(57)【要約】本発明は、組換えゼラチンペプチド内のアミノ酸総数の少なくとも２５％によって隔たれている少なくとも２個の外側リシン残基を含む組換え生産されたゼラチンから調製された細胞担体粒子に関する。本発明は、前記細胞担体が使用されている応用にも関し、例えば、組織増大又は美容整形用の注入可能な細胞担体として、或いはインビトロ細胞培養におけるマイクロキャリアとして応用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え生産された架橋ゼラチンポリペプチドを含む細胞担体粒子であって、前記組換え生産されたゼラチンポリペプチドが、少なくとも２個のリシン残基を含み、前記リシン残基が極限リシン残基であり、第１極限リシン残基が、ポリペプチドのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２極限リシン残基が、ポリペプチドのＣ末端に最も近いリシン残基であり、前記極限リシン残基が、組換えゼラチンポリペプチド内のアミノ酸の総数の少なくとも２５％によって隔たれている、細胞担体粒子。
【請求項２】
組換え生産されたゼラチンポリペプチドが、２個の極限リシン残基の間に少なくとも１個のリシン残基を含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞担体粒子。
【請求項３】
組換え生産されたゼラチンポリペプチドが、少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、前記２個のアミノ酸残基が極限アミノ酸残基であり、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基から別個に選択され、第１アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基が、ポリペプチドのＮ末端に最も近いアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり、第２極限アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基が、ポリペプチドのＣ末端に最も近いアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり、前記極限アスパラギン酸残基及び／又はグルタミン酸残基が、組換えゼラチンポリペプチド内のアミノ酸の総数の少なくとも２５％によって隔たれていることを特徴とする、請求項１又は２記載の細胞担体粒子。
【請求項４】
組換え生産されたゼラチンポリペプチドが、極限アスパラギン酸残基及び／又はグルタミン酸残基との間に、少なくとも１個のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を含むことを特徴とする、請求項３記載の細胞担体粒子。
【請求項５】
リシン残基が、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸残基に共役(coupled)していることを特徴とする、請求項１〜４いずれかに記載の細胞担体粒子。
【請求項６】
組換え生産されたゼラチンが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＣＤ）で架橋されていることを特徴とする、請求項５記載の細胞担体粒子。
【請求項７】
組換え生産されたゼラチンポリペプチドの５０個のアミノ酸の各ストレッチが、少なくとも２個のリシン残基を含むことを特徴とする、請求項１〜６いずれかに記載の細胞担体粒子。
【請求項８】
組換え生産されたゼラチンポリペプチドの５０個のアミノ酸の各ストレッチが、アスパラギン酸又はグルタミン酸から別個に選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項１〜７いずれかに記載の細胞担体粒子。
【請求項９】
平均粒子サイズからのサイズ偏移が２０％を超える粒子が１０％未満であることを特徴とする、請求項１〜８いずれかに記載の細胞担体粒子。
【請求項１０】
平均粒子サイズからのサイズ偏移が５０％を超える粒子が実質的に存在しないことを特徴とする、請求項１〜９記載の細胞担体粒子。
【請求項１１】
組換え生産されたゼラチンポリペプチドが、少なくとも１個のＲＧＤモチーフを含むことを特徴とする、請求項１〜１０いずれかに記載の細胞担体粒子。
【請求項１２】
ＲＧＤモチーフを含有する組換え生産されたゼラチンポリペプチド内のアミノ酸の総数に対するＲＧＤモチーフの割合が、少なくとも０．４であり、前記コラーゲンポリペプチドが、３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０アミノ酸の各ストレッチが、少なくとも１個のＲＧＤモチーフを含むことを特徴とする、請求項１１記載の細胞担体粒子。
【請求項１３】
ＲＧＤモチーフの割合が、少なくとも０．６、好ましくは少なくとも０．８、より好ましくは少なくとも１．０、さらに好ましくは少なくとも１．２、もっとも好ましくは少なくとも１．５であることを特徴とする、請求項１１又は１２記載の細胞担体粒子。
【請求項１４】
組換え生産されたゼラチンポリペプチドの分子量が、２．５ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、好ましくは１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、より好ましくは２０ｋＤａ〜７５ｋＤａであることを特徴とする、請求項１〜１３いずれかに記載の細胞担体粒子。
【請求項１５】
請求項１〜１４いずれかに記載の細胞担体粒子の、細胞の局所送達に注入可能な細胞担体としての使用であって、前記粒子が２００μｍ以下の平均粒子サイズを有することを特徴とする使用。
【請求項１６】
細胞が、心筋瘢痕組織部位に送達される心筋細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１〜１４いずれか記載の細胞担体粒子の、組織増大又は形成外科用の注入可能な細胞担体としての使用。
【請求項１８】
請求項１〜１４いずれか記載の細胞担体粒子の、美容整形における使用。
【請求項１９】
請求項１〜１４いずれか記載の細胞担体粒子の、インビトロ細胞培養におけるマイクロキャリアとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼラチンから調製される細胞担体粒子に関する。具体的には、本発明は、組換え生産されたゼラチンから調製された、かかる粒子に関する。本発明は、さらに、前記細胞担体が用いられる適用に関し、例えば、組織増大又は美容整形用に注入可能な細胞担体として、或いはインビトロ細胞培養用のマイクロキャリアとして用いられる。
【背景技術】
【０００２】
多くの動物細胞は成長するために、表面に固定される（anchored）必要があることは知られている。表面接着を必要とする細胞としては、ケラチノサイト、繊維芽細胞、心筋細胞、卵巣細胞、肝細胞、ランゲルハンス島細胞等が挙げられる。
【０００３】
多くの医薬用途において、細胞が接着し、その結果細胞の成長を促進するマトリックスが提供されている。例えば、国際公開公報第００／２９５５３号に記載されているように、火傷又はその他の外傷の治療において、ケラチノサイト及び／又は繊維芽細胞がその上で増殖したシート素材が、皮膚交換（skin replacement）として使用されている。
【０００４】
細胞接着が細胞の増殖に重要であるさまざまな用途で細胞サポートが使用されている。ゼラチンは、細胞接着用の基質としてよく知られている。細胞培養用に、ポリスチレン又はガラス粒子等の担体材料のコーティングとして使用されている。組織エンジニアリングにおける足場又は、移植材料のコーティングとしてゼラチンを使用することはよく知られている。多くの場合、ゼラチンは架橋されている。しかし、ゼラチンにはいくつかの欠点がある。天然由来であるので、組成は一般的に定義されておらず、タンパク質、ウイルス、及びプリオン等の汚染物質が存在している可能性があり、生体適合性を保証するにはさらなる方策を必要としている。
【０００５】
国際公開公報第２００５／０７９８７９号は、架橋コラーゲンファイバーからなる細胞担体又は医薬素材を製造する工程を記載している。架橋ゼラチン層が、インプラントをコーティングするために用いられている。国際公開公報第００／６７０１号は、心筋瘢痕組織の修復するための細胞接着、又はペースメーカーのコーティングにゼラチン足場を使用することを記載している。
【０００６】
例えば酵母細胞又は動物細胞のインビトロ培養において、細胞接着用の表面を提供するために担体が用いられている。かかる表面の細胞結合特性は、ゼラチンでコーティングすることにより亢進することができ、また、ゼラチンは、架橋ゼラチン粒子からなっていてもよい。
【０００７】
欧州特許第０２２２７１８号は、アンカー依存細胞を培養するマイクロキャリアとして適切な多孔性粒子に関して記載しているが、多孔性以外の特性に関しては何も記載されていない。ゼラチンマイクロキャリアの調製は、例えば、国際公開公報第９０／１３６２５号、ＳＵ１７２４６８７、国際公開公報第０２／４８２４７号、国際公開公報第０３／１０４３１３号に記載されている。
【特許文献１】国際公開公報第００／２９５５３号
【特許文献２】国際公開公報第２００５／０７９８７９号
【特許文献３】国際公開公報第００／６７０１号
【特許文献４】国際公開公報第９０／１３６２５号
【特許文献５】ＳＵ１７２４６８７
【特許文献６】国際公開公報第０２／４８２４７号
【特許文献７】国際公開公報第０３／１０４３１３号
【０００８】
（発明の概要）
本発明の課題は、生分解性及び細胞接着等の均一な物理的、（生）化学特性を有するゼラチンをベースにした細胞担体を提供することである。
さらに、接着細胞が組織の修復、治癒過程に寄与する応用において、又はインビトロ細胞培養工程において、均一なパフォーマンスを有するかかる細胞担体を提供することも本発明の課題である。
さらに、細胞接着性が改善された、ゼラチンをベースとした細胞担体を提供することも本発明の課題である。
さらに、ウイルス感染の恐れがなく、健康上のリスクがあり、免疫原性の低下させる汚染物質が含まれていない、細胞担体を提供することも本発明の課題である。
【０００９】
組換え生産された架橋ゼラチンポリペプチドを含む細胞担体粒子であって、かかる組換え生産されたゼラチンポリペプチドが少なくとも２個のリシン残基を含み、リシン残基が極限リシン残基であり、第１極限リシン残基がポリペプチドのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２極限リシン残基が、ポリペプチドのＣ末端に最も近いリシン残基であり、前記極限リシン残基が、組換えゼラチンポリペプチド内のアミノ酸総数の少なくとも２５％によって隔たれている、細胞担体粒子によって、かかる課題が解決された。
【００１０】
細胞接着のレベル及び架橋のレベルの調整が可能であり、リシン残基、さらにリシン残基と架橋するアミノ酸、グリコシル化、アミノ酸配列−アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−（以下ＲＧＤモチーフと記載）等の特異的細胞結合配列の存在等の要素の存在を調節することによって、テーラーメードにすることができる、均一な細胞担体を生産することができることは、本発明の細胞担体の重要な利点である。さらに、１つの種類の組換えゼラチンから調製された全ての粒子が、同程度の特性を有することも利点である。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
天然ゼラチンには、いくつかの欠点がある。よく知られているプリオン汚染以外に、素材は、天然由来であることにより、またその調製方法により、分子量が定義されていない。一定の平均分子量を有するゼラチンの分子量分布は幅広い。超遠心分離法等の方法によって、天然で生産された加水分解されたゼラチンを、分子量の高い画分と低い画分とに分離することができるが、各画分のサイズ分布は幅広くなる。例えば５０キロダルトン（ｋＤａ）程度の高分子量の画分は、最大２００ｋＤa又は３００ｋＤａの大きな構造を含む可能性がある。例えば５０ｋＤａ以下の低分子量の画分は、５ｋＤａ以下、若しくは１ｋＤａ以下、若しくはそれより低い分子量の分子を含む場合がある。かかる天然ゼラチン又はコラーゲンを架橋することにより、細胞担体粒子が形成される。しかし、高い分子量のゼラチン画分を架橋した場合には、大きすぎる粒子が形成され、低い分子量のゼラチン画分を架橋した場合には、小さすぎる粒子が形成される。
【００１２】
インビトロ細胞培養における使用や、医薬用途において均一な細胞密度が得られるように、細胞担体粒子のサイズが均一であることが好ましい。粒子が大きすぎると、容積に対して結合する細胞が少なくなり、したがって効果が少なくなる。粒子が小さすぎると、細胞に結合しなくなり、したがって、生産性がない。粒子サイズ分布が均一で、均一な物理的、（生）化学特性を有し、均一な挙動を有する、ゼラチンをベースにした細胞担体は、組換えゼラチンポリペプチド内のアミノ酸総数の少なくとも２５％によって隔たれている少なくとも２個の外側（outer）（極限（extreme）と記載することもある）リシン残基を含む、組換えゼラチンを使用することによって生産することができることを見い出した。好ましい態様では、組換え生産されたゼラチンポリペプチドは、外側（極限）リシン残基の間に、少なくとも１個のリシン残基を含む。    
【００１３】
本発明の細胞担体粒子のさらに好ましい態様では、組換え生産されたゼラチンポリペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、かかる２個のアミノ酸残基は、極限アミノ酸残基であり、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基から別個に選択され、第１アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基は、ポリペプチドのＮ末端に最も近いアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり、第２極限アルパラギン酸残基又はグルタミン酸残基は、ポリペプチドＣ末端に最も近いアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基である。かかる極限アスパラギン酸残基及び／又はグルタミン酸残基は、組換えゼラチンポリペプチド内のアミノ酸総数の少なくとも２５％によって隔たれている。さらなる実施態様では、組換え生産されたゼラチンポリペプチドは、かかる極限アスパラギン残基及び／又はグルタミン残基との間に少なくとも１個のアスパラギン酸残基又はグルタミン残基を含む。
【００１４】
ゼラチン又はコラーゲンは、リシンのアミノ基を介して、グルタミン酸又はアルパラギン酸のカルボキシ基を介して、又はその組合せを介して架橋することができる。適切な架橋剤は、生分解の間に解放された時に、毒性又は抗原性の影響がないものが好ましい。適切な架橋剤としては、例えば、１又は複数の、グルタルアルデヒド、水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合物、ホルマリン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ビス−ヒドロキシ−サクシニイミド、アルキレングリコール、ジグリシジルエーテル又はポリグリセロールポリグリシジルエーテル等のグリシジルエーテル；ヘキサメチレンジイソシアネート、アジ化ジフェニルホスホリル、Ｄ−リボース等のジイソシアネートが挙げられる。架橋技術は、Weadock et. al. in Evaluation of collagen crosslinking techniques (Biomater. Med. Devices Artif. Organs, 1983-1984, 11 (4): 293-318)に記載されている。好ましい態様において、水溶性の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が使用される。
【００１５】
その他の適切な架橋剤としては、トリアジン、例えば、ジクロロヒドロキシ−トリアジンが挙げられる。他の架橋剤としては、ジビニルスルホン、二無水物、二機能性イミダート、ジエポキシド又はジマレイイミジンが挙げられる。また、１つの分子内にエポキシド及び無水物を含む二機能性架橋化合物等の異なる活性基を含む二機能性架橋化合物を用いることもできる。
【００１６】
トランスグルタミナーゼ等の酵素架橋化合物も有用である。
【００１７】
さらに、例えばリシン残基等の架橋可能なアミノ酸残基を２個以上接着できる架橋化合物も使用することができ、例としては、シアヌル酸クロリドを挙げることができる。この点に関して、３以上の反応基が組み合わされた化合物は、２個のエポキシド基及び１つの無水物基を含む化合物等が想定される。
【００１８】
１つの態様において、コラーゲン性（collageneous）ポリペプチドの架橋は、１又は複数の架橋剤を添加することによって達成できる。かかる架橋剤は、コラーゲン性ポリペプチド溶液に添加と同時に、又は例えばｐＨを調整後、又は光イニシエーション（photo initiation）又は他の活性メカニズムによって、架橋を開始する薬剤を含む。
【００１９】
よく知られた生体適合性の架橋剤としては、例えば、２個のリシン残基を架橋するグルタルアルデヒドが挙げられる。他のよく知られた生体適合性の架橋剤としては、アミンとカルボキシ基を共役（couple）するＥＤＣが挙げられる。
【００２０】
粒子形成に寄与するために、組換えゼラチンは少なくとも２個のリシン残基を含む。好ましくは、組換えコラーゲンポリペプチドは、少なくとも３個、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１又は少なくとも１２個のリシン残基を含む。さらなる態様において、組換えゼラチンポリペプチドは、リシンに加えて、アルパラギン酸及びグルタミン酸から選択される少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、より好ましくは、組換えゼラチンポリペプチドは、少なくとも３個、又は少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１又は少なくとも１２個のアスパラギン酸及びグルタミン酸残基を含む。
【００２１】
３次元網目構造に寄与するために、リシン、アルパラギン酸及び／又はグルタミン酸残基は、ポリペプチド上で空間分布を有さなければならない。したがって、ある態様においては、５０アミノ酸の各ストレッチは、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個のリシン残基を含み、又は少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個のアスパラギン酸又はグルタミン酸を含み、又は少なくとも１個のリシン残基及び少なくとも１個のアルパラギン酸又はグルタミン酸残基を含む。好ましくは４０アミノ酸の各ストレッチは、少なくとも１個のリシン残基及び／又は少なくとも１個のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を含み、より好ましくは２５アミノ酸の各ストレッチである。
【００２２】
好ましくは、架橋可能なアミノ酸残基は、互いに隣接していない。より好ましくは、少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸によって隔たれている。
【００２３】
特に組換え生産されたゼラチンの場合、リシン残基の数は、望むとおりに増やすことができる。多くの架橋剤は、リシン残基及び／又はＮ末端アミンに結合する。天然ゼラチンは、１０００個のアミノ酸あたり、２５〜２７個のリシン残基、及び１１２〜１３３個のグルタミン酸及びアルパラギン酸残基を含む。組換えゼラチンにおいて、リシンの数を例えば、１０００個のアミノ酸あたり２０、１５、１０又は５個のリシン以下に減らすことができ、或いは、１０００個のアミノ酸あたり約３０、４０又は５０個以上のリシンに増やすことができる。グルタミン酸又はアスパラギン酸の数は、例えば１０００個のアミノ酸あたり、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０又は５個以下の残基にまで減らすことができ、或いは１０００個のアミノ酸あたり１５０個以上の残基まで増やすことができる。
【００２４】
ヒトコラーゲン配列の一部が発現した場合には、アスパラギン及びアスパラギン酸両方、並びにグルタミン及びグルタミン酸両方が、組換えポリペプチドに存在することができる。望む場合には、グルタミン及びアスパラギン酸残基は、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基に変換することにより、アミノ酸を取り除くこと（de-aminated）ができる。
【００２５】
１つの態様において、細胞担体粒子の組換えゼラチンは、組換えゼラチン１グラムあたり、０．０２〜１．０ミリモルの（１又は複数の）架橋化合物を添加することにより架橋される。したがって、（１又は複数の）架橋化合物は、１グラムのゼラチンあたり、０．０２、０．０５、０．１、０．２５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０ミリモルの量で存在することができる。別の態様においては、細胞担体粒子は、組換えゼラチン１ｇあたり、０．５〜５．０ミリモル、好ましくは約１．０〜２．５ミリモル／ｇの架橋化合物を添加することにより架橋される（又は同等の放射誘導架橋）。したがって、（１又は複数の）架橋化合物は、１グラムの組換えゼラチンあたり、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０及び５．０ミリモルの量で存在することができる。さらに別の態様において、組換えゼラチンは、ゼラチン性ポリペプチド１ｇあたり、０．２５〜２．５ミリモルの（１又は複数の）架橋化合物を添加することによって架橋される。
【００２６】
したがって、架橋可能なアミノ酸残基及び、使用される架橋化合物の量は、組換えコラーゲン粒子の物理的特性を決定又はカスタマイズするために使用することができる。高い数の架橋可能な残基及び／又は高い濃度の架橋可能な化合物により、粒子が機械的ストレスに供される、細胞培養に適した粒子を産出することができる。より低い数の架橋可能なアミノ酸残基及び／又は低い濃度の架橋可能な化合物によって、簡単に変形する粒子が産出され、医薬又は薬学的用途の注入可能なコラーゲン粒子に使用することができる。
【００２７】
１つの態様において、架橋剤は、細胞担体粒子の調製中に添加される。別の態様においては、粒子形成の最終段階において、若しくは粒子が形成された後に粒子が形成され、架橋化合物が添加され、その結果、表面架橋されているが本質的に内部架橋のない粒子を産出する。
【００２８】
ゼラチンの組換え生産により、単分散の分子量の分布、さらにゼラチンポリペプチドの均一なアミノ酸組成が得られる。架橋された細胞担体粒子を調製するために、天然ゼラチンを加水分解する時に、リシン残基を含まない若しくは１個しな含まない低い分子量の画分が存在する可能性があり、また架橋に効率的に寄与するには近すぎるリシン残基のクラスターが存在する場合がある。かかる構造は、粒子の構造に寄与しない。天然ゼラチン由来の、低い分子量の画分の多くが、細胞接着に有利なアリギニン-グリシン−アルパラギン酸（−ＲＧＤ−）のアミノ酸配列を有さない。したがって、もしより小さい細胞担体粒子が形成された場合には、細胞接着に寄与しないかもしれない。ＲＧＤモチーフが存在しないことが好ましい場合には、当業者は、天然ゼラチンを使用することをためらうかもしれない。ＲＧＤ配列を含まない組換え生産されたコラーゲンをこの場合使用することができる。
【００２９】
粒子のサイズの多様性により、天然ゼラチンから細胞担体粒子が形成された場合には、アミノ酸組成さらには架橋度合い、生分解性度合いも変動する。これにより、医薬用途における細胞送達等の使用において、治癒工程でさらなる不均衡をもたらす可能性があり、ある場所においては、治癒が所望の通りに進み、治療の完全な効果がもたらされるが、他の場所では、有利な効果が障害され、完全なものではない可能性がある。組織増大又は美容整形の場合には、アンバランスな生分解性により、注入された領域の形がイレギュラーとなり、美容的には受け入れられないものとなる。
【００３０】
本発明にしたがって、均一なサイズと均一な特性を有する粒子を、組換えゼラチンポリペプチドを用いて作出することができるので、生分解速度を調整できるようになり、さらに重要なことには、均一な生分解速度が得られるようになった。
【００３１】
したがって、本発明によれば、組換えゼラチンを用いて、天然ゼラチンから調製された粒子よりも均一な特性を有する、細胞担体粒子を作出することができる。サイズ分布はより狭くなり、極端に小さい或いは極端に大きな粒子は形成されない。したがって、組換え生産されたゼラチンから調製された集団においては、平均粒子サイズからのサイズ偏移が２０％を超える粒子は１０％以下であり、平均粒子サイズからのサイズ偏移が５０％を超える粒子が実質的に存在しないことが期待される。好ましくは、平均粒子サイズからのサイズ偏移が２０％を超える粒子は５％以下である。より好ましくは、平均粒子サイズからのサイズ偏移が１０％を超える粒子は５％以下である。最も好ましくは、平均粒子サイズからのサイズ偏移が５％を超える粒子は２．５％以下である。
【００３２】
細胞担体粒子は、多孔性であってもなくてもよく、例えば国際公開公報第２００３／１０４３１３号に記載されているように、接着できる細胞数を増やすために、空洞を有してよい。
【００３３】
本発明の組換え細胞担体粒子を作出するのに適切なゼラチンポリペプチドは、組換え源（recombinant source）由来のゼラチン（又はコラーゲン）である。厳密に言えば、コラーゲンとゼラチンとは異なるものの、この相違は通常本発明には重要ではない。但し、特別な要件により、一定の使用に対するコラーゲン又はゼラチンの選択は明らかなものとなる場合がある。この点に関して、『コラーゲン』は『ゼラチン』と置き換えることもでき、さらに『コラーゲンポリペプチド』を『ゼラチンポリペプチド』と置き換えることもできる。ゼラチン若しくはコラーゲン又はコラーゲン性若しくはゼラチン性ポリペプチドは、少なくとも１つのＧＸＹ領域が、少なくとも５個の連続したＧＸＹトリプレットの長さで存在し、ゼラチン性ポリペプチドの少なくとも２０％のアミノ酸が、連続したＧＸＹトリプレットの形で存在し、ＧＸＹトリプレットは、グリシンを示すＧと任意のアミノ酸を示すＸとＹとからなる。適切には、Ｘ及び／又はＹの少なくとも５％はプロリンを示してもよく、特にコラーゲン性ポリペプチドのＧＸＹ部分のアミノ酸の少なくとも５％、さらには１０〜３３％がプロリンである。
【００３４】
ゼラチン性ポリペプチドは、好ましくは分子量が１５０ｋＤａ以下で、より好ましくは１００ｋＤａ以下である。５０〜１００ｋＤaの範囲は適切であり、７５ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以上のゼラチン性ポリペプチド、若しくは５〜４０ｋＤａのゼラチン性ポリペプチドを用いることができる。好ましくは、コラーゲン性ペプチドの平均分子量は、少なくとも５ｋＤａであり、好ましくは少なくとも１０ｋＤａであり、より好ましくは少なくとも３０ｋＤａである。粘着性が低いために、ゼラチン性ポリペプチドがより高い濃度であることが要求されるときには、分子量が低いことが好ましい。
【００３５】
組換えゼラチン性ポリペプチドの作製方法は、同一出願人による、欧州特許第０９２６５４３号、及び欧州特許第１０１４１７６号に詳細に記載されている。前記特許は、参照により本明細書に組み込まれる。手順は、”High yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris”, M.W.T. Werten et al., Yeast 15, 1087-1096 (1999)に記載されている。適切な組換えゼラチンは、国際公開公報第２００４／８５４７３号に記載されている。
【００３６】
一つの実施態様においては、組換えゼラチン性ポリペプチドは、安定した三重らせん（triple helice）を形成せず、特に、摂氏５度以上の温度、又は摂氏２５度以上の温度では形成しない。かかるゼラチン性ポリペプチドは、ＧＸＹトリプレットにおいて、哺乳類由来のコラーゲン若しくはゼラチン、又は魚等の冷血動物由来のコラーゲンと比較できる数のプロリンの量を有することが好ましい。安定した三重らせんを防ぐために、ゼラチン性ポリペプチドに存在するアミノ酸の２ナンバー％以下、好ましくは１ナンバー％以下が水酸化される。ヒドロキシプロリンは、プロリルヒドロキシラーゼ（prolylhydroxylase）を共発現しない微生物か、他の方法でその機能を満たすことによって、実質的にゼロにまで低減させることができる。実質的にゼロとは、例えば酵母等の成長培地内にヒドロキシプロリンが存在することにより、ゼラチン性ポリペプチド内にかかるアミノ酸のいくつかが組み入れられることになる、ことを意味する。水酸化されていない、アナフィラキシーショックの発生を避ける利点を有する組換えゼラチン性ポリペプチドは、欧州特許第１２３８６７５号に記載されている。
【００３７】
好ましい実施態様においては、細胞担体粒子は、優れた細胞接着特性を有し、健康に関する危険性がないゼラチン性ポリペプチドを含む。有利には、これはアミノ酸の総数に対するＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４である、ＲＧＤ強化ゼラチン性ポリペプチド（RGD-enriched gelatineous polypeptide）を生産することによって達成される。ＲＧＤ強化ゼラチン性ポリペプチドは、３５０以上のアミノ酸を含む場合、各３５０アミノ酸のストレッチは少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含む。好ましくは、ＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．６、より好ましくは少なくとも０．８、より好ましくは少なくとも１．０、さらに好ましくは少なくとも１．２、最も好ましくは少なくとも１．５である。
【００３８】
ＲＧＤモチーフの割合の０．４は、２５０アミノ酸あたり少なくとも１つのＲＧＤ配列に相当する。ＲＧＤモチーフの数は整数であり、したがって、０．４％の特性を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチン性ポリペプチドは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、ＲＧＤ強化組換えゼラチン性ポリペプチドは、２５０のアミノ酸あたり少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、最も好ましくは２５０のアミノ酸あたり少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。さらなる実施態様において、ＲＧＤ強化ゼラチン性ポリペプチドは、少なくとも４つのＲＧＤモチーフを含み、好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００３９】
『ＲＧＤ強化ゼラチン性ポリペプチド(RGD-enriched gelatineous polypeptide)』なる文言は、本発明においては、ゼラチン性ポリペプチドが一定レベルのＲＧＤモチーフを有し、分子ごとのアミノ酸の総数に対する割合として計算され、より均等なＲＧＤの分布である。
【００４０】
天然ゼラチンはＲＧＤ配列を含むことが知られている。天然水素化されたゼラチン内のポリペプチドの画分のみが、ＲＧＤ配列を有する。しかし、組換え粒子は、ＲＧＤモチーフを含まない大きすぎる部分を含まないことが重要である。ＲＧＤモチーフを含まない大きすぎる部分は、細胞接着の可能性を低減させる。実際、ゼラチン性ポリペプチド内の全てのＲＧＤ配列が、細胞接着のためにどのような状況でも使えるわけではない。ＲＧＤ配列を含まない３５０以上のアミノ酸のストレッチを有するゼラチンと比較して、３５０のアミノ酸の各ストレッチ内に少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含む本発明のゼラチン性ポリペプチドにおいて、細胞接着が著しく改善されたことを見い出した。３５０以下のアミノ酸を有するゼラチン性ポリペプチドにおいては、ＲＧＤ配列の割合が少なくとも０．４であれば十分である。
【００４１】
本発明で用いられる組換えゼラチン性ポリペプチドは、コラーゲン性配列に由来することが好ましい。コラーゲンをコードする核酸配列は、当該技術で一般的に記載されている（Fuller and Boedtker (1981) Biochemistry 20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J Biol Chem 259: 7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem 259: 13668-13673; French et al. (1985) Gene 39: 311-312; Metsaranta et al. (1991) J Biol Chem 266: 16862-16869; Metsaranta et al. (1991) Biochim Biophys Acta 1089: 241-243; Wood et al. (1987) Gene 61: 225-230; Glumoff et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217: 41-48 ; Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J 253: 919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J 252: 633640; and Ala-Kokko et al. (1989) Biochem J 260: 509-516  参照）。
【００４２】
薬学的用途及び医学的用途には、天然ヒトコラーゲンのアミノ酸配列と非常に類似した、若しくは同一の組換えゼラチン性ポリペプチドが好ましい。より好ましくは、ゼラチン性ポリペプチドのアミノ酸配列は、ヒトコラーゲンの選択されたアミノ酸配列の繰り返し使用によって設計されている。ＲＧＤモチーフを含む天然コラーゲン配列が選択される。かかる選択された配列におけるＲＧＤモチーフの割合は、選択された配列の選択した長さに依存し、短い配列を選択すると、ＲＧＤ割合が高くなる。選択されたアミノ酸配列の繰り返し使用によって、より高い分子量の非抗原性で、（天然ゼラチン又はコラーゲンと比較して）ＲＧＤモチーフの数が増加したゼラチンとなる。
【００４３】
したがって、好ましい実施態様において、組換えゼラチン性ポリペプチドは、自然の（native）ヒトコラーゲン配列の一部を含む。好ましくは、ＲＧＤ強化ゼラチン性ポリペプチドは、少なくとも８０％の、１又は複数の自然ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなる。好ましくは、ヒトコラーゲン配列の各部分は、少なくとも３０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも４５アミノ酸長、もっとも好ましくは少なくとも６０アミノ酸長、例えば最大２４０、好ましくは最大１５０、もっとも好ましくは最大１２０アミノ酸長であり、各部分が１又は複数のＲＧＤ配列を含むことが好ましい。好ましくは、ＲＧＤ強化ゼラチン性ポリペプチドは、１又は複数の自然ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなる。
【００４４】
本発明の組換え粒子を調製するためのゼラチン性ポリペプチドの適切な源としては、ヒトＣＯＬ１Ａ１−１が挙げられる。ＲＧＤ配列を含む２５０アミノ酸の一部は、国際公開公報第０４／８５４７３号に記載されている。コラーゲン性ポリペプチドのＲＧＤ配列は、インテグリンと呼ばれる細胞壁の特定のレセプターに接着することができる。かかるインテグリンは、アミノ酸配列に結合する細胞を認識するという特性で異なる。天然ゼラチンと、例えばフィブロネクチンは、ＲＧＤ配列を含んでもよく、ゼラチンはフィブロネクチンに結合しない細胞に結合することができ、その逆もなりたつ。したがって、ＲＧＤ配列を含むフィブロネクチンは、細胞接着を目的として、いつもゼラチンと置換できるわけではない。
【００４５】
上記の通り、ＲＧＤ強化ゼラチン性ポリペプチドは、欧州特許第０９２６５４３号、欧州特許第１０１４１７６号、又は国際公開公報第０１／３４６４６号に開示される組換え方法で製造することができる。本発明の細胞担体粒子を調製するに適切なゼラチン性ポリペプチドの製造及び精製については、欧州特許第０９２６５４３号及び欧州特許第１０１４１７６号の実施例を参照する。ＲＧＤ強化ゼラチン性ポリペプチドを製造する方法は、好ましくは、ＲＧＤアミノ酸配列を含むコラーゲンタンパク質の一部をコードする天然核酸配列から開始する。この配列をリピートすることにより、ＲＧＤ強化ゼラチン性ポリペプチドが得られる。
【００４６】
Ｘ−ＲＧＤ−Ｙが、天然コラーゲンアミノ酸配列の一部である場合、３つのＲＧＤアミノ酸配列を有するゼラチン性ポリペプチド（の一部）は、−Ｘ−ＲＧＤ−Ｙ−（ＧＸＹＧ）ｍ−Ｘ−ＲＧＤ−Ｙ−（ＧＸＹＧ）ｎ−Ｘ−ＲＧＤ−Ｙ−の構造を有する。かかる式中、ｍ及びｎは０から出発する整数である。全アミノ酸のＲＧＤ配列の番号であるｎを変更することにより、ＲＧＤモチーフの割合を管理することができる。この方法の明らかな利点は、アミノ酸配列がもっとも天然であり、したがって、臨床応用で免疫応答を誘導する危険がもっとも低いことである。
【００４７】
ゼラチン性ポリペプチド（の一部）をコードする天然核酸配列から出発すると、点変異が応用でき、ＲＧＤ配列をコードする配列を産出することができる。既知のコドンに基づいて、変異後のＲＧＸ配列がＲＧＤ配列を産出するように、点変異が行われ、またＹＧＤ配列はＲＧＤ配列を産出するために変異することができる。また、ＹＧＸ配列がＲＧＤ配列となるように、２つの変異を行うこともできる。また、１又は複数のヌクレオチドを挿入、或いは１又は複数のヌクレオチドを削除して、所望のＲＧＤ配列を産出することができる。
【００４８】
したがって、ゼラチン性ポリペプチドは、適切な微生物によって、かかるポリペプチドをコードする核酸配列の発現によって生産されることができる。プロセスは、真菌細胞又は酵母細胞で行うことができる。適切な宿主細胞としては、ハンゼヌラ、トリコデルマ、アスペルギルス、クリュイベロミセス、アカパンカビ、又はピチア等の高度発現宿主細胞である。反復配列の不適切な発現に対する感受性が低いため、真菌細胞又は酵母細胞は細菌より好ましい。もっとも好ましくは、宿主は、発現するコラーゲンの構造を攻撃するような高いレベルのプロテアーゼを有さないことである。この点では、ピチア又はハンゼヌラは、非常に適切な発現システムの例を提供している。発現システムとしてのピチア・パストリス（Pichia  pastoris）の使用は、欧州特許第０９２６５４３号及び欧州特許第１０１４１７６号に開示されている。微生物は、特にプロリンの水酸化及びリシンの水酸化等の、活性化した翻訳後のプロセッシング機構を含んでなくてもよい。あるいは、宿主システムは、それによってゼラチン性ポリペプチドが、非常に効率的に水酸化される内因性プロリン水酸化活性を有してもよい。本明細書中に記載の必要なパラメーターに基づいて、既知の工業的酵素から真菌宿主細胞、特に酵母細胞を産生する適切な宿主細胞を選択し、宿主細胞及び発現する配列に関する知識と組み合わせて、宿主細胞を、人工皮膚として使用するために適切なゼラチン性ポリペプチドの発現に適切とすることは、当業者であれば行うことができる。
【００４９】
別の実施態様において、細胞担体粒子を産生する組換えゼラチン性ポリペプチドは、天然発生ゼラチンより高いガラス転移温度を有する。かかる配列は、国際公開公報第０５／１１７４０号に記載されている。
【００５０】
さらなる実施態様では、細胞担体粒子を作成するために用いられるゼラチンはグリコシル化が低い。グリコシル化が低い、又は欠如していることを確認する方法は多数存在する。グリコシル化は、翻訳後の修飾であり、それにより炭水化物がコバレントに、タンパク質又はポリペプチドの一定のアミノ酸に接着する。したがって、アミノ酸配列及びアミノ酸配列が産出される宿主細胞（及び酵素、特にその中のグリコシルトランスフェラーゼ）の両方が、グリコシル化パターンを決定する。グリコシル化には２種類ある。Ｎ−グリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アクチルグルコサミン）とアスパラギンのアミド基（Ｎ又はＡｓｎ）の結合より開始し、Ｏ−グリコシル化は、ＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）をアミノ酸セリン（Ｓ又はＳｅｒ）又はスレオニン（Ｔ又はＴｈｒ）のヒドロキシ基を共通に結合する。
【００５１】
グリコシル化は、したがって、適切な発現宿主の選択、及び／又は宿主グリコシルトランスフェラーゼにより認識されるコンセンサス部位が欠如する配列を修飾又は選択することによって制御することができ、特に低減又は予防することができる。明らかに、タンパク質又はポリペプチドの化学合成は、非グリコシル化タンパク質をもたらす。また、グリコシル化タンパク質は、炭水化物の全て又は大部分を除去して産出して処理することができるし、又は非グリコシル化タンパク質は既知の方法により、グリコシル化タンパク質から単離することができる。
【００５２】
酵母においては、アスパラギンのＮ−結合グリコシル化は、コンセンサス部位Ａｓｎ―Ｘ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ（式中Ｘはアミノ酸である）で起きる。一般的に、酵母でのグリコシル化は、マンノースのＮ結合及びＯ結合単糖となる。したがって、酵母における発現には、核酸配列は、コンセンサス部位が低減或いは好ましくは欠如しているよう、修飾又は選択されることが好ましい。Ａｓｎコドン及び／又はＴｈｒコドンは、突然変異又はデノボ合成によって修飾されうる。好ましくは、Ａｓｎコドン及び／又はＴｈｒコドンは、別のアミノ酸によって置換される。また、Ａｓｐも別のアミノ酸によって置換されてもよい。ある実施態様では、ポリペプチド配列は、Ｓｅｒ及び／又はＡｓｎを含まない。
【００５３】
翻訳後の修飾のレベルを分析するために、又はグリコシル化の内容を決定するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法質量分析）等の質量分析を当該技術で知られている通りに行ってもよい。
【００５４】
或いは、グリコシル化の量は、Michel Dubois et al, "Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances", Analytical Chemistry, vol 28, No.3, March 1956, 350 356に記載されている滴定方法を用いて決定してもよい。この方法は、還元性基を含まない又は含まない可能性のあるメチルエーテルを含む、単純な糖、単糖、多糖、及びその誘導体を決定するために用いることができる。
【００５５】
ゲラチン性ポリペプチドのグリコシル化の内容は、好ましくは約２（ｍ／ｍ）％以下、より好ましくは約１（ｍ／ｍ）％以下、もっとも好ましくは約０．５（ｍ／ｍ）％、約０．２（ｍ／ｍ）％、又は約０．１（ｍ／ｍ）％以下である。好ましい実施態様において、グリコシル化のレベルは０である。グリコシル化のレベルとは、例えば上記のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法質量分析）又はDuboisによる滴定方法によって決定される、コラーゲン性ポリペプチドのユニット重量あたりの、全炭水化物重量を意味する。『グリコシル化』なる用語は、単糖だけでなく、ジ、トリ、又はテトラサッカリド等の多糖も意味する。
【００５６】
本発明の組換え粒子上に、接着及び／又はそこで育成することができる細胞は、遺伝的に修飾された生細胞か、悪性生細胞であってもよい。好ましくは、繊維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、心筋培養細胞等のヒト（又は哺乳類）細胞である。好ましい実施態様では、細胞は、治療する対象から入手する。
【００５７】
１つの実施態様では、粒子はＲＧＤモチーフを含まない。細胞の選択性接着が起きる場合、又は接着がＲＧＤ配列に依存しない場合に用いることができる。ＲＧＤ−アンカレッジ依存細胞からの競争は、かかる粒子では防止することができ、これは天然ゼラチンから作成された粒子では不可能である。好ましくは、かかる粒子は、マクロ多孔性粒子である。
【００５８】
組換えゼラチンポリペプチドは、ホルモン、成長プロモーター、抗生物質、免疫抑制剤等の生物活性化合物をさらに１又は複数含んでもよい。さらに、細胞担体粒子は、創傷治癒過程で有用となる１又は複数の化合物を含んでもよい。『生物活性化合物（bioactive compound）』とは、他の細胞において、生物学的な効果を発揮するあらゆる化合物（天然化合物又は合成化合物）である。かかる化合物は、当該技術において幅広く入手することができる。化合物は、製造過程において、粒子内に取り込まれてもよいし、粒子にその後添加してもよい。１つの実施態様では、組換え粒子を含む２つの細胞担体バッチが提供され、各細胞担体バッチは、異なる細胞又は生物活性化合物を有し、２つのバッチを混合した後に注入されてもよいし、連続して注入してもよい。
【００５９】
細胞担体粒子の平均サイズは、１〜５００ミクロンである。
１つの実施態様では、粒子は、注入可能な細胞担体として適切であり、粒子の平均サイズは、２００μ以下、例えば１０〜２００μ、又は１０〜１７５μ、又は１０〜１５０μ、又は１０〜１２５μである。あるいは、かかる粒子の平均サイズは、１００μ以下であり、例えば１０〜７５μである。注入可能な細胞担体は、例えば心筋の瘢痕に心筋培養細胞の送達等の侵襲的手術を行わずに、組織を回復する細胞の送達に応用することができる。
【００６０】
別の実施態様では、粒子は、注入可能な組織充填剤、組織増大、形成外科、美容整形用に適切である。かかる応用では、粒子の平均サイズは、好ましくは１００μ以上である。１５０〜５００の粒子の平均サイズも好ましい。別の適切な粒子の平均サイズは、２２０、２５０、３００、３５０、４００及び４５０μｍである。組織充填剤又は増加剤として適切な粒子は、しこりが形成されずに、粒子の注入後に自然な印象を与えるために変形可能でなければならない。
【００６１】
さらに別の態様では、組換えコラーゲン粒子は、インビトロ細胞培養用に孔性又は非孔性マイクロキャリアに適切である。好ましくは、マイクロキャリアの平均サイズは、１００〜２００μｍである。かかるマイクロキャリアは、当該技術において既知であり、例えば国際公開公報第２００３／１０４３１３号、国際公開公報第９０／１３６２５号、ＳＵ１７３８８５１、ＳＵ１３２１７４８及び『Pure gelatin microcarriers: synthesis and use in cell attachment and growth of fibroblasts and endothelial cells” - (Wisseman et al, In Vitro (1985) 21,7, 391-401)』に記載されている。
【００６２】
１つの実施態様において、細胞担体バッチは、単分散の組換え粒子の集団を含む。別の実施態様では、細胞担体は、１又は２以上の単分散組換え粒子集団の混合であり、各集団は異なる平均サイズを有する。
【００６３】
本発明の粒子は、当該技術において既知の方法で、組換えゼラチンより調製することができ、粒子は、組換えゼラチンの出発溶液から形成される。かかる方法は、油／水エマルジョン技術を用いた粒子形成を含み、例えば欧州特許第２２２７１８号又は国際公開公報第２００３／１０４３３１３号に記載の位相反転、或いはＳＵ１１６１５４８に記載されているような沈殿技術を含む。
［実施例］
【実施例１】
【００６４】
アセトン沈殿による、ゼラチンベース細胞担体粒子の調製
０．１ｍｌのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）の２５％溶液を添加した５０ｍｌのアセトンに、組換えゼラチン（配列番号１、２１ｋＤａ）の２０ｍｌの２％水溶液を添加、攪拌した。混濁分散は、攪拌せずに１０分間放置した。混合液を、５００ｍｌの水中に急冷した。粒子は、遠心分離及び水に再懸濁を３サイクル行って、残りのＥＤＣ及びアセトンから洗浄された。最終的に粒子は真空乾燥された。平均サイズ約２０μｍの粒子を得た（顕微鏡分析）。
【００６５】
同様に、ＲＧＤモチーフを含む組換えゼラチンで粒子を調製した。（配列番号２、２４ｋＤａ）。
【００６６】
比較するために、平均分子量２１ｋＤａの加水分解した牛骨（limed bone）ゼラチンを用いて粒子を上記の方法で調製した。
【００６７】
視覚による比較により、組換えゼラチンから調製された粒子はより均一なサイズを有し、つまりより単分散性であることが示された。
【実施例２】
【００６８】
細胞接着の比較
細胞の種類と培養条件
ミドリザル腎臓（ベロ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、健康なラット腎臓繊維芽（ＮＲＫ−４９Ｆ）細胞及びMadine Darby イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞をＡＴＣＣより購入した。４つ全ての細胞種を継代培養し、７５ｃｍ２フラスコで、３７℃で、５％ＣＯ２環境下で維持した。ベロ細胞及びＮＲＫ−４９Ｆ細胞は、ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地で培養した。ＣＨＯ細胞は、ハムＦ１２（Ham’s F-12 Nutrient Mixture）で培養し、ＭＤＣＫ細胞は、アール塩（Earle’s salt）とＭＥＭで培養した。
【００６９】
ベロ細胞及びＣＨＯ細胞において、培地に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００ユニット／ｍｌのペニシリン（最終ｐＨ  ７．１）を添加した。ＮＲＫ−４９Ｆ細胞では、ＤＭＥＭに５％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸（各０．１ｍＭ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び０．２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（最終ｐＨ  ７．１）を添加した。ＭＤＣＫ細胞では、ＭＥＭに１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、非必須アミノ酸（各０．１ｍＭ）及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び０．２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（最終ｐＨ  ７．１）を添加した。
【００７０】
各実験の前に細胞の生理学を統一するために、細胞を、マイクロキャリアビーズのイノキュレーションの２〜３日前に、１５０ｃｍ２フラスコに入れた。細胞をトリプシン化（０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳ内）して、フラスコより取り出した。マイクロキャリアの実験には、細胞を遠心分離により、トリプシン培地を除去し、細胞培地内に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。生細胞の濃度は、トリパン染色除去により決定した（０．９％食塩水内に０．４％トリパンブルー）。
【００７１】
スピナフラスコ内での細胞培養及び分析
細胞接着分析には、２０ｍｇ／ｍｌの細胞担体粒子を用いた。細胞濃度は、それぞれの細胞種で、１．５×１０５細胞／ｍｌであった。
細胞担体粒子は、２５０ｍｌのスピナ容器に維持した１００ｍｌの培養液で培養し、懸濁磁性羽根車で攪拌した（５０ｒｐｍ）。
【００７２】
細胞接着の動力学は、上清細胞濃度の低下として分析した。サンプル除去には、攪拌を一旦（約３０秒）停止し、その間細胞担体粒子を固定し、上清サンプルを、以下の通り細胞の定量化のために除去した。
細胞数は、０．１Ｍのクエン酸内に、同量のクリスタルバイオレット（０．１％ｗ／ｗ）を混合して細胞を染色して、血球計で計数した。培地からの細胞の減少は、ビーズに接着した細胞の指標として用いた。
【００７３】
培地から除去した細胞が、細胞担体粒子に接着した（溶解したのではなく）ことを確認するために、各細胞接着アッセイ終了時に、細胞担体粒子に接着した細胞を定量化した。よく攪拌した担体培地１ｍｌずつ等分したものを除去し、マイクロキャリアを固定し、固定した細胞担体粒子は、上記の通りクリスタルバイオレット／クエン酸に再懸濁した。１時間３７℃でインキュベートした後、懸濁液を、パスツールピペットで吸引し、吸出することによって、核を解放してせん断し、血球計で定量化した。
【００７４】
上記の方法で、従来のゼラチン性粒子と、ＲＧＤモチーフを含む組換え生産されたゼラチンから調製された粒子とを比較した（配列番号２）。細胞担体粒子を調製するための出発物質内のＲＧＤモチーフの割合は同じであったが（両方とも０．８％）、組換えコラーゲンより調製した粒子は、よりよい細胞接着性を有していた。これは、ＲＧＤが組換えコラーゲン内でより均一に存在し、よりよく分布していたことによる。
【配列表】
2009520501000001.xml
【国際調査報告】
2009520501.tif 000005
2009520501.tif 000006