(57)【要約】  被験体において、鬱血性心不全疾患が原因である組織の老化、障害、または損傷を処置、予防、阻害、または軽減するため、あるいは、上記疾患によって悪影響を受けた組織を回復させるための処置方法には、被験体に、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴが含まれているペプチド試薬、その保存的変異体、あるいは、組織の中でＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴペプチドの生産を刺激するペプチド試薬、またはその保存的変異体が含まれている組成物の有効量を被験体に投与する工程が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、鬱血性心不全疾患が原因である組織の劣化、損傷、または破損を処置、予防、阻害、または軽減する、あるいは、前記疾患により悪影響を受けた組織を回復させるための処置方法であって、前記疾患が原因である組織の劣化、損傷、または破損を阻害するか、あるいは、上記疾患によって悪影響を受けた組織を回復させるよう、被験体に、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴが含まれているペプチド試薬、それらの保存的変異体、あるいは、前記組織の中でのＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴペプチドの生産を刺激する刺激因子、またはその保存的変異体が含まれている組成物の有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記組織の劣化、損傷、または破損に、心臓の大きさまたは重さの増大、心臓組織の大きさまたは重さの増大、心筋の肥厚、または肺水腫の少なくとも１つが含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチド試薬がサイモシンβ４（Ｔβ４）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチド試薬がＴβ４以外である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチド試薬が酸化型Ｔβ４以外である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチド試薬に、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴ、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴＱ、およびＴβ４のＮ末端変異体、Ｔβ４のＣ末端変異体、またはＴβ４のイソ型が含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチド試薬が、約１〜３０マイクログラムの範囲の投与量で前記被験体に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬が、前記組織への直接の投与、あるいは、静脈内、腹腔内内、皮下、吸入、経皮、または経口投与によって前記被験体に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が全身的に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が直接投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、溶液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、スプレー、懸濁剤、分散剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ヒドロゲル、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、泡剤、または油剤の形態である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチド試薬が組み換え体ペプチドまたは合成ペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
鬱血性心不全疾患を呈している組織を候補の化合物と接触させる工程；および、前記組織の中でのＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴペプチドの活性を測定する工程が含まれる、請求項１で定義した刺激因子をスクリーニングするための方法であって、前記候補の化合物が含まれていない対応する組織の中での前記のペプチドの活性のレベルと比較した、前記組織の中での前記ペプチドの活性の増大が、前記化合物が前記刺激因子を誘導することができることを示す、方法。
【請求項１４】
前記ペプチドがサイモシンβ４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチド試薬が直ちに、長期的に、またはそれらの組み合わせで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドの投与によって、心臓の左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）の低下、心臓の左心室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）の低下、心臓の左心室収縮末期容積の減少、心臓の左心室末期拡張期容積の減少、心臓の経時的な左心室圧の上昇の変化率（速度）（ｄＰ／ｄｔ）、の増大、心臓の経時的な左心室圧の低下の変化率（速度）（ｐｄＰ／ｄｔ）の増大、心筋の破損／損傷後の肺水腫の軽減、あるいは、心臓の左心室の筋肉肥厚の軽減の少なくとも１つが生じる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
関連出願に対する相互参照
本出願は、２００５年７月２６日に提出された米国仮特許出願番号６０／７０２，２６９の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、鬱血性心不全が原因である組織の劣化、損傷、または破損の処置または予防の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術の説明
鬱血性心不全（ＣＨＦ）疾患は、心臓が血液の循環を適切に維持することができない、心臓のポンプ機能の不均等において、現れる。ＣＨＦの最も重篤な兆候である肺水腫は、この不均等によって、肺の毛細血管から肺の間質と肺胞への漏出に続く肺液の増加が引き起こされると発症する。
【０００４】
ＣＨＦは、前方または後方心室不全（ｆｏｒｗａｒｄ  ｏｒ  ｂａｃｋｗａｒｄ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆａｉｌｕｒｅ）として分類することができる。後方心室不全は、全身静脈圧の上昇に続くが、左心室不全は、大動脈および全身の循環に向かう流れの減少に続く。さらに、心不全は、収縮機能損傷および拡張機能損傷にさらに分類することができる。収縮機能損傷は、収縮性の低下を伴う左心室の拡張を特徴とし、一方、拡張機能損傷は、弛緩する能力、および血液を受け取りそして排出する能力の低下を伴う、正常であるかまたは損なわれていない左心室において起こる。
【０００５】
ＣＨＦのＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによる機能分類は、最も有用なものの１つである。クラスＩは、症状により正常な身体的活動が制限されない患者を記載する。クラスＩＩは、通常の身体的活動によって疲労、呼吸困難、または他の症状が生じる場合を記載する。クラスＩＩＩは、正常な身体的活動が顕著に制限されることを特徴とする。クラスＩＶは、休止状態にあるか、または何らかの身体的活動を有している症状によって定義される。
【０００６】
ＣＨＦは、スターリング力（Ｓｔａｒｌｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ）の不均等、または次の収縮における収縮期の機械的作業の延長に対する拡張周期の繊維伸張の割合の程度の不均等として、最もうまく集約される。この不均等は、間質と肺胞を乾燥した状態に保つ機構と、間質への体液の移行を担っている反対向きの力との間での機能不全を特徴とし得る。
【０００７】
肺の毛細管圧（約７〜１２ｍｍＨｇ）よりも高く血漿の膠質浸透圧（一般的には、約２５ｍｍＨｇ）を維持すること、結合組織および細胞障壁の血漿タンパク質に対する比較的不浸透性の維持、および広範囲におよぶリンパシステムの維持が、間質および肺胞を乾燥した状態に保つ機構である。
【０００８】
間質への体液の移行を担っている反対向きの力としては、肺の毛細管圧と血漿の膠質浸透圧が挙げられる。正常な状況下では、体液が速いリンパ液の流れとともに肺の間質へと移行しても、間質の容積は大きくならない。しかし、リンパ排液の能力が過剰である場合には、気管支および肺血管系の周辺の間質空間に液体が蓄積し、したがって、ＣＨＦが生
じる。多量の体液と高い圧力によって、肺胞周辺の間質空間へのトラッキング、および肺胞膜の結合部分の破壊が起こり、体液が肺胞へと流れ、肺水腫の原因となる。
【０００９】
米国では、３００万人を上回る人がＣＨＦを有しており、毎年、４０万人を超える新しい患者が存在している。ＣＨＦの患者数は一般的な集団の１〜２％である。
【００１０】
ＣＨＦ患者のうちのおよそ３０〜４０％が毎年入院する。ＣＨＦは、６５歳を超える入院患者の中では、第１位となる診断別分類である。診断後の５年生存率は１９７１年には、男性については６０％、そして女性については４５％と報告された。１９９１年には、データは、基本的に変化のないままであるＣＨＦの５年生存率を示し、男性については３．２年、そして女性については５．４年の平均生存期間を示した。これは、他の疾患が原因である死亡率の低下に伴い、米国の高齢者の集団にとっては第２位となり得る。
【００１１】
ＣＨＦによる死亡の最も一般的な原因は進行性心不全であるが、突然死が全ての死亡の４５％を占める。１９９２年から１９９３年の間のＣＨＦで入院している４６０６人の患者についてのデータを監査した後、病院内での死亡率は１９％であり、心臓以外の原因による死が３０％あった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
鬱血性心不全が原因である組織の劣化、損傷、または破損を処置、予防、阻害、または軽減するための処置方法が、当該分野で依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
１つの態様にしたがうと、被験体において、鬱血性心不全疾患が原因である組織の劣化（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）、損傷（ｉｎｊｕｒｙ）または破損（ｄａｍａｇｅ）を処置、予防、阻害、または軽減するため、あるいは、上記疾患によって悪影響を受けた組織を回復させるための処置方法には、そのような処置が必要な被験体に、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴ、それらの保存的変異体、あるいは、ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴペプチドの生産を刺激する刺激因子、またはその保存的変異体が含まれるペプチド試薬が含まれている組成物の有効量を上記組織に投与する工程が含まれ、それによって、鬱血性心不全が原因である上記組織の劣化、損傷、または破損が阻害されるか、あるいは、上記疾患によって悪影響を受けた組織が回復する。
【発明の効果】
【００１４】
発明の詳細な説明
鬱血性心不全はまた心不全とも呼ばれ、これは、心臓が効率よく血液をくみ上げる能力が低下しており、もはや心臓が置かれている正常な需要に応じて維持することができない損傷である。心筋を破損させるかまたは弱めてしまい、そして心室を伸ばす（拡張させる）症状の結果として、機能しなくなったポンプは、循環システムを通じて血液を効率よく移動させることができない。血液は逆流し始め、それによって血圧が上昇し、血管から体の組織へと体液が流れる。この症状は、心臓の右側に影響を与える場合も、左側に影響を与える場合も、または両側に影響を与える場合もある。通常、心不全により、血液の背圧によって肺の中に体液が集まってしまう（肺水腫）という機能不全（左心不全／左心室不全）が始まる。肺の中のこの余分な液体により、肺は吸入の際に気道を広げることがさらに難しくなる。呼吸はより困難になり、息切れ（呼吸困難）が起こる。心臓の右側が機能しなくなり始める（右心不全）と、心臓に入ろうとする血液の背圧が生じて、肢、踵、および下肢に体液が集まる。心不全が悪化すると、上肢が腫れ、そして最終的には腹部に体液が集まる（腹水）。体重の増加には体液の貯留が付随する。はれぼったい隆起（末梢浮
腫）は右心不全の兆候であり、特に、浮腫が圧痕水腫である場合にはそうである。肺、脚、肢、踵、肝臓、および腹部でのこの体液の貯留は、心不全の鬱血性の側面である。
【００１５】
ＣＨＦの発症は進行性であり、一般的には、慢性の長期にわたる症状であるが、これは、心臓発作または心筋の炎症性疾患（例えば、拡張型心筋症または拘束型心筋症など）の後に突然発症する場合もある。
【００１６】
拡張型（鬱血性）心筋症は最も一般的な形態であり、心臓腔の拡大および伸張（心臓の拡張）が原因で起こり、これによって心臓が弱くなり、ポンプ機能が異常となる。異常な心臓の律動（不整脈）および心臓の電気伝導の損傷もまた起こる場合がある。この症状の原因は多くの場合には判っていないが、ウイルス、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）および過剰なアルコール摂取によって引き起こされる可能性がある。加えて、伸張した不整脈の心臓によっては、血液はよりゆっくりと、そして乱れて流され、血塊の形成の原因となる。
【００１７】
拘束型心筋症は、最も少ない心筋症のタイプであり、破損を受けた心筋が繊維性の瘢痕および脂肪組織に置き換わった場合に発症する。心臓の右側（心房が含まれる）が最初に肥厚し、そして後に拡張する、すなわち、薄くなっていく。これは、電気的活動の混乱を導く可能性があり、いくつかの場合には、心臓のポンプ作用の混乱を導く可能性がある。ほとんどの部分については、心室は、収縮の間に血液で満たされるには困難なほどに堅くなる。
【００１８】
ＣＨＦは、年齢が進むに伴ってより一般的となる。危険要因としては、肥満、糖尿病、タバコの使用、アルコール依存症、コカインの使用が挙げられる。
【００１９】
病因
鬱血性心不全の最も一般的な原因は、冠動脈疾患（アテローム性動脈硬化症）である。これは、心筋の一部の領域を酸素が多く含まれている血液および栄養素が慢性的に枯渇した状態にすることによって、心臓を弱くする。結果として、心臓のこれらの領域は、あまり活発にポンプ機能を行うことができない。多くの場合には、心筋への血液の流れは、筋肉の生存を維持するためにしか十分ではなく、満足に機能するためには十分ではない。他の場合には、心筋の１つの領域への血流が完全にブロックされてしまうと、心臓発作が起こる。心筋が死亡した領域はポンプ機能を行う心臓の全体的な能力を弱める。
【００２０】
ＣＨＦの別の重要な原因は高血圧であり、これにより、左心室不全が生じる。血圧が高い場合には、心臓は、体の隅々にまで血液を循環させなければならないので、それが行うよりもさらに激しく機能しなければならない。時間と共に、行わなければならない余分な作業を補うために心筋は肥厚し得るが、これには全く利益がないか、ほとんど利益はない。いくつかの場合には、心臓は大きくなるであろう。最終的に、心筋は、血液を効率よくポンプで送るためには、堅くなりすぎるか、または弱くなりすぎるかのいずれかであろう。
【００２１】
心不全の他の構造的または機能的原因としては、心臓弁疾患（不全または狭窄）、鬱血性心疾患、筋ジストロフィー（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ）、特発性拡張型心筋症（原因不明の心筋の疾患／破損／劣化）、長期にわたる深刻な不整脈（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｓｅｒｉｏｕｓ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ）、および肺疾患（例えば、肺動脈高血圧）が挙げられる。
【００２２】
ＣＨＦの分類
収縮期心不全：左心室のポンプ作用が低下するかまたは弱くなり、それにより、激しく
収縮するその能力の喪失が生じる。左心室機能の一般的な臨床的測定は駆出率である。収縮期心不全の患者は、５０％未満の低い駆出率を有する（通常は、約４０％またはそれ未満）。正常な駆出率は５０％より大きい。
【００２３】
拡張期心不全：左心室は、通常通り収縮しているように見えるが、完全に弛緩または満たされるその能力が失われている（すなわち、それが弛緩しており血液で満たされている場合に、堅い、またはあまり弾性がない）。これは心臓への血液の充填を遅らせて、肺への逆流を生じる。拡張期心不全は、７５歳を超える人にはより一般的である。拡張期心不全においては、駆出率は正常である。
【００２４】
いずれの特定の理論にも束縛はされないが、アクチン隔離ペプチド（例えば、サイモシンβ４（Ｔβ４またはＴＢ４））、およびアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴが含まれているアクチン隔離ペプチドまたはペプチド断片を含む他の因子、あるいはその保存的変異体は、鬱血性心不全疾患が原因である組織の劣化、損傷、または破損の反転あるいは予防を促進する。
【００２５】
サイモシンβ４は、インビトロで、内皮細胞の移動と分化の間にアップレギュレートされるタンパク質として最初に同定された。サイモシンβ４は胸腺から初めて単離され、これは、様々な組織の中で同定された４３アミノ酸で、４．９ｋＤａの至るところに存在しているポリペプチドである。いくつかの役割がこのタンパク質に帰するとされており、これには、内皮細胞の分化および移動、Ｔ細胞の分化、アクチンの隔離、血管新生、および創傷の治癒における役割が含まれる。
【００２６】
１つの実施形態にしたがうと、本発明は、被験体の、鬱血性心不全疾患が原因である組織の劣化、損傷、または破損を処置、予防、阻害、または軽減するため、あるいは、上記疾患によって悪影響を受けた組織を回復させるための処置方法である。この方法には、そのような処置が必要な被験体に、ペプチド試薬が含まれている組成物の有効量を投与する工程が含まれる。ペプチド試薬は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴ、または鬱血性心不全疾患を阻害する活性を有しているそれらの保存的変異体が含まれているポリペプチド（好ましくは、サイモシンβ４および／またはＴβ４イソ型、アナログ、もしくは誘導体（これには、ＫＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＥＴＱ、酸化型Ｔβ４、Ｔβ４のＮ末端変異体、Ｔβ４のＣ末端変異体などが含まれる））であり得る。
【００２７】
好ましい実施形態においては、組織の劣化、損傷、または破損には、心臓の大きさまたは重さの増大、心臓組織の大きさまたは重さの増大、心筋の肥厚、または肺水腫の少なくとも１つが含まれる。
【００２８】
本発明にしたがって使用することができる組成物としては、サイモシンβ４（Ｔβ４）、および／またはＴβ４イソ型、アナログ、または誘導体（酸化型Ｔβ４、Ｔβ４のＮ末端変異体、Ｔβ４のＣ末端変異体が含まれる）、ならびに、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴが含まれているまたは原則としてそれらから構成されているポリペプチドまたはペプチド断片、あるいは、鬱血性心不全疾患を阻害する活性を有しているその保存的変異体のようなペプチド試薬が含まれる。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（引用により本明細書中に組み入れられる）には、本発明にしたがって有用であり得るＴβ４のイソ型、さらには、本発明とともに利用することができるアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴおよびそれらの保存的変異体が開示されている。国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／００８３３（ＷＯ９９／４９８８３）（引用により本明細書中に組み入れられる）には、本発明にしたがって利用することができる酸化型のサイモシンβ４が開示されている。本発明は、主にＴβ４およびＴβ４イソ型に関して、本明細書中以後に記載されるが、以下の記載は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴ、ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫ
ＫＴＮＴが含まれているかまたは基本的にそれらから構成されているペプチドおよび断片、鬱血性心不全疾患を阻害する活性を有しているその保存的変異体、ならびに／あるいはＴβ４イソ型、アナログ、または誘導体（酸化型Ｔβ４、Ｔβ４のＮ末端変異体、およびＴβ４のＣ末端変異体が含まれる）などにも同様に適用できるように意図されることが理解される。
【００２９】
１つの実施形態においては、本発明により、心臓組織を本明細書中に記載されるペプチド試薬が含まれている組成物の有効量と接触させることによる、被験体の、鬱血性心不全疾患が原因である組織の劣化、損傷、または破損を処置、予防、阻害、または軽減するため、あるいは、上記疾患によって悪影響を受けた組織を回復させるための処置方法が提供される。この接触は、直接である場合も、また、全身的である場合もある。直接の投与の例としては、例えば、本明細書中に記載されるペプチド試薬が含まれている、溶液剤、ローション剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、スプレー、懸濁剤、分散剤、ヒドロゲル、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、泡剤、または油剤との、直接の塗布あるいは吸入による組織の接触が挙げられる。全身的な投与としては、例えば、注射用水のような薬学的に許容される担体の中に本明細書中に記載されるペプチド試薬が含まれている組成物の、静脈内、腹腔内、筋肉内注射が挙げられる。
【００３０】
本発明で使用されるペプチド試薬は、本明細書中に記載されるように、任意の有効量で投与することができる。例えば、本明細書中に記載されるペプチド試薬は、約０．０００１〜１，０００，０００マイクログラムの範囲の投与量で、より好ましくは、約０．１〜５，０００マイクログラムの範囲の量で、最も好ましくは、約１〜３０マイクログラムの範囲で投与することができる。
【００３１】
本発明にしたがう組成物は、１日に１回、１日おきに、１週間おきに、１ヶ月おきになどで、投与日１日につき１回の投与または複数回の投与（例えば、投与日１日につき２回、３回、４回、またはそれ以上の投与回数）で投与することができる。
【００３２】
多くのＴβ４イソ型が同定されており、これらは、Ｔβ４についての既知のアミノ酸配列に対して、約７０％、または約７５％、または約８０％、またはそれ以上の相同性を有している。このようなイソ型としては、例えば、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４、および、Ｔβ１５が挙げられる。Ｔβ４と同様に、Ｔβ１０およびＴβ１５イソ型は、アクチンを隔離することが示されている。Ｔβ４、Ｔβ１０、およびＴβ１５、ならびにこれらの他のイソ型は、アクチンの隔離または結合を媒介することに関係していると見られているアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴを共有している。いずれの特定の理論にも束縛されることは望ましくないが、本明細書中に記載されるペプチド試薬の活性は、そのような試薬の抗炎症活性および／またはアクチン調節活性に、少なくとも一部原因があり得る。Ｔβ４は、アクチンの重合を調節することもできる（例えば、β−サイモシンは、遊離のＧ−アクチンを隔離することによってＦ−アクチンを脱重合させると見られている）。Ｔβ４のアクチンの重合を調節する能力は、ＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴ配列を介してアクチンに結合するかまたはアクチンを隔離するその能力が原因である可能性がある。したがって、Ｔβ４と同様に、抗炎症性であり、そして／また、アクチンに結合するかもしくはアクチンを隔離する、またはアクチンの重合を調節する他のタンパク質（アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴを有しているＴβ４イソ型が含まれる）は、本明細書中で示されるように、単独で、またはＴβ４と組み合わせて有効であるようである。
【００３３】
本明細書中に記載されるペプチド試薬、例えば、Ｔβ４およびＴβ４イソ型は、炎症性ケモカイン、サイトカイン、およびカスパーゼ活性を低下させる。
【００３４】
したがって、既知のＴβ４イソ型（例えば、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４、および、Ｔβ１５）、ならびにまだ同定されていないＴβ４イソ型も、本発明の方法に有用であろうということが具体的に意図される。したがって、そのようなＴβ４イソ型は、被験体において行われる方法が含まれる、本発明の方法の方法において有用である。したがって、本発明によってはさらに、Ｔβ４、ならびにＴβ４イソ型（Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４、および、Ｔβ１５）と、薬学的に許容される担体が含まれている薬学的組成物が提供される。
【００３５】
加えて、例えば、抗炎症活性および／またはアクチンを隔離するかもしくはアクチンに結合する能力を有しているか、あるいは、適切な隔離、結合、移動、もしくは重合アッセイにおいて明らかであるか、またはアクチンの結合を媒介するアミノ酸配列（例えば、ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴ）の存在によって同定される、アクチンを移動させることができるかまたはアクチンの重合を調節することができる他の試薬またはタンパク質も、本発明の方法において同様に使用することができる。このようなタンパク質としては、例えば、ゲルゾリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、デパクチン、ＤｎａｓｅＩ、ビリン、フラグミン、セヴェリン（ｓｅｖｅｒｉｎ）、キャッピングタンパク質、β−アクチン、およびアキュメンチンを挙げることができる。このような方法には、被験体において行われる方法が含まれるので、本発明によってさらに、本明細書中に示されるような、ゲルゾリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、デパクチン、ＤｎａｓｅＩ、ビリン、フラグミン、セヴェリン、キャッピングタンパク質、β−アクチン、およびアキュメンチンが含まれている薬学的組成物が提供される。したがって、本発明には、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴ、およびそれらの保存的置換体が含まれているポリペプチドの使用が含まれる。
【００３６】
本明細書中で使用される場合は、用語「保存的変異体」またはその文法上のバリエーションは、別の生物学的に類似している残基による１つのアミノ酸残基の置き換えを示す。保存的変異体の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような疎水性残基の、別のものでの置き換え、極性残基の別のものでの置き換え（例えば、アルギニンのリジンでの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸での置換、またはグルタミンのアスパラギンでの置換など）が挙げられる。
【００３７】
Ｔβ４は、多数の組織および細胞のタイプに局在化させられている。したがって、ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴペプチドの生産を刺激する因子（例えば、Ｔβ４または本明細書中に記載されている別のペプチド試薬）を、組織および／または細胞によってペプチド試薬の生産を行わせるために組成物に添加することができ、また、そのような因子には、組織および／または細胞によってペプチド試薬の生産を行わせるための組成物を含むことができる。そのような刺激因子としては、成長因子のファミリーのメンバー（例えば、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、サイモシンα１（Ｔα１）、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ））を挙げることができる。より好ましくは、刺激因子は、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）またはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーである。
【００３８】
１つの実施形態にしたがうと、被験体は、本明細書中で定義されるようなペプチド試薬の被験体の中での生産を刺激する刺激因子で処置される。
【００３９】
加えて、鬱血性心不全疾患が原因である組織の劣化、損傷、または破損の軽減を助ける、あるいは、上記疾患によって悪影響を受けた組織を回復させる他の試薬が、本明細書中に記載されるペプチド試薬と共に、組成物に添加される場合もある。例えば、限定ではな
いが、本明細書中に記載されるペプチド試薬は、単独で、または組み合わせにおいて、有効量の以下の薬剤の任意の１つ以上と組み合わせて添加することができる：抗生物質、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＬ−１、プロサイモシンαおよび／またはサイモシンα１。
【００４０】
本発明にはまた、薬学的に許容される担体の中に、本明細書中に記載されるペプチド試薬の治療有効量が含まれている薬学的組成物も含まれる。このような担体としては、本明細書中に列挙されるものが挙げられる。
【００４１】
処置を提供する実際の投与量または試薬、処方、または組成は多くの要因に応じて様々であり得、これには、被験体の大きさおよび健康状態が含まれる。しかし、当業者は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（前出）およびその中で引用されている参考文献の中に開示されている臨床的な投与量を決定するための方法および技術を記載している教示を、使用する適切な投与量を決定するために使用することができる。
【００４２】
適切な処方物には本明細書中に記載されるペプチド試薬が、約０．００１〜５０重量％の範囲、より好ましくは、約０．０１〜０．１重量％の範囲、最も好ましくは、約０．０５重量％の範囲の濃度で含まれ得る。
【００４３】
本明細書中に記載される治療用アプローチには、本明細書中に記載されるペプチド試薬の、被験体への様々な投与経路または送達が含まれる。これには、任意の従来の投与技術（例えば、直接の投与、局所注射、吸入、または全身投与であるが、これらに限定はされない）が含まれる。本明細書中に記載されるペプチド試薬を使用するかまたはそれが含まれている方法および組成物は、薬学的に許容される非毒性の賦形剤または担体との混合によって、薬学的組成物になるように処方され得る。
【００４４】
本発明には、本明細書中に記載されるペプチド試薬と相互作用する、ペプチド試薬を強化する、またはペプチド試薬を阻害する抗生物質の使用が含まれる。様々なエピトープに関する特異性を有しているプールされたモノクローナル抗体から原則として構成される抗体、ならびに異なるモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（前出）に開示されているような当業者に周知の方法により、タンパク質の断片が含まれている抗原から作製される。用語「抗体」は、本発明において使用される場合は、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体が含まれるように意味される。
【００４５】
なお別の実施形態においては、本発明により、遺伝子発現を調節する刺激因子の有効量を投与することにより、被験体を処置する方法が提供される。用語「調節する」は、本明細書中に記載されるペプチド試薬が過剰発現された場合の発現の阻害または抑制、ならびに、本明細書中に記載されるペプチド試薬が過少発現（ｕｎｄｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）された場合の発現の誘導を意味する。用語「有効量」は、本明細書中に記載されるペプチド試薬の遺伝子発現の調節、それによる、鬱血性心不全疾患が原因である組織の劣化、損傷、または破損の症状の軽減、あるいは、上記疾患によって悪影響を受けた組織の回復に有効である刺激因子の量を意味する。本明細書中に記載されるペプチド試薬の遺伝子発現を調節する刺激因子は、例えば、ポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドは、アンチセンスである場合も、３本鎖の因子（ｔｒｉｐｌｅｘ  ａｇｅｎｔ）である場合も、またリボザイムである場合もある。例えば、本明細書中に記載されるペプチド試薬の構造遺伝子の領域に対するアンチセンス、またはペプチド試薬のプロモーター領域に対するアンチセンスを利用することができる。本明細書中に記載されるペプチド試薬の遺伝子発現を調節する刺激因子はまた、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である場合もある。
【００４６】
別の実施形態においては、本発明により、本明細書中に記載されるペプチド試薬の活性を調節する化合物を利用するための方法が提供される。本明細書中に記載されるペプチド試薬の活性に影響を与える化合物（例えば、アンタゴニストおよびアゴニスト）としては、ペプチド、ペプチド模倣物、ポリペプチド、化合物、ミネラル（例えば、亜鉛）、および生物学的因子が挙げられる。
【００４７】
本明細書中に定義される刺激因子をスクリーニングするための方法には、鬱血性心不全疾患を呈している心臓組織を候補の化合物と接触させる工程；および、上記組織の中でのＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴペプチドの活性を測定する工程が含まれる。ここでは、上記候補の化合物が含まれていない対応する組織の中での上記のペプチドの活性のレベルと比較した、上記組織の中での上記ペプチドの活性の増大が、上記化合物が上記刺激因子を誘導することができることを示す。
【実施例】
【００４８】
実施例１
マウスの心筋梗塞（ＭＩ）心不全モデルにおけるサイモシンβ４の実験
目的：
本実験の目的は、マウスのＭＩによって誘導した心不全モデルにおけるサイモシンβ４の効果を評価することであった。
【００４９】
モデル
本実験で使用した手順は、Ｎａｔｕｒｅ（４３２：４６６−４７２，２００４）に報告された手順と正確に同じとした。簡単に説明すると、Ｃ５７ブラックマウス（１４週齢）を本実験で使用した。マウスには、サイモシンβ４（Ｂａｃｈｅｍ，Ｌｏｔ＃ＦＴＨＹＢ４０５０１Ｂ）（１５０μｇ／マウス）を心筋梗塞の直後、および、その後は、４週間にわたり、３日おきにｉ．ｐ．注射によって投与した。この実験のパラメーターには、心臓の形態学と、心エコー検査（エコー）、Ｍｉｌｌａｒカテーテルを使用した侵襲的な心臓機能の測定、生存率、および組織化学的分析による機能を含めた。
【００５０】
心臓発作（心筋梗塞）は、直ちに、心停止（心拍がない）または左心室の永久的な破損の原因となり得る。破損が悪すぎると、心臓の複数の領域が適切に機能することができない場合があり、これは心不全に至る場合がある。Ｎａｔｕｒｅ  ２００４（上記）には、ＴＢ４は、マウスのモデルにおいて心臓発作の直後に投与されると、機能的短縮および駆出率を改善することができることが示されている。この場合、薬剤は的確に投与され、機能の改善が明らかになった。機能の改善は患者の生存に重要であるが、ＴＢ４が動物モデルにおいて誘導した心臓発作によって生じた有意な破損後の結果を軽減または改善できることを示唆しているデータは存在していない。結果として、ＴＢ４が生存している動物において起こるであろう心不全を処置することができることは明らかではなかった。
【００５１】
本実験は、ＴＢ４が、心不全／鬱血性心不全（ＣＨＦ）を有している哺乳動物を処置することにおいて有効であることを示唆している。この場合、ＴＢ４もまた、的確に投与された。しかし、実際には、薬物は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の直後および／またはその後長期的に、あるいは、ＣＨＦの症状の進行および悪化を停止させるために進行性心不全の患者において長期的に投与され得る。
【００５２】
血流力学的改善：
心室内圧の低下：
ＴＢ４での処置は、心筋の破損／損傷後に左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）を改善する（すなわち、低下させる）傾向を示した。高い左心室収縮期圧および／または左心室収縮期圧の上昇には、その根底に、特定のタイプの鬱血性心不全の原因がある。
【００５３】
ＴＢ４での処置によっては、左心室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）が有意に低下した。高い左心室拡張末期圧および／または左心室拡張末期圧の上昇は、特定のタイプの鬱血性心不全が原因である。
【００５４】
心室容積の減少
ＴＢ４での処置によっては、ＣＨＦ患者において増大している、左心室収縮末期容積が有意に低下した。収縮末期容積は、収縮機能に関係している心臓の排出の適性の測定であるので、収縮期心不全のＣＨＦ患者に関係している。
【００５５】
ＴＢ４での処置によっては、左心室拡張末期容積が有意に減少した。罹患している心臓においては、心室の容積および心臓拡張の容積が高レベルにまで増大すると、心不全の場合にそうであるように、心拍出量が下がる。左心室拡張末期容積の増大は、拡張期心不全のＣＨＦ患者に付随する。
【００５６】
ＴＢ４での処置によっては、心室収縮力の代替的測定値である経時的な左心室圧の上昇の変化率（速度）（ｄＰ／ｄｔ）は有意に改善された。排出に利用できる一定時間だけが存在するので、心室内圧上昇速度の低下（すなわち、より長い収縮時間）によっては、１回の動作で拍出される血液の減少が生じる。これは、収縮期心不全のＣＨＦ患者において明らかである。
【００５７】
ＴＢ４での処置は、左心室の弛緩における変化率（速度）に影響を与える（改善する）傾向を示した。ｄＰ／ｄｔがよりネガティブであればあるほど、心臓はより速く弛緩することができる。拡張期心不全のＣＨＦ患者は、弛緩し、血液で満たされる時に、あまり弾力のない心臓を有している。これにより、心室への血液の充填が遅れ、肺への逆流が生じる。
【００５８】
臓器の重量
ＴＢ４での処置によっては、心筋の破損／損傷後の肺水腫が有意に軽減される。肺水腫は、左心不全の結果としてＣＨＦ患者において起こる重篤な結果である。
【００５９】
ＴＢ４での処置によっては、心臓のポンプ作用にネガティブな影響を与える左心室の筋肉の肥厚が軽減された。
【００６０】
この実験では、ＴＢ４で処置した動物のグループ、媒体で処置した動物のグループ、および未処置の動物（偽治療）のグループにおいて臓器の重量（心臓および肺）を評価した。これらのデータは、ＴＢ４が、ストレス／損傷が原因である心筋の肥厚および肺水腫（左心不全が原因である肺での体液の蓄積）の両方を軽減したことを示しており、ＴＢ４が鬱血性心不全（ＣＨＦ）の患者の処置に有効であり得ることを強く示している。ＣＨＦ（心不全とも呼ばれる）は、大抵は慢性的な長期間にわたる症状であるので、ＴＢ４による長期間におよぶ処置によって症状の悪化の進行を遅らせるかまたは停止させることができる。
【００６１】
実施例２
筋ジストロフィー（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）の発症の間のサイモシンβ４の使用を実験した。本発明者らは、自然発生したジストロフィン欠損ｍｄｘマウスモデルを使用し、非侵襲的な心エコー検査を用いて心機能を縦方向で追跡した。サイモシンβ４は、膜安定性および抗線維症のその特性を通じて、心筋症の進行を遅らせることに有効な効果を有し得る。筋ジストロフィーにおいては、ジストロフィン（ｄｙｓｔｏｐｈｉｎ）と、細胞外マトリックスに対するその結合が欠損していることが原因
で剪断力はほとんど寛容化されない（ｐｏｏｒｌｙ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）。これらの力は、細胞死および線維症を導く筋細胞膜の破裂の原因となる。サイモシンβ４は、膜を安定化させる特性を有していることが示されており、これはおそらく、アクチンの重合に対する作用と関係している。本発明者らはまた、サイモシンβ４の投与によって利点を得るであろう骨格筋機能の機能的パラメーターも追跡した。予備的なデータを表１に示す。サイモシンβ４はまた、抗血栓症特性をも有している。剪断力およびカルシウムの流入が原因で破損を受けた心筋は、筋肉を再形成させるサイモシンβ４の調節による利点を得ることができる。線維症が軽度であれば、より長い時間、心臓機能を維持できる。
【００６２】
試験パラメーターと実験の設計：
マウスの４つのグループをサイモシンβ４で処置した。グループ１は、プラセボを投与した（処置しなかった）正常なマウス（ＢＬ１０）である。グループ２は、サイモシンβ４で処置した正常なマウスである。グループ３は、プラセボで処置したジストロフィン欠損（ｍｄｘ）マウスである。グループ４は、サイモシンβ４で処置したｍｄｘマウスである。マウスを、１週間に２回腹腔内に投与した３００マイクロリットルの緩衝液中の１５０マイクログラムのサイモシンβ４で処置した。プラセボマウスには、緩衝液だけを３００マイクロリットル投与した。このマウスを、１週間に２回、１２メートル／分の速度で３０分間、トレッドミル（ｔｒｅａｄｍｉｌｌ）で運動させた。機能、行動、および心エコー検査のデータを、ベースラインと、処置の２ヵ月後、４ヵ月後、および６ヵ月後に得た。
【００６３】
機能のデータは、骨格筋機能の非侵襲的測定である。前脚および後脚の筋肉の強度を、握力強度計（ｇｒｉｐ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｍｅｔｅｒ）を使用して評価した。動物を、測定用の台（ｍｅｔｅｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）の上に載せ、その後、彼らが握力を失うまでゆっくりと引き上げた。掴まりを離させるために必要であった力の量を記録した。複数回の測定を、それぞれの時点で個々のマウスについて行った。同じプロトコールを、後ろ脚の筋肉の強度についても続いて行った。別の機能の測定は、Ｒｏｔａｒｏｄ試験である。ここでは、マウスを回転する棒の上に載せ、速度を上げつつ棒を回転させながら（１分間に１０ＲＰＭ、その後、次の３分間で０．２ＲＰＭの上昇）、彼らに平衡状態と位置を維持させた。マウスが落下するまでの時間を測定した。この試験もまた複数回繰り返した。
【００６４】
行動のデータは、ＶｅｒｓａＭａｘ（登録商標）動物の活動モニタリングシステムを使用して集めた。マウスをモニターボックスに入れ、活動を様々なセンサーによって定量した。水平方向の活動、垂直方向の活動、および移動した合計距離、および多くの他の活動のパラメーターを含むデータを測定した。複数回の測定を３日間かけて行った。
【００６５】
心エコー検査による評価を、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ６６０（登録商標）高周波システムを使用して行った。心室の大きさ、心室機能、および流入／流出ドップラー速度の評価は、イソフロラン麻酔下で完了した。心エコー検査を行い、測定する心臓専門医には、実験グループについては盲検とした。
【００６６】
表１：ベースラインとサイモシンβ４での処置の２ヶ月後の正常なマウス（ＢＬ１０）とジストロフィン欠損（ｍｄｘ）マウスにおいて測定した機能のパラメーター
【００６７】
【表１】
2009502938.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月18日(2008.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはその保存的変異体、ＬＫＫＴＮＴもしくはその保存的変異体、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のイソ型、アナログ、もしくは誘導体、ＫＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＥＴＱ、酸化型Ｔβ４、Ｔβ４のＮ末端変異体、Ｔβ４のＣ末端変異体、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４、Ｔβ１５、ゲルゾリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、デパクチン、ＤｎａｓｅＩ、ビリン、フラグミン、セヴェリン、キャッピングタンパク質、β−アクチン、またはアキュメンチンを含むペプチド試薬が含まれている組成物の使用、あるいは、鬱血性心不全疾患が原因である組織の劣化、損傷、もしくは破損を処置、予防、阻害、もしくは軽減する、または、前記疾患により悪影響を受けた組織を回復させるための医薬品の製造における、組織の中での前記ペプチド試薬の生産を刺激する刺激因子の使用。
【請求項２】
前記組織の劣化、損傷、または破損に、心臓の大きさまたは重さの増大、心臓組織の大きさまたは重さの増大、心筋の肥厚、または肺水腫の少なくとも１つが含まれる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ペプチド試薬がサイモシンβ４（Ｔβ４）である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ペプチド試薬がＴβ４以外である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記ペプチド試薬が酸化型Ｔβ４以外である、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチド試薬に、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴ、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴＱ、およびＴβ４のＮ末端変異体、Ｔβ４のＣ末端変異体、またはＴβ４のイソ型が含まれる、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記ペプチド試薬が、約１〜３０マイクログラムの範囲の投与量である、請求項２に記
載の使用。
【請求項８】
前記試薬が、前記組織への直接の投与、あるいは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、吸入、経皮、または経口投与による投与のための試薬である、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が全身的な投与のための組成物である、請求項２に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物が直接的な投与のための組成物である、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
前記組成物が、溶液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、スプレー、懸濁剤、分散剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ヒドロゲル、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、泡剤、または油剤の形態である、請求項２に記載の使用。
【請求項１２】
前記ペプチド試薬が組み換え体ペプチドまたは合成ペプチドである、請求項２に記載の使用。
【請求項１３】
鬱血性心不全疾患を呈している組織を候補の化合物と接触させる工程；および、前記組織の中でのペプチド試薬の活性を測定する工程が含まれる、請求項１で定義した刺激因子をスクリーニングするための方法であって、前記候補の化合物が含まれていない対応する組織の中での前記のペプチド試薬の活性のレベルと比較した、前記組織の中での前記ペプチド試薬の活性の増大が、前記化合物が前記刺激因子を誘導することができることを示す、方法。
【請求項１４】
前記ペプチド試薬がサイモシンβ４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチド試薬が直ちの、長期的、またはそれらの組み合わせでの投与のための試薬である、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
前記組成物は、心臓の左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）の低下、心臓の左心室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）の低下、心臓の左心室収縮末期容積の減少、心臓の左心室末期拡張期容積の減少、心臓の経時的な左心室圧の上昇の変化率（速度）（ｄＰ／ｄｔ）、の増大、心臓の経時的な左心室圧の低下の変化率（速度）（ｐｄＰ／ｄｔ）の増大、心筋の破損／損傷後の肺水腫の軽減、あるいは、心臓の左心室の筋肉肥厚の軽減の少なくとも１つのために投与される組成物である、請求項１に記載の使用。
【国際調査報告】
2009502938.tif 000003