(57)【要約】界面活性剤による分析装置の汚染の問題を回避しつつ、分析対象タンパク質を十分に酵素消化することができ、消化後のタンパク質又はペプチド断片を十分に回収することができる、タンパク質試料の調製方法を提供する。  界面活性剤を使用してタンパク質を可溶化及びプロテアーゼ消化し、その後、界面活性剤を除去する手法において、界面活性剤を脂溶化して有機溶媒中に分離することを特徴とするタンパク質試料の調製方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）分析対象タンパク質；（ｉｉ）１種又は２種以上の脂溶性に改変可能な界面活性剤；及び（ｉｉｉ）プロテアーゼを含む反応溶液中で、分析対象タンパク質を消化するステップと、
（ｂ）該反応溶液に前記界面活性剤を脂溶化する試薬を添加するステップとを含み、
脂溶化された前記界面活性剤を有機溶媒中に分離することを特徴とする、タンパク質試料の調製方法。
【請求項２】
脂溶性に改変可能な界面活性剤がイオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
イオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記界面活性剤を脂溶化する試薬はカリウム塩であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
イオン性界面活性剤はカルボン酸型界面活性剤であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６】
カルボン酸型界面活性剤はコール酸ナトリウム、グリココール酸、ラウリルサルコシン酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム又はウルソデオキシコール酸ナトリウムであることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
脂溶性に改変可能な界面活性剤が酸不安定界面活性剤であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
酸不安定界面活性剤は、３−［（２−メチル−２−ウンデシル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシル］−１−プロパンスルホン酸ナトリウム又は３−［３−（１，１−アルキルオキシエチル）ピリジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記界面活性剤を脂溶化する試薬は酸であることを特徴とする請求項５又は７記載の方法。
【請求項１０】
前記酸はトリフルオロ酢酸であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
２種以上の脂溶性に改変可能な界面活性剤は、カルボン酸型界面活性剤から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
カルボン酸型界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウム及びラウリルサルコシン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記有機溶媒は予め前記反応溶液中に混合されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記反応溶液はマイクロエマルジョンの形態であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）後に前記有機溶媒を前記反応溶液に添加し、脂溶化された前記界面活性剤を有機溶媒中に分離することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記有機溶媒はオクタノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル、クロロホルム又はヘキサノールであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
分析対象タンパク質は電気泳動による分離後に切り出したゲルに含まれる目的のタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法によりタンパク質試料を調製し、分析に供することを特徴とするタンパク質の分析方法。
【請求項１９】
前記分析は該サンプルを液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）であることを特徴とする請求項１８記載のタンパク質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質試料、例えば、質量分析に使用するための不溶性タンパク質試料の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を質量分析計で測定する場合、感度などの問題からトリプシンなどの切断特異性の明らかな消化酵素で断片化した後に測定する。その際、溶液中で消化する場合と、ゲル電気泳動で分離後、ゲル内で消化する場合があり、それぞれに一長一短があるが、これらの方法によりプロテオームレベルでのタンパク質の網羅的な解析が可能となっている。
タンパク質を消化酵素で断片化する際には、タンパク質を可溶化する必要がある。従来、タンパク質、特に不溶性タンパク質を可溶化するために、界面活性剤や有機溶媒などが使用されてきた。しかし、有機溶媒はタンパク質可溶化能に乏しく、高濃度で添加すると逆にタンパク質を不溶化したり、消化酵素を変性させてしまうという不都合を有する。また界面活性剤も消化酵素の変性という問題を有する上、分析装置の汚染の問題を抱えている。
このような状況において、近年、タンパク質試料を可溶化するために界面活性剤を用い、タンパク質試料の消化後に界面活性剤を除去する技術が提案されている。
例えば、非特許文献１は、膜タンパク質の消化後に界面活性剤を除去する技術として、デオキシコール酸ナトリウム（以下、「ＳＤＣ」とも称する）を用いる手法を開示している。この文献には、最大２．０％濃度のＳＤＣはトリプシンの活性に有意な影響を与えないこと、及びＳＤＣを含むタンパク質消化反応溶液にトリフルオロ酢酸を添加することでＳＤＣを沈殿させ、質量分析前にＳＤＣを遠心分離除去できることが記載されている。
また非特許文献２は、トリプシン消化バッファー中での酸不安定界面活性剤（ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の使用が、タンパク質の可溶化及び分解を増加させること、及びトリプシン消化バッファーを酸性化した後に酸不安定界面活性剤を遠心分離除去できることを記載している。
【非特許文献１】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６，５，２５４７−２５５３「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒａｔ  Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ」
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７  Ｊｕｌ；６（７）：２５２９−３８「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｈｏｔｇｕｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」
【発明の開示】
【０００３】
しかし、上記のようなタンパク質試料の消化後に界面活性剤を沈殿除去する手法によれば、界面活性剤による分析装置の汚染の問題を回避することはできるが、タンパク質消化画分の回収効率は十分なものではない。これは、消化反応溶液中に生じる界面活性剤の沈殿を固液分離する際に、一部のタンパク質画分を欠失してしまうことに起因するものと考えられる。
そこで本発明は、界面活性剤による分析装置の汚染の問題を回避しつつ、分析対象タンパク質を十分に酵素消化することができ、消化後のタンパク質又はペプチド断片を十分に回収することができる、タンパク質試料の調製方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、界面活性剤を使用してタンパク質を可溶化及びプロテアーゼ消化し、その後、界面活性剤を除去する手法において、界面活性剤を脂溶化して有機溶媒に分離することで、タンパク質消化画分を効率的に回収できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。
（１）（ａ）（ｉ）分析対象タンパク質；（ｉｉ）１種又は２種以上の脂溶性に改変可能な界面活性剤；及び（ｉｉｉ）プロテアーゼを含む反応溶液中で、分析対象タンパク質を消化するステップと、
（ｂ）該反応溶液に前記界面活性剤を脂溶化する試薬を添加するステップとを含み、
脂溶化された前記界面活性剤を有機溶媒中に分離することを特徴とする、タンパク質試料の調製方法。
（２）脂溶性に改変可能な界面活性剤がイオン性界面活性剤であることを特徴とする（１）記載の方法。
（３）イオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であることを特徴とする（２）記載の方法。
（４）前記界面活性剤を脂溶化する試薬はカリウム塩であることを特徴とする（３）記載の方法。
（５）イオン性界面活性剤はカルボン酸型界面活性剤であることを特徴とする（２）記載の方法。
（６）カルボン酸型界面活性剤はコール酸ナトリウム、グリココール酸、ラウリルサルコシン酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム又はウルソデオキシコール酸ナトリウムであることを特徴とする（５）記載の方法。
（７）脂溶性に改変可能な界面活性剤が酸不安定界面活性剤であることを特徴とする（１）記載の方法。
（８）酸不安定界面活性剤は、３−［（２−メチル−２−ウンデシル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシル］−１−プロパンスルホン酸ナトリウム又は３−［３−（１，１−アルキルオキシエチル）ピリジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸であることを特徴とする（７）記載の方法。
（９）前記界面活性剤を脂溶化する試薬は酸であることを特徴とする（５）又は（７）記載の方法。
（１０）前記酸はトリフルオロ酢酸であることを特徴とする（９）記載の方法。
（１１）２種以上の脂溶性に改変可能な界面活性剤は、カルボン酸型界面活性剤から選択されることを特徴とする（１）記載の方法。
（１２）カルボン酸型界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウム及びラウリルサルコシン酸ナトリウムであることを特徴とする（１１）記載の方法。
（１３）前記有機溶媒は予め前記反応溶液中に混合されていることを特徴とする（１）記載の方法。
（１４）前記反応溶液はマイクロエマルジョンの形態であることを特徴とする（１３）記載の方法。
（１５）ステップ（ｂ）後に前記有機溶媒を前記反応溶液に添加し、脂溶化された前記界面活性剤を有機溶媒中に分離することを特徴とする（１）記載の方法。
（１６）前記有機溶媒はオクタノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル、クロロホルム又はヘキサノールであることを特徴とする（１）記載の方法。
（１７）分析対象タンパク質は電気泳動による分離後に切り出したゲルに含まれる目的のタンパク質であることを特徴とする（１）記載の方法。
（１８）（１）〜（１７）のいずれか記載の方法によりタンパク質試料を調製し、分析に供することを特徴とするタンパク質の分析方法。
（１９）前記分析は該サンプルを液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）であることを特徴とする（１８）記載のタンパク質の分析方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−２５９１７６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＳＤＣを用いた相間移動法、酸沈殿法及び尿素法における大腸菌膜画分のタンパク質同定結果の比較を示す。
図２は、本発明において、界面活性剤として１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、有機溶媒として消化反応溶液に対して２倍用量のオクタノール（ＯｃｔＯＨ）を使用した場合に、脂溶化ＳＤＳを完全に液液分離できたことを示す。
図３は、本発明において、界面活性剤として１０％コール酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液に対して２倍用量のオクタノール（ＯｃｔＯＨ）を使用した場合に、脂溶化コール酸ナトリウムを完全に液液分離できたことを示す。
図４は、本発明において、界面活性剤として１０％グリココール酸を、有機溶媒として消化反応溶液と等量のオクタノール（ＯｃｔＯＨ）を使用した場合に、脂溶化グリココール酸を完全に液液分離できたことを示す。
図５は、本発明において、界面活性剤として１％ラウリルサルコシン酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液に対して０．５倍用量のオクタノールを使用した場合に、脂溶化ラウリルサルコシン酸ナトリウムを完全に液液分離することができたことを示す。
図６は、本発明において、界面活性剤として１０％デオキシコール酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液に対して０．５倍用量のオクタノールを使用した場合に、脂溶化デオキシコール酸ナトリウムを完全に液液分離することができたことを示す。
図７は、本発明において、界面活性剤として１０％デオキシコール酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液と等量のヘキサノールを使用した場合に、脂溶化デオキシコール酸ナトリウムを完全に液液分離することができたことを示す。
図８は、本発明において、界面活性剤として１％デオキシコール酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液と等量の酢酸エチルを使用した場合に、脂溶化デオキシコール酸ナトリウムを完全に液液分離することができたことを示す。
図９は、本発明において、界面活性剤として１％デオキシコール酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液に対して６倍用量のジエチルエーテルを使用した場合に、脂溶化デオキシコール酸ナトリウムを完全に液液分離することができたことを示す。
図１０は、本発明において、界面活性剤として１％デオキシコール酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液に対して８倍用量のクロロホルムを使用した場合に、脂溶化デオキシコール酸ナトリウムを完全に液液分離することができたことを示す。
図１１は、本発明において、界面活性剤として１％ＲａｐｉＧｅｓｔＴＭＳＦを、有機溶媒として消化反応溶液に対して０．５倍用量のオクタノールを使用した場合に、脂溶化ＲａｐｉＧｅｓｔＴＭＳＦを完全に液液分離することができたことを示す。
図１２は、本発明において、界面活性剤として１％グリコケノデオキシコール酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液に対して０．５倍用量のオクタノールを使用した場合に、脂溶化グリコケノデオキシコール酸ナトリウムを完全に液液分離することができたことを示す。
図１３は、本発明において、界面活性剤として１０％ケノデオキシコール酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液に対して１．５倍用量のオクタノールを使用した場合に、脂溶化ケノデオキシコール酸ナトリウムを完全に液液分離することができたことを示す。
図１４は、本発明において、界面活性剤として１０％ウルソデオキシコール酸ナトリウムを、有機溶媒として消化反応溶液に対して３．５倍用量のオクタノールを使用した場合に、脂溶化ウルソデオキシコール酸ナトリウムを完全に液液分離することができたことを示す。
図１５は、ＳＤＣ、ＳＬＳおよびＳＤＣ−ＳＬＳ混合系を用いた相間移動法による大腸菌膜画分のタンパク質同定結果の比較を示す。なお、図中の数値は大腸菌膜画分から同定されたタンパク質の総数を示し、カッコ内の数値は同定された膜タンパク質の数を示す。
図１６は、ＳＤＣ、ＳＬＳおよびＳＤＣ−ＳＬＳ混合系を用いた相間移動法による大腸菌膜画分の同定膜タンパク質における膜貫通領域数の比較を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明のタンパク質試料の調製方法は、タンパク質の可溶化に用いた界面活性剤を脂溶性に改変することにより、該界面活性剤を有機溶媒中に分離する（以下、「相間移動法」とも称する）ことを特徴とする。この方法によれば、分析装置への影響が懸念される界面活性剤をプロテアーゼ処理後のタンパク質画分を含む試料から除去することができる。一方、界面活性剤の沈殿形成によるタンパク質画分の一部欠失の問題を回避することができるため、タンパク質回収効率の向上を可能にするという利点を有する。
具体的に、本発明の方法は、（ａ）（ｉ）分析対象タンパク質；（ｉｉ）脂溶性に改変可能な界面活性剤；及び（ｉｉｉ）プロテアーゼを含む反応溶液中で、分析対象タンパク質を消化するステップと、（ｂ）該反応溶液に前記界面活性剤を脂溶化する試薬を添加するステップとを包含する。
ステップ（ａ）は、脂溶性に改変可能な界面活性剤を含む溶液に分析対象タンパク質を溶解し、プロテアーゼ消化するステップである。
分析対象のタンパク質は特に制限されず、例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官等の破砕物、タンパク質抽出物などを常法に従って調製して使用することができる。本発明では、分析対象タンパク質が、膜タンパク質、ＧＰＩアンカー（グリコシルフォスファチジルイノシトールアンカー）化などの翻訳後修飾を受けたタンパク質、膜付着タンパク質などの不溶性、難溶性タンパク質を含む場合に特に有効である。
「脂溶性に改変可能な界面活性剤」とは、特定の試薬の添加に起因するｐＨの変化などにより、その全体又は一部の脂溶性が増大する界面活性剤を指す。本発明において、脂溶性に改変可能な界面活性剤として、例えば、イオン性界面活性剤又は酸不安定界面活性剤を挙げることができる。
本発明に使用することができるイオン性界面活性剤は、陽イオン界面活性剤及び陰イオン界面活性剤の両者を含む。本発明において、イオン性界面活性剤として、酸性条件下で脂溶性に改変されるカルボン酸型界面活性剤を用いることが好ましい。そのようなカルボン酸型界面活性剤として、これに限定されるものではないが、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、ウルソデオキシコール酸ナトリウムなどのコール酸類、ラウリルサルコシン酸ナトリウムなどのサルコシン類、アミノ基をアルキル化したアミノ酸誘導体などが挙げられる。また本発明において、イオン性界面活性剤として、硫酸型界面活性剤を使用することも同様に好ましい。そのような硫酸型界面活性剤として、カリウムを添加することにより脂溶性に改変可能なドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを挙げることができる。
本明細書中、酸不安定界面活性剤は、酸性条件下で分子内構造における疎水性部が切り離されることにより脂溶性を獲得する界面活性剤を指し、酸性条件下で親水性部と疎水性部とに切断されるものであればイオン性であっても非イオン性であってもよい。タンパク質可溶化能を考慮すれば、イオン性の酸不安定界面活性剤を使用することが好ましい。このような酸不安定界面活性剤としては、３−［（２−メチル−２−ウンデシル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシル］−１−プロパンスルホン酸ナトリウム、３−［３−（１，１−アルキルオキシエチル）ピリジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸などが挙げられ、それぞれ商品名ＲａｐｉｇｅｓｔＴＭＳＦ（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、ＰＰＳ  ＳＩＬＥＮＴＴＭ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）として市販されている。
以下にＲａｐｉｇｅｓｔＴＭＳＦ、ＰＰＳ  ＳＩＬＥＮＴＴＭの構造を記載する：
【化１】
2009044903.tif 000003
【化２】
2009044903.tif 000004
本発明では、酸不安定界面活性剤として、上記市販の酸不安定界面活性剤を使用することができる。
その他、ステップ（ａ）で使用することができる界面活性剤として、双性界面活性剤を挙げることができる。双性界面活性剤は、水に溶解した際、アルカリ性領域では陰イオン界面活性剤の性質を、酸性領域では陽イオン界面活性剤の性質を示す界面活性剤であり、非限定的にＣＨＡＰＳ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、アルキルベタイン類などを挙げることができる。
プロテアーゼ消化反応溶液中に添加する上記界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤に応じて異なるが、プロテアーゼを不活化しない濃度であれば特に限定されない。したがって、従来使用されてきた界面活性剤の濃度に比較して、より高い濃度で使用することが可能であるという利点を有する。すなわち、本発明の相間移動法は、従来技術で認められる界面活性剤の沈殿形成に起因するタンパク質画分の一部欠失の問題を生じないため、より高濃度の界面活性剤の添加が可能であり、その結果、従来同定することができなかった疎水性の高いタンパク質をも可溶化することができる。これにより、疎水性の高いタンパク質に対してもプロテアーゼによる消化が可能になる。
例えば、上記界面活性剤の添加濃度は、使用する界面活性剤に応じて、０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜１５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）、例えば１％（ｗ／ｖ）とすることができる。当業者は使用する界面活性剤の種類に応じて、プロテアーゼを不活化しない最適な界面活性剤の濃度を適宜設定することができる。
上記界面活性剤の濃度は、脂溶化後に消化反応溶液の０．５〜２０倍用量、好ましくは０．５〜１５倍用量、より好ましくは０．５〜１０倍用量の有機溶媒に溶解する濃度であることが好ましい。
ステップ（ａ）で使用するプロテアーゼは特に制限されず、タンパク質消化の目的に応じて当業者はプロテアーゼを適宜選択することができる。例えば、本発明の方法により調製したタンパク質試料を質量分析に使用する場合には、プロテアーゼとしてトリプシンを使用することが好ましい。なお、酵素処理条件として特別な方法を用いる必要はなく、当業者は常法に従って処理温度、ｐＨ、酵素添加量を設定することができる。
ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で使用した界面活性剤を脂溶化するステップである。具体的にステップ（ｂ）では、プロテアーゼ消化反応溶液に、ステップ（ａ）で使用した界面活性剤を脂溶化する試薬を添加する。添加すべき試薬はステップ（ａ）で使用した界面活性剤に応じて異なるが、典型的には酸又はカリウム塩である。
ステップ（ｂ）で使用することができる酸の形態は特に制限されるものではなく、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸、硫酸、リン酸、ヘキサフルオロ酪酸、酢酸、ギ酸などを挙げることができる。またその添加量は、プロテアーゼ消化反応溶液のｐＨを酸性、すなわちｐＨ０〜４、好ましくはｐＨ０〜３にするのに十分な量である。上記添加量の酸により、プロテアーゼ消化反応溶液中の界面活性剤の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％が脂溶性に改変されることが好ましい。
ステップ（ｂ）で使用することができるカリウム塩の形態も特に制限されない。例えば塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、酢酸カリウム、ギ酸カリウムなど、任意のカリウム塩の形態を使用することができる。またその添加量は、プロテアーゼ消化反応溶液に含まれる界面活性剤（例えばＳＤＳなど）の濃度に応じて異なるが、該反応溶液中に含まれる界面活性剤の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％が脂溶性に改変される量に設定することが好ましい。
このように、ステップ（ａ）で使用した界面活性剤を脂溶化することにより、界面活性剤を有機溶媒中に分離することができる。
有機溶媒は、予めプロテアーゼ消化反応溶液中に添加されていてもよいし、界面活性剤を脂溶化する試薬と同時に、又は該試薬の添加後に添加してもよい。
有機溶媒を予めプロテアーゼ消化反応溶液中に添加する場合には、該溶液をエマルジョンの形態とすることが好ましい。エマルジョンとは、油滴が水中に分散している状態を指し、この状態では水と接触する油滴の表面積が増大している。したがって、タンパク質をより溶解し易くするという利点を有する。エマルジョンは、水と有機溶媒とを含む溶液を激しく振とうすることにより容易に作製することができる。
プロテアーゼ消化反応溶液はマイクロエマルジョンの形態を採ることがさらに好ましい。本明細書において、マイクロエマルジョンは、エマルジョン形態の中でも特に油滴の粒径が約１０μｍとなるものを指す。マイクロエマルジョンは通常のエマルジョンに比較して水と接触する油滴の表面積がより大きくなり、タンパク質の溶解性をより増大させることができるという利点を有する。また、消化反応溶液がマイクロエマルジョンの形態を採る際、プロテアーゼは影響を受けないことが確認されており、プロテアーゼ活性の維持の点にも優れている。さらに、マイクロエマルジョンは通常のエマルジョンとは異なり、静止状態でも数日間その形態を維持することができるという利点も有する。
マイクロエマルジョンは、プロテアーゼ消化反応溶液中の水、有機溶媒、界面活性剤、及び場合により補助界面活性剤を所定の範囲の量にて、混合し、超音波処理などを行うことにより作製できる。詳細については、例えばＨ．Ｋｕｎｉｅｄａ  ａｎｄ  Ｋ  Ｏｈｙａｍａ，Ｊ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．，１９９０，１３６（２），４３２−４３９を参照されたい。
有機溶媒を、界面活性剤を脂溶化する試薬と同時に、又は該試薬の添加後に添加する場合には、プロテアーゼ処理後に有機溶媒を添加することになるため、有機溶媒によるプロテアーゼの不活化を考慮する必要がないという利点がある。
本発明の方法で使用することができる有機溶媒は水と２相に分離するものであれば特に制限されるものではなく、例えばオクタノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル、クロロホルム、ヘキサノール、ヘプタノール、ジクロロメタン、ジオキサン、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ピリジンなどを挙げることができる。
また添加する有機溶媒の量は、使用する界面活性剤の種類及び濃度、並びに使用する有機溶媒の種類に応じて、当業者は適宜最適な添加量を設定することができる。有機溶媒は、脂溶化した界面活性剤の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％を溶解する量で添加することが好ましい。
本発明において、２種以上の脂溶性に改変可能な界面活性剤を併用することも可能である。２種以上の界面活性剤の使用により、単一の界面活性剤を使用するよりも低い界面活性剤の添加濃度でさえ、プロテアーゼ処理後のタンパク質消化画分の回収効率をさらに改善することができ、より多くのタンパク質及び膜タンパク質を同定することができるという利点がある。
２種以上の界面活性剤は、同一の界面活性剤の群から選択してもよいし、異なる界面活性剤の群から選択してもよい。したがって、２種以上の界面活性剤は、イオン性界面活性剤、酸不安定界面活性剤及び双性界面活性剤よりなる群から選択することができる。
好ましくは、２種以上の界面活性剤は、同一の界面活性剤の群から選択される。上記のとおり、界面活性剤を脂溶化するために使用される試薬は、使用する界面活性剤の性質によって異なるため、同一の界面活性剤の群に属する２種以上の界面活性剤を使用することにより、複数の試薬を添加する煩雑さを回避することができるからである。例えば、２種以上の界面活性剤が、カルボン酸型界面活性剤から選択される２種以上、又は酸不安定界面活性剤から選択される２種以上である場合には、これらの界面活性剤を脂溶化するために酸を添加するだけでよい。
同様に、２種以上の界面活性剤が酸性条件下で脂溶性に改変されるカルボン酸型界面活性剤と酸不安定界面活性剤との組合せであることも好ましい。
特に好ましい界面活性剤の組合せは、デオキシコール酸ナトリウムとラウリルサルコシン酸ナトリウムの組合せである。
本発明の方法は、ゲル内のタンパク質の消化に応用することができる。例えば、電気泳動による分離後に切り出したゲルに含まれるタンパク質を消化、抽出する過程で本発明の方法を使用することができる。具体的にはゲル内消化で用いるプロテアーゼ溶液に界面活性剤を共存させておき、ゲル内消化終了後の生成したペプチドのゲルからの抽出過程においても抽出溶液のｐＨを中性、またはアルカリ性で行った後に、ペプチドと界面活性剤を含む溶液に対し、溶液消化時と同じく有機溶媒を添加し、溶液を酸性側にシフトさせることで、ペプチドを高い効率で回収できる。採用される電気泳動は、電気泳動によりゲルを介してタンパク質が分子量や等電点の違いにより分離できる限り特に限定されず、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、２次元電気泳動などを挙げることができる。これにより、比較的発現量が低く、従来法では同定が困難であったタンパク質の同定効率を向上させることができる。
以上のように、本発明の方法によれば、膜タンパク質等の疎水性の高いタンパク質であっても十分に可溶化してプロテアーゼ処理を行うことができ、また、界面活性剤を分離したとしても消化後のタンパク質画分を高効率に回収することができる。換言すれば、本発明の方法によれば、界面活性剤を分離するに際してプロテアーゼ処理後のタンパク質画分の一部が界面活性剤とともに欠失してしまうような不都合を回避することができる。したがって、本発明の方法によれば、例えば質量分析装置等の各種分析装置を汚染する界面活性剤を十分に除去しながらも分析対象のタンパク質を確実に分析できるタンパク質試料を調製することができる。
よって、本発明の方法により調製されたタンパク質試料は、その後、質量分析、アミノ酸分析、抗体を用いたイムノアッセイ等、任意の分析に供することができる。例えば、上記タンパク質試料を質量分析に供した場合、従来の方法では同定できなかったタンパク質画分を検出し、同定することができる。すなわち、本発明の方法によれば、質量分析等の分析系によってタンパク質画分を同定する際に、従来の方法と比較して同定効率を大幅に向上させることができる。
本発明の方法により調製したタンパク質試料を、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）又はマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）に供することが特に有効である。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【実施例】
【０００６】
実施例１：本発明の相間移動法、酸沈殿法及び尿素を用いた溶液消化法におけるタンパク質同定結果の比較
試料調製
本実施例では不溶性タンパク質の可溶化及び分解効率を調査するために不溶性タンパク質としてタンパク質膜画分を用いた。
膜画分は大腸菌Ｋ−１２株ＢＷ２５１１３から採取した。ＢＷ２５１１３は５０ｍＬのＬＢ培地で培養（３７℃、８時間）したものを１０分間遠心分離（５０００回転、４℃）をして集菌した。集菌したＢＷ２５１１３は５ｍＬの１Ｍ塩化カリウム、１０ｍＭトリス溶液（洗浄バッファー）で懸濁し、１０分間遠心分離（５０００回転、４℃）して洗浄した。洗浄作業は２回行った。５ｍＬの洗浄バッファーに懸濁したＢＷ２５１１３を超音波破砕機（ＴＯＭＹ，ＵＤ−２０１）で破砕し、２５００回転で５分間、遠心分離して沈殿物を除去した。上清は超遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ、Ｏｐｔｉｍａ  ＸＬ−１００Ｋ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて４０，０００回転で１時間遠心分離し、遠心分離後の沈殿物を粗膜画分として回収した。粗膜画分を１０ｍＬの０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液に懸濁し、５００μＬずつ１．５ｍＬチューブに分注し、１５，０００回転で１０分間遠心分離した沈殿物を膜画分として回収した。膜画分は使用するまで−３０℃で保存した。
膜タンパク質の可溶化剤には０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＪＩＮＤＯ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ５２０：ＳＤＣ）及び８Ｍ尿素（和光純薬Ｃａｔ．Ｎｏ．２１７−００６１５）を用いた。採取したＢＷ２５１１３の膜画分に対して５００μＬの可溶化剤を加えて懸濁した後、９５℃で５分間加熱した。膜タンパク質懸濁液は超音波発生器（ＴＯＣＨＯ、ＵＣ−１３３１Ｎ）で１０分間処理し、不溶物は１５，０００回転で１０分間遠心分離して除いた。５０μＬの試料を用い、５μＬの１０ｍＭのジチオスレイトール（和光純薬Ｃａｔ．Ｎｏ．０４０−２９２２３：ＤＴＴ）を５μＬ加え、室温で３０分インキュベーションしてタンパク質中のシステイン残基を還元した。その後、５５ｍＭのヨードアセトアミド（和光純薬Ｃａｔ．Ｎｏ．０９１−０２１５３）を５μＬ加え、３０分インキュベーションしてシステイン残基をアルキル化した。以下１）〜２）に示すように、それぞれの可溶化剤でタンパク質を可溶化し、その後プロテアーゼで消化した。
１）８Ｍ尿素を用いた消化
８Ｍ尿素で可溶化した上記のタンパク質試料溶液に、０．２ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ−Ｃ（和光純薬Ｃａｔ  Ｎｏ．１２５−０５０６１）を１μＬ加え、室温で４時間インキュベーションしタンパク質を消化した。１５０μＬの５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を加えた後、０．５ｍｇ／ｍＬのトリプシン（プロメガ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ５１１Ｃ）を１μＬ加え、室温で２４時間インキュベーションし、タンパク質を消化した。消化後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を終濃度で１％となるように加え、トリプシンを失活させた。消化後の溶液を以後の操作に用いた。
２）０．５％ＳＤＣを用いた消化
０．５％ＳＤＣで可溶化した上記のタンパク質試料溶液は、０．５ｍｇ／ｍＬのトリプシン（プロメガ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ５１１Ｃ）を１μＬ加え、室温で２４時間インキュベーションして消化した。ＳＤＣは酸沈殿法又は相間移動法で除去した。酸沈殿法は消化後の試料にＴＦＡを終濃度で１％となるように加え、不溶化したＳＤＣを１３，０００回転で２分間、遠心分離して除去した。相間移動法は試料と等量の酢酸エチル（和光純薬Ｃａｔ．Ｎｏ．０５５−０５９９１）を加え、ＴＦＡを終濃度で１％になるように添加した。２液を懸濁させた後、１３，０００回転で２分間遠心分離して、２層に分配した。ＳＤＣを含む酢酸エチル相（上層）をピペッティングで除去した。水相（下層）は減圧乾燥機（ＴＯＭＹ  ＣＣ−１０５）で４５分間処理した後、以後の操作に用いた。
ＬＣ−ＭＳ測定
上記１）〜２）の処理により調製した試料溶液について、以下のようにＬＣ−ＭＳ測定を行った。
２００μＬ用ピペットチップとＥｍｐｏｒｅ  Ｃ１８ディスクを用いてＣ１８−ＳｔａｇｅＴｉｐ（自家製、Ｊ．Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，Ｙ．Ｉｓｈｉｈａｍａ，Ｍ．Ｍａｎｎ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５（２００３）６６３）を作製した。ＳｔａｇｅＴｉｐは２０μＬのメタノール、２０μＬの８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ（以下、「溶液Ｂ」という）及び２０μＬの５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ（以下、「溶液Ａ」という）をロードして活性化させた。活性化させたＳｔａｇｅＴｉｐに、上記１）〜２）の処理により調製した各試料溶液をＳｔａｇｅＴｉｐにロードした。２０μＬの溶液Ａで洗浄した後、４０μＬの溶液ＢでＳｔａｇｅＴｉｐからペプチドを溶出させた。溶出したペプチド溶液は遠心濃縮した後、２０μＬの溶液Ａで溶解し、ＬＣ−ＭＳ用試料溶液とした。
この試料溶液についてＬＣ（Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ）／ＭＳ（ＡＢＩ／Ｑｓｔａｒ  ＸＬ）システムを用いての測定を行った。ＨＰＬＣ条件として、Ｃ１８シリカゲル（ＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  １２０  Ｃ１８−ＡＱ，３μｍ）を充填した自家製のエレクトロスプレー一体型カラム（Ｙ．Ｉｓｈｉｈａｍａ，Ｊ．Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｍａｎｎ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ９７９（２００２）２３３．）０．１ｘ１５０ｍｍに移動相Ａとして０．５％酢酸水、移動相Ｂとして８０％アセトニトリルを含む０．５％酢酸水を用いて、初期Ｂ濃度を５％として、最初の１５分間で直線的に３０％、その後５分間で直線的に１００％とし、その後移動相Ｂを１００％にして５分間維持、その後移動相Ｂを５％として３５分後に次のサンプルを注入した。送液にはＤＩＯＮＥＸ社のＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００を用い、５００ｎＬ／分の流速で分析を行った。試料溶液をＣＴＣ社のオートサンプラーＰＡＬによって５μＬ注入し、試料を一度インジェクターのサンプルループに注入した後に分析カラムに送り込んだ。日京テクノス社製ＬＣ−ＭＳインターフェースを装備したＡＢＩ社のＱｓｔａｒ  ＸＬを用いて、ＥＳＩ電圧として２．４ｋＶを印加した。測定は、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎモードで、１秒間のＳｕｒｖｅｙスキャンの後、最大３つのＭＳＭＳスキャン（各０．６秒）を行った。ＭＳＭＳモードからＳｕｒｖｅｙスキャンへのスイッチは１スペクトルとした。
得られたデータについては、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ社）及び大腸菌（Ｗ３１１０）データベース用いてタンパク質の自動同定を行った。目的ピークの定量はＭａｓｓＮａｖｉｇａｔｏｒ（三井情報開発）を用いて行った。Ｒ．Ｍｏｎｉｃａらの報告（Ｒ．Ｍｏｎｉｃａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４（２００６）１）を参考にして、ＴＭＨＭＭアルゴリズムで膜貫通領域を持つものを膜タンパク質とした。ペプチドのＧＲＡＶＹ（ｇｒａｎｄ  ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）スコアはＫｙｔｅらの方法（Ｊ．Ｋｙｔｅ，ＲＦ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １５２（１９８２）１０５）に従って計算し、スコアが正のものを疎水性ペプチド、負のものを親水性ペプチドとした。
結果を図１に示す。ＳＤＣに可溶化させた大腸菌の膜タンパク質画分について相間移動法と酸沈殿法で大腸菌膜画分タンパク質の同定結果を比較したところ、相間移動法を用いることで酸沈殿法に比べて、タンパク質及びペプチドの同定数は約１．４倍に増加した。また、同定できたペプチドの疎水性度をＧＲＡＶＹスコアに従い計算し、疎水性が高いとされるＧＲＡＶＹスコアが０より大きいペプチドの数は約１．６倍に増加していた。さらに、膜タンパク質の同定数は約２倍に増加した。既存の方法である８Ｍ尿素を用いた方法に比べても、相間移動法を組み合わせたＳＤＣを用いた方法では膜タンパク質の同定数が約３倍増加し（ＳＤＣ：１４、尿素：４）、全体では同定数が５．０８倍増加した（ＳＤＣ：１０８、尿素：３７）。また、同定できたペプチドの数を比べると、ＳＤＣの方が尿素を用いるよりも、約５．３倍増加した。
上記の通り、本発明の相間移動法は、従来の方法を用いて調製したタンパク質試料に比較して、同定されるタンパク質数及びペプチド数の面で大きく向上することがわかった。
実施例２：界面活性剤及び有機溶媒の組合せにおける液液分離評価
本実施例では、本発明の方法に種々の界面活性剤及び有機溶媒の組合せを使用した際の液液分離を評価した。なお、本実施例では、実施例１で調製したタンパク質膜画分を不溶性タンパク質試料として使用し、下記に記載する点を除いて実施例１の相間移動法と同様にして実施した。
本実施例で使用した界面活性剤と、相間移動に使用した有機溶媒の組合せを下記に示す。なおいずれの試料溶液も５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを添加して調製した：
2009044903.tif 000005
2009044903.tif 000006
使用した上記界面活性剤及び有機溶媒の製造元を下記の表１に示す。
【表１】
2009044903.tif 000007
液液分離の評価は以下のように行った。すなわち、試料中の界面活性剤を、１００μＬの試料溶液に対して、１μＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ＳＤＳの場合は５０μＬの１Ｍ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ）を加えて脂溶化させた。脂溶化界面活性剤は小型遠心機で５分間遠心分離して沈殿させ、次いで、上記組合せに対応した有機溶媒を添加した。その後、ボルテックスをして、小型遠心機で５分間遠心分離し、脂溶化界面活性剤の溶解を評価した。
上記組合せ１〜１３における液液分離の結果をそれぞれ図２〜１４に示す。
なお、上記実験に関する追加情報は以下の通りである：
組合せ１において、ＳＤＳの塩は５０ｕＬの１Ｍ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  Ｔｒｉｓで交換した。
組合せ４において、１０％ラウリルサルコシン酸ナトリウムは１０倍量のＯｃｔＯＨを加えても除去できなかった。
組合せ７において、１０％デオキシコール酸ナトリウムは１０倍量のＥｔＡｃを加えても除去できなかった。
組合せ８において、１０％デオキシコール酸ナトリウムは１０倍量のジエチルエーテルを加えても除去できなかった。
組合せ９において、１０％デオキシコール酸ナトリウムは１０倍量のクロロホルムを加えても除去できなかった。
組合せ１０において、ＲａｐｉＧｅｓｔＴＭＳＦは０．５％ＴＦＡとなるように添加し、３７℃で３０分間、インキュベートして分解した。
組合せ１１において、グリコケノデオキシコール酸ナトリウムは１０％の濃度では完全に溶けなかった。
図からわかるとおり、界面活性剤として１％濃度のデオキシコール酸ナトリウムを使用した場合には、有機溶媒の種類によらず、消化反応溶液に対して０．５〜８倍用量の有機溶媒に、脂溶化デオキシコール酸ナトリウムを完全に溶解することができた（図５、８〜１２）。また１０％濃度のデオキシコール酸ナトリウムを使用した場合には、消化反応溶液に対して０．５倍用量のオクタノール又は等量のヘキサノールには溶解するが（図６及び７）、有機溶媒として酢酸エチル、ジエチルエーテル及びクロロホルムを使用する場合には、消化反応溶液に対して１０倍用量で用いても完全には溶解しなかった（図８〜１０）。これらの結果は、脂溶化デオキシコール酸ナトリウムは特にオクタノール又はクロロホルムに溶解し易く、デオキシコール酸ナトリウムとオクタノール又はクロロホルムとの組合せが、消化タンパク質の回収効率を向上し、結果、タンパク質の同定効率を向上させるために有用であることを示唆する。
また有機溶媒としてのオクタノールの使用は、界面活性剤として１０％ラウリルサルコシン酸ナトリウム又は１０％グリコケノデオキシコール酸ナトリウムを使用した場合を除き、消化反応溶液に対して等量〜３．５倍用量のオクタノールに脂溶化界面活性剤を完全に溶解することができた（図２〜５、１３〜１４）。これらの結果は、有機溶媒としてのオクタノールの使用は、高濃度の脂溶化界面活性剤の溶解に比較的適していることを示す。
以上の結果から、使用する界面活性剤の種類及び量に応じて、本発明の液液分離に好適な有機溶媒との組合せが存在することが示唆された。当業者は、本発明の開示に基づき、適当な界面活性剤及びその濃度、並びに有機溶媒の組合せを選択することができる。
実施例３：本発明の相間移動法において、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリルサルコシン酸ナトリウムおよびその混合物を用いた溶液消化法におけるタンパク質同定結果の比較
試料調製
膜画分は、実施例１と同様にして、大腸菌Ｋ−１２株ＢＷ２５１１３から調製した。
膜タンパク質の可溶化剤には１２０ｍＭ（５％相当）デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ，和光純薬Ｃａｔ．Ｎｏ．１９０−０８３１３）、２４ｍＭ  Ｎ−ラウリルサルコシン酸ナトリウム（ＳＬＳ，和光純薬Ｃａｔ．Ｎｏ．１９２−１０３８２）及び１２ｍＭ  ＳＤＣ−１２ｍＭ  ＳＬＳ混合物を用いた。採取したＢＷ２５１１３の膜画分に対して２００μＬの可溶化剤を加えて懸濁した後、９５℃で５分間加熱した。膜タンパク質懸濁液は超音波発生器（ＴＯＣＨＯ、ＵＣ−１３３１Ｎ）で１０分間処理した。１０μＬの試料を用い、１μＬの１０ｍＭのジチオスレイトール（和光純薬Ｃａｔ．Ｎｏ．０４０−２９２２３：ＤＴＴ）を加え、室温で３０分インキュベーションしてタンパク質中のシステイン残基を還元した。その後、５５ｍＭのヨードアセトアミド（和光純薬Ｃａｔ．Ｎｏ．０９１−０２１５３）を１μＬ加え、３０分インキュベーションしてシステイン残基をアルキル化した。１２０ｍＭ  ＳＤＣ、２４ｍＭ  ＳＬＳを含む試料溶液は５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液で１０倍に、１２ｍＭ  ＳＤＣ−１２ｍＭ  ＳＬＳを含む試料溶液は５倍に希釈した後、０．１ｍｇ／ｍＬのトリプシン（プロメガ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ５１１Ｃ）を２μＬ加え、室温で２４時間インキュベーションし、タンパク質を消化した。ＳＤＣ、ＳＬＳは相間移動法で除去した。相間移動法は試料と等量の酢酸エチル（和光純薬Ｃａｔ．Ｎｏ．０５５−０５９９１）を加え、ＴＦＡを終濃度で１％になるように添加した。２液を懸濁させた後、１３，０００回転で２分間遠心分離して、２相に分配した。ＳＤＣを含む酢酸エチル相（上相）をピペッティングで除去した。水相（下相）は減圧乾燥機（ＴＯＭＹ  ＣＣ−１０５）で４５分間処理した後、以後の操作に用いた。
ＬＣ−ＭＳ測定
実施例１と同様にして、ＬＣ（Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ）／ＭＳ（ＡＢＩ／ＱＳＴＡＲ  ＸＬ）システムを用いての測定をｎ＝３で行った。また、データ解析についても実施例１と同様に行い、ｎ＝３の結果を結合して解析した。
結果を図１５に示す。ＳＤＣとＳＬＳを混合することにより、より多くのタンパク質および膜タンパク質を同定できることがわかった。膜タンパク質における膜貫通領域数についても比較を行ったところ、こちらについてもＳＤＣ−ＳＬＳ混合系で、より多くの膜貫通領域が同定されることが認められた（図１６）。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の方法によれば、分析装置への影響が少ないタンパク質試料を調製することができる。また本発明の方法により、分析対象タンパク質をプロテアーゼ処理した後のタンパク質消化画分の回収効率を格段に向上させることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図１６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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