(57)【要約】式ＴＮＮのヌクレオチド配列に結合する亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合領域が含まれるポリペプチドが提供される。複数のポリペプチド、特異的結合活性を有する単離されたヘプタペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる組成物、およびそのようなポリペプチド、組成物、およびポリヌクレオチドで遺伝子発現を調節する方法もまた提供される。好ましくは、この標的ヌクレオチドは、式ＴＡＮ、ＴＣＮ、ＴＧＮ、ＴＴＮ、ＴＮＡ、ＴＮＣ、ＴＮＧ、またはＴＮＴを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５個から１０個のアミノ酸残基のヌクレオチド結合領域を含む、単離され、精製された亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドであって、該領域が式ＴＮＮの標的ヌクレオチドに優先的に結合し、Ｎが、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記標的ヌクレオチドが、式ＴＡＮ、ＴＣＮ、ＴＧＮ、ＴＴＮ、ＴＮＡ、ＴＮＣ、ＴＮＧ、またはＴＮＴを有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記標的ヌクレオチドが、式ＴＡＡ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＡＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＴＧＴ、ＴＴＡ、ＴＴＣ、ＴＴＧ、またはＴＴＴを有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記結合領域が、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記結合領域が、配列番号１から配列番号４６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記結合領域が、配列番号１から配列番号６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記結合領域が、その中に配列番号１から配列番号４１１のいずれかを含むポリペプチドとの結合について競合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記結合領域が、その中に配列番号１から配列番号４６のいずれかを含むポリペプチドとの結合について競合する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記結合領域が、その中に配列番号１から配列番号６のいずれかを含むポリペプチドとの結合について競合する、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記結合領域が、配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記結合領域が、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記結合領域が、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド結合領域が７残基であり、α−ヘリックス構造を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記結合領域が、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド：
（ａ）配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列の結合領域；および
（ｂ）２つ以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列とは異なる結合領域であって、ここで、解離定数は、置換が行われる前のポリペプチドの解離定数の１２５％を超えず、そして保存的アミノ酸置換は以下の置換のうちの１つである：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕ。
【請求項１５】
前記結合領域が、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記結合領域が、２つ以下の保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記結合領域が、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記結合領域が、２つ以下の保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記結合領域が、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド結合領域に７アミノ酸の亜鉛フィンガードメインが含まれており、ここで、該ドメインの７個のアミノ酸には−１から６の番号が付けられ、該ドメインは以下からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド：
（ａ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、およびＳからなる群より選択される、ドメイン；
（ｂ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｓである、ドメイン；
（ｃ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、およびＩからなる群より選択される、ドメイン；
（ｄ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、２と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＤである、ドメイン；
（ｅ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ａ、およびＣからなる群より選択される、ドメイン；
（ｆ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｈ、およびＤからなる群より選択される、ドメイン；
（ｇ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｉ、およびＫからなる群より選択される、ドメイン；
（ｈ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＮからなる群より選択される、ドメイン；
（ｉ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される、ドメイン；
（ｊ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される、ドメイン；
（ｋ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＨである、ドメイン；
（ｌ）５’−（ＴＧＧ）−３’および５’−（ＴＧＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＨからなる群より選択される、ドメイン；
（ｍ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｗ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される、ドメイン；
（ｎ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＨである、ドメイン；
（ｏ）５’−（ＴＴＡ）−３’および５’−（ＴＴＧ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、ＳおよびＡからなる群より選択される、ドメイン；
（ｐ）５’−（ＴＴＣ）−３’および５’−（ＴＴＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＨである、ドメイン；
（ｑ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＲである、ドメイン；
（ｒ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される、ドメイン；ならびに、
（ｓ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、４と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＣからなる群より選択される、ドメイン。
【請求項２１】
ヌクレオチド結合領域が、分子モデリングによって配列番号１から配列番号４１１のいずれかであるヌクレオチド結合領域から導かれ、その結果、水素結合パターンが、配列番号１から配列番号４１１の少なくとも１つに実質的に類似しているポリペプチドに由来する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
式ＡＮＮ、ＣＮＮ、またはＧＮＮの標的ヌクレオチドに優先的に結合する少なくとも１つの他の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドに対して動作可能であるように連結されている、請求項１に記載のポリペプチドであって、式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである、ポリペプチド。
【請求項２３】
１つ以上の転写調節因子に動作可能であるように連結された、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１に記載の複数のポリペプチドが含まれるポリペプチド組成物であって、該ポリペプチドが互いに動作可能であるように連結されている、ポリペプチド組成物。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、５から１５個のアミノ酸残基の可撓性ペプチドリンカーによって動作可能であるように連結されている、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２６】
前記リンカーが、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、および配列番号４２２からなる群より選択される配列を有する、請求項２５に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２７】
前記組成物に２個から１８個のポリペプチドが含まれる、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２８】
前記組成物に２個から１２個のポリペプチドが含まれる、請求項２７に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、式５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’の配列を含むヌクレオチド配列に結合する、請求項２８に記載のポリペプチド組成物であって、式中、Ｎは、Ａ，Ｃ、Ｇ、またはＴであり、ｎは２から１２である、ポリペプチド組成物。
【請求項３０】
前記組成物に、２個から６個のポリペプチドが含まれる、請求項２８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、式５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’の配列を含むヌクレオチド配列に結合する、請求項３０に記載のポリペプチド組成物であって、式中、Ｎは、Ａ，Ｃ、Ｇ、またはＴであり、ｎは２から６である、ポリペプチド組成物。
【請求項３２】
前記組成物に、さらに、配列５’−（ＡＮＮ）−３’、５’−（ＣＮＮ）−３’、または５’−（ＧＮＮ）−３’のヌクレオチドサブサイトに結合する結合領域を含む少なくとも１つのポリペプチドが含まれる、請求項２７に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３３】
各々のポリペプチドの結合領域に、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列が含まれる、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３４】
各々のポリペプチドの結合領域に、配列番号１から配列番号４６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列が含まれる、請求項３３に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３５】
各々のポリペプチドの結合領域に、配列番号１から配列番号６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列が含まれる、請求項３４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３６】
各々のポリペプチドの結合領域が、その中に配列番号１から配列番号４１１のいずれかを含むポリペプチドとの結合について競合する、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３７】
各々のポリペプチドの結合領域が、その中に配列番号１から配列番号４６のいずれかを含むポリペプチドとの結合について競合する、請求項３６に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３８】
各々のポリペプチドの結合領域が、その中に配列番号１から配列番号６のいずれかを含むポリペプチドとの結合について競合する、請求項３７に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３９】
各々のポリペプチドの結合領域が、配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４０】
各々のポリペプチドの結合領域が、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項３９に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４１】
各々のポリペプチドの結合領域が、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４２】
各々のポリペプチドのヌクレオチド結合領域が７残基であり、α−ヘリックス構造を有する、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４３】
各々のポリペプチドの結合領域が、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載のポリペプチド組成物：
（ａ）配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列の結合領域；および
（ｂ）２つ以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列とは異なる結合領域であって、ここで、解離定数は、置換が行われる前のポリペプチドの解離定数の１２５％を超えず、そして保存的アミノ酸置換は以下の置換のうちの１つである：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕ。
【請求項４４】
各々のポリペプチドの結合領域が、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項４３に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４５】
各々のポリペプチドの結合領域が、２つ以下の保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４６】
各々のポリペプチドの結合領域が、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項４５に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４７】
各々のポリペプチドの結合領域が、２つ以下の保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４８】
各々のポリペプチドの結合領域が、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項４７に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４９】
各々のポリペプチドのヌクレオチド結合領域に７アミノ酸の亜鉛フィンガードメインが含まれており、ここで、該ドメインの７個のアミノ酸には−１から６の番号が付けられ、該ドメインは以下からなる群より選択される、請求項２４に記載のポリペプチド組成物：
（ａ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、およびＳからなる群より選択される、ドメイン；
（ｂ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｓである、ドメイン；
（ｃ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、およびＩからなる群より選択される、ドメイン；
（ｄ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、２と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＤである、ドメイン；
（ｅ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ａ、およびＣからなる群より選択される、ドメイン；
（ｆ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｈ、およびＤからなる群より選択される、ドメイン；
（ｇ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｉ、およびＫからなる群より選択される、ドメイン；
（ｈ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＮからなる群より選択される、ドメイン；
（ｉ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される、ドメイン；
（ｊ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される、ドメイン；
（ｋ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＨである、ドメイン；
（ｌ）５’−（ＴＧＧ）−３’および５’−（ＴＧＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＨからなる群より選択される、ドメイン；
（ｍ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｗ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される、ドメイン；
（ｎ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＨである、ドメイン；
（ｏ）５’−（ＴＴＡ）−３’および５’−（ＴＴＧ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、ＳおよびＡからなる群より選択される、ドメイン；
（ｐ）５’−（ＴＴＣ）−３’および５’−（ＴＴＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、３と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＨである、ドメイン；
（ｑ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基はＲである、ドメイン；
（ｒ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される、ドメイン；ならびに、
（ｓ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、４と番号が付けられる該ドメインのアミノ酸残基は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＣからなる群より選択される、ドメイン。
【請求項５０】
各々のポリペプチドのヌクレオチド結合領域が、分子モデリングによって配列番号１から配列番号４１１のいずれかであるヌクレオチド結合領域から導かれ、その結果、水素結合パターンが、配列番号１から配列番号４１１の少なくとも１つに実質的に類似しているポリペプチド組成物に由来する請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項５１】
前記ポリペプチド組成物に、２つの半分の部分が含まれる二重特異的亜鉛フィンガータンパク質が含まれており、それぞれの半分の部分には６個の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインが含まれる、請求項２４に記載のポリペプチド組成物であって、ここで、該半分の部分の少なくとも一方に、５’−（ＴＮＮ）−３’型の標的ヌクレオチド配列に結合する少なくとも１つのドメインが含まれ、その結果、該二重特異的亜鉛フィンガーの２つの半分の部分は独立して作動することができる、ポリペプチド組成物。
【請求項５２】
前記二重特異的亜鉛フィンガータンパク質の前記２つの半分の部分がリンカーによって連結されている、請求項５１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項５３】
前記リンカーが、アミノ酸残基配列ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号４１４）を有する、請求項５２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項５４】
前記ポリペプチド組成物に、さらに、ＦｏｋＩのヌクレアーゼ触媒ドメインが含まれており、その結果、該ポリペプチド組成物は、選択されたゲノム標的での部位特異的切断を指示する、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項５５】
式ＡＮＮ、ＣＮＮ、またはＧＮＮの標的ヌクレオチドに優先的に結合する少なくとも１つの他の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドに対して動作可能であるように連結されており、式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項５６】
１つ以上の転写因子に動作可能であるように連結された、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項５７】
α−ヘリックス構造を有しており、式ＴＮＮの標的ヌクレオチドに優先的に結合する、単離されたヘプタペプチドであって、式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである、ヘプタペプチド。
【請求項５８】
前記標的ヌクレオチドが、式ＴＡＮ、ＴＣＮ、ＴＧＮ、ＴＴＮ、ＴＮＡ、ＴＮＣ、ＴＮＧ、またはＴＮＴを有する、請求項５７に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項５９】
前記標的ヌクレオチドが、式ＴＡＡ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＡＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＴＧＴ、ＴＴＡ、ＴＴＣ、ＴＴＧ、またはＴＴＴを有する、請求項５８に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６０】
前記ヘプタペプチドが、配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項５７に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６１】
前記ヘプタペプチドが、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項６０に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６２】
前記ヘプタペプチドが、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項６１に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６３】
前記ヘプタペプチドが、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する、請求項５７に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６４】
前記ヘプタペプチドが、配列番号１から配列番号４６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する、請求項６３に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６５】
前記ヘプタペプチドが、配列番号１から配列番号６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する、請求項６４に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６６】
前記ヘプタペプチドが、その中に配列番号１から配列番号４１１のいずれかを含むポリペプチドとの結合について競合する、請求項５７に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６７】
前記ヘプタペプチドが、その中に配列番号１から配列番号４６のいずれかを含むポリペプチドとの結合について競合する、請求項６６に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６８】
前記ヘプタペプチドが、その中に配列番号１から配列番号６のいずれかを含むポリペプチドとの結合について競合する、請求項６７に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項６９】
前記ヘプタペプチドが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５７に記載の単離されたヘプタペプチド：
（ａ）配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列の結合領域；および
（ｂ）２つ以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列とは異なる結合領域であって、ここで、解離定数は、置換が行われる前のヘプタペプチドの解離定数の１２５％を超えず、そして保存的アミノ酸置換は以下の置換のうちの１つである：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕ。
【請求項７０】
前記結合領域が、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項６９に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項７１】
前記結合領域が、２つ以下の保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項６９に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項７２】
前記結合領域が、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項７１に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項７３】
前記結合領域が、２つ以下の保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項７１に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項７４】
前記結合領域が、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列とは異なる、請求項７３に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項７５】
前記ヘプタペプチドが以下からなる群より選択される、請求項５７に記載の単離されたヘプタペプチド：
（ａ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＡ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、−１と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、およびＳからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｂ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＡ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、−１と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｓである、ヘプタペプチド；
（ｃ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、およびＩからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｄ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、２と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基はＤである、ヘプタペプチド；
（ｅ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ａ、およびＣからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｆ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＣ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｈ、およびＤからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｇ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＮ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｉ、およびＫからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｈ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＮ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＮからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｉ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＣ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｊ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＧ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｋ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基はＨである、ヘプタペプチド；
（ｌ）５’−（ＴＧＧ）−３’および５’−（ＴＧＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＨからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｍ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＣ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｗ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｎ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基はＨである、ヘプタペプチド；
（ｏ）５’−（ＴＴＡ）−３’および５’−（ＴＴＧ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、ＳおよびＡからなる群より選択される、ヘプタペプチド；
（ｐ）５’−（ＴＴＣ）−３’および５’−（ＴＴＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、３と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基はＨである、ヘプタペプチド；
（ｑ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＡ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基はＲである、ヘプタペプチド；
（ｒ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される、ヘプタペプチド；ならびに、
（ｓ）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＮ）−３’に特異的に結合するヘプタペプチドであって、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、４と番号が付けられる該ヘプタペプチドのアミノ酸残基は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＣからなる群より選択される、ヘプタペプチド。
【請求項７６】
ヘプタペプチドの配列が、分子モデリングによって配列番号１から配列番号４１１のいずれかであるヌクレオチド結合領域から導かれ、その結果、水素結合パターンが、配列番号１から配列番号４１１の少なくとも１つに実質的に類似している、ヘプタペプチドに由来する請求項５７に記載の単離されたヘプタペプチド。
【請求項７７】
１つ以上の転写調節因子に動作可能であるように連結された、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
前記転写調節因子が転写のリプレッサーである、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
前記転写調節因子が転写の活性化因子である、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
前記転写調節因子が、ヒストンデアセチラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼの発現の調節因子からなる群より選択される、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
１つ以上の転写調節因子に動作可能であるように連結された、請求項２４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項８２】
前記転写調節因子が転写のリプレッサーである、請求項８１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項８３】
前記転写調節因子が転写の活性化因子である、請求項８１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項８４】
前記転写因子が、ヒストンデアセチラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼの発現の調節因子からなる群より選択される、請求項８１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項８５】
前記ポリペプチドは、ＨＩＶ−１  ｔＲＮＡプライマー結合部位の少なくとも一部に結合する人工的な転写因子である、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
前記人工的な転写因子が、６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有しており、そして式ＴＮＮの標的ヌクレオチドに優先的に結合する１つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する、請求項８５に記載のポリペプチドであって、式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである、ポリペプチド。
【請求項８７】
前記人工的な転写因子が、Ｓｐ１Ｃ亜鉛フィンガー足場に集合される、請求項８５に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
前記人工的な転写因子に、少なくとも１つのＫＲＡＢ抑制ドメインが含まれる、請求項８５に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド。
【請求項９０】
請求項２４に記載のポリペプチド組成物をコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド。
【請求項９１】
請求項５７に記載の単離されたヘプタペプチドをコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド。
【請求項９２】
請求項８９に記載の単離され、精製されたポリヌクレオチドが含まれるベクター。
【請求項９３】
請求項９０に記載の単離され、精製されたポリヌクレオチドが含まれるベクター。
【請求項９４】
請求項９１に記載の単離され、精製されたポリヌクレオチドが含まれるベクター。
【請求項９５】
請求項９２に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項９６】
真核生物である、請求項９５に記載の宿主細胞。
【請求項９７】
原核生物である、請求項９５に記載の宿主細胞。
【請求項９８】
請求項９３に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項９９】
真核生物である、請求項９８に記載の宿主細胞。
【請求項１００】
原核生物である、請求項９８に記載の宿主細胞。
【請求項１０１】
請求項９４に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１０２】
真核生物である、請求項１０１に記載の宿主細胞。
【請求項１０３】
原核生物である、請求項１０１に記載の宿主細胞。
【請求項１０４】
請求項９５に記載のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１０５】
真核生物である、請求項１０４に記載の宿主細胞。
【請求項１０６】
原核生物である、請求項１０４に記載の宿主細胞。
【請求項１０７】
請求項９０に記載のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１０８】
真核生物である、請求項１０７に記載の宿主細胞。
【請求項１０９】
原核生物である、請求項１０７に記載の宿主細胞。
【請求項１１０】
請求項９１に記載のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１１１】
真核生物である、請求項１１０に記載の宿主細胞。
【請求項１１２】
原核生物である、請求項１１０に記載の宿主細胞。
【請求項１１３】
以下からなる群より選択される、単離され、精製されたポリヌクレオチド：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド；および
（ｂ）核酸配列が、特異的核酸結合活性を備える請求項１に記載のポリペプチドの活性を有するポリペプチドに翻訳されるとの条件で、（ａ）の配列と少なくとも９５％同一である核酸配列。
【請求項１１４】
以下からなる群より選択される、単離され、精製されたポリヌクレオチド：
（ａ）請求項２４に記載のポリペプチド組成物をコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド；および
（ｂ）核酸配列が、特異的核酸結合活性を備える請求項１９に記載のポリペプチド組成物の活性を有するポリペプチドに翻訳されるとの条件で、（ａ）の配列と少なくとも９５％同一である核酸配列。
【請求項１１５】
以下からなる群より選択される、単離され、精製されたポリヌクレオチド：
（ａ）請求項５７に記載のヘプタペプチドをコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド；および
（ｂ）核酸配列が、特異的核酸結合活性を備える請求項５０に記載のヘプタペプチドの活性を有するポリペプチドに翻訳されるとの条件で、（ａ）の配列と少なくとも９５％同一である核酸配列。
【請求項１１６】
配列５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’を含むヌクレオチド配列の発現を調節するプロセスであって、式中、ｎは２から１２であり、該プロセスは、該ヌクレオチド配列を、請求項２４に記載のポリペプチド組成物の有効量に曝す工程を含む、プロセス。
【請求項１１７】
前記配列５’−（ＴＮＮ）−３’が５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’配列の中に配置されている、請求項１１６に記載のプロセス。
【請求項１１８】
前記配列５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’が、前記ヌクレオチド配列の転写される領域の中に配置されている、請求項１１６に記載のプロセス。
【請求項１１９】
前記配列５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’が、前記ヌクレオチド配列のプロモーター領域の中に配置されている、請求項１１６に記載のプロセス。
【請求項１２０】
前記配列５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’が発現される配列タグの中に配置されている、請求項１１６に記載のプロセス。
【請求項１２１】
前記ポリペプチド組成物が、１つ以上の転写調節因子に動作可能であるように連結させられる、請求項１１６に記載のプロセス。
【請求項１２２】
前記転写調節因子が転写のリプレッサーである、請求項１２１に記載のプロセス。
【請求項１２３】
前記転写調節因子が転写の活性化因子である、請求項１２１に記載のプロセス。
【請求項１２４】
前記転写調節因子が、ヒストンデアセチラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼの発現の調節因子からなる群より選択される、請求項１２１に記載のプロセス。
【請求項１２５】
前記ヌクレオチド配列が遺伝子である、請求項１１６に記載のプロセス。
【請求項１２６】
前記遺伝子が真核生物の遺伝子である、請求項１２５に記載のプロセス。
【請求項１２７】
前記遺伝子が原核生物の遺伝子である、請求項１２５に記載のプロセス。
【請求項１２８】
前記遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項１２５に記載のプロセス。
【請求項１２９】
前記真核生物の遺伝子が哺乳動物の遺伝子である、請求項１２６に記載のプロセス。
【請求項１３０】
前記哺乳動物の遺伝子がヒトの遺伝子である、請求項１２９に記載のプロセス。
【請求項１３１】
前記真核生物の遺伝子が植物の遺伝子である、請求項１２６に記載のプロセス。
【請求項１３２】
前記原核生物の遺伝子が細菌の遺伝子である、請求項１２７に記載のプロセス。
【請求項１３３】
ＨＩＶ−１ウイルスの複製を阻害する方法であって、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した個体に対して、十分な量の、ｔＲＮＡプライマー結合部位に結合することができる請求項８５に記載の人工的な転写因子を投与し、その結果、ＨＩＶ−１の複製が阻害される工程を含む、方法。
【請求項１３４】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１３５】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項２４に記載のポリペプチド組成物の治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１３６】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項５７に記載のヘプタペプチドの治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１３７】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項８５に記載の人工的な転写因子の治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１３８】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項８９に記載のポリヌクレオチドの治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１３９】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項９０に記載のポリヌクレオチドの治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１４０】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項９１に記載のポリヌクレオチドの治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１４１】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項１１３に記載のポリヌクレオチドの治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１４２】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項１１４に記載のポリヌクレオチドの治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１４３】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項１１５に記載のポリヌクレオチドの治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１４４】
以下を含む薬学的組成物：
（ａ）請求項８５に記載の人工的な転写因子をコードするポリヌクレオチドの治療有効量；および
（ｂ）薬学的に許容される担体。
【請求項１４５】
ＨＩＶ−１ウイルスの複製を阻害するための方法であって、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した個体に対して、十分な量の、請求項８５に記載の人工的な転写因子をコードするポリヌクレオチドを投与し、その結果、ＨＩＶ−１の複製が阻害される工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
この出願は、本明細書中に、その全体が参考として援用されるＣａｒｌｏｓ  Ｆ．  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩおよびＢｉｒｇｉｔ  Ｄｒｅｉｅｒにより２００５年１１月２８日に出願された、米国仮特許出願第６０／７４０，５２５号（「ＴＮＮのための亜鉛フィンガー結合ドメイン」と題す）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（政府の所有権）
本明細書中に報告される研究の一部を支援するために使用された資金は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ  ＧＭ  ５３９１０）によって提供された。したがって、米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明の分野は、標的ヌクレオチドに結合する亜鉛フィンガータンパク質である。さらに具体的には、本発明は、式５’−（ＴＮＮ）−３’の標的ヌクレオチドに特異的に結合する亜鉛フィンガーのα−ヘリックスドメインの中のアミノ酸残基の配列に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
人工的な転写因子の構築は、ここ数年の間に大きな関心となっている。遺伝子発現は、調節ドメインに融合させられたポリダクチル（ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ）亜鉛フィンガータンパク質によって特異的に調節することができる。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ファミリーの亜鉛フィンガードメインは、それらのモジュール構造の理由から人工的な転写因子の構築について最も期待されている。個々のドメインはおよそ３０アミノ酸から構成されており、そして疎水性相互作用、および保存されているＣｙｓ２−Ｈｉｓ２残基による亜鉛イオンのキレート化によって安定化させられたα−ヘリックス構造へと折り畳まれる。今日までに、亜鉛フィンガータンパク質のこのファミリーの中で最も特性決定されたタンパク質は、マウスの転写因子Ｚｉｆ２６８である（非特許文献１；非特許文献２）。Ｚｉｆ２６８／ＤＮＡ複合体の分析により、ＤＮＡの結合が、−１位、３位、および６位のαヘリックスのアミノ酸残基の、それぞれ、３ｂｐのＤＮＡサブサイト（ｓｕｂｓｉｔｅ）の３’中央、および５’ヌクレオチドとの相互作用によって大部分が行われることを示唆していた。１位、２位、および５位は、ＤＮＡのリン酸骨格と直接接触する、または水によって媒介されて接触することが示されている。ロイシンは、通常、４位で見られ、これは、ドメインの疎水性コアの中に包まれる。α−ヘリックスの２位は、他のヘリックス残基と相互作用することが示されており、加えて、３ｂｐのサブサイトの外側のヌクレオチドと接触することができる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００５】
５’−（ＧＮＮ）−３’ＤＮＡサブサイトのそれぞれを高い特異性および親和性で認識するモジュールである亜鉛フィンガードメインの選択、ならびに部位特異的突然変異によるそれらの改良が明らかにされている（特許文献１（その開示は引用により本明細書中に組み入れられる））。これらのモジュールドメインは、ヒトゲノムまたは任意の他のゲノムにおいて特有である、１８ｂｐに広がるＤＮＡ配列を認識する亜鉛フィンガータンパク質へと集合することができる。加えて、これらのタンパク質は転写因子として機能し、調節ドメインに融合させられると遺伝子発現を変化させることができ、さらには、核ホルモン受容体のリガンド結合ドメインへの融合によってホルモン依存性となることができる。任意のＤＮＡ配列に結合する亜鉛フィンガーをベースとする転写因子の迅速な構築を可能にするためには、遺伝子コードにおいて意味が割り当てられている６４種類の可能なＤＮＡトリプレットのそれぞれを認識するように、モジュールである亜鉛フィンガードメインの既存のセットを伸張させることが重要である。この目的は、ファージディスプレイ選択および／または合理的な設計によって行うことができる。亜鉛フィンガー／ＤＮＡ相互作用についての構造のデータが限られているという理由から、亜鉛タンパク質の合理的な設計には非常に時間がかかり、多くの場合には不可能であり得る。加えて、ほとんどの自然界に存在している亜鉛フィンガータンパク質は、５’−（ＧＮＮ）−３’型のＤＮＡ配列を認識するドメインから構成されている。５’−（ＮＮＮ）−３’型のＤＮＡ標的配列に結合する新規の亜鉛フィンガードメインを同定するための最も見込みのあるアプローチは、ファージディスプレイによる選択である。このアプローチの律速工程は、それぞれのモジュールによって認識されるサブサイトの中の５’アデニン、シトシン、またはチミンの特定を可能にするライブラリーの構築である。ファージディスプレイ選択はＺｉｆ２６８に基づき、ここで、このタンパク質の様々なフィンガーが無作為化された（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。５’−（ＧＮＮ）−３’型のＤＮＡ配列を認識する１６個のドメインのセットは、Ｃ７のフィンガー２（Ｚｉｆ２６８の誘導体（非特許文献７））が無作為化されているライブラリーから、これまでに報告されている（非特許文献１０）。このようなストラテジーでは、選択は、フィンガー−２サブサイトの中の５’グアニンまたはチミンの相補的な塩基と接触するフィンガー３のＡｓｐ２が原因で、５’−（ＧＮＮ）−３’または５’−（ＴＮＮ）−３’を認識するドメインに限定される（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
上記のストラテジーによる５’−（ＴＮＮ）−３’型の配列を認識する亜鉛フィンガードメインの選択が可能であるにもかかわらず、実際には、そのような配列はほとんど選択、および同定されていない。したがって、５’−（ＴＮＮ）−３’型の配列を認識し、その結果、亜鉛フィンガードメインの幅広い「語彙（ｖｏｃａｂｕｌａｒｙ）」を、マルチフィンガー亜鉛フィンガータンパク質の構築に利用できるようにする亜鉛フィンガードメインを発見する必要性がある。５’−（ＴＮＮ）−３’型の配列を認識する亜鉛フィンガードメインの有用性により、はるかに多種多様な核酸配列を認識する他の核酸配列認識機能を有する人工的な転写因子およびタンパク質を調製する能力が導かれる。５’−（ＴＮＮ）−３’型の配列を特異的に認識する能力は、主要な終結コドンであるＴＧＡ、ＴＡＧ、およびＴＡＡがこの形態であり、そして調節配列が鎖の末端領域に非常に近い位置に頻繁に存在するために特に重要である。加えて、終結コドンは、多くの場合に、自然界に存在しているＤＮＡの中ではタンデムで見られ、これらの領域を標的化させるために望ましい。５’−（ＴＮＮ）−３’型の配列を認識する亜鉛フィンガードメインが不足すると、これは非常に難しくなる。
【０００７】
本発明のアプローチは、科学界による亜鉛フィンガータンパク質の迅速な構築を可能にし、サブサイトを越えた（ｃｒｏｓｓ−ｓｕｂｓｉｔｅ）相互作用によって強要される限界に関する懸念が限られた数の場合にしか起こらないことが示されている亜鉛フィンガードメインのモジュール方式に基づく。本発明の開示により、５’−（ＴＮＮ）−３’型のＤＮＡ配列を特異的に認識する亜鉛フィンガードメインの選択のための新しいストラテジーが導入される。これらのドメインの特異的なＤＮＡ結合特性は、１６種類の５’−（ＣＮＮ）−３’トリプレット全てに対する多標的ＥＬＩＳＡ（ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ  ＥＬＩＳＡ）によって評価された。これらのドメインは、それぞれが１８ｂｐに広がる配列を特異的に認識する様々な数の５’−（ＴＮＮ）−３’ドメインを含むポリダクチルタンパク質の中に容易に取り込ませることができる。さらに、これらのドメインは、調節ドメインに融合させられると、遺伝子発現を特異的に変化させることができる。これらの結果は、予め定義された構成要素（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）からポリダクチルタンパク質を構築することの実現可能性を強調する。加えて、本明細書中で特性決定されたドメインは、人工的な転写因子を用いて標的化させることができるＤＮＡ配列の数を大幅に増大させる。
【特許文献１】米国特許第６，１４０，０８１号明細書
【非特許文献１】Ｐａｖｌｅｔｉｃｈら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２（５００７），８０９−８１７
【非特許文献２】Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４（１０），１１７１−１１８０
【非特許文献３】Ｉｓａｌａｎ，Ｍ．ら、（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１１），５６１７−５６２１
【非特許文献４】Ｃｈｏｏら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（２３），１１１６８−７２
【非特許文献５】Ｒｅｂａｒら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１８８３−）２６３（５１４７），６７１−３
【非特許文献６】Ｊａｍｉｅｓｏｎら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，５６８９−５６９５
【非特許文献７】Ｗｕら、（１９９５）ＰＮＡＳ  ９２，３４４−３４８
【非特許文献８】Ｊａｍｉｅｓｏｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３，１２８３４−１２８３９
【非特許文献９】Ｇｒｅｉｓｍａｎら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５（５３００），６５７−６６１
【非特許文献１０】Ｓｅｇａｌら、（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），２７５８−２７６３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の簡単な要旨）
１つの態様においては、本発明により、５から１０アミノ酸残基のヌクレオチド結合領域（この領域は、式ＴＮＮ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する）を含む、単離されそして精製された亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが提供される。好ましくは、標的ヌクレオチドは、式ＴＡＮ、ＴＣＮ、ＴＧＮ、ＴＴＮ、ＴＮＡ、ＴＮＣ、ＴＮＧ、またはＴＮＴを有する。さらに好ましくは、標的ヌクレオチドは、式ＴＡＡ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＡＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＴＧＴ、ＴＴＡ、ＴＴＣ、ＴＴＧ、またはＴＴＴを有する。１つの実施形態においては、本発明のポリペプチドには、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する結合領域が含まれる。そのようなポリペプチドは、ヌクレオチド標的への結合について、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと競合する。すなわち、好ましいポリペプチドには、競合様式で配列番号１から配列番号４１１のいずれかの結合に置き換わる結合領域が含まれる。競合結合を決定するための手段は当該分野で周知である。好ましくは、結合領域は、配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、結合領域は、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列を有する。なおさらに好ましくは、結合領域は配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を有する。あるいは、結合領域は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し得る：（１）配列番号１から配列番号４１１のいずれか、配列番号１から配列番号４６のいずれか、または配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列の結合領域；および（２）配列番号１から配列番号４１１のいずれか、配列番号１から配列番号４６のいずれか、または配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列とは、２つ以下の保存的アミノ酸置換によって異なる結合領域であって、ここで、解離定数が置換が行われる前のポリペプチドの解離定数の１２５％を超えず、保存的アミノ酸置換が以下の置換のうちの１つである、結合領域：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕ。なお別の手段においては、ヌクレオチド結合領域には、７アミノ酸の亜鉛フィンガードメインが含まれる。ここで、このドメインの７個のアミノ酸には−１から６の番号が付けられ、そしてこのドメインは以下からなる群より選択される：（１）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、およびＳからなる群より選択される）；（２）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓである）；（３）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、およびＩからなる群より選択される）；（４）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、このドメインの２と番号が付けられるアミノ酸残基はＤである）；（５）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ａ、およびＣからなる群より選択される）；（６）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｈ、およびＤからなる群より選択される）；（７）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｉ、およびＫからなる群より選択される）；（８）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＮからなる群より選択される）；（９）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される）；（１０）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される）；（１１）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１２）５’−（ＴＧＧ）−３’および５’−（ＴＧＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＨからなる群より選択される）；（１３）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｗ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される）；（１４）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１５）５’−（ＴＴＡ）−３’および５’−（ＴＴＧ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、ＳおよびＡからなる群より選択される）；（１６）５’−（ＴＴＣ）−３’および５’−（ＴＴＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１７）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＲである）；（１８）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される）；ならびに、（１９）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、４と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＣからなる群より選択される）。
【０００９】
別の態様においては、本発明により、複数の、そして好ましくは約２個から約１８個の、本明細書中に開示される亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインを含むポリペプチド組成物が提供される。これらのドメインは、通常、動作可能であるように連結され、例えば、５個から１５個のアミノ酸残基の可撓性のペプチドリンカーによって連結される。動作可能な連結は、好ましくは、配列番号４１２に示されるような可撓性のペプチドリンカーによって行われる。そのような組成物は、通常、式５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、ｎは２から１２である）の配列を含むヌクレオチド配列に結合する。好ましくは、ポリペプチド組成物には、約２個から約６個の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインが含まれ、これらは、式５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’（式中、ｎは２から６である）の配列を含むヌクレオチド配列に結合する。結合は、１μＭから１０μＭのＫＤで起こる。好ましくは、結合は、１０μＭから１μＭ、１０ｐＭから１００ｎＭ、１００ｐＭから１０ｎＭのＫＤで、さらに好ましくは、１ｎＭから１０ｎＭのＫＤで起こる。好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドおよびポリペプチド組成物はいずれも、１つ以上の転写調節因子（例えば、転写のリプレッサーまたは転写の活性化因子）に動作可能であるように連結される。
【００１０】
なお別の態様においては、本発明によってさらに、α−ヘリックス構造を有する単離されたヘプタペプチドが提供され、これは、式ＴＮＮ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する。好ましい標的ヌクレオチドは上記に記載した通りである。好ましいヘプタペプチドは、上記ポリペプチドの結合領域のヘプタペプチドと同じである。
【００１１】
加えて、本発明によってさらに、二重特異的亜鉛フィンガーが提供される。二重特異的亜鉛フィンガーには、２つの半分の部分が含まれ、それぞれの半分の部分には、６個の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインが含まれる。ここで、半分の部分の少なくとも一方に、５’−（ＴＮＮ）−３’型の標的ヌクレオチド配列に結合する少なくとも１つのドメインが含まれ、その結果、二重特異的亜鉛フィンガーの２つの半分の部分は独立して作動することができる。
【００１２】
加えて、本発明によってはさらに、その中に少なくとも１つの５’−（ＴＮＮ）−３’型の標的ヌクレオチド配列が含まれる部位で切断する配列特異的ヌクレアーゼであるＦｏｋＩのヌクレアーゼ触媒ドメインを含む配列特異的ヌクレアーゼが提供される。本発明によってはさらに、そのような配列特異的ヌクレアーゼを使用する核酸配列の配列特異的切断のための方法が提供される。
【００１３】
本発明によってはさらに、本発明のポリペプチドまたは組成物をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびポリヌクレオチドまたは発現ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。
【００１４】
本発明によってはさらに、標的ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＮ）−３’を含むヌクレオチド配列の発現を調節するプロセスが提供される。標的ヌクレオチド配列は、より長い５’−（ＮＮＮ）−３’配列の中のどこにでも配置することができる。このプロセスには、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドまたは本明細書中に示される組成物の有効量に対して、ヌクレオチド配列を曝す工程を含む、。１つの実施形態においては、プロセスによって、配列５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’（式中、ｎは２から１２である）を含むヌクレオチド配列の発現が調節される。このプロセスには、本発明の組成物の有効量に対してヌクレオチド配列を曝す工程を含む、。配列５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’は、ヌクレオチド配列の転写される領域の中に配置することも、ヌクレオチド配列のプロモーター領域の中に配置することも、また、発現される配列タグの中に配置することもできる。組成物は、好ましくは、１つ以上の転写調節因子（例えば、転写のリプレッサーまたは転写の活性化因子）に動作可能であるように連結させられる。１つの実施形態においては、ヌクレオチド配列は、真核生物遺伝子、原核生物遺伝子、またはウイルス遺伝子のような遺伝子である。真核生物遺伝子は、ヒト遺伝子のような哺乳動物遺伝子であっても、また、あるいは、植物の遺伝子であってもよい。原核生物遺伝子は、細菌の遺伝子であり得る。本発明による１つの特異的な方法は、ＨＩＶ−１ウイルスの複製を阻害する方法であり、これには、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した個体に対して、十分な量の、ｔＲＮＡプライマー結合部位に結合することができる本発明の人工的な転写因子を投与し、その結果、ＨＩＶ−１の複製が阻害される工程を含む、。あるいは、本発明による別の特異的な方法は、ＨＩＶ−１ウイルスの複製を阻害する方法であり、これには、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した個体に対して、十分な量の、本発明の人工的な転写因子をコードするポリヌクレオチドを投与し、その結果、ＨＩＶ−１の複製が阻害される工程を含む、。
【００１５】
なお別の実施形態においては、本発明により、以下を含む薬学的組成物が提供される：
（１）ポリペプチド、ポリペプチド組成物（例えば、人工的な転写因子）、または上記のような本発明の単離されたヘプタペプチドの治療有効量；および
（２）薬学的に許容される担体。
【００１６】
なお別の実施形態においては、本発明により、以下を含む薬学的組成物が提供される：
（１）ポリペプチド、ポリペプチド組成物（例えば、人工的な転写因子）、または上記のような本発明の単離されたヘプタペプチドをコードする、ヌクレオチド配列の治療有効量；および
（２）薬学的に許容される担体。
【００１７】
以下の本発明は、明細書、添付される特許請求の範囲、および添付の図面を参照してさらに理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
定義
特に明記されていない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合は、用語「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、または同様の用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味し、これには、一本鎖の形態または二本鎖の形態、そしてコード形態または非コード（例えば、「アンチセンス」）形態が含まれる。この用語には、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸が含まれる。この用語にはまた、修飾もしくは置換された塩基が、相補的なヌクレオチドのワトソンクリック結合を妨害せず、また、特異的に結合するタンパク質（例えば、亜鉛フィンガータンパク質）によるヌクレオチド配列の結合も妨害しない限りは、修飾された塩基あるいは置換された塩基を含む核酸も含まれる。この用語にはまた、合成の骨格を有する核酸様構造も含まれる。本発明によって提供されるＤＮＡ骨格アナログには、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファミン酸塩、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、カルバミン酸モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第６００巻，Ｂａｓｅｒｇａ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ編（ＮＹＡＳ  １９９２）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。ＰＮＡには、非イオン性骨格（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位）が含まれる。ホスホロチオエート結合は、例えば、米国特許第６，０３１，０９２号；同第６，００１，９８２号；同第５，６８４，１４８号に記載されている。ＷＯ９７／０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７もまた参照のこと。この用語に含まれる他の合成の骨格としては、メチルホスホネート結合、またはメチルホスホネートとホスホジエステルの交互の結合（例えば、米国特許第５，９６２，６７４号；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８６９２−８６９８を参照のこと）、およびベンジルホスホネート結合（例えば、米国特許第５，５３２，２２６；Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ６：１５３−１５６を参照のこと）が挙げられる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合は、用語「転写調節ドメインまたは因子」は、遺伝子の転写を調節するように機能する、本明細書中に提供される融合ポリペプチドの一部をいう。例示的であり、そして好ましい転写リプレッサードメインはＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、デアセチラーゼ（Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）、ならびに、それらの誘導体、多量体、およびそれらの組み合わせ（例えば、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、（ＫＲＡＢ）２、（ＫＲＡＢ）３、ＫＲＡＢ−Ａ、（ＫＲＡＢ−Ａ）２、（ＳＩＤ）２、（ＫＲＡＢ−Ａ）−ＳＩＤ、およびＳＩＤ−（ＫＲＡＢ−Ａ））である。本明細書中で使用される場合は、用語「ヌクレオチド結合ドメインまたは領域」は、特異的な核酸結合能力を提供する、本明細書中に提供されるポリペプチドまたは組成物の一部を意味する。ヌクレオチド結合領域は、特異的遺伝子に対して目的のポリペプチドを標的化させるように機能する。本明細書中で使用される場合は、用語「動作可能であるように連結される」は、例えば、ポリペプチドの複数のエレメントが、それぞれが意図されるように役割を果たす、または機能するように連結されることを意味する。例えば、リプレッサーは、その結合ドメインを介して標的ヌクレオチドに結合させた場合には、リプレッサーが転写を阻害するまたは妨げるように作用するような様式で、結合ドメインに結合させられる。エレメントの間およびそれらの中での結合は、直接である場合も、または間接的である（例えば、リンカーを介する）場合もある。複数のエレメントは、必ずしも隣接している必要はない。したがって、リプレッサードメインは、当該分野で周知の任意の連結手順を使用してヌクレオチド結合ドメインに連結させることができる。２つのドメインの間にリンカー部分を含めることが必要である場合がある。そのようなリンカー部分は、通常は、アミノ酸残基の短い配列であり、これによって、それらのドメインの間に間隔がもたらされる。リンカーが結合ドメインまたはリプレッサードメインの機能のいずれをも妨害しない限りは、任意の配列を使用することができる。
【００２１】
本明細書中で使用される場合は、用語「調節する」は、それが過剰に活性化される場合には、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターからの発現の阻害もしくは抑制を想定し、また、それが発現が抑えられる場合には、そのようなプロモーターからの発現の増大もしくは増強を想定する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合は、本明細書中に現れる様々なアミノ酸配列において生じるアミノ酸は、それらの周知の三文字または一文字の省略形にしたがって特定される。様々なＤＮＡ断片の中に生じるヌクレオチドは、当該分野で日常的に使用される標準的な一文字の表記で指定される。
【００２３】
ペプチドまたはタンパク質においては、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、これらは、一般的には、得られる分子の生物学的活性を変化させることなく作成することができる。当業者は、一般的に、ポリペプチドの必須ではない領域の中の１つのアミノ酸の置換によっては生物学的活性が実質的には変化することはないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，第４版，１９８７，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，２２４頁を参照のこと）。具体的には、そのような保存的変異体は修飾されたアミノ酸配列を有しており、その結果、変化（単数または複数）は、タンパク質の（保存的変異体の）構造および／または活性（例えば、抗体活性、酵素活性、または受容体活性）を実質的に変化させることはない。これらには、アミノ酸配列の保存的に修飾されたバリエーション、すなわち、タンパク質の活性に重要ではないそれらの残基のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失、または、類似する特性（例えば、酸性、塩基性、正電荷を有する、もしくは負電荷を有する、極性もしくは非極性など）を有する残基でのアミノ酸の置換が含まれ、その結果、さらに重要なアミノ酸の置換によっても、構造および／または活性は実質的には変化しない。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は当該分野で周知である。例えば、保存的置換を選択するための１つの例示的な指針としては、以下が挙げられる（もとの残基の後に例示的な置換が続く）：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕ。別の例示的な指針では、以下の６つのグループが使用され、それぞれには、互いに保存的置換であるアミノ酸が含まれる：（１）アラニン（ＡもしくはＡｌａ）、セリン（ＳもしくはＳｅｒ）、スレオニン（ＴもしくはＴｈｒ）；（２）アスパラギン酸（ＤもしくはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥもしくはＧｌｕ）；（３）アスパラギン（ＮもしくはＡｓｎ）、グルタミン（ＱもしくはＧｌｎ）；（４）アルギニン（ＲもしくはＡｒｇ）、リジン（ＫもしくはＬｙｓ）；（５）イソロイシン（ＩもしくはＩｌｅ）、ロイシン（ＬもしくはＬｅｕ）、メチオニン（ＭもしくはＭｅｔ）、バリン（ＶもしくはＶａｌ）；および（６）フェニルアラニン（ＦもしくはＰｈｅ）、チロシン（ＹもしくはＴｙｒ）、トリプトファン（ＷもしくはＴｒｐ）；（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｓｃｈｕｌｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｅｒ（１９７９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇもまた参照のこと）��当業者は、上記で特定された置換が限られた可能な保存的置換ではないことを理解するであろう。例えば、いくつかの目的については、全ての電荷を有するアミノ酸を、それらがポジティブであるかまたはネガティブであるかにはかかわらず、互いに保存的置換として見なすことができる場合がある。加えて、コードされる配列の中の１つのアミノ酸またはアミノ酸のうちの少ない割合を変化させる、付加する、または欠失させる個々の置換、欠失、または付加もまた、導かれるタンパク質の三次元構造および機能がそのようなバリエーションによって保存されると考えられる場合には、「保存的に修飾されたバリエーション」と考えることができる。
【００２４】
本明細書中で使用される場合は、用語「発現ベクター」は、プラスミド、ウイルス、ファージミド、または異種ＤＮＡ（例えば、本明細書中の融合タンパク質をコードする核酸または本明細書中に提供される発現カセット）の挿入または取り込みによって操作されている当該分野で公知の他の媒体を意味する。そのような発現ベクターには、通常、細胞の中での挿入された核酸の効率的な転写のためのプロモーター配列が含まれる。発現ベクターには、通常、複製起点、プロモーター、ならびに、形質転換された細胞の表現形による選択を可能にする特異的な遺伝子が含まれる。
【００２５】
本明細書中で使用される場合には、用語「宿主細胞」は、その中でベクターが増殖することができ、そのＤＮＡが発現させられる細胞をいう。この用語にはまた、目的の宿主細胞の任意の子孫も含まれる。複製の間に起こる変異が存在する可能性があるので、全ての子孫がもとの細胞と同じでない場合があることが理解される。そのような子孫は、用語「宿主細胞」が使用される場合には含まれる。外来ＤＮＡが宿主の中で持続的に維持される安定な導入方法は当該分野で公知である。
【００２６】
本明細書中で使用される場合は、遺伝子治療には、そのような治療が想定される疾患または症状を有する哺乳動物（特に、ヒト）の特定の細胞、標的細胞への異種ＤＮＡの導入が含まれる。ＤＮＡは、異種ＤＮＡが発現させられ、それによってコードされる治療用の産物が生産される様式で、選択された標的細胞に導入される。あるいは、異種ＤＮＡは、いくつかの様式で、治療用産物をコードするＤＮＡの発現を媒介することができるか、またはこれは、いくつかの様式において、治療用産物の発現を直接もしくは間接的に媒介するペプチドまたはＲＮＡのような産物をコードする場合もある。遺伝子治療はまた、欠損遺伝子に置き換わる遺伝子産物をコードする核酸、またはそれが導入される哺乳動物または細胞によって生産される遺伝子産物を補うものを送達するために使用される場合もある。導入された核酸は、治療用化合物（例えば、その成長因子阻害剤、または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤（例えば、それについての受容体）をコードする場合がある。これらは、通常は、哺乳動物宿主の中では生産されないか、または治療有効量では、もしくは治療上有用なタイミングでは生産されない。治療用産物をコードする異種ＤＮＡは、産物もしくはその発現を高めるかまたは別の方法で変化させるために、罹患した宿主の細胞に導入される前に修飾される場合がある。遺伝子治療にはまた、阻害剤もしくはリプレッサー、または遺伝子発現の他の調節因子の送達が含まれる場合がある。
【００２７】
本明細書中で使用される場合は、異種ＤＮＡは、その中でそれが発現させられる細胞によっては通常はインビボでは生産されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするＤＮＡであるか、あるいは、転写、翻訳、または他の調節することができる生化学的プロセスに影響を与えることによって内因性ＤＮＡの発現を変化させる媒介因子を媒介するかまたはコードするＤＮＡである。異種ＤＮＡはまた、外来ＤＮＡと呼ばれる場合もある。当業者が、それが発現させられる細胞に対して異種または外来と認識する、またはそのように考える任意のＤＮＡが、本明細書中では異種ＤＮＡに含まれる。異種ＤＮＡの例としては、追跡することができるマーカータンパク質（例えば、薬剤耐性を付与するタンパク質）をコードするＤＮＡ、治療上有効である物質（例えば、抗ガン剤、酵素、およびホルモン）をコードするＤＮＡ、ならびに、他のタイプのタンパク質（例えば、抗体）をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。異種ＤＮＡによってコードされる抗体は、異種ＤＮＡが導入されている細胞の表面上に分泌される場合も、また、その表面上で発現される場合もある。
【００２８】
したがって、本明細書中の異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡには、ゲノムの中で見られる対応するＤＮＡ分子としての正確な方向および位置では存在していないＤＮＡ分子が含まれる。これはまた、別の生物または種に由来する（すなわち、外因性の）ＤＮＡ分子を意味する場合もある。
【００２９】
本明細書中で使用される場合は、治療上有効な産物は、異種核酸、通常はＤＮＡによってコードされる産物である。これは、核酸が宿主細胞に導入されると、遺伝性または後天性の疾患の症状、発現を緩和するかまたは排除するか、あるいは、疾患を治癒させる産物が発現される。通常、所望される遺伝子産物をコードするＤＮＡはプラスミドベクターにクローニングされ、日常的に行われている方法（例えば、リン酸カルシウム媒介性のＤＮＡの取り込み（（１９８１）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：６０３−６１６を参照のこと）、またはマイクロインジェクション）によってプロデューサー細胞（例えば、パッケージング細胞）に導入される。プロデューサー細胞の中での増幅の後、異種ＤＮＡを含むベクターが選択された標的細胞に導入される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合は、発現ベクターまたは送達ベクターは、適切な宿主細胞の中での発現のためにその中に外来または異種ＤＮＡを挿入することができる任意のプラスミドまたはウイルスを意味する。すなわち、ＤＮＡによってコードされるタンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞のシステムにおいて合成される。１つ以上のタンパク質をコードするＤＮＡセグメント（遺伝子）の発現を指示することができるベクターは、本明細書中では「発現ベクター」と呼ばれる。逆転写酵素を使用して生産されたｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローニングを可能にするベクターもまた含まれる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合は、遺伝子は、そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。遺伝子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。遺伝子には、コード領域に先行する領域とコード領域に続く領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに、個々のコードセグメント（エキソン）の間に介在配列（イントロン）が含まれる場合もある。
【００３２】
本明細書中で使用される場合には、核酸分子またはポリペプチドまたは他の生態分子に関する用語「単離された」は、核酸またはポリペプチドが、そのポリペプチドまたは核酸が得られた遺伝的環境から分離されていることを意味する。これはまた、生体分子が天然の状態から変化していることを意味する場合もある。例えば、生存している動物の中には自然に存在しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その自然界での状態では一緒に存在している物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中でこの用語が使用される場合には、「単離されている」。したがって、組み換え体である宿主細胞の中で生産されるおよび／またはその中に含まれるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、単離されていると見なされる。組み換え宿主細胞から、または自然界の供給源から部分的または実質的に精製されているポリペプチドあるいはポリヌクレオチドもまた、「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」として含まれる。例えば、化合物の組み換えによって生産されたバージョンは、Ｓｍｉｔｈら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１４０に記載されている１工程の方法によって実質的に精製することができる。用語「単離された」および「精製された」は、同じ意味で使用される場合がある。
【００３３】
したがって、「単離された」によっては、核酸が、自然界に存在しているゲノムにおいては、目的の核酸をコードする遺伝子にすぐ隣接しているそのような遺伝子のコード配列を含まないことが意味される。単離されたＤＮＡは、一本鎖である場合も、また、二本鎖である場合もあり、ゲノムＤＮＡである場合も、ｃＤＮＡである場合も、組み換え体であるハイブリッドである場合も、また、合成のＤＮＡである場合もある。これは、自然界に存在しているＤＮＡ配列と同一である場合も、また、１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、または置換によってそのような配列とは異なる場合もある。
【００３４】
「単離された」または「精製された」は、それらの用語が生物学的細胞または宿主から作成された調製物をいうように使用される場合には、目的のＤＮＡまたはタンパク質の粗抽出物を含む、示されたＤＮＡまたはタンパク質を含む任意の細胞抽出物を意味する。例えば、タンパク質の場合には、精製された調製物は、個々の技術、または一連の分配もしくは生化学的技術にしたがって得ることができ、目的のＤＮＡまたはタンパク質は、これらの調製物の中に様々な純度で存在し得る。特にタンパク質については、手順としては、例えば、硫酸アンモニウム分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、等電点電気泳動、クロマト分画、および電気泳動を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３５】
「実質的に純粋」または「単離された」ＤＮＡまたはタンパク質の調製は、そのようなＤＮＡまたはタンパク質が自然界において通常は会合している、自然界に存在している材料を含まない調製物を意味すると理解されるべきである。「本質的に純粋」は、目的のＤＮＡまたはタンパク質が少なくとも９５％を構成している、「高度に」精製された調製物を意味すると理解されるべきである。
【００３６】
目的のＤＮＡまたはタンパク質を含む細胞抽出物は、目的のタンパク質を発現するかまたは目的のＤＮＡを含む細胞から得られた、ホモジネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）調製物または細胞を含まない調製物を意味すると理解されるべきである。用語「細胞抽出物」は、培養培地、特に、そこから細胞が取り出された使用済みの培養培地を含むように意図される。
【００３７】
本明細書中で使用される場合には、「調節する」は、機能の抑制、増強、または誘導を意味する。例えば、亜鉛フィンガー−核酸結合ドメインおよびその変異体は、プロモーターの中のモチーフに結合し、それによってプロモーターである細胞性のヌクレオチド配列に動作可能であるように連結された遺伝子の転写を増大させるかまたは抑制することによって、プロモーター配列を調節することができる。あるいは、調節には、遺伝子の転写の阻害が含まれ得る。ここで、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体が構造遺伝子に結合し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を読み取ることをブロックし、それによって遺伝子の転写を阻害する。構造遺伝子は、例えば、正常な細胞性の遺伝子または腫瘍遺伝子であり得る。あるいは、調節には、転写物の翻訳の阻害が含まれる場合がある。
【００３８】
本明細書中で使用される場合は、用語「阻害」は、プロモーターに動作可能であるように連結された構造遺伝子の転写の活性化のレベルの抑制を意味する。例えば、本明細書中の方法については、遺伝子には亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合モチーフが含まれる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合は、用語「転写調節領域」は、標的細胞中で遺伝子の発現を駆動する領域を意味する。本明細書中での使用に適している転写調節領域としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶエンハンサーに結合させられたＰＧＫおよびα−アクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の転写調節領域もまた当該分野で公知である。
【００４０】
本明細書中で使用される場合は、遺伝子のプロモーター領域には、通常は構造遺伝子の５’側に存在している調節エレメント（単数または複数）が含まれ、複数の調節エレメントが、介在するヌクレオチド配列によって間隔を隔てられて存在することができる。遺伝子が活性化させられる場合には、転写因子として知られているタンパク質が遺伝子のプロモーター領域に結合する。この集合は、酵素がＤＮＡからＲＮＡへと第２の遺伝子セグメントを転写することを可能にする「スイッチオン（ｏｎ  ｓｗｉｔｃｈ）」と似ている。ほとんどの場合には、得られるＲＮＡ分子は、特異的なタンパク質の合成のための鋳型となる。多くの場合は、ＲＮＡ自体が最終産物である。プロモーター領域は、正常な細胞性のプロモーター、または例えば、腫瘍プロモーター（ｏｎｃｏ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ）であり得る。腫瘍プロモーターは、一般的には、ウイルスに由来するプロモーターである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ポリペプチドをそれに対して標的化させることができるウイルスプロモーターとしては、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、およびレンチウイルスプロモーター（例えば、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）１および２、ならびに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１または２）に由来するプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＩＶ−１  ＬＴＲからの転写を抑制するＴＮＮ−特異的亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む亜鉛フィンガー結合ポリペプチドの一例は、以下の実施例１２に提供される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合は、用語「有効量」には、すでに活性化されたプロモーターの不活化を生じる量、または亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターの不活化を生じる量、または構造遺伝子の転写もしくはＲＮＡの翻訳をブロックする量が含まれる。必要とされる亜鉛フィンガーに由来するヌクレオチド結合ポリペプチドの量は、既存のタンパク質／タンパク質複合体の中の天然の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質のいずれかを置き換えるために必要な量、または、プロモーター自体と複合体を形成することについて天然の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質と競合するために必要な量である。同様に、構造遺伝子またはＲＮＡをブロックするために必要な量は、それぞれ、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子からの読み取りをブロックする量、または、翻訳を阻害する量である。好ましくは、この方法は細胞内で行われる。プロモーターまたは構造遺伝子を機能的に不活化させることにより、転写または翻訳が抑制される。亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質モチーフを含む細胞性のヌクレオチド配列に結合する、またはそれらに「接触する」ための有効量の阻害性タンパク質の送達は、本明細書中に記載される機構のうちの１つ（例えば、レトロウイルスベクターまたはリポソーム）、あるいは当該分野で周知の他の方法によって行うことができる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合は、用語「短縮型」は、天然の亜鉛フィンガー結合タンパク質において見られる亜鉛フィンガーの総数よりも少ない亜鉛フィンガーを含むか、あるいは、所望されない配列が欠失させられている、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体を意味する。例えば、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質ＴＦＩＩＩＡ（これは、自然界においては、９個の亜鉛フィンガーを含む）の短縮によっては、亜鉛フィンガーを１個から３個しか有していないポリペプチドが生じ得る。用語「拡大」は、さらに亜鉛フィンガーモジュールが付加されている亜鉛フィンガーポリペプチドを意味する。例えば、ＴＦＩＩＩＡは、３個の亜鉛フィンガードメインを付加することによって１２フィンガーに拡大させることができる。加えて、短縮型の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドには、１つ以上の野生型ポリペプチドに由来する亜鉛フィンガーモジュールが含まれ得、したがって、「ハイブリッド」亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが生じる。
【００４３】
本明細書中で使用される場合は、用語「突然変異した」は、タンパク質をコードするＤＮＡの無作為の、または部位特異的突然変異誘発を行うための公知の方法のうちのいずれかを行うことによって得られた、亜鉛フィンガーに由来するヌクレオチド結合ポリペプチドを意味する。例えば、ＴＦＩＩＩＡにおいては、突然変異誘発は、コンセンサス配列の１つ以上の繰り返しの中の保存されていない残基を置き換えるために行うことができる。短縮型または拡大型の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質もまた、突然変異させることができる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合は、ポリペプチド「変異体」または「誘導体」は、ポリペプチドの突然変異した形態であるポリペプチド、または組み換えによって生産されたが、所望される活性（例えば、リガンドもしくは核酸分子に結合する能力、または転写を調節する能力）をなおも保持しているポリペプチドを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合は、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドの「変異体または「誘導体」は、亜鉛フィンガータンパク質の突然変異した形態であるポリペプチド、または組み換えによって生産されたポリペプチドを意味する。変異体は、例えば、第２のタンパク質の亜鉛フィンガードメイン（単数または複数）に連結させられた、１つのタンパク質に由来する亜鉛フィンガードメイン（単数または複数）を含むハイブリッドであり得る。ドメインは野生型である場合も、また、突然変異している場合もある。「変異体」または「誘導体」には、野生型の亜鉛フィンガータンパク質の短縮型が含まれ得、これには、野生型タンパク質の中のフィンガーのもともとの数よりも少ないフィンガーの数が含まれる。誘導体または変異体をそれから生産することができる亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドの例としては、ＴＦＩＩＩＡおよびｚｉｆ２６８が含まれる。同様の用語が、「変異体」または「誘導体」核ホルモン受容体、および「変異体」または「誘導体」転写エフェクタードメインを意味するように使用される。
【００４６】
本明細書中で使用される場合は、「亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合標的またはモチーフ」は、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合誘導ポリペプチドがそれに対して特異性を伴って結合するヌクレオチドセグメントの、任意の２次元または３次元特性を意味する。この定義には、ヌクレオチド配列（一般的には、５ヌクレオチド未満のもの）、ならびに、ＤＮＡ二重ヘリックスの三次元態様（例えば、主溝および副溝とヘリックスの表面であるが、これらに限定されない）が含まれる。モチーフは、通常は、亜鉛フィンガーポリペプチドがそれに結合することができる適切な長さの任意の配列である。例えば、３フィンガーポリペプチドは、通常は約９から約１４塩基対を有するモチーフに結合する。好ましくは、ゲノムの中での特異性を確実にするためには、認識配列は、少なくとも約１６塩基対である。したがって、何らかの特異性を有する亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドが提供される。亜鉛フィンガー結合モチーフは、経験によって設計された任意の配列であっても、また、それに対して亜鉛フィンガータンパク質が結合する任意の配列であってもよい。このモチーフは、任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の中で見ることができ、これには、調節配列、エキソン、イントロン、または任意の非コード配列が含まれる。
【００４７】
本明細書中で使用される場合は、用語「薬学的に許容される」、「生理学的に寛容である」、およびそれらの文法上のバリエーションは、それらが組成物、担体、希釈剤、および試薬を意味する場合には、ほとんど同じ意味で使用され、それらの材料を、組成物の投与が禁止される程の望ましくない生理学的作用（例えば、吐き気、眩暈、異常亢進など）を生じることなく、ヒトに投与することができることを示す。
【００４８】
本明細書中で使用される場合は、用語「ベクター」は、様々な遺伝的環境の間で、それに動作可能であるように連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。好ましいベクターは、自己複製、およびそれに対して動作可能であるように連結されているＤＮＡセグメントの中に存在している構造遺伝子産物の発現ができるベクターである。したがって、ベクターには、好ましくは、レプリコンと、先に記載された選択マーカーが含まれる。ベクターとしては、発現ベクターが挙げられるが、必ずしもこれに限定はされない。
【００４９】
ＤＮＡ断片を含む核酸分子に関して本明細書中で使用される場合は、表現「動作可能であるように連結された」は、配列またはセグメントが、好ましくは、従来のホスホジエステル結合によって、ＤＮＡの１つの鎖（一本鎖の形態であるか二本鎖の形態であるかは問わない）になるように共有結合されており、その結果、動作可能であるように連結された部分が意図されるように機能することを意味する。それに対して本明細書中に提供される転写単位またはカセットが動作可能であるように連結させられるベクターの選択は、当該分野で周知であるように、所望される機能的特性（例えば、ベクターの複製およびタンパク質の発現）、ならびに、形質転換される宿主細胞に直接依存する。これらは、組み換えＤＮＡ分子の構築の分野で固有の限定である。
【００５０】
本明細書中で使用される場合は、治療用組成物の投与は任意の手段によって行うことができ、これには、経口、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、注入技術、腹腔内投与、および非経口投与が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
Ｉ．本発明
本発明により、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチド、１つ以上のそのようなポリペプチドを含む組成物、そのようなポリペプチドおよび組成物をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、そのようなポリヌクレオチドまたは発現ベクターで形質転換された細胞、ならびに、ヌクレオチド構造および／または機能を調節するためのポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、および発現ベクターの使用が提供される。
【００５２】
ＩＩ．ポリペプチド
本発明により、単離され、精製された亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが提供される。ポリペプチドには、５から１０個のアミノ酸残基、好ましくは、約７アミノ酸残基のヌクレオチド結合領域が含まれる。通常は、ヌクレオチド結合領域は、「ドメイン」と本明細書中で呼ばれる７アミノ酸の配列であり、これは、その立体構造においては主にα−へリックスである。このドメインの構造は、以下にさらに詳細に記載される。しかし、ヌクレオチド結合領域にはそれぞれの側に５個までのアミノ酸を隣接させることができ、用語「ドメイン」には、本明細書中で使用される場合には、これらの追加のアミノ酸が含まれる。ヌクレオチド結合領域は、式ＴＮＮ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する。好ましくは、標的ヌクレオチドは、式ＴＡＮ、ＴＣＮ、ＴＧＮ、ＴＴＮ、ＴＮＡ、ＴＮＣ、ＴＮＧ、またはＴＮＴを有する。さらに好ましくは、標的ヌクレオチドは、式ＴＡＡ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＡＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＴＧＴ、ＴＴＡ、ＴＴＣ、ＴＴＧ、またはＴＴＴを有する。
【００５３】
本発明のポリペプチドは自然界には存在しない変異体である。本明細書中で使用される場合は、用語「自然界には存在しない」は、例えば、以下の１つ以上を意味する：（ａ）自然界には存在しないアミノ酸配列から構成されるポリペプチド；（ｂ）それが自然界において存在している場合にはそのポリペプチドには関係のない、自然界には存在しない二次構造を有するポリペプチド；（ｃ）自然界においてそのポリペプチドが中に存在している生物種とは通常は関係のない１つ以上のアミノ酸を含むポリペプチド；（ｄ）１つ以上のアミノ酸の立体異性体を含むポリペプチドが含まれるポリペプチドであって、立体異性体は、それが自然界において存在している場合にはそのポリペプチドプチドとは無関係である；（ｅ）自然界に存在しているアミノ酸以外の１つ以上の化学的部分を含むポリペプチド；または（ｆ）自然界に存在しているアミノ酸配列の単離された部分（例えば、短縮型の配列）。本発明のポリペプチドは、実質的に混入している物質がない、単離された形態および精製された形態で存在する。ポリペプチドは、天然の供給源から単離し、精製することができる。あるいは、ポリペプチドは、当該分野で周知の技術（例えば、遺伝子操作または固相ペプチド合成）を使用して新しく作成することができる。亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドは、好ましくは、亜鉛フィンガータンパク質の突然変異した形態、または組み換えによって生産されたものであるポリペプチドを意味する。ポリペプチドは、例えば、第２のタンパク質の亜鉛フィンガードメイン（単数または複数）に連結させられた１つのタンパク質に由来する亜鉛フィンガードメイン（単数または複数）を含むハイブリッドであり得る。ドメインは、野生型である場合も、また、突然変異している場合もある。ポリペプチドには、野生型の亜鉛フィンガータンパク質の短縮型が含まれ得る。ポリペプチドを生産することができる亜鉛フィンガータンパク質の例としては、ＳＰ１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡ、およびＺｉｆ２６８、ならびに、Ｃ７（Ｚｉｆ２６８の誘導体）、および当該分野で公知の他の亜鉛フィンガータンパク質が挙げられる。他の亜鉛フィンガータンパク質を導くことができるこれらの亜鉛フィンガータンパク質は、本明細書中では「骨格」または「足場」と呼ばれる。
【００５４】
本発明の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドには、ポリペプチドのα−ヘリックスドメインの中に特有のヘプタマー（連続している７アミノ酸残基の配列）が含まれ、このヘプタマー配列が標的ヌクレオチドに対する結合特異性を決定する。ヘプタマー配列は、α−ヘリックスドメインの中のどの場所にでも配置することができるが、残基に当該分野での従来の番号付けを行った場合に、ヘプタマーが−１位から６位までに広がることが好ましい。本発明のポリペプチドには、亜鉛フィンガータンパク質の一部として機能するように、当該分野で公知の任意のβ−シート、およびフレームワーク配列を含めることができる。多数の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドを作成し、ＴＮＮトリプレットを含む標的ヌクレオチドに対する結合特異性について試験した。
【００５５】
亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体を、短縮もしくは拡大によって野生型亜鉛フィンガータンパク質から、または部位特異的突然変異のプロセスによって野生型に由来するポリペプチドの変異体として、あるいは、これらの手順の組み合わせによって抽出、あるいは作成することができる。加えて、短縮型の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドには、１つ以上の野生型ポリペプチドに由来する亜鉛フィンガーモジュールが含まれ得、それによって、「ハイブリッド」亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドが生じる。
【００５６】
用語「突然変異した」は、タンパク質をコードするＤＮＡの無作為の、または部位特異的突然変異誘発を行うための公知の方法のうちのいずれかを行うことによって得られた、亜鉛フィンガーに由来するヌクレオチド結合ポリペプチドを意味する。例えば、ＴＦＩＩＩＡにおいては、突然変異誘発は、コンセンサス配列の１つ以上の繰り返しの中の保存されていない残基を置き換えるために行うことができる。短縮型の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質もまた、突然変異させることができる。亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の機能を阻害するための、本発明による短縮型、拡大型、および／または突然変異型であり得る公知の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドの例としては、ＴＦＩＩＩＡおよびＺｉｆ２６８が挙げられる。他の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質は当業者に公知である。
【００５７】
通常、結合領域は７個のアミノ酸残基を有しており、α−ヘリックス構造を有する。
【００５８】
加えて、本発明のポリペプチドは、より長いポリペプチドの中に組み込むことができる。これについてのいくつかの例が、ポリペプチドが人工的な転写因子を作成するために使用される場合について、以下に記載される。しかし、一般的には、ポリペプチドはより長い融合タンパク質の中に組み込まれ、それらの特異的ＤＮＡ結合活性を保持することができる。これらの融合タンパク質には、当該分野で公知の様々なさらなるドメイン（例えば、精製タグ、酵素ドメイン、または他のドメイン）を、亜鉛フィンガーポリペプチドの特異的ＤＮＡ結合活性を有意に変化させることなく、含めることができる。１つの例においては、ポリペプチドは、細胞内またはインビボで配列に意味を持たせるために、β−ラクタマーゼ様の開裂酵素の２つの半分の部分の中に組み込むことができる。その後、そのような開裂酵素の２つの半分の部分の結合によって、開裂酵素の集合が可能となる（Ｊ．Ｍ．Ｓｐｏｔｔｓら、「Ｔｉｍｅ−Ｌａｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１５１４２−１５１４７（２００２））。別の例においては、本発明のマルチ亜鉛フィンガードメインはタンデムに連結させることができ、より長いＤＮＡ配列に対して特異的な結合親和性を有するポリペプチドを形成させることができる。これは以下にさらに説明する。具体的には、ポリペプチドを、式ＡＮＮ、ＣＮＮ、またはＧＮＮ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する、少なくとも１つの他の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドに動作可能であるように連結させることができる。あるいは、ポリペプチドは、１つ以上の転写調節因子に動作可能であるように連結させることができる。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、当該分野で周知の様々な標準的な技術を使用して作成することができる。実施例において本明細書中以後に詳細に開示されるように、亜鉛フィンガータンパク質のファージディスプレイライブラリーを作成し、配列特異的タンパク質の富化に好ましい条件下で選択した。多数の配列を認識する亜鉛フィンガードメインには、ファージ選択データと構造情報の両方によって導かれる部位特異的突然変異誘発による確認が必要であった。
【００６０】
本発明者らは、５’−（ＧＮＮ）−３’型のＤＮＡ配列のそれぞれを特異的に認識する１６個の亜鉛フィンガードメインの特性決定を以前に報告した。これらは、マウスの転写因子Ｚｉｆ２６８の変異体であるＣ７に基づいてファージディスプレイ選択によって単離され、部位特異的突然変異によって確認された（Ｓｅｇａｌら、（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），２７５８−２７６３；Ｄｒｅｉｅｒら、（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０３，４８９−５０２；および米国特許第６，１４０，０８１号（その開示は引用により本明細書中に組み入れられる））。一般的には、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２型の亜鉛フィンガードメインの特異的ＤＮＡ認識は、それぞれのα−ヘリックスの−１位、３位、および６位のアミノ酸残基によって媒介されるが、全ての場合において、３つの塩基がすべてＤＮＡ塩基と接触しているわけではない。１つの優性なサブサイトを超えた相互作用が、認識ヘリックスの２位から観察されている。Ａｓｐ２は、続く３ｂｐのサブサイトの、それぞれ、５’−チミンまたはグアニンの、相補的なアデニンまたはシトシンへの直接の接触によって、亜鉛フィンガードメインの結合を安定化させることが示されている。これらの非モジュール相互作用は、標的部位の重複として記載されている。加えて、拡大された結合部位を作成する３ｂｐのサブサイトの外側のヌクレオチドとのアミノ酸の他の相互作用が報告されている（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２（５００７），８０９−８１７；Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４（１０），１１７１−１１８０；Ｉｓａｌａｎら、（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１１），５６１７−５６２１）。
【００６１】
多数の亜鉛フィンガードメインについての結果から得られた、特定のＤＮＡトリプレットに結合する亜鉛フィンガードメインの配列の一般化のいくつかを、以下の表１に示す。一般的には、亜鉛フィンガードメインの−１位のアミノ酸は、トリプレット部位の３’ヌクレオチドの特定に主に関与しており、亜鉛フィンガードメインの３位のアミノ酸は、トリプレット部位の中央のヌクレオチドの特定に主に関与しており、そして亜鉛フィンガードメインの６位のアミノ酸は、トリプレット部位の５’ヌクレオチドの特定に主に関与している。これらの一般化が、実施例１に記載される亜鉛フィンガーに基づくさらなる亜鉛フィンガーの構築のために、以下で使用される。
【００６２】
【表１】
2009520463.tif 000002
グアニンまたはチミン以外の５’ヌクレオチドに結合する亜鉛フィンガードメインについての以前に報告されているファージディスプレイライブラリーの選択は、フィンガー３認識ヘリックスＲＳＤ−Ｅ−ＬＫＲ（配列番号４１３）の２位のアスパラギン酸からのサブサイトを超えた相互作用が原因で成功していない。人工的な転写因子の構築のために亜鉛フィンガードメインの利用性を拡大するために、５’−（ＡＮＮ）−３’型のＤＮＡ配列を特異的に認識するドメインが選択された（２００１年２月２１日に提出された米国特許出願番号０９／７９１，１０６（その開示は引用により本明細書中に組み入れられる））。他のグループによっては、４種類の５’−（ＡＮＮ）−３’サブサイト、５’−（ＡＡＡ）−３’、５’−（ＡＡＧ）−３’、５’−（ＡＣＡ）−３’、および５’−（ＡＴＡ）−３’を認識するドメインの特性決定へと導く連続する選択方法が記載されている（Ｇｒｅｉｓｍａｎら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５（５３００），６５７−６６１；Ｗｏｌｆｅら、（１９９９）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８５（５），１９１７−１９３４）。本開示では、標的部位の重複を排除することによる、ＴＮＮ部位を認識する亜鉛フィンガードメインを選択するためのアプローチが使用される。
【００６３】
３フィンガータンパク質Ｃ７．ＧＡＴに基づいて、ライブラリーが、これまでに、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈの中に構築されている（Ｂａｒｂａｓら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，７９７８−７９８２；Ｒａｄｅｒら、（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（４），５０３−５０８）。無作為化には、ＶＮＳコドンドーピングストラテジー（Ｖ＝アデニン、シトシン、またはグアニン、Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニン、またはチミン、Ｓ＝シトシンまたはグアニン）を使用するフィンガー２のα−ヘリックスの−１位、１位、２位、３位、５位、および６位が含まれていた。これにより、それぞれの無作為化されたアミノ酸位置について２４の可能性が可能となり、一方では、芳香族アミノ酸Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒ、さらには終結コドンが、このストラテジーにおいては排除された。ＬｅｕはＣｙｓ２−Ｈｉｓ２型の亜鉛フィンガードメインの認識ヘリックスの４位に優先的に見られるので、この位置は無作為化されなかった。ＥＲ２５３７細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）へのライブラリーの形質転換の後、ライブラリーには１．５×１０９のメンバーが含まれていた。これは、必要なライブラリーの大きさを６０倍上回っており、全てのアミノ酸の組み合わせを含めるに十分であった。
【００６４】
これまでに、５’−（ＣＮＮ）−３’型の亜鉛フィンガードメイン結合配列に関して、６回の亜鉛フィンガー−ディスプレイファージの選択が、非ビオチニル化競合因子ＤＮＡの存在下で、それぞれ、１６種類の５’−ＧＡＴ−ＣＮＮ−ＧＣＧ−３’（配列番号３６９）ビオチニル化ヘアピン標的オリゴヌクレオチドのそれぞれに対する結合について行われた。選択のストリンジェンシーは、ビオチニル化標的オリゴヌクレオチドの量を減少させること、および競合因子オリゴヌクレオチド混合物の量を増加させることによって、毎回高められた。６回目には、標的濃度は、通常、１８ｎＭであり、５’−（ＡＮＮ）−３’、５’−（ＧＮＮ）−３’、および５’−（ＴＮＮ）−３’競合因子混合物は、それぞれ、各オリゴヌクレオチドのプールについて５倍過剰であり、特異的５’−（ＣＮＮ）−３’混合物（標的配列を排除する）は１０倍過剰であった。ビオチニル化標的オリゴヌクレオチドに対するファージの結合は、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズへの捕捉によって回収された。クローンは、通常、６回の選択の後で分析された。同様の選択プロセスを、５’−（ＴＮＮ）−３’型の配列に特異的に結合する亜鉛フィンガードメインの選択に使用することができる。このプロセスは、以下に実施例１で説明する。
【００６５】
これらの結果により、当業者が本発明において配列を決定するための多数の指針が提供される。これらの指針のいくつかは、式５’−（ＴＮＮ）−３’型の配列に特異的に結合する亜鉛フィンガードメインの選択にもまた有用である。これらの指針には、以下が含まれる：（１）サブサイトが５’−ＴＡＡ−３’である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、またはＳｅｒが−１位であることが好ましい。（２）サブサイトが５’−ＴＣＡ−３’である場合に、はＳｅｒが−１位であることが好ましい。（３）標的サブサイトが３’−グアニンを有する場合には、−１位にＡｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＩｌｅを有することが一般的には好ましく、Ａｒｇが特に好ましい。（４）５’−ＴＮＧ−３’サブサイトへの結合のためには、２位にＡｓｐを有することが一般的には好ましい。（５）サブサイト５’−ＴＮＴ−３’への結合のためには、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、およびＣｙｓが−１位にあることが一般的には好ましい。（６）３’−シトシンを含むサブサイトについては、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、またはＡｓｐが−１位にあることが通常は好ましい。（７）５’−ＴＡＮ−３’（すなわち、中央のアデニン）の認識については、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓが３位にあることが通常は好ましく；Ａｓｎが強く好ましい。（８）５’−ＴＣＮ−３’サブサイト（すなわち、中央のシトシン）を認識するヘリックスの３位には、ＴｈｒまたはＡｓｐが特に好ましいが、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＡｓｎもまた推奨され得る。（９）標的部位５’−ＴＣＣ−３’については、３位は好ましくはＡｓｎまたはＨｉｓである。（１０）標的部位５’−ＴＣＧ−３’については、３位はＴｈｒまたはＨｉｓのいずれかが好ましい。（１１）標的部位５’−ＴＧＮ−３’については、３位にはＨｉｓが好ましい。（１２）標的部位５’−ＴＧ（Ｇ／Ｔ）−３’については、３位にはＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、およびＧｌｙが好ましく；Ｈｉｓもまた好ましい。（１３）標的部位５’−ＴＧＣ−３’については、３位にはＴｒｐおよびＴｈｒが、通常は好ましく；Ｈｉｓも可能である。（１４）一般的には、５’−ＴＧＮ−３’の中央のグアニンは、３位のＨｉｓによって認識され得る。（１５）標的部位５’−ＴＴＮ−３’については、Ｈｉｓが好ましい５’−ＴＴＣ−３’および５’−ＴＴＴ−３’を除き、３位にはＳｅｒまたはＡｌａのいずれかが好ましい。（１６）１位、２位および５位は幅広く変化することができる。（１７）３’アデニンの認識については、−１位には、通常は、Ｇｌｎが好ましい。（１８）３’グアニンの認識については、−１位には、通常は、Ａｒｇが好ましい。（１９）３’チミンの認識については、−１位には、通常、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｉｓが好ましい。これらは一部の指針にすぎず、本発明の亜鉛フィンガードメインが組み込まれているタンパク質またはポリペプチドの二次構造または三次構造から、特定のサブサイト、またはそのようなサブサイトの定義された位置の特定のヌクレオチドの認識に好ましい様々なアミノ酸を導くことができる。加えて、複数の亜鉛フィンガー部分を有するタンパク質の中の特定の亜鉛フィンガー部分の立体構造が結合に影響を与え得る。
【００６６】
他のアミノ酸残基もまた、変異または置換の目的である。例えば、ロイシンは、多くの場合は７アミノ酸のドメインの４位に存在し、タンパク質の疎水性コアの中に包まれている。したがって、４位のロイシンは、タンパク質の三次元構造または機能を乱すことなく、他の比較的小さい疎水性残基（例えば、バリンおよびイソロイシン）で置き換えることができる。あるいは、４位のロイシンはまた、フェニルアラニンまたはトリプトファンのような他の疎水性残基で置き換えることもできる。
【００６７】
他のアミノ酸置換が可能である。例えば、トリプレット部位が中央の位置にＣを有する場合には、ヘリックスの３位について、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、およびＴｈｒの間で置換を行うことができる。Ｇがトリプレットの中央の位置にある場合には、Ｈｉｓがヘリックスの３位について可能であり、その場所の別のアミノ酸に置き換わることができる。トリプレットの最後の２つの塩基がＣＧまたはＣＣである場合には、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、およびＧｌｙが３位についての代替であり、その場所の別のアミノ酸に置き換わることができる。トリプレットの最後の２つの塩基がＧＣである場合には、ＴｒｐおよびＴｈｒが３位についての代替であり、その場所の別のアミノ酸に置き換わることができる。トリプレットの中央の塩基がＴである場合には、ヘリックスの３位についての代替としては、Ｓｅｒ、Ａｌａがあげられ、Ｈｉｓも可能である。これらのアミノ酸残基は、ヘリックスの３位の別のアミノ酸に置き換わることができる。特に、Ｌｅｕがその場所に存在する場合には、Ｃｙｓもまた４位についての代替である。
【００６８】
以下の表（表２）には、５’塩基がＴであると仮定した場合の潜在的に有用なアミノ酸置換の範囲が記載される。
【００６９】
【表２】
2009520463.tif 000003
表２には、特に好ましいアミノ酸が下線で示されている。「Ｎ」は、４種類の可能な自然界に存在しているヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のいずれかである。
【００７０】
加えて、実施例１２には、トリプレット５’−ＴＣＴ−３’に結合するさらなる亜鉛フィンガードメインＲＧＧ−Ｗ−ＬＱＡ（配列番号４６）が提供される。この亜鉛フィンガードメインは、ＨＩＶ−１の高度に保存されているプライマー結合部位を標的化し、５’−ＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧ−３’（配列番号４２５）のＤＮＡ配列全体に結合する、人工的な転写因子の６フィンガーのＤＮＡ結合配列の中にある（実施例１２、表１３）。
【００７１】
したがって、本発明のポリペプチドの中に含まれる好ましい亜鉛フィンガードメイン、および５’−（ＴＮＮ）−３’型の結合配列としては、以下が挙げられる：
【００７２】
【化１】
2009520463.tif 000004
【００７３】
【化２】
2009520463.tif 000005
これらの中では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６が特に好ましい。
【００７４】
亜鉛フィンガードメインの以下のアミノ酸配列は、表１において上記に示されたアミノ酸の置換についての一般的な適用性の規則によって、配列番号１から配列番号４６のアミノ酸配列から導かれる。これらには、配列番号３５９から配列番号４１１が含まれ、これらは、実施例１２によってＲＧＧ−Ｗ−ＬＱＡ（配列番号４６）から導かれる。したがって、これらの配列は本発明の範囲に含まれ、そしてこれらの配列が組み込まれ、特定のヌクレオチドトリプレット配列に結合するポリペプチドもまた、本発明の範囲に含まれる。これらの配列のそれぞれによって結合されるトリプレットは括弧内である。これらの配列は以下である：
【００７５】
【化３】
2009520463.tif 000006
【００７６】
【化４】
2009520463.tif 000007
【００７７】
【化５】
2009520463.tif 000008
【００７８】
【化６】
2009520463.tif 000009
【００７９】
【化７】
2009520463.tif 000010
【００８０】
【化８】
2009520463.tif 000011
【００８１】
【化９】
2009520463.tif 000012
【００８２】
【化１０】
2009520463.tif 000013
【００８３】
【化１１】
2009520463.tif 000014
【００８４】
【化１２】
2009520463.tif 000015
【００８５】
【化１３】
2009520463.tif 000016
【００８６】
【化１４】
2009520463.tif 000017
１つの実施形態においては、本発明のポリペプチドには、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を含む結合領域が含まれる。これらの結合特性が決定される方法についての詳細な記載は、実施例において本明細書中以後に見ることができる。そのようなポリペプチドは、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと、ヌクレオチド標的に対する結合について競合する。すなわち、好ましいポリペプチドには、競合様式で、配列番号１から配列番号４１１のいずれかの結合に取って代わる結合領域が含まれる。競合結合を決定するための手段は当該分野で周知である。さらに好ましくは、ポリペプチドには、配列番号１から配列番号４６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を含む結合領域が含まれる。これは、配列番号１から配列番号４６のいずれかと、ヌクレオチド標的に対する結合について競合するか、あるいは、競合様式で、配列番号１から配列番号４６のいずれかの結合に取って代わる結合領域が含まれる。なおさらに好ましくは、ポリペプチドには、配列番号１から配列番号６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を含む結合領域が含まれる。これは、配列番号１から配列番号６のいずれかと、ヌクレオチド標的に対する結合について競合するか、あるいは、競合様式で、配列番号１から配列番号６のいずれかの結合に取って代わる結合領域が含まれる。好ましくは、結合領域は、配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、結合領域は、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列を有する。なおさらに好ましくは、結合領域は、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を有する。
【００８７】
上記で開示されたポリペプチドとは異なるポリペプチド（例えば、２つ以下の保存的アミノ酸置換が配列番号１から配列番号４１１のいずれか、配列番号１から配列番号４６のいずれか、もしくは配列番号１から配列番号６のいずれかの中に含まれており、置換が行われる前のポリペプチドの少なくとも８０％程度の、所望されるサブサイトもしくは標的領域に対する結合親和性を有するポリペプチド）もまた、本発明の範囲に含まれる。解離定数に関しては、これは、置換が行われる前のポリペプチドの解離定数の１２５％を超えない解離定数に等しい。この状況では、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の置換のうちの１つと定義される：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕ。好ましくは、ポリペプチドは、わずか１つの保存的アミノ酸置換によって、上記ポリペプチドとは異なる。
【００８８】
加えて、亜鉛フィンガーが組み込まれているタンパク質またはポリペプチドは、実施例１１において以下に詳細に記載されるように、分子的にモデル化することができる。分子のモデル化のための１つの適切なコンピュータープログラムは、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩである。分子モデリングは、本明細書中に記載される亜鉛フィンガー部分のバリエーションに基づいて他の亜鉛フィンガー部分を作成するために使用することができ、これは本発明の範囲に含まれる。モデル化によって、そのような変異体が、本発明の範囲に含まれる亜鉛フィンガー部分の水素結合パターンと実質的に類似しており、モデル化のための基準として使用される水素結合パターンを有することが確立される場合には、そのような変異体もまた本発明の範囲に含まれる。本明細書中で使用される場合は、水素結合パターンに関する用語「実質的に類似している」は、同じ数の水素結合が存在すること、それぞれの水素結合の結合角が約１０℃を超えないで変化すること、そしてそれぞれの水素結合の結合の長さが約０．２Åを超えないで変化することを意味する。
【００８９】
通常、ポリペプチドと適切な配列のＤＮＡとの間での結合は、１μＭから１０μＭまでのＫＤで生じる。好ましくは、結合は、１０μＭから１μＭ、１０ｐＭから１００ｎＭ、１００ｐＭから１０ｎＭのＫＤで、さらに好ましくは、１ｎＭから１０ｎＭのＫＤで起こる。これらの結合パラメーターもまた、これらのポリペプチドが組み込まれている他のポリペプチド（例えば、本明細書中で以下に記載されるポリペプチド組成物）の結合を特性決定する。
【００９０】
したがって、他の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインを、本発明のポリペプチドに含めることができる。これらのドメインの全てに、７アミノ酸の亜鉛フィンガードメインが含まれており、ここで、このドメインの７個のアミノ酸には−１から６の番号が付けられる。これらのドメインには、以下が含まれる：（１）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、およびＳからなる群より選択される）；（２）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓである）；（３）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、およびＩからなる群より選択される）；（４）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、このドメインの２と番号が付けられるアミノ酸残基はＤである）；（５）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ａ、およびＣからなる群より選択される）；（６）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｈ、およびＤからなる群より選択される）；（７）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｉ、およびＫからなる群より選択される）；（８）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＮからなる群より選択される）；（９）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される）；（１０）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される）；（１１）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１２）５’−（ＴＧＧ）−３’および５’−（ＴＧＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＨからなる群より選択される）；（１３）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｗ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される）；（１４）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１５）５’−（ＴＴＡ）−３’および５’−（ＴＴＧ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、ＳおよびＡからなる群より選択される）；（１６）５’−（ＴＴＣ）−３’および５’−（ＴＴＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１７）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＲである）；（１８）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される）；ならびに、（１９）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、４と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＣからなる群より選択される）。
【００９１】
本発明のポリペプチドの中に組み込むことができるなお他の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインは、上記のドメイン、すなわち、配列番号１から配列番号４１１から、部位特異的突然変異およびスクリーニングによって導くことができる。部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）技術（部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）技術としても知られている）は当該分野で周知であり、本明細書中に詳細に記載される必要はない。そのような技術は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１），第２巻，第１３章，ｐｐ．１３．１−１３．５６に記載されている。
【００９２】
ＩＩＩ．ポリペプチド組成物
別の態様においては、本発明により、５’−（ＴＮＮ）ｎ−３’（式中、ｎは１より大きい整数である）として定義されるヌクレオチド標的モチーフに特異的に結合するように、動作可能に連結させられた複数の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ドメインが含まれるポリペプチド組成物が提供される。標的モチーフは、任意のより長いヌクレオチド配列（例えば、３個から１３個またはそれ以上のＴＮＮ、ＧＮＮ、ＡＮＮ、またはＮＮＮ配列）の中に配置することができる。好ましくは、ｎは２から１８、より好ましくは２から１２、なおさらに好ましくは２から６までの整数である。個々のポリペプチドは、オリゴペプチドリンカーに連結させられることが好ましい。そのようなリンカーは、好ましくは、自然界に存在している亜鉛フィンガータンパク質の中で見られるリンカーに似ている。本発明での使用に好ましいリンカーは、アミノ酸残基配列ＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）である。このリンカーの修飾もまた使用することができる。例えば、リンカーの３位のグルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）で置き換えることができる。１位のスレオニン（Ｔ）はセリン（Ｓ）で置き換えることができる。２位のグリシン（Ｇ）はアラニン（Ａ）で置き換えることができる。４位のリジン（Ｋ）はアルギニン（Ｒ）で置き換えることができる。本発明での使用に好ましい別のリンカーは、アミノ酸残基配列ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号４１４）である。このより長いリンカーは、実質的に独立した様式で動作するより長い複数の亜鉛フィンガー結合ポリペプチドの２つの半分の部分を有することが所望される場合に使用され得る。このより長いリンカーの修飾もまた使用することができる。例えば、４個のグリシン（Ｇ）残基のポリグリシンの並びは、それぞれが、より長いまたはより短いものであり得る（すなわち、それぞれ、３個または５個のグリシン残基）。ポリグリシンの並びの間のセリン残基（Ｓ）は、スレオニン（Ｔ）で置き換えることができる。リンカーＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号４１４）の一部を含むＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）部分は、ＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）リンカーの単独についての上記と同様に修飾することができる。ペプチド（例えば、単鎖抗体ドメイン）を連結させるための他のリンカー（例えば、グリシンまたはセリンの繰り返し）は当該分野で周知であり、本発明の組成物において使用することができる。リンカーの使用は全ての目的について必要ではなく、状況に応じて省略することができる。
【００９３】
他のリンカーが当該分野で公知であり、代わりに使用することができる。これらとしては、リンカーＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号４１６）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号４１７）、ＧＧＲＧＲＧＲＧＲＱ（配列番号４１８）、ＱＮＫＫＧＧＳＧＤＧＫＫＫＱＨＩ（配列番号４１９）、ＴＧＧＥＲＰ（配列番号４２０）、ＡＴＧＥＫＰ（配列番号４２１）、およびＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号４２２）、ならびに、アミノ酸置換がＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）およびＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号４１４）について上記に記載されたように行われているそれらのリンカーの誘導体が挙げられる。例えば、これらのリンカーにおいては、ＱＮＫＫＧＧＳＧＤＧＫＫＫＱＨＩ（配列番号４１９）またはＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号４２２）の中のジグリシンまたはポリグリシンの並びの間のセリン（Ｓ）残基は、スレオニン（Ｔ）で置き換えることができる。ＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号４２２）においては、９位のグルタミン酸（Ｅ）はアスパラギン酸（Ｄ）で置き換えることができる。これらのリンカーおよびこれらのリンカーの誘導体を含むポリペプチド組成物は、本発明のポリペプチド組成物に含まれる。
【００９４】
これらのポリペプチド組成物においては、亜鉛フィンガードメインはそれぞれ、配列番号１から配列番号４１１の配列である。通常、亜鉛フィンガードメインはそれぞれ、配列番号１から配列番号４６の配列である。好ましくは、亜鉛フィンガードメインはそれぞれ、配列番号１から配列番号６の配列である。
【００９５】
あるいは、これらのポリペプチド組成物においては、これらの亜鉛フィンガードメインのそれぞれには、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する結合領域が含まれる。これらの結合領域は、ヌクレオチド標的への結合について、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと競合するか、または、競合様式で配列番号１から配列番号４１１のいずれかの結合に置き換わる。あるいは、好ましくは、これらの亜鉛フィンガードメインのそれぞれには、配列番号１から配列番号４６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する結合領域が含まれる。これらの結合領域は、ヌクレオチド標的への結合について、配列番号１から配列番号４６のいずれかと競合するか、または、競合様式で配列番号１から配列番号４６のいずれかの結合に置き換わる。さらに好ましくは、これらの亜鉛フィンガードメインのそれぞれには、配列番号１から配列番号６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する結合領域が含まれる。これらの結合領域は、ヌクレオチド標的への結合について、配列番号１から配列番号６のいずれかと競合するか、または、競合様式で配列番号１から配列番号６のいずれかの結合に置き換わる。
【００９６】
あるいは別に、これらの亜鉛フィンガードメインのそれぞれには、上記に開示された結合領域とは異なる結合領域（例えば、２つ以下の保存的アミノ酸置換が配列番号１から配列番号４１１のいずれか、配列番号１から配列番号４６のいずれか、もしくは配列番号１から配列番号６のいずれかの中に含まれており、置換が行われる前の結合領域の少なくとも８０％程度の、所望されるサブサイトもしくは標的領域に対する結合親和性を有する結合領域）が含まれる。これらのマルチ結合領域ポリペプチドの中の所望されるサブサイトまたは標的領域に対する結合親和性の評価においては、結合親和性は、他の結合領域からの干渉のない条件で決定される。
【００９７】
あるいはなお別に、上記に記載された本発明のポリペプチド組成物においては、亜鉛フィンガードメインのそれぞれは以下のようなドメインである：（１）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、およびＳからなる群より選択される）；（２）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓである）；（３）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、およびＩからなる群より選択される）；（４）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、このドメインの２と番号が付けられるアミノ酸残基はＤである）；（５）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ａ、およびＣからなる群より選択される）；（６）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｈ、およびＤからなる群より選択される）；（７）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｉ、およびＫからなる群より選択される）；（８）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＮからなる群より選択される）；（９）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される）；（１０）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＧ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される）；（１１）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１２）５’−（ＴＧＧ）−３’および５’−（ＴＧＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＨからなる群より選択される）；（１３）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＣ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｗ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される）；（１４）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１５）５’−（ＴＴＡ）−３’および５’−（ＴＴＧ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、ＳおよびＡからなる群より選択される）；（１６）５’−（ＴＴＣ）−３’および５’−（ＴＴＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１７）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＡ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＲである）；（１８）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される）；ならびに、（１９）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＮ）−３’に特異的に結合する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメイン（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、４と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＣからなる群より選択される）。
【００９８】
あるいはなお他には、上記に記載された亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインのうちの任意のものを、本発明のポリペプチド組成物に含めることができる。
【００９９】
上記に記載された分子モデリングによって作成された結合領域を含む、これらのポリペプチドの結合領域についての他の代わりとなるものは本発明の範囲に含まれる。
【０１００】
あるいはなお別に、ポリペプチド組成物には、２つの半分の部分が含まれる二重特異的亜鉛フィンガータンパク質が含まれ得る。それぞれの半分の部分には、６個の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインが含まれる。ここで、半分の部分の少なくとも一方に、５’−（ＴＮＮ）−３’型の標的ヌクレオチド配列に結合する少なくとも１つのドメインが含まれ、その結果、二重特異的亜鉛フィンガーの２つの半分の部分は独立して作動することができる。２つの半分の部分は、アミノ酸残基配列ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号４１４）のようなリンカーまたは上記に記載された別のリンカーによって連結させることができる。通常、二重特異的亜鉛フィンガータンパク質のこの形態のリンカーには、約１２から約１８個のアミノ酸残基が含まれる。
【０１０１】
あるいは別に、ポリペプチド組成物には、配列５’−（ＴＮＮ）−３’を有するヌクレオチドサブサイトまたは標的領域に特異的に結合する結合領域に加えて、配列５’−（ＡＮＮ）−３’、５’−（ＣＮＮ）−３’、または５’−（ＧＮＮ）−３’を有するヌクレオチドサブサイトまたは標的領域に特異的に結合する結合領域を含む１つ以上のポリペプチドが含まれ得る。配列５’−（ＡＮＮ）−３’を有するヌクレオチドサブサイトに特異的に結合する結合領域は、例えば、Ｂａｒｂａｓら、による米国特許出願公開番号２００２／０１６５３５６（引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。配列５’−（ＣＮＮ）−３’を有するヌクレオチドサブサイトに特異的に結合する結合領域は、例えば、Ｂａｒｂａｓら、による米国特許出願公開番号２００４／０２２４３８５（引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。配列５’−（ＧＮＮ）−３’を有するヌクレオチドサブサイトに特異的に結合する結合領域は、例えば、Ｂａｒｂａｓの米国特許第６，６１０，５１２号およびＢａｒｂａｓの米国特許第６，１４０，０８１号（いずれも、引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。適切な特異性のヌクレオチド配列に結合する他の結合領域は当該分野で公知である。
【０１０２】
ポリペプチドに、構造５’−（ＡＮＮ）−３’、５’−（ＴＮＮ）−３’、または５’−（ＴＮＮ）−３’のヌクレオチドサブサイトに特異的に結合する結合領域が含まれる場合には、これらは、ポリペプチドが構造５’−（ＴＮＮ）−３’のヌクレオチドサブサイトに結合する少なくとも１つの結合領域を有する限りにおいて、ポリペプチドの中では任意の順序で存在することができる。例えば、しかし限定ではないが、ポリペプチドには、結合領域（その全てが構造５’−（ＴＮＮ）−３’のヌクレオチドサブサイトに結合する）のブロックが含まれ得るか、あるいは、構造５’−（ＡＮＮ）−３’、５’−（ＣＮＮ）−３’、または５’−（ＴＮＮ）−３’の結合領域結合ヌクレオチドサブサイトが散りばめられている構造５’−（ＴＮＮ）−３’の結合領域結合ヌクレオチドサブサイトを有することができる。ポリペプチドには、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、またはそれ以上の結合領域が含まれ得、それぞれは、重ねて、ポリペプチドが構造５’−（ＴＮＮ）−３’のヌクレオチドサブサイトに結合する少なくとも１つの結合領域を有する限りにおいて、構造５’−（ＡＮＮ）−３’、５’−（ＣＮＮ）−３’、５’−（ＧＮＮ）−３’、または５’−（ＴＮＮ）−３’のサブサイトに結合する。１つの別の方法においては、ポリペプチドの中の結合領域の全てが、構造５’−（ＴＮＮ）−３’のヌクレオチドサブサイトに結合する。したがって、本発明には、式ＡＮＮ、ＣＮＮ、またはＧＮＮ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する少なくとも１つの他の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドに動作可能であるように連結された上記ポリペプチド組成物が含まれる。あるいは、以下に記載されるように、本発明のポリペプチド組成物は、１つ以上の転写因子に動作可能であるように連結させることができる。
【０１０３】
本発明のポリペプチド組成物は、１つ以上の機能的なポリペプチドに動作可能であるように連結させることができる。そのような機能的なポリペプチドは、定義された機能を有するタンパク質の完全な配列であってよく、また、定義された機能を有するタンパク質の中に生じる１つのドメインもしくは複数のドメインに由来することもできる。そのような機能的なポリペプチドは当該分野で周知であり、転写調節因子（例えば、リプレッサーまたは活性化ドメイン）または他の機能を有するポリペプチドであり得る。組み込むことができる例示的であり、好ましい機能的なポリペプチドは、ヌクレアーゼ、ラクタマーゼ、インテグラーゼ、メチラーゼ、核局在化ドメイン、および制限酵素（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）、ならびに加水分解活性のような酵素活性を有する他のドメインである（例えば、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８０：８４１−８４８，１９９９を参照のこと）。通常、動作可能な連結は、融合タンパク質を形成させるために亜鉛フィンガードメインを他の機能的なポリペプチド（単数または複数）と結合させて１つのポリペプチドを作成することによって行われる。連結は、上記に記載されたように、直接行うことも、また、１つ以上のリンカーを介して行うこともできる。中でも、本発明のポリペプチド組成物に結合させることができる他のポリペプチドは、例えば、選択されたゲノム標的での部位特異的切断を指示することができる構築物を作成するための、ＦｏｋＩのヌクレアーゼ触媒ドメインである。
【０１０４】
例示的なリプレッションドメインポリペプチドは、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）であり（Ｓｇｏｕｒａｓ，Ｄ．Ｎ．，Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅａｌ，Ｇ．Ｊ．，Ｊｒ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｌａｉｒ，Ｄ．Ｇ．＆Ｍａｖｒｏｔｈａｌａｓｓｉｔｉｓ，Ｇ．Ｊ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，４７８１−４７９３）、これは、ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）の４７３位から５３０位のアミノ酸によって定義される。このドメインは、ｅｔｓファミリーの転写因子の活性に対するＥＲＦのアンタゴニスト効果を媒介する。合成のリプレッサーが、亜鉛フィンガータンパク質のＮ末端またはＣ末端に対してこのドメインを融合させることによって構築された。第２のリプレッサータンパク質は、Ｋｒuｐｐｅｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｏｘ（ＫＲＡＢ）ドメインを使用して調製された（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｗ．，Ｋ．−Ｈ．，Ｖｉｓｓｉｎｇ，Ｈ．，Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｈ．−Ｊ．＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｆ．Ｊ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，４５０９−４５１３）。このリプレッサードメインは、一般的には、亜鉛フィンガータンパク質のＮ末端に見られ、おそらくは、距離および方向非依存性の様式（Ｐｅｎｇｕｅ，Ｇ．＆  Ｌａｎｉａ，Ｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１０１５−１０２０）で、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１と相互作用することによってＴＡＴＡ依存性の転写に対してその抑制活性を発揮する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｄ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．−Ｐ．，Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｆ．Ｊ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１０，２０６７−２０７８）。本発明者らは、亜鉛フィンガータンパク質ＫＯＸ１の１位から９７位の間のアミノ酸に見られるＫＲＡＢドメインを利用した（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｗ．，Ｋ．−Ｈ．，Ｖｉｓｓｉｎｇ，Ｈ．，Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｈ．−Ｊ．＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｆ．Ｊ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，４５０９−４５１３）。この場合、亜鉛フィンガーポリペプチドを有するＮ末端融合体が構築された。最後に、抑制についてのヒストン脱アセチル化の有用性を調べるためにＭａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）の１位から３６位のアミノ酸が亜鉛フィンガータンパク質のＮ末端に融合させられた（Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｌａｈｅｒｔｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｑ．Ａ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ａ．Ｐ．＆Ｅｉｓｅｎｍａｎ，Ｒ．Ｎ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，５７７２−５７８１）。この小さいドメインは、転写因子ＭａｄのＮ末端で見られ、これは、ｍＳＩＮ３との相互作用によってその転写抑制を媒介する役割を担っている。これは次いで、コリプレッサーであるＮ−ＣＯＲ、およびヒストンデアセチラーゼｍＲＰＤ１と相互作用する（Ｈｅｉｎｚｅｌ，Ｔ．，Ｌａｖｉｎｓｋｙ，Ｒ．Ｍ．，Ｍｕｌｌｅｎ，Ｔ．−Ｍ．，Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ，Ｍ．，Ｌａｈｅｒｔｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．−Ｍ．，Ｂｒａｒｄ，Ｇ．，＆Ｎｇｏ，Ｓ．Ｄ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，４３−４６）。遺伝子特異的活性化を試験するために、転写活性化因子が、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質の４１３位から４８９位のアミノ酸に対して亜鉛フィンガーポリペプチドを融合させることによって（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．，Ｍａ，Ｊ．，Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．＆Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，５６３−５６４）、またはＶＰ６４と呼ばれるＶＰ１６の最小活性化ドメインの人工的な四量体反復に対して亜鉛フィンガーポリペプチドを融合させることによって（Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．，Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｏ．＆Ｓｃｈａｆｆｌｅｒ，Ｗ．（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，４９６１−４９６８）作成された。
【０１０５】
上記で示された本発明のポリペプチドは、１つ以上の転写調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）または調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）に動作可能であるように連結させることができる。調節因子（例えば、転写活性化因子または転写抑制因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）もしくはリプレッサー）は当該分野で周知である。そのような因子に対してポリペプチドを動作可能であるように連結させるための手段もまた当該分野で周知である。例示的であり、好ましいそのような因子、および遺伝子発現を調節するためのそれらの使用は、本明細書中以後で詳細に述べる。
【０１０６】
遺伝子特異的転写調節因子として亜鉛フィンガータンパク質を使用する概念を試験するために、６フィンガーのタンパク質が多数のエフェクタードメインに融合させられた。転写リプレッサーは、亜鉛フィンガータンパク質に対して３つのヒト由来のリプレッサードメインのいずれかを結合させることによって作成された。第１のリプレッサータンパク質は、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）を使用して調製され（Ｓｇｏｕｒａｓ，Ｄ．Ｎ．，Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅａｌ，Ｇ．Ｊ．，Ｊｒ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｌａｉｒ，Ｄ．Ｇ．＆Ｍａｖｒｏｔｈａｌａｓｓｉｔｉｓ，Ｇ．Ｊ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，４７８１−４７９３）、これは、ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）の４７３位から５３０位のアミノ酸によって定義される。このドメインは、ｅｔｓファミリーの転写因子の活性に対するＥＲＦのアンタゴニスト効果を媒介する。合成のリプレッサーが、亜鉛フィンガータンパク質のＣ末端に対してこのドメインを融合させることによって構築された。第２のリプレッサータンパク質は、Ｋｒuｐｐｅｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｏｘ（ＫＲＡＢ）ドメインを使用して調製された（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｗ．，Ｋ．−Ｈ．，Ｖｉｓｓｉｎｇ，Ｈ．，Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｈ．−Ｊ．＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｆ．Ｊ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，４５０９−４５１３）。このリプレッサードメインは、一般的には、亜鉛フィンガータンパク質のＮ末端に見られ、おそらくは、距離および方向非依存性の様式（Ｐｅｎｇｕｅ，Ｇ．＆Ｌａｎｉａ，Ｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１０１５−１０２０）で、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１と相互作用することによってＴＡＴＡ依存性の転写に対してその抑制活性を発揮する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｄ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．−Ｐ．，Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｆ．Ｊ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１０，２０６７−２０７８）。本発明者らは、亜鉛フィンガータンパク質ＫＯＸ１の１位から９７位のアミノ酸の間に見られるＫＲＡＢドメインを利用した（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｗ．，Ｋ．−Ｈ．，Ｖｉｓｓｉｎｇ，Ｈ．，Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｈ．−Ｊ．＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｆ．Ｊ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，４５０９−４５１３）。この場合、６フィンガータンパク質を有するＮ末端融合体が構築された。最後に、抑制についてのヒストン脱アセチル化の有用性を調べるために、Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）の１位から３６位のアミノ酸が亜鉛フィンガータンパク質のＮ末端に融合させられた（Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｌａｈｅｒｔｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｑ．Ａ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ａ．Ｐ．＆Ｅｉｓｅｎｍａｎ，Ｒ．Ｎ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，５７７２−５７８１）。この小さいドメイ��は、転写因子ＭａｄのＮ末端で見られ、これは、ｍＳＩＮ３との相互作用によってその転写抑制を媒介する役割を担っている。これは次いで、コリプレッサーであるＮ−ＣｏＲ、およびヒストンデアセチラーゼｍＲＰＤ１と相互作用する（Ｈｅｉｎｚｅｌ，Ｔ．，Ｌａｖｉｎｓｋｙ，Ｒ．Ｍ．，Ｍｕｌｌｅｎ，Ｔ．−Ｍ．，Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ，Ｍ．，Ｌａｈｅｒｔｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．−Ｍ．，Ｂｒａｒｄ，Ｇ．，＆Ｎｇｏ，Ｓ．Ｄ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，４３−４６）。別の代わりとなるものは、ＨＤＡＣ１のようなヒストンデアセチラーゼとの直接の融合体である。
【０１０７】
遺伝子特異的活性化を試験するために、転写活性化因子が、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質の４１３位から４８９位のアミノ酸に対して亜鉛フィンガーポリペプチドを融合させることによって（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．，Ｍａ，Ｊ．，Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．＆Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，５６３−５６４）、またはＶＰ６４と呼ばれるＶＰ１６の最小活性化ドメインＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ（配列番号４１５）の人工的な四量体反復に対して亜鉛フィンガーポリペプチドを融合させることによって（Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．，Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｏ．＆Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｗ．（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，４９６１４９６８）作成された。
【０１０８】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合させられたｅｒｂＢ−２プロモーターの断片を含むレポーター構築物が、本発明者らが設計した転写調節因子の特異的活性を試験するために作成された。標的レポータープラスミドには、ＡＴＧ開始コドンに関して−７５８位から−１位のヌクレオチドが含まれていた。プロモーター断片は、ＨｅＬａ細胞の中に一時的にトランスフェクトされた場合には、以前の観察（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｌ．Ｇ．，Ｅｒｔｌ，Ａ．Ｐ．＆Ｇｉｌｌ，Ｇ．Ｎ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，４３８９−４３９３）と一致して、同様の活性を示した。ｅｒｂＢ−２プロモーター活性に対する亜鉛フィンガー−リプレッサードメイン融合体構築物の効果を試験するために、ＨｅＬａ細胞を、亜鉛フィンガー発現ベクターとルシフェラーゼレポーター構築物で一時的に同時トランスフェクトした。有意な抑制が、それぞれの構築物を用いた場合に観察された。転写の活性化を媒介する遺伝子特異的ポリダクチルタンパク質の有用性を、同じ２つのレポーター構築物を使用して研究した。
【０１０９】
本明細書中のデータは、新規の９ｂｐおよび１８ｂｐのＤＮＡ標的部位、さらには他の長さのＤＮＡ標的部位に結合することができる亜鉛フィンガータンパク質を、５’−（ＴＮＮ）−３’部位を認識する予め定義されたドメイン、またはさらには、５’−（ＴＮＮ）−３’、５’−（ＴＮＮ）−３’、または５’−（ＴＮＮ）−３’部位を認識するドメインを使用して迅速に調製することができることを示している。この情報は、それぞれが１８ｂｐのＤＮＡ配列に結合することができる、１億６６００万または１７００万個の新規の６フィンガータンパク質の調製に十分である。新規の亜鉛フィンガータンパク質の構築のためのこの迅速な方法には、他の研究者によって提案されている亜鉛フィンガードメインの連続的な作成および選択（Ｇｒｅｉｓｍａｎ，Ｈ．Ａ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，６５７−６６１）を上回る利点があり、、５’−（ＴＮＮ）−３’部位を標的化するタンパク質の中では回避される、上記で定義されたような標的の重複の問題についての可能性を示唆する構造情報が利用される。複合体、および十分に研究されているｅｒｂＢ−２プロモーター、および生存しているヒト細胞を使用した場合には、データは、これらのタンパク質を、適切なエフェクタードメインと共に提供される場合には、発現を誘発または活性化させるために、そして、これらの実験でのバックグラウンドのレベルにまで下げる段階的な抑制レベルを生じさせるために用いることができることを示している。
【０１１０】
ＴＮＮ特異的亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む人工的な転写因子のさらなる例は、実施例１２に提供される。これらの実施例には、（１）以下のような６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含み：Ｆ１  ＲＳＤ−Ｄ−ＬＶＲ（配列番号４５３）；Ｆ２  ＲＳＤ−Ｖ−ＬＶＲ（配列番号４５２）；Ｆ３  ＱＳＧ−Ｄ−ＬＲＲ（配列番号４５１）；Ｆ４  ＱＲＨ−Ｓ−ＴＬＥ（配列番号４５０）；Ｆ５  ＲＧＧ−Ｗ−ＬＯＡ（配列番号４６）；およびＦ６  ＱＲＡ−Ｎ−ＬＲＡ（配列番号４４９）、そしてＤＮＡ配列ＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧ（配列番号４３３）に結合する、ＰＢＳ１と命名された、２つの半分の部分に分けられた人工的な転写因子であって、ここで、ＲＧＧ−Ｗ−ＬＯＡ（配列番号４６）はトリプレット５’−ＴＣＴ−３’に結合する；（２）以下のような６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含み：Ｆ１  ＲＳＤ−Ｄ−ＬＶＲ（配列番号４５３）；Ｆ２  ＲＳＤ−Ｖ−ＬＶＲ（配列番号４５２）；Ｆ３  ＱＳＧ−Ｄ−ＬＲＲ（配列番号４５１）；Ｆ４  ＱＲＡ−Ｎ−ＬＲＡ（配列番号４４９）；Ｆ５  ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ（配列番号１４）；およびＦ６  ＲＳＤ−Ｖ−ＬＶＲ（配列番号４５２）、そしてＤＮＡ配列ＧＴＣＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧ（配列番号４３４）に結合するＰＢＳ１ａと命名された、ＡＴＣＴＣＴＡの非結合性の介在配列を有する２つの半分の部分に分けられた人工的な転写因子であって、ここで、ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ（配列番号１４）はトリプレット５’−ＴＧＧ−３’に結合する；および（３）以下のような６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含み：Ｆ１  ＤＰＧ−Ｎ−ＬＶＲ（配列番号４６０）；Ｆ２  ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＮ（配列番号４５９）；Ｆ３  ＤＳＧ−Ｎ−ＬＲＶ（配列番号４５８）；Ｆ４  ＲＮＤ−Ｔ−ＬＴＥ（配列番号４５７）；Ｆ５  ＨＴＧ−Ｈ−ＬＬＥ（配列番号４５４）Ｉ、およびＦ６  ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ（配列番号１４）、そしてＤＮＡ配列ＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣ（配列番号４３６）に結合するＰＢＳ３と命名された、２つの半分の部分に分けられた人工的な転写因子であって、ここで、ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ（配列番号１４）は（この６フィンガーの人工的な転写因子の中の）トリプレット５’−ＴＧＧ−３’に結合する。これらの因子は、実施例１において表１３に示される。これらの因子をベースとする他の人工的な転写因子、および他のＴＮＮ特異的亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの置換もまた、本発明の範囲に含まれる。例えば、ＰＢＳ１においては、以下のような他のＴＣＴ結合亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン：ＷＶＧ−Ｗ−ＬＧＳ（配列番号２２）、ＲＬＲ−Ｄ−ＩＱＦ（配列番号２３）、ＧＲＳ−Ｑ−ＬＳＣ（配列番号２４）、ＡＥＡ−Ｅ−ＬＱＲ（配列番号３９）、ＱＧＧ−Ｖ−ＬＡＡ（配列番号４０）、ＴＡＳ−Ｔ−ＬＩＳ（配列番号８０）、ＴＡＳ−Ｄ−ＬＩＳ（配列番号８１）、ＴＡＳ−Ｅ−ＬＩＳ（配列番号８２）、ＳＡＳ−Ｔ−ＬＩＳ（配列番号８７）、ＳＡＳ−Ｄ−ＬＩＳ（配列番号８８）、ＳＡＳ−Ｅ−ＬＩＳ（配列番号８９）、ＳＬＤ−Ｔ−ＬＱＴ（配列番号１３４）、ＳＬＤ−Ｄ−ＬＱＴ（配列番号１３５）、ＳＬＤ−Ｅ−ＬＱＴ（配列番号１３６）、ＡＲＧ−Ｔ−ＬＲＴ（配列番号１４１）、ＡＲＧ−Ｄ−ＬＲＴ（配列番号１４２）、ＡＲＧ−Ｅ−ＬＲＴ（配列番号１４３）、ＴＫＤ−Ｔ−ＬＲＧ（配列番号１８９）ＴＫＤ−Ｄ−ＬＲＧ（配列番号１９０）、ＴＫＤ−Ｅ−ＬＲＧ（配列番号１９１）、ＳＫＤ−Ｔ−ＬＲＧ（配列番号１９６）、ＳＫＤ−Ｄ−ＬＲＧ（配列番号１９７）、ＳＫＤ−Ｅ−ＬＲＧ（配列番号１９８）、ＶＲＧ−Ｔ−ＬＲＴ（配列番号２０２）、ＶＲＧ−Ｄ−ＬＲＴ（配列番号２０３）、ＶＲＧ−Ｅ−ＬＲＴ（配列番号２０４）、ＴＬＲ−Ａ−ＬＤＲ（配列番号２１２）、ＳＬＲ−Ａ−ＬＤＲ（配列番号２１３）、ＴＹＱ−Ｓ−ＬＲＱ（配列番号２２４）、ＳＹＱ−Ｓ−ＬＲＱ（配列番号２２５）、ＴＳＬ−Ｌ−ＬＧＡ（配列番号２３６）、ＳＳＬ−Ｌ−ＬＧＡ（配列番号２３７）、ＴＫＨ−Ｍ−ＬＤＴ（配列番号２４８）、ＳＫＨ−Ｍ−ＬＤＴ（配列番号２４９）、ＴＬＧ−Ｇ−ＬＲＱ（配列番号２５３）、ＳＬＧ−Ｇ−ＬＲＱ（配列番号２５４）、ＡＥＡ−Ｔ−ＬＱＲ（配列番号２５６）、ＡＥＡ−Ｄ−ＬＱＲ（配列番号２５７）、ＴＥＤ−Ｔ−ＬＨＴ（配列番号２９９）、ＴＥＤ−Ｄ−ＬＨＴ（配列番号３００）、ＴＥＤ−Ｅ−ＬＨＴ（配列番号３０１）、ＳＥＤ−Ｔ−ＬＨＴ（配列番号３０６）、ＳＥＤ−Ｄ−ＬＨＴ（配列番号３０７）、ＳＥＤ−Ｅ−ＬＨＴ（配列番号３０８）、ＴＥＤ−Ｔ−ＬＩＳ（配列番号３４５）、ＴＥＤ−Ｄ−ＬＩＳ（配列番号３４６）、ＴＥＤ−Ｅ−ＬＩＳ（配列番号３４７）、ＳＥＤ−Ｔ−ＬＩＳ（配列番号３５２）、ＳＥＤ−Ｄ−ＬＩＳ（配列番号３５３）、ＳＥＤ−Ｅ−ＬＩＳ（配列番号３５４）、ＴＧＧ−Ｗ−ＬＱＡ（配列番号３５９）、ＳＧＧ−Ｗ−ＬＱＡ（配列番号３６０）、ＲＧＧ−Ｔ−ＬＱＡ（配列番号３６４）、ＲＧＧ−Ｄ−ＬＱＡ（配列番号３６５）、ＲＧＧ−Ｅ−ＬＱＡ（配列番号３６６）、ＴＧＧ−Ｔ−ＬＱＡ（配列番号３７２）、ＴＧＧ−Ｄ−ＬＱＡ（配列番号３７３）、ＴＧＧ−Ｅ−ＬＱＡ（配列番号３７４）、ＳＧＧ−Ｔ−ＬＱＡ（配列番号３８０）、ＳＧＧ−Ｄ−ＬＱＡ（配列番号３８１）、ＳＧＧ−Ｅ−ＬＱＡ（配列番号３８２）、および表２のような、その配列が上記に記載された規則に従うこれらの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの修飾で、ＲＧＧ−Ｗ−ＬＯＡ（配列番号４６）を置換することができる。ＰＢＳ１ａおよびＰＢＳ３においては、他のＴＧＧ結合亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＲＡＳ−Ｈ−ＬＩＳ（配列番号７６）、ＲＡＳ−Ｋ−ＬＩＳ（配列番号７７）、ＲＬＤ−Ｈ−ＬＱＴ（配列番号１０２）、ＲＬＤ−Ｋ−ＬＱＴ（配列番号１０３）、ＲＫＤ−Ｈ−ＬＲＧ（配列番号１６４）、ＲＫＤ−Ｋ−ＬＲＧ（配列番号１６５）、ＲＬＲ−Ｈ−ＩＱＦ（配列番号２２９）、ＲＬＲ−Ｋ−ＩＱＦ（配列番号２３０）、ＲＧＲ−Ｃ−ＬＶＴ（配列番号２６４）、ＲＥＤ−Ｈ−ＬＨＴ（配列番号２７４）、ＲＥＤ−Ｋ−ＬＨＴ（配列番号２７５）、ＲＥＤ−Ｈ−ＬＩＳ（配列番号３２０）、およびＲＥＤ−Ｋ−ＬＩＳ（配列番号３２１））、ならびに、表２のような、その配列が上記の規則に従うこれらの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの修飾で、ＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ（配列番号１４）を置換することができる。加えて、これらの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの結合の特異性は、より長いポリペプチド、または融合タンパク質（例えば、人工的な転写因子）への組み込みによって変化させることができる。例えば、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合領域メインＲＳＤ−Ｈ−ＬＴＴ（配列番号１４）は、ＰＢＳ１ａおよびＰＢＳ３の中のＴＧＧに結合する。しかし、これは、ＴＣＡおよびＴＣＴに対して親和性を有する（表９）。したがって、これらの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの結合の特異性は、好ましくは、人工的な転写因子全体、または、マルチフィンガー部分を形成させるように動作可能であるように連結させられる亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの少なくともセット全体の状況において決定される。通常、本発明の人工的な転写因子は、ＨＩＶ−１  ｔＲＮＡプライマー結合部位の少なくとも一部に結合する。通常、人工的な転写因子は６個の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有しており、式ＴＮＮ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する少なくとも１つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する。通常、人工的な転写因子は、Ｓｐ１Ｃ亜鉛フィンガー足場に集合される。通常、人工的な転写因子には、少なくとも１つのＫＲＡＢ抑制ドメインが含まれる。しかし、人工的な転写因子には、他の抑制ドメインまたは活性化ドメインを含めることができる。
【０１１１】
ＩＶ．単離されたヘプタペプチド
本発明の別の態様は、α−ヘリックス構造を有する単離されたヘプタペプチドであり、これは、式ＴＮＮ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである）の標的ヌクレオチドに優先的に結合する。好ましい標的ヌクレオチドは上記に記載した通りである。ヘプタペプチドは、配列番号１から配列番号４１１であり得る。
【０１１２】
好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を有する。
【０１１３】
別の方法においては、本発明のヘプタペプチドは、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する。そのようなヘプタペプチドは、配列番号１から配列番号４１１のいずれかと、ヌクレオチド標的に対する結合について競合する。すなわち、好ましいヘプタペプチドは、競合様式で、配列番号１から配列番号４１１のいずれかの結合に取って代わる。さらに好ましくは、ヘプタペプチドは、配列番号１から配列番号４６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する。これは、配列番号１から配列番号４６のいずれかと、ヌクレオチド標的に対する結合について競合するか、あるいは、競合様式で、配列番号１から配列番号４６のいずれかの結合に取って代わる。なおさらに好ましくは、ヘプタペプチドには、配列番号１から配列番号６のいずれかと同じヌクレオチド結合特性を有するアミノ酸配列を有する。これは、配列番号１から配列番号６のいずれかと、ヌクレオチド標的に対する結合について競合するか、あるいは、競合様式で、配列番号１から配列番号６のいずれかの結合に取って代わる結合領域が含まれる。
【０１１４】
なお別の代わりの方法においては、ヘプタペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：
（１）配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列；および
（２）２つ以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１から配列番号４１１のいずれかのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列であって、ここで、解離定数は、置換が行われる前のポリペプチドの解離定数の１２５％を超えず、保存的アミノ酸置換は以下の置換のうちの１つである：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕ。
【０１１５】
この別の方法では、好ましくは、ヘプタペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：
（１）配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列；および
（２）２つ以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１から配列番号４６のいずれかのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列であって、ここで、解離定数は、置換が行われる前のポリペプチドの解離定数の１２５％を超えず、保存的アミノ酸置換は以下の置換のうちの１つである：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕ。
【０１１６】
さらに好ましくは、この別の方法においては、ヘプタペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：
（１）配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列；および
（２）２つ以下の保存的アミノ酸置換によって配列番号１から配列番号６のいずれかのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列であって、ここで、解離定数は、置換が行われる前のポリペプチドの解離定数の１２５％を超えず、保存的アミノ酸置換は以下の置換のうちの１つである：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕ。
【０１１７】
これらの別の方法においては、好ましくは、ヘプタペプチドは、わずかに１つの保存的アミノ酸置換によって、配列番号１から配列番号４１１、配列番号１から配列番号４６、または配列番号１から配列番号６のアミノ酸配列とは異なる。
【０１１８】
なお別の代わりとなる方法においては、ヘプタペプチドは、以下のうちの１つである（ここで、ヘプタペプチドの残基には、上記に記載されたように−１から６の番号が付けられる）：（１）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＡ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタンペプチド（ここで、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、およびＳからなる群より選択される）；（２）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＡ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓである）；（３）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、およびＩからなる群より選択される）；（４）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＧ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、このドメインの２と番号が付けられるアミノ酸残基はＤである）；（５）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ａ、およびＣからなる群より選択される）；（６）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＣ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｈ、およびＤからなる群より選択される）；（７）ヌクレオチド配列５’−（ＴＡＮ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｉ、およびＫからなる群より選択される）；（８）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＮ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＮからなる群より選択される）；（９）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＣ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される）；（１０）ヌクレオチド配列５’−（ＴＣＧ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、およびＧからなる群より選択される）；（１１）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１２）５’−（ＴＧＧ）−３’および５’−（ＴＧＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＨからなる群より選択される）；（１３）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＣ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｗ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される）；（１４）ヌクレオチド配列５’−（ＴＧＮ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１５）５’−（ＴＴＡ）−３’および５’−（ＴＴＧ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、ＳおよびＡからなる群より選択される）；（１６）５’−（ＴＴＣ）−３’および５’−（ＴＴＴ）−３’からなる群より選択されるヌクレオチド配列に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、３と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＨである）；（１７）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＡ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基はＲである）；（１８）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＴ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、−１と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｓ、Ｔ、およびＨからなる群より選択される）；ならびに、（１９）ヌクレオチド配列５’−（ＴＮＮ）−３’に特異的に結合する単離されたヘプタペプチド（ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかであり、４と番号が付けられるこのドメインのアミノ酸残基は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＣからなる群より選択される）。
【０１１９】
Ｖ．ポリヌクレオチド、発現ベクター、および形質転換された細胞
本発明には、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ペプチドまたはポリペプチド（上記に記載されたポリペプチド、ポリペプチド組成物、および単離されたヘプタペプチドを含む）をコードするヌクレオチド配列が含まれる。本発明の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド（天然のもの、短縮型、および伸張型のポリペプチドを含む）をコードするＤＮＡ配列は、いくつかの方法によって得ることができる。例えば、ＤＮＡは、当該分野で周知であるハイブリダイゼーション手順を使用して単離することができる。これらには、以下が含まれるが、それらに限定されない：（１）共有されているヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーに対するプローブのハイブリダイゼーション；（２）共有されている構造上の特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング；および（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による合成。本発明のＲＮＡ配列は当該分野で公知の方法によって得ることができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら、編，１９８９を参照のこと）。
【０１２０】
本発明の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする特異的ＤＮＡ配列の開発は、以下によって得ることができる：（１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖のＤＮＡ配列の単離；（２）目的のポリペプチドについての不可欠なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の化学的製造；および（３）真核生物ドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のインビトロでの合成。後者の場合には、ｍＲＮＡの二本鎖のＤＮＡ補体が最終的に形成され、これは一般的には、ｃＤＮＡと呼ばれる。組み換え手順において使用される特異的ＤＮＡ配列を開発するためのこれらの３つの方法のうち、ゲノムＤＮＡの単離は極めてまれである。これは、哺乳動物のポリペプチドの微生物による発現を得ることが所望される場合には、イントロンの存在が原因で、特にその通りである。亜鉛フィンガーに由来するＤＮＡ結合ポリペプチドを得るためには、所望されるポリペプチド産物のアミノ酸残基の配列全体がわかっている場合には、ＤＮＡ配列の合成が、頻繁に選択される方法である。所望されるポリペプチドのアミノ酸残基の配列全体がわかっていない場合には、ＤＮＡ配列の直接の合成は不可能であり、選択される方法は、ｃＤＮＡ配列の形成である。中でも、目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な手順は、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞の中に豊富に存在しているｍＲＮＡの逆転写によって導かれる、プラスミドに保有されているｃＤＮＡライブラリーの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて使用される場合には、さらに珍しい発現産物をクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の有意な部分がわかっている場合には、標的ｃＤＮＡの中に存在すると推定される配列を複製する標識された一本鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡプローブ配列の生産が、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション手順において使用され得る。これは、一本鎖の形態へと変性させられた、クローニングされたｃＤＮＡのコピーに対して行われる（Ｊａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：２３２５，１９８３）。
【０１２１】
本発明の範囲に含まれるヌクレオチド配列に関しては、記載されるような本発明の実施形態であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は全て、本発明の範囲に含まれるヌクレオチド配列の中に含まれる。これにはさらに、上記で定義されたように、保存的アミノ酸置換が組み込まれている本発明のポリペプチドをコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。これにはさらに、融合タンパク質を含む、亜鉛フィンガードメインが組み込まれているより大きなタンパク質、および亜鉛フィンガードメインに動作可能であるように連結させられた転写調節因子が組み込まれているタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【０１２２】
本発明の核酸配列にはさらに、上記の配列と少なくとも９５％同一である核酸配列が、そのような核酸配列が塩基の置換が行われる前の配列の活性（ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の任意の活性、および核酸レベルで発現されるヌクレオチド配列の任意の活性が含まれる）を保持しているという条件で含まれ、例えば、転写に影響を与えるタンパク質についての結合部位である。好ましくは、核酸配列は、少なくとも９７．５％同一である。さらに好ましくは、これらは少なくとも９９％同一である。これらの目的から、「同一」は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｓ．Ｂ．Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｃ．Ｄ．Ｗｕｎｓｃｈ，“Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））にしたがって定義される。
【０１２３】
本発明に含まれるヌクレオチド配列はまた、当該分野で周知であるように、ベクター（発現ベクターが含まれるが、これに限定されない）の中に組み込むことができ、適切な宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用することができる。本発明に含まれるヌクレオチド配列が組み込まれているベクターもまた本発明の範囲に含まれる。ベクターで、または、本発明のポリヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列で形質転換あるいはトランスフェクトされた宿主細胞もまた、本発明の範囲に含まれる。宿主細胞は、原核生物であっても、また、真核生物であってもよい。真核生物である場合には、宿主細胞は哺乳動物細胞であっても、昆虫細胞であっても、また、酵母細胞であってもよい。原核生物である場合には、宿主細胞は、通常は細菌細胞である。
【０１２４】
組み換えＤＮＡでの宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来技術によって行うことができる。宿主が原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である場合には、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞を、指数増殖期の後に回収された細胞から調製することができ、続いて、当該分野で周知の手順によってＣａＣｌ２法によって処理することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することもできる。形質転換はまた、宿主細胞のプロトプラストを形成させた後に、またはエレクトロポレーションによって行うこともできる。
【０１２５】
宿主が真核生物である場合には、リン酸カルシウム共沈のようなＤＮＡのトランスフェクションの方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームの中に含まれるプラスミドの挿入のような従来の機械的手順、あるいはウイルスベクターを使用することができる。
【０１２６】
様々な宿主発現ベクターシステムを、亜鉛フィンガーに由来するヌクレオチド結合コード配列を発現させるために利用することができる。これには、以下のような微生物が含まれるが、これらに限定されない：亜鉛フィンガーに由来するヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；亜鉛フィンガーヌクレオチド結合コード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させられたか、または、亜鉛フィンガーに由来するＤＮＡ結合コード配列を含む組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞システム；亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させられた昆虫細胞システム；あるいは、亜鉛フィンガーに由来するヌクレオチド結合コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染させられた動物細胞システム、または、安定な発現のために操作された形質転換された動物細胞システム。グリコシル化が重要であり得るような場合には、翻訳による修飾および翻訳後修飾を提供する発現システム（例えば、哺乳動物、昆虫、酵母、または植物発現システム）が使用され得る。
【０１２７】
利用される宿主／ベクターシステムに応じて、任意の多数の適切な転写および翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどが含まれる）が、発現ベクターの中で使用され得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４，１９８７を参照のこと）。例えば、細菌システムのクローニングの場合には、誘導性プロモーター（例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）など）が使用され得る。哺乳動物細胞システムのクローニングの場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルス長末端反復；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が使用され得る。組み換えＤＮＡまたは合成技術によって得られるプロモーターもまた、挿入された亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする配列の転写を提供するために使用され得る。
【０１２８】
細菌システムにおいては、多数の発現ベクターを、発現させられた亜鉛フィンガーに由来するヌクレオチド結合ポリペプチドについて意図される用途に応じて、有利であるように選択することができる。例えば、大量に生産される場合には、容易に精製することができる融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが所望され得る。タンパク質の回収を補助する切断部位が含まれるように操作されているものが好ましい。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，２：１７９１，１９８３）（ここで、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質コード配列を、ｌａｃＺコード領域とインフレームとなるようにベクターの中に連結することができ、その結果、ハイブリッド亜鉛フィンガー−ｌａｃＺタンパク質が生産される）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９，１９８５；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９，１９８９）など。
【０１２９】
酵母においては、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが含まれる多数のベクターを使用することができる。概要については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１９８８，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，第１３章；Ｇｒａｎｔら、１９８７，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｗｕ＆Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，３１９８７，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，第１５３巻，ｐｐ．５１６−５４４；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８６，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第ＩＩ巻，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，第３章；およびＢｉｔｔｅｒ，１９８７，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ編，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，第１５２巻，ｐｐ．６７３−６８４；ならびに、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，１９８２，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，第Ｉ巻およびＩＩ巻を参照のこと。構成的な酵母プロモーター（例えば、ＡＤＨまたはＬＥＵ２）、あるいは誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ）を使用することができる（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，第３章，Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  Ｉｎ：ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第１１巻，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＤＭ  Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８６，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．）。あるいは、酵母の染色体の中への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターが使用され得る。
【０１３０】
植物発現ベクターが使用される場合には、亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする配列の発現は、多数のプロモーターのうちのいずれかによって駆動させることができる。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３１０：５１１−５１４，１９８４））、またはＴＭＶの外殻タンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３０７−３１１，１９８７）を使用することができる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小さいサブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０，１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３，１９８４）；または熱ショックプロモーター（例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅもしくはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：５５９−５６５，１９８６）のような植物プロモーター使用することができる。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接のＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して植物細胞に導入することができる。そのような技術の概要については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，第ＶＩＩＩ章，ｐｐ．４２１−４６３，１９８８；およびＧｒｉｅｒｓｏｎ＆Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，第７−９章，１９８８を参照のこと。
【０１３１】
本発明のタンパク質を発現させるために使用することができる別の発現システムは昆虫システムである。１つのそのようなシステムにおいては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の中で増殖する。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの必須ではない領域（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、例えば、ポリヘドリン遺伝子の中）にクローニングすることができ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする配列の挿入がうまくできていれば、ポリヘドリン遺伝子の不活化が生じ、非閉塞組み換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質様の外殻を含まないウイルス）が生産される。これらの組み換えウイルスは、その後、挿入された遺伝子がその中で発現させられる細胞を感染させるために使用される（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．４６：５８４，１９８３；Ｓｍｉｔｈ，米国特許第４，２１５，０５１号を参照のこと）。
【０１３２】
真核生物システム（および好ましくは、哺乳動物発現システム）により、発現させられた哺乳動物タンパク質の適切な翻訳後修飾を行うことが可能である。したがって、真核生物細胞（例えば、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、リン酸化、および遺伝子産物の有利な分泌のための細胞性の機構を有する哺乳動物細胞）が、亜鉛フィンガーに由来するヌクレオチド結合ポリペプチドの発現のための好ましい宿主細胞である。そのような宿主細胞株としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、およびＷＩ３８を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１３３】
発現を指示する組み換えウイルスまたはウイルスエレメントを利用する哺乳動物細胞システムを操作することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターが使用される場合には、亜鉛フィンガーに由来するポリペプチドのコード配列を、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび三成分リーダー配列）に連結させることができる。このキメラ遺伝子は、その後、インビトロまたはインビボでの組み換えによってアデノウイルスのゲノムの中に挿入することができる。ウイルスゲノムの必須ではない領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入によっては、生存可能であり、感染させられた宿主の中で亜鉛フィンガーポリペプチドを発現することができる組み換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９，１９８４を参照のこと）。あるいは、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを使用することができる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７４１５−７４１９，１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７−８６４，１９８４；Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７−４９３１，１９８２を参照のこと）。染色体外エレメントとして複製する能力を有するウシパピローマウイルスをベースとするベクターが、具体的な目的である（Ｓａｒｖｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４８６，１９８１）。このＤＮＡのマウス細胞への侵入の直後に、プラスミドは、細胞１個あたり約１００から２００コピーに複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写には、宿主の染色体へのプラスミドの組み込みは必要なく、それによって高レベルの発現が生じる。これらのベクターは、プラスミドの中に選択マーカー（例えば、ｎｅｏ遺伝子）を含めることによって安定な発現のために使用することができる。あるいは、レトロウイルスのゲノムは、宿主細胞の中に亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質遺伝子を導入し、その中でその発現を指示することができるベクターとしての使用のために修飾することができる（Ｃｏｎｅ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９−６３５３，１９８４）。高レベルの発現はまた、誘導性プロモーター（メタロチオネインＩＩＡプロモーターおよび熱ショックプロモーターが含まれるが、これらに限定されない）を使用して行うこともできる。
【０１３４】
長期間にわたる多量の組み換えタンパク質の生産のためには、安定な発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターが使用されるよりもむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるｃＤＮＡ、および選択マーカーで形質転換することができる。組み換えプラスミドの中の選択マーカーによっては、選択に対する耐性が付与され、細胞がそれらの染色体へプラスミドを安定に組み込むことを可能にし、その後にクローニングすることができ、細胞株の中で増殖させることができる遺伝子座を形成させるために増殖させることができる。例えば、外来ＤＮＡの導入後に、操作された細胞を富化培地の中で１〜２日間増殖させることができ、これらはその後、選択培地に移される。多数の選択システムを使用することができ、これには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３，１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６，１９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ，２２：８１７，１９８０）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。これらは、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞の中で使用することができる。また、代謝物質に対する耐性を付与する遺伝子を選択のための基準として使用することができる。例えば、ｄｈｆｒについての遺伝子（これは、メトトレキセートに対する耐性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７，１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７，１９８１）；ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２，１９８１）；ｎｅｏ（これは、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与する）（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１）；およびｈｙｇｒｏ（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９８４））。最近、さらに別の選択可能な遺伝子、すなわち、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）；ｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ＆Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０４，１９８８）；およびＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（これは、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を付与する）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  Ｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編，１９８７）が記載された。
【０１３５】
本発明によって提供される微生物によって発現されたタンパク質、またはそれらの断片の単離および精製は、従来の手段によって行うことができ、これには、分取クロマトグラフィーおよび免疫学的分離（モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体が含まれる）が含まれる。本発明で提供される抗体は、本発明の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合タンパク質と免疫反応性である。原則として様々なエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体から構成される抗体、ならびに異なるモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法によって、タンパク質の断片を含む抗原から作成される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８９）。
【０１３６】
ＶＩ．薬学的組成物
別の態様においては、本発明により、以下が含まれる薬学的組成物が提供される：
（１）上記に記載された本発明のポリペプチド、ポリペプチド組成物、または単離されたヘプタペプチドの治療有効量；および
（２）薬学的に許容される担体。
【０１３７】
あるいは、本発明によってまた、以下が提供される。
【０１３８】
（１）上記に記載された本発明のポリペプチド、ポリペプチド組成物、または単離されたヘプタペプチドをコードするヌクレオチド配列の治療有効量；および
（２）薬学的に許容される担体。
【０１３９】
その中に有効成分が溶解させられているかまたは分散させられている薬学的組成物の調製物は、当該分野で十分に理解されている。通常、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液、水性または非水性としてのいずれかで、滅菌の注射可能なものとして調製される。しかし、使用前に液体の中の溶液または懸濁液とするために適している固体の形態もまた調製することができる。調製物はまた、乳化させることもできる。有効成分は、薬学的に許容され、有効成分と適合性である賦形剤と共に、そして本明細書中に記載される治療方法での使用に適した量で混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。加えて、所望される場合には、組成物には、有効成分の有効性を高める少量の補助物質（例えば、湿潤剤、または乳化剤、さらにはｐＨ緩衝化剤など）を含めることができる。薬学の分野で一般的であるなお他の成分（例えば、キレート化剤、保存剤、抗微生物薬、抗酸化剤、着色剤、香味剤など）を、組成物の特性、および組成物の意図される投与経路に応じて使用することができる。
【０１４０】
本発明の薬学的組成物には、その中に成分の薬学的に許容される塩を含めることができる。薬学的に許容される塩としては、無機酸（例えば、塩酸、またはリン酸）を用いて形成させられたか、あるいは有機酸（例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成させられた酸付加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基を用いて形成されたもの）が挙げられる。遊離のカルボキシル基を用いて形成させられた塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することができる。生理学的に許容される担体は当該分野で周知である。液体担体の例は、有効成分と水以外にはいずれの物質も含まれていないか、または生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウムのような緩衝液、生理食塩水、もしくはそれらの両方（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）が含まれる滅菌の水溶液である。なおさらに、水性担体には、１つ以上の緩衝塩、さらには、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムのような塩、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含めることができる。液体組成物にはまた、水に加えて、そして水を除く液体相も含めることができる。そのようなさらなる液体相の例は、グリセリン、植物油（例えば、菜種油）、有機エステル（例えば、オレイン酸エチル、および水−油エマルジョン）である。
【０１４１】
具体的には、本発明の薬学的組成物には以下を含めることができる：（１）ＨＩＶ−１  ｔＲＮＡプライマー結合部位、または人工的な転写因子をコードするポリヌクレオチドの少なくとも一部に結合する、そのような人工的な転写因子の治療有効量；および（２）薬学的に許容される担体。
【０１４２】
ＶＩＩ．使用
１つの実施形態においては、本発明の方法には、ＴＮＮ標的配列を含むヌクレオチド配列の発現を調節する（阻害するか、または抑制する）ためのプロセスが含まれる。この方法には、ヌクレオチドを、モチーフに結合する本発明の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドの有効量と接触させる工程を含む、。ヌクレオチド配列がプロモーターである場合には、この方法には、亜鉛フィンガー−ＤＮＡ結合モチーフを含むプロモーターの転写によるトランス活性化を阻害することが含まれる。用語「阻害する」は、プロモーターに動作可能であるように連結させられた構造遺伝子（例えば、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合モチーフが含まれる）の転写の活性化のレベルの抑制を意味する。加えて、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドは、構造遺伝子内、またはＲＮＡ配列内の標的に結合することができる。
【０１４３】
用語「有効量」には、すでに活性化されているプロモーターの脱活性化を生じる量、または標的ヌクレオチドを含むプロモーターの不活化を生じる量、または構造遺伝子の転写もしくはＲＮＡの翻訳をブロックする量が含まれる。必要とされる亜鉛フィンガーに由来するヌクレオチド結合ポリペプチドの量は、既存のタンパク質／プロモーター複合体の中の天然の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質のいずれかに置き換わるために必要な量、または、プロモーター自体との複合体を形成するために天然の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質と競合するために必要な量である。同意に、構造遺伝子またはＲＮＡをブロックするために必要な量は、それぞれ、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を通じて読み取ることをブロックする量、または翻訳を阻害する量である。好ましくは、この方法は細胞内で行われる。プロモーターまたは構造遺伝子を機能的に不活化させることによって、転写または翻訳が抑制される。標的配列を含む細胞性のヌクレオチド配列に結合するまたはそれと「接触する」ための有効量の阻害性タンパク質の送達は、本明細書中に記載される機構のうちの１つによって（例えば、レトロウイルスベクターまたはリポソームによって）、あるいは当該分野で周知の他の方法によって行うことができる。用語「調節する」は、機能の抑制、増強、または誘導を意味する。例えば、本発明の亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドは、プロモーターの中の標的配列に結合することによってプロモーター配列を調節することができ、それによって、プロモーターヌクレオチド配列に動作可能であるように連結された遺伝子の転写が増強または抑制される。あるいは、調節には、遺伝子の転写の阻害が含まれる場合がある。この場合、亜鉛フィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドは構造遺伝子に結合し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を通じて読み取ることをブロックし、それによって遺伝子の転写が阻害される。構造遺伝子は、正常な細胞性の遺伝子である場合も、または、例えば、腫瘍遺伝子である場合もある。あるいは、調節には、転写物の翻訳の阻害が含まれる場合がある。
【０１４４】
遺伝子のプロモーター領域には、通常は構造遺伝子の５’に存在する調節エレメントが含まれる。複数の調節エレメントを、介在するヌクレオチド配列によって間隔を空けて存在させることができる。遺伝子が活性化させられる場合には、転写因子として知られているタンパク質が遺伝子のプロモーター領域に結合させられる。この集合は、酵素がＤＮＡからＲＮＡへと第２の遺伝子セグメントを転写することを可能にする「スイッチオン（ｏｎ  ｓｗｉｔｃｈ）」と似ている。ほとんどの場合には、得られるＲＮＡ分子は、特異的なタンパク質の合成のための鋳型となる。多くの場合は、ＲＮＡ自体が最終産物である。
【０１４５】
プロモーター領域は、正常な細胞性のプロモーター、または例えば、腫瘍プロモーターであり得る。腫瘍プロモーターは、一般的には、ウイルスに由来するプロモーターである。例えば、レトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）が、本発明の亜鉛フィンガーポリペプチド変異体に対してそれを標的化させることができるプロモーター領域である。レンチウイルスのグループのメンバー（これには、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）１および２、ならびに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１または２）のような病原体が含まれる）に由来するプロモーターが、本発明の亜鉛フィンガー結合ポリペプチドによる転写調節の標的とすることができるウイルスプロモーター領域の例である。
【０１４６】
標的ＴＮＮヌクレオチド配列は、遺伝子の転写される領域の中、または発現させられる配列タグの中に配置することができる。上記のように、標的ＴＮＮ配列はまた、遺伝子の転写終結部位に隣接して配置することもできる。標的配列を含む遺伝子は、植物遺伝子、動物遺伝子、またはウイルス遺伝子であり得る。遺伝子は、真核生物遺伝子であっても、また、原核生物遺伝子（例えば、細菌遺伝子）であってもよい。動物遺伝子は、哺乳動物遺伝子（ヒト遺伝子を含む）であり得る。好ましい実施形態においては、ヌクレオチドの発現を調節する方法は、標的ヌクレオチド配列を含む細胞を、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは組成物で形質転換することによって行われる。好ましくは、コードポリヌクレオチドは、標的細胞の中での使用に適している発現ベクターの中に含まれる。適切な発現ベクターは当該分野で周知である。
【０１４７】
ＴＮＮ標的は、他の標的トリプレット配列との任意の組み合わせで存在し得る。すなわち、特定のＴＮＮ標的は、伸張させられたＴＮＮ配列（例えば、［ＴＮＮ］２−１２）の一部として、あるいは（ＧＮＮ）１−１２、（ＡＮＮ）１−１２、（ＣＮＮ）１−１２、または（ＮＮＮ）１−１２のような任意の他の伸張型の配列の一部として存在し得る。
【０１４８】
具体的には、本発明には、ＨＩＶ−１ウイルスの複製を阻害する方法も含まれる。この方法には、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した個体に対して、上記に記載されたような、ｔＲＮＡプライマー結合部位に結合することができ、その結果、ＨＩＶ−１の複製が阻害される、十分な量の本発明の人工的な転写因子を投与する工程を含む、。本明細書中で使用される場合は、用語「阻害される」には、ＨＩＶ−１の複製の完全な阻害またはブロックは必要ではなく、少なくとも１つの臨床的に有用な結果が得られる程度のＨＩＶ−１の複製の何らかの程度の阻害が含まれる。用語「臨床的に有用な結果」には、循環しているＣＤ４陽性Ｔリンパ球の数の増加、ウイルス負荷の減少、日和見感染に対する抵抗力の増大、ならびに、活動力および満足感の増大が含まれるが、これらに限定されない。同様に、本発明にはまた、ＨＩＶ−１ウイルスの複製を阻害するための方法も含まれる。これには、ＨＩＶ−１ウイルスに感染した個体に対して、ＨＩＶ−１の複製が阻害される程度の十分な量の本発明の人工的な転写因子をコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む、。
【０１４９】
以下の実施例では本発明の好ましい実施形態が説明されるが、これらは決して、明細書および特許請求の範囲の限定ではない。
【実施例】
【０１５０】
（実施例１）
５’−（ＴＮＮ）−３’ＤＮＡ配列に対して特有の結合特異性を有する亜鉛フィンガードメインの選択および特性決定
序論
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガータンパク質は、真核生物の転写因子の中で見られる最も一般的なＤＮＡ結合モチーフの１つである。これらの亜鉛フィンガーは、２つのβ−鎖と亜鉛の連結によって安定化させられた１つの両親媒性α−ヘリックスを含む小型のドメインである。α−ヘリックスの表面上のアミノ酸は、ＤＮＡの主溝の中の塩基と接触する。亜鉛フィンガータンパク質には、通常、ＤＮＡに沿ってタンデムに接触する複数のフィンガーが含まれる。ＤＮＡ認識の態様は、原則として、認識ヘリックスに由来するアミノ酸とＤＮＡ塩基との間での１対１相互作用である。１つのフィンガーは、通常、３塩基対（ｂｐ）を認識する。これらのフィンガーは独立したモジュールとして機能するので、様々なトリプレット特異性を有するフィンガーを、より長いＤＮＡ配列の特異的認識を得るために組み合わせることができる。亜鉛フィンガードメインのこの単純なモジュール構造と、認識することができるＤＮＡ配列の幅広い多様性によって、これらは、新しいＤＮＡ結合タンパク質の設計のための魅力的なフレームワークとなる。
【０１５１】
ＤＮＡ配列に対する予め決定された特異性を有するタンパク質を迅速に調製する能力により、広範囲の技術が可能となり得る。これは、例えば、遺伝子の発現を指示するために、または遺伝子およびゲノムを物理的に修飾するために使用することができる。遺伝子の調節のための普遍的なシステムを開発するために、多くの努力が、ポリダクチル亜鉛フィンガータンパク質をベースとする人工的な転写因子の開発に注がれている（Ｂｌａｎｃａｆｏｒｔ，Ｐ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版（２００４）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６６（６），１３６１−１３７１；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版（２００２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（２），１３５−１４１；Ｊａｎｔｚ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．（２００４）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．１０４（２），７８９−７９９）。そのようなシステムは、生物学およびバイオテクノロジーに相当の影響を与える可能性があり、そして、指示された遺伝子調節に基づいて疾患の処置のための新しいアプローチを付与できる可能性がある。遺伝子発現を、１８塩基対（ｂｐ）の標的部位に結合するポリダクチル亜鉛フィンガータンパク質をベースとする人工的な転写因子を使用して特異的に変化させることができることは、現在示されている（Ｂｌａｎｃａｆｏｒｔ，Ｐ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版（２００４）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６６（６），１３６１−１３７１；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版（２００２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（２），１３５−１４１）。９ｂｐ程度の小さな部位の標的化もまた、クロマチン閉塞（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の助けを借りて、おそらくはある程度の調節特異性を提供することができる（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｓｐｒａｔｔ，Ｓ．Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｑ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｂ．，Ｑｉ，Ｈ．，Ｒａｓｃｈｋｅ，Ｅ．Ｅ．，Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｒｅｂａｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｗｏｌｆｆｅ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｃａｓｅ，Ｃ．Ｃ．（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（４３），３３８５０−３３８６０；Ｌｉｕ，Ｐ．Ｑ．，Ｒｅｂａｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｑ．，Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｌｉａｎｇ，Ｙ．，Ｑｉ，Ｈ．，Ｌｉ，Ｐ．Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｂ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｍ．Ｃ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｅ，Ｙ．Ｌ．，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｐ．，Ｓｐｒａｔｔ，Ｓ．Ｋ．，Ｃａｓｅ，Ｃ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆｅ，Ａ．Ｐ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（１４），１１３２３−１１３３４；Ｂｌａｎｃａｆｏｒｔ，Ｐ．，Ｍａｇｎｅｎａｔ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１（３），２６９−２７４）。転写調節に加えて、新規の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合特異性は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとのそれらの融合による相同組み換えを指示することにおいて多大な期待が示されている（Ｕｒｎｏｖ  ＦＤ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｅｅ  ＹＬ，Ｂｅａｕｓｅｊｏｕｒ  ＣＭ，Ｒｏｃｋ  ＪＭ，Ａｕｇｕｓｔｕｓ  Ｓ，Ｊａ���ｉｅｓｏｎ  ＡＣ，Ｐｏｒｔｅｕｓ  ＭＨ，Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＰＤ，Ｈｏｌｍｅｓ  ＭＣ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（７０４２），６４６−６５１；Ｂｉｂｉｋｏｖａ，Ｍ．，Ｂｅｕｍｅｒ，Ｋ．，Ｔｒａｕｔｍａｎ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｄ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００（５６２０），７６４）。
【０１５２】
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２型の亜鉛フィンガードメインは特有であり、それらのモジュールの性質の理由から、伸張型のＤＮＡ配列の認識について有望なタンパク質のクラスである。それぞれのドメインは、疎水性相互作用と、保存されているＣｙｓ２−Ｈｉｓ２残基による亜鉛イオンのキレート化によって安定化させられたββα構造に折り畳まれたおよそ３０個のアミノ酸から構成されている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，ＭｃＬａｃｈｌａｎ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｋｌｕｇ，Ａ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４（６），１６０９−１６１４；Ｌｅｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｇｉｐｐｅｒｔ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｏｍａｎ，Ｋ．Ｖ．，Ｃａｓｅ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｅ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１８８３−）２４５（４９１８），６３５−６３７）。今日までに、鉛フィンガータンパク質のこのファミリーの中で最も特性決定されているタンパク質は、マウスの転写因子Ｚｉｆ２６８である。Ｚｉｆ２６８の３個の亜鉛フィンガードメインのそれぞれは、ＤＮＡ二重ヘリックスの主溝へのα−認識ヘリックスの挿入によって、３ｂｐのサブサイトに結合する（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１８８３−）２５２（５００７），８０９−８１７；Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｍ．，Ｒｏｕｌｄ，Ｍ．Ａ．，Ｎｅｋｌｕｄｏｖａ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４，１１７１−１１８０）。ＤＮＡ結合タンパク質の迅速な構築を容易にするため、およびタンパク質−ＤＮＡ相互作用を研究するために、５’−ＧＮＮ−３’および５’−ＡＮＮ−３’ファミリーのＤＮＡ配列に結合する複数のドメインが、これまでに作成されている（Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版．（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），２７５８−２７６３；Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版．（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０３（４），４８９−５０２；Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｆｌｉｐｐｉｎ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（３１），２９４６６−２９４７８）。これらのドメインが、９ｂｐから１８ｂｐの標的部位を特異的に認識するポリダクチル亜鉛フィンガータンパク質に集合することができるモジュール認識単位として機能することが明らかにされている。重要なのは、１８ｂｐの部位が、ヒトまたは任意の他のゲノムの中で唯一であり得るに十分な長さであることであり、そして、そのようなタンパク質の転写特異性が、アレイ分析を使用してトランスジェニック植物およびヒト細胞の中で明らかにされている（Ｇｕａｎ，Ｘ．，Ｓｔｅｇｅ，Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｍ．，Ｄａｈｍａｎｉ，Ｚ．，Ｆａｎ，Ｎ．，Ｈｅｉｆｅｔｚ，Ｐ．，Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版，ａｎｄ  Ｂｒｉｇｇｓ，Ｓ．Ｐ．（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９（２０），１３２９６−１３３０１；Ｔａｎ，Ｓ．，Ｇｕｓｃｈｉｎ，Ｄ．，Ｄａｖａｌｏｓ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｙ．Ｌ．，Ｓｎｏｗｄｅｎ，Ａ．Ｗ．，Ｊｏｕｖｅｎｏｔ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｓ．，Ｈｏｗｅｓ，Ｋ．，ＭｃＮａｍａｒａ，Ａ．Ｒ．，Ｌａｉ，Ａ．，Ｕｌｌｍａｎ，Ｃ．，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｌ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．，Ｉｓａｌａｎ，Ｍ．，Ｂｅｒｇ，Ｌ．Ｐ．，Ｃａｍｐｏｓ，Ｂ．，Ｑｉ，Ｈ．，Ｓｐｒａｔｔ，Ｓ．Ｋ．，Ｃａｓｅ，Ｃ．Ｃ．，Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．，Ｃａｍｐｉｓｉ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｐ．Ｄ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１００（２１），１１９９７−１２００２）。構成的な調節に加えて、核ホルモン受容体に由来するリガンド結合ドメインと特異的な結合ドメインとの融合によって、このクラスの転写因子を用いた誘導性の遺伝子調節が提供される（Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｃｈｏｐｆｅｒ，Ｕ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版．（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（４２），３２６１７−３２６２７）。ＤＮＡの標的化において最終的な自由度を提供するためには、それぞれ可能な３ｂｐのサブサイトを標的化するために必要である６４種類のＤＮＡ結合ドメインを特定することが重要である。
【０１５３】
亜鉛フィンガー／ＤＮＡ相互作用についての構造データが限られているので（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１８８３−）２６１（５１２９），１７０１−１７０７；Ｋｉｍ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，９４０−９４５；Ｆａｉｒａｌｌ，Ｌ．，Ｓｃｈｗａｂｅ，Ｊ．Ｗ．Ｒ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｌ．，Ｆｉｎｃｈ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｄ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６６（６４５４），４８３−４８７；Ｈｏｕｂａｖｉｙ，Ｈ．Ｂ．，Ｕｓｈｅｖａ，Ａ．，Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｂｕｒｌｅｙ，Ｓ．Ｋ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３（２４），１３５７７−１３５８２；Ｗｕｔｔｋｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｃａｓｅ，Ｄ．Ａ．，Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｅ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３（１），１８３−２０６；Ｎｏｌｔｅ，Ｒ．Ｔ．，Ｃｏｎｌｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｓ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５（６），２９３８−２９４３）、新規の配列に対して高度な特異性で結合する亜鉛タンパク質の新たな設計はわずかしか成功していない（Ｈａｖｒａｎｅｋ  ＪＪ，Ｄ．Ｃ．，Ｂａｋｅｒ  Ｄ．（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３４４（１），５９−７０）。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ファミリーの亜鉛フィンガードメインの相互作用の形式に関する結晶学的データおよび突然変異実験によって、本発明者らは、多くのＤＮＡサブサイトを認識するドメインの選択のためのファージディスプレイライブラリーの構築へと導かれた（Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｆｌｉｐｐｉｎ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（３１），２９４６６−２９４７８）。Ｚｉｆ２６８／ＤＮＡ複合体の分析は、ＤＮＡ結合が、−１位、３位、および６位のαヘリックスのアミノ酸残基の、それぞれ、３ｂｐのＤＮＡサブサイトの３’中央、および５’ヌクレオチドとの相互作用によって大部分が行われることを示唆していた（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１８８３−）２５２（５００７），８０９−８１７；Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｍ．，Ｒｏｕｌｄ，Ｍ．Ａ．，Ｎｅｋｌｕｄｏｖａ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４，１１７１−１１８０）。α−ヘリックスの１位、２位、および５位は、ＤＮＡのリン酸骨格と直接接触、または水によって媒介されて接触し、タンパク質の最終的な特異性についての重要な要因である。ロイシンは、通常、４位で見られ、ドメインの疎水性コアの中に包まれる。α−ヘリックスの２位は、他のヘリックス残基と相互作用し、加えて、３ｂｐのサブサイトの外側のヌクレオチドと接触することができ、それにより標的部位の重複��生じる（Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版．（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（６），２７５８−２７６３；Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｆｌｉｐｐｉｎ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，第３版．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（３１），２９４６６−２９４７８；Ｗｏｌｆｅ  ＳＡ，Ｇ．Ｈ．，Ｒａｍｍ  ＥＩ，Ｐａｂｏ  ＣＯ．（１９９９）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２８５（５），１９１７−１９３４；Ｉｓａｌａｎ，Ｍ．，Ｃｈｏｏ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｋｌｕｇ，Ａ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１１），５６１７−５６２１；Ｐａｂｏ  Ｃ．Ｏ．，Ｎｅｋｌｕｄｏｖａ，Ｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３０１（３），５９７−６２４）。
【０１５４】
最も研究されている、新しい特異性を有するタンパク質を組み立てるための足場は、マウスの転写因子Ｚｉｆ２６８であり、これは、ヒトの転写因子Ｓｐ１と構造的に関連がある。
【０１５５】
図１には、マウスの転写因子Ｚｉｆ２６８の亜鉛フィンガー−ＤＮＡ複合体を示す。
【０１５６】
両方のタンパク質の構造およびＤＮＡ結合特異性は十分に研究されている（Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｍ．，Ｒｏｕｌｄ，Ｍ．Ａ．，Ｎｅｋｌｕｄｏｖａ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４，１１７１−１１８０；Ｎａｒａｙａｎ，Ｖ．Ａ，Ｋｒｉｗａｃｋｉ，Ｒ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｃａｒａｄｏｎｎａ，Ｊ．Ｐ．（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，７８０１−７８０９）。図２は、ＤＮＡの特異的な塩基と転写因子の３つのフィンガーの特異的なアミノ酸との間での相互作用に関する、転写因子Ｚｉｆ２６８のタンパク質−ＤＮＡ相互作用を示す。−１位、３位、および−６位は、通常、それぞれ、塩基のトリプレットの３’中央、および５’ヌクレオチドと接触することが観察されている。−２位、１位、および５位は、多くの場合には、リン酸骨格との直接の接触、または水によって媒介される接触に関係している。４位は、通常、ロイシン残基であり、ドメインの疎水性コアの中に包まれている。２位は、他のヘリックス残基、および／またはヘリックス構造に応じた塩基と相互作用することが示されている。Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ複合体においては、フィンガー２の２位、およびフィンガー３の２位のアスパラギン酸は、それぞれ、相補的ＤＮＡ鎖上のシトシンまたはアデニンと接触する。これは、「標的部位の重複」と呼ばれる。他の亜鉛フィンガー結合タンパク質からは際立って、Ｚｉｆ２６８およびＳｐ１は、ドメイン間での共同する結合活性をわずかしか示さず、これにより、これらは亜鉛フィンガーの構造−活性の関係の研究、および新規の亜鉛フィンガードメインの設計のための魅力的なフレームワークとなっている。
【０１５７】
しかし、認識の構造的な詳細は、定義することはなおも困難である。ＤＮＡに特異的に結合するための、詳細に特性決定されている亜鉛フィンガードメインの選択は、これまでのところ、５’−（ＧＮＮ）−３’標的ファミリーに集中している。この研究による詳細なアミノ酸−塩基相互作用についてのいくつかの情報を表１に提供する。
【０１５８】
成功した選択のほとんどにはこの形態の部位が含まれる。残りの４８種類のトリプレットの大部分については、所望される特異性を有する数個のフィンガーしか報告されていない。これが、５’−（ＧＮＮ）−３’標的、またはこれまでに試験されたまさに限られた標的部位に対する結合について亜鉛フィンガーの固有の優先をどの程度示すかは、未だにわかっていない。２位から隣接しているトリプレット上の隣の塩基対に対する「鎖を超えた」相互作用が、結合の特異性に影響を与え得るという事実にしたがって、亜鉛フィンガーが３個の塩基対に結合する原則として独立したモジュールであるという単純なモデルを、隣接しているフィンガーの間での相乗効果を考慮するモデルに改善した。マルチフィンガータンパク質の構築は、ドメイン間の共働の理由だけではなく、リンカー領域および亜鉛フィンガータンパク質構造のβ−鎖の影響も考慮しなければならないとの理由から、依然として困難である。この実施例に報告する研究の目的は、５’−（ＴＮＮ）−３’ＤＮＡ配列に特異的に結合する亜鉛フィンガードメインを選択することである。今日までには、α−ヘリックスの６位のアミノ酸による５’−ヌクレオチドの認識は、５’−グアニンのアルギニンまたはリジンとの相互作用を除き、理解されていない（表１）。
【０１５９】
結果
ドメインの数を増やすために、既存のファージディスプレイライブラリーを選択に使用した。このライブラリーは、これらの３フィンガータンパク質のフィンガー−３ヘリックスの２位のアスパラギン酸が、フィンガー２標的部位での５’−グアニンまたはチミンの認識を可能にするとの理由から、５’−（ＧＮＮ）−３’に結合する亜鉛フィンガードメインについて以前に作成されたドメインであり、そして５’−（ＴＮＮ）−３’標的部位に特異的に結合するドメインの選択に十分に適しているはずである（図２）。ファージディスプレイライブラリーの構築は、Ｚｉｆ２６８の変異体であるＣ７タンパク質をベースとした。２つのサブライブラリーを、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈの中で構築した。ＮＮＫライブラリーには、終結コドンを除く全てのアミノ酸の組み合わせを可能にするコドンドーピングストラテジーを使用して、−１位、１位、２位、３位、５位、および６位でのフィンガー２のα−ヘリックスのアミノ酸残基の無作為化を含め、それにより３２種類のコドンの可能性を作成した。ＶＮＳライブラリーは、芳香族アミノ酸Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐ、さらには終結コドンを除く、−２位、−１位、１位、２位、３位、５位、および６位の無作為化によって構築し、これによってそれぞれのコドンについて２４種類の可能性を残した。ライブラリーは、それぞれが５’−ＧＣＧＮＮＮＧＣＧ−３’（配列番号４２３）型の配列を認識することができる、それぞれ、４．４×１０９および３．５×１０９個のメンバーから構成されていた。これらのサブライブラリーを増幅させ、そして選択手順のために混合した。６回のパンニングの中で、競合因子ＤＮＡの濃度を増大させ、選択圧を増大させるために、標的濃度を低下させた（表３、８、１１）。最後の回のパンニングの後、それぞれの５’−（ＴＮＮ）−３’標的部位について選択した４つのシングルクローンのＤＮＡ配列を決定し、アミノ酸配列を予想した。最初のセットのパンニング（それぞれのセットは、同時に実験した６種類のＤＮＡ標的から構成される）から、５’−（ＴＡＡ）−３’、５’−（ＴＡＣ）−３’、５’−（ＴＡＧ）−３’、５’−（ＴＡＴ）−３’、および５’−（ＴＴＧ）−３’ＤＮＡ標的部位に選択的に結合したコンセンサス配列を見出した。コンセンサスではない配列は、５’−（ＴＣＧ）−３’に結合するように選択したクローンについて見られた。
【０１６０】
一般的には、それぞれのセットは、アミノ酸レベルでの良好な保存を示していた。５’−（ＴＡＡ）−３’に選択的に結合するドメインの場合には、分析した４つのクローンは全て、フィンガー２のヘリックス領域（−１位から６位）の中に同じアミノ酸配列を有していた。５’−（ＴＡＣ）−３’ＤＮＡ標的に結合するように選択したクローンは、１位、２位、３位、４位、５位、および６位については保存を示したが、−１位はＡｌａまたはＳｅｒと特定した。対照的に、５’−（ＧＮＮ）−３’−特異的ドメインによる３’−シトシンの認識は、アミノ酸ＡｓｐまたはＧｌｕによって媒介される（表１）。５’−（ＴＡＧ）−３’配列に結合するように選択したクローンは、１位、２位、３位、５４位、および６位に保存を示した。１位はＬｅｕまたはＳｅｒであり得、そして５位はＧｌｎまたはＴｈｒであり得る。いずれの位置も、ＤＮＡ塩基との相互作用には直接は関係していなかったが、多くの場合には、リン酸骨格に対して水によって媒介されて接触していた（図２）。５’−（ＴＡＴ）−３’に結合するドメインは、１位、２位、３位、４位、５位、および６位で保存されており、一方、−１位は、ＡｌａまたはＶａｌであることが明らかになった。５’−（ＧＮＮ）−３’サブサイトに結合するドメインについては、３’−チミンの認識は、１位のＴｈｒまたはＳｅｒによって行われていた。さらに、この実施例にいたる研究において単離された５’−（ＴＡＮ）−３’サブサイトに結合するクローンは全て、α−ヘリックスの３位に保存を示し、これは中央のアデニンの認識がＡｓｎ３によって媒介されることを示している。この知見は、５’−（ＧＮＮ）−３’についての研究による結果（表１）と一致している。加えて、５’−（ＴＴＧ）−３’に結合するように選択したドメインは、１位、２位、３位、４位、５位、および６位では保存されおり、一方、−１位はＡｒｇまたはＧｌｕであり得る。Ａｒｇ−１はまた、５’−（ＧＮＧ）−３’標的部位に結合するドメインの全てについて以前に特性決定された３’−グアニンの認識についても強く選択された（表１）。興味深いことに、５’−（ＴＮＮ）−３’に特異的に結合するように実施例１にいたる研究において選択されたドメインは、α−ヘリックスの６位において保存を示し、これは通常、３塩基対のサブサイトの中の５’ヌクレオチドの認識を媒介する。アミノ酸Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙは６位で同定された。Ｔｈｒ６はまた、Ｚｉｆ２６８のフィンガー−２ドメインにも存在していた（図２）が、その位置によるタンパク質／ＤＮＡ複合体の構造の研究においては接触は観察されなかった。驚くべきことに、ファージディスプレイ選択によっては、５’−チミンの優先的な認識を示す数個の特異的なアミノ酸残基が生じた（図３）。
【０１６１】
新しく選択されたフィンガー−２ドメインを含む３フィンガータンパク質についてのコード領域を発現ベクターｐＭａｌにクローニングし、そしてＸＬ−１ブルーに形質転換した。ＩＰＴＧでの誘導後、タンパク質抽出物を調製した。これらのタンパク質の、１６種類の可能性のある５’−（ＴＮＮ）−３’フィンガー−２サブサイトの全てに対する結合特異性を、マルチ標的ＥＬＩＳＡによって実験した（図３）。全てのタンパク質が、それらの標的ＤＮＡサブサイトに対して高度な結合特異性を示した（図３）。５’−（ＴＡＣ）−３’に特異的に結合するように選択したクローンは、３’−ヌクレオチドの認識に関与しているフィンガー２の−１位（ＳｅｒまたはＡｌａ）だけが異なっていた。研究したクローンはいずれも、５’−（ＴＡＡ）−３’および５’−（ＴＡＴ）−３’ＤＮＡ標的とわずかな交差反応性を示した。５’−（ＴＡＧ）−３’ＤＮＡ標的について選択したクローンは、フィンガー２の１位（ＬｅｕまたはＳｅｒ）および５位（ＧｌｎまたはＴｈｒ）が異なっていた。いずれの残基も、通常は、ＤＮＡ塩基との接触には関与していないので、これらのヘリックスが異なるＤＮＡ結合の優先性を示したことは驚くべきことであった。クローンＴＡＧ−３ｄ−２は、中央のヌクレオチドの区別なく、５’−（ＴＮＧ）−３’標的部位に結合する。クローンＴＡＧ−３ｃ−２は、標的に対して高い特異的結合を示した。５’−（ＴＡＴ）−３’に結合するように選択したクローンはいずれも、−１位（ＡｌａまたはＶａｌ）、５位（ＡｒｇまたはＬｙｓ）、および６位（ＴｈｒまたはＳｅｒ）においてフィンガー２のアミノ酸配列が異なっていた。これらが、全ての場合において高度に保存的であるアミノ酸置換であり、そしていずれのクローンも、これらの位置で類似するアミノ酸側鎖についての選択を示すことに留意されたい（疎水性については−１位、塩基性については５位、そして極性の電荷を有していない残基については６位）。興味深いことに、いずれのクローンも、それらの標的部位に対する結合を優先するが、ＯＤ４０５値によって概算される親和性は比較的低く、そして−１位がＶａｌである場合（クローン４ｄ−２）には、３’−ヌクレオチドの認識にはほとんど区別がない。５’−（ＴＴＧ）−３’ＤＮＡ標的に結合させるために選択したクローンは、５’−（ＴＡＧ）−３’に対してはわずかな交差反応性を示し、５’−（ＴＧＧ）−３’に対しては、より少ない交差反応性を示した。同様の効果が、５’−（ＧＮＧ）−３’結合タンパク質の選択についても観察された。２回目のパンニングのセットには、ＤＮＡ標的５’−（ＴＣＡ）−３’、５’−（ＴＣＣ）−３’、５’−（ＴＣＴ）−３’、５’−（ＴＧＡ）−３’、５’−（ＴＧＣ）−３’、および５’−（ＴＣＧ）−３’を含めた。なぜなら、フィンガー２のα−ヘリックスについてのコンセンサス配列が、１回目のパンニング手順の後には、これらの標的については見られなかったからである。６回の選択の後に、それぞれのプールに由来する４個のシングルクローンを、ＤＮＡ配列決定、およびα−ヘリックスの中のアミノ酸残基の予想によって分析した。いずれのセットも、それらの選択したフィンガー−２ドメイン��コンセンサス配列を示さなかった。驚くべきことに、ポジティブ対照である５’−（ＴＧＡ）−３’の選択についてもなお、コンセンサス配列は見られなかった。このＤＮＡサブサイトに結合するドメインは以前の研究において特性決定されており、これは、さらに特異的なクローンを単離する試みのために本明細書中で使用した。２回目のパンニングのセットからいずれのドメインも単離できなかった１つの理由としては、選択した比較的高い選択圧であった可能性がある（表８）。したがって、低い競合因子の濃度を用いて、これらの標的についてのパンニング手順を繰り返した。非常に穏やかな選択圧を用いても、それらの標的ＤＮＡに特異的に結合するドメインは単離されず、また、アミノ酸のレベルでの保存は全く示されなかった（表１０〜１２）。
【０１６２】
まとめ
この実施例で報告した研究は、５’−（ＴＮＮ）−３’ＤＮＡ標的に対して結合特異性を有する新しい亜鉛フィンガードメインの選択を目的とした。
【０１６３】
Ｄ７タンパク質に基づいて構築されたファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより、５個の新しいフィンガー−２ドメインが、５’−（ＴＡＡ）−３’、５’−（ＴＡＣ）−３’、５’−（ＴＡＧ）−３’、５’−（ＴＡＴ）−３’、および５’−（ＴＴＧ）−３’ＤＮＡ標的部位に選択的に結合することを見出した。新しく選択したドメインのアミノ酸配列は、以前に報告された亜鉛フィンガードメインのアミノ酸配列と、特に、−１位のＧｌｎによる３’−アデニン、３位のＡｓｐによる中央のアデニン、および−１位のＡｒｇによる３’−グアニンの認識について、強い相同性が明らかである（表１）。この相同性は、５’−（ＴＮＮ）−３’の形態の亜鉛フィンガードメイン結合配列については知られていなかった。さらに、新しいフィンガー−２ドメインの分析により、５’−チミンを有するヘリックス領域の中の６位の可能性のある相互作用パターンについてのさらなる知見が導かれた。これらの結果に基づくと、５’−チミンの認識は、おそらく、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙによって行われる。
【０１６４】
実験
１．ライブラリーの増幅
選択は、Ｃ７タンパク質（Ｚｉｆ２６８の誘導体）のフィンガー２の６個のアミノ酸が無作為化されたファージディスプレイライブラリーに基づいた。このライブラリーを、ＰＣＲによって無作為化したＤＮＡ断片をファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈの中にクローニングし、そしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換することによって作成した。ライブラリーには、１０９のメンバーが含まれていた。
【０１６５】
ファージライブラリーを、ＯＤ６００が約１．０のＥ．ｃｏｌｉ（ＥＲ２５３７）の１０ｍｌの培養物（ＳＢ培地）を１０μｌのファージライブラリーに感染させることによって増幅させた。５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む１０ｍｌのＳＢを、３７℃で１時間の震盪後に添加した。２ｍｌのヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３；約１０１３ｃｆｕ／ｍｌ）をさらに１時間の後に添加し、そして、培養物を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンと９０μＭのＺｎＣｌ２を含む２００ｍｌの新しいＳＢ培地に移した。３７℃で２時間の震盪の後、カナマイシンを７０μｇ／ｍｌとなるように添加した。培養物を３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌ調製によって調製し、プールし、そして１つのセットあたり６種類の異なるＤＮＡ標的に対するパンニングに使用した。漸増量の競合因子ＤＮＡを用いた標的結合ファージの選択を６回行った（表４、８、１１）。
【０１６６】
２．選択手順
ファージの調製のために、一晩培養物を５，０００ｒｐｍで２０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−ＨＳ遠心分離機の中のＪＬＡ−１０．５ローターの中で、遠心分離した。培養上清からファージを、４％のＰＥＧ  ８０００、および０．５ＭのＮＡＣｌを用いて、氷上で３０分間沈殿させた。混合物を９，０００ｒｐｍでさらに３０分間遠心分離した。上清を廃棄し、そしてファージペレットを風乾（１０〜２０分間）させた。ファージペレットを、５ｍＭの新鮮なＤＴＴを含む１％のＢＳＡ／亜鉛緩衝液Ａ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５；９０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、９０μＭのＺｎＣｌ２）の中に再度懸濁させ、０．２μＭのＣＡ−膜／ＣＦ−プレフィルターシリンジフィルター（ＣＡ−ｍｅｍｂｒａｎｅ／ＣＦ−ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ）を通して滅菌濾過した。これらの「投入（ｉｎｐｕｔ）」ファージの力価を、段階稀釈、およびＯＤ６００＝１．０のＥＲ２５３７の接種によって決定した。ファージ調製物は、１０μｌの２％ＮａＮ３を加えた後、４℃で保存した。
【０１６７】
１００μｌのこれらのファージ調製物を、標的オリゴヌクレオチドに対する結合反応に使用した。結合反応は、５００μｌの容量の、５ｍＭの新鮮なＤＴＴ、非特異的競合因子としての剪断したニシンの精子ＤＮＡ、および様々な濃度の競合因子オリゴヌクレオチドを含む亜鉛緩衝液Ａ中の１％のＢｌｏｔｔｏの中で行った（表４、８、１１）。Ｂｌｏｔｔｏ、５ｍＭの新鮮なＤＴＴ、剪断したニシンの精子ＤＮＡ、競合因子オリゴヌクレオチドを含む亜鉛緩衝液Ａ、およびファージ調製物を一緒に混合し、そして４℃で１時間（または室温で３０分間）、一定速度で穏やかに混合しながらインキュベートした。その後、標的オリゴヌクレオチドを加え、４℃で一晩（または室温で３時間）、インキュベーションを続けた。５０μｌのストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、５００μｌの、亜鉛緩衝液Ａ中の１％のＢＳＡで２回洗浄し、その後、５００μｌの、亜鉛緩衝液Ａ中の５％のＢｌｏｔｔｏで、一定速度で穏やかに混合しながら４℃でまた一晩（または室温で３時間）ブロックした。
【０１６８】
ブロック溶液を廃棄し、全量の結合反応混合物で置き換えた。ビオチニル化された標的オリゴヌクレオチドのストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズへの結合を、一定速度で穏やかに混合しながら、４℃で１時間行った。ビーズを、５ｍＭの新鮮なＤＴＴを含む亜鉛緩衝液Ａ中の２％のＴｗｅｅｎで、穏やかに混合しながら１０回洗浄した。最後の洗浄工程には、亜鉛緩衝液Ａ（５ｍＭのＤＴＴ）を使用して界面活性剤を除去した。ＤＮＡが結合したファージを、２５μｌの、亜鉛緩衝液Ａ中の１０ｍｇ／ｍｌトリプシンを添加して、室温で３０分間、磁気ビーズから溶出させた。タンパク質分解を、７５μｌのＳＢ培地の添加によって停止させた。
【０１６９】
１００μｌの溶出混合物を使用して、ＯＤ６００＝１．０のＳＢ中の、５ｍｌのＥＲ２５３７  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を感染させた。３７℃で３０分のインキュベーションの後、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む５ｍｌのＳＢを添加した。この工程では、１０μｌの反応混合物を取り出し、そして「出力（ｏｕｔｐｕｔ）」ファージの数を決定するために、１００μｌのＳＢ培地と混合した（表３、７、および１０）。細胞を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に段階稀釈でプレートした。３０分後、１ｍｌのヘルパーファージを添加し、全混合物を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンと９０μＭのＺｎＣｌ２を含む、１００ｍｌの新鮮な、予め温めておいたＳＢ培地を含む遠心分離管に移した。１．５時間後、カナマイシンを７０μｇ／ｍｌになるように添加した。培養物を３７℃で一晩インキュベートした。
【０１７０】
ＤＮＡの単離
最後の回のパンニングの後、細菌ペレットを、１０ｍｌのＰ１緩衝液（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ２５０，ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）に再度懸濁させた。５００μｌのこの懸濁液を、このキットを使用してＤＮＡを調製するために使用した。残りの容量は２０℃で保存した。１．５μｇの単離したＤＮＡを、２００ｎｇのＯｍｐ  ｓｅｑ  ＧＴＧプライマーと混合し、そして配列を分析した。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡアッセイのためのｐＭａｌ−融合タンパク質の細菌抽出物
選択した亜鉛フィンガータンパク質を、発現のためにｐＭａｌベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングした。構築物を、エレクトロポレーションによりＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株に導入し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に画線した。それぞれの変異体の４個のシングルコロニーを、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンと１％のグルコースを含む３ｍｌのＳＢ培地に植菌した。培養物を３７℃で一晩増殖させた。１．２ｍｌの培養物を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、０．２％のグルコース、９０μｇ／ｍｌのＺｎＣｌ２を含む２０ｍｌの新鮮なＳＢ培地に移し、３７℃でさらに２時間増殖させた。ＩＰＴＧを、０．３ｍＭの最終濃度になるように添加した。インキュベーションを２時間続けた。培養物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＰＲ遠心分離機の中で３５００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。細菌ペレットを、５ｍＭの新鮮なＤＴＴを含む１．２ｍｌの亜鉛緩衝液Ａの中に再度懸濁させた。タンパク質抽出物を、凍結／解凍手順によって、ドライアイス／エタノールと温水を使用して単離した。この手順を６回繰り返した。試料を４℃で５分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機の中で遠心分離した。上清を清潔な１．５ｍｌの遠心分離管に移し、そしてＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＰＢＳ中の０．２μｇ／２５μｌの濃度のストレプトアビジンを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０，ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）の個々のウェルに添加し、その後、３７℃で１時間（または４℃で一晩）インキュベートした。プレートを、水で２回洗浄し、その後、ＰＢＳ中の０．０２５μｇ／２５μｇのビオチニル化されたオリゴヌクレオチド、またはＢＳＡ対照についてはＰＢＳだけを添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを水で２回洗浄した。ブロック反応については、それぞれのウェルを（濾過した）ＰＢＳ中の３％のＢＳＡで満たし、そして３７℃で１時間インキュベートした。ＢＳＡを除去し、２５μｌの細菌抽出物またはファージ懸濁液をウェルに添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、プレートを水で１０回洗浄した。α−ＭＢＰ抗体をウェルに添加し、続いて、α−ｍ−ａｌｋＰｈｏｓ抗体（ｐＭａｌ−融合タンパク質について；ＰＢＳ中に１：１０００に稀釈した）、または西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させられたα−Ｍ１３ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ファージ懸濁液について；ＰＢＳ中に１：５０００に稀釈した）をそれぞれのウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを水で１０回洗浄した。α−ｍ−ａｌｋＰｈｏｓ  Ａｂについては２５μｌのアルカリホスファターゼ基質溶液（Ｓｉｇｍａ）を、また、（α−Ｍ１３ｍＡｂについては）２５μｌのＡＢＴＳ基質を、それぞれのウェルに添加した。インキュベーションを室温で行った。それぞれのウェルのＯＤ４０５を、通常は、２０分および６０分の時点で決定した。
【０１７３】
【表３】
2009520463.tif 000018
【０１７４】
【表４】
2009520463.tif 000019
【０１７５】
【表５】
2009520463.tif 000020
【０１７６】
【表６】
2009520463.tif 000021
【０１７７】
【表７】
2009520463.tif 000022
【０１７８】
【表８】
2009520463.tif 000023
【０１７９】
【表９】
2009520463.tif 000024
【０１８０】
【表１０】
2009520463.tif 000025
【０１８１】
【表１１】
2009520463.tif 000026
【０１８２】
【表１２】
2009520463.tif 000027
分析した多数の亜鉛フィンガーについてのマルチ標的特異性アッセイの結果を図３に示す。これらは、以下である：（ａ）ＱＡＳ−Ｎ−ＬＩＳ（ＴＡＡ−１ａ−２）（配列番号１；５’−（ＴＡＡ）−３’に結合する；（ｂ）ＳＲＧ−Ｎ−ＬＫＳ（ＴＡＣ−２ｃ−２）（配列番号２；５’−（ＴＡＣ）−３’に結合する；（ｃ）ＡＲＧ−Ｎ−ＬＫＳ（ＴＡＣ−２ｄ−２）（配列番号７；５’−（ＴＡＣ）−３’に結合する；（ｄ）ＲＬＤ−Ｎ−ＬＱＴ（ＴＡＧ−３ｃ−２）（配列番号３；５’−（ＴＡＧ）−３’に結合する；（ｅ）ＲＳＤ−Ｎ−ＬＴＴ（ＴＡＧ−３ｄ−２）（配列番号８；５’−（ＴＡＧ）−３’に結合する；（ｆ）ＡＲＧ−Ｎ−ＬＲＴ（ＴＡＴ−４ｃ−８）（配列番号４；５’−（ＴＡＴ）−３’に結合する）；（ｇ）ＶＲＧ−Ｎ−ＫＬＳ（ＴＡＴ−４ｄ−２）（配列番号９；５’−（ＴＡＴ）−３’に結合する）；および（ｈ）ＲＫＤ−Ａ−ＬＲＧ（ＴＴＧ−６ｃ−２）（配列番号５；５’−（ＴＴＧ）−３’に結合する）。
【０１８３】
図４は、作成された様々なフィンガーに対するマルチ標的特異性の結果についての第２のセットを示す：（ａ）ＲＬＤ−Ｎ−ＬＱＴ（配列番号３；５’−（ＴＡＧ）−３’に結合する；（ｂ）ＡＲＧ−Ｎ−ＬＲＴ（配列番号４；５’−（ＴＡＴ）−３’に結合する；（ｃ）ＳＲＧ−Ｎ−ＬＫＳ（配列番号２；５’−（ＴＡＴ）−３’に結合する；（ｄ）ＱＡＳ−Ｎ−ＬＩＳ（配列番号１；５’−（ＴＡＡ）−３’に結合する；（ｅ）ＲＥＤ−Ｎ−ＬＨＴ（配列番号６；５’−（ＴＡＧ）−３’に結合する；および（ｆ）ＡＲＧ−Ｎ−ＬＫＳ（配列番号７；５’−（ＴＡＴ）−３’に結合する）。
【０１８４】
（実施例２）
リンカー領域が変化している新しい無作為化された亜鉛フィンガーライブラリーの設計
序論
隣接している亜鉛フィンガーを繋ぐリンカー領域は、ＤＮＡ部位に沿った複数のフィンガーの間隔の制御を助ける重要な構造エレメントである。最も一般的なリンカーの配置は、１つのフィンガーの最後のヒスチジンと、次のフィンガーの最初の保存されている芳香族アミノ酸との間に５個の残基を有する。亜鉛フィンガーのリンカーのほぼ半分は、コンセンサス配列ＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）に適合するＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｄａｔａｂａｓｅの中に見られる。リンカー残基のそれぞれの構造上の役割は、すでに研究されている（図４）。隣接するフィンガーの結合は、前のフィンガーのヘリックスの９位の側鎖と、続くフィンガーの骨格カルボニルまたは−２位の側鎖との間での接触によってさらに安定化させられる。この接触は、ＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）リンカーと関係している可能性がある。複数の亜鉛フィンガーの間でこれが起こる場合にはいつでも、前のフィンガーの２つのヒスチジンの間に、ほぼ必ず３個の残基が存在し、これらのタンパク質の８０％においては、９位に塩基性アミノ酸（アルギニンまたはリジン）が存在する。この位置にアルギニンがある場合には、これは、−２位の骨格カルボニルとフィンガー内接触を形成する。いくつかの構造においては、このアルギニンの立体構造が、リンカーに由来するグルタミン酸との相互作用によって安定化させられることが明らかになっている。
【０１８５】
突然変異実験では、リンカー配列が高親和性のＤＮＡ結合に重要であることが明らかにされている。いくつかの点変異によっては、ＤＮＡ結合親和性の１０倍〜１００倍の低下が生じ、これは、インビボでは機能の欠失を引き起こし得る。ＮＭＲ実験は、ＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）リンカーは遊離のタンパク質においては可撓性であるが、ＤＮＡに結合するとより固くなることを示している。
【０１８６】
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガータンパク質は、多くの場合には、高い親和性および特異性で、それらの標的部位に結合する。いくつかのグループは、ＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）に連結されたフィンガーの数が１個から２個から３個へと増加するに伴い、付随してＤＮＡ結合親和性が増大することに注目している。３個のフィンガーを含むタンパク質（例えば、Ｚｉｆ２６８およびＳＰ１）は、それらの好ましい配列に、通常は１０−８Ｍから１０−１１Ｍの間の解離定数で結合する。予想外に、ＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）リンカーを使用したさらなるフィンガーの結合によっては、ＤＮＡに対する結合親和性のさらなる増大はわずかしか得られなかった。それについての理由は完全には明らかではなく、この作用の根拠を理解するためにはさらなる実験が必要である。マルチフィンガータンパク質の中に４個以上のフィンガーが存在することによって生じる構造上、およびエネルギー的な問題は、ＤＮＡに結合すると亜鉛フィンガーによって引き起こされる、ＤＮＡ分子の湾曲によって起こる可能性がある。ＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）リンカーによって繋がれた亜鉛フィンガーは、ＤＮＡに結合すると、ＤＮＡのヘリックスピッチに完全には合っていないヘリックス配置をとり、その結果、さらにフィンガーが結合されると、さらなる立体障害が蓄積する。したがって、立体障害のネガティブエネルギーの影響により、立体障害が存在しない場合の結合親和性よりも結合親和性は弱まる。スーパーコイルレベルでの実験は、亜鉛フィンガーの結合が、１つのフィンガーについておよそ１８°、ＤＮＡを解くことを示している。得られる複合体においては、ＤＮＡは、１つのターンおよび大きくなった主溝あたり、約１１塩基対の変異体Ｂ型立体構造をとる。
【０１８７】
それらのＤＮＡ標的に対して特異的に、そして高い親和性で結合するポリダクチル亜鉛フィンガータンパク質を作成するためには、これまでは２つのアプローチしか存在していなかった。そのうちの１つは、より長い可撓性リンカーを、共有により配置されている基準に沿って連結されたフィンガーの２つのセットの間に挿入することである。より長い可撓性のリンカーによって繋がれたＺｉｆ２６８およびＮＲＥに由来する２つの３フィンガータンパク質からなる６フィンガーの構築物は、フェムトモルの解離定数を示した。別の可能性は、基準に沿った亜鉛フィンガーのセットに対する二量化ドメインの結合である。二量化ドメインによっては、より大きな複合体への亜鉛フィンガーの集合が誘導され、それにより、より長いアミノ酸ＤＮＡ標的部位の認識が誘導される。このアプローチは、二量体の安定性に影響を与えることができるので、完全なモジュールである。これは、例えば、オンオフ状態のチューニングを可能にする。
【０１８８】
設計概念
さらに別のフィンガーを結合させるために全て基準に沿ったリンカーが使用されるポリダクチル亜鉛フィンガータンパク質についての設計ストラテジーは、ＤＮＡ結合親和性の比較的控えめな増大を生じた。構造的および生化学的分析は、亜鉛フィンガーペプチドに結合されると、ＤＮＡは多くの場合にはわずかに解かれることを示している。モデル化の実験は、基準に沿ったリンカーが、好ましい結合（例えば、理想的なＢ−ＤＮＡへのＺｉｆ２６８の結合）を可能にするには短すぎることを示していた。この理由は、亜鉛フィンガーのヘリックスの周期性が、Ｂ−ＤＮＡのヘリックスの周期性とほとんどあっておらず、そして、解かれた鎖は、さらなるフィンガーが使用される場合にはより深刻な問題となることである。結合はエネルギー的には比較的好ましくなくなってしまうので、これは結合親和性を低下させる作用を有する。
【０１８９】
ファージディスプレイを使用するポリダクチル亜鉛フィンガータンパク質のＤＮＡ結合親和性に対するリンカー領域の構造の影響を実験することを決定した。したがって、２つの異なるポリダクチル亜鉛フィンガータンパク質Ｂ３Ｃ２およびＶｅｇｆ５’１６を選択した。いずれも、約１ｎｍのＤＮＡ結合親和性を有する６フィンガータンパク質である。
【０１９０】
それぞれのペプチドについて２つの異なる種類のライブラリーを構築した。第１のライブラリーは、あまり拘束されておらず、そしてＤＮＡに固く結合することができる、アミノ酸配列が変化している変異体を選択するための基準に沿ったリンカーＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）の５つの位置を無作為化した。より長い、さらに可撓性のリンカーもまた求めた。ライブラリーの第２のセットは、基順に沿ったリンカーＴＧＥＫＰ（配列番号４１２）の中のＴおよびＧを維持し、３位、４位、および５位を無作為化し、そして３個のさらに別のアミノ酸を付加した（図６）。４フィンガーのタンパク質（フィンガー２〜５を含む）を、ライブラリーの構築を容易にするために、６フィンガーのタンパク質から構築した。これらの４フィンガーのタンパク質を、無作為化したライブラリーを構築するためのＰＣＲの鋳型とした。
【０１９１】
（実施例３）
ゲル移動度のシフトの分析
（期待される実施例）
ゲルシフト分析を、原則として記載されている通りに、精製したタンパク質を用いて行う（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。一般的には、融合タンパク質を、ＺＢＡ／５ｍＭのＤＴＴをカラム緩衝液として使用したことを除き、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、＞９０％の均質性となるまで精製する。タンパク質の純度および濃度を、ＢＳＡ標準物に対する比較によって、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）で染色した１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから決定する。標的オリゴヌクレオチドを、それらの５’または３’末端で［３２Ｐ］で標識し、そしてゲル精製する。タンパク質の１１種類の３倍段階希釈物を、２０μｌの結合反応物（１×結合緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）／１０％のグリセロール／約１ｐＭの標的オリゴヌクレオチド）の中で室温で３時間インキュベートし、その後、０．５×ＴＢＥ緩衝液中の５％のポリアクリルアミドゲル上で再度分離させる。乾燥させたゲルの定量を、ホスホルイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）とＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して行い、そしてＫＤをＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定する。
【０１９２】
（実施例４）
一般的方法
（期待される実施例）
トランスフェクションとルシフェラーゼアッセイ
ＨｅＬａ細胞を、４０〜６０％の細胞集密度で使用する。細胞を、１６０ｎｇのレポータープラスミド（ｐＧＬ３−プロモーター構築物）と４０ｎｇのエフェクタープラスミド（ｐｃＤＮＡ３中の亜鉛フィンガー−エフェクタードメイン融合体）で、２４ウェルプレートの中でトランスフェクトする。細胞抽出物をトランスフェクションの４８時間後に調製し、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９６Ｐ照度計（ＥＧ＆Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）の中でルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定する。
【０１９３】
レトロウイルス遺伝子標的化とフローサイトメトリー分析
これらのアッセイは、記載されている通りに行う（Ｂｅｅｒｌｉら、（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（４），１４９５−１５００；Ｂｅｅｒｌｉら、（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４２），３２６１７−３２６２７］。一次抗体として、ＥｒｂＢ−１特異的ｍＡｂ  ＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＥｒｂＢ−２特異的ｍＡｂ  ＦＳＰ７７（Ｎａｎｃｙ  Ｅ．Ｈｙｎｅｓから譲り受けた；Ｈａｒｗｅｒｔｈら、１９９２）、およびＥｒｂＢ−３特異的ｍＡｂ  ＳＧＰ１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用する。蛍光標識されたロバＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用する（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【０１９４】
（実施例５）
亜鉛フィンガー−エフェクタードメイン融合タンパク質の構築
（期待される実施例）
亜鉛フィンガー−エフェクタードメイン融合タンパク質の構築のために、ｅｔｓリプレッサー因子（ＥＲＦ）リプレッサードメイン（ＥＲＤ）の４７３位から５３０位のアミノ酸（Ｓｇｏｕｒａｓ，Ｄ．Ｎ．，Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅａｌ，Ｇ．Ｊ．，Ｊｒ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｌａｉｒ，Ｄ．Ｇ．＆Ｍａｖｒｏｔｈａｌａｓｓｉｔｉｓ，Ｇ．Ｊ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，４７８１−４７９３）、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインの１位から９７位のアミノ酸（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｗ．，Ｋ．−Ｈ．，Ｖｉｓｓｉｎｇ，Ｈ．，Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｈ．−Ｊ．＆  Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｆ．Ｊ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，４５０９−４５１３）、またはＭａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）の１位から３６位のアミノ酸（Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｌａｈｅｒｔｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｑ．Ａ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ａ．Ｐ．＆  Ｅｉｓｅｎｍａｎ，Ｒ．Ｎ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，５７７２−５７８１）をコードするＤＮＡを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して重複しているオリゴヌクレオチドから集合させる。ＶＰ１６転写活性化ドメインの４１３位から４８９位のアミノ酸のコード領域（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．，Ｍａ，Ｊ．，Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．＆Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，５６３−５６４）を、ｐｃＤＮＡ３／Ｃ７−Ｃ７−ＶＰ１６（１０）からＰＣＲ増幅させる。ＶＰ６４  ＤＮＡ（４３７位から４４７位のアミノ酸を含む、ＶＰ１６の最小活性化ドメインの四量体反復をコードする）（Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．，Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｏ．＆Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｗ．（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，４９６１−４９６８）を、相補的なオリゴヌクレオチドの２つの対から作成する。得られる断片を、標準的なクローニング手順によって亜鉛フィンガーコード領域に融合させ、その結果、それぞれの得られる構築物に、内部ＳＶ４０核局在化シグナル、さらには、Ｃ末端ＨＡデカペプチドタグを含める。融合構築物を真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。
【０１９５】
（実施例６）
ルシフェラーゼレポータープラスミドの構築
（期待される実施例）
ＡＴＧ開始コドンに関して−７５８位から−１位のヌクレオチドを含むｅｒｂＢ−２プロモーター断片を、ＴａｑＥｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてヒトの骨髄のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させ、ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にクローニングする。−１５７１位から−２４位のヌクレオチドを含むヒトｅｒｂＢ−２プロモーター断片を、ｐＳＶＯＡＬＤ５’／ｅｒｂＢ−２（Ｎ−−Ｎ）（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｌ．Ｇ．，Ｅｒｔｌ，Ａ．Ｐ．＆Ｇｉｌｌ，Ｇ．Ｎ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，４３８９−４３９３）から、Ｈｉｎｄ３消化によって切り出し、そしてｐＧＬ３ｂａｓｉｃの中に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にサブクローニングする。
【０１９６】
（実施例７）
ルシフェラーゼアッセイ
（期待される実施例）
全てのトランスフェクションには、ＨｅＬａ細胞を４０〜６０％の細胞集密度で使用する。通常、細胞を、４００ｎｇのレポータープラスミド（ｐＧＬ３−プロモーター構築物、またはネガティブ対照としてのｐＧＬ３ｂａｓｉｃ）、５０ｎｇのエフェクタープラスミド（ｐｃＤＮＡ３の中の亜鉛フィンガー構築物、またはネガティブ対照としての空のｐｃＤＮＡ３）、および２００ｎｇの内部標準プラスミド（ｐｈｒＡｃｔ−ｂＧａｌ）で、６ウェル皿のウェルの中で、リポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用してトランスフェクトする。細胞抽出物をトランスフェクションのおよそ４８時間後に調製する。ルシフェラーゼ活性はルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、βＧａｌ活性はＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ（Ｔｒｏｐｉｘ）を用いて、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ  ９６Ｐ照度計（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）の中で測定する。ルシフェラーゼ活性は、βＧａｌ活性に対して較正する。
【０１９７】
（実施例８）
ＨｅＬａ細胞の中でのｅｒｂＢ−２遺伝子の調節
（期待される実施例）
ｅｒｂＢ−２遺伝子を、課された調節のために標的化する。天然のｅｒｂＢ−２遺伝子を調節するために、合成のリプレッサータンパク質および転写活性化因子タンパク質を利用する（Ｒ．Ｒ．Ｂｅｅｒｌｉ，Ｄ．Ｊ．Ｓｅｇａｌ，Ｂ．Ｄｒｅｉｅｒ，Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１４６２８（１９９８））。このＤＮＡ結合タンパク質は、６個の予め定義された、モジュールである亜鉛フィンガードメインから構築される（Ｄ．Ｊ．Ｓｅｇａｌ，Ｂ．Ｄｒｅｉｅｒ，Ｒ．Ｒ．Ｂｅｅｒｌｉ，Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，２７５８（１９９９））。リプレッサータンパク質には、Ｋｏｘ−１  ＫＲＡＢドメインが含まれており（Ｊ．Ｆ．Ｍａｒｇｏｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，４５０９（１９９４））、一方、トランス活性化因子ＶＰ６４には、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６に由来する最小活性化ドメインの四量体反復が含まれる（Ｋ．Ｓｅｉｐｅｌ，Ｏ．Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｗ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，４９６１（１９９２））。
【０１９８】
ヒト子宮頸ガン細胞株ＨｅＬａの誘導体である、ＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆを（Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５５４７（１９９２））利用する。ＨｅＬａ細胞は上皮起源であるので、これらはＥｒｂＢ−２を発現し、そしてｅｒｂＢ−２遺伝子の標的化の研究に十分に適している。ＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞は、テトラサイクリンによって制御されるトランス活性化因子を生産し、それによって、増殖培地からのテトラサイクリン、またはその誘導体であるドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の除去により、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）の制御下で目的の遺伝子を誘導することができる。このシステムは、化学的な制御下で転写因子を置くために使用する。したがって、リプレッサープラスミドと活性化因子プラスミドを構築し、そしてＢａｍＨＩおよびＣｌａＩ制限部位を使用してｐＲｅｖＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、そしてにＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用してＰＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｘ．Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１０６６９（１９９７））サブクローニングする。ＰＣＲ増幅の忠実度を配列決定によって確認し、ＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞にトランスフェクトし、そして２０個のの安定なクローンをそれぞれ単離し、Ｄｏｘ依存性の標的遺伝子の調節について分析する。構築物を、ＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞株（Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５５４７（１９９２））にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用してトランスフェクトする。ハイグロマイシンを含む培地の中での２週間の選択後、２ｍｇ／ｍｌのＤｏｘの存在下で、安定なクローンを単離し、Ｄｏｘ依存性のＥｒｂＢ−２の発現の調節について分析する。ウェスタンブロット、免疫沈降、ノーザンブロット、およびフローサイトメトリー分析を、原則として記載されている通りに行う（Ｄ．Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ，Ｒ．Ｒ．Ｂｅｅｒｌｉ，Ｎ．Ｅ．Ｈｙｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，１１８２（１９９５））。ｅｒｂＢ−２プロモーター活性の読み出しとしてＥｒｂＢ−２タンパク質レベルを最初にウェスタンブロッティングによって分析する。これらのクローンの有意な画分は、４日間、Ｄｏｘを除去すると、ＥｒｂＢ−２の発現の調節（すなわち、リプレッサークローンの中のＥｒｂＢ−２のダウンレギュレーションおよび活性化因子クローンのアップレギュレーション）を示す。ＥｒｂＢ−２タンパク質レベルは、それらの特異的なｍＲＮＡレベルの変化に関係しており、このことは、ＥｒｂＢ−２発現の調節が転写の抑制または活性化の結果であることを示している。
【０１９９】
（実施例９）
Ｅ２Ｓ−ＫＲＡＢ、Ｅ２Ｓ−ＶＰ６４、Ｅ３Ｆ−ＫＲＡＢ、およびＥ３Ｆ−ＶＰ６４タンパク質をコードする領域のレトロウイルスベクターｐＭ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰへの導入
（期待される実施例）
Ｅ２Ｓ−ＫＲＡＢ、Ｅ２Ｓ−ＶＰ６４、Ｅ３Ｆ−ＫＲＡＢ、およびＥ３Ｆ−ＶＰ６４タンパク質をいくつかの細胞株の中で発現させるために、それらのコード領域を、レトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰに導入する。
【０２００】
これらの構築物の配列を、ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３プロモーターの特異的領域に結合するように選択する。コード領域を、ｐｃＤＮＡ３をベースとする発現プラスミドからＰＣＲ増幅させ（Ｒ．Ｒ．Ｂｅｅｒｌｉ，Ｄ．Ｊ．Ｓｅｇａｌ，Ｂ．Ｄｒｅｉｅｒ，Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１４６２８（１９９８））、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩ制限部位を使用してｐＲｅｖＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、そしてＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用してｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｘ．Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１０６６９（１９９７））にサブクローニングする。ＰＣＲ増幅の忠実度を配列決定によって確認する。このベクターは、亜鉛フィンガータンパク質の翻訳のための１つの２シストロン性のメッセージと、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）からは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。いずれのコード領域も同じｍＲＮＡを共有しているので、それらの発現は互いに物理的に関連しており、ＧＦＰの発現は亜鉛フィンガーの発現の指標である。これらのプラスミドから調製したウイルスを、その後、ヒトのガン細胞株Ａ４３１を感染させるために使用する。
【０２０１】
（実施例１０）
ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３遺伝子の発現の調節
（期待される実施例）
実施例９によるプラスミドを、両親媒性パッケージング細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して一時的にトランスフェクトし、２日後に、培養上清を、８ｍｇ／ｍｌのポリブレンの存在下での標的細胞の感染のために使用する。感染の３日後、細胞を分析のために回収する。感染の３日後に、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３の発現をフローサイトメトリーによって測定する。結果は、Ｅ２Ｓ−ＫＲＡＢとＥ２Ｓ−ＶＰ６４組成物が、それぞれ、ＥｒｂＢ−２遺伝子の発現を阻害し、そして増強することを示すと予想される。データは、Ｅ３Ｆ−ＫＲＡＢとＥ３Ｆ−ＶＰ６４組成物が、それぞれ、ＥｒｂＢ−２遺伝子の発現を阻害し、そして増強することを示すと予想される。
【０２０２】
ヒトｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３遺伝子を、亜鉛フィンガーをベースとする転写のスイッチの開発のためのモデル標的として選択した。ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーは、ヒトの悪性腫瘍の発生において重要な役割を担っている。具体的には、ｅｒｂＢ−２は、多数の部位（乳房、卵巣、肺、胃、および唾液腺を含む）に生じているヒトの腺ガンの高い割合において、遺伝子増幅および／または転写の脱制御の結果として過剰発現される（Ｈｙｎｅｓ，Ｎ．Ｅ．＆Ｓｔｅｍ，Ｄ．Ｆ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９８，１６５−１８４）。ＥｒｂＢ−２の発現の増大は、その内因性のチロシンキナーゼの構成的活性化を導き、そして、培養された細胞の形質転換を引き起こすことが示されている。多数の臨床試験では、ＥｒｂＢ−２の発現レベルが増大している腫瘍を有する患者は、予後が不良であることが示されている（Ｈｙｎｅｓ，Ｎ．Ｅ．＆Ｓｔｅｒｎ，Ｄ．Ｆ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９８，１６５−１８４）。ヒトのガンにおける関与に加えて、ｅｒｂＢ−２は、哺乳動物の成体においても、そして胚発生の間にも重要な生物学的役割を担っている（Ｈｙｎｅｓ，Ｎ．Ｅ．＆Ｓｔｅｍ，Ｄ．Ｆ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９８，１６５−１８４，Ａｌｔｉｏｋ，Ｎ．，Ｂｅｓｓｅｒｅａｕ，Ｊ．−Ｌ．＆Ｃｈａｎｇｅｕｘ，Ｊ．−Ｐ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，４２５８−４２６６，Ｌｅｅ，Ｋ．−Ｆ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｂａｔｅｓ，Ｂ．，Ｈｕｎｇ，Ｍ．−Ｃ．＆Ｈａｕｓｅｒ，Ｃ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，３９４−３９８）。
【０２０３】
したがって、ｅｒｂＢ−２プロモーターは、人工的な転写調節因子の開発についての興味深いテストケースを呈する。このプロモーターは詳細に特性決定されており、そして比較的複雑であることが示されており、これには、ＴＡＴＡ依存性およびＴＡＴＡ非依存性転写開始部位の両方が含まれる（Ｉｓｈｉｉ，Ｓ．，Ｉｍａｍｏｔｏ，Ｆ．，Ｙａｍａｎａｓｈｉ，Ｙ．，Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，Ｋ．＆Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４３７４４３７８）。初期の研究では、ポリダクチルタンパク質が、転写を特異的に活性化または抑制する転写調節因子として作用できることが示されているが、これらのタンパク質は、タンパク質結合部位の６個のタンデムな反復に対して、人工的なプロモーターの上流に結合させられた（Ｌｉｕ，Ｑ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｈｉａｒａ，Ｊ．Ｂ．＆Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，５５２５−５５３０）。さらに、この研究では、結合特異性が修飾されていないポリダクチルタンパク質が利用された。本明細書中では、本発明者らは、天然のｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３プロモーターの中の１つの部位に結合する、予め定義されたビルディングブロックから集合させられたポリダクチルタンパク質の効力を試験する。
【０２０４】
所望されるＤＮＡ結合特異性を有するポリダクチルタンパク質を作成するために、現在の研究は、予め定義された亜鉛フィンガードメインの集合に集中しており、これは、Ｇｒｅｉｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ（Ｇｒｅｉｓｍａｎ，Ｈ．Ａ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，６５７−６６１）によって提案された連続的な選択ストラテジーとは対照的である。このようなストラテジーには、個々の必要なタンパク質について６個の亜鉛フィンガーライブラリーの連続的な作成および選択が必要であり、そのためにこの実験アプローチを、ほとんどの研究室は利用できず、誰にとっても極めて時間のかかることとなっている。さらに、このストラテジーにおいて別の配列への結合に対して特異的なネガティブ選択を適用することは難しいので、最近報告されたように、比較的非特異性であるタンパク質が生じる可能性がある。（Ｋｉｍ，Ｊ．−Ｓ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２９７９５−２９８００）。
【０２０５】
１８ｂｐのＤＮＡ配列を認識する３フィンガーのタンパク質を作成するための２つの異なるストラテジーの一般的な有用性を研究する。個々のストラテジーは、亜鉛フィンガードメインのモジュールの性質に基づき、５’−（ＮＮＮ）−３’のトリプレットを認識する亜鉛フィンガードメインのファミリーを利用する。ｅｒｂＢ−２またはｅｒｂＢ−３標的部位の半分の部位を認識する３個の６フィンガータンパク質を、ＰＣＲ集合ストラテジーを使用して、予め定義されたフィンガー２（Ｆ２）ドメイン変異体を一緒に融合させることによって、第１のストラテジーにおいて作成する。
【０２０６】
その標的に対する個々のタンパク質の親和性を、電気泳動の移動度のシフトアッセイによって決定する。これらの実験は、亜鉛フィンガーペプチドが、Ｚｉｆ２６８および他の天然の転写因子に匹敵する親和性を有することを示すと予想される。
【０２０７】
ＤＮＡ標的部位に対する個々のタンパク質の親和性を、ゲルシフト分析によって決定する。
【０２０８】
（実施例１１）
コンピューターによるモデル化
（期待される実施例）
コンピューターモデルを、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を使用して作成する。モデルは、Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡの共晶構造の座標に基づく（ＰＤＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  １ＡＡＹ）。構造は最小化されたエネルギー状態ではなく、相互作用の可能性を示唆するために示されるにすぎない。水素結合は、重原子の間の距離が３（±０．３）Åである場合がふさわしいと考えられ、そして重原子と水素によって形成される角度は１２０℃以上である。
【０２０９】
（実施例１２）
ＴＮＮ配列に特異的に結合し、ＨＩＶ−１の高度に保存されているプライマー結合部位を標的化する亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインが組み込まれている人工的な転写因子の構築
ＡＩＤＳは、最近数十年間で世界的流行病となったウイルスによる免疫系の疾患である。この疾患に関係しているウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）はＣＤ４Ｔ細胞に感染し、そして感染した細胞の潜伏しているプールを確立する。ＡＩＤＳについての現在の治療には、強力な抗レトロウイルス療法（ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＨＡＡＲＴ））と呼ばれる多剤混合物（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）の使用が含まれる。ＨＡＡＲＴは、この疾患の強力な治療法であることが証明されているが、このアプローチには有意な欠点があり、これには、毒性、多数の副作用、そして、さらに重要なものとしては、混合物の効果を逃してしまうウイルスの変異が含まれる（２１）。さらに、ＨＡＡＲＴの直後に、最初はウイルス負荷が減少するにもかかわらず、潜伏している感染した細胞のレザーバーは依然として患者の血液中に留まり、そしてウイルスは薬物の使用中止後に迅速に再活性化される（４８）。したがって、新しい方法が、変異により治療を回避するＨＩＶの能力を防ぐために、また、潜伏している感染した細胞が患者のウイルス力価を再び満たすことを防ぐためにも、開発される必要がある。ＨＩＶ−１は高い変異率を有するが、ウイルスゲノムの中の特定の配列は、ウイルスの適切な複製のために保存されていなければならず、そして新しい治療方法の開発のためのこれらの配列の標的化が多くの研究者の目的である。
【０２１０】
ウイルスの生活環は、ウイルスおよび宿主因子の両方が必要である多数の工程から構成されている。これらの工程のうちのいずれか１つが遮られると、ウイルスの生産を阻害するための実行可能な手段が提供されるであろう。ＨＩＶ−１の生活環の１つの特に十分に研究されている工程は、組み込まれたウイルスゲノムからのＲＮＡの転写である。ＨＩＶ−１の５’長末端反復（ＬＴＲ）には、多数の宿主転写因子（Ｓｐ１、Ｎｆ−κＢ、およびＬｅｆ−１が含まれる）の結合部位が含まれる（４３）。これらの因子の結合は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写の開始を媒介し、発生期の転写物上のトランス活性化応答エレメントに対するＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質の結合は、宿主タンパク質のポジティブ転写伸張因子ｂの動員により伸張を刺激する（３７）。多数のストラテジーが、標的ＨＩＶ−１転写物を標的化するために使用されており、これには、リボザイム（１９、５９）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（２）、およびさらに最近は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（８、２５、２６）が含まれる。これらのアプローチの１つの欠点は、これらが標的ｍＲＮＡに対して設計されることであり、したがって、標的の複数のコピーが不活化されなければならない。高度に発現したｍＲＮＡは、ほとんどのウイルス転写物がそうであるように、完全に抑制することは難しい。したがって、より効果的なストラテジーは、ＤＮＡレベルで転写を標的化することであり、なぜなら、１つのＤＮＡプロウイルスだけに、ウイルスの生産を阻害するために結合されればよいからである。
【０２１１】
Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガー（ＺＦ）モチーフは、後生動物において最も遍在するＤＮＡ結合モチーフである。１つの亜鉛フィンガーは、亜鉛イオンによって配位されて折り畳まれた１つのββαから構成されている。α−ヘリックスの中の残基は、３個のヌクレオチドと特異的に接触する。以前の研究によって、６４種類のメンバーのトリプレットのアルファベットのうち、５’−（Ｇ／Ａ／Ｃ）ＮＮ−３’サブセットを認識するドメインの特定に至っている（１６、１７、４９）。加えて、５’−ＴＮＮ−３’ファミリーの配列を認識する多くのドメインを本出願において開示した。亜鉛フィンガーモチーフのモジュール性により、ゲノム中の特有の部位に結合する可能性があるポリダクチル転写因子の構築が可能である。転写活性化因子（例えば、Ｖ１６トランス活性化ドメイン（４７））またはリプレッサー（例えば、Ｋｒuｐｐｅｌ会合ボックス（Ｋｒuｐｐｅｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｏｘ（ＫＲＡＢ））ドメイン（３８）を加えることにより、目的の遺伝子の強力なアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションが可能である（３−５、３４）。このような人工的な転写因子は、多くの様々な動物細胞および植物細胞の中で多数の内因性の遺伝子を調節することが示されている（３、２２、２３、２８、５３、６１）。
【０２１２】
本発明者らは、以前に、ＨＩＶ−１の５’ＬＴＲを調節するために人工的な亜鉛フィンガー転写因子を使用した（５０）。ＨＬＴＲ３と指定した試験したタンパク質のうちの１つは、一時的なトランスフェクション後にＨＩＶ−１の転写を効率よく阻害し、そして転写因子を安定に発現する細胞株および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の中でのウイルスの複製を阻害する。ＨＬＴＲ３は、２つのＳｐ１結合部位が重複しているＨＩＶ−１  ＬＴＲの中の１つの部位に結合する。他の研究によってもまた、ＺＦ転写因子でこの領域が標的化された（３０、４５）。この配列は、Ｂクレードの中では十分に保存されているが、この領域は、いくつかの他のクレードの中では有意な配列のバリエーションを示す（２７）。したがって、本発明者らは、全てのクレードの間で十分に保存されているＬＴＲの中の配列を標的化することを考えた。ｔＲＮＡプライマー結合部位（ＰＢＳ）は、ＨＩＶ−１ゲノムの中の最も高度に保存されている部位である。ヒトｔＲＮＡＬｙｓ３はＰＢＳに結合し、そして逆転写のためのプライマーとして使用されている（３６、３９）。ＰＢＳは、複数のクレードの間で完全に保存されており（１４）、そしてＰＢＳへの変異は、ウイルスの生産および感染性にネガティブな影響を与える（４２、４６）。ＰＢＳに隣接している配列もまた高度に保存されている。さらに、ＰＢＳは、ＤＮａｓｅ  Ｉおよびミクロコッカスヌクレアーゼ消化に接近しやすい、ヌクレオソームが含まれていない配列の中の、ＬＴＲの３’末端に存在している（５４）。したがって、この部位に対して標的化させられたＺＦタンパク質は、結合し、転写を調節するはずである。
【０２１３】
この研究では、いくつかのＺＦタンパク質を、ＨＩＶ−１  ＰＢＳの中の配列と隣接配列に結合するように設計し、ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合させた。これらの転写因子を、レポーターアッセイにおいてはＬＴＲの転写を抑制するそれらの能力について、そしてＰＢＭＣの感染後のウイルスの生産を阻害するそれらの能力について試験した。最後に、エスケープアッセイ（ｅｓｃａｐｅ  ａｓｓａｙ）を、ＺＦに対する長期間の暴露によって、リプレッサーの有効性を低下させ得るウイルスの変異が誘導されるかどうかを決定するために行った。本発明者らの結果は、ＨＩＶ−１  ＰＢＳを標的化する転写リプレッサーが、ＨＩＶ−１疾患の新しい治療薬である可能性があることを示唆している。
【０２１４】
材料および方法
カスタムＤＮＡ結合タンパク質の構築
６個の亜鉛フィンガードメインを含むＤＮＡ結合タンパク質を、Ｓｐ１Ｃ亜鉛フィンガー足場上に、以前に記載されている方法およびドメインを使用して集合させた（４、１６、１８、４９）。簡単に説明すると、重複しているＰＣＲプライマーを、特有の３ｂｐの部位に結合することが予め決定されている亜鉛フィンガードメインをコードするように設計した。３フィンガータンパク質を、オーバーラップＰＣＲによって集合させ、その後、Ａｇｅｌ／Ｘｍａｌ連結によって６フィンガータンパク質へと集合させた。最近、本発明者らは、亜鉛フィンガータンパク質を自動的に設計することができる、Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｔｏｏｌｓと呼ばれるウェブをベースとするプログラムを発表した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｍｂＴｈａｒｂａｓ／ｚｆｄｅｓｉｇｎＪｚｆｄｅｓｉｇｎｈｏｍｅ．ｐｈｐ）。インビトロでの特性決定のために、構築物を原核生物発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングした。マルトース結合タンパク質との融合体を発現させ、タンパク質の融合および精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）システム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて精製した。電気泳動の移動度のシフトアッセイは、以前に記載した通りに行った（４、４９）。
【０２１５】
エフェクタープラスミドおよびレポータープラスミド
６フィンガータンパク質であるＰＢＳ１、ＰＢＳ１ａ、ＰＢＳ２、およびＰＢＳ３を、上記に記載した通りに、ＫＲＡＢ抑制ドメインを含むｐｃＤＮＡをベースとするエフェクタープラスミドにクローニングした（４）。４個の６フィンガータンパク質もまた、ｐＭＸ  ＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３およびｐＳＩＮ−ＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３（５０）をＳｆ１で消化し、その後、ｐＭａｌ−ｃ２ベクターに由来するＳｆ１で消化した４個の６フィンガータンパク質のそれぞれを、ｐＭＸレトロウイルスベクターおよびｐＳＩＮレンチウイルスベクターと連結させることによって、ｐＭＸレトロウイルスベクターおよびｐＳＩＮレンチウイルスベクターにクローニングした。ＨＩＶ−１  ＬＴＲレポーターであるＬＴＲ６５８−ｌｕｃを、正方向プライマー５’−ＧＡＴＡＣＧＡＣＡＧＣＴＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣ−３’（配列番号４２６）と逆方向プライマー５’−ＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣ−３’（配列番号４２７）を使用して、プラスミドｐＩＩＩｅｎｖ３−１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ［ＮＡＲＲＲＰ］）（５２）からＰＣＲによってＨＩＶ  ＬＴＲを増幅させることにより構築した。ＰＣＲ産物をＮｈｅｌとＸｈｏｌで消化し、そして予めＮｈｅｌとＸｈｏｌで消化しておいたｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結させた。シミアンウイルス４０（５Ｖ４０）プロモーターによって駆動されるｐＧＬ３プロモーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）をネガティブ対照として使用した。細胞培養物および一時的なトランスフェクションアッセイ。ＨｅＬａ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、ＴＺＭ−ｂｌ細胞（ＮＡＲＲＲＰ）（１５、４４、６０）、およびＧａｇ−Ｐｏｌ  ２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン−ストレプトマイシン−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ））の中で、３７℃、そして５％ＣＯ２で維持した。一時的なトランスフェクションアッセイのために、およそ５×１０４個の細胞を２４ウェルプレートに、４０から６０％の細胞集密度で播種した。ＨｅＬａ細胞を、１０ｎｇのレポータープラスミド、７５ｎｇのＴａｔ発現プラスミドｐＳＶ２ｔａｔ７２（ＮＡＲＲＲＰ）（２０）、１００ｎｇのエフェクタープラスミド、および１００ｎｇのＣＭＶ−ｌａｃＺプラスミドで、リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。ＴＺＭ−ｂｌ細胞は、レポータープラスミドを使用しなかったことを除き同様にトランスフェクトし、５０ｎｇのタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ＣＭＶ−ｌａｃＺの代わりにトランスフェクトした。細胞抽出物をトランスフェクションの約４８時間後に調製した。ルシフェラーゼ活性と３−ガラクトシダーゼ活性を、それぞれ、ＰｒｏｍｅｇａとＴｒｏｐｉｘによるアッセイ試薬キットを使用して、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９６Ｐ照度計（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）において測定した。ルシフェラーゼ活性は、ＨｅＬａ細胞の中の３−ガラクトシダーゼ活性と、ＴＺＭ−ｂｌ細胞中のタケルシフェラーゼ活性に対して較正した。Ｚｆタンパク質の発現、および一時的にトランスフェクトされたプラスミドをベースとするＨＩＶの発現の阻害の決定は、以前に記載した通りに行った（５０）。
【０２１６】
ＺＦタンパク質のレトロウイルスによる送達とクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
ＫＲＡＢ−ＰＢＳタンパク質のＴＺＭ−ｂｌ細胞の中へのレトロウイルス形質導入を、モロニーマウス白血病ウイルスをベースとするｐＭＸベクターを使用して、原則として以前に記載した通りに行った（３５）。形質導入効率を、亜鉛フィンガー発現カセットの中の内部リボソーム侵入部位から発現された緑色蛍光タンパク質のフローサイトメトリー分析によってモニターした（データは示さない）。およそ１０７個の感染細胞を１％のホルムアルデヒドで架橋し、クロマチンを以前に記載した通りに調製した（７）。クロマチンを１ｕｇのＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０μｌのＺＦ抗体（３５）、または抗体を用いることなく免疫沈降させた。免疫沈降したクロマチンを十分に洗浄し、ＤＮＡを以前に記載した通りに精製した。免疫沈降したＤＮＡ、ならびに、抗体を含まない試料から採取した投入ＤＮＡの全量の２０％の１：１００希釈物を、ＨＩＶ−１  ＬＴＲプライマー５’−ＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４２８）と５’−ＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧ−３’（配列番号４２９）を使用して、３０から３５サイクルのＰＣＲによって増幅させた。
【０２１７】
ｔＲＮＡ発現のノーザンブロット分析。
【０２１８】
ＨｅＬａ細胞を、１０ｃｍの皿の上に２×１０６細胞の密度でプレートし、細胞を、示したＫＲＡＢ−ＺＦを発現する４μｇのプラスミド、またはネガティブ対照としての空のプラスミドでトランスフェクトした。４８時間後、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離した。全部で６０μｇのＲＮＡを１５％のＴｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ−尿素ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、ＸＣｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓメンブレン（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に、製造業者の説明書にしたがって移動させた。メンブレンのプレハイブリダイゼーションを、５ｍｌのＲａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の中で、４２℃で１５分間行った。その後、メンブレンを１０６から１０７ｃｐｍの３２Ｐで末端標識したｔＲＮＡプローブと、４２℃で１から２時間ハイブリダイズさせた。ブロットを、０．１％のＳＤＳ−０．１ｘＳＳＣ（１５ｍＭのＮａＣｌと１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）中で、４２℃で１５ｍｍで２回洗浄し、その後、蛍光スクリーン上で２４から４８時間感光させた。これをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓホスホリメージャーで現像した。ｔＲＮＡＬｙｓ３プローブの配列は５’−ＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣ−３’（配列番号４３０）であり、ｔＲＮＡＰｈｅプローブは５’−ＴＧＣＣＧＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡ−３’（配列番号４３１）である。
【０２１９】
レンチウイルスの生産と送達、およびＰＭＢＣのＨＩＶ−１感染
レンチウイルスの生産、滴定、ＰＢＭＣへの形質導入、そしてその後のＨＩＶ−１でのチャレンジを、以前に記載した通りに（５０）、自己不活化レンチウイルスベクターシステムを用いて行った。ＰＢＳ亜鉛フィンガーに対して耐性であるＨＩＶ−１クローンのインビトロでの選択を、Ｋｅｕｌｅｎら（２９）によって記載された通りに行った。簡単に説明すると、選択は、野生型ＮＬ４−３（０．０２の感染多重度［ＭＯＩ］）でのＳｕｐＴ１細胞の感染によって開始した。３７℃で１時間の後、培養物を分け、細胞に１または１０のＭＯＩで個々の亜鉛フィンガーリプレッサーを形質導入した。形質導入しなかった細胞のアッセイを、阻害性の亜鉛フィンガーが存在しない条件下でのウイルスの複製および細胞増殖のレベルを決定するために使用した。細胞に、５日目に２回目の形質導入を行った。５日目の２回目の形質導入の後、培養物の半分を、Ｋｅｕｌｅｎら（２９）によって記載されている通りに（２９）、限界稀釈による９６ウェルプレートの中での滴定に使用した。１週間後、個々のウェルからの試料を、細胞増殖とウイルスの複製を最適化させるために２４ウェルプレートに移した。細胞を含まない上清と細胞を、大きなシンチウムが観察された時点で個々のウェルから回収した。細胞の遺伝子型分析を、ＰＢＳ領域に重複するプライマーを用いて行った。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、個々のクローンを配列決定した。２から３週間の培養後、亜鉛フィンガーを発現しない細胞の中でのウイルスの複製との比較によって、２０個のウェルをポジティブと考えた。ポジティブではないウェルは、１０のＭＯＩで形質導入した細胞の滴定後に得られた。野生型ウイルスは、１のＭＯＩで形質導入したいくつかのウェルの中で複製することができた。したがって、インビトロで選択したウイルスを、１のＭＯＩでＳＩＮ−ＰＢＳＢを先に形質導入した新しいＳｕｐＴ１細胞上で継代させた。１０個の試料が１のＭＯＩで最適に複製することができた。これらの１０個のウイルスの配列分析により、ＰＢＳ部位の中のＧからＡへの変異の存在が明らかになった。
【０２２０】
結果
プライマー結合部位亜鉛フィンガータンパク質の設計、発現、および分析
ＨＩＶ−１  ＰＢＳに結合するように４種類の亜鉛フィンガータンパク質を構築した（図７；表１３）。図７は、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ上のＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質の結合部位を示している図である。示した配列は、ＨＸＢ２参照株に由来する。タンパク質のうちの３種類は、ＰＢＳのすぐ上流、またはＰＢＳの中の１８ヌクレオチドの配列に結合するように設計した。タンパク質のうちの１つであるＰＢＳ１ａは、７ｂｐ離れた、２つの隣接していない９ｂｐの部位に結合するように設計した。これは、長いリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧＥＫＰ）（配列番号４２２）によって間隔を空けられた２つの３フィンガードメインから構成されている。ＨＩＶ−１の転写を調節するそれらの能力の最初の評価として、ＰＢＳに対するＺＦのそれぞれの結合定数を決定した。タンパク質を発現させ、マルトース結合タンパク質融合体として精製し、その後、以前に記載した通りに（５０）マルチ標的酵素結合免疫吸着アッセイと電気泳動の移動度のシフトアッセイ（ＥＭＳＡＳ）において、ＰＢＳ配列を含むオリゴヌクレオチドヘアピンに結合する能力について試験した。それらの標的に対するタンパク質ＰＢＳ１、ＰＢＳ１ａ、ＰＢＳ２、およびＰＢＳ３の平衡解離定数（ＫＤ）値は、ＥＭＳＡによって決定すると、それぞれ、０．７９、１．２５、２．４、および０．９３ｎＭであった（図８Ａ）。図８は、ＰＢＳ亜鉛フィンガー結合定数と、一時トランスフェクションアッセイにおけるＨＩＶ−１  ＬＴＲの阻害を示す。（Ａ）ＰＢＳ亜鉛フィンガーのゲルシフト。ＰＢＳ配列を含む３２Ｐで標識したＤＮＡヘアピンオリゴヌクレオチドを、タンパク質の量を減少させながらインキュベートした。遊離のＤＮＡと結合したＤＮＡの密度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量し、そしてそれぞれのタンパク質についてＫＤを計算した。（Ｂ）ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合させたＰＢＳタンパク質の抑制と比較した一時レポーターアッセイ。左のグラフは、ＨＩＶ−１  ＬＴＲによって駆動されるルシフェラーゼレポーターとＴａｔタンパク質を発現するプラスミドでのＫＲＡＢ−亜鉛フィンガータンパク質のトランスフェクションによる結果を示す。右のグラフは、ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターでのＫＲＡＢ−亜鉛フィンガータンパク質の対照のトランスフェクションを示す。（Ｃ）ＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質のタンパク質発現レベル。細胞を、パネル（Ｂ）と同様に亜鉛フィンガータンパク質で一時的にトランスフェクションし、細胞抽出物を調製した。タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離させ、ポリ二フッ化ビニリデンメンブレンに移動させた。ブロットを、亜鉛フィンガータンパク質上のＨＡタグを認識する抗体、またはβ−アクチン抗体でプローブした。相対的なタンパク質の発現を、個々の試料中のβ−アクチンの発現に対して亜鉛フィンガーの発現を較正することによって計算した。
【０２２１】
【表１３】
2009520463.tif 000028
ＺＦヘリックスについての配列番号は、Ｆ１からＦ６である：それぞれ、ＰＢＳ１については：配列番号４５３、４５２、４５１、４５０、４６、および４４９；ＰＢＳ１ａについては：配列番号４５３、４５２、４５１、４４９、１４、および４５２；ＰＢＳ２については：配列番号４５６、４５５、４５４、４５３、４５２、および４５１；そしてＰＢＳ３については：配列番号４６０、４５９、４５８、４５７、４５４、および１４。標的部位についての配列番号は：ＰＢＳ１、ＰＢｓ１ａ、ＰＢＳ２、およびＰＢＳ３について、それぞれ、配列番号４３３、４３４、４３５、および４３６である。
【０２２２】
転写の抑制を可能にするために、ＺＦタンパク質をＫＲＡＢドメインに融合させた。その後、タンパク質をＨＩＶ−１  ＬＴＲによって駆動されるルシフェラーゼレポーターＬＴＲ６５８−ｌｕｃ、およびＴａｔタンパク質を発現する構築物とともにＨｅＬａ細胞の中で発現させた。ネガティブ対照として、ＨＩＶ−１  ＬＴＲには結合しないが、その標的配列を含むレポーターを調節することにおいて機能する６フィンガータンパク質ＫＲＡＢ−Ａａｒｔもまた試験した。ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１ａ、およびＫＲＡＢ−ＰＢＳ２は、それぞれ、２０倍、９．５倍、および２８倍のレポーターの発現を抑制した。有意な抑制は、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３については観察されなかった。予想した通り、ＫＲＡＢ−Ａａｒｔは、レポーターを抑制することはなかった。加えて、抑制ドメインが付加されて発現されたＰＢＳ亜鉛フィンガーはいずれも、ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターの発現を変化させることはなかった（図８Ｂ）。最後に、これらの観察がタンパク質の発現の差が原因ではないことを確認するために、ウェスタンブロット分析を行った。ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２およびＫＲＡＢ−ＰＢＳ３は、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１およびＫＲＡＢ−ＰＢＳ１ａよりも約２倍高いレベルで発現されていた（図８Ｃ）。
【０２２３】
ＰＢＳ  ＺＦによるクロマチンの中でのＨＩＶ−１  ＬＴＲ発現の抑制
一時的なトランスフェクションにおいては、レポータープラスミドは染色体遺伝子と同じ様式でクロマチンの中にはパッケージされておらず、結果、一時アッセイで見られた調節は、ゲノム標的を用いた場合には観察されないであろう。これは、哺乳動物のゲノムに組み込まれたレポーターを抑制する、ＰＢＳに結合するＺＦタンパク質の能力を試験するためのより関連するアッセイである。したがって、ＰＢＳ  ＺＦおよびＴａｔの一時的なトランスフェクションを、レンチウイルスをベースとするルシフェラーゼレポーターと３−ガラクトシダーゼレポーターのコピーが組み込まれているＨｅＬａ誘導体であるＴＺＭ−ｂｌ細胞株の中で繰り返した（図９Ａ、上部）。図９は、染色体に組み込まれたＨＩＶ−１  ＬＴＲレポーター上のＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質の抑制とインビボでの結合を示す。（Ａ）ＫＲＡＢ−ＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質とＴＡｔを、ルシフェラーゼおよびｌａｃＺ遺伝子の発現を駆動するＨＩＶ構築物が染色体に組み込まれているＨｅＬａ細胞株であるＴＺＭ−ｂｌ細胞株の中で一時的に発現させた。（Ｂ）亜鉛フィンガータンパク質に結合したＨＩＶ−１  ＬＴＲのクロマチン免疫沈降。亜鉛フィンガータンパク質をＴＺＭ−ｂｌ細胞株の中でのレトロウイルス形質導入によって発現させた。細胞を、ホルムアルデヒドで架橋し、核抽出物を調製した。抽出物をＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）またはＳｐ１コンセンサス亜鉛フィンガー（Ｓｐ１Ｃ）を認識する抗体とともにインキュベートし、Ｓｔａｐｈ  Ａ細胞と共に沈殿させた。免疫沈降したＤＮＡを精製し、ＬＴＲに特異的なプライマーを使用して、ＨＩＶ−１  ＬＴＲの存在についてＰＣＲによって分析した。（Ｃ）ｔＲＮＡＬｙｓ３のノーザンブロット。ＨｅＬａ細胞を、示したＫＲＡＢ−ＺＦタンパク質でトランスフェクトし、全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲルによって分離させ、膜に移動させた。これを、ｔＲＮＡＬｙｓ３およびｔＲＮＡＰｈｅについて放射性標識オリゴヌクレオチドでプローブした。それぞれのレーンの下の数字は、ｔＲＮＡＰｈｅに対して較正した後の、ｔＲＮＡＬｙｓ３の相対的な発現を示す。ＨＩＶ−１  ＬＴＲの抑制を、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１ａ、およびＫＲＡＢ−ＰＢＳ２の存在下で観察したが、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３およびＫＲＡＢ−Ａａｒｔは、レポーターを一時的にトランスフェクトした場合に観察されたように、抑制は示さなかった（図９Ａ）。ＺＦは一時アッセイにおいて観察されたレベルと同様のレベルで、染色体に組み込まれたレポーターを抑制した。ルシフェラーゼレポーターは、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１によっては７倍、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１ａによっては１５倍、そしてＫＲＡＢ−ＰＢＳ２によっては２０倍抑制された。同様のレベルの抑制は、３−ガラクトシダーゼレポーターについても観察された。
【０２２４】
ＰＢＳ  ＺＦがＨＩＶ−ＬＴＲに結合したことを確認するために、ＣｈＩＰアッセイを、ＴＺＭ−ｂｌ細胞を用いて行った。ＰＢＳ  ＺＦを、レトロウイルス感染によってＴＺＭ−ｂｌ細胞の中で発現させた。細胞をホルムアルデヒドで架橋し、クロマチンを超音波処理し、そして核から単離した。ＤＮＡに結合したＺＦを、亜鉛フィンガー骨格を認識する抗体を用いて免疫沈降させ、免疫沈降したＤＮＡを、ＨＩＶ−１  ＬＴＲに特異的なプライマーを使用してＰＣＲによって分析した。クロマチンを、ポジティブ対照としてのＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体で免疫沈降させた。レポーターアッセイと一致して、本発明者らは、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１ａ、およびＫＲＡＢ−ＰＢＳ２はＨＩＶ−１  ＬＴＲに結合し、一方、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３はインビボではＬＴＲに結合しなかったことを発見した（図９Ｂ）。プライマー結合部位がｔＲＮＡＬｙｓ３に相補的であるので、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３がｔＲＮＡＬｙｓ３遺伝子に、そしてＨＩＶ  ＬＴＲに結合でき、ｔＲＮＡの発現を抑制できることが可能である。なぜなら、ＫＲＡＢドメインはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写に影響を与えることが示されているからである（４１、５１）。この可能性を試験するために、ノーザンブロットを、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３、またはＫＲＡＢ−Ａａｒｔの存在下でのｔＲＮＡＬｙｓ３のレベルを測定するために行った。ｔＲＮＡＰｈｅの較正を行った後、本発明者は、いずれのＺＦによってもｔＲＮＡＬｙｓ３レベルに対しては有意な影響がないことを明らかにした（図９Ｃ）。
【０２２５】
ＰＢＳ  ＺＦによるＨＩＶ−１ウイルスの生産の阻害
感染の条件下でＨＩＶ−１ウイルスの生産を阻害するＰＢＳ  ＺＦの能力の事前の試験として、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ発現プラスミドをそれぞれ、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３ゲノムをコードするプラスミドと共に同時トランスフェクトした。４８時間後、ウイルス生産の有意な阻害が、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１を発現する細胞（７５％）およびＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を発現する細胞（約９０％）において見られたが、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１ａとＫＲＡＢ−ＰＢＳ３は、ウイルスの生産を＜５０％しか阻害しなかった（図１０）。図１０はＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質のウイルス生産の一時的な阻害を示しているグラフである。示したＫＲＡＢ−ＰＢＳ亜鉛フィンガーを発現するプラスミドと、ＨＩＶ−１のＮＬ４−３株のゲノムを、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。ウイルスの生産をｐ２４  ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【０２２６】
本発明者らは、次に、転写因子が、より生理学的な設定においてもウイルスの生産を阻害できるかどうかを研究した。したがって、本発明者らは、ＨＩＶ−１に感染させた初代Ｔ細胞の中でのウイルスの複製に対するＰＢＳ  ＺＦの効果を分析した。ＰＢＭＣに、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ転写因子を発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。ＺＦのＣ末端ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを認識する抗体を使用してフローサイトメトリー分析を行って、形質導入の効率を決定した：ＰＢＭＣによって発現されたＺＦのおよそ２０から３０％（図１１Ａ）。図１１は、初代細胞の中でのＰＢＳ亜鉛フィンガーによるＨＩＶウイルスの生産の阻害を示す。（Ａ）ＰＢＭＣの中での亜鉛フィンガーの発現のフローサイトメトリー分析。ＰＢＭＣに、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質を発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。細胞を固定し、ＺＦのＣ末端ＨＡタグを認識する抗体で染色し、そして亜鉛フィンガーの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。右側のパネルは、ＣＤ４およびＨＡ抗体について染色したＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を形質導入した細胞のフローサイトメトリー分析を示す。（Ｂ）ＰＢＭＣに、示したＫＲＡＢ−ＰＢＳレンチウイルスベクターを形質導入し、その後、０．１のＭＯＩで、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３による感染でチャレンジした。ｐ２４レベルを、感染の３日、７日、１２日、および１８日後にモニターした。本発明者らはフローサイトメトリー分析を行った。ここで、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を形質導入した細胞を、ＨＡ抗体に加えてＣＤ４抗体でも染色した。これは、形質導入した細胞のおよそ３分の２がＣＤ４を発現しており、したがって、ＨＩＶ−１許容細胞であることを示していた（図１１Ａ）。これらの結果は、末梢血単核細胞の形質導入における本発明者らの以前の結果と一致していた（５０）。形質導入した細胞をＨＩＶ−１でチャレンジし、ウイルスの生産をｐ２４の定量によってモニターした。４種類のＰＢＳに結合する転写因子のうち、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２だけが、ウイルスの生産を阻害することができた。ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を形質導入した細胞においては、形質導入しなかった細胞についてのウイルスの生産と比較して、ウイルスの生産の＞９０％の減少が観察された（図１１Ｂ）。ウイルスの生産の減少が、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２の過剰発現が原因で生じる細胞傷害性の理由にはよらないことを確認するために、細胞の生存性を、ＨＩＶ−１感染後の様々な時点で測定した。全ての試料が、測定した全ての時点で同様の生存性を有することが明らかになった（図１２）。図１２は、亜鉛フィンガー（ＺＦ）タンパク質でのＰＢＭＣの形質導入によっては細胞の生存性には影響がないことを示しているグラフである。示したＺＦ転写因子を形質導入したＰＢＭＣ、または形質導入しなかった細胞を、ＨＩＶ−１でチャレンジした。示した時点で、細胞の生存性をＷＳＴ−１アッセイによって決定した。
【０２２７】
本発明者らは、これまでに、ＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３（ＨＩＶ−１  ＬＴＲの中のＳｐ１部位に結合するように設計されたタンパク質）がウイルスの複製を効率よく阻害することを見出した。ＨＬＴＲ３  ＺＦタンパク質を、ＨＩＶ−１のＢサブタイプ（米国および欧州で優勢なウイルス株であり、ほとんどの研究において使用されているウイルスである）のＬＴＲに結合するように設計した。しかし、ＬＴＲのこの領域の配列は、サブタイプの間で変化した。多数のサブタイプについてのＨＬＴＲ−３結合部位のＤｅ  Ｂａａｒら、（１４）による配列の試験は、ＨＬＴＲ−３結合配列の中に数個の相違が存在することを示しており、これは、ＫＲＡＢ−ＨＴＬＲ３がこれらのウイルスの複製を阻害できるであろうことを示唆している（図１３Ａ）。図１３は、Ｆ−サブタイプのＬＴＲに対するＫＲＡＢ−ＨＬＴ１の有効性の低下を示しているグラフである。（Ａ）様々なＨＩＶ−１  Ｍグループサブタイプの中のＨＬＴＲ３とＰＢＳ２  ＺＦ結合部位の配列比較。点線は配列同一性を示し、点は欠失を示す。（Ｂ）ＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３（左）またはＫＲＡＢ−ＰＢＳ２（右）のいずれかを形質導入したＰＢＭＣを、野生型またはＦサブタイプのＬＴＲのいずれかを含むＢサブタイプのウイルスでチャレンジした。ウイルスの複製をｐ２４の生産を測定することによってモニターした。しかし、ＦサブタイプのＨＬＴＲ３配列はＢサブタイプとは大きく異なり、ＢサブタイプのＨＬＴＲ３標的配列とは、１８個のうちの９個のヌクレオチドが異なっていた。対照的に、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２の標的部位の配列は、分析した複数のサブタイプについて同じであった。ＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３の、ＦサブタイプＬＴＲを調節する能力を試験するために、ＦサブタイプウイルスのＵ３配列で置き換えたＬＴＲのＵ３領域を有するＢサブタイプのウイルスを使用した。ＰＢＭＣにＫＲＡＩ３−ＨＬＴＲ３を形質導入し、その後、キメラウイルスでチャレンジした。予想した通り、ＦサブタイプＬＴＲウイルスの生産を阻害するＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３の能力は、野生型ウイルスと比較すると大幅に低下した（図１３Ｂ）。予想した通り、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２はキメラウイルスとＢサブタイプウイルスの複製を同じ程度阻害した。なぜなら、試験したウイルスにはいずれにも、Ｂサブタイプに由来するＰＢＳが含まれるからである。しかし、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２結合部位の配列は、ＦサブタイプとＢサブタイプにおいては同じであり、その結果ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２がＦサブタイプウイルスを阻害することができるであろうと予想した。したがって、抗ＨＩＶ−１治療薬としてのＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３の使用の可能性には限界があるが、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２は、任意の公知のＨＩＶ−１株を処置するために使用できる可能性がある。
【０２２８】
ＡＩＤＳ治療の主要な問題点は、迅速に変異してしまうＨＩＶの能力であり、治療薬に対する耐性が生じることである。本発明者らは、転写因子についての標的部位としてプライマー結合部位を選択した。なぜなら、これは、公知の全てのＨＩＶ−１サブタイプにおいて保存されており、このことは、この配列がウイルスの複製について不変であることを示唆している。実際、多くの研究により、ＰＢＳへの変異によってウイルスの生産速度の低下が生じることが示されている。ＰＢＳに結合するように本発明者らが設計した４種類のＺＦ転写因子のうち、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２は、ウイルスの転写と複製を最も効率よく抑制した。本発明者らは、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２に対するＨＩＶ−１の暴露の繰り返しによって、ウイルスが調節を回避できるような変異を生じ得るかどうかを決定したいと考えた。ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を形質導入したＰＢＭＣをＨＩＶ−１のＮＬ４−３株に感染させ、生産されたウイルスを回収し、これを使用してＫＲＡＢ−ＰＢＳ２が形質導入されたＰＢＭＣの新しい集団を感染させた。数回の感染後、得られたウイルスをクローニングし、２０個のクローンのプライマー結合部位領域を配列決定した。２０個のクローンのうち、わずかに２個にしか野生型ＰＢＳ配列は含まれていなかった。残りの１８個はＰＢＳの中に１個または２個の変異を有する３種類の配列から構成されていた（図１４Ａ）。図１４は亜鉛フィンガーの抑制に応答するプライマー結合部位の変異を示す。（Ａ）ＰＢＭＣにＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を形質導入し、ＨＩＶ−１に感染させた。ウイルスを上清から回収し、形質導入した細胞の新しい集団を再度感染させるために使用した。数回の後、出力ウイルスをクローニングし、２０個のクローンに由来するプライマー結合部位領域を配列決定した。変異の部位は下線で示す。（Ｂ）ＫＲＡＢ−ＰＢＳを形質導入したＰＢＭＣの、野生型およびＭｕｔ−３  ＨＩＶによる感染。（Ｃ）野生型およびＭｕｔ−３ヘアピンオリゴヌクレオチドを用いたＰＢＳ２のゲルシフト。Ｍｕｔ−３と指定した、配列決定したクローンの半分において生じた変異を有するウイルスクローンをウイルスにパッケージし、ＰＢＳ  ＺＦが形質導入されているＰＢＭＣを感染させるために使用して、このウイルスが設計した転写因子による調節に対して耐性であるかどうかを決定した。野生型ウイルスを用いた場合と同様に、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１ａ、およびＫＲＡＢ−ＰＢＳ３は、Ｍｕｔ−３ウイルスの複製に対しては効果がなかった。ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２はＭｕｔ−３ウイルスの複製を抑制することができたが、野生型ウイルスの抑制よりもはるかに効率が悪かった（図１４Ｂ）。加えて、変異したウイルスは、野生型ＨＩＶ−１よりもはるかに低いウイルスレベルを生じた。これらの結果は、ＰＢＳに対する変異によって、その標的配列に対するＫＲＡＢ−ＰＢＳ２の親和性が低下することを示唆している。これを試験するために、ＥＭＳＡを行って、ＰＢＳ２  ＺＦがＭｕｔ−３配列に結合できるかどうかを決定した。本発明者らは、ＰＢＳ２  ＺＦが、この相互作用の結合定数が計算できないほどに弱く、この配列に結合したことを明らかにした（図１４Ｃ）。したがって、ＰＢＳ領域は、���Ｆによる調節を回避するような変異に対して寛容であり得るが、ウイルスの生産効率が犠牲になることが明らかである。
【０２２９】
考察
ＰＢＳ配列は、特定した全てのＨＩＶ−１サブタイプにおいて同じであり、ＨＩＶ−１の全ての天然の株が、逆転写の開始のためにｔＲＮＡＬｙｓ３を使用する（３１）。変異の効果を試験する研究により、ＰＢＳの配列の変化によりウイルスの複製の減少が生じること、および変異体ウイルスは天然のｔＲＮＡＬｙｓ３プライミング部位へと迅速に戻ることが明らかにされている（４２、４６）。これらの重要な特徴により、保存されているこの領域の性質を利用する治療が期待される。この実験では、本発明者らは、高度に保存されているプライマー結合部位への結合を通じてＨＩＶ−１の転写を調節する人工的な亜鉛フィンガー転写因子を設計し、発現させ、そして特性決定した。本発明者らが試験した４種類のＺＦ転写因子のうち、わずかに１つだけ（ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２）がＲＥＶ−ｉウイルスの生産を阻害することができた。不思議なことに、２つの他のタンパク質（ＫＲＡＢ−ＰＢＳ１およびＫＲＡＢ−ＰＢＳ１ａ）はＣｈＩＰアッセイによって明らかなようにＰＢＳ配列に結合し、一時的なレポーターアッセイにおいてＨＩＶ−１  ＬＴＲを阻害したが、これらは、ＰＢＭＣの中でのウイルスの生産は阻害しなかった。これについての可能性のある説明は、一時的なレポーターと安定なレポーターのいずれを用いたアッセイにおいても、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２は、他の２つのタンパク質よりもわずかに良好なリプレッサーであったことである。したがって、ウイルスの複製の効果的な阻害に必要な転写抑制についてはいくつかの閾値がある可能性があり、試験したＺＦのうち、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２だけがこのレベルに達したのであろう。
【０２３０】
ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３は、本発明者らのアッセイのいずれにおいても、ＨＩＶ−１  ＬＴＲを調節することができず、ゲルシフトアッセイにおいて試験した他のＺＦについてのＫＤ値に匹敵する二本鎖のＤＮＡ結合部位についてのＫＤ値を有するにもかかわらず、ＣｈＩＰアッセイによって示される、核の中のＬＴＲに結合することができなかった。１つの可能性は、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３が、ＨＩＶ−１  ＰＢＳと同じ配列が含まれるｔＲＮＡＬｙｓ３遺伝子に結合することである。核の中にｔＲＮＡ遺伝子の複数のコピーが存在しているので、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３の結合についてＨＩＶゲノムの１つの組み込まれたコピーを完全に打ち負かすと考えることができる。しかし、レポーターの一時的なトランスフェクションにおいては、ＨＩＶ  ＬＴＲの何千ものコピーが核の中に存在しており、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３はＬＴＲからの転写を抑制することがなおもできなかった（図８）。また、ｔＲＮＡＬｙｓ３遺伝子に対するＫＲＡＢ−ＰＢＳ３の直接の結合は試験しなかったが、ｔＲＮＡＬｙｓ３が抑制されていないことがノーザンブロットから見られた（図９）。したがって、細胞環境では、ＬＴＲは、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ３に結合できない立体構造を有する可能性がある。この表現形は、ＨＩＶ−１  ＬＴＲに結合するように設計した他のＺＦ転写因子について観察された。Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、およびＫｉｍら（３０，４５）による研究では、ＬＴＲのＳｐ−１結合部位に対して標的化された複数のポリダクチル転写因子が構築された。いずれの研究においても、タンパク質の大部分は、レポーターアッセイによって試験した場合には調節されていないことを示した。これらの知見は、設計した転写因子の有効性を決定するためには複数のアッセイを使用する必要があることを明らかにしている。願わくば、さらなるＺＦ転写因子が構築され、試験されると、標的部位の選択のためのパラメーターがより明確になるであろう。最近発売されたウェブをベースとするソフトウェアによって、現在は、人工的な亜鉛フィンガー転写因子の自動的な設計が可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｍｂ／ｂａｒｂａｓ／ｚｆｄｅｓｉｇｎ／ｚｆｄｅｓｉｇｎｈｏｍｅ．ｐｈｐ）。
【０２３１】
ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２に対するＨＩＶ−１の長期にわたる暴露によって、リプレッサーの有効性が低下してしまうようなＰＢＳの中での変異が誘導されるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を形質導入した細胞を使用してウイルスを複数回継代することにより、ウイルスの変異を回避するために選択した。本発明者らは、得られたウイルスにはＰＢＳの中に変異が含まれており、そしてＫＲＡＢ−ＰＢＳ２による調節に対してより耐性であることを実際に見出した。しかし、このウイルスはまた、野生型と比較して遅い複製速度論も有していた。本発明者らが試験したウイルス変異体は、ＰＢＳの６番目と７番目のヌクレオチドにＣＣからＧＡへの変異を有していた（図１４Ａ）。ＰＢＳの変異分析は、ＨＩＶ−１  ＰＢＳの最初の６個のヌクレオチドが、マイナス鎖の合成の開始に必要であり、一方、最後の５個のヌクレオチドは、プラス鎖の合成の間の効率のよい鋳型の移動に重要であることを示唆している（９、４６、５７）。１位から６位のヌクレオチドの中のｔＲＮＡＬｙｓ３に相補的であり、ＰＢＳの下流の５ヌクレオチドの挿入に沿った７位から１８位のヌクレオチドの中のｔＲＮＡＰｈｅに相補的なＰＢＳを用いた、複製可能なウイルスを使用した、その後の研究では、それらの複製能力に対する最初の６ヌクレオチドのそれぞれの中に点変異を有するウイルスを試験した。６番目のヌクレオチドに変異を有する２つのウイルスのうち、ＣからＡへの変異を有する変異体は感染性ではなかった。ＣからＵへの変異を有する変異体は感染性であったが、ウイルスの出現は野生型と比較すると遅れた（５６）。本明細書中の本発明者らの観察と一致して、ＰＢＳの６番目のヌクレオチドでのいくつかの変異は、６番目のヌクレオチドで本発明者らが観察したＣからＧへの変異がそうであったように、寛容化される。
【０２３２】
変異したウイルスが生存可能であるようであるという事実は、ウイルスが、逆転写に備えて別のｔＲＮＡを使用できることを示唆している。しかし、データベースの検索では、この新しいＰＢＳの配列と適合するｔＲＮＡは見出せなかった。したがって、ｔＲＮＡＬｙｓ３がプライマーであること、これらの変異は逆転写の間に生じ、そしてこれらは修復される代わりにＫＲＡＢ−ＰＢＳ２による調節を回避するための圧力によって連続して選択される可能性がある。ＰＢＳの変異についてのほとんどの研究においては、選択圧を用いることなく培養された変異したＰＢＳを有するウイルスは、通常、野生型ＰＢＳ配列へと戻った（１１、３３、５８）。しかし、ＨＩＶが様々なｔＲＮＡを使用できるように設計した変異によって安定なクローンが生じた実例がある。具体的には、ｔＲＮＡＬｙｓ１，２、ｔＲＮＡＨｉｓ、およびｔＲＮＡＭｅｔを使用することができるウイルスが単離されている（１  １２、４０、５５）。重要なことは、これらの単離物がＨＴＶ−１の研究室での操作によって得られたことであり、これらの変異体が自然界に存在し得ることを示唆している証拠はない。天然のプライマーのバリエーションだけがｔＲＮＡＬｙｓ５のめったに起こらない使用に関係しており、これによって、ＨＴＶ−サル免疫不全ウイルス単離物の約５％において１ヌクレオチド多形が生じる（１２、１３）。これらの結果は、ＡＩＤＳの治療薬としてＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を使用するための最良のストラテジーが、任意のウイルスが戻るように変異することを可能にし、その後に、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２での処置を再び始めることができる間隔で、処置が中断されることを示唆している。「休止」期間の間に、別の治療法が使用される場合があり、これには、ＨＴＶ−１  ＬＴＲの中の他の部位（例えば、ＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３）を標的化するＺＦタンパク質が含まれるが、これに限定はされない。しかし、本発明者らが単離した変異体ウイルスが、実際に、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２が存在しない条件下で野生型ＰＢＳ配列に戻るかどうかを決定するためにさらなる研究を行う必要がある。
【０２３３】
ＲＮＡｉは、多数の疾患についての可能性のある処置として最近、浮上してきた。具体的には、いくつかの研究が、ＨＩＶ−１を標的化する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を用いて行われており、ウイルス遺伝子の発現の強力なダウンレギュレーションが示されている（８、２５、２６）。残念なことに、長期にわたる研究では、ｓｉＲＮＡに対する長時間の暴露によって、調節を回避することができるウイルスの変異が生じることが示されている（６、１０）。最近、１つの研究により、ＰＢＳを標的化するｓｉＲＮＡがＨＩＶ−１感染を阻害できることが示された（２４）。ＰＢＳの中に変異がないことが、ｓｉＲＮＡに対する暴露の１４日後までに見られたが、本発明者らの研究は、ＨＩＶがＰＢＳ領域を変異させてＲＮＡｉによる標的化を回避できることを示唆している。これは、ｓｉＲＮＡストラテジーの使用における有意な欠点であり得る。なぜなら、１つの点変異が、ＨＩＶがｓｉＲＮＡによる調節を回避するためには十分であり得ることが示されているからである（６）。しかし、ＰＢＳ配列が戻ることを可能にするための上記に示唆されたこのストラテジーは、ＲＮＡ干渉を含む任意の治療にも適用することができる。実際、ＨＩＶ−１の処置におけるＲＮＡ干渉と転写因子の両方の使用は、強力な治療用混合物であることを証明することができた。なぜなら、これらは２つの異なるレベルで作用するからである。このアプローチは、ｖｅｇｆ−ａ遺伝子の調節においてすでに明らかにされており、ここで、人工的な転写因子とｓｉＲＮＡの使用が、別々よりも一緒の場合により大きな抑制を有することが示されている（３２）。
【０２３４】
結論として、この実験の結果により、抗ＨＩＶ治療に使用される可能性がある転写因子として、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を同定した。ＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３と同様に、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２は、長期間にわたり初代リンパ球の中でのウイルスの生産を阻害することができ、これには明らかな毒性は伴わない。有意であるのは、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ２が、ＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３の調節を回避するウイルスの複製を阻害できることである。ＨＩＶ−１の全ての公知のサブタイプにおいて高度に保存されている配列であるＫＲＡＢ−ＰＢＳ２標的と同様に、これは、世界中のあらゆる地域で治療薬として使用される可能性がある。ＨＩＶ−１に対する低分子アプローチによって確立されているように、遺伝子をベースとするアプローチにはまた、ＨＩＶ−１の回避を制限するためのエフェクターの混合物を組み入れることもできる。
【０２３５】
（引用文献）
以下の参考文献は、実施例１２においてそれらの番号の参照により本明細書中に引用される。これらの番号の参照が実施例１２にだけ適用されることに留意されたい。
【０２３６】
【化１５】
2009520463.tif 000029
【０２３７】
【化１６】
2009520463.tif 000030
【０２３８】
【化１７】
2009520463.tif 000031
【０２３９】
【化１８】
2009520463.tif 000032
【０２４０】
【化１９】
2009520463.tif 000033
【０２４１】
【化２０】
2009520463.tif 000034
【０２４２】
【化２１】
2009520463.tif 000035
【０２４３】
【表１４−１】
2009520463.tif 000036
【０２４４】
【表１４−２】
2009520463.tif 000037
【０２４５】
【表１４−３】
2009520463.tif 000038
【０２４６】
【表１４−４】
2009520463.tif 000039
【０２４７】
【表１４−５】
2009520463.tif 000040
【０２４８】
【表１４−６】
2009520463.tif 000041
【０２４９】
【表１４−７】
2009520463.tif 000042
【０２５０】
【表１４−８】
2009520463.tif 000043
【０２５１】
【表１４−９】
2009520463.tif 000044
【０２５２】
【表１４−１０】
2009520463.tif 000045
【０２５３】
【表１４−１１】
2009520463.tif 000046
本発明の利点
本発明により、核酸配列（特に、ＤＮＡ配列）についての多用途の結合タンパク質が提供される。これらの結合タンパク質は、転写調節因子と結合することができ、したがって、特異的な様式での特定の遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに利用することができる。したがって、これらの結合タンパク質は、ガン、自己免疫疾患、代謝性疾患、発育障害、および遺伝子発現の不調が関係している他の疾患または症状の処置のための遺伝子治療またはタンパク質治療に使用することができる。
【０２５４】
本発明によるポリペプチド、ポリペプチド組成物、単離されたヘプタペプチド、薬学的組成物、および方法は、遺伝子発現の制御または調節によって処置することができる疾患および症状（ＨＩＶ−１感染を含む）を処置することができる医薬品の調製についての産業上の適用性を有する。
【０２５５】
値の範囲に関して、本発明には、文中に明記されていない限りは、範囲の上限および下限の間に存在しているそれぞれの値から、下限値の少なくとも１０分の１までが含まれる。さらに、本発明には、記載した範囲から具体的に排除されていない限りは、任意の他の記載した間に存在している値と範囲が含まれ、これには、範囲の上限と下限のいずれかまたは両方が含まれる。
【０２５６】
他に明記されていない限りは、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語の意味は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味である。当業者にはまた、本明細書中に記載されている方法と材料に類似するかまたは同等である任意の方法と材料もまた、本発明を実施または試験するために使用できることは明らかであろう。
【０２５７】
本明細書中で議論した刊行物および特許は、本出願の出願日前のそれらの開示だけが提供される。本明細書中では、本発明が以前の発明からそのような刊行物を予見することの了解とは解釈されない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認することが必要であり得る。
【０２５８】
引用した全ての刊行物は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられ、これには、全ての公開された特許、特許出願、学術文献、さらには、そのような公開されている文献の中に引用されている刊行物が含まれる。しかし、引用により本明細書中に組み入れられる任意の刊行物が今後公開される情報について言及する範囲に関して、出願人は、本出願の提出日以後に公開された全てのそのような情報は先行技術としては認めない。
【０２５９】
本明細書中、および添付の特許請求の範囲において使用される場合は、単数形には複数形が含まれる。例えば、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文中に明記されていない限りは、複数についての言及も含まれる。加えて、一連のエレメントの前の用語「少なくとも」は、一連のエレメントのそれぞれについて言及されると理解される。本明細書中に実例を伴って記載された本発明は、本明細書中には特に開示されていない任意のエレメント（単数または複数）、限定（単数または複数）が存在しない条件下で安定に行うことができる。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含まれる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡大して読まれるべきであり、限定されるべきではない。加えて、本明細書中で使用される用語および表現は、記述的な用語として使用され、限定ではなく、またそのような用語および表現の使用によって、将来示され、記載されるあらゆる等価物またはその一部を除く意図はなく、そして、請求される本発明の範囲内において様々な改良が可能であると理解される。したがって、本発明は好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書中に開示されている本発明の改良および変更は当業者が行うことができること、そして、そのような改良および変更が本明細書中に開示される本発明の範囲内に含まれると考えられることが理解されるべきである。本発明は、本明細書中で広く、一般的に記載されている。一般的な開示の範囲に含まれるより狭い種、および亜族のグループのそれぞれもまた、これらの発明の一部を形成する。これには、条件付きでの個々の発明の一般的な記載、または属から任意の目的の物を除くネガティブな限定が、排除される物質が具体的にその中に残っているかどうかにはかかわらず、含まれる。加えて、本発明の特徴または態様がＭａｒｋｕｓｈのグループで記載されている場合には、当業者は、それによってＭａｒｋｕｓｈグループの任意の個々のメンバーまたは複数のメンバーのサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。上記記載が説明を意図するものであって、限定を意図しないこともまた理解される。上記の説明を参照すれば、当業者にとって多くの実施形態は明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、上記記載を参照して決定されるべきではなく、代わりに、特許請求の範囲に与えられる等価物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。当業者は、日常的に行われる実験だけを使用して、記載された本発明の多くの特異的な実施形態の等価物を理解、または確認できるであろう。そのような等価物のことは、以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】図１は、マウスの転写因子Ｚｉｆ２６８の亜鉛フィンガー−ＤＮＡ複合体のモデルである。
【図２】図２は、ＤＮＡの特異的な塩基と転写因子の３つのフィンガーの特異的なアミノ酸との間での相互作用に関する、転写因子Ｚｉｆ２６８のタンパク質−ＤＮＡ相互作用を示している図である。
【図３】図３は、実施例１のプロセスによって作成された亜鉛フィンガーの数についての多標的特異性アッセイの結果を示しているグラフの第１のシリーズである：（（ａ）ＱＡＳ−Ｎ−ＬＩＳ（ＴＡＡ−１ａ−２）（配列番号１；５’−（ＴＡＡ）−３’に結合する；（ｂ）ＳＲＧ−Ｎ−ＬＫＳ（ＴＡＣ−２ｃ−２）（配列番号２；５’−（ＴＡＣ）−３’に結合する；（ｃ）ＡＲＧ−Ｎ−ＬＫＳ（ＴＡＣ−２ｄ−２）（配列番号７；５’−（ＴＡＣ）−３’に結合する；（ｄ）ＲＬＤ−Ｎ−ＬＱＴ（ＴＡＧ−３ｃ−２）（配列番号３；５’−（ＴＡＧ）−３’に結合する；（ｅ）ＲＳＤ−Ｎ−ＬＴＴ（ＴＡＧ−３ｄ−２）（配列番号８；５’−（ＴＡＧ）−３’に結合する；（ｆ）ＡＲＧ−Ｎ−ＬＲＴ（ＴＡＴ−４ｃ−８）（配列番号４；５’−（ＴＡＴ）−３’に結合する）；（ｇ）ＶＲＧ−Ｎ−ＫＬＳ（ＴＡＴ−４ｄ−２）（配列番号９；５’−（ＴＡＴ）−３’に結合する）；および（ｈ）ＲＫＤ−Ａ−ＬＲＧ（ＴＴＧ−６ｃ−２）（配列番号５；５’−（ＴＴＧ）−３’に結合する））。
【図４】図４は、分析したさらに別の多数の亜鉛フィンガーについての多標的特異性アッセイの結果を示しているグラフの第２のシリーズである：（（ａ）ＲＬＤ−Ｎ−ＬＱＴ（配列番号３；５’−（ＴＡＧ）−３’に結合する；（ｂ）ＡＲＧ−Ｎ−ＬＲＴ（配列番号４；５’−（ＴＡＴ）−３’に結合する；（ｃ）ＳＲＧ−Ｎ−ＬＫＳ（配列番号２；５’−（ＴＡＴ）−３’に結合する；（ｄ）ＱＡＳ−Ｎ−ＬＩＳ（配列番号１；５’−（ＴＡＡ）−３’に結合する；（ｅ）ＲＥＤ−Ｎ−ＬＨＴ（配列番号６；５’−（ＴＡＧ）−３’に結合する；および（ｆ）ＡＲＧ−Ｎ−ＬＫＳ（配列番号７；５’−（ＴＡＴ）−３’）に結合する）。
【図５】図５は、亜鉛フィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８のリンカー領域の構造と機能を示している図である。
【図６】図６は、改良されたリンカーの構築のための設計概念を示している図である（実施例２）。
【図７】図７は、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ上のＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質の結合部位を示している図である。示した配列は、ＨＸＢ２参照株に由来する（実施例１２）。
【図８】図８は、一時トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）アッセイにおけるＰＢＳ亜鉛フィンガー結合定数とＨＩＶ−１  ＬＴＲの阻害を示す。（Ａ）ＰＢＳ亜鉛フィンガーのゲルシフト。ＰＢＳ配列を含む３２Ｐ標識ＤＮＡヘアピンオリゴヌクレオチドを、タンパク質の量を減少させながらインキュベートした。遊離のＤＮＡと結合したＤＮＡの密度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して定量し、それぞれのタンパク質についてＫＤを計算した。（Ｂ）ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合させられたＰＢＳタンパク質の抑制を比較する一時的なレポーターアッセイ。左側のグラフは、ＨＩＶ−１  ＬＴＲによって駆動されるルシフェラーゼレポーターと、Ｔａｔタンパク質を発現するプラスミドでのＫＲＡＢ−亜鉛フィンガータンパク質のトランスフェクションによる結果を示す。右側のグラフは、ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターでのＫＲＡＢ−亜鉛フィンガータンパク質の対照のトランスフェクションを示す。（Ｃ）ＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質のタンパク質発現レベル。細胞を、パネル（Ｂ）と同様に亜鉛フィンガータンパク質で一時的にトランスフェクトし、細胞抽出物を調製した。タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離させ、ポリビニリデンジフルオライド膜に移動させた。ブロットを、亜鉛フィンガータンパク質上のＨＡタグを認識する抗体またはβ−アクチン抗体でプローブした。相対的なタンパク質の発現を、亜鉛フィンガーの発現をそれぞれの試料中のβ−アクチンの発現に対して較正することによって計算した。
【図９】図９は、染色体に組み込まれたＨＩＶ−１  ＬＴＲレポーター上のＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質の抑制、およびインビボでの結合を示す。（Ａ）ＫＲＡＢ−ＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質およびＴａｔを、ＴＺＭ−ｂｌ細胞株（ルシフェラーゼおよびｌａｃＺ遺伝子の発現を駆動する染色体に組み込まれたＨＩＶ構築物が含まれるＨｅＬａ細胞株）の中で一時的に発現させた。（Ｂ）亜鉛フィンガータンパク質に結合させたＨＩＶ−１  ＬＴＲのクロマチン免疫沈降。亜鉛フィンガータンパク質を、ＴＺＭ−ｂｌ細胞の中でのレトロウイルス形質導入によって発現させた。細胞をホルムアルデヒドで架橋させ、核抽出物を調製した。抽出物を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）またはＳｐ１コンセンサス亜鉛フィンガー（Ｓｐ１Ｃ）を認識する抗体とともにインキュベートし、Ｓｔａｐｈ  Ａ細胞で沈降させた。免疫沈降させたＤＮＡを精製し、ＬＴＲに特異的なプライマーを使用してＨＩＶ−１  ＬＴＲの存在についてＰＣＲによって分析した。（Ｃ）ｔＲＮＡＬｙｓ３のノーザンブロット。ＨｅＬａ細胞を示したＫＲＡＢ−ＺＦタンパク質でトランスフェクトし、全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲルによって分離させ、膜に移動させた。これを、ｔＲＮＡＬｙｓ３およびｔＲＮＡＰｈｅについて放射性標識オリゴヌクレオチドでプローブした。それぞれのレーンの下の数字は、ｔＲＮＡＰｈｅに対して較正した後の、ｔＲＮＡＬｙｓ３の相対的な発現を示す。
【図１０】図１０は、ＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質のウイルス生産の一時的な阻害を示しているグラフである。示したＫＲＡＢ−ＰＢＳ亜鉛フィンガーを発現するプラスミド、およびＨＩＶ−１のＮＬ４−３株のゲノムを、２９３Ｔ細胞の中に同時トランスフェクトした。ウイルスの生産を、ｐ２４  ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【図１１】図１１は、初代細胞の中でのＰＢＳ亜鉛フィンガーによるＨＩＶウイルスの生産の阻害を示す。（Ａ）ＰＢＭＣの中での亜鉛フィンガーの発現のフローサイトメトリー分析。ＰＢＭＣに、ＫＲＡＢ−ＰＢＳ亜鉛フィンガータンパク質を発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。細胞を固定し、ＺＦのＣ末端ＨＡタグを認識する抗体で染色し、そして亜鉛フィンガーの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。右側のパネルは、ＣＤ４およびＨＡ抗体について染色したＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を形質導入した細胞のフローサイトメトリー分析を示している。（Ｂ）示したＫＲＡＢ−ＰＢＳレンチウイルスベクターをＰＢＭＣに形質導入し、その後、０．１のＭＯＩでのＨＩＶ−１株ＮＬ４−３による感染でチャレンジした。ｐ２４レベルを、感染の３日後、７日後、１２日後、および１８日後にモニターした。
【図１２】図１２は、亜鉛フィンガー（ＺＦ）タンパク質でのＰＢＭＣの形質導入は細胞の生存性に影響を与えなかったことを示しているグラフである。示したＺＦ転写因子を形質導入したＰＢＭＣ、または形質導入しなかった細胞をＨＩＶ−１でチャレンジした。示した時点で、細胞の生存性をＷＳＴ−１アッセイによって決定した。
【図１３】図１３は、ＦサブタイプＬＴＲに対するＫＲＡＢ−ＨＬＴ１の有効性の低下を示しているグラフである。（Ａ）様々なＨＩＶ−１  Ｍグループのサブタイプの中のＨＬＴＲ３およびＰＢＳ２  ＺＦ結合部位の配列比較。点線は配列同一性を示し、点は欠失を示す。（Ｂ）ＫＲＡＢ−ＨＬＴＲ３（左）またはＫＲＡＢ−ＰＢＳ２（右）のいずれかを形質導入したＰＢＭＣを、野生型またはＦサブタイプＬＴＲのいずれかを含むＢサブタイプウイルスでチャレンジした。ウイルスの複製を、ｐ２４の生産を測定することによってモニターした。
【図１４】図１４は、亜鉛フィンガーの抑制に反応するプライマー結合部位の変異を示す。（Ａ）ＰＢＭＣにＫＲＡＢ−ＰＢＳ２を形質導入し、ＨＩＶ−１に感染させた。ウイルスを上清から回収し、これを使用して形質導入した細胞の新しい集団を再度感染させた。数回の後、生じたウイルスをクローニングし、２０個のクローンからプライマー結合部位領域を配列決定した。変異の部位を下線で示した。（Ｂ）野生型およびＭｕｔ−３  ＨＩＶによるＫＲＡＢ−ＰＢＳを形質導入したＰＢＭＣの感染。（Ｃ）野生型およびＭｕｔ−３ヘアピンオリゴヌクレオチドを用いたＰＢＳ２のゲルシフト。
【図１】
2009520463.tif 000047
【図２】
2009520463.tif 000048
【図３】
2009520463.tif 000049
【図４】
2009520463.tif 000050
【図５】
2009520463.tif 000051
【図６】
2009520463.tif 000052
【図７】
2009520463.tif 000053
【図８】
2009520463.tif 000054
【図９】
2009520463.tif 000055
【図１０】
2009520463.tif 000056
【図１１】
2009520463.tif 000057
【図１２】
2009520463.tif 000058
【図１３】
2009520463.tif 000059
【図１４】
2009520463.tif 000060
【配列表】
2009520463000001.app
【国際調査報告】
2009520463.tif 000061
2009520463.tif 000062