(57)【要約】  本発明は、パルミテート（１６：０）のステアリン酸（１８：０）への変換を触媒可能な菌・カビＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼに関する。詳細には、モルティエレラ・アルピナＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼのヌクレオチド配列が提供される（「ＥＬＯ３」として表される）。Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼの過剰発現により、微生物油の生成を増大させ、多価不飽和脂肪酸の生合成経路への炭素フラックスを増大させ、かつ多価不飽和脂肪酸の含量を増加させる方法が本明細書に記載される。最も望ましくは、本ＥＬＯ３の基質特異性は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの油性酵母内での長鎖多価不飽和脂肪酸の蓄積を可能にするのに特に有用になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする単離核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）に完全に相補的な単離核酸分子
よりなる群から選択される、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１、配列番号１８および配列番号２９よりなる群から選択される請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
アラインメントのＢＬＡＳＴ方法に基づき、配列番号２で示される配列を有するポリペプチドと比較される場合に、少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも２７５個のアミノ酸のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離核酸分子。
【請求項５】
適切な調節配列に作動可能に連結される請求項１に記載の単離核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項７】
藻、細菌、菌・カビおよび酵母よりなる群から選択される請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項８】
酵母が油性酵母である請求項７に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項９】
油性酵母細胞が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞がアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
アルカン資化酵母が、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃２０３６２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃８８６２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃１８９４４、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃７６９８２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃９０８１２およびアルカン資化酵母ＬＧＡＭ  Ｓ（７）１よりなる群から選択される株である請求項１０に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
ａ）適切な調節配列の制御下で、配列番号２で示される、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸断片を含んでなる油性酵母を提供し、
ｂ）パルミテートを含んでなるエロンガーゼ基質のソースを提供し、
ｃ）ステップ（ａ）（ｉ）またはステップ（ａ）（ｉｉ）の核酸分子が発現されかつステアリン酸が生成されるという条件下で、（ｂ）のエロンガーゼ基質とともにステップ（ａ）の油性酵母を成長させ、
ｄ）場合により、ステップ（ｃ）のステアリン酸を回収する
ことを含んでなるステアリン酸の生成方法。
【請求項１３】
ａ）（ｉ）配列番号２で示されるＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸断片と、
（ｉｉ）機能性多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子と
を含んでなる油性酵母を提供し、
ｂ）パルミテートを含んでなるエロンガーゼ基質のソースを提供し、
ｃ）多価不飽和脂肪酸が生成される条件下で、ステップ（ａ）の油性酵母を（ｂ）のエロンガーゼ基質とともに成長させ、
ｄ）場合により、ステップ（ｃ）の多価不飽和脂肪酸を回収する
ことを含んでなる多価不飽和脂肪酸の生成方法。
【請求項１４】
多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
機能性多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子が、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０脂肪酸エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２脂肪酸エロンガーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９脂肪酸エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼよりなる群から選択される酵素をコードする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
油性酵母が、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐ．）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）よりなる群から選択される請求項１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ヤロウィア属が、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃２０３６２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃８８６２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃１８９４４、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃７６９８２およびアルカン資化酵母ＬＧＡＭ  Ｓ（７）１よりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２または１３のいずれか一項に記載の方法によって生成される微生物油。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの分野に含まれる。より詳細には、本発明は、油性微生物内でのステアリン酸の生成を増大させるのに有用なＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする核酸断片の単離および特徴づけに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内でのオイルの生合成は、一般にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の合成を示し、ＴＡＧはグリセリン分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基よりなる中性脂質として定義される。かかるオイルは、飽和および不飽和脂肪酸ならびに短鎖および長鎖脂肪酸を含む広範な脂肪酸を含有しうる。また、驚くことではないが、極めて多数の因子が、そのように生成されるオイルの量および特定の微生物内でのその最終脂肪酸組成物に作用する。
【０００３】
従来のアプローチ（例えばブリーディング）および遺伝子工学のアプローチが、［例えばラウレートに富むカノーラ、ステアレートに富むカノーラ、オレイン酸に富む大豆およびオレイン酸に富むトウモロコシの商業的な使用可能性によって示される］オイル含量の改善された油料種子作物の生成への適用において成功しているが、油性微生物内でのオイル含量における類似の操作についてはこれまであまり探求されていない。しかし、長鎖ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」、例えば１８：３、１８：４、２０：３、２０：４、２０：５、２２：６の脂肪酸）を工業的に製造する能力をオイル画分内に有する微生物を設計するという最近の取組みによって、脂質代謝への炭素の流れを増やすための方法に対する需要が創出されている。
【０００４】
大部分の生物内での脂質代謝は、多重酵素である脂肪酸シンターゼ複合体（「ＦＡＳ」）によって触媒され、最初に８つの二重炭素断片（アセチル−ＣｏＡに由来するアセチル基）の縮合によって生じ、パルミテートすなわち１６−炭素飽和脂肪酸が形成される（非特許文献１）。一旦、遊離パルミテート（１６：０）がＦＡＳから放出されると、分子は伸長（すなわちＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼを介してステアリン酸（１８：０）を生成すること）または不飽和（すなわちΔ９デサチュラーゼを介してパルミトオレイン酸（１６：１）を生成すること）のいずれかの過程を経る。他のすべての脂肪酸分子については、これらの２つの代謝前駆体から合成される。しかし、パルミテートの主な行方が伸長であることから（脱飽和が大部分の生物内では軽微な反応にすぎない一方）、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼが脂肪酸生合成経路内への炭素フラックス全体を決定するのに重要な役割を果たし、それによりそのように生成されたオイルの量および組成物の双方において決定的役割を果たすと結論づけられる。
【０００５】
近年、種々の脂肪酸エロンガーゼが単離されかつ特徴づけられている。例えば、酵母、哺乳類、植物および低級の真核生物における長鎖脂肪酸の伸長について考察している有用なレビューは、非特許文献２のものである。レオナルド（Ｌｅｏｎａｒｄ）らによる表１では、脂肪酸エロンガーゼ遺伝子、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号および各酵素が触媒する反応についての概要が提供されている（すなわち、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）［ＥＬＯ１、ＥＬＯ２、ＥＬＯ３］、ヒト、マウス［Ｅｌｏｖ１、Ｅｌｏｖ２、Ｅｌｏｖ３、Ｅｌｏｖ４、Ｌｃｅ］、ラット［ｒＥＬＯ１、ｒＥＬＯ２］、シー・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）［ＣＥＥＬＯ１］、モルティエレラ・アルピナ［ＧＥＥＬＯ、ＭＡＥＬＯ］、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）［ＩｇＡＳＥ１］およびヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）［ＰＳＥ１］に由来）。記載がなされかつ機能的に特徴づけられているさらなる脂肪酸エロンガーゼには、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）［ＯｔＥＬＯ１、ＯｔＥＬＯ２］、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）［ＴｐＥＬＯ１、ＴｐＥＬＯ２］、ゼノプス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）［ＸｌＥＬＯ］およびニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）［ＯｍＥＬＯ］（非特許文献３）；スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）（特許文献１）；ヒメツリガネゴケ［ｐａｖＥＬＯ］（非特許文献４）；ならびにシー・エレガンスＣｅＥＬＯ２（非特許文献５）に由来するものが含まれる。しかし、ラットｒＥＬＯ２およびシー・エレガンスＣｅＥＬＯ２エロンガーゼのみが、パルミテートのステアリン酸への変換を可能にするのに適する基質特異性を有するＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼとして分類される。したがって本明細書では、遺伝子工学の技術を用い、油性微生物内で脂質代謝への炭素流れの上方制御を可能にする手段として新規のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼを同定しかつ特徴づけることが望ましかった。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，６７７，１４５号明細書
【非特許文献１】スミス  Ｓ．（Ｓｍｉｔｈ  Ｓ．）  ファセブ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．）、８（１５）：１２４８−５９頁（１９９４年）
【非特許文献２】レオナルド  Ａ．Ｅ．（Ｌｅｏｎａｒｄ  Ａ．Ｅ．）ら（プログレス・イン・リピッド・リサーチ（Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．）  ４３：３６−５４頁（２００４年））
【非特許文献３】メイヤー  Ａ．（Ｍｅｙｅｒ  Ａ．）ら、ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．）  ４５（１０）：１８９９−１９０９頁（２００４年）
【非特許文献４】ペレイラ  Ｓ．（Ｐｅｒｅｉｒａ  Ｓ．）ら、バイオケミストリー・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）３８４：３５７−３６６頁（２００４年）
【非特許文献５】クニアゼヴァ  Ｍ．（Ｋｎｉａｚｅｖａ  Ｍ．）ら、ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）  １６３：１５９−１６９頁（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
出願人は、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼをコードする遺伝子をモルティエレラ・アルピナから単離し、油性酵母のアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での遺伝子の過剰発現時における１６：０から１８：０への変換の増大を示すことによって前述の課題を解決している。これにより、微生物油中でのＰＵＦＡ含量の増加およびオイル生合成の増大が可能になった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、特に油性酵母中での微生物オイルの生成をもたらす生化学的経路の操作において有用なモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）から単離されるＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする遺伝子に関する。
【０００９】
したがって、本発明は、
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする単離核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）に完全に相補的な単離核酸分子
よりなる群から選択される、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする単離核酸分子を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、本発明の単離核酸分子によってコードされるポリペプチド、キメラ遺伝子およびそれを発現する宿主細胞を提供する。
【００１１】
同様の実施形態では、本発明は、アラインメントのＢＬＡＳＴ方法に基づき、配列番号２で示される配列を有するポリペプチドと比較される場合に、少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも２７５個のアミノ酸のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離核酸分子を提供する。
【００１２】
さらに、
ａ）適切な調節配列の制御下で、配列番号２で示されるＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸断片を含んでなる油性酵母を提供し、
ｂ）パルミテートを含んでなるエロンガーゼ基質のソースを提供し、
ｃ）ステップ（ａ）（ｉ）またはステップ（ａ）（ｉｉ）の核酸分子が発現されかつステアリン酸が生成されるという条件下で、（ｂ）のエロンガーゼ基質とともにステップ（ａ）の油性酵母を成長させ、
ｄ）場合により、ステップ（ｃ）のステアリン酸を回収する
ことを含んでなるステアリン酸の生成方法が提供される。
【００１３】
同様に、本発明は、
ａ）（ｉ）配列番号２で示されるＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸断片と、
（ｉｉ）機能性多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子と
を含んでなる油性酵母を提供し、
ｂ）パルミテートを含んでなるエロンガーゼ基質のソースを提供し、
ｃ）多価不飽和脂肪酸が生成される条件下で、ステップ（ａ）の油性酵母を（ｂ）のエロンガーゼ基質とともに成長させ、
ｄ）場合により、ステップ（ｃ）の多価不飽和脂肪酸を回収する
ことを含んでなる多価不飽和脂肪酸の生成方法を提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって提供される微生物油を提供する。
【００１５】
本発明は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明および添付の配列記述からより十分に理解されうる。
【００１６】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を有する特許出願における要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、かつ、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表における要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００１７】
配列番号１、２、７、１４、１７〜２２および２５〜２８は、表１で同定されているように、ＯＲＦをコードする遺伝子またはタンパク質（もしくはその一部）またはプラスミドである。
【００１８】
【表１】
2009512437.tif 000002
【００１９】
配列番号３、４および５は、ベクトン・ディッキンソン−クロンテック（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）クリエイター・スマート（Ｃｒｅａｔｏｒ  Ｓｍａｒｔ）（登録商標）ｃＤＮＡライブラリーキットのプライマーのスマートＩＶ（ＳＭＡＲＴ  ＩＶ）のオリゴヌクレオチド、ＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマーおよび５’−ＰＣＲプライマーに対応する。
【００２０】
配列番号６は、ｃＤＮＡライブラリー配列決定にとって有用なＭ１３フォワードプライマーに対応する。
【００２１】
配列番号８および９は、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３の３’末端領域を単離するための、ゲノムウォーキングとして用いられるクロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）のユニバーサル・ゲノムウォーカー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ）（商標）キットからのゲノムウォーカー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ）アダプターに対応する。
【００２２】
配列番号１０〜１３の各々は、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３の３’末端領域を単離するための、ゲノムウォーキングとして用いられるプライマーＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）３’１、ＡＰ１、ＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）３’２およびＡＰ２に対応する。
【００２３】
配列番号１５および１６の各々は、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３の５’末端領域を単離するための、ゲノムウォーキングとして用いられるプライマーＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）５’１およびＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）５’２に対応する。
【００２４】
配列番号２３および２４の各々は、モルティエレラ・アルピナｃＤＮＡに由来する完全なＥＬＯ３の増幅に用いられるプライマーＭＡエロング（ＭＡ  ＥＬＯＮＧ）５’  ＮｃｏＩ３およびＭＡエロング（ＭＡ  ＥＬＯＮＧ）３’  ＮｏｔＩ  １に対応する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および公報は、その全体が参照により援用される。これは詳細には、以下の出願人の譲受人の同時係属中の出願、すなわち米国特許出願第１０／８４０４７８号明細書（２００４年５月６日に出願）、米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書（２００４年５月６日に出願）、米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書（２００４年６月１６日に出願）、米国特許出願第１０／９８７５４８号明細書（２００４年１１月１２日に出願）、米国特許出願第１１／２２５３５４号明細書（２００５年９月１３日に出願）、米国仮特許出願第６０／６２４８１２号明細書（２００４年１１月４日に出願）、米国特許出願第１１／１８３６６４号明細書（２００５年７月１８日に出願）および米国特許出願第１１／１８５３０１号明細書（２００４年７月２０日に出願）を含むがこれらに限定されない。
【００２６】
出願人は、パルミテートのステアリン酸への変換を担うＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼをコードするモルティエレラ・アルピナ遺伝子を単離している。（本明細書中で「ＥＬＯ３」として同定された）この遺伝子は、アルカン資化酵母などの油性酵母内に生成される長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の量を改変するのに有用でありうる。
【００２７】
ＰＵＦＡが重要であることは明白である。例えば、特定のＰＵＦＡは、正常細胞の重要な生物学的成分であり、哺乳類内でデノボ合成不可能な「必須」脂肪酸として認識されており、その代わり、食事で取得されるかあるいはさらにリノール酸（ＬＡ）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ）の脱飽和および伸長によって誘導されなければならない。さらに、長鎖ω−３  ＰＵＦＡの大量摂取によって心血管保護効果がもたらされる（ダイアーベルグ  Ｊ．（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ  Ｊ．）ら、アメリカン・ジャ−ナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．）  ２８：９５８−９６６頁（１９７５年）；ダイアーベルグ  Ｊ．（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ  Ｊ．）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）２（８０８１）：１１７−１１９頁（１９７８年７月１５日）；シモカワ  Ｈ．（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ  Ｈ．）、ワールド・レビュー・オブ・ニュートリション・アンド・ダイエテティクス（Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ）、８８：１００−１０８頁（２００１年）；フォン・シャッキー  Ｃ．（ｖｏｎ  Ｓｃｈａｃｋｙ  Ｃ．）、およびダイアーベルグ  Ｊ．（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ  Ｊ．）、ワールド・レビュー・オブ・ニュートリション・アンド・ダイエテティクス（Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ）、８８：９０−９９頁（２００１年））。極めて多数の他の研究においては、種々の症状および疾患（例えば、喘息、乾癬、湿疹、糖尿病、癌）に対するω−３および／またはω−６脂肪酸の投与によってもたらされる広範な健康上の利益について実証されている。
【００２８】
したがって、本発明では多数の用途が見出される。本明細書で開示される方法によって蓄積されたＰＵＦＡまたはその誘導体を、代替食、またはサプリメント、特に乳児用調製物（ｉｎｆａｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａ）として、静脈内供給を受けている患者のため、あるいは栄養不良の予防または治療のために用いてもよい。あるいは、精製ＰＵＦＡ（またはその誘導体）は、通常の使用であれば食事補給において受け手が所望の量を受けることになるように配合されたクッキングオイル、脂肪またはマーガリンに混入可能である。ＰＵＦＡは、乳児用調製物、栄養サプリメントまたは他の食品にも混入可能であり、それには抗炎症またはコレステロール低下剤としての用途が見出されうる。場合により、組成物は製薬用途（ヒトまたは動物用）に用いられうる。この場合には、ＰＵＦＡは一般に経口投与されるが、非経口（例えば、皮下、筋肉内または静脈内）、直腸、膣または局所（例えば、皮膚軟膏またはローションとして）を例とする、十分に吸収されうるための任意の経路によって投与されうる。
【００２９】
ヒトまたは動物への組換え手段によって生成されたＰＵＦＡの補給の結果、追加のＰＵＦＡならびにそれらのメタボリック・プロジェニー（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｙ）のレベルの上昇がもたらされうる。例えば、ＡＲＡによる治療の結果、ＡＲＡだけでなくプロスタグランジンなどのＡＲＡの下流産物のレベルの上昇がもたらされうる。複合体調節機構により、かかる機構の阻止、制御または克服により個人における特定のＰＵＦＡの所望のレベルを得るための、様々なＰＵＦＡの結合またはＰＵＦＡの異なる抱合体の添加が望ましいものになる。
【００３０】
定義
本開示では、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義が提供される。
【００３１】
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略される。
【００３２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略される。
【００３３】
「アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）」はＡＴＣＣと略される。
【００３４】
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略される。
【００３５】
「微生物オイル」または「単細胞オイル」は、微生物（例えば、藻、油性酵母および糸状菌・カビ）によってそれらの寿命の間に天然に生成されるオイルである。これらのオイルは、一般に細胞内に「中性脂質」として貯蔵される。「トリアシルグリセロール」、「オイル」および「ＴＡＧ」という用語は、グリセリン分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基よりなる中性脂質を示し（かつかかる用語は本明細書における本開示を通して同義的に用いられる）。かかるオイルは、短鎖および長鎖の飽和および不飽和脂肪酸を含有しうる。したがって、「オイルの生合成」は一般に細胞内でのＴＡＧの合成を示す。
【００３６】
「脂肪酸」という用語は、約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長（より長い鎖長の酸もより短い鎖長の酸もいずれも既知であるが）の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を示す。主要な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２である。脂肪酸の構造は、「Ｘ：Ｙ」（式中、Ｘは特定の脂肪酸内の炭素（Ｃ）原子の総数であり、かつＹは二重結合の数である）の単純な表記法によって示される。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）と「オメガ−６脂肪酸」（ω−６もしくはｎ−６）対「オメガ−３脂肪酸」（ω−３もしくはｎ−３）の間の区別に関してさらに詳細には、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットに示されている。
【００３７】
本開示にてＰＵＦＡを記述するのに用いられる命名法は下記の表２に示される。「簡単な表記法」というタイトルのカラムでは、オメガ参照系は、オメガ炭素（このために１の番号が付けられる）からカウントした、炭素数、二重結合数およびオメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示すために用いられる。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸とそれらの前駆体の一般名、本明細書を通して用いられることになる略語ならびに各化合物の化学名をまとめたものである。
【００３８】
【表２】
2009512437.tif 000003
【００３９】
「エロンガーゼ系」は、エロンガーゼ系の作用対象の脂肪酸基質よりも２個の炭素分だけ長い酸を生成するための脂肪酸炭素鎖の伸長を担う４種の一連の酵素を示す。より詳細には、伸長のプロセスは脂肪酸シンターゼとの関連で生じ、そこではＣｏＡはアシル担体である（ラッスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）ら、ザ・プラント・セル（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ）  ８：２８１−２９２頁（１９９６年））。基質特異的であり、律速でもあることが判明している第１のステップでは、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡで縮合されると、ＣＯ２およびβ−ケトアシル−ＣｏＡが生成される（アシル部分が２個の炭素原子によって伸長されている場合）。本明細書ではその目的のため、この第１の縮合反応を触媒する酵素は以後、「エロンガーゼ」または「脂肪酸エロンガーゼ」と称されることになる。それに続く反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および伸長されたアシル−ＣｏＡを生成するための第２の還元が含まれる。
【００４０】
当該技術分野で周知のように、脂肪酸エロンガーゼは異なる基質特異性および選択性を有する可能性があり、ここでは「基質特異性」は単一の基質と会合する場合における酵素の活性を示し、「基質選択性」は基質混合物からの特定の基質の選択を示す。例えば、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼはＣ１６基質の方を選択し、Ｃ１８／２０脂肪酸エロンガーゼはＣ１８基質の方を選択し、かつＣ２０／２２脂肪酸エロンガーゼはＣ２０基質の方を選択することになる。同様に、Δ９脂肪酸エロンガーゼはＬＡおよびＡＬＡの各々のＥＤＡおよびＥＴｒＡへの変換を触媒可能である。いくつかの脂肪酸エロンガーゼが幅広い特異性を有することから、単一の酵素がいくつかの脂肪酸エロンガーゼ反応を触媒する（例えば、それによりＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼとＣ１８／２０脂肪酸エロンガーゼの双方として作用する）能力を有しうることに注目することは重要である。好ましい実施形態では、脂肪酸エロンガーゼの特異性を、適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼに対する遺伝子で形質転換し、その宿主の脂肪酸特性に対する効果を測定することによって実験的に判定することが最も望ましい。
【００４１】
本開示の文脈内では、「ＥＬＯ３」という用語は、ｅｌｏ３遺伝子（配列番号１）でコードされる、（本明細書中で配列番号２として提供される）モルティエレラ・アルピナＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素を示す。本明細書中で報告されるデータに基づき、ＥＬＯ３はパルミテート（１６：０）のステアリン酸（１８：０）への変換を選択的に触媒する。
【００４２】
「デサチュラーゼ」という用語は、１つもしくはそれ以上の脂肪酸において脱飽和するすなわち二重結合を挿入することで一価または多価不飽和脂肪酸を生成可能なポリペプチドを示す。本明細書を通して特定の脂肪酸に関してオメガ参照系が用いられるにもかかわらず、デルタ系を用いる基質のカルボキシル末端からのカウントにより、デサチュラーゼの活性を示すとより好都合である。本明細書においては、パルミテートのパルミトオレイン酸（１６：１）への変換および／またはステアレートのオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼが特に注目される。本開示に関する他のデサチュラーゼとして、分子のカルボキシル末端から数えて１２番目および１３番目の炭素原子の間の脂肪酸を脱飽和させかつオレイン酸のＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ；ＬＡのＡＬＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ；ＤＧＬＡのＥＴＡへの変換および／またはＡＲＡのＥＰＡへの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ；ＬＡのＧＬＡへの変換および／またはＡＬＡのＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ；ＤＧＬＡのＡＲＡへの変換および／またはＥＴＡのＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ；ＤＰＡのＤＨＡへの変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ；ならびにＥＤＡのＤＧＬＡへの変換および／またはＥＴｒＡのＥＴＡへの変換を触媒するΔ８デサチュラーゼが挙げられる。
【００４３】
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、特定の酵素（例えばデサチュラーゼまたはエロンガーゼ）が基質を産物に変換しうる場合の効率を示す。変換効率は、以下の式（［産物］／［基質＋産物］）＊１００（式中、「産物」はそれに由来する経路内の直接産物およびすべての産物を含む）に従って測定される。
【００４４】
「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」という用語は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９脂肪酸エロンガーゼ、Ｃ１４／１６脂肪酸エロンガーゼ、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ、Ｃ１８／２０脂肪酸エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２脂肪酸エロンガーゼを含む、ＰＵＦＡの生合成に関連する酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを示す。同様に、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現される場合、ω−３およびω−６脂肪酸のいずれかもしくは双方の直接的または間接的な生成を触媒する酵素をコードする遺伝子セットを示す。代表的経路が図３に図示され、それは様々な中間体を介するミリスチン酸のＤＨＡへの変換を提供しており、それはω−３およびω−６脂肪酸の双方がいかに共通のソースから生成されうるかを示している。経路は天然に２つの部分に分かれ、その場合、一方の部分はω−３脂肪酸を生成しかつもう一方の部分はω−６脂肪酸のみを生成することになる。ω−３脂肪酸を生成するだけの部分は本明細書中でω−３脂肪酸生合成経路と称されることになり、それ故にω−６脂肪酸のみを生成する部分は本明細書中でω−６脂肪酸生合成経路と称されることになる。
【００４５】
ＰＵＦＡ生合成経路と関連して本明細書中で用いられる「機能的」という用語は、経路内の遺伝子の一部（またはすべて）が活性酵素を発現することを意味する。多数の脂肪酸産物ではこの経路の遺伝子のサブセットの発現のみが必要になることから、「ＰＵＦＡ生合成経路」または「機能的ＰＵＦＡ生合成経路」が先のパラグラフ中で列挙されるすべての遺伝子が必要であることを意味しない点は理解されるべきである。
【００４６】
「油性」という用語は、脂質の形態でエネルギー源を貯蔵する傾向がある生物を示す（ウィート（Ｗｅｅｔｅ）、ファンガル・リピッド・バイオケミストリー（Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２版、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、１９８０年）。「油性酵母」という用語は、オイルを作製可能な酵母として分類される微生物を示す。一般に、油性微生物の細胞オイルまたはＴＡＧ含量はＳ字形曲線に従い、ここで脂質の濃度は後期の対数期または初期の定常成長期で最大に達するまで増加し、次いで後期の定常期および死滅期の間に漸減する（ヨングマニチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）  ５７：４１９−２５頁（１９９１年））。オイルとしての乾燥細胞重量の約２５％を超えて蓄積することは、油性微生物にとって異常なことではない。油性酵母の例として、以下の属、すなわちヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが決してこれらに限定されることはない。
【００４７】
本明細書で用いられる「単離核酸断片」または「単離核酸分子」という用語は、同義的に用いられ、かつ、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有する、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味することになる。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸断片については、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントから構成されうる。
【００４８】
核酸分子については、核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニール可能である場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、サムブルック  Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．）、フリッツ  Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス  Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）  モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１９８９年）、特にその中の第１１章および表１１．１（全体として参照により本明細書中に援用される）に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」を決定する。ストリンジェンシー条件を調節することで、中等度に類似した断片（遠縁関係にある生物に由来する相同配列など）、高度に類似した断片（近縁関係にある生物に由来する機能酵素を複製する遺伝子など）をスクリーニング可能である。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１セットでは、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温で１５分間に始まり、次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで４５℃で３０分間繰り返し、次いで０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃で３０分間を２回繰り返すという一連の洗浄が用いられる。ストリンジェントな条件のより好ましいセットでは、より高温が用いられ、この場合、洗浄は０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの最後の２回の３０分の洗浄における温度が６０℃に上昇することを除いて上記に一致する。高度にストリンジェントな条件における別の好ましいセットでは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での２回の最終洗浄が用いられる。ストリンジェントな条件の追加のセットには、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、それに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が含まれる。
【００４９】
ハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチがあっても、２つの核酸が相補配列を有することが必要である。核酸のハイブリダイズに適するストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高まると、それらの配列を有する核酸のハイブリッドにおけるＴｍの値が増加する。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は、以下の順序すなわちＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。１００を超えるヌクレオチド長のハイブリッドにおいては、Ｔｍを計算するための方程式が得られている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、９．５０−９．５１を参照）。より短い核酸すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいては、ミスマッチの部分がより重要になり、かつオリゴヌクレオチド長がその特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、１１．７−１１．８を参照）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸における長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸における最短長は少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、かつ最も好ましい長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は温度および洗浄溶液の塩濃度がプローブ長などの要素による必要性に応じて調節可能であることを理解するであろう。
【００５０】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」はポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を十分に含んでなる部分であり、そのポリペプチドまたは遺伝子は、当業者による配列のマニュアル評価、またはＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルツシュール  Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを用いる、コンピュータで自動化された配列の比較および同定のいずれかによって推定的に同定される。一般に、既知のタンパク質または遺伝子に相同性があるポリペプチドまたは核酸配列を推定的に同定するため、１０個もしくはそれ以上の隣接アミノ酸または３０個もしくはそれ以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０個の隣接ヌクレオチドを含んでなる遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）といった配列に依存した方法において使用可能である。さらに、プライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るため、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用可能である。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を含んでなる核酸断片の特異的な同定および／または単離を行うための配列を十分に含んでなる。本明細書では、部分的または完全なアミノ酸および１つもしくはそれ以上の特定の菌・カビタンパク質をコードするヌクレオチド配列が教示される。本明細書で報告される配列の利点を有する当業者は、当業者に既知の目的のため、ここでは開示される配列の全部または実質的部分を使用することができる。したがって、本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列と同様、上で定義された配列の実質的部分を含んでなる。
【００５１】
「相補的」という用語は、相互にハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を示すために用いられる。例えば、ＤＮＡに関連して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、添付の配列表中に報告された完全な配列ならびに実質的に類似した核酸配列に相補的な単離核酸断片も含む。
【００５２】
当該技術分野で既知の「％同一性」という用語は、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を示し、それは配列の比較によって判定されるものである。「同一性」は、当該技術分野では、場合によってはポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の間での配列の関係性の程度も意味し、それはかかる配列の文字列間でのマッチングによって判定される。「同一性」および「類似性」は、１）コンピューテーショナル・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（レスク  Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ  Ａ．Ｍ．）編）  オックスフォード大学（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）：ニューヨーク州（１９８８年）；２）バイオコンピューティング：インフォーマティクス・アンド・ゲノム・プロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）（スミス  Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．Ｗ．）編）  アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）：ニューヨーク州（１９９３年）；３）コンピュータ・アナラシス・オブ・シーケンス・データ、パートＩ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ）（グリフィン  Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ａ．Ｍ．）およびグリフィン  Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ｈ．Ｇ．）編）  ヒューマニア（Ｈｕｍａｎｉａ）：ニュージャージー州（１９９４年）；４）シーケンス・アナラシス・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（フォン・ハインジェ  Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ  Ｇ．）編）  アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）（１９８７年）；ならびに５）シーケンス・アナラシス・プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）（グリブスコフ  Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  Ｍ．）およびデヴリュー  Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．）編）  ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ）：ニューヨーク州（１９９１年）において記載されるものを含むがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算可能である。同一性を判定するための好ましい方法は、試験される配列間のベストマッチをもたらすように設計される。同一性および類似性を判定するための方法は、公用のコンピュータプログラムでコード化される。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォーマティクスコンピューティングスイートのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム（ディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）を用いて実行可能である。配列の複数のアラインメントが、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）を有するアラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）方法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、コンピューター・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンス（ＣＡＢＩＯＳ．）  ５：１５１−１５３頁（１９８９年））を用いて実施される。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）方法を用いるペアワイズアラインメントにおけるデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ＝５および保存された対角（ｄｉａｇｏｎａｌｓ  ｓａｖｅｄ）＝５である。
【００５３】
適切な核酸断片（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、本明細書で報告されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、かつより好ましくは少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、本明細書で報告されるアミノ酸配列に対して約８５％同一のアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸断片は、本明細書で報告されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。本明細書で報告されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片が最も好ましい。適切な核酸断片は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００５４】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析にとって有用な任意のコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列分析ソフトウェア」は、市販されるかまたは独立に開発される場合がある。典型的な配列分析ソフトウェアは、１）プログラム（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ジェネティック・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）のＧＣＧスイート；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルツシュール  Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２１５：４０３−４１０頁（１９９０年））；３）ディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ）（ディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）；４）シーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）（ジーン・コード・コーポレーション（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アンアーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）、ミシガン州）；および５）スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み込んでいるファスタ（ＦＡＳＴＡ）プログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、コンピューテーショナル・メソッド・イン・ゲノム・リサーチ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．）、［プロシーディングス・オブ・ザ・インターナショナル・シンポジウム（Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．）］（１９９４年）、会議日（Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ）  １９９２年、１１１−２０  スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンドール（Ｓａｎｄｏｒ）編、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）：ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ニューヨーク州）を含むことになるがこれらに限定されない。本願の文脈の中で、配列分析ソフトウェアが分析に用いられる場合、他に規定されない限り、分析の結果が参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことになるという点が理解されるであろう。本明細書で用いられる「デフォルト値」は、最初に初期化される場合でのソフトウェアに最初にロードする値またはパラメータの任意のセットを意味することになる。
【００５５】
「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に作用することなくヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝子コードにおける性質を示す。当業者は、所定のアミノ酸を特定することを目的に、ヌクレオチドコドンが使用された特異的な宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について理解している。したがって、宿主細胞内での改善された発現を意図して遺伝子を合成する場合、遺伝子をそのコドンの使用頻度が宿主細胞での好ましいコドンの使用頻度に近づくように設計することが望ましい。
【００５６】
「最適化されるコドン」という用語は、核酸断片の遺伝子またはコード領域を示す際、ＤＮＡのコード対象のポリペプチドを改変することなく、宿主生物での典型的なコドンの使用を反映するための、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を示す。
【００５７】
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現し、かつコード領域のみを示すかまたはコード配列の上流（５’非コード配列）および下流（３’非コード配列）の調節配列を含む場合がある核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自身の調節配列を伴う天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を示し、天然に共に見出されることのない調節およびコード配列を含んでなる。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来する調節配列およびコード配列、または同じソースに由来するが天然に見出される様式とは異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでなる場合がある。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内でのその天然の位置における天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子は、遺伝子転移によって宿主生物に導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然の生物に挿入される天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入される天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含んでなりうる。「コドンの最適化がなされた遺伝子」は、コドンの使用頻度が宿主細胞での好ましいコドンの使用頻度を模倣するように設計された遺伝子である。
【００５８】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、かつ関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に作用するヌクレオチド配列を示す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。
【００５９】
「プロモ−ター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を示す。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３’方向に位置する。プロモ−ターは、それら全体が天然遺伝子に由来するか、天然に見出される、異なるプロモーター由来の異なる要素からなるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含んでなる場合がある。異なるプロモーターが、異なる組織内または細胞種内で、発生の異なる段階で、または異なる環境条件もしくは生理的条件に応答して遺伝子の発現を指示しうることが当業者によって理解されている。ほぼ常に大部分の細胞種内で遺伝子の発現を引き起こすプロモ−ターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に確定されていないことから、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることが認識されている。
【００６０】
「３’非コード配列」または「転写ターミネーター」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示す。これはポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に作用可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸トラクトのｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に作用することとして特徴づけられる。３’領域は、転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性、あるいは関連したコード配列の翻訳に影響を与えうる。
【００６１】
「ＲＮＡ転写産物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼで触媒された転写から得られる産物を示す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写産物と称されるか、またはそれは一次転写産物の転写後プロセシングから誘導されるＲＮＡ配列である場合があり、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを伴わず、細胞によってタンパク質に翻訳されうるＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに対して相補的でありかつそれから誘導される二本鎖ＤＮＡを示す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むことから細胞によってタンパク質に翻訳されうるＲＮＡ転写産物を示す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的でありかつ標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写産物を示す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写産物の任意の部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列とともにありうる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されていなくても細胞プロセスに対して効果を有する他のＲＮＡを示す。
【００６２】
「作動可能に連結される」という用語は、単一の核酸断片上での核酸配列の会合を示し、ここでは１つの機能が他の機能による影響を受ける。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に作用可能である（すなわちコード配列はプロモーターの転写調節の下にある）場合にそのコード配列に作動可能に連結されている。コード配列は、調節配列に対してセンスまたはアンチセンス方向に作動可能に連結されうる。
【００６３】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も示す場合がある。
【００６４】
「形質転換」は、核酸分子の宿主生物への転移の結果、遺伝的に安定な形質がもたらされることを示す。核酸分子は、自己複製するプラスミドである場合があり、例えば、またはそれは宿主生物のゲノム内への融合を可能にする。形質転換された核酸断片を有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と称される。
【００６５】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運搬することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である特別な染色体要素を示す。かかる要素は、任意のソースに由来する一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自己複製配列、ゲノム融合配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線形体または環状体である場合があり、ここでは多数のヌクレオチド配列が、適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物におけるプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能な固有の作成物に連結または組換えがなされている。「発現カセット」は、外来遺伝子を有しかつ外来宿主内でのその遺伝子の発現の促進を可能にする外来遺伝子以外の要素を有する特定のベクターを示す。
【００６６】
「相同組換え」という用語は、（クロスオーバーの間での）２個のＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換を示す。交換される断片は、２個のＤＮＡ分子間の同一のヌクレオチド配列の部位（すなわち「相同性の領域」）で隣接される。
【００６７】
「相同性の領域」は、相互に相同性を有する相同組換えに関与する核酸断片上のヌクレオチド配列のストレッチを示す。有効な相同組換えが、一般に相同性のこれらの領域が少なくとも約１０ｂｐの長さである（ここでは少なくとも約５０ｂｐの長さが好ましい）場合に生じることになる。典型的には、組換えが意図されている断片は、標的遺伝子の破壊または置換が望ましい場合での相同性の少なくとも２つの領域を有する。
【００６８】
本明細書で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サムブルック  Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．）、フリッチＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１９８９年）（以下では「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；シルハヴィ  Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ  Ｔ．Ｊ．）、ベナン  Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ  Ｍ．Ｌ．）およびエンキスト  Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ  Ｌ．Ｗ．）、エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１９８４年）；およびアウスベル  Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．）ら、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）により発行（１９８７年）にて記載されている。
【００６９】
モルティエレラ・アルピナＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼにおける配列の同定
本発明では、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼをコードする遺伝子（本明細書中で「ＥＬＯ３」と表される）は、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）所有のモルティエレラ・アルピナのｃＤＮＡライブラリーから単離されている。モルティエレラ・アルピナは、ＴＡＧ画分内でＣ２０に等しいかもしくはそれを超える鎖長を有する脂肪酸を天然に蓄積する生物であることから、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼが高効率で機能することでＰＵＦＡ生合成経路へのステアリン酸の大規模な流れが保証される可能性が高い。
【００７０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルツシュール  Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）  ２５：３３８９−３４０２頁（１９９７年））を用いた、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼヌクレオチド塩基および推定上のアミノ酸配列と公的データベースとの比較により、最も類似した既知の配列が、本明細書中で報告される、２７５個を超えるアミノ酸長のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼのアミノ酸配列に対して約３７％同一であることが示される。好ましいアミノ酸断片は、本明細書中の配列に対して少なくとも約７０％〜８０％同一であり、この場合、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。同様に、本ＯＲＦに対応する、好ましいＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼをコードする核酸配列は活性タンパク質をコードする配列であり、ここでは本明細書中で報告されるＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼをコードする核酸配列に対して少なくとも約７０％〜８０％同一であり、この場合、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。
【００７１】
ホモログの同定および単離
本発明のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ核酸断片を用い、同じもしくは他の細菌、藻、菌・カビまたは植物種に由来する相同タンパク質をコードする遺伝子の同定および単離が可能である。
【００７２】
同定技術
例えば、本明細書中に記載のモルティエレラ・アルピナＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼのアミノ酸またはヌクレオチド配列の実質的部分を用い、関連のポリペプチドまたは遺伝子を、当業者による配列のマニュアル評価またはＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルツシュール  Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））およびクラスタルＷ（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）（ディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム）などのアルゴリズムを用いるコンピュータで自動化された配列の比較および同定のいずれかによって推定的に同定してもよい。
【００７３】
あるいは、ここでの脂肪酸エロンガーゼ配列は、ホモログを同定するためのハイブリダイゼーション試薬として使用可能である。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本要素は、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子断片を有すると考えられる試料および特異的なハイブリダイゼーション方法を含む。本発明のプローブは、典型的には検出対象の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列である。プローブについては、検出対象の核酸配列に対して「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は５塩基〜幾万もの塩基で可変であり、実施されるべき特定の試験に依存することになる。典型的には、約１５塩基〜約３０塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが検出対象の核酸配列に対して相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列の間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間で生じるものであり、ハイブリダイズされた領域内での塩基の特定の画分が適切な相補的塩基と対をなさないという結果を伴う。
【００７４】
ハイブリダイゼーション方法は十分に確立されている。典型的には、プローブおよび試料は、核酸ハイブリダイゼーションが可能になる条件下で混合されなければならない。これは適切な濃度および温度条件下での無機塩または有機塩の存在下でプローブと試料を接触させるステップを含む。プローブと試料核酸は、プローブと試料核酸の間で任意の可能なハイブリダイゼーションが生じうるのに十分に長時間、接触状態になければならない。混合物中でのプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションの発生に必要な時間を決定することになる。プローブまたは標的の濃度が高まると、ハイブリダイゼーションに必要なインキュベーション時間が短縮される。場合により、カオトロピック剤が添加される場合がある。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性の阻害により核酸を安定化させる。さらに、カオトロピック剤は、室温での短いオリゴヌクレオチドプローブにおける感度がよくストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（ヴァン・ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）  １９：５１４３−５１５１頁（１９９１年））。適切なカオトロピック剤には、特に塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが含まれる。典型的には、カオトロピック剤は約３Ｍの最終濃度で存在することになる。必要に応じ、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に添加し、典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）にしてもよい。
【００７５】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いてもよい。典型的には、これらは極性有機溶媒の約２０〜６０％容量、好ましくは３０％容量を含んでなる。一般のハイブリダイゼーション溶液には、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍ塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍ緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ピペス（ＰＩＰＥＳ）またはヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ範囲が約６〜９））、約０．０５〜０．２％洗浄剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）または０．５〜２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、フィコル（ＦＩＣＯＬＬ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．））（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンが用いられる。典型的なハイブリダイゼーション溶液中には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識の担体核酸、断片化された核ＤＮＡ（例えば、子牛胸腺もしくはサケ精子ＤＮＡまたは酵母ＲＮＡ）および場合により約０．５〜２％  ｗｔ／ｖｏｌのグリシンも含まれる。種々の極性の水溶性剤または膨張性剤（ｓｗｅｌｌａｂｌｅ  ａｇｅｎｔ）（例えばポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート）およびアニオン性糖ポリマー（ｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）（例えば、硫酸デキストラン）を含む容量排除剤（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）などの他の添加剤も含まれうる。
【００７６】
核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイ形式に適合性がある。最適なものの１つがサンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適合性がある。サンドイッチ型アッセイの主要な成分は固体支持体である。固体支持体はそれに吸着しているかまたはそれに未標識でかつ配列の一部に相補的な固定化核酸プローブを共有結合している。
【００７７】
単離方法
本明細書中で同定されたモルティエレラ・アルピナＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼを用い、配列依存性のプロトコルに基づく、同じもしくは他の細菌、藻、菌・カビまたは植物種に由来する相同タンパク質をコードする遺伝子の単離が可能である。例えば、これらのプロトコルは、１）核酸ハイブリダイゼーションの方法、２）核酸増幅技術［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、タボー  Ｓ．（Ｔａｂｏｒ  Ｓ．）ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）  ８２：１０７４頁（１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８９：３９２頁（１９９２年）］の様々な使用により例示されたＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法、ならびに３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニングの方法を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
例えば、本明細書中に記載の脂肪酸エロンガーゼに対して類似のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子であれば、当業者に周知の方法を用い、本核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用いて直接単離することで、任意の所望の酵母または菌・カビからライブラリーをスクリーニングすることが可能である（ここではＰＵＦＡを生成する酵母または菌・カビであれば好ましいことになる）。本核酸配列に基づく特異的なオリゴヌクレオチドプローブについては、当該技術分野で既知の方法を用いて設計および合成を行ってもよい（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上記）。さらに、配列全体を直接用い、当業者に既知の方法（例えば、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識技術）によってＤＮＡプローブを、あるいは使用可能なインビトロ転写系用いてＲＮＡプローブを合成してもよい。さらに、特異的なプライマーを本配列の一部（または完全長）を増幅するように設計しかつ使用してもよい。得られた増幅産物を、増幅反応の間に直接標識するかまたは増幅反応後に標識し、かつプローブとして用い、適切なストリンジェンシーの条件下で完全長ＤＮＡ断片を単離してもよい。
【００７９】
典型的には、ＰＣＲ型増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、かつ互いに相補的ではない。プライマーの配列は、所望の試験条件に応じ、標的核酸の効率的かつ忠実な複製をもたらすように設計される必要がある。ＰＣＲプライマー設計の方法は汎用性があり、当該技術分野で周知である（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、ヒューマン・ジェネティック・ディジーズ：ア・プラクティカル・アプローチ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｋ．Ｅ．デイビス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６年）  ３３−５０頁、アイアールエル（ＩＲＬ）：ハーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）、バージニア州；およびリクリク  Ｗ．（Ｒｙｃｈｌｉｋ  Ｗ．）、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ホワイト  Ｂ．Ａ．（Ｗｈｉｔｅ  Ｂ．Ａ．）編（１９９３年）  第１５巻、３１−３９頁、ＰＣＲプロトコルズ：カレント・メソッズ・アンド・アプリケーションズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）  ヒューマニア（Ｈｕｍａｎｉａ）：トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州）。
【００８０】
一般に、本ＥＬＯ３配列の２つの短いセグメントをＰＣＲプロトコルにおいて用いると、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来する相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅可能である。ＰＣＲをクローニングされた核酸断片のライブラリー上でも実施可能であり、ここでは一方のプライマーの配列はここでの核酸断片から誘導され、かつもう一方のプライマーの配列は微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を利用している。あるいは、第２のプライマー配列は、例えばＰＣＲの利用によりｃＤＮＡを生成して転写産物内の一点と３’または５’末端の間の領域のコピーを増幅するためのレース（ＲＡＣＥ）プロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）  ８５：８９９８頁（１９８８年））を用い、クローニングベクターから誘導される配列に基づく場合がある。３’および５’方向に方向づけられたプライマーを本配列から設計してもよい。市販の３’レース（ＲＡＣＥ）系または５’レース（ＲＡＣＥ）系（ギブコ／ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を用い、特定の３’または５’  ｃＤＮＡ断片を単離してもよい（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）  ８６：５６７３頁（１９８９年）；ロー（Ｌｏｈ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）  ２４３：２１７頁（１９８９年））。
【００８１】
本ヌクレオチドおよび推定上のアミノ酸Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ配列が使用可能であることから、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的なスクリーニングが容易になる。本アミノ酸配列の一部を示す合成ペプチドは合成可能である。これらのペプチドを用いて動物を免疫することで、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質に対して特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生が可能である。次いで、これらの抗体を用いてＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることで、目的の完全長ＤＮＡクローンの単離が可能である（ラーナー  Ｒ．Ａ．（Ｌｅｒｎｅｒ  Ｒ．Ａ．）  アドバンシーズ・イン・イミュノロジー（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）  ３６：１頁（１９８４年）；マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上記）。
【００８２】
改善された異種発現における遺伝子の最適化
特定のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ（例えば配列番号１および２）の同定および単離の後、種々の技術を用い、別の宿主内で目的のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼの発現を改善することが可能である。２つのかかる技術には、コドンの最適化および遺伝子の突然変異誘発が含まれる。
【００８３】
当業者によって理解されるように、（修飾されたポリペプチドが別の宿主によって好ましいコドンを用いるように）外来宿主内で発現されるべき特定のポリペプチドをコードするコドンの一部を修飾することが有用なことは多く、それはこれによりポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現が実質的に促進されうるためである。当業者は、目的の特定の宿主種内で宿主に好ましいコドンを判定し、別のコード配列を計算しかつ合成するための技術（例えば国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットを参照）を理解するであろう。したがって、例えば本発明の一実施形態では、ＥＬＯ３ポリペプチドをコードするコドンの一部を修飾することでアルカン資化酵母内での遺伝子の発現を促進することが望ましい場合がある。
【００８４】
別の実施形態では、インビトロ突然変異誘発および選択、部位特異的突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２７（４）：１０５６−１０６２頁（１９９９年２月１５日））、「遺伝子シャッフリング」（米国特許第５，６０５，７９３号明細書；米国特許第５，８１１，２３８号明細書；米国特許第５，８３０，７２１号明細書；および米国特許第５，８３７，４５８号明細書）または他の手段などの突然変異誘発技術を用い、本明細書中に記載のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼなどの天然エロンガーゼ遺伝子の変異体を取得してもよい（ここでかかる変異体は欠失、挿入および点突然変異、またはそれらの組み合わせを含みうる）。これを仮定すると、特定の宿主細胞内での機能においてより望ましい物理的および速度論的パラメータ（例えば、所望の脂肪酸のより長い半減期またはより高速の生成）を備えた脂肪酸エロンガーゼ活性をインビボで有するポリペプチドの生成が可能となる。あるいは、必要に応じ、酵素活性にとって重要な目的のポリペプチドの領域を、通常の突然変異誘発、得られた突然変異ポリペプチドの発現およびそれらの活性の測定を通して判定してもよい。これらの技術の概要は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット中に記載されている。
【００８５】
本明細書中に記載のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ遺伝子から誘導されるあらゆるかかる突然変異タンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内にある。それに、本発明の方法は、添付の配列表中に報告されるＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ遺伝子の完全配列、この完全配列の相補体、この配列の実質的部分、それらから得られるコドンの最適化がなされたエロンガーゼ、およびそれらに対して実質的に相同性がある配列の使用を含んでなる。
【００８６】
脂肪酸の微生物生合成
脂質代謝は、ほぼすべての動物、植物、および微生物が有する基本的な代謝過程であり、それ故、ほぼすべてのこれらの生物は、パルミテート（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）およびオレイン酸（１８：１）を合成する能力を有する（これらの脂肪酸はリン脂質生合成に必須であるため）。図３中に図示のように、これらの脂肪酸の各々はミリスチン酸（１４：０）から誘導される。詳細には、遊離パルミテートがミリスチン酸から伸長反応を介して生成され（すなわち、Ｃ１４／１６脂肪酸エロンガーゼによって触媒され）、次いでパルミテートがＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼによって伸張されてステアリン酸が生成されるかまたは不飽和化されてパルミトオレイン酸（１６：１）が生成される。しかし、パルミテートの主要な行方が伸長であることから、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼが、微生物細胞内で生成されるステアリン酸の量を制御する故に、脂肪酸生合成経路への炭素フラックス全体の測定において重要な役割を果たすと結論づけられた。
【００８７】
生化学的経路の操作にとって有用な方法は当業者に周知である。本明細書中に記載のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼをコードするキメラ遺伝子を適切なプロモーターの制御下で導入することで、形質転換宿主生物内でのステアリン酸の生成が増大する結果になることが想定される。したがって、油性酵母内でステアリン酸を生成するための方法を提供することが本発明の目的であり、ここで油性酵母は、（ａ）配列番号２で示されるＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼをコードする単離核酸断片、および（ｂ）パルミテートを含んでなるエロンガーゼ基質のソースとして提供され、ここで酵母はキメラエロンガーゼ遺伝子が発現されかつパルミテートがステアリン酸に変換されるような条件下で成長され、ここでステアリン酸は場合により回収される。
【００８８】
さらに、本明細書中に記載のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ遺伝子およびそれに対応する酵素産物をω−３および／またはω−６ＰＵＦＡを生成するために間接的に用いてもよい。詳細には、本明細書中に記載のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼは、一連の反応が生じて所望のＰＵＦＡ産物を生成するように、他の酵素をコードする１つもしくはそれ以上の遺伝子とともに発現可能であると考えられる。
【００８９】
（藻、細菌、かび、菌・カビおよび酵母を含む）多数の微生物は細胞代謝の通常の経路においてＰＵＦＡおよびオメガ脂肪酸を合成しうるが、この能力をＰＵＦＡを天然に生成する（または所望のＰＵＦＡおよび／または脂質特性をもたらす）ことのない生物に導入することも可能である。当業者は、ＰＵＦＡ生合成に適する酵素をコードする発現カセットを好ましい宿主生物に導入するのに必要な検討事項および技術を理解するであろう。これらの目的のため、ＰＵＦＡの生成に関与する種々のデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子が遺伝的手段によって同定されており、これらの遺伝子の一部のＤＮＡ配列は公的に利用できる（例えば、ジェンバンクにて入手可能な遺伝子に関するレビューとしての国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットおよび／またはデサチュラーゼもしくはエロンガーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択するための特許文献および検討事項を参照のこと）。また、極めて多くの教示内容が、本明細書中で詳述されないとはいえ、文献中で提供され、ここでは様々な生物が特定のＰＵＦＡを生成するように設計され、一部の例示的な参考文献が以下のように提供されるが、これらは国際公開第９８／４６７６３号パンフレット；国際公開第９８／４６７６４号パンフレット；国際公開第９８／４６７６５号パンフレット；国際公開第９９／６４６１６号パンフレット；国際公開第２００２／０７７２１３号パンフレット；国際公開第２００３／０９３４８２号パンフレット；国際公開第２００４／０５７００１号パンフレット；国際公開第２００４／０９０１２３号パンフレット；国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレット；米国特許第６，１４０，４８６号明細書；米国特許第６，４５９，０１８号明細書；米国特許第６，１３６，５７４号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１７２３９９号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１７２６８２号明細書；米国特許出願公開第２００４／０９８７６２号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１１１７６３号明細書；米国特許出願公開第２００４／００５３３７９号明細書；米国特許出願公開第２００４／００４９８０５号明細書；米国特許出願公開第２００４／０２３７１３９号明細書；米国特許出願公開第０４／０１７２６８２号明細書；ビュードイン  Ｆ．（Ｂｅａｕｄｏｉｎ  Ｆ．）ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、９７（１２）：６４２１−６４２６頁（２０００年）；ダイヤー  Ｊ．Ｍ．（Ｄｙｅｒ  Ｊ．Ｍ．）ら、アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、５９：２２４−２３０頁（２００２年）；ドマーグ  Ｆ．（Ｄｏｍｅｒｇｕｅ  Ｆ．）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２６９：４１０５−４１１３頁（２００２年）；チ  Ｂ．（Ｑｉ  Ｂ．）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）  ２２：７３９−７４５頁（２００４年）；およびアバディ（Ａｂｂａｄｉ）ら、ザ・プラント・セル（Ｔｈ��  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ）、１６：２７３４−２７４８頁（２００４年）を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９０】
したがって、例えば本明細書に記載のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼは、一連の反応の発生により所望のＰＵＦＡ産物が生成するように、ＰＵＦＡ酵素をコードする１つもしくはそれ以上のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子とともに発現される。好ましい実施形態では、例えば宿主生物は、１）本発明のモルティエレラ・アルピナＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼをコードするキメラ遺伝子、および２）ＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えば、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０脂肪酸エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２脂肪酸エロンガーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９脂肪酸エロンガーゼおよび／またはΔ８デサチュラーゼ）をコードする追加の遺伝子を含んでなるベクターとともに共形質転換されうる。この形質転換宿主であれば、本発明のモルティエレラ・アルピナＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼをコードするキメラ遺伝子を発現していない同じ形質転換宿主内で生じる場合よりも増加した量のω−３および／またはω−６脂肪酸（例えば、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ；図３を参照）が生成されると想定されることになる。特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡ特性および／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼ特性）、基質の使用可能性、ならびに所望の最終産物に依存することになる。
【００９１】
別の実施形態では、本明細書中に記載の完全配列、それら完全配列の相補体、それら配列の実質的部分、それらから誘導されるコドンの最適化がなされたデサチュラーゼおよびそれらに対して実質的に相同な配列に基づき、宿主生物の天然Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼを破壊することが有用でありうる。例えば、宿主生物内でのＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼの標的とされた破壊により、ステアリン酸を合成できない突然変異株がもたらされ、したがって生存のためにＣ１８脂肪酸の補給が必要である。
【００９２】
別の実施形態では、天然Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼの破壊または不活化を含んでなる形質転換宿主生物は、次いで異種のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼを発現するように有利に形質転換されうる（例えば、異種のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼが天然Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼとは異なる基質特異性を有する場合）。この操作を仮定すると、天然および異種のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼの間での基質競合が低下しうる。したがって、異種のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ（すなわち配列番号２）を対応する天然アルカン資化酵母Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼのノックアウトとともに発現するのであれば、ＰＵＦＡ生合成のために設計された形質転換アルカン資化酵母宿主細胞内で生成される長鎖ω−３／ω−６ＰＵＦＡ全体が有意に増加しうる。
【００９３】
遺伝子破壊においては、外来ＤＮＡ断片（典型的には選択可能なマーカー遺伝子）が、コード配列を中断することによって遺伝子を機能的に不活化するため、構造遺伝子に挿入され、それが破壊される。破壊カセットの宿主細胞への形質転換の結果、相同組換えにより機能的天然遺伝子が非機能的破壊遺伝子と置換される（例えば、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）  １７１：４６１７−４６２２頁（１９８９年）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）  １３６：２１１−２１３頁（１９９３年）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）  ２４：２５１９−２５２４頁（１９９６年）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、メソッズ・イン・モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）  ５：２７０−２７７頁（１９９６年）を参照）。
【００９４】
アンチセンス技術は、標的遺伝子の配列が既知の場合に遺伝子を下方制御する別の方法である。これを行うため、所望の遺伝子に由来する核酸セグメントがクローニングされ、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されることになるようにプロモーターに作動可能に連結される。次いで、このコンストラクトは宿主細胞に導入され、ＲＮＡのアンチセンス鎖は生成される。アンチセンスＲＮＡは、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を阻止することにより遺伝子発現を阻害する。当業者は、特定の遺伝子の発現を低下させるため、アンチセンス技術の使用には特別な考慮を必要とすることを認識しているであろう。例えば、アンチセンス遺伝子の適切なレベルの発現には、当業者に既知の異なる調節因子を用いる、異なるキメラ遺伝子の使用が必要でありうる。
【００９５】
標的遺伝子の破壊およびアンチセンス技術は配列が既知である場合の遺伝子を下方制御する有効な手段を提供するが、配列をベースとしない他のあまり具体的でない方法が開発されている（例えば、ＵＶ放射／化学物質を介する突然変異誘発または転移因子／トランスポゾンの使用；米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書を参照）。
【００９６】
発現系、カセットおよびベクター
本明細書中に記載の本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種の微生物宿主細胞内、特に油性酵母（例えばアルカン資化酵母）の細胞内で生成されうる。
【００９７】
外来タンパク質の高レベルの発現を指示する調節配列を含有する微生物発現系および発現ベクターは当業者に周知である。これらのいずれかを用いるならば、本脂肪酸エロンガーゼ配列の遺伝子産物の生成を目的としてキメラ遺伝子を作成することが可能である。次いで、これらのキメラ遺伝子を形質転換を介して適切な微生物に導入すれば、コードされた酵素の高レベルの発現をもたらすことが可能である。
【００９８】
適切な宿主細胞の形質転換にとって有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、当該技術分野で周知である。コンストラクト内に存在する配列の特異的選択は、所望の発現産物（上記）、宿主細胞の性質および形質転換されていない細胞に対して形質転換細胞を分離する提案された手段に依存している。しかし、典型的には、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、ならびに自己複製または染色体融合を可能にする配列を有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の領域５’および転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’を含んでなる。それは、両制御領域が形質転換宿主細胞に由来する遺伝子から誘導される場合に最も好ましいが、かかる制御領域が生成宿主として選択される特定の種に由来する遺伝子から誘導される必要がないことは理解されるべきである（例えば、有用な開始調節領域およびターミネーターに関するレビューとして米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書を参照）。しかし、一部の好ましい実施形態では、転写開始調節領域は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書；同時係属中の米国特許出願第１１／１８３６６４号明細書）、ホスホグリセレートムターゼ（米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書）、フルクトース−ビホスフェートアルドラーゼ（米国特許出願第１０／９８７５４８号明細書）、グリセリン−３−ホスフェートＯ−アシルトランスフェラーゼ（米国仮特許出願第６０／６１００６０号明細書）、アンモニウムトランスポータータンパク質（同時係属中の米国特許出願第１１／１８５３０１号明細書）および翻訳伸長因子ＥＦ１−α（ＴＥＦ）タンパク質（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）から得られる。
【００９９】
当業者に既知のように、単に遺伝子をクローニングベクターに挿入しても、要求されるレベルでの発現が成功するという保証はない。速い発現速度への需要に応じ、多数の専用の発現ベクターが転写、翻訳、タンパク質の安定性、酸素制限、および宿主細胞からの分泌の局面を制御する多数の異なる遺伝的因子の操作によって作製されている。より詳細には、遺伝子発現を制御するために操作されているいくつかの分子的特徴には、１）関連の転写プロモーターおよびターミネーターの配列の性質；２）クローニングされた遺伝子のコピーの数および遺伝子がプラスミドに担持されるかまたは宿主細胞のゲノムに融合されるかということ；３）合成された外来タンパク質の最終の細胞位置；４）宿主生物内での翻訳の効率；５）宿主細胞内でのクローニングされた遺伝子タンパク質の固有の安定性；および６）クローニングされた遺伝子内でのコドンの使用（その頻度が宿主細胞における好ましいコドンの使用頻度に近づくように）が含まれる。これらの修飾のタイプは、本明細書中に記載のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼの発現をさらに最適化するための手段として本発明に包含される。
【０１００】
Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼの組換え発現における好ましい微生物宿主
本Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ遺伝子および核酸断片を発現するための宿主細胞は、広範な温度およびｐＨ値にわたり、単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコールおよび／または炭化水素を含む種々の供給原料上で成長する微生物宿主を含みうる。本発明で記載の遺伝子が油性酵母内、特にアルカン資化酵母内での発現のために単離されているが、転写、翻訳およびタンパク質生合成装置が高度に保存されることから、任意の細菌、酵母、藻および／または糸状菌・カビが本核酸断片を発現するための適切な宿主になると考えられる。
【０１０１】
好ましい微生物宿主は、油性酵母などの油性生物である。これらの油性生物は天然でオイルの合成および蓄積を可能にし、ここでは全オイル含量は、細胞乾燥重量の約２５％超、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％超、および最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％超を含んでなりうる。さらに、米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書および同時係属中の米国仮特許出願第６０／６２４８１２号明細書において見られるＰＵＦＡの生成を目的としたこれらの生物の使用には基準が存在する。
【０１０２】
油性酵母として典型的に同定される属は、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロンおよびリポマイセスを含むがこれらに限定されない。より詳細には、具体的なオイルを合成する酵母には、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、リポマイセス・リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レヴカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・アティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、トリコスポロン・キュータネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルーラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、ロドトルーラ・グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）およびアルカン資化酵母（かつてはカンジダ・リポリチカ（カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））として分類されたもの）が含まれる。
【０１０３】
油性酵母アルカン資化酵母が最も好ましく、かつさらなる実施形態では、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃９０８１２および／またはＬＧＡＭ  Ｓ（７）１として表されるアルカン資化酵母株が最も好ましい（パパニコロー  Ｓ．（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．）およびアゲリス  Ｇ．（Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．）、バイオリソース・テクノロジー（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）  ８２（１）：４３−９頁（２００２年））。
【０１０４】
微生物宿主の形質転換
一旦油性酵母内での発現に適するポリペプチドをコードするＤＮＡが得られていると、それは宿主細胞内で自己複製可能なプラスミドベクター内に挿入されるか、または宿主細胞のゲノムに直接融合される。発現カセットの融合については、宿主ゲノム内でランダムに生じうるかまたは宿主遺伝子座との組換えを標的にするのに十分な宿主ゲノムと相同性がある領域を有するコンストラクトの使用を通して標的化されうる。コンストラクトが内因性遺伝子座に標的化される場合、転写および翻訳調節領域の全部または一部が内因性遺伝子座によって提供されうる。
【０１０５】
２つもしくはそれ以上の遺伝子が別々の複製ベクターから発現される場合、各ベクターが異なる選択の手段を有し、安定な発現を維持しかつコンストラクト内での諸因子の混ぜ合わせを阻止するのに他のコンストラクトに対する相同性がないことが望ましい。調節領域の賢明な選択、導入されたコンストラクトの増殖における選択手段および方法については、すべての導入遺伝子が所望の産物の合成をもたらすのに必要なレベルで発現されるように実験的に決定してもよい。
【０１０６】
目的のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ遺伝子を含んでなるコンストラクトは、任意の標準技術によって宿主細胞内に導入されうる。これらの技術は、形質転換（例えば、酢酸リチウム形質転換［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９４：１８６−１８７頁（１９９１年）］）、原形質融合、バイオリスティック効果、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または目的遺伝子を宿主細胞に導入する任意の他の方法を含む。油性酵母（すなわちアルカン資化酵母）に適用可能なより具体的な教示として、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書ならびにチェン  Ｄ．Ｃ．（Ｃｈｅｎ  Ｄ．Ｃ．）ら（アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）  ４８（２）：２３２−２３５頁（１９９７年））が挙げられる。
【０１０７】
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を利用するための任意の方法によって操作されている宿主細胞は、本明細書中で「形質転換された」または「組換え」として称されることになる。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノムに融合されるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するか否かに応じ、少なくとも１つの発現コンストラクトのコピーを有することになり、かつ２つもしくはそれ以上の発現コンストラクトのコピーを有する場合がある。形質転換宿主細胞を、米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書および米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書に記載される様々な選択技術により同定してもよい。本明細書中での使用における一部の好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシンおよびアミノ配糖体Ｇ４１８に耐性があるとともに、ウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを含有しない培地上で成長する能力を有する。
【０１０８】
形質転換後、本Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ（および、場合により宿主細胞内で共発現される他のＰＵＦＡ酵素）に適する基質は、天然にまたは遺伝子導入で宿主により生成されるかあるいは体外から提供されうる。
【０１０９】
ステアリン酸を生成するための発酵プロセス
形質転換された微生物宿主細胞は、脂肪酸生合成遺伝子の活性を最適化し、最大かつ最も経済的な収量の脂肪酸（例えば、次々と様々なω−３および／またはω−６脂肪酸の生成を高めうるステアリン酸）を生成する条件下で成長される。一般に、最適化可能な培地条件には、炭素源の種類と量、窒素源の種類と量、炭素対窒素の比、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生成段階の長さ、オイル蓄積段階の長さおよび細胞採取の時間が含まれる。油性酵母などの目的微生物は複合培地（例えば、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース培養液（ＹＰＤ））内または成長に必要な成分を含有しない確立された最小培地内で成長され、それにより所望の発現カセット（例えば、イーストナイトロジェンベース（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ）（ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州））の選択がなされる。
【０１１０】
本発明における発酵培地は、適切な炭素源を含有しなければならない。適切な炭素源は、単糖（例えば、グルコース、フルクトース）、二糖（例えば、乳糖またはショ糖）、オリゴ糖、多糖（例えば、デンプン、セルロースまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えばグリセリン）、あるいは再生可能な供給原料（例えば、乳清透過液、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、シュガービートモラセス（ｓｕｇａｒ  ｂｅｅｔ  ｍｏｌａｓｓｅｓ）、大麦麦芽（ｂａｒｌｅｙ  ｍａｌｔ））に由来する混合物を含みうるがこれらに限定されない。さらに、炭素源は、アルカン、脂肪酸、脂肪酸のエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、ならびに植物油（例えば大豆油）および動物脂肪を含む様々な商業ソースの脂肪酸を含みうる。さらに、炭素基質は１炭素基質（例えば二酸化炭素またはメタノール）を含む場合があり、それにおいては主要な生化学的中間体への代謝変換が示されている。それ故、本発明で用いられる炭素源は、多種多様な炭素を含有する基質を包含する場合があり、かつ単に宿主生物の選択によって限定されることになると考えられる。上記の炭素基質およびそれらの混合物のすべてが本発明において適切であると想定されるが、好ましい炭素基質は糖類および／または脂肪酸である。１０〜２２個の炭素を含有するグルコースおよび／または脂肪酸が最も好ましい。
【０１１１】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸塩）ソースから供給されうる。発酵培地は、適切な炭素源および窒素源に加え、微生物の成長およびＰＵＦＡの生成にとって必要な酵素経路の促進に適する、適切なミネラル、塩、共同因子、緩衝液、ビタミン、および当業者に既知の他の成分も含有しなければならない。特に注目される対象は、脂質およびＰＵＦＡの合成を促進する数種類の金属イオン（例えば、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）である（ナカハラ  Ｔ．（Ｎａｋａｈａｒａ  Ｔ．）ら、インダストリアル・アプリケーション・オブ・シングル・セル・オイルズ（Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ）、Ｄ．Ｊ．カイル（Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｒ．Ｃｏｌｉｎ）編、６１−９７頁（１９９２年））。
【０１１２】
本発明の好ましい成長培地は、イーストナイトロジェンベース（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ）（ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州）などの一般の商用に調製された培地である。他の確立されたまたは合成の成長培地も使用可能であり、特定の微生物の成長に適する培地が微生物学または発酵科学における当業者によって認識されるであろう。発酵に適するｐＨ範囲は、典型的には約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０であり、初期の成長条件における範囲としてはｐＨ５．５〜ｐＨ７．０が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で可能であり、ここでは微好気性条件が好ましい。
【０１１３】
典型的には、代謝状態が脂肪の成長と合成／保存の間で「均衡」されなければならないことから、油性酵母細胞内での高レベルのＰＵＦＡの蓄積には２段階のプロセスが必要である。したがって最も好ましくは、油性酵母内でのＰＵＦＡの生成においては２段階発酵プロセスが必要である。このアプローチは、様々な適切な発酵プロセスの設計（すなわちバッチ、供給バッチおよび連続バッチ）および成長の間での検討として、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット中に記載されている。
【０１１４】
ＰＵＦＡの精製
ＰＵＦＡを含む脂肪酸は、宿主微生物内に遊離脂肪酸としてまたはアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質などのエステル化形態で見出される場合があり、かつ当該技術分野で周知の種々の手段により宿主細胞から抽出される場合がある。酵母脂質における抽出技術、品質分析および許容度の標準に関する１つのレビューが、Ｚ．ヤコブ（Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ）（クリティカル・レビュー・イン・バイオテクノロジー（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）  １２（５／６）：４６３−４９１頁（１９９２年））のものである。下流プロセシングに関する短いレビューが、Ａ．シン（Ａ．Ｓｉｎｇｈ）およびＯ．ワード（Ｏ．Ｗａｒｄ）（アドバンシーズ・イン・アプライド・マイクロバイオロジー（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）  ４５：２７１−３１２頁（１９９７年））でも入手可能である。
【０１１５】
一般に、ＰＵＦＡを精製するための手段は、有機溶媒による抽出、ソニフィケーション（ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用）、鹸化、およびプレスなどの物理的手段、またはそれらの組み合わせを含みうる。さらに詳細には、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットの教示内容が参照される。
【０１１６】
好ましい実施形態の説明
本明細書中に記載される研究の最終目標は、ω−３および／またはω−６ＰＵＦＡに富むオイルを蓄積する油性酵母の開発である。このような目的で、油性酵母内で効率的に機能することでこれらの宿主内での好ましいＰＵＦＡの合成および高蓄積を可能にする脂肪酸エロンガーゼが同定されなければならない。先行研究では、出願人は、ラットＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼタンパク質（ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）に由来するｒＥＬＯ２；ジェンバンク登録番号ＡＢ０７１９８６）を過剰発現させ、下流ＰＵＦＡ（米国仮特許出願第６０／６２４８１２号明細書）の生成を増大させるための手段としての、アルカン資化酵母内でのｒＥＬＯ２の発現に成功したが、形質転換宿主内でのこの遺伝子の存在は規制認可の取得に向けて支持するものではなかった。その結果、本研究に着手し、より適切なＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼを同定した。
【０１１７】
ｃＤＮＡ断片がＢＬＡＳＴ分析に基づく独自のモルティエレラ・アルピナｃＤＮＡライブラリーにおいて同定された。遺伝子（仮称が「ｅｌｏ３」）のコード領域が強力な天然プロモーターの制御下でアルカン資化酵母内で過剰発現されることにより、対照株よりも３５％多いＣ１８脂肪酸（１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２およびＧＬＡ）ならびに３１％少ないＣ１６脂肪酸を生成する形質転換体が得られた。したがって、これらのデータは、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３が基質としてＣ１６脂肪酸を用い、Ｃ１８脂肪酸を生成することを示した。
【０１１８】
モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３がω−３／ω−６脂肪酸生合成経路への炭素フラックスを増大させ、それにより設計されたヤロウィア株のより長い鎖脂肪酸のオイル含量を増加させるのに適することになると想定される。したがって、本発明の一実施形態は、油性酵母内で脂肪酸の特性を改変する方法であり、それによってモルティエレラ・アルピナＥＬＯ３は、単独でまたは他のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子（例えば、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０脂肪酸エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２脂肪酸エロンガーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９脂肪酸エロンガーゼおよび／またはΔ８デサチュラーゼ）との組み合わせで発現され、長鎖ＰＵＦＡ（例えば、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡ）の生成の増大が可能になる。
【実施例】
【０１１９】
本発明は、以下の実施例でさらに規定される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、あくまで図示目的で与えられることを理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認でき、かつその趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および改良を行い、それを様々な使用および条件に適合させることができる。
【０１２０】
一般的方法
実施例で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、１）サムブルック  Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．）、フリッチＥ．Ｆ．（ＦｒｉｔｓｃｈＥ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（ＭａｎｉａｔｉｓＴ．）、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１９８９年）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；２）Ｔ．Ｊ．シルハヴィ（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンキスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１９８４年）；および３）アウスベル  Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．）ら、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）により発行（１９８７年）にて記載されている。
【０１２１】
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法は当該技術分野で周知である。以下の実施例での使用に適する技術は、マニュアル・オブ・メソッド・フォー・ジェネラル・バクテリオロジー（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）  Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ  Ｎ．コスチロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、アメリカン・ソサエティ・フォー・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）：ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４年））；またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、バイオテクノロジー：ア・テキストブック・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、シナウアー・アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）：サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）マサチューセッツ州（１９８９年）にて示されるものとして見出されうる。他に規定されない限り、細菌細胞の成長および維持のために用いられるすべての試薬、制限酵素および材料をアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ウィスコンシン州）、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州）、ギブコ／ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）から入手した。
【０１２２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞および大腸菌エレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂ細胞をインヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）から入手した。大腸菌ＤＨ５αのマックス・エフィシエンシー（Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）コンピテント細胞をギブコ／ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）から入手した。大腸菌（ＸＬ１−ブルー）コンピテント細胞をストラタジーン・カンパニー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）から購入した。すべての大腸菌株を典型的にはルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で成長させた。
【０１２３】
一般の分子クローニングを標準的方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記）に従って実施した。オリゴヌクレオチドをシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）（スプリング（Ｓｐｒｉｎｇ）、テキサス州）により合成した。ＰＣＲ産物をプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｐＧＥＭ−Ｔ−イージィ（ｅａｓｙ）ベクター（マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）にクローニングした。
【０１２４】
ＤＮＡ配列を、ベクターとインサート特異的なプライマーの組み合わせを用いるダイターミネーター（ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；欧州特許第２７２，００７号明細書）を用い、エービーアイ（ＡＢＩ）オートマティック・シーケンサー（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）上で生成した。配列編集をシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）（ジーン・コード・コーポレーション（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アンアーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）、ミシガン州）で行った。すべての配列は、両方向に少なくとも２回のカバーを示す。遺伝子配列の比較をディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア（ディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）を用いて行った。
【０１２５】
略語の意味は以下の通りである。すなわち、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、かつ「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１２６】
アルカン資化酵母の培養
アルカン資化酵母株ＡＴＣＣ＃７６９８２およびＡＴＣＣ＃９０８１２をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）から購入した。アルカン資化酵母株を通常、ＹＰＤ寒天（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン（ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ）、２％グルコース、２％寒天）上で２８℃で成長させた。
【０１２７】
特に断りのない限り、アルカン資化酵母の形質転換を、チェン  Ｄ．Ｃ．（Ｃｈｅｎ  Ｄ．Ｃ．）ら（アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）  ４８（２）：２３２−２３５頁（１９９７年））の方法に従って行った。つまり、ヤロウィアをＹＰＤプレート上にストリークし、３０℃で約１８時間成長させた。数白金耳量の細胞をプレートからこすり落とし、５０％ＰＥＧ２．２５ｍＬ、平均分子量３３５０、２Ｍ  酢酸リチウム０．１２５ｍＬ、ｐＨ６．０、２Ｍ  ＤＴＴ０．１２５ｍＬ、および５０μｇの剪毛したサケ精子ＤＮＡを含有する形質転換用緩衝液１ｍＬに再懸濁した。次いで、約５００ｎｇの線状にしたプラスミドＤＮＡを再懸濁された細胞１００μｌ中でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃で１時間維持した。細胞を選択培地プレート上に蒔き、３０℃で２〜３日間維持した。
【０１２８】
形質転換体の選択においては最小培地（「ＭＭ」）を一般に用い、ここでＭＭの組成物は、硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含有しない０．１７％イーストナイトロジェンベース（ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ）（ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州）、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１である。ウラシルの補充分を０．０１％の最終濃度に適するように添加した（それにより２０ｇ／Ｌの寒天を用いて調製された「ＭＭＵ」選択培地が得られた）。
【０１２９】
あるいは、形質転換体を、硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含有しない０．１７％イーストナイトロジェンベース（ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ）（ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州）、２％グルコース、０．１％プロリン、７５ｍｇ／Ｌのウラシル、７５ｍｇ／Ｌのウリジン、９００ｍｇ／ＬのＦＯＡ（ザイモ・リサーチ・コーポレーション（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）、オレンジ（Ｏｒａｎｇｅ）、カリフォルニア州）および２０ｇ／Ｌの寒天を含んでなる５−フルオロオロト酸（「ＦＯＡ」；５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物とも称される）の選択培地上で選択した。
【０１３０】
最後に、高グルコース培地（「ＨＧＭ」）を以下のように調製した。１４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、８０ｇ／Ｌのグルコース（ｐＨ６．５）。この培地を油性（ｏｌｅａｇｉｎｙ）の条件を促進するように設計した。
【０１３１】
アルカン資化酵母の脂肪酸分析
脂肪酸分析においては、ブライ  Ｅ．Ｇ．（Ｂｌｉｇｈ  Ｅ．Ｇ．）およびダイヤー  Ｗ．Ｊ．（Ｄｙｅｒ  Ｗ．Ｊ．）（カナディアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）  ３７：９１１−９１７頁（１９５９年））に記載のように、細胞を遠心分離によって回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルを、ナトリウムメトキシドを用いる脂質抽出物のエステル交換により調製し（ローワン  Ｇ．（Ｒｏｕｇｈａｎ  Ｇ．）およびニシダ  Ｉ．（Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．）  アーカイブ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．）  ２７６（１）：３８−４６頁（１９９０年））、次いで３０−ｍ  Ｘ  ０．２５ｍｍ（内径）  ＨＰ−イノワックス（ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ）（ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ））カラムを装備したヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣを用いて分析した。オーブン温度を１７０℃（２５分保持）から３．５℃／分で１８５℃にした。
【０１３２】
直接の塩基エステル交換においては、ヤロウィア培養物（３ｍＬ）を採取し、蒸留水中で１回洗浄し、スピード−バック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内、真空下で５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１％で１００μｌ）を試料に添加し、次いで試料をボルテックスし、２０分間振動させた。１Ｍ  ＮａＣｌを３滴およびヘキサン４００μｌ添加後、試料をボルテックスし、回転した。上層を取り出し、上記のようにＧＣで分析した。
【０１３３】
実施例１
モルティエレラ・アルピナｃＤＮＡライブラリーの構築
本実施例は、製造業者のプロトコルに従ってベクトン・ディッキンソン−クロンテック（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）クリエイター・スマート（Ｃｒｅａｔｏｒ  Ｓｍａｒｔ）（登録商標）ｃＤＮＡライブラリーキット（ミシサガ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）、オンタリオ州、カナダ）を用いるモルティエレラ・アルピナのｃＤＮＡライブラリーの構築について記載している。
【０１３４】
具体的には、モルティエレラ・アルピナ株ＡＴＣＣ＃１６２６６を６０ｍＬのＹＰＤ培地（２％バクト−酵母抽出物、３％バクト−ペプトン、２％グルコース）内、２３℃で３日間成長させた。細胞を、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＧＨ３．８ローター内、３７５０ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によりペレット状にし、６Ｘ  トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌｅ）試薬（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））０．６ｍＬ中に再懸濁した。再懸濁された細胞を６つの２ｍＬのスクリューキャップチューブ（各々、０．５ｍｍのガラスビーズ０．６ｍＬを含有する）に移した。細胞を、２分間、バイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ）（バートルスビル（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ）、オクラホマ州）ミニビードビーター上で均質化（ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＥ）の設定にて均質化した。チューブを短時間回転させ、ビーズを定着させた。液体を４つの新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移し、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）０．２ｍＬを各チューブに添加した。チューブを手動で１分間振とうし、３分間放置した。次いで、チューブを４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させた。上層を４つの新しいチューブに移した。イソプロピルアルコール（０．５ｍＬ）を各チューブに移した。チューブを室温で１５分間インキュベートした後、４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。ペレットを、（ＲＮアーゼ−自由水で作製した）７５％の各エタノール１ｍＬで洗浄し、風乾した。次いで、全ＲＮＡ試料を水５００μｌに再溶解し、ＲＮＡの量を、１：５０に希釈したＲＮＡ試料を用いてＡ２６０ｎｍで測定した。全部で３．１４ｍｇのＲＮＡを取得した。
【０１３５】
この全ＲＮＡ試料を、製造業者のプロトコルに従ってキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）の全ＲＮＡ用ミディ・キット（Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）で精製した。したがって、全ＲＮＡ試料を２ｍＬに希釈し、β−メルカプトエタノール８０μｌおよび１００％エタノール５．６ｍＬを有する緩衝液ＲＬＴ８ｍＬと混合した。試料を４つの部分に分け、４つのＲＮイージー・ミディ（ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ）カラム上に充填した。次いで、カラム４５００×ｇで５分間遠心した。カラムを洗浄するため、緩衝液ＲＰＥ２ｍＬを充填し、カラムを４５００×ｇで２分間遠心した。遠心分離時間を５分に延長したことを除き、洗浄ステップを１回繰り返した。全ＲＮＡを、ＲＮアーゼ−自由水２５０μｌの各カラムへの適用、１分間の待機、および４５００×ｇでの３分間の遠心により溶出した。
【０１３６】
次いで、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のｍＲＮＡ精製キットのプロトコルに従い、ポリＡ（＋）ＲＮＡを上記の全ＲＮＡ試料から単離した。つまり、２つのオリゴ−ｄＴ−セルロースカラムを用いた。カラムを各高塩緩衝液１ｍＬで２回洗浄した。先のステップからの全ＲＮＡ試料を全容量２ｍＬに希釈し、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡに調整した。試料を６５℃で５分間加熱し、次いで氷上に載せた。試料緩衝液（０．４ｍＬ）を添加し、次いで試料を、重力送りで２つのオリゴ−ｄＴ−セルロースカラム上に充填した。カラムを３５０×ｇで２分間遠心し、その度毎に各高塩緩衝液０．２５ｍＬで２回洗浄した後、３５０×ｇで２分間遠心した。カラムを、同じ遠心分離のルーチンに従って低塩緩衝液で３回さらに洗浄した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、カラムを６５℃に予備加熱した各溶出緩衝液０．２５ｍＬで４回洗浄することにより溶出した後、同じく遠心分離の手順を踏んだ。精製プロセス全体を１回繰り返した。精製ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを３０．４ｎｇ／μｌの濃度で取得した。
【０１３７】
ｃＤＮＡを、ベクトン・ディッキンソン−クロンテック（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および０．１μｇのポリＡ（＋）ＲＮＡ試料によって規定されるＬＤ−ＰＣＲ方法を用いて生成した。具体的には第１の鎖のｃＤＮＡ合成においては、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ試料３μｌをＳＭＡＲＴ  ＩＶオリゴヌクレオチド（配列番号３）１μｌおよびＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号４）１μｌと混合した。混合物を７２℃で２分間加熱し、氷上で２分間冷却した。チューブに以下のもの、すなわち第１の鎖の緩衝液２μｌ、２０ｍＭ  ＤＴＴ１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μｌおよびパワースクリプト（Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素１μｌを添加した。混合物を４２℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却した。
【０１３８】
第１の鎖のｃＤＮＡ合成混合物をＰＣＲ反応における鋳型として用いた。具体的には、反応混合物は以下のもの、すなわち第１の鎖のｃＤＮＡ混合物２μｌ、５’−ＰＣＲプライマー（配列番号５）２μｌ、ＣＤＳＩＩＩ／３’−ＰＣＲプライマー（配列番号４）２μｌ、水８０μｌ、１０×アドバンテ−ジ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２  ＰＣＲ緩衝液１０μｌ、５０×ｄＮＴＰミックス２μｌおよび５０×アドバンテ−ジ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２ポリメラーゼミックス２μｌを含有した。熱サイクラー条件を９５℃で２０秒間に設定した後、ジェンアンプ（ＧｅｎＡｍｐ）９６００機器上で９５℃、５秒間および６８℃、６分間を１４サイクル実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により定量した。
【０１３９】
上記のＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ）７５μｌを、キットを補充した２０μｇ／μｌのプロテイナーゼＫ３μｌと混合した。混合物を４５℃で２０分間インキュベートし、次いで水７５μｌを添加し、混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合物（２５：２４：１）１５０μｌとともに抽出した。水相をクロロホルム：イソアミルアルコール（２５：１）１５０μｌとともにさらに抽出した。次いで、水相を３Ｍ酢酸ナトリウム１５μｌ、２０μｇ／μｌのグリコーゲン２μｌおよび１００％エタノール４００μｌと混合した。その直後に混合物を遠心管内で、室温、１４０００ｒｐｍで２０分間遠心した。ペレットを８０％エタノール１５０μｌで１回洗浄し、風乾し、水７９μｌ中に溶解した。
【０１４０】
次に、溶解されたｃＤＮＡをＳｆｉＩで消化した（ｃＤＮＡ７９μｌを１０×ＳｆｉＩ緩衝液１０μｌ、ＳｆｉＩ酵素１０μｌおよび１００×ＢＳＡ１μｌと混合し、混合物を５０℃で２時間インキュベートした）。キシレンシアノール染料（２μｌ、１％）を添加した。次いで、混合物を、製造業者の手順に正確に従い、キットを装備したクロマ（Ｃｈｒｏｍａ）スピン−４００（Ｓｐｉｎ−４００）カラム上で分画した。カラムから回収した画分をアガロースゲル電気泳動により分析した。ｃＤＮＡを含有する最初の３つの画分をプールし、ｃＤＮＡをエタノールで沈殿させた。沈殿したｃＤＮＡを水７μｌ中に再溶解し、キットが提供されたｐＤＮＲ−ＬＩＢにライゲートした。
【０１４１】
ライブラリーの配列決定
ライゲーション産物を用い、大腸菌ＸＬ−１ブルーエレクトロポレーション用のコンピテント細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を形質転換した。推定では全部で２×１０６個のコロニーを得た。ｃＤＮＡライブラリーの配列決定は、Ｍ１３フォワードプライマー（配列番号６）を用いてアジェンコート・バイオサイエンス・コーポレーション（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州）により行われた。
【０１４２】
実施例２
モルティエレラ・アルピナに由来する部分的な脂肪酸エロンガーゼ配列の同定
本実施例は、９，９８４のｃＤＮＡ配列の中からのモルティエレラ・アルピナの脂肪酸エロンガーゼの一部をコードするｃＤＮＡ断片（配列番号７）の同定について記載する。
【０１４３】
配列の同一性を、（三次元構造のブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）プロテインデータバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）、スイスプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースに由来するすべての非冗長なジェンバンクＣＤＳの翻訳配列を含んでなる）ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース内に含まれる配列に対する類似性についてのモルティエレラ・アルピナｃＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルツシュール  Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）  ２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））探索を行うことによって判定した。ｃＤＮＡ配列をすべてのリーディングフレーム内で翻訳し、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＣＢＩ）によって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ  Ｗ．（Ｇｉｓｈ  Ｗ．）およびステーツ  Ｄ．Ｊ．（Ｓｔａｔｅｓ  Ｄ．Ｊ．）  ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）  ３：２６６−２７２頁（１９９３年））を用い、「ｎｒ」データベース内に含まれるあらゆる公用のタンパク質配列に対する類似性について比較した。１つのｃＤＮＡ断片（配列番号７）は多数の脂肪酸エロンガーゼに対して有意な相同性を有していたことから、エロンガーゼとして仮の同定を行った。
【０１４４】
配列番号７に対して最大の類似性を有していた配列について総括するＢＬＡＳＴ比較の結果を、％同一性、％類似性、および期待値として報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一であるアミノ酸の百分率として定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質間で同一であるかまたは保存されているアミノ酸の百分率として定義される。「期待値」は、所定のスコアとのマッチングの数を規定する、マッチングの統計的有意性を推定するものであり、ここでマッチングはこのサイズのデータベースの探索において全く偶然に期待されるものである。したがって、配列番号７の翻訳されたアミノ酸配列は、４ｅ−１３の期待値で、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＳＣ５３１４に由来する脂肪酸エロンガーゼ候補のタンパク質配列（ジェンバンク登録番号ＥＡＬ０４５１０．１、その中でサッカロマイセス・セレビシエのＥＵＲ４、ＦＥＮ１およびＥＬＯ１に類似する３つの脂肪酸エロンガーゼ遺伝子候補のうちの１つとして注釈づけられたもの）と３２％の同一性および４６％の類似性を有していた。さらに、配列番号７は、サッカロマイセス・セレビシエに由来するＥＬＯ１（ジェンバンク登録番号ＮＣ＿００１１４２、染色体Ｘの塩基６７８４９〜６８７８１）と３５％の同一性および５３％類似性を有していた。サッカロマイセス・セレビシエのＥＬＯ１を中鎖アシルエロンガーゼとして記載し、それは不飽和Ｃ１２〜Ｃ１６脂肪酸アシル−ＣｏＡｓのＣ１６〜Ｃ１８脂肪酸へのカルボキシ末端の伸長を触媒する。
【０１４５】
上で報告の相同性に基づき、配列番号７のアルカン資化酵母遺伝子産物を本明細書では「エロンガーゼ３」または「ＥＬＯ３」と表した。
【０１４６】
実施例３
完全なモルティエレラ・アルピナＥＬＯ３の配列決定
部分的な脂肪酸エロンガーゼのｃＤＮＡ配列（配列番号７）の分析では、５’および３’末端がいずれも不完全であることが示された。欠失領域を得るため、ゲノムウォーキング技術を用いた。
【０１４７】
モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３の３’末端領域を単離するためのゲノムウォーキング
クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ユニバーサル・ゲノムウォーカー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ）（商標）キットを用い、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３の３’末端領域に対応するゲノムＤＮＡ断片を得た。つまり、モルティエレラ・アルピナの各ゲノムＤＮＡ２．５μｇをそれぞれＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩまたはＳｔｕＩで消化し、消化されたＤＮＡ試料をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイックＰＣＲ（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ）精製キットを用いて精製し、キット用の各緩衝液ＥＢ３０μｌで溶出し、次いで精製された試料を、以下に示されるゲノムウォーカー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ）アダプター（配列番号８［トップ鎖（ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ）］および９［ボトム鎖（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ）］）とライゲートした。
【０１４８】
５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＴ−３’
３’−Ｈ２Ｎ−ＣＣＣＧＡＣＣＡ−５’
各ライゲーション反応混合物は、２５μＭゲノムウォーカー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ）アダプター１．９μｌ、１０×ライゲーション緩衝液１．６μｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ０．５μｌおよび精製され消化されたゲノムＤＮＡの１つの試料４μｌを含有した。反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした。７０℃で５分間のインキュベーションによって反応を終結させた。次いで、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の緩衝液７２μｌを各ライゲーション反応ミックスに添加した。
【０１４９】
４つの別々のＰＣＲ反応を、それぞれ４つのライゲーション混合物のうちの１つを鋳型として用いて実施した。ＰＣＲ反応混合物は、ライゲーション混合物１μｌ、２０μＭプライマーＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）３’１（配列番号１０）０．５μｌ、１０μＭのキット用プライマーＡＰ１（配列番号１１）１μｌ、水２２．５μｌ、およびイーエックスタック（ＥｘＴａｑ）プレミックスのタック（Ｔａｑ）２Ｘ  ＰＣＲ溶液（タカラ・バイオ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）、大津（Ｏｔｓｕ）、滋賀、５２０−２１９３、日本）２５μｌを含有した。ＰＣＲ反応を、以下の条件、すなわち９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３分間の伸長を用い、３２サイクルにわたり実施した。７２℃で７分間の最終の伸長サイクルを実施した後、４℃で反応を終結させた。
【０１５０】
各ＰＣＲ反応の産物をそれぞれ１：５０に希釈し、ＰＣＲの第２回目における鋳型として用いた。各反応混合物は、鋳型としての希釈された１つのＰＣＲ産物１μｌ、２０μＭプライマーＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）３’２（配列番号１２）０．５μｌ、１０μＭのキット用プライマーＡＰ２（配列番号１３）１μｌ、水２２．５μｌおよびイーエックスタック（ＥｘＴａｑ）プレミックスのタック（Ｔａｑ）２Ｘ  ＰＣＲ溶液（タカラ（ＴａＫａＲａ））２５μｌを含有した。ＰＣＲ反応を、上記と同じ熱サイクラー条件を用い、３２サイクルにわたり実施した。
【０１５１】
１０４１ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲの第２回目から取得した（配列番号１４）。この断片を精製し、ｐＣＲ２．１−トポ（ＴＯＰＯ）にクローニングし、配列決定した。配列分析は、断片が遺伝子の「ＴＡＡ」停止コドンの約６４０ｂｐ下流を含むＥＬＯ３の３’末端を有することを示した。
【０１５２】
モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３の５’末端領域を単離するためのゲノムウォーキング
クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）３’末端レース（ＲＡＣＥ）（上記）で用いられる４つのライゲーション混合物の同じセットをまた用い、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３の５’末端領域を得た。詳細には、ＰＣＲの第１回目を、ＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）５’１（配列番号１５、５’末端で入れ子構造をなす）およびＡＰ１をプライマーとして（すなわち、プライマーＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）３’１およびＡＰ１の代わりに）用いたことを除いて上記と同じ成分および条件を用いて実施した。ＰＣＲの第２回目では、ＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）５’２（配列番号１６、５’末端で入れ子構造をなす）およびＡＰ２をプライマーとして用いた。２２２３ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１７）を得た。それを精製し、ｐＣＲ２．１−トポ（ＴＯＰＯ）にクローニングし、配列決定した。配列の分析によると、それがＥＬＯ３遺伝子の５’領域を有することが示された。
【０１５３】
したがって、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３のｃＤＮＡ配列全体（配列番号１）を、元の部分的なｃＤＮＡ配列（配列番号７）をゲノムウォーキングにより得られた重複する５’および３’配列（各々、配列番号１４および１７；図１に図示）と結合させることによって得た。これにより、ＥＬＯ３の推定上の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの２０９１ｂｐ上流、８２８ｂｐのＥＬＯ３  ＯＲＦ（すなわち配列番号１、配列番号１８の塩基２０９２〜２９１９に対応）、およびＥＬＯ３停止コドンの６３８ｂｐ下流（配列番号１８の塩基２９２０〜３５５７に対応）を含んでなる、配列番号１８として本明細書中で同定された３５５７ｂｐの配列が得られた。
【０１５４】
モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３に対応するゲノムの配列は、配列番号１８として提供されるｃＤＮＡ断片よりも長い。詳細には、５４２ｂｐのイントロン（配列番号１９）がＯＲＦの３１８ｂｐでＥＬＯ３遺伝子を有するゲノムＤＮＡ内で見出されたことから、本明細書中で配列番号２９として提供されるゲノムＤＮＡ断片は４，０９９ｂｐである（図１）。
【０１５５】
翻訳されたＥＬＯ３タンパク質配列（配列番号２）は、ＢＬＡＳＴプログラム分析（上記、実施例２）に基づくと、既知の脂肪酸エロンガーゼに対して以下の相同性、すなわち４ｅ−４３の期待値で、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＳＣ５３１４に由来する脂肪酸エロンガーゼ候補（ジェンバンク登録番号ＥＡＬ０４５１０．１）に対して３７％の同一性および５１％の類似性を有していた。さらに、翻訳されたＥＬＯ３は、３ｅ−４４の期待値で、アカバンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）に由来するＸＰ＿３３１３６８のタンパク質配列（その中では「仮想（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）タンパク質」として注釈づけられたもの）と３３％の同一性および４４％の類似性を共有していた。
【０１５６】
実施例４
アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃２０３６２株Ｙ２０３１の生成
本実施例では、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来する株Ｙ２０３１の作成について記載される。Ｙ２０３１株を、プラスミドｐＫＵＮＴ２に由来するＴＥＦ：：Ｙ．Δ１２：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子のＡＴＣＣ＃２０３６２のＵｒａ３遺伝子座への融合により生成し、それによりＵｒａ−遺伝子型が得られた。プラスミドｐＫＵＮＴ２は以下の成分を含有していた。
【０１５７】
【表３】
2009512437.tif 000004
【０１５８】
ｐＫＵＮＴ２プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法に従い、野生型アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃２０３６２の形質転換に用いた。形質転換細胞をＦＯＡ選択培地プレートに蒔き、３０℃で２〜３日間維持した。ＦＯＡ耐性コロニーを採取し、ＭＭおよびＭＭＵ選択プレート上にストリークした。ＭＭＵプレート上で成長できたがＭＭプレート上で成長できなかったコロニーをＵｒａ−株として選択した。次いで、Ｕｒａ−株の単一のコロニー（５）を液体ＭＭＵ中に３０℃で接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振動させた。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣで分析した。
【０１５９】
ＧＣ分析では、野生型ＡＴＣＣ＃２０３６２内での約２０％のＬＡと比較し、２つのＵｒａ−株（株＃２および＃３）内に約４５％のＬＡが存在することが示された。形質転換株＃２を株「Ｙ２０３１」と表した。
【０１６０】
実施例５
アルカン資化酵母株Ｙ２０３１内でのモルティエレラ・アルピナ脂肪酸ＥＬＯ３の異種発現
本実施例では、アルカン資化酵母株Ｙ２０３１内でのアルカン資化酵母プロモーターの制御下での、キメラ遺伝子内でのモルティエレラ・アルピナＥＬＯ３  ＯＲＦの過剰発現およびＴＡＧ含量の分析によって判定された過剰発現の効果について記載される。
【０１６１】
ＦＢＡＩＮ：：ＥＬＯ３：：ＰＥＸ１６−３’キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴの作成
モルティエレラ・アルピナ脂肪酸ＥＬＯ３  ＯＲＦを以下のようにクローニングした。プライマーのＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）５’  ＮｃｏＩ３およびＭＡエロング（ＭＡ  ｅｌｏｎｇ）３”  ＮｏｔＩ（配列番号２３および２４）を用い、ＥＬＯ３  ＯＲＦをモルティエレラ・アルピナ（実施例１）のｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。反応混合物は、ｃＤＮＡ１μｌ、プライマーの各々１μｌ、水２２μｌおよびイーエックスタック（ＥｘＴａｑ）プレミックス２Ｘタック（Ｔａｑ）ＰＣＲ溶液（タカラ（ＴａＫａＲａ））２５μｌを含有した。増幅を、以下、すなわち最初に９４℃で３０秒間の変性、その後の９４℃で３０秒間３２サイクルの変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１２０秒間の伸長といったように実施した。７２℃で７分間の最終の伸長サイクルを実施した後、４℃で反応を終結させた。約８３０ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ反応から取得した。それを、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州）ＰＣＲ精製キットを用い、製造業者のプロトコルに従って精製した。精製ＰＣＲ産物を２つの一定分量に分け、一方をＮｃｏＩおよびＮｓｐＩで消化する一方、もう一方をＮｓｐＩおよびＮｏｔＩで消化した。約２７０ｂｐのＮｃｏＩ−ＮｓｐＩおよび約５６０ｂｐのＮｓｐＩ−ＮｏｔＩの断片を、遺伝子がアルカン資化酵母の発現用の自己複製ベクター内でアルカン資化酵母ＦＢＡＩＮプロモーターおよびＰＥＸ１６−３’ターミネーター領域（ジェンバンク登録番号Ｕ７５４３３）の制御下にあるように、３つのライゲーションによりＮｃｏＩ−ＮｏｔＩで切断されたｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣベクター（図２Ａ；配列番号２５）にクローニングした。「ＦＢＡＩＮプロモーター」は、ｆｂａ１遺伝子によってコードされかつ発現に必要な、フルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の５’上流の未翻訳領域に加え、ｆｂａ１遺伝子のイントロンを有する５’コード領域の一部を示す（さらに詳細には国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレットを参照）。正確な形質転換体をミニプレップ分析により確認し、得られたプラスミドを「ｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣ−Ｅ３」（配列番号２６）として表した。
【０１６２】
プラスミドｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣ−Ｅ３をＣｌａＩおよびＰａｃＩで消化し、約２．２ｋＢバンド（すなわち、ＦＢＡＩＮ：：ＥＬＯ３：：ＰＥＸ１６−３’断片）をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した。断片を、Ｐｅｘ２０−３’ターミネーター（すなわち、ＦＢＡＩＮ：：Ｄ６Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子）およびＵｒａ３遺伝子を有するＦＢＡＩＮプロモーターの制御下で、ＣｌａＩ−ＰａｃＩで切断されたｐＺＵＦ６Ｓ（図２Ｂ；配列番号２７）、モルティエレラ・アルピナΔ６デサチュラーゼＯＲＦ（「Ｄ６Ｓ」；ジェンバンク登録番号ＡＦ４６５２８１）を有する自己複製プラスミドにクローニングした。正確な形質転換をミニプレップ分析により確認し、得られたプラスミドを「ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ」（配列番号２８；図２Ｃ）として表した。
【０１６３】
モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３を過剰発現する形質転換アルカン資化酵母内での脂質含量の分析
アルカン資化酵母株Ｙ２０３１を、一般的方法に従い、プラスミドｐＺＵＦ６Ｓ（ＦＢＡＩＮ：：Ｄ６Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子を含んでなる対照）およびプラスミドｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ（ＦＢＡＩＮ：：Ｄ６Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子およびＦＢＡＩＮ：：ＥＬＯ３：：ＰＥＸ１６キメラ遺伝子を含んでなる）で形質転換した。形質転換体をアミノ酸を補充した合成ＭＭ内で２日間、その後ＨＧＭ内で４日間成長させた。ｐＺＵＦ６Ｓを有する６個のクローン（クローン＃１〜６、単一の形質転換から取得）およびｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴを有する２２個のクローン（４つの異なる形質転換［すなわち＃３、５、６、および７］から取得）における脂肪酸特性を、（一般的方法に記載のように）ＧＣ分析に基づく下記の表４に示す。脂肪酸を１６：０（パルミテート）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）およびＧＬＡとして同定し、各々の組成物を脂肪酸全体における％として示す。
【０１６４】
【表４】
2009512437.tif 000005
【０１６５】
試料の一部（太字およびイタリック体で標識）は期待の読み取り値から逸脱していた。詳細には、ＧＬＡを生成したのはＹ２０３１＋ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ＃３−３でもＹ２０３１＋ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ＃５−６でもない。同様に、Ｙ２０３１＋ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ＃７−１、＃７−３および＃７−４はＧＣエラーを有し、ここでは１６：０および１６：１のピークはＧＣによって単一のピークとして読み取られたものである。これらの変異結果の結果として、表５では対照株およびＥＬＯ３を発現する形質転換体株における平均的な脂質が報告されている。詳細には、表５は表４における脂肪酸の特性からの平均を示すが、これらの平均を計算する場合、表４にて不正確なものとして太字およびイタリック体で示されるラインは含まなかった。「全Ｃ１６」は１６：０および１６：１の平均領域の合計を示す一方、「全Ｃ１８」は１８：０、１８：１、１８：２およびＧＬＡの平均領域の合計を示す。
【０１６６】
【表５】
2009512437.tif 000006
【０１６７】
上で報告されたデータに基づき、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３の過剰発現の結果、アルカン資化酵母株Ｙ２０３１内でモルティエレラ・アルピナΔ６デサチュラーゼと共発現される場合、モルティエレラ・アルピナΔ６デサチュラーゼのみを過剰発現するＹ２０３１の対照株の場合に対し、Ｃ１８の百分率が増加しかつＣ１６の百分率が減少した。これは、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３が確かにＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼであることを示した。
【０１６８】
他のキメラ遺伝子であれば設計されたヤロウィア内でモルティエレラ・アルピナＥＬＯ３遺伝子と共発現することで様々な他の脂肪酸の生成を増大させることが可能であることが当業者にとって明白になるであろう。例えば、（発現を高めるために場合によりコドンの最適化がなされうる）モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３に加え、炭素流れの脂質代謝への上方制御を可能にするための手段として、Ｃ１４／１６脂肪酸エロンガーゼおよび／またはΔ９デサチュラーゼを容易に発現できた。別の実施形態では、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３であれば、以下、例えばΔ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９脂肪酸エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０脂肪酸エロンガーゼ、Ｃ２０／２２脂肪酸エロンガーゼおよび／またはΔ４デサチュラーゼを含むＰＵＦＡ生合成経路遺伝子のいずれかを用いて容易に共発現することで様々なＰＵＦＡの生成を増大させることができた（図３）。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】配列番号１、２、７、１４、１７、１８、１９および２９（これらの各々はモルティエレラ・アルピナ内のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素（ＥＬＯ３）に関する）の間の関係を図示する。
【図２】（Ａ）ｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣ、（Ｂ）ｐＺＵＦ６Ｓ、および（Ｃ）ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴに対するプラスミドマップを提供する。
【図３】ＰＵＦＡ生合成経路および前駆体を図示する。
【図１】
2009512437.tif 000007
【図２Ａ】
2009512437.tif 000008
【図２Ｂ】
2009512437.tif 000009
【図２Ｃ】
2009512437.tif 000010
【図３】
2009512437.tif 000011
【配列表】
2009512437000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月8日(2008.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする単離核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）に完全に相補的な単離核酸分子
よりなる群から選択される、Ｃ16/18脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする単離核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の単離核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項３】
アラインメントのＢＬＡＳＴ方法に基づき、配列番号２で示される配列を有するポリペプチドと比較される場合に、少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも２７５個のアミノ酸のＣ16/18脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離核酸分子。
【請求項４】
適切な調節配列に作動可能に連結される請求項１に記載の単離核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項６】
ａ）適切な調節配列の制御下で、配列番号２で示される、Ｃ16/18脂肪酸エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸断片を含んでなる油性酵母を提供し、
ｂ）パルミテートを含んでなるエロンガーゼ基質のソースを提供し、
ｃ）ステップ（ａ）（ｉ）またはステップ（ａ）（ｉｉ）の核酸分子が発現されかつステアリン酸が生成されるという条件下で、（ｂ）のエロンガーゼ基質とともにステップ（ａ）の油性酵母を成長させ、
ｄ）場合により、ステップ（ｃ）のステアリン酸を回収する
ことを含んでなるステアリン酸の生成方法。
【請求項７】
ａ）（ｉ）配列番号２で示されるＣ16/18脂肪酸エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸断片と、
（ｉｉ）機能性多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子と
を含んでなる油性酵母を提供し、
ｂ）パルミテートを含んでなるエロンガーゼ基質のソースを提供し、
ｃ）多価不飽和脂肪酸が生成される条件下で、ステップ（ａ）の油性酵母を（ｂ）のエロンガーゼ基質とともに成長させ、
ｄ）場合により、ステップ（ｃ）の多価不飽和脂肪酸を回収する
ことを含んでなる多価不飽和脂肪酸の生成方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法によって生成される微生物油。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
他のキメラ遺伝子であれば設計されたヤロウィア内でモルティエレラ・アルピナＥＬＯ３遺伝子と共発現することで様々な他の脂肪酸の生成を増大させることが可能であることが当業者にとって明白になるであろう。例えば、（発現を高めるために場合によりコドンの最適化がなされうる）モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３に加え、炭素流れの脂質代謝への上方制御を可能にするための手段として、Ｃ14/16脂肪酸エロンガーゼおよび／またはΔ９デサチュラーゼを容易に発現できた。別の実施形態では、モルティエレラ・アルピナＥＬＯ３であれば、以下、例えばΔ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９脂肪酸エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Ｃ18/20脂肪酸エロンガーゼ、Ｃ20/22脂肪酸エロンガーゼおよび／またはΔ４デサチュラーゼを含むＰＵＦＡ生合成経路遺伝子のいずれかを用いて容易に共発現することで様々なＰＵＦＡの生成を増大させることができた（図３）。本発明の特徴および態様の主たるものを次に示す：
態様１.  （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする単離核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）に完全に相補的な単離核酸分子
よりなる群から選択される、Ｃ16/18脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする単離核酸分子。
態様２.  配列番号１、配列番号１８および配列番号２９よりなる群から選択される態様１に記載の単離核酸分子。
態様３.  態様１に記載の単離核酸分子によってコードされるポリペプチド。
態様４．  アラインメントのＢＬＡＳＴ方法に基づき、配列番号２で示される配列を有するポリペプチドと比較される場合に、少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも２７５個のアミノ酸のＣ16/18脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離核酸分子。
態様５．  適切な調節配列に作動可能に連結される態様１に記載の単離核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
態様６．  態様５に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
態様７．  藻、細菌、菌・カビおよび酵母よりなる群から選択される態様６に記載の形質転換宿主細胞。
態様８．  酵母が油性酵母である態様７に記載の形質転換宿主細胞。
態様９．  油性酵母細胞が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される態様８に記載の形質転換宿主細胞。
態様１０．  宿主細胞がアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である態様９に記載の形質転換宿主細胞。
態様１１．  アルカン資化酵母が、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃２０３６２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃８８６２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃１８９４４、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃７６９８２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃９０８１２およびアルカン資化酵母ＬＧＡＭ  Ｓ（７）１よりなる群から選択される株である態様１０に記載の形質転換宿主細胞。
態様１２．  ａ）適切な調節配列の制御下で、配列番号２で示される、Ｃ16/18脂肪酸エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸断片を含んでなる油性酵母を提供し、
ｂ）パルミテートを含んでなるエロンガーゼ基質のソースを提供し、
ｃ）ステップ（ａ）（ｉ）またはステップ（ａ）（ｉｉ）の核酸分子が発現されかつステアリン酸が生成されるという条件下で、（ｂ）のエロンガーゼ基質とともにステップ（ａ）の油性酵母を成長させ、
ｄ）場合により、ステップ（ｃ）のステアリン酸を回収する
ことを含んでなるステアリン酸の生成方法。
態様１３．  ａ）（ｉ）配列番号２で示されるＣ16/18脂肪酸エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸断片と、
（ｉｉ）機能性多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子と
を含んでなる油性酵母を提供し、
ｂ）パルミテートを含んでなるエロンガーゼ基質のソースを提供し、
ｃ）多価不飽和脂肪酸が生成される条件下で、ステップ（ａ）の油性酵母を（ｂ）のエロンガーゼ基質とともに成長させ、
ｄ）場合により、ステップ（ｃ）の多価不飽和脂肪酸を回収する
ことを含んでなる多価不飽和脂肪酸の生成方法。
態様１４．  多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選択される態様１３に記載の方法。
態様１５．  機能性多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子が、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20脂肪酸エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Ｃ20/22脂肪酸エロンガーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９脂肪酸エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼよりなる群から選択される酵素をコードする態様１３に記載の方法。
態様１６．  油性酵母が、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐ．）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）よりなる群から選択される態様１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
態様１７．  ヤロウィア属が、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃２０３６２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃８８６２、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃１８９４４、アルカン資化酵母ＡＴＣＣ＃７６９８２およびアルカン資化酵母ＬＧＡＭ  Ｓ（７）１よりなる群から選択される態様１６に記載の方法。
態様１８．  態様１２または１３のいずれか一項に記載の方法によって生成される微生物油。
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月24日(2008.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009512437000001.app
【国際調査報告】
2009512437.tif 000048
2009512437.tif 000049
2009512437.tif 000050