(57)【要約】本出願は、本明細書に記載した通りの式（Ｉ）又は（ＩＩ）に従う錯体と、電気化学的バイオセンサ内でのレドックスメディエータとしての該錯体の使用とを対象とする。
2009520792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レドックスメディエータとしての式Ｉの錯体の使用であって、
【化１】
2009520792.tif 000020
式中、Ｍがルテニウム又はオスミウムであって０、１、２、３又は４の酸化状態を有し、
ｘ及びｎが独立に、１〜６から選択された整数であり、ｙが１〜５から選択された整数であり、ｍが−５〜＋４の整数であり、ｚが−２〜＋１の整数であり、
Ａが一座又は二座の芳香族配位子であって１個又は２個の窒素原子を含み、
Ｂが、窒素含有複素環式配位子を除く適切な配位子であるように独立に選択され、
Ｘが適切な対イオンであって、
任意にＡが、置換又は無置換のアルキル、アルケニル又はアリール基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＮＨ２、−ＳＨ、アリール、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキサミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ、アルキルチオから、独立に選択された１〜８個の基で置換され、
配位原子数が６である
ことを特徴とする、レドックスメディエータとしての式Ｉの錯体の使用。
【請求項２】
Ａが、１個以上のＣＯ２Ｒ２基で置換した一座配位子、又は１個以上のＣＯ２Ｒ２基で任意に置換した二座若しくは三座配位子であることを特徴とする、請求項１に記載のレドックスメディエータとしての式Ｉの錯体の使用。
【請求項３】
Ｒ２がＨであるように選択されることを特徴とする、請求項２に記載のレドックスメディエータとしての式Ｉの錯体の使用。
【請求項４】
Ａが、ニコチン酸、イソニコチン酸、２，２’−ビピリジン、２，２’−ビピリジン−５，５’−ジカルボン酸、２，２−ビピリジル−４，４’−ジカルボン酸、５−クロロ−８−ヒドロキシキノリンから選択されることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のレドックスメディエータとしての式Ｉの錯体の使用。
【請求項５】
レドックスメディエータとしての式ＩＩの錯体の使用であって、
【化２】
2009520792.tif 000021
式中、Ｍがルテニウム又はオスミウムであって０、１、２、３又は４の酸化状態を有し、
ｘ及びｎが独立に、１〜６から選択された整数であり、ｙが０〜５から選択された整数であり、ｍが−５〜＋４の整数であり、ｚが−２〜＋１の整数であり、
Ａが二座、三座、四座、五座又は六座配位子であって、式Ｒ１ＲＮ（Ｃ２Ｈ４ＮＲ）ＷＲ１を有する直鎖式、又は式（ＲＮＣ２Ｈ４）ｖ、（ＲＮＣ２Ｈ４）ｐ（ＲＮＣ３Ｈ６）ｑ若しくは［（ＲＮＣ２Ｈ４）（ＲＮＣ３Ｈ６）］ｓを有する環式であることができ、ｗが１〜５の整数であり、ｖが３〜６の整数であり、ｐ及びｑが１〜３の整数であってｐとｑとの和が４、５又は６であり、ｓが２又は３であり、Ｒ及びＲ１が水素又はメチルであり、
Ｂが、適切な配位子であるように独立に選択され、
Ｘが適切な対イオンであって、
任意にＢが、置換又は無置換のアルキル、アルケニル又はアリール基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＮＨ２、−ＳＨ、アリール、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキサミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ、アルキルチオから、独立に選択された１〜８個の基で置換され、
配位原子数が６であることを特徴とする、レドックスメディエータとしての式ＩＩの錯体の使用。
【請求項６】
Ａが二座、三座又は四座配位子であって、式Ｒ１ＲＮ（Ｃ２Ｈ４ＮＲ）ＷＲ１を有する直鎖式、又は式（ＲＮＣ２Ｈ４）ｖ、（ＲＮＣ２Ｈ４）ｐ（ＲＮＣ３Ｈ６）ｑ若しくは［（ＲＮＣ２Ｈ４）（ＲＮＣ３Ｈ６）］ｓを有する環式であることができ、ｗが１〜３の整数であり、ｖが３又は４であり、ｐ及びｑが１〜３の整数であってｐとｑとの和が４であり、ｓが２又は３であることを特徴とする、請求項に記載のレドックスメディエータとしての式ＩＩの錯体の使用。
【請求項７】
Ａが、１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン又は１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、１，２−ジメチルエチレンジアミン若しくは１，１，２，２−テトラメチルエチレンジアミンから選択される、ことを特徴とする、請求項５に記載のレドックスメディエータとしての式ＩＩの錯体の使用。
【請求項８】
Ｂが、ＮＨ３若しくはＮＭｅ３のようなアミン配位子から、又はＣＯ、ＣＮ、ハロゲン及びアセチルアセトナト（ａｃａｃ）、３−ブロモ−アセチルアセトナト（Ｂｒａｃａｃ）、シュウ酸塩、ピリジン若しくは５−クロロ−８−ヒドロキシキノリンから選択されることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
Ａ又はＢが二座であるように選択された場合、錯体の配位がシス形又はトランス形であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
金属の酸化状態が２＋、３＋又は４＋であるように選択されることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
金属の酸化状態が３＋であるように選択されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
錯体上の全電荷が＋３、＋２、＋１、０、−１、−２及び−３の群から選択されるように配位子Ａ及びＢが選択されることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
対イオンが、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−、ＮＨ４＋、ＮＲ４＋、ＰＦ６−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＳＯ４２−、ＣｌＯ４−、ＯＨ−、Ｋ＋、Ｎａ＋、ＬＩ＋から選択されることを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
対イオンの組み合わせが使用されることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記錯体が［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（３−ブロモ−２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−５，５’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−４，４’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−４−ＣＯＯＨ）（ピリジン−４−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ２、［ＯｓＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ、［Ｒｕ（２，２’−ビピリジン）２（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（Ｃ２Ｏ４）］、Ｋ［ＲｕＩＩＩ（Ｃ２Ｏ４）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）２］、［ＲｕＩＩＩ（１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン）（２，４−ペンタンジオネート）（ピリジン）］（ＮＯ３）２のいずれかであることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記錯体が［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン）（２，４−ペンタンジオネート）（ピリジン）］（ＮＯ３）２又は［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ２であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
レドックスメディエータが電気化学的センサ内で使用されることを特徴とする、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
電気化学的センサが微小帯電極を含むことを特徴とする請求項に記載の使用。
【請求項１９】
電気化学的センサが電気化学的バイオセンサであることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記電気化学的バイオセンサが、体液、環境試料、食品及び飲料、獣医学的試料、医薬内において検体を検知するために使用されることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
請求項１乃至１６のいずれか一項に記載された式Ｉ又は式ＩＩのルテニウム錯体又はオスミウム錯体の、バイオセンサ内における使用。
【請求項２２】
錯体がｐＨ６〜１０で使用されることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
錯体がｐＨ７〜９で使用されることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
バイオセンサが、適合した検体と共に使用されることを特徴とする、請求項２１乃至２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
検体が、生体液内に見出されることになり、また、酵素、酵素基質、抗原、抗体、核酸配列、コレステロール、コレステロールエステル、リポ蛋白、中性脂肪又は微生物のいずれかからも選択できることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
（ａ）  式Ｉ又は式ＩＩに従うＲｕ含有化合物又はＯｓ含有化合物の群から選択されたレドックスメディエータと酵素とを含む溶液に、検体を含む試料を接触されるステップと、
（ｂ）  酵素が検体に作用するようになる条件下で接触試料を培養するステップと、
（ｃ）  ステップ（ｂ）の培養試料を、測定可能な信号変化が生じる条件に掛けるステップと、
（ｅ）  その結果生じた信号を測定するステップとを含む検体を測定する検知システム。
【請求項２７】
測定可能な信号が、電気化学、比色分析、熱、インピーダンス測定、容量又は分光の各信号である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
測定可能な信号が、微小帯電極を用いて測定される電気化学的信号である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
電気化学的信号が、電流測定検知方法において微小帯電極を用いて検知される、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
式Ｉの錯体であって、
【化３】
2009520792.tif 000022
式中、Ｍがルテニウム又はオスミウムであって０、１、２、３又は４の酸化状態を有し、
ｘ及びｎが独立に、１〜６から選択された整数であり、ｙが１〜５から選択された整数であり、ｍが−５〜＋４の整数であり、ｚが−２〜＋１の整数であり、
Ａが一座又は二座の芳香族配位子であって１個又は２個の窒素原子を含み、
Ｂが、窒素含有複素環式配位子を除く１個以上の適切な配位子であるように独立に選択され、
Ｘが適切な対イオンであって、
任意にＡが、置換又は無置換のアルキル、アルケニル又はアリール基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＮＨ２、−ＳＨ、アリール、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキサミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ、アルキルチオから、独立に選択された１〜８個の基で置換され、
配位原子数が６である錯体。
【請求項３１】
Ａが、１個以上のＣＯ２Ｒ２基で置換した一座配位子、又は１個以上のＣＯ２Ｒ２基で任意に置換した二座若しくは三座配位子であって、前記１個以上のＣＯ２Ｒ２基が各々、配位結合ヘテロ原子に対してメタ位置にある、請求項３０に記載の錯体。
【請求項３２】
Ｒ２がＨであるように選択される、請求項３１に記載の錯体。
【請求項３３】
Ａが、ニコチン酸、イソニコチン酸、５−カルボキシ−ニコチン酸、６−ピリジル−ニコチン酸、２，２’−ビピリジン−５，５’−ビス−カルボン酸、２，２’−ビピリジン−４，４’−ビス−カルボン酸、２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン−３，９−ビス−カルボン酸から選択される、請求項３０〜３２のいずれかに記載の錯体。
【請求項３４】
式ＩＩの錯体であって、
【化４】
2009520792.tif 000023
式中、Ｍがルテニウム又はオスミウムであって０、１、２、３又は４の酸化状態を有し、
ｘ及びｎが独立に、１〜６から選択された整数であり、ｙが０〜５から選択された整数であり、ｍが−５〜＋４の整数であり、ｚが−２〜＋１の整数であり、
Ａが二座、三座、四座、五座又は六座配位子であって、式Ｒ１ＲＮ（Ｃ２Ｈ４ＮＲ）ＷＲ１を有する直鎖式、又は式（ＲＮＣ２Ｈ４）ｖ、（ＲＮＣ２Ｈ４）ｐ（ＲＮＣ３Ｈ６）ｑ若しくは［（ＲＮＣ２Ｈ４）（ＲＮＣ３Ｈ６）］ｓを有する環式であることができ、ｗが１〜５の整数であり、ｖが３〜６の整数であり、ｐ及びｑが１〜３の整数であってｐとｑとの和が４であり、ｓが２又は３であり、Ｒ及びＲ１が水素又はメチルであり、
Ｂが、適切な配位子であるように独立に選択され、
Ｘが適切な対イオンであって、
任意にＡが、置換又は無置換のアルキル、アルケニル又はアリール基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＮＨ２、−ＳＨ、アリール、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキサミド、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ又はアルキルチオから、独立に選択された１〜７個の基で置換され、
配位原子数が６である錯体。
【請求項３５】
Ａが二座、三座又は四座配位子であって、式Ｒ１ＲＮ（Ｃ２Ｈ４ＮＲ）ＷＲ１を有する直鎖式、又は式（ＲＮＣ２Ｈ４）ｖ、（ＲＮＣ２Ｈ４）ｐ（ＲＮＣ３Ｈ６）ｑ若しくは［（ＲＮＣ２Ｈ４）（ＲＮＣ３Ｈ６）］ｓを有する環式であることができ、ｗが１〜３の整数であり、ｖが３又は４であり、ｐ及びｑが１〜３の整数であってｐとｑとの和が４であり、ｓが２又は３である、請求項３４に記載の錯体。
【請求項３６】
Ａが、１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン又は１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、１，２−ジメチルエチレンジアミン若しくは１，１，２，２−テトラメチルエチレンジアミンから選択される、請求項３５に記載の錯体。
【請求項３７】
Ｂが、ＮＨ３のようなアミン配位子、ＣＯ、ＣＮ、ハロゲン及びアセチルアセトナト（ａｃａｃ）、３−ブロモ−アセチルアセトナト（Ｂｒａｃａｃ）、シュウ酸塩、シュウ酸塩、または５−クロロ−８−ヒドロキシキノリンから選択される、請求項３０〜３６のいずれかに記載の錯体。
【請求項３８】
Ａ及びＢが二座であるように選択された場合、錯体の配位がシス形又はトランス形である、請求項３０〜３７のいずれかに記載の錯体。
【請求項３９】
金属の酸化状態が２＋又は３＋であるように選択される、請求項３０〜３８のいずれかに記載の錯体。
【請求項４０】
金属の酸化状態が３＋であるように選択される、請求項３０〜３９のいずれかに記載の錯体。
【請求項４１】
錯体上の全電荷が＋２、＋１、０、−１、−２及び−３の群から選択されるように、配位子Ａ及びＢが選択される、請求項４０に記載の錯体。
【請求項４２】
対イオンが、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−、ＮＨ４＋、ＮＲ４＋、ＰＦ６−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＳＯ４２−、ＣｌＯ４−、ＯＨ−、Ｋ＋、Ｎａ＋、ＬＩ＋から選択される、請求項３０〜４１のいずれかに記載の錯体。
【請求項４３】
対イオンの組み合わせが使用される、請求項４２に記載の錯体。
【請求項４４】
前記錯体が［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（３−ブロモ−２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−５，５’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−４，４’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−２，２’−ビピリジン）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−４−ＣＯＯＨ）（ピリジン−４−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ２、［ＯｓＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ、［Ｒｕ（２，２’−ビピリジン）２（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（Ｃ２Ｏ４）］、Ｋ［ＲｕＩＩＩ（Ｃ２Ｏ４）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）２］又は［ＲｕＩＩＩ（１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン）（２，４−ペンタンジオネート）（ピリジン）］（ＮＯ３）２である、請求項３０〜４３のいずれかに記載の錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なルテニウム錯体又はオスミウム錯体と、バイオセンサ内での当該錯体の使用に関する。具体的には本発明は、ルテニウム（ＩＩＩ）状態においてルテニウム含有化学種上の全電荷が３＋未満であるルテニウム錯体のレドックスメディエータとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサは、生化学的認識成分又は感知要素と物理的トランスデューサとを組み合わせた分析ツールである。当該センサは、個人の健康の監視、環境スクリーニング及び監視、バイオプロセス監視、並びに食品及び飲料業界内のような様々な分野で広範な用途を有する。
【０００３】
生物学的な感知要素は酵素、抗体、ＤＮＡ配列であるか又は微生物でさえあることできる。生化学的な成分は、反応を選択的に触媒するか又は結合事象を促進するのに役立つ。生化学的な認識事象を選択することによりバイオセンサは、例えば体液内のような複雑な試料マトリクス内で動作可能となる。トランスデューサは、生化学的事象を測定可能な信号に変換し、このようにして当該事象を検知する手段として機能する。測定可能な事象は、酵素反応生成物／基質の生産又は消費によるスペクトル変化から、生化学的錯形成時の質量変化まで様々である。
【０００４】
一般にトランスデューサは、種々の形態を取り、測定される物理化学的パラメータを指示する。よってトランスデューサは、吸光、蛍光又は屈折率等の変化を測定する光学ベースのものであることもできる。トランスデューサは、生物学的に誘導した結合反応に伴う質量変化を測定する質量ベースのものであることもできる。加えてトランスデューサは、熱ベース（エンタルピー（熱）変化を測定する）、又は電流測定ベース若しくはインピーダンスベース（検体・バイオ認識層相互作用に伴う電気的特性変化を測定する）のものであることもできる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バイオセンサは、分散測定の便利さと容易を提供し、すなわち、懸念点又はポイント・オブ・ケアに対しアッセイを行うことができる潜在的可能性を提供する。適切に設計し製造したバイオセンサ装置は、便利に大量生産することもできる。
【０００６】
しかしながら、バイオセンサの使用には幾つかの制限がある。この制限には、汚れ（foulant）及び干渉に対するトランスデューサの脆弱性が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
酵素ベースのバイオセンサは、臨床的、環境的、農業的及びバイオ工学的用途の検体検知に広く使用される。ヒト体液の臨床アッセイにおいて測定できる検体には、例えばブドウ糖、乳酸塩、コレステロール、ビリルビン及びアミノ酸が含まれる。血液のような生体液内における当該検体のレベルは、疾病の診断及び監視のために重要である。
【０００８】
酵素ベースのシステムに通例使用できるセンサが、ポイント・オブ・ケアとして又は対抗装置として設けられる。当該センサを用いて新鮮な未改質の指尖全血試料を試験し、装置に試料を加えてから１〜２分以内に（注：この時間は一定ではなく大幅な変動を受ける可能性が高い）総コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬ及びＬＤＬの濃度を定量することができる。当該４つのパラメータは互いに組み合わされて、成人の心疾患リスクの非常に良好な指標となることが臨床的に証明されている。高コレステロールが無症候性であることは良く知られており、よって、全ての成人が試験を受けて自身のリスクを評価することが推奨される。高リスクであることが判明した場合、食餌療法のみによるか又は治療薬との組み合わせによる適正な管理によって、リスクを大幅に減らすことができる。
【０００９】
かかる酵素ベースのバイオセンサの一例では、問題の検体を検知するために電気化学的アッセイが利用される。メディエータの酸化状態の変化が利用され、定量される検体と反応済みの酵素と、当該メディエータとが相互作用する。メディエータがもっぱら、基質を加え次第、酵素と相互作用する状態であるように、メディエータの酸化状態は選択される。検体は、酵素を介して化学量論濃度のメディエータと反応する。これによってメディエータが酸化又は還元（酵素反応によって決まる）され、所与の電位における発生電流を定量することにより、メディエータのレベルの変化を測定可能となる。
【００１０】
電気化学的アッセイは通常、少なくとも１つの測定又は作用電極と１つの参照電極とを含む２つ又は３つの電極を備えたセル内で行われる。３電極システムでは、第三の電極は対電極である。２電極システムでは、参照電極が対電極の役割も果たす。これらの電極は、ポテンショスタットのような回路を通じて接続される。測定又は作用電極は、炭素又は金属導体である。作用電極を電流が通過し次第、酸化還元酵素が電気酸化又は電気還元される。当該酵素は、検知される検体又は当該検体の生成物に特異的なものである。酵素のターンオーバー率は通常、試験溶液内における検体自体の濃度又はその生成物に関連する（好ましくは直線的に、ただし、必ずしもそうである必要はない）。
【００１１】
酵素の電気酸化又は電気還元は、溶液内又は電極上のレドックスメディエータの存在により促進されることが多い。レドックスメディエータは通例、作用電極と酵素との間の電気的伝達を手助けする。レドックスメディエータは、分析される流体に溶解することができ、電極に電解接触する。有用な装置は、例えば、レドックスメディエータと酵素とを含む被膜で電極を被覆することにより作成することができ、その場合、当該酵素は、希望検体又はその生成物に対して触媒的に特異的なものある。水溶性又は不水溶性であることのできる拡散性のレドックスメディエータは、例えば酵素と電極との間において、電子を往復させることにより機能する。いかなる場合もレドックスメディエータは、酵素基質が電気酸化される場合には基質還元酵素から電極に電子を運搬し、当該基質が電気還元される場合には電極から基質酸化酵素に電子を運搬する。
【００１２】
現在までに使用されてきた多くの酵素ベース電気化学的センサには、単量体のフェロセン、キニーネを含むキノイド化合物（例えばベンゾキノン）、サイクラミン酸ニッケル及びルテニウムアミンのような幾つかの異なるレドックスメディエータが用いられてきた。これらのレドックスメディエータの大多数には、次のような制限が１つ以上存在する。制限とはすなわち、レドックスメディエータの、試験溶液内における溶解度の低さ、化学的安定性、光安定性、熱安定性若しくはｐＨ安定性の不足、又は酵素、電極若しくはそれらの両方との間での電子交換速度の不足。加えて、これら報告されたレドックスメディエータの多くの酸化還元電位は、還元済みメディエータが電極上で電気酸化される電位で、検体以外の溶液成分もまた電気酸化されるほど酸化性であり、その他の場合には、例えば溶存酸素のような溶液成分もまた急速に電気還元されるほど還元性である。その結果として、当該メディエータを利用するセンサは十分に特異的ではない。
【００１３】
これまでルテニウムベース錯体は、例えばコレステロール脱水素酵素を含む反応におけるレドックスメディエータとして利用されてきた。例えば、存在する［ＲｕＩＩ（ＮＨ３）６］２＋種は、適切な電位に保った電極で［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）６］３＋に転換される。すなわち、通過電流は、酵素反応を介して形成されたＲｕＩＩ（ＮＨ３）６種の量に比例する。しかしながら、［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）６］３＋型のような高電荷種は多かれ少なかれ、通例はイオン対の形で錯体となり、それに伴い、分析プロセスが効果的且つ効率的に行われるために必要な反応は、酵素上及び電極表面上の負電荷基によって妨げられる。
【００１４】
従って、分析混合物及び電極の成分と錯体を形成する力がより弱いか又は全くないレドックスメディエータを利用し、そのようにして、前記メディエータから測定される応答の信頼性、安定及び再現可能性を高めることが望ましい。
【００１５】
本発明の第一の態様によれば、レドックスメディエータとしての式Ｉの錯体の使用が提供され、
【００１６】
【化５】
2009520792.tif 000003
式中、Ｍはルテニウム又はオスミウムであって０、１、２、３又は４の酸化状態を有し、
ｘ及びｎは独立に、１〜６から選択された整数であり、ｙは１〜５から選択された整数であり、ｍは−５〜＋４の整数であり、ｚは−２〜＋１の整数であり、
Ａは一座又は二座の芳香族配位子であって１個又は２個の窒素原子を含み、
Ｂは、窒素含有複素環式配位子を除く適切な配位子であるように独立に選択され、
Ｘは適切な対イオンであって、
任意にＡは、置換又は無置換のアルキル、アルケニル又はアリール基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＮＨ２、−ＳＨ、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキサミド、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ、アルキルチオから、独立に選択された１〜８個の基で置換され、
配位原子数は６である。
【００１７】
配位子Ａは、１個以上のＣＯ２Ｒ２基で置換した一座配位子、又は１個以上のＣＯ２Ｒ２基で任意に置換した二座若しくは三座配位子であることができる。
基Ｒ２はＨであるように選択することができる。
【００１８】
配位子Ａは、ニコチン酸、イソニコチン酸、２，２’−ビピリジン、２，２−ビピリジン−５，５’−ジカルボン酸、２，２−ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸又は５−クロロ−８−ヒドロキシキノリンから選択することができる。
【００１９】
本発明の第二の態様に従う式ＩＩの錯体の、レドックスメディエータとしての使用が提供され、
【００２０】
【化６】
2009520792.tif 000004
式中、Ｍはルテニウム又はオスミウムであって０、１、２、３又は４の酸化状態を有し、
ｘ及びｎは独立に、１〜６から選択された整数であり、ｙは０〜５から選択された整数であり、ｍは−５〜＋４の整数であり、ｚは−２〜＋１の整数であり、Ａは二座、三座、四座、五座又は六座配位子であって、式Ｒ１ＲＮ（Ｃ２Ｈ４ＮＲ）ＷＲ１を有する直鎖式、又は式（ＲＮＣ２Ｈ４）ｖ、（ＲＮＣ２Ｈ４）ｐ（ＲＮＣ３Ｈ６）ｑ若しくは［（ＲＮＣ２Ｈ４）（ＲＮＣ３Ｈ６）］ｓを有する環式であることができ、ｗは１〜５の整数であり、ｖは３〜６の整数であり、ｐ及びｑは１〜３の整数であってｐとｑとの和が４、５又は６であり、ｓは２又は３であり、Ｒ及びＲ１は水素又はメチルであり、
Ｂは、適切な配位子であるように独立に選択され、
Ｘは適切な対イオンであって、
任意にＢは、置換又は無置換のアルキル、アルケニル又はアリール基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＮＨ２、−ＳＨ、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキサミド、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ、アルキルチオから、独立に選択された１〜８個の基で置換され、
配位結合数は６である。
【００２１】
配位子Ａは二座、三座又は四座配位子であることができて、式Ｒ１ＲＮ（Ｃ２Ｈ４ＮＲ）ＷＲ１を有する直鎖式、又は式（ＲＮＣ２Ｈ４）ｖ、（ＲＮＣ２Ｈ４）ｐ（ＲＮＣ３Ｈ６）ｑ若しくは［（ＲＮＣ２Ｈ４）（ＲＮＣ３Ｈ６）］ｓを有する環式であることができ、ｗは１〜３の整数であり、ｖは３又は４であり、ｐ及びｑは１〜３の整数であってｐとｑとの和が４であり、ｓは２又は３である。
【００２２】
配位子Ａは、１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン又は１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、１，２−ジメチルエチレンジアミン若しくは１，１，２，２−テトラメチルエチレンジアミンから選択することができる。
【００２３】
式Ｉ又は式ＩＩの配位子Ｂは、ＮＨ３のようなアミン配位子から、又はＣＯ、ＣＮ、ハロゲン及びアセチルアセトナト（ａｃａｃ）、３−ブロモ−アセチルアセトナト（Ｂｒａｃａｃ）、シュウ酸塩、ピリジン若しくは５−クロロ−８−ヒドロキシキノリンから選択することができる。
【００２４】
式Ｉ又は式ＩＩの配位子Ａ及びＢは、二座であって、錯体の配位がシス形又はトランス形であるように選択することができる。
式Ｉ又は式ＩＩの錯体内の金属の酸化状態は２＋、３＋又は４＋であるように選択することができる。
【００２５】
式Ｉ又は式ＩＩの錯体内の金属の酸化状態は３＋であるように選択することができる。
式Ｉ又は式ＩＩの配位子Ａ及びＢは、＋２、＋１、０、−１、−２及び−３の群から選択することができる。
【００２６】
式Ｉ又は式ＩＩの錯体内の対イオンは、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−、ＮＨ４＋、ＮＲ４＋、ＰＦ６−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＳＯ４２−、ＣｌＯ４−、Ｋ＋、Ｎａ＋、ＬＩ＋から選択することができる。対イオンの組み合わせを使用することができる。
【００２７】
式Ｉ又は式ＩＩの錯体は、［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（３−ブロモ−２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−５，５’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−４，４’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−４−ＣＯＯＨ）（ピリジン−４−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ２、［ＯｓＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（Ｃ２Ｏ４）］、Ｋ［ＲｕＩＩＩ（Ｃ２Ｏ４）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）２］、［ＲｕＩＩＩ（１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン）（２，４−ペンタンジオネート）（ピリジン）］（ＮＯ３）２から選択することができる。
【００２８】
式Ｉ又は式ＩＩの錯体は、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン）（２，４−ペンタンジオネート）（ピリジン）］（ＮＯ３）２又は［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ２から選択することができる。
【００２９】
レドックスメディエータは、電気化学的センサに使用することができる。電気化学的センサは微小帯電極を含むことができる。電気化学的センサは、電気化学的バイオセンサであることができる。電気化学的バイオセンサを用いて体液、環境試料、食品及び飲料、獣医学的試料、医薬内の検体を検知することができる。
【００３０】
本発明の第三の態様によれば、上記に定義した通りの式Ｉ又は式ＩＩのルテニウム錯体の、バイオセンサ内での使用が提供される。
式Ｉ又は式ＩＩの錯体は、ｐＨ６〜１０で使用することができる。式Ｉ又は式ＩＩの錯体は、ｐＨ７〜９で使用することができる。
【００３１】
バイオセンサは、適合した生化学的検体と共に使用することができる。検体は生体液内に見出すことができ、また、酵素、酵素基質、抗原、抗体、核酸配列、コレステロール、コレステロールエステル、リポ蛋白、中性脂肪又は微生物のいずれかからも選択することができる。
【００３２】
本発明の第四の態様によれば、検体を測定するための検知システムであって、
（ａ）  式Ｉ又は式ＩＩに従うＲｕ含有化合物又はＯｓ含有化合物の群から選択されたレドックスメディエータを含む溶液に、検体を含む試料を接触されるステップと、
（ｂ）  接触した試料を、酵素が検体に作用するようになる条件下で培養するステップと、
（ｃ）  ステップ（ｂ）で培養した試料を、測定可能な信号変化が生じる条件に掛けるステップと、
（ｄ）  その結果生じた信号を測定するステップとを含む検知システムが提供される。
【００３３】
測定可能な信号は、電気化学、比色分析、熱、インピーダンス測定、容量又は分光の各信号であることができる。測定可能な信号は、微小帯電極で測定される電気化学的信号であることができる。
【００３４】
本発明の第五の態様によれば、式Ｉの錯体が提供され、
【００３５】
【化７】
2009520792.tif 000005
式中、Ｍはルテニウム又はオスミウムであって０、１、２、３又は４の酸化状態を有し、
ｘ及びｎは独立に、１〜６から選択された整数であり、ｙは１〜５から選択された整数であり、ｍは−５〜＋４の整数であり、ｚは−２〜＋１の整数であり、
Ａは一座又は二座の芳香族配位子であって１個又は２個の窒素原子を含み、
Ｂは、窒素含有複素環式配位子を除く１個以上の適切な配位子であるように独立に選択され、
Ｘは適切な対イオンであって、
任意にＡは、置換又は無置換のアルキル、アルケニル又はアリール基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＮＨ２、−ＳＨ、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキサミド、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ、アルキルチオから、独立に選択された１〜８個の基で置換され、
配位原子数は６である。
【００３６】
配位子Ａは、１個以上のＣＯ２Ｒ２基で置換した一座配位子、又は１個以上のＣＯ２Ｒ２基で任意に置換した二座若しくは三座配位子であることができ、前記１個以上のＣＯ２Ｒ２基のＲ２は、Ｈであるように選択することができる。
【００３７】
配位子Ａは、ニコチン酸、イソニコチン酸、５−カルボキシ−ニコチン酸、６−ピリジル−ニコチン酸、２，２’−ビピリジン−５，５’−ビス−カルボン酸、２，２’−ビピリジン−４，４’−ビス−カルボン酸、２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン−３，９−ビス−カルボン酸から選択することができる。
【００３８】
本発明の第六の態様によれば、式ＩＩの錯体が提供され、
【００３９】
【化８】
2009520792.tif 000006
式中、Ｍはルテニウム又はオスミウムであって０、１、２、３又は４の酸化状態を有し、
ｘ及びｎは独立に、１〜６から選択された整数であり、ｙは０〜５から選択された整数であり、ｍは−５〜＋４の整数であり、ｚは−２〜＋１の整数であり、
Ａは二座、三座、四座、五座又は六座配位子であって、式Ｒ１ＲＮ（Ｃ２Ｈ４ＮＲ）ＷＲ１を有する直鎖式、又は式（ＲＮＣ２Ｈ４）ｖ、（ＲＮＣ２Ｈ４）ｐ（ＲＮＣ３Ｈ６）ｑ若しくは［（ＲＮＣ２Ｈ４）（ＲＮＣ３Ｈ６）］ｓを有する環式であることができ、ｗは１〜５の整数であり、ｖは３〜６の整数であり、ｐ及びｑは１〜３の整数であってｐとｑとの和が４であり、ｓは２又は３であり、Ｒ及びＲ１は水素又はメチルであり、
Ｂは、適切な配位子であるように独立に選択され、
Ｘは適切な対イオンであって、
任意にＡは、置換又は無置換のアルキル、アルケニル又はアリール基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＮＨ２、−ＳＨ、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、アルコキシ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキサミド、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシアミノ、アルキルチオから、独立に選択された１〜７個の基で置換され、
配位原子数は６である。
【００４０】
配位子Ａは二座、三座又は四座配位子であることができて、式Ｒ１ＲＮ（Ｃ２Ｈ４ＮＲ）ＷＲ１を有する直鎖式、又は式（ＲＮＣ２Ｈ４）ｖ、（ＲＮＣ２Ｈ４）ｐ（ＲＮＣ３Ｈ６）ｑ若しくは［（ＲＮＣ２Ｈ４）（ＲＮＣ３Ｈ６）］ｓを有する環式であることができ、ｗは１〜３の整数であり、ｖは３又は４であり、ｐ及びｑは１〜３の整数であってｐとｑとの和が４であり、ｓは２又は３である。
【００４１】
配位子Ａは、１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン又は１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、１，２−ジメチルエチレンジアミン若しくは１，１，２，２−テトラメチルエチレンジアミンから選択することができる。
【００４２】
配位子Ｂは、ＮＨ３若しくはＮＭｅ３のようなアミン配位子から、又はＣＯ、ＣＮ、ハロゲン、アセチルアセトナト（ａｃａｃ）、３−ブロモ−アセチルアセトナト（Ｂｒａｃａｃ）、シュウ酸塩、１，４，７−トリエチレンクラウンエーテル、シュウ酸塩若しくは５−クロロ−８−ヒドロキシキノリンから選択することができる。
【００４３】
配位子Ａ又はＢが二座であるように選択した場合、錯体の配位はシス形又はトランス形であることができる。
式Ｉ又は式ＩＩの錯体内の金属の酸化状態は、２＋又は３＋であるように選択することができる。式Ｉ又は式ＩＩの錯体内の金属の酸化状態は、３＋であるように選択することができる。
【００４４】
配位子Ａ及びＢは、式Ｉ又は式ＩＩの錯体上の全電荷が＋２、＋１、０、−１、−２及び−３の群から選択されるように、選択することができる。
対イオンは、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−、ＮＨ４＋、ＮＲ４＋、ＰＦ６−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＳＯ４２−、ＣｌＯ４−、Ｋ＋、Ｎａ＋、ＬＩ＋から選択することができる。対イオンの組み合わせを使用することができる。
【００４５】
式Ｉ又は式ＩＩの錯体は、［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（３−ブロモ−２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−５，５’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−４，４’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−４−ＣＯＯＨ）（ピリジン−４−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ２、［ＯｓＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（Ｃ２Ｏ４）］、Ｋ［ＲｕＩＩＩ（Ｃ２Ｏ４）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）２］、［ＲｕＩＩＩ（１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン）（２，４−ペンタンジオネート）（ピリジン）］（ＮＯ３）２から選択することができる。
【００４６】
当然のことながら、式Ｉ又は式ＩＩの各錯体内において金属は、必要に応じてルテニウム又はオスミウムであるように選択できる。加えて、対応するルテニウム錯体又はオスミウム錯体を形成するために、上記特定の錯体内の金属を変更することができる。錯体内のＲｕをＯｓに置換することにより、錯体の作用電位（working potential）が約−４００ｍＶ〜−６００ｍＶだけ変化すること、及び、必要な場合には金属中心の周囲の配位子を変更することにより、メディエータが−３００ｍＶ〜＋３００ｍＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの作用電位に達するまで作用電位を逆向きに更に微調整できることを、当業者であれば正しく理解するはずである。
【００４７】
例えば、［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］のＥ１／２電位は−１７５ｍＶである。［ＲｕＩＩＩ（３−Ｂｒａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］は［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］に類似するが、ａｃａｃの代わりにブロモａｃａｃを有し、そのＥ１／２電位は−１４２ｍＶである。
【００４８】
［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−４−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−４−ＣＯＯ）］は、［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］に類似するが、異なる場所にＣＯＯＨを有し（ｐｙ−３−ＣＯＯＨの代わりにｐｙ−４−ＣＯＯＨを有し）、そのＥ１／２電位は−１６５ｍＶである。作用電位はＥ１／２よりも約１５０ｍＶ高くなければならないことを、当業者であれば理解するはずである。
【００４９】
本明細書において説明したＲｕ錯体に対応する錯体は、次の通りである。［ＯｓＩＩＩ（ＮＨ３）５（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＯｓＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＯｓＩＩＩ（３−ブロモ−２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＯｓＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−５，５’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＯｓＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン−４，４’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＯｓＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（２，２’−ビピリジン）］Ｃｌ、［ＯｓＩＩＩ（２，４−ペンタンジオネート）２（ピリジン−４−ＣＯＯＨ）（ピリジン−４−ＣＯＯ）］、［ＯｓＩＩＩ（５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）（ピリジン−３−ＣＯＯ）］、［ＯｓＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２，４−ペンタンジオネート）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＯｓＩＩＩ（１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン）（２．４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ２、［ＯｓＩＩ（２，２’−ビピリジン）２（２，４−ペンタンジオネート）］Ｃｌ、［ＯｓＩＩ（２．２’−ビピリジン）２（Ｃ２Ｏ４）］、Ｋ［ＯｓＩＩＩ（Ｃ２Ｏ４）２（ピリジン−３−ＣＯＯＨ）２］、［ＯｓＩＩＩ（１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン）（２，４−ペンタンジオネート）（ピリジン）］（ＮＯ３）２。
【００５０】
本明細書で使用される用語は次のように定義される。
「アルキル」という用語は、直鎖又は分岐鎖の飽和脂肪族炭化水素を含む。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、第三ブチル、シクロペンチル及び類似の基が含まれる。別途記載のない限り、「アルキル」という用語はアルキル基とシクロアルキル基との両方を含む。
【００５１】
「アルコキシ」という用語は、酸素原子によりアルキル基が残りの構造に結びついている状態を指す。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、第三ブトキシ、シクロペントキシ及び類似の基が含まれる。加えて、別途記載のない限り、「アルコキシ」という用語は、アルコキシ基とシクロアルコキシ基との両方を含む。
【００５２】
「アルケニル」という用語は、直鎖又は分岐鎖の不飽和脂肪族炭化水素であって少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有するものを指す。アルケニル基の例には、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−メチル−１−プロペニル、シクロペンテニル及び類似の基が含まれる。加えて、別途記載のない限り、「アルケニル」という用語は、アルケニル基とシクロアルケニル基との両方を含む。
【００５３】
「反応性基」とは、分子の官能基であって、別の化合物と反応して当該他方化合物の少なくとも一部分を当該分子に結合させることのできるものである。反応性基には、カルボキシ、活性エステル、ハロゲン化スルホニル、スルホン酸エステル、イソシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、エポキシド、アジリジン、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、アミノ、アクリルアミド、チオール、アジ化アシル、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ハロゲン化アルキル、イミダゾール、ピリジン、フェノール、アルキル、スルホン酸塩、ハロトリアジン、イミドエステル、マレイミド、ヒドラジド、ヒオドロキシ及び光反応性アジドアリール基が含まれる。当該技術分野において理解される通りの活性エステルには通例、スクシンイミジル、ベンゾトリアゾリル又はアリールのエステルであってスルホ基、ニトロ基、シアノ基又はハロ基のような電子吸引基で置換したものが含まれる。
【００５４】
「ａｃａｃ」という用語は、２，４−ペンタンジオンの共役塩基であるアセチルアセトナト・アニオンを指す。
「置換」官能基（例えば置換アルキル、アルケニル又はアルコキシ基）は、次の基から選択された少なくとも１つの置換分を含む。すなわち、ハロゲン、アルコキシ、メルカプト、アリール、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、アルカノイルアミノ、ジアルカノイルアミノ、アリールカルボキミド、ヒドラジノ、アルキルチオ、アルケニル及び反応性基。
【００５５】
「生体液」とは、その中の検体を測定することができる体液又は体液誘導体、例えば血液、間質液、血漿、皮膚液、汗及び涙である。
「電気化学的センサ」とは、電気化学的な酸化又は還元反応を介して試料内の検体の存在を検知するか又はその濃度若しくは量を測定するように構成された装置である。これらの反応は通常、検体の量又は濃度に相関させることのできる電気的信号に変換することができる。
【００５６】
「レドックスメディエータ」とは、検体又は検体還元酵素若しくは検体酸化酵素と電極との間において、直接的に又は１つ以上の追加的な電子移動剤を介して電子を運搬する電子移動剤である。
【００５７】
「電解」とは、電極において直接に、又は１つ以上の電子移動剤（例えばレドックスメディエータ又は酵素）を介して行われる化合物の電気酸化又は電気還元である。
「参照電極」という用語は、別途指定のない限り、ａ）参照電極と、ｂ）対電極としても機能できる参照電極（すなわち対・参照電極）との両方を含む。
【００５８】
「対電極」という用語は、別途指定のない限り、ａ）対電極と、ｂ）参照電極としても機能できる対電極（すなわち対・参照電極）との両方を含む。
「測定可能な信号」という用語は、電極電位、蛍光、スペクトル吸収、発光、光散乱、ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、熱変化又は圧電変化のような容易に測定することのできる信号を意味する。
【００５９】
「生化学的検体」という用語は、生体液内に存在しうる測定可能な化学物質又は生化学的物質を含み、また、酵素、抗体、ＤＮＡ配列又は微生物のいずれかをも含む。
一座、二座及び三座とは、本発明に従う場合、当該技術分野において一般に認められた意味を持つ。すなわち、一座配位子は、１個の潜在的配位原子を有する化学部分又は基として定義される。２個以上の潜在的配位原子は多座配位子と呼ばれ、潜在的配位原子の数が、二座、三座などという用語で示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
本発明において使用できる既知のバイオセンサは、例えばストリップから成り、当該ストリップに４つの試薬ウェルと共通の疑似基準とがあって各ウェルが独自の管状の微小帯作用電極を有することもできる。ストリップの感知成分は、異なる特別配合試薬を各ウェル内で乾燥させることにより提供され、当該試薬は少なくとも、試験試料内の特定の検体と相互作用する酵素及びメディエータを含む。異なる試薬を各ウェルに加えて乾燥させることが潜在的に可能であるために、単一の試験試料を用いて多検体試験を完了できることが明らかである。ウェルの数は変更可能で、それに伴い、独自試験の数も変更可能であり、例えば、１〜６個のウェルを用いるセンサを使用することもできる。
【００６１】
通常は作用電極及び参照電極付きの、従来型の微小電極を使用することができる。作用電極は通例、パラジウム、プラチナ、金又は炭素で作成される。対電極は通常、炭素、Ａｇ／ＡｇＣｌ、Ａｇ／Ａｇ２ＳＯ４、パラジウム、金、プラチナ、Ｃｕ／ＣｕＳＯ４、Ｈｇ／ＨｇＯ、Ｈｇ／ＨｇＣｌ２、Ｈｇ／ＨｇＳＯ４又はＺｎ／ＺｎＳＯ４である。
【００６２】
好ましい微小電極では作用電極は、前記微小電極を形成するレセプタクルの壁内にある。本発明において使用できる微小電極の例は、ＷＯ０３／０９７８６０において開示された電極である。
【実施例】
【００６３】
本発明の実施例を、添付の図を参照して単なる例としてのみ説明する。
全ての溶液は、ミリポアシナジー１８５浄水システムによるミリＱ試薬水、又は試薬等級の溶媒を用いて調製された。全ての固体は、更に精製することなく受け取ったままの状態で使用された。メディエータは、酵素仲介を用いてか又は酵素カスケードを用いて仲介を試験した。酵素カスケード用の電極及び配合は、出願人らの同時係属出願ＷＯ２００３５６３１９において記載されている。
【００６４】
次のようなメディエータを合成した。
［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（３−Ｂｒａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ−５，５’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ−４，４’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−４−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−４−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（５−Ｃｌ−ＱｕＩｎ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］、［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ６−ｔｅｔ）（ａｃａｃ）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）、［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ６−ｔｅｔ）（ａｃａｃ）］Ｃｌ２、［ＯｓＩＩ（２，２’−ｂｐｙ）２（ａｃａｃ）］Ｃｌ、［Ｒｕ（２，２’−ｂｐｙ）２（ａｃａｃ）］Ｃｌ、［ＲｕＩＩ（２，２’−ｂｐｙ）２（Ｃ２Ｏ４）］、Ｋ［ＲｕＩＩＩ（Ｃ２Ｏ４）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）２］及び［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ３−ＴＡＣＮ）（ａｃａｃ）（ｐｙ）］（ＮＯ３）２であって、
式中、ｐｙ＝ピリジン、３−Ｂｒａｃａｃ＝３−ブロモ−２，４−ペンタンジオネート、ａｃａｃ＝２，４−ペンタンジオネート、２，２’−ｂｐｙ＝２，２’−ビピリジン、２，２’−ｂｐｙ−５，５’−（ＣＯＯＨ）２＝２，２’−ビピリジン−５，５’−ジカルボン酸、Ｍｅ６−ｔｅｔ＝１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、Ｍｅ３−ＴＡＣＮ＝１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン、５−Ｃｌ−ＱｕＩｎ＝５−クロロ−８−ヒドロキシキノリンであるもの。
【００６５】
各錯体について、特に対応するルテニウム錯体又はオスミウム錯体は、同じ合成手順に従い単に対応するルテニウム又はオスミウム化合物に出発化合物を変更するだけで、調製することができる。
【００６６】
≪［ＲｕＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）］（ＰＦ６）２及び［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）の合成≫
【００６７】
【化９】
2009520792.tif 000007
≪材料≫
ＲｕＣｌ３・３Ｈ２Ｏ（ヘレウス）
ヒドラジン一水和物（８０％、ＲＤＨ）
ニコチン酸（アルドリッチ）
ｐ−トルエンスルホン酸銀（アルドリッチ）
トリフルオロメタンスルホン酸銀（アルドリッチ）
ヘキサフルオロリン酸アンモニウム（アルドリッチ）
クロロペンタアミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物である［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｃｌ］Ｃｌ２を、文献の方法（Ａ．Ｄ．アレン、Ｉｎｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．１９７０、１２、２）に従って三塩化ルテニウムから調製し、０．１ＭのＨＣｌからの４０℃での再晶出により精製した。
【００６８】
［ＲｕＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）］（ＰＦ６）２
［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｃｌ］Ｃｌ２（１．０ｇ、３．４ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの水に懸濁した懸濁液に、２等量のｐ−トルエンスルホン酸銀（１．９ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合液を室温で１時間撹拌した後、溶液を濾過してＡｇＣｌを除去した。その結果生じた淡黄色の溶液をアルゴンで脱気した後、溶液に４倍過剰のニコチン酸（ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ、１．６７ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）と、１２〜１５片の粒状亜鉛アマルガム（約１０ｇ）とを加えた。混合液をＡｒ下において室温で２時間撹拌した後、溶液を濾過した。その結果生じた赤橙色の溶液に、過剰のヘキサフルオロリン酸アンモニウム（ＮＨ４ＰＦ６、３ｇ）を加え、混合液を４℃で一晩放置した。濾過してアセトン／ジエチルエーテルからこの粗生成物を再晶出させた後、０．６ｇの［ＲｕＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）］（ＰＦ６）２を得た。（収率：２９．５％）
［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）
［ＲｕＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）］（ＰＦ６）２（１６０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのアセトンに溶解した溶液に、１．３等量のトリフルオロメタンスルホン酸銀（ＡｇＣＦ３ＳＯ３、８９ｍｇ）を加え、混合液を暗所において室温で１時間撹拌した。遠心分離により銀を除去し、淡黄色の溶液を得た。その結果生じた溶液を２５０ｍＬのジメチルエーテルに滴下で加えながら撹拌し、混合液を４℃で３時間放置して淡黄色の沈殿を得た。生成物をジエチルエーテルで洗浄し、アセトン及びジエチルエーテルから再晶出させた。（収率：９０ｍｇ、４４％）
≪［ＲｕＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）２］の合成≫
【００６９】
【化１０】
2009520792.tif 000008
Ｒｕ（ａｃａｃ）３（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）とニコチン酸（４９４ｍｇ、４ｍｍｏｌ）とをエタノールに混合した混合液を、数片の粒状亜鉛アマルガムと共にアルゴン下で５時間還流した。その結果生じた赤褐色の混合液を冷却し、濾過によりＺｎ／Ｈｇを除去した。赤褐色の沈殿を濾過により収集し、０．１ＭのＨＣｌ、水及びジエチルエーテルで洗浄した。（粗生成物収率：２５０ｍｇ、９１％、Ｚｎ／Ｈｇ残骸を含む）。
【００７０】
≪［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］の合成≫
シス−［ＲｕＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）２］（２００ｍｇ）を０．１ＭのＮＨ３に溶解した後、濾過した。赤褐色の濾過液を空気中で一晩（約１８時間）撹拌し、濃紫色の溶液を得た。溶液を濾過して蒸発乾固させた。濃紫色の残分を収集し、アセトン及びジエチルエーテルで洗浄した後、空気乾燥させた。（収量：１５０ｍｇ）
≪シス−［ＲｕＩＩＩ（３−Ｂｒａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯ）（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）］の合成≫
【００７１】
【化１１】
2009520792.tif 000009
シス−［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯ）（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）］（９３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのＨ２Ｏに溶解した。その後、４．３ｍＬの０．０４１Ｍ臭素水（０．１７ｍｍｏｌのＢｒ２）を加えた。その結果生じた青紫色の懸濁液を空気中で一晩撹拌した。青色の沈殿を収集し、水で洗浄した。収率＝２５％。Ｅ０＝０．１８Ｖ対ＮＨＥ、ｐＨ＝８（リン酸緩衝液）において。
【００７２】
≪［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（５，５’−（ＣＯＯ）（ＣＯＯＨ）−２，２’−ｂｐｙ］の合成≫
【００７３】
【化１２】
2009520792.tif 000010
Ｒｕ（ａｃａｃ）３（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と５，５’−（ＣＯＯＨ）２−２，２’−ｂｐｙ（１２２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）とを３０ｍＬのエタノールに混合した赤色の混合液を、数片の粒状Ｚｎ／Ｈｇアマルガムと共にアルゴン下で一晩還流した。その結果生じた褐色の混合液を冷却し、亜鉛アマルガムをピンセットで除去した。褐色の沈殿を濾過により収集し、エタノール及びジエチルエーテルで洗浄した。褐色の固体をその後、５０ｍＬの０．１ＭのＮＨ３に溶解し、濾過した。緑色の濾過液を空気中で一晩撹拌し、赤色の溶液を得た。溶液を濾過した後、蒸発乾固させた。紫〜赤色の沈殿を収集し、アセトン及びジエチルエーテルで洗浄した後、空気乾燥させた。収率：２２％。Ｅ０＝０．１５Ｖ対ＮＨＥ、ｐＨ＝８（リン酸緩衝液）において。
【００７４】
［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ）］（ＰＦ６）
【００７５】
【化１３】
2009520792.tif 000011
［ＲｕＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ）］（７５ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解した。ヘキサフルオロリン酸フェロセニウム（５４．６ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解した溶液を、［ＲｕＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ）］の溶液に少しずつ加えながら、室温で激しく撹拌した。数分後、溶液の色は深緑色から赤みを帯びた色に変化した。更に１０分間撹拌した後、溶液を濾過し、ジエチルエーテル（６０ｍＬ）を加え、沈殿を遠心分離により収集し、ジエチルエーテルで洗浄した。（収率＝５０％）
≪［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ）］Ｃｌの合成≫
［Ｂｕ４Ｎ］Ｃｌ（４６３ｍｇ、１．６６７ｍｍｏｌ）をアセトン（１５ｍＬ）に溶解した溶液を、［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ）］（ＰＦ６）（２００ｍｇ、０．３３３ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのアセトンに溶解した溶液に滴下で加えながら、室温で撹拌した。紫色の沈殿を濾過により収集し、アセトン及びジエチルエーテルで洗浄した後、空気乾燥させた。沈殿をアセトニトリルに溶解し、ジエチルエーテルによる蒸気拡散を介した晶出によって精製した。（収率＝５０％）
≪［ＲｕＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−４−ＣＯＯＨ）２］の合成≫
【００７６】
【化１４】
2009520792.tif 000012
Ｒｕ（ａｃａｃ）３（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）とｐｙ−４−ＣＯＯＨ（１２４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）とを４０ｍＬのエタノールに混合した赤色の混合液を、数片の粒状Ｚｎ／Ｈｇアマルガムと共にアルゴン下で４時間還流した。その結果生じた濃紫色の混合液を冷却し、亜鉛アマルガムをピンセットで除去した。暗褐色の沈殿を濾過により収集し、０．１ＭのＨＣｌ及び水に続きジエチルエーテルで洗浄した。（粗生成物の収率＝２５０ｍｇ、９１％、Ｚｎアマルガムを含む）
≪［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−４−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−４−ＣＯＯ）］の合成≫
ＲｕＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−４−ＣＯＯＨ）２（２５０ｍｇ）を０．１ＭのＮＨ３に溶解した後、濾過した。赤褐色の濾過液を空気中で一晩撹拌し、紫色の溶液を得た。溶液を濾過した後、蒸発乾固させた。紫色の沈殿を収集し、アセトン及びジエチルエーテルで洗浄した後、空気乾燥させた。収率＝５０％。Ｅ０＝０．１２Ｖ対ＮＨＥ、ｐＨ＝８（リン酸緩衝液）において。
【００７７】
≪［ＲｕＩＩＩ（５−Ｃｌ−ＱｕＩｎ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］の合成≫
【００７８】
【化１５】
2009520792.tif 000013
ニコチン酸（９２．３ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）とＲｕ（５−Ｃｌ−ＱｕＩｎ）３（２００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）とをエタノール（２５ｍＬ）に溶解した溶液を、数片の亜鉛アマルガムと共にアルゴン下で２４時間還流した。その結果生じた明褐色の固体を濾過により単離し、エタノールで洗浄し、空気乾燥させた。褐色の固体を水（１５ｍＬ）に懸濁し、ＫＯＨ（０．２ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間撹拌した後、その結果生じた濃褐色の溶液を濾過し、回転器で蒸発乾固させた。残分をエタノールで洗浄し、１：１のメタノール／エタノールに溶解した後で溶液を元の体積の約５０％近くまでゆっくりと蒸発させることにより再晶出させた。固体を真空中で６０℃で乾燥させた。収率：５７％（１５０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）。ＭＳ：ｍ／ｚ６３４（Ｍ＋１）。Ｅ０＝０．０９７Ｖ対ＮＨＥ、ｐＨ＝８（リン酸緩衝液）において。
【００７９】
≪［ＲｕＩＩ（Ｔｅｔ−Ｍｅ６）（ａｃａｃ）］（ＰＦ６）の合成≫
【００８０】
【化１６】
2009520792.tif 000014
シス−［ＲｕＩＩＩ（Ｔｅｔ−Ｍｅ６）Ｃｌ２］（ＰＦ６）（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）とＬＩ（ａｃａｃ）（４０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）とを１０ｍＬのエタノールに混合した黄色の混合液を、一晩還流した。その結果生じた褐色の溶液を冷却した後、濾過した。濾過液を約１ｍＬに濃縮し、ジエチルエーテルを加え、褐色の沈殿を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄した後、空気乾燥させた。収率＝８５％。ＲｕＣ１７Ｈ３７Ｎ４Ｏ２ＰＦ６に関する計算値：Ｃ３５．４８％、Ｈ６．４８％、Ｎ９．７３％、検出値：Ｃ３５．３９％、Ｈ６．３７％、Ｎ９．６０％。
【００８１】
≪［ＲｕＩＩＩ（Ｔｅｔ−Ｍｅ６）（ａｃａｃ）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）の合成≫
［ＲｕＩＩ（Ｔｅｔ−Ｍｅ６）（ａｃａｃ）］（ＰＦ６）（１２５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのアセトンに溶解した溶液に、ＡｇＣＦ３ＳＯ３（６７ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。褐色の溶液は直ちに青色に変化し、この混合液を暗所で３０分間撹拌した。溶液内の金属銀を遠心分離により除去した後、青色の溶液を、約８０ｍＬのジメチルエーテルにゆっくりと加えた。青色の沈殿を濾過により収集し、ジメチルエーテルで洗浄した後、真空中で一晩乾燥させた。収率＝７０％。Ｅ０＝０．１８Ｖ対ＮＨＥ、ｐＨ＝８（リン酸緩衝液）において。
【００８２】
≪［ＲｕＩＩＩ（Ｔｅｔ−Ｍｅ６）（ａｃａｃ）］Ｃｌ２の合成≫
［Ｒｕ（Ｍｅ６−ｔｅｔ）（ａｃａｃ）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）をＭｅＯＨに溶解した溶液に、［ｎ−Ｂｕ４Ｎ］Ｃｌを加えることにより、［Ｒｕ（Ｍｅ６−ｔｅｔ）（ａｃａｃ）］Ｃｌ２の沈殿が生じ、当該沈殿を濾取し、真空中で一晩乾燥させた。
【００８３】
≪［ＯｓＩＩ（ａｃａｃ）（ｂｉｐｙ２）Ｃｌの合成≫
【００８４】
【化１７】
2009520792.tif 000015
［ＯｓＩＩ（ｂｉｐｙ）２Ｃｌ２］（０．２５ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を水（２０ｍＬ）及びアルコール（１０ｍＬ）に入れた中に、アセチルアセトン（１ｍＬ）を加え、混合液を過剰のＣａＣＯ３（０．５ｇ）の存在下で６時間還流した。揮発性物質を蒸発除去し、残分をクロロホルム（３０ｍＬ）で抽出した。非常に濃い赤褐色のクロロホルム抽出液を濾過し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて少量にし、ジエチルエーテルを加えると［ＯｓＩＩ（ｂｐｙ）２（ａｃａｃ）Ｃｌ］が暗橙〜褐色の小板として晶出した。その後、これらの小板を濾取し、空気乾燥させた。収率：６３％（０．１７６ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）。ＭＳ：ｍ／ｚ６０３（Ｍ）。Ｅ０＝０．３１Ｖ対ＮＨＥ、ｐＨ＝８（リン酸緩衝液）において。
【００８５】
≪［ＲｕＩＩ（ｂｉｐｙ）２（ａｃａｃ）］Ｃｌの合成≫
【００８６】
【化１８】
2009520792.tif 000016
［Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２Ｃｌ２］（３００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を水（２０ｍＬ）及びエタノール（２０ｍＬ）に懸濁した懸濁液に、アセチルアセトン（１ｍＬ、９．７０ｍｍｏｌ）を加え、混合液を過剰のＣａＣＯ３の存在下で６時間還流した。混合液を濾過し、濾過液を回転器で蒸発乾固させた。残分をクロロホルム（３０ｍＬ）で抽出し、濾過した。濾過液をＭｇＳＯ４上で乾燥させた後、蒸発させて約５ｍＬにした。ジエチルエーテルを加えると、［ＲｕＩＩ（ｂｉｐｙ）２（ａｃａｃ）Ｃｌ］が暗褐色の結晶性固体としてゆっくりと晶出させた。固体を、真空中において６０℃で乾燥させた。収率：７０％（２３６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）。ＭＳ：ｍ／ｚ５１３（Ｍ）。Ｅ０＝０．７１Ｖ対ＮＨＥ、ｐＨ＝８（リン酸緩衝液）において。
【００８７】
≪ＲｕＩＩ（ｂｉｐｙ）２ｏｘの合成≫
【００８８】
【化１９】
2009520792.tif 000017
Ｒｕ（ｂｉｐｙ）２Ｃｌ２（０．２ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を、水（２０ｍＬ）及びエタノール（１０ｍＬ）に懸濁し、混合液を２分間沸騰させた。シュウ酸カリウム二水和物（５２．１ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加え、混合液を還流下で２時間加熱し、鮮赤色の溶液を得た。冷却し次第、緑色の結晶性固体が得られ、当該固体を濾取し、水及びジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥させた。収率：９４％、０．１９ｇ。ＭＳ：ｍ／ｚ５０３．１（Ｍ）。Ｅ０＝３２．５ｍＶ対Ｆｃ／Ｆｃ＋、０．１ＭのＴＢＨＰを含むアセトニトリル内において。
【００８９】
≪Ｋ［ＲｕＩＩＩ（ｏｘ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）２］の合成≫
【００９０】
【化２０】
2009520792.tif 000018
Ｋ３［Ｒｕ（ｏｘ）３］（５００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）とｐｙ−３−ＣＯＯＨ（２５５ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）とを５０ｍＬのＨ２０に溶解した溶液を、空気中で一晩還流した。その結果生じた褐色の溶液を冷却した後、濾過した。濾過液を約１ｍＬに濃縮し、アセトンを加え、淡褐色の沈殿を濾取し、アセトン及びジエチルエーテルで洗浄した。粗生成物をＨ２０／アセトンから３回再晶出させた。収率：７０％。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝６０２（Ｍ＋Ｋ）＋。ＲｕＩＩＩ／ＩＩのＥ１／２＝０．１６Ｖ対ＮＨＥ、リン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０５）内において。
【００９１】
≪［ＲｕＩＩ（ＤＭＳＯ）４Ｃｌ２］の調製≫
三塩化ルテニウム三水和物（１．０ｇ）を、ジメチルスルホキシド（５ｍＬ）内で５分間還流した。体積を真空中で半減させ、アセトン（２０ｍＬ）を加え、黄色の沈殿を得た。分離した黄色の錯体を濾取し、アセトン及びエーテルで洗浄し、真空乾燥させた。
【００９２】
≪［ＲｕＩＩＩ（Ｌ）Ｃｌ３］の調製≫
ＲｕＩＩ（ＤＭＳＯ）４Ｃｌ２（１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を無水エタノール（２５ｍＬ）に混合した混合液に、Ｌ（０．８０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）（Ｌ＝１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン）を加えながら撹拌した。懸濁液を、深赤色〜褐色の溶液が得られるまで、１時間掛けて６０℃まで加熱し、当該溶液をその後、２時間還流した。溶媒を減圧下で回転器により蒸発除去した。赤〜橙色の残分を濃ＨＣｌで処理し、空気の存在下において還流下で３０分間加熱した。橙色の微結晶性固体を濾過により収集し、水、エタノール及びジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥させた。
【００９３】
≪［ＲｕＩＩＩ（Ｌ）（ａｃａｃ）（ＯＨ）］ＰＦ６・Ｈ２Ｏの調製≫
ナトリウム２，４−ペンタンジオネート（ａｃａｃ）（３．０ｇ、約２４ｍｍｏｌ）を水（６０ｍＬ）に溶解した溶液に、固体ＲｕＩＩＩ（Ｌ）Ｃｌ３（２．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えながら、周囲温度で撹拌した。混合液を、透明な赤色の溶液が得られるまで３．５時間撹拌した。ＮａＰＦ６（２．０ｇ）をＨ２Ｏ（５ｍＬ）に溶解した溶液を加え、０℃まで冷却すると、橙色の微結晶の沈殿が始まり、当該微結晶を濾過により収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥させた。
【００９４】
≪［ＲｕＩＩ（Ｌ）（ａｃａｃ）（ｐｙ）］ＰＦ６の調製≫
無水エタノール／ピリジン（５ｍＬ）（４：１、ｖ／ｖ）内に［ＲｕＩＩＩ（Ｌ）（ａｃａｃ）（ＯＨ）］ＰＦ６（１０５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を含む溶液を加熱し、１０片の亜鉛アマルガムの存在下においてアルゴン雰囲気下で４時間還流した。周囲温度まで冷却した後、赤色の微結晶性沈殿を濾過により収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥させた。生成物を、アセトン／ジエチルエーテルから再晶出させた。収率：９４ｍｇ、７９％。ＥＳＩ／ＭＳ（正イオンモード）：ｍ／ｚ＝４５１［Ｍ］＋。ＲｕＩＩＩ／ＩＩのＥ１／２＝−０．１８Ｖ対Ｆｃ＋／０、０．１ＭのＴＢＡＨを含むＣＨ３ＣＮ内において。
【００９５】
≪［ＲｕＩＩＩ（Ｌ）（ａｃａｃ）（ｐｙ）］（ＮＯ３）２の調製≫
【００９６】
【化２１】
2009520792.tif 000019
ＡｇＣＦ３ＳＯ３（４２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をアセトン（１ｍＬ）に溶解した溶液を、［ＲｕＩＩ（Ｍｅ３−ＴＡＣＮ）（ａｃａｃ）（ｐｙ）］ＰＦ６（９０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を含む橙色のアセトン溶液（３ｍＬ）にゆっくりと加えた。５分間撹拌した後、固体［ｎ−Ｂｕ４Ｎ］ＮＯ３（３０４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を加え、紫色の沈殿を濾取し、アセトンに続きジエチルエーテルで洗浄した。生成物を、メタノール／ジエチルエーテルから再晶出させた。収率：６４ｍｇ、８７％。ＥＳＩ／ＭＳ（正イオンモード）：ｍ／ｚ＝４５１．０［Ｍ］＋、２２５．４［Ｍ］２＋。ＲｕＩＩＩ／ＩＩのＥ０＝０．２Ｖ対ＮＨＥ、ｐＨ８．０５リン酸緩衝液内において。
【００９７】
≪［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（４，４’−（ＣＯＯ）（ＣＯＯＨ）−２，２’−ｂｐｙ）］の合成≫
Ｒｕ（ａｃａｃ）３（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と４，４’−（ＣＯＯＨ）２−２，２’−ｂｐｙ（１２２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）とを３０ｍＬのエタノールに混合した赤色の混合液を、数片の粒状Ｚｎ／Ｈｇアマルガムと共にアルゴン下で一晩還流した。その結果生じた褐色の混合液を冷却し、亜鉛アマルガムをピンセットで除去した。褐色の沈殿を収集し、エタノール及びジエチルエーテルで洗浄した。褐色の固体をその後、５０ｍＬの０．１ＭのＮＨ３に溶解し、濾過し、空気中で一晩撹拌して紫〜赤色の溶液を得た。溶液を濾過した後、蒸発乾固させた。紫色の沈殿を収集し、アセトン及びジエチルエーテルで洗浄した後、空気乾燥させた。収率：４５％。Ｅ０＝０．２１Ｖ対ＮＨＥ、ｐＨ＝８（リン酸緩衝液）において。
【００９８】
≪電気化学的試験≫
≪サイクリックボルタンメトリーを用いる仲介試験（ＰｄＲ）≫
還元型で合成したメディエータ、すなわち、［ＲｕＩＩＩ（５−Ｃｌ−ＱｕＩｎ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］及び［ＯｓＩＩ（２，２’−ｂｐｙ）２（ａｃａｃ）］Ｃｌを試験するために一式の実験に着手し、かかる実験においてＲｕ２＋（ＲｕＩＩ（５−Ｃｌ−ＱｕＩｎ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）又はＯｓ２＋（［ＯｓＩＩ（２，２’−ｂｐｙ）２（ａｃａｃ）］Ｃｌ）を、ＮＡＤＨの存在下で電気化学的に酸化させた。プチダレドキシン還元酵素（ＰｄＲ）（仲介酵素）を加えると、酸化電流の大幅な増加と、リバース走査での還元ピークの不存在とによって特定される電極触媒作用が生じた。
【００９９】
≪サイクリックボルタンメトリーを用いる仲介試験用の溶液の調製（ＰｄＲ）≫
一連のプチダレドキシン還元酵素（バイオカタリスツ社、ウェールズ）溶液を、次のようにして作成した。すなわち、０．１Ｍにしたトリズマ（登録商標）調製済み結晶ｐＨ９（シグマ・アルドリッチ社）にＰｄＲを溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの原液を得て、当該原液を連続希釈し、異なるＰｄＲ濃度の溶液を得た。その後、これらの溶液と、メディエータを含むＮＡＤＨ（シグマ・アルドリッチ社）又はＴＮＡＤＨ（オリエンタル酵母社、日本）溶液とを１：１（ｖ：ｖ）で混合した。全ての最終試験溶液は、１ｍＭのメディエータと、５ｍＭのＴＮＡＤＨ（又は１０ｍＭのＮＡＤＨ）と、様々な濃度のＰｄＲ（５ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬ）とを含んだ。
【０１００】
≪サイクリックボルタンメトリーを用いる仲介試験用の溶液の調製（ＧＯｘ）≫
一連のブドウ糖酸化酵素（ＧＯｘ）（シグマ・アルドリッチ社）溶液を、次のようにして作成した。すなわち、０．１Ｍにしたトリズマ（登録商標）調製済み結晶ｐＨ７（シグマ・アルドリッチ社）にＧＯｘを溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの原液を得て、当該原液を連続希釈し、異なるＧＯｘ濃度の溶液を得た。その後、これらの溶液と、メディエータを含むＮＡＤＨ（シグマ・アルドリッチ社）又はＴＮＡＤＨ（オリエンタル酵母社、日本）溶液とを１：１（ｖ：ｖ）で混合した。全ての最終試験溶液は、１ｍＭのメディエータと、５ｍＭのＴＮＡＤＨ（又は１０ｍＭのＮＡＤＨ）と、様々な濃度のＧＯｘ（２．５ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬ）とを含んだ。
【０１０１】
≪実験１≫
新規メディエータ［Ｒｕ（ＩＩ）（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２の電気化学的応答を定量するために、１０ｍＭのメディエータ溶液（脱酸素化していない水を用いて調製した）を標準電極上に位置づけ、サイクリックボルタンメトリーを用いて試験した。
【０１０２】
結果を図１に示す。同図は、標準電極上で試験した１０ｍＭのメディエータ溶液（酸素化）のサイクリックボルタモグラムであり、１００ｍＶ／秒の走査周波数で−０．３５Ｖ〜０．５Ｖの間でループする。ボルタモグラムは、メディエータの酸化とその後の還元との明確に規定されたピークを示し、ピーク分離は比較的小さい。
【０１０３】
≪実験２≫
新規メディエータ［ＲｕＩＩ（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２の還元型の、溶在酸素による直接的酸化に対する安定性を試験するために、センサを、嫌気性条件と好気性条件との両方における繰り返し酸化により試験した（同じ溶液を用いて）。
【０１０４】
図２は、センサをグローブボックス内（四角）及び開放空気内（円）で試験した時に得られた繰り返し酸化（＋０．２５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌでの）の結果を示す。
結果は、新規メディエータの酸化電流が、試験を繰り返す間に−１１回の繰り返し酸化で約１２％−減少したことを示したが、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ２と比較した場合、溶在酸素の影響は大幅に低下した。
【０１０５】
≪実験３≫
実験１において説明した条件下で、０．１ＭのｐＨ９のトリス内におけるメディエータ［ＲｕＩＩ（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２）のボルタンメトリーを調査し、それが依然として同じであるか否かを定量した。１００ｍＶ／秒の掃引速度を用いてサイクリックボルタンメトリーを行い、＋０．５Ｖ及び−０．３５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌを掃引限界として０Ｖから始めて最初は正方向に掃引した。図３は、水（０．１ＭのＫＣｌを含む）内及び０．１ＭのトリスｐＨ９内におけるメディエータのボルタモグラムを示す。ボルタモグラムは非常に似ており、ピーク電位及び絶対電流がほぼ同じであった。Ｒｕ３＋種の還元の、Ｒｕ２＋種の酸化に比べて小さいピークによって、溶液内の種が大部分はＲｕ２＋であることが示された。Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ２を用いて着手された同様の実験では、Ｒｕ２＋／Ｒｕ３＋酸化還元対の５０：５０のピーク電流比が示された。
【０１０６】
≪実験４≫
酸素による酸化に対するメディエータ［ＲｕＩＩ（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２の安定性を、標準電極上で調査した。１％のタウロコール酸ナトリウム（ＮａＴＣ）と、５０ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．１ＭのＫＣｌとを含む０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ９に１０、５及び１ｍＭの新規メディエータを溶解した溶液を調製した後、標準電極上で繰り返し時間手順を用いて＋０．２５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位で試験した。結果を図４に示す。データによると、試験した全てのメディエータ濃度において新規メディエータが酸素による酸化に対して安定している。新規メディエータの較正グラフは１５６ｎＡ／ｍＭの勾配を示しており、それに比べて、標準的なルテニウムヘキサミンメディエータでは１９９ｎＡ／ｍＭ（同じ電極シートに関する記録値）であった。グラフからの％ＣＶ（分散係数）（２．８４％）は、標準的ルテニウムヘキサミンに関する観測値（２．８１％）とほとんど同一であった。データによると、グラフの切片は９５ｎＡであり、ルテニウムヘキサミンに関する観測値（７２ｎＡ）に匹敵する。
【０１０７】
≪実験５≫
新規メディエータ［ＲｕＩＩ（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２がブドウ糖酸化酵素（ＧＯｘ）への電子の行き来を仲介できるか否かを試験するために、新規メディエータの（部分的に酸素で酸化した）溶液にＧＯｘの部分標本を加えた。その他の全ての条件は、実験３において説明した通りであった。図５は、その結果としてＧＯｘの不存在下及び存在下の記録されたボルタモグラムを示す。新規メディエータがＧＯｘと電極との間において電子移動を仲介できることを、データは示した。
【０１０８】
≪実験６≫
メディエータ［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）を、裸センサ上におけるサイクリックボルタンメトリーにより調査した。０．１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）、０．１ＭのＫＣｌ及び１％ｗ／ｖの界面活性剤（ＮａＴＣ又はＣＨＡＰＳ）内において５０ｍＭのメディエータ溶液を調製した。メディエータは容易に溶解し、非常に濃い黄色の溶液になった。１００ｍＶ／秒の掃引速度を用いてサイクリックボルタンメトリーを行い、＋０．７Ｖ及び−０．７ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌを掃引限界として０ｍＶから始めて最初は正方向に掃引した。各ウェルにおいて２回の掃引を行い、２回目の掃引を保存した（図６）。サイクリックボルタモグラムは、各々の界面活性剤タイプについて全く同じであった。ボルタモグラムは、２つの還元ピークと１つの酸化ピークとに加え、酸化波上の更なる肩状部をも示し、材料が何らかの不純物を含む可能性があることを暗示する。ピークの酸化電位はＲｕヘキサミンよりも正の値が大きく、酸化クロノ電流測定実験用に＋２５０ｍＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位が選択された。還元実験用の電位は変更せず、−３００ｍＶのままにした。
【０１０９】
０．１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）、５％のＣＨＡＰＳ、５％のデオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ及び６６ｍｇ／ｍＬのコレステロール脱水素酵素（ＣｈＤＨ）内に入れた当該メディエータを用いて、総コレステロールセンサを調製した。メディエータを加え、４８．３ｍＭの最終濃度にした。ペテックス拡散膜と１０μＬの解凍血漿とを用いてセンサ応答を定量した。
【０１１０】
第一実験では、５回の繰り返し時間測定を行った。電流−濃度応答の傾斜は合理的に高かったが、切片もまた高かった。これは、メディエータが何らかの不純物（例えば何らかのＲｕＩＩ種）を含んでいたことを示す可能性がある。平均電流対時間のグラフ（図７Ａ〜Ｃ参照）は、いったん最大電流値に達した後は応答が非常に安定していることを示す。この応答安定性の改善は、十中八九、新規Ｒｕメディエータの安定性の増大によるものである。データによると、総コレステロールセンサ内において［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）がメディエータとして機能すること、及び新規メディエータがＰｄＲとの電子交換を容易に行うことがわかる。
【０１１１】
≪実験７≫
ヘキサミン錯体に比べて明らかに増大した新規メディエータ［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）のこの安定性を更に調査するために、時間期間を延長した繰り返し時間測定を用いて第二実験を行った。
【０１１２】
通常測定時間（１１８秒）及び最終測定時間（２０２秒）におけるセンサ応答の結果を下記に示す。応答はほとんど同一であり、図８Ａ〜８Ｄにも示した平均電流対時間のグラフによれば、応答が、よってメディエータが、非常に安定していることを示す。
【０１１３】
≪実験８≫
図９は、低酸素雰囲気中（還元型）及び空気中（酸化型）におけるメディエータの外観を示す。まず容器内で水を沸騰させ、次に容器を密封した後、Ｎ２で２０分間パージすることにより、低酸素溶液を調製した。その後、容器をパラフィルムで密封し、不活性雰囲気グローブボックス（≪９ｐｐｍＯ２）に移した。いったん内部に入れた後、この脱酸素化水を用いて０．１ＭのＫＣｌを作成し、次いでこれに新規メディエータに加え、１０ｍＭ溶液にした。当該溶液は赤色を呈した（図左下）のに対して、酸素化水を用いて作成した（そして４時間放置した）溶液は黄色を呈する（図右）。
【０１１４】
メディエータの異なる酸化還元状態は異なる色を呈し、かかる色を分光測定に用いることができる。
本発明の錯体は、正又は負電荷が低く（ｐＨ７〜１０で＋２〜−１）、分析混合物及び電極の成分と錯体を形成する力がより弱いか又は全くなく、よって、電気化学的プロセスの信頼性、安定及び再現可能性を高める。加えて、酸素分子によるルテニウム（ＩＩ）種の急速な酸化が確実に起こらない点にも注目すべきである。
【０１１５】
蛋白質、酵素及びその他の負電荷種と電極との関係に関連する問題により酵素反応が複雑にならないことを、新規メディエータは保証する。換言すればルテニウム種は、意図された仕事、すなわち、効率的且つ効果的な電子移動メディエータとしての役割を、効率的に果たすことができる。これらの化合物は、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３に関して報告された仲介品質を保持すると同時に、用いられている酵素反応に最も良く適合するように錯体上の電荷を選択することを可能にする。
【０１１６】
本明細書において説明した本発明の範囲から逸脱することなく、更なる修正及び改善を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】０．１ＭのＫＣｌを含む緩衝液にメディエータ［ＲｕＩＩ（ｐｙ−３ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２）を溶解した１０ｍＭ溶液の、ＷＯ２００３５６３１９において説明された通りの標準ウェル電極を１００ｍＶｓ−１の走査周波数で用いて記録したボルタンメトリーを示す。
【図２】図２は、０．１ＭのＫＣｌ内における１０ｍＭの新規メディエータ［ＲｕＩＩ（ｐｙ−３ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２の、脱酸素化（赤）及び酸素化（青）環境において記録した繰り返し酸化試験（＋０．２５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌでの）を示す。
【図３】０．１ＭのｐＨ９トリス緩衝液（０．１ＭのＫＣｌを含む）（ａ）内、及び０．１ＭのＫＣｌ溶液（水溶液）（ｂ）内における新規メディエータ［ＲｕＩＩ（ｐｙ−３ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２のサイクリックボルタンメトリーを示す。
【図４ａ】０．１ＭのＫＣｌ内における新規メディエータ［ＲｕＩＩ（ｐｙ−３ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２の、酸素化環境において記録した繰り返し酸化試験（＋０．２５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌでの）を示す。
【図４ｂ】電流に対するメディエータ濃度のＲｕ２＋較正データを示す。
【図５】ブドウ糖酸化酵素の不存在下（黒−（ａ））及び存在下（灰色−（ｂ））における［ＲｕＩＩ（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ＮＨ３）５］（ＰＦ６）２のサイクリックボルタモグラムを示す。
【図６】ＷＯ２００３５６３１９において説明された通りの総コレステロール混合物内における［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）のサイクリックボルタモグラムを示す。
【図７Ａ】総コレステロールと新規メディエータ［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）との混合物の、血漿を試験溶液とした場合の時間＝１１８秒での酸化を示す。
【図７Ｂ】総コレステロールとメディエータ［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ−ピリジン）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）との混合物の、血漿を試験溶液とした場合の時間＝１１８秒での還元電流を示す。
【図７Ｃ】メディエータ［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（３−ＣＯＯＨ−ピリジン）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）を用いた場合のタイムポイント実験を示し、異なる濃度のコレステロールに関する平均酸化電流の経時変化を示す。
【図８Ａ】メディエータ［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（３−ＣＯＯＨ−ピリジン）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）を用いた場合の酸化電流の、時間＝１１８秒でのタイムポイント実験を示す。
【図８Ｂ】メディエータ［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（３−ＣＯＯＨ−ピリジン）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）を用いた場合の酸化電流の、時間＝２０２秒でのタイムポイント実験を示す。
【図８Ｃ】メディエータ［ＲｕＩＩＩ（ＮＨ３）５（３−ＣＯＯＨ−ピリジン）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）を用いた場合の還元電流の、時間＝２０２秒でのタイムポイント実験を示す。
【図８Ｄ】Ｒｕメディエータ［Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ＣＦ３ＳＯ３）を用いた場合のタイムポイント実験を示し、異なる濃度のコレステロールに関する平均酸化電流の経時変化を示す。
【図９】１０ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］と、０．１ＭのＫＣｌと、１６ｍＭのＣＨＡＰＳと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とから成る溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図１０】メディエータとして［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］を用いた場合の、ウェル内における異なるヒト血漿試料の酸化電流対総コレステロール（ＴＣ）濃度のグラフを示す。電流は、作用電極に＋０．１５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ参照の酸化電位を印加した後、記録された。
【図１１】１０ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（３−Ｂｒａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］と、０．１ＭのＫＣｌと、１６ｍＭのＣＨＡＰＳと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とから成る溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図１２】０．５ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（３−Ｂｒａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］から成る溶液の、０．７５ｍＭのＮＡＤＨ及び０．０３ｍｇ／ｍＬのＰｄＲの不存在下（黒−（ａ））及び存在下（灰色−（ｂ））における紫外・可視吸収スペクトルを示す。
【図１３】メディエータとして［ＲｕＩＩＩ（３−Ｂｒａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］を用いた場合の、ウェル内における異なる凍結乾燥血清試料の酸化電流対総コレステロール（ＴＣ）濃度のグラフを示す。電流は、作用電極に＋０．１５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ参照の酸化電位を印加した後、記録された。
【図１４】１ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ−５，５’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］と、０．１ＭのＫＣｌと、１６ｍＭのＣＨＡＰＳと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とから成る溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図１５】メディエータとして［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ−５，５’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］を用いた場合の、ウェル内における異なる凍結乾燥血清試料の酸化電流対総コレステロール（ＴＣ）濃度の較正グラフを示す。電流は、＋０．１５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ参照の酸化電位を作用電極に印加した後、記録された。
【図１６】１０ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ）］Ｃｌと、０．１ＭのＫＣｌと、１６ｍＭのＣＨＡＰＳと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とから成る溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図１７】１ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ）］Ｃｌと１ｍＭのＮＡＤＨとの溶液の、０．０１７ｍｇ／ｍＬのＰｄＲの不存在下（濃−（ａ））及び存在下（淡−（ｂ））における紫外・可視吸収スペクトルを示す。
【図１８】メディエータとして［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ）］Ｃｌを用いた場合の、ウェル内における異なる凍結乾燥血清試料の酸化電流対総コレステロール（ＴＣ）濃度のグラフを示す。電流は、＋０．１５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ参照の酸化電位を作用電極に印加した後、記録された。
【図１９】１０ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−４−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−４−ＣＯＯ）］と、０．１ＭのＫＣｌと、１６ｍＭのＣＨＡＰＳと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とから成る溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２０】メディエータとして［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（ｐｙ−４−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−４−ＣＯＯ）］を用いた場合の、ウェル内における異なるヒト血漿試料の酸化電流対総コレステロール（ＴＣ）濃度のグラフを示す。電流は、＋０．１５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ参照の酸化電位を作用電極に印加した後、記録された。
【図２１】１０ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（５−Ｃｌ−ＱｕＩｎ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］と、０．１ＭのＫＣｌと、１６ｍＭのＣＨＡＰＳと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とから成る溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２２】１０ｍＭのＮＡＤＨの存在下において（ａ）０、（ｂ）０．１、（ｃ）０．５、（ｄ）１及び（ｅ）５ｍｇ／ｍＬのＰｄＲを含むスクリーン印刷炭素微小電極ストリップでの、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）内における［ＲｕＩＩＩ（５−Ｃｌ−ＱｕＩｎ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］（１ｍＭ）のサイクリックボルタモグラム（１０ｍＶ／秒での）を示す。
【図２３】０．２５ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（５−Ｃｌ−ＱｕＩｎ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］と０．２５ｍＭのＮＡＤＨとを含む溶液の、０．０３３ｍｇ／ｍＬのＰｄＲの不存在下（濃−（ａ））及び存在下（淡−（ｂ））における紫外・可視吸収スペクトルを示す。
【図２４】５ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ６−ｔｅｔ）（ａｃａｃ）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）と、０．１ＭのＫＣｌと、１６ｍＭのＣＨＡＰＳと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とから成る溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２５】５ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ６−ｔｅｔ）（ａｃａｃ）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）と０．５ｍＭのＮＡＤＨとから成る溶液の、０．０３３ｍｇ／ｍＬのＰｄＲの不存在下（濃−（ａ））及び存在下（薄−（ｂ））における紫外・可視吸収スペクトルを示す。
【図２６】メディエータとして［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ６−ｔｅｔ）（ａｃａｃ）］（ＰＦ６）（ＣＦ３ＳＯ３）を用いた場合の、ウェル内における異なるヒト血漿試料の酸化電流対総コレステロール（ＴＣ）濃度のグラフを示す。電流は、作用電極に＋０．１５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ参照の酸化電位を印加した後、記録された。
【図２７】１０ｍＭの［ＯｓＩＩ（２，２’−ｂｐｙ）２（ａｃａｃ）］Ｃｌと、０．１ＭのＫＣｌと、１６ｍＭのＣＨＡＰＳと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とから成る溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２８】１０ｍＭのＮＡＤＨの存在下において（ａ）０、（ｂ）０．１、（ｃ）０．５、（ｄ）１及び（ｅ）５ｍｇ／ｍＬのＰｄＲを含むスクリーン印刷炭素微小電極ストリップでの、０．１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）内における［ＯｓＩＩ（２，２’−ｂｐｙ）２（ａｃａｃ）］Ｃｌ（１ｍＭ）のサイクリックボルタモグラム（１０ｍＶ／秒での）を示す。
【図２９】１ｍＭの［ＲｕＩＩ（２，２’−ｂｐｙ）２（ａｃａｃ）］Ｃｌと、０．１ＭのＫＣｌと、１６ｍＭのＣＨＡＰＳと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とを含む溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１０ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図３０】０．１Ｍのブドウ糖の存在下において（ａ）０、（ｂ）０．５、（ｃ）１．２５及び（ｄ）２．５ｍｇ／ｍＬのブドウ糖酸化酵素を含むスクリーン印刷炭素微小電極ストリップでの、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．０）内における［Ｒｕ（２，２’−ｂｐｙ）２（ａｃａｃ）］Ｃｌ（１ｍＭ）のサイクリックボルタモグラム（１０ｍＶ／秒での）を示す。
【図３１】０．１Ｍのブドウ糖の存在下において（ａ）０、（ｂ）０．２５、（ｃ）１．２５及び（ｄ）５ｍｇ／ｍＬのブドウ糖酸化酵素を含むスクリーン印刷炭素微小電極ストリップでの、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．０）内における［ＲｕＩＩ（２，２’−ｂｐｙ）２（Ｃ２Ｏ４）］（１ｍＭ）のサイクリックボルタモグラム（１０ｍＶ／秒での）を示す。
【図３２】０．１Ｍのブドウ糖の存在下において（ａ）０及び（ｂ）５ｍｇ／ｍＬのブドウ糖酸化酵素を含むスクリーン印刷炭素微小電極ストリップでの、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．０）内におけるＫ［ＲｕＩＩＩ（Ｃ２Ｏ４）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）２］（５ｍＭ）のサイクリックボルタモグラム（１００ｍＶ／秒での）を示す。
【図３３】ＣＨ３ＣＮ内における［ＲｕＩＩ（Ｍｅ３ＴＡＣＮ）（ａｃａｃ）（ｐｙ）］ＰＦ６のＥＳＩ質量スペクトル（＋ｖｅモード）を示す。
【図３４】メタノール内における［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ３−ＴＡＣＮ）（ａｃａｃ）（ｐｙ）］（ＮＯ３）２のＥＳＩ質量スペクトル（＋ｖｅモード）を示す。
【図３５】１０ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ３−ＴＡＣＮ）（ａｃａｃ）（ｐｙ）］（ＮＯ３）２と、０．１ＭのＫＣｌと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とを含む溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図３６】２ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ３−ＴＡＣＮ）（ａｃａｃ）（ｐｙ）］（ＮＯ３）２と５ｍＭのＮＡＤＨとを含む溶液の、０．０３３ｍｇ／ｍＬのＰｄＲの不存在下（濃−（ａ））及び存在下（淡−（ｂ））における紫外・可視吸収スペクトルを示す。
【図３７】１ｍｇ／ｍＬのＰｄＲを含む１０ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（Ｍｅ３−ＴＡＣＮ）（ａｃａｃ）（ｐｙ）］（ＮＯ３）２溶液の、酸化電流対ＮＡＤＨ濃度のグラフを示す。
【図３８】３．３ｍＭの［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ−４，４’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］と、０．１ＭのＫＣｌと、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とを含む溶液内におけるスクリーン印刷炭素微小電極ストリップの、１００ｍＶ／秒の走査周波数で記録したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図３９】５０ｍＭのＮＡＤＨの存在下において（ａ）０及び（ｂ）１０ｍｇ／ｍＬのＰｄＲを含む標準的なスクリーン印刷炭素微小電極ストリップでの、０．１ＭのＫＣｌと０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）とを含む溶液内における［ＲｕＩＩＩ（ａｃａｃ）２（２，２’−ｂｐｙ−４，４’−（ＣＯＯＨ）（ＣＯＯ）］（３．３ｍＭ）のサイクリックボルタモグラム（１００ｍＶ／秒での）を示す。
【図４０】０．１ＭのＫＣｌ内における、本発明のメディエータの１０ｍＭ溶液の還元型（左）及び酸化型（右）を示す。
【図４１】本発明に従うルテニウム錯体の例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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