(57)【要約】（１）リドカインが投与された被験者に由来する脳脊髄液中のリドカイン又はその代謝物の量を測定する測定工程と、（２）測定された量に基いて、被験者がアルツハイマー病であるか否かを判定する判定工程とを含む、アルツハイマー病の検査方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）リドカインが投与された被験者に由来する脳脊髄液中のリドカイン又はその代謝物の量を測定する測定工程と、
（２）測定された量に基いて、被験者がアルツハイマー病であるか否かを判定する判定工程と、
を含む、アルツハイマー病の検査方法。
【請求項２】
測定工程が、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、イムノアッセイ、又は、キャピラリー電気泳動により行われる請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
測定工程が、質量分析により行われる請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
測定工程が、液体クロマトグラフィーと質量分析により行われる請求項１に記載の検査方法。
【請求項５】
リドカインを定量するための試薬及び／又は装置を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検査方法に使用するための、アルツハイマー病用検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（以下、ADと称す）は、脳に老人斑の出現や神経原線維変化を伴う神経変性疾患であり、病理学的にはニューロン細胞体内の神経原線維のもつれ、及び神経炎性（又は老年）斑として生じるコンゴレッド親和性の繊維状物質の病的な蓄積、そしてベータアミロイドタンパク質の沈着を特徴としている。老人斑の中核をなすのは、このベータアミロイドと呼ばれる39−42残基程度のペプチドであり、アミロイド前駆体タンパク質から切り出されてきたものである。【０００３】
ADの診断は臨床症状と問診が中心であり、脳波やCTスキャンでの大脳萎縮により確認される。脳脊髄液中のタウタンパク質やリン酸化タウタンパク質、可溶性ベータアミロイドなども指標として用いられているが、診断の精度（感度や特異性）は未だ不十分であり、広く用いられるに至っていない（非特許文献１〜５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Clark CM, Davatzikos C, Borthakur A, Newberg A, Leight S, Lee VM, Trojanowski JQ. Biomarkers for early detection of Alzheimer pathology. Neurosignals. 2008; 16(1):11-8.
【非特許文献２】Reijn TS, Rikkert MO, van Geel WJ, de Jong D, Verbeek MM. Diagnostic accuracy of ELISA and xMAP technology for analysis of amyloid beta(42) and tau proteins. Clin Chem. 2007; 53(5):859-65.
【非特許文献３】Ramani A, Jensen JH, Helpern JA. Quantitative MR imaging in Alzheimer disease. Radiology. 2006; 241(1):26-44.
【非特許文献４】Azzazy HM, Mansour MM, Kazmierczak SC. Nanodiagnostics: a new frontier for clinical laboratory medicine. Clin Chem. 2006; 52(7):1238-46.
【非特許文献５】Sunderland T, Gur RE, Arnold SE. The use of biomarkers in the elderly: current and future challenges. Biol Psychiatry. 2005 Aug 15; 58(4):272-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、脳脊髄液を用いた感度・特異性に優れるADの検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、AD患者の脳脊髄液中に見出される物質を探索し、リドカインが、AD患者特異的に低い濃度で検出されることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
［１］（１）リドカインが投与された被験者に由来する脳脊髄液中のリドカイン又はその代謝物の量を測定する測定工程と、
（２）測定された量に基いて、被験者がアルツハイマー病であるか否かを判定する判定工程と、
を含む、アルツハイマー病の検査方法。
［２］測定工程が、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、イムノアッセイ、又は、キャピラリー電気泳動により行われる［１］に記載の検査方法。
［３］測定工程が、質量分析により行われる［１］に記載の検査方法。
［４］測定工程が、液体クロマトグラフィーと質量分析により行われる［１］に記載の検査方法。
［５］リドカインを定量するための試薬及び／又は装置を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の検査方法に使用するための、アルツハイマー病用検査キット。
【発明の効果】
【０００８】
感度・特異性に優れるADの検査方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の検査方法は、リドカインが投与された被験者、好ましくはヒト、に由来する脳脊髄液中のリドカイン又はその代謝物の量を測定する測定工程と、測定された量に基づいて、被験者がADであるか否かを判定する判定工程とを含む。
【００１０】
被験者に由来する脳脊髄液は、腰椎穿刺等の公知の方法により採取されたものでよい。リドカインの投与は、脳脊髄液の採取の際の硬膜外麻酔のために行われるものと同様でよい。脳脊髄液の採取のための硬膜外麻酔にリドカイン麻酔を採用した場合には、その麻酔のためのリドカインの投与で十分である。一般には、リドカイン塩酸塩として200mgが硬膜外に投与される。脳脊髄液の採取時期は、麻酔が持続している間であり、一般には、リドカイン投与後直ちに又は１０分以内に行われる。
【００１１】
脳脊髄液中のリドカインは、局所麻酔薬として知られている物質である。また、脳脊髄液中のリドカイン代謝物は、脳脊髄液中に存在するものであれば特に制限されず、例えば、モノエチルグリシンキシリジド(monoethylglycinexylidide; MEGX)である。
【００１２】
脳脊髄液中のリドカイン又はその代謝物を測定する方法については特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。また、その測定の実施に適した測定又は分析用の装置を用いることができる。具体的には、ガスクロマトグラフィー（Tsai PS et al., Anesth Analg. 1998 Sep;87(3):601-4、Hattori H et al., J Chromatogr. 1991 Mar 8;564(1):278-82）及び液体クロマトグラフィー（Chen L et al., J Pharm Biomed Anal. 2007 Apr 11;43(5):1757-62. Epub 2006 Dec 30, Marttila E et al., Eur J Clin Pharmacol. 1983;25(5):639-41）などのクロマトグラフィー、並びにラジオイムノアッセイ（Calvo B et al., J Clin Pharmacol. 1995 Apr;35(4):426-31）、エンザイムイムノアッセイ及び蛍光イムノアッセイなどのイムノアッセイ、キャピラリー電気泳動（Anderson MS et al., Rapid Commun Mass Spectrom. 2004;18(22):2612-8、Vera-Candioti L et al., Anal Chim Acta. 2007 Jul 9;595(1-2):310-8）が挙げられる。また、質量分析によって測定を行うことができる（Kadioglu Y, Atila A.,  Biomed Chromatogr. 2007;  21(10):1077-82、Maes A, Weiland L, Sandersen C, Gasthuys F, De Backer P, Croubels S., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007; 852(1-2):180-7）。
【００１３】
好ましい方法として、液体クロマトグラフィー（LC）と質量分析（MS）とを組み合わせた方法（LC-MS）が挙げられる（Chik Z, Lee TD, Holt DW, Johnston A, Tucker AT., J Chromatogr Sci. 2006; 44(5):262-5、Kawano S, Murakita H, Yamamoto E, Asakawa N., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003; 792(1):49-54.）。
【００１４】
脳脊髄液は、測定方法に応じて、タンパク質除去処理や脱塩などの前処理をすることができる。
【００１５】
脳脊髄液中のリドカイン又はその代謝物の量を指標として用いることにより、ADであるか否かが判定される。例えばリドカイン又はその代謝物の値が、健常者における値（正常値）と比較して低値であるときに、ADと判定することができる。また、正常値下限（カットオフ値）を設定し（例えば、健常者コントロール群の濃度の平均値−標準偏差）、それとの比較でADの有無を判定してもよい。
【００１６】
さらに本発明は、本発明の検査方法に用いるためのAD検査キットであって、脳脊髄液中のリドカイン又はその代謝物を定量するための試薬及び／又は装置を含むことを特徴とするキットに関する。
【００１７】
脳脊髄液中のリドカイン又はその代謝物を定量するための試薬及び／又は装置は、測定工程の測定原理に応じて適宜選択される。
【００１８】
例えば、クロマトグラフィーによる場合には、脳脊髄液の前処理に必要は試薬及び／又は装置が含まれる。このような試薬及び／又は装置としては、タンパク質成分を除去するための限外ろ過フィルター、脱塩カラム、緩衝液、内部標準物質などが挙げられる。また、イムノアッセイによる場合には、リドカイン又はその代謝物に対する抗体が含まれる。この場合には、この抗体の他に、二次抗体、リドカイン標準液、希釈液、洗浄液、検出用の基質などが含まれてもよい。
【実施例】
【００１９】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２０】
１．サンプルの前処理
アルツハイマー病患者17名（男性10名、女性7名、いずれも白人）の脳脊髄液、及び年齢と性別、人種をあわせた17名の健常者の脳脊髄液をサンプルとして使用した。サンプル採取は、リドカインによる硬膜外麻酔下に行った（穿刺箇所にリドカイン塩酸塩（基準用量200mg）を皮下投与した）。各脳脊髄液150マイクロリットルから5000NMWLの限外ろ過フィルター（ミリポア社製、Ultrafree-MC BIOMAX-5, UFC3BCC00）によってタンパク質成分を除去した。そこに内部標準物質としてL-Valine-13C5,15NとL-Lysine-13C5,15Nを含む溶液（0.1％ギ酸、50％メタノール溶媒）25マイクロリットルと0.15％の塩酸溶液800マイクロリットルを加えた。このサンプル溶液をWaters社製の固相抽出カラムOasisのMCX(10mg)に負荷した。まず１ｍLの水で洗浄し、続いて１ｍLの0.1％ギ酸を含む50％メタノール溶媒、続いて１ｍLの水、そして１ｍLのメタノールで洗浄した。その後１ｍLの25% アンモニア水とメタノール混液（2: 3, v/v)で溶出させて、溶出物を乾燥後、25マイクロリットルの50％メタノールで再溶解して、ポアサイズが0.22マイクロメートルのPVDF膜フィルターで不要物を除去しLC/MS用サンプルとした。【００２１】
２．LC/MS条件
LCカラムの充填剤はSIELC Technologies社（Prospect Heights, IL）のPrimesep A（粒子サイズ5マイクロメートル、ポアサイズ100オングストローム）樹脂を、予めレーザープラーP-2000（サッター社製）によって先端を約8マイクロメートルと先細にした内径150マイクロメートルのフューズドシリカキャピラリー（内壁をTC-WAX処理したもの）（ジーエルサイエンス社製、カタログ番号1010-27012）に窒素ガス圧、約7MPaにて15センチほど充填したものをカラムとして使用した。移動相Aは0.1%ギ酸を含む50%メタノール、移動相Bは0.1%のギ酸に2%のトリフルオロ酢酸を含む90%メタノールを使用した。移動相Bの濃度勾配は、開始時から0分（0%）−5分（0%）−25分（25%）−25.1分（50%）−50分（100%）−60分（100%）とし、流速は毎分1マイクロリットルに設定した。なお内部標準物質のバリンは5−25分の間、リジンは25−50分の間に溶出するので、各物質の定量を行う際には溶出時間によって内部標準物質を使い分けることにした。質量分析計はアプライドバイオシステムズ社製のQstar パルサーiを正イオン検出モードで印加電圧2400ボルト、感度向上のためにDP値を10、IP値を100とし、スキャン範囲50から700amuで測定を行った。【００２２】
３．データ解析
１サンプルあたり数百から千数百のピークから目視にて選別を行い、約30分に溶出するm/z235.17及び約25分に溶出するm/z207.15の２つのピークが健常者には多く、アルツハイマー病患者には極めて少ないことを見つけた。そしてMS/MS測定によって、前者からはプロダクトイオンとしてm/z86.08、後者からはm/z58.06を得た。前者はリドカイン、後者はリドカインの代謝物であるMEGXであると推定された。そこでこれらの標品を入手して同じLC/MS条件で測定した結果、保持時間とマススペクトルが一致し、これらのピークがリドカイン及びMEXGであることが確認された。【００２３】
表１にAD患者及び健常人でのリドカイン及びMEXGの測定値を示した。表１から明らかなように、脳脊髄液では、リドカイン及びその代謝物であるMEXGが、AD患者特異的に低い濃度で検出された。また、リジンに対するリドカインのピーク強度比から、例えば、0.6以下をアルツハイマー病、0.9以上を正常として判断すると、感度はアルツハイマー病患者のうち15名を検出できるため88.2％、特異性は正常者のうち14名を正常であると判定できるため82.4％となることが確認された。脳脊髄液中のリドカイン及びMEGXを測定することにより、ADの診断が可能であることが明らかとなった。【００２４】
【表１】
2009151091.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００２５】
ADの検査方法及びそのためのキットが提供される。
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月11日(2010.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
好ましい方法として、液体クロマトグラフィー（LC）と質量分析（MS）とを組み合わせた方法（LC/MS）が挙げられる（Chik Z, Lee TD, Holt DW, Johnston A, Tucker AT., J Chromatogr Sci. 2006; 44(5):262-5、Kawano S, Murakita H, Yamamoto E, Asakawa N.,
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003; 792(1):49-54.）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
１．サンプルの前処理
アルツハイマー病患者17名（男性10名、女性7名、いずれも白人）の脳脊髄液、及び年齢と性別、人種をあわせた17名の健常者の脳脊髄液をサンプルとして使用した。サンプル採取は、リドカインによる硬膜外麻酔下に行った（穿刺箇所にリドカイン塩酸塩（基準用量200mg）を皮下投与した）。各脳脊髄液150マイクロリットルから5000NMWLの限外ろ過フィルター（ミリポア社製、Ultrafree-MC BIOMAX-5, UFC3BCC00）によってタンパク質成分を除去した。そこに内部標準物質としてL-Valine-13C5,15NとL-Lysine-13C5,15Nを含む溶液（0.1％ギ酸、50％メタノール溶媒）25マイクロリットルと0.15％の塩酸溶液800マイクロリットルを加えた。このサンプル溶液をWaters社製の固相抽出カラムOasisのMCX(10mg)に負荷した。まず１ｍLの水で洗浄し、続いて１ｍLの0.1％ギ酸を含む50％メタノール溶媒、続いて１ｍLの水、そして１ｍLのメタノールで洗浄した。その後１ｍLの25% アンモニア水とメタノール混液（2: 3, v/v)で溶出させて、溶出物を乾燥後、25マイクロリットルの50％メタノールで再溶解して、ポアサイズが0.22マイクロメートルのPVDF膜フィルターで不溶物を除去しLC/MS用サンプルとした。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
３．データ解析
１サンプルあたり数百から千数百のピークから目視にて選別を行い、約30分に溶出するm/z235.17及び約25分に溶出するm/z207.15の２つのピークが健常者には多く、アルツハイマー病患者には極めて少ないことを見つけた。そしてMS/MS測定によって、前者からはプロダクトイオンとしてm/z86.08、後者からはm/z58.06を得た。前者はリドカイン、後者はリドカインの代謝物であるMEGXであると推定された。そこでこれらの標品を入手して同じLC/MS条件で測定した結果、保持時間とマススペクトルが一致し、これらのピークがリドカイン及びMEGXであることが確認された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
表１にAD患者及び健常人でのリドカイン及びMEGXの測定値を示した。表１から明らかなように、脳脊髄液では、リドカイン及びその代謝物であるMEGXが、AD患者特異的に低い濃度で検出された。また、リジンに対するリドカインのピーク強度比から、例えば、0.6以下をアルツハイマー病、0.9以上を正常として判断すると、感度はアルツハイマー病患者のうち15名を検出できるため88.2％、特異性は正常者のうち14名を正常であると判定できるため82.4％となることが確認された。脳脊髄液中のリドカイン及びMEGXを測定することにより、ADの診断が可能であることが明らかとなった。
【国際調査報告】
2009151091.tif 000003
2009151091.tif 000004
2009151091.tif 000005
2009151091.tif 000006