(57)【要約】  新たなアポトーシス抑制薬の提供。  次式（１）（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）で表されるビフェニルカルボキサミド化合物を有効成分とするアポトーシス抑制薬。2009093471.tif 000012
2009093471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（１）
【化１】
2009093471.tif 000004
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）
で表されるビフェニルカルボキサミド化合物を有効成分とするアポトーシス抑制薬。
【請求項２】
Ｒ１が低級アルコキシ基であり、Ｒ２が低級アルカノイル基であり、ｎが４である請求項１記載のアポトーシス抑制薬。
【請求項３】
Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がアセチル基であり、ｎが４である請求項１記載のアポトーシス抑制薬。
【請求項４】
アポトーシスが、酸化ストレス誘発性アポトーシスである請求項１〜３のいずれか１項記載のアポトーシス抑制薬。
【請求項５】
次式（１）
【化２】
2009093471.tif 000005
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）
で表されるビフェニルカルボキサミド化合物を有効成分とする酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療薬。
【請求項６】
Ｒ１が低級アルコキシ基であり、Ｒ２が低級アルカノイル基であり、ｎが４である請求項５記載の予防治療薬。
【請求項７】
Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がアセチル基であり、ｎが４である請求項５記載の予防治療薬。
【請求項８】
次式（１）
【化３】
2009093471.tif 000006
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）
で表されるビフェニルカルボキサミド化合物、並びに薬学的に許容される担体を含有してなるアポトーシス抑制用医薬組成物。
【請求項９】
Ｒ１が低級アルコキシ基であり、Ｒ２が低級アルカノイル基であり、ｎが４である請求項８記載のアポトーシス抑制用医薬組成物。
【請求項１０】
Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がアセチル基であり、ｎが４である請求項８記載のアポトーシス抑制用医薬組成物。
【請求項１１】
アポトーシスが、酸化ストレス誘発性アポトーシスである請求項８〜１０のいずれか１項記載のアポトーシス抑制用医薬組成物。
【請求項１２】
次式（１）
【化４】
2009093471.tif 000007
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）
で表されるビフェニルカルボキサミド化合物、並びに薬学的に許容される担体を含有してなる酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療用医薬組成物。
【請求項１３】
Ｒ１が低級アルコキシ基であり、Ｒ２が低級アルカノイル基であり、ｎが４である請求項１２記載の予防治療用医薬組成物。
【請求項１４】
Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がアセチル基であり、ｎが４である請求項１２記載の予防治療用医薬組成物。
【請求項１５】
次式（１）
【化５】
2009093471.tif 000008
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）
で表されるビフェニルカルボキサミド化合物のアポトーシス抑制薬製造のための使用。
【請求項１６】
Ｒ１が低級アルコキシ基であり、Ｒ２が低級アルカノイル基であり、ｎが４である請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がアセチル基であり、ｎが４である請求項１５記載の使用。
【請求項１８】
アポトーシスが、酸化ストレス誘発性アポトーシスである請求項１５〜１７のいずれか１項記載の使用。
【請求項１９】
次式（１）
【化６】
2009093471.tif 000009
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）
で表されるビフェニルカルボキサミド化合物の酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療薬製造のための使用。
【請求項２０】
Ｒ１が低級アルコキシ基であり、Ｒ２が低級アルカノイル基であり、ｎが４である請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がアセチル基であり、ｎが４である請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
次式（１）
【化７】
2009093471.tif 000010
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）
で表されるビフェニルカルボキサミド化合物の有効量を投与するアポトーシス抑制方法。
【請求項２３】
Ｒ１が低級アルコキシ基であり、Ｒ２が低級アルカノイル基であり、ｎが４である請求項２２記載のアポトーシス抑制方法。
【請求項２４】
Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がアセチル基であり、ｎが４である請求項２２記載のアポトーシス抑制方法。
【請求項２５】
アポトーシスが、酸化ストレス誘発性アポトーシスである請求項２２〜２４のいずれか１項記載のアポトーシス抑制方法。
【請求項２６】
次式（１）
【化８】
2009093471.tif 000011
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）
で表されるビフェニルカルボキサミド化合物の有効量を投与する酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療方法。
【請求項２７】
Ｒ１が低級アルコキシ基であり、Ｒ２が低級アルカノイル基であり、ｎが４である請求項２６記載の予防治療方法。
【請求項２８】
Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がアセチル基であり、ｎが４である請求項２６記載の予防治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレスによって誘発されるアポトーシスを抑制する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素は、体内で脂質、蛋白質、糖、核酸等を酸化変性させ、細胞機能を障害することが知られている。体内で活性酸素が過剰に生成すると、体内の酸化ストレスが増加し、動脈硬化、心筋梗塞、糖尿病、癌などの疾患が発症すると考えられている。また、脳組織における神経細胞死は、活性化ミクログリアから産生される過剰量のＮＯによっても生じると考えられている。【０００３】
従って、体内の酸化ストレスに起因する体内の細胞死（アポトーシス）は、種々の疾患の発生、進展に深く関与しており、当該アポトーシスを抑制する成分が求められている。【０００４】
一方、４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミド（ＧＲ１０３６９１）に代表されるビフェニルカルボキサミド化合物は、ドパミンＤ３受容体アンタゴニストとして市販されている（非特許文献１及び２）。
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９６  Ｄｅｃ．３０；３１８（２−３）；２８３−２９３
【非特許文献２】Ｊ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９８  Ｏｃｔ；２８７（１）；１８７−１９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、新たなアポトーシス抑制薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、酸化ストレス細胞死のモデルである、培養細胞系における低酸素−再酸素化誘発細胞死モデル系を用いて種々の化合物のアポトーシス抑制作用を検討したところ、全く意外にもドパミンＤ３受容体のアンタゴニストとして知られているビフェニルカルボキサミド化合物に強いアポトーシス抑制作用があることを見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、次式（１）【０００８】
【化１】
2009093471.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシ基を示し、Ｒ２は水素原子又は低級アルカノイル基を示し、ｎは２〜５の数を示す）
で表されるビフェニルカルボキサミド化合物を有効成分とするアポトーシス抑制薬を提供するものである。
また、本発明は上記化合物（１）を有効成分とする酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療薬を提供するものである。
また、本発明は上記化合物（１）、並びに薬学的に許容される担体を含有してなるアポトーシス抑制用医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は上記化合物（１）、並びに薬学的に許容される担体を含有してなる酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療用医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は上記化合物（１）のアポトーシス抑制薬製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は上記化合物（１）の酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療薬製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は上記化合物（１）の有効量を投与するアポトーシス抑制方法を提供するものである。
また、本発明は上記化合物（１）の有効量を投与する酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療方法を提供するものである。
また、本発明はアポトーシス抑制のための上記化合物（１）を提供するものである。
さらに、本発明は、酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療のための上記化合物（１）を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
式（１）の化合物は、酸化ストレス誘発性のアポトーシスに対して強い抑制作用を示すことから、酸化ストレス誘発性細胞死に関する疾患、例えば、動脈硬化症、心筋梗塞、糖尿病、癌、アルツハイマー症、血液再灌流障害、皮膚血管炎等の治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】低酸素−再酸素化誘発細胞死に及ぼすＧＲ１０３６９１の影響（ＬＤＨ遊離量）を示す。
【図２】低酸素−再酸素化誘発細胞死に及ぼすナファドトリドの影響を示す。
【図３】グルタミン酸誘発細胞死に及ぼすＧＲ１０３６９１の影響を示す。
【図４】ツニカマイシン誘発細胞死に及ぼすＧＲ１０３６９１の影響を示す。
【図５】低酸素−再酸素化誘発細胞死のＰＩ染色像を示す。
【図６】低酸素−再酸素化負荷による細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）上昇に対するＧＲ１０３６９１の影響を示す。
【図７】マウス脳虚血再灌流モデルにおける海馬ＣＡ１領域のＦＪＢ染色像を示す。
【図８】ＦＪＢ陽性細胞数の全細胞数に占める割合を示す。
【図９】マウス脳虚血再灌流モデルにおける海馬ＣＡ１領域のｓｓＤＮＡ陽性細胞像の全細胞数に占める割合（ａ）とｓｓＤＮＡ染色像（ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のアポトーシス抑制薬の有効成分は、式（１）で表されるビフェニルカルボキサミド化合物である。式（１）中、Ｒ１で示される低級アルコキシ基としては、炭素数１〜６のアルコキシ基、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロピルオキシ基、ブトキシ基等が挙げられるが、メトキシ基が特に好ましい。
【００１３】
式（１）中、Ｒ２で示される低級アルカノイル基としては、炭素数２〜６のアルカノイル基、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が挙げられるが、アセチル基が特に好ましい。
【００１４】
式（１）中、ｎは２〜５の数を示すが、３〜５、特に４が好ましい。
【００１５】
式（１）中、Ｒ１がメトキシ基、Ｒ２がアセチル基、ｎが４である化合物がさらに好ましく、特に前記ＧＲ１０３６９１（４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミド）が好ましい。
【００１６】
式（１）の化合物は、それ自体公知であり、例えばＧＲ１０３６９１は、ドパミンＤ３受容体アンタゴニストとして市販されている。
【００１７】
式（１）の化合物は、後記実施例に示すように、酸化ストレス誘発性細胞死である低酸素−再酸素化誘発細胞死に対し強い抑制作用を示した。一方、式（１）の化合物と化学構造は相違するが、ＧＲ１０３６９１と同様にドパミンＤ３受容体アンタゴニストとして知られているナファドトリドは、同様の試験系でアポトーシスを抑制しなかった。また、式（１）の化合物は、低酸素−再酸素化とは誘発機構が異なるが酸化ストレス誘発性細胞死の１種であるグルタミン酸誘発細胞死も抑制した。そして、式（１）の化合物は、低酸素−再酸素化負荷による細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の上昇を有意に抑制したことから、当該ＲＯＳ上昇抑制作用によって酸化ストレス誘発性細胞死抑制効果をもたらすものと推察される。よって、本発明のアポトーシス抑制作用はドパミンＤ３受容体アンタゴニストによる作用ではなく、式（１）の化合物特有の作用であると考えられる。
従って、本発明のアポトーシス抑制薬は、酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する種々の疾患、例えば、動脈硬化症、心筋梗塞、癌、アルツハイマー症、血液再灌流障害（脳梗塞再灌流障害等）、皮膚血管炎等の治療薬として有用である。
【００１８】
本発明の医薬は、式（１）の化合物に賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化剤、懸濁化剤、溶剤、安定化剤、吸収助剤、軟膏基剤等の１以上の薬学的に許容される担体を適宜添加し、常法により経口投与用、注射投与用、直腸内投与用、外用等の剤形に製剤化することによって得られる。
【００１９】
経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤などが；直腸内投与用の製剤としては、坐薬軟カプセル等が好ましい。
本発明の医薬は上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬は、式（１）の化合物として、１日当り約１〜５００ｍｇ／ｋｇを１〜４回投与するのが好ましい。
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【００２１】
実施例１
（方法）
（１）細胞培養
ＨＴ２２細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、３７ｏＣ、１０％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。【００２２】
（２）低酸素−再酸素化負荷
低酸素負荷には、酸素吸収・炭酸ガス発生剤であるアネロパックケンキ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌＴＭを用い、正常酸素状態に戻すことで再酸素化とした。【００２３】
（３）Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）アッセイ
ＬＤＨアッセイは、目的の処置をした細胞のｍｅｄｉｕｍの上清を試料として、測定キット（ＬＤＨ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｅｓｔ）を用いて行った。
すなわち、９６ｗｅｌｌ  ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅで細胞を培養し、目的の処置後、ｍｅｄｉｕｍのみを５０μＬ採取し、新たに準備したｐｌａｔｅに移し、各ｗｅｌｌに発色試薬を添加した。２０分間インキュベートした後、反応停止液１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーを用い、５７０ｎｍで測定した。結果は、コントロール細胞の吸光度を１００％として表した。ここで、ＬＤＨは、死細胞から逸脱してくる酵素でｍｅｄｉｕｍ中のＬＤＨ量の増加は、細胞死が起こっていることを示す。【００２４】
（４）ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴアッセイは、目的の処置をした細胞を試料として定法により行った。
すなわち、９６ｗｅｌｌ  ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅで細胞を培養し、目的の処置後、ＭＴＴ溶液を１０μＬ添加して４時間インキュベートした。反応停止液１００μＬを加え、一晩放置後、マイクロプレートリーダーを用い、吸光度（測定波長５７０ｎｍ、対照波長６５５ｎｍ）を測定した。結果は、コントロール細胞の吸光度を１００％として表した。ここで、ＭＴＴ値とは、ミトコンドリアの還元能を示す値で、多くの場合、細胞の生存率と相関することから、細胞の生存率の指標として用いられる。ＨＴ２２細胞におけるグルタミン酸誘発細胞死においては、ＭＴＴアッセイの結果が細胞の生存率と相関することを確認している。【００２５】
（結果）
（１）低酸素−再酸素化誘発細胞死に及ぼすＧＲ１０３６９１の影響を図１に示す。
１８時間、低酸素（Ｈ１８）後に２４時間、再酸素化（Ｒ２４）し、ＬＤＨ遊離量を測定した。コントロールとして４２（１８＋２４）時間通常酸素状態下（Ｎ４２）においた細胞を用いた。ＧＲ１０３６９１は、再酸素化直前（コントロール細胞は１８時間培養後）に添加した。【００２６】
低酸素−再酸素化（Ｈ１８Ｒ２４）後のＬＤＨ遊離量は、コントロール（Ｎ４２）に比べ有意な上昇、すなわち、細胞死が認められる。再酸素化直前にＧＲ１０３６９１を添加すると、濃度依存的にＨ１８／Ｒ２４のＬＤＨ遊離量を低下させ、１μＭ以上の低下は有意なものであった。なお、コントロール細胞のＬＤＨ遊離量は、ＧＲ１０３６９１により影響を受けなかった。また、１８時間の低酸素負荷のみではＬＤＨの増加は認められず、再酸素化に伴ってＬＤＨが増加し、再酸素化１８時間後（Ｈ１８／Ｒ１８）から有意な上昇となった。【００２７】
（２）低酸素−再酸素化誘発細胞死に及ぼすナファドトリド（ｎａｆａｄｏｔｒｉｄｅ）の影響を図２に示す。
１８時間、低酸素（Ｈ１８）後に２４時間、再酸素化（Ｒ２４）し、ＬＤＨ遊離量を測定した。コントロールとして４２（１８＋２４）時間通常酸素状態下（Ｎ４２）においた細胞を用いた。ナファドトリドは、再酸素化直前（コントロール細胞は１８時間培養後）に添加した。【００２８】
現在、ＧＲ１０３６９１はＤ３アンタゴニストとして市販されているので、図１の作用がＤ３アンタゴニストに共通の作用であるか否かを調べるため、Ｄ３アンタゴニストとして市販されているナファドトリドの影響を見た。ＧＲ１０３６９１と同様に再酸素化直前にナファドトリドを添加したが、Ｈ１８／Ｒ２４によるＬＤＨ遊離量の増加に影響を及ぼさなかった。なお、ナファドトリドは、ＧＲ１０３６９１がほぼ最大の効果を示した３μＭを用いた。【００２９】
（３）グルタミン酸誘発細胞死に及ぼすＧＲ１０３６９１の影響を図３に示す。
グルタミン酸添加２４時間後にＭＴＴアッセイを行った。ＧＲ１０３６９１は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）添加の直前に添加した。【００３０】
ＧＲ１０３６９１の細胞死抑制効果が低酸素−再酸素化誘発細胞死に特異的なものか否かを調べるため、グルタミン酸誘発細胞死に及ぼす影響を見た。グルタミン酸によりＭＴＴ低下、すなわち、細胞死が認められるが、ＧＲ１０３６９１は、グルタミン酸によるＭＴＴ値の低下を有意に回復させた。【００３１】
（４）ツニカマイシン誘発細胞死に及ぼすＧＲ１０３６９１の影響を図４に示す。
ツニカマイシン（ＴＭ）添加２４時間後にＭＴＴアッセイを行った。ＧＲ１０３６９１は、ツニカマイシン（ＴＭ）添加の直前に添加した。【００３２】
ＴＭ誘発細胞死は、小胞体ストレスによって誘発される細胞死である。ＴＭによりＭＴＴ低下、すなわち、細胞死が認められるが、ＧＲ１０３６９１はＴＭによるＭＴＴ値の低下に影響を及ぼさなかった。【００３３】
これらの結果から、ＧＲ１０３６９１は、酸化ストレス誘発性アポトーシスに対する抑制効果を有することが確認された。【００３４】
（５）低酸素−再酸素化誘発細胞死のＰＩ染色像を図５に示す。
コントロール及びＨ１８／Ｒ２４処置後の細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｈｏｅｃｈｓｔ）とｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で二重染色したときの顕微鏡写真である。【００３５】
生細胞を青く染色するＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｈｏｅｃｈｓｔ）と死細胞を赤く染めるｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）でコントロール及びＨ１８／Ｒ２４処置後の細胞を二重染色したときの顕微鏡写真を示している。コントロール細胞はすべてＨｏｅｃｈｓｔにより染色されていてＰＩでは染色されない。Ｈ１８／Ｒ２４処置した細胞は、細胞数がコントロールより少なくなっており、かつ、その中にＰＩで染色された細胞、すなわち、死細胞が観察される。この細胞の観察により、低酸素−再酸素化誘発細胞死がアポトーシスによるものであることがわかる。【００３６】
実施例２
（方法）
（１）細胞培養
ＨＴ２２細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、３７ｏＣ、１０％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。【００３７】
（２）低酸素−再酸素化負荷
低酸素負荷には、酸素吸収・炭酸ガス発生剤であるアネロパックケンキ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌＴＭを用い、正常酸素状態に戻すことで再酸素化とした。【００３８】
（３）細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイ
細胞内ＲＯＳレベルは、Ｈ２ＤＣＦＤＡを用いて測定した。目的の処置をした後、Ｈ２ＤＣＦＤＡ  ５μＭを処置した。１５分後、蛍光顕微鏡下（４８０ｎｍ／５２６ｎｍ）で観察した。【００３９】
（結果）
１８時間、低酸素（Ｈ１８）後に再酸素化し、１２時間後まで経時的に、ＲＯＳの変化の様子を調べた。コントロールとして同じ時間通常酸素状態下（Ｎ３０）においた細胞を用いた。ＧＲ１０３６９１は、再酸素化直前（コントロール細胞は１８時間培養後）に３μＭ添加した。
低酸素−再酸素化負荷による細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）上昇に対するＧＲ１０３６９１の影響を図６に示す。図６はＲＯＳをＨ２ＤＣＦＤＡで染色したときの蛍光顕微鏡写真である。【００４０】
Ｈ２ＤＣＦＤＡ処置によりＲＯＳが蛍光に光る。コントロール細胞では調べたどの時間においても、Ｈ２ＤＣＦＤＡ陽性細胞は認められなかった（図６には最長の培養時間である３０時間を示した）が、再酸素化処置により一過性にＨ２ＤＣＦＤＡ陽性細胞が観察された。Ｈ２ＤＣＦＤＡ陽性細胞は、再酸素化３時間後（Ｈ１８Ｒ３）に最も多く認められ、その後は減少し、１２時間後にはほとんど認められなくなった。Ｈ１８／Ｒ３処置した細胞で認められたＲＯＳの一過性の上昇は、ＧＲ１０３６９１の添加により抑制された。
当該ＲＯＳ上昇抑制作用によって、ＧＲ１０３６９１は低酸素−再酸素化誘発細胞死及びグルタミン酸誘発細胞死などの酸化ストレス誘発性アポトーシスに対する抑制効果をもたらすものと推察された。【００４１】
実施例３
（方法）
雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（９−１２週齢）を使用し、ハロタン麻酔後、脳血流量をモニターしながら左右総頸動脈を１７分間結紮した。その後、血流を再開させることによって脳虚血再灌流モデルを作製した。再灌流７２時間後、定法に従って、脳パラフィン切片を作成し、死細胞を緑に染めるＦｌｕｏｒｏ  Ｊａｄｅ  Ｂ（ＦＪＢ）染色、或いは核の断片化を染色することでアポトーシス細胞を検出できるＳｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を免疫染色し、細胞を顕微鏡観察した。ＧＲ１０３６９１は再灌流後１０分以内に尾静脈から１、３、１０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ投与した。また、比較のため、脳梗塞急性期に伴う神経症候、日常生活動作障害及び機能障害の改善のために使用されているエダラボン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製）３、１０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ投与した。コントロールとして、Ｓａｌｉｎｅ投与群、及び虚血処置のみを行わないＳｈａｍ群の観察を行った。【００４２】
（結果）
ＦＪＢ染色像を図７に示す。図７において明るい緑色はアポトーシス細胞を示す。また、ＦＪＢ陽性細胞数をカウントし、全細胞数に占める割合を求めた（図８）。結果は、各群の平均±標準誤差で示した。
脳虚血再灌流モデルにおいては、虚血再灌流障害に脆弱である海馬ＣＡ１領域に細胞死が認められたが（図７の（ｂ）Ｓａｌｉｎｅ投与群）、ＧＲ１０３６９１により用量依存的に抑制された。特に１０ｍｇ／ｋｇ投与により有意に抑制された。その抑制作用はエダラボン（ＥＤＡ）とほぼ同程度であった（図８）。
ｓｓＤＮＡ陽性細胞の全細胞数に占める割合（ａ）と、ｓｓＤＮＡ免疫染色像（ｂ）を図９に示す。図９（ｂ）において薄紫色は核の断片化が起きていない正常な細胞を示し、茶色は核の断片化が起きたアポトーシス細胞を示す。海馬ＣＡ１領域におけるｓｓＤＮＡ陽性細胞は、ＧＲ１０３６９１により用量依存的に減少し、特に１０ｍｇ／ｋｇ投与により有意に減少した。その減少作用はエダラボン（ＥＤＡ）とほぼ同程度であった（図９）。
これらの結果から、ＧＲ１０３６９１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞系のみならず、ｉｎ  ｖｉｖｏ系においても酸化ストレス誘発性細胞死に対する抑制効果を発揮することが確認された。
【図１】
2009093471.tif 000013
【図２】
2009093471.tif 000014
【図３】
2009093471.tif 000015
【図４】
2009093471.tif 000016
【図５】
2009093471.tif 000017
【図６】
2009093471.tif 000018
【図７】
2009093471.tif 000019
【図８】
2009093471.tif 000020
【図９】
2009093471.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月24日(2009.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミドを有効成分とするアポトーシス抑制薬。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
アポトーシスが、酸化ストレス誘発性アポトーシスである請求項１記載のアポトーシス抑制薬。
【請求項５】
４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミドを有効成分とする酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療薬。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミド、並びに薬学的に許容される担体を含有してなるアポトーシス抑制用医薬組成物。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
アポトーシスが、酸化ストレス誘発性アポトーシスである請求項８記載のアポトーシス抑制用医薬組成物。
【請求項１２】
４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミド、並びに薬学的に許容される担体を含有してなる酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療用医薬組成物。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミドのアポトーシス抑制薬製造のための使用。
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
アポトーシスが、酸化ストレス誘発性アポトーシスである請求項１５記載の使用。
【請求項１９】
４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミドの酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療薬製造のための使用。
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
（削除）
【請求項２２】
４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミドの有効量を投与するアポトーシス抑制方法。
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
（削除）
【請求項２５】
アポトーシスが、酸化ストレス誘発性アポトーシスである請求項２２記載のアポトーシス抑制方法。
【請求項２６】
４’−アセチル−Ｎ−［４−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］ブチル］−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキサミドの有効量を投与する酸化ストレス誘発性アポトーシスに起因する疾患の予防治療方法。
【国際調査報告】
2009093471.tif 000022
2009093471.tif 000023
2009093471.tif 000024
2009093471.tif 000025
2009093471.tif 000026
2009093471.tif 000027
2009093471.tif 000028