(57)【要約】  安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能な酵母、及び、この酵母を含有する食品を提供することを目的とする。  細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ  ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であることを特徴とする酵母である。前記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５４及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５のうちいずれかが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ  ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であることを特徴とする酵母。
【請求項２】
免疫賦活能がマクロファージ活性化能である請求の範囲第１項に記載の酵母。
【請求項３】
突然変異誘発法により免疫賦活能を獲得した請求の範囲第１項から第２項のいずれかに記載の酵母。
【請求項４】
遺伝子組換えされていない請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の酵母。
【請求項５】
突然変異誘発法に用いられる親株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求の範囲第３項から第４項のいずれかに記載の酵母。
【請求項６】
突然変異誘発法が、突然変異誘発剤、紫外線照射及び放射線照射のうちいずれかを利用する方法である請求の範囲第３項から第５項のいずれかに記載の酵母。
【請求項７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５４及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５のうちいずれかである請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の酵母。
【請求項８】
請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の酵母を含有する食品又は飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができる酵母、及び、これを含有する食品又は飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫とは、外部から侵入したウイルスや細菌、癌細胞等による生体への攻撃から、生体が自己を防御する機構である。免疫には、多くの種類の細胞が関与しているが、なかでもマクロファージは、全動物に普遍的に存在しており、免疫応答の特に初期段階での働きを含めてあらゆる段階に関与することから、その重要性が認識されている。
免疫が低下すると、癌、感染症、アレルギー症状等の各種疾患が誘発されることが知られている。逆に免疫が賦活されると、発癌抑制、制癌作用、抗感染症、抗アレルギー作用、更には体調リズムの回復・恒常性維持等様々な効果が期待できる。【０００３】
そこで、消費者の健康状態を改善することを目的として、免疫賦活作用を有する様々な化合物や微生物が提供されている。例えば、ラクトフェリンの加水分解物を用いるもの（例えば、特許文献１参照）、キチン（例えば、特許文献２参照）、トレハロース（例えば、特許文献３参照）、フコイダン（例えば、特許文献４参照）等の糖質を用いるもの、植物由来物質を用いるもの（例えば、特許文献５参照）、ペプチド（例えば、特許文献６参照）やインターロイキン（例えば、特許文献７参照）を用いるもの、核酸を用いるもの（例えば、特許文献８参照）、グルタチオン（例えば、特許文献９参照）、アミノ酸（例えば、特許文献１０参照）、ポリリジン（例えば、特許文献１１参照）を用いるもの、腸内細菌（例えば、特許文献１２参照）、乳酸菌（例えば、特許文献１３参照）、エンテロコッカス属細菌（例えば、特許文献１４参照）等の微生物を用いるもの、等が挙げられる。
また、近年では、βグルカンの免疫賦活効果が注目されており、例えば酵母あるいはキノコ類からβグルカンを精製し、それを用いた免疫賦活方法が提案されている（例えば、特許文献１５，１６参照）。【０００４】
しかしながら、前記免疫賦活作用を有する化合物を用いて、消費者の免疫を賦活させるためには、その化合物を大量に精製して投与しなければならず、多くの作業工程、労力及び費用を要する。また、前記免疫賦活作用を有する微生物の中には、性状が明らかではないものがあり、食品用途に適さないものがある。また、前記免疫賦活能を有する微生物は、その微生物自身が食品の製造（発酵等）に直接利用できない場合には、食品に免疫賦活能を付与するために、食品に対して別途添加する必要があった。【０００５】
ここで、酵母の染色体上の遺伝子のうち、ＭＣＤ４遺伝子、ＧＡＳ１遺伝子及びＣＷＨ４１遺伝子からなる群のうち１つ又は２つ以上の遺伝子が破壊された結果、免疫賦活能を有している酵母が、開示されている（例えば、特許文献１７参照）。前記特許文献１７に開示される酵母によれば、前記特許文献１５、１６に記載の技術のように、酵母から特にβグルカンを精製することなく、酵母をそのまま投与した場合であっても、免疫を賦活させることができる。【０００６】
しかしながら、特許文献１７に開示される酵母は、遺伝子組換え技術により、前記特定の遺伝子が破壊されている。近年、遺伝子組換え技術の発達にともない、安全性が確認された上で数多くの遺伝子組換え食品が認可乃至販売されているが、消費者から見れば、遺伝子組換えされた食物の安全性に対する不安感は依然として高い。したがって、現時点では、前記特許文献１７に開示される酵母を食用として用いることは、実用上難しい。
さらに、特許文献１７に開示される酵母は、細胞壁の構造に関わる遺伝子が欠損していることから予期されるように、浸透圧が低い培地では極めて増殖が遅いことが明らかとなった。したがって、前記酵母の培養には、構造が脆くなった細胞壁に負荷を与えないように、例えば糖を培地中に添加して培地の浸透圧を上げて、培地と酵母の細胞膜内の溶液との浸透圧を等張にしなければならず、培養コストがかかる等の問題があった。また、前記酵母を、例えばパン等の食品の発酵に用いる場合には、発酵条件が制限されたり、発酵液を等張にするために糖を添加したときに食品の風味が変化してしまったりする等の問題があった。【０００７】
一方、突然変異誘発法は、例えば、突然変異誘発剤、紫外線照射、放射線照射等の突然変異誘発要因により、自然変異に比べて高い頻度でＤＮＡに変異を引き起こす方法である。前記突然変異誘発法は、前記遺伝子組換え技術とは異なり、その食物が本来有している塩基配列以外の塩基配列が導入されることがない。したがって、前記突然変異誘発法により遺伝的形質が変化した食物は、現状においても比較的安全性が高いものとして消費者に受け入れられている。【０００８】
したがって、現在までのところ、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能な酵母等の微生物は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。【０００９】
【特許文献１】特開平５−１７８７５９号公報
【特許文献２】特開平６−２７１４７０号公報
【特許文献３】特開２００３−８１８３９号公報
【特許文献４】特開２００１−１８１３０３号公報
【特許文献５】特開平６−５６６８５号公報
【特許文献６】特許第２８７３４３４号公報
【特許文献７】特開２００２−３３９５号公報
【特許文献８】特許第２５２９６０５号公報
【特許文献９】特開平１１−４９６９６号公報
【特許文献１０】特開２０００−２８１５７１号公報
【特許文献１１】特開２００３−１２８５８９号公報
【特許文献１２】特開平６−５６６７８号公報
【特許文献１３】特開平７−２２８５３６号公報
【特許文献１４】特開平１１−９２３８９号公報
【特許文献１５】特開２００１−３５４５７０号公報
【特許文献１６】特開２００３−１８３１７６号公報
【特許文献１７】特開２００６−７５０３９号公報
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能な酵母、及び、この酵母を含有する食品又は飼料を提供することを目的とする。
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、現在食品製造に広く利用されている酵母に対して、エチルメタンスルホン酸を利用した突然変異誘発法により、酵母染色体上に変異を導入したところ、細胞壁のマンナンが少ない酵母を取得することができたこと；この酵母は、細胞壁のマンナンが少ないことにより、菌体表面にβグルカンが露出しているので、特にこの酵母からβグルカンを精製せずに、菌体のまま免疫賦活能試験に供しても、顕著な免疫賦活能が示されたこと；この酵母は、細胞壁のマンナンが少ないにも関わらず、予期しなかったことに低浸透圧に対して高い耐性を示し、酵母そのものの製造（培養）、並びに、この酵母を含有する食品及び飼料の製造に好適に利用できることを知見した。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ  ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であることを特徴とする酵母である。
＜２＞  免疫賦活能がマクロファージ活性化能である前記＜１＞に記載の酵母である。
＜３＞  突然変異誘発法により免疫賦活能を獲得した前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の酵母である。
＜４＞  遺伝子組換えされていない前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の酵母である。
＜５＞  突然変異誘発法に用いられる親株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の酵母である。
＜６＞  突然変異誘発法が、突然変異誘発剤、紫外線照射及び放射線照射のうちいずれかを利用する方法である前記＜３＞から＜５＞のいずれかに記載の酵母である。
＜７＞  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５４及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５のうちいずれかである前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の酵母である。
＜８＞  前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の酵母を含有する食品又は飼料である。
【００１３】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能な酵母、及び、この酵母を含有する食品又は飼料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、変異体１〜４の顕微鏡像である。
【図２】図２は、変異体１〜４についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、変異体３及び親株についての増殖試験の結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、変異体３及び親株についての増殖試験の結果を示す図である。
【図４】図４は、特開２００６−７５０３９号公報に記載の変異体（ＭＣＤ４Δ株）についての増殖試験の結果を示す図である。
【図５】図５は、変異体３を含有する実施例６、７で製造した食品についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（酵母）
本発明の酵母は、細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ  Ｏｓｍ（オスモル）のＹＰＤ液体培地で増殖可能であることを特徴とする。【００１６】
＜免疫賦活能＞
前記免疫賦活能は、自然免疫を賦活する能力である。前記自然免疫とは、生体が備える免疫のうち、生体に先天的に備わっており、事前に抗原に暴露していなくても前記抗原を生体から排除するに際に機能する機構を意味する。前記抗原としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、ウイルスや細菌等の外来の抗原、及び、癌細胞等の内来の抗原が挙げられる。【００１７】
前記免疫賦活能としては、前記自然免疫を賦活できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、食細胞（マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞）、抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、多形核白血球（好酸球、好塩基球、肥満細胞）等の活性化能が挙げられる。中でも、各種生物に広く存在し、抗原を排除する効果が高い点で、前記マクロファージの活性化能が好ましい。【００１８】
前記酵母が前記免疫賦活能を有することを評価する方法としては、特に制限はなく、自然免疫に関与する前記細胞の種類に応じた従来公知の評価方法の中から、適宜選択することができる。
例えば、前記マクロファージの活性化能の評価は、マクロファージに対して培地又は緩衝液中で前記酵母を接触させることにより、前記マクロファージを刺激し、刺激前後において前記マクロファージが産生するサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α等）の量を測定することで、行うことができる。【００１９】
前記酵母が免疫賦活能を有する理由としては、細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有するβグルカンが菌体表面に露出しているためと考えられている。【００２０】
＜マンナン＞
一般に、マンナンとは、酵母の細胞壁を構成する主要成分の一つであり、Ｄ−マンノースを主体とする糖鎖である。マンナンは、タンパク質と結合したマンナンタンパク質として存在する。酵母の細胞壁においては、細胞膜の外周面に沿ってβグルカン層が形成されており、前記マンナンタンパク質は、このβグルカンにＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカーという糖脂質を介して結合されている。その結果、マンナンは、βグルカンを覆い隠すようにして、細胞壁の最外層（即ち、菌体表面）に配される。これに対し、本発明の前記酵母においては、細胞壁のマンナンが少ないことにより、マンナンに代えてβグルカンが菌体表面に露出している。【００２１】
前記酵母において、細胞壁のマンナンが少ない理由は明らかではないが、例えば、マンナン、マンナンタンパク質及びＧＰＩアンカーのうち少なくとも一つが、生合成されていない；生合成はされたが細胞膜外に輸送されない；互いの結合部位に欠損や変異が生じている；等が考えられる。【００２２】
前記酵母において、細胞壁のマンナンが少ないことは、例えば、マンナンに特異的な抗体や、マンナン中のＤ−マンノースやメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド等に対して特異的に結合するＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）レクチン等を利用して確認することができる。具体的には、前記抗体又は前記ＣｏｎＡを、例えばＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）等の蛍光色素により標識し、前記抗体又は前記ＣｏｎＡの菌体表面への結合を、蛍光により検出する。この場合、菌体表面に前記抗体又は前記ＣｏｎＡの結合に由来する蛍光が検出されなければ、細胞壁のマンナンが少ないと判定できる。前記蛍光の検出は、蛍光顕微鏡下で目視により行ってもよく、例えば、フローサイトメーター、蛍光プレートリーダー等の装置を用いて定量的に行ってもよい。【００２３】
また、前記酵母において、細胞壁のマンナンが少ないことは、例えば、細胞壁中のマンナンの含有量を定量することにより、調べることができる。マンナンの含有量を定量する方法としては、特に制限はないが、例えば、以下の手順により定量できる。
即ち、まず、細胞をガラスビーズで破砕し、遠心によって細胞壁画分を調整し凍結乾燥する。次に、Ｄａｌｌｉｅｓらの方法（Ｙｅａｓｔ，１９９８，１４，ｐ１２９７−１３０６）に従い硫酸加水分解を行い、中和した後の上清を凍結乾燥し、ＲＥＺＥＸＴＭ  ＲＰＭ−Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  （ＳｈｉｍａｄｚｕＧＬＣ  ＬＴＤ）などのカラムを用いＨＰＬＣで解析し、グルコースとマンノースとの比を求めることで、細胞壁中のマンナンの含有量を求めることができる。【００２４】
細胞壁中のマンナンの含有量としては、βグルカンが菌体表面に露出される程度に少なくなっている限り、特に制限はなく、細胞壁中にマンナンを有さないことがより好ましい。【００２５】
前記βグルカンとは、酵母の細胞壁を構成する主要成分の一つであり、グルコースがβ１−３型で結合されてなる糖鎖である。
前記βグルカンの平均分子量及び修飾の態様としては、免疫賦活能を有する限り、特に制限はなく、酵母の種類や培養条件に応じて変化しうる。【００２６】
前記酵母において、βグルカンが菌体表面に露出していることを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、βグルカンに特異的な抗体や、アニリンブルー等の蛍光試薬を利用して確認することができる。また、電子顕微鏡により、菌体表面のβグルカン線維を観察することにより、確認することもできる。【００２７】
＜浸透圧に対する耐性＞
一般に、酵母を含む一部の微生物や、植物が備える細胞壁は、浸透圧への耐性や細胞形態の維持等、極めて重要な機能を有している。
これに対して、本発明の前記酵母は、前記したように細胞壁のマンナンが少ないので、浸透圧への耐性が失われることが危惧されていた。しかしながら、本発明者らにより製造された酵母は、予期しなかったことに浸透圧への耐性を有していることが、後記する実施例において明らかとなっている。【００２８】
本発明の前記酵母が低浸透圧に対して耐性であることを示す指標としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、浸透圧が３００ｍ  ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であることが好ましい。ただし、前記ＹＰＤ液体培地としては、１質量％イーストエキス，２質量％ペプトン，２質量％グルコースの組成のものを用いる。また、前記ＹＰＤ液体培地に用いるイーストエキスとしては、オリエンタル酵母工業（株）社製のものを使用し、ペプトンとしては、日本製薬（株）社製のものを使用し、グルコースとしては、国産化学（株）社製のものを使用することとする。
前記浸透圧は、例えば、ソルビトールなどの非発酵性糖類、ＮａＣｌなどにより、調節することができる。
前記浸透圧は、例えば、浸透圧計Ｆ−２０００（ｒｏｅｂｌｉｎｇ社製）により、測定することができる。【００２９】
本発明における「増殖可能」とは、高浸透圧培地であるＹＰＤＳ液体培地で前培養した培養液の一部をＯＤ６６０が０．１となるように前記ＹＰＤ液体培地に添加して、適切な条件で振盪培養したときに、２４時間培養後のＯＤ６６０が１．０以上であることを意味する。ただし、前記ＹＰＤＳ液体培地としては、１質量％イーストエキス，２質量％ペプトン，２質量％グルコース，５．５質量％（０．３ｍｏｌ／Ｌ）ソルビトールの組成の培地を用いる。また、前記ＹＰＤＳ液体培地に用いるイーストエキスとしては、オリエンタル酵母工業（株）社製のものを使用し、ペプトンとしては、日本製薬（株）社製のものを使用し、グルコースとしては、国産化学（株）社製のものを使用し、ソルビトールとしては、和光純薬工業（株）社製のものを使用することとする。【００３０】
なお、増殖試験が行われる酵母がウラシル要求性である場合には、使用するＹＰＤ液体培地及びＹＰＤＳ液体培地のいずれにも、グルコースの含有量に対して、０．３質量％以上のウラシルを含有させて増殖試験を行うこととする。即ち、ＹＰＤ液体培地又はＹＰＤＳ液体培地に対するグルコースの含有量が２質量％である場合には、ＹＰＤ液体培地又はＹＰＤＳ液体培地に対するウラシルの含有量は、６×１０−３質量％以上である。
また、増殖試験が行われる酵母が他の要求性を有している場合にも、使用するＹＰＤ液体培地及びＹＰＤＳ液体培地のいずれにも、その要求される物質を充分量含有させて増殖試験を行うこととする。
前記ＯＤ６６０は、例えば、分光光度計により測定することができる。【００３１】
前記酵母は、浸透圧が３００ｍ  ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であるので、例えば、培地の浸透圧を上げるために糖などを添加する必要がなくなり、培養コストを低減させることができる。また、前記酵母を食品に添加する場合には、培養後に低浸透圧の溶液で洗浄しても菌体が破壊されないので、生菌の回収率を高めることができ、食品の製造効率を上げることができる。【００３２】
＜酵母＞
前記酵母の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パン酵母、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母及び味噌醤油酵母等が挙げられる。なかでも、パン酵母が好ましい。【００３３】
前記酵母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ウイリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属等が挙げられる。【００３４】
前記酵母の種としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｉｔｏａｎａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｌｉｇｅｒａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ、等が挙げられる。
これらの中でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓが好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが特に好ましい。【００３５】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１４、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５４及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５が好ましく、免疫賦活能が高い点で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５４及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５が特に好ましい。
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１４、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５４及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５は、本発明者らにより製造された株であり、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。【００３６】
なお、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１４、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５４及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５の染色体上の変異部位は、精確には判明していないが、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５においては、１５番染色体の約１万ｂｐのＢａｍＨＩ切断断片上に変異を有することが明らかとなっている。前記ＢａｍＨＩ切断断片には、完全な遺伝子としてＲＰＳ１２，ＭＲＳ６，ＧＰＢ１，ＲＡＤ１７，ＮＤＤ１が含まれ、部分的な遺伝子としてＳＣＰ１が含まれている。したがって、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５が有する免疫賦活能は、特開２００６−７５０３９号公報に記載されている、ＭＣＤ４遺伝子、ＧＡＳ１遺伝子及びＣＷＨ４１遺伝子の変異によるものではないことが示唆される。【００３７】
また、前記酵母のゲノム数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一倍体などが挙げられる。【００３８】
−培養方法−
前記酵母の培養方法としては、特に制限はなく、従来公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バッチ培養、流加培養等が挙げられる。
前記培養は、ジャーファーメンターを用いて好適に行うことができ、このときのジャーファーメンターにおける条件としては、特に制限はなく適宜決定することができるが、例えば、培養温度としては２８〜３３℃程度であり、培養時間としては１〜１２０時間程度であり、ｐＨとしては４〜７程度であり、通気量としては０〜５ｖｖｍ程度であり、攪拌速度としては１００〜７００ｒｐｍ程度である。【００３９】
−用途−
前記酵母の用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、食品に添加されて用いられる食品素材、飼料、餌料等としての用途が好ましく、前記食品素材としての用途が特に好ましい。また、前記酵母は、例えばパンやビールの発酵など、食品の製造に好適に用いることができる。本発明の酵母を用いることにより、免疫賦活能を有する食品、免疫賦活能を有する飼料、免疫賦活能を有する餌料等が得られる。このとき、前記酵母は、菌体が破砕されない状態のまま使用されてもよいし、破砕された状態で使用されてもよく、また、乾燥された状態で使用されてもよいし、生菌乃至未乾燥の状態で使用されてもよい。
前記破砕の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ダイノミル等の物理的破砕処理であってもよいし、化学的破砕処理であってもよい。【００４０】
前記酵母の適用対象としては、自然免疫を有する限り、特に制限はなく、例えば、ヒト、ヒトを除く動物（ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマ等の家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物、鶏、アヒル、七面鳥、ダチョウ等の家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミ等の甲殻類等、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキ等の貝類、ペット動物としてイヌ、ネコ等）等が挙げられる。【００４１】
＜酵母の製造方法＞
前記酵母は、食品用途に使用可能な酵母を親株とし、この親株に対して突然変異誘発法により染色体上に変異を誘発することにより、製造することができる。また、食品用途に使用可能な酵母を親株とし、この親株において自然突然変異により染色体上に変異を生じたものを利用してもよい。
前記食品用途に使用可能な親株としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記＜酵母＞の項目において例示した酵母を利用することができる。【００４２】
前記突然変異誘発法とは、例えば、突然変異誘発剤、紫外線照射、放射線照射等の突然変異誘発要因により、自然変異に比べて高い頻度でＤＮＡに変異を引き起こす方法を意味する。前記突然変異誘発法を用いることにより、親株が本来有している塩基配列以外の塩基配列が導入されることなく、染色体上に変異を生じさせることができる。
前記突然変異誘発剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エチルメタンスルホン酸、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル等が挙げられる。
前記放射線としては、例えば、Ｘ線、α線、β線、γ線、粒子線等が挙げられる。【００４３】
突然変異誘発処理を行った後に免疫賦活能を有する酵母をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、選択培地に対する耐性、細胞表層のマンナン含量、マクロファージ活性化能等を指標として、スクリーニングすることができる。【００４４】
前記突然変異誘発法又は前記自然突然変異により変異が生じる遺伝子としては、親株が免疫賦活能を獲得できる限り、特に制限はなく、例えば、ＲＰＳ１２，ＭＲＳ６，ＧＰＢ１，ＲＡＤ１７，ＮＤＤ１，ＳＣＰ１，ＭＣＤ４，ＧＡＳ１，ＣＷＨ４１などの遺伝子が挙げられる。また、これらの遺伝子以外の染色体上の塩基配列が変異していてもよい。
また、前記変異の種類としても、親株が免疫賦活能を獲得できる限り、特に制限はなく、例えば、塩基置換、挿入、欠失、逆位などが挙げられる。【００４５】
（食品又は飼料）
本発明の食品又は飼料は、前記酵母を含有することを特徴とする。
前記食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パン、ビスケットやスコーン等の製菓、病院食、流動食、水産・食肉加工品、麺類、調味料、ビールやジュース等の飲料、健康食品、健康飲料等が挙げられる。
前記飼料としては、特に制限はなく、適用対象に応じて適宜選択することができる。前記適用対象としては、特に制限はなく、例えば、前記酵母の用途の項目で例示した適用対象が挙げられる。
前記食品又は飼料は、高い免疫賦活能を有する前記酵母を含有していることにより、高い免疫賦活能を有している。
【実施例】
【００４６】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。【００４７】
（実施例１）
−免疫賦活能を有する酵母の製造−
−−突然変異誘発処理−−
突然変異誘発処理に供する親株としては、実用パン酵母の一倍体であるＴ−２１（オリエンタル酵母工業株式会社製）のウラシル要求性変異株Ｔ−２１Ｕ株を用いた。
なお、前記Ｔ−２１Ｕ株は、Ｔ−２１株をＹＰＤ液体培地で培養した後、５−フルオロオロチン酸を含む培地（０．７質量％  ＹＥＡＳＴ  ＮＩＴＲＯＧＥＮ  ＢＡＳＥ（ＤＩＦＣＯ）、２質量％グルコース、０．１質量％５−フルオロオロチン酸、０．０５質量％ウラシル、２質量％寒天）に塗沫し、３０℃で３日間培養して生育させることにより、自然突然変異体として選抜された菌株である。【００４８】
ウラシル含有ＹＰＤ液体培地（１質量％イーストエキス（オリエンタル酵母工業（株）社製），２質量％ペプトン（日本製薬（株）社製），２質量％グルコース（国産化学（株）社製），６×１０−３質量％ウラシル（和光純薬工業（株）社製）、以下同じ）を用いて、前記親株を一晩培養した。培養菌体をエッペンチューブ２本に分注し、遠心分離し集菌した。上清を除去し、滅菌水で２度洗浄し、０．１Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ、以下同じ）リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）に菌体を懸濁した。３０μｌのエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を混合し、３０℃で１時間、振とうしながらインキュベートした。菌体を遠心により回収し、上清を捨て、２００μｌの５質量％チオ硫酸ナトリウムに再懸濁した。懸濁液を新しいチューブに移し、遠心回収、２００μｌの５質量％チオ硫酸ナトリウムによる洗浄を２度行なった。菌体を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、適度に希釈した後に、ＹＰＤ寒天培地に塗布した。【００４９】
−−スクリーニング−−
前記突然変異誘発処理した酵母群の中から、免疫賦活能を有する酵母を、下記の一次〜三次スクリーニングによりスクリーニングした。
一次スクリーニングとして、細胞壁変異株の選択を行った。ウラシル含有ＹＰＤ寒天培地（１質量％イーストエキス，２質量％ペプトン，２質量％グルコース，６×１０−３質量％ウラシル，２質量％寒天）、ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地（０．２質量％イーストエキス，０．４質量％ペプトン，０．４質量％グルコース，１．２×１０−３質量％ウラシル、２質量％寒天）、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５％ＳＤＳ寒天培地に塗布した。３０℃で３日間培養した後に、（１）ウラシル含有ＹＰＤ寒天培地とウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地で増殖が遅く、かつ、（２）ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地と、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ＳＤＳ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＦＤ＋０．０５質量％ＳＤＳ寒天培地で増殖が遅い株（あるいは死滅する株）を選択した。
一次スクリーニングを行った結果、３１２０株の変異体が得られた。【００５０】
二次スクリーニングとして、ＦＩＴＣ標識ＣｏｎＡによるマンナン染色を行った。コロニーを爪楊枝でかきとり、ＰＢＳ＋１．０Ｍソルビトール溶液に懸濁した。遠心回収し、ＰＢＳ＋１．０Ｍソルビトール溶液で再懸濁した後に、ＦＩＴＣ標識ＣｏｎＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社）に混合し、室温、遮光下で３０分間放置した。１回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いてＢｌｕｅ励起光下で菌体を観察した。全体的に観察したときに殆ど蛍光が見られず、撮像した写真上で蛍光が確認できない株を選択した。
前記二次スクリーニングの結果、３１２０株から４株（変異体１〜４）を選択した。
図１は、変異体１〜４の顕微鏡像であって、上段は光学顕微鏡像であり、下段はマンナン染色後に観察された蛍光顕微鏡像である。図１において、変異体１〜４は、蛍光がほとんど観察されず、特に変異体２〜４は、蛍光が全く観察されていない。【００５１】
なお、変異体１は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１３であり、変異体２は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１４であり、変異体３は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５４であり、変異体４は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３５５であり、４株とも、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。【００５２】
三次スクリーニングとして、変異体１〜４のマクロファージ活性化能を測定した。変異体１〜４を遠心集菌し、エタノールで処理後、滅菌水で２度洗浄した。さらにＲＰＭＩ−１６４０培地で１度洗浄した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、血球計算盤で酵母数をカウントした。酵母濃度が、規定量となるように調整し、サンプルとした。
マクロファージは、培養２日目の細胞を使用した。培養したマクロファージを培養フラスコから回収し、新しい培地で２度洗い、血球計算盤で細胞数をカウントした。マクロファージの細胞濃度が、規定量となるように調整し、活性測定用のマクロファージ培養液とした。【００５３】
前記マクロファージ培養液を２４穴プレートに分注し、前記サンプルを酵母対マクロファージの細胞数の割合が３０：１になるように混合した。これを３７℃、５％ＣＯ２下で、６時間培養した後、培養液をチューブに取り、遠心した。上清を回収し、上清中に含まれるＴＮＦ−αのタンパク量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ−α  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して測定した。マクロファージ活性化に対するポジティブコントロールとしては、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ，Ｗａｋｏ社）を用いた。【００５４】
図２は、変異体１〜４についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。図２において、変異体３，４は、親株に比べ、非常に強いマクロファージ活性化能（免疫賦活能）を有することが示された。
前記三次スクリーニングの結果、変異体１〜４の４株の中から、２株（変異体３，４）を選択した。【００５５】
（実施例２）
−低浸透圧培地での増殖試験−
実施例１の変異体３を試料として用い、下記の試験法により低浸透培地での増殖能を試験した。【００５６】
まず、変異体３をウラシル含有ＹＰＤＳ液体培地（１質量％イーストエキス（オリエンタル酵母工業（株）社製），２質量％ペプトン（日本製薬（株）社製），２質量％グルコース（国産化学（株）社製），５．５質量％（０．３Ｍ）ソルビトール（和光純薬工業（株）社製），６×１０−３質量％ウラシル（和光純薬工業（株）社製）、以下同じ）で前培養した。前培養した培養液の一部を、ウラシル含有ＹＰＤ液体培地及びウラシル含有ＹＰＤＳ液体培地に、ＯＤ６６０が０．１となるように植菌した後、３０℃で振盪培養した。そして、培養中の培地のＯＤ６６０を、分光光度計を用いて測定することにより、菌体数の経時的変化（増殖）を評価した。
また、対照として、親株と、特開２００６−７５０３９号公報に記載の遺伝子組換え技術によって製造した変異体（ＭＣＤ４Δ）とを用い、変異株３と同じ方法により培養し、菌体数の経時的変化（増殖）を評価した。【００５７】
図３Ａ、及び図３Ｂは、変異体３及び親株についての増殖試験の結果を示す図であり、図４は、特開２００６−７５０３９号公報に記載の変異体（ＭＣＤ４Δ株）についての増殖試験の結果を示す図である。
図３Ａ、及び図３Ｂの結果から、本発明の酵母（変異体３）は、低浸透圧のウラシル含有ＹＰＤ液体培地及び浸透圧を調整したウラシル含有ＹＰＤＳ液体培地のいずれにおいても、親株と同様に増殖できることが示された。
一方で、図４の結果から、特開２００６−７５０３９号公報に記載の遺伝子組換え技術によって製造した変異体（ＭＣＤ４Δ）は、浸透圧を調整したウラシル含有ＹＰＤＳ液体培地では比較的早く増殖するものの、低浸透圧のウラシル含有ＹＰＤ液体培地では極めて増殖が遅いことが示された。【００５８】
（実施例３）
−圧搾生酵母の製造−
実施例１で得られた変異体３を使用して、圧搾生酵母を製造した。
ウラシル含有ＹＭＰＤ液体培地（０．３質量％イーストエキス、０．３質量％マルトエキス、０．５質量％ペプトン、３質量％グルコース，９×１０−３質量％ウラシル）で培養した変異体３を種酵母として、流加培養を実施した。糖溶液（相当糖濃度：２６０ｇ／Ｌ、尿素：１９．４９ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：５２ｇ／Ｌを添加した溶液）を連続流加し培養した。流加方法は常法に従った。培養終了後、培養ブロスを分離・水洗・ろ過して圧搾生酵母を得た。【００５９】
（実施例４）
−発酵力試験−
実施例３の圧搾生酵母を試料として用い、下記の試験法により圧搾生酵母の発酵力を試験した。
イースト工業会が定める酵母の発酵力測定方法に準じて、１２０分間のガス発生量を測定した。結果を表１に示す。
【表１】
2009075290.tif 000002
【００６０】
表１の結果から、本発明の酵母（変異体３）の発酵力性能は、親株には数値上劣るものの、比較的高いレベルにあることが示された。とりわけ、無糖パン及び食パンの製造には、実用上充分な発酵力性能が示されている。【００６１】
（実施例５）
−食パンの製造−
実施例３の圧搾生酵母を使用して、食パンを製造した。【００６２】
表２に示す材料を混捏した後、生地の膨張度合を確認しながら第一発酵、ガス抜き、分割、ベンチ、成型、ホイロをおこない、焼成することにより食パンを製造した。
【表２】
2009075290.tif 000003
【００６３】
得られた食パンを食してみたところ、香り、味等の風味、及び、食感においては、従来の食パン（親株で製造した圧搾生酵母を使用）と全く変わらないものであった。【００６４】
（実施例６）
−乾燥酵母粉末の製造−
実施例３の圧搾生酵母を使用して、乾燥酵母粉末を製造した。
圧搾生酵母を水に懸濁し、この懸濁液をスプレードライヤー（大川原化工機（株）製）で乾燥減量７％未満にまで噴霧乾燥処理をした。このときの熱風温度を１８５℃、排気温度を１００℃、処理量を３ｋｇ／時間とした。
得られた乾燥酵母粉末を食してみたところ、香り、味等の風味、及び、食感においては、従来の乾燥酵母粉末（親株で製造した圧搾生酵母を使用）と全く変わらないものであった。【００６５】
（実施例７）
−スコーンの製造−
実施例３の圧搾生酵母を使用して、スコーンを製造した。
薄力粉１００ｇに、４ｇの実施例３で得られた圧搾生酵母、およびその他、ベーキングパウダー、砂糖、食塩、生クリーム、油脂、牛乳等を適宜加え、２４℃でミキシング・捏上、ホイロ３０℃／７５％ＲＨで３０分放置し、２００℃にて焼成した。充分に発酵したトップの立ったスコーンが製造出来た。
得られたスコーンを食してみたところ、香り、味等の風味、及び、食感においては、従来のスコーン（親株で製造した圧搾生酵母を使用）と全く変わらないものであった。【００６６】
（実施例８）
−ドッグフードの製造−
実施例３の圧搾生酵母を使用して、ドッグフードを製造した。
イヌ用動物実験用飼料ＤＳ−Ａ（オリエンタル酵母工業株式会社製）の仕込み原料に仕上がり固形物ペレット中の乾燥含量が３％になるように、実施例３で得られた圧搾生酵母を加え、攪拌、水を加え捏ね上げ、ペレット状に成型し、乾燥した。通常製品のＤＳ−Ａと同様に製造することが出来た。【００６７】
（実施例９）
−マクロファージ活性化能試験−
実施例６、７で製造した食品を試料として用い、下記の試験法により前記食品のマクロファージ活性化能を試験した。【００６８】
ＲＯ水８０ｇと実施例６、７の食品２０ｇ（湿重量）とを混ぜ、更にホモジナイザーを用いて混合した後に、均一化することにより、懸濁液を得た。
マクロファージは、培養２日目の細胞を使用した。培養したマクロファージを培養フラスコから回収し、新しい培地で２度洗い、血球計算盤で細胞数をカウントした。マクロファージの細胞濃度が、規定量となるように調整し、活性測定用のマクロファージ培養液とした。【００６９】
マクロファージの細胞数が１穴当たり２．５×１０５個になるように、前記マクロファージ培養液を２４穴プレートに分注した。そして、各穴に、食品の終濃度が図４に示す値になるように、前記懸濁液を添加し、前記マクロファージ培養液と前記懸濁液とを混合した。これを３７℃、５％ＣＯ２下で、６時間培養した後、培養液をチューブに取り、遠心した。上清を回収し、上清中に含まれるＴＮＦ−αのタンパク量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ−α  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して測定した。マクロファージ活性化に対するポジティブコントロールとしては、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ，Ｗａｋｏ社）を用いた。【００７０】
図５は、変異体３を含有する実施例６、７で製造した食品についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。
図５の結果から、本発明の酵母（変異体３）を用いて製造された乾燥酵母粉末及びスコーンは、食品の添加量に依存してマクロファージ活性化能が増加することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の酵母は、優れた免疫賦活能を有し、安全に摂取することができるので、免疫機能が低下した消費者の免疫機能の改善、並びに、癌、アレルギー症状、感染症などの疾患の予防及び治療に、好適に利用することができる。具体的には、前記酵母は、食品素材、飼料、餌料等に添加したり、パンやビールの発酵など、食品の製造に使用したりすることができる。
【図１】
2009075290.tif 000004
【図２】
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【図３Ａ】
2009075290.tif 000006
【図３Ｂ】
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【図４】
2009075290.tif 000008
【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月6日(2009.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ  ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であり、
前記増殖が、ＹＰＤＳ培地で前培養した培養液の一部を、ＯＤ６６０が０．１となるように前記ＹＰＤ液体培地に添加して、３０℃で培養したときに、２４時間培養後のＯＤ６６０が１．０以上であることを特徴とする酵母。
【国際調査報告】
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