(57)【要約】  クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物等を含有することを特徴とするセラミド吸収促進用組成物を提供する。この組成物により、セラミドの効率的な利用を図ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物を、グルコシルセラミドを含有する培地で培養し、培養物中からセラミドを採取することを特徴とするセラミドの製造方法。
【請求項２】
クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が生産するグルコシルセラミド分解酵素によりグルコシルセラミドを分解し、セラミドを生成させることを特徴とするセラミドの製造方法。
【請求項３】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、クロストリジウムクラスターXIVに属する微生物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセラミドの製造方法。
【請求項４】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、クロストリジウム・グルセラセイに属する微生物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセラミドの製造方法。
【請求項５】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、配列番号１に記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセラミドの製造方法。
【請求項６】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号２に記載の塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセラミドの製造方法。
【請求項７】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、受託番号NITE BP-479で寄託されたクロストリジウム・グルセラセイHFTH-1であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセラミドの製造方法。
【請求項８】
クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物、又は前記微生物が生産するグルコシルセラミド分解酵素を含有することを特徴とするセラミド吸収促進用組成物。
【請求項９】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、クロストリジウムクラスターXIVに属する微生物であることを特徴とする請求項８に記載のセラミド吸収促進用組成物。
【請求項１０】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、クロストリジウム・グルセラセイに属する微生物であることを特徴とする請求項８に記載のセラミド吸収促進用組成物。
【請求項１１】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、配列番号１に記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物であることを特徴とする請求項８に記載のセラミド吸収促進用組成物。
【請求項１２】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号２に記載の塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物であることを特徴とする請求項８に記載のセラミド吸収促進用組成物。
【請求項１３】
グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、受託番号NITE BP-479で寄託されたクロストリジウム・グルセラセイHFTH-1であることを特徴とする請求項８に記載のセラミド吸収促進用組成物。
【請求項１４】
請求項８乃至１３のいずれか一項に記載のセラミド吸収促進用組成物、及びグルコシルセラミドを含有することを特徴とする医薬品。
【請求項１５】
請求項８乃至１３のいずれか一項に記載のセラミド吸収促進用組成物、及びグルコシルセラミドを含有することを特徴とする化粧品。
【請求項１６】
請求項８乃至１３のいずれか一項に記載のセラミド吸収促進用組成物を含有することを特徴とする食品。
【請求項１７】
グルコシルセラミドを含有することを特徴とする請求項１６に記載の食品。
【請求項１８】
請求項８乃至１３のいずれか一項に記載のセラミド吸収促進用組成物を含有することを特徴とする飼料。
【請求項１９】
グルコシルセラミドを含有することを特徴とする請求項１８に記載の飼料。
【請求項２０】
グルコシルセラミド分解能を持つクロストリジウム・グルセラセイHFTH-1（受託番号NITE BP-479）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物又はその微生物が生産するグルコシルセラミド分解酵素を用いたセラミドの製造方法に関する。また、本発明は、体内へ吸収され難いグルコシルセラミドを分解し、より吸収され易いセラミドにするために用いられる組成物、並びにその組成物を含有する医薬品、化粧品、食品、及び飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
セラミドは、スフィンゴ脂質の一種であり、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合した一群の化合物をいう。最近、セラミドが肌障害の改善（引用文献１〜３）や大腸ガンの予防及び抑制（引用文献４〜６）に対して有効であるという報告があったことから、セラミドを含んだ健康食品や化粧品などが販売されるようになってきている。これらの製品に利用されているセラミドは、米ぬかや小麦粉などの植物性の原料から製造されているが、植物中に存在するセラミドの大部分は、グルコースと結合したグルコシルセラミドという形で存在しているため、これらの製品に配合されているセラミドもグルコシルセラミドである場合が多い。しかし、グルコシルセラミドは、セラミドに比べ腸管から吸収されにくいという欠点がある（引用文献７）。このため、現在販売されているセラミドを含んだ健康食品や化粧品は、配合されているセラミドを十分に利用できていない可能性があり、セラミドの有効利用を図るため、グルコシルセラミドを効率的にセラミド変換する手段の確立が望まれている。【０００３】
グルコシルセラミドを酵素などによってセラミドに分解し、それを利用することも考えられる。グルコシルセラミドを分解し、セラミドを生成させる酵素や微生物については、既に幾つか報告がある（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。【０００４】
特許文献１は、グラム陽性の短桿菌由来のエンドグリコセラミダーゼについて報告しており、この酵素はグルコセレプロシド（グルコシルセラミド）を分解することが記載されている。【０００５】
非特許文献１及び非特許文献２は、パエニバチルス(Paenibacillus )sp. TS12が化学合成されたグルコシルセラミド（セラミドのアシル基がC:12）を僅かに分解することを報告している。【０００６】
【特許文献１】特開平6-7161号公報
【非特許文献１】Sumida T, Sueyoshi N, Ito M. Molecular cloning and characterization of a novel glucocerebrosidase of Paenibacillus sp. TS12. J Biochem. 2002 Aug;132(2):237-43.
【非特許文献２】Sumida T, Sueyoshi N, Ito M. Utilization of ganglioside-degrading Paenibacillus sp. strain TS12 for production of glucosylceramide. Appl Environ Microbiol. 2002 Nov;68(11):5241-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように、グルコシルセラミドを分解する微生物や酵素は既に知られているものの、これらの微生物等によるセラミドの製造方法は実用化されていない。本発明の目的は、従来の技術に代わる、効率的なセラミドの製造手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、高いグルコシルセラミド分解能を有する菌株を見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。【０００９】
特許文献１には、グルコシルセラミド分解酵素（エンドグリコセラミダーゼ）が記載されている。この酵素を生産する微生物は、グラム陽性の短桿菌とあるだけで、どの属に属する細菌であるかは記載されていない。しかし、この細菌は、好気的な培養法によって培養する必要があるため（段落番号００１２）、嫌気的条件で培養する必要があるクロストリジウム属に属する細菌ではないことは明らかである。【００１０】
非特許文献１及び非特許文献２に記載されている細菌は、アシル基の炭素数が12であるグルコシルセラミドを僅かに分解する。しかし、植物中に含まれるグルコシルセラミドのアシル基の炭素数は16〜26であるが、この細菌は、このようなグルコシルセラミドを分解することができない。従って、非特許文献１及び非特許文献２に記載されている細菌は、本発明者らによって分離された細菌に比べ、有用性において著しく劣る。【００１１】
また、上記２種の細菌はいずれも好気性菌であるのに対し、本発明者らによって分離された細菌は嫌気性菌であるため、プロバイオティクスとして用いるのに適している。【００１２】
本発明は、以上のような知見に基づき完成されたものである。【００１３】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（２０）を提供するものである。【００１４】
（１）クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物を、グルコシルセラミドを含有する培地で培養し、培養物中からセラミドを採取することを特徴とするセラミドの製造方法。【００１５】
（２）クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が生産するグルコシルセラミド分解酵素によりグルコシルセラミドを分解し、セラミドを生成させることを特徴とするセラミドの製造方法。【００１６】
（３）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、クロストリジウムクラスターXIVに属する微生物であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のセラミドの製造方法。【００１７】
（４）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、クロストリジウム・グルセラセイに属する微生物であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のセラミドの製造方法。【００１８】
（５）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、配列番号１に記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のセラミドの製造方法。【００１９】
（６）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号２に記載の塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のセラミドの製造方法。【００２０】
（７）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、受託番号NITE BP-479で寄託されたクロストリジウム・グルセラセイHFTH-1であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のセラミドの製造方法。【００２１】
（８）クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物、又は前記微生物が生産するグルコシルセラミド分解酵素を含有することを特徴とするセラミド吸収促進用組成物。【００２２】
（９）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、クロストリジウムクラスターXIVに属する微生物であることを特徴とする（８）に記載のセラミド吸収促進用組成物。【００２３】
（１０）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、クロストリジウム・グルセラセイに属する微生物であることを特徴とする（８）に記載のセラミド吸収促進用組成物。【００２４】
（１１）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、配列番号１に記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物であることを特徴とする（８）に記載のセラミド吸収促進用組成物。【００２５】
（１２）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号２に記載の塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物であることを特徴とする（８）に記載のセラミド吸収促進用組成物。【００２６】
（１３）グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が、受託番号NITE BP-479で寄託されたクロストリジウム・グルセラセイHFTH-1であることを特徴とする（８）に記載のセラミド吸収促進用組成物。【００２７】
（１４）（８）乃至（１３）のいずれか一項に記載のセラミド吸収促進用組成物、及びグルコシルセラミドを含有することを特徴とする医薬品。【００２８】
（１５）（８）乃至（１３）のいずれか一項に記載のセラミド吸収促進用組成物、及びグルコシルセラミドを含有することを特徴とする化粧品。【００２９】
（１６）（８）乃至（１３）のいずれか一項に記載のセラミド吸収促進用組成物を含有することを特徴とする食品。【００３０】
（１７）グルコシルセラミドを含有することを特徴とする（１６）に記載の食品。【００３１】
（１８）（８）乃至（１３）のいずれか一項に記載のセラミド吸収促進用組成物を含有することを特徴とする飼料。【００３２】
（１９）グルコシルセラミドを含有することを特徴とする（１８）に記載の飼料。【００３３】
（２０）グルコシルセラミド分解能を持つクロストリジウム・グルセラセイHFTH-1（受託番号NITE BP-479）。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の製造方法により効率的なセラミドの製造が可能になる。また、本発明の組成物により、セラミドの体内への吸収を促進することが可能になる。これにより、セラミドの効率的な利用やセラミドの持つ様々な効果の増大を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】グルコシルセラミド溶出に用いた溶媒Ｂの濃度と時間の関係を示す図。
【図２】単離菌（No. 172 及び No. 472）の培養液中のグルコシルセラミド量とセラミド量の経時的変化を示す図。●：No. 172培養液中のグルコシルセラミド量、○：No. 172培養液中のセラミド量、▲：No. 472培養液中のグルコシルセラミド量、△：No. 472培養液中のセラミド量。
【図３】単離菌とクロストリジウムXIVクラスターに属する細菌の関係を示す系統樹を示す図。系統樹は、約１０００のヌクレオチドの比較に基づく近隣結合法によって作成された。分岐点の数値は、５０％以上のブートストラップ値を示す。
【図４】イヌ糞中微生物培養系におけるグルコシルセラミド量の経時的変化を示す図。●：コントロール、▲：HFTH-1添加。
【図５】HFTH-1から得られた粗酵素の活性とｐＨの関係を示す図。
【図６】HFTH-1から得られた粗酵素の活性と温度との関係を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明を詳細に説明する。【００３７】
本発明のセラミドの製造方法は、クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物を、グルコシルセラミドを含有する培地で培養し、培養物中からセラミドを採取する、又は該微生物が生産するグルコシルセラミド分解酵素によりグルコシルセラミドを分解し、セラミドを生成させることを特徴とするものである。【００３８】
使用する微生物は、クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物であれば特に限定されないが、受託番号NITE BP-479で寄託されたクロストリジウム・グルセラセイ(Clostridium glucerasei) HFTH-1を使用するのが最も好ましい。この菌株は、本発明者によって分離された菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受領番号NITE BP-479として寄託されている（受託日：2008年1月23日）。また、このHFTH-1の代わりに、以下の微生物を使用してもよい。【００３９】
（Ａ）クロストリジウムクラスターXIV（Clostridium cluster XIV）に属する微生物：HFTH-1、及びHFTH-1と同様にグルコシルセラミド分解菌として分離されたクロストリジウム・ネクサイル（Clostridium nexile） GLCR-1は、クロストリジウムクラスターXIVに属する。従って、クロストリジウムクラスターXIVに属する微生物には、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が多数存在する可能性が高く、当業者であればそのような性質を持つ微生物を容易に分離できると考えられる。【００４０】
（Ｂ）クロストリジウム・グルセラセイに属する微生物：HFTH-1は、新種クロストリジウム・グルセラセイに属する。従って、クロストリジウム・グルセラセイに属する微生物には、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が多数存在する可能性が高く、当業者であればそのような性質を持つ微生物を容易に分離できると考えられる。【００４１】
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と95％以上相同な塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物：HFTH-1の16S rDNA（塩基配列は配列番号１に示すとおりである。）と高い相同性を示す16S rDNAを有する菌株は、HFTH-1と近縁の菌株であると考えられる。従って、配列番号１に記載の塩基配列と相同性の高い（具体的には95％以上）塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物には、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が多数存在する可能性が高く、当業者であればそのような性質を持つ微生物を容易に分離できると考えられる。【００４２】
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号２に記載の塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物：HFTH-1の16S rDNA又はGLCR-1の16S rDNA（塩基配列は配列番号２に示すとおりである。）と同一の16S rDNAを有する菌株は、HFTH-1又はGLCR-1と非常に近縁の菌株であると考えられる。従って、配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号２に記載の塩基配列からなる16S rDNAを有する微生物には、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物が多数存在する可能性が高く、当業者であればそのような性質を持つ微生物を容易に分離できると考えられる。【００４３】
微生物としては、凍結乾燥菌体などを使用することができる。【００４４】
使用する培地は、グルコシルセラミドを含みクロストリジウム属の微生物を増殖させ得るものであれば特に限定されず、例えば、実施例で使用しているPYG培地にグルコシルセラミドを加えた培地を使用することができる。【００４５】
培地中グルコシルセラミドの濃度は特に限定されないが、0.001〜1mg/mlとするのが好ましく、0.05〜0.2mg/mlとするのが更に好ましい。【００４６】
培養条件は、クロストリジウム属の微生物の培養に用いられる一般的な条件でよい。培養時の温度は、20〜50℃とするのが好ましく、より好ましくは35〜39℃であり、嫌気的条件で培養を行う。【００４７】
培養物中からのセラミドの採取は、微生物の生産物を分離する際に常用される方法で行うことができる。【００４８】
また、上記微生物が生産するグルコシルセラミド分解酵素によりグルコシルセラミドを分解してセラミドを製造する場合、使用するグルコシルセラミド分解酵素は、必ずしも精製されている必要はなく、粗酵素であってもよい。粗酵素としては、培養上清や菌体の破砕液などを利用することができる。酵素によるグルコシルセラミドの分解はどのような方法で行ってもよい。例えば、単純に酵素とグルコシルセラミドを混合してもよいし、酵素を固定化したカラムにグルコシルセラミドを含む溶液を流してもよい。【００４９】
本発明のセラミド吸収促進用組成物は、クロストリジウム属に属し、グルコシルセラミド分解能を持つ微生物、又はこの微生物が生産するグルコシルセラミド分解酵素を含有することを特徴とするものである。本発明における「セラミド吸収促進用組成物」とは、体内へ吸収され難いグルコシルセラミドを分解し、より吸収され易いセラミドにするために使用される組成物であり、グルコシルセラミドを含む医薬品、化粧品、食品、飼料などに添加して用いる。【００５０】
使用する微生物は、上述したセラミドの製造方法と同様のものでよい。【００５１】
本発明の医薬品は、上述した本発明のセラミド吸収促進用組成物、及びグルコシルセラミドを含有することを特徴とするものである。本発明の医薬品は、グルコシルセラミド又はセラミドが有効である疾病等に用いることができる。このような疾病等としては、例えば、ガン（特に大腸ガン）、肌障害（肌荒れ、乾燥肌、乾癬、アトピー性皮膚炎）、炎症性腸疾患、アレルギー、病原菌感染症などを挙げることができる。【００５２】
本発明の医薬品は、本発明のセラミド吸収促進用組成物とグルコシルセラミドのほか、賦形剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、稀釈剤、担体、溶解助剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤、コーティング剤などの添加成分や水などを含むものであってもよい。添加成分の具体例としては、でん粉、乳糖等の糖類、硫酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体、大豆油、ゴマ油等の植物油、動物油若しくは合成油、ガム類、エタノール、１，３−ブチレングリコール、ポリアルキレングリコール等のアルコール類などを挙げることができる。【００５３】
本発明の医薬品は、経口投与、経皮投与などにより投与することができ、投与方法に適した医薬品の形態とすることができる。具体的には、例えば、液剤、シロップ剤、注射剤、液状吸入剤、乳剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、軟膏剤、クリーム剤、固形吸入剤、座剤などの形態とすることができる。【００５４】
本発明の医薬品中のグルコシルセラミドの含有量は、既知のグルコシルセラミド含有医薬品と同様の量以下でよい。【００５５】
本発明の医薬品中のグルコシルセラミド分解能を持つ微生物等の含有量は特に限定されないが、一般的には、医薬品中に含まれるグルコシルセラミド1gに対し、凍結乾燥菌体量で0.01〜20gが好ましく、より好ましくは0.05g〜5g、更に好ましくは0.1〜2gである。微生物の代わりに酵素を用いる場合は、前記した量の微生物が分泌する酵素量が医薬品中に含まれるようにすればよい。【００５６】
本発明の医薬品の投与量は、既知のグルコシルセラミド含有医薬品と同様の量以下でよい。【００５７】
本発明の化粧品は、上述した本発明のセラミド吸収促進用組成物、及びグルコシルセラミドを含有することを特徴とするものである。グルコシルセラミドを含む化粧品は公知であり、本発明の化粧品は、そのような公知の化粧品に本発明のセラミド吸収促進用組成物を添加することにより製造できる。化粧品の種類としては、肌荒れ用化粧品、乾燥肌用化粧品、ヘアケア用化粧品（頭髪の保湿）などを例示できる。また、ペット動物の場合は毛づやの改善も期待できる。【００５８】
本発明の化粧品中のグルコシルセラミド分解能を持つ微生物等の含有量は特に限定されないが、一般的には、化粧品中に含まれるグルコシルセラミド1gに対し、凍結乾燥菌体量で0.01〜20gが好ましく、より好ましくは0.05g〜5g、更に好ましくは0.1〜2gである。微生物の代わりに酵素を用いる場合は、前記した量の微生物が分泌する酵素量が化粧品中に含まれるようにすればよい。【００５９】
本発明の食品は健康食品や健康補助食品（サプリメント）を包含し、上述した本発明のセラミド吸収促進用組成物を含有することを特徴とするものである。食品中の微生物量はセラミド吸収促進効果が発揮され得る範囲内であれば特に限定されないが、１日当たりのヒトの菌体摂取量（凍結乾燥菌体量）が10mg〜1g程度、好ましくは、20mg〜700mg程度となるように食品中に配合するのが望ましい。【００６０】
本発明の食品は、本発明のセラミド吸収促進用組成物のほか、グルコシルセラミドを含有してもよい。このような食品は、グルコシルセラミドを含む食品に本発明のセラミド吸収促進用組成物を添加することにより製造できる。食品の種類としては、豆腐、納豆、野菜、パン、ご飯、ジュース、茶、ヨーグルト、飴や煎餅等のお菓子などの一般的な食品のほか、錠剤、カプセル剤、液剤などの形態をとるサプリメントなどを例示できる。食品中に含まれるグルコシルセラミドと微生物との重量比は特に限定されないが、グルコシルセラミド1gに対し、微生物量（凍結乾燥菌体量）は、0.01〜20g程度、好ましくは0.05g〜5g程度、より好ましくは0.1〜2g程度含まれることが望ましい。微生物の代わりに酵素を用いる場合は、前記した量の微生物が分泌する酵素量が食品中に含まれるようにすればよい。【００６１】
本発明の飼料は、動物用の健康食品や健康補助食品（サプリメント）を包含し、上述した本発明のセラミド吸収促進用組成物を含有することを特徴とするものである。飼料中の微生物量はセラミド吸収促進効果が発揮され得る範囲内であれば特に限定されないが、１日当たりの動物（ヒトと同程度の体重に換算）の菌体摂取量（凍結乾燥菌体量）が10mg〜1g程度、好ましくは、20mg〜700mg程度となるように飼料中に配合するのが望ましい。【００６２】
本発明の飼料は、本発明のセラミド吸収促進用組成物のほか、グルコシルセラミドを含有してもよい。飼料の原料となる糠、麸、豆類などには、グルコシルセラミドが含まれているので、これらの原料を含む飼料に本発明のセラミド吸収促進用組成物を添加することにより、グルコシルセラミドを含む本発明の飼料を製造することができる。また、前記した原料を使用しない場合であっても、飼料にグルコシルセラミドと本発明のセラミド吸収促進用組成物を添加することにより、本発明の飼料を製造することができる。給餌対象とする動物としては、牛、馬、豚、家禽、犬、猫などを例示できる。飼料中に含まれるグルコシルセラミドと微生物との重量比は特に限定されないが、グルコシルセラミド1gに対し、微生物量（凍結乾燥菌体量）は、0.01〜20g程度、好ましくは0.05g〜5g程度、より好ましくは0.1〜2g程度含まれることが望ましい。微生物の代わりに酵素を用いる場合は、前記した量の微生物が分泌する酵素量が飼料中に含まれるようにすればよい。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。【００６４】
〔実施例１〕新規グルコシルセラミド分解菌の分離
（１）実験方法
（１−１）糞の採取
一般家庭で飼育されているイヌから排泄直後の新鮮な糞を採取した。いずれの個体も、健康状態は良好であった。イヌには、いずれも市販のペットフードが与えられていた。採取した糞サンプルは、できるだけ嫌気条件を保ちつつ氷冷下で実験室に運び込んだ。実験に用いるまで、糞サンプルは-80 ℃で冷凍保存した。【００６５】
（１−２）供試菌の培養
増殖培地はヤギのルーメン液の遠沈上清液 （引用文献８）と基礎培地を1:3の割合で混合して調製した。基礎培地は次のような組成であった（g/L）。すなわち、K2HPO4  0.45、KH2PO4  0.45、(NH4)2SO4  0.9、NaCl  0.9、CaCl2・2H2O  0.12、MgSO4・7H2O  0.19、トリプチケース・ペプトン（BBL;Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA） 1.0、酵母抽出エキス（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA） 1.0、グルコース 1.0、セロビオース 1.0、マルトース1.0、およびシステイン・HCl  1.0（pH 7.0）。30 mL容ワクチンバイアルに培養液15 mLを移し、バッチ培養法で各菌を37 ℃で嫌気的に培養した。特に断らない限り、培養は2連で行った。培地のpHは7. 0に調製した。培養中、2〜3時間毎に嫌気的かつ無菌的に調製した8％ Na2CO3を加えることよってpHをほぼ一定に維持した。【００６６】
（１−３）グルコシルセラミド（GluCer）分解菌を含む糞便の選抜
GluCer分解菌を含む糞便の選抜はGluCerを添加した培地で糞便を培養し、培養後の培養液（培養混液）中のGluCer減少量を測定することにより行った。詳細は以下の通りである。GluCer添加培地Aは上述の増殖培地15 mLにGluCer （Avanti Polar Lipids, inc., Alabaster, AL, USA）1 mgとなるように添加して調製した。CO2通気下で新鮮な糞便約0.5 gをGluCer添加培地Aに加え、上述の条件で24時間培養した。培養後、氷冷により培養を停止した。培養混液を50 mL容ガラス遠沈管に移した後、培養液にクロロホルムとメタノールの混液（C + M混液、1:1、v/v）を加えた。室温で20分間激しく撹拌した後、遠沈（1,000 × g、10 min）により二層に分画した。下層のクロロホルム層を50 mLナシ型フラスコに回収し、ロータリーエバポレーターで溶媒を溜去した。以上の操作を2回繰り返した後に、C + M混液（8:2）1.5 mLに溶解した。この溶液を0.45 μmシリンジフィルター（Millex LH, Cat No. SLLHH04NL; Millipore, Billerica, MA, USA）でろ過した。GluCerの定量は、蒸発光散乱検出器（Evaporative Light Scattering Detector; ELSD）を装備した高速液体クロマトグラフィー（HPLC; ELSD-LTシステム, Shimadzu, Kyoto, Japan）を用いて行った。すなわち、上述の通りに調製したサンプル10 μLを注入し、溶出溶媒としてクロロホルム（溶媒A）およびメタノール + 2%アンモニア水（溶媒B）を用い、直線的勾配により溶出した(図１)。また、カラムと検出器の温度は40℃に設定した。【００６７】
（１−４）GluCer分解菌の単離
GluCer減少量が多かった糞便からロールチューブ法を用いて常法に従って菌を分離した（引用文献９）。各コロニーから単離した菌のGluCer分解能の有無はGluCer添加培地で培養した後にセラミドおよび（または）スフィンゴイドの生成が認められた菌をGluCer分解菌とした。詳細は以下の通りである。GluCer（とうもろこし胚芽由来、辻製油株式会社[三重]より譲渡されたものを純度約80％まで精製して使用）を上述の増殖培地4 mLに0.3 mg（0.4 μmol）となるように添加したGluCer添加培地Bを用いた。GluCer添加培地Bに単離菌を接種し、24時間培養した。培養後、上述と同様の方法で総脂質を抽出し、C + M混液（2:1）0.1 mLに溶解した。この脂質溶液10 μLを薄層クロマトグラフィー（TLC）用プレート（Silica gel 60, 10×20, Cat No. 1.05626.0001; Merck, Darmstadt, Germany）に着点し、展開溶媒としてクロロホルム + アセトン（70:30、v/v）を用いて展開した。セラミドおよびスフィンゴイドのRf値の位置をかき取り、10 mL容ねじ口試験管に入れた。水性塩酸メタノール1 mLを加え、サーモアルミバス（Thermo Alumi Bath, ALB-220; Iwaki, Tokyo, Japan）を用いて100℃で2時間加熱した（酸加水分解によるスフィンゴイドの生成）。この反応液に2 N NaOH溶液1 mL、脱イオン水3 mL、および酢酸エチル5 mLを加え、10分間撹拌した後、遠沈により二相分画した（1,000 × g、10 min）。上層（酢酸エチル層）を新たなねじ口試験管に移し、0.5％メチルオレンジ水溶液0.1 mLと10 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 3.7）2 mLを加え、上述の条件で撹拌・遠沈した。上層（酢酸エチル層）の波長415 nmにおける吸光度を測定することにより、スフィンゴイドを定量した。【００６８】
（１−５）GluCer分解菌の分解能の比較
単離菌はPYG培地を用いてバッチ培養法で37 ℃で嫌気的に培養した。PYG培地としては次のような組成（g /L）であった。すなわち、PYG培地はグルコース 5.0（g/L、以下同様）、ポリペプトン（Wako, Osaka, Japan） 5.0、トリプチケースペプトン（BBL; Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA） 5.0、酵母抽出エキス（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA） 10.0、CaCl2・2H2O 0.01、MgSO4・7H2O 0.02、KH2PO4 0.04、NaCl 0.08、K2HPO4 0.04、およびNaHCO3 0.4、システイン・HCl 1.0（pH 7.0）。PYG培地15 mLにGluCer （Avanti Polar Lipids, inc., Alabaster, AL, USA）1 mgとなるように添加してGluCer添加PYG培地を調製した。GluCer添加PYG培地で単離菌を培養し、経時的にサンプリングした。GluCerおよびセラミドの定量はHPLCを用いて、上述（GluCer分解菌を含む糞便の選抜の項）の条件で行った。【００６９】
（２）結果および考察
（２−１）GluCer分解菌の分離
イヌの糞便からGluCer分解菌の分離を行った。大部分の糞便からはGluCer分解菌は分離できなかったが、１個体のイヌから得た糞便中からGluCer分解菌を2株分離できた。以後は、単離菌2菌株をNo. 172およびNo. 472と記述する。【００７０】
（２−２）単離菌のGluCer分解能
単離菌No. 172とNo. 472のGluCer分解について比較したところ、GluCer減少量およびセラミド生成量はNo. 472の方が多かった（図２）。また、いずれの菌もセラミドの分解産物であるスフィンゴイドを生成しなかったことから、単離菌2菌はセラミダーゼを持たないことがわかった。スフィンゴイドよりもセラミドの方がアポトーシスを誘導する能力が高いことから（引用文献１０）、大腸癌の予防・抑制を目的とした場合には大腸内でセラミドの形で存在する方が望ましいので、本菌はプロバイオティクスとしての有用性が高いと考えられる。また、単離菌No. 172とNo. 472はセラミダーゼを持たないことから、本菌はGluCerからセラミドを生成するのに非常に好都合である。【００７１】
以上のことから、単離菌No. 172とNo. 472はヒトおよびペット動物のプロバイオティクスの生産、ヒト用の化粧品やハンドクリーム等の製造（ペット動物の場合は毛のつや）、ヒトやペット動物のアトピー性皮膚炎の治療薬、および研究用試薬の製造に応用出来る利用価値の高い菌である。【００７２】
〔実施例２〕GluCer分解菌の同定と特性
（１）実験方法
（１−１）単離菌の染色体DNAの抽出
分離した菌の同定のために16S rDNAのシークエンスを行う目的で、先ず染色体DNAを抽出した。すなわち、対数増殖後期に培養を停止した後、菌を遠沈（20,000 × g, 10 分間, 4 ℃）により回収し、GTE緩衝液［50 mM グルコース, 25 mM Tris緩衝液（pH 8.0）, 10 mM EDTA］で洗浄した。沈殿した菌を同緩衝液に懸濁し、リゾチーム（1 mg/mL）を加えて激しく撹拌した後、室温で5分間放置することにより、細胞壁を破壊した。続いて、0.5 % (w/v) SDSおよびproteinase K（0.16 mg/mL）を加えて緩やかに混合し、55 ℃で30分間保温した。等量の中性フェノールを加えて緩やかに混合した後、遠沈（10,000×g, 10分間, 4 ℃）した。水層を回収し、RNase A（0.075 mg/mL）を加えて37 ℃で30分間保温することにより、RNAを分解した。その後、フェノール・クロロホルム抽出を2回繰り返し、エタノール沈殿を行った。糸状に析出した染色体DNAを、滅菌したガラス棒に巻き取って回収した。回収したDNAは70 % (v/v)エタノールで洗浄した後、TE緩衝液［10 mM Tris緩衝液（pH 8.0）, 1 mM EDTA］に溶解した。【００７３】
（１−２）単離菌の16S rDNAの調製
単離菌の16S rDNAの全長を増幅するために、9Fおよび1541Rのプライマーを用いた（表１）。このプライマーは、様々な菌種の16S rDNAにおいて保存されている領域にアニーリングするように設計されたものである（引用文献１１）。【００７４】
PCRは、サーマルサイクラー（Thermal Cycler PCR machine TC-412; Techne, Stone, UK）およびTaKaRa Ex Taq polymerase（Takara Bio Inc., Shiga, Japan）を用いて、以下のように行った。すなわち、94 ℃で5分間変性させ、続いて94 ℃で60秒間の変性、55 ℃で90秒間の2本鎖形成、および72 ℃で2分間の伸長反応を30サイクル行った。最後のサイクルの後、72 ℃で10分間伸長反応を行った。PCR産物をアガロースゲル上で電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色し、UVトランスイルミネーションにより検出した。【００７５】
【表１】
2009107223.tif 000002
（１−３）塩基配列の解析
PCR産物は、Amicon Microcon-PCR Centrifugal Filter Devices（Millipore, Billerica, MA, USA）を用いて精製し、シークエンス反応の鋳型として用いた。シークエンス解析には4組のプライマー対を用いた(表１)。すなわち、9Fとこれらのプライマー配列も、上述したように様々な菌種の16S rDNAの保存領域にアニーリングするように設計したものである。DNAの塩基配列は、BigDye-Terminator Sequencing Kit（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）とABI 310 シークエンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて両鎖を解析して決定した。シークエンス反応およびシークエンサーの取り扱い等は付属の説明書に従って行った。シークエンスデータはGENETYX-MAC version 8.0（Genetyx, Tokyo, Japan）を用いて解析した。DNAの塩基配列は、NCBIのBLAST （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）のBLASTNおよびDDBJのFASTA（http://fasta.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてデータベースに登録されている他菌の16 S rDNA配列との相同性を調べた。【００７６】
（１−４）菌の属および種に特異的なプライマーを用いた単離菌の解析
上述の通りに調製した16S rDNAの全長をシークエンス反応の鋳型として用いた。PCRはClostridium属のサブグループ（Clostridium cluster I、Clostridium cluster XI、Clostridium cluster XIV）に特異的なプライマー（引用文献１２）およびC. nexileに特異的なプライマー（引用文献１３）を用いて、以下の条件で行った（表２）。すなわち、94 ℃で5分間変性させ、続いて94 ℃で20秒間の変性、63 ℃（Clostridium cluster I）、58 ℃（Clostridium cluster XI）、52 ℃（Clostridium cluster XIV）、および60 ℃（C. nexile）で30秒間の2本鎖形成、および72 ℃で2分間の伸長反応を45サイクル行った。PCR産物をアガロースゲル上で電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色し、UVトランスイルミネーションにより検出した。【００７７】
【表２】
2009107223.tif 000003
（１−５）単離菌の形状とグラム染色性
単離菌を上述の増殖培地に接種し、37℃で嫌気的に一夜振盪培養した。培養後、グラム染色を行い、菌の形状とグラム染色性を調べた。【００７８】
（１−６）単離菌の好気性発育
好気的に調製した増殖培地（液体培地と2％寒天培地）、EG寒天培地、およびBL寒天培地に単離菌を接種し、37℃で24時間培養後に発育の有無を観察した。発育が認められない場合は、さらに24時間培養を続け、発育しない場合は偏性嫌気性菌とし、発育した場合は通性嫌気性菌とした。【００７９】
（１−７）芽胞形成
PYG培地で嫌気的に37 ℃で72時間培養した後、グラム染色して芽胞形成の有無を調べた。【００８０】
（１−８）単離菌のグルコースからの発酵産物
上述の増殖培地から糖基質（グルコース、マルトース、セロビオース）を除いた培地にグルコース（5 g/L）を添加した培地に単離菌を接種し、一夜振盪培養した。尚、培養は2連で行った。培養後、スルホサリチル酸で培養液から除タンパクした。菌により生成された有機酸量は、HPLCにより分析した（引用文献１４）
（１−９）単離菌の糖基質の資化性
増殖培地から糖基質（グルコース、マルトース、セロビオース）を除いた培地に17種類の糖基質（グルコース、マンノース、マンニトール、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、イヌリン、ラフィノース、ソルビトール、アラビノース、キシロース、キシラン、セロビオース、デンプン、セルロースパウダーD、ペクチン、およびフルクトオリゴサッカロイド）をそれぞれ3 g/Lとなるように加えた培地を調製した。これらの培地に単離菌を接種し、一夜培養した。培養後、それぞれの培養液の波長600 nmにおける吸光度（OD600）を測定し、基質の資化性を調べた。【００８１】
（１−１０）レシチナーゼおよびリパーゼ活性の測定
レシチン（ホスファチジルコリン; PC）またはトリオレイン（TG）を50 mg添加した増殖培地（15 mL）に単離菌を接種し、嫌気的に37 ℃で24時間培養した。氷冷により培養を停止した後、上述の方法で総脂質を抽出した。この総脂質をTLCに着点し、展開溶媒としてクロロホルム + メタノール + 水 + 酢酸（65:25:4:1、v/v; PC分析用）またはクロロホルム + メタノール（95:5、v/v; TG分析用）を用いて展開した。50%硫酸を噴霧し、乾熱器を用いて120℃で15分間加熱することによりスポットを検出した。TLCプレートをPersonal Density Scanning Imager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) を用いて撮影し、ImageQuaNT (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)を用いてデンシトメトリー法によりPCおよびTGを定量した。【００８２】
（１−１１）糞中微生物混合系への単離菌の添加とその培養
糞中混合微生物は、上述と同様にCO2通気下でマウスの新鮮な糞便約0.5 gをGluCer添加培地Aに加え、培養した。また、単離菌No. 472を添加した場合は、糞中混合微生物の総菌数（2×1010 cfu/mL）の1 ％（2×108 cfu/mL）となるように培養液中に添加した。菌の計数は培養液を適度に希釈し、ロールチューブ法により形成されたコロニー数を数えた（引用文献９）。【００８３】
（１−１２）急性毒性試験
単離菌No. 472の生菌懸濁液5×108 cfuをマウス（1区10頭）に経口投与した。対照区には、0.8% NaCl溶液を菌懸濁液の場合と同様に投与した。投与後3時間の行動および3時間目での糞の状態を観察した。更に、投与後7日間は毎日体重、餌の摂取量、および糞量の測定を行い、また糞の状態を観察した。8日目に頚椎脱臼により屠殺し、消化管内およびその他の臓器の状態を観察した。【００８４】
（２）結果および考察
（２−１）単離菌の16S rDNAのシークエンスおよび菌属・菌種特異的プライマーを用いた単離菌の解析
No. 172の16S rDNA配列の解析と相同性検索を行ったところ、Clostridium nexile DSM 1787 (ATCC 27757)との相同性が一番高く、98%の相同性が見られた。一方、No. 472の16S rDNA配列の解析と相同性検索を行ったところ、相同性92〜95％の菌が多数見られ、その多くはClostridium属であった。そのため、Clostridium属のサブグループ特異的プライマーを用いてPCRを行ったところ、No. 172およびNo. 472はClostridium cluster XIVに特異的なプライマーでPCR産物が検出された（結果は省略）。そこで、主なClostridium cluster XIVに属する菌の16S rDNAのデータベースを基に系統樹を作成して比較した（図３）。その結果、No. 172、No. 472、C. nexile DSM 1787、Ruminococcus lactaris ATCC29176、C. oroticum ATCC13619、Eubacterium contortum ATCC25540、およびC. glycyrrhizinilyticum JCM13368が遺伝的に近かった。また、C. nexileに特異的なプライマーを用いてPCRを行ったところ、No. 172においてPCR産物が検出された（結果は省略）。これらのことから、No. 172およびNo. 472はそれぞれC. nexileおよびClostridium属の新種の菌である可能性が高いと考えられた。【００８５】
（２−２）単離菌の生化学的性状
単離菌No. 172およびNo. 472はC. nexile DSM 1787、Ruminococcus lactaris ATCC29176、C. oroticum ATCC13619、Eubacterium contortum ATCC25540、およびC. glycyrrhizinilyticum JCM13368と遺伝的に近いことから（上述）、単離菌の特性に関してはC. nexile DSM 1787、Ruminococcus lactaris ATCC29176、およびC. oroticum ATCC13619と比較した。【００８６】
単離菌をグラム染色したところ、No. 172とNo. 472はともに有芽胞のグラム陽性桿菌で、C. nexile DSM 1787、およびC. oroticum ATCC13619と似ていた（表３）。また、単離菌を好気的に培養したところ、いずれも増殖が認められなかったことから（表３）、No. 172とNo. 472はともに偏性嫌気性菌であると断定した。【００８７】
基質の資化性を調べたところ、No. 172はC. nexileとほとんど同じであったが、セロビオースのみ異なった（表３）。一方、No. 472はC. oroticumと全体的に近かったが、マンノース、マンニトール、イヌリン、ソルビトール、キシラン、およびデンプンの資化性が異なった（表３）。また、No. 172とNo. 472の基質の資化性はR. lactarisとは大きく異なった。【００８８】
グルコースを基質とした際の発酵産物を調べたところ、No. 172の主な発酵産物はギ酸と酢酸で、No. 472は酢酸、ギ酸、乳酸であった（表３）。これらの結果をC. nexile 、C. oroticum、およびR. lactarisと比較すると、No. 172およびNo. 472はそれぞれC. nexileおよびR. lactarisと似ていた。【００８９】
リパーゼおよびレシチナーゼ活性を測定したところ、いずれの菌もこれらの酵素活性を持たなかった（表３）。この結果はC. nexile およびC. oroticumと同様であった。【００９０】
以上の単離菌の16S rDNAのシークエンスと菌属・菌種特異的プライマーを用いた単離菌の解析および単離菌の生化学的性状の結果から、No. 172はC. nexileに分類できると考えられた（C. nexile GLCR-1と命名）。また、No. 472はClostridium属の新種の菌（Clostridium glucerasei HFTH-1と命名）であると判断した。【００９１】
【表３】
2009107223.tif 000004
（２−３）マウスの糞中微生物培養系への単離菌、C. glucerasei HFTH-1の添加がGluCer分解に及ぼす影響
マウスの糞中微生物培養系（2×1010 cfu/mL）にC. glucerasei HFTH-1を1 ％（2×108 cfu/mL）添加したところ、時間の経過とともにGluCerの分解量が増加した（図４）。C. glucerasei HFTH-1を添加しなかった場合にはこのようなGluCerの分解量の増加はみられなかったことから、GluCerの分解量の増加は、C. glucerasei HFTH-1の添加によるものであると考えられる。【００９２】
Nilssonは、ラットが摂取したGluCerのうち約25％は分解されずにそのまま糞中に排泄されること、及びラットの消化管内にはGluCer分解菌がほとんど存在しないことを報告している（引用文献７）。このNilssonの報告及び上記糞中微生物培養系における実験結果を考慮すると、C. glucerasei HFTH-1を動物に経口投与することにより、糞中微生物培養系と同様に、動物の腸管内においても、GluCerの分解量及びセラミドの生成量は増加すると推測される。セラミドは、GluCerよりも腸管から吸収されやすいことから、C. glucerasei HFTH-1を動物に投与することにより、スフィンゴ脂質の吸収量を増大させることができると考えられる。【００９３】
（２−４）マウスの健康に対するC. glucerasei HFTH-1の投与の効果
C. glucerasei HFTH-1を5×108 cfu投与した区において、餌の摂取量（約2.8 g/day/animal）、糞量（約0.6 g/day/animal）、および見かけの消化率（約78%）は、対照区と違いがなかった。また、投与後に異常な様子は見られず、体重の増加も対照区とほぼ同様であった。投与後7日間は、菌投与区のマウスに糞の状態に下痢や血便などの異常は見られなかった。また、いずれの区も投与1週間後の消化管内に炎症はなく、他の臓器にも投与による影響は認められなかった。これらのことから、本菌の経口投与は、マウスに対して少なくとも5×108 cfuまでならば急性毒性はないものと考えられた。【００９４】
〔実施例３〕  酵素の至適pHおよび温度
（１）実験方法
（１−１）粗酵素の調製
Clostridium glucerasei HFTH-1は、バッチ培養法で37 ℃で嫌気的に培養した。PYG培地は次のような組成（g /L）であった。すなわち、PYG培地はグルコース 5.0（g/L、以下同様）、ポリペプトン（Wako, Osaka, Japan） 5.0、トリプチケース・ペプトン（BBL;Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA） 5.0、酵母抽出エキス（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA） 10.0、CaCl2・2H2O 0.01、MgSO4・7H2O 0.02、KH2PO4 0.04、NaCl 0.08、K2HPO4 0.04、およびNaHCO3 0.4、システイン・HCl 1.0（pH 7.0）。30 mL容ワクチンバイアルに培養液15 mLを移し、培養に用いた。Clostridium glucerasei HFTH-1をPYG培地で培養し、OD600 = 6（培養混液を希釈して波長600 nmの光学密度を測定した）の時点で氷冷により培養を停止した。この培養混液を超音波破砕機（TOMY社, ULTRASONIC DISRUPTOR, UD-201）を用いて超音波処理（OUTPUT 4; DUTY continue; 処理5秒; 氷冷55秒; 10サイクル）することにより菌体破砕を行った（粗酵素溶液）。【００９５】
（１−２）グルコシルセラミドからセラミドが生成する酵素活性の測定
上述のように調製した粗酵素溶液を少量のNaOHまたはHClを用いて反応液と同様のpHに調整した。この粗酵素溶液10 μLとGluCer溶液（20 μM NBD-GluCer 〔[N-[12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoyl]-D-Glucosyl-β1-1'-Sphingosine, Avanti Polar Lipids, inc. Alabaster, AL, USA〕、100 μM GluCer [Avanti Polar Lipids, inc. Alabaster, AL, USA]、および0.2%タウロコール酸ナトリウムを含む50 mM KPi 、セラミドが生成する至適pHを調べる場合はpH 5.0〜9.0、セラミドが生成する至適温度を調べる場合はpH 6.0を用いた）10 μLを氷上の1.5 mLエッペンドルフチューブに入れ、ボルテックスで撹拌した。セラミドが生成する至適pHを調べる場合はこれを37℃で30分、セラミドが生成する至適温度を調べる場合は30〜60℃で15分間インキュベートした。反応後、沸騰したお湯で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。エッペンドルフチューブにクロロホルム + メタノール（2:1、v/v）30 μLを加え、2分間ボルテックスした。遠沈した後（10,000×g, 30 sec）、上清を除去した。エアポンプを用いてエッペンドルフチューブに残ったクロロホルム層を溜去した。エッペンドルフチューブ内の脂質をクロロホルム + メタノール（2:1、v/v）20 μLに溶解した。サンプル10 μLを高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）プレート（Silica gel 60, 10×10 cm; Merck, Whitehouse Station, NJ）に着点し、展開溶媒としてクロロホルム + メタノール + 25%アンモニア水（90:20:0.5、v/v）を用いて展開した。FluorImager 595 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) を用いてレーザー強度 800 V、励起波長488 nm、蛍光波長530 nmの条件でTLCプレートを撮影し、ImageQuaNT (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) を用いてグルコシルセラミド分解量とセラミド生成量を測定した。【００９６】
（２）結果と考察
上述の方法でセラミド生成の至適pHおよび温度を調べたところ、至適pHは6.5で、至適温度は45〜50℃であった（図５及び図６）。【００９７】
〔実施例４〕培養混液中の酵素の所在
（１）実験方法
（１−１）粗酵素の調製
実施例３の方法の通り、C. glucerasei HFTH-1をPYG培地で培養し、OD600 = 6の時点で氷冷により培養を停止した。この培養混液を遠沈し（20,000×g, 10 min, 4℃）、培養液上清 ()ll homogenateCONTTORと沈殿（菌）に分離した。沈殿を50 mM KPi（pH 6.5）で懸濁した。この菌懸濁液を超音波破砕機（TOMY社, ULTRASONIC DISRUPTOR, UD-201）を用いて超音波処理（OUTPUT 4; DUTY continue; 処理5秒; 氷冷55秒; 10サイクル）することにより菌体破砕を行った（菌破砕液）。培養液上清および菌破砕液を少量のNaOHまたはHClを用いてpH 6.5に調整した。【００９８】
（１−２）酵素活性の測定
酵素反応はpH 6.5および45℃で15分間の条件で行い、その他の方法は実施例３と同様に行った。【００９９】
（２）結果と考察
上述の方法でC. glucerasei HFTH-1の培養混液中のグルコシルセラミダーゼ（GCase）の所在を調べたところ、全体の約8割が培養液上清に存在することがわかった（表４）。そのため、本菌のグルコシルセラミダーゼは放出型酵素（細胞内で合成された後、細胞外に放出される酵素）であると考えられる。【０１００】
【表４】
2009107223.tif 000005
〔実施例５〕  GluCerとセラミドの皮膚における透過性の比較
（１）実験方法
麻酔下（ネンブタールを腹腔内投与）でマウス（オス、4ヶ月齢、日本クレア）の背中の毛を剃り、20％グリセロールを含んだ50 mM KPi (pH 7.0)に乳化したGluCer（100 μmol/mL）およびセラミド（100 μmol/mL）を20 μL塗布した（それぞれ2 μmol塗布）。麻酔下で4時間放置した後、頚椎脱臼によりマウスを屠殺して、スフィンゴ脂質を塗布した背中の皮を剥いだ。GluCerまたはセラミドを塗抹した側をクロロホルム + メタノール（C + M、2:1、v/v）で洗浄した。この洗浄液を濃縮し、TLCで分離した後、水性塩酸メタノールを用いて酸水解した。酸水解により生成したスフィンゴシンを抽出し、メチルオレンジを用いたスフィンゴシン定量を行った。【０１０１】
（２）結果および考察
皮膚表面のスフィンゴ脂質の残存量を測定したところ、セラミドの方がGluCerよりも残存量が有意に少なかった（表５）。このことから、皮膚に塗布する場合はセラミドの方がGluCerよりも透過しやすいと考えられる。マウスよりもヒトの方が皮膚の角質層が硬く厚いことを考慮すると、ヒトの場合には更に透過性の差が大きくなると思われる。つまり、セラミドの形にすることによって、肌の保湿効果やバリア機能の増強効果が顕著に増大すると推測される。【０１０２】
【表５】
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〔実施例６〕  グルコシルセラミダーゼの基質特異性
（１）実験方法
（１−１）培地の調製および培養条件
5 mLのワクチンバイアルに分注したPYG培地（組成は以前の報告書に記載）3 mLにGluCer （Avanti Polar Lipids, inc., Alabaster, AL, USA）、ラクトシルセラミド（Avanti Polar Lipids, inc., Alabaster, AL, USA）、またはガングリオシドGM3（HyTest Ltd., Turku, Finland）を200 nmol添加して、スフィンゴ脂質添加培地を調製した。Clostridium glucerasei HFTH-1は、上述の培地を用いたバッチ培養法により37℃で嫌気的に8時間振盪培養した。【０１０３】
（１−２）スフィンゴ脂質の定量
培養後、培養混液を10 mLねじ口試験管に移し、クロロホルムとメタノールの混液（C + M混液、1:1、v/v）6 mLを加えた。室温で20分間激しく撹拌した後、遠沈（1,000 × g、10 min）により二層に分画した。下層のクロロホルム層を新たな10 mLねじ口試験管に回収し、クロロホルムをN2ガスで溜去した。以上の操作を2回繰り返した後に、C + M混液（2:1）40 μLに溶解した。この溶液20 μLを薄層クロマトグラフィー（TLC）用プレート（Silica gel 60, 10×20, Cat No. 1.05626.0001; Merck, Darmstadt, Germany）に着点し、展開溶媒としてクロロホルム + メタノール + 水（65:15:2、v/v）を用いて展開した。GluCer、ラクトシルセラミド、ガングリオシドGM3、およびセラミドのRf値に対応する部分をかき取り、10 mL容ねじ口試験管に入れた。3％のHClを含むメタノール＋水（85:15, v/v）1 mLを加え、サーモアルミバス（Thermo Alumi Bath, ALB-220; Iwaki, Tokyo, Japan）を用いて100℃で2時間加熱した（酸加水分解によるスフィンゴイドの生成）。この反応液に2 N NaOH溶液1 mL、脱イオン水3 mL、および酢酸エチル5 mLを加え、10分間撹拌した後、遠沈により二相に分画した（1,000 × g、10 min）。上層（酢酸エチル層）を新たなねじ口試験管に移し、0.5％メチルオレンジ水溶液0.1 mLと10 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 3.7）2 mLを加え、上述の条件で撹拌・遠沈した。上層（酢酸エチル層）の波長415 nmにおける吸光度を測定することにより、スフィンゴイドを定量した。【０１０４】
（２）結果および考察
GluCer、ラクトシルセラミド、およびガングリオシドGM3を添加した培地でC. glucerasei HFTH-1を培養したところ、GluCerは約100%分解されたが、ラクトシルセラミドおよびガングリオシドGM3は全く分解されなかった（データは省略）。このことから、本菌はグルコース以外の糖（または糖鎖）をもつスフィンゴ糖脂質のβ-グルコシド結合を分解することはできないと推測される。【０１０５】
〔引用文献〕
引用文献１：Dillehay, D. L., S. K. Webb, E. M. Schmelz, and A. H. Merrill Jr. 1994. Dietary sphingomyelin inhibits 1,2-dimethylhydrazine-induced colon cancer in CF1 mice. J. Nutr., 124: 615-620.
引用文献２：Lemonnier, L. A., D. L. Dillehay, M. J. Vespremi, J. Abrams, E. Brody,  and E.M. Schmelz. 2003. Sphingomyelin in the suppression of colon tumors: prevention versus intervention. Arch. Biochem.  Biophys., 419: 129-138.
引用文献３：Schmelz, E. M., D. L. Dillehay, S. K. Webb, A. Reiter, J. Adams, and A. H. Merrill Jr. 1996. Sphingomyelin consumption suppresses aberrant colonic crypt foci and increases the proportion of adenomas versus adenocarcinomas in CF1 mice treated with 1,2-dimethylhydrazine: implications for dietary sphingolipids and colon carcinogenesis. Cancer Res., 56: 4936-4941.
引用文献４：Tsuji K, Mitsutake S, Ishikawa J, Takagi Y, Akiyama M, Shimizu H, Tomiyama T, Igarashi Y. Dietary glucosylceramide improves skin barrier function in hairless mice. J Dermatol Sci. 2006 Nov;44(2):101-7.
引用文献５：Kimata H. Improvement of atopic dermatitis and reduction of skin allergic responses by oral intake of konjac ceramide. Pediatr Dermatol. 2006 Jul-Aug;23(4):386-9.
引用文献６：Asai S, Miyachi H. Evaluation of skin-moisturizing effects of oral or percutaneous use of plant ceramides Rinsho Byori. 2007 Mar;55(3):209-15.
引用文献７：Nilsson A. Metabolism of cerebroside in the intestinal tract of the rat. Biochim Biophys Acta. 1969 Jul 29;187(1):113-21.
引用文献８：Hino, T., H. Mukunoki, K. Imanishi and K. Miyazaki. 1992. Necessity of ready electron disposal and interspecies hydrogen transfer for the utilization of ethanol by rumen bacteria. Asian-Australas. J. Anim., 5: 511-517.
引用文献９：Ogimoto, K. and Imai, S. 1981. Atlas of Rumen Microbiology. Japan Scientific Societies Press, Tokyo.
引用文献１０：Ahn EH, Schroeder JJ. Sphingoid bases and ceramide induce apoptosis in HT-29 and HCT-116 human colon cancer cells. Exp Biol Med (Maywood). 2002 May;227(5):345-53.
引用文献１１：中川, 田村, 川崎, 2001, 16S rRNA遺伝子の塩基配列決定法, 「放線菌の分類と同定」, (日本放線菌学会編), p88〜117, 東京, （財）日本学会事務センター
引用文献１２：Song Y, Liu C, Finegold SM. Real-time PCR quantitation of clostridia in feces of autistic children. Appl Environ Microbiol. 2004 Nov;70(11):6459-65.
引用文献１３：Kikuchi E, Miyamoto Y, Narushima S, Itoh K. Design of species-specific primers to identify 13 species of Clostridium harbored in human intestinal tracts. Microbiol Immunol. 2002;46(5):353-8.
引用文献１４：Hino, T., Miyazaki K. and Kuroda, S. 1991. Role of extracellular acetate in the fermentation of glucose by a ruminal bacterium, Megasphaera elsdenii. J. gen. applied microbial., 37 : 121-9.
引用文献１５：Bergey's manual of systematic bacteriology/P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe and J. G. Holt. Volume 2. Williams & Wilkins, Baltimore. USA.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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