(57)【要約】  本発明は発芽玄米含有成分の新たな機能を見出すことを課題とし、安全性が高く、継続的な摂取も可能であり、大量に製造することもでき、食品等への添加が容易で、かつ、有効な神経障害若しくは糖尿病性神経障害予防若しくは改善剤又は機能性食品の提供を課題とする。  本発明は、発芽玄米由来ステロール配糖体(Acylated steryl-β-glucoside(ASG))を有効成分とする神経障害若しくは糖尿病性神経障害予防若しくは改善剤又は機能性食品を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
2-ヒドロキシ-オクタデカン酸を含むステロール配糖体を有効成分とする神経障害予防及び改善組成物。
【請求項２】
請求項1記載のステロール配糖体のステロール骨格が5α-cholest-8(14)-en-3β-olであることを特徴とする神経障害予防及び改善組成物。
【請求項３】
脂肪酸部分として2-ヒドロキシ-オクタデカン酸を含むステロール配糖体を有効成分とする神経障害の予防又は改善剤。
【請求項４】
ステロール骨格として5α-cholest-8(14)-en-3β-olを含むステロール配糖体を有効成分とする神経障害の予防又は改善剤。
【請求項５】
脂肪酸部分として2-ヒドロキシ-オクタデカン酸を含み、かつ、ステロール骨格として5α-cholest-8(14)-en-3β-olを含む、ステロール配糖体を有効成分とする神経障害の予防又は改善剤。
【請求項６】
脂肪酸部分として2-ヒドロキシ-オクタデカン酸を含むステロール配糖体を有効成分とするホモシステインチオラクトナーゼ活性化組成物。
【請求項７】
請求項6記載のステロール配糖体のステロール骨格が5α-cholest-8(14)-en-3β-olであることを特徴とするホモシステインチオラクトナーゼ活性化組成物。
【請求項８】
以下の(i)又は(ii)のいずれかの条件を満たす、一般式(A)で表されるステロール配糖体。
【化１】
2009110612.tif 000014
・・・・・・・・・・・(A)
(i) 一般式(A)中のXは以下の群から選択され、かつ、Yは5α-cholest-8(14)-en-3β-olである
パルミチン酸(16:0)、
ステアリン酸(18:0)、
2-ヒドロキシ-オクタデカン酸(18:0(2h))、
オレイン酸(18:1)、
リノール酸(18:2)、又は、
リグノセリン酸(24:0)
(ii) 一般式(A)中のXは2-ヒドロキシ-オクタデカン酸(18:0(2h))であり、かつ、Yは以下の群から選択される
Campesterol、
Stigmasterol、
5α-cholest-8(14)-en-3β-ol、又は、
β-Sitosterol
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発芽玄米に含まれる新規化合物に関し、当該新規化合物の利用に関する。さらに詳しくは、当該新規化合物の糖尿病性神経障害を予防又は改善する用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者数は、2000年の統計ではアジアでは8,450万人、世界では1億5,100万人である。2002年の厚生労働省糖尿病実態調査によると日本では、糖尿病患者とその予備軍が1,620万人にのぼり、実に成人の6.3人に1人にあたる。また、患者数は2015年にはアジアでは1億3,230万人、世界では2億2,100万人に達すると予測されている(非特許文献1参照)。【０００３】
糖尿病(とうにょうびょう、DiabetesMellitus: DM)は、糖代謝の異常によって起こるとされ、血液中のグルコース濃度が病的に高まることによって、様々な特徴的な合併症をきたすか、きたす危険性のある病気である。ここで、合併症とはその病気がもとになって起こる病気や症状のことをいう。糖尿病自体には重篤な自覚症状がなく、合併症を引き起こすまで治療を受けず病態を悪化させる場合が多い。【０００４】
糖尿病の合併症としては、脳梗塞、脳卒中、心筋梗塞、糖尿病腎症、下肢閉塞性動脈硬化症、糖尿病網膜症、皮膚疾患、感染症、糖尿病性神経障害、高脂血症、脳血管性痴呆症などがあり、中でも糖尿病腎症、糖尿病網膜症、糖尿病性神経障害は三大合併症と呼ばれる。【０００５】
糖尿病の原因としては、遺伝的な要因によるものもあるが、食事などの生活習慣に起因するものが大半を占め、健康食品・機能性食品に対する期待は高まっている。近年、発芽玄米の糖尿病の合併症に対する有用性が注目され、高脂血症の改善効果、心臓血管系疾患の予防(血栓形成抑制)、糖尿病腎症の予防効果などが報告されている。【０００６】
ここで、発芽玄米は玄米を発芽させたもので、出芽の状態がおよそ1mm未満のものをいう。発芽の過程で、降圧作用や抗ストレス作用が知られているγ-アミノ酪酸(γ-aminobutyric acid(GABA))が産生されることが特徴的である。さらに、発芽玄米は豊富な食物繊維、ビタミン、ミネラル、未知の脂質をぬかの層や芽に含んでおり、日本では新しい全粒穀物として、さらには、主食とするための研究対象として一般的である。発芽玄米では様々な健康に対する有用性が研究されており、動物実験においては、ストレプトゾトシン(Streptozotocin(STZ))により誘導された糖尿病ラットの血中グルコース濃度を低下させる作用があることが報告されている(非特許文献2参照)。また、白米と比較して発芽玄米の食事は健常者(非特許文献3参照)及び高血糖の患者(非特許文献4参照)において食後の血中グルコース濃度及びインスリンを低下させることが知られており、糖尿病の予防のための主食としての意義が高いと評価されている。【０００７】
発芽玄米は、従来から健康食品として利用されてきているため、安全性も高く長期運用が可能な製剤や食品を提供できる可能性を持つ。近年、発芽玄米の高脂血症に対する改善効果、心臓血管系疾患の予防(血栓形成抑制)、糖尿病腎症の予防効果などが注目されている。【０００８】
さらに、発芽玄米の糖尿病性神経障害に対する改善効果が調べられているが(非特許文献5)、その有効成分については全く知られていなかった。そこで、本発明者らは、発芽玄米に含まれる糖尿病性神経障害に対する改善効果を有する有効成分を同定し、それによって新規な化合物を見出し、本発明を完成させた。【０００９】
【特許文献１】特開2001-352916公報
【特許文献２】特開2002-136263公報
【特許文献３】特開2002-360192公報
【非特許文献１】Zimmet P, AlbertiKG, Shaw J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature.2001 Dec 13;414(6865):782-7. Review
【非特許文献２】Hagiwara H, Seki T,Ariga T. The effect of pre-germinated brown rice intake on blood glucose andPAI-1 levels in streptozotocin-induced diabetic rats. Biosci Biotechnol Biochem. 2004 Feb;68(2):444-7.
【非特許文献３】Ito Y, Mizukuchi A, Kise M, Aoto H, Yamamoto S, Yoshihara R, Yokoyama J. Postprandial blood glucose and insulin responses to pre-germinated brown ricein healthy subjects. J Med Invest. 2005 Aug;52(3-4):159-64.
【非特許文献４】Ito Y, Shen M, Kise M, Hayamizu K, Yoshino G, Yoshihara R, Yokoyama J. Effectof pre-germinated brown rice on postprandial blood glucose and insulin level insubjects with hyperglycemia. Jpn J Food Chem 2005;12(2):80-4.
【非特許文献５】Usuki S, Ito Y, Morikawa K, Kise M, Ariga T, Rivner M, Yu RK. Effect ofpre-germinated brown rice intake on diabetic neuropathy instreptozotocin-induced diabetic rats. Nutr Metab (Lond). 2007 Nov 23;4(1):25
【非特許文献６】Abbott CA, Mackness MI, Kumar S, Boulton AJ, Durrington PN.  Serumparaoxonase activity, concentration, and phenotype distribution in diabetesmellitus and its relationship to serum lipids and lipoproteins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995 Nov;15(11):1812-8.
【非特許文献７】Silva IV, Caruso-Neves C, Azeredo IM, Carvalho TL, Lara LS, de Mello MC, LopesAG. Urea inhibition of renal (NA+ + K+)ATPase activity is reversed by cAMP.Arch Biochem Biophys. 2002 Oct 15;406(2):183-9.
【非特許文献８】Chung BH, Wilkinson T, Geer JC, Segrest JP. Preparative and quantitativeisolation of plasma lipoproteins: rapid, single discontinuous density gradientultracentrifugation in a vertical rotor. J Lipid Res. 1980 Mar;21(3):284-91.
【非特許文献９】Coste T, Pierlovisi M, Leonardi J, Dufayet D, Gerbi A, Lafont H, Vague P,Raccah D. Beneficial effects of gamma linolenic acid supplementation on nerveconduction velocity, Na+, K+ ATPase activity, and membrane fatty acidcomposition in sciatic nerve of diabetic rats. J Nutr Biochem. 1999Jul;10(7):411-20.
【非特許文献１０】Shaheen Faizi, Muhammad Ali, Rubeena Saleem, Irfanullah, Sarah Bibi, Complete1H and 13C NMR assignments of stigma-5-en-3-O-β-glucoside and its acetylderivative. Magnetic Resonance in Chemistry, 39(7):399-405 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発芽玄米は従来から健康食品として利用されてきているため、安全性も高く長期運用が可能な製剤や食品を提供できる可能性を持つ。すなわち、本発明の糖尿病神経障害の改善効果を得るためには、単離した有効成分を摂取するまでもなく発芽玄米のまま全体として摂取することにより一定の効果が得られる。また、当該改善効果は複数の因子が協同的に働くことによりもたらされている可能性がある。【００１１】
一方で、もし当該効果を有する有効成分の同定に成功すれば、発芽玄米そのままでは不可能な大量又は高濃度の投与が可能になるだけでなく、糖尿病性神経障害の発症メカニズムの解明につながることさえ期待される。【００１２】
そこで、本発明は発芽玄米に含まれ糖尿病性神経障害を改善する機能を有する有効成分の同定を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、発芽玄米又は発芽玄米の糠(ぬか)の層に含まれるステロール配糖体(Acylated steryl-β-glucoside(ASG)。本出願においては、ステロール配糖体、Acylatedsteryl-β-glucoside、ASGの用語を同義に用いる。)に糖尿病性神経障害を改善することを見出し本発明に至った。【００１４】
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
(1)2-ヒドロキシ-オクタデカン酸を含むステロール配糖体を有効成分とする神経障害予防及び改善組成物。
(2)(1)記載のステロール配糖体のステロール骨格が5α-cholest-8(14)-en-3β-olであることを特徴とする神経障害予防及び改善組成物。
(3)脂肪酸部分として2-ヒドロキシ-オクタデカン酸を含むステロール配糖体を有効成分とする神経障害の予防又は改善剤。
(4)ステロール骨格として5α-cholest-8(14)-en-3β-olを含むステロール配糖体を有効成分とする神経障害の予防又は改善剤。
(5)脂肪酸部分として2-ヒドロキシ-オクタデカン酸を含み、かつ、ステロール骨格として5α-cholest-8(14)-en-3β-olを含む、ステロール配糖体を有効成分とする神経障害の予防又は改善剤。
(6)脂肪酸部分として2-ヒドロキシ-オクタデカン酸を含むステロール配糖体を有効成分とするホモシステインチオラクトナーゼ活性化組成物。
(7)(6)記載のステロール配糖体のステロール骨格が5α-cholest-8(14)-en-3β-olであることを特徴とするホモシステインチオラクトナーゼ活性化組成物。
(8)以下の(i)又は(ii)のいずれかの条件を満たす、一般式(A)で表されるステロール配糖体。【００１５】
【化１】
2009110612.tif 000002
・・・・・・・・・・・(A)
(i) 一般式(A)中のXは以下の群から選択され、かつ、Yは5α-cholest-8(14)-en-3β-olである
パルミチン酸(16:0)、
ステアリン酸(18:0)、
2-ヒドロキシ-オクタデカン酸(18:0(2h))、
オレイン酸(18:1)、
リノール酸(18:2)、又は、
リグノセリン酸(24:0)
(ii) 一般式(A)中のXは2-ヒドロキシ-オクタデカン酸(18:0(2h))であり、かつ、Yは以下の群から選択される
Campesterol、
Stigmasterol、
5α-cholest-8(14)-en-3β-ol、又は、
β-Sitosterol
【発明の効果】
【００１６】
本発明の発芽玄米又は発芽玄米の糠(ぬか)の層を原料とした(Acylated steryl-β-glucoside, ASG)は、糖尿病性神経障害改善効果を有する。
したがって、本発明によれば糖尿病性神経障害の予防剤又は改善剤として利用することができる。
そして、安全性が高く、継続的な摂取も可能であり、かつ精製あるいは合成して大量に製造することもでき、食品等への添加が可能であることからも、人又は動物の健康増進や疾病予防などとして貢献できる可能性が大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】Acylatedsteryl-β-glucoside(ASG)の構造
【図１−２】Campesterol及びStigmasterolの構造
【図１−３】5α-cholest-8(14)-en-3β-ol及びβ-sitosterolの構造
【図２】ホモシステイン・チオラクトン修飾LDL(HT-modifiedLDL)存在下において、発芽玄米由来ASGが神経軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase(Na/KATPase)活性に与える影響
【図３】発芽玄米脂質画分の各フラクションを更に薄層クロマトグラフィー(thinlayer chromatography, TLC)を用いて分画し、オルシノール(Orcinol)染色した結果
【図４】A2をヘリコバクター菌(Helicobacterpylori)由来の脂質H4(Acylated steryl-β-glucoside)と比較した結果
【図５−１】発芽玄米由来ASG(A2画分)を核磁気共鳴分析法(NMR)で解析したスペクトル(1)
【図５−２】発芽玄米由来ASG(A2画分)を核磁気共鳴分析法(NMR)で解析したスペクトル(2)
【図６】発芽玄米由来ASG(A2画分)を核磁気共鳴分析法(NMR)で解析した結果
【図７】ガスクロマト質量分析法(GCMS)による解析の結果
【図８】ASGがHTase活性に与える影響
【図９】各フラクションのHPTLC展開像-1
【図１０】各フラクションのHPTLC展開像-2
【符号の説明】
【００１８】
A2     発芽玄米の糠の抽出分離画分Fr.2に含まれ、TLC-オルシノール発色で検出される糖脂質成分。
A3     糠の抽出分離画分Fr.2に含まれ、TLC-オルシノール発色で検出される糖脂質成分。
A4     発芽玄米の糠の抽出分離画分Fr.2に含まれ、TLC-オルシノール発色で検出される糖脂質成分。
A5     糠の抽出分離画分Fr.2に含まれ、TLC-オルシノール発色で検出される糖脂質成分。
B1     糠の抽出分離画分Fr.3に含まれ、TLC-オルシノール発色で検出される糖脂質成分。
B2     糠の抽出分離画分Fr.3に含まれ、TLC-オルシノール発色で検出される糖脂質成分。
B3     糠の抽出分離画分Fr.3に含まれ、TLC-オルシノール発色で検出される糖脂質成分。
B4     糠の抽出分離画分Fr.3に含まれ、TLC-オルシノール発色で検出される糖脂質成分。
B5     糠の抽出分離画分Fr.3に含まれ、TLC-オルシノール発色で検出される糖脂質成分。
A2(alkaline)      精製したA2をアルカリ処理したもの
【００１９】
Fr     発芽玄米あるいは玄米の糠の粗脂質抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーでさらに分画したもの。
GSL St      Standardglycosphingolipid
Cer     Ceramide
GlcCer     Glucosylceramide
GalCer     Galactosylceramide
LacCer     Lactosylceramide
Gb3     Globotriaosylceramide
Gb4     Golbotetraosylceramide
C/M/W     クロロホルム/メタノール/水
C:M:W     クロロホルム:メタノール:水
【００２０】
Glc     Glucose
Lac     Lactose
Suc     Sucrose
BBG     Bovine brain ganglioside mixture
ASG     Acylated steryl-β-glucoside、ステロール配糖体
H4(helicobacter)      Acylated steryl-β-glucosidederived from Helicobacter pylori
H6(helicobacter)      Steryl-β-glucoside derived fromHelicobacter pylori
ASG-matreya     Commercial standard of ASG derived from soybean
【００２１】
16:0     パルミチン酸(palmitic acid)
18:0     ステアリン酸(stearic acid)
18:0(2h)       2-ヒドロキシ-オクタデカン酸(2-hydroxy-octadecanoicacid)
18:1     オレイン酸(oleic acid)
18:2     リノール酸(linoleic acid)
22:0     ベヘン酸(behenic acid)
24:0     リグノセリン酸(lignoceric acid)
【００２２】
HTase     ホモシステイン・チオラクトン(homocysteine thiolactone)の加水分解酵素
HT     ホモシステイン・チオラクトン(homocysteine thiolactone)
LDL     低密度リポタンパク質
HT-modifiedLDL      ホモシステイン・チオラクトン修飾LDL
HT-LDL     ホモシステイン・チオラクトン修飾LDL
Na/KATPase      ナトリウム/カリウムATPase
SG     発芽玄米由来ASGから脂肪酸を除去したもの
S-ASG     大豆より精製したASG
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
[定義]
糖尿病性神経障害とは、糖尿病がもとになって起こる合併症の一つであり、末梢神経障害と自律神経障害のことである。臨床的には初期には手足などのしびれや痛み、慢性期には感覚麻痺、運動神経失調を引き起こす障害である。病理学的には、神経組織のミエリン鞘と軸索の変性と損傷が挙げられる。これらの神経障害は、末梢神経伝導速度の低下、神経軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase(Na, K-ATPase)活性の低下として観察、定量することができる。【００２４】
糖尿病性神経障害の改善効果とは、発芽玄米由来ASG又は発芽玄米由来ASGの有効成分が有する効果であって、人又は動物の個体、組織又は細胞において、糖尿病性神経障害を原因として低下したナトリウム/カリウムATPase活性又はHTase活性を正常値に近づけるべく上昇させる効果あるいは運動神経伝導速度の低下を防止する効果をいう。【００２５】
本発明でいう神経障害とは、糖尿病性神経障害と同一又は類似の生理学的、細胞組織学的、又は生化学的所見を示す病態をいうが、糖尿病を原因とするものに限られない。すなわち、中枢および末梢神経において、病理組織学的には、特に、神経軸索の損傷、ミエリン鞘脱髄、神経生理学的には、運動神経伝導速度の低下、生化学的には、神経膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の低下、又は血清中の高密度リポ蛋白(HDL)分画に含まれているHTase活性の低下として観察、定量することができる全ての神経障害をいう。【００２６】
HTaseとは、動脈硬化の危険因子であるホモシステイン・チオラクトン(homocysteinethiolactone)の加水分解酵素のことであり、パラオキソナーゼ(paraoxonase)ファミリーに分類される。神経障害を伴った患者ではパラオキソナーゼ活性が低下することが報告されていることから(非特許文献6参照)、HTase活性の低下は動脈硬化の危険因子となるだけではなく、神経障害の進行程度にも関連すると考えられている。【００２７】
[実験材料及び方法]
<発芽玄米>
公知の方法(特許文献1-3参照)により調整した。【００２８】
<分画-脂質画分の抽出>
脂質画分は5gの発芽玄米あるいは玄米の糠から、30ml及び20mlのクロロホルム・メタノール(1:1及び2:1、容積比)を用いて2回抽出して脂質画分とした。【００２９】
<分画-シリカゲルクロマトグラフィー>
糖脂質の組成分析と各成分の精製
発芽玄米および玄米の脂質画分をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー(1x15 cm)にかけ、溶媒クロロホルム:ヘキサン(1:1) 40 ml、クロロホルム:ヘキサン(9:1) 70 ml を通液して得た分画をFr.1とする。引き続き、溶媒クロロホルム:メタノール(9:1)80 mlを通液して得た分画をFr.2とする。さらに溶媒クロロホルム:メタノール:水(7:3:0.1) 80 ml、溶媒クロロホルム:メタノール:水(3:6:0.8)120 mlを通液して得たそれぞれの分画をFr.3とFr.4とする。各分画をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。各分画1 μgをシリカゲルはく層(TLC)プレートにスポットして、溶媒クロロホルム:メタノール:水(70:30:0.1)にて展開する。展開後、TLCプレートにオルシノール試薬をスプレーする。TLCプレートをホットプレートに載せ110℃で5分間加熱する。オルシノール発色で検出された各糖脂質成分をデンシトメータで定量して組成を求めた。【００３０】
A2画分の精製
発芽玄米および玄米の糠の抽出分離画分Fr.2およびFr.3に含まれる各糖脂質成分(A2, A4, B1, B2, B3, B4, B5)をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー(1x15cm)にかけ、溶媒(クロロホルム:メタノール:水(70:30:0.1)、流速0.2ml/min)を用いてフラクションコレクターで単離精製をした。【００３１】
<アルカリ分解>
A2 (0.1mg)に0.5 mlの0.5 M NaOH /メタノール:水(4:1)を加えて溶解して室温で20時間撹拌する。撹拌後に、2.5 mlのクロロホルム:メタノール(2:1)を加えてフォルチ分配をおこなう。
下層を集めて、濃縮する。分配した下層を少量のクロロホルムTLCプレートにスポットして、溶媒 クロロホルム:メタノール:水(70:30:0.1)にて展開する。展開後、TLCプレートにオルシノール試薬をスプレーする。TLCプレートをホットプレートに載せ110℃で5分間加熱する。オルシノール発色させ、アルカリ処理前後のA2およびA4のTLC展開移動度を比較した。【００３２】
<分画-薄層クロマトグラフィー>
シリカゲルをコートした市販の縦10 cm のTLCプレート(Silica gel 60, Merck)の下より1.5cmの位置にマイクロシリンジでサンプルを塗布する。展開溶媒クロロホルム:メタノール:水(70:30:0.1)にて展開した。展開後風乾した。【００３３】
<オルシノール(orcinol)染色>
0.2%オルシノール/2N硫酸をスプレーによりTLCプレートに均一にスプレーする。スプレーを受けたTLCプレートを110℃に熱されたホットプレート上で加熱する。TLCプレート上で分離した糖を含む各成分は特異的な小豆色の発色を呈することで同定された。【００３４】
<ガスクロマト質量分析法(GCMS)>
A2(50μg)を1.0mlの1 N 塩酸/メタノールに溶かし、86℃で16から24時間、加水分解した。反応後、室温まで冷却した後に、1.0 mlのヘキサンを加えて撹拌、遠心して2層に分離した。下層
に再び1.0 mlのヘキサンを加えて2層分離を行った。さらに下層に対してもう一回2層分離をおこなった。ヘキサンを多く含む上層のみを集めて窒素ガスで乾燥させて脂肪酸分画とした。ヘキサン層は脂肪酸のGCMS分析に用いられた。一方、残った塩酸メタノール層に等量のエチルエーテルを加えて2層分配をおこなった。エーテル層は窒素ガスで乾燥させてステロール分画としてステロールのGCMS分析に用いられた。GCMS分析はHewlett-PackardGC-MS (5972 MS & 5890 GC)に装着したキャピラリーカラム DB-1 (50 m X0.25 mm)によって実施された。脂肪酸の分析は初期温度70℃(5分), 10℃/分(18分), 終温度250℃(15分)の10℃/分のグラデイエント昇温プログラムで実施された。ステロールの分析は初期温度70℃ (1分),10℃/分(18分), 終温度250℃(21分)のグラデイエント昇温プログラムで実施された。【００３５】
<核磁気共鳴分析法(NMR)>
A2(1.0 mg)を0.5 mlのCD2Cl2に溶解して予備的なNMRデータを取った後に、CD2Cl2を窒素ガスで乾燥除去した。再び0.5mlのCDCl3に溶解して本格的な測定をおこなった。データは25℃で800 MHzと900MHzでおこなった。データの収集は1HNMRのスペクトラムに加えて、2次元スペクトル[COSY、HSQC(carbon-proton one-bond correlated data)、HMBC(carbon-proton multiple bond correlated data)]でも収集された。【００３６】
<リポタンパク質の分離>
リポタンパク質は以前に報告された手順(非特許文献8参照)で準備した。簡単に述べると、正常ラットから採取した新鮮な血清を集め、固体KBrを用いて密度を1.3g/mlに合わせた。上記の調製した血清(1.5ml、1.3g/ml)の上に通常の生理食塩水(3.5ml、1.006g/ml)を重層し、超遠心により遠心管の中に不連続の密度勾配を作製した。リポタンパク質はTV865ローターで369548g、4℃、45分間の超遠心により分離した。3種の主なリポタンパク質画分(VLDL、LDL、HDL)を回収し、PBSに対して4℃で一晩透析した。本明細書においてはLDLは当該方法で得られた画分を意味する。【００３７】
<HTase活性測定>
ラット血清HDL中のHTase活性は市販の測定キットを用いて測定した(AlfresaAuto HTLase; Alfresa Pharma Corp., Osaka, Japan)。このキットはγ-チオブチロラクトン(thiobutyrolactone)を基質として利用する。HTaseはラクトン環を加水分解し、遊離チオール(thiol)基を生成する。チオール基は5,5'-ジチオビス(5,5'-dithiobis(2-netrobenzoic acid))と反応することにより、450nmの吸収で測定される5-チオ-2-ニトロベンゾイック酸(5-thio-2-netrobenzoicacid)を生成した。450 nmの吸収を測定して酵素活性を算出した。【００３８】
<ナトリウム/カリウムATPase活性のための粗精製坐骨神経膜の調製>
粗精製膜は以前に報告された手順(非特許文献7参照)により調製した。簡単に述べると、ラットの坐骨神経を、冷却等浸透圧溶液(250mM スクロース、10mMHEPES-Tris緩衝液(pH7.6)、2mM EDTA、1mM PMSF)中で破砕均質化した。当該均質化した液を10分間4℃で3000rpmで遠心分離し、上澄み液を回収し、さらに45分間45000rpmで遠心分離した。上澄み液を捨てた後に、沈殿を100μlの250mMスクロース溶液(10mMHEPES-Tris緩衝液(pH7.6)に溶解)に懸濁した。【００３９】
<ホモシステイン・チオラクトン修飾LDLの調整>
試験管内でのLDLのホモシシテイン・チオラクトン化は以前に報告された実験条件で行った(非特許文献5)。簡単に述べると、適量のLDL溶液(LDLタンパク質、100μg)を10 mM PBS (pH8.2)に懸濁し、全体を37℃で優しく掻き混ぜながらホモシシテイン・チオラクトン(100μmol/L)及び表示した量の全脂質画分(TLp)あるいはASG(0.01から10.0μg)と2時間インキュベートした。インキュベート後に、未反応のホモシシテイン・チオラクトンを除去するために、10mM PBS (pH8.2)で平衡させたBio-gelP-2カラムに当該混合液を通過した。【００４０】
<Na/K ATPase活性測定>
ナトリウム/カリウムATPase活性は以前の報告(非特許文献7参照)のように測定した。簡単に述べると、ナトリウム/カリウム依存的活性を測定するためのナトリウム/カリウムATPase活性測定溶液(0.2ml)の組成は10mMMgCl2、20mM HEPES-Tris(pH7.0)、120mM NaCl、30mM KCl、0.5mg/mlの粗精製膜タンパク質、及び25mM[γ-32P]ATP(10,000cpm)であった。測定溶液を37度で15分インキュベートした後、0.1mg/mlの活性炭を加え、15,000rpmで15分間遠心分離した。上澄み液を回収し、無機の32P放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。【００４１】
[結果及び考察]
<発芽玄米由来の有効成分の分画>
発芽玄米の糠の層に含まれる脂質画分をフラクション1、2、3及び4に分画し、さらに薄層クロマトグラフィーを用いて分画することにより、非特許文献5で示された糖尿病性神経障害の改善機能を有する有効成分はAcylatedsteryl-β-glucoside(ASG)であることが判明した。【００４２】
有効成分が単一の画分A2(以下、A-2と表記する場合もあるが、特に区別しない)にのみ含まれていたことは特筆すべきことである。すなわち、発芽玄米のような天然の食品に特定の薬学的効果が認められた場合に、複数の因子が協同的に働いて効果を発揮していたとしても不思議は無いからである。なお、単一の画分A2は複数種類のASGを含んでいたが、薄層クロマトグラフィーを用いた分画ではそれぞれを分離することは出来なかった。これは、それぞれのASGの構造及び化学的性質が互いに類似しているからと考えられる。【００４３】
本明細書で「ASG」というときは、一般名称としてのASGを表す。「発芽玄米由来(の)ASG」というときは、A2画分に相当する複数種類のASGの集合を表す。ただし、文脈上明らかな場合には「ASG」がA2画分に相当する複数種類のASGの集合を表すこともある。
本発明は当該発芽玄米由来のASGに関するものであり、また、当該発芽玄米由来のASGを用いた糖尿病性神経障害の改善又は予防剤に関するものである。【００４４】
<発芽玄米由来の有効成分の同定>
A2画分についてNMRを用いて解析を行った結果、予想通り、A2画分はASGで構成されることが確認され、A2を構成するASGのステロールはCampesterol、Stigmasterol、5α-cholest-8(14)-en-3β-ol及びβ-Sitosterolであることが判明した。また、A2を構成するASGの脂肪酸はパルミチン酸(16:0、以下略号で示すことがある。他の脂肪酸についても同じ。)、ステアリン酸(18:0)、2-ヒドロキシ-オクタデカン酸(18:0(2h))、オレイン酸(18:1)、リノール酸(18:2)及びリグノセリン酸(24:0)であることが判明した。ASGの一般構造及びA2を構成するASGのステロールの構造を図1に示す。【００４５】
図1から分かるように、A2画分のASGは、糖(Sugar)の骨格に上記4種類のステロールの何れかが結合し、かつ、上記6種類の脂肪酸の何れかが結合している。理論的には24種類の組み合わせがあり、したがって、24種類のASGが含まれうるが、現実のA2画分のASGはより少ない種類に限定されている可能性がある。なお、糖とステロールの結合様式にはα結合とβ結合があるが、発芽玄米由来ASGの場合にはβ結合のみであることが判明した(下記を参照)。【００４６】
<発芽玄米由来ASGのHTase活性に対する効果>
HTaseとは、動脈硬化の危険因子であるホモシステイン・チオラクトン(homocysteinethiolactone)の加水分解酵素のことであり、パラオキソナーゼ(paraoxonase)ファミリーに分類される。神経障害を伴った患者ではパラオキソナーゼ活性が低下することが報告されていることから(非特許文献5参照)、HTase活性の低下は動脈硬化の危険因子となるだけではなく、神経障害の進行程度にも関連すると考えられている。本願発明のASGはラット血清LDL中のHTase活性を上昇させることから、神経障害の改善又は予防剤としての機能を有することを示唆する。【００４７】
<発芽玄米由来ASGに特異的なHTase活性に対する効果>
発芽玄米由来ASG(ASG)を加えた場合には量依存的なHTaseの活性上昇が見られるのに対して、SG(発芽玄米由来ASGから脂肪酸を除去したもの)及び大豆由来ASG(S-ASG)を加えた場合にはHTaseの活性上昇は見られなかった(表6)。このことは、量依存的にHTaseの活性を上昇させる効果は、発芽玄米由来ASGに特異的なものであることを示している。【００４８】
<発芽玄米由来ASGの神経障害の改善効果>
神経障害は、末梢神経伝導速度の低下又は神経軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase(Na, K-ATPase)活性の低下として観察、定量できることが知られているが(非特許文献5及び9)、本研究においては、多数のサンプルを処理するための利便性等の観点から、ナトリウム/カリウムATPase活性を神経障害の指標として用いた。即ち、ナトリウム/カリウムATPase活性がより低い方が、神経障害の程度が重篤であることを示す。【００４９】
神経軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase活性の低下は、ホモシステイン・チオラクトンによってLDLが修飾されLDLの機能が阻害されることが原因であると考えられている。本研究においては、神経障害を再現するために、健常ラットから調整した粗精製坐骨神経膜のナトリウム/カリウムATPase活性をホモシステイン・チオラクトン修飾LDL(HT-modifiedLDL)存在下で測定した。
ホモシステイン・チオラクトン修飾LDL(HT-modified LDL)存在下において、発芽玄米由来ASGは神経軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase(Na/KATPase)活性を量依存的に上昇させた(図2)。このことから、発芽玄米由来ASGが神経障害を改善させる機能を有することが示された。【００５０】
<発芽玄米由来ASGに特異的な神経障害の改善効果>
発芽玄米由来ASG(ASG)を加えた場合には量依存的なナトリウム/カリウムATPaseの活性上昇が見られるのに対して、SG及び大豆由来ASG(S-ASG)を加えた場合にはナトリウム/カリウムATPaseの活性上昇は見られなかった(表7)。このことは、量依存的にナトリウム/カリウムATPaseの活性を上昇させる効果は、発芽玄米由来ASGに特異的なものであることを示している。【００５１】
<発芽玄米由来ASGの有効成分(S-ASGとの比較)>
前述のように、発芽玄米由来ASGは単一のASGではなく、複数種類のASGの混合物である(表4及び表5)。発芽玄米由来ASGには、ステロール部分としてCampesterol、Stigmasterol、β-Sitosterol又は5α-cholest-8(14)-en-3β-olを有するものが含まれている。一方、大豆由来ASGにはステロール部分としてCampesterol、Stigmasterol又はβ-Sitosterolを有するものしか含まれていない。これは、発芽玄米由来ASGの真の有効成分が、ステロール部分として5α-cholest-8(14)-en-3β-olを有するASGである可能性を強く示唆する。理論的には、弱い作用を有する複数の因子が協働的に作用して強い効果を生み出すこともあり得るが、現実的には考えにくい。【００５２】
また、発芽玄米由来ASGには、脂肪酸部分として16:0、18:0、18:0 (2h)、18:1、18:2又は24:0を有するものが含まれている。一方、大豆由来ASGには脂肪酸部分として16:0、18:0、18:1、18:2、22:0(ベヘン酸)又は24:0を有するものしか含まれていない。これは、発芽玄米由来ASGの真の有効成分が、脂肪酸部分として18:0(2h) を有するASGである可能性を強く示唆する。やはり、理論的には、弱い作用を有する複数の因子が協働的に作用して強い効果を生み出すこともあり得るが、現実的には考えにくい。【００５３】
したがって、発芽玄米由来ASGに含まれる真の有効成分は、ステロール部分として5α-cholest-8(14)-en-3β-olを有するか又は脂肪酸部分として18:0(2h) を有するASGである可能性が極めて高い。理論的には、発芽玄米由来ASGには4×6=24種類のASGが含まれうるが、本研究によれば、発芽玄米由来ASGに含まれる真の有効成分の候補は、6+4-1=9種類のASGに限定される。即ち、ステロール部分として5α-cholest-8(14)-en-3β-olを有しかつ脂肪酸部分として16:0、18:0、18:0(2h)、18:1、18:2又は24:0を有する6種類のASG、又は、ステロール部分としてCampesterol、Stigmasterol、β-Sitosterol又は5α-cholest-8(14)-en-3β-olを有しかつ脂肪酸部分として18:0(2h)を有する4種類のASGである(1種類は重複してカウントされている)。【００５４】
本願発明は、この発芽玄米由来ASGの真の有効成分に関するものであり、真の有効成分を含む発芽玄米由来ASGに関するものである。【００５５】
<発芽玄米由来ASGの有効成分(SGとの比較)>
本研究では、発芽玄米由来ASGを加水分解して脂肪酸部分を除去することにより調整したSGとの比較も行った。脂肪酸部分を失ったSGは神経障害の改善作用を有さず(表6及び表7)、脂肪酸部分の存在は必須であることが分かった。【００５６】
<産業上の応用>
本発明の発芽玄米由来ASG(単一又は複数種類)は、上記の方法により得られた画分をそのまま直接使用してもよいが、一般的には適当な液体に溶解するかもしくは分散させ、または、適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、場合によっては、さらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤等を添加し、乳剤、油剤、水和剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の製剤として使用する。【００５７】
製剤として使用する場合における、画分の使用量は製剤の形態によっても異なるが、有効な投与量であれば良く、安全性に問題がないので特に上限は規定しない。
また、本発明でいう機能性食品とは、発芽玄米由来ASGを有効成分とし、神経障害を予防する機能又は改善する機能を有する食品、あるいは食品の摂取によりこれらの機能の発揮が期待される食品をいい、健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品のいずれをも含む。【００５８】
食品としては、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケットまたはスナック等の菓子、アイスクリーム、シャーベットまたは氷菓等の冷菓、飲料、プリン、ジャム、乳製品、調味料等が挙げられ、これらの食品を目常的に摂取することが可能である。これらの食品に対する本発明の脂質画分の添加量としては、食品の形態によっても異なるが、安全性に問題がないのでその濃度に上限を設ける必要はない。【００５９】
[参考例1]
[発芽玄米由来の有効成分の分画]
実験材料及び方法に記載の方法で発芽玄米脂質画分をフラクション1、2、3及び4(Fr1, Fr2, Fr3 Fr4)に分画した。各フラクションについてHTase活性測定を行ったところ、Fr2が活性を有し(表1)、糖尿病性神経障害を改善する機能を有する有効成分は当該Fr2に含まれることが分かった。即ち、添加物(Additive)として1.0μgのFr.2を添加した場合にのみ、何も添加しない場合(None)と比較してHTaseの活性の上昇が観察された。【００６０】
【表１】
2009110612.tif 000003
【００６１】
各フラクションを更に薄層クロマトグラフィー(thin layer chromatography, TLC)を用いて分画し、オルシノール(Orcinol)染色した結果を図3Aに示す。Fr1、Fr2、Fr3の順に、TLC展開の上から下へ向かって極性の異なる成分が移動度の順に溶出されていることが観察される。GSLStをマーカーとして用いた。Fr2及びFr3の主要なバンドを上から順に、それぞれ、A1-A5及びB1-B5と名づけた。各バンドについてHTase活性測定を行ったところ、A2が活性を有し(表2)、糖尿病性神経障害を改善する機能を有する有効成分は当該A2に含まれることが分かった。即ち、添加物(Additive)として0.1μgのA2(発芽玄米の脂質(TLp)由来)を添加した場合にのみ、何も添加しない場合(None)と比較して顕著なHTaseの活性の上昇が観察された。なお、通常の玄米の脂質(TLb)を分画した場合にはA2に相当するバンドは見られなかった(ND、notdeterminedの略)。【００６２】
【表２】
2009110612.tif 000004
【００６３】
精製したA2、A4及びアルカリ処理したA2について、TLC展開した結果を図3Bに示す。A2をアルカリ処理するとA4と同じ移動度を示す。A4はアルカリ処理によって移動度が変化しなかった。Matreya社から市販されている大豆由来のASGがA2と同じ移動度を示し、アルカリ処理することでA4と同一の移動度を示すようになった。さらに、図4に示すようにヘリコバクター菌(Helicobacterpylori)由来の脂質H4(Acylated steryl-β-glucoside)と同じ移動度を示すことが分かった。H4もアルカリ処理によってヘリコバクター菌由来のH6と同じ移動度を示すようになった。A4とH6とを比較した場合には、僅かに移動度が異なっていたが、ほぼ同じ移動度を示した。このことからA2もH4もA4とH6がアシル化した構造であるということが判明した。移動度のわずかな相違はSteryl-β-glucosideとSteryl-β-glucosideの相違点、β結合かα結合であるかという立体異性体の特性によって起こったと考えられる。即ち、A2はAcylatedsteryl-β-glucosideであることが分かった。ASGは図1の一般式で示され、中心となる糖にステロールと脂肪酸(図中Rで表す)が結合した構造を有する。
【実施例１】
【００６４】
[発芽玄米由来の有効成分の同定]
<NMRによる構造解析>
発芽玄米由来ASGを構成するステロール及び脂肪酸の構造並びに上記結合様式(α結合又はβ結合)を明らかにするために、本発明者らは核磁気共鳴分析法(NMR)を行った。その結果を図5及び表3に示す。【００６５】
A2のアルカリ分解前後のTLCプレート上の移動度の変化、その他のサンプル(A4,H6, A4, S2など)とのTLCプレート上での移動度(挙動)の比較から、A2がASGであることが予想されたが、A2がどのようなASGであるかをNMR解析で明らかにした。NMRデータの解析方法は非特許文献10を参照のこと。NMRで明らかになったのは以下の4点である:(1)A2にはグルコースと脂肪酸とステロールが1分子含まれている(2)グルコースの6位に脂肪酸がエステルとして結合している(3)グルコースはステロールにβ結合している(4)主要なステロールはSitosterolである。
1H-13C NMRの2次元スペクトラムのシグナルをグルコース、Sitosterol、脂肪酸に含まれる個々のプロトンのシグナルに割り当てることができた(表3)。【００６６】
グルコースのプロトン(Glucose 1 〜Glucose 6)、Sitosterol(Sitosterol C, Sitosterol CH,Sitosterol CH2, Sitosterol CH3)、脂肪酸(Acylgroup CH2, Acylgroup H1)として表3にシグナル値が記されている。番号は図6に示すとおりである。【００６７】
【表３】
2009110612.tif 000005
【００６８】
Glucose1のH1は4.359 ppmであり、H2へのスカラーカップリング(7.7 Hz)していることからグルコースはβ結合であることが判明した。グルコースに関してはGlucose6のH6とH6'が低磁場へシフトしていることから6位にアシル化がされていることが判明した。6位のアシル化は2.32および1.59 ppmのシグナルが同じカルボニル基に結合したCH2プロトンであることから6位には長鎖の脂肪酸が結合していることが判明した。ステロール骨格に特徴的なシグナルも表3にあるように見出され、主要成分としてSitosterolをほぼ検証できる結果を示した。【００６９】
<GCMSによる構造解析>
NMR構造解析ではステロールおよび脂肪酸に含まれる成分すべてを同定できないためにA2を構成するステロール成分および脂肪酸成分としての組成比をGCMS構造解析で求めた。
A2を構成するASGのステロールの組成及び大豆由来ASGのステロールの組成を表4に示す。【００７０】
【表４】
2009110612.tif 000006
【００７１】
Campesterol、Stigmasterol及びβ-Sitosterolは大豆由来ASGにも含まれ、既によく知られている。注目すべき点は、A2には新規のステロールである「5α-cholest-8(14)-en-3β-ol」が比較的高い割合で含まれていることである。5α-cholest-8(14)-en-3β-olの構造を同定したGCMSのデータを図7Aに示し、その構造を図1に示した。【００７２】
次に、NMRを用いた解析により明らかとなった、A2を構成するASGの脂肪酸の組成及び大豆由来ASGの脂肪酸の組成を表5に示す。【００７３】
【表５】
2009110612.tif 000007
【００７４】
16:0、18:0、18:1、18:2、22:0及び24:0は大豆由来ASGにも含まれ、既によく知られている。注目すべき点は、A2には新規の脂肪酸である「18:0(2h)」が含まれていることである。18:0 (2h)を同定したGCMSスペクトラムを図7Bに示す。
【実施例２】
【００７５】
[発芽玄米由来ASGの血清HDL由来HTase活性に対する効果]
発芽玄米由来ASGがHTase活性に与える効果を調べた。実験方法を簡単に述べる。正常ラットのプール血清よりHDLを調製し、それをHTaseの酵素源としてASGを添加してHTaseの活性化を調べた。
この結果を図8に示す。添加するASGの量が0から0.1μgの間で、量依存的なHTase活性の上昇が見られた。このHTaseの活性上昇は、添加するASGの量が0.5μgで飽和し、それ以上加えた場合も大きな変化は無かった。
【実施例３】
【００７６】
[発芽玄米由来ASGに特異的なHTase活性に対する効果]
上記発芽玄米由来ASGのHTase活性に対する効果が、発芽玄米由来ASGに特異的なものか否かを明らかにするために、本発明者らは図8と同じ試験を繰り返した。発芽玄米由来ASG(ASG)、発芽玄米由来ASGから脂肪酸を除去したもの(SG)及び大豆由来ASG(S-ASG)について、HTase活性の変化を調べた結果を表6に示す。ASG、SG又はS-ASGの何れも加えない場合のHTase活性を100として相対値で表す。【００７７】
【表６】
2009110612.tif 000008
【００７８】
発芽玄米由来ASG(ASG)を加えた場合には、図8と同様の結果が得られたのに対し、SG及び大豆由来ASG(S-ASG)を加えた場合には、量依存的なHTaseの活性上昇は見られなかった。
【実施例４】
【００７９】
[発芽玄米由来ASGの神経障害の改善効果]
発芽玄米由来ASGが発芽玄米と同様の糖尿病性神経障害の改善効果(非特許文献5)を有するか否かを確認するために、ホモシステイン・チオラクトン修飾LDL(HT-modifiedLDL)存在下において、発芽玄米由来ASGがナトリウム/カリウムATPase(Na/K ATPase)活性に与える影響を調べた。実験方法を簡単に述べる。正常ラットの坐骨神経よりNa/KATPase粗分画を調製した。正常ラット血清より調製したLDLをホモシステイン化して、ASGと一緒に加えてNa/K ATPaseの活性に及ぼす影響を調べた。【００８０】
この結果を図2に示す。添加するASGの量が0から1.0μgの間で、量依存的なNa/KATPase活性の上昇が見られた。このNa/K ATPaseの活性上昇は、添加するASGの量が1.0μgで飽和し、それ以上加えた場合も大きな変化は無かった。
【実施例５】
【００８１】
[発芽玄米由来ASGに特異的な神経障害の改善効果]
上記発芽玄米由来ASGのナトリウム/カリウムATPase活性に対する効果が、発芽玄米由来ASGに特異的なものか否かを明らかにするために、本発明者らは図2と同じ試験を繰り返した。発芽玄米由来ASG(ASG)、発芽玄米由来ASGから脂肪酸を除去したもの(SG)及び大豆由来ASG(S-ASG)について、ナトリウム/カリウムATPase活性の変化を調べた結果を表7に示す。ASG、SG又はS-ASGの何れも加えない場合のナトリウム/カリウムATPase活性を100として相対値で表す。【００８２】
【表７】
2009110612.tif 000009
【００８３】
発芽玄米由来ASG(ASG)を加えた場合には、図2と同様の結果が得られたのに対し、SG及び大豆由来ASG(S-ASG)を加えた場合には、量依存的なナトリウム/カリウムATPaseの活性上昇は見られなかった。
【実施例６】
【００８４】
[溶媒抽出法によるASGの抽出方法]
発芽玄米の糠5gを秤量し、30mLのヘキサンで15分間攪拌、洗浄した後、ブフナーロート（Buechnerfunnel）で濾過し、残留物を得た。濾液は廃棄した。残留物を上記の条件でさらに2回洗浄した後、残留物にエタノール又は、エタノールと蒸留水の混合液（エタノール：水＝2：1又は1：1。以下それぞれ、エタ水（2：1）又はエタ水（1：1）と略す場合がある。）又はクロロホルムとメタノールの混合液（クロロホルム：メタノール＝2：1。以下、クロメタ（2：1）と略す場合がある。）30mLを加え、30分間攪拌、抽出しブフナーロートで濾過し、濾液を得た。残留物は廃棄した。エタノール、エタ水（2：1）、エタ水（1：1）又はクロメタ（2：1）の濾液は全量をナス形フラスコに移し、エバポレーターを用いて濃縮乾固し、発芽玄米由来のASG濃縮物E（エタノール抽出）、F（エタ水（2：1）抽出）、G（エタ水（1：1）抽出）、H（クロメタ（2：1）抽出）を得た。【００８５】
上記ASG濃縮物E、F、Gは、クロメタ（2：1）30mLを加え、15分間再度溶解させた後、クロメタ（2：1）を用いて500mLにメスアップした。上記ASG濃縮物Hは、クロメタ（2：1）30mLを加え、15分間再度溶解させた後、クロメタ（2：1）を用いて1500mLにメスアップした。メスアップした各濃縮物E、F、G、H2mLを1500g×10分の条件で遠心し、上澄みを測定サンプルとした。なお、各回収物中のASGは高速液体クロマト（HPLC）を用いて、ASGの含有率を求めた。ASGの分析方法の詳細は以下の通りである。【００８６】
[ASGの分析方法]
ASGのHPLC分析は、表8の分析条件を用いて行った。【００８７】
【表８】
2009110612.tif 000010
【００８８】
移動相及びグラジエント条件は、表9に示す。【００８９】
【表９】
2009110612.tif 000011
【００９０】
[分析結果]
各抽出画分中のASG含有率の分析結果は、表10に示す。【００９１】
【表１０】
2009110612.tif 000012
【実施例７】
【００９２】
[イアトロビーズ（粒状多孔性微粒子シリカゲル）クロマトグラフィーによるASGの精製]
高純度のASGを得る目的で上記実施例6の分析結果に基づいてイアトロビーズクロマトグラフィー法により抽出精製を行った。
発芽玄米の糠25gを秤量し、イアトロビーズクロマトグラフィー（Iatrobeadschromatography）により分画を回収し、Fraction 2を得た。さらにFraction 2を濃縮乾固させ、イアトロビーズクロマトグラフィーによりFraction8〜12を分取、これらを乾固させ濃縮乾固I（アルファベットのI）を得た。【００９３】
<カラム>
Φ2cm×30cm(シリカゲル（イアトロビーズ6RS-8060、株式会社三菱化学ヤトロン製）に充填)【００９４】
<方法>
1. 発芽玄米の糠25gをヘキサンで洗浄した後、クロロホルム:ヘキサン＝1:1で総脂質画分(TL)を抽出する。
2. TLをロータリーエバポレーターで完全に乾固する。
3. 乾固したTLを30mlのクロロホルム:ヘキサン(C:H)＝1:1に溶解する。
4. C:H=9:1を200mlずつ通液し通過液を回収する(Fraction1)。
5. クロロホルム:メタノール＝9:1を200ml通液し通過液を回収する(Fraction2)。
6. クロロホルム:メタノール:水(C:M:W)＝7:3:0.1を通液し通過液を回収する(Fraction3)。
7. C:M:W＝30:60:0.8を200ml通液し通過液を回収する(Fraction4)。
8. 各フラクションをHPTLC（シリカゲル60、メルク社製）に供し、ASG溶出フラクションを確認した。
各フラクション5μLをシリカゲルコートした市販の縦10cmのHPTLCプレート(Silicagel 60，Merck)の下より1.5cmの位置にマイクロシリンジでサンプル塗布し、展開溶媒クロロホルムにて展開した後風乾燥し、再度クロロホルム：メタノール(95:5)で２次展開を行い風乾した。【００９５】
<結果>
各フラクションを上記条件で薄層クロマトグラフィーに供し、ASGの存在を確認したところ、TLに含まれているASGは、すべてFraction 2に溶出されていた。この結果を図9に示す。【００９６】
[イアトロビーズクロマトグラフィーによるASGの精製つづき]
<カラム>
Φ1cm×40cm(イアトロビーズ20cm充填)【００９７】
<方法>
1. 上記のFraction2をエバポレーターで乾固させた後、10mlのクロロホルム:ヘキサン=1:1に溶解する。
2. 溶解液をカラムにアプライする。
3. クロロホルム:ヘキサン(C:H)＝1:1を75ml通液する。
4. クロロホルム(C)を75ml通液する。
5. C:M＝95:5を通液し、2ml/fractionずつ分取する。
6. FractionNo.30まで分取を行い、上記と同様の条件でHPTLCにてASGの溶出を確認する。【００９８】
<結果>
FractionNo.10〜12周辺にASGのバンドが確認できた。また、1 fraction当たりの溶出時間は5分であった。この結果を図10に示す。【００９９】
[ASGの分析方法]
ASG含有率の分析は、実施例6と同様に行った。即ち、表8の分析条件及び表9の移動相及びグラジエント条件を用いて行った。【０１００】
[分析結果]
ASGの分析結果は、表11に示す。【０１０１】
【表１１】
2009110612.tif 000013
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の発芽玄米由来ASGは糖尿病性神経障害を予防又は改善する効果を有する。
したがって、本発明によれば糖尿病性神経障害の予防又は改善剤として利用することができる。
そして、発芽玄米は、従来から健康食品として利用されてきているため、発芽玄米由来ASGは安全性が高く、継続的な摂取も可能であり、かつ大量に製造することもでき、食品等への添加が容易であることからも、人又は動物の健康増進や疾病予防などとして貢献できる可能性が大きい。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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