(57)【要約】この発明は、細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プローブ試薬であって、蛍光又は発光蛋白質及びマーカー蛋白質を含むか、蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質及び調節因子を含むか、あるいは蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質、切断配列及び調節因子を含み、ここで、マーカー蛋白質は、活性酸素による酸化ストレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、調節因子は、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可能である蛋白質であるプローブ試薬、並びにこのプローブ試薬を用いて、細胞で酸化ストレスを測定する方法、或いは、細胞で酸化ストレス抑制又は促進物質をスクリーニングする方法に関する。
2009107876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プローブ試薬であって、前記試薬が、蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質、切断配列及び調節因子を含む融合蛋白質からなり、ここで、前記マーカー蛋白質は、活性酸素による酸化ストレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、前記調節因子は、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可能である蛋白質であり、前記蛍光又は発光蛋白質と前記マーカー蛋白質は、任意の順序で互いに隣りあって連結体を形成しており、前記切断配列は、前記連結体と前記調節因子との間に配置されかつ切断可能な配列を含み、並びに、前記試薬が細胞又は生物内において前記切断配列で切断されて、前記連結体と調節因子とが分離されて存在し、及び、調節因子とマーカー蛋白質との結合又は解離によってマーカー蛋白質の分解を促進又は抑制することを特徴とする、前記プローブ試薬。
【請求項２】
Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、（１）蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質、切断配列及び調節因子、（２）マーカー蛋白質、蛍光又は発光蛋白質、切断配列及び調節因子、（３）調節因子、切断配列、蛍光又は発光蛋白質、及びマーカー蛋白質、或いは、（４）調節因子、切断配列、マーカー蛋白質、及び蛍光又は発光蛋白質、の順に配置されている、請求項１に記載のプローブ試薬。
【請求項３】
前記マーカー蛋白質が分解されるとき、蛍光又は発光蛋白質も分解されて蛍光又は発光を発しなくなる、請求項１又は２に記載のプローブ試薬。
【請求項４】
前記調節因子の、活性酸素応答による構造変化が可逆的である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプローブ試薬。
【請求項５】
前記マーカー蛋白質の分解が、プロテアソームによるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプローブ試薬。
【請求項６】
前記酸化ストレスがリアルタイムで測定可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプローブ試薬。
【請求項７】
前記蛍光又は発光蛋白質と前記マーカー蛋白質との間にリンカーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプローブ試薬。
【請求項８】
前記蛍光又は発光蛋白質が、サンゴ又はオワンクラゲ由来の蛍光蛋白質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプローブ試薬。
【請求項９】
前記蛍光又は発光蛋白質が、ルシフェラーゼである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプローブ試薬。
【請求項１０】
前記マーカー蛋白質及び調節因子がそれぞれ、ヒトＮｒｆ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ３２１８８）及びヒトＫｅａｐ１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ２１９５７）、或いはそれらのホモログまたはそれらのアナログである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプローブ試薬。
【請求項１１】
前記プローブ試薬が配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡによってコードされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプローブ試薬。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプローブ試薬をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ。
【請求項１３】
配列番号７に示される塩基配列を含む、請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１５】
前記ＤＮＡの発現を可能にする制御配列をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプローブ試薬或いは請求項１４又は１５に記載のベクターを細胞又は生物（ヒトを除く）内に導入し、細胞内の蛍光又は発光強度に基いて酸化ストレスを測定することを含む、細胞での酸化ストレス測定方法。
【請求項１７】
前記測定が、リアルタイムで行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞又は生物（ヒトを除く）において酸化ストレスを測定する方法であって、前記方法が、
前記細胞又は生物において酸化ストレスの程度に応じて分解が制御されるマーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質との連結体、あるいは該連結体をコードする核酸を含むベクター、を前記細胞又は生物内に導入して、前記連結体を細胞又は生物内に存在させる工程と、
前記蛍光又は発光蛋白質に由来する蛍光又は発光量を測定することにより、前記連結体の分解が制御される程度に基いて前記細胞又は生物における酸化ストレスの存在又はそのレベルを決定する工程と、
を含み、ここで、前記マーカー蛋白質は調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、及び前記連結体の分解が、活性酸素に応答して調節因子によって制御されることを特徴とする、前記方法。
【請求項１９】
前記調節因子と前記マーカー蛋白質とが同種の生物由来のものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記調節因子が、外因性又は内因性のいずれかである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記外因性の調節因子が、該調節因子をコードするＤＮＡを含むベクターの形態で前記細胞又は生物内に導入される、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プローブ試薬であって、前記試薬が、マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質とを含む連結体を含み、ここで、前記マーカー蛋白質は、活性酸素による酸化ストレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、前記調節因子は、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可能である蛋白質であり、前記調節因子と前記マーカー蛋白質との結合又は解離によってマーカー蛋白質の分解が促進又は抑制されることを特徴とする、前記プローブ試薬。
【請求項２３】
請求項２２に記載のプローブ試薬をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ。
【請求項２４】
請求項２３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項２５】
細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プローブ試薬であって、前記試薬が、マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質とを含む連結体と、調節因子とを含み、前記連結体と前記調節因子とがリンカーを介して結合されており、ここで、前記マーカー蛋白質は、活性酸素による酸化ストレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、前記調節因子は、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可能である蛋白質であり、前記調節因子と前記マーカー蛋白質との結合又は解離によってマーカー蛋白質の分解が促進又は抑制されることを特徴とする、前記プローブ試薬。
【請求項２６】
酸化ストレスが負荷された細胞又は生物（ヒトを除く）内に、請求項１〜１１、２２及び２５のいずれか１項に記載のプローブ試薬或いは請求項１４、１５又は２４に記載のベクター及び候補物質を導入し、細胞又は生物内の蛍光又は発光強度を低下又は増大させる物質をスクリーニングすることを含む、酸化ストレス制御物質のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項１〜１１、２２及び２５のいずれか１項に記載のプローブ試薬、請求項１２、１３又は２３に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ、及び請求項１４、１５又は２４に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１つを含む、酸化ストレス測定用又は酸化ストレス制御物質スクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プローブ試薬に関する。
本発明はまた、上記プローブ試薬をコードする核酸、及び該核酸を含むベクターに関する。
本発明はさらに、上記プローブ試薬又はベクターを用いて、細胞又は生物での酸化ストレスを測定する方法、或いは、酸化ストレス制御物質のスクリーニング方法に関する。
本発明はさらに、上記プローブ試薬、核酸、又はベクターを含む、酸化ストレス測定用又は酸化ストレス制御物質スクリーニング用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酸化ストレスと呼ばれる細胞内で起こる過剰な酸化反応が、生体に有害な影響を及ぼすことがわかってきた。この酸化反応は活性酸素と呼ばれる、細胞内で生じる酸化力が強い分子種によって引き起こされる。活性酸素としては、過酸化水素，一重項酸素，ヒドロキシルラジカル，スーパーオキサイドアニオンなどが知られている。本来、活性酸素は免疫系での異物除去や有害分子の解毒作用などにも使われ、生体にとって有用な面も持つ。また、細胞には酵素や抗酸化能をもつ分子による活性酸素の消去系があり、発生した過剰な活性酸素は速やかに除去されるため、これによる悪影響は抑えられている。
しかし、活性酸素の生成と消去のバランスがくずれ、活性酸素の生成が過剰となることで、生体に有害な影響を与えるようになる。酸化ストレスにより、ＤＮＡ、蛋白質、脂質など、細胞の正常な活動に不可欠な分子が損傷を受け、その結果、癌や動脈硬化、心筋梗塞、糖尿病といった疾患や老化が引き起こされるといわれている。酸化ストレスが生じる原因としては、過度の運動や、運動不足、偏った食事、喫煙などといった不健康な生活習慣が挙げられており、酸化ストレスは現代の生活と密接に関係した問題となっている。
また、活性酸素は、虚血にさらされた臓器で、血流の再開時に起こる再灌流傷害の原因物質としても注目されている。血流が途絶えた臓器はその間、無酸素状態に置かれるが、再灌流後の急激な再酸素化によって大量の活性酸素が発生する。これが広範囲にわたる細胞に損傷を与え、臓器レベルの傷害を引き起こすと考えられている。このような傷害が生じるおそれが、虚血臓器の迅速な治療を困難なものにしている（非特許文献１）。
このように、活性酸素に関わる種々の問題が挙げられている状況で、生体内で発生する活性酸素の分布や量の変化を測定することが、疾患の発症や老化のメカニズムに関して重要な知見を与え、さらには有効な予防法や治療法の開発に大きく寄与するものと期待される。そのために、生体内で効率よく活性酸素の挙動を測定できる技術が要求されている。
酸化ストレスの原因となる活性酸素を測定する手法として、イソルミノール（ｉｓｏｌｕｍｉｎｏｌ）などの化学発光試薬によるものがある。これは、活性酸素による試薬の酸化反応にともなう発光現象を測定するものである。この反応は、白血球の免疫活性の評価法として、体内に侵入した異物を攻撃する際に放出する活性酸素を測定するためによく使われている（非特許文献２）。しかし、イソルミノールは細胞膜の透過性に乏しく、細胞外に放出される活性酸素の測定は行えるが、細胞内で発生する活性酸素の測定には向かない。また、この発光の強度は弱く、その計測に大量の細胞を必要としたり、高感度の検出器でも長時間の積算時間を要したりするため、効率のよい測定が困難である。
有機系の蛍光色素による測定も行われている。色素としては、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン、ジヒドロエチジウム（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｙｉｄｉｕｍ）などがよく使われている（非特許文献３）。これらは、非蛍光性の化合物であるが、活性酸素による酸化反応によりその構造が変化し蛍光性となる。すなわち、この蛍光を測定することで、その場の活性酸素の量を測定することできる。これらの試薬は細胞膜を通して細胞に導入することができる。しかし、細胞内の特定のオルガネラに選択的に取り込ませることはできず、特定の部位に限定した活性酸素の測定は困難である。さらに、これらの色素の蛍光の発光は不可逆であり、いったん酸化された分子はもはや活性酸素に対する反応性を失い、その後の測定に寄与できなくなる。
最近では、オワンクラゲなどから単離され、その特性が改良された蛍光蛋白質が、細胞内の生理活性を測定するためのプローブ試薬としてよく使われるようになっている。蛋白質により構成されるプローブ試薬は、その遺伝子としても扱うことができる。この遺伝子をプラスミドという形で細胞に取り込ませ、プローブ試薬として発現させることで測定に使用することができる。この手法では、生体内の特定の細胞や、細胞内の特定のオルガネラのみに限定してプローブ試薬を発現させることもでき、より限定された領域での生理活性の測定が可能となる。
蛍光蛋白質を利用した酸化ストレスプローブ試薬も開発されている。このような試薬は、活性酸素を検知するマーカー蛋白質に、蛍光蛋白質が結合された構造になっている。マーカー蛋白質としては、活性酸素との反応でその構造を変化させるものが使われる。その構造の変化が、蛍光蛋白質が発する蛍光の強度や波長を変化させるように設計されている。例えば、Ｈｙｐｅｒと呼ばれるプローブ試薬では、過酸化水素に特異的に反応する蛋白質がセンサー蛋白質として使われ、これが蛍光蛋白質であるＹＦＰと結合した構造になっている。過酸化水素がセンサー蛋白質と作用することでＹＦＰの蛍光強度を変化させる（非特許文献４）。別の例として、蛍光エネルギー移動の現象を応用したものがある。このプローブ試薬では、２種類の蛍光波長が異なる蛍光蛋白質がセンサー蛋白質を挟み込んだ構造をとっている。センサー蛋白質の活性酸素との反応で生じる構造の変化が、両端にある蛍光蛋白質間の距離を変化させる。この変化がエネルギー移動の効率に変化を与えている。この試薬では、蛍光スペクトルの変化から活性酸素をモニタすることができる（特許文献１）。しかし、このようなセンサー蛋白質の構造変化に基づく試薬の蛍光の変化は数倍程度と小さく、特に活性酸素の発生量が少ないときにはその検出が困難になる。
細胞には酸化ストレスにさらされると、それに対する防御反応として発現される蛋白質がある。細胞に対する酸化ストレスはこのような蛋白質の増加量を測定することでも検出できる。筋肉で酸化ストレスが測定された例では、ＴＮＦα，ｐＩκＢなどの蛋白質がその指標として測定されている（特許文献２）。この手法では、目的とする蛋白質をウェスタンブロッティング法などの生化学的な手法で測定する。そのために、細胞を破壊し内部の蛋白質を抽出し、さらにこれらを分離するなど煩雑な作業を要し、生きた細胞で迅速かつ継続的な活性酸素の測定は行えない。
【特許文献１】特開２００５−９５１７１
【特許文献２】特開２００６−１６２３４６
【非特許文献１】Ｄｒｏｇｅ，Ｗ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８２，４７−９５，２００２
【非特許文献２】Ｄａｈｌｇｒｅｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ａ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２３２，３−１４，１９９９
【非特許文献３】Ｍｕｎｚｅｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２２，１７６１−１７６８，２００２
【非特許文献４】Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｖ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３，２８１−２８６，２００６
【発明の開示】
【０００３】
背景技術のなかで取りあげたように、活性酸素に関わる種々の問題が挙げられている状況で、生体内で発生する活性酸素の分布や量の変化を精確に測定することが、活性酸素が関係する種々の疾患の発症や老化のメカニズムに関して重要な知見を与え、さらには有効な予防法や治療法の開発に大きく寄与するものと期待されている。しかし、現在使用されている又は提案されている酸化ストレスを引き起こす活性酸素の測定法には、個々に、上記のような問題点が指摘されている。そのために、そのような問題点を克服して生体内で効率よく活性酸素の挙動を測定できる技術が要望されている。
したがって、本発明の目的は、活性酸素に対する応答が可逆的であり、それによって細胞又は生物内で酸化ストレスを連続的にかつリアルタイムでモニタできる蛍光又は発光プローブ試薬を提供することである。
本発明の別の目的は、上記プローブ試薬又は該試薬をコードするＤＮＡを含むベクターを用いて、細胞又は生物内で酸化ストレスを測定する方法、或いは、細胞又は生物内で酸化ストレスを抑制又は促進させる物質をスクリーニングする方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、上記プローブ試薬、上記ＤＮＡもしくはＲＮＡ、或いは上記ベクターを含む、酸化ストレス関連測定用キットを提供することである。
上記課題を解決するために、本発明者は、今回、生細胞で酸化ストレスの動態をモニタすることが可能である新規の蛍光プローブ試薬を見出した。このプローブ試薬は、２〜４種のエレメント、すなわち、少なくとも蛍光又は発光蛋白質及びマーカー蛋白質を含み、場合により調節配列、又は切断配列と調節因子、をさらに含む融合蛋白質から構成されており、該プローブ試薬をコードする核酸（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を細胞又は生物に導入し細胞内で発現させることによって、蛍光又は発光蛋白質の蛍光又は発光強度の変化から酸化ストレスの増減をモニタすることを可能にする。また、細胞自身がもつ蛋白質の分解反応を利用することで、酸化ストレスの変化に応じてプローブ試薬の存在量がダイナミックに変化するため、大きな蛍光強度の変化を得ることができる。このような連続的なモニタリングを可能にするプローブの特徴は、活性酸素に対する応答が可逆的であることに基く。
要約すると、本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プローブ試薬であって、前記試薬が、蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質、切断配列及び調節因子を含む融合蛋白質からなり、ここで、前記マーカー蛋白質は、活性酸素による酸化ストレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、前記調節因子は、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可能である蛋白質であり、前記蛍光又は発光蛋白質と前記マーカー蛋白質は、任意の順序で互いに隣りあって連結体を形成しており、前記切断配列は、前記連結体と前記調節因子との間に配置されかつ切断可能な配列を含み、並びに、前記試薬が細胞内において前記切断配列で切断されて、前記連結体と調節因子とが分離されて存在し、及び、調節因子とマーカー蛋白質との結合又は解離によってマーカー蛋白質の分解を促進又は抑制することを特徴とする、前記プローブ試薬。
（２）Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、（ｉ）蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質、切断配列及び調節因子、（ｉｉ）マーカー蛋白質、蛍光又は発光蛋白質、切断配列及び調節因子、（ｉｉｉ）調節因子、切断配列、蛍光又は発光蛋白質、及びマーカー蛋白質、或いは、（ｉｖ）調節因子、切断配列、マーカー蛋白質、及び蛍光又は発光蛋白質、の順に配置されている、上記（１）に記載のプローブ試薬。
（３）上記マーカー蛋白質が分解されるとき、蛍光又は発光蛋白質も分解されて蛍光又は発光を発しなくなる、上記（１）又は（２）に記載のプローブ試薬。
（４）上記調節因子の、活性酸素応答による構造変化が可逆的である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のプローブ試薬。
（５）上記マーカー蛋白質の分解が、プロテアソームによるものである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のプローブ試薬。
（６）上記酸化ストレスがリアルタイムで測定可能である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のプローブ試薬。
（７）上記蛍光又は発光蛋白質と前記マーカー蛋白質との間にリンカーを含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のプローブ試薬。
（８）上記蛍光又は発光蛋白質が、サンゴ又はオワンクラゲ由来の蛍光蛋白質である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のプローブ試薬。
（９）上記蛍光又は発光蛋白質が、ルシフェラーゼである、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のプローブ試薬。
（１０）上記マーカー蛋白質及び調節因子がそれぞれ、ヒトＮｒｆ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ３２１８８）及びヒトＫｅａｐ１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ２１９５７）、或いはそれらのホモログ又はそれらのアナログである、上記（１）〜（９）のいずれかに記載のプローブ試薬。
（１１）前記プローブ試薬が配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡによってコードされる、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のプローブ試薬。
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のプローブ試薬をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ。
（１３）配列番号７に示される塩基配列を含む、上記（１２）に記載のＤＮＡ。
（１４）上記（１２）又は（１３）に記載のＤＮＡを含むベクター。
（１５）上記ＤＮＡの発現を可能にする制御配列をさらに含む、上記（１４）に記載のベクター。
（１６）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のプローブ試薬或いは上記（１４）又は（１５）に記載のベクターを細胞又は生物（ヒトを除く）内に導入し、細胞又は生物内の蛍光又は発光強度に基いて酸化ストレスを測定することを含む、細胞での酸化ストレス測定方法。
（１７）前記測定が、リアルタイムで行われる、上記（１６）に記載の方法。
（１８）細胞又は生物（ヒトを除く）において酸化ストレスを測定する方法であって、前記方法が、前記細胞又は生物において酸化ストレスの程度に応じて分解が制御されるマーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質との連結体、あるいは該連結体をコードする核酸を含むベクター、を前記細胞又は生物内に導入して、前記連結体を細胞又は生物内に存在させる工程と、前記蛍光又は発光蛋白質に由来する蛍光又は発光量を測定することにより、前記連結体の分解が制御される程度に基いて前記細胞又は生物における酸化ストレスの存在又はそのレベルを決定する工程と、を含み、ここで、前記マーカー蛋白質は調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、及び前記連結体の分解が、活性酸素に応答して調節因子によって制御されることを特徴とする、前記方法。
（１９）前記調節因子と前記マーカー蛋白質とが同種の生物由来のものである、上記（１８）に記載の方法。
（２０）前記調節因子が、外因性又は内因性のいずれかである、上記（１８）又は（１９）に記載の方法。
（２１）前記外因性の調節因子が、該調節因子をコードするＤＮＡを含むベクターの形態で前記細胞又は生物内に導入される、上記（１８）〜（２０）のいずれかに記載の方法。
（２２）細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プローブ試薬であって、前記試薬が、マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質とを含む連結体を含み、ここで、前記マーカー蛋白質は、活性酸素による酸化ストレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、前記調節因子は、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可能である蛋白質であり、前記調節因子と前記マーカー蛋白質との結合又は解離によってマーカー蛋白質の分解が促進又は抑制されることを特徴とする、前記プローブ試薬。
（２３）上記（２２）に記載のプローブ試薬をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ。
（２４）上記（２３）に記載のＤＮＡを含むベクター。
（２５）細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プローブ試薬であって、前記試薬が、マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質とを含む連結体と、調節因子とを含み、前記連結体と前記調節因子とがリンカーを介して結合されており、ここで、前記マーカー蛋白質は、活性酸素による酸化ストレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、前記調節因子は、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可能である蛋白質であり、前記調節因子と前記マーカー蛋白質との結合又は解離によってマーカー蛋白質の分解が促進又は抑制されることを特徴とする、前記プローブ試薬。
（２６）酸化ストレスが負荷された細胞又は生物（ヒトを除く）内に、上記（１）〜（１１）、（２２）及び（２５）のいずれかに記載のプローブ試薬或いは上記（１４）、（１５）又は（２４）に記載のベクター及び候補物質を導入し、細胞内の蛍光又は発光強度を低下又は増大させる物質をスクリーニングすることを含む、酸化ストレス制御物質のスクリーニング方法。
（２７）上記（１）〜（１１）、（２２）及び（２５）のいずれかに記載のプローブ試薬、上記（１２）、（１３）又は（２３）に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ、及び上記（１４）、（１５）又は（２４）に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１つを含む、酸化ストレス測定用又は酸化ストレス制御物質スクリーニング用キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−０４９８９５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明の蛍光酸化ストレスプローブ試薬が取りうる４つの構造を示す。マーカー蛋白質内のＲ及びＵはそれぞれ、調節因子結合部位、ユビキチン結合部位を示す。
図２は、本発明の蛍光酸化ストレスプローブをコードするＤＮＡ構造の模式図を示す。
図３ａは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に１００μＭになるようＤＥＭ（マレイン酸ジエチル（酸化ストレス誘導剤））を添加した後の顕微鏡画像の時間変化（時：分）を示す。
図３ｂは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に１００μＭ  ＤＥＭ（黒丸）又はコントロールとしての０．１％エタノール（ＥｔＯＨ）（白丸）になるよう添加した後の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。横軸は時間（ｈ）、縦軸は蛍光強度を表す。
図４ａは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に１００μＭになるようＤＥＭを添加した後の顕微鏡画像の時間変化（時：分）を示す。ＤＭＥを添加した後、１５時間後に培地交換（「ｗａｓｈ」）しＤＥＭを除去した。
図４ｂは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に１００μＭになるようＤＥＭを添加した後の蛍光強度の時間変化を示す。ＤＥＭを添加した後、１５時間後に培地交換（「ｗａｓｈ」）しＤＥＭを除去した。横軸は時間（ｈ）、縦軸は蛍光強度を表す。
図５ａは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に１０μＭになるようＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤；Ｓｉｇｍａ社）を添加した後の顕微鏡画像の時間変化（時：分）を示す。
図５ｂは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に１０μＭ  ＭＧ１３２（黒丸）、又は０．１％ＤＭＳＯ（コントロール；白丸）になるよう添加した後の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。横軸は時間（ｈ）、縦軸は蛍光強度を表す。
図６は、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に１００μＭ  ＤＥＭ、０．１％ＥｔＯＨ、１０μＭ  ＭＧ１３２、又は０．１％ＤＭＳＯになるよう添加し、８時間経過した後の抗Ｎｒｆ２抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。＊は、ｍＫＯ２−Ｎｒｆ２を示し、＊＊は、Ｔ２Ａで分かれていないｍＫＯ２−Ｎｒｆ２−Ｔ２Ａ−Ｋｅａｐ１を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明をさらに詳細に説明する。
１．新規プローブ試薬
上で述べたような、従来の酸化ストレス測定法の問題点を克服したプローブ試薬（単に、「プローブ」と称してもよい）を開発した。この試薬は実質的に蛋白質で作られており、その蛋白質をコードする核酸（例えば、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの化学修飾体）を細胞又は生物に導入することで、細胞又は生物内に発現させ機能させることができる。構造の一部として蛍光又は発光蛋白質および酸化ストレスを検知するマーカー蛋白質を含み、蛍光又は発光蛋白質の蛍光又は発光強度の変化から酸化ストレスの増減をモニタする。細胞自身がもつ蛋白質の分解反応を利用することで、酸化ストレスの変化に応じてプローブ試薬の存在量がダイナミックに変化するため、大きな蛍光又は発光強度の変化を得ることができる。またその応答は可逆的であり、酸化ストレスの増減を生細胞又は生物で連続的にモニタすることができる。以下に、このプローブ試薬の特徴を述べる。
本発明においては、関連した次のプローブ試薬が提供される。
第１のプローブ試薬は、マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質を含む連結体を含むものである。この連結体が細胞内又は生物内に導入されると（この場合、該連結体をコードする核酸を発現可能に含むベクターを細胞内又は生物内に導入してもよい）、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御する調節因子と該連結体との相互作用を介して、活性酸素による酸化ストレスの存在又はレベル（もしくは程度）を測定することを可能にする。
本発明の第２のプローブ試薬は、蛍光又は発光を発する蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御する調節因子、および切断配列を含み、これらのエレメントを１本のアミノ酸鎖として連結した融合蛋白質である。その構造を図１に示す。
図１に示すように、本発明のプローブ試薬は、４つの可能な構造：すなわち、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、（１）蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質、切断配列及び調節因子、（２）マーカー蛋白質、蛍光又は発光蛋白質、切断配列及び調節因子、（３）調節因子、切断配列、蛍光又は発光蛋白質、及びマーカー蛋白質、或いは、（４）調節因子、切断配列、マーカー蛋白質、及び蛍光又は発光蛋白質、の順に配置された構造を含むことができる。
第３のプローブ試薬は、上記連結体と調節因子を含み、これらがリンカーを介して結合されているプローブである。リンカーは、調節因子が、連結体を構成するマーカー蛋白質上の調節因子結合部位に結合可能な程度の長さを有しているべきである。リンカーは、例えば、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸又はこれらのミックスからなるペプチド性又はポリペプチド性リンカーであり、具体的には１８アミノ酸程度のリンカーであっても、又は１４２アミノ酸程度のリンカーであっても、本発明の上記効果を達成しうる。
本発明のプローブ試薬では、蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋白質は隣り合って連結されている。配列としてそのどちらがＮ末端側、Ｃ末端側にあってもよい。また、蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋白質の間にリンカー（例えば１又は数個のアミノ酸からなるリンカー、例えば１０アミノ酸以下のペプチド）が含まれてもよい。マーカー蛋白質には、調節因子を結合する部位と、細胞内に存在し蛋白質の分解に関与するユビキチンと呼ばれる蛋白質分子が結合する部位がある。
切断配列は、蛍光蛋白質−マーカー蛋白質の連結体と調節因子の間にある。蛍光又は発光蛋白質−マーカー蛋白質の連結体と調節因子は、切断配列をはさんで、そのどちらがＮ末端側、Ｃ末端側にあってもよい。
本発明のプローブ試薬は、蛋白質の形態で細胞内に直接導入してもよいし、或いは該プローブ試薬をコードするＤＮＡを発現可能に含むベクターを細胞内に導入することによって細胞内で発現、翻訳されてもよい。プローブ試薬のうち上記第２のプローブ試薬は、細胞内で（導入後又は翻訳後に）自動的に切断配列で切断されて、蛍光又は発光蛋白質−マーカー蛋白質の連結体と調節因子が分離される。本発明によれば、調節因子は、活性酸素との反応によりその構造を変化させ、マーカー蛋白質に結合または解離することでマーカー蛋白質の分解を促進または抑制するため、このことが酸化ストレスの定性的又は定量的測定を可能にする。
蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋白質は、好ましくは、マーカー蛋白質が分解されたときに蛍光又は発光蛋白質も続けて分解され、蛍光又は発光を発しなくなるように連結した形となっている。
調節因子として、活性酸素との反応での構造変化が可逆的に起こるものを選択することで、プローブ試薬の酸化ストレスに対する応答性を可逆的にすることができる。酸化ストレスの変化をより大きな蛍光又は発光の変化として示すために、調節因子としては、細胞が受ける程度の酸化ストレス量でマーカー蛋白質の分解を強く促進、あるいは抑制するものを使うことが望ましい。
酸化ストレスは、上述したように、細胞内で起こる過剰な酸化反応（すなわち、酸化−抗酸化因子のバランスが酸化の方向に傾いた状態）が生体に有害な影響を及ぼすことであり、この酸化反応は活性酸素と呼ばれる、細胞内で生じる酸化力が強い分子種によって引き起こされる。活性酸素としては、過酸化水素、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキサイドアニオンなどが知られている。また、前述したように、活性酸素の生成が過剰となること、すなわち酸化ストレスにより、細胞の正常な活動に不可欠な分子が損傷を受け、その結果、癌、動脈硬化、心筋梗塞、糖尿病などの疾患、老化が引き起こされる。さらにまた、活性酸素は、虚血又は低酸素状態にさらされた臓器で、血流の再開時に起こる再灌流傷害の原因物質としても知られている。本発明は、酸化ストレスが影響するこのような疾患の検出や予防管理のために有用である。
マーカー蛋白質と調節因子は、生体に存在するそのままの形態の蛋白質を使用してもよいし、プローブ試薬の能力を向上させるために、その一部を人工的に改変したものを使用してもよい。人工的改変の例は、マーカー蛋白質Ｎｒｆ２のＣ末端部位欠損である。欠損の程度は、調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を損なわないで、かつ、蛋白質のネイティブの立体構造（コンフォメーション）を実質的に保持するような程度であることが望ましい。プローブ試薬の能力とは、例えば細胞内での発現効率、マーカー蛋白質と調節因子との結合の強さ、酸化ストレスに対する応答の速さや大きさなどである。
本発明のプローブ試薬の酸化ストレスに応じた分解には、細胞自身がもつユビキチン−プロテアソーム系による蛋白質分解反応を利用する。ユビキチンが結合した蛋白質は、蛋白質分解酵素複合体であるプロテアソームによって分解される。この分解系は真核細胞に普遍的に存在するものであるため、あらゆる種類の細胞（例えばヒト細胞を含む動物細胞、植物細胞、酵母細胞、菌類細胞など）、及び真核生物（ヒトを除く哺乳動物、鳥類、両生類、爬虫類、魚類、昆虫などの動物、植物、酵母、菌類など）を測定対象とすることができる。
以下に、本発明のプローブ試薬を構成するエレメントの具体例を挙げるが、それらに限定されないものとする。
蛍光蛋白質としては、オワンクラゲ由来のＧＦＰ，ＥＢＦＰ，ＥＣＦＰ，ＥＧＦＰ，ＥＹＦＰなどやこれらから派生したもの、またサンゴ由来のＤｓＲｅｄ，ＨｃＲｅｄ，ｍＣｈｅｒｒｙなどやこれらから派生したものなどを使用することができるが、これらに限定せずに、蛍光蛋白質であれば任意のものを使用できる。これらの蛋白質は、レーザー等により励起されると、基底状態に戻るときに発光する。蛍光蛋白質の種類によって異なるが、励起波長域は例えば約３５０〜６００ｎｍであり、発光波長域は例えば約５００〜６００ｎｍである。或いは、蛍光蛋白質の位置にホタルなどがもつ生物発光反応を触媒する酵素であるルシフェラーゼを配置してもよい。蛍光蛋白質を発光させるためには、外部から励起光を照射させる必要がある。そのため、自家蛍光が強い試料や光照射が生理活性に影響を与える試料の場合には測定が困難になる。発光法では励起光が不要で、ルシフェリンなどの発光基質を細胞に与えることで反応が進むため、励起光の照射が困難な試料に対しても測定が行えるようになるという利点を有する。上記のような蛍光又は発光蛋白質は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓなどから市販されている。
マーカー蛋白質及び調節因子の組み合せとしては、ヒト由来のＮｒｆ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ３２１８８）及びＫｅａｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ２１９５７）をそれぞれ例示することができるが、他の生物種（例えば動物種）に由来する同機能をもつホモログ蛋白質の組み合わせを使用してもよい。また、マーカー蛋白質としては、調節因子結合部位とユビキチン結合部位をともに含んでいれば、その一部のドメインのみを使用してもよくプローブ試薬として機能することができる。
Ｎｒｆ２は細胞内において酸化ストレスに応答して、これに対する防御機能を担う抗酸化蛋白質の発現を誘導する転写因子として働いている。細胞に酸化ストレスがない状態では、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１と結合した形で細胞質に存在している。このときＫｅａｐ１はさらにユビキチンリガーゼ複合体と結合して、Ｎｒｆ２のユビキチン化を促進している。ユビキチン化されたＮｒｆ２は蛋白質分解酵素複合体であるプロテアソームによって分解を受けるため、その増加が抑えられている状態にある。一方、細胞が酸化ストレスにさらされると、活性酸素がＫｅａｐ１と反応し、その構造に変化を与える。この構造変化によりＫｅａｐ１がＮｒｆ２から解離することでＮｒｆ２のユビキチン化が抑えられる。これにより分解が抑制されたＮｒｆ２は、細胞内での量を増加させ、転写因子としての機能を発揮するようになる。Ｎｒｆ２の標的遺伝子として、シスチントランスポーター、グルタチオンシンターゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン、チオレドキシンなどが報告されており、Ｎｒｆ２はこれらの遺伝子発現を統一的に制御して生体を酸化ストレスから防御している。Ｎｒｆ２の活性を制御する因子が、Ｋｅａｐ１である。Ｎｒｆ２／Ｋｅａｐ１を介した酸化ストレス防御機構については、伊東健、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）７８（２）ｐｐ．７９−９２（２００６）（日本）に総説されている。
このように、好ましくは、本発明で使用可能なマーカー蛋白質は、生体を酸化ストレスから防御するために発現される遺伝子類を統一的に制御するような蛋白質（例えば転写因子）であり、また、調節因子は、マーカー蛋白質の活性を制御する蛋白質である。このようなマーカー蛋白質と調節因子の他の組み合わせは、例えば低酸素検出するマーカー蛋白質であるＨＩＦ１−αとその調節因子であるｐＶＨＬを挙げることができる（Ｍ  Ｏｈｈら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００，２：４２３−４２７）。ＨＩＦ１−αは低酸素応答性因子（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ）１−αと略称される転写因子であり、酸素により制御されている。すなわち、定常時の酸素の存在下ではユビキチン−プロテアソーム経路によって蛋白質分解されているが、一方、低酸素時（例えば血管新生、腫瘍形成など）に機能することが知られている。ｐＶＨＬはｖｏｎＨｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒとして知られ、酸素依存的にＨＩＦ１−αと結合してＨＩＦ１−αをユビキチン化する。
切断配列は、蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋白質との連結体と、調節因子との間に配置されかつ切断可能な配列を含み、並びに、前記試薬が前記切断配列で切断されると、上記連結体と調節因子とが分離される。このような切断配列の好ましい例は、自己切断型ペプチドであり、例えばウイルス由来の自己切断型２Ａペプチド類（ＡＬ  Ｓｚｙｍｃｚａｋら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，５：５８９−５９４）、具体的にはＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ  ２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号８）、Ｐｏｒｃｉｎｅｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ−１  ２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号９）を含み、これらのペブチドの切断部位はＣ末端側のグリシン（Ｇ）とプロリン（Ｐ）の間である。本明細書で使用する「自己切断型ペプチド」とは、翻訳時に加水分解を受け、ＧとＰの間で２つの蛋白質に分かれるペプチド配列のことをいう。
好適実施形態によれば、本発明のプローブ試薬は、上記のとおり、細胞内又は生物内において上記切断配列で切断されて、上記連結体と調節因子とが分離して存在し、分離した調節因子は、活性酸素との反応によりその構造を変化させて、マーカー蛋白質との結合又は解離によってそれぞれ、マーカー蛋白質の分解を促進又は抑制する。このようなマーカー蛋白質の分解の促進又は抑制は、酸化ストレスの存在（又は有無）やそのレベル（又は量又は程度）に依存する。
すなわち、細胞が酸化ストレスにさらされていない場合、マーカー蛋白質は、それに調節因子が結合することによってユビキチン化が促進され、プロテアソームにより分解され、同時に蛍光又は発光蛋白質も分解され、これによって蛍光又は発光を発しない。これに対して、細胞が酸化ストレスにさらされている場合、マーカー蛋白質への調節因子の結合が抑制されるためマーカー蛋白質のユビキチン化が抑制され、その結果、蛍光又は発光が生じるようになる。このとき、酸化ストレスの程度と蛍光又は発光強度との間には相関を認めることができる。
また、酸化ストレスに対する本発明のプローブ試薬の応答は可逆的である。このことは、細胞又は生物において酸化ストレスがある状態から酸化ストレスがない又は抑制された状態に変化するときには、蛍光又は発光強度が、比較的高い状態から比較的低い状態に連続的に変化する、或いは、基線レベルまで変化することを意味する。
本発明のプローブ試薬の具体例では、マーカー蛋白質がＮｒｆ２蛋白質、そのホモログ又は同等活性をもつそのアナログであり、調節因子がＫｅａｐ１蛋白質、そのホモログ又は同等活性をもつそのアナログであり、蛍光又は発光蛋白質が任意の蛋白質であり、並びに、切断配列が自己切断される任意の配列（例えば上記のＴ２Ａペプチド）である、プローブ試薬である。これら４つのエレメントの配置は、図１に示す４つの態様のいずれかである。
本明細書で使用するホモログなる用語は、同等の活性及び性質を有するが異なる生物種由来の蛋白質を意味する。例えばヒトＮｒｆ２のホモログは、ヒト以外の生物種由来のＮｒｆ２、例えばマウスＮｒｆ２などを含む。同様に、例えばヒトＫｅａｐ１のホモログには、マウスＫｅａｐ１などのヒト以外の生物種のＫｅａｐ１が含まれる。
本明細書で使用するアナログなる用語は、天然又は野生型蛋白質のアミノ酸配列において１又は複数（好ましくは１又は数個）のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列を有する変異型誘導体、或いは、糖鎖、アシル基、アルキル基、リン酸基、ＡＤＰ−リボシル基などの修飾基を有する化学修飾型誘導体、などを含む。ここで、数個とは、２〜１０の整数、例えば２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３などの整数を意味する。
あるいは、上記アナログは、天然又は野生型蛋白質のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する変異型誘導体であってもよい。同一性は、２つ以上の蛋白質間でギャップを導入するか或いはギャップを導入しないで整列を行い、総アミノ酸数に対する同一アミノ酸数の割合（％）を意味する。アミノ酸又は塩基配列の配列間の同一性の比較（ホモロジー検索、相同配列検索など）は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用して実施することができる（例えば、ＳＦ  Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５（３）：４０３−４１０など）。検索は、ＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）、ＥＭＢＬなどの公知のデータベースにアクセスし、例えば高木利久及び金久實編、「ゲノムネットのデータベース利用法」共立出版、東京、日本（１９９８年）に記載されるような手順で実施することができる。
上記のアナログにおいて、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸間の置換、或いは非保存的アミノ酸間の置換を含む。保存的アミノ酸は、化学的性質又は構造的性質の類似したアミノ酸群を指し、例えば、極性アミノ酸群（セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシンなど）、疎水性アミノ酸群（アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニンなど）、塩基性アミノ酸群（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸群（グルタミン酸、アスパラギン酸）、分岐アミノ酸群（バリン、イソロイシン、ロイシンなど）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）などに分けることができる。一方、非保存的アミノ酸は、互いに化学的又は構造的性質の異なるアミノ酸を指す。好ましい置換は、保存的アミノ酸置換である。
上記のホモログ及びアナログでは、蛋白質について説明したが、同様のことは核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）にも適用される。このような核酸は、上記蛋白質ホモログ又はアナログのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することができる。また、核酸アナログには、一塩基多型、スプライス変異、サイレント変異などの突然変異核酸も含まれる。
本発明のプローブ試薬のより具体的な例は、後述の実施例に記載されるような配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡによってコードされる融合蛋白質である（図２）。このＤＮＡが細胞又は生物内に発現可能に導入されると、該融合蛋白質は、切断配列にて連結体と調節因子とに分離され、酸化ストレスの増減に応じた蛍光強度の増減が認められる（図３〜図５）。このプローブは、細胞又は生物内での酸化ストレスの動態をリアルタイムで測定することを可能にする。
本発明のプローブ試薬は、上で説明したように、通常、融合蛋白質の形態をとっており、従って、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。このような技法の詳細は、後述の「２．プローブ試薬をコードする核酸」に記載しているが、ただし、プローブ試薬をコードするＤＮＡの発現は原核細胞（例えば大腸菌、バチルス属細菌など）及び真核細胞のいずれでも可能である。
２．プローブ試薬をコードする核酸
本発明はまた、上で定義し説明したプローブ試薬のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸（ＤＮＡ又は該ＤＮＡに対応するＲＮＡ）を提供する。ここで、ＲＮＡは、該ＤＮＡの塩基配列中、デオキシリボースをリボースに、かつ、チミジン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）に置き換えた構造を有している。好ましいＲＮＡは、該ＤＮＡに対応するｍＲＮＡである。上記ＤＮＡ又はＲＮＡはさらに、上記４つのエレメントのそれぞれをコードする塩基配列の他に、組換え操作を容易にするための１又は複数の制限酵素サイトを含んでもよい。
このようなＤＮＡの構築は、各エレメントに対応するＤＮＡを、生物の適当な組織由来のｃＤＮＡライブラリーから、特異的プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特異的プローブによるストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーション、クローニング法などによって調製することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えばヒトＮｒｆ２及びＫｅａｐ１のクローニングの場合、これらの遺伝子の発現が認められる、小腸、肝臓、心臓などの組織から調製可能である。これらの組織から全ＲＮＡを抽出し、さらにｍＲＮＡを取出し、これを鋳型にしてｃＤＮＡを合成することを含む公知の方法にてライブラリーを調製することができる。
ＰＣＲ法について、この方法は、二本鎖ＤＮＡの一本鎖への変性ステップ（例えば、約９４〜９８℃、３０秒〜２分）、プライマーのアニーリングステップ（例えば、約５５℃、３０秒〜１分）、及びＤＮＡの伸長ステップ（例えば、約７２℃、３０秒〜数分）からなる操作を１サイクルとし、これを約２０〜４０サイクル実施することを含む。この一連の実施の前に同様の温度及び時間範囲内での変性ステップ、また、その実施の後に同様の温度及び時間範囲内での伸長ステップを１回ずつ含んでもよい。ＰＣＲに使用するプライマーは、好ましくは、鋳型ＤＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補的な配列、又はそれと９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上同一性の配列を有するものを使用してもよいし、或いは目的蛋白質の部分アミノ酸配列に基づいて作製されたミックスプライマーを使用してもよいし、或いはランダムプライマーを使用してもよい。プライマーは、好ましくはセンスプライマーとアンチセンスプライマーからなり、それらのサイズは、通常１５〜５０塩基、好ましくは２０〜３０塩基である。ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼの存在下、Ｍｇ２＋含有ＰＣＲバッファー中で実施する。ＰＣＲの実施にあたっては、サーマルサイクラーなどの市販のＰＣＲ装置（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，宝酒造など）を用いて行うと便利である。ＰＣＲの手法の具体例については、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＲＡ  Ｓｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８５，２３０：１３５０−１３５４、ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５２：１６４３−１６５１などを参照することができる。
ハイブリダイゼーション法については、配列が公知の目的ＤＮＡの塩基配列に相補的な配列、又はそれと９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上同一性の配列を有するものをプローブとし、２０塩基以上、好ましくは３０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上、例えば６０〜２００塩基、６０〜１５０塩基、６０〜１００塩基などの長さのプローブを使用し、ストリンジェントな条件にてハイブリダイゼーションを実施することができる。ストリンジェントな条件は、例えば２〜６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）で、４０〜５０℃でのハイブリダイゼーションのあと、０．１〜０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、５０〜６５℃で１回又は複数回の洗浄からなる条件を含むことができる。ハイブリダイゼーションの手法の具体例は、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載されている。
本発明のＤＮＡは、上記第１のプローブ試薬又は第２のプローブ試薬をコードするＤＮＡであり、その具体例は、配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡである。
本発明はさらに、上記ＤＮＡと、該ＤＮＡを発現可能にする制御配列とを含むベクターを提供する。
ベクターは、細胞、特に真核細胞、例えば動物細胞（ヒト細胞を含む哺乳動物細胞、鳥類細胞、魚類細胞、昆虫細胞など）、植物細胞（単子葉植物細胞、双子葉植物細胞など）、酵母細胞、菌類細胞（糸状菌、担子菌など）などの宿主細胞でのＤＮＡ発現に好適なベクターが好ましい。このようなベクターとしては、市販されているものか、或いは文献記載のものを使用することができる。ベクターの例は、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＢＲ系などのプラスミドベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを挙げることができる。植物細胞で使用可能なベクターの例は、Ｔ−ＤＮＡ領域の左側及び右側ボーダー（ＬＢ及びＲＢ）を含むバイナリーベクター（例えばｐＢＩ系プラスミド）、Ｔｉプラスミドなどである。
ベクターは、ＤＮＡの発現のための種々の制御配列を含むことができる。制御配列には、例えばプロモーター、プロモーター／エンハンサー、リボソーム結合配列、ターミネーターなどを含むことができる。プロモーターの例は、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＣａＭＶなどのウイルス由来のプロモーター、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの解糖系酵素のプロモーターなどを挙げることができる。また、ベクターは、組換え体の選択のための選択マーカー配列、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼなどの優性選択マーカー、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性相補選択マーカーなどを含むこともできる。
本発明のプローブ試薬をコードするＤＮＡを細胞に導入するときには、細胞内で該ＤＮＡが発現されて該プローブ試薬が生じる。細胞へのＤＮＡ（場合により、ＲＮＡ）を導入する方法の例としては、例えばリポフェクションなどのリポソーム法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、アグロバクテリウム法、ジーンボンバートメント法などを挙げることができる。これらの手法は、例えば松橋通生ら監訳、ワトソン・組換えＤＮＡの分子生物学第２版（１９９４年）、丸善、東京、日本などに記載されている。
３．酸化ストレスの測定
本発明はさらに、上記プローブ試薬或いは上記ベクターを細胞又は真核生物（ヒトを除く）内に導入し、該細胞又は生物内の蛍光又は発光強度に基いて酸化ストレスを測定することを含む、該細胞又は生物での酸化ストレス測定方法を提供する。
あるいは、本発明は、細胞又は生物（ヒトを除く）において酸化ストレスを測定する方法であって、該方法が、該細胞又は生物において酸化ストレスの程度に応じて分解が制御されるマーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質との連結体、あるいは該連結体をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含むベクター、を該細胞又は生物内に導入して、該連結体を細胞又は生物内に存在させる工程と、該蛍光又は発光蛋白質に由来する蛍光又は発光量を測定することにより、該連結体の分解が制御される程度に基いて該細胞又は生物における酸化ストレスの存在又はそのレベルを決定する工程と、を含み、ここで、該マーカー蛋白質は調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、及び該連結体の分解が、活性酸素に応答して調節因子によって制御されることを特徴とする、上記方法を提供する。
本発明の方法では、連結体と調節因子とは少なくとも同じ細胞内で発現される状態にあればよく、例えば連結体をコードするＤＮＡと調節因子をコードするＤＮＡとを別々のベクターに挿入して導入することも場合によっては可能である。もちろん、導入効率、発現制御の容易さ、などを考慮した場合は、これらを単一のベクターに挿入して導入することがより好ましい。
なお、前記調節因子は、上記のように外因性のものだけでなく、前記細胞に内在性（もしくは、内因性）のもの（すなわち、細胞が元々持っているもの）を用いることも可能である。また、調節因子とマーカー蛋白質との組み合わせは、酸化ストレスの程度に応じてその相互作用が調整されるものであれば、それらの起源はいずれのものでもよいが、好ましくは同種の生物由来のものである。
本発明の測定法の特徴の１つは、該測定をリアルタイムで行うことができることである。このとき、活性酸素との反応での構造変化が可逆的に起こる調節因子であれば、酸化ストレスに対するプローブ試薬の応答性も可逆的となる。このような効果を提供するプローブ試薬−調節因子の組み合わせは、実施例で例証されるようなＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１系である。上記応答が可逆的であるために、細胞又は生物が酸化ストレスを受けると蛍光又は発光強度が徐々に増大する一方、酸化ストレスが解消されると蛍光又は発光強度が減衰するというように、酸化ストレスの増減に応じて蛍光又は発光強度をリアルタイムに測定することができる（図４ａ及び図４ｂ）。
本発明で使用可能な細胞は、上記のとおり、哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）などの脊椎動物細胞、昆虫細胞などの無脊椎動物細胞、植物細胞、藍藻細胞、酵母細胞、菌類細胞などの真核細胞である。これらの細胞は、卵母細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、精原細胞、始原生殖細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの分化多能性細胞も含む。
本発明で使用可能な生物（ヒトを除く）は、哺乳動物を含む脊椎動物、無脊椎動物などの動物、単子葉植物、双子葉植物などの植物、酵母、菌類などを含む。これらの動物又は植物には、トランスジェニック動物（ヒトを除く）やトランスジェニック植物も包含される。
本発明のプローブ試薬が正しく機能するためには、その原理上、プローブ試薬が測定の間、常に発現され続けている必要がある。長期の測定を行う際には、その遺伝子の安定した発現を誘導するプロモータと連結させて発現させることが望ましい。そのためには、ベクターとして、プローブ試薬をコードするＤＮＡを発現可能な自律複製可能ベクターを使用するか、該ＤＮＡを組み込んだ人工染色体（例えば、ＨＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣなど）を使用するか、或いは、該ＤＮＡを細胞ゲノムに相同組換え法で組み込むためのベクターを使用することができる。また上記のようにプローブ試薬を一過性に細胞に発現させる手法に加え、その遺伝子を保持し、プローブ試薬を安定して発現させる細胞を作製して測定に用いてもよい。
本発明のプローブ試薬は酸化ストレスの強さに応じて蛍光又は発光強度が変化するため、この試薬をコードするＤＮＡを含むトランスジーンを導入したトランスジェニック生物を作製することで、細胞レベルだけでなく個体レベルでの酸化ストレスの測定も行うことができる。その際に、トランスジーンを適当なプロモータの下流に連結することで、目的とする臓器、組織に選択的に発現させて測定に用いることも可能である。
トランスジェニック動物（ヒトを除く）の作製には、例えば核移植法やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの分化多能性細胞を利用することができる。これらの方法を以下に簡単に説明する。
核移植法は、例えば線維芽細胞などの体細胞のゲノムにトランスジーンを導入したのち、該細胞から取出した核を、除核した受精卵又は未受精卵にマイクロインジェクトし、これを仮親の子宮又は卵管に戻し、発生、出産させてキメラ動物を得ることを含む。
ＥＳ細胞を利用する方法は、動物（ヒトを除く）の受精後の胚盤胞又は８細胞期胚から取出した内部細胞塊にトランスジーンをマイクロインジェクション、マイクロセル融合法、電気融合法などの手法によって導入したのち、ＥＳ細胞を別の胚盤胞に注入し移植胚を得、この胚を仮親の子宮に移植し、出産させてキメラ動物を得ることを含む（例えば、押村光雄ら編、クロマチン・染色体実験プロトコール（２００４年）羊土社、東京、日本）。
上記のように作製されたキメラ動物はさらに、同種の野生型と交配し、さらに、得られたヘテロ接合体同士の交配を繰り返すことによってホモ接合性の子孫動物（ヒトを除く）を得ることができる。
ｉＰＳ細胞は、哺乳動物の体細胞に転写因子（例えばＯｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃなど）又はそれをコードするＤＮＡ（ベクター仲介でもよい）を導入し、培養することによって得ることができる分化多能性細胞であり、生殖系列への寄与が可能であることが知られている（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６）。
トランスジーンは、例えばＮｒｆ２遺伝子の５’−及び３’−非翻訳領域に相同な長さ約２〜７ｋｂのＤＮＡ配列間に本発明のＤＮＡ配列（配列番号７）を挿入してなる構築体（ベクター）である。或いは、本発明のＤＮＡ配列又はＮｒｆ２遺伝子は人工染色体（ＨＡＣ，ＹＡＣ，ＢＡＣなど）に組み込んでもよい。構築体又は人工染色体はさらに、薬剤耐性遺伝子、プロモーター／エンハンサー、ＩＲＥＳ、ポリＡ配列、ターミネーターなどを適宜含むことができる。
なお、トランスジェニック植物の作製については、本発明のＤＮＡを含むベクターをアグロバクテリウム法、パーティクルガン法などで葉片、茎片などの組織に導入したのち、カルスを形成し、植物体に再生する方法が含まれる。
トランスジーンでは、プローブ試薬の蛍光蛋白質の位置にホタルなどがもつ生物発光反応を触媒する酵素であるルシフェラーゼをコードするＤＮＡを配置してもよい。蛍光蛋白質を発光させるためには、外部から励起光を照射させる必要がある。そのため、自家蛍光が強い試料や光照射が生理活性に影響を与える試料の場合には測定が困難になる。発光法では励起光が不要で、ルシフェリンなどの発光基質を細胞や生物に与えることで反応が進むため、励起光の照射が困難な試料に対しても測定が行えるようになる。
プローブ試薬を動物の細胞内に導入する別の方法には、例えばカチオン性リポソームを利用する方法（例えば静脈内投与など）がある。この方法では、細胞表面の負電荷とカチオン性リポソームとが互いに誘引して融合体を形成しインターナリゼーションを介して細胞内にプローブ試薬が入る。
なお、プローブ試薬のＤＮＡを保持し、プローブ試薬を安定して発現させる細胞を作製して、その細胞を動物に移植する方法も含む。
本発明のプローブ試薬やＤＮＡを用いた測定には、一般的な蛍光または発光測定装置が使用可能である。単一細胞レベルでの測定を行うためには、顕微鏡を用いたイメージング装置が使用できる。一方、個体レベルあるいはマイクロプレートでの測定を行うためには、暗箱を用いたマクロ用のイメージング装置が使用できる。タイムラプスイメージングの機能を装備した装置を用いることで、生きた試料で酸化ストレスの変動をリアルタイムで測定することができる。
４．酸化ストレス制御物質のスクリーニング
本発明はさらに、酸化ストレスが負荷された細胞又は生物（ヒトを除く）内に、上記プローブ試薬或いは上記ベクターと候補物質とを導入し、細胞内の蛍光又は発光強度を低下又は増大させる物質をスクリーニングすることを含む、酸化ストレス制御物質のスクリーニング方法を提供する。
この方法で使用される細胞や生物（ヒトを除くトランスジェニック生物）の種類は、上記例示のとおりであり、トランスジェニック生物の作製についても上で説明したとおりである。
候補物質は、低分子（有機分子又は無機物質）、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質などの任意の物質、公知の医薬剤などを含む。
細胞を使用するときは、培地に候補物質を添加する。一方、生物を使用するときは、候補物質を摂取又は投与（経口、静脈内、直腸内、皮下、筋肉内、経粘膜投与など）する。
細胞又は生物に酸化ストレスを与えた時の候補物質の作用効果を、特定波長の光で励起することによって発光した蛍光の強度を測定することによって判断する。候補物質によって蛍光強度が減少又は基線レベルまで低下するとき、候補物質は、酸化ストレス抑制物質であると推定できる。
本発明の方法によって見出された酸化ストレス抑制物質は、酸化ストレスが原因となって引き起こされる例えば癌、動脈硬化、心筋梗塞、糖尿病などの疾患、老化、虚血又は低酸素状態にさらされた臓器などの予防及び治療のために役立つだろう。
５．キット
本発明はさらに、上記プローブ試薬、上記ＤＮＡ又はＲＮＡ、及び上記ベクターからなる群から選択される少なくとも１つを含む、酸化ストレス測定用又は酸化ストレス制御物質スクリーニング用キットを提供する。
キットは、各構成成分を別個の容器に収容又は密封したものに加えて、バッファー、基質、使用説明書などを含むことができる。
【実施例】
【０００６】
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明の範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。
実施例１
プローブ試薬の設計
上に示した特長をもつプローブ試薬の一例として、蛍光蛋白質としてｍＫＯ２を、またマーカー蛋白質としてＮｒｆ２、調節因子としてＫｅａｐ１という蛋白質を使った酸化ストレスのプローブ試薬を作製した。この試薬では酸化ストレスが増加することで、プローブ試薬の分解が抑制され、その蛍光強度が増加する。
まずＮｒｆ２とＫｅａｐ１の本来の細胞内での動態を説明する。Ｎｒｆ２は細胞内において酸化ストレスに応答して、これに対する防御機能を担う抗酸化蛋白質の発現を誘導する転写因子として働いている。細胞に酸化ストレスがない状態では、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１と結合した形で細胞質に存在している。このときＫｅａｐ１はさらにユビキチンリガーゼ複合体と結合して、Ｎｒｆ２のユビキチン化を促進している。ユビキチン化されたＮｒｆ２は蛋白質分解酵素複合体であるプロテアソームによって分解を受けるため、その増加が抑えられている状態にある。一方、細胞が酸化ストレスにさらされると、活性酸素がＫｅａｐ１と反応し、その構造に変化を与える。この構造変化によりＫｅａｐ１がＮｒｆ２から解離することでＮｒｆ２のユビキチン化が抑えられる。これにより分解が抑制されたＮｒｆ２は、細胞内での量を増加させ、転写因子としての機能を発揮するようになる。
作製したプローブ試薬（ｍＫＯ２−Ｎｒｆ２＿１００−Ｔ２Ａ−Ｋｅａｐ１）の構造を図２に示す。Ｎ末端から、蛍光蛋白質ｍＫＯ２、Ｋｅａｐ１結合部位とユビキチン結合部位を含むＮｒｆ２のドメイン（Ｎ末端から１〜１００番目までのアミノ酸）、自己切断ペプチドであるＴ２Ａ、Ｋｅａｐ１が一列に連結した構造となっている。ここでは蛍光蛋白質として、サンゴの１種であるクサビライシ由来のｍＫＯ２を使用したが、他の蛍光蛋白質を使用してもよい。蛍光蛋白質としてはオワンクラゲ由来のＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰなどやこれらから派生したもの、またサンゴ由来のＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙなどやこれらから派生したものなどがある。マーカー蛋白質、調節因子としては、ヒト由来のＮｒｆ２およびＫｅａｐ１をそれぞれ使用したが、他の生物種に由来する同機能をもつ蛋白質の組み合わせを使用してもよい。ここではマーカー蛋白質として、Ｎｒｆ２の一部のドメインのみを使用したが、調節因子結合部位とユビキチン結合部位をともに含んでいればプローブ試薬として機能させることができる。ここで用いたＮｒｆ２のサイズは、プローブ試薬の細胞内での発現量や、酸化ストレスに対する応答能などを評価することで最適化されたものである。
実施例２
ｃＤＮＡの作製
以下に示す方法でプローブ試薬の遺伝子であるｃＤＮＡを作製し、これを細胞に導入するためのプラスミドに組み込んだ。
ヒト心臓のｃＤＮＡライブラリーからＮｒｆ２遺伝子とＫｅａｐ１遺伝子をクローニングした。Ｎｒｆ２遺伝子を鋳型としてセンスプライマー（配列番号１）とアンチセンスプライマー（配列番号２）およびＰｒｉｍｅＳＴＡＲ酵素（タカラバイオ社製）を用いて、Ｎｒｆ２の１〜１００番目のアミノ酸を増幅するためのＰＣＲ反応を行った。センスプライマーにはＸｈｏＩ切断部位、アンチセンスプライマーにはＴ２Ａペプチドの遺伝子配列およびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位が含まれている。また、Ｋｅａｐ１遺伝子を鋳型としてセンスプライマー（配列番号３）とアンチセンスプライマー（配列番号４）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ酵素を用いてＰＣＲ反応を行った。センスプライマーにはＨｉｎｄＩＩＩ切断部位が含まれ、アンチセンスプライマーにはＸｂａＩ切断部位が含まれている。
Ｎｒｆ２を鋳型として用いたＰＣＲ産物の両端を制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して切断し、Ｋｅａｐ１を鋳型として用いたＰＣＲ産物の両端を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを使用して切断し、細胞に発現させるためのプラスミドであるｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のＸｈｏＩおよびＸｂａＩ切断部位に挿入した。
センスプライマー（配列番号５）とアンチセンスプライマー（配列番号６）を用いて蛍光タンパク質ｍＫＯ２をＰＣＲで増幅した（ＰＣＲ条件：変性９８℃，１０秒；アニーリング５５℃，３０秒；伸長７２℃，１分）。センスプライマーにはＥｃｏＲＩ切断部位、アンチセンスプライマーにはＥｃｏＲＶ切断部位が含まれている。ＰＣＲ産物の両端を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶを使用して切断し、ｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ切断部位に挿入した（図２）。
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実施例３
細胞のイメージングによるプローブ試薬の評価
ガラスボトムディッシュで培養したＨｅＬａ細胞に、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（ロシュ・アプライド・サイエンス製）を用いて、作製したｃＤＮＡをトランスフェクションし、１２時間後、新しい培養液に置き換えた。その２４時間後に、インキュベーター顕微鏡（オリンパス社、ＬＣＶ１００）にて蛍光観察を行った。この顕微鏡には冷却型ＣＣＤカメラが接続されており、経時的に細胞の蛍光画像を取得することができる。実験前では、プローブ試薬を発現させた細胞でも、背景光程度の蛍光しか観察されなかった。このことは、酸化ストレスが負荷されていない定常状態では、細胞内のプローブ試薬のほとんどすべてが分解されていることを示している。
作製したプローブ試薬の酸化ストレスに正しく応答するかどうかを確認するために、酸化ストレス誘導剤であるｄｉｅｔｈｙｌｍａｌｅａｔｅ（ＤＥＭ）を１００μＭになるよう添加し、ｍＫＯ２の蛍光強度（ｅｘ；ＢＰ５２０−５４０ＨＱ、ｅｍ；ＢＰ５５５−６００ＨＱ）を測定した。ＤＥＭ添加後、１０倍以上のｍＫＯ２の蛍光強度の増大が観察された（図３）。コントロールとして溶媒であるエタノールを０．１％になるよう添加したときは、ｍＫＯ２の蛍光強度は増大しなかった。以上のことからこのプローブは酸化ストレス依存的に蛍光強度を増大することが示された。さらに、添加したＤＥＭを洗い流すと、ｍＫＯ２の蛍光強度は基底状態まで減少した（図４）。このことから、このプローブ試薬の酸化ストレスに対する応答は可逆性であることが示された。
このプローブ試薬が、酸化ストレスにさらされていない状態では、細胞内でプロテアソームによる分解を受けていることを確認するために、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を用いて実験を行った。ＭＧ１３２を１０μＭになるよう添加した場合は、その後のｍＫＯ２の蛍光強度の増大が観察された。一方、コントロールとして溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を０．１％になるよう添加した後では、ｍＫＯ２の蛍光強度は増大しなかった（図５）。以上のことからこのプローブ試薬は酸化ストレスにさらされていないときには、プロテアソームによって分解されていることが示された。
実施例４
ウェスタンブロッティングによるプローブ試薬の評価
このプローブ試薬が、設計どおりに細胞内で修飾を受けていることを確認するために、ウェスタンブロッティングによる実験を行った。
まず、このプローブ試薬が細胞内でＴ２ＡペプチドによってｍＫＯ２−Ｎｒｆ２連結体とＫｅａｐ１に分離されていることを確認するために、以下に示す実験を行った。３５ｍｍディッシュに培養したＨｅＬａ細胞に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（ロシュアプライドサイエンス社）を用いて作製したｃＤＮＡをトランスフェクションし、１２時間後、新しい培養液に置き換えた。その１２時間後にＤＥＭを１００μＭになるよう、また、コントロールとしてエタノールを０．１％になるよう添加し、さらに８時間培養した。その後、抗Ｎｒｆ２抗体（サンタクルズ社）を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＤＥＭを加えたもの、エタノールを加えたものでともにｍＫＯ２−Ｎｒｆ２連結体のバンドが検出されたが、これにＫｅａｐ１が繋がっているプローブ試薬のバンドはほとんど観察されなかった。この結果から、このプローブ試薬は細胞内でＴ２Ａペプチドにより、ｍＫＯ２−Ｎｒｆ２連結体とＫｅａｐ１に分かれていることが示された。またＤＥＭを加えたものでは、エタノールを加えたものと比べてバンドが濃く検出されたことは、ＤＥＭによる酸化ストレスによりプローブ試薬の量が増大していることを示している（図６）。
次に、このプローブ試薬が、細胞内でプロテアソームによる分解を受けていることを、ウェスタンブロッティングでも確認した。同様に培養したＨｅＬａ細胞にプロテアソーム阻害剤、ＭＧ１３２を１０μＭになるよう添加した。またコントロールの細胞にはＤＭＳＯを０．１％になるよう添加した。ＭＧ１３２を添加したものでは、ＤＭＳＯを添加したものと比較して濃いバンドが検出され、細胞内のプローブ試薬の量が増大していることが示された。この結果は、酸化ストレスにさらされていない状態では、このプローブ試薬はプロテアソームによる分解を受けていることを示している。（図６）。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明は、生細胞又は生物内で酸化ストレスの動態をリアルタイムで測定できるプローブ試薬を提供する。検出感度のよい蛍光又は発光プローブを作製するためには、応答時のシグナルを大きくするかもしくは非応答時のシグナルを下げることが重要である。本発明のプローブ試薬は、蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋白質との連結体を含むプローブ試薬、あるいは、該連結体と、これのプロテアソームによる分解を促進する調節因子とを同一プローブ内に含めたプローブ試薬のいずれかである。後者の場合、調節因子は、細胞内でプローブから切断分離されてマーカー蛋白質に作用するか、又はプローブから分離されない状態でマーカー蛋白質に作用することができる。
本発明では、連結体と調節因子をプローブ内に含みかつ連結体と調節因子が切断分離されうるようなプローブ試薬が好ましく、このプローブ試薬を使用することによって、非応答時の蛍光シグナルを背景光レベルにまで抑えることができる。そのため、応答時の蛍光シグナルの増加が従来法と比べダイナミックに示されるようになり、非常に検出感度のよいプローブ試薬とすることができる。このように、微小な酸化ストレスの変化でも精確に検出できる能力は、酸化ストレス発生の初期段階を検出したい場合などに有効である。またこの能力は、組織による光散乱等により、微小な光量差の計測が困難な動物個体の深部での酸化ストレスを測定する場合にも有効である。
本発明のプローブ試薬では、酸化ストレスに対する応答が可逆的であることが示された。そのため、酸化ストレスを促進するような条件、逆に抑制するような条件の両面の測定が可能になる。これにより、酸化ストレスの原因となる物質のスクリーニング、また逆に酸化ストレスを抑制する物質のスクリーニングを１つの試薬で行うことができる。また、応答が可逆的であることで、１個の生体試料で投与する薬剤の種類や量を変えた測定も可能となる。これにより、実験に使われる生体試料を減らすことができるとともに、同じ試料で測定できることで、結果の比較が容易かつ精確に行えるようになる。
本発明は、酸化ストレスによる疾患や老化のメカニズムの解明、またこれらを抑える薬剤の探索など、医学、産業の分野で有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号７：ｍＫＯ２−Ｎｒｆ２＿１００−Ｔ２Ａ−Ｋｅａｐ１のＤＮＡ配列
［配列表］
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【図１】
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【図３ｂ】
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【図４ｂ】
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【図５ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図４ａ】
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【図５ａ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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