(57)【要約】  本特許出願は、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５のヘマグルチニンに特異的に結合するモノクローナル抗体、ならびにヘマグルチニン結合活性の少なくとも５０％をブロックすることができるモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、例えばトリインフルエンザウイルスの検出、診断、予防、および治療において有用である。また本明細書において、ハイブリドーマ細胞系、単離核酸分子、および本明細書で提供されるモノクローナル抗体に関する短いペプチド、および医薬組成物ならびに本明細書で提供されるモノクローナル抗体を含むキットが提供される。
2009524434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５のヘマグルチニンに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体が、
（ｉ）配列番号２８〜３０に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｈ鎖；
（ｉｉ）配列番号３４〜３６に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｈ鎖；
（ｉｉｉ）配列番号４０〜４２に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｈ鎖；
（ｉｖ）配列番号４６〜４８に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｈ鎖；
（ｖ）配列番号５２〜５４に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｈ鎖；および
（ｖｉ）配列番号５８〜６０に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｈ鎖
から成る群より選択される可変Ｈ鎖を含むモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記可変Ｈ鎖が、配列番号２、配列番号６、列番号１０、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
（ｉ）配列番号３１〜３３に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｌ鎖；
（ｉｉ）配列番号３７〜３９に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｌ鎖；
（ｉｉｉ）配列番号４３〜４５に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｌ鎖；
（ｉｖ）配列番号４９〜５１に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｌ鎖；および
（ｖ）配列番号６１〜６３に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｌ鎖
から成る群より選択される可変Ｌ鎖をさらに含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記可変Ｌ鎖が、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１９、および配列番号２７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
（ｉ）配列番号３１〜３３に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲ含む可変Ｌ鎖；
（ｉｉ）配列番号３７〜３９に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｌ鎖；
（ｉｉｉ）配列番号４３〜４５に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｌ鎖；
（ｉｖ）配列番号４９〜５１に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｌ鎖；および
（ｖ）配列番号６１〜６３に記載されたアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む可変Ｌ鎖
から成る群より選択される可変Ｌ鎖をさらに含む請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記可変Ｌ鎖が、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１９および配列番号２７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖである請求項６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２またはＦｖである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が、１×１０−５Ｍ未満のＫＤでトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５のヘマグルチニンに結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が、１×１０−６Ｍ未満のＫＤでヘマグルチニンに結合する請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が、マウスとは異なる種に由来する非ＣＤＲ領域を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記非ＣＤＲ領域が、ヒト抗体に由来する請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
前記ヒト非ＣＤＲ領域が、マウスの抗体由来の１つまたは複数のアミノ酸置換を有する請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５のヘマグルチニンに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
（ｉ）ハイブリドーマ細胞系８Ｈ５（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０７）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系３Ｃ８（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０５）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系１０Ｆ７（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０８）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｉｖ）ハイブリドーマ細胞系４Ｄ１（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０６）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｖ）ハイブリドーマ細胞系３Ｇ４（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０４）によって産生されるモノクローナル抗体；および
（ｖｉ）ハイブリドーマ細胞系２Ｆ２（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００４２４）によって産生されるモノクローナル抗体
から成る群より選択されるモノクローナル抗体であるモノクローナル抗体。
【請求項１５】
（ｉ）ハイブリドーマ細胞系８Ｈ５（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０７）；
（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系３Ｃ８（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０５）；
（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系１０Ｆ７（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０８）；
（ｉｖ）ハイブリドーマ細胞系４Ｄ１（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０６）；
（ｖ）ハイブリドーマ細胞系３Ｇ４（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０４）；および
（ｖｉ）ハイブリドーマ細胞系２Ｆ２（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００４２４）
から成る群より選択されるハイブリドーマ細胞系。
【請求項１６】
トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５のヘマグルチニンに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
（ｉ）ハイブリドーマ細胞系８Ｈ５（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０７）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系３Ｃ８（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０５）によって産生さるモノクローナル抗体；
（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系１０Ｆ７（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０８）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｉｖ）ハイブリドーマ細胞系４Ｄ１（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０６）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｖ）ハイブリドーマ細胞系３Ｇ４（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０４）によって産生されるモノクローナル抗体；および
（ｖｉ）ハイブリドーマ細胞系２Ｆ２によって産生されるモノクローナル抗体（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００４２４）
から成る群より選択されるモノクローナル抗体のヘマグルチニン結合活性の少なくとも５０％をブロックすることができるモノクローナル抗体。
【請求項１７】
ヘマグルチニン結合活性の少なくとも７０％をブロックすることができる請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
ヘマグルチニン結合活性の少なくとも９０％をブロックできる請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
（ｉ）配列番号２８〜３０；
（ｉｉ）配列番号３４〜３６；
（ｉｉｉ）配列番号４０〜４２；
（ｉｖ）配列番号４６〜４８；
（ｖ）配列番号５２〜５４；および
（ｖｉ）配列番号５８〜６０
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む抗体Ｈ鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項２０】
前記Ｈ鎖可変領域が、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１７、配列番号２１および配列番号２５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１９に記載の単離核酸分子。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１６、配列番号２０および配列番号２４から成る群より選択される核酸配列を含む請求項２０に記載の単離核酸分子。
【請求項２２】
請求項１９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
（ｉ）配列番号３１〜３３；
（ｉｉ）配列番号３７〜３９；
（ｉｉｉ）配列番号４３〜４５；
（ｉｖ）配列番号４９〜５１；および
（ｖ）配列番号６１〜６３
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む抗体Ｌ鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項２５】
前記Ｈ鎖可変領域が、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１９および配列番号２７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項２４に記載の単離核酸分子。
【請求項２６】
配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１８および配列番号２６から成る群より選択される核酸配列を含む請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
サンプル中のトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５を検出する方法であって、
ａ）請求項１に記載のモノクローナル抗体とサンプルを接触させる工程と；
ｂ）前記ウイルスと前記モノクローナル抗体との反応を検出する工程と
を含む方法。
【請求項３０】
前記モノクローナル抗体が固相に結合している請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記固相が、マイクロタイタープレート、磁気粒子、ラテックス粒子、およびニトロセルロースメンブレンから成る群より選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記モノクローナル抗体が、前記サンプルと前記モノクローナル抗体との結合効率を増加させる配向で前記固相に結合している請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記モノクローナル抗体が、その定常領域を介して前記固相に結合している請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記反応が、酵素カラーアッセイによって検出される請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記反応が、蛍光アッセイによって検出される請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記反応が、化学ルミネセンスアッセイによって検出される請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記モノクローナル抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、またはＦｖである請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルが、トリまたはヒト対象由来の生体サンプルである請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１に記載のモノクローナル抗体の薬剤学的に許容し得る塩を含む医薬組成物。
【請求項４０】
（ｉ）ハイブリドーマ細胞系８Ｈ５（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０７）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系３Ｃ８（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０５）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系１０Ｆ７（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０８）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｉｖ）ハイブリドーマ細胞系４Ｄ１（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０６）によって産生されるモノクローナル抗体；
（ｖ）ハイブリドーマ細胞系３Ｇ４（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０４）によって産生されるモノクローナル抗体；および
（ｖｉ）ハイブリドーマ細胞系２Ｆ２（寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００４２４）によって産生されるモノクローナル抗体
から成る群より選択される１つまたは複数のモノクローナル抗体の薬剤学的に許容し得る塩を含む医薬組成物。
【請求項４１】
他の抗ウイルス剤の薬剤学的に許容し得る塩をさらに含む請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記モノクローナル抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、またはＦｖである請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
対象におけるトリインフルエンザウイルス感染と関連する疾患を予防または治療する方法であって、前記対象に請求項３９に記載の医薬組成物の薬学的有効量を投与することを含む方法。
【請求項４４】
固相基材に結合した請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む、サンプル中のトリインフルエンザウイルスを検出するために有用な組成物。
【請求項４５】
前記モノクローナル抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖである請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記モノクローナル抗体が、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１７、配列番号２１および配列番号２５から成る群より選択されるペプチド配列を含む可変Ｈ鎖を含む請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記モノクローナル抗体が、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１９および配列番号２７から成る群より選択されるペプチド配列を含む可変Ｌ鎖をさらに含む請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記固相基材が、マイクロタイタープレート、磁気粒子、ラテックス粒子、およびニトロセルロースメンブレンから成る群より選択される請求項４４に記載の組成物。
【請求項４９】
前記固相基材が、試験ストリップである請求項４４に記載の組成物。
【請求項５０】
前記試験ストリップが、少なくとも１つの試験領域および１つの対照領域を有する請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記抗体が、前記サンプルと前記モノクローナル抗体との結合効率を増加させる配向で前記固相基材に結合している請求項４４に記載の組成物。
【請求項５２】
複数の区画を有する固相基材を含む、サンプル中のトリインフルエンザウイルスを検出するために有用な装置であって、前記区画の１つまたは複数が請求項１に記載のモノクローナル抗体でコーティングされている装置。
【請求項５３】
前記区画の１つまたは複数が、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５のヘマグルチニンに特異的に結合する前記モノクローナル抗体とは異なる結合剤でコーティングされている請求項５２に記載の装置。
【請求項５４】
前記結合剤が、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ１、Ｈ３、Ｈ７またはＨ９に特異的に結合する抗体である請求項５３に記載の装置。
【請求項５５】
トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５のヘマグルチニンに対する前記モノクローナル抗体の結合を検出できる自動化検出装置をさらに含む請求項５２に記載の装置。
【請求項５６】
固相基材に結合した請求項１に記載のモノクローナル抗体および検出可能に標識した二次モノクローナル抗体を含む、サンプル中のトリインフルエンザウイルスを検出するためのキット。
【請求項５７】
前記二次モノクローナル抗体が、トリインフルエンザウイルスを特異的に結合できる請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記二次モノクローナル抗体が、トリインフルエンザウイルスヘマグルチニンを特異的に結合できる請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
対照標準物質をさらに含む請求項５６に記載のキット。
【請求項６０】
配列番号６４〜６８、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４および９６から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項６１】
配列番号７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５および９７から成る群より選択される核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項６２】
前記ペプチドが、８Ｈ５ｍＡｂに特異的に結合する請求項６０または６１に記載のペプチド。
【請求項６３】
配列番号７０〜７３から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項６４】
前記ペプチドが、３Ｃ８ｍＡｂに特異的に結合する請求項６３に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年１月２６日付け出願の中国特許出願第２００６１０００２３１２．１号の恩典を主張し、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本出願は、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５ヘマグルチニン（ＨＡ）に結合するモノクローナル抗体およびそれらのフラグメント、それらのペプチド配列、そのようなモノクローナル抗体を産生する細胞系、ならびに診断および治療目的で抗体およびそれらのフラグメントを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
１９９６年に中国の広東省のガチョウ飼育場で、Ｈ５トリインフルエンザが最初に発生（Xu, X. et al., 1999, Virology）して以後、インフルエンザの大流行が、香港のトリ飼育場で（１９９７年４月）および市場で（１９９７年１１月）Ｈ５ウイルスから派生した別のウイルスにより引き起こされた。トリからヒトへのトリインフルエンザウイルスの直接的な伝播は、ヒトの歴史の中で最初にこのように記録された伝播であった。１８人がトリインフルエンザウイルスに感染していると最終的に診断され、そのうち６人が死亡した。２００３年以降、Ｈ５トリインフルエンザの継続的な大流行が、東アジアおよび東南アジアの国々まで押し寄せている。世界保健機関（ＷＨＯ）およびインフルエンザ専門家は、亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスが次のヒトインフルエンザ大流行を引き起こす最も可能性の高い流行ウイルス株であると予測した。２００４年前半に、中国の１０を超える省で高病原性Ｈ５トリインフルエンザが連続して発生し、ニワトリ、アヒル、アオサギ、トラおよびネコを含む動物が、香港、タイ、オランダおよび他の国々でＨ５トリインフルエンザウイルスに感染していることが報告された。さらに悪いことは、タイとマレーシアでのヒトからヒトへの感染の疑いがある出来事であった。２００５年にＨ５トリインフルエンザウイルスの感染により死んだトリの症例が、ルーマニア、ロシアおよびトルコを含むヨーロッパ諸国で引き続いて報告され、高病原性Ｈ５トリインフルエンザのさらなる拡散と伝播のコントロールをより困難にしているのは、ウイルスを有する渡り鳥であると専門家らは考えている。渡り鳥によって伝播されるトリインフルエンザウイルスの亜型Ｈ５は、ユーラシアとアフリカ−アジア陸橋を通って衛生状態が悪いアフリカ諸国にさらに伝播する可能性があり、トリインフルエンザウイルスの亜型Ｈ５が、その他のヒトインフルエンザウイルスと完全に組み換わるための機会と時間を提供する可能性があると専門家らは予測した。そのとき、新しい致命的なヒトインフルエンザウイルスが出現する可能性があり、それにより引き起こされるヒトの生命の大きな損失を推定することは困難である。ＷＨＯの統計によれば、２００６年１月１９日までにＨ５Ｎ１型ウイルスの感染により引き起こされた世界の死亡者数は８０人にまで至り、全世界の公衆衛生の安全性に大きな課題をもたらした。
【０００４】
最新の研究（Li, K.S. et al., 2004, Nature）は、中国南部の水鳥（アヒル）がトリインフルエンザウイルスの亜型Ｈ５の主要なキャリアおよび媒介生物であり、その大流行は季節的で生物多様性（多くの遺伝子型）の進化を伴っていたことを示している。しかし分子疫学に関する研究では、感染したアヒルの約３０％は症状を示さず、感染したニワトリの１０％までが広く行き渡った無症候性のキャリアであったことを示している。これらの感染した動物は、絶えずヒトに感染する可能性があり、非常にヒトの健康をおびやかすであろう。東アジア、東南アジア、およびヨーロッパにおける高病原性Ｈ５トリインフルエンザウイルスの伝播のコントロールは、ヒトに対する早期診断、早期隔離、早期管理および早期治療によってのみ確保することができることにすべて専門家は同意している。
【０００５】
従来のウイルス単離および血清診断法によりトリインフルエンザウイルスを診断するには４〜５日かかり、大部分のヒトおよび動物疾病コントロール実験室システムは、グレード３のバイオセーフティ実験室を欠いている。したがって、東南アジアの国と地域におけるＨ５トリインフルエンザの大流行の診断は明らかに遅れてしまった。多数のニワトリが死亡または殺処分された後にも、最終的な診断は報告されないことが多かった。この事態がウイルスの大流行をコントロールすることを困難にした。さらに一部のトリ（特にアヒルなどの水鳥）の間での無症候性のキャリアは大きな問題を提起し、現在の隔離システムでは有効な試験施設が存在していない。これが多くの国と地域で繰り返しウイルスが発生する結果となった。
【０００６】
Ｈ５トリインフルエンザウイルス（その中でもＧｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６が代表的な株であった）は、高病原性ウイルスのグループに属し、すべての一般的な家禽に対し致死性である。しかしＨＡの抗原性は遺伝工学的方法により完全には得ることができていない。多くの世界的に著名な研究室が、ウイルスを標的するモノクローナル抗体の調製を試みたが失敗した。現在、ウイルス抗原性解析には、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／１３７０／８３（Ｈ５Ｎ２）およびＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／８１２５／８３（Ｈ５Ｎ２）によって調製されたモノクローナル抗体を採用しなければならないが、このいずれもが診断試薬のための特異性および反応性の要件を満たしていない。
【０００７】
したがって、便利なリアルタイム診断法が緊急に必要とされている。これは最初の異種間感染世代の患者の隔離と治療を可能にし、ウイルスがヒトに適応する前に、ヒトからヒトへの感染予防および伝染鎖の中断をもたらす。最終的には広く蔓延したるヒトインフルエンザが引き起こすウイルスの脅威を根本的に取り除くことができる。
【０００８】
中国で、トリインフルエンザウイルスの抗亜型Ｈ５を検出することに関する研究が報告された。揚州大学、畜産獣医学部（Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ  ａｎｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｙａｎｇｚｈｏｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のQinらは、（Qin, Aijian et al., Journal of Chinese Prevention Veterinary Medicine, 2003, No. 3）亜型Ｈ５および亜型Ｈ９のトリインフルエンザウイルスに対するＨＡ特異的モノクローナル抗体を調製し、これらのモノクローナル抗体を用いて、対応するトリインフルエンザウイルスが間接免疫蛍光アッセイにより、２４時間以内に迅速に検出され得ることが確認された。トリインフルエンザウイルスの高病原性亜型Ｈ５に対する検出時間を４時間まで短縮し得ることが２００５年１２月１０日にさらに臨床的に確認され、この試験は出入国検査検疫北京事務所（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｆｏｒ  ｅｎｔｒｙ−ｅｘｉｔ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｒａｎｔｉｎｅｔ）により迅速蛍光ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施された。高い特異性を有するマイクロ中和実験（ｍｉｃｒｏ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ）またはＥＬＩＳＡが、亜型Ｈ５のウイルス株に対する抗体を検出するために必要とされたが、（Guo Yuanji, "Human Avian Influenza Research Present Situation," Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology, 2004, No.3）、ＥＬＩＳＡによる亜型Ｈ５の検出に関する研究は報告されなかったとGuo Yuanjiは述べていた。
【０００９】
ＥＬＩＳＡによるＨ５Ｎ１抗体の検出が中国外で報告された。Roweらは、間接ＥＬＩＳＡによるＨ５Ｎ１抗体を検出を対象とする抗原としての組換え型のＨＡタンパク質の使用を報告し、ＥＬＩＳＡの感受性は８０％で特異性は６２％であった（Rowe, T. et al.，J. Clin. Microbiol., April 1999, 37 (4)：937-43）。しかし、この研究は、亜型Ｈ５Ｎ１のＨＡ遺伝子の特異的モノクローナル抗体に直接に向けられていなかった。Zhouら（Zhou, E.M. et al.，Avian Dis., 1998, 42 (4)：757-61）およびShaferら（Shafer, A.L., et al., Avian Dis., 1998, 42 (1)：28-34）は、競合ＥＬＩＳＡにより抗コアタンパク質に対する抗体を検出した。しかし、対象は、Ａ型トリインフルエンザのすべての亜型Ｈ１〜Ｈ１６のＮＰタンパク質に対するすべての抗体であり、亜型は確認され得なかった。Luは、モノクローナル抗体に基づくＤｏｔ−ＥＬＩＳＡによるトリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）を検出する方法を報告した。この方法は、他のトリウイルスとの交差反応を伴わないで直接にＡＩＶ抗原を検出した（Lu, H., Avian Dis., 2003, 47 (2)：361-9）。Salaらは、亜型Ｈ７の特異的表面糖タンパク質のモノクローナル抗体に基づくＥＬＩＳＡを確立したにもかかわらず、Ｈ５と異なる亜型およびモノクローナル抗体が、ＨＡ遺伝子に特異的であるよりはむしろ表面糖タンパク質に特異的であった（Sala G, Cordioli P, Moreno-Martinet al.，Avian Dis. 2003, 47 (3 Suppl): 1057-9）。
【発明の開示】
【００１０】
残念なことに、トリインフルエンザウイルスの免疫学的診断で使用された大部分のモノクローナル抗体は、直接にコアタンパク質（ＮＰタンパク質）に向けられており、したがってＡ型亜型間を区別することができない。Ａ型インフルエンザウイルスは、実際に全部で１６の亜型を有する亜型Ｈ１〜Ｈ１６を含み、この中の大部分の亜型は病原性を有していないかまたは低い病原性のみを有し、亜型Ｈ５のみが高病原性を有する最も有害なトリインフルエンザウイルスである。したがって利用可能な技術は、臨床的検出の要求を満たすには到底及ばない。
【００１１】
本発明の目的は、トリインフルエンザウイルスに対する利用可能な免疫的検出技術の欠点を克服することである。本発明で採用されたモノクローナル抗体は、直接に亜型Ｈ５のＨＡタンパク質に向けられており、トリインフルエンザウイルスの高病原性亜型Ｈ５の特異的検出を可能にする。
【００１２】
発明の概要
本発明は、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５のヘマグルチニンに特異的に結合するモノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体のヘマグルチニン結合活性の少なくとも５０％をブロックすることができるモノクローナル抗体を提供する。また本発明は、ハイブリドーマ細胞系、単離核酸分子、およびこれに関連する短いペプチド、ならびに医薬組成物、検出装置、およびモノクローナル抗体を含むキットを提供する。また本発明は、本明細書で提供されるモノクローナル抗体を用いて、トリインフルエンザウイルス、特にトリインフルエンザウイルスの亜型Ｈ５を検出し、診断し、予防し、治療する方法を提供する。
【００１３】
図の簡単な説明
図１は、ゴールドマーク法（ｇｏｌｄ  ｍａｒｋ  ｍｅｔｈｏｄ）によるトリインフルエンザウイルスの亜型Ｈ５に関するＨＡ抗原検出キットの検出結果を示し、「ａ」は、２つの赤線が出現する場合の陽性を示し；「ｂ」は、ただ１つだけで精度管理線が出現する場合の陰性を示し；「ｃ」は、赤線が出現しない場合の無効の試験結果を示す図である。
【００１４】
図２は、ゴールドマーク法によるトリインフルエンザウイルスの亜型Ｈ５に関する抗ＨＡ抗体検出キットの検出結果を示し、「ａ」は、ただ１つだけで精度管理線が出現する場合の陽性を示し；「ｂ」は、２つの赤線が出現する場合の陰性を示し；「ｃ」は、赤線が出現しない場合の無効の試験結果を示す図である。
【００１５】
図３は、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５に関するＨＡ抗原Ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡ検出キットの検出結果を示し、「＋」は、色が楕円形領域に出現する場合の陽性を示し；「−」は、色が楕円形領域に出現しない場合の陰性を示す図である。
【００１６】
図４は、キメラ抗体に関する６つの発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ８Ｈ５、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ８Ｈ５、ｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ１０Ｆ７、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ１０Ｆ７、ｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ４Ｄ１、およびｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ４Ｄ１の概略図である。
【００１７】
図５は、ウイルス株Ｃｋ／ＨＫ／Ｙｕ２２／０２を用いた、３つのタイプのキメラ抗体のＨＡ凝集阻害試験の結果を示す図である。列１、２および３：ＰＢＳ対照；列４および５：１０Ｆ７ｃＡｂ；列６：１０Ｆ７  ｍＡｂ；列７および８：４Ｄ１ｃＡｂ；列９：４Ｄ１  ｍＡｂ；列１０および１１：８Ｈ５ｃＡｂ；列１２：８Ｈ５ｍＡｂ。
【００１８】
図６は、Ｈ５ヘマグルチニンを発現する細胞を用いたキメラ抗体の免疫蛍光アッセイの結果を示す図である。Ａ．ｃＡｂ  ４Ｄ１（ＤＡＰＩ）；Ｂ．ｃＡｂ  ４Ｄ１（ＦＩＴＣ）；Ｃ．ｃＡｂ  １０Ｆ７（ＤＡＰＩ）；Ｄ．ｃＡｂ  １０Ｆ７（ＦＩＴＣ）；Ｅ．抗ＨＢＶｃＡｂ（ＤＡＰＩ）；Ｆ．抗ＨＢＶｃＡｂ（ＦＩＴＣ）。
【００１９】
図７は、バクテリオファージペプチドファゴトープ（ｐｈａｇｏｔｏｐｅ）に関するＥＬＩＳＡ試験のＯＤ（４５０／６２０）値のヒストグラムである。
【００２０】
図８は、ｐＴＯ−Ｔ７およびｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２３のプラスミド地図の概略図である。
【００２１】
図９は、ｐＴＯ−Ｔ７およびｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２５のプラスミド地図の概略図である。
【００２２】
図１０は、精製融合タンパク質（または組換え型タンパク質）２３９−１２３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す図である。レーン１：タンパク質分子量マーカー；レーン２：２３９−１２３を発現するイー・コリの全細菌溶菌液；レーン３：全細菌溶菌液の遠心分離で得た上清；レーン４：緩衝液Ｉ中の２３９−１２３；レーン５：２Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２３；レーン６：４Ｍの尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２３；レーン７：８Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２３。
【００２３】
図１１は、精製融合タンパク質２３９−１２５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す図である。レーン１：タンパク質分子体重マーカー；レーン２：２３９−１２５を発現するイー・コリの全細菌溶菌液；レーン３：全細菌溶菌液の遠心分離で得た上清；レーン４：緩衝液Ｉ中の２３９−１２５；レーン５：２Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２５；レーン６：４Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２５；レーン７：８Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２５。
【００２４】
図１２は、水平軸に示したような種々の抗体系統に結合する融合タンパク質２３９−１２３のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値で示された）のヒストグラムを用いた融合タンパク質２３９−１２３の特異的親和性を示す図である。
【００２５】
図１３は、融合タンパク質２３９−１２５の特異的親和性を示す図である：これは、水平軸に示したような種々の抗体系統に結合する融合タンパク質２３９−１２５のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値で示される）のヒストグラムである。
【００２６】
図１４は、ｍＡｂの系列希釈における８Ｈ５ｍＡｂに結合する融合タンパク質２３９−１２３（三角形点線）または８Ｃ１１  ｍＡｂ（正方形点線）のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値で示される）を示す図である。
【００２７】
図１５は、プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔおよびｐＣ１４９−ｍｕｔ−１２３を示す概略図である。
【００２８】
図１６は、プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔおよびｐＣ１４９−ｍｕｔ−１２５を示す概略図である。
【００２９】
図１７は、小規模に発現させた「組換え型」タンパク質の全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す図である。レーン１：Ｄ１２３；レーン２：Ｔ１２３；レーン３：Ｆ１２３；レーン４：Ｑ１２３；レーン５：Ｄ１２５；レーン６：Ｔ１２５；レーン７：Ｆ１２５；レーン８：Ｑ１２５。
【００３０】
図１８は、精製した組換え型のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す図である。レーン１：Ｄ１２３；レーン２：Ｔ１２３；レーン３：Ｆ１２３；レーン４：Ｑ１２３；レーン５：Ｄ１２５；レーン６：Ｔ１２５；レーン７：Ｆ１２５；レーン８：Ｑ１２５。
【００３１】
図１９は、ＨＢＶｃＡｇフラグメントおよび抗体結合性ペプチドの組換え型のタンパク質からアセンブルしたウイルス様粒子を示す電子顕微鏡画像を示す図である。
【００３２】
図２０は、融合タンパク質ＨＢｃ−１２３／１２５と８Ｈ５ｍＡｂ間の結合親和性および反応性のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値として示された）のヒストグラムを示す図である。
【００３３】
図２１は、種々のｍＡｂと融合タンパク質ＨＢｃ−Ｑ１２３またはＨＢｃ−Ｄ１２５間の結合親和性および反応性のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値として示された）のヒストグラムを示す図である。この結果は、融合タンパク質ＨＢｃ−Ｑ１２３およびＨＢｃ−Ｄ１２５は、８Ｈ５ｍＡｂと特異的に結合することを示した。
【００３４】
図２２は、０週〜４週まで融合タンパク質ＨＢｃ−１２３で免疫されたマウスの免疫マウス血清抗体タイターの増加（上昇曲線）を示す図である。抗体タイターは、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【００３５】
図２３は、０週〜４週まで融合タンパク質ＨＢｃ−１２５で免疫されたマウスの免疫マウス血清抗体タイターの増加（上昇曲線）を示す図である。抗体タイターは、ＥＬＩＳＡによって検出された。
【００３６】
図２４は、免疫のマウス血清とＳＦ２１細胞で発現されたＨＡタンパク質との間の反応の免疫蛍光画像を示す図である。
【００３７】
図２５は、組換え型のタンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８、およびＨＢｃ−１２９によりアセンブルしたウイルス様粒子を示す電子顕微鏡画像を示す図である。
【００３８】
図２６は、融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９間の種々のｍＡｂに対する結合親和性のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値として示された）のヒストグラムを示す図である。この結果は、融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９は特異的に８Ｈ５ｍＡｂと結合したことを示した。
【００３９】
図２７は、１２ａａ１２ＶＬＰペプチドの融合タンパク質からアセンブルしたウイルス様粒子とＨ５Ｎ１ウイルス間の酵素標識８Ｈ５ｍＡｂに対する競合結合の結果を示す図である。垂直軸は、色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値として示された）である。水平軸は、種々のウイルス様粒子およびこの試験で使用されたＰＢＳ対照である。
【００４０】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で用いる用語「ヘマグルチニン」とは、トリインフルエンザウイルスのエンベロープ糖タンパク質を意味する。ヘマグルチニンは、宿主細胞へのインフルエンザウイルスの吸着および侵入を媒介する。トリインフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質は、それぞれ１６種のウイルス亜型Ｈ１からＨ１６に関連するＨＡ  １からＨＡ  １６の１６種の異なる血清学的亜型を示す。
【００４１】
本明細書で用いる用語「抗体」とは、特異的な抗原と結合する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的または二重特異性抗体を含むすべての免疫グロブリンを意味する。完全な抗体は、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖を含む。各Ｈ鎖は、可変領域および第１、第２、および第３の定常領域から成り、各Ｌ鎖は、可変領域および定常領域から成る。抗体は、ジスルフィド結合を介して互いに結合した２本のＨ鎖の第２のおよび第３の定常領域から成るＹの基部を有する「Ｙ」形状を有する。Ｙの各腕は、１本のＬ鎖の可変領域および定常領域と結合した１本のＨ鎖の可変領域および第１の定常領域から成る。Ｌ鎖およびＨ鎖の可変領域が、抗原結合に関与する。両鎖の可変領域は、一般に相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽（Ｌ）鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重（Ｈ）鎖ＣＤＲ）（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), vols. 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md.により定義されるように）と呼ばれる３つの超可変ループを含む。３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高度に保存されており、超可変ループを支える足場を形成するフレームワーク（ＦＲ）として知られている隣接する領域に挿入されている。Ｈ鎖およびＬ鎖の定常領域は抗原結合には関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。抗体は、そのＨ鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づくクラスに割り当てられる。抗体の主要なクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２などのサブクラスに分けられたいくつかのクラスを有する。
【００４２】
完全な免疫グロブリンに加えて、本明細書で用いる用語「抗体」は、さらにその免疫グロブリンフラグメント（すなわち、免疫グロブリン分子の少なくとも１つの免疫学的に活性な部分）、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体分子、１つまたは複数のＣＤＲを含む免疫グロブリン分子の任意のフラグメントから形成された多重特異的抗体を意味する。さらに本明細書で用いる抗体は、１つまたは複数の異なるヒト免疫グロブリンからフレームワークに移植された特定のヒト免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲを含み得る。
【００４３】
抗体に関して「Ｆａｂ」とは、ジスルフィド結合によって１本のＨ鎖の可変領域および第１の定常領域に結合された１本のＬ鎖（可変および定常領域の両方）から成る抗体のその部分を意味する。
【００４４】
「Ｆａｂ’」とは、ヒンジ領域の部分を含むＦａｂフラグメントを意味する。
【００４５】
「Ｆ（ａｂ’）２」とは、Ｆａｂ’の二量体を意味する。
【００４６】
抗体に関して「Ｆｃ」とは、ジスルフィド結合を介して第２Ｈ鎖の第２および第３の定常領域に結合した第１Ｈ鎖の第２および第３の定常領域から成る抗体のその部分を意味する。抗体のＦｃ部分は、種々のエフェクター機能に関与するが、抗原結合には機能しない。
【００４７】
抗体に関して「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位を持つ抗体の最小フラグメントを意味する。Ｆｖフラグメントは、１本のＨ鎖の可変領域に結合した１本のＬ鎖の可変領域から成る。
【００４８】
「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、直接にまたはペプチドリンカー配列を介して互いに連結されたＬ鎖可変領域とＨ鎖可変領域から成る改変抗体を意味する（Ｈｏｕｓｔｏｎ  １９８８）。
【００４９】
「単鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域に結合されたｓｃＦｖから成る改変抗体を意味する。
【００５０】
本明細書で用いる用語「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原分子上の原子および／またはアミノ酸のグループを意味する。
【００５１】
本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」または「ｍＡｂ」とは、実質的に均質な抗体、すなわち少量存在する場合がある起こりうる天然の突然変異を除き、集団を構成する個々の抗体が同一である集団から得られた抗体またはそのフラグメントを意味する。モノクローナル抗体は、極めて特異的で抗原上の１つのエピトープ対して指向されている。モノクローナル抗体は、典型的には抗原上の異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体と対照的である。モノクローナル抗体は伝統的にはハイブリドーマに由来するにもかかわらず、本発明のモノクローナル抗体は、それらの産生方法よって限定されない。例えば本発明のモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。
【００５２】
本明細書で用いる用語「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖および／またはＬ鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同であり、Ｈ鎖および／またはＬ鎖の残部が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同である抗体、ならびにそのようなフラグメントが所望の抗原結合性活性を示すかぎりはそのような抗体フラグメントを意味する（Cabillyらに発行された米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)）。
【００５３】
本明細書で用いる用語「ヒト化抗体」とは、レシピエントの一部もしくはすべてのＣＤＲに由来する残基が、ヒト以外の種（ドナー抗体）、例えば所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットもしくはウサギのＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である抗体またはそのフラグメントを意味する。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基が、対応するヒト以外の残基によって置換される。さらにまたヒト化抗体は、レシピエント抗体またはインポートされたＣＤＲもしくは骨格配列のいずれにおいても見い出されない残基を含むことができる。これらの変更は、抗体機能をさらに改良して最適化するために施される。一般にヒト化抗体は、ヒト以外の免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応するすべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域およびすべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリン配列のこれら領域である少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含む。またヒト化抗体は、最適には免疫グロブリンＦｃ領域の少なくとも一部を含み、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986)；Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992)；およびClark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000)を参照のこと。
【００５４】
本明細書で用いる「単離された」とは、「人工的」にその天然状態から変えられることを意味する。「単離された」組成物または物質が自然に生じる場合、そのオリジナル環境から変化させられるかもしくは取り出されるか、またはその両方であった。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペチドは「単離されて」ないが、実質的に純粋な状態で存在するように、その天然状態の共存物質から十分に単離されている場合、同じポリヌクレオチドまたはポリペチドは「単離されて」いる。本明細書で用いる「単離された」とは、他の化合物もしくは物質との人工もしくは合成混合物または活性を妨げない不純物の存在を除外しない。
【００５５】
本明細書で用いる用語「ベクター」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、そのタンパク質の発現をもたらすように作動可能に挿入され得る核酸ビヒクルを意味する。宿主細胞内でベクターが運び込む遺伝的エレメントの発現をもたらすように宿主細胞をトランスフォーム、トランスデュース、またはトランスフェクトするために、ベクターが使用され得る。ベクターの例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えばラムダファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスが含まれる。ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーには、レトロウィルス（レンチウイルスを含む）、アデノウィルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウィルス（例えば単純ヘルペスウィルス）、ポックスウィルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウィルス（例えばＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能なエレメントおよびリポーター遺伝子を含む発現を制御するための種々のエレメントを含むことができる。さらにベクターは、複製開始点を含むことができる。またベクターは、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングを含むがこれに限定されない、細胞へのベクターの侵入を助ける物質を含むことができる。
【００５６】
本明細書で用いる用語「宿主細胞」とは、ベクターが導入された細胞を意味する。宿主細胞は、例えばイー・コリもしくは枯草菌細胞などの細菌細胞、酵母菌細胞もしくはアスペルギルス細胞などの真菌細胞、ショウジョウバエＳ２もしくはスポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞、または繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、コス細胞、ＮＳＯ細胞、ヒーラ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、もしくはヒト細胞などの動物細胞を含む種々の細胞型から選択され得る。
【００５７】
本明細書で用いる用語「中和抗体」とは、中和抗体が結合する標的ウイルス抗原の毒性を除去するかもしくは著しく減少することができる抗体またはそのフラグメントを意味する。
【００５８】
核酸またはポリペチド配列に関する用語「パーセント（％）配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性を達成するために、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しないで、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の配列における、核酸またはアミノ酸残基それぞれと同一である候補配列における核酸またはアミノ酸残基のパーセンテージとして定義されることを本明細書では意味する。核酸またはアミノ酸のパーセント配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般公開されているコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長に対して最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００５９】
本明細書で用いる用語「特異的に結合する」とは、２つの分子間の、例えば抗体とその抗体に対する抗原間の無作為ではない結合反応を意味する。本明細書で用いられる特異的に第１の抗原と結合する抗体は、第２の抗原に対する検出可能な結合親和性が無いか、または低レベルの結合性親和性を示す場合がある。ある実施形態では、特異的に抗原を結合する抗体は、≦１０−５Ｍ（例えば、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍなど）の結合親和性（ＫＤ）で抗原と結合する。本明細書で用いられる会合速度に対する解離速度の比率（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を意味するＫＤは、当該技術分野において知られている方法を用いて決定され得る。
【００６０】
抗体
本発明は、特異的に亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスに結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明の一態様は、特異的に亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合できるモノクローナル抗体およびこのようなモノクローナル抗体の種々の抗原結合性フラグメントに関する。
【００６１】
本発明は、マウスハイブリドーマ細胞系８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２により産生される抗Ｈ５モノクローナル抗体を提供する。これらのモノクローナル抗体は、細胞を産生するハイブリドーマ細胞系統にちなんで名付けられる。したがってマウスハイブリドーマ細胞系統８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２によって産生される抗Ｈ５モノクローナル抗体はそれぞれ、モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２とそれぞれ名付けられる。モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２は、亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに特異的に結合する。マウスハイブリドーマ細胞系統８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２は、ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０７（ハイブリドーマ細胞系統８Ｈ５）、ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０５（ハイブリドーマ細胞系統３Ｃ８）、ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０８（ハイブリドーマ細胞系統１０Ｆ７）、ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０６（ハイブリドーマ細胞系統４Ｄ１）、ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６０４（ハイブリドーマ細胞系統３Ｇ４）およびＣＣＴＣＣ−Ｃ２００４２４（ハイブリドーマ細胞系統２Ｆ２）の寄託番号で２００６年１月１７日に、Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ、Ｗｕｈａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗｕｈａｎ、Ｃｈｉｎａ）に寄託した。
【００６２】
また本発明は、モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４または２Ｆ２の、亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンへの結合をブロックするモノクローナル抗体を提供する。このようなブロッキングモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４、または２Ｆ２によって認識されるヘマグルチニン上の同じエピトープに結合する可能性がある。あるいは、これらのブロッキングモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４または２Ｆ２によって認識されるエピトープと立体的に重なり合うエピトープに結合する可能性がある。これらのブロッキングモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４または２Ｆ２の、亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンへの結合を少なくとも約５０％減少することができる。あるいはこれらは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９９％結合を減少することができる。
【００６３】
既知のモノクローナル抗体のＨ５ヘマグルチニンへの結合を減少する試験モノクローナル抗体の能力は、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のような通常の競合アッセイで測定され得る。例えばそのようなアッセイは、抗原でマイクロタイタープレートを予備コーティングし、選択した濃度の標識した既知の抗体と混合した未標識試験抗体の階段希釈と共に予備コーティングしたプレートをインキュベートし、インキュベーション混合物を洗浄し、試験抗体の種々の希釈におけるプレートに結合した既知の抗体の量を検出して測定することにより実施され得る。試験抗体が抗原への結合を既知の抗体と競合するのが強ければ強いほど、抗原への既知の抗体の結合が一層減少するであろう。通常、抗原を９６ウェルプレート上に予備コーティングし、標識した抗体の結合をブロックする未標識抗体の能力を放射性標識または酵素標識を用いて測定する。
【００６４】
モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得る。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物を、免疫剤および所望であればアジュバントの１回または複数回の注射によって免疫する。典型的には免疫剤および／またはアジュバントを、複数回の皮下または腹腔内注射により宿主動物に注射する。免疫する宿主動物で免疫原性であることがわかっている血清アルブミンまたは大豆トリプシンインヒビターなどのタンパク質に免疫剤を結合するのが有用である場合がある。用いられ得るアジュバントの例には、フロインド完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭが含まれる。免疫の後、宿主動物は免疫に用いた抗原と特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を作り出す。あるいは、リンパ球はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫され得る。所望のリンパ球を採取し、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996）。
【００６５】
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは１つまたは複数の未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する物質を含む適切な培地に接種して増殖させる。例えば親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、この物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。
【００６６】
好ましいミエローマ細胞は、効率良く融合し、選択された抗体産生細胞により安定な高レベルの抗体産生を保持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性である細胞である。これらの細胞の中で、好ましいミエローマ細胞系は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ．から入手可能なＭＯＰ−２１およびＭＣ−１１マウス腫瘍ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．ＵＳＡ．から入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来する細胞系などのマウスのミエローマ系である。またヒトミエローマおよびマウスヒトヘテロミエローマ細胞系が、ヒトモノクローナル抗体産生のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）。
【００６７】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合アッセイにより測定する。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えばMunson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)のスキャッチャード解析によって測定し得る。
【００６８】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体産生をするハイブリドーマ細胞が同定された後に、細胞を限界希釈法によってサブクローニングし、標準的方法により増殖し得る（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996）。この目的に適切な培養培地には、例えばＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらにハイブリドーマ細胞は、動物の腹水癌としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖し得る。
【００６９】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、通常の免疫グロブリン精製法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、腹水液、または血清から適切に分離される。
【００７０】
また本発明のモノクローナル抗体は、通常の遺伝子工学的手法よって作製し得る。モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡ分子は、例えばモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いるＰＣＲを介してハイブリドーマ細胞から単離し得る。次いで、ＤＮＡ分子を、発現ベクターに挿入する。この発現ベクターを宿主細胞に、例えばイー・コリ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産生しないものであればミエローマ細胞にトランスフェクションする。この宿主細胞を、抗体の発現に適切な条件下で培養する。
【００７１】
本発明の抗体は、高い特異性および親和性を有するＨ５ヘマグルチニンに結合することができる。この抗体は、ヘマグルチニンの他の亜型と低い交差反応性を有し、好ましくはヘマグルチニンの他の亜型とまったく交差反応性を有していない。一態様において、本発明は、１×１０−５Ｍ未満のＫＤ値でＨ５ヘマグルチニンに結合する抗体を提供する。ＫＤ値は、１×１０−６Ｍ未満であるのが好ましい。ＫＤ値は、１×１０−７Ｍ未満であるのがより好ましい。ＫＤ値は、１×１０−８Ｍ未満であるのが最も好ましい。
【００７２】
本発明の抗体は、２つのＨ鎖および２つのＬ鎖から成る通常の「Ｙ」形状構造を含み得る。さらにまたこの抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメントもしくはＦｖフラグメント、またはヘマグルチニンへの結合親和性保持する通常の「Ｙ」形状構造の別の部分的断片であり得る。このフラグメントのヘマグルチニンへの結合親和性は、通常の「Ｙ」形状の抗体の結合親和性より高いかまたは低くなり得る。
【００７３】
抗体フラグメントは、完全な抗体のタンパク質分解により作製され得る。（例えば、Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods, 24:107-117, (1992)およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照のこと）。さらにまたこれらのフラグメントは、組換え型の宿主細胞によって直接に産生され得る（Hudson, Curr. Opin. Immunol., 11: 548-557 (1999)；Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)に概説されている）。例えば、Ｆａｂ’フラグメントを、イー・コリから直接回収することができ、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Carter et al., Bio/Technology, 10:163 167 (1992)）。別の実施形態においては、Ｆ（ａｂ’）２分子のアセンブリを促進するためにロイシンジッパーＧＣＮ４を用いてＦ（ａｂ’）２が形成される。別の方法に従えば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え型の宿主細胞培養から直接に単離することができる。抗体フラグメントを産生のための他の技術は、当業者には明らかである。
【００７４】
抗体核酸配列
本発明は、特異的にＨ５ヘマグルチニンに結合する抗体またはそのフラグメントをコードする単離核酸分子を提供する。抗体をコードする核酸分子は、ハイブリドーマ細胞から単離することができる。この分子の核酸配列は、当業者に知られている通常の技術を用いて決定することができる。また本発明の核酸分子は、通常の遺伝子工学的技術ならびに化学合成を使用して調製され得る。一態様において、本発明は、抗Ｈ５（ＨＡ）抗体のＨ鎖の可変領域をコードする単離された核酸分子またはこの核酸分子の一部を提供する。他の態様では、本発明は、抗Ｈ５（ＨＡ）抗体のＬ鎖の可変領域をコードする単離核酸分子またはこの核酸分子の一部を提供する。他の態様では、本発明は、抗体Ｈ鎖またはＬ鎖可変領域のＣＤＲをコードする単離核酸分子を提供する。
【００７５】
一態様において、本発明は、モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２のＨ鎖ならびにＬ鎖の可変領域をコードする単離核酸分子を提供する。モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２のＨ鎖可変領域（ＶＨ、Ｖｈ）をコードする核酸配列は、それぞれ配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１６、配列番号２０および配列番号２４に記載されている。モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１および２Ｆ２のＬ鎖可変領域（ＶＫ、Ｖｋ）をコードする核酸配列は、それぞれ配列番号３、配列番号：７、配列番号１１、配列番号１８、配列番号２６に記載されている。また本発明は、モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域をコードする核酸分子の縮重したアナログ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｏｇ）を含む。
【００７６】
他の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４または配列番号２６の核酸配列と配列同一性を共有する単離した核酸変異体を提供する。一実施形態では、この核酸変異体は、少なくとも７０％の配列同一性を、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４または配列番号２６の配列と共有する。
【００７７】
また本発明は、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５に依然として特異的に結合できる抗体フラグメントをコードする単離核酸分子を提供する。
【００７８】
本発明は、配列番号２８〜３０、配列番号３４〜３６、配列番号４０〜４２、配列番号４６〜４８、配列番号５２〜５４、または配列番号５８〜６０に記載されたアミノ酸の配列を含む抗体のＨ鎖可変領域をコードする単離核酸分子をさらに提供する。本発明は、配列番号３１〜３３、配列番号３７〜３９、配列番号４３〜４５、配列番号４９〜５１、または配列番号６１〜６３に記載されたアミノ酸の配列を含む抗体のＬ鎖可変領域をコードする単離核酸分子を提供する。
【００７９】
本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクターを発現する組換え型を提供する。また本発明は、核酸分子でトランスフォームした宿主細胞を提供する。さらにまた本発明は、抗体を産生するために核酸分子が発現される条件下で宿主細胞を培養し、宿主細胞から抗体を単離することを含む本発明の抗体を産生する方法を提供する。
【００８０】
抗体ポリペチド配列
モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２のＨ鎖ならびにＬ鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それらそれぞれの核酸配列から推定された。モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２５に記載されている。モノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１および２Ｆ２のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１９、および配列番号２７に記載されている。一態様において、本発明は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１７、配列番号２１、または配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域を含む抗Ｈ５抗体を提供する。他の態様では、本発明は、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１９、または配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域を含む抗Ｈ５抗体を提供する。
【００８１】
他の態様では、本発明は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１７、配列番号２１、または配列番号２５に記載されたアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性を、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する可変領域を含む抗体のＨ鎖を提供する。
【００８２】
他の態様では、本発明は、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１９、または配列番号２７に記載されたアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性を、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する可変領域を含む抗体Ｌ鎖を提供する。
【００８３】
またモノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４および２Ｆ２のＨ鎖ならびにＬ鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列が以下の通りに決定された。
【００８４】
モノクローナル抗体８Ｈ５のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２８〜３０に記載されている。モノクローナル抗体８Ｈ５のＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３１〜３３に記載されている。
【００８５】
モノクローナル抗体３Ｃ８のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４〜３６に記載されている。モノクローナル抗体３Ｃ８のＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３７〜３９に記載されている。
【００８６】
モノクローナル抗体１０Ｆ７のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０〜４２に記載されている。モノクローナル抗体１０Ｆ７のＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３〜４５に記載されている。
【００８７】
モノクローナル抗体４Ｄ１のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６〜４８に記載されている。モノクローナル抗体４Ｄ１のＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４９〜５１に記載されている。
【００８８】
モノクローナル抗体３Ｇ４のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５２〜５４に記載されている。
【００８９】
モノクローナル抗体２Ｆ２のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５８〜６０に記載されている。モノクローナル抗体２Ｆ２のＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６１〜６３に記載されている。
【００９０】
他の態様では、本発明は以下のＣＤＲ、すなわち、（ｉ）配列番号２８〜３０から選択される１つまたは複数のＣＤＲ；（ｉｉ）配列番号３４〜３６から選択される１つまたは複数のＣＤＲ；（ｉｉｉ）配列番４０〜４２から選択される１つまたは複数のＣＤＲ；（ｉｖ）配列番号４６〜４８から選択される１つまたは複数のＣＤＲ；配列番号５２〜５４から選択される１つまたは複数のＣＤＲ；または（ｖｉ）配列番号５８〜６０から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む抗Ｈ５モノクローナル抗体のＨ鎖またはそのフラグメントを提供する。一実施形態では、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＨ鎖またはそのフラグメントは、それぞれ配列番号２８〜３０に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＨ鎖またはそのフラグメントは、それぞれ配列番号３４〜３６に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＨ鎖またはそのフラグメントは、配列番号４０〜４２に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＨ鎖またはそのフラグメントは、配列番号４６〜４８に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＨ鎖またはそのフラグメントは、配列番号５２〜５４に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＨ鎖またはそのフラグメントは、配列番号５８〜６０に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【００９１】
他の態様では、本発明の抗Ｈ５モノクローナル抗体のＨ鎖またはそのフラグメントを含むＣＤＲは、配列番号２８〜３０、３４〜３６、４０〜４２、４６〜４８、５２〜５４または５８〜６０に記載されたアミノ酸配列からの１つまたは複数のアミノ酸置換、付加および／または欠失を含むことができる。アミノ酸置換、付加および／または欠失は、３つ以下のアミノ酸の位置で生じるのが好ましい。アミノ酸置換、付加および／または欠失は、２つ以下のアミノ酸の位置で生じるのがより好ましい。アミノ酸置換、付加および／または欠失は、１つ以下のアミノ酸の位置で生じるのが最も好ましい。
【００９２】
他の態様では、本発明は以下のＣＤＲ、すなわち、（ｉ）配列番号３１〜３３から選択される１つまたは複数のＣＤＲ；（ｉｉ）配列番号３７〜３９から選択される１つまたは複数のＣＤＲ；（ｉｉｉ）配列番号４３〜４５から選択される１つまたは複数のＣＤＲ；（ｉｖ）配列番号４９〜５１から選択される１つまたは複数のＣＤＲ；または（ｖ）配列番号６１〜６３から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む抗Ｈ５モノクローナル抗体のＬ鎖またはそのフラグメントを提供する。一実施形態では、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＬ鎖またはそのフラグメントは、それぞれ配列番号３１〜３３に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＬ鎖またはそのフラグメントは、それぞれ配列番号３７〜３９に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＬ鎖またはそのフラグメントは、配列番号４３〜４５に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＬ鎖またはそのフラグメントは、配列番号４９〜５１に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。別の実施形態においては、抗Ｈ５モノクローナル抗体のＬ鎖またはそのフラグメントは、配列番号６１〜６３に記載されたアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【００９３】
他の態様では、本発明の抗Ｈ５モノクローナル抗体のＬ鎖またはそのフラグメントに含まれるＣＤＲは、配列番号３１〜３３、３７〜３９、４３〜４５、４９〜５１または６１〜６３に記載されたアミノ酸配列からの１つまたは複数のアミノ酸置換、付加および／または欠失を含むことができる。アミノ酸置換、付加および／または欠失は、３つ以下のアミノ酸の位置で生じるのが好ましい。アミノ酸置換、付加および／または欠失は、２つ以下のアミノ酸の位置で生じるのがより好ましい。アミノ酸置換、付加および／または欠失は、１つ以下のアミノ酸の位置で生じるのが最も好ましい。
【００９４】
上記の抗体または上記のＣＤＲの可変領域においてアミノ酸置換、付加および／または欠失により作製された変異体は、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５に特異的に結合する能力を保持する。また本発明は、そのような変異体の抗原結合性フラグメントを含む。
【００９５】
本発明のモノクローナル抗体変異体は、通常の遺伝子工学的手法より作製され得る。核酸突然変異を、当業者に知られている方法を用いてＤＮＡ分子に導入され得る。あるいは、Ｈ鎖およびＬ鎖変異体をコードする核酸分子は、化学合成により作製され得る。
【００９６】
キメラ抗体、ヒト化抗体および融合タンパク質
他の態様では、また本発明はヒトモノクローナル抗体の定常領域と組み合わせた、マウスモノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４もしくは２Ｆ２またはこれらの変異体のＨ鎖および／またはＬ鎖可変領域を全体的または部分的に含むキメラ抗体を提供する。さらに本発明は、ヒト抗体骨格に移植されたマウスのモノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１、３Ｇ４もしくは２Ｆ２またはこれらの変異体の１つまたは複数ＣＤＲを含むヒト化抗体を含む。
【００９７】
他の態様では、本発明は、別の１つの分子または複数の分子と結合した本発明のモノクローナル抗体を、全体的または部分的に含む融合タンパク質を提供する。
【００９８】
本明細書において開示されているキメラ抗体、ヒト化抗体および融合タンパク質は、通常の遺伝子工学的手法により産生され得る。例えばキメラもしくはヒト化抗体および融合タンパク質を産生するために、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、相同なマウス配列の代わりにヒトＨ鎖およびＬ鎖の定常ドメインをコードする配列を置換することにより（Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851 (1984)）、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペチドのコード配列のすべてもしくは部分を共有結合で結合することにより修飾され得る。
【００９９】
中和抗体
他の態様では、本発明は亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのウイルス活性を中和することができる抗Ｈ５抗体を提供する。一実施形態では、このような中和抗体は、亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのウイルス活性の少なくとも６０％を、または少なくとも７０％を、好ましくは少なくとも７５％を、より好ましくは少なくとも８０％を、より好ましくは少なくとも８５％を、より好ましくは少なくとも９０％を、さらにより好ましくは少なくとも９５％を、最も好ましくは少なくとも９９％を中和することでできる。
【０１００】
亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのウイルス活性を中和する抗体の能力は、当業者に知られている通常の方法を用いてアッセイされる。実施例１は、本発明の特定の抗Ｈ５モノクローナル抗体の中和活性を測定するために発明者らによって使用された中和アッセイを記載する。
【０１０１】
短いペプチド
他の態様では、本発明は本明細書で提供されるｍＡｂｓの抗原部位結合をシミュレートする短いペプチドを提供する。
【０１０２】
７個のアミノ酸を有する９種の短いペプチドが、８Ｈ５ｍＡｂまたは３Ｃ８ｍＡｂに結合するこれらの能力に基づいて同定された。配列番号６４〜６８に記載された配列を有するこれらのペプチドのうちの５種は、８Ｈ５ｍＡｂに対する結合を示し、配列番号７０〜７３に記載された配列を有するペプチドのうちの４種は、３Ｃ８ｍＡｂに対する結合を示す（表１４）。
【０１０３】
７−ａａペプチド８Ｈ５Ａ（配列番号６４）および８Ｈ５Ｅ（配列番号６８）は、特異的な反応を示す。ペプチド８Ｈ５Ａとモノクローナル抗体８Ｈ５間の反応は特に良好であるが、８Ｈ５Ａと他の３種のモノクローナル抗体間の特異的な反応は弱かった。８Ｈ５Ｅとモノクローナル抗体８Ｈ５間の特異的な反応は比較的劣っていた。
【０１０４】
さらにまた、１２個のアミノ酸を有する１２種の短いペプチド（表１６、アミノ酸配列および塩基配列に対する配列番号７４〜９７）のそれぞれは、８Ｈ５ｍＡｂに対するそれらの結合特異性に基づき同定された。
【０１０５】
ペプチドセクション番号１２３または１２５の１２ａａペプチドが、融合タンパク質２３９−１２３および２３９−１２５を作製するために使用され、これらはそれぞれ８Ｃ１１および８Ｈ５に対する特異性を示す。またＨＢＶｃＡｇを有する１２ａａペプチド１２３および１２５の融合タンパク質は、８Ｈ５に対する結合特異性を示したが、他のｍＡｂｓに対する結合特異性は示さなかった。融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９は８Ｈ５とのみ反応し、その他のｍＡｂとは反応しなかった。融合タンパク質ＨＢｃ−１２３、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２５、ＨＢｃ−１２８またはＨＢｃ−１２９からアセンブルしたウイルス様粒子は、それぞれ８Ｈ５ｍＡｂに対する抗原部位結合の一部をシミュレートすることが示された。
【０１０６】
検出法
本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体を用いて、サンプル中のトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５の抗原および／または抗体の存在を検出する方法を提供する。
【０１０７】
一態様において、本発明は、サンプル中のトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５の存在を検出する方法であって、（ｉ）本発明のモノクローナル抗体またはこれらのフラグメントと前記サンプルとを接触させて、前記ウイルスと前記抗体またはフラグメントとの複合体を形成する工程と、（ｉｉ）前記サンプル中の前記ウイルスの存在を測定するために前記複合体を検出する工程とを含む方法を提供する。
【０１０８】
他の態様では、本発明は、（ｉ）固体支持体に第１抗体を付着する工程と；（ｉｉ）前記支持体にトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５を有する疑いのあるサンプルを添加する工程と；（ｉｉｉ）標識剤に結合した第２抗体を前記支持体に添加する工程と；（ｉｖ）トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５の存在を測定するために標識剤の存在を検出する工程とを含む、サンプル中のトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５の存在を検出する方法を提供する。
【０１０９】
他の態様では、本発明は、（ｉ）固体支持体に抗体を付着する工程と；（ｉｉ）前記支持体に、標識Ｈ５ヘマグルチニンと前混合したトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５を有する疑いのあるサンプルを添加する工程と；（ｉｉｉ）標識Ｈ５ヘマグルチニンの存在を検出する工程とを含む、サンプル中のトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５の存在を検出する方法を提供する。
【０１１０】
検出法には、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、エンザイムイムノアッセイ、化学ルミネセンスイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、免疫クロマトグラフィー、競合イムノアッセイ等を使用することができる。競合法またはサンドイッチ法により標的抗原または抗体を検出する検出法を用いることができる。
【０１１１】
競合法は、本発明のモノクローナル抗体に対する、サンプル中の抗原と既知量の標識抗原との定量的な競合的結合に基づいている。競合法に基づく免疫学的アッセイを実施するために、未知量の標的抗原を含むサンプルを、本発明のモノクローナル抗体が既知の方法により物理的にまたは化学的に結合して反応を進行させることができる固体支持体に添加する。同時に、標識剤で前標識した所定の量の標的抗原を添加して反応を進行させる。インキュベーション後に、固体支持体を洗浄し、固体支持体に結合した標識剤の活性を測定する。
【０１１２】
サンドイッチ法では、サンプル中の標的抗原は、本発明の固定化されたモノクローナル抗体と標識剤で標識した本発明のモノクローナル抗体との間に挟まれ、次いで、酵素などの標識剤用の基材が添加され、基材の色変化が検出され、これにより抗原の存在を検出する。サンドイッチ法に基づく免疫学的アッセイを実施するために、例えば未知量の標的抗原を含むサンプルを、本発明のモノクローナル抗体が既知の方法により物理的にまたは化学的に結合して反応を進行させることができる固体支持体に添加する。その後、標識剤で標識した本発明のモノクローナル抗体を添加して反応を進行させる。インキュベーション後、固体支持体を洗浄して固体支持体に結合した標識剤の活性を測定する。標識剤は、１２５Ｉなどの放射性同位元素、酵素、酵素基質、イソルミノールおよびアクリジンエステルなどの発光性物質、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光物質、ビオチン、ならびに着色したラテックス粒子および金コロイドなどの着色した物質であってもよい。標識化酵素は、ペルオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼであってもよい。反応のための適切な基質は、ＡＢＴＳ、ルミノール−Ｈ２Ｏ２、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ２Ｏ２（ペルオキシダーゼに対する）、パラニトロフェニルリン酸、メチルウンベリフェリルリン酸、３（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（アルカリホスファターゼに対する）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース、およびメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトース（β−ガラクトシダーゼに対する）から選択され得る。別の標識には、量子ドット標識、発色団標識、酵素標識、親和性リガンド標識、電磁スピン標識、重元素標識、ナノ粒子光散乱標識または他のナノ粒子で標識されたプローブ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＴＲＩＴＣ、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−７、テキサスレッド、ファルレッド（Ｐｈａｒ−Ｒｅｄ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、エピトープ標識、例えばＦＬＡＧまたはＨＡエピトープ、および酵素標識、例えばアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、Ｉ２−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼおよびジゴキシゲニンもしくはジニトロフェニルなどのハプテン結合体、または複合体を形成できる結合対のメンバー、例えばストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチンまたは例えば、ウサギＩｇＧおよび抗ウサギＩｇＧを含む抗原／抗体複合体；フルオロフォア、例えばウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、蛍光ランタニド複合体、例え��ユウロピウムおよびテルビウムを含む複合体複合体、Ｃｙ３、Ｃｙ５、分子ビーコンおよびこれらの蛍光誘導体、発光性物質、例えばルミノール；光散乱またはプラスモン共鳴物質、例えば金もしくは銀粒子または量子ドット；または１４Ｃ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、Ｔｃ９９ｍ、３５Ｓまたは３Ｈを含む放射性物質；または球状シェル、および当業者には周知のその他のシグナル生成標識で標識したプローブが含まれる。例えば、検出可能な分子には、限定されるものではないが、フルオロフォアならびに例えば、Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz (Editor), Plenum Pub Corp, 2nd edition (July 1999)およびthe 6th Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P. Hoaglandに記載されているように当分野で知られている他のものが含まれる。ある実施形態では、標識は、米国特許第６，２０７，３９２号で記載された量子ドット（すなわち、Ｑｄｏｔｓ）などの半導体ナノクリスタルを含む。Ｑｄｏｔｓは、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている。本発明の実施において有用な半導体ナノクリスタルには、ＩＩ〜ＶＩ族半導体、例えばＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、およびＨｇＴｅとこれらの混合組成物のナノクリスタルならびにＩＩＩ〜Ｖ族半導体、例えばＧａＡｓ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、およびＩｎＡｓとこれらの混合組成物のナノクリスタルが含まれる。またＩＶ族半導体、例えばゲルマニウムあるいはシリコンの使用、または有機半導体の使用が、特定の条件下においては実行可能であり得る。また半導体ナノクリスタルは、上記のＩＩＩ〜Ｖ族化合物、ＩＩ〜ＶＩ族化合物、ＩＶ族エレメント、およびこれらの組合せから成る群から選択される２またはそれ以上の半導体を含む合金を含み得る。
【０１１３】
ある実施形態では、蛍光エネルギー受容体が、検出プローブに対する標識として結合される。一実施形態では、蛍光エネルギー受容体は、一重項酸素と反応して蛍光化合物を形成する化合物またはそこで蛍光化合物に変換される補助化合物と反応できる化合物の結果として形成され得る。そのような補助化合物は、本発明の装置に含まれる緩衝液に含むことができる。他の実施形態では、蛍光エネルギー受容体を、また化学発光物質を含む化合物の一部に組み込み得る。例えば蛍光エネルギー受容体は、希土類金属の金属キレート、例えばユウロピウム、サマリウム、テルリウムなどを含み得る。これらの物質は、ルミネセンスのその鮮明なバンドのため特に魅力的である。さらにまたユウロピウム（ＩＩＩ）などのランタニド標識は、有効で長期にわたるシグナル放出を提供し、かつ光退色に耐性であり、従って必要ならば長期間処理され／反応したサンプルを含む試験装置を取り置くことができる。長い有効期間を有する蛍光ユウロピウム（ＩＩＩ）キレートナノ粒子は、種々のヘテロジーニアスおよびホモジニアス免疫アッセイにおいて標識として適切であることが示された。Huhtinen et al, Clin. Chem., October 2004, 50 (10): 1935-6を参照のこと。時間分解能を有する蛍光検出と組み合わせて、これらの内因的に標識したナノ粒子が使用される場合、アッセイ性能は改善することができる。ヘテロジーニアスアッセイで、低濃度でのアッセイにおけるダイナミックレンジは拡張することができる。さらにまたアッセイの動力学的特徴は、従来法で標識した検出抗体の代わりに、検出抗体でコーティングした高特異的活性ナノ粒子標識の使用により改善することができる。ホモジニアスアッセイにおいて、ユウロピウム（ＩＩＩ）ナノ粒子は蛍光共鳴エネルギー転移において簡便で迅速な高処理スクリーニングを可能にする有効なドナーであることが示された。ある実施形態では、本明細書に開示されている標識（例えば、蛍光標識）は、生体分子と結合したナノ粒子標識として含まれる。換言すれば、ナノ粒子は検出または捕捉プローブと共に使用することができる。例えば、サンプル中の特定の分析物を検出するためのモノクローナル抗体またはストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したユウロピウム（ＩＩＩ）標識ナノ粒子を、本発明の実施に使用することができる（例えば、ナノ粒子に基づくイムノアッセイ）。ナノ粒子は、特異的結合剤を分析物および検出（すなわち標識）部分または捕捉部分のいずれかに付着する基材として役立つ。また標識の例は、米国特許第４，６９５，５５４号、第４，８６３，８７５号、第４，３７３，９３２号および第４，３６６，２４１号において見ることができる。コロイド金属および色素粒子は、米国特許第４，３１３，７３４号および第４，３７３，９３２号に開示されている。非金属コロイドの調製および使用は、米国特許第４，９５４，４５２号に開示されている。標識として使用するための有機ポリマーラテックス粒子は、米国特許第４，２５２，４５９号に開示されている。
【０１１４】
標識剤は、マレイミド法（J. Biochem. (1976), 79, 233）、活性化ビオチン法（J. Am. Chem. Soc. (1978), 100, 3585）、疎水性結合法、活性化エステル法またはイソシアネート法（"Enzyme immunoassay techniques", published in 1987 by Igaku Shoin）により抗原または抗体に結合され得る。
【０１１５】
上記の標識剤が放射性同位元素である場合、測定はウェルカウンターまたは液体シンチレーションカウンターを用いて実施される。標識剤が酵素である場合、基質が添加され、酵素活性が比色法または蛍光比色法により測定される。標識剤が蛍光物質、発光性物質または着色物質である場合、測定は当分野で知られている方法によってそれぞれ行うことができる。
【０１１６】
本発明における、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５を検出するために使用されたサンプルには、限定されるものではないが、動物または患者からの排泄物、口および鼻腔からの分泌物、完全なウイルスまたはニワトリ胚培養での溶菌ウイルス液体、その他が含まれる。
【０１１７】
検出装置およびキット
本発明は、さらに、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５による感染の診断用のキット、特にサンプル中のトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５の抗原または抗体検出用のキットに関する。発明の診断キットは、本発明の少なくとも１つのモノクローナル抗体種を含む。本発明の診断キットに使用される本発明のモノクローナル抗体は、特に制限されるものではないが、Ｈ５ヘマグルチニン抗原を認識するいずれかのモノクローナル抗体であり得て、本発明のモノクローナル抗体の任意の抗原結合性フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどであり得る。
【０１１８】
一態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のモノクローナル抗体またはこれらの活性フラグメントもしくは変異体を含むトリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５検出用の２種類のキットに関する。本発明のキットは、抗原抗体反応の検出に適切な検出試薬を含むのが好ましい。
【０１１９】
他の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明のモノクローナル抗体またはこれらの活性フラグメントもしくは変異体を含む抗Ｈ５トリインフルエンザウイルス検出用キットに関する。本発明で述べたキットは、抗原抗体反応の検出に適切な検出試薬を含むのが好ましい。
【０１２０】
本発明の検出法で使用される固体基材または固相基材としては、これらに制限されるものではないが、マイクロプレート、磁気粒子、免疫クロマトグラフィー用濾紙、ポリスチレンなどのポリマー、ガラスビーズ、ガラスフィルターおよびその他の不溶性キャリアが含まれる。一実施形態では、固相基材は複数の区画または領域を含み、少なくとも１つの区画は、本発明の抗体でコーティングされている。好ましい実施形態では、少なくとも１つの区画（または第１区画）は、本発明の抗体でコーティングされており、少なくとも１つの残りの区画（または第２区画）は、Ｈ５以外のトリインフルエンザウイルス亜型（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６）、好ましくは亜型Ｈ１、Ｈ３、Ｈ７またはＨ９に特異的に結合する抗体でコーティングされている。
【０１２１】
本発明の診断キットは、さらに他の構成要素を含んでもよい。他の構成要素には、これらに限定されるものではないが、標識化用の酵素、それらの基質、放射性同位元素、発光性物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、およびプレートが含まれ、上で言及されたものは、このように使用することができる。
【０１２２】
本発明の診断キットにおいて、本発明のモノクローナル抗体は、前もって固体支持体上に固定化され得る。好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、抗原に対する抗体の結合効率を促進する配向で固体支持体上に固定化される。TaeWoon Chaら（Proteomics 5, 416-419 (2005)）は、固定化されたタンパク質分子の配向を制御することおよび固体支持体表面上で理想的な局所的化学的環境を設計することが、固定化されたタンパク質の反応活性および効率を維持し促進することに重要であることを示した。所望の配向で固体支持体に抗体を付着するさまざまな方法が報告されている。Shawn Wengら（Proteomics 2, 48-57 (2002)）は、タンパク質に結合した核酸を介して均一な様式で表面上にタンパク質を方向付ける方法を報告した。Soellner, M.ら（J. AM. CHEM. SOC., 125, 11790-11791 (2003)）は、１つの方法を開示したが、この方法にしたがって抗体および抗原を含むタンパク質が、アジドとホスフィノチオエステルが反応してアミドを形成するＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションを介して均一の様式で表面に固定化された。Hairong Zhangら（Anal. Chem., 78, 609-616 (2006)）は、抗体のすべての抗原結合部位が好ましい方向に向けられる基準となる粒子表面に対して、抗体のＦａｂ’フラグメントの遊離チオールの反応を介して金コーティングした磁気粒子上で抗体を方向付ける方法を開示した。Hairong Zhangら（Anal. Chem., 78, 609-616 (2006)）は、抗体のＦａｂ’フラグメントの遊離チオールの反応を介して金コーティングした磁気粒子上で抗体を方向付ける方法を開示したが、この方法にしたがって抗体のすべての抗原結合部位が好ましい方向に向けられた。Hai Xuら（J. Phys. Chem. B, 110, 1907-1914 (2006)）は、親水性シリコン酸化物／水表面に抗体を吸着する方法を報告した。Seung-yong Seongら（Proteomics, 3, 2176-2189 (2003)）は、このような方法で使用される表面およびタンパク質分子に対するタンパク質の指向性固定化の方法の概要を提供した。すべての参照文献は、その全体が本明細書に援用される。
【０１２３】
本発明の診断キットにおいて、本発明のモノクローナル抗体または抗原は、予め上述の標識剤で標識し得る。
【０１２４】
本発明はさらに、自動化した工程によってサンプル中のトリインフルエンザウイルスを検出できる自動化装置を提供する。
【０１２５】
免疫化学を用いて生体体液サンプル中の分析物の存在を検出する種々の装置が、当該技術分野で記載されている。装置は、いわゆる「サンドイッチ」アッセイ、例えば抗原などの標的分析物が、標識抗体と固体支持体上へ固定化された抗体の間に「挟まれている」アッセイを用いてもよい。アッセイは、結合した抗原−標識抗体複合体の存在および／または量を観察することによって読み取られる。また装置は、固体表面に結合した抗体が未知量の抗原分析物を含むサンプルおよび同じタイプの標識抗原と接触する競合イムノアッセイを組み込んでもよい。次いで、サンプル中の抗原分析物の量の間接的な評価基準を提供するために、固体表面上に結合した標識抗原の量を測定する。種々のアッセイは、例えば、試験基材（例えば、吸湿性または非吸湿性メンブレン）の指定されているかまたはアドレス指定可能な領域に、異なる抗体または抗原を組み込むことによる、多数の異なる分析物をアッセイするのに適した装置を利用する。以下に述べるこれらおよび他の方法は、抗体および抗原を検出することができるので、これらは一般に免疫化学的リガンド−受容体アッセイまたは単にイムノアッセイと呼ばれている。
【０１２６】
サンドイッチタイプまたは競合タイプにかかわらず固相イムノアッセイ装置は、血液または尿などの生体体液サンプル中の分析物の高感度の検出を提供する。固相イムノアッセイ装置は、１つのメンバーのリガンド−受容体対、通常は抗体、抗原、またはハプテンが結合する固体支持体を組み込んでいる。固体支持体の一般的な初期の形式は、ラジオイムノアッセイおよびエンザイムイムノアッセイの分野でよく知られているプレート、管、またはポリスチレンビーズであった。より最近では多くの多孔性物質、例えばナイロン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、グラスファイバー、およびその他の多孔性ポリマーが固体支持体として使われている。抗原、ハプテン、または抗体などの免疫化学的成分の固相キャリアとして多孔性物質を用いる多くの自蔵式のイムノアッセイキットが記載されている。これらのキットは、設計において通常ディップスティックタイプ、フロースルータイプまたは移動タイプである。イムノアッセイまたは特異的結合アッセイを実施するためのいずれかの従来のよく知られた装置が、インフルエンザを検出するために本発明において使用され得る。
【０１２７】
本発明の特定の態様では、これは種々のインフルエンザウイルス型または亜型により引き起こされる感染の診断用装置に含まれる。ある実施形態では、サンプルが１つまたは複数のインフルエンザウイルス型または亜型に感染した対象由来であるかどうかを測定するために、１つまたは複数のインフルエンザウイルスまたは抗インフルエンザウイルス抗体を含む可能性があるサンプルが装置に投与される。固体支持体を含む装置は、その上に配置した抗インフルエンザウイルス抗体またはインフルエンザウイルス抗原を含むことができ、したがってインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルスタンパク質または抗インフルエンザウイルス抗体が含まれる疑いのあるサンプルを検査する手段を提供する。種々の実施形態において、本発明の装置で使用される抗体には、限定されるものではないがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、またはこれらの保存的もしくは機能的変異体、キメラ抗体、再構築された抗体、ヒト化抗体、これらの生物活性フラグメント、または１つまたは複数のこのような抗体の任意の組合せが含まれ、いずれかのこのような機能的抗体またはこれらのフラグメントは、本明細書では抗体または複数の抗体と総称され得る。本発明の抗体は、インフルエンザウイルスの検出を可能にするするために、任意の装置に適合することができる。例えば、サンプル中のＨ５タンパク質または抗亜型Ｈ５抗体を標的にすることにより、Ｈ５トリインフルエンザウイルスを検出することができる。一実施形態では、Ｈ５はトリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）由来である。
【０１２８】
本明細書に開示されている抗体または抗原を結合するために、容易に適合することができる多くの装置が市販されている。装置は、マイクロプレート、磁気粒子、免疫クロマトグラフィー用濾紙、ポリマー例えばポリスチレン、ガラスビーズ、ガラスフィルターおよびそ他の不溶性キャリアを含むがこれに限定されない検出法で用いられる固体支持体を組み込むことができる。基材は一般に、ストリップ、シート、チップ、粒子、ビーズもしくはウェル、例えばマイクロタイタープレートのウェル、または適切な任意のその他の形状を含むがこれらに限定されない形状である。さらにまた結合パートナー（すなわち、抗原または抗体）が結合する基材は、様々な形状のいずれか、例えばマイクロタイターディッシュ、試験管、ディップスティック、微小遠心管、ビーズ、スピン可能なディスク（ｓｐｉｎｎａｂｌｅ  ｄｉｓｋ）などであり得る。適切な物質には、ガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレンなど）、タンパク質、紙、炭水化物、およびその他の固体支持体が含まれる。用い得るその他の物質には、セラミック、金属、メタロイド、半導性物質、セメントなどが含まれる。ある実施形態では、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）で使用されるマイクロタイタープレートは、９６ウェル、３８４ウェルプレートもしくは１５３６ウェル形式、またはその他の市販プレートなどのさらに多数のウェルを含むことができる。
【０１２９】
いくつかの典型的な装置は、例えば、米国特許第６，４４８，００１号、第４，９４３，５２２号、第６，４８５，９８２号、第６，６５６，７４４号、第６，８１１，９７１号、第５，０７３，４８４号、第５，７１６，７７８号、第５，７９８，２７３号、第６，５６５，８０８号、第５，０７８，９６８号、第５，４１５，９９４号、第６，２３５，５３９号、第６，２６７，７２２号、第６，２９７，０６０号、第７，０９８，０４０号、第６，３７５，８９６号、第７，０８３，９１２号、第５，２２５，３２２号、第６，７８０，５８２号、第５，７６３，２６２号、第６，３０６，６４２号、第７，１０９，０４２号、第５，９５２，１７３号、および第５，９１４，２４１号に開示されているようなディップスティック、側方流動、カートリッジ、多重化された、マイクロタイタープレート、マイクロ流体、プレートもしくはアレイまたはハイスループットプラットフォームを含む。典型的なマイクロ流体装置には、米国特許第５，７０７，７９９号およびＷＯ２００４／０２９２２１に記載のものが含まれる。
【０１３０】
ディップスティック
家庭用妊娠および排卵確認キットに代表されるようなディップスティックアッセイのさらに一般的な形態では、抗体などの免疫化学的成分が固相に結合している。アッセイ装置を、未知の抗原分析物を含む疑いのあるサンプル中へインキュベーションのために「浸」する。あるいは少量のサンプルを、サンプル受け取りゾーン上に置くことができる。次いで、標識抗体を添加し、所望の分析物の存在の指標として標識を検出する。ある場合には標識は酵素であり、したがって次いで、酵素標識抗体を同時にかかまたはインキュベーション後に添加する。次に装置を洗浄し、続いて酵素用の基質を含む第２溶液に挿入する。酵素標識は、もし存在するならば基質と相互作用して固相上へ沈着物として沈着するか、または基質溶液中で視認できる色変化を生じる着色産物の形成を引き起こす。Baxterら（ＥＰ−Ａ０１２５１１８）は、そのようなサンドイッチタイプディップスティックイムノアッセイを開示している。Kaliら（ＥＰ−Ａ０２８２１９２）は、競合タイプアッセイに使用するディップスティック装置を開示している。ディップスティック用の物質、形式および標識は周知であり、インフルエンザアッセイに適用することができる。典型的なディップスティック装置には、米国特許第４，２３５，６０１号、第５，５５９，０４１号、第５，７１２，１７２号、および第６，７９０，６１１号に記載のものが含まれる。ある実施形態では、本発明の抗体はディップスティック装置上へ配置することができる。例えば１つまたは複数の四角形のマトリックスに取り付けられた固相支持体ディップスティックを用いることにより、抗亜型Ｈ５  ＡＩＶ抗体がサンプル中に検出される。１つの四角形のマトリックスは、結合した非特異的な対照抗体を有し、１つの四角形のマトリックスは抗体または抗体の機能的フラグメントが結合したものを有する。これらの四角形のマトリックスは、タンパク質結合部位および／または抗原結合部位であり、通常ニトロセルロースで作られていが、当分野で知られている任意の適切な媒体、例えばある種のナイロンおよびポリビニリデンを使用することができる。ある実施形態では、多数のマトリックスが固体支持体に結合しており、各々のマトリックスは複数のインフルエンザウイルス亜型に対する抗原または抗体を含んでいる。
【０１３１】
フロースルー
フロースルータイプのイムノアッセイ装置は、ディップスティックアッセイに伴う過剰なインキュベーションおよび煩わしい洗浄工程の必要性を除去するように設計された。Valkirsら（米国特許第４，６３２，９０１号）は、液体サンプルが添加される多孔性メンブレンまたはフィルターに結合された（標的抗原分析物に特異的な）抗体を含む装置を開示している。液体はメンブレンを通って流れるので、標的分析物は抗体に結合する。サンプルの付加を、標識抗体の添加に引続き行い得る。標識抗体の視覚検出は、サンプル中の標的抗原分析物の存在の指標を提供する。Koromら（ＥＰＡ０２９９３５９）は、標識抗体が試薬デリバリーシステムとして機能するメンブレンに組み込まれているフロースルー装置の変形を開示している。このような装置は、サンプル中の成分に対するフィルターとして機能するレイヤから成り、アッセイで使用される試薬を含み得る。サンプルが１つのレイヤから別のレイヤへと流れるにつれて、サンプルは特異的結合試薬と接触して反応し、場合によっては分析物の存在の指標を提供するための標識化システムの成分と接触して反応する。
【０１３２】
免疫濾過装置
免疫濾過装置は市販されており（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、本発明の抗体を結合するために容易に適合することができる。酵素結合イムノフローアッセイ（ＥＬＩＦＡ）法では、９６ウェルサンプル適用プレートと減圧チャンバ間に挟まれたニトロセルロースメンブレンを使用する。反応物はサンプル適用プレートに添加され、減圧により反応物をメンブレンを通して引き入れる。カニューレが、非結合の産物をコレクションチャンバに移動する。検出のために、酵素基質を添加する前にマイクロプレートをコレクションチャンバに配置する。自動化マイクロプレート読取機で解析するために、減圧によりマイクロプレートウェル中に着色産物を移動できる。ＥＬＩＦＡは、ウェルからウェルへの一定流速を与える緊密なシールガスケットを有する正確にカットされたプレキシグラスから成っている。カニューレは、解析のためのマイクロプレートウェルに色産物を正確に移送する。基本的には本発明の捕捉抗体を、基材（例えば、マイクロタイタープレート、メンブレンまたはチップ）上にスポットする。インフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス抗原を含む疑いのある生体サンプルが適用され、捕捉抗体が結合できるようにインキュベートする。その後、検出抗体を添加する。ハイスループットの免疫濾過装置の例が、米国特許出願第２００３／０１０８９４９号に開示されている。このような装置は、フィルターとして機能するかかつ／またはアッセイで使用される試薬を含むレイヤを含んでもよい。サンプルが特異的な結合試薬と反応するにつれて、場合によっては、標識化システムの成分と反応するにつれて分析物の存在の指標を提供する。
【０１３３】
側方流動装置
側方流動タイプのアッセイにおいて、メンブレンをアッセイの実施に必要な一部またはすべての試薬を含浸させる。標識析物が検出される分析物検出ゾーンが提供される。例えばTomら、米国特許第４，３６６，２４１号、およびZuk、ＥＰ−Ａ０１４３５７４を参照のこと。多くの変形が側方流動アッセイ装置について知られている。装置は、特異的結合アッセイ用試薬の一部を含んでもよい（サンプルを、側方流動ストリップに適用前にいくつかの試薬と反応し得るか、もしくは追加の試薬をストリップに逐次的に適用し得る）か、またはストリップは、特異的結合アッセイ用のすべての必要な試薬を含んでもよい。側方流動装置は、最も多くの場合これらの中に着色標識に結合した試薬が組み込まれており、さらに物質を添加しなくてもそれによりアッセイ結果の可視検出が可能である。例えばBernstein、米国特許第４，７７０，８５３号、Mayら、ＷＯ８８／０８５３４、およびChingら、ＥＰ−Ａ０２９９４２８を参照のこと。装置は一般に、サンプル適用位置、試薬ゾーンおよび検出ゾーンを含むように作製される。装置は典型的には、サンプルが、サンプル適用ゾーンから試薬または反応ゾーンを通って検出ゾーン（複数可）にメンブレンを通って流れるようにする吸湿性の物質から作製される。ストリップへサンプル適用前に反応の一部が起こる可能性があるが、ある実施形態では反応ゾーン（複数可）はイムノアッセイ用の試薬を含んでいる。１つの特異的結合試薬、例えば抗体は、サンプル適用ゾーンまたは反応ゾーンでストリップに拡散して結合でき、そのためこれはサンプル中の抗原と結合して、ストリップに沿ってサンプルと共に流れることができる。抗原抗体複合体は、検出ゾーンにおいて直接に抗原もしくは抗体に対する別の特異的結合パートナーによって捕捉され得るか、または抗原抗体複合体は、アビジンもしくはストレプトアビジンおよびビオチンなどの別の特異的結合パートナーを用いて、間接的に捕捉され得る。同様に、標識は直接的にまたは間接的に抗原または抗体に結合し得る。典型的な側方流動装置には、米国特許第４，８１８，６７７号、第４，９４３，５２２号、第５，０９６，８３７号（ＲＥ  ３５，３０６）、第５，０９６，８３７号、第５，１１８，４２８号、第５，１１８，６３０号、第５，２２１，６１６号、第５，２２３，２２０号、第５，２２５，３２８号、第５，４１５，９９４号、第５，４３４，０５７号、第５，５２１，１０２号、第５，５３６，６４６号、第５，５４１，０６９号、第５，６８６，３１５号、第５，７６３，２６２号、第５，７６６，９６１号、第５，７７０，４６０号、第５，７７３，２３４号、第５，７８６，２２０号、第５，８０４，４５２号、第５，８１４，４５５号、第５９３９，３３１号、第６，３０６，６４２号に記載のものが含まれる。液体サンプル中の複数の分析物の識別可能な検出に用いるために修飾され得るその他の側方流動装置には、米国特許第４，７０３，０１７号、第６，１８７，５９８号、第６，３５２，８６２号、第６，４８５，９８２号、第６，５３４，３２０号および第６，７６７，７１４号が含まれる。
【０１３４】
また通常は、各々の分析物用の別々の検出ゾーンを確立することによって、単一の試験ストリップを用いてサンプル由来の複数の分析物をアッセイする。異なる分析物間の識別は、異なる標識を用いることによりまたは異なる検出ゾーンにおける同じ標識を測定することにより達成することができる。複数の分析物に対するアッセイは、いずれかの従来の装置を用いて達成することができる。
【０１３５】
イムノアッセイは、生物に対して病原性であるかまたは外来である抗原の存在に応答して抗体が産生される免疫系の機構を利用する。これらの抗体および抗原、すなわち免疫反応物は互いに結合することがで、これにより試験サンプル中のその特定の抗原の存在または濃度を測定するために使用し得る高度に特異的な反応機構を引き起こす。
【０１３６】
このような側方流動装置は、通常は所望により強固な物質により支持された多孔性メンブレンを含む。一般に、多孔性メンブレンは液体が通過することができるさまざまな物質のいずれかから作製され得る。例えば、多孔性メンブレンを形成するために用いた物質には、限定されるものではないが、合成的に修飾された天然、合成、もしくは天然に存在する物質、例えば多糖（例えば、紙などのセルロース物質およびセルロースアセテートおよびニトロセルロースなどのセルロース誘導体）；ポリエーテルスルホン；ポリエチレン；ナイロン；ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）；ポリエステル；ポリプロピレン；シリカ；ポリマー例えば塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマー、および塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーを有する無機物質、例えば非活性化アルミナ、珪藻土、ＭｇＳＯ４、または、一様に多孔性ポリマー基材に分散されたその他の無機の微細に分割された物質；布、天然に存在するもの（例えば、綿）および合成（例えば、ナイロンもしくはレーヨン）の両方；多孔性ゲル、例えばシリカゲル、アガロース、デキストラン、およびゼラチン；ポリマーフィルム、例えばポリアクリルアミド；その他が含まれ得る。１つの特定の実施形態では、多孔性メンブレンは、ニトロセルロースおよび／またはポリエーテルスルホン物質から形成される。用語「ニトロセルロース」とは、ニトロセルロース単独または硝酸およびその他の酸の混合エステル、例えば１つから７つの炭素原子を有する脂肪族カルボン酸であり得るセルロースの硝酸エステルを意味することを理解されたい。
【０１３７】
またこのような装置は、試験／検出または対照ゾーンの上流域または下流域に配置された吸収性パッドを有するストリップを含んでもよい。本技術分野でよく知られているように、吸収性パッドは、毛管作用の促進およびメンブレンを通しての液体の流れを助け得る。ある実施形態では、吸収性パッドは可動性イムノアッセイ試薬（例えば、抗体）を含み得る。また可動性のまたは固定化されたイムノアッセイ試薬は、検出／試験または対照ゾーンの上流の何処にもおよび検出システムの別の成分中に配置することができることは当然理解される。
【０１３８】
種々の実施形態で、サンプルパッドを形成するために使用され得るいくつかの適切な物質には、限定されるものではないが、ニトロセルロース、セルロース、多孔性ポリエチレンパッド、およびグラスファイバーフィルターペーパーが含まれる。所望であればサンプルパッドはまた、共有結合または非共有結合のいずれかでサンプルパッドに結合した１つまたは複数のアッセイ前処理試薬を含み得る。試験サンプルは、サンプルパッドからサンプリングパッドの１つの末端と連通して配置された結合パッドへ移動する。結合パッドは、液体が通過することができる物質から形成される。例えば、一実施形態では、結合パッドはグラスファイバーから形成される。他の結合パッドも本発明で使用され得ることを理解されたい。あるいはある実施形態では、結合体または他の免疫試薬が、試験ストリップへの適用前にサンプルと混合される成分中に含まれ得る。
【０１３９】
試験サンプル中の分析物の有無の検出を容易にするために、種々の検出プローブが結合パッドに適用され得る。結合パッド上に含まれている間、検出プローブがサンプリングパッドから結合パッド（または所望により液体中）の中に通過するとき、これらの検出プローブは分析物と結合可能な状態にある。分析物と結合後、検出プローブは後で分析物の有無を同定するのに役立ち得る。検出プローブは、アッセイの検出と検定の両方に使用され得る。しかし別の実施形態では、別の検定プローブが同時に検定と検出を容易にするために検出プローブと共に使用する結合パッドに適用でき、それによりしばしば従来のアッセイ検定システムで生じる不正確さを除去し得る。しかし検出プローブおよび／または検定プローブは、アッセイの任意の位置に一緒にまたは別々に適用でき、結合パッドに適用する必要はないことを理解されたい。さらにまた検出プローブおよび／または検定プローブは、同じかまたは異なる結合パッドに適用され得ることを理解されたい。あるいは検出プローブおよび／または検定プローブは、診断検査ユニット、例えば液体、フローチャネル、またはスワブ中などの自蔵式試験装置中の別の領域に配置され得る。
【０１４０】
場合によっては、検出プローブが分析物とさらに容易に結合できるように、何らかの方法で検出プローブを修飾することが所望されるかもしれない。このような場合、検出プローブはそれに付着して結合プローブを形成する、ある種の特異的な結合メンバーで修飾され得る。特異的な結合メンバーは、一般に特異的な結合対のメンバー、すなわち２つの異なる分子を意味し、この場合、分子の１つが化学的および／または物理的に第２の分子と結合する。例えば免疫反応特異的結合メンバーは、抗原、ハプテン、アプタマー、抗体（第１または第２）、およびこれらの複合体を含むことができ、組換えＤＮＡ法またはペプチド合成により形成されるこれらを含むことができる。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、これらの組換え型タンパク質または混合物（複数可）またはフラグメント（複数可）、ならびに抗体およびその他の特異的な結合メンバーの混合物であり得る。このような抗体の調製の詳細および特異的な結合メンバーとして用いるためのこれらの適性が本明細書に開示されている。その他の一般的な特異的結合対には、限定されるものではないが、ビオチンおよびアビジン（またはこれらの誘導体）、ビオチンおよびストレプトアビジン、炭水化物およびレクチン、相補的核酸配列（標的核酸配列を検出するためにＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイで使用されるプローブおよび捕捉核酸配列を含む）、組換え技術によって形成されるペプチド配列を含む相補的ペプチド配列、エフェクターおよび受容分子、ホルモンおよびホルモン結合タンパク質、酵素コファクターおよび酵素、酵素阻害剤および酵素などが含まれる。さらにまた、特異的結合対は、本来の特異的結合メンバーのアナログであるメンバーを含んでもよい。例えば、分析物の誘導体またはフラグメント、すなわち分析物アナログを、これが分析物と共通する少なくとも１つのエピトープを有する限りは使用することができる。
【０１４１】
例えば一実施形態では、試験サンプルを含む液体は結合パッドへ移動し、そこで分析物は特異的結合メンバーを用いて修飾された検出プローブと混合されて分析物複合体を形成する。結合パッドは多孔性メンブレンと流体で連絡しているので、複合体は結合パッドから多孔性メンブレン上に存在する検出ゾーンに移動することができる。あるいは複数の検出ゾーンを、異なる抗原に対して特異的な抗体を結合することにより用いることができる（例えば、異なるインフルエンザウイルスまたは異なるインフルエンザウイルス由来のウイルス抗原）。検出ゾーン（複数可）は、一般に分析物および／またはこれらの複合体と化学的または物理的な結合を形成することができる固定化された試薬を含むことができる（例えば、検出プローブと分析物の複合体）。ある実施形態では、試薬は本明細書に開示されている抗体などの生物学的試薬であり得る。その他の生物学的試薬が、当分野において良く知られており、限定されるものではないが、抗原、ハプテン、抗体、プロテインＡまたはＧ、アビジン、ストレプトアビジン、およびこれらの複合体が含まれ得る。ある場合には、これらの生物学的試薬は、検出プローブを有する分析物および／または分析物の複合体と結合できることが望ましい。
【０１４２】
これらの試薬は、検出プローブ／分析物複合体に対する固定された結合部位として機能する。場合によっては、抗体、抗原などの分析物は、２つの結合部位を有する。検出ゾーン（複数可）に到達後、これらの結合部位の１つが複合型プローブの特異的な結合メンバーによって占められる。しかし分析物の遊離の結合部位は、固定化された試薬と結合することができる。固定化された試薬に結合された後、複合型プローブは新たな三重のサンドイッチ複合体を形成する。
【０１４３】
使用者が試験サンプル中の特定の分析物の存在をより良好に測定できるように、検出または試験ゾーン（複数可）は、一般に任意の数の相異なる検出領域を提供できる。各領域は同じ試薬を含むことができるか、または複数の分析物を補足するための異なる試薬を含むことができる。例えば検出ゾーン（複数可）は、２つまたはそれ以上の相異なる検出領域を含むことができる（例えば、線、点、その他）。検出領域は、アッセイ中の試験サンプルの流れに対して実質的に垂直となる方向に線の形態で配置され得る。同様にある実施形態では、検出領域はアッセイ装置中の試験サンプルの流れと実質的に平行となる方向に線の形態で配置され得る。
【０１４４】
ある場合にはまたメンブレンは、使用者にアッセイが適切に実施しされているシグナルを与える対照ゾーン（図示せず）を定めることができる。例えば対照ゾーン（図示せず）は一般に、プローブまたはプローブ上に固定化された試薬と化学的および／または物理的に結合を形成することができる固定化された試薬を含むことができる。このような試薬のいくつかの例には、限定されるものではないが、抗原、ハプテン、抗体、プロテインＡまたはＧ、アビジン、ストレプトアビジン、二次抗体、およびこれらの複合体が含まれる。さらに対照ゾーン試薬用の種々の非生物物質を利用することも所望されるかもしれない。例えばある実施形態では、また対照ゾーン試薬は、上記のような未捕捉プローブと結合できる高分子電解質を含むことができる。対照ゾーンの試薬はプローブに対してのみ特異的であるので、分析物が存在するかどうかにかかわらずシグナルが生じる。対照ゾーンはメンブレンに沿って任意の位置に配置され得るが、検出ゾーンより上流に配置されるのが好ましい。
【０１４５】
種々の形式を、アッセイに使用する分析物の有無を試験するために使用し得る。例えば上記の実施形態では、「サンドイッチ」形式が用いられる。このようなサンドイッチタイプアッセイのその他の例は、Grubbらに発行された米国特許第４，１６８，１４６号およびTomらに発行された第４，３６６，２４１号により記載されており、これらはすべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書中に援用される。さらに、「競合」形式などのその他の形式も用い得る。競合アッセイでは、標識プローブは一般に、分析物と同一であるかまたは分析物のアナログである分子と結合されている。したがって標識プローブは、利用可能な試薬に対して所望の分析物と競合する。競合アッセイは、典型的には分析物、例えばハプテン、一価であり１つの抗体分子のみと結合できる各ハプテンの検出に使用される。競合イムノアッセイ装置の例は、Deutschらへ発行された米国特許第４，２３５，６０１号、Liottaへ発行された第４，４４２，２０４号およびBuechlerらへ発行された第５，２０８，５３５号に記載されており、これらはすべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書中に援用される。また種々の他の装置構成および／またはアッセイ形式が、Lambofteらへ発行された米国特許第５，３９５，７５４号、Jouらへ発行された米国特許第５，６７０，３８１号、Malickらへ発行された第６，１９４，２２０号に記載されており、これらはすべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１４６】
マイクロフルイデイック装置
本発明のいくつかの態様において、本明細書に開示されている抗体を、マイクロフルイデイック装置に組み込むことができる。装置は、１つまたは複数の分析物を結合することができるマイクロフルイディックフローシステムである。結合した分析物は、装置で直接分析され得るかまたは、例えばさらに分析もしくは処理するために装置から取り出し得る。あるいは、装置に結合しなかった分析物は、例えばさらに分析もしくは処理するために採取され得る。
【０１４７】
典型的な装置は、サンプルが流入する平板チャネルを有するフロー装置であり、このような装置は、米国特許第５，８３７，１１５号に記載されている。サンプルは、重力、毛細管によるかまたは能動的な力により、例えばサンプル（例えば血液）をマイクロフルイデイック装置中へ灌流する注入ポンプによる装置推進力によって進むことができる。当技術分野で既知の他のポンプで注入する方法も用いられ得る。マイクロフルイデイック装置は、所望により分析物捕捉用の装置中の構造体のアレイに依存することができる。構造体は、レーザー加工、エンボシング、電気整形リトグラフィー（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）（ＬＩＧＡ）、電気メッキ、電型法、フォトリソグラフィー、反応性イオンエッチング、イオンビームミリング、圧縮成形、鋳造、反応注入成形、注入成形、および物質の微小機械加工を含むがこれに限定されるものではない、種々の製法よって作製することができる。理解できるように、本発明の装置を製造するために利用される方法は、その方法が大量の均一な構造体および装置に結びつく限り重要でない。さらにまた方法は、構造体の広い表面領域をもたらし、狭いチャネルを作製するために互いにに緊密に接近されて配列されるのでなければならない。狭いチャネルは、液体中での分析物の拡散を可能にして、捕捉部位における分析物および／または標識試薬の捕捉効率の促進を生じることができる。
【０１４８】
大量生産された構造体は、種々のポリマー物質でできているのが好ましい。これらの中には限定することを意図するものではないが、ポリオレフィン、例えばポリプロピレンおよびポリエチレン、ポリエステル、例えばポリエチレンテレフタラート、ポリマーを含むスチレン、例えばポリスチレン、スチレンアクリロニトリル、およびアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリカーボネート、アクリルポリマー、例えばポリメチルメタクリレートおよびポリアクリロニトリル、ポリマーを含む塩素、例えばポリ塩化ビニルおよびポリ塩化ビニリデン、アセタールホモポリマーおよびコポリマー、セルロース化合物およびこれらのエステル、ニトロセルロース、ポリマーを含むフッ素、例えばポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリマーを含む硫黄、例えばポリフェニレニサルファイドおよびポリエーテルサルホン、ポリウレタン、ポリマーを含むシリコン、例えばポリジメチルシロキサンが含まれる。さらに構造体は、コポリマー、上記の物質の混合物および／またはラミネート、金属ホイル、例えばアルミホイル、金属化フィルムおよび上記物質上に蒸着した金属ならびにガラスおよびセラミック物質から製造することができる。このような方法の１つにおいて、レーザー、例えばエキシマレーザーを、フォトマスクを通過した光線が下層材料を除去して、基体にチャネル形成するようにフォトマスクの照射に使用することができる。Sercel, J., et al., SPIE Proceedings, Vol. 998, (September, 1988)。
【０１４９】
一般にマイクロフルイデイック装置は、試験サンプルを最初に与える入口ポートを含むことができる。一般にチャネルは毛細管であり、入口ポートから装置である捕捉部位、および出口、例えば装置のガスを排出する出口ポートを提供する構造体のアレイ中へ試験サンプルの移送を提供する。さらにチャンバおよび追加の毛細管を、装置をカスタマイズするために追加し得る。一般に装置を通る試験サンプル移動は、毛細管力に依存する。さらに１つまたは複数の毛細管を、試験サンプルを入口ポートからチャネルに導くために使用することができる。さらに、１つまたは複数の毛細管を、装置の構造体領域を出るために使用することができる。しかし、毛細管力の代わりに、または毛細管力に加えて流体の流れを装置に動かすために、圧力差を使用することができる。
【０１５０】
液体が流れることができる隣接した構造体の間に、チャネルは作製される。チャネルと構造体設計は、構造体表面と液体分子間の接触を最適化するために重要である。典型的にはチャネルの深さは、約１マイクロメートル（μｍ）から約１ミリメートル（μｍ）の範囲にわたる。チャネルの平均幅は、典型的には約０．０２μｍから２０μｍの範囲にわたる。チャネルは、高さが典型的には約１μｍから１ｍｍの範囲にわたり、平均幅が典型的には１μｍから１ｍｍの範囲にわたるひし形、六角形、円形、または四角を含む種々の形状の構造体を含むことができる。
【０１５１】
固定化された試薬は、構造体の表面上ならびに毛細管および／またはチャンバ内へ、共有結合または非共有結合で結合することができる。試薬は徐放性試薬、空間的に分離された試薬として、または表面上へコーティングして乾燥して適用することができる。表面上に固定化された試薬を配置するこのような技術は、当業者には周知である。一実施形態では、固定化された試薬は、インフルエンザウイルス抗原（例えば、Ｈ５  ＡＩＶ）を標的にする本明細書に開示されている抗体である。
【０１５２】
本発明の装置を利用する方法は、特異的な結合メンバーを含む。検出の方法は、蛍光色素または着色粒子などの着色標識の結合を含むことができる。あるいは検出は、着色産物を生じることができる酵素の結合を含むことができる。
【０１５３】
本発明の装置に、１つまたは複数の別の流路を使用することができる。入口ポートから試験サンプルを移動する毛細管は、異なる経路である構造体への主経路および代替経路に分岐する。代替経路は、複数の捕捉部位を可能にし、１つの試験部位における複数の分析物の存在または量の同時測定を可能にする。好ましい実施態様においては、複数の分析物（異なるインフルエンザ亜型）を試験装置で測定する。
【０１５４】
代替経路は、試験サンプルと試薬を混合するための領域を含むことができる。例えばチャンバは、試薬添加の領域として使用することができる。さらに、ある大きさを越えた液体成分を除去するために、トラップ装置が装置経路中に含まれ得る。例えば本発明の装置は、例えば全血から血漿または血清を分離するための分離器を含むことができる。例えば、親水性焼結多孔性物質のマトリックスは、その表面に適用された赤血球凝固剤を有することができる。マトリックスは、構造体の前方の装置中に配置されてもよい。全血サンプルの赤血球は、マトリックスの隙間に閉じ込められるが、実質的に血液細胞を含まない血清または血漿は、マトリックスを通り抜け、装置の構造体部分に毛細管作用によって移動する。米国特許第４，９３３，０９２号を、参考として本明細書中に完全に援用する。
【０１５５】
自動化
本発明の抗体は、自動化免疫化学分析器に容易に適合することができる。本発明の方法の自動化を容易にするために、および所用時間を減らすために、本発明のイムノアッセイの捕捉抗体は磁気粒子に結合し得る。
【０１５６】
抗体は、Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（ＵＳＡ）からのＭ−２８０ヒツジ抗ウサギＩｇＧでコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓおよび標的タンパク質に対するウサギ抗体として商業的に入手可能な技術を使用することにより、またはＤｙｎａｌ，Ｉｎｃ．からのＭ−４５０トシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用し、これに対して適切な抗体を共有結合で結合することにより、このような磁性ビーズに結合することができる。あるいは、グルタールアルデヒドなどの薬剤を、対象抗体を固体支持体、好ましくは磁性ビーズに共有結合で結合させるために使用してもよい。代表的なカプリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシニミドエステル、ジイソシアネート、グルタールアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンを含むことができる。
【０１５７】
好ましい自動化／イムノアッセイシステムはＡＣＳである。すなわち、ＡＣＳ：１８０  ＰＬＵＳ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＡＣＳ：１８０  ＳＥ  Ｓｙｓｔｅｍ；およびＡＣＳ：ＣＥＮＴＡＵＲ．ＲＴＭ．Ｓｙｓｔｅｍを含む、ＡＣＳ：１８０．ＲＴＭ．自動化化学ルミネセンスシステム（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ｍｅｄｆｉｅｌｄ、Ｍａｓｓ．（ＵＳＡ）。ＡＣＳ：１８０．ＲＴＭ．自動化イムノアッセイシステムは、Dudley, B. S., J. Clin. Immunoassay, 14 (2): 77 (Summer 1991)に記載されている。このシステムは、トレーサーとして化学発光標識および固相試薬としての常磁性粒子（ＰＭＰ）を使用する。ＡＣＳ：１８０  ｓｙｓｔｅｍは競合的結合アッセイおよびサンドイッチタイプアッセイに適合し、工程の各々は自動化されている。ＡＣＳ：１８０は、利用できる表面領域を最大にし、遠心分離を伴わない非結合トレーサーから結合トレーサーの迅速な磁気分離手段を提供するミクロンサイズの常磁性粒子を使用する。試薬は、同時にまたは逐次的に添加することができる。その他の標識、例えば酵素標識を、化学発光標識、例えばアクリジニウムエステルの代わりに使用することができる。発光シグナルは、照度計で検出されるのが好ましい。同様に好ましいのは、Ｂａｙｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏ  １．ＴＭ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍである。本発明の抗体を使用するイムノアッセイを実施するために容易に適合することができるその他の典型的な自動化装置は、米国特許第５，８０７，５２２号および第６，９０７，７２２号に記載されている。
【０１５８】
別の実施形態においては、イムノアッセイ法を使用するために、本発明の抗インフルエンザ抗体を自動化マルチウェルプラットフォームに組み込むことができる。マルチウェルアッセイモジュール（例えば、プレート）を、マルチウェルアッセイモジュールの１つまたは複数のウェルまたはチャンバ（例えば、マルチウェルアッセイプレートのウェル）中の誘導ルミネセンスに基づくアッセイに適用する。マルチウェルアッセイプレートは、例えばプレート上部、プレート底部、ウェル、作用電極、対電極、基準電極、誘電体、電気接続用の接触面、電極および接触面を電気的に結合する導電スルーホール、接着剤、アッセイ試薬、ならびにマーキングまたは標識の同定を含むいくつかの構成要素を含むことができる。プレートのウェルは、プレート上部のホールにより画定することができ、プレート上部のホールの内壁は、ウェルの壁を画定することができる。プレート底部は、プレート上部に（直接にまたは他の構成部分と組み合わせて）取り付けることができ、ウェルの底部として機能することができる。
【０１５９】
マルチウェルアッセイモジュール（例えば、プレート）は、任意のパターンまたは構成で配列された、任意の大きさまたは形状の任意の数のウェルおよび／またはチャンバを有することができ種々の異なる物質で構成することができる。本発明の好ましい実施形態は、プレートおよびウェルの数、大きさ、形状および構成について業界標準マルチウェルプレート形式を使用するマルチウェルアッセイプレートである。標準形式の例には、二次元アレイで構成されるウェルを有する９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルおよび９６００ウェルプレートが含まれる。他の形式には、１ウェル、２ウェル、６ウェルおよび２４ウェルおよび６１４４ウェルプレートが含まれる。ウェルおよび／またはチャンバは、その中に組み込まれた少なくとも１本の第１電極を有するのが好ましく、少なくとも１本の第２電極も含むのがさらに好ましい。好ましい実施形態に従えば、ウェルおよび／またはチャンバは、その中に組み込まれた少なくとも１つの作用電極を有し、また少なくとも１本を含むのがさらに好ましい。特に好ましい実施形態に従えば、作用電極、対電極および所望により基準電極が、ウェルおよび／またはチャンバに組み込まれる。アッセイプレートは、平坦であるのが好ましいが、湾曲（平坦でない）していてもよい。
【０１６０】
さらに１つまたは複数のアッセイ試薬が、アッセイモジュール（例えば、マルチウェルアッセイプレートのウェル中）のウェル、チャンバおよび／またはアッセイドメインに含まれ得る。例えば、異なるインフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルスポリペチドの異なるエピトープに対する抗体を含むアッセイ試薬が、マイクロタイタープレート（複数可）の異なる領域で使用し得る。これらのアッセイ試薬は、１つまたは複数のウェルおよび／もしくはチャンバの表面（好ましくは電極の表面上に、最も好ましくは作用電極の表面上に）に固定化され得るかまたは配置され得えて、１つまたは複数の別個のアッセイドメイン中に（例えば、ウェルおよび／またはチャンバの１つまたは複数の表面上に固定化された、好ましくは作用電極および／または対電極上に、最も好ましくは作用電極上に固定化された試薬のパターン化されたアレイ中に）固定化され得るかまたは配置され得る。またアッセイ試薬は、ウェルおよび／またはチャンバ内の機能によって含まれ得るかまたは配置され得る。例えばパターン化された誘電体は、液体を閉じ込めるかまたは局所化することができる。
【０１６１】
一実施形態では、本発明の装置は、アッセイモジュールで、好ましくはマルチウェルアッセイプレートで実施されるアッセイにおいて、ルミネセンスを誘導して測定するために使用することができる。例えば、それは１つまたは複数の光検出器；遮光性の容器；アッセイモジュールを接触させるための電気コネクタ；マルチウェルアッセイモジュールを装置中に出し入れ（特に、遮光性の容器の出し入れ）するよう移動するためのメカニズム；光検出器（複数可）および電気的接点とマルチウェルアッセイモジュールとを整列させ向きを定めるためのメカニズム；モジュールを追跡して同定するためのメカニズム（例えば１つまたは複数のバーコード読取機（例えば、モジュールまたはプレートの１つの側面を読むための１つのバーコード読取機およびモジュールまたはプレートのもう１つの側面を読むための別の読取機）；方位センサー（複数可）；モジュールに電気接続のためのメカニズム；モジュールでルミネセンスを誘導するための１つまたは複数の電気エネルギー供給源；ならびに適切な電子装置およびソフトウェアを組み込むことができる。
【０１６２】
また装置は、１つまたは複数のアッセイモジュール（例えばマルチウェルプレートスタッカ）を貯蔵、スタック、移動および／または配布するためのメカニズムを含むことができる。装置は、光検出器のアレイ（例えば、フォトダイオードのアレイ）または光を測定するためのイメージング光検出器（例えばＣＣＤカメラ）を有利に使用することができる。これらの検出器は、装置が複数のウェル（および／もしくはチャンバ）からの光を同時に測定できるようにし、かつ／または個々のウェル（および／もしくはチャンバ）から放射される光の強度および空間分布を画像化できるようにする。
【０１６３】
装置は、アッセイモジュールの、好ましくはマルチウェルアッセイプレートの１つまたは複数のセクターからの光を測定できるのが好ましい。ある実施形態では、セクターは、アッセイモジュール（例えばマルチウェルプレート中の行、列、またはウェルの二次元のサブアレイ）中のウェル（および／またはチャンバ）の１と総ウェル数未満の数の番号をつけたウェル（および／またはチャンバ）の群を含む。好ましい実施態様においては、セクターは、マルチウェルプレートのウェルの４パーセントと５０パーセントの間を含む。特に好ましい実施形態では、マルチウェルアッセイプレートは、柱状のセクター（ウェルの１つの行または列を有する各セクター）または四角のセクター（例えば、標準サイズのマルチウェルプレートは、等しい大きさの６つの四角のセクターに分割することができる）に分割される。ある実施形態では、あるセクターは、１つまたは複数のウェルを含むことができる。装置は、所定のモジュール、好ましくはプレート中のセクターからＥＣＬを逐次的に誘導するおよび／またはＥＣＬを逐次的に測定するのに適しているのが好ましい。
【０１６４】
装置はまた、装置内部で特定の機能を制御するために、およびデータの記憶、解析および表示を助けるためにマイクロプロセッサおよびコンピュータを組み込むことができる。これらのマイクロプロセッサおよびコンピュータは、装置中に存在することができるか、または装置と情報のやりとり（例えばネットワーク接続を介して）を行う離れた場所に存在することができる。
【０１６５】
メンブレン／表面
本発明の種々の態様では、インフルエンザウイルス抗原または抗インフルエンザウイルス抗体を組み込んでいる装置は、表面またはメンブレンを含む。種々の表面またはメンブレンは、種々の通常のイムノアッセイ装置で使用するために、抗体または抗原が固定化されるかまたは配置されている表面を提供することができる。このようにメンブレンは、試験結果（例えば、サンプルが１つまたは複数のウイルスを含むかどうか）を可視化できる免疫試薬を使用する試験ならびに対照領域を含む領域を提供することができる。種々の実施形態において、その上に配置されたインフルエンザウイルス抗原または抗インフルエンザウイルス抗体を有しているメンブレンは、次に固体支持体（例えば、側方流動またはディップスティック装置）上に配置される。
【０１６６】
抗原／抗体が結合することができるメンブレンまたは表面は、限定するものではないがセルロース、ニトロセルロース、ナイロン、第４級アミノ電荷を持つカチオン化ナイロン（ゼータプローブ）、ＤＰＴに変換されたアミノフェニルチオエーテル（ＡＰＴ）ペーパー、ジアゾ誘導体（これは酵素検出可能標識の使用で染色することはできない）または親水性ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．から入手可能）を含む物質を含むことができる。用語「ニトロセルロース」とは、セルロースの任意の硝酸エステルを意味する。したがって適切な物質は、セルロースのカルボン酸エステルと組み合わせたニトロセルロースを含むことができる。ニトロセルロースメンブレンの細孔サイズは大きく変化することができるが、多くの場合約５〜２０ミクロンの範囲内であり、好ましくは８〜１５ミクロンの範囲内である。しかし、当業者に知られているその他の物質も意図される。ある実施形態では、試験領域は、透明なマイラーバッキングに積層したミリポアニトロセルロースロールで作られているニトロセルロースウェブアセンブリを含む。別の実施形態においては、抗原／抗体（または「試験領域」）を含む領域はナイロンで作られている。別の実施形態においては、試験領域は、特異的に分析物に結合できる第２の試薬を運ぶラテックスまたは他の粒子を固定化することができる物質を含んでおり、これにより試験ゾーン、例えば圧縮ナイロン粉末または繊維ガラスを画定する。副次的な実施形態では、試験領域は乾燥状態では不透明であり、湿潤状態では透明である物質を含んでいる。
【０１６７】
試験および対照ゾーン
装置は、試験領域に関して上記のようないずれかの物質から作製した試験および対照ゾーンを含むメンブレン／表面を含むことができる。しばしば試験および対照ゾーンは、試験領域の定義された構成部分を形成する。一実施形態では、試験および対照ゾーンは試験領域と同じ物質を含んでいる。多くの場合、用語「試験領域」は、本明細書においては少なくとも試験および対照ゾーンを含む装置中／上の領域を指すのに使用される。ある実施形態では、装置は吸湿性の物質を使用するが、非吸湿性の流れを提供するいくつかの実施形態では、これらの物質は吸湿性メンブレンの吸湿性質の原因となる作用をブロックすることができるブロック剤で処理し得る。適切なブロック剤には、ウシ血清アルブミン、メチル化ウシ血清アルブミン、全動物血清、カゼイン、および脱脂乾燥乳、ならびに多くの界面活性剤およびポリマー、例えばＰＥＧ、ＰＶＡなどが含まれる。ある実施形態では、未処理の吸湿性メンブレン上の妨害となる部位を、ブロック剤で完全にブロックして非吸湿性の流れがそこを通過できるようにする。本明細書で示すように、本開示は複数の試験および対照ゾーンを有する試験装置を意図している。
【０１６８】
試験領域は一般に、サンプルの流れが予想通りであることを確かめるのに有効である１つまたは複数の対照ゾーンを含む。対照ゾーンの各々は、しばしば標識対照試薬と反応する特異的な結合対の固定化されたメンバーを含む空間的に相異なる領域を含む。副次的な実施形態では、手順の対照ゾーンは、所望の分析物の基準サンプルまたはそれらのフラグメントを含む。この実施形態では、１つのタイプの標識試薬が使用でき、液体サンプルが標識試薬を試験および対照ゾーンに移動させ、次いで、所望の分析物に結合していない標識試薬が対照ゾーンに配置された所望の分析物の基準サンプルに結合する。別の実施形態においては、対照ラインは、標識試薬に特異的であるか、さもなければ、標識試薬の固定化を提供する抗体を含む。操作において、所望の分析物の一部または全部が試験サンプルに存在しない場合でも、標識試薬は１つまたは複数の対照ゾーンの各々において拘束される。
【０１６９】
ある実施形態では、固体支持体は、所望の任意の形状（例えば、四角、楕円形、円形、垂直または水平ライン）に設計することができる抗原／抗体−結合マトリックス領域を含むパターン化された領域を含むことができる。例えば、抗原結合マトリックス領域は、プラスチックまたはマイラーなどの物質で作られ得る固体支持体のディップスティック上へ配置された。本発明を用いることにより、単一の試験ストリップ上または単一の固相支持体ディップスティック上の種々の位置でそれぞれ異なる特異的な抗原を含む複数のマトリックススクエアの取り込みによって、１回の試験で複数の抗亜型Ｈ５  ＡＩＶ抗体を検出することができる。
【０１７０】
種々の実施形態において、イムノアッセイで使用される本発明の抗体を含む装置は、キット中に含有され得る。キットは、使用されているイムノアッセイの特定の形式について必要な試薬を含むように調製される。キットは、ディップスティックおよびそれとともに使用される別の試薬、インフルエンザの複数の亜型のアッセイに必要な抗体を固定化する側方流動装置、または必要な試薬を有する任意の通常の装置を含むことができる。例えばキットで提供される一組の試薬を通してディップスティックを順番に浸す工程によって、サンプル中の特定の抗亜型インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５  ＡＩＶ抗体）またはインフルエンザウイルス抗原（例えば、Ｈ５抗原）の有無が簡単迅速に確認できる。このようなキットは専門家および同様に素人の使用にも適している。本発明のキット使用により、血液、尿、喀痰、精液、大便、唾液、胆汁、髄液、鼻部スワブ、尿生殖器スワブ、鼻部吸引液、脊髄液などのような体液から、インフルエンザウイルス（例えば、ＡＩＶ）の迅速な血清学的診断ができるようになるであろう。
【０１７１】
別の実施形態においては、固相支持体ディップスティックまたは側方流動装置を、インフルエンザウイルス（例えば、ＡＩＶ）に感染していと疑われる患者または動物由来の検体サンプルが添加されている試験管または同様の容器中に入れる。検体サンプルを、ディップスティック上に結合した抗原／抗体と反応させる。次いで、ディップスティックを取り出し、穏やかに洗浄する。固相支持体ディップスティックを洗浄液から取り出し、サンプルが採取された種に特異的であり、アルカリホスファターゼまたは別の適切な酵素に結合されている高希釈のアフィニティー精製した免疫グロブリンを含む別の管に入れる。次いで、ディップスティックを第２抗体溶液から取り出し、洗浄液の容器に入れる。洗浄液から取り出した後、ディップスティックを、予備混合したクロモゲン溶液または他の適切な基質溶液の最後の管に入れる。陽性反応は、陽性（下部のスポット）と対照（上部のスポット）の簡単な目視比較によって評価することができる。陽性スポットが対照より濃い場合は、試験は陽性であると考えられる。アフィニティー精製した免疫グロブリンに共有結合で結合されている酵素は、酵素基質反応の末に発色反応産物を生じる基材と反応する。このようにして、結合したアフィニティー精製した免疫グロブリンの存在を容易に検出することができ、これにより検体サンプル中のインフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５抗原）に特異的である抗体の存在を示すことができる。本明細書でも開示されるように、この技術は周知のＥＬＩＳＡ技術を組み込んでいる。
【０１７２】
適切な酵素および基質ならびに適切な反応条件の選択は、当業者によく知られていることが理解されよう。これらの酵素は、免疫グロブリン分子に結合した後も活性を保持している。それぞれの酵素基質の一組は、化学的に反応して着色反応生成物を生成する。さらに酵素および基質は、両方ともアフィニティー精製した免疫グロブリン溶液に結合されるが、アフィニティー精製した免疫グロブリンが検体抗体に結合した後に、酵素および基質のみが反応して着色反応生成物を形成する代替の結合体がある。
【０１７３】
もちろん、異なる抗体／抗原を使用することによって、サンプルは異なるウイルス型または亜型のパネルに関して容易にスクリーニングすることができる。本明細書で記載されるイムノアッセイにより様々なパネルがアッセイされ得ることを当業者は理解するであろう。例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligan, John E., et. al., eds. 1999)を参照のこと。
【０１７４】
アレイ
また本発明の抗体は、サンプル中の１つまたは複数のインフルエンザウイルスタンパク質（例えば、Ｈ５）または１つまたは複数の抗インフルエンザウイルス抗体の検出を含む、分析物検出ハイスループット法のために適用する装置での使用のために容易に適用され得る。このような方法は、抗体は他のインフルエンザ亜型（例えば、ＡＩＶ）などの複数の異なるウイルスを標的にするその他の抗体を含むアレイ形式で表示される実施形態を含む。他の実施形態では、抗体は同じ抗原または標的を標的にすることができるが、所定のポリペプチド上の異なるエピトープに特異的に結合する。
【０１７５】
本発明のまたさらなる実施形態において、抗体のアレイは、基材および基材表面部分上の別々で既知の領域に配列された複数のパッチを含み、（ｉ）それぞれパッチは、基材上に固定化された抗体を含み、所定のパッチの前記抗体は、特定のウイルスの発現産物、これらのフラグメント、または抗ウイルス抗体などの宿主タンパク質を結合することができ、かつ（ｉｉ）アレイは複数の異なる抗体を含み、これらの各々は異なるウイルスの発現産物、これらのフラグメント、または抗ウイルス抗体などの宿主タンパク質を結合することができる。
【０１７６】
抗体は、アレイのパッチ上に直接的または間接的に共有結合して固定化されるのが好ましい。ほとんどの場合、アレイは、少なくとも約１０個のパッチを含む。好ましい実施形態では、アレイは少なくとも約５０個のパッチを含む。特に好ましい実施形態では、アレイは、少なくとも約１００個のパッチを含む。別の好ましい実施形態では、抗体のアレイは１０３個、１０４個または１０５個を超えるパッチを含むことができる。
【０１７７】
それぞれのパッチよって覆われた基材の表面領域は、約０．２５ｍｍ２を超えないのが好ましい。それぞれのパッチによって覆われた基材表面の領域は、約１μｍ２と約１０，０００μｍ２の間であるのが好ましい。特に好ましい実施形態では、それぞれパッチは、約１００μｍ２から約２，５００μｍ２までの基材表面の領域を覆っている。代わりの実施形態では、アレイ上のパッチは約２，５００のｎｍ２程度の小さな基材表面の領域を覆うことができるが、一般にそのような小型のパッチはアレイの使用に必要ではない。
【０１７８】
アレイのパッチは、任意の幾何学的形状であり得る。例えばパッチは、矩形または円形であり得る。またアレイのパッチは、不規則に成形し得る。パッチは、所望により基礎をなす基材の正中面から持ち上がっている。
【０１７９】
アレイのパッチが分離している距離は、変化することができる。アレイのパッチは、隣接したパッチから約１μｍから約５００μｍ離れているのが好ましい。典型的には、パッチが１０μｍを超える大きさを有する場合、アレイ上でパッチを分離している距離は直径またはパッチの辺長と概略的に比例している。パッチの大きさがより小さい場合、パッチを分離している距離はパッチの大きさより典型的には大きいであろう。
【０１８０】
アレイの特定の実施形態では、アレイのパッチは、すべて基材表面上の約１ｃｍ２以下の領域の中に含まれる。したがってアレイの１つの好ましい実施形態では、アレイは基材表面上の約１ｃｍ２以下の全領域中に１００個以上のパッチを含む。あるいは特に好ましいアレイは、約１ｃｍ２以下の全領域中に１０３以上のパッチを含む。好ましいアレイは、所望により基材表面上の約１ｃｍ２の領域中に１０４個または１０５個以上のパッチを含むことさえできる。本発明の他の実施形態では、アレイのすべてのパッチは基材表面上の約１ｍｍ２以下の領域中に含まれる。
【０１８１】
典型的には、アレイの１つのパッチ上にはただ１つの抗体が存在する。１つを超える抗体が１つのパッチ上に存在する場合、そのパッチ上の抗体の全は共通の結合パートナーを共有する必要がある。例えばパッチは、インフルエンザウイルスタンパク質に対する多様な抗体を含むことができる（潜在的に抗体は所定のインフルエンザウイルス上の異なるエピトープに結合することができるにもかかわらず）。好ましい実施態様においては、インフルエンザウイルスタンパク質／抗原はＨ５であり、インフルエンザウイルスはＡＩＶである。
【０１８２】
本発明のアレイは、任意の数の複数の異なる抗体を有することができる。典型的には、アレイは、少なくとも約１０種の異なる抗体を含む。アレイは、少なくとも約５０種の異なる抗体を含むのが好ましい。アレイは、少なくとも約１００種の異なる抗体を含むのがより好ましい。別の好ましいアレイは、約１０３種を超える異なる抗体または約１０４種を超える異なる抗体を含む。アレイは、所望により約１０５種を超える異なる抗体を含むことさえできる。
【０１８３】
アレイの一実施形態では、アレイのそれぞれのパッチは異なる抗体を含む。例えば約１００個のパッチを含むアレイは、約１００種の異なる抗体を含むことができる。同様に約１０，０００個のパッチのアレイは、約１０，０００種の異なる抗体を含むことができる。しかし代わりの実施形態では、それぞれ異なる抗体が、アレイ上の１つを超える別々のパッチ上に固定化される。例えばそれぞれ異なる抗体が、所望により２個〜６個の異なるパッチ上に存在することができる。したがって本発明のアレイは、約３０００個の抗体パッチを含むことができるが、それぞれ異なる抗体が３個の異なるパッチ上で存在するので、約１０００種の異なる抗体のみを含む。
【０１８４】
典型的には、アレイ上の複数の異なる抗体により結合され得る異なるタンパク質の数は、少なくとも約１０個である。しかしアレイ上の複数の異なる抗体は、さらに多数の異なるタンパク質を、例えば少なくとも約５０個または少なくとも約１００個を結合することができるのが好ましい。さらにまた好ましい実施形態では、アレイ上の複数の異なる抗体は、少なくとも１０３個のタンパク質と結合できる。
【０１８５】
この実施形態の抗体アレイの使用は、全表面領域２５ｍｍ２当り約１〜１０μＬの液量を有すフローチャンバ中に、所望により二次元のアレイを配置することを含むことができる。フローチャンバ中のアレイの上のカバーは、透明または半透明であるのが好ましい。一実施形態では、カバーは、パイレックス（登録商標）または石英ガラスを含むことができる。他の実施形態では、カバーは、アレイ上に固定化された抗体と細胞の抽出液などの溶液中のタンパク質間の相互作用をモニターする検出システムの部分であることができる。フローチャンバは、抗体を保護するために適切な水溶液で満たされていなければならない。塩、温度およびその他の状態を、正常な生理学的条件と同様な状態に保つのが好ましい。所望により液体溶液中のサンプルをフローチャンバ中に流し入れ得て、固定化された抗体とのそれらの相互作用を測定し得る。抗体とその結合パートナー間の結合が生じるように十分な時間が与えらなければならない。このために必要とされる時間は、その結合パートナーに対する抗体の親和性によって変わるであろう。特殊な微量流体ポンプ、弁、または混合技術は、アレイへの液体のデリバリーのために必要とされない。
【０１８６】
検出方法
本発明の抗体を使用する任意の装置に適用可能であるように、広範囲にわたる検出要素が、結合パートナーの存在を検出するために利用できる。本発明のアレイは、光学的検出法、例えば可視または赤外線の範囲の吸収、化学発光、ならびに蛍光発光（寿命、偏光、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を含む）と連結することができる。さらにまた、検出の他の様式、例えば光導波路ＰＣＴ発行物（ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）に基づく検出、表面プラスモン共鳴、サーフェスチャージセンサー、ならびにサーフェスフォースセンサーが本発明の多く実施形態と適合する。あるいは技術、例えばブリュースター角顕微鏡（ＢＡＭ）（Schaaf et al., Langmuir, 3:1131-1135 (1987)）に基づく技術ならびに偏光解析法（米国特許第５，１４１，３１１号および第５，１１６，１２１号；Kim, Macromolecules, 22:2682-2685 (1984)）を適用することができる。水晶振動子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅｓ）および脱着プロセス（例えば米国特許第５，７１９，０６０号を参照）が、少なくともいくつかの本発明アレイの実施形態に適したさらに他の代替検出法を提供する。表面プラスモン共鳴、内部全反射面蛍光（ＴＩＲＦ）、ブリュースター角顕微鏡、オプティカルウエイブガイドライトモードスペクトロスコピー（ｏｐｔｉｃａｌ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｌｉｇｈｔｍｏｄｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＯＷＬＳ）、サーフェスチャージ測定、および偏光解析法を含む本発明のいくつかのアレイおよび種々の非標識検出原理の両方に適合する光学的バイオセンサーシステムの例は、米国特許第５，３１３，２６４号において見い出すことができる。
【０１８７】
ある実施形態では、本発明の抗体を組み込む装置は、読取機、特に内蔵のコンピュータを有する読取機、例えばリフレクタンスおよび／または蛍光に基づく読取機、ならびに所望により生体サンプル中の分析物の存在または濃度を正確に測定するために訓練されたニューラルネットワークと組み合わせた、データリダクションおよびカーブフィッティングアルゴリズムを用いるデータプロセッシングソフトウェアを含むシステムに組み込むことができる。本明細書で用いる読取機は、データ、例えば本発明の抗体を使用する試験装置に含まれる試験ストリップ上のデータを検出および／または数量化するための機器を意味する。データは肉眼で視認し得るが、必ずしも視認できる必要はない。本方法は、患者サンプルでイムノアッセイを実施する工程と、読取機に基づきリフレクタンスおよび／または蛍光を使用してデータを読む工程と、およびデータリダクションを用いるデータプロセッシングソフトウェアを使用する得られたデータを処理する工程とを含む。好ましいソフトウェアは、所定のサンプル中の分析物の存在または量を測定するために、所望により訓練されたニューラルネットワークと組み合わせたカーブフィッティングアルゴリズムを含む。次いで、読取機から得られたデータは、アウトプットとしてリスクアセスメントまたは医学的状態の診断を提供するために、医学診断システムによりさらに処理することができる。別の実施形態では、アウトプットは、後の意志決定支援システム、例えばこのようなデータを評価するために訓練されたニューラルネットワークへのインプットとして使用することができる。
【０１８８】
種々の実施形態で、読取機は、装置から検出されるシグナルに依存するリフレクタンス、トランスミッション、蛍光、化学−生物発光、マグネチックまたはアンペロメトリー読取機（または２またはそれ以上の組合せ）であることができる。さらにまた標識の使用を必要とする従来のイムノアッセイに一般に使用された検出法のタイプの一部が、本発明のアレイに適用され得る。これらの技術には、非競合イムノアッセイ、競合イムノアッセイ、および二重標識、レシオメトリックイムノアッセイ（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が含まれる。これらの特定の技術は、異なる特異性を有する異なる抗体の数が少ない（約１００未満）場合、主として抗体アレイで用いるのに適している。競合法では、結合部位占有率は間接的に測定される。この方法では、アレイの抗体は典型的には分析物または分析物アナログの標識バージョンである標識した顕色剤に暴露される。顕色剤は、抗体上の結合部位を分析物と競合する。異なるパッチ上の抗体の部分的占有率は、それぞれのパッチの抗体への顕色剤の結合により測定することができる。
【０１８９】
非競合法では、結合部位占有率が直接に測定される。この方法では、アレイのパッチはタンパク質−捕捉薬剤上の結合した分析物または占有された結合部位のいずれかに対して結合できる標識した顕色剤に暴露される。例えば、顕色剤は占有された部位に対する標識抗体であり得る（すなわち、「サンドイッチアッセイ」）。あるいは、抗体が１つの標識で標識され、第２の顕色剤が第２の標識で標識される場合、二重標識、レシオメトリックな方法をとることができる（Ekins, et al., Clinica Chimica Acta., 194:91-114, 1990）。ラジオアイソトープ法、酵素法、化学発光法、および蛍光法を含む多くの異なる標識化方法が、上述した技術で使用され得る。ある実施形態では、蛍光検出法が好ましい。検出の方法には、限定することを意図しないが、色変化、光吸収、または光透過度、ｐＨ、伝導率、蛍光、物理的な相変化などが含まれる。
【０１９０】
試験サンプルは、検出システムの検出可能な成分を提供することができるか、またはそのような成分を添加することができる。検出システムの性質に依存して、成分は大きく変わるであろう。そのような１つの検出法は、粒子が光散乱または流速の変化を提供する粒子の使用を含んでいる。粒子は限定することを意図しないが、細胞、液系と非混和性であるポリマー粒子、ラテックス粒子、チャコール粒子、金属粒子、多糖類またはタンパク質粒子、セラミック粒子、核酸粒子、凝集した粒子などであってもよい。粒子の選択は、検出方法、分散体の分散性または安定性、不活発性、流れの変化への関与などに依存する。捕捉部位での特異的結合メンバーに対する分析物の結合は、所望により装置中の試験サンプルの圧力をモニターすることによって検出することができる。例えば、チャネルに出入りする試験サンプルに結合した圧力検出器は、チャネル流の制限を生じる分析物の結合によって生じる圧力低下の検出を可能にする。
【０１９１】
例えば、存在する検出可能な標識（例えば、抗体−結合体）の量、したがって存在する抗原量を定量するために、Hazelgrove et al., Anal. Biochem., 150:449-456, 1985）の方法および装置を使用することができる。この方法は、コンピュータに結合したＴＶカメラに基づいている。ドットがＴＶカメラで画像化されたライトボックス上に表示され、デジタル化ボード（Ｔｅｃｈｍａｒ，Ｉｎｃ．）でデジタル化される。デジタル化した後に、コンピュータでそれぞれドットの位置、幅、高さおよび相対的な領域が読み取られる。吸光度（ＯＤ）測定値が、絶対タンパク質濃度に対してプロットされる。
【０１９２】
別の実施形態においては、Ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡ試験を組み込んだ装置が、直接に任意のサンプルから標的タンパク質を検出するために使用される。したがって本発明の抗体は、
（ａ）モノクローナル抗体に基づくアッセイを実施するための固体支持体を提供する工程と；
（ｂ）インフルエンザウイルスを含む疑いのあるサンプルを固体支持体に適用する工程と；
（ｃ）クエン酸または乳酸などの有機酸を含む溶液を固体支持体に適用する工程と；
（ｄ）粘液溶解剤および界面活性剤を含む溶液を固体支持体に適用する工程と；
（ｅ）ＭＡｂ、キメラＭＡｂ、変異体またはフラグメントおよびＨ５  ＡＩＶタンパク質が互いに結合して抗原結合一次ＭＡｂを形成することを可能にするのに十分な時間、一次ＭＡｂ、キメラＭＡｂ、変異体またはフラグメントと固体支持体を接触させる工程と；
（ｆ）結合体に対する抗原結合ＭＡｂの結合を促進するのに十分な時間、抗原結合一次ＭＡｂと酵素標識抗ＭＡｂ結合体を接触させる工程と；
（ｇ）発色試薬を固体支持体に適用する工程であって、前記発色試薬が、酵素によって触媒されてＨ５  ＡＩＶタンパク質の、すなわちサンプル中の存在の視覚検出を可能にする着色マーキングを生ずる工程
とを含むプロセスにおいて利用できる。典型的なＤｏｔ−ＥＬＩＳＡ法は、米国特許出願第２００６／０２４６４２９号に開示されており、その全体を参考として援用する。
【０１９３】
ある実施形態では、本発明の装置またはキットは、発色検出システム、例えばアルカリホスファターゼを用いるシステムを使用することができる医療施設の分野または場所で利用できる。例えば所望の色を達成するために順番に使用するように設計されている緩衝液中のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）を含む別々のバイアルが、キットの成分として供給され得る。発色検出システム用いて、いかなる装置も用いることなく結果を可視化できる。一実施形態では、装置はアルカリホスファターゼを用いて存在するＡＩＶ量を数量化することができる。アルカリホスファターゼを含むそのような装置は、デンシトメーターと共に使用したとき正確な定量的結果を与えるであろう。
【０１９４】
一実施形態では、Ｈ５  ＡＩＶタンパク質または抗亜型Ｈ５  ＡＩＶ抗体検出用のキットは、検出可能な標識、例えばキット上に結合したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体；ニトロブルーテトラゾリウムを含む試薬（ＮＢＴまたは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）；および参照標準物質を含むことができる。
【０１９５】
本明細書で開示されるいずれかの実施形態において、試験サンプルは、例えば限定することを意図するものではないが生理学的な供給源に由来し得る。本発明の装置に投与することができる試験サンプルの例には、ヒト以外の動物またはヒト対象から得られる抗原または抗体を含むことが疑われるサンプルが含まれ、限定されるものではないが生理的液体例えば血液、血清、血漿、唾液、眼球レンズ液、脳脊髄液、膿汁、滲出液、乳汁、汗、涙液、イヤフロー（ｅａｒ  ｆｌｏｗ）、喀痰、リンパ、尿、排泄物、口または鼻腔からの分泌物、組織、例えば肺、脾臓および腎臓、ニワトリ胚培養由来の完全なウイルスまたは溶菌ウイルスの液体、および可溶性であるかまたは適切な液体の中に懸濁され得るインフルエンザウイルスタンパク質または抗インフルエンザウイルス抗体を含む疑いのあるその他のサンプルが含まれる。試験サンプルは前処理に、例えば限定することを意図するものではないが、抽出、添加、分離、希釈、濃度、濾過、蒸留、透析などに付されてもよい。生理的液体の他に、その他の液体試験サンプルを用いることができ、所望の成分は液体または固体のいずれかであり得て、それにより液体培地中に固体は溶解されるかまたは懸濁される。一実施形態では、スワブまたはその他の採取装置で採取した鼻腔由来のサンプルが、イムノアッセイ装置中でまたはこの装置を用いて使用される。多くの場合装置は、１つまたは複数の抗原または抗体が結合できる表面を含んでいる。
【０１９６】
治療方法および医薬組成物
本発明は、対象におけるトリインフルエンザウイルス感染と関連する疾患の予防または治療する方法であって、前記対象に本発明の１つまたは複数のモノクローナル抗体を含む医薬組成物の薬学的有効量を投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、本発明の１つまたは複数のモノクローナル抗体または薬学的に許容し得るその塩を含む医薬組成物を提供する。
【０１９７】
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、経口、頬側、舌下、眼内、局所、非経口、直腸、嚢内、腟内、腹腔内、膀胱内、局所（例えば、散剤、軟膏、または滴剤）、または鼻部経路を含む通常の投与経路で対象に投与され得る。
【０１９８】
非経口注射に適切な医薬組成物は、薬学的に許容し得る無菌の水性溶液または非水性溶液、分散液、懸濁液、または乳液、および無菌の注射溶液または分散液に即時再構成用の無菌の散剤を含んでもよい。適切な水性担体および非水性担体、ビヒクル、および希釈剤の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、これらの適切な混合物、植物油（例えばオリーブ油）、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適度な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用より、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１９９】
本発明の医薬組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントをさらに含むことができる。本組成物の微生物汚染の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などで達成することができる。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含むのが望ましい場合もある。注射可能な医薬組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させることができる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって影響され得る。
【０２００】
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、散剤、および顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形では、有効成分は、少なくとも１種類の不活性な通常の医薬賦形剤（もしくは担体）、例えばクエン酸ナトリウムもしくは燐酸カルシウム、または（ａ）充填剤または増量剤、例えばデンプン類、ラクトース、シュークロース、マンニトール、およびケイ酸；（ｂ）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、シュークロース、およびアラビアゴム；（ｃ）保湿剤、例えばグリセロール；（ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ澱粉またはタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種の複合体ケイ酸、および炭酸ナトリウム；（ｅ）溶液保持剤、例えばパラフィン；（ｆ）吸収促進剤、例えば第四アンモニウム化合物；（ｇ）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセリン；（ｈ）吸着剤、例えばカオリンおよびベントナイト；および／または（ｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合される。カプセル剤および錠剤の場合、剤形はさらに緩衝剤を含むことができる。
【０２０１】
固体剤形は、放出速度緩和剤として機能する別の賦形剤と共に即時放出剤形用に上記に詳述した、装置上にコーティングされるかおよび／または装置本体内に含まれるような賦形剤を含む、徐放およびパルス放出剤形として製剤化され得る。放出速度緩和剤には、限定されるものではないがヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテート、ポリエチレンオキサイド、キサンタンガム、アンモニオメタクリレートコポリマー、水添ヒマシ油、カルナバワックス、パラフィンワックス、セルロースアセテートフタラート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、メタクリル酸コポリマーおよびこれらの混合物が含まれる。徐放性およびパルス放出剤形は、放出速度を緩和する賦形剤の１つまたは１つの組合せを含むことができる。
【０２０２】
本発明の医薬組成物は、次の成分を含む急速に分散または溶解する投薬処方物（ＦＤＤＦ）をさらに含むことができる：アスパルテーム、アセスルファームカリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ジアスコルビン酸、アクリル酸エチル、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メタクリル酸メチル、ミント香料、ポリエチレングリコール、ヒュームドシリカ、二酸化ケイ素、ナトリウムデンプングリコール酸、ナトリウムステアリルフマル酸、ソルビトール、キシリトール。本明細書中でＦＤＤＦを記述するために使用される分散または溶解するという用語は、使用した製剤原料の溶解性に依存する。すなわち、製剤原料が不溶性の場合は急速に分散する剤形が調製され得て、製剤原料が可溶性の場合には急速に溶解する剤形が調製され得る。
【０２０３】
同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖、および高分子量のポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する軟質および硬質ゼラチンカプセル中の充填剤としても用い得る。
【０２０４】
錠剤、糖衣剤、カプセル剤、および顆粒剤のような固体剤形、腸溶性コーティングおよび当業者によく知られた他のものなどのコーティングおよび剤皮を施して調製することができる。またそれらは不透明化剤を含むことができ、またそれらは除放的に、持続的にまたは制御された様式で活性化合物（複数可）を放出するような組成物にすることもできる。使用することができる埋封組成物の例は、ポリマー物質およびワックスである。適切であれば、上記の賦形剤の１つまたは複数を用いて、活性化合物（複数可）をマイクロカプセル化した形態にすることもできる。
【０２０５】
経口投与用の液体剤形は、薬剤学的に許容し得る乳剤、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシルを含む。活性化合物に加えて、液体剤形は、当該分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば水もしくは他の溶媒、溶解剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカルボナート、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル類、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、および胡麻実油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などを含むことができる。
【０２０６】
そのような不活性希釈剤の他に、医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、風味剤、および香料などの補助剤も含むことができる。医薬組成物は、懸濁剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、およびトラガカントゴム、またはこれらの物質の混合物などをさらに含むことができる。
【０２０７】
また本発明の医薬組成物は、獣医学的用途における治療のために構成され得て、ここで本発明の化合物、もしくは獣医学的に許容し得るそれらの塩、または獣医学的に許容し得る溶媒化合物もしくはそれらのプロドラッグが標準の獣医学の実務に従って適切に許容し得る製剤として投与され、獣医師が特定の動物に最も適切である投薬方法および投与経路を決定する。
【０２０８】
本発明の１つまたは複数のモノクローナル抗体が、Ｈ５トリインフルエンザウイルス感染に伴う疾患の予防および／または治療のために、他の抗ウイルス薬剤と組み合わせて使用し得る。モノクローナル抗体は、他の抗ウイルス薬剤と同時に、別々に、または順番に投与され得る。その他の抗ウイルス薬剤の例には、これに限定されるものではないがリバビリン、アマンタジン、ヒドロキシウレア、リバビリン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびペンタフシド（ｐｅｎｔａｆｕｓｉｄｅ）が含まれる。
【０２０９】
ペプチドスクリーニング方法ならびに抗体およびワクチンにより認識されるペプチド
本発明は、本発明のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープをシミュレートする短いペプチドをスクリーニングする方法を提供する。さらにまた本発明は、本発明のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープをシミュレートする短いペプチドを提供する。一態様において、本発明は、配列番号６４〜６８、７０〜７３、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４および９６に記載されたアミノ酸配列を有する短いペプチドを提供する。これらの短いペプチドは、本発明のモノクローナル抗体に結合することができる。したがって、これらの短いペプチドは、Ｈ５ヘマグルチニンと同じ抗原特異性を有する。この短いペプチドは、トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５としてワクチンを生産するために使用し得る。またこの短いペプチドは、抗Ｈ５抗体の存在を検出するために使用され得る。
【０２１０】
他の態様では、本発明のスクリーニング法は、（ｉ）ペプチドの発現に適切な条件下で、ペプチド表示ライブラリを培養する工程と；（ｉｉ）培養溶液を、本発明のモノクローナル抗体と接触させる工程と；（ｉｉｉ）特異的に前記モノクローナル抗体に結合するファージクローンを選択する工程とを含む。スクリーニングに使用されるモノクローナル抗体は、これに限定されるものではないがモノクローナル抗体８Ｈ５、３Ｃ８、１０Ｆ７、４Ｄ１  ２Ｆ２および／または３Ｇ４を含み得る。本明細書で含まれる実施例１１〜１３は、ペプチドファージディスプレイライブラリーを用いて、本発明のモノクローナル抗体に結合する短いペプチドを良好にスクリーニングしたアッセイを詳細に記載している。
【実施例】
【０２１１】
以下の実施例は、本発明を詳細に説明するものであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。
実施例１
【０２１２】
トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５のＨＡ抗原に対するモノクローナル抗体の調製
抗原の調製
受精した９日齢のニワトリ胚に、ウイルス株Ｃｋ／ＨＫ／Ｙｕ２２／０２（Ｈ５Ｎｌ）（「Ｙｕ２２」と呼ぶ）を３０℃で２日間接種した。ニワトリ胚上清を採取して、増殖したＹｕ２２ウイルスを得た。Ｙｕ２２生ウイルスを採取し、４℃で０．０３％ホルマリンで不活化した。不活化ウイルスのＨＡ抗原を検出し、不活化ウイルスのタイターを測定した（ＨＡタイター測定および赤血球凝集抑制（ＨＩ）検出のための特異的方法に関するＷＨＯのガイドラインを参照のこと。本発明者らはウイルス株ＨＡ＝１０２４を選択したが、この株は香港大学微生物学教室（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）より提供された）。
【０２１３】
マウス
６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、厦門大学の抗癌センター（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｘｉａｍｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から購入した。マウスは、センターで飼育して試験した。
【０２１４】
ハイブリドーマの作製
本発明者らは、標準的なｉｎ  ｖｉｖｏ免疫法およびＰＥＧ融合法を使用してハイブリドーマを作製した。この方法の詳細については、Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)を参照のこと。この方法を以下に簡単に説明する。
【０２１５】
マウスの免疫。前記のウイルス上清を、等容量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合して乳化した。この混合物を、１回の注射当りマウス当り３００μｌの用量でマウスの４つの脚の筋肉の複数の点に注射した。最初の免疫後の１５日目および２９日目に、この混合物を、ブースターとしての同じ用量で再びマウスに注射した。２回目のブースターの後、血液サンプルをマウスから採取し、赤血球凝集抑制試験により阻害力価を測定した。力価が１：６４０に到達したとき、マウス脾臓を採取し、融合実験を実施した。別のブースターを、融合実験の７２時間前に尾静脈中にマウス当り５０μｌの用量で注射した。１０個の融合プレートを作製した。
【０２１６】
融合。最も高いＨＩタイターを有するマウス脾臓をマウスミエローマ細胞と融合した。最初に脾臓をすり砕いて脾臓細胞懸濁液を得た後、これを対数期増殖にあるＳＰ２／０のマウスミエローマ細胞と、１０個の脾臓細胞対１個のミエローマ細胞の比率で融合した。ＰＥＧ１５００の存在下で１分間、細胞を融合した。次いで、１００ｍｌの融合細胞溶液を１０枚の９６ウェルプレートで培養した。融合培地は、ＨＡＴおよび２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０完全培地であった。所望の抗原特異性を有するクローンを、ＨＩ試験によってスクリーニングし、安定なモノクローナル抗体を産生している細胞系を、３ラウンドのクローニング後に得た。
【０２１７】
ハイブリドーマのスクリーニング。融合細胞を、１０日間９６ウェル細胞プレート上で培養した。細胞上清を取り出してＨＩ試験を実施した。陽性のクローンを含むウェルを、この細胞系により分泌される抗体が、安定してＹｕ２２ウイルス株とニワトリ血液間の凝集を抑制できるまでさらに培養した。
【０２１８】
スクリーニングの結果。６つのモノクローナル抗体細胞系、２Ｆ２、３Ｇ４、３Ｃ８、４Ｄ０１、８Ｈ５および１０Ｆ７が得られた。
【０２１９】
ハイブリドーマの培養。モノクローナル抗体を産生できる安定な細胞系を、９６ウェルプレートを用いて最初ＣＯ２インキュベーターで培養し、次いで、２４ウェルプレートへ移し、その後さらに増殖するために５０ｍｌの細胞培養フラスコへ移した。細胞を細胞フラスコから採取し、マウス腹腔に注射した。７〜１０日後にマウス腹腔から腹水を抜き取った。
【０２２０】
モノクローナル抗体の精製
腹水を５０％硫酸アンモニウムで沈澱させ、次いで、ｐＨ７．２のＰＢＳを用いて透析し、ＨＰＬＣによるＤＥＡＥカラムで精製して精製モノクローナル抗体を得た。精製モノクローナル抗体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。
【０２２１】
モノクローナル抗体のウイルスＨＩアッセイ
異なるウイルス亜型に属するヴェトナム、インドネシア、マレーシア、タイ、香港、中国、ヨーロッパなどからの３４株のＨ５Ｎ１ウイルス（Chen et al. PNAS, 103: 2845 (2006)）および１４株の非Ｈ５ウイルス（Ｈ１〜Ｈ１３、ニワトリＮＤＶ）を選択し、ＨＩアッセイを使用してウイルスと選択したモノクローナル抗体との反応性を試験した。この結果を表１および２に示す。結果は、Ｈ５モノクローナル抗体のすべての５つの系統がＨ５ウイルスに対する良好な特異性を有し、非Ｈ５ウイルスとは反応しないことを示した。Ｈ５ウイルス株との反応活性に関しては、反応特異性はそれぞれのモノクローナル抗体で異なった。３Ｇ４の最も狭い反応スペクトルを除いて、他の４つのモノクローナル抗体のウイルスに対する反応スペクトルは、すべて１００％に近いかまたは１００％であった。
【０２２２】
【表１】
2009524434.tif 000003
【０２２３】
【表２】
2009524434.tif 000004
【０２２４】
モノクローナル抗体とウイルス間の中和試験
Ｈ５Ｎ１ウイルスとの上記モノクローナル抗体の中和活性を、マイクロウェル中和試験によって検出した（Hulse-Post et al., PNAS,102:10682-7, (2005)）。表３の結果は、モノクローナル抗体８Ｈ５がすべてのＨ５Ｎ１ウイルス株に対して良好な中和活性を有していたことを示している。
【０２２５】
【表３】
2009524434.tif 000005
【０２２６】
実施例２
亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルス用のＨＡ抗原検出キットのアセンブリ（酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する）
キットは、サンプル中の亜型Ｈ５インフルエンザウイルスのＨＡ抗原を検出するために二重抗体サンドイッチ法を使用した。最初に、亜型Ｈ５インフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対するモノクローナル抗体を、キットボックス中のポリエチレンマイクロウェルプレート表面に事前に結合させた。ＨＡ抗原を含む亜型Ｈ５インフルエンザウイルスを事前に溶解後、マイクロウェルに添加した。事前に結合したモノクローナル抗体がＨＡ抗原を捕捉する。次いで、酵素標識モノクローナル抗体をウェルに添加し、抗原と結合する。最後に結合結果を、酵素によって触媒される基材の色の変化により可視化した。サンプルがいかなるインフルエンザウイルス抗原も含まないか、またはウイルスが亜型Ｈ５インフルエンザウイルスでなかった場合、基材は色が変化しない。サンプルは動物排泄物、口および鼻腔の分泌物、完全なウイルス、またはニワトリ胚で培養された溶解したウイルスであってもよい。
【０２２７】
ＥＬＩＳＡプレートの調製
亜型Ｈ５インフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対するモノクローナル抗体は、キットのポリエチレンマイクロウェルプレート表面に事前に結合されている。モノクローナル抗体を、３７℃で終夜、１０ｎＭリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ＝７．４）中でインキュベートしてプレートに事前に結合させた後、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ  ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄し、乾燥し、シール溶液（１０ｍＭ  ＰＢＳ＋２％ゼラチン）で３７℃で２時間シールした。次いで、プレートを再び乾燥し、真空中で包装して、検出キットのＥＬＩＳＡプレート（８×１２ウェル）を製作した。
【０２２８】
検出キット用の他の成分の調製
ウイルス溶解溶液の組成物：
溶解緩衝液Ａ（ＬＢ−Ａ）：６％ＣＨＡＰＳ＋２％Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％Ｔｗｅｅｎ−８０；
溶解緩衝液Ｂ（（ＬＢ−Ｂ）：１００ｍＭ  ＰＭＳＦ、イソプロピルで溶解し、最終作用濃度は２ｎＭであった。
細胞溶解緩衝液Ｃ（ＬＢ−Ｃ）：１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４。
酵素標識試薬：抗ＨＡモノクローナル抗体をワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識し、使用のために適当な濃度に希釈した。
陽性対照：不活化Ｈ５Ｎ１Ｙｕ２２ウイルス株を、陽性対照として適当なタイターで使用した。
陰性対照：溶解緩衝液Ａを陰性対照として使用した。
発色緩衝液Ａ：発色緩衝液Ａ：１３．４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４１２Ｈ２Ｏ＋４．２ｇ／Ｌ  クエン酸水性溶液＋０．３ｇ／Ｌ  過酸化尿素。
発色緩衝液Ｂ：０．２ｍＭ／Ｌ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）＋２０ｍＭ／Ｌ  ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）。
停止緩衝液：２Ｍ濃硫酸
濃縮洗浄緩衝液：２０×ＰＢＳＴ
マイクロプレートシーリングフィルム：シート２枚
ジッパー付バッグ：１個
取り扱い説明書：１枚
【０２２９】
検出手順
溶液調製：使用のために、５０ｍｌの濃縮洗浄緩衝液（２０×）を蒸留水または脱イオン水で１０００ｍｌに希釈した。
【０２３０】
番号付け：サンプルにマイクロプレート配列に従って番号を付けた。３つの陰性対照ウェル、２つの陽性対照ウェルおよび１つのブランク対照ウェルをすべてのプレート上にセットした（サンプルおよび酵素標識試薬はブランク対照ウェルには添加せず、ブランク対照ウェルに対する残りの工程は、他のウェルと同じであった）。
【０２３１】
サンプルの処理および適用
サンプルが液体（元のサンプル、ニワトリ胚培養サンプル、細胞培養サンプルを含む）であった場合：１００μｌ  ＬＢ−Ａ＋４μｌのＬＢＢの比率のＬＢ−ＡとＬＢ−Ｂの混合物の適切な量を調製した。最初に１００μｌのサンプルを、プレートのそれぞれウェルに添加し、次いで、１００μｌのＬＢ−ＡおよびＬＢ−Ｂの調製した混合物を添加した。
【０２３２】
サンプルが乾燥スワブサンプルであった場合：１ｍｌのＬＢ−Ａ、４０μｌのＬＢ−Ｂおよび１ｍｌのＰＢＳを混合してサンプル管に添加した。サンプルを攪拌して溶液に溶解し、室温で３０分間インキュベートした。混合物を懸濁するために再び攪拌し、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り出し、試験のためにサンプルとして１００μｌの上清をウェルに添加した。
【０２３３】
サンプルが乾燥動物排泄物であった場合：１ｍｌのＬＢ−Ａ、４０μｌのＬＢ−Ｂおよび１ｍｌのＰＢＳを混合し、サンプル管に添加した。乾燥動物排泄物を溶液中に懸濁して、１０％（ｗ／ｖ）のサンプル懸濁を作製した。攪拌後にサンプルを溶解し、室温で３０分間インキュベートした。混合物を懸濁するために再攪拌し、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、上清を取り出し、試験のためにサンプルとして１００μｌの上清をウェルに添加した。
【０２３４】
陰性および陽性対照ウェルを、検出実験ごとに含まなければならない。１００μｌの対照溶液を、それぞれの対照ウェルに添加しなければならない。
【０２３５】
インキュベーション：マイクロプレートシーリングフィルムを用いてプレートをシールし、プレートシェーカーを高速または適度な速度に設定して、室温（２５〜２８℃）で６０分間プレートを振盪した。
【０２３６】
洗浄：シーリングフィルムを注意深く取り除き、プレート洗浄器でプレートを５回洗浄した後、乾燥した。
【０２３７】
酵素の添加：１００μｌの酵素標識試薬を、各々の適切なウェルに添加した。
【０２３８】
インキュベーション：プレートをシーリングフィルムでシールし、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２３９】
工程６を繰り返す。
【０２４０】
発色反応：それぞれ５０μｌの発色緩衝液Ａおよび発色緩衝液Ｂを、それぞれのウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪して、これらをよく混合し、混合物を３７℃で３０分の発色反応の間光から遠ざけた。
【０２４１】
検出：１滴の停止緩衝液（５０μｌ）を各ウェルに添加し、穏やかに振盪してよく混合した。各ウェルのＯＤ値を、４５０ｎｍの単一波長で（ブランク対照を必要とした）または４５０ｎｍ／６３０ｎｍの二重波長でプレートアナライザーを用いて測定した。
【０２４２】
結果の評価
ａ）陰性対照の標準範囲：通常の条件下で、陰性ウェルのＯＤ値は０．１を超えなかった（すべての陰性対照ウェルのＯＤ値が０．１を超える場合、これは廃棄する。すべての陰性対照ウェルのＯＤ値が０．１を超える場合、実験を繰り返さなければならない。陰性対照ウェルのＯＤ値が０．０３未満であった場合、ＯＤ値は０．０３とみなされる）。
ｂ）陽性対照の標準範囲：通常の条件下で、陽性対照のＯＤ値は０．５を下回らないはずである。
ｃ）カットオフ値の決定（低いケース）：０．１５を陰性対照ウェルの平均ＯＤ値に加えた。
ｄ）陽性反応の決定：ＯＤ値≧カットオフの場合、これはＨ５トリインフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対し陽性の反応であった。
ｅ）陰性反応の決定：ＯＤ値＜カットオフの場合、これは、Ｈ５トリインフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対し陰性の反応であった。
【０２４３】
臨床サンプルの検出試験
本キットを、すべての種類のＨ５および非Ｈ５ウイルスサンプルを検出するために使用し、結果を表４に示す。キットは、非常に良好な検出感度および特異性を有することを示した。
【０２４４】
【表４】
2009524434.tif 000006
【０２４５】
実施例３
亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスの抗ＨＡ抗体用検出キット（ＥＬＩＳＡ）のアセンブリ
このキットは、血清サンプル中の特異的な抗ＨＡ抗体を検出するために競合法を使用した。最初に、亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対するモノクローナル抗体を、キットのマイクロウェルプレート表面に事前に結合させた。次に組換えにより発現された亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのＨＡ抗原を、事前に結合させた抗体に結合した。血清サンプルおよび酵素標識モノクローナル抗体をプレートに添加したとき、サンプル中の特異的抗体および酵素標識モノクローナル抗体が、プレート上の抗原に対する結合を競合する。血清サンプルが、ＨＡ抗原に対する酵素標識モノクローナル抗体の結合を顕著に阻害した場合、これはサンプルが特異的な抗ＨＡ抗体を含んでいたことを示すであろう。サンプルが抗ＨＡ抗体を含まない場合、またはそれが亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスに対する抗体でなかった場合、酵素標識モノクローナル抗体と抗原間の反応は阻害されないであろう。
【０２４６】
ＥＬＩＳＡプレートの調製
亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対するモノクローナル抗体を、キットのポリエチレンマイクロウェルプレート表面に事前に結合させた。モノクローナル抗体を、１０ｎＭリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ＝７．４）中、３７℃で終夜インキュベートして結合し、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ  ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１回洗浄し、乾燥後、シーリング溶液でシールした。これを組換え型ＨＡ抗原の結合のために再び乾燥した。組換え型のＨＡ抗原を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で希釈後、１００μｌの希釈溶液を抗体を事前に結合したプレートの各ウェルに添加し、これを３７℃で２時間インキュベートし、１回洗浄して２時間シールし、次いで、真空中で包装してキットの完成ＥＬＩＳＡプレート（８×１２ウェル）にした。
【０２４７】
キットの他の成分の調製
ａ）酵素標識試薬：モノクローナル抗体を、ＨＲＰを有するＨ５インフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対し標識した。標識抗体は、試薬を作製するために適当な希釈で保存した。
ｂ）陽性対照：Ｈ５インフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対するモノクローナル抗体の適当な濃度を陽性対照として使用した。
ｃ）陰性対照：１００％仔ウシ血清（ＮＢＳ）を陰性対照として使用した。
ｄ）発色緩衝液Ａ：１３．４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ＋４．２ｇ／Ｌ  クエン酸水性溶液＋０．３ｇ／Ｌ  過酸化尿素
ｅ）発色緩衝液Ｂ：０．２ｍＭ／Ｌ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）＋２０ｍＭ／Ｌ  ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
ｆ）停止緩衝液：２Ｍ濃硫酸
ｇ）濃縮洗浄緩衝液：２０×ＰＢＳＴ。
ｈ）マイクロプレートシーリングフィルム：２枚
ｉ）ジッパー付バッグ：１個
ｊ）取り扱い説明書：１枚
【０２４８】
検出手順
ａ）液体の調製：今後の使用のために、５０ｍｌの濃縮洗浄緩衝液（２０×）を蒸留水または脱イオン水で１０００ｍｌに希釈した。
ｂ）番号付け：サンプルにマイクロプレート配列に従って番号を付けた。３つの陰性対照ウェル、２つの陽性対照ウェルおよびブランク対照ウェルをすべてのプレート上にセットした（サンプルおよび酵素標識試薬は、ブランク対照ウェルには添加せず、対照ウェルに対する残りの工程は、サンプルに対するのと同じであった）。
ｃ）サンプルの適用：５０μｌのサンプル、陰性対照および陽性対照を適切なウェルに添加した。
ｄ）酵素の添加：５０μｌの酵素標識試薬を適切なウェルに添加した。
ｅ）インキュベーション：ウェル中の溶液を混合後、プレートをシーリングフィルムでシールし、次いで、これを３７℃で６０分間インキュベートした。
ｆ）洗浄：シーリングフィルムを注意深く取り除き、プレートをプレートウォッシャーで５回洗浄後、乾燥した。
ｇ）発色反応：それぞれ５０μｌの発色緩衝液Ａおよび発色緩衝液Ｂを各ウェルに添加し、穏やかに振盪してよく混合した。混合物を３７℃で１５分の発色反応の間光から遠ざけた。
ｈ）検出：１滴の停止緩衝液（５０μｌ）を各ウェルに添加し、穏やかに振盪してよく混合した。各ウェルのＯＤ値を、４５０ｎｍの単一波長で（ブランク対照を必要とした）または４５０ｎｍ／６３０ｎｍの二重波長でプレートアナライザーを用いて測定した。
【０２４９】
結果の評価
ａ）陰性対照の標準の範囲：通常の条件下で、陰性対照のＯＤ値は０．１を下回らなかった。
ｂ）陽性対照の標準の範囲：通常の条件下で、陽性対照のＯＤ値は０．１を超えるべきでない。
ｃ）カットオフ値の決定  カットオフ値＝陰性ウェルの平均ＯＤ値の半分。
ｄ）陽性の反応の決定：サンプルがＯＤ値＜カットオフの場合、サンプルは、抗ＨＡ抗体に関して陽性であった。
ｅ）陰性反応の決定：サンプルのＯＤ値≧カットオフの場合、サンプルは、抗ＨＡ抗体に関して陰性であった。
【０２５０】
臨床サンプルの検出試験
Ｈ５抗体キットをヒトおよびニワトリ血清サンプルを試験するために使用した。表５は、キットが非常に良好な検出感度および特異性を有したことを示す。
【０２５１】
【表５】
2009524434.tif 000007
【０２５２】
実施例４
亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルス用のＨＡ抗原検出キットのアセンブル（金コロイド標識方法）
試験紙は、金コロイドイムノクロマトグラフィー技術を使用する新世代の診断試薬であった。試験することができるサンプルには、動物排泄物、口および鼻腔の分泌物、完全なウイルスまたはニワトリ胚で培養された溶解したウイルスなどが含まれる。製品は単回使用用に精巧に設計されており、簡単で、安全で、信頼性が高く、かつ汚染を生じない。これはこれ自体に精度管理を含み、追加の試薬を必要としなかった。表示された結果は明確であった。反応は迅速であり、全操作には３０分のみしか必要としなかった。
【０２５３】
試験紙は、ニトロセルロースフィルター上の試験領域に抗ＨＡモノクローナル抗体および対照領域にヤギ抗マウスＩｇＧを含んでいた。試験時に、サンプル中のＨ５インフルエンザウイルスおよび金コロイド標識抗ＨＡモノクローナル抗体（Ａｂ−Ａｕ）は、複合体（Ａｇ−Ａｂ−Ａｕ）を形成し、複合体は層流剥離効果によりメンブレンに沿って移動し、これは試験領域で抗ＨＡモノクローナル抗体と二重抗体サンドイッチ免疫複合体を形成することができる。陽性サンプルである場合、それぞれ試験的領域および対照領域で赤いラインを形成することができ；陰性サンプルである場合、対照領域で赤いラインをのみを形成することができる。
【０２５４】
キットの試験紙の調製：試験紙は、標準的方法を使用して調製された。
【０２５５】
キットは、試験紙、溶解緩衝液および取り扱い説明書を含んでいた。
【０２５６】
操作手順
ａ）サンプル処理および適用
ｉ）サンプルが液体（元のサンプル、ニワトリ胚培養サンプル、細胞培養サンプルを含む）であった場合：
１００μｌ  ＬＢ−Ａ対４μｌ  ＬＢ−Ｂ比率の適切な量のＬＢ−ＡおよびＬＢ−Ｂの溶解混合物を調製した。プレートの各ウェルに１００μｌのサンプルを添加し、次いで、各ウェルに７０μｌの溶解混合物を添加した。
ｉｉ）サンプルが乾燥スワブサンプルであった場合：
１ｍｌのＬＢ−Ａ、４０μｌのＬＢ−Ｂおよび１ｍｌのＰＢＳを混合し、サンプル管に添加した。サンプルを攪拌して溶解した後、室温で３０分間インキュベートした。この混合物を再懸濁のために再び攪拌し、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この上清を取り出し、７０μｌの上清を検出のために各ウェルに添加した。
ｉｉｉ）サンプルが乾燥動物排泄物であった場合：
１ｍｌのＬＢ−Ａ、４０μｌのＬＢ−Ｂおよび１ｍｌのＰＢＳを混合し、サンプル管に添加した。乾燥動物排泄物を混合物中に懸濁して、１０％（ｗ／ｖ）のサンプル懸濁液を作製した。攪拌後、このサンプルを溶解して室温で３０分間インキュベートした。この混合物を再懸濁のために攪拌後、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り出し、７０μｌの上清を試験のために各ウェルに添加した。
ｂ）７０μｌのサンプルをサンプルローディングサイトに少しずつ添加し、次いで、室温に放置した。
【０２５７】
結果の評価：結果は３０分以内に観察した。
【０２５８】
結果は２本の赤いラインが出現した場合は陽性であり、精度管理ラインのみが出現した場合は陰性であり、赤いラインが出現しない場合は無効であった。図１に試験紙を使用した検出結果を示した。
【０２５９】
実施例５
亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルス用の抗ＨＡ抗体検出キットのアセンブル（金コロイド標識方法）
試験紙は、ニトロセルロースフィルター上の試験領域に抗ＨＡモノクローナル抗体および対照領域にヤギ抗マウスＩｇＧを含んでいた。グラスファイバー上に、金コロイドで標識した凍結乾燥抗ＨＡモノクローナル抗体および亜型Ｈ５インフルエンザの組換えにより発現されたＨＡ抗原が存在していた。競合法を適用して、サンプル中の亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルス抗ＨＡ抗体を検出した。抗ＨＡ抗体がサンプル存在する場合、これは金コロイド標識抗ＨＡモノクローナル抗体と競合し、したがって金コロイド標識抗体およびＨＡ抗原の複合体の形成を阻止し、色は発色しないであろう；抗ＨＡ抗体が陰性である場合、複合体が形成されて色が発色するであろう。
【０２６０】
キットの試験紙の調製：試験紙は、標準的方法を使用して調製した。
【０２６１】
キットの組成物：キットは、試験紙および取り扱い説明書を含有していた。
【０２６２】
検出手順
試験紙を取出して７０μｌの血清サンプルをサンプルローディングサイトに少しずつ添加し、次いで、室温に放置した。結果を３０分以内に観察した。時間が３０分を越えた場合には結果は無効である。
【０２６３】
結果の評価
精度管理ラインのみが出現した場合は、結果は陽性であり、２つの赤いラインが出現した場合は陰性であり、赤いラインが出現しない場合は無効であった。図２にこのような試験結果を示した。
【０２６４】
実施例６
亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルス用のＨＡ抗原Ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡ検出キットのアセンブリ
試験紙を、ニトロセルロースフィルター上の試験領域において抗Ｈ５（ＨＡ）モノクローナル抗体で予備コーティングし、対照領域においてヤギ抗マウスＩｇＧで予備コーティングした。亜型Ｈ５インフルエンザウイルスを含む溶解サンプルを添加後、予備コーティングしたモノクローナル抗体がそれらを補足して抗原抗体複合体（Ａｂ−Ａｇ）を形成し、次いで、Ａｂ−Ａｇ複合体を結合するために酵素標識モノクローナル抗体（Ａｂ−ＨＲＰ）を添加し、抗体−抗原−酵素標識抗体複合体（Ａｂ−Ａｇ−Ａｂ−ＨＲＰ）が形成され、次いで、酵素触媒基質呈色反応によって結果を観察した。亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスが存在した場合、試験領域および対照領域両方で基質の発色が生ずるであろう。トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５が存在しない場合、試験領域は色を表示しないで、着色斑点のみが対照領域に形成されるであろう。
【０２６５】
浸透検出装置（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ）の調製
ニトロセルロースメンブレンおよび水を吸収するフィルターペーパーを平底支持体上に置いた。中央にウェルを有する適合するカバーを底部支持体上に置いた。カバー上の開口部に適合する形状を有するフローコントロールユニットは、開口部に適合した。フローコントロールユニットは、サンプルおよび対照をそれぞれロードするための２つのウェルを有する。ニトロセルロースメンブレンおよびフィルターペーパー上のサンプルの流れを規制するために、フローコントロールユニットの底部を底部支持体に対してぴったりと押圧した。フローコントロールユニット中で、抗Ｈ５（ＨＡ）モノクローナル抗体を試験領域上へコーティングし、ヤギ抗マウスＩｇＧをコントロール領域上へコーティングした。この試験紙を１時間空気乾燥し、真空中で包装して浸透検出装置にした。
【０２６６】
キットの組成物
本キットは、次の品目を含んでいた：
ａ）浸透検出装置
ｂ）サンプル処理装置：その上にネジ止めされたフィルターキャップを有するボトル；フィルターキャップは、その中央に溶液をこれを通して濾過することができるフィルターを含んでいた。
ｃ）酵素標識試薬：ＨＲＰを有する抗Ｈ５（ＨＡ）モノクローナル抗体を標識し、適当な濃度に希釈して酵素標識試薬を作製した。
ｄ）溶解緩衝液：３％ＮＰ４０＋１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋４０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４。
ｅ）洗浄緩衝液：２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋２０ｍＭのＥＤＴＡ＋０．２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０＋０．１％プロクリン３００（Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００）＋１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ＋５ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４。
ｆ）発色緩衝液：３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）メンブレン用の液体基質システム。
ｇ）停止緩衝液：Ｈ２Ｏ中の５０ｍＭクエン酸。
ｈ）取り扱い説明書
【０２６７】
検出手順
ａ）サンプル処理および適用：
２００μｌのサンプルを、各サンプル処理ユニットに添加した。８滴の溶解緩衝液を加えて十分に混合した。次いで、すべての溶解したサンプルを、フィルターキャップを通してサンプル処理ユニットから絞り出し、検出ウェルにロードした。サンプルが十分に吸収された後（約２５分）、フローコントロールユニットを取り外した。
ｂ）洗浄：５滴の洗浄緩衝液を添加し、次いで、十分に吸収されるまで放置した。
ｃ）酵素の添加：４滴の酵素標識試薬を添加した。すべての酵素が吸収された後に、サンプルを反応さすために２分間放置した。
ｄ）洗浄：洗浄を２回行った。最初の洗浄で８滴の洗浄緩衝液を添加し、最初の洗浄の洗浄緩衝液が吸収された後に５滴を再び添加し、次いで、これらが十分に吸収されるまで放置した。
ｅ）着色：２滴の発色緩衝液を添加した。結果を液体が十分に吸収された２分後に観察した。５分後には結果は臨床的有意性を有していない。図３に、結果の評価のための概略図を示した。
【０２６８】
臨床サンプル検出。Ｈ５迅速検出キットを臨床サンプルを検出するために使用し、結果を表６に示す。結果は、本キットが非常に良好な感度および特異性を有することを示した。
【０２６９】
【表６】
2009524434.tif 000008
【０２７０】
実施例７
モノクローナル抗体のＬ鎖およびＨ鎖遺伝子の単離
１０７個のハイブリドーマ細胞を、半付着性培養フラスコ（ｓｅｍｉ−ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｌａｓｋ）で培養した。フラスコ内壁に付着している細胞を、内壁から吹き流して細胞を懸濁した。この細胞を４ｍｌの別の遠沈管へ移し、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。沈殿した細胞を採取し、１００μｌのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４５）に再懸濁し、次いで、別の１．５ｍｌの遠沈管へ移した。８００μｌのＴｒｉｚｏｌ（トリゾル）（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を管に添加し、穏やかに混合し、１０分間インキュベートした。２００μｌのクロロホルムを添加し、１５秒間攪拌し、１０分間インキュベートし、４℃で１５分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した。液体の上層を、別の１．５ｍｌの遠沈管へ移した。同容量のイソプロパノールの等容量を管に添加して混合し、１０分間インキュベートした。混合物を４℃で１０分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、６００μｌの７５％エタノールを添加して残渣を洗浄した。混合物を４℃で５分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、混合物の残りを６０℃で沈殿させ、５分間排気した。透明な沈殿物を、７０μｌのＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏに溶解した。この溶液を２本の管に分割した。逆転写用の１μｌのプライマーを各管に添加した。１本の管において、プライマーは、ＭＶＪｋＲ（５’−ＣＣｇＴＴＴ（Ｔ／ｇ）ＡＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＣＣＡｇＣＴＴｇｇＴ（ｇ／Ｃ）ＣＣ−３’）であった。これをＬ鎖の可変領域の遺伝子を増幅するために使用した。別の管におけるプライマーは、ＭＶＤＪｈＲ（５’−ＣｇｇＴｇＡＣＣｇ（Ｔ／Ａ）ｇｇＴ（Ｃ／ｇ／Ｔ）ＣＣＴＴｇ（ｇ／Ａ）ＣＣＣＣＡ−３’）であり、これをＨ鎖の可変領域の遺伝子を増幅するために使用した。１μｌのｄＮＴＰ（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓａｎｇｏｎ）を、各管に添加した。管を、７２℃で１０分間１０分間ウォーターバスに入れた。次いで、この管を、ただちに５分間氷浴に入れた。１０μｌの５×逆転写緩衝液、１μｌのＡＭＶ（１０ｕ／μｌ、Ｐｏｒｍｅｇａ）および１μｌのＲｎａｓｉｎ（４０ｕ／μｌ、Promega）を管に添加して混合した。ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を４２℃で実施した。
【０２７１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、抗体遺伝子のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域を増幅するために使用した。プライマーのセットは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏａｓｉａで合成された。その他の２つのプライマー、ＭＶＪｋＲおよびＭＶＤＪｈＲが、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏａｓｉａで設計されて合成された。上記の逆転写により合成された２つのｃＤＮＡ分子をテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃で５分間、９４℃で４０秒間、５３℃で１分間、７２℃で５０秒間を３５サイクル繰り返し、７２℃で１５分間であった。ＰＣＲ産物を採取し、ｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローニングした。ＰＣＲ産物をＳｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏａｓｉａで配列決定し、可変領域の配列はＢＬＡＳＴの配列比較により確認した。対応するアミノ酸配列は、遺伝子配列から推定した。
【０２７２】
上記の方法を使用して、抗体の可変領域遺伝子を６系統のトリインフルエンザモノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞系からクローニングし、この対応するアミノ酸配列を推定した。このプライマー配列を表７に示す。６系統のモノクローナル抗体および対応するアミノ酸の可変領域核酸のシリアルナンバーを表８に示す。相補的決定領域（ＣＤＲ）を表９に示す。
【０２７３】
【表７】
2009524434.tif 000009
【０２７４】
【表８】
2009524434.tif 000010
【０２７５】
【表９】
2009524434.tif 000011
【０２７６】
実施例８
８Ｈ５単鎖抗体の発現およびその活性の検出
８Ｈ５抗体遺伝子のＨ鎖およびＬ鎖の可変域遺伝子を、短いペプチド（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸と結合して、単鎖抗体をコードするＤＮＡフラグメントを形成した。８Ｈ５ＨＦ１／８Ｈ５ＨＲ１を、８Ｈ５のＨ鎖の可変領域ＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーの対として使用した。８Ｈ５ＫＦ１／８Ｈ５ＫＲ１を、８Ｈ５のＬ鎖の可変領域ＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマー対として使用した。これらのプライマー配列を表１０に示す。増幅したＤＮＡフラグメントを回収し、別のラウンドのＰＣＲ増幅によるオーバーラッピングイクステンション（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を実施するために、互いにプライマーおよびテンプレートとして使用した。少数の全長単鎖抗体ＤＮＡフラグメントが得られた。次いで、全長ＤＮＡフラグメントをテンプレートとして使用し、多数の全長ＤＮＡフラグメントを増幅するために８Ｈ５ＨＦ１／８Ｈ５ＫＲ１をプライマーとして使用した。増幅されたＤＮＡフラグメントを回収し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して原核生物発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７にクローニングした。宿主細胞としてＥＲ２５６６イー・コリを使用し、単鎖抗体タンパク質を標準的方法を用いて発現させた。発現したタンパク質は、不溶性封入体の形状であった。封入体を超音波処理によって分解し、生じた沈殿物を標準的方法を使用して精製した。精製した沈殿物を８Ｍ尿素に溶解した。この尿素溶液を１×ＰＢＳにゆっくり透析して、タンパク質を再生できるようにした。透析した溶液を、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、残存する沈殿物を除去した。最後に精製した単鎖抗体溶液の活性を試験した。
【０２７７】
【表１０−１】
2009524434.tif 000012
【０２７８】
【表１０−２】
2009524434.tif 000013
【０２７９】
競合ＥＬＩＳＡ法を、精製した８Ｈ５単鎖抗体の活性を測定するために適用した。トリインフルエンザポリクローナル抗体をポリスチレンプレートに予備コーティングしてＢＳＡでブロックし、５０μlの上記モノクローナル抗体溶液および５０μｌのトリインフルエンザＨ５ウイルスを試験ウェルに入れた。５０μｌの１×ＰＢＳおよび５０μｌの亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスを陰性対照ウェルに入れ、５０μｌのポリクローナル抗体溶液および５０μｌ亜型Ｈ５トリインフルエンザウイルスを陽性対照ウェルに入れた。ウェル中の溶液を穏やかに混合して３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＨＲＰ標識トリインフルエンザポリクローナル抗体を二次抗体として添加した。溶液をさらに０．５時間インキュベートし、発色緩衝液ＡおよびＢの添加後、３７℃で１５分間発色させた。発色反応を停止した後に、結果をマイクロプレートアナライザーで読み取った。陰性対照の平均値は１．８７１であり、陽性対照の平均値０．０８９であり、試験ウェルの平均値は０．５９７であった。この結果は、最初に精製した８Ｈ５単鎖抗体タンパク質は高い反応活性を有していることを示した。
【０２８０】
２６株のＨ５Ｎ１ウイルスをＨＩアッセイのために選んで、このウイルスと８Ｈ５単鎖抗体間の反応活性を同定した。２５μｌのＰＢＳを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。２５μｌの８Ｈ５単鎖抗体溶液（０．０８ｍｇ／ｍｌ）を、第１のウェルに添加し、十分に混合した。２５μｌの第１ウェルからの混合物を第２ウェルに添加し、以下同様に抗体を希釈した。２５μｌのそれぞれのウイルスを別々にウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、５０μｌの０．５％ニワトリ赤血球を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートして血液を凝集させる。この結果は、８Ｈ５単鎖抗体が試験した２６ウイルス株の１６株に対してＨＡ阻害活性を有することを示した（表１１）。
【０２８１】
実施例９
１０Ｆ７および４Ｄ１の単鎖抗体の発現およびこれらの活性試験
実施例８に記載しているように、それぞれの抗体のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域遺伝子を、短いペプチド（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸で結合して、単鎖抗体をコードするＤＮＡフラグメントを形成した。１０Ｆ７のＨ鎖の可変領域のＤＮＡフラグメントを増幅するための、プライマー対としての１０Ｆ７ＶＨＦ／１０Ｆ７ＶＨＲの使用。１０Ｆ７のＬ鎖の可変領域のＤＮＡフラグメントを増幅するための、プライマー対としての１０Ｆ７ＶＫＦ／１０Ｆ７ＶＫＲの使用。４Ｄ１のＨ鎖の可変領域のＤＮＡフラグメントを増幅するための、プライマー対としての４Ｄ１ＶＨＦ／４Ｄ１ＶＨＲの使用。４Ｄ１のＬ鎖の可変領域のＤＮＡフラグメントを増幅するための、プライマー対としての４Ｄ１ＶＫＦ／４Ｄ１ＶＫＲの使用。
【０２８２】
オーバーラップしている１０Ｆ７単鎖ＤＮＡフラグメントを増幅するための、プライマーとしての１０Ｆ７ＶＨＦ／１０Ｆ７ＶＫＲの使用。オーバーラップしている４Ｄ１のＨ鎖のＤＮＡフラグメントを増幅するための、プライマーとしての４Ｄ１ＶＨＦ／４Ｄ１ＶＫＲの使用。増幅されたＤＮＡフラグメントを回収し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して、同じ制限酵素での消化した原核生物発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７にクローニングした。宿主細胞としてイー・コリＥＲ２５６６を用いて、単鎖抗体タンパク質を標準的方法を使用して発現させた。発現したタンパク質は、不溶性封入体の形状でであった。封入体を超音波処理により分解し、生じた沈殿物を標準的方法を使用して精製した。精製した沈殿物を８Ｍ尿素に溶解した。この尿素溶液を、１×ＰＢＳ溶液にゆっくりと透析し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して残存している沈殿物を除去した。最終の精製した単鎖抗体溶液を活性について試験した。
【０２８３】
上述したＨＩアッセイを使用して、上記の精製した１０Ｆ７および４Ｄ１単鎖抗体活性を試験するために２６株のＨ５Ｎ１ウイルスを選択する。１０Ｆ７単鎖抗体の濃度は、１．０６ｍｇ／ｍｌで使用する。４Ｄ１単鎖抗体の濃度は、０．３４ｍｇ／ｍｌで使用する。４Ｄ１単鎖抗体は、ウイルス株の２３株に対してＨＡ阻害活性を示している。１０Ｆ７単鎖抗体は、ウイルス株の１４株に対してＨＡ阻害活性を示している（表１１）。
【０２８４】
【表１１】
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【０２８５】
ＨＩタイターは、２の「ｎ」乗に希釈する。「ｎ」は、表に示された数である。
【０２８６】
上記の精製１０Ｆ７単鎖抗体の活性を、中和法を用いて試験した。２００２年から２００６年の間に、香港、インドネシア、青海およびその他の地域でニワトリ、アヒルおよび種々の野鳥から単離した７株のウイルスを用いて、ＨＩアッセイによって１０Ｆ７の活性を試験した。抗体は、５株のウイルスに対して良好な中和活性を示した（表１２）。６４倍希釈で、抗体は宿主細胞のウイルス感染をなお阻止することができた。
【０２８７】
【表１２】
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【０２８８】
実施例１０
キメラ抗体の発現および抗体活性の試験
シグナルペプチドを、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域の遺伝子に付け加え、次いで、ヒトガンマ１  Ｈ鎖およびカッパーＬ鎖定常領域を含む真核生物の発現プラスミドにクローニングした。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨは、ヒトガンマ１  Ｈ鎖定常領域ＤＮＡ配列を含んでいた。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋは、カッパーＬ鎖定常領域を含んでいた。
【０２８９】
部分的なシグナルペプチドを有する８Ｈ５のＨ鎖可変領域配列を増幅するための、プライマー対としての８Ｈ５８ＣＨＦ１／８Ｈ５ＶＨＲの使用。増幅されたフラグメントをＰＣＲテンプレートとして使用し、８Ｈ５８ＣＨＦ２／８Ｈ５ＶＨＲを完全なシグナルペプチドを有する８Ｈ５のＨ鎖可変領域配列を増幅するためのプライマー対として使用した。増幅された配列を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨにクローニングした。得られたプラスミドは、ヒトマウスキメラＨ鎖に対する発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ８Ｈ５であった。部分的なシグナルペプチドを有する８Ｈ５のＬ鎖可変領域配列を増幅するための、プライマー対としての８Ｈ５８ＣＫＦ１／８Ｈ５ＶＫＲ１の使用。増幅されたフラグメントをＰＣＲテンプレートとして使用し、８Ｈ５８ＣＫＦ２／８Ｈ５ＶＫＲ１を、完全なシグナルペプチドを有する８Ｈ５のＬ鎖可変領域配列を増幅するためのプライマー対として使用した。増幅された配列を、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋにクローニングした。得られたプラスミドは、ヒトマウスキメラＬ鎖に対する発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ８Ｈ５であった。
【０２９０】
部分的なシグナルペプチドを有する１０Ｆ７のＨ鎖可変領域配列を増幅するための、プライマー対としての１０Ｆ７８ＣＨＦ１／１０Ｆ７ＶＨＲの使用。増幅されたフラグメントをＰＣＲテンプレートとして使用し、完全なシグナルペプチドを有する１０Ｆ７のＨ鎖可変領域配列を増幅するために、１０Ｆ７８ＣＨＦ２／１０Ｆ７ＶＨＲをプライマー対として使用した。増幅された配列を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨにクローニングした。得られたプラスミドは、ヒトマウスキメラＨ鎖に対する発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ１０Ｆ７であった。部分的なシグナルペプチドを有する１０Ｆ７のＬ鎖可変領域配列を増幅するための、プライマー対として１０Ｆ７８ＣＫＦ１／１０Ｆ７ＶＫＲの使用。増幅されたフラグメントをＰＣＲテンプレートとして使用し、１０Ｆ７８ＣＫＦ２／１０Ｆ７ＶＫＲを、完全なシグナルペプチドを有する１０Ｆ７のＬ鎖可変領域配列を増幅するためのプライマー対として使用した。増幅された配列を、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋにクローニングした。得られたプラスミドは、ヒトマウスキメラＬ鎖に対する発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ１０Ｆ７であった。
【０２９１】
部分的なシグナルペプチドを有する４Ｄ１のＨ鎖可変領域配列を増幅するための、プライマー対として４Ｄ１ＶＨＦ１／４Ｄ１ＶＨＲの使用。増幅されたフラグメントをＰＣＲテンプレートとして使用し、４Ｄ１ＶＨＦ２／４Ｄ１ＶＨＲを、完全なシグナルペプチドを有する４Ｄ１のＨ鎖可変領域配列を増幅するためのプライマー対として使用した。増幅された配列を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨにクローニングした。得られたプラスミドは、ヒトマウスキメラＨ鎖に対する発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ４Ｄ１であった。シグナルペプチドを有する４Ｄ１のＬ鎖可変領域配列を増幅するためのプライマー対として４Ｄ１ＶＫＦ／４Ｄ１ＶＫＲの使用。増幅された配列を、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋにクローニングした。得られたプラスミドは、ヒトマウスキメラＬ鎖に対する発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ４Ｄ１であった。
【０２９２】
図４に、３つのキメラ抗体に関する発現ベクター構造体の概略図を示す。
【０２９３】
２９３ＦＴ細胞にキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖を有するプラスミドを、リン酸カルシウム形質転換法で一緒に形質転換した。細胞培養の上清を採取し、飽和硫酸アンモニウムで沈殿して、最初の精製キメラ抗体（ｃＡｂ）を得た。ｃＡｂおよびマウスｍＡｂ溶液の濃度を、０．７μｇ／ｍｌに調整した。ウイルス株Ｃｋ／ＨＫ／Ｙｕ２２／０２をＨＩアッセイに使用して、抗体活性を試験した。結果は、３つのｃＡｂの活性は、そのそれぞれのマウスｍＡｂと同じであることを示した（図５）。
【０２９４】
２３のＨ５Ｎ１ウイルス株を選択して、最初に精製した１０Ｆ７および４Ｄ１ｃＡｂの活性を上記のＨＩアッセイによって試験した。結果は、両方のｃＡｂがすべて２３のウイルス株に対してＨＡ阻害活性を有することを示した（表１３）。
【０２９５】
【表１３】
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【０２９６】
さらにｃＡｂの活性を、免疫蛍光アッセイを使用して試験した。ガラススライドを、２４ウェル細胞培養プレートの中に入れた。昆虫ＳＦ２１細胞を、ガラススライド上に播種した。トリインフルエンザＨＡタンパク質は、昆虫細胞−バクロウイルス発現系によってＳＦ２１細胞で発現された。ＨＡタンパク質を発現している細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のポリホルムアルデヒドで固定し、ヤギ抗血清でブロックした。４Ｄ１または１０Ｆ７ｃＡｂを細胞に添加し、室温で１時間インキュベートした。特異的な抗ＨＢＶｃＡｂを陰性対照として使用した。蛍光標識ヤギ抗ヒト抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を二次抗体として添加し、半時間インキュベートした。細胞核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で１０分間染色した。染色したサンプルを蛍光顕微鏡下で観察した（Ｎｉｋｏｎ）。図６の結果は、４Ｄ１および１０Ｆ７ｃＡｂが、ＳＦ２１細胞で発現されたトリインフルエンザウイルスＨＡタンパク質に特異的に結合できることを示した。
【０２９７】
実施例１１
バクテリオファージディスプレイ７ａａペプチドライブラリ由来のｍＡｂへ結合する抗原部位をシミュレートする短いペプチドのスクリーニング
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃｏｍｐａｎｙのファージディスプレイ７ａａペプチドライブラリを、８Ｈ５ｍＡｂまたは３Ｃ８ｍＡｂに結合できる７ａａペプチドをスクリーニングするために使用した。スクリーニングは、製造業者の取り扱い説明書に従って実施した。このスクリーニング手順を以下に簡単に記述した。
【０２９８】
５０μｌのプロテインＡ−アガロース媒体（５０％水懸濁液）を、マイクロ遠心管に等分した。１ｍｌのＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）溶液を管に添加した。管を、穏やかにタブするかまたは揺り動かしてアガロース媒体を再懸濁した。管を３０秒間低速で遠心分離してアガロース媒体を沈殿させた。上清を注意深く除去した。沈殿したアガロース媒体を１ｍｌのブロッキング緩衝液に再懸濁し、時々の混合しながら４℃で６０分間インキュベートした。一方、２×１０１１ファージ粒子（元のファージライブラリの１０μｌに相当するもの）および３００ｎｇのｍＡｂを、ＴＢＳ緩衝液で最終容量２００μｌに希釈した。ｍＡｂの最終濃度は１０ｎｍであった。この溶液を室温で２０分間インキュベートした。ブロッキング反応後、媒体を低速の遠心分離により沈殿させ、次いで、１ｍｌのＴＢＳで合計４回洗浄し、毎回洗浄後に遠心分離を繰り返した。ファージ−ｍＡｂ混合物を洗浄した媒体に添加して穏やかに混合し、頻繁に混合しながら室温で１５分間インキュベートした。媒体を低速の遠心分離で沈殿させた。上清を捨てた。媒体を１０回１ｍｌのＴＢＴＳで洗浄した。次いで、媒体を１ｍｌの０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）および１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡに再懸濁し、室温で１０分間インキュベートして結合したファージ粒子を遊離した。この混合物を１分間遠心分離し、上清を別のマイクロ遠心管に注意深く取り出した。上清を直ちに１５０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和した。約１μｌの前記の溶液を、ファージのタイターを確認するために使用した。残りの溶液を、２０ｍｌの初期対数増殖期にあるＥＲ２７３８宿主細胞に添加した。宿主細胞を、３７℃で４．５時間振盪して培養した。細胞培養を、５０ｍｌの遠沈管へ移し、２０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清の上部８０％を採取し、６分の１容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０％ＰＥＧ−８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を添加した。この溶液を１時間の４℃にセットし、次いで、４℃で１５分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、沈殿したファージを２００μｌのＰＢＳに懸濁し、４℃で保存した。上述の手順を、別のスクリーニングに対して繰り返した。
【０２９９】
終夜培養したＥＲ２７３８宿主細胞を、１：１０の比率でＬＢ培地に希釈し、培養管に等分（１ｍｌ／管）した。ｍＡｂスクリーニングごとに、３ラウンドのスクリーニングを受けたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌ培養プレート上の１０個の青い単一コロニーのファージプラークを選択し、前記の培養管に接種した。細胞培養を、３７℃で４．５時間振盪しながらインキュベートした。この細胞培養を１．５ｍｌの遠沈管へ移し、１０分間１０，０００ｇで遠心分離した。２００μｌの上清を採取した。少量のＭ１３単離および精製試薬キット（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｈｕａｓｈｕｎ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）を使用し、製造業者の取り扱い説明書に従って、ファージｓｓＤＮＡを上清から単離した。挿入した７ａａペプチドの配列は、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｏｙａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．で入手し、表１４に示した。
【０３００】
【表１４】
2009524434.tif 000017
【０３０１】
実施例１２
７ａａペプチド活性の検出
８Ｈ５Ａ、８Ｈ５Ｅおよび３Ｃ８Ａの７ａａペプチドを含む３つのバクテリオファージを大量に増幅した。これらをＰＥＧで沈殿した後にＰＢＳに溶解した。ファージタイターは、１０１１と１０１２の間であった。マイクロプレートを、５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体８Ｈ５、４Ａ１、９Ｎ７および４Ｄ１１で予備コーティングした。プレートを、５％ミルクを含むＰＢＳでブロックした。３つのバクテリオファージを連続希釈して、プレートに添加した。反応を１時間続行した。次いで、プレートを５回洗浄した。１：５，０００希釈したマウス抗Ｍ１３／ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｍａｒｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）を二次抗体として添加し、０．５時間インキュベートした。反応が完了した後に結果を読みとった。ペプチド８Ｈ５Ａとモノクローナル抗体８Ｈ５の間の特異的反応は良好であり、８Ｈ５Ａと他の３つのモノクローナル抗体間の特異的反応は弱いことを示す結果を表１５に示す。８Ｈ５Ｅとモノクローナル抗体８Ｈ５の間の特異的反応は、比較的低かった。
【０３０２】
【表１５】
2009524434.tif 000018
【０３０３】
実施例１３
ファージディスプレイ１２ａａペプチドライブラリから、８Ｈ５ｍＡｂに結合する抗原部位をシミュレートする短いペプチドのスクリーニング
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃｏｍｐａｎｙのファージディスプレイ１２ａａペプチドライブラリを、８Ｈ５ｍＡｂに結合することができる１２ａａペプチドをスクリーニングするために使用した。スクリーニングは、製造業者の取り扱い説明書に従って実施した。詳細な実験手順は、実施例１１と同様であった。
【０３０４】
３ラウンドのスクリーニング後、約１μｌのファージ溶液を、ファージタイターを測定するために使用した。単一コロニーのファージプラークを選択し、対数期増殖のＥＲ２７３８細菌に接種した。接種した細菌培養を、３７℃で４．５〜５時間インキュベートした。次いで、これらを遠心分離して、ＥＬＩＳＡ試験用に上清を採取した。マウス８Ｈ５ｍＡｂを、１０μｇ／ｍｌの濃度でＥＬＩＳＡマイクロプレート上に固定した。ファージ溶液を一次抗体として使用した。１：５，０００希釈の抗Ｍ１３／ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｍａｒｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）を二次抗体として使用した。トリインフルエンザ抗体４Ｄ１  ｍＡｂ、１０Ｆ７  ｍＡｂおよび抗ＨＥＶ  Ｅ２  ８Ｃ１１  ｍＡｂを、マウスｍＡｂに対する陰性対照として使用した。図７に、良好な結合活性を示した１２のファージペプチドの試験結果を示す。この試験は、大部分のファージペプチドが標的８Ｈ５ｍＡｂに対して対照より３倍高いＯＤ値を有することを示し、このペプチドは良好な特異性を有すること示した。
【０３０５】
ファージＤＮＡは、製造業者の取り扱い説明書に従いファージｓｓＤＮＡ単離試薬キット（Ｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて単離した。単離したＤＮＡを配列決定した。１２個の１２ａａペプチドの核酸およびアミノ酸配列を得た（表１６）。
【０３０６】
【表１６】
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【０３０７】
実施例１４
１２ａａペプチド１２３または１２５およびペプチド２３９を含む融合タンパク質の発現ならびにそれらの活性の検出
融合タンパク質２３９−１２３および２３９−１２５に対する発現ベクターの作製
１２ａａペプチド１２３または１２５をペプチド２３９（これはＨＥＶ  ＯＲＦ２の残基３６８〜６０６由来の２３９アミノ酸フラグメントである）のｃ末端に結合して、ＰＣＲによって原核細胞発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２３（図８）およびｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２５（図９）を作製した。最初に、２３９遺伝子および１２ａａペプチド遺伝子用のプライマーを調製した。次いで、２３９遺伝子をテンプレートとして使用し、プライマー２３９−１２３Ｆ／２３９−１２３Ｒ１および２３９−１２５Ｆ／２３９−１２５Ｒ１を、それぞれ第１ラウンドのＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ産物を採取し、精製後、第２ラウンドのＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。第２ラウンドのＰＣＲ増幅で、プライマー２３９−１２３Ｆ／２３９−１２３Ｒ２および２３９−１２５Ｆ／２３９−１２５Ｒ２を、それぞれフラグメント２３９−１２３および２３９−１２５の作製のために使用した。作製されたフラグメント２３９−１２３および２３９−１２５を採取し、制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化してベクターｐＴＯ−Ｔ７にクローニングした。ベクターでイー・コリＥＲ２５６６を形質転換し、複製して制限酵素消化によって調べた。陽性の宿主細胞クローンは、組換え型の原核生物発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２３およびｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２５を含んでいた。
【０３０８】
【表１７】
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【０３０９】
融合タンパク質２３９−１２３および２３９−１２５の発現と精製
ｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２３およびｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２５ベクターを含むＥＲ２５６６の単一コロニーの各々を、２ｍｌのＫｎ耐性ＬＢ培地に接種した。この細菌培養を、ＯＤ６００値が約０．５に達するまで３７℃で振盪してインキュベートした。次いで、培養を１：１０００の比率で５００ｍｌのＬＢ培地に移し、ＯＤ６００値が約１．０に達するまでインキュベートした。次いで、５００μｌのＩＰＴＧを細菌培養に添加し、３７℃で４時間タンパク質の発現を誘導した。細菌を、４℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して採取した。上清を捨てた。細菌残渣を２０ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁し、氷上でインキュベートして、細菌を破壊するために超音波破壊処理を行った。超音波処理条件は以下とおりであった。作用時間：１０分；処理パルス：２秒間パルス処理して５秒間停止；パワー出力：７０％。超音波処理後、細菌溶液を１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を保存し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードするために、図１０および１１のレーン３）、残渣を２０ｍｌ  ２％Ｔｒｉｔｏｎに再懸濁し、３０分間振盪し、次いで、１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。Ｔｒｉｔｏｎ洗浄を１回繰り返した。次いで、上清を保存し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードするために、図１０および１１のレーン４）、残渣を２０ｍｌの２Ｍ尿素緩衝液に再懸濁し、３０分間振盪し、１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。再び上清を保存し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードするために、図１０および１１のレーン５）、残渣を２０ｍｌの４Ｍ尿素に再懸濁し、３０分間振盪し、次いで、１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。さらにまた上清を保存し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードするために、図１０および１１のレーン６）、残渣を２０ｍｌの８Ｍ尿素に再懸濁し、３０分間振盪し、次いで、１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を保存した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードするために、図１０および１１のレーン７）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードするサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためにすべての前記上清から調製した（図１０および図１１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、タンパク質は９０％の純度で８Ｍ尿素に大部分が溶解したことを示した。８Ｍ尿素タンパク質溶液を、勾配透析（８Ｍ尿素−４Ｍ尿素−２Ｍ尿素−ＰＢＳ）でＰＢＳに透析した。
【０３１０】
融合タンパク質２３９−１２３および２３９−１２５の活性の検出
直接ＥＬＩＳＡ法試験
最初の精製した融合タンパク質２３９−１２３および２３９−１２５を、濃度１０μｇ／ｍｌで３７℃で２時間、９６ウェルプレート上へ別々に固定した。その後、プレートを１回洗浄し、非特異的な結合部位をブロックするために、ＥＤブロッキング緩衝液で３７℃で２時間処理し、次いで、４℃で終夜処理した。次にブロッキング緩衝液を捨てた。その後、異なるマウスｍＡｂを、ウェル当り１００μｌでこのプレートに添加した。８Ｃ１１、７Ｈ８、３Ｃ８、８Ｈ５、１Ａ６、１３Ｅ１、１Ｄ８、１Ｇ２、３Ｇ４１、１３Ａ２、１１Ｈ８、４Ｄ１、１０ＨＤ４、１４Ｈ１２、６ＣＦ３、７Ｄ１、７Ｅ８、１０ＤＥ２、１６Ａ１２、３ＦＣ１、８Ｅ２、３Ｄ２、１０Ｄ１２２、１３Ｅ７を含む２４種のｍＡｂが存在した。８Ｃ１１  ｍＡｂは、特異的な抗２３９タンパク質抗体であった。８Ｈ５ｍＡｂを、１２ａａペプチドのスクリーニングに使用した。他の２２のｍＡｂは、トリインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に対する抗体であった。このｍＡｂを３７℃で１時間プレート中でインキュベートした。プレートを５回ＰＢＳＴで洗浄した。１００μｌのＧＡＭ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈）を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを５回ＰＢＳＴで洗浄した。発色溶液を色発現のために１０分間プレートに添加し、次いで、停止緩衝液を添加して発色反応を停止した。色の強度を、マイクロプレートリーダーで読み取った。図１２および１３は、融合タンパク質２３９−１２３および２３９−１２５は、それぞれ８Ｃ１１および８Ｈ５とのみ反応し、他のいずれのｍＡｂとも反応もしないことを示していた。この結果は、融合タンパク質２３９−１２３および２３９−１２５は、非常に良好な抗体特異性を有していることを示していた。
【０３１１】
実施例１５
ＨＢＶｃＡｇを有する１２ａａペプチド番号１２３および番号１２５の融合タンパク質の発現
融合タンパク質発現ベクターの作製
イー・コリで発現したＨＢＶｃＡｇのａａ１−１４９フラグメントを、ウイルス様粒子中にアセンブルすることができる。ａａ１−１４９フラグメントに対する遺伝子を、イー・コリ発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７に挿入した。次いで、フラグメントの７９位および８０位の２つのアミノ酸を、その核酸配列が制限酵素認識部位を含む置換基として働くアミノ酸で置換して、変異体ＨＢＶｃＡｇ発現プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔを作製した。ＨＢＶｃＡｇは、実質的に免疫原性である。ＨＢＶｃＡｇの内部のＭＩＲ（主要な免疫優性領域、ａａ  ７８−８３）に融合された外来のペプチドは、粒子にアセンブルするＨＢＶｃＡｇの能力を変えないが、このペプチドエピトープは粒子表面から暴露するであろう。
【０３１２】
ペプチド１２３および１２５の１〜５コピーを、それぞれＨＢｃＡｇのアミノ酸７９位および８０位に挿入して、それぞれＨＢｃ−１２３およびＨＢｃ−１２５と呼ばれる一連の融合タンパク質を得た。１２ａａペプチドおよびベクターｐＣ１４９−ｍｕｔの配列に基づき、１２ａａペプチドの配列を含む５’−末端プライマーおよび３’−末端プライマー１４９ＭＲＰを設計した（表１８、下線を付した部分は、挿入されたペプチド配列であった）。プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔをテンプレートとして使用し、プライマーＨＢｃ１２３Ｆ２／ＨＢｃＲおよびＨＢｃ１２３Ｆ２／ＨＢｃＲを、第１ラウンドのＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ産物を回収し精製して、テンプレートとして使用し、プライマーＨＢｃ１２３Ｆ１／ＨＢｃＲおよびＨＢｃ１２３Ｆ１／ＨＢｃＲを、第２ラウンドのＰＣＲ増幅に使用した。この結果として、１２ａａペプチド配列に結合するＣ１４９ａａ８１−１４９を作製した。フラグメントをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して精製した。プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して精製し、１２ａａペプチド配列を含むＣ１４９フラグメントに結合した。発現および制限酵素消化分析のために、この結合した産物でイー・コリＥＲ２５６６を形質転換した。分析では、挿入された１２ａａペプチド遺伝子の１コピーを有する、それぞれｐＣ１４９−ｍｕｔ−１２３およびｐＣ１４９−ｍｕｔ−１２５と呼ばれるプラスミドを選択した。このプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。１２ａａペプチドを含むフラグメントをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、消化したプラスミドと結合した。１２ａａペプチドの２コピーを含む組換え型の原核生物発現プラスミドを選択し、それぞれｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｄ１２３およびｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｄ１２５と称した。同様に、ＰＣ１４９−ｍｕｔ−Ｔ１２３、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｆ１２３、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｑ１２３およびｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｔ１２５、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｆ１２５、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｑ１２５プラスミドを含む、１２ａａペプチドの３、４および５コピーを含む組換え型の原核生物発現ベクターを作製した。組換え型のプラスミドの構造を図１５および１６に示す（プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔ−３２３およびｐＣ１４９−ｍｕｔ−１２５のみを例として示した）。
【０３１３】
【表１８】
2009524434.tif 000021
【０３１４】
融合タンパク質の発現および精製
プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｄ１２３、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｔ１２３、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｆ１２３、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｑ１２３、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｄ１２５、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｔ１２５、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｆ１２５、ｐＣ１４９−ｍｕｔ−Ｑ１２５によって発現された融合タンパク質は、それぞれＤ１２３、Ｔ１２３、Ｆ１２３、Ｑ１２３、Ｄ１２５、Ｔ１２５、Ｆ１２５、Ｑ１２５と呼ぶ。これらの８つのプラスミドそれぞれを含むＥＲ２５６６細菌を、それぞれ２ｍｌのＫｎ耐性ＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００値が０．５に達するまで３７℃で振盪した。次いで、この培養を１：１０００の比率で、５００ｍｌのＬＢ培地に移し、ＯＤ６００値が約０．８に達するまでインキュベートした。その後、５００μｌのＩＰＴＧを、細菌培養に添加して１８℃で２０時間タンパク質の発現を誘導した。細菌を４℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して採取した。上清は捨てた。細菌残渣を２０ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁し、氷上でインキュベートし、細菌を破壊すために超音波破壊処理を行った。超音波処理の条件は以下とおりであった。作用時間：１０分；処理パルス：２秒間パルス処理して５秒間停止；パワー出力：７０％。超音波処理の後、細菌溶液を１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を保存し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動した。結果は、すべての融合タンパク質は上清中に存在していたことを示した（図１７）。
【０３１５】
上記の上清は、なお多くの夾雑物を含みさらに精製が必要であった。これらのタンパク質は、適切な条件下で粒子にセルフアセンブリすることができた。これらのタンパク質のセルフアセンブリ条件も、これらのタンパク質のさらなる精製の間に考慮した。次の手順をタンパク質をさらに精製するために使用し、タンパク質が粒子にセルフアセンブリするのを促進した。すなわち、飽和硫酸アンモニウムを、全容量の２０％の最終濃度になるように添加し；次いで、混合物を３０分間、氷上でインキュベートし；混合物を１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し；上清を捨て；残渣を、５％のβ−メルカプトエタノールを含むＣＢ緩衝液に再懸濁し；３７℃で３０分間振盪して１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を採取し、ＰＢ５．８緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）に透析した。緩衝液は８時間毎に交換した。緩衝液を６回交換後、透析した溶液を採取して１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を採取し、単離したタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確かめた。この方法を使用して、タンパク質を最初に２０％飽和硫酸アンモニウム沈殿で精製し、次いで、５％のβ−メルカプトエタノールを含むＣＢ緩衝液を、このタンパク質が二量体にアセンブルするのを促進するために使用し、次いで、低いｐＨおよび高い塩の状況下でタンパク質粒子を形成した。さらにまたタンパク質を、これらの条件下でさらに精製することができた（図１８）。
【０３１６】
上記の方法によって精製した８つの融合タンパク質を、２％リンタングステン酸で陰性染色して電子顕微鏡下で直接観察した（図１９）。アセンブルした粒子は、均一な中空の球体（いくつかの粒子は、内部が充填されていた）としては示された。この粒子は２つの大きさがあり、１つは３５ｎｍの直径を有し、他のものは２０ｎｍを有していた。
【０３１７】
実施例１６
ＨＢｃ−１２３およびＨＢｃ−１２５融合タンパク質の活性をＥＬＩＳＡによって試験した
８つの融合タンパク質を、３７℃で２時間、１０μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレート上へ別々に固定した。その後、プレートを１回洗浄して、非特異的な結合部位をブロックするために３７℃で２時間次いで、４℃で終夜、ＥＤブロッキング緩衝液で処理した。その後に１００μｌの８Ｈ５ｍＡｂを各ウェルに添加した。このｍＡｂを、３７℃で１時間プレート中でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。１００μｌのＧＡＭ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈）を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。発色溶液を色発現のために１０分間プレートに添加した。次いで、停止緩衝液を添加して発色反応を停止した。色の強度を、マイクロプレートリーダーで読み取った。図２０は、すべての８つの融合タンパク質が８Ｈ５ｍＡｂに特異的に結合したことを示していた。
【０３１８】
Ｑ１２３およびＤ１２５タンパク質を、抗体の結合特異性について試験した。この２つのタンパク質を、１０μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で２時間９６ウェルプレート上へ別々に固定した。プレートを１回洗浄し、非特異的な結合部位をブロックするために、３７℃で２時間、次いで、４℃で終夜ＥＤブロッキング緩衝液で処理した。次に、８Ｈ５、８Ｇ９、３Ｃ８、４Ｄ１、１０Ｆ７、１Ｇ２、３Ｄ２、３ＣＦ１、７Ｄ１、６ＣＦ３、７Ｈ８、１０ＤＥ２、１３Ｅ７、１６Ａ１２の合計１４種のｍＡｂを含む異なるｍＡｂをウェル当たりの１００μｌでプレートに添加した。８Ｈ５ｍＡｂを、１２ａａペプチドをスクリーニングするために使用した。他の１３種のｍＡｂは、トリインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に対する抗体であった。ｍＡｂは、３７℃で１時間プレート中でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。１００μｌのＧＡＭ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈）を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。発色溶液を、色発現のために１０分間プレートに添加した。次いで、停止緩衝液を添加して発色反応を停止した。色の強度を、マイクロプレートリーダーで読み取った。ＥＬＩＳＡ（図２１）の結果は、融合タンパク質Ｑ１２３およびＤ１２５は８Ｈ５とのみ反応し、他のいずれのｍＡｂとも反応もしないことを示していた。この結果は、融合タンパク質Ｑ１２３およびＤ１２５は、非常に良好な抗体特異性を有することを示していた。
【０３１９】
実施例１７
融合タンパク質ＨＢｃ−１２３およびＨＢｃ−１２５の免疫原性の分析
上記８つのＨＢｃ−１２３およびＨＢｃ−１２５融合タンパク質を、等量のフロインドアジュバントと別々に混合した（完全フロインドアジュバントは最初の免疫のために使用し、不完全フロインドアジュバントは追加免疫のために使用した）。免疫するタンパク質およびアジュバントを、マウス当り１００μｇのタンパク質用量で複数回の皮下注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。１群には３匹〜４匹のマウスが含まれた。最初の免疫後、追加免疫を１週おきに行い、同時に血液をマウスの目から採取した。作製された抗血清を以下の通りに分離した。すなわち、血液を３７℃で２時間保ち、次いで、終夜４℃で保存して血液細胞を凝集させた。次に血液を１０分間４，０００ｇで遠心分離した。抗血清を含んだ上清を採取して、将来の使用のために−４℃に保存した。
【０３２０】
融合タンパク質２３９−１２３および２３９−１２５を、ウェル当たり１μｇでマイクロプレート上に固定した。ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、二次抗体として使用した。したがって間接ＥＬＩＳＡを、１２ａａペプチド１２３および１２５に対する特異的抗体を検出するために実施することができる。間接ＥＬＩＳＡは、１２ａａペプチド１２３および１２５に結合できる抗血清、結合特異性、抗体タイターおよびその他の関連する機能を検出するために使用することができる。間接ＥＬ１ＳＡ試験を、種々のＨＢｃ−１２３融合タンパク質に対する１：１，０００希釈抗血清を使用して実施し、結果を図２２に示す。間接ＥＬＩＳＡ試験を、種々のＨＢｃ−１２５融合タンパク質に対する１：２，０００希釈抗血清を使用して実施し、結果を図２３に示す。
【０３２１】
実施例１８
マウス抗血清の免疫蛍光検出
ガラススライドを、２４ウェル細胞培養プレートの中に入れた。昆虫のＳＦ２１細胞を、ガラススライド上に播種した。細胞−バキュロウイルス発現系によって、トリインフルエンザＨＡタンパク質が昆虫ＳＦ２１細胞で発現された。ＨＡタンパク質を発現している細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のポリホルムアルデヒドで固定し、ヤギ抗血清でブロックした。１：２０希釈のＴ１２３およびＦ１２５に対するマウス抗血清を細胞に別々に添加し、室温で１時間インキュベートした。抗ＨＢｃマウス抗血清を陰性対照として使用した。蛍光標識ヤギ抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を二次抗体として添加し、３０分間インキュベートした。細胞核を、１０分間ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で染色した。染色したサンプルを、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）下で観察した。図２４の結果は、Ｔ１２３およびＦ１２５に対するマウス抗血清は、ＳＦ２１細胞で発現されたトリインフルエンザウイルスＨＡタンパク質に特異的に結合することができたことを示し、さらに１２ａａペプチド１２３および１２５は、適切にＨＡ抗原部位をシミュレートしたことを確認した。
【０３２２】
実施例１９
ＨＢＶｃＡｇを有する１２ａａペプチド１２２、１２４、１２８および１２９の融合タンパク質の発現およびこれらの活性の検出
４つの１２ａａペプチド１２２、１２４、１２８および１２９の２コピーをＨＢＶｃＡｇタンパク質に挿入し、それぞれ融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９を得た。
【０３２３】
融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９に対する発現ベクターを作製する方法は、融合タンパク質ＨＢｃ−１２３およびＨＢｃ−１２５に対する作製方法と同じであった。作製方法で使用したプライマーを表１９に示す。１回目のＰＣＲ増幅用の上流プライマーはＦ３であり、２回目のＰＣＲ増幅用の上流プライマーはＦ２であり、３回目のＰＣＲ増幅用の上流プライマーは、Ｆ１であった。下流プライマーは、ＨＢｃＲであった。３ラウンドのＰＣＲ増幅を通して、標的１２ａａペプチドをＣ１４９−ｍｕｔフラグメントと結合した。この結合したフラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、発現プラスミドを形成するためにＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＣ１４９−ｍｕｔベクターに挿入した（詳細は実施例１５を参照のこと）。
【０３２４】
【表１９−１】
2009524434.tif 000022
【０３２５】
【表１９−２】
2009524434.tif 000023
【０３２６】
融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９の発現および精製の方法は、融合タンパク質ＨＢｃ−１２３およびＨＢｃ−１２５の発現および精製の方法と同じであった（詳細は実施例１５を参照のこと）。１２ａａペプチドの融合タンパク質およびＨＢｃの発現ならびに粒子アセンブリの結果を以下の表２０に示す。アセンブルした粒子の電子顕微鏡画像を図２５に示す。
【０３２７】
【表２０】
2009524434.tif 000024
【０３２８】
融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９の活性を検出するために間接ＥＬＩＳＡを使用すること
融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９を、３７℃で２時間、１０μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレート上へ別々に固定した。プレートを１回洗浄し、非特異的な結合部位をブロックするために、ＥＤブロッキング緩衝液で３７℃で２時間次いで、４℃で終夜処理した。次に合計１２のｍＡｂ（８Ｈ５、８Ｇ９、３Ｃ８、１Ｇ２、３Ｄ２、３ＣＦ１、７Ｄ１、６ＣＦ３、７Ｈ８、１０ＤＥ２、１３Ｅ７、１６Ａ１２）を含む異なるｍＡｂを、ウェル当たり１００μｌでプレートに添加した。８Ｈ５ｍＡｂを用いて１２ａａペプチドをスクリーニングした。他の１１種のｍＡｂは、トリインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に対する抗体であった。ｍＡｂを、３７℃で１時間プレート中でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。１００μｌのＧＡＭ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈）を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。発色溶液を、色発現のために１０分間プレートに添加した。次いで、停止緩衝液を添加して発色反応を停止した。色の強度を、マイクロプレートリーダーで読み取った。図２６の結果は、融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｅ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９は、８Ｈ５とのみ反応し、他のいずれのｍＡｂとも反応もしなかったことを示した。この結果は、融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９は、８Ｈ５ｍＡｂに対して非常に良好な結合特異性を有したことを示した。
【０３２９】
実施例２０
１２ａａペプチドを表示するウイルス様粒子とトリインフルエンザウイルスの競合ＥＬＩＳＡ
Ｈ５Ｎ１にトリインフルエンザウイルスを特異的に結合することができるマウス２Ｆ２  ｍＡｂを、１０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロプレート上へ固定した。１：４０希釈したウイルス株Ｃｋ／ＨＫ／Ｙｕ２２／０２をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ウェル中の溶液を捨てた。１０μｇの精製したウイルス様粒子および１：１，０００希釈した８Ｈ５／ＨＲＰを、一緒にウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。１２ａａペプチド１２６および１２７は、８Ｈ５ｍＡｂに結合できなかったが、陰性対照としてウイルス様粒子上に提示された。さらにウイルス様粒子を含まないＰＢＳも陰性対照として使用した。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。発色溶液を、色発現のために１０分間プレートに添加した。次いで、停止緩衝液を添加して発色反応を停止した。色の強度を、マイクロプレートリーダーで読み取った。図２７の結果は、融合タンパク質ＨＢｃ−１２３、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２５、ＨＢｃ−１２８またはＨＢｃ−１２９からアセンブルしたウイルス様粒子はそれぞれ、８Ｈ５ｍＡｂに結合する抗原部位の一部をシミュレートすることができたことを示した。
【図面の簡単な説明】
【０３３０】
【図１】ゴールドマーク法（ｇｏｌｄ  ｍａｒｋ  ｍｅｔｈｏｄ）によるトリインフルエンザウイルスの亜型Ｈ５に関するＨＡ抗原検出キットの検出結果を示し、「ａ」は、２つの赤線が出現する場合の陽性を示し；「ｂ」は、ただ１つだけで精度管理線が出現する場合の陰性を示し；「ｃ」は、赤線が出現しない場合の無効の試験結果を示す図である。
【図２】ゴールドマーク法によるトリインフルエンザウイルスの亜型Ｈ５に関する抗ＨＡ抗体検出キットの検出結果を示し、「ａ」は、ただ１つだけで精度管理線が出現する場合の陽性を示し；「ｂ」は、２つの赤線が出現する場合の陰性を示し；「ｃ」は、赤線が出現しない場合の無効の試験結果を示す図である。
【図３】トリインフルエンザウイルス亜型Ｈ５に関するＨＡ抗原Ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡ検出キットの検出結果を示し、「＋」は、色が楕円形領域に出現する場合の陽性を示し；「−」は、色が楕円形領域に出現しない場合の陰性を示す図である。
【図４】キメラ抗体に関する６つの発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ８Ｈ５、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ８Ｈ５、ｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ１０Ｆ７、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ１０Ｆ７、ｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ４Ｄ１、およびｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ４Ｄ１の概略図である。
【図５】ウイルス株Ｃｋ／ＨＫ／Ｙｕ２２／０２を用いた、３つのタイプのキメラ抗体のＨＡ凝集阻害試験の結果を示す図である。列１、２および３：ＰＢＳ対照；列４および５：１０Ｆ７ｃＡｂ；列６：１０Ｆ７  ｍＡｂ；列７および８：４Ｄ１ｃＡｂ；列９：４Ｄ１  ｍＡｂ；列１０および１１：８Ｈ５ｃＡｂ；列１２：８Ｈ５ｍＡｂ。
【図６】Ｈ５ヘマグルチニンを発現する細胞を用いたキメラ抗体の免疫蛍光アッセイの結果を示す図である。Ａ．ｃＡｂ  ４Ｄ１（ＤＡＰＩ）；Ｂ．ｃＡｂ  ４Ｄ１（ＦＩＴＣ）；Ｃ．ｃＡｂ  １０Ｆ７（ＤＡＰＩ）；Ｄ．ｃＡｂ  １０Ｆ７（ＦＩＴＣ）；Ｅ．抗ＨＢＶｃＡｂ（ＤＡＰＩ）；Ｆ．抗ＨＢＶｃＡｂ（ＦＩＴＣ）。
【図７】バクテリオファージペプチドファゴトープ（ｐｈａｇｏｔｏｐｅ）に関するＥＬＩＳＡ試験のＯＤ（４５０／６２０）値のヒストグラムである。
【図８】ｐＴＯ−Ｔ７およびｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２３のプラスミド地図の概略図である。
【図９】ｐＴＯ−Ｔ７およびｐＴＯ−Ｔ７−２３９−１２５のプラスミド地図の概略図である。
【図１０】精製融合タンパク質（または組換え型タンパク質）２３９−１２３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す図である。レーン１：タンパク質分子量マーカー；レーン２：２３９−１２３を発現するイー・コリの全細菌溶菌液；レーン３：全細菌溶菌液の遠心分離で得た上清；レーン４：緩衝液Ｉ中の２３９−１２３；レーン５：２Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２３；レーン６：４Ｍの尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２３；レーン７：８Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２３。
【図１１】精製融合タンパク質２３９−１２５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す図である。レーン１：タンパク質分子体重マーカー；レーン２：２３９−１２５を発現するイー・コリの全細菌溶菌液；レーン３：全細菌溶菌液の遠心分離で得た上清；レーン４：緩衝液Ｉ中の２３９−１２５；レーン５：２Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２５；レーン６：４Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２５；レーン７：８Ｍ尿素中の精製融合タンパク質２３９−１２５。
【図１２】水平軸に示したような種々の抗体系統に結合する融合タンパク質２３９−１２３のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値で示された）のヒストグラムを用いた融合タンパク質２３９−１２３の特異的親和性を示す図である。
【図１３】融合タンパク質２３９−１２５の特異的親和性を示す図である：これは、水平軸に示したような種々の抗体系統に結合する融合タンパク質２３９−１２５のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値で示される）のヒストグラムである。
【図１４】ｍＡｂの系列希釈における８Ｈ５ｍＡｂに結合する融合タンパク質２３９−１２３（三角形点線）または８Ｃ１１  ｍＡｂ（正方形点線）のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値で示される）を示す図である。
【図１５】プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔおよびｐＣ１４９−ｍｕｔ−１２３を示す概略図である。
【図１６】プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔおよびｐＣ１４９−ｍｕｔ−１２５を示す概略図である。
【図１７】小規模に発現させた「組換え型」タンパク質の全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す図である。レーン１：Ｄ１２３；レーン２：Ｔ１２３；レーン３：Ｆ１２３；レーン４：Ｑ１２３；レーン５：Ｄ１２５；レーン６：Ｔ１２５；レーン７：Ｆ１２５；レーン８：Ｑ１２５。
【図１８】精製した組換え型のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す図である。レーン１：Ｄ１２３；レーン２：Ｔ１２３；レーン３：Ｆ１２３；レーン４：Ｑ１２３；レーン５：Ｄ１２５；レーン６：Ｔ１２５；レーン７：Ｆ１２５；レーン８：Ｑ１２５。
【図１９】ＨＢＶｃＡｇフラグメントおよび抗体結合性ペプチドの組換え型のタンパク質からアセンブルしたウイルス様粒子を示す電子顕微鏡画像を示す図である。
【図２０】融合タンパク質ＨＢｃ−１２３／１２５と８Ｈ５ｍＡｂ間の結合親和性および反応性のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値として示された）のヒストグラムを示す図である。
【図２１】種々のｍＡｂと融合タンパク質ＨＢｃ−Ｑ１２３またはＨＢｃ−Ｄ１２５間の結合親和性および反応性のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値として示された）のヒストグラムを示す図である。この結果は、融合タンパク質ＨＢｃ−Ｑ１２３およびＨＢｃ−Ｄ１２５は、８Ｈ５ｍＡｂと特異的に結合することを示した。
【図２２】０週〜４週まで融合タンパク質ＨＢｃ−１２３で免疫されたマウスの免疫マウス血清抗体タイターの増加（上昇曲線）を示す図である。抗体タイターは、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【図２３】０週〜４週まで融合タンパク質ＨＢｃ−１２５で免疫されたマウスの免疫マウス血清抗体タイターの増加（上昇曲線）を示す図である。抗体タイターは、ＥＬＩＳＡによって検出された。
【図２４】免疫のマウス血清とＳＦ２１細胞で発現されたＨＡタンパク質との間の反応の免疫蛍光画像を示す図である。
【図２５】組換え型のタンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８、およびＨＢｃ−１２９によりアセンブルしたウイルス様粒子を示す電子顕微鏡画像を示す図である。
【図２６】融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９間の種々のｍＡｂに対する結合親和性のＥＬＩＳＡ試験の色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値として示された）のヒストグラムを示す図である。この結果は、融合タンパク質ＨＢｃ−１２２、ＨＢｃ−１２４、ＨＢｃ−１２８およびＨＢｃ−１２９は特異的に８Ｈ５ｍＡｂと結合したことを示した。
【図２７】１２ａａ１２ＶＬＰペプチドの融合タンパク質からアセンブルしたウイルス様粒子とＨ５Ｎ１ウイルス間の酵素標識８Ｈ５ｍＡｂに対する競合結合の結果を示す図である。垂直軸は、色強度（ＯＤ（４５０／６２０）値として示された）である。水平軸は、種々のウイルス様粒子およびこの試験で使用されたＰＢＳ対照である。
【図１】
2009524434.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2009524434.tif 000034
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2009524434.tif 000040
【図１７】
2009524434.tif 000041
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2009524434.tif 000045
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2009524434.tif 000050
【図２７】
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【配列表】
2009524434000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月8日(2008.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009524434000001.app
【国際調査報告】
2009524434.tif 000067
2009524434.tif 000068
2009524434.tif 000069