(57)【要約】効率的にγ−グルタミルシステインを生産する酵母、及び、γ−グルタミルシステインを蓄積した酵母の製造方法、並びに同酵母を用いた酵母エキスの製造法を提供する。解決手段は、γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母を育種し、当該酵母を培地中で培養してγ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた後、温水で抽出して酵母エキスを製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母。
【請求項２】
１０μＭ以上のセルレニンに耐性を有する請求項１記載の酵母。
【請求項３】
変異型ＦＡＳ２遺伝子を有することにより１０μＭ以上のセルレニンに耐性となった請求項２記載の酵母。
【請求項４】
変異型ＦＡＳ２遺伝子が配列表の配列番号５の天然型ＦＡＳ２遺伝子によりコードされるタンパク質の１４７５番目のアミノ酸がリジン及び／又は１８００番目のアミノ酸がアスパラギンである請求項３記載の酵母。
【請求項５】
γ−グルタミルシステイン生産能が細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失するように改変することで得られたものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項６】
酵母がサッカロマイセス属に属する請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項７】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエであることを特徴とする請求項６記載の酵母。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵母を培地中で培養することにより、γ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた酵母の製造法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵母を培地中で培養することにより、γ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた後、酵母中の内容物を抽出して得られる酵母エキスの製造法。
【請求項１０】
γ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた後、低温で菌体洗浄を行った後、酵母中の内容物を抽出して得られる請求項９記載の酵母エキスの製造法。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の酵母エキスを更に、加熱又は酵素処理に付すことにより、酵母エキス中のγ−グルタミルシステインの一部又は全てをシステインに変換させた酵母エキスの製造法。
【請求項１２】
酵母エキス固形分当たりのシステイン含量が３．５％以上、塩基性アミノ酸含量が１．０％以下である請求項１１記載の酵母エキスの製造法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の酵母エキスを飲食品原料に混合し、次に、加工して得られる飲食品。
【請求項１４】
γ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた後、低温で菌体洗浄を行った後、酵母内容物を抽出して得られる酵母エキスを製造する工程において、２段階の異なる温度領域で加熱することによりエキス分を抽出する工程を含むことを特徴とする請求項９記載の酵母エキスの製造方法。
【請求項１５】
２段階の異なる温度領域で加熱することによりエキス分を抽出する工程が、１段階目の抽出温度が２５〜６０℃であり、２段階目の抽出温度が６５〜９９℃であることを特徴とする請求項１４記載の酵母エキスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−グルタミルシステインを生産する酵母、γ−グルタミルシステインを蓄積した酵母を用いる酵母エキスの製造法、及び当該酵母エキスを含有する飲食品に関するものである。尚、γ−グルタミルシステインは飲食品、医薬品、化成品、特に調味料分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
現在、含硫化合物は、その高い効能から食品、医薬品、化成品などの幅広い分野で使用されている。例えば、グルタミン酸、システイン、グリシンからなるトリペプチドであるグルタチオン（ＧＳＨ）は、医薬品としての薬効を有することが知られている。現在、医薬品としてのＧＳＨ製剤は、解毒剤及び眼科用剤として位置づけられており、各種の中毒、慢性肝臓疾患、抗癌剤の副作用や放射線療法による障害の防止、皮膚疾患および白内障や角膜損傷の治療に用いられている（非特許文献１）。
また、食品用途として、グルタチオンは食品にコク味を付与する物質であることが知られており（非特許文献２）、グルタチオンを高含有する酵母エキスが調味料用途に用いられている。
一方で、含硫化合物の一つであるシステインは、食品用途として主に食品の風味改善などを目的に用いられている。例えば、システイン及びその酸化型ジスルフィドであるシスチンを含有する電解液に食品を浸漬し、食品の褐変を抑制する方法が開示されている（特許文献１）。この発明によると、シスチンが還元極においてシステインに還元され、このシステインにより酵素的酸化によるキノン類の精製を経た褐色色素の生成が抑制されていると開示されている。
また、動植物タンパク質に含まれる酸化型システイン残基を還元して得られるシステイン残基をパン生地の改良に用いる技術が開示されている（特許文献２）。更には、肉風味フレーバーの製造方法を開示した特許文献の実施例１又は２では、チキン又はポークとシステインなどを混合して加熱することにより肉風味が高まったと記載されている（特許文献３）。
このように調味料分野で有用なシステインの製造方法としては、蛋白分解法や半合成法などが知られており、これらの方法が現在主に用いられている。しかしながら、消費者の近年の天然志向の高まりから、システインを食品用途で用いる際にこれを高含有量で含有する食品素材の強い要望があるが、システインを高含有量で含有する食品素材は従来知られていなかった。
本発明者らは、グルタミン酸とシステインからなるジペプチドであるγ−グルタミルシステインを高含有する酵母に着目し、同酵母抽出物を一定の条件下で加熱処理又は酵素処理することによりシステインを高含有する食品素材が調製できることを報告している（特許文献４）。
その他にも、含硫化合物であるγ−グルタミルシステインに糖類を添加して加熱処理することにより、良好なフレーバー組成物が得られることが報告されている（特許文献５）。或いは、グルタチオン、システイン、グルタミルシステイン等の含硫化合物を２〜２０重量％含有する酵母エキスに糖類を加えて脂肪酸非存在下で加熱処理することによりローストミートフレーバー様の調味料が得られることが報告されている（特許文献６）。
このような利用方法を持つγ−グルタミルシステインに関して、これまでにいくつかの検討がなされてきたが以下のような２つの技術改良が必要であると考えられている。
一つは、酵母菌体中のγ−グルタミルシステイン含有量を上昇させることにより、力価を高めることである。もう一つは、γ−グルタミルシステインを含有する酵母より調製したシステイン含有素材に関するものである。この調製した素材は、システインを高含有しており食品の風味改善目的に使用可能であるものの、その調製工程の特徴からシステインの他に酵母特有の呈味、香りも有している。その為、このような素材を食品に大量に加えた場合、システインの効能の他に酵母風味を食品に付与してしまう為、純品のシステインを食品に添加する場合に比較して、その添加量が制限されてしまうという改良の余地も残されていた。このような背景の下、より酵母特有の呈味や香りを低減させるという技術改良が望まれていた。
しかしながら、γ−グルタミルシステインに関する有用性はグルタチオンと比較して明らかになり始めたばかりであり、これを効率的に生産する手段はあまり検討されてこなかった。現在までの先行知見等は以下のとおりである。
例えば、本発明者らは、γ−グルタミルシステインとグリシンを基質としてグルタチオンを生合成するグルタチオン合成酵素を破壊又は弱化させることにより、γ−グルタミルシステインを高含有する酵母を取得したことを報告している（特許文献３、特許文献７〜１０）。これらの技術では、γ−グルタミルシステインからグルタチオンへの代謝を抑制し、前駆体としてのγ−グルタミルシステインを酵母に高含有させることを目的としている。しかし、γ−グルタミルシステインの含有量は１〜２重量％であり、更に効率化させる余地がある。
また、本発明者等は、γ−グルタミルシステイン産生能を有しパントテン酸要求性の酵母を、パントテン酸含有培地で培養後、パントテン酸を含まない培地で培養することにより、菌体内のγ−グルタミルシステインを上昇させる技術を開示している（特許文献１１）。同文献では、γ−グルタミルシステインを４％弱含有した酵母が示されており、γ−グルタミルシステインを効率的に生産する手段と考えられる。しかしながら、同酵母に安定的にγ−グルタミルシステインを高含有させるためには培養途中のパントテン酸量を制御する必要がある。
さらに、本発明者らは、遺伝子によってコードされる蛋白質の５６９位のセリン残基が他のアミノ酸残基に変異したＭＥＴ３０遺伝子産物を保持させることにより、γ−グルタミルシステインの蓄積量と酵母の生育速度を共に満たすことができることを報告している（特許文献１２）。
一方で、酵母のセルレニン耐性に関する研究が行われ、少なくともＹＡＰ１遺伝子（別名としてＰＤＲ４遺伝子）（非特許文献３）やＦＡＳ２遺伝子（非特許文献４）がセルレニン耐性に関与していると報告されている。ＹＡＰ１遺伝子は、ＧＳＨ１遺伝子（γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子）やＧＳＨ２遺伝子（グルタチオン合成酵素遺伝子）の転写因子であることが報告されているが（非特許文献５）、ＹＡＰ１遺伝子の改変により酵母菌体内のＧＳＨ又はγ−グルタミルシステインの含有量がどのように変化するかは確かめられていない。また、ＦＡＳ２遺伝子は、脂肪酸合成のαサブユニットをコードしており、ＦＡＳ１遺伝子によってコードされるβサブユニットと６量体を形成している（非特許文献６）。このような脂肪酸合成酵素遺伝子であるＦＡＳ２遺伝子遺伝子の変異によっても酵母にセルレニン耐性が付与されることから、必ずしもセルレニン耐性によってγ−グルタミルシステイン含有量が変化するともいえない。更に、セルレニン耐性酵母を清酒生産に利用しようとの報告（特許文献１３）はあるが、γ−グルタミルシステイン生産能がある酵母、特にグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母にセルレニン耐性を付与したとの報告はない。
また、このようなセルレニン耐性を有する酵母由来の酵母エキスがどのような呈味、香りを有するかについても報告はない。
【特許文献１】特開平１０−１３６８８３号公報
【特許文献２】ＷＯ  ９３／０８２７４
【特許文献３】ＥＰ０１３６４２８
【特許文献４】ＷＯ  ００／３０４７４
【特許文献５】特許第２８３０４１５
【特許文献６】特許第２９０３６５９
【特許文献７】ＷＯ０１／０９０３１０
【特許文献８】特開２００３−１５９０４８
【特許文献９】特開２００３−１５９０４９
【特許文献１０】ＷＯ２００３／０８０８３２
【特許文献１１】特開２００４−２０１６７７
【特許文献１２】特開２００４−１１３１５５
【特許文献１３】特開平８−２３９５４
【非特許文献１】蛋白質核酸酵素  １９８８−７  ＶＯＬ．３３  ＮＯ．９  ＩＳＳＮ  ００３９０９４５０臨時増刊  「グルタチオン研究のエポック」ｐ１６２６
【非特許文献２】Ｙ．Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１，１９７７−１９８０（１９９７）
【非特許文献３】Ｎｏｂｕｓｉｇｅ  Ｎａｇａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．７６，Ｎｏ  １，６０−６３，１９９３
【非特許文献４】Ｋａｚｕｏ  Ａｒｉｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｏｃｈｅｍ．，６８（１），２０６−２１４，２００４
【非特許文献５】Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００），２７５（２０），１５５３５−１５５４０
【非特許文献６】Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｅ．Ｉｎ  Ｒａｔｌｅｄｇｅ．Ｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｇ．（ｅｄｓ），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｉｐｉｄｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．２，ｐ３−５０（１９８９）
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、効率的にγ−グルタミルシステインを生産する酵母を提供すること、γ−グルタミルシステインを蓄積した酵母を用いる酵母エキスの製造法を提供すること、及び当該酵母エキスを含有する風味、呈味良好な飲食品を提供することを課題とする。
本発明者らは鋭意検討を行った結果、γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母が、安定的かつ効率的にγ−グルタミルシステインを生産することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母。
（２）１０μＭ以上のセルレニンに耐性を有する（１）記載の酵母。
（３）変異型ＦＡＳ２遺伝子を有することにより１０μＭ以上のセルレニンに耐性となった（２）記載の酵母
（４）変異型ＦＡＳ２遺伝子が配列表の配列番号５の天然型ＦＡＳ２遺伝子によりコードされるタンパク質の１４７５番目のアミノ酸がリジン及び／又は１８００番目のアミノ酸がアスパラギンである（３）記載の酵母
（５）γ−グルタミルシステイン生産能が細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失するように改変することで得られたものである（１）〜（４）のいずれか一項に記載の酵母。
（６）酵母がサッカロマイセス属に属する（１）〜（５）のいずれか一項に記載の酵母。
（７）酵母がサッカロマイセス・セレビシエであることを特徴とする（６）記載の酵母
（８）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の酵母を培地中で培養することにより、γ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた酵母の製造法。
（９）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の酵母を培地中で培養することにより、γ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた後、酵母中の内容物を抽出して得られる酵母エキスの製造法。
（１０）γ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた後、低温で菌体洗浄を行った後、酵母中の内容物を抽出して得られる（９）記載の酵母エキスの製造法。
（１１）（９）又は（１０）記載の酵母エキスを更に、加熱又は酵素処理に付すことにより、酵母エキス中のγ−グルタミルシステインの一部又は全てをシステインに変換させた酵母エキスの製造法。
（１２）酵母エキス固形分当たりのシステイン含量が３．５％以上、塩基性アミノ酸含量が１．０％以下である（１１）記載の酵母エキスの製造法。
（１３）（９）〜（１２）のいずれか一項に記載の酵母エキスを飲食品原料に混合し、次に、加工して得られる飲食品。
（１４）γ−グルタミルシステインを酵母中に蓄積させた後、低温で菌体洗浄を行った後、酵母内容物を抽出して得られる酵母エキスを製造する工程において、２段階の異なる温度領域で加熱することによりエキス分を抽出する工程を含むことを特徴とする（９）記載の酵母エキスの製造方法。
（１５）２段階の異なる温度領域で加熱することによりエキス分を抽出する工程が、１段階目の抽出温度が２５〜６０℃であり、２段階目の抽出温度が６５〜９９℃であることを特徴とする（１４）記載の酵母エキスの製造方法。
本発明の酵母は、効率的にγ−グルタミルシステインを生産することができる。特に、好適な形態では、高密度で培養した場合、経時的なγ−グルタミルシステインの蓄積量の上昇が、セルレニン耐性を有さない酵母に比べて良好である。さらに、本発明の酵母由来の酵母エキスは、酵母特有の呈味や香りが少ない為食品の風味改良素材にも適している。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、酵母の培養時間とγ−グルタミルシステイン含有量との関係を示す図である。
図２は、酵母の培養時間とγ−グルタミルシステイン含有量との関係を示す図である。
図３は、酵母菌体洗浄中の上清Ｂｒｉｘ変化を示す図である。
図４は、酵母菌体ブロス中の溶存気体量を測定する実験方法を示す図である。
図５は、ＡＪ１４８００株（セルレニン非耐性株）の２段階抽出によるエキス分抽出率を示す図である。
図６は、ＡＪ１４８９２株（セルレニン耐性株）の２段階抽出によるエキス分抽出率を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
＜１＞本発明の酵母
本発明の酵母は、γ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有する酵母である。本発明の酵母は、γ−グルタミルシステイン生産能を有する酵母にセルレニン耐性を付与することにより取得することができる。また、本発明の酵母は、セルレニン耐性を有する酵母にγ−グルタミルシステイン生産能を付与するか、あるいは、セルレニン耐性を有する酵母のγ−グルタミルシステイン生産能を高めることによっても取得することができる。また、本発明の酵母は、γ−グルタミルシステイン生産能を有する酵母のＦＡＳ２遺伝子を変異させることによっても取得することができる。
本発明において、「γ−グルタミルシステイン生産能を有する」とは、γ−グルタミルシステインを生産し、菌体内に蓄積する能力を有することをいい、好ましくは、酵母野生株よりも多量のγ−グルタミルシステインを菌体内に蓄積することをいう。より好ましくは、本発明の酵母を最小培地で培養したとき、その対数増殖期に、乾燥酵母菌体当たり１重量％以上、さらに好ましくは１．４重量％以上のγ−グルタミルシステインを蓄積することをいう。また、乾燥酵母菌体当たりのグルタチオン蓄積量が０．１重量％以下であることが好ましい。
本発明の酵母は、γ−グルタミルシステイン生産能を有する限り特に制限されない。サッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属、キャンディダ・ユティリス等のキャンディダ属、ピピア・パストリス等のピピア属、シゾサッカロマイセス・ポンベ等のシゾサッカロマイセス属等を例示することができる。上記の酵母の中では、γ−グルタミルシステイン生産能を向上させる技術、例えばグルタチオン合成酵素の破壊や弱化の方法が知られており、さらにγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子がクローニングされているものが、本発明の酵母を構築する上で好適である。そのような酵母として、サッカロマイセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。
γ−グルタミルシステイン生産能を有する酵母としては、例えば、細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母、もしくは、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されるように改変された酵母、又は、細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失し、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されるように改変された酵母が挙げられる。
細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母は、例えば、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子（ＧＳＨ２）の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素を産生しないように改変した遺伝子、又は酵素活性が低下するような変異を有する遺伝子（以下、単に「変異型ＧＳＨ２遺伝子」という）を含むＤＮＡを用いた遺伝子置換により創製することができる。また、細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母は、実施例に記載したのと同様に、野生型酵母を、通常の変異処理、例えばＵＶ照射、あるいはＮ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硝酸、アクリジン等の変異剤による処理によって、取得することもできる。得られた変異株が目的の変異を有していることは、例えばＰＣＲ法等により確認することができる。
前記のようなグルタチオン合成酵素活性が低下するような変異としては、例えば、３７０位のアルギニン残基を終止コドンに変更する変異が挙げられる（配列表の配列番号１及び２参照）。
また、グルタチオン合成酵素活性が低下する他の変異としては以下の変異が挙げられる（国際公開０３／０４６１５５号パンフレット参照）。
（１）４７位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異（配列表の配列番号１及び２参照）。
（２）３８７位のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換する変異（配列表の配列番号１及び２参照）。
（３）５４位のプロリン残基がロイシン残基に置換する変異（配列表の配列番号１及び２参照）。
上記変異は、少なくとも（１）または（２）を含む限り、単独でも、任意の組合せでもよいが、（１）と（３）の組合せ、及び（２）と（３）の組合せが好ましい。
グルタチオン合成酵素遺伝子への目的の変異の導入は、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異法によって行うことができる。
前記遺伝子置換は、以下のようにして行うことができる。変異型ＧＳＨ２遺伝子を含む組換えＤＮＡで酵母を形質転換し、変異型ＧＳＨ２遺伝子と染色体上のＧＳＨ２遺伝子との間で組換えを起こさせる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にし、さらに、酵母で機能する複製制御領域を除いておくと、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。
酵母の形質転換は、プロトプラスト法、ＫＵ法、ＫＵＲ法、エレクトロポレーション法等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。
上記のようにして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、変異型ＧＳＨ２遺伝子と染色体上にもともと存在するＧＳＨ２遺伝子との組換えを起こし、野生型ＧＳＨ２遺伝子と変異型ＧＳＨ２遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。
融合遺伝子２個のうち、変異型ＧＳＨ２遺伝子のみを残すために、２個のＧＳＨ２遺伝子の組換えにより１コピーのＧＳＨ２遺伝子を、ベクター部分（マーカー遺伝子を含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、野生型ＧＳＨ２遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、変異型ＧＳＨ２遺伝子が切り出される場合と、反対に変異型ＧＳＨ２遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、野生型ＧＳＨ２遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合もマーカー遺伝子が脱落するので、２回目の組換えが生じたことは、マーカー遺伝子に対応する表現形質によって確認することができる。また、目的とする遺伝子置換株は、ＰＣＲによりＧＳＨ２遺伝子を増幅し、その構造を調べることによって、選択することができる。
尚、遺伝子置換に用いる変異型ＧＳＨ２遺伝子は、グルタチオン合成酵素タンパク質全長をコードするものであってもよいが、欠失部位を含む限り、タンパク質の一部をコードする遺伝子断片であってもよい。
サッカロマイセス・セレビシエのグルタチオン合成酵素遺伝子（ＧＳＨ２）は塩基配列が報告されており（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３９５（１９９８）３１５−３２０、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｙ１３８０４、配列番号１）、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、サッカロマイセス・セレビシエ染色体ＤＮＡから取得することができる。また、導入する遺伝子は、サッカロマイセス属以外の微生物に由来する遺伝子を用いることができる。
本発明に用いる変異型ＧＳＨ２遺伝子は、前記４７位、３８７位、５４位の変異以外に、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数箇所の位置における１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有するＧＳＨ２産物をコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には例えば、前記「数個」は、２〜１０個、好ましくは、２〜６個、より好ましくは２〜３個である。あるいは、変異型ＧＳＨ２遺伝子は、ＧＳＨ２産物のアミノ酸配列全体に対し、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、ＧＳＨ２遺伝子を保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
尚、ＧＳＨ２遺伝子を破壊する場合は、遺伝子置換に用いる変異型ＧＳＨ２遺伝子は必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。また、ＧＳＨ２遺伝子の取得に用いる微生物は、同遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いる微生物の相同遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されない。
前記サッカロマイセス・セレビシエのＧＳＨ２遺伝子と相同組換えを起こし得るＤＮＡとして具体的には、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡと、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。より具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、６０℃、１×ＳＣＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件が挙げられる。
また、グルタチオン合成酵素活性が低Ｆ又は消失した酵母は、実施例に記載したのと同様に、野生型酵母を、通常の変異処理、例えばＵＶ照射、あるいはＮ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硝酸、アクリジン等の変異剤による処理によって、取得することもできる。
また、酵母細胞内のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を増強する方法としては、同酵素遺伝子（ＧＳＨ１）（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ９０２２０）を挿入したプラスミドで酵母を形質転換し、同遺伝子の細胞内のコピー数を高めるか、染色体上のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のプロモーターを強転写プロモーターで置換する方法（大竹康之ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５０巻第１０号、第９８９〜９９４頁、１９９２年）が挙げられる。γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子としては、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子も知られており（特開２００５−０７３６３８）、本発明に使用することができる。
細胞内のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性及びグルタチオン合成酵素性は、それぞれ、Ｊａｃｋｓｏｎの方法（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１１１，３０９（１９６９））、及びＧｕｓｈｉｍａらの方法（Ｇｕｓｈｉｍａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５，２１０（１９８３））によって測定することができる。
また、ＭＮＮＧ耐性の付与（特開２００３−１５９０４８）、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を保持させること（特開２００４−１１３１５５）、ＭＥＴ２５遺伝子発現を脱抑制させること（特開２００４−２０１６７７）、パントテン酸要求性を付与すること（特開２００４−２０１６７７）によって、酵母のγ−グルタミルシステイン生産能を向上させること、あるいは酵母に好ましい性質を付与することができる。
本発明の酵母は、上記のようなγ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ、セルレニン耐性を有するように改変された酵母菌株である。本発明において「セルレニン耐性を有する」とは、酵母の非改変株、例えば野生株、又は本発明の酵母の取得に用いる親株が増殖できない濃度のセルレニンを含む培地で増殖できることをいう。具体的には例えば、セルレニンを含むＹＰＤプレート等の寒天培地に酵母懸濁液を広げ、好適な温度、例えば３０℃で培養したときに、非改変株がコロニーを形成せず、改変株がコロニーを形成すれば、同改変株はセルレニン耐性を有する。ここで、「コロニー」とは、肉眼により確認できるコロニーをいう。
（ＹＰＤ培地組成）
グルコース        ２％
ペプトン          ２％
酵母エキス        １％
（ｐＨ５．０）
（寒天培地の場合、寒天２％）
酵母がサッカロマイセス・セレビシエである場合、より具体的には、酵母をＹＰＤ培地に植菌し、生育至適温度、例えば３０℃で３日間培養した培養液を、ある濃度のセルレニンを含むＹＰＤプレートに広げ、生育指摘温度で培養したときに、５日以内にコロニーを形成すれば、前記酵母はその濃度のセルレニンに耐性を有する。セルレニン耐性を付与されるように改変されていないサッカロマイセス・セレビシエ、例えば実施例に記載のＡＪ１４８００株では、少なくとも７μＭのセルレニンを含むＹＰＤプレートでは、３日以内にほとんどコロニーを形成しない。本発明の酵母は、好ましくは１０μＭ以上、より好ましくは１５μＭ以上、特に好ましくは２０μＭ以上のセルレニンに耐性を有することが好ましい。
セルレニン耐性を有する酵母は、例えば、酵母の野生株又はγ−グルタミルシステイン生産能を有する酵母を変異処理し、野生株が生育できない濃度のセルレニンを含む寒天培地に接種し、コロニーを形成する株を選択することによって、取得することができる。また、こうして取得された株の培養液を再度セルレニンを含む寒天培地に広げ、コロニー形成能を有する株を選択する操作を、２回又はそれ以上繰返してもよい。さらに、取得されたセルレニン耐性を有する酵母を、再度変異処理し、前記選択操作を行ってもよい。変異処理としては、グルタチオン合成酵素活性が低下又は消失した酵母について記載したのと同様に、通常の変異処理、例えばＵＶ照射、あるいはＮ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硝酸、アクリジン等の変異剤による処理が挙げられる。
また、セルレニン耐性を有する酵母は、変異処理を行わず、野生株から上記と同様にしてセルレニンを含む培地で培養することによっても、自然変異株として取得することができる。
本発明の酵母は、前記セルレニン耐性を有する酵母の中で変異型ＦＡＳ２遺伝子を有することによってセルレニン耐性となった酵母を含む。変異型ＦＡＳ２遺伝子を有するとは、野生型ＦＡＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列にセルレニン耐性を与えるような変異が入ることを意味する。一例として、サッカロマイセス・セレビシエが有する配列表の配列番号５、６記載のアミノ酸配列において、１３００番目のアミノ酸から１３０５番目のアミノ酸よりなるＴＰＶＧＡＣという配列部位にセルレニンが結合し（Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｆｕｎａｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，７５１−７５５（１９８９））、ＦＡＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害することが知られている。このアミノ酸配列特に、１３０５番目のシステイン残其にセルレニンが直接結合することから、この部位に変異が入るとセルレニン耐性を与えると考えられている。また、キャンディダ・アルビカンスが有するＦＡＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質も同様にＴＰＶＧＡＣというアミノ酸配列を有する（Ｓｕｓａｎ  Ｂ．Ｓｏｕｔｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ，１５６（１９９５）１３３−１３８）ことが知られている。この他にも、配列番号５及び６記載のアミノ酸配列において、１２５０番目のグリシンがセリン、アラニン、またはシステインに変化する変異（Ｋａｚｕｏ  ＡＲＩＴＯＭＩ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８（１），２０６−２１４（２００４））を例示することができる。更には、１４７５番目のグルタミン酸がリジンに変化する変異、１８００番目のセリンがアスパラギンに変化する変異も例示することができる。
この様に、変異型ＦＡＳ２遺伝子は、野生型ＦＡＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列にセルレニン耐性を付加する変異であれば特に制限されない。特に、配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列において１２５０番目のグリシン、１３０５番目のシステイン、１４１７番目のセリン、１４７５番目のグルタミン酸、１８００番目のセリンがその他のアミノ酸への変異が好ましい。
例えば、１２５０番目のグリシンのセリン、アラニン、又はシステインへの変異、１４７５番目のグルタミン酸のリジンへの変異、１８００番目のセリンのアスパラギンへの変異が好ましい。１４７５番目のグルタミン酸のリジンへの変異、及び／又は１８００番目のセリンのアスパラギンへの変異を導入するのがより好ましい。更に、１４７５番目のグルタミン酸のリジンへの変異、及び、１８００番目のセリンのアスパラギンへの変異を両方導入するのが最も好ましい。
なお、本発明の変異型ＦＡＳ２遺伝子は、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１又は数箇所の位置における１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には例えば、前記「数個」は、２〜２０個、好ましくは、２〜１０個、より好ましくは２〜５個である。
また、変異型ＦＡＳ遺伝子は、セルレニン耐性に寄与する限り、通常の野生型遺伝子と共存しても構わない。
本発明の酵母は、１倍体でもよいが、２倍性またはそれ以上の倍数性を有することが、生育が良好である点で好ましい。２倍性またはそれ以上の倍数性を有する酵母は、倍数性を有する酵母を変異処理しγ−グルタミルシステインを生産する株を選択すること、或いはγ−グルタミルシステイン生産株の育種に用いた１倍体酵母と、野生型酵母の１倍体を接合させ、得られた２倍体酵母を胞子形成させ、γ−グルタミルシステインを生産する株を選択し、相異なる接合型を有するγ−グルタミルシステイン生産１倍体酵母２株を接合させることによって、取得することができる。同様にして、３倍性又はそれ以上の倍数性を有する酵母を取得することができる。
上記のような酵母の育種、改変に関する操作は、「化学と生物  実験ライン３１酵母の実験技術」初版  廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０  酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ｉｎ  ＹＥＡＳＴ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等に記載されている。
上記のように、セルレニン耐性を有する酵母は、効率的にγ−グルタミルシステインを生産する。したがって、セルレニン耐性を指標として、γ−グルタミルシステインを効率よく産生する菌株をスクリーニング又は育種することができる。
＜２＞本発明の酵母の利用
本発明の酵母を培地で培養することにより、γ−グルタミルシステインを菌体内に蓄積した酵母、及びその培養物、更には酵母エキスを製造することができる。
本発明の酵母の培養に用いる培地は、本発明の酵母が良好に生育し、かつ、γ−グルタミルシステインを効率よく産生するものであれば特に制限されず、通常、工業的に用いられる培地を用いることができる。尚、必要に応じて、用いる酵母の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。
例えば、パン酵母では、対数増殖期又は定常期まで培養した培養液を、２％となるように栄養培地に接種し、２５℃〜３５℃で８〜２４時間、振とう培養すれば、対数増殖期の菌体が得られる。
目的とするγ−グルタミルシステイン蓄積量に達したら、培養を終了する。通常は、好適な条件下では、培養時間は１０〜３０時間、好ましくは１５〜２７時間である。
本発明においては、培養の形態として、高密度培養を採用することができる。本発明において「高密度培養」とは、液体培養における細胞密度が、１×１０８個細胞／ｍｌ以上、好ましくは２．５×１０８個細胞／ｍｌ以上、より好ましくは４×１０８個細胞／ｍｌ以上であることをいう。あるいは、液体培養における菌体乾燥重量が、１ｇ／１００ｍｌ以上、好ましくは２．５ｇ／１００ｍｌ以上、より好ましくは４ｇ／１００ｍｌ以上である場合も、高密度培養に含まれる。培養の全期間が高密度培養である必要はなく、少なくとも一部の期間において前記細胞密度に達していればよい。例えば、培養期間の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上で、前記細胞密度に達していることが好ましい。
本発明の酵母は、高密度培養において、経時的に菌体当りのγ−グルタミルシステイン含有量が上昇する。セルレニン耐性を有さない従来のγ−グルタミルシステイン酵母も、高密度培養でγ−グルタミルシステイン含有量は上昇するものがあるが、培養期間の経過と共にγ−グルタミルシステイン含有量の上昇が頭打になる傾向がある。それに対して、本発明の酵母は、好的な形態では、従来の酵母に比べてγ−グルタミルシステイン含有量の上昇が顕著である。
上記のようにして得られる培養物又はその分画物は、γ−グルタミルシステインを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体、菌体破砕物、又は菌体抽出物（酵母エキス）であってもよい。また、菌体破砕物又は酵母エキスから、γ−グルタミルシステインを含む画分を得てもよい。
上記酵母菌体を含む培養液から、酵母菌体を分離・洗浄する場合は、低温で行うことが好ましい。低温とは、酵母を培養するときの温度より低い温度を意味する。即ち、培養温度が３０℃であれば、３０℃未満を意味する。より好ましくは、２０℃以下、更に好ましくは１６℃以下、最も好ましくは１０℃以下である。なお、あまりに低い温度帯では培養液が凍結してしまい菌体の分離が進行しない為、培養液が凍結しない温度が下限になることは言うまでもない。菌体洗浄に水を用いる場合は、温度下限は０℃より高い温度に設定する必要がある。
培養液からの酵母菌体の分離は、通常の方法を用いることができる。遠心分離、膜分離、フィルタープレス、デカンテーションなどを例示できるが、操作性の観点から遠心分離が好ましい。
酵母エキス等の調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。即ち、酵母菌体を抽出又は消化してものから得ることができる。抽出する場合は、酵母菌体（場合により酵母菌体を含む培養液）を熱水抽出する。酵母菌体の熱水抽出の条件は、通常５０〜９９℃、好ましくは６０〜９５℃、より好ましくは６５〜９０℃である。
また、上記γ−グルタミルシステインを含む酵母エキスを加熱又は酵素処理に付すことにより、γ−グルタミルシステインの一部又は全てをシステインに変換させることができる。この場合の加熱条件は特に制限はないが、通常５０〜１２０℃で３〜３００分加熱すればよい。また、酵素処理に付す場合は、γ−グルタミルペプチド加水分解酵素で処理すればよい。尚、γ−グルタミルペプチド加水分解酵素としては、具体的にグルタミナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ等が使用できる。上記酵素を１又２種以上組み合わせて使用すればよい。
また、セルレニン耐性を有する酵母菌体を熱水抽出する際は、２段階の異なる温度領域で加熱すること、すなわち、低い温度領域で加熱しその後高い温度領域で加熱することにより、エキス分の抽出率を向上させることができる。低い温度領域と高い温度領域に５℃以上の温度差があればよい。低い温度領域は２５〜６０℃であることが好ましく、２５〜５５℃であればより好ましく、３５〜５５℃であることが更に好ましい。高い温度領域は、６５〜９９℃であることが好ましく、６５〜９５℃であればより好ましく、７０〜９０℃が更に好ましい。低い温度領域では一定時間加熱すればよく、通常２０秒以上、好ましくは２分以上、より好ましくは２０分以上加熱すればよい。加熱時間が長くなるほどより効果が顕著に見られるが、あまりに長時間加熱した場合汚染微生物が増殖する危険性があるため好ましくない。加熱時間はこれらを考慮して設定できるが、一例として加熱時間の上限として１５時間と設定することもできる。高い温度領域でも一定時間加熱すればよく、例えば３０秒〜２０分、好ましくは１分〜２０分、より好ましくは１分〜１５分、更に好ましくは２〜１０分である。
γ−グルタミルシステインを含む酵母エキスを加熱又は酵素処理して得られる酵母エキスの中でも、特に、酵母由来のエキス固形分当たりのシステイン含量が３．５％以上、塩基性アミノ酸含量が１．０％以下のものは酵母特有の呈味、香りが少なく、好ましい。尚、本発明において、塩基性アミノ酸とは、ヒスチジン、アルギニン、リジンを意味する。より好ましくは、酵母由来のエキス固形分あたりのシステイン含量が３．５％以上、塩基性アミノ酸含量が０．８％以下のものがよく、更に好ましくは酵母由来のエキス固形分あたりのシステイン含量が３．５％以上、塩基性アミノ酸含量が０．６％以下のものがよい。
上記γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む酵母エキス、本発明のγ−グルタミルシステイン高生産能の酵母を培養して得られる培養物及びその分画物は、飲食品の製造に用いることができる。即ち、上記γ−グルタミルシステイン又はシステインを含む酵母エキス、本発明のγ−グルタミルシステイン高生産能の酵母を培養して得られる培養物及びその分画物を単独又は組み合わせて飲食品原料に混合し、加熱等の加工処理を行えばよい。飲食品としては、アルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料等の飲料又は食品が挙げられる。尚、熱処理によるγ−グルタミルシステインからシステインの生成は、飲食品の製造中、又は製造の後に行われてもよい。
上記飲食品はγ−グルタミルシステイン又はシステインを含む酵母エキス、本発明のγ−グルタミルシステイン高生産能の酵母を培養して得られる培養物及びその分画物を単独又は組み合わせて食品原料に混合し、飲食品に加工することによって製造される。本発明の飲食品は、前記、酵母エキス、培養物、分画物を使用すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。
このような原料としては、例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンスターチ等、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。
【実施例】
【０００６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下実施例になんら限定されるものではない。
（参考例１）ＹＡＰ１遺伝子高発現による高γ−ＧＣ酵母の分子育種
γ−グルタミルシステイン産生酵母ＡＪ１４８００株から、ＹＡＰ１遺伝子が高発現する株を育種した。
ＡＪ１４８００株は、野生型サッカロマイセス・セレビシエに由来するグルタチオン合成酵素活性が弱化した菌株ＡＪ１４８０９株と、サッカロマイセス・セレビシエ野生株ＡＪ１４８１０株（ＭＡＴａ）を接合させ、グルタチオン合成酵素活性が弱化し、γ−グルタミルシステインを産生する株を選択することにより取得された２倍体酵母（ｇｓｈ２／ｇｓｈ２）である（特開２００３−１５９０４８、米国特許公開２００４−０２１４３０８Ａ１）。
ＡＪ１４８０９株は、２００１年１０月１日に、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４６の受託番号で寄託され、２００２年１１月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２８が付与されている。また、ＡＪ１４８１０株は、２００１年１０月１日に、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４７の受託番号で寄託され、２００２年１１月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２２９が付与されている。
まず、常法に基づき、ＹＡＰ１遺伝子を高発現するベクター（ＹＡＰ１／ｐＡＵＲ１２３）を、以下のようにして作製した。ＡＪ１４８００株をＹＰＤ培地で培養し、その対数増殖期に染色体ＤＮＡを回収した。回収した染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）、プライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いてＹＡＰ１遺伝子のＯＲＦ領域を増幅した。プライマーの末端にはＳｍａＩサイト又はＸｂａＩサイトが付加されるように設計されているため、ＰＣＲ産物のＮ末端側にはＳｍａＩサイトが、Ｃ末端側にはＸｂａＩサイトが付加される。このＰＣＲ産物を精製し、精製産物と、酵母用のタンパク発現型シャトルベクターｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社）を各々制限酵素ＳｍａＩ、ＸｂａＩで切断し、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いて連結した。連結物でエシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換して、形質転換体を取得した。目的の発現ベクターを保持する形質転換体を選抜し、得られた株からＹＡＰ１／ｐＡＵＲ１２３ベクターを大量調製した。
上記のようにして作製したＹＡＰ１／ｐＡＵＲ１２３ベクター及びｐＡＵＲ１２３で各々ＡＪ１４８００株を形質転換した。具体的には次のような操作を行った。ＡＪ１４８００株をＹＰＤ培地で培養し、その対数増殖期に集菌した。１Ｍソルビトール溶液で２回洗浄した菌体を、以下の組成の溶液に懸濁し、５℃で１時間放置した。
（組成）
０．１Ｍ  ＬｉＣｌ
１０ｍＭ  ＤＴＴ
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
その後、１Ｍソルビトール溶液で菌体を２回洗浄した。このようにして調製した菌体に上述のようにして作製したＰＣＲ産物を混合し、エレクトロポレーションを行った（「バイオマニュアルシリーズ１０  酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社）。その後、混合物をＹＰＤ培地に接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。培養物を、ｐＡＵＲ１２３ベクターの選択マーカーであるオーレオバシジンＡ（宝酒造ｃｏｄｅ９０００）を０．２μｇ／ｍｌ含有するＹＰＤ寒天培地にスプレッドし、３日間３０℃で培養した。尚、ＡＪ１４８００株のオーレオバシジンＡに対する最小生育阻止濃度は０．０５μｇ／ｍｌである。出現したコロニーを０．２μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含有するＹＰＤ寒天培地に塗布し、オーレオバシジンＡに対する耐性を有するコロニーを選抜した。それらのコロニーから、目的のベクターを保持している形質転換体を選抜し、各々ＡＪ１４８００／ＹＡＰ１／ｐＡＵＲ１２３株及びＡＪ１４８００／ｐＡＵＲ１２３株を取得した。
上記２株を、各々０．２μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含むＹＰＤ培地（４ｍｌ、試験管）に植菌し、３０℃で振とう培養した。その前培養液を各々０．２μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含むＳＤ培地（５０ｍｌ、坂口フラスコ）に２％シードし、３０℃で振とう培養した。対数増殖期（シード後１６時間）に集菌し、乾燥菌体当りのγ−グルタミルシステイン含有量を測定したところ、ＡＪ１４８００／ＹＡＰ１／ｐＡＵＲ１２３株は１．７重量％、ＡＪ１４８００／ｐＡＵＲ１２３株は１．４重量％であった。
以上より、ＹＡＰ１遺伝子の発現量を向上させることにより、菌体内のγ−グルタミルシステイン含有量が上昇することが確認された。
（ＳＤ培地組成）
グルコース    ２％
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  １倍濃度
（１０倍濃度Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅは、１．７ｇのＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社）と５ｇの硫酸アンモニウムを混合したものを１００ｍｌの滅菌水に溶解し、ｐＨを５．２程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの）
また、各種濃度のセルレニンを含有するＹＰＤ寒天培地を作製し、前述の２株に対するセルレニンの最小生育阻止濃度を測定した。具体的には、各菌株をＹＰＤ液体培地で、３０℃で振とう培養し、定常期に達した培養液３μｌをセルレニンを含有する寒天培地にスポットし、３０℃で３日間培養し、コロニー形成の有無により菌体の生育を評価した。その結果、最小生育阻止濃度は、ＡＪ１４８００／ＹＡＰ１／ｐＡＵＲ１２３株は９μＭ、ＡＪ１４８００／ｐＡＵＲ１２３株は７μＭであった。このことより、ＹＡＰ１遺伝子の発現量を向上させることにより、セルレニン耐性が上昇することが確認された。
（実施例１）
（セルレニン耐性株の取得）
参考例１と同様にしてＡＪ１４８００株のセルレニンに対する最小生育阻止濃度を調べたところ７μＭであった。
次に、ＡＪ１４８００株をＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で３日間培養した。その培養物を、ＹＰＤプレートセルレニンを７μＭ含有するＹＰＤプレート、セルレニンを１０μＭ含有するＹＰＤプレートにスプレッドし、セルレニン耐性株を取得した。耐性株の出現率を、ＹＰＤプレート上及びセルレニンを含有するＹＰＤプレートに上に形成されたコロニーの数を比較することにより評価したところ、７μＭのプレートで１００株に１株、１０μＭのプレートで２０００株に１株であった。
（実施例２）セルレニン耐性株の分類
実施例１で取得したセルレニン耐性株について、セルレニン耐性度（生育阻止濃度）を調べたところ、以下のとおりであった。
セルレニン耐性度  ７μＭ以上１０μＭ未満：４２０株
セルレニン耐性度  １０μＭ以上：６１３株
これらの菌株のγ−グルタミルシステイン含有量を測定し、親株よりもγ−グルタミルシステイン含有量が上昇しかつ生育が良好な菌株を選抜したところ、各群について、以下のような数の菌株が選抜された。
セルレニン耐性度  ７μＭ以上１０μＭ未満：８株
セルレニン耐性度  １０μＭ以上：１８株
各々の群から最優良株として、７−４６株（セルレニン耐性度  ７μＭ以上１０μＭ未満の群から選抜）、１０−２９株（セルレニン耐性度  １０μＭ以上の群から選抜）を選抜した。これらの菌株をＳＤ培地で培養し、その対数増殖期のγ−グルタミルシステイン含有量を測定したところ、ＡＪ１４８００株は１．５０％、７−４６株は１．６８％（親株比１．１倍）、１０−２９株は１．８０％（親株比１．２倍）であった。
ＡＪ１４８００株と１０−２９株のＹＡＰ１遺伝子の塩基配列を決定したところ、相違点は見出せなかった。このことより、１０−２９株のγ−グルタミルシステイン含有量が上昇した原因はＹＡＰ１遺伝子の変異以外にあると推測された。なお、１０−２９株はセルレニン２５μＭのプレート上でも生育可能であった。
（実施例３）高密度培養時のγ−グルタミルシステイン含有量
ＡＪ１４８００株、７−４６株、１０−２９株をミニジャーを用いて高密度培養し、γ−グルタミルシステイン含有量を測定した。
ＹＰＤ培地５０ｍｌ（５００ｍｌ容坂口フラスコ）に各々の菌株を１エーゼ植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで振とう培養することによりプレシード培養を行った。次に、プレシード培養物５ｍｌをＹＰＤ培地５００ｍｌ（２Ｌバッフル付三角フラスコ）に植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで４８時間振とう培養することによりシード培養を行った。シード培養物２００ｍｌをメイン培地に植菌し、ミニジャー（液量２Ｌ）を用いて以下の条件で培養を行った。
【表１】
2009110624.tif 000002
Ａ区、Ｂ区、Ｃ区は各々別々にオートクレーブ殺菌（１２０℃２０分）後、混合した。また、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔは総窒素量が０．２３ｇ／ｄｌになるように添加した。培養温度は３０℃、通気量は１／１ＶＶＭ、攪拌数は８００ｒｐｍで培養を行った。糖フィード液として、４６．７％（Ｗ／Ｖ）のグルコース液を用い、培養ブロスのｐＨが６．０になったらフィードを開始した。培養途中のｐＨは、糖フィード開始後、アンモニアガスを用いてｐＨ６．０に制御した。糖フィード後３時間毎に培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定し、０．２μｇ−グルコース／乾燥菌体重量（ＤＣＷ）ｇ／ｈｒとなるようにグルコースを添加した。換算式としてＤＣＷ＝０．２２×ＯＤ６６０ｎｍを使用した。
一定時間毎にγ−グルタミルシステイン含有量を測定した結果を図１に示す。また、培養４８時間目の乾燥菌体重量（ＤＣＷ）及びγ−グルタミルシステイン含有量（γ−ＧＣ）を測定した結果を以下に示す。
ＡＪ１４８００株  ：γ−ＧＣ  ２．１０％  ＤＣＷ３．６５ｇ／ｄｌ
７−４６株        ：γ−ＧＣ  ２．６６％  ＤＣＷ３．２３ｇ／ｄｌ
１０−２９株      ：γ−ＧＣ  ３．４８％  ＤＣＷ３．１６ｇ／ｄｌ
１０−２９株は、顕著に経時的にγ−グルタミルシステイン含有量が上昇した。また、セルレニン耐性度１０μＭ以上の群から選抜した別の菌株も、高密度培養下で顕著に経時的にγ−グルタミルシステイン含有量が上昇した。
（実施例４）１０−２９株のグルタチオン合成酵素活性の更なる低下検討
次に、１０−２９株のグルタチオン合成酵素遺伝子を破壊することにより、更にグルタチオン合成酵素活性を低下させた場合の影響を検討した。特開２００４−２０１６７７の実施例３に記載された方法と同様の方法により、１０−２９株のグルタチオン合成酵素遺伝子の破壊を行った。得られた菌株は、プライベートナンバーＡＪ１４８９２が付与され、２００６年８月２５日付けで、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１００７として寄託され、２００９年２月１９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０９７が付与されている。
上記のようにして取得したＡＪ１４８９２株を実施例３と同様に高密度培養を行った。糖フィード液として６０％グルコース溶液を用い、ブロスのｐＨが６．０になったときに糖フィードを開始した。糖フィード流量は、糖フィード開始０．５時間後までは２０μｌ／ｍｉｎ、５．９時間後までは７５μｌ／ｍｉｎ、それ以降は１３５μｌ／ｍｉｎに設定した。
一定時間毎にγ−グルタミルシステイン含有量を測定した結果を図２に示す。また、培培養４８時間目の乾燥菌体重量（ＤＣＷ）及びγ−グルタミルシステイン（γ−ＧＣ）含有量は、以下のとおりであった。
γ−ＧＣ：  ４．１２％
ＤＣＷ  ：  ５．０２ｇ／ｄｌ
本菌株も１０−２９株と同様に、顕著に高密度培養で経時的にγ−グルタミルシステイン含有量が上昇した。この結果より、グルタチオン合成酵素活性を更に低下させてもγ−グルタミルシステイン含有量は経時的に上昇することがわかった。
（実施例５）酵母抽出組成物（酵母エキス）の調製
実施例３記載のＡＪ１４８００株及び実施例４記載のＡＪ１４８９２株の培養ブロスより、下記の方法でシステインを高含有する酵母抽出組成物（酵母エキス）を調製した。
培養ブロスを各々遠心分離し、酵母菌体と培地成分を分離した。この遠心分離では、酵母菌体に付着母液として培地成分が含まれている。そこで、付着母液として菌体に付着している培地成分を除去する目的で、洗浄水を酵母菌体に添加し、懸濁した。この懸濁液を更に遠心分離し、培地成分（軽液）と酵母菌体（重液）に分離した。この操作を軽液のＢｒｉｘが０．６になるまで繰り返した。なお、ラボスケールでは、遠心分離は短時間に終了するが、工業レベルを想定したＢＰ、ＣＰスケールではこの培地成分の除去に数時間かかることもある。そこで、そのＢＰ、ＣＰスケールでの影響を考慮し、酵母菌体を約１０ｇ−ＤＣＷ（乾燥酵母菌体重量）／ｄｌの濃度になるように懸濁し、スターラーで攪拌しながら（酵母が沈殿しないレベルの攪拌速度）１６℃で４時間保持した。その後、遠心分離により酵母菌体を回収した。この酵母菌体を約１２ｇ−ＤＣＷ／ｄｌの濃度になるように水に懸濁した。この酵母懸濁液を７０℃で１０分間加熱することにより酵母菌体より内容物を抽出した。遠心分離により、酵母菌体残渣と内容物を分離した。このようにして、γ−ＧＣを含有する内容物を調製した。本内容物を１２０ｍｍＨｇの減圧下で温度を５０℃に制御して濃縮、約１０時間後に固形分濃度約３０％まで濃縮した。このようにして酵母抽出組成物Ａ（酵母エキスＡ）を調製した。更に、酵母抽出組成物Ａ（酵母エキスＡ）に塩酸を添加してｐＨを４．５に調製した濃縮液を９０℃で約１時間保持し、システインを高含有する酵母抽出組成物Ｂ（酵母エキスＢ）を調製した。
（実施例６）酵母抽出組成物（酵母エキス）の評価
実施例５で調製した酵母抽出組成物Ａ及びＢを各々５０℃の湯で希釈して１％溶液としたものについて官能評価を行った。官能評価は、専門のパネラー１０名により、２点識別法で行った。
【表２】
2009110624.tif 000003
【表３】
2009110624.tif 000004
その結果、ＡＪ１４８９２株ブロス抽出組成物の方がγ−ＧＣ（γ−グルタミルシステインの略）やシステイン特有の硫黄臭が高い一方で、課題である酵母エキス特有のＹＥ臭（酵母特有の臭）やＹＥ呈味（酵母特有の味）が少ないことがわかった。よって、γ−ＧＣを含有する酵母にセルレニン耐性を付与したことによって、γ−ＧＣ含有量が上昇するだけでなく酵母エキス特有のＹＥ臭やＹＥ呈味が少ない酵母抽出組成物（酵母エキス）が得られることがわかった。
なお、実施例５で調製した酵母抽出組成物Ｂを分析したところ、エキス固形分あたりの各成分含量は以下の通りであった。
【表４】
2009110624.tif 000005
【表５】
2009110624.tif 000006
これらの結果からもわかるように、ＡＪ１４８９２株ブロス抽出組成物Ｂは、ＡＪ１４８００株ブロス抽出組成物Ｂに比べてエキス固形分あたりのシステイン含量が上昇している一方で、エキス固形分あたりの塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）含量が減少していた。
これらの傾向は、実施例２で１０μＭ以上のセルレニンに耐性を有し、γ−ＧＣ含量が上昇した菌株として選抜した酵母の中からランダムに選抜した、１０−９株、１０−２９株、１０−３４０株においても同様であった。なおこの時の、システイン含量は各々３．９０％、３．８８％、３．６２％であった。
（実施例７）酵母菌体洗浄中の成分変化
ＡＪ１４８９２株ブロスとＡＪ１４８００株ブロスの菌体洗浄中に菌体から内容物が遊離するか否か次のようにして調べた。実施例１と同様にして、実施例３記載のＡＪ１４８００株及び実施例４記載のＡＪ１４８９２株の培養ブロスを遠心分離及び洗浄することにより、軽液のＢｒｉｘが０．６で酵母菌体濃度が約１０ｇ−ＤＣＷ（乾燥酵母菌体重量）／ｄｌの懸濁液を調製した。この懸濁液をスターラーで攪拌しながら（酵母が沈殿しないレベルの攪拌速度）１６℃で保持した。一定時間毎に懸濁液をサンプリングし、遠心分離して上清Ｂｒｉｘを測定した。ＡＪ１４８９２株では、ＡＪ１４８００株と異なり微小な変化ではあるが、経時的に上清Ｂｒｉｘの上昇が見られた（図３）。なお、ＡＪ１４８９２株で、酵母菌体重量あたりのγ−ＧＣ含量の変化はほとんどなかった。この洗浄工程においても、セルレニン耐性株の場合酵母菌体からＹＥ（酵母エキス）特有の成分が除去されると推定される為、さらにＹＥ特有のＹＥ呈味やＹＥ臭が低減した酵母菌体抽出組成物が得られたと推定された。
（参考例２）酵母菌体ブロス中の溶存気体
酵母は通性嫌気性である為、通常通気を行って培養する。その為、培養ブロスには通気された空気と酵母の呼吸によって発生する二酸化炭素などの気体が溶け込んでいる。このような溶存気体が溶け込んだ状態で、ＣＳ機を用いて酵母菌体から内容物を抽出すると、抽出時に溶存気体が気化するためにＣＳ機内に気泡が発生する。その結果、ＣＳ機による熱水抽出工程が不安定になる。このような不安定化を避ける為に、通常は酵母の培養温度よりも高い温度で菌体洗浄を行う。その結果、菌体洗浄工程においてブロス中の溶存気体が脱気され、熱水抽出工程が安定化する。
ブロス中に溶け込んでいる溶存気体が、菌体洗浄工程の温度によってどのように変化するかを次のようにして調べた。
実施例５と同様にして、実施例３記載のＡＪ１４８００株培養ブロスを遠心分離、菌体洗浄することにより、上清Ｂｒｉｘが０．６、酵母菌体濃度が約１０ｇ−ＤＣＷ／ｄｌである酵母懸濁液を約２００ｍｌ調製した。この酵母懸濁液１００ｍｌずつを実施例１と同様にスターラーで攪拌しながら、３５℃又は１６℃で４時間保持した。この懸濁液に含まれている溶存気体を以下のようにして調べた。１００ｍｌ容量の三角フラスコに１００ｍｌの懸濁液を入れ、上部を密栓した。このとき三角フラスコには約５０ｍｌの空間が発生する。三角フラスコを６０℃のウオーターバスに浸漬し、スターラーで攪拌しながら懸濁液を２０分間ホールドした。この２０分間に発生した溶存気体をメスシリンダーにて測定した（図４）。
その結果、３５℃で４時間保持したサンプルには２９ｍｌの溶存気体が含まれており、１６℃で４時間保持したサンプルには５５ｍｌの溶存気体が含まれていた。この結果からも、酵母の培養温度よりも高い温度３５℃で菌体洗浄することにより、酵母重液中の溶存気体が脱気されることにより熱水抽出工程で発生する気体量を低減し、熱水抽出工程の安定化につながることがわかった。即ち、通常の３０℃以上の温度での菌体洗浄工程では、熱水抽出工程の安定化というメリットが得られている。
しかし、本発明では培養温度よりも低温で菌体洗浄するという、定法とは異なる方法を採用することで、臭い、香りとも向上した酵母エキスが得られたのは前述の実施例の通りである。
（実施例８）セルレニン耐性株１０−９株の変異遺伝子の同定
実施例２で取得した１０−９株は、親株であるＡＪ１４８００株の培養中に生じた自然変異株をセルレニン耐性という選択圧を利用して選抜した変異株である。そこで、その変異遺伝子を特定する目的で、１０−９株の遺伝子発現ｃＤＮＡライブラリーを作成した。１０−９株を１０μＭのセルレニンを含むＳＤ培地にて３０℃で培養した。その対数増殖期に菌体を集菌し、常法に従ってＴｏｔａｌ−ＲＮＡを回収した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡを利用して、Ｇａｔｅｗａｙ技術によりｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈのｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製した。（本ライブラリーの作製は、Ｇａｔｅｗａｙ技術を保有するインビトロジェン株式会社に依頼して行った。なお、同社より発売されているＵｎｃｕｔ，Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  Ｕｎｃｕｔ，ａｎｄ  Ｎａｎｏｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｕｎｃｕｔ  Ｃｕｓｔｏｍ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏｓ．１１１４４−０１０、１１１４４−０２０、ａｎｄ  １１６４９−０２０）を用いることによっても作製可能である。）この時、発現ライブラリーのｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒとして同社製のｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．１２２８６−０１９）を用いた。このようにして、ＧＡＬ１プロモーターに１０−９株の遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーを作製した。
次に、１０−９株の遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーを常法に従い、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳｃ１株（インビトロジェン株式会社、コードＣ８１０００）に形質転換した。形質転換は、Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン株式会社、コード４５−０４７６）を用いて作製したＩＮＶＳｃ１株のコンピテントセルを用いて、マニュアルに従って行った。同形質転換体をグルコースの代わりに同濃度のガラクトースを用いて作製したＳＤ培地（Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐは必要濃度添加）に植菌し、３０℃で２４ｈｒ振とう培養した。培養液を全て、１０μＭのセルレニンを含むＳＤ寒天培地（グルコースの代わりにガラクトースを使用。Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐは必要濃度添加）にスプレッドし、３０℃で７日間静置培養したところ３個のコロニーが出現した。これら３株から、各々常法に従い、プラスミドを回収した。３個のプラスミドには全て１０−９株のＦＡＳ２遺伝子が含まれていた。このようにして、１０−９株にセルレニン耐性を付ケし、γ−ＧＣ含有量向上に寄与した遺伝子としてＦＡＳ２遺伝子を特定した。
（実施例９）ＦＡＳ２遺伝子の変異点解析
常法に従い取得したプラスミドに含まれるＦＡＳ２遺伝子の塩基配列を決定したところ、ＦＡＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質の１４７５番目のグルタミン酸がリジンに変化しかつ１８００番目のセリンがアスパラギンに変化している（配列表の配列番号５、６参照）など、配列表の配列番号７の野生型のタンパク質とは相違が見られた。そこで、常法にしたがい、ＡＪ１４８００株及び１０−９株より染色体ＤＮＡを回収し、ＦＡＳ２遺伝子の増幅及び塩基配列の決定を行った。
その結果、ＡＪ１４８００株（２倍体）のＦＡＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質は２つとも１４７５番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ１８００番目のアミノ酸がセリンであった。一方、１０−９株（２倍体）ではＦＡＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質の１つは１４７５番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ１８００番目のアミノ酸がセリンであった。しかし、もう１つは１４７５番目のアミノ酸がリジンであり、かつ、１８００番目のアミノ酸がアスパラギンであった。
（実施例１０）２段階加熱によるエキス抽出率向上
実施例３記載のＡＪ１４８００株及び実施例４記載のＡＪ１４８９２株の培養ブロスより、下記の方法でエキス分を２段階加熱により抽出した。
培養ブロスを各々遠心分離し、酵母菌体と培地成分を分離した。付着母液として菌体に付着している培地成分を除去する目的で、洗浄水を酵母菌体に添加し、懸濁した。この懸濁液を更に遠心分離し、培地成分（軽液）と酵母菌体（重液）に分離した。この操作を軽液のＢｒｉｘが０．６になるまで繰り返した。その後、酵母菌体を約１０ｇ−ＤＣＷ（乾燥酵母菌体重量）／ｄｌの濃度になるように懸濁し、スターラーで攪拌しながら（酵母が沈殿しないレベルの攪拌速度）１６℃で４時間保持した。その後、遠心分離により酵母菌体を回収した。この酵母菌体を約１２ｇ−ＤＣＷ／ｄｌの濃度になるように水に懸濁した。この酵母懸濁液を１５〜７０℃の各温度で１時間ホールドすることにより１段階目加熱抽出を行った。次に、加熱温度を７０または８０℃に上昇させ、１０分間加熱抽出を行った。酵母抽出菌体を遠心分離し、上清と抽出菌体残渣を分離した。上清のＢｒｉｘを測定し、各種条件での抽出効率を比較した。
図５及び図６に示すようにセルレニン耐性を有さないＡＪ１４８００株ではいずれの条件でもエキス分の抽出率はほとんど不変であったが、セルレニン耐性を有するＡＪ１４８９２株では１段階目加熱を行うことによりエキス分の抽出率が上昇した。なお、エキス分の抽出率は１段階目加熱時間が１４時間までは経時的に上昇することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のγ−グルタミルシステインが蓄積された酵母、又は当該酵母を用いて得られる酵母エキスはアルコール飲料、パン食品、発酵調味料等の飲食品に広く使用できる。
［配列表］
2009110624.tif 000007
2009110624.tif 000008
2009110624.tif 000009
2009110624.tif 000010
2009110624.tif 000011
2009110624.tif 000012
2009110624.tif 000013
2009110624.tif 000014
2009110624.tif 000015
2009110624.tif 000016
2009110624.tif 000017
2009110624.tif 000018
2009110624.tif 000019
2009110624.tif 000020
2009110624.tif 000021
2009110624.tif 000022
2009110624.tif 000023
2009110624.tif 000024
【図１】
2009110624.tif 000025
【図２】
2009110624.tif 000026
【図３】
2009110624.tif 000027
【図４】
2009110624.tif 000028
【図５】
2009110624.tif 000029
【図６】
2009110624.tif 000030
【国際調査報告】
2009110624.tif 000031
2009110624.tif 000032
2009110624.tif 000033
2009110624.tif 000034
2009110624.tif 000035
2009110624.tif 000036