(57)【要約】本発明の目的は、有機溶媒を用いずに抽出された薬理効果のあるアシュワガンダの葉抽出物を有効成分として含む組成物、及びその製造方法を提供することである。上記目的は、アシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む、老化の抑制若しくは予防、腫瘍若しくは癌の治療若しくは予防、正常細胞の増殖促進若しくは寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発、正常細胞の酸化的若しくはＵＶ照射ストレスからの保護、癌細胞若しくは腫瘍細胞の殺傷若しくは増殖抑制、又は癌細胞の抗癌剤に対する感受性増強のための組成物、並びに水にアシュワガンダの葉を加えて２０〜７０℃で６〜１００時間処理する工程；又は水にアシュワガンダの葉を加えて７０〜１００℃にまで熱した後に、１〜３０℃にまで放冷する工程を含む、上記組成物の製造方法を提供することにより解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む、老化の抑制若しくは予防、又は腫瘍若しくは癌の治療若しくは予防のための組成物。
【請求項２】
アシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む、正常細胞の増殖促進若しくは寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発、正常細胞の酸化的若しくはＵＶ照射ストレスからの保護、癌細胞若しくは腫瘍細胞の殺傷若しくは増殖抑制、又は癌細胞の抗癌剤に対する感受性増強のための組成物。
【請求項３】
前記組成物が、食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品又は化粧品である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アシュワガンダの葉水抽出物が、
水にアシュワガンダの葉を加えて２０〜７０℃で６〜１００時間処理する工程；又は
水にアシュワガンダの葉を加えて７０〜１００℃にまで熱した後に、１〜３０℃にまで放冷する工程
により提供される、請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の組成物の製造方法であって、
水にアシュワガンダの葉を加えて２０〜７０℃で６〜１００時間処理する工程；又は
水にアシュワガンダの葉を加えて７０〜１００℃にまで熱した後に、１〜３０℃にまで放冷する工程
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００８年３月６日出願の日本特願２００８−０５５８２８号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、アシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む組成物に関する。詳しくは、本発明は、アシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む、老化の抑制若しくは予防、腫瘍若しくは癌の治療若しくは予防、正常細胞の増殖促進若しくは寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発、正常細胞の酸化的若しくはＵＶ照射ストレスからの保護、癌細胞若しくは腫瘍細胞の殺傷若しくは増殖抑制、又は癌細胞の抗癌剤に対する感受性増強のための組成物に関する。【０００３】
さらに本発明は、水にアシュワガンダの葉を加え、アシュワガンダの葉に含まれる水溶成分を抽出するために適した条件下で処理する工程を含む、アシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む組成物の製造方法に関する。【０００４】
背景技術
アーユルベーダは、インドを起源とする5,000年に及ぶ、世界でもっとも古い医学体系の一つである。アーユルベーダは古代サンスクリット語の語源からきており'ayu' は生命を、' ved' は知識を意味し、多くの場合、生命の科学と訳されている。何世紀もの間、預言者や自然科学者たちが考えぬき、発展させてきた健康維持法で、研究・実験を繰り返し、討論を重ね、さらに熟考が加えられてきた。彼らの教えは何千年もの間、師からその弟子へと語り継がれていき、紀元前5−6世紀には、懇切丁寧な指導書が古代インド語のサンスクリット語で書かれている。アーユルベーダは病気の予防、若返り促進、そして寿命を延長する効果があると言われている。さらに最近では、世界中の科学者達がアーユルベーダのハーブ調剤を医療現場で実証する試みをはじめている。【０００５】
アシュワガンダ（Withania somnifera）はアーユルベーダの中で最もすぐれた薬草で、'アーユルベーダの女王'  又は、'アーユルベーダの賜物' 等と呼ばれており、常緑樹でインドの乾燥地帯で見かけられ、高さは１ｍほどに成長する。葉を一年中付けており、肥沃で、適度の湿気と水はけの良い土地で生育する。根の使用は3,000年以上前から行われている。なお、アシュワガンダは下記のいくつかの呼び名で呼ばれている：Withania somnifera（ラテン語）、アシュワガンダ（サンスクリット語）、アシュガンダ（ヒンズー語）、及びインディアンジンセン（インド人参）又は、ウィンターチェリー（英語）。【０００６】
アシュワガンダは強壮薬（アーユルベーダ薬草の中で最も信頼されている）として分類され、健康増進、若返り促進薬そして寿命延長をもたらす力があるとして広く評価されている。一般的に信じられている効能は以下の通りである。【０００７】
（抗ストレス作用）
アシュワガンダはアーユルベーダの中でも抗ストレス効果のある薬草として位置付けられており、過酷なストレスに適応できる自然の力を養い、必要に応じて精神力を強化させる。現代語で、adaptogen”適応薬”と言える。さらに勉学や仕事で肉体的、精神的疲労が加えられた時にストレスに適応できる自然の力を向上させる（Archana, R., and Namasivayam, A. (1999) J Ethnopharmacol 64, 91-93； Singh, B., Chandan, B. K., Sharma, N., Singh, S., Khajuria, A., and Gupta, D. K. (2005) Phytomedicine 12, 468-481；Bhattacharya, S. K., and Muruganandam, A. V. (2003) Pharmacol Biochem Behav 75, 547-555. を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【０００８】
（抗炎症作用）
アシュワガンダには抗炎症作用があり、関節の不具合を和らげる。また、アシュワガンダの持つ温感や浸透性は体内の血液の循環を良くする。このためアシュワガンダは 発熱、関節炎、腫瘍や様々な感染症などの処方によく使われている。体力、精力、持久力維持を促進し（Anbalagan, K., and Sadique, J. (1981) Indian J Exp Biol 19, 245-249； al-Hindawi, M. K., al-Khafaji, S. H., and Abdul-Nabi, M. H. (1992) J Ethnopharmacol 37, 113-116； Agarwal, R., Diwanay, S., Patki, P., and Patwardhan, B. (1999) J Ethnopharmacol 67, 27-35； Rasool, M., and Varalakshmi, P. (2006) Vascul Pharmacol 44, 406-410を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）、その効力はチョウセンニンジンに匹敵すると言える。【０００９】
（抗酸化作用）
アシュワガンダは重要な抗酸化栄養素である。特に脳細胞においてフリーラジカルによる損傷を抑制することが証明されている。アシュワガンダに含まれている化学物質は強力な抗酸化物と考えられ、これらは体内の三つの抗酸化酵素（スーパーオキサイドジスムターゼ、カタラーゼそしてグルタチオンペルオキシターゼ）を増加させる（Bhattacharya, S. K., Satyan, K. S., and Ghosal, S. (1997) Indian J Exp Biol 35, 236-239； Bhattacharya, A., Ghosal, S., and Bhattacharya, S. K. (2001) J Ethnopharmacol 74, 1-6； Russo, A., Izzo, A. A., Cardile, V., Borrelli, F., and Vanella, A. (2001) Phytomedicine 8, 125-132を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【００１０】
（抗菌作用）
アシュワガンダのアルコール及び水抽出物は広い範囲の抗菌活性を持っていることが認められている（Owais, M., Sharad, K. S., Shehbaz, A., and Saleemuddin, M. (2005) Phytomedicine 12, 229-235； Arora, S., Dhillon, S., Rani, G., and Nagpal, A. (2004) Fitoterapia 75, 385-388を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【００１１】
（糖尿病予防）
血液中の血糖値やコレステロール値を低下させることができ、これにより心血管系の状態を良好に保つ（Hemalatha, S., Wahi, A. K., Singh, P. N., and Chansouria, J. P. (2004) J Ethnopharmacol 93, 261-264；Parihar, M. S., Chaudhary, M., Shetty, R., and Hemnani, T. (2004) J Clin Neurosci 11, 397-402を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【００１２】
（関節炎・月経不順）
関節炎の治療と月経不順に効果があると考えられる（Begum, V. H., and Sadique, J. (1988) Indian J Exp Biol 26, 877-882を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【００１３】
（強精作用）
特に男性の生殖機能の強壮薬としての作用があり、健全な性衝動を呼び起こす。さらに精神的安定性を促進しながら性機能を修復し、全体としての活力を引き出す効力がある（Ilayperuma, I., Ratnasooriya, W. D., and Weerasooriya, T. R. (2002) Asian J Androl 4, 295-298を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【００１４】
（神経の刺激）
アシュワガンダは精神を強化するラサヤナ（強壮薬）で、行為を強める効果がある。記憶や問題解決能力を引き出し、脳全体の調和のとれた機能性を高め強化する。さらに神経系に滋養を与える効果があり、神経を強め、神経機能を維持する。
永い間インドの人々はアシュワガンダを認知障害の老人の脳疾患の治療薬として処方してきた（Jain, S., Shukla, S. D., Sharma, K., and Bhatnagar, M. (2001) Phytother Res 15, 544-548； Shukla, S. D., Jain, S., Sharma, K., and Bhatnagar, M. (2000) Indian J Exp Biol 38, 1007-1013を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【００１５】
（老人性疾患の治療薬）
アシュワガンダは特に老人の健康改善と病気予防に使われている（Mishra, L. C., Singh, B. B., and Dagenais, S. (2000) Altern Med Rev 5, 334-346を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【００１６】
（化学療法）
アシュワガンダの効能は放射線や化学療法を受けている患者に対して、有益な加療法になると考えられる（Prakash, J., Gupta, S. K., Kochupillai, V., Singh, N., Gupta, Y. K., and Joshi, S. (2001) Phytother Res 15, 240-244； Prakash, J., Gupta, S. K., and Dinda, A. K. (2002) Nutr Cancer 42, 91-97； Park, E. J., and Pezzuto, J. M. (2002) Cancer Metastasis Rev 21, 231-255を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【００１７】
元来インドにおいてアーユルベーダ薬として一般的に使用されてきたのは、アシュワガンダの根の部分である。本発明者らは、アシュワガンダの葉の抽出物に効能があるかについて研究を行った。根の部分に比べて葉は採取しやすい上、大量に入手可能だからである。本発明者らはすでに、有機溶媒を用いたアシュワガンダの葉抽出物に抗変異原効果があることを発表している（Kaur, K., Rani, G., Widodo, N., Nagpal, A., Taira, K., Kaul, S. C., and Wadhwa, R. (2004) Food Chem Toxicol 42, 2015-2020； Rani, G., Kaur, K., Wadhwa, R., Kaul, S. C., and Nagpal, A. (2004) Food and Chemical Toxicology in pressを参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。さらに、この葉の有機溶媒抽出物がガン細胞を特異的に死滅させることがわかった（Widodo, N., Kaur, K., Shreshtha, B., Takagi, Y., Ishii, H., Kaul, S. C., and Wadhwa, R. (2006) Clinc. Cancer. Res；ＷＯ２００５／０８２３９２号公報を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【００１８】
これまでに薬理効果のあるアシュワガンダの葉抽出物として、メタノールやヘキサンなどの有機溶媒を用いて抽出したものだけが知られていた。しかし、有機溶媒を用いた抽出物は、有機溶媒の残存影響などにより、疾病の治療や予防の用途としては問題がある。さらに、有機溶媒を用いた抽出工程は複雑であり、さらに有機溶媒による作業者や装置への影響が問題となる。【００１９】
したがって、本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。すなわち、本発明は、有機溶媒を用いずに抽出された薬理効果のあるアシュワガンダの葉抽出物を有効成分として含む組成物、及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。【００２０】
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アシュワガンダの葉を水に加えて適した温度及び時間で処理することにより、薬理効果の高いアシュワガンダの葉水抽出物を得ることに成功した。本発明は、上記知見に基づいて完成された発明である。【００２１】
すなわち、本発明によれば、アシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む、老化の抑制若しくは予防、又は腫瘍若しくは癌の治療若しくは予防のための組成物が提供される。【００２２】
さらに本発明の別の側面によれば、アシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む、正常細胞の増殖促進若しくは寿命延長、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発、正常細胞の酸化的若しくはＵＶ照射ストレスからの保護、癌細胞若しくは腫瘍細胞の殺傷若しくは増殖抑制、又は癌細胞の抗癌剤に対する感受性増強のための組成物が提供される。【００２３】
好ましくは、本発明の組成物は、前記組成物が、食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品又は化粧品である。【００２４】
好ましくは、本発明の組成物は、前記アシュワガンダの葉水抽出物が水にアシュワガンダの葉を加えて２０〜７０℃で６〜１００時間処理する工程；又は水にアシュワガンダの葉を加えて７０〜１００℃にまで熱した後に、１〜３０℃にまで放冷する工程により提供される組成物である。【００２５】
さらに本発明の別の側面によれば、本発明の組成物の製造方法であって、水にアシュワガンダの葉を加えて２０〜７０℃で６〜１００時間処理する工程；又は水にアシュワガンダの葉を加えて７０〜１００℃にまで熱した後に、１〜３０℃にまで放冷する工程を含む、前記方法が提供される。【００２６】
発明の効果
本発明により、正常細胞の増殖促進及び寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用、正常細胞の酸化的及びＵＶ照射ストレスからの保護作用、癌細胞及び腫瘍細胞の殺傷及び増殖抑制作用、並びに癌細胞の抗癌剤に対する感受性増強作用を有するアシュワガンダの葉水抽出物が提供される。さらに、本発明の組成物は、老化の抑制及び予防、並びに腫瘍及び癌の治療及び予防をすることを可能にする。さらに、本発明の製造方法によれば、単独又は他の物質と併用することにより、アンチエイジング又は癌や腫瘍の形成抑制が期待できる、医薬用途、保健用途、医薬部外品用途、又は化粧品用途に用いられるアシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む組成物を、大量、簡易かつ迅速に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＷＥＸ−１による特異的な抗がん細胞活性を測定した結果を示す。
【図２】図２は、ＷＥＸ−２による特異的な抗がん細胞活性を測定した結果を示す。
【図３】図３は、ＷＥＸ−３によるヒト正常細胞及びがん細胞の処理結果を示す。
【図４】図４は、ＷＥＸ−１又はＷＥＸ−２による特異的ながん細胞殺傷活性を測定した結果を示す。
【図５】図５は、ＷＥＸ−１によるｉｎ  ｖｉｖｏヌードマウスの腫瘍を抑制した結果を示す。
【図６】図６は、ＷＥＸ−１によるヒト正常細胞のより高い生存活性及び長期増殖活性を測定した結果を示す。
【図７】図７は、ＷＥＸ−１によるヒト正常細胞におけるプロテアソーム活性を測定した結果を示す。
【図８】図８は、ＷＥＸ−１によるヒト正常細胞の酸化的ダメージの保護作用を測定した結果を示す。
【図９】図９は、ＷＥＸ−１で処理したＵＶ損傷細胞のｐ５３レベルを測定した結果を示す。
【図１０】図１０は、ＷＥＸ−１による正常細胞又は腫瘍由来細胞のモータリン誘導活性を測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、ＷＥＸ−１のＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの測定結果を示す。
【図１２】図１２は、ウィザノン検出条件下におけるＷＥＸ−１のＨＰＬＣ測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の組成物は、アシュワガンダの葉水抽出物を有効成分として含む、正常細胞の増殖促進及び寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用、正常細胞の酸化的及びＵＶ照射ストレスからの保護作用、癌細胞及び腫瘍細胞の殺傷及び増殖抑制作用、並びに癌細胞の抗癌剤に対する感受性増強作用を有し、老化の抑制若しくは予防、又は腫瘍若しくは癌の治療若しくは予防のために用いられる組成物である。本発明の組成物は、例えば、食品、栄養補助食品、医薬品、医薬部外品又は化粧品の形でありうる。
【００２９】
本明細書にいう「アシュワガンダ」とは、学名Withania somniferaを意味する。したがって、本明細書にいう「アシュワガンダの葉」とはWithania somniferaの葉を意味し、「アシュワガンダの葉水抽出物」とは、アシュワガンダの葉を水で抽出して得られる抽出物を意味する。
【００３０】
アシュワガンダの葉は採取したままの新鮮葉、それを乾燥させたもの、または焙煎させたものの何れでもよいが、乾燥させたものが望ましい。原料とするアシュワガンダは天然に生育するものに限定されず、in vitroで培養したものであってもよいが、アシュワガンダの葉に含有される成分の組成はアシュワガンダの産地や樹齢等により若干の差があると考えられるため、本発明のアシュワガンダの葉水抽出物を得るためには、インド国内で種から栽培した２〜４年目の植物を用いることが望ましい。
【００３１】
上記アシュワガンダの葉水抽出物は、例えば、水にアシュワガンダの葉を加えて２０〜７０℃で６〜１００時間処理する工程、又は水にアシュワガンダの葉を加えて７０〜１００℃にまで熱した後に、１〜３０℃にまで放冷する工程の何れかの工程により得ることができる。
【００３２】
本明細書にいう「水」とは、通常用いられる水であれば特に制限されず、例えば、水道水や医薬用水等が挙げられる。本明細書にいう「水にアシュワガンダの葉を加えて２０〜７０℃で６〜１００時間処理する工程」は、水にアシュワガンダの葉を加えてアシュワガンダの葉水抽出物が得られる工程であって、温度範囲は２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは４０〜５０℃とし、処理時間は６〜１００時間、好ましくは８〜４８時間、より好ましくは１２〜２４時間とする工程である。上記工程を達成せしめる方法としては、上記した温度および時間の範囲を逸脱しなければ特に制限されない。上記工程の具体例としては、例えば、実施例に示した通り、１０ｇのアシュワガンダドライリーフパウダー（インド原産、（株）iGENEより購入）を１００mlの水に混ぜ、アシュワガンダの葉が１０％である混濁液を用意し、該混濁液を４５℃のインキュベーター内にてオーバーナイトでゆっくり振盪する工程を挙げることができる。
【００３３】
本明細書にいう「水にアシュワガンダの葉を加えて７０〜１００℃にまで熱した後に、１〜３０℃にまで放冷する工程」は、上記と同様に、水にアシュワガンダの葉を加えてアシュワガンダの葉水抽出物が得られる工程であって、加熱温度の範囲は７０〜１００℃、好ましくは７０〜９０℃、より好ましくは８０〜９０℃とし、放冷時の温度範囲は１〜３０℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃、最適に好ましくは２０〜２５℃とする工程である。加熱時間および放冷時簡については特に制限はなく、アシュワガンダの葉水抽出物が得られるのであれば、上記工程を１又は２度以上繰り返してもよい。例えば、急速に加熱する（例えば、１〜１０分間で８０〜９０℃にまで熱する）場合は、上記工程を２度以上繰り返すことが好ましい。上記工程を達成せしめる方法としては、上記した加熱および放冷時の温度範囲を逸脱しなければ特に制限されない。上記工程の具体例としては、例えば、実施例に示した通り、１０ｇのアシュワガンダドライリーフパウダー（インド原産、（株）iGENEより購入）を１００mlの水に混ぜ、アシュワガンダの葉が１０％である混濁液を用意し、電子レンジで該混濁液が約８０℃〜９０℃になるまで加熱し、その後室温まで放冷することを二度繰り返す工程を挙げることができる。
【００３４】
水にアシュワガンダの葉を加えて２０〜７０℃で６〜１００時間処理する工程、及び水にアシュワガンダの葉を加えて７０〜１００℃にまで熱した後に、１〜３０℃にまで放冷する工程の何れとも、任意に撹拌操作を加えることができる。撹拌操作として、振盪以外にも、マグネチックスターラーやボルテックスミキサーなどを用いた機械的な撹拌を採用してもよい。さらに、上記工程の前後に無菌ろ過やＵＶ殺菌などの除菌・殺菌処理を加えることができる。上記工程の前に除菌・殺菌処理を加える場合には、上記工程を無菌的に実施するのが好ましい。本発明の製造方法は、アシュワガンダの葉水抽出物を得ることができれば、撹拌や除菌・殺菌処理以外にも、任意に種々の操作や処理を加えることができる。アシュワガンダの葉水抽出物は、温風乾燥や凍結乾燥などの乾燥、カラムクロマトグラフィーなどを用いて適宜濃縮・精製してもよい。
【００３５】
アシュワガンダの葉水抽出物には、図１１Ａで示される化合物や図１１Ｂで示される少なくとも６つのタンパク質を含む。さらに、図１２が示す通り、アシュワガンダの葉水抽出物は、アシュワガンダの葉から有機溶媒抽出によって得られるウィザノンと異なる。よって、アシュワガンダの葉水抽出物における、正常細胞の増殖促進及び寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用、正常細胞の酸化的及びＵＶ照射ストレスからの保護作用、癌細胞及び腫瘍細胞の殺傷及び増殖抑制作用、並びに癌細胞の抗癌剤に対する感受性増強作用は、アシュワガンダの葉水抽出物に含まれる、ウィザノンと異なる、水性化合物（タンパク質）の１種又は２種以上の組み合わせによってもたらされる可能性が高い。
【００３６】
本発明の組成物が医薬用組成物であるときの投与方法は特に限定されるものではなく、経口、経鼻、非経口、経肺、経皮、経粘膜などが可能である。本発明の医薬用組成物は種々の剤形とすることができる。例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができるが、これらに限定されない。また、製剤には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤、ビタミンＣ、抗酸化剤を含むことができるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の医薬用組成物の投与量は、一般的には、アシュワガンダ葉抽出物に換算して成人１日用量として１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇを使用する。もちろん個別的に、投与されるヒトの年齢、体重、症状、投与経路、投与期間、治療経過等に応じて変化させることもできる。１日あたりの量を数回に分けて投与することもできる。また、他の抗腫瘍剤や治療法と組み合わせて投与することもできる。
【００３８】
本発明の組成物は、食品又は栄養補助食品の形態とすることもできる。例えば、アシュワガンダ葉抽出物を原材料に配合することにより、麺類、パン、キャンディー、ゼリー、クッキー、スープ、健康飲料、焼酎などのアルコール飲料等の形態とすることができる。このような食品、栄養補助食品にはアシュワガンダ葉抽出物の他に、鉄、カルシウム等の無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖、キトサン等の食物繊維、大豆抽出物等のタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖、乳糖等の糖類を加えることができる。
【００３９】
本発明の組成物は、アシュワガンダ葉抽出物を原材料に配合することにより、医薬部外品または化粧品の形態とすることもできる。本発明の組成物を医薬部外品または化粧品とするときは、本発明の効果を損なわない範囲で、アシュワガンダ葉抽出物に加えて、通常医薬部外品や化粧品に用いられる他の成分、例えば油分、湿潤剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、保湿剤、香料、水、アルコール、増粘剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００４０】
本発明の組成物は、正常細胞の増殖促進及び寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用、正常細胞の酸化的及びＵＶ照射ストレスからの保護作用、癌細胞及び腫瘍細胞の殺傷及び増殖抑制作用、並びに癌細胞の抗癌剤に対する感受性増強作用を有し、老化の抑制及び予防、並びに腫瘍及び癌の治療及び予防を可能とする。本発明の組成物が正常細胞の増殖促進及び寿命延長作用、正常細胞のプロテアソーム活性の誘発作用、正常細胞の酸化的及びＵＶ照射ストレスからの保護作用、癌細胞及び腫瘍細胞の殺傷及び増殖抑制作用、並びに癌細胞の抗癌剤に対する感受性増強作用を有するかどうか、又は老化の抑制及び予防、並びに腫瘍及び癌の治療及び予防を可能とするどうかについては、以下に記載する実施例に記載の各方法を用いることができるが、これに限定されない。
【００４１】
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例１】
【００４２】
１．アシュワガンダ植物葉からの水抽出物（ＷＥＸ）の調整
１０ｇのアシュワガンダドライリーフパウダー（インド原産、（株）iGENEより購入）を１００mlの水に混ぜ、１０％の混濁液を用意した。次に下記のいずれかの処理を行った。
（１）混濁液を４５℃のインキュベーター内にてオーバーナイトでゆっくり振盪した。
（２）電子レンジで混濁液が約８０℃〜９０℃になるまで加熱し、その後室温まで放冷。再び、電子レンジで混濁液が約８０℃〜９０℃になるまで加熱し、その後室温まで放冷した。
（３）混濁液を１２０℃２０分間のオートクレーブ処理を行い、その後室温まで放冷した。再び、１２０℃２０分間のオートクレーブ処理を行い、その後室温まで放冷した。
上記（１）〜（３）のいずれかの処理を経た混濁液を20分間10,000rpmで遠心し、この上澄みを0.45ミクロンのフィルターを用いてフィルタレーションした。このフィルタレーション水溶液を、１〜２ｍｌに小分けし実験に使用するまで、−２０℃で冷凍保存した。なお、今後は上記（１）の処理を経たものをＷＥＸ-１、上記（２）の処理を経たものをＷＥＸ−２、上記（３）の処理を経たものをＷＥＸ−３とよぶ。
【実施例２】
【００４３】
２．ＷＥＸ−１及びＷＥＸ−２の特異的な抗がん細胞活性
正常なヒト二倍体繊維芽細胞（ＴＩＧ−１とＭＲＣ５）及び種々のがん細胞（骨肉腫由来のＵ２ＯＳ、乳癌由来のＭＣＦ７、繊維肉腫由来のＨＴ１０８０、大腸癌由来のＨＣＴ１１６（４０−１６）及び胆嚢癌由来のＳＫＣＨ）を、１０％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略称）を含有するダルベッコの改変イーグル最小培地（以下ＤＭＥＭと略称）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社、米国）にて９６穴培養皿を用いて加湿培養器内（３７℃及び５％二酸化炭素濃度）で培養した。細胞（３×１０5個〜５×１０5個）をＷＥＸ−１又はＷＥＸ−２で処理した。生存細胞数をＷＳＴベースの細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ社）でモニターした（図１及び図２）。その結果、ＷＥＸ−１及びＷＥＸ−２は、ヒトがん細胞を殺し、正常ヒト細胞には影響をもたらさなかった。
【実施例３】
【００４４】
３．ＷＥＸ−３の抗がん細胞活性
実施例２と同様にして、ＷＥＸ−３でヒト正常細胞及びがん細胞を処理した（図３）。その結果、ＷＥＸ−３はがん細胞や正常細胞に何の影響ももたらさなかった。ＷＥＸ−３はＷＥＸ−１及びＷＥＸ−２でみられた活性が失われており、これはＷＥＸ−１を高圧高温下で処理するとそのがん細胞殺傷効果が破壊されることを証明する結果となった。
【実施例４】
【００４５】
４．ＷＥＸ−１及びＷＥＸ−２のがん細胞殺傷活性
実施例２と同様に細胞を培養した。細胞をＷＥＸで処理した後、氷冷メタノール（−２０℃で保存）で２〜３分間固定し、ＰＢＳで洗浄後、約１〜２時間クリスタルバイオレット（２５％メタノールに溶解する０．５％クリスタルバイオレット溶液）に浸けた。そして細胞を水で過剰にリンスし、乾燥させ、写真撮影した（図４）。その結果、がん細胞（Ｕ２ＯＳ、ＭＣＦ７及びＨＴ１０８０）は、ＷＥＸ−１処理及びＷＥＸ−２処理により細胞増殖が停止した。正常細胞（ＴＩＧ−１及びＭＲＣ５）は、細胞増殖に何ら差がみられなかった。したがって、ＷＥＸ−１及びＷＥＸ−２は、がん細胞殺傷活性を有しかつ正常細胞に安全な水溶性の調整に利用できる。
【実施例５】
【００４６】
５．ＷＥＸ−１を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍アッセイにために、Ｂａｌｂ／ｃ系統ヌードマウスにヒト繊維肉腫由来（ＨＴ１０８０）細胞（０．５  ｍｌの成長培地に１×１０6個）をヌードマウスの側面皮下に注射した（一匹のマウスにつき２箇所）。対照のマウス、ＷＥＸを注射したマウス（腫瘍ヶ所に局注）及びＷＥＸを餌として与えたマウス（一日おきにＷＥＸを経口投与；２％滅菌カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を伝達体とし可動式テフロン（登録商標）注射を使用してマウスの消化管に流し込んだ）の腫瘍形成をモニターした（図５）。その結果、ＷＥＸ−１の腫瘍箇所への局注及びＷＥＸ−１の餌与が、ｉｎ  ｖｉｖｏヌードマウスアッセイにおいて腫瘍抑制を導いた。
【実施例６】
【００４７】
６．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ寿命研究
短期生存能力アッセイ（Ａ）又は長期連続継代アッセイ（Ｂ）において正常ヒト繊維芽細胞をＷＥＸ−１存在下で培養した（図６）。ＷＥＸ−１存在下の培養細胞は、より高い生存性を示し（Ａ）、長期増殖能力も増加が認められた（Ｂ）。【００４８】
正常ヒト繊維芽細胞（ＴＩＧ−１とＭＲＣ５）をＷＥＸ−１存在下で培養し、プロテアソーム活性を測定した（図７）。ＷＥＸ−１処理すると、使用した両方のタイプの正常細胞でプロテアソーム活性が誘導される結果となった。
【実施例７】
【００４９】
７．酸化ダメージに対する正常細胞の防御
正常細胞繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）を過酸化水素水処理により酸化的ストレスにさらし、ＷＥＸ−１存在下又は非存在下での回復をみた（図８）。その結果、ＷＥＸ−１存在下では酸化的ダメージから身を守り、あるいは、酸化的ダメージから回復した。
【実施例８】
【００５０】
８．ＵＶダメージに対する正常細胞の防御
正常細胞繊維芽細胞（ＴＩＧ−１）をＵＶストレス（２０  ｍＪ／ｃｍ2）にさらした。ＵＶダメージ反応の分子マーカーであるｐ５３タンパク質のレベルをウェスタンブロッティングで調べ、細胞生存数をＷＳＴアッセイで調査した（図９）。その結果、ＷＥＸ−１処理した細胞は、ｐ５３のレベルが落ちる結果となった。ｉ−Ｆａｃｔｏｒ（ウィダノン）は、ポジティブコントロールとして使用した（Ａ−Ｂ）。ＷＥＸ−１存在下では細胞生存数もまた増加した。
【実施例９】
【００５１】
９．正常細胞のみにおけるストレスシャペロンモータリンの誘導
正常細胞繊維芽細胞（ＴＩＧ−１；若い細胞と老化した細胞の二種類）及び腫瘍由来細胞（Ｕ２ＯＳ、ＳＫＣＨ、及びＭＣＦ７）を４８〜７２時間ＷＥＸで処理し、ストレスタンパク質とｐ５３のレベルをウェスタンブロッティングで調べた（図１０）。その結果、ＷＥＸ−１は正常細胞においてのみモータリンを誘導した（Ａ）。興味深いことに、ＳＫＣＨでは変異型ｐ５３のレベルがＷＥＸ処理により劇的に減少した（Ｂ）。
【実施例１０】
【００５２】
１０．ＷＥＸ−１の分画と分析
ＷＥＸ−１を下記に示すようにＨＰＬＣとＳＤＳ  ＰＡＧＥで解析した。ＷＥＸの分画はＣ１８カラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ、東ソー社）を用いた逆相ＨＰＬＣで行った。流速は、１  ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とし、グラジェント抽出には、水（溶液Ａ）とエタノール（溶液Ｂ）を用いた。３５分のグラジェントプログラムは次の通りである：溶液Ａ  １００％一定５分、溶液Ｂ  ０．７５％までのグラジェント１５分、溶液Ｂ  ０．７５％から５０％までのグラジェント５分、溶液Ｂ  ５０％一定５分、溶液Ｂ  ５０％から０％までのグラジェント２分、そして最後に、溶液Ａ  １００％一定５分。検出は２２０  ｎｍで行った（図１１）。その結果、図１１Ａに示すように、ＷＥＸは４つの構成物に分画できた（分画１〜４）。ＷＥＸ−１をまたＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで分離し、クマシーブリリアントブルー染色を行った。図１１Ｂに示すように、ａ〜ｆとラベルした６つのタンパク質をＷＥＸは含んでいた。これは、ＷＥＸには多数の水溶性タンパク質が存在することを示すものであり、有機溶媒を使用するウィザノンの抽出法では存在し得ないタンパク質である。
【実施例１１】
【００５３】
１１．抽出液の組成分析
下記に示すウィザノンを検出できる条件下でＨＰＬＣ解析を実施した（図１２）。
カラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ−１８  （５μｍ  １５０（Ｌ）×４．６（Ｄ））
カラムオーブン：４０℃
Ａ溶液：１％メタノール
Ｂ溶液：メタノール：エタノール：ｉ−プロパノール＝５２．２５：４５．３０：２．４５
グラデーションプログラム：
イニシャル：Ａ６５％  （Ｂ３５％）
→２０ｍｉｎ：Ａ５９％  （Ｂ４１％）
→２３ｍｉｎ：Ａ０％  （Ｂ１００％）
→２８ｍｉｎ：Ａ０％  （Ｂ１００％）
→３１ｍｉｎ：Ａ６５％  （Ｂ３５％）
→３６ｍｉｎ：Ａ６５％  （Ｂ３５％）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器波長：２２０ｎｍ【００５４】
図１２に示す通り、ＷＥＸ中にウィザノンを検出できなかった。この結果は、ＷＥＸは水抽出液であり、一方ウィザノンは化学的性質として溶解度が低く水に難溶であるため水抽出では得られないことを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１２】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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