(57)【要約】  油の蒸留後の植物から価値のある化合物及び物質を回収する方法を開示する。本発明の方法は、既に油が蒸留留去された植物材料の様々な水性及び非水性溶媒抽出を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種以上の物質を植物材料から得る方法であって、下記を含む当該方法：
(ａ)既に精油の水又は水蒸気蒸留にかけられた蒸留後の植物材料を用意し；
(ｂ)その蒸留後植物材料を溶媒と、その植物材料からその溶媒中への一種以上の物質の抽出を可能にする条件下で接触させ；そして
(ｃ)一種以上の物質をその溶媒から得る。
【請求項２】
植物材料が、花、種、葉、茎又は根の少なくとも一つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一種以上の物質を、フェノール化合物、フラボン、イソフラボン、グリコシド、アントシアニン、プロアントシアニジン、プロシアニジン、カテキン、テルペン、リグニン、タンニン、グルコシニレート、脂肪族及び環式有機酸から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
一種以上の物質が、抗酸化活性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
植物材料が、オリガヌム、メンタ、アガスターシェ、オシマム、サルビア、アルテミシア、メリッサ、アキレア、サイマス、コリドサイマス、ミクロメリア、ロスマリナス、ペラルゴニウム及びコレウスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
植物材料が、メンタ・スピカタ、メンタ・ピペリタ、ロスマリナス・オフィシナリス、オリガヌム・シリアクム、オリガヌム・ダイ、オリガヌム・ブルガレ、サイマス・ブルガレ、オシマム・バシリクム又はメリッサ・オフィシナリスに由来する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
溶媒が、アルコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
溶媒が、８０％エタノールである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
蒸留後植物材料を第二の溶媒で抽出することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第二の溶媒が、ＮａＯＨである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二の溶媒が、ヘキサンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
エタノールを溶媒から除去すること及び残った水を酢酸エチルで抽出することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
精油及び少なくとも一種の更なる物質を植物材料から得る方法であって、下記を含む当該方法：
(ａ)植物材料を精油を得るために水又は水蒸気蒸留にかけて、蒸留後植物材料を生成する工程；
(ｂ)その蒸留後植物材料を溶媒と、少なくとも一種の物質をその植物材料からその溶媒中に抽出することを可能にする条件下で接触させる工程；そして
(ｃ)その(それらの)少なくとも一種の物質をその溶媒から得る工程。
【請求項１４】
植物材料が、花、種、葉、茎及び根の少なくとも一つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一種の物質を、フェノール化合物、フラボン、イソフラボン、グリコシド、アントシアニン、プロアントシアニジン、プロシアニジン、カテキン、テルペン、リグニン、タンニン、グルコシニレート、脂肪族及び環式有機酸から選択する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも一種の物質が、抗酸化活性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
植物材料が、オリガヌム、メンタ、アガスターシェ、オシマム、サルビア、アルテミシア、メリッサ、アキレア、サイマス、コリドサイマス、ミクロメリア、ロスマリナス、ペラルゴニウム及びコレウスから選択される植物の属に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
植物材料が、メンタ・スピカタ、メンタ・ピペリタ、ロスマリナス・オフィシナリス、オリガヌム・シリアクム、オリガヌム・ダイ、オリガヌム・ブルガレ、サイマス・ブルガレ、オシマム・バシリクム又はメリッサ・オフィシナリスに由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
溶媒が、アルコールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
溶媒が、８０％エタノールである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
蒸留後植物材料を第二の溶媒で抽出することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
第二の溶媒が、ＮａＯＨである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第二の溶媒が、ヘキサンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
エタノールを溶媒から除去すること及び残った水を酢酸エチルで抽出することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１又は１３に記載の方法によって生成された植物物質の収集物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００５年１２月１６日に出願された米国暫定特許出願第６０／７５０，５８８号(その全内容を、参考として、本明細書中に援用する)の利益を請求するものである。
【０００２】
本発明は、植物に由来する化学的及び生物学的成分に関する。特に、この発明は、植物材料からの精油の蒸留後に、その材料の残留物から物質を回収するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
特許、公開された出願、技術論文及び学術論文を含む様々な刊行物が、この明細書中で引用される。これらの引用された刊行物の各々は、本明細書中にそっくりそのまま援用される。明細書中で完全に引用されてない刊行物の完全な引用を、明細書の最後に示してある。
【０００４】
広範な種類の植物が、数千年にわたって、健康促進のために、特に医薬目的のために利用されてきた。近年において、研究は、植物ベースのフェノール、フラボノイド、イソフラボン、テルペン、グルコシノレート及び他の果実、野菜及びハーブの葉(他の種類の植物中で)中に存在する化合物が、抗酸化剤及び抗発癌性(他の健康促進利益のうちで)を有することを明らかにした。ある種の芳香性ハーブ例えばミント及びオレガノのうちで、精油及びエキスは、防腐剤、抗菌剤、抗炎症剤及び抗ウイルス剤を含むことが見出されている。
【０００５】
天然物および自然治療への増大する消費者の好みのために、植物由来の治療剤の価値は、着実に増大してきた。その上、ある種の植物成分例えば香味料及び芳香剤産業の一層伝統的な価値基盤は、確固としている。
【０００６】
精油は、価値のある植物成分の一種を構成するものである。精油は、濃縮された、揮発性の芳香性成分を含む疎水性の液体であり、様々な植物部分からの蒸留により得られる。精油は、香水、アロマテラピー、化粧品、香(食品及び飲料の香り付け用)において、及び医薬において利用されている。ある種の精油の医薬的価値は、相当なものでありうる。例えば、オレガノの精油(これは、主として、カルバクロール、チモール及びｐ−シメンを含む)は、強力な抗細菌剤であり且つ抗微生物剤である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
精油は、水又は水蒸気蒸留により製造される。典型的には、植物材料を水に浸して煮沸し、又は水蒸気流にさらす。その水蒸気及び油気を濃縮して、該油を水から分離する。慣例的に、一度精油を蒸留したならば、残留の植物材料は、該材料は、一度蒸留工程にかけられたものであれば応用できる更なる成分又は物質を生成しないであろうという仮定のもとに、捨てられている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一面は、(ａ)既に精油の水又は水蒸気蒸留にかけられたことのある蒸留後植物材料を用意し；(ｂ)該蒸留後植物材料を、該植物材料から溶媒中に一種以上の物質の抽出が可能となる条件下で溶媒と接触させ；そして(ｃ)該一種以上の物質を該溶媒から得ることを含む、植物材料から一種以上の物質を得るための方法を特徴とする。この植物材料は、植物全体であっても、花、種、葉、茎及び根の少なくとも一つを含む植物の任意の部分であってもよい。ある具体例において、この植物材料は、茎及び葉よりなり、典型的具体例においては、葉が用いられる。
【０００９】
この植物材料は、精油が抽出される任意の植物に由来するものであってよい。ある具体例においては、この植物材料は、ハナハッカ属、ハッカ属、アガスタシェ属、オシマム属、サルビア属、ヨモギ属、メリッサ属、ノコギリソウ属、サイマス属、コリドサイマス属、ミクロメリア属、ローズマリー属、ペラルゴニューム属及びコレウス属から選択される。特定の具体例において、この植物材料は、メンタ・スピカタ、メンタ・ピペリタ、ローズマリナス・オフィシナリス、オリガヌム・シリアクム、オリガヌム・ダイ、オリガヌム・ブルガレ、サイマス・ブルガレ、オシマム・バシリクム又はメリッサ・オフィシナリスに由来する。
【００１０】
この方法によって単離することのできる物質には、フェノール化合物、フラボン、イソフラボン、グリコシド、アントシアニン、プロアントシアニジン、プロシアニジン、カテキン、テルペン、リグニン、タンニン、グルコシニレート、脂肪族及び環式有機酸が含まれるが、これらに限られない。一具体例において、一種以上の物質は、抗酸化活性を有する。特定の具体例において、この方法は、フェノール化合物の好適な抽出に適合される。
【００１１】
この溶媒又は溶媒系は、ここに記載のものなどの植物からの物質の抽出に慣例的に用いられる何れの型であってもよい。一具体例において、この溶媒は、アルコールである。特定の抽出において、溶媒は、８０％エタノールである。水を含む溶媒を利用する具体例において、この方法は、更に、溶媒を水から除去すること及び残っている水を別の溶媒例えば酢酸エチルで抽出することを含むことができる。
【００１２】
ある具体例において、この方法は、更に、蒸留後植物材料の他の溶媒を用いる抽出をも含む。一具体例において、他の溶媒は、塩基例えばＮａＯＨである。他の具体例においては、他の溶媒は、炭化水素例えばヘキサンである。他の具体例においては、種々の溶媒を用いる２、３又はそれ以上の抽出を、蒸留後植物材料において行なうことができる。別法として、又は組み合わせて、この植物材料を、同じ溶媒で２回以上抽出することができる。
【００１３】
この発明の他の面は、精油及び一種以上の更なる物質を植物材料から得るための方法であって、該方法は：(ａ)植物材料を水又は水蒸気蒸留にかけて精油を得、蒸留後植物材料を生じ；(ｂ)その蒸留後植物材料を、該蒸留後植物材料からの一種以上の物質の溶媒中への抽出を可能にする条件下で溶媒と接触させ；そして(ｃ)一種以上の物質を該溶媒から得ることを含むことを特徴とする。この植物材料は、植物全体に由来してもよいし、又は花、種、葉、茎及び根の少なくとも一つを含む植物の何れかの部分に由来してもよい。ある具体例において、この植物材料は、茎及び葉よりなり、典型的具体例においては、葉が用いられる。
【００１４】
この植物材料は、上記の属及び種を含む(但し、これらに限られない)精油が抽出される何れの植物に由来してもよい。
【００１５】
この方法によって単離することのできる物質には、精油及び、制限はしないが、上記の及び／又は詳細な説明及び実施例に詳述した任意の物質が含まれる。特定の具体例において、この方法は、フェノール化合物の好適な抽出に適合される。
【００１６】
植物材料からの物質例えばここに記載したものの抽出に慣例的に用いられている任意の型の溶媒又は溶媒系を用いることができる。一具体例において、その溶媒は、アルコールである。特定の抽出において、その溶媒は、８０％エタノールである。水を含む溶媒を利用する一具体例において、その方法は、更に、溶媒を水から除去すること及び残りの水を異なる溶媒例えば酢酸エチルを用いて抽出することを含む。
【００１７】
ある具体例において、その方法は、更に、蒸留後植物材料の他の溶媒による抽出を含む。他の具体例において、他の溶媒は、塩基例えばＮａＯＨである。他の具体例において、他の溶媒は、炭化水素例えばヘキサンである。他の具体例において、２、３又はそれ以上の抽出を、種々の溶媒を用いて、蒸留後植物材料について行なうことができる。別法として、又は組み合わせて、この植物材料を、２回以上、同じ溶媒で抽出することができる。
【００１８】
この発明の他の面は、上記の方法の何れかによって得られた一種以上の植物材料の収集物を特徴とする。一具体例において、この収集物は、溶媒の蒸発後に形成された乾燥した残留物中に存在する。他の具体例においては、この収集物は、抽出に用いられた溶媒中に存在する。他の具体例においては、この収集物は、種々の溶媒又は溶媒系に存在する。この収集物は、上記の又はこの明細書中に列記された物質の少なくとも一種の物質を含むことができる。典型的具体例において、植物材料は、オレガノである。一具体例において、この収集物は、ピロカテコール；４−ビニルフェノール；５，４’−ジメトキシ−２−メチルビベンジル；４−ビニルグアヤコール；シリンゴール；４−アセチルアニソール；４−ヒドロキシベンズアルデヒド；バニリン；２，１，３−ベンゾチアジアゾール；３−ヒドロキシアセトフェノン；アセトバニロン；アセトベラトロン；シリングアルデヒド；及びアセトシリンゴンの少なくとも一種を含む。他の典型的具体例において、この収集物は、シリンガ酸(syringic acid)；ジテルペン；２−イソプロピル−５−メチル−ヒドロキノン；クマル酸；フェルラ酸；ジヒドロカフェー酸；カフェー酸；ローズマリー酸；及び様々なフラボノイドの少なくとも一つを含む。他の典型的具体例において、この収集物は、チモール；カルバクロール；β−ビサボレン；ネオフィタジン；チモキノン；チモヒドロキノン；フィトールアセテート；スクアレン；ビタミンＥ；フィトール；及び(２３Ｓ)−エチルコレスト−５−エン−３.ベータ−オールの少なくとも一つを含む。
【００１９】
この発明の他の特徴及び利点は、下記の図面、詳細な説明及び実施例を参照することにより明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の様々な面により、精油の水又は水蒸気蒸留に既にかけられた植物材料から関心ある物質を得るための方法が提供される。これまで、この産業においては、精油の蒸留後の残留植物材料は、利用価値のある更なる成分をかかる残留材料から得ることはできないという仮定のもとに、捨てられてきた。この考えに反して、本発明により、幾つかの物質を実際にかかる植物材料から回収することができ、その多くが、水又は水蒸気蒸留にかけられてない植物材料から単離された物質からのものと同等の機能的特徴、例えば抗酸化特性を示すということが発見された。
【００２１】
これらの方法は、任意の植物において実践することができる。適当な植物は、下記の方法により抽出可能な物質又は薬剤を含む少なくとも一つの組織又は器官を有し且つそこから精油を水又は水蒸気蒸留によって得ることができるものである。
【００２２】
ある具体例において、選択される物質又は薬剤(ここでは、ときに、成分と呼ぶ)には、フェノール化合物、フラボン、イソフラボン又は他のフラボノイド化合物、グリコシド、アントシアニン、プロアントシアニジン及びプロシアニジン及び関連化合物、カテキン、テルペン、リグニン、タンニン、グルコシニレート、脂肪族及び環式有機酸が含まれる。
【００２３】
適当な植物には、アンゲリカ根、アニス、バルサム、バシル、ゲッケイジュ、蜜蝋、安息香、ベルガモット、ベルガモットハッカ、ボワドローズ、ボローニア、カヤプト、カルダモン、ニンジン種、シーダー材、カモミレ、シナモン、コウスイガヤ、サルビアセージ、チョウジ芽、コエンドロ、ヒノキ、イノンド、エレミ、ユーカリ(レモンユーカリを含む)、ウイキョウ、モミの葉、ガルバヌム、ゼラニウム(テンジクアオイを含む)、生姜、グレープフルーツ、ムギワラギク、ヒソップ、ロダンテ、ジャスミン、杜松子、カヌカ、ラベンダー、ラベンジン、レモン、レモングラス、ライム、リンデン花、マンダリン、マヌカ、マヨラナ、メイチャン、ミリス、ミルテ(レモンミルテを含む)、ネロリ、ニアウリ、ナツメグ、オークモス、オリバナムオレンジ(苦味及び甘味)、ハナハッカ、パルマローザ、パセリ、パチョリ、胡椒(黒胡椒、白胡椒、アマトウガラシ又はトウガラシを含む)、ペパーミント及び関連ミント類、プチグレン、松、ラベンサラ、バラ、ローズマリー、シタン、ビャクダン、スペアミント、カンショウ、トウヒ、タンジェリン、チャノキ(普通、レモン、ニュージーランド)、タイム、タバコ、ツベローズ、バニラ、ベチベルソウ、スミレ葉、ノコギリソウ及びイランイランノキ が含まれるが、これらに限られない。典型的には、ラビアシアエ属、セリ科及びキク科(セリ科)に由来する精油産生植物を用いるのが好ましい。特定の具体例において、これらの植物は、シソ科又は他の芳香性ハーブ例えばハナハッカ及びローズマリーに由来する。特に適した植物には、ハナハッカ属の種(例えば、Ｏ．シリアクム、Ｏ．ダイ、Ｏ．ブルガレ、Ｏ．オニテス)、ハッカ種(例えば、Ｍ．ロンギフォリア、Ｍ．スピカタ、Ｍ．ピペリタ)アガスターシェ、オシマム種(例えば、Ｏ．バシリクム、Ｏ．グラティシマム、Ｏ．カヌム、Ｏ．アメリカヌム)、サルビア種(例えば、Ｓ．オフィシナリス、Ｓ．フルチコサ)、ヨモギ属の種(例えば、Ａ．ドラヌンクルス、Ａ．ジュダイカ、Ａ．アボレセンス、Ａ．アブシンタム)、メリッサ・オフィシナリス、ノコギリソウ属の種(例えば、Ａ．ミレンフォリウム、Ａ．フラグランティシマム)、サイマス・ブルガレ、コリドサイマス・カピタトゥス、ミクロメリア・フルチコサ、ローズマリナス・オフィシナリス、ペラルゴニューム・グラベオレンス(ゼラニウム)及びコレウス属の種が含まれるが、これらに限られない。典型的具体例において、ハッカ(例えば、メンタ・スピカタ、Ｍ．ピペリタ)、ローズマリー(ローズマリナス・オフィシナリス)、ハナハッカ(オリガヌム・シリアクム、Ｏ．ダイ、Ｏ．ブルガレ)、タイム(サイマス・ブルガレ)、オシマム・バシリクム及びメリッサ・オフィシナリスが用いられる。
【００２４】
精油が得られる植物の任意の部分は、本発明での使用に適している。これらには、花、種、包葉及び他の花の部分、茎、葉及び根が含まれるが、これらに限られない。ある具体例においては、葉及び茎を用いる。他の具体例においては、葉を用いる。
【００２５】
この方法は、(１)精油の水又は水蒸気蒸留にかけられた残留植物材料を得ること；(２)その植物材料を溶媒と、その植物材料からその溶媒中への物質の抽出を可能にする条件下で接触させること；及び(３)その溶媒からそれらの物質を得ることを含む。好適具体例において、この溶媒は、水混和性有機溶媒例えばアルコールである。適宜、植物残留物を、その植物材料から感心ある一種以上の他の物質を放出するようにデザインした異なる溶媒系を用いる一回以上の更なる抽出にかけることができる。一つの典型的具体例においては、残留材料を、フェノールを細胞壁から放出させるためにＮａＯＨを用い、適宜加熱する第二の抽出にかける。他の典型的具体例においては、残留物を、非極性溶媒例えばペンタン、ヘキサン、又はヘプタンを用いて抽出し、抽出物を蒸発させて乾燥させ、溶解させた固体を適当な媒質例えば油に再懸濁させる。植物材料を、慣例的に行なうように、抽出の前及び／又は後で乾燥工程にかけることができることは、当業者には理解されよう。
【００２６】
一回より多くの抽出を含む他の具体例においては、抽出の順序は、逆転可能であり、又は、２回より多い抽出の場合には、抽出の順序を変えることができる。例えば、非極性溶媒を用いる抽出を、極性又は水混和性溶媒を用いる抽出の前に行なうことができる。
【００２７】
他の具体例においては、抽出された植物物質を含む溶媒をそれ自体、更なる抽出にかけることができる。例えば、植物材料を、水性アルコール例えば８０％エタノールを用いて抽出することができる。このアルコールを、次いで、溶媒から除去して水を残すことができる。次いで、この水を、他の溶媒例えば酢酸エチルを用いて抽出することができる。相対的溶解度によって、幾つかの植物物質は水相に残り、他は、他の溶媒相へ分配される。
【００２８】
本発明で用いるのに適した溶媒には、上記のように、植物材料から選択した成分又は物質を抽出することのできる任意の溶媒が含まれる。特に適当な溶媒は、無毒性のもの又は毒性の限られたものである。適当な溶媒の例には、酢酸、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ｔ−ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、エチルエーテル、蟻酸エチル、蟻酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、酢酸プロピル、テトラヒドロフラン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、酢酸エチル、植物油、プロピレングリコール、ネオベ油、グリセリン、ベンジルアルコール及びトリアセチンが含まれるが、これらに限られない。好適具体例において、この溶媒は、食品等級である。
【００２９】
他の適当な溶媒には、ジクロロメタン、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１，４−ジオキサン、２−エトキシエタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、ヘキサン、メタノール、２−メトキシエタノール、メチルブチルケトン、メチルシクロヘキサン、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ピリジン、スルホネート、テトラリン、トルエン、１，１，２−トリクロロエタン及びキシレンが含まれるが、これらに限られない。
【００３０】
特定の具体例において、フェノール化合物及び他の水溶性物質は、抽出の標的とされる。この例において、特に適当な第一の抽出は、蒸留後植物材料を水性アルコール例えば８０％エタノールと接触させることを含む。この植物材料のその後の抽出は、フェノール物質を細胞壁から遊離させるために塩基例えば水酸化ナトリウムを含むことができる。この水の、第一の溶媒中のアルコールの蒸発後の更なる抽出(例えば、酢酸エチル使用)は、更に、フェノール化合物を精製して濃縮することができる。
【００３１】
この発明の他の面は、少なくとも一種の精油及び少なくとも一種の他の選択した成分の植物からの回収のためのシステムを特徴とする。この方法は、精油の典型的な水又は水蒸気蒸留と、その後の溶媒抽出工程(又は、工程の組合せ)を含む(上記の通り)。この方法は、次の基本的工程を含む：(１)選択した植物材料に対して当分野で公知の標準的方法によって水及び／又は水蒸気蒸留を行なって精油を得ること；(２)蒸留の完了後に、その植物材料を溶媒と、その植物材料からその溶媒中への物質の抽出を可能にする条件下で接触させること；及び(３)それらの物質をその溶媒から得ること。好適具体例において、この溶媒は、水混和性有機溶媒例えばアルコールである。適宜、植物残留物を、一種以上の他の関心ある物質をこの植物材料から遊離させるためにデザインした異なる溶媒系を用いる一回以上の更なる抽出にかけることができる。一つの典型的具体例において、残留材料は、フェノール化合物を細胞壁から遊離させるためにＮａＯＨを用いる第二の抽出(適宜、加熱する)にかけられる。他の典型的具体例において、この残留物は、非極性溶媒例えばペンタン、ヘキサン又はヘプタンにより抽出され、抽出物は、蒸発されて乾燥され、溶解された固体は、適当な媒質例えば油に再懸濁される。
【００３２】
他の具体例において、抽出された植物物質を含む溶媒はそれ自体、更なる抽出にかけることができる。例えば、植物材料は、水性アルコール例えば８０％エタノールで抽出することができる。次いで、そのアルコールを溶媒から除去して、水を残すことができる。次いで、その水を、他の溶媒例えば酢酸エチルで抽出することができる。相対的溶解度によって、幾つかの植物物質は水相に残り、他は、他の溶媒相に分配される。
【００３３】
先の方法に関して、植物材料を、慣例的に行われるように、蒸留前に、及び／又は抽出の前若しくは後で乾燥工程にかけることができることは、当業者には理解されよう。これらの溶媒の工程は逆転させることができ、又は多数の抽出の場合には、順序を変えることができる(所望であれば)ということも又、理解されよう。この方法に適した溶媒は、先の方法について列記したものと同じである。
【００３４】
この発明の他の面は、上記の方法の何れかによって得られる少なくとも一種の植物物質の収集物を特徴とする。一具体例において、この収集物は、溶媒の蒸発後に形成された乾燥した残留物中に存在する。他の具体例においては、この収集物は、抽出に用いられた溶媒中に存在する。他の具体例においては、この収集物は、異なる溶媒又は溶媒系中に存在する。
【００３５】
当業者は認めるであろうが、この選択した溶媒系及び抽出手順は、抽出される種々の物質の含有量及び量に影響を及ぼすであろう。従って、植物材料、抽出に用いる溶媒系及び条件によって、異なる抽出プロフィルを得ることができる。例えば、ハナハッカを用いる典型的具体例において、水性エタノールを用いる抽出は、実施例３に示したような１２〜１４の特定の物質の収集物を生成し、ヘキサン抽出は、重複するが同一でない物質の収集物を生成した。
【００３６】
下記の実施例は、この発明を一層詳細に記載するために与えるものである。それらは、この発明を説明することを意図したものであり、制限することを意図したものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１（蒸留後ハナハッカ植物材料の抽出）
これらのプロセスのために、ハナハッカ植物の様々な部分例えば葉、茎、花を用いた。これらの手順の幾つかにおいては、植物部分を合わせ、他の手順においては、それらを別々に処理した。ハナハッカの葉は、特に適していることが見出された。精油を取り出すために既に水／水蒸気蒸留にかけられた植物材料を、約７〜１０％の水分含量まで乾燥させて微粉末にまで粉砕した。その粉末を、８０％エタノールと、粉末一部対溶媒１０部の比で混合して、回転式シェーカー(約１５０ｒｐｍ)上に１２時間２０〜２５℃で置いた。
【００３８】
この溶媒を、植物残留物から、重力により及び吸引濾過により分離した。そのエタノールを溶媒から、真空下で、３０℃で蒸発させ、溶解した植物物質を含む水を保持した。
【００３９】
随意的工程として、これらの植物物質を含む水画分を、その水画分を分液漏斗中で酢酸エチルと混合してからそれらの相を互いに分離することにより酢酸エチルを用いて抽出した。この抽出は、典型的には、２〜４回行ない、そして、酢酸エチル画分を合せた。
【００４０】
この植物残留物を、ヘキサンと混合することにより第二の抽出にかけた。そのヘキサンを植物残留物から濾過により分離した。この溶媒は、蒸発されて乾燥され、溶解された固体を油に再懸濁させた。この工程を、少なくとも２回、一層典型的には３〜４回反復し、その後、ヘキサン抽出した植物材料は廃棄した。
【００４１】
別の試料においては、別の第二の抽出を用いた。エタノール抽出した植物残留物を、過剰の１Ｍ ＮａＯＨと混合して、一晩６０℃でインキュベートした。この抽出物を、次いで、ＨＣｌで、ｐＨが４．５になるまで中和した。細胞壁に結合したフェノール化合物を含むこの液体を、植物残留物から濾過により分離した。この植物残留物は廃棄した。
【００４２】
エタノール抽出及び随意の更なる一回の抽出を含む前述の抽出手順は、次ぎの種に由来する蒸留後植物材料に対して行なわれた：ハッカ種(例えば、Ｍ．スピカタ、Ｍ．ピペリタ)、ローズマリナス・オフィシナリス、ハナハッカ種(例えば、Ｏ．シリアクム、Ｏ．ダイ、Ｏ．ブルガレ)、オシマム・バシリクム、サイマス・ブルガレ及びメリッサ・オフィシアナリス。
【００４３】
実施例２（メンタ・ロンギフォリアからの精油の蒸留及び植物材料の抽出）
植物材料
メンタ・ロンギフォリア Ｌ．の選択したクローンを、２５の野生の集団から分離して、Newe Ya'ar Research Center(イスラエル国、Yishay在)の実験用圃場に移した。これらの植物を、局所的粘土土壌にて滴下潅流を用いて成長させた。用いた農業プラクティスは、シソ科の他の種について記載されたもの(Dudai等、1992 Physiologia Plantanum 84: 453-459)であった。収集した植物からの葉及び茎を４０℃で７２時間乾燥させて、次に、抽出直前にコーヒーグラインダーで粉砕した。
【００４４】
精油の蒸留
試料(約２５０ｇの新鮮な植物材料)を、水で１．５時間、改変Clevenger装置にて蒸留した。その精油を冷却して、一緒にいる水から分離した(Dudai等、1992, 前出)。
【００４５】
フェノール化合物の酸抽出、分析及び抗酸化活性の抽出
１．遊離型のフェノール化合物の抽出(抽出Ｉ)。３００ｍｇの粉砕したメンタ種の葉及び茎を、２５ｍＬの８０％メタノールと５０ｍＬチューブ中で混合した。それらのチューブを、１６５ｒｐｍで、一晩室温で振盪した。次に、２ｍＬのメタノール抽出物を、エッペンドルフチューブに入れて、エッペンドルフ遠心機で５分間回転させて、分析に使う前に粒子を除去した。この抽出物の残りは、更なる分析のために−２０℃に保持した。
【００４６】
２．細胞壁に結合したフェノール化合物の抽出。抽出Ｉからの上清を用いて、遊離形態のフェノール化合物を評価した。抽出後に残った植物材料を３容のメタノール及び３容のアセトンで洗って残留の遊離のフェノール化合物を除去した(即ち、洗浄溶媒の読みが、２８０ｎｍで零になるまで洗った)(Agilent 8453 UV-Visible 分光光度計使用)。この溶媒で洗って風乾させた残留物５０ｍｇを２ｍＬのエッペンドルフチューブに入れて、１ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨと混合した。これらのチューブを、一晩、６０℃でインキュベートした。次に、約１００μＬの１０Ｍ ＨＣｌを加えて抽出物を、ｐＨ４．５まで中和した。これらのチューブを、次いで、エッペンドルフ遠心機にて５分間遠心分離した。その結果生成した上清(細胞壁抽出物と呼ぶ)を、細胞壁に結合したフェノールを評価するために用いた。
【００４７】
３．抗酸化活性。１，１−ジフェニル−２−ピクリルドラジル(ＤＰＰＨ)を用いる遊離基スカベンジャーアッセイ。遊離基スカベンジャーアッセイを、ＤＰＰＨ(Sigma, St. Louis, 米国)の還元を、ハッカの葉及び茎組織の抽出物(遊離形態のフェノール化合物に相当)、又は細胞壁抽出物(壁に結合したフェノール化合物に相当)の存在下でモニターすることにより測定した。抗酸化活性の測定を、以下に概説するように、Agilent 8453 UV-Visible 分光光度計を用いて、顕微鏡観察により行なった。６ｍｇのＤＰＰＨを、１００ｍＬの１００％エタノール中で、１５分間激しく混合することによりそれが溶解するまで混合した。この反応剤を、各々の新たな分析のために新鮮なものを作成した。紫色の新鮮な未還元ＤＤＰＨ試薬をＯＤ517＝１．０付近に調節した。このハッカ抽出物(遊離形態又は壁結合型)１０μＬを、乾燥したエッペンドルフチューブに入れた。次いで、９９０μＬのＤＰＰＨ試薬を加えた。この混合物を、暗黒中で室温で１時間インキュベートし、その後、ＤＰＰＨ−ハッカ混合物の吸光度を５１７ｎｍで読んだ。得られた吸光度値を、元の紫色のＯＤ517＝１．０のベースラインの読みから引いた。試料を、直線的範囲内に留まるようにするために、０．３〜０．６のＯＤ517の範囲内で読むように注意を払った。この理由のために、幾つかの試料を、アッセイ前に希釈した。クロロゲン酸(Sigma社製, St. Louis, 米国)誘導されたＤＰＰＨの還元についての標準曲線を、このハッカ抽出物と同じ条件下で行なった。次いで、抗酸化活性を、クロロゲン酸換算で表した。
【００４８】
ロスマリン酸、クマル酸及びコーヒー酸のＨＰＬＣ分析
フェノール酸類の分離及び評価のためにＨＰＬＣ(Waters社製, 米国)を用いた。メタノール性(methanolic)ハッカ葉及び茎組織抽出物を、ロスマリン酸含量の分析に用いた。これらのＨＰＬＣ条件は以下の通りであった：
【００４９】
Ｃ−１８カラム(Sigma社製, St. Louis, 米国)、２５０×４．６ｍｍ、５μｍの粒度、１ｍＬ／分の流量、及び２０μＬの注入容積。ＨＰＬＣ溶出されるロスマリン酸の量を、ロスマリン酸についての標準曲線(０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬ)から計算した。コーヒー酸及びクマル酸についての標準曲線は、０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬであった。
【００５０】
ロスマリン酸について用いた溶出プロトコールを、下記の表１に記載した。コーヒー酸及びクマル酸に用いた溶出プロトコールは、下記の表２に記載した。
【００５１】
【表１】
2009520080.tif 000002
【００５２】
【表２】
2009520080.tif 000003
【００５３】
別手順においては、上記のプロトコールを、水／水蒸気蒸留にかけたＭ．ロンギフォリア植物材料に対して行なう。
【００５４】
実施例３（精油の蒸留、及び抽出物の分析の前後でのハナハッカ抽出物における総フェノール化合物及び抗酸化活性の比較）
植物材料
栽培したハナハッカ(オリガヌム・ブルガレ)を用いた。蒸留の前又は後で(処理による)植物材料を、７〜１０％の水分含量にまで乾燥させて、粉末に粉砕した。
【００５５】
精油の蒸留
乾燥場で乾燥させた約２，０００ｋｇのハナハッカ(水分量４０％)を、２０立方メートルの容器中で、市販の水蒸気蒸留装置(Newhouse Manufacturing Co., Inc.社製 オレゴン、Redmond在)によって蒸留した。この材料の試料を用いた。
【００５６】
フェノール酸類の抽出、分析及び抗酸化活性の抽出
遊離形態のフェノール化合物の抽出(抽出Ｉ)。２〜３００ｍｇの粉砕した葉及び茎(蒸留前又は蒸留後)を、２５〜５０ｍＬの８０％エタノールと、約１５０〜１６５ｒｐｍで一晩室温で混合した。次に、エタノール性抽出物のアリコートを、分析に用いる前に、５分間の遠心分離にかけて粒子を除去した。抽出物の残りを、更なる分析のために、−２０℃に維持した。
【００５７】
次に、エタノール性抽出物のアリコートを、分析に用いる前に、５分間の遠心分離にかけた。抽出物の残りを、更なる分析のために、−２０℃に維持した。
【００５８】
細胞壁に結合したフェノール化合物のＮａＯＨ抽出。抽出Ｉからの上清を、遊離型のフェノール化合物の評価に用いた。エタノール抽出後に残っている植物材料の一部分を３容のエタノール及び３容のアセトンで洗って、残留している遊離のフェノール化合物を除去した(即ち、洗浄溶媒の読みが２８０ｎｍで零になるまで洗った)。５０ｍｇの溶媒洗浄して風乾した残留物を、２ｍＬのエッペンドルフチューブに入れて、１ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨと混合した。これらのチューブを、６０℃で一晩インキュベートした。次に、約１００μＬの１０Ｍ ＨＣｌをこの抽出物に加えてｐＨ４．５になるまで中和した。次いで、これらのチューブをエッペンドルフ遠心機にて５分間遠心分離した。その結果生成した上清(細胞壁抽出物と呼ぶ)を、細胞壁に結合したフェノール化合物を評価するために用いた。
【００５９】
更なる水不溶性成分のヘキサン抽出。エタノール抽出後に残っている植物材料の一部分を乾燥させてから、ヘキサンと混合して、一晩、回転式シェーカー(１５０ｒｐｍ)上で、２５℃でインキュベートした。このヘキサン抽出物を、濾過により、植物材料から分離した。この抽出工程をこの植物材料に対して３〜４回反復し、その後、ヘキサン画分を合わせ、ヘキサンを蒸発させ、残りの材料を再懸濁させてＧＣ質量分析用に調製した(標準的方法による)。
【００６０】
抗酸化活性。１，１−ジフェニル−２−ピクリルドラジル(ＤＰＰＨ)を用いる遊離基スカベンジャーアッセイ。遊離基スカベンジャーアッセイを、植物組織抽出物(遊離型フェノール化合物を表す)の存在下で、又は細胞壁抽出物(細胞壁に結合したフェノール化合物を表す)の存在下でＤＰＰＨ(Sigma社製, 米国、St. Louis在)の還元をモニターすることにより測定した。抗酸化活性の測定を、以下に概説するように、分光分析法により行なった。６ｍｇのＤＰＰＨを、１００ｍＬの１００％エタノール中で溶解するまで、１５分間の激しい混合により混合した。この反応剤は、各分析用に新鮮なものを作成した。紫色の新鮮な還元されてないＤＤＰＨ試薬を、約ＯＤ517＝１．０に調節した。１０μＬのハッカ抽出物(遊離型又は壁結合型)をエッペンドルフチューブに入れた。次いで、９９０μＬのＤＰＰＨ試薬を加えた。この混合物を、暗黒中で室温で１時間インキュベートし、その後、ＤＰＰＨ−ハッカ混合物の吸光度を５１７ｎｍで読んだ。得られた吸光度値は、元のＯＤ517＝１．０のベースラインの読みから引かれた。直線的範囲内に残るために、ＯＤ517０．３〜０．６の範囲内で試料を読むように注意を払った。この理由のために、幾つかの試料を、アッセイ前に希釈した。クロロゲン酸(Sigma社製、米国、St. Louis在)誘導されるＤＰＰＨの還元についての標準曲線を、植物抽出物と同じ条件下で行なった。次いで、抗酸化活性を、クロロゲン酸換算で表した。
【００６１】
ロスマリン酸及びコーヒー酸のＨＰＬＣ分析
フェノール酸類の分離及び評価のために、ＨＰＬＣ(Waters社製、米国)を利用した。エタノール性組織抽出物(遊離型のフェノール化合物を表す)を用いて、ロスマリン酸の含有量を分析した。これらのＨＰＬＣ条件は、次の通りであった：
【００６２】
Ｃ−１８カラム(Sigma社製、米国、St. Louis在)、２５０×４．６ｍｍ、５μｍの粒度、１ｍＬ／分の流量、及び２０μＬの注入容積。ＨＰＬＣ溶出されるロスマリン酸の量は、ロスマリン酸についての標準曲線(０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬ)から計算した。コーヒー酸についての標準曲線は、０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬであった。
【００６３】
ロスマリン酸についての溶出プロトコールは、実施例２の表１に記載したものと同じであった。コーヒー酸についての溶出プロトコールは、実施例２の表２に記載したものと同じであった。
【００６４】
エタノール性抽出物(抽出物Ｉ)及びヘキサン抽出物も又、標準的方法により、ＧＣ質量分析により分析して、主成分を同定した。
【００６５】
結果：
蒸留前及び蒸留後の植物材料のエタノール抽出物(遊離フェノール化合物)及びＮａＯＨ抽出物(細胞壁材料)中のすべてのフェノール化合物及び抗酸化活性を測定して、これらの結果を表３に与えた。
【００６６】
【表３】
2009520080.tif 000004
【００６７】
蒸留前及び蒸留後の植物材料のエタノール抽出物(遊離フェノール化合物)及びエタノールとその後のＮａＯＨによる抽出物(細胞壁材料)中のロスマリン酸(ＲＡ)の量及びエタノールとその後のＮａＯＨによる抽出物中のコーヒー酸(ＣＡＦ)の量を測定して、それらの結果を表４に与えた。
【００６８】
【表４】
2009520080.tif 000005
【００６９】
蒸留後ハナハッカ植物材料のエタノール抽出物は、化合物を同定するために、ＧＣ質量分析及びＨＰＬＣ質量分析にかけられた。一の試料のＧＣ−ＭＳ分析は、次の化合物を同定した：ピロカテコール；４−ビニルフェノール；５，４’−ジメトキシ−２−メチルビベンジル；４−ビニルグアヤコール；シリンゴール；４−アセチルアニソール；４−ヒドロキシベンズアルデヒド；バニリン；２，１，３−ベンゾチアジアゾール；３−ヒドロキシアセトフェノン；アセトバニロン；アセトベラトロン；シリングアルデヒド；及びアセトシリンゴン。他の試料のＧＣ−ＭＳ分析は、次の化合物を同定した：３−ヒドロキシアセトフェノン；４−アセチルアニソール；４−ヒドロキシベンズアルデヒド；４−ビニルグアヤコール；アセトシリンゴン；ピロカテコール；４−ビニルフェノール；アセトバニロン；アセトベラトロン；シリングアルデヒド；シリンゴール；及びバニリン。他の試料のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、次の化合物を同定した：シリンガ酸；ジテルペン；２−イソプロピル−５−メチル−ヒドロキノン；クマル酸；フェルラ酸；ジヒドロコーヒー酸；コーヒー酸；ロスマリン酸；及び様々なフラボノイド。
【００７０】
エタノール抽出した蒸留後植物材料のヘキサン抽出物を、ＧＣ質量分析にかけて化合物を同定した。２つの異なる試料のＧＣ−ＭＳ分析は、次の化合物を同定した：チモール；カルバクロール；β−ビスアボレン；ネオフィタジエン；サイモキノン；サイモハイドロキノン；フィトールアセテート；スクアレン；ビタミンＥ；フィトール；及び(２３Ｓ)−エチルコレスト−５−エン−３．ベータ−オール。
【００７１】
実施例４（精油の抽出前後のローズマリー抽出物の全フェノール化合物及び抗酸化活性の比較）
栽培したローズマリー(ロズマリナス・オフィシナリス)植物物質を、精油の蒸留の前又は後に、エタノール抽出にかけた(実施例２に記載の方法を使用)。これらの抽出物中の全フェノール化合物及び抗酸化活性を測定して、結果を表５に与えた。
【００７２】
【表５】
2009520080.tif 000006
【００７３】
この例において見られるように、フェノール化合物及び抗酸化性物質の発見は、蒸留前材料よりも蒸留後材料からの方が一層大きい。如何なる特定の基礎的機構にも制限はされないが、この結果についての一つの説明は、蒸留工程自体が、これらの物質の部分的分離を引き起こしてそれらをエタノールによる抽出に一層利用可能にしたということである。
【００７４】
本発明は、上記した具体例及び典型例に限られず、添付の請求の範囲の範囲内の変形や改変を含むことができる。
【国際調査報告】
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