(57)【要約】  単一信号源からの複数の異なる光信号をモニターするための方法及びシステムであって、前記異なる各光信号を相互に空間分離し、一般に少数の光学素子及び／又は操作の使用により、異なる検出器又は単一検出器上の異なる位置に誘導する方法及びシステム。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の光信号が少なくとも第２の光信号の波長と異なる波長を含む少なくとも第１及び第２の光信号の信号源を準備する段階と；
第１及び第２の光信号を分岐経路で伝送する光学素子列に光信号を通過させる段階と；
第１及び第２の光信号を単一光検出器上の異なる位置で受光する段階を含む光信号の検出方法。
【請求項２】
拘束信号源が少なくとも第１及び第２の光信号の波長と異なる波長を含む少なくとも第３の光信号を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第３の光信号を第１及び第２の光信号から空間分離し、単一光検出器上の第１及び第２の位置と異なる第３の位置に誘導する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
拘束信号源が少なくとも第１、第２及び第３の光信号の波長と異なる波長を含む少なくとも第４の光信号を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第４の光信号を第１、第２及び第３の光信号から空間分離し、単一光検出器上の第１、第２及び第３の位置と異なる第４の位置に誘導する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第３の光信号を第１及び第２の光信号から空間分離し、第２の光検出器上の第１の位置に誘導する請求項２に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも第１及び第２の光信号が少なくとも部分的に同時である請求項２に記載の方法。
【請求項８】
第１及び第２の光信号が非同時である請求項２に記載の方法。
【請求項９】
信号源が夫々第１及び第２の光信号を発生する少なくとも第１及び第２の蛍光成分を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
第１及び第２の蛍光成分が少なくとも第１及び第２の異なるヌクレオチドポリリン酸又はヌクレオチドポリリン酸アナログと共有結合した第１及び第２の蛍光ラベルを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
信号源が拘束ゼロモード導波管を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
信号源がゼロモード導波管内に固定化されたポリメラーゼ、鋳型核酸及び鋳型核酸の一部に相補的なプライマー配列を含む複合体を含み、夫々第１及び第２の蛍光ラベルをもつ第１及び第２の異なるヌクレオチドポリリン酸又はヌクレオチドポリリン酸アナログが複合体と結合するときに第１及び第２の光信号が発生される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１及び第２の光信号を空間分離する段階が第１及び第２の光信号を分岐経路で誘導する光学素子列に第１及び第２の光信号を通過させる段階を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
光学素子列が第１及び第２の光信号を空間分離するための光格子を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
光学素子列が第１及び第２の光信号を空間分離するためのプリズムを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
第１及び第２の光信号が誘導された検出器上の位置に基づいて第１及び第２の光信号を特性決定する段階を更に含む請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
信号源が未知光信号を含み、未知光信号が誘導される単一検出器上の位置により未知光信号が第１の光信号であるか又は第２の光信号であるかを決定する段階を更に含む請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
第１の光信号が少なくとも第２の光信号の波長と異なる波長を含む少なくとも第１及び第２の光信号を発生する反応混合物を収容するための拘束反応領域と；
拘束反応領域と光学的に連携しており、第１及び第２の光信号を受光し、第１及び第２の光信号を空間分離し、光検出器上の異なる位置に誘導するための光学素子列を含む分析システム。
【請求項１９】
光検出器がフォトダイオードアレイを含む請求項１８に記載の分析システム。
【請求項２０】
光検出器が電荷結合素子（ＣＣＤ）を含む請求項１８に記載の分析システム。
【請求項２１】
光学素子列がこの光学素子列を通って誘導される第１及び第２の光信号を空間分離する光格子を含む請求項１８に記載の分析システム。
【請求項２２】
光学素子列がこの光学素子列を通って誘導される第１、第２及び第３の光信号を空間分離する光格子を含む請求項２１に記載の分析システム。
【請求項２３】
光学素子列がこの光学素子列を通って誘導される第１、第２、第３及び第４の光信号を空間分離する光格子を含む請求項２２に記載の分析システム。
【請求項２４】
光学素子列が少なくとも第１及び第２の光信号を空間分離する第１のプリズムを含む請求項１８に記載の分析システム。
【請求項２５】
拘束反応領域がマルチウェルプレートのウェルを含む請求項１８に記載の分析システム。
【請求項２６】
拘束反応領域が分子アレイの要素を含む請求項１８に記載の分析システム。
【請求項２７】
拘束反応領域がゼロモード導波管を含む請求項１８に記載の分析システム。
【請求項２８】
光学素子列が更に第１のプリズムと直列に配置された少なくとも第２のプリズムを含む請求項２４に記載の分析システム。
【請求項２９】
第１及び第２のプリズムの少なくとも一方が光学素子列を通過する光信号の分散プロファイルを調節するように光学素子列の光軸の周囲に回転可能である請求項１８に記載の分析システム。
【請求項３０】
検出器上の異なる位置に入射する第１及び第２の光信号を個々に又は集合的に記録し、前記光信号が入射した検出器上の異なる位置に基づいて第１及び第２の光信号を特性決定するように検出器に機能的に接続されたプロセッサーを更に含む請求項１８に記載の分析システム。
【請求項３１】
第１の光信号が少なくとも第２の光信号の波長と異なる波長を含む少なくとも第１及び第２の光信号を発生する反応混合物を収容するための拘束反応領域と；
拘束反応領域と光学的に連携しており、第１及び第２の光信号を受光し、第１及び第２の光信号を空間分離し、光検出器上の異なる位置に誘導するための光学素子列を含み、前記光学素子列がこの光学素子列を通過する第１及び第２の光信号を空間分離する交換可能なモジュラー光コンポーネントを含む分析システム。
【請求項３２】
交換可能なモジュラーコンポーネントが少なくとも第１のプリズムを含む請求項３１に記載の分析システム。
【請求項３３】
モジュラーコンポーネントが少なくとも第１のプリズムと第２のプリズムを含む請求項３１に記載の分析システム。
【請求項３４】
第１及び第２のプリズムの少なくとも一方が光学素子列の光軸の周囲に回転可能である請求項３２に記載の分析システム。
【請求項３５】
交換可能なモジュラーコンポーネントが光格子を含む請求項３１に記載の分析システム。
【請求項３６】
更に複数の交換可能なモジュラーコンポーネントのライブラリーを含み、複数のモジュラーコンポーネントの各々が異なる光信号に異なる分散プロファイルをもつ請求項３１に記載の分析システム。
【請求項３７】
第１の光信号が少なくとも第２の光信号の光学特性と異なる光学特性を含む少なくとも第１及び第２の光信号の信号源を準備する段階と；
第１及び第２の光信号を分岐経路で伝送する光学素子列に光信号を通過させる段階と；
単一光検出器上の異なる位置で第１及び第２の光信号を受光する段階を含む光信号の検出方法。
【請求項３８】
第１の光信号が少なくとも第２の光信号の波長と異なる波長を含む少なくとも第１及び第２の光信号の信号源を準備する段階と；
第１及び第２の光信号を単一光検出器上の異なる位置に誘導する段階を含む光信号の検出方法。
【請求項３９】
異なる各光信号が相互に異なる波長を含む複数の異なる光信号の信号源を準備する段階と；
複数の異なる光信号を空間分離し、単一光検出器上の別個の位置に誘導する段階を含む光信号の検出方法。
【請求項４０】
第１の光信号が少なくとも第２の光信号の波長と異なる波長を含む少なくとも第１及び第２の光信号の拘束信号源を準備する段階と；
第１及び第２の光信号を空間分離し、第１及び第２の光信号を第１の光検出器上の第１及び第２の異なる位置に誘導する段階を含む光信号の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願はＵＳＳＮ１１／２０１，７６８（発明の名称「単一信号源からの複数の光信号をモニターするための方法及びシステム（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＭＯＮＩＴＯＲＩＮＧ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＯＰＴＩＣＡＬ  ＳＩＧＮＡＬＳ  ＦＲＯＭ  Ａ  ＳＩＮＧＬＥ  ＳＯＵＲＣＥ）」、発明者Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、出願日２００５年８月１１日）の優先権と特典を主張する。この先願を全目的で参照により本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究に関する陳述）
適用なし。
【背景技術】
【０００３】
異なる光信号をこのような信号の集合から個々に確認、識別及び／又は定量することは多数の異なる分野で重要である。特に、異なる光学特性をもつ光信号イベントを利用し、光信号を相互に別々に確認し、場合により定量する多重分析操作（例えば化学アッセイ等）の使用が注目される。このような分析アッセイとしては医療診断試験、食品及び他の産業工程分析、並びに生物学研究及び開発の基本ツールが挙げられる。これらの信号の解析には多様な光学的及び化学的アプローチが適用されているが、このようなシステムは特に高レベルの感度を必要とする操作では、複雑さ及び／又は費用レベルによりアプローチの総合効果を減じることが多い。本発明は他のシステム及び方法のこれらの欠点に対処する。
【特許文献１】公開米国特許出願第２００３／０１７４９９２  Ａ１号
【特許文献２】米国特許第６，６９９，６５５号
【特許文献３】米国特許出願第２００３／００４４７８１Ａ１号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は一般には好ましくは拘束された単一信号源からの複数の異なる光信号を検出及びモニターするための方法及びシステムを提供する。好ましい側面では、このようなシステム及び方法は流体材料、特に該当化学、生化学又は生物反応の反応体及び／又は生成物からの発光又は蛍光信号の検出に適用される。
【０００５】
第１の側面では、本発明は第１の光信号が少なくとも第２の光信号の光学特性と異なる光学特性を含む少なくとも第１及び第２の光信号の信号源を準備する段階を含む光信号の検出方法を提供する。好ましい側面では、光学特性は光信号の波長である。光信号は例えば第１及び第２の光信号を分岐経路で伝送する光学素子列に信号を通過させることにより検出器上の異なる位置に誘導された後、単一光検出器上の異なる位置で受光される。
【０００６】
１関連側面では、光信号の検出方法は、異なる各光信号が相互に異なる波長を含む複数の異なる光信号の信号源を準備する段階と、複数の異なる光信号を空間分離し、単一光検出器上の別個の位置に誘導する段階を含む。
【０００７】
別の側面では、第１の光信号が少なくとも第２の光信号と異なる光学特性（即ち波長）を含む少なくとも第１及び第２の光信号の拘束信号源を準備する段階を含む光信号の検出方法が提供される。その後、信号は空間分離され、第１の光検出器上の第１及び第２の異なる位置に誘導される。
【０００８】
本発明は上記方法を実施するのに有用なシステムも提供する。例えば１側面では、本発明は第１の光信号が少なくとも第２の光信号と異なる光学特性を含む少なくとも第１及び第２の光信号を発生する反応混合物を収容するための拘束反応領域を含む分析システムを提供する。このようなシステムは更に拘束反応領域と光学的に連携しており、第１及び第２の光信号を受光し、第１及び第２の光信号を空間分離し、光検出器上の異なる位置に誘導するための光学素子列を含む。
【０００９】
本発明の関連システムは第１の光信号が少なくとも第２の光信号の波長と異なる波長を含む少なくとも第１及び第２の光信号を発生する反応混合物を収容するための拘束反応領域と、拘束反応領域と光学的に連携しており、第１及び第２の光信号を受光し、第１及び第２の光信号を空間分離し、光検出器上の異なる位置に誘導するための光学素子列を含む。代替側面では、光学素子列はこの光学素子列を通過する第１及び第２の光信号を空間分離する交換可能なモジュラー光コンポーネントを含む。モジュール集合又はライブラリーから異なるモジュールを選択することにより、システム全体の効率を増すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
Ｉ．概論
本発明は一般には光信号の集合及び前記信号から誘導されるデータの簡単で効率的でコストパフォーマンスの高い分析及び／又は管理装置、システム及び方法に関する。特に、これらの装置、システム及び方法は該当反応（例えば核酸合成等の化学及び生化学反応）の分析と、これらの反応に含まれる段階の特性決定に利用すると有用である。
【００１１】
一般に、本発明は光信号を相互に分離し、単一光検出器上の異なる検出機能部分又は異なる位置に誘導することにより、光信号源からの２個以上の異なる光信号を測定するための方法、システム及び装置に関する。異なる光信号を別々に検出することにより、各信号の原因イベントの発生を認識することができる。更に、これを少数の検出器又は単一検出器もしくは検出器アレイ内で実施することにより、その効率及び／又は感度を増すと同時にシステムとこれに付随する制御及び分析工程の複雑さ及び費用を低減することができる。
【００１２】
本発明のシステム及び方法全体は多様な用途に広く利用することができるが、これらのシステム及び方法は反応プロセス中にこのような異なる光信号を天然又は人工的に発生する化学及び／又は生化学反応の分析及び特性決定に利用すると特に有用である。本発明は複数の光信号を発生する多種多様な分析反応に利用することができる。これらの反応としては、異なる波長の光信号（例えば蛍光及び／又は蛍光発生反応体又は生成物、発光反応体又は生成物、発色及び／又は色素発生反応体又は生成物等）を使用する反応と、他の特性が相違する光信号（例えば偏光シフト又は発光の位相変調）を使用する反応が挙げられる。一般に、本明細書で光信号の波長と言う場合には、このような信号の波長範囲を意味する。特に、光信号（例えば発生した蛍光、発光等）は光スペクトルの一部に対応し、スペクトル全体のうちの１ｎｍ〜３０ｎｍから１００ｎｍ以上に及ぶ。本発明に関して、異なる波長の光信号とは波長範囲を相互に区別できる信号を意味する。従って、異なる信号の波長範囲は殆ど又は全くオーバーラップしないことが理想的であるが、信号を個々に確認できるのであれば、実質的量の波長範囲オーバーラップも許容できる。光学システム、即ち光学素子の使用及び／又はストリンジェントデータ選択により信号を信号オーバーラップ又はノイズから確認及び識別する方法は当分野で周知である。特に好ましい１側面では、本発明の分析方法及びシステムは核酸解析、特に核酸配列解析に利用される。
【００１３】
本発明の方法及びシステムは複雑さが少なく、その結果として感度が高いため、検出する光信号が比較的弱い用途、例えば光レベルが低い場合や、シグナルイベント数が少ない場合等に特に有用である。特に、本発明で利用するシステムは信号に実施する光学操作数を最小限にするので、このような各操作から累積するシステムの総合効率低下も少なくなる。例えば、光信号に多重ビームスプリッティング、再合焦、フィルター等の操作を実施する場合には、各段階に付随する低下によりアッセイ全体の感度が著しく低下する可能性がある。更に、例えば制限帯域フィルター等を使用して信号全体の光スペクトルの一部のみを試験する際の低下は、そうでない場合に検出操作で使用可能な信号量を更に低下させる可能性がある。本発明の方法及びシステムの場合には、信号全体のスペクトル全体を検出し、異なる各信号成分の選択は単一検出器上の位置を選択すればよく、例えば信号の一部を検出する前に光学カットオフフィルターによりカットオフするのではなく、例えば検出器アレイの画素を所与信号の評価に適用する。
【００１４】
多くの用途はこのような低下を見越して十分な信号強度で開始するが、用途によっては効率低下と相俟って信号レベルがシステム全体の有意検出レベルを下回る場合や、光信号の変化がシステムのノイズレベル内であり、例えば信号が信号強度のランダム変動から区別できないほど弱い場合がある。これらの低信号型用途の例としては例えば、任意所与時点で非常に少数又は１個の検出可能な分子しか検出に利用できない単分子又は少数分子反応等の低濃度化学分析が挙げられる。
ＩＩ．方法
【００１５】
上記のように、１側面では、本発明は相互に異なる光信号を分離し、その少なくとも一部を単一光検出器又は検出器アレイ上の別個の位置に誘導することにより、複数の異なる光信号の信号源からの光信号を検出する方法に関する。複数の信号を単一検出器上の異なる位置で検出する場合には、当然のことながら、このような検出器は信号強度及び時間のみならず、このような信号が入射するアレイの場所又は位置にも相関する入射信号に関する信号情報を提供する機能をもつか又はそのように構成することができる。このような検出器の単純な例としては光学分野で一般に公知のアレイ型検出器が挙げられ、本明細書ではその所定の例について詳細に記載する。単一点信号を別個の検出器で検出しようとする場合には、当然のことながら、入射信号の位置情報は単一検出器又は検出器アレイ内の位置ではなく、個々の各検出器の位置により提供される（但し、一般には必ずしも複数の個々の検出器の必要はない）。
【００１６】
本発明の方法は多様な型の光信号源に適用することができるが、好ましい側面では、光信号源は拘束信号源を含む。本発明の拘束信号源は一般に特定光信号を発生する信号源の１個以上の成分が空間的に拘束されており、検出中に拘束信号源に流入及び／又は信号源から流出しないことを特徴とする。このような拘束信号源は信号発生成分、反応体等が導管内の検出点を通過して活発に流動するシステムとは対照的である。上記にかかわらず、本発明で使用される信号発生メカニズムの成分は本明細書に記載するパラメーターに該当しながら、拘束空間に流出入する場合もある。しかし、多くの場合には、信号メカニズムに寄与する１個以上の成分は拘束空間内に固定化される。
【００１７】
信号源が拘束されていると、光信号が反応性化学種、特に流体反応性化学種（例えば水性及び／又は有機流体）に由来する場合に特に有利である。特に、異なる光信号の流体源の場合には、信号源が拘束されていると、このような流体は検出中に拘束空間に流出入できない。流体拘束の例としては、例えば従来のマルチウェル分析プレート（例えば９６、３８４又は１５３６ウェルプレート）が挙げられる。このような流体反応体の拘束の他の例としてはナノスケールウェル又はアパーチャー、即ちその開示内容全体を全目的で参照により本明細書に組込む公開米国特許出願第２００３／０１７４９９２  Ａ１号に記載されており、物理的拘束と光学拘束の両者として機能し、例えば導波管に侵入する光量を制限し、従って信号（例えば蛍光信号）が発生する容積を有効に制限するゼロモード導波管構造が挙げられる。このようなゼロモード導波管は非常に小容量（例えば流体反応体）からの異なる光信号をモニターでき、少数の分子間の相互作用等をモニターできるので、本発明の利用に特に有用である。従って、ゼロモード導波管が拘束空間の代表例であるが、この拘束空間の実測容積は導波管の寸法等により決定されるこのような空間の容積の一部である。この部分的な実測容積は信号源の別の拘束の例である。鋳型依存的核酸合成、分子相互作用モニター、即ちＤＮＡハイブリダイゼーション、イムノアッセイ、酵素反応等における標識ヌクレオチドアナログと核酸ポリメラーゼの段階的反応によるＤＮＡ配列確認等の単分子相互作用でこのような拘束容積を使用すると特に有利である。
【００１８】
例えばウェル、レザバー等を使用する構造拘束に加え、拘束は付加又は代替として、即ち任意構造拘束の代用又は追加として、光信号の１個以上を発生する化学種の化学的固定化を含むことができる。このような化学的拘束の例としては化学種と基板表面の間の共有、ファン・デル・ワールス又は他の結合相互作用、構造的拘束を形成するための化学的相互作用の使用（例えば流体種と化学種を拘束するように疎水性バリアで包囲された親水性領域をもつ基板）等が挙げられる。拘束が所与位置への反応体の化学的固定化を意味する場合には、例えば支持体又は基板の表面への反応体の共有結合（例えばシラン又はエポキシド結合）等の各種固定化技術を利用することができる。同様に、例えば反応体を基板又は支持体に結合するための相補的結合対の使用等の他の結合も利用できる。このような結合としては、例えば抗体／抗原結合、ビオチン／アビジン結合等が挙げられる。化学的に形成された構造的拘束の場合にも、基板にこのような「構造」を配置するために各種技術を利用できる。特に、本来親水性のシリカ表面にアルキルシラン基を配置することにより疎水性バリアを形成することができる。このような材料は疎水性バリア領域で包囲された親水性拘束を規定するように、従来の写真平版技術、スクリーン印刷、インクジェット印刷等を使用して基板表面に容易にパターニングされる。
【００１９】
上記に示唆したように、好ましい側面では、信号源から発生する光信号は反応性化学種に由来し、このような種の反応は光信号を発生、消滅、増加、減少又はその特性を変化させる。このような反応種としては例えば１種以上の波長の光に対する材料の透過率を変化させ、即ち反応すると変色する発色又は色素発生反応体が挙げられる。活性化光源を使用して発光する反応体種（蛍光又は蛍光発生）又はこのような励起源を使用せずに発光する反応体種（発光）が本発明の方法で使用するのに好ましい。更に、本発明では、このような反応種を流体溶液に加え、異なる光信号が基質、生成物又は両者の組み合わせに由来する反応混合物として提供することが最も好ましい。
【００２０】
好ましい側面では、上記のように、検出する異なる光信号は異なる波長の光から構成され、例えば異なるフルオロフォアにより異なる波長スペクトルで発生される光や、異なるクロモフォアにより異なる波長スペクトルで発生される光である。このような場合には、例えばビームスプリッターと１個以上の二色性フィルターの併用、又はプリズムもしくは光格子の使用により２個以上の異なる光信号を空間分離し、異なる信号を光検出器又は検出器アレイ上の異なる位置に誘導する。代替側面では、例えば偏光フィルター又は復調フィルターの使用により空間分離して検出器又は検出器アレイ上の異なる領域に誘導できるのであれば、異なる光信号はその相対極性、その変調位相又は周波数等の他の特性が相違していてもよい。このような特性の相違に基づく生化学アッセイの例は例えば米国特許第６，６９９，６５５号に記載されており、同特許は偏光で励起した場合の（一般に偏光作用剤との併用下の）蛍光反応体及び生成物の相対極性の検出による反応進行のモニターを開示している。
【００２１】
異なる光信号を空間分離し、及び／又は光検出器又は検出器アレイ上の異なる位置に誘導する方法は一般に検出の差の基礎となる異なる光信号の特性に依存する。例えば、異なる光信号の波長が相違する場合には、分離と誘導は異なる波長の光を異なる方法及び／又は異なる程度で選択的に透過又は再誘導する光学フィルター及び／又はプリズムを使用して実施することができる。例えば、拘束信号源から発生する光の２種の異なる波長を含む複合信号は例えば二色性フィルターの使用により２本のビームに分割して他方の信号成分を除去した後にバリアフィルターに通すことにより、信号全体の一部のみを光検出器又は検出器アレイに誘導することができる。他方、本発明によると、より単純な光学素子列を使用して光信号を分離し、検出器又は検出器アレイ上の異なる位置、あるいは場合によっては複数の異なる検出器又は検出器アレイに誘導する。特に、この結果を達成するためにはウェッジプリズム又は光格子を利用することができる。このようなプリズム又は回折格子を使用すると、システム全体の光学素子列が単純になり、その結果、複雑な光学システムに比較して伝送性の高い光路が得られる。更に、カットオフフィルター（例えば二色性フィルター）を使用する場合とは対照的に、信号のスペクトル全体又は例えばプリズムの反射損失を低下するように少なくとも選択的にフィルターした信号の部分を検出器又は検出器アレイに誘導することができる。その結果、検出、操作及びデコンボリューションに利用可能な信号量が増加する。本発明の単純さは更にシステムのフレキシビリティにも有利であり、光学素子列の交換可能なプリズム部分を異なるプリズムのライブラリー又は集合からの別のプリズムに交換するだけで多様な操作（例えば異なる範囲の光信号を各々利用する操作）を実施するように単一機器を容易に構成することができる。これに対して、従来のマルチフィルター光学素子列を再構成するには、より実質的な変更（例えば複数のフィルターの交換等）が必要であった。特に、本発明の所定側面によると、光信号を空間分離する光学素子列のコンポーネントは機器の適当な受容スロットに着脱可能な容易に交換可能なモジュラーコンポーネント（例えばプリズム、複合プリズム及び／又は光格子）から構成することができる。更に、各々異なる光信号又は光信号の集合について異なる光分散プロファイルを提供するこのようなモジュラーコンポーネントのライブラリーを所与機器に補充又は補充可能にすることができるので、エンドユーザーは分離コンポーネントを容易に再構成することができ、エンドユーザーにとって有用性とフレキシビリティが最大になる。本明細書では所定の光学素子列の例を詳細に記載する。
【００２２】
本明細書に記載する光学素子列の単純さに伴い、複数の並列光信号の最終検出は一般に少数の検出器を使用して実施される。特に、ｎ個の光信号（ｎ＞１）の検出は一般に最大ｎ−１個の別個の検出器を使用して実施される。特に好ましい側面では、２、３、４、５、６個又はそれ以上の異なる光信号が１個以上、あるいは信号が３個以上の場合には２個以上の光検出器又は検出器アレイ上の異なる位置に誘導される。本発明によると、当然のことながら、所与検出器上の２個以上の位置に２個以上の信号が誘導される場合には、このような検出器は単一点検出器（例えば単純なフォトダイオード）ではなく、検出器への光信号の入射を指示すると共にこのような信号が入射した検出器上の位置を指示する信号を発生する検出領域をもつ。このような検出器の例としては、電荷結合素子（ＣＣＤ）等の撮像検出器が挙げられ、ＣＣＤ上の各画素は単一点検出器を構成するが、素子全体は検出器アレイを構成し、検出器信号は信号が入射した画素とこの画素におけるこの信号の強度を指示する。同様に、信号強度とアレイ内の信号位置情報を提供するように空間的に配置及びインターフェースされた多数のフォトダイオードを含む大型のダイオードアレイ検出器も使用できる。上記にかかわらず、本発明によると、単一点検出器をこのような検出器アレイと併用してもよく、その場合には、例えば単一信号を単一検出器に誘導し、異なる信号を同一検出器上の領域ではなく、異なる又は別個の検出器に誘導する。
【００２３】
主要な好ましい側面は複数の光信号を単一検出器もしくは検出器アレイ又は検出する異なる光信号数よりも少数の検出器に誘導する方法及びシステムに関するが、例えば光格子又は色分散プリズム（例えばウェッジプリズム）を使用して波長の異なる光信号を空間分離する所定の代替側面では、異なる各信号を場合により異なる検出器エレメント（例えば点検出器）に誘導する。このような場合には、単純でコストパフォーマンスの高い分離光学素子（例えばプリズム又は光格子）を組込むと、複雑な光学素子列よりも資金面と光学効率の両面で高い効率が得られる。従って、単一検出器又は検出器アレイを使用する単純さはないが、複数の低コストの点検出器又は低解像度の検出器アレイを検出器エレメントとして使用する場合には費用効率が得られる。更に、このようなシステムは複雑なシステム及び方法よりも実質的な費用効率を保持する。
【００２４】
空間分離と誘導により、光信号が検出器又は検出器アレイの特定位置に入射すると、２個の光信号の一方が拘束信号源から発生又は伝送されていると判断される。検出器上の２個以上の位置又は検出器アレイの２個以上のエレメントが光信号の入射を示す場合には、２個以上の異なる光信号が発生されていると判断される。入射信号を示している特定位置又はエレメントをモニターすることにより、どの信号が発生されているかを確認し、実施されている反応に基づき、出現している反応状態（例えば所与生成物の生成又は所与反応体の消費）を確認することができる。
【００２５】
本発明の方法の簡略模式図を図１Ａに示す。図面から明らかなように、システム１００では、少なくとも２個の異なる光信号１０２及び１０４がこのような信号の拘束信号源１０６から発生する。本明細書の他の箇所に記載するように、このような拘束信号源は流体化学反応体を含む規定位置（例えば反応ウェル又は領域、ゼロモード導波管等）が好ましいと思われる。その後、異なる光信号はこれらの信号を適当な光コンポーネント（例えばプリズム１０８、光格子等）に通過させることにより（実線矢印１０２及び破線矢印１０４の分岐経路により示すように）空間分離される。分離後、信号はレンズ１１０（例えば結像レンズ）を通って合焦し、検出器アレイ１１２の２個の異なる位置１１４及び１１６に入射する。信号の分離を図１Ｂに模式的に示す。特に、複合光信号はスポット１５０により表すような信号としてプリズム１０８に入射する。信号は光学素子列の空間分離コンポーネント（例えばプリズム１０８）を通過し、検出器で合焦すると、スポット１５２及び１５４により表すように、夫々の異なる光信号成分に空間分離される。
【００２６】
図２は信号が同時又は非同時である経時的検出動作を模式的に示す。特に、図面から明らかなように、システム１００は更にプロット２０２として模式的に示す記録／読取システムに接続されている。経時的に、プロット２０２の横軸により示すように、（時点２０４及び２０６に示すように）異なる時点又は同時（時点２０８）に拘束信号源１０６から異なる光信号が発生する。光信号は検出器１１２の異なる位置で検出され、各位置は（例えば接点２１０及び２１２で）別々に記録システムに接続されている。その結果、単一拘束信号源からの光信号が別々に検出及び記録され、所与時点に帰属することができる。
【００２７】
本発明の方法の１使用例は核酸配列解析法の実施であり、特に成長中の合成鎖に取込まれる異なる標識付きヌクレオチドアナログの検出により相補的核酸配列の鋳型依存的合成をモニターすることにより核酸配列を解析する単分子法の実施に利用される。例えばその開示内容全体を全目的で参照により本明細書に組込む米国特許出願第２００３／００４４７８１Ａ１号参照。
【００２８】
このような１方法では、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を鋳型核酸配列と結合又は複合体化し、鋳型又はポリメラーゼを介して基板の表面に結合し、固定化する。ポリメラーゼ酵素により取込まれる異なる標識付きヌクレオシドポリリン酸（例えばヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、ヌクレオシド四リン酸、ヌクレオシド五リン酸等）又はこれらの任意ヌクレオシドポリリン酸のアナログ又は他のヌクレオシドもしくはヌクレオチド分子等（便宜上、本明細書ではこれらの全てをＮＴＰと言う）を含む適切な重合反応条件に複合体を暴露し、異なる各ＮＴＰ（例えばＡ、Ｔ、Ｇ又はＣ）は異なる発光波長プロファイルをもつ蛍光ラベルで標識する。異なる各型のＮＴＰが取込まれると、取込みイベントを示す異なる光信号が発生する。例えば、固定化ポリメラーゼ／鋳型複合体を収容する拘束容積を使用する方法では、所与蛍光塩基が取込まれると、この塩基は取込まれない塩基よりも長時間検出領域内に保持される。取込まれた塩基に関連する信号を検出することにより、鋳型依存的合成で取込まれる塩基を順次確認することができる。本発明によると、一般に蛍光パルスとして特徴付けられる各取込み信号を光検出器アレイ上の異なる位置に誘導し、検出器アレイ上のこの位置により確認する。従って、図２に示すように、単一拘束信号源内で異なる光信号が発生するが、例えば各塩基が取込まれるにつれて順次、異なる時点で発生する場合もある。
【００２９】
このような場合には、重合反応環境は基板表面へのその固定化により拘束されるが、一般には更に例えばゼロモード導波管内及び／又はマルチウェルプレートの反応ウェル内で構造的にも拘束される。
【００３０】
別の例では、核酸鎖（例えばポリヌクレオチド）を基板表面に固定化し、異なる光ラベルを結合した核酸プローブで探索する。固定化核酸の拘束領域内でハイブリダイズ（例えば局在）するプローブを確認することにより、固定化配列の配列を確認することができる。同様に、固定化配列が分かっている場合には、この配列とハイブリダイズするプローブ配列の配列を確認することができる。
【００３１】
別の例では、本発明の方法及びシステムを使用して、基質と生成物の蛍光偏光能の差を検出するアッセイをモニターすることができる。例えば、その開示内容全体を全目的で参照により本明細書に組込む米国特許第６，６９９，６５５号は反応体と生成物が実質的に異なる電荷をもつ反応をモニターすることが可能な均質アッセイシステムを記載している。このようなアッセイとしては、リン酸基の付加又は脱離の結果としてリン酸化又は脱リン酸化生成物がその基質と実質的に異なる電荷をもつキナーゼ又はホスファターゼアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、プロテアーゼアッセイ等が挙げられる。要約すると、大きな荷電分子又は他の構造は電荷の差により基質又は生成物と結合するので、基質又は生成物の回転拡散が変化し、従って、偏光励起放射線に応答して付着蛍光ラベルから発生した蛍光の相対偏光が変化する。本発明によると、偏光解消した蛍光の異なる平面成分を別々の検出器に誘導するのではなく、２個の異なる信号をまず空間分離した後に、同一検出器上の異なる位置に誘導する。異なる偏光信号を区別する用途の実施に使用するシステムの１例を図４に示す。
【００３２】
所定型のアッセイについて記載したが、当然のことながら、本発明の方法は２個以上の光信号が単一拘束信号源から発生するが、別々に検出、記録及び／又はモニターしたい各種分析状況（例えば内部制御信号の使用等）で有用である。
ＩＩＩ．システム
【００３３】
本発明は上記方法の実施に有用なシステム及び装置も提供する。図３は本発明の方法を実施するためのシステムの１例を模式的に示す。図面から明らかなように、システム全体３００は少なくとも２個の異なる光信号の信号源３０２を含む。図面から明らかなように、信号源３０２は少なくとも１個、好ましくはアレイ状のゼロモード導波管３０４を搭載した基板を含む。導波管３０４を含む信号源３０２と光学的に連携する光学素子列３０６も配置されている。図面から明らかなように、光学素子列３０６は信号源３０２内の蛍光又は蛍光発生光信号成分と併用するための励起放射線源（例えばレーザー３０８、レーザーダイオード、ＬＥＤ等）を含む。図例の光学素子列３０６は励起放射線を反射し、例えば導波管３０４を含む信号源３０２に誘導するが、発生した蛍光を透過する二色性ミラー３１０も含む。励起放射線を合焦させ、更に信号源３０２に誘導し、光信号（例えば蛍光）を信号源から誘導するために対物レンズ又は他の合焦レンズ３１２も一般に配置される。図例システムでは、信号はバリア又はノッチフィルター３１４を通過し、二色性ミラー３１０により反射されなかった励起放射線を更に減衰した後、プリズム３１６又は光格子を通過し、例えば波長により励起放射線を空間分離し、レンズ３１２を通して光検出器（例えばＣＣＤ３２０）に誘導する。有用なプリズム及び／又は光格子は一般に例えばＴｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＣＶＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｌｂｅｒｑｕｅｒｑｕｅ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ）等の各種商業的光学素子供給業者から市販されている。ＣＣＤ３２０で検出された信号（その強度と位置／画素データを含む）は、（例えば反応パラメーター等を帰属させるための）１種以上のデータ操作をこのような記録信号データに実施することができるプロセッサー３２２により記録された後に例えばディスプレイ３２４に使い易い読取フォーマットで提供される。
【００３４】
単一プリズム又は格子として図示したが、当然のことながら、場合によっては、２個以上のプリズムを使用することが望ましい場合もある。特に、場合により、所与プリズムの分散プロファイルによる異なる信号の空間分離は所望空間分離を達成できない場合がある。例えば、検出器アレイにおける検出器エレメントの密度が高い場合には、規則的又は直線的に離間した信号成分を提供することが望ましいと思われる。しかし、所与プリズムの分散プロファイルは直線的でなくてもよく、例えば得られる透過信号は均等に空間分離されない。他方、例えば高密度信号集合を検出するためにＣＣＤを使用する際に全信号が相互に同様に分離されるように確保することにより検出を助長する場合には、検出する信号の各々に準直線的分離プロファイルを提供するように異なる分散プロファイルをもつプリズムを組み合わせると有利であると思われる。同様に、所定の場合では、２個以上の信号成分間の分離を直線分離よりも強化することにより、異なる信号の検出を最適化することができる。このような場合には、２個以上のプリズムを調節できるので、このようにシステムのフレキシビリティーを増すことができる。付加プリズム又は格子の使用に加え、当然のことながら、プリズム又は他の分散光学素子を例えば光学システムの光軸の周囲に色分離方向に垂直に回転させて分散度を調節することにより、システムの調節を実施することができる。従って、システム態様では、光軸の周囲に容易に回転可能な構成でプリズムの１個以上を配置すると有用であると思われる。
【００３５】
図例のシステムの動作において、異なる光信号の信号源３０２は少なくとも２個の異なる光信号を発生する生成物を生成するか又は基質を消費する反応混合物（例えば異なる波長の光を発光する蛍光ラベルを付着した基質、中間体及び／又は生成物）を含む。光源（例えばレーザー３０８）は励起放射線（例えば信号源３０２に存在する蛍光ラベルに適した励起波長の光）を二色性ミラー３１０に誘導する。励起放射線は二色性ミラー３１０により反射され、対物レンズ３１２を通り、信号源３０２に入射し、信号源に含まれる蛍光ラベルを励起する。発生した蛍光は再び対物レンズ３１２により集光され、励起放射線の波長の光を反射するが、発生した蛍光の波長の光を透過するように選択された二色性ミラー３１０を通る。その結果、反射した励起放射線は蛍光から除去される。その後、蛍光信号は異なる信号を波長により空間分離するプリズム３１６又は光格子を通り、レンズ３１８（例えば結像レンズ）を使用して再合焦され、光検出器アレイ（例えばＣＣＤ３２０、光子計数アバランシェフォトダイオードアレイ、光電子増倍管（ＰＭＴ）アレイ等）の異なる位置に誘導される。本発明では、例えばダイオードアレイ、ＣＣＤアレイ等の各種検出器アレイを利用することができる。小型で解像度が高く、費用が安いことからＣＣＤが一般に好ましく、一般に検出器として利用することができる。所与分析の必要性に応じて、例えば標準型ＣＣＤ、電子増倍型ＣＣＤ（ＥＭＣＣＤ）、及び／又はインテンシファイア付きＣＣＤ（ＩＣＣＤ）等の各種ＣＣＤを利用することができる。
【００３６】
上記のように、他の光学特性が相違する信号をモニターするために本発明の変形システムを利用することができる。特に、図４は発生した蛍光の相対極性が相互に相違する光信号を誘導するシステムの模式図である。このような検出は生成物又は反応体の実質的寸法変化を生じ、従って、反応体又は生成物の偏光解消蛍光発生能を変化させる反応をモニターするのに利用することができる（例えば米国特許第６，６９９，６５５号参照）。２つの直交面で発生した光を測定することにより、偏光励起光に応答する蛍光発光の相対偏光解消を評価することができる。図面から明らかなように、システム４００はこの場合も二色性フィルター４０６と対物レンズ４０８を通って拘束反応容器又は領域４１０に誘導される活性化光源４０２を含む。光源４０２は偏光源でもよいし、偏光フィルター４０４を通して反応容器４１０に偏光励起放射線を供給してもよい。その後、発生した蛍光は対物レンズ４０８により集光され、ビームスプリッター４１２を通り、２本の同様のビームに分割される。その後、各ビームは２個の逆方向の偏光フィルター４１４及び４１６の一方を別々に通り、２つの直交面の一方の蛍光のみがレンズ４１８を通過し、検出器アレイ４２０上の領域４２２及び４２４の各々に到達する。検出器アレイ上の各信号の位置はどの蛍光面が検出されているかを示す。その後、信号の強度を比較し、反応混合物からの蛍光の相対偏光解消を決定する（同様に米国特許第６，６９９，６５５号参照）。
【実施例】
【００３７】
拘束信号源からの複数の光信号の分離における光学素子列の効果を試験するために、図３に示すシステムと実質的に同様のシステムを準備した。図面から明らかなように、システムには一連のゼロモード導波管を搭載した基板を配置した。基板は対物レンズと光学的に連携するようにこれと近接して配置し、ゼロモード導波管基板の上方に白色光源を配置し、狭帯域フィルターを通して導波管基板に誘導した。対物レンズを使用し、ウェッジプリズムを通して導波管からの光信号を合焦させた。ウェッジプリズムにより分離後、異なる光信号を結像レンズに通し、５１２×５１２画素ＥＭＣＣＤカメラチップに送った。動作中には、（白色光スペクトルの連続サブセットから構成される）広帯域光を対物レンズにより集光した後、ウェッジプリズムに通した後に、ＣＣＤカメラで分離信号の集合として合焦させた。図５Ａは８個の異なるゼロモード導波管からの光と４種の異なる波長である４０５ｎｍ（Ａ）、４８８ｎｍ（Ｂ）、５６８ｎｍ（Ｃ）及び６４７ｎｍ（Ｄ）に対応するＣＣＤの４個の異なる領域からの画像を示す。図５Ｂは未分離信号の位置からの距離（ミクロン）で表した相対位置のプロットであり、分離した信号間の相対分離距離を示す。
【００３８】
プリズムによる分離効率がフィルターによる波長分離よりも高いことを立証するために比較実験を実施した。特に、異なるピーク発光波長（夫々４８８ｎｍ及び５６８ｎｍ）をもつ２種の異なる蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲの市販品Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５６８）の混合物を調製し、適当な励起放射線を使用して探索した。混合物からの発光を対物レンズに通し、（２個のＳｅｍｒｏｃｋトリプルノッチフィルターを使用して）フィルターにより波長分離又はウェッジプリズムにより分離した後に、分離した信号をＣＣＤチップに合焦させた。下表はＥＭＣＣＤを使用して測定した異なる各光学素子列における各信号の蛍光強度を示す。表から明らかなように、プリズムによる分離はフィルターシステムに比較して分離後の信号の検出効率が実質的に高い。
【表１】
2009505076.tif 000002
【００３９】
以上、例証の目的で多少詳細に記載したが、本発明の範囲内で当業者に公知又は認識される多数の変更を実施できることは容易に理解されよう。状況からそうでないことが明らかであるか又は特に記載する場合を除き、本明細書に記載する全濃度値は一般に混合物の特定成分の添加時又は添加後に生じる変換を考慮せずに混合物の値又は百分率として表す。特に本明細書に組込むと記載していない場合でも、本開示に引用した全刊行物及び特許文献はその開示内容全体を全目的で参照により本明細書に組込む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１Ａは本発明の方法及びシステムの簡略模式図である。図１Ｂは図１Ａのシステムからの光信号の分離を模式的に示す。
【図２】複数の異なる光信号の経時的モニターにおける本発明のシステム及び方法の動作を示す模式図である。
【図３】本発明のシステムの１例を詳細に示す模式図である。
【図４】光の他の特性（例えば波長）ではなく、その相対偏光が相違する複数の光信号をモニターするための代替システム構成を模式的に示す。
【図５】図５Ａは単一の複合信号源から発生し、本発明の方法を実施して単一ＣＣＤカメラチップの異なる位置に入射する異なる光信号を示す。図５Ｂは分離した信号間の相対分離距離を示す。
【図１】
2009505076.tif 000003
【図２】
2009505076.tif 000004
【図３】
2009505076.tif 000005
【図４】
2009505076.tif 000006
【図５】
2009505076.tif 000007