(57)【要約】本発明は、エクオール合成の関与する酵素、前記酵素をコードする遺伝子及びこれらを用いてエクオール及びその中間体を製造する方法を提供することを目的とする。ジヒドロダイゼイン合成酵素、テトラヒドロダイゼイン合成酵素、及びエクオール合成酵素、並びにこれらをコードする遺伝子を提供する。更に、これらの酵素を用いてジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン、及び／又はエクオールを合成する方法を提供する。
2009084603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチド：
(Ca)配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Cb)配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド；
(Cc)配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の(Cd)〜(Cf)のいずれかであるポリヌクレオチド：
(Cd)配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ce)配列番号１３に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
テトラヒドロダイゼインに対して、請求項１に記載のポリペプチドを作用させる工程を含む、エクオールの製造方法。
【請求項４】
以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチド：
(Ba)配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Bb)配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Bc)配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
以下の(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチド：
(Bd)配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Be)配列番号７に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
ジヒドロダイゼインに対して、請求項４に記載のポリペプチド、並びにNADPH及び／又はNADHを作用させる工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法。
【請求項７】
以下の(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチド：
(Aa)配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Ab)配列番号１に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Ac)配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
以下の(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチド：
(Ad)配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ae)配列番号１に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
ダイゼインに対して、請求項７に記載のポリペプチド、並びにNADPH及び／又はNADHを作用させる工程を含む、ジヒドロダイゼインの製造方法。
【請求項１０】
以下の（第１工程）及び（第２工程）を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法：
（第１工程）ダイゼインに、以下の(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、及びＮＡＤＰＨを作用させることにより、ジヒドロダイゼインを生成する工程；
(Aa)配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Ab)配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Ac)配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
（第２工程）ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成する工程；
(Ba)配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Bb)配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Bc)配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
【請求項１１】
以下の（第２工程）及び（第３工程）を含む、エクオールの製造方法：
（第２工程）ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成する工程；
(Ba)配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Bb)配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Bc)配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
（第３工程）テトラヒドロダイゼインに、以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを作用させることにより、エクオールを製造する工程、
(Ca)配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Cb)配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド；
(Cc)配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。
【請求項１２】
（第１工程）〜（第３工程）を含む、エクオールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド、ジヒドロダイゼインを基質としてテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド、及びテトラヒドロダイゼインを基質としてエクオールを合成する活性を有するポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。更に、本発明は、前記ポリペプチドを利用したジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン、及びエクオールの製造方法、並びにそれに利用される製造装置に関し、これらに関連した技術を提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来、イソフラボン誘導体は、生理学的又は薬学的に様々な効能があると考えられており、食品原料や医薬品原料として利用されている。しかしながら、イソフラボン誘導体に関する機能が解明されるに連れて、従来信じられていたようにイソフラボン誘導体のみがエストロジェン様の効果を示すのではなく、種々の腸内細菌によりこれら誘導体が菌体内で代謝(生合成)を受けた後に、より強いエストロジェン様の作用を有するエクオールが産生され、このエクオールが菌体外に放出された後腸管から吸収されることによりエストロジェン作用を全身的に発揮しているものと報告されるに至っている。而るに、全てのヒトにおいて腸内でエクオールを産生する能力があるわけではなく、エクオール産生能はヒトによって個人差がある。例えば、腸内にエクオール産生菌を有していないヒトや腸内にエクオール産生菌を有していてもそのエクオール産生能が低いヒトもいる。【０００３】
そこで、エクオールを体内で有効に利用させることは、高齢化社会を迎えたわが国などでは、特に骨粗鬆症を代表とする慢性老人性疾患への対応の面からも重要である。そして、上述したようにエクオール産生腸内細菌を内在しているヒトと、いないヒトが存在するという現実を考えれば、エクオールの効率的な人的生産を念頭に置き、その材料作りに対しても目を向けなければならない。【０００４】
このような背景の下、エクオール合成原料の供給という面で、当該生合成経路に関係する酵素の同定およびその利用は極めて重要である。しかしながら、これら生合成経路において関連するいくつかの中間生成物を生産或いは触媒する酵素に関する情報は全くなく、関連酵素の同定が望まれていた。
【特許文献１】特開２００６−２９６４３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、エクオール合成の原料となるジヒドロダイゼイン合成に携わる酵素を提供することを目的とする。具体的には、本発明は、ダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチドを提供することを目的とする。更に、本発明は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチドを利用したジヒドロダイゼインの合成に関する技術等を提供することを目的とする。【０００６】
また、本発明は、エクオール合成の原料となるテトラヒドロダイゼイン合成に携わる酵素を提供することを目的とする。具体的には、本発明は、ジヒドロダイゼインを基質としてテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチドを提供することを目的とする。更に、本発明は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチドを利用したテトラヒドロダイゼインの合成に関する技術等を提供することを目的とする。【０００７】
さらに、本発明は、エクオール合成に携わる酵素を提供することを目的とする。具体的には、本発明は、テトラヒドロダイゼインを基質としてエクオールを合成する活性を有するポリペプチドを提供することを目的とする。更に、本発明は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチドを利用したエクオールの合成に関する技術等を提供することを目的とする。【０００８】
さらに、本発明は、ダイゼインからエクオールを製造するにあたり生成されるジヒドロダイゼインやテトラヒドロダイゼインという中間体の製造方法、及び得られた中間体を利用できるエクオールの製造方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、これらの製造に利用される製造装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力を重ねた結果、エクオール産生腸内細菌より、エクオール合成の原料となる、ジヒドロダイゼインを合成することのできる酵素、テトラヒドロダイゼインを合成することのできる酵素、及びエクオールを合成することのできる酵素を単離し、これらの構造を明らかにすることに成功した。また、本願発明者らは、更なる研究を重ね、前記の酵素を利用して、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン、エクオールを人為的に製造することに成功した。本発明は、かかる知見に基づいて更に改良を重ねることにより完成したものである。【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する：
項Ａ１．  以下の(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチド：
(Aa)配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Ab)配列番号１に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Ac)配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
項Ａ２．  以下の(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチド：
(Ad)配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ae)配列番号１に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項Ａ３．  項Ａ２に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
項Ａ４．  項Ａ３に記載の発現ベクターによって形質転換された組換え細胞。
項Ａ５．  組換え細胞が細菌性原核細胞である、項Ａ４に記載の組換え細胞。
項Ａ６．  細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項Ａ５に記載の組換え細胞。
項Ａ７．  項Ａ４乃至Ａ６のいずれかに記載の細胞を培養し、ダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドを得る工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
項Ａ８．  項Ａ７に記載の製造方法により得られるポリペプチド。
項Ａ９．  ダイゼインに対して、項Ａ１又はＡ８に記載のポリペプチド、並びにNADPH及び／又はNADHを作用させる工程を含む、ジヒドロダイゼインの製造方法。
項Ａ１０．  ダイゼインに、項Ａ４乃至Ａ６のいずれかに記載の細胞を作用させる工程を含む、ジヒドロダイゼインの製造方法。
項Ａ１１．  項Ａ１に記載のポリペプチド、又は項Ａ２に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに結合性を有する抗体。
項Ａ１２．  項Ａ１１に記載の抗体を被験試料に接触させる工程を含む、項Ａ１に記載のポリペプチド又は項Ａ２に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法。
項Ａ１３．  検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項Ａ１２に記載の方法。
項Ａ１４．  項Ａ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項Ａ２に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プローブ。
項Ａ１５．  項Ａ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項Ａ２に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プライマー。
項Ａ１６．  項Ａ１４に記載のプローブを用いて、項Ａ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項Ａ２に記載のポリヌクレオチドを検出又は測定する方法。
項Ａ１７．  検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項Ａ１６に記載の方法。
項Ａ１８．  項Ａ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、項Ａ２に記載のポリヌクレオチド又はこれらの一部をPCRにより増幅させる工程を含む、項Ａ１６に記載の方法。
項Ａ１９．  項Ａ１記載のポリペプチド、又は項Ａ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを含有することを特徴とする、ジヒドロダイゼイン合成酵素組成物。
項Ａ２０．  更にNADPH及び／又はNADHを含む、項Ａ１９に記載の組成物。
項Ａ２１．  (Ai)項Ａ１記載のポリペプチド、又は項Ａ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、(Aii)NADPH及び／又はNADH、及び(Aiii)ダイゼインを含有することを特徴とする、ジヒドロダイゼイン合成原料組成物。
項Ａ２２．  (Aiv)項Ａ４乃至Ａ６のいずれかに記載の細胞、及び(Aiii)ダイゼインを含有することを特徴とする、ジヒドロダイゼイン合成原料組成物。
項Ａ２３．  (Ai)項Ａ１記載のポリペプチド、又は項Ａ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、(Aii)NADPH及び／又はNADH、及び(Aiii)ダイゼインを含む、ジヒドロダイゼイン合成用キット。
項Ａ２４．  (Aiv)項Ａ４乃至６のいずれかに記載の細胞、及び(Aiii)ダイゼインを含む、ジヒドロダイゼイン合成用キット。
項Ａ２５．  少なくとも項Ａ１１に記載の抗体を含む、項Ａ１記載のポリペプチド、又は項Ａ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを測定するための免疫学的測定用キット。
項Ａ２６．  少なくとも項Ａ１５に記載のプライマーを含む、項Ａ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項Ａ２に記載のポリヌクレオチドの検出用PCR用キット。
項Ａ２７．  項Ａ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項Ａ２に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞の同定用である、項Ａ２６に記載の同定用キット。
項Ａ２８．  PCR用のキットである、項Ａ２７に記載の同定用キット。
項Ａ２９．  項Ａ１に記載のポリペプチドからなる、ジヒドロダイゼイン合成酵素。
項Ｂ１．  以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチド：
(Ba)配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Bb)配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Bc)配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
項Ｂ２．  以下の(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチド：
(Bd)配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Be)配列番号７に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
；
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項Ｂ３．  項Ｂ２に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
項Ｂ４．  項Ｂ３に記載の発現ベクターによって形質転換された組換え細胞。
項Ｂ５．  組換え細胞が細菌性原核細胞である、項Ｂ４に記載の組換え細胞。
項Ｂ６．  細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項Ｂ５に記載の組換え細胞。
項Ｂ７．  項Ｂ４乃至Ｂ６のいずれかに記載の細胞を培養し、ジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドを得る工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
項Ｂ８．  項Ｂ７に記載の製造方法により得られるポリペプチド。
項Ｂ９．  ジヒドロダイゼインに対して、項Ｂ１又はＢ８に記載のポリペプチド、並びにNADPH及び／又はNADHを作用させる工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法。
項Ｂ１０．  ジヒドロダイゼインに、項Ｂ４乃至Ｂ６のいずれかに記載の細胞を作用させる工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法。
項Ｂ１１．  項Ｂ１に記載のポリペプチド、又は項Ｂ２に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに結合性を有する抗体。
項Ｂ１２．  項Ｂ１１に記載の抗体を被験試料に接触させる工程を含む、項Ｂ１に記載のポリペプチド又は項Ｂ２に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法。
項Ｂ１３．  検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項Ｂ１２に記載の方法。
項Ｂ１４．  項Ｂ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項Ｂ２に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プローブ。
項Ｂ１５．  項Ｂ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はＢ項２に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プライマー。
項Ｂ１６．  項Ｂ１４に記載のプローブを用いて、項Ｂ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項Ｂ２に記載のポリヌクレオチドを検出又は測定する方法。
項Ｂ１７．  検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項Ｂ１６に記載の方法。
項Ｂ１８．  項Ｂ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、項Ｂ２に記載のポリヌクレオチド又はこれらの一部をPCRにより増幅させる工程を含む、項Ｂ１６に記載の方法。
項Ｂ１９．  項Ｂ１記載のポリペプチド、又は項Ｂ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを含有することを特徴とする、テトラヒドロダイゼイン合成酵素組成物。
項Ｂ２０．  更にNADPH及び／又はNADHを含む、項Ｂ１９に記載の組成物。
項Ｂ２１．  (Bi)項Ｂ１記載のポリペプチド、又は項Ｂ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、(Bii)NADPH及び／又はNADH、並びに(Biii)ジヒドロダイゼインを含有することを特徴とする、テトラヒドロダイゼイン合成原料組成物。
項Ｂ２２．  (Biv)項Ｂ４乃至６のいずれかに記載の細胞、及び(Biii)ジヒドロダイゼインを含有することを特徴とする、テトラヒドロダイゼイン合成原料組成物。
項Ｂ２３．  (Bi)項Ｂ１記載のポリペプチド、又は項Ｂ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、(Bii)NADPH及び／又はNADH、並びに(Biii)ジヒドロダイゼインを含む、テトラヒドロダイゼイン合成用キット。
項Ｂ２４．  (Biv)項Ｂ４乃至６のいずれかに記載の細胞、及び(Biii)ジヒドロダイゼインを含む、テトラヒドロダイゼイン合成用キット。
項Ｂ２５．  少なくとも項Ｂ１１に記載の抗体を含む、項Ｂ１記載のポリペプチド、又は項Ｂ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを測定するための免疫学的測定用キット。
項Ｂ２６．  少なくとも項Ｂ１５に記載のプライマーを含む、項Ｂ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項Ｂ２に記載のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの検出用PCR用キット。
項Ｂ２７．  項Ｂ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項Ｂ２に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞の同定用である、項Ｂ２６に記載の同定用キット。
項Ｂ２８．  PCR用のキットである、項Ｂ２７に記載の同定用キット。
項Ｂ２９．  項Ｂ１に記載のポリペプチドからなる、テトラヒドロダイゼイン合成酵素。
項Ｃ１．  以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチド：
(Ca)配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Cb)配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド；
(Cc)配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。
項Ｃ２．  以下の(Cd)〜(Cf)のいずれかであるポリヌクレオチド：
(Cd)配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ce)配列番号１３に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項Ｃ３．  項Ｃ２に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
項Ｃ４．  項Ｃ３に記載の発現ベクターによって形質転換された組換え細胞。
項Ｃ５．  組換え細胞が細菌性原核細胞である、項Ｃ４に記載の組換え細胞。
項Ｃ６．  細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項Ｃ５に記載の組換え細胞。
項Ｃ７．  項Ｃ４乃至Ｃ６のいずれかに記載の細胞を培養し、テトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドを得る工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
項Ｃ８．  項Ｃ７に記載の製造方法により得られるポリペプチド。
項Ｃ９．  テトラヒドロダイゼインに対して、項Ｃ１又はＣ８に記載のポリペプチドを作用させる工程を含む、エクオールの製造方法。
項Ｃ１０．  テトラヒドロダイゼインに、項Ｃ４乃至Ｃ６のいずれかに記載の細胞を作用させる工程を含む、エクオールの製造方法。
項Ｃ１１．  項Ｃ１に記載のポリペプチド、又は項Ｃ２に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに結合性を有する抗体。
項Ｃ１２．  項Ｃ１１に記載の抗体を被験試料に接触させる工程を含む、項Ｃ１に記載のポリペプチド又は項Ｃ２に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法。
項Ｃ１３．  検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項Ｃ１２に記載の方法。
項Ｃ１４．  項Ｃ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項Ｃ２に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プローブ。
項Ｃ１５．  項Ｃ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項Ｃ２に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プライマー。
項Ｃ１６．  項Ｃ１４に記載のプローブを用いて、項Ｃ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項Ｃ２に記載のポリヌクレオチドを検出又は測定する方法。
項Ｃ１７．  検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項Ｃ１６に記載の方法。
項Ｃ１８．  項Ｃ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、項Ｃ２に記載のポリヌクレオチド又はこれらの一部をPCRにより増幅させる工程を含む、項Ｃ１６に記載の方法。
項Ｃ１９．  項Ｃ１記載のポリペプチド、又は項Ｃ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを含有することを特徴とする、エクオール合成酵素組成物。
項Ｃ２０．  (Ci)項Ｃ１記載のポリペプチド、又は項Ｃ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、並びに(Cii)テトラヒドロダイゼインを含有することを特徴とする、エクオール合成原料組成物。
項Ｃ２１．  (Ciii)項Ｃ４乃至Ｃ６のいずれかに記載の細胞、及び(Cii)テトラヒドロダイゼインを含有することを特徴とする、エクオール合成原料組成物。
項Ｃ２２．  (Ci)項Ｃ１記載のポリペプチド、又は項Ｃ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、並びに(Cii)テトラヒドロダイゼインを含む、エクオール合成用キット。
項Ｃ２３．  (Ciii)項Ｃ４乃至Ｃ６のいずれかに記載の細胞、及び(Cii)テトラヒドロダイゼインを含む、エクオール合成用キット。
項Ｃ２４．  少なくとも項Ｃ１１に記載の抗体を含む、項Ｃ１記載のポリペプチド、又は項Ｃ２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを測定するための免疫学的測定用キット。
項Ｃ２５．  少なくとも項Ｃ１５に記載のプライマーを含む、項Ｃ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項Ｃ２に記載のポリヌクレオチドの検出用PCR用キット。
項Ｃ２６．  項Ｃ１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項Ｃ２に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞の同定用である、項Ｃ２５に記載の同定用キット。
項Ｃ２７．  PCR用のキットである、項Ｃ２６に記載の同定用キット。
項Ｃ２８．  項Ｃ１に記載のポリペプチドからなる、エクオール合成酵素。
項Ｄ１．以下の（第１工程）及び（第２工程）を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法：
（第１工程）ダイゼインに、以下の(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを用させることにより、ジヒドロダイゼインを生成する工程；
(Aa)配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Ab)配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Ac)配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
（第２工程）ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成する工程；
(Ba)配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Bb)配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Bc)配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
項Ｄ２．項Ｄ１に記載の方法により製造された、テトラヒドロダイゼインを含有する生成物。
項Ｄ３．以下の（第２工程）及び（第３工程）を含む、エクオールの製造方法：
（第２工程）ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成する工程；
(Ba)配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Bb)配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Bc)配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
（第３工程）テトラヒドロダイゼインに、以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを作用させることにより、エクオールを製造する工程、
(Ca)配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Cb)配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド；
(Cc)配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。
項Ｄ４．項Ｄ３に記載の方法により製造された、エクオールを含有する生成物。
項Ｄ５．（第１工程）〜（第３工程）を含む、エクオールの製造方法。
項Ｄ６．項Ｄ５に記載の方法により製造された、エクオールを含有する生成物。
項Ｄ７．以下の(Ad)〜(Af)、(Bd)〜(Bf)及び(Cd)〜(Cf)からなる群より選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを有する発現ベクター：
(Ad)配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ae)配列番号１に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Bd)配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Be)配列番号７に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Cd)配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ce)配列番号１３に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項Ｄ８．項Ｄ７に記載の発現ベクターによって形質転換された組換え細胞。
項Ｄ９．組換え細胞が細菌性原核細胞である、項Ｄ８に記載の組換え細胞。
項Ｄ１０．細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項Ｄ９に記載の組換え細胞。
項Ｄ１１．以下の（第４工程）〜（第６工程）の少なくとも２つの工程を含む、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造方法：
（第４工程）(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞をダイゼインを含有する培地で培養することにより、ジヒドロダイゼインを生成させる工程、
(Ad)配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ae)配列番号１に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（第５工程）(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞をジヒドロダイゼインを含有する培地で培養することにより、テトラヒドロダイゼインを生成させる工程、
(Bd)配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Be)配列番号７に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（第６工程）(Cd)〜(Cc)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞をテトラヒドロダイゼインを含有する培地で培養することにより、エクオールを生成させる工程、
(Cd)配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ce)配列番号１３に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ここで、(Ad)〜(Af)、(Bd)〜(Bf)及び(Cd)〜(Cf)からなる群より選択されるポリヌクレオチドの少なくとも２つが一つの組換え細胞内にあってもよい。
項Ｄ１２．組換え細胞が細菌性原核細胞である、項Ｄ１１に記載の製造方法。
項Ｄ１３．細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項Ｄ１２に記載の製造方法。
項Ｄ１４．項Ｄ１１〜Ｃ１３のいずれかに記載の方法により製造された、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールを含有する生成物。
項Ｄ１５．以下の（第１反応槽）〜（第３反応槽）の少なくとも１つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造装置：
（第１反応槽）(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素が固定されている反応手段を有しており、該ポリペプチドからなる酵素を用いてダイゼインからジヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のダイゼインと接触できるように配置されている；
（第２反応槽）(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素が固定されている反応手段を有しており、該ポリペプチドからなる酵素を用いてジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のジヒドロダイゼインと接触できるように配置されている；
（第３反応槽）(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素が固定されている反応手段を有しており、該ポリペプチドからなる酵素を用いてテトラヒドロダイゼインからエクオールを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のテトラヒドロダイゼインと接触できるように配置されている；
ここで、前記反応手段の少なくとも２つは一つの反応槽に共に存在していてもよい。
項Ｄ１６．以下の（第４反応槽）〜（第６反応槽）の少なくとも１つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造装置：
（第４反応槽）(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞が固定されている反応手段を有しており、該反応手段を用いてダイゼインからジヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のダイゼインと接触できるように配置されている；
（第５反応槽）(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞が固定されている反応手段を有しており、該反応手段を用いてジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のジヒドロダイゼインと接触できるように配置されている；
（第６反応槽）(Cd)〜(Cf)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞が固定されている反応手段を有しており、該反応手段を用いてテトラヒドロダイゼインからエクオールを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のテトラヒドロダイゼインと接触できるように配置されている；
ここで、前記反応手段の少なくとも２つが一つの反応槽に共に存在していてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリペプチドによれば、（１）ダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成すること、（２）ジヒドロダイゼインを基質としてテトラヒドロダイゼインを合成すること、及び（３）テトラヒドロダイゼインを基質としてエクオールを合成することができる。従って、本発明は、ダイゼインからエクオールを製造する際に出現し得る中間体であるジヒドロダイゼイン及び／又はテトラヒドロダイゼインの工業的な合成、更にはエクオールの工業的な合成を実現する上で有用である。従来、エクオール産生菌については取り扱いが困難な嫌気性菌株しか見出されていないが、本発明によって、従来のエクオール産生菌を使用せずとも、エクオールの工業的製造への道が開かれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書におけるアミノ酸、ポリペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(特許庁編)および当該分野における慣用記号に従うものとする。【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
Ａ：ジヒドロダイゼイン合成酵素
本項では、ジヒドロダイゼイン合成酵素（以下、E1酵素と表記する場合もある）について詳しく説明する。ジヒドロダイゼイン合成酵素に関する一般的な説明は、別段の記載がされる場合を除き、後述するテトラヒドロダイゼイン合成酵素及びエクオール合成酵素についても適用される。【００１４】
Ａ−１．ポリペプチド
本発明は、ダイゼインを基質として利用し、ジヒドロダイゼインを合成するポリペプチドとして、以下の(Aa)〜(Ac)のポリペプチド（以下、該ポリペプチドを「E1ポリペプチド」と表記することもある）を提供する：
(Aa)配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；例えば１〜２５０個、好ましくは１〜２００個、より好ましくは１〜１５０個、より好ましくは１〜１００個、より好ましくは、１〜５０個、より好ましくは1〜３０個、更に好ましくは1〜１５個、更により好ましくは1〜５個、特に好ましくは１〜４個、より特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個が挙げられる。
(Ab)配列番号１に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Ac)配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。【００１５】
上記(Ab)のポリペプチドにおいて、「1若しくは複数」の範囲は、該ポリペプチドがダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成する活性を有することを限度として特に限定されないが、このような(Ab)のポリペプチドの具体例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。配列番号１に記載されるアミノ酸配列と比較して配列番号２に記載されるアミノ酸配列は、３個のアミノ酸が置換している。配列番号１に記載のアミノ酸配列と比較して配列番号３に記載のアミノ酸配列は、１０個のアミノ酸が置換している。配列番号２に記載されるアミノ酸配列は、バクテロイデス・オバタスＥ−２３−１５株（FERM BP-6435号）由来のＥ１酵素に相当する。配列番号３に記載されるアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・コンステラタス  Ａ６Ｇ−２２５株（FERM BP-6437号）由来のＥ１酵素に相当する。【００１６】
また、上記(Ab)のポリペプチドにおけるアミノ酸の置換としては、特に制限されないが、ポリペプチドの表現型に変化を来さないという観点から、類似アミノ酸同士による置換が好ましい。具体的には、類似アミノ酸としては、以下のようにグループ分けができる：
芳香族アミノ酸：Phe、Trp、Tyr
脂肪族アミノ酸：Ala、Leu、Ile、Val
極性アミノ酸：Gln、Asn
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、His
酸性アミノ酸：Glu、Asp
水酸基を有するアミノ酸：Ser、Thr
側鎖の小さいアミノ酸：Gly、Ala、Ser、Thr、Met。【００１７】
更に、上記(Ab)のポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加は、ポリペプチドの高次構造に大きく影響しない領域やジヒドロダイゼイン合成酵素としての活性中心に阻害的影響を与えない領域で為されることが望ましい。そのような領域とは、例えば、配列番号１、２、及び３に記載のアミノ酸配列の間で保存性の低い領域及びその近辺、又はＮ末端領域又はＣ末端領域を挙げることができる。具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第４５番のロイシン、第８０番目のアスパラギン第１６７番目のバリン、第２３１番目のアスパラギン酸、第２３３番目のイソロイシン、第４３５番目のアルギニン、第４５９番目のアスパラギン酸、第４６２番目のバリン、第５２８番目のアルギニン、第５４０番目のセリン、及び第６３９番目イソロイシン、並びにこれらのアミノ酸の近辺の領域を挙げることができる。前記「近辺の領域」とは、ジヒドロダイゼイン合成酵素活性に影響を与えない範囲において、前記の特定の位置のアミノ酸を基点として、例えば、前後５個以内のアミノ酸、好ましくは前後４個以内のアミノ酸、より好ましくは前後３個のアミノ酸、特に好ましくは前後２個のアミノ酸を意味し、より特に好ましくは前後１個のアミノ酸である。【００１８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において第１１２番目〜第１１６番目のアミノ酸配列は、ＮＡＤＰＨ結合ドメインに相当すると考えられる。ＮＡＤＰＨ結合ドメインの機能を阻害しない限り、当該５個のアミノ酸からなる配列において、アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加が為されていてもよい。好ましくは、当該配列において、３個以下のアミノ酸、より好ましくは２個以下のアミノ酸、更に好ましくは１個のアミノ酸に対してそのような変異が為されていてもよく、最も好ましくは、当該アミノ酸配列には変異が為されていない。特に、第１１２番目、１１５番目及び１１６番目のアミノ酸に対しては、置換、欠失、挿入又は付加は為されていないことが好ましい。【００１９】
配列番号１に記載のアミノ酸配列における第２６０番目のヒスチジンはも上記プロトンリレーサイトに関与すると考えられる。よって、プロトンリレーサイトの機能を阻害しない限り、当該ヒスチジンは他のアミノ酸に置換されていてもよいが、好ましくは置換されていない。【００２０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第３４３番目〜第３６３番目のアミノ酸からなる配列は、Ｆｅ−Ｓクラスターモチーフに相当すると考えられる。よって、当該モチーフの機能を阻害しない限り、当該配列において任意のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されていても良いが、第３４３番目、第３４６番目、第３５０番目及び第３６３番目のシステインは変異されていないことが好ましい。当該配列における前記３個のアミノ酸以外のアミノ酸が他のアミノ酸に置換される場合は、好ましくは、４個以下のアミノ酸が置換され、より好ましくは３個以下のアミノ酸が置換され、更に好ましくは２個以下のアミノ酸が置換され、特に好ましくは１個のアミノ酸が置換されている。最も好ましくは、当該配列において、アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加は為されていない。【００２１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第３９０番目〜第４１３番目のアミノ酸からなる配列は、ＦＡＤ結合ドメインに相当すると考えられる。よって、当該ドメインの機能を阻害しない限り、当該配列において任意のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されていても良いが、第３９０番目、第３９２番目、及び第３９５番目のグリシンは、変異されていないことが好ましい。当該配列においてアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加される場合は、好ましくは４個以下のアミノ酸、より好ましくは３個以下のアミノ酸、更に好ましくは２個以下のアミノ酸、特に好ましくは１個のアミノ酸について為されていることが好ましい。最も好ましくは、当該配列においてアミノ酸の変異は為されていない。【００２２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、第５１２番目〜第５４０番目のアミノ酸からなる配列も、ＦＡＤ結合ドメインに相当すると考えられる。よって、当該ドメインの機能を阻害しない限り、当該配列において任意のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されていても良いが、第５１２番目、第５１４番目、及び第５１７番目のグリシンは、変異されていないことが好ましい。当該配列においてアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加される場合は、好ましくは４個以下のアミノ酸、より好ましくは３個以下のアミノ酸、更に好ましくは２個以下のアミノ酸、特に好ましくは１個のアミノ酸について為されていることが好ましい。最も好ましくは、当該配列においてアミノ酸配列において変異は為されいない。【００２３】
上記のような機能が想定されるアミノ酸配列領域を示すアライメントを図２６に示す。【００２４】
特定のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加させる技術は公知である。【００２５】
上記(Ac)のポリペプチドにおいて、アミノ酸の同一性は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、例えば60％以上であればよいが、通常８０％以上、好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、更に特に好ましくは９９％以上であることが望ましい。【００２６】
上記（Ac）のポリペプチドの具体例としては、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。配列番号１のアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とのアミノ酸の同一性は、９９．５％であり、配列番号１のアミノ酸配列と配列番号３のアミノ酸配列とのアミノ酸の同一性は、９８．６％である（Ｂｌａｓｔ２）。従って、本発明の好適な一実施形態において、(Ac)ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、好ましくは９８．６％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有する。【００２７】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、及びLambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）にして、他の各種パラメータもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列の同一性（identity）の値（%）を算出する。【００２８】
また、上記(Ab)及び(Ac)のポリペプチドにおいて、「ダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性」は、次のようにして確認することができる。即ち、下記組成の基質溶液中に、確認対象となるポリペプチドを0.001 mg/mLとなるように添加し、37℃で２時間インキュベートし、その後、溶液中にジヒドロダイゼインの有無を確認する。インキュベート後の溶液にジヒドロダイゼインの存在が確認された場合、そのポリペプチドは「ダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性」を有していると判定される。【００２９】
基質溶液の組成
0.1 M リン酸カリウム緩衝液 
1 mM PMSF(フェニルメチルスルフォニルフルオライド)
2 mM dithiothreitol
5 mM Sodium hydrosulfite
2 mM NADPH又はNADH
40 μM ダイゼイン  
pH 7.0 【００３０】
酵素特性
Ｅ１ポリペプチドは、ダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成する酵素活性を有する。よって、Ｅ１ポリペプチドは、Ｅ１酵素とも称される。Ｅ１酵素は、Sodium hydrosulfite等の還元剤やマンガンイオンや鉄イオン等の金属イオンの存在により、その酵素活性が賦活化される。Ｅ１酵素は、補酵素として、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを必要とし、至適温度は３０℃付近であり、至適ｐＨは７．０である。Ｅ１酵素は、ダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成するだけでなく、その逆反応、即ち、ジヒドロダイゼインを基質としてダイゼインを合成することも可能である。【００３１】
E1ポリペプチドは、後述する遺伝子工学的手法により製造することができるが、E1ポリペプチド産生能を有する微生物から単離精製することも可能である。また、E1ポリペプチドは、配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することもできる、該化学合成法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。【００３２】
以下、E1ポリペプチド産生能を有する微生物から、E1ペプチドを単離精製する方法について、説明する。先ず、E1ポリペプチド産生能を有する微生物の菌体を破砕し、該微生物の粗抽出物を得る。ここで、菌体の破砕には、フレンチプレス、セルミル等の破砕機による処理；低張溶液下超音波処理等の通常の菌体破砕処理に使用されている方法が使用される。また、得られた粗抽出物には、適当な緩衝液を添加しておいてもよい。また、E1ポリペプチドが嫌気性に馴化している場合には、得られた粗抽出物に適当な還元剤を添加し、E1ポリペプチドの失活を抑制しておくことが望ましい。得られた粗抽出物に対しては、その精製度を上げるために、更に、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール等を利用した有機溶媒沈殿、又は等電点沈殿等の精製処理に供しても良い。次いで、粗抽出物を、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、各種アフィニテイークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー等の処理に供することにより、E1ポリペプチドを含む画分を得ることができる。なお、これらのクロマトグラフィーによる処理は、必要に応じてオープンカラムを使用してもよく、またHPLCを使用してもよい。また、斯くして得られたE1ポリペプチドを含む画分の純度については、電気泳動、特にSDS-PAGEによって、可視的に簡便に推定できる。また、E1ポリペプチドは、アミノ酸配列分析法；MALDI-TOF MS、ESI Q-TOF MS又はMALDI Q-TOF MS等の質量分析装置を利用した質量分析法；ペプチドマスフィンガープリンティング法等によって確認することもできる。【００３３】
また、ここで、E1ポリペプチド産生能を有する微生物は、ダイゼインを所定量含有する培地（特に限定されないが、例えば0.01μg/mＬ以上含有する培地）で培養されることが、効率的にE1ペプチドを産生させる点で望ましい。【００３４】
また、E1ポリペプチドは、単量体として存在しても良いが、ジヒドロダイゼイン合成能を有する限り、2量体又はそれ以上の多量体として存在してもよい。また、E1ポリペプチドは、安定性を向上させる目的等で、必要に応じて、ポリエチレングリコール又は糖鎖を付加修飾されたものであってもよい。【００３５】
E1ポリペプチドは、ダイゼインを基質として、ジヒドロダイゼインに変換する触媒的役割を演じることができる。該ジヒドロダイゼインは、後述するテトラヒドロダイゼイン合成酵素（Ｅ２酵素）及びエクオール合成酵素（Ｅ３酵素）によってエクオールに変換される。エクオールは生体内において、種々の生理作用を発揮するものと考えられており、その意味において、エクオールの合成原料を提供できるE1ポリペプチドは重要であると言える。【００３６】
Ａ−２．ポリヌクレオチド
本発明は、更に、ダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、該ポリヌクレオチドを「E1ポリヌクレオチド」と表記することもある）を提供する。具体的には、E1ポリヌクレオチドとして、以下の(Ad)〜(Af)のポリヌクレオチドを提供する：
(Ad)配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ae)配列番号１に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００３７】
配列番号１に記載のアミノ酸配列は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に相当する。配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に相当する。配列番号３に記載のアミノ酸配列は、配列番号６に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に相当する。【００３８】
上記(Af)のポリヌクレオチドにおいて、「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする」とは、標準的なハイブリダイゼーション条件下に、２つのポリヌクレオチド断片が互いにハイブリダイズできることを意味し、本条件は、Sambrook et al., Molecular Cloning : A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAに記載されている。より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、6.0x SSC中で、約45℃にてハイブリダイゼーションを行い、そして2.0x SSCによって50℃にて洗浄することを意味する。このような上記（Aｆ）のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５に記載のヌクレオチド配列及び配列番号６に記載のヌクレオチド配列を挙げることができる。【００３９】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、通常、プローブとして使用するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と一定以上の相同性を有する。その相同性は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、更に特に好ましくは９８％以上である。ヌクレオチド配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastnを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出する。【００４０】
配列番号４のヌクレオチド配列と配列番号５のヌクレオチド配列との塩基配列の相同性は、９９．６％であり、配列番号４のヌクレオチド配列と配列番号６のヌクレオチド配列との塩基配列の相同性は、９７．６％である（Ｂｌａｓｔ２）。従って、本発明の好適な一実施形態において、(Af)のポリヌクレオチドは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列に対して、９７．６％以上の相当性を有し、より好ましくは９９．６％以上の相当性を有することが好ましい。【００４１】
また、上記(Af)のポリヌクレオチドにおいて、「ダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性」は、上記(Ab)又は(Ac)のポリペプチドの場合と同様の方法で確認される。【００４２】
E1ポリヌクレオチドは、配列番号４、５、又は６の配列情報に基づいて、化学的DNA合成法により製造、取得することができるが、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）等参照〕。【００４３】
化学的DNA合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。【００４４】
また、一般的遺伝子工学的手法としては、具体的には、E1ポリヌクレオチドが発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、E1ポリヌクレオチドに特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science122, 778 (1983)等〕。【００４５】
ここで、ｃＤＮＡの起源としては、E1ポリヌクレオチドを発現する生物であれば特に制限されないが、具体的には、エクオール産生能を有する微生物、好ましくはエクオール産生能を有する乳酸菌、バクテロイデス属に属する菌及びストレプトコッカス属に属する菌、更に好ましくはエクオール産生能を有するラクトコッカス・ガルビエ、バクテロイデス・オバタス、及びストレプトコッカス・コンステラタス、特に好ましくはエクオール産生能を有する糞便由来のラクトコッカス・ガルビエ、特にエクオール産生能を有する糞便由来のラクトコッカス・ガルビエであるラクトコッカス20-92株（FERM BP-10036号；独立行政法人産業技術綜合研究所  特許生物寄託センターにて寄託）、バクテロイデス・オバタスＥ−２３−１５株（FERM BP-6435号；独立行政法人産業技術綜合研究所  特許生物寄託センターにて寄託）、ストレプトコッカス・コンステラタス  Ａ６Ｇ−２２５株（FERM BP-6437号；独立行政法人産業技術綜合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号）にて寄託）が例示される。【００４６】
また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施することができる。また、本発明のポリヌクレオチドをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を例示できる。【００４７】
ここで用いられるプローブとしては、E1ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に関する情報（例えば、配列番号４、５、又は６のヌクレオチド配列）をもとにして化学合成されたＤＮＡ等が一般的に例示できる。また、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づき設定したセンスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。【００４８】
E1ポリヌクレオチドの取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science130, 1350 (1985)〕またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕等の採用が好適である。これらＲＡＣＥ法及び５’−ＲＡＣＥ法は、真核生物由来のＥ１ポリヌクレオチドを取得する際に有用である。【００４９】
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、E1ポリヌクレオチドの配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。【００５０】
E1ポリヌクレオチドによれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、該ポリヌクレオチドの産物（即ち、上記ポリペプチド）を容易に大量に、安定して製造することができる。従来、エクオール産生菌については取り扱いが困難な嫌気性菌株しか見出されていないが、E1ポリヌクレオチドの単離に成功したことによって、従来のエクオール産生菌を使用せずとも、エクオールの工業的生産への道が開かれる。【００５１】
Ａ−３．発現ベクター
本発明の発現ベクターは、E1ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ該E1ポリヌクレオチドを発現できるものであれば特に制限されず、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。【００５２】
宿主細胞として原核生物の細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、例えば該宿主細胞中で複製可能なプラスミドベクターであって、このベクター中に上記ポリヌクレオチドが発現できるように上記ポリヌクレオチドの上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列を付与した発現プラスミドを挙げることができる。具体的には、PLプロモーター、T7プロモーターおよびlacプロモーターを利用した発現プラスミドを挙げることができる。他の好ましい細菌発現ベクターとしてはtacプロモーター又はtrcプロモーターを利用したプラスミドpKK233−２及びpKK233−３等を挙げることができる。ただし、これらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターをも利用できる。【００５３】
また、宿主細胞として真核細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、通常発現しようとする上記ポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。上記ポリヌクレオチドを挿入するのに有用な真核生物ベクターはよく知られている。例えば、適当な真核生物ベクターとしてはpCD及びpCMVを例示することができる。また、これらの他には、必要に応じて、MMTV又はSV40後期プロモーターを利用したpMSG及びpSVLを挙げることができる。ただし、これらに限定されず公知の各種の真核生物及びベクターをも利用できる。【００５４】
Ａ−４．組み換え細胞
本発明は、上記E1ポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換された組み換え細胞（形質転換体）を提供する。【００５５】
組み換え細胞に使用される宿主細胞としては、原核細胞及び真核細胞のいずれを使用してもよい。【００５６】
宿主細胞として使用される原核細胞としては、ラクトコッカス属に属する乳酸菌等の細菌性原核細胞を好適に使用できるが、他に、好気的条件下で生育可能な細菌性原核細胞（例えば、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等）を例示することができる。【００５７】
宿主細胞として使用される真核細胞としては、例えば、酵母、アスペルギルス等の真核微生物；ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞；Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞等を例示することができる。【００５８】
また、上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、特に制限されず、一般的な各種方法を採用することができる。例えば、上記発現ベクターの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  １９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）等の多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法に従って行うことができ、その具体的手法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング  （ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等が挙げられる。【００５９】
該組み換え細胞は、ジヒドロダイゼイン変換酵素であるE1ポリペプチドを産生できるので、ジヒドロダイゼイン変換酵素の製造のために利用することができ、また細胞の状態のままジヒドロダイゼインの製造に利用することもできる。【００６０】
Ａ−５．組み換え細胞を用いたポリペプチドの製造
E1ポリヌクレオチドが導入された組み換え細胞を培養し、細胞及び又は培養物からE1ポリペプチドを回収することにより、E1ポリペプチドを製造することができる。【００６１】
培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行えばよい。培養は、組み換え細胞の内外に生産されたE1ポリペプチド量を指標にして、E1ポリペプチドが適当量得られるまで行えばよい。【００６２】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。【００６３】
また、斯くして得られるE1ポリペプチドは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987) 等参照〕により分離、精製できる。具体的には、上記「Ａ−１．ポリペプチド」の欄に記載の「E1ポリペプチド産生能を有する微生物から、E1ペプチドを単離精製する方法」と同様の方法が例示される。【００６４】
Ａ−６．E1ポリペプチドを用いたジヒドロダイゼインの製造
本発明は、E1ポリペプチドを用いたジヒドロダイゼインの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、E1ポリペプチドを、NADPH及び／又はNADHの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。好ましくは、E1ポリペプチドを、NADPHの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。【００６５】
Ｅ１ポリペプチドのジヒドロダイゼイン合成酵素活性は、Ｍｎ２＋及びＦｅ２＋の存在によって賦活されるため、Ｍｎ２＋及び／又はＦｅ２＋の存在下でＥ１ペプチドをダイゼインに作用させることが好ましい。Ｅ１ポリペプチドの当該酵素活性を賦活することができる限りＭｎ２＋及び／又はＦｅ２＋の反応溶液における濃度は特に制限されない。Ｆｅ２＋の濃度は、好ましくは２ｍＭ以上であり、より好ましくは２ｍＭ〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０ｍＭ〜４０ｍＭである。Ｍｎ２＋の濃度は、好ましくは０．２μＭであり、より好ましくは０．２μＭ〜１００ｍＭであり、更に好ましくは１．０μＭ〜４０ｍＭである。【００６６】
本製造方法に採用される反応は、適当な緩衝液中で行うことができる。例えば、緩衝液としては、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等を例示される。また、該反応におけるpH条件については、E1ポリペプチドの所望の酵素活性が失活しない範囲で適宜反応条件とすることができるが、好ましくはpH 5.0〜10.0、更に好ましくは6.0〜8.0を例示することができる。【００６７】
また、該反応には、必要に応じてPMSF、EDTA等のプロテアーゼ阻害剤を適当量添加していてもよい。また、上記ポリペプチドが嫌気性菌由来であることを考慮すると、DTT、2ME、DET、Sodium hydrosulfite等の還元剤を適当量添加していてもよい。【００６８】
本製造方法に採用される反応は、例えば、反応開始時に溶媒中で各成分を下記の濃度範囲を満たすように添加して原料混合物を調製し、これを20〜45℃、好ましくは25〜40℃、更に好ましくは30〜38℃の温度条件で、0.5〜10時間、好ましくは1〜6時間、更に好ましくは2〜4時間インキュベートすることにより実施される：
上記ポリペプチドが0.0001〜1.0重量％、好ましくは0.001〜0.1重量％、更に好ましくは0.001〜0.01重量％；
ダイゼインが0.0001〜10.0重量％、好ましくは0.001〜1.0重量％、更に好ましくは0.001〜0.1重量％；及び
NADPH及び／又はNADHが0.01〜5重量％、好ましくは0.05〜1重量％、更に好ましくは0.1〜0.5重量％。【００６９】
また、本発明は、ジヒドロダイゼインを合成するための混合原料として、(Ai)E1ポリペプチド、(Aii)NADPH及び／又はNADH、及び(Aiii)ダイゼインを含有するジヒドロダイゼイン合成原料組成物を提供する。更に本発明はジヒドロダイゼインを合成するための混合原料として、(Ai)E1ポリペプチド、(Aii)NADPH及び／又はNADH、(Aiii)ダイゼイン、並びに（Aiv）Ｍｎ２＋及び／又はＦｅ２＋を含有するジヒドロダイゼイン合成原料組成物を提供する。該合成原料組成物を前述する条件でインキュベートすることにより、該合成原料組成物中のダイゼインをジヒドロダイゼインに変換することができる。該合成原料組成物は、上記ジヒドロダイゼインの製造において、反応開始時の原料混合物に相当するものであり、該合成原料組成物におけるE1ポリペプチドの配合濃度、NADPH及び／又はNADHの配合濃度、ダイゼインの配合濃度、並びに該合成原料組成物に配合可能な他の成分等についても、上記製造方法に採用される反応系（反応開始時の原料混合溶液）の場合と同様である。【００７０】
更に、本発明は、ジヒドロダイゼインを合成するためのキットとして、(Ai)E1ポリペプチド、(Aii)NADPH及び／又はNADH、並びに(Aiii)ダイゼインを含有するジヒドロダイゼイン合成用キットを提供する。本発明は、ジヒドロダイゼインを合成するためのキットとして、(Ai)E1ポリペプチド、(Aii)NADPH及び／又はNADH、 (Aiii)ダイゼイン、並びに（Aiv）Ｍｎ２＋及び／又はＦｅ２＋を含有するジヒドロダイゼイン合成用キットを提供する。該合成用キットには、前述する条件でダイゼインからジヒドロダイゼインの合成を簡易に実施できるように、各成分が必要に応じて区分けされて備えられていればよい。また、該合成用キットには、必要に応じて、使用する緩衝液が含まれていても良い。更に、該合成用キットは、ジヒドロダイゼインの合成を簡易に行うために、必要となる器具や操作マニュアルを含んでいても良い。【００７１】
Ａ−７．ジヒドロダイゼイン合成酵素組成物
本発明は、更に、E1ポリペプチドを含むジヒドロダイゼイン合成酵素組成物を提供する。該酵素組成物は、E1ポリペプチドを用いたジヒドロダイゼインの製造方法において、ジヒドロダイゼイン合成酵素として好適に使用される。【００７２】
該酵素組成物は、粗精製の状態のE1ポリペプチドであってもよく、また粗精製又は精製されたE1ポリペプチドを適当な担体に配合したものであってもよい。【００７３】
該酵素組成物において、E1ポリペプチドの配合割合については、上記ジヒドロダイゼインの製造方法において、ジヒドロダイゼイン合成酵素として使用できる限り、特に制限されない。具体的には、該酵素組成物の総量当たり、E1ポリペプチドが0.001〜20.0重量％、好ましくは0.005〜5.0重量％、更に好ましくは0.01〜1.0重量％が例示される。【００７４】
該酵素組成物には、E1ポリペプチドの補酵素として作用するNADPH及び／又はNADHを含んでいても良い。該酵素組成物にNADPH及び／又はNADHを配合する場合、該NADPH及び／又はNADHの配合割合については、特に制限されないが、該酵素組成物当たり、0.0005〜25.0重量％、好ましくは0.005〜5.0重量％、更に好ましくは0.01〜2.5重量％が例示される。【００７５】
また好適な一実施形態において、該酵素組成物は、Ｍｎ２＋及び／又はＦｅ２＋を含む。該酵素組成物にＭｎ２＋及び／又はＦｅ２＋の金属イオンを含む場合、金属イオンの配合割合は、Ｅ１ポリペプチドのジヒドロダイゼイン合成酵素活性を賦活することができる限り特に制限されない。Ｆｅ２＋の配合割合は、当該組成物当たり、好ましくは２ｍＭ以上であり、より好ましくは２ｍＭ〜１００ｍＭであり、更に好ましくは１０ｍＭ〜４０ｍＭである。Ｍｎ２＋の配合割合は、当該組成物当たり、好ましくは０．２μＭ以上であり、より好ましくは０．２μＭ〜１００ｍＭであり、更に好ましくは１.０μＭ〜４０ｍＭ配合される。【００７６】
更に、該酵素組成物には、E1ポリペプチドの他に、該ポリペプチドの安定性を向上せしめるために、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール、システイン等の抗酸化剤を含んでいても良い。また、該酵素組成物の保存性を担保するために、必要に応じて、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等の保存剤を添加してもよい。【００７７】
Ａ−８．上記組み換え細胞を用いたジヒドロダイゼインの製造方法
本発明は、E1ポリヌクレオチドが導入された組み換え細胞を用いたジヒドロダイゼインの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、上記組み換え細胞を、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。【００７８】
本製造方法に採用される反応は、上記組み換え細胞が生存でき、且つダイゼインをジヒドロダイゼインに変換できる環境下で実施される。【００７９】
具体的には、上記組み換え細胞が生育可能な培地中に、上記組み換え細胞、及びダイゼインを適当量添加して培養を行うことにより実施される。【００８０】
本製造方法において、使用される培地は、組み換え細胞の宿主細胞として採用した細胞の種類に応じて、慣用される各種のものを適宜選択利用される。【００８１】
また、該培地には、必要に応じてPMSF、EDTA等のプロテアーゼ阻害剤を適当量添加していてもよい。また、上記ポリペプチドが嫌気性菌由来であることを考慮すると、DTT、2ME、DET、Sodium hydrosulfite等の還元剤を適当量添加していてもよい。また、上記組み換え細胞を利用する場合、NADPH及び／又はNADHの添加は、必須ではないが、必要に応じて、培地中にNADPH及び／又はNADHを添加しても良い。更に、該培地には、Ｍｎ２＋及び／又はＦｅ２＋を添加してもよい。【００８２】
本製造方法は、具体的には、ダイゼインを0.001〜1重量％、好ましくは0.01〜1重量％、更に好ましくは0.01〜0.5重量％を含む培地に、上記組み換え細胞を接種し、生育可能温度条件下で6〜30時間、好ましくは7〜24時間、更に好ましくは7〜18時間インキュベートすることにより実施される。【００８３】
また、本発明は、ジヒドロダイゼインを合成するための混合原料として、(Aiv)上記組み換え細胞、及び(Aiii)ダイゼインを含有するジヒドロダイゼイン合成原料組成物を提供する。該合成原料組成物を前述する条件で培養することにより、該合成原料組成物中のダイゼインをジヒドロダイゼインに変換することができる。該合成原料組成物は、上記ジヒドロダイゼインの製造において、反応開始時の原料混合物に相当するものであり、該合成原料組成物における上記組み換え細胞、及びダイゼインの濃度、並びに該合成原料組成物に配合可能な他の成分等についても、上記製造方法に採用される条件等と同様である。【００８４】
更に、本発明は、ジヒドロダイゼインを合成するためのキットとして、(Aiv)上記組み換え細胞、及び(Aiii)ダイゼインを含有するジヒドロダイゼイン合成用キットを提供する。また、本発明は、ジヒドロダイゼインを合成するためのキットとして、(Aiv)上記組み換え細胞、 (Aiii)ダイゼイン、並びに（Aiv）Ｍｎ２＋及び／又はＦｅ２＋を含有するジヒドロダイゼイン合成用キットを提供する。該合成用キットには、前述する条件でダイゼインからジヒドロダイゼインの合成を簡易に実施できるように、上記組み換え細胞とダイゼインが、必要に応じて区分けされて備えられていればよい。また、該合成用キットには、必要に応じて、緩衝液や培地が含まれていても良い。更に、該合成用キットは、ジヒドロダイゼインの合成を簡易に行うために、必要となる器具や操作マニュアルを含んでいても良い。【００８５】
なお、該合成用キットに含まれる上記組み換え細胞は、公知の方法で保存されたものであってもよい。組み換え細胞を保存する技術は公知であり、例えば、ジメチルホルムアミド等に組み換え細胞を入れて凍結乾燥機でアンプルが真空状態になるよう処理した後、４〜２５℃で保存する方法等を挙げることができる。この他にも、１０％グリセロール加保存培地に菌体を懸濁し、これを専用アンプルに収め、液体窒素タンク（−１５０〜−１９６℃）で保管する液体窒素法を挙げられる。【００８６】
Ａ−９．上記ポリペプチドに結合性を有する抗体
本発明は、更に、E1ポリペプチドに結合性を有する抗体(IgG抗体)を提供する。【００８７】
モノクローナル抗体は、従来法に従って作製される。具体的には、ハーローとレーン（Ｈａｒｌｏｗ，Ｈ． ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．）、「抗体：実験室マニュアル」中、コールドスプリングハーバーラボ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ）、ニューヨーク、１３９−２４０頁（１９８８）に記載の方法に従って作製することができる。【００８８】
また、ポリクローナル抗体についても、従来法に従って作製される。具体的には、細胞工学実験プロトコール（東京大学医科学研究所制癌研究部編、1992年、155〜173ページ）等に記載の方法に従って作製することができる。【００８９】
ポリクローナルIgG抗体及びモノクローナルIgG抗体とも、通常の硫酸アンモニウム沈澱法及びプロテインＡクロマトグラフィー等により精製することができる。【００９０】
Ａ−１０．上記ポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法
更に、本発明は、上記抗体を用いてE1ポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法を提供する。具体的には、該免疫学的方法は、上記抗体を被験試料に接触させることにより実施される。即ち、上記抗体を被験試料に接触させることにより、被験試料中にE1ポリペプチドが存在する場合には、上記抗体とE1ポリペプチドが特異的に結合する。次いで、E1ポリペプチドに結合した上記抗体を検出し、必要に応じてこれを定量することにより、被験試料中の上記ポリペプチドを検出又は測定することができる。【００９１】
ここで、被験試料とは、E1ポリペプチドの検出又は測定の対象となる試料である。E1ポリペプチドは、細菌性原核細胞内に見出されることが予測されるので、細菌性原核細胞内に存在するE1ポリペプチドの検出又は測定の目的に、該免疫学的方法は好適である。なお、細胞内に存在するE1ポリペプチドの検出又は測定を行う場合には、当該細胞に対して破砕処理を行ったもの、又は該破砕処理の後にタンパク質の精製処理を行ったものを被験試料として使用すればよい。【００９２】
抗体を利用した免疫学的方法によって、目的のポリペプチドを検出又は測定する手法は公知であり、当業者であれば、免疫学的方法における適当な諸条件については適宜設定可能である。例えば、ラジオイムノアッセイ法、ELISA法等を採用し、適当な条件を適宜設定すればよい。【００９３】
更に、本発明は、E1ポリペプチドを検出又は測定するためのキットとして、上記抗体を含有する免疫学的検出用キットを提供する。該検出用キットには、必要に応じて、E1ポリペプチドが標準品として含まれていてもよい。更に、該検出用キットには、前述する条件でE1ポリペプチドの検出を簡易に実施できるように、その他に使用される試薬等が、必要に応じて備えられていてもよい。また、該検出用キットは、E1ポリペプチドの検出を簡易に行うために、必要となる器具や操作マニュアルを含んでいても良い。【００９４】
Ａ−１１．上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出又は測定する方法
また、本発明は、E1ポリヌクレオチドを検出又は測定する方法を提供する。該方法は、具体的には、E1ポリヌクレオチドに結合するプローブを被験試料と接触させることにより実施される。即ち、該プローブを被験試料に接触させることにより、被験試料中にE1ポリヌクレオチドが存在する場合には、該プローブとE1ポリヌクレオチドがハイブリダイズする。次いで、この二本鎖の形成の有無を検出し、必要に応じてこれを定量することにより、被験試料中のE1ポリヌクレオチドを検出又は測定することができる。【００９５】
ここで、被験試料とは、E1ポリヌクレオチドの検出又は測定の対象となる試料である。E1ポリヌクレオチドは、細菌性原核細胞内に見出されることが予測されるので、細菌性原核細胞内に存在するE1ポリヌクレオチドの検出又は測定の目的に、該方法は好適である。なお、細胞内に存在するE1ポリヌクレオチドの検出又は測定を行う場合には、当該細胞に対して破砕処理を行ったもの、又は該破砕処理の後に核酸の精製処理を行ったものを被験試料として使用すればよい。【００９６】
また、該方法に使用されるプローブとしては、上記ポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有するものが使用される。ここで、ストリンジェントな条件とは、プローブ又はプライマーとして用いられる通常の条件を挙げることができるが、具体的には上記Ａ−２．セクションに示す条件が例示される。【００９７】
該プローブは、E1ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、配列番号４、５、又は６に記載のヌクレオチド配列）に関する情報を基にして化学合成したものであってもよく、また既に取得されたE1ポリヌクレオチドやその断片からなるものであってもよい。また、該プローブは、通常、標識したプローブを用いるが、非標識であってもよい。また、該プローブをPCR用のプライマー(センスプライマー叉はアンチセンスプライマー)として使用する場合、その長さについては、約10〜40ヌクレオチド程度、特に20〜30ヌクレオチド程度が好ましく例示される。【００９８】
該方法は、該プローブを用いて、上記ポリヌクレオチドを特異的に検出する方法としては、例えば、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲ法等が挙げられるが、感度の点からは、該プローブをプライマーとして利用したＰＣＲ法によりE1ポリヌクレオチド又はその一部を増幅する方法が好適に採用される。【００９９】
ＰＣＲ法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いられる種々の変法を適応することが出来る。ＰＣＲ法を用いて、E1ポリヌクレオチドの存在とその量を定量することも可能である。該方法としては、ＭＳＳＡ法の如き競合的定量法(Kinoshita, M.,et al., CCA, 228, 83-90 (1994))、または一本鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるＰＣＲ−ＳＳＣＰ法(Orita, Ｍ.,et al., Genomics, 5, 874-879 (1989))を例示できる。【０１００】
更に、本発明は、E1ポリヌクレオチドを検出又は測定するためのキットとして、上記プローブを含有するE1ポリヌクレオチド検出用キットを提供する。該検出用キットには、前述する条件でE1ポリヌクレオチドの検出を簡易に実施できるように、上記プローブ以外に使用される試薬等が、必要に応じて備えられていてもよい。また、該検出用キットは、E1ポリヌクレオチドを含有する細胞を同定するためのキットとして使用することもできる。また、該検出用キットとしては、精度の高い検出を可能にするという観点から、好ましくはＰＣＲによる検出を行うためのキットが挙げられる。【０１０１】
Ｂ．テトラダイゼイン合成酵素
Ｂ−１．ポリペプチド
本発明は、ジヒドロダイゼインを基質として利用しテトラヒドロダイゼインを合成するポリペプチドとして、以下の(Ba)〜(Bc)のポリペプチド（以下、該ポリペプチドを「E2ポリペプチド」と表記することもある）を提供する：
(Ba)配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Bb)配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Bc)配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。【０１０２】
上記(Bb)のポリペプチドにおいて、「１若しくは複数」の範囲は、該ポリペプチドがジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有することを限度として特に限定されないが、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、更に好ましくは１〜５個、より更に好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個、更に特に好ましくは１又は２個が挙げられる。【０１０３】
このような(Bb)のポリペプチドの具体例としては、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して配列番号８に記載のアミノ酸配列は、２個のアミノ酸配列が置換されており、Ｎ末端に２４アミノ酸からなるアミノ酸配列が付加されている。配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して配列番号９に記載のアミノ酸配列と、２０個のアミノ酸が置換されており、１個のアミノ酸が欠失している。配列番号８に記載されるアミノ酸配列は、バクテロイデス・オバタスＥ−２３−１５株（FERM BP-6435号）由来のＥ２酵素に相当する。配列番号９に記載されるアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・コンステラタス  Ａ６Ｇ−２２５株（FERM BP-6437号）由来のＥ２酵素に相当する。【０１０４】
上記（Bb）のポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加は、前記A-1.セクションに記載されるE1ポリペプチドにおける置換、欠失、挿入又は付加に準じて為され得る。(Bb)のポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加は、ポリペプチドの高次構造に大きく影響しない領域やテトラヒドロダイゼイン合成酵素としての活性中心に阻害的影響を与えない領域で為されることが望ましい。そのような領域としては、例えば、配列番号７、８、及び９に記載のアミノ酸配列の間で保存性の低い領域及びその近辺、又はＮ末端領域又はＣ末端領域を挙げることができる。具体的には、配列番号７に記載されるアミノ酸配列において、第７番目のバリン、第８番目のプロリン、第２６番目のバリン、第３６番目のロイシン、第４６番目のアルギニン、第９４番目のアスパラギン酸、第１０１番目のグルタミン酸、第１２６番目のグリシン、第１３７番目のイソロイシン、第１５６番目のグルタミン、第１５７番目のリジン、１５９番目のアスパラギン酸、第１６０番目、第１７１番目のアラニン、第１８５番目のシステイン、第２２１位番目のセリン、第２３３番目のアラニン、第２４１番目のバリン、第２５８番目のセリン、第２６６番目のイソロイシン、及び第２８６番目のバリン、並びにこれらのアミノ酸の近辺の領域を挙げることができる。前記「近辺の領域」とは、テトラヒドロダイゼイン合成酵素活性に影響を与えない範囲において、前記の特定の位置のアミノ酸を基点として、前後５個以内のアミノ酸、好ましくは、前後４個以内のアミノ酸、より好ましくは前後３個以内のアミノ酸、更に好ましくは前後２個以内のアミノ酸、特に好ましくは前後１個のアミノ酸である。【０１０５】
配列番号７に記載されるアミノ酸配列において、第３８番目〜４５番目のアミノ酸からなる配列は、ＮＡＤＰＨ結合ドメインに相当すると考えられる。よって、当該ドメインの機能が阻害されない限り、当該配列において、任意のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されていてもよいが、好ましくは、第３８番目のスレオニン、第３９番目のグリシン、第４３番目のグリシン、及び第４５番目のグリシンは変異されていないことが好ましい。当該配列においてアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加される場合は、好ましくは４個以下のアミノ酸、より好ましくは３個以下のアミノ酸、更に好ましくは２個以下のアミノ酸、特に好ましくは１個のアミノ酸について為されていることが好ましい。【０１０６】
配列番号７に記載されるアミノ酸配列において、第１１５番目〜第１１８番目のアミノ酸から成る配列は、ＳＤＲファミリーに保存性の高いモチーフに相当すると考えられる。当該配列においてアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加が為される場合は、好ましくは３個以下のアミノ酸、より好ましくは２個以下のアミノ酸、更に好ましくは１個のアミノ酸について為される。当該配列においては、アミノ酸の変異が為されないことが最も好ましい。【０１０７】
配列番号７に記載されるアミノ酸配列において、第１６８番目のセリン、第１８２番目のヒスチジン、第１８６番目のリジンは、Ｅ２酵素の活性中心に関与していると考えられる。よって、当該酵素活性を阻害しない限り、前記３個のアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換することができるが、これらのアミノ酸に対しては、変異が為されていないことが好ましい。【０１０８】
配列番号７に記載されるアミノ酸配列において、第２１２番目〜２１７番目のアミノ酸から成る配列は、補因子との結合に関与すると考えられる。よって、当該機能を阻害しない限り、当該配列において任意のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されていてもよいが、好ましくは、第２１２番目のプロリン、第２１３番目のグリシン、及び第２１７番目のスレオニンは変異されない。当該配列においてアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加される場合は、好ましくは３個以下のアミノ酸、より好ましくは２個以下のアミノ酸、更に好ましくは１個のアミノ酸ついて為されている。特に好ましくは、当該配列においてアミノ酸の変異が為されていない。上記のような機能が想定されるアミノ酸配列領域を示すアライメントを図２７に示す。【０１０９】
上記(Bc)のポリペプチドにおいて、アミノ酸の同一性は、配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して、例えば６０％以上であればよいが、通常８０％以上、好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、更に特に好ましくは９９％以上であることが望ましい。【０１１０】
上記（Bc）のポリペプチドの具体例としては、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。配列番号７に記載のアミノ酸配列と配列番号８に記載のアミノ酸配列との同一性は、９９．３％であり、配列番号７に記載のアミノ酸配列と配列番号９に記載のアミノ酸配列との同一性は、９３．０％である（Ｂｌａｓｔ２）。従って、本発明の好適な一実施形態において、(Bc)ポリペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して、好ましくは９３．０％以上、より好ましくは９９．３％以上の同一性を有する。【０１１１】
また、上記(Bb)及び(Bc)のポリペプチドにおいて、「ジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性」は、次のようにして確認することができる。即ち、下記組成の基質溶液中に、確認対象となるポリペプチドを0.001 mg/mLとなるように添加し、37℃で２時間インキュベートし、その後、溶液中にテトラヒドロダイゼインの有無を確認する。インキュベート後の溶液にテトラヒドロダイゼインの存在が確認された場合、そのポリペプチドは「ジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性」を有していると判定される。【０１１２】
基質溶液の組成
0.1 M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
1 mM PMSF(フェニルメチルスルフォニルフルオライド)
2 mM dithiothreitol
5 mM Sodium hydrosulfite
2 mM NADPH
2 mM NADH
40 μM ジヒドロダイゼイン   【０１１３】
酵素特性
Ｅ２ポリペプチドは、ジヒドロダイゼインを基質としてテトラヒドロダイゼインを合成する酵素活性を有する。よって、Ｅ２ポリペプチドは、Ｅ２酵素とも称される。Ｅ２酵素は、補酵素として、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを必要とする。Ｅ２酵素の至適温度は３７℃付近であり、至適ｐＨは４．５である。Ｅ２酵素は、ジヒドロダイゼインを基質としてテトラヒドロダイゼインを合成するだけでなく、その逆反応、即ち、テトラヒドロダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成することも可能である。【０１１４】
E2ポリペプチドは、前記E1ペプチドと同様に、配列番号１０、１１、又は１２に記載のヌクレオチド配列情報を用いて遺伝子工学的手法で得ることができる。また、配列番号７、８、又は９に記載のアミノ酸配列情報に基づいて化学合成法によって得ることもできる。さらにE2ポリペプチド産生能を有する微生物から単離精製することによって得ることも可能である。これらの方法は、上記A-1.セクションの記載に準じて行うことが出来る。【０１１５】
E2ポリペプチド産生能を有する微生物は、所望量のジヒドロダイゼイン、さらにはダイゼインを含有する培地で培養してもよい。この場合でも、E2ポリペプチド産生能を有する微生物からE2ポリペプチドを産生させることができる。【０１１６】
E2ポリペプチドは、単量体として存在しても良いが、テトラヒドロダイゼイン合成能を有する限り、2量体又はそれ以上の多量体として存在してもよい。また、E2ポリペプチドは、安定性を向上させる目的等で、必要に応じて、ポリエチレングリコール又は糖鎖を付加修飾されたものであってもよい。【０１１７】
E2ポリペプチドは、ジヒドロダイゼインを基質として、テトラヒドロダイゼインに変換する触媒的役割を演じることができる。該テトラヒドロダイゼインは、更に後述するエクオール合成酵素によってエクオールに変換される。エクオールは生体内において、種々の生理作用を発揮するものと考えられており、その意味において、エクオールの合成原料を提供できるE2ポリペプチドは重要であると言える。このように、本発明は、前記(Ba)〜(Bc)のポリペプチドを含むテトラヒドロダイゼイン合成酵素を提供する。【０１１８】
Ｂ−２．ポリヌクレオチド
本発明は、更に、ジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、該ポリヌクレオチドを「E2ポリヌクレオチド」と表記することもある）を提供する。具体的には、E2ポリヌクレオチドとして、以下の(Bd)〜(Bf)のポリヌクレオチドを提供する：
(Bd)配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Be)配列番号７に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【０１１９】
配列番号７に記載のアミノ配列は、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に相当する。配列番号８のアミノ酸配列は、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に相当する。配列番号９に記載のアミノ酸配列は、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に相当する。【０１２０】
上記（Bf）ポリヌクレオチドに関する「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、前記A-2.に記載の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」と同義である。（Bf）のポリヌクレオチドの具体例としては、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列及び配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を挙げることができる。配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と配列番号１１に記載のヌクレオチド配列との塩基配列の相同性は、９９．７％であり、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と配列番号１２に記載のヌクレオチド配列との塩基配列の相同性は、９１．０％である（Ｂｌａｓｔ２）。従って、本発明の好適な一実施形態において、(Bf)のポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列に対して、９１．０％以上の相当性を有し、より好ましくは９９．７％以上の相当性を有する。【０１２１】
上記(Bf)のポリヌクレオチドにおいて、「ジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性」は、上記(Bb)又は(Bc)のポリペプチドの場合と同様の方法で確認される。【０１２２】
E2ポリヌクレオチドは、配列番号１０、１１、又は１２に記載の配列情報に基づいて、化学的合成法又は遺伝子工学的手法によって製造・取得することが可能である。具体的な手法としては、上記E1ポリヌクレオチドに関する A-2.セクションに記載した方法を使用することができる。そのような方法は、必要に応じて、修正・変更することができる。【０１２３】
E2ポリヌクレオチドのｃＤＮＡの起源としては、E2ポリヌクレオチドを発現する微生物であれば特に制限されないが、具体的には、エクオール産生能を有する微生物、好ましくはエクオール産生能を有する乳酸菌、バクテロイデス属に属する菌及びストレプトコッカス属に属する菌、更に好ましくはエクオール産生能を有するラクトコッカス・ガルビエ、バクテロイデス・オバタス、及びストレプトコッカス・コンステラタス、特に好ましくはエクオール産生能を有する糞便由来のラクトコッカス・ガルビエ、特にエクオール産生能を有する糞便由来のラクトコッカス・ガルビエであるラクトコッカス20-92株（FERM BP-10036号；独立行政法人産業技術綜合研究所  特許生物寄託センターにて寄託）、バクテロイデス・オバタスＥ−２３−１５株（FERM BP-6435号；独立行政法人産業技術綜合研究所  特許生物寄託センターにて寄託）、ストレプトコッカス・コンステラタス  Ａ６Ｇ−２２５株（FERM BP-6437号；独立行政法人産業技術綜合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号）にて寄託）が例示される。【０１２４】
通常の遺伝子工学的手法を用いて、E2ポリヌクレオチドを発現させることにより、該ポリヌクレオチドの産物（即ち、上記ポリペプチド）を容易に大量に、安定して製造することができる。従来、エクオール産生菌については取り扱いが困難な嫌気性菌株しか見出されていないが、E2ポリヌクレオチドの単離に成功したことによって、従来のエクオール産生菌を使用せずとも、エクオールの工業的生産への道が開かれる。【０１２５】
Ｂ−３．発現ベクター
本発明の発現ベクターは、E2ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ該E2ポリヌクレオチドを発現できるものであれば特に制限されず、E1ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと同様に、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。具体的な宿主細胞としては、前記A-3.セクションに記載のものを使用することができる。【０１２６】
Ｂ−４．組換え細胞
本発明は、上記E2ポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換された組換え細胞（形質転換体）を提供する。組換え細胞に使用される宿主細胞としては、前記Ａ−４．セクションに記載のものを特に制限なく使用することができる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法については、上記Ａ−４．セクションの記載に従って行うことが出来る。【０１２７】
該組換え細胞は、テトラヒドロダイゼイン変換酵素であるE2ポリペプチドを産生できるので、テトラヒドロダイゼイン変換酵素の製造のために利用することができ、また細胞の状態のままテトラヒドロダイゼインの製造に利用することもできる。【０１２８】
Ｂ−５．組換え細胞を用いたポリペプチドの製造
E2ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、培養物からE2ポリペプチドを回収することにより、E2ポリペプチドを製造することができる。培養は、前記Ａ−５．セクションの記載に準じて行うことができる。【０１２９】
Ｂ−６．E2ポリペプチドを用いたテトラヒドロダイゼインの製造
本発明は、E2ポリペプチドを用いたテトラヒドロダイゼインの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、E2ポリペプチドを、NADPH及び／又はNADHの存在下で、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。【０１３０】
本製造方法に採用される反応は、前記Ａ−６．セクションに記載されるような適当な緩衝液中で行うことができる。【０１３１】
本製造方法に採用される反応は、例えば、反応開始時に緩衝液（反応開始時の原料混合物）中で各成分を下記の濃度範囲を満たすように添加し、上記Ｅ２ポリペプチド、ジヒドロダイゼイン等の原料、及びテトラヒドロダイゼイン等の生成物が変質・不活性化されない温度条件で、0.5〜10時間、好ましくは1〜6時間、更に好ましくは2〜4時間インキュベートすることにより実施される。このような温度条件であれば反応温度は限定されないが、例えば0℃以下に設定する際は、これらの反応温度で凍結しない緩衝液等が用いられる。反応温度は、好ましくは0〜45℃、さらに好ましくは0〜37℃が例示される。また、テトラヒドロダイゼインにはシス型及びトランス型が存在するが、前記反応温度や時間等の条件を変更することによりシス型とトランス型の生成をコントロールすることも可能である。例えば、反応温度0℃として、シス型及びトランス型が混在したテトラヒドロダイゼインを生成させることが可能であり、37℃としてトランス型を優先して生成させることが可能である。【０１３２】
上記の製造方法における各成分の濃度範囲とは、以下の通りである。【０１３３】
Ｅ２ポリペプチドが0.0001〜1.0重量％、好ましくは0.001〜0.1重量％、更に好ましくは0.001〜0.01重量％；
ジヒドロダイゼインが0.0001〜10.0重量％、好ましくは0.001〜1.0重量％、更に好ましくは0.001〜0.1重量％；及び
NADPH及び／又はNADHが0.01〜5重量％、好ましくは0.05〜1重量％、更に好ましくは0.1〜0.5重量％。【０１３４】
また、本発明は、テトラヒドロダイゼインを合成するための混合原料として、(Bi)E2ポリペプチド、(Bii)NADPH及び／又はNADH、並びに(Biii)ジヒドロダイゼインを含有するテトラヒドロダイゼイン合成原料組成物を提供する。該合成原料組成物を前述する条件でインキュベートすることにより、該合成原料組成物中のジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換することができる。該合成原料組成物は、上記テトラヒドロダイゼインの製造において、反応開始時の原料混合物に相当するものであり、該合成原料組成物におけるE2ポリペプチドの配合濃度、NADPH及び／又はNADHの配合濃度、ジヒドロダイゼインの配合濃度、並びに該合成原料組成物に配合可能な他の成分等についても、上記製造方法に採用される反応系（反応開始時の原料混合溶液）の場合と同様である。【０１３５】
更に、本発明は、テトラヒドロダイゼインを合成するためのキットとして、(Bi)E2ポリペプチド、(Bii)NADPH及び／又はNADH、並びに(Biii)ジヒドロダイゼインを含有するテトラヒドロダイゼイン合成用キットを提供する。該合成用キットには、前述する条件でジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインの合成を簡易に実施できるように、各成分が必要に応じて区分けされて備えられていればよい。また、該合成用キットには、必要に応じて、使用する緩衝液が含まれていても良い。更に、該合成用キットは、テトラヒドロダイゼインの合成を簡易に行うために、必要となる器具や操作マニュアルを含んでいても良い。【０１３６】
Ｂ−７．テトラヒドロダイゼイン合成酵素組成物
本発明は、更に、E2ポリペプチドを含むテトラヒドロダイゼイン合成酵素組成物を提供する。該酵素組成物は、E2ポリペプチドを用いたテトラヒドロダイゼインの製造方法において、テトラヒドロダイゼイン合成酵素として好適に使用される。【０１３７】
該酵素組成物は、粗精製の状態のE2ポリペプチドであってもよく、また粗精製又は精製されたE2ポリペプチドを適当な担体に配合したものであってもよい。該担体は、E2ポリペプチドの活性に悪影響を与えないものであり、適当量配合される。【０１３８】
該酵素組成物において、E2ポリペプチドの配合割合については、上記テトラヒドロダイゼインの製造方法において、テトラヒドロダイゼイン合成酵素として使用できる限り、特に制限されない。具体的には、該酵素組成物の総量当たり、E2ポリペプチドが0.001〜20.0重量％、好ましくは0.005〜5.0重量％、更に好ましくは0.01〜1.0重量％が例示される。【０１３９】
該酵素組成物には、E2ポリペプチドの補酵素として作用するNADPH及び/又はNADHを含んでいても良い。該酵素組成物にNADPH及び/又はNADHを配合する場合、該NADPH及び/又はNADHの配合割合については、特に制限されないが、該酵素組成物当たり、0.005〜50.0重量％、好ましくは0.05〜10.0重量％、更に好ましくは0.1〜5.0重量％が例示される。【０１４０】
更に、該酵素組成物には、E2ポリペプチドの他に、該ポリペプチドの安定性を向上せしめるため及び／又は保存性を担保するために、上記Ａ−７．セクションに記載の各種の抗酸化剤や保存剤を添加することもできる。【０１４１】
Ｂ−８．上記組換え細胞を用いたテトラヒドロダイゼインの製造方法
本発明は、E2ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を用いたテトラヒドロダイゼインの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、上記組み換え細胞を、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。【０１４２】
本製造方法に採用される反応は、上記組換え細胞が生存でき、且つジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換できる環境下で実施される。【０１４３】
具体的には、上記組換え細胞が生育可能な培地中に、上記組換え細胞、及びジヒドロダイゼインを適当量添加して培養を行うことにより実施される。【０１４４】
本製造方法において、使用される培地は、組換え細胞の宿主細胞として採用した細胞の種類に応じて、慣用される各種のものを適宜選択利用される。【０１４５】
また、該培地には、必要に応じてPMSF、EDTA等のプロテアーゼ阻害剤を適当量添加していてもよい。また、上記ポリペプチドが嫌気性菌由来であることを考慮すると、DTT、2ME、DET、Sodium hydrosulfite等の還元剤を適当量添加していてもよい。また、上記組換え細胞を利用する場合、NADPH及び／又はNADHの添加は、必須ではないが、必要に応じて、培地中にNADPH及び／又はNADHを添加しても良い。【０１４６】
本製造方法は、具体的には、ジヒドロダイゼインを0.001〜1重量％、好ましくは0.01〜0.5重量％、更に好ましくは0.01〜0.１重量％を含む培地に、上記組換え細胞を接種し、生育可能温度条件下で7〜30時間、好ましくは15〜24時間、更に好ましくは17〜20時間インキュベートすることにより実施される。ここで、生育可能温度条件は特に限定されず、前記「Ｂ−６．E2ポリペプチドを用いたテトラヒドロダイゼインの製造」と同様の温度で実施することができる。【０１４７】
また、本発明は、テトラヒドロダイゼインを合成するための混合原料として、(Biv)上記組換え細胞、及び(Biii)ジヒドロダイゼインを含有するテトラヒドロダイゼイン合成原料組成物を提供する。該合成原料組成物を前述する条件で培養することにより、該合成原料組成物中のジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換することができる。該合成原料組成物は、上記テトラヒドロダイゼインの製造において、反応開始時の原料混合物に相当するものであり、該合成原料組成物における上記組換え細胞、及びジヒドロダイゼインの濃度、並びに該合成原料組成物に配合可能な他の成分等についても、上記製造方法に採用される条件等と同様である。【０１４８】
更に、本発明は、テトラヒドロダイゼインを合成するためのキットとして、(Biv)上記組換え細胞、及び(Biii)ジヒドロダイゼインを含有するテトラヒドロダイゼイン合成用キットを提供する。該合成用キットには、前述する条件でジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインの合成を簡易に実施できるように、上記組換え細胞とジヒドロダイゼインが、必要に応じて区分けされて備えられていればよい。また、該合成用キットには、必要に応じて、緩衝液や培地が含まれていても良い。更に、該合成用キットは、テトラヒドロダイゼインの合成を簡易に行うために、必要となる器具や操作マニュアルを含んでいても良い。【０１４９】
なお、該合成用キットに含まれる上記組み換え細胞は、公知の方法で保存されたものであってもよい。組換え細胞を保存する技術は公知であり、例えば、ジメチルホルムアミド等に組み換え細胞を入れて凍結乾燥機でアンプルが真空状態になるよう処理した後、４〜２５℃で保存する方法等を挙げることができる。この他にも、１０％グリセロール加保存培地に菌体を懸濁し、これを専用アンプルに収め、液体窒素タンク（−１５０〜−１９６℃）で保管する液体窒素法を挙げられる。【０１５０】
Ｂ−９．上記ポリペプチドに結合性を有する抗体
本発明は、更に、E2ポリペプチドに結合性を有する抗体(IgG抗体)を提供する。【０１５１】
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、従来法に従って作製される。具体的には、前記A-9.セクションに記載の方法に従って作成することができる。【０１５２】
Ｂ−１０．上記ポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法
更に、本発明は、上記抗体を用いてE2ポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法を提供する。具体的には、該免疫学的方法は、前記A-10．セクションに記載の方法に準じて行うことが出来る。【０１５３】
本発明は、E2ポリペプチドを検出又は測定するためのキットとして、上記抗体を含有する免疫学的検出用キットを提供する。該検出用キットには、必要に応じて、E2ポリペプチドが標準品として含まれていてもよい。更に、該検出用キットには、前述する条件でE2ポリペプチドの検出を簡易に実施できるように、その他に使用される試薬等が、必要に応じて備えられていてもよい。また、該検出用キットは、E2ポリペプチドの検出を簡易に行うために、必要となる器具や操作マニュアルを含んでいても良い。【０１５４】
Ｂ−１１．上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出又は測定する方法
また、本発明は、E2ポリヌクレオチドを検出又は測定する方法を提供する。該方法は、具体的には、E2ポリヌクレオチドに結合するプローブを被験試料と接触させることにより実施され、前記Ａ−１１.セクションに記載の方法に準じて行うことが出来る。【０１５５】
更に、本発明は、E2ポリヌクレオチドを検出又は測定するためのキットとして、上記プローブを含有するE2ポリヌクレオチド検出用キットを提供する。該検出用キットには、前述する条件でE2ポリヌクレオチドの検出を簡易に実施できるように、上記プローブ以外に使用される試薬等が、必要に応じて備えられていてもよい。また、該検出用キットは、E2ポリヌクレオチドを含有する細胞を同定するためのキットとして使用することもできる。また、該検出用キットとしては、精度の高い検出を可能にするという観点から、好ましくはＰＣＲによる検出を行うためのキットが挙げられる。【０１５６】
Ｃ．エクオール合成酵素
Ｃ−１．ポリペプチド
本発明は、テトラヒドロダイゼインを基質として利用しエクオールを合成するポリペプチドとして、以下の(Ca)〜(Cc)のポリペプチド（以下、該ポリペプチドを「E3ポリペプチド」と表記することもある）を提供する：
(Ca)配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Cb)配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド；
(Cc)配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。【０１５７】
上記(Cb)のポリペプチドにおいて、「１若しくは複数」の範囲は、該ポリペプチドがテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有することを限度として特に限定されないが、例えば１〜２００個、好ましくは１〜１５０個、より好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜４５個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、更に好ましくは１〜５個、更により好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個、更に特に好ましくは１又は２個が挙げられる。【０１５８】
このような(Cb)のポリペプチドの具体例としては、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。配列番号１３に記載のアミノ酸配列と比較して配列番号１４に記載のアミノ酸配列は、２個のアミノ酸が置換されている。配列番号１３に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号１５に記載のアミノ酸配列は、アミノ酸４２個が置換されており、Ｃ末端に１個のアミノ酸（グルタミン酸）が付加されている。配列番号１４に記載されるアミノ酸配列は、バクテロイデス・オバタスＥ−２３−１５株（FERM BP-6435号）由来のＥ３酵素に相当する。配列番号１５に記載されるアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・コンステラタス  Ａ６Ｇ−２２５株（FERM BP-6437号）由来のＥ３酵素に相当する。【０１５９】
上記（Cb）のポリペプチドにおける「アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加」は、前記A-1.セクションに記載されるE1ペプチドにおける置換、欠失、挿入、又は付加に準じて為され得る。上記(Cb)のポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加については、ポリペプチドの高次構造に大きく影響しない領域やエクオール合成酵素としての活性中心に影響を与えない領域において為されることが望ましい。そのような領域としては、例えば、配列番号１３、１４、及び１５に記載のアミノ酸配列の間で保存性の低い領域及びその近辺、並びにＮ末端領域又はＣ末端領域を挙げることができる。具体的には、配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、第３番目のグルタミン酸、第２８番目のアルギニン、第２９番目のグルタミン酸、第３２番目のアルギニン、第６１番目のアスパラギン、第８０番目のイソロイシン、第９２番目のアスパラギン、第１１２番目のアスパラギン酸、第１１９番目のアラニン、第１２９番目のアスパラギン、第１７２番目のアスパラギン酸、第１７４番目のアラニン、第２０４番目のセリン、第２０６番目のグルタミン酸、第２２３番目のスレオニン、第２３０番目のバリン、第２４４番目のプロリン、第２４６番目のチロシン、第２８０番目のスレオニン、第２８２番目のアルギニン、第２８５番目のアラニン、第３０７番目のバリン、第３２２番目のアラニン、第３４７番目のグルタミン酸、第３５９番目のグリシン、第３６０番目のセリン、第３６６番目のアラニン、第３６７番目のロイシン、第３６８番目のイソロイシン、第３７２番目のバリン、第３７３番目のアスパラギン酸、第３７４番目のスレオニン、第３７７番目のアラニン、第３８０番目のアラニン、第３８１番目のアスパラギン酸、第３９９番目のグルタミン、第４０３番目のプロリン、第４０４番目のメチオニン、第４０５番目のバリン、第４０６番目のグルタミン酸、第４０７番目のグリシン、第４２６番目のアルギニン、第４３４番目のバリン、第４３６番目のアラニン、第４３８番目のチロシン、及び第４４０番目のアラニン、並びにこれらのアミノ酸の近辺の領域を挙げることが出来る。前記「近辺の領域」とは、エクオール合成酵素活性を阻害しない範囲において、前記の特定の位置のアミノ酸を基点として、前後５個以内のアミノ酸、好ましくは前後４個のアミノ酸、より好ましくは前後３個のアミノ酸、更に好ましくは前後２個のアミノ酸、特に好ましくは前後１個のアミノ酸である。前記保存性の低い領域及びその近辺として、好ましくは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、第２５番目〜第３５番目に相当する領域、第１７０番目〜１７７番目に相当する領域、第２０１番目〜第２０８番目に相当する領域、２４２番目〜２４８番目に相当する領域、第２７６番目〜第２８９番目に相当する領域、第３５５番目〜第３８５番目に相当する領域、第３９６番目〜第４０９番目に相当する領域、及び第４３１番目〜第４４３番目に相当する領域を挙げることが出来る。【０１６０】
配列番号１３に記載されるアミノ酸配列において、第１４番目のアミノ酸〜第１９番目のアミノ酸から成る配列は、ＦＡＤ結合ドメインに相当すると考えられる。よって、当該ドメインの機能を阻害しない限り、当該配列において任意のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されていてもよいが、好ましくは第１４番目のグリシン、第１６番目のグリシン及び第１９番目のグリシンは変異されていない。当該配列において、アミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されている場合は、好ましくは３個以下のアミノ酸、より好ましくは２個以下のアミノ酸、更に好ましくは１個のアミノ酸について為され、最も好ましくは変異は為されていない。【０１６１】
図２８に配列番号１３、１４及び１５に記載のアミノ酸配列のアライメントを示す。【０１６２】
上記(Cc)のポリペプチドにおいて、アミノ酸の同一性は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して、例えば６０％以上であればよいが、通常８０％以上、好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、更に特に好ましくは９９％以上であることが望ましい。【０１６３】
上記（Cc）のポリペプチドの具体例としては、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド及び配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。配列番号１３に記載のアミノ酸配列と配列番号１４に記載のアミノ酸配列との同一性は、９９．６％であり、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と配列番号１５に記載のアミノ酸配列との同一性は、９０．９％である（Ｂｌａｓｔ２）。従って、本発明の好適な一実施形態において、(Cc)ポリペプチドは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して、好ましくは９０．９％以上、より好ましくは９９．６％以上の同一性を有する。【０１６４】
上記(Cb)及び(Cc)のポリペプチドにおいて、「テトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性」は、次のようにして確認することができる。即ち、下記組成の基質溶液中に、確認対象となるポリペプチドを0.001 mg/mLとなるように添加し、37℃で２時間インキュベートし、その後、溶液中にエクオールの有無を確認する。インキュベート後の溶液にエクオールの存在が確認された場合、そのポリペプチドは「テトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性」を有していると判定される。【０１６５】
基質溶液の組成
0.1 M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
1 mM PMSF(フェニルメチルスルフォニルフルオライド)
2 mM dithiothreitol
5 mMSodium hydrosulfite
40 μM テトラヒドロダイゼイン 【０１６６】
酵素特性
Ｅ３ポリペプチドは、テトラヒドロダイゼインを基質としてエクオールを合成する酵素活性を有する。よって、Ｅ３ポリペプチドは、Ｅ３酵素とも称される。Ｅ３酵素の至適温度は約２３〜３７℃であり、至適ｐＨは４．５である。Ｅ３酵素は、テトラヒドロダイゼインを基質としてエクオールを合成するだけでなく、その逆反応、即ち、エクオールを原料としてテトラヒドロダイゼインを合成することも可能である。【０１６７】
E3ポリペプチドは、E1ペプチドやE2ペプチドと同様に、配列番号１６、１７、又は１８に記載のヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法によって得ることができる。また、配列番号１３、１４、又は１５に記載のアミノ酸配列情報に基づいて、化学合成法によって得ることもできる。さらに、E3ポリペプチド産生能を有する微生物から単離精製することによって得ることができる。これらの手法は、前記A-1.セクションの記載に従って行うことが出来る。【０１６８】
E3ポリペプチド産生能を有する微生物は、所望量のテトラヒドロダイゼインを含有する培地で培養してもよい。この場合でも、E3ポリペプチド産生能を有する微生物からE3ポリペプチドを産生させることができる。【０１６９】
また、E3ポリペプチドは、単量体として存在しても良いが、エクオール合成能を有する限り、2量体又はそれ以上の多量体として存在してもよい。また、E3ポリペプチドは、安定性を向上させる目的等で、必要に応じて、ポリエチレングリコール又は糖鎖を付加修飾されたものであってもよい。【０１７０】
E3ポリペプチドは、テトラヒドロダイゼインを基質として、エクオールに変換する触媒的役割を演じることができる。エクオールは生体内において、種々の生理作用を発揮するものと考えられており、その意味において、エクオールを提供できるE3ポリペプチドは重要であると言える。このように、本発明は、前記(Ca)〜(Cc)のポリペプチドを含むエクオール合成酵素を提供する。【０１７１】
Ｃ−２．ポリヌクレオチド
本発明は、更に、テトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、該ポリヌクレオチドを「E3ポリヌクレオチド」と表記することもある）を提供する。具体的には、E3ポリヌクレオチドとして、以下の(Cd)〜(Cf)のポリヌクレオチドを提供する：
(Cd)配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ce)配列番号１３に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【０１７２】
配列番号１３に記載のアミノ配列は、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に相当する。配列番号１４に記載のアミノ酸配列は、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸配列に相当する。配列番号１５に記載のアミノ酸配列は、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に相当する。【０１７３】
上記（Cf）ポリヌクレオチドに関する「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、前記A-2.セクションに記載の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」と同義である。（Cf）のポリヌクレオチドの具体例としては、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列及び配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を挙げることができる。配列番号１６に記載のヌクレオチド配列と配列番号１７に記載のヌクレオチド配列との塩基配列の相同性は、９９．８％であり、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列と配列番号１８に記載のヌクレオチド配列との相同性は、８５．２％である。従って、本発明の好適な一実施形態において、(Cf)のポリヌクレオチドは、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列に対して、８５．２％以上の相当性を有し、より好ましくは９９．８％以上の相当性を有する。【０１７４】
また、上記(Cf)のポリヌクレオチドにおいて、「テトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性」は、上記(Cb)又は(Cc)のポリペプチドの場合と同様の方法で確認される。【０１７５】
E3ポリヌクレオチドは、配列番号１６、１７、又は１８の配列情報に基づいて、化学的DNA合成法又は遺伝子工学的手法により製造・取得することが可能である。具体的手法としては、前記A-2.セクションに記載の方法を使用することができる。【０１７６】
E3ポリヌクレオチドのｃＤＮＡの起源としては、E3ポリヌクレオチドを発現する微生物であれば特に制限されないが、具体的には、エクオール産生能を有する微生物、好ましくはエクオール産生能を有する乳酸菌、バクテロイデス属に属する菌及びストレプトコッカス属に属する菌、更に好ましくはエクオール産生能を有するラクトコッカス・ガルビエ、バクテロイデス・オバタス、及びストレプトコッカス・コンステラタス、特に好ましくはエクオール産生能を有する糞便由来のラクトコッカス・ガルビエ、特にエクオール産生能を有する糞便由来のラクトコッカス・ガルビエであるラクトコッカス20-92株（FERM BP-10036号；独立行政法人産業技術綜合研究所  特許生物寄託センターにて寄託）、バクテロイデス・オバタスＥ−２３−１５株（FERM BP-6435号；独立行政法人産業技術綜合研究所  特許生物寄託センターにて寄託）、ストレプトコッカス・コンステラタス  Ａ６Ｇ−２２５株（FERM BP-6437号；独立行政法人産業技術綜合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号）にて寄託）が例示される。【０１７７】
通常の遺伝子工学的手法を用いて、E3ポリヌクレオチドを発現させることにより、該ポリヌクレオチドの産物（即ち、上記ポリペプチド）を容易に大量に、安定して製造することができる。従来、エクオール産生菌については取り扱いが困難な嫌気性菌株しか見出されていないが、E3ポリヌクレオチドの単離に成功したことによって、従来のエクオール産生菌を使用せずとも、エクオールの工業的生産への道が開かれる。【０１７８】
Ｃ−３．発現ベクター
本発明の発現ベクターは、E3ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ該E3ポリヌクレオチドを発現できるものであれば特に制限されず、E1ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと同様に、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。具体的な宿主細胞としては、前記A-3．セクションに記載のものを使用することが出来る。【０１７９】
Ｃ−４．組換え細胞
本発明は、上記E3ポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換された組換え細胞（形質転換体）を提供する。組み換え細胞細胞に使用される宿主細胞としては、前記A-4.セクションに記載されるものを特に制限なくしようすることができる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法については、上記A-4.セクションの記載に従って行うことが出来る。【０１８０】
該組換え細胞は、エクオール変換酵素であるE3ポリペプチドを産生できるので、エクオール変換酵素の製造のために利用することができ、また細胞の状態のままエクオールの製造に利用することもできる。【０１８１】
Ｃ−５．組換え細胞を用いたポリペプチドの製造
E3ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、培養物からE3ポリペプチドを回収することにより、E3ポリペプチドを製造することができる。培養は、前記Ａ−５．セクションの記載に従って行うことができる。【０１８２】
Ｃ−６．E3ポリペプチドを用いたエクオールの製造
本発明は、E3ポリペプチドを用いたエクオールの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、E3ポリペプチドを、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。【０１８３】
本製造方法に採用される反応は、適当な緩衝液中で行うことができる。具体的には、前記Ａ−６．セクションに記載される緩衝液を使用することが出来る。【０１８４】
本製造方法に採用される反応は、例えば、反応開始時に緩衝液（反応開始時の原料混合物）中で各成分を下記の濃度範囲を満たすように添加し、上記Ｅ３ポリペプチド、テトラヒドロダイゼイン等の原料、及びエクオール等の生成物が変質・不活性化されない温度条件で、0.5〜10時間、好ましくは1〜6時間、更に好ましくは2〜4時間インキュベートすることにより実施される。このような温度条件であれば反応温度は限定されないが、例えば0℃以下に設定する際は、これらの反応温度で凍結しない緩衝液等が用いられる。反応温度は、好ましくは0〜45℃、さらに好ましくは0〜37℃が例示される。【０１８５】
上記Ｅ３ポリペプチドが0.0001〜1.0重量％、好ましくは0.001〜0.1重量％、更に好ましくは0.001〜0.01重量％；
テトラヒドロダイゼインが0.0001〜10.0重量％、好ましくは0.001〜1.0重量％、更に好ましくは0.001〜0.1重量％。【０１８６】
また、本発明は、エクオールを合成するための混合原料として、(Ci)E3ポリペプチド、並びに(Cii)テトラヒドロダイゼインを含有するエクオール合成原料組成物を提供する。該合成原料組成物を前述する条件でインキュベートすることにより、該合成原料組成物中のテトラヒドロダイゼインをエクオールに変換することができる。該合成原料組成物は、上記エクオールの製造において、反応開始時の原料混合物に相当するものであり、該合成原料組成物におけるE3ポリペプチドの配合濃度、テトラヒドロダイゼインの配合濃度、並びに該合成原料組成物に配合可能な他の成分等についても、上記製造方法に採用される反応系（反応開始時の原料混合溶液）の場合と同様である。【０１８７】
更に、本発明は、エクオールを合成するためのキットとして、(Ci)E3ポリペプチド、並びに(Cii)テトラヒドロダイゼインを含有するエクオール合成用キットを提供する。該合成用キットには、前述する条件でテトラヒドロダイゼインからエクオールの合成を簡易に実施できるように、各成分が必要に応じて区分けされて備えられていればよい。また、該合成用キットには、必要に応じて、使用する緩衝液が含まれていても良い。更に、該合成用キットは、エクオールの合成を簡易に行うために、必要となる器具や操作マニュアルを含んでいても良い。【０１８８】
Ｃ−７．エクオール合成酵素組成物
本発明は、更に、E3ポリペプチドを含むエクオール合成酵素組成物を提供する。該酵素組成物は、E3ポリペプチドを用いたエクオールの製造方法において、エクオール合成酵素として好適に使用される。【０１８９】
該酵素組成物は、粗精製の状態のE3ポリペプチドであってもよく、また粗精製又は精製されたE3ポリペプチドを適当な担体に配合したものであってもよい。該担体は、E3ポリペプチドの活性に悪影響を与えないものであり、適当量配合される。【０１９０】
該酵素組成物において、E3ポリペプチドの配合割合については、上記エクオールの製造方法において、エクオール合成酵素として使用できる限り、特に制限されない。具体的には、該酵素組成物の総量当たり、E3ポリペプチドが0.001〜20.0重量％、好ましくは0.005〜5.0重量％、更に好ましくは0.01〜1.0重量％が例示される。【０１９１】
更に、該酵素組成物には、E3ポリペプチドの他に、該ポリペプチドの安定性を向上せしめるため及び／又は保存性を担保するために、上記Ａ−７．セクションに記載の各種の抗酸化剤や保存剤を添加することもできる。【０１９２】
Ｃ−８．上記組換え細胞を用いたエクオールの製造方法
本発明は、E3ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を用いたエクオールの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、上記組み換え細胞を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。【０１９３】
本製造方法に採用される反応は、上記組換え細胞が生存でき、且つテトラヒドロダイゼインをエクオールに変換できる環境下で実施される。【０１９４】
具体的には、上記組換え細胞が生育可能な培地中に、上記組換え細胞、及びテトラヒドロダイゼインを適当量添加して培養を行うことにより実施される。【０１９５】
本製造方法において、使用される培地は、組換え細胞の宿主細胞として採用した細胞の種類に応じて、慣用される各種のものを適宜選択利用される。【０１９６】
また、該培地には、必要に応じてPMSF、EDTA等のプロテアーゼ阻害剤を適当量添加していてもよい。また、上記ポリペプチドが嫌気性菌由来であることを考慮すると、DTT、2ME、DET、Sodium hydrosulfite等の還元剤を適当量添加していてもよい。また、上記組換え細胞を利用する場合、NADPH及び／又はNADHの添加は、必須ではないが、必要に応じて、培地中にNADPH及び／又はNADHを添加しても良い。【０１９７】
本製造方法は、具体的には、テトラヒドロダイゼインを0.001〜1重量％、好ましくは0.01〜0.5重量％、更に好ましくは0.01〜0.１重量％を含む培地に、上記組換え細胞を接種し、生育可能温度条件下で7〜30時間、好ましくは15〜24時間、更に好ましくは17〜20時間インキュベートすることにより実施される。ここで、生育可能温度条件は特に限定されず、前記Ｃ−６．セクションに記載の温度と同様の温度で実施することができる。【０１９８】
また、本発明は、エクオールを合成するための混合原料として、(Ciii)上記組換え細胞、及び(Cii)テトラヒドロダイゼインを含有するエクオール合成原料組成物を提供する。該合成原料組成物を前述する条件で培養することにより、該合成原料組成物中のテトラヒドロダイゼインをエクオールに変換することができる。該合成原料組成物は、上記エクオールの製造において、反応開始時の原料混合物に相当するものであり、該合成原料組成物における上記組換え細胞、及びテトラヒドロダイゼインの濃度、並びに該合成原料組成物に配合可能な他の成分等についても、上記製造方法に採用される条件等と同様である。【０１９９】
更に、本発明は、エクオールを合成するためのキットとして、(Ciii)上記組換え細胞、及び(Cii)テトラヒドロダイゼインを含有するエクオール合成用キットを提供する。該合成用キットには、前述する条件でテトラヒドロダイゼインからエクオールの合成を簡易に実施できるように、上記組換え細胞とテトラヒドロダイゼインが、必要に応じて区分けされて備えられていればよい。また、該合成用キットには、必要に応じて、緩衝液や培地が含まれていても良い。更に、該合成用キットは、エクオールの合成を簡易に行うために、必要となる器具や操作マニュアルを含んでいても良い。【０２００】
なお、該合成用キットに含まれる上記組み換え細胞は、公知の方法で保存されたものであってもよい。組換え細胞を保存する技術は公知であり、例えば、ジメチルホルムアミド等に組み換え細胞を入れて凍結乾燥機でアンプルが真空状態になるよう処理した後、４〜２５℃で保存する方法等を挙げることができる。この他にも、１０％グリセロール加保存培地に菌体を懸濁し、これを専用アンプルに収め、液体窒素タンク（−１５０〜−１９６℃）で保管する液体窒素法を挙げられる。【０２０１】
Ｃ−９．上記ポリペプチドに結合性を有する抗体
本発明は、更に、E3ポリペプチドに結合性を有する抗体(IgG抗体)を提供する。【０２０２】
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、従来法に従って作製される。具体的には、前記Ａ−９．セクションに記載の方法に従って作成することができる。【０２０３】
Ｃ−１０．上記ポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法
更に、本発明は、上記抗体を用いてE3ポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法を提供する。具体的には、該免疫学的方法は、前記Ａ−１０．セクションに記載の方法に準じて行うことが出来る。【０２０４】
本発明は、E3ポリペプチドを検出又は測定するためのキットとして、上記抗体を含有する免疫学的検出用キットを提供する。該検出用キットには、必要に応じて、E3ポリペプチドが標準品として含まれていてもよい。更に、該検出用キットには、前述する条件でE3ポリペプチドの検出を簡易に実施できるように、その他に使用される試薬等が、必要に応じて備えられていてもよい。また、該検出用キットは、E3ポリペプチドの検出を簡易に行うために、必要となる器具や操作マニュアルを含んでいても良い。【０２０５】
Ｃ−１１．上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出又は測定方法
本発明は、E3ポリヌクレオチドを検出又は測定する方法を提供する。該方法は、具体的には、E3ポリヌクレオチドに結合するプローブを被験試料と接触させることにより実施され、前記Ａ−１１．セクションに記載の方法に準じて行うことができる。【０２０６】
更に、本発明は、E3ポリヌクレオチドを検出又は測定するためのキットとして、上記プローブを含有するE3ポリヌクレオチド検出用キットを提供する。該検出用キットには、前述する条件でE3ポリヌクレオチドの検出を簡易に実施できるように、上記プローブ以外に使用される試薬等が、必要に応じて備えられていてもよい。また、該検出用キットは、E3ポリヌクレオチドを含有する細胞を同定するためのキットとして使用することもできる。また、該検出用キットとしては、精度の高い検出を可能にするという観点から、好ましくはＰＣＲによる検出を行うためのキットが挙げられる。【０２０７】
Ｄ．Ｅ１〜Ｅ３酵素を使用したエクオール又はその中間体の製造方法
Ｄ−Ｉ−１．第１工程及び第２工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法
本発明は、以下の、ダイゼインからジヒドロダイゼインを生成する第１工程、及びジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを生成する第２工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法（以下、該製造方法を「第１製造方法」と表記することもある）を提供する。【０２０８】
（第１工程）ダイゼインに、以下の(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、及びＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを作用させることによりジヒドロダイゼインを生成する工程：
(Aa)配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Ab)配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Ac)配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。【０２０９】
（第２工程）ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチド（以下、該ポリペプチドを「Ｅ２ポリペプチド」と表記することもある）からなる酵素、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを作用させることによりテトラヒドロダイゼインを生成する工程：
(Ba)配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Bb)配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Bc)配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。【０２１０】
本発明の第１製造方法では、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０２１１】
第１工程
第１工程では、Ｅ１ポリペプチドからなる酵素を、ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。  第１工程に採用される反応は、前記Ｅ１ポリペプチドからなる酵素、ダイゼイン及びＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを含有する溶液中で、前記Ｅ１ポリペプチドからなる酵素、ダイゼイン等の原料及びジヒドロダイゼイン等の生成物が変質・不活性化されない温度条件及び時間インキュベートすることにより実施される。具体的には、上記Ａ−６．セクションに記載の条件に従って実施することができる。【０２１２】
該第１工程と後述の第２工程とを同条件で実施する場合には、第１及び第２工程の両者を効率よく実施する観点から、採用される反応は、反応開始時の反応系（反応開始時の原料混合物）で各成分を下記の濃度範囲を満たすように原料混合物を調製し、これを１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃、更に好ましくは３０〜３８℃の温度条件で、０．５〜１０時間、好ましくは１〜６時間、更に好ましくは２〜４時間インキュベートすることにより実施される：
Ｅ１ポリペプチドからなる酵素が０．０００１〜１．０重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、更に好ましくは０．００１〜０．０１重量％；
ダイゼインが０．０００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％、更に好ましくは０．００１〜０．１重量％；及び
ＮＡＤＰＨ／またはＮＡＤＨが０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％、更に好ましくは０．１〜０．５重量％。【０２１３】
第１工程において基質として使用されるダイゼインの由来は限定されない。例えば市販のダイゼインを使用してもよく、適宜生成又は合成したダイゼインを使用してもよい。【０２１４】
また、例えば、第１工程においてジヒドロダイゼインを生成するための混合原料として、（Ａｉ）Ｅ１ポリペプチドからなる酵素、（Ａｉｉ）ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨ、及び（Ａｉｉｉ）ダイゼインを含有する、ジヒドロダイゼイン合成原料組成物を使用してもよい。該合成原料組成物を前述する条件でインキュベートすることにより、該合成原料組成物中のダイゼインをジヒドロダイゼインに変換することができる。前記合成原料組成物は、上記Ａ−６．及びＡ−７．セクションにおいてより詳しく説明される。【０２１５】
第２工程
第２工程では、Ｅ２ポリペプチドからなる酵素を、ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの存在下で、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。【０２１６】
第２工程に採用される反応は、例えば、前記Ｅ２ポリペプチドからなる酵素、ジヒドロダイゼイン及びＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを含有する溶液中で、前記Ｅ２ポリペプチドからなる酵素、ジヒドロダイゼイン等の原料及びテトラヒドロダイゼイン等の生成物が変質・不活性化されない温度条件及び時間インキュベートすることにより実施される。具体的には、上記Ｂ−６．セクションに記載の条件に従って実施することができる。【０２１７】
テトラヒドロダイゼインにはシス型及びトランス型が存在するが、前記反応温度や時間等の条件を変更することによりシス型とトランス型の生成をコントロールすることも可能である。例えば、反応温度０℃として、シス型及びトランス型が混在したテトラヒドロダイゼインを生成させることが可能であり、３７℃としてトランス型を優先して生成させることが可能である。【０２１８】
また、前述の第１工程と第２工程とを同条件で実施する場合には、第１及び第２工程の両者を効率よく実施する観点から、採用される反応は、前記「第１工程」に記載の、第１工程と第２工程とを同条件で実施する場合の条件で両者をインキュベートすることにより実施される。この場合、Ｅ２ポリペプチドからなる酵素、ジヒドロダイゼイン、並びにＮＡＤＰＨ及び／またはＮＡＤＨの濃度は以下のように設定できる：
Ｅ２ポリペプチドからなる酵素が０．０００１〜１．０重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、更に好ましくは０．００１〜０．０１重量％；
ジヒドロダイゼインが０．０００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％、更に好ましくは０．００１〜０．１重量％；及び
ＮＡＤＰＨ及び／またはＮＡＤＨが０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％、更に好ましくは０．１〜０．５重量％。【０２１９】
ただし、第１工程と第２工程とを、Ｅ１ポリペプチドからなる酵素及びＥ２ポリペプチドからなる酵素の共存下で行う場合には、Ｅ１ポリペプチドからなる酵素を使用したジヒドロダイゼインの生成反応を効率よく実施する観点から、ＮＡＤＰＨが必須である。この場合、ＮＡＤＰＨの濃度は、前記「第１工程」に記載の、第１工程と第２工程とを同条件で実施する場合の条件に基づき決定される。そして、ＮＡＤＰＨと併用されるＮＡＤＨの濃度は０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％、更に好ましくは０．１〜０．５重量％と設定される。【０２２０】
第２工程においても、基質として使用されるジヒドロダイゼインの由来は限定されない。【０２２１】
例えば、第１工程においてダイゼインから生成されたジヒドロダイゼインを、第２工程における基質として使用してもよい。この場合、該ジヒドロダイゼインとしては、第１工程において生じた、ジヒドロダイゼインを含有する溶液そのままであってもよく、粗精製されたものであってもよく、精製されたものであってもよい。【０２２２】
また、例えば市販のジヒドロダイゼインを使用してもよく、適宜合成したジヒドロダイゼインを使用してもよい。【０２２３】
また、第２工程においてテトラヒドロダイゼインを合成するための混合原料として、（Ｂｉ）Ｅ２ポリペプチドからなる酵素、（Ｂｉｉ）ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨ、並びに（Ｂｉｉｉ）ジヒドロダイゼインを含有するテトラヒドロダイゼイン合成原料組成物を使用してもよい。該合成原料組成物を前述する条件でインキュベートすることにより、該合成原料組成物中のジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換することができる。前記構成原料組成物に関する説明は、上記Ｂ−６．及びＡ−７．セクションにおいてより詳しく説明される。【０２２４】
第２工程においては、第１工程においてダイゼインから生成されたジヒドロダイゼインが、第２工程における基質として好ましく使用され、市販のジヒドロダイゼイン、前記合成原料組成物、前記酵素組成物等が併用されてもよい。【０２２５】
Ｅ１ポリペプチド及びＥ２ポリペプチド
本発明の第１製造方法では、前記Ａ−１．に記載のＥ１ポリペプチドからなる酵素及び前記Ｂ−１．に記載のＥ２ポリペプチドからなる酵素が使用される。【０２２６】
Ｄ−Ｉ−２．第１製造方法により製造されたテトラヒドロダイゼインを含有する生成物
本発明は、第１工程及び第２工程を含むテトラヒドロダイゼインの製造方法（第１製造方法）により製造された、テトラヒドロダイゼインを含有する生成物を提供する。【０２２７】
前述の通り、本発明の第１製造方法では、ダイゼインからジヒドロダイゼインを、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造することができる。【０２２８】
このことから、本発明の第１製造方法により製造されたテトラヒドロダイゼインを含有する生成物には、テトラヒドロダイゼインだけでなく、ジヒドロダイゼイン、さらにダイゼインが含有される場合もある。【０２２９】
また、本発明の生成物は、第１製造方法により得られる溶液そのままであってもよく、該溶液からテトラヒドロダイゼイン等が粗精製されたものであってもよく、さらに精製されたものであってもよい。【０２３０】
本発明の生成物は、飲食品、化粧料、医薬品等に配合することができ、また基質として使用することもできる。【０２３１】
Ｄ−Ｉ−３．第２工程及び第３工程を含む、エクオールの製造方法
本発明は、以下の、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを生成する第２工程、及びテトラヒドロダイゼインからエクオールを生成する第３工程を含む、エクオールの製造方法（以下、該製造方法を「第２製造方法」と表記することもある）を提供する。【０２３２】
（第２工程）ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチド（以下、該ポリペプチドを「Ｅ２ポリペプチド」と表記することもある）からなる酵素、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを作用させることによりテトラヒドロダイゼインを生成する工程：
(Ba)配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Bb)配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド；
(Bc)配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。【０２３３】
（第３工程）テトラヒドロダイゼインに、以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチド（以下、該ポリペプチドを「Ｅ３ポリペプチド」と表記することもある）からなる酵素を作用させることによりエクオールを製造する工程、
(Ca)配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(Cb)配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド；
(Cc)配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。【０２３４】
本発明の第２製造方法では、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。
第２工程
本発明の第２製造方法に含有される第２工程は、前述の第１製造方法に含有される第２工程と同様に説明される。【０２３５】
なお、第２工程と後述の第３工程とを同条件で実施する場合には、第２及び第３工程の両者を効率よく実施する観点から、採用される反応は、反応開始時の反応系（反応開始時の原料混合物）で各成分を下記の濃度範囲を満たすように原料混合物を調製し、これを１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃、更に好ましくは３０〜３８℃の温度条件で、０．５〜１０時間、好ましくは１〜６時間、更に好ましくは２〜４時間インキュベートすることにより実施される：
Ｅ２ポリペプチドからなる酵素が０．０００１〜１．０重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、更に好ましくは０．００１〜０．０１重量％；
ジヒドロダイゼインが０．０００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％、更に好ましくは０．００１〜０．１重量％；及び
ＮＡＤＰＨ及び／またはＮＡＤＨが０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％、更に好ましくは０．１〜０．５重量％。【０２３６】
第３工程
第３工程では、Ｅ３ポリペプチドからなる酵素を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。【０２３７】
第３工程に採用される反応は、前記Ｅ３ポリペプチドからなる酵素、テトラヒドロダイゼインを含有する溶液中で、前記Ｅ３ポリペプチドからなる酵素、テトラヒドロダイゼイン等の原料及びエクオール等の生成物が変質・不活性化されない温度条件及び時間インキュベートすることにより実施される。具体的には、上記Ａ−６．セクションに記載の条件に従って該反応を行うことが出来る。【０２３８】
前述の第２工程と第３工程とを同条件で実施する場合には、第２及び第３工程の両者を効率よく実施する観点から、採用される反応は、前記「第２工程」に記載の、第２工程と第３工程とを同条件で実施する場合の条件で両者をインキュベートすることにより実施される。この場合、Ｅ３ポリペプチドからなる酵素、テトラヒドロダイゼイン、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの濃度は以下のように設定できる：
Ｅ３ポリペプチドからなる酵素が０．０００１〜１．０重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、更に好ましくは０．００１〜０．０１重量％；
テトラヒドロダイゼインが０．０００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％、更に好ましくは０．００１〜０．１重量％；及び
ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨが０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％、更に好ましくは０．１〜０．５重量％。【０２３９】
第３工程においても、基質として使用されるテトラヒドロダイゼインの由来は限定されない。【０２４０】
例えば、第２工程においてジヒドロダイゼインから生成されたテトラヒドロダイゼインを、第３工程における基質として使用してもよい。この場合、該テトラヒドロダイゼインとしては、第２工程において生じた、テトラヒドロダイゼインを含有する溶液そのままであってもよく、粗精製されたものであってもよく、精製されたものであってもよい。【０２４１】
また、例えば市販のテトラヒドロダイゼインを使用してもよく、適宜合成したテトラヒドロダイゼインを使用してもよい。【０２４２】
また、第３工程においてエクオールを合成するための混合原料として、（Ｃｉ）Ｅ３ポリペプチドからなる酵素、及び（Ｃｉｉ）テトラヒドロダイゼインを含有するエクオール合成原料組成物を使用してもよい。該合成原料組成物を前述する条件でインキュベートすることにより、該合成原料組成物中のテトラヒドロダイゼインをエクオールに変換することができる。該合成原料組成物の説明は、前記Ｃ−６．及びＣ−７．セクションにおいてより詳しく説明される。【０２４３】
第３工程においては、第２工程においてジヒドロダイゼインから生成されたテトラヒドロダイゼインが、第３工程における基質として好ましく使用され、市販のテトラヒドロダイゼイン、前記合成原料組成物、前記酵素組成物等が併用されてもよい。【０２４４】
Ｅ２ポリペプチド及びＥ３ポリペプチド
本発明の第２製造方法では、前記Ｂ−１．セクションに記載のＥ２ポリペプチドからなる酵素及び前記Ｃ−１．セクションに記載のＥ３ポリペプチドからなる酵素が使用される。【０２４５】
Ｄ−Ｉ−４．第２製造方法により製造されたエクオールを含有する生成物
本発明は、第２工程及び第３工程を含むエクオールの製造方法（第２製造方法）により製造された、エクオールを含有する生成物を提供する。【０２４６】
前述の通り、本発明の第２製造方法では、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０２４７】
このことから、本発明の第２製造方法により製造されたエクオールを含有する生成物には、エクオールだけでなく、テトラヒドロダイゼイン、さらにジヒドロダイゼインが含有される場合もある。【０２４８】
また、本発明の生成物は、第２製造方法により得られる溶液そのままであってもよく、該溶液からエクオール等が粗精製されたものであってもよく、さらに精製されたものであってもよい。【０２４９】
本発明の生成物は、飲食品、化粧料、医薬品等に配合することができ、また基質として使用することもできる。【０２５０】
Ｄ−Ｉ−５．第１工程〜第３工程を含む、エクオールの製造方法
本発明は、前記第１工程、第２工程及び第３工程を含む、エクオールの製造方法（以下、該製造方法を「第３製造方法」と表記することもある）を提供する。【０２５１】
本発明の第３製造方法では、ダイゼインからジヒドロダイゼインを、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０２５２】
第１工程
本発明の第３製造方法に含有される第１工程では、Ｅ１ポリペプチドからなる酵素を、ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。本発明の第３製造方法に含有される第１工程は、前述の第１工程と同様に説明される。【０２５３】
なお、第１工程及び第２工程を同条件で実施する場合、第１工程及び第３工程を同条件で実施する場合、又は第１工程〜第３工程を同条件で実施する場合には、これらの工程を効率よく実施する観点から、採用される反応は、前記「第１工程」に記載の、第１工程及び第２工程等を同条件で実施する場合に基づく条件・各濃度でインキュベートすることにより実施される。【０２５４】
第２工程
本発明の第３製造方法に含有される第２工程では、Ｅ２ポリペプチドからなる酵素を、ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの存在下で、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。第２工程は、前述の第２工程と同様に説明される。【０２５５】
なお、前記第１工程及び第２工程を同条件で実施する場合、又は第１工程〜第３工程とを同条件で実施する場合には、各工程を効率よく実施する観点から、採用される反応は、前記「第２工程」に記載の、第１工程及び第２工程等を同条件で実施する場合に基づく条件・各濃度でインキュベートすることにより実施される。【０２５６】
また、第１工程及び第２工程をＥ１ポリペプチドからなる酵素及びＥ２ポリペプチドからなる酵素の共存下で行う場合、又は第１工程〜第３工程をＥ１ポリペプチドからなる酵素、Ｅ２ポリペプチドからなる酵素及びＥ３ポリペプチドからなる酵素の共存下で行う場合も、前記「第２工程」等に記載の、Ｅ１ポリペプチドからなる酵素及びＥ２ポリペプチドからなる酵素の共存下で行う場合の条件・各濃度でインキュベートすることにより実施される。【０２５７】
また、第２工程及び第３工程を同条件で実施する場合には、各工程を効率よく実施する観点から、採用される反応は、前記「第２工程」に記載の、第２工程及び第３工程等を同条件で実施する場合に基づく条件・各濃度でインキュベートすることにより実施される。【０２５８】
第３工程
本発明の第３製造方法に含有される第３工程では、Ｅ３ポリペプチドからなる酵素を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。第３工程は、前述の第３工程と同様に説明される。【０２５９】
なお、前記第１工程及び第３工程を同条件で実施する場合、又は第１工程〜第３工程を同条件で実施する場合には、各工程を効率よく実施する観点から、採用される反応は、前記「第１工程」に記載の、第１工程及び第２工程等を同条件で実施する場合の条件でインキュベートすることにより実施される。この場合、Ｅ３ポリペプチドからなる酵素、テトラヒドロダイゼイン、並びにＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの濃度は以下のように設定できる：
Ｅ３ポリペプチドからなる酵素が０．０００１〜１．０重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、更に好ましくは０．００１〜０．０１重量％；
テトラヒドロダイゼインが０．０００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％、更に好ましくは０．００１〜０．１重量％；及び
ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨが０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％、更に好ましくは０．１〜０．５重量％。【０２６０】
ただし、第１工程及び第３工程をＥ１ポリペプチドからなる酵素及びＥ３ポリペプチドからなる酵素の共存下で行う場合、又は第１工程〜第３工程をＥ１ポリペプチドからなる酵素、Ｅ２ポリペプチドからなる酵素及びＥ３ポリペプチドからなる酵素の共存下で行う場合には、前述のように、Ｅ１ポリペプチドからなる酵素を使用したジヒドロダイゼインの生成反応を効率よく実施する観点から、ＮＡＤＰＨが必須である。この場合、ＮＡＤＰＨの濃度は、前記「第１工程」に記載の、第１工程及び第２工程等を同条件で実施する場合の条件に基づき決定される。そして、ＮＡＤＰＨと併用されるＮＡＤＨの濃度は、前記「第２工程」に記載の、Ｅ１ポリペプチドからなる酵素及びＥ２ポリペプチドからなる酵素の共存下で行う場合の条件、及び前記「第２工程」に記載の、第２工程及び第３工程等を同条件で実施する場合の条件に基づき決定される。【０２６１】
Ｅ１〜Ｅ３ポリペプチド
本発明の第３製造方法では、前記Ｅ１ポリペプチドからなる酵素、Ｅ２ポリペプチドからなる酵素及びＥ３ポリペプチドからなる酵素が使用される。Ｅ１〜Ｅ３ポリペプチドは、前述と同様に説明される。【０２６２】
Ｄ−Ｉ−６．第３製造方法により製造されたエクオールを含有する生成物
本発明は、第１工程〜第３工程を含むエクオールの製造方法（第３製造方法）により製造された、エクオールを含有する生成物を提供する。【０２６３】
前述の通り、本発明の第３製造方法では、ダイゼインからジヒドロダイゼインを、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０２６４】
このことから、本発明の第３製造方法により製造されたエクオールを含有する生成物には、エクオールだけでなく、テトラヒドロダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、ダイゼインが含有される場合もある。【０２６５】
また、本発明の生成物は、第３製造方法により得られる溶液そのままであってもよく、該溶液からエクオール等が粗精製されたものであってもよく、さらに精製されたものであってもよい。【０２６６】
本発明の生成物は、飲食品、化粧料、医薬品等に配合することができ、また基質として使用することもできる。【０２６７】
Ｄ−Ｉ−７．第４工程〜第６工程の少なくとも２つの工程を含む、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造方法
本発明は、以下の、ダイゼインからジヒドロダイゼインを生成する第４工程、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを生成する第５工程、及びテトラヒドロダイゼインからエクオールを生成する第６工程のうち少なくとも２つの工程を含む、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造方法（以下、該製造方法を「第４製造方法」と表記することもある）を提供する。【０２６８】
（第４工程）(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチド（以下、該ポリヌクレオチドを「Ｅ１ポリヌクレオチド」と表記することもある）を有する組換え細胞をダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインを生成させる工程：
(Ad)配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ae)配列番号１に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【０２６９】
（第５工程）(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチド（以下、該ポリヌクレオチドを「Ｅ２ポリヌクレオチド」と表記することもある）を有する組換え細胞をジヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成させる工程：
(Bd)配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Be)配列番号７に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【０２７０】
（第６工程）(Cd)〜(Cf)のいずれかであるポリヌクレオチド（以下、該ポリヌクレオチドを「Ｅ３ポリヌクレオチド」と表記することもある）を有する組換え細胞をテトラヒドロダイゼインに作用させることにより、エクオールを生成させる工程：
(Cd)配列番号１６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(Ce)配列番号１３に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【０２７１】
本発明の第４製造方法では、第４〜６工程の各種組み合わせに応じて、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオール製造することができる。【０２７２】
本発明の第４製造方法は、前述の通り、第４工程、第５工程及び第６工程のうち少なくとも２つの工程を含む。【０２７３】
例えば、本発明の第４製造方法が第４工程及び第５工程の２工程を含み、第６工程を含まない場合、本発明の第４製造方法では、ダイゼインからジヒドロダイゼインを、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造することができる。【０２７４】
また、例えば、本発明の第４製造方法が第５工程及び第６工程の２工程を含み、第４工程を含まない場合、本発明の第４製造方法では、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０２７５】
本発明の第４製造方法が第４〜６工程の３工程を含む場合、本発明の第４製造方法では、ダイゼインからジヒドロダイゼインを、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０２７６】
本発明の第４製造方法において使用される組換え細胞は、一つの細胞内に、(Ad)〜(Af)、(Bd)〜(Bf)及び(Cd)〜(Cf)からなる群より選択される１種のポリヌクレオチドを有していてもよく、該群より選択される２種以上のポリヌクレオチドを有していてもよい。【０２７７】
例えば、一つの細胞が、(Ad)〜(Af)から選択される１種のポリヌクレオチドと(Bd)〜(Bf)から選択される１種のポリヌクレオチドの２種を有している場合、この組換え細胞を用いることにより第４工程及び第５工程を１種類の組換え細胞により実施することができる。【０２７８】
また、例えば、一つの細胞が、(Ad)〜(Af)から選択される１種のポリヌクレオチドと(Bd)〜(Bf)から選択される１種のポリヌクレオチドと(Cd)〜(Cf)から選択される１種のポリヌクレオチドの３種を有している場合、この組換え細胞を用いることにより第４工程〜第６工程を１種類の組換え細胞により実施することができる。【０２７９】
また、本発明の第４製造方法では、例えば、前述のような、(Ad)〜(Af)から選択される１種のポリヌクレオチドと(Bd)〜(Bf)から選択される１種のポリヌクレオチドの合計２種を有している組換え細胞と、(Cd)〜(Cf)から選択される１種のポリヌクレオチドを有している組換え細胞とを用いることによっても、第４工程〜第６工程を実施することができる。【０２８０】
同様に、例えば、本発明の第４製造方法では、(Ad)〜(Af)から選択される１種のポリヌクレオチドと(Cd)〜(Cf)から選択される１種のポリヌクレオチドの合計２種を有している組換え細胞と、(Bd)〜(Bf)から選択される１種のポリヌクレオチドを有している組換え細胞とを用いることによっても、第４工程〜第６工程を実施することができる。【０２８１】
第４工程
第４工程では、前記Ａ−２．セクションに記載のＥ１ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。【０２８２】
第４工程に採用される反応は、上記第１工程と同様の条件で行うことが出来る。具体的には、ダイゼインを０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜１重量％、更に好ましくは０．０１〜０．５重量％を含む培地に、前記組換え細胞を接種し、生育可能温度条件下で６〜３０時間、好ましくは７〜２４時間、更に好ましくは７〜１８時間インキュベートすることにより実施される。ここで、生育可能温度条件は特に限定されず、前記「第１工程」と同様の温度で実施することができる。【０２８３】
第４工程で使用される組換え細胞
第４工程で使用される組換え細胞はＥ１ポリヌクレオチドを有し、Ｅ１ポリヌクレオチドを発現できる限り制限されない。具体的には、前記Ａ−４．セクションに記載の組み換え細胞を使用することが出来る。【０２８４】
Ｅ１ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いたＥ１ポリペプチドからなる酵素の製造
Ｅ１ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、細胞及び／又は培養物からＥ１ポリペプチドを回収することにより、Ｅ１ポリペプチドからなる酵素を製造することができる。具体的には、前記Ａ−５．セクションに記載の条件に従って当該組換え細胞を培養することによってＥ１ポリペプチドを製造することが出来る。【０２８５】
第５工程
第５工程では、前記Ｂ−２．セクションに記載のＥ２ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。【０２８６】
第５工程に採用される反応は、上記第２工程と同様の条件で行うことが出来る。具体的には、ジヒドロダイゼインを０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．５重量％、更に好ましくは０．０１〜０．１重量％を含む培地に、前記組換え細胞を接種し、生育可能温度条件下で７〜３０時間、好ましくは１５〜２４時間、更に好ましくは１７〜２０時間インキュベートすることにより実施される。ここで、生育可能温度条件は特に限定されず、前記「第２工程」と同様の温度で実施することができる。【０２８７】
第５工程で使用される組換え細胞
第５工程で使用される組換え細胞は前記Ｂ−２．セクションに記載のＥ２ポリヌクレオチドを有し、Ｅ２ポリヌクレオチドを発現できる限り制限されない。具体的には、前記Ｂ−４．セクションに記載の組み換え細胞を使用することが出来る。【０２８８】
Ｅ２ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いたＥ２ポリペプチドからなる酵素の製造
Ｅ２ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、細胞及び／又は培養物からＥ２ポリペプチドを回収することにより、Ｅ２ポリペプチドからなる酵素を製造することができる。【０２８９】
また、Ｅ２ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞の培養、培養に用いられる培地、Ｅ２ポリペプチドの分離・精製は、前記「Ｅ１ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いたＥ１ポリペプチドからなる酵素の製造」と同様にして実施できる。【０２９０】
第６工程
第６工程では、前記Ｃ−２．セクションに記載のＥ３ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。【０２９１】
第６工程に採用される反応は、上記第３工程と同様の条件で行うことが出来る。例えば、テトラヒドロダイゼインを０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．５重量％、更に好ましくは０．０１〜０．１重量％を含む培地に、前記組換え細胞を接種し、生育可能温度条件下で７〜３０時間、好ましくは１５〜２４時間、更に好ましくは１７〜２０時間インキュベートすることにより実施される。ここで、生育可能温度条件は特に限定されず、前記「第３工程」と同様の温度で実施することができる。【０２９２】
第６工程において基質として使用される、テトラヒドロダイゼインの由来は限定されない。【０２９３】
例えば、第５工程においてジヒドロダイゼインから生成されたテトラヒドロダイゼインを、第６工程における基質として使用してもよい。この場合、該テトラヒドロダイゼインとしては、第５工程において生じた、テトラヒドロダイゼインを含有する溶液そのままであってもよく、粗精製されたものであってもよく、精製されたものであってもよい。【０２９４】
また、例えば市販のテトラヒドロダイゼインを使用してもよく、適宜合成したテトラヒドロダイゼインを使用してもよい。【０２９５】
また、例えば、第６工程においてエクオールを合成するための混合原料として、Ｅ３ポリヌクレオチドを有する組換え細胞、及びテトラヒドロダイゼインを含有するエクオール合成原料組成物を使用してもよい。該合成原料組成物を前述する条件で培養することにより、該合成原料組成物中のテトラヒドロダイゼインをエクオールに変換することができる。該合成原料組成物における前記組換え細胞及びテトラヒドロダイゼインの濃度、並びに該合成原料組成物に配合可能な他の成分等、また反応条件は、前述と同様に説明される。【０２９６】
好ましくは、第５工程においてジヒドロダイゼインから生成されたテトラヒドロダイゼインを、第５工程における基質として使用され、市販のテトラヒドロダイゼインや前記合成原料組成物等が併用されてもよい。【０２９７】
第６工程で使用される組換え細胞
第６工程で使用される組換え細胞は前記Ｃ−２．セクションに記載のＥ３ポリヌクレオチドを有し、Ｅ３ポリヌクレオチドを発現できる限り制限されない。具体的には、前記Ｃ−４．セクションに記載の組換え細胞を使用することが出来る。【０２９８】
Ｅ３ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いたＥ３ポリペプチドからなる酵素の製造
Ｅ３ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、細胞及び／又は培養物からＥ３ポリペプチドを回収することにより、Ｅ３ポリペプチドからなる酵素を製造することができる。【０２９９】
また、Ｅ３ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞の培養、培養に用いられる培地、Ｅ３ポリペプチドの分離・精製は、前記「Ｅ１ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いたＥ１ポリペプチドからなる酵素の製造」と同様にして実施できる。【０３００】
Ｅ１〜Ｅ３ポリヌクレオチド
本発明の第４製造方法では、Ｅ１〜Ｅ３ポリヌクレオチドの少なくとも１種が使用される。これらのポリヌクレオチドは、各々前記Ａ−２．、Ｂ−２．及びＣ−２．セクションに説明されるものである。【０３０１】
Ｄ−Ｉ−８．第４製造方法により製造された、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールを含有する生成物
本発明は、第４製造方法により製造された、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールを含有する生成物を提供する。【０３０２】
前述の通り、本発明の第４製造方法では、第４〜６工程の各種組み合わせにより、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールを製造することができる。【０３０３】
このため、本発明の第４製造方法により製造された生成物には、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールが含有される。【０３０４】
また、本発明の生成物は、第４製造方法により得られる溶液そのままであってもよく、該溶液からジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールが粗精製されたものであってもよく、さらに精製されたものであってもよい。【０３０５】
本発明の生成物は、飲食品、化粧料、医薬品等に配合することができ、また基質として使用することもできる。【０３０６】
Ｄ−ＩＩ−１．第１反応槽〜第３反応槽の少なくとも１つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造装置
本発明は、以下の第１反応槽〜第３反応槽の少なくとも１つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造装置（以下、「第１製造装置」と表記することもある）を提供する。
（第１反応槽）(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチド（すなわち、Ｅ１ポリペプチド）からなる酵素が固定されている反応手段（以下、これを「反応手段１」と表記することもある）を有しており、該ポリペプチドを用いてダイゼインからジヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は該反応槽内のダイゼインと接触できるように配置されている；
（第２反応槽）(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチド（すなわち、Ｅ２ポリペプチド）からなる酵素が固定されている反応手段（以下、これを「反応手段２」と表記することもある）を有しており、該ポリペプチドを用いてジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は該反応槽内のジヒドロダイゼインと接触できるように配置されている；
（第３反応槽）(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチド（すなわち、Ｅ３ポリペプチド）からなる酵素が固定されている反応手段（以下、これを「反応手段３」と表記することもある）を有しており、該ポリペプチドを用いてテトラヒドロダイゼインからエクオールを製造するための反応槽、ここで該反応手段は該反応槽内のテトラヒドロダイゼインと接触できるように配置されている。【０３０７】
本発明の第１製造装置では、第１反応槽〜第３反応槽の各種組み合わせに応じて、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールを製造することができる。【０３０８】
本発明の第１製造装置は、第１反応槽、第２反応槽及び第３反応槽のうち少なくとも１つの反応槽を備える。【０３０９】
例えば、本発明の第１製造装置が第１反応槽を備えており、第２反応槽及び第３反応槽を備えていない場合、本発明の第１製造装置を使用することにより、ダイゼインからジヒドロダイゼインを製造することができる。【０３１０】
例えば、本発明の第１製造装置が第２反応槽を備えており、第１反応槽及び第３反応槽を備えていない場合、本発明の第１製造装置を使用することにより、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造することができる。【０３１１】
例えば、本発明の第１製造装置が第３反応槽を備えており、第１反応槽及び第２反応槽を備えていない場合、本発明の第１製造装置を使用することにより、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０３１２】
また、例えば、本発明の第１製造装置が第１反応槽及び第２反応槽の２つの反応槽を備えており、第３反応槽を備えていない場合、本発明の第１製造装置を使用することにより、ダイゼインからジヒドロダイゼインを、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造することができる。【０３１３】
また、例えば、本発明の第１製造装置が第２反応槽及び第３反応槽の２つの反応槽を備えており、第１反応槽を備えていない場合、本発明の第１製造装置を使用することにより、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０３１４】
また、例えば、本発明の第１製造装置が第１反応槽〜第３反応槽の３つの反応槽を備えている場合、本発明の第１製造装置を使用することにより、ダイゼインからジヒドロダイゼインを、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０３１５】
また、本発明の第１製造装置では、反応手段１〜３の少なくとも２つの手段が、一つの反応槽に共に存在していてもよい。【０３１６】
例えば、反応手段１及び２が一つの反応槽に共に存在している場合には、第１反応槽及び第２反応槽における各々の反応を一つの反応槽内で実施することができる。また、例えば、反応手段１〜３が一つの反応槽に共に存在している場合には、第１反応槽〜第３反応槽における各々の反応を一つの反応槽内で実施することができる。【０３１７】
これらの反応手段は、反応槽において所望の効果を発揮できる限り、反応槽への配置手段は限定されない。【０３１８】
また、本発明の第１製造装置では、該製造装置が反応手段１〜３の少なくとも２つの手段を有し、かつ異なる複数の反応槽を有している場合には、これらの反応層は供給手段を介して接続されている。【０３１９】
例えば、本発明の第１製造装置が第１反応槽及び第２反応槽を備え、第３反応槽を備えておらず、かつ第１反応槽及び第２反応槽が各々独立し、第１反応槽内には反応手段１が、第２反応槽内には反応手段２が配置されている場合、該第１反応槽及び第２反応槽は、第１反応槽において生成されたジヒドロダイゼインを含有する生成物を第２反応槽に供給するための供給手段を介して接続されている。【０３２０】
また、例えば、本発明の第１製造装置が、反応手段１及び２を一つの反応槽に備え、反応手段３を別の反応槽に備えている場合、反応手段１及び２が配置された反応槽と反応手段３が配置された反応槽は、反応手段１及び２が配置された反応反槽において生成された生成物を反応手段３が配置された反応槽に供給するための供給手段を介して接続されている。【０３２１】
ここで、生成物は、得られた溶液の状態であってもよく、ジヒドロダイゼイン等が粗精製されたものであってもよく、さらに精製されたものであってもよい。【０３２２】
反応槽
本発明の第１製造装置において使用される第１反応槽〜第３反応槽の形状、大きさ、素材等は、前記反応手段を有することができ、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造が好適に実施される限り制限されない。【０３２３】
反応手段
本発明の第１製造装置において使用される反応手段１〜３は、各々の反応手段が有する前記ポリペプチドからなる酵素が固定されており、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造に好適に適用できる限り制限されない。【０３２４】
各反応手段に固定される各ポリペプチドからなる酵素は、粗精製の状態であってもよく、精製されたものであってもよい。ポリペプチドからなる酵素の反応手段への固定化は、従来公知の技術に従い実施される。【０３２５】
例えば、ポリペプチドからなる酵素が担体に固定されている場合、該担体は、各ポリペプチドからなる酵素が有する所望の活性の発揮を妨げない限り制限されない。例えば、該担体としては、前記ポリペプチドからなる酵素と共有結合により結合できるアミノ基、カルボキシル基、水酸基などの官能基を有するもの、また、前記ポリペプチドからなる酵素とリンカーを介して接続できるもの等が例示される。担体の形状も限定されない。このような担体、官能基、リンカー等は、ポリペプチドからなる酵素を担体に固定する従来公知の技術に従い適宜選択される。また、ポリペプチドからなる酵素の担体への固定化も、従来公知の技術に従い実施される。【０３２６】
供給手段
本発明の第１製造装置において使用される供給手段は、本発明の第１製造装置において使用され得る異なる反応槽を該供給手段を介して接続させることができ、本発明の第１製造装置においてジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールを製造できる限り制限されない。該供給手段は、従来公知の技術に従い適宜選択される。【０３２７】
Ｅ１〜Ｅ３ポリペプチド
本発明の第１製造装置において使用されるＥ１〜Ｅ３ポリペプチドは、前述と同様に説明される。【０３２８】
第１反応槽におけるジヒドロダイゼインの製造
第１反応槽では、反応手段１に固定されたＥ１ポリペプチドからなる酵素を、ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。Ｅ１ポリペプチドからなる酵素は、Ｅ１ポリペプチドからなる酵素の補酵素として作用するＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨとともに、反応手段に固定されていても良い。第１反応槽における反応は、前述の「第１工程」に基づき実施される。【０３２９】
第２反応槽におけるテトラヒドロダイゼインの製造
第２反応槽では、反応手段２に固定されたＥ２ポリペプチドからなる酵素を、ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの存在下で、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。Ｅ２ポリペプチドからなる酵素は、Ｅ２ポリペプチドからなる酵素の補酵素として作用するＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨとともに、反応手段に固定されていても良い。第２反応槽における反応は、前述の「第２工程」に基づき実施される。【０３３０】
第３反応槽におけるエクオールの製造
第３反応槽では、反応手段３に固定されたＥ３ポリペプチドからなる酵素を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。第３反応槽における反応は、前述の「第３工程」に基づき実施される。【０３３１】
Ｄ−ＩＩ−２．第４反応槽〜第６反応槽の少なくとも１つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造装置
本発明は、以下の第４反応槽〜第６反応槽の少なくとも１つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造装置（以下、「第２製造装置」と表記することもある）を提供する。
（第４反応槽）(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチド（すなわち、Ｅ１ポリヌクレオチド）を有する組換え細胞が固定されている反応手段（「以下、これを反応手段４と表記することもある」）を有しており、該反応手段を用いてダイゼインからジヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のダイゼインと接触できるように配置されている；
（第５反応槽）(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチド（すなわち、Ｅ２ポリヌクレオチド）を有する組換え細胞が固定されている反応手段（「以下、これを反応手段５と表記することもある」）を有しており、該反応手段を用いてジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のジヒドロダイゼインと接触できるように配置されている；
（第６反応槽）(Cd)〜(Cf)のいずれかであるポリヌクレオチド（すなわち、Ｅ３ポリヌクレオチド）を有する組換え細胞が固定されている反応手段（「以下、これを反応手段６と表記することもある」）を有しており、該反応手段を用いてテトラヒドロダイゼインからエクオールを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のテトラヒドロダイゼインと接触できるように配置されている。【０３３２】
本発明の第２製造装置では、第４反応槽〜第６反応槽の各種組み合わせに応じて、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールを製造することができる。【０３３３】
本発明の第２製造装置は、第４反応槽、第５反応槽及び第６反応槽のうち少なくとも１つの反応槽を備える。【０３３４】
例えば、本発明の第２製造装置が第４反応槽を備えており、第５反応槽及び第６反応槽を備えていない場合、本発明の第２製造装置を使用することにより、ダイゼインからジヒドロダイゼインを製造することができる。【０３３５】
例えば、本発明の第２製造装置が第５反応槽を備えており、第４反応槽及び第６反応槽を備えていない場合、本発明の第２製造装置を使用することにより、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造することができる。【０３３６】
例えば、本発明の第２製造装置が第６反応槽を備えており、第４反応槽及び第５反応槽を備えていない場合、本発明の第２製造装置を使用することにより、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０３３７】
また、例えば、本発明の第２製造装置が第４反応槽及び第５反応槽の２つの反応槽を備えており、第６反応槽を備えていない場合、本発明の第２製造装置を使用することにより、ダイゼインからジヒドロダイゼインを、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造することができる。【０３３８】
また、例えば、本発明の第２製造装置が第５反応槽及び第６反応槽の２つの反応槽を備えており、第４反応槽を備えていない場合、本発明の第２製造装置を使用することにより、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０３３９】
また、例えば、本発明の第２製造装置が第４反応槽〜第６反応槽の３つの反応槽を備えている場合、本発明の第２製造装置を使用することにより、ダイゼインからジヒドロダイゼインを、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを、テトラヒドロダイゼインからエクオールを製造することができる。【０３４０】
また、本発明の第２製造装置では、反応手段４〜６の少なくとも２つの手段が、一つの反応槽に共に存在していてもよい。【０３４１】
例えば、反応手段４及び５が一つの反応槽に共に存在している場合には、第４反応槽及び第５反応槽における各々の反応を一つの反応槽内で実施することができる。また、例えば、反応手段４〜６が一つの反応槽に共に存在している場合には、前記第４反応槽〜第６反応槽における各々の反応を一つの反応槽内で実施することができる。【０３４２】
これらの反応手段は、反応槽において所望の効果を発揮できる限り、反応槽への配置手段は限定されない。【０３４３】
また、本発明の第２製造装置では、該製造装置が反応手段４〜６の少なくとも２つの手段を有し、かつ異なる複数の反応槽を有している場合には、該反応は前記異なる反応槽と供給手段を介して接続されている。【０３４４】
例えば、本発明の第２製造装置が第４反応槽及び第５反応槽を備え、第６反応槽を備えておらず、かつ第４反応槽及び第５反応槽が各々独立し、第４反応槽内には反応手段４が、第５反応槽内には反応手段５が配置されている場合、該第４反応槽及び第５反応槽は、第４反応槽において生成されたジヒドロダイゼインを含有する生成物を第５反応槽に供給するための供給手段を介して接続されている。【０３４５】
また、例えば、本発明の第２製造装置が、反応手段４及び５を一つの反応槽に備え、反応手段６を別の反応槽に備えている場合、反応手段４及び５が配置された反応槽と反応手段６が配置された反応槽は、反応手段４及び５が配置された反応反槽において生成された生成物を反応手段６が配置された反応槽に供給するための供給手段を介して接続されている。【０３４６】
ここで、生成物は、得られた溶液の状態であってもよく、ジヒドロダイゼイン等が粗精製されたものであってもよく、さらに精製されたものであってもよい。【０３４７】
反応槽
本発明の第２製造装置において使用される第４反応槽〜第６反応槽の形状、大きさ、素材等は、前記反応手段を有することができ、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造が好適に実施される限り制限されない。【０３４８】
反応手段
本発明の第２製造装置において使用される反応手段４〜６は、各々の反応手段が有する前記組換え細胞が固定されており、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造に好適に適用できる限り制限されない。【０３４９】
組換え細胞の反応手段への固定化は、各組換え細胞が有する所望の効果の発揮を妨げない限り制限されず、従来公知の技術に従い実施される。また、組み換え細胞は、反応手段において細胞が培養できる、又は培養されている状態にあってもよい。ここで適用される組換え細胞の培養条件は、前述の「第４工程」、「第５工程」及び「第６工程」等の記載に基づき各々設定される。【０３５０】
供給手段
本発明の第２製造装置において使用される供給手段は、本発明の第２製造装置において使用され得る異なる反応槽を該供給手段を介して接続させることができ、本発明の第２製造装置においてジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールを製造できる限り制限されない。該供給手段は、従来公知の技術に従い適宜選択される。【０３５１】
組換え細胞
本発明の第２製造装置において使用される組換え細胞は、前述の「第４工程で使用される組換え細胞」、「第５工程で使用される組換え細胞」及び「第６工程で使用される組換え細胞」等の記載と同様に説明される。【０３５２】
Ｅ１〜Ｅ３ポリヌクレオチド
本発明の第２製造装置において使用されるＥ１〜Ｅ３ポリヌクレオチドは、前述と同様に説明される。【０３５３】
第４反応槽におけるジヒドロダイゼインの製造
第４反応槽では、反応手段４に固定された、Ｅ１ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いて、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。第４反応槽における反応は、前述の「第４工程」等の記載に基づき実施される。【０３５４】
第５反応槽におけるテトラヒドロダイゼインの製造
第５反応槽では、反応手段５に固定された、Ｅ２ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いて、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。第５反応槽における反応は、前述の「第５工程」等の記載に基づき実施される。【０３５５】
第６反応槽におけるエクオールの製造
第６反応槽では、反応手段６に固定された、Ｅ３ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いて、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。第６反応槽における反応は、前述の「第６工程」等の記載に基づき実施される。【０３５６】
Ｄ−ＩＩ−３．第１反応槽〜第３反応槽の少なくとも１つの反応槽、及び第４反応槽〜第６反応槽の少なくとも１つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造装置
本発明は、前述の第１反応槽〜第３反応槽の少なくとも１つの反応槽、及び第４反応槽〜第６反応槽の少なくとも１つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び／又はエクオールの製造装置（以下、「第３製造装置」と表記することもある）を提供する。【０３５７】
第３製造装置における各反応槽、各反応手段の組み合わせは、前述の第１及び第２製造装置と同様に説明される。また、第３製造装置において使用される反応槽、反応手段、ポリヌクレオチド、組換え細胞、及び各反応槽における反応も、前述の第１及び第２製造装置と同様に説明される。
【実施例】
【０３５８】
実施例Ａ
参考例Ａ１
ラクトコッカス20-92株(FERM BP-10036号)を、ダイゼイン含有増殖用液体培地（ダイゼインを10μｇ／ｍＬとなる量で変法GAMブイヨン培地（日水製薬株式会社）に添加したもの）に接種し、嫌気的条件下（BBL Gas Pack systemsを使用）、37℃で7から18時間適宜培養した。培養後、遠心分離により集菌して冷凍保存し、以下の実施例に使用した。【０３５９】
実施例Ａ１  菌体破砕物の遠心上清中におけるジヒドロダイゼイン生合成活性の存在の確認、及びNADPH依存性の確認
保存してある凍結菌体（67mＬ分、2本）を融解後8,000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈渣を以下の試験に供した。沈渣を、1 mM PMSF(和光純薬工業株式会社）及び2mM DTT（和光純薬工業株式会社）、5 mM Sodium hydrosulfite（和光純薬工業株式会社）を含有する0.1 M リン酸カリウム溶液2mLに懸濁させた。懸濁液をあらかじめ0.1 mm zirconia/silica beads（BioSpec Products, Inc.）を入れておいた2ml容スクリューキャップ付チューブ（株式会社アシスト製）2本に移し、FastPrep（登録商標） FP100A（Thermo ELECTRON CORPORATION）にて菌体を破砕し(6500rpm  10秒  氷冷を8回)、菌体破砕液を得た。得られた菌体破砕液を約10,000rpm、4℃にて10分間遠心して遠心上清を得、遠心上清を1 mM PMSF及び2mM DTT、5 mM Sodium hydrosulfiteを含有する0.1 M リン酸カリウム溶液で4.5mＬに希釈し、これを酵素源とした。【０３６０】
下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、得られた酵素反応生成物に3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行った後、乾固して、HPLC分析に供した。HPLC分析の標準溶液はダイゼイン（フナコシ株式会社）、エクオール（フナコシ株式会社）、ジヒドロダイゼイン（トレンドリサーチケミカル社）の混合溶液（各2μg／mＬ)を用いた。
酵素反応液組成
2009084603.tif 000003
【０３６１】
結果を図１に示す。この結果から、菌体破砕物の遠心上清にはジヒドロダイゼイン生合成活性が存在することが確認された。また、ダイゼインからジヒドロダイゼインへの変換反応は、補酵素NADPHに依存性を示すことが確認された。【０３６２】
実施例Ａ２  ジヒドロダイゼイン合成酵素の精製
培養ボトル当たり67 mlの変法GAMブイヨン培地（日水製薬株式会社）にて18時間培養したラクトコッカス20-92株菌体9本を遠心後、2 mM DTT（1, 4-Dithiothreitol、Merck）、5 mM Sodium hydrosulfite（和光純薬工業株式会社）及びプロテアーゼインヒビター（コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルEDTA-free、Roche Diagnostics）を含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7に縣濁させた。懸濁液を0.1 mm zirconia/silica beads（BioSpec Products, Inc.）を入れた2ml容スクリューキャップ付チューブ（株式会社アシスト製）3本に移し、FastPrep（登録商標） FP100A（Thermo ELECTRON CORPORATION）にて菌体を破砕し(6500rpm、20秒を4回)、破砕液を遠心して上清を得た。また、培養ボトル当たり200mlの同液体培地にて18時間培養したラクトコッカス20-92株菌体8本を同様に菌体破砕後遠心し8本分の上清を得た。【０３６３】
精製には1 mM PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride、Sigma Aldrich）、2 mM DTT及び5 mM Sodium hydrosulfiteを含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7（以下、「Buffer A」と表記する）を用いた。得られた菌体の破砕上清を等量の2 M 硫安を含むBuffer Aと混合し、Butyl Sepharose 4 Fast Flow（ゲルは1本当り約0.3 ml、GEヘルスケア）を詰め、1 M 硫安を含むBuffer Aにて平衡化したマイクロバイオスピンカラム（11本、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）に供した。1 M 硫安を含むBuffer Aにて洗浄後、0.75 mlの0.5 M 硫安を含むBuffer Aを2回流した後、Buffer A を0.75 ml、次いで0.5 ml加えてジヒドロダイゼイン合成活性を有する画分を溶出した。前記Buffer A を0.75 mlを加えて得られた溶出液を溶出液I、前記0.5 ml加えてを加えて得られた溶出液を溶出液IIとする。【０３６４】
溶出液I 0.75 mlには0.3 ml、溶出液II 0.5 mlには0.2 mlの3.4 M硫安を含むBuffer Aをそれぞれ加えた後に、これらを混合し、これを1 M硫安を含む溶離液で平衡化したTSKgel Ether-5PWカラム（東ソー）を用いたHPLCに供した。混合液0.5 mlを2〜9回カラムに注入後、流速0.1 ml/分で1 M 硫安を含む溶離液（溶離液B）で洗浄し、その後、溶離液Bと溶離液Aの混合比率を変えることにより、15分間で直線的に0 M硫安（溶離液A）にするプログラムを実行した。酵素活性は約0.6 M〜0.35 M硫安の溶出画分に認められ、合計で約3.5 mlの溶出液を得た。HPLCの条件を以下に示す。蛋白質の吸収として、280 nmの吸収を測定した。
カラム: TSKgel Ether-5PW
流速: サンプルアプライ時0.05〜0.1 ml/分、溶出時 0.1 ml/分
溶離液A: 0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7/2mM DTT/2.5 mM Sodium hydrosulfite/1% 2-プロパノール
溶離液B: 1M 硫安を含む溶離液A【０３６５】
酵素活性が認められた溶出画分の溶出液をBuffer Aで希釈し、これをBuffer Aで平衡化した2’5’ ADP Sepharose 4B（ゲルは約0.3 ml、GEヘルスケア）を詰めたマイクロバイオスピンカラムに供した。Buffer Aによるカラム洗浄後、20 mM NADPHを含むpH 7.5 のBuffer A組成液0.7 ml、次いで0.6 mlにてジヒドロダイゼイン合成活性を有する画分を溶出した。【０３６６】
得られた溶出液をpH 7.5 の溶離液Cで平衡化したMono Qカラム（GEヘルスケア）を用いたHPLCに供した。流速0.1 ml/分で溶離液Cをカラムに送液し、洗浄後、溶離液Cと溶離液Dの混合比率を変えることにより、32.5 分間で直線的に0.65 M NaClにするプログラムを実行した。HPLCの条件を以下に示す。蛋白質の吸収として、280 nmの吸収を測定した。
カラム: Mono Q PC 1.6/5
溶離液C: 0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7.5/3 mM DTT/2.5 mM Sodium hydrosulfite/1% 2-プロパノール
溶離液D: 1M NaClを含む溶離液C
酵素活性は0.4〜0.46 M NaCl画分（フラクション No. 28〜30）に認められた。【０３６７】
斯くして実施したMono Q HPLCの結果と酵素活性を図２に示す。また、図３に還元条件下でのフラクションNo. 27〜31のSDS-PAGEの結果を示す。この結果、ジヒドロダイゼイン合成活性のあるフラクションに、還元条件下で70kDaのバンドが認められた。【０３６８】
実施例Ａ３  N末端アミノ酸配列の決定
70μlのMono Q HPLCで得たジヒドロダイゼイン合成活性のあるフラクション、No. 29に、30μlの0.1 %トリフルオロ酢酸（TFA）を加えて100μlとした。【０３６９】
10μlのメタノールにてProSorbカートリッジ（アプライドバイオシステムズジャパン）のPVDF膜を湿らせ、続いて先に混合した液を添加した。ProSorbフィルター（アプライドバイオシステムズジャパン）を用いて吸水後、膜を乾燥させ、メンブレン用パンチ（アプライドバイオシステムズジャパン）を用いて、膜を切り取った。該膜を20 % メタノール水で5回洗浄し、乾燥させた。この膜をプロテインシーケンサ（アプライドバイオシステムズ、Procise 494cLC）にてN末端アミノ酸配列分析を行い、次に示す22残基の連続したアミノ酸配列を得た。
Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr Ile Gly Asn Leu Glu Val Glu Asn  （配列番号１９）【０３７０】
実施例Ａ４  内部アミノ酸配列の決定
ジヒドロダイゼイン合成活性を示す酵素タンパク質を消化酵素で断片化しペプチドとした。ペプチドのN末端アミノ酸配列分析を行って、内部アミノ酸配列情報を得た。【０３７１】
（１）試料の調製
培養ボトル当たり200 mlの変法GAMブイヨン培地（日水製薬株式会社）にて18時間培養したラクトコッカス20‐92株菌体3本を遠心後、2 mM DTT（1, 4-Dithiothreitol、Merck）、5 mM Sodium hydrosulfite（和光純薬工業株式会社）及びプロテアーゼインヒビター（コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルEDTA-free、Roche Diagnostics）を含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7に縣濁させた。懸濁液を0.1 mm zirconia/silica beads（BioSpec Products, Inc.）を入れた2ml容スクリューキャップ付チューブ（アシスト）3本に移し、FastPrep（登録商標） FP100A（Thermo ELECTRON CORPORATION）にて菌体を破砕し(6500rpm、20秒を4回)、破砕液を遠心して上清を得た。【０３７２】
以後の操作には1 mM PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride、Sigma Aldrich）、2 mM DTT及び5 mM Sodium hydrosulfiteを含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7 (以下、「Buffer A」と表記する)を用いた。菌体の破砕上清を等量の2 M 硫安を含むBuffer Aと混合し、Butyl Sepharose 4 Fast Flow（ゲルは1本当り約0.3 ml、GEヘルスケア）を詰め、1 M 硫安を含むBuffer Aにて平衡化したマイクロバイオスピンカラム（3本、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）に供した。1 M 硫安を含むBuffer Aにて洗浄後、0.75 mlの0.5 M 硫安を含むBuffer Aを2回流した後、0.75 mlのBuffer A を2回加えてジヒドロダイゼイン合成活性を有する画分を溶出した。【０３７３】
2’5’ADP Sepharose 4Bを詰めたマイクロバイオスピンカラム1本をBuffer Aで平衡化し、先に溶出した溶液1.5 mlを添加した。0.75 mlのBuffer Aで5回洗浄後、20 mM NADPHを含むBuffer A 0.75 ml、次いで0.45 mlにて溶出した。溶出液を混合し、微量用遠心濃縮チューブ（NANOSEP 10K OMEGA、Pall Life Sciences）にて5 μlまで脱塩濃縮した。【０３７４】
濃縮液と2-メルカプトエタノールを含む2倍濃度のSDS-PAGE用サンプルバッファを用いて回収した液を混合し、90 ℃で7 分間加熱処理した後、Laemmuli法に従いSDS-PAGEを行った。電気泳動のゲル板はスーパーセップ HG 10-20 %（和光純薬工業株式会社）を用いた。Colloidal Blue（Invitrogen）染色し、ミリQ水にて脱色後、約70 kDaに泳動されたバンドを切り出した。コントロールとしてタンパク質を泳動していない部分より同等の分子量位置及び大きさのゲル片を切り出し、以後同様に処理した。尚、別途同様な操作で菌体を処理し、SDS-PAGE後PVDF膜に転写した同位置のバンドを用いてN末端アミノ酸配列分析を行い、Mono Q HPLCフラクションNo.29で得た配列と一致することを確認した。【０３７５】
（２）還元カルボキサミドメチル化と酵素消化
切り出したゲル片は細断し、50 %アセトニトリル水溶液を用いて脱色した後アセトニトリルで脱水し、遠心濃縮機（SpeedVac A160、Savant）にて乾燥させた。55 mM のDTTを含む100 mM炭酸水素アンモニウム水溶液を加え、56 ℃で1時間還元した。DTT溶液を除き、100 mMのヨードアセトアミドを含む100 mM炭酸水素アンモニウム水溶液を加え、遮光下、室温で30 分間ゆるく振とうしてカルボキサミドメチル化処理を行った。反応試薬を除去後、50 %アセトニトリル水溶液、アセトニトリル、100 mM炭酸水素アンモニウム水溶液、及びアセトニトリルの順に洗浄し、ゲルを遠心濃縮機にて乾燥した。2 μgのAchromobacter protease I（和光純薬工業株式会社）を含む0.02 % Tween 20入り20 mMトリス塩酸緩衝液 pH 9を加え、37℃で7 時間消化した。遠心上清を別チューブに移し、ゲルに60 % アセトニトリル- 0.1 % TFA水溶液を加えて30 ℃で20 分間加温後、10 分間ボルテックスする操作を3回行って断片化したペプチドを抽出した。集めた上清液はUltrafree-MC（0.22μm、Amicon）を用いてろ過した後、遠心濃縮した。【０３７６】
（３）ペプチドマッピング
逆相HPLCを行い、酵素消化後のペプチドを分離した。
カラム: μRPC C2/C18 SC2.1/10（GEヘルスケアバイオサイエンス）
流速: 0.1 ml/分
溶離液E: 0.05 % TFA
溶離液F: 90 % アセトニトリル/0.04 % TFA
溶出プログラム：  0 分    5 %F
3 分    5 %F
43 分   65 %F
48 分  100 %F
68 分  100 %F
フラクション: 30μl
検出： 215 nm
なお、例えば上記「0 分  5 %B」は、溶出0時間時には溶離液Eが95％、溶離液Fが5％含有された溶離液を使用したことを示す。【０３７７】
（４）内部アミノ酸配列分析
コントロールのクロマトグラムとの比較により、ジヒドロダイゼイン合成活性を示す酵素タンパク質由来のペプチドピークを選び、プロテインシーケンサ（アプライドバイオシステムズ、Procise 492HT）にてN末端アミノ酸配列分析を行った。逆相HPLCで分離開始後、20.6分から溶出し始めたピークのアミノ酸配列（以下、Peptide１とする）は次の通りであった。
PheAspGluProValTyrProGlnAlaGlu（配列番号２０）
22.1分から溶出し始めたピークのアミノ酸配列（以下、Peptide２とする）は次の通りであった。
AlaSerArgMetValMetAspAlaValHisGluGlyTyrIleAlaGly（配列番号２１）
26.6分から溶出し始めたピークは、非特異的に切断されたペプチドであったが、次に示すように当該酵素タンパク質のN末端から13残基目のグリシンをN末とするペプチドであった（以下のアミノ酸配列を、Peptide３とする）。
GlyTyrIleGlyAsnLeuGluValGluAsnArgAlaIleArgMetProMet（配列番号２２）
図４に、実施例Ａ４においてペプチドマッピングを行った結果及び各ピークに対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
ピーク1（20.6 分）
ピーク2（22.1分）
ピーク3（26.6分）【０３７８】
実施例Ａ５  精製ポリペプチドのN末端及び部分アミノ酸配列からのジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の増幅
上記実施例Ａ３及びＡ４で得られたN末端及び部分アミノ酸配列を基にDegenerative-プライマーを設計、作製し、ラクトコッカス20-92株のゲノムDNAを鋳型にDegenerative-PCRを行うことによりジヒドロダイゼイン合成酵素をコードする遺伝子の増幅を試みた。【０３７９】
（１）ラクトコッカス20-92株からのゲノムDNAの精製
変法GAMブイヨン培地（日水製薬株式会社）  40mＬで嫌気培養したラクトコッカス20-92株を5000rpm、4℃、10分間で遠心し、培地をデカンテーションで除去し、菌体を集めた。集めた菌体は直ちにQIAGEN Genomic DNA Buffer Set（キアゲン）のB1溶液１１mＬ （200μg／mＬ RNaseを含有）に懸濁し、更に300μLのLysozyme溶液（100mg／mＬ）、500μLのQIAGEN Proteinase K solution（キアゲン）を加えて、37℃、16時間インキュベーションした。次いで、B2溶液４mＬ加え、数回転倒混和した後、50℃、３時間インキュベーションした。【０３８０】
次いで、5000rpm、4℃、10分間遠心し、その上清をQBT溶液で平衡化したQIAGEN Genomic-tip 500/G（キアゲン）カラムに通し、ゲノムDNAをカラムに吸着させた。30mＬのQC溶液で2回カラムを洗浄後、15mＬのQFでカラムからゲノムDNAを溶出させ、10.5mＬのイソプロパノールを加えて塩析させた。糸状に析出したゲノムDNAのみを1.5mＬ容マイクロチューブに採り、75％エタノールで洗浄し、風乾した後、250μLのTE溶液（0.4μg／μL）で溶解した。こうして得られたゲノムDNA溶液は濃度を測定後、TE溶液で40ng／μLに調製し、PCRの鋳型として使用した。【０３８１】
（２）Degenerative-プライマーの設計、作製
Degenerative-プライマーの設計では縮退数を小さくするため、５’側の配列はラクトコッカス ガルビエのコドンユーセイジ情報（Codon Usage Database  http://www.kazusa.or.jp/codon/）に基づき、各アミノ酸において最も出現頻度が高いコドンを採用した。３’側は混合塩基を利用することにより、ジヒドロダイゼイン合成酵遺伝子とのミスマッチが起こらないように工夫した。【０３８２】
実施例Ａ３で決定したN末端配列：MKNKFYPKTFERGYIGNLEVENを基に以下のDegenerative-プライマーを設計、作製し、Degenerative-PCRに使用した。
E1-N-terminal-31：TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGA（配列番号２３）
（ただし、配列番号２３において、位置１１及び１４の「Ｎ」はイノシンを示し、位置２０及び２６の「Ｎ」はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを示す。）
E1-N-terminal-37：TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGARRGNGG（配列番号２４）
（ただし、配列番号２４において、位置１１、１４、２０及び２６の「Ｎ」はイノシンを示し、位置３５の「Ｎ」はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを示す。）
E1-N-terminal-F32：ATGAAGAATAAGTTTTAYCCNAARACNTTYGA（配列番号２５）
（ただし、配列番号２５において、位置２１及び２７の「Ｎ」はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを示す。）【０３８３】
また、実施例Ａ４で決定した内部配列Peptide２：ASRMVMDAVHEGYIAGを基に以下のDegenerative-プライマーを設計、作製し、Degenerative-PCRに使用した。
E1-internal-RP1：CCTGCAATATAACCTTCATGTACNGCRTCCATNACCAT（配列番号２６）
（ただし、配列番号２６において、位置２４及び３３の「Ｎ」はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを示す。）【０３８４】
尚、本実施例でプライマーとして使用したオリゴDNAは全てシグマ  アルドリッチ  ジャパンで作製した。【０３８５】
（３）Degenerative-PCRによるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の増幅
上記のDegenerative-プライマーを用いてDegenerative-PCRによるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の増幅を試みた。
Degenerative-PCRに用いたDegenerative-プライマーの組み合わせを以下に示す。
［１］E1-N-terminal-31とE1-internal-RP1
［２］E1-N-terminal-37とE1-internal-RP1
［３］E1-N-terminal-F32とE1-internal-RP1
Degenerative-PCRによるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の増幅はEx-Taq DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）を使用し、増幅プログラム：
95℃  2min、（95℃  45sec、38℃−54℃  30sec、72℃  2min）×50cycles、72℃  3minで行った。Degenerative-プライマーのゲノムＤＮＡへのミスマッチを考慮し、アニーリングの温度は38℃から4℃刻みに54℃までの5段階で行った。PCR反応終了後、PCR産物に1/10量の10×Dyeを加え、6μLを0.8％のアガロースゲルで電気泳動した。本実施例におけるアガロース電気泳動ではエチジウムブロミドによる染色で行い、分子量マーカーにはλ／StyI（株式会社ニッポンジーン）、100bp ladder（東洋紡績株式会社）を使用した。【０３８６】
Degenerative-PCR産物の電気泳動の結果を図５に示す。本実施例内（３）で示した［３］のDegenerative-プライマーの組み合わせ（E1-N-terminal-F32とE1-internal-RP1）でいずれのアニーリング温度においても約1.9kbのDNA断片の増幅を確認した。中でも最も増幅されたのはアニーリング温度54℃であった。【０３８７】
（４）増幅したDNA断片の塩基配列の決定
増幅した約1.9kbのDNA断片（アニーリング温度54℃）をアガロースゲルから切り出し、Gel-Extraction kit（キアゲン）を用いて精製した。精製したDNA断片はpT7-Blue Cloning Vector（Novagen）に挿入し、塩基配列を決定した。【０３８８】
得られたDNA塩基配列はDNAシークエンス-アセンブルソフトウェアSEQUENCHER（Gene Codes  Inc、USA)を使用して解析を行った。その結果、実施例Ａ４で決定したPeptide１及び3のアミノ酸配列に相当する塩基配列が存在していた。【０３８９】
実施例Ａ６  ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の全塩基配列の決定
実施例Ａ５で得られた1.9kbのジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の５’端及び３’端の配列を決定し、全塩基配列の決定をおこなうため、ラクトコカッス20-92株のゲノムDNAライブラリーを鋳型にcＤＮＡ末端配列の急速増幅（５’−、３’−RACE(rapid amplification of cDNA ends)）を行った。【０３９０】
（１）ゲノムDNAライブラリーの作製
実施例Ａ５で精製したラクトコカッス20-92株のゲノムDNAを制限酵素（BamHI,EcoRI,HindIII,KpnI,PstI,SacI,SalI,Sau3AI,XhoI)（いずれもタカラバイオ株式会社）により37℃、16時間消化することで断片化し、フェノール・クロロホルム処理後、エタノール沈殿にて精製した。精製したゲノムDNA断片はあらかじめ相当する制限酵素で切断処理し、Shrimp Alkaline Phosphatase（タカラバイオ株式会社）処理により脱リン酸化しておいたpUC19クローニング ベクターへTaKaRa Ligation kit var.2.1(タカラバイオ株式会社）を用いてライゲーションし、ゲノムDNAライブラリーを作製した。【０３９１】
（２）cＤＮＡ末端配列の急速増幅（５’−RACE、３’−RACE）
ゲノムDNAライブラリー（ライゲーション反応液）を滅菌水で20倍希釈し、1μＬを鋳型に使用して、cＤＮＡ末端配列の急速増幅（５’−RACE、３’−RACE）によるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の５’端及び３’端の配列の増幅を試みた。【０３９２】
（２−１）使用プライマー
５’−RACE、３’−RACEにそれぞれ用いたプライマーの組み合わせを以下に示す。【０３９３】
（２−１−１）  ５’−RACE
First-PCR：E1-RACE-N-P1とpUC19-FP-1、E1-RACE-N-P1とpUC19-RP-1
Nested-PCR：E1-RACE-N-P2とpUC19-FP-2、E1-RACE-N-P2とpUC19-RP-2【０３９４】
（２−１−２）  ３’−RACE
First-PCR：E1-RACE-RP2-1とpUC19-FP-1、E1-RACE-RP2-1とpUC19-RP-1
Nested-PCR：E1-RACE-RP2-2とpUC19-FP-2、E1-RACE-RP2-2とpUC19-RP-2【０３９５】
（２−１−３）使用プライマーの配列
５’−RACE、３’−RACEにそれぞれ用いたプライマーの配列を以下に示す。
ベクター側プライマー：
pUC19-FP-1: ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG（配列番号２７）
pUC19-RP-1: AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGC（配列番号２８）
pUC19-FP-2: ATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG（配列番号２９）
pUC19-RP-2: CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG（配列番号３０）
ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子側プライマー
E1-RACE-N-P1: ATGCGGATCGCTCGGTTCTCGACCTCTAGGTTAC（配列番号３１）
E1-RACE-RP2-1: ATCGAGGAGAAGTGCGAGGACGTCAGGGTCATC（配列番号３２）
E1-RACE-N-P2: TTCTCGACCTCTAGGTTACCGATGTAGCCGC（配列番号３３）
E1-RACE-RP2-2: ACGTCAGGGTCATCGGCATCGGCGACTGCAAG（配列番号３４）【０３９６】
尚、本実施例でプライマーとして使用したオリゴDNAは全てシグマ  アルドリッチ  ジャパンで作製した。【０３９７】
（２−２） ５’−RACE及び３’−RACEによるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の５’端及び３’端の配列の増幅
５’−RACE、３’−RACEにはEx-Taq DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）を使用し、First-PCR及びNested-PCRを同増幅プログラム： 
95℃  2min、（95℃  45sec、60℃  30sec、72℃  １min）×30cycles、72℃  3minで行った。First-PCRでは鋳型に調製方法を上記記載したゲノムＤＮＡ希釈液１μL（40ng）を使用し、Nested-PCRには0.5μLのFirst-PCR産物を使用した。【０３９８】
Nested-PCR反応終了後、PCR産物に1/10量の10×dayを加え、5μLを0.8％のアガロースゲルで電気泳動し、５’−RACEでは約1.2kb（SacI）,約1.0 kb(Sau3AI)、３’−RACEでは約0.6kb(SacI),0.3kb（KpnI）のDNA断片の増幅を確認した。【０３９９】
本実施例におけるアガロース電気泳動ではエチジウムブロミド（株式会社ニッポンジーン）による染色で行い、分子量マーカーにはλ／StyI（株式会社ニッポンジーン）、100bp ladder(東洋紡績株式会社)を使用した。【０４００】
増幅したDNA断片をアガロースゲルから切り出し、Gel-Extraction kit（キアゲン）を用いて精製した。精製したDNA断片は増幅に使用したプライマーを使用したダイレクトシークエンスにより、塩基配列を決定した。その結果、５’−RACEでは上記の約1.2kb（SacI）、約1.0 kb(Sau3AI)、３’−RACEでは約0.6kb(SacI)のDNA断片がジヒドロダイセイン合成酵素遺伝子の配列であった。【０４０１】
（３）ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の全塩基配列決定
実施例Ａ５で示したDegenerative-PCR及び本実施例内（２）に示したcＤＮＡ末端配列の急速増幅により得られたDNA塩基配列をDNAシークエンス-アセンブルソフトウェアSEQUENCHER（Gene Codes  Inc、USA）を使用してアセンブル解析を行った。その結果、3548bpのジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子周辺のゲノム構造を決定し、ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子は1935ヌクレオチド、644アミノ酸からなるポリペプチドであることが判明した。【０４０２】
塩基配列から決定された全アミノ酸配列とアミノ酸シークエンスから判明した部分アミノ酸配列の照合を行った結果、アミノ酸シークエンスから判明した部分アミノ酸配列の全てが塩基配列から決定された全アミノ酸配列に帰属できた。【０４０３】
（４）コーディング領域の塩基配列の確認
本実施例内（３）で得られた配列にはPCRでの増幅の際、DNAポリメラーゼの塩基取り込みエラーによるクローン間で塩基の異なる箇所が多数見られた。そのため、First strand cDNAを鋳型にして、High-FidelityDNA−PolymeraseであるEasy-A(R) High-Fidelity PCR Cloning Enzyme （Stratagene)を使用したPCRにより、ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子のコーディング領域を含んだ領域（2368bp）を増幅させた。
使用した増幅プライマーを以下に示す。
E1-conf-NP：TGCCGGTGCAATGGCTGACATCATGTTCAACCTG（配列番号３５）
E1-conf-CP：TCCTCCATCGTTCCTCCAATCAGTAAGACACGCG（配列番号３６）
得られたDNA断片はGel-Extraction kit（キアゲン）を用いて精製し、ダイレクトシークエンスにより、配列の確認、最終決定を行った。【０４０４】
実施例Ａ７  増殖培養液中へのダイゼインの添加によるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の発現誘導
実施例Ａ１で示したようにラクトコッカス20-92株の増殖用培養液に基質であるダイゼインを添加した場合、培養された菌体はジヒドロダイゼイン合成活性を有する。このことから増殖培養液中へのダイゼインの添加により、ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の転写が誘導され、更にタンパク質へと翻訳されることが推測されるため、ダイゼインを添加した培地及び添加していない培地でそれぞれ培養したラクトコッカス２０−９２株菌体由来のcＤＮＡを作製し、RT-PCRを行うことで増殖培養液中へのダイゼインの添加によりジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の発現が誘導されるか否かについて検討した。【０４０５】
（１）ラクトコッカス２０−９２株からの全RNAの抽出、精製
ラクトコッカス２０−９２株からの全RNAの抽出、精製は以下の方法で行った。【０４０６】
4℃で密封保存しておいたラクトコッカス２０−９２株をダイゼイン（フナコシ株式会社）10mg/Lを含むもしくは含まない変法GAMブイヨン培地で37℃、8時間嫌気培養を行った後、培養液25ｍL を50ｍL容のチューブに移し、3500rpm、4℃、10分間遠心し、培地をデカンテーションで除き、集菌した。集めた菌体はすばやく液体窒素で凍結させ、次いでTRIzol溶液（Invitrogen）１ｍLを用いてマニュアルに従い、全RNAを抽出、精製した。精製した全RNAはDNase I（Invitrogen)処理を行うことにより、混入しているゲノムDNAを除去し、first-strand cDNAの合成に使用した。【０４０７】
（２）全RNAからのfirst-strand cDNAの合成
DNaseI処理を施した全RNA  2μgからSuperScript（登録商標）First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen)を用いてfirst-strand cDNA（逆転写物）を合成した。ＤＮＡ合成のための伸長プライマーには付属のランダムヘキサマーミックスを用いてマニュアルに従いfirst-strand cDNAの合成を行った。また、first-strand cDNAの合成に用いたDNase I処理済みの全RNAへのゲノムDNAの混入が無いことを確認するため、逆転写を行わない反応も併せて行った。RT−PCRの鋳型には最終反応液を使用した。【０４０８】
上記で調製した最終反応液は以下の4種類である。
１．ダイゼイン添加培地で培養した菌体由来全RNAの逆転写物（DZN(+)RT(+)）
２．ダイゼイン無添加培地で培養した菌体由来全RNAの逆転写物（DZN(‐)RT(+)）
３．ダイゼイン添加培地で培養した菌体由来全RNAの無逆転写物（DZN(+)RT(‐)）
４．ダイゼイン無添加培地で培養した菌体由来全RNA無逆転写物（DZN(‐)RT(‐)）【０４０９】
（３）ＲＴ−PCRによるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の発現の確認
本実施例内（２）で示した4種類の最終反応物を鋳型にしてRT-PCRを行うことにより、ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子を増幅し、発現量を比較した。コントロール遺伝子として１６Ｓ−リボゾームＲＮＡ配列を採用し、併せてRT-PCRを行った。【０４１０】
RT-PCRの増幅条件及び、それぞれの遺伝子増幅に使用したプライマー配列を以下に示す。
RT-PCRにはEx-Taq DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）を使用し、増幅プログラム： 
95℃  2min、（95℃  30sec、56℃  20sec、72℃  30sec）×30cycles、72℃  2minで行った。鋳型には本実施例内（２）の最終反応液１μLを使用した。【０４１１】
本実施例のRT-PCRに使用したプライマー配列及び増幅するDNA断片のサイズを以下に示す。
ジヒドロダイゼイン合成酵素：239bp
E1-FP：CTACATCGGTAACCTAGAGGTCG（配列番号３７）
E1-RP：CCGTGCTGCTTGATGGTCTTTGC（配列番号３８）
１６Ｓ−リボゾームＲＮＡ配列：326bp
Gar-１６S-Ribo-FP：TGCGTAGATATATGGAGGAAC（配列番号３９）
Gar-１６S-Ribo-RP：CTTATCTCTAAGGATAGCACG（配列番号４０）【０４１２】
尚、１６Ｓ−リボゾームＲＮＡ配列の増幅に用いたプライマーは米国生物工学情報センター（National Center of Biotechnology Information:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)が提供している塩基配列データベース(GenBank)内のLactococcus garvieae strain FLG12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence(Accesion No.AF352163-66)の配列を基に作製した。【０４１３】
PCR産物に1/10量の10×dayを加え、5μLを1.5％のアガロースゲルで電気泳動し、それぞれの遺伝子の増幅を観察した。【０４１４】
本実施例におけるアガロース電気泳動ではエチジウムブロミド（株式会社ニッポンジーン）による染色で行い、分子量マーカーにはλ／StyI（株式会社ニッポンジーン）、100bp ladder(東洋紡績株式会社)を使用した。【０４１５】
結果を図６に示す。【０４１６】
ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子のRT-PCRによる増幅結果から明らかなように、鋳型にダイゼイン添加培地で培養した菌体由来の逆転写物を使用した場合にのみ、前記遺伝子が効率良く発現されたことが観察された。コントロールとして増幅させた１６Ｓ−リボゾームＲＮＡ配列は培地中へのダイゼインの添加の有無に関係なく、同等の発現が観察された。また、無逆転写物ではジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子及び１６Ｓ−リボゾームＲＮＡ配列双方とも前記遺伝子が増幅されなかったことからfirst-strand cDNAの合成に用いたDNase I処理済みの全RNAへのゲノムDNAの混入が無いことが確認された。以上のことから、培地へのダイゼインの添加により、ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子のmＲＮＡの発現が誘導されることが示された。【０４１７】
実施例Ａ８  大腸菌を用いた組換えE1ポリペプチドの発現及びそのジヒドロダイゼイン合成活性の確認
大腸菌を用いた組換えタンパク質発現システムであるpＥＴシステムを用いてE1ポリペプチドを発現させ、そのジヒドロダイゼイン合成活性を確認した。【０４１８】
（１）E1ポリペプチド発現ベクターの作製
E1ポリペプチド発現ベクター（pET21-E1-His）を作製する目的でPCRにより、E1ヌクレオチドのオープン・リーディング・フレーム領域のDNAを増幅した。【０４１９】
実施例Ａ６で決定したE1ヌクレオチド配列を基に下記の増幅プライマーを作製した。
exp.E1 pet F Nde：AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA  （配列番号：４１)
exp. E1 pet His：AATCGAATTCCTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT  （配列番号：４２)
上記増幅プライマー：exp.E1 pet F Nde、exp.E1 pet HisにはpET21a（Novagen)へ挿入するため、それぞれ制限酵素NdeI切断部位、EcoRI切断部位配列を含ませてある。【０４２０】
上記プライマーを各5pmol、dNTP 5nmol each、実施例Ａ５で精製したラクトコッカス20-92株のゲノムDNA  40ng 、KOD-plus DNA polymerase用１０×緩衝液（東洋紡績株式会社）2.5μL、KOD-Plus DNA polymerase 0.3ユニット（東洋紡績株式会社）を含む25μLの反応液を用い、増幅プログラム：95℃ 3分、（94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 2分)×30cycles、68℃ 7分でGeneAmpPCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ）を用いて行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、予想される大きさのバンドが検出できた。PCR産物全量をQIAGEN PCR Purification kit（キアゲン）にて回収した。【０４２１】
回収したDNA断片を制限酵素NdeI及びEcoRIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Qiagen Gel Extraction kit (キアゲン) により精製、回収した。  得られたDNA断片はNdeI及びEcoRIで消化したpET21aとDNA Ligation Kit ver.2.1（タカラバイオ株式会社)を用いて、16 ℃、終夜ライゲーションした後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株（タカラバイオ株式会社)を形質転換した。【０４２２】
形質転換体をアンピシリン（50μg/mL）を含むＬＢ培地アガー（GIBCO)プレート上で37℃、終夜生育させ、コロニーを得た。得られたシングルコロニーはアンピシリン（50μg/mL）を含むLB培地（GIBCO)３mＬで終夜培養した後、プラスミド自動抽出機PI-100（KURABO)を用いてプラスミドDNAを抽出した。【０４２３】
プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法によりシークエンスを行い、目的どおり正しくE1ヌクレオチドが挿入されていることを確認し、pET21-E1-Hisを得た。本実施例におけるDNAシークエンスはDNAシークエンサーABI3700（アプライド・バイオシステムズ）を用いて行った。【０４２４】
（２）大腸菌内での組換え体の作製ならびにE1ポリペプチドの発現および確認
組換えE1ポリペプチドを発現するプラスミドpET21-E1-His とpET21a(ネガティブコントロール）を用いて、大腸菌BL21（DE3)株（Novagen）を形質転換した。形質転換体はアンピシリン（50μg/mL）を含むＬＢ培地アガープレート上で37℃、終夜生育させ、シングルコロニーを得た。【０４２５】
上記の大腸菌BL21（DE3）形質転換体それぞれをアンピシリン50μg/ｍLを含む3mLの液体LB培地で終夜37℃において培養を行った。その培養液0.5ｍL を同濃度のアンピシリンを含む液体LB培地50ｍL 加え、3時間（OD630nmが約0.4になるまで）前培養し、終濃度が1mM になるようにIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）（和光純薬工業株式会社）を加え、さらに37℃で4時間培養を行った。【０４２６】
培養終了後、菌体をAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離（6000rpm  4℃ 15分）により集菌した。以降の操作は氷上で行った。遠心上静（培地）を除いた後、1mM PMSF、2mM DTT、5mM Sodium hydrosulfiteを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH7.0（KPB-PDH)1ｍLに懸濁し、あらかじ0.7mＬ容のジルコニア-シリカビーズ（BioSpec Products, Inc.）及びKPB-PDH 400μLを入れておいた2mL容アシストチューブへ入れ、FastPrep(R)（Thermo ELECTRON CORPORATION）を用いて6500rpm、20秒間処理-3分間氷冷を２回繰り返すことで、菌体を破砕し、菌体破砕液を得た。【０４２７】
大腸菌内での組換えE1ポリペプチドの発現確認はSDS-ポリアクリルアミド-ゲル電気泳動（SDS-PAGE）で行った。【０４２８】
上記菌体破砕液10μLに5×サンプル緩衝液（125mM Tris-HCl（pH6.5)/ 25% グリセロール/5% SDS/5% 2-メルカプトエタノール/BPB 0.5%)を2.5μL加え、98℃ 5分間加熱変性後、氷冷し、うち５μLをSDS-PAGEで泳動した。SDS‐PAGEには市販のゲル板（SuperSepTM5-20％ (和光純薬工業株式会社））を使用し、染色はクイックCBB（和光純薬工業株式会社）で行った。分子量マーカーにはPrestained XL-Ladder Broad range(株式会社アプロサイエンス）を使用した。【０４２９】
SDS-PAGEの結果を図７に示す。pET21-E1-His形質転換体由来の菌体破砕液で分子量約70kＤａの組換えE1ポリペプチドが確認された。【０４３０】
（３）組換え体から得られたE1ポリペプチドのジヒドロダイゼイン合成活性の確認
本実施例内（２）で得た菌体破砕液を酵素源として、ダイゼインからジヒドロダイゼインへの変換活性を測定し、発現させた組換えE1ポリペプチドにその活性を確認した。【０４３１】
本実施例でのダイゼインからジヒドロダイゼインへの変換活性の測定は以下の方法で行った。【０４３２】
下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で2時間インキュベートした。
酵素反応液組成
2009084603.tif 000004
インキュベート後、得られた酵素反応液に3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行い、乾固した後、移動層（溶離液）で溶解した。溶解物をHPLC分析することにより、酵素反応液中のダイゼイン及びジヒドロダイゼインの含量を測定した。【０４３３】
HPLC分析の結果を図８に示す。組換えE1ポリペプチドを発現するプラスミドpET21-E1-Hisの形質転換体由来の菌破砕液では酵素反応液に加えたダイゼイン（基質）がジヒドロダイゼインへと変換されることが観察された。ネガティブコントロールであるpET21a形質転換体では酵素反応液中にジヒドロダイゼインは検出されなかった。【０４３４】
以上のことから組換えE1ポリペプチドがダイゼインからのジヒドロダイゼイン合成活性を有することが示された。【０４３５】
（実施例Ｂ）
参考例Ｂ１  シス−テトラヒドロダイゼイン及びトランス−テトラヒドロダイゼインの合成
シス−テトラヒドロダイゼイン及びトランス−テトラヒドロダイゼインを、以下のフローに従って製造した。なお、以下、化合物の表記に関して、下記の略記を使用する。
化合物1（ダイゼイン）：  4’,7−ジヒドロキシイソフラボン
化合物2：  4’,7−ジアセトキシイソフラボン
化合物3：  4’,7−ジアセトキシイソフラバン−4−オン
化合物4：  シス−4’,7−ジアセトキシイソフラバン−4−オール
化合物5：  トランス−4’,7−ジアセトキシイソフラバン−4−オール
化合物6：  シス−テトラヒドロダイゼイン
化合物7：  トランス−テトラヒドロダイゼイン【０４３６】
【化１】
2009084603.tif 000005
【０４３７】
化合物2の合成
ダイゼイン（化合物1） 500 mg（1.97 mmol）のピリジン（5 mL）溶液に無水酢酸0.76 mL（8.0 mmol）を加え、60℃で2時間撹拌した。反応液に少量のメタノールを加えた後に、3N塩酸中に注いだ。水で希釈した後に析出した固体を濾取し、これを水洗した。得られた固体を室温にて風乾して白色粉末状の化合物2  609 mg（1.80 mmol、91％収率）を得た。
化合物2：1H  NMR（250 MHz, CDCl3）δ（ppm）: 2.33 (3H, s), 2.37 (3H, s), 7.13-7.22 (3H, m), 7.32 (1H, d, J = 2.3 Hz), 7.54-7.63 (2H, m), 8.01 (1H, s), 8.33 (1H, d, J = 8.8 Hz). 【０４３８】
化合物3の合成
化合物2  400 mg（1.18 mmol）及び10％パラジウム−炭素（含水品、約50 wt%）150 mgのメタノール（6 mL）−酢酸エチル（6 mL）懸濁液を水素雰囲気下、室温で2時間撹拌した。反応液をセライト濾過し、残渣を酢酸エチルで洗浄した。濾液を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：ジクロロメタン／酢酸エチル= 100/0 − 19/1）で精製して、白色粉末状の化合物3  312 mg（0.917 mmol、78％収率）を得た。
化合物3：1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ(ppm): 2.29 (3H, s), 2.32 (3H, s), 3.93-4.04 (1H, m), 4.60-4.75 (2H, m), 6.76-6.84 (2H, m), 7.04-7.13 (2H, m), 7.27-7.35 (2H, m), 7.93-8.01 (1H, m). 【０４３９】
化合物4及び化合物5の合成
化合物3  100 mg（0.294 mmol）のメタノール（1 mL）−ジクロロメタン（1 mL）溶液に0℃で水素化ホウ素ナトリウム11 mg（0.29 mmol）を加え、0℃で30分撹拌した。反応液に1N塩酸2 mL、水50 mLを順に加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水の順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：ジクロロメタン／酢酸エチル= 19/1−3/1）で精製した。得られたジアスレレオマー混合物を中圧カラムクロマトグラフィー（山善製ウルトラパックSI-40B：n-へキサン／酢酸エチル = 3/2）で精製して、無色針状の化合物4  44 mg（0.13 mmol、44％収率）及び無色針状の化合物5  26 mg（75 mmol、26％収率）を得た。化合物4：1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ(ppm): 1.80 (1H, d, J = 4.0 Hz), 2.30 (3H, s), 2.31 (3H, s), 3.32 (1H, td, J = 3.5, 11.5 Hz), 4.32 (1H, ddd, J = 1.3, 3.5, 10.5 Hz), 4.59 (1H, dd, J= 10.5, 11.5 Hz), 4.76-4.83 (1H, m), 6.64-6.73 (2H, m), 7.06-7.14 (2H, m), 7.27-7.35 (3H, m). 
化合物5：1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ(ppm): 2.02 (1H, d, J = 5.5 Hz), 2.29 (3H, s), 2.30 (3H, s), 3.11-3.24 (1H, m), 4.26 (1H, dd, J = 9.0, 11.3 Hz), 4.37 (1H, dd, J = 3.8, 11.3 Hz), 4.92 (1H, dd, J = 5.5, 7.8 Hz), 6.62 (1H, d, J = 2.3 Hz), 6.72 (1H, dd, J= 2.3, 8.5 Hz), 7.04-7.12 (2H, m), 7.21-7.30 (2H, m), 7.47 (1H, d, J = 8.5 Hz). 【０４４０】
化合物6の合成
化合物4  116 mg（0.339 mmol）のメタノール（4 mL）溶液にナトリウムメトキシド55 mg（1.0 mmol）を加え、室温で2時間撹拌した。反応液にイオン交換樹脂（ダウエックス50×8W、アンモニウムフォーム）を加えて中和した後に、樹脂を濾去した。濾液を濃縮して得られた固体をメタノールで洗浄して、白色粉末状の化合物6  62 mg（0.24 mmol、71％収率）を得た。
化合物6：1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 3.03 (1H, td, J = 3.3, 12.0 Hz), 4.00-4.15 (1H, m), 4.31-4.51 (2H, m, including 4.39, dd, J = 10.3, 12.0 Hz), 4.96 (1H, d, J = 5.8 Hz), 6.18 (1H, d, J = 2.3 Hz), 6.32 (1H, dd, J = 2.3, 8.3 Hz), 6.69 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.09 (2H, d, J= 8.5 Hz), 9.19 (1H, br s), 9.31 (1H, br s). 【０４４１】
化合物7の合成
化合物5  84 mg（0.25 mmol）のメタノール（2 mL）懸濁液に1N水酸化ナトリウム0.73 mL（0.73 mmol）を加え、室温で2.5時間撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水の順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去して白色粉末状の化合物7  64 mg（0.25 mmol、定量的収率）を得た。
化合物7：1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 2.82-2.96 (1H, m), 4.04-4.22 (2H, m), 4.60 (1H, t, J = 7.0 Hz), 5.18 (1H, d, J = 7.0 Hz), 6.14 (1H, d, J = 2.3 Hz), 6.34 (1H, dd, J= 2.3, 8.5 Hz), 6.67 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.04 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.16 (1H, d, J = 8.5 Hz), 9.21 (1H, s), 9.28 (1H, s).【０４４２】
参考例Ｂ２ 
ラクトコッカス２０−９２株(FERM BP-10036号)を、ダイゼイン含有増殖用液体培地に接種し、嫌気的条件下、37℃で7から24時間培養した。培養後、遠心分離により集菌して冷凍保存し、以下の実施例に使用した。【０４４３】
実施例Ｂ１  テトラヒドロダイゼイン生成の確認
以下の試験を行い、テトラヒドロダイゼインがエクオール生合成の中間代謝物であることを確認した。【０４４４】
(1)菌破砕物の調製
-80℃で保存したラクトコッカス20‐92株菌体をすばやく融解、タッピングで懸濁し、8000rpm×5min,4℃で遠心分離VC‐960（タイテック株式会社（製））した。上清を取り除いた後に、0.1Mリン酸カリウム緩衝液／1mM PMSF（PhenylMethaneSulfonyl Fluoride）／2mM DTT(dithiothreitol）／5mM Sodium hydrosulfite（pH7.0）を加え、菌懸濁液を得た。次いで、予め、ジルコニア‐シリカビーズ[0.1mm  １lb（和研薬株式会社（製））を約0.8mL容入れておいた2 mlチューブに菌懸濁液を入れ、更に0.1Mリン酸カリウム緩衝液／1mM PMSF／2mM DTT／5mM Sodium hydrosulfite（pH7.0）を加え、チューブをほぼ一杯にした。次いで、チューブの蓋をして、氷冷しながらFastPrepTM‐FP100A（Thermo ELECTRON CORPORATION(製)）を用いて6500rpm×20秒-氷冷の操作を合計4回繰り返して、破砕処理を行った。斯くして得られた菌破砕物を酵素源として酵素反応を行った。【０４４５】
(2)酵素反応
上記(1)の菌破砕物を0.1ml含む下記組成の酵素反応液1mLを調製し、37℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、得られた酵素反応生成物に3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行った後、乾固して、HPLC分析に供した。【０４４６】
酵素反応液組成
0.1Mリン酸カリウム緩衝液／1mM PMSF／2mM DTT／5mM Sodium hydrosulfite（pH7.0）
2 mM NADPH
2 mM NADH  
10μg／mL  ジヒドロダイゼイン又はテトラヒドロダイゼイン【０４４７】
(3)酵素反応によるジヒドロダイゼインからのテトラヒドロダイゼインの生成
基質にジヒドロダイゼインを用いて、菌破砕物を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析の結果を図９に示す。また、上記参考例１で合成したテトラヒドロダイゼインのHPLC分析を図９に併せて示す。この結果から、基質にジヒドロダイゼインを用いて、菌破砕物を酵素源にして得られた酵素反応生成物には、トランス−テトラヒドロダイゼインの保持時間に一致する保持時間を有する中間体の存在が認められ、トランス−テトラヒドロダイゼインが生成していることが明らかとなった。【０４４８】
(4)酵素反応によるテトラヒドロダイゼインからのエクオールの生成
基質にシス−テトラヒドロダイゼイン又はトランス−テトラヒドロダイゼインを用いて、菌破砕物を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析の結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、いずれの化合物からもエクオールが生成され、テトラヒドロダイゼインはシス型及びトランス型を問わず、エクオール生合成過程において基質として利用されることが判明した。【０４４９】
実施例Ｂ２  菌体破砕物の遠心上清中におけるテトラヒドロダイゼイン生合成活性の存在の確認、及びNADH又はNADPH依存性の確認
保存してある凍結菌体を融解後5000×G、4℃、15分間遠心分離し、沈渣を以下の試験に供した。沈渣(湿重量2.7 g)を、1 mM PMSF及び5 mM Sodium hydrosulfiteを含有する0.1 M リン酸一カリウム溶液10 mlに縣濁させ、37℃で5分間予温した後、Lysozymeを湿重量1g当たり100 mg/ wet weightとなるよう加え、37℃にて1.5時間反応させた。次いで、得られた反応液に、等量の0.1Mリン酸二カリウム溶液を加えた後、更にジルコニア‐シリカビーズ3 ml量を加えVortex Mixerにて激しく攪拌し、更に超音波処理機 （Branson Sonifier Cell Disruptor 200）にて菌体破砕した(5min処理2min休憩のサイクルを3回)。得られた菌体破砕液を約10,000 ×Gにて15 分間遠心して遠心上清を得、これを酵素源とした。【０４５０】
下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、得られた酵素反応生成物に5mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行った後、乾固して、HPLC分析に供した。【０４５１】
酵素反応液組成
2009084603.tif 000006
【０４５２】
結果を図１１に示す。この結果から、菌体破砕物の遠心上清にはテトラヒドロダイゼイン生合成活性が存在することが確認された。また、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインへの変換反応は、補酵素NADH又はNADPHに依存性を示すが、NADPHの方がはるかにその依存性が高いことが確認された。【０４５３】
実施例Ｂ３  テトラヒドロダイゼイン合成酵素の精製
培養ボトル当たり67 mlのダイゼイン含有増殖用液体培地にて20時間培養したラクトコッカス20‐92株菌体10本分を遠心後1 mM PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride）及び4 mM DTT（Dithiothreitol）を含有する0.02 M リン酸カリウム緩衝液pH 7 (以下、「Buffer A」と表記する)に縣濁させ、フレンチプレス(SLM INSTRUMENTS INC)にて菌体を破砕し(1800 psiにて6回)、破砕液を遠心して上清液を得た。また、培養ボトル当たり200mlの液体培地にて18時間培養したラクトコッカス20‐92株菌体5本分を同様にフレンチプレスに供して菌体破砕後遠心し上清を得た。前者及び後者の遠心上清を、それぞれ38 ml及び47mlを混合し、その混合液の82 mlを、予めBuffer Aにて平衡化しておいたRed-Sepharose(約7 ml)に供した。次いで、150 mlのBuffer AにてRed-Sepharoseを洗浄した後、10 mMのNADPHを含むBuffer Aにて溶出した(20 ml/フラクション)。各フラクションを酵素源として用いて、実施例Ｂ２に示す酵素反応条件（補酵素としてNADPHを使用）と同条件でテトラヒドロダイゼイン生合成活性について測定し、活性画分としてフラクションNo.1〜5を得た。【０４５４】
テトラヒドロダイゼイン生合成活性を有するフラクションNo.1〜5をAmicon Ultra Centrifugal UFC801024 ( MW Cut : 10,000 )を用いて限外ろ過濃縮し、濃縮液約2.1 mlを得た。濃縮液は3分割しそれぞれ等量の3M硫安を含むBuffer Aと混合した後、TSKgel Phenyl-5PW（東ソー株式会社）を用いたHPLCに供した。HPLCの条件を以下に示す。蛋白質の吸収として、280 nmの吸収を測定した。【０４５５】
Column:  TSKgel Phenyl-5PW
流速:  1 ml / min
フラクション:  2 ml/2 min/フラクション
溶離液 A:  0.02 M リン酸カリウム緩衝液pH 7/1mM DTT / 2.5 mM Sodiumhydrosulfite/0.5% isoPrOH 
溶離液 B:  1M 硫安を含む溶離液A
溶出プログラム:  時間(min)    （溶離液B）／（溶離液A＋溶離液B）
0                      1
5                      1
25                      0
45                      0【０４５６】
このHPLCの結果、テトラヒドロダイゼイン合成活性を有するフラクションは、15番目以降（フラクションNo.15以降、保持時間 30分以降）に広範囲に認められたが、HPLCのフラクションNo.19〜22を混合し、限外ろ過濃縮[Amicon Ultra Centrifugal UFC801024 ( MW Cut : 10,000 )]した。得られた濃縮液約130μlのうちの100μlを以下の条件下でTSKgel G2000SWXL（東ソー株式会社）を用いたゲルろ過HPLCに供した。【０４５７】
Column:  TSKgel G2000SWXL
流速:  0.6 ml/min
フラクション:  1.2 ml/2 min/フラクション
溶離液:  0.05 Mリン酸カリウム緩衝液pH 7/1mM DTT/2.5 mM Sodium hydrosulfite/1% isoPrOH/0.3M NaCl【０４５８】
ゲルろ過HPLCの結果を図１２に示す。また、図１３に還元条件下での各フラクションのSDS-PAGEの結果を示す。この結果、テトラヒドロダイゼイン合成活性を示す主フラクションであるフラクションNo.7に、還元条件下で28kDa及び32kDaのバンドが認められた。【０４５９】
実施例Ｂ４  テトラヒドロダイゼイン合成酵素のアミノ酸配列解析
上記実施例３で得られたテトラヒドロダイゼイン合成活性を有するフラクション（フラクションNo.7）をサンプルとしてMS分析を行った。具体的には、サンプルをSDS-PAGEにて分離し、バンドを切り出した。切り出したバンドをゲル内還元アルキル化し、トリプシンでゲル内消化した。次いで、トリプシン消化ペプチドを回収・精製し、LC-MSにて分析した。LC-MS分析により取得されたデータについてMS分析支援ソフトウェアであるPEAKSTM（インフォコム株式会社）を用いたde novo シーケンシングを行うことにより、ペプチドのアミノ酸配列を計算・推定した。詳細な方法等については、以下の通りである。【０４６０】
(1)実験材料
本試験では、SuperSep HG 10/20% (和光純薬工業株式会社）、Flamingo gel staining kit (Bio-Rad)、TCEP（Tris[2-carboxyethyl]phosphine）（Pierce）、分子量マーカー（株式会社アプロサイエンス）、DTT（Calbiochem）、ヨードアセトアミド（和光純薬工業株式会社）、アセトニトリル（関東化学株式会社）、トリプシン（Promega）、TFA（Pierce）、Ammonium Bicarbonate（Sigma）、アンモニア水（メルク株式会社）、ギ酸（関東化学株式会社）、Empore Cation-SR Disk（住友スリーエム株式会社）、MonoCap濃縮カラム（GLサイエンス株式会社）、MonoCap for Nano Flow 0.1X150mm（GLサイエンス株式会社）、FortisTip（エーエムアール株式会社）、SpeedVac Concentrator（SAVANT）、HTS-PALオートサンプラー（CTC-Analytics）、Chorus220（CTC-Analytics）、QSTAR Pulsar i（アプライドバイオシステムズ）、PEAKSTMソフトウェア（インフォコム株式会社）を使用した。【０４６１】
（２）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
上記実施例Ｂ３で得られた、テトラヒドロダイゼイン合成活性を有するフラクション（フラクションNo.7）20μl に100mM TCEPを１μl加え、70℃にて10分還元処理を行った。サンプルをSuperSep HGに全量アプライし、定法に従いSDS-PAGEを行った。泳動後にFlamingo Gel staining kit（Bio-Rad）にて染色した（図１４参照）。染色後に確認されたバンドLG1及びLG2をそれぞれ切り出し1mm角程度に裁断した。切り出したゲルを100mM Ammonium Bicarbonate溶液にて洗浄後、アセトニトリルで脱水し、SpeedVac Concentratorにて乾燥固化した。【０４６２】
（３）ゲル内トリプシン消化  
乾燥したゲル片にDTT溶液（1.54mg/ml in 100mM Ammonium Bicarbonate）を加え55℃にて45分間インキュベートし、還元処理を実施した。DTT溶液を捨て、ヨードアセトアミド溶液（10.1mg/ml in 100mM Ammonium Bicarbonate）を加えて室温遮光条件下で30分間インキュベーションした。溶液を捨て、ゲル片を50%アセトニトリル溶液、100%アセトニトリル溶液、100mM Ammonium Bicarbonate溶液、100%アセトニトリル溶液で順次洗浄し、SpeedVac Concentratorにて乾燥固化した。乾燥したゲル片にトリプシン溶液（12.5μg/ml in 50mM Ammonium Bicarbonate）を少量加え、氷上にて45分間浸透させた。浸透後に余分なトリプシン溶液を取り除き、ゲル片が浸る程度の50mM Ammonium Bicarbonate溶液を加え37℃にて16時間反応させた。【０４６３】
（４）質量分析によるアミノ酸配列解析
トリプシン消化ペプチドを回収し、Empore Cation-SR Diskをピペットチップに詰めた簡易カラムで前処理精製した。トリプシン消化ペプチドの回収は、0.1%TFA/90%アセトニトリル溶液にて洗浄回収した。簡易カラムの操作は、平衡化0.1%TFA/2%アセトニトリル溶液、サンプル吸着、カラム洗浄0.1%TFA/90%アセトニトリル溶液、サンプル溶出5%アンモニア/30%アセトニトリル溶液の順に行い、溶出させた消化ペプチドをSpeedVac Concentratorにて乾燥濃縮した。消化ペプチド溶液にTFAを加えpH3付近になるよう調整し、オートサンプラーHTS-PALにセットした。HTS-PALにセットしたサンプルを、LC-MS用インジェクターバルブにあるサンプル濃縮カラムにロードし、オンカラム洗浄を行った。濃縮カラムのサンプルを、nanoHPLC-Chorus220により分析カラムにて分離し、分析カラムにセットしたFortisTipにおいてイオン化し、QSTAR Pulsar iにて分析した。LC-MS分析条件は、次の通りである。【０４６４】
LC部Chorus220 ; A溶媒：0.1%ギ酸/2%アセトニトリル、B溶媒：0.1%ギ酸/90%アセトニトリル, Flow rate=300nl/min, Gradient 5%A-65%B/20min, MS ; NanoESI Positive mode, Information dependent acquisition mode;(m/z=400 to 1400, Over25counts, Charge state=2 to 4) 4experiments/1cycle Experiment1;(TOF-MS, m/z=400 to 1400, Accumulation time=1sec), Experiment2to4;(Positive Product Ion, m/z=100 to 1400, Accumulation time=2sec)【０４６５】
バンドLG1, LG2（図１４参照）それぞれについてLC-MSにて取得したデータをPEAKSTMソフトウェアにて、de novo シークエンシングを行うことにより、消化ペプチドのアミノ酸配列を推定した。【０４６６】
実施例Ｂ５  ジヒドロダイゼイン合成（E1)酵素遺伝子の周辺ゲノムDNA配列の解析
（１）Inverse-PCR用ゲノムDNAライブラリーの作製
実施例Ａ５で精製したラクトコッカス２０−９２株（FERM BP-10036号）のゲノムDNAを以下に示す制限酵素（BamHI,EcoRI,HindIII,KpnI,PstI,SacI,SalI,Sau3AI,XhoI)（いずれもタカラバイオ株式会社）により37℃、16時間消化することで断片化し、フェノール・クロロホルム処理後、エタノール沈殿にて精製した。精製したゲノムDNA断片はTaKaRa Ligation kit var.2.1(タカラバイオ株式会社）を用いてセルフ−ライゲーションした。各ライゲーション溶液を滅菌水で10倍希釈することにより、Inverse-PCR用ゲノムDNAライブラリーを作製した。【０４６７】
（２）Inverse-PCR
上記（１）に記載したInverse-PCR用ゲノムDNAライブラリー1μＬ（40ng相当）を鋳型に使用して、Inverse-PCRにより、E1ポリヌクレオチド周辺上流及び下流域のゲノムDNAの増幅を試みた。上流側領域増加のInverse-PCRにはPstI、XhoIで処理したものを、下流側領域増加のInverse-PCRにはHindIII,PstI,SacI,XhoIで処理したものをそれぞれ鋳型DNAとして使用した。Inverse-PCRにはTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社）を使用した。First-PCRは1×PCR Buffer（Mg2+ free）、プライマー各0.5nM、dNTP 各0.5ｍM、MgCl2 2.5mM、TaKaRa LA Taq 0.2U を含む20μLの反応液を用いて、ゲノムDNAライブラリー希釈液１μL（40ng）を鋳型に使用し、以下の増幅プログラム： 98℃  1min、（95℃  10sec、62℃  10sec、68℃  10min）×35cycles、68℃  15minで行った。更に、続いてNested-PCRをFirst-PCR産物0.5μLを鋳型に1×PCR Buffer（Mg2+ free）、プライマー各0.5nM、dNTP各0.5ｍM、MgCl2 2.5mM、TaKaRa LA Taq 0.3U を含む30μLの反応液を用いて、以下の増幅プログラム：98℃  1min、（95℃  10sec、62℃  10sec、68℃  10min）×30cycles、68℃  15minで行った。【０４６８】
（２−１）使用プライマー
Inverse-PCRに用いたプライマーの組み合わせを以下に示す。【０４６９】
（２−１−１)  上流側
First-PCR：RACE-N-P3-1とE1-Bub-N-P1
Nested-PCR：RACE-N-P3-2とE1-Bub-N-P2【０４７０】
（２−１−２)  下流側
First-PCR：RACE-C-P3-1とE1-Bub-C-P1
Nested-PCR：RACE-C-P3-2とE1-Bub-C-P2【０４７１】
（２−２）使用プライマーの配列
上流側及び下流側のInverse-PCRそれぞれに用いたプライマーの配列を以下に示す。
上流側の増幅プライマー配列
RACE-N-P3-1: ATGGAGATAGTGCCGCTGGCAAGGCAACGGCAC  (配列番号：４３）
RACE-N-P3-2: TCAACGAAGACTCGATTTGAGCGAGAGGCGAGG  (配列番号：４４）
E1-Bub-N-P1: ACGGTGGAACCGGCATCGTGTTCATGGACAAC  (配列番号：４５）
E1-Bub-N-P2: GCGTGACCCAGTTCCACCATGTCGGACTGTC  (配列番号：４６）
下流側の増幅プライマー配列
RACE-C-P3-1: GACATCCCGTTCGAGCGCAGGATCACCCATGAG  (配列番号：４７）
RACE-C-P3-2: AGGATCACCCATGAGCGCATCGCTATCATGGAC  (配列番号：４８）
E1-Bub-C-P1: CATCGCTCTTGCAGTCGTTGTCCAGGAAGTCC  (配列番号：４９）
E1-Bub-C-P2: TTGTCCAGGAAGTCCATCGCGTACACGACGGAG  (配列番号：５０）【０４７２】
尚、本実施例で増幅プライマーとして使用したオリゴDNAは全てシグマ・アルドリッチ・ジャパンにて合成した。【０４７３】
（３)Inverse-PCRより増幅したジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子周辺ゲノムDNA断片の精製及び塩基配列決定
本実施例（２）で実施したNested-PCR産物に1/10量の10×dayを加え、5μLを0.8％のアガロースゲルで電気泳動し、上流側領域で0.5kb（PstI),3.5kb（XhoI）のDNA断片の増幅を、下流側領域で1kb（HindIII）、1kb（SacI）、2.5kb（XhoI)のDNA断片の増幅を確認した。本実施例におけるアガロース電気泳動ではエチジウムブロミド（株式会社ニッポンジーン）による染色を行い、分子量マーカーにはλ／StyI（株式会社ニッポンジーン）、100bp ladder(東洋紡株式会社)を使用した。増幅したDNA断片をアガロースゲルから切り出し、QIAGEN Gel-Extraction kit（キアゲン）を用いて精製した。精製したDNA断片は増幅に使用したプライマーを使用したダイレクトシークエンス、及びウォーキング法により、その塩基配列を決定した。【０４７４】
（４）ゲノム配列の解析及びORF(Open Reading Frame)の予測
本実施例（３）で得られたDNA配列をシーケンス−アセンブルソフトウェアSEQUENCHER（Gene Codes Inc、USA)を使用してアセンブル解析を行い、さらにORFの予測を行った。その結果、E1酵素遺伝子を含めた周辺ゲノム領域6685bpの配列を決定した。解析結果から得られたジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子周辺のゲノム構造の略図を図１５に示す。ORF予測の結果、E1酵素遺伝子の上流に３つ（うち一つはN末端未同定）、下流に１つのORFを見出した。見出したORFはジヒドロダイゼイン合成酵素から上流に向かってUpstream（US)1、US2、US3、下流に向かってDownstream（DS)1とした。【０４７５】
実施例Ｂ６ LC-MS分析による消化ペプチド配列とゲノム配列との照合
上記実施例Ｂ４において得られた推定アミノ酸配列を上記実施例Ｂ５で決定したジヒドロダイゼイン合成（E1）酵素遺伝子の周辺ゲノムDNA配列データと照合した。その結果、主にLG2より得られたいくつかの配列がORF-US2ヌクレオチド配列から推定されるポリペプチドの配列に一致した。以上のことからORF-US2ポリペプチドがテトラヒドロダイゼイン合成酵素である可能性が示唆された。以下にORF-US2ポリペプチドと一致した消化ペプチド配列を示す。また、図１６−１、１６−２、１６−３にLC-MSにて取得したデータを示す。【０４７６】
【表１】
2009084603.tif 000007
【０４７７】
上記においてm/zは質量電荷比、ｚは電荷数、Massはペプチドの質量、Peptideは推定アミノ酸配列を記載した。ScoreはPEAKSソフトウェア上で算出される配列計算の確からしさをスコア値（100％が最上値）で表している。尚、イソロイシン（I)とロイシン（L)は分子量が同じであり、区別不可であるため、前記ORF-US2ポリペプチドと一致した消化ペプチド配列においては双方共Xと表示している。【０４７８】
実施例Ｂ７  無細胞系タンパク質合成システムを用いたORF-US2ポリペプチドの合成及びそのテトラヒドロダイゼイン合成活性の確認
ORF-US2ポリペプチドを無細胞系タンパク質合成システム（PURESYSTEM Classic II mini(ポストゲノム研究所））を用いて合成し、そのテトラヒドロダイゼイン合成活性を確認した。【０４７９】
（１）鋳型DNAの作製
2段階PCRにより、無細胞系タンパク質合成に用いたORF-US2ポリヌクレオチド鋳型DNAを作製した。【０４８０】
(１−１)使用プライマー
ORF-US2用鋳型DNA作製のためのPCRに使用したプライマーを以下に示す。E2-invitroTS-FP1：ACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCACAGGAAGTCAAAGTCC (配列番号：５７)
E2-invitroTS-RP：CTAGACCTCGATCTCGCCCTGCATGCCG  (配列番号：５８)
Universal-Primer：GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA  (配列番号：５９)
E2-invitroTS-FP1及びE2-invitroTS-RPは実施例Ｂ５で決定したORF-US2ヌクレオチド配列を基にシグマ アルドリッチ ジャパンにて合成した。また、Universal-PrimerはPURESYSTEM Classic II mini(ポストゲノム研究所）に付属されていたものを使用した。【０４８１】
（１−２）２段階PCRによる鋳型DNAの作製
ORF-US2ポリペプチドの合成に用いた鋳型DNAはマニュアルに従い、2段階PCRで作製した。本実施例でのPCRにはDNA-ポリメラーゼにEasy-A（登録商標） High-Fidelity PCR Cloning Enzyme （ストラタジーン）、PCR装置はGeneAmp PCR System 9700 (アプライド・バイオシステムズ)を用いた。【０４８２】
1段階目PCRはラクトコッカス２０-９２株のゲノムDNAを鋳型に本実施例（１−１）に上記したプライマー：E2-invitroTS-FP1とE2-invitroTS-RPでORF-US2ヌクレオチドを増幅した。得られたPCR産物（ORF-US2ヌクレオチド）を鋳型にUniversal- PrimerとE2-invitroTS-RPで2段階目のPCRを行った。PCR産物300μL（50μL×6本）はPCR-Purification kit(キアゲン）で精製し、鋳型DNA（ORF-US2ポリペプチド合成用鋳型DNA）としてORF-US2ポリペプチドの合成に用いた。1段階目及び2段階目のPCRは以下の条件で行った。【０４８３】
１段階目：増幅プライマー各10pmol、dNTP各2.5pmol、ラクトコッカス２０-９２株由来ゲノムDNA 40ｎｇ、Easy-A用緩衝液 (ストラタジーン)、Easy-A（登録商標） High-Fidelity PCR Cloning Enzyme 2Ｕ (ストラタジーン)を含む50μLの反応液を用い、以下の増幅プログラム：95℃ 2min (95℃ 45sec、58℃ 20sec、72℃ 1min)×30cycles、72℃ 3min で行った。【０４８４】
2段階目：増幅プライマー各10pmol、dNTP 各2.5pmol、1段階目のPCR反応液0.5μL、Easy-A用緩衝液、Easy-A（登録商標） High-Fidelity PCR Cloning Enzyme 2Uを含む50μLの反応液を用い、以下の増幅プログラム：95℃ 2min (95℃ 45sec、45℃ 20sec、72℃ 1min)×5cycles、(95℃ 45sec、60℃ 20sec、72℃ 1min)×25cycles 72℃ 3min で行った。【０４８５】
（２）ORF-US2ポリペプチドの無細胞系タンパク質合成及びそのテトラヒドロダイゼイン合成活性の確認
−80℃保存しておいたPURESYSTEM Classic II miniのA液25μLとB液10μLを氷上で融解後、混合し、そこへ2段階PCRで作製したORF-US2ポリペプチド合成用鋳型DNA（開始コドンの5‘側上流にT7‐プロモーター配列及びリボゾーム結合配列を有する）を0.6μg（60ng/μLを10μL）加え、さらに滅菌水を加えて計50μLにして37℃、90分間インキュベーションすることで目的のポリペプチドを合成した。このシステムを用いたタンパク質合成のポジティブコントロールにはPURESYSTEM Classic II miniに付属のジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR)合成用鋳型DNAを0.5μg（0.2μg/μLを2μL）用いた。ネガティブコントロールには鋳型となるDNAは添加せず、滅菌水のみを使用した。活性測定は前記反応液40μLを以下の組成の酵素反応用バッファーに加え、37℃、6時間インキュベーションし、反応終了後、酵素反応液を3mＬの酢酸エチルで抽出、乾固し、泳動バッファーで溶解してHPLC分析により、酵素反応液中のテトラヒドロダイゼインを測定した。【０４８６】
酵素反応用バッファー組成
0.1Mリン酸カリウム緩衝液／1mM PMSF／2mM DTT／5mM Sodium hydrosulfite（pH7.0）
2 mM NADPH
2 mM NADH  
10μg／mL  ジヒドロダイゼイン
なお、前記ヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR)合成用鋳型DNAを用いた場合には、当該DNAを基にしてタンパク質が良好に発現されたが、鋳型となるDNAを添加しない場合には、タンパク質は発現されなかった。このことから、当該実験は適切に行われているものと判断される。  【０４８７】
結果を図１７に示す。ORF-US2ポリペプチドを発現させた反応液では反応6時後のサンプルで約6.7分の位置にテトラヒドロダイゼインのピークが見られた。しかしながら、タンパク質合成なし（NC)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ発現（DHFR)反応液ではテトラヒドロダイゼインのピークは認められなかった。また、ORF-US2ポリペプチドを発現させた反応液ではテトラヒドロダイゼインの生合成に伴うジヒドロダイゼイン（基質）の減少が見られたがタンパク質合成なし（NC)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ発現（DHFR)反応液ではそのジヒドロダイゼインの減少は認められなかった。以上のことからORF-US2ポリペプチドがジヒドロダイゼインからのテトラヒドロダイゼイン生合活性を有することが示された。すなわち、ORF-US2ポリペプチドは、前記E2ポリペプチドに相当するといえる。【０４８８】
実施例Ｂ８  大腸菌を用いた組換えORF-US2ポリペプチドの発現及びそのテトラヒドロダイゼイン合成活性の確認
大腸菌を用いた組換えタンパク質発現システムであるpＥＴシステムを用いてORF-US2ポリペプチドを発現させ、そのテトラヒドロダイゼイン合成活性を確認した。【０４８９】
（１）ORF-US2ポリペプチド発現ベクターの作製
ORF-US2ポリペプチド発現ベクター（pET21-US2）を作製する目的でPCRにより、ORF-US2ポリペプチドのオープン・リーディング・フレーム領域のDNAを増幅した。
実施例Ｂ５で決定したORF-US2ポリペプチド配列を基に下記の増幅プライマーを作製した。
exp.US2 pet F Nde：TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC  （配列番号：６０)
exp. US2 pet：AATCGAATTCCTAGACCTCGATCTCGCCCTGC  （配列番号：６１)【０４９０】
上記増幅プライマー：exp.US2 pet F Nde、exp.US2 petにはpET21a（Novagen)へ挿入するため、それぞれ制限酵素NdeI切断部位、EcoRI切断部位配列を含ませてある。【０４９１】
上記プライマーを各5pmol、dNTP 5nmol each、ラクトコッカス20-92株のゲノムDNA  40ng、KOD-plus DNA polymerase用１０×緩衝液 (東洋紡) 2.5μL、KOD-Plus DNA polymerase 0.3ユニット(東洋紡)を含む25μLの反応液を用い、増幅プログラム：95℃ 3分、（94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 1分)×30cycles、68℃ 7分でGeneAmpPCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ）を用いてPCR反応を行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、予想される大きさのバンドが検出できた。PCR産物全量をQIAGEN PCR Purification kit（キアゲン）にて回収した。【０４９２】
回収したDNA断片を制限酵素NdeI及びEcoRIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Qiagen Gel Extraction kit (キアゲン) により精製、回収した。得られたDNA断片はNdeI及びEcoRIで消化したpET21aとDNA Ligation Kit ver.2.1（タカラバイオ)を用いて、16 ℃、終夜ライゲーションした後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株（タカラバイオ)を形質転換した。【０４９３】
形質転換体はアンピシリン（50μg/mL）を含むＬＢ培地アガー（GIBCO)プレート上で37℃、終夜生育させ、コロニーを得た。得られたシングルコロニーはアンピシリン（50μg/mL）を含むLB培地（GIBCO)３mＬで終夜培養した後、プラスミド自動抽出機PI-100（KURABO)を用いてプラスミドDNAを抽出した。【０４９４】
プラスミドに挿入したDNAの塩基配列をダイターミネーター法によりシークエンスを行い、目的どおり正しくORF-US2ポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。本実施例におけるDNAシークエンスはDNAシークエンサーABI3700（アプライド・バイオシステムズ）を用いて行った。【０４９５】
（２）大腸菌内での組換えORF-US2ポリペプチドの発現および確認
組換えORF-US2ポリペプチドを発現するプラスミドpET21-US2 とpET21a(ネガティブコントロール）を用いて、大腸菌BL21（DE3)株（Novagen）を形質転換した。形質転換体はアンピシリン（50μg/mL）を含むＬＢ培地アガープレート上で37℃、終夜生育させ、シングルコロニーを得た。【０４９６】
上記の大腸菌BL21（DE3）形質転換体それぞれをアンピシリン50μg/ｍLを含む3mLの液体LB培地で終夜37℃において培養を行った。その培養液0.5ｍL を同濃度のアンピシリンを含む液体LB培地50ｍL 加え、3時間（OD630nmが約0.4になるまで）前培養し、終濃度が1mM になるようにIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）（和光純薬工業株式会社）を加え、さらに37℃で4時間培養を行った。【０４９７】
培養終了後、菌体をAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離（6000rpm 4℃ 15分）により集菌した。以降の操作は氷上で行った。遠心上清（培地）を除いた後、1mM PMSF、2mM DTT、5mM Sodium hydrosulfiteを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH7.0（KPB-PDH)1ｍLに懸濁し、あらかじ0.7mＬ容のジルコニア-シリカビーズ（BioSpec Products, Inc.）及びKPB-PDH 400μLを入れておいた2mL容アシストチューブへ入れ、FastPrep(R)（Thermo ELECTRON CORPORATION）を用いて6500rpm、20秒間処理-3分間氷冷を２回繰り返すことで、菌体を破砕し、菌体破砕液を得た。【０４９８】
大腸菌内での組換えORF-US2ポリペプチドの発現確認はSDS-ポリアクリルアミド-ゲル電気泳動（SDS-PAGE）で行った。【０４９９】
上記菌体破砕液20μLに5×サンプル緩衝液（125mM Tris-HCl（pH6.5)/ 25% グリセロール/5% SDS/5% 2-メルカプトエタノール/BPB 0.5%)を5μL加え、98℃ 5分間加熱変性後、氷冷し、うち10μLをSDS-PAGEで泳動した。SDS‐PAGEには市販のゲル板（SuperSepTM  5-20％ (和光純薬工業株式会社））を使用し、染色はクイックCBB（和光純薬工業株式会社）で行った。分子量マーカーにはPrestained XL-Ladder Broad range(株式会社アプロサイエンス）を使用した。【０５００】
SDS-PAGEの結果を図１８に示す。pET21-US2形質転換体由来の菌体破砕液で分子量約２９kＤａの組換えポリペプチドが確認された。【０５０１】
（３）組換えORF-US2ポリペプチドのジヒドロダイゼイン合成活性の確認
本実施例内（２）で得た菌体破砕液を酵素源として、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインへの変換活性を測定し、発現させた組換えORF-US2ポリペプチドにその活性を確認した。【０５０２】
本実施例でのジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインへの変換活性の測定は以下の方法で行った。【０５０３】
下記組成の酵素反応液を調製し、0℃で2時間インキュベートした。
酵素反応液組成
菌体破砕液(酵素源)                          100 μl
NADH(100 mM)                                 20 μl
NADPH(100 mM)                               20 μl
ジヒドロダイゼイン (2 mg / ml)                5 μl
KPB-PDH                                     855 μl
計  1000 μl【０５０４】
インキュベート後、得られた酵素反応液に3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行い、乾固した後、移動層（溶離液）で溶解した。溶解物をHPLC分析することにより、酵素反応液中のジヒドロダイゼイン及びシス-、トランス-テトラヒドロダイゼインの含量を測定した。【０５０５】
HPLC分析の結果を図１９に示す。組換えORF-US2ポリペプチドを発現するプラスミドpET21-US2の形質転換体由来の菌破砕液では酵素反応液に加えたジヒドロダイゼイン（基質）がシス-テトラヒドロダイゼイン（ｃ−ＴＨＤ）及びトランス-テトラヒドロダイゼイン（ｔ−ＴＨＤ）へと変換されることが観察された。ネガティブコントロールであるpET21a形質転換体では酵素反応液中にテトラヒドロダイゼインは検出されなかった。【０５０６】
以上のことから組換えORF-US2ポリペプチドがジヒドロダイゼインからのテトラヒドロダイゼイン合成活性を有することが示された。すなわち、組換えORF-US2ポリペプチドは前記E2ポリペプチドに相当するといえる。【０５０７】
実施例Ｃ
実施例Ｃ１  菌体のテトラヒドロダイゼインからのエクオール生合成活性の確認
ラクトコッカス20-92株(FERM BP-10036号)を、テトラヒドロダイゼイン含有増殖用液体培地（シス-もしくはトランス-テトラヒドロダイゼイン（自社で有機合成：参考例Ｂ１参照）を10μｇ／ｍＬとなる量に加えた変法GAMブイヨン培地（日水製薬株式会社））に接種し、嫌気的条件下（BBL Gas Pack systemsを使用）37℃で18時間培養した。培養終了後、直ちに培養液１mＬを蓋付ガラス製遠沈管に分取し、3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行った後、乾固し、HPLC分析を行った。HPLC分析の標準溶液にはダイゼイン（フナコシ株式会社）、エクオール（フナコシ株式会社）、ジヒドロダイゼイン（トレンドリサーチケミカル社）シス-テトラヒドロダイゼイン、トランス-テトラヒドロダイゼイン（共に自社で化学合成）の混合溶液（各2μg／mＬ)を用いた。【０５０８】
結果を図２０に示す。図２０から明らかなようにラクトコッカス20-92株はシス-及びトランス-テトラヒドロダイゼイン双方からエクオールを生合成する活性を有することが確認された（図２０中、下）。尚、図中ではダイゼインはDZN、ジヒドロダイゼインはDD、シス-テトラヒドロダイゼインはc-THD、トランス-テトラヒドロダイゼインはt-THD、エクオールはEQLの略語で示している。【０５０９】
実施例Ｃ２  大腸菌を用いた組換えタンパク質発現システムを用いたエクオール合成酵素の探索及びその同定
大腸菌を用いた組換えタンパク質発現システムであるpETシステム（Novagen)を用いて、実施例Ｂ５において決定したジヒドロダイゼイン合成（E1)酵素遺伝子周辺ゲノムDNA配列上に同定した３つのORFポリヌクレオチド（ORF-US3,US1,DS1)に対応するポリペプチドを大腸菌内でそれぞれ発現させ、そのテトラヒドロダイゼインからのエクオールへの変換を触媒する活性を調べることにより、エクオール合成（E3)
酵素の探索を行った。【０５１０】
（１）ORFポリペプチド発現ベクターの作製
各ORFポリペプチド（ORF-US3,US1,DS1)の発現ベクターを作製する目的でPCRにより、それぞれのオープン・リーディング・フレーム領域のポリヌクレオチドを増幅し、pET21ａベクター(Novagen)に挿入した。【０５１１】
（１−１）増幅プライマー
実施例Ｂ５で決定したジヒドロダイゼイン合成酵素（E1)周辺ゲノム配列を基に下記の増幅プライマーを作製した。
ORF-US3ポリペプチド
exp.US3 F：TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG  （配列番号：６２)
exp.US3 R：CCGCAAGCTTCTACATAGTGGAGATCGCGTGG  （配列番号：６３)
ORF-US1ポリペプチド
exp.US1 F：TATACATATGTTCAAGGGTCCACAGGGC  （配列番号：６４)
exp.US1 R：GCTCGAATTCTTAGTGCTGCTGTGCCTTTTCAG  （配列番号：６５)
ORF-DS1ポリペプチド
exp.DS1 F：ATATACATATGCAGGATATGGACTTCATGG  （配列番号：６６)
exp.DS1 R：GCTCGAATTCTCATAGTGACATCAGCGCTCCC  （配列番号：６７)【０５１２】
上記増幅プライマー：exp.US3 F、exp.US1 F、exp.DS1 FにはpET21a（Novagen)へ挿入するため、制限酵素NdeI切断部位配列を、exp.US3 R にはHindIII切断部位配列を、exp.US1 R、exp.DS1 RにはEcoRI切断部位配列を含ませてある。【０５１３】
（１−２）各ORFポリヌクレオチドの増幅
上記した増幅プライマーを各5pmol、dNTP 5nmol each、実施例Ａ５において精製したラクトコッカス20-92株のゲノムDNA  40ng 、KOD-plus DNA polymerase用10×緩衝液（東洋紡績株式会社）2.5μL、KOD-Plus DNA polymerase 0.3ユニット（東洋紡績株式会社）を含む25μLの反応液を用い、増幅プログラム：95℃ 3分、（94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 2分)×30cycles、68℃ 7分でGeneAmpPCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ）を用いてPCRを行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動した結果、それぞれに予想される大きさのバンドが検出できた。PCR産物全量をQIAGEN PCR Purification kit（キアゲン）にて回収した。【０５１４】
（１−３）ORFポリペプチド発現ベクターの作製
（1-2)で回収したORF-US3ポリヌクレオチド断片を制限酵素NdeI及びHindIIIで、ORF-US1及びORF-DS1ポリヌクレオチド断片をNdeI及びEcoRIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Qiagen Gel Extraction kit (キアゲン)により精製、回収した。得られたポリヌクレオチド断片はDNA Ligation Kit ver.2.1（タカラバイオ株式会社)を用いて、NdeI及びHindIIIもしくはEcoRIで消化したpET21aと16 ℃、終夜でライゲーションした後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株（タカラバイオ株式会社)を定法で形質転換した。斯くして得た形質転換体を、アンピシリン（50μg/mL）を含むＬＢ培地アガー（GIBCO)プレート上で37℃、終夜生育させ、コロニーを形成させた。得られたシングルコロニーを、アンピシリン（50μg/mL）を含むLB培地（GIBCO)３mＬで終夜培養した後、プラスミド自動抽出機PI-100（KURABO)を用いてプラスミドDNAを抽出した。【０５１５】
プラスミドに挿入したDNAの塩基配列をダイターミネーター法によりシークエンスを行い、目的どおり正しく各ポリヌクレオチドが挿入されていることを確認し、pET-US3、pET-US1、pET-DS1を得た。本実施例におけるDNAシークエンスはDNAシークエンサーABI3700（アプライド・バイオシステムズ）を用いて行った。【０５１６】
（２）大腸菌内で各組換えポリペプチドの発現
（２−１）大腸菌BL21形質転換体の作製
組換えORFポリペプチドを発現するプラスミドpET-US3、pET-US1、pET-DS1とpET21a(ネガティブコントロール）を用いて、大腸菌BL21（DE3)株（Novagen）を定法で形質転換した。形質転換体はアンピシリン（50μg/mL）を含むＬＢ培地アガープレート上で37℃、終夜生育させ、シングルコロニーを得た。【０５１７】
（２−２）組換えポリペプチドの発現誘導
上記の大腸菌BL21（DE3）形質転換体それぞれをアンピシリン（50μg/ｍL）を含む3mLの液体LB培地で終夜37℃において培養を行った。その培養液0.5ｍLを同濃度のアンピシリンを含む液体LB培地50ｍLに加え、3時間（OD630nmが約0.4-0.7になるまで）前培養し、終濃度が1mMになるようにIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）（和光純薬工業株式会社）を加え、さらに37℃で4時間培養し、大腸菌内での組換えポリペプチドの発現誘導行った。【０５１８】
（２−３）菌体破砕液の調製
上記(2-2)での発現誘導終了後、菌体をAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離（6000rpm 4℃ 15分）により集菌した。以降の操作は氷上で行った。遠心上静（培地）を除いた後、1mM PMSF、2mM DTT、5mM Sodium hydrosulfiteを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH7.0（以後KPB-PDHと略す)1ｍLに懸濁し、あらかじ0.7mＬ容のジルコニア-シリカビーズ（BioSpec Products, Inc.）及びKPB-PDH 400μLを入れておいた2mL容アシストチューブへ入れ、FastPrep(R)（Thermo ELECTRON CORPORATION）を用いて6500rpm、20秒間処理-3分間氷冷を2回繰り返すことで、菌体を破砕し、菌体破砕液を得た。【０５１９】
（２−４）SDS-ポリアクリルアミド-ゲル電気泳動（SDS-PAGE）による組換えポリペプチドの発現確認
大腸菌内での各組換えORFポリペプチドの発現確認はSDS-PAGEで行った。（2-3）に記した菌体破砕液20μLに5×サンプル緩衝液（125mM Tris-HCl（pH6.5)/ 25% グリセロール/5% SDS/5% 2-メルカプトエタノール/BPB 0.5%)を5μL加え、98℃ 5分間加熱変性後、氷冷し、うち4μLをSDS-PAGEで泳動した。SDS‐PAGEには市販のゲル板（SuperSepTM5-20％ (和光純薬工業株式会社））を使用し、染色はクイックCBB（和光純薬工業株式会社）で行った。分子量マーカーにはPrestained XL-Ladder Broad range(株式会社アプロサイエンス）を使用した。SDS-PAGEの結果を図２１に示す。pET-US3、pET-DS1形質転換体由来の菌体破砕液それぞれにおいて分子量約52kDa、50kDaの組換えORF-US3及びORF-DS1ポリペプチドの発現が確認された。pET-US1形質転換体由来の菌体破砕液では組換えORF-US1ポリペプチドの発現は確認できなかった。【０５２０】
実施例Ｃ３  組換えORFポリペプチドのエクオール合成活性の測定
実施例Ｃ２で得た各形質転換体菌破砕液を酵素源として、テトラヒドロダイゼインからエクオールへの変換活性を測定した。本実施例でのテトラヒドロダイゼインからエクオールへの変換活性の測定は以下の方法で行った。【０５２１】
下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で1時間インキュベートした。
酵素反応液組成
2009084603.tif 000008
【０５２２】
インキュベート後、得られた酵素反応液に3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行い、乾固した後、移動層（溶離液）で溶解した。溶解物をHPLC分析することにより、酵素反応液中のジヒドロダイゼイン、シス-テトラヒドロダイゼイン、トランス-テトラヒドロダイゼイン、エクオールの含量を測定した。HPLC分析での標準溶液にはダイゼイン（フナコシ株式会社）、エクオール（フナコシ株式会社）、ジヒドロダイゼイン（トレンドリサーチケミカル社）シス-テトラヒドロダイゼイン、トランス-テトラヒドロダイゼイン（共に自社で化学合成）の混合溶液（各2μg／mＬ)を用いた。【０５２３】
HPLC分析の結果、組換えORF-US3ポリペプチドを発現するプラスミドpET-US3の形質転換体由来の菌破砕液では酵素反応液に加えたテトラヒドロダイゼインはエクオールに変換されることが観察された（図２２）。またエクオール生合成経路においてテトラヒドロダイゼインの前駆物質であるジヒドロダイゼインへの変換活性も併せ持つことが確認された（図２２）。pET-US1、pET-DS1形質転換体及びネガティブコントロールであるpET21a形質転換体では酵素反応液中にテトラヒドロダイゼイン以外は検出されなかった。尚、図中ではダイゼインはDZN、ジヒドロダイゼインはDD、シス-テトラヒドロダイゼインはc-THD、トランス-テトラヒドロダイゼインはt-THD、エクオールはEQLの略語で示している。【０５２４】
以上のことからORF-US3ポリペプチドがテトラヒドロダイゼインからのエクオール生合活性を有することが示された。すなわち、ORF-US3ポリペプチドは、前記E3ポリペプチドに相当するといえる。【０５２５】
実施例Ｄ
実施例Ｄ１  大腸菌を用いた組換えHis-タグ付きエクオール産生関連酵素の発現及び精製
大腸菌を用いた組換えタンパク質発現システムであるpET システム（Novagen)を用いて、Ｈｉｓ−タグ付きエクオール産生関連酵素[ジヒドロダイゼイン合成酵素（E1),テトラヒドロダイゼイン合成酵素（E2),エクオール合成酵素（E3)]を発現させ、His-タグ付きタンパク質精製用（Ni)カラムを用いてアフィニティー精製を行った。【０５２６】
（１）His-タグ付き酵素発現ベクターの作製
各酵素（E1,E2,E3)の発現ベクターを作製する目的でPCRにより、それぞれのオープン・リーディング・フレーム領域のポリヌクレオチドを増幅し、pET21ａベクター(Novagen)に挿入した。【０５２７】
（１−１）増幅プライマー
実施例Ｂ５で決定したジヒドロダイゼイン合成酵素（E1)周辺ゲノム配列を基に下記の増幅プライマーを作製した。
His-タグ付きE1酵素
exp.E1 pet F Nde：AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA  （配列番号：４１)
exp.E1 pet His：AATCGAATTCGTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT  （配列番号：４２)
His-タグ付きE2酵素
exp.US2 pet F Nde：TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC  （配列番号：６０)
exp.E2 pet His：AATCGAATTCGAGACCTCGATCTCGCCCTGC  （配列番号：６８)
His-タグ付きE3酵素
exp.US3 F：TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG  （配列番号：６２)
exp.E3 R His：CCGCAAGCTTGTACATAGTGGAGATCGCGTGG  （配列番号：６９)
上記増幅プライマー：exp.E1 pet F Nde、exp.US2 pet F、exp.US3 FにはpET21a（Novagen)へ挿入するため、制限酵素NdeI切断部位配列を、exp.E1 pet His、exp.E2 pet HisにはEcoRI切断部位配列をexp.E3 R HisにはHindIII切断部位配列を含ませてある。【０５２８】
（１−２）各His-タグ付き酵素ポリヌクレオチドの増幅
上記した増幅プライマーを各5pmolとdNTPを各5nmolと実施例Ａ５において精製したラクトコッカス20-92株（FERM BP-10036号）のゲノムDNA  40ng 、KOD-plus DNA polymerase用10×緩衝液（東洋紡績株式会社）2.5μL、KOD-Plus DNA polymerase 0.3ユニット（東洋紡績株式会社）を含む25μLの反応液を用い、増幅プログラム：95℃ 3分、（94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 2分)×30cycles、68℃ 7分でGeneAmpPCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ）を用いてPCRを行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動した結果、それぞれに予想される大きさのバンドが検出できた。PCR産物全量をQIAGEN PCR Purification kit（キアゲン）にて回収した。【０５２９】
（１−３）His-タグ付き酵素ポリペプチド発現ベクターの作製
（1-2)で回収した各His-タグ付き酵素ポリヌクレオチド断片を制限酵素NdeI及びEcoRIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Qiagen Gel Extraction kit (キアゲン) により精製、回収した。得られたポリヌクレオチド断片はDNA Ligation Kit ver.2.1（タカラバイオ株式会社)を用いて、NdeI及びEcoRIで消化したpET21aと16 ℃、終夜でライゲーションした後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株（タカラバイオ株式会社)を定法で形質転換した。斯くして得た形質転換体を、アンピシリン（50μg/mL）を含むＬＢ培地アガー（GIBCO)プレート上で37℃、終夜生育させ、コロニーを形成させた。得られたシングルコロニーを、アンピシリン（50μg/mL）を含むLB培地（GIBCO)３mＬで終夜培養した後、プラスミド自動抽出機PI-100（KURABO)を用いてプラスミドDNAを抽出した。【０５３０】
プラスミドに挿入したDNAの塩基配列をダイターミネーター法によりシークエンスを行い、目的どおり正しく各ポリヌクレオチドが挿入されていることを確認し、pET-E1-His、pET-E2-His、pET-E3-Hisを得た。本実施例におけるDNAシークエンスはDNAシークエンサーABI3700（アプライド・バイオシステムズ）を用いて行った。【０５３１】
（２）大腸菌内での各組換えHis-タグ付き酵素ポリペプチドの発現及びアフィニティー精製
（２−１）大腸菌BL21形質転換体の作製
His-タグ付き酵素ポリペプチドを発現するプラスミドpET-E1-His、pET-E2-His、pET-E3−Hisを用いて、大腸菌BL21（DE3)株（Novagen）を定法で形質転換した。形質転換体はアンピシリン（50μg/mL）を含むＬＢ培地アガープレート上で37℃、終夜生育させ、シングルコロニーを得た。【０５３２】
（２−２）組換えHis-タグ付きE1及びE2酵素ポリペプチドの精製
（２−２−１）大腸菌培養及び組換えHis-タグ付きE1及びE2酵素ポリペプチドの発現誘導
上記pET-E1-His又はpET-E2-Hisによる大腸菌BL21（DE3）形質転換体それぞれをアンピシリン（50μg/ｍL）を含む10mLの液体LB培地で終夜37℃において培養を行った。その培養液7.5ｍL を同濃度のアンピシリンを含む液体LB培地150ｍL 加え、37℃で2時間（OD600nmが約0.5になるまで）前培養し、終濃度が0.5mM になるようにIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）（和光純薬工業株式会社）を加え、さらに弱い振とう条件下で30℃、4時間培養し、大腸菌内での組換えHis-タグ付きE1及びE2酵素ポリペプチドの発現誘導行った。【０５３３】
（２−２−２）菌ライゼートの調製
上記(2-2)での発現誘導終了後、菌体をAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離（6000rpm  4℃ 10分）により集菌し、組換えHis-タグ付きE1及びE2酵素ポリペプチド発現大腸菌をそれぞれ湿重量にして0.66g及び0.73gを得た。得た菌体はBugbuster protein Extraction solution（Novagen）が菌体湿重量1gあたり15mLになるように加え、ピペットで穏やかに懸濁し、更にLysozyme（SIGMA)  を2000units/ｍL、Benzonase（Novagen)を 25units（1μL)/ｍＬになるように加えた。その後、ローテーター（RT-50：タイテック）を用いて30分間室温でゆっくり攪拌し、菌ライゼートAを得た。更に菌ライゼートAをAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離（8000rpm  4℃ 15分）により、その上清である菌ライゼートBを得た。【０５３４】
（２−２−３）組換えHisタグ付きE1及びE2酵素ポリペプチドのアフィニティー精製
His-タグ付きタンパク質精製用カラムにはHis GraviTrap（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用い、取り扱い説明書に記載されている手順に従い、一部変更した方法でHis-タグ付きE1及びE2酵素ポリペプチドのアフィニティー精製を行った。即ち、His GraviTrapを氷冷した10ｍLの結合バッファーで平衡化した後、（2-2-2）で調製した菌ライゼートBを全量注ぎ込み、自然落下にて目的のHis-タグ付きE1或いはE2酵素をHis GraviTrapに吸着させた。その後、His GraviTrapを氷冷した10mLの洗浄バッファーで2回洗浄した後、氷冷しておいた3mLの溶出バッファーで目的のHis-タグ付きE1及びE2酵素をHis GraviTrapより溶出した。溶出液にDTT[dithiothreitol]（和光純薬工業株式会社）を終濃度が3ｍMになるように加えた後、 300μLずつマイクロチューブに小分けした。それらの一部を用いて、それぞれの溶出液のE1酵素活性及びE2酵素活性を確認し、溶出液は酵素実験に使用するまで4℃で保存した。【０５３５】
本精製で使用した結合バッファー、洗浄バッファー、溶出バッファーの組成は以下の通りである。
結合バッファー：20ｍM Tris-HCl、20mM Imidazole(和光純薬工業株式会社）、0.5M NaCl(和光純薬工業株式会社）、1mM DTT[dithiothreitol](和光純薬工業株式会社）、1 mM PMSF[phenylmethylsulfonyl fluoride]（和光純薬工業株式会社）
洗浄バッファー：20ｍM Tris-HCl、 60mM Imidazole、0.5M NaCl、1mM DTT[dithiothreitol]、1 mM PMSF[phenylmethylsulfonyl fluoride]
溶出バッファー：20ｍM Tris-HCl 500mM Imidazole、0.5M NaCl、1mM DTT[dithiothreitol]、1 mM PMSF[phenylmethylsulfonyl fluoride]【０５３６】
（２−３）組換えHis-タグ付きE3酵素ポリペプチドの精製
（２−３−１）大腸菌培養及び組換えHis-タグ付きE3酵素ポリペプチドの発現誘導
上記（2-1）に記載のpET-E3-Hisによる大腸菌BL21（DE3）形質転換体をアンピシリン（50μg/ｍL）を含む50mLの液体LB培地で終夜37℃において培養を行った。その培養液20ｍL を同濃度のアンピシリンを含む液体LB培地１Lに加え、37℃で3時間（OD660nmが約0.4になるまで）前培養した。終濃度が0.5mM になるようにIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）（和光純薬工業株式会社）を加え、37℃で4時間振とう培養し、大腸菌内での組換えHis-タグ付きE3酵素ポリペプチドの発現誘導行った。発現誘導を行った大腸菌をAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離（6000rpm  4℃ 10分）をして集菌した。菌体を1 mM PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride）2 mM DTT（和光純薬工業株式会社）5mM  Sodiumhydrosulfite（和光純薬工業株式会社）を含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7.0（以後バッファーAとする)を25 ml加えて懸濁し、遠心分離（6000rpm  4℃ 10分）後そのままの状態で-80℃に保存した。【０５３７】
（２−３−２）菌ライゼートの調製
上記（2-3-1）で保存した菌体を融解後、遠心(10,000xg 15 min)し、新しいバッファーAを25 ml加えて懸濁させた。その懸濁液をFastPrep(R)（Thermo ELECTRON CORPORATION）を用いて6500rpm、20秒間処理-3分間氷冷を3回繰り返すことで、菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を遠心 (10000 X g, 15 min)し、その上清を分離し、菌ライゼートを得た。【０５３８】
（２−３−３）組換えHisタグ付きE3酵素ポリペプチドのアフィニティー精製
上記（2-3-3）で得た菌ライゼート4 mLを以下に示す精製条件によりHis-タグ融合タンパク質精製用カラムであるHisTrap HP (GEヘルスケアバイオサイエンス)に供して、組換えHisタグ付きE3酵素の精製を行った。蛋白質の測定は280 nmの吸収によった。またフラクションコレクターによる分画は素通り画分の280nmにおける吸収がベースラインに低下した後開始した。【０５３９】
流速:  1 ml / min
フラクション:  2 ml/2 min/フラクション
溶離液 A:  0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7/0.5 M NaCl /1 % isoPrOH 
溶離液 B:  0.5 M  Imidazoleを含む溶離液A
溶出プログラム:            時間(min)    （溶離液B）／（溶離液A＋溶離液B）
0              0.05
5              0.05
25              0.5
30              1
35              1
37              0.05【０５４０】
この結果、E3合成活性はフラクションNo.7〜9に認められた。複数の精製によって得られた活性フラクションをプールした後、更に8%となるようにグリセリンを加えて-28℃に保存し、用事融解して実験に供した。【０５４１】
実施例Ｄ２  組換えHis-タグ付きE１及びE2酵素を用いたダイゼインからのテトラヒドロダイゼイン合成
上記実施例Ｄ１の(2-2-3)にて得た組換えHis-タグ付きE１酵素及びE2酵素を酵素源として、下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で2時間反応させることでダイゼインからテトラヒドロダイゼインの合成を行った。また、同時に酵素源として組換えHis-タグ付きE１、E2酵素それぞれを単独で用いた反応も行った。
酵素反応液組成
2009084603.tif 000009
【０５４２】
インキュベート後、得られた酵素反応液に3mLの酢酸エチル(和光純薬)を添加して抽出処理を行い、乾固した後、移動層（溶離液）で溶解した。溶解物をHPLC分析することにより、酵素反応液中のシス-及びトランス-テトラヒドロダイゼインを測定した。
HPLC分析の標準溶液はダイゼイン（フナコシ）、エクオール（フナコシ）、ジヒドロダイゼイン（トレンドリサーチケミカル社）シス-テトラヒドロダイゼイン（参考例Ｂ１）、トランス-テトラヒドロダイゼイン（参考例Ｂ１）の混合溶液（各2μg／mＬ)を用いた。
HPLC分析の結果を図２３に示す。酵素源に組換えHis-タグ付きE1酵素及びE2酵素の混合を使用した場合、その生成物にシス-及びトランス-テトラヒドロダイゼインを確認した。しかしながら、酵素源に組換えHis-タグ付きE1酵素もしくは組換えHis-タグ付きE2酵素単独で使用した場合には、その生成物にシス-及びトランステトラヒドロダイゼインは確認できなかった。【０５４３】
実施例Ｄ３  組換えHis-タグ付きE2及びE3酵素を用いたジヒドロダイゼインからのエクオール合成
上記実施例Ｄ１の (2-2-3)及び（2-3-3）にて得た組換えHis-タグ付きE2及びE3酵素を酵素源として、下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で2時間反応させることでジヒドロダイゼインからエクオールの合成を行った。また、同時に酵素源として組換えHis-タグ付きE2酵素及びE3酵素それぞれを単独で用いた反応も行った。
酵素反応液組成
2009084603.tif 000010
インキュベート後、得られた酵素反応液に3mLの酢酸エチル(和光純薬)を添加して抽出処理を行い、乾固した後、移動層（溶離液）で溶解した。溶解物をHPLC分析することにより、酵素反応液中のエクオールを測定した。
HPLC分析の結果を図２４に示す。酵素源に組換えHis-タグ付きE2、E3酵素混合を使用した場合、その生成物にエクオールを確認した。しかしながら、酵素源に組換えHis-タグ付きE2酵素もしくは組換えHis-タグ付きE3酵素を単独で使用した場合には、その生成物にエク オールは確認できなかった。【０５４４】
実施例Ｄ４  組換えHis-タグ付きE1酵素、E2酵素及びE3酵素を用いたダイゼインからのエクオール合成
上記実施例Ｄ１の(2-2-3)及び（2-3-3）にて得た組換えHis-タグ付きE1酵素、E2酵素及びE3酵素を酵素源として、下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で2時間反応させることでダイゼインからエクオールの合成を行った。また、同時に酵素源として組換えHis-タグ付きE1酵素、E2酵素、及びE3酵素をそれぞれ単独で用いた反応も行った。
酵素反応液組成
2009084603.tif 000011
【０５４５】
インキュベート後、得られた酵素反応液に3mLの酢酸エチル(和光純薬)を添加して抽出処理を行い、乾固した後、移動層（溶離液）で溶解した。溶解物をHPLC分析することにより、酵素反応液中のエクオールを測定した。
HPLC分析の結果を図２５に示す。酵素源にそれぞれの組換えHis-タグ付き酵素単独で使用した場合、その生成物にエクオールは確認できなかった。しかしながら、酵素源に組換えHis-タグ付きE1酵素、E2酵素及びE3酵素混合を使用した場合には、その生成物にエクオールが確認された。【０５４６】
実施例Ｅ  His-タグ付き組換えE1酵素のジヒドロダイゼン合成活性に対する金属イオンの影響
Ni-Sepharoseにて精製した大腸菌発現His-タグ付き組換えE1酵素(E1-His)を酵素源として、ダイゼインからジヒドロダイゼインへの変換活性に対する金属イオンの影響を検討した。  各種金属 (MnCl2・2H2O、FeSO4・7H2O、CaCl2・2 H2O、Zn(CH3COO)2・2H2O、CoSO4・7H2O、MgSO4・7 H2O、NiSO4・6 H2O ) を蒸留水にて100mMとなるよう溶解し、実験に供した。活性の測定は下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で1時間インキュベートして行った。
酵素反応液組成
組換えHis−タグ付きＥ１酵素                                20 μl
NADH(100 mM)                                                10 μl
NADPH(100 mM)                                               10 μl
ダイゼイン (1 mg / ml)                                       10 μl
金属イオン溶液                                               100 μl
0.2M KPB-DH                                                 850 μl
計  1000 μl【０５４７】
インキュベート後、得られた酵素反応液に3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行い、乾固した後、移動層（溶離液）で溶解した後、溶解物をHPLC分析することにより、酵素反応液中のダイゼイン、ジヒドロダイゼインの含量を測定した。  実験の結果、Mn2+、Fe2+に活性促進作用のあることが認められた（図２６）。  
【図面の簡単な説明】
【０５４８】
【図１】実施例Ａ１におけるHPLC分析の結果を示す。図１中、上に示す３つのクロマトグラフは、Control（補酵素未添加）、補酵素としてNADHを添加、補酵素としてNADPHを添加した場合に得られた酵素反応生成物のHPLC分析結果である。また、図１中、下に示す棒グラフは、Control（補酵素未添加）、補酵素としてNADHを添加、補酵素としてNADPHを添加した場合において、ジヒドロダイゼインに相当するピーク面積を示す図である。
【図２】実施例Ａ２において実施したMono Q HPLCの結果を図２中、上に、各フラクションにおけるジヒドロダイゼイン合成酵素の活性を図２中、下に示す。酵素活性はダイゼインを基質とし、生成したジヒドロダイゼインのピーク面積を示す。
【図３】実施例Ａ２において実施したSDS-PAGEの結果を図３中の左に、各フラクションにおけるジヒドロダイゼイン合成酵素の活性を図３中の右に示す。酵素活性はダイゼインを基質とし、生成したジヒドロダイゼインのピーク面積を示す。SDS‐PAGEには市販のゲル板（SuperSepTM10-20％ (和光純薬工業株式会社））を使用した。
【図４】実施例Ａ４におけるペプチドマッピングを行った結果及び各ピークに対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。図４中、上に示すHPCL分析チャート内に示す矢印▼の番号は各々、１：ＦＤＥＰＶＹＰＱＡＥ、２：ＡＳＲＭＶＭＤＡＶＨＥＧＹＩＡＧ、３：ＧＹＩＧＮＬＥＶＥＮＲＡＩＲＭＰＭで示されるペプチドを示す。
【図５】実施例Ａ５において実施したDenerative-PCR産物のアガロース電気泳動の結果を示す。(1)E1-N-terminal-31とE1-internal-RP1、(2)E1-N-terminal-37とE1-internal-RP1、(3)E1-N-terminal-F32とE1-internal-RP1、マーカーＭ１：λ/Styl、Ｍ２：100bp Ladder
【図６】実施例Ａ７において実施したRT-PCR産物のアガロース電気泳動の結果を示す。上の図は、ジヒドロダイゼイン合成酵素であり、下の図は、リボゾームRNAである。
【図７】実施例Ａ８において実施したSDS-PAGEの結果を示す。
【図８】実施例Ａ８において実施したHPLC分析の結果を示す。上の図はコントロール、真ん中の図はｐET-E1-His、下の図はpET21aを示す。
【図９】実施例１におけるHPLC分析の結果を示す。図９の中で、上のチャートは、シス−テトラヒドロダイゼイン（REF-000312）のHPLC分析結果；中のチャートは、基質にジヒドロダイゼインを用い、菌破砕物を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析結果；下のチャートは、トランス−テトラヒドロダイゼイン（REF-000313）のHPLC分析結果をそれぞれ示す。
【図１０】実施例Ｂ１におけるHPLC分析の結果を示す。図１０の中で、上の２つのチャートは、基質にシス−テトラヒドロダイゼイン（REF-000312）を用い、菌破砕物を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析結果；下の２つのチャートは、基質にトランス−テトラヒドロダイゼイン（REF-000313）を用い、菌破砕物を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析結果をそれぞれ示す。
【図１１】実施例Ｂ２におけるHPLC分析の結果を示す。図１１の中で、上に示す３つのチャートは、Control（補酵素未添加）、補酵素としてNADHを添加、補酵素としてNADPHを添加した場合に得られた酵素反応生成物のHPLC分析結果である。また、図１１の中で、下に示す棒グラフは、Control（補酵素未添加）、補酵素としてNADHを添加、補酵素としてNADPHを添加した場合において、テトラヒドロダイゼインに相当するピーク面積を示す図である。
【図１２】実施例Ｂ３におけるゲルろ過HPLC分析の結果を示す。図１２中、上のグラフは標準タンパク質のゲルろ過HPLC分析結果；中のグラフは各フラクションの酵素活性を生成したテトラヒドロダイゼインに相当するピーク面積として示したもの；下のグラフは各フラクションのタンパク質に相当する吸収（280nm）の強度を示す。
【図１３】実施例Ｂ３においてSDS-PAGEを行った結果を示す。
【図１４】実施例Ｂ４においてSDS-PAGEを行った結果を示す。
【図１５】実施例Ｂ５において決定したジヒドロダイゼイン合成（E1)酵素遺伝子周辺ゲノム構造の模式図を示す。
【図１６−１】実施例Ｂ６においてLC-MS分析にて取得したデータ及びそれから推定される消化ペプチドのアミノ酸配列の一例を示す。図１６−１中にＬで表されるアミノ酸残基は、明細書中においてＸで表されるアミノ酸残基と同一である。上の図は、ペプチド：TPGVAASVADEXKについてである。下の図は、ペプチド：MPGAPVFGKについてである。
【図１６−２】実施例Ｂ６においてLC-MS分析にて取得したデータ及びそれから推定される消化ペプチドのアミノ酸配列の一例を示す。図１６−２中にＬで表されるアミノ酸残基は、明細書中においてＸで表されるアミノ酸残基と同一である。上の図は、ペプチド：KXXXTGTTKについてである。下の図は、VTQEXXCAHGAFVCGSGRについてである。
【図１６−３】実施例Ｂ６においてLC-MS分析にて取得したデータ及びそれから推定される消化ペプチドのアミノ酸配列の一例（WXSPEESVGQR）を示す。図１６−３中にＬで表されるアミノ酸残基は、明細書中においてＸで表されるアミノ酸残基と同一である。
【図１７】実施例Ｂ７におけるHPLC分析の結果を示す。図１７の中で、上の左２つのチャートは基質にジヒドロダイゼインを用い、ORF-US2ポリペプチドを発現させた反応液を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析結果（ORF-US2)；上の右２つのチャートはタンパク質合成させていない反応液を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析結果（NC)を示す。また、図１７の中で、下に示す棒グラフは、NC（タンパク質合成無し）、DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ発現反応液）、ORF-US2（ORF-US2ポリペプチド発現反応液）を酵素源として酵素反応を行った場合における酵素反応中のＤＤ（ジヒドロダイゼイン）及びＴＨＤ（テトラヒドロダイゼイン）に相当するピーク面積を示す図である。
【図１８】実施例Ｂ８においてSDS-PAGEを行った結果を示す。
【図１９】実施例Ｂ８におけるHPLC分析の結果を示す。図１９の中で、上の２つのチャートの上段は、基質にジヒドロダイゼインを用い、組換えORF-US2ポリペプチドを発現するプラスミドpET21-US2の形質転換体由来の菌破砕液を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析結果（pET21-US2）を示す。図１９の中で、上の２つのチャートの下段は、基質にジヒドロダイゼインを用い、ネガティブコントロールであるpET21a形質転換体由来の菌破砕液を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析結果（pET21a）を示す。また、図１９の中で、下に示す棒グラフは、ORF-US2ポリペプチドを発現させた反応液またはpET21a形質転換体由来の菌破砕液を酵素源として酵素反応を行った場合における酵素反応中のジヒドロダイゼイン（ＤＤ）ならびにシス−（ｃ−ＴＨＤ）及びトランス−テトラヒドロダイゼイン（ｔ−ＴＨＤ）に相当するピーク面積を示す図である。
【図２０】実施例Ｃ１におけるHPLC分析の結果を示す。
【図２１】実施例Ｃ２において実施したSDS-PAGEの結果を示す。
【図２２】実施例Ｃ３において実施したHPLC分析の結果を示す。上の図はスタンダード、真ん中の図はpET-US3、下の図はpET21aについてである。
【図２３】実施例Ｄ２において実施したHPLC分析の結果を示す。最上図はスタンダード、上から二番目の図はE1及びE2、上から３番目の図はE1、一番下の図はE2についてである。
【図２４】実施例Ｄ３において実施したHPLC分析の結果を示す。最上図はスタンダード、上から二番目の図はE2及びE3、上から３番目の図はE2、一番下の図はE3についてである。
【図２５】実施例Ｄ４において実施したHPLC分析の結果を示す。最上図はスタンダード、上から二番目の図はE1、E2及びE3、上から３番目の図はE1、上から４番目の図はE2、一番下の図はE3についてである。
【図２６】Ｅ１酵素に対する金属イオンの影響を示す。
【図２７】配列番号１、２及び３に記載のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２８】配列番号７、８及び９に記載のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２９】配列番号１３、１４及び１５に記載のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０５４９】
配列番号２３はプライマーE1-N-terminal-31の塩基配列を示す。
配列番号２４はプライマーE1-N-terminal-37の塩基配列を示す。
配列番号２５はプライマーE1-N-terminal-F32の塩基配列を示す。
配列番号２６はプライマーE1-internal-RP1の塩基配列を示す。
配列番号２７はプライマーpUC19-FP-1の塩基配列を示す。
配列番号２８はプライマーpUC19-RP-1の塩基配列を示す。
配列番号２９はプライマーpUC19-FP-２の塩基配列を示す。
配列番号３０はプライマーpUC19-RP-２の塩基配列を示す。
配列番号３１はプライマーE1-RACE-N-P1の塩基配列を示す。
配列番号３２はプライマーE1-RACE-RP2-1の塩基配列を示す。
配列番号３３はプライマーE1-RACE-N-P2の塩基配列を示す。
配列番号３４はプライマーE1-RACE-RP2-2の塩基配列を示す。
配列番号３５はプライマーE1-conf-NPの塩基配列を示す。
配列番号３６はプライマーE1-conf-CPの塩基配列を示す。
配列番号３７はプライマーE1-FPの塩基配列を示す。
配列番号３８はプライマーE1-RPの塩基配列を示す。
配列番号３９はプライマーGar-１６S-Ribo-FPの塩基配列を示す。
配列番号４０はプライマーGar-１６S-Ribo-RPの塩基配列を示す。
配列番号４１はプライマーexp.E1 pet F Ndeの塩基配列を示す。
配列番号４２はプライマーexp. E1 pet Hisの塩基配列を示す。
配列番号４３はプライマーRACE-N-P3-1の塩基配列を示す。
配列番号４４はプライマーRACE-N-P3-2の塩基配列を示す。
配列番号４５はプライマーE1-Bub-N-P1の塩基配列を示す。
配列番号４６はプライマーE1-Bub-N-P2の塩基配列を示す。
配列番号４７はプライマーRACE-C-P3-1の塩基配列を示す。
配列番号４８はプライマーRACE-C-P3-2の塩基配列を示す。
配列番号４９はプライマーE1-Bub-C-P1の塩基配列を示す。
配列番号５０はプライマーE1-Bub-C-P2の塩基配列を示す。
配列番号５７はプライマーE2-invitroTS-FPの塩基配列を示す。
配列番号５８はプライマーE2-invitroTS-RPの塩基配列を示す。
配列番号５９はプライマーUniversal-Primerの塩基配列を示す。
配列番号６０はプライマーexp.US2 pet F Ndeの塩基配列を示す。
配列番号６１はプライマーexp. US2 petの塩基配列を示す。
配列番号６２はプライマーexp.US3 Fの塩基配列を示す。
配列番号６３はプライマーexp.US3 Rの塩基配列を示す。
配列番号６４はプライマーexp.US1 Fの塩基配列を示す。
配列番号６５はプライマーexp.US1 Rの塩基配列を示す。
配列番号６６はプライマーexp.DS1 Fの塩基配列を示す。
配列番号６７はプライマーexp.DS1 Rの塩基配列を示す。
【図１】
2009084603.tif 000012
【図２】
2009084603.tif 000013
【図３】
2009084603.tif 000014
【図４】
2009084603.tif 000015
【図５】
2009084603.tif 000016
【図６】
2009084603.tif 000017
【図７】
2009084603.tif 000018
【図８】
2009084603.tif 000019
【図９】
2009084603.tif 000020
【図１０】
2009084603.tif 000021
【図１１】
2009084603.tif 000022
【図１２】
2009084603.tif 000023
【図１３】
2009084603.tif 000024
【図１４】
2009084603.tif 000025
【図１５】
2009084603.tif 000026
【図１６−１−ａ】
2009084603.tif 000027
【図１６−１−ｂ】
2009084603.tif 000028
【図１６−２−ａ】
2009084603.tif 000029
【図１６−２−ｂ】
2009084603.tif 000030
【図１６−３】
2009084603.tif 000031
【図１７】
2009084603.tif 000032
【図１８】
2009084603.tif 000033
【図１９】
2009084603.tif 000034
【図２０】
2009084603.tif 000035
【図２１】
2009084603.tif 000036
【図２２】
2009084603.tif 000037
【図２３】
2009084603.tif 000038
【図２４】
2009084603.tif 000039
【図２５】
2009084603.tif 000040
【図２６】
2009084603.tif 000041
【図２７】
2009084603.tif 000042
【図２８】
2009084603.tif 000043
【図２９】
2009084603.tif 000044
【配列表】
2009084603000001.app
【国際調査報告】
2009084603.tif 000045
2009084603.tif 000046
2009084603.tif 000047
2009084603.tif 000048