(57)【要約】  マトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制剤、マトリックスメタロプロテネース９関連疾患の治療薬及び制癌剤を提供する。  当該薬剤は、Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子プロモーターの所定の塩基配列（配列番号２，４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテネース９（以下ｈＭＭＰ−９とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−８４〜−２４（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
【請求項２】
更にβアラニン単位を含む請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
ヒトマトリックスメタロプロテネース９関連疾患の治療のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
制癌剤として用いるための請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
前記標的領域がヒトマトリックスメタロプロテネース９プロモーターの塩基配列−７７〜−７０（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項８】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬剤。
【化１】
2009128547.tif 000010
【請求項９】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
2009128547.tif 000011
【請求項１０】
Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子プロモーターの塩基配列−６１５〜−５５３（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
【請求項１１】
更にβアラニン単位を含む請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項１０に記載の薬剤。  
【請求項１３】
ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制のための請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１４】
ヒトマトリックスメタロプロテネース９関連疾患の治療のための請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１５】
制癌剤として用いるための請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記標的領域がヒトマトリックスメタロプロテネース９プロモーターの塩基配列−６０５〜−５９９（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の薬剤。
【化３】
2009128547.tif 000012
【請求項１８】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化４】
2009128547.tif 000013
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤及び請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項９及び請求項１８に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。
【請求項２１】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化５】
2009128547.tif 000014
【請求項２２】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化６】
2009128547.tif 000015
【請求項２３】
基礎実験の試薬として用いる請求項９、１８、２１及び２２に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマトリックスメタロプロテネース９（以下ＭＭＰ−９とも言う）遺伝子発現抑制剤、マトリックスメタロプロテネース９関連疾患の治療薬及び制癌剤に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミド（以下ＰＩＰとも言う）を含んでなる薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの形成と進行に腫瘍の周囲の環境が極めて重要な役割を果たすことを示唆する知見がある。特にマトリックスメタロプロテネース（以下ＭＭＰとも言う）は、細胞外マトリックスを分解することで腫瘍を周囲環境の制御から離脱させることで、細胞の増殖、浸潤、播種、転移を可能にすると示唆されている。【０００３】
ＭＭＰは５つのグループに大別され、少なくとも２８のサブタイプが存在することが分かっている。共通した特徴として活性部位に亜鉛イオンの結合部位があること、活性に２価のカルシウムイオンが必要であること、共通の一次構造を持っていること、そして潜在型で産生され、自分自身或いは他の酵素で切断されることにより活性化されることが挙げられる。ＭＭＰ遺伝子の発現は、大きく誘導型と恒常型の２つに分けられる。誘導型にはマトリックスメタロプロテネース−１、３、７、９、１１、１２、１３等が属し、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）や炎症性サイトカイン、増殖因子などで誘導され、主として繊維芽細胞で産生される。遺伝子の発現は、そのプロモーター部分に作用する転写因子によって制御されるが、誘導型のプロモーターには、恒常型には見られない増殖因子によって誘導される転写因子ＥＴＳの結合部位やこれにより活性化され、転写因子のＡＰ−１の結合部位ＴＲＥが存在する。このＭＭＰの中でもＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ型コラーゲンとフィブロネクチンを分解するゼラチナーゼＡ及びＢ（以下ＧｅｌａｔｉｎａｓｅＡ及びＢもしくはＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９とも言う）は腫瘍の血管新生に関与し、腫瘍浸潤、腫瘍転移や腫瘍の悪性化にも関与すると報告されている。更にゼラチナーゼの阻害作用を持つＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２もＭＭＰの内在性阻害因子として癌への関与が示唆されている。ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９は腫瘍、特に悪性度の高い癌で高発現が見られたという報告が多く見られ、ＭＭＰ−９が腫瘍浸潤と血管新生に対し重要な働きを示すことが培養細胞、および生体で証明されている（非特許文献１及び２）。【０００４】
９２−ｋＤａのコラゲナーゼＩＶ型ＭＭＰ−９（或いはゼラチナーゼＢ（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅＢ）とも呼ばれる）が宿主マクロファージの細胞表面で発現すると、異種移植した癌細胞の増殖と浸潤が促進され、ＭＭＰ−９の発現しないＭＭＰ−９ノックアウト宿主マクロファージでは増殖浸潤が抑えられた。また、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４を特異的に阻害するＢＰＨＡ（ＭＭＰ阻害薬）は癌細胞を移植した皮下チャンバーで血管新生を抑制した。【０００５】
ヒト卵巣癌細胞を注射されたＭＭＰ−９ノックアウト（−／−）マウスはＭＭＰ−９野生型（＋／＋）マウスより統計的に有意に低下した腫瘍発生率及び腫瘍増殖性を示した。また、早期段階のメラノーマ細胞株ではＭＭＰ−９の発現はなく、これらの細胞が腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の誘導後、ＭＭＰ−９発現のみだけでなく、大量のＭＭＰ−９分泌が誘導される。これらの事実及び実験動物での腫瘍、炎症抑制効果より、癌における劇的なＭＭＰ−９の大量発現はがん細胞の潜在的な浸潤及び転移に重要な役割を果たしていることを示唆している。従って、ＭＭＰ−９は、潜在的な新しい薬剤のターゲットであることが示唆される。このような知見により、ＭＭＰ阻害剤が開発され臨床試験が行われている。しかし、ＭＭＰ阻害剤ｍａｒｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ−２５１６）の臨床試験の失敗により、ＭＭＰ阻害剤の民間レベルでの開発は遅れている。【０００６】
このｍａｒｉｍａｓｔａｔは、広範囲のメタプロテネース阻害剤（金属酵素を広く阻害する金属酵素阻害剤）で、臨床試験では筋肉痛、関節痛の副作用が見られ実用化には到らなかった。多数のＭＭＰ活性阻害剤が作成され、臨床試験へ進もうとしていたが、ｍａｒｉｍａｓｔａｔ同様に副作用のため見送られている。ＭＭＰ類が構造や性質上共通の特徴をもつため単独のサブタイプに対する特異的な小分子阻害剤の開発は困難である。また、最近の研究で一部のＭＭＰは細胞内に存在し、細胞内タンパク質の分解にも関与していることが判明しており、単純にＭＭＰ類を阻害することによる副作用の問題は避けられないかもしれない。しかし、特定のＭＭＰのみを病変細胞特異的に適度にノックダウンし、しかも限定した部位で使用するのであれば副作用の問題も最小限に抑えられるか若しくは臨床的に問題ないレベルになる可能性は残されているものと考えられる。【０００７】
ピロールイミダゾールポリアミドは抗生物質であるｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ−Ａとｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ−ＡがＤＮＡを塩基特異的に認識することを基に、Ｄｅｒｖａｎらにより見出された化学合成物質である（特許文献１、非特許文献３、非特許文献４）。ＰＩＰは二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造のマイナーグルーブに結合することから、標的遺伝子の発現を特異的に制御する事が可能である（非特許文献４）。また、ＰＩＰは、これまでの遺伝子発現制御薬であるアンチセンス・リボザイム・ｓｉＲＮＡ等と異なり、生体内において核酸分解酵素によって分解されず、核酸への結合能が高いことから、新規の分子標的治療薬として、抗癌剤等への臨床応用が期待されるところである。【０００８】
逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、相同組換えは組換え効率が一般に低く一部の細胞でしか効果がみられない、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。【０００９】
一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。【００１０】
ピロールイミダゾールポリアミド（以下Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとも言う）は一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（特許文献１、非特許文献３）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献２〜４）。【００１１】
このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献３）。最近の研究によればＡ−Ｔ縮合はＰｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果としてＨｐ／Ｐｙが優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている。【００１２】
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモーター領域において特異的な認識配列に結合する転写因子が複合体を形成し、その複合体がＤＮＡ配列と結合するいくつかの過程を必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子もしくは、複合体の特定配列への結合が遺伝子発現において重要であれば、転写因子もしくはその複合体の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）プロモーター中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ−１配列、及びＥＴＳ−１配列が包含される。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモーターにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ９８／４９１４２ Ａ１
【特許文献２】特許第３０４５７０６号
【特許文献３】特開２００１−１３６９７４
【特許文献４】ＷＯ０３／０００６８３  Ａ１
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Katori et al: J. Surg. Oncol. 93, 2006, 80-85
【非特許文献２】Lakka et al: J. Biol.Chem.280 (23), 2005, 21882-21892
【非特許文献３】Sugiyama et al: Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93:14405-14410
【非特許文献４】Dervan: Bioorg Med. Chem.2001;9:2215-35
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
先に述べたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。これまでに、マトリックスメタロプロテネース９の遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたマトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制剤又はマトリックスメタロプロテネース９関連疾患の治療薬についての報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、マトリックスメタロプロテネース９（ＭＭＰ９）のプロモーターの特定の領域に特異的に結合してマトリックスメタロプロテネース９遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。そこで、本発明者らは、ヒトマトリックスメタロプロテネース９（以下ｈＭＭＰ−９ともいう）遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るべく、マトリックスメタロプロテネース９遺伝子プロモーターの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、ＭＭＰ−９遺伝子の６５３塩基までの上流にあるプロモーター調節領域、図１、配列番号１で表わされる配列のうち−６５３〜−２４の領域中、ＡＰ−１結合領域及びＧＴ  ｂｏｘ  調節領域を含む領域、好ましくは、−８４〜−２４の領域（配列番号２）、より好ましくは−７７〜−７０（図２、配列番号３）の領域に結合する化合物及びＮＦ−κＢ結合領域を含む領域、好ましくは、−６１５〜−５５３の領域（配列番号４）、より好ましくは−６０５〜−５９９の領域（図３、配列番号５）に結合する化合物が、ヒトＭＭＰ−９遺伝子プロモーターの活性を有意に阻害し、ヒト乳腺癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてヒトＭＭＰ−９遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。【００１７】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子プロモーターの塩基配列−８４〜−２４（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
（２）更にβアラニン単位を含む上記（１）に記載の薬剤。
（３）更にフルオレセインイソチオシアネート（以下ＦＩＴＣとも言う）単位を含む上記(１)に記載の薬剤。
（４）ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制のための上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の薬剤。
（５）ヒトマトリックスメタロプロテネース９関連疾患の治療のための上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の薬剤。
（６）制癌剤として用いるための上記（５）に記載の薬剤。
（７）前記標的領域がヒトマトリックスメタロプロテネース９プロモーターの塩基配列−７７〜−７０（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の薬剤。
（８）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
【化１】
2009128547.tif 000002
（９）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
2009128547.tif 000003
（１０）Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子プロモーターの塩基配列−６１５〜−５５３（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
（１１）更にβアラニン単位を含む上記（１０）に記載の薬剤。
（１２）更にフルオレセインイソチオシアネート（以下ＦＩＴＣとも言う）単位を含む上記(１０)に記載の薬剤。
（１３）ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制のための上記（１０）〜（１２）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１４）ヒトマトリックスメタロプロテネース９関連疾患の治療のための上記（１０）〜（１２）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１５）制癌剤として用いるための上記（１４）に記載の薬剤。
（１６）前記標的領域がヒトマトリックスメタロプロテネース９プロモーターの塩基配列−６０５〜−５９９（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１０）〜（１５）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１７）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（１０）〜（１６）のいずれか一項に記載の薬剤。
【化３】
2009128547.tif 000004
（１８）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化４】
2009128547.tif 000005
（１９）上記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の薬剤及び上記（１０）〜（１７）のいずれか一項に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
（２０）上記（９）及び上記（１８）に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。
（２１）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の薬剤。
（２２）前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記（２１）に記載の薬剤。
（２３）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記（１０）〜（１７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（２４）前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記（２３）に記載の薬剤。
（２５）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化５】
2009128547.tif 000006
（２６）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化６】
2009128547.tif 000007
（２７）基礎実験の試薬として用いる上記（９）、（１８）、（２５）及び（２６）に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるので化学療法剤のような副作用がなく、また化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、マトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制のための薬剤、マトリックスメタロプロテネース９遺伝子関連疾患の治療のための薬剤及び制癌剤を得ることができる。さらに、本発明によれば、この遺伝子を用いた基礎実験の試薬を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子プロモーター領域の塩基配列を示す。
【図２】本発明のピロールイミダゾールポリアミドＨＭＭＰ９ＡＰ１のヒトＭＭＰ−９プロモーター配列上の結合部位を示す。
【図３】本発明のピロールイミダゾールポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβのヒトＭＭＰ−９プロモーター配列上の結合部位を示す。
【図４】本発明のピロールイミダゾールポリアミドＨＭＭＰ９ＡＰ１を示す。
【図５】本発明のピロールイミダゾールポリアミドＨＭＭＰ９ＡＰ１−ＦＩＴＣを示す。
【図６】本発明のピロールイミダゾールポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβを示す。
【図７】本発明のピロールイミダゾールポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβ−ＦＩＴＣを示す。
【図８】ＨＭＭＰ９ＡＰ１を用いたゲルシフト分析（ＥＭＳＡ）の結果を示す。レーン１：「マッチ」一本鎖ＤＮＡ、レーン２：「マッチ」二本鎖ＤＮＡ、レーン３：ＨＭＭＰ９ＡＰ１を添加した「マッチ」二本鎖ＤＮＡ、レーン４：二塩基対変異を有する「ミスマッチ」一本鎖ＤＮＡ、レーン５：二塩基対変異を有する「ミスマッチ」二本鎖ＤＮＡ、レーン６：ＨＭＭＰ９ＡＰ１を添加した二塩基対変異を有する「ミスマッチ」二本鎖ＤＮＡのゲルシフト分析の結果を示す。
【図９】ＨＭＭＰ９ＮＦκβを用いたゲルシフト分析（ＥＭＳＡ）の結果を示す。レーン１：「マッチ」一本鎖ＤＮＡ、レーン２：「マッチ」二本鎖ＤＮＡ、レーン３：ＨＭＭＰ９ＮＦκβを添加した「マッチ」二本鎖ＤＮＡ、レーン４：二塩基対変異を有する「ミスマッチ」一本鎖ＤＮＡ、レーン５：二塩基対変異を有する「ミスマッチ」二本鎖ＤＮＡ、レーン６：ＨＭＭＰ９ＮＦκβを添加した二塩基対変異を有する「ミスマッチ」二本鎖ＤＮＡのゲルシフト分析の結果を示す。
【図１０】創傷治癒アッセイの結果を示す。ＨＭＭＰ９ＡＰ１で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は濃度依存的に細胞の移動が減少することを示す。
【図１１】創傷治癒アッセイの結果を示す。ＨＭＭＰ９ＮＦκβで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＨｅＬａ細胞は濃度依存的に細胞の移動が減少することを示す。
【図１２】マトリゲル浸潤アッセイの結果を示す。ＨＭＭＰ９ＡＰ１で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるマトリゲル浸潤の結果である。ＨＭＭＰ９ＡＰ１の濃度依存的にマトリゲル浸潤は減少することを示す。結果は三回の実験の平均値±ＳＥで表現した。
【図１３】マトリゲル浸潤アッセイの結果を示す。ＨＭＭＰ９ＮＦκβで処理されたＨｅＬａ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるマトリゲル浸潤の結果である。ＨＭＭＰ９ＮＦκβの濃度依存的にマトリゲル浸潤は減少することを示す。結果は三回の実験の平均値±ＳＥで表現した。
【図１４】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＨＭＭＰ９ＡＰ１処理によってＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるｍＲＮＡの発現量が濃度依存的に減少することを示す。結果は三回の実験の平均値±ＳＥで表現した。Ｐ＜０．０５（*）のｐ値を有意であると判定した。
【図１５】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＨＭＭＰ９ＮＦκβ処理によってＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるｍＲＮＡの発現量が濃度依存的に減少することを示す。結果は三回の実験の平均値±ＳＥで表現した。Ｐ＜０．０５（*）のｐ値を有意であると判定した。
【図１６】ゼラチンを基質として用いたザイモグラフィアッセイの結果を示す。ＨＭＭＰ９ＡＰ１によって処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から得た条件培地を１０％ザイモグラムゼラチンゲルで電気泳動した。ゲル上の明確なバンドはマトリックスメタロプロテナーゼの活性を示す。
【図１７】ゼラチンを基質として用いたザイモグラフィアッセイの結果を示す。ＨＭＭＰ９ＮＦκβによって処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から得た条件培地を１０％ザイモグラムゼラチンゲルで電気泳動した。ゲル上の明確なバンドはマトリックスメタロプロテナーゼの活性を示す。
【図１８】ウエスタンブロッティング分析（タンパク質の測定）の結果を示す。ＨＭＭＰ９ＮＦκβによって処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から抽出したタンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す。ＭＭＰ−９タンパク質抗体でプローブしたＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜をストリッピング後、β−アクチンで再度プローブした結果も示す（下図）。濃度依存的にＭＭＰ−９タンパク質の発現量が減少することを示す。
【図１９】蛍光標識ＰＩＰの分布を示す。蛍光標識したＨＭＭＰ９ＡＰ１を添加し４５分間インキュベートした後の細胞内でのＨＭＭＰ９ＡＰ１の分布を示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）蛍光（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は核を染色する。
【図２０】蛍光標識ＰＩＰの分布を示す。蛍光標識したＨＭＭＰ９ＮＦκβを添加し３０分間及び９６時間インキュベートした後の細胞内でのＨＭＭＰ９ＮＦκβの分布を示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ｃ）蛍光の結果を示す。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は核を染色する。
【図２１】本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１のＨＰＬＣの結果を示す。
【図２２】本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１−ＦＩＴＣのＨＰＬＣの結果を示す。
【図２３】本発明のＨＭＭＰ９ＮＦκβのＨＰＬＣの結果を示す。
【図２４】本発明のＨＭＭＰ９ＮＦκβ−ＦＩＴＣのＨＰＬＣの結果を示す。
【図２５】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＨｅＬａ細胞を用いた増殖阻害アッセイの結果を示す。本発明のＨＭＭＰ９ＮＦκβによってＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＨｅＬａ細胞の増殖が阻害されたことを示す。
【図２６】ミスマッチピロールイミダゾールポリアミドの結合配列（Ａ）及びミスマッチピロールイミダゾールポリアミドを示す。
【図２７】抗ＮＦ−κβ抗体による免疫沈降ＰＣＲアッセイの結果を示す。in vivoにおいて、本発明のポリアミドＭＭＰ９ＮＦκβがＭＭＰ−９プロモーター領域とＮＦ−κβタンパク質の特異的な結合を阻害したことを示す。
【図２８】蛍光標識ポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβの組織内分布を示す。ＦＩＴＣ標識をしたポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβは投与１日後に肝臓、腎臓の細胞の核に多く取り込まれた。また、脾臓の細胞の核にも取り込まれたことが観察された。添加後６日後であっても強いＦＩＴＣの蛍光が観察された。
【図２９】胸腺欠損免疫不全マウス（ヌードマウス）ヒト大腸がん肝転移モデルによる本発明のポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβの評価の結果を示す。ＨＭＭＰ９−ＮＦκβポリアミドにより、ヌードマウスにおいて脾臓に移植されたヒト大腸がんの肝臓への転移が抑制された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位（以下γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１〜３参照）。
【００２１】
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
【００２２】
上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
【００２３】
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
【００２４】
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
【００２５】
本発明のマトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテネース９プロモーターの塩基配列−７７〜−７０（配列番号３）及び塩基配列−６０５〜−５９９（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
【００２６】
通常ＤＮＡの螺旋の骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
【００２７】
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。
【００２８】
ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子調節領域の塩基配列は図１及び配列番号１に示す通りである。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドＨＭＭＰ９ＡＰ1及びＨＭＭＰ９ＮＦκβは下記に示す通りである。
【００２９】
ＨＭＭＰ９ＡＰ1
【化７】
2009128547.tif 000008
ＨＭＭＰ９ＮＦκβ
【００３０】
【化８】
2009128547.tif 000009
【００３１】
ＨＭＭＰ９ＡＰ１は、分子式Ｃ75Ｈ93Ｎ31Ｏ15、分子量１６６８．６を有し、その標的配列はヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子調節領域（配列番号１）の−６５３〜−２４の領域のうち、ＡＰ１結合領域および  ＧＴ  ｂｏｘ  調節領域を含む−８４〜−２４（配列番号２）の領域であり、より具体的には−７７〜−７０の領域のａｇｔｃａｇｃａ（配列番号３）の８塩基に結合することにより、ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子の発現を抑制する。
【００３２】
ＨＭＭＰ９ＮＦκβは、分子式Ｃ66Ｈ84Ｎ24Ｏ13、分子量１４２１．３を有し、その標的配列はヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子調節領域（配列番号１）の−６５３〜−２４の領域のうち、ＮＦκβ領域を含む−６１５〜−５５３（配列番号４）の領域であり、より具体的には−６０５〜−５９９の領域のｔｇｇａａｔｔ（配列番号５）の７塩基に結合することにより、ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子の発現を抑制する。
【００３３】
本発明者らはヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子プロモーターの特定の領域を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。ＨＭＭＰ９ポリアミドは核内に４８時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムと比較して、ポリアミドはよりすぐれた透過性（低濃度、トランスフェクション媒体不要）とより高い安定性を培養乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において示した。ポリアミドの高い透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。
【００３４】
最近までＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発はプロモーター配列における転写因子−ＤＮＡ複合体の構造的特性に基づいていた。ＴＡＴＡボックス含有プロモーター中の配列を標的とする効率的な方法は、ＴＡＴＡボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。ＴＡＴＡボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子において転写開始部位の上流２５〜３５塩基対に位置している。転写介在因子Ｄ（ＴＡＦＩＩＤ）はＴＡＴＡボックスに特異的に結合するＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を含んでおり、コアプロモーターにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス（ＰＩＣ）を形成する。ＰＩＣは遺伝子転写を開始してアクチベータ又はサプレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。ＴＢＰも二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合するので（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ２０；６７（６）：１２４１−５０、  Ｓｔａｒｒ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１；６７：１２３１−４０、  Ｃｏｕｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８）、合成ポリアミドはＴＡＴＡ結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモーターで設計したポリアミドの成功例のうちで、ＴＡＴＡボックスを標的とするものが常に機能することが知られている。
【００３５】
ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子の上流調節領域には、転写因子アクチベータタンパク質−１（以下ＡＰ−１ともいう）、ＮＦ−κβ、及び刺激性タンパク質−１（以下Ｓｐ−１とも言う）、転写因子Ｅｔｓの結合部位およびＧＴ  ｂｏｘ調節領域が存在する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験モデルから、ＡＰ−１タンパク質は、細胞増殖、分化、アポトーシス及び形質変換の調節に関し重要な働きをすることが分かっている（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６８（１９９３）２３４６０−２３４６８，Ｓｈａｕｌｉａｎ  ＆  Ｋａｒｉｎ：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０ （２００１）２３９０−２４００，Ｈｉｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ  ａｌ：  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４  （１９９７）  １９９５−１９９８）。また、ＮＦ−κβタンパク質は腫瘍細胞の浸潤、転移及び薬剤抵抗性の調節に重要な働きをすることが分かっている（Ｂｏｎｄ ｅｔ  ａｌ：ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３５ (１９９８）２９−３４、及びＰａｈｌ  ：Ｏｎｃｏｇｅｎ  １８  （１９９９）  ６８５３−６８６６)。さらにＭＭＰ−９におけるＧＴ  ｂｏｘ調節領域（ＧＧＧＧＴＧＧＧＧ  −５４〜−４６；配列番号６）がＭＭＰ−９の発現に重要な働きをしており上流のＡＰ−１結合領域（ＴＧＡＧＴＣＡ  −７９〜−７３；配列番号７）までの転写調節領域の−７１〜−３０の配列に蛋白複合体として結合することでＭＭＰ−９の発現を正に調節していることが明らかになっている(Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６８（１９９３）２３４６０−２３４６８，および Ｆａｒｉｎａ  ｅｔ aｌ：Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １０（１９９９）３５３−３６７)。
【００３６】
上記結合部位における変異は、組織プラスミノーゲン活性化因子によるＭＭＰ−９誘導の低下又は停止を、及びＭＭＰ−９の発現抑制は、腫瘍細胞の浸潤及び転移能力の低下を引き起こしうる。従って、当該転写因子の機能抑制はＭＭＰ発現及び活性の抑制という治療目的の重要な標的である。
【００３７】
ＮＦ−κβ結合部位における変異又はＮＦ−κβデコイは、化学療法剤によるＭＭＰ−９誘導の減少を示した。ＭＭＰ−９プロモーターにおける腫瘍壊死因子α、組織プラスミノーゲン活性化因子及びＮＦ−κβ結合の特異的阻害は、正常細胞におけるＭＭＰ−９発現及び他のＭＭＰ遺伝子発現への影響を及ぼさないものと考えられる。
【００３８】
本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１はＡＰ−１結合部位およびＧＴ  ｂｏｘ調節領域を認識する複合体の認識部位を含む配列に結合することにより、ＡＰ−１タンパク質およびＧＴ  ｂｏｘ認識複合体の結合を阻害すると考えられ、ｈＭＭＰ−９のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を特異的に低下させた。本発明のＨＭＭＰ９ＮＦκβは、ＮＦ−κβ結合部位に結合することにより、ＮＦ−κβ複合体の結合を阻害すると考えられ、ｈＭＭＰ−９のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を特異的に低下させた。
【００３９】
プロモーター領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデニレーション、スプライシング、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始等を包含するものである（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００１；５：２６３−８、  ＭｃＫｅｏｗｎ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１３３−５５、  Ｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ：Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１９９４；１９：３３６−４０、  Ｋｏｚａｋ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１９７−２２５）。合成ポリアミドはヌクレオソームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合・脱縮合構造に影響を与えている可能性がある（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００２；３２１：２４９−６３；Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６１５−２９。）。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、ＧＡＦの結合を可能とし、その結果ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは合成が比較的容易であり、特定の配列を標的とするように設計することができる。このことで、ゲノムの機能解析や最終的にはヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子阻害や他の関連する遺伝子調節を変化させ、阻害、活性化するような遺伝子治療に使用できる可能性がある。
本発明に係るＰｙ−Ｉｍポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。従って、本発明のＭＭＰ９ＡＰ１及びＭＭＰ９ＮＦκβはヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制のための薬剤、当該遺伝子関連疾患の治療、及び制癌剤として使用することができる。
【００４０】
既存の細胞内の特定塩基配列に結合する小分子は分子細胞学の分野において便利な検査薬剤、評価薬剤として使用でき、ヒトに対する薬品としても有用であると考えられる。本発明のポリアミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの染色体ＤＮＡに結合するだけでなく、細胞外膜を通過して生存細胞の核に到達することができる。
【００４１】
転移は細胞浸潤を含む多段階の過程で成り立つ、腫瘍細胞の基底膜への浸潤、血管内への侵入、血管外への遊出、遠位臓器の組織中への浸潤、そして血管内への侵入を繰り返すことで次の浸潤カスケードという過程をたどる。進行性、転移性の様々な癌においてＭＭＰ−９は過剰に発現されている。ＭＭＰ−９の過剰発現が細胞基底膜を含む細胞外基質を分解することで、腫瘍細胞が動くことを可能にし、腫瘍浸潤に導くことが仮定されている。さらに新生血管内皮細胞増殖による腫瘍への栄養血管の進入にもＭＭＰ−９の発現が重要であり、腫瘍浸潤、転移、血管新生阻害を目的に多数のＭＭＰ分子阻害剤を用いた、多様な癌での臨床試験が実施された。しかし、初期の臨床試験において腱炎を伴う筋肉痛及び関節痛が副作用として見られた。これらの副作用は、阻害剤が適切なＭＭＰに特異的に働かないことおよび正常細胞での作用も阻害することから起こるものである。従って、一つのＭＭＰ分子に対する特異的な阻害剤がとくに腫瘍浸潤や炎症の誘発時にのみ阻害効果を強く発揮することが必要とされる。
【００４２】
この点において、ヒトＭＭＰ−９遺伝子を標的にした「非−アルキル化」Ｐｙ−Ｉｍポリアミドを設計した。ＭＭＰ−９は、細胞マトリックス、特に基底膜を分解することによった腫瘍の増殖を伴う腫瘍の浸潤や転移、血管の新生などに重要な役割を果たしている。
【００４３】
持続的ＭＭＰ−９の高発現は、乳癌を含む多くの癌の悪性化に関連している。特にＭＭＰ−９プロモーターに対する、周期性ＮＦ−κβ刺激や、ＧＴ  ｂｏｘへの転写複合体結合が癌の悪性化に関与する報告がされている。またｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける多数の実験モデルでＡＰ−１タンパク質は細胞増殖、アポトーシス、及び形質転換の調節に重要な役割を果たしていることも示唆されている。
【００４４】
更に、腫瘍浸潤及び転移に加えて、ヒトＭＭＰ−９のＮＦ−κβ結合部位は、化学療法又は放射線療法後の治療的耐性の標的であり得るかもしれない（Ｆｕｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００７  ４６  ４０２−４１３）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける多数の実験モデルから周期性ＮＦ−κβタンパク質刺激は腫瘍細胞の浸潤、転移、及び薬剤耐性の調節に重要な役割を果たしていることが示唆されている。周期性ＮＦ−κβ刺激は急性反応から持続性の炎症反応、慢性炎症への移行に関与する遅反応性蛋白の発現制御と関わると考えられている（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  １０９  １２４１−１２４５）。Ｐｙ−ＩｍポリアミドのＮＦ−κβ結合部位への結合はＮＦ−κβタンパク質の結合と競合することで、この周期性の刺激を阻害すると考えられる。このことによりＮＦ−κβタンパク質の周期性の刺激によるＭＭＰ−９の持続的発現が阻害されることが容易に推測される。
【００４５】
ゲルシフト分析において、本発明のポリアミドは標的ＤＮＡに対する強力かつ選択的結合を示した。また、本発明のポリアミドＨＭＭＰ９ＡＰ１−ＦＩＴＣは、乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加４５分後に核に局在すること、さらに９６時間後でもなお核に局在することが分かった。ポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβ−ＦＩＴＣについても、乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加３０分後に核に局在すること、さらに９６時間後でもなお核に局在することが分かった。従って、本発明のポリアミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて速やかに核に移動し、核に特異的に局在することが分かった。アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、及びデコイなどの核酸医薬は、遺伝子サイレンシング剤として開発されてきた。しかし、特にデコイはポリアミドと似た様式での標的転写因子の結合を阻害する。しかしながら、ヌクレアーゼによって薬剤が容易に分解されるので、組織に到達させる充分なドラッグデリバリーシステムが必要となる。一方、本発明のポリアミドはヌクレアーゼに対して完全な耐性を有するため、遺伝子サイレンシング医薬としてより適している。従って、ドラックデリバリーシステム等の手法を用いなくても、本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１は細胞の核内に移行するため薬剤として有利である。当該有利な効果は、本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβをヒトマトリックスメタプロテネース９遺伝子抑制剤、当該遺伝子関連疾患の治療、及び制癌剤に用いるために有利である。
【００４６】
本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβは、ヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びヒト子宮頸がん由来のＨｅＬａ細胞の浸潤活性をポリアミドの濃度依存的に阻害した。従って、本発明のポリアミドには癌細胞の移動を抑制することにより、抗癌剤として使用できる点で有利である。
また、本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβはヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びヒト子宮頸がん由来のＨｅＬａ細胞の濃度依存的に生細胞数を減少させた。このことより、本発明のポリアミドが当該細胞の増殖を抑制したことが分かった。
なお、本発明のポリアミドが標的とする塩基配列以外の配列（図１において四角で囲まれた配列）に対して合成されたポリアミドは、ＨｅＬａ細胞を用いた増殖抑制アッセイにおいて増殖の抑制を示さなかった（データは示さない）。このことより、本発明のポリアミドの特異性が示された。
【００４７】
本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβは、ヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びヒト子宮頸がん由来のＨｅＬａ細胞の移動を濃度依存的に阻害した。移動は浸潤の第一段階であるため、移動能の阻害性を評価することは重要である。従って、本発明のポリアミドは癌細胞の移動、ひいては浸潤を抑制することにより、抗癌剤として使用できる点で有利である。
【００４８】
本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβは、ヒト乳腺癌細胞においてＭＭＰ−９ｍＲＮＡの発現及びＭＭＰ−９タンパク質の発現を顕著に抑制した。したがって、本発明のポリアミドによって、ＭＭＰ−９遺伝子発現が抑制されることが分かった。
本発明のＨＭＭＰ９ＮＦκβによって、マウスヒト大腸がん肝転移モデルにおける肝転移巣の数及び面積が減少した。
従って、本発明のポリアミドは、ＭＭＰ−９遺伝子発現抑制のための薬剤、ＭＭＰ−９関連疾患、具体的には、血管新生、繊維化、細胞浸潤を含む病態、浸潤性腫瘍、転移性腫瘍、腫瘍血管新生の治療のための薬剤、及び制癌剤として使用できる点で有利である。
【実施例】
【００４９】
１．ヒトプロモーターに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの合成【００５０】
（１）ヒトマトリックスメタロプロテネース９遺伝子のＡＰ−１、ＧＴ  ｂｏｘ  複合体、及びＮＦκβ結合部位に対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
Ｉ．材料及び方法
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとして、ヒトマトリックスメタロプロテネース９プロモーター領域の−７７〜−７０又はヒトマトリックスメタロプロテネース９プロモーターの−６０５〜−５９９の塩基対に結合するように、上記のようなＨＭＭＰ９ＡＰ１、及びＨＭＭＰ９ＮＦκβを設計した。【００５１】
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。【００５２】
ＦＩＴＣカップリング：４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
一般的手順：  Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行い、これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。最終カップリング工程を終えた後、Ｎ末端アミノ基をピペリジンにより除去したのち、4等量のフルオレセインとDIEAを反応容器に加え60分間反応させた。反応終了後、ＤＭＦおよびメタノールにより反応樹脂の洗浄と回収を行った。【００５３】
カルボン酸としての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
アミンとしての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍＬ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
精製：  最終精製は、１０ｍＬ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水又は０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出により行った。ＨＭＭＰ９ＡＰ１、ＨＭＭＰ９ＡＰ１−ＦＩＴＣ、ＨＭＭＰ９ＮＦκβ及びＨＭＭＰ９ＮＦκβ−ＦＩＴＣを図４、図５、図６及び図７に示す。またそれぞれのＲＰ−ＨＰＬＣのチャートを図２１、図２２、図２３及び図２４に示す。【００５４】
２．ゲルシフトアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ  （ＥＭＳＡ））
Ｉ．材料及び方法
オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、ＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβプロモーターの塩基対に対応する２種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした。一方の一本鎖オリゴヌクレオチドをＦＩＴＣで標識し、相補的配列の一本鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして二本鎖ＤＮＡを作成した。具体的なヌクレオチドの塩基配列は、ＡＰ−１結合部位を含む−７７〜−７０領域に相当するＨＭＭＰ９ＡＰ１（マッチ）センスプライマー（５’ＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡＣＴＴＧＣＣ）（配列番号８）及びこれに２塩基変異を有するＨＭＭＰ９ＡＰ１オリゴＤＮＡ（ミスマッチ１）センスプライマー（５’ＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＣＡＣＴＴＧＣＣ）（配列番号９）、並びにＮＦκβ結合部位を含む−６０５〜−５９９を含むＨＭＭＰ９ＮＦκβ（マッチ）センスプライマー（５’ＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧＣ）（配列番号１０）及びこれに２塩基変異を有するＨＭＭＰ９ＮＦκβ（ミスマッチ１）センスプライマー（５’ＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣ）（配列番号１１）および前記４つのプライマーにそれぞれ相補的なアンチセンスプライマーを作成した。０．６μＭの蛍光標識されたマッチ二本鎖ＤＮＡ又はミスマッチ二本鎖ＤＮＡ（蛍光センスプライマーとアンチセンスプライマーにより作成された２本鎖ＤＮＡ）を、３７℃で１時間、結合緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７。９、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で１０μＭポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、蛍光標識二本鎖オリゴヌクレオチドの移動度を蛍光イメージ解析機（フジフィルム、ＬＡＳ−４０００、東京、日本）で解析した。【００５５】
ＩＩ．結果
合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
ゲルシフトアッセイによりＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβの標的配列への結合を検討した。それぞれのピロールイミダゾールポリアミドの標的配列を含む２２塩基のセンス、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを作成し、これをアニーリングさせて標的部位の二本鎖ＤＮＡを作成し、これとそれぞれのピロールイミダゾールポリアミドとをインキュベートした。これらをポリアクリルアミドゲルで電気泳動してピロールイミダゾールポリアミドと標的配列との結合性を検討した。ＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβとともに二本鎖ＤＮＡ（ＤＳ）にピロールイミダゾールポリアミド（Ｐｙ−Ｉｍ）を加えると、ＤＳのみのレーンと比べ泳動度が低下し、高分子化したことが示唆され、ＤＳとＰｙ−Ｉｍとの結合が証明された。結果を図８及び図９に示す。【００５６】
３.細胞型及び培養条件
ヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を使用した。１００μｇ／mlのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓt.Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）中で、５％ＣＯ２を含む加湿環境、３７℃で培養した。ヒト子宮頸がん細胞ＨｅＬａ細胞は１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ  Ｌ-グルタミンを含有するダルベッコ基礎培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養した。【００５７】
４．創傷治癒アッセイ（Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
Ｉ．材料及び方法
創傷治癒過程における細胞の移動を測定するために、８ウェルチャンバースライドの各々のウェルに細胞（３×１０５）を播種し、細胞が集密状態に達したときに、細胞層をプラスチックマイクロピペットによって傷つけた。培地及びデブリは吸引除去し、種々のポリアミドを含む１００μｌの新鮮な培地に入れ替えた。傷をつけてから４８時間後に細胞はＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ溶液（国際試薬株式会社、神戸、日本）によって固定してから染色し、位相差顕微鏡によって撮影した。【００５８】
ＩＩ．結果
本発明のポリアミドの細胞移動能を評価する為に様々な濃度のポリアミドを用いて細胞を処理した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は創傷治癒分析の結果、本発明のポリアミドによって移動を阻害されることが分かった。ＤＭＳＯ処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１は４８時間で傷を受けた領域が閉じることが分かった。対照的に、本発明のポリアミドである、ＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の移動を濃度依存的に阻害することが分かった。また、ＨＭＭＰ９ＮＦκβはＨｅＬａ細胞の移動を濃度依存的に阻害することが分かった。これらの結果より、本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβはヒト乳腺癌細胞において細胞の移動を阻害することが分かった。また、ＨＭＭＰ９ＮＦκβはヒト子宮頸がん細胞においても細胞の移動を阻害することが分かった。結果を図１０及び図１１に示す。【００５９】
５．マトリゲル浸潤アッセイ（Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｉｎｔｏ  ｍａｔｒｉｇｅｌ）
Ｉ．材料及び方法
細胞浸潤アッセイは、２４ウェル細胞培養ＢｉｏＣｏａｔマトリゲル浸潤チャンバー（ベクトンディックソンラボウエア、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０３細胞／ウェル）又はＨｅＬａ細胞（１×１０３細胞／ウェル）を０．１％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地またはＤＭＥＭ培地に懸濁させ、上部チャンバーに添加した。５％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地又はＤＭＥＭ培地は下部チャンバーに添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ２で２２時間培養した。メンブレンの上部に残った非浸潤細胞はコットンスワブによってふき取った。浸潤細胞は固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋキットで染色した。メンブレンに浸潤した細胞の数を、光学顕微鏡（拡大率２００×）を用いて一つのメンブレンで１０視野のカウントを、計３つの膜で行い平均と標準偏差を求めた。【００６０】
ＩＩ．結果
細胞外マトリックス構成タンパク質の分解は、腫瘍細胞浸潤において重要である。本発明のＭＭＰ９Ｐｙ−Ｉｍポリアミド、ＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβの腫瘍細胞浸潤に対する影響を評価するために、種々の濃度のポリアミドと５×１０３のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２２時間インキュベートした。ＤＭＳＯ及び本発明のポリアミドで処理した細胞の浸潤性をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において比較した。ＤＭＳＯで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はマトリゲルでコートした透過膜を顕著に浸潤した。これは、細胞が顕著に染色されたことから示唆される。対照的に、本発明のＨＭＭＰ９ＡＰ１及びＨＭＭＰ９ＮＦκβで処理した細胞では、メンブレンへの浸潤が顕著に減少した。これは、対照と比較した染色強度によって示唆される。０．３μＭ、１μＭ、３μＭ及び１０μＭのＨＭＭＰ９ＡＰ１で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＤＭＳＯ処理対照と比べて、それぞれ、９０％、５２％、４４％及び２５．４％の浸潤の減少を示した。０．３μＭ、１μＭ、３μＭ及び１０μＭのＨＭＭＰ９ＮＦκβで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＤＭＳＯ処理対照と比べて、それぞれ、８８％、６１％、３０％及び２２％の浸潤の減少を示した。これらの結果より、濃度依存的にマトリゲルを通過する浸潤細胞が減少することが分かった。結果を図１２及び図１３に示す。【００６１】
６．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ｍＲＮＡ発現の測定）
Ｉ．材料及び方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を種々の濃度の本発明のポリアミドで処理した。処理の４８時間後、細胞分画は製造者の手順に従ったトライゾール試薬（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．）を用いたＲＮＡ分離に供した。ＲＮＡはｃＤＮＡ合成の前にＤＮａｓｅによって処理された。逆転写による相補的ＤＮＡ鎖はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄｋｉｔ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．）によって合成された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ＴＰ８００，  Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，  Ｊａｐａｎ）は、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を使用した。ＨＭＭＰ９ＡＰ１のためのプライマーは、（フォワード、  ５’−ＧＡＧＡＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＡＧ−３’，配列番号１２；  リバース  ５’−ＴＡＣＡＣＧＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧ−３’，配列番号１３；２３６ｂｐ），  及び内部標準ヒト内在性グリセルアルデヒド−３−ホスフェート  ジヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ；フォワード、５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３’，配列番号１４；リバース、５’−ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ−３’，配列番号１５；１３８ｂｐ）を使用した。また、ＨＭＭＰ９ＮＦκβのためのプライマーは、（フォワード、５’−ＧＡＧＡＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＡＧ−３’，配列番号１６；リバース、５’−ＴＡＣＡＣＧＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧ−３’，配列番号１７；２３６ｂｐ）及び内部標準ヒト内在性グリセルアルデヒド−３−ホスフェート  ジヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ；フォワード、５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３’，配列番号１８；リバース、５’−ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ−３’，配列番号１９；１３８ｂｐ）を使用した。ツーステップＲＴ−ＰＣＲ混合物２５μｌは、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸＴＡｑ１２．５μｌ、夫々のフォワード及びリバースプライマー０．５μｌ、ＲＮａｓｅフリー水１０．５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ１μｌからなる。リアルタイムサイクル条件は、９５℃、１０秒、９５℃、５秒  ６０℃、３０秒の反応系によって行った。ＭＭＰ−９遺伝子の定量はＧＡＰＤＨ発現と比較することによって標準化した。【００６２】
ＩＩ．結果
本発明のポリアミドによる細胞移動及び浸潤活性がＭＭＰ−９発現の減少と相関しているかどうかを更に調べるために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、本発明のポリアミドで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＤＭＳＯ処理したコントロールのＭＭＰ−９発現レベルを比較した。転写調節はＭＭＰ−９発現に重要な役割を果たす。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる分析は、ＨＭＭＰ９ＡＰ１では、ＭＭＰ−９ｍＲＮＡの発現量は０．３μＭで８４％、１μＭで５４％、３μＭで３８％、１０μＭで２６％減少した（図１４）。ＨＭＭＰ９ＮＦκβでは、ＭＭＰ−９ｍＲＮＡの発現量は０．３μＭで８６％、１μＭで６８％、３μＭで４０％、１０μＭで２８％減少した（図１５）。本発明のポリアミドによって、濃度依存的にＭＭＰ−９ｍＲＮＡの量が減少していることが分かった。【００６３】
７．ザイモグラフィアッセイ
Ｉ．材料及び方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清から採取したタンパク質をＮｏｖｅｘ（登録商標）ザイモグラムゼラチンゲル及びＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋＴＭ  Ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．）を用いて行った。２．５×１０５細胞に種々の濃度の本発明のポリアミドを加えた。４８時間インキュベート後に上清を採取した。各サンプルからのタンパク質をＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳサンプルバッファー（２×）に混合し、１０％ザイモグラムゼラチンゲルで分離した。製造者のマニュアルに従って、ゲルは再生バッファー及び現像バッファーで洗浄した。その後ゲルはデジタル化された。【００６４】
ＩＩ．結果
４８時間処理した細胞から採取された細胞培養上清の蛋白活性を測定した。コントロールと比べて、１μＭのＨＭＭＰ９ＡＰ１の処理でゼラチン分解活性が５０％抑制され、１０μＭでほとんど完全にＭＭＰ−９の酵素活性は阻害された（図１６）。１μＭのＨＭＭＰ９ＮＦκβの処理でゼラチン分解活性が６２％抑制され、１０μＭでは８２％抑制された（図１７）。【００６５】
８．ウエスタンブロッティング分析（タンパク質の測定）
Ｉ．材料及び方法  
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、種々の濃度の本発明のポリアミドで処理した。処理の４８時間後、細胞を採取し、全細胞ライセートを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むプロテアーゼ阻害カクテル（ベーリンガーインゲルハイム、ＧｍｂＨ、ドイツ）を含む抽出バッファー中に準備した。ホモジネートは、１５，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を採取し、タンパク質濃度を測定した。タンパク質サンプル（１０μｇ）をＮｕＰＡＧＥ＋ＴＭ１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．）上で電気泳動し、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）ポリビニリデンジフルオライド膜（ミリポア、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）にトランスファーした。ＰＶＤＦ膜は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）から入手したラビット抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）（１：５００）とともに終夜インキュベートした。ＰＶＤＦ膜を０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝液で三回洗浄した。免疫複合体化タンパク質は、ウサギＩｇＧに対するペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体（ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）との反応によって同定され、次に化学発光検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって増幅された。【００６６】
ＩＩ．結果
本発明のポリアミドがＭＭＰ−９タンパク質発現を抑制するかを調べるために、ウエスタンブロッティング分析を行った。本発明のポリアミド処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＤＭＳＯ処理したコントロールのＭＭＰ−９発現レベルを比較した。転写調節はＭＭＰ−９タンパク質発現に重要な役割を果たす。ウエスタンブロッティング分析は、ＨＭＭＰ９ＮＦκβで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で、ＭＭＰ−９タンパク質の発現がＨＭＭＰ９ＮＦκβの濃度依存的に低下したことを示した。結果を図１８に示す。【００６７】
９．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける蛍光標識ＰＩＰの分布【００６８】
Ｉ．材料及び方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、６ウェルプレートの各ウェルに３．０×１０４となるよう播種した。２ｍｌの１０％ＦＢＳ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて３７℃、５％、ＣＯ２で培養した。培養２４時間後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に蛍光標識ポリアミドＨＭＭＰ９ＡＰ１（以下ＨＭＭＰ９ＡＰ１−ＦＩＴＣとも言う）及び蛍光標識ポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβ（以下ＨＭＭＰ９ＮＦκβ−ＦＩＴＣとも言う）を最終濃度１０μＭで成長培地に添加し２時間培養した。細胞は洗浄しＦＢＳフリー培地を添加した。あらかじめ決められた時間（30分と96時間）において、生存細胞を×２００の倍率で観察し４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって染色し、再度観察した。【００６９】
ＩＩ．結果
ＨＭＭＰ９ＡＰ１−ＦＩＴＣは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を培養している成長培地に添加された４５分後すべての細胞で核での局在が観察された（データは示さない）。添加から９６時間後であってもＨＭＭＰ９ＡＰ１−ＦＩＴＣは、安定に核に存在することが確認された。また、ＨＭＭＰ９ＮＦκβ−ＦＩＴＣは、添加された３０分後すべての細胞の核での局在が観察された。添加から９６時間後であってもＨＭＭＰ９ＮＦκβ−ＦＩＴＣは、安定に核に存在することが確認された。結果を図１９及び図２０に示す。【００７０】
１０．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＨｅＬａ細胞を用いた増殖阻害アッセイ
Ｉ．材料及び方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＨｅＬａ細胞を用いて細胞増殖抑制試験を行った。ＨｅＬａ細胞を、２５００細胞となるよう９６穴マイクロタイタープレートに播種し、１００μｌの培地、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、にて２４時間培養後、培地を交換し、０μＭから３０μＭ（０μＭ，０．３μＭ，１μＭ，３μＭ，１０μＭ，３０μＭ）のポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβを含む１０％子牛血清添加培地で７２時間培養し、生細胞数測定試薬ＳＦ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，  Ｉｎｃ．）を１０μｌずつ添加し、２時間呈色反応を行い、ＡＲＶＯマイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお，当該実験は水溶性ホルマザンを用いたｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（ＷＳＴ−８ＴＭ：  Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，  Ｉｎｃ．）で施行した。【００７１】
ＩＩ．結果
ポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβをＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＨｅＬａ細胞に添加することによって、濃度依存性に生細胞数の減少が見られた。このような結果は、本発明のポリアミドが制癌剤として有効であることを示唆する。結果を図２５に示す。【００７２】
１１．抗ＮＦ−κβ抗体による免疫沈降ＰＣＲアッセイ
Ｉ．材料及び方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＨｅＬａ細胞を用いて抗ＮＦκβ抗体による免疫沈降ＰＣＲアッセイを行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＨｅＬａ細胞を１００ｍｍ培養皿に播種し１００μｌの培地、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて２４時間培養後、１μＭのマッチポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβ及び１μＭのミスマッチポリアミド（図２６に示す。）とともに４時間培養した。蛋白−ＤＮＡ複合物は１％ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定し、特異的ＮＦ−κＢｐ６５抗体と非特異的ｒａｂｂｉｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  抗体との反応を行い、抗体−蛋白−ＤＮＡ複合物として、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｂｅａｄｓで沈降させ回収した。蛋白−ＤＮＡの複合物は５Ｍ  ＮａＣｌで反応することによってＤＮＡを分離し、ＭＭＰ９ＮＦκβ結合配列を挟むＰＣＲプライマーで増幅反応を行った。ＭＭＰ９遺伝子プロモータ領域のＮＦκβと結合したＤＮＡが、ＰＣＲ産物として同定される。
ＰＣＲプライマーは、フォワード：  ５’−ＴＧＴＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＡ−３’（配列番号２０），  リバース：  ５’−ＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴ−３’（配列番号２１））を用い、ＭＭＰ−９プロモータ領域（−６５７から−４８４）を増幅した。(Schwingshackl A, Duszyk M, Brown N, Moqbel R. HμＭan eosinophils release matrix metalloproteinase-9 on stimulation with TNF-α. J Allergy Clin Immunol 104: 983-989, 1999). 【００７３】
ＩＩ．結果
ＭＭＰ−９プロモーターのＮＦ−κβ領域は、本発明のポリアミドで未処理及びミスマッチポリアミドで処理した場合には、抗ＮＦ−κβｐ６５抗体によって免疫沈降された。しかしながら、ＮＦ−κβｐ６５−ＮＦ−κβ結合領域複合体は、本発明のポリアミドＭＭＰ９ＮＦκβで処理した場合には、上記免疫沈降アッセイで検出されなかった。結果は図２７に示す。この結果は、in vivoにおいて、本発明のポリアミドＭＭＰ９ＮＦκβがＭＭＰ−９プロモーター領域とＮＦ−κβタンパク質の特異的な結合を阻害したことを示す。【００７４】
１２．蛍光標識ポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβの組織内分布
Ｉ．材料及び方法
０．１５ｍｇ蛍光標識ポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβ（以下、ＨＭＭＰ９ＮＦκβ−ＦＩＴＣとも言う）を最終濃度７．５ｍｇ／ｋｇでマウスに尾静脈注射した。静脈注射後１日（２４時間）、６日および２１日目にマウスを解剖し、肝臓、脾臓、腎臓の各組織を採集し、冷凍切片を作製し４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって染色し、観察した。【００７５】
ＩＩ．結果
ＦＩＴＣ標識をしたポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβは投与１日後肝臓、腎臓の細胞の核に多く取り込まれた。脾臓の細胞の核にも取り込まれた。また，添加後６日後でも、強いＦＩＴＣの蛍光が認められた。さらに，６日でＦＩＴＣの蛍光強度があまり減弱しない事より、ポリアミドＨＭＭＰ９ＮＦκβが細胞核内で非常に安定であることが示唆された。しかし２１日後には、各組織の細胞でのＦＩＴＣの蛍光強度は顕著に減弱しており、細胞核内でのＤＮＡの結合は徐々に失われていくものと考えられた。これは他のポリアミド化合物と同様に、尿や胆汁よりポリアミドが排泄されることで説明できる現象であった。結果は図２８に示す。【００７６】
１３．胸腺欠損免疫不全マウス（ヌードマウス）ヒト大腸がん肝転移モデルによる評価
Ｉ．材料及び方法
５週齢の雄ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｎｕｄｅ  Ｍｉｃｅ  ＣＢｙ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊ）（ジャクソンラボラトリー）を購入し、無病原体環境で６週齢まで維持し、実験に使用した。ヒト大腸がん細胞株ＨＴ２９を１００ｃｍ２細胞培養フラスコで単層培養し、コンフルエント前に０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ、０．０２％ＥＤＴＡ液で処理し、細胞を採取、８００ｒｐｍで３分遠心後Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳで洗浄し、１時間ポリアミド１０μＭ濃度に調整した培養液もしくはポリアミドを含まない培養液で一時間培養後に再度１００μｌ中３×１０６細胞となるようにＰＢＳで細胞サスペンジョンを作製した。このようにしてＨＭＭＰ９ＮＦκβポリアミド含有、ミスマッチポリアミド含有及びポリアミド非含有ＰＢＳによる３群の細胞をそれぞれ６匹のヌードマウスに投与した。ヌードマウスは麻酔下に左側腹部皮膚に縦切開を入れ、腹膜を切開し、脾臓に達し、２９ゲージの注射針を用い、脾臓被膜下に、上記大腸がん細胞サスペンジョンを１００μｌ移植した（図２９Ａ）。細胞移植部の脾臓被膜を通した色調の変化及び出血、サスペンジョン液の漏出がないことで移植細胞の脾臓被膜下への確実な移入を確認した。移植後のマウスは、６週間飼育され、剖検を行った。肝臓と脾臓を摘出し、１０％緩衝ホルマリン溶液で固定し、ヘマトキシリン・エオジン組織染色を行い、顕微鏡観察に供した。図２９Ｂにそれぞれの群における転移巣数を示す。肝臓転移巣部分を標本中に円の中として示す。【００７７】
ＩＩ．結果
全ての症例で大腸腺がん細胞の浸潤が脾臓の移植部に原発巣として、肝に転移巣として認められた。図２９（Ｂ）に示されるように肝転移巣の数と大きさがＨＭＭＰ９ＮＦκβ群で明らかに少なく面積も小さいことが示された。これに対しポリアミド未処理群、ミスマッチポリアミド投与群では転移巣の大きさが大きく、転移巣同士の融合傾向が強く、転移巣の数も多い傾向が見られた（図２９）。このことは、ＨＭＭＰ９ＮＦκβポリアミドによりヌードマウスにおいて脾臓に移植されたヒト大腸がんの肝臓への転移が抑制されたことを示すものと考えられた。【００７８】
１４．統計解析
結果は平均値±ＳＥで表現した。統計的有意性はスチューデントｔ−検定により評価した。０．０５未満のｐ値を有意であると判定した。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明はマトリックスメタロプロテネース９遺伝子発現抑制剤、マトリックスメタロプロテネース９関連疾患の治療薬及び制癌剤に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤に関する。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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