(57)【要約】  従来技術ではホエイに含まれる乳糖をキシリトールへ変換しようとすると、β-ガラクトシダーゼを用いて、乳糖をグルコースとガラクトースへ変換する工程が必須であり、このグルコースをアラビトールへ変換していた。このとき、未反応のグルコースや不要なガラクトースが不純物として反応液中に存在し、それらを分離する操作が必要であった。そこで、本発明では、乳糖からアラビトールへ直に変換することで、グルコースやガラクトースの発生を防止し、不純物を分離する操作が不要となる方法の開発を課題とする。  乳糖からアラビトールという変換を可能にする酵母を新たに見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳糖（ラクトース）をアラビトールに変換する能力を有する微生物で、乳糖を含有する溶液を処理することによる、乳糖をアラビトールに変換する方法。
【請求項２】
乳糖を含有する溶液が、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物、ホエイの濃縮液、ホエイの希釈液、ホエイの粉末の水溶液、ホエイUF透過液の濃縮液、ホエイUF透過液の希釈液、ホエイUF透過液の粉末の水溶液、脱乳糖ホエイUF透過液の濃縮液、脱乳糖ホエイUF透過液の希釈液、脱乳糖ホエイUF透過液の粉末の水溶液、ホエイ加水分解物の濃縮液、ホエイ加水分解物の希釈液、及びホエイ加水分解物の粉末の水溶液からなる群から選ばれる１種又は２種以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】
乳糖をアラビトールに変換する能力を有する微生物が乳糖資化性・好浸透圧性の酵母である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
乳糖資化性・好浸透圧性の酵母がKluyveromyces lactis NBRC 0433及び／又はKluyveromyces lactis NBRC 1903である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記溶液に酵母抽出物（酵母エキス）を5〜50g/Lで含む請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記溶液が更に塩化ナトリウム塩及び／又は塩化カリウム塩を0.3〜1.0mol/Lで含む請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記溶液に空気を通気して処理する、前記溶液を穏やかに振盪させて処理する、又は前記溶液中の前記微生物の菌体濃度を高めた後に穏やかに振盪させて処理する請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記溶液を乳糖の初期濃度が100g/L以上となるように調製することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記溶液を30℃から37℃で処理することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、乳糖を含む溶液からキシリトールを生産する方法。
（１）乳糖をアラビトールに変換する能力を有する微生物で、乳糖を含有する溶液を処理することによる、アラビトールに変換する工程、
（２）アラビトールをキシルロースに変換する能力を有する微生物で、アラビトールを含む溶液を処理することによる、アラビトールをキシルロースに変換する工程、
（３）キシルロースをキシリトールに変換する能力を有する微生物で、キシルロースを含む溶液を処理することによる、キシルロースをキシリトールに変換する工程
【請求項１１】
乳糖を含有する溶液が、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物、ホエイの濃縮液、ホエイの希釈液、ホエイの粉末の水溶液、ホエイUF透過液の濃縮液、ホエイUF透過液の希釈液、ホエイUF透過液の粉末の水溶液、脱乳糖ホエイUF透過液の濃縮液、脱乳糖ホエイUF透過液の希釈液、脱乳糖ホエイUF透過液の粉末の水溶液、ホエイ加水分解物の濃縮液、ホエイ加水分解物の希釈液、及びホエイ加水分解物の粉末の水溶液からなる群から選ばれる１種又は２種以上である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
乳糖をアラビトールに変換する能力を有する微生物がKluyveromyces lactis NBRC 0433及び／又はKluyveromyces lactis NBRC 1903である請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
アラビトールをキシルロースに変換する能力を有する微生物がGluconobacter属に属する微生物である請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
キシルロースをキシリトールに変換する能力を有する微生物がKluyveromyces lactis NBRC 1903及び／又はCandida shehatae IAM 12953である請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ホエイの有効利用の技術分野に属する。また、本願発明は、糖アルコールの製造の技術分野にも属する。より具体的には、ホエイを用いて糖アルコールを製造する方法の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
近年のチーズの生産量の拡大に伴い、チーズホエイが余剰となってきている。ホエイは、乳糖、可溶性タンパク質、脂質、塩類などから構成されており、限外濾過（UF）膜分離によって獲得されるホエイタンパク質濃縮物（WPC）や、ホエイUF透過液から分離される乳糖は、商業規模で製品として活用されている。しかし、脱乳糖ホエイUF透過液では、固形分の70%程度を乳糖が占めるが、その乳糖を依然として未利用の状態としており、その有効な利用法を創出することが課題となっている。【０００３】
ホエイUF透過液に発酵原料のデキストロースを加えてから、ワイン酵母を作用させ、遠心分離、濾過、脱塩によって、ワイン（アルコールの濃度：9.5％）を製造する方法が考案されている（Palmer, 1979、非特許文献１）。また、乳糖を100g/Lで含むホエイ調製液に、Lactobacillus sp. RKY2を作用させ、乳酸を91g/Lで生成させる方法が考案されている（Kim et al., 2005、非特許文献２）。さらに、天然高分子原料としてのチーズホエイの用途開発を提案する研究も見られる（Fialho et al., 1999、非特許文献３）。【０００４】
ホエイUF透過液や脱乳糖ホエイUF透過液に含まれる乳糖は、新たな資源として注目され始めているが、商業規模や工業化の視点では、まだ十分に検討されていない。【０００５】
他方、糖アルコールでは、例えば、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、ソルビトールは甘味料として利用されており、アラビトールは医薬品製造用原料、食品添加剤として注目されており、ラクチトールは食品増量剤、食品添加剤、タンパク質の熱安定性保護添加剤として利用されている。【０００６】
現在まで、ホエイを用いて多糖アルコールを工業的（商業的）に製造する方法は十分に研究されておらず、乳糖からキシリトールを製造する公知の経路は開拓されていない。但し、乳糖に対して、b-ガラクトシダーゼを作用させ、グルコース、ガラクトースを獲得する技術は既に確立されており、また、グルコースを出発原料としてキシリトールを製造する公知の経路（Ohnishi et al., 1969、非特許文献４；Mayer et al., 2002、非特許文献５；Suzuki et al., 2002、非特許文献６；Sonoko et al., 2000、非特許文献７）、組換えDNA技術（Harkki et al., 1997、非特許文献８；Povelainea et al.,2006、非特許文献９）もある。即ち、Ohnishiらは、Debaryomyces hanseniiによりグルコースをアラビトールに変換、次いでAcetobacter suboxydansによりアラビトールをキシルロースに変換、更にCandida guilliermondiiによりキシルロースをキシリトールに変換している。Mayerらは、同様な手法を用いて、グルコースをキシルロースとした後に、キシリトールデヒドロゲナーゼを作用させ、キシリトールを獲得している。Povelaineaらは、Bacillus subtilisを組換え、収率20％でグルコースをキシリトールに変換している。これら文献以外にも、当該経路上の中間物質であるアラビトールの生産に関して、公知の生物変換、触媒変換技術がある。例えば、酵母Saccharomyces rouxiiを標識グルコースに作用させた実験より、アラビトールは、リブロース-5-リン酸を代謝中間物質とし、これを脱リン酸化して生じるリブロースから誘導されることが公知となっている（Ingram et al., 1965、非特許文献１０）。また、酵母Candida famata R28がグルコース（10%）からアラビトール（5%）を生成することが報告されている（Ahmed et al., 1999、非特許文献１１）。ルテニウム触媒をアラビノン酸、ラクトンに作用させ、アラビトールを獲得した例もある（Fabre et al., 2002、非特許文献１２）。食品用のキシリトールの生産を意識し、組換え菌の使用を前提とした研究例を除外すると、これらの組合せより、乳糖からキシリトールを獲得する経路は、図１のように要約できる。いずれも、ガラクトース又はグルコースを経由することを必須とするものである。
【非特許文献１】Palmer, G. M. ： “Wine Production from Cheese Whey”, EPA-600/2-79-189 (1979)
【非特許文献２】Jin-Nam Kim, Hyang-Ok Kim, Young-Jung Wee, Doman Kim, Hwa-Won Ryu and Jong-Sun Yun ： “Lactic Acid Production from Cheese Whey and Corn Steep Liquor by Lactobacillus sp. RKY2,” 27th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, P4-21 (2005)
【非特許文献３】Fialho, A.M., Ligia O. Martins, M-L. Donval, J.H. Leitao, M.J. Ridout, A.J. Jay, V.J. Morris and I.Sa-Correia ： “Structures and Properties of Gellan Polymers Produced by Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 from Lactose Compared with Those Produced from Glucose and from Cheese Whey”, Appl. Environmnt’l Microbiol., 65, 2485-2491 (1999)
【非特許文献４】Ohnishi,H. and T.Suzuki ： “Microbial Production of Xylitol from Glucose,” Appl. Microbiol., 18, 1031-1035 (1969)
【非特許文献５】Mayer,G., K.D.Kulbe and B.Nidetzky ： “Utilization of Xylitol Dehydrogenase in a Combined Microbial/Enzymatic Process for Production of Xylitol from D-Glucose,” Appl. Biochem. Biotechnol., 98-100, 577-589 (2002)
【非特許文献６】Suzuki,S., M.Sugiyama, Y.Mihara, K.Hashiguchi and K.Yokozeki ： “Novel Enzymatic Method for the Production of Xylitol from D-Arabitol by Gluconobacter oxydans,” Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2614-2620 (2002)
【非特許文献７】Sonoko,T. Y.Jojima, N.Tonouchi, R.Fudou and K.Yokozeki ： “Microorganism    Capable of Producing Xylitol or D-Xylulose,” EP Patent, 0974646 (2000)
【非特許文献８】Harkki,S.Z. and J.London ： “Manufacture of Xylitol using Recombinant hosts, US Patent, 5631150 (1997)
【非特許文献９】Povelainen,M. and A.N.Miasnikov ： “Production of Xylitol by Metabolically  Engineered Strain of Bacillus subtilis,” J.Biotechnol., 128, 24-31 (2006)
【非特許文献１０】Ingram,J.M. and W.A.Wood ： “Enzymatic Basis for D-Arabitol Prouction by Saccharomyces rouxii,” J. Bacteriol., 89, 1186-1194 (1965)
【非特許文献１１】Ahmed, Z., H.Sasahara, S.H.Bhuiyan, T.Saiki, T.Shimonishi, G.Takada, K.Izumori ： “Production of D-Lyxose from D-Glucose by Microbial and Enzymatic Reactions, “ J. Biosci. Bioeng., 88, 676-678 (1999)
【非特許文献１２】Fabre,L., P.Gallezot and A.Perrard ： ”Catalytic Hydrogenation of Arabinonic Acid and Lactones to Arabitol,” J. Catal., 208, 247-254 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術では、ホエイに含まれる乳糖をキシリトールへ変換しようとすると、「乳糖→グルコース（＋ガラクトース）→アラビトール→キシルロース→キシリトール」という変換経路しか存在しなかった。つまり、β-ガラクトシダーゼを用いて、乳糖をグルコースとガラクトースへ変換する工程が必須であり、このグルコースをアラビトールへ変換していた。このとき、未反応のグルコースや不要なガラクトースが不純物として反応液中に存在し、それらを分離する操作が必要であった。【０００８】
また、アラビトールは医薬品製造用原料、食品添加剤として注目されていながら、効率的な製造方法が確立していなかった。【０００９】
そこで、本発明は、乳糖をアラビトールへ直に変換することで、反応液中へのグルコースやガラクトースの発生を防止し、不純物を分離する操作が不要となる方法の開発を課題とする。【００１０】
また、本発明は、乳糖の消費活性を有する好浸透圧性の酵母であるKluyveromyces属に注目し、高濃度の乳糖をエタノールと糖アルコール（糖のカルボニル基が還元された多価アルコール）に変換する方法の開発も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは「乳糖→アラビトール→キシルロース→キシリトール」という変換経路のうち、特に「乳糖→アラビトール」という変換を可能にする酵母を見出して、本願発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１２】
本発明では、乳糖をアラビトールへ直に変換でき、グルコースやガラクトースが菌体外（反応液中）に存在しないため、不純物を分離する操作が不要となる。【００１３】
これにより、安価で大量に得られる乳糖から医薬品製造用原料、食品添加剤となるアラビトールを大量に提供でき、更に、アラビトールを経てキシリトールへ変換することで、ホエイの有効利用が可能となる。【００１４】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-001592号、2008-157574号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】乳糖からキシリトールへの変換経路の可能性を示す。
【図２】微生物による乳糖の代謝経路の可能性を示す。
【図３】基本培地でNBRC1903株を好気的に培養し、糖代謝に及ぼす培地成分の影響を検討した結果である。
【図４】基本培地に硫酸アンモニウム：41.5 g/L、リン酸二水素カリウム：3 g/L、リン酸水素二カリウム：1 g/L、硫酸マグネシウム七水和物：1 g/Lを添加した溶液：50mLでNBRC1903株を培養し、培養開始から12h後と24h後に、乳糖一水和物：250 g/Lを、それぞれ10mLずつ添加した結果を示す。
【図５】基本培地で酵母抽出物の濃度を変化させた溶液：2mLでNBRC1903株を培養した結果を示す。200rpmで（往復）振盪培養を行い、中位の好気的条件を設定した。
【図６】基本培地で酵母抽出物の濃度を変化させた溶液：50mLでNBRC1903株を培養した結果を示す。空気流量で100 mL/minの気泡塔反応器で培養を行い、高位の好気的条件を設定した。
【図７】Aは、ホエイUF透過液粉、酵母抽出物の混合液中における酵母のK.lactis NBRC1903の菌体濃度（◆）、乳糖濃度（■）及びエタノール濃度（△）の経時変化を示し、Bは、代謝物のアラビトール濃度（●）の経時変化を示す。
【図８】基本培地に複合塩（塩化ナトリウム：塩化カリウムを重量比で3：7に調製した）を添加して、複合塩濃度がアラビトール生産に及ぼす影響を検討した結果を示す。
【図９】AとBは、それぞれ、基本培地に塩化ナトリウムや塩化カリウムを添加して、各塩濃度がアラビトール生産に及ぼす影響を検討した結果を示す。
【図１０】G. oxydans NBRC 3172株を好気的に培養（反応）して、アラビトールからキシルロースへの変換の経時変化の影響を検討した結果を示す。
【図１１】C.shehatae IAM12953を培養（反応）して、キシルロースからキシリトールへの変換の経時変化の影響を検討した結果を示す。
【図１２】詳細な微生物の代謝マップを示す。Embden-Myerhof Parnas pathway（EMPP）よりも、Pentose phosphate pathway（PPP）への進行を優先させることで、エタノールではなくアラビトールを優先的に生産させることができる。Kluyveromyces lactis による乳糖からのD-アラビトール生成と関連代謝経路  アンダーライン, 測定項目；H,NAD(P)H2の生成または消費
【図１３】初期の乳糖濃度がD-アラビトール生産に及ぼす影響を、乳糖濃度を20ｇ/L、50g/L、100g/L及び200g/Lに変化させて検討した結果を示す。■が残存乳糖、◆が菌体、●がD-アラビトール、▼がグリセロール、△がエタノールの濃度を示す。
【図１４】初期の塩濃度(浸透圧)がD-アラビトール生産に及ぼす影響を検討した結果を示す。
【図１５】初期のグルタミン濃度及び培養温度がD-アラビトール生産に及ぼす影響を検討した結果を示す。Aはアラビトールの濃度、Bは乳糖あたりのアラビトールの生産量を示す。◆は30℃、■は35℃、▲は37℃での培養を示す。
【図１６】菌体濃縮操作と酸素供給操作がD-アラビトール生産に及ぼす影響を検討した結果を示す。Aは乳糖濃度、Bはアラビトール濃度、Cはエタノール濃度の変化を示す。対照（コントロール）として回分培養を示し、培養液量は2mLである。■の「2X2mL」では、菌体濃度が対照に比べて2倍であり、培養液量は2mLである。◆の「2X1mL」では、菌体濃度が対照に比べて2倍であり、培養液量は1mLである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
１．乳糖から糖アルコールへの変換
本発明者らは、ホエイに多量に含まれる乳糖の有効利用として、種々の用途のある糖アルコールへの変換を検討した。糖アルコールには、例えば、糖尿病の予防や治療に用いられる、ソルビトール、マルチトール、歯牙のう蝕防止に用いられる、エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、ダイエットに用いられる、エリスリトールなどが含まれる。図２には、乳糖からエタノールや糖アルコールへの代謝経路の可能性を示す。乳糖から生成する6炭糖は、グルコース、及びガラクトースであるが、ガラクトースがグルコースに異性化されると、グルコースはEmbden-Myerhof-Parnas（EMP）pathwayを経由し、条件が整えば、エタノール、グリセロール、エリスリトールに変換され得る。また、グルコースはPentose phosphate pathway（PPP）を経由し、5炭糖に変換され、条件が整えば、アラビトール、キシリトールなどの5炭糖の糖アルコールに変換され得る。グルコースから糖アルコールへの変換では、乳糖から糖アルコールへの変換では、グリセロールの事例が報告されているが、他の糖アルコールの事例は余り見受けられない。そこで、本発明者らは、乳糖を糖アルコールに変換できる微生物を探索することとした。【００１７】
２．好浸透圧性の微生物から乳糖を糖アルコールに変換する能力を有する微生物の探索
好浸透圧性の微生物は一般に糖アルコールを生成する傾向があると言われており、Kluyveromyces属の活用は、乳糖から有価物質を導出する可能性があると考える。そこで、本発明者らは、Kluyveromyces属の菌体を高濃度の乳糖に作用させ、エタノールや糖アルコールへの変換の可能性を評価し、有価物質の導出のために、培養の操作変数を検討した。その結果、糖アルコールの特にアラビトールへの変換に優れた菌株として、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及びKluyveromyces lactis NBRC 1903を見出した。【００１８】
３．ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などの乳糖含有物又は乳糖からアラビトールへの変換
ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物の成分を含む水溶液又は乳糖を含む高浸透圧培地（例えば、乳糖が4重量％以上、好適には、乳糖の濃度が100g/L以上で190g/L以下の浸透圧を示す流体）を、例えば、20〜39℃、好適には、30〜37℃、より好適には、35〜37℃で、24h以上、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及び／又はKluyveromyces lactis NBRC 1903で処理すること、具体的には、好気的に培養することで、乳糖をアラビトールに変換することができる。【００１９】
具体的には、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及び／又はKluyveromyces lactis NBRC 1903の培養条件として、乳糖の初期濃度（含量）が100g/L以上の水溶液となるように調製した、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などの乳糖含有物又は乳糖を含む高浸透圧水溶液に、窒素源を加えた培地を調製し、20〜39℃、好適には、30〜37℃、より好適には、35〜37℃で、好気的条件を設定し、24h以上で当該菌を培養することが望ましい。ここで、乳糖含有物としては、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などのいずれか１種又は２種以上の混合物、これらの濃縮液、希釈液、粉末の水溶液のいずれか１種又は２種以上の混合物、あるいは、これら原液、濃縮液、希釈液、粉末のいずれか２種以上の混合物であってもよい。なお、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物では、通常、固形分濃度は、それぞれ6〜6.5、5〜5.5、5〜5.5、6〜6.5重量％であり、いずれも、乳糖濃度は、4〜5重量％である。窒素源としては、アンモニア又は硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、その他無機・有機含窒素化合物、又は酵母抽出物（酵母エキス）、ホエイ、ホエイ加水分解物、カゼイン加水分解物などを用いることができる。塩類としては、塩化ナトリウム塩及び／又は塩化カリウム塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを用いることができる。【００２０】
この時、アラビトールの生産を促すためには浸透圧を高めることが肝要であり、乳糖の初期濃度は、水溶液中の乳糖（あるいは乳糖一水和物）の溶解度の限界に相当する190g/L〜200g/L程度にすることが望ましい。また、浸透圧を高めるには、塩化ナトリウム塩及び／又は塩化カリウム塩を0〜30g/L、或いは0.3〜1.0  Mol/Lで含むように調製することが望ましい。好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウムが重量比で3：7に含む複合塩を、その濃度が15g/L以上、好適には、0.3〜1.0mol/L、より好適には、0.5〜1.0mol/Lとなるように調製する。【００２１】
更に、温度は、重要条件で、増殖上限温度に近い温度に保つことが望ましく、例えば、35〜37℃、より好適には、37℃とすることが出来る。【００２２】
また、D-アラビトールの生産を高めるためには、好気条件が低下しないようにすることが望ましい。例えば、培養溶液に空気を通気して処理する、培養溶液を穏やかに振盪させて処理する、又は前記溶液中の前記微生物の菌体濃度を高めた後に穏やかに振盪させて処理することができる。具体的には、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物の成分を含む水溶液又は乳糖を含む高浸透圧培地（例えば、乳糖が4重量％以上、好適には、乳糖の濃度が100g/L以上で190g/L以下の浸透圧を示す流体）で、例えば、好適には、35〜37℃で、一定時間、例えば、24h、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及び／又はKluyveromyces lactis NBRC 1903を好気的に培養してから、遠心分離処理や膜分離処理などを適用して菌体濃度を上げた後に穏やかに振盪させて処理することができる。【００２３】
酵母抽出液の濃度は、振盪フラスコレベルの好気的条件（中位の好気的条件、微好気的条件ともいう）では40g/L程度、気泡塔反応器レベルの好気的条件（高位の好気的条件）では5〜10g/L程度にすることが望ましい。酵母抽出液に代えて、グルタミン酸を添加して用いることもでき、グルタミン酸は、例えば、2〜10g/L、好適には、およそ5g/Lを添加することができる。  本発明によれば、副産物としてのグルコースやガラクトースを菌体外（反応液中）へ産生させずに、乳糖からアラビトールを産生することができる。【００２４】
４．ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などの乳糖含有物又は乳糖からキシリトールの生産
前記の「３．ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などの乳糖含有物又は乳糖からアラビトールへの変換」により生産された、アラビトールを、更にキシルロースに変換し、引き続き、キシリロースをキシリトールに変換することができる。【００２５】
４−１．アラビトールからキシルロースへの変換
アラビトールをキシルロースに変換する能力を有する微生物を用いて、アラビトールを処理することで、キシルロースに変換することができる。【００２６】
アラビトールをキシルロースへ変換できる菌株では、種々の微生物が既に知られており、Acetobacter属に属する微生物、Gluconobacter属に属する微生物、Klebsiella属に属する微生物などが挙げられる。【００２７】
該処理には、アラビトールを含む培地で、前記の微生物を培養する方法（手段）を採用することもできるが、前記の微生物を担体に固定した固定化菌体を用いることもできる。例えば、アラビトールを含む培地で、Gluconobacter oxydans NBRC 3172を培養することで、アラビトールをキシルロースに変換することができる。具体的に、前培養では、バッフル付きの三角フラスコ（500mL）に、Gluconobacterの前培養用の培地（マンニトール：50g/L、ペプトン：10g/L、酵母抽出物：10g/L）の50mLを入れてから、Gluconobacter oxydans NBRC 3172を植菌し、30℃、200rpm、48hで振盪式の培養を行った後に、遠心分離で上清を除去して集菌し、蒸留水で洗浄して調製することで、本培養に供する方法（手段）を採用することができる。本培養では、アラビトールを30g/Lで含む水溶液に、当該菌をOD600（600nmの吸光度）が20になるように植菌し、30℃で培養を行って反応を進める。これにより、アラビトールをキシルロースへ変換することができる。この変換効率は100％近くになる。なお、Ohmomoらは、Gluconobacter suboxydans Kawai株をκ-カラギーナンに固定化した生体触媒を用い、アラビトールからキシルロースへの変換を実施している（Ohmomo,S., Y.Tozawa and K.Ueda ： “Biotransformation of D-Arabitol to D-Xylulose by Gluconobacter suboxydans Immobilized within k-Carrageenan,” J. Ferment. Technol., 61, 373-378 (1983)）。【００２８】
４−２．キシルロースからキシリトールへの変換
キシルロースをキシリトールに変換する能力を有する微生物を用いて、キシルロースを処理することで、キシリトールに変換することができる。【００２９】
キシルロースをキシリトールへ変換できる菌株では、公知の微生物として、Kluyveromyces属に属する微生物、Candida属に属する微生物、Zygosaccharomyces属に属する微生物、Debaryomyces属に属する微生物、Pichia属に属する微生物などが挙げられる。具体的には、Kluyveromyces lactis NBRC 1903、Candida shehatae IAM 12953、Kluyveromyces marxianus ATCC 26548、Zygosaccharomyces rouxii IAM 12879、Candida melibiosica NBRC 10238、Debaryomyces hansenii IAM 12837、Candida mogii NBRC 0436、Pichia farinose IAM 12223、Pichia stipitis IAM 12952などが含まれる。【００３０】
該処理には、キシルロースを含む培地で、前記の微生物を培養する方法（手段）を採用することもできるが、前記の微生物を担体に固定した固定化菌体を用いることもできる。例えば、キシルロースを含む培地で、Kluyveromyces lactis NBRC 1903及び／又はCandida shehatae IAM 12953を培養することで、キシルロースをキシリトールに変換することができる。具体的に、まず、アラビトールを30g/Lで含む水溶液に、G. oxydans NBRC 3172を植菌して作用させ、キシルロースを調製した。次に、前培養では、試験管（20mL）に、キシリトールの生産用の培地（キシルロース：30g/L、酵母抽出物：3g/L、硫酸アンモニウム：5g/L、リン酸水素二カリウム：2g/L、硫酸マグネシウム七水和物：1g/L）の2mLを入れてから、Kluyveromyces lactis NBRC 1903及び／又はCandida shehatae IAM 12953を植菌し、30℃、200rpm、24hで振盪式の培養を行った後に、その前培養後の培養液の0.9mLを分取し、遠心分離で上清を除去して集菌し、前記したキシリトールの生産用の培地の0.9mLを新たに添加し、30℃で培養を行って反応を進める。これにより、キシルロースからキシリトールへの生物変換を実施した。実際の実験では、培養条件として静置培養又は中位の好気的培養を採用した。静置培養では、3hおきに一時撹拌し、9h後に試料を採取した。好気的培養では、200rpmで振盪式の培養を行った。なお、Suihkoらは、酵母のSaccharomyces cerevisiae VTT-C-76029、Candida tropicalie ATCC 1369又はPachysolen tannophilusを、アルギン酸ゲルに固定化した生体触媒を用い、キシルロースからキシリトールへの変換を実施している（Suihko,M-L., and K.Poutanen ： “D-Xylulose Fermentation by Free and Immobilized SACCHAROMYCES CEREVISIAE Cells,” Biotechnol. Lett., 6, 189-194 (1984)）。
【実施例１】
【００３１】
乳糖からアラビトールを産生できる菌体の探索
本実施例では、酵母であるKluyveromyces lactis var. lactis NBRC 0433及びNBRC 1903、Kluyveromyces marxianus NBRC 1735及びNBRC 10005（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（NBRC）より購入した）、並びにKluyveromyces marxianus ATCC 26548及びATCC 52486（American Type Culture Collection（ATCC）より購入した）を用いた。各種の菌株は、寒天プレート（グルコース：2%、酵母抽出物：1%、ペプトン：2%、寒天：2%）に、277K（ケルビン。以下、同じ）で保存した。【００３２】
実験に供試する菌体の調製に、前培養では、試験管（20mL）に、培地（乳糖一水和物：10g/L、酵母抽出物：3g/L、硫酸アンモニウム：5g/L、リン酸水素二カリウム：2g/L、硫酸マグネシウム七水和物：1g/L）の5mLを入れてから、各種の菌株を植菌し、200rpm、303K、12hで振盪式の培養を行った。そして、本培養では、試験管（20mL）に、高濃度の乳糖を含む基本培地（乳糖一水和物：200g/L、酵母抽出物：10g/L）の5 mLを入れてから、各種の菌株を植菌し、200rpm、303K、72hで振盪式の培養を行った。【００３３】
菌体の濃度の測定では、カルチャー（菌体培養物）より試料を採取し、分光光度計（島津製作所、UV-120-02）を用いて、波長600nmの濁度（OD600）より求めた。NBRC1903株のカルチャーでは、OD600が乾燥菌体の濃度で0.225g/Lに相当した。【００３４】
菌株の特性の評価では、試験管（20mL）に、基本培地（乳糖一水和物：200g/L、酵母抽出物：10g/L）の2mLを入れてから、K. lactis NBRC 0433株、K. lactis NBRC1903株、K. marxianus NBRC1735株、K. marxianus NBRC 10005株、K. marxianus ATCC 26548株、K. marxianus ATCC 52486株を、それぞれ菌体の初期濃度でOD600が0.05になるように植菌し、200rpm、303K、72hで振盪培養を行った。【００３５】
糖や糖アルコールの分析では、試料を遠心分離して菌体を沈降させた後に、その上清を精密濾過（細孔径：0.2μm）した溶液を用いた。その溶液へ高速液体クロマトグラフィー（島津製作所、LC-10AD）と示差屈折計検出器（RID-6A）を適用して、糖や糖アルコールの濃度を測定した。高速液体クロマトグラフィーには、順相モードと配位子交換モードで分離するSZ5532カラム（6.0×150mm）（昭和電工）を用いて、カラムの温度を333Kとした。移動相には、アセトニトリル／水（75／25）を用いて、流量を1.0mL/minとした。糖や糖アルコールの同定や濃度の測定では、標準液を用いて流出ピークを事前に作成し、そのピークを比較対照に用いた。その結果を表１に示す。
【表１】
2009088037.tif 000002
【００３６】
K. lactis NBRC0433株、K. lactis NBRC1903株、K. marxianus NBRC1735株の菌体（3種）で、乳糖の消費活性が特に高く、代謝生成物として、エタノールとグリセロールが検出された。乳糖の反応率は、K. lactis NBRC0433株で91.3％、K. lactis NBRC1903株で89.1％、K. marxianus NBRC1735株で73.9％であった。これら3種の菌株で、エタノールの生成量は類似していたが、K. lactis NBRC0433株で最も高濃度であり、その濃度は59.3g/Lに達していた。【００３７】
そして、K. lactis NBRC 0433株、K. lactis NBRC 1903株の菌体（2種）では、代謝生成物として、アラビトールも検出された。アラビトールの生成は、既往の研究では報告されておらず、全く新しい知見である。【００３８】
一方、K. marxianus NBRC 10005株、K. marxianus ATCC 26548株、K. marxianus ATCC 52486株の菌体（3種）で、乳糖の消費活性が低く、反応溶液中に代謝生成物は検出されなかった。これら3種の菌株は、乳糖に対してkluyver negative（炭素源を消費できるが、発酵できない性質）である可能性がある。
【実施例２】
【００３９】
糖代謝に及ぼす培地成分の影響
糖代謝に及ぼす培地成分の影響を検討する本実施例では、K. lactis NBRC1903株を用いた。【００４０】
バッフル付きの三角フラスコ（500mL）に、実施例１で用いた基本培地（乳糖一水和物：200g/L、酵母抽出物：10g/L）の50mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、菌体の初期濃度でOD600が0.0104になるように植菌し、200rpm、303K、所定時間で振盪培養を行った。フラスコの蓋には通気性の良いシリコ栓を用いた。その結果を図３に示す。【００４１】
実施例２（図３）では、エタノールは31.5g/L、グリセロールは3.11g/L、アラビトールは3.67g/Lに達していた。実施例１（表１）と比較すると、実施例２（図３）では、好気的条件が向上していることで、エタノールの生成量が低下し、グリセロールの生成量が向上している。アラビトールの生成量は、実施例１と実施例２で同等であった。
【実施例３】
【００４２】
乳糖の添加の影響
バッフル付きの三角フラスコ（500mL）に、実施例１で用いた基本培地（乳糖一水和物：200g/L、酵母抽出物：10g/L）で複合塩（硫酸アンモニウム：41.5g/L、リン酸二水素カリウム：3g/L、リン酸水素二カリウム：1g/L、硫酸マグネシウム七水和物：1g/L）を添加して調製した溶液の50mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、実施例２と同じ条件にして培養を行った。培養の開始から12h後と24h後に、乳糖一水和物：250 g/Lを、それぞれ10mLずつで添加した。その結果を図４に示す。【００４３】
実施例２（図３）と比較すると、実施例３（図４）では、エタノールは24.5g/Lと低い反面、グリセロールは7.21g/L、アラビトールは8.43g/Lと大幅に向上していた。乳糖の添加は、EMP pathway（Embden-Myerhof Parnas pathway）を辿る代謝反応を抑制し、PPP（Pentose phosphate pathway）への代謝反応を促進したと考えられる。
【実施例４】
【００４４】
酵母抽出物の濃度の影響（中位の好気的条件における培養）
試験管（20mL）に、実施例１で用いた基本培地（乳糖一水和物：200g/L、酵母抽出物：10g/L）で酵母抽出物の濃度を変化させて調製した溶液の2mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、菌体の初期濃度でOD600が0.010になるように植菌し、200rpm、303K、72hで（往復式の）振盪培養を行った。このとき、中位の好気的条件で培養したこととなる。その結果を図５に示す。【００４５】
酵母抽出物が40g/Lの場合に、アラビトールは最大値で12.7g/Lに達していた。
【実施例５】
【００４６】
酵母抽出物の濃度の影響（高位の好気的条件における培養）
気泡塔反応器（30mmfx200mm）に、実施例１で用いた基本培地（乳糖一水和物：200g/L、酵母抽出物：10g/L）で酵母抽出物の濃度を変化させて調製した溶液の20mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、菌体の初期濃度でOD600が0.02になるように植菌し、反応器の底部より空気を100 mL/minで連続的に供給しながら、303K、72hで培養を行った。このとき、高位の好気的条件で培養したこととなる。その結果を図６に示す。【００４７】
酵母抽出物が5〜10g/Lの場合に、アラビトールは最大値で9g/Lに達していた。
【実施例６】
【００４８】
ホエイからアラビトールの生産
ホエイからアラビトールの生産を検討した。ホエイUF透過液の粉末を含む培地を調製し、K. lactis NBRC1903株を植菌し、振盪培養を行った。その結果を図７に示す。【００４９】
ホエイUF透過液の粉末のみを含む培地では、ホエイUF透過液の粉末の初期濃度を250 g/Lに調製した。この培地では、K. lactis NBRC 1903株の増殖を確認できた。アラビトールは最大値で4.15 g/Lに達していた。
【実施例７】
【００５０】
複合塩濃度の影響
バッフル付きの三角フラスコ（500mL）に、実施例１で用いた基本培地で複合塩（塩化ナトリウムと塩化カリウムを重量比で3：7に調整した）の濃度を変化させて調製した培地の50mLを加えてから、K. lactis NBRC1903株を植菌し、50rpm、303K、90hで振盪培養を行い、複合塩の濃度がアラビトール生産に及ぼす影響を検討した。その結果を図８に示す。【００５１】
複合塩の濃度が向上すると、アラビトールの生産量は向上し、複合塩の濃度が30g/Lの場合に、アラビトールは最大値で2.1g/Lに達していた。
【実施例８】
【００５２】
塩濃度の影響
バッフル付きの三角フラスコ（500mL）に、実施例１で用いた基本培地で複合塩（塩化ナトリウムと塩化カリウムを重量比で変化させて調整した）の濃度を変化させて調製した培地の50mLを加えてから、K. lactis NBRC1903株を植菌し、50rpm、303K、90hで振盪培養を行い、各塩の濃度がアラビトール生産に及ぼす影響を検討した。その結果を図９に示す。【００５３】
塩化ナトリウムは10g/Lの場合に、アラビトール生産量は最大値で2.1g/Lに達していた。一方、塩化カリウムは30g/Lの場合に、アラビトール生産量は最大値で2.2g/Lに達していた。
【実施例９】
【００５４】
初期の乳糖濃度がD-アラビトール生産に及ぼす影響
初期の乳糖（一水和物）濃度を20〜200g/Lとし、酵母抽出物を濃度が40g/Lとなるように添加した培地の2mLに、 K. lactis NBRC1903を植菌し、200rpmの振盪条件下、303Kで回分培養した。その結果を図１３に示す。【００５５】
■が残存乳糖、◆が菌体、●がD-アラビトール、▼がグリセロール、△がエタノールの濃度を示す。D-アラビトール生成に関し、初期の乳糖濃度は極めて重要であり、初期の乳糖濃度が100g/L以上の場合にだけ、D-アラビトール生産が確認できた。初期の乳糖濃度が100、200g/Lの時の168h後におけるD-アラビトール生産量は、それぞれ0.62 g/L、18.0g/Lであった。補足実験として初期の乳糖濃度200g/Lで、K. lactis NBRC1903を培養し、乳糖濃度が125g/Lとなった24h後に、乳糖を添加して150g/Lとし、浸透圧を上げて培養を行った。D-アラビトール生産量は13.1g/Lに低下した。次に、初期の乳糖濃度200g/LでK. lactis NBRC1903を培養し、乳糖濃度が初期濃度の1/10程度に低下した72h後に、乳糖を添加して100g/Lとし、浸透圧を上げて培養を継続させた。D-アラビトール生産量は17.1g/Lとなった。さらに、初期の乳糖濃度が100g/Lで、K. lactis NBRC1903を培養し、乳糖濃度が初期濃度の1/10程度に低下した24h後に、乳糖を添加して100g/Lとし、浸透圧を上げて培養を継続させた。D-アラビトール生産量は8.01g/L（上記の0.62g/Lの10倍以上）にまで向上した。初期のD-アラビトール生産は、高乳糖濃度が齎す高浸透圧に対する、K. lactis NBRC1903の細胞応答のように見受けられる。高浸透圧に対する、酵母Saccharomyces cereviaeの細胞応答では、グリセロールの蓄積が報告されている。但し、図１３では、K. lactis NBRC1903の細胞外のグリセロール濃度は余り向上していないことが分かる。
【実施例１０】
【００５６】
初期の塩濃度がD-アラビトール生産に及ぼす影響
バッフル付きのフラスコ（500mL）に、液量で50mLの培地を準備した。培地には、乳糖（一水和物）を200g/L、酵母抽出物を10g/Lの他に塩を加えた。この塩は質量比で3:7のNaClとKClを含んだ複合塩であり、その濃度が0〜50g/Lとなるように、NaClとKClを加えて調製した。また、NaCl又はKClの単一塩を濃度が0〜30g/Lの範囲で添加する実験も行った。その結果を図１４に示す。図１４（Ｄ)では、それぞれに条件設定したイオン濃度の合計値 ci=[Na+]+[K+]+[Cl-]   (1)  に対し、D-アラビトール生産量をプロットした。複合塩、単一塩、いずれの実験結果も一本の曲線状にプロットされているように見受けられる。このことより、イオン濃度に比例する浸透圧に応じて細胞は応答し、D-アラビトールを生成していることが推論される。
【実施例１１】
【００５７】
初期のグルタミン濃度及び培養温度がD-アラビトール生産に及ぼす影響
試験管（20mL）を用いて、液量で2mLの培地（乳糖（一水和物）、200g/L；(NH4)2SO4、3.4g/L；KH2PO0、2g/L；MgSO0・7H0O、1g/L；Glutamine、2〜10g/L；Yeast Nitrogen Base without Amino Acid）に植菌し、温度を303、308、310Kとして、200 rpmで振盪培養を行い、グルタミン濃度と培養温度の影響を調べた。その結果を図１５に示す。酵母抽出物を使用した実験に比べると、全体的にD-アラビトール生産量は低いが、培養温度を高めると、D-アラビトール生産量は高まり、310K（37℃）では、グルタミン濃度の5g/Lで、D-アラビトール生産量は17.1g/Lを達していることが分かる。
【実施例１２】
【００５８】
菌体濃縮操作と酸素供給操作がD-アラビトール生産に及ぼす影響
K. lactis NBRC1903の濃縮操作と酸素供給操作がD-アラビトール生産量に及ぼす影響を検討した。培地には、乳糖を100g/L又は200g/L；(NH0)0SO0、3.4g/L；KH0PO0、2g/L；MgSO0・7H0O、1g/L；Glutamine、5g/L；Yeast Nitrogen Base without Amino Acidから成る液体で2mLを用いて、温度を310Kとして、200rpmで振盪培養を行った。培養開始から24h後に、遠心分離操作によって菌体濃度を2倍として、培養を継続させた。その結果を図１６にを示す。菌体濃縮操作を行い、液量で2mLの培地を用いて、200rpmで振盪培養を継続させたところ、D-アラビトール生産量は、菌体濃縮操作を行わない場合と比べて若干低下した。菌体濃縮操作を行った結果、エタノール濃度が向上して、嫌気性が向上し、D-アラビトール生産量が低下したと考えられた。菌体濃縮操作を行い、液量で1mLの培地を用いて、200rpmで振盪培養を継続させたところ、D-アラビトール生産量は、菌体濃縮操作を行わない場合と比べて向上し、120h後には26.7 g/Lに達した。上記の実施例１と比べて、6.8倍に到る濃度を獲得することができた。【００５９】
［参考例１］
アラビトールからキシルロースへの変換
本参考例では、アラビトールからキシルロースへの変換を検討した。【００６０】
バッフル付きの三角フラスコ（500mL）に、培地（マンニトール：50g/L、酵母抽出物：10g/L、ペプトン：10g/L）の50mLを入れてから、保存培地上にあったGluconobacter oxydans NBRC 3172株を白金耳の先端量だけ植菌し、200rpm、303K、48hで振盪培養を行った。この培養液を遠心分離して洗浄しながら、菌体を沈降濃縮した後に、試験管（20mL）に、アラビトールを30g/Lで含む水溶液の1mLを入れてから、前記で調製したG. oxydans NBRC 3172株を菌体の初期濃度でOD600が20になるように植菌し、200rpm、303K、所定時間で振盪培養を行った。その結果を図１０に示す。【００６１】
培養の開始から6h後に、大部分のアラビトールが反応し、キシルロースが生成されていた。そのキシルロースの収率は約100%であった。このとき、微量のキシリトールが副産物で生成されていた。【００６２】
［参考例２］
キシルロースからキシリトールへの変換
本参考例では、キシルロースからキシリトールへの変換を検討した。【００６３】
試験管（20mL）に、培地（キシルロース：32.9g/L、キシリトール：0.4g/L、酵母抽出物：3g/L、硫酸アンモニウム：5g/L、リン酸水素二カリウム：2 g/L、硫酸マグネシウム七水和物：1g/L）の2mLを入れてから、Kluyveromyces lactis NBRC 1903株、Kluyveromyces marxianus ATCC 26548株、Candida melibiosica NBRC 10238株、Candida mogii NBRC 0436株、Candida shehatae IAM 12953株、Zygosaccharomyces rouxii IAM 12879株、Debaryomyces hansenii IAM 12837株、Pichia farinose IAM 12223株、Pichia stipitis IAM 12952株（財団法人応用微生物学研究奨励会（IAM）より購入した）を、それぞれ白金耳の先端量だけ植菌し、200rpm、303K、24hで（往復式の）振盪培養を行った。これらの培養の終了時にOD600は、Kluyveromyces lactis NBRC 1903株で18.7、Kluyveromyces marxianus ATCC 26548株で27.3、Candida melibiosica NBRC 10238株で32、Candida mogii NBRC 0436株で16.3、Candida shehatae IAM 12953株で30.8、Zygosaccharomyces rouxii IAM 12879株で3.6、Debaryomyces hansenii IAM 12837株で16.6、Pichia farinose IAM 12223株で17.1、Pichia stipitis IAM 12952株で20.7であった。これらの培養液の0.9mLをマイクロテストチューブ（1.5mL）に入れてから、遠心分離して洗浄しながら、菌体を沈降濃縮した後に、前記の培地の0.9mLを新たに加えてから、303Kで静置培養を行った。培養の開始から3h後と6h後に、マイクロチューブ内の培養液を一時撹拌した。その結果を表２に示す。
【表２】
2009088037.tif 000003
【００６４】
比較対照の実験として、試験管（20mL）に、前記した菌体を植菌し、200rpm、30℃、所定時間で好気的に振盪培養を行った。【００６５】
キシリトールの生産量は、Kluyveromyces marxianus ATCC 26548株で0.42g/L、Candida melibiosica NBRC 102388株で0.88 g/L、Candida shehatae IAM 129538株で1.79g/L、Zygosaccharomyces rouxii IAM 128798株で0.15g/L、Pichia farinose IAM 122238株で0.13g/L、Pichia stipitis IAM 129528株で0.10g/Lであった。【００６６】
一方、Kluyveromyces lactis NBRC 19038株、Candida mogii NBRC 04368株、Debaryomyces hansenii IAM 128378株で、キシリトールは検出できなかった。【００６７】
Candida shehatae IAM 129538株を、OD600が30.8となるように集菌し、マイクロテストチューブ（1.5mL）に入れてから、前記の培地の0.9mLを新たに加えてから、静置培養を行った。その結果を図１１に示す。【００６８】
基本的には静置培養であるが、培養の開始から、3、6、9、12h後に、培養液を一時撹拌した。初期の段階で、キシルロースの32.9g/Lのうち、85.0%が消費され、最終の段階で、キシリトールは6.32g/Lに達していた（初期のキシリトール：0.54g/L）。このとき、キシリトールの収率は0.22であった。副生成物のアラビトールは低濃度であった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本願発明は、糖アルコールの製造の技術分野で利用することができる。【００７０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2009088037.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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