(57)【要約】  短期間で所望の組織・器官に癌を発生させることが可能なモデル動物（非ヒト哺乳動物）及びその用途を提供することを課題とする。部位特異的組換え酵素の作用を受けたときにヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子を発現する発現カセットがゲノム中に組み込まれているトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。また、当該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いたスクリーニング方法が提供される。
2009037950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的組換え酵素の作用を受けたときにヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子を発現する発現カセットがゲノム中に組み込まれているトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
発現カセットが、一対の部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたスタッファー配列がプロモーターとヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子の間に挿入された構造を備える、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
部位特異的組換え酵素がCreリコンビナーゼであり、部位特異的組換え酵素認識配列がloxP配列である、請求項２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
プロモーターがCAGプロモーターである、請求項２又は３に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
スタッファー配列が選択マーカー遺伝子を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
ヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子にタグ配列が連結されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
タグがヘマグルチニンエピトープタグである、請求項６に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
発現カセットが、5'末端側から3'末端側に向かって順にCAGプロモーター、loxP配列、ポリAシグナル配列を伴うネオマイシン耐性遺伝子、loxP配列、及びポリAシグナル配列を伴うヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子が配置された構造からなる、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
発現カセットが、5'末端側から3'末端側に向かって順にCAGプロモーター、loxP配列、ポリAシグナル配列を伴うネオマイシン耐性遺伝子、loxP配列、及びポリAシグナル配列を伴い且つヘマグルチニンエピトープタグが連結されたヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子が配置された構造からなる、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
部位特異的組換え酵素遺伝子を標的組織又は器官に送達し発現させることによって、該標的組織又は器官で癌が発生する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
標的組織又は器官が、肺若しくは膵臓又はそれらの一部である、請求項１０に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
非ヒト哺乳動物が齧歯類である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
非ヒト哺乳動物がラットである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップを含む、標的組織又は器官に癌を発症する非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項１５】
前記ステップにおける送達が、組換えアデノウイルスベクターの感染によって行われる、請求項１４に記載の作製方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、抗癌性物質又は発癌性物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを含む、抗癌性物質又は発癌性物質のスクリーニング方法、
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップ；
（ｂ）試験物質を投与するステップ、
（ｃ）癌の発生の有無、癌の発生までの所要時間、所定時間後の癌の大きさ、癌の悪化又は改善（退縮）の程度、及び血清腫瘍マーカー濃度からなる群より選択される一以上の指標について評価するステップ。
【請求項１８】
以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを含む、抗癌性物質又は発癌性物質のスクリーニング方法、
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップ；
（ｂ）試験物質を投与するステップ、
（ｃ）試験物質を投与しないこと以外は同一の条件で処理したトランスジェニック非ヒト哺乳動物（対照群）との間で、癌の発生の有無、癌の発生までの所要時間、所定時間後の癌の大きさ、癌の悪化又は改善（退縮）の程度、及び血清腫瘍マーカー濃度からなる群より選択される一以上の指標について比較・評価するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子改変動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物）に関する。詳しくは、ヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子をコンディショナルに発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物を用いた抗がん剤の検索や効能判定をするために、担がん動物の開発が必要である。動物の自然発生腫瘍を用いようとするとヒトとの類似性において解決すべき問題が多い。その代表的なものは、がんの発生に長期間を要することである。化学物質によって発がんさせようとすると、投与後、半年から一年の期間を経てはじめて腫瘍の発生がみられる。抗癌剤等のがん治療法の開発にあたっては、短期間に任意の臓器にがんを発生させることが必要である。しかし、これまでの方法では、長期に亘る発がん処置と坦がん動物の維持が必要であり、それに伴う莫大な費用を要する。短期間で確実に標的とする臓器に発がんする動物モデルの確立は、がん治療の研究開発に不可欠である。この目的のため、いくつかの遺伝子改変マウスが開発されたが、発生する腫瘍の多くは非上皮性腫瘍であった。化学物質で誘導されたがんに関する知見の蓄積によって、ラットのがんはマウスに比べ生物学的にヒトに近いものが多いことが分かっており、ヒトがんのモデルとしてはラットの方がより実際的といえる。【０００３】
発がん物質に高感受性であるヒト正常型c-Ha-rasトランスジェニックラットの確立に成功したことが報告されている（特許文献１及び２、非特許文献１及び２を参照）。このラットでは発がん物質の投与によって乳腺・皮膚・舌等において6〜20週の短期間にがんが発生する。このラットは、乳腺発がんを指標として発がん物質・発がん修飾物質・がん予防物質の検索を短期に行うことが可能な動物モデルとして注目されている。
また、ヒト変異型Ha-rasが導入されたコンディショナルトランスジェニックラットの確立が報告された（非特許文献３）。このラットは膵管がんのモデルとして期待されている。
【特許文献１】特許第３４６３０６１号公報
【特許文献２】米国特許第６，５７６，８１１  Ｂ１号公報明細書
【非特許文献１】Asamoto, M., Ochiya, T., Toriyama-Baba, H., Ota, T., Sekiya, T., Terada, M., and Tsuda, H. (2000). Transgenic rats carrying human c-Ha-ras proto-oncogenes are highly susceptible to N-methyl-N-nitrosourea mammary carcinogenesis. Carcinogenesis 21, 243-249.
【非特許文献２】Tsuda, H., Fukamachi, K., Ohshima, Y., Ueda, S., Matsuoka, Y., Hamaguchi, T., Ohnishi, T., Takasuka, N., and Naito, A. (2005). High susceptibility of human c-Ha-ras proto-oncogene transgenic rats to carcinogenesis: a cancer-prone animal model. Cancer Sci 96, 309-316.
【非特許文献３】Ueda, S., Fukamachi, K., Matsuoka, Y., Takasuka, N., Takeshita, F., Naito, A., Iigo, M., Alexander, D.B., Moore, M.A., Saito, I., Ochiya, T., and Tsuda, H. (2006). Ductal origin of pancreatic adenocarcinomas induced by conditional activation of a human Ha-ras oncogene in rat pancreas. Carcinogenesis 27, 2497-2510.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、短期間で所望の組織・器官に癌を発生させることが可能なモデル動物（非ヒト哺乳動物）及びその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上の課題に鑑みて本発明者らは、12番目のコドンにアミノ酸置換を伴う変異が生じた場合に発がん癌遺伝子として働くK-ras遺伝子に注目した。罹患率・死亡率の高い肺・膵臓がん等ではK-rasの変異が高頻度に認められ、K-rasの活性化が持続的に起こっていることが知られている。そこで、活性型（変異型）のヒトK-ras（K-rasV12）遺伝子が導入されたトランスジェニックラットの作製を目指して検討を重ねた。これまでの研究により、強力なプロモーターを用いたコンベンショナルな活性型Ras遺伝子トランスジェニック動物は胎性致死であることが知られている。そこで、時期・臓器特異的にK-rasV12遺伝子の発現を調節可能になるよう、Cre/loxPシステムを用いた発現カセット（導入遺伝子）を導入することにした。この発現カセットは通常はK-rasV12遺伝子を発現しないが、Creリコンビナーゼにより組換えが生ずることにより、loxP配列に挟まれたスタッファー配列が取り除かれ、プロモーターにより直接、K-rasV12遺伝子が制御されるようになる。
最終的に合計４系統のヒト変異型K-ras（K-rasV12）コンディショナルトランスジェニックラットの樹立に成功した。これらトランスジェニックラット系統は次世代に導入遺伝子を伝搬できることが確認され、系統維持可能なことが示された。
樹立に成功したトランスジェニックラットの肺に、Creリコンビナーゼを発現するアデノウイルスベクターを感染させてCreリコンビナーゼを発現させたところ、6週間程度で肺腺がんが発生した。また、同様に膵管でCreリコンビナーゼを発現させると、これまでのモデル動物では発生させることの困難だった膵がんが8週間で発生した。検討を進めた結果、わずか１週間という極めて短期間で膵がんを発生する個体を認めた。従来の技術と比較すれば、１週間程度でがんの発生が可能なことは驚異的であり、特筆に値する。このように、樹立に成功したトランスジェニックラットを用いれば極めて短期間で所望の組織や器官にがんを発生させることが可能であることが示され、抗がん剤等の治療開発を行う際に大幅な期間短縮・費用削減効果をもたらすことが期待された。
以上の成果より、部位特異的組換え酵素を利用したシステムによってヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子がコンディショナルに発現するように遺伝子操作すれば、極めて短期間で所望の組織・器官にがんが発生するモデル動物（非ヒト哺乳動物）を樹立可能であるとの知見が得られた。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであり、以下のトランスジェニック非ヒト哺乳動物及びその用途を提供する。
［１］部位特異的組換え酵素の作用を受けたときにヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子を発現する発現カセットがゲノム中に組み込まれているトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［２］発現カセットが、一対の部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたスタッファー配列がプロモーターとヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子の間に挿入された構造を備える、［１］に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［３］部位特異的組換え酵素がCreリコンビナーゼであり、部位特異的組換え酵素認識配列がloxP配列である、［２］に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［４］プロモーターがCAGプロモーターである、［２］又は［３］に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［５］スタッファー配列が選択マーカー遺伝子を含む、［２］〜［４］のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［６］ヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子にタグ配列が連結されている、［２］〜［５］のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［７］タグがヘマグルチニンエピトープタグである、［６］に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［８］発現カセットが、5'末端側から3'末端側に向かって順にCAGプロモーター、loxP配列、ポリAシグナル配列を伴うネオマイシン耐性遺伝子、loxP配列、及びポリAシグナル配列を伴うヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子が配置された構造からなる、［１］に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［９］発現カセットが、5'末端側から3'末端側に向かって順にCAGプロモーター、loxP配列、ポリAシグナル配列を伴うネオマイシン耐性遺伝子、loxP配列、及びポリAシグナル配列を伴い且つヘマグルチニンエピトープタグが連結されたヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子が配置された構造からなる、［１］に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［１０］部位特異的組換え酵素遺伝子を標的組織又は器官に送達し発現させることによって、該標的組織又は器官で癌が発生する、［１］〜［９］のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［１１］標的組織又は器官が、肺若しくは膵臓又はそれらの一部である、［１０］に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［１２］非ヒト哺乳動物が齧歯類である、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［１３］非ヒト哺乳動物がラットである、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
［１４］［１］〜［１３］のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップを含む、標的組織又は器官に癌を発症する非ヒト哺乳動物の作製方法。
［１５］前記ステップにおける送達が、組換えアデノウイルスベクターの感染によって行われる、［１４］に記載の作製方法。
［１６］［１］〜［１３］のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、抗癌性物質又は発癌性物質のスクリーニング方法。
［１７］以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを含む、抗癌性物質又は発癌性物質のスクリーニング方法、
（ａ）［１］〜［１３］のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップ；
（ｂ）試験物質を投与するステップ、
（ｃ）癌の発生の有無、癌の発生までの所要時間、所定時間後の癌の大きさ、癌の悪化又は改善（退縮）の程度、及び血清腫瘍マーカー濃度からなる群より選択される一以上の指標について評価するステップ。
［１８］以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを含む、抗癌性物質又は発癌性物質のスクリーニング方法、
（ａ）［１］〜［１３］のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップ；
（ｂ）試験物質を投与するステップ、
（ｃ）試験物質を投与しないこと以外は同一の条件で処理したトランスジェニック非ヒト哺乳動物（対照群）との間で、癌の発生の有無、癌の発生までの所要時間、所定時間後の癌の大きさ、癌の悪化又は改善（退縮）の程度、及び血清腫瘍マーカー濃度からなる群より選択される一以上の指標について比較・評価するステップ。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】トランスジェニックラットの作製に使用した発現カセット（導入遺伝子）の構成。Ａの発現カセット（CALNLKrasV12）では、5'末端側から3'末端側に向かって順にCAGプロモーター（CAG）、loxP配列（loxP）、ポリAシグナル配列（pA：SV40初期ポリAシグナル）を伴うネオマイシン耐性遺伝子（neo）、loxP配列（loxP）、及びポリAシグナル配列（GpA：ウサギβグロビン・ポリAシグナル）を伴うヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子が配置される。Ｂの発現カセット（CALNLHAKrasV12）では、5'末端側から3'末端側に向かって順にCAGプロモーター（CAG）、loxP配列（loxP）、ポリAシグナル配列（pA：SV40初期ポリAシグナル）を伴うネオマイシン耐性遺伝子（neo）、loxP配列（loxP）、及びポリAシグナル配列（GpA：ウサギβグロビン・ポリAシグナル）を伴い且つヘマグルチニンエピトープ（HA）タグが連結されたヒト変異型K-ras（HA-KasV12）遺伝子が配置される。
【図２】K-ras遺伝子、K-rasV12遺伝子、及びHA-K-KasV12遺伝子の配列の比較。上段はヒト野生型K-ras遺伝子（Kras）の配列（配列番号：３）、中段はヒト変異型K-ras遺伝子（Kras V12）の配列（配列番号：１）、下段は5'末端側にHAタグ（3個、下線）を連結したヒト変異型K-ras遺伝子（HAKras V12）の配列（配列番号：２）を示す。太字が変異塩基（GGT；グリシンからGTT；バリンへ置換）。導入ヒト変異型K-ras遺伝子の5’末端にSacI(四角囲み)、3’末端にKpnI（角丸四角囲み）の制限酵素認識配列を付加し、PCALNL5ベクターに挿入した。
【図３】トランスジェニックラット（HAKras301系統、HAKras327系統）に発生した肺がんを示す、HE染色による組織像。Ａ及びＢ：HAKras301系統、Ｃ及びＤ：HAKras327系統。いずれの組織像においても肺癌の発生が認められる。尚、Kras409系統、Kras417系統についても同様の組織像が観察された。
【図４】トランスジェニックマウス（Kras417系統）に発生した膵がんを示す、HE染色による組織像。Ａ：初期病変、Ｂ：膵上皮内腫瘍性病変（Pancreatic Intraepithelial Neoplasia;PanIN-2およびPanIN-3）、Ｃ：Adenocarcinoma（膵管がん）、Ｄ：繊維化を伴う増殖性病変。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の第１の局面は、特定の発現カセット（導入遺伝子）がゲノム中に組み込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。ゲノム中に組み込まれた発現カセットのコピー数は特に限定されるものではないが、例えば1〜100である。また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は発現カセットに関してホモ接合体であってもヘテロ接合体であってもよい。【０００８】
「トランスジェニック非ヒト哺乳動物」とは、発生初期に外来性DNA（導入遺伝子）が導入されることによって、それを構成するすべての細胞が当該外来性DNAを保有することとなる、ヒト以外の哺乳動物又はその子孫（但し、当該外来性DNAを保有するもの）をいう。ここでの哺乳動物の種（属）は特に限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、及びウマ等を含む。好ましくはラット（例えば、SD（Sprague-Dawley）、Lewis(Rtw)、WFC(Rte)、DA(Rta)ラット（これらのラットは例えば日本チャールズリバーから入手可能である））やマウス（例えばH-2qマウスDBA/J系統やB10.Q系統、又はH-2rマウスR10.RIII系統（これらのマウスは例えば日本チャールズリバーから入手可能である））などの齧歯目動物であり、最も好ましくはラットである。尚、本明細書では「トランスジェニック非哺乳動物」のことを「TG動物」ともいう。【０００９】
本発明における発現カセットとは、部位特異的組換え酵素の作用を受けたときにのみヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子を発現するDNAコンストラクトである。当該発現カセットをゲノム中に保有した本発明のTG動物では、標的組織又は器官において部位特異的組換え酵素が作用するように操作したとき（即ち標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素を外部から送達したとき）、発現カセットからK-rasV12遺伝子が発現し、その結果として標的組織又は器官でがんが発生する。ここでの「標的組織又は器官」は特に限定されず、その例として肺、膵臓及びこれらの一部を挙げることができる。尚、ヒト変異型K-rasでは、ヒト正常型K-rasにおける１２番アミノ酸がグリシンからバリンに置換されている。本明細書では「ヒト変異型K-ras」を慣例に従い「K-rasV12」と表記する。K-rasV12遺伝子の塩基配列を添付の配列表の配列番号：１に示す。【００１０】
部位特異的組換え酵素の作用を受けたときにK-rasV12遺伝子を発現するという機能を備える限り、発現カセットの構成は特に限定されない。例えば、一対の部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたスタッファー配列がプロモーターとK-rasV12遺伝子の間に挿入された構造を備えた発現カセットであれば、当該機能を発揮できる。【００１１】
本発明における「部位特異的組換え酵素」は標的組織又は器官に対して外来性であり（即ち標的組織又は器官に本来は存在しない酵素である）、特定の配列を認識して組換えを生じさせる。部位特異的組換え酵素としてとしてはCreリコンビナーゼ、Flpリコンビナーゼ、及びこれらの変異体などを使用することができる。【００１２】
部位特異的組換え酵素が認識する配列（部位特異的組換え酵素認識配列）には、採用する部位特異的組換え酵素に対応するものを使用する。例えば、部位特異的組換え酵素としてCreリコンビナーゼを採用した場合、部位特異的組換え酵素認識配列にはloxP配列を使用すればよい。また、Flpリコンビナーゼを採用した場合、部位特異的組換え酵素認識配列にはFRT配列を使用すればよい。尚、lox66、lox7等の改変配列であっても、所望の組換えが生ずる限りにおいて部位特異的組換え酵素認識配列として使用することができる。【００１３】
「スタッファー配列」とは、部位特異的組換え酵素の作用によって発現カセットから除去される配列である。プロモーターとK-rasV12遺伝子との間にスタッファー配列が介在することによって、部位特異的組換え酵素が作用するまではK-rasV12遺伝子が発現しない。部位特異的組換え酵素が作用して組換えが生ずると、スタッファー配列が除去され、K-rasV12遺伝子がプロモーターの制御を受ける。即ち、部位特異的組換え酵素による組換えの後の発現カセットでは、K-rasV12遺伝子がプロモーターの制御下に配置されることになる。ここでの「制御下に配置される」とは、発現カセットに組み込まれたプロモーターが作用してK-rasV12遺伝子の転写が生ずるように、K-rasV12遺伝子が直接又は他の配列を介して当該プロモーターに連結されている状態をいう。通常、組換え後の発現カセットでは、当該プロモーターの下流且つ近接した位置にK-rasV12遺伝子が配置される。【００１４】
「プロモーター」とは、その制御下にある遺伝子の転写の開始を調節する機能領域のことをいう。プロモーターとして、CAGプロモーター（サイトメガロウイルスのエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターを連結させた構造を有する）、CMV-IE（サイトメガロウイルス初期遺伝子由来プロモーター）、SV40ori、レトロウイルスLTP、SRα、EF1α、βアクチンプロモーター等を例示できる。アセチルコリンレセプタープロモーター、エノラーゼプロモーター、L7プロモーター、ネスチンプロモーター、アルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、ケラチンプロモーター、インスリンプロモーター等、組織特異的プロモーターを使用してもよい。【００１５】
本発明の一態様ではスタッファー配列が選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、発現カセットのクローニングやサブクローニングの際の識別・選択などに利用される。各種の選択マーカーが周知である。例えば、ネオマイシンに対する耐性を付与するneo遺伝子、カナマイシン等に対する耐性を付与するnpt遺伝子(Herrera Estrella、EMBO J. 2（1983）、987-995)やnptII遺伝子(Messing & Vierra．Gene 1 9:259-268(1982))、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子(Blochinger & Diggl mann，Mol Cell Bio 4:2929-2931)、メタトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子(Bourouis et al.，EMBO J．2(7))、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、GFP遺伝子（Gerdes、FEBS Lett. 389（1996）、44-47）、ルシフェラーゼ（Giacomin、P1. Sci. 116（1996）、59〜72；Scikantha、J. Bact. 178（1996）、121）などを、使用するベクター宿主系や使用目的などに応じて適宜選択して用いることができる。【００１６】
本発明の一態様では、タグ配列が連結したK-rasV12遺伝子が発現カセットに組み込まれる。当該発現カセットを用いることによって、K-rasV12遺伝子の発現状態がタグの検出によって把握可能となる。本発明のTG動物に対して部位特異的組換え酵素を作用させた後、例えばタグに特異的な抗体を用いて検出すれば、K-rasV12遺伝子が発現した細胞を特定することができ、がん起始細胞やがん幹細胞の同定に役立つ。ここでのタグとして、ヘマグルチニンエピトープ（HA）タグ、FLAGタグ、Mycタグ、Hisタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)タグ、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、lacZ遺伝子等を用いることができる。【００１７】
発現カセットの具体的な構造を二つ示す。一つ目の構造は、後述の実施例に示した導入遺伝子CALNLKrasV12に対応するものであり、5'末端側から3'末端側に向かって順にCAGプロモーター、loxP配列、ポリAシグナル配列を伴うネオマイシン耐性遺伝子、loxP配列、及びポリAシグナル配列を伴うK-rasV12遺伝子が配置された構造である。二つ目の構造は、後述の実施例に示した導入遺伝子CALNLHAKrasV12に対応するものであり、5'末端側から3'末端側に向かって順にCAGプロモーター、loxP配列、ポリAシグナル配列を伴うネオマイシン耐性遺伝子、loxP配列、及びポリAシグナル配列を伴い且つヘマグルチニンエピトープタグが連結されたK-rasV12遺伝子が配置された構造である。【００１８】
本発明のTG動物の作製方法としては、受精卵の前核に直接DNAの注入を行うマイクロインジェクション法、レトロウイルスベクターを利用する方法、ES細胞を利用する方法などを用いることができる。以下では、本発明のTG動物の作製方法として、ラットを用いたマイクロインジェクション法を具体例として説明する。
マイクロインジェクション法では、まず交尾が確認された雌ラット（例えばSDラット）の卵管より受精卵を採取し、そして培養した後にその前核に所定のDNAコンストラクト（発現カセット）の注入を行う。DNAコンストラクトの形態は特に限定されないが、導入効率の点から直鎖状又は環状であることが好ましい。特に好ましくは、直鎖状に調製したDNAコンストラクトを使用する。導入目的の遺伝子が効率的に染色体に組み込まれ、且つその良好な発現が確保できるようにDNAコンストラクトを調製する。
注入操作を終了した受精卵を偽妊娠ラットの卵管に移植し、移植後のラットを所定期間飼育して仔ラット（F0）を得る。仔ラットの染色体に導入遺伝子が適切に組込まれていることを確認するために、仔ラットの尾などからDNAを抽出し、サザンハイブリダイゼ−ション分析、スロットブロット（ドットブロット）分析、PCR分析等を実施する。
次に、同定されたトランスジェニック個体を他のラット（例えばSDラット）との交配に供する。ここでの「他のラット」として、以上の操作の結果得られた他のトランスジェニック個体を使用することもできる。【００１９】
本発明のTG動物では、部位特異的組換え酵素遺伝子を標的組織又は器官に送達し発現させることによって、該標的組織又は器官で癌を発生させることができる。そこで本発明の第２の局面は、本発明のTG動物の標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップを含む、標的組織又は器官に癌を発症する非ヒト哺乳動物の作製方法を提供する。部位特異的組換え酵素には、TG動物のゲノムに組み込まれた発現カセットに用いた部位特異的組換え酵素認識配列に対応するものを使用する。例えば発現カセットがloxP配列を含む場合、Creリコンビナーゼを使用する。部位特異的組換え酵素遺伝子の標的組織又は器官への送達は、部位特異的組換え酵素遺伝子を保持するベクターによって行われる。ここでの「ベクター」とは、標的組織又は器官を構成する細胞内に所望の遺伝子を導入し且つ発現させることが可能な核酸性分子をいい、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態をとる。ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、ウイルスが細胞へと感染する現象を巧みに利用するものであり、高い遺伝子導入効率が得られる。ウイルスベクターとしてアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が開発されている。この中でアデノウイルスベクターではベクターに組み込んだ外来遺伝子が宿主染色体へと組み込まれることがなく、本発明の目的には好適なものといえる。即ち、アデノウイルスベクターを利用して部位特異的組換え酵素遺伝子を送達、発現させることにすれば、ベクター（又はその一部）が宿主染色体に取り込まれることがなく、本発明のTG動物のゲノム中に存在する発現カセットの発現が影響を受けない。【００２０】
一方、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターではベクターに組み込んだ外来遺伝子が宿主染色体へと組み込まれ、安定かつ長期的な発現が期待できる。レトロウイルスベクターの場合はウイルスゲノムの宿主染色体への組み込みには細胞の分裂が必要であることから非分裂細胞への遺伝子導入には適さない。一方、レンチウイルスベクターやアデノ随伴ウイルスベクターは非分裂細胞においても感染後に外来遺伝子の宿主染色体への組み込みが生ずる。従って、これらのベクターは神経細胞や肝細胞などの非分裂細胞において安定かつ長期的に外来遺伝子を発現させるために有効である。【００２１】
各ウイルスベクターは既報の方法に従い又は市販される専用のキットを用いて作製することができる。例えば、アデノウイルスベクターの作製はCOS-TPC法や完全長DNA導入法などで行うことができる。COS-TPC法は、目的のcDNA又は発現カセットを組み込んだ組換えコスミドと、親ウイルスDNA-末端タンパク質複合体（DNA-TPC）を293細胞に同時トランスフェクションし、293細胞内でおこる相同組換えを利用して組換えアデノウイルスを作製する方法である（Miyake,S., Makimura,M., Kanegae,Y., Harada,S., Takamori,K., Tokuda,C., and Saito,I. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1320.）。一方、完全長DNA導入法は、目的の遺伝子を挿入した組換えコスミドを制限消化処理した後、293細胞にトランスフェクションすることによって組換えアデノウイルスを作製する方法である（寺島美保、近藤小貴、鐘ヶ江裕美、斎藤泉（2003）実験医学 21（7）931.）。COS-TPC法はAdenovirus Expression Vector Kit (Dual Version)（タカラバイオ株式会社）、Adenovirus genome DNA-TPC（タカラバイオ株式会社）を利用して行うことができる。また、完全長DNA導入法は、Adenovirus Expression Vector Kit (Dual Version)（タカラバイオ株式会社）を利用して行うことができる。【００２２】
一方、レトロウイルスベクターは以下の手順で作製することができる。まず、ウイルスゲノムの両端に存在するLTR（Long Terminal Repeat）の間のパッケージングシグナル配列以外のウイルスゲノム（gag、pol、env遺伝子）を取り除き、そこへ目的の遺伝子を挿入する。このようにして構築したウイルスDNAを、gag、pol、env遺伝子を構成的に発現するパッケージング細胞に導入する。これによって、パッケージングシグナル配列をもつベクターRNAのみがウイルス粒子に組み込まれ、レトロウイルスベクターが産生される。【００２３】
アデノウイルスベクターを応用ないし改良したベクターとして、ファイバータンパク質の改変により特異性を向上させたもの（特異的感染ベクター）や目的遺伝子の発現効率向上が期待できるguttedベクター（ヘルパー依存性型ベクター）などが開発されている。このようなウイルスベクターを利用して、部位特異的組換え酵素遺伝子を標的組織又は器官へ送達することにしてもよい。【００２４】
非ウイルスベクターとしてリポソーム、正電荷型リポソーム（Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987）、HVJ(Hemagglutinating virus of Japan)-リポソーム（Dzau, V.J., Mann, M., Morishita, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:11421-11425, 1996、Kaneda, Y., Saeki, Y. & Morishita, R., Molecular Med. Today, 5:298-303, 1999）等が開発されている。このような非ウイルス性ベクターを利用して、部位特異的組換え酵素遺伝子を標的組織又は器官へ送達することにしてもよい。【００２５】
本発明のTG動物では、所定の操作によって短期間で標的組織又は器官にがんを発生させることができる。従って、本発明のTG動物は、がんを研究する上で有効な手段（モデル動物）となる。特に、本発明のTG動物を用いることによって、「がんに関連する物質」の探索及び効果の検証などを行える。そこで本発明は第３の局面として、本発明のTG動物を用いた、「がんに関連する物質」のスクリーニング方法を提供する。ここでの「がんに関連する物質」は抗癌性物質と発癌性物質に大別される。「抗癌性物質」とは、抗癌剤と互換的に使用される用語であり、がんの発生を抑制又は阻害する物質、がんの増大や進行（悪化）を抑制又は阻害する物質、がんを退縮又は消失させる物質など、がんの発生又は進行に対して抑制的に作用する物質のことをいう。抗発癌物質、抗発癌イニシエーター、及び抗発癌プロモーターはいずれも抗癌性物質に該当する。【００２６】
一方、「発癌性物質」とは、発癌の原因となる物質、発癌を促進する物質、がんの増大や進行（悪化）を促進する物質など、がんの発生又は進行に対して促進的に作用する物質のことである。発癌物質及び発癌プロモーターは発癌性物質の代表例である。
以下の説明では、がんに対する抗癌性物質の作用を包括的に「抗癌作用」と表現し、がんに対する発癌性物質の作用を包括的に「発癌作用」と表現する。【００２７】
本発明のスクリーニング方法では、本発明のTG動物の標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップ（ステップ（ａ））、試験物質を投与するステップ（ステップ（ｂ））、及び癌の発生の有無、癌の発生までの所要時間、所定時間後の癌の大きさ、癌の悪化又は改善（退縮）の程度、及び血清腫瘍マーカー濃度からなる群より選択される一以上の指標について評価するステップ（ステップ（ｃ））を実施する。【００２８】
ステップ（ａ）ではまず本発明のTG動物を用意する。そして、標的組織又は器官に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達し、発現させる。このステップの詳細に関しては、上記第２の局面での説明が援用される。尚、「標的組織又は器官」は特に限定されず、その例として肺、膵臓及びこれらの一部を挙げることができる。【００２９】
ステップ（ｂ）では試験物質を投与する。試験物質の投与方法として経口投与、経鼻投与、経気管投与、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内又は腹腔内注射、標的組織又は気管への注入（例えば経胆道的に総胆管から膵管内へ注入）を例示することができる。【００３０】
試験物質としては様々な分子サイズの有機化合物（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等））又は無機化合物を用いることができる。試験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを試験物質として用いてもよい。【００３１】
ステップ（ｃ）では、がんに対する効果の指標について評価する。ここでの「指標」の例として、癌の発生の有無、癌の発生までの所要時間、所定時間後の癌の大きさ、癌の悪化又は改善（退縮）の程度、及び血清腫瘍マーカー濃度を挙げることができる。これらの指標は互いに排他的なものではない。即ち、このステップにおいて、２以上の指標に対する評価を行うことにしてもよい。【００３２】
指標「癌の発生までの所要時間」における所要時間を計算する基準（基準時）は任意であり、例えば部位特異的組換え酵素遺伝子を送達する操作を行った時点を基準に所要時間を計算したり、当該操作後のある時点（例えば１日後、３日後、１週間後）を基準に所要時間を計算したりすることができる。指標「所定時間後の癌の大きさ」における所定時間を計算する基準（基準時）についても同様である。【００３３】
「腫瘍マーカー」とは、腫瘍細胞が産生する物質、又は腫瘍の存在によって非腫瘍細胞が産生する物質であり、臨床診断や腫瘍の転移・再発の早期発見に有用なものをいう。腫瘍マーカーの内、血清を試料とした検査によって検出可能なものを「血清腫瘍マーカー」とよぶ。「血清腫瘍マーカー」の例を挙げると、CEA（癌胎児性抗原）、CA19-9、SLX(シアリルLex-i抗原)、STN(シアリルTn抗原)、TPA（組織ポリペプチド抗原）、CA72-4、CA125、SCC（扁平上皮癌関連抗原）、DUPAN-2、SPan-1、エラスターゼ１、BCA-225、CA15-3、CYFRA（サイトケラチン19フラグメント）、PSA（前立腺特異抗原）、γ-セミノプロテイン、PAP（前立腺酸性フォスファターゼ）、AFP（α-フェトプロテイン）、PIVKA-II、NCC-ST-439、CA130等である。
誘導するがんの種類に応じて適切な血清腫瘍マーカーを選択することが好ましい。例えば、肺がんを誘導した場合に好適な血清腫瘍マーカーはCEA、SLX、CYFRA、SCC等であり、膵がんを誘導した場合に好適な血清腫瘍マーカーはCA-125、CA19-9、CEA、エラスターゼ１、NCC-ST-439、SLX、STN等である。【００３４】
このステップでの評価には各種の染色法が利用できる。染色法を例示すると、HE染色（hematoxylin-eosin staining）、PAS染色（Periodic acid Schiff stain）、アルシアンブルー染色（Alcian blue stain）、ムチカルミン染色（Mucicarmine stain）、コロイド鉄染色（Colloidal iron stain）、アルシアンブルー・PAS重染色（Alcian blue-PAS double stain)、がん抗原異的抗体による免疫染色等である。尚、「がん抗原」の例として、CEA（carcinoembryonic antigen）、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor、別名HER-1、c-erbB-1）、AFP（α-fetoprotein）、HER2（別名erbB-2、c-erbB-2）、CD46抗原（別名MCP、gp45-70）、ITGA3(integrin  ITGA3(integrin  alph：別名alpha3beta1  alpha3beta1  Epiligrin  Recept、VLA-3）、ICAM1（Intercellular  adhesion  molecule-1：別名Intercellular  Intercellular  Adsion  sion  Molecule、CD54  CD54  Antig）、ALCAM（Activaed  leukocyte  cell  adhesion  molecule：別名CD166抗原、KG-CAM）、CD147抗原（別名BSG、TCSF）、C1qR、CD44、CD73、EpCAM、BCAM（basal  cell  adhesion  molecule）を挙げることができる。【００３５】
好ましくは、ステップ（ｂ）後のTG動物（試験群）に加え、試験物質を投与しないこと以外は同一の条件で処理したTG動物（対照群）を用意し、試験群と対照群との間で特定の指標を比較・評価する。比較の結果、試験群と対照群との間に差異が認められれば、試験物質が「がんに関連する物質」であると評価できる。例えば、対照群ではがんの発生が確認されるのに対し、試験群ではがんの発生が確認されない場合や、対照群に比較して試験群に有意ながんの退縮が認められた場合などには、試験物質に抗癌作用があると評価される。【００３６】
試験群及び対照群に含まれる個体数は特に限定されない。一般に使用する個体数が多くなるほど信頼性の高い結果が得られるが、多数の個体を同時に取り扱うことは使用する個体の確保や操作（飼育を含む）の面で困難を伴う。そこで例えば各群に含まれる個体数を１〜５０、好ましくは２〜３０、さらに好ましくは５〜２０とする。【００３７】
本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物が抗癌性物質として十分な薬効を有する場合には、当該化合物をそのまま抗癌剤の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で、抗癌剤の有効成分として当該化合物を使用することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。【００３８】
特に記載のない限り、本明細書における遺伝子工学的操作は例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或いはCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参考にして行うことができる。
【実施例】
【００３９】
＜ヒト変異型K-ras（K-rasV12）コンディショナルトランスジェニックラットの樹立、及び腫瘍の誘導＞
コンディショナルに発現するようにヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子が導入されたラットの樹立を目指し、以下の実験を行った。【００４０】
１．方法
（１）導入遺伝子の調製
pCALNL5ベクター（理研DNAバンク；RDB No.1862）（Kanegae, Y., Lee, G., Sato, Y., Tanaka, M., Nakai, M., Sakaki, T., Sugano, S., and Saito, I. (1995). Efficient gene activation in mammalian cells by using recombinant adenovirus expressing site-specific Cre recombinase. Nucleic Acids Res 23, 3816-3821.；Kanegae, Y., Takamori, K., Sato, Y., Lee, G., Nakai, M., and Saito, I. (1996). Efficient gene activation system on mammalian cell chromosomes using recombinant adenovirus producing Cre recombinase. Gene 181, 207-212.；Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991). Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-199.）のSacIとKpnIサイト間にヒト変異型K-ras（K-rasV12)cDNAを挿入し発現カセット（CALNLKrasV12）を構築した（図１Ａ）。また同様にK-rasV12のN末にHAタグをつけたHA-K-rasV12 cDNAを挿入した発現カセット（CALNLHAKrasV12）も構築した（図１Ｂ）。具体的には強力なプロモーターであるCAGプロモーターと目的遺伝子であるK-rasV12遺伝子（図２、配列番号：１）又はHAタグを付けたK-rasV12遺伝子（図２、配列番号：２）の間に二つのloxP配列で挟まれたポリAシグナルを伴うネオマイシン耐性遺伝子を挿入した発現カセットを作製した。作製した発現カセットをSalIとHindIIIで切り出し導入遺伝子とした。【００４１】
（２）トランスジェニックラットの作製
受精卵に導入遺伝子のインジェクションを実施し、2細胞期の段階で偽妊娠ラットの卵管内に移植を行った。産仔の遺伝子型の判定はPCR法により行い、導入遺伝子の有無を確認した。【００４２】
（３）アデノウイルスの調製
HEK293細胞にCre発現アデノウイルス（AdexCre：理研DNAバンク：RDB1748）を感染させアデノウイルスを増殖させた。アデノウイルスは精製後、力価を測定し-80℃にて保存した。【００４３】
（４）腫瘍の誘導
Cre発現アデノウイルス（AdexCre）を肺に感染させるため、口腔から気管へマイクロスプレーを挿入し、アデノウイルスを噴霧した（300μl, 1 x 109 ifu/ml）。AdxCreを膵臓へ感染させるため、経胆道的に総胆管から膵管内に注入した（150 μl, 4 x 109 ifu/ml）。【００４４】
２．結果
（１）ヒト変異型K-rasコンディショナルトランスジェニックラット系統の樹立
CALNLKrasV12を361個のSDラット受精卵に注入し、12匹の偽妊娠ラットの卵管内に265個移植を行った。37匹が産まれ、5匹が遺伝子導入ラットであることがPCRにより確認された。このうち次世代に導入遺伝子を伝搬可能でCreリコンビナーゼにより発がんする二系統のコンディショナルK-rasV12トランスジェニックラット（Kras409、Kras417）を樹立した。
またCALNLHAKrasV12を400個のSDラット受精卵に注入し、12匹の偽妊娠ラットの卵管内に295個移植を行った。45匹が産まれ、5匹が遺伝子導入ラットであることがPCRにより確認された。このうち次世代に導入遺伝子を伝搬可能でCreリコンビナーゼにより発がんする二系統のコンディショナルHA-K-rasV12トランスジェニックラット（HAKras301、HAKras327）を樹立した。HAKras301は3コピー、HAKras327は6コピーの導入遺伝子を持つ。
これらトランスジェニックラット系統は安定に次世代に導入遺伝子を伝搬できることが確認され、系統維持可能なことが示された。【００４５】
（２）肺がんの誘導
AdexCreを気管から噴霧することによって、コンディショナルK-rasV12トランスジェニックラット及びコンディショナルHA-K-rasV12トランスジェニックラットの肺へアデノウイルスを感染させた。6週後に肺を摘出し、病理標本を作製した。その結果、Kras409、Kras417、HAKras301、HAKras327の全ての系統において肺腺がんの発生がみられた（図３）。【００４６】
（３）膵がんの誘導
AdexCreを経胆道的に膵管へ注入することによって、コンディショナルK-rasV12トランスジェニックラット（Kras417）及びコンディショナルHA-K-rasV12トランスジェニックラット（HAKras327）の膵管にアデノウイルスを感染させた。その結果、8週後にKras417、HAKras327系統で肉眼的に多数の白い結節が認められ、腫瘍が発生した。病理学的に膵管がんであることが明らかとなった（図４）。【００４７】
（４）がんの発生時期の検討
同様の手法を用いてコンディショナルK-rasV12トランスジェニックラットを作製し、膵がんの誘導を行った。その結果、わずか１週間という極めて短期間で膵がんを発生する個体を認めた。【００４８】
３．考察
樹立に成功したトランスジェニックラットの肺へCreリコンビナーゼ発現アデノウイルスベクターを投与することによって、6週間程度で肺がんが発生することが示された。また、同様にCreリコンビナーゼの感染によって、これまでのモデル動物では発生させることの困難だった膵がんが8週間で発生した。更なる検討の結果、１週間程度で膵がんが発生することが確認された。このように、樹立に成功したトランスジェニックラットでは、Cre発現アデノウイルスベクターの感染により、感染部位において極めて短期間で発がんすることが確認された。当該トランスジェニックラットを用いれば極めて短期間でがんを発生させることが可能となり、抗がん剤等の治療開発を行う際に大幅な期間短縮・費用削減効果がもたらされる。当該トランスジェニックラットは、肺及び特に治療の困難な残されたがんと言われている膵臓においてがんの診断法や治療法を開発するために有用といえる。【００４９】
内因性のラットK-rasタンパク質とヒトK-rasタンパク質は約97%の相同性を持ち、抗体での区別は困難である。樹立に成功したHAKras301、HAKras327は導入遺伝子（即ちK-rasV21遺伝子）のN末端をHAタグで標識している。従って、HA抗体を用いれば導入遺伝子の発現量・発現部位を特定することが可能である。Creリコンビナーゼによって導入遺伝子の発現が活性化された細胞からがんが発生すると考えられることから、導入遺伝子の発現細胞をHA抗体で特定することによって、がん起始細胞・がん幹細胞の同定が可能といえる。また、アデノウイルスベクターに組み込んだCreやGFPの免疫染色によって、導入K-rasV21遺伝子の活性化された細胞、即ちがん起始細胞の同定も可能である。【００５０】
４．まとめ
ヒト変異型K-ras（K-rasV12）遺伝子をコンディショナルに発現するトランスジェニックラットの樹立に成功した。このトランスジェニックラットは、Cre発現アデノウイルスベクターの感染により、感染部位において極めて短期間で発がんする。このように極めて短期間に確実に腫瘍を発生させることが可能であることに加え、K-ras遺伝子の変異がヒトの膵・大腸・肺等で見出されている事実を考慮すれば、がんの診断法や治療法の確立のためのモデルとして当該トランスジェニックラットの有用性は非常に高い。当該トランスジェニックラットでは、今までに発生させることができなかった膵管がんや肺扁平上皮がんを1週間〜2月という極めて短期間に確実に発生させることも可能である。このように当該トランスジェニックラットは、ヒト難治がんの発生母地による特性の把握とそれを利用した治療開発に資する可能性を秘めたモデル動物である。
また、樹立に成功したトランスジェニックラットでは、従来の遺伝子改変動物と異なり、目的に応じてCre発現アデノウイルスベクターを種々の臓器に任意の時に投与することによってそれぞれの臓器にがんを発生させることが可能であり、特に難治がんのひとつである膵がんの治療開発に有用である。
以上の通り、樹立に成功したトランスジェニックラットは、新規の短期発がんモデル動物として極めて有用である。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のTG動物は、所定の操作によって極めて短期間で標的組織又は器官にがんが発生する。従って、抗癌性物質や発癌性物質のスクリーニングや評価に有用且つ使い易いモデルとなる。本発明のTG動物はまた、がんに対する再生医学的治療法の効果を調べるためのモデルとして、或いはがんの発症機構や進行機構の解明のための実験動物としても有用である。【００５２】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2009037950.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月9日(2009.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的組換え酵素の作用を受けたときにヒト変異型Ｋ−ｒａｓ（Ｋ−ｒａｓＶ１２）遺伝子を発現する発現カセットがゲノム中に組み込まれており、
部位特異的組換え酵素遺伝子を膵臓又はその一部に送達し発現させることによって、膵管で癌が発生する、トランスジェニックラット。
【請求項２】
発現カセットが、一対の部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれたスタッファー配列がプロモーターとヒト変異型Ｋ−ｒａｓ（Ｋ−ｒａｓＶ１２）遺伝子の間に挿入された構造を備える、請求項１に記載のトランスジェニックラット。
【請求項３】
部位特異的組換え酵素がＣｒｅリコンビナーゼであり、部位特異的組換え酵素認識配列がｌｏｘＰ配列である、請求項２に記載のトランスジェニックラット。
【請求項４】
プロモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項２又は３に記載のトランスジェニックラット。
【請求項５】
スタッファー配列が選択マーカー遺伝子を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のトランスジェニックラット。
【請求項６】
ヒト変異型Ｋ−ｒａｓ（Ｋ−ｒａｓＶ１２）遺伝子にタグ配列が連結されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載のトランスジェニックラット。
【請求項７】
タグがヘマグルチニンエピトープタグである、請求項６に記載のトランスジェニックラット。
【請求項８】
発現カセットが、５’末端側から３’末端側に向かって順にＣＡＧプロモーター、ｌｏｘＰ配列、ポリＡシグナル配列を伴うネオマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘＰ配列、及びポリＡシグナル配列を伴うヒト変異型Ｋ−ｒａｓ（Ｋ−ｒａｓＶ１２）遺伝子が配置された構造からなる、請求項１に記載のトランスジェニックラット。
【請求項９】
発現カセットが、５’末端側から３’末端側に向かって順にＣＡＧプロモーター、ｌｏｘＰ配列、ポリＡシグナル配列を伴うネオマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘＰ配列、及びポリＡシグナル配列を伴い且つヘマグルチニンエピトープタグが連結されたヒト変異型Ｋ−ｒａｓ（Ｋ−ｒａｓＶ１２）遺伝子が配置された構造からなる、請求項１に記載のトランスジェニックラット。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のトランスジェニックラットの膵臓又はその一部に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップを含む、膵管に癌を発症するラットの作製方法。
【請求項１５】
前記ステップにおける送達が、組換えアデノウイルスベクターの感染によって行われる、請求項１４に記載の作製方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のトランスジェニックラットを用いることを特徴とする、抗癌性物質又は発癌性物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを含む、抗癌性物質又は発癌性物質のスクリーニング方法、
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のトランスジェニックラットの膵臓又はその一部に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップ；
（ｂ）試験物質を投与するステップ、
（ｃ）癌の発生の有無、癌の発生までの所要時間、所定時間後の癌の大きさ、癌の悪化又は改善（退縮）の程度、及び血清腫瘍マーカー濃度からなる群より選択される一以上の指標について評価するステップ。
【請求項１８】
以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを含む、抗癌性物質又は発癌性物質のスクリーニング方法、
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のトランスジェニックラットの膵臓又はその一部に部位特異的組換え酵素遺伝子を送達して発現させるステップ；
（ｂ）試験物質を投与するステップ、
（ｃ）試験物質を投与しないこと以外は同一の条件で処理したトランスジェニックラット（対照群）との間で、癌の発生の有無、癌の発生までの所要時間、所定時間後の癌の大きさ、癌の悪化又は改善（退縮）の程度、及び血清腫瘍マーカー濃度からなる群より選択される一以上の指標について比較・評価するステップ。
【国際調査報告】
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2009037950.tif 000008
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