(57)【要約】  ATL細胞をはじめとした複数の腫瘍細胞株に対して特異的な反応性を有し、かつ安全性と治療効果を兼ね備えたヒト抗体及び該抗体フラグメントを提供する。腫瘍細胞の表面に発現するHLA-DRβ鎖を認識するヒト抗体及び該抗体フラグメントを得た。特に該抗体フラグメントであるscFvの二量体（ダイアボディ）が該HLA-DRβ鎖発現細胞に対する強いアポトーシス誘導能を有することを見出した。本発明により得られた抗体及び該抗体フラグメントは、ATLをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症の検出試薬、診断薬および予防または治療薬として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域（CDR）と、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域（CDR）とを含むヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
（ａ）CDR1として配列番号２、CDR2として配列番号３、CDR3として配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）CDR1として配列番号７、CDR2として配列番号８、CDR3として配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【請求項２】
（ｂ）および（ｄ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
【請求項３】
以下の（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む請求項１に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
【請求項４】
（ｆ）および（ｈ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
【請求項５】
当該抗体フラグメントが、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb、scFv、(scFv)2、scFv二量体（ダイアボディ）、またはその他のscFvを２個以上結合した抗体フラグメント及びそれらのFc融合体である請求項１ないし４のいずれかに記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
【請求項６】
当該抗体フラグメントが、scFvまたはscFv-Fcである請求項５に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または当該抗体フラグメント。
【請求項７】
当該抗体フラグメントが、ダイアボディまたは当該ダイアボディとFcの融合体である請求項５に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
【請求項８】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域（CDR）を含むポリペプチドからなる、ヒト抗HLA-DRβ鎖抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
（ａ）CDR1として配列番号２、CDR2として配列番号３、CDR3として配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【請求項９】
（ｂ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項８に記載のＨ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１０】
当該Ｈ鎖のCDRを含むポリペプチドが、以下の（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドである請求項８に記載のＨ鎖可変領域フラグメント。
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
【請求項１１】
（ｆ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１０に記載のＨ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１２】
以下の（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域（CDR）を含むポリペプチドからなる、ヒト抗HLA-DRβ鎖抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
（ｃ）CDR1として配列番号７、CDR2として配列番号８、CDR3として配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【請求項１３】
（ｄ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１２に記載のＬ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１４】
当該Ｌ鎖のCDRを含むポリペプチドが、以下の（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドである請求項１２に記載のＬ鎖可変領域フラグメント。
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
【請求項１５】
（ｈ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１４に記載のＬ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１６】
請求項８ないし１１のいずれかに記載のＨ鎖可変領域フラグメントと、請求項１２ないし１５のいずれかに記載のＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなるscFv、(scFv)2、ダイアボディ、またはscFvが２個以上結合されたその他の抗体フラグメントである、ヒト抗HLA-DRβ鎖抗体フラグメント。
【請求項１７】
当該抗体フラグメントがscFvである請求項１６に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体フラグメント。
【請求項１８】
当該抗体フラグメントがダイアボディである請求項１６に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体フラグメント。
【請求項１９】
請求項８ないし１１のいずれかに記載のＨ鎖可変領域フラグメント及び／または、請求項１２ないし１５のいずれかに記載のＬ鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、HLA-DRβ鎖に対するヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
【請求項２０】
当該抗体フラグメントが、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb、scFv-Fc、(scFv)2-Fc、ダイアボディのFc融合体、またはscFvを２個以上結合したその他の抗体フラグメントのFc融合体である請求項１９に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメントとペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体。
【請求項２２】
請求項１から２０のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメントまたは請求項２１に記載の融合抗体に修飾剤が結合されてなる修飾抗体。
【請求項２３】
請求項１から２０のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメントまたは請求項２１に記載の融合抗体をコードする遺伝子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項２６】
請求項２３に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメントを生産する方法。
【請求項２７】
請求項１から２０のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメント、請求項２１に記載の融合抗体、または請求項２２に記載の修飾抗体を含む、ATLをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症の検出試薬及び／または診断薬。
【請求項２８】
請求項１から２０のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメント、請求項２１に記載の融合抗体、または請求項２２に記載の修飾抗体を含む、ATLをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症の予防または治療剤。
【請求項２９】
ATLをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症を予防または治療するための医薬の製造における、請求項１から２０のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメント、請求項２１に記載の融合抗体、または請求項２２に記載の修飾抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞等に高発現している細胞表面分子であるHuman Leukocyte Antigen (HLA)-DRβ鎖を標的とし、HLA-DRβ鎖高発現細胞に対して細胞死（アポトーシス）を誘導するヒト抗体および該抗体フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬は、さまざま疾患に対して有効な医薬品としての地位を固めつつある。抗体医薬は、生物由来の分子を医薬品とする生物医薬品であるため、毒性などの大きな副作用は少なく、抗体自身、本来免疫系のなかで異物の特異的な認識にかかわる最も重要な分子の一つであることから、それをもとに作られた抗体医薬も最も高度に分子認識を行う分子標的医薬の一つである。特に癌に対しては、すでに、Ｂ細胞リンパ腫に対する抗CD20抗体（リツキシマブ）や、乳癌に対する抗HER2抗体（ハーセプチン）などが先行して治療に用いられており、有効な治療効果が得られている。この治療効果は、癌に特異的な抗原（癌マーカー）に対する抗体を投与することで、抗体が結合集積した癌細胞に対し、NK（ナチュラルキラー）細胞などによる特異的な免疫誘導、すなわち抗体依存的細胞障害（Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity；ADCC）や補体依存的細胞障害（Complement-Dependent Cytotoxicity；CDC）が起こり、癌細胞をアポトーシスに導くことが主要なメカニズムと考えられている。【０００３】
現在、癌を含む様々な疾患に対する治療薬として数多くの抗体医薬品が開発されているが、それらの抗体を作製する手法としては、大きく三つあげられる。一つは、従来のマウスハイブリドーマ法を用いてマウスモノクローナル抗体を作成しこれを抗体工学によってヒト化する方法である。しかしながら、ヒト化抗体は非ヒト由来の配列を一部含むため、反復投与や長期投与により、投与するヒト化抗体の活性を阻害するような抗体が作られ、その効果を著しく減弱するだけでなく、重篤な副作用を招く可能性がある。また、ヒト化により活性が低下することも多く、構築には多大な労力とコストを要する。【０００４】
その他の抗体作製方法としては、ヒト染色体の一部を組み込んだいわゆるトランスクロモマウスを用いたハイブリドーマ技術による方法、もう一つには、抗体ファージライブラリ法がある。これらの２つは直接ヒト抗体の単離が可能な手法として、今後ますますその利用が加速されることが予想される。【０００５】
ATL（成人T細胞白血病）は、レトロウイルスであるヒトT細胞好性ウイルス１型（HTLV-1）が引き起こす疾患である（非特許文献１）。HTLV-1は、多くは母乳などの母子感染によって伝播され、日本では120万人のキャリアがいると言われるが、その分布は鹿児島を含む南九州に多く偏っている。ATLは、通常、長期の潜伏期間を経て発症するが、キャリアのすべてが発症するわけではなく、その発症率は男性で6.6% 女性で2.1% 程度である。また、同じウイルスが原因となる神経変性疾患であるHAM（HLLV-1 associated myelopathy）を併発することが多く、これらを一旦発症すると、その予後は悪く、現在有効な治療法も確立されていない（非特許文献２）。また、これまでにHTLV-1感染細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体についての報告例はない。【０００６】
一方、他のリンフォーマや白血病細胞に関しては、高発現している分子の一つとして、主要組織適合遺伝子複合体クラスII（Major Histocompatibility Complex Class II, MHC Class II）が知られている。MHC Class IIは、リンパ球と抗原提示細胞間におけるシグナルとして機能する分子であり、生理的条件においては、免疫系細胞（Bリンパ球、活性化Tリンパ球、マクロファージ及び樹状細胞）にのみ発現しているが、ある種の病態（腫瘍性疾患、自己免疫疾患及び感染症）においては、種々の細胞でサイトカイン誘導性の発現が認められることが報告されている。【０００７】
抗MHC Class II抗体については、リンフォーマや白血病細胞に、カスパーゼ非依存性のアポトーシスの誘導が引き起こされることが報告されている（非特許文献３〜非特許文献６）。作用機序としては、Apoptosis inducing factorによる細胞内Protein kinase Cの活性化を経由した機構が有力である（非特許文献７）。ヒトのMHC Class IIであるHLA-DRについても、マウス抗HLA-DR抗体1D10からヒト化された抗体(非特許文献８)や、ヒト合成抗体ファージライブラリ（HuCAL）から得られたヒト抗HLA-DR抗体（非特許文献９）、さらには最近では、HLA-DR-transfected L929 cells.を免疫したトランスクロモマウスからハイブリドーマ技術によって単離されたヒト抗HLA-DR抗体（非特許文献１０）が、種々のリンフォーマや白血病細胞に対し、アポトーシスを誘導することが報告されている。しかしながら、これらのほとんどは、完全分子型抗体を用いて行われた実験である。【０００８】
完全分子型抗体については、長年の研究により物性や機能についての知見が蓄積されており、抗体医薬としての実績は最も多い。半減期が数週間以上と長いことも長所の一つと考えられている。しかしながら、抗MHC Class II抗体によりアポトーシスを誘導するといったようなアゴニスト抗体としての使用を試みる場合には、半減期が長いことが、デメリットとなる可能性が考えられる。実際、抗CD28抗体をアゴニスト抗体として、自己免疫疾患治療に利用することを目指した第Ｉ相臨床試験において、重篤な副作用が生じたため、治験が中止された例がある（TGN1412）。そのように、アゴニスト抗体については半減期のコントロールが可能な分子形態の方が有用である可能性が考えられる。【０００９】
低分子化抗体については、タンパク質工学的手法による分子改変や修飾が容易であるという特徴を有する。一般的に、低分子化抗体そのものは血中半減期が非常に短いものの、ポリエチレングリコール（PEG）による修飾や、アルブミンとの融合、或いはアルブミンまたはIgG結合配列との融合等により、血中半減期を延長させることが可能であることが知られている。【００１０】
また、完全分子型抗体はFc領域を介してADCC活性やCDC活性を発揮するが、それらの活性は標的細胞に対しては有効に働き得るが、標的細胞以外の細胞に抗体が作用してしまう場合には、有害な副反応を引き起こす可能性が懸念される。それに対して、Fc領域を有しない低分子化抗体であれば、可変領域のみの作用を想定すればよいため、ADCC活性やCDC活性等による副反応の可能性を否定できる。【００１１】
また、低分子化抗体については、分子サイズの小ささから、生産性が高い点や組織浸透性に優れている点など、用途によっては完全分子型抗体よりも医薬品としての有用性が高いとも考えられている。【００１２】
以上のことから、HLA-DRを抗原とし、かつ強力なアポトーシス誘導活性を有するヒト低分子化抗体を創出することができれば、有用な癌治療用の抗体医薬になりうることが期待されるが、これまでにそのような報告例はなかった。
【非特許文献１】Tsukasaki, K. et al., Bailliere's Best Practice & Research 13, p.231-243 (2000).
【非特許文献２】Ohshima, K. et al., Cancer Science 98, p.772-778 (2007).
【非特許文献３】Newell, M.K. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90, p.10459-10463 (1993).
【非特許文献４】Bertho, N. et al., J Immunol 164, p.2379-2385 (2000).
【非特許文献５】Al-Daccak, R. et al., Current Opinion in Immunology 16, p.108-113 (2004).
【非特許文献６】Nagy, Z.A. & Mooney, N.A., Journal of Molecular Medicine-Jmm 81, p.757-765 (2003).
【非特許文献７】Bertho, N. et al., International Immunology 14, p.935-942 (2002).
【非特許文献８】Kostelny, S.A. et al., International Journal of Cancer 93, p.556-565 (2001).
【非特許文献９】Nagy, Z.A. et al., Nature Medicine 8, p.801-807 (2002).
【非特許文献１０】Tawara, T. et al., Cancer Science 98, p.921-928 (2007).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ATL細胞をはじめとした複数の腫瘍細胞株に対して特異的な反応性を有し、かつ安全性と治療効果を兼ね備えたヒト抗体及び該抗体フラグメントを提供するとともに、それらの利用方法を提案するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では以上の知見にもとづき、ATL等の新しい癌治療法確立のための抗体医薬の創製を目指し、ATL患者由来の細胞株であるS1Tに対する特異的なヒト抗体を、すでに構築している単鎖Fv（scFv）ヒト抗体ファージライブラリからのスクリーニングによって単離することに成功した。得られた抗体について解析した結果、その抗原は他のリンフォーマや白血病細胞にも高発現していることが知られているHLA-DRのβ鎖であった。興味深いことに、得られたscFvヒト抗体の二量体（ダイアボディ）は、きわめて強力なアポトーシス誘導能をS1Tに対して有することが分かった。よって、HLA-DRβ鎖を高発現している他の細胞に対しても、本抗体は選択的反応性とアポトーシス誘導活性を示すことが考えられる。【００１５】
本発明で得られたヒト抗体ダイアボディは、これまでに報告されている抗MHC Class II抗体よりも、きわめて低濃度でアポトーシス誘導能を示すものであった。また、抗MHC Class II抗体としては初めて低分子化抗体のフォーマットでその作用を確認したことにより、安全性、生産性及び組織浸透性に優れた、MHC Class II分子を標的とした抗癌剤としての可能性を示すことができた。【００１６】
すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として下記１）〜２９）の発明を含むものである。
１）  以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域（CDR）と、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域（CDR）とを含むヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
（ａ）CDR1として配列番号２、CDR2として配列番号３、CDR3として配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）CDR1として配列番号７、CDR2として配列番号８、CDR3として配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
２）  （ｂ）および（ｄ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、上記１）に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
３）  以下の（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む上記１）に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
４）  （ｆ）および（ｈ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、上記３）に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
５）  当該抗体フラグメントが、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb、scFv、(scFv)2、scFv二量体（ダイアボディ）、またはその他のscFvを２個以上結合した抗体フラグメント及びそれらのFc融合体である上記１）ないし４）のいずれかに記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
６）  当該抗体フラグメントが、scFvまたはscFv-Fcである上記５）に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または当該抗体フラグメント。
７）  当該抗体フラグメントが、ダイアボディまたは当該ダイアボディとFcの融合体である上記５）に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
８）  以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域（CDR）を含むポリペプチドからなる、ヒト抗HLA-DRβ鎖抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
（ａ）CDR1として配列番号２、CDR2として配列番号３、CDR3として配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
９）  （ｂ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、上記８）に記載のＨ鎖可変領域フラグメント。
１０）  当該Ｈ鎖のCDRを含むポリペプチドが、以下の（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドである上記８）に記載のＨ鎖可変領域フラグメント。
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
１１）  （ｆ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、上記１０）に記載のＨ鎖可変領域フラグメント。
１２）  以下の（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域（CDR）を含むポリペプチドからなる、ヒト抗HLA-DRβ鎖抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
（ｃ）CDR1として配列番号７、CDR2として配列番号８、CDR3として配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
１３）  （ｄ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、上記１２）に記載のＬ鎖可変領域フラグメント。
１４）  当該Ｌ鎖のCDRを含むポリペプチドが、以下の（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドである上記１２）に記載のＬ鎖可変領域フラグメント。
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
１５）  （ｈ）に記載のポリペプチドが、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加される前のアミノ酸配列と約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上のアミノ酸配列同一性を有する、上記１４）に記載のＬ鎖可変領域フラグメント。
１６）  上記８）ないし１１）のいずれかに記載のＨ鎖可変領域フラグメントと、上記１２）ないし１５）のいずれかに記載のＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなるscFv、(scFv)2、ダイアボディ、またはscFvが２個以上結合されたその他の抗体フラグメントである、ヒト抗HLA-DRβ鎖抗体フラグメント。
１７）  当該抗体フラグメントがscFvである上記１６）に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体フラグメント。
１８）  当該抗体フラグメントがダイアボディである上記１６）に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体フラグメント。
１９）  上記８）ないし１１）のいずれかに記載のＨ鎖可変領域フラグメント及び／または、上記１２）ないし１５）のいずれかに記載のＬ鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、HLA-DRβ鎖に対するヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
２０）  当該抗体フラグメントが、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb、scFv-Fc、(scFv)2-Fc、ダイアボディのFc融合体、またはscFvを２個以上結合したその他の抗体フラグメントのFc融合体である上記１９）に記載のヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメント。
２１）  上記１）から２０）のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメントとペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体。
２２）  上記１）から２０）のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメントまたは上記２１）に記載の融合抗体に修飾剤が結合されてなる修飾抗体。
２３）  上記１）から２０）のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメントまたは上記２１）に記載の融合抗体をコードする遺伝子。
２４）  上記２３）に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
２５）  上記２３）に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
２６）  上記２３）に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗HLA-DRβ鎖抗体または該抗体フラグメントを生産する方法。
２７）  上記１）から２０）のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメント、上記２１）に記載の融合抗体、または上記２２）に記載の修飾抗体を含む、ATLをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症の検出試薬及び／または診断薬。
２８）  上記１）から２０）のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメント、上記２１）に記載の融合抗体、または上記２２に記載の修飾抗体を含む、ATLをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症の予防または治療剤。
２９）  ATLをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症を予防または治療するための医薬の製造における、上記１）から２０）のいずれかに記載の抗体または該抗体フラグメント、上記２１）に記載の融合抗体、または上記２２）に記載の修飾抗体の使用。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のヒトモノクローナル抗体及び該抗体フラグメントは、ATL等の腫瘍細胞に高発現している細胞表面分子であるHLA-DRβ鎖を標的とし、HLA-DRβ鎖発現細胞に対してアポトーシス誘導作用を有する。【００１８】
抗体医薬は、その標的化メカニズム、作用機序が明確であり、医薬品開発の実用化へのプロセスが比較的容易なため、実用化の可能性は極めて高い。本発明の抗体が認識するHLA-DRβ鎖は、ATLやその他の癌の優れたマーカーである可能性は高く、比較的容易に治療法の確立を達成できる可能性があり、産業上の有用性は十分に大きいと言える。加えて、自己免疫疾患や移植片拒絶反応など、免疫系の異常が引き起こす免疫疾患や、各種感染症に対しても有効な治療薬となる可能性が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細胞蛍光標識によるフローサイトメータを用いた特異細胞を標的とする抗体ファージを取得するためのバイオパンニング法の流れを示す図。
【図２】１〜３の各パンニングのラウンドで得られた抗体ファージの混合物についてS1T細胞との反応性をフローサイトメーターにより解析した結果を示す図。
【図３】１〜３の各パンニングのラウンドで得られた抗体ファージクローンについてS1T細胞との反応性をフローサイトメーターにより解析した結果を示す図。
【図４】S1T細胞に特異的に結合するscFv抗体ファージクローン（MS-S1TA3）のアミノ酸配列を示す図。
【図５】精製したscFv抗体（MS-S1TA3）のS1T細胞への結合特性をFACS解析した結果を示す図。A：細胞のみ；B：マウス抗His抗体＋FITC化抗マウスIgG抗体により染色；C：MS-S1TA3 scFv＋マウス抗His抗体＋FITC化抗マウスIgG抗体により染色。
【図６】scFv抗体（MS-S1TA3）のHTLV-1感染株と非感染株の細胞に対する結合特性を比較した結果を示す図。A：細胞のみ；B：マウス抗His抗体＋FITC化抗マウスIgG抗体により染色；C：MS-S1TA3 scFv＋マウス抗His抗体＋FITC化抗マウスIgG抗体により染色。
【図７】S1T細胞のライセートに対するscFv抗体（MS-S1TA3）の反応性をウェスタンブロッティング解析した結果を示す図。
【図８】HLA-DRβ鎖（DRB1*0101）とHLA-DRα（DRA*0101）鎖を発現するL細胞形質転換株（L57.23）に対するscFv抗体（MS-S1TA3）の結合活性を示す図。L243について、A：細胞のみ；B：PEラベル化抗HLA-DR抗体により染色。MS-S1TA3について、A：細胞のみ；B：マウス抗His抗体＋FITC化抗マウスIgG抗体により染色；C：MS-S1TA3 scFv＋マウス抗His抗体＋FITC化抗マウスIgG抗体により染色。
【図９】組換えHLA-DR分子に対するscFv抗体（MS-S1TA3）の結合特性を示す図。
【図１０】scFv抗体（MS-S1TA3）の添加によってS1T細胞にアポトーシスが誘導されることを示す図。
【図１１】L243マウスモノクローナル抗体によるS1T細胞に対するアポトーシス誘導活性を示す図。
【図１２】異なるリンカーの長さを持つscFv抗体（MS-S1TA3）のモノマーによるS1T細胞に対するアポトーシス誘導活性を示す図。
【図１３】異なるリンカーの長さを持つscFv抗体（MS-S1TA3）のダイマー（ダイアボディ）によるS1T細胞に対するアポトーシス誘導活性を示す図。
【図１４】MS-S1TA3の各種誘導体の構造を示す図。
【図１５】scFv-Fc抗体（MS-S1TA3）のHLA-DRへの結合活性をELISAにより解析した結果を示す図。
【図１６】scFv-Fc抗体（MS-S1TA3）のS1T細胞への結合特性をFACS解析した結果を示す図。A：細胞のみ；B：コントロールIgG抗体＋ビオチン化抗ヒトFc抗体＋PE標識したストレプトアビジンにより染色；C：MS-S1TA3 scFv-Fc＋ビオチン化抗ヒトFc抗体＋PE標識したストレプトアビジンにより染色。
【図１７】scFv-Fc抗体（MS-S1TA3）のS1T細胞に対するアポトーシス誘導活性を他のフォーマットと比較した結果を示す図。
【図１８】種々のリンフォーマ、白血病細胞に対するscFv抗体（MS-S1TA3）ダイアボディのアポトーシス誘導効果を示す図。
【図１９】種々のリンフォーマ、白血病細胞におけるHLA-DRの発現の違いを示す図。図中、括弧内の数値は、細胞集団の蛍光強度の中央値を示す。A：細胞のみ；B：PEラベル化抗HLA-DR抗体により染色。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明について詳述する。scFvディスプレイファージライブラリーは、以下のようにして作製することができる。複数の健常者から採取した末梢血Bリンパ球より、RT-PCR法にて免疫グロブリン重（Ｈ）鎖、軽（Ｌ）鎖cDNAを合成する。次に各種プライマーを組み合わせて、Ｈ鎖可変領域（VH）とＬ鎖可変領域（VL）を増幅させ、両者をlinker DNAで結合させることにより、健常者リンパ球由来のVHとVLのランダムな組み合わせによるscFv遺伝子のライブラリーが作製される。このscFv遺伝子をファージミドベクターpCANTAB5Eに組込み、約108〜1011クローンからなる健常者由来scFvディスプレイファージライブラリーを構築することができる。【００２１】
抗体ファージライブラリを用いて特異的な抗体を単離する手法をパンニングと呼んでいるが、これにはさまざまな方法が報告されている。最も一般的なものは、標的とする抗原が明らかである場合、抗原を組み換えたんぱくなどによって調製し、それをプラスチックプレートなどに固定化し、抗体ファージライブラリを反応させ特異的に結合する抗体ファージを濃縮するという方法がとられる。しかしながら今回のように、標的とするタンパク抗原が明らかではない状態で、細胞株に特異的な抗体ファージを単離するためには、細胞そのものとフローサイトメーターを用いたパンニングが可能である。或いは、細胞そのものではなく、膜画分を調製して抗原として用いることもできる。【００２２】
例えば、コントロール細胞であるMOLT-4細胞と、前もってFITC標識抗体で、あるいは直接FITC標識試薬でラベル化した標的細胞であるS1T細胞の混合物に抗体ファージライブラリを加え、4℃で1時間ゆっくりと混合しながら反応させる。遠心後、上清を除き、沈殿した細胞を洗浄する。遠心後の沈殿した細胞をFACS緩衝液に分散させ、フローサイトメータを用いてS1T細胞を分取する。回収した細胞より、酸溶液の添加によってファージを溶出させ、中和して大腸菌（TG1）に感染させる。ヘルパーファージを用いて抗体ファージをレスキューし、再度、同様なパンニングのプロセスに供する。パンニングを複数回繰り返すことにより、特異クローンを濃縮することができる。【００２３】
得られた各パンニングのステップでの抗体ファージについては、S1T細胞との結合活性をフローサイトメータを用いて調べるとよい。S1TならびにMOLT-4細胞に対する反応性を評価した結果、パンニングの回数を重ねることによって、明らかに結合によると見られるピークの蛍光強度のシフトが、S1T細胞にのみ見られれば、S1T細胞に特異的に結合する抗体ファージが濃縮されていることが分かる。【００２４】
濃縮が確認されれば、そのラウンドの抗体ファージを大腸菌に感染後クローン化し、各ファージクローンとS1T細胞との結合活性をフローサイトメータを用いて解析するとよい。その結果、S1T細胞に対する特異的反応性が認められれば、それらのクローンについて、DNAシーケンス解析を行うことにより、VHならびにVLの領域のDNA配列から翻訳される抗体のアミノ酸配列を同定することができる。【００２５】
このようにして得られたクローンのscFvを調製し、標的細胞との反応性を確認するとよい。scFvの発現方法としては、例えば大腸菌で発現させることができ、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等を機能的に結合させて発現させることができる。プロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーター等を用いることができる。scFvの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、pelBシグナル配列（J. Bacterio R 1987, 169: 4379-4383）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはM13ファージのg3タンパク質のシグナル配列を用いることもできる。【００２６】
細胞内外に発現されたscFvは、宿主から分離し均一にまで精製することができる。scFvのＣ末端にEtag配列が付加されている場合には、抗Etag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、His-tag配列が付加されている場合には、NTAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせて抗体を分離・精製することができる。精製した標品については、HPLCゲルろ過分析等で分子形態を分析することができる。【００２７】
得られたscFv精製品を用いて、S1T細胞との結合性をフローサイトメータ解析により確認することができる。【００２８】
得られたscFv抗体の特異性については、種々のHTLV-1感染株のセルライン（例えばHTLV-1感染TリンフォーマであるS1T、MT-4、M8166及びMT-2）と非感染株のセルライン（例えば非HTLV-1感染リンフォーマであるMOLT-4、CEM、Jurkat及びDaudi）を用いて解析することが望ましい。HTLV-1感染株に対して非感染株より強く結合する傾向が見られれば、当該scFv抗体がHTLV-1感染T細胞リンフォーマに対する有効な標的抗体である可能性が示唆される。【００２９】
scFv抗体の抗原を同定するには、標的細胞のライセートをウェスタンブロッティングにより、SDS-PAGE（還元状態）後、scFv抗体にて免疫染色を行うとよい。その結果バンドが検出されれば、電気泳動後のゲルからそのバンドを切り出し、ゲル内で還元アルキル化、トリプシン消化を行い、得られるペプチド断片についてLC-MS/MS解析を行うことができる。得られるフラグメントのマススペクトルから、MASCOT検索により、ゲル中に含まれる候補タンパク質の絞り込みを行い、その結果スコアの高いタンパク質のうち、細胞表面のタンパク質を抗原の候補とすることができる。【００３０】
この結果を確認するためには、例えば抗原候補のタンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクションした細胞への結合特性をフローサイトメータで調べるか、または精製した抗原候補タンパク質に対する反応性をウェスタンブロッティングやELISA或いはBiacoreを用いて評価するとよい。それらの結果をふまえて、scFv抗体の抗原について結論付けることができる。【００３１】
得られたscFv抗体の生物活性についても評価するとよい。例えば、アポトーシス誘導活性に関しては、標的細胞とscFv抗体を混合して反応後、FITCラベル化したAnnexin VとPIで染色し、フローサイトメータで解析することができる。標的細胞特異的に、scFv抗体の添加により、ダブルポジティブの細胞が増加していることが確認されれば、当該scFv抗体がアポトーシス誘導能を有していることが示唆される。【００３２】
一般にscFvのフォーマットでは、モノマーの状態のものとダイマーすなわちダイアボディが混在することが報告されている（Kortt, A.A, 2001）ことから、アポトーシスを誘導する分子種がどちらのフォーマットのものであるかを確認するために、分子篩クロマトグラフィーによりモノマーとダイマーを分離後、そのアポトーシス誘導能を比較するとよい。また、scFvのリンカー部分の長さを現状の15 mer（linker 3,（GGGGS）×3：配列番号１５；対応する塩基配列を配列番号１６に示す）から、10 mer（linker 2、（GGGGS）×2：配列番号１３；対応する塩基配列を配列番号１４に示す）、5 mer（linker 1,（GGGGS）×1：配列番号１１；対応する塩基配列を配列番号１２に示す）に変換したscFvを作成し、それらのモノマー、ダイマーのアポトーシス誘導能と比較検討することもできる。【００３３】
上記の方法により、ATL細胞由来の細胞株であるS1T細胞に対する特異的なヒト抗体をヒトscFv抗体ファージライブラリからスクリーニングした結果、特異クローンの取得に成功した。この抗体は、S1T細胞に特異的に結合するだけでなく、他のATL関連細胞株にも結合するが、ATL非関連の細胞株ならびに非活性化T細胞にはほとんど結合しなかった。このことから、この抗体の認識する抗原は、ATLの優れた癌マーカーになる可能性がある。さらに得られた抗体（scFvの二量体）は、S1Tにアポトーシスを誘導することから、癌細胞の治療薬としての利用可能性が期待される。【００３４】
上記結合活性を有するscFvのVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、下記の通りである。クローンMS-S1TA3のVH鎖のアミノ酸配列を配列番号１に示した。当該VH鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号２〜４に示した。すなわち、配列番号１に示すVH鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がCDR1（配列番号２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がCDR2（配列番号３）、９９番目〜１１１番目のアミノ酸配列がCDR3（配列番号４）に対応している。また、当該VH鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に示した。【００３５】
また、クローンMS-S1TA3のVL鎖のアミノ酸配列を配列番号６に示した。当該VL鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号７〜９に示した。すなわち、配列番号６に示すVL鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３３番目のアミノ酸配列がCDR1（配列番号７）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がCDR2（配列番号８）、８８番目〜９８番目のアミノ酸配列がCDR3（配列番号９）に対応している。また、当該VL鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示した。【００３６】
本発明の抗体およびその抗体フラグメントは、上記VH鎖及びVL鎖、並びにそれらのCDRとして、上記配列番号に示される配列に限定されるものではなく、それらの一部が改変された変異ポリペプチドであってもよい。すなわち、各配列番号に記載されたアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつHLA-DRβ鎖を認識し、該HLA-DRβ鎖発現細胞に対するアポトーシス誘導能を有する抗体のＨ鎖またはＬ鎖の相補性決定領域、Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域となるポリペプチドも含まれる。置換、欠失、挿入、および／または付加される１またはそれ以上のアミノ酸としては、例えば1〜12個、好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸が挙げられる。【００３７】
アミノ酸配列に変異を導入して機能的に同等なタンパク質を取得する方法は、当業者に公知である。例えば、変異の導入方法としては部位特異的変異誘発法（Current Protocols in Molecular Biology edit. 1987, 5: Section 8, 1-8）や、抗体の可変領域にランダムに変異を導入する方法（PCR methods and Applications, 1992, 2: 28-33）、その他、抗体の親和性を試験管内で向上させる方法（Nature Medicine, 1996, 2: 100-102）が挙げられる。これらの方法によって取得した抗体から、本発明の特性を有する抗HLA-DRβ鎖抗体を選択することが可能である。【００３８】
このように、「変異」としては、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然（例えばヒト）に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。【００３９】
別の好ましい実施形態においては、本発明の抗HLA-DRβ鎖抗体は、該抗体のVH鎖が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。【００４０】
別の好ましい実施形態においては、本発明の抗HLA-DRβ鎖抗体は、該抗体のVL鎖が、配列番号６に記載のアミノ酸配列と90％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。【００４１】
さらに、別の好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、
（ａ）該抗体のVH鎖が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、
（ｂ）該抗体のVL鎖が、配列番号６に記載のアミノ酸配列と90％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。【００４２】
アミノ酸配列同一性の程度は、例えば約90％、より好ましくは約95％、最も好ましくは約97％、約98％または約99％以上であり得る。アミノ酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、アミノ酸配列同一性（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら（J. Mol. BioR1970, 48: 444-453）、Myers及びMiller（CABIOS, 1988, 4: 11-17）のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Needlemanらのアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれており、同一性（%）は、例えばBLOSUM 62 matrixまたはPAM250 matrix、並びにgap weight:16、14、12、10、8、6もしくは4、及びlength weight:1、2、3、4、5もしくは6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Myers及びMillerのアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALLIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、例えば、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。アミノ酸配列同一性は、上記のいずれの方法で決定されたものであってもよいが、好ましくは計算に際して、上記の方法のなかで最も低い値を示す方法が採用され得る。【００４３】
本発明で開示されるVH鎖及び／またはVL鎖は、ファージ抗体法を用いてscFvの形で得られたものであり、その評価もscFv或いはダイアボディの分子形態で行ったが、原則としてその適用はそれらの分子形態に限定されることはない。例えば、開示したVH鎖及び／またはVL鎖をヒト免疫グロブリンの定常領域と連結した完全分子型、またヒト免疫グロブリンの定常領域の一部と組み合わせたFab、Fab'またはF(ab')２、さらにscFvをヒト免疫グロブリンのL鎖の定常領域と結合させた一本鎖抗体（scAb）やscFvを２個連結して一本鎖化した分子である(scFv)２などの他の抗体フラグメントもその適用範囲に含まれる。【００４４】
また、本発明の抗体またはそのフラグメントは、当該抗体またはフラグメントにペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体であってもよい。【００４５】
また、これらの抗体及び抗体フラグメントタンパク質分子に、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾タンパク質分子も同様に本発明に包含される。【００４６】
Ｈ鎖とＬ鎖のFvを適当なリンカーで連結させたscFvを調製する場合、ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸10〜25残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ここで、ペプチドリンカーの長さを、例えばアミノ酸５残基程度に短くすることにより、scFvが二量体化しやすくなり、ダイアボディの分子形態を取ることが知られている。【００４７】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、配列番号５及び１０に示した本発明により得られた各クローンのVH鎖及びVL鎖をコードする遺伝子配列情報をもとに、適当な宿主（例えば、細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはそのフラグメントを発現させることができる。【００４８】
本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、ATLをはじめ各種癌の検出試薬及び診断薬として利用可能である。さらに、本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、ATLをはじめ各種癌の治療薬として利用可能である。【００４９】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
《実施例１：健常者からのファージライブラリーの構築》
J. D. Marks ら（J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991）により報告されている方法を参考にし、健常者20名由来末梢血由来リンパ球を出発材料とし、ファージライブラリーを構築した。構築したVH(γ)−Vκ、VH(γ)−Vλ、VH(μ)−Vκ、VH(μ)−Vλの各サブライブラリーはそれぞれ1.1×108、2.1×108、8.4×107、5.3×107クローンの多様性を有すると評価された。【００５１】
《実施例２：ATL細胞株を用いたスクリーニング》
ATL細胞株であるS1Tに対する特異抗体を作製するために、図１に示したようなフローサイトメーターを用いたパンニングの手法を考案した。すなわち、106個のMOLT4細胞と、前もってFITC化抗CD30抗体でラベル化した等量のS1T細胞の混合物（500μl、1％BSA in PBS）に、抗体ファージライブラリを1012TU加え、4℃で1時間ゆっくりと混合しながら反応させた。遠心後（3,000×30秒）、上清を除き、沈殿した細胞を1% BSA500μlを加え分散させた。同様な操作で、再度洗浄を行い、8 mlのFACS緩衝液（0.1% NaN3、2% FBS in PBS）に分散させた。フィルターろ過後、フローサイトメータを用いて約2×105程度の細胞を分取した。分取した細胞は、RPMI培地中に分散させ、その後、3,000 rpmで6分間遠心し、細胞を回収した。回収した細胞に100μlのPBSを加え（全量200μl）に、pH 2.5の76 mMクエン酸溶液300μlを加え、5分間、放置した後、1 M Tris-HCl（pH 7.4）を500μl加え中和した。これを30mlの大腸菌（TG1）の培養液に移し、30分間37℃、放置にて感染後、30分培養、培地換えを行い、プロトコールに従い、抗体ファージのレスキューを行った。回収した抗体ファージは、再度、同様なパンニングのプロセスに供した。パンニングは合計３回繰り返した。【００５２】
《実施例３：ファージ抗体のフローサイトメータによる反応性解析》
得られた各パンニングのステップでの抗体ファージの溶液とS1T細胞との結合活性をフローサイトメータを用いて調べた結果を図２に示した。図２に示したように、１回目のパンニング終了後では、S1TならびにMOLT-4細胞ともに、結合は見られないが、２回目、３回目のパンニングによって得られた抗体ファージでは、明らかに結合によると見られるピークの蛍光強度のシフトが、S1T細胞にのみ見られた。このことから、S1T細胞に特異的に結合する抗体ファージが濃縮されていることが分かった。【００５３】
そこで、２ラウンド目と３ラウンド目の抗体ファージを大腸菌に感染後クローン化し、各ファージクローンとS1T細胞との結合活性をフローサイトメータを用いて解析した。その結果、２ラウンド目の14クローンの抗体ファージ中で5クローンが、３ラウンド目14クローン中で2クローンが結合活性を示した（図３）。【００５４】
《実施例４：特異クローンの配列解析》
さらにこれらのクローンについて、DNAシーケンス解析を行ったところすべてのクローンが単一の配列を有していることがわかった。VHならびにVLの領域のDNA配列から翻訳される抗体のアミノ酸配列を図４に示した。【００５５】
《実施例５：scFvの発現と精製》
得られたscFvを大腸菌で発現すると、ペリプラズム画分よりも細胞質に多く存在した。これらのscFvの精製を容易にするために、C末端に任された検出精製用のタグE-tagをHisタグに変換し、大腸菌HB2151にて、IPTG誘導によってscFvを産生させた。Hisタグカラムによって精製したscFvを用いて、S1T細胞との結合を確認した結果を図５に示した。【００５６】
《実施例６：scFvのフローサイトメータによる反応性解析》
得られたscFv抗体（MS-S1TA3）の結合を、種々のHTLV-1感染株と非感染株のセルラインで比較した結果を図６に示す。HTLV-1感染のT細胞株であるS1T、MT-4、M8166には比較的強く結合しており、MT-2にも弱いながらはっきりと結合が見られた。これに対しT細胞由来の非感染株に対しては、いずれもほとんど結合が見られず、B細胞リンフォーマであるDaudi細胞に結合が見られた。これらのことは、本scFv抗体がHTLV-1感染T細胞リンフォーマに対する有効な特異抗体である可能性を示唆している。【００５７】
《実施例７：LC-MS/MS解析による抗原同定》
次に、scFv抗体（MS-S1TA3）の抗原を同定するため、S1T細胞のライセートをウェスタンブロッティングにより、SDS-PAGE（還元状態）後、scFv抗体にて免疫染色を行った。その結果、図７に示したように、弱いながらも、分子量で約32,000の位置にバンドが検出されたことから、電気泳動後のゲルからこのバンドを切り出し、ゲル内で還元アルキル化、トリプシン消化を行い、得られるペプチド断片にLC-MS/MS解析を行い、得られるフラグメントのマススペクトルから、MASCOT検索により、ゲル中に含まれる候補タンパク質の絞り込み行った。その結果、スコアの高い上位50のタンパク質のうち、唯一細胞表面タンパク質として同定されたのがHLA class II DRβ鎖であった。【００５８】
《実施例８：HLA-DRとの反応性評価》
この結果を確認するために、Ｌ細胞にHLA-DRβ鎖（DRB1*0101）とHLA-DRα鎖（DRA*0101）をコトランスフェクションした形質転換株L57.23に対するscFv抗体（MS-S1TA3）の結合特性をフローサイトメータで調べた。図８に示したように、市販の抗HLA-DRαマウス抗体と同様な反応性での結合性を示した。【００５９】
さらに、EBトランスフォームのヒトＢ細胞株EBwaから抗ＨＬＡ抗体を用いて精製したHLA-DR分子（埼玉医大松下祥先生より恵与）を用いて、scFv抗体（MS-S1TA3）の結合特性を確認した（図９）。すなわち、DRB1*0405由来のHLA-DRタンパク質に対する結合活性をELISAで確認したところ、図９の左パネルに示したように、MS-S1TA3抗体のHLA-DRに対する明らかな結合特異性が見られた。また、ウェスタンブロッティングによる免疫染色を行ったところ、34kDaほどに見えるHLA-DRα鎖のバンドに対してではなく、31kDa付近のHLA-DRβ鎖のバンドが特異的に染色されたことから、このscFv抗体（MS-S1TA3）の抗原は、HLA-DRβ鎖であると結論した。【００６０】
しかし、実際には、HLA遺伝子には、複数の遺伝子座とそれを共有する対立遺伝子が存在する。S1T細胞のHLAタイピングの結果は、HLA-DRβ鎖には、HLA-DRB1*040501が含まれることが明らかになり、また、cDNAをHLA-DRβ特異的なプライマーによって増幅、シークエンス解析した結果から、S1T細胞中の主要なHLA-DRβ鎖分子として、HLA-DRB1のほかにHLA-DRB4が含まれていることがわかった。以上のことから、scFv抗体（MS-S1TA3）が標的とするS1T細胞上の抗原は、これらの2つの遺伝子由来のHLA-DRβ鎖のどちらか一方か、もしくは、両方であることがわかった。【００６１】
《実施例９：scFvのアポトーシス誘導能の評価》
非常に興味深いことに、このscFv抗体（MS-S1TA3）で、S1T細胞を1時間37℃で処理をすると、極めて強力なアポトーシスを引き起こすことがわかった。約50μg/lのscFv抗体を加えた1時間後、FITCラベル化したAnnexin VとPIで染色し、フローサイトメータで解析した結果を図１０に示す。コントロールのMOLT-4では、scFv抗体添加、非添加で差が無いが、S1Tの場合、scFv抗体の添加により、ダブルポジティブの細胞が増加しており、アポトーシス様の細胞死が起こっていることが確認された。【００６２】
《実施例１０：各種分子形態における活性比較》
一般にscFvのフォーマットでは、モノマーの状態のものとダイマーすなわちダイアボディが混在することが報告されている。そこで、このアポトーシスを誘導する分子種がどちらのフォーマットのものであるかを確認するために、分子篩クロマトグラフィーによりモノマーとダイマーを分離後、そのアポトーシス誘導能を比較した。また同時に、scFvのリンカー部分の長さを現状の15 mer（linker 3, (GGGGS)×3：配列番号１５）から、10 mer（linker 2、(GGGGS)×2：配列番号１３）及び5 mer（linker 1, (GGGGS)×1：配列番号１１）に変換したscFvを作成し、それらのモノマー、ダイマーのアポトーシス誘導能と比較検討した。アポトーシス誘導能は、1×105 cell/100μLと各々のscFvを96ウェルプレートに加え、37℃、CO2存在下で２時間反応後、フローサイトメータによって細胞数をカウントすることにより測定した（図１１〜図１３）。その結果、図１２及び図１３に示したように、モノマーでは、アポトーシス誘導能がほとんど見られないか、もしくは極めて弱いのに対し、ダイマーでは、6 nMの濃度で強いものでは80%以上のアポトーシスが見られた。このことは、scFv抗体（MS-S1TA3）によって誘導されるアポトーシス様の細胞死は、HLA-DRβ鎖をscFv抗体のダイマーで、２量体化することにより、強力なアポトーシスを誘導していることを示唆している。図１１では、アポトーシスを誘導すると報告されている抗HLA-DRα鎖に対するL243マウスモノクローナル抗体によるアポトーシス誘導活性を比較しているが、L243のアポトーシス誘導能のEC50が、20 nMであるのに対し、scFv抗体（MS-S1TA3）のダイマーでは、EC50が1.5 nMと、約10倍以上の低濃度で同じ効果をもたらしていることは、特筆に値する。【００６３】
《実施例１１：scFv-Fcの作製と調製》
MS-S1TA3抗体はダイアボディで顕著なアポトーシス誘導活性を示したのに対し、L243抗体のアポトーシス誘導はそれほど強くないことが示されたことから、抗体によって架橋されるHLA-DR分子間の距離がアポトーシス誘導活性に重要である可能性が考えられた。しかしながら、MS-S1TA3抗体とL243抗体では認識するエピトープが異なる（MS-S1TA3抗体はHLA-DRのβ鎖を認識するのに対し、L243抗体はHLA-DRのα鎖を認識する）ことがアポトーシス誘導活性の差の原因となっている可能性も残されていた。そこで、MS-S1TA3抗体の誘導体として、scFvにヒトIgG1由来のFcを融合させたscFv-Fcタンパク質を作製し（図１４）、そのアポトーシス誘導活性を、MS-S1TA3抗体のダイアボディと比較、検討することとした【００６４】
scFv-Fcの遺伝子構築は以下の手順で行った。MS-S1TA3抗体のscFv遺伝子領域をPCR増幅し、ヒトFc融合蛋白質発現ベクターのクローニングサイトに挿入した。本ベクターにおいては、細胞外への分泌発現を促すリーダー配列とscFv遺伝子、及びヒトFc遺伝子領域が連結されており、その発現はCAGプロモーターにより制御されている。また本ベクターは、薬剤耐性遺伝子として、ネオマイシン耐性遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子とを有している。【００６５】
scFv-Fcの発現は、フリースタイル293-F細胞（Invitrogen）を宿主とした一過性発現により行った。293フェクチン試薬（Invitrogen）を用いて遺伝子導入を行い、フリースタイル293発現培地（Invitrogen）で2〜3日培養後、培養上清を遠心及び0.22μmフィルター濾過により回収した。【００６６】
精製はProtein Aカラムクロマトグラフィーを用いて常法に従って行った。PBS透析後に得られたscFv-Fc溶液を精製標品とした。【００６７】
《実施例１２：scFv-Fcの反応性解析》
まず、作製したMS-S1TA3 scFv-FcのHLA-DRに対する結合活性をELISAで評価した。HLA-DR50ngをプラスチックプレートにコートし、0.25％BSAを用いてブロッキングを行った。調製したscFv-Fc（50 nM）を反応後、結合したscFv-FcはAP標識抗ヒトFcのヤギFab抗体によって検出した。その結果を図１５に示す。scFv-Fcは、HLA-DRをコートしたウェルに特異的に反応したことから、調製したscFv-FcはHLA-DRに対する結合活性を保持していることが確認された。【００６８】
次に、scFv-Fcの結合活性をフローサイトメータにより確認した。その結果、図１６に示すように、MS-S1TA3のscFv-Fc抗体は、極めて強くS1T細胞に結合したが、コントロール細胞のMOLT4に対しては全く結合しなかった。【００６９】
《実施例１３：scFv-FcとダイアボディのS1T細胞に対するアポトーシス誘導能の比較》
結合特異性が確認されたscFv-Fcについて、S1Tに対するアポトーシス誘導活性を評価した結果を図１７に示す。scFv-Fcでは、約30 nM付近でアポトーシスを50％の細胞に誘導したが、これはL243 抗体とほぼ同様な活性であった。一方、ダイアボディの場合は、約2 nM程度で50％のアポトーシス誘導を示すころから、ダイアボディは明らかにscFv-Fcより強いアポトーシス誘導活性を持っていることが明らかとなった。【００７０】
以上のことは、強いアポトーシスを誘導するには、少なくとも抗体によって架橋されるHLA-DR間の距離が短いことが重要な因子であることを示すと同時に、通常の完全抗体やscFv-Fc抗体よりも、scFvのダイマー構造（ダイアボディ）の方が、HLA-DRを介した細胞死のシグナルの誘導に効果的であることを強く示している。【００７１】
《実施例１４：各種HLA-DR発現細胞に対するアポトーシス誘導能の評価》
このscFv抗体（MS-S1TA3）のダイアボディによるアポトーシスが、S1T以外の細胞でも誘導されるのかどうかを検討した結果を図１８に示す。S1Tに対するアポトーシス誘導が90%以上の条件下で、MOLT-4細胞に対しては、いずれのリンカーの異なるscFvのダイアボディにもアポトーシスは見られないが、Daudi細胞またはM8166細胞で8〜15%程度の弱いアポトーシスが見られた。【００７２】
この効果の違いが、何に由来するのかを調べるため、細胞上でのHLA-DRの発現量を抗HLA-DRα鎖抗体（L243）を用いたFACS解析で調べた。図１９に示したように、S1Tでは抗HLA-DRα鎖抗体による染色によって強い蛍光（蛍光の中央値で520）が出ているのに対して、Daudiでは、その蛍光強度の約1/10、M8166では1/100にまで減少していた。これらの結果は、図６で見たように、scFv抗体（MS-S1TA3）によるこれらの細胞染色の結果とほぼ同じであった。これらのことから、S1Tに比べ、Daudi、M8166では、HLA-DRの発現が低く、このことが、図１８で見られるscFv抗体（MS-S1TA3）のアポトーシス誘導活性が低い原因と考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上の結果より、成人T細胞白血病（ATL）に高発現している細胞表面分子であるHLA-DRβ鎖を標的とし、ATL細胞に対してアポトーシスを誘導するヒト抗体である当該抗体及び抗体フラグメントについては、ATLをはじめ各種癌の早期診断ならびに治療への利用可能性が大いに期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月18日(2009.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、配列番号６のアミノ酸配列のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含むダイアボディであるヒト抗ＨＬＡ−ＤＲβ鎖抗体フラグメント。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
当該抗体フラグメントが、当該ダイアボディとＦｃの融合体である請求項３に記載のヒト抗ＨＬＡ−ＤＲβ鎖抗体フラグメント。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
請求項３または７に記載の抗体フラグメントとペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体。
【請求項２２】
請求項３または７に記載の抗体フラグメントまたは請求項２１に記載の融合抗体に修飾剤が結合されてなる修飾抗体。
【請求項２３】
請求項３または７に記載の抗体フラグメントまたは請求項２１に記載の融合抗体をコードする遺伝子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項２６】
請求項２３に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗ＨＬＡ−ＤＲβ鎖抗体フラグメントを生産する方法。
【請求項２７】
請求項３または７に記載の抗体フラグメント、請求項２１に記載の融合抗体、または請求項２２に記載の修飾抗体を含む、ＡＴＬをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症の検出試薬及び／または診断薬。
【請求項２８】
請求項３または７に記載の抗体フラグメント、請求項２１に記載の融合抗体、または請求項２２に記載の修飾抗体を含む、ＡＴＬをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症の予防または治療剤。
【請求項２９】
ＡＴＬをはじめとした癌及び／またはウイルス感染症を予防または治療するための医薬の製造における、請求項３または７に記載の抗体フラグメント、請求項２１に記載の融合抗体、または請求項２２に記載の修飾抗体の使用。
【国際調査報告】
2009066655.tif 000037
2009066655.tif 000038
2009066655.tif 000039
2009066655.tif 000040
2009066655.tif 000041
2009066655.tif 000042