(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相と、前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、を含有するＨＩＶ抗原検出用試薬を提供する。
2009084369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、
固相と、
前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、
を含有するＨＩＶ抗原検出用試薬。
【請求項２】
前記第１抗体を含む第１試薬と、前記固相としての粒子を含む第２試薬と、前記第２抗体を含む第３試薬とを備えた請求項１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬。
【請求項３】
前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質を含む第４試薬をさらに備えた請求項２に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬。
【請求項４】
前記固相がアビジンまたはストレプトアビジンを保持し、前記固相に結合可能な物質がビオチンである、請求項１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬。
【請求項５】
前記固相が、磁性粒子である、請求項１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬。
【請求項６】
検体に含まれるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体との複合体を固相上に形成し、この複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出するＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項７】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する工程、
前記混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項８】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
第１混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合する第２混合工程、
第２混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項９】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
第１混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、
第２混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１０】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、
第１混合工程で得られた混合物と、第２混合工程で得られた混合物とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１１】
前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質と、前記粒子上に形成された前記複合体とを混合する工程を備え、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応に基づいてＨＩＶ抗原を検出する請求項７に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１２】
前記基質が、発光基質または発色基質であり、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応によって生じる発光または発色を検出することによりＨＩＶ抗原を検出する請求項１１に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１３】
前記固相が、磁性粒子である、請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の検出用試薬及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染することにより引き起こされる疾患である。従来、ＡＩＤＳの診断は、血液中のＨＩＶ抗体を検出することで行われている。しかし、ＨＩＶ感染初期の血液中では抗体価が上がらない空白期間が存在する。そのため、ＨＩＶ抗体を検出する検査方法では、初期のＨＩＶ感染患者を見逃す可能性がある。【０００３】
このような問題点を解決するために、血液中のＨＩＶ抗原を検出する方法が知られている。また、安定な抗原性を示す１型ＨＩＶウイルスのｐ２４コアタンパク質（以下、「ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原」という）を検出する方法も知られている。従来公知の方法は、例えば米国特許第５１７３３９９号公報（特許文献１）、米国特許第４９８３５２９号公報（特許文献２）、米国特許第６４３２６３３号公報（特許文献３）などに記載されるサンドイッチイムノアッセイ方法である。
【特許文献１】米国特許第５１７３３９９号公報
【特許文献２】米国特許第４９８３５２９号公報
【特許文献３】米国特許第６４３２６３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
血液中のＨＩＶ抗原の検出は、ＨＩＶ抗原が血液中に微量しか含まれていないので、高い感度が要求される。また、従来のイムノアッセイ方法では、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を検出するための抗体としてマウスモノクローナル抗体が用いられている。よって、検体がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を含む場合、試薬として含まれるマウスモノクローナル抗体と、検体中のＨＡＭＡとが反応して、偽陽性の結果を与える可能性がある。【０００５】
そこで、本発明は、ＨＡＭＡによる偽陽性を低減できるとともに、高感度にＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を検出できる試薬及びその方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、
１）ヒトモノクローナル抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイ法により、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を高感度に検出できること；及び
２）ヒトモノクローナル抗体を用いることにより、ＨＡＭＡを含む検体であっても偽陽性を低減できること
を見出し、本発明を完成した。【０００７】
よって、本発明は、
（１）ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相と、前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、を含有するＨＩＶ抗原検出用試薬；
（２）前記第１抗体を含む第１試薬と、前記固相としての粒子を含む第２試薬と、前記第２抗体を含む第３試薬とを備えた（１）に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬；
（３）前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質を含む第４試薬をさらに備えた（２）に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬；
（４）前記固相がアビジンまたはストレプトアビジンを保持し、前記固相に結合可能な物質がビオチンである、（１）〜（３）の何れか１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬；
（５）前記固相が、磁性粒子である、（１）〜（４）の何れか１に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬；
（６）検体に含まれるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体との複合体を固相上に形成し、この複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出するＨＩＶ抗原検出方法；
（７）前記抗原と、前記第１抗体とを混合する工程、前記混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる（６）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（８）前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、第１混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合する第２混合工程、第２混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる（６）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（９）前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、第１混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、第２混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる（６）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（１０）前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、第１混合工程で得られた混合物と、第２混合工程で得られた混合物とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる（６）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（１１）前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質と、前記粒子上に形成された前記複合体とを混合する工程を備え、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応に基づいてＨＩＶ抗原を検出する（７）〜（１０）の何れか１に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（１２）前記基質が、発光基質または発色基質であり、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応によって生じる発光または発色を検出することによりＨＩＶ抗原を検出する（１１）に記載のＨＩＶ抗原検出方法；
（１３）前記固相が、磁性粒子である、（６）〜（１２）の何れか１に記載のＨＩＶ抗原検出方法
を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＨＩＶ抗原の検出用試薬及び検出方法は、ヒトモノクローナル抗体を用いてＨＩＶ抗原を検出する。そのため、ＨＡＭＡを含む検体であっても偽陽性の結果を低減できる。また、従来の方法に比べてより高感度にＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を検出することができる。よって、ＨＩＶ抗原の検出に必要な検体の量を低減できる。さらに、検体の前処理を行わなくても高精度の結果を提供できる。よって、検査の煩雑さを低減できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の、第１試薬、第２試薬及び第３試薬を含むＨＩＶ抗原検出用試薬を概念的に表した図を示す。
【図２】本発明のＨＩＶ抗原検出方法の反応を概念的に表した図を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のＨＩＶ抗原検出用試薬は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相と、前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、を含有する。本発明のＨＩＶ抗原検出用試薬は、単一の試薬及び複数の試薬から構成される試薬キットを含む。本発明のＨＩＶ抗原検出用試薬において、第１抗体、固相、及び第２抗体は、それぞれ別々の試薬に含まれていてもよい。また、第１抗体、固相、及び第２抗体のいずれか二つ、又はそれら全てが、同一の試薬に含まれていてもよい。例えば、第１抗体を含む試薬と、固相及び第２抗体を含む別の試薬とを含む試薬キットが挙げられる。この場合、第２試薬中の第２抗体は、固相に結合していてもよい。また、第１抗体、固相、及び第２抗体を全て含む試薬も挙げられる。この場合も、試薬中の第２抗体は、固相に結合していてもよい。【００１１】
本発明のＨＩＶ抗原検出用試薬としては、第１抗体、固相及び第２抗体を、別々の試薬に含む、試薬キットが好ましい。ここで、試薬に含まれる固相としては、後述する粒子が挙げられる。すなわち、前記第１抗体を含む第１試薬と、前記固相としての粒子を含む第２試薬と、前記第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットが好ましい。
図１に、該試薬キットの第１試薬、第２試薬及び第３試薬の模式図を示す。第１試薬には第１抗体、第２試薬には固相としての粒子、及び第３試薬に第２抗体がそれぞれ含まれている。【００１２】
本発明において用いられる、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１及び第２のヒトモノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識できるヒトモノクローナル抗体であれば、特に限定されない。抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭなどを含む。該抗体は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識できるのであれば、抗体のフラグメント及びその誘導体であってもよい。抗体のフラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓＦｖフラグメントなどが挙げられる。これらのフラグメントは、例えばペプシン処理のような従来公知の方法により抗体を処理することにより得ることができる。【００１３】
ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識するヒトモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、
（１）ＨＩＶに感染した患者のリンパ球と、マウスミエローマ細胞とを融合させる。次に、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。そして、選択されたハイブリドーマにより産生させることにより抗体を得る方法；
（２）ヒト型免疫グロブリンを産生できる哺乳動物（例えばXENOMOUSE（登録商標））をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原で免疫することにより目的の抗体を得る方法；
（３）ＨＩＶ感染患者の血液から採取したＢリンパ球にエプスタイン−バーウイルスを感染させる。次に、目的の抗体を産生するＢリンパ球をスクリーニングする。そして、スクリーニングされたＢリンパ球をクローニングすることにより得られる、目的抗体産生遺伝子をＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの哺乳動物細胞に導入して、目的抗体を得る方法；
などが挙げられる。また、市販品として入手することもできる。具体例としては、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp.1624-1628, 1989に記載されているＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識するヒトモノクローナル抗体や、バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）から入手できるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識するヒトモノクローナル抗体などが挙げられる。【００１４】
本発明においては、上記の第１及び第２のヒトモノクローナル抗体として、バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）から入手されるヒトモノクローナル抗体を用いることが好ましい。【００１５】
上記の第１及び第２のヒトモノクローナル抗体は、それぞれ、抗原の異なる部位（エピトープ）を認識できる抗体である。【００１６】
上記の第１抗体は、検出可能な標識物質で標識されている。該標識物質は、通常の免疫測定法において用い得る標識物質であれば特に限定されない。例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。
酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。
上記の標識物質は酵素が好ましく、特に好ましくはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である。【００１７】
第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識する方法は、当該分野で通常用いられている方法であれば特に限定されない。例えば、抗体中のチオール基（−ＳＨ基）を用いて上記の標識物質を抗体と結合させる方法が知られている。具体的には、チオール基と反応できる官能基、例えばマレイミド基を導入した上記の標識物質を、第１のヒトモノクローナル抗体と反応させることにより、上記の抗体を標識物質で標識できる。【００１８】
上記の第２抗体は、固相に結合可能である。第２抗体と固相との間の結合は、第２抗体の固相に結合可能な物質（以下、「固相結合用物質」という場合がある）と、固相に保持された結合物質との間の結合によるものが好ましい。
上記の固相結合用物質と結合物質は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の検出方法が行われる条件下で、特異的に結合できる物質の組み合わせであれば特に限定されない。これらの組み合わせとしては、例えばビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが挙げられる。ハプテンと抗ハプテン抗体としては、例えばジニトロフェノール（ＤＮＰ）と抗ＤＮＰ抗体が挙げられる。【００１９】
上記の第２抗体と固相との結合は、ビオチン−アビジン結合又はビオチン−ストレプトアビジン結合によるものが好ましい。よって、固相結合用物質と結合物質の組み合わせは、ビオチンとアビジン又はビオチンとストレプトアビジンの組み合わせが好ましい。
ここで、固相結合用物質と結合物質の組み合わせは、上記の特異的に結合できる物質の組み合わせから選択されればよく、特に限定されない。例えば、固相結合用物質がビオチンを含む場合、結合物質はアビジン又はストレプトアビジンである。逆に、固相結合用物質がアビジン又はストレプトアビジンを含む場合、結合物質はビオチンである。ここで、好ましくは、固相結合用物質がビオチンを含み、結合物質がアビジン又はストレプトアビジンである。言い換えると、第２抗体がビオチンを結合させた抗体であり、固相がアビジン又はストレプトアビジンを保持させた固相であることが好ましい。【００２０】
上記の固相結合用物質を第２のヒトモノクローナル抗体に結合させて、固相に結合可能な第２抗体を得る方法は、当該分野において公知である。例えば、抗体中の一級アミノ基（−ＮＨ2基）やチオール基などと反応性を有する官能基を用いて、磁性粒子結合物質を第２のヒトモノクローナル抗体に結合することができる。一級アミノ基と反応性を有する官能基としては、スクシンイミド基（ＮＨＳ基）などが挙げられる。チオール基と反応性を有する官能基としては、マレイミド基などが挙げられる。【００２１】
上記の固相の材料は、免疫測定に用いられる通常の固相の材料であれば特に限定されない。例えば、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーンなどのポリマー材料；アガロース；ゼラチン；赤血球；シリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、磁性体などの無機材料などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせてもよい。【００２２】
また、固相の形状としては、免疫測定に用いられる通常の固相の形状であれば特に限定されない。例えば、マイクロタイタープレート、試験管、粒子などが挙げられる。ここで、試薬に含有される固相としては、粒子が好ましい。固相が粒子であれば、容易に試薬に含有させることができる。粒子としては、磁性粒子、ラテックス、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。【００２３】
なお、上記の結合物質は、直接固相に保持されてもよい。また、固相の表面に予め被覆された物質に保持されてもよい。例えば、固相の表面がアミノ基、カルボキシル基などの親水基を有する場合、結合物質を、該親水基に化学反応により結合させることで、固相に保持させることができる。また、固相の表面がポリマーやタンパク質などの物質で被覆されている場合、結合物質を、該物質に化学結合や分子間力を用いて結合させることで、固相に保持させることができる。【００２４】
本発明の固相としては、磁性粒子が好ましい。磁性粒子は、磁性を有する粒子を基材として含む粒子である。このような磁性粒子は当該技術において公知である。基材として例えばＦｅ2Ｏ3及び／又はＦｅ3Ｏ4、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。好ましい磁性粒子として、
（１）磁性粒子の表面がポリマーやタンパク質などで被覆された磁性粒子；
（２）磁性粒子の表面からカルボキシル基が露出した磁性粒子；
（３）磁性を有する基材が樹脂中に分散した構成を有する磁性粒子；
などが挙げられる。これらの磁性粒子は、上述の結合物質を、容易に保持することができる。【００２５】
上記の結合物質を磁性粒子に保持させる方法は、当該技術分野において公知である。例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。
例えば、磁性粒子にアビジン又はストレプトアビジンを保持させる場合、表面にカルボキシル基が露出した磁性粒子を用い、化学反応により磁性粒子にアビジン又はストレプトアビジンを保持させることができる。より具体的には、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下に、アビジンまたはストレプトアビジンの分子中のアミノ基を、粒子本体の表面に露出するカルボキシル基に反応させてアミド結合を形成することにより、アビジン又はストレプトアビジンを磁性粒子に保持させることができる。また、磁性粒子の表面がポリマーやタンパク質などの物質で被覆されている場合、アビジンまたはストレプトアビジンを、該物質に化学結合や分子間力を用いて結合させることで、固相に保持させることができる。また、磁性を有する基材が樹脂中に分散した構成を有する磁性粒子の場合、アビジンまたはストレプトアビジンを、該樹脂に化学結合や分子間力を用いて結合させることで、固相に保持させることができる。【００２６】
本発明のＨＩＶ検出用試薬は、第１抗体、固相及び第２抗体以外に、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の検出を妨げない及び／又は検出を促進できるその他の成分を含むことができる。その他の成分としては、界面活性剤、保存剤、血清タンパク質などが挙げられる。例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットの場合、試薬キットを構成する各々の試薬が、上記のその他の成分を含むことができる。【００２７】
本発明のＨＩＶ検出用試薬は、第１抗体、固相としての粒子及び第２抗体を、上記のその他の成分とともに適切な溶媒に懸濁又は溶解した、液体の状態であってもよい。また、該液体を凍結乾燥などの処理により固体の状態にしたものであってもよい。好ましくは、本発明のＨＩＶ検出用試薬は、液体である。例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットの場合、第１試薬、第２試薬及び第３試薬の全てが、液体である試薬キットが好ましい。
適切な溶媒としては、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の検出を妨げない溶媒であれば特に限定されない。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）などを用いることができる。
第１試薬、第２試薬及び第３試薬のｐＨは、６．０〜１０．０程度が好ましい。【００２８】
上記の第１抗体及び第２抗体は、用いる抗体の種類にもよるが、これらの抗体が検体中に含まれ得る抗原と反応する際に、該抗原に対して過剰量で存在することが好ましい。すなわち、抗原と反応する際の第１及び第２抗体の濃度は、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５μｇ／ｍｌであればよい。
また、上記のＨＩＶ検出用試薬中の固相が磁性粒子である場合、ＨＩＶ検出用試薬は、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの磁性粒子を含有することが好ましい。【００２９】
本発明のＨＩＶ検出用試薬は、上記の第１抗体を標識する標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を含む別の試薬を有する、試薬キットであることが好ましい。例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットの場合、該酵素に対する基質を含む第４試薬をさらに含むことが好ましい。該酵素に対する基質は、上記の標識物質として例示した酵素に応じて、従来公知の化学発光基質や生物発光基質などの発光基質、及び発色基質などを用いることができる。上記の酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質としては、例えば、AMPPD（登録商標）（3-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-(3"-ホスフォリルオキシ)フェニル-1,2-ジオキセタン）、ＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発色基質が挙げられる。【００３０】
本発明のＨＩＶ検出用試薬は、洗浄液をさらに含むことができる。例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットの場合、別の試薬として洗浄液をさらに含むことが好ましい。該洗浄液は、ｐＨ６．０〜１０．０程度の緩衝液が好ましく、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。【００３１】
本発明は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の検出方法（以下、単に「検出方法」ともいう）も提供する。【００３２】
本発明の検出方法は、検体に含まれるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に、固相に結合可能な物質を結合した第２抗体との複合体を固相上に形成し、この複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する。すなわち、本発明の検出方法は、第１抗体と抗原、及び固相上に形成された第２抗体と抗原の、抗原−抗体反応によるサンドイッチ法を用いて、目的抗原（ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原）を検出することができれば、特に限定されない。
よって、例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットを用いた検出方法の場合、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を含む可能性がある検体、第１試薬、第２試薬、及び第３試薬は、いずれの順序で混合してもよい。【００３３】
本発明の検出方法は、最初にＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と第１抗体を混合する工程を行うことが好ましい。この工程により、前記抗原と第１抗体が接触し、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と第１抗体とからなる複合体が形成される。次に、第２抗体を用いて、固相にＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と第１抗体と第２抗体からなる複合体を形成し、該複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する。この順序でＨＩＶ抗原を検出すると、より高い感度で目的抗原を検出することができる。この順序でＨＩＶ抗原を第１及び第２抗体により捕捉する場合を概念的に表した図を、図２に示す。【００３４】
例えば、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットを用いた場合、好ましい検出方法は、
（ａ）ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と第１試薬とを混合して、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と第１抗体とからなる複合体を形成させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で形成した複合体を、第３試薬に含まれる第２抗体を用いて、第２試薬に含まれる固相としての粒子に形成する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で前記粒子上に形成された前記複合体の、第１抗体の標識物質を検出する工程とを含む。この検出方法により、より高い感度でＨＩＶ抗原を検出することができる。【００３５】
抗原と第１抗体を混合する工程を行った後に行われる、上述の第２抗体を用いて、固相にＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と第１抗体と第２抗体からなる複合体の形成としては、以下の（１）〜（４）が挙げられる。【００３６】
（１）混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合する：
混合工程で得られた混合物には第１抗体−抗原からなる複合体（以下、「第１抗体−抗原複合体」という場合がある）が含まれている。（１）の場合、第１抗体−抗原複合体は、第２抗体と粒子に、同時に接触する。第２抗体は、該複合体と結合して第１抗体−抗原−第２抗体からなる複合体（以下、「第１抗体−抗原−第２抗体複合体」という場合がある）を形成した後に、粒子と結合する。又は、第２抗体は、粒子と結合した後に、第１抗体−抗原複合体と結合する。結果として、第１抗体−抗原−第２抗体複合体が粒子上に形成される。【００３７】
（２）混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合した後に、前記第２抗体を混合する：
（２）の場合、混合物中の第１抗体−抗原複合体は、最初に粒子と接触する。第１抗体−抗原複合体は、粒子との結合部位を有さない。従って、第１抗体−抗原複合体は、粒子に結合しない。次いで、第２抗体を、抗原−第１抗体複合体と粒子に接触させる。これにより、第２抗体は、抗原−第１抗体複合体と結合して第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成した後に、粒子と結合する。又は、第２抗体は、粒子と結合した後に、抗原−第１抗体複合体と結合する。結果として、粒子上に第１抗体−抗原−第２抗体複合体が粒子上に形成される。【００３８】
（３）混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合した後に、前記固相としての粒子を混合する：
（３）の場合、混合物中の第１抗体−抗原複合体は、最初に第２抗体と接触する。これにより、第１抗体−抗原−第２抗体複合体が形成される。その後、第１抗体−抗原−第２抗体複合体は、粒子と接触する。これにより、第１抗体−抗原−第２抗体複合体と粒子が結合する。結果として、第１抗体−抗原−第２抗体複合体が粒子上に形成される。【００３９】
（４）前記固相としての粒子と前記第２抗体とを混合して得られた混合物と、混合工程で得られた混合物とを混合する：
（４）の場合、まず、第２抗体と粒子とが接触する。これにより、第２抗体は、粒子に結合する。次いで、混合物中の第１抗体−抗原複合体と、粒子に結合した第２抗体とが接触する。これにより、粒子に結合した第２抗体と、第１抗体−抗原複合体とが結合する。結果として、第１抗体−抗原−第２抗体複合体が粒子上に形成される。また、粒子に結合していない第２抗体が、抗原−第１抗体複合体と結合して第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成した後に、第１抗体−抗原−第２抗体複合体が粒子上に形成される場合もある。【００４０】
なお、第１抗体を含む第１試薬と、固相としての粒子を含む第２試薬と、第２抗体を含む第３試薬とを含む試薬キットを用いた検出方法の場合、上記の工程（ｂ）は、
（ｂ１）工程（ａ）で形成した複合体と第２試薬と第３試薬とを混合することにより行われるか、
（ｂ２）工程（ａ）で形成した複合体と第２試薬とを混合した後に、第３試薬を混合することにより行われるか、
（ｂ３）工程（ａ）で形成した複合体と第３試薬とを混合した後に、第２試薬を混合することにより行われるか、又は
（ｂ４）第２試薬と第３試薬とを混合した後に、工程（ａ）で形成した複合体を混合することにより行われる。【００４１】
上記のそれぞれの場合に考えられる反応は、次のとおりである。
（ｂ１）工程（ａ）で形成した複合体と第２試薬と第３試薬とを混合させる場合：
工程（ａ）で形成した抗原−第１抗体複合体は、第３試薬中の第２抗体と第２試薬中の粒子とに、同時に接触する。このことにより、第２抗体は、抗原−第１抗体複合体と結合して第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成した後に、粒子と結合する。又は、第２抗体は、粒子と結合してから抗原−第１抗体複合体と結合する。結果として、粒子上に第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成することができる。【００４２】
（ｂ２）工程（ａ）で形成した複合体と第２試薬とを混合した後に、第３試薬を混合する場合：
工程（ａ）で形成した抗原−第１抗体複合体を第２試薬中の粒子と接触させる。この場合、第１抗体及び抗原は、粒子との結合部位を有さない。従って、抗原−第１抗体複合体は、粒子に結合しない。次いで、第３試薬に含まれる第２抗体を、抗原−第１抗体複合体と粒子に接触させる。これにより、第２抗体は、抗原−第１抗体複合体と結合して第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成した後、粒子と結合する。又は、第２抗体は、粒子と結合した後、抗原−第１抗体複合体と結合する。結果として、粒子上に第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成することができる。【００４３】
（ｂ３）工程（ａ）で形成した複合体と第３試薬とを混合した後に、第２試薬を混合する場合：
工程（ａ）で形成した抗原−第１抗体複合体と第３試薬中の第２抗体とを接触させる。これにより、第１抗体−抗原−第２抗体複合体が形成される。その後、第２試薬に含まれる粒子を、第１抗体−抗原−第２抗体複合体に接触させる。結果として、第１抗体−抗原−第２抗体複合体を粒子上に形成することができる。【００４４】
（ｂ４）第２試薬と第３試薬とを混合した後に、工程（ａ）で形成した複合体を混合する場合：
第３試薬中の第２抗体と第２試薬中の粒子とを接触させることにより、第２抗体の全量又は一部分は、粒子に結合する。次いで、工程（ａ）で形成した抗原−第１抗体複合体を、第２試薬及び第３試薬の混合物と混合する。これにより、粒子に結合した第２抗体が該複合体と結合して、粒子上に第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成する。又は、粒子に結合していない第２抗体が、抗原−第１抗体複合体と結合して第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成し、この複合体が粒子と結合する。結果として、粒子上に第１抗体−抗原−第２抗体複合体を形成することができる。【００４５】
本発明の方法において、上記の第１抗体及び第２抗体は、用いる抗体の種類にもよるが、検体中に含まれ得る抗原に対して過剰量で反応させることが好ましい。すなわち、抗原と反応する際の第１及び第２抗体の濃度は、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５μｇ／ｍｌであればよい。上記のＨＩＶ検出用試薬は、このような量の抗体を提供し得る濃度で第１及び第２抗体を含有することが好ましい。
また、上記の固相が磁性粒子である場合、磁性粒子は、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ１０／ｍｌの濃度で存在することが好ましい。【００４６】
上記の標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する方法は、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。すなわち、標識物質が放射性同位元素である場合、例えばシンチレーションカウンターなどの従来公知の装置を用いて放射能を検出する方法を用いることができる。また、標識物質が蛍光物質である場合、ルミノメータなどの従来公知の装置を用いて蛍光を検出する方法を用いることができる。好ましくは、上記の標識物質が酵素であり、該酵素を、上記の第４試薬中の酵素に対する基質と反応させて得られる発光又は発色を検出する方法である。発光又は発色の検出は、分光光度計、ルミノメータなどの従来公知の装置を用いて行うことができる。【００４７】
なお、前記標識物質が酵素の場合、上述の検出方法は、該酵素の基質と、粒子上に形成された第１抗体−抗原−第２抗体複合体とを混合する工程をさらに備える。前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応に基づいてＨＩＶ抗原を検出する。ここで、基質としては、上述の発光基質及び発色基質が挙げられる。基質として発光基質又は発色基質を用いた場合、酵素と基質との反応により生じる、発光又は発色を検出することで、ＨＩＶ抗原を検出することができる。【００４８】
ここで、検出とは、測定も含む概念である。標準物質の検出と同様に、標識物質の測定も、標識物質の種類に応じ、従来公知の装置を使用して行うことができる。測定された値を用いて、既知の濃度のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を含む溶液から得られた標準曲線により、検体中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の量を定量することもできる。
【実施例】
【００４９】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。
実施例１〜７及び比較例１で用いた試薬の作製方法について説明する。
（１）ビオチン標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体の作製
バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）より、認識部位の異なる２種類の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を入手した。入手した２種類のうちの１つの抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を、公知の方法に従って調製されたビオチン−マレイミドと反応させることにより、ビオチン標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を得た。【００５０】
（２）ビオチン標識抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体の作製
バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）より、抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体を入手した。抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体を、公知の方法に従って調製されたビオチン−マレイミドと反応させることにより、ビオチン標識抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体を得た。【００５１】
（３）アルカリホスファターゼ（ALP）標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体の作製
バイオマリック社（BioMARIC、ベルギー）より入手した認識部位の異なる２種類の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体のうち、（１）でビオチン標識した抗体とは別の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を、公知の方法に従って調製されたALP−マレイミドと反応させることにより、ALP標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を得た。【００５２】
（４）アルカリホスファターゼ（ALP）標識抗ｐ２４Ｆａｂ’の作製
上記（３）でALP標識するために選択した抗体と同じ抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を、常法に従ってペプシン消化してＦａｂ’を調製した後、（３）と同様にALP−マレイミドと反応させることにより、ALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’を得た。【００５３】
下記の３種類の測定手順で、サンドイッチイムノアッセイ法により、HIV-1p24抗原の測定を行った。
なお、以下の手順において、抗体は抗体緩衝液（０．１Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）(pH 6.0)、１％ウシ血清アルブミン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム）を用いて希釈した。【００５４】
測定手順１
1)  反応容器に、標識物質で標識された第１抗体として、ALP標識抗ｐ２４モノクローナル抗体又はALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’（０．１Ｕ／ｍＬ）５０μＬと、試料としてのHIV-1p24抗原溶液（濃度０又は３２５ｐｇ／ｍＬ、バイオマリック社製）５０μＬを分注し、４２℃で２分間反応させた。
2)  ストレプトアビジン磁性粒子（平均粒子２μｍ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)中に５ｍｇ／ｍＬ）３０μＬを加え、４２℃で２．５分間反応させた。
3)  磁性粒子に結合可能な第２抗体として、上記のビオチン標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体（０．８μｇ／ｍＬ）５０μＬを分注し、４２℃で２．５分間反応させた後、磁気分離した。
4)  洗浄液（０．０１Ｍ  ＭＥＳ(pH 6.5)、０．１％アジ化ナトリウム）１００〜７００μＬを加えて撹拌し、磁気分離した。この洗浄操作を計４回行った。
5)  分散液（０．０１Ｍ  ＭＥＳ(pH 6.5)、０．１％アジ化ナトリウム）５０μＬを加えて撹拌し、ストレプトアビジン磁性粒子を分散した。
6)  発光基質液（CDP-Star, Applied Biosystems社）１００μＬを加えて撹拌し、４２℃で５分間反応させ、ルミノメータで発光強度を測定した。【００５５】
測定手順２
1)  反応容器に、磁性粒子に結合可能な第２抗体としてのビオチン標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体（０．８μｇ／ｍＬ）５０μＬと、試料としてのHIV-1p24抗原溶液（濃度：０又は３２５ｐｇ／ｍＬ）５０μＬとを分注し、４２℃で２分間反応させた。
2)  ストレプトアビジン磁性粒子（平均粒子２μｍ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)中に５ｍｇ／ｍＬ）３０μＬを加え、４２℃で２．５分間反応させた。
3)  標識物質で標識された第１抗体として、ALP標識抗ｐ２４モノクローナル抗体又はALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’（０．１Ｕ／ｍＬ）５０μＬを加えて、４２℃で２．５分間反応させた後、磁気分離した。
4)  洗浄液１００〜７００μＬを加えて撹拌し、磁気分離した。この洗浄操作を計４回行った。
5)  分散液５０μＬを加えて撹拌し、ストレプトアビジン磁性粒子を分散した。
6)  発光基質液（CDP-Star, Applied Biosystems社）１００μＬを加えて撹拌し、４２℃で５分間反応させ、ルミノメータで発光強度を測定した。【００５６】
測定手順３
1)  反応容器に、磁性粒子に結合可能な第２抗体としてのビオチン標識抗ｐ２４モノクローナル抗体（０．８μｇ／ｍＬ）５０μＬと、試料としてのHIV-1p24抗原溶液（濃度：０又は３２５ｐｇ／ｍＬ）５０μＬとを分注し、４２℃で２分間反応させた。
2) ストレプトアビジン磁性粒子（平均粒子２μｍ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中に５ｍｇ／ｍＬ）３０μＬを加え、４２℃で２．５分間反応させた後、磁気分離した。
3)  洗浄液１００〜７００μＬを加えて撹拌し、磁気分離した。この洗浄操作を計４回行った。
4)   標識物質で標識された第１抗体として、ALP標識抗ｐ２４モノクローナル抗体又はALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’（０．１Ｕ／ｍＬ）を５０μＬ加えて、４２℃で２．５分間反応させた後、磁気分離した。
5)  洗浄液１００〜７００μＬを加えて撹拌し、磁気分離した。この洗浄操作を計４回行った。
6)  分散液５０μＬを加えて撹拌し、ストレプトアビジン磁性粒子を分散した。
7)  発光基質液（CDP-Star, Applied Biosystems社）１００μＬを加えて撹拌し、４２℃で５分間反応させ、ルミノメータで発光強度を測定した。【００５７】
実施例１
上記の（１）で調製したビオチン標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体（０．８μg／ｍL）と、上記の（３）で調製したALP標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体とを用いて、測定手順１に従って測定を行った。【００５８】
比較例１
実施例１のビオチン標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体の代わりに、上記の（２）で調製したビオチン標識抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体（０．８、４．０、８．０μｇ／ｍＬ）を用いて測定手順１に従い測定を行った。【００５９】
上記の実施例１及び比較例１で得られた結果に基づいて、HIV-1p24抗原を含む試料（抗原溶液）を用いて得られた結果（特異的シグナル）と、HIV-1p24抗原を含まない試料を用いて得られた結果（非特異的シグナル）との比（シグナル／ノイズ比；Ｓ／Ｎ比）を求めた。結果を表１に示す。
【表１】
2009084369.tif 000003
【００６０】
上記の結果から、本発明に従って抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いると、抗体の使用量が同等である場合（０．８μｇ／ｍＬ）、抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体よりもHIV-1p24抗原測定におけるＳ／Ｎ比及び特異的シグナルが５倍近く高いことがわかる。また、抗ｐ２４マウスモノクローナル抗体が最も高い特異シグナルを示す４．０μｇ／ｍＬでさえ、特異シグナルは１／２以下であったことから、抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いると、高い感度でHIV-1p24抗原を検出できることがわかる。【００６１】
実施例２
実施例１と同様の抗体、すなわち上記の（１）で調製したビオチン標識ｐ２４ヒトモノクローナル抗体と、上記の（３）で調製したALP標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体（以下、「ＩｇＧ−ＡＬＰ」という）とを用いて、測定手順１で測定を実施した。【００６２】
実施例３
実施例２と同じ抗体を用いて、測定手順２で測定を実施した。【００６３】
実施例４
実施例２と同じ抗体を用いて、測定手順３で測定を実施した。【００６４】
実施例５
実施例２のALP標識抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体の代わりに、上記の（４）で調製したALP標識抗ｐ２４Ｆａｂ’（Ｆａｂ’−ＡＬＰ）を用いて測定手順１で測定を実施した。【００６５】
実施例６
実施例５と同じ抗体を用い、測定手順２で測定を実施した。【００６６】
実施例７
実施例５と同じ抗体を用い、測定手順３で測定を実施した。【００６７】
上記の実施例２〜７で得られた結果に基づいて、HIV-1p24抗原を含む試料（抗原溶液）を用いて得られた結果（特異的シグナル）と、HIV-1p24抗原が存在しない試料を用いて得られた結果（非特異的シグナル）との比（シグナル／ノイズ比；Ｓ／Ｎ比）を求めた。結果を表２及び３に示す。
【表２】
2009084369.tif 000004
【表３】
2009084369.tif 000005
【００６８】
上記の結果から、本発明に従って抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いると、測定手順１〜３のいずれの反応順序であっても、また、抗体がＩｇＧ−ＡＬＰ又はＦａｂ’−ＡＬＰのいずれであっても、特異シグナルが確認できることがわかる。これらの中でも測定手順１を用いた場合にＳ／Ｎ比がより高く、また、Ｆａｂ’−ＡＬＰよりもＩｇＧ−ＡＬＰを用いた方がより高い感度で抗原の検出を行うことができることもわかる。【００６９】
実施例８及び比較例２
第１抗体としての、上記の（４）で調製したALP標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体と、第２抗体としての、上記の（１）で調製したビオチン標識抗ｐ２４抗原ヒトモノクローナル抗体（０．８μg／ｍL）と、試料としての、市販のＨＩＶセロコンバージョンパネル検体であるＨＩＶ−１  Ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｐａｎｅｌ  ＢＢ（ＰＲＢ９５２）（ＢＢＩ社）とを用いて、測定手順１に従ってＨＩＶ−１ ｐ２４抗原の検出を行った。【００７０】
実施例８の手順に基づいて、ＨＩＶ抗原の検出を行った結果を表４に示す。また、比較例２として、市販のＨＩＶ−１ｐ２４抗原検出用の試薬であるルミパルスＩ ＨＩＶ−１ｐ２４（登録商標、富士レビオ社製）を用いて、上記のＨＩＶセロコンバージョンパネル検体を測定した、ルミパルスＩ ＨＩＶ−１ｐ２４の添付文書に記載の結果を示す。ここで、ルミパルスＩ ＨＩＶ−１ｐ２４は、ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原を検出するための抗体として抗ｐ２４抗原マウスモノクローナル抗体を用いている。また、ルミパルスＩ ＨＩＶ−１ｐ２４では、試料の前処理として、界面活性剤であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含む検体処理液を試料に加え攪拌する操作を行っている。
【表４】
2009084369.tif 000006
【００７１】
表４から明らかなように、ルミパルスＩ ＨＩＶ−１ｐ２４では、初回採血から１０日目でＨＩＶ−１ ｐ２４抗原が検出されている。それに対し、本発明の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いたＨＩＶ抗原の検出では、初回採血から７日目でＨＩＶ−１ ｐ２４抗原を検出することができる。即ち、本発明の本発明の抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を用いたＨＩＶ抗原の検出は、ルミパルスＩ ＨＩＶ−１ｐ２４よりも、３日も早くＨＩＶ−１ ｐ２４抗原を検出することができる。また、本発明のＨＩＶ抗原の検出においては、ルミパルスＩ ＨＩＶ−１ｐ２４のように、試料の前処理を行わなくても、高感度にＨＩＶ−１ ｐ２４抗原を検出できることも明らかとなった。【００７２】
本出願は、２００７年１２月２８日に出願された日本国特許出願特願２００７−３４０３７０号に関し、この特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
2009084369.tif 000007
【図２】
2009084369.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月28日(2009.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、
固相と、
前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、
を含有するＨＩＶ抗原検出用試薬。
【請求項２】
ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体を含む第１試薬と、
固相としての粒子を含む第２試薬と、
前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体を含む第３試薬と
を備えたＨＩＶ抗原検出用試薬キット。
【請求項３】
前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質を含む第４試薬をさらに備えた請求項２に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬キット。
【請求項４】
前記粒子がアビジンまたはストレプトアビジンを保持し、前記粒子に結合可能な物質がビオチンである、請求項２に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬キット。
【請求項５】
前記粒子が、磁性粒子である、請求項２に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬キット。
【請求項６】
検体に含まれるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体との複合体を固相上に形成し、この複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出するＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項７】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する工程、
前記混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項８】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
第１混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合する第２混合工程、
第２混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項９】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
第１混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、
第２混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１０】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、
第１混合工程で得られた混合物と、第２混合工程で得られた混合物とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１１】
前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質と、前記粒子上に形成された前記複合体とを混合する工程を備え、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応に基づいてＨＩＶ抗原を検出する請求項７に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１２】
前記基質が、発光基質または発色基質であり、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応によって生じる発光または発色を検出することによりＨＩＶ抗原を検出する請求項１１に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１３】
前記固相が、磁性粒子である、請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月15日(2010.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、
固相と、
前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体と、
を含有するＨＩＶ抗原検出用試薬。
【請求項２】
ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体を含む第１試薬と、
固相としての粒子を含む第２試薬と、
前記固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体を含む第３試薬と
を備えたＨＩＶ抗原検出用試薬キット。
【請求項３】
前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質を含む第４試薬をさらに備えた請求項２に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬キット。
【請求項４】
前記粒子がアビジンまたはストレプトアビジンを保持し、前記粒子に結合可能な物質がビオチンである、請求項２又は３に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬キット。
【請求項５】
前記粒子が、磁性粒子である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のＨＩＶ抗原検出用試薬キット。
【請求項６】
検体に含まれるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第１のヒトモノクローナル抗体を標識物質で標識した第１抗体と、固相に結合可能な物質をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識する第２のヒトモノクローナル抗体に結合させた第２抗体との複合体を固相上に形成し、この複合体に含まれる前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出するＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項７】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する工程、
前記混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項８】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
第１混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合する第２混合工程、
第２混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項９】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
第１混合工程で得られた混合物と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、
第２混合工程で得られた混合物と、前記固相としての粒子とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１０】
前記抗原と、前記第１抗体とを混合する第１混合工程、
前記固相としての粒子と、前記第２抗体とを混合する第２混合工程、
第１混合工程で得られた混合物と、第２混合工程で得られた混合物とを混合し、前記粒子上に前記複合体を形成する工程、および
前記粒子上に形成された前記複合体に含まれる、前記標識物質に基づいてＨＩＶ抗原を検出する工程からなる請求項６に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１１】
前記標識物質が酵素であり、この酵素の基質と、前記粒子上に形成された前記複合体とを混合する工程を備え、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応に基づいてＨＩＶ抗原を検出する請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１２】
前記基質が、発光基質または発色基質であり、前記検出工程は前記酵素と前記基質の反応によって生じる発光または発色を検出することによりＨＩＶ抗原を検出する請求項１１に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【請求項１３】
前記固相が、磁性粒子である、請求項６〜１２のいずれか１項に記載のＨＩＶ抗原検出方法。
【国際調査報告】
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