(57)【要約】  本発明の課題は、検出対象を迅速、安価、簡便且つ高精度に検出、定量できる検出対象の検出方法及び定量方法を提供することである。  検出方法は、刺激応答性ポリマー１１及び微粒子状の磁性物質１９を含有する第１の物質と検出対象５０に対する第１の抗体１３とが結合した第１の結合物１０と、検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマー１１が凝集する条件下においた後、磁力を付加し、発生する磁界を測定して、磁力の付加後における磁界の増加の程度に基づいて、検出対象５０を検出する工程を含む。
2009084596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性ポリマー及び微粒子状の磁性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下においた後、磁力を付加し、
発生する磁界を測定して、磁力の付加後における磁界の増加の程度に基づいて、前記検出対象を検出する工程を含む方法。
【請求項２】
磁力の付加の前に、第１の物質を前記混合物に更に添加する工程を更に含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１の結合物及び前記検体を、有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と混合し、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマー及び微粒子状の磁性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下においた後、磁力を付加し、
発生する磁界を測定し、前記検出対象の量と磁界との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
【請求項５】
磁力の付加の前に、第１の物質を前記混合物に更に添加する工程を更に含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
第１の結合物及び前記検体を、有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と混合し、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる請求項４又は５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象の検出方法及び定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、被検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が行われてきた。ラテックス凝集法とは、生体試料等の流体中における抗原を検出する場合、抗原に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させたラテックスと、流体とを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量する方法である（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
このラテックス凝集法によれば、検体として添加された抗原が複数のラテックス結合抗体を架橋させ、ラテックスの凝集を促す。このように手順が単純であるから、簡便且つ迅速に抗原を検出できる。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいため、ラテックスが十分に凝集しない。このため、微量の抗原を検出することが困難であった。【０００４】
そこで、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法といった酵素基質反応を利用する方法も広く採用されている。これらの方法では、例えば、抗原に特異的に結合する一次抗体を抗原に結合させ、この一次抗体に酵素を有する二次抗体を結合させる。ここで、酵素の基質を添加し、酵素が触媒する反応の程度を測定することで、抗原を検出又は定量する。【０００５】
これらの方法によれば、例えば基質として発光試薬を用いると、基質添加後の発光の検出感度が高いため、微量の抗原も検出できる。
【特許文献１】特公昭５８−ｌｌ５７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、酵素基質反応を利用する方法では、二次抗体や発光試薬等の特殊な試薬が多数必須であり、作業コストが高い。また、発光試薬の退色（ブリーチング現象）を抑制するべく、測定工程を極めて短時間に終了せざるを得ないため、測定精度が不充分になることが懸念される。【０００７】
一方、図１０に示すように、この方法は、試料及び各試薬をインキュベーションする工程（ＳＴ１１０、ＳＴ１３０）、系を洗浄する工程（ＳＴ１２０）、発光を測定する工程（ＳＴ１４０）等の多段階からなっており、操作が煩雑である。しかも、各段階に要する時間が極めて長く、大規模処理には適さない。【０００８】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、検出対象を迅速、安価、簡便且つ高精度に検出、定量できる検出対象の検出方法及び定量方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、有電荷又は親水性物質に接近されると刺激応答性ポリマーの凝集が阻害されること、磁力を活用することで刺激応答性ポリマーの凝集の程度を高精度に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。【００１０】
［１］検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性ポリマー及び微粒子状の磁性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下においた後、磁力を付加し、
発生する磁界を測定して、磁力の付加後における磁界の増加の程度に基づいて、前記検出対象を検出する工程を含む方法。
［２］磁力の付加の前に、第１の物質を前記混合物に更に添加する工程を更に含む［１］記載の方法。
［３］第１の結合物及び前記検体を、有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と混合し、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる［１］又は［２］記載の方法。
［４］検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマー及び微粒子状の磁性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下においた後、磁力を付加し、
発生する磁界を測定し、前記検出対象の量と磁界との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
［５］磁力の付加の前に、第１の物質を前記混合物に更に添加する工程を更に含む［４］記載の方法。
［６］第１の結合物及び前記検体を、有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と混合し、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる［４］又は［５］記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、検出対象が存在する場合、この結合対象に第１の親和性物質が結合する。すると、検出対象の電荷部分又は親水性部分が、第１の親和性物質に結合した刺激応答性ポリマーに接近する。これにより、電荷部分又は親水性部分が刺激応答性ポリマーの近傍に配置されるため、刺激に応答した刺激応答性ポリマーによる第１の物質の凝集は検出対象の量に依存して阻害される。
ここで、第１の物質は、磁力が付加されると、凝集状態にある場合には強磁性を示して大きな残留磁気を有するようになるが、非凝集状態にある場合には超常磁性を示して残留磁気を有しないという特性を備える。つまり、磁力の付加後における磁界の増加の程度は、第１の物質の凝集の程度に依存することになる。
よって、磁力の付加後における磁界の増加の程度が検出対象の量に依存することになるので、磁界の増加の程度に基づいて検出対象を検出できる。また、検出対象量及び磁界の相関式に基づいて検出対象を定量できる。【００１２】
しかも、以上の手順は、いずれも特殊な試薬を特に使用することなく行うことができ、安価且つ簡便である。また、磁界を測定するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速且つ高精度に検出対象の検出又は定量を行うことができる。また、測定される磁界は検出対象中の夾雑物に大きく影響されるものではないので、測定前に夾雑物を除去するといった予備手順を必ずしも行う必要がなく、高精度且つより迅速に検出対象の検出又は定量を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る方法において使用される第１の結合物の概略構成図である。
【図２】前記実施形態に係る第１の結合物の使用状態を示す模式図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る方法において使用される検査装置の概略構成図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る方法において使用される第１の結合物及び第２の結合物の概略構成図である。
【図５】前記実施形態に係る第１の結合物及び第２の結合物の使用状態を示す模式図である。
【図６】参考例に係る方法に係る方法における測定時間と濁度との関係を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施例に係る方法において使用した計測装置の概略構成図である。
【図８】前記実施例に係る方法における測定時間と磁界との関係を示すグラフである。
【図９】前記実施例に係る方法における検出対象の量と、磁界との相関式を示すグラフである。
【図１０】従来例に係る方法のフローチャートである。
【符号の説明】
【００１４】
１０  第１の結合物
１１  刺激応答性ポリマー
１３  第１の抗体（第１の親和性物質）
１５  アビジン
１７  ビオチン
１９  磁性物質
２０  第２の結合物
２１  第２の物質
２３  第２の抗体（第２の親和性物質）
５０  検出対象
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。なお、第１実施形態以外の各実施形態の説明において、第１実施形態と共通するものについては、同一符号を付し、その説明を省略する。
【００１６】
＜第１実施形態＞  検出方法
〔混合・凝集〕
本発明の検出方法では、まず、第１の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。まず、ここで用いる第１の結合物について詳細に説明する。
【００１７】
［第１の結合物］
第１の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と、検出対象に対する第１の親和性物質とが結合したものである。
【００１８】
（第１の物質）
本発明で用いられる第１の物質は刺激応答性ポリマーを含有する物質であり、この刺激応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）、電場変化等が挙げられる。
【００１９】
特に、本発明では、刺激応答性ポリマーとしては、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーが利用できる。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度を有するポリマー（以下、ＵＣＳＴとも称する）が挙げられる。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＬＣＳＴ未満の温度の水溶液中では完全に分散し、ＬＣＳＴ以上に水温を上昇させると直ちに凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＵＣＳＴを越える温度の水溶液中では完全に分散し、ＵＣＳＴ以下に水温を下降させると直ちに凝集させることができる。
【００２０】
本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。
【００２１】
本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。
【００２２】
また、本発明では、刺激応答性ポリマーとして、ｐＨ変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマーが利用できる。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における第１の結合物、第２の結合物、及び検体の変性等による検出・定量精度の低下を抑制できる点で、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。
【００２３】
このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。
【００２４】
（微粒子状の磁性物質）
ここで用いる微粒子状の磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質（磁性微粒子）は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。
【００２５】
（第１の親和性物質）
第１の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
【００２６】
［第１の結合物の作製］
第１の結合物は、第１の物質と第１の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第１の物質側（例えば刺激応答性ポリマー部分）及び第１の親和性物質（例えば、第１の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第１の物質及び第１の親和性物質を結合させる。
【００２７】
具体的には、刺激応答性ポリマーへのビオチンの結合は、国際公開ＷＯ０１／００９１４１号パンフレットに記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。また、第１の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行うことができる。次に、ビオチン結合刺激応答性ポリマー及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーが結合する。
【００２８】
別法として、ポリマーの重合時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に第１の抗体を結合させることにより、刺激応答性ポリマーと、検出対象の抗原に対する第１の抗体との第１の結合物が作製される。
【００２９】
あるいは、ポリマーの重合時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に対する第１の抗体を常法に従って直接結合させてもよい。
【００３０】
あるいは、微粒子状の磁性物質に第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーを結合させてもよい。
【００３１】
第１の物質を刺激応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、第１の結合物を精製してもよい。第１の結合物の精製は、刺激応答性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、更に第１の親和性物質を結合させた後、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。
【００３２】
微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。
【００３３】
再び、検出方法の手順の説明に戻る。以上のような第１の結合物及び検体の混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におくと、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが検出対象の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する。一方、検出対象が存在しない場合には、刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。
【００３４】
この現象を、図１〜図２を参照しながら説明する。
【００３５】
図１に示されるように、第１の結合物１０は刺激応答性ポリマー１１を含有し、この刺激応答性ポリマー１１はアビジン１５及びビオチン１７を介して検出対象５０に対する第１の抗体１３に結合されている。また、第１の結合物１０は微粒子状の磁性物質１９を含み、この磁性物質１９の表面に刺激応答性ポリマー１１が結合されている。これにより、検出対象５０は第１の抗体１３を介して磁性物質１９に接近でき、このとき検出対象５０の正電荷部分が磁性物質１９の近傍に位置することになる。なお、本実施形態では検出対象５０の正電荷部分が磁性物質１９の近傍に位置する構成としたが、これに限られず、負電荷部分又は親水性部分が磁性物質１９の近傍に位置する構成であってもよい。
【００３６】
刺激応答性ポリマー１１を凝集させるためには、例えば温度応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器を温度応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。温度応答性ポリマーには、上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーと、下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーの２種類がある。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を３７℃以上の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を５℃未満の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。
【００３７】
また、ｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある分散混合液の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。
【００３８】
また、光応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。凝集させるための好ましい光は、光応答性ポリマーに含まれる光応答性官能基の種類及び構造により異なるが、一般に波長１９０〜８００ｎｍの紫外光又は可視光が好適に使用できる。このとき、強度は０．１〜１０００ｍＷ／ｃｍ２が好ましい。なお、光応答性ポリマーは、測定精度を向上できる点で、濁度の測定に用いられる光が照射された際、分散を生じにくいもの、換言すれば凝集するものであることが好ましい。光応答性ポリマーとして、濁度の測定に用いられる光が照射された際に分散を生じるものを用いる場合、照射時間を短縮することで測定精度を向上できる。
【００３９】
かかる条件下に第１の結合物１０及び検体の混合物をおくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が検出対象５０の正電荷部分によって凝集阻害されて分散する（図２（Ａ））。一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（図２（Ｂ））。
【００４０】
なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第１の結合物及び検出対象の結合後に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。
【００４１】
ここで、下限臨界溶液温度は、次のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。
【００４２】
また、上限臨界溶液温度の場合は、次のように決定する。１℃／分の速度で試料を冷却し、下限臨界溶液温度の場合と同様に５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＵＣＳＴとして求める。
【００４３】
〔磁力の付加・磁場の測定〕
磁力の付加及び磁場の測定は、常法に従って行えばよい。以下、一態様について説明するが、この態様に本発明が限定されるものではない。
【００４４】
図３は、検査装置６０の概略構成図である。検査装置６０は、磁力付加系７０と、磁場測定系８０と、を備える。
【００４５】
磁力付加系７０は支持筒７１を備え、この支持筒７１の内部には、支持筒７１の軸方向に沿って試料チューブ７５が挿通されている。この試料チューブ７５の内部では、シリンジポンプ７７から押し出された試料Ｍが移動する。ここで、試料Ｍは、第１の結合物及び検体の混合物である。
【００４６】
一方、支持筒７１の軸方向に関する両端にヘルムホルツコイル７３ａ，７３ｂが支持されている。ヘルムホルツコイル７３ａ，７３ｂは交流電源７４に電気的に接続され、この交流電源７４からヘルムホルツコイル７３ａ，７３ｂへと交流電流が供給されると、支持筒７１内部に交流磁界が発生する。これにより、支持筒７１内に押し出された試料Ｍは、磁力を付加された後、支持筒７１外へと移動する。
【００４７】
ヘルムホルツコイル７３ａ，７３ｂは、半径及び巻数の等しい一対の円筒コイルが軸方向に間隔をあけて配置され、互いに直列に接続されたものであり、単一コイルでつくられる磁界よりも均一な磁界が望まれる場合に好適である。なお、本実施形態では両コイル７３ａ，７３ｂの巻方向が同方向であり、発生する磁界の極性は同じになる。
【００４８】
磁場測定系８０はＳＱＵＩＤ磁気センサ８１を備え、この磁気センサ８１は耐熱容器８３上に載置されている。ＳＱＵＩＤ（超伝導量子干渉デバイス）とは、超伝導リングが一つ又は二つのジョセフソン接合で結合されたものであり、高感度磁力計、近磁界アンテナ、微弱電流又は電圧の測定に適する。かかる磁気センサ８１は、支持筒７１の下方に位置し、磁気センサ８１内を通過する試料Ｍから発生する磁場を受信する。このとき、試料Ｍに検出対象が存在した場合には、第１の結合物は分散しているため、磁場を有意には増加しないが、試料Ｍに検出対象が存在しなかった場合には、第１の結合物は凝集しているため、磁場を有意に増加する。
【００４９】
かかる磁場信号を磁気センサ８１はＳＱＵＩＤ駆動回路８４に送信し、ＳＱＵＩＤ駆動回路８４は磁場信号を電圧信号に変換してロックインアンプ８５へ送信する。ロックインアンプ８５に受信された電圧信号は、増幅された後にレコーダ８６に出力される。
【００５０】
レコーダ８６に出力された信号の変化を観測し、その信号強度の有意な増加が認められた場合には検体中に検出対象が存在しなかったと判断でき、有意な増加が認められない場合には検体中に検出対象が存在したと判断できる。ここで、「有意な増加」の幅は、検出に用いた系の条件に応じて、予め設定される。
【００５１】
（検出対象）
以上の検出方法で検出できる対象としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン（例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン等）、薬剤等が挙げられる。
【００５２】
これらの検出対象が含まれると疑われる検体（血液等）には、多種類且つ多量の夾雑物が混在する場合が多いが、測定される磁界は検出対象中の夾雑物に大きく影響されるものではない。このため、測定前に夾雑物を除去するといった予備手順を必ずしも行わなくてもよい。
【００５３】
〔作用効果〕
本発明の第１実施形態によれば、以下のような作用効果が得られる。
【００５４】
検出対象が存在する場合、この結合対象に第１の親和性物質が結合する。すると、検出対象の電荷部分又は親水性部分が、第１の親和性物質に結合した刺激応答性ポリマーに接近する。これにより、電荷部分又は親水性部分が刺激応答性ポリマーの近傍に配置されるため、刺激に応答した刺激応答性ポリマーによる第１の物質の凝集は検出対象の量に依存して阻害される。
ここで、第１の物質は、磁力が付加されると、凝集状態にある場合には強磁性を示して大きな残留磁気を有するようになるが、非凝集状態にある場合には超常磁性を示して残留磁気を有しないという特性を備える。つまり、磁力の付加後における磁界の増加の程度は、第１の物質の凝集の程度に依存することになる。
よって、磁力の付加後における磁界の増加の程度が検出対象の量に依存することになるので、磁界の増加の程度に基づいて検出対象を検出できる。
【００５５】
しかも、以上の手順は、いずれも特殊な試薬を特に使用することなく行うことができ、安価且つ簡便である。また、磁界を測定するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速且つ高精度に検出対象の検出を行うことができる。また、測定される磁界は検出対象中の夾雑物に大きく影響されるものではないので、測定前に夾雑物を除去するといった予備手順を必ずしも行う必要がなく、高精度且つより迅速に、全血試料等の中の検体の検出を行うことができる。
【００５６】
＜第２実施形態＞  定量方法
本発明の定量方法では、まず、第１の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下においた後、磁力を付加する。続いて、発生する磁界を測定し、検出対象の量と磁界との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。前半部分の手順は前述した検出方法と類似するので、説明を省略する。
【００５７】
（相関式）
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と磁界との相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と磁界との測定は、２点以上の検出対象の量に関するものであればよいが、信頼性の高い相関式が得られる点で、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
【００５８】
ここで、検出対象の量と磁場との相関式は、検出対象の量と磁場との直接的な相関を示す式のみならず、検出対象の量と磁場を反映するパラメータ（例えば、電圧）との相関式であってもよい。
【００５９】
（算出）
磁場測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。
【００６０】
〔作用効果〕
本発明の第２実施形態によれば、以下の作用効果が得られる。
第１実施形態と同様に、磁力の付加後における磁界の増加の程度が検出対象の量に依存することになるので、検出対象量及び磁界の相関式に磁場測定値を代入することで、検出対象を定量できる。
しかも、この手順は安価且つ簡便であり、迅速且つ高精度に検出対象の定量を行うことができる。また、測定前に夾雑物を除去するといった予備手順を必ずしも行う必要がなく、高精度且つより迅速に全血試料等の中の検出対象の定量を行うことができる。
【００６１】
＜第３実施形態＞  第１の物質の添加
本実施形態は、磁力の付加の前に、第１の物質を混合物に更に添加する工程を含む点で第１〜２実施形態とは異なる。
【００６２】
即ち、本実施形態では、第１の結合物及び検体に、更に第１の物質が添加された状態で、混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。すると、第１の結合物の凝集物に第１の物質が更に凝集し、凝集物が肥大化する。その後、磁力を付加すると、肥大化した凝集物は強力に磁化され、より強い残留磁気を具備することになる。
【００６３】
なお本実施形態では、第１の結合物及び検体の混合物に第１の物質を添加したが、これに限られず、第１の結合物、検体、第１の物質を添加する順序は任意であってよい。また、第１の物質は、単独で添加されてもよく、他の物質と複合化された状態、例えば第１の親和性物質が結合された第１の結合物の状態で添加されてもよい。
【００６４】
本実施形態によれば、前記実施形態に加え、以下のような作用効果が得られる。
第１の結合物及び検体に更に第１の物質を添加したので、形成される凝集体が肥大化する。これにより、磁力付加後により強い磁界が発生するため、検出対象の量の差異が増幅されて検出される。よって、より高精度に検出対象を検出又は定量できる。
【００６５】
＜第４実施形態＞  第２の結合物の使用
本実施形態は、第１の結合物及び検体を第２の結合物と混合する点で、前記実施形態とは異なる。以下、具体的に説明する。
【００６６】
［第２の結合物］
第２の結合物は、有電荷又は親水性の第２の物質と検出対象に対する第２の親和性物質とが結合したものである。
【００６７】
（第２の物質）
有電荷の第２の物質は、例えば電荷を有する高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボキシルを含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン（カルボキシル）やポリカチオン（アミノ）の官能基数は、２５個以上が好ましい。
【００６８】
親水性の第２の物質は、例えば水溶性の高分子化合物であり、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等のエーテル結合を含有する高分子、ポリビニルアルコール等のアルコール性水酸基を含有する高分子、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性多糖類等が挙げられる。
【００６９】
これら有電荷又は親水性の物質は、高分子鎖の中又は末端に、第２の親和性物質を結合させるための官能基等を有していてもよい。
【００７０】
（第２の親和性物質）
第２の親和性物質は、第１の親和性物質とは異なる部位において、第１の親和性物質と同時に検出対象に結合できるものである。第１の親和性物質及び第２の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。
【００７１】
［作製方法］
第２の結合物は、第２の物質と第２の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第２の物質側及び第２の親和性物質（例えば、第２の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第２の物質及び第２の親和性物質を間接的に結合させる。
【００７２】
第２の物質と第２の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合させてもよく、例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、  １、  ７１−７６、１９９０）のマレイミド−チオールカップリングに従って結合できる。具体的には、以下の２つの方法が挙げられる。
【００７３】
第１の方法では、まず、核酸の５’末端にメルカプト基（別名、スルフヒドリル基）を導入する一方、抗体に６−マレイミドヘキサノイックアシッドスクシンイミドエステル（例えば、「ＥＭＣＳ（商品名）」（（株）同仁化学研究所製））を反応させてマレイミド基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
【００７４】
第２の方法では、まず、第１の方法と同様にして核酸の５’末端にメルカプト基を導入し、このメルカプト基に更にホモ二官能性試薬であるＮ，Ｎ−１，２−フェニレンジマレイミドと反応させることによって核酸の５’末端にマレイミド基を導入する一方、抗体にメルカプト基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
【００７５】
この他に、核酸をタンパク質に導入する方法としては、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１５巻５２７５頁（１９８７年）及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１６巻３６７１頁（１９８８年）に記載された方法が知られている。これらの技術は核酸と抗体の結合に応用できる。
【００７６】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１６巻３６７１頁（１９８８年）によると、まず、オリゴヌクレオチドを、シスタミン、カルボジイミド及び１−メチルイミダゾールと反応させることによって、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基にメルカプト基を導入する。メルカプト基を導入したオリゴヌクレオチドを精製した後、ジチオトレイトールを用いて還元し、この後に２、２’−ジピリジルジスルフィドを加えることによってオリゴヌクレオチドの５’末端にジスルフィド結合を介してピリジル基を導入する。一方、タンパク質に対しては、イミノチアレンを反応させてメルカプト基を導入しておく。これらピリジルジスルフィドを導入したオリゴヌクレオチドとメルカプト基を導入したタンパク質を混合し、ピリジル基とメルカプト基を特異的に反応させてタンパク質とオリゴヌクレオチドを結合させる。
【００７７】
Ｎｕｌｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｃｈ  第１５巻５２７５頁（１９８７年）によると、まず、オリゴヌクレオチドの３’末端にアミノ基を導入しておき、ホモ二官能性試薬であるジチオ−ビス−プロピオニックアシッド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ）を反応させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することによりジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ分子中のジスルフィド結合を還元して、オリゴヌクレオチドの３’末端にメルカプト基を導入する。タンパク質の処理については、特開平５−４８１００号公報に示すようなヘテロ二官能性架橋剤が用いられる。まず、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ基）と反応しうる第１の反応性基（スクシンイミド）、及びメルカプト基と反応しうる第２の反応性基（例えば、マレイミド等）を有するヘテロ二官能性架橋剤と、タンパク質を反応させることにより、タンパク質に第２の反応性基を導入し、予め活性化されたタンパク試薬とする。このようにして得られたタンパク試薬をチオール化ポリヌクレオチドのメルカプト基へ共有結合させる。
【００７８】
核酸以外のポリアニオンやポリカチオンを使用する場合にも、これらの末端等にメルカプト基を導入することで、上記と同様の操作で第２の結合物を作製できる。
【００７９】
検出及び定量方法の手順の説明に戻る。本発明の検出方法及び定量方法では、以上の第２の結合物を、第１の結合物及び検体と混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。すると、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが第２の結合物中の電荷によって凝集阻害されて分散する一方、検出対象が存在しない場合には刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。この現象を、図４〜図５を参照しながら説明する。
【００８０】
図４に示されるように、第２の結合物２０は負電荷又は親水性を有する第２の物質２１を含み、この第２の物質２１は検出対象５０に対する第２の抗体２３に結合されている。そして、第１の抗体１３及び第２の抗体２３は、検出対象５０の異なる部位において、同時に検出対象５０に結合できる。
【００８１】
図５に示されるように、第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物を所定条件下におくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の電荷又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する（図５（Ａ））。ここで、第１の結合物１０の凝集阻害の程度は、前述の実施形態よりも大きい（図２（Ａ）参照）。
【００８２】
一方、検出対象５０が存在しない場合には、刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（図５（Ｂ））。
【００８３】
なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第１の結合物及び第２の結合物の検出対象への結合の後に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。ただし、温度応答性ポリマーが凝集する条件が、第１の結合物及び第２の結合物が検出対象に結合する条件と大幅に異なる場合、前者が好ましい。
【００８４】
本実施形態によれば、前記実施形態に加え、以下のような作用効果が得られる。
検出対象が存在すると、この結合対象に第１の親和性物質及び第２の親和性物質が結合するため、第１の親和性物質に結合した刺激応答性ポリマーと、第２の親和性物質に結合した第２の物質が接近する。これにより、有電荷部分又は親水性部分が刺激応答性ポリマーの近傍に配置されるため、刺激に応答した刺激応答性ポリマーの凝集が阻害される。従って、この凝集阻害の有無を観察することで、検出対象の存否を検出できる。また、凝集阻害の程度を測定することで、検出対象を定量できる。
また、凝集阻害は、第２の物質の有電荷部分又は親水性部分に依存し、検出対象種への依存の程度が大幅に低下する。このため、あらゆる検出対象の検出又は定量を行うことができ、確実性及び汎用性を向上できる。
【実施例】
【００８５】
本実施例では、第１の結合物として保護チオール基を含む温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子（以後、ＴＭ−ＬＰＤＰとも称する）を、第２の結合物としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドが結合したポリエチレングリコール（以後、ＮＨＳ−ＰＥＧとも称する）「ＳＵＮ  ＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−４００ＣＳ」（日油（株）製、重量平均分子量４００００）を用いて、グルタチオン（略号ＧＳＨ）を検出、定量する例を示す。
本発明の実施例で用いた代表的な試薬は次のとおりである。
ＰＢＳバッファー：１０倍濃度の市販のＰＢＳ（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ニッポンジーン（株）製）を精製水で１／１０（Ｖ／Ｖ）に希釈して用いた。
ホウ酸緩衝液：ポリサイエンス社製Ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、１００ｍＭ  ホウ酸、ｐＨ８．５。
精製水：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製「Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ」（商品名）で精製した水。  【００８６】
（第１の結合物の調製）
アミノ基結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子として、マグナビート（社）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ  ＬＡｍ  Ａｍｉｎｅ（以後、ＴＭ−ＬＡｍと称する）０．４質量％を用いた。ＴＭ−ＬＡｍ  ２ｍＬを２ｍＬマイクロチューブにとり、このマイクロチューブを４２℃に加熱することで、ＴＭ−ＬＡｍを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。除去後のマイクロチューブにホウ酸緩衝液２ｍＬを加えて溶媒を置換し、ＴＭ−ＬＡｍを充分に分散させることで、磁性微粒子含有ホウ酸緩衝液を得た。【００８７】
続いて、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（（株）同仁化学研究所製、ＳＰＤＰ）２ｍｇをジメチルスルホキシド１００μＬに溶解した溶液と、上記の磁性微粒子含有ホウ酸緩衝液とを混合し、２０℃で一晩に亘り撹拌した。撹拌された液を４２℃に加熱し、凝集体を磁石で回収した後、上清を除去した。その後、凝集体にＰＢＳバッファー  ２ｍＬを加え、充分に分散させた。以上の洗浄を２回行い、未反応のＳＰＤＰを除去した。分散液を４２℃に再加熱し、凝集体を磁石で回収し、上清を除去した後、保護チオール基を含む温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子をＰＢＳバッファーに分散させることで、第１の結合物を調製した（粒子の含有量０．３質量％）。【００８８】
（保護チオール基を含む温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド結合ポリエチレングリコールを用いたグルタチオンの定量）
［試料の調製］
Ｐｒｏ  ＭｅｄＤｘ  ＬＬＣ．（１０  Ｃｏｍｍｅｒｃｅ  Ｗａｙ  Ｎｏｒｔｈ，  ＭＡ  ０２７６６）製のヒト正常血清のうち、顕著な乳び検体（Ｓｃａｎ＃：１２２８７６１）に、還元型グルタチオン（和光純薬工業（株）製）を１２μｇ／ｍＬ及び６μｇ／ｍＬとなるよう溶解したもの、及びグルタチオンを含まないものをそれぞれ試料とした。【００８９】
［定量］
（混合）
１．５ｍＬチューブに、上述した第１の結合物のＰＢＳバッファー分散液５００μＬをとり、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８、ニッポンジーン社製）１０μＬを添加し、混合することで溶液を作製した。この溶液に上記の試料２００μＬを加え、４℃で１２時間に亘り撹拌した。その後、チューブに、ＮＨＳ−ＰＥＧ又はＰＥＧを７００μＬ（２００μＭ）加え、４℃で２４時間に亘り撹拌した。この撹拌物４００μＬにＰＢＳバッファー８００μＬを加え、混合物を得た。【００９０】
（相関式の作成１）
従来汎用されている分光光度計用セミミクロセルの光路外に、寸法５ｍｍ×９ｍｍ×２ｍｍのネオジム永久磁石７３（ネオマグ（株）製）を取り付けた。このセルを、セル温度制御機が設けられた紫外可視分光光度計Ｖ−６６０ＤＳ（日本分光（株）製）内に設置し、３７℃のもと１０分間以上保持した。【００９１】
前述の混合物をセル内に分注し、分光光度計に添付の使用説明書に従ってゼロ補正し、波長４２０ｎｍの光を用いて、直ちにバンド幅２．０ｎｍで１０００秒間にわたって連続して測定した。この結果を図６に示す。【００９２】
図６に示されるように、いずれの試料の吸光度も短時間内に検出限界値を超えてしまい、測定不能であった。これにより、乳び検体のように元来の濁度が高い試料の場合には、濁度による検出対象の定量は困難であることが確認された。【００９３】
（相関式の作成２）
図７は、本実施例で用いる計測システム１６０の模式図である。なお、試料に印加される交流磁界印加装置は省略されている。図７において、１５１は試料が搭載されるスライド基板、１５２はワイヤ、１５３は駆動モータ、１５４は制御装置、１５５はクライオスタット（低温保持容器）、１５６は磁気シールドボックス、１５７は低温保持容器１５５の上部であり且つスライド基板１５１の近傍に配置されるＳＱＵＩＤ（超高感度）磁気センサ、１５８は駆動回路、１５９はアンプ、１６１はパーソナルコンピュータ、１６３はＸ−Ｙペンレコーダである。【００９４】
この計測システム１６０は、（１）温度応答性磁性ナノ粒子の磁気信号計測をするＳＱＵＩＤ（超高感度）磁気センサ１５７及び駆動回路１５８、（２）ＳＱＵＩＤ（超高感度）磁気センサ１５７を低温に保持するためのクライオスタット（低温保持容器）１５５、（３）駆動モータ１５３とワイヤ１５２と制御装置１５４からなる基板移動機構、（４）地磁気等の磁気ノイズを遮断するための磁気シールドボックス１５６等から構成される。駆動回路１５８は低ノイズ化のために用いる。【００９５】
前述の混合物９０μＬを、ポリスチレン製のウェルプレート（高さ１１ｍｍ、直径８ｍｍの円筒容器。底の厚み０．５ｍｍ）に分注し、更に９０μＬのＰＢＳバッファーを添加して混合した。各ウェルプレートを、３７℃の恒温槽内で磁石「ダルマ  マグタッチ」（ベロス（株）製）上に置き、３．５分間静置した（磁気分離）。【００９６】
その後、各ウェルプレートをスライド基板１５１に乗せ、磁気シールドボックス１５６外に設置された移動機構によってＳＱＵＩＤ（超高感度）磁気センサ１５７の直上に移動させ、磁気センサ１５７の通過時の磁気信号を計測し、記録した。この結果を図８に示す（図８における縦軸は、磁気信号としての磁束である）。なお、計測は、試料にヘルムホルツコイルにより交流磁界を印加しつつＳＱＵＩＤ磁気センサで計測する交流磁界法で行った。また、励磁磁界は８８μＴ、励磁周波数は１００Ｈｚ、サンプル移動速度は１０ｍｍ／ｓｅｃ、リフトオフ（ＳＱＵＩＤ磁気センサ１５７と試料との距離）は１ｍｍとした。【００９７】
図８に示されるように、検出対象であるグルタチオンの含有量によって、磁気信号の計測値が大きく異なっていた。これにより、血清試料の中でも濁度の高い乳び検体のように、濁度測定では検出対象を検出困難（図６）な検体を用いても、検出対象を高精度に検出できることが確認された。従って、本実施例の方法によれば、広範な全血試料について検出対象を高精度に検出できることが分かった。【００９８】
上記の第１の結合物、第２の結合物及び試料を４℃の暗所内で保存し、１日１回ずつ３日間、同様の手順で磁気信号の計測を３回行った。グルタチオン含有量と、磁気信号（ｐＴ）の平均値との相関式を示すグラフを図９に示す。【００９９】
図９に示されるように、相関式は、ｙ＝−３０．２０８ｘ＋６１０．４２（式中、ｘはグルタチオンの量、ｙは磁気信号である）と求められた。また、相関係数Ｒ２は０．９４と極めて高く、この相関式を用いることで、乳び検体のように、濁度測定では検出対象を検出困難な検体を用いても、検出対象を高精度に定量できることが分かった。【０１００】
本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。また、本発明では刺激応答性ポリマーを必須に用いるが、ポリマーに限られず、刺激応答性の低分子を用いてもよい。かかる低分子としては、例えば、特許第３６９３９７９号公報、特許第３９１６３３０号公報、特開２００２−８５９５７号公報、特許第４０７１７３８号公報、特許第２８６９６８４号公報、特許第２９２７６０１号公報、特許第３８４５２４９号公報、特開２００６−２４２５９７号公報等に開示される低分子が挙げられる。
【図１】
2009084596.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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