７を組み立てる基本構造として働いた。これらのプラスミドにより、改変された抗体重鎖（可変ドメインなしにＮ末端複合、ｃＤＮＡ組織化）をＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現できるようになった。プラスミド４９６２は以下の機能性エレメントを含む。
【００８９】
γ１−重鎖定常領域用の発現カセットの他に、このベクターは以下：
−  選択可能なマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子、
−  エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−  大腸菌でこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８の複製起点、および
−  大腸菌にアンピシリン耐性を授けるβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【００９０】
γ１−重鎖定常領域遺伝子（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の転写ユニットは、以下のエレメント：
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  ５’末端に単一のＢｇｌＩＩ制限部位および３’末端（ＣＨ１Ｎ末端内ＮｈｅＩ部位）に単一のＮｈｅＩ制限部位を含む合成リンカー（配列番号１３）。
【表３】
2009512655.tif 000005
−  ヒトγ１−重鎖遺伝子定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ｃＤＮＡ組織化）、
−  ヒトγ１−免疫グロブリンのポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
−  ５’末端および３’末端に、それぞれ特有の制限部位ＡｓｃＩおよびＦｓｅＩ
から構成される。
【００９１】
γ１−重鎖定常領域遺伝子ベクター４９６２のプラスミドマップを図４に示す。
【００９２】
ｄ）プラスミド４９６１
ベクター４９６１は発現プラスミド４９７０〜４９７５を組み立てる基本構造として働いた。これらのプラスミドにより、改変された抗体重鎖（Ｃ末端複合）をＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現できるようになった。
【００９３】
基本ベクター４９６１は、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞中で抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体重鎖（ゲノム的に組織化された発現カセット）を一時的に発現させるための発現プラスミドである。それは以下の機能性エレメントを含む。
【００９４】
抗ＩＧＦ−１Ｒ γ１−重鎖発現カセットの他に、このベクターは以下：
−  選択可能なマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子、
−  エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−  大腸菌でこのプラスミドを複製させるベクターｐＵＣ１８の複製起点、および
−  大腸菌にアンピシリン耐性を授けるβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【００９５】
抗ＩＧＦ−１Ｒ γ１−重鎖遺伝子の転写ユニットは、以下のエレメント：
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  合成５’ＵＴ、
−  シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（Ｌ１、イントロン、Ｌ２）、
−  特有のＢｓｍＩ制限部位を５’末端（Ｌ２シグナル配列）に、そしてスプライスドナー部位と特有のＮｏｔＩ制限部位を３’末端に置くセグメント配列をコードするクローン化した抗ＩＧＦ−１Ｒ可変重鎖、
−  マウス重鎖エンハンサーエレメントを含むマウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン２（部分ＪＨ３、ＪＨ４）（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、
−  ゲノムヒトγ１−重鎖遺伝子定常領域と、わずかに改変されたＣＨ３−ＩｇＧ１ポリアデニル化（ｐＡ）連結領域（配列番号１４、特有のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位の挿入）、
【表４】
2009512655.tif 000006
−  ヒトγ１−免疫グロブリンのポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、ならびに
−  ５’末端と３’末端に、それぞれ特有の制限部位ＡｓｃＩおよびＦｓｅＩ
から構成される。
【００９６】
改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ γ１−重鎖発現ベクター４９６１のプラスミドマップを図５に示す。
【００９７】
ｅ）プラスミド４９６４
ベクター４９６４は発現プラスミド４９７６および４９７７を組み立てる基本構造として役立てた。これらのプラスミドにより、改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖（Ｎ末端結合）をＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現できるようになった。
【００９８】
プラスミド４９６４は、発現プラスミド４８０２の変異体である。
【００９９】
抗ＩＧＦ−１Ｒ κ−軽鎖遺伝子の転写ユニットを以下に示すように改変した：
【０１００】
特有のＢｇｌＩＩ制限部位を５’末端に、そして特有のＮｈｅＩ制限部位をＶＬ領域に直接連結して３’末端に置く合成リンカーにより、未変性軽鎖シグナル配列を置き換える（配列番号１５）。
【表５】
2009512655.tif 000007
【０１０１】
改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ κ−軽鎖発現ベクター４９６４のプラスミドマップを図６に示す。
【０１０２】
ｆ）プラスミド４９６９
発現プラスミド４９６８および４９６９は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖用の発現プラスミドであるプラスミド４８０２に由来する。そのプラスミドは、改変された抗体軽鎖フラグメントをコードする（可変ドメインなしにＮ末端結合、ポリペプチド−リンカー−κ鎖定常領域）。
【０１０３】
プラスミド４９６８および４９６９を構築するために、特有のＢｇｌＩＩ制限部位をＣＭＶプロモーターの３’末端に導入し、特有のＢｂｓＩ制限部位を抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖の定常領域の内側に導入した（配列番号１６）。
【表６】
2009512655.tif 000008
【０１０４】
ｇ）プラスミド４９６３
ベクター４９６３は、発現プラスミド４９７８および４９７９を組み立てる基本構造として役立てた。これらのプラスミドにより、改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖（Ｃ末端結合）をＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現できるようになった。
【０１０５】
プラスミド４９６３は、発現プラスミド４８０２の変異体である。
【０１０６】
抗ＩＧＦ−１Ｒ κ−軽鎖遺伝子の転写ユニットを以下に示すように改変した。
−  ヒトκ−軽鎖定常遺伝子領域をＣ−κ−Ｉｇ−κｐＡ連結領域でわずかに改変した（特有のＨｉｎｄＩＩＩおよびＫａｓＩ制限部位の挿入、配列番号１７）。
【表７】
2009512655.tif 000009
【０１０７】
改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ軽鎖発現ベクター４９６３のプラスミドマップを図７に示す。
【０１０８】
実施例２
最終発現プラスミドの作製
公知の組換え法や技術を用いて、一致する核酸セグメントの結合により、免疫グロブリン遺伝子セグメント、任意のリンカー遺伝子セグメント、およびポリペプチド遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン融合遺伝子（重鎖および軽鎖）を組み立てた。
【０１０９】
ペプチドリンカーおよびポリペプチドをコードする核酸配列をそれぞれ化学合成で合成し、次いで大腸菌プラスミド中にライゲートした。ＤＮＡシークエンシングによって、サブクローン化した核酸配列を検証した。
【０１１０】
それぞれ、免疫グロブリンポリペプチド鎖フラグメント（抗体軽鎖または重鎖の定常領域）、ポリペプチド結合位置（Ｎ末端またはＣ末端）である、使用した免疫グロブリンポリペプチド鎖（全長重鎖または軽鎖）、使用したリンカー、ならびに使用したポリペプチドを表２（３ページ目）、表３、および表３ａに示す。
【０１１１】
表３：使用したタンパク質およびポリペプチド。アミノ酸配列、および位置ナンバーリングはＢＨ８参照株に示す通りである（座位ＨＩＶＨ３ＢＨ８；フランスから得たＨＩＶ−１単離ＬＡＩ／ＩＩＩＢクローンＢＨ８；Ratner, L. ら, Nature 313 (1985) 277-284）。
【０１１２】
【表８】
2009512655.tif 000010
【０１１３】
表３ａ：化学的に調製した免疫グロブリン複合体遺伝子構築に使用した遺伝子セグメント。
【表９】
2009512655.tif 000011
【０１１４】
改変された免疫グロブリンポリペプチド軽鎖および重鎖（発現カセット）を一時的に発現させるための最終発現プラスミドの構築に使用した成分を、使用した基本的プラスミド、クローニング部位、および抱合型免疫グロブリンポリペプチドをコードする挿入核酸配列に関して表４に示す。
【０１１５】
表４：使用した発現プラスミドの構築に利用した成分。
【表１０】
2009512655.tif 000012
【０１１６】
表５は、ＨＩＶ−１阻害特性を有する、使用したポリペプチド（Ｔ−６５１、Ｔ−２６３５、およびＨＩＶ−１  ｇｐ４１細胞外ドメイン変異体）、免疫グロブリン軽鎖または重鎖を生物活性ペプチドで結合させるために使用したペプチドリンカー、およびコードされたアミノ酸配列から推定された改変抗体鎖の推定分子量のリストである。
【０１１７】
表５：使用したポリペプチドおよび改変された免疫グロブリンポリペプチド鎖の推定分子量の概要。
【表１１】
2009512655.tif 000013
【０１１８】
実施例３
ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞中での免疫グロブリン変異体の一時的発現
１０％超低ＩｇＧ FCS（ウシ胎仔血清、Gibco）、２mMグルタミン（Gibco）、１容量／容量％（v/v）非必須アミノ酸（Gibco）、および２５０μg/ml Ｇ４１８（Roche Molecular Biochemicals）を補充したDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地、Gibco）中で培養した、接着増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（Epstein-Barrウイルス核抗原を発現するヒト胚腎細胞系２９３；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ−１０８５２）の一時的トランスフェクションによって、組換え免疫グロブリン変異体を生成した。トランスフェクションには、Fugene（商標）6トランスフェクション試薬（Roche Molecular Biochemicals）を試薬（μl）：ＤＮＡ（μg）＝３：１〜６：１の範囲の割合で使用した。１：２〜２：１のモル比で軽鎖：重鎖をコードするプラスミドを使用して、異なる２個のプラスミドから免疫グロブリン軽鎖および重鎖を発現させた。細胞培養上清を含む免疫グロブリン変異体をトランスフェクションから４〜１１日後に回収した。上清は、精製するまで氷水浴中０℃で貯蔵した。
【０１１９】
例えば、ＨＥＫ２９３細胞でのヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的情報は、Meissner, P.ら, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に示している。
【０１２０】
実施例４
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング転写、および免疫グロブリン特異的抗体複合体による検出法を用いる発現分析
発現し分泌されたペプチド−免疫グロブリン−複合体は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって処理し、分離した免疫グロブリン複合体鎖をゲルから膜に転写し、続いて免疫学的方法によって検出した。
【０１２１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
４倍濃縮（４×）ＬＤＳ試料緩衝液：グリセロール４ｇ、Tris-Base０．６８２ｇ、Tris塩酸塩０．６６６ｇ、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）０．８ｇ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酸）０．００６ｇ、１重量％（w/w）Serva Blue G250水溶液０．７５ml、１重量％（w/w）フェノールレッド溶液０．７５ml、水を加えて総容量を１０mlにする。
【０１２２】
分泌されたペプチド−免疫グロブリン−複合体を含む培養液を遠心分離して、細胞および細胞残屑を除去した。清澄な上清のアリコートと、４×ＬＤＳ試料緩衝液の１／４容量（v/v）および０．５M １，４−ジチオトレイトール（dithiotreitol）（ＤＴＴ）の１／１０容量（v/v）を混合した。次いで、その試料を７０℃で１０分間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した。NuPAGE（登録商標）Pre-Cast gelシステム（Invitrogen）を製造業者の使用説明書に従って使用した。特に、１０％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）Bis-Tris Pre-Castゲル（ｐＨ６．４）およびNuPAGE（登録商標）MOPS泳動用緩衝液を使用した。
【０１２３】
ウエスタンブロット
転写緩衝液：３９mMグリシン、４８mM Tris塩酸塩、０．０４重量％（w/w）ＳＤＳ、および２０容量％メタノール（v/v）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Burnette（Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203）の「セミドライ−ブロッティング方法」に従って、電気泳動により、分離した免疫グロブリン複合体ポリペプチド鎖をニトロセルロースフィルター膜（孔径：０．４５μm）に移した。
【０１２４】
免疫学的検出
ＴＢＳ緩衝液：５０mM Tris塩酸塩、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に調整
ブロッキング液：１％（w/v）Western Blocking試薬（Roche Molecular Biochemicals）を含むＴＢＳ緩衝液
ＴＢＳＴ緩衝液：０．０５容量％（v/v）Tween-20を含む１×ＴＢＳ緩衝液
免疫学的検出に、ウェスタンブロッティング膜は、振盪しながら室温で、ＴＢＳ緩衝液中で５分間を２回インキュベートし、そしてブロッキング液中で９０分間１回インキュベートした。
【０１２５】
免疫グロブリン複合体ポリペプチド鎖の検出
重鎖：ペプチド−免疫グロブリン−複合体の重鎖を検出するために、ペルオキシダーゼに結合している精製ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した（DAKO, Code No. P 0214）。
【０１２６】
軽鎖：ウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体（DAKO, Code No. P 0129）に結合している精製ペルオキシダーゼを用いて、ペプチド−免疫グロブリン−複合体軽鎖を検出した。
【０１２７】
それらの抗体軽鎖および重鎖の可視化には、洗浄しブロックしたウエスタンブロット膜を最初に、重鎖の場合にはペルオキシダーゼと結合している精製ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体と、または軽鎖の場合にはウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体と結合させた精製ペルオキシダーゼと、１０mlブロッキング溶液中１：１０，０００希釈で、振盪しながら終夜４℃でインキュベートした。室温で１０分間、膜をＴＢＴＳ緩衝液で３回、そしてＴＢＳ緩衝液で１回洗浄後、ウエスタンブロット膜をルミノール／ペルオキシド（peroxid）溶液で展開し化学発光させた（Lumi-Light<PLUS>ウェスタンブロッティング基質、Roche Molecular Biochemicals）。従って、膜を１０mlのルミノール／ペルオキシド（peroxid）溶液中で１０秒〜５分間インキュベートし、その後Lumi-Imager F1 Analysator（Roche Molecular Biochemicals）を用いて発光を検出し、かつ／またはＸ線フィルムにより記録した。
【０１２８】
LumiAnalystソフトウェア（３．１版）によりスポット強度を数量化した。
【０１２９】
免疫ブロットの複数染色
検出用に使用した二次的ペルオキシダーゼで標識化した抗体複合体は、１００mM β−メルカプトエタノールおよび２０％（w/v）ＳＤＳを含む１M Tris塩酸塩緩衝液（ｐＨ６．７）中で、膜を７０℃で１時間をインキュベートすることによって、染色されたブロットから除去することができる。この処理後、ブロットを異なる２次抗体により２度目の染色をすることができる。２回目の検出をする前に、ブロットを、ＴＢＳ緩衝液を用いて室温で振盪しながらそれぞれ１０分間３回洗浄する。
【０１３０】
試料配合を表６ａ〜６ｃに記載する。
【０１３１】
表６ａ：ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル／ウエスタンブロット法−ゲル１の試料配合
【表１２】
2009512655.tif 000014
【０１３２】
表６ｂ：ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル／ウエスタンブロット法−ゲル２の試料配合
【表１３】
2009512655.tif 000015
【０１３３】
表６ｃ：ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル／ウエスタンブロット法−ゲル３の試料配合
【表１４】
2009512655.tif 000016
【０１３４】
実施例５
組み立てられた免疫グロブリン複合体の検出
タンパク質A-Sepharose（商標）CL-4Bとの親和性結合による免疫グロブリン複合体ポリペプチドの精製および濃縮
（１つ以上の）プラスミド上に位置する（１個以上の）構造的免疫グロブリンポリペプチド鎖遺伝子の一時的発現に適切な条件下で、１つ以上のプラスミドを含むＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を６〜１０日間培養した。１．８mlのエッペンドルフカップに入れた１mlの清澄な培養上清に、０．１mlのタンパク質A-Sepharose（商標）CL-4B（Amersham Biosciences）懸濁液［タンパク質A-Sepharose（商標）とＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４，１３７mM ＮａＣｌ、および２．７mM ＫＣｌ（ｐＨ７．４）の１：１（v/v）懸濁液］を加えた。懸濁液を室温で１〜１６時間振盪しながらインキュベーションした。その後、遠心分離によって（３０秒、５０００rpm）によってSepharoseビーズを沈降させ、上清を廃棄した。続いて、Sepharoseのペレットを、それぞれ、１．６mlのＰＢＳ緩衝液、１．６mlの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、および１．６mlの蒸留水で洗浄した。０．１mlの１×ＬＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を用いて、７０℃で５〜１０分間、タンパク質Ａ結合免疫グロブリンをSepharoseビーズから抽出した。実施例４に記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離とクマシーブリリアントブルーでの染色により分析を行った。
【０１３５】
結果：
一時的発現後の重鎖および軽鎖の発現／分泌分析：
図８ａ−ｃ：アフィニティー精製した免疫グロブリン複合体をクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。試料配合は表６による。
免疫グロブリンポリペプチド鎖の免疫検出：
図９ａ−ｃ：ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現後、細胞培養上清中の軽鎖の免疫検出。
図１０ａ−ｃ：ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現後、細胞培養上清中の重鎖の免疫検出。
【０１３６】
図８ａ−ｃ、９ａ−ｃおよび１０ａ−ｃから、免疫グロブリン軽鎖および重鎖は一時的に発現し、培地に分泌されることが推定できる。免疫グロブリン鎖が、１つまたはいくつかの糖鎖形成部位を有する場合、最終ペプチド−免疫グロブリン−複合体鎖および単一免疫グロブリン複合体鎖は、それぞれ、厳密には所定の分子量を持たないが、グリコシル化の程度に応じて分子量が分配されている。これにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、一免疫グロブリン複合体鎖を表す、全ての種が均質に遊走せず、従ってそれらのバンドは広がるということが生じる。
【０１３７】
免疫グロブリンとタンパク質Ａの親和性結合は、（１つ以上の）重鎖のＦｃ−部分の相互作用にのみ基づくということ、そして重鎖に加えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー色素での染色後に軽鎖が検出されるということによって、免疫グロブリン複合体は正確に組み立てられ、軽鎖および重鎖からなると結論づけることができる。
【０１３８】
実施例６
ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡで発現された重鎖の定量
細胞培養上清中の免疫グロブリン複合体重鎖ポリペプチドの濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量したが、このＥＬＩＳＡは、捕獲試薬としてビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを使用し、検出には、ペルオキシダーゼに結合させた抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントを使用した。
【０１３９】
ストレプトアビジンでコートした９６ウェルプレート［Pierce Reacti-Bind（商標）ストレプトアビジンでコートしたポリスチレンストリッププレート、コード番号：１５１２１］を０．５μg/mlのビオチン化したヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント［（Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ−Ｆｃγ＞Bi；Dianova、コード番号：１０９−０６６−０９８］捕獲抗体（０．１ml/well）を含む希釈緩衝液［希釈緩衝液：０．５重量／容量％（w/v）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液］を用いて、室温で（ＲＴ）１時間振盪しながらインキュベーションすることによりコートした。その後、プレートを、０．３mlを超える洗浄緩衝液［洗浄緩衝液：１重量／容量％（w/v）Tween 20を含むＰＢＳ］で３回洗浄した。細胞培養上清を含むＩｇＧ免疫グロブリン複合体（試料）を希釈緩衝液中０．５〜２０ng/mlの濃度になるまで連続的に（二回）希釈し、プレートに入れ、室温で１時間振盪しながらインキュベーションした。精製した抗ＩＧＦ−１Ｒ標準的抗体（０．５〜２０ng/ml）を含む希釈緩衝液をＩｇＧタンパク質の検量線の生成に使用した。０．３ml/wellの洗浄緩衝液でプレート３回を洗浄後、ヤギポリクローナル抗ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ＩｇＧ［Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ−Ｆｃγ＞POD；Dianova、コード番号：１０９−０３６−０９８］のペルオキシダーゼと結合したＦ（ａｂ’）２フラグメントによって、ヒトＦｃγに結合した複合体を検出した。プレートを０．３ml/wellの洗浄緩衝液で３回洗浄後、そのプレートをABTS（登録商標）［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸］ペルオキシダーゼ基質溶液（Roche Molecular Biochemicals、コード番号：１６８４３０２）で展開した。１０〜３０分後、Tecan Spectrafluorplusプレートリーダー（Tecan Deutschland GmbH）により、４０５nmおよび４９０nmで、試薬ブランク（インキュベーション緩衝液＋ＡＢＴＳ溶液）に対して吸光度を測定した。バックグラウンド補正には、式Ｉによる４０５nmでの吸光度から４９０nmでの吸光度を差し引いた。全試料を少なくとも二つ組でアッセイし、二重または三重の吸光度の測定値を平均化した。試料のＩｇＧ含有量を検量線から算出した。
【化１】
2009512655.tif 000017
【０１４０】
実施例７
生ウイルス抗ウイルスアッセイ
生ＮＬ−Ｂａｌウイルスを産生させるために、１０％ウシ胎仔血清（FCS），１００U/mLペニシリン、１００μg/mLストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミン、および０．５mg/mLゲニチシン（geniticin）（培地は全てInvitrogen／Gibco社製）を含むダルベッコ改変最少培地（DMEM）で培養したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞系（Invitrogen）中に、プラスミドｐＮＬ−Ｂａｌ（米国国立衛生研究所ＡＩＤＳ試薬プログラム）をトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、ウイルス粒子を含む上清を回収し、孔径０．４５μmのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルター（Nalgene）により細胞残屑をろ過除去し、アリコートに入れて−８０℃で貯蔵した。アッセイ性能を規準化するために、ウイルスストックアリコートを使用して、ＪＣ５３−ＢＬ（米国国立衛生研究所ＡＩＤＳ試薬プログラム）細胞に感染させ、ウェル当たり約１．５×１０５RLU（相対的光単位）を得た。試験ペプチド−免疫グロブリン−複合体、抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体２Ｄ７（PharMingen；ＣＣＲ５、ケモカイン受容体；ＨＩＶ−１感染の共受容体）を含む参照抗体、および参照ペプチド（Ｔ−６５１およびＴ−２６３５）を９６ウェルプレート中で連続希釈した。アッセイは四つ組で実施した。各プレートには、細胞対照ウェルとウイルス対照ウェルを含めた。各ウェルにウイルスストック１．５×１０５RLUの等量を加え、次いで２．５×１０４ ＪＣ５３−ＢＬ細胞を各ウェルに加え、最終アッセイ容量を２００μl/wellにした。３日間３７℃、９０％相対湿度、および５％ＣＯ２でインキュベーションした後、培地を吸引し、Steady-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega）５０μlを各ウェルに加えた。室温で１０分間インキュベーションした後、アッセイプレートをルミノメーター（Luminoskan, Thermo Electron Corporation）で読み取った。バックグラウンドを差し引いた後、各用量点のルシフェラーゼ活性％阻害を算出し、Excel用（3.0.5版Build12; Microsoft）XLfit曲線適合化ソフトウェアを使用し、ＩＣ５０を定量した。
【０１４１】
表７：ペプチドおよびペプチド−免疫グロブリン−複合体の抗ウイルス活性
【表１５】
2009512655.tif 000018
【０１４２】
実施例８
単一サイクル抗ウイルスアッセイ
偽型ＮＬ−Ｂａｌウイルスを産生させるために、プラスミドｐＮＬ４−３△ｅｎｖ（ｅｎｖ遺伝子中に欠失を有するＨＩＶ ｐＮＬ４−３ゲノム構築体）およびｐＣＤＮＡ３．１／ＮＬ−ＢＡＬ ｅｎｖ［（国立生物学的製剤研究所ＡＩＤＳ試薬センター施設から入手した）ＮＬ−Ｂａｌ ｅｎｖ遺伝子含有ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド］を１０％ウシ胎仔血清（FCS），１００U/mLペニシリン，１００μg/mLストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミンおよび０．５mg/mLゲニチシン（培地は全てInvitrogen／Gibco社製）を含むダルベッコ改変最少培地（DMEM）で培養したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞系（Invitrogen）に共トランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、偽型ウイルスを含む上清を回収し、孔径０．４５μmのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルター（Nalgene）により細胞残屑をろ過除去し、アリコートに入れて−８０℃で貯蔵した。アッセイ性能を規準化するために、ウイルスストックアリコートを使用して、ＪＣ５３−ＢＬ（米国国立衛生研究所ＡＩＤＳ試薬プログラム）細胞に感染させると、ウェル当たり約１．５×１０５RLU（相対的光単位）が得られた。試験ペプチド−免疫グロブリン−複合体、参照抗体、および参照ペプチド（Ｔ−２０、Ｔ−６５１およびＴ−２６３５）を９６ウェルプレート中で連続希釈した。アッセイは四つ組で実施した。各プレートには、細胞対照ウェルとウイルス対照ウェルを含めた。各ウェルにウイルスストック１．５×１０５RLUの等量を加え、次いでその各ウェルに２．５×１０４ ＪＣ５３−ＢＬ細胞を加え、最終アッセイ容量を２００μl/wellにした。３日間３７℃、９０％相対湿度、および５％ＣＯ２でインキュベーションした後、培地を吸引し、Steady-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega）５０μlを各ウェルに加えた。室温で１０分間インキュベーション後、アッセイプレートをルミノメーター（Luminoskan, Thermo Electron Corporation）で読み取った。バックグラウンドを差し引いた後、各用量点のルシフェラーゼ活性％阻害を算出し、Excel用（3.0.5版Build12; Microsoft）XLfit曲線適合化ソフトウェアを使用しＩＣ５０値を定量した。
【０１４３】
表８：ペプチドおよびペプチド−免疫グロブリン−複合体の抗ウイルス活性
【表１６】
2009512655.tif 000019
【０１４４】
実施例９
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）での抗ウイルスアッセイ
Ficoll-Paque（Amersham, Piscataway, New Jersey, USA）密度勾配遠心分離により、製造業者のプロトコルに従って、（スタンフォード血液センターより入手した）バフィーコートからヒトＰＢＭＣを単離した。手短に言えば、バフィーコートから血液を５０ml円錐チューブに移し、滅菌ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Invitrogen／Gibco）で希釈して最終容量を５０mlにした。２本の５０ml円錐チューブに希釈血液２５mlを移し、１２．５mlのFicoll-Paque Plus（Amersham Bioscienceｓ）で慎重に沈降させ、室温で２０分間４５０×ｇで遠心分離したがブレーキはかけなかった。新たな５０ml円錐チューブに白血球層を慎重に移しＰＢＳで２回洗浄した。残存する赤血球を除去するために、室温で５分間ACK溶解緩衝液（Biosource）で細胞をインキュベーションし、もう一度ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＭＣをカウントし、１０％FCS（Invitrogen／Gibco）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミン、１mMナトリウム−ピルビン酸塩、および２μg/ml Phytohemagglutinin（Invitrogen）を含むRPMI1640中２〜４×１０６細胞/mlの濃度で３７℃、２４時間インキュベーションした。５ Units/mlのヒトＩＬ−２（Roche Molecular Biochemicals）とともに、細胞を最短４８時間インキュベーションした後アッセイした。９６ウェル丸底プレート中、連続希釈した試験ペプチド−免疫グロブリン−複合体、参照免疫グロブリン、および参照ペプチド（Ｔ−２０、Ｔ−６５１およびＴ−２６３５）の存在下、１×１０５ＰＢＭＣにＨＩＶ−１ＪＲ−ＣＳＦウイルス（Koyanagi, Y.ら. Science 236 (1987) 819-822）を感染させた。使用したウイルス量は、１．２ng ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原/wellと等量であった。感染は四つ組で準備した。プレートを３７℃で６日間インキュベーションした。感染の最後で、一結合部位を有するＳ字形用量応答モデルを用いて、p24 ELISA（HIV-1 p24 ELISA #NEK050B）を使用することによって、Microsoft Excel Fit（3.0.5版Build12; equation 205; Microsoft）でウイルス産生を測定した。
【０１４５】
表９：ペプチドおよびペプチド−免疫グロブリン−複合体抗のウイルス活性
【表１７】
2009512655.tif 000020
【０１４６】
実施例１０
ポリペプチドの結合親和性の定量
２５℃でBIAcore（登録商標）3000 instrument（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を使用し、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１タンパク質（ＨＲ、ヘプタッドリピート１および２領域）のＨＲ１−ＨＲ２相互作用をベースとする、ポリペプチドの結合親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。
【０１４７】
BIAcore（登録商標）システムは、分子の相互作用の研究において十分に確立されている。そのシステムによってリガンド／検体結合を連続的リアルタイムモニタリングし、それによって会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡定数（ＫＤ）が定量できる。ＳＰＲ技術は、金被膜バイオセンサーチップの表面近くの屈折率を測定することに基づく。屈折率の変化は、固定リガンドと、溶液に注入された検体との相互作用によって生じた表面の質量変化を示す。分子が表面の固定リガンドに結合すると、質量が増大し、解離すると質量は減少する。
【０１４８】
結合アッセイ
センサーチップＳＡ（ＳＡ、ストレプトアビジン）は、１M ＮａＣｌを含む５０mM ＮａＯＨを３回連続１分間注入することによって予め洗浄した。次いで、ＳＡをコートしたセンサーチップ上に、ビオチン化させたＨＲ１ペプチドビオチン−Ｔ−２３２４（配列番号３７）を固定した。物質移動限界を回避するために、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液［１０mMＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０mM ＮａＣｌ、０．００５％（v/v）界面活性剤Ｐ２０］に溶解しているＨＲ１ペプチドの最低可能値（約２００RU、共鳴単位）をＳＡチップ上に乗せた。測定を開始する前に、５０μL/minの流量で０．５％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１分間パルスすることにより、チップに一回目の再生を行った。
【０１４９】
分析するポリペプチドを含むＨＲ２ ＨＩＶ−１  ｇｐ４１をまず、５０mM ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９）に約１mg/mLの濃度で溶解し、次いでＨＰＳ−Ｐ緩衝液で２５〜１．９５ｎＭの範囲の様々な濃度に希釈した。試料接触時間は５分である（会合相）。その後、チップ表面をＨＢＳ−Ｐで５分間洗浄した（解離相）。全ての相互作用は厳密に２５℃（標準的温度）で実施した。測定サイクル中、試料は１２℃で貯蔵した。１秒につき１シグナルの検出速度でシグナルを検出した。試料を上昇濃度で５０μL/minの流量でＨＲ１結合バイオセンサーエレメントに注入した。０．５％（w/v）ＳＤＳ溶液により５０μL/minの流量で１分間洗浄することによって表面を再生した。
【０１５０】
ｋａ／ｋｄとして定義される平衡定数（ＫＤ）は、BIAevaluation 4.1ソフトウェアパッケージを使用し、数種の異なる濃度によって得られたセンサグラム（sensogram）曲線を分析するによって定量した。ＨＲ２−ＨＲ１相互作用の値から、遊離ストレプトアビジン表面と相互作用したポリペプチドを含むＨＲ２の応答値を引くことによって非特異的結合を修正した。データの適合化後、１：１Langmuir結合モデルを使用した。
【０１５１】
ポリペプチドの脱グリコシル化
ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（PNGaseF, Prozyme, San Leandro, CA）を用いて、Ｎ−グリコシル化したポリペプチド１mgにつきPNGaseFを５０mU使用し、ＰＢＳ緩衝液に約２mg/mlの濃度で溶解した、ＨＲ２を含むポリペプチド試料を３７℃で１２〜２４時間インキュベーションすることにより脱グリコシル化（Ｎ−グリカンの除去）した。
【０１５２】
表１０ａ：ポリペプチドを含むＨＲ２のＨＲ１との代表的な結合定数
【表１８】
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【０１５３】
表１０ｂ：ポリペプチドを含むＨＲ２のＨＲ１に対する代表的なＫＤ値
【表１９】
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【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】ＩｇＧクラス免疫グロブリンの一般的構造を示す図である。
【図２】抗ＩＧＦ−１Ｒ γ１−重鎖発現ベクター４８１８のプラスミドマップである。
【図３】抗ＩＧＦ−１Ｒ κ−軽鎖発現ベクター４８０２のプラスミドマップである。
【図４】γ１−重鎖定常領域遺伝子ベクター４９６２のプラスミドマップである。
【図５】改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ γ１−重鎖発現ベクター４９６１のプラスミドマップである。
【図６】改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ κ−軽鎖発現ベクター４９６４のプラスミドマップである。
【図７】改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ軽鎖発現ベクター４９６３のプラスミドマップである。
【図８ａ】アフィニティー精製した免疫グロブリン複合体のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。試料配合は表６による。
【図８ｂ】アフィニティー精製した免疫グロブリン複合体のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。試料配合は表６による。
【図８ｃ】アフィニティー精製した免疫グロブリン複合体のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。試料配合は表６による。
【図９ａ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現後、細胞培養上清中の軽鎖の免疫検出を示す図である。試料配合は表６による。
【図９ｂ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現後、細胞培養上清中の軽鎖の免疫検出を示す図である。試料配合は表６による。
【図９ｃ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現後、細胞培養上清中の軽鎖の免疫検出を示す図である。試料配合は表６による。
【図１０ａ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現後、細胞培養上清中の重鎖の免疫検出を示す図である。試料配合は表６による。
【図１０ｂ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現後、細胞培養上清中の重鎖の免疫検出を示す図である。試料配合は表６による。
【図１０ｃ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現後、細胞培養上清中の重鎖の免疫検出を示す図である。試料配合は表６による。
【図１１】軽鎖の両アミノ末端が異なる、または類似するペプチドと結合しているペプチド−免疫グロブリン−複合体を示す図である。
【図１２】１個の免疫グロブリンと異なる２個のペプチドからなるペプチド−免疫グロブリン−複合体を示す図である。
【図１３】第一のペプチドが免疫グロブリン軽鎖アミノ末端と結合しており、第二のペプチドが免疫グロブリン重鎖カルボキシ末端と結合している、ペプチド−免疫グロブリン−複合体を示す図である。
【図１４】第一のペプチドが免疫グロブリン軽鎖アミノ末端と結合しており、第二のペプチドが免疫グロブリン重鎖カルボキシ末端と結合している、ペプチド−免疫グロブリン−複合体を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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