(57)【要約】本発明は、固定された捕捉プローブと単分子配列決定技術とを使用して、標的核酸分子を検出するための方法およびそのための組成物を提供する。本発明はまた、固定された捕捉プローブと単分子配列決定技術とを使用して、標的核酸分子を計数するための方法およびそのための組成物を提供する。本発明はまた、固定された捕捉プローブと単分子配列決定技術とを使用して、標的核酸分子を同定するための方法およびそのための組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸から配列情報を得るための方法であって、該方法は、
配列特異的捕捉プローブを用いて標的核酸を捕捉して、標的／プローブ二重鎖を生成する工程；
該標的／プローブ二重鎖から該標的核酸を単離する工程；
該標的核酸の少なくとも一部が個別に光学的に分解可能であるように、該標的核酸を表面に結合させる工程；
該標的核酸を、標的／プライマー二重鎖を形成可能な核酸プライマーに曝す工程；
ポリメラーゼと、光学的に検出可能な標識を含む少なくとも１つのヌクレオチド種とを、該プライマーへの鋳型依存性ヌクレオチド付加のために充分な条件下で導入する工程；
取り込まれていないヌクレオチドを除去する工程；
該プライマーに取り込まれたヌクレオチド種を同定し、それによって該標的から配列情報を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記プライマーに取り込まれたヌクレオチドから、前記光学的に検出可能な標識を除去する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記捕捉する工程は、ポリアクリルアミドゲル中に固定された捕捉プローブに対して、前記標的核酸をハイブリダイズすることを包含する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記捕捉プローブはビーズに結合される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記捕捉プローブはクロマトグラフィーカラムに固定される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記光学的に検出可能な標識は蛍光標識である、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記導入する工程、除去する工程、および同定する工程は、少なくとも１回反復される、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記表面はエポキシドを含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記結合させる工程は、３’アミンまたは５’アミンを導入するように前記標的核酸を改変することを包含する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記プライマーは前記表面に結合される、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記表面はストレプトアビジン化される、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記標的および／または前記プライマーは、ビオチン末端標識を含む、方法。
【請求項１３】
選択された核酸から配列情報を得るための方法であって、該方法は、
配列特異的捕捉プローブを用いて標的核酸を捕捉して、複数の標的／プローブ二重鎖を生成する工程；
該複数の二重鎖の少なくともいくつかのメンバーが個別に光学的に分解可能であるように、該複数の二重鎖のメンバーを表面に結合させる工程；
ポリメラーゼと、光学的に検出可能な標識を含む少なくとも１つのヌクレオチド種とを、該プローブへの鋳型依存性ヌクレオチド付加のために充分な条件下で導入する工程；
取り込まれていないヌクレオチドを除去する工程；
該プローブに取り込まれたヌクレオチド種を同定し、それによって該標的から配列情報を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記導入する工程、除去する工程、および同定する工程は、少なくとも１回反復される、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記表面はエポキシド表面である、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記エポキシド表面は、前記二重鎖の結合のために誘導体化される、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記表面はストレプトアビジンを用いて誘導体化される、方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の方法であって、前記標的および前記プローブは、前記表面に結合される、方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法であって、前記標識は蛍光標識である、方法。
【請求項２０】
選択された核酸から配列情報を得るための方法であって、該方法は、
表面に結合された配列特異的捕捉プローブを用いて標的核酸を捕捉して、標的／プローブ二重鎖を生成する工程；
ポリメラーゼと、光学的に検出可能な標識を含む少なくとも１つのヌクレオチド種とを、該プローブへの鋳型依存性ヌクレオチド付加のために充分な条件下で導入する工程；
取り込まれていないヌクレオチドを除去する工程；
該プローブに取り込まれたヌクレオチド種を同定し、それによって該標的から配列情報を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記表面はエポキシド表面である、方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、前記導入する工程、除去する工程、および同定する工程は、少なくとも１回反復される、方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法であって、
前記表面を洗浄して、捕捉されていない標的核酸を除去する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法であって、前記標識は蛍光標識である、方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の方法であって、前記エポキシド表面はストレプトアビジンを用いて誘導体化される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００５年８月２６日に出願された米国特許出願第１１／２１３，６２１号（本明細書により、その全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、核酸を検出、計数、および同定するための方法および組成物に関する。これは、標的核酸を捕捉および精製するための捕捉プローブを、捕捉または精製した核酸分子の単分子配列決定と組み合わせて用いることによる。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ヒトゲノムの知識は、生物学的機能および機能不全における差異の基礎として、個体の差異および個体内の差異への疑問を生じさせた。一塩基多型（ＳＮＰ）またはＳＮＰの組み合わせ程度に小さい差異が、表現型の差異を導き得る。ＳＮＰの組合わせの検出から、個体が特定の疾患にかかる可能性または個体が処置に対してどのように反応するかを予想し得る。
【０００４】
例えば、大部分の癌は、細胞の小さな部分集団で起こる一連のゲノム変化（一部は微細な変化であり、一部は顕著な変化である）から生じる。癌をもたらす配列変化の知識は、この疾患の病因の理解ならびにこの疾患の治療方法および／または予防方法へと導く。ゲノムの複雑度を理解するうえで必須の第一のステップは、高分離配列決定を実行する能力である。それゆえに、正常な機能または異常な機能のどちらにおけるその複雑度の真の理解にも、多数の標的核酸分子に由来する特定の配列情報を必要とする。
【０００５】
大量配列決定技術は、微細であるかまたはまれなヌクレオチドの変化の同定にはしばしば有効ではない。それは、個々のヌクレオチドに関係する有用な情報を得るプロセスを複雑にする多くのクローニング、増幅および電気泳動のステップに起因する。個々の患者から得た単分子群を配列決定してそれらの単分子群から情報を得る能力は、ゲノム配列決定に関する次の標石である。しかしながら、単分子配列決定を介する重要な疾患の有効な診断および管理は、個々の分子をスクリーニングするための費用効果の高い道具および方法の欠如により妨げられている。
【０００６】
単分子の測定に基づく新しい配列決定技術を開発するための多くのもくろみがあった。それらは一般に、特定のタンパク質とＤＮＡとの相互作用を観察すること、または超高解像度走査型プローブ顕微鏡法を用いることのうちのどちらかによるものである。例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５を参照せよ。最近の技術は、単分子レベルでの合成による配列決定反応における光学的検出を用いる。非特許文献６。本発明は、配列決定（特に単分子配列決定）における改良を提供する。
【非特許文献１】Ｒｉｇｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１）８６（３）：１６１
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，（１９９７）１６（５−６）：５４３−５５０
【非特許文献３】Ｈｏｗｏｒｋａ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１）１９（７）：６３６−６３９
【非特許文献４】Ｍｅｌｌｅｒ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．（２０００）９７（３）：１０７９−１０８４
【非特許文献５】Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６（６２８１）：２９４−２９６
【非特許文献６】Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ，ら、ＰＮＡＳ（２００３）１００：３９６０−３９６４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、核酸を配列決定するための方法を提供する。本発明によると、配列決定すべき標的核酸を配列決定前に捕捉することより、配列決定が容易になる。好ましい実施形態において、標的核酸は、単分子レベルで配列決定され、結果としてサンプル特異的な高スループットの配列情報を生じる。従って、本発明の一つの局面によれば、問題の標的核酸を単離するために、配列特異的な捕捉プローブが用いられる。その標的集団は、同じ配列の核酸から構成されてもよいし、もしくは混合した配列の核酸の集団であってもよい。単離した標的核酸は、その後配列決定される。一つの実施形態において、捕捉プローブをプライマーとして用い、捕捉した核酸の配列決定が直接的に実行される。または、標的／プローブ二重鎖が融解され得、その後、その標的核酸は、鋳型依存性の配列決定のためのプライマーにハイブリダイズさせられ得る。
【０００８】
好ましい実施形態において、単分子配列決定が、高分離高スループットの配列情報を提供するために行われる。鋳型依存性の、単分子の、合成による配列決定が、プライマーまたはプローブへの付加のために光学的に標識されたヌクレオチドを用いて行われる。標的（鋳型）またはプライマー／プローブのどちらか、または両方が、光学的なシグナル検出を増強するようにデザインされた表面に取り付けられる。特に好ましい表面は、ガラスまたは石英ガラスにコーティングした、エポキシド表面である。核酸は、エポキシドまたはエポキシド誘導体に容易に結合される。好ましい方法は、直接的なアミンの結合である。核酸は、５’アミンまたは３’アミンをもつものが購入され得る。あるいは、エポキシド環へ結合するための末端アミンを導入するために、ターミナルトランスフェラーゼが用いられ得る。あるいは、エポキシド表面が、核酸結合のために誘導体化され得る。例えば、その表面は、ストレプトアビジンを組み込み得る。ストレプトアビジンは、ビオチン化した核酸に結合する。標的、プライマー／プローブ、またはその両方のうちのいずれかが、公知の方法を用いてビオチン化され得る。代替の表面としては、Ｂｒａｓｌａｖａｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １００：３９６０−６４（２００３）（本明細書中で参考として援用する）に記載されたような高分子電解質多層が挙げられる。本質的に、本来の蛍光が低くかつオリゴヌクレオチドを結合させ得るどのような表面も、本発明のために有用である。
【０００９】
単分子配列決定は、光学的に検出できる標識を用いて有利に実行される。特に好ましいのは蛍光標識であり、それらの蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、ローダミン色素誘導体（例えば、ＴＡＭＲＡ）、りん光体、ポリメタジン（ｐｏｌｙｍｅｔｈａｄｉｎｅ）色素、蛍光性ホスホロアミダイト、テキサスレッド、グリーン蛍光タンパク質、アクリジン、シアニン、シアニン５色素、シアニン３色素、５−（２’−アミノエチル）−アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ＢＯＤＩＰＹ、１２０ＡＬＥＸＡ、または前記のものいずれかの誘導体、もしくは改変体が挙げられる。
【００１０】
配列決定前の捕捉工程は、任意の適当な、ハイブリダイゼーションによる捕捉法でもよい。例えば、捕捉は、溶液中、ビーズ（ポリスチレンビーズ）上、カラム（例えば、クロマトグラフィーカラム）中、ゲル（例えば、ポリアクリルアミドゲル）中で起こってもよいし、または配列決定のために用いられる表面上で直接的に起こってもよい。支持体に結合した捕捉オリゴのアレイは、標的配列に対して特異的にハイブリダイズするために用いられ得る。さらに、クロマトグラフィーに基づく捕捉技術が、有用である。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、ならびにゲルに基づくクロマトグラフィーは、全て有用である。一つの実施形態において、ゲルに基づく捕捉が、配列特異的な捕捉を成し遂げるために用いられる。この方法を用いて、複数の異なる配列が、ゲル中に固定されたプローブを用いて同時に捕捉される。標的配列は、その配列を含むゲルの一部を取り出すこと、および配列決定のためにそれらのゲルの一部から標的を溶出することにより、単離される。
【００１１】
代わりになる実施形態において、標的核酸分子は、アダプター配列（例えば、ポリアデニレーション領域）を含むか、または含むように改変されているかのいずれかである。そのアダプター配列は、標的の捕捉を促進する目的で捕捉プローブの一部分に相補的である。好ましい実施形態は、固定した捕捉プローブを含み、そのプローブは、そのアダプター配列とハイブリダイズする配列（例えば、アダプター配列に相補的な配列）を持つ。本発明の方法は、捕捉プローブと、標的核酸分子を含むサンプルとを、その標的核酸分子と、固定された捕捉プローブとの間の特異的なハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させ、それにより、標的／捕捉プローブ二重鎖を形成することによって、実施される。洗浄工程は、サンプル中の、残屑およびハイブリダイズしていない核酸を除去する。一つの実施形態において、標的核酸が、鋳型依存性の合成による配列決定のためのプライマーとして捕捉プローブを用いて、配列決定される。別の実施形態において、標的／捕捉プローブ二重鎖は、標的核酸を遊離させるために融解される。その結果として生じる精製された標的の集団が、以下に述べるように配列決定される。
【００１２】
標的核酸が、融解されて捕捉プローブから遊離した場合、その標的は、配列決定のために表面に結合させられるか、またはその表面に結合させられたプライマーにハイブリダイズさせられる。配列決定のための、表面へのオリゴヌクレオチドの結合は、直接的であっても、間接的であってもよい。例えば、核酸は、下に述べられるように直接のアミンの結合を介してエポキシド表面に結合させられる。あるいは、その表面は、結合されるパートナーを備えて調製される。そのパートナーの反対側は、核酸に結合される。例えば、その表面は、ストレプトアビジン化され得る。ビオチン化された核酸が、その表面において結合を形成するように用いられ得る。他の結合の対（例えば、抗体／抗原（例えば、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｅｎ）／抗ジゴキシゲニン（ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｅｎ）、およびジニトロフェノール／抗ジニトロフェノール））もまた用いられ得る。
【００１３】
好ましい実施形態において、本発明は、光学的配列決定を企図する。好ましくは、鋳型依存性の、合成による配列決定が、光学的に検出可能な標識を用いて実施される。最良の標識としては、下に詳細に述べるような蛍光標識が挙げられる。上記表面は、組み込まれたヌクレオチドの光学的な検出のために、バックグラウンドを最小にするように調製される。その表面に取り付けられたプライマー／鋳型二重鎖は、適切なヌクレオチド重合化酵素の存在下で、その酵素が鋳型依存性の様式で少なくとも一個のヌクレオチドをプライマーに付加するのに適した条件のもとで、標識されたヌクレオシドトリホスフェートに曝される。その付加されたヌクレオチドが検出され、それにより、少なくとも一個の結合した標的核酸分子において少なくとも一個のヌクレオチドが同定される。
【００１４】
当業者によって認識されるように、本発明の個々の特徴は、別々に用いられても、または任意の組み合わせにおいて用いられてもよい。本発明の実施形態の詳細な説明が、以下に提供される。本発明の他の実施形態は、以下の詳細な説明を検討すれば明白である。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、核酸を配列決定するための方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、ハイブリッドの形成により捕捉した核酸の単分子配列決定の使用を包含する。本発明の方法は、多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）により遂行され、そして多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）に基づいて分析され得る。結果として、生物学的なサンプルが、広いダイナミックレンジにわたって迅速に分析され得る。
【００１６】
本発明の方法は、標的核酸をハイブリッド形成により捕捉する工程、およびその捕捉した核酸を配列決定する工程を包含する。捕捉された標的核酸は、鋳型依存性の合成のためのプライマーとして捕捉プローブを用いることで直接配列決定することができる。従って、捕捉プローブは、表面に取り付けられ、そしてサンプルの核酸に曝露される。標的核酸とプローブの相補的な結合が起こり、そしてその残りの核酸および他のサンプル中の含有物は表面から洗浄される。次に、以下に記述されるように、本質的には、配列決定を行う。一つの代替方法において、標的核酸は、標的核酸分子を含むサンプルを、標的核酸とハイブリダイズ可能な固定した捕捉プローブと接触させることにより、単離される。標的核酸。その表面は、非標的核酸および他の残屑を除くため洗浄され、そしてその標的は、標的／捕捉プローブ二重鎖から融解され遊離する。必要に応じて洗浄した後、その標的は、本質的には以下に述べられるように、配列決定のために表面に取り付けられる。標的核酸分子は、好ましくは、以下に述べられる単分子配列決定技術を用いて分析される。好ましい実施形態において、標的核酸は、核酸合成のためのプライマーの相補的な部分に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列の付加により、改変される。例えば、標的は、ポリアデニレーションを受け得る。標的は、配列決定のためにポリ−ｄＴプローブ／プライマーを用いて捕捉され得る。
【００１７】
（標的核酸分子）
標的核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸は、単離されていても、インサイチューで捕捉されていてもよい。好ましい選択肢において、標的核酸は、多様な他の成分（例えば、タンパク質、脂質、および非標的核酸）を含む生物学的なサンプルから単離される。標的核酸分子は、任意の細胞性の材料（動物、植物、細菌、ウイルス、真菌類、または任意の他の細胞性の生物体から得られる）から、得られる。標的核酸は、生物体から直接的に、もしくは生物体から得られた生物学的なサンプル（例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、便、および組織）から取得され得る。任意の組織試料または体液試料が、本発明における使用のための核酸の供給源として用いられ得る。核酸分子はまた、培養細胞（例えば、初代細胞培養物または細胞株）から単離され得る。標的核酸が得られた細胞は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染し得る。
【００１８】
サンプルはまた、生物学的試料から抽出された全ＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、またはゲノムＤＮＡであってもよい。核酸は、代表的には、捕捉および／または精製、ならびに分析のために適切なフラグメントを生成するようにフラグメント化される。一つの実施形態において、生物学的サンプル由来の核酸が、音波破砕によりフラグメント化される。テストサンプルは、２００３年１０月９日に公開された米国特許出願第２００２／０１９０６６３  Ａ１号（米国特許出願第２００２／０１９０６６３  Ａ１号の教示は、本明細書中でその全体が援用される）において記述されたように、獲得し得る。一般的に、核酸は、多様な方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）により記述された方法）により、生物学的サンプルから抽出され得る。一般的に、標的核酸分子は、約５塩基〜約２０ｋｂであり得る。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域をともなう二本鎖（例えば、ステム（ｓｔｅｍ）構造およびループ（ｌｏｏｐ）構造）であり得る。
【００１９】
本明細書に記載される生物学的サンプルは、洗剤または界面活性剤の存在下で均質化されても分別されてもよい。バッファー中の洗剤の濃度は、約０．０５％〜約１０．０％であり得る。洗剤の濃度は、最大で、洗剤が溶液中で可溶性のままである量であってもよい。好ましい実施形態において、洗剤の濃度は、約０．１％〜約２％である。洗剤（特に、非変性の効き目が軽めの洗剤）は、サンプルを可溶化するように作用し得る。洗剤はイオン性であっても非イオン性であってもよい。非イオン性洗剤の例としては、ｔｒｉｔｏｎ（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ＸＯＨ、ｘ＝９〜１０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４  ｘ＝７−８）、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ６３０  オクチルフェニルポリエチレングリコール、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（ベータＯＧ）、ｎ−ドデシル−ベータ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０ポリエチレングリコールソルビタンモノオレアート、ポリドカノール（ｐｏｌｉｄｏｃａｎｏｌ）、ｎ−ドデシルベータ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコールｎ−ドデシルモノエーテル）、ヘキサエチレングリコールモノ−ｎ−テトラデシルエーテル（Ｃ１４ＥＯ６）、オクチル−ベータ−チオグルコピラノシド（オクチルチオグリコシド、ＯＴＧ）、Ｅｍｕｌｇｅｎ、およびポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）が挙げられる。イオン性洗剤（アニオン性またはカチオン性）の例としては、デオキシコレート、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンおよびセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）が挙げられる。双生イオン試薬（例えば、Ｃｈａｐｓ、双生イオン３−１４、および３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）もまた、本発明の精製スキームにおいて使用され得る。尿素が、別の洗剤または界面活性剤とともにか、それらを含まずに添加され得ることも意図される。
【００２０】
溶解溶液または均質化溶液は、さらに他の薬剤（例えば、還元剤）を含んでもよい。このような還元剤の例としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ＤＴＥ、ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、または亜硫酸の塩が挙げられる。
【００２１】
好ましい緩衝剤濃度は、溶液またはサンプルを含む溶液中で、約５ｍＭ〜約５００ｍＭである。溶解（ｌｙｓｉｎｇ）溶液中の緩衝剤濃度は、約１０ｍＭと３００ｍＭとの間であり得る。
【００２２】
均質化溶液に曝露した後に、サンプルは、機械的手段によってさらに均質化され得る。機械式ブレンダー、ローター−ステーターホモジナイザー、またはせん断型（ｓｈｅａｒ−ｔｙｐｅ）ホモジナイザーが利用され得る。あるいは、組織は溶解溶液中で均質化され得、組織の残留物（ｒｅｍａｉｎ）は、沈降、遠心分離、または濾過によって分離され得る。これらの残留物は、次に、先に記載されるように均質化溶液および抽出条件によって処理され得る。
【００２３】
標的核酸分子は、固定した捕捉プローブに相補的であるアダプター配列を含んでも、それを含むように改変されてもよい。このアダプター配列および固定した捕捉プローブは、アダプター配列を含む標的核酸分子が固定した捕捉プローブにハイブリダイズすることができるように選択される。代表的に、このアダプター配列はホモポリマー（例えば、オリゴ（ｄＡ））であり、そして対応する固定した捕捉プローブはオリゴ（ｄＴ）配列を含む。アダプター配列は、標的核酸分子内に内因的に含まれ得る。例えば、アダプター配列は、標的核酸分子内の目的の配列であり得る。あるいは、アダプター配列は、ベクター配列を含み得る。
【００２４】
一実施形態において、ユニバーサルプローブが固定した捕捉プローブとして使用され、そして標的核酸分子がユニバーサルプローブに相補的な配列を含むアダプターによって改変され、それによって、この改変された核酸分子が固定したプローブにハイブリダイズすることが可能となる。
【００２５】
固定した捕捉プローブ内のアダプター配列および相補的な配列は、標的核酸分子が固定した捕捉プローブにハイブリダイズし、それによって標的核酸分子を捕捉し、標的プローブ／二重鎖を形成するのに適切な長さである。標的プローブ／二重鎖はまた、十分に安定であり、任意に二重鎖を洗浄して、生物学的サンプルのあらゆる残留する成分（非標的核酸が挙げられる）を除去することを可能にする。アダプターの配列および固定した捕捉プローブの相補的な配列は、約１０ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長であり得、好ましくは、５０ヌクレオチド長であり得る。アダプター配列および相補的な固定した捕捉配列は、同じ長さであっても異なる長さであってもよい。プローブの長さおよび／またはオリゴヌクレオチドの長さを調整してハイブリダイゼーションを最適化することは、当該分野において慣例的である。
【００２６】
アダプター配列は、酵素を用いて核酸分子に結合され得る。この酵素は、リガーゼであってもポリメラーゼであってもよい。リガーゼは、核酸分子にオリゴヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を連結することができる酵素であり得る。適切なリガーゼとしては、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴ４  ＲＮＡリガーゼ（このようなリガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のＮＥＢ．ｃｏｍで）から市販されている）が挙げられる。好ましい実施形態において、標的核酸分子は、脱リン酸化（ｄｅｐｈｏｙｓｈｏｒｙｌａｔｅｄ）され、その後アダプターを連結する。リガーゼを使用するための方法は、当該分野で周知である。
【００２７】
ポリメラーゼは、標的核酸分子にヌクレオチドを結合することができる任意の酵素であり得る。ポリメラーゼは、例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＵＳＢから市販されている（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のＵＳＢｗｅｂ．ｃｏｍで）酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼが挙げられる）、ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などであり得る。ポリメラーゼは、製造者の説明書にしたがって使用され得る。
【００２８】
（標的核酸分子の精製）
本明細書に記載されるように、標的核酸分子は、標的分子を含むサンプルと１つ以上のクラスの固定した捕捉プローブとを接触させることによって精製され得る。１種類より多い標的分子が精製される場合、異なる標的分子は同一または異なるアダプター配列を有し得る。所定のクラスの固定した捕捉プローブは、標的核酸分子が固定した捕捉プローブにハイブリダイズし、それによって標的／プローブ二重鎖を形成するのに適する条件下で、対応するアダプター配列を含む標的核酸分子にハイブリダイズするように選択される。種々の捕捉プローブが、標的核酸分子を精製するために使用され得る。捕捉プローブは、代表的に、標的核酸分子の領域に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を含み、標的核酸分子が捕捉プローブにハイブリダイズし得る。標的核酸分子と捕捉プローブとの間の相補性は、標的核酸分子を特異的に結合し、そして試験サンプルからの標的核酸分子の精製を達成するのに十分であることのみが必要とされる。本発明において使用するために適切なプローブとしては、核酸（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、核酸アナログ、改変核酸から形成されたプローブ、および別の成分を有する核酸（例えば、ペプチド核酸）を含む混合されたクラスのキメラプローブが挙げられる。捕捉プローブは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。好ましくは、捕捉プローブの長さは、少なくとも５ヌクレオチド、より好ましくは約５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間であるが、この長さは、最大数千ヌクレオチドであり得る。さらなるプローブは、２００２年８月２９日に公開された米国特許出願第２００２／０１１９４８０号Ａ１（この教示は、その全体が本明細書に援用される）に記載される。
【００２９】
捕捉プローブは、臭化シアンまたは塩化シアヌル活性化を使用して、アガロース、デキストラン、セルロース、ビーズ、微粒子およびデンプンポリマーにカップリングされ得る。特に有用なビーズおよび微粒子は、２００３年１０月９日に公開された米国特許出願第２００３／０１９０６６３号Ａ１（この教示は、その全体が本明細書に援用される）に記載される。カルボキシル基を含むポリマーは、カルボジイミドカップリングを使用して、一級アミン基を有する合成捕捉プローブにカップリングされ得る。一級アミンを含むポリマーは、グルタルアルデヒドまたは塩化シアヌルによってアミン含有プローブにカップリングされ得る。ポリマーはまた、チオール含有プローブにカップリングすることができるチオール反応基で改変され得る。多くの他の適切な方法が文献中に見出され得る（Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ  １９９３）。重合可能な化学基に捕捉プローブを共有結合させるための方法もまた、米国特許出願第２００２／０１１９４８０号Ａ１（この教示は、本明細書に援用される）に記載される。さらに、米国特許出願第２００２／０１１９４８０号Ａ１に記載されるように、核酸は、それ自体が電気泳動媒体に組み込まれ得る粒子に結合され得る。
【００３０】
標的核酸分子を精製するために、試験サンプルは、例えば、少なくとも１つの固定した捕捉プローブを含む電気泳動媒体と接触され得る。電界が電気泳動媒体を横切って印加され、負に荷電した分子がこの媒体を通って移動し得る。試験サンプルの標的ではない成分は電気泳動バッファーに移動するが、標的核酸分子は、電気泳動媒体内の捕捉プローブにハイブリダイズする（標的／プローブ二重鎖を形成する）ことによって捕捉される。電気泳動工程に使用されるバッファー（試験サンプルの標的ではない成分を含む）は、新しいバッファーと置換され得、電流が電気泳動媒体を横切って印加され、この複合体を変性し、それによって捕捉プローブから標的核酸分子を放出し得る。放出された標的核酸分子は、逆の電界を印加することによって溶出され得る。
【００３１】
本発明の方法は、多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）に適する。先に記載されるように、サンプルは、１つより多い標的核酸分子を含み得る。アダプターが使用される場合、異なる標的核酸分子は、同一または異なるアダプター配列を有し得る。多重化反応において、標的核酸分子が異なるアダプター配列を含む場合、試験サンプルは、先に記載されるように、２つ以上のクラスの固定した捕捉プローブと接触される。標的核酸分子は、それらの各々の固定した捕捉プローブに捕捉される。捕捉された標的核酸分子は、先に記載されるように放出され得る。標的核酸分子を捕捉し精製するための他の方法は、米国特許出願第２００２／０１１９４８０号Ａ１（この教示は、本明細書に援用される）に記載される。
【００３２】
（表面に標的核酸分子を結合させる）
好ましい実施形態において、標的核酸分子は、表面に結合され、そして単分子配列決定（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による分析に供される。標的核酸分子は、それらが個々に光学的に分解可能であるように表面に結合される。本発明に使用される基材は、二次元であっても三次元であってもよく、平坦な表面（例えば、ガラススライド）を含んでも、そのように形成されてもよい。基材としては、ガラス（例えば、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ））、石英、プラスチック（例えば、ポリスチレン（架橋の程度が低い（ｌｏｗ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）ポリスチレンおよび架橋の程度が高い（ｈｉｇｈ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）ポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリメチルメタクリレート））、アクリルコポリマー、ポリアミド、ケイ素、金属（例えば、アルカンチオレート誘導体化金）、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲルマトリクス（例えば、シリカゲル）、ポリアクロレイン、または複合材が挙げられ得る。
【００３３】
適切な三次元基材としては、例えば、球、微粒子、ビーズ、メンブレン、スライド、プレート、微小加工チップ（ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ  ｃｈｉｐｓ）、チューブ（例えば、毛管）、マイクロウェル、微小流体デバイス、フィルター、または、核酸を係留するのに適切な任意の他の構造が挙げられる。基材は、標的核酸またはプライマーの集団を含む領域を有することができる平坦なアレイまたはマトリクスを含み得る。例としては、ヌクレオシド誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレンスライド；誘導体化磁気スライド；ポリエチレングリコールでグラフトされたポリスチレンなどが挙げられる。
【００３４】
一実施形態において、基材は、最適な光学処理および核酸の結合を可能にするようにコーティングされる。本発明に使用される基材は、バックグラウンドを低減するために処理される。例示的なコーティングとしては、エポキシドおよび誘導体化エポキシド（例えば、結合分子（例えば、ストレプトアビジン）を含む）が挙げられる。表面はまた、分析のために、結合した核酸（例えば、標的核酸分子、プライマー、または標的分子／プライマー複合体）の位置決めを改善するために処理され得る。したがって、本発明にしたがう表面は、荷電分子（例えば、負に荷電した標識ヌクレオチド）をはじくために、１つ以上の荷電層（例えば、負荷電）で処理され得る。例えば、本発明にしたがう基材は、ポリアリルアミン、続いてポリアクリル酸で処理され得、高分子電解質多層を形成し得る。ポリアクリル酸層のカルボキシル基は負に荷電し、それゆえ、負に荷電した標識ヌクレオチドをはじき、検出のための標識の位置決めを改善する。基材に適用されたコーティングまたはフィルムは、実質的な分解も基材からの解離（ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）もなく、その後の処理工程（例えば、光暴露（ｐｈｏｔｏｅｘｐｏｓｕｒｅ）、煮沸、焼成、および温かい洗剤を含有する液体での浸漬など）に耐えることができるべきである。
【００３５】
基材コーティングの例としては、ガラススライド製品に適用されるような３−アミノプロピルトリメトキシシランの気相コーティング（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製）が挙げられる。さらに、一般的に、疎水性基材コーティングおよびフィルムが基材表面上の親水性分子の均一な分布を補助する。重要なことに、基材コーティングまたはフィルムを使用する本発明の実施形態において、プライマー伸長および検出工程に実質的に干渉しないコーティングまたはフィルムが好ましい。さらに、基材に適用されたあらゆるコーティングまたはフィルムが、基材への標的分子の結合を増大させるか、または少なくとも標的の結合を実質的に損なわないことのいずれかが好ましい。
【００３６】
基材の表面に標的核酸分子を係留または固定するために、種々の方法が使用され得る。固定は、表面への直接的または間接的な結合を介して達成され得る。結合は、共有結合によってもよい。Ｊｏｏｓら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７：９６−１０１、１９９７；Ｏｒｏｓｋａｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１５４７−１５５５、１９９６；およびＫｈａｎｄｊｉａｎ，Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ．１１：１０７−１１５、１９８６を参照のこと。好ましい結合は、表面に組み込んだエポキシドへの末端ヌクレオチドの直接的なアミン結合である。この結合はまた、非共有結合を介してもよい。例えば、ビオチン−ストレプトアビジン（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２４：１４４３、１９９１）およびジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１２２、１９９２）は、表面およびパラレル（ｐａｒａｌｌｅｌ）に核酸を係留するための一般的なツールである。あるいは、この結合は、脂質単層または脂質二重層に疎水性鎖を係留することによって達成され得る。支持体に核酸分子を結合させるための当該分野で公知の他の方法もまた使用され得る。
【００３７】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの結合のための表面は、エポキシドでコーティングされ得る。エポキシドは、当該分野で公知の多くの方法によって蒸着され得る。エポキシシラン表面が好ましい。種々の分子または分子の組み合わせが、表面にエポキシドを連結するのに役立ち得る。理想的には、表面は、標的核酸分子の導入の前に、均一に分布したエポキシドによってコーティングされる。標的核酸分子は、エポキシドに直接的または間接的に連結され得る。直接結合の実施形態において、エポキシドは、アミン基を保持する核酸に導入される。好ましい実施形態において、ターミナルトランスフェラーゼが、表面に結合される核酸にアミン末端のヌクレオチドを付加するために使用される。
【００３８】
核酸を係留するために、ビオチン−ストレプトアビジン結合が使用され、この核酸は、ビオチン化され得、一方、基材の一方の表面は、ストレプトアビジンでコーティングされ得る。
【００３９】
核酸分子の表面密度は、表面に適用されるストレプトアビジンの濃度を調整することによって制御され得る。表面をビオチン化するための試薬は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得され得る。あるいは、ビオチン化は、ＢＬＣＰＡ：ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ビオチン  ＬＣ−ＰＥＯ−アミン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ．２１３４７）、または任意の他の公知もしくは便利な方法によって実行され得る。一部の実施形態において、極めて低い濃度（例えば、μＭ、ｎＭまたはｐＭの範囲）の標識されたストレプトアビジンが、係留する前に基材表面をコーティングするために使用される。このことは、単分子の分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）での核酸の固定を促進する。
【００４０】
リンカーの他の例としては、抗原／抗体、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、および当該分野で公知の他のハプテンが挙げられる。あるいは、核酸は、エポキシド環のコンフォメーション変化をもたらし、そして開いたエポキシド環への標的核酸分子の直接結合をもたらす他の結合部分を含んでもよい。
【００４１】
あるいは、プライマーは、表面上に固定されてもよい。１つ以上のプライマーの末端が、表面にプライマーをつなぐためのリンカー部分を保持するように改変され得るか、または、この末端は表面に直接結合され得る。次に、プライマーに相補的な配列を含む標的核酸分子が、結合したプライマーにハイブリダイズされる。基材の表面に核酸（例えば、プライマー）を結合させるための方法は、先に詳細に記載される。
【００４２】
表面への分子の非特異的な結合を阻害するために、表面は、不活性化（ｐａｓｓｉｖａｔｉｎｇ）（ブロッキング）剤によって処理され得る。好ましいブロッキングストラテジーは、表面に付着するか、または表面の化学特性を変化させる検出不能な分子に表面を曝露することを含み、その結果、非特異的な結合が低減される。光学的に検出可能な標識が使用される方法において、表面をブロックまたは不活性化する一方法は、標識された分子と同じ型の未標識分子に表面を曝露することである。未標識分子は、表面上の非特異的な結合に関して、標識分子とは別に競合（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）し、それによって、非特異的な標識に起因するバックグラウンドを低減する。他のストラテジーは、ホスフェート、Ｔｒｉｓ、硫酸塩、または表面と相互作用して非特異的な結合を防止するアミンで表面を処理することを含む。反応性ではないタンパク質もまた適切である。好ましい実施形態において、高度に洗浄可能であり、かつ非特異的なバックグラウンドが低い表面を提供するために、ブロッキング試薬のマトリクスが表面上に提供される。一部の実施形態において、ブロッキング試薬は、高アニオン性のヌクレオシドトリホスフェートの静電反発力を提供するために選択される。
【００４３】
ブロッキング剤は、分析の間の任意の時間に導入または再導入され得る。また、一部の実施形態において、ブロッキング剤は、標的核酸分子またはプライマーに基材を曝露する前に、表面を予め処理するために使用され得る。さらに、洗剤（例えば、Ｔｒｉｓ）のようなブロッキング剤は、インキュベーション期間および／または洗浄の間、表面を不活性化するために、洗浄工程の一部または全てに含まれ得る。
【００４４】
表面の電荷は、核酸の結合およびプライマー伸長の両方の間、理想的な条件を達成するために操作され得る。例えば、核酸（標的核酸分子またはプライマー）が表面に結合されるローディング段階（ｌｏａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）の間、基材上により正の表面電荷を生成し、核酸のアミン部分とエポキシド環との間の反応を促進するために、溶液の塩濃度は増大され得る。反対に、核酸が表面に固定された後に、基材の表面から核酸をはじき、それによって、アニーリングおよび配列分析のために核酸を立体的に順応させるために、溶液の塩濃度は低下され得る。
【００４５】
別の実施形態において、基材は、ポリアニオンの層を含み、核酸分子は、ポリアニオンの層に係留される。したがって、核酸は、実質的に並行になることを回避する（例えば、ポリアニオンの層上に横たわることを妨げる）ために位置決めされる。一部の実施形態において、基材の表面は、核酸の結合およびその後のアニーリングおよび配列分析を促進する表面化学を生成するように予め処理される。これらの実施形態の一部において、基材表面は、高分子電解質多層（ＰＥＭ）でコーティングされる。一部の場合において、ビオチンは、ＰＥＭに適用され得、続いて、ストレプトアビジンが適用され得る。次に、基材は、ビオチン化された標的核酸分子を結合するために使用され得る。
【００４６】
一部の実施形態において、正電荷と負電荷とが交互になった多層が使用される。不完全に荷電された表面の場合、多層蒸着（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｌａｙｅｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、十分に規定され安定なレベルまで表面の電荷を増大させる傾向がある。例えば、表面は、光に誘発される空間的な結合（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を介するプライマーの結合のためのＰＥＭでコーティングされ得る。あるいは、標的核酸分子は、ＰＥＭコーティングされた表面に化学的に結合され得る。ＰＥＭ形成は、Ｄｅｃｈｅｒら（Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ、２１０：８３１−８３５、１９９２）（この教示は明細書に援用される）に記載されている。ＰＥＭ形成は、ポリカチオンおよびポリアニオン（これらは、それぞれ多くの正電荷または負電荷を有するポリマーである）の連続的な付加によってによって進行する。負に荷電した表面にポリカチオンを付加する際に、ポリカチオンをこの表面に置き、薄いポリマー層を形成し、表面の電荷を逆にする。同様に、正に荷電した表面上に置いたポリアニオンは、ポリマーの薄層を形成し、負に荷電した表面を残す。交互にポリ（＋）およびポリ（−）に曝露することによって、高分子電解質多層構造を生成し、表面の電荷は、最後に付加された高分子電解質によって決定される。このことは、負に荷電したヌクレオチドをはじく、強力に負に荷電した表面を生成し得る。核酸を固定するために、ＰＥＭで基材をコーティングするための詳細な手順は、２００５年５月２５日に出願された米国特許出願第１１／１３７，９２８号に記載される。
【００４７】
本発明の別の局面において、基材は、例えば、疎水性を増大または低減させる化学薬品でのコーティングまたはプライマーの共有結合を可能にする化学薬品でのコーティングによって調製され得る。一部の化学コーティング（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏａｔｉｎｇ）は、疎水性を変更すること、および共有結合を可能にすることの両方を行い得る。固体基材上の疎水性は、シラン処理または当該分野で公知の他の処理によって容易に増大され得る。リンカー分子は、表面に付着し、生体分子と反応する官能性部分を含む。多くのこのようなリンカーは、容易に利用可能であり、かつ当該分野で公知である。例えば、基材または支持体は、光不安定性の保護（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）ヒドロキシル基、アルコキシもしくは脂肪族誘導体化ヒドロキシル基、または他の化学薬品で改変される。疎水性を低下させること、およびリンカーを提供することの両方をおこなう好ましいコーティングは、ポリ（エチレンイミン）である。
【００４８】
本発明の方法はまた、任意に表面乾燥工程を包含する。一部の実施形態において、化学反応（例えば、ヌクレオチド取り込み工程）の前、その間、および／またはその後、この表面は乾燥剤に曝露される。好ましい乾燥剤の例としては、ホスフェートバッファー、アルコール（例えば、ＥｔＯＨ）、空気および／またはＮ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
（結合した標的核酸分子を分析する）
本明細書に記載されるように、結合した標的核酸分子は、単分子配列決定によって分析される。少なくとも１つのヌクレオチドが、少なくとも１つの結合した標的核酸分子内で同定される。標的分子は、プライマーにハイブリダイズされ、表面上に核酸標的分子／プライマー二重鎖を形成する。先に記載されるように、標的核酸分子またはプライマーのいずれか、またはそれらの両方が、表面に結合される。その後、鋳型依存性プライマー伸長を実施して、ヌクレオチド重合化酵素とヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰおよび／またはｄＧＴＰ）またはヌクレオチドアナログとを使用して、ハイブリダイズした核酸分子の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する。ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの取り込みは、表面上の別個の位置で検出される。核酸標的分子／プライマー二重鎖および取り込まれたヌクレオチドは、単分子の実施形態において個別に分解可能である。あるいは、混合した核酸集団または核酸のクローン性の集団からのバルクのシグナルが得られる。
【００５０】
迅速な試薬の適用および除去が、本発明の別の利点である。例えば、ヌクレオチドおよび／または他の試薬の濃度は、異なる時点で変更され得る。このことは、ヌクレオチドの１つ以上の単一の種を個々に導入することを含む実施形態において特に有用な特徴である。このことは、取り込み速度および感度の増大をもたらし得る。例えば、４つの型全てのヌクレオチドが反応中に同時に存在し、ヌクレオチドの動的な取り込みをモニタリングする場合、各ヌクレオチドの濃度は、第一の範囲と第二の範囲との間で変更され得る。このことは、低濃度のヌクレオチドが存在する場合にシグナルの良好な視覚化、および高濃度のヌクレオチドが存在する場合に重合速度の増大の両方をもたらす。
【００５１】
標的核酸は、プライマーにハイブリダイズし、このハイブリダイズしたプライマーへの鋳型依存性のヌクレオチド付加を可能にするのに、十分プライマーに対して相補的である配列を含み得るか、それを含むように改変され得る。プライマーに対して相補的な配列は、先に記載したアダプター配列と同一であり得る。したがって、固定した捕捉プローブおよびプライマーは、同一の配列を含み得る。プライマー配列は、約１０ヌクレオチド長〜約１０００ヌクレオチド長であり得る。プライマー配列および相補的な標的核酸分子配列は、同じ長さであっても異なる長さであってもよい。核酸標的にプライマーをハイブリダイズさせるための条件は、周知である。アニーリング反応は、配列特異性を保証するのに十分ストリンジェントな条件下で実行され、受容可能な速度で安定なハイブリッドの形成を可能にするのになお十分許容される。プライマーアニーリングに必要とされる温度および時間の長さは、塩基組成、プライマーの長さおよび濃度、使用される溶媒の性質（例えば、共溶媒（例えば、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ホルムアミドまたはグリセロール）および対イオン（例えば、マグネシウム）の濃度）が挙げられるいくつかの要因に依存する。代表的に、プライマーと標的核酸との間のハイブリダイゼーション（アニーリング）は、アニーリング溶媒中での標的−プライマーハイブリッドの融解温度より約５℃〜１０℃低い温度で実行される。代表的に、アニーリング温度は、５５℃〜７５℃の範囲であり、プライマー濃度は約０．２μＭである。このような条件下で、アニーリング反応は、通常数秒以内に完了する。
【００５２】
本発明にしたがう方法は、プライマー伸長反応を実行する工程（例えば、少なくとも１つの塩基によってプライマーを伸長するのに十分な条件下で、ポリメラーゼおよび１つ以上のヌクレオチドに核酸／プライマー複合体を曝露する工程）を包含する。本明細書で使用される配列決定は、１つ以上のヌクレオチドが１つ以上の核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）内で同定されるように実行され得る。本発明にしたがう方法はまた、プライマーへ伸長塩基（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｂａｓｅ）を連続的に取り込むことに基づく分子（核酸）の配列を収集する工程を包含する。
【００５３】
分析する工程において、ハイブリダイズした核酸分子は、例えば、２００５年５月２５日に出願された米国特許出願第１１／１３７，９２８号および／または米国特許第６，７８０，５９１号（これらの教示は、その全体が本明細書に援用される）に記載される、単分子配列決定を使用して配列決定され得る。本発明で有用なポリメラーゼとしては、プライマーへの鋳型依存性のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの付加を触媒することができる、あらゆる核酸ポリメラーゼが挙げられる。標的核酸の特徴に依存して、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素あるいは任意の上記のものの変異体または改変形態が使用され得る。本発明の一局面にしたがって、高温性ポリメラーゼ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°ＮＴＭ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、ＶｅｎｔＴＭおよびＤｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ）が使用される。
【００５４】
ポリメラーゼがプライマーの３’末端への鋳型依存性のｄＮＴＰの付加を触媒するような条件下、ポリメラーゼの存在下で、標的核酸分子／プライマー複合体をｄＮＴＰと接触させる。本明細書に記載されるように、ｄＮＴＰは検出可能に標識され得、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在を検出することによって、ヌクレオチドが同定される。先に記載されるように、取り込まれなかった標識ｄＮＴＰは、取り込まれた標識ｄＮＴＰを検出する前に、表面から除去され得る。このプロセスは、１回以上反復され得、ここで鋳型／プライマー複合体はポリメラーゼの存在下でさらなるｄＮＴＰとともに提供され、続いて、取り込まれなかった標識ｄＮＴＰを除去し、そして取り込まれた標識ｄＮＴＰを検出する。鋳型の配列は、検出された（同定された）ｄＮＴＰを収集することによって決定される。この様式において、１つ以上の鋳型の配列全体が決定され得る。さらに、単分子配列決定技術を使用することによって、表面に結合した各核酸分子についての配列を決定することは、サンプル中の異なるまたは固有の核酸分子の数を提供する。さらに、生物学的サンプル中の各核酸配列のコピー数もまた提供される。
【００５５】
連続的に付加されたフルオロフォア標識ヌクレオチドのさらなる伸長および検出を可能にするために、取り込まれたヌクレオチドのフルオロフォアを、プライマーに取り込まれたヌクレオチドから除去し得る。例えば、光学標識（例えば、蛍光標識）は、米国特許第６，７８０，５９１号（この教示は、その全体が本明細書に援用される）に記載される光化学破壊（ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によって破壊することができる。このサイクルは、サンプルの損失が回避される場合に、多大な回数で反復され得る。一実施形態において、このような損失は、アレイデバイス（例えば、顕微鏡スライド）の表面に標的核酸分子またはプライマーを結合させ、このアレイデバイス全体を反応容器および蛍光リーダーとの間に移すことによって回避される。
【００５６】
伸長反応は、酵素媒介伸長を進行させるために必要な適切な濃度の塩、ｄＮＴＰおよびヌクレオチド重合化酵素を含む緩衝溶液中で実行される。このような条件に関するさらなる指針については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）を参照のこと。
【００５７】
本発明で特に有用なヌクレオチドは、検出可能な標識を含む。標識ヌクレオチドは、直接的または間接的に検出可能な標識を含むように改変された任意のヌクレオチドを含む。好ましい標識としては、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、シアニン−５染料、シアニン−３染料または上記のものの任意の誘導体または改変のような蛍光標識またはフルオロフォアを含む光学的に検出可能な標識が挙げられ、またハプテン標識のような標識システムもまた挙げられる。したがって、本発明の方法は、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼにプライマー／標的核酸複合体を曝露する工程をさらに提供する。
【００５８】
配列決定は、プライマー／鋳型複合体中のプライマーに正しいヌクレオチドを迅速かつ完全に付加することを達成し、一方で正しくないヌクレオチドの誤った取り込みを制限するように最適化され得る。例えば、ｄＮＴＰ濃度は、プライマーへの正しくないヌクレオチドの誤った取り込みを低減するために低下され得る。正しくないｄＮＴＰについてのＫｍ値は、正しいヌクレオチドについてのＫｍ値よりも１０００倍も高くあり得、ｄＮＴＰ濃度の低減は、ヌクレオチドの誤った取り込みの率を低減し得ることが示唆される。したがって、本発明の好ましい実施形態において、配列決定反応におけるｄＮＴＰの濃度は、約５〜２０μＭである。
【００５９】
加えて、比較的短い反応時間は、誤った取り込みの可能性を低減するために使用され得る。１秒あたり約４００ヌクレオチドの最大速度に迫る取り込み速度に関して、約２５ミリ秒の反応時間は、プライマー鎖のうちの９９．９９％の伸長を確保するのに十分である。
【００６０】
（検出）
使用される標識の型に適切な任意の検出方法が使用され得る。したがって、例示的な検出方法としては、放射性検出、光学吸光度検出（例えば、ＵＶ−可視吸光度検出）、光学放出（ｏｐｔｉｃａｌ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）検出（例えば、蛍光または化学発光）が挙げられる。例えば、伸長されたプライマーは、使用される走査方法に依存して、同時または連続的に基材全てまたは各基材の一部を走査することによって基材上で検出され得る。蛍光標識に関しては、基材上の選択された領域を、蛍光顕微鏡装置（Ｆｏｄｏｒ（米国特許第５，４４５，９３４号）およびＭａｔｈｉｅｓら（米国特許第５，０９１，６５２号）に記載されるようなもの）を使用して１つずつまたは列ごとに連続的に走査し得る。単一の分子からの蛍光を感知することができるデバイスとしては、走査トンネル顕微鏡（ｓｉＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）が挙げられる。ハイブリダイゼーションパターンもまた、適切なレンズ（Ｐｌｏｅｍ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｓｏｎ，Ｔ．Ｇ．Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌａｎｄｏｎ，ｐｐ．１−１１（１９９３）、例えば、Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．９３：４９１３（１９９６）に記載される）を有するＣＣＤカメラ（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ＴＥ／ＣＣＤ５１２ＳＦ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｒｅｎｔｏｎ、ＮＪ．）を使用して走査され得るか、またはＴＶモニタリングによって画像化され得る。放射性シグナルに関しては、燐光イメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）デバイスが使用され得る（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６、１９９０；Ｄｒｍａｎａｃら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６、１９９２；１９９３）。画像化装置の他の商用供給者としては、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，Ｍａｓｓ．Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のｇｅｎｓｃａｎ．ｃｏｍで）、Ｇｅｎｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗａｔｅｒｌｏｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ；Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のｃｏｎｆｏｃａｌ．ｃｏｍで）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．が挙げられる。このような検出方法は、複数の結合した標的核酸の同時走査を達成するのに特に有用である。
【００６１】
本発明は、単一のヌクレオチドから単一の標的核酸分子までの分子の検出を提供する。多くの方法がこの目的に利用可能である。介在する染料で標識された核酸内の単一の分子を可視化するための方法としては、例えば、蛍光顕微鏡法が挙げられる。例えば、単一の分子の励起状態の蛍光スペクトルおよび寿命を測定することができる。標準的な検出器（例えば、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオード）が使用され得る。２段階画像増強（ｉｍａｇｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ）ＣＯＤカメラでの全視野画像化（ｆｕｌｌ  ｆｉｅｌｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）もまた使用され得る。さらに、低ノイズ冷却ＣＣＤもまた単一の蛍光分子を検出するために使用され得る。
【００６２】
シグナルのための検出システムは、利用可能な化学によって規定され得る、使用される標識部分に依存し得る。光学シグナルに関しては、検出工程において光ファイバーまたは電荷結合素子（ＣＣＤ）の組み合わせが使用され得る。基材自体が使用される放射に対して透明である状況において、入射光ビームを、基材を通過させ、基材の標的核酸とは反対に検出器を配置することが可能である。電磁標識部分に関しては、種々の形態の分光学システムが使用され得る。検出システムについての種々の物理的な方向付け（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）が利用可能であり、重要な設計パラメーターについての議論が当該分野で提供されている。
【００６３】
多くのアプローチが、単一の核酸分子への蛍光標識されたヌクレオチドの取り込みを検出するために使用され得る。光学構成としては、近接場走査顕微鏡法、遠距離場共焦点顕微鏡法（ｆａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、広視野エピ照射（ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ  ｅｐｉ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、光散乱、暗視野顕微鏡法、光変換（ｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）、単一フォトンおよび／または複数フォトン励起、スペクトル波長識別（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、フルオロフォア同定、エバネセント波照射（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｗａｖｅ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）および全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法が挙げられる。一般的に、特定の方法は、カメラを装備した顕微鏡を使用するレーザー活性化蛍光の検出を包含する。適切なフォトン検出システムとしては、フォトダイオードおよび増強型ＣＣＤカメラが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、増強型電荷結合素子（ＩＣＣＤ）カメラが使用され得る。表面近傍の流体中の個々の蛍光染料分子を画像化するためにＩＣＣＤカメラを使用することは、多くの利点を提供する。例えば、ＩＣＣＤ光学構成によって、フルオロフォアの一連の画像（動画）を取得することが可能である。
【００６４】
本発明の一部の実施形態は、二次元画像化のためにＴＩＲＦ顕微鏡法を使用する。ＴＩＲＦ顕微鏡法は、全反射された励起光を使用し、これは当該分野で周知である。例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｎｉｋｏｎ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｊｐ／ｅｎｇ／ｐａｇｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｉｒｆ．ａｓｐｘ．を参照のこと。特定の実施形態において、検出は、エバネセント波照射および全反射蛍光顕微鏡法を使用して実行される。エバネセント光照射野が、表面に設定され得、例えば、蛍光標識された核酸分子を画像化する。レーザービームが液体と固体基材（例えば、ガラス）との間の界面で全反射される場合、励起光線は、液体へ短い距離しか貫通しない。光場（ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｉｅｌｄ）は反射性の界面で急には終わらないが、その強度は、距離と共に指数関数的に落ちる。この表面電磁場（「エバネセント波」と呼ばれる）は、界面近傍の液体中の蛍光分子を選択的に励起し得る。界面での薄いエバネセント光場は、低いバックグラウンドを提供し、可視波長で高いシグナル対ノイズ比で、単一の分子の検出を容易にする。
【００６５】
エバネセント場（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ）はまた、ポリメラーゼの存在下で、結合した標的核酸標的分子／プライマー複合体に蛍光標識されたヌクレオチドが取り込まれた際に、それらを画像化することができる。それゆえ、全反射蛍光顕微鏡法が、単一の分子の分解能で結合した標的核酸標的分子／プライマー複合体および／または取り込まれたヌクレオチドを可視化するために使用される。
【００６６】
測定されたシグナルは、手動でか、または結果を表にする適切なコンピュータによる方法によって分析され得る。基材および反応条件は、ハイブリダイゼーションおよび伸長条件の完全性を確認するため、および所望される場合に、定量化のための標準曲線を提供するための適切なコントロールを含み得る。例えば、コントロール核酸は、サンプルに添加され得る。予測した伸長産物が存在しないことは、サンプルまたはアッセイ成分に正すべき欠陥が存在することを示す。
【００６７】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、検出スキームとして使用され得る。配列決定の状況でのＦＲＥＴは、概してＢｒａｓｌａｖａｓｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１００：３９６０−３９６４（２００３）（参考として、本明細書に援用される）に記載される。本質的に、一実施形態において、ドナーフルオロフォアは、プライマー、ポリメラーゼまたは鋳型に結合される。プライマーへ取り込まれるために付加されたヌクレオチドは、ドナーとアクセプターとの二つが近接した場合にドナーによって活性化されるアクセプターフルオロフォアを含む。
【００６８】
本明細書に記載されるように、本発明の方法を実行するのに適切な製造物品の組み合わせが提供される。適切な表面は、先に記載される。先に記載されるように、酵素は、リガーゼであってもポリメラーゼであってもよい。アダプター配列は、必要に応じてアダプター配列の５’末端にリンカー部分を含み得、このリンカー部分は、表面に標的分子を結合するのに適する。他の適切なリンカー部分は、先に記載される。
【実施例】
【００６９】
バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８の７２４９ヌクレオチドのゲノムを本発明の単分子システムを用いて配列決定を行った。精製された一本鎖ウイルスＭ１３ｍｐ１８のゲノムＤＮＡはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社より取得した。約２５μｇのＭ１３ＤＮＡを、０．１ＵのＤｎａｓｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、４０ｂｐの平均のフラグメントの大きさまで３７℃で１０分間消化した。消化されたＤＮＡフラグメントの大きさを、消化混合物のアリコートをｐｒｅｃａｓｔ変性（ＴＢＥ−Ｕｒｅａ）１０％  ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖａｇｅｎ）上で泳動（ｒｕｎ）し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）で染色することにより推定した。ＤＮａｓｅ  Ｉで消化したゲノムＤＮＡは、約３０ｎｔ未満の小さな消化産物を除去するために、ＹＭ１０  限外濾過スピンカラム（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過した。おおよそ２０ｐｍｏｌの濾過したＤＮａｓｅ  Ｉ消化物を、その後、既知の方法（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｒ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｒ．１９８０，Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ３’  ｔｅｒｍｉｎｉ  ｏｆ  ＤＮＡ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６５（１）：４３−６２）にしたがってターミナルトランスフェラーゼを用いてポリアデニル化した。ｄＡテール（ｔａｉｌ）の平均の長さは５０＋／−５ヌクレオチドであった。次に、そのフラグメントを、ターミナルトランスフェラーゼを用いてＣｙ３−ｄＵＴＰで標識した。その後、フラグメントはジデオキシＴＴＰで終結させた（これもまたターミナルトランスフェラーゼを用いて付加した）。得られたフラグメントは、遊離のヌクレオチドを除去するためＹＭ１０限外濾過スピンカラムで再度濾過した後、−２０℃でｄｄＨ２Ｏ中に保存した。
【００７０】
エポキシドでコーティングしたスライドガラスをオリゴの取り付けのために調製した。エポキシドで機能化した直径４０ｍｍの＃１．５ガラスカバースリップ（スライド）はＥｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）より取得した。そのスライドは３×ＳＳＣ中に３７℃で１５分間浸すことによって、あらかじめ調整した。次に、５’アミノ化したポリｄＴ（５０）（５’末端アミンを持つ長さ５０ｂｐのポリチミジン）の５００ｐＭアリコートをそれぞれのスライドと３０分間室温で８０ｍｌ容量中でインキュベートした。その結果として得られたスライドはエポキシドへの直接的なアミンの連結により結合したポリ（ｄＴ５０）プライマーを有する。そのスライドを、その後、表面を不動態化するため、室温で４時間、ホスフェート（１Ｍ）で処理した。スライドは、その後、それらを配列決定に用いるまで、ポリメラーゼリンスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．００１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ８．０）中に保存した。
【００７１】
配列決定のために、そのスライドを５０μｍ厚のガスケットを用いる改変したＦＣＳ２  フローセル（ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ）（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ，  Ｂｕｔｌｅｒ，  ＰＡ）中に置いた。そのフローセルを、内部全反射（ＴＩＲ）対物レンズを装備したＮｉｋｏｎ  ＴＥ−２０００倒立顕微鏡の周囲に構築した高効率蛍光画像化システムの部分である可動のステージ上に置いた。そのスライドを、その後、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳバッファーでリンスし、そして温度５０℃に平衡化した。上に述べたＭ１３鋳型フラグメントのアリコートを３×ＳＳＣ中で１．２ｎＭの最終濃度に希釈した。１００μｌのアリコートをそのフローセル中に置き、そして、そのスライド上で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、そのフローセルを１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳでリンスし、続いてＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌでリンスした。パッシブ真空装置を、フローセルを通って流体を引くために用いた。その結果として得られたスライドはＭ１３鋳型／オリゴ（ｄＴ）プライマー二重鎖を含んだ。フローセルの温度を、その後、配列決定のために３７℃に下げ、そしてその対物レンズをフローセルと接触させた。
【００７２】
配列決定のために、それぞれがｃｙａｎｉｎｅ−５で標識されたシトシントリホスフェート、グアニジントリホスフェート、アデニントリホスフェート、ウラシルトリホスフェート（ＡＴＰとＧＴＰについては７−デアザの位置、ＣＴＰとＵＴＰについてはＣ５の位置を標識（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））を、バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＨＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＮ）を含む）中に別個に保存した。配列決定は以下のように進めた。
【００７３】
まず第一に、初期画像化を用いて、上記のエポキシド表面上の二重鎖の位置を決定した。二重鎖の位置を確立するために、５３２ｎｍの放射線に調整されたレーザー（Ｖｅｒｄｉ  Ｖ−２  Ｌａｓｅｒ，Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いた励起により、Ｍ１３鋳型に取り付けたＣｙ３標識を画像化した。それぞれのスライドについて、個別に存在する蛍光分子だけをこの段階で画像化して、計数した。下記の組み込まれたヌクレオチドの画像化は、６３５ｎｍの放射線レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を用いるｃｙａｎｉｎｅ−５色素の励起によりなし遂げた。５μＭのＣｙ５ＣＴＰを上記フローセルの中へ置き、そして上記スライドに２分間曝すした。インキュベーション後、そのスライドを１×ＳＳＣ／１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ／ｐＨ７．０（“ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ”）でリンスし（各６０μｌ容積中で１５回）、続いて１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．０（“ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ”）でリンスした（６０μｌ容積中で１０回）。３０％のアセトニトリルとスカベンジャーバッファー（ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌを１３４μｌ、ｐＨ６．１のＭＥＳ中の１００ｍＭ  Ｔｒｏｌｏｘを２４μｌ、ｐＨ６．１のＭＥＳ中のＤＡＢＣＯを１０μｌ、２Ｍのグルコースを８μｌ、２０μｌのＮａＩ（水に溶かした５０ｍＭの貯蔵物）、４μｌのグルコースオキシダーゼ）を含む酸素スカベンジャーを次に加えた。そのスライドは、それから、Ｉｎｏｖａ３０１Ｋレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を用い６４７ｎｍで０．２秒間の画像を造り（５００フレーム）、続けて二重鎖の位置を確認するために、Ｖｅｒｄｉ  Ｖ−２レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を５３２ｎｍで２秒間用い、緑色の画像化を行った。検出できる蛍光を持つ位置を記録した。画像化後、フローセルをＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μｌ）とＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０μｌ）でそれぞれ５回リンスした。次に、フローセル中へ５０ｍＭ  ＴＣＥＰを５分間加えることにより、ｃｙａｎｉｎｅ−５を、それが組み込まれていたＣＴＰから切断し、その後、そのフローセルをＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μｌ）とＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０μｌ）でそれぞれ５回リンスした。残存するヌクレオチドを５０ｍＭのヨードアセトアミドを５分間用いてキャップし、続けて、ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μｌ）とＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０μｌ）でそれぞれ５回リンスした。上に述べた方法でスカベンジャーを再び加え、そして切断／キャップステップの有効性を決定するため、および非組み込み蛍光物を同定するために再びそのスライドを画像化した。
【００７４】
その後、上に述べた手順を、１００ｎＭのＣｙ５ｄＡＴＰに実施し、続いて１００ｎＭのＣｙ５ｄＧＴＰに実施し、そして最後に５００ｎＭのＣｙ５ｄＵＴＰに実施した。その手順（ヌクレオチドに曝す、ポリメラーゼ、リンス、スカベンジャー、画像化、リンス、切断、リンス、キャップ、リンス、スカベンジャー、最終的な画像化）をＡＴＰ、ＧＴＰ、そしてＵＴＰについて、先に述べたように正確に繰り返した。ただしＣｙ５ｄＵＴＰは２分間の代わりに５分間インキュベートした。チミジンの代わりにウリジンを用いた。これは、Ｃｙ５標識が、チミジントリホスフェートでは通常はメチル基により占められている位置に組み込まれたことに起因した。従ってｄＴＴＰをｄＵＴＰに変えた。全て（Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｕ）において、６４サイクルを、この段落と直前の段落で述べたように、実施した。
【００７５】
一度、６４サイクルが完了すると、画像スタックデータ（すなわち、表面に結合した多様な二重鎖より得られた個別分子の配列群）をＭ１３参照配列にアラインメントした。得られた画像データを圧縮し、ホモポリマー領域をつぶした。従って、配列“ＴＣＡＡＡＧＣ”はアラインメントに用いたデータタグ中では“ＴＣＡＧＣ”として表示した。同様に、参照配列中のホモポリマー領域を、アラインメントのためにつぶした。上に述べた配列決定の手順は、（適用範囲の広さに依存して）９８．８％〜９９．９６％の精度でアラインメントしたＭ１３配列を生じた。得られた個々の単分子の配列の読み取られた長さは、２連続ヌクレオチド〜３３連続ヌクレオチドの範囲にあり、約１２．６連続ヌクレオチドが平均長であった。
【００７６】
アラインメントのアルゴリズムは、上述したようにして得た配列を、実際のＭ１３の直線状配列にマッチさせた。得られた配列のＭ１３上での配置は、その得られた配列と、同じ長さのＭ１３の部分との間での最良のマッチに基づき、起こりうる誤差は０、１、２を考慮した。誤差が０で得られた全ての９マー（Ｍ１３参照配列中の９マーに厳密にマッチしたことを意味する）を、まず最初にＭ１３とアラインメントした。その後、誤差が０または１である、１０マーのアラインメント、１１マーのアラインメント、そして１２マーのアラインメントを行った。最後に、誤差が０、１または２である全ての１３マーまたは１３マーより大きいもののアラインメントを行った。適用範囲の広さが１より大きいかまたは１に等しいとき、５，０６６塩基の、つぶしたＭ１３ゲノムのうちの、５，００１塩基を９８．８％の精度でカバーした。同様に、適用範囲の広さが５より大きいか、または５に等しいとき、そのゲノムの８３．６％を９９．３％の精度でカバーした。そして、適用範囲の広さが１０より大きいか、または１０に等しいとき、そのゲノムの５１．９％を９９．９６％の精度でカバーした。適用範囲の広さの平均は１２．６ヌクレオチドであった。
【国際調査報告】
2009505659.tif 000002
2009505659.tif 000003
2009505659.tif 000004