(57)【要約】  記載されているのは、患者にインスリンを経鼻送達するための、速効型インスリンであってよいヒトインスリン、可溶化剤、及び界面活性剤の水性混合物を含む薬物のための医薬組成物、製剤、及びそれらの使用である。【選択図】  図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者にインスリンを経鼻送達するための医薬製剤であって、当該製剤がモノマ状インスリン、可溶化剤、及び界面活性剤の水性混合物を含むことを特徴とする製剤。
【請求項２】
請求項１に記載の製剤において、前記インスリンがヒトインスリンであることを特徴とする製剤。
【請求項３】
請求項１に記載の製剤において、前記インスリンが速効型ヒトインスリンであることを特徴とする製剤。
【請求項４】
請求項１に記載の製剤において、前記インスリンが、天然ヒトインスリン、ヒトインスリン（ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９）、ヒトインスリン（ＬｙｓＢ３、ＩｌｅＢ２８）、ヒトインスリン（ＧｌｙＡ２１、ＨｉｓＢ３１、ＨｉｓＢ３２）、ヒトインスリン（ＡｓｐＢ２８）、ヒトインスリン（ＡｓｐＢ１０）、ヒトインスリン（ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９）、及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする製剤。
【請求項５】
請求項４に記載の製剤において、前記インスリンがヒトインスリン（ＡｓｐＢ２８）であることを特徴とする製剤。
【請求項６】
請求項１に記載の製剤において、前記可溶化剤が、シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする製剤。
【請求項７】
請求項６に記載の製剤において、前記可溶化剤がメチル−β−シクロデキストリンであることを特徴とする製剤。
【請求項８】
請求項１に記載の製剤において、前記界面活性剤が、ノニオン性ポリオキシエチレンエーテル、フシジン酸及びその誘導体、タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジデカノイル、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリエチレングリコール、セチルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ラノリンアルコール、モノオレイン酸ソルビタン、及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする製剤。
【請求項９】
請求項８に記載の製剤において、前記界面活性剤がＬ−α−ホスファチジルコリンジデカノイルであることを特徴とする製剤。
【請求項１０】
請求項８に記載の製剤において、前記界面活性剤がポリソルベート８０であることを特徴とする製剤。
【請求項１１】
請求項１に記載の製剤において、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール四酢酸、及びこれらの混合物からなる群から選択されるキレート剤を更に具えることを特徴とする製剤。
【請求項１２】
請求項１に記載の製剤において、１又はそれ以上のポリオールを更に具えることを特徴とする製剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載の製剤において、前記ポリオールが、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−エリトロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、トレハロース、Ｄ−ガラクトース、ラクツロース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセリン、ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする製剤。
【請求項１４】
請求項１２に記載の製剤において、前記ポリオールがラクトース及びソルビトールであることを特徴とする製剤。
【請求項１５】
請求項１に記載の製剤において、防腐剤を更に具えることを特徴とする製剤。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製剤において、前記防腐剤が、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、フェノール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする製剤。
【請求項１７】
請求項１５に記載の製剤において、前記防腐剤がメチルパラベン及びプロピルパラベンであることを特徴とする製剤。
【請求項１８】
請求項１に記載の製剤において、直径１乃至７００ミクロンのサイズを有するエアロゾル滴を更に具えることを特徴とする製剤。
【請求項１９】
請求項１７に記載の製剤において、湿潤剤を更に具えることを特徴とする製剤。
【請求項２０】
請求項１９に記載の製剤において、前記湿潤剤が、プロピレングリコール、グリセリン、グリセリントリアセテート、ポリオール、高分子ポリオール、乳酸、尿素、及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする製剤。
【請求項２１】
請求項２０に記載の製剤において、前記湿潤剤がプロピレングリコールであることを特徴とする製剤。
【請求項２２】
請求項１に記載の製剤において、バッファを更に具えることを特徴とする製剤。
【請求項２３】
請求項２２に記載の製剤において、前記バッファが、グルタミン酸塩、酢酸塩、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、メチオニン、乳酸塩、ギ酸塩、グリコール酸塩、及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする製剤。
【請求項２４】
請求項２３に記載の製剤において、前記バッファがアルギニンであることを特徴とする製剤。
【請求項２５】
請求項２２に記載の製剤において、前記バッファが５乃至９のｐＫａを有することを特徴とする製剤。
【請求項２６】
請求項２２に記載の製剤において、前記バッファが６乃至８のｐＫａを有することを特徴とする製剤。
【請求項２７】
請求項１に記載の製剤において、増粘剤を更に具えることを特徴とする製剤。
【請求項２８】
請求項２７に記載の製剤において、前記増粘剤が、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボマ、カルボキシメチルセルロース、及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする製剤。
【請求項２９】
請求項２８に記載の製剤において、前記増粘剤がカルボマであることを特徴とする製剤。
【請求項３０】
請求項２８に記載の製剤において、前記増粘剤がカルボキシメチルセルロースであることを特徴とする製剤。
【請求項３１】
請求項２８に記載の製剤において、前記増粘剤がゼラチンであることを特徴とする製剤。
【請求項３２】
請求項１に記載の製剤であって、当該製剤が７．０±０．５のｐＨを有することを特徴とする製剤。
【請求項３３】
請求項１に記載の製剤であって、当該製剤が等張化剤を更に具えることを特徴とする製剤。
【請求項３４】
請求項１に記載の製剤であって、当該製剤が５０乃至３５０ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度を有することを特徴とする製剤。
【請求項３５】
請求項１に記載の製剤であって、当該製剤が約１５％を超える生体利用率を有することを特徴とする製剤。
【請求項３６】
ヒトインスリン、メチル−β−シクロデキストリン、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジデカノイル、エデト酸二ナトリウム、ポリソルベート８０、アルギニンバッファ、及びカルボマの水溶液を具えることを特徴とする医薬製剤。
【請求項３７】
請求項３６に記載の製剤において、前記ヒトインスリンが速効型ヒトインスリンであることを特徴とする製剤。
【請求項３８】
請求項３６に記載の製剤において、前記ヒトインスリンがヒトインスリン（ＡｓｐＢ２８）であることを特徴とする製剤。
【請求項３９】
個体の満腹を誘起し、個体の体重減少、肥満、癌、結腸癌及び前立腺癌を促進する真性糖尿病、高血糖、異脂肪血症を含む、ヒトにおける疾患又は状態の兆候及び症状を治療するための薬物の製造における、請求項１乃至３８のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項４０】
個体の満腹を誘起し、個体の体重減少、肥満、癌、結腸癌及び前立腺癌を促進する真性糖尿病、高血糖、異脂肪血症を含む、ヒトにおける疾患又は状態の兆候及び症状を治療するための薬物の製造における、モノマ状インスリン、可溶化剤、及び界面活性剤の水性混合物を具えることを特徴とする医薬製剤の使用。
【請求項４１】
請求項４０に記載の使用において、前記インスリンが、天然ヒトインスリン、ヒトインスリン（ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９）ヒトインスリン（ＬｙｓＢ３、ＩｌｅＢ２８）、ヒトインスリン（ＧｌｙＡ２１、ＨｉｓＢ３１、ＨｉｓＢ３２）、ヒトインスリン（ＡｓｐＢ２８）、ヒトインスリン（ＡｓｐＢ１０）、ヒトインスリン（ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９）及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項４２】
請求項４０に記載の使用において、前記インスリンがヒトインスリン（ＡｓｐＢ２８）であることを特徴とする使用。
【請求項４３】
請求項４０に記載の使用において、前記疾患が真性糖尿病であることを特徴とする使用。
【請求項４４】
請求項４０に記載の使用において、前記疾患が真性糖尿病であり、薬物を直径１乃至７００ミクロンのサイズを有するエアロゾル滴として投与することを特徴とする使用。
【請求項４５】
請求項４０に記載の使用において、前記可溶化剤がメチル−β−シクロデキストリンであり、界面活性剤がＬ−α−ホスファチジルコリンジデカノイルであることを特徴とする使用。
【請求項４６】
請求項４０に記載の使用において、前記医薬製剤が、増粘剤、防腐剤、バッファ及び等張化剤を更に具えることを特徴とする使用。
【請求項４７】
請求項４０に記載の使用において、前記薬物が、投与後少なくとも約６時間の間、ヒトの血液のインスリンレベルを上昇させることを特徴とする使用。
【請求項４８】
請求項４０に記載の使用において、前記薬物が、ヒトのグルコースレベルを約１０％を超えて低下させることを特徴とする使用。
【請求項４９】
請求項４０に記載の使用において、前記薬物が、直径１乃至７００ミクロンのサイズを有するエアロゾル滴として投与されることを特徴とする使用。
【請求項５０】
ヒトにおける真性糖尿病又は高血糖を治療する薬物の製造において、ヒトインスリン、メチル−β−シクロデキストリン、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジデカノイル、エデト酸二ナトリウム及びポリソルベート８０の水溶液を具えることを特徴とする医薬組成物の使用。
【請求項５１】
請求項５０に記載の使用において、前記ヒトインスリンが速効型インスリンであることを特徴とする使用。
【請求項５２】
請求項５０に記載の使用において、前記ヒトインスリンがヒトインスリン（ＡｓｐＢ２８）であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
インスリンは重要なグルコース調節ポリペプチドホルモンである。それは膵臓により分泌される天然に生ずるホルモンである。インスリンは、グルコースを血液から除去して使用するために体細胞により要求される。グルコースは、細胞が細胞機能を実行するために必要とするエネルギーを発生することを可能にする。炭水化物ホメオスタシスにおける主要エフェクタであることに加えて、インスリンは、脂肪代謝にも効果を有する。それは、貯蔵脂肪を遊離させる肝臓の能力を変化させることができる。インスリンは、体全体にわたる種々な薬力学的効果を有する。
【０００２】
研究者達は、１９２２年にインスリンを含む有効な膵臓抽出物を若い糖尿病患者に初めて与え、ＦＤＡは１９３９年に初めてインスリンを承認した。現在、治療に使用されているインスリンは、ウシ及びブタの膵臓並びに組換え（ヒト）技法に由来する。最初の組換えヒトインスリンは１９８２年にＦＤＡにより承認された。
【０００３】
インスリンは、真性糖尿病の幾つかの形態で医薬として使用される。真性糖尿病患者は血液からグルコースを取り込み使用する能力に欠け、結果として、血中グルコースレベルが上昇する。１型糖尿病において、膵臓は十分なインスリンを産生することができない。それ故、インスリン療法が必要とされる。２型糖尿病において、患者はインスリンを産生するが、体全体の細胞がインスリンに正常に応答しない。それにも拘わらず、インスリンは、インスリンに対する細胞の抵抗に打ち克つために２型糖尿病においても使用することができる。細胞によるグルコース取込みを増大させて血中グルコース濃度を低下させることにより、インスリンは、血管、眼、腎臓及び神経に対する損傷を含む糖尿病の長期合併症を予防し又は減少させる。インスリンは、通常、皮膚の下への（皮下）注射により投与される。胴体部の皮下組織が好ましく、それは、インスリンの吸収が、他の部位の皮下組織よりもこの部位からの方が安定しているからである。
【０００４】
インスリンが最初発見されて糖尿病を有する人達に使用可能になったとき、ただ１種類の短期間作用するインスリンだけが存在した。これは１日数回の注射を必要とした。時が経つにつれ、より長期に持続して注射回数の必要もより少ない新しいインスリンが開発されたが、食事のタイミングに厳格な注意が必要であった。現在、種々のタイプのインスリンが使用可能である。このことが投与の回数およびタイミングにより柔軟性を与え、患者の生活様式に基づいて、目標血中グルコースレベルを維持することを容易にしている。インスリンは、種々の形態、例えば、急速、中間的、及び長期作用の形態で使用可能である。インスリンは、通常、皮下注射により送達される。ポンプ送達、及びより最近では肺送達などの他の選択肢が使用可能である。
【０００５】
組換えＤＮＡ技法で調製された数種のインスリン類似体が臨床使用のために使用可能である。これらの薬剤の中に、インスリンアスパルト（ＮｏｖｏＬｏｇ（商標）；Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）があり、これはＢ２８位のプロリンをアスパラギン酸に単一置換した以外はレギュラーヒトインスリンと相同性である。この単一置換が分子の６量体を形成する傾向を減少させる。その結果、インスリンアスパルトは、短期作用インスリンよりも、皮下注射後より急速に吸収され、作用のより早い開始と短い作用期間との両方を有する。
【０００６】
インスリン混合物も、特に２型糖尿病の人達に使用されている。インスリン混合物は、１つの組合せ投与で、異なるタイプのインスリンによる治療を可能にする。
【０００７】
注射用インスリンは、３種の異なる形態のバイアル、事前充填注射器、及びカートリッジで供給される。カートリッジは注射を簡単にするペン様デバイス中で使用される。ヒト組換えインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト及びインスリングラルギンは普通に使用されているインスリンである。ウシ及びブタインスリンは、まれに使用される。レギュラーヒトインスリン（ノボリンＲ、Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ）は、バイアル、カートリッジ、及び事前充填注射器で入手可能である。
【０００８】
ＮＰＨヒトインスリン（ノボリンＮ、Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｎ）は、バイアル、カートリッジ、及び事前充填注射器で入手可能である。７０％のＮＰＨヒトインスリンと３０％のレギュラーヒトインスリンとの混合物（ノボリン７０/３０、Ｈｕｍｕｌｉｎ  ７０/３０）は、バイアル、カートリッジ、及び事前充填注射器で入手可能である。
【０００９】
５０％のＮＰＨヒトインスリンと５０％のレギュラーヒトインスリンとの混合物（Ｈｕｍｕｌｉｎ  ５０/５０）はバイアルで入手可能である。レンテヒトインスリン（ノボリンＬ、Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｌ）はバイアルで入手可能である。ウルトラレンテヒトインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｕ）はバイアルで入手可能である。インスリンリスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ）はバイアル及びカートリッジで入手可能である。インスリンアスパルト（Ｎｏｖｏｌｏｇ）はバイアル及びカートリッジで入手可能である。インスリングラルギン（Ｌａｎｔｕｓ）はバイアル及びカートリッジで入手可能である。
【００１０】
モノマ状形態のインスリンはインスリン相同体を含み、速効型、例えば、インスリングルリシン（ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９）、ＨＭＲ−１１５３ （ＬｙｓＢ３、ＩｌｅＢ２８）、ＨＭＲ−１４２３（ＧｌｙＡ２１、ＨｉｓＢ３１、ＨｉｓＢ３２）、インスリンアスパルト（ＡｓｐＢ２８）又は（ＡｓｐＢ１０）、リスプロ（ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９）として知られている。上記のどの場合も、類似体の命名はインスリンのＡ又はＢ鎖の、鎖のＮ端から数えた特定位置におけるアミノ酸置換の記述に基づいており、配列の残余は天然ヒトインスリンの配列である。
【００１１】
速効型インスリンの乾燥粉末製剤は、天然ヒトインスリンのアミノ酸配列を有するインスリンを含む肺送達について報告されている（米国特許第６，７３７，０４５号）。速効型インスリンを含む医薬製剤、即ち、６０分以内にピーク血清レベル及び９０分以内にグルコーストラフを与え得る医薬製剤をさらに開発する必要がある。
【００１２】
インスリンを注射する人達に使用可能な幾つかの選択がある。インスリンは手作業で注射できるか又はインスリンポンプと呼ばれる小さな電子注入デバイスの助けで体内に注入することができる。注射器は多分最も普通で対費用効果の高い選択であり、２種のインスリンを混合して一緒に取る患者にとって有用である。注射器に代わるものはインスリンペンであり、それはインスリンで予め充填されて供給され、使い捨て又は（ディスポーザブルインスリンカートリッジで）再使用のいずれも可能である。このデバイスはキャップの下に細い針及び他端にプランジャのある大きいペンに似ている。使用者はダイヤルで投与量を調節することができる。インスリンペンは、７０／３０（ＮＰＨ及びレギュラーインスリン）などの最も頻繁に処方されるタイプのインスリン混合物としても入手可能である。ある人達は注射器よりもペンを選び、それは携帯及び使用が容易だからである。
【００１３】
インスリンジェットインジェクタとして知られる他のデバイスは、皮膚を通してインスリンの微細な噴霧を送るために高圧の噴射空気を使用することにより作動する。これは注射嫌いの患者達に良い選択肢であるかも知れない。しかしながら、ジェットインジェクタは大きな出費を必要とし、必ずしも保険でまかなえるとは限らない。
【００１４】
インスリンポンプはある人達にとって１型糖尿病を制御するより有効な方法であり得る。それはインスリンポンプが膵臓のインスリン産生をより近く模倣しているからである。インスリンポンプは、「基本速度」として知られる一日を通しての少量の定常的なインスリンの流れを患者に投与する付属の注入セット（又はチューブ）付きのコンパクトな電子式デバイスである。食前に、ポンプ使用者は、食事による血中グルコースレベルの対応する上昇を補償する速効性インスリンの「大量瞬時投与」を送達するようにポンプをプログラムする。ポンプ流量は必要に応じて１日を通して使用者により手作業でも調節することができる。
【００１５】
グルコース調節ペプチドは、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ），妊娠糖尿病、又はインスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療、肥満の治療及び異脂肪血症の治療に治療可能性を有することが示されている種類のペプチドである。米国特許第６，５０６，７２４号、米国特許出願公開第２００３００３６５０４Ａ１号、欧州特許第１０８３９２４Ｂ１号、国際特許出願公開ＷＯ９８／３０２３１Ａ１号、及び国際特許出願ＷＯ００／７３３３１Ａ２号を参照されたい。インスリン及びインスリン類似体に加えて、グルコース調節ペプチドには、グルカゴン様ペプチド、ＧＬＰ例えばＧＬＰ−１、エキセンディン、特にエクセナチドとしても知られるエキセンディン−４並びにアミリンペプチド及びプラムリンチドなどのアミリン類似体が含まれる。今日まで、これらのペプチドは注射によりヒトに投与されてきた。
【００１６】
したがって、グルコース調節ペプチド、特に速効型インスリンの、注射による以外の投与のための医薬製剤を開発する必要性がある。
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明のより良き理解を提供するために、次の定義を与える。
【００１８】
インスリン及びインスリン類似体
本発明は、６０分以内にピーク血清レベルを及び９０分以内にグルコーストラフを与え得る速効型インスリンの経鼻投与に主として重点を置く。本発明によれば、グルコース調節ペプチドは、ペプチドの遊離塩基、酸付加塩又はカリウム若しくはナトリウム塩などの金属塩、並びにアミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、ホスホリル化、アセチル化、環化及び他の周知の共有結合性改変法のような方法により改変されたペプチドも含む。
【００１９】
本明細書で使用する用語「ヒトインスリン」は、組換えヒトインスリンを含む。
【００２０】
薬学的に許容される塩は、無機酸塩、有機アミン塩、有機酸塩、アルカリ土類金属塩、及びそれらの混合物を含む。薬学的に許容される塩の適当な例には、ハロゲン化物、グルコサミン、アルキルグルコサミン、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、臭化水素酸塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレン−ジアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリシン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、リン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、安息香酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メシレート、グルコン酸塩、トシレート、マレイン酸塩、フマル酸塩、ステアリン酸塩、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２１】
したがって、本発明によれば、上記のペプチド及びそれらの混合物は、経粘膜送達、特に経鼻送達に適した医薬製剤中に組み込まれる。
【００２２】
ペプチド類似体及び模倣体
本発明において使用する生物活性ペプチドの定義には、天然又は合成の、治療的若しくは予防的に有効な、ペプチド（共有結合で連結した２つ以上のアミノ酸から構成される）、タンパク質、ペプチド若しくはタンパク質のフラグメント、ペプチド若しくはタンパク質の類似体、及び活性なペプチド若しくはタンパク質の化学的に改変された誘導体又は塩が含まれる。グルコース調節ペプチドの広範囲の有用な類似体及び模倣体が、本発明中での使用に考慮され、公知の方法により製造し、生物活性を試験することができる。しばしば、本発明中で使用するグルコース調節ペプチドのペプチド若しくはタンパク質又は他の生物活性ペプチド若しくはタンパク質は、天然に生ずる即ち未変性の（例えば、野生型、天然に生ずる変異型、又は対立遺伝子多型）ペプチド若しくはタンパク質配列内でのアミノ酸の部分的置換、付加又は欠失により容易に得られる突然変異蛋白質である。それに加えて未変性ペプチド又はタンパク質の生物活性フラグメントが含まれる。そのような変異誘導体及びフラグメントは未変性ペプチド又はタンパク質の所望の生物活性を実質的に保持している。炭水化物鎖を有するペプチド又はタンパク質の場合、これらの炭水化物種の変性により特徴づけられた生物活性変種も本発明内に含まれる。
【００２３】
本明細書で使用する用語「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基の一般的互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有する一般的に互換性のアミノ酸群は、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン及びヒスチジンであり、またイオウ含有側鎖を有するアミノ酸群は、システイン及びメチオニンである。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの非極性（疎水性）残基を他のものに置換することが挙げられる。同様に、本発明は、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、及びトレオニンとセリンとの間などでの極性（親水性）残基の置換も考慮する。それに加えて、リシン、アルギニン若しくはヒスチジンなどの塩基性残基の他のものへの置換又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの酸性残基の他のものへの置換も考慮される。代表的な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。ペプチド又はタンパク質の類似体を対応する未変性ペプチド又はタンパク質と最適にアラインすることにより、また適当なアッセイ、例えば付着性タンパク質若しくは受容体結合アッセイを使用して選択された生物活性を測定することにより、本発明の方法及び組成物における用途に使用可能なペプチド及びタンパク質類似体を容易に同定することができる。使用可能なペプチド及びタンパク質類似体は、通常、対応する未変性ペプチド又はタンパク質に対して生じさせた抗体と特異的に免疫反応性である。
【００２４】
粘膜送達増強剤
「経粘膜送達増強剤」は、水、塩及び／又は普通のバッファ、及びグルコース調節ペプチドを含む製剤（対照製剤）に加えたときに、血液、血清、脳脊髄液中の最高濃度（Ｃｍａｘ）により、又は濃度対時間のプロットにおける曲線下の面積ＡＵＣにより測定される、粘膜を通過するグルコース調節ペプチドの輸送を効果的に増大させる製剤を生成させる化学物質及び他の賦形剤と定義される。粘膜には、鼻、口腔、腸、頬、気管支肺、膣、及び直腸の粘膜表面が含まれ、実際、外部と通じる全ての体腔又は通路を内張りしている全ての粘液分泌粘膜が含まれる。経粘膜送達増強剤は時により「担体」と呼ばれる。
【００２５】
「エンドトキシンフリー製剤」は、グルコース調節ペプチドと、エンドトキシン及び／又は関連する発熱物質を実質的に含まない１つ又は複数の経粘膜送達増強剤とを含む製剤を意味する。エンドトキシンは、微生物の内側に限局されていて、微生物が破壊されたか又は死んだときにだけ遊離される毒素を含む。発熱物質は、細菌及び他の微生物の外膜からの発熱誘発性で熱安定性の物質（糖タンパク質）を含む。これらの物質の両方とも、ヒトに投与されると発熱、低血圧及びショックを惹起し得る。エンドトキシンフリーの製剤を製造するには、特別の設備、専門の技能者が必要になる可能性があり、エンドトキシンフリーでない製剤を作製するよりも著しく費用がかかる可能性がある。齧歯類にエンドトキシンを注入すると同時にＧＬＰ又はアミリンを静脈内に投与すると、エンドトキシン単独投与に伴う低血圧を及び死亡さえ防止することが示されたので（米国特許第４，８３９，３４３号）、これらの及び他のグルコース調節ペプチド治療薬のエンドトキシンフリー製剤を製造することが、非経口的でない（注射でない）投与にとって必要であると要求はされないであろう。
【００２６】
非注入投与
「非注入投与」は、動脈又は静脈中への直接注射、（通常液体）を何かの中に圧入し又は打ち込んで、特に、体部に針、注射器、若しくは他の侵襲的方法により導入する方法を含まない任意の送達方法を意味する。非注入投与は、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射及び粘膜への非注射的送達方法を含む。
【００２７】
送達方法及び組成物
グルコース調節ペプチドの哺乳類被験者への粘膜投与のための改良された方法及び組成物により、グルコース調節ペプチドの投与スケジュールは最適化される。本発明は、１つ又は複数の経粘膜送達増強剤を添加して製剤化されたグルコース調節ペプチドの経粘膜送達を提供し、グルコース調節ペプチドの投与量放出は実質的に基準化され、及び／又はグルコース調節ペプチド放出の有効な送達期間、粘膜投与後約０．１から２．０時間、０．４から１．５時間、０．７から１．５時間、又は０．８から１．０時間の範囲に維持される。グルコース調節ペプチドの徐放化放出の達成は、本発明の方法及び組成物を利用する外来性グルコース調節ペプチドの反復投与により容易にすることができる。グルコース調節ペプチドの哺乳類被験者への粘膜投与の改良された組成物及び方法により、グルコース調節ペプチドの投与スケジュールは最適化される。本発明は、１つ又は複数の経粘膜送達増強剤及び１つ又は複数の任意選択の徐放性増強剤と組み合わせたグルコース調節ペプチドを含む製剤の改良された経粘膜（例えば鼻粘膜）送達を提供する。本発明の経粘膜送達増強剤は、粘膜投与されたグルコース調節ペプチドの治療活性を増強する送達の効果的な上昇、例えば血漿中最高濃度（Ｃｍａｘ）の上昇を生ずる。血漿及びＣＮＳ中のグルコース調節ペプチドの治療活性に影響する第２の要因は滞留時間（ＲＴ）である。徐放化放出増強剤は、経鼻送達増強剤と組み合わされて、グルコース調節ペプチドのＣｍａｘを上昇させ、滞留時間を延長させる。徐放性増強製剤を生ずる本発明のポリマ性送達媒体及び他の薬剤及び方法、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、本明細書で開示されている。
【００２８】
本発明は、個体の満腹を誘起し、個体の体重減少、哺乳類被験者における肥満、結腸癌、前立腺癌又は他の癌を促進する糖尿病、高血糖、異脂肪血症を含む、疾患及び状態に関連する症状を治療するための、改良されたグルコース調節ペプチドの送達方法及び投与形態を提供する。
【００２９】
本発明の経粘膜送達製剤及び方法において、グルコース調節ペプチドはしばしば経粘膜送達に適当な担体又は媒体と組み合わされ又は協調して投与される。本明細書で使用する用語「担体」は、薬学的に許容される固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化材を意味する。含水液体担体は、酸性化剤、アルカリ化剤、抗菌防腐剤、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤、錯化剤、可溶化剤、湿潤剤、溶媒、懸濁及び／又は増粘剤、等張化剤、保水剤又は他の生体適合性材料などの薬学的に許容される添加物を含むことができる。上記のカテゴリーにより掲載した成分の錠剤化は「米国薬局方処方集」１９９０年版１８５７〜１８５９頁に見出すことができる。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料の幾つかの例は、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びセルロースアセテートなど；粉末化したトラガカントガム；モルト；ゼラチン；タルク；ココアバター及び座剤ワックスなどの賦形剤；ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びダイズ油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル溶液、エチルアルコール及びリン酸緩衝溶液、並びに医薬製剤で使用される他の無毒性適合性物質、並びにそれらの混合物である。
【００３０】
例えば、湿潤剤の幾つかの例には、プロピレングリコール、グリセリン、グルセリルトリアセテート、ポリオール、ポリマ状ポリオール、乳酸、尿素、及びそれらの混合物が挙げられる。
【００３１】
バッファ及び緩衝塩の幾つかの例は、グルタミン酸塩、酢酸塩、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、メチオニン、乳酸塩、ギ酸塩、グリコール酸塩、及びそれらの混合物を主成分とする。
【００３２】
保水剤、乳化剤、及び潤滑剤例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなど、並びに着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、及び抗酸化剤も、配合者の所望により組成物中に存在させることができる。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等などの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；及びクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、及びそれらの混合物などの金属キレート剤が挙げられる。単回投与量形態を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、投与の特定の様式に依存して変化するであろう。
【００３３】
本発明の経粘膜送達組成物及び方法においては、粘膜表面の中への又はそれを通過するグルコース調節ペプチドの送達を増強する種々の送達増強剤が利用される。これに関連して、粘膜上皮を通過するグルコース調節ペプチドの送達は、「経細胞的に」又は「傍細胞的に」起こり得る。これらの経路が全体の流束に寄与する程度及びグルコース調節ペプチドの生体利用率は、粘膜の環境、有効薬剤の物理化学的性質及び粘膜上皮の性質に依存する。傍細胞輸送は受動的拡散のみを含み、それに対して経細胞輸送は受動的、促進性即ち能動的過程により起こり得る。一般に、親水性の受動的に輸送される極性溶質は傍細胞経路を通って拡散し、一方より親油性の溶質は経細胞経路を使用する。多種多様な受動的に及び能動的に吸収される溶質の吸収及び生体利用率（例えば、透過係数又は生理学的アッセイにより反映されるような）は、本発明中の任意に選択されたグルコース調節ペプチドに対して、傍細胞及び経細胞送達成分の両方に関して、容易に評価することができる。受動的に吸収される薬物について、傍細胞及び経細胞経路の薬物輸送に対する相対的寄与は、薬物のｐＫａ、分配係数、分子半径及び電荷、薬物が送達される管腔環境のｐＨ、並びに吸収表面面積に依存する。傍細胞経路は、鼻粘膜上皮の到達可能な表面面積の比較的小さい部分を占める。一般論として、細胞膜は、傍細胞空隙により占められる面積より千倍大きい粘膜表面を占有しているということが報告されている。したがって、より小なる到達可能面積、及び高分子の透過に対するサイズ及び電荷に基づく差別は、傍細胞経路は薬物輸送に対して経過細胞送達よりも一般的に有利でないであろうということを示唆するであろう。驚いたことに、本発明の方法及び組成物は、生物治療剤の傍細胞経路による粘膜上皮中への及びそれを通過する顕著に増強された輸送を提供する。したがって、本発明の方法及び組成物は、選択的に又は単一の方法若しくは組成物において、傍細胞及び経細胞経路の両方を首尾よくターゲットにする。
【００３４】
本明細書で使用する用語「経粘膜送達増強剤」は、グルコース調節ペプチド又は他の生物活性化合物の、放出若しくは溶解度（例えば、製剤送達媒体による）、拡散速度、浸透能力及びタイミング、取込み、滞留時間、安定性、有効半減期、ピーク若しくは持続される濃度レベル、クリアランス及び他の所望の経粘膜送達特性（例えば、送達部位で又は血流若しくは中枢神経系など選択された活性標的部位で測定された）を増強させる薬剤を含む。このように、経粘膜送達の増強は、種々の機構のいずれによっても、例えばグルコース調節ペプチドの拡散、輸送、残留性又は安定性を増大させること、膜流動性を増大させること、細胞内若しくは傍細胞透過を調節するカルシウム及び他のイオンの有効度若しくは作用を調節すること、粘膜成分（例えば脂質）を可溶化すること、粘膜組織中の非タンパク質及びタンパク質のスルフヒドリルレベルを変化させること、粘膜表面を通過する水流束を増大させること、上皮接合部の生理機能を調節すること、粘膜上皮の上を覆う粘液の粘度を低下させること、粘膜繊毛クリアランス速度を低下させること及び他の機構により起こり得る。
【００３５】
本明細書で使用する用語「グルコース調節ペプチドの粘膜で有効な量」は、グルコース調節ペプチドの、種々の送達若しくは移送経路を含み得る、被験者における薬剤活性の必要な標的部位への有効な経粘膜送達を考慮している。例えば、与えられた有効薬剤は、粘膜細胞間の間隙を通って通路を見出し、近傍の血管壁に達するかもしれず、一方薬剤は、他の経路により、受動的若しくは能動的のいずれかで粘膜細胞に取り込まれて細胞内で作用し、又は排泄され即ち細胞から外へ輸送され、全身的循環などの二次的標的部位に到達し得る。本発明の方法及び組成物は、有効薬剤の１つ若しくは複数のそのような別経路に沿っての移動を促進することができ、又は粘膜組織若しくは近位の血管組織に直接作用して、活性薬剤の吸収若しくは浸透を促進することができる。これに関連する吸収又は浸透の促進は、これらの機構に限定されない。
【００３６】
本明細書で使用する用語「血漿中のグルコース調節ペプチドのピーク濃度（Ｃｍａｘ）」、「血漿中のグルコース調節ペプチドの濃度対時間曲線下の面積（ＡＵＣ）」、「血漿中のグルコース調節ペプチドの血漿中最高濃度に至る時間（ｔｍａｘ）」は、当業者に知られた薬物動態学的パラメータである。Ｌａｕｒｓｅｎら、「Ｅｕｒ.Ｊ.Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１３５巻」：３０９〜３１５頁、１９９６年。「濃度対時間曲線」は、経鼻、筋肉内、皮下、又は他の非経口投与経路のいずれかにより被験者にグルコース調節ペプチドの１投与量を投与した後の、被験者の血清中のグルコース調節ペプチド濃度対時間の測定である。「Ｃｍａｘ」は、被験者にグルコース調節ペプチドを単回投与後の被験者の血清中のグルコース調節ペプチドの最高濃度である。「ｔｍａｘ」は、被験者にグルコース調節ペプチドを単回投与後に、被験者の血清中のグルコース調節ペプチドが最高濃度に達する時間である。
【００３７】
本明細書中で使用する「血漿中のグルコース調節ペプチド濃度対時間曲線下の面積（ＡＵＣ）」は、線形台形公式に従って計算し、残余の面積を加えたものである。２投与間の２３％の減少又は３０％の増加は、９０％の確率で検出されるであろう（ＩＩ型誤差β＝１０％）。「送達速度」又は「吸収速度」は、最高濃度（Ｃｍａｘ）に達する時間（ｔｍａｘ）の比較により測定される。Ｃｍａｘ及びｔｍａｘは両方ともノンパラメトリック法を使用して分析される。筋肉内、皮下、静脈内及び経鼻グルコース調節ペプチド投与の薬物動態の比較は分散分析（ＡＮＯＶＡ）により実施した。対比較のために、ボンフェローニ−ホームズ逐次法を使用して有意性を推定する。３回の経鼻投与間の投与応答関係は、回帰分析により推定する。Ｐ＜０．０５が有意とみなされる。結果は平均値＋／−ＳＥＭで与えられる。
【００３８】
吸収促進の機構は、本発明の経粘膜送達増強剤が異なれば変り得るが、この関係で有用な試薬は粘膜組織に実質的に副作用はなく、特定のグルコース調節ペプチド又は他の有効な薬剤若しくは送達増強剤の物理化学的特性に従って選択されるであろう。この関連で、粘膜組織の浸透又は透過性を増大させる送達増強剤は、粘膜の保護的透過障壁の何らかの変化をしばしば生じさせるであろう。本発明において、そのような送達増強剤が価値あるものであるためには、粘膜の透過性における如何なる有意な変化も薬剤送達の所望期間に適した時間枠内で可逆的であることが一般に望まれる。さらに、長期使用により、実質的な蓄積する毒性も、粘膜の障壁の性質に誘起される如何なる永久的な有害な変化もあるべきではない。
【００３９】
本発明のある局面において、本発明のグルコース調節ペプチドとの共投与又は組合せ製剤のための吸収促進剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、エタノール、プロピレングリコール、及び２−ピロリドンを含むが、これらに限定はされない親水性の小分子から選択される。あるいは、長鎖の両親媒性分子、例えば、デアシルメチルスルホキシド（ｄｅａｃｙｌｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、アゾン（ａｚｏｎｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸、及び胆汁酸塩が、グルコース調節ペプチドの粘膜浸透を増強させるために利用され得る。さらに他の局面において、グルコース調節ペプチドの経鼻送達を増強するために、界面活性剤（例えばポリソルベート）が、補助剤化合物、工程処理剤、又は製剤添加物として利用される。ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール及びエタノールなどの薬剤は、送達環境に十分高濃度で存在すれば（例えば事前投与又は治療製剤中への導入により）、粘膜の水性相に入り、その可溶化特性を変化させ、それによりグルコース調節ペプチドの、媒体から粘膜への分配を増大させる。
【００４０】
したがって、可溶化剤の幾つかの例には、シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、及びそれらの混合物が挙げられる。
【００４１】
本発明の共投与及び加工方法及び組合せ製剤で有用なさらなる経粘膜送達増強剤には、混合ミセル；エナミン；一酸化窒素供与剤（例えば、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン、ＮＯＲ１、ＮＯＲ４；これらは、カルボキシ−ＰＩＴＯ又はドクロフェナックナトリウムなどのＮＯスカベンジャーと共投与されることが好ましい）；サリチル酸ナトリウム；アセト酢酸グリセロールエスエル（例えば、グリセリル−１，３−ジアセトアセテート又は１，２−イソプロピリデングリセリン−３−アセトアセテート）；及び経粘膜送達に生理学的に適合性の他の放出−拡散又は上皮内若しくは経上皮浸透促進剤が含まれるが、これらに限定はされない。他の吸収促進剤は、グルコース調節ペプチドの経粘膜送達、安定性、活性又は経上皮浸透を増強する種々の担体、基剤及び賦形剤から選択される。これらは、とりわけ、シクロデキストリン類及びβ−シクロデキストリン誘導体（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン及びヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン））を含む。これらの化合物は、１つ又は複数の有効成分と結合していてもよく、またさらに油脂性基剤中で製剤化されていてもよく、本発明の粘膜用製剤の生体利用率を増大させる。経粘膜送達のためのさらに他の吸収増強剤には、モノ−及びジグリセリド（例えば、カプリン酸ナトリウム、ココナツ油の抽出物、Ｃａｐｍｕｌ）及びトリグリセリド（例えば、アミロデキストリン、Ｅｓｔａｒａｍ  ２９９、ミグリオール８１０）を含む中程度の鎖長の脂肪酸が挙げられる。
【００４２】
本発明の経粘膜治療及び予防用組成物は、グルコース調節ペプチドの粘膜障壁を越える吸収、拡散又は浸透を容易にする任意の適当な浸透促進剤で補完することができる。浸透促進剤は、薬学的に許容される任意の促進剤であってよい。したがって、本発明のより具体的な態様において、サリチル酸ナトリウム及びサリチル酸誘導体（サリチル酸アセチル、サリチル酸コリン、サリチルアミド等）；アミノ酸及びそれらの塩（例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリンなどのモノアミノカルボン酸；セリンなどのヒドロキシアミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸；リシンなどの塩基性アミノ酸；それらのアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩も含む）；及びＮ−アセチルアミノ酸（Ｎ−アセチルアラニン、Ｎ−アセチルフェニルアラニン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルグリシン、Ｎ−アセチルリシン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、Ｎ−アセチルプロリン、Ｎ−アセチルヒドロキシプロリン等）及びそれらの塩（それらのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩）から選択される１つ又は複数の浸透促進を含有する組成物が提供される。本発明の方法及び組成物における浸透促進剤として、通常乳化剤として使用される物質（例えば、オレイルリン酸ナトリウム、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル等）、カプロン酸、乳酸、リンゴ酸、及びクエン酸、並びにそれらのアルカリ金属塩、ピロリドンカルボン酸、アルキルピロリドンカルボン酸エステル、Ｎ−アルキルピロリドン、プロリンアシルエステル等も提供される。
【００４３】
本発明の種々の態様において、本発明のグルコース調節ペプチド及び他の治療薬の、投与部位と選択された標的部位との間の粘膜障壁を通過する送達を可能にする改良された経鼻粘膜送達製剤及び方法が提供される。ある製剤は、選択された標的細胞、組織若しくは器官又はさらに特定の病状に特異的に適合させられている。他の態様において、製剤及び方法は、所定の細胞内又は細胞間の経路に沿って特異的に道筋を定められたグルコース調節ペプチドの、効率的で選択的なエンドサイトーシス若しくはトランスサイトーシスを提供する。通常、グルコース調節ペプチドは、担体又は他の送達媒体中に効果的な濃度で有効に加えられて、送達され、薬剤が作用する遠隔標的部位（例えば、血流又は所定の組織、器官若しくは細胞外区画）に至る、例えば、鼻粘膜で及び／又は細胞内区画及び膜を通る通路の間で、安定化された形態に維持される。グルコース調節ペプチドは、送達媒体中で、又は他の方法で改変されて（例えば、プロドラッグの形態で）提供されてもよく、その場合、グルコース調節ペプチドの放出又は活性化は生理学的刺激（例えば、ｐＨ変化、リソソーム酵素その他）により開始される。しばしば、グルコース調節ペプチドは、活性が必要な標的部位に到達するまで薬理的に不活性である。大抵の場合、グルコース調節ペプチド及び他の製剤成分は無毒性で非免疫原性である。この関係で、担体及び他の製剤成分は、一般的に、生理学的条件下で急速に分解され排出される能力を理由に選択される。同時に、製剤は、有効貯蔵期間中投与形態で化学的及び物理的に安定である。タンパク質安定性を増強するために含水率を効果的に制御する種々の添加物、希釈剤、基剤及び送達媒体が、本発明で提供される。この意味で抗凝集剤として有効なこれらの試薬及び担体物質は、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、及びカルボキシメチルセルロースなどの種々の機能性を有するポリマを含み、それらは、それらと混合された又はそれらに結合したペプチド又はタンパク質の安定性を大いに向上させ、かつ固相凝集を減少させる。ある場合には、タンパク質の活性及び物理的安定性は、ペプチド又はタンパク質薬剤の水溶液への種々の添加物によっても増強することができる。例えば、ポリオール（糖類を含む）などの添加物、アミノ酸、コラーゲン及びゼラチンなどのタンパク質、及び種々の塩類が使用される。
【００４４】
ある種の添加物、特に糖類及び他のポリオールも、乾燥した、例えば、凍結乾燥されたタンパク質に顕著な物理的安定性を付与する。これらの添加物も、凍結乾燥の間だけでなく、乾燥状態での貯蔵期間中にもタンパク質を凝集から保護するために本発明で使用することができる。例えば、スクロース及びフィコール７０（スクロース単位を有するポリマ）は、種々の条件下で固相インキュベーションの間ペプチド又はタンパク質の凝集に対して顕著な保護を示す。これらの添加物は、ポリマのマトリックス中に埋め込まれた固体のタンパク質の安定性も向上させることができる。
【００４５】
さらに他の添加物、例えば、スクロースは、本発明のある種の徐放化製剤で起こり得る高温高湿度の雰囲気中でタンパク質を固体状態の凝集に対して安定化させる。ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質も、この関係で不安定なタンパク質の変性及び凝集を減少させるための安定剤又は増量剤として役立つ。これらの添加物は、本発明のポリマ溶融工程中に及び組成物中に含有させることができる。例えば、ポリペプチド微粒子は、上記の種々の安定化添加物を含む溶液を単に凍結乾燥するか又は噴霧乾燥することにより調製することができる。それにより、非凝集ペプチド及びタンパク質の徐放を長期間にわたって得ることができる。
【００４６】
可溶化剤を使用して実質的に純粋な非凝集形態で安定化された、凝集しやすいペプチド及びタンパク質の経粘膜送達のための製剤を与える種々の付加的調製成分及び方法並びに特別の製剤添加物が、本明細書中で提供される。成分及び添加物の範囲は、これらの方法及び製剤中で使用するために考慮される。これらの可溶化剤の代表的なものはシクロデキストリン類（ＣＤｓ）であり、それはポリペプチドの疎水性側鎖に選択的に結合する。これらのＣＤｓは凝集を顕著に阻止する様式でタンパク質の疎水性部分に結合することが見出された。この阻止は、関与するＣＤ及びタンパク質の双方に関して選択的である。タンパク質凝集のそのような選択的阻止は、本発明の経鼻送達方法及び組成物に付加的な利点を提供する。この関係で使用する追加の薬剤は、ペプチド及びタンパク質の凝集を特異的に阻止する、リンカーにより制御された種々の幾何学的配置を有するＣＤ２量体、３量体及び４量体を含む。さらに、本発明における混和のための溶解剤及び方法は、タンパク質とタンパク質との相互作用を選択的に阻害するペプチド及びペプチド模倣体の使用を含む。一態様において、ＣＤ多量体について報告されている疎水性側鎖の特異的結合は、タンパク質凝集を同様に阻止するペプチド及びペプチド模倣体の使用によりタンパク質に拡張される。広範囲の適当な方法及び抗凝集剤が、本発明の組成物及び方法における混和のために使用可能である。
【００４７】
電荷改変及びｐＨ制御剤及び方法
疎水性粘膜障壁を通過する増強された送達を目的として、生物活性薬剤（グルコース調節ペプチド、他の活性ペプチド及びタンパク質、並びに高分子量及び低分子量薬剤を含む）の輸送特性を改良するために、本発明は本明細書中に記載した選択された生物活性薬剤又は送達増強剤の電荷改変のための技法及び試薬も提供する。これに関連して、高分子の相対的透過性は、一般的にそれらの分配係数に関係する。分子のイオン化の程度は、分子のｐＫａ及び粘膜表面のｐＨに依存し、また分子の透過性にも影響する。本発明のグルコース調節ペプチド及び類似体を含む、経粘膜送達のための生物活性薬剤の透過及び分配は、活性薬剤又は透過化剤の電荷の変化又は電荷の広がりにより有利になり得る。それは、例えば、荷電官能基の変更により、活性薬剤が送達される送達媒体若しくは溶液のｐＨの改変により、又は活性薬剤と共に電荷若しくはｐＨ改変試薬を共投与することにより達成される。
【００４８】
これらの一般的知識と一致して、本発明の方法及び組成物における、グルコース調節ペプチド及び他の生物活性ペプチド及びタンパク質を含む荷電高分子種の経粘膜送達は、その活性薬剤が、実質的にイオン化していない即ち中性の電荷状態にある粘膜表面に送達されるときに、実質的に向上する。
【００４９】
本発明で使用する粘膜用製剤のある種のグルコース調節ペプチド及び他の生物活性ペプチド及びタンパク質成分は、電荷を改変されてペプチド又はタンパク質の正電荷密度が増加する。これらの改変は、本明細書中で開示したペプチド及びタンパク質結合体、担体及び他の送達形態のカチオン化にも及ぶ。カチオン化は、本発明のタンパク質及び高分子の体内分布及び輸送特性を変化させる便利な手段を提供する。カチオン化は、活性薬剤の生物活性を保存して且つ組織損傷及び毒性を含む潜在的副作用を制限するような様式で行われる。
【００５０】
「バッファ」は、通常、溶液のｐＨを殆んど一定の値に維持するために使用される。バッファは、少量の強酸又は強塩基が溶液に加えられたときでさえ、水素及び水酸化物イオンの濃度の大きな変化を防止し即ち中和することにより、溶液のｐＨを維持する。バッファは一般に弱酸とその適当な塩（又は弱塩基とその適当な塩）からなる。弱酸の適当な塩は弱酸中に存在するものと同一の負イオンを含む（Ｌａｇｏｗｓｋｉ、「Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第１巻、Ｓｉｍｏｎ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年、２７３〜４頁を参照されたい）。ヘンダーソン・ハッセルバッハの式、ｐＨ＝ｐＫａ＋ｌｏｇ１０［Ａ］／［ＨＡ］が緩衝を記述するために使用され、弱酸解離のための標準式、
2009512709.tif 000003
に基づく。通常使用されるバッファ原料の例には、次のもの挙げられる：酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、乳酸塩、グリシン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸塩、メチオニン、ギ酸塩、及びグリコール酸塩。
【００５１】
「緩衝能力」は、有意のｐＨ変化が起こる前に緩衝溶液に加えることができる酸又は塩基の量を意味する。ｐＨが弱酸のｐＫ＋１及びｐＫ−１の範囲内にあれば、緩衝能力は相当のものであるが、この範囲外では緩衝能力は殆んど価値がない程度に落ちる。したがって、与えられた系は、弱酸（又は弱塩基）のｐＫの両側で１ｐＨ単位の範囲内において有用な緩衝作用を有するのみである（Ｄａｗｓｏｎ、「Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、第３版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８６年、４１９頁を参照されたい）。一般に、適当な濃度は、溶液のｐＨが弱酸（又は弱塩基）のｐＫａに近いように選ばれる（Ｌｉｄｅ、「ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ」、第８６版、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ、２００５〜２００６年、２〜４１頁を参照されたい）。さらに、強酸及び強塩基の溶液は、通常緩衝液として分類されず、それらは２．４から１１．６のｐＨ値の間で緩衝能力を発揮しない。
【００５２】
分解酵素阻害剤及び方法
粘膜用製剤に含まれてよい他の賦形剤は分解酵素阻害剤である。本発明の経粘膜送達製剤及び方法において有用な代表的粘膜付着性ポリマ酵素複合体は、カルボキシメチルセルロース−ペプスタチン（抗ペプシン活性あり）；ポリ（アクリル酸）−ボーマン・バーク（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ）阻害剤（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）−キモスタチン（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；カルボキシメチルセルロース−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；ポリカルボフィル−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；キトサン−アンチパイン（抗トリプシン）；ポリ（アクリル酸）−バシトラシン（抗アミノペプチダーゼＮ）；キトサン−ＥＤＴＡ（抗アミノペプチダーゼＮ、抗カルボキシペプチダーゼＡ）；キトサン−ＥＤＴＡ−アンチパイン（抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ）を含むが、これらに限定はされない。下でさらに詳細に説明するように、本発明のある態様は、場合により新規なキトサン誘導体又は化学的に改変された形態のキトサンを取り入れてもよい。本発明で使用する１つのそのような新規な誘導体は、β−［１→４］−２−グアニジノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースポリマ（ポリ−ＧｕＤ）と表示される。
【００５３】
酵素活性を阻害して生物活性薬剤を保護する如何なる阻害剤も、本発明の組成物及び方法において役立てて利用することができる。生物活性タンパク質及びペプチドの保護のために有用な酵素阻害剤には、例えば、ダイズトリプシン阻害剤、エキセンディントリプシン阻害剤、キモトリプシン阻害剤並びにジャガイモ（ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ.）塊茎から単離されたトリプシン及びキモトリプシン阻害剤が含まれる。阻害剤の組合せ又は混合物を利用することができる。本発明において使用するさらに他のタンパク分解酵素阻害剤には、オボムコイド−酵素、ガバキセートメシレート、α１−アンチトリプシン、アプロチニン、アマスタチン、ベスタチン、ピューロマイシン、バシトラシン、リューペプシン、α２−マクログロブリン、ペプスタチン、及び卵白又は大豆トリプシン阻害剤が含まれる。これらの及び他の阻害剤は、単独で又は組み合わせて使用することができる。阻害剤は、生物活性薬剤と組み合わせて、投与形態の鼻粘膜に接触する表面上にコートした担体、例えば、親水性ポリマ中に含有させるか若しくはそれに結合するか、又は表面の表層に、若しくは別に投与される（例えば、事前投与）製剤に含有させることができる。
【００５４】
阻害剤、例えば、場合により本発明の組成物に組み込まれるタンパク分解酵素阻害剤などの量は、（ａ）特異的阻害剤の性質、（ｂ）その分子中に存在する官能基（ヒドロゲルを形成するモノマとの共重合に必要なエチレン性不飽和を導入するために反応させることができる）の数、及び（ｃ）阻害剤の分子中に存在するグリコシドなどのレクチン基の数に依存して変化するであろう。その量は、投与することを意図する特定の治療剤にも依存し得る。一般論として、酵素阻害剤の有用な量は、製剤（即ち分離したプロテアーゼ阻害剤の製剤又は阻害剤と生物活性薬剤とを組み合わせた製剤）中に、約０．１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ、しばしば約０．２ｍｇ／ｍｌから約２５ｍｇ／ｍｌ、より普通には約０．５ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌである。
【００５５】
トリプシン阻害の場合、適当な阻害剤は、例えば、アプロチニン、ＢＢＩ、ダイズトリプシン阻害剤、ニワトリオボムコイド、ニワトリオボインヒビター、ヒトエキセンジントリプシン阻害剤、カモスタットメシレート、フラボノイド阻害剤、アンチパイン、リューペプチン、ｐ−アミノベンズアミジン、ＡＥＢＳＦ、ＴＬＣＫ（トシルリシンクロロメチルケトン）、ＡＰＭＳＦ、ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、及びポリ（アクリレート）誘導体から選択することができる。キモトリプシン阻害の場合、適当な阻害剤は、例えば、アプロチニン、ＢＢＩ、ダイズトリプシン阻害剤、キモスタチン、ベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ、ＦＫ−４４８、ニワトリオボインヒビター、糖ビフェニルボロン酸錯体、ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、β−フェニルプロピオネート、及びポリ（アクリレート）誘導体から選択することができる。エラスターゼ阻害の場合、適当な阻害剤は、例えば、エラスタチナール、メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトン（ＭＰＣＭＫ）、ＢＢＩ、ダイズトリプシン阻害剤、ニワトリオボインヒビター、ＤＦＰ、及びＰＭＳＦから選択することができる。
【００５６】
本発明で使用するさらなる酵素阻害剤は、それらの性能及び毒性の程度が様々の広範囲の非タンパク質阻害剤から選択される。下でさらに詳細に説明するように、これらの補助的薬剤のマトリックス若しくは他の送達媒体への固定化又は化学的に改変された類似体の開発は、容易に実行されて、毒性を、それに直面したときに、低下させ又は排除することさえできる。本発明で使用する酵素阻害剤候補のこの広範な群の中に、フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）などの有機リン阻害剤があり、それらはセリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン及びキモトリプシン）の強力な不可逆的阻害剤である。これらの化合物によるアセチルコリンエステラーゼのさらなる阻害は、無制御送達の状況ではそれらを高度に毒性にする。他の阻害剤候補フッ化４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）は、ＤＦＰ及びＰＭＳＦに匹敵する阻害活性を有するが、毒性は著しく低い。フッ化（４−アミノフェニル）−メタンスルホニル塩酸塩（ＡＰＭＳＦ）はトリプシンのもう一つの強力な阻害剤であるが、無制御の状況では毒性である。これらの阻害剤とは対照的に、４−（４−イソプロピルピペラジノカルボニル）フェニル１,２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフトエートメタンスルホネート（ＦＫ−４４８）は低毒性物質であり、キモトリプシンの強力な特異的阻害剤を代表する。阻害剤候補のこの非タンパク質群の、低毒性リスクを示すさらなる代表は、カモスタットメシレート（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイルメチル−ｐ−（ｐ’−グアニジノ−ベンゾイルオキシ）フェニルアセテートメタンスルホネート）である。
【００５７】
本発明の方法及び組成物で使用するさらに他のタイプの酵素阻害剤は、特定の治療用化合物の酵素分解に干渉するアミノ酸および改変アミノ酸である。この関係での使用にとって、アミノ酸および改変アミノ酸は実質的に無毒性であり、低原価で製造することができる。しかしながら、それらの分子サイズの小ささ及び溶解性の良さのために、それらは粘膜環境で容易に希釈され吸収される。それにも拘わらず、適当な条件下でアミノ酸は、プロテアーゼ酵素の可逆的な競争的阻害剤として作用することができる。ある改変アミノ酸は非常に強い阻害活性を発揮することができる。この関係で所望の改変アミノ酸は「遷移状態」阻害剤として知られている。これらの化合物の強力な阻害活性は、その遷移状態の幾何学的配置における、基質に対するそれらの構造的類似性に基づくが、それらは酵素の活性部位に対して基質自体よりももっと高い親和性を有するものが通常選択される。遷移状態阻害剤は、可逆的な競争的阻害剤である。このタイプの阻害剤は、ボロ−ロイシン、ボロ−バリン及びボロ−アラニンなどのα−アミノボロン酸誘導体である。これらの誘導体中のホウ素原子は、アミノペプチダーゼによるそれらの加水分解中に、ペプチドの遷移状態に似ていると信じられている四面体ボロン酸イオンを形成することができる。これらのアミノ酸誘導体は、アミノペプチダーゼの強力な可逆的阻害剤であり、ボロ−ロイシンは酵素阻害において、ベスタチンよりも１００倍を超えて効果的であり、ピューロマイシンよりも１０００倍を超えて効果的であると報告されている。強いプロテアーゼ阻害活性が報告されている他の改変アミノ酸は、Ｎ−アセチルシステインであり、それはアミノペプチダーゼＮの酵素活性を阻害する。この助剤も粘液溶解性を示し、本発明の方法及び組成物で、粘膜拡散障壁の効果を減少させるために利用することができる。
【００５８】
本発明の共投与法及び組合せ製剤で使用するさらに他の有用な酵素阻害剤は、ペプチド及び改変ペプチド酵素阻害剤から選択することができる。この種類の阻害剤の重要な代表は、リケニホルミス菌から得られる環状ドデカペプチド、バシトラシンである。これらの種類のペプチドに加えて、ある種のジペプチド及びトリペプチドはある種のプロテアーゼに対して弱い非特異的阻害活性を示す。アミノ酸との類推により、それらの阻害活性は化学的改変により改良することができる。例えば、ホスフィン酸ジペプチド類似体も、アミノペプチダーゼに対する強力な阻害活性を有する「遷移状態」阻害剤である。報告によれば、それらは経鼻投与されたロイシンエンケファリンを安定化するために使用された。遷移状態類似体の他の例は、改変ペンタペプチドのペプスタチンであり、それはペプシンの非常に強い阻害剤である。数種類の合成類似体の阻害活性を試験することによるペプスタチンの構造分析は、阻害活性に関連する分子の主要な構造機能特性を明らかにした。他の特別なタイプの改変ペプチドは、それらの構造中に末端に位置するアルデヒド官能基を有する阻害剤を含む。例えば、キモトリプシンの公知の一次的及び二次的特異性の要求を満足する配列ベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＣＨＯが、この標的プロテイナーゼの強力な可逆的阻害剤であることが見出された。末端に位置するアルデヒド官能基を有するさらに他の阻害剤、例えば、アンチパイン、リューペプチン、キモスタチン及びエラスタチナールの化学構造も、ホスホルアミドン、ベスタチン、ピューロマイシン及びアマスタチンなどの他の知られている可逆的な改変ペプチド阻害剤の構造と同様に当技術分野で知られている。
【００５９】
ポリペプチドプロテアーゼ阻害剤は、それらの比較的高い分子質量のために、より小さい化合物よりも、薬剤担体マトリックス中の濃縮された送達に適する。本発明の製剤及び方法におけるプロテアーゼ阻害のためのさらなる薬剤は、錯化剤の使用を伴う。これらの薬剤は、鼻内環境（又は調製又は治療用組成物）から、多くのプロテアーゼの補因子である２価イオンを奪うことにより、酵素阻害を媒介する。例えば、錯化剤ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡは、適当な濃度で共投与された又は組合せ製剤化された助剤として、選択されたプロテアーゼを阻害するのに十分で、それにより本発明の生物活性薬剤の経鼻送達を増強する。この種類の阻害剤のさらなる代表は、ＥＧＴＡ、１，１０−フェナントロリン及びヒドロキシキノリンである。それに加えて、２価イオンをキレートするそれらの性質により、これらの及び他の錯化剤は、直接的吸収促進剤として本発明において有用である。
【００６０】
本明細書中他の場所で詳細に記載したように、種々のポリマ、特に粘膜付着性ポリマを、本発明の共投与、多重処理及び／又は組合せ製剤の方法及び組成物において、酵素阻害剤として使用することも意図されている。例えば、ポリ（アクリル酸）及びポリカルボフィルなどのポリ（アクリレート）誘導体は、トリプシン及びキモトリプシンを含む種々のプロテアーゼの活性に影響し得る。これらのポリマの阻害効果も、Ｃａ２＋及びＺｎ２＋などの２価カチオンの錯体形成に基づいている可能性がある。これらのポリマは、上記のように、さらなる酵素阻害剤の複合パートナー又は担体として役立ち得ることがさらに考慮される。例えば、亜鉛依存性プロテアーゼの酵素活性に対して強い阻害効果を示すキトサン−ＥＤＴＡ複合体が開発され、本発明において有用である。この関係で、他の酵素阻害剤の共有結合による結合後のポリマの粘膜付着性は、実質的に損なわれないと考えられ、そのようなポリマの、本発明における生物活性薬剤のための送達媒体としての一般的有用性も減じないと予想される。反対に、粘膜付着機構によりもたらされた送達媒体と粘膜表面との間の減少した距離は、活性薬剤の全身循環前(初回通過)代謝を最小化するであろうが、一方共有結合で結合した酵素阻害剤は薬物送達部位に濃縮されてとどまり、阻害剤の望ましくない希釈効果並びに毒性及びそれにより惹起される他の副作用を最小化する。この様式で、共投与される酵素阻害剤の有効量は、希釈効果の排除により減少させることができる。
【００６１】
本発明の粘膜用製剤及び方法において有用な代表的粘膜付着性ポリマ−酵素阻害剤錯体には、カルボキシメチルセルロース−ペプスタチン（抗ペプシン活性あり）；ポリ（アクリル酸）−ボーマン・バーク阻害剤（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）−キモスタチン（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；カルボキシメチルセルロース−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；ポリカルボフィル−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；キトサン−アンチパイン（抗トリプシン）；ポリ（アクリル酸）−バシトラシン（抗アミノペプチダーゼＮ）；キトサン−ＥＤＴＡ（抗アミノペプチダーゼＮ、抗カルボキペプチダーゼＡ）；キトサン−ＥＤＴＡ−アンチパイン（抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ）が含まれるが、これらに限定はされない。
【００６２】
粘液溶解及び粘液清浄剤及び方法
経鼻投与による生物治療剤の効果的送達は、粘膜層の糖タンパク質に結合することによる薬剤損失に加えて、鼻粘膜の保護粘膜内層を通過する薬物輸送速度の減少を考慮に入れなければならない。正常な粘液は、水、電解質、ムチン、高分子、及び脱落上皮細胞からなる粘弾性のゲル様物質である。それは主として、下にある粘膜組織の細胞保護及び潤滑性被覆として役立つ。粘液は鼻上皮及び他の粘膜上皮に位置する無秩序に分布する分泌細胞により分泌される。粘液の構造単位はムチンである。この糖タンパク質は粘液の粘弾性的性質の主原因であるが、他の高分子もこの性質に寄与し得る。気道粘液中において、そのような高分子は、局所的に産生された分泌性ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、リゾチーム、及びブロンコトランスフェリンを含み、それらは宿主の防衛機構において重要な役割を演じている。
【００６３】
本発明の共投与法は、効果的な粘液溶解性又は粘液清浄剤を場合により含有してもよく、それらは鼻内の粘膜表面から薄く透明な粘液を分解することに役立ち、経鼻投与された生物治療剤の吸収を容易にする。これらの方法において、粘液溶解又は粘液清浄剤は助剤化合物として共投与され、生物活性薬剤の経鼻送達を増強する。あるいは、有効量の粘液溶解又は粘液清浄剤は、本発明の多重処理法における処理剤として、又は本発明の組合せ製剤における添加物として組み込まれ、鼻内粘液の障壁効果を減少させることにより生物治療剤化合物の経鼻送達を増強する改良された製剤を提供する。
【００６４】
種々の粘液溶解又は粘液清浄剤が、本発明の方法及び組成物に組み込むために入手可能である。それらの作用機構に基づき、粘液溶解又は粘液清浄剤はしばしば次の群に分類することができる：ムチン糖タンパク質のタンパク質の核を分解するプロテアーゼ（例えば、プロナーゼ、パパイン）；ムコタンパク質のジスルフィド結合を切断するスルフヒドリル化合物；及び粘液内の非共有結合を切断する洗浄剤（例えば、トリトンＸ−１００、ツイーン２０）。この関係のさらなる化合物は、胆汁酸塩及び界面活性剤、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、及びリソホスファチジルコリンを含むが、これらに限定はされない。
【００６５】
粘液の構造破壊の惹起における胆汁酸塩の有効性は、デオキシコール酸塩＞タウロコール酸塩＞グリココール酸塩の順である。粘液の粘度又は付着を減少させて本発明の方法による経鼻送達を増強する他の有効な薬剤は、例えば、短鎖脂肪酸、及びＮ−アシルコラーゲンペプチド、胆汁酸、及びサポニンなどのキレート形成により作用する粘液溶解剤（後者は、粘液層構造を維持することにおいて重要な役割を演ずるＣａ２＋及び／又はＭｇ２＋を一部キレートすることにより機能する）を含む。
【００６６】
本発明の方法及び組成物において使用するさらなる粘液溶解剤は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＡＣＳ）を含み、これは気管支肺粘液の粘度及び付着の両方を減少させる強力な粘液溶解剤で、麻酔されたラットでヒト成長ホルモンの経鼻生体利用率を中程度に増大させると報告されている（７．５から１２．２％）。これらの及び他の粘液溶解性又は粘液清浄剤は、通常約０．２から２０ｍＭの濃度範囲で、生物活性薬剤の投与と協調して鼻粘膜と接触し、鼻内粘液の極性粘度及び／又は弾性を減少させる。
【００６７】
さらに他の粘液溶解又は粘液清浄剤は、粘液糖タンパク質内のグリコシド結合を切断できる様々なグリコシダーゼ酵素から選択することができる。α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼは、この種類の酵素の代表であるが、それらの粘液溶解効果は限られている可能性がある。対照的に、細菌のグリコシダーゼはこれらの微生物がそれらの宿主の粘液層を透過することを可能にする。
【００６８】
ペプチド及びタンパク質治療薬を含む本発明の中で最も生物学的に活性な薬剤との組合せによる使用として、非イオン原性洗浄剤も、粘液溶解又は清浄剤として通常有用である。これらの薬剤は、通常、治療薬ポリペプチドの活性を改変しないか又は実質的に損なわない。
【００６９】
繊毛静止剤及び方法
ある種の粘膜組織（例えば鼻粘膜組織）の粘液線毛クリアランスによる自浄能力は、保護機能として必要であるから（例えば塵、アレルゲン、及び細菌を除去するため）、この機能は粘膜の薬物治療により実質的に損なわれるべきではないと、一般に考えられてきた。呼吸管中の粘液繊毛輸送は、感染に対して特に重要な防御機構である。この機能を果たすために、鼻内及び気道通路内の繊毛運動は、粘液層を粘膜に沿って動かし、吸入された粒子及び微生物を除去する。
【００７０】
繊毛静止剤は、本発明の方法及び組成物において使用を見出し、粘膜に投与された（例えば経鼻）グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体並びに本明細書中で開示された他の生物活性薬剤の滞留時間を増加させる。特に、本発明の方法及び組成物中のこれらの薬剤の送達は、ある局面において、粘膜細胞の繊毛活性を可逆的に阻害するように機能して、粘膜に投与された有効薬物の滞留時間を一次的に可逆的に増大させる１つ又は複数の繊毛静止剤の共投与又は組合せ製剤により著しく増強される。本発明のこれらの局面において使用するために、前述の繊毛静止因子は、それらは特異的又は間接的のいずれかで活性であるが、適当な量で（濃度、送達の期間及び様式に依存する）、全て繊毛静止剤として成功的に利用できる候補であり、それらは、投与の粘膜部位で粘膜繊毛クレアランスを一時的（即ち可逆的）に減少させ、グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体、並びに本明細書中で開示された他の生物活性薬剤の送達を、許容されない副作用効果なしに増強する。
【００７１】
さらに詳細な局面において、特定の繊毛静止因子が、１つ又は複数のグルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体、及び／又は本明細書中で開示した他の生物活性薬剤との組合せ製剤又は共投与プロトコルで使用される。文献にある単離され特性を決定された種々の細菌繊毛静止因子が、本発明のこれらの態様で利用され得る。緑膿菌という細菌からの繊毛静止因子は、フェナジン誘導体、化膿化合物（２−アルキル−４−ヒドロキシキノリン）及びラムノリピド（溶血素としても知られている）を含む。化膿化合物は、５０μｇ／ｍｌの濃度で、明確な超微細構造的病変なしに、繊毛静止を生じさせた。フェナジン誘導体も繊毛運動を阻害したが、４００μｇ／ｍｌという実質的により高い濃度でとはいえ若干の膜破裂を惹起した。気管の外植片のラムノリピドに対する限定された曝露は繊毛静止を生じ、それは繊毛膜の変化を伴った。ラムノリピドへのより強い曝露は軸糸からダイニン腕の除去を伴う。
【００７２】
界面活性剤及び方法
本発明のより詳細な局面において、グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体並びに本明細書中で開示した他の生物活性薬剤の経粘膜送達を増強するために、本発明の経粘膜送達法又は製剤において、１つ又は複数の膜浸透増強剤が利用できる。この関係で、膜浸透増強剤は、（ｉ）界面活性剤；（ｉｉ）胆汁酸塩；（ｉｉｉ）リン脂質添加物、混合ミセル、リポソーム、又は担体；（ｉｖ）アルコール；（ｖ）エナミン；（ｖｉ）ＮＯ供与化合物；（ｖｉｉ）長鎖両親媒性分子；（ｖｉｉｉ）低分子疎水性浸透増強剤；（ｉｘ）ナトリウム又はサリチル酸誘導体；（ｘ）アセト酢酸グリセロールエステル；（ｘｉ）シクロデキストリン又はβ−シクロデキストリン誘導体；（ｘｉｉ）中程度の鎖長の脂肪酸；（ｘｉｉｉ）キレート剤；（ｘｉｖ）アミノ酸又はその塩；（ｘｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸又はその塩；（ｘｖｉ）選択された膜成分を分解する酵素；（ｘｖｉｉ）脂肪酸合成阻害剤；（ｘｖｉｉｉ）コレステロール合成阻害剤；又は（ｘｉｘ）（ｉ）から（ｘｖｉｉｉ）に挙げた膜浸透増強剤の任意の組合せから選択することができる。
【００７３】
ある種の界面活性剤は、膜吸収増強剤として、本発明の経粘膜送達製剤及び方法中に容易に組み込まれる。これらの薬剤は、グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体、並びに本明細書中で開示された他の生物活性薬剤と共投与されるか又は組み合わせて製剤化されるが、公知の界面活性剤の広範な集合から選択することができる。界面活性剤は、一般に３つのクラスの中に入る：即ち（１）ノニオン性ポリオキシエチレンエーテル；（２）グリコール酸ナトリウム（ＳＧＣ）及びデオキシコール酸塩（ＤＯＣ）などの胆汁酸塩；及び（３）タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）などのフシジン酸誘導体である。これら種々のクラスの界面活性剤の作用機構は、典型的には生物活性薬剤の可溶化を含む。凝集体をしばしば形成するタンパク質及びペプチドに対して、これらの吸収促進剤の界面活性剤的性質は、界面活性剤などの小さな単位で覆われたモノマが溶液中により容易に保たれるようなタンパク質との相互作用を可能にすることができる。他の界面活性剤の例は、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジデカノイル（ＤＤＰＣ）、ポリソルベート８０及びポリソルベート２０である。これらのモノマは凝集体よりも輸送性のよい単位であると推定される。第２の可能性ある機構は、膜環境中のプロテアーゼによるタンパク分解からペプチド又はタンパク質を保護することである。報告によれば、胆汁酸塩及び幾つかのフシジン酸誘導体の両方とも、タンパク質の吸収を増強するために必要な濃度以下の濃度で、鼻粘膜のホモジェネートによるタンパク質のタンパク分解性分解を阻害する。このプロテアーゼ阻害は、短い生物学的半減期のペプチドにとって特に重要であり得る。
【００７４】
このように、界面活性剤の幾つかの例には、ノニオン性ポリオキシエチレンエーテル、フシジン酸及びその誘導体、タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジデカノイル、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリエチレングリコール、セチルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ラノリンアルコール、ソルビタンモノオレエート、及びそれらの混合物が挙げられる。
【００７５】
増粘剤
増粘又は懸濁剤は、投与製剤からの薬剤の放出及び吸収速度に影響し得る。薬学的に許容される増粘剤として役立ち得る材料の幾つかの例は、ゼラチン、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セルロース、デンプン、ヘタスターチ、ポロキサマ、プルロニック、ＣＭＣナトリウム、ソルビトール、アカシア、ポビドン、カルボマ、ポリカルボフィル、キトサン、キトサンミクロスフェア、アルギン酸塩ミクロスフェア、キトサングルタメート、アンバーライト樹脂、ヒアルロナン、エチルセルロース、モルトデキストリンＤＥ、ドラム乾燥ワックス状トウモロコシデンプン（ＤＤＷＭ）、分解性デンプンミクロスフェア（ＤＳＭ）、デオキシグリコレート（ＧＤＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、微結晶性セルロース（ＭＣＣ）、ポリメタクリル酸及びポリエチレングリコール、スルホブチルエーテルＢシクロデキストリン、架橋エルデキソマ（ｅｌｄｅｘｏｍｅｒ）デンプンバイオスフェア、タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、Ｎ−トリメチルキトサンクロリド（ＴＭＣ）、分解デンプンミクロスフェア、アンバーライト樹脂、キトサンナノ粒子、噴霧乾燥クロスポビドン、噴霧乾燥デキストランミクロスフェア、噴霧乾燥微結晶性セルロース、及び架橋エルデキソマ（ｅｌｄｅｘｏｍｅｒ）デンプンミクロスフェアである。Ｕｇｗｏｋｅら、「Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．」  第２９巻、１６５６〜５７頁、１９９８年にある他の増粘剤は参照することにより組み入れられる。
【００７６】
分解酵素並びに脂肪酸及びコレステロール合成阻害剤
本発明の関連局面において、粘膜投与のためのグルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体、及び他の選択された生物活性薬剤は、製剤化され、分解酵素、又は代謝刺激剤、又は脂肪酸、ステロール若しくは他の上皮障壁成分の合成阻害剤から選択される浸透増強剤と共投与される；米国特許第６，１９０，８９４号。例えば、ホスホリパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ及びコンドロイチナーゼなどの分解酵素は、粘膜障壁に不可逆的損傷を惹起せずに、グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤の粘膜浸透を増強するために使用することができる。一態様において、コンドロイチナーゼは、本明細書で提供される方法及び組成物で使用され、粘膜の透過障壁の糖タンパク質又は糖脂質構成要素を変化させて、それによりグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体、並びに本明細書中で開示された他の生物活性薬剤の粘膜吸収を増強する。
【００７７】
粘膜障壁構成要素の合成阻害剤に関して、遊離酸が重量で上皮の２０〜２５％を占めることは注目される。遊離脂肪酸の生合成における２つの律速酵素は、アセチルＣｏＡカルボキラーゼ及び脂肪酸合成酵素である。一連の段階を通して、遊離脂肪酸はリン脂質に代謝される。したがって、本発明の方法及び組成物で使用する遊離脂肪酸合成及び代謝の阻害剤は、５−テトラドデシルオキシ−２−フランカルボン酸（ＴＯＦＡ）などのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤；脂肪酸合成阻害剤；ゴミシンＡ、２−（ｐ−アミルシンナミル）アミノ−クロロ安息香酸、臭化ブロモフェナシル、モノアリド、７，７−ジメチル−５，８−エイコサジエン酸、ニセルゴリン、セファランチン、ニカルジピン、ケルセチン、ジブチリル−サイクリックＡＭＰ、Ｒ−２４５７１、Ｎ−オレオイルエタノールアミン、Ｎ−（７−ニトロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾール−４−イル）ホスホスチジルセリン、シクロスポリンＡ、ジブカインを含む局所麻酔薬、プレニラミン、全ｔｒａｎｓ及び１３−ｃｉｓ−レチン酸などのレチノイド、Ｗ−７、トリフルオロペラジン、Ｒ−２４５７１（カルミダゾリウム）、１−ヘキサドシル−３−トリフルオロエチルグリセロ−ｓｎ−２−ホスホメントール（ＭＪ３３）などのホスホリパーゼＡ阻害剤；ニカルジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、ニフェジピン及びニモジピンを含むカルシウムチャンネル遮断薬；キナクリン、メパクリン、クロロキン及びヒドロキシクロロキンを含む抗マラリア薬；プロパナロール及びラベタロールを含むベータ遮断薬；カルモジュリンアンタゴニスト；ＥＧＴＡ；チメルソール；デキサメタゾン及びプレドニゾロンを含むグルココルチコステロイド；並びにインドメタシン及びナプロキセンを含む非ステロイド抗炎症薬を含むが、これらに限定はされない。
【００７８】
遊離ステロールは、主としてコレステロールであるが、重量で上皮脂質の２０〜２５％を占める。コレステロール生合成の律速酵素は、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル（ＨＭＧ）ＣｏＡレダクターゼである。本発明の方法及び組成物で使用するコレステロール合成阻害剤は、シンバスタチン、ロバスタチン、フルインドスタチン（フルバスタチン）、プラバスタチン、メバスタチンなどの（ＨＭＧ）ＣｏＡレダクターゼの競争的阻害剤並びに、コレステロールオレエート、コレステロールサルフェート及びホスフェート、及び２５−ＯＨ−及び２６−ＯＨ−コレステロールなどの酸素化ステロール類など他のＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤；スクワレン合成酵素阻害剤；スクワレンエポキシダーゼ阻害剤；２２，２５−ジアザコレステロール、２０，２５−ジアザコレステロール、ＡＹ９９４及びトリパラノールなどのＤＥＬＴＡ７又はＤＥＬＴＡ２４レダクターゼ阻害剤を含むが、これらに限定はされない。
【００７９】
脂肪酸合成阻害剤又はステロール合成阻害剤の各々は、活性薬剤の増強された上皮浸透を達成するために、本明細書中で開示した１つ又は複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに他の生物活性薬剤と共投与又は組合せ製剤化することができる。経粘膜送達のための治療薬又は助剤製剤中のステロール阻害剤の有効濃度範囲は、通常、全重量を基準にして約０．０００１％から約２０％、より典型的には約０．０１％から約５％である。
【００８０】
一酸化窒素供与剤及び方法
本発明の他の関連する局面において、一酸化窒素（ＮＯ）供与体は、本明細書中で開示した１つ又は複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに他の生物活性薬剤の経粘膜送達を増強するための膜浸透増強剤として選択される。種々のＮＯ供与体が当技術分野において知られており、本発明の方法及び製剤における有効濃度で有用である。代表的ＮＯ供与体は、ニトログリセリン、ニトロプルシド、ＮＯＣ５［３−（２−ヒドロキシ−１−（メチル−エチル）−２−ニトロソヒドラジノ）−１−プロパンアミン］、ＮＯＣｌ２［Ｎ−エチル−２−（１−エチル−ヒドロキシ−２−ニトロソヒドラジノ）−エタンアミン］、ＳＮＡＰ［Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン］、ＮＯＲＩ及びＮＯＲ４を含むが、これらに限定はされない。本発明の方法及び組成物において、有効量の選択されたＮＯ供与体は、粘膜上皮中に又はそれを通して、本明細書中で開示した１つ若しくは複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに／又は他の生物活性薬剤と共投与又は組合せ製剤化される。
【００８１】
上皮接合構造及び／又は生理機能を調節する薬剤
本発明は、経粘膜送達のための医薬製剤に製剤化された、本明細書中で開示された経粘膜送達増強剤と組み合わせて１つ若しくは複数のグルコース調節ペプチド、タンパク質、類似体及び模倣体並びに／又は他の生物活性薬剤を含む医薬組成物を提供する。
【００８２】
透過化剤は、通常、被験者の粘膜上皮表面で上皮接合構造及び／又は生理機能を調節することにより、粘膜上皮の傍細胞輸送を可逆的に増強する。この効果は、通常、隣接する上皮細胞の上皮膜接着性タンパク質間の同型又は異型結合の透過化剤による阻害を含む。同型または異型結合のこの遮断の標的タンパク質は、種々の関係する接合接着性分子（ＪＡＭｓ）、オクルディン、又はクローディンから選択することができる。この例は、これらのタンパク質の細胞外領域に結合する抗体、抗体フラグメント又は単鎖抗体である。
【００８３】
さらに追加の詳細な態様において、本発明は、粘膜上皮傍細胞輸送を増強するための透過化ペプチド及びペプチド類似体及び模倣体を提供する。対象のペプチド及びペプチド類似体及び模倣体は、通常、本発明の組成物及び方法において、哺乳類被験者における上皮接合構造及び／又は生理機能を調節することにより作用する。ある態様において、ペプチド及びペプチド類似体及び模倣体は、接合接着性分子（ＪＡＭ）、オクルディン、又はクローディンから選択された上皮膜接着性タンパク質の同型及び／又は異型結合を効果的に阻害する。
【００８４】
広く研究されている１つのそのような薬剤は、「閉鎖帯毒素」（ＺＯＴ）として知られるコレラ菌由来の細菌毒素である。この毒素は、腸粘膜の透過性増大を媒介して、感染した被験者に下痢を含む症状を惹起する。Ｆａｓａｎｏら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．」第８巻、５２４２〜５２４６頁、１９９１年。ラビットの回腸粘膜で試験したとき、ＺＯＴは細胞間の接着結合の構造を調節することにより、腸の透過性を増大させた。より最近、ＺＯＴは、腸粘膜において接着結合を可逆的に開くことができることが見出された。ＺＯＴは鼻粘膜において接着結合を可逆的に開くことができることも報告された。米国特許第５，９０８，８２５号。
【００８５】
本発明の方法及び組成物において、ＺＯＴ並びにＺＯＴ活性のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能する種々のＺＯＴ類似体及び模倣体は、鼻粘膜の中への又はそれを通過する傍細胞吸収を増大させることにより、生物活性薬剤の経鼻送達を増強するために有用である。この関係で、ＺＯＴは、通常、接合タンパク質ＺＯ１の変化した局在化により特徴づけられる接着結合の構造再組織化を惹き起すことにより作用する。本発明のこれらの局面において、ＺＯＴは、実質的な副作用なしで鼻粘膜の透過性を可逆的に増大させることにより、活性薬剤の有意に増強された吸収を生ずるのに効果的な量で、生物活性薬剤と共投与又は組合せ製剤化される。
【００８６】
血管拡張剤及び方法
本発明の共投与及び組合せ製剤化方法並びに組成物において有益な効用を示すさらに他のクラスの吸収増強剤は、血管作用性化合物、より特別には血管拡張剤である。これらの化合物は、本発明において、粘膜下の血管系の構造および生理機能を調節するように機能して、グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体並びに他の生物活性薬剤の粘膜上皮の中への若しくはそれを通過する及び／又は特定の標的組織若しくは区画（例えば、全身的循環又は中枢神経系）への輸送速度を増大させる。
【００８７】
本発明において使用する血管拡張剤は、細胞質内カルシウムの減少、一酸化窒素（ＮＯ）の増加によるか又はミオシン軽鎖キナーゼの阻害によるかのいずれかにより通常、粘膜下血管の弛緩を惹起する。それらは一般的に９クラスに分けられる：即ちカルシウムアンタゴニスト、カリウムチャンネル開口固定薬、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシン−ＩＩ受容体アンタゴニスト、α−アドレナリン作動性及びイミダゾール受容体アンタゴニスト、β１−アドレナリン作動性アゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、エイコサノイド並びにＮＯ供与体である。
【００８８】
化学的相違にも拘らず、カルシウムアンタゴニストの薬物動態学的性質は同様である。全身的循環中への吸収は高く、したがってこれらの薬剤は肝臓によりかなりの初回通過代謝を受け、薬物動態に個人差が生ずる。ジヒドロピリシン型の比較的新しい薬剤（アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニルバジピン、ニソルジピン及びニトレンジピン）を例外として、カルシウムアンタゴニストの半減期は短い。したがって、これらの多くに対して有効薬剤濃度を維持するためは、本明細書中他の場所で説明するように、反復投与又は制御放出製剤による送達が必要になり得る。カリウムチャンネル開口固定薬ミノキシジルによる治療も潜在的副作用により投与様式及びレベルが制限されることがある。
【００８９】
ＡＣＥ阻害剤は、アンジオテンシン−Ｉのアンジオテンシン−ＩＩへの変換を防止し、レニン産生が増大したときに最も有効である。ＡＣＥは、強力な内因性血管拡張剤ブラディキニンを不活性化するキニナーゼ−ＩＩと同一であるから、ＡＣＥ阻害はブラディキニン分解の減少の原因になる。動物モデルで、ＡＣＥ阻害剤は、心臓線維症及び心室肥大を予防し逆転することにより、心保護的且つ心修復的効果の加わった利点を提供する。大部分のＡＣＥ阻害剤の主要な排除経路は腎臓による排泄である。したがって、腎臓機能障害は低下した排除を伴い、中等度から重症の腎機能障害を有する患者においては２５から５０％の投与量削減が勧められる。
【００９０】
ＮＯ供与体に関して、これらの化合物は、粘膜透過性に対するそれらの付加的効果のために、本発明において特に有用である。上記のＮＯ供与体に加えて、ＮＯ／求核剤と称する求核剤とＮＯとの錯体即ちＮＯＮＯエートが、生理的ｐＨで水溶液に溶解されたときに、自発的に若しくは非酵素的にＮＯを放出する。対照的に、ニトログリセリンなどのニトロ血管拡張剤は、ＮＯ放出のために特異的酵素活性を必要とする。ＮＯＮＯエートは、所定の化学量論的に、予測できる速度で、ジエチルアミン／ＮＯに対する３分未満からジエチレントリアミン／ＮＯ（ＤＥＴＡＮＯ）に対する約２０時間の範囲でＮＯを放出する。
【００９１】
本発明のある方法及び組成物において、選択された血管拡張剤は、活性薬剤の粘膜吸収を増強させて被験者の標的組織又は区画（例えば、肝臓、肝門脈、ＣＮＳ組織若しくは液、又は血漿）に達するのに効果的な量で、１つ又は複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに他の生物活性薬剤と共投与され（例えば、全身的に又は鼻内に、同時に又は組み合わせて有効な一時的会合で）又は組み合せて製剤化される。
【００９２】
選択的輸送増強剤及び方法
本発明の組成物及び送達方法は、１つ又は複数の生物活性薬剤の輸送を促進する選択的輸送増強剤を場合により組み入れてもよい。これらの輸送増強剤は、本明細書中で開示した１つ又は複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体との組合せ製剤化又は共投与プロトコルにおいて、１つ又は複数の追加的生物活性薬剤の粘膜輸送障壁を通過する送達を協調的に増強し、被験者の標的組織または区画（例えば、粘膜上皮、肝臓、ＣＮＳ組織若しくは液、又は血漿）に達する活性薬剤の粘膜送達を増強するために利用することができる。あるいは、輸送増強剤は、組合せ製剤化又は共投与プロトコルにおいて、１つ又は複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体の経粘膜送達を直接的に増強するために利用することができるが、追加的生物活性薬剤の送達は増強されることもあり、されないこともある。
【００９３】
本発明のこの局面において使用するための代表的な選択的輸送増強剤は、グリコシド、糖含有分子、及び上皮輸送障壁成分と特異的に相互作用することが知られているレクチン結合剤などの結合剤を含むが、これらに限定はされない。例えば、受容体媒介相互作用により細胞表面の糖部分に結合する種々の植物及び細菌レクチンを含む特異的「生体付着性」リガンドは、本発明における生物活性薬剤の経粘膜例えば経鼻送達を促進するための担体又は複合輸送媒介物質として利用することができる。本発明において使用するためのある生体付着性リガンドは、特定化された細胞輸送過程により付着性リガンドの選択的取込み（エンドサイトーシス又はトランスサイトーシス）を開始させる、上皮標的細胞への生体シグナルの伝達を媒介するであろう。したがって、これらの輸送媒介物質は、１つ又は複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに他の生物活性薬剤の粘膜上皮中への及び／又はそれを通る直接的な選択的取込みを刺激する「担体系」として利用することができる。これらの及び他の選択的輸送増強剤は、本発明の高分子生物薬（特にペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドベクタ）の経粘膜送達を著しく増強する。レクチンは、真核細胞の糖タンパク質及び糖脂質の表面に見出される特異的な糖に結合する植物タンパク質である。レクチンの濃縮された溶液は、「ムコトラクティブ（ｍｕｃｏｔｒａｃｔｉｖｅ）」効果を有し、種々の研究により、レクチン及びレクチン複合体（例えば、金コロイド粒子に結合したコンカナバリンＡ）の粘膜表面を通過する急速な受容体媒介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）が示されている。それに加わる研究により、レクチンの取込み機構はｉｎ  ｖｉｖｏで腸内薬物ターゲティングに利用され得ることが報告されている。これらの研究のあるものにおいて、ポリスチレンナノ粒子（５００ｎｍ）がトマトレクチンに共有結合で結合され、ラットに経口投与後の改良された全身的取込みが生ずることが報告された。
【００９４】
植物レクチンに加えて、微生物付着及び侵入因子は、本発明の経粘膜送達方法及び組成物において、付着性／選択的輸送担体として使用される候補の豊富な資源を提供する。２つの成分が細菌付着過程にとって必要であり、「アドヘシン」（付着又はコロニ化因子）及び宿主細胞表面上の受容体である。粘膜感染を起こす細菌は、上皮表面に付着する前に粘液層に侵入する必要がある。この付着は、通常、細菌の繊毛又はピリ繊毛構造により媒介されるが、他の細胞表面成分もこの過程に参加し得る。付着性細菌は、増殖及びシグナル伝達機構（毒素の支援により又はそれなしで）による標的細胞内部における一連の生化学的反応の開始により、粘膜上皮にコロニを形成する。これらの侵入機構に関連して、種々の細菌及びウイルスにより独自に産生される広範囲の種々の生体付着タンパク質（例えば、インベーシン、インターナリン）が知られている。これらは、そのような微生物の宿主種及びさらに特に標的組織に対する印象的な選択性を有する細胞外付着を可能にする。そのような受容体リガンド相互作用により伝達されたシグナルは、完全な生きている微生物のエンドサイトーシス及びトランスサイトーシス過程による上皮細胞中への、及び最終的にはそれを通る輸送を開始させる。そのような自然で起こる現象は、本明細書中での教示にしたがって、粘膜上皮中への若しくはそれを通過する及び／又は薬物作用の指定された他の標的部位への生物活性薬剤の増強された送達のために利用することができる（例えば、グルコース調節ペプチドなどの生物活性薬剤とアドヘシンとを錯体形成させることにより）。
【００９５】
上皮表面にレクチン様の特異的な様式で結合する種々の細菌及び植物毒素も、本発明の方法及び組成物において有用である。例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）は、ＲＭＥにより宿主細胞に急速に入る。同様に、非耐熱性の毒素である大腸菌のＢサブユニットは、高度に特異的なレクチン様の様式で、腸上皮細胞の刷子縁に結合する。この毒素の取込み及び腸細胞の基底面へのトランスサイトーシスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで報告されている。他の研究者らは、大腸菌にジフテリア毒素の膜透過ドメインをマルトース結合融合タンパク質として発現させ、それを高分子量ポリ（Ｌ−リシン）に化学的に結合した。その結果生じた複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでレポータ遺伝子の内在化を媒介するために首尾よく使用される。これらの例に加えて、黄色ブドウ球菌は、スーパー抗原及び毒素の両方として作用する一組のタンパク質（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、ＳＥＢ、毒性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１））を産生する。これらのタンパク質に関する研究により、Ｃａｃｏ−２細胞中のＳＥＢ及びＴＳＳT−１の投与量依存性の亢進したトランスサイトーシスが報告されている。
【００９６】
ウイルスヘマグルチニンは、本発明の方法及び組成物における生物活性薬剤の経粘膜送達を促進する他のタイプの輸送剤を含む。多くのウイルス感染における最初の段階は、表面タンパク質（ヘマグルチニン）の粘膜細胞への結合である。これらの結合タンパク質は、ロタウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、アデノウイルス、ジャガイモ葉巻ウイルス及びレオウイルスを含む大部分のウイルスについて同定されている。これらの及び他の代表的ウイルスヘマグルチニンは、本明細書中で開示した１つ又は複数のグルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体との組合せ製剤（例えば、混合物又は複合製剤）又は共投与プロトコルにおいて、１つ又は複数の追加の生物活性薬剤の経粘膜送達を協調的に促進するために利用することができる。あるいは、ウイルスヘマグルチニンは、組合せ製剤又は共投与プロトコルにおいて、１つ又は複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体の経粘膜送達を直接的に増強するために利用することができる。ただし、追加の生物活性薬剤の送達は増強されることもされないこともある。
【００９７】
種々の内因性の選択的輸送媒介因子も、本発明において使用可能である。哺乳類細胞は、特異的基質の内在化を促進して、これらを所定の目標区画に向ける機構の組合せを発達させている。まとめて、膜変形のこれらの過程は、「エンドサイトーシス」と命名され、食作用、飲作用、受容体媒介エンドサイトーシス（クラスリン媒介ＲＭＥ)、及びポトサイトーシス（非クラスリン媒介ＲＭＥ）を含む。ＲＭＥは、高度に特異的な細胞生物学的過程であり、それにより、その名の通り、種々のリガンドが細胞表面受容体に結合し、それに続いて内在化され、細胞内部で輸送される。多くの細胞で、膜表面全体が内在化されて３０分未満で置き換わるほどエンドサイトーシス過程が活発である。２つのクラスの受容体が、細胞膜中のそれらの配向に基づき提唱されている。即ちＩ型受容体のアミノ末端は膜の細胞外部に位置するが、ＩＩ型受容体はこの同一のタンパク質の尾部を内部環境に有するという提唱である。
【００９８】
本発明のさらに他の態様は、経粘膜送達された生物活性薬剤のＲＭＥの担体又は刺激剤としてトランスフェリンを利用する。８０ｋＤａの鉄含有糖タンパク質であるトランスフェリンは、ＲＭＥにより細胞中に効率的に取り込まれる。トランスフェリン受容体は、大部分の増殖中の細胞の表面に、赤芽球及び多くの種類の腫瘍に増加した数で見出される。トランスフェリン（Ｔｆ）及びトランスフェリン複合体のトランスサイトーシスは、カビの代謝物ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の存在で増強されると報告されている。他の研究で、ＢＦＡ処理は、ＭＤＣＫ細胞でリシン及びＨＲＰ両者の先端エンドサイトーシスを急速に増加させると報告されている。したがって、ＢＦＡ及び受容体媒介輸送を刺激する他の薬剤は、本発明の方法において、組合せ製剤化された（例えば、複合体化された）及び／又は共投与される薬剤として、グルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体を含む生物活性薬剤の受容体媒介輸送を増強するために利用することができる。
【００９９】
ポリマ状送達媒体及び方法
本発明のある局面において、本明細書中で開示したグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに他の生物活性薬剤、並びに上記の送達増強剤は、個別に又は組み合わされて、担体又は基剤として機能する生体適合性ポリマを含む経粘膜（例えば経鼻）投与製剤中に組み込まれる。そのようなポリマ担体には、他のポリマ形態の中で、ポリマ粉末、マトリックス又は微粒子化送達媒体が含まれる。ポリマは、植物、動物、又は合成由来のものでよい。しばしばポリマは架橋されている。さらに、これらの送達系において、グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体は、それらがポリマに共有結合で結合されて簡単な洗浄によりポリマから分離しないようにできる様式で官能化することができる。他の態様において、ポリマは酵素阻害剤又は生物活性薬剤を分解又は不活性化し得る他の薬剤及び／又は送達増強剤で化学的に修飾される。ある製剤において、ポリマは、部分的又は完全に水不溶性であるが、水で膨潤し得るポリマ例えばヒドロゲルである。本発明のこの局面において有用なポリマは、望ましくは水と相互作用性及び／又は親水性の性質で、大量の水を吸収し、それらは、水又は水性媒質と接触して水との平衡に達するのに十分な時間置かれたときに、しばしばヒドロゲルを形成する。より詳細な態様において、ポリマは、過剰の水と接触して置かれたときに、室温で水に曝されたときの平衡で、水を自重の少なくとも２倍吸収するヒドロゲルである。米国特許第６，００４，５８３号。
【０１００】
生分解性ポリマを主成分とする薬剤送達系は、そのような系は加水分解により又は酵素反応により無毒性分子に分解されるので、多くの生物医学用途において好ましい。分解速度は生分解性ポリママトリックスの組成を操作することにより制御される。したがって、これらのタイプの系は、生物活性薬剤の長期間放出に対してある設定で使用することができる。ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、及び（Ｄ，Ｌ−乳酸−グルコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）などの生分解性ポリマは、これらのポリマの分解生成物が低毒性であることが見出されて以来、可能性ある薬剤担体として相当の注意を惹いてきた。体の正常な代謝機能の間に、これらのポリマは二酸化炭素と水に分解する。これらのポリマは優れた生体適合性も示した。
【０１０１】
グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体並びに本明細で開示した他の生物活性薬剤、並びにオプションの送達増強剤の生物活性を持続させるために、これらの薬剤を、ポリママトリックス例えばポリオルトエステル、ポリアンハイドライド、又はポリエステル中に組み込むことができる。このことは、例えばポリママトリックスの分解により決定される活性薬剤の持続された活性及び放出をもたらす。合成ポリマの内部への生物治療剤分子のカプセル化は貯蔵中および放出中それらを安定化することができるが、ポリマ系放出技法の最大の障碍は、熱、超音波又は有機溶媒をしばしば伴う製剤化工程中の治療剤分子の活性損失である。
【０１０２】
本発明において使用を考慮される吸収促進ポリマは、変化、改変又はブレンドが、吸水、ヒドロゲル形成、及び／又は化学的安定性などの有用な用途に対する所望の性質に悪影響を及ぼさない限り、上記のタイプのポリマの誘導体及び化学的又は物理的に改変した変種に加えて、他の天然に生ずる又は合成ポリマ、ガム、樹脂、及び他の薬剤、並びにこれらの材料の互いの又は他のポリマとのブレンドを含むことができる。本発明のより詳細な局面において、ナイロン、アクリラン、及び他の通常は疎水性の合成ポリマが、反応により十分に改変されて、水膨潤性になり且つ／又は水性媒質中で安定なゲルを形成することができる。
【０１０３】
本発明の吸収促進ポリマは、次のビニルモノマ即ち、アクリル及びメタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート又はメタクリレート、ビニルピロリドンの種々の組合せに基づくホモ及びコポリマの群のポリマ、並びにポリビニルアルコール、及びそのコポリマ及びターポリマ、ポリ酢酸ビニル、それと上に掲載したモノマ及び２−アクリルアミド−２−メチル−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ（登録商標））とのコポリマ及びターポリマを含むことができる。上に掲載したモノマと、アクリル又はメタクリルアミド、エステル基が直鎖又は分岐鎖アルキル、１から６個の炭素のアルキル置換基を含むことができる４つ以下の芳香族環を有するアリールに由来するアクリル酸又はメタクリル酸エステル、ステロイド系、硫酸エステル、リン酸エステルモノマ、又はＮ，Ｎ−ジメチルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノアルキル（メタ）アクリレート、塩化（メタ）アクリロキシアルキルトリメチルアンモニウム、塩化（メタ）アクリロキシアルキルジメチルベンジルアンモニウムなどのカチオン性モノマなどの共重合可能な官能性モノマとのコポリマは非常に有用である。
【０１０４】
本発明において使用する追加の吸収促進ポリマは、デキストラン、デキストリンとして分類されるもの、及び天然ゴム及び樹脂として分類される材料のクラス由来のもの、又は天然ポリマのクラス由来のもの、例えば、加工したコラーゲン、キチン、キトサン、プルラン、ズーグラン、アルギン酸塩及び「ケルコロイド」（ポリエチレングリコール修飾アルギン酸塩）などの修飾アルギン酸塩、「ケロコゲル」などのゲランガム、「ケルトロール」などのキサンタンガム、エラスチチン、アルファヒドロキシ酪酸塩及びそのコポリマ、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリ乳酸及びグリコール酸などである。
【０１０５】
本発明において応用し得る非常に有用なクラスのポリマは、少なくとも１つの活性化された炭素−炭素オレフィン系二重結合と少なくとも１つのカルボキシル基を含むオレフィン系不飽和カルボン酸である：即ち、モノマ分子中に、カルボキシル基に関してα−β位に又は末端メチレン基の部分としてのいずれかで存在することにより重合中に容易に機能するオレフィン性二重結合を含む酸又は容易に酸に変換される官能基である。このクラスのオレフィン性不飽和酸は、アクリル酸そのもの、α−シアノアクリル酸、β−メタクリル酸（クロトン酸）、α−フェニルアクリル酸、β−アクリロキシプロピオン酸、ケイ皮酸、ｐ−クロロケイ皮酸、１−カルボキシ−４−フェニルブタジエン−１，３、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、グルタコン酸、アコニチン酸、マレイン酸、フマル酸、及びトリカルボキシエチレンにより代表されるアクリル酸類のような材料を含む。本発明において使用する用語「カルボン酸」は、ポリカルボン酸及び無水マレイン酸などこれらの酸の無水物を含み、酸無水物基は同じカルボン酸分子に位置する２つのカルボキシル基から１分子の水の脱離することにより形成される。
【０１０６】
本発明において吸収増強剤として有用な代表的アクリル酸エステルには、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸イソブチル、メタクリル酸メチル、エタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸オクチル、アクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ノニル、アクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ｎ−ヘキシル等が含まれる。高級アクリル酸アルキルエステルは、アクリル酸デシル、メタクリル酸イソデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸ベヘニル及びアクリル酸メリシル及びそのメタクリル酸エステル版である。２つ又は３つ以上の長鎖アクリル酸エステルの混合物は、カルボン酸モノマの１つと具合よく重合させることができる。他のコモノマは、α−オレフィンを含むオレフィン、ビニルエーテル、ビニルエステル、及びそれらの混合物を含む。
【０１０７】
アクリル系ニトリル類を含む他のビニリデンモノマも、本発明の方法及び組成物において、被験者の標的組織又は区画（例えば、肝臓、肝門静脈、ＣＮＳ組織若しくは液、又は血漿）への活性薬剤の送達を増強することを含む、１つまたは複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに他の生物活性薬剤の送達及び吸収を増強するための吸収促進剤として使用することができる。有用なα，β−オレフィン性不飽和ニトリル類は、好ましくは、アクリロニトリル、メタクリロニトリルなどの３から１０個の炭素原子を有するモノオレフィン性不飽和ニトリル類である。最も好ましいものは、アクリロニトリル及びメタクリロニトリルである。モノオレフィン性不飽和アミドを含む３から３５個の炭素原子を含むアクリルアミド類も使用できる。代表的アミドには、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−シクロヘキシルアクリルアミド、窒素上のアルキル基が８から３２個の炭素原子を含む高級アルキルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−プロパノールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−メチロールマレイミド、Ｎ−メチロールマレアミン酸エステル、Ｎ−メチロール−ｐ−ビニルベンズアミドなどの４から１０個の炭素原子を有するものを含むα，β−オレフィン性不飽和カルボン酸のＮ−アルキロールアミドを含むアクリルアミド類が含まれる。
【０１０８】
さらに他の有用な吸収促進材料は、２から１８個の炭素原子を含む、より好ましくは２から８個の炭素原子を含むα−オレフィン；４から１０個の炭素原子を含むジエン；酢酸ビニルなどのビニルエステル及びアリルエステル；スチレン、メチルスチレン及びクロロスチレンなどのビニル芳香族化合物；ビニルメチルエーテルおよびビニルメチルケトンなどのビニル及びアリルエーテル類及びケトン類；クロロアクリル酸エステル；アクリル酸α−シアノメチル、及びアクリル酸α−、β−、及びγ−シアノプロピルなどのアクリル酸シアノアルキル；アクリル酸メトキシエチルなどのアルコキシアクリレート；アクリル酸クロロエチルなどのハロアクリレート；ハロゲン化ビニル及び塩化ビニル、塩化ビニリデン等；ジビニルエーテル、ジエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、メチレン−ビス−アクリルアミド、アリルペンタエリスリトールなどのジビニル類、ジアクリレート類及び他の多官能性モノマ；及びビニルホスホン酸ビス（β−クロロエチル）などのアルケニルホスホン酸ビス（β−ハロアルキル）等であり、当業者に知られている。カルボキシ含有モノマは少量成分であって他のビニリデンモノマが主成分として存在するコポリマは、本明細書で開示した方法により容易に調製される。
【０１０９】
本発明においてヒドロゲルが吸収増強剤として利用されるとき、これらは水相互作用性及び膨潤性の、アクリル酸及びメタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＡ）又はメタクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、及びビニルピロリドンの群からの合成コポリマで構成することができる。特にペプチド又はタンパク質の送達に有用なポリマの特に実例となる例は、次のタイプのポリマである：（メタ）アクリルアミドと０．１％から９９ｗｔ％の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリルアミドと０．１〜７５ｗｔ％の塩化（メタ）アクリロキシエチルトリメチルアンモニウム；（メタ）アクリルアミドと０．１〜７５ｗｔ％の（メタ）アクリルアミド；アクリル酸と０．１〜７５ｗｔ％の（メタ）アクリル酸アルキル；（メタ）アクリルアミドと０．１〜７５ｗｔ％のＡＭＰＳ．ＲＴＭ．（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ Ｃｏｒｐ．の商標）；（メタ）アクリルアミドと０から３０ｗｔ％のアルキル（メタ）アクリルアミド及び０．１〜７５ｗｔ％のＡＭＰＳ．ＲＴＭ．；（メタ）アクリルアミドと０．１〜９９ｗｔ％のＨＥＭＡ；（メタ）アクリルアミドと０．１から７５ｗｔ％のＨＥＭＡ及び０．１から９９％の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリル酸と０．１〜９９ｗｔ％のＨＥＭA；５０ｍｏｌ％のビニルエーテルと５０ｍｏｌ％の無水マレイン酸；（メタ）アクリルアミドと０．１から７５ｗｔ％の塩化（メタ）アクリロキシアルキルジメチルベンジルアンモニウム；（メタ）アクリルアミドと０．１から９９ｗｔ％のビニルピロリドン；（メタ）アクリルアミドと５０ｗｔ％のビニルピロリドン及び０．１〜９９．９ｗｔ％の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリル酸と０．１から７５ｗｔ％のＡＭＰＳ．ＲＴＭ及び０．１〜７５ｗｔ％のアルキル（メタ）アクリルアミド。上記の例において、アルキルはＣ１からＣ３０、好ましくは、Ｃ１からＣ２２の直鎖又は分岐、及びＣ４からＣ１６の環状を意味し、（メタ）が使用されている場合、メチル基を有する又は有しないモノマが含まれていることを意味する。他の非常に有用なヒドロゲルポリマは、ポリ（ビニルピロリドン）デンプン、カルボキシメチルセルロース及びポリビニルアルコールの膨潤性であるが不溶性の変種である。
【０１１０】
本発明において有用なその他のポリマ性ヒドロゲルには、（ポリ）（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル；アニオン性及びカチオン性ヒドロゲル；ポリ（電解質）錯体；酢酸エステル残基の少ないポリ（ビニルアルコール）；架橋した寒天と架橋したカルボキシメチルセルロースとの膨潤性混合物；僅かに架橋した寒天と混合されたメチルセルロースを含む膨潤性組成物；無水マレイン酸とスチレン、エチレン、プロピレン若しくはイソブチレンとの微細化されたコポリマの分散により生成される水膨潤性コポリマ；Ｎ−ビニルラクタムの水膨潤性ポリマ；カルボキシメチルセルロースの水膨潤性ナトリウム塩等が含まれる。
【０１１１】
本発明における生物活性薬剤の経粘膜送達のための親水性ヒドロゲル形成に有用な他のゲル化可能な液体吸収性且つ保持性ポリマには、ペクチン；寒天、アカシアガム、カラヤガム、トラガカントガム、アルギン、及びグアー及びそれらの架橋型などの多糖類；アクリル酸ポリマ、コポリマ及び塩誘導体、ポリアクリルアミド；水膨潤性インデン無水マレイン酸ポリマ；デンプングラフトコポリマ；自重の約２から４００倍の吸水率を有するアクリル酸エステル型ポリマ及びコポリマ；ポリグルカンのジエステル；架橋されたポリ（ビニルアルコール）とポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）との混合物；ポリオキシブチレン−ポリエチレンブロックコポリマゲル；カロブガム；ポリエステルゲル；ポリ尿素ゲル；ポリエーテルゲル；ポリアミドゲル；ポリイミドゲル；ポリペプチドゲル；ポリアミノ酸ゲル；ポリセルロース性ゲル；架橋インデン−無水マレイン酸アクリル酸エステルポリマ；及び多糖類が含まれる。
【０１１２】
本発明において使用する合成ヒドロゲルポリマは、数種類のモノマの数種類の比率での無限の組合せにより作製することができる。ヒドロゲルは、架橋することができて、一般に液体を吸い込み吸収し、拡大した平衡状態まで膨潤し膨張する能力を有する。ヒドロゲルは通常鼻粘膜表面に送達されて膨潤又は膨張し、水を自重の２〜５、５〜１０、１０〜５０、５０〜１００倍以上吸収する。与えられたヒドロゲルの膨潤率の最適の程度は、ポリマにより運搬される又はその中に捕捉され若しくは封入される活性薬剤の分子量、サイズ、溶解度及び拡散特性のような要因並びに個々のポリマに付随する特異的孔間隔及び共同分子鎖運動に依存して個別の生物活性薬剤に対して決定されるであろう。
【０１１３】
本発明において有用な親水性ポリマは、水不溶性であるが水膨潤性である。そのような水で膨潤したポリマは、通常ヒドロゲル又はゲルと称される。そのようなゲルは、ポリマを適当な架橋剤で架橋させる方法により水溶性ポリマから容易に製造することができる。しかしながら、安定なヒドロゲルは、ｐＨ、温度及び／又はイオン濃度の所定条件下で、当技術分野で知られた方法により、特定のポリマから製造することもできる。典型的には、ポリマは架橋され、即ち、ポリマが良好な親水性を有する程度に架橋されて、物理的統合性を向上し（同一の又は類似のタイプの非架橋ポリマに比較して）、ゲルのネットワーク内に関心ある生物活性薬剤及びそれと共投与するサイトカイン又は酵素阻害剤などの追加の化合物を保持する改良された能力を示す一方、活性薬剤を適当な位置及び時期に放出する能力を保持する。
【０１１４】
本発明において使用するヒドロゲルポリマは、一般に、コポリマを形成するモノマの重量を基準にして０．０１から２５重量％、より好ましくは０．１から２０重量％、及びよりしばしば０．１から１５重量％の架橋剤の量で、二官能性架橋により架橋されている。架橋剤の他の有用な量は０．１から１０重量％である。トリ、テトラ又はそれを超える多官能性の架橋剤も利用することができる。そのような反応剤が使用されるときは、同等の架橋密度即ち、生物活性薬剤を効果的に含むために十分な、架橋度又はネットワーク特性を得るために必要な量はより少なくてよい。
【０１１５】
架橋は、含水液体の存在で膨潤する性能を有するポリマについて、共有結合、イオン結合又は水素結合でよい。そのような架橋剤及び架橋反応は当業者に知られており、多くの場合にポリマ系に依存する。したがって、架橋ネットワークは、不飽和モノマのフリーラジカル共重合により形成させることができる。ポリマ性ヒドロゲルはアルコール、酸、アミン、などのポリマに存在する官能基をグリオキサール、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド、ビスアンハイドライド等のような基と反応させることにより架橋を予め形成させたポリマによっても形成させることができる。
【０１１６】
ポリマは、任意のポリエン、例えば、デカジエン又はトリビニルシクロヘキサン；Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス（アクリルアミド）などのアクリルアミド類；トリメチロールプロパントリアクリレートなどの多官能性アクリル酸エステル；又は例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、アクリル酸アリル等を含む、少なくとも２つの末端ＣＨ２＜基を含む多官能性ビニリデンモノマで架橋することができる。ある態様において、コポリマの調製に使用する架橋性モノマは、１分子当り２つ以上のアルケニルエーテル基を有するポリアルケニルエーテルであり、それはオレフィン性二重結合が末端メチレン基に結合して存在するアルケニル基を場合により有し得る（例えば、少なくとも２個の炭素原子及び少なくとも２つのヒドロキシル基を含む多価アルコールのエーテル化により作製される）。この種の化合物は、塩化アリル又は臭化アリルなどのハロゲン化アルケニルを１つ又は複数の多価アルコールの強アルカリ性水溶液と反応させることにより製造することができる。生成物は、異なる数のエーテル基を有するポリエーテルの複雑な混合物であり得る。ポリエーテル架橋剤の有効性は、分子中の重合の可能性のある基の数と共に増大する。通常、１分子当り平均２つ以上のアルケニルエーテル基を含むポリエーテルが使用される。他の架橋性モノマには、例えば、ジアリルエステル類、ジメタリルエーテル類、アクリル酸アリル又はアクリル酸メタリル類及びアクリルアミド類、テトラビニルシラン、ポリアルケニルメタン、ジアクリレート、及びジメタクリレート、ジビニルベンゼンなどのジビニル化合物、リン酸ポリアリル、ジアリロキシ化合物、及び亜リン酸エステル類等が含まれる。代表的架橋剤は、アリルペンタエリスリトール、アリルスクロース、トリメチロールプロパントリアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、トリメチロールプロパンジアリルエーテル、ペンタエリスリトールトリアクリレート、テトラメチレンジメタクリレート、エチレンジアクリレート、エチレンジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート等である。アリルペンタエリスリトール、トリメチロールプロパンジアリルエーテル及びアリルスクロースは適当なポリマを与える。架橋剤が存在するとき、ポリマ混合物は、通常、カルボン酸モノマに加えた他のモノマの合計を基準にして約０．０１から２０重量％の間、例えば、重量で１％、５％又は１０％以上の架橋性モノマを含む。
【０１１７】
本発明のより詳細な局面において、グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体並びに本明細書で開示した他の生物活性薬剤の経粘膜送達は、徐放性の又は酵素的に若しくは生理学的に保護的な担体又は媒体中に、例えば、活性薬剤を分解酵素の作用から遮断するヒドロゲル中に、活性薬剤を保持することにより増強される。ある態様において、活性薬剤は、担体又は媒体に化学的手段により結合され、それに酵素阻害剤、サイトカインなどの追加される薬剤も混合又は結合されてもよい。あるいは、活性薬剤は、担体又は媒体例えばポリママトリックス中に十分な物理的封入により固定化することもできる。
【０１１８】
本発明において有用なヒドロゲルなどのポリマは、それと共に製剤化される活性薬剤の経鼻生体利用率を増強するために、ポリマ中に化学的に組み込まれたグリコシドなどの官能基の結合された薬剤を含むことができる。そのようなグリコシドの例は、グルコシド、フルクトシド、ガラクトシド、アラビノシド、マンノシド及びそれらのアルキル置換誘導体、並びにアルブチン、フロリシン、アミグダリン、ディジトニン、サポニン及びインジカンなどの天然のグリコシドである。代表的グリコシドをポリマに結合することができる数通りの方法がある。例えば、グルコシド又は他の類似の炭水化物のヒドロキシル基の水素をヒドロゲルポリマのアルキル基により置換してエーテルを形成させることができる。グリコシドのヒドロキシル基を反応させてポリマヒドロゲルのカルボキシル基をエステル化してその場でポリマ性エステルを形成させることもできる。他の取組み方はアセトブロモグルコースのコレスト−５−エン−３−β−オールとのマレイン酸のコポリマ上での縮合を利用することである。Ｎ−置換ポリアクリルアミドは活性化されたポリマとω−アミノアルキルグルコシドとの反応により合成することができる：（１）（炭水化物−スペーサ）（ｎ）−ポリアクリルアミド、擬多糖体；（２）（炭水化物−スペーサ）（ｎ）−ホスファチジルエタノールアミン（ｍ）−ポリアクリルアミド、ネオ糖脂質、ホスファチジルエタノールアミン誘導体；及び（３）（炭水化物−スペーサ）（ｎ）−ビオチン（ｍ）−ポリアクリルアミド。これらのビオチン化誘導体は、粘膜表面のレクチンに結合して、生物活性薬剤、例えば、ポリマ封入グルコース調節ペプチドの吸収を容易にすることができる。
【０１１９】
本発明のより詳細な局面において、１つ又は複数のグルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体並びに／又は本明細書で開示した他の生物活性薬剤（プロテアーゼ阻害剤、サイトカイン、細胞間接合生理機能の追加的調節剤などの補助的活性薬剤を場合により含む）が、改変されてポリマ性担体又はマトリックスに結合される。これは、例えば、ペプチド又はタンパク質活性薬剤及び他のオプションの薬剤を架橋されたポリマネットワーク中に化学的に結合することにより達成することができる。グリコシド含有分子などの相互作用性薬剤でポリマを別々に化学的に改変することも可能である。ある局面において、生物活性薬剤及びオプションの補助的薬剤を官能化することができる：即ち、その場合、その活性薬剤に適当な反応性基の存在が確認されるか又は化学的に付加される。最も多くの場合、エチレン性の重合性基が付加された後、官能化された活性薬剤がモノマ及び架橋剤と、溶液重合（通常水中）、乳化、懸濁又は分散重合などの標準的重合方法を使用して共重合される。しばしば、官能化剤は、活性薬剤の数か所が官能化されることを確実にするのに十分高い官能基又は重合性基濃度で供給される。例えば、１６のアミン部位を含むポリペプチドにおいては、少なくとも２、４、５、７及び８まで又はそれを超える部位を官能化することが一般的には望ましい。
【０１２０】
官能化後、官能化された活性薬剤は、関心のあるポリマが形成される反応剤を含むモノマ及び架橋剤と混合される。次にこの媒質中で重合を起こさせて、結合された活性薬剤を含むポリマを創生する。次にポリマを水又は他の適当な溶媒で洗浄し、他の方法で精製して痕跡量の未反応不純物を除去し、必要ならば、攪拌、篩通し、超音波処理、又は他の適当な手段などの物理的手段で所望の粒子サイズに粉砕または破砕する。次に、溶媒を、通常は水であるが、活性薬剤を変性させたり分解したりしない様式で除去する。１つの望ましい方法は凍結乾燥（凍らせて乾燥する）であるが、他の方法も使用可能であり、使用されてよい（例えば、真空乾燥、風乾、噴霧乾燥等）。
【０１２１】
本発明におけるペプチド、タンパク質及び他の活性薬剤に重合性基を導入するために、使用可能なアミノ、ヒドロキシル、チオール及び他の反応性基を、求電子剤を含む不飽和基と反応させることが可能である。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、トリクロロフェニルカーボネートなどの活性カーボネート、トレシレート、オキシカルボニルイミダゾール、エポキシド、イソシアネート、及びアルデヒドを含む不飽和モノマ、並びに不飽和カルボキシメチルアジド及び不飽和オルトピリジル−ジスルフィドがこの分類の反応剤に属する。不飽和反応剤の実例になる例は、アリルグリシジルエーテル、塩化アリル、臭化アリル、ヨウ化アリル、塩化アクリロイル、アリルイソシアネート、塩化アリルスルホニル、無水マレイン酸、無水マレイン酸のコポリマ、及びアリルエーテル等である。
【０１２２】
アルデヒドを例外として、全てのリシン活性誘導体は、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのヒドロキシル基及びシスチンのチオール基などの他のアミノ酸と、局所的環境がこれらの基の求核性を増強させていれば、通常は反応し得る。アルデヒド含有官能化反応剤はリシンに特異的である。リシン、システイン、チロシンの使用可能な基とのこれらのタイプの反応は、文献に広く記録されており、当業者に知られている。
【０１２３】
アミノ基を含む活性薬剤の場合には、そのような基を塩化アクリロイルなどの塩化アシロイルと反応させて反応させた薬剤に重合性アクリル基を導入することが便利である。次に、アクリルアミドとアクリル酸とのコポリマの架橋中などポリマの調製中に、官能化された活性薬剤が、アクリル基によってポリマに取り付けられ、それに結合する。
【０１２４】
本発明のさら他の局面において、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド及びｉｎ  ｖｉｖｏで生物活性である他の分子を含む生物活性薬剤は、１つ又は複数の活性薬剤を、親水性部分例えば直鎖状ポリアルキレングリコールと親油性部分との両方を不可欠な部分として含むポリマに共有結合で結合することにより複合化安定化される（例えば、米国特許第５，６８１，８１１号を参照されたい）。一局面において、生物活性薬剤は、（ｉ）直鎖状ポリアルキレングリコール部分、及び（ｉｉ）親油性部分を含むポリマに共有結合で結合され、その中で、活性薬剤、直鎖状ポリアルキレングリコール部分及び親油性部分は、活性治療薬剤が酵素による分解にｉｎ  ｖｉｖｏでの増強された抵抗性（即ち、活性薬剤がそれに結合したポリマのない複合化していない状態での同様な条件下における安定性に比較して）を有するように配座の相互関係を整えられる。他の局面において、複合化安定化した製剤は、（ｉ）直鎖状ポリアルキレングリコール部分と、（ｉｉ）親油性部分とを含むポリソルベート複合体と共有結合で結合した生物活性薬剤を含む３次元配座を有し、その中で、活性薬剤、直鎖状ポリアルキレングリコール部分、及び親油性部分は、互いの関係において、（ａ）親油性部分が３次元配座において外部に接し得、且つ（ｂ）組成中の活性薬剤が「酵素による分解」に対してｉｎ  ｖｉｖｏでの増強された抵抗性を有するように、配座を整えられる。
【０１２５】
さらに関連する局面において、トリグリセリド骨格部分の炭素原子に結合したポリアルキレングリコールスペーサ基を通してトリグリセリド骨格部分に共有結合で結合された生物活性薬剤、及びトリグリセリド骨格部分の炭素原子に直接共有結合で又はポリアルキレングリコールスペーサ部分を通して共有結合でのいずれかで結合された少なくとも１つの脂肪酸部分を含む多リガンド結合複合体が提供される（例えば、米国特許第５，６８１，８１１号を参照されたい）。そのような多リガンド結合治療薬複合体において、トリグリセリド生物活性部分のα’及びβ炭素原子は、それに直接、又はポリアルキレングリコールスペーサ部分を通してそれに間接的のいずれかで共有結合で結合された脂肪酸部分を含むことができる。あるいは、脂肪酸部分は、トリグリセリド骨格部分のα及びα’炭素に直接又はポリアルキレングリコールスペーサ部分を通してかのいずれかで共有結合により結合することができ、生物活性治療薬はトリグリセリド骨格部分のγ炭素に共有結合で結合することができ、それに直接共有結合で結合されるか又はポリアルキレンスペーサ部分を通してそれに間接的に結合されるかのいずれかである。本発明の範囲内で、トリグリセリド骨格部分を含む多リガンド結合治療薬複合体に対して広範囲の構造的、組成的、及び配座的形態が可能であることが認識されるであろう。本発明の範囲内で、そのような多リガンド結合治療薬複合体において、生物活性薬剤を、アルキルスペーサ基又は別の許容されるスペーサ基を通してトリグリセリド改変骨格部分と都合よく共有結合で結合することができることは、さらに注目される。そのような関係で使用されるスペーサ基の許容性とは、立体的、組成的及び最終用途特異的許容特性を意味する。
【０１２６】
本発明のさらに追加される局面において、（ｉ）脂肪酸基と；（ｉｉ）ポリエチレングリコールに共有結合で結合した、例えば、ポリエチレングリコール基の適当な官能基に結合した生物活性薬剤若しくは部分を有するポリエチレングリコール基とを含む官能性基を、骨格のα、α’及びβ炭素原子に共有結合で結合しているトリグリセリド骨格を含むポリソルベート部分を含むポリソルベート複合体を含む複合化安定化された複合体が提供される。そのような共有結合による結合は、例えばポリエチレングリコール基のヒドロキシ末端官能基に直接的であるか、又はもう一つの選択肢として、共有結合による結合は、例えば、ポリエチレングリコール基のヒドロキシ末端を末端カルボキシ官能性スペーサ基と反応させてキャッピングし、その結果キャッピングされたポリエチレングリコールは末端カルボキシ官能性を有し、それに生物活性薬剤若しくは部分が共有結合で結合されることにより間接的であるかのいずれかであってよい。
【０１２７】
本発明のさらに追加の局面において、生理学的に適合性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で改変されたに糖脂質部分に共有結合で結合された、１つ若しくは複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに／又は本明細書で開示した他の生物活性薬剤を含む安定な水溶性の複合化安定化複合体が提供される。そのような複合体において、生物活性薬剤は、活性薬剤の遊離アミノ酸基で、生化学的加水分解及び／又はタンパク分解によりｉｎ  ｖｉｖｏで切断可能な不安定な共有結合により、生理学的適合性ＰＥＧ修飾糖脂質部分に共有結合で結合することができる。生理学的適合性ＰＥＧ修飾糖脂質部分は、ポリソルベートポリマ、例えば、モノパルミテート、ジパルミテート、モノラウレート、ジラウレート、トリラウレート、モノオレエート、ジオレエート、トリオレエート、モノステアレート、ジステアレート、及びトリステアレートからなる群から選択される脂肪酸エステル基を含むポリソルベートポリマを都合良く含むことができる。そのような複合体において、生理学的適合性ＰＥＧ修飾糖脂質部分は、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸及びステアリン酸からなる群から選択される脂肪酸を含む脂肪酸のポリエチレングリコールエーテル及び上記脂肪酸のポリエチレングリコールエステルからなる群から選択されるポリマを適当に含むことができる。
【０１２８】
材料の貯蔵及び製造
本発明のある局面において、本発明における組合せ製剤及び／又は共投与法は、荷電されたガラスに付着してそれにより容器中の有効濃度を減少させ得るペプチド及びタンパク質の有効量を含む。シラン処理された容器は、例えばシラン処理ガラス容器は、ポリペプチド又はタンパク質のガラス容器への吸着を減少させるために、最終製品の貯蔵に使用される。
【０１２９】
本発明のさらに追加の局面において、哺乳類被験者治療用のキットは、前記被験者における肥満、癌、又は癌に関係する栄養不良若しくはイスチング（ｉｓｔｉｎｇ）の１つ又は複数の症状を、許容されない副作用なしに軽減するのに有効な、哺乳類被験者への経粘膜送達のために製剤化された１つ又は複数のグルコース調節ペプチドの安定な医薬組成物を含む。そのキットは、１つ又は複数のグルコース調節ペプチド化合物を入れた医薬品バイアルをさらに含む。その医薬品バイアルは、医薬品グレードのポリマ、ガラス又は他の適当な材料で構成されている。医薬品バイアルは例えばシラン処理ガラスバイアルである。そのキットは、被験者の鼻粘膜表面への組成物の送達のための開口部をさらに備える。送達用開口部は、医薬品グレードのポリマ、ガラス又は他の適当な材料で構成されている。送達開口部は例えばシラン処理ガラスである。
【０１３０】
シラン処理技法は、シラン処理されるべき表面のための特別の清浄化技法と低圧のシラン処理工程とを併用する。シランは、気相の状態で、シラン処理されるべき表面の上昇された温度で存在する。この方法は、単層の特性を有する安定で均一な官能性シラン層を有する再現性ある表面を提供する。シラン処理された表面は、ポリペプチド又は本発明の経粘膜送達増強剤のガラスへの結合を防止する。
【０１３１】
この手順は、本発明のグルコース調節ペプチド組成物を保持するためのシラン処理医薬品バイアルを調製するために有用である。ガラストレイは、使用前に再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）ですすぐことにより清浄化する。次にシラントレイは９５％ＥｔＯＨですすぎ、アセトントレイはアセトンですすぐ。医薬品バイアルをアセトン中で１０分間超音波処理する。アセトン超音波処理後、薬品バイアルをｄｄＨ２Ｏトレイ中で少なくとも２回洗浄する。薬品バイアルを０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で１０分間超音波処理する。薬品バイアルがＮａＯＨ中で超音波処理されている間に、シラン溶液をフードの下で作製する（シラン溶液：８００ｍＬの９５％エタノール；９６Ｌの氷酢酸；２５ｍＬのグリシドキシプロピルトリメトキシシラン）。ＮａＯＨ超音波処理後、薬剤バイアルをｄｄＨ２Ｏトレイ中で少なくとも２回洗浄する。薬品バイアルをシラン溶液中で３から５分間超音波処理する。薬品バイアルを１００％ＥｔＯＨトレイ中で洗浄する。薬品バイアルを精製Ｎ２ガスで乾燥し、使用前に少なくとも２時間１００℃オーブン中で保管する。
【０１３２】
鼻噴霧製品製造工程は、約８５％の水に加えた、グルコース調節ペプチドを含まない鼻噴霧製剤成分を含む鼻噴霧希釈剤の調製を含むことができる。次に希釈剤のｐＨを測定し、必要ならば水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを４．０±０．３に調節する。鼻噴霧は、最終目標容積の約８５％の希釈剤のスクリューキャップ瓶への非無菌的移送により調製される。適当量のグルコース調節ペプチドを加え、完全に溶解されるまで混合する。ｐＨを測定し、必要ならば水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを７．０±０．３に調節する。最終目標容積に達するように十分な量の希釈剤を加える。スクリューキャップ瓶を満たしてキャップを固定する。製造工程の上記の記述は薬剤製品の初期の臨床用バッチを調製するために使用された方法を示す。この方法は、製造工程を最適化するための開発過程で改良されてよい。
【０１３３】
現在上市されている注射用グルコース調節ペプチドは、ＦＤＡ規制遵守のために滅菌製造条件を必要とする。注射又は注入用のインスリンを含む非経口投与は、滅菌された（無菌的）製造工程を必要とする。滅菌された薬品製造に関する現行の医薬品の製造及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）には、設計及び構成に関する特質基準（２１ＣＦＲ  §２１１．４２（２００５年４月１日））；成分薬物製品容器及び密閉の試験及び承認又は却下に関する基準（§２１１．８４）；微生物汚染の制御に関する基準（§ ２１１．１１３）；並びに他の特別な試験規定（§２１１．１６７）が含まれる。本発明の経鼻用製品などの非経口でない（非無菌的）製品は、これらの特化された無菌的製造条件を必要としない。容易に理解されるように、無菌的製造工程に対する要求は、非無菌的製品製造工程に必要とされるものよりも実質的に高く、それに対応してより経費がかかる。これらの経費は、より大なる設備投資並びにより高い製造原価を含み、即ち、無菌的製造のための余分の設備は追け加える場所及び換気を含み、無菌的製造に関連する余分の経費はより多くの人手、広範囲の品質管理及び品質保証並びに管理上の支援を含む。結果として、本発明のものなどの経鼻用グルコース調節ペプチド製品の製造原価は、非経口的投与されるグルコース調節ペプチド製品の原価よりもはるかに低い。本発明は、グルコース調節ペプチドの非滅菌製造工程に対する要求を満足させる。
【０１３４】
滅菌溶液は、必要量の活性化合物を適当な溶媒に、濾過滅菌に続いて必要に応じて上で列挙した成分の１つ又は組合せと共に組み入れることにより調製することができる。通常、分散液は、活性化合物を、基剤の分散媒及び上で列挙したものうち必要な他の成分を含む滅菌媒体中に組み入れることにより調製される。滅菌散剤の場合、調製方法は、有効成分に任意の所望の成分を加えた粉末を、予め滅菌濾過したその溶液から生成させる真空乾燥又は凍結乾燥を含む。微生物の作用の防止は、種々の抗菌及び抗カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により達成される。
【０１３５】
本発明の粘膜投与は、投与量及び副作用を制御しモニターする十分な防護手段があれば、患者の効果的な自己投与を可能にする。粘膜投与は、注射などの、苦痛があり患者を感染の可能性に曝し、薬剤の生体利用率の問題を呈し得る他の投与形態のある種の欠点も克服する。
【０１３６】
生体付着性送達媒体及び方法
本発明のある局面において、本発明における組合せ製剤及び／又は共投与法は、１つ又は複数の生物活性薬剤の経粘膜送達を増強する助剤化合物又は担体として有効量の無毒性生体付着剤を組み入れる。この関係の生体付着剤は、標的粘膜の１つ又は複数の成分又は表面に一般的又は特異的付着を示す。この生体付着剤は、生物活性薬剤の粘膜中への又はそれを通しての所望の濃度勾配を維持して、大きい分子（例えば、ペプチド及びタンパク質）でさえ粘膜上皮中へ又はそれを通して確実に浸透させる。通常、本発明の方法及び組成物における生体付着剤の利用は、粘膜上皮中への又はそれを通るペプチド及びタンパク質の透過率の２から５倍、しばしば５から１０倍の増大を生ずる。上皮透過のこの増大は、大きい高分子の、例えば、鼻上皮の基底部若しくは付近の細胞外区域又は血漿又はＣＮＳ組織若しくは液への効果的な経粘膜送達をしばしば可能にする。
【０１３７】
この増大された送達は、生物活性ペプチド、タンパク質及び他の高分子量治療薬種の送達の大きく改良された有効性を提供する。これらの結果は、化合物の親水性に一部依存し、それにより、より大なる浸透は、水不溶性化合物に比較して親水性の種で達成されるであろう。これらの効果に加えて、粘膜表面での薬剤残留を増強させる生体付着剤の利用は、遅延性薬物送達の蓄積機構を誘発することができ、それにより、化合物は、粘膜組織を通過して浸透するだけでなく、ひとたび表面における物質が消費し尽くされると粘膜表面へ逆拡散もする。
【０１３８】
種々の適当な生体付着剤が、経口投与のために当技術分野において開示されている。米国特許第３，９７２，９９５号；第４，２５９，３１４号；第４，６８０，３２３号；第４，７４０，３６５号；第４，５７３，９９６号；第４，２９２，２９９号；第４，７１５，３６９号；第４，８７６，０９２号；第４，８５５，１４２号；第４，２５０，１６３号；第４，２２６，８４８号；第４，９４８，５８０号；及び米国再発行特許第３３，０９３号で、これらは本発明の新規な方法及び組成物において使用できる。本発明の方法及び組成物における粘膜例えば経鼻送達基盤としての種々の生体付着性ポリマの可能性は、グルコース調節ペプチドを保持し放出するそれらの性能を測定することにより、並びにそれらの中への活性薬剤の組込みに続いて粘膜表面と相互作用する能力により、容易に評価することができる。それに加えて、よく知られた方法が、選択されたポリマの粘膜投与部位における組織との生体適合性を決定するために応用されるであろう。標的粘膜が粘液により覆われているとき（即ち、粘液分解又は粘液清浄化処理は存在しないで）、それは下に存在する粘膜上皮への結合リンクとして役立つことができる。したがって、本明細書で使用する用語「生体付着剤」は、本発明における生物活性薬剤の経粘膜送達を増強するために有用な粘膜付着性化合物も包含する。しかしながら、粘液ゲル層への付着により媒介される粘膜組織への付着性接触は、粘液層と下に存在する組織との間の不完全で一時的な結合により、急速な粘液浄化が起こる鼻内表面においては特に、限定され得る。この関係で、ムチン糖タンパク質は連続的に分泌され、細胞又は腺からの放出後直ちに粘弾性ゲルを形成する。付着性ゲル層の管腔表面は、しかしながら、機械的、酵素的及び／又は繊毛作用により絶えず侵食されている。そのような活動がより顕著な場合、又はより長い付着時間が望まれる場合、本発明の共投与法及び組合せ製剤化法は、本明細書中上で開示した粘液分解及び／又は繊毛静止方法若しくは薬剤をさらに組み入れることができる。
【０１３９】
通常、本発明において使用する粘膜付着性ポリマは、複雑であるが非特異的機構により湿潤粘膜組織表面に付着する天然又は合成高分子である。これらの粘膜付着性ポリマに加えて、本発明は、受容体媒介を含む特異的相互作用性により、粘液よりむしろ細胞表面に直接付着する生体付着剤を組み込んでいる方法及び組成物も提供する。この特異的様式で機能する生体付着剤の一例は、レクチンとして知られる化合物群である。鼻内上皮細胞膜の一部を形成し、「レクチン受容体」と見なし得る糖分子、例えば、糖タンパク質又は糖脂質を特異的に認識して結合する能力を有する糖タンパク質がある。
【０１４０】
本発明のある局面において、生物活性薬剤の経鼻送達を増強する生体付着剤材料は、親水性例えば、水溶性若しくは膨潤性のポリマの混合物又は湿潤粘液性表面に付着できるポリマの混合物を含む。これらの付着剤は、軟膏、ヒドロゲル（上を参照されたい）、薄いフィルム及び他の応用形態として製剤化することができる。しばしば、これらの付着剤は、活性薬剤の徐放性又は局所送達を実現するために、それらと混合した生物活性薬剤を有する。幾つかのものは、鼻粘膜を通して、例えば、その個体の循環系中への活性薬剤の浸透を容易にする追加成分と共に製剤化される。
【０１４１】
種々のポリマは、天然及び合成の両方とも、生理的条件下で粘液及び／又は粘膜上皮表面に顕著な結合を示す。この相互作用の強さは、機械的剥離又は剪断試験により容易に測定することができる。湿潤粘膜表面に適用されたとき、多くの乾燥した材料は、少なくとも僅かに自発的に付着するであろう。そのような初期の接触で、幾つかの親水性材料は、吸着、膨潤又は毛管力により水を引きつけ始め、この水が下にある基質から又はポリマと組織との界面から吸収されるのであれば、付着は、生物活性薬剤の経粘膜吸収を増強する目的を達成するために十分であり得る。そのような「水和による付着」は十分強力であり得るが、この機構を利用するように適合された製剤は、投薬が水和した粘滑薬に変形するとき継続する膨潤を起こさなければならない。これは、本発明において有用な多くの親水コロイド、特に、予め水和された状態で適用されたときに通常非付着性である幾つかのセルロース誘導体に対して予想される。それにも拘らず、粘膜投与のための生体付着性薬剤送達系は、そのような材料が乾燥ポリマ粉末、ミクロスフェアの形態、又はフィルム型送達形態で適用されたとき、本発明において有効である。
【０１４２】
他のポリマは、乾燥状態で適用されたときだけでなく、十分に水和されて過剰の水の存在で適用されても、粘膜表面に付着する。したがって、粘膜付着剤の選択は、組織への接触が生じて維持される生理学的並びに物理化学的条件の十分な考慮を必要とする。特に、付着の意図された部位に通常存在する水および湿気の量および支配的ｐＨは、種々のポリマの粘膜付剤結合力に大きく影響することが知られている。
【０１４３】
過去２０年に数通りのポリマ性生体付着性薬剤送達系が作製されて研究されたが、常に成功したわけではない。しかしながら、そのような種々の担体は、現在、歯科、整形外科、眼科及び外科用途を含む臨床用途で使用されている。例えば、アクリル系ヒドロゲルは生体付着性デバイス用として広く使用されてきた。アクリル系ヒドロゲルは、部分的膨潤状態における、接触している組織に損傷を惹起する摩滅を減少するそれらの柔軟性及び表面を傷つけない特性のために、生体付着によく適している。さらに、膨潤状態におけるそれらの高い透過性により、重合後、未反応モノマ、未架橋ポリマ鎖、及び開始剤をマトリックスから洗い出すことが可能になり、それは本発明において使用する生体付着材料の選択にとって重要な特徴である。アクリル系ポリマのデバイスは、非常に高い付着結合力を発揮する。ペプチド及びタンパク質薬剤の制御経粘膜送達のために、本発明の方法及び組成物は、場合により担体、例えば、生物活性薬剤をタンパク分解による破壊から一部保護するように機能するポリマの送達媒体の使用を含む一方、同時に、ペプチド又はタンパク質の鼻粘膜中への又はそれを通る浸透を増強する。この関係で、生体付着性ポリマは、増強された経口薬剤送達に対する相当の可能性を示している。例として、粘膜付着性ポリ（アクリル酸）誘導体ポリカルボフィルの１％（ｗ／ｖ）食塩水分散液と一緒にラットの十二指腸に投与された９−デスグリシンアミド、８−アルギニンバソプレッシン（ＤＧＡＶＰ）の生体利用率は、このポリマを含まないペプチド薬剤の水溶液に比較して３〜５倍増大した。
【０１４４】
ポリ（アクリル酸）タイプの粘膜付着性ポリマは、幾つかの腸内プロテアーゼの強力な阻害剤である。酵素阻害の機構は、このクラスのポリマの、トリプシン及びキモトリプシンなどのメタロプロテイナーゼの必要不可欠な補因子であるカルシウム又は亜鉛などの２価カチオンに対する強い親和性により説明される。ポリ（アクリル酸）によりプロテアーゼからそれらの補因子を奪うと、酵素活性の消失を伴う酵素タンパク質の不可逆的構造変化が誘発されると報告されている。同時に、他の粘膜付着性ポリマ（例えば、幾つかのセルロース誘導体及びキトサン）は、ある条件ではタンパク分解酵素を阻害しないことがある。比較的小分子である本発明において使用を考慮される他の酵素阻害剤（例えば、アプロチニン、ベスタチン）と対照的に、阻害性ポリマの経鼻吸収はこれらの分子のサイズに照らして、極小と思われ、それにより副作用の可能性を排除する。したがって、粘膜付着性ポリマ、特にポリ（アクリル酸）タイプは、特に安全性の懸念が考慮されるとき、吸収促進付着剤及び抗酵素剤の両者として役立つことができ、ペプチド及びタンパク質薬剤の制御送達を増強する。
【０１４５】
酵素的分解に対する保護に加えて、本発明において使用する生体付着剤及び他のポリマ性又は非ポリマ性吸収増強剤は、生物活性薬剤に対する粘膜透過性を直接増大させることができる。ペプチド及びタンパク質などの大きい親水性分子の、鼻上皮障壁を通過する輸送を促進するために、粘膜付着性ポリマ及び他の薬剤が、送達系の延長された粘膜前滞留時間により説明される効果を超える増強された透過効果を生ずると想定されてきた。報告によれば、薬剤の血漿中濃度の時間経過は、生体付着性ミクロスフェアが、インスリンの鼻粘膜を通過する透過性の急激な、しかし一時的な増加を惹起したことを示唆した。本発明において使用する他の粘膜付着性ポリマ、例えばキトサンは、それらが水溶液又はゲルとして適用されたときでさえ、ある粘膜上皮の透過性を増強すると報告されている。上皮透過性に直接影響すると報告されている他の粘膜付着性ポリマは、ヒアルロン酸及びそのエステル誘導体である。本発明の共投与及び／又は組合せ製剤化方法及び組成物の中で特に有用な生体付着剤は、キトサン並びにその類似体及び誘導体である。キトサンは、低毒性及び良好な生体適合性といった好ましい性質のために薬学的及び医学的用途に広く使用されている無毒性、生体適合性及び生分解性のポリマである。キトサンはアルカリを使用するＮ−アセチル化によりキチンから調製された天然のポリアミノサッカライドである。本発明の方法及び組成物において使用するキトサンは、グルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに本明細書で開示した他の生物活性薬剤の適用粘膜部位における保持を増大させる。この投与様式は、患者の服薬率及び認容性も改善することができる。本明細書においてさらに提供するように、本発明の方法及び組成物は、新規キトサン誘導体又はキトサンの化学的改変形態を場合により含むであろう。本発明において使用する１つのそのような新規誘導体は、β−［ｌ→４］−２−グアニジノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースポリマ（ポリ−ＧｕＤ）と表示される。キトサンはキチンのＮ−アセチル化生成物であり、経口及び経鼻製剤用のミクロスフェアを調製するために広く使用されてきた天然産ポリマである。キトサンポリマは非経口薬剤送達の可溶性担体としても提唱されている。本発明の一局面において、Ｏ−メチルイソウレアがキトサンアミンをそのグアニジニウム部分に変換するために使用される。グアニジニウム化合物は、例えば、８．０を超えるｐＨで、キトサン及びＯ−メチルイソウレアの等規定溶液間の反応により調製される。
【０１４６】
本発明において使用する生体付着剤として分類される追加の化合物は、生体付着性化合物の相補的構造と粘膜上皮表面の成分との間の「受容体−リガンド相互作用」として通常分類される特異的相互作用を媒介することにより作用する。多くの天然の例が、レクチン−糖相互作用により代表される特異的結合性生体付着のこの形態を例示する。レクチンは、多糖類又は糖複合体に結合する非免疫由来の（糖）タンパク質である。
【０１４７】
数通りの植物レクチンが、可能性ある薬剤吸収増強剤として研究されている。１つの植物レクチン、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ヘマグルチニン（ＰＨＡ）は、ラットに給餌後１０％を超える高い経口生体利用率を示す。トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｕｔｕｍ）レクチン（ＴＬ）は投与の種々の様式に対して安全のようである。
【０１４８】
まとめると、前述の生体付着剤は、本発明の組合せ製剤及び共投与法において有用であり、それは、１つ又は複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに他の生物活性薬剤の持続を延長させるか又はさもなければ粘膜吸収を増大させるために、有効な量及び形態の生体付着剤を場合により取り込んでいる。生体付着剤は、本発明の組合せ製剤中の助剤化合物又は添加物として協調的に投与することができる。ある態様において生体付着剤が「医薬接着剤」として作用するが、他の態様においては、生体付着剤の補助的送達又は組合せ製剤が、ある場合には上皮細胞「受容体」との特異的受容体−リガンド相互作用を促進することにより、また他の場合には上皮の透過性を増大させて、送達標的部位（例えば、肝臓、血漿、又はＣＮＳ組織若しくは液）で測定される薬剤濃度勾配を顕著に増大させることにより、生物活性薬剤の鼻粘膜との接触を強化するために役立つ。本発明において使用するさらに他の生体付着剤は、酵素（例えばプロテアーゼ）阻害剤として作用し、生体付着剤と協調的に又は組み合せた製剤で送達された経粘膜投与生物治療剤の安定性を増強する。
【０１４９】
リポソーム及びミセル状送達媒体
本発明の共投与法及び組合せ製剤化は、効果的な脂質若しくは脂肪酸を主成分とする担体、処理剤、又は送達媒体を場合により取り込み、グルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに他の生物活性薬剤の経粘膜送達のための改良された製剤を提供する。例えば、経粘膜送達における化学的及び物理的安定性を増強し、生物活性薬剤の半減期を増大させる（例えば、タンパク分解、化学的改変及び／又は変性の受け易さを減少させることにより）ために、リポソーム、混合ミセル担体又はエマルションと混合され若しくはそれらによりカプセル化され又はそれらと共投与されるペプチド又はタンパク質などの１つ又は複数のこれらの活性薬剤を含む種々の製剤及び方法が、経粘膜送達のために提供される。
【０１５０】
本発明のある局面において、生物活性薬剤の特別の送達系はリポソームとして知られる小脂質胞を含む。これらは、通常、天然の生分解性、無毒性且つ非免疫原脂質分子から作製され、ペプチド及びタンパク質を含む薬剤分子をそれらの膜の内側に又はその上に効率的に捕捉又は結合することができる。本発明におけるペプチド及びタンパク質送達系としてのリポソームの魅力は、カプセル化されたタンパク質が小胞内でそれらの好ましい水性環境に留まることができ、一方リポソーム膜はタンパク質をタンパク分解及び他の不安定化因子から保護するという事実により増大する。知られているリポソーム調製法が、ペプチド及びタンパク質のカプセル化において、それらの固有の物理的及び化学的性質の故に、全て実行可能ということではないとはいえ、数通りの方法により、実質的失活のないこれらの高分子のカプセル化が可能になる。
【０１５１】
種々の方法が、本発明において使用するリポソームを調製するために利用可能である。米国特許第４，２３５，８７１号；第４，５０１，７２８号；及び第４，８３７，０２８号。リポソーム送達で使用するために、生物活性薬剤は、通常、リポソーム又は脂質小胞中に捕捉されるか若しくは小胞の外側に結合される。
【０１５２】
リポソームのように、不飽和長鎖脂肪酸（これも粘膜吸収のための送達活性を増強する）は、二重層様構造（いわゆる「ｕｆａソーム」）を有する閉小胞を形成することができる。これらは、例えば、本発明の経粘膜例えば経鼻送達のために生物活性ペプチド及びタンパク質を捕捉するためにオレイン酸を使用して、形成させることができる。
【０１５３】
本発明において使用する他の送達系は、ポリマとリポソームとの使用を組み合わせて、天然ポリマであるフィブリンの内側にカプセル化するなど両媒体の有利な性質を合わせる。それに加えて、この送達系からの生物治療剤化合物の放出は、共有結合架橋の使用及びフィブリンポリマに対する抗フィブリン分解剤の添加により、制御可能である。
【０１５４】
本発明において使用するためにより簡単化された送達系は、送達媒体又は担体として、脂質担体とタンパク質及びポリアニオン性の核酸のような荷電した生物活性薬剤との間の静電気的相互作用を提供するために効果的に利用し得るカチオン性脂質を使用することを含む。これは、薬剤を経粘膜投与及び／又はそれに続く全身的区画への送達に適した形態に効率的に入れ込むことを可能にする。
【０１５５】
本発明において使用するさらに他の送達媒体は、長鎖の及び中程度の鎖長の脂肪酸並びに脂肪酸と界面活性剤と混合されたミセルを含む。エステル形態の大部分の天然産脂質は、粘膜表面を通過するそれら自体の輸送に関して、重要な関連を有する。遊離脂肪酸及び結合した極性基を有するそれらのモノグリセリドは、混合ミセルの形態で、浸透増強剤として腸内障壁に作用することが示されている。遊離脂肪酸（１２から２０個の範囲の炭素原子の鎖長を有するカルボン酸）及びそれらの極性誘導体の障壁改変機能のこの発見は、粘膜吸収増強剤としてのこれらの薬剤の応用に関する広範な研究を活気づけた。
【０１５６】
本発明において使用するために、長鎖脂肪酸、特に膜融合性脂質（オレイン酸、リノール酸、リノール酸、モノオレイン等の不飽和脂肪酸及びモノグリセリド）は、グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体並びに本明細書で開示した他の生物活性薬剤の経粘膜送達を増強する有用な担体を提供する。中程度の鎖長の脂肪酸（Ｃ６からＣ１２）及びモノグリセリドも、腸内薬物吸収に増強活性を有することが示されており、本発明の経粘膜送達製剤及び方法における使用に適合させることができる。それに加えて、中程度鎖長及び長鎖の脂肪酸のナトリウム塩は、本発明における生物活性薬剤の経粘膜送達のための有効な送達媒体及び吸収増強剤である。したがって、脂肪酸は、ナトリウム塩の可溶性形態で又は無毒性界面活性剤例えばポリオキシエチル化水素化ヒマシ油、タウロコール酸ナトリウムなどの添加により利用することができる。本発明において有用な他の脂肪酸及び混合ミセル製剤には、グリココール酸塩及びタウロコール酸塩などの胆汁酸塩と場合により組み合わされた、カプリン酸Ｎａ（Ｃ８）、カプロン酸Ｎａ（Ｃ１０）、ラウリン酸Ｎａ（Ｃ１２）又はオレイン酸Ｎａ（Ｃ１８）が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１５７】
ペグ化
本発明において提供されるさらに他の方法及び組成物は、生物活性ペプチド及びタンパク質の、ポリマ性材料例えばデキストラン、ポリビニルピロリドン、糖ペプチド、ポリエチレングリコール及びポリアミノ酸などとの共有結合による化学的改変を包含する。結果として生ずる複合ペプチド及びタンパク質は、それらの生物活性及び粘膜投与のための溶解性を保持している。別の態様において、グルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに他の生物活性ペプチド及びタンパク質が、ポリアルキレンオキシドポリマ、特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合化される。米国特許第４，１７９，３３７号。
【０１５８】
本発明において使用するアミン反応性ＰＥＧポリマは、２０００、５０００、１００００、１２０００及び２００００の分子質量を有するＳＣ−ＰＥＧ；Ｕ−ＰＥＧ−１００００；ＮＨＳ−ＰＥＧ−３４００−ビオチン；Ｔ−ＰＥＧ−５０００；Ｔ−ＰＥＧ−１２０００；及びＴＰＣ−ＰＥＧ−５０００を含む。生物活性ペプチド及びタンパク質のＰＥＧ化は、カルボキシル位の修飾（例えば、カルボキシル末端に付加したアスパラギン酸又はグルタミン酸基）により達成することができる。カルボジイミド活性化タンパク質カルボキシル基の酸性条件下における選択的修飾におけるＰＥＧ−ヒドラジドの有用性が報告されている。あるいは、生物活性ペプチド及びタンパク質の二官能性ＰＥＧ修飾を利用することができる。ある手順では、リシン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸を含む荷電アミノ酸残基は、タンパク質表面において溶媒接触可能になる顕著な傾向を有する。
【０１５９】
活性薬剤の他の安定化改変
ＰＥＧ化に加えて、本発明において使用するペプチド及びタンパク質などの生物活性薬剤は、活性薬剤を他の知られた保護又は安定化化合物との結合により遮蔽することにより、例えば、１つ又は複数の免疫グロブリン鎖などの１つ又は複数の担体タンパク質に結合された活性ペプチド、タンパク質、類似体又は模倣体との融合タンパク質の創生により、循環半減期を増大させるように改変することができる。
【０１６０】
製剤及び投与
本発明の経粘膜送達製剤は、グルコース調節ペプチド、類似体及び模倣体を、通常、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、及び場合により他の治療成分と一緒に組み合わせて含む。担体は、製剤の他の成分と適合性で、被験者に許容できない有害な影響を誘発しないという意味で「薬学的に許容される」ものでなければならない。そのような担体は、本明細書中の上で記載されており又はそうでなければ薬学の当業者に周知である。望ましくは、製剤は、投与されるべき生物活性薬剤が非適合性であると知られている酵素又は酸化剤などの物質を含むべきでない。製剤は製薬の技術分野で周知の任意の方法により調製することができる。
【０１６１】
本発明の組成物及び方法において、グルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに本明細書で開示した他の生物活性薬剤は、経口、直腸内、膣内、経鼻、肺内、若しくは経皮送達、又は眼、耳、皮膚若しくは他の粘膜表面への局所送達を含む種々の粘膜投与様式により被験者に投与することができる。場合により、グルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに本明細書で開示した他の生物活性薬剤は、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、腹腔内、又は非経口経路を含む非粘膜経路により、協調的に若しくは付属的に投与することができる。他の別法による態様において、生物活性薬剤は、例えば、適当な液体又は固体担体中に生物活性薬剤を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏ組織又は器官の治療製剤の成分として、哺乳類被験者に由来する細胞、組織又は器官に直接接触させることによりｅｘ  ｖｉｖｏで投与することができる。
【０１６２】
本発明の組成物は、鼻又は肺噴霧として水溶液で投与することができ、また当業者に知られている種々の方法により、噴霧の形態で投薬することができる。鼻噴霧としての投薬液の好ましい系は、米国特許第４，５１１，０６９号に開示されている。製剤は多回投与容器で、例えば、米国特許第４，５１１，０６９号で開示された密封投薬系で提供することができる。その他のエアロゾル送達形態は、医薬用溶媒、例えば、水、エタノール、又はそれらの混合物に溶解した又は懸濁された生物活性薬剤を送達する、例えば、圧搾空気の、ジェットの、超音波の、及び圧電式のネブライザーを含む。本発明のエアロゾル製剤は、サイズで１から７００ミクロンの直径を有する滴を有することができる。
【０１６３】
本発明の組成物及び製剤は、５０から３５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は５０から３００ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度を有することができる。製剤の容量オスモル濃度、重量オスモル濃度又は張度を調節するために、等張化剤を使用することができる。
【０１６４】
本発明の鼻用及び肺用噴霧溶液は、通常、薬剤即ち送達されるべき薬剤を、場合によりノニオン性界面活性剤（例えばポリソルベート−８０）などの界面活性剤及び１つ又は複数のバッファと共に製剤化されて含む。本発明の幾つかの態様において、鼻噴霧溶液は噴霧剤をさらに含む。鼻噴霧溶液のｐＨは、場合により約ｐＨ３．０から９の間、好ましくは７．０±０．５である。これらの組成物で使用する適当なバッファは、上で記載されたものか又は当技術分野で知られている他のものである。他の成分は、化学的安定性を増強するか又は維持するために加えることができ、防腐剤、界面活性剤、分散剤又は気体を含む。適当な防腐剤は、フェノール、メチルパラベン、パラベン、ｍ−クレゾール、チオメルサール、クロロブタノール、塩化ベンジルアルコニウム、安息香酸ナトリウム等を含むが、これらに限定はされない。適当な界面活性剤は、オレイン酸、ソルビタントリオレエート、ポリソルベート、レシチン、ホスファチジルコリン、及び種々の長鎖ジグリセリド及びリン脂質を含むが、これらに限定はされない。適当な分散剤は、エチレンジアミン四酢酸等を含むが、これらに限定はされない。適当な気体は、窒素、ヘリウム、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣｓ）、ヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣｓ）、二酸化炭素、空気等を含むが、これらに限定はされない。
【０１６５】
別の態様において、粘膜用製剤は、経鼻送達のために、生物活性薬剤を適当な粒子サイズ又は適当な粒子サイズ範囲内の乾燥した、通常凍結乾燥された形態で含む乾燥粉末製剤として投与される。鼻又は肺通路内に沈着するために適当な最少粒子サイズは、しばしば約０．５μ質量平均空気力学直径（ＭＭＥＡＤ）、通常約１μＭＭＥＡＤ、及びより典型的には約２μＭＭＥＡＤである。鼻通路内に沈着するために適当な最大粒子サイズは、しばしば約１０μＭＭＥＡＤ、通常約８μＭＭＥＡＤ、及びより典型的には約４μＭＭＥＡＤである。これらのサイズ範囲内の鼻内呼吸可能な散剤は、噴射粉砕、噴霧乾燥、溶媒沈澱、超臨界流体凝縮などの種々の従来技法により製造することができる。これらの適当なＭＭＥＡＤの乾燥散剤は、患者の呼吸に頼り、肺又は鼻に吸入して、散剤をエアロゾル化した量に分散する従来の乾燥散剤吸入器（ＤＰＩ）により患者に投与することができる。あるいは、乾燥散剤は、外部動力源を使用して散剤をエアロゾル化した量に分散するエアアシステッドのデバイス例えばピストンポンプにより投与することができる。
【０１６６】
乾燥散剤デバイスでは、通常、単回エアロゾル化投与量（「パフ」）を生ずるために、約１ｍｇから２０ｍｇの範囲の散剤質量が必要である。生物活性薬剤の必要な又は所望の量がこの量未満であれば、粉末化された活性薬剤は、通常、必要な全粉末質量を供給するために、医薬用乾燥粉末増量剤と配合されるであろう。好ましい乾燥粉末増量剤は、スクロース、ラクトース、デキストロース、マンニトール、グリシン、トレハロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びデンプンを含む。他の適当な乾燥粉末増量剤は、セロビオース、デキストラン、マルトトリオース、ペクチン、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等を含む。
【０１６７】
本発明における経粘膜送達のための組成物を製剤化するために、生物活性薬剤は、種々の薬学的に許容される添加物並びに活性薬剤を分散するための基剤又は担体と組み合わせることができる。所望の添加物は、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸、酢酸などのｐＨ調節剤を含むが、これらに限定はされない。それに加えて、局所麻酔薬（例えば、ベンジルアルコール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻止剤（例えば、ツイーン８０）、溶解性増強剤（例えば、シクロデキストリン及びその誘導体）、安定剤（例えば血清アルブミン）、及び還元剤（例えばグルタチオン）が含まれてよい。経粘膜送達用組成物が液体であるとき、０．９％（ｗ／ｖ）生理的食塩溶液の張度を１とした基準で測定した製剤の張度は、通常、投与部位の鼻粘膜に実質的な不可逆的組織損傷が誘起されないであろう値に調節される。一般に、溶液の張度は約１／３から３、より典型的には１／２から２、最も頻繁に３／４から１．７の値に調節される。
【０１６８】
生物活性薬剤は、活性薬剤及び任意の所望の添加物を分散する能力を有する親水性化合物を含む基剤又は媒体に分散することができる。基剤は、ポリカルボン酸又はそれらの塩、カルボン酸無水物（例えば無水マレイン酸）と他のモノマ（例えば、（メタ）アクリル酸メチル、アクリル酸その他）のコポリマ、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの親水性ビニルポリマ、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにキトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、及びそれらの無毒性金属塩などの天然ポリマを含むが、これらに限定はされない広範囲の適当な担体から選択することができる。しばしば、生分解性ポリマが基剤又は担体として選択され、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマ、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸−グリコール酸）コポリマ及びそれらの混合物である。それと別に又はそれに加えて、ポリグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステルなどの合成脂肪酸エステルを担体として利用することができる。親水性ポリマ及び他の担体は、単独で又は組み合わせて使用することができ、担体に増強された構造の完全性を、部分的結晶化、イオン結合、架橋等により与えることができる。担体は、鼻粘膜に直接適用するために、流体又は粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、ミクロスフェア及びフィルムを含む種々の形態で提供することができる。この関係で選択された担体の使用は、生物活性薬剤の吸収を促進する結果をもたらすことができる。
【０１６９】
生物活性薬剤は、種々の方法に従って基剤又は担体と組み合わせることができ、活性薬剤の放出は、拡散、担体の崩壊、又それに伴う水チャネルの形成によることができる。ある状況においては、活性薬剤は、例えば２−シアノアクリル酸イソブチルなどの適当なポリマから調製されたマイクロカプセル（ミクロスフェア）又はナノカプセル（ナノスフェア）中に分散されて、鼻粘膜に適用される生体適合性の分散媒中に分散され、長時間に及び持続する送達及び生物活性をもたらす。
【０１７０】
本発明における医薬の経粘膜送達をさらに増強するために、活性薬剤を含む製剤は、基剤又は賦形剤として親水性低分子量化合物を含むこともできる。そのような親水性低分子量化合物は、生理学的に活性なペプチド又はタンパク質などの水溶性活性薬剤が、基剤を通って活性薬剤が吸収される体表面まで拡散できる通過媒質を提供する。親水性低分子量化合物は、場合により、粘膜又は投与環境から湿気を吸収して水溶性活性ペプチドを溶解する。親水性低分子量化合物の分子量は、一般に１００００以下、好ましくは３０００以下である。代表的親水性低分子量化合物は、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−エリトロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、トレハロース、Ｄ−ガラクトース、ラクツロース、セロビオース、ゲンチビオースなどのオリゴ−、ジ−及びモノサッカライド、グリセリン、及びポリエチレングリコールなどのポリオール化合物を含む。本発明における担体として有用な親水性低分子量化合物の他の例は、Ｎ−メチルピロリドン、及びアルコール類（例えば、オリゴビニルアルコール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコールその他）を含む。これらの親水性低分子量化合物は、単独で又は相互に若しくは経鼻製剤の他の活性若しくは不活性成分と組み合わせて使用することができる。
【０１７１】
本発明の組成物は、近似的生理学的条件に必要とされる薬学的に許容される担体物質、例えば、ｐＨ調節及び緩衝剤、張度調節剤、保水剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートその他を別に含むことができる。固体組成物に対して、在来の無毒性で薬学的に許容される担体を使用することができ、それには例えば、薬学規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。
【０１７２】
生物活性薬剤を投与するための治療用組成物は、溶液、マイクロエマルション、又は高濃度の有効成分に適した他の指定した構造としても製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの適当な混合物を含む溶媒又は分散媒であってよい。溶液の適当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散性の製剤の場合には所望の粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合に、等張化剤、例えば、マンニトール、ソルビトールなどの糖類、ポリアルコール又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが望ましいであろう。生物活性薬剤の延長された吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことによりもたらすことができる。
【０１７３】
本発明のある態様において、生物活性薬剤は、時間放出製剤で、例えば徐放性ポリマを含む組成物で投与される。活性薬剤は、急速な放出を防止するであろう担体、例えばポリマなどの制御放出媒体、マイクロカプセル化送達系、又は生体付着性ゲルと共に製剤化することができる。本発明の種々の組成物における活性薬剤の延長送達は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤例えば、モノステアリン酸アルミニウムヒドロゲル及びゼラチンなどを含むことによりもたらすことができる。生物活性薬剤の制御放出製剤が望まれるとき、本発明による使用に適した制御放出結合剤は、活性薬剤に対して不活性であり且つ生物活性薬剤を組み込むことができる任意の生体適合性制御放出材料を含む。多数のそのような材料が当技術分野で知られている。有用な制御放出結合剤は、それらの経鼻送達後に生理的条件で（例えば、鼻粘膜表面で、又は経粘膜送達後に体液の存在で）徐々に代謝される材料である。適当な結合剤は、徐放性製剤に当技術分野で以前に使用された生体適合性ポリマ及びコポリマを含むが、これらに限定はされない。そのような生体適合性化合物は無毒性で、周囲の組織には活性であり、鼻内刺激、免疫応答、炎症などの顕著な副作用を誘発しない。それらは代謝生成物に代謝され、代謝生成物もまた生体適合性であって、容易に体から排除される。
【０１７４】
この関係で使用する代表的ポリマ材料は、加水分解可能なエステル結合を有するコポリマ及びホモポリマであるポリエステルから誘導されたポリママトリックスを含むが、これらに限定はされない。これらの多数は、当技術分野で知られているように、生分解性であり、無毒性又は低毒性の分解生成物を生ずる。代表的ポリマは、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ−乳酸−グリコール酸）（ＤＬ  ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ−乳酸−グリコール酸）（Ｄ  ＰＬＧＡ）、及びポリ（Ｌ−乳酸−グリコール酸）（Ｌ  ＰＬＧＡ）を含む。他の有用な生分解性又は生侵食性ポリマは、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ε−カプロラクトン−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン−グリコール酸）、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（２−シアノアクリル酸アルキル）などのポリマ、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）などのヒドロゲル、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）（即ちＬ−ロイシン、グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等）、ポリ（エステルウレア）、ポリ（２−ヒドロキシエチル  ＤＬ  アスパルタミド）、ポリアセタールポリマ、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリマレアミド、ポリサッカライド及びそれらのコポリマを含むが、これらに限定はされない。そのような製剤を調製する多くの方法が当業者に一般的に知られている。他の有用な製剤は、制御放出組成物例えば、マイクロカプセル（米国特許第４，６５２，４４１号及び第４，９１７，８９３号）、マイクロカプセル及び他の製剤を作製するのに有用な乳酸−グリコール酸コポリマ（米国特許第４，６７７，１９１号及び第４，７２８，７２１号）、並びに水溶性ペプチドのための徐放性組成物（米国特許第４，６７５，１８９号）を含む。
【０１７５】
鼻及び肺送達には、噴霧としての治療薬液制御エアロゾル投薬系がよく知られている。一態様においては、活性薬剤の計量された投与量を特別に構成された機械的ポンプバルブにより送達する（米国特許第４，５１１，０６９号）。
【０１７６】
投薬
予防及び治療目的のために、本明細書で開示した生物活性薬剤は、単回大量瞬時投与送達で、長期間にわたる連続的送達により（例えば、連続経皮、経粘膜、又は静脈内送達）、又は反復投与プロトコルで（例えば、毎時、毎日、又は毎週繰り返す投与プロトコル）被験者に投与することができる。この関係で、グルコース調節ペプチドの治療的有効量は、上で説明した対象疾患又は状態に関連する１つ又は複数の症状又は検知可能な状態を軽減する臨床的に有意な結果を生ずるであろう長期予防又は治療投与計画における反復投与量を含むことができる。この関係における有効投与量の決定は、通常、動物モデル研究に続くヒト臨床試験に基づいており、被験者における対象疾患の症状又は状態の発症又は重症度を有意に減少させる有効投与量及び投与プロトコルを決定することにより導かれる。これに関する適当なモデルは、例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、ヒト以外の霊長類、及び当技術分野で知られている他の許容される動物モデルである。あるいは、有効投与量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（例えば、免疫学的及び組織病理学的アッセイ）を使用して決定することができる。そのようなモデルを使用して、通常、普通の計算及び調節だけが、生物活性薬剤の治療的有効投与量（所望の応答を引き出すために、例えば、経鼻で有効な、経皮で有効な、静脈内で有効な、又は筋肉内で有効な量）を投与するための概略の濃度及び投与量を決定するために要求される。
【０１７７】
別の態様において、本発明はグルコース調節ペプチドの経鼻送達のための組成物及び方法を提供し、その送達において、長期の投与期間中グルコース調節ペプチドの治療的に有効な高低パルス状レベルを維持するために、被験者への日間又は週間スケジュールの間、グルコース調節ペプチドの多回投与を含む、経鼻有効投与量の投与計画により、１つ又は複数のグルコース調節ペプチド化合物が反復投与される。この組成物及び方法は、８時間から２４時間の延長された投与期間中グルコース調節ペプチドの治療的に有効な高低パルス状レベルを維持するために、１日に１から６回の間、経鼻製剤で被験者により自己投与されるグルコース調節ペプチド化合物を提供する。
【０１７８】
キット
本発明は、哺乳類被験者の疾患及び他の状態の予防及び治療のための、上記の医薬組成物、有効成分、及び／又はそれらを投与する手段を含むキット、パッケージ及びマルチコンテナユニットも含む。簡単にいえば、これらのキットは、１つ又は複数のグルコース調節ペプチドタンパク質、類似体及び模倣体並びに／又は他の生物活性薬剤を、本明細書で開示した経粘膜送達増強剤と組み合わせて、経粘膜送達のための薬物製剤に製剤化して含むコンテナ又は製剤を含む。
【０１７９】
本発明の経鼻製剤は、任意の噴霧ボトル又は注射器を使用して、又は点滴注入により投与することができる。鼻噴霧ボトルの例は、「ナザール噴霧ポンプｗ／安全クリップ」、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  ＳＡＰ  ＃６０５４８であり、それは１噴射当り０．１ｍＬの投与量を送達し、３６．０５ｍｍの浸漬管長を有する。それは、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ＮＪから購入することができる。
【０１８０】
グルコース調節ペプチドのエアロゾル経鼻投与
本発明者らは、鼻噴霧又はエアロゾルを使用してＧＲＰを鼻内に投与することができることを見出した。多くのタンパク質及びペプチドが、噴霧又はエアロゾル生成においてアクチュエータにより生ずる機械的力により剪断され又は変性されることが示されているので、これは驚くべきことである。この領域で次の定義は有用である。
【０１８１】
１．エアロゾル―加圧下に容器に入れられて、適当なバルブ系の作動で放出される治療的に有効な成分を含む製品。
２．計量されたエアロゾル―各作動で一定量の噴霧の送達を可能にする計量投与バルブから構成される加圧された投与形態。
３．散剤エアロゾル―加圧下に容器に入れられて、適当なバルブ系の作動で放出される治療的に有効な成分を粉末の形態で含む製品。
４．噴霧エアロゾル―製品を湿潤噴霧として噴出させるのに必要な力を提供する噴射剤として、圧縮ガスを利用するエアロゾル製品；それは水性溶媒中の薬剤溶液に一般的に適用可能である。
５．噴霧―空気又は水蒸気の噴射により微細に分割された液体。鼻噴霧薬製品は、加圧されていない計量分配器中の賦形剤の溶液又は混合物中に溶解又は懸濁された治療的有効成分を含む。
６．計量された噴霧―各作動で特化された量の分配を可能にするバルブから構成される加圧されていない投与形態。
７．懸濁噴霧―液体媒体中に分散された固体粒子を含む液体製剤であって、粗い液滴の又は微細に分割された固体としての形態になる。
【０１８２】
薬剤送達デバイス（「ＤＤＤ」）としての計量された鼻噴霧ポンプにより発射されたエアロゾル噴霧の流体力学のキャラクタリゼーション。噴霧のキャラクタリゼーションは、新規及び既存の鼻噴霧ポンプの研究及び開発、品質保証、及び安定性試験手順の米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）承認に必要な提出書類の不可欠の部分である。
【０１８３】
噴霧のキャラクタリゼーションを通じて、幾何学的位置関係が鼻噴霧ポンプの全体的性能の最良な指標であることが見出された。特に噴霧のそれがデバイスを出るときの発散角度（噴流幾何学）の測定；噴霧の断面の楕円率、一様性及び粒子／液滴分布（噴霧パターン）；及び発生する噴霧の時間的展開が、鼻噴霧のキャラクタリゼーションにおいて最も代表的な性能量であることが見出された。品質保証及び安定性試験を通じて、噴流幾何学及び噴霧パターン測定が、鼻噴霧ポンプの承認データ基準との一致及び適合を証明するための重要確認事項である。
【０１８４】
定義
噴流高さ―アクチュエータの先端から噴流角度が、線形流の破綻のため非線形になる点までの測定値。デジタル画像の視覚的検査に基づき、噴霧パターンの最遠測定点に合わせた幅に対して測定点を定め、３０ｍｍの高さと、この研究のためには定義する。
長軸―適合させた噴霧パターン中でＣＯＭｗを通過して引かれ得る最大弦で、基本単位で表示（ｍｍ）。
短軸―適合させた噴霧パターン中でＣＯＭｗを通過して引かれ得る最小弦で、基本単位で表示（ｍｍ）。
楕円率―長軸の短軸に対する比。好ましくは１．０と１．５の間、最も好ましくは１．０と１．３の間。
Ｄ１０―試料の液体容積合計の１０％がそれより小さい直径の液滴からなる、液滴の直径（μｍ）。
Ｄ５０―試料の液体容積合計の５０％がそれより小さい直径の液滴からなる、液滴の直径（μｍ）であって、質量平均直径としても知られている。
Ｄ９０―試料の液体容積合計の９０％がそれより小さい直径の液滴からなる、液滴の直径（μｍ）。
スパン―分布の幅の測定値であって、値が小さいほど分布が狭い。スパンは（Ｄ９０−Ｄ１０）／Ｄ５０として計算される。
ＲＳＤ（％）―百分率で表した標準偏差：数列の平均により標準偏差を除し、１００を乗じた値、ＣＶ（％）としても知られている。
容積―各作動により送達デバイスから放出された液体又は粉末の容積。好ましくは０．０１ｍＬと約２．５ｍＬの間、最も好ましくは０．０２ｍＬと０．２５ｍＬの間。
【０１８５】
本明細書で挙げた全ての出版物、引用文献、特許、公開特許及び特許出願は、各々それらの全体を参照により特異的に本明細書に組み込む。
【０１８６】
本発明を、ある態様に関連して記述し、多くの詳細を例示の目的で説明したが、本発明がさらなる態様を含み、本明細書で開示された詳細のあるものが本発明から逸脱せずにかなり変更され得ることは、当業者には明らかであろう。本発明は、そのようなさらなる態様、改変、及び同等物を含む。特に、本発明は種々の例示成分及び実施例の特徴、用語又は要素の任意の組合せを含む。
【０１８７】
本発明の説明及び特許請求の範囲における用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様な用語の使用は、単数及び複数の両方を含むと解釈するものとする。用語「含む」、「有する」、「含む」及び「含有する」は、例えば「含むが、これらに限定はされない」を意味する拡張可能な用語と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記述は、範囲内の値の幾つかが明確に挙げられていてもいなくても、それが本明細書中で個別に挙げられているかのように、その範囲内に入る個々別々の値を個別に指す。本明細書中で使用される特定の値は、代表的なものとして理解され、本発明の範囲を限定しないものとする。
【０１８８】
本明細書で示される実施例及び本明細書で使用される代表的言語は、単に例示目的のためであり、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０１８９】
実施例
実施例１  インスリンアスパルト製剤
表１は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥｐｉＡｉｒｗａｙモデル系を使用して、経上皮抵抗アッセイ（ＴＥＲ），細胞生存率アッセイ（ＭＴＴ）、乳酸脱水素酵素細胞死アッセイ（ＬＤＨ）、及び組織透過アッセイについて試験した１２のインスリンアスパルト製剤を記載している。結果は、どの製剤が、有意の細胞毒性を生じないで、最高度の組織透過及びＴＥＲ減少を達成したかを決定するために使用した。
【０１９０】
インスリンアスパルトは、Ｂ２８位でプロリンをアスパラギン酸で単一置換した以外は標準的なヒトインスリンと相同のインスリン類似体である。ＮｏｖｏＬｏｇ（ＮｏｖｏＬｏｇ（商標）；Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、滅菌された無色透明水溶液であり、インスリンアスパルト（Ｂ２８ ａｓｐレギュラー標準ヒトインスリン類似体）１００単位ユニット／ｍＬ，グリセリン１６ｍｇ／ｍＬ、フェノール１．５０ｍｇ／ｍＬ、メタクレゾール１．７２ｍｇ／ｍＬ、亜鉛１９．６μｇ／ｍＬ、リン酸水素二ナトリウム二水和物１．２５ｍｇ／ｍＬ、及び塩化ナトリウム０．５８ｍｇ／ｍＬを含む。ＮｏｖｏＬｏｇは７．２〜７．６のｐＨを有する。新規インスリンアスパルト製剤を生成させた。各製剤について合計容積０．５ｍＬを作製した。この製剤は、種々の濃度のインスリンアスパルト、ＮｏｖＬｏｇ希釈剤、及び賦形剤のメチル−β−シクロデキストリン（Ｍ−β−ＣＤ）、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジデカノイル（ＤＤＰＣ）、及びエデト酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を単独で又は組み合わせて含んだ。賦形剤無添加の対照コントロールも研究本試験に含めた。少量の２Ｎ  ＨＣｌ又はＮａＯＨを、必要な時は、所望のｐＨに達するまで製剤に加えた。製剤を調製するために使用した試薬を、表２に示した。
【０１９１】
表１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のためのインスリンアスパルト製剤
【表１】
2009512709.tif 000004
【０１９２】
表２  インスリンアスパルト製剤の試薬
【表２】
2009512709.tif 000005
【０１９３】
実施例２  経鼻粘膜送達−透過動態及び細胞毒性
次の方法は、本発明の製剤及び方法におけるインスリンの経鼻粘膜送達パラメータ、動態及び副作用を評価するために、並びにインスリンアスパルトとの組合せ製剤化又は共投与のためのに、本明細書で開示した、種々の経粘膜送達増強剤の有効性及び特性をの測定するために一般的に有用である。１つの代表的プロトコルにおいて、透過動態及び許容できない細胞毒性のないことが、インスリンアスパルトにより代表される生物活性治療薬と組み合わされた、上で開示された経鼻送達増強剤に対してについては透過動態及び許容できない細胞毒性のないことが示される。
【０１９４】
細胞培養
ＥｐｉＡｉｒｗａｙシステムは、気道を覆う多列上皮のモデルとして、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ（マサチューセッツ州Ａｓｈｌａｎｄ）により開発された。上皮は、底部が多孔質膜メンブラン性の細胞培養インサート上、空気と液体との界面で増殖させられると、その結果高度に分極した形態への細胞分化を生じる。頂端膜メンブラン側は微絨毛超微細構造で繊毛があり、上皮は粘液を産生する（ムチンの存在がイムノブロッティングにより確認されている）。インサートは０．８７５ｃｍの直径を有し、０．６ｃｍ２の表面積を提供する。細胞は出荷の約３週間前に製作所でインサート上に播種される。
【０１９５】
ＥｐｉＡｉｒｗａｙ（商標）細胞膜メンブランは実験開始の前日に受け取られた。それら細胞はフェノールレッド無添加不含且つヒドロコルチゾン無添加不含のダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で出荷された。各組織インサートは０．９ｍＬの無血清ＤＭＥＭを含む６ウェルプレートのウェル中に入れた。次にその膜メンブランを５％ＣＯ２中３７℃で２４時間培養し、組織を平衡に達しさせた。インサートには各回収の日に栄養を供給した。ＤＭＥＭを主成分とする培地は無血清であるが、上皮増殖因子及び他の因子で補完した。培地は、経鼻送達を考慮されている如何なるサイトカイン又は増殖因子の内在性レベルについても試験し、インスリンを例外として現在までに研究されている全てのサイトカイン及び因子を全く含んでいなかった。容積はそれらのスタンド上のユニットの底部への接触を提供するに十分であったが、上皮の頂端膜メンブラン側は空気と直接接触したままにしておいた。液体を含むウェルにユニットを移すことを含むこのステップ及び全てのこの後のステップで滅菌ピンセットを使用し、ユニットの底部と培地との間に空気が閉じ込められないことを確実にした。
【０１９６】
各ＮｏｖｏＬｏｇ含有製剤のＴＥＲ、細胞生存率（ＭＴＴ）、細胞毒性（ＬＤＨ）、及び透過への影響を評価するために、ＥｐｉＡｉｒｗａｙ（商標）モデルシステムを使用した。これらのアッセイの詳細は下に記載してある。全ての実験において、試験すべき経鼻粘膜送達製剤を、各ユニットの頂端膜メンブラン側に、頂端膜メンブラン側全体を覆うのに十分な１００μＬで適用した。頂端膜メンブラン側に適用された濃度でにある適当な容積の試験製剤（通常１００μＬ以下が必要）を、後でＥＬＩＳＡ又は他の指定されたアッセイにより活性物質の濃度を測定するために取っておいた。
【０１９７】
経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）
ＴＥＲ測定値は、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｖｏｌｔｏｈｍｅｔｅｒ（上皮電圧抵抗計）に電極リード線で接続したＴｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｃｈａｍｂｅｒ（組織抵抗測定室）を使用して読み取った。両者共Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製である。第一に、各インサートについて実験開始日におけるバックグラウンドＴＥＲを読んだ。ＴＥＲ読み取り後、１ｍＬの新鮮培地を６ウェルプレートの各ウェルの底部に入れた。インサートは紙タオルで水気を切り、新鮮な培地入りの新しいウェルに置き、その際インサートには、バックグラウンドＴＥＲ測定値と関係づけた番号を付けておいた。１００μＬの実験用製剤を各インサートに加えた。インサートは振盪インキュベーター中に１００ｒｐｍ及び３７℃で１時間入れておいた。
【０１９８】
照合較正に先立って電源を切り、電極及び組織培養のブランクインサートを、少なくとも２０分間新鮮培地中で平衡化させた。バックグラウンド抵抗を、Ｅｎｄｏｈｍ組織チェンバ中の１．５ｍＬの培地及びブランクであるＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ中の３００μＬの培地で測定した。上部電極は、それが培地中に浸漬するが、インサート膜メンブランの上側表面とは接触しないように調節した。ブランクインサートのバックグラウンド抵抗は５〜２０オームであった。各ＴＥＲ測定のために、３００μＬの培地をインサートに加え、続いて２０分間室温でインキュベーション後、Ｅｎｄｏｈｍチェンバ中に入れてＴＥＲを読んだ。抵抗は、（測定された抵抗−ブランク）×０．６ｃｍ２として表した。全てのＴＥＲ値が組織の表面積の関数として報告された。
【０１９９】
ＴＥＲは
ＴＥＲ＝（ＲＩ−Ｒｂ）×Ａ
として計算された。式中、ＲＩはメンブランを有するインサートの膜との抵抗、Ｒｂはブランクインサートの抵抗、及びＡは膜メンブランの面積（０．６ｃｍ２）である。対照コントロール値（対照コントロール＝約１０００オーム・ｃｍ２；１００に正規化）に対するＴＥＲ値の減少は、細胞膜メンブラン抵抗の減少及び粘膜上皮細胞透過性の増大を示す。１時間のインキュベーション終了後、組織インサートをインキュベーターから取り出した。２００μＬの新鮮培地を２４ウェルプレートの各ウェルに入れ、組織インサートをその２４ウェルプレートに移した。２００μＬの新鮮培地を各組織インサートに穏やかに加えた。ＴＥＲを再び各インサートについて測定した。
【０２００】
組織培養インサートを６ウェルプレートから２４ウェルプレートに移した後、基本培地を３部分に細分してエッペンドルフチューブ中に貯蔵保存した。３つの細分は全部、使用するまで−８０℃に置いた。
【０２０１】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ
細胞死の量は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．製のＣｙｔｏＴｏｘ９６細胞毒性アッセイキットを使用して、細胞からのＬＤＨ放出を測定することによりアッセイした。この試験では、各組織培養インサートについて三つ組重複する三つの系の試料を試験した。５０μＬの収集した培地（４℃で貯蔵保存）を９６ウェルプレート中の三つ組重複する三つの系に負荷した。細胞を含まない新鮮な培地をブランクとして使用した。５０μＬの基質溶液（キットにより作製してＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｍｉｘの新鮮ボトルに加えた１２ｍＬのＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ）を、各ウェルに加え、プレートを暗所において室温で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、５０μＬの停止溶液を各ウェルに加え、μＱｕａｎｔ光学密度プレートリーダー上でＫＣＪｒソフトウェアを使用して、４９０ｎｍでプレートを読んだ。
【０２０２】
ＭＴＴアッセイ
各組織培養インサートの細胞生存率は、ミトコンドリアレダクターゼ活性を試験するＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ−１００、ＭａｔＴｅｋ  ｋｉｔ）により試験した。このキットは、ホルマザン色素の取込み及びテトラゾリウムへの変換を測定する。ＭＴＴ濃縮物を解凍し、２ｍＬのＭＴＴ:８ｍＬの培地の比で培地により希釈した。希釈したＭＴＴ濃縮物を２４ウェルプレートにピペットで移した（３００μＬ）。組織インサートを穏やかに乾燥し、プレートウェルに入れて、暗所において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、各インサートをプレートから取り出し、軽く液体を吸い取り、２４ウェルの抽出プレートに入れた。次に細胞培養インサートをウェル当り２．０ｍＬの抽出溶媒に浸漬した（試料を完全に覆うように）。抽出物の蒸発を減少させるために、抽出物プレートを覆い、密閉した。暗所において１夜室温でインキュベーション後、各インサート中の液体を、それを取り出した元のウェルにデカントで戻して、インサートは廃棄した。各ウェルからの抽出溶媒（５０μＬ）は、抽出物ブランクも添えて、９６ウェルのマイクロタイタープレートに三つ組重複する三つの系でピペットにより移し、１５０μＬの新鮮抽出溶媒での添加により希釈した。試料の光学密度をμＱｕａｎｔ光学密度プレートリーダー上でＫＣＪｒソフトウェアを使用して、５５０ｎｍでプレートを読んだ。
【０２０３】
ＴＥＲ結果
３７℃で１時間のインキュベーション前後の、実験製剤に対するのＴＥＲ測定値（オーム×ｃｍ２）を、対照コントロールと比較した。結果は、増強剤を含む製剤は、＃７及び＃８を例外として、１時間のインキュベーション後に有意のＴＥＲ減少を有することを示している。
【０２０４】
ＭＴＴ結果
殆んど全ての製剤が、対照コントロールに比較して優秀から良好の細胞生存率を示した。大部分の製剤のＭＴＴ（％）は８０％を超えた（＃１、＃６、及び＃１２を除く）。
【０２０５】
ＬＤＨ結果
試験した大部分の製剤は、非常に低い細胞毒性を意味する、非常に小さいＬＤＨを示した。
【０２０６】
まとめ
ＴＥＲ、ＭＴＴ、及びＬＤＨアッセイの結果は、＃２、＃６、＃９、＃１０、及び＃１１のは全てが、毒性増加なしにＴＥＲの有意な減少を示すことを表す。
【０２０７】
実施例３
インスリンアスパルト透過性
インサートの頂端部から基底外側部へ通過して透過するインスリン又はインスリン類似体の量を定量するために、ＥＬＩＳＡを使用した。インスリンはＭａＴｔｅｋ培地に存在するので、粗生データは、培地試料中に存在する平均濃度を他の全ての試料から差し引くことにより補正した。
【０２０８】
イソ−インスリンＥＬＩＳＡキットは、Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、（ニューハンプシャー州Ｗｉｎｄｈａｍ、カタログ番号０８−１０−１１２８−０１）から購入した。キットにより提供されたアッセイ緩衝液で試料を希釈した。希釈液を静かに上下反転させることにより混合し、テフロンコートされた蔽いを有する透明なシラン処理ＨＰＬＣバイアル中に入れ、静かに上下反転させることにより混合した。試料の光学密度は、μＱｕａｎｔ光学密度プレートリーダー上でＫＣＪｒソフトウェアを使用して、４５０ｎｍで（プロトコルで指示されているように）測定した。
【０２０９】
負荷容積はインサート当り１００μＬであり、透過サンプリング時間は６０分であった。各製剤並びに対照コントロールを、ｎ＝３インサートを使用して試験した。この試験の対照コントロールはＭａｔＴｅｋ基本培地及び９％トリトンＸ−１００を含むものであった。各組織インサートを、０．９５ｍＬのＭａｔＴｅｋ基本培地を入れた個々のウェルに入れた。試験計画に従って、インサートの頂端膜メンブラン側に１００μＬの試験製剤を適用し、試料を３７℃で１時間振盪機に置いた（約１００ｒｐｍ）。インキュベーション期間の終わりに約２０，０００キロ国際単位のアプロチン５０μＬを下側の各培養液試料に加えて、ＥＬＩＳＡ分析のために２〜８℃で貯蔵保存した。
【０２１０】
表３は、ＥＬＩＳＡによりアッセイした、基底部の試料からの透過性の結果を示す。平均値は、実験試料から培地だけの試料に存在するインスリン量の平均を差し引くことにより補正した。
【０２１１】
表３  インスリンアスパルト製剤試験透過結果（％）
【表３】
2009512709.tif 000006
【０２１２】
これらの透過結果は、透過増強剤を用いて経鼻製剤によりインスリンアスパルトを送達するために使用できることを示す。全ての増強剤含有製剤は、少なくとも９％（約９〜２１％）透過する結果であり、それに比較して増強剤を含有しない製剤は、最大で約１〜２％の結果であった。透過性増強が最高の試料には、＃１、＃２、＃９、＃１０、＃１１、及び＃１２が含まれた。ＴＥＲ、ＭＴＴ、及びＬＤＨ結果と一緒にして、試料＃２（５Ｕ／ｍＬ  インスリンアスパルト、４５ｍｇ／ｍＬ  Ｍｅ−β−ＣＤ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、５％ＮｏｖｏＬｏｇ希釈剤、ｐＨ４）；＃９（２０Ｕ／ｍＬインスリンアスパルト、４５ｍｇ／ｍＬＭｅ−β−ＣＤ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、２０％ＮｏｖｏＬｏｇ希釈剤、ｐＨ４）；＃１０（２０Ｕ／ｍＬインスリンアスパルト、４５ｍｇ／ｍＬＭｅ−β−ＣＤ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、２０％ＮｏｖｏＬｏｇ希釈剤、ｐＨ３）；及び＃１１（５Ｕ／ｍＬインスリンアスパルト、０ｍｇ／ｍＬＭｅ−β−ＣＤ、０ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、５％ＮｏｖｏＬｏｇ希釈剤、ｐＨ４）が、最小の細胞毒性で最大の透過性増強を有した。
【０２１３】
実施例４
インスリン透過性に対するＮＰＧ及びＰＮ１５９の効果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、インスリンの透過性に対する、小分子及びペプチド系透過増強剤の両方の効果を評価した。７通りの異なる処理をＥｐｉＡｉｒｗａｙ  ９６ウェルプレートに３７℃で１時間適用すると共に、０．１Ｕインスリンを頂端膜メンブラン側に適用した。標準曲線及び高低対照コントロールは予想通りであり、基底面側培地へのインスリン添加は殆んど１００％の回収を示した。処理の内容は：ＰＢＳ＋インスリン０．１Ｕ；２５μＭ  ＰＮ１５９＋インスリン０．１Ｕ；５０μＭ  ＰＮ１５９＋インスリン０．１Ｕ；ＰＤＦ＋インスリン０．１Ｕ；ＰＢＳ＋インスリン０．１Ｕ＋ＮＰＧ  １５０ｍＭ；２５μＭ  ＰＮ１５９＋インスリン０．１Ｕ＋ＮＰＧ  １５０ｍＭ；及びＰＤＦ+インスリン０．１Ｕ＋ＮＰＧ  １５０ｍＭ）である。
【０２１４】
この試験で使用されたインスリンはＳｉｇｍａ組換え（酵母由来）天然配列ヒトインスリンである。この組換えヒトインスリンはプロインスリンに由来して、化学的に、物理的に及び生物学的に、膵臓のヒトインスリンと同一である。ＰＢＳはリン酸緩衝食塩水である。ＰＤＦは４５ｍｇ／ｍＬメチル−β−シクロデキストリン、１ｍｇ／ｍＬエチレンジアミン四酢酸塩、１ｍｇ／ｍＬジデカノイルホスファチジルコリン、及び１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．５からなる混合物である。モンモメリック（ｍｏｎｍｏｍｅｒｉｃ）モノマ安定剤（ＮＰＧ）はＮ−ピバロイルグルコサミンである。ＰＮ１５９は同時係属出願の米国特許出願第１１/２３３，２３９号に記載したペプチドである。結果は次の表４に示す。
【０２１５】
表４  ＰＤＦ、ＰＮ１５９、及びＮＰＧ製剤での透過性結果
【表４】
2009512709.tif 000007
【０２１６】
ＰＮ１５９はインスリン透過率を増加させた。２５μＭ  ＰＮ１５９は透過率０．８％の結果であり、一方５０μＭ  ＰＮ１５９は透過率を２．５％に増加させた。ＮＰＧと組み合わせて、２５μＭ  ＰＮ１５９の結果は１．８％の透過率であった。表の結果は、ＰＤＦ単独で、ＰＢＳ単独よりも約１２倍大きい３％の透過率を提供したことを示した。ＰＤＦがＮＰＧと組み合わされると、透過率は７．６％に増加して、ＰＢＳに対して３０倍の増加であった。
【０２１７】
ＴＥＲ、ＬＤＨ、ＭＴＴを試験するためにさらに検討を実施し、ＰＮ１５９を含有する製剤を含めて、製剤の透過率を表５に示した。全ての製剤は、ＥｐｉＡｉｒｗａｙモデルで、ｎ＝３のインサートを使用して試験した。レギュラー標準インスリンは約２８Ｕ／ｍｇ（即ち、２００Ｕ／ｍＬ＝約７．１４ｍｇ／ｍＬ）であった。
【０２１８】
表５  製剤
【表５】
2009512709.tif 000008
【０２１９】
実験製剤に対する３７℃で１時間のインキュベーション前後のＴＥＲ測定結果（オーム×ｃｍ２）を対照コントロールと比較した。結果は、増強剤含有製剤が、１時間のインキュベーション後に有意なＴＥＲ減少を有することを示す。示した製剤＃５、＃６、及び＃８は細胞生存率を有し、全ての製剤は、＃７を除き、ＰＢＳ対照コントロールと同様に同程度極小の細胞毒性を有した。透過結果は表６に示す。
【０２２０】
表６  透過結果
【表６】
2009512709.tif 000009
【０２２１】
製剤＃１、（４．４７％）及び＃７（４．６６％）が最高の透過率（％）を有していた。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＮ１５９の添加はＰＤＦ（Ｍｅ−β−ＣＤ、ＤＤＰＣ、及びＥＤＴＡ）を超えてインスリンの透過を有意に増強することはないことを示す。
【０２２２】
実施例５
インスリン透過率に対する代替緩衝液の効果
ＰＤＦ製剤と組み合わせた代替緩衝液（Ｍｅ−β−ＣＤ、ＤＤＰＣ、及びＥＤＴＡ）を比較する透過率試験を実施した。これらの透過率のデータは、６０分間のインキュベーション後、５０μＬの負荷容積を使用して、ＥＬＩＳＡ（ＬＩＮＣＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ,  Ｉｎｃ．製、カタログ＃ＥＺＨＩ−１４Ｋ）により得た。表７に掲載した全ての製剤は、ＭＴＴ及びＬＤＨアッセイにより測定してしたところ、良好な細胞生存率及び低い細胞毒性を有していた。
【０２２３】
表７  代替緩衝液での透過率結果
【表７】
2009512709.tif 000010
【０２２４】
アルギニン緩衝液は、３％から６％のインスリン透過率（％）を有する中程度の性能の緩衝液である。酢酸塩緩衝製剤は、７％から１２％の透過率（％）を達成した。リン酸緩衝製剤の透過率（％）は、５％から２８％の範囲にあった。最高透過率（％）の２８％は、１０ｍＭ  リン酸緩衝剤、４５ｍｇ／ｍＬ  Ｍｅ−β−ＣＤ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、２８０Ｕ／ｍＬインスリン、ｐＨ７（＃４）で達成された。
【０２２５】
実施例６
最適経鼻用インスリン製剤のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング試験
成分濃度及びｐＨ範囲を変化させて２８０Ｕ／ｍＬ及び８４０Ｕ／ｍＬのインスリン製剤に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏの予備的スクリーニングを実施した。基本の１×ＰＤＦ製剤は、４５ｍｇ／ｍＬ  Ｍｅ−β−ＣＤ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸塩、１０ｍＭホスファターゼ、及び２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  ＮａＣｌを含むものであった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験１の製剤成分を表８に示す。
【０２２６】
表８  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験１製剤成分
【表８】
2009512709.tif 000011
【０２２７】
最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のために試験した時間経過は、３０、６０、及び１２０分のインキュベーションを含んでいた。インキュベーションはＣａ＋＋及びＭｇ＋＋添加ＰＢＳ（インスリンは標準ＭａｔＴｅｋ培地中に存在することに注意されたい）中で行った。アッセイ条件は、３７℃での１００ｒｐｍのスピン及び５０μＬの試験した製剤の適用を含んでいた。全ての製剤について有意のＴＥＲ減少が観察された。ＭＴＴアッセイで高い毒性が観察され、ＬＤＨアッセイで低い細胞生存率が観察された。
【０２２８】
２８０Ｕ／ｍＬのインスリン濃度に対するの透過のデータは、３０及び６０分で取られ、１×ＰＤＦ、ｐＨ３；２×ＰＤＦ、ｐＨ３；１×ＰＤＦ、ｐＨ４；及び０．５×ＰＤＦ、ｐＨ３を比較した。約１０％の透過が、１×ＰＤＦ、ｐＨ３；１×ＰＤＦ、ｐＨ４；及び０．５×ＰＤＦ、ｐＨ３のを用いて６０分で得られた。２×ＰＤＦ、ｐＨ３は２％透過の結果になった。増強剤なしの対照コントロールは１％未満の透過を示した。
【０２２９】
２８０Ｕ／ｍＬインスリン及び８４０Ｕ／ｍＬインスリンの濃度に対する透過のデータを、２×ＰＤＦ、ｐＨ３の製剤において３０及び６０分で比較した。透過における有意の差は、おそらく高いインスリン濃度での沈澱による大きいばらつきのために、観察されなかった。
【０２３０】
１×ＰＤＦ、ｐＨ３の中で３０及び６０分に取られた、２８０Ｕ／ｍＬのインスリン濃度に対する透過のデータを、１×ＰＤＦ、ｐＨ７と比較した。結果は、ｐＨ７で製剤は、ｐＨ３におけるよりも良く性能を発揮することを示した。１×ＰＤＦ、ｐＨ３に対する透過率（％）は、１０％であり、一方１×ＰＤＦ、ｐＨ７に対する透過率は３５％であった。
【０２３１】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ試験のまとめ
ＰＢＳ（Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋添加）中３０、６０、及び１２０分のインキュベーションでの透過試験は、高い細胞毒性及び低い細胞生存率という結果になった。１×及び０．５×ＰＤＦの結果は、２×ＰＤＦよりもよい透過であった。ＰＤＦは１０ｍｇ／ｍＬ（即ち２８０Ｕ／ｍＬ）まで溶解し得るが、３０ｍｇ／ｍＬ（即ち８４０Ｕ／ｍＬ）は溶解し得なかった。透過率（％）の結果はｐＨ３よりもｐＨ７に対して高かった。
【０２３２】
２番目の試験は、基本製剤として１×ＰＤＦ（４５ｍｇ／ｍＬ  Ｍｅ−β−ＣＤ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸塩、１０ｍＭホスファターゼ、及び２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  ＮａＣｌ）を使用して実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験２の製剤成分は表９に示す。
【０２３３】
表９  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ試験２の製剤成分
【表９】
2009512709.tif 000012
【０２３４】
第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の時間経過は、６０分のインキュベーションを含んでいた。インキュベーションはＣａ＋＋及びＭｇ＋＋添加ＰＢＳ中で行った。アッセイ条件は、３７℃で１００ｒｐｍのスピン及び５０μＬの試験された製剤の適用を含んでいた。全ての製剤について有意のＴＥＲ減少が観察された。可溶化剤不使用の場合でさえ、高い毒性がＭＴＴアッセイで観察され、低い細胞生存率がＬＤＨアッセイで観察された。
【０２３５】
２８０Ｕ／ｍＬのインスリン濃度に対する透過データを、６０分で取り、１×ＰＤＦ、ｐＨ３.５；１×ＰＤＦ、ｐＨ７；１×ＰＤＦ＋０．５％ＣＥＬ、ｐＨ３.５；１×ＰＤＦ＋１％ＣＥＬ、ｐＨ３.５；１×ＰＤＦ＋０．１％ツイーン８０、ｐＨ３.５；及び１×ＰＤＦ＋１％ツイーン８０、ｐＨ３.５で比較した。ｐＨ３．５で全ての製剤について、少なくとも１０％の透過率が得られた。透過はｐＨ３．５に比較してｐＨ７の製剤で増大した。
【０２３６】
２８０Ｕ／ｍＬ及び８４０Ｕ／ｍＬのインスリン濃度に対する透過のデータを、１×ＰＤＦ、ｐＨ７；１×ＰＤＦ＋０．５％ＣＥＬ、ｐＨ３．５；１×ＰＤＦ＋０．５％ＣＥＬ、ｐＨ７；１×ＰＤＦ＋１％ＣＥＬ、ｐＨ３．５；１×ＰＤＦ＋０．１％ツイーン８０、ｐＨ３．５；及び１×ＰＤＦ＋１％ツイーン８０、ｐＨ３．５の製剤において６０分で比較した。８４０Ｕ／ｍＬ  インスリンの製剤は、可溶化剤が存在するとき、インサートの表面で可視的に可溶性であった。ｐＨ７の製剤はｐＨ３．５の製剤よりも高い透過性を有するということを除き、全ての製剤は同様の透過性を有していた。
【０２３７】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ試験２のまとめ
高濃度インスリン製剤（８４０Ｕ／ｍＬ）は、追加の界面活性剤（即ち、ツイーン又はクレモホール）の存在で上首尾に安定化された（且つ溶解された）。６０分のインキュベーションでさえ、増大した細胞毒性及び減少した細胞生存率が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで全ての製剤について観察された。
【０２３８】
第３の試験は、３種の異なる界面活性剤（ツイーン８０、ツイーン２０、及びプルロニックＦ６８）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ透過性に対する効果を測定するために、ｐＨ７で２８０Ｕ／ｍＬ及び８４０Ｕ／ｍＬ、１×ＰＤＦのインスリン製剤を使用して、第３の試験を測定するために実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験３の製剤成分を表１０に示す。
【０２３９】
表１０  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験３の製剤成分
【表１０】
2009512709.tif 000013
【０２４０】
第３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の時間経過は、６０分のインキュベーションを含んでいた。インキュベーションは、Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋添加ＰＢＳ中で行った。アッセイ条件は、３７℃で１００ｒｐｍのスピン及び５０μＬの試験された製剤の適用を含んでいた。全ての製剤について有意のＴＥＲ減少が観察された。高い毒性がＭＴＴアッセイで観察され、低い細胞生存率がＬＤＨアッセイで観察された。
【０２４１】
２８０Ｕ／ｍＬ及び８４０Ｕ／ｍＬのインスリン濃度に対する透過のデータは、６０分で取られ、１×ＰＤＦ＋１％ツイーン８０、ｐＨ７；１×ＰＤＦ＋０．０１％プルロニックＦ６８、ｐＨ７；及び１×ＰＤＦ＋０．１％プルロニックＦ６８、ｐＨ７の製剤で比較した。結果はプルロニックＦ６８が透過を増強するほど十分にはインスリンを可溶化しないことを示した。
【０２４２】
１×ＰＤＦ製剤（インスリン濃度２８０Ｕ／ｍＬ及び８４０Ｕ／ｍＬ）におけるツイーン８０及びツイーン２０のインスリン透過に対する効果を試験した。透過率（％）データは、１×ＰＤＦ＋１％ツイーン８０、ｐＨ７；１×ＰＤＦ＋０．１％ツイーン８０、ｐＨ７；１×ＰＤＦ（ＤＤＰＣなし）＋１％ツイーン８０、ｐＨ７；１×ＰＤＦ（ＤＤＰＣなし）＋０．１％ツイーン８０、ｐＨ７；１×ＰＤＦ＋１％ツイーン２０、ｐＨ７；１×ＰＤＦ＋０．１％ツイーン２０、ｐＨ７；及び１×ＰＤＦ＋１％ツイーン８０、ｐＨ７（低張性）の製剤において６０分で比較した。結果は、１％ツイーンが（ツイーン８０及びツイーン２０両者共）、０．１％ツイーンよりも大きい透過性を提供することを示した。ツイーン２０に対する透過の結果は、ツイーン８０と同じであった。ＤＤＰＣの除去はこれらの製剤における透過率（％）に影響を有しなかった。
【０２４３】
ツイーン８０の量を増加させて（０．０１％、０．１％、０．５％、及び１％）、ｐＨ７で１×ＰＤＦ製剤における２８０Ｕ／ｍＬのインスリンの透過に対する影響について試験した。製剤中のツイーン８０の量は透過率（％）に影響した。透過は、ツイーン８０の濃度が増加するにつれて増加した。ツイーン濃度の透過に対する影響のさらなる分析は、１×ＰＤＦ製剤で１％、２％、及び５％のツイーン８０でアッセイした。それに加えて、２×ＰＤＦ製剤での透過を、１％及び２％のツイーン８０で試験した。結果は、ツイーン８０濃度がひとたび１％を超えると、１×又は２×ＰＤＦのいずれでも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの透過のさらなる増強はなかった。
【０２４４】
Ｍｅ−β−ＣＤ除去の効果は、０．１％ツイーン及び１％ツイーン製剤（１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡを含む）で試験した。製剤からのＭｅ−β−ＣＤ除去は、透過性に劇的な減少低下をもたらした。結果は、２８０Ｕ／ｍＬ及び８４０Ｕ／ｍＬの製剤の両方で観察された。
【０２４５】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ試験３のまとめ
ツイーン８０及びツイーン２０は両方とも、１×ＰＤＦ製剤と組み合わせて使用したとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで透過の結果は良好であった。プルロニックＦ６８は透過を増強しなかった。ツイーン８０又はツイーン２０単独は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインサートの増大した透過を達成するには十分でなかった。製剤からＭｅ−β−ＣＤを除去した結果、インスリンの透過は有意に減少した。ツイーンを１％まで増加させた結果、透過は増大したが、１％を超えてもそれ以上の利益は観察されなかった。１％ツイーンの製剤は、幾つかの市販されているツイーン含有鼻用製品よりも低い。
【０２４６】
実施例７
インスリン製剤の安定性データ
５℃、２５℃、４０℃、及び５０℃で２８日までの使用時の安定性試験を１×ＰＤＦ（４５ｍｇ／ｍＬ  Ｍｅ−β−ＣＤ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１ｍ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸塩、１０ｍＭホスファターゼ、及び２２０ｍＯｍ／ｋｇ  ＮａＣｌ）インスリン噴霧製剤について実施した。ペプチド回収率（％）をアッセイするためにＨＰＬＣを使用した。試験で評価されたした製剤パラメータは表１１に示した。
【０２４７】
表１１  予備的インスリン安定性試験製剤のパラメータ
【表１１】
2009512709.tif 000014
【０２４８】
１×ＰＤＦインスリン噴霧製剤は、食塩及びバッファのみと共に貯蔵保存したインスリンに比較してより安定な状態が持続した。ツイーンの存在は１×ＰＤＦ製剤の安定性に影響しなかった。ｐＨ７の製剤は、ｐＨ３．５の製剤よりもずっと良好な安定性を維持した。１×ＰＤＦ中で貯蔵保存したインスリンの安定性は、５℃、２５℃、４０℃、及び５０℃で２８日まで非常に良好で、表示の約１００％の回収が、２８０Ｕ／ｍＬ及び８４０Ｕ／ｍＬのインスリン濃度の両方について観察された。
【０２４９】
さらに、１×ＰＤＦインスリン噴霧製剤の安定性を評価するために、使用時アッセイ（単位投与量及び８日）を実施した。「単位投与量」は、装填プライミング及び１回作動後のインスリン安定性を評価するために使用した。８日の使用時試験の条件は、５℃及び３０℃貯蔵保存における８日間毎日３回の作動を含むものであった。試験ではペプチド含有量をアッセイした。使用時ペプチド含有量試験の結果は、ＰＤＦインスリン噴霧製剤が単位投与量及び８日間使用の両方で良好な安定性を示すことを明らかにした。この試験で、貯蔵保存温度３０℃での安定性は、貯蔵保存温度５℃と同様に安定であると思われる。
【０２５０】
実施例８
ラビットにおける経鼻投与インスリンの薬物動態結果
薬物動態（ＰＫ；即ちインスリン測定）値は、インスリン処置したニュージーランド白色ラビットについて、２４０分までの特定した時点で測定した。４つの（４）鼻内（ＩＮ）投与群、１つの（１）皮下（ＳＣ）投与群、及び１つの（１）静脈内（ＩＶ）投与群が、生体利用率バイオアベイラビリティデータを得たこの試験に含まれた。各群は５頭の雄ラビットを含んでいた。全てのデータ計算は、投与量で正規化し、ＰＫデータは基準線ベースライン補正した。ＰＫ試験１のための処置及び投与量の詳細は表１２に示す。
【０２５１】
表１２  ラビットＰＫ（及びＰＤ）試験１の処置及び投与量詳細
【表１２】
2009512709.tif 000015
【０２５２】
ＰＫ試験１の結果は、表１３及び図１に示す。インスリンのＩＮ投与は通常の標準的なＳＣインスリンよりも迅速なＴｍａｘを生じた。１％ツイーン（投与量６ＩＵ／ｋｇ）添加ＩＮ／１×ＰＤＦ、＃３は経鼻製剤の最高ピークを示した。インスリンの生体利用率バイオアベイラビリティ（ＢＡ）（％）は、１％ツイーン添加ＩＮ／１×ＰＤＦ製剤、＃２及び＃３の両者について約３〜５％であった（ＳＣに対して）。ＳＣに対する絶対ＢＡ（％）は３０％であり、一方ＩＮでは１％であった。ＩＮに対するＣＶ（％）はＡＵＣ（曲線下面積）を基準に基づいて５０％であり、一方ＳＣでは２０％であった。
【０２５３】
表１３  ラビットにおけるＰＫ試験１の結果
【表１３】
2009512709.tif 000016
【０２５４】
第２のＰＫ試験は、ＰＤＦにツイーンを加えた経鼻製剤とＮｏｖｏＬｏｇ速効製剤（ＮｏｖｏＬｏｇ希釈剤は、１６ｍｇ／ｍＬグリセリン、１．５ｍｇ／ｍＬフェノール、１．７２ｍｇ／ｍＬ  ｍ−クレゾール、１９．６μｇ／ｍＬ亜鉛、１．２５ｍｇ／リン酸水素二ナトリウム二水和物、及び０．５８ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２〜７．６からなる）とを比較するために実施した。ＰＫ試験２のパラメータを表１４に示す。
【０２５５】
表１４  ＰＫ（及びＰＤ）試験２の製剤パラメータ
【表１４】
2009512709.tif 000017
【０２５６】
表１５に示したものは、ＰＫ基準線ベースラインを差し引いた、試験２のＳＣ−ＮｏｖｏＬｏｇ結果に対するＴｍａｘ、Ｃｍａｘ（％）、ＡＵＣｌａｓｔ、ＡＵＣｉｎｆ、及びＢＡ（％）であり、ＩＮ／１×ＰＤＦ１％ツイーン（＃３）及びＳＣレギュラー標準（＃５）製剤に対する試験１の結果も含まれている。ＰＫ試験２の結果は図２に示す。試験２のＰＫ曲線は、試験１で見られる曲線に類似しており、ＩＮ／１×ＰＤＦは速効性ＰＫプロファイルを生ずることを示す。インスリンの第２のピークは幾つかのＩＮ処置動物で観察された。
【０２５７】
表１５  ラビットにおけるＰＫ試験２の結果
【表１５】
2009512709.tif 000018
【０２５８】
ＰＫ試験２の結果は、ＩＮ／１×ＰＤＦ２％ツイーンが、試験した経鼻製剤の最高のＢＡ（％）、Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔを有することを示す。ＢＡ（％）、Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔは、ＤＤＰＣが除去されると減少した。試験２のＩＮ／１×ＰＤＦ１％ツイーンの結果は、試験１の結果と符合一致した。ＳＣレギュラー標準、ＳＣ−ＮｏｖｏＬｏｇ、及びＳＣ−ＰＤＦインスリンは、同様な生体利用率バイオアベイラビリティになった。ＢＡ（％）については、経鼻製剤は約２〜５％の生体利用率バイオアベイラビリティになった。ＩＮ／１×ＰＤＦ２％ツイーンは、最高の生体利用率バイオアベイラビリティ５％を示した。
【０２５９】
実施例９
ラビットにおける経鼻投与インスリンの薬物動態データ
薬力学（ＰＤ；即ちグルコース測定）値は、インスリン処置したニュージーランド白色ラビットについて、２４０分までの特定した時点で測定した。グルコースは各時点で二つ組重複する二つの系にしてＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｏｎｅ−Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ）を使用して測定した。ＰＤ試験１（試験群は上記の実施例８、表１２に示してある）の結果を、表１６及び図３に示す。全てのデータ計算は、投与量に基づいて正規化し、ＢＡ（％）は試験項目の名目アッセイ値に基づく。
【０２６０】
表１６  ＰＤ試験１の結果
【表１６】
2009512709.tif 000019
【０２６１】
試験１において、ＩＮ／ＰＤＦ−ツイーン（＃２及び＃３）、ＳＣ（＃５）、及びＩＶ（＃６）インスリンに対するＣｍａｘｉｎ（％）は、約４０％であった。Ｔｍｉｎは、ＳＣ（１２０分）よりもＩＮ／ＰＤＦ−ツイーンに対して速かった（３０〜４５分）。１％ツイーン添加ＩＮ  ＰＤＦのグルコースＢＡ（％）は、約８％であった（ＳＣに比較して）。
【０２６２】
第２のＰＤ試験は、経鼻用ＰＤＦ製剤をＮｏｖｏＬｏｇ速効製剤（ＮｏｖｏＬｏｇ希釈剤は、１６ｍｇ／ｍＬグリセリン、１．５ｍｇ／ｍＬフェノール、１．７２ｍｇ／ｍＬ  ｍ−クレゾール、１９．６μｇ／ｍＬ亜鉛、１．２５ｍｇ／ｍＬリン酸水素二ナトリウム二水和物及び０．５８ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２〜７．６からなる）と比較するために実施した。ＰＤ試験２のパラメータは上記実施例８及び表１４に示してある。ＰＤ試験２に対するＣｍｉｎ、Ｃｍａｘ及びＴｍｉｎの結果を表１７に示す。
【０２６３】
表１７  ＰＤ試験２に対するＣｍｉｎ及びＴｍｉｎ結果
【表１７】
2009512709.tif 000020
【０２６４】
図４において、試験２についてのＰＤ結果を試験１と比較している。ＩＮ／１×ＰＤＦ５％ツイーン、ＩＮ／２×ＰＤＦ１％ツイーン、ＳＣ  ＮｏｖｏＬｏｇに対するＴｍｉｎは約３０分であった。ＳＣレギュラー標準＊に対するＴｍｉｎは約４０分であった。他の製剤に対するＴｍｉｎは約４５分であった。ＰＤ試験２の結果は、２×ＰＤＦ１％ツイーンが、全ての経鼻製剤の中でＰＤに対する最大の効果を有していることを示した。製剤中のＤＤＰＣの存在はＰＤ結果に影響しなかった。
【０２６５】
鼻内への刺激は、ＩＮ投与のラビットにおいては存在しないか又は無症候性であった。記載したＰＤデータは速効型プロファイルの経鼻インスリン送達製剤を支持するものであった。最良性能の製剤は、可溶化剤及び界面活性剤を含むものであった。さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ投与のためのＩＮインスリン製剤の明細を表１８に示す。
【０２６６】
表１８  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ試験のための製剤
【表１８】
2009512709.tif 000021
【０２６７】
実施例１０
前臨床試験３：ラビットにおけるインスリンの静脈内、皮下、及び経鼻投与後のＰＫ及びＰＤ結果
表１９は試験３における投薬群を示す。次の略記号を使用した：ＰＤＦ＝４５ｍｇ／ｍＬ  Ｍｅ−β−ＣＤ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭアルギニン、ｐＨ７．０、約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇにするためにＮａＣｌを添加；２×ＰＤＦ＝９０ｍｇ／ｍＬ  Ｍｅ−β−ＣＤ、２ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、２ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ（他の成分はＰＤＦ中と同一のままである）；この場合防腐剤（Ｐｒｅ）は、１０ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、０．３３ｍｇ／ｍＬメチルパラベン、及び０．１７ｍｇ／ｍＬプロピルパラベンの組合せであった。種々の製剤にポリソルベート８０（ツイーン）を、表示したように１％又は２％（１０又は２０ｍｇ／ｍＬ）で加えた。２つのＳＣ群を投与し、１つは増強剤なしのレギュラー標準インスリン、及び１つはＰＤＦを存在させた存在下でのレギュラー標準インスリンであった。
【０２６８】
表１９  前臨床試験３において投薬された群の説明
【表１９】
2009512709.tif 000022
【０２６９】
前臨床試験３で投薬された群のＰＤデータを表２０及び図５に示す。
【０２７０】
表２０  前臨床試験３で投薬された群のＰＤデータ
【表２０】
2009512709.tif 000023
【０２７１】
全ての経鼻投与群がおよそ同じＰＤ効果（Ｔｍｉｎ及びＣｍｉｎ（％））を示した。ＰＤＦを存在させずに又は存在させての非存在下又は存在下で皮下送達されたレギュラー標準インスリンは、同様なＰＤ効果（及び予想されたようにより遅いＴｍｉｎ及びより大きいＣｍｉｎ（％））を有していた。データは、立ち上がり（Ｔｍｉｎにより示される）は、対照コントロール製剤（ＳＣに対してで６０分）に比較してＰＤＦ製剤中のレギュラー標準インスリンに対してより速い（ＳＣに対して４５分；鼻内鼻腔内に対して３０分）ことを示した。データは、経鼻製剤中のレギュラー標準インスリンが速効型インスリンプロファイルと一致することを示す。
【０２７２】
前臨床試験３で投薬された群のＰＫデータを、図６及び表２１、表２２及び表２３に示す。
【０２７３】
表２１  前臨床試験３で投薬された群のＰＫパラメータ
【表２１】
2009512709.tif 000024
【０２７４】
表２２  前臨床試験３で投薬された群のＰＫデータ（バイオアベイラビリティ）
【表２２】
2009512709.tif 000025
【０２７５】
表２３  前臨床試験３で投薬された群のＰＫデータのＣＶ（％）
【表２３】
2009512709.tif 000026
【０２７６】
種々のＰＫパラメータのＣＶ（％）は、種々の群に対してついて同様であった。ツイーン添加ＰＤＦ製剤に対するのＦ（％）（ＳＣ対照コントロールに比較した生体利用率バイオアベイラビリティ）は、ＳＣレギュラー標準インスリン対照コントロールに比較して約２〜６％、及びＴｍａｘは１２〜３６分の範囲にあった。最高の生体利用率バイオアベイラビリティ（％）のＩＮ製剤はＤＤＰＣ無添加不含の１×ＰＤＦ／２％ツイーンであった（５．８％）。これらのＰＤデータは、増加した生体利用率バイオアベイラビリティを得るために、ＤＤＰＣはＰＤＦ製剤中には必要ないことを示唆する。
【０２７７】
実施例１１
前臨床試験４：ラビットにおけるインスリンの経口及び経鼻投与後のＰＫ及びＰＤ結果
表２４は試験４における投薬群を記載している。次の略個号を使用した：ＰＤＦ＝４５ｍｇ／ｍＬ  Ｍｅ−β−ＣＤ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、１ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭアルギニン、ｐＨ７．０、約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇにするためにＮａＣｌを添加；２×ＰＤＦ＝９０ｍｇ／ｍＬ  Ｍｅ−β−ＣＤ、２ｍｇ／ｍＬ  ＤＤＰＣ、２ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＴＡ（他の成分はＰＤＦ中と同一のままである）；ＴＤＭ＝２．５ｍｇ／ｍＬテトラデシルマルトシド。ポリソルベート８０（ツイーン）を、表示したように種々の製剤に１％（１０ｍｇ／ｍＬ）で添加した。プロピレングリコール（ＰＧ）を、種々の製剤に１％又は２．５％（１０又は２５ｍｇ／ｍＬ）で添加した。ゼラチンの０．２％での効果を、ＩＮ製剤で試験した。３つの経口群、即ち、１つは増強剤なしのレギュラー標準インスリン（＃８）、１つはＰＤＦ存在下のレギュラー標準インスリン（＃９）、１つはＤＤＰＣなしのＰＤＦの存在下のレギュラー標準インスリン（＃７）を投与した。
【０２７８】
表２４  前臨床試験４において投薬された群の説明
【表２４】
2009512709.tif 000027
【０２７９】
前臨床試験４において投薬された群のＰＤデータを、図７に示す。ＰＤデータは、全ての経鼻製剤間で類似であったが、ＳＣ投薬は経鼻に対して延長されたＰＤ効果を有した。経口投薬群についてはＰＤ効果が観察されなかった。ＰＤＦを存在させずに及び存在させての非存在下又は存在下で皮下送達されたレギュラー標準インスリンは、同様なＰＤ効果（及び予想したようなより遅いＴｍｉｎ及びより大きいＣｍｉｎ（％））を有した。データは、立ち上り（Ｔｍｉｎにより示される）がＰＤＦ製剤中のレギュラー標準インスリンでより速いことを示す。
【０２８０】
前臨床試験４において投薬された群のＰＫデータを、図８及び表２５、表２６及び表２７に示す。
【０２８１】
表２５  前臨床試験４において投薬された群のＰＫパラメータ
【表２５】
2009512709.tif 000028
【０２８２】
表２６  前臨床試験４において投薬された群のＰＫデータ（バイオアベイラビリティ）
【表２６】
2009512709.tif 000029
【０２８３】
表２７  前臨床試験４において投薬された群のＰＫパラメータのＣＶ（％）
【表２７】
2009512709.tif 000030
【０２８４】
ＰＧを含有又は不含のＰＤＦを含む経鼻投与群並びにＴＤＭを含む群に対して、ＰＫデータは同様で、Ｆ（％）（ＳＣレギュラー標準インスリンと比較した生体利用率バイオアベイラビリティ）は約５．４〜１０．６％で、Ｔｍａｘは１８〜５９分の範囲であった。０．２％ゼラチンの存在下に１％ツイーンを添加した１×ＰＤＦの場合、生体利用率バイオアベイラビリティは増加して約１４．９％であった。ＰＧを含有又は不含のＰＤＦを含む経鼻投与群並びにＴＤＭを含む群に対して、Ｃｍａｘ及びＡＵＣのＣＶ（％）は５０〜２００％の間であった。対照的に、０．２％ゼラチンの存在下に１％ツイーンを添加した１×ＰＤＦにおいて、Ｃｍａｘ及びＡＵＣにおいて、それぞれ２１．３％及び３５．３％への減少低下があった。０．２％ゼラチンの存在下に１％ツイーンを添加した１×ＰＤＦ製剤のＣｍａｘ及びＡＵＣのＣＶ（％）は、ＳＣ注射について観察されたものより低いことが認められた。
【０２８５】
これらのデータは、立ち上がり（Ｔｍｉｎにより示される）は、ＰＤＦ製剤中のレギュラー標準インスリンに対して、ＳＣ製剤よりも速く、結果として、このインスリンは速効型インスリンのプロファイルを有することを示す。ゼラチンの添加は、ＰＤＦ製剤に対して、ＰＤ及びＰＫ効果を増強する（ＳＣに比較して１４．９％の生体利用率バイオアベイラビリティ）。
【０２８６】
実施例１２
増粘剤を含む製剤についてのＰＫ及びＰＤ結果
種々の増粘剤を含む経鼻用インスリン製剤を投与したラビットについて、ＰＫ及びＰＤを評価した。増粘剤には、ゼラチン、ＨＰＭＣ、ＭＣ、及びカルボマを含めた。カルボマはカルボポール（登録商標）として知られているポリマのファミリに対する総称である。時点は、５、１０、１５、３０、４５、６０、１２０および２４０分にとった。グルコースは時点毎にＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｏｎｅ−Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ）で測定した。所望のｐＨにするために、必要なときには、少量の２Ｎ  ＨＣｌ又はＮａＯＨを製剤に加えた。試験に使用したインスリンの濃度は約２８Ｕ／ｍｇであった。表２８はこの試験で使用された製剤を示す。
【０２８７】
表２８  増粘剤を含むインスリン製剤
【表２８】
2009512709.tif 000031
【０２８８】
１５ｍＬの各製剤を作製して３ｃｃの透明なシラン処理をしていないガラスバイアル中に貯蔵保存した。全ての試験製剤は２〜８℃で貯蔵保存した。全ての製剤は６．０ＩＵ／ｋｇで投与された。表２９にこの試験で使用された投薬群を記載する。
【０２８９】
表２９  増粘剤投薬群
【表２９】
2009512709.tif 000032
【０２９０】
初期からのグルコース（％）についてのＰＤの結果を図９に示す。図９は、試験した８群について時間を追ってグルコース（％）における平均の変化を示している。群６（１×ＰＤＦ／１％ツイーン／（０．２５％カルボポール））は、他の全ての群に比較して初期からのグルコース（％）で最大の減少を示した。８群についてグルコースのトラフは図９の示したように９０分以内に起こった。群８（等張化剤を含んでいた）は、他のゼラチン製剤に比較して初期からのグルコース（％）における最大の減少を有していた。カルボマ（０．２５％カルボポール）及びＣＭＣを含む製剤は、他のゼラチンを含まない製剤に比較して初期からのグルコース（％）で最大の減少を有していた。
【０２９１】
時点毎の平均データのＰＫ結果を、図１０に示す。図１０では、時間を追ってインスリンの平均濃度（μＩＵ／ｍＬ）を、試験した８群について示す。Ｃｍａｘは、他の製剤に比較して、１×ＰＤＦ／１％ツイーン／（０．２５％カルボポール）の群６が最大であることを図１０は示す。図１０に示したように、８群に対して、血清インスリンレベルのピークは６０分以内に起こった。ＰＫパラメータを表３０にまとめてある。
【０２９２】
表３０  ラビットにおける増粘剤ＰＫパラメータ
【表３０】
2009512709.tif 000033
【０２９３】
ＣＶ（％）の結果は表３１に示す。
【０２９４】
表３１  ラビットにおける増粘剤ＣＶ（％）の結果
【表３１】
2009512709.tif 000034
【０２９５】
Ｆ（％）（生体利用率バイオアベイラビリティ）の結果を表３２に示す。
【０２９６】
表３２  ラビットにおける増粘剤のＦ（％）の結果
【表３２】
2009512709.tif 000035
【０２９７】
まとめ
ＰＫ及びＰＤの結果は、試験した経鼻用インスリン製剤が、６０分以内のピーク血清インスリンレベル及び９０分以内のグルコーストラフを有する速効型インスリンのプロファイルを有しいていたことを示す。ＰＤＦ経鼻用インスリン製剤に増粘剤を加えると、生体利用率バイオアベイラビリティが増大した。張度を上げるとゼラチン含有製剤の生体利用率バイオアベイラビリティが増大した。ゼラチン含有製剤は、低張条件（群＃２；ＮａＣｌを含まずゼラチン０．２％）に比較して等張条件（群８；ＮａＣｌを含みゼラチン０．２％）で改良された恒常体性能を示した。カルボマ及びＣＭＣを含有する製剤は、経鼻用インスリン製剤として、ＰＫ及びＰＤ結果における最大の増加を示した。Ｆ（％）により示される生体利用率バイオアベイラビリティは、カルボマ及びＣＭＣについてそれぞれ１９．７％及び１７．８％であった。初期からのグルコース（％）で示されるＰＤ効果は、経鼻用インスリン製剤にカルボマ及びＣＭＣなどの増粘剤を加えると改良された。
【０２９８】
ラビットにおけるＰＫ及びＰＤのデータは、製剤増強剤の存在による鼻粘膜を通過するインスリン透過増大のｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果を裏付ける。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの薬剤透過データ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＫのラビットデータは、経鼻用インスリン製剤に対する実質的相互関係を示した。代表的経鼻製剤を使用して、Ｘ軸にＡＵＣｌａｓｔ（分＊μＵ／ｍＬ）及びＹ軸に透過率（％）でのＸＹプロット分析は、Ｒ２＝０．８９９４、Ｙ＝０．０００７ｘ＋０．４１９１を示した。
【０２９９】
実施例１３
ＡＥＴ試験１〜８：抗菌効果試験（ＡＥＴ）
ＡＥＴ試験１
メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、及びプロピレングリコールを含むインスリン鼻噴霧のプラセボの抗菌効果（ＡＥＴ）を測定するために、ＡＥＴ試験を実施した。それに加えて、ＡＥＴ試験は、増加させたＥＤＴＡのみのＡＥＴを調べた。ＡＥＴ試験で評価した製剤を表３３に示す。約１２０ｍＬの各製剤を作製して二つ組重複する二つの系で試験した（試料当りｎ＝２の分析）。
【０３００】
表３３  ＡＥＴ試験で評価された製剤
【表３３】
2009512709.tif 000036
【０３０１】
使用したＡＥＴの方法は、米国薬局方（ＵＳＰ）及び欧州薬局方（ＥＰ）のＡＥＴの要件に適合していたものであり、表３４及び３５にそれぞれ記載する。製剤は、ｐＨ（標準操作手順（ＳＯＰ）４０３による）、外観（視覚による）、および重量オスモル濃度（標準操作手順（ＳＯＰ）４０００による）についても試験した。
【０３０２】
表３４  ＵＳＰ  ＡＥＴ  要件（ＵＳＰ＜５１＞）
【表３４】
2009512709.tif 000037
【０３０３】
表３５  ＥＰ  ＡＥＴ要件（ＥＰ＜５．１．３＞）
【表３５】
2009512709.tif 000038
【０３０４】
０．３３ｍｇ／ｍＬのメチルパラベンナトリウム、０．１７ｍｇ／ｍＬのプロピルパラベンナトリウム、及び少なくとも２５ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコールの組合せは、有効な防腐剤配合であり、ＵＳＰ規格に適合した。これらの製剤は、ＵＳＰ要件の全てに合格したが、ＥＰには合格しなかった（黄色ブドウ球菌及びクロカビについて）。増加させたＥＤＴＡ単独は、ＵＳＰ又はＥＰのいずれにも有効であるとは思われなかった。
【０３０５】
ＡＥＴ試験２
ＡＥＴ試験２は、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムが防腐剤として使用されたとき、湿潤剤（プロピレングリコール）が抗菌効果を改良する向上させるかどうかを決定するために実施した。塩化ベンズアルコニウム（ＢＡＫ）、ベンジルアルコール、及び安息香酸ナトリウムなどの他の防腐剤も評価した。５００Ｕ／ｍＬ又は１０００Ｕ／ｍＬのレベルの２つのインスリン群を試験した。ＡＥＴ試験２で評価した製剤を表３６に掲載する。
【０３０６】
表３６  ＡＥＴ試験２で評価した製剤
【表３６】
2009512709.tif 000039
【０３０７】
ＡＥＴ試験２の方法は、ＡＥＴ試験１について記載したようにして実施した。それに加えて、陽性ポジティブ対照コントロール（５ｍｇ／ｍＬ安息香酸ナトリウム添加ＰＢＳ）及び陰性ネガティブ対照コントロール（ＰＢＳ単独）が含まれた。ＡＥＴ試験２の結果は、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムは、製剤に湿潤剤（プロピレングリコールなど）が含まれていないと無効な効果を奏しない防腐剤であることを示した。塩化ベンズアルコニウムは、ＵＳＰ及びＥＰ両方の抗菌効果試験に関して優れた防腐剤であったが、インスリンと不適合性であることが見出された（即ち、製剤中にそれが存在するとインスリンの沈澱が起こった）。ベンジルアルコール及び安息香酸ナトリウムも、中性のｐＨで有効な防腐剤ではなかったので、インスリン鼻噴霧製剤中での使用に適当でなかった。
【０３０８】
ＡＥＴ試験３
ＡＥＴ試験３の目的は、塩化ベンズアルコニウム（ＢＡＫ）、ベンジルアルコール、及び安息香酸ナトリウムなどの他の防腐剤を評価することであった。５００Ｕ／ｍＬ又は１０００Ｕ／ｍＬのレベルのインスリン２群を試験した。ＡＥＴ試験３のための製剤を表３７に掲載する。
【０３０９】
表３７  ＡＥＴ試験３で評価した製剤
【表３７】
2009512709.tif 000040
【０３１０】
ＡＥＴ試験３の分析は、ＡＥＴ試験１について記載したようにして実施した。ＡＥＴ試験３の結果は、塩化ベンズアルコニウムはインスリンとは不適合性であるが（沈澱を惹起した）、最良の抗菌性能を維持することを示した。ベンジルアルコール、及びベンジルアルコール／メチルパラベンナトリウム／プロピルパラベンナトリウムは、この試験における抗菌剤として無効であった。
【０３１１】
ＡＥＴ試験４
ＡＥＴ試験４の目的は、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムと共に使用したときに、より低レベルの湿潤剤（プロピレングリコール）で満足なＵＳＰ及びＥＰのＡＥＴ結果が達成できるかどうかを決定することである。それに加えて、代替防腐剤ｍ−クレゾール及びベンジルアルコールを評価した。ＡＥＴ試験４の製剤を表３８に掲載する。
【０３１２】
表３８  ＡＥＴ試験４で評価した製剤
【表３８】
2009512709.tif 000041
【０３１３】
ＡＥＴ試験４のために使用した方法は、ＡＥＴ試験１のために記載したようにして実施した。低濃度の湿潤剤（即ちプロピレングリコール）と共にメチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムを含有する製剤では、抗菌効果は得られない。プロピレングリコールと共に使用するメチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムの最適レベルは、プロピレングリコール１ｍＬ当り１ｍｇと２５ｍｇの間にあった。さらに、ベンジルアルコール及びｍ−クレゾールは、インスリン鼻噴霧製剤に有効な防腐剤ではなかった。
【０３１４】
ＡＥＴ試験５
ＡＥＴ試験５の目的は、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムが最適の防腐効果にとって両方とも必要であるかどうか、及びその一方が他方よりも有効であるかどうかを決定するために、インスリン噴霧製剤（プラセボ及び活性有効成分の）の抗菌効果試験（ＡＥＴ）を実施することである。それに加えて、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムの増大させたレベルをについて、製剤中のそれらの含有量を増加させると抗菌効果が増大するかどうかを決定するために、評価を行った。ＡＥＴ試験５で使用した製剤を表３９に掲載した。
【０３１５】
表３９  ＡＥＴ試験５で評価した製剤
【表３９】
2009512709.tif 000042
【０３１６】
ＡＥＴ試験５のために使用した方法は、ＡＥＴ試験１のために記載したようにして実施した。ＡＥＴ試験５は、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムのレベルを、少なくとも０．３３ｍｇ／ｍＬメチルパラベンナトリウム及び０．１７ｍｇ／ｍＬプロピルパラベンナトリウムの少なくとも１０倍に上げることが、抗菌効果を増大させることを示した。さらに、０．３３ｍｇ／ｍＬメチルパラベンナトリウム単独は、０．１７ｍｇ／ｍＬプロピルパラベンナトリウム単独と同じ有効性を有し、それも組合せと同じ抗菌効果を有することは明らかであった。
【０３１７】
ＡＥＴ試験６
ＡＥＴ試験６の目的は、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムと共に使用するために必要なプロピレングリコールの最適レベルを決定するためにインスリン噴霧製剤（プラセボ）の抗菌効果試験（ＡＥＴ）を実施することである。さらに、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムの増大させたレベルをについて、製剤中のそれらの含有量を上げることが抗菌効果を増大させるかどうかを決定するために、プロピレングリコールのレベルを一定にして評価を行った。最後に、可能性ある防腐剤としてエタノールも評価した。ＡＥＴ試験６で評価した製剤を表４０に掲載した。
【０３１８】
表４０  ＡＥＴ試験６で評価した製剤
【表４０】
2009512709.tif 000043
【０３１９】
ＡＥＴ試験６のために使用した方法は、ＡＥＴ試験１のために記載したようにして実施した。ＡＥＴ試験６の結果は、プロピレングリコールの最適レベルが１０ｍｇ／ｍＬであったことを示す。１０、１５、２０及び２５ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコールを含むインスリン噴霧鼻噴霧製剤のＡＥＴの結果は、非常に似通っていたが、ＡＥＴ結果は、プロピレングリコールのレベルが１０ｍｇ／ｍＬ未満であったときに、より劣っていた。全ての製剤は、緑膿菌要件を除きＵＳＰのＡＥＴ要件に合格した。この範疇に関して、製剤は静菌性であった（即ち、微生物増殖の徴候はなかった）。全ての製剤が、各必須微生物に対するについての最初期時点に対するにおけるＥＰ要件に不合格であった。エタノール単独（１％及び２％で）が、メチルパラベンナトリウム／プロピルパラベンナトリウム／プロピレングリコールと同様な抗菌活性を有するように思われた。
【０３２０】
ＡＥＴ試験７
ＡＥＴ試験７の目的は、２０ｍｇ／ｍＬのツイーン８０を含有するインスリン噴霧製剤（プラセボ）の抗菌効果試験（ＡＥＴ）を実施することである。１つのｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験は、ツイーン８０含有量を２０ｍｇ／ｍＬに上げることが生体利用率バイオアベイラビリティを増大させることに役立ち得ることを示したが、ツイーン８０のミセルは防腐剤（特にパラベン類）と相互作用することも知られている。それに加えて、ＡＥＴ試験７は、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムと共に使用するために必要なプロピレングリコールの最適レベルを決定するために実施した。メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムの増大させたレベルについて、製剤中のそれらの含有量を上げることが抗菌効果を増大させるかどうかを決定するために、プロピレングリコールのレベルを一定にして評価を行った。最後に、可能性ある防腐剤としてエタノールも評価した。ＡＥＴ試験７で使用した製剤を表４１に掲載する。
【０３２１】
表４１  ＡＥＴ試験７で評価した製剤
【表４１】
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【０３２２】
ＡＥＴ試験７のために使用した方法は、ＡＥＴ試験１のために記載したようにして実施ＡＥＴ試験１について記載したように実施した。ＡＥＴ試験７の結果は、プロピレングリコールの最高レベル（即ち２５ｍｇ／ｍＬ）を添加したときでさえ、ツイーン８０含有量を１０ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬに上げることが抗菌効果を減少させることを示した。エタノールは、２０ｍｇ／ｍＬのツイーン８０と組み合わせて使用したときに有効な防腐剤（１％で）ではなかった。
【０３２３】
ＡＥＴ試験８
ＡＥＴ試験８は、インスリン噴霧製剤（活性）の抗菌効果試験（ＡＥＴ）を試験するために、プロピレングリコールを１、５、１０、及び２５ｍｇ／ｍＬのレベルで含有する製剤を使用して実施した。それに加えて、インスリン鼻噴霧製剤の３通りの濃度、２５０、５００、及び１０００Ｕ／ｍＬを試験した。ＡＥＴ試験８で使用した製剤を表４２に掲載する。
【０３２４】
表４２  ＡＥＴ試験８で評価した製剤
【表４２】
2009512709.tif 000045
【０３２５】
分析のために使用した方法は、ＡＥＴ試験１のために記載した。ＡＥＴ試験８の結果は、インスリンを製剤に添加すると、ＡＥＴ性能が改良改善されることを示した。さらに、プロピレングリコールレベルが高いとき（即ち２５ｍｇ／ｍＬ又は１０ｍｇ／ｍＬ）、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムを添加したインスリン含有製剤は、ＵＳＰのＡＥＴ要件に合格した。しかしながら、ＥＰ要件には適合しなかった。
【０３２６】
ＡＥＴ試験１から８までのまとめ
試験１〜８のデータは、ＡＥＴに関して、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、及び湿潤剤プロピレングリコールの組合せの結果、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウム単独に比較して増大した防腐効果が生じたことを示した。さらに、これらの試験の過程で、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸ナトリウム、ベンジルアルコール、エタノール、増大させたＥＤＴＡ、塩化ベンゼトニウム及びメタ−クレゾールなどの数種類の他の防腐剤が評価された。しかしながら、最良の結果は、メチルパラベンナトリウム／プロピルパラベンナトリウム／プロピレングリコールで達成された。他の防腐剤の各々は、インスリンと不適合性であるか（インスリン沈澱を惹起した塩化ベンズアルコニウムの場合のように）、又は恐らくメチル−β−シクロデキストリン、及び／若しくはポリソルベート８０との相互作用により無効にされるかのいずれかであった。メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムもメチル−β−シクロデキストリン及び／若しくはポリソルベート８０と相互作用したが、添加した湿潤剤のプロピレングリコールがこの相互作用に干渉して、それによりパラベン類を抗菌活性に対してより利用可能なものにした。結果は、０．１７ｍｇ／ｍＬプロピルパラベンナトリウム、０．３３ｍｇ／ｍＬメチルパラベンナトリウムの製剤に１０ｍｇ／ｍＬの湿潤剤を加えると、良好な抗菌活性が生ずることを示した。
【０３２７】
本明細書における本発明の一態様は、米国薬局方及び欧州薬局方の抗菌効果試験（ＡＥＴ）用に処理した場合、静菌効果を提供するインスリン鼻噴霧製剤中で使用する防腐剤の組合せからなる。
【０３２８】
ＡＥＴ性能最良の製剤は、水、１つ又は複数の可溶化剤、１つ又は複数の界面活性剤、緩衝剤、キレート剤、等張化剤、及び防腐剤を含むものであった。好ましい可溶化剤はＭｅ−β−ＣＤであった。好ましい界面活性剤はＤＤＰＣ及びポリソルベート（ツイーン８０など）の組合せ又はポリソルベート単独であった。好ましいキレート剤はＥＤＴＡであった。好ましい等張化剤は塩化ナトリウムであった。好ましい防腐剤は、メチルパラベンナトリウム及びプロピルパラベンナトリウムであった。製剤は、プロピレングリコールなどの湿潤剤も含み、それが最適ＡＥＴ性能を提供した。
【０３２９】
実施例１４
インスリン製剤安定性
鼻内用インスリン製剤について、５℃／環境湿度（通常の貯蔵保存）、２５℃／６０％ＲＨ（加速貯蔵保存）、攪拌付き加速貯蔵保存、及び毎日３回（ＴＩＤ）エアロゾル化（患者使用を模倣するため）と組み合わせた通常又は加速貯蔵保存で試験した。３か月（８４日）貯蔵保存後、ＨＰＬＣの結果は、５℃／環境湿度でインスリン含有量に有意の変化を示さず（インスリン回収９９．２％）、２５℃／６０％ＲＨでインスリン含有量の僅かな消失損失が観察された（インスリン回収９６．３％）。２５０Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ又は１０００Ｕ／ｍＬを含有する製剤について、短期のインキュベーション時間（１１日）のではＴＩＤエアロゾル化におけるよる有意のインスリン損失はなかった。加速温度で２４時間１００ｒｐｍの攪拌後に、安定性に有意の減少は観察されなかったが、対照的に、市販のインスリン製品は同じ条件で少なくとも２０％のインスリン含有量減少を示した。
【０３３０】
実施例１５
ヒトＰＤ臨床試験
ヒトでの試験は、現行市販のグルコース調節薬剤ＮｏｖｏＬｏｇ及びＥｘｕｂｅｒａの投与と比較して、増強剤入りのインスリン製剤投与後の薬力学的（ＰＤ）データを測定して完了するした。グルコースレベルを測定するためにｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒを使用した。各処置群についてのグルコース減少率（％）のまとめを表４３に示す。各処置群に対するグルコース減少率（％）３０％、２０％、及び１０％の頻度発生率を表４４に示す。
【０３３１】
表４３  処置群によるグルコース減少率（％）
【表４３】
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【０３３２】
表４４  ３０％、２０％、及び１０％のグルコース減少があったヒト被験者の発生率
【表４４】
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【０３３３】
この初期ＰＤ試験の結果は、インスリンの経鼻投与が患者における内のグルコース（％）を減少させることに有効であることを示す。５０ＩＵ及び１００ＩＵの経鼻投与は、現行市販のグルコース調節薬剤Ｅｘｕｂｅｒａと同様なグルコース低下をもたらした。
【０３３４】
前述の発明を、理解を明確にする目的で実施例により詳細に記述したが、ある特定の変更及び改変はこの開示により包含され、且つ限定でなく説明のために提示した添付の特許請求の範囲の範囲内で不必要な過度の実験をせずに実施することができることは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３３５】
【図１】ＰＤＦ単独とツイーン添加ＰＤＦ製剤を比較するラビットウサギ試験１のＰＫ結果を示す図である。
【図２】ツイーン添加ＰＤＦ製剤のＩＮ投与とＮｏｖＬｏｇのＳＱ投与を比較するラビットウサギ試験２のＰＫ結果を示す図である。
【図３】ＩＮ対照コントロール、ＩＮ  ＰＤＦ、ツイーン添加ＩＮ  ＰＤＦ、ＩＶ及びＳＣ製剤を比較するラビットウサギ試験１のＰＤ結果、グルコース（％）を示す図（対数直線目盛）である。
【図４】試験２と試験１とのデータを比較するＰＤ結果、初期からのグルコース（％）を示す図（直線グラフ）である。
【図５】前臨床試験３で投薬された群についてのＰＤデータ、初期からのグルコース（％）を示す図（直線グラフ）である。
【図６】ツイーン添加ＩＮ  ＰＤＦ（ＤＤＰＣ添加又は無添加）、ＳＣ  ＰＤＦ、及びＳＣ対照コントロール製剤を比較する前臨床試験３で投薬された群についてのＰＫデータを示す図である。
【図７】０．２％ゼラチン又はＰＧを含有するツイーン添加ＩＮ  ＰＤＦ（ＤＤＰＣ添加又は無添加）を比較する前臨床試験４で投薬された群についてのＰＤデータを示す図である。
【図８】０．２％ゼラチン又はＰＧを含有するツイーン添加ＩＮ  ＰＤＦ（ＤＤＰＣ添加又は無添加）、ＴＤＭ低張、ＴＤＭ等張、経口ＰＤＦ（ＰＧ及び／若しくはＤＤＰＣ添加又は無添加）、及びＳＣ対照コントロールを比較する前臨床試験４で投薬された群についてのＰＫデータを示す図である。
【図９】増粘剤（ゼラチン、ＨＰＭＣ、ＭＣ、カルボマ、及びＣＭＣ）製剤を投薬された全ての群について初期ＰＤデータの初期からのグルコース（％）ＰＤデータを示す図である。
【図１０】増粘剤（ゼラチン、ＨＰＭＣ、ＭＣ、カルボマ、及びＣＭＣ）製剤を投薬された全ての群についてのＰＫデータを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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