(57)【要約】  生物学的サンプルの画像形成に関する方法および装置が提供される。より詳細には、それらは、サンプルの構造および動力学を研究するために、このようなサンプル中に存在する蛍光種から発せられる光を検出することに関する。このような分析方法は、サンプルに励起エネルギーのパルスを照射して、サンプル中の蛍光種に蛍光を発生させること；パルス後の所定の期間にわたって、サンプルから発せられる光を検出すること；少なくとも時間に対する検出された光の波長を記録したデータを作りかつ蓄積すること；およびデータを蛍光種のそれぞれの寿命に対して分析することにより、所定の期間の少なくとも一部において同時に光を放射し、それらの波長または寿命のみからは互いに識別することのできない３つ以上の異なる蛍光種からのそれぞれの放射の存在を検出することを含む。
2009524040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルを分析する方法であって：
（ａ）複数の蛍光種を含む生物学的サンプルを提供すること；  
（ｂ）サンプルに励起エネルギーのパルスを照射して、サンプル中の蛍光種に蛍光を発生させること；
（ｃ）パルス後の所定の期間にわたって、サンプルから発せられる光を検出すること；
（ｄ）少なくとも時間に対する検出された光の波長を記録したデータを作りかつ蓄積すること；および
（ｅ）データを蛍光種のそれぞれの寿命に対して分析することにより、前記所定の期間の少なくとも一部において同時に光を放射し、それらの波長または寿命のみからは互いに識別することのできない３つ以上の異なる蛍光種からのそれぞれの放射の存在を検出すること、
を含む、方法。
【請求項２】
検出工程（ｃ）が、前記所定の期間にわたって特定の波長範囲においてサンプルから発せられる光の強度分布を検出すること、および前記所定の期間にわたってサンプルから発せられる光の組み合わせた強度を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、特定の範囲の励起エネルギーを走査することにより照射される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、工程（ｂ）において励起エネルギーの複数のパルスにより照射される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
サンプルから発せられる光の偏光化に関連するデータが、工程（ｄ）において蓄積され、かつ分析工程（ｅ）で用いられる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
サンプルから発せられる光の空間分布が検出されかつ記録される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
所定の期間に、光が所定の一連の間隔で検出される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
複数の蛍光種を含む生物学的サンプルを分析するための装置であって、少なくとも所定の期間にサンプルから発せられる光の波長を時間に対して記録したデータを、蛍光種のそれぞれの寿命について分析することにより、前記所定の期間の少なくとも一部において同時に光を放射する３つ以上の異なる蛍光種からのそれぞれの放射であって、他の方法ではそれらの波長または寿命のみからは互いに識別することのできない放射の存在を検出するための処理手段を含む、装置。
【請求項９】
光検出手段が、以下：少なくとも１つのＰＭＴ、空間感受性検出器、画像形成検出器、空間的に仕切られた画像形成検出器、および波長感受性検出器のアレイから選択される、請求項８記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的サンプルの画像形成に関し、より詳細には、このようなサンプルの構造および動力学を研究するために、サンプル中に存在する蛍光種から放射する光を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞は高度に複雑な実体であり、それらの研究には、複数の相互作用する成分、従って複数のパラメータ（多重化）についての情報の収集が必要とされる。従来のアプローチは、サンプルに導入された（例、ＦＩＴＣ）、サンプル中で合成された（例、ＧＦＰ）またはサンプル中に天然に存在する（例、ＮＡＤＨ）複数の蛍光種を用いて、（異なる放射波長についての）検出チャネルをマッチングして、１標識当たり１チャネルのそのような情報を収集することである。このアプローチは、通常、標識のスペクトル放射重複および低光条件下での検出器のスペクトル識別能力によって、約３または４（Ｎ＝３または４）の多重蛍光種に限定される。あるいは、蛍光種はそれらの蛍光寿命に基づいて識別され得る。これもまた、いずれか１つの時間（Ｍ＝２または３）におけるわずかな数の検出チャネルに限定される。従来、これらの検出様式は、異なる装置で利用可能であり、得られる情報は実験間で相関していなければならない。さらに、測定は、代表的には、キュベット内で行われてきたが、これはいくつかの成分の複雑な混合物を含み得る。
【０００３】
スペクトル的に分解された蛍光
蛍光種（フルオロフォア）は、典型的にはより短い波長範囲内での励起スペクトル（ピークの形態）およびより長い波長範囲を有する放射スペクトル（ピークの形態）を示し（図１ａ）、これによって、励起スペクトルは、その波長に応じて基底状態にある種を励起する入射光子の可能性を示す。短い期間の後、励起した種は、典型的には、光子を放射して基底状態に戻る。放射された光子が特定の波長を有する可能性は、放射スペクトルにより示される。
【０００４】
蛍光プロセスは非効率的であり、放射光は、用いる励起光よりもずっと強度が低く、典型的には１％よりずっと低い。実用的な実施形態では、特定の種は、典型的には、特定の励起波帯域にわたって放射される光を用いて、源からの光により励起される。放射光のうち、特定の放射または検出波帯域は、検出サブシステムへの送達用に選択され得る（図Ｉｂ）。励起は、レーザなどの狭い帯域源か、またはランプ（例、キセノンまたは水銀）などのより広域な帯域源であり得、これから適した波帯域が選択される。放射帯域は、光学フィルタを用いることにより選択され得る。
【０００５】
蛍光種の励起スペクトルと放射スペクトルとの間には、典型的には重複が存在するので、このことにより、用いられ得る励起帯域および放射または検出帯域に実用上の制限が設定される。広域の放射または検出帯域を用いることが望ましく、なぜならこれによって放射光が検出される可能性がより高くなり、かつ、機器が、この種に対してより感受性が高くなり得るからである。励起光は、典型的には放射光よりもずっと強度が高いので、検出器に利用可能な光の放射帯域が、蛍光種の非存在下で検出器を破壊するかまたは誤ったバックグラウンドシグナルを引き起こす、用いられる励起帯域の部分を全く含まないことを確認することが通常は必要である。低いバックグラウンドを維持することは、目的の蛍光種が低濃度で存在し得る場合に特に重要である。従って、検出効率を向上させるためにより短い波長に向かって放射または検出帯域を延長するには、励起帯域をさらにより短い波
長に向かって設定する必要があり、励起ピークから離れる可能性は、結果としてより悪い励起効率を生じる。特定の実施形態の設計は、典型的には、励起帯域および放射または検出帯域の選択の慎重なトレードオフを含む。
【０００６】
サンプルが２つ以上の蛍光種を含む場合、状況はより複雑になり、追加のなすべきトレードオフが存在する。個別の蛍光種が順に時間内に次々と得られなければならないか（一時的な多重化）、または複数の励起帯域および放射帯域が、干渉を避けるように選択されなければならない。単一の蛍光種を用いた検出と比べると、感度の喪失がおそらくあるであろう、なぜなら、帯域幅および位置の選択がより限定されるからである（図Ｉｃ）。いずれの場合においても、用いられる蛍光種は、慎重に選択されなければならない、なぜなら、非常に似通った励起および放射スペクトルを有する蛍光種は、識別され得ないからである。さらに、いくつかの蛍光種は、それらの励起および放射スペクトルにおいて顕著な第２のピークを有するが、これらは複数の種の検出において干渉を引き起こし、利用可能な感度およびダイナミックレンジを限定する。
【０００７】
蛍光検出方法は、キュベットまたはウェル中のサンプルに適用され得、例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ＶａｒｉｏｓｋａｎおよびＴｅｃａｎにより市販されている多くの市販の機器で利用可能である。追加の成分を適切に選択することによって、それらもまた画像形成の様式として適用されて、細胞または組織などのサンプルの画像を形成し得、この場合、各画素は、当該ポイントについて測定された値に対応する数により表される。適切な蛍光顕微鏡は、Ｚｅｉｓｓ、Ｎｉｋｏｎ、ＯｌｙｍｐｕｓおよびＬｅｉｃａなどの供給元から入手可能であり、適切な成分は、ＣＲＩなどの供給元から入手可能である。
【０００８】
複数のスペクトル感受性検出器を備えた画像形成機器が記載されてきた（例えば、Ｚｅｉｓｓ  ５１０  ＭＥＴＡでは３２個）。しかしながら、広い放射ピークを有する多くの蛍光種については、チャネル１つ当たりに捕捉される光子の数は統計的に同じなので、スペクトル重複および感度の限定を克服することは不可能である［Ｎｅｈｅｒ  ２００４］。典型的には、機器は、可視帯域（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）を用いる場合、測定が３個までの蛍光種に限定され、これを紫外線および赤外線（２５０ｎｍ〜１１００ｎｍ）に延長した場合でも、４個の蛍光種に限定される。
【０００９】
研究および医薬開発を含む生物学的システムの研究において特に重要な１つの応用領域は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）として知られるシステムである［Ｂｅｒｎｅｙ
２００３］。この技術において、目的の種は、１つの蛍光標識（ドナー）で標識され、一方、第１の種と相互作用すると考えられる第２の種は、さらなる蛍光標識（アクセプタ）で標識されるが、それはドナーの放射スペクトルがアクセプタの励起スペクトルとのスペクトル重複を提供するように慎重に選択される。目的の２つの種が近位に接近する場合（および双極子配向などの他の因子が好ましい場合）、エネルギーは励起したドナーからアクセプタに転移し、次いで光子を放射し得る。次いで、ドナーおよびアクセプタの両方における放射の変化の測定を用いて、ＦＲＥＴの有無で決定し、それにより目的の２つの種が近位に接近しているかどうか、従って相互作用しそうであるかどうかを決定し得る。この方法は、感知すべき特定の種に感受性のドメインが、一方がドナーとして作用し他方がアクセプタとして作用する２つのフルオロフォア（感知すべき種の存在がバイオセンサの位置を改変して２つのフルオロフォアの配置が変更になり、ＦＲＥＴが増強されるかまたは抑制されるように配置されている）と関連する場合に、バイオセンサプローブと組み合わせて用いると強力である。多くの細胞シグナリング種に感受性のこのようなバイオセンサが記載され、研究への経路を可能にしている［Ｓｃｈｕｌｔｚ  ２００５］。
【００１０】
しかしながら、ＦＲＥＴ技術は、励起チャネルおよび測定チャネルの両方におけるクロ
ストークによるスペクトル手段を用いて信頼できる測定を行う際の困難性などの多くの問題（これらは適切な制御を用いてしばしば対処され得るが）を抱えている［Ｂｅｒｎｅｙ
２００３］。ドナーおよびアクセプタの励起ピークおよび放射ピークにより処理される実質的なスペクトル帯幅は、１つを超えるＦＲＥＴシステムが所定のサンプル内で作動するのを妨げる。
【００１１】
蛍光種が良好に定義された励起スペクトルおよび放射スペクトルを有する場合、状況の単純化を達成していくつかの多重化された性能を得ることが可能である。例えば、量子ドットは共通の励起スペクトルおよび非常に狭い放射ピークを有することが周知である。従って、いくつかの狭い帯域の放射フィルタと共に単一の励起波長を用いて、いくつかの種を同時に検出することが可能である。
【００１２】
時間分解蛍光
蛍光種を検出および識別するための代替のアプローチは、励起エネルギーを高速で調節することおよび得られた放射エネルギーの調節を検査することである。多くの蛍光種が、励起と放射との間の特徴的な減衰（数ミリ秒〜ナノ秒未満の範囲）を示し、これは寿命（最初の強度の１／ｅに低下する時間）として表される。このパラメータは、種を識別するために用いられ得る。
【００１３】
図２において、特徴的な寿命Ｔｌが特徴的な寿命Ｔ２よりずっと短い場合、励起パルスは、ＴｌおよびＴ２を有する種ＳｌおよびＳ２を刺激する。典型的には、この機能は、励起源をパルスし、放射された光子の到着（単一の光子計数またはＴＣＳＰＣに相関する時間）を計時することにより、励起パルス（または時間分解蛍光寿命）後の所定の時間ウインドウ内で集められた光を測定することにより、または周波数を調節した源と検出シグナル（周波数ドメイン法）との間の相シフトを測定することにより行われ得る。時間ウインドウを変化させ、かつ適切な校正を行うことにより、蛍光種を識別し得る。最新の概説として［Ｍｕｎｓｔｅｒ  ２００５］を参照されたい。
【００１４】
いくつかの分子は、きわめて長い寿命を有し、希土類（ランタニド）化合物および他のもの（例、ルテニウム）は、１０００マイクロ秒までの範囲の寿命を示し、生命科学の研究に有用な範囲のアッセイ法を開発するのに用いられてきた。これらは、散乱および自己蛍光を除去する時間分解特性の能力のために、スペクトル識別のみに基づく感度およびダイナミックレンジよりも高い感度およびダイナミックレンジにより特徴付けられ、より良好な選択性およびコントラストを生じる。  
【００１５】
多くの小分子は、ナノ秒の範囲の寿命を有する［ＩＳＳ  ｗｅｂｓｉｔｅ］。例えば、分子のＰＵＲＥＴＩＭＥ範囲は、２ｎｓ〜３００ｎｓの範囲の寿命を有する。いくつかの生物学的組織および細胞サンプルは、短波長（５００ｎｍ以下）の光で励起させた場合、ＦＡＤおよびＮＡＤＨなどの固有種によって蛍光を示す（自己蛍光）。これらの種は、典型的には、短寿命の広帯域発光を示す。これは、追加の標識種を用いることなくコントラストの源として用いられ得るか、または目的の蛍光種の観察を妨げ得る。
【００１６】
希土類（ランタニド）に基づく寿命検出技術および応用は、一般に、時間分解蛍光（ＴＲＦ）およびナノ秒寿命として利用可能である。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎ、Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａなどの多くの市販の機器が、キュベットまたはウェルから読み取るために利用可能であり、これらはフラッシュランプまたはパルス化ダイオード源を用いる。適切なソフトウェアは、集めた遅延曲線を寿命概算値に変換する。現存するシステムは、特定の範囲の寿命の種について設定されなければならず、２〜３種を超える種を扱うことができない。
【００１７】
追加の成分の適切な選択により、蛍光寿命測定は  画像形成方法としても応用されて細胞または組織などのサンプルの画像を形成し得、ここで、各画素はそのポイントについて測定された値に対応する数により表される。多くのこのような顕微鏡が開発され、市販の多光子顕微鏡；ゲート化増圧器またはＣＣＤカメラ付きマルチチャネルプレート（ＭＣＰ）を用いる、カスタマイズされた周波数ドメインシステム；ならびにＢｅｃｋｅｒおよびＨｉｃｋｌなどの供給源からのＴＣＳＰＣシステムでアップグレードされたもの（これらもまた必要な後処理を行って寿命概算値を算出する）［Ｍｕｎｓｔｅｒ  ２００５］が含まれる。しかしながら、これらのシステムは非常に遅い傾向があり、単一の画像を集めるのに長い時間がかかることにより、動力学的プロセスをモニタリングするのは難しくなる。
【００１８】
ＦＲＥＴは、蛍光寿命測定システムへの一般的な応用である。なぜなら、ドナーの蛍光寿命は、適切なアクセプタの存在下で低減されるからである（図３ａ）。ドナー寿命の変化の測定は、しばしば、上記スペクトルＦＲＥＴ法よりも人工物に対して感度が低い。最近、「ダークな」アクセプタ（非放射性減衰経路を有するので、放射および発光しないもの）の使用により［Ｇａｎｅｓａｎ  ２００６］、ドナーの放射のみが観察されるより明瞭なシステムが得られ（図３ｂ）、これによって必要なスペクトル帯域幅を減少させることが提案された。
【００１９】
多重化
蛍光種間での識別のための現存するアプローチは、一般に、図４ａに示すように波長のみを用いるか、または図４ｂに示すように寿命のみを用いる。図４ａにおいて、２つの種ＡおよびＢは同様の寿命を有するが、異なる放射スペクトルを有するので、スペクトル軸における光子のヒストグラムは２つのピークを示すが、１つのみの寿命を示す；一方、図４ｂでは、ＡおよびＣは同様の放射スペクトルを示すが、２つの別個の寿命を示すので、ヒストグラムは２つの寿命のピークを示すが、波長軸において１つのピークのみを示す。
【００２０】
限られた時間およびスペクトル的に分解された多重化が［Ｖｉｋｓｔｒｏｅｍ  ２００４］に記載されており、ここで、２つのランタニド（３４０ｎｍで励起したユーロピウム、７３０ｕｓの特徴的寿命で６１５ｎｍで放射する；および同様に３４０ｎｍで励起したサマリウム、５０ｕｓの特徴的寿命で６４３ｎｍで放射する）および１つの迅速な蛍光標識（４８５ｎｍで励起し５３５ｎｍで放射するＳＹＴＯ２４）である。しかしながら、波長における１つの種および寿命における２つの種の検出を超える完全な多重化は記載されていない。このことは図４ｃに図示され、ここで、Ｆはナノ秒の寿命および５３５ｎｍの放射を有する小分子であり、一方、ＤおよびＥは長寿命の標識（いずれも６１５〜６４０ｎｍで７３０ｕｓおよび５０ｕｓ）である。理解され得るように、標識を特徴的放射スペクトルまたは寿命単独で識別するポテンシャルがあっても、５３５ｎｍチャネルでの寿命は測定されない。
【００２１】
さらなる報告［Ｖｉｋｓｔｒｏｅｍ  ２００４ｂ］は、吸収剤、時間分解蛍光および蛍光読み取りモードの組み合わせを用いる４つの読み取り値：細胞ストレス（吸収剤染料を用いる）、細胞増殖（サマリウム系標識を用いる）、ＤＮＡ断片化（ユーロピウム系標識を用いる）および細胞数（蛍光染料を用いる）をアッセイするためのアプローチを記載する。引用された利点は、同一のウェルから全ての必要な読み取り値を作成することができ、それによって従来の放射活性読み取り値に比べて材料および努力を節約することができることである。しかしながら、読み取り値を同時に作成することはできず、特に、時間分解蛍光および蛍光読み取りの前に細胞を固定化し、抗体で標識する。このアプローチはまた、ポイント（ＰＭＴ）検出器を備えたウェルプレートリーダ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＥｎＶｉｓｉｏｎシステム）を用いて測定を行うので、画像形成は全く用いないし、経時の読み取りも生じない。
【００２２】
［Ｈａｎｌｅｙ  ２００２］には、組み合わせのスペクトル寿命顕微鏡が記載され、この時間は、ＭＣＰ／ＣＣＤ検出器を備えた周波数ドメインシステムならびにスペクトル（４３０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲にわたる５０帯域）および寿命の両方の測定を可能にするための空間光調節器（ＳＬＭ）コーディングシステムに基づき、Ｈａｄａｍａｒｄ変換器を用いて再構成される。提示されたデータは図４ｄに示すとおりであり、ここで、２つの集団ＡおよびＢは、同じ放射範囲にわたって異なる寿命を示す；そして、２つの集団ＡおよびＢを有する図４ｅは、放射帯域に応じて可変の寿命を示す。［Ｈａｎｌｅｙ  ２００１］もまた参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
多重化のためのさらなるアプローチは、金属イオン［Ｋｏｍａｔｓｕ  ２００５］またはキナーゼ／ホスホリパーゼ［Ｓｃｈｕｌｔｚ  ２００５］の存在下で励起−放射スペクトルの変化により１つを超える生化学種に感受性のバイオセンサを用いることであった。しかしながら、これらは、それらの強度がバイオセンサの濃度の測定値およびそれが感受性である種の濃度の測定値の両方であるので、２つを混同するという欠点がある。絶対的な概算値を得るべき場合、他のコントロールを入れなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
発明の概要
本発明は、生物学的サンプルを分析する方法であって：  
（ａ）複数の蛍光種を含む生物学的サンプルを提供すること；
（ｂ）サンプルに励起エネルギーのパルスを照射して、サンプル中の蛍光種に蛍光を発生させること；
（ｃ）パルス後の所定の期間にわたって、サンプルから発せられる光を検出すること；
（ｄ）少なくとも時間に対する検出された光の波長を記録したデータを作りかつ蓄積すること；および
（ｅ）データを蛍光種のそれぞれの寿命に対して分析することにより、上記所定の期間の少なくとも一部において同時に光を放射し、それらの波長または寿命のみからは互いに識別することのできない３つ以上の異なる蛍光種からのそれぞれの放射の存在を検出すること、
を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本方法は、多くの蛍光種を含むサンプルからより多くの測定値を得ることを容易にし、サンプルの構造および動力学へのより深い洞察を得ることを可能にする。サンプルは毎回励起エネルギーを照射されるが、これはサンプルを変化させるおよび／または損傷するリスクがあるので、各励起から抽出され得るデータおよび情報の量を最大化する必要がある。
【００２６】
本発明は、波長および寿命測定技術を組み合わせて用いることを提案する。技術的思想は、Ｎ種間を波長測定により、かつＭ種間を寿命測定により識別することが可能である場合、励起および検出のサブシステムを慎重にパラメータ化することにより、合計でＭ×Ｎ種を識別することが可能であるというものである。本発明者らは、これを完全なまたは真の多重化と命名する。例示のため図５に表されるシステムにおいて、フルオロフォアの慎重な選択により、波長測定および寿命測定を行い、かつ必要な代数学を演算することにより、４つの種Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを識別することが可能である。この場合、典型的には最大値（Ｍ、Ｎ）および最良でＭ＋Ｎ−１からＭ×Ｎまで、可能なサンプルの数が増加する。Ｍ＝２およびＮ＝３（今日の技術で比較的適度な数）である場合、これは３または（２
＋３−１＝）４種〜（２×３＝）６種の改善を示す。利点はより速く得られること、研究すべきより速い処理を可能にすること、および光ブリーチングが少ないことである。この方法では、標識のスペクトル特性および寿命特性の両方を利用することができ、実験の開発者に与えられた柔軟性を大いに増加する。
【００２７】
好ましい実施形態では、検出工程（ｃ）は、上記所定の期間にわたって特定の波長範囲においてサンプルから発せられる光の強度分布を検出すること、および上記所定の期間にわたってサンプルから発せられる光の合わせた強度を検出することを含む。次いで、これらの検出手順から生じるシグナルを、分析用のデータとして蓄積する。例えば、代数学的手法を用いて、集めたデータから、サンプル中の３つ以上の異なる蛍光種からのそれぞれの放射の存在を推定し得る。サンプル中に存在する蛍光種の知識があれば、個別の種の放射に対して検出された強度に関する連立方程式を展開し、次いで集めたデータを用いて解くことができる。
【００２８】
サンプルは、特定の範囲の励起エネルギーを走査することにより照射されることができる。また、サンプルは、同じ励起エネルギーの複数のパルスまたは特定の範囲のそれぞれの励起エネルギーにより照射され得る。
【００２９】
さらなる実施では、サンプルから発せられる光の偏光に関するデータが蓄積されかつ分析され得る。光の検出を励起波長および偏光化などの他のパラメータに拡張することにより、より大きな多重化、従ってより多数の蛍光種間の区別が許容される。
【００３０】
好ましくは、サンプルから発せられる光の空間分布が検出されかつ記録される。
光は、所定の期間の間に所定の一連の間隔をおいて、または所定の期間の間に連続的に検出され得る。
【００３１】
本発明は、さらに、複数の蛍光種を含む生物学的サンプルを分析するための装置であって、少なくとも所定の期間にサンプルから発せられる光の波長を時間に対して記録したデータを、蛍光種のそれぞれの寿命について分析することにより、前記所定の期間の少なくとも一部において同時に光を放射する３つ以上の異なる蛍光種からのそれぞれの放射であって、他の方法ではそれらの波長または寿命のみからは互いに識別することのできない放射の存在を検出するための処理手段を含む、装置を提供する。
【００３２】
装置は、少なくとも１つのＰＭＴ、空間感受性検出器、画像形成検出器、空間的に仕切られた画像形成検出器、および波長感受性検出器のアレイから選択される光検出手段を含み得る。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、所定の配列のパルスを放射するように設計され得る励起光源が用いられ得る。全てのパルス、または各パルスの個別の存続期間、帯域および／または強度、ならびに／あるいはパルス間の間隔の長さを予備選択することが容易になり得る。
【００３４】
本発明の実施形態により提供される利益には、複数の蛍光種を多重化することによる、細胞系についてのより関連性がありかつより詳細な情報へのアクセスが挙げられる。特に：
・類似する蛍光種を分離すること。類似する化学構造を有する蛍光種は、類似する化学特性を有するが、類似する蛍光励起／放射特性を有する。追加のコントロールの必要なく、寿命に基づいてそれらを識別することが可能であり、なぜなら、これらのコントロールは内部測定値により提供されるからである。
・バックグラウンドの除去。強い干渉性のバックグラウンドシグナルを生じる遊離蛍光種
は、結合した蛍光種と識別され得る。このことは、洗浄工程を避けること、液相アッセイを許容すること、ならびに高速寿命画像形成を許容すること、生存細胞の挙動、動力学、細胞活性の調節および毒性応答についての情報へのアクセスを提供することに有用である。
・多重化は、細胞の生存率（生死）および異形細胞型（空間画像形成）の検討などの組み込むべき機能上の情報を可能にする。
・蛍光種の寿命およびスペクトル特性は、種のマイクロ環境と共に変動する。複数の測定による変動の試験により、複数の蛍光種の存在および種のマイクロ環境についての情報へのアクセスが提供される。
【００３５】
得られたパラメータは、医薬開発の際のスクリーニングシステムにおいて用いられてアッセイ終点を測定し得、また、毒性試験において用いられ得る。最近の開発により高含量スクリーニングシステムがもたらされ、ここで、刺激の後に、複数のパラメータが、画像セットの空間的および／または一時的な分析（転座等）から抽出した複数の測定値から決定され得る。このアプローチはまた、本明細書に記載のアプローチを用いて抽出した測定値にも適用することができるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明の実施形態を、実施例により、および添付の概略図を参照しながら説明する。
詳細な説明
本発明の実施形態を、図６での例示により示すが、ここで、種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、本明細書に記載の技術を用いて、組み合わせた波長および寿命ドメインにおいて識別され得る。波長のみの測定値は、Ａ／Ｅ／ＤをＢ／Ｃ／Ｆと区別するであろうが、ＡをＥからＤから区別することはできず、同様に、Ｂ、ＣおよびＦについては、寿命のみではＡ／ＦをＢ／ＥからＣ／Ｄから区別するであろうが、同様に、これらの対の間で区別することはできない。実際に、これらの６種を識別する単独の波長のみまたは寿命のみの方法の組み合わせは存在しない。
【００３７】
図は明らかに、種が自由に存在する広い領域は、より高い多重化（検出、時間等の制限内で）を可能にすることを示す。このことは、低いバックグラウンドのために、ノイズに対する改善されたシグナルを提供する。自己蛍光の干渉は、典型的には短寿命領域（＜２ｎｓ）に現れ、かつゲートアウト（ｇａｔｅｄ  ｏｕｔ）され得る。検出は、励起および／または放射波長を走査し、かつ光学回転を推定するために偏光化することにより（図７）、ならびにその組み合わせにより、延長することができる。
【００３８】
蛍光検出用装置の実施形態を、図８に示す。これは、
−少なくとも時間内に調節され得、かつ、励起帯域が選択され得る、励起光源（１）；
−この励起エネルギーをサンプルに送達するための送達手段（２）；
−少なくとも蛍光を示す能力を有する少なくとも１つの種（３ａ）を含むサンプルフォルダ中のサンプル（３）；
−サンプルからの放射エネルギーを検出器に送達するための送達手段（４）；
−その上で、放射エネルギーが、時間ゲーティングおよびフィルタの組み合わせを用いて少なくとも時間および波長を含む放射エネルギーのいくつかの特定の態様に感受性となるよう指向される、１つ以上の検出器（５）；
−検出器からのシグナルを、さらなる処理、分析およびディスプレイ（７）のためのコンピュータメモリなどのデジタル記憶装置に捕捉するための手段（６）
を含む。
【００３９】
好ましい実施形態では、励起光源（１）は速い−すなわち、これは、パルスの存続期間、各パルスの帯域および出力、ならびにパルス間のタイミングが迅速に特定および変化さ
れ得る特定のパルスプロトコールを放射するようにプログラムされ得る。これは、種の特定のパルス型および減衰寿命の感受性に従って、広範囲にわたり、サンプル中の特定の種を選択的に励起または飽和するのに（例えば、長いｍｓ寿命のランタニドを短いｎｓ寿命の小分子種と組み合わせて、現存する機器のダイナミックレンジの制限を克服し、かつ捕捉速度を改善するのに）用いられ得る。  
【００４０】
さらなる実施形態では、検出器（５）は、全ての光子が捕捉され得るように、異なる帯域に感受性である領域を有するように設計される。入射する光子を、まず、二色鏡により、それらの波長帯域に従って２つのビームに分ける。次いで、光子を、２つの時間ゲート化検出器のうち１つに投影する。このことにより、特定の時間ウインドウ内の各光子が一方または他方の検出器により捕捉されることが確実になる。このことにより、波長および寿命データの両方を集めることが可能になるので、より少ないブリーチングで、より効率的かつより速い作業が可能になる。
【００４１】
別の実施形態では、検出器（５）は、光子エネルギーおよびタイミングの両方に感受性のものに置き換えられる［Ｆｒａｓｅｒ  ２００３］。このことにより、波長および寿命データの両方を集めることが可能になるので、より少ないブリーチングで、より効率的かつより速い作業が可能になる。
【００４２】
励起光源（１）は、１つ以上のレーザ、ダイオードレーザ、ＤＰＳＳ、発光ダイオードおよび／またはスーパーコンティニューム源を含み得る。
【００４３】
送達手段（２）は、１つ以上のレンズアセンブリ、光ファイバ、鏡、二色鏡等を含み得る。
【００４４】
サンプル（３）は、細胞、接着細胞層、細胞懸濁物またはビーズのアセンブリを含み得る。サンプルフォルダは、Ｚ軸に沿って輸送するための機構、ＸＹにおけるキャリッジおよび輸送手段、ならびに生存細胞用のインキュベータ、流体を分注する手段、温度制御器を含み得る。蛍光種（３ａ）は、１つ以上の、フルオレセイン等の小蛍光分子、ＧＦＰ等の遺伝子的にコードされた蛍光分子、ＦＡＤおよびＮＡＤＨ等の固有種、ピュアタイム染料、Ｅｕ−キレート、Ｆｕｒａ、Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ等のバイオセンサなどを含み得る。
【００４５】
検出器（５）は、１つ以上のＰＭＴ、空間的に感受性の検出器、ＭＣＰ等のゲーティング素子、画像形成検出器、空間的に仕切られた画像形成検出器、波長感受性検出器のアレイを、画像形成用の時間ウインドウ、帯域および走査メカニズムを含む１つ以上の選択機構と組み合わせて含み得る。
【００４６】
データ捕捉および処理システム（６，７）は、デコンボリューションおよび他の変換器などの解析手段、ならびに動力学的データを計算するための一連の時間的経過の収集手段を含み得る。
【００４７】
本方法は、ＦＲＥＴ−ＦＬＩＭ法を用いて行う活発なＦＲＥＴ実験を可能にし、かつ、複数のＦＲＥＴシステムが一度に作動して、例えば、特定の細胞経路内での事象の順番を決定することを可能にする。図９に示すように、あるＦＲＥＴ法は、ドナーＤ１の寿命の変化を特定の帯域で観察することにより研究され得るが、別のＦＲＥＴ法は、ドナーＤ２の寿命の変化を別の帯域で観察することにより研究され得る。
【００４８】
本方法を用いる用途のいくつかのさらなる実施例は、図１０ａ〜１０ｃに例示される。それらは、組み合わせた放射および寿命を用いて目的物の特性を同定しかつ局在化するこ
との利点を示す。これらの実施例は例示的なものにすぎず、固有の（天然に存在する）フルオロフォアなどの異なる標識を用いて他の組み合わせが考えられ得ることが理解されるであろう。
【００４９】
目的物の考えられ得る特性には、（１）生物学的機能−例えば、タンパク質−タンパク質相互作用（ＦＲＥＴシグナルにより示されるような）、（２）マイクロ環境、例えばｐＨなどのイオン濃度、および（３）例えばＤＮＡまたはＲＮＡなどの構造的または生化学的種の存在が挙げられる。これらの３つの特性は、医薬の発見において、生存細胞が刺激に応答するとき、生存細胞の状態を理解することがしばしば重要である。
【００５０】
図１０ａは、
−ＦＲＥＴ対のドナー、例えば相互作用（ＦＲＥＴ／ＦＲＥＴなし）の状態に応じて５０５〜５３０ｎｍでの放射および１．５ｎｓと２．５ｎｓとの間の寿命を有するＧＦＰ−ＹＦＰ  ＦＲＥＴシステムからのＧＦＰを示す機能プローブＤ；
−マイクロ環境を感知するプローブであって、ここで、ＢおよびＦは、５８０ｎｍ付近での放射および０．５〜３ｎｓからの寿命を有するｐＨプローブＲｅｓｏｒｕｆｉｎの極値を示す；
−５００〜５２０ｎｍでの放射および６ｎｓの寿命を有する核染料ＢＯＤＩＰＹなどの構造的プローブＣ
を含む、４８８ｎｍ付近の励起帯域についての組み合わせ放射および寿命分析システムの使用を示す。
【００５１】
さらに、Ｅは、６２５ｎｍでの放射および複合寿命を有する機能化された量子ドットプローブを表す。
【００５２】
図１０ｂは、また４８８ｎｍ付近の励起帯域を用いる別の実施例を示し、ここで、Ｄは、５１０〜５５０ｎｍでの放射、およびＡＴに富むＤＮＡに結合した場合１．５ｎｓの寿命を、ＧＣに富むＤＮＡに結合した場合４．１ｎｓの寿命を有するＹＯＹＯ−Ｉなどの核酸プローブであり；
Ｃは、５６０ｎｍでの放射を有し、２２ｎｓの寿命を有するＰｕｒｅｔｉｍｅ２２染料に基づく機能的プローブであり；
ＢおよびＦは、５７０〜６３０ｎｓ付近での放射および１．８〜３．６ｎｓの寿命を有するリップオーダー（ｌｉｐ  ｏｒｄｅｒ）染料Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＤＨＱ等の環境プローブの極値であり；
Ｅは、７００ｎｍでの放射および複合寿命を有する機能化された量子ドットプローブを表す。
【００５３】
このようなスキームの利点は、非常に少数の質的な質問しか許容しない従来のアプローチと比べて、いくつかのタイプの質的（構造が存在するのか？）および量的（ｐＨはいくらか？）との質問を同時にシステムに尋ねることができるということである。
【００５４】
実施例は、４８８ｎｍまたは同等の励起波長についてのものである。実施例は、明らかに、他のおよび複数の励起波長に拡張することが可能である。例えば、励起帯域は、ＧＦＰ２−ＹＦＰ  ＦＲＥＴ対についての４０５ｎｍから、ｅＧＦＰ−ＹＦＰ  ＦＲＥＴ対についての４８８ｎｍに切り替えられ得る。
【００５５】
さらなる実施例（図１０ｃ）では、３６０ｎｍ付近の励起帯域が用いられ、機能的プローブＢを、４５０ｎｍでの放射および３ｎｓの寿命を有するＣｏｕｍａｒｉｎ誘導体に基づいて用いることができた；
塩化物イオンの存在は、４６０ｎｍでの放射帯域および２５ｎｓの特徴的寿命を有するＭ
ＱＡＥなどのプローブＣを用いて感知することができた；
核などの構造的成分Ｄは、４６０ｎｍでの放射および０．２〜２ｎｓの寿命を有するＤＡＰＩプローブを用いて感知することができた。
【００５６】
同一のシステムもまた、３６０ｎｍで励起しかつそれぞれ量子ドットに従って選択される帯域（典型的には５００ｎｍ〜８００ｎｍおよびそれを超える）で放射する機能化量子ドットに基づく一連のプローブ（Ｅ）を同時に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１ａ】先行技術の蛍光検出技術を図示する、波長に対する振幅のプロットである。
【図１ｂ】先行技術の蛍光検出技術を図示する、波長に対する振幅のプロットである。
【図１ｃ】先行技術の蛍光検出技術を図示する、波長に対する振幅のプロットである。
【図２】先行技術の蛍光寿命を示す、時間に対する振幅のプロットである。
【図３ａ】公知のＦＲＥＴ技術を図示する、波長に対する寿命のプロットである。
【図３ｂ】公知のＦＲＥＴ技術を図示する、波長に対する寿命のプロットである。
【図４ａ】先行技術による蛍光種の識別を図示する、波長に対する寿命のプロットである。
【図４ｂ】先行技術による蛍光種間の識別を図示する、波長に対する寿命のプロットである。
【図４ｃ】先行技術による蛍光種間の識別を図示する、波長に対する寿命のプロットである。
【図４ｄ】先行技術による蛍光種間の識別を図示する、波長に対する寿命のプロットである。
【図４ｅ】先行技術による蛍光種間の識別を図示する、波長に対する寿命のプロットである。
【図５】本発明の実施形態による複数の蛍光種間の識別を図示する、波長に対する寿命のプロットである。
【図６】本発明のさらなる実施形態による複数の蛍光間種の識別を図示する、波長に対する寿命のプロットである。
【図７】本発明のさらなる実施形態による特定の範囲のパラメータに基づく蛍光種の識別を図示する。
【図８】本発明の実施形態による蛍光検出機器の形状のブロック図である。
【図９】本発明を利用するＦＲＥＴ用途のための、波長に対する寿命のプロットである。
【図１０ａ】本発明を利用する用途の３つのさらなる実施例のための、波長に対する寿命のプロットを示す。
【図１０ｂ】本発明を利用する用途の３つのさらなる実施例のための、波長に対する寿命のプロットを示す。
【図１０ｃ】本発明を利用する用途の３つのさらなる実施例のための、波長に対する寿命のプロットを示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月19日(2008.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
同一のシステムもまた、３６０ｎｍで励起しかつそれぞれ量子ドットに従って選択される帯域（典型的には５００ｎｍ〜８００ｎｍおよびそれを超える）で放射する機能化量子ドットに基づく一連のプローブ（Ｅ）を同時に利用することができる。
［参照文献］
2009524040.tif 000022
【国際調査報告】
2009524040.tif 000023
2009524040.tif 000024
2009524040.tif 000025