(57)【要約】  本発明は、下記Ｎ末端配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇを含むペプチド、または、ヒトフィブリンのＢβ鎖（すなわち、Ｂβ１５−４２）における誘導性ＶＥ−カドヘリン結合モチーフと一致する生物学的特性を有する前記ペプチドの対立遺伝子の変異体または誘導体の、ショック、より具体的には出血性ショックの治療用製剤の調製のための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のＮ末端配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇを含むペプチド、または、ヒトフィブリンのＢβ鎖（すなわち、Ｂβ１５−４２）における誘導性ＶＥ−カドヘリン結合モチーフと一致する生物学的特性を有する前記ペプチドの対立遺伝子の変異体または誘導体の、出血性ショック及びその続発症の治療用製剤の調製のための使用。
【請求項２】
前記ペプチドが、
Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
フィブリンＥ断片を用いた誘発の後に内皮細胞からのインターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出の阻害を測定することによって、ペプチドの抗炎症作用を判定する方法。
【請求項４】
ショックが、適切な組織潅流の維持の能力をもたらす大量出血に関連するか、それによって引き起こされるものであり、上記ペプチドの使用が、これに限定するものではないが、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肝不全、腎不全、および多臓器不全を含むこの状況の有害な結果を低減または除去する、請求項１または２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は出血性ショックおよびその続発症を治療するための製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ショックとは、心血管系が適切な潅流圧を維持できないことを特徴とする多数の異なる病態の急性合併症である。さらに具体的には、出血性ショックにおいては、適切な組織潅流および酸素化を代償し供給する身体能力を失血が上回る。これは外傷に起因することが多いが、自発的出血（例えば、消化管出血、出産）、手術、およびその他の原因によって生じることもある。
【０００３】
ほとんどの場合、臨床的な出血性ショックは、別個の引き金となる事象を伴った急性出血エピソードによって起こる。一般的ではないが、出血性ショックは亜急性失血を伴う慢性症状にみられることがある。この状態は１〜４４歳の年齢群では主な死因である。
【０００４】
出血に対する生理学的代償機構には、中枢循環へ血液を短絡する抹消および腸間膜の初期血管収縮作用がある。その後、この収縮作用は進行性の頻脈によって増進される。侵襲的モニタリングによって、心係数増大、酸素運搬量（すなわち、ＤＯ２）増大、および組織による酸素消費量（すなわち、ＶＯ２）増大が明らかとなり得る。乳酸濃度、酸塩基状態、および他のマーカーも生理学的状態の有用な指標となり得る。年齢、薬剤、および共存する因子はどれも、出血性ショックに対する患者の反応に影響を及ぼす可能性がある。
【０００５】
出血性ショックにおいて代償機構に障害があれば、死に至ることがある。重篤な出血性ショックでは、処置しない場合には、死亡率の古典的な三峰性の分布が見られる。死亡率の最初のピークは、即時の放血により出血の数分以内に起こる。次のピークは進行性の代償不全により１〜数時間後に起こる。第３のピークは敗血症または臓器不全により数日ないし数週間後に生じ、これは臓器への再潅流障害の帰結としてよくみられるものである。
【０００６】
炎症反応および凝固系の変化に関与する二次作用が非依存性になり、適切な体液および血液の交換が可能であるか否かという疑問に関わらず患者を死に至らしめるため、多量失血によって生じるショックの治療は大きな課題である。事故または他の損傷に起因する多量失血ならびに出血性ショックの特異的な治療法は、臓器潅流を再確立するために晶質またはコロイドを用いた輸液療法からなる。また、現行の処置は症状の緩和を目的としたものであり、これには機械的人工換気法、補液療法、心臓作用薬の使用、ならびに酸素飽和度、ヘモグロビン、グルコース、および腎機能の厳格な管理が挙げられる。例えば高用量ステロイドを用いた炎症反応のみの管理あるいは抗トロンビンを用いた凝固の阻害は、生存率を改善しない。
【０００７】
失血および出血性ショックの続発症としてのショックは、フィブリン形成およびフィブリン断片の増大を伴う血漿フィブリノゲンの顕在的または非顕在的な変化に関与する。この凝固およびフィブリン溶解経路の活性化は、結果として、顕在的または非顕在的な播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を引き起こすことがある。播種性血管内凝固症候群の結果、血管閉塞および臓器末端障害が起こり、その結果、凝固因子の消耗により出血が生じる。重要なことは、フィブリノゲン、フィブリン、およびフィブリン断片は血液凝固の役割を果たすだけでなく、細胞タンパク質およびマトリックスタンパク質の結合部位をいくつか有することである。この結合部位が、フィブリノゲン、フィブリン、およびフィブリン断片が白血球、血小板、内皮細胞、およびマトリックス構造と相互作用することを可能とする。これにより、細胞活性、細胞移動、サイトカイン放出が生じ、最終的には炎症反応が起きる。炎症におけるフィブリノゲンまたはフィブリンの役割は、十分に記載されている（Ａｌｔｉｅｒｉ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８２：７８１〜７８６；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１：７４１〜４６）。この分子のＤ領域は、マトリックス分子、内皮細胞、血小板、及び炎症細胞の結合部位を多く含んでいる。フィブリンのＥ領域はＣＤ１１ｃと結合する（Ｌｏｉｋｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：１０４４〜４８）。
【０００８】
我々は最近、炎症におけるフィブリンＢβ１５−４２配列の新規の役割を説明した（ＷＯ０２／４８１８０）。この配列はフィブリンのＥ領域にも存在し、フィブリノペプチドが切断されたときに限り活性化する。β鎖の遊離のＮ末端にこの配列を含んでいるフィブリン断片は、内皮と結合し、炎症を引き起こし、フィブリンのβ鎖のアミノ酸１５−４２と一致するペプチドは、フィブリン断片が内皮表面と結合するのを阻止し、試験管内で炎症を阻止する（ＷＯ０２／４８１８０）。生体内では、このペプチドは心筋炎を妨げ、虚血／再灌流の状況において心筋梗塞の規模を低減する（ＷＯ０２／４８１８０）。
【０００９】
フィブリン断片は、フィブリン形成障害およびフィブリン溶解障害のどのような状況でも生じる。特にショックの状況下では、この変化したフィブリン形成およびフィブリン溶解が主な問題となる。多くの疾患に関し、フィブリン形成／フィブリン溶解における成果と障害との直接的な関連が記載されている。例えば、デング熱に関して記載されている(ｖａｎ  Ｇｏｒｐら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  ２００２、６７：５４９〜５４、Ｍａｉｒｕｈｕら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓ  ２００３；３：３３〜４１)。成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、顕症期の血管外フィブリン沈着を特徴とする急性肺損傷の一形態である(Ｉｄｅｌｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ．  ２００２；１：３８３〜９１)。肺血管系における血栓症および播種性血管内凝固症候群はまた、ＡＲＤＳを伴って観察された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記Ｎ末端配列
Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
を含むペプチド、または、ヒトフィブリンのＢβ鎖における誘導性ＶＥ−カドヘリン結合モチーフ（すなわち、Ｂβ１５−４２）と一致する生物学的特性を有する前記ペプチドの対立遺伝子の変異体または誘導体の、ショックの治療用製剤の調製のための使用に関する。
【００１１】
好ましい実施形態では、前記ペプチドは、
Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
である。
【００１２】
我々は驚くべきことに、上記ペプチドが大量出血後の再潅流ならびに出血性ショックの結果および合併症から温血動物を保護する際にきわめて有用な効果を有することを見いだした。我々は、上記ペプチドが出血性ショックおよび再潅流によって生じた急性炎症反応から起こる臓器障害および臓器不全を防止することができることを明らかにすることができた。このペプチドは全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、腎不全、肝不全、および多臓器不全のような疾患を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
ペプチドおよびタンパク質
ペプチドは、固相ペプチド合成により製造し、ヌクレオシル１００−１０Ｃ１８カラム（ＰｉＣｈｅｍ社、オーストリア国グラーツ所在）を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製した。なお、β１５−４２領域は、保存アミノ酸置換を考慮すると、生物種間で１００％の類似性があることに留意されたい。アミノ酸Ａα１−５１、βＢ１−１１８、およびγ１−７８から構成されるフィブリノゲンのＮ末端ジスルフィド結合（ＮＤＳＫ）は、以前の記載（ＷＯ０２／４８１８０）に基づいて調製した。アミノ酸Ａα１７−５１、Ｂβ１５−１１８、およびγ１−７８から構成されるフィブリンのＮ末端ジスルフィド結合（ＮＤＳＫ−ＩＩ，フィブリノペプチドＡおよびＢが欠けている）は、ＮＤＳＫをトロンビン（２０Ｕ／１ｍｇＮＤＳＫ）で、３７℃３時間処理することにより調製した。残りのトロンビンは１０ｍＭディスプロピルフルオロリン酸塩（Ｆｌｕｋａ社、ウィスコンシン州ミルウォーキー所在）を用いて、３７℃で２時間中和した。次いで、全生成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で透析した。
【００１４】
ＥＬＩＳＡ
ペプチドＢβ１５−４２はＶＥカドヘリンと結合する
フィブリンのＢβ鎖（Ｂβ１５−４２）が内皮細胞と相互作用することにより、形態変化（Ｂｕｎｃｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８９：８４２〜５０；Ｂａｃｈら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３８：３２４〜３４；Ｃｈａｌｕｐｏｗｉｃｚら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３０：２０７〜１５；Ｈａｍａｇｕｃｈｉら、Ｂｌｏｏｄ  ８１：２３４８〜５６；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  １９：２９１〜３０６）、増殖（Ｓｐｏｒｎら、Ｂｌｏｏｄ  ８６：１８０２〜１０）、フォンヴィレブランド因子の放出（Ｒｉｂｅｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７９：１１７〜２３、Ｒｉｂｅｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８４：４３５〜４２；ＥｒｂａｎおよびＷａｇｎｅｒ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７、２４５１〜５８）およびＩＬ−８の放出（可能性のある場合）（Ｑｉら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３５９３〜３６０２）、および、ＣＤ５４の膜発現（Ｈａｒｌｅｙら、Ａｒｔ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２０：６５２〜６５８）が生じる。ＶＥカドヘリンは配列Ｂβ１５−４２の結合リガンドとして同定されたものであり、ＥＬＩＳＡが開発されて、この内皮細胞および／またはＶＥカドヘリンのフィブリンまたはフィブリン断片との相互作用が実証された。Ｍａｒｔｉｎｅｚらは、抗パンカドヘリン抗体を用いて内皮細胞からカドヘリンを捕獲し、続いてフィブリンと一緒に培養した（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９３６：３８６〜４０５）。ＨＵＶＥＣ単一層（ＶＥカドヘリンを発現する）は、放射性標識されたフィブリン断片またはペプチドＢβ１５−４２を用いて覆われた（Ｂａｃｈら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：３０７１９〜２８；Ｈａｒｌｅｙら、Ａｒｔ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２０：６５２〜６５８）。遺伝子組み換えＶＥカドヘリンがＧｏｒｌａｔｏｖおよびＭｅｄｖｅｄにより用いられた（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：４１０７〜１６）。他の者は、血中のフィブリンフラグメントを検出するためにＥＬＩＳＡを使用し、ほとんどの場合、Ｂβモチーフに対する抗体を含め、フィブリノゲン分子中で特徴的な配列に対する抗体を用いることによるものであった。（Ｆａｒｅｅｄら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ８：１８４５〜５３においてレビューされた）。
【００１５】
我々は、他の者により記載されたものと同じ原理で働く改変型ＥＬＩＳＡを開発したが、ここに記載したＥＬＩＳＡの目的は、フィブリン分解産物を定量することではなく、Ｂβ１５−４２配列とＶＥカドヘリンとの結合に干渉するタンパク質、ペプチド、または化合物を探索することである。この原理は、切断型タンパク質として、全長タンパク質として、あるいはＢβ１５−４２結合部位に干渉しない他のタンパク質と結合したタンパク質としてのＶＥカドヘリンが、フィブリンのＢβ１５−４２配列と相互作用できることである。この系では、追加で他の物質を導入し、この物質がＶＥカドヘリン／Ｂβ１５−４２結合を阻害するか否かを測定することができる。
【００１６】
具体的には、９６ウェルタンパク質イモビライザープレート（Ｅｘｉｑｏｎ社、デンマーク国Ｖｅｄｂａｅｋ所在）に、ＰＢＳに入っている遺伝子組み換えヒトＶＥカドヘリンＦＣ融合タンパク質（８ｎＭ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社、米国ミネソタ州ミネアポリス所在）を被覆し、４℃で一晩放置した。次いで、このプレートを洗浄し、ペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）のタグを付けたペプチドＢβ１５−４２（ＧＨＲＰＬＤＫＫＲＥＥＡＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲ）と共に、またはＦＲＡＧタグ付きランダムペプチド（ＤＲＧＡＰＡＨＲＰＰＲＧＰＩＳＧＲＳＴＰＥＫＥＫＬＬＰＧ）と共に０〜８０μＭｏｌ／ｍｌの濃度でインキュベートした。洗浄後、結合したＦＲＡＧタグ付きペプチドを、ペルオキシダーゼ標識された抗ＦＲＡＧ抗体（シグマ社、米国セントルイス州）および発色基質とインキュベートすることにより検出した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより、波長４５０ｎｍにおける吸光度を決定した。データは、独立した３つの実験（各実験は３組で行った）の平均値を表している。下記の表から、ペプチドＢβ１５−４２は、濃度に依存して、ＶＥカドヘリンと結合したことがわかる。対照的に、ランダムペプチドはわずかな結合しか示さなかった。
【００１７】
【表１】
2009520696.tif 000002
【００１８】
ＶＥカドヘリンとの結合において、ペプチドＢβ１５−４２およびフィブリン断片は競合する。
【００１９】
次の段階では、我々はこのＥＬＩＳＡを利用し、ＶＥカドヘリンへのＢβ１５−４２配列の結合と競合する他のペプチド／化合物をスクリーニングできるか否かを分析した。予想通り、ペプチドＢβ１５−４２は、ＦＲＡＧタグペプチドＢβ１５−４２の結合を完全に阻害し、陽性対照として用いた。また、ランダムペプチドまたは溶媒は、全く影響せず、陰性対照として用いた。短いペプチドは、Ｂβ１５−４２のＶＥカドヘリンへの結合を部分的に阻害した。ＮＤＳＫ−ＩＩは、Ｂβ１５−４２の濃度依存的な結合を阻害した。Ｂβ１５−４２とＮＤＳＫ−ＩＩ間の平衡（５０％阻害）は、２４：１のモル比において達せられた。ＮＤＳＫはほとんど影響しなかった。
【００２０】
プラスチック表面に８ｎＭ／ｍｌの濃度でＶＥカドヘリンを被覆した。次いで、示されたペプチドを２００μＭ／ｍｌの濃度で添加し、ＮＤＳＫまたはＮＤＳＫ−ＩＩを示された濃度で添加した。ＦＬＡＧタグ付きＢβ１５−４２（１２μＭ／ｍｌ）の結合の検出は上述のように行った。
【００２１】
また我々は、主張されるペプチドの活性を判定するための特異的アッセイを同定した。このアッセイは、内皮細胞からのインターロイキン−６の放出の阻害を測定することから成る。インターロイキン−６は、ショック状態における転帰および死亡率の強力な予測因子であることがわかっている。したがって、インターロイキン−６は、上記ペプチドの有益な効果を判定するための価値あるパラメータである。このため、このアッセイも本発明の一部である。
【００２２】
【表２】
2009520696.tif 000003
【００２３】
内皮細胞からのインターロイキン−６放出の阻害
９６ウェル細胞培養プレートを１％ゼラチンで被覆した。各ウェルには、約２３，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の入った２００μｌの培地をピペットで入れた。ＨＵＶＥＣは異なる４つのドナープールの４代継代から取った。希釈に使用した培地は、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地に１０％ＦＣＳ，ＥＣＧＳを加えた標準培地とした（Ｐｅｔｚｅｌｂａｕｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：５０６２−５０７２、１９９３）。インキュベータ内では、３７℃で約１８時間以内に、集密的な細胞単層が形成された。上清を除去し、ＮＤＳＫ−ＩＩ単独またはペプチドＢβ１５−４２（ＧＨＲＰＬＤＫＫＲＥＥＡＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲ）を加えたＮＤＳＫ−ＩＩのいずれかを入れた培地と交換した。最終総量は２００μｌであった。５％ＣＯ２下３７℃で４時間培養後、細胞培養上清を再度除去し、３０００Ｕ／分、４℃で１０分間遠心分離した。市販のアッセイ（ＩＬ−６  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；カタログ番号Ｄ６０５０；ロット番号：２３１３６１）を用いて、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の濃度を測定した。遺伝子組み換えインターロイキン−６および培地を種々希釈して、アッセイ製造業者により供給された標準プロトコルに従って較正を行った。吸光度の読み取りは、基準波長５５０ｎｍを用いて波長４５０ｎｍにおいて行った。
【００２４】
【表３】
2009520696.tif 000004
【００２５】
家畜ブタにおける出血性ショック
２０〜３５ｋｇのランドレース種の家畜雄ブタに標準飼料を給餌し、水を自由摂取させた。すべての手順は、ＡＡＡＬＡＣガイドラインに準拠し、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（保健社会福祉省、国立衛生研究所、公布番号８６−２３）に従って行った。ブタにはアザペロン（４ｍｇ／ｋｇ）を前投与した。耳静脈にカニューレ挿入し、麻酔剤プロポフォールを投与した。安定したベースラインを得るために、動物には完全に器具を取り付け、１時間平衡化した。続いて、４０ｍｍＨｇの平均動脈圧に達するまで、動物（ｎ＝１６）を放血した。動物をこの動脈圧に維持して、１時間出血性ショックにした。この後、失血量を、流れ出た血と塩との溶液（晶質）と入れ替えた。さらに、ペプチドＢβ１５−４２（ｎ＝８）またはランダム配列ペプチド（ｎ＝８）を単回静脈内ボーラス投与として各々２．４ｍｈ／ｋｇの容量で動物にボーラス投与した。５時間にわたる次の再潅流期間の間、Ｈｏｒｒｏｗｉｔｚ指数（血液酸素化を測定する）、ＰＥＥＰ（呼気終末陽圧（ｍｍＨＧ））、および心拍出量（ｃａｒｄｉａｃ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）を種々のタイムポイントで判定した。以下の表では、次のタイムポイントを用いた：
タイムポイント１：出血性ショック１時間前
タイムポイント２：出血性ショック中
タイムポイント３：再潅流開始１時間後
タイムポイント４：再潅流開始３時間後
タイムポイント５：再潅流開始５時間後
【００２６】
【表４】
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【００２７】
【表５】
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【００２８】
【表６】
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【国際調査報告】
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