(57)【要約】  周囲温度もしくは非冷蔵温度で生存性を保持する細胞または乾燥状態で保存され得る細胞を作製するための方法が記載される。特に、細胞保存は、細胞生存能力を維持したまま、周囲温度または非冷蔵温度での哺乳動物細胞などの細胞の長期保存のためのものである。また、標的粒子、生物学的薬剤または他の物質を検出し得、周囲温度もしくは非冷蔵温度で生存可能なままであるか、または乾燥状態で保存され得るセンサー細胞が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をカスパーゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター、プロテオソームインヒビターまたはその組合せで処理する工程を含む細胞保存法。
【請求項２】
細胞がエミッター細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
休止調節遺伝子の発現を増加し、それにより細胞が休止状態を維持し得る時間を増加させる工程を含む、細胞保存法。
【請求項４】
細胞がエミッター細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
アポトーシスを調節する遺伝子の発現を制御する工程を含む、細胞保存法。
【請求項６】
アポトーシスを調節する遺伝子がアポトーシスタンパク質インヒビター(IAP)である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
発現がアポトーシスインヒビター遺伝子の上方調節である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
発現がアポトーシス活性化遺伝子の下方調節である、請求項５記載の方法。
【請求項９】
休止を誘導する工程を含む、細胞保存法。
【請求項１０】
休止の誘導が細胞において細胞周期を阻害することを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
細胞周期の阻害が、細胞に１つ以上の細胞周期インヒビターを添加することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上の細胞周期インヒビターが、アクチノマイシンD、マイトマイシンC、ラパマイシン、メバスタチン、ツニカマイシン、ウォルトマンニンおよびその組合せからなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
極限環境微生物であるエミッター細胞。
【請求項１４】
乾燥耐性極限環境微生物である、請求項１３記載のエミッター細胞。
【請求項１５】
極限環境微生物がクラミドモナス  アルゲである、請求項１４記載のエミッター細胞。
【請求項１６】
極限環境微生物が標的粒子のレセプターおよびエミッター分子を発現する、請求項１３記載のエミッター細胞。
【請求項１７】
レセプターが抗体である、請求項１６記載のエミッター細胞。
【請求項１８】
レセプターがFcレセプターである、請求項１６記載のエミッター細胞。
【請求項１９】
エミッター分子が細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出する、請求項１３記載のエミッター細胞。
【請求項２０】
エミッター分子がエクオリンである、請求項１９記載のエミッター細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は2005年11月30日に出願された米国仮出願第60/741,384号の恩恵を主張する。上記出願の全教示は参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（政府支援）
本発明は、全体又は部分的に、米国空軍契約書番号F19628-00-C-0002の政府基金によって支援された。政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
長期間、環境をモニターすることが可能な生物学的薬剤の、少量で早く、かつ感度のある検出体のための必要性が、生物学的兵器及び化学兵器の急増によって強調される。戦場の条件下で、利用可能な検出体は、特定の生物学的又は化学的薬剤が検出される場合、迅速に兵士に警告し、結果として対策がすばやく実施され得る。かかる検出体は非軍隊適用においても利用可能である。患者における抗生物質耐性細菌の迅速な検出は、臨床医がより有効な治療養生法を選択するのに役立つ。都市の飲料用水供給の連続的なモニタリングは潜在的な病原体の早期の警告を提供し、公共に対する潜在的な健康リスクを管理するためのより多くの時間を役人に与える。さらに、食肉及び家禽検査におけるこれらの検出体の使用は、現在の「棒の先端でつついて匂いをかぐ」手順に対して有意な改善である。一般に、かかる検出体は、医学（例えば、獣医学）、農業、（例えば、シック建物症候群を診断する）環境保護及び食品加工又は規制の分野内の分析適用及び診断適用に非常に必要とされる。
【０００４】
複数及びまれな標的粒子又は抗原の検出に多様な抗体を利用する装置が例えば、米国特許第6,087,114号及び米国特許第6,248,542号に記載されている。これらの装置は一般に、本明細書で「CANARY」細胞又は「エミッター」細胞としても呼ばれるセンサー細胞（例えば、B細胞、マクロファージ又は線維芽細胞）を含む液体培地、光学検出器、及び検出される標的粒子を受ける液体培地を含む。哺乳動物細胞は、マイナス80℃以下の温度で凍結保存され得るが、冷蔵温度又は周囲温度の液体状態で保存される場合、数週間以内に生存能力を失う。さらに、生存能力を維持しながら拡張された時間のために乾燥状態で細胞を保存する技術は、開発中である。マイナス80℃以下以外での温度条件でのセンサー細胞の保存はセンサー細胞を使用する装置の簡便性を大いに改善する。
【０００５】
従って、周囲温度若しくは非冷蔵温度で生存する又は乾燥状態で保存され得る、哺乳動物細胞等の細胞のための必要性がある。特に、生物学的薬剤又は他の物質を検出し得、かつ周囲温度又は非冷蔵温度で生存する、或いは乾燥状態で保存され得る、センサー細胞のための必要性がある。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、細胞が、他の場合では減少又は損失した細胞生存能力をもたらす周囲温度又は非冷蔵温度で保存される場合に細胞の生存能力を保存する方法を提供する。
【０００７】
1つの態様において、細胞保存技術は（本明細書でCANARY細胞、又はセンサー細胞とも呼ばれる）エミッター細胞のためである。特定の態様において、エミッター細胞は標的粒子のための1つ以上のレセプターを発現する。1つの態様において、レセプターは抗体である。別の態様において、レセプターはFcレセプターである。さらなる態様において、エミッター細胞はB細胞、マクロファージ又は線維芽細胞である。
【０００８】
なおさらなる態様において、エミッター細胞はエミッター分子を発現する。特定の態様において、エミッター分子は細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出する。さらなる態様において、エミッター分子はエクオリンである。
【０００９】
さらなる態様において、細胞保存方法は、アポトーシス、酸化、及び／又はタンパク質分解と1つ以上のカスパーゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター、及び／又はプロテオソームインヒビターとの組み合わせから（エミッター細胞等の）細胞を保護することを含む。
【００１０】
別の態様において、細胞保存方法は更に又は或いは、休止を誘導及び／又は維持するために重要である遺伝子の発現を細胞中で増大し、それによって細胞が休止状態で維持し得る時間を増大することを含む。
【００１１】
さらなる態様において、細胞保存方法は更に又は或いは、アポトーシスを調節する遺伝子の発現を制御することを含む。特定の態様において、アポトーシスタンパク質インヒビター（IAP）は細胞で発現する。
【００１２】
別の態様において、細胞保存方法は更に又は或いは、周囲温度及び冷蔵温度の液体における長期保存を含む条件を拡張することを含む。
【００１３】
さらなる態様において、細胞保存方法は更に又は或いは、細胞周期インヒビターの添加を含む保護休止状態を誘導することを含む。特定の態様において、細胞周期インヒビターはアクチノマイシンD、マイトマイシンC、ラパミシン、メバスタチン、ツニカマイシン及びウォルトマンニンからなる群より選択される。
【００１４】
本明細書に記載される本発明はまた、極限環境微生物（extremophile）であるエミッター細胞を提供する。特定の態様において、極限環境微生物は、乾燥耐性極限環境微生物である。1つの態様において、極限環境微生物は、クラミドモナス  アルゲ（chlamydomonas algae）である。特定の態様において、極限環境微生物は標的粒子のための1つ以上のレセプターを発現する。1つの態様において、レセプターは抗体である。別の態様において、レセプターはFcレセプターである。
【００１５】
さらなる態様において、極限環境微生物はエミッター分子を発現する。特定の態様において、エミッター分子は細胞内カルシウムの増大に応答して光子を放出する。さらなる態様において、エミッター分子はエクオリンである。
【００１６】
特許又は特許出願書類はカラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を有するこの特許公開物又は特許出願公開物のコピーは請求及び必要な費用の支払いの際に庁によって提供される。
【００１７】
本発明の、前記及び他の対象、特徴及び利点は、付随する図面に例示されるような、本発明の好ましい態様の以下のより具体的な記載から明白である。図面は必ずしも共通の尺度でなく、本発明の原理を例示することを強調する。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
哺乳動物細胞は、-80℃以下の温度で冷凍保存され得るが、冷蔵温度又は周囲温度の液体状態で保存される場合に数週間以内に生存能力を損失することは周知である。さらに、生存能力を維持しながら拡張した期間のために乾燥状態で細胞を保存する技術が開発中である。生存細胞の乾燥保存を改善するいくつかのアプローチが細胞内又は細胞外のいずれかでのトレハロース等の非還元二糖の使用を含むが、これらは限定された成功を満足した[Nat. Biotechnol., 2000, 18(2):168-171; FEBS Lett., 2000,487:199-202;J. Opthalmol., 85:610-612(2001);Cryobiology, 42(3):207-217(2001);J.Physiol., 558:181-191(2004)]。ヒト細胞株の６週間周囲温度保存は最近、あるレベルの水分量を維持し、かつ利用可能な酸素及び静電気を減らしながら休止状態を誘導することによって達成された [Jack et al., J.Cell. Physiol., 206(2);526-536(2005)]。休止状態はスフェロイドと呼ばれる3次元構造において細胞を成長させることによって誘導され、アポトーシス及び他の形態の細胞死からの保護を提供すると信じられている。
【００１９】
本発明は、この技術に対して、以下の(1)アポトーシス、酸化、及び／又はタンパク質分解とカスパーゼインヒビター（例えば、Z-AEVD-FMK、Z-DEVD-FMK、Z-LEED-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-WEHD-FMK、Z-VAD-FMK、Z-VDVAD-FMK、Z-YVAD-FMK、Z-VEID-FMK、Z-IETD-FMK、OPH-109及び／又はパンカスパーゼIIIインヒビター）、抗酸化物（例えば、セレナイトナトリウム、N-アセチルシステイン、デフェロキサミン、アミノグアニジン、トロロックス、エブセレン、及び／又はテンポール）、及び／又はプロテアーゼ及び／又はプロテオソームインヒビター（例えば、AEBSF、アプロトニン、ベスタチン、カルペプチン、カセプシンLインヒビター、E-64、ロイペプチン、及び／又はペプスタチンA）との組み合わせからのさらなる保護を提供すること；(2)細胞が休止状態で維持し得る時間を増大するために休止を誘導及び維持するために重要な遺伝子の発現を増大すること（かかる遺伝子は例えば、当業者に公知である技術を用いる転写分析において同定され得る）、増大した遺伝子発現は、例えば強力なプロモーターを有する遺伝子を細胞で過剰発現することによって当該分野で公知の任意の手段によって達成され得る；(3)例えば、遺伝子的方法によって、アポトーシスを制御する遺伝子の発現を調節すること、XIAP等のアポトーシスタンパク質インヒビター（IAP）の過剰発現等：(4)周囲温度及び冷蔵温度の液体中の長期保存を含む条件を拡張すること；及び／又は(5)細胞周期インヒビター（例えば、アクチノマイシンD、マイトマイシンC、ラパミシン、メバスタチン、ツニカマイシン、及び／又はウォルトマンニン）の使用で保護的休止状態を誘導すること、を含む細胞保存技術の１つ以上を使用して改善する。本明細書で使用する場合、「長期保存」とは、約10年より長い、約1年より長い、約9ヶ月より長い、約6ヶ月より長い、約3ヶ月より長い、約2ヶ月より長い、約1ヶ月より長い、約2週間より長い、約1週間より長い、又は約72時間より長い期間のことをいう。
【００２０】
さらに、本明細書に記載されるように、本発明は、周囲温度、冷蔵温度又は非冷蔵温度での液体状態、半液体状態又は乾燥状態におけるエミッター細胞等の細胞保存法を提供する。本明細書で使用される場合、周囲温度又は非冷蔵温度は約5℃〜約50℃、約10℃〜約40℃、約15℃〜約30℃、約20℃〜約30℃の範囲である。
【００２１】
特定の態様において、1つ以上の細胞保存技術はエミッター細胞（本明細書でCANARY細胞又はセンサー細胞と呼ばれる）に適用される。本明細書で使用される場合、エミッター細胞は標的粒子（生物学的抗原、可溶性抗原、核酸、毒素、化合物等）の検出に使用される。標的粒子の検出は、エミッター細胞の細胞表面に直接又は間接的に発現したレセプターへの標的粒子の結合によって部分的に仲介される。直接結合は標的粒子に直接又は特異的に結合する抗体等の、レセプターを介してであり得る。標的粒子の間接結合は、例えば、標的粒子に連結（例えば、結合）した抗体に結合するFcレセプターを介してであり得る。抗原のレセプターへの結合はカルシウム濃度の増大となる。エミッター細胞はまた、細胞質において、1つ以上のエミッター細胞分子（例えば、エクオリン）を含み、細胞質で増大したカルシウム濃度に応答して光子を放出する。光子放出が検出され、それによって標的粒子の存在を検出し得る。これはまた、本明細書で「CANARYアッセイ」と呼ばれる。エミッター細胞、それを用いる光電子検出システム、及びCANARYアッセイに対するさらなる情報について、例えば、米国特許出願シリアル第11/001,583号、米国特許出願第2004/0121402号、米国特許第6,087,114号及び米国特許第6,248,542号を参照、全教示はその全体を参照によって本明細書に援用される。
【００２２】
代替的なアプローチは、CANARY細胞としての使用のための乾燥耐性極限環境微生物の遺伝子改変である。例えば、クラミドモナス  アルゲは、局所環境生息地が降雨の欠如から乾燥する場合に胞子を形成することが公知である。これらの胞子は、胞子形成後70年にわたる生存能力に再水和することが報告されている。さらに、クラミドモナスはB細胞のものと類似する細胞表面レセプター活性化カルシウムシグナリングトランスダクションカスケードを有することが公知である。従って、極限環境微生物は、抗体又はFcレセプターのような1つ以上のレセプター及びエクオリンのようなエミッター分子を発現するように遺伝子組み換えされ得る。細胞表面上のレセプターの発現は病原体又は抗原によってクロスリンクされる場合、細胞内カルシウム濃度の増大を生じるシグナリングカスケードを刺激し、この増大した濃度の細胞内カルシウムイオンが標的抗原又は病原体の存在と共に測定及び相関され得る光を放出するエミッター分子を刺激する。従って、極限環境微生物のエミッター細胞は例えば、周囲温度、冷蔵温度又は非冷蔵温度での乾燥状態における長期間（例えば、長期保存）のために保存され得、例えばCANARYアッセイの使用のための再水和の際、生存可能なままである。
【実施例】
【００２３】
実施例１
ツニカマイシンはCANARY  B細胞の細胞生存能力及び活性の両方を増大する（図2参照）。室温でのツニカマイシンを用いるCANARY  B細胞（Yersinia pestisに特異的なレセプターを発現する）の保存の後に、CANARY  B細胞はYersinia pestisの検出感度を保持した（図2のグラフを参照）。
【００２４】
さらに、ウォルトマンニンを用いるCANARY細胞の処理はまた、冷蔵保存されたCANARY細胞の生存能力及び抗原検出活性の両方を増大した。
【００２５】
実施例２
パンカスパーゼIIIインヒビター（図3の棒グラフにおいて、「カスパーゼIII」と呼ばれる）を用いる細胞の処置はウォルトマンニン無しでの1、2、及び3週間室温で保存された細胞と比較して、1、2及び3週間室温で保存された細胞の生存能力を高める（図3の棒グラフを参照）。
【００２６】
実施例３
細胞保存ロジスティックにおいて示された改善
CANARY  B細胞 生物薬剤センサー技術は公知の任意の生物薬剤同定技術のためのスピード及び感度の最良の組み合わせを示す[Rider et al., Science 301:213(2003)]。CANARYは空気、食物、表面、及び医学試料を含む多くのマトリックス及びフォーマットにおける病原体を検出し得る。しかし、B細胞自身の簡易及び安価な保存及びロジスティッのための必要性がなおある。細胞は使用用意まで典型的に冷凍又は冷蔵され、多くの医薬及び自国環境に（最適でないが）許容され得るが、全ての環境、例えば前線配備軍隊に最適でない。さらに、ほとんどのユーザーは、約6ヶ月〜約10年以上の期間、周囲温度で貯蔵所又は実験室の棚に置くことができ、かつ取り出され、センサーに負荷され、試験に使用され得るエミッター細胞（例えばB細胞）試薬キットを所望する。かかるキットは例えば、エミッター細胞及び任意にCANARYアッセイのようなアッセイにおけるエミッター細胞を使用するための説明書を含む。
【００２７】
本出願人らの発明以前では、CANARY細胞試薬の貯蔵寿命は室温で2日間および4℃で2週間であった。細胞は-80℃以下の温度で永久に凍結保存され得るが、これは、液体窒素または実験室では全く有し得ない特別なフリーザーを必要とする。本明細書に室温(例えば、周囲温度)および／または4℃で長期間保存された細胞の生存能力および活性の両方を改善するための種々の処理、添加剤および遺伝子の過剰発現の例を記載する。
【００２８】
方法および材料
調査した化学添加剤は、カスパーゼインヒビターAEVD、DEVD、LEED、LEHD(50μMで毒性、WEHD(50μMで毒性)、VAD、VDVAD、YVAD、VEID、IETD (R&D Systems)、OPH-109 (MP Biomedicals)、カスパーゼインヒビターIII(Calbiochem)；プロテアーゼインヒビターAEBSF、アプロトニン、ベスタチン、カルペプチン、カテプシンLインヒビター、E-64、ロイペプチン、ペプスタチンA (Sigma)；細胞周期インヒビターラパマイシン(LC Labs)、アクチノマイシンD、マイトマイシンC、メバスタチン、ツニカマイシン、ウォルトマンニン (Sigma)；抗酸化剤亜セレン酸ナトリウム、N-アセチル-システイン、デフェロキサミン、アミノグアニジン、Trolox、エブセレン、Tempol (Sigma)、MnTBAP (A.G. Scientific)であった。
【００２９】
4℃での保存では、細胞を1〜3μMウォルトマンニン中2.5〜3×105細胞/mLの密度で、24時間37℃でインキュベートし、次いで、2%DMSO中、5×105 細胞/mLの濃度で24時間37℃でインキュベートした。次いで、細胞を、50μMコエレンテラジン(Molecular Probes、Eugene、OR)を含むアッセイ培地[CO2非依存培地、10%ウシ胎児血清、50μg/mlストレプトマイシン、50U/mlペニシリン、および250ng/mLアンホテリシンB (Life Technologies)]中、室温で2時間、暗所でインキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、以下のもの：100μM Z-LEED-FMK、50μg/mL N-アセチルシステイン、150 ng/mL 亜セレン酸ナトリウム、15μMデフェロキサミン (新たに作製したストック)、1.5mMアミノグアニジン(guanadine)(新たに作製したストック)を添加したアッセイ培地中に、5×105細胞/mLの最終濃度で再懸濁し、室温で一晩回転させた。
【００３０】
室温での保存では、細胞を0.1μg/mL ツニカマイシン中2.5〜3×105 細胞/mLの密度で24時間37℃でインキュベートし、次いで、2% DMSO中、5×105 細胞/mLの濃度で24時間37℃でインキュベートした。次いで、細胞を50μMコエレンテラジンを含むアッセイ培地中、室温で2時間、暗所でインキュベートし、２回洗浄し、100μM カスパーゼインヒビターIIIを含むアッセイ培地中、5×105細胞/mLの最終濃度で再懸濁した。
【００３１】
MagicVacシーラーを用いて細胞のチューブを食品保存バッグ内で真空密封し、最大限まで充填せずに15-mLおよび50-mLチューブに細胞を保存することにより上部に空間を提供した。抗CD40で刺激した細胞を2×105細胞/mLの濃度で抗体(BD Biosciences)とともに24時間37℃でインキュベートし、次いで、2%DMSOで処理し、上記のようにしてコエレンテラジン中でインキュベートした。熱ショック条件は42℃で2〜5時間であった。熱ショック応答を蛍ルシフェラーゼの発現を駆動するHsp70応答性プロモーターおよびトランスフェクション効率の対照としてrenilla ルシフェラーゼプラスミドでトランスフェクトすることにより測定した。細胞をエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、24〜48時間回復させ、熱ショックに供し、翌日、Dual Luciferase Reporter Assay (Promega)を用いてアッセイした。
【００３２】
Artemia p26およびアルテミン(artemin)を有するpcDNA3.1プラスミドでトランスフェクトされた細胞を、500μg/mLハイグロマイシン(Invitrogen)中で選択した。マウスGADD45βをRT-PCRによってクローニングし、pEF6/V5/His-TOPO (Invitrogen)に挿入した。このプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、5μg/mLブラスチシジン(Invitrogen) 中で選択した。PCRによってヒトBcI-XL遺伝子(Invivogen)に制限部位を付加し、これをpcDNA3.1 (Invitrogen) のNheIおよびXhoI部位に挿入し、配列を確認した。過剰発現されたが保存中に保護が与えられなかった他の遺伝子としては、Artemia p22およびp21 (２つの型、１つはアミノ酸位置62にGを有し、１つはEを有する)、BiP、XIAP、バキュロウイルスp35、および構成的に活性であることが示されているHSF1の欠失変異体 (アミノ酸221〜315)[Voellmy、Methods 35：199 (2005)]が挙げられる。
【００３３】
細胞をエレクトロポレーション(BioRad)によって270V、950μFでトランスフェクトし、限界希釈によってクローニングした。TaqMan（登録商標）Gene Expression Assays (Applied Biosystems)を使用し、定量的RT-PCRによってクローンを発現について分析した。中程度および高度の発現を有するいくつかのクローンを続く保存実験のために選択した。2% DMSOを添加した成長培地中で5×105細胞/mLの濃度でのインキュベーションによって、発光アッセイのためにB細胞を調製した。20〜24時間後、細胞を、50μMコエレンテラジン(Molecular Probes、Eugene、OR)を含むアッセイ培地[CO2非依存培地、10%ウシ胎児血清、50μg/mlストレプトマイシン、50U/mlペニシリン、および250ng/mLアンホテリシンB(Life Technologies)]中、室温で2時間、暗所でインキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、1.5-mLマイクロ遠心チューブ内でアッセイ培地中に5×105細胞/mLの最終濃度で再懸濁し、室温で一晩回転させた。調製後、細胞を1.5-mLマイクロ遠心チューブ内のアッセイ培地中に保存した。
【００３４】
結果
アッセイおよび／または保存のための調製中での細胞への化学物質の添加を、4℃または室温のいずれかで保存した場合の細胞の活性および／または生存能力の改善について試験した。化学物質は、以下のクラス：アポトーシスインヒビター、抗酸化剤、細胞周期インヒビター、およびプロテアーゼインヒビターから選択した。完全なリストを方法および材料に示す。下記参照。各添加剤は、種々の濃度で適用した。保存前および保存中1週間隔で生存能力を評価し、活性を試験した。有益であると決定された添加剤を、次いで、さらなる実験において互いに合わせた。
【００３５】
一般に、１つの保存温度で有益であることが見出された処理は、必ずしも別の保存温度において利益を提供せず、一例において(4℃で保存されたツニカマイシン処理細胞)有害であった。CANARYアッセイのための調製前に細胞をウォルトマンニンとともにインキュベートし、カスパーゼインヒビターZ-LEED-FMKおよび抗酸化剤N-アセチルシステイン、亜セレン酸ナトリウム、デフェロキサミンおよび／またはアミノグアニジンの存在下で保存した場合、4℃で保存された細胞の改善された生存能力および活性が見出された。この処理により、細胞が活性の損失なく4℃で2週間〜3週間保存され得る時間の長さが延長された。独立して適用した場合、ウォルトマンニン処理では、生存能力および活性の両方が改善されるが、Z-LEED-FMKおよび抗酸化剤中の保存では活性のみか改善されることが見出された。同様に、アッセイのための調製前に細胞をツニカマイシンとともにインキュベートし、カスパーゼインヒビターIIIの存在下で保存した場合、室温で保存された細胞の生存能力および活性が改善されることが見出された。この処理により、細胞が活性の損失なく室温で2日〜1週間保存され得る時間の長さが延長された。独立して適用した場合、ツニカマイシン処理およびカスパーゼインヒビターIII中での保存の両方により、生存能力および活性の両方が改善された。細胞の活性に改善を提供した他の処理は真空密封、上部に空間を伴う細胞の保存、および抗CD40抗血清での細胞の刺激であった。しかしながら、これらの処理後に保存された細胞の応答は相互に一致せず、図6に示す結果は、半分より多いが75%を超えない実験で生じた結果を表す。
【００３６】
ある種の遺伝子の過剰発現もまた、保存中の保護利益について研究した。成長停止およびDNA損傷誘導β(Growth Arrest and DNA-Damage-inducible beta)(GADD45β) 遺伝子は、保存中、HEK293細胞において劇的に転写を上方調節され、これらの細胞は、室温で6週間の保存後、生存可能なままである[Jack et al.、J. Cell Physiol. 206：526 (2006)]。同様に、CANARY B細胞もまた、アッセイのための調製後、GADD45βを上方調節し、保存中、該レベルを維持する(図7参照)。Artmia franciscana由来の熱ショックタンパク質は、哺乳動物細胞で発現された場合、ストレスへの耐性を付与することが示されている[例えば、Ma. et al、Cryobiol. 51：、15 (2005)；Villeneuve et al、Cell Stress Chaperones 11：71 (2006)；ならびにCollinsおよびClegg、Cell Biol. Int. 28：449 (2004)を参照]。GADD45βおよびArtmia p26およびアルテミンの過剰発現により、室温で保存されたB細胞の活性が改善され、活性の損失なく保存期間が1週間に増加した(図8参照)。一般に、アルテミンを発現する細胞の活性は、p26を発現するかもしくはGADD45βを過剰発現する細胞のものよりも良好であった。抗アポトーシスタンパク質であるBcl-XLの過剰発現により、4℃で保存された細胞の生存能力および活性の両方が改善され、最大保存期間が2〜4週間に増大した(図9参照)。いくつかの実験において、これらの細胞は、充分な活性を6週間まで維持した。上記の添加剤および処理をいずれかの過剰発現細胞株に適用した場合、観察される利益はなかった。
【００３７】
考察
CANARYは、他の方法によっては適合されない速さおよび感度の組合せを提供する。しかしながら、生細胞試薬は、一般的に、室温2日間および4℃で2週間の限定された貯蔵寿命を有する。試薬(すなわち、CANARY細胞)は-80℃以下で凍結保存され得るが、これは、液体窒素または特別なフリーザーを必要とする。保存された細胞を新たに調製された細胞と比較する実験では、保存中の活性の低下は、生存能力の減少のためだけでなく、抗原に応答した細胞あたりの発光量の減少のためでもあることが示された(図10参照)。したがって、本出願人らは、細胞の応答性および生存能力の両方を経時的に保存するための方法を探索した。本出願人らは、カスパーゼインヒビターおよび抗酸化剤の両方が、おそらく、カスパーゼインヒビターが生存能力を保存し、抗酸化剤が一般的な細胞の健康またはエクオリンの補因子であるコエレンテラジンの酸化状態のいずれかを保存するため、有益であることを見出した。
【００３８】
HEK293細胞は、良好な生存可能性を有したまま室温で6週間も保存され得、休止状態がその生存の鍵である[Jack et al.、J. Cell Physiol. 206：526 (2006)]。CANARY細胞を細胞周期を停止する化学物質で処理し、休止状態を誘導した。興味深いことに、細胞をウォルトマンニンおよびツニカマイシンで処理した場合、有益な効果が示されたが、細胞成長を阻害する濃度ではなかった。
【００３９】
熱ショック応答は、種々のストレス条件で誘導され、分子シャペロンおよびプロテアーゼを含む、折り畳まれていない中間体の凝集および沈殿から細胞を保護するタンパク質によって提示される[WinterおよびJakob、Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 39：297 (2004)；Mosser et al、Mol. Cell Biol. 17：5317 (1997)]。Artemia 熱ショック遺伝子p26およびアルテミンの発現により、室温で保存されたCANARY細胞の活性が保存されることが見いだされた。
【００４０】
GADD45βは、細胞周期調節およびアポトーシスの両方においてある役割を果たす。B細胞のCD40刺激によって誘導され、Fas誘導アポトーシス抑制を媒介するのは抗アポトーシスタンパク質である。また、これはストレス応答遺伝子として記載されており、GADD45βの発現は、本出願人らが一貫した活性を確保するのに有用であることを見出した工程であるDMSO処理後のCANARY細胞において上方調節される。GADD45βは、DMSOでの処理時にCANARY細胞において発現の変化を示すDNA損傷に関連する唯一の遺伝子ではない。GADD45βおよびヒストン1 H1c (Hist1H1c)の発現は増加するが、リンパ特異的ヘリカーゼ(Hells)の発現は減少する(図7参照)。しかしながら、GADD45βの上方調節は、保存後に同様に良好な生存能力を示すHEK293細胞においてより劇的である。遺伝子のより高度の発現を誘導することにより、本発明者らは、室温で保存されたCANARY細胞の改善された活性を示すことができた。
【００４１】
アポトーシスが保存中の生存可能細胞の減少の原因となる機構であることは証明されていないが、少なくとも一部原因であり得ることを示すいくつかの証拠がある。第１に、保存された細胞の生存能力および活性を改善する少なくとも2つのアポトーシスインヒビターがある。第２に、転写分析により、Bcl2様11(Bcl2l11)、プログラムされた細胞死1リガンド1(Pdcd1lg1)およびBcl2修飾因子(Bmf)などのいくつかのアポトーシス促進因子が上方調節されることが示された(図7参照)。Bmfは、抗アポトーシスファミリーメンバー(Bcl2、Bcl-w、Mcl-1およびBcl-XL)に物理的に結合することが示されており、プロアポトーシスタンパク質を捕捉し、不活性化させるその能力を阻害し、それによりアポトーシス経路を抑制解除すると考えられる。さらに、哺乳動物細胞株におけるBmfの過剰発現により、上記の抗アポトーシスタンパク質を過剰発現することにより克服され得る効果であるアポトーシスが誘導される。本出願人らは、4℃で保存後にBcl-XLを過剰発現する細胞の生存能力および活性の両方における改善を示した。興味深いことに、他のものはp35の発現もまたBmf過剰発現の効果を逆転することを示したが、CANARY細胞において発現された場合、明白な利益を提供しなかった。
【００４２】
別の観察は、CANARY細胞で過剰発現された遺伝子の多くは観察可能な効果は有しなかったが、XIAPの過剰発現では、抗原への細胞応答が完全に阻害されたことであった。これは、ヒトおよびマウスの両方のXIAPをトランスフェクトした場合、および試験したすべてのクローンにおいて起こったため、不測の挿入効果のためではなさそうである。
【００４３】
これらの結果は、エミッター細胞などの生細胞試薬の貯蔵寿命が延長され得ることを示す。アポトーシスを阻害するか、または分子シャペロンとして作用する遺伝子の過剰発現により、細胞死およびおそらく細胞成分の分解からの保護が付与され、CANARY細胞の貯蔵寿命が室温で1週間および4℃で少なくとも約4週間に延長された。
【００４４】
本発明を、その好ましい態様を参照して具体的に示し、記載したが、形態および詳細における種々の変形が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者によって理解されよう。
【００４５】
本明細書に挙げたすべての参考文献、特許および特許出願の関連する教示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図1は、細胞保存技術の概要及びスフェロイド(spheroid)形成中のB細胞の写真である。
【図２】図2は、室温で1週間の保存後の細胞活性を示すグラフである。
【図３】図3は、パンカスパーゼIIIインヒビターの有り無しでの、室温で1週間の保存後の細胞活性を示す直線グラフ及び室温で1〜3週間の保存後の生存細胞のパーセントの棒グラフである。
【図４】図4は、HEK293細胞の休止の誘導、保存及び回復中の遺伝子発現分析の結果を示すグラフである。
【図５】図5は、異なる温度及び乾燥保存条件での細胞の保存及び使用の条件のB細胞ロジスティックの概要である。
【図６】図6（a）及び（b）は、長期間保存されるCANARY細胞の活性を増強する処理及び添加物を有する結果のグラフである。図6（a）は、細胞がアッセイのための調製前にウォルトマンニンでインキュベートされ、かつカスパーゼインヒビターZ-LEED-FMK及び抗酸化物N-アセチルシステイン、セレナイトナトリウム、デフェロキサミン、並びにアミノグアナジンの存在下で保存される場合、4℃で保存された細胞の改善された生存能力及び活性を示すグラフである。図6（b）は、細胞がアッセイのための調製前にツニカマイシンでインキュベートされ、かつカスパーゼインヒビターIIIの存在下で保存される場合、室温で保存される細胞の改善された生存能力及び活性を示すグラフである。この処置は、細胞が2日〜1週間活性の損失がなく、室温で保存され得る時間の長さを拡張した。
【図７】図7は、対照と比較して（ｘ軸の「0」）、2％DMSOで24時間処置後（x軸の「1」）、室温で24時間回転後（x軸の「2」）、及び4℃で1週間保存した後（x軸の「3」）の、CANARY細胞における遺伝子の発現パターン（レベル）のグラフである。
【図８】図8は、アルテミア  フランシスカナ  熱ショック遺伝子であるアルテミンの過剰発現が室温で保存された細胞の活性を改善し、活性の損失が1週間までない保存時間を増大することを示すグラフである。
【図９】図9は、抗アポトーシス遺伝子であるBcl-XLの過剰発現が4℃で保存された細胞の生存能力及び活性の両方を改善し、2〜4週間まで保存時間を増大することを示す棒グラフである。
【図１０】図10は、新しく調製されたCANARY細胞対保存されたCANARY細胞の活性の比較を示すグラフである。Y.pestisに特異的な新しく調製された（新しいもの）細胞、及び３週間室温で保存された（保存されたもの）細胞の等しい数（１６００細胞）がCANARYアッセイの抗原への応答について比較された。
【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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