(57)【要約】  本発明は、均一な幹細胞の凝集体を迅速に形成させる工程を含むことで、幹細胞の無血清培地中での効率的な浮遊培養を可能にし、幹細胞の選択的神経分化誘導法、大脳皮質神経ネットワークを試験管内で形成する方法、および脳組織の立体構造を試験管内で産生する方法を提供し、また、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地において多能性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、及び培養物から視床下部ニューロンの前駆細胞を単離することを含む、視床下部ニューロンの前駆細胞の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を形成させる工程を含む、幹細胞の分化誘導法。
【請求項２】
幹細胞の凝集体形成の時間が１２時間以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を浮遊培養する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
浮遊培養を６０時間〜３５０時間行うことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらにＮｏｄａｌシグナル阻害剤および／またはＷｎｔシグナル阻害剤の存在下で無血清培地中で培養する工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
さらにＮｏｔｃｈシグナル阻害剤の存在下で無血清培地中で培養する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
さらに分泌型パターン形成因子の存在下で無血清培地中で培養する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
神経系細胞への分化誘導法である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
大脳前駆細胞への分化誘導法である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
大脳皮質前駆細胞への分化誘導法である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
大脳皮質神経細胞への分化誘導法である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
層特異的ニューロンへの選択的な分化誘導法である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
無血清培地が、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地である、請求項３記載の方法。
【請求項１４】
無血清培地が亜セレン酸またはその塩を含有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
無血清培地がＳｈｈシグナル促進剤を含有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
無血清培地がＳｈｈシグナル促進剤を実質的に含有しない、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
得られ得る前駆細胞が腹側視床下部ニューロンの前駆細胞である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
得られ得る前駆細胞が背側視床下部ニューロンの前駆細胞である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも７日間培養する、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
無血清培地が、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡｋｔ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの阻害剤並びにインシュリン類を含有し、且つＮｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤及びレチノイン酸を実質的に含有しない無血清培地である、請求項３記載の方法。
【請求項２１】
無血清培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を更に含有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法により得られる、細胞培養物。
【請求項２３】
無血清培地中で均一な幹細胞の凝集塊を形成させる工程および無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を浮遊培養する工程を含む、脳組織の立体構造を試験管内で産生する方法。
【請求項２４】
脳組織が、大脳皮質組織である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
無血清培地が細胞外マトリクス成分を含有することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法により得られる、培養産物。
【請求項２７】
無血清培地中で均一な幹細胞の凝集塊を形成させる工程および無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を浮遊培養する工程を含む、大脳皮質神経ネットワークを試験管内で形成する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法により得られる、培養産物。
【請求項２９】
請求項２２に記載の細胞培養物、請求項２６に記載の培養産物または請求項２８に記載の培養産物を用いることを特徴とする、被検物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の培養方法に関する。詳細には、幹細胞の凝集体培養を行う際に、迅速な再凝集と３次元浮遊培養を組み合わせることを特徴とする、幹細胞の分化誘導方法、当該方法により得られる細胞培養物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに本発明者らの報告（非特許文献１−３、特許文献１及び２）を含め、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から神経分化誘導を行う培養法はいくつか知られており、ＥＳ細胞由来の神経細胞（例、ドーパミン神経細胞など）は神経難病への再生医療である細胞移植治療の移植細胞ソースとして大きな期待を寄せられている。そのためには、脳の中に存在する病気に関連する神経細胞を正確に産生する必要があるが、脳の中には非常に多くの種類の神経細胞が存在するため、未だ効率の良い試験管内分化に成功していない神経細胞や脳組織も多い。【０００３】
大脳、特に大脳皮質は高次脳機能中枢であり、その障害は重篤な運動、精神、認知障害をもたらす。例えば、アルツハイマー病、脳梗塞、てんかん、運動ニューロン疾患（ＡＬＳ）などが挙げられる。大脳障害の治療のためには、これまでにも病因研究、創薬研究、細胞移植治療研究などが進められているが、こうした研究のためにヒトの大脳組織を得ることは非常に難しい。また胚性幹細胞からの皮質前駆細胞への分化誘導が最近可能になった（非特許文献４参照）ものの、それらの前駆細胞からの特定の大脳皮質ニューロンへの選択的な分化誘導を制御することは困難であった。【０００４】
本発明者らはこれまで動物及びヒトのＥＳ細胞等の多能性幹細胞から神経分化誘導を行う方法として、無血清培地での分散浮遊培養（ＳＦＥＢ法）が有効であることを示した（非特許文献３、４及び特許文献１を参照）。この方法では、前脳、特に大脳や神経網膜の神経細胞や感覚細胞の分化誘導が効率よく行える。また、Ｗｎｔなどの増殖因子の培地への添加で、小脳などの脳幹部組織の分化誘導にも成功した。
しかしながらマウス胚性幹細胞を用いた解析によると、ＳＦＥＢ法を適用した場合、３割程度の細胞が大脳神経細胞に分化したものの、残りの過半の細胞はそれ以外の種類の神経細胞の混雑物であった。また分化誘導した大脳神経細胞のうち、大脳皮質細胞はさらにその４割程度であり、その誘導効率は良好なものではなかった。さらにＳＦＥＢ法などの従来法で誘導された大脳組織のうち大半のものは、明確な皮質組織の形態を示さず、乱雑な細胞塊になることが殆どであった。また従来のＳＦＥＢ法では、中枢神経系の最も吻側から発生する吻側部の間脳、特に視床下部の組織の分化誘導をＥＳ細胞から効率よく行うことができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００５／１２３９０２  パンフレット
【特許文献２】特開２００８−９９６６２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｕｅｎｏ，Ｍ．，Ｋａｍｉｙａ，Ｄ．，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．，Ｗａｔａｙａ，Ｔ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｊ．Ｂ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．−ｉ．，Ｍｕｇｕｒｕｍａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｓａｓａｉ，Ｙ．（２００７）Ａ  ＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，６８１−６８６
【非特許文献２】Ｓｕ，Ｈ．−Ｌ．，Ｍｕｇｕｒｕｍａ，Ｋ．，Ｋｅｎｇａｋｕ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｏ−Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓａｓａｉ，Ｙ．（２００６）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２９０，２８７−２９６
【非特許文献３】Ｉｋｅｄａ，Ｈ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｍｉｚｕｓｅｋｉ，Ｋ．，Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｈ．，Ｋａｍｉｙａ，Ｄ．，Ｈｏｎｄａ，Ｙ．，Ｓａｓａｉ，Ｎ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｎ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓａｓａｉ，Ｙ．（２００５）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｘ＋／Ｐａｘ６＋  ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２，１１３３１−１１３３６
【非特許文献４】Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｋａｍｉｙａ，Ｄ．，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｋａｔａｙａｍａ，Ｔ．，Ｎｏｚａｋｉ，Ｓ．，Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｓｅｋｉ，Ｋ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｓａｓａｉ，Ｙ．（２００５）Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，２８８−２９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞の分化誘導、特に大脳皮質組織への分化誘導、または間脳、特に視床下部のニューロンの選択的分化誘導を可能とする、実用性の高い方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＳＦＥＢ法によれば大脳神経細胞、特に大脳皮質細胞が低効率でしか分化誘導できなかった理由として、神経組織では前駆細胞の間は神経上皮と呼ばれる上皮構造を持っており、この形成が大脳皮質の効率的な分化と組織発生に必須であるので、大脳皮質細胞への分化誘導にも上皮様構造の形成が必須であるとの仮説をもとに、血清非存在下において胚性幹細胞の分化誘導条件を鋭意検討した。その結果本発明者らは、無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を形成させることで、ＥＳ細胞から神経細胞、特に大脳皮質細胞を高効率で分化誘導できることを見出した。【０００９】
さらに本発明では、それまで視床下部を含む吻側部の間脳組織のＥＳ細胞からの分化誘導が困難であった理由が、無血清培地に含まれる阻害物質の為であることを解明し、それを回避する培養法を開発することで、視床下部の神経細胞の効率的な分化誘導に成功した。無血清培地では、一般に血清の代替としていくつかの増殖因子（Ｗｎｔ、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、レチノイン酸、ＦＧＦ、ｌｉｐｉｄ−ｒｉｃｈアルブミンなど）を添加することが多い。しかし、視床下部を含む吻側部の間脳組織の分化には、これらの増殖因子はいずれも阻害的に働くことが判った。しかも、最も頻繁に無血清培地に添加されるインシュリンも強く視床下部を含む吻側部の間脳組織の分化を阻害すること、また、その阻害はインシュリンの下流シグナルであるＡｋｔという細胞内酵素（リン酸化酵素）の活性化が原因であることを解明した。【００１０】
これらの知見を利用して、インシュリンを含まない化学合成培地でマウスＥＳ細胞の分化誘導を行うことで、視床下部の前駆細胞を分化させ、それを更に成熟させることで、バゾプレシン産生細胞などの視床下部の内分泌系ニューロンを分化させることが可能となった。さらに、ヒトＥＳ細胞の分化培養では、インシュリンを除いた培地では生存が悪いが、インシュリンを含む化学合成培地にＡｋｔ阻害剤を併用することで、視床下部神経組織を分化誘導することが可能となった。【００１１】
発明者らはさらに本発見に基づいて鋭意検討し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである：【００１２】
［１］  無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を形成させる工程を含む、幹細胞の分化誘導法。
［２］  さらに無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を浮遊培養する工程を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］  幹細胞が多能性幹細胞である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］  幹細胞が胚性幹細胞である、上記［３］に記載の方法。
［５］  浮遊培養を６０時間〜３５０時間行うことを特徴とする、上記［２］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］  さらにＮｏｄａｌシグナル阻害剤および／またはＷｎｔシグナル阻害剤の存在下で培養する工程を含む、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］  Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤が、Ｌｅｆｔｙ−１である、上記［６］に記載の方法。
［８］  Ｗｎｔシグナル阻害剤が、Ｄｋｋ１である、上記［６］に記載の方法。
［９］  さらにＮｏｔｃｈシグナル阻害剤の存在下で培養する工程を含む、上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］  Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤が、ＤＡＰＴである、上記［９］に記載の方法。
［１１］  さらに分泌型パターン形成因子の存在下で培養する工程を含む、上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］  神経系細胞への分化誘導法である、上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］  大脳前駆細胞への分化誘導法である、上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］  大脳皮質前駆細胞への分化誘導法である、上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］  大脳皮質神経細胞への分化誘導法である、上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］  層特異的ニューロンへの選択的な分化誘導法である、上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］  カハール・レチウス細胞への分化誘導法である、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］  尾側大脳皮質神経細胞の分化誘導法である、上記［１］〜［５］および［８］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］  Ｆｇｆシグナル阻害剤の存在下で培養することを特徴とする、上記［１８］に記載の方法。
［２０］  Ｆｇｆシグナル阻害剤が、Ｆｇｆ受容体阻害剤である、上記［１９］に記載の方法。
［２１］  吻側大脳皮質神経細胞への分化誘導法である、上記［１］〜［５］および［８］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］  吻側大脳皮質神経細胞が、嗅球ニューロンである、上記［２１］に記載の方法。
［２３］  Ｆｇｆシグナル促進剤の存在下で培養することを特徴とする、上記［２１］または［２２］に記載の方法。
［２４］  Ｆｇｆシグナル促進剤が、Ｆｇｆまたはそのアゴニストである、上記［２３］に記載の方法。
［２５］  海馬神経細胞への分化誘導法である、上記［１］〜［５］および［８］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］  Ｗｎｔの存在下またはＢＭＰの存在下、あるいはその両方で培養することを特徴とする、上記［２３］に記載の方法。
［２７］  大脳基底核神経細胞への分化誘導法である、上記［１］〜［５］および［８］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］  Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下で培養することを特徴とする、上記［２７］に記載の方法。
［２９］  Ｓｈｈシグナル促進剤が、Ｓｈｈである、上記［２８］に記載の方法。
［３０］  Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地において多能性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、及び培養物から視床下部ニューロンの前駆細胞を単離することを含む、視床下部ニューロンの前駆細胞の製造方法。
［３１］  無血清培地が、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地である、上記［２］記載の方法。
［３２］  無血清培地が亜セレン酸またはその塩を含有する、上記［３０］または［３１］記載の方法。
［３３］  無血清培地がＳｈｈシグナル促進剤を含有する、上記［３０］または［３１］記載の方法。
［３４］  無血清培地がＳｈｈシグナル促進剤を実質的に含有しない、上記［３０］または［３１］記載の方法。
［３５］  得られ得る前駆細胞が腹側視床下部ニューロンの前駆細胞である、上記［３３］記載の方法。
［３６］  得られ得る前駆細胞が、内腹側核ニューロン、Ａ１２型ドーパミンニューロン、弓状核ニューロン又はオレキシン陽性ニューロンへの分化能を有する、上記［３３］記載の方法。
［３７］  得られ得る前駆細胞が背側視床下部ニューロンの前駆細胞である、上記［３４］記載の方法。
［３８］  得られ得る前駆細胞がバゾプレシン産生内分泌細胞への分化能を有する、上記［３４］記載の方法。
［３９］  少なくとも７日間培養する、上記［３０］または［３１］記載の方法。
［４０］  ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡｋｔ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの阻害剤並びにインシュリン類を含有し、且つＮｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤及びレチノイン酸を実質的に含有しない無血清培地において多能性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、及び培養物から視床下部ニューロンの前駆細胞を単離することを含む、視床下部ニューロンの前駆細胞の製造方法。
［４１］  無血清培地が、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡｋｔ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの阻害剤並びにインシュリン類を含有し、且つＮｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤及びレチノイン酸を実質的に含有しない無血清培地である、上記［２］記載の方法。
［４２］
無血清培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を更に含有する、上記［４０］または［４１］記載の方法。
［４３］
多能性幹細胞が霊長類の多能性幹細胞である、上記［４０］または［４１］記載の方法。
［４４］  上記［１］〜［４３］のいずれか一項に記載の方法により得られる、細胞培養物。
［４５］  無血清培地中で均一な幹細胞の凝集塊を形成させる工程を含む、脳組織の立体構造を試験管内で産生する方法。
［４６］  脳組織が、大脳皮質組織である、上記［４５］に記載の方法。
［４７］  大脳皮質組織が層形成を伴うことを特徴とする、上記［４６］に記載の方法。
［４８］  無血清培地が細胞外マトリクス成分を含有することを特徴とする、上記［４５］に記載の方法。
［４９］  上記［４５］〜［４８］のいずれか一項に記載の方法により得られる、培養産物。
［５０］  無血清培地中で均一な幹細胞の凝集塊を形成させる工程を含む、大脳皮質神経ネットワークを試験管内で形成する方法。
［５１］  大脳皮質神経ネットワークが、同期した自発発火を伴うことを特徴とする、上記［５０］に記載の方法。
［５２］  上記［５０］または［５１］に記載の方法により得られる、培養産物。
［５３］  上記［４４］に記載の細胞培養物、上記［４９］に記載の培養産物または上記［５２］に記載の培養産物を用いることを特徴とする、被検物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、幹細胞を大脳皮質前駆細胞に効率的に分化誘導することができる。また本発明の方法は、従来の分化誘導法では困難であった神経系細胞、特に大脳皮質細胞の効率的な分化誘導をも可能とする。従って、本発明の方法は大脳組織に異常がある疾患に対する細胞治療の応用という観点から特に有用である。【００１４】
本発明の方法によれば、選択的に層特異的なニューロンを分化誘導することができる。また大脳皮質細胞のみならず、海馬神経細胞や、大脳基底核神経細胞などといった、その他の前脳神経細胞をも効率良く分化誘導することも可能である。【００１５】
また本発明の方法を用いれば、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から間脳、特に視床下部のニューロンやその前駆細胞を効率よく製造することが出来る。視床下部は中枢性尿崩症など内分泌異常、摂食障害（拒食症、過食症）、睡眠障害などの医学的に重要な疾患の責任部位であり、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞からそれらの組織を試験管内で産生できれば、再生医療のみならず、内分泌異常、摂食障害、睡眠障害などに対する創薬や安全性試験に役立つことが期待される。【００１６】
本発明の方法によれば、大脳皮質神経ネットワークを試験管内で形成することができるので、本発明の方法を適用することにより、シナプス機能促進剤やてんかんの治療薬などの創薬、毒性試験を有効に行うことができる点で有用である。【００１７】
さらに本発明は、層構造を有する大脳皮質組織の立体構造を試験管内で産生することも可能である。従って本発明の方法は、再生医療の分野や上述の医薬等の創薬、毒性試験などに有用な「組織材料」を提供することができる点でも極めて有用である。【００１８】
本発明はさらに、誘導源として動物由来細胞を使用することなく幹細胞を分化誘導でき、幹細胞の培養により得られる細胞の移植を同種移植のリスクレベルまで軽減できるため有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、上皮様構造を有する均一な神経細胞に分化することを示す図である。
【図２】図２は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、大脳皮質前駆細胞を経て大脳特異的なニューロンへ分化することを示す図である。
【図３−１】図３−１は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、大脳ニューロンによる神経ネットワークを形成することを示す図である。
【図３−２】図３−２は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、大脳ニューロンによる神経ネットワークを形成することを示す図である。
【図４】図４は、ＳＦＥＢｑ法により得られる大脳ニューロンが、生体大脳組織へ組み込まれることを示す図である。
【図５】図５は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、大脳皮質前駆細胞を経て大脳皮質層特異的なニューロンへ分化することを示す図である。
【図６】図６は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、大脳皮質前駆細胞を経て特定の層特異的な大脳皮質ニューロンへ分化することを示す図である。
【図７−１】図７−１は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、大脳皮質前駆細胞を経て部位特異的な大脳皮質ニューロンへ分化することを示す図である。
【図７−２】図７−２は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、大脳皮質前駆細胞を経て部位特異的な大脳皮質ニューロンへ分化することを示す図である。
【図８】図８は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、大脳皮質の初期形成を試験管内で自己組織化的に模倣できることを示す図である。
【図９】図９は、ＳＦＥＢｑ法により得られるヒトＥＳ細胞の凝集体が、大脳皮質ニューロンへ分化することを示す図である。
【図１０】図１０は、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が、大脳基底核神経細胞へ分化することを示す図である。
【図１１】図１１は、ＳＦＥＢｑ法により得られるヒトＥＳ細胞の凝集体が、前方または後方の大脳皮質ニューロンへ分化することを示す図である。
【図１２】図１２は、浮遊培養段階において細胞外マトリクス成分（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を培地に添加すると、ＳＦＥＢｑ法により得られるＥＳ細胞の凝集体が胎仔脳胞に類似した構造を形成し、その構造が培養開始１０日後までも保持されることを示す図である。
【図１３】ＳＦＥＢｑ培養したＲｘ−ＥＧＦＰ細胞における、示されたマーカー遺伝子の発現についてのｑＰＣＲ解析の結果を示す図である。
【図１４】ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ培養したＲｘ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞に対するインシュリン及びＩＧＦ−Ｉの影響の用量応答解析の結果を示す図である。分化培養の開始時から、示された濃度でインシュリン又はＩＧＦ−Ｉと共に細胞を培養し、Ｒｘ−ＧＦＰ＋細胞の割合を７日目にＦＡＣＳ解析した。コントロール（インシュリンを含まないｇｆＣＤＭ）のＲｘ−ＧＦＰ＋割合を１．０とし、相対的な比として示す。
【図１５】Ｒｘ−ＧＦＰ＋の割合に対するインシュリンの影響を示すｔｉｍｅ−ｗｉｎｄｏｗ解析の結果を示す図である（７日目にＦＡＣＳ）。インシュリン（７μｇ／ｍｌ）を、左側のバーに示したとおり、除去（上のグラフ）又は添加（下のグラフ）した。ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ培養物のＲｘ−ＧＦＰ＋の割合に対するインシュリンの存在下でのＲｘ−ＧＦＰ＋の割合の比（横列１；１．０とする）を、グラフの右側に示す。
【図１６】示されたマーカー遺伝子の発現に対するインシュリンの影響を示す図である。
【図１７】インシュリンシグナル伝達経路に関する阻害剤の、インシュリン（７μｇ／ｍｌ）有り又は無しのｇｆＣＤＭ中でＳＦＥＢｑ培養したＥＳ細胞に対する影響を示す図である。コントロール（ｇｆＣＤＭ＋インシュリン、ＤＭＳＯを含む）に対する統計的有意性はＤｕｎｎｅｔｔｅ検定によって評価した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図１８】視床下部ニューロンの前駆細胞からのバゾプレシン産生内分泌細胞の生成を示す図である。（左）ｇｆＣＤＭ培養したＧＦＰ＋凝集塊において見られたＮＰ  ＩＩ＋ニューロン。（右）高Ｋ＋刺激の際のＡＶＰ放出の解析。馴化培地中のＡＶＰ濃度をＲＩＡで測定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、無血清培地中で均一な幹細胞の凝集塊を形成させる工程を含む、幹細胞の分化培養法を提供する。本発明はまた、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸等の増殖因子並びにインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地において多能性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、及び培養物から視床下部ニューロンの前駆細胞を単離することを含む、視床下部ニューロンの前駆細胞の製造方法を提供する。
以下、本発明の詳細を説明する。【００２１】
（１）幹細胞
「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持することができる細胞のことをいう。幹細胞の例としては、受精卵あるいはクローン胚由来で多能性を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、生体内の組織中に存在する体性幹細胞や多能性幹細胞、各組織の基になる肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、生殖幹細胞由来の多能性幹細胞、体細胞由来で核初期化によって得られる多能性幹細胞などが挙げられる。【００２２】
なかでも「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいい、胚性幹細胞もこれに含まれる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞から得られる。また、体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た分化万能性を人工的に持たせた細胞（人工多能性幹細胞ともいう）も含む。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作成することが可能である。例えば、Ｃｅｌｌ  １３１（５）ｐｐ．８６１−８７２や、Ｃｅｌｌ  １２６（４）ｐｐ．６６３−６７６に記載の方法などが挙げられる。【００２３】
幹細胞としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
具体的に本発明の方法で用いられる幹細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞Ｉ」と省略）、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩ」と省略）、体細胞へ数種類の転写因子を導入することにより樹立した誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、および胚性幹細胞Ｉ、胚性幹細胞ＩＩ又はｉＰＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した多能性幹細胞（以下、「改変多能性幹細胞」と省略）が挙げられる。【００２４】
より具体的には、胚性幹細胞Ｉとしては、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立された胚性幹細胞、始原生殖細胞から樹立されたＥＧ細胞、着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、あるいはその細胞を培養することによって得られる細胞などが挙げられる。
胚性幹細胞Ｉは、着床以前の初期胚を、文献（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４））に記載された方法に従って培養することにより調製することができる。【００２５】
胚性幹細胞ＩＩは、例えば、Ｗｉｌｍｕｔら（Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，８１０（１９９７））、Ｃｉｂｅｌｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６（１９９８））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素，４４，８９２（１９９９））、Ｂａｇｕｉｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６（１９９９））、Ｗａｋａｙａｍａら（Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４（１９９９））、ＲｉｄｅｏｕｔＩＩＩら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９（２０００））等によって報告された方法を用いることにより、例えば以下のように作製することができる。【００２６】
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を開始した卵が得られる。【００２７】
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、核を提供する側の細胞を培養している培地を、５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、より好ましくは０．５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導することで初期化することができる。【００２８】
また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し、数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することができる。【００２９】
初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複数の方法が知られている。細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。【００３０】
同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。【００３１】
いったん発生を開始した卵が得られれば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。【００３２】
ｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（必要に応じて更にｃ−Ｍｙｃ又はｎ−Ｍｙｃ）を導入することにより製造することが出来る（Ｃｅｌｌ，１２６：ｐ．６６３−６７６，２００６；Ｎａｔｕｒｅ，４４８：ｐ．３１３−３１７，２００７；Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２６：ｐ．１０１−１０６，２００８；Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２，２００７）。【００３３】
改変多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変多能性幹細胞の作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法を用い、行うことができる。【００３４】
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した幹細胞を作製することができる。【００３５】
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。【００３６】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができ、また、選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。【００３７】
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。【００３８】
また、幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞の例としては、ＥＢ５細胞などが挙げられる。【００３９】
幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。【００４０】
（２）本発明の方法で分化誘導可能な神経系細胞
本発明の方法により、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞などの多能性幹細胞の分化細胞を得ることができる。本発明の方法により幹細胞から分化誘導される細胞は特に限定されず、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、外胚葉系細胞のいずれであってもよいが、好ましくは外胚葉系細胞、より好ましくは神経系細胞である。本発明の方法により得られた細胞がいずれの細胞であるかは、自体公知の方法、例えば細胞マーカーの発現により確認できる。【００４１】
神経系細胞マーカーとしては、例えば、ＮＣＡＭ、ＴｕＪ１、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）、セロトニン、ネスチン、ＭＡＰ２、ＭＡＰ２ａｂ、ＮｅｕＮ、ＧＡＢＡ、グルタメート、ＣｈＡＴ、Ｓｏｘ１、Ｂｆ１、Ｅｍｘ１、ＶＧｌｕＴ１、Ｐａｘ、Ｎｋｘ、Ｇｓｈ、Ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｎ、ＧｌｕＲ１、ＣａｍＫＩＩ、Ｃｔｉｐ２、Ｔｂｒ１、Ｒｅｅｌｉｎ、Ｔｂｒ１、Ｂｒｎ２などが挙げられるが、これらに限定されない。以下、本発明の方法により分化誘導可能な外胚葉系細胞の例として、神経系細胞について詳述する。【００４２】
本発明の方法により得られる神経系細胞としては、例えば、神経幹細胞、神経細胞、神経管の細胞、神経堤の細胞などが挙げられる。【００４３】
（２−１）神経幹細胞
神経幹細胞とは、神経細胞、アストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）およびオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化しうる能力を有し、かつ自己複製能力を有する細胞をいい、脳内において神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを供給する機能を有している。
神経幹細胞であることを確認する方法としては、実際に脳に移植してその分化能を確認する方法、インビトロで神経幹細胞を神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化誘導させて確認する方法などが挙げられる（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，８，３８９（１９９７）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，５３４（１９９９））。また、このような機能を有した神経幹細胞は、神経前駆細胞での発現が確認されているマーカーである細胞骨格蛋白質ネスチンを認識する抗ネスチン抗体で染色可能である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，６６（１９９７））。従って、抗ネスチン抗体で染色することにより神経幹細胞を確認することもできる。【００４４】
（２−２）神経細胞
神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）とは、他の神経細胞あるいは刺激受容細胞からの刺激を受け別の神経細胞、筋あるいは腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞をいう。神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類でき、例えば、分泌する神経伝達物質などの違いで分類されている。これらの神経伝達物質で分類される神経細胞としては、例えば、ドパミン分泌神経細胞、アセチルコリン分泌神経細胞、セロトニン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞、グルタミン酸分泌神経細胞などがあげられる。ドパミン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞を総称してカテコールアミン分泌神経細胞と呼ぶ。【００４５】
あるいは、本発明の方法により得られる神経細胞、特に大脳神経細胞は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる神経細胞は、高頻度、例えば約８０％以上、好ましくは約８０〜９０％の頻度で、Ｓｏｘ１陽性である。また、本発明の方法により得られる神経細胞は、後述する大脳神経細胞マーカーが陽性であることがより好ましい。【００４６】
別の観点では、神経細胞は、神経細胞が存在する部位の違いにより分類できる。これらの存在部位で分類される神経細胞としては、例えば、前脳神経細胞、中脳神経細胞、小脳神経細胞、後脳神経細胞、脊髄神経細胞などが挙げられる。本発明の方法はこれら任意の神経細胞を分化誘導できるが、なかでも、前脳神経細胞、好ましくは大脳神経細胞、より好ましくは大脳皮質神経細胞（大脳背側細胞）を効率的に分化誘導できる。また本発明の方法は、好ましくはカハール・レチウス細胞、海馬神経細胞をも効率的に分化誘導することができる。以下、前脳神経細胞について詳述する。【００４７】
（２−２−１）前脳神経細胞
本発明の方法によれば、神経細胞として前脳神経細胞、好ましくは大脳神経細胞をより効率的に分化誘導できる。前脳神経細胞とは、前脳組織（即ち、大脳及び間脳から構成される組織）に存在する神経細胞、あるいは前脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞（例、大脳前駆細胞）をいう。【００４８】
前脳神経細胞は、大脳（終脳）神経細胞、間脳神経細胞（例えば、視床細胞、視床下部細胞など）に分類できる。大脳神経細胞はさらに、背側細胞（例えば、大脳皮質細胞、カハール・レチウス細胞、海馬神経細胞など）、腹側細胞（例えば、大脳基底核細胞など）に分類できる。
本発明の方法により得られた細胞が前脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、前脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。前脳神経細胞マーカーとしては、Ｏｔｘ１（前脳）、Ｂｆ１（大脳）、Ｅｍｘ１（大脳背側）、Ｇｓｈ２及びＮｋｘ２．１（大脳腹側）などが挙げられる。【００４９】
本発明の一つの局面によれば、本発明の方法は、大脳神経細胞のなかでも、背側大脳神経細胞を効率的に分化誘導でき、また逆に、腹側大脳神経細胞への分化を抑制することができる。背側大脳神経細胞とは、背側大脳組織に存在する神経細胞、あるいは背側大脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞（例、大脳皮質前駆細胞）をいう。背側大脳組織としては、例えば、大脳皮質が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が背側大脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、背側大脳神経マーカーの発現により確認できる。背側大脳神経細胞マーカーとしては、例えば、大脳皮質神経細胞マーカー（例えば、Ｐａｘ６、Ｅｍｘ１、Ｔｂｒ１）が挙げられる。【００５０】
また本発明のもう一つの局面では、本発明の方法は、大脳神経細胞のなかでも、腹側大脳神経細胞を効率的に分化誘導でき、また逆に、背側大脳神経細胞への分化を抑制することができる。腹側大脳神経細胞とは、腹側大脳組織に存在する神経細胞、あるいは腹側大脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞（例、大脳基底核前駆細胞）をいう。腹側大脳組織としては、例えば、大脳基底核が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が腹側大脳神経細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、腹側大脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。腹側大脳神経細胞マーカーとしては、例えば、大脳基底核神経細胞マーカー（例えば、Ｇｓｈ２、Ｍａｓｈ１、Ｎｋｘ２．１、Ｎｏｚ１）が挙げられる。【００５１】
あるいは別の観点では、本発明の方法により得られる前脳神経細胞（特に、大脳神経細胞）は、細胞マーカーにより特徴付けることができる。本発明の方法により得られる前脳神経細胞は、高頻度、例えば約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上の頻度で、Ｂｆ１陽性（以下、「Ｂｆ１＋」と記載する）である。従来のＳＤＩＡ法では、約１％の頻度でしか、胚性幹細胞からＢｆ１＋細胞を分化誘導できなかったし、またＳＦＥＢ法であっても１０％程度でしか胚性幹細胞からＢｆ１＋細胞を分化誘導できなかったが、本発明の方法により、高頻度でＢｆ１＋細胞を得ることが可能となった。【００５２】
本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約２０％以上、好ましくは約２０〜８０％、より好ましくは約２０〜５０％の細胞が、Ｇｓｈ陽性であり得る。また、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約５％以上、好ましくは約５〜５０％、より好ましくは約５〜２０％の細胞が、Ｎｋｘ２．１陽性であり得る。さらに、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約１０％以上、好ましくは約１０〜９０％、より好ましくは約１０〜５０％の細胞が、Ｐａｘ陽性であり得る。
また、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上の細胞が、Ｅｍｘ１陽性であり得る。さらに、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、例えば約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上の細胞が、ＶＧｌｕＴ１陽性であり得る。また、本発明の方法により得られるＢｆ１＋細胞のうち、いくつかの細胞において、Ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｎ、ＧｌｕＲ１、ＣａｍＫＩＩ、Ｃｔｉｐ２、Ｔｂｒ１の発現も観察されうる。【００５３】
（３）無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を形成させる工程
本発明は、無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を形成させる工程を含む、幹細胞の分化誘導法を提供する。【００５４】
「均一な幹細胞の凝集体を形成させる」とは、幹細胞を集合させて幹細胞の凝集体を形成させて培養させる（凝集体培養）際に、「一定の数の分散した幹細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な幹細胞の凝集体を形成することをいう。さらに、特に「細胞を迅速に凝集」させることによって、幹細胞から派生する細胞の上皮化を促進させることをいう。すなわち本明細書中、「細胞を迅速に凝集」させるとは、幹細胞を均一に凝集させることによって産生される細胞の上皮様構造を再現性よく形成させることをいう。【００５５】
均一な幹細胞の凝集体の形成は、「細胞を迅速に凝集」させることで均一な幹細胞の凝集体が形成され、幹細胞から産生される細胞の上皮様構造を再現性よく形成することができる限りどのような方法を採用してもよく、このような方法としては、例えば、ウェルの小さなプレート（９６穴プレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法などが挙げられる。【００５６】
凝集体の形成時に用いられる培養器は、「細胞を迅速に凝集」させることで均一な幹細胞の凝集体形成が可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。そしてこれらの培養器は、均一な凝集体を形成させる観点から、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものを使用できる。【００５７】
凝集体の形成時に用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。【００５８】
凝集体の形成時に用いられる無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明においては、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避するという観点からは、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、１−２０％）添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はｄＭＥＭ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム）を使用できる。【００５９】
また無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。【００６０】
また、浮遊培養で用いる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。【００６１】
凝集体形成時の幹細胞の濃度は、幹細胞の凝集塊をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができる。凝集体形成時の幹細胞の濃度は、幹細胞の均一な凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いる場合、１ウェルあたり約１×１０３〜約５×１０３細胞、好ましくは約２×１０３〜約４×１０３細胞となるように調製した液を添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。【００６２】
また凝集体形成時の培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。【００６３】
凝集体形成までの時間は、細胞を迅速に凝集させることができる限り、用いる幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するために出来る限り早く行われることが望ましい。従来、このような凝集体形成は２日間ほどの時間をかけて行なわれるが（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，２８８−２９６、Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ，Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  Ｎ．  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００３；３６５：４４６−４６１を参照のこと）、本発明ではこの時間を短くすることにより、目的の神経細胞等の効率よい分化誘導をもたらすことが可能となった。例えばマウス胚性幹細胞の場合、好ましくは１２時間以内、より好ましくは６時間以内に凝集体を形成させることが望ましい。一方ヒト胚性幹細胞の場合は、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内に凝集体を形成させることが望ましい。この時間を超えると、均一な幹細胞の凝集体が形成できず、後の分化効率が著しく低下する原因となり得る。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することで当業者であれば適宜調節することが可能である。【００６４】
幹細胞の凝集体が「均一に」形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集塊のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき、当業者であれば判断することが可能である。【００６５】
均一な幹細胞の凝集体の形成として具体的には、例えば胚性幹細胞の維持培養後、分散処理した胚性幹細胞を適切な培地（例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地に１０％のＫＳＲ、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸溶液、２ｍＭ  グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸および０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを添加した培地。必要に応じて後述する因子などを適量含んでいてもよい。）に懸濁し、細胞非接着性のＵ底９６穴培養プレートに、１ウェルあたり３×１０３細胞になるように１５０μＬの上記培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させる方法が挙げられる。【００６６】
（４）無血清培地中で均一な幹細胞の凝集体を浮遊培養する工程
本工程は、（３）で形成した均一な幹細胞の凝集体を浮遊培養することで、幹細胞を分化誘導する工程である。
均一な幹細胞の凝集体を「浮遊培養する」または「浮遊凝集体（凝集塊ともいう）として培養する」とは、上記（３）で得られた集合し均一な凝集体を形成した幹細胞群を、培養培地中において、細胞培養器に対して非接着性の条件下で培養することをいう（本明細書中、上記（３）の工程と（４）の工程とをあわせて、「ＳＦＥＢｑ法」と記載する場合がある）。幹細胞を浮遊培養する場合、浮遊凝集体の形成をより容易にするため、並びに／あるいは、効率的な分化誘導（例えば、神経系細胞等の外胚葉系細胞への分化誘導）のために、フィーダー細胞の非存在下で培養を行うのが好ましい。【００６７】
上記（３）で得られた凝集体の浮遊培養で用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。また特に断りの無い限り、（３）記載の工程で用いた培地をそのまま浮遊培養に用いても構わない。【００６８】
上記凝集体を浮遊培養する場合、培地としては無血清培地が用いられる。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。【００６９】
浮遊培養で用いられる無血清培地は、例えば、血清代替物を含有するものであり得る。血清代替物は、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。【００７０】
また、本発明の方法で用いられる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。例えば、２−メルカプトエタノールは、胚性幹細胞の培養に適する濃度で使用される限り特に限定されないが、例えば約０．０５〜１．０ｍＭ、好ましくは約０．１〜０．５ｍＭ、より好ましくは約０．２ｍＭの濃度で使用できる。【００７１】
浮遊培養に用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避するという観点からは、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、１−２０％）添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はｄＭＥＭ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム）を使用できる。【００７２】
浮遊培養で用いられる培養器は、細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。【００７３】
凝集体を浮遊培養する場合、培養器は細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものを使用できる。【００７４】
凝集体の浮遊培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。また本工程の時間は特に限定されないが、通常４８時間以上である。【００７５】
浮遊培養後、凝集体をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、細胞を接着条件下でさらに培養することもできる（以下、必要に応じて「接着培養」と記載する）。なお接着培養する場合、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリクス等（例えば、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。また、接着培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は、当業者であれば容易に決定できる。【００７６】
浮遊培養及び接着培養では、既知の分化誘導物質を併用できる。例えば、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する場合には、既知の神経系細胞への分化誘導物質を併用できる。このような分化誘導物質としては、例えば、ＮＧＦ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９，５５２（１９９４））、レチノイン酸（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６８，３４２（１９９５）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，１０５６（１９９６））、ＢＭＰ阻害因子（Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３３３−３３６（１９９５））、ＩＧＦ（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５，３０２３−８（２００３））などが挙げられる。【００７７】
上述した浮遊培養法、及び浮遊培養と接着培養との組合せ法によれば、培養期間等を適宜設定することで、胚性幹細胞から外胚葉系細胞等の分化細胞を得ることができる。しかしながら、後述する方法論を適宜さらに組合せることで、神経系細胞をより効率的に分化誘導することができる。【００７８】
（５）神経系細胞の分化誘導
神経系細胞として前脳神経細胞の分化誘導を例に挙げ、より好適な、（３）で得られる幹細胞の均一な凝集体（以下、「本発明の凝集体」と記載する場合がある）の浮遊培養を行うために組合せるべき本発明の方法論を以下に詳述する。すなわち本発明のＳＦＥＢｑ法において、以下の方法論を組み合わせることで、選択的に前脳神経細胞を得ることが可能となる。【００７９】
（５−１）前脳神経細胞の分化誘導
前脳神経細胞は、上述した本発明の浮遊培養により、又は必要に応じて上述した浮遊培養と接着培養との組合せにより、幹細胞から分化誘導することができる。好ましくは、前脳神経細胞の分化効率の向上・安定化等の観点から、以下に述べる方法論を併用できる。【００８０】
（５−１−１）パターン形成因子
本発明の凝集体の浮遊培養は、パターン形成因子の存在下で行うことができる。パターン形成因子とは、幹細胞または前駆細胞に働いて多様な分化の方向性を制御する物質であり、このようなパターン形成因子としては、分泌型パターン形成因子が挙げられる。分泌型パターン形成因子としては、分化制御に関わる細胞内シグナルを活性化あるいは抑制する活性物質である限り特に限定されないが、例えば、ＦＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔ、Ｎｏｄａｌ、Ｎｏｔｃｈ、Ｓｈｈなどが挙げられる。
分泌型パターン形成因子を適用した前脳神経細胞への分化誘導については、例えば、以下の方法論を適用できる。【００８１】
（Ａ）Ｎｏｄａｌシグナルの阻害およびＷｎｔシグナルの阻害
一つの方法論は、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤および／またはＷｎｔシグナル阻害剤の存在下における、本発明の凝集体の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に大脳神経細胞）への分化効率を向上・安定化させる場合に有用である。また、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤の併用により、さらに著しい効果が期待できる。【００８２】
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、Ｎｏｄａｌにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、Ｌｅｆｔｙ−Ｂ、Ｌｅｆｔｙ−１、Ｌｅｆｔｙ−２、可溶型Ｎｏｄａｌ受容体、Ｎｏｄａｌ抗体、Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤が挙げられるが、なかでも、Ｌｅｆｔｙ−ＡまたはＬｅｆｔｙ−１が好ましい。【００８３】
本発明の凝集体の浮遊培養に用いられるＮｏｄａｌシグナル阻害剤の濃度は、本発明の凝集体の神経分化促進、あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＬｅｆｔｙについては約０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１．０〜１０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５μｇ／ｍｌであり得る。【００８４】
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後（例えば、培養１０日以内の時期）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、培養５日以内の時期に培地に添加される。【００８５】
Ｗｎｔシグナル阻害剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル阻害剤としては、例えば、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ蛋白、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔ蛋白が挙げられるが、なかでも、Ｄｋｋ１又はＣｅｒｂｅｒｕｓ蛋白が好ましい。【００８６】
本発明の凝集体の浮遊培養に用いられるＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、本発明の凝集体の神経分化促進、あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＤｋｋ１については約０．０５〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５〜５．０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１μｇ／ｍｌであり得る。【００８７】
Ｗｎｔシグナル阻害剤は、幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後（例えば、培養１０日以内の時期）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル阻害剤は、培養５日以内の時期に培地に添加される。なお、本発明の凝集体の浮遊培養は、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、これら培養条件を切り替えることも可能である。【００８８】
また別の方法論は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地、あるいはＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤が実質的に不活化された無血清培地における、本発明の凝集体の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に大脳神経細胞）への分化を促進する場合に有用である。【００８９】
Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地とは、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を全く含有しない無血清培地、あるいは本発明の凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養（例えば、分化誘導を目的とする培養）に不利な影響を与えない程度の量のＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を含有する無血清培地をいう。【００９０】
Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地は、例えば、培地成分としてのＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の未添加、またはＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤含有培地からのＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の除去処理により調製できる。【００９１】
また、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤が実質的に不活化された無血清培地とは、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤含有無血清培地に対するＮｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の添加により、本発明の凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養に不利な影響を与えない程度にまでＮｏｄａｌシグナル促進剤及び／又はＷｎｔシグナル促進剤の活性が喪失した無血清培地をいう。【００９２】
Ｎｏｄａｌシグナル促進剤は、Ｎｏｄａｌにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｄａｌシグナル促進剤としては、例えば、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦβファミリーに属する蛋白（例えば、アクチビン）、Ｓｍａｄ蛋白、活性型Ｎｏｄａｌ受容体が挙げられる。【００９３】
Ｗｎｔシグナル促進剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル促進剤としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属する蛋白（例えば、Ｗｎｔ１〜１６）、ＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔ受容体、Ｌｉ＋イオンが挙げられる。【００９４】
（Ｂ）Ｎｏｔｃｈシグナルの阻害
一つの方法論は、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤の存在下における、本発明の凝集体の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に大脳神経細胞）への分化効率を向上・安定化させる場合に有用である。【００９５】
Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤は、Ｎｏｔｃｈにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤としては、例えば、ＤＡＰＴ、ＤＢＺ、ＭＤＬ２８１７０などが挙げられるが、なかでも、ＤＡＰＴが好ましい。【００９６】
本発明の凝集体の浮遊培養に用いられるＮｏｔｃｈシグナル阻害剤の濃度は、本発明の凝集体の神経分化促進、あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＤＡＰＴの場合は、約０．１〜１０００μＭ、好ましくは約０．５〜５００μＭ、より好ましくは約１〜１００μＭ、最も好ましくは約１０μＭであり得る。【００９７】
Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤は、幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後（例えば、培養１０日以内の時期）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤は、培養５日以内の時期に培地に添加される。一方で、後述するように、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を特定の任意の時期に培地に添加することによって、特定の層特異的ニューロンを選択的に分化誘導することも可能である。【００９８】
また別の方法論は、Ｎｏｔｃｈシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地、あるいはＮｏｔｃｈシグナル促進剤が実質的に不活化された無血清培地における、本発明の凝集体の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に大脳神経細胞）への分化を促進する場合に有用である。【００９９】
Ｎｏｔｃｈシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地とは、Ｎｏｔｃｈシグナル促進剤を全く含有しない無血清培地、あるいは本発明の凝集体の形成、及び／又は当該凝集体の培養（例えば、分化誘導を目的とする培養）に不利な影響を与えない程度の量のＮｏｔｃｈシグナル促進剤を含有する無血清培地をいう。Ｎｏｔｃｈシグナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地は、例えば、培地成分としてのＮｏｔｃｈシグナル促進剤の未添加、またはＮｏｔｃｈシグナル促進剤含有培地からのＮｏｔｃｈシグナル促進剤の除去処理により調製できる。【０１００】
（Ｃ）Ｆｇｆシグナルの促進または阻害
さらに別の方法論は、Ｆｇｆシグナル促進剤の存在下における、本発明の凝集体の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、腹側大脳神経細胞や腹側大脳皮質神経細胞への分化を促進する場合、背側大脳神経細胞や背側大脳皮質神経細胞への分化を抑制する場合に有用である。またかかる方法論は、吻側大脳神経細胞や吻側大脳皮質神経細胞への分化を促進する場合、尾側大脳神経細胞や尾側大脳皮質神経細胞への分化を抑制する場合にも有用である。【０１０１】
Ｆｇｆシグナル促進剤は、Ｆｇｆにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｆｇｆシグナル促進剤としては、好ましくは、ＦＧＦ（例、Ｆｇｆ８、Ｆｇｆ２など）、Ｆｇｆアゴニスト、Ｆｇｆ受容体アゴニストペプチドが挙げられる。Ｆｇｆアゴニストとしては、自体公知のＦｇｆアゴニストであれば特に限定されない。またＦｇｆ受容体アゴニストペプチドとしては、自体公知のＦｇｆ受容体アゴニストペプチドであれば特に限定されない。【０１０２】
本発明の凝集体の浮遊培養に用いられるＦｇｆシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＦｆｇ８の場合、約０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜５００ｎｇ／ｎｌ、より好ましくは約１〜１００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１０〜１００ｎｇ／ｍｌであり得る。【０１０３】
Ｆｇｆシグナル促進剤は、本発明の凝集体の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、浮遊培養２日後以降、好ましくは浮遊培養４日後以降などに培地に添加してもよい。なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｆｇｆシグナル促進剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。【０１０４】
また別の方法論は、Ｆｇｆシグナル阻害剤の存在下における、本発明の凝集体の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、背側大脳神経細胞や背側大脳皮質神経細胞への分化を促進する場合、腹側大脳神経細胞や腹側大脳皮質神経細胞への分化を抑制する場合に有用である。またかかる方法論は、尾側大脳神経細胞や尾側大脳皮質神経細胞への分化を促進する場合、吻側大脳神経細胞や吻側大脳皮質神経細胞への分化を抑制する場合にも有用である。【０１０５】
Ｆｇｆシグナル阻害剤は、Ｆｇｆにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｆｇｆシグナル阻害剤としては、例えば、Ｆｇｆシグナル促進剤に対する抗体、Ｆｇｆシグナル促進剤のドミナントネガティブ変異体、可溶型Ｆｇｆ受容体、Ｆｇｆ受容体阻害剤が挙げられるが、なかでも、Ｆｇｆ抗体、Ｆｇｆドミナントネガティブ変異体、Ｆｇｆ受容体阻害剤が好ましい。【０１０６】
浮遊培養に用いられるＦｇｆシグナル阻害剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えば可溶型Ｆｇｆ受容体の場合、約１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであり得る。【０１０７】
Ｆｇｆシグナル阻害剤は、本発明の凝集体の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、浮遊培養２日後以降、好ましくは浮遊培養４日後以降などに培地に添加してもよい。なお、本発明の凝集体の浮遊培養は、Ｆｇｆシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。【０１０８】
（Ｄ）ＢＭＰシグナルの促進およびＷｎｔシグナルの促進
一つの方法論は、ＢＭＰシグナル促進剤またはＷｎｔシグナル促進剤、あるいはその両方の存在下における、本発明の凝集体の浮遊培養である。かかる方法論は、例えば、前脳神経細胞（特に大脳神経細胞）、好ましくは背側大脳神経細胞や尾側大脳神経細胞、より好ましくは海馬神経細胞への分化を促進する場合に有用である。また、吻側大脳神経細胞への分化を抑制する場合に有用である。腹側大脳神経細胞は必ずしも抑制しない。【０１０９】
ＢＭＰシグナル促進剤は、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。ＢＭＰシグナル促進剤としては、例えば、ＢＭＰファミリーに属する蛋白（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＧＤＦ）、ＢＭＰ受容体、Ｓｍａｄ蛋白が挙げられる。好ましくはＢＭＰ４である。【０１１０】
浮遊培養に用いられるＢＭＰシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＢＭＰ４の場合、約０．０５〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．２〜２ｎｇ／ｍｌであり得る。【０１１１】
ＢＭＰシグナル促進剤は、本発明の凝集体の培養開始時に既に培地に添加されていてもよく、また浮遊培養２日後以降、好ましくは浮遊培養４日後以降に培地に添加してもよい。なお、本発明の凝集体の浮遊培養は、ＢＭＰシグナル促進剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。【０１１２】
Ｗｎｔシグナル促進剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル促進剤としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属する蛋白（例えば、Ｗｎｔ３ａ）、ＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔ受容体、Ｌｉ＋イオンなどが挙げられるが、なかでもＷｎｔ３ａが好ましい。
本発明の凝集体の浮遊培養後に用いられるＷｎｔシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度である限り限定されないが、例えば、Ｗｎｔ３ａについては約０．１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５．０〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
Ｗｎｔシグナル促進剤は、本発明の凝集体の培養開始時に既に培地に添加されてもよく、接着培養直後から数日後（例えば、浮遊培養開始４日以降、または浮遊培養１０日以内の期間）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル促進剤は、浮遊培養５日以内の時期に培地に添加される。【０１１３】
（Ｅ）Ｓｈｈシグナルの促進
さらに別の方法論は、Ｓｈｈシグナル促進剤の存在下における本発明の凝集体の浮遊培養である。かかる方法論は大脳神経細胞、好ましくは大脳基底核神経細胞への分化を促進する場合に有用であるところ、大脳基底核腹側部神経細胞への分化を促進する場合にも有用であるし、また大脳基底核背側部神経細胞への分化を促進する場合にも有用である。
詳細には後述するように、培地に添加するＳｈｈシグナル促進剤の濃度を変えることで、幹細胞を選択的に背側部、腹側部の大脳基底核神経細胞へとそれぞれ分化誘導することができる。【０１１４】
Ｓｈｈシグナル促進剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル促進剤としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニストが挙げられるが、なかでも、Ｓｈｈが好ましい。【０１１５】
浮遊培養に用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＳｈｈの場合、約１．０〜１０００ｎＭ、好ましくは約１．０〜５００ｎＭ、より好ましくは約２〜５００ｎＭ、最も好ましくは約３〜３００ｎＭであり得る。
ここでＳＦＥＢｑ法を適用した培養において、大脳基底核背側部神経細胞へと分化誘導させる場合は、例えば約０．５〜２０ｎＭ、好ましくは約２〜１０ｎＭのＳｈｈシグナル促進剤の濃度で培養することが望ましい。一方、ＳＦＥＢｑ法を適用した培養において、大脳基底核腹側部神経細胞へと分化誘導させる場合は、例えば約１０〜３００ｎＭ、好ましくは約２０〜１００ｎＭのＳｈｈシグナル促進剤の濃度で培養することが望ましい。【０１１６】
Ｓｈｈシグナル促進剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、例えば浮遊培養２日後以降、好ましくは浮遊培養４日後以降に培地に添加できる。なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｓｈｈシグナル促進剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。【０１１７】
また別の方法論は、Ｓｈｈシグナル阻害剤の存在下における、胚性幹細胞の浮遊培養である。Ｓｈｈシグナル促進剤の添加により、胚性幹細胞の腹側前脳神経細胞への分化が促進されること、胚性幹細胞の背側前脳神経細胞への分化が抑制されること等が予想される。従って、Ｓｈｈシグナル阻害剤を用いれば、腹側前脳神経細胞分化の抑制、背側前脳神経細胞分化の促進等の効果が期待できると考えられる。
Ｓｈｈシグナル阻害剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル阻害剤としては、例えば、Ｓｈｈシグナル促進剤に対する抗体、Ｓｈｈシグナル促進剤のドミナントネガティブ変異体、可溶型Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アンタゴニストが挙げられるが、なかでも、Ｓｈｈ抗体、Ｓｈｈドミナントネガティブ変異体が好ましい。
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｓｈｈシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。【０１１８】
（５−１−２）接着培養
また別の方法論は、ＳＦＥＢｑ法の後に接着培養を行うことである。凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）後に、細胞を接着培養に供することができる。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリクス等（例えば、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養は、例えば１日以上、好ましくは１〜１４日、より好ましくは２〜５日行うことができる。
本発明のＳＦＥＢｑ法で得られた幹細胞の均一な凝集体は、上記コーティング処理された培養器上においても、浮遊培養した場合と同様に、良好に分化誘導される。【０１１９】
（５−１−３）まとめ
上述した各種方法論は、前脳神経細胞、あるいは特定の前脳神経細胞（例えば、大脳神経細胞、腹側大脳神経細胞、背側大脳神経細胞、吻側大脳神経細胞、尾側大脳神経細胞、大脳基底核背側神経細胞、大脳基底核腹側神経細胞など）を効率的に得るために適宜組合せることができる。
また同一の効果を奏する方法論を組合せることで、より優れた効果が期待できる。【０１２０】
（６）大脳皮質層特異的ニューロンへの選択的分化誘導
上述したとおり、大脳皮質神経細胞は、上述した本発明の凝集体の浮遊培養（ＳＦＥＢｑ法）により幹細胞から分化誘導することができるところ、大脳皮質層特異的ニューロンを選択的に分化誘導する観点から、以下に述べる方法論を併用することが好ましい。ここで、「大脳皮質」とは大脳の表面に広がる神経細胞の灰白質の層であり、神経細胞が規則正しい６層構造をなして整然と並んでいる。本明細書における「大脳皮質層特異的ニューロン」とは、６つの層をそれぞれ構成する特異的な大脳皮質神経細胞のことをいう。【０１２１】
（６−１）浮遊培養の時間的制御 
一つの方法論は、本発明の凝集体の浮遊培養を６０時間〜３５０時間行うことを特徴とする方法である。かかる方法論によれば、例えば一般的な神経分化を経て、幹細胞を大脳皮質の層構造特異的な細胞に分化させることができる。【０１２２】
すなわち本発明のＳＦＥＢｑ法によれば、大脳前駆細胞への分化誘導を経て、上記時間範囲内において、発生過程での大脳皮質層特異的ニューロンの発生順（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，９，７４３−７５１（２００６）参照）と一致した順番で各層特異的ニューロンが誘導される。
具体的には、まず大脳第１層特異的なＲｅｅｌｉｎ陽性細胞（カハール・レチウス細胞）が誘導され、次いで第６層特異的なＴｂｒ１陽性細胞が誘導される。さらに、第５層特異的なＣｒｉｐ２陽性細胞が誘導され、次いで第２−３層特異的なＢｒｎ２陽性細胞が誘導される。【０１２３】
（６−２）Ｎｏｔｃｈシグナルによる制御
また別の方法論は、本発明のＳＦＥＢｑ法において、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を任意の時期に培地に添加することによって、特定の層特異的ニューロンを選択的に分化誘導することである。かかる方法論によれば、幹細胞を、大脳皮質の層構造特異的な細胞に分化させることができる。【０１２４】
Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤の種類、浮遊培養中の濃度については、前記（５−１−１）の（Ｂ）で記載したとおりである。【０１２５】
Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤は、適切な時期に培地に添加することにより、大脳皮質層特異的ニューロンを分化誘導することができる。例えばマウスＥＳ細胞にＳＦＥＢｑ法を適用した場合、９日間（約２１６時間）の培養後にＤＡＰＴ処理を行った細胞は、大脳第１層特異的なＲｅｅｌｉｎ陽性細胞（カハール・レチウス細胞）に誘導される。一方で１２日間（約２８８時間）の培養後にＤＡＰＴ処理を行った細胞は、第５層特異的なＣｒｉｐ２陽性細胞に誘導される。【０１２６】
（７）視床下部ニューロンへの選択的分化誘導
また本発明は、間脳、特に視床下部ニューロンの前駆細胞、またはそこからさらに分化成熟した視床下部ニューロンを幹細胞から分化誘導する方法を提供する。この場合、上記ＳＦＥＢｑ法に適用する無血清培地が、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸等の増殖因子並びにインシュリン類を実質的に含有しないことが望ましい。これらの増殖因子並びにインシュリン類を実質的に含有しないことを条件に、任意の動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。
浮遊培養で用いる無血清培地は、視床下部ニューロンの前駆細胞への選択的分化を促進するため亜セレン酸またはその塩を含むことが好ましい。亜セレン酸の塩としては、亜セレン酸ナトリウムが好ましい。亜セレン酸またはその塩の濃度は、通常約１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０〜５０μｇ／ｍｌである。【０１２７】
亜セレン酸またはその塩は、多能性幹細胞の培養開始時に培地に添加しておいてもよいが、例えば浮遊培養開始２日後以降に培地に添加できる。【０１２８】
浮遊培養で用いる無血清培地は、視床下部ニューロンの前駆細胞への選択的分化を促進するためＳｈｈシグナル促進剤を含んでいてもよい。Ｓｈｈシグナル促進剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル促進剤としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｓｈｈ、Ｓｈｈ−Ｎ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト（例、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（２−（１−Ｎａｐｈｔｈｏｘｙ）−６−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏａｎｉｌｉｎｏ）−９−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｐｕｒｉｎｅ））が挙げられるが、なかでも、Ｓｈｈ、Ｓｈｈ−Ｎ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅが好ましい。【０１２９】
浮遊培養に用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、視床下部ニューロンの前駆細胞への選択的分化を達成可能であるような濃度であり得る。このような濃度は、例えばＳｈｈ−Ｎの場合、約０．５〜５００ｎＭ、好ましくは約３〜３００ｎＭであり、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅの場合、約０．０２〜２０ｎＭ、好ましくは約０．１〜５ｎＭであり得る。【０１３０】
Ｓｈｈシグナル促進剤は、多能性幹細胞の培養開始時に培地に添加しておいてもよいが、例えば浮遊培養開始２日後以降、好ましくは浮遊培養開始４日後以降に培地に添加できる。【０１３１】
浮遊培養に用いる培地（本明細書中で「分化培地」と呼ぶ）は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸等の増殖因子並びにインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地である。【０１３２】
「増殖因子及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地」とは、増殖因子及びインシュリン類を全く含有しない無血清培地、あるいは視床下部ニューロンの前駆細胞への選択的分化に不利な影響を与えない程度の量の増殖因子及び／又はインシュリン類を含有する無血清培地をいう。このような無血清培地は、例えば、培地成分としての増殖因子及びインシュリン類の未添加、またはＮｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸及びインシュリン類を含有する培地からのこれらの因子の除去処理により調製できる。【０１３３】
或いは、増殖因子及びインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地は、増殖因子及びインシュリン類が実質的に不活化された無血清培地であり得、この培地は、増殖因子及びインシュリン類含有無血清培地に対する増殖因子シグナル阻害剤及び／又はインシュリンシグナル阻害剤の添加により、視床下部ニューロンの前駆細胞の選択的分化に不利な影響を与えない程度にまで増殖因子及びインシュリン類の活性が喪失した無血清培地をいう。【０１３４】
本明細書中で「増殖因子を実質的に含有しない培地」という場合の「増殖因子」とは、無血清培地での細胞培養において、血清代替物として一般に添加される因子であって、ＥＳ細胞からの視床下部ニューロンの前駆細胞の選択的分化を阻害／抑制する作用を有する任意の因子を意味する。具体的には、この「増殖因子」としては、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸等を挙げることができる。好ましくは、「増殖因子を実質的に含有しない培地」は、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤及びレチノイン酸からなる群より選択される少なくとも１つの増殖因子を実質的に含有しない培地であり、最も好ましくは、これら全ての因子を実質的に含有しない培地である。また、ｌｉｐｉｄ−ｒｉｃｈアルブミンも「増殖因子」に含まれ、本発明において使用される培地は好ましくはｌｉｐｉｄ−ｒｉｃｈアルブミンを含有しない培地である。【０１３５】
Ｎｏｄａｌシグナル促進剤としては、例えば、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦβファミリーに属するタンパク質（例えば、アクチビン）、Ｓｍａｄタンパク質、活性型Ｎｏｄａｌ受容体が挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＮｏｄａｌシグナル促進剤は、Ｎｏｄａｌである。【０１３６】
Ｗｎｔシグナル促進剤としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｗｎｔ１〜１６）、ＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔ受容体、Ｌｉ＋イオンが挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＷｎｔシグナル促進剤は、Ｗｎｔ３ａである。【０１３７】
ＦＧＦシグナル促進剤としては、例えば、ＦＧＦファミリーに属するタンパク質（例えば、ＦＧＦ１〜２３）が挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＦＧＦシグナル促進剤は、ＦＧＦ８ｂである。【０１３８】
ＢＭＰシグナル促進剤としては、例えば、ＢＭＰファミリーに属するタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＧＤＦ）、ＢＭＰ受容体、Ｓｍａｄタンパク質が挙げられる。好ましくは、無血清培地への混入が所望されないＢＭＰシグナル促進剤は、ＢＭＰ７である。【０１３９】
本明細書中で使用する場合、「インシュリン類」とは、インシュリンシグナルを促進する化合物を意味する。インシュリンシグナル促進剤とは、インシュリン類によるシグナルの伝達に対して促進的に作用するものである限り特に限定されず、インシュリンシグナル伝達経路のどの段階で作用するものであってもよい（インシュリンの上流または下流に対して作用する因子、インシュリンのアゴニスト、類似物質など）。【０１４０】
インシュリン類には、インシュリン及びインシュリンの類似物質（アナログ）が含まれる。インシュリンの類似物質とは、インシュリン様の作用（本明細書中では、多能性幹細胞からの、間脳、特に視床下部、具体的には吻側視床下部の神経細胞（ニューロン）、またはそれらの前駆細胞の選択的分化を阻害／抑制する作用をいう）を有する任意の物質をいい、例えば、ＩＧＦ−Ｉ等が挙げられる。【０１４１】
上記無血清培地を得るための増殖因子及びインシュリン類含有培地からの増殖因子及びインシュリン類の除去処理には、例えば、上記増殖因子（例えば、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸、ｌｉｐｉｄ−ｒｉｃｈアルブミンなど）及びインシュリン類に対する抗体を用いることができる。また、増殖因子及びインシュリン類の不活化は、増殖因子シグナル阻害剤及びインシュリンシグナル阻害剤の添加によって実施され得る。このような阻害剤は、増殖因子又はインシュリンによるシグナル伝達経路の上流又は下流を阻害する任意の物質であり得、例えば、増殖因子／インシュリンに対する抗体、増殖因子／インシュリンの可溶型受容体、増殖因子／インシュリン受容体に対する抗体、増殖因子／インシュリンのアンタゴニストなどが挙げられる。これらの物質は、所望の効果（視床下部ニューロンの前駆細胞への選択的分化）を得るのに適した量で培地に添加される。【０１４２】
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、Ｎｏｄａｌにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤としては、例えば、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ）、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、Ｌｅｆｔｙ−Ｂ、Ｌｅｆｔｙ−１、Ｌｅｆｔｙ−２、可溶型Ｎｏｄａｌ受容体、Ｎｏｄａｌ抗体、Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤が挙げられるが、なかでも、ＳＢ４３１５４２（４−（５−ｂｅｎｚｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ−４−ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）が好ましい。【０１４３】
Ｗｎｔシグナル阻害剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル阻害剤としては、例えば、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔタンパク質が挙げられるが、なかでも、Ｄｋｋ１が好ましい。【０１４４】
ＦＧＦシグナル阻害剤は、ＦＧＦにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル阻害剤としては、例えば、抗ＦＧＦ抗体、可溶型ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体阻害剤（例えば、Ｓｕ５４０２）が挙げられる。【０１４５】
ＢＭＰシグナル阻害剤は、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。ＢＭＰシグナル阻害剤としては、例えば、ＢＭＰＲＦｃ（Ｒ＆Ｄ）、抗ＢＭＰ抗体、可溶型ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体阻害剤が挙げられるが、なかでもＢＭＰＲＦｃが好ましい。【０１４６】
レチノイン酸（ＲＡ）阻害剤は、ＲＡにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。ＲＡ阻害剤としては、例えば、抗ＲＡ抗体、可溶型ＲＡ受容体、ＲＡ受容体阻害剤が挙げられる。【０１４７】
浮遊培養に用いられる上記各シグナル阻害剤の濃度は、視床下部ニューロンの前駆細胞への選択的分化を達成可能であるような濃度であり得る。例えば、ＳＢ４３１５４２について、このような濃度は、約０．１〜１００ｎＭ、好ましくは約５〜３０ｎＭである。Ｄｋｋ１については、約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００〜１０００ｎｇ／ｍｌである。また、ＢＭＰＲＦｃについては、約０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜３μｇ／ｍｌである。【０１４８】
上記各シグナル阻害剤は、多能性幹細胞の培養開始時に培地に添加しておくことが最も好ましいが、場合により、培養数日後に培地に添加することも考えられる。【０１４９】
インシュリンの細胞内シグナル伝達には、大きく分けて２つの経路（ＭＡＰＫ経路とＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路）が関与しているが、本発明の浮遊培養で使用されるインシュリンシグナル阻害剤としては、インシュリンシグナル伝達経路の下流因子であるＰＩ３Ｋの阻害剤、そしてさらに下流の因子であるＡｋｔの阻害剤が挙げられる（ＭＡＰＫ阻害剤ＰＤ９８０５９は、視床下部ニューロンの前駆細胞への分化に対するインシュリンの阻害作用を拮抗しなかった（実施例１５））。本発明において使用され得るＰＩ３Ｋ阻害剤としては、ＬＹ２９４００２（２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）−８−ｐｈｅｎｙｌ−１（４Ｈ）−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ＦＥＲＭＥＮＴＥＫ）などが挙げられるが、好ましくはＬＹ２９４００２である。本発明において使用され得るＡｋｔ阻害剤としては、Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ〜Ｘ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）などが挙げられるが、好ましくはＡｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩ（１，３−Ｄｉｈｙｄｒｏ−１−（１−（（４−（６−ｐｈｅｎｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｇ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ−７−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ）−４−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）−２Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｏｎｅ）である。【０１５０】
インシュリンシグナルが阻害され、視床下部ニューロンの前駆細胞の選択的分化が達成される限り、浮遊培養においては、上記ＰＩ３Ｋ阻害剤又はＡｋｔ阻害剤から選択される阻害剤を単独で用いてもよく、あるいはＰＩ３Ｋ阻害剤とＡｋｔ阻害剤とを併用してもよい。各阻害剤から２種以上を選択して併用することもできる。【０１５１】
浮遊培養に用いられるＰＩ３Ｋ阻害剤／Ａｋｔ阻害剤の濃度は、視床下部ニューロンの前駆細胞への選択的分化を達成可能であるような濃度であり得る。例えば、ＬＹ２９４００２について、このような濃度は、約０．５〜３０μＭ、好ましくは約２〜１０μＭである。Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩについては、約０．１〜１０μＭ、好ましくは約０．５〜５μＭである。【０１５２】
ＰＩ３Ｋ阻害剤／Ａｋｔ阻害剤は、多能性幹細胞の培養開始時に培地に添加しておくことが最も好ましいが、げっ歯類（例えばマウス）多能性細胞の分化の場合は少なくとも培養６日目まで（好ましくは少なくとも培養２日目までに添加する）の時期に、霊長類（例えばヒト）多能性細胞の分化の場合は少なくとも培養２４日目まで（好ましくは少なくとも培養９日目までに添加する）の時期には、分化培地に添加すべきである。【０１５３】
好ましい態様において、本発明で使用される分化培地は、上述の増殖因子もインシュリン類も含有しない、化学的に規定された（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ）培地（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｆｒｅｅ  ＣＤＭ；ｇｆＣＤＭと呼ぶ）である（以下の実施例１３を参照のこと）。このｇｆＣＤＭ培地は、以前に報告されたＣＤＭ培地（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１４１−１５１（１９９５））を改変したものである。
内因性の増殖因子／インシュリンの作用を抑制するため、このようなｇｆＣＤＭ培地あるいは他の培地に増殖因子阻害剤／インシュリン阻害剤をさらに添加してもよい。【０１５４】
別の好ましい態様において、本発明で使用される分化培地は、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡｋｔ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの阻害剤並びにインシュリン類を含有し、且つインシュリン以外の上述の増殖因子（Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸等）を実質的に含有しない無血清培地である。例えば、以下の実施例１９に示されるように、霊長類の多能性幹細胞の分化誘導においては、インシュリンを含有しない培地により浮遊培養を行うと、細胞が死滅して増殖しにくい場合がある。このような細胞死を回避するために、細胞増殖を亢進させるためのインシュリン添加を実施し、同時にインシュリンの分化誘導阻害効果に拮抗するインシュリンシグナル阻害剤（例、ＰＩ３Ｋ阻害剤／Ａｋｔ阻害剤）を添加することが好ましい。この場合、分化培地に含まれるインシュリン類の濃度は、多能性幹細胞の増殖を促進し得る濃度である。例えば、インシュリンについてこのような濃度は、通常約０．０２〜４０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｍｌである。ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡｋｔ阻害剤の濃度範囲は上述の通りである。【０１５５】
また、分散浮遊培養時の細胞死を抑制するために、インシュリン添加に加えて、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２（（＋）−（Ｒ）−ｔｒａｎｓ−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；渡辺ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７）を培養開始時から添加することが好ましい。浮遊培養に用いられるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、分散浮遊培養時の細胞死を抑制し得る濃度である。例えば、Ｙ−２７６３２について、このような濃度は、通常約０．１〜２００μＭ、好ましくは約２〜５０μＭである。【０１５６】
本発明の方法においては、浮遊培養に用いる培地中のＳｈｈシグナル促進剤の有無により、得られ得る視床下部ニューロン前駆細胞の分化能が異なる。【０１５７】
Ｓｈｈシグナル促進剤を含有する培地中で多能性幹細胞の浮遊培養を行うと、内腹側核ニューロン、Ａ１２型ドーパミンニューロン、弓状核ニューロン又はオレキシン陽性ニューロンへの分化能を有する、腹側視床下部ニューロンの前駆細胞が選択的に誘導される。Ｓｈｈシグナル促進剤としては、Ｓｈｈ、Ｓｈｈ−Ｎ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅが好ましい。【０１５８】
浮遊培養に用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、腹側視床下部ニューロン前駆細胞への選択的分化を達成可能であるような濃度であり得る。このような濃度は、例えばＳｈｈ−Ｎの場合、約１〜１０００ｎＭ、好ましくは約１０〜１００ｎＭであり、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅの場合、約０．０５〜５０ｎＭ、好ましくは約０．１〜１０ｎＭであり得る。【０１５９】
Ｓｈｈシグナル促進剤は、多能性幹細胞の培養開始時に培地に添加しておいてもよいが、例えば浮遊培養開始２日後以降、好ましくは浮遊培養開始４日後以降に培地に添加できる。必要に応じて、Ｓｈｈシグナル促進剤の有無を浮遊培養の途中で切り替えてもよい。【０１６０】
一方、Ｓｈｈシグナル促進剤を実質的に含有しない培地中で多能性幹細胞の浮遊培養を行うと、バゾプレシン産生内分泌細胞への分化能を有する、背側視床下部ニューロンの前駆細胞が選択的に誘導される。【０１６１】
Ｓｈｈシグナル促進剤を実質的に含有しない培地中での浮遊培養は、Ｓｈｈシグナル阻害剤の存在下に行なってもよい。Ｓｈｈシグナル阻害剤の使用により、腹側視床下部ニューロン分化の抑制、背側視床下部ニューロン分化の促進等の効果が期待できる。【０１６２】
Ｓｈｈシグナル阻害剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル阻害剤としては、例えば、Ｓｈｈシグナル促進剤に対する抗体、Ｓｈｈシグナル促進剤のドミナントネガティブ変異体、可溶型Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アンタゴニストが挙げられる。Ｓｈｈシグナル阻害剤としては、例えば、Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ（１１−Ｄｅｏｘｏｊｅｒｖｉｎｅ）等が挙げられる。必要に応じて、Ｓｈｈシグナル阻害剤の有無を浮遊培養の途中で切り替えてもよい。【０１６３】
多能性肝細胞の浮遊培養に用いる培養器は、細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。【０１６４】
多能性幹細胞を浮遊培養する場合、培養器は細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものを使用できる。【０１６５】
培養開始時の多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の浮遊凝集体をより効率的に形成させるように適宜設定できる。培養開始時の多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の浮遊凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば、約１×１０４〜約５×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは約３×１０４〜約１×１０５細胞／ｍｌであり得る。【０１６６】
多能性肝細胞の浮遊培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。【０１６７】
具体的には、多能性肝細胞の浮遊培養としては、例えば、多能性幹細胞の維持培養後、分散処理した多能性幹細胞を適切な培地に懸濁し、細胞非接着性の培養器に、１×１０４〜５×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で播種し、例えば、少なくとも５日間（好ましくは７日間以上）３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて培養する方法が挙げられる。【０１６８】
例えば、多能性肝細胞の浮遊培養は、非接着性の９６穴培養プレートに、１ウェル当たり約２５００〜約５０００細胞（例えば、約３０００細胞）となるよう、１５０μｌの分化培地に浮遊させることにより実施する。【０１６９】
浮遊培養の培養物から、視床下部ニューロンの前駆細胞を単離することにより、視床下部ニューロンの前駆細胞を得ることができる。「培養物」とは、細胞を培養することにより得られる結果物をいい、細胞、培地、場合によっては細胞分泌性成分等が含まれる。「単離」とは目的とする細胞以外の成分（細胞、タンパク質、培地等）を除去することを意味する。【０１７０】
浮遊培養後、視床下部ニューロンの前駆細胞を含む凝集塊をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、次いで細胞を接着条件下でさらに培養できる（以下、必要に応じて「接着培養」と省略）。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリクス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。また、接着培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は、当業者であれば容易に決定できる。【０１７１】
接着培養において使用する培地は、視床下部ニューロンの前駆細胞を意図した細胞へと分化させることが可能である限り、他のいずれの物質を含んでもよい。この培地は、浮遊培養においては排除されていた「増殖因子」又は「インシュリン」などを必要に応じて含有していてもよく、血清代替物、並びに脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有していてよい。血清代替物は、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得、市販の血清代替物としては、例えば、ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。【０１７２】
また、接着培養において使用する培地は、必要に応じて更に種々の添加物（Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物等）を含有することができる。【０１７３】
接着培養では、既知の分化誘導物質を使用することができる。視床下部ニューロンの前駆細胞からさらに特定の視床下部ニューロン（背側視床下部ニューロン、腹側視床下部ニューロン等）を分化誘導する場合に使用され得る分化誘導物質としては、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）等が挙げられる。分化誘導物質は、目的とする成熟細胞の種類に依存して適宜選択することが可能である。また、添加時の濃度も、用いる物質及び目的細胞の種類などに応じて適宜設定できる。例えば、ＣＮＴＦを使用して背側視床下部ニューロン又は腹側視床下部ニューロンを誘導する場合の適切な濃度は、通常１〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２〜５０ｎｇ／ｍｌである。ＢＤＮＦを使用して、腹側視床下部ニューロン（内腹側核ニューロン、Ａ１２型ドーパミンニューロン、弓状核ニューロン、オレキシン陽性ニューロン等）を誘導する場合の適切な濃度は、通常１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２００ｎｇ／ｍｌである。【０１７４】
分化誘導物質は、接着培養開始時に既に培地に添加されてもよく、接着培養直後から数日後に培地に添加してもよい。【０１７５】
上述した浮遊培養法、及び浮遊培養と接着培養との組合せ法によれば、培養期間等を適宜設定することで、多能性幹細胞から視床下部ニューロンの前駆細胞を得ることができ、そこからさらに分化成熟した視床下部ニューロンを得ることもできる。【０１７６】
上記浮遊培養法、及び浮遊培養と接着培養との組合せ法により得られた細胞は、マーカー遺伝子の発現の有無、又は神経内分泌細胞の場合には分泌タンパク質（ホルモン）の培地への放出若しくは細胞内におけるその前駆タンパク質の蓄積等を指標とし、必要に応じてそれらを組み合わせることにより、いずれの細胞に分化したかを確認することができる。また、細胞の形態を観察することによって、得られた細胞を特定することもできる。更に、このようなマーカー発現パターンや細胞の形態に基づき、所望の特定の細胞を単離することもできる。【０１７７】
このようなマーカー遺伝子としては、例えば、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（神経細胞）、Ｒｘ（視床下部及び網膜の前駆細胞）、ｎｅｓｔｉｎ（視床下部ニューロンの前駆細胞では発現されるが網膜前駆細胞では発現されない）、Ｓｏｘ１（視床下部神経上皮で発現され、網膜では発現されない）、ＢＦ１（終脳前駆細胞）、Ｎｋｘ２．１（腹側）、ＰＡＸ６（背側）、Ｆｏｘｂ１（尾側視床下部中の乳頭体ニューロン）、ＳＦ１（有糸分裂後のＶＭＨ前駆細胞）、Ｏｔｐ（背側視床下部）、ＧｌｕＴ２、ＴＨ、ＡｇＲＰ、ＮＰＹ、Ｏｒｅｘｉｎ、Ｏｔｘ２（前−中脳マーカー）、Ｓｉｘ３（吻側前脳）、Ｖａｘ１、Ｉｒｘ３（尾側間脳及びそれより尾側の脳組織）、Ｅｎ２（典型的に中脳）及びＨｏｘｂ９（尾側ＣＮＳ）などの公知のマーカーが利用可能であるが、これらに限定されない。これらのマーカー遺伝子の発現の有無を適宜組み合わせることにより、得られた細胞の正体を特定することができる。【０１７８】
マーカー遺伝子の発現は、定量ＰＣＲを、例えば、製造者の指示に従って７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施し、ＧＡＰＤＨ発現によってデータを正規化することにより解析する。定量ＰＣＲの方法は当業者に公知である。或いは、目的とするマーカー遺伝子が、マーカー遺伝子産物とＧＦＰなどとの融合タンパク質として発現されるように、細胞を操作してもよい（ノックイン）。マーカー遺伝子産物に対して特異的な抗体を用いて、タンパク質の発現を検出することができる。【０１７９】
視床下部が分泌するホルモンとしては、ＣＲＨ（副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン）、ＧＨＲＨ（成長ホルモン放出ホルモン）、ＧＩＨ（成長ホルモン抑制ホルモン）、ＧｎＲＨ（生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＰＲＦ（プロラクチン放出因子）、ＰＩＦ（プロラクチン抑制因子）、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＳＳ（ソマトスタチン）、バゾプレシン（ＡＤＨ：抗利尿ホルモン）、オキシトシンなどが挙げられる。これらのホルモンの産生／分泌を指標として、本発明の方法で得られた細胞の性状を確認する。【０１８０】
例えば、アルギニン−バゾプレシン（ＡＶＰ）産生ニューロンは、形態的には、大きな丸型又は卵形の細胞体（長軸方向に２０−３０μｍ）、長い軸索及び少数の樹状突起を有している。このニューロンは、Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎ  ＩＩ（ＮＰ  ＩＩ）を細胞内に蓄積しており、高カリウム刺激により培地中にＡＶＰを放出する。
これらのタンパク質の検出は、免疫染色又はラジオイミュノアッセイにより実施することができる。また、その他のホルモン産生ニューロンについても、産生されるホルモン等に特異的な抗体等を用いて、同様のアッセイが可能である。このような方法は当業者に公知である。【０１８１】
（８）細胞培養物、及び医薬としての使用
本発明はまた、本発明の方法により得られる細胞培養物を提供する。本発明の細胞培養物は、例えば、幹細胞の浮遊凝集体、浮遊凝集体を分散処理した細胞、分散処理細胞の培養により得られる細胞などであり得る。また、本発明は、かかる細胞培養物より被験体に投与し得る程度に単離・精製された均質な細胞、例えば、大脳神経細胞、視床下部ニューロン等の前脳神経細胞を提供する。【０１８２】
本発明の方法により得られた細胞は、神経系細胞、例えば前脳神経細胞、感覚器系細胞の障害に基づく疾患の治療薬、又はその他の原因による細胞損傷状態において当該細胞を補充するためなどに用いることができる。神経系細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、てんかん、脳外傷、脊髄損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。具体的には、前脳神経細胞、特に終脳神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、脳外傷が挙げられる。【０１８３】
間脳は視床及び視床下部の総称である。視床下部は自律神経の中枢であり、またホルモンを分泌して下垂体の機能を調節し、体温、摂食、飲水、循環系などの調節に関与する。従って、本発明の方法により得られた細胞は、間脳、特に視床下部の細胞障害（細胞の損傷、機能不全など）に起因する疾患の治療薬として用いることができ、また、脳外科手術後（例えば、脳腫瘍摘出後）などに失われた細胞を補充するために用いることもできる。
本発明の方法で得られた細胞を移植することにより治療／緩和され得る疾患としては、内分泌異常（例えば、中枢性尿崩症、フレーリッヒ症候群、視床下部性下垂体機能低下症、視床下部症候群）、摂食障害（拒食症／過食症）、睡眠障害、日内リズム障害などが挙げられる。【０１８４】
また、本発明の方法により得られた細胞、例えば、神経系細胞を、当該細胞の障害に基づく疾患の治療薬として用いる場合、当該細胞の純度を高めた後に被験体に移植することが好ましい。【０１８５】
細胞の純度を高める方法は、公知となっている細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、例えば、フローサイトメーターを用いる方法（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，２７５（１９９８）参照）、パニング法（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，２７９７（１９８８）参照）、ショ糖濃度の密度差を利用する細胞分画法（例えば、組織培養の技術（第三版），朝倉書店（１９９６）参照）が挙げられる。【０１８６】
本発明の細胞の純度を高める方法は、上述のような幹細胞を分化誘導して得られた細胞、例えば神経系細胞を、抗癌剤を含む培地中で培養する工程を含む。これにより、未分化な状態の細胞を除去することができ、より純度の高い分化細胞を得ることが可能で、医薬としてより好適となる。即ち、抗癌剤で処理することにより、目的とする分化細胞以外の細胞、例えば未分化な細胞を除去することができる。【０１８７】
ここで、抗癌剤としては、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、アラＣまたはメトトレキセートなどが挙げられる。これら抗癌剤は、分化誘導した細胞よりも未分化な状態の細胞に、より細胞毒性を示す濃度で用いることが好ましい。具体的には、上述した培養方法に準じて、これら抗癌剤を用いた培養を行い、至適濃度を決定することができ、例えば、これら抗癌剤を生体に用いる日本薬局方記載の濃度の１００分の１〜１倍の濃度で含む培地を用い、５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターで、３７℃で数時間、好ましくは２時間培養する方法を挙げることできる。【０１８８】
ここで使用する培地としては、分化誘導した細胞を培養することが可能な培地であればいかなるものも用いることができる。具体的には、上述の培地等を挙げることができる。【０１８９】
また、移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、体細胞の核を核移植した幹細胞、又は染色体上の遺伝子を改変した幹細胞を用いることで当該問題を克服できる。【０１９０】
また、体細胞の核を核移植した幹細胞を用いて分化誘導することで、体細胞を提供した個体の細胞、例えば、神経系細胞、感覚器系細胞を得ることができる。このような個体の細胞は、その細胞自身が移植医療として有効のみならず、既存の薬物がその個体に有効か否かを判断する診断材料としても有用である。さらに、分化誘導した細胞を長期に培養することで酸化ストレスや老化に対する感受性の判定が可能であり、他の個体由来の細胞と機能や寿命を比較することで神経変性疾患等の疾患に対する個体のリスクを評価することができ、それら評価データは将来の発病率が高いと診断される疾患の効果的な予防法を提供するために有用である。【０１９１】
本発明の方法により幹細胞から分化誘導された細胞、例えば神経系細胞は、自体公知の方法により患者の疾患部位に移植できる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２，１１３７（１９９９）参照）。【０１９２】
（９）大脳神経ネットワークの形成
本発明は、（３）の工程を含む、大脳皮質神経ネットワークを試験管内で形成する方法を提供する。この方法によれば、ＳＦＥＢｑ法により得られた細胞凝集体が乱雑な細胞塊になることなく、その中に大脳皮質神経ネットワークを形成することができる。【０１９３】
試験管内の細胞凝集体において本発明の大脳皮質神経ネットワークが構築されたことは、例えばカルシウム放出を指標としたイメージング解析により確認することができる。ここで「試験管内」とは、単に生体内で無い（インビトロ）ことを示す。
また本発明の方法によって形成される大脳皮質神経ネットワークにおいては、多くの細胞で周囲の細胞と同調した、または同調しないＣａ２＋上昇（カルシウムオシレーション）が繰り返し観察される。このように、本発明の方法で形成される大脳皮質神経ネットワークは、好ましくは同期した自発発火を伴うものであり、ここで「発火」とは、神経細胞の脱分極による興奮性活動のことをいい、「自発発火」とは、それが自発的に起こることをいう。すなわち本発明の方法で形成される大脳皮質神経ネットワークは、ある面で生体組織と類似した神経活動を起こしうる。【０１９４】
本発明によれば、本発明の方法により得られた培養産物、具体的には上記大脳神経ネットワークを構築している細胞凝集体が提供される。当該培養産物（細胞凝集体）は、生体における神経ネットワークと極めて類似した神経ネットワークを構築しているので、神経系細胞、例えば前脳神経細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬のスクリーニング、またはそれらの毒性試験などに用いることができる。ここで神経系細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、てんかん、脳外傷、脊髄損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。具体的には、前脳神経細胞、特に大脳神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、脳外傷が挙げられる。【０１９５】
また当該培養産物（細胞凝集体）は、神経系細胞、例えば前脳神経細胞の障害に基づく疾患の治療薬、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬などとして用いることもできる。【０１９６】
（１０）大脳皮質組織構造の形成
本発明は、（３）の工程を含む、脳組織の立体構造を試験管内で形成する方法を提供する。この方法によれば、ＳＦＥＢｑ法により得られた細胞凝集体が乱雑な細胞塊になることなく、その中に脳組織の立体構造を形成することができる。より好ましくは、初期の大脳原基で認められる大脳皮質層と同様の順序で、自己組織化が進む大脳皮質の組織形成の初期過程を模倣することが可能である。【０１９７】
試験管内の細胞凝集体において脳組織の立体構造が構築されたことは、例えばＰａｘ６、Ｔｂｒ１等の層特異的神経細胞マーカーの発現、光学あるいは電子顕微鏡による形態解析、ＧＦＰ導入細胞のライブイメージングなどにより確認することができる。ここで「試験管内」とは、上記と同様の意味を示す。また脳組織としては特に限定されず、脳を構成する組織のあらゆる構造を形成し得るが、好ましくは大脳組織であり、より好ましくは大脳皮質組織である。【０１９８】
本発明によれば、本発明の方法により得られた培養産物、具体的には脳組織の立体構造を構築している細胞凝集体が提供される（以下、（９）で得られる大脳神経ネットワークを形成する細胞凝集体、（１０）で得られる脳組織の立体構造を構築している細胞凝集体、および（１１）で得られる胎仔脳胞に類似した組織学的特徴を持つ構造を有する細胞凝集体をまとめて、「本発明の培養産物」と記載する）。本発明の培養産物は、大脳皮質の組織形成の初期過程と極めて類似した脳組織を構築しているので、神経系細胞、例えば前脳神経細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬のスクリーニング、またはそれらの毒性試験などに用いることができる。ここで神経系細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、てんかん、脳外傷、脊髄損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。具体的には、前脳神経細胞、特に終脳神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患（例えば、脳卒中）、脳外傷が挙げられる。【０１９９】
また本発明の培養産物は、神経系細胞、例えば前脳神経細胞の障害に基づく疾患の治療薬、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬などとして用いることもできる。【０２００】
（１１）大脳皮質組織の上皮構造形成の促進
上記浮遊培養において培地中に細胞外マトリクス成分を添加することにより、無添加の場合よりも長期間にわたって大脳皮質組織の上皮構造が安定に維持され、胎仔脳胞に類似した組織学的特徴を持つ構造が得られる。
胎仔脳胞との類似性は、以下の特徴を指標として判断することができる：１）ｒａｄｉａｌ  ｇｌｉａ細胞の高い密度、２）ラミニン陽性の連続した基底膜の保持、３）ｒａｄｉａｌ  ｇｌｉａ細胞の基底膜接着部に見られるｅｎｄ  ｆｏｏｔ構造。ｒａｄｉａｌ  ｇｌｉａは、ＢＬＢＰをマーカーとして検出することができる。【０２０１】
「細胞外マトリクス成分」とは、細胞外マトリクス中に通常見出される各種成分をいう。本発明の方法では、基底膜成分を用いることが好ましい。基底膜の主成分としては、例えばＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンが挙げられる。
培地に添加する細胞外マトリクス成分としては市販のものが利用でき、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ヒト型ラミニン（シグマ）などが挙げられる。
Ｍａｔｒｉｇｅｌは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ  Ｈｏｌｍ  Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであるが、これらに加えてＴＧＦ−β、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、組織プラスミノゲン活性化因子、ＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。
Ｍａｔｒｉｇｅｌのｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ製品は、通常のＭａｔｒｉｇｅｌよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はＥＧＦが＜０．５ｎｇ／ｍｌ、ＮＧＦが＜０．２ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦが＜５ｐｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−１が５ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−βが１．７ｎｇ／ｍｌである。本発明の方法では、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ製品の使用が好ましい。【０２０２】
浮遊培養で培地に添加する細胞外マトリクス成分の濃度は、大脳皮質組織の上皮構造が安定に維持される限り特に限定されず、Ｍａｒｔｉｇｅｌを用いる場合には培養液の１／５００-１／２０の容量、さらに好ましくは１／１００の容積で添加することが好ましい。細胞外マトリクス成分は幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、好ましくは、浮遊培養開始後数日以内の時期（例えば、浮遊培養開始１日後）に培地に添加される。【０２０３】
（１２）スクリーニング方法
本発明は、本発明の細胞培養物または本発明の培養産物を用いることを特徴とする、被検物質のスクリーニング方法を提供する。特に本発明の培養産物は、生体における神経ネットワークと極めて類似した神経ネットワークを構築しており、また大脳皮質の組織形成の初期過程と極めて類似した脳組織を構築しているので、神経系細胞、例えば前脳神経細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬のスクリーニング、またはそれらの毒性試験、さらには神経系疾患の新たな治療方法の開発などに適用することができる。【０２０４】
ここで「被検物質」としては、例えば神経系疾患の治療薬として有効性を確認したい物質や、その他の疾患の治療薬であって脳神経への影響（例えば、毒性）を確認することが必要な物質が挙げられる。当該物質は、低分子化合物、高分子化合物、タンパク質、遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、ウイルスなど、どのようなものであってもよい。このような物質は、当業者が適宜選択することができる。【０２０５】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０２０６】
実施例１：ＳＦＥＢｑ法による高効率の大脳皮質前駆細胞への分化誘導
（方法）
マウスＥＳ細胞（Ｅ１４由来）のＥＢ５細胞または、Ｅ１４由来の細胞株で神経分化レポーターとして大脳神経マーカーＢｆ１遺伝子に改変ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＶｅｎｕｓ遺伝子を相同組替えにてノックインした細胞（以下「Ｂｆ１／Ｖｅｎｕｓ−ｍＥＳ  細胞」と記載する）を、文献（渡辺ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５）記載の通りに培養し、実験に用いた。
培地にはＧ−ＭＥＭ  培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１％  牛胎児血清、１０％  ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ  グルタミン、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１ｍＭ  ピルビン酸、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび２０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦを添加したものを用いた。浮遊培養による神経分化誘導には、０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン  スフェロイド  プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり３×１０３細胞になるように１５０μｌの分化培地に浮遊させ、凝集塊を速やかに形成させた後、３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベーションした（ＳＦＥＢｑ法；図１Ａ）。
その際の分化培地には、Ｇ−ＭＥＭ培地に１０％ＫＳＲ、２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１ｍＭ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、０．１ｍＭ  ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．１ｍＭ  ２−ＭＥ、２５０  μｇ／ｍｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｄｋｋ−１、１  μｇ／ｍｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｌｅｆｔｙ−１を添加した無血清培地（渡辺ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５参照）を用いた。
凝集塊を６ｃｍの非接着性プラスチックシャーレ（３．５ｍｌの分化培地）に回収し、さらに３日間浮遊培養を継続したのち（計１０日間）、蛍光免疫染色法で分化状態を解析した。結果を図１に示す。【０２０７】
（結果）
免疫染色解析の結果、分化培養開始後１０日の凝集塊の細胞のうち約７割の細胞が大脳特異的マーカーＢｆ１を発現していた。また、Ｂｆ１陽性細胞のうち９割の細胞が大脳皮質特異的マーカーＥｍｘ１を発現していた。Ｂｆ１／Ｖｅｎｕｓ−ｍＥＳ  細胞を分化させたものをＶｅｎｕｓ−ＧＦＰの発現で解析した場合も、約７割の細胞が陽性であり、その大半がＥｍｘ１を発現していた（図１Ａ）。このように、ＳＦＥＢｑ法は上記の分化培地を用いた場合、高効率で大脳皮質細胞（前駆細胞）を分化誘導することが可能である。なお、１０ｃｍ培養ディッシュを用いて、緩徐にＥＳ細胞の凝集塊を形成させる既存の方法（渡辺ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５）では、Ｂｆ１陽性細胞は３割にとどまり、そのうち大脳皮質マーカーＥｍｘ１陽性となるのは４割未満であった。また凝集体が極性を持った上皮様構造を有していることは、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ−１３３、ラミニンなどの発現（図１Ｂ〜Ｇ）や、電子顕微鏡によるタイトジャンクション（図１Ｈ、括弧）やアドヘレンスジャンクション（図１Ｉ、括弧）などの形態観察、ロゼットの形成（図１Ｊ、図１Ｋ、点線はロゼットを示す）、極性マーカーの発現（図１Ｌ〜Ｏ、点線はロゼットを示し、星印は内腔を示す）などにより確認した。
このように、ＳＦＥＢｑ法は従来法に比して、より高効率に大脳、とりわけ大脳皮質へのＥＳ細胞の分化を促進する。【０２０８】
実施例２：ＳＦＥＢｑ法により誘導された大脳皮質前駆細胞からの大脳ニューロンの試験管内産生
（方法）
実施例１に記載の方法で培養を継続し、１２日間分化培養した凝集塊を酵素的に分散させ（スミロン  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎキット）、ｐｏｌｙ−Ｄ−リジン／ラミニン／フィブロネクチンでコートした培養プレートの上に５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１×Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔと１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を添加した培地で２日間培養した。その後、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ＮＴ３でさらに６日間培養した。分化したニューロンの性状を蛍光抗体法で解析した。結果を図２に示す。【０２０９】
（結果）
試験管内の細胞のほとんどがＴｕＪ１陽性のニューロンとなっており、そのうち８割が大脳皮質特異的なマーカーであるＥｍｘ１陽性で、グルタミン酸作動性ニューロン（大脳皮質に豊富に存在）のマーカーであるＶＧｌｕＴ１陽性であった（図２Ａ〜Ｂ）。また、大脳ニューロンに特徴的な複数の神経マーカー（Ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｎ、ＧｌｕＲ１、ＣａｍＫＩＩ、Ｃｔｉｐ２、Ｔｂｒ１など）の発現も観察された（図２Ｃ〜Ｆ）。
このように、ＳＦＥＢｑ法により誘導された大脳皮質前駆細胞からの大脳特異的なニューロンへの分化が確認された。【０２１０】
実施例３：ＳＦＥＢｑ法により産生された大脳ニューロンによる神経ネットワークの形成（方法）
ＳＦＥＢｑ法により産生された大脳ニューロンの活動とネットワーク形成を確認するために、ｆｌｕｏ４−ＡＭを用いたＣａ＋＋イメージング法による解析を行った。観察方法は、文献（Ｉｋｅｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，５２，１３２−１３８）に記載した通りである。
実施例１に記載の方法で、１８日間培養したマウスＥＳ細胞由来の凝集塊をＴｒａｎｓｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で、Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔしたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いてさらに７日間培養した（図３Ａ）。Ｃａ＋＋イメージングは人工脳脊髄液を用いて、室温で行った。結果を図３に示す。【０２１１】
（結果）
Ｃａ＋＋イメージングでは、多くの細胞で周囲の細胞と同調したあるいは同調しないＣａ＋＋上昇を繰り返し観察した（図３Ｂ〜Ｃ）。これらのＣａ＋＋上昇はいずれも、グルタミン投与により強められ（図３Ｄ）、神経活動電位の遮断を起こすテトロドトキシンの添加により阻害された（図３Ｅ〜Ｆ）ので、神経伝達依存的なネットワークによる事が示唆された。また、７割の凝集塊では、１ｍｍに及ぶ長距離で高速の伝搬速度（１ｍｍ／秒以上）で同調するＣａ＋＋上昇の繰り返し活動（Ｃａ＋＋オシレーション）を観察した（図３Ｇ〜Ｉ；図３Ｈにおける符号Ａ〜Ｅは個々の細胞を示し、また図３Ｉにおける数字もまた個々の細胞を示す。）。これらすべてのＣａ＋＋上昇はグルタミン拮抗剤のＣＮＱＸ（図３Ｊ）またはテトロドトキシンの添加により阻害される。
以上の結果は、ＳＦＥＢｑ由来の大脳組織が生体組織と類似した神経活動を（少なくともある面においては）起こすことを示している。【０２１２】
実施例４：ＳＦＥＢｑ法により産生された大脳ニューロンの大脳組織への組み込み
（方法）
Ｂｆ１／Ｖｅｎｕｓ−ｍＥＳ細胞は、文献（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，８７−９０）記載の方法により作成した。Ｂｆ１／Ｖｅｎｕｓ−ｍＥＳ細胞を実施例１に記載の方法で１４日間培養した後、生じたＶｅｎｕｓ陽性の細胞塊を下記の実験に用いた。マウス胎生１４．５日または生後１日目の大脳のスライス組織に、Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞塊を脳室の部分に細胞塊を置くかたちで接触させ（図４Ａ）、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｆｉｌｔｅｒ上で共培養を３日間行った。
また、Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞塊（分化培養１１日後）を塊のまま、あるいは分散して、新生児マウスの大脳皮質運動野近傍に生体移植し、移植４週間後に組織学的に解析した。結果を図４に示す。【０２１３】
（結果）
マウス胎生１４．５日または生後１日目の大脳のスライス組織との共培養では、Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞塊から多数のＶｅｎｕｓ陽性神経細胞が大脳皮質組織に侵入した（図４Ｂ〜Ｃ）。新生児マウスの大脳皮質運動野近傍への生体移植では、分散し移植したＶｅｎｕｓ陽性細胞からは大脳錐体細胞と形態的に類似したニューロンが分化した（図４Ｄ）。細胞塊のまま移植したものからは、脳の広範囲の組織への軸索投射が認められ、特に大脳皮質ニューロンからの軸索投射が多い、視床、線条体、大脳脚、橋核部に多くのＶｅｎｕｓ陽性の投射が確認された（図４Ｅ；符号Ｏ〜Ｕ；図４Ｅ中、Ｃｘは皮質を示す）。【０２１４】
実施例５：ＳＦＥＢｑ法により産生された大脳前駆細胞からの大脳皮質層特異的ニューロンへの分化誘導
（方法）
実施例１に記載の方法で７日後から１５日後まで培養し、その間の大脳皮質層特異的ニューロンのマーカーの発現を蛍光免疫染色法で解析した。また、層特異的ニューロンの最終分化（細胞周期を出る）のタイミングをＢｒｄＵパルスラベルによるｂｉｒｔｈ−ｄａｔｅ解析法（Ｅｕｒ．Ｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２，３３１−３４２）で解析した。結果を図５に示す。【０２１５】
（結果）
大脳第１層のＣａｊａｌ−Ｒｅｔｚｉｕｓ細胞特異的なＲｅｅｌｉｎを発現する細胞はＳＦＥＢｑ培養の７日目から出現した。また、大脳第６層特異的なＴｂｒ１／Ｂｆ１陽性細胞も７日目から認められた。大脳第５層特異的なＣｉｔｐ２陽性細胞は９−１０日目から有意に出現し（図５Ｂ）、大脳第２−３層に特異的なＢｒｎ２陽性ニューロンは１１−１２日目に有意に認められた（図５Ｃ）。この順（図５Ａ）は、発生過程でのこれらの大脳層特異的ニューロンの発生順と一致する。また、その相関はＢｒｄＵパルスラベルによるｂｉｒｔｈ−ｄａｔｅ解析法でも確認され、第１層、６層、５層、２−３層の順に細胞周期を出ることが確認された（図５Ｄ〜Ｈ）。
このことは、ＳＦＥＢｑ法で分化した大脳前駆細胞が発生過程の大脳皮質と類似した時間制御下に層特異的ニューロンを生み出すことを示し、生体内での大脳皮質前駆細胞と非常に良く似た性格を有することを示唆している。【０２１６】
実施例６：ＳＦＥＢｑ法により産生された大脳前駆細胞からの特定の層特異的ニューロンへの優先的な分化誘導
（方法）
Ｂｆ１／Ｖｅｎｕｓ−ｍＥＳ細胞を異なった長さの期間（９日間あるいは１２日間）、分化培養した後に、生じたＶｅｎｕｓ陽性細胞をＦＡＣＳで分離し、非細胞接着性の９６穴培養プレートで急速再凝集（５０００細胞／ウェル）を行った。翌日からＮｏｔｃｈ阻害剤のＤＡＰＴ（１０μＭ；ニューロンの分化を促進することが知られている；Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００７）の処理で急速なニューロンへの分化誘導を行い、さらに６日間分化培養後に層特異的マーカーを蛍光免疫染色法で解析した（図６Ａ）。結果を図６に示す。【０２１７】
（結果）
９日間分化培養した後ＤＡＰＴ処理を行ったものでは、５割以上の細胞がＲｅｅｌｉｎ陽性のＣａｊａｌ−Ｒｅｔｚｉｕｓ細胞に分化した（図６Ａ、Ｂ）。一方、１２日間分化培養した後ＤＡＰＴ処理を行ったものでは、６割以上の細胞がＣｔｉｐ２／Ｅｍｘ１陽性の第５層特異的な大脳皮質ニューロンに分化しており、Ｒｅｅｌｉｎ陽性細胞は１割未満であった（図６Ａ、Ｃ）。
このように、ＳＦＥＢｑ法では異なった培養期間と時期特異的なＮｏｔｃｈ阻害により、異なった層特異性を有する大脳ニューロンを選択的に産生することが可能である。【０２１８】
実施例７：ＳＦＥＢｑ法により産生された大脳前駆細胞からの大脳の部位特異的組織への試験管内分化誘導
（方法）
Ｂｆ１／Ｖｅｎｕｓ−ｍＥＳ細胞を７日間、ＳＦＥＢｑ法で分化培養した後に、生じたＶｅｎｕｓ陽性細胞をＦＡＣＳで分離し、非細胞接着性の９６穴培養プレートで急速再凝集（５０００細胞／ウェル）を行った。そこへＦｇｆ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｇｆ受容体阻害剤ＦＧＦＲ３−Ｆｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（０．５ｎｇ／ｍｌ）などの分泌型のパターン形成因子を添加して、培養を３〜１２日間行った。大脳部位特異的マーカーの発現を蛍光免疫染色法で解析した（図７Ａ）。結果を図７に示す。【０２１９】
（結果）
パターン形成因子を添加していない再凝集塊（再凝集培養３日後）では、大脳組織のうちで尾側大脳皮質型の細胞（Ｃｏｕｐ−ＴＦ１＋／Ｂｆ１＋）と吻側大脳皮質型の細胞（Ｃｏｕｐ−ＴＦ１−／Ｂｆ１＋）が５割ずつを占めていた。一方、Ｆｇｆ８ｂ添加群では、９割の細胞が吻側大脳皮質型（Ｃｏｕｐ−ＴＦ１−／Ｂｆ１＋）となり、Ｆｇｆ受容体阻害剤ＦＧＦＲ３−Ｆｃ添加群では、８割の細胞が尾側大脳皮質型（Ｃｏｕｐ−ＴＦ１＋／Ｂｆ１＋）となっていた（図７Ｂ〜Ｉ）。このことは、ＳＦＥＢｑで誘導した大脳皮質組織は、Ｆｇｆシグナルの有無により、それぞれ吻側あるいは尾側大脳皮質組織に選択的に分化誘導可能であることを示す。【０２２０】
なお、１２日間培養した場合、Ｆｇｆ８添加群のみで、吻側大脳組織の一つである嗅球のニューロン（Ｔｂｒ２１陽性）の有意の分化を観察した（図７Ｊ〜Ｎ；図７Ｍおよび図７Ｎの鏃は、ＴＢｘ２１発現細胞を示す。）。この結果も、Ｆｇｆシグナルによる吻側大脳組織の分化を示すものである。
Ｗｎｔ３ａ添加群では、大脳の最尾側かつ背側に存在するｈｅｍ領域（海馬周辺組織）の部位特異的マーカーであるＯｔｘ２およびＬｍｘ１ａの発現誘導を２−３割の細胞で観察した（図７Ｏ〜Ｒ）。
ＢＭＰ４添加群では、Ｏｔｘ２およびＬｍｘ１ａの発現に加えて、大脳の最背側に存在する脈絡膜組織（ＴＴＲ陽性）の分化を認めた（図７Ｏ、Ｓ）。特に、Ｗｎｔ３ａ＋ＢＭＰ４添加群ではこの発現が強められ、５割以上の細胞でＯｔｘ２およびＬｍｘ１ａの発現を、２割の細胞でＴＴＲの発現を認めた（図７Ｔ〜Ｕ）。【０２２１】
これらの結果は、ＳＦＥＢｑ法とＷｎｔシグナルおよびＢＭＰシグナルの組み合わせにより、大脳の最も尾側および背側の組織への分化誘導もＥＳ細胞から可能であることを示す（図７Ｖ）。【０２２２】
実施例８：ＳＦＥＢｑ法により産生された大脳前駆細胞からの層構造をもった大脳皮質組織の形成
（方法）
実施例１の方法で、マウスＥＳ細胞をＳＦＥＢｑ培養で１０日間培養し、その間の浮遊凝集塊内での組織形成とニューロン産生を蛍光免疫染色で観察した。組織切片の調製は凍結切片で行った。また、初期の組織像の詳細な解析には透過型電子顕微鏡も用いた。結果を図８等に示す。【０２２３】
（結果）
ＳＦＥＢｑ培養では、浮遊凝集塊は一定の均一なサイズで形成され、凝集塊間の分化程度もほぼ同一であった（図１Ａ）。分化培養開始３〜４日後より、神経前駆細胞マーカーＳｏｘ１やＮ−カドヘリンの集積を認め（図１Ｂ〜Ｃ）、５日後では９割以上の細胞が神経前駆細胞マーカーを発現した。５日後では、こうした神経前駆細胞は組織学的に単層の円柱上皮（神経上皮）を連続した形で形成し、こうした上皮は再現性良く内部をａｐｉｃａｌ側とする極性を有していた（図１Ｄ〜Ｆ）。７−８日後には、神経上皮は数個の球状の塊（ロゼット）に分かれたが、なおその内部をａｐｉｃａｌ側とする極性を保持していた。
１０日後の組織解析では、各ロゼットの最内部はＰａｘ６／ＣＤ１３３／Ｋｉ６７陽性の分裂能を持つ、神経前駆細胞の層が占め、その外側には大脳皮質第５−６層の神経細胞であるＴｂｒ１やＣｔｉｐ２陽性のニューロンが占める大脳板（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｐｌａｔｅ）様の層が存在した（図８Ａ〜Ｂ）。この２つの層にまたがるように、大脳皮質第２−３層など後期大脳板（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｐｌａｔｅ）由来のニューロンの前駆細胞であるＴｂｒ２陽性細胞の層が存在していた（図８Ｃ）。さらに、Ｔｂｒ１やＣｔｉｐ２陽性のニューロンの外側には、しばしば大脳皮質第１層のニューロンであるＲｅｅｌｉｎ陽性細胞の層が存在していた。これらの層の順は、初期の大脳原基（例、マウス胎生１４日）で認められる層の順やマーカー発現パターンと同じであり、ＳＦＥＢｑ法では大脳皮質の組織形成の初期過程を試験管内で自己組織化的に模倣することができる（図８Ｄ〜Ｅ）ことを示す。【０２２４】
実施例９：ＳＦＥＢｑ／ＲＩ法によるヒトＥＳ細胞由来の大脳皮質組織およびニューロンの産生
（方法）
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ＃１；京都大学中辻教授樹立）は既に報告した通りに維持培養した（上野ら，ＰＮＡＳ，２００６）。分化誘導に関しては、分散浮遊培養時の細胞死を抑制することを私たちが報告したＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２；渡辺ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７）を培養開始時から培地に添加して行った（ＳＦＥＢｑ／ＲＩ法）。Ｇ−ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、１０μＭ  Ｙ２７６３２、２ｍＭ  グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２５０μｇ／ｍｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｄｋｋ−１（５００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、さらにＮｏｄａｌ阻害剤Ｌｅｆｔｙ−Ａ（５μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ＢＭＰ阻害剤ＢＭＰＲＦｃ（１．５μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）を添加したものを分化培地に用いた。単一分散したヒトＥＳ細胞（渡辺ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７）を９０００細胞／１５０μｌ／ウェルずつ、実施例１と同様の方法で非細胞接着性の９６穴培養プレートに分注し、３７℃、５％ＣＯ２下に１８日間浮遊培養した。その後、浮遊凝集塊を非細胞接着性の６ｃｍシャーレ（スミロン  Ｃｅｌｌｉ−ｔｉｇｈｔ−Ｘ）に回収し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＮ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加した培地でさらに７日間培養した。さらに凝集塊をｐｏｌｙ−Ｄ−リジン／ラミニン／フィブロネクチンでコートした８−ｗｅｌｌ  チャンバースライド培養器の上でＢ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン入り）を用いて、合計４６日目まで培養した（図９Ａ）。結果を図９に示す。【０２２５】
（結果）
ヒトＥＳ細胞由来の細胞凝集塊はコートした培養器の上でもドーム型の立体構造を保っていた（図９Ａ）。９割以上の凝集塊では、Ｂｆ１／Ｅｍｘ１陽性の大脳皮質型の神経上皮が連続的な組織として存在しており、内部をａｐｉｃａｌ側とする極性を有していた（図９Ｂ〜Ｄ）。同様の構築は、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ４；Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ，２００８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，１０１−１０６）を用いた同様の培養でも認められた。
重要なことに、マウスＥＳ細胞由来の大脳組織と同様に、層特異的な大脳ニューロンの産生が認められ、しかも細胞凝集塊内で同様の層状の配置がそれらのニューロン群に認められた。すなわち、最も内部の層にはＰａｘ６陽性の分裂能を有する大脳皮質前駆細胞組織が存在し、その外側にＴｂｒ１、Ｃｔｉｐ２陽性の大脳皮質第５−６層のニューロンの層が存在した。それらの層の間にまたがる形で、後期大脳板（第２−３層）に対応するニューロンの前駆細胞であるＴｂｒ２陽性細胞群が存在した。さらに、Ｔｂｒ１、Ｃｔｉｐ２陽性の外側には、大脳第１層に対応するＲｅｅｌｉｎ陽性細胞が存在した（図９Ｅ〜Ｊ）。【０２２６】
これらはマウスＥＳ細胞と同様に、ヒトＥＳ細胞などのヒト多能性幹細胞でも組織形成やニューロンの産生などを試験管内で自己組織化的に行うことができることを示す。なお、こうした大脳皮質型の神経上皮組織形成は、ヒトＥＳ細胞では約８週間の培養期間で観察可能であり、こうした自己形成されたヒト由来の大脳組織を利用した創薬研究、毒性研究、薬効研究などに利用可能であることが示唆された。【０２２７】
実施例１０：ＳＦＥＢｑ法により産生された大脳前駆細胞へのＳｈｈ添加による大脳基底核神経細胞の分化誘導
（方法）
Ｂｆ１／Ｖｅｎｕｓ−ｍＥＳ  細胞を１０日間ＳＦＥＢｑ法で分化培養した。この際、最初の６日間はＷｎｔ阻害剤Ｄｋｋ１（１００ｎｇ／ｍｌ）および１０％ＫＳＲを添加したＧＭＥＭ培地で培養し、分化培養開始３日後より６ｍＭのＳｈｈタンパクを培地に添加した。分化培養開始６日後に培地を６ｍＭ  ＳｈｈおよびＮ２サプリメントを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２に交換し、さらに４日間浮遊培養した。合計１０日間培養したのち、生じたＶｅｎｕｓ陽性細胞をＦＡＣＳで分離し、非細胞接着性の９６穴培養プレートで急速再凝集（２００００細胞／ウェル）を行った。形成された凝集塊は６ｍＭ  Ｓｈｈ、Ｎ２サプリメントおよび１０％牛血清培地を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地でさらに１週間浮游培養し、神経マーカーで免疫染色を行った（計１７日）。また、Ｓｈｈを添加していないもの、あるいは３０ｎＭのＳｈｈを添加したものと比較した。結果を図１０に示す。【０２２８】
（結果）
発生過程で大脳基底部背側（外側基底核隆起）から由来する線条体神経細胞マーカーにはＦｏｘＰ１およびＮｏｌｚ１などがある。６ｎＭのＳｈｈを添加し培養した場合、１７日後に９割のＢｆ１／Ｖｅｎｕｓ陽性凝集塊（図１０Ｃ）がＦｏｘＰ１およびＮｏｌｚ１を発現していた。うちＮｏｌｚ１（線条体前駆細胞にも発現する）は全細胞の５割に（図１０Ａ）、ＦｏｘＰ１（より成熟した線条体神経細胞のマーカー）は２−３割に（図１０Ｂ、図１０Ｄ）発現していた。またこれらの神経はＧＡＢＡ作動性ニューロンマーカーであるＧＡＤを発現していた（図１０Ｅ、図１０Ｆ）。これらのマーカーの発現はＳｈｈを添加しない場合は、全体の５％未満であった。
一方、６ｎＭのＳｈｈを添加し培養した場合、大脳基底部腹側（内側基底核隆起）から発生する神経細胞（淡蒼球ニューロン、大脳皮質介在ニューロン、線条体介在ニューロンなど）のマーカーであるＮｋｘ２．１の発現は認められなかった。しかし、３０ｎＭのＳｈｈを添加した同様の培養では、４割のＢｆ１／Ｖｅｎｕｓ陽性凝集塊でＮｋｘ２．１の発現を認めた。【０２２９】
これらのことは、ＳＦＥＢｑ培養に低濃度のＳｈｈを添加することで、外側基底核隆起から発生する線条体神経細胞が、高濃度のＳｈｈを添加することで、より腹側の内側基底核隆起から発生する神経細胞が分化誘導できることを示す。【０２３０】
実施例１１：Ｆｇｆ８処理によるヒトＥＳ細胞由来の大脳皮質組織の前方組織、後方組織への選択的誘導
（方法）
ヒトＥＳ細胞は実施例９と同様の方法で大脳皮質組織に分化させ、４７日間培養後に固定した。なお、この培養では、Ｎｏｄａｌ阻害剤Ｌｅｆｔｙ−Ａの代わりに、Ｌｅｆｔｙ−Ａと同様に大脳マーカーＢｆ１を誘導する低分子のＮｏｄａｌ受容体阻害剤ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を用いた。分化培養開始後２５日からＦｇｆ８（１００μｇ／ｍｌ）を培地に添加し、以後３日おきにＦｇｆ８を含む培地を用いて培地交換を行い、４７日まで培養した。対照には、Ｆｇｆ８を添加しないものを用いた。後方の大脳皮質組織マーカーであるＣｏｕｐＴｆ１を用い、これが陽性である後方皮質細胞と陰性である前方皮質細胞の割合を免役染色で解析した。結果を図１１に示す。【０２３１】
（結果）
Ｆｇｆ８添加の有無に関わらず、８割以上の細胞がＢｆ１陽性であった。Ｆｇｆ８を添加しない対照では、Ｂｆ１陽性の８割の細胞がＣｏｕｐＴｆ１陽性の後方型であった（図１１Ａ）。一方、Ｆｇｆ８添加群では、ＣｏｕｐＴｆ１陽性細胞は２割以下で、大半はＣｏｕｐＴｆ１陰性の前方型であった（図１１Ｂ）。
以上の結果は、ヒトＥＳ細胞からＳＦＥＢｑ法で分化させた大脳皮質組織は、その細胞の多くが後方皮質細胞のタイプであるが、実施例７でのマウス細胞と同様に、Ｆｇｆシグナルの作用で前方皮質細胞への選択分化を誘導できることを示す。このようにＦｇｆシグナルを人為的に調節することで、試験管内で後方皮質細胞と前方皮質細胞をヒト多能性幹細胞から選択的に産生することが可能である。【０２３２】
実施例１２：ＳＦＥＢｑ法におけるマトリクス成分添加によるＥＳ細胞からの神経分化および神経組織構築の改善効果
（方法）
Ｓｏｘ１−ＧＦＰ  ｍＥＳ細胞（ＧＦＰを初期神経マーカー遺伝子Ｓｏｘ１座にノックインしたマウスＥＳ細胞）をＳＦＥＢｑ法（９６ウェルの低細胞結合性培養プレート）で分化培養した。その際、実施例１の培養液を用い、１ウェルあたり３個-３０００個の細胞を植えた。１日後より、細胞外マトリクス成分の効果をみるため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ仕様；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ＢＤによれば主要なタンパク成分のうち、６１％ラミニン、３０％コラーゲンＩＶ、７％エンタクチン）を培養液の容積あたり１／１００量添加して、その効果を神経分化や組織構築に関して、観察した。【０２３３】
（結果）
Ｍａｔｒｉｇｅｌを加えない培養液のみで培養した群では、１ウェルあたりの播き込み細胞数を５００-３０００個にすると培養５日後には８割の細胞がＳｏｘ１陽性の神経前駆細胞に分化していた。ところが、播き込み数を３個-５０個にすると、Ｓｏｘ１陽性細胞への分化は全く認められなかった。ところが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加群では、３個-５０個しか播き込まなかった場合も９割の細胞がＳｏｘ１陽性に分化した。このことは、ＳＦＥＢｑ培養で神経分化に好ましくない条件下でも、細胞外マトリクス成分の培養液での添加により、神経分化が大きく改善することを意味する。これにより３個などのごく少数のＥＳ細胞からも再現性良く神経分化の制御が可能であることが示された。（なお、５００-３０００個の播き込みの場合にもＭａｔｒｉｇｅｌを添加した場合、９割程度の細胞が神経前駆細胞に分化しており、この場合も軽度の促進効果が確認された。）
更に重要なことは、ＥＳ細胞由来の神経細胞塊の組織構築を観察した結果である（細胞播き込みウェル当たり２０００個）。実施例８にあるように、Ｍａｔｒｉｇｅｌの添加の有無によらず、５-６日後では、神経前駆細胞は組織学的に単層の円柱上皮（神経上皮）を連続した形で形成し、神経上皮組織は再現性良く内部をａｐｉｃａｌ側とする極性を有していた。Ｍａｔｒｉｇｅｌの非添加群では、７-８日後には、神経上皮は数個の球状の小塊（ロゼット）に分かれ出し、１０日後には神経上皮が１つの袋状に連続した形は全く認められなかった。
ところが、Ｍａｔｒｉｇｅｌの添加群では１０日後でも細胞塊の表面に神経上皮が１つの袋状に連続した形で残っており、ロゼットに分裂しなかった。非添加群と異なり、Ｍａｔｒｉｇｅｌの添加群の１０日後の神経上皮は、１）ｒａｄｉａｌ  ｇｌｉａ細胞の高い密度、２）ラミニン陽性の連続した基底膜の保持、３）ｒａｄｉａｌ  ｇｌｉａ細胞の基底膜接着部に見られるｅｎｄ  ｆｏｏｔ構造などの「胎児の脳胞（大脳皮質の神経上皮組織）により良く似た組織上の特徴」が確認された（図１２）。
このことは、マトリクス成分の培養液への添加により、基底膜などの構造がより強固になり、神経上皮の主要構造成分の細胞であるｒａｄｉａｌ  ｇｌｉａ細胞の増殖、維持および形態保持が促進され、胎児の脳胞を模倣する大脳皮質組織の上皮構造形成が促進されたことを強く示唆する。【０２３４】
実施例１３
増殖因子を含まない化学合成培地でのマウスＥＳ細胞の浮遊培養（ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法）によるＥＳ細胞からの神経分化誘導
（方法）
マウスＥＳ細胞（ＥＢ５及びＳｏｘ１−ＧＦＰ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ）は以前に記載の通り（渡辺らＮａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５：非特許文献４）に維持培養した。培地にはＧ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１％  牛胎児血清、１０％  ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ  グルタミン、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１ｍＭ  ピルビン酸、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び２０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦを添加したものを用いた。
浮遊培養による神経分化誘導には、０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−Ｃｏａｔ，ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．）の１ウェルあたり３０００細胞になるように１５０μｌの分化培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベーションした。
分化培地にはＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）／Ｈａｍｓ  Ｆ１２  １：１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、モノチオグリセロール（４５０μＭ；Ｓｉｇｍａ）および牛血清アルブミン（＞９９％の純度の再結晶精製品；Ｓｉｇｍａ）を添加したものを用いた。
ヒトａｐｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（１５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）の添加の有無は、以下の結果のいずれにも影響がなかった。
神経前駆細胞への分化は以前に記載の通り（渡辺らＮａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５）、神経分化した細胞が蛍光を発するＳｏｘ１−ＧＦＰ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓを用いて、ＦＡＣＳを用いて解析した。ＦＡＣＳはＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用い、ＦＡＣＳＤｉｖａ  ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。また、ＥＢ５細胞を用いて、蛍光抗体法でも神経分化を解析した。
（結果）
非接着性の９６穴培養プレートを用いることで、１つのウェルに入れた細胞のほとんどが半日以内に１つの浮遊凝集塊を再現性良く形成し、増殖因子を含まない化学合成培地での培養でも、ほとんど細胞死を認めずに良く成長した。培養５日後では、ＦＡＣＳ解析で９０％以上の細胞がＳｏｘ１−ＧＦＰ陽性となった。蛍光抗体法でも９０％以上の細胞が神経マーカーＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性であった。これらの結果は、上記の培養条件（ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法）では、選択的な神経分化をマウスＥＳ細胞から誘導することができることを示す。【０２３５】
実施例１４
ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法による視床下部前駆細胞のＥＳ細胞からの視床下部分化誘導と各種増殖因子の効果
（方法）
実施例１３と同様の培養条件で、７日間分化培養を行った。分化細胞の解析には、視床下部と網膜の前駆細胞のマーカーであるＲｘというタンパクの抗体を用いた。視床下部の前駆細胞ではＲｘに加えて、ｎｅｓｔｉｎというタンパクを発現しているが、網膜の前駆細胞ではＲｘのみでｎｅｓｔｉｎを発現していないため、Ｒｘとｎｅｓｔｉｎの共発現を指標として、視床下部の前駆細胞の同定を蛍光抗体法で行った。
さらにＲｘ遺伝子座にＧＦＰをノックインしたＥＢ５細胞（以下、Ｒｘ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞）を作成し、Ｒｘ−ＧＦＰの発現をＦＡＣＳでも解析した。
また、ＦＡＣＳ分画したＲｘ−ＧＦＰ＋  ＥＳ細胞において、Ｏｔｘ２、Ｒｘ、Ｓｉｘ３、Ｖａｘ１、Ｉｒｘ３、Ｅｎ２及びＨｏｘｂ９の発現を確認した。
（結果）
ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法でＥＢ５細胞およびＳｏｘ１−ＧＦＰ  ＥＳ細胞に対し７日間分化培養を行ったのち、その凝集塊を凍結切片にし、蛍光抗体法で組織染色を行ったところ、４５−６５％の細胞がＲｘ陽性であった。それらのＲｘ陽性細胞はすべてｎｅｓｔｉｎ陽性であった。他のマーカーについての結果は図１３を参照のこと。このことは、ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法による培養で、マウスＥＳ細胞が選択的に視床下部前駆細胞に分化誘導されることを示唆する。
Ｒｘ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞のＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ培養でも５０−７０％の高い分化効率を確認した。これを指標に、各種の増殖因子の効果を検討した。３日目から７日までＮｏｄａｌ（１μｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｇｆ８ｂ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ７（５００ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．２μＭ）、ｌｉｐｉｄ−ｒｉｃｈアルブミン（１ｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のそれぞれを培地に添加したところ、いずれもＲｘ−ＧＦＰのパーセントを１０％未満に低下させた。逆に、Ｓｈｈ−Ｎ（３０μＭ）の添加はＲｘ−ＧＦＰのパーセントを約８０％に上昇させた。一方、分化培地に亜セレン酸ナトリウムを追加添加する（分化培地では０．０１７ｍｇ／Ｌであるが、これを０．０２５ｍｇ／Ｌに増加）ことでも、Ｒｘ−ＧＦＰのパーセントを約８０％に上昇させることができた。以上のことは、ＥＳ細胞からの視床下部前駆細胞への分化には、Ｎｏｄａｌ、Ｗｎｔ３ａ、Ｆｇｆ８ｂ、ＢＭＰ７、レチノイン酸、ｌｉｐｉｄ−ｒｉｃｈアルブミンなどの無血清培地にしばしば添加される増殖因子・添加剤を含まないことが重要であることを示す。逆に、Ｓｈｈの添加や亜セレン酸ナトリウムの増量は、視床下部前駆細胞への分化を中程度に促進する効果を示すことも示唆された。【０２３６】
実施例１５
ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法による視床下部前駆細胞分化に対するインシュリンおよびＡｋｔ阻害剤の効果
（方法）
実施例１４と同様の培養条件で、７日間分化培養を行い、培地へのインシュリンの添加の、ＥＳ細胞からの視床下部前駆細胞分化への影響を、Ｒｘ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞を用いてＦＡＣＳ解析した。また、インシュリンの細胞内シグナル伝達には、大きく分けて２つの経路（ＭＡＰＫ経路とＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路）が関与する。従って、ＭＡＰＫを阻害するＰＤ９８０５９やＰＩ３Ｋを阻害するＬＹ２９４００２、およびＰＩ３Ｋのさらに下流因子であるＡｋｔの阻害剤Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の視床下部前駆細胞分化への効果も同様に検討した。ＬＹ２９４００２、Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩ、ＰＤ９８０５９又はＤＭＳＯ（ビヒクルコントロール）は、培養２日目に添加した。
（結果）
７μｇ／ｍｌのインシュリンの添加で、Ｒｘ−ＧＦＰの陽性率は５％未満に低下した。同様の分化阻害はインシュリンと構造の近い０．５μｇ／ｍｌ  ＩＧＦの添加でも認められた（図１４）。これらのことは、インシュリンやその類似物質を培地に含まないことが、視床下部前駆細胞へ選択的に分化誘導させるための培地に重要であることを示す。
タイムウインドウ（ｔｉｍｅ−ｗｉｎｄｏｗ）解析（図１５）により、最初の３日間のＣＤＭ中のインシュリンの存在は、Ｒｘ−ＧＦＰ＋％に対して殆ど阻害効果を及ぼさなかったが、４日目以降にインシュリンが存在した場合には、Ｒｘ−ＧＦＰ＋％が実質的に減少したことが示された。逆に、５日目又はそれ以前のｇｆＣＤＭへのインシュリンの添加はＲｘ−ＧＦＰ発現を抑制した。このことは、４日目及び５日目の間の高インシュリンシグナルの非存在が、効率的なＲｘ発現に重要であることを示唆している。
また、ＳＦＥＢｑ培養物中の他のマーカー遺伝子の発現に対するインシュリンの影響をｑＰＣＲで解析したところ、インシュリンが、最も吻側のＣＮＳマーカーの発現に対し抑制効果を有し、インシュリン処理により尾側マーカー発現が中程度に誘導されることが示された（図１６）。
７μｇ／ｍｌのインシュリンの添加による阻害効果は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（５μＭ）の添加やＡｋｔ阻害剤Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩ（２μＭ）の添加で拮抗され、それぞれ約２０％、２８％まで回復した。しかし、ＭＡＰＫ阻害剤ＰＤ９８０５９（０．５−１０μＭ）では、インシュリンの阻害効果に対する拮抗は認められなかった（図１７）。このことは、インシュリンを含む分化培地では、ＰＩ３Ｋ阻害剤またはＡｋｔ阻害剤、あるいはその両方を添加することで、ＥＳ細胞からの視床下部前駆細胞への分化誘導を行うことが可能あることを示唆する。インシュリンは多くの無血清培地に含まれており、この阻害剤添加によりインシュリンの分化阻害作用を拮抗できることは重要な方法論である。【０２３７】
実施例１６
ＥＳ細胞から産生した視床下部前駆細胞からの背側および腹側視床下部神経細胞への分化（方法）
実施例１４と同様の培養条件で、ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法で７日間Ｒｘ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞の分化誘導を行ったのち、Ｒｘ−ＧＦＰ陽性とＲｘ−ＧＦＰ陰性の細胞をＦＡＣＳで分画した。それぞれの分画の細胞を１ウェルあたり２５００−５０００細胞ずつ非細胞接着性の９６穴培養プレートに分注し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に７ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ、１０％  ＫＳＲおよびｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加したものを培地として、更に３日間培養した。このウェルの中で分画した細胞は半日以内に再凝集塊を形成した。３日後、ＤＦＮＢ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２に７ｇ／ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｘＮ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔと１ｘＢ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを加えたもの）に１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＮＴＦを添加した培地を半分置換し、更に３日間培養した。
合計１３日間培養後、再凝集塊を凍結切片にし、分化した細胞の性状を蛍光抗体法で解析した。Ｓｈｈの効果を観る場合は、３０ｎＭのＳｈｈを培養開始４日後から添加した。
（結果）
Ｓｈｈ無処理のＲｘ−ＧＦＰ陽性の再凝集塊では、４５％の細胞が背側視床下部のマーカーであるＯｔｐを発現していたが、Ｒｘ−ＧＦＰ陰性の分画からの細胞には発現は認められなかった。Ｒｘ−ＧＦＰ陽性分画でのＯｔｐの発現は、Ｓｈｈ処理で強く抑制された（７％）。一方、Ｓｈｈ処理をしたＲｘ−ＧＦＰ陽性の再凝集塊では、腹側視床下部のマーカーであるＮｋｘ２．１、ＳＦ１という２つのタンパク質を発現している細胞が多数認められた（２３％の細胞）、Ｓｈｈ無処理のＲｘ−ＧＦＰ陽性の再凝集塊ではほとんど認められなかった。背側マーカーＰａｘ６の発現もこの結果と一致した。Ｓｈｈシグナル阻害剤Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅによる処理では、これらのマーカーの発現についてＳｈｈ処理とは逆の結果が得られた（図示せず）。
以上の結果は、ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭで分化させたＥＳ細胞由来の視床下部細胞は、Ｓｈｈが無い条件では背側の視床下部の性格を持ち、Ｓｈｈ処理された場合は、腹側の視床下部の性格を持つことが明らかになった。Ｓｈｈと同様の効果は、Ｓｈｈ受容体のアゴニストであるＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（０．５μＭ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をＳｈｈの代わりに用いても得ることが出来た。【０２３８】
実施例１７
ＥＳ細胞から産生した視床下部前駆細胞からのバゾプレシン産生内分泌細胞への分化
（方法）
背側視床下部由来の典型的な神経細胞は室傍核や視索上核に存在するバゾプレシン産生内分泌細胞である。実施例１６と同様に、ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法で７日間Ｒｘ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞の分化誘導を行ったのち、Ｒｘ−ＧＦＰ陽性の細胞をＦＡＣＳで分画した。これを実施例１６と同様に、１３日まで再凝集塊として培養後、さらにこれをカルチャーインサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ；コーニング）上で培養をさらに１２日間継続した。培地にはＤＦＮＢ培地に１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＮＴＦを添加したものを用いた。ニューロンの性状は蛍光抗体法で調べた。一方、高カリウム濃度（１００ｍＭ）の人工髄液に反応して分泌されるバゾプレシンをラジオイミュノアッセイ（２抗体法）で定量した。
（結果）
蛍光抗体法では、多数のバゾプレシン抗体（抗ＮＰ  ＩＩ抗体）に陽性の大型ニューロン（２０−３０μＭの直径の細胞体）が検出された（全体の細胞の６％）。高カリウム濃度（１００ｍＭ）の人工髄液で３７℃にて培養すると、１０個の細胞塊から１０分間で約７ｐｇのバゾプレシンの放出を検出した（図１８）。
このことは、ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法で、視床下部内分泌細胞の前駆細胞をＥＳ細胞から分化誘導でき、それを分化成熟させることで実際にホルモンを産生するニューロンが産生できることを示す。【０２３９】
実施例１８
ＥＳ細胞から産生した視床下部前駆細胞からの他の視床下部ニューロンへの分化
（方法）
実施例１６と同様の方法で、Ｓｈｈ処理下にＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ培養をＲｘ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞に対して行い、７日後に、Ｒｘ−ＧＦＰ陽性の細胞をＦＡＣＳで分画した。これを実施例１６と同様に、１３日まで再凝集塊として培養後、さらにこれをＮｅｕｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎキット（スミロン）を用いて分散し、ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ／ｌａｍｉｎｉｎ／ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎでコートした培養プレートの上に２００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、ＤＦＮＢ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦで２５日まで培養した。分化したニューロンの性状を蛍光抗体法で解析した。
（結果）
Ｓｈｈ処理した培養では、バゾプレシンを産生する内分泌細胞は認められなかったが、代わりに腹側視床下部由来の細胞の性質をもったニューロンが複数種類同定された。それらは、ＳＦ１とＧｌｕＴ２を共発現する内腹側核ニューロン（分化誘導したニューロンの１３％；視床下部では満腹中枢を担うニューロンと言われる）、ＴＨ（チロシン水酸化酵素）とＮｋｘ２．１を共発現するＡ１２型ドーパミンニューロン（分化誘導したニューロンの１４％；視床下部では下垂体のプロラクチン分泌の調整などを行うことが知られている）、ＡｇＲＰやＮＰＹ共発現する弓状核ニューロン（分化誘導したニューロンの１．５％；摂食行動を制御する）、Ｏｒｅｘｉｎ陽性ニューロン（分化誘導したニューロンの約０．５％；摂食行動を制御する）などが含まれていた。
これらの結果は、ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法にＳｈｈ処理を組み合わせることで、様々な行動や内分泌制御を行う中枢である腹側の視床下部のニューロンをＥＳ細胞から産生できることを示す。【０２４０】
実施例１９
ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法の変法によるヒトＥＳ細胞からの視床下部前駆細胞の分化誘導
（方法）
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ＃１；京都大学中辻教授樹立）は既に報告した通りに維持培養した（上野ら、ＰＮＡＳ  ２００６）。分化誘導に関しては、実施例１３のように、ヒトＥＳ細胞をＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ分散後、再凝集浮遊培養を行うと、ほとんど死滅して増殖しない。これを次の２つの方法を組み合わせて、回避した。一つは分散浮遊培養時の細胞死を抑制することを本発明者らが報告したＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２；渡辺ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７）を培養開始時から培地に添加することである。もう一つは細胞増殖を亢進させるためインシュリンを添加することである。しかし、後者は視床下部への分化誘導を阻害する可能性があるため、その阻害効果に拮抗するＡｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩを培地に添加した。この改良によりヒトＥＳ細胞をＳＦＥＢｑ法により培養し、増殖させることができる。
具体的には、実施例１３の分化培地に７μｇ／ｍｌインシュリン、５０μＭ  Ｙ−２７６３２、Ｗｎｔ阻害剤Ｄｋｋ１（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、Ｎｏｄａｌ阻害剤ＳＢ４３１５４２（１μＭ；Ｓｉｇｍａ）、ＢＭＰ阻害剤ＢＭＰＲＦｃ（１μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）を添加したものを分化培地に用い、単一分散したヒトＥＳ細胞（渡辺ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｈｙ  ２００７）を６０００細胞／１５０μｌ／ウェルずつ、実施例１３と同様の方法で非細胞接着性の９６穴培養プレートに分注し、３７℃、５％ＣＯ２下に１８日間培養した。培地にはＡｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩを２μＭの濃度で培養開始９日後から添加した。次に、実施例１３の分化培地に７μｇ／ｍｌインシュリン、２μＭ  Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩを添加したものを用いて、さらに１３日間培養した。
視床下部の遺伝子マーカーの発現を定量的ＰＣＲ法で解析した。
（結果）
合計３１日間の培養後、上記の培養細胞塊の定量的ＰＣＲ法による解析では、Ｒｘ、Ｓｉｘ３、Ｖａｘ１、Ｎｋｘ２．１などの視床下部特異的遺伝子の有意の発現が検出された。一方、Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩを添加しなかったものについては、Ｒｘは５０％、Ｖａｘ１は２５％に発現が低下していた。
これらの結果は、Ｙ−２７６３２、インシュリン、Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩの追加添加により、ヒト多能性幹細胞からもＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ法で視床下部組織の分化誘導が可能であることを示す。【０２４１】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２４２】
本発明の方法によれば、神経系細胞を効率的に分化誘導できるため、神経変性疾患に対する細胞治療の応用が可能となる。また、本発明の方法によれば、従来の分化法では困難であった前脳組織（特に大脳組織）を効率的に分化誘導できるため、前脳組織に異常がある疾患に対する細胞治療の応用が可能となる。【０２４３】
さらに本発明によれば、大脳皮質神経ネットワークや層構造を有する大脳皮質組織の立体構造を試験管内で産生することが可能である。従って再生医療の分野や上述の医薬等の創薬、毒性試験などに有用な「組織材料」を提供することができる点でも極めて有用である。【０２４４】
また本発明によれば、誘導源として動物由来細胞を使用していないため、胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植を同種移植のリスクレベルまで軽減することが可能となる。【０２４５】
本発明の方法によれば、哺乳動物の多能性幹細胞から、間脳、特に視床下部ニューロンの前駆細胞を得ることができ、また、さらに分化成熟した細胞を得ることができる。視床下部は中枢性尿崩症など内分泌異常、摂食障害（拒食症、過食症）、睡眠障害などの医学的に重要な疾患の責任部位であり、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞からそれらの組織を試験管内で産生できれば、再生医療のみならず、内分泌異常、摂食障害、睡眠障害などに対する創薬や安全性試験に役立つことが期待される。【０２４６】
本出願は、日本で２００８年６月６日に出願された特願２００８−１４９８８０及び２００８年１０月３１日に出願された特願２００８−２８２２９９を基礎としており、それらの内容は本明細書中に援用される。
【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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