(57)【要約】  本発明は、細胞内に取り込まれた被検物質を詳細かつ簡便に検出できる検出方法に関する。アミノ基またはイミノ基を有する被検物質をＮＢＤ−Ｆ（４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン）で標識し、標識物質を細胞内に取り込ませる。細胞内に取り込まれた標識物質からの蛍光を検出することで、細胞内に取りこまれた被検物質を詳細かつ簡便に観察することができる。本発明は、例えば、薬物や神経伝達物質などの作用機序の研究などに有用である。
2009037839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）の化合物で標識された被検物質を準備するステップと、
前記標識された被検物質を細胞内に取り込ませるステップと、
前記細胞内の前記標識された被検物質からの蛍光を検出するステップと、
を含む、細胞内に存在する被検物質の検出方法。
【化１】
2009037839.tif 000010
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）
【請求項２】
前記化合物は、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記被検物質は、アミノ基またはイミノ基を有する物質である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記被検物質は、アミノ基またはイミノ基を有する薬物、アミノ基またはイミノ基を有する神経伝達物質、あるいはアミノ基またはイミノ基を有するアミノ酸である、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
一般式（１）の化合物と、アミノ基またはイミノ基を有する被検物質とを含む、細胞内に存在する被検物質の検出キット。
【化２】
2009037839.tif 000011
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）
【請求項６】
一般式（１）の化合物で標識された被検物質を含む、細胞内に存在する被検物質の検出キット。
【化３】
2009037839.tif 000012
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）
【請求項７】
前記化合物は、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンである、請求項５に記載の検出キット。
【請求項８】
前記化合物は、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンである、請求項６に記載の検出キット。
【請求項９】
前記被検物質は、アミノ基またはイミノ基を有する薬物、アミノ基またはイミノ基を有する神経伝達物質、あるいはアミノ基またはイミノ基を有するアミノ酸である、請求項５に記載の検出キット。
【請求項１０】
前記被検物質は、アミノ基またはイミノ基を有する薬物、アミノ基またはイミノ基を有する神経伝達物質、あるいはアミノ基またはイミノ基を有するアミノ酸である、請求項６に記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に存在する被検物質の検出方法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物の作用機序を調べる上で、その薬物の細胞内動態に関する情報は非常に有用である。従来、このような情報を得るためには、トリチウム（３Ｈ）などの放射性同位元素で薬物を標識する方法が行われていた（例えば、非特許文献１参照）。この方法では、放射性同位元素で標識された薬物を細胞に取り込ませ、その細胞内に取り込まれた標識薬物から放出される放射線の量を測定することで、薬物が細胞内に取り込まれているかどうかなどの情報を得ることができる。【０００３】
一方、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（以下「ＮＢＤ−Ｆ」という）および４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（以下「ＮＢＤ−Ｃｌ」という）は、それ自身は蛍光を発しないが、第一アミンや第二アミン、アミノ酸などと一定条件化で反応すると、強い蛍光を発する安定な反応生成物を生成する化合物として知られている。従来、ＮＢＤ−ＦおよびＮＢＤ−Ｃｌは、この特性を利用して、ＨＰＬＣにおけるアミンやアミノ酸の分析に蛍光ラベル化剤として用いられていた（例えば、非特許文献２参照）。
【非特許文献１】Birthelmer A., Ehret A., Riegert C., Rothmaier A. K., Leemhuis J., Jackisch R., "Modulation of electrically evoked serotonin release in cultured rat rapheneurons" J. Neurochem., Vol. 100(6), (2007), pp. 1613-1625.
【非特許文献２】Watanabe Y. and Imai K., "Pre-column labelling for high-performance liquid chromatography of amino acids with 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole and its application to protein hydrolysates", J. Chromatogr., Vol. 239, (1982), pp. 723-732.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、放射性同位元素による標識を用いた上記方法では、その薬物が細胞内に取り込まれているかどうかなどの大まかな情報しか得ることができず、細胞内に取り込まれた薬物が細胞内のどこにどのような状態で存在しているのかという薬物の作用機序を調べる上で重要な情報を得ることができなかった。また、上記方法には、放射性同位元素を用いているため、実験場所や実験方法などの制限が多いという問題もあった。【０００５】
本発明の目的は、細胞内に存在する被検物質をより詳細かつ簡便に検出することができる、細胞内に存在する被検物質の検出方法および検出キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、鋭意研究を行った結果、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｆ）または４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｃｌ）で被検物質を標識することで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明は、以下の細胞内に存在する被検物質の検出方法に関する。
［１］一般式（１）の化合物で標識された被検物質を準備するステップと、前記標識された被検物質を細胞内に取り込ませるステップと、前記細胞内の前記標識された被検物質からの蛍光を検出するステップと、を含む、細胞内に存在する被検物質の検出方法。
【化１】
2009037839.tif 000003
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）
［２］前記化合物は、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンである、［１］に記載の検出方法。
［３］前記被検物質は、アミノ基またはイミノ基を有する物質である、［１］に記載の検出方法。
［４］前記被検物質は、アミノ基またはイミノ基を有する薬物、アミノ基またはイミノ基を有する神経伝達物質、あるいはアミノ基またはイミノ基を有するアミノ酸である、［３］に記載の検出方法。【０００８】
また、本発明は、以下の細胞内に存在する被検物質の検出キットに関する。
［５］一般式（１）の化合物と、アミノ基またはイミノ基を有する被検物質とを含む、細胞内に存在する被検物質の検出キット。
【化２】
2009037839.tif 000004
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）
［６］一般式（１）の化合物で標識された被検物質を含む、細胞内に存在する被検物質の検出キット。
【化３】
2009037839.tif 000005
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）
［７］前記化合物は、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンである、［５］または［６］に記載の検出キット。
［８］前記被検物質は、アミノ基またはイミノ基を有する薬物、アミノ基またはイミノ基を有する神経伝達物質、あるいはアミノ基またはイミノ基を有するアミノ酸である、［５］または［６］に記載の検出キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞内に存在する所望の被検物質に関する詳細な情報を簡便に得ることができる。したがって、本発明によれば、薬物や神経伝達物質の細胞内動態に関する詳細な情報を簡便に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランを取り込んだＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像。図１Ｂは、図１Ａと同視野の透過型微分干渉顕微鏡像。図１Ｃは、図１Ａの写真と図１Ｂの写真との合成像。
【図２】図２Ａは、比較例のＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像。図２Ｂは、図２Ａと同視野の透過型微分干渉顕微鏡像。図２Ｃは、図２Ａの写真と図２Ｂの写真との合成像。
【図３】図３Ａは、ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンを取り込んだＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡像と透過型微分干渉顕微鏡像との合成像。図３Ｂは、図３Ａと別の細胞の合成像。
【図４】実施例３の結果を示すグラフ。
【図５】実施例４の結果を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１．本発明の検出方法
本発明の検出方法は、細胞内に存在する所望の被検物質を検出する方法であって、一般式（１）の化合物で標識された被検物質を準備するステップと、前記標識された被検物質を細胞内に取り込ませるステップと、前記細胞内の前記標識された被検物質からの蛍光を検出するステップとを含むことを特徴とする。
【化４】
2009037839.tif 000006
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）【００１２】
上記一般式（１）において、Ｘは、アミノ基（−ＮＨ２）またはイミノ基（−ＮＨ−、＝ＮＨ）と置換可能な基であれば特に限定されず、例えばハロゲン基であってもよい。具体的には、式（２）の４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール：ＮＢＤ−Ｆ）および式（３）の４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール：ＮＢＤ−Ｃｌ）は、本発明の検出方法において被検物質を標識する化合物として好適に用いることができる。
【化５】
2009037839.tif 000007
【００１３】
上記一般式（１）の化合物（例えば、ＮＢＤ−ＦまたはＮＢＤ−Ｃｌ）は、それ自身は蛍光を発しないが、被検物質のアミノ基またはイミノ基に結合して、強い蛍光を発する安定な反応生成物を生成する化合物である。ＮＢＤ−ＦおよびＮＢＤ−Ｃｌはほぼ同様の手順で被検物質を標識することができるが、反応性が高いＮＢＤ−Ｆの方がより緩やかな条件で被検物質と結合させることができる。したがって、被検物質に熱を加えることが好ましくないときなどは、ＮＢＤ−ＣｌよりもＮＢＤ−Ｆを用いることが好ましい。【００１４】
被検物質は、アミノ基またはイミノ基を有する物質であれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。被検物質の例には、ミルナシプラン（抗うつ薬）、フルボキサミン（抗うつ薬）、カルバマゼピン（抗てんかん薬）、ゾニサミド（抗てんかん薬）、レボドパ（抗パーキンソン薬）、ドロキシドパ（抗パーキンソン薬）、フロロピパミド（抗精神病薬）などのアミノ基またはイミノ基を有する薬物；セロトニン、ノルエピネフリン、ドパミン、ヒスタミン、トリプトファンなどのアミノ基またはイミノ基を有する神経伝達物質；アミノ基またはイミノ基を有するアミノ酸などが含まれる。【００１５】
上記一般式（１）の化合物で標識された被検物質（以下、「標識被検物質」ともいう）を取り込ませる細胞の種類は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、神経細胞に作用すると考えられている薬剤（ミルナシプラン、フルボキサミンなど）や神経伝達物質の細胞内動態を調べたい場合は、神経細胞のモデル細胞株として広く用いられているＰＣ１２細胞（ラット副腎褐色細胞腫由来細胞）を選択すればよい。【００１６】
被検物質を上記一般式（１）の化合物で標識する方法は、被検物質のアミノ基またはイミノ基に前記化合物を結合させることができれば特に限定されない。例えば、被検物質を溶媒に溶解した溶液に、上記一般式（１）の化合物（例えば、ＮＢＤ−ＦまたはＮＢＤ−Ｃｌ）を有機溶媒に溶解した溶液を添加し、６０℃で４分間インキュベーションすることで被検物質を標識することができる。標識した後は、ＨＰＬＣなどを用いて標識被検物質を精製することが好ましい。後述する実施例に、ＮＢＤ−Ｆで薬物または神経伝達物質を標識した例を示す。【００１７】
標識被検物質を細胞に取り込ませる方法は、特に限定されない。例えば、標識被検物質を添加した液体培地中で細胞を培養することで、標識被検物質を細胞に取り込ませることができる。後述する実施例に、ＮＢＤ−Ｆで標識した薬物または神経伝達物質をＰＣ１２細胞に取り込ませた例を示す。【００１８】
細胞内に取り込まれた標識被検物質からの蛍光を検出する方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、標識被検物質を取り込ませた細胞を蛍光顕微鏡（共焦点レーザー走査型顕微鏡を含む）を用いて観察することで、細胞内に取り込まれた標識被検物質からの蛍光を検出することができる。励起光の波長および検出する蛍光の波長は、用いた化合物に応じて適宜設定することが好ましい。例えば、ＮＢＤ−Ｆ（最大吸収波長：４７０ｎｍ、最大蛍光波長：５３０ｎｍ）で被検物質を標識する場合は、波長が４７０ｎｍ周辺の光を励起光とし、５３０ｎｍ周辺の蛍光を検出すればよい。同様に、ＮＢＤ−Ｃｌ（最大吸収波長：４８０ｎｍ、最大蛍光波長：５４０ｎｍ）で被検物質を標識する場合は、波長が４８０ｎｍ周辺の光を励起光とし、５４０ｎｍ周辺の蛍光を検出すればよい。本発明の検出方法では、標識被検物質を取り込ませた細胞を生きたまま観察することもできる。したがって、標識被検物質を取り込ませた細胞をタイムラプス観察することで、所望の被検物質の細胞内動態の経時的な情報も得ることができる。【００１９】
以上のように、本発明の検出方法によれば、上記一般式（１）の化合物で被検物質を標識し、この標識被検物質を所望の細胞に取り込ませることで、当該被検物質の細胞内動態に関する詳細な情報を簡便に得ることができる。【００２０】
また、本発明の検出方法によれば、薬物や神経伝達物質、アミノ酸などの分子量が小さい被検物質の場合であっても、被検物質そのものの細胞内動態を観察することができる。すなわち、分子量が大きい蛍光標識物質で分子量の小さい被検物質を標識すると、蛍光標識物質の特性が被検物質に大きく影響してしまうため、被検物質そのものの細胞内動態を観察することが困難となってしまう。これに対し、本発明の検出方法では、他の蛍光標識物質と比較して分子量が小さい化合物（例えば、ＮＢＤ−Ｆの分子量は１８３.１０、ＮＢＤ−Ｃｌの分子量は１９９.５５である）で被検物質を標識することで、蛍光標識物質の特性が被検物質に与える影響を小さくすることができるため、被検物質そのものの細胞内動態を観察することができるのである。【００２１】
さらに、本発明の検出方法によれば、被検物質の細胞内動態を長時間観察することができる。すなわち、上記一般式（１）の化合物は、他の蛍光標識物質と比較して退色しにくいため、細胞内に取り込まれた標識被検物質からの蛍光を長時間検出することができるのである。したがって、本発明の検出方法によれば、長時間の観察を要する薬物の代謝の様子なども観察することができる。【００２２】
なお、上記一般式（１）の化合物（例えば、ＮＢＤ−ＦまたはＮＢＤ−Ｃｌ）は、チオール基にも結合することができるため、本発明の検出方法では、チオール基を有する物質も被検物質とすることができる。【００２３】
２．本発明のキット
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法において標識被検物質を準備する際に使用されるキットであって、一般式（１）の化合物と被検物質とを含むこと（実施の形態１）、または一般式（１）の化合物で標識された被検物質を含むこと（実施の形態２）を特徴とする。【００２４】
一般式（１）の化合物は特に限定されない。化合物の例には、ＮＢＤ−ＦやＮＢＤ−Ｃｌなどが含まれる。被検物質も、アミノ基またはイミノ基を有するものであれば特に限定されない。被検物質の例には、ミルナシプラン（抗うつ薬）、フルボキサミン（抗うつ薬）、カルバマゼピン（抗てんかん薬）、ゾニサミド（抗てんかん薬）、レボドパ（抗パーキンソン薬）、ドロキシドパ（抗パーキンソン薬）、フロロピパミド（抗精神病薬）などのアミノ基またはイミノ基を有する薬物；セロトニン、ノルエピネフリン、ドパミン、ヒスタミン、トリプトファンなどのアミノ基またはイミノ基を有する神経伝達物質；アミノ基またはイミノ基を有するアミノ酸などが含まれる。【００２５】
一般式（１）の化合物と被検物質とを含む態様（実施の形態１）のキットの場合、一般式（１）の化合物および被検物質は、同一の容器に入っていてもよいし、それぞれ別個の容器に入っていてもよい。また、一般式（１）の化合物および被検物質は、それぞれ溶媒に溶解した状態のものでもよいし、乾燥した状態のものでもよい。実施の形態１のキットは、キットに含まれる一般式（１）の化合物と被検物質とを反応させることで、本発明の検出方法に用いられる標識被検物質を簡便に調製することができる。【００２６】
一般式（１）の化合物で標識された被検物質を含む態様（実施の形態２）のキットの場合、キットに含まれる標識被検物質は、前述のように一般式（１）の化合物と被検物質とを反応させて調製すればよい。実施の形態２のキットは、本発明の検出方法に用いられる標識被検物質として、キットに含まれる標識被検物質をそのまま提供することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。【００２８】
［実施例１］
実施例１は、抗うつ薬のミルナシプランを被検物質として細胞内に取り込ませた例を示す。【００２９】
式（４）のミルナシプラン（旭化成ファーマ株式会社：トレドミン）を０.１Ｍホウ酸水溶液に溶解させたもの（１ｍＭ、１ｍＬ）に、ＮＢＤ−Ｆ（株式会社同仁化学研究所）のアセトニトリル溶液（６００ｍＭ、２５μＬ）を加え、６０℃で４分間インキュベーションすることで、ミルナシプランをＮＢＤ−Ｆで標識した。その後、０℃の氷上で反応を停止させた。
【化６】
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【００３０】
得られたサンプル（１００μＬ）をＨＰＬＣを用いて分離し、ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランとミルナシプランに結合していないＮＢＤ−Ｆ（以下、「未結合ＮＢＤ−Ｆ」という）とを得た。検出器は、ＵＶ−ＶＩＳ検出器（ＳＰＤ−１０Ａ：株式会社島津製作所）を用いた。カラムは、ULTRASPHERE Column（２５０×４.６ｍｍ ＩＤ，５μｍ，Ｃ１８：ベックマン・コールター株式会社）を用いた。移動相は、本発明者が独自に開発した、アセトニトリル１５５ｍＬ、過塩素酸０.５ｍＬおよび２０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液１４４.５ｍＬの混合液（用時調製）を用いた。分離条件は、カラム温度２５℃、流量０.６ｍＬ／分、検出波長２１０ｎｍとした。【００３１】
ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランを取り込ませる細胞には、ＰＣ１２細胞（ラット副腎褐色細胞腫由来細胞）を用いた。ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン（サンプル１００μＬから得た分）をＤ−ＭＥＭ培地（＋４.５ｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、＋４.５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、＋１１０ｍｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、無血清、ｐＨ７.５：インビトロジェン株式会社）に加えて合計２ｍＬとした。このＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有培地に２.４×１０６個のＰＣ１２細胞を撒き、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１０〜１２０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ：カールツァイス株式会社）で細胞を観察した（励起波長４８８ｎｍ）。【００３２】
図１は、ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランを含む培地中でインキュベーションしたＰＣ１２細胞の写真である。図１Ａは蛍光顕微鏡像、図１Ｂは同視野の透過型微分干渉顕微鏡像、図１Ｃは蛍光観察像と透過型微分干渉顕微鏡像との合成像である。これらの写真から、ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランが細胞内に取り込まれていること、取り込まれたＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランは細胞質だけでなく核小体にも存在することなどがわかる。【００３３】
図２は、比較例として、未結合ＮＢＤ−Ｆを含む培地中で同じ時間インキュベーションしたＰＣ１２細胞の写真である。図２Ａは蛍光顕微鏡像、図２Ｂは同視野の透過型微分干渉顕微鏡像、図２Ｃは蛍光観察像と透過型微分干渉顕微鏡像との合成像である。これらの写真では細胞内でほとんど蛍光が観察されないことから、図１Ａにおいて観察された蛍光はＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン由来のものであることがわかる。【００３４】
ミルナシプランは、シナプス前細胞の細胞膜に存在するセロトニントランスポーターおよびノルエピネフリントランスポーターに選択的に結合することにより、シナプス間隙に存在するセロトニンおよびノルエピネフリンの再取り込みを阻害すると考えられている。したがって、ミルナシプランが細胞内に取り込まれることは当業者には予想すらされていないことであったが、本発明者は、ミルナシプランが細胞内に取り込まれるという驚くべき事実を本発明の方法を用いて初めて見出すことができた。【００３５】
以上のように、本発明の方法およびキットは、薬物の作用機序を研究する上で非常に有用であることがわかる。【００３６】
［実施例２］
実施例２は、神経伝達物質のセロトニンを被検物質として細胞内に取り込ませた例を示す。【００３７】
式（５）のセロトニン（5-Hydroxytryptamine hydrochloride：和光純薬工業株式会社）を０.１Ｍホウ酸水溶液に溶解させたもの（１ｍＭ、１ｍＬ）に、ＮＢＤ−Ｆのアセトニトリル溶液（６００ｍＭ、２５μＬ）を加え、６０℃で４分間インキュベーションすることで、セロトニンをＮＢＤ−Ｆで標識した。その後、０℃の氷上で反応を停止させた。得られたサンプルを実施例１と同様にＨＰＬＣを用いて分離し、ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンを得た。
【化７】
2009037839.tif 000009
【００３８】
実施例１と同様に、ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンを取り込ませる細胞には、ＰＣ１２細胞を用いた。ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン（サンプル１００μＬから得た分）をＤ−ＭＥＭ培地に加えて合計２ｍＬとした。このＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン含有培地に２.４×１０６個のＰＣ１２細胞を撒き、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１０〜１２０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡で細胞を観察した（励起波長４８８ｎｍ）。【００３９】
図３は、ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンを含む培地中でインキュベーションしたＰＣ１２細胞の写真である。図３Ａおよび図３Ｂ共に、蛍光観察像と透過型微分干渉顕微鏡像との合成像である。これらの写真から、ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンが細胞内に取り込まれていること、取り込まれたＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンは細胞質だけでなく核内にも存在することなどがわかる。【００４０】
セロトニンは、シナプス前細胞のシナプス小胞内に貯蔵されており、エキソサイトーシスによりシナプス間隙に放出される。シナプス間隙に放出されたセロトニンのうち、シナプス後細胞のセロトニン受容体に結合しなかったものは、シナプス前細胞のセロトニントランスポーターから細胞内に取り込まれ、再度シナプス小胞内に貯蔵されると考えられている。したがって、セロトニンが細胞質だけでなく核内にも存在することは当業者には予想すらされていないことであったが、本発明者は、セロトニンが核内にまで取り込まれるという驚くべき事実を本発明の方法を用いて初めて見出すことができた。【００４１】
以上のように、本発明の方法およびキットは、神経伝達物質の細胞内動態を研究する上で非常に有用であることがわかる。【００４２】
［実施例３］
実施例３は、ミルナシプランの細胞内取り込み量をマルチラベルカウンターを用いて測定した例を示す。【００４３】
ミルナシプランを０.１Ｍホウ酸水溶液に溶解させたもの（４ｍＭ、１ｍＬ）に、ＮＢＤ−Ｆのアセトニトリル溶液（６００ｍＭ、２５μＬ）を加え、６０℃で１０分間インキュベーションすることで、ミルナシプランをＮＢＤ−Ｆで標識した。その後、氷中で１０分間冷却して反応を停止させ、塩酸（５０ｍＭ、４００μＬ）を加えた。【００４４】
得られたサンプル（１００μＬ）をＨＰＬＣを用いて分離し、ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランと未結合ＮＢＤ−Ｆとを得た。ポンプは、８８０−ＰＵ（日本分光株式会社）を用いた。ＵＶ検出器は、ＳＰＤ−６Ａ（株式会社島津製作所）を用いた。蛍光検出器は、Ｌ−２４８５（株式会社日立ハイテクノロジーズ）を用いた。フラクションコレクターは、ＦＣ２０３Ｂ（ギルソン社）を用いた。カラムは、ULTRASPHERE Column（２５０×４.６ｍｍ ＩＤ，５μｍ，Ｃ１８：ベックマン・コールター株式会社）を用いた。移動相は、アセトニトリル１５５ｍＬ、過塩素酸０.５ｍＬおよび２０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液１４４.５ｍＬの混合液を用いた。分離条件は、カラム温度２５℃、流量０.６ｍＬ／分、ＵＶ検出波長２１０ｎｍ、励起波長４８８ｎｍ、蛍光測定波長５４０ｎｍとした。【００４５】
実施例１と同様に、ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランを取り込ませる細胞には、ＰＣ１２細胞を用いた。１２ウェルマイクロプレートの各ウェルにＤ−ＭＥＭ培地を１ｍＬずつ分注した。各ウェル内の培地に６×１０５個のＰＣ１２細胞を撒き、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間間インキュベーションして、ＰＣ１２細胞をマイクロプレートに定着させた。【００４６】
ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランをＤ−ＭＥＭ培地（ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾンおよびＦＢＳ非含有）に加えて、ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有Ｄ−ＭＥＭ培地を調製した。ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランの濃度は、１００μＭまたは２００μＭとした。１２ウェルマイクロプレートの各ウェルのＤ−ＭＥＭ培地を除去した後、各ウェルにＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有培地（１００μＭまたは２００μＭ）を１ｍＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で６０分間インキュベーションして、ＰＣ１２細胞にＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプランを取り込ませた。細胞を０.５％ ＮＰ４０含有ＰＢＳで１回、ＮＰ４０非含有のＰＢＳで２回洗浄した。各ウェルにＰＢＳを３００μＬ分注し、−８０℃で３０分間静置してＰＣ１２細胞およびＰＢＳを凍結させた。室温で解凍後、各ウェル内のＰＢＳ（ＰＣ１２細胞の内容物を含む）を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに移し、マルチラベルカウンター（ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ：パーキンエルマー社）を用いて９６ウェルマイクロプレートの各ウェルの蛍光強度を測定した（励起波長４８５ｎｍ、測定波長５３５ｎｍ、測定時間０.２秒）。【００４７】
図４は、ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有培地（１００μＭまたは２００μＭ）中で細胞を培養したウェルの蛍光強度を示すグラフである。１００μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度は１６０８０であり、２００μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度は３２５１０であった。一方、１２ｍＭ 未結合ＮＢＤ−Ｆ含有培地中でＰＣ１２細胞を同じ時間培養したウェルの蛍光強度（ブランク）は１３３７であった。したがって、ブランクの蛍光強度を引くと、１００μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度は１４７４３となり、２００μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度は３１１７３となる。【００４８】
２００μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度（３１１７３）は、１００μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識ミルナシプラン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度（１４７４３）の２.１１倍であった。このことから、臨床で使用される濃度範囲内では、ミルナシプランは濃度依存的に細胞内に取り込まれることが示唆される。【００４９】
以上のように、本発明の検出方法を用いることで、薬物の細胞内濃度を複数のサンプルについて一回で測定することができる。【００５０】
［実施例４］
実施例４は、セロトニンの細胞内取り込み量をマルチラベルカウンターを用いて測定した例を示す。【００５１】
セロトニンを０.１Ｍホウ酸水溶液に溶解させたもの（４ｍＭ、１ｍＬ）に、ＮＢＤ−Ｆのアセトニトリル溶液（６００ｍＭ、２５μＬ）を加え、６０℃で１０分間インキュベーションすることで、セロトニンをＮＢＤ−Ｆで標識した。その後、氷中で１０分間冷却して反応を停止させ、塩酸（５０ｍＭ、４００μＬ）を加えた。得られたサンプルを実施例３と同様にＨＰＬＣを用いて分離し、ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンおよび未結合ＮＢＤ−Ｆを得た。【００５２】
実施例３と同様に、ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンを取り込ませる細胞には、ＰＣ１２細胞を用いた。９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにＤ−ＭＥＭ培地を１００μＬずつ分注した。各ウェル内の培地に１×１０４個のＰＣ１２細胞を撒き、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間間インキュベーションして、ＰＣ１２細胞をマイクロプレートに定着させた。【００５３】
ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンをＤ−ＭＥＭ培地（ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾンおよびＦＢＳ非含有）に加えて、ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン含有Ｄ−ＭＥＭ培地を調製した。ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンの濃度は、３１.２５μＭ、６２.５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭのいずれかとした。９６ウェルマイクロプレートの各ウェルのＤ−ＭＥＭ培地を除去した後、各ウェルにＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン含有培地（３１.２５〜５００μＭ）を１００μＬずつ分注した。各ウェル内の培地に１×１０４個のＰＣ１２細胞を撒き、３７℃、５％ＣＯ２条件下で６０分間インキュベーションして、ＰＣ１２細胞にＮＢＤ−Ｆ標識セロトニンを取り込ませた。細胞を０.５％ ＮＰ４０含有ＰＢＳで１回、ＮＰ４０非含有のＰＢＳで２回洗浄した。−８０℃で３０分間静置してＰＣ１２細胞およびＰＢＳを凍結させた。室温で解凍後、マルチラベルカウンターを用いて各ウェルの蛍光強度を測定した（励起波長４８５ｎｍ、測定波長５３５ｎｍ、測定時間０.２秒）。【００５４】
図５は、ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン含有培地（３１.２５〜５００μＭ）中で細胞を培養したウェルの蛍光強度（ブランクを引いた後の値）を示すグラフである。３１.２５μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度（ブランクを引いた後の値。以下同じ。）は３９であり、６２.５μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度は９２であり、１２５μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度は１０７であり、２５０μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度は１５３であり、５００μＭ ＮＢＤ−Ｆ標識セロトニン含有培地中で細胞を培養したウェルの蛍光強度は２３１であった。１２ｍＭ 未結合ＮＢＤ−Ｆ含有培地中でＰＣ１２細胞を同じ時間培養したウェルの蛍光強度（ブランク）は９９９であった。【００５５】
このことから、生理的な濃度範囲内では、セロトニンは濃度依存的に細胞内に取り込まれることが示唆される。【００５６】
以上のように、本発明の検出方法を用いることで、神経伝達物質の細胞内濃度を複数のサンプルについて一回で測定することができる。【００５７】
本出願は、２００７年９月１８日出願の特願２００７−２４１０１０に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、細胞内に取り込まれた被検物質に関する詳細な情報を簡便に得ることができるため、例えば薬物や神経伝達物質などの作用機序の研究などに有用である。
【図４】
2009037839.tif 000013
【図５】
2009037839.tif 000014
【図１】
2009037839.tif 000015
【図２】
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【図３】
2009037839.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月17日(2009.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）の化合物で標識された候補薬物または候補神経伝達物質を準備するステップと、
前記標識された候補薬物または候補神経伝達物質を細胞内に取り込ませるステップと、
前記細胞内の前記標識された候補薬物または候補神経伝達物質からの蛍光を検出するステップと、
を含む、薬物または神経伝達物質のスクリーニング方法。
【化１】
2009037839.tif 000018
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）
【請求項２】
前記化合物は、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記候補薬物または候補神経伝達物質は、アミノ基またはイミノ基を有する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
一般式（１）の化合物と、アミノ基またはイミノ基を有する候補薬物または候補神経伝達物質とを含む、薬物または神経伝達物質のスクリーニングキット。
【化２】
2009037839.tif 000019
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）
【請求項６】
一般式（１）の化合物で標識された候補薬物または候補神経伝達物質を含む、薬物または神経伝達物質のスクリーニングキット。
【化３】
2009037839.tif 000020
（式中、Ｘはアミノ基またはイミノ基と置換可能な基を表す。）
【請求項７】
前記化合物は、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンである、請求項５に記載のスクリーニングキット。
【請求項８】
前記化合物は、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンまたは４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンである、請求項６に記載のスクリーニングキット。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
前記候補薬物または候補神経伝達物質は、アミノ基またはイミノ基を有する、請求項６に記載のスクリーニングキット。
【国際調査報告】
2009037839.tif 000021
2009037839.tif 000022
2009037839.tif 000023
2009037839.tif 000024