(57)【要約】【課題】毎分数ナノリットルという極めて低流量の送液を安定して高精度に行うことが可能なグラディエント送液装置を備える液体クロマトグラフの提供。【解決手段】単行程シリンジポンプ内に溶離液勾配Gを形成し送液を行うグラディエント送液装置2と、このグラディエント送液装置2を備え、試料中の成分を分離するためのカラム14の上流に、該グラディエント送液装置2から送液される前記溶離液勾配Gを流路145内に導入するための注入ポート15が設けられた液体クロマトグラフ1を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単行程シリンジポンプ内に溶離液勾配を形成し送液を行うグラディエント送液装置を備え、
試料中の成分を分離するためのカラムの上流に、グラディエント送液装置から送液される溶離液勾配を流路内に導入するための注入ポートが設けられた液体クロマトグラフ。
【請求項２】
複数の溶媒が所定の混合比率で混合された溶離液を貯留し、前記単行程シリンジポンプに供給する溶離液タンクを有する請求項１記載の液体クロマトグラフ。
【請求項３】
前記各溶媒を前記溶離液タンクに送液するためのポンプを備えた複数の流路と、
設定された混合比率に基づいて各ポンプの駆動を制御する制御手段と、を有する請求項２記載の液体クロマトグラフ。
【請求項４】
前記溶離液タンクが、
前記ポンプからの前記溶媒の供給口と、
供給口の下方に設けられ、溶媒を外部に排出する排出口と、
供給口と排出口との間に設けられ、供給口から排出口に向かって流れる溶媒を一時的に貯留して前記単行程シリンジポンプへ供給する貯留部と、を備える請求項３記載の液体クロマトグラフ。
【請求項５】
前記溶離液タンクが、
前記ポンプからの前記溶媒の供給口と、
供給口の上方に設けられ、溶媒を外部に排出する排出口と、
供給口と排出口との間に溶媒を充満させて前記単行程シリンジポンプへ供給する貯留部と、を備えており、
貯留部内への単行程シリンジポンプの導入位置が、供給口を挟んで排出口と反対側とされている請求項３記載の液体クロマトグラフ。
【請求項６】
単行程シリンジポンプ内に溶離液勾配を形成し送液を行う液体クロマトグラフのグラディエント送液装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ及びグラディエント送液装置に関する。より詳しくは、単行程シリンジポンプ内に溶離液の勾配を形成し送液を行うグラディエント送液装置と、このグラディエント送液装置を備える液体クロマトグラフに関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフ（HPLC）は微量成分の分離、分析のための代表的な手段となっている。図１０に一般的なHPLCの構成を示す。このHPLC10は、溶媒タンク101からポンプ102で溶媒（移動相）を送出し、インジェクター103から流路に試料を導入する。流路へ導入された試料中の微量成分は、カラム104に吸着・保持される。カラム104に保持された各微量成分は、グラディエント溶離によって分離され、カラム104に接続された紫外線分光光度計や質量分析器等へ送液される。【０００３】
従来のHPLCにおける溶媒流量は、通常スケールのHPLCで毎分約0.1 〜 5.0ml程度、マイクロスケールのHPLCでも毎分約1〜100μl程度となっている。これらの通常スケール及びマイクロスケールのHPLCでは、ポンプ102として、往復動プランジャーを備え、無限送液が可能なプランジャーポンプが採用されている。【０００４】
近年では、微量成分を高分離能で分離するため、HPLCの低流量化が進み、ナノスケール流量で溶媒の送出を行うナノ高速液体クロマトグラフ（ナノLC）が開発されてきている。ナノLCでは、毎分100〜500nl程度の低流量での溶媒送出が行われるが、上記のプランジャーポンプでは吸引の際に脈流が生じてしまうため、高い精度と信頼性を伴ってナノスケール流量での送出を行うことは難しい。そこで、ナノLCでは、ポンプから送出される溶媒の大部分を廃棄して、ごく一部のみをカラムへ誘導することが行われている。【０００５】
図１１に、従来のナノLCにおいて、グラディエント溶離を行うために採用されている送液装置の構成を示す。このグラディエント送液装置20は、溶媒タンク201, 201中の二種の溶媒を、それぞれプランジャーポンプ202, 202によりミキサー205に送出する。グラディエント送液装置20は、プランジャーポンプ202, 202の駆動を制御することにより、二種の溶媒の混合比率を順次変化させ、カラム104でのグラディエント溶離を行う。【０００６】
この際、カラム104への流量を毎分100〜500nl程度のナノスケールとするため、ミキサー205から送出される混合溶媒の大部分は、分流器206によって廃液タンク207側へ分流され、ごく一部のみがカラム104側へ分流される。この分流器206における分流比率を、分流器206及びカラム104等の透過率（Permeability）に基づき設定することで、カラム104への流量をナノスケールとできる。【０００７】
しかし、分流器206の透過率は経時劣化により変化し得るものであり、またカラム104の透過率も分析毎もしくは同一分析内で変化し得る。このため、分流器206における分流比率にばらつきが生じ、カラム104への流量に容認できないばらつきが生じることがある。このようなばらつきは分析精度の低下をもたらす。【０００８】
そこで、グラディエント送液装置20では、流量センサ208によって分流器206からカラム104への流量を測定し、測定された流量を分流器206にフィードバックすることによってカラム104への流量を一定に制御している。【０００９】
この流量センサ208として使用可能なセンサには、圧力測定流量センサや熱流量センサがある。このうち、圧力測定流量センサは、グラディエント溶離のために分析中に溶媒組成が変化し得るHPLCにおいては、溶媒の組成変化に伴う粘度変化を補償できない可能性がある。また、圧力測定流量センサは、そのシステム容積が通常100μl程度と大きいため、ナノLCに必要とされる十分な測定感度を得ることが難しい。このため、熱流量センサがより好適に採用されている。【００１０】
図１２を参照して、熱流量センサの測定原理を説明する。溶媒が充填された流路の中に導入された熱は、熱伝導及び熱拡散によって上流方向と下流方向の両方に拡散する。流路中の溶媒が流れていない場合に、溶媒の一点（加熱点）が加熱されると、図１２中曲線Aに示される温度プロファイルが現れる。この温度プロファイルの形状は、流体に加えられた熱の量、ならびにその液体の上流温度と下流温度に依存する。流路中の溶媒が流れていない場合には、加熱点から等距離に存在する２点（P1及びP2）で測定される溶媒温度は等しくなる。【００１１】
これに対して、流路中の溶媒が流れている場合には、曲線Bに類似した温度プロファイルが現れる。すなわち、溶媒が流れている状態では、熱の対称的な拡散に加え、加熱された溶媒の非対称的な対流が溶媒の流れの方向で生じる。このため、流路中の溶媒が流れている場合には、P1及びP2で測定される溶媒温度は異なる。【００１２】
曲線Bに示される温度プロファイルの形状は、溶媒の流量（流速）及びもたらされる熱対流に依存する。従って、P1及びP2で測定される溶媒温度の温度差に基づけば、溶媒の流量を毎分数十ナノリットルの範囲で測定することが可能となる。特許文献１には、この熱流量センサを用いて、HPLCシステムの実用流路内の流体のナノスケールの流量を監視し、制御するための方法および装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００７−５１３３３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ナノLCでは、毎分100〜500nl程度の低流量で溶媒送出が行われているが、近年では、さらなる高分離能を実現するため、毎分数ナノリットルという極めて低流量での送液が求められるようになっている。【００１５】
上述した従来のグラディエント送液装置20では、流量センサ208に熱流量センサを採用することにより、流量測定に関しては毎分数十ナノリットルの精度で行うことができる。しかし、測定された流量に基づき、分流器206において分流比率を制御しようとする際、毎分数十ナノリットルという流量に対して分流器206そのものの容積が大き過ぎるという問題があった。【００１６】
すなわち、分流器206は、流量センサ208からフィードバックされる測定流量に基づいて内部に設けられたバルブを開閉することにより、分流比率の制御を行っている。このため、毎分数十ナノリットルの精度での測定流量のフィードバックが得られたとしても、このバルブに起因するシステム容積のために、同等の精度でカラム104への流量を制御することはできなかった。【００１７】
そこで、本発明は、毎分数ナノリットルという極めて低流量の送液を安定して高精度に行うことが可能なグラディエント送液装置を備える液体クロマトグラフを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題解決のため、本発明は、単行程シリンジポンプ内に溶離液勾配を形成し送液を行うグラディエント送液装置を備え、試料中の成分を分離するためのカラムの上流に、グラディエント送液装置から送液される溶離液勾配を流路内に導入するための注入ポートが設けられた液体クロマトグラフを提供する。
この液体クロマトグラフでは、定流量の送液が可能な単行程シリンジポンプを採用しているため、シリンジの内径及びピストンの線速度を適宜設定することで、毎分数ナノリットルという極めて低流量で、安定かつ高精度に溶離液勾配の送液を行うことができる。
この液体クロマトグラフは、複数の溶媒が所定の混合比率で混合された溶離液を貯留し、前記単行程シリンジポンプに供給する溶離液タンクを有することができる。
さらに、この液体クロマトグラフは、前記各溶媒を前記溶離液タンクに送液するためのポンプを備えた複数の流路と、設定された混合比率に基づいて各ポンプの駆動を制御する制御手段と、を有することが好適となる。
この場合、前記溶離液タンクは、前記ポンプからの前記溶媒の供給口と、供給口の下方に設けられ、溶媒を外部に排出する排出口と、供給口と排出口との間に設けられ、供給口から排出口に向かって流れる溶媒を一時的に貯留し前記単行程シリンジポンプへ供給する貯留部と、を備えることが好適となる。
あるいは、前記溶離液タンクは、前記ポンプからの前記溶媒の供給口と、供給口の上方に設けられ、溶媒を外部に排出する排出口と、供給口と排出口との間に溶媒を充満させて前記単行程シリンジポンプへ供給する貯留部と、を備えていてもよい。このとき、貯留部内への単行程シリンジポンプの導入位置は、供給口を挟んで排出口と反対側とされる。【００１９】
本発明において、「単行程シリンジポンプ」とは、液体を内部に収容し得るシリンジ本体と、このシリンジ本体の開口から液体を内部に吸引するためのピストンと、を有するシリンジを備えており、シリンジ本体の内径に基づいてピストンを所定の線速度で移動させることによって、シリンジ本体内外へ液体の吸引及び吐出を所定流量で脈流なく行うことが可能な送液ポンプをいうものとする。この単行程シリンジポンプは、液体をシリンジ本体内部に収容する構成の他、シリンジ本体の開口に取り付けられた細管（ニードル）内部に液体を収容し、吸引及び吐出を行う構成とすることもできる。【００２０】
また、本発明において、「溶離液」とは、液体クロマトグラフの移動相として用いられる液体であって、水や、アセトニトリル、メタノール、イソプロピルアルコール等の有機溶媒、これらの混合溶媒を意味するものとする。溶離液には、水や有機溶媒に添加して使用されるギ酸や酢酸、トリフルオロ酢酸、トリエチルアミン、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、酢酸アンモニウム等が含まれ得る。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、毎分数ナノリットルという極めて低流量の送液を安定して高精度に行うことが可能なグラディエント送液装置を備える液体クロマトグラフが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に係る液体クロマトグラフの構成を説明する模式図である。
【図２】グラディエント送液装置2のニードル21内に溶離液勾配Gを形成するための構成を説明する模式図である。
【図３】グラディエント送液装置2に好適に採用され得る溶離液タンク25の一実施形態を示す模式図である。
【図４】グラディエント送液装置2に好適に採用され得る溶離液タンク25の他の一実施形態を示す模式図である。
【図５】グラディエント送液装置2のニードル21内に溶離液勾配Gを形成するための他の構成を説明する模式図である。
【図６】液体クロマトグラフ1の一実施形態の試料送液時の動作を説明する模式図である。
【図７】液体クロマトグラフ1の一実施形態の溶離液勾配送液時の動作を説明する模式図である。
【図８】液体クロマトグラフ1の他の一実施形態の試料送液時の動作を説明する模式図である。
【図９】液体クロマトグラフ1の他の一実施形態の溶離液勾配送液時の動作を説明する模式図である。
【図１０】一般的なHPLCの構成を示す模式図である。
【図１１】従来のナノLCにおいて、グラディエント溶離を行うために採用されている送液装置の構成を示す模式図である。
【図１２】熱流量センサの測定原理を説明する図である。
【図１３】従来の送液装置を備えた液体クロマトグラフで生じ得る「グラディエントの立ち上がりの遅れ」を説明する図である。
【図１４】従来の回動バルブを用いた液体クロマトグラフの構成を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２４】
図１は、本発明に係る液体クロマトグラフの構成を説明する模式図である。
【００２５】
この液体クロマトグラフ1は、試料中の微量成分を分離するためのカラム14と、カラム14に対し溶離液勾配Gを送液して微量成分を溶離させるためのグラディエント送液装置2を備えている。グラディエント送液装置2から送液される溶離液勾配Gは、カラム14の上流に設けられた注入ポート15から流路145内に導入され、カラム14へ送液される。
【００２６】
グラディエント送液装置2は、通常使用される単行程シリンジポンプ又はこれを改良したものによって構成される。グラディエント送液装置2の典型的な構成としては、図１に示すように、シリンジ本体22と、このシリンジ本体22の開口221に取り付けられたニードル21内部に液体を吸引するためのピストン222とを有し、ピストン222を所定の線速度で移動させることによって、ニードル21の先端開口部211からニードル21内外への液体の吸引及び吐出を行う構成を採用できる。ピストン222の駆動は、モータ23によるネジ24の回転駆動により行うことができる。グラディエント送液装置2では、ピストン222を一回押し切ることによって、ニードル21内に導入された溶離液勾配Gの全量が吐出されるように構成されている。
【００２７】
このような単行程シリンジポンプとしては、最小で毎分数plの超低流量送液が可能なポンプが市販されている（例えば、HARVARD APPARATUS社）。本発明においても、これら市販のシリンジポンプ又はこれを改変したものを採用できる。なお、単行程シリンジポンプにおいて、図１に示したニードル21は必須の構成とはなるものではない。単行程シリンジポンプにニードル21を設けない場合には、シリンジ本体22の開口221から直接シリンジ本体22内外へ液体の吸引及び吐出を行う。
【００２８】
グラディエント送液装置2では、モータ23によるネジ24の回転駆動によって定流量の送液が可能な単行程シリンジポンプを採用しているため、シリンジ本体22の内径とピストン222の線速度を適宜設定することで、カラム14に対する溶離液勾配Gの送液を毎分数ナノリットルという極めて低流量で、安定かつ高精度に行うことが可能である。
【００２９】
一般に、HPLCでは、カラムに対してその容積の10〜20倍程度の溶離液勾配が送液される。従って、例えば、カラム14の容積が15nl程度である場合、毎分5nl・30分間（総量150nl）程度の送液を行う。この場合、シリンジ本体22は、内径50μm・長さ150mm程度が好適となる。シリンジ本体22の内径（すなわち、ピストン222の外径）は50〜250μm程度であってよく、シリンジ本体22及びピストン222の成形が可能な限りにおいて、さらに細く形成することもできる。
【００３０】
グラディエント送液装置2において、溶離液勾配Gと接触し得るニードル21、シリンジ本体22、ピストン222等の部材は、耐蝕性金属、すなわち腐食され難い金属又は合金によってによって形成されることが望ましい。これらの部材が溶離液に添加されたギ酸等によって腐食されると、腐食した部材から金属イオンが溶離液中に溶出して分析時の化学ノイズの原因となる。これを防止するため、ニードル21等の部材は、耐蝕性金属、具体的にはチタン、クロム、ジルコニア、ステンレス又は金等によって形成することが望ましい。
【００３１】
チタン、クロム、ジルコニア、ステンレスの酸化物は、非常に安定で腐食され難く、空気中では金属表面に酸化物の被膜（いわゆる「不動態膜」）を形成する。金属が酸素と結びついて形成するこの不動態膜は、薄く緻密な膜であり、金属内部を酸による腐食や酸化などから保護し、強い耐蝕性を発揮する。チタン等は、プールベアダイアグラム（電位−ｐＨ図）において、腐食が進行する「腐食域」に対して、不動態膜の形成により腐食の進行が停止する「不動態域」や非常に安定で腐食され難い「不感域（安定域）」が広い。このため、チタン等によりニードル21等の部材を形成することで、腐食による溶離液中への金属イオンの溶出を防止することができる。なお、チタン、クロム、ジルコニアは、それぞれアルミニウムや銅、鉄、マンガン、モリブデンなどとの合金とすることができ、ステンレスに含まれるクロムやニッケルなどの比率も適宜設定され得るものとする。
【００３２】
ニードル21等の部材は、チタン、クロム、ジルコニア、ステンレス以外に、金によって形成することもできる。金は、プールベアダイアグラムの不感域にあたる不感態（immunity）を作り、非常に安定で腐食され難い。このため、金によりニードル21等の部材を形成することによって、腐食による溶離液中への金属イオンの溶出を防止することができる。この他、ニードル21等の部材の材質には、耐蝕性金属を広く採用しでき、例えば、ニッケルを主成分としモリブデンやクロムを配合したハステロイ（登録商標）を採用できる。  
【００３３】
図２は、グラディエント送液装置2において、ニードル21内に溶離液勾配Gを形成するための構成を説明する模式図である。
【００３４】
グラディエント送液装置2は、複数の溶媒が所定混合比率で混合された溶離液を貯留する溶離液タンク25を有している。図では、溶媒タンクa内の溶媒A及び溶媒タンクb内の溶媒Bが、それぞれポンプ26aを備えた流路27a及びポンプ26bを備えた流路27bによって、所定比率で混合され溶離液として溶離液タンク25に供給される場合を示した。グラディエント送液装置2は、溶離液タンク25に供給された溶離液中にニードル21の先端開口部211を位置させた状態で、ピストン222を駆動し、ニードル21内を陰圧とすることによって、溶離液をニードル21内に吸引する（図２（A）参照）。
【００３５】
流路27a, 27bはミキサー28で合流されており、ポンプ26a, 26bから吐出される溶媒A, Bは所定の比率で混合され、溶離液として溶離液タンク25に送液、貯留される。このようなシステムは、ポンプ26a, 26bの吐出側の液体に送圧圧力がかかる位置で各液が合流し混合されるため、高圧グラディエントシステムと呼ばれている。
【００３６】
高圧グラディエントシステムでは、設定された混合比率に基づいてポンプ26a, 26bの駆動を制御する不図示の制御手段が設けられる。グラディエント送液装置2では、この制御手段によって、例えば、溶媒A, Bを混合比率100：0で溶離液タンク25に供給を開始し、徐々に溶媒Aを減らして溶媒Bを増やし、最終的に溶媒A, Bを混合比率0：100で供給することが可能である。
【００３７】
ポンプ26a, 26bの制御手段には、例えば、２台のポンプが相互に通信することで制御を行う方式や、外部コントローラによってそれぞれの制御を行う方式を採用することができる。また、ポンプ26a, 26bをひとつのユニットとしたバイナリーポンプを採用してもよい。いずれの場合にも、設定された混合比率を、ポンプ26a, 26bの駆動量（送液流量）に置き換えて送液を行うことで、混合比率の制御を実現する。
【００３８】
なお、３液の混合送液を行う場合は、さらに溶媒Cの入った溶媒タンクcと、それに対するポンプ26c及び流路27cが設けられ、ミキサー28で３液を混合し、送液する３液高圧グラディエントシステムを採用すればよい。４液以上の混合送液についても同様に行うことが可能である。
【００３９】
グラディエント送液装置2は、このようにポンプ26a, 26b及びミキサー28等から構成される高圧グラディエントシステムにより、溶媒A,Bの混合比率を変化させながら溶離液タンク25に供給する。そして、逐次、ピストン222を駆動させて溶離液をニードル21内に吸引することによって、ニードル21内に溶離液勾配G（図１参照）を形成する。
【００４０】
具体的には、例えば、溶離液タンク25に対し、初めに溶媒A, Bを混合比率100：0で供給し、ニードル21内に所定量を吸引する。続いて、溶離液タンク25に貯留された混合比率100：0の溶離液を溶離液タンク25から排出した後、溶媒A, Bを混合比率95：5で供給し、ニードル21内に所定量を吸引する。同様に、溶離液タンク25内の溶離液の排出と、新たな混合比率での溶離液の供給及びニードル21内への吸引を繰り返すことによって、ニードル21内に段階的に濃度変化する溶離液を吸引し、溶離液勾配Gを形成する。
【００４１】
図３は、グラディエント送液装置2に好適に採用され得る溶離液タンク25の実施形態を示す模式図である。図は、溶離液タンク25を点線で、タンク内に供給された溶離液を実線で示している。
【００４２】
高圧グラディエントシステムでは、高圧下で溶媒の混合を行うため、気泡の発生が少ないという特徴がある。しかし、図２で説明したように、本発明に係るグラディエント送液装置2では、ポンプ26a, 26b及びミキサー28等から構成される高圧グラディエントシステムによって混合された溶離液を、圧力がかかっていない溶離液タンク25に供給するため、溶離液タンク25内で気泡が発生してしまう可能性がある。図３中、気泡を符号Kにより示す。この気泡が、ニードル21内に吸引されてしまうと、ニードル21内で精度良く溶離液勾配Gを形成することができなくなる。
【００４３】
これを防止するため、溶離液タンク25は、図３に示すように、ポンプ26a, 26b及びミキサー28等からの溶離液の供給口25aに対し、溶離液の排出口25bを下方に設けている。そして、供給口25aから排出口25bに向かって重力に従って流れ出る溶離液を、供給口25aと排出口25bとの中間に設けた貯留部25c内に一時的に貯留させ、この貯留部25cからニードル21内へ溶離液を供給するように構成している。なお、図中、矢印は、溶離液の流れる方向を示す。
【００４４】
まず供給口25aから溶離液タンク25内に溶離液を供給し、供給口25aから流れ出て貯留部25cに溜まった溶離液をニードル21で吸引することにより、溶離液タンク25内へ溶離液が導入された際に供給口25aで気泡が発生したとしても、気泡がニードル21内へ吸引されるのを防止することができる。
【００４５】
また、供給口25aから溶離液タンク25内に導入される溶離液を、随時、排出口25bから溶離液タンク25外へ排出することができ、溶離液タンク25外への溶離液の排出と、新たな混合比率での溶離液の導入を繰り返すことなく、ポンプ26a, 26b及びミキサー28等によって溶媒の混合比率を連続的に変化させることで、ニードル21内に連続的に濃度変化する溶離液勾配Gを形成することが可能となる。
【００４６】
図４は、グラディエント送液装置2に好適に採用され得る溶離液タンク25の他の実施形態を示す模式図である。図は、溶離液タンク25を点線で、タンク内に供給された溶離液を実線で示している。
【００４７】
図４に示す溶離液タンク25では、ポンプ26a, 26b及びミキサー28等からの溶離液の供給口25aに対し、溶離液の排出口25bを上方に設けている。そして、供給口25aと排出口25bとの間の貯留部25c内に溶離液を充満させ、この貯留部25cからニードル21内へ溶離液を供給するように構成している。
【００４８】
この際、貯留部25c内へのニードル21の導入位置（貯留部25c内に導入されたニードル21の先端開口部211の位置）が、供給口25aを挟んで排出口25bと反対側となるようにする。これにより、溶離液タンク25内への溶離液供給時に発生した気泡（符号K参照）を排出口25bの方へ誘導し、気泡がニードル21内へ吸引されるのを防止することができる。さらに、排出口25bに吸引ポンプを接続し、吸引によって溶離液を強制的に排出して、供給口25aから排出口25bへの溶離液の流れを積極的に作り出すことにより、気泡がニードル21内へ吸引されるのを一層効果的に防止することができる。
【００４９】
グラディエント送液装置2は、ニードル21内に形成した溶離液勾配Gを、カラム14の上流に設けられた注入ポート15から流路145及びカラム14へ送液するため、溶離液タンク25及び注入ポート15に対するニードル21の相対位置を変更し得る駆動手段（不図示）を備えている。
【００５０】
グラディエント送液装置2は、ニードル21の先端開口部211が溶離液タンク25内に位置する溶離液の吸引ポジション（図２（A）に示す位置）と、先端開口部211が注入ポート15に接続する溶離液の吐出ポジション（図２（B）に示す位置）との２つのポジションを、上記駆動手段によって図２中矢印X方向に移動されることによって往復する。この駆動手段は、吸引ポジションにおいてニードル21の先端開口部211を溶離液タンク25内の溶離液内に浸漬させるため、また吐出ポジションにおいて先端開口部211を注入ポート15に圧着させるため、図２中矢印Y方向へもニードル21を移動可能に構成されている。なお、グラディエント送液装置2においてニードル21を設けない場合には、吸引ポジションではシリンジ本体22の開口221を溶離液タンク25内の溶離液内に浸漬し、吐出ポジションでは開口221を注入ポート15に圧着させる。
【００５１】
グラディエント送液装置2では、定流量の単行程シリンジポンプを採用し、モータ23によるネジ24の回転駆動によって溶離液の吸引及び吐出を行うため、微量の吸引及び吐出を、脈動を生じさせることなく一定速度で行うことができる。これにより、グラディエント送液装置2では、ニードル21内に高精度に勾配を形成して、形成された溶離液勾配を安定的に維持して送液することができ、カラム14の保持力を精緻に変化させながら微量成分の溶離を行うことが可能である。
【００５２】
以上のように、液体クロマトグラフ1では、グラディエント送液装置2によって正確な溶離液勾配を安定して、かつ毎分数ナノリットルという極めて低流量で送液することにより、後段の吸光度検出器や質量分析器等による分析において高い測定感度及び測定精度を得ることが可能となる。
【００５３】
また、液体クロマトグラフ1では、グラディエント送液装置2を採用することにより、図１１で説明した従来のグラディエント送液装置20のように流量センサ208によって流量測定や測定流量のフィードバックを行う必要がないため、装置の構成を簡略にし、製造コストの低減を図ることが可能である。さらに、液体クロマトグラフ1では、従来のグラディエント送液装置20の分流器26のようなバルブ開閉を行う構成を不要とすることができるため、バルブ開閉によって発生する磨耗カス（不純物）が試料に混入することによって生じる測定感度の低下を防止することが可能となる。
【００５４】
液体クロマトグラフ1では、グラディエント送液装置2を採用することにより、従来のグラディエント送液装置20を備えた液体クロマトグラフで生じていた、いわゆる「グラディエントの立ち上がり」の問題を解決することも可能である。従来の液体クロマトグラフでは、ポンプ202, 202（図１１参照）を制御して、例えば図１３（A）に示すように、溶媒A, Bを混合比率100：0で溶離液タンク25に供給を開始し、徐々に溶媒Aを減らして溶媒Bを増やして供給しようとした場合、「グラディエントの立ち上がり」の問題が生じていた。すなわち、供給開始直後、ミキサー205（図１１参照）には、100％量の溶媒Aを送液するポンプ202から強い送液圧がかかっている。そのため、溶媒Bの供給を他方のポンプ202から開始しようとしても、この送液圧によって押し返されて送液を開始することができず、濃度勾配の変化に、図１３（B）に示すような遅れが生じる。この立ち上がりの遅れは、同時に濃度勾配の急激な変化も引き起こす。そのため、精度の良いグラディエント溶離を行うことができず、正確な分析結果を得ることができなかった。なお、図１３中、横軸は時間、縦軸は溶媒A及び溶媒Bの混合比率を示している。
【００５５】
このグラディエントの立ち上がりの遅れは、高圧グラディエントシステムによって溶離液勾配を形成し、低流量で送液しようとする場合、特に問題となる。例えば、図１１に示すグラディエント送液装置20では、分流器206によってミキサー205から送出される混合溶媒の大部分を廃液タンク207へ分流しているが、この場合でも、カラム104への流量をナノスケールとするためには、各ポンプ202から供給される溶媒の総流量を毎分数十μl程度の低流量とする必要がある。このとき、例えば、一方のポンプ202から溶媒Aを毎分50μlで供給し、この送液圧に逆らって他方のポンプ202から溶媒Bを毎分1μlで供給しようとすると、溶媒A側の押し返しによって溶媒Bの送液を開始することができない。この押し返しの影響は、溶媒の総流量が低い程大きくなる。
【００５６】
これに対して、本発明に係るグラディエント送液装置2では、ポンプ26a, 26b及びミキサー28等から構成される高圧グラディエントシステムにより、溶媒A,Bの混合溶液を一旦溶離液タンク25に供給する構成であるため、高圧グラディエントシステムよる送液そのものを低流量で行う必要はない。そのため、ポンプ26a, 26bからの溶媒の総流量を、例えば毎分数百μl程度にまで大きくすることで、上記のような押し返しの影響を排除することができる。従って、グラディエント送液装置2では、グラディエントの立ち上がりの遅れがない状態で、溶離液タンク25への混合溶媒の送液を行うことができる。そして、逐次、ピストン222を駆動させて溶離液をニードル21内に吸引し、ニードル21内に形成した溶離液勾配G（図１参照）を吐出させることで、高精度のグラディエント溶離を行うことが可能となる。
【００５７】
図２では、溶離液タンク25への溶媒A及び溶媒Bの供給を、高圧グラディエントシステムによって行う場合を説明した。高圧グラディエントシステムは、各ポンプそのものの性能によってグラディエントの精度がほぼ決定するため勾配精度に優れる反面、溶媒ごとにポンプが必要となるというコスト面でのデメリットがある。
【００５８】
一方、従来、低圧グラディエントシステムと呼ばれているシステムでは、溶媒圧縮率の影響、溶媒選択バルブの応答性などにより、勾配精度は高圧グラディエントシステムより劣る。しかし、送液ポンプが１台で済むことや溶媒数を増やしやすいなどのメリットがある。グラディエント送液装置2においては、これらのメリットとデメリットを勘案して、高圧グラディエントシステム及び低圧グラディエントシステムを適宜選択して採用することができる。
【００５９】
低圧グラディエントシステムを採用する場合、典型的には、１つのポンプに複数の溶媒タンクが接続され、各溶媒タンクとポンプとの間に溶媒選択バルブが配設される。溶媒選択バルブは、溶媒タンクのどれかひとつのみを選択して接続することができる。この溶媒選択バルブは、設定された混合比率になるよう周期的にバルブを切り換えながら、ミキサーを介して溶離液タンクへ溶媒を送液する。低圧グラディエントシステムを採用する場合には、このようにポンプの吸引側、すなわち溶媒が減圧される位置で各溶媒が合流し混合を行う。
【００６０】
図５は、グラディエント送液装置2において、ニードル21内に溶離液勾配Gを形成するための他の構成を説明する模式図である。
【００６１】
このグラディエント送液装置2は、複数の溶媒が所定混合比率となるように予め混合された溶離液を貯留する溶離液タンクを5つ（溶離液タンク251〜255）有している。
【００６２】
溶離液タンク251〜255には、例えば、2種の溶媒を所定比率で混合して溶離液勾配を形成する場合、溶媒A, Bを予め混合比率が100：0から0：100までの間で徐々に変化するように混合して貯留させておく。具体的には、例えば、溶離液タンク251には溶媒A, Bを混合比率100：0で、溶離液タンク251には溶媒A, Bを混合比率95：5でというように、配設する溶離液タンクの数に応じて段階的に混合比率を変化させておく。
【００６３】
一方、グラディエント送液装置2には、ニードル21の溶離液タンク251〜255及び注入ポート15に対する相対位置を変更し得る駆動手段（不図示）が設けられている。グラディエント送液装置2は、この駆動手段により、ニードル21を図５中矢印X及びY方向に移動させながら、各溶離液タンク内の溶離液を順次ニードル21内に吸引し、ニードル21内に溶離液勾配Gを形成する（図５（A）参照）。そして、溶離液勾配の形成後、グラディエント送液装置2は、先端開口部211が注入ポート15に接続する溶離液の吐出ポジション（図５（B）に示す位置）にまで移動し、溶離液勾配を注入ポート15から流路145及びカラム14へ送液する。
【００６４】
このように複数の溶媒が予め所定混合比率で混合された溶離液を貯留する溶離液タンクを複数（図５では５つ）設け、ニードル21を移動させながら順次溶離液を吸引し溶離液勾配を形成する方式では、図２を用いて説明したような高圧グラディエントシステム又は低圧グラディエントシステムを用いた方式とは異なり、ポンプや各ポンプの制御手段が不要であるため、グラディエント送液装置2そのものの構成を簡略化することができる。
【００６５】
次に、図６及び図７を参照しながら、液体クロマトグラフ1における分析方法の一例を説明する。図６及び図７は、図１で説明した液体クロマトグラフ1の構成をより詳しく示した図となっている。
【００６６】
液体クロマトグラフ1は、カラム14（図１参照）として、分離カラム141とプレカラム142を有している。分離カラム141及びプレカラム142には、一般に、メチルやブチル、オクチル、オクタデシル、ドコシル基などのアルキル基を化学結合したシリカ、ガラスまたは樹脂ビーズあるいはジビニルベンゼン―スチレン共重合体、ポリスチレンなどの樹脂ビーズを充填したものが用いられる。プレカラム142は、分離カラム141の流路上流に接続され、試料を一時的に保持（トラップ）するために使用されるものである。
【００６７】
液体クロマトグラフ1では、分離カラム141の上流に流路146によりプレカラム142が接続され、さらにプレカラム142の上流には流路145を介して溶離液勾配をプレカラム142及び分離カラム141内に導入するための注入ポート15が設けられている。また分離カラム141とプレカラム142を接続する流路146には、試料を流路内に導入するための試料ポート16が設けられている。液体クロマトグラフ1では、グラディエント送液装置2にサンプラーとしての機能を付与し、初めに試料ポート16から試料の送液を行わせ、次いで注入ポート15から溶離液勾配の送液を行わせるように構成することができる。
【００６８】
グラディエント送液装置2に試料の送液を行わせるためには、例えば、図２で示した溶離液タンク25に試料タンクを併設すればよい。そして、溶離液タンク25内からの溶離液の吸引と同様に、試料タンク内の試料をニードル21内へ吸引させた後、上述の駆動手段によってニードル21を試料ポート16に接続する位置まで移動させ、試料を試料ポート16から吐出させる（図６中矢印S1参照）。なお、試料タンクは、例えば、図５で示した溶離液タンク251〜255に併設したり、溶離液タンク251〜255のうちひとつを試料用タンクに用いることもできる。
【００６９】
分離カラム141は高分離能を得るために、プレカラム142に比べ粒子径の細かい充填剤を長いカラムに充填しているため背圧が高く、これを試料が通過するためには高い送出圧が必要となる。従って、グラディエント送液装置2から試料を試料ポート16に注入すると、流路146内へ導入された試料は、分離カラム141へ送液されることなく、プレカラム142側へ送液され、注入ポート15に連通されている流路ヘッド17及び流路171を通って、矢印S2方向へ排出される。これにより、試料中の微量成分がプレカラム142に吸着される。
【００７０】
次に、グラディエント送液装置2のニードル21内に、図２又は図５で説明した方法によって溶離液勾配を形成し、駆動手段によってニードル21を注入ポート15に接続する位置まで移動させ、溶離液勾配を吐出させる（図７参照）。
【００７１】
このとき、注入ポート15に連通されていた流路ヘッド17及び流路171は、グラディエント送液装置2と同様に駆動手段によって注入ポート15に対して相対移動され、注入ポート15との連通が解除される。同時に、試料ポート16は、閉塞ヘッド18によって塞がれる。閉塞ヘッド18も、同様に駆動手段によって試料ポート16に対する相対位置を移動可能に構成されており、試料ポート16に圧着されてこれを閉塞し得る位置（図７参照）と、閉塞を解除する位置（図６参照）とを往復可能とされている。
【００７２】
図７に示す状態で、グラディエント送液装置2から注入ポート15に溶離液勾配が送液されると、溶離液勾配はプレカラム142に導入され、カラム内に吸着された微量成分が溶離される。このとき、試料ポート16は閉塞ヘッド18により塞がれているため、溶離された微量成分は分離カラム141へ送出される。そして、分離カラム141に送出された微量成分は、分離・フラクション化された後、さらに後段の紫外線分光光度計や質量分析装置へと送出されることになる（矢印S3参照）。
【００７３】
図６及び図７では、試料ポート16への試料の注入時に、分離カラム141とプレカラム142との背圧差を利用して、プレカラム142への試料の吸着を行う場合を説明した。図８及び図９では、分離カラム141とプレカラム142との背圧差がない場合もしくは小さい場合の液体クロマトグラフ1における分析方法の一例を説明する。
【００７４】
この例では、試料ポート16を塞ぐ閉塞ヘッド18に替えて、流路ヘッド19を設けている。この流路ヘッド19には、流路191によって分離カラム141が接続されている。
【００７５】
図８に示すように、グラディエント送液装置2から試料を試料ポート16に注入すると、流路146内へ導入された試料は、プレカラム142、注入ポート15、流路ヘッド17及び流路171を通って矢印S2方向へ排出され、試料中の微量成分がプレカラム142に吸着される。
【００７６】
次に、グラディエント送液装置2のニードル21内に溶離液勾配を形成し、駆動手段によってニードル21を注入ポート15に接続する位置まで移動させ、溶離液勾配を吐出させる（図９参照）。同時に、分離カラム141が接続された流路ヘッド19を駆動手段によって移動させ、試料ポート16に連通させる。これにより、プレカラム142に吸着された微量成分が、グラディエント送液装置2から注入ポート15に送液された溶離液勾配によって溶離され、分離カラム141を通って紫外線分光光度計等へと送出される（矢印S3参照）。
【００７７】
この例では、試料ポート16への試料の注入時の分離カラム141の接続を完全に切り離すことができるため、分離カラム141とプレカラム142との背圧差にかかわらず分析が可能である。また、分離カラム141とプレカラム142を直接接続する必要がないため、両カラムの組み合わせの自由度を高めることができる。
【００７８】
このように、液体クロマトグラフ1における分析では、プレカラム142への試料の吸着とグラディエント溶離のための流路切換を、従来の液体クロマトグラフのようなバルブ切換えを行うことなく、グラディエント送液装置2のニードル21と流路ヘッド17、閉塞ヘッド18又は流路ヘッド19を移動させることによって簡単に行うことが可能である。
【００７９】
従来の液体クロマトグラフでは、図１４に示されるような回動バルブVを用いて、プレカラム142への試料の吸着（図１４(A)参照）とグラディエント溶離（図１４(B)参照）のための流路切換を行っている。具体的には、図１４(A)の状態では、矢印Q1から流路へ供給された試料は、回動バルブVを通過して、矢印Q2から排出され、このとき試料中の微量成分がプレカラム142に吸着される。
【００８０】
回動バルブVを同心円上に60度回転させて流路を切換えると（図１４(B)参照）、今度は矢印R1から送出される溶離液勾配がプレカラム142に導入されることとなる。これにより、プレカラム142に吸着された微量成分が溶離され、分離カラム141へと導入される。そして、溶離された各微量成分が分離カラム141により分離・フラクション化され、矢印R2方向へ送出される。
【００８１】
このような従来の液体クロマトグラフでは、回動バルブVの容積が、流路全体の容積（システム体積）に対して、相当程度の割合を占めることとなるため、バルブ容積に起因して、溶媒や試料のデッドボリュームが発生したり、溶媒や試料の送液に時間がかかるという問題があった。
【００８２】
また、回動バルブVは、通常、金属製のステータと樹脂製のロータとで構成されるが、ロータの回転駆動時に漏れが生じないようにステータとロータは厳密に密着されている。このため、ステータとロータの接着面において金属や樹脂の磨耗カス（不純物）が発生し、溶媒や試料に混入することがあった。さらに、回動バルブVでは、バルブ内に溶媒や試料が満たされた状態で切換えを行うため、溶媒や試料のキャリーオーバーが発生することがあった。
【００８３】
従来の液体クロマトグラフでは、以上のような回動バルブVに起因した問題のため、分析感度や分析速度の低下が生じていた。特に、極微量の試料を極めて低流量で送液することが必要となるナノLCでは、バルブに起因してデッドボリュームやキャリーオーバー、不純物の混入が生じると、試料や溶媒のロスやコンタミネーションの原因となり、分析感度の著しい低下が引き起こされる。
【００８４】
これに対して、液体クロマトグラフ1における分析では、図６〜９に示したように、プレカラム142への試料の吸着とグラディエント溶離を、バルブ切換えを行うことなく、グラディエント送液装置2のニードル21と流路ヘッド17、閉塞ヘッド18又は流路ヘッド19を移動させることにより行うことが可能である。
【００８５】
従って、バルブ切換えに起因したデッドボリュームやキャリーオーバー、不純物の混入の発生がなく、試料や溶媒のロスやコンタミネーションをなくして、分析感度を向上させることが可能となる。また、バルブを省略したことで、システム体積を小さくすることができるので分析時間を短縮し、分析効率を向上させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明に係る液体クロマトグラフ及びグラディエント送液装置は、微量成分の分離・分析のために用いられ、特にナノスケール流量で溶媒の送出を行うナノ高速液体クロマトグラフに好適に採用され得るものである。
【符号の説明】
【００８７】
1  液体クロマトグラフ
14  カラム
141  分離カラム
142  プレカラム
145, 146, 171, 27a, 27b, 27c  流路
15  注入ポート
16  試料ポート
17, 19  流路ヘッド
18  閉塞ヘッド
2  グラディエント送液装置
21  ニードル
211  先端開口部
22  シリンジ本体
221  開口
222  ピストン
23  モータ
24  ネジ
25, 251, 252, 253, 254, 255  溶離液タンク
25a  供給口
25b  排出口
25c  貯留部
26a, 26b, 26c  ポンプ
28  ミキサー
a, b, c  溶媒タンク
G  溶離液勾配
【図１】
2009151096.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2009151096.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
2009151096.tif 000014
【図１３】
2009151096.tif 000015
【図１４】
2009151096.tif 000016
【国際調査報告】
2009151096.tif 000017
2009151096.tif 000018
2009151096.tif 000019
2009151096.tif 000020