(57)【要約】本発明は、ＰＮＡオリゴマー／核酸複合体の安定性調節に関する方法、キット及び組成物に関する。本発明は特に、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、Ｎ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含み、ただし、該基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではない、ＰＮＡオリゴマーに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、Ｎ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含み、ただし、該基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではない、ＰＮＡオリゴマー。
【請求項２】
各々のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基が生理的ｐＨで荷電していない、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項３】
各々の基が置換または非置換環状炭化水素基を含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項４】
各々の環状炭化水素基が、置換または非置換シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基またはシクロヘキシル基である、請求項３に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５】
各々の基が生理的ｐＨで塩基性窒素を含まない、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６】
各々の基が前記Ｎ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に間接的に連結されている、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項７】
各々の間接的に連結された基が、天然に存在しないアミノ酸の側鎖である、請求項６に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項８】
各々の基が前記Ｎ末端アミン基に直接連結されている、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項９】
各々の基が前記Ｃ末端カルボニル炭素に直接連結されている、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１０】
異なる基が前記Ｃ末端および前記Ｎ末端の各々に連結されている、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１１】
同じ基が前記Ｃ末端および前記Ｎ末端の各々に連結されている、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１２】
各々の基が、独立して式：
【化１】
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【化２】
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［式中、各々のＪ’は、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＸ３、−ＳＣＸ３または−ＯＣＸ３［式中、各々のＸは、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである］である］
を有する、請求項７または８のいずれかに記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１３】
前記基における式Ｃ（Ｊ’）２の１以上の部分が、必要に応じて式：Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＳまたはＯの部分で置換されており、かつ／または該基における式：
【化３】
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の部分の１以上が、置換されているとき該基が芳香族ではないことを条件として、かつさらに該基が式：
【化４】
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を有さないことを条件として、必要に応じて式：
【化５】
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の部分で置換されている、請求項１２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１４】
各々の基が、独立して式：
【化６】
2009505636.tif 000028
【化７】
2009505636.tif 000029
【化８】
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［式中、各々のＪ’は、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＸ３、−ＳＣＸ３または−ＯＣＸ３［式中、各々のＸは、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである］であり；ＷはＯまたはＳである］
を有する、請求項８に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１５】
前記基における式Ｃ（Ｊ’）２の１以上の部分が、必要に応じて式：Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＯまたはＳの部分で置換されているか、かつ／または該基における式：
【化９】
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の部分の１以上が、置換されているとき該基が芳香族ではないことを条件として、必要に応じて式：
【化１０】
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の部分で置換されている、請求項１４に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１６】
各々の基が、独立して式：
【化１１】
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【化１２】
2009505636.tif 000034
【化１３】
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［式中、Ｋ’はＮ、ＯまたはＳであり；
各々のＪ’は、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＸ３、−ＳＣＸ３または−ＯＣＸ３［式中、各々のＸは、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである］であり；そして
Ｋ’がＯまたはＳである場合、Ｒ１は存在しないが、Ｋ’がＮである場合は、Ｒ１は水素またはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基である］
を有する、請求項９に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１７】
前記基における式Ｃ（Ｊ’）２の１以上の部分が、必要に応じて式：Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＯまたはＳの部分で置換されており、かつ／または基の中の式：
【化１４】
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の部分の１またはそれ以上が、置換されているとき該基が芳香族ではないことを条件として、必要に応じて式：
【化１５】
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の基で置換されている、請求項１６に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１８】
少なくとも１個の検出可能部分をさらに含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１９】
生理的ｐＨで荷電基を含む少なくとも１個のアミノ酸を含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２０】
少なくとも１個のユニバーサル核酸塩基をさらに含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２１】
少なくとも１個のジアミノプリン核酸塩基をさらに含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２２】
前記ＰＮＡオリゴマーが、少なくとも１個のエネルギー供与体部分と少なくとも１個のエネルギー受容体部分とをさらに含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２３】
前記ＰＮＡオリゴマーがＣ末端カルボン酸基を含む、請求項８に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２４】
前記ＰＮＡオリゴマーが、１以上の連結Ｃ末端ヌクレオシドを含むＰＮＡキメラである、請求項８に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２５】
ＰＮＡオリゴマーが支持体に結合している、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２６】
ＰＮＡオリゴマーがアレイに結合している、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２７】
Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、Ｎ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含むＰＮＡオリゴマーを形成することを含み、ただし、該基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではない、方法。
【請求項２８】
ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体を形成することを含む方法であって、該ＰＮＡオリゴマーは、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、Ｎ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含み、ただし、該基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではない、方法。
【請求項２９】
Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含むＰＮＡオリゴマーに対して、基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではないことを条件として、ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体を形成するために使用される該ＰＮＡオリゴマーの該Ｎ末端アミン基および／または該Ｃ末端カルボニル炭素に、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基を直接または間接的に共有結合で連結することにより、ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体のＴｍを実質的に予測可能に調節することを含む、方法。
【請求項３０】
Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではないことを条件として、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含むＰＮＡオリゴマーを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００５年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／６９５，７９６号および２００６年６月２９日に出願された米国特許出願（出願番号はまだ割り当てられていない）に対する優先権を主張する。
【０００２】
ここで使用する章の表題は構成だけを目的とするものであり、いかなる意味においても述べられている事柄を限定すると解釈されるべきではない。
【０００３】
分野
本発明はペプチド核酸の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
導入
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、核酸および他のポリ核酸塩基鎖に配列特異的にハイブリダイズすることができるオリゴマーを含む合成核酸塩基のクラスである。ポリ核酸塩基鎖の核酸塩基の間のハイブリダイゼーションは、水素結合についての広く確立された法則に従う。ワトソン‐クリック塩基対に関しては、典型的にはアデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と塩基対合する。様々な塩基対モチーフが核酸技術分野において周知である。
【０００５】
核酸塩基８−アザ−７−デアザアデニン（８−Ａ−７−ＤＡＡ）を含むヌクレオシドが検討され、ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ヌクレオシドの性質を示すことが認められた（非特許文献１）。ユニバーサルヌクレオシドという用語は、４つの標準ＤＮＡ核酸塩基（すなわちアデニン、チミン、シトシンおよびグアニン）に対して特異的水素結合を形成するヌクレオシドを指す。いくつかのユニバーサル核酸塩基がＰＮＡオリゴマーにおける使用に適すると提案された（非特許文献２および非特許文献３）。理論的には、ユニバーサル核酸塩基は４つの標準ＤＮＡ核酸塩基のいずれに対しても特異的水素結合を形成するはずである。
【０００６】
より長いＰＮＡオリゴマーを形成するように連結され得る短いＰＮＡオリゴマーのライブラリーは、大規模なゲノム解析プロジェクトのために必要なプローブの迅速な作製を容易にする手段として興味深い（たとえば特許文献１参照）。しかし、多くの短いＰＮＡオリゴマーを多くの長いオリゴマーへと連結するために必要な労力を費やさすことなく、そのような大規模ゲノム解析プロジェクトのために必要なプローブのすべてが得られることは有用である。さらに、ＰＮＡオリゴマーを作製するために連結が使用される場合でも、より短いプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することができれば有益であると考えられる。
【０００７】
それにもかかわらず、より短いプローブ（非修飾ＰＮＡのため）が、典型的には、堅固なハイブリダイゼーション分析のために典型的に使用される条件下ではハイブリダイゼーションが起こらないほど低い熱融解温度（Ｔｍ）を有することを考慮すると最小プローブ長はおおよそ１０量体であるため、完全なサイズのＰＮＡオリゴマーのライブラリーの作製は困難である。ライブラリーの１０量体プローブが４つの天然に生じる核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ＆Ｔ）を含むと仮定して、完全なライブラリーセットを作製するために必要なプローブの総数は１，０４８，５７６（４１０）個の異なるプローブである。セットを完成するために必要なプローブの膨大な数を考えると、そのようなライブラリーの生産は、現時点では単に経済的に実現不可能である。
【０００８】
しかしある種の手法の適用は、おそらく完全なセットを形成するために必要な異なるプローブの数を低減することができ、それによって有用ならの生産を容易にし得る。たとえばユニバーサル塩基をいくつかの位置に使用することができる。これは、各々の位置に４個の異なる可能な塩基を置く代わりに、１個の塩基しか必要としないため、ライブラリーの複雑さを低減する。たとえばユニバーサル塩基を１０量体の１０の位置のうち４で使用すれば、合計４０９６（４６）個の異なるプローブがセットを完成させる。
【０００９】
さらに、セットのプローブのＴｍを非配列依存的に上げることが可能であれば、セットを完成させるためにさらに一層少ないプローブしか必要としないと考えられる。たとえばセットのすべてのプローブの平均融解温度を実質的に非配列依存的に約１０−１５℃上げることができれば、８量体または９量体プローブセットを使用することが可能であると考えられる。Ｔｍを実質的に非配列依存的に調節する（たとえば上昇させる）ことができるプローブセットの作製は、以下で述べる本発明の実施形態についての１つの可能な適用である。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００７７６０８号明細書
【非特許文献１】Ｓｅｅｌａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８（１７）：３２２４−３２３２（２０００）
【非特許文献２】Ｃｈａｌｌａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１（１０）：１６３９−１６４１（１９９９）
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３：１３２−１４０（２００１）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
特許、特許出願、記事、書籍、論文およびインターネットウエブページを含むがこれらに限定されない、本出願において引用するすべての文献および同様の資料は、そのような文献および同様の資料の形式に関わりなく、ありとあらゆる目的のためにその全体が参照により明白にここに組み込まれる。
【００１１】
定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適切な場合は常に、単数で使用される用語は同時に複数も包含し、逆もまた同様である。以下で述べる何らかの定義が、参照によりここに組み込まれる書類を含む他の何らかの書類におけるその語の使用法と相容れない場合は、以下で述べる定義に準拠するものとする。
【００１２】
ａ．ここで使用する、「核酸塩基」は、核酸および他のポリ核酸塩基鎖に配列特異的に結合することができポリ核酸塩基鎖を作製するために核酸テクノロジーを利用するまたはペプチド核酸テクノロジーを利用する人々に一般的に知られる、天然に生じるおよび天然に存在しない複素環式部分を指す。適切な核酸塩基の非限定的な例は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−アミンプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（８−アザ−７−デアザアデニン）を含む。適切な核酸塩基の他の非限定的な例は、図１Ａおよび１Ｂに例示されている核酸塩基を含む（米国特許第６，３５７，１６３号の図２Ａおよび２Ｂも参照のこと）。
【００１３】
ｂ．ここで使用する、「核酸塩基配列」は、ポリ核酸塩基鎖の何らかのセグメント、あるいは２またはそれ以上のセグメントの集合体（すなわち連結高分子）を指す。適切なポリ核酸塩基鎖の非限定的な例は、オリゴデオキシヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（たとえばＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、核酸類似体および／または核酸ミミックを含む。
【００１４】
ｃ．ここで使用する、「標的配列」は、決定しようとするポリ核酸塩基鎖の核酸塩基配列を指す。
【００１５】
ｄ．ここで使用する、「核酸塩基含有サブユニット」という語句は、核酸塩基を含むポリ核酸塩基のサブユニットを指す。オリゴヌクレオチドについては、核酸塩基含有サブユニットはヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドに関して、当業者は、他の種のポリ核酸塩基鎖と結合したサブユニットの形態を認識する。
【００１６】
ｅ．ここで使用する、「ポリ核酸塩基鎖」は、２またはそれ以上の核酸塩基含有サブユニットを含む完全な高分子一本鎖を指す。
【００１７】
ｆ．ここで使用する、「核酸」は、もっぱらヌクレオチドだけから形成される骨格を有するポリ核酸塩基鎖、またはその類似体を指す。好ましい核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｌ−ＤＮＡまたはロックト核酸（ＬＮＡ）である。疑わしさを避けるため、ＰＮＡは核酸ミミックであり、核酸または核酸類似体ではない。ＰＮＡは、ヌクレオチドから形成されないため、核酸ではない。本明細書を解釈するために、ＰＮＡキメラ（ペプチド核酸／核酸キメラ）は核酸ではない。
【００１８】
ｇ．ここで使用する、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、同第６，１０７，４７０号および同第６，３５７，１６３号においてペプチド核酸として言及または特許請求されている何らかのポリ核酸塩基鎖またはポリ核酸塩基鎖のセグメントを含むが、これらに限定されない、２またはそれ以上のＰＮＡサブユニットを含む何らかのポリ核酸塩基鎖またはポリ核酸塩基鎖のセグメントを指す。疑わしさを避けるため、ここで使用するＰＮＡオリゴマーはＰＮＡキメラを含む。
【００１９】
「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語はまた、以下の公表文献：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１（１９９７）１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５５５−５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．，３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，３：９１２−９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３（９）：１２６９−１２７２（２００１）に述べられている核酸ミミックおよび国際公開番号第ＷＯ９６／０４０００号に開示されているＳｈａｈらのペプチドベースの核酸ミミック（ＰＥＮＡＭ）の２またはそれ以上のサブユニットを含む何らかのポリ核酸塩基鎖またはポリ核酸塩基鎖のセグメントに適用される。
【００２０】
一部の実施形態では、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、式：
【００２１】
【化１６】
2009505636.tif 000003
［式中、各々のＪは、同じかまたは異なり、Ｈ、Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから成る群より選択される；各々のＫは、同じかまたは異なり、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ’から成る群より選択される；各々のＲ’は、同じかまたは異なり、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基であり得る；たとえばＲ’は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、メトキシ、エトキシ、ベンジルまたはフェニルであり得る；
各々のＡは、単結合、式：−（ＣＪ２）ｓ−の基または式：−（ＣＪ２）ｓＣ（Ｏ）−の基［式中、Ｊは上記で定義したとおりであり、各々のｓは１−５の整数である］である；各々のｔは１または２であり、各々のｕは１または２である；各々のＬは、同じかまたは異なり、独立してアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミンプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）、Ｎ８−（８−アザ−７−デアザアデニン）、他の天然に生じる核酸塩基類似体または他の天然に存在しない核酸塩基（たとえば図１Ａおよび１Ｂ）である］
の２またはそれ以上の共有結合サブユニットを含むポリ核酸塩基鎖またはポリ核酸塩基鎖のセグメントである。
【００２２】
一部の実施形態では、ＰＮＡサブユニットは、メチレンカルボニル結合を通してＮ−［２−（アミノエチル）］グリシン骨格のＮ−α−グリシル窒素に結合した天然に生じるまたは天然に存在しない核酸塩基であり得る；これは現在最も一般的に使用される形態のペプチド核酸サブユニットである。
【００２３】
ｈ．ここで使用する、「ＰＮＡキメラ」は、２またはそれ以上のＰＮＡサブユニットおよび１またはそれ以上の核酸サブユニット（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むオリゴマーまたはポリマーセグメント、またはそれらの類似体を意味する。ＰＮＡサブユニットと核酸サブユニットは、共有結合によってまたはリンカーによって他方と連結され得る。たとえばＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、化学結合をとおして、少なくとも１個の２’−デオキシリボ核酸サブユニットに共有結合で連結された少なくとも２個のＰＮＡサブユニットを含み得る（ＰＮＡキメラの作製に関する例示的な方法および組成物については、米国特許第６，０６３，５６９号参照）。本発明に関して、ＰＮＡキメラは、異なる種類の核酸塩基含有サブユニット（たとえばＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の組合せを含むが、グリシン、などのアミノ酸サブユニット、あるいは１またはそれ以上の標識またはリンカーの単なる組み込みは、オリゴマーがＰＮＡキメラであることを意味しない。さらに、疑わしさを避けるため、ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、本明細書を解釈するためには、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニルまたは複素環式炭化水素基ではない。
【００２４】
ｉ．ここで使用する、「配列特異的に」は、水素結合をとおしての塩基対合によるハイブリダイゼーションを指す。標準塩基対合の非限定的な例は、チミンまたはウラシルとアデニンの塩基対合およびシトシンとグアニンの塩基対合を含む。塩基対合モチーフの他の非限定的な例は以下を含むが、これらに限定されない：５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、２−チオウラシルまたは２−チオチミンのいずれかとアデニンの塩基対合；５−メチルシトシンまたはプソイドイソシトシンのいずれかとグアニンの塩基対合；ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）またはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）のいずれかとシトシンの塩基対合；２−アミンプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）またはＮ９−（２，６−ジアミノプリン）のいずれかとチミンまたはウラシルの塩基対合；および、たとえばアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミンプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチンまたはＮ９−（７−デアザ−グアニン）のいずれかのような、他の何らかの核酸塩基と、ユニバーサル塩基であるＮ８−（８−Ａ−７−ＤＡＡ）の塩基対合。
【００２５】
ｊ．ここで使用する、「連結高分子」という用語は、リンカーによって連結されている２またはそれ以上の高分子セグメントを含むポリ核酸塩基鎖を指す。連結高分子を形成するように連結され得る高分子セグメントは、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド、ポリアミド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはＰＮＡキメラであり得る。一部の実施形態では、ＰＮＡキメラは、オリゴマーのＰＮＡ部分がリンカーによってオリゴマーの核酸（ＮＡ）部分に連結されているポリ核酸塩基鎖であり得る。疑わしさを避けるため、連結高分子は、１つのＣ末端と１つのＮ末端を含む高分子を指す。
【００２６】
ｋ．ここで使用する、「アルキル」という用語は、完全に飽和され得る直鎖または分枝Ｃ２−Ｃ１５炭化水素または環状Ｃ３−Ｃ１５炭化水素（すなわちシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基またはシクロヘキシルメチレン基などのシクロアルキル基）を指す。ここで使用するとき、「アルキル」という用語は、置換されていてもよくまたは置換されていなくてもよい基を指す。ここで使用するとき、「アルキル」はまた、置換または非置換メチレン基の炭素原子の１またはそれ以上がケイ素原子（Ｓｉ）によって置換されていてもよいアルキル基を指す。一部の実施形態では、アルキル基は、完全に飽和され得る直鎖または分枝Ｃ２−Ｃ１２炭化水素または環状Ｃ３−Ｃ１０炭化水素であり得る。
【００２７】
ｌ．ここで使用する、「アルキレン」という用語は、少なくとも２つの部分（たとえば−｛ＣＨ２｝−（メチレン）、−｛ＣＨ２ＣＨ２｝−（エチレン）、
【００２８】
【化１７】
2009505636.tif 000004
等［式中、括弧は結合点を指示する］）への少なくとも２つの結合点を有する直鎖または分枝アルキル鎖または環状アルキル基を指す。ここで使用するとき、「アルキレン」という用語は、置換されていてもよくまたは置換されていなくてもよい基を指す。一部の実施形態では、アルキレン基はＣ１−Ｃ１０炭化水素であり得る。
【００２９】
ｍ．ここで使用する、「アルケニル」という用語は、１またはそれ以上の二重結合を有する直鎖または分枝Ｃ２−Ｃ１５炭化水素または環状Ｃ３−Ｃ１５炭化水素を指す。ここで使用するとき、「アルケニル」という用語は、置換されていてもよくまたは置換されていなくてもよい基を指す。本明細書に関して、「アルケニル」はまた、置換または非置換メチレン基の炭素原子の１またはそれ以上がケイ素原子（Ｓｉ）によって置換されたアルケニル基を指すことができる。一部の実施形態では、アルケニル基は、１またはそれ以上の二重結合を有する直鎖または分枝Ｃ２−Ｃ１２炭化水素または環状Ｃ３−Ｃ１０炭化水素であり得る。
【００３０】
ｎ．ここで使用する、「アルキニル」という用語は、１またはそれ以上の三重結合を有する直鎖または分枝Ｃ２−Ｃ１５炭化水素または環状Ｃ３−Ｃ１５炭化水素を指す。ここで使用するとき、「アルキニル」という用語は、置換されていてもよくまたは置換されていなくてもよい基を指す。本明細書に関して、「アルキニル」はまた、置換または非置換メチレン基の炭素原子の１またはそれ以上がケイ素原子（Ｓｉ）によって置換されたアルキニル基を指すことができる。一部の実施形態では、アルキニル基は、１またはそれ以上の三重結合を有する直鎖または分枝Ｃ２−Ｃ１２炭化水素または環状Ｃ３−Ｃ１０炭化水素であり得る。
【００３１】
ｏ．ここで使用する、「ヘテロアルキル」という用語は、アルキル鎖内の１またはそれ以上のメチレン基が−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されているアルキル基を指す。ここで使用するとき、「ヘテロアルキル」という用語は、置換されていてもよくまたは置換されていなくてもよい基を指す。
【００３２】
ｐ．ここで使用する、「ヘテロアルケニル」という用語は、１またはそれ以上のメチレン基が−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されているアルケニル基を指す。ここで使用するとき、「ヘテロアルケニル」という用語は、置換され得るまたは非置換であり得る基を指す。
【００３３】
ｑ．ここで使用する、「ヘテロアルキニル」という用語は、１またはそれ以上のメチレン基が−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されているアルキニル基を指す。ここで使用するとき、「ヘテロアルキニル」という用語は、置換されていてもよくまたは置換されていなくてもよい基を指す。
【００３４】
ｒ．ここで使用する、「複素環式炭化水素」という用語は、１またはそれ以上の酸素および／または硫黄原子を含む非芳香族炭化水素環を指す。ここで使用する、「複素環式炭化水素」という用語は、置換されていてもよくまたは置換されていなくてもよい基を指す。
【００３５】
ここで使用する、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、複素環式炭化水素基は、芳香族置換基を含まない。これを除いて、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、複素環式炭化水素基についての適切な置換基は、本発明の実施形態において使用される反応条件下で安定である他のいかなる置換基も含み得る。適切な置換基の非限定的な例は、アルキル（たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロヘキシル等）基、ハロアルキル（たとえばトリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル）基、アルコキシ（たとえばメトキシ、エトキシ等）基、シアノ基またはハロ（たとえばフッ素、塩素、臭素およびヨウ素）基を含む。
【００３６】
ｓ．ここで使用する、「アミノ酸」は、Ｒ’’’−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ’’’’）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ’’’［式中、Ｒ’’’は、独立して水素、脂肪族基、置換脂肪族基、芳香族基、もう１つ別のアミノ酸、ペプチドまたは置換芳香族基である］によって表される基を指す。「天然に生じるアミノ酸」は、自然界で認められるアミノ酸である。これらは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシン、オルニチン、プロリン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンおよびヒスチジンである。本明細書を解釈するため、「天然に生じるアミノ酸」は、ＰＮＡオリゴマーに検出可能部分を間接的に連結するために使用される天然に生じるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、Ｒ’’’’は、水素または天然に生じるアミノ酸の側鎖であり得る。天然に生じるアミノ酸の側鎖は、メチル（アラニン）、イソプロピル（バリン）、ｓｅｃ−ブチル（イソロイシン）、−ＣＨ２ＣＨ（−ＣＨ３）２（ロイシン）、ベンジル（フェニルアラニン）、ｐ−ヒドロキシベンジル（チロシン）、−ＣＨ２−ＯＨ（セリン）、−ＣＨＯＨＣＨ３（トレオニン）、−ＣＨ２−３−インドイル（トリプトファン）、−ＣＨ２ＣＯＯＨ（アスパラギン酸）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（グルタミン酸）、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（アスパラギン）、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（グルタミン）、−ＣＨ２ＳＨ（システイン）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３（メチオニン）、−（ＣＨ２）４ＮＨ２（リシン）、−（ＣＨ２）３ＮＨ２（オルニチン）、−｛（ＣＨ）２｝４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２（アルギニン）および−ＣＨ２−３−イミダゾイル（ヒスチジン）を含む。
【００３７】
ヘテロ原子含有官能基を含むアミノ酸の側鎖、たとえばアルコール（セリン、チロシン、ヒドロキシプロリンおよびトレオニン）、アミン（リシン、オルニチン、ヒスチジンおよびアルギニン）は、ここで論じる反応（すなわちＰＮＡオリゴマー合成）を促進するために保護基を必要とし得る。ヘテロ原子含有官能基が保護基を含むように修飾されるとき、側鎖は、アミノ酸の「保護側鎖」と称される。保護基はペプチド合成において一般的に使用され、これらは当業者に公知であり、しばしば当業者によって使用される。たとえば保護アミノ酸の製造のための多くの適切な保護基および方法が、Ｇｒｅｅｎら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に見出される。
【００３８】
ｔ．ここで使用する、「標識」という用語は、ＰＮＡオリゴマーに連結された何らかの付加物を指す。「標識」という用語は、「レポーター部分」または「検出可能部分」などの用語を包含する。本明細書に関して、標識はまた、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基を指すことができる。
【００３９】
ｕ．ここで使用する、「レポーター部分」および「検出可能部分」という用語は、交換可能であり、オリゴマーを装置または方法によって検出可能にするためにポリ核酸塩基鎖に結合され得る部分を指す。たとえば標識は、（ｉ）検出可能シグナルを提供する；（ｉｉ）第一または第二標識によって提供される検出可能シグナルを修飾するように大にシグナルと相互作用する；または（ｉｉｉ）捕獲機能、すなわち疎水的親和性、抗体／抗原、イオン錯体形成を付与する何らかの部分であり得る。
【００４０】
ｖ．ここで使用する、「消光（クエンチング）」は、機序に関わりなく、消光物質に関連したエネルギー移動によって引き起こされる蛍光部分の蛍光低下を指す。
【００４１】
ｗ．ここで使用する、「支持体結合」は、固体支持体にまたはその上に固定化されたＰＮＡオリゴマーを指す。
【００４２】
ｘ．ここで使用する、「固体支持体」または「固体担体」は、ＰＮＡオリゴマーがその上で合成、結合、連結またはさもなければ固定化される何らかの固相物質を意味する。固体支持体は、「樹脂」、「固相」、「表面」および「支持体」などの用語を包含する。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミドなどの有機高分子、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトで構成され得る。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、多孔性ガラス（ＣＰＧ、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）、または逆相シリカなどの無機物であり得る。固体支持体の形状は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲルまたは表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性のいずれでもよく、膨張特性または非膨張特性を有していてもよい。固体支持体は、穴、くぼみまたは他の入れ物、容器、機構または位置の形態に構成され得る。複数の固体支持体が、試薬のロボット送達のためあるいはレーザー照射および共焦点または偏向集光による走査を含む検出手段によって、特定可能な様々な位置でアレイに構成され得る。
【００４３】
ｙ．「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体支持体上にまたは容器に配置されて存在するオリゴマーのあらかじめ定められた空間配置を意味する。ある種のアレイ形式は、「チップ」または「バイオチップ」と称される（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，Ｅｄ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ（２０００））。アレイは、低密度数の特定可能な位置、たとえば２−約１２、中間密度、たとえば１００またはそれ以上の位置、または高密度数、たとえば１，０００またはそれ以上の特定可能位置を含み得る。典型的には、アレイ形式は、製造、取り扱い、配置、積み重ね、試薬導入、検出および貯蔵を可能にする幾何学的に規則正しい形状である。アレイは、各々の位置の間に規則正しい間隔を置いて、列および段形式に構成され得る。あるいは、位置は、均等な処理またはサンプリングのために束ねるか、混合または均質に混和してもよい。アレイは、各々の位置が、ハイスループットな取り扱い、ロボット送達、マスキングまたは試薬のサンプリングのために、あるいはレーザー照射および共焦点または偏向集光による走査を含む検出手段によって、空間的に特定可能であるように構成された複数の特定可能位置を含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
５．説明
Ｉ．概説：
この「概説」の章で以下に述べる考察は、ここで説明する本発明の様々な実施形態の一部または全部に関し得ることが了解されるべきである。
【００４５】
ＰＮＡ合成：
ＰＮＡオリゴマーの化学的構築のための方法は公知である（たとえば米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号および同第６，１０７，４７０号参照）。ＰＮＡ合成方法のための一般的な参考文献としては、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）参照。
【００４６】
ペプチド核酸の支持体結合自動化学的構築のための化学物質および装置は入手可能である。標識および非標識ＰＮＡオリゴマーの両方が、注文作製ＰＮＡオリゴマーの商業的販売者から入手可能である。ＰＮＡの化学的構築は固相ペプチド合成と類似しており、構築の各々のサイクルに、オリゴマーは、伸長する高分子に付加する次のシントンと縮合することができる反応性アルキルアミノ末端を有する。標準ペプチド化学を利用するため、天然および非天然アミノ酸を常套的にＰＮＡオリゴマーに組み込むことができる。ＰＮＡはポリアミドであるため、Ｃ末端（カルボキシル末端）およびＮ末端（アミノ末端）を有する。Ｃ末端は、合成のために選択される合成方法に依存して、Ｃ末端カルボン酸またはＣ末端アミドであり得る（図２参照）。
【００４７】
標的配列への逆平行結合（好ましい方向）に適するハイブリダイゼーションプローブの設計のために、ＰＮＡプローブのプローブする核酸塩基配列のＮ末端は、等しいＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル末端の等価物である。ＰＮＡオリゴマーはまた、核酸およびＰＮＡオリゴマーの両方に平行に結合することが知られるため、ハイブリダイゼーションの方向は限定ではない。
【００４８】
ＰＮＡ標識化：
ＰＮＡオリゴマーを標識するための非限定的な方法は、米国特許第６，１１０，６７６号、同第６，３５５，４２１号、同第６，３６１，９４２号および同第６，４８５，９０１号に述べられているか、またはさもなければＰＮＡオリゴマーの技術分野において公知である。ＰＮＡオリゴマーを標識するための他の非限定的な例は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）においても論じられている。ＰＮＡオリゴマーおよびオリゴヌクレオチドはまた、米国特許第６，１９７，５１３号に述べられているようにタンパク質（たとえば酵素）およびペプチドで標識することもできる。それゆえ、様々な標識ＰＮＡオリゴマーを作製するまたは商業的販売者から購入することができる。ここで使用する、ＰＮＡ標識化は、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基を、直接または間接的に、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に共有結合で連結することを含む。ＰＮＡを標識するための様々な方法を図３Ａ−３Ｃに例示する。
【００４９】
構築の合成化学は基本的に同じであるため、ペプチドを標識するために一般的に使用される何らかの方法が、しばしばＰＮＡオリゴマーの標識化を実施するために適合させ得る。一般に、高分子のＮ末端は、カルボン酸基または活性カルボン酸基を有する部分との反応によって標識化できる（図３Ａ）。１またはそれ以上のスペーサー部分を、必要に応じて、標識部分とオリゴマーの核酸塩基含有サブユニットの間に導入できる。一般に、スペーサー部分は、標識化反応を実施する前に組み込むことができる。所望する場合は、スペーサーを標識内に埋め込み、それによって標識化反応の間に組み込んでもよい。
【００５０】
Ｎ末端はまた、アミンのアルキル化によっても修飾できる。アルキル化反応は周知であり、塩基性条件下にアミンを標識化試薬のハロゲン化物（たとえば臭化エチル）で処理することによって実施できる（図３Ｂ）。アルキル化は、アミンが２回アルキル化するように進行し得る。従って、一部の実施形態ではアミンはモノアルキル化され、また別の実施形態ではアミンはビスアルキル化される。
【００５１】
高分子のＣ末端は、最初に標識部分または官能基部分を、ＰＮＡオリゴマーを構築する支持体と縮合することによって標識化できる（たとえば図３Ｃ参照）。次に、ＰＮＡオリゴマーの第一核酸塩基含有シントンを標識部分または官能基部分と縮合することができる。あるいは、１またはそれ以上のスペーサー部分（たとえば８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸；「Ｏ−リンカー」）を、標識部分または官能基部分とオリゴマーの第一核酸塩基サブユニットとの間に導入することができる。作製しようとする分子が、Ｎ末端標識および／または修飾された単量体付加の繰り返しによってひとたび完全に構築されれば、標準方法を用いて支持体から切断し、脱保護して、精製することができる。
【００５２】
さらにもう１つの方法により、ＰＮＡオリゴマーが完全に構築され、支持体から切断された後、標識をＰＮＡオリゴマーに結合することができる。この方法は、標識が、オリゴマーを製造するために一般的に使用される切断、脱保護または精製の方法と不適合性である場合に適用できる。標識化は、標識化反応が溶液中で起こり、ＰＮＡオリゴマーが支持体結合している間に起こるのではないことを除いて、一般に図３Ａ−３Ｃに例示するように進行し得る。この方法により、ＰＮＡオリゴマーは、高分子上の官能基と標識上の官能基の反応によって溶液中で標識化され得る。
【００５３】
当業者は、カップリング溶液の組成物が、たとえば供与体または受容体部分などの、オリゴマーと標識の性質に依存することを認識する。溶液は、有機溶媒、水またはそれらの何らかの組合せを含み得る、一般に、有機溶媒は極性非求核溶媒である。適切な有機溶媒の非限定的な例は、アセトニトリル（ＡＣＮ）、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）を含む。
【００５４】
標識化しようとする高分子上の官能基は求核試薬（たとえばＮ末端アミンなどのアミノ基）であり、標識上の官能基は求電子試薬（たとえばカルボン酸基または活性カルボン酸（すなわちＣ末端カルボン酸）であり得る。しかし、これは、高分子上の官能基が求電子試薬（たとえばカルボン酸基または活性カルボン酸）であり、標識上の官能基が求核試薬（たとえばアミノ酸基）であり得るように逆にできることが考慮される。活性カルボン酸官能基の非限定的な例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを含む。水溶液中で、ＰＮＡまたは標識のいずれかのカルボン酸基（選択する成分の性質に依存する）を水溶性カルボジイミドで活性化することができる。試薬、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）は、特に水溶性アミド形成縮合反応のために販売されている市販試薬である。出願人は、同様に、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をＥＤＣと混合したとき、そのような縮合反応を改善できることを認めた。
【００５５】
水溶液のｐＨは、縮合反応の間緩衝液で調節することができる。たとえば縮合の間のｐＨは約４−約１０の範囲内であり得る。一般に、非水性反応の塩基性度は、非求核有機塩基の添加によって調節できる。適切な塩基の非限定的な例は、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含む。あるいは、ｐＨは、（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）（ＨＥＰＥＳ）または４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）などの生物学的緩衝液または重炭酸ナトリウムなどの無機緩衝液を用いて調節することができる。
【００５６】
核酸合成と修飾
核酸オリゴマー（オリゴヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチド）の合成は長年にわたって常套的となってきた。核酸合成の詳細な説明については、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ参照。当業者は、標識および非標識オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの合成類似体）の両方が容易に入手可能であることを認識する。それらは、商業的に入手可能な装置と試薬を用いて合成できるか、または注文製造オリゴヌクレオチドの商業的販売者から購入することができる。
【００５７】
ＰＮＡキメラの合成と修飾
ＰＮＡキメラは、核酸とペプチド核酸サブユニットの組合せである。ＰＮＡキメラの合成、標識化および修飾のための適切な参考文献は米国特許第６，０６３，５６９号に見出される。さらに、ＰＮＡ合成と標識化について上述した方法は、しばしばＰＮＡキメラのＰＮＡ部分を修飾するために使用できる。付加的に、核酸の合成と標識化のための公知の方法がしばしばＰＮＡキメラの核酸部分を修飾するために使用できる。それゆえ、ＰＮＡキメラの合成、標識化および修飾は、当業者に公知の方法ならびに上述したまたは上記で参照した方法を利用することができる。
【００５８】
標識：
ＰＮＡオリゴマー（ＰＮＡキメラを含む）は、少なくとも１つの検出可能部分を含み得る。ポリ核酸塩基鎖（たとえばＰＮＡオリゴマー）を標識するために使用できる検出可能部分の非限定的な例は、デキストラン複合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルまたは化学発光化合物を含む。他の適切な標識化試薬および結合の好ましい方法は、ＰＮＡ、ペプチドまたは核酸合成の当業者によって認識される。
【００５９】
ハプテンの非限定的な例は、５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニンおよびビオチンを含む。
【００６０】
蛍光色素（発蛍光団）の非限定的な例は、５（６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、シアニン２（Ｃｙ２）染料、シアニン３（Ｃｙ３）染料、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）染料、シアニン５（Ｃｙ５）染料、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）染料、シアニン７（Ｃｙ７）染料、シアニン９（Ｃｙ９）染料（シアニン染料２、３、３．５、５および５．５はＡｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬよりＮＨＳエステルとして入手可能である）またはＡｌｅｘａ染料シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含む。
【００６１】
酵素の非限定的な例は、ポリメラーゼ（たとえばＴａｑポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１およびｐｈｉ２９ポリメラーゼ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ダイズペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼを含む。
【００６２】
スペーサー／リンカー部分：
ＰＮＡオリゴマー（ＰＮＡキメラを含む）は、スペーサーおよび／またはリンカー部分を含み得る。一般に、スペーサーは、かさの高い標識試薬がプローブのハイブリダイゼーション特性に及ぼし得る有害作用を最小限に抑えるために使用される。リンカーは、典型的にはポリ核酸塩基鎖に柔軟性と無秩序性を誘導するか、またはさもなければポリ核酸塩基鎖の２またはそれ以上の核酸塩基配列を連結する。ここで述べるポリ核酸塩基鎖のための好ましいスペーサー／リンカー部分は、１またはそれ以上のアミノアルキルカルボン酸（たとえばアミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（たとえばリシンまたはオルニチンの側鎖）、天然アミノ酸（たとえばグリシン）、アミノオキシアルキル酸（たとえば８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）、アルキル二酸（たとえばコハク酸）、アルキルオキシ二酸（たとえばジグリコール酸）またはアルキルジアミン（たとえば１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン）を含み得る。スペーサー／リンカー部分はまた、付随的にまたは意図的に、ポリ核酸塩基鎖の水溶解度を改善するように構築され得る（たとえばＧｉｌｄｅａら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３９：７２５５−７２５８（１９９８）および米国特許第６，３２６，４７９号および同第６，７７０，４４２号参照）。
【００６３】
たとえばスペーサー／リンカー部分は、式：−Ｑ−（Ｏｍ−（ＣＭ２）ｎ）ｏ−Ｔ−を有する１またはそれ以上の連結化合物を含み得る。Ｑ基は、単結合、−（ＣＭ２）ｐ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＭ２）ｐ−、−Ｃ（Ｓ）（ＣＭ２）Ｐ−および−Ｓ（Ｏ２）（ＣＭ２）ｐ−から成る群より選択され得る。Ｔ基は、式ＮＨ、ＮＲ’’’’’Ｓ、−ＳＯ２−またはＯを有し得る。各々のＭは、独立してＨ、Ｒ’’’’’、−ＯＲ’’’’’、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり得る；前記式中、各々のＲ’’’’’は、−ＣＶ３、−ＣＶ２ＣＶ３、−ＣＶ２ＣＶ２ＣＶ３、−ＣＶ２ＣＶ（ＣＶ３）２および−Ｃ（ＣＶ３）３［式中、各々のＶは、独立して水素（Ｈ）、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）またはヨウ素（Ｉ）であり得る］から成る群より独立して選択され得る。各々のｍは、独立して０または１であり得る。各々のｎ、ｏおよびｐは、独立して０−１０の整数であり得る。一部の実施形態では、各々のｎ、ｏおよびｐは、独立して０−３の整数であり得る。
【００６４】
エネルギー移動：
エネルギー移動はハイブリダイゼーション分析において使用できる。エネルギー移動がハイブリダイゼーションを測定する上で有用であるためには、少なくとも１個のエネルギー移動供与体と少なくとも１個のエネルギー移動受容体部分を含むエネルギー移動セットが存在すべきである。たとえば自己指示性ＰＮＡオリゴマーを、米国特許第６，３２６，４７９号、同第６，３５５，４２１号または同第６，４８５，９０１号に述べられているように標識することができる。しばしば、エネルギー移動セットは１個の供与体部分と１個の受容体部分を含むが、これは限定ではない。エネルギー移動セットは２個以上の供与体部分および／または２個以上の受容体部分を含み得る。供与体と受容体部分は、１またはそれ以上の状態部分が、１またはそれ以上の供与体部分から転移されたエネルギーを受容するか、またはさもなければ供与体部分（１またはそれ以上）からのシグナルを消光するように働く。それゆえ一部の実施形態では、供与体部分（１またはそれ以上）と受容体部分（１またはそれ以上）の両方が発蛍光団である。先に列挙した発蛍光団（適切なスペクトル特性を備える）がエネルギー移動受容体としても働き得るが、受容体部分はまた、４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル）などの消光物質部分でもあり得る。エネルギー移動セットの標識は、オリゴマーブロック末端で連結され得るかまたはＰＮＡオリゴマー内の部位で連結され得る。１つの実施形態では、エネルギー移動セットの２個の標識の各々は、ＰＮＡオリゴマーの最も遠位の末端で連結され得る。供与体と受容体部分を含むＰＮＡオリゴマーはまた、生理的ｐＨで荷電基を含む少なくとも１個の連結アミノ酸を含み得る。
【００６５】
供与体と受容体部分の間でのエネルギーの移動は、エネルギー移動セットの密接に関連する部分の衝突をとおしてまたは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの非放射工程をとおして、などの何らかのエネルギー移動工程をとおして起こり得る。ＦＲＥＴが起こるためには、エネルギー移動セットの供与体と受容体部分の間でのエネルギーの移動は、前記の２つの部分が空間的に近接していることおよび供与体の発光スペクトルが受容体の吸収スペクトルと実質的な重複を有することを必要とする（Ｙａｒｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２２８−２３５（１９７９）、特にｐａｇｅ  ２３２，ｃｏｌ．１−ｐａｇｅ  ２３４，ｃｏｌ．１参照）。あるいは、衝突を介した（無放射）エネルギー移動は、供与体部分の発光スペクトルが受容体部分の吸収スペクトルと実質的な重複を有するか否かに関わらず、非常に密接に関連する供与体と受容体部分の間で起こり得る（Ｙａｒｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２２８−２３５（１９７９）、特にｐａｇｅ  ２２９，ｃｏｌ．  １−ｐａｇｅ  ２３２，ｃｏｌ．１参照）。この工程は、消光が供与体と受容体部分の直接接触によって引き起こされると考えられるため、分子内衝突と称される（Ｙａｒｏｎら参照）。本出願におけるエネルギー移動への言及は、これらの機序的に異なる現象のすべてを包含することが了解されるべきである。また、エネルギー移動は２以上のエネルギー移動工程をとおして同時に起こり得ること、および検出可能シグナルの変化は２またはそれ以上のエネルギー移動工程の活性の測定であり得ることが了解されるべきである。エネルギー移動はまた、記述されていない機序によっても起こり得ることが了解されるべきである。従って、エネルギー移動の機序は本発明の限定ではない。
【００６６】
自己指示性ＰＮＡオリゴマーにおけるエネルギー移動の検出：
一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは自己指示性である。たとえば自己指示性ＰＮＡオリゴマーは、米国特許第６，３２６，４７９号、同第６，３５５，４２１号または同第６，４８５，９０１号に述べられているように標識することができる。自己指示性高分子の様々な例が図４Ｃ−４Ｆに見出される。図面からわかるように、疎水基、エネルギー受容体部分およびエネルギー受容体部分に関して様々な配置が可能である。一部の実施形態では、荷電基を含むアミノ酸も付加し得る（図４Ｆ）。これらの荷電基は、ある種の立体配座の非ハイブリダイズオリゴマーを安定化する塩橋を形成し得る。様々な図面からわかるように、エネルギー供与体とエネルギー受容体部分はどちらの末端にも位置し得るが、典型的にはＰＮＡオリゴマーの反対側の末端に存在する。
【００６７】
自己指示性ＰＮＡオリゴマーとポリ核酸塩基鎖の間の雑種形成は、ＰＮＡオリゴマーがハイブリダイズしていない状態で存在するときと比較して、ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体が形成されたとき検出可能に異なる、エネルギー移動セットの少なくとも１つの成員の少なくとも１つの物理的性質を測定することによって観測できる。我々はこの現象をＰＮＡオリゴマーの自己指示性と称する。検出可能シグナルのこの変化は、核酸配列へのＰＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーションによって引き起こされる供与体と受容体部分の間でのエネルギー移動の効率の変化から生じる。
【００６８】
たとえば検出の手段は、エネルギー移動セットの供与体または受容体発蛍光団の蛍光を測定することを含み得る。たとえばエネルギー移動セットは、供与体発蛍光団の蛍光の測定が核酸へのＰＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーションを検出する、同定するおよび／または定量するために使用できるように、少なくとも１個の供与体発蛍光団と少なくとも１個の受容体（蛍光または非蛍光）消光物質を含み得る。
【００６９】
一部の実施形態では、エネルギー移動セットは、少なくとも１個の供与体部分または１個の受容体部分のいずれかまたは両方の蛍光の測定が、核酸へのＰＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーションを検出する、同定するおよび／または定量するために使用できるように、少なくとも１個の供与体発蛍光団と少なくとも１個の受容体発蛍光団を含む。
【００７０】
検出可能および独立して検出可能な部分／多重分析：
一部の実施形態では、多重ハイブリダイゼーションアッセイを実施する。多重アッセイでは、対象とする数多くの条件を同時にまたは連続的に検討する。多重分析は、アッセイの間またはアッセイが完了した後、試料成分またはそれに関連するデータを分析する能力に基づく。多重アッセイを実施するとき、１またはそれ以上の異なる独立して検出可能な成分が、アッセイで使用される２またはそれ以上のＰＮＡオリゴマーを標識するために使用できる。独立して検出可能であるとは、１つの検出可能部分をその他の検出可能部分とは独立して、およびその他の検出可能部分の存在下で、測定することが可能であることを意味する。データは、異なる独立して標識されたＰＮＡオリゴマーの各々の、試料中の測定しようとする特定標識配列へのハイブリダイゼーションと相関するため、独立して検出可能な部分の各々を識別するおよび／または定量する能力はハイブリダイゼーションアッセイを多重化するための手段を提供する。その結果、多重アッセイは、たとえば同じ試料中の２またはそれ以上の標的配列の存在、不在、数、位置および／または同一性を同じアッセイにおいて同時におよび／または連続的に検出するために使用することができる。
【００７１】
ＩＩ．本発明の様々な実施形態
出願人は、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素への１またはそれ以上のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基の直接または間接的な共有結合による連結が、ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体のＴｍを有意に上昇させ得ることを発見した。ＰＮＡオリゴマー／核酸複合体（ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体）の熱安定性（Ｔｍ）の上昇は、連結する１またはそれ以上の基の性質、数および位置に依存する。従って、複合体のＴｍは、ＰＮＡオリゴマーに連結する基の性質、数および位置に依存して調節することができる。
【００７２】
Ｔｍの上昇は、ＰＮＡオリゴマーの配列には実質的に依存しないと思われる。それゆえ、同じ長さの２またはそれ以上の異なるＰＮＡオリゴマー上の同じ位置に同じ置換基を連結することは、ＰＮＡオリゴマーとその相補的ポリ核酸塩基鎖の間で形成される複合体のＴｍをほぼ同じ℃数だけ上昇させるはずである。従って、相補的ポリ核酸塩基鎖についてのＰＮＡオリゴマーのＴｍを実質的に予測可能に調節する（たとえば上昇させる）ことができる、個々のＰＮＡオリゴマー、ＰＮＡオリゴマーのセットおよび／またはＰＮＡオリゴマーのライブラリーを作製することができる。
【００７３】
一部の実施形態では、出願人は、非修飾ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体と比較して、修飾ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体に関して１０℃を超えるＴｍの上昇を認めた（実施例２および表参照）。それゆえ、大規模な遺伝子解析プロジェクトのためならびに他のプローブに基づくアッセイ形成における使用のために有用と考えられる、ユニバーサル核酸塩基を含むまたは含まない、８量体および／または９量体ライブラリーを構築することが可能である。
【００７４】
ａ．組成物：
従って、一部の実施形態では、本発明は、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではないことを条件として、Ｎ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含むＰＮＡオリゴマーに関する。一部の実施形態では、前記の基は、置換または非置換環状炭化水素を含み得る。たとえば各々の基は、置換または非置換シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシル基を含み得る。疑わしさを避けるため、連結基（直接または間接的に）と称するとき、シクロヘキシル基を含むＰＮＡオリゴマーサブユニットなどのＰＮＡオリゴマーに不可欠である基（たとえばＰＮＡオリゴマー骨格構造の成分またはＰＮＡオリゴマー骨格の、Ｎ末端アミン以外の、窒素に連結されたリガンド）を意味しない（たとえばＬａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．３（６）：９１２−９１９（１９９７）参照）。
【００７５】
一部の実施形態では、以下の条件の１またはそれ以上も適用され得る。一部の実施形態では、各々の基はステロイドではない。一部の実施形態では、各々の基は、生理的ｐＨで荷電していない。一部の実施形態では、各々の基は、生理的ｐＨで塩基性窒素を含まない。一部の実施形態では、各々の基は、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素に直接連結される（たとえば基は、連結アミノ酸残基と結合していない）。一部の実施形態では、基は、ＰＮＡオリゴマーを固体支持体に連結するために使用されるリンカーではない。
【００７６】
一部の実施形態では、基の１またはそれ以上は、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素に間接的に連結される（図３Ａ−４Ｆ参照）。たとえば１またはそれ以上の連結基は、β−シクロヘキシルアラニンなどの非天然アミノ酸の側鎖であり得る（たとえば図４Ａ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅおよび４Ｆ）。この実施形態では、基はシクロヘキシルメチレンである。一部の適切な基の非限定的な例は、式：
【００７７】
【化１８】
2009505636.tif 000005
【００７８】
【化１９】
2009505636.tif 000006
【００７９】
【化２０】
2009505636.tif 000007
［式中、各々のＪ’は、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＸ３、−ＳＣＸ３または−ＯＣＸ３［式中、各々のＸは、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである］である］
を有する。上記に示す構造に関して、一部の実施形態では、基の中の式Ｃ（Ｊ’）２の１またはそれ以上の部分は、必要に応じて式：Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＳまたはＯの部分で置換され得るおよび／または基の中の式：
【００８０】
【化２１】
2009505636.tif 000008
の部分の１またはそれ以上は、置換されているとき基が芳香族ではないことを条件とし、およびさらに基が式：
【００８１】
【化２２】
2009505636.tif 000009
を有さないことを条件として、必要に応じて式：
【００８２】
【化２３】
2009505636.tif 000010
の部分で置換され得る。
【００８３】
一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、Ｎ末端アミンに直接連結された前記の基の１またはそれ以上を含む（たとえば図３Ｂおよび４Ｂ（化合物ＩおよびＩＩ）。これらの基は、前記アミンの直接アルキル化によって末端アミンに直接連結され得る。
【００８４】
一部の実施形態では、Ｎ末端アミンに直接または間接的に連結される基は、式：
【００８５】
【化２４】
2009505636.tif 000011
【００８６】
【化２５】
2009505636.tif 000012
【００８７】
【化２６】
2009505636.tif 000013
［式中、各々のＪ’は、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＸ３、−ＳＣＸ３または−ＯＣＸ３［式中、各々のＸは、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである］であり；およびＷはＯまたはＳである］
を有し得る（たとえば図３Ａ、４Ａ、４Ｂ（化合物Ｉ）および４Ｄ）。上記に示す構造に関して、一部の実施形態では、基の中の式Ｃ（Ｊ’）２の１またはそれ以上の部分は、必要に応じて式：Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＳまたはＯの部分で置換され得るおよび／または基の中の式：
【００８８】
【化２７】
2009505636.tif 000014
の部分の１またはそれ以上は、置換されているとき基が芳香族ではないことを条件として、必要に応じて式：
【００８９】
【化２８】
2009505636.tif 000015
の部分で置換され得る。
【００９０】
一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーはＣ末端カルボン酸基を含み得る。一部の実施形態では、Ｃ末端カルボン酸基は、所望する場合、組合せ型オリゴマーを形成するためにＰＮＡオリゴマーに連結するために使用でき（米国特許出願公開第２００３−００７７６０８号参照）、ＰＮＡオリゴマーを支持体に固定化するために使用でき、またはＰＮＡオリゴマーに標識（たとえば基）を連結するために使用できる（図３Ｄ）。
【００９１】
一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、Ｃ末端カルボニル炭素に直接連結された１またはそれ以上の基を含む（図３Ｄ、３Ｅ、４Ｅおよび４Ｆ）。たとえばＣ末端カルボニル炭素に直接連結される基は、式：
【００９２】
【化２９】
2009505636.tif 000016
【００９３】
【化３０】
2009505636.tif 000017
【００９４】
【化３１】
2009505636.tif 000018
［式中、Ｋ’はＮ、ＯまたはＳであり、各々のＪ’は、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＸ３、−ＳＣＸ３または−ＯＣＸ３［式中、各々のＸは、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである］であり；およびＫ’がＯまたはＳである場合、Ｒ１は存在しない（すなわちＫ’に共有結合で連結された基は存在しない）が、Ｋ’がＮである場合は、Ｒ１は水素またはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基である］
を有し得る。上記に示す構造に関して、一部の実施形態では、基の中の式Ｃ（Ｊ’）２の１またはそれ以上の部分は、必要に応じて式：Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＳまたはＯの部分で置換され得るおよび／または基の中の式：
【００９５】
【化３２】
2009505636.tif 000019
の部分の１またはそれ以上は、置換されているとき基が芳香族ではないことを条件として、必要に応じて式：
【００９６】
【化３３】
2009505636.tif 000020
の部分で置換され得る。
【００９７】
上述したように、一部の実施形態では、１またはそれ以上の基がＮ末端アミンに連結され、一部の実施形態では、１またはそれ以上の基がＣ末端カルボニル炭素に連結され、また一部の実施形態では、１またはそれ以上の基がＮ末端アミンとＣ末端カルボニル炭素の両方に連結される。一部の実施形態では、同じかまたは異なる基の２またはそれ以上がＮ末端アミンに連結される。一部の実施形態では、同じかまたは異なる基の２またはそれ以上がＣ末端カルボニル炭素に連結される。一部の実施形態では、同じかまたは異なる基の２またはそれ以上が、Ｎ末端アミンおよびＣ末端カルボニル炭素の各々に連結される。基は、１またはそれ以上の検出可能部分などの他の部分に加えて連結され得る。他の部分が存在するとき、様々な基および部分は様々な位置で連結され得る（たとえば図４Ａ−４Ｆ）。
【００９８】
一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、少なくとも１個の検出可能部分をさらに含み得る（たとえば図４Ｂ）。一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、少なくとも１個のエネルギー供与体部分と少なくとも１個のエネルギー受容体部分をさらに含み得る（たとえば図４Ｃ−４Ｆ）。少なくとも１個のエネルギー供与体部分と少なくとも１個のエネルギー受容体部分を含むプローブは、自己指示性であり得、リアルタイムおよびエンドポイントハイブリダイゼーション分析においておよび多重ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用できる（たとえば米国特許第６，３５５，４２１号および同第６，４８５，９０１号参照）。
【００９９】
一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、生理的ｐＨで荷電基を含む少なくとも１個の天然アミノ酸をさらに含み得る。たとえばＰＮＡオリゴマーは、酸性側鎖（たとえばカルボン酸基）を含む１またはそれ以上のアミノ酸および／または塩基性側鎖（たとえばアミン）を含む１またはそれ以上のアミノ酸を含み得る（たとえば図４Ｆ）。一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、少なくとも１個のユニバーサル核酸塩基を含み得る（たとえば図１Ｂ）。一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、少なくとも１個のジアミノプリン核酸塩基を含み得る（たとえば図１Ｂ）。
【０１００】
一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーは、１またはそれ以上の連結Ｃ末端ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むＰＮＡキメラである。１またはそれ以上の連結Ｃ末端ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むＰＮＡキメラは、ポリメラーゼによって伸長することができる（米国特許第６，３１６，２３０号参照）。従ってそれらは、ＤＮＡ塩基配列決定、ＤＮＡフラグメント分析、逆転写、ミニシーケンシング、染色体標識化、増幅および一塩基多型（ＳＮＰ）検出などの様々な種類の遺伝子分析において使用できる。
【０１０１】
一部の実施形態では、２またはそれ以上のＰＮＡオリゴマーのライブラリーを作製することができる。たとえばＰＮＡオリゴマーが、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではないことを条件として、Ｎ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含む、８量体または９量体ＰＮＡオリゴマーのライブラリーを作製することができる。
【０１０２】
一部の実施形態では、ライブラリーのＰＮＡオリゴマーは、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブおよび／またはプライマーとして使用できる。一部の実施形態では、ライブラリーのＰＮＡオリゴマーは、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブおよび／またはプライマーとして使用できるより長いＰＮＡオリゴマーを生産するための連結反応において使用できる（たとえば米国特許出願公開第２００３−００７７６０８号参照）。
【０１０３】
一部の実施形態では、ここで述べるＰＮＡオリゴマーは固体支持体に連結することができる（たとえば図３Ｅ）。一部の実施形態では、ここで述べる１またはそれ以上のＰＮＡオリゴマーは、アレイを形成するために使用することができる。支持体結合ＰＮＡオリゴマーは、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブおよび／またはプライマーとして使用できる。
【０１０４】
ｂ．方法：
出願人は、ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体の融解温度（Ｔｍ）がＮ末端連結基の疎水度に関連して上昇することを認めた。Ｃ末端およびＮ末端の両方への基の連結がＴｍをさらに上昇させる。Ｔｍの上昇は、関与するオリゴヌクレオチドの配列とは実質的に無関係であり、主として、ｌｏｇＰｏｃｔ（すなわちオクタノール−水抽出における化合物の分配係数）によって測定したときのＮ末端連結基の疎水度に依存する。図６は、ＰＮＡオリゴマーに連結し得る様々な可能な基およびｌｏｇＰｏｃｔスケールでのそれらの関係を示す。従って、Ｔｍの上昇は、ＰＮＡオリゴマーに連結している基の性質、数および位置に依存する。さらに、発蛍光団および荷電部分などの他の基の存在も、ＰＮＡオリゴマーと相補的ポリ核酸塩基鎖によって形成される複合体のＴｍに影響を及ぼすことができ（すなわち上昇または低下させ得る）、おそらく付加された疎水基の影響を過小評価させる。
【０１０５】
基本的に、ＰＮＡオリゴマーにアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基を連結することは、標識化と同様である。上記の「組成物」と題する章で述べたＰＮＡオリゴマーは、標識化のために使用される標準合成手順（たとえば上記の「ＰＮＡ標識化」と題する章参照）および適切に修飾された基を適用することにより、１またはそれ以上の基をＰＮＡオリゴマーに共有結合で連結することによって生産できる。たとえばＮ末端は、アミノ酸と反応させる、アルキル化する、または活性カルボン酸を含む基と反応させることができる。
【０１０６】
従って、一部の実施形態では、本発明は、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではないことを条件として、Ｎ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含むＰＮＡオリゴマーを形成することに関する。
【０１０７】
上述したＰＮＡオリゴマー組成物は、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブおよび／またはプライマーとして使用できる。ＰＮＡプローブ／プライマーは、複合体を形成するように相補的ポリ核酸塩基鎖にハイブリダイズすることができる。たとえばＰＮＡプローブ／プライマーは、ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体を形成するように核酸にハイブリダイズすることができる。従って、本発明はまた、ＰＮＡオリゴマーが、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではないことを条件として、Ｎ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含む、ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体を形成することを含む方法に関する。
【０１０８】
先に論じたように、ＰＮＡオリゴマーに連結された基の性質、数および位置は、非修飾ＰＮＡオリゴマーから形成される複合体と比較したとき、ポリ核酸塩基鎖で形成される複合体のＴｍに影響を及ぼす。出願人は、Ｔｍの調節への作用はＰＮＡオリゴマーの核酸塩基配列とは実質的に無関係であると思われることを認めた。従って、様々な基がＴｍにどのような作用を及ぼすかについての基本的情報が得られることを条件として、ＰＮＡオリゴマーに連結する１またはそれ以上の基を賢明に選択することにより、ＰＮＡオリゴマーのＴｍを予測可能に調節することが可能である。そのような情報は常套的実験によって生成され得る。たとえば様々な形態の修飾ＰＮＡオリゴマーを作製し、Ｔｍを測定することができる。Ｔｍの調節は核酸塩基配列と実質的に無関係であるため、１またはそれ以上の基の存在が、実験データが得られたものに従って修飾された様々な他のＰＮＡオリゴマーのＴｍに及ぼす作用を合理的に予測するために、管理された実験から導かれる情報を利用することが可能である。
【０１０９】
従って、本発明はさらに、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含むＰＮＡオリゴマーに対して、基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではないことを条件として、ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体を形成するために使用されるＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基を直接または間接的に共有結合で連結することにより、ＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体のＴｍを実質的に予測可能に調節することを含む方法に関する。「実質的に予測可能」とは、±１−２℃以内に予測可能であることを意味する。
【０１１０】
ｃ．キット：
一部の実施形態では、本発明はまた、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含み、基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではないことを条件として、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に直接または間接的に共有結合で連結された、少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基をさらに含むＰＮＡオリゴマーを含むキットに関する。
【０１１１】
前記キットは、特異的ハイブリダイゼーションアッセイのために設計することができる。たとえばキットは、ＰＣＲ分析のために設計できる。そのようなＰＣＲキットは、ＰＮＡオリゴマーおよびＰＣＲアッセイを実施するために選択される他の試薬、混合物および／または組成物を含み得る。たとえばキットは、ポリメラーゼ酵素およびヌクレオチド三リン酸を含み得る。キットが塩基配列決定のために使用される場合、キットはジデオキシターミネーターをさらに含み得る。
【実施例】
【０１１２】
本発明の教示の態様は以下の実施例に照らしてさらに理解され得るが、それらはいかなる意味においても本発明の教示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１１３】
実施例１
Ｔｍ調節の概念がＰＮＡオリゴマーに適用できることを確認するために２個のＰＮＡを合成した。１個のＰＮＡオリゴマーをアセチル化し（化合物ＩＩＩ、図５）、２番目のＰＮＡオリゴマーをシクロヘキシルブチリル化した（化合物ＩＶ、図５）ＰＮＡオリゴマーは長い間アセチルキャップされてきたため、アセチル基を含むＰＮＡオリゴマーを対照として選択した。より長いアルキル基に関連する作用を調べるために対照と比較したときのＴｍの調節を測定した。
【０１１４】
ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＰＮＡ合成装置で標準Ｆｍｏｃプロトコールを用いて実施した。ＰＮＡオリゴマーがまだ支持体結合している間にＮ末端の修飾（アセチルまたはシクロヘキシルブチリル基の付加）を実施した。どちらの場合も、ＰＮＡオリゴマーを無水酢酸（化合物ＩＩＩを生成するため）またはＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）と組み合わせたシクロヘキシル酪酸（化合物ＩＶを生成するため）のいずれかと反応させた。両方のＰＮＡを、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣ精製法を用いて高純度で得た。
【０１１５】
これら２個のＰＮＡの融解温度試験は、アセチル化ＰＮＡに比べてシクロヘキシルブチリル修飾したＰＮＡのＴｍの７−８℃の上昇が存在することを明らかにした。
【０１１６】
実施例２
付加的な実験では、いくつかのＰＮＡオリゴマーを作製し、それらのＴｍを比較した。この実施例のために、ＰＮＡオリゴマーをＣ末端修飾、Ｎ末端修飾、またはＣ末端とＮ末端の両方を修飾した。修飾を実施するため、アミノ酸Ｆｍｏｃ−β−シクロヘキシル−Ａｌａ−ＯＨ（３９３．５ｇ／ｍｏｌ、ロット番号５２２４３４、Ｂａｃｈｅｍ  Ｐ／Ｎ  Ｂ  １９７５）をＥｘｐｅｄｉｔｅ合成装置で単量体として使用した。それゆえ、前記アミノ酸は、単にＰＮＡオリゴマー構築の間にアミノ酸をカップリングすることによってＣ末端、Ｎ末端、またはＣ末端とＮ末端の両方に組み込むことができた（表参照）。このアミノ酸の付加は、ＰＮＡオリゴマー内の様々な位置にシクロヘキシルメチレン基を導入する。
【０１１７】
【表１】
2009505636.tif 000021
ＣｈＡｌａ＝β−シクロヘキシル−Ａｌａ
表のデータを参照して、Ｔｍ調節は、基がＣ末端またはＮ末端に連結しているかどうかに依存して実質的に異なることがわかる（項目１および３参照）。しかし、両方の末端が基を含む場合、今回の場合はＴｍの正味上昇が１０℃を超えるような、付加的な作用が存在する。それゆえ、データから、ＰＮＡオリゴマーに付加する基の性質、数および位置に依存してＴｍの大きな上昇を達成し得ることは明らかである。様々な位置の様々な基のＴｍの適切な評価と共に、Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボニル炭素を含むＰＮＡオリゴマーに対して、基がアセチル基または末端に連結された天然アミノ酸の側鎖ではないことを条件として、ＰＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体を形成するために使用されるＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミン基および／またはＣ末端カルボニル炭素に少なくとも１個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基または複素環式炭化水素基を直接または間接的に共有結合で連結することにより、ＮＡオリゴマー／ＮＡ複合体のＴｍを実質的に予測可能に調節することが可能となるはずである。
【０１１８】
本発明の教示を様々な実施形態と共に説明したが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図しない。逆に、本発明の教示は、当業者に認識されるように、様々な代替物、修正および等価物を包含する。
【０１１９】
【数１】
2009505636.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
当業者は、以下で述べる図面が例示だけを目的することを了解する。図面はいかなる意味においても本発明の教示の範囲を限定することを意図しない。
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、核酸、ＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡキメラに組み込むことができる一部の核酸塩基の例示である。
【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂは、核酸、ＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡキメラに組み込むことができる一部の核酸塩基の例示である。
【図２】図２は、Ｃ末端カルボニル炭素およびＮ末端アミンを特定するＰＮＡオリゴマーの一般構造の例示である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミンがカルボン酸基を含む標識試薬と縮合する縮合反応の例示である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｎ末端アミンがハロゲン原子を含む標識試薬でモノまたはビスアルキル化されるアルキル化反応の例示である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、側鎖標識（たとえば疎水基）を有するアミノ酸を含む合成支持体上でのＰＮＡオリゴマーの構築によって例示的ＰＮＡオリゴマーのＣ末端を標識するための方法の例示である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、Ｃ末端カルボニル炭素がアミン基を含む疎水性標識試薬と反応する縮合反応の例示である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、Ｃ末端疎水基を含むＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミンが共有結合で固体支持体に固定化される縮合反応の例示である。
【図４Ａ】図４Ａは、ビス標識ＰＮＡオリゴマーの実施形態の例示である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、各々がＮ末端疎水基と検出可能部分を含む２個のＰＮＡオリゴマーの実施形態の例示である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、２個の疎水基、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含むＰＮＡオリゴマーの実施形態の例示である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、２個の疎水基、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含むＰＮＡオリゴマーのもう１つ別の実施形態の例示である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、２個の疎水基、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含むＰＮＡオリゴマーのさらにもう１つ別の実施形態の例示である。
【図４Ｆ】図４Ｆは、２個の疎水基、２個の荷電アミノ酸、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分を含むＰＮＡオリゴマーの実施形態の例示である。
【図５】図５は、各々がアセチル基またはシクロヘキシルブチリル基のいずれかを含む２個のＰＮＡオリゴマーの例示である。
【図６】図６は、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミンまたはＣ末端カルボニル炭素に連結することができる様々な基ならびにｌｏｇＰｏｃｔスケールでのそれらの相対的疎水度の例示である。
【図１Ａ】
2009505636.tif 000038
【図１Ｂ】
2009505636.tif 000039
【図２】
2009505636.tif 000040
【図３Ａ】
2009505636.tif 000041
【図３Ｂ】
2009505636.tif 000042
【図３Ｃ】
2009505636.tif 000043
【図３Ｄ】
2009505636.tif 000044
【図３Ｅ】
2009505636.tif 000045
【図４Ａ】
2009505636.tif 000046
【図４Ｂ】
2009505636.tif 000047
【図４Ｃ】
2009505636.tif 000048
【図４Ｄ】
2009505636.tif 000049
【図４Ｅ】
2009505636.tif 000050
【図４Ｆ】
2009505636.tif 000051
【図５】
2009505636.tif 000052
【図６】
2009505636.tif 000053
【国際調査報告】
2009505636.tif 000054