(57)【要約】本発明は、タンパク質毒素の免疫原断片をコードする遺伝子構築物を含んだ溶液を動物に投与し、続いて投与区域に電界を印加し、そして血清を分離することによる、タンパク質毒素に対する抗血清を得る方法を対象としている。該方法によって得られる抗血清、ならびに、哺乳動物における毒素の吸収に関わる毒作用を予防または治療することを目的とした医薬品を製造するための溶液の利用方法も本発明に含まれ、該溶液の利用方法は、前記医薬品が電気移動によって患者に投与されることを目的として製剤されることを特徴としている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのタンパク質毒素に対する抗血清を得る方法であり、
ａ）前記毒素の少なくとも一つの免疫原断片をコードする核酸を含んでいる少なくとも一つの遺伝子構築物を含む溶液を得る過程、
ｂ）過程ａ）で得られた溶液を動物に注射によって投与する過程、
ｃ）注射区域に電界を印加する過程、そして、
ｄ）後に血液全体を採取し、血清を分離する過程、
を含んでいる方法。
【請求項２】
電界が、１００マイクロ秒を越える長さで、そして０．１ヘルツと１０００ヘルツの間に含まれる周波数の１〜１０００００矩形パルスの形で、１Ｖ／ｃｍと８００Ｖ／ｃｍの間に含まれる電界強度を有していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電界が、１ミリ秒と５０ミリ秒の間に含まれる長さで、そして１ヘルツ〜１０ヘルツの周波数の１〜２０の矩形パルスの形で、８０Ｖ／ｃｍと２５０Ｖ／ｃｍの間に含まれる電界強度を有していることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
注射が皮内注射または筋肉内注射であることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
溶液の投与過程ｂ）が、ヒアルロニダーゼのような細胞外基質の分解酵素を含有する溶液を注射する過程の後に行われることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
０．１Ｕ／μｌ〜２Ｕ／μｌのヒアルロニダーゼを含有する、５μｌと２００μｌの間に含まれる溶液を注射することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
毒素が、ボツリヌス菌毒素、破傷風菌毒素、炭疽菌毒素、リシン、ジフテリア毒素およびコレラ毒素で構成されるグループから選択されることを特徴とする、請求項１〜請求項６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記毒素の免疫原断片が、
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１である血清型Ａのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２である血清型Ｂのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３である血清型Ｃのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４である血清型Ｄのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５である血清型Ｅのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６である血清型Ｆのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７である血清型Ｇのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、および
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８である破傷風菌毒素のＨｃ断片
ならびに
それらの変異体
で構成されるグループから選択されるＣ末端断片（Ｈｃ）であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子構築物が、前記毒素の少なくとも一つの断片をコードする核酸の５’にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを含んでいることを特徴とする、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子構築物が、細胞外分泌シグナルをコードする配列を含んでいることを特徴とする、請求項１〜請求項９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
細胞外分泌シグナルをコードする配列が、マウスのエリスロポエチンの細胞外分泌シグナルをコードする配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、およびヒトのアルカリフォスフォターゼの細胞外分泌シグナルをコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、ならびにそれらの変異体の一つから選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子構築物が、プロモーターの５’に、ＫＯＺＡＫ配列と呼ばれる、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１である翻訳開始部位の核酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項９〜請求項１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
前記毒素の少なくとも一つの断片をコードする核酸配列の少なくとも一つの開始コドンが、同一のアミノ酸をコードしている異なったコドンで置き換えられ、真核細胞における該コドンの頻度が、表１で定義しているように、ボツリヌス菌における頻度よりも高いことを特徴とする、請求項１〜請求項１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子構築物がさらに、少なくとも一つのサイトカインをコードする核酸を含んでいることを特徴とする、請求項１〜請求項１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
過程（ａ）の溶液が、サイトカインをコードする核酸を含むもう一つの遺伝子構築物を含んでおり、前記二つの遺伝子構築物が過程（ｂ）で同時投与されることを特徴とする、請求項１〜請求項１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
サイトカインをコードする核酸の配列が、
造血成長因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、
マウスのインターロイキン１２のｐ３５サブユニットをコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、
マウスのインターロイキン１２のｐ４０サブユニットをコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４、
マウスのインターロイキン４をコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５
および
ヒトのインターロイキン１０をコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６
で構成されるグループから選択されることを特徴とする、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子構築物がさらに、グアニン塩基とシトシン塩基に富んだ、１０ヌクレオチドと１００００ヌクレオチドの間に含まれるサイズを有するメチル化していない免疫活性化配列を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項１６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
抗血清が少なくとも二つのタンパク質毒素に対するものであり、過程ａ）の溶液が少なくとも二つの遺伝子構築物の混合物を含み、前記構築物のそれぞれが、前記毒素の少なくとも一つの免疫原断片をコードする核酸を含んでいることを特徴とする、請求項１〜請求項１７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
動物が、マウス、ウサギ、ウマおよびブタから選択されることを特徴とする、請求項１〜請求項１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
過程ｂ）および過程ｃ）が過程ｄ）の前に少なくとも一回繰り返されることを特徴とする、請求項１〜請求項１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２１】
過程ｃ）が、前記毒素の組換え免疫原断片を動物に投与する前に行われることを特徴とする、請求項１〜請求項２０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
抗毒素抗体の力価が１００以上であり、中和力が１００以上であることを特徴とする、請求項１〜請求項２１のいずれか一つに記載の方法によって得ることのできるタンパク質毒素に対する抗血清。
【請求項２３】
哺乳動物における毒素の吸収に関わる毒作用を前記哺乳動物において中和することを目的とした予防血清または解毒剤として利用するための、請求項２２に記載の抗血清。
【請求項２４】
哺乳動物における、ボツリヌス菌毒素、破傷風菌毒素、炭疽菌毒素、リシン、ジフテリア毒素およびコレラ毒素で構成されるグループから選択される毒素の吸収に関わる毒作用を予防または治療することを目的とした医薬品を製造するための、請求項１および請求項７〜請求項１８で定義した少なくとも一つの遺伝子構築物を含有する溶液の利用方法であり、前記医薬品が電気移動による投与を目的として製剤されることを特徴とする利用方法。
【請求項２５】
溶液がさらに免疫活性化アジュバントを含んでいることを特徴とする、請求項２４に記載の利用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質毒素の免疫原断片をコードする遺伝子構築物を含んだ溶液を動物に投与し、続いて投与区域に電界を印加し、そして血清を分離することによる、タンパク質毒素に対する抗血清を得る方法を対象としている。また、該方法によって得られる抗血清、ならびに、哺乳動物における毒素の吸収に関わる毒作用を予防または治療することを目的とした医薬品を製造するための溶液の利用方法も本発明に含まれ、該溶液の利用方法は、前記医薬品が電気移動によって患者に投与されることを目的として製剤されることを特徴としている。
【背景技術】
【０００２】
今日最もよく使われている、タンパク抗原、たとえば毒素または毒物に対する抗血清を得ることを可能にする手段は、動物において免疫応答を誘発するために組換えタンパク質または精製した天然タンパク質の注射を繰り返し行う方法である。あるいは、ウイルスのカプシドまたはエンベロープ上、またはＶｉｒｏｓｏｍｅタイプの粒子の中にタンパク質を発現させることもできる。ボツリヌス毒素またはその他の致死毒素については、毒素全体を用いて免疫付与することができない。従来的には、細菌から毒素を産生し、該毒素を精製し、そして抗原性を保持しながら、致死性を不活性化するようにそのタンパク質を修飾する必要がある。これは、たとえば、毒素のサブユニットを精製することで得られ、したがって毒素は全体が機能的であるわけではない。また、たとえば大腸菌において、このような組換えサブユニットを産生することもできる。これは、毒素を不活性化するための信頼できる手段がない場合には必要不可欠である。不活性化した天然タンパク質の産生または組換え断片の産生のいずれの場合にも、技術は面倒なものであり、コストのかかるものである。このことは、たとえば、これまでボツリヌス毒素のさまざまな血清型に対して多価血清の一つのストックのみが作られてきたことの理由である。
【０００３】
抗血清を得るためのもう一つの方法は、遺伝子免疫法であり、該免疫法においては、毒素をコードするＤＮＡが免疫付与する動物に投与される。コード遺伝子に適切なプロモーターに続き、ポリアデニル化配列を備えているコードＤＮＡは、ウイルスベクター（アデノウイルス、ＡＡＶ、レトロウイルス、レンチウイルスなど）あるいは細菌のプラスミドに担持させることができる。また、該コードＤＮＡは、たとえばＰＣＲによるインビトロでの無細胞合成によって産生することもできる。
【０００４】
プラスミドＤＮＡの注射により免疫付与を得る可能性は、およそ１０年前に初めて示された（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９２  Ｍａｒ  １２；３５６（６３６５）：１５２−４；Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３  Ｍａｒ  １９；２５９（５１０２）：１７４５−９）。遺伝子免疫法は、骨格筋または皮膚、あるいはその他の組織に、抗原タンパク質をコードし、細菌の環状ＤＮＡ断片（プラスミド）に挿入された遺伝子を直接注射することからなる。生物体自体が抗原を産生し、該抗原が免疫応答を誘発することになる。現在では、ＤＮＡによる免疫付与が長期的な細胞性応答と体液性応答を共に誘発することは十分に確立されている（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１８：９２７−７４．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００２  Ａｕｇ  １９；２０（２５−２６）：３１８７−９２）。
【０００５】
近年の多くの刊行物がこの体液性応答を援用して体液性応答のいくつかの例を挙げることができる。
−ＨＢＶウイルス（Ｂ型肝炎）のエンベロープタンパク質をコードするプラスミドのみを筋肉内注射することで、少なくとも７４週の間、効果的な防御に適合する力価で、抗体の産生が引き起こされる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９７  Ｍａｒ；４（３）：１８１−８）。
−クンジンウイルスの突然変異ゲノムをコードするプラスミドがマウスに筋肉内注射されると、抗体は１０〜４０で変動する力価で産生される。これらのマウスが野生型クンジンウイルス、または西ナイルウイルスに非常に似ているウイルスにかかると、該マウスは防御される（０〜２０％の致死率）（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３  Ｓｅｐ  ２；１００（１８）：１０４６０−４．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ａｕｇ  １３）。
−ヒトタンパク質の膜部分のＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）をコードするプラスミドをマウスに筋肉内注射することにより、このタンパク質に対する抗体が産生される（Ｋｕｒａｔｓｕｋｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．２００２  Ｊｕｌ；４２（１）：６７−７３）。
【０００６】
これらのいくつかの例は、ＤＮＡによる免疫付与によって、動物において満足のいく力価を有する中和抗体を得ることが可能であることを示している。これは特にマウスにあてはまり、該方法はより大型の動物では少し効果が低い（Ｂａｂｉｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００３  Ｊａｎ  ３０；２１（７−８）：６４９−５８．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｄｅｐｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｓｅｐ  １；１６５（５）：２８５０−８）。
【０００７】
最も効果的な遺伝子の導入は、物理的技術を用いることで行うことができる。たとえば、ＤＮＡで覆われた金の粒子を用いた「遺伝子銃」という衝撃による方法であり、該粒子は非常に早い速度で動物の皮膚または粘膜に発射され、これらの組織の細胞核にＤＮＡが投与されることになる。もう一つの技術は超音波を用いるものである。「流体力学的または流体静力学的」な方法と呼ばれるＤＮＡ注入のもう一つの技術は、コードＤＮＡを含む大量の液体の静脈内または動脈内への高速注入を用いたものであり、これによって、細胞内、たとえば、肝細胞、内皮細胞または筋肉細胞の中にＤＮＡが入ることが可能となる。ＤＮＡ投与の非常に効果的な最後の物理的方法は電気移動であり、該方法は本発明者が研究所で開発したものである。電気移動は遺伝子導入の単純で効果的な技術であり、ＤＮＡ溶液を筋肉内注射し、続いて発電機に接続された電極を用いて一連の電気パルスを印加することからなる（Ａｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８  Ｓｅｐ；１６（９）：８６７−７０．；Ｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ  Ｒ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＩＩＩ．１９９８  Ｎｏｖ；３２１（１１）：８９３−９．；Ｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９９  Ａｐｒ  １３；９６（８）：４２６２−７）。これによって、タンパク質の発現をおよそ数倍に向上させることが可能となっている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ．１９９７  Ａｕｇ  ３１；７（４）：４９５−５０１；Ｋｉｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ａｕｇ；１５（４）：４７１−６．Ｒｅｖｉｅｗ）。
【０００８】
近年の複数の研究では、ＤＮＡによる免疫付与の際の電気移動技術の効果が示されている。たとえば、ＨＢＶウイルスの表面抗原をコードするプラスミドの電気移動後、産生された抗体の力価はマウスにおいて係数１００ほど増加する（Ｗｉｄｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｍａｙ  １；１６４（９）：４６３５−４０）。この増加係数は、ウサギまたはモルモットの場合にはおよそ１０である。また、高い抗体力価は、Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープの糖タンパク質をコードするプラスミドを筋肉内で電気移動したマウスおよびウサギにおいても（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０００  Ｄｅｃ；７４（２４）：１１５９８−６０７）、結核菌のタンパク質をコードするプラスミドを電気移動したマウスにおいても得られている（Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００２  Ｓｅｐ  １０；２０（２７−２８）：３３７０−８）。この技術はまた、ヤギまたはウシのようなより大型の動物にも適用することができる（Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｍａｒ；５７（３）：２２９−３８）。本発明者自身も、研究所において、インフルエンザの血球凝集素をコードするプラスミドの電気移動によって、単なる筋肉内注射よりも、マウスにおいてより良好な免疫応答が誘発されることを示している（Ｂａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００１  Ｆｅｂ  ８；１９（１３−１４）：１６８８−９３）。最後に、電気移動によるマウスの免疫付与によってダニのアレルゲンに対するモノクローナル抗体を生成することも可能であることに留意することができる（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００３  Ｍａｙ；３３（５）：６６３−８）。
【０００９】
電気移動の技術は単純で、実施するのが容易であり、従来の免疫付与の際に必要な、一般的に時間がかかり面倒でコストの高い過程である、組換えタンパク質の精製を必要としない。したがって、該技術によって素早く複数のエピトープを試験することが可能である。
【００１０】
上記で引用した遺伝子免疫法の技術（衝撃による方法、超音波方法、流体力学的方法、流体静力学的方法または電気的方法）は、タンパク質による従来の免疫付与の方法と組み合わせることができる。たとえば、第一の遺伝子免疫法を実施し、続いて数週間後に１〜２回の遺伝子免疫法、そして最後に、数週間または数ヶ月後に同一の抗原に対するタンパク質による複数の免疫付与を実施することができる。また、その他に、最初にタンパク質に対するワクチン接種をし、次に遺伝子免疫法を実施することもできる。
【００１１】
ボツリヌス神経毒素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ：ボツリヌス菌）および破傷風神経毒素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ：破傷風菌）は共通の組成を有している。該神経毒素は単一のタンパク質鎖の形で合成され（〜１５０ｋＤａ）、該タンパク質鎖は二つのタンパク質鎖を規定するタンパク質分解的切断によって活性化される。二つのタンパク質鎖とは、Ｎ末端における軽鎖すなわちＬ鎖（〜５０ｋＤａ）と、Ｃ末端における重鎖すなわちＨ鎖（〜１００ｋＤａ）であり、これらはジスルフィド結合によって一つになっている。これらの神経毒素について三つの機能領域が決定されている。Ｈ鎖のＣ末端側の半分（Ｈｃと呼ぶ）は、ニューロンの表面にある特異的な受容体を認識する領域である。Ｈ鎖のＮ末端側の半分（Ｈ−Ｎ）は、ニューロンにおけるＬ鎖の内在化に関与するものである。後者は、ＳＮＡＲＥタンパク質に対するタンパク質分解の酵素部位を含み、また、神経のエクソサイトーシスの遮断をもたらす神経毒素のニューロン内活性の原因である。これら三つの機能領域のそれぞれは、特徴的な三次元構造に関連づけられている。Ｈｃ領域はβシートに富んだ二つの構造を含み、Ｈ−Ｎ領域は二つの非常に長いαヘリックスで形成され、そしてＬ鎖はβシートに富んだ小型の構造を形成している（Ｋｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９８６  Ｊｕｎ；５２（３）：７８６−９１；Ｋｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９８７  Ｄｅｃ；５５（１２）：３０５１−６）。
【００１２】
ボツリヌス神経毒素および破傷風神経毒素の全遺伝子がシーケンシングされ、ボツリヌス神経毒素ＡおよびＢならびに破傷風神経毒素についての結晶構造が明らかにされている。
【００１３】
これら神経毒素の免疫原断片を明らかにするためにさまざまな研究が行われている。パパインによるタンパク質分解によって得られ、クロマトグラフィーによって精製された破傷風毒素のＨｃ断片が非毒性であり、そして抗Ｈｃ免疫付与をすることで試験用量の毒素からマウスが防御されることが最初に示された（Ｋｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９８９  Ｓｅｐ；５７（９）：２６３４−９．）。そして、この断片は大腸菌における組換えタンパク質として産生されており、優れた免疫原であることも明らかになっている（Ｈａｌｐｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９８９  Ｊａｎ；５７（１）：１８−２２）。
【００１４】
試験されたボツリヌス神経毒素Ａのすべての組換え断片のうち、マウスの完全な防御をもたらす唯一のものは重鎖のＣ末端領域であり、該領域は破傷風神経毒素のＨｃ領域に対応している（Ｃｌａｙｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９５  Ｊｕｌ；６３（７）：２７３８−４２；Ｄｅｒｔｚｂａｕｇｈ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔ，Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９６  Ｎｏｖ；１４（１６）：１５３８−４４；Ｋｕｂｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７  Ａｐｒ；６３（４）：１２１４−８；ＬａＰｅｎｏｔｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ．１９９５  Ｏｃｔ；３３（１０）：１３８３−６．Ｒｅｖｉｅｗ）。免疫原としてボツリヌス神経毒素Ａの全体を用いて得られた中和モノクローナル抗体はすべて、Ｈｃ断片に対するものである。ヒトにおけるホルマリン処理されたボツリヌス神経毒素の全体を用いたワクチン接種によって生成された抗体の分析は、抗体の大半が軽鎖に対するものでありＨｃ断片に対するものがほとんどないことを示している。この研究は、Ｈｃ断片に基づくワクチンが、毒素全体によって調製したワクチンより防御能が高いと結論付けている（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．１９９７  Ｏｃｔ；１６（５）：４４７−５６）。したがって、ＵＳＡＭＲＩＩＤによって開発された抗ボツリヌスワクチンの第二世代は、組換えられ精製された、ボツリヌス神経毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧという七つの毒素型のＨｃ断片から成っている。
【００１５】
組換えＨｃ断片の方が、従来の仕方で調製された対応するアナトキシンよりも効果的となることが指摘されている。神経毒素の中和抗体を用いた防御は、本質的にはＨｃ断片による細胞受容体の認識を遮断することから成る（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００１６】
また、ボツリヌス神経毒素に対する中和モノクローナル抗体を得るために多くの研究が行われている。ボツリヌス神経毒素Ａの全体を用いて行われた実験が実りの少ないものとなったことが多いのに対し、組換えＨｃタンパク質を用いてマウスに免疫付与することで産生されたものは、相当数の中和モノクローナル抗体を得ることを可能にした（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９７  Ｓｅｐ；６５（９）：３７４３−５２；Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．１９９５；３８３：９３−８）。このように、Ｈｃ断片は、中和抗体をもたらすための、無毒化された神経毒素全体よりも優れた免疫原であることが明らかとなっている。
【非特許文献１】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．１９９７  Ｏｃｔ；１６（５）：４４７−５６
【非特許文献２】Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９７  Ｓｅｐ；６５（９）：３７４３−５２；Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．１９９５；３８３：９３−８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
今日利用されている方法は天然タンパク質または組換えタンパク質の産生を必要とするものであり、これは時間がかかりコストの高い過程である。さらに、天然タンパク質または組換えタンパク質が毒性であれば、該タンパク質は動物に注射する前に変性させなければならない。これは、エピトープに対する抗体だけが得られるために、中和力が弱い抗血清が得られるという結果になりうるものである。
【００１８】
したがって今日では、とりわけバイオテロの場合に、ボツリヌス毒素（またはその他の毒素）に対して防御する抗血清を有しておく現実的な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、タンパク質毒素に対する抗血清を得る新たな方法を開発し、この方法で得られる抗血清は、ボツリヌス毒素に対する中和抗体の力価が高いものである。さらに、この新たな方法は、実施しやすくコストがほとんどかからないという利点も有している。
【００２０】
したがって、第一の態様によると、本発明は、少なくとも一つのタンパク質毒素に対する抗血清を得る方法を対象としており、該方法は、
ａ）前記毒素の少なくとも一つの免疫原断片をコードする核酸を含んでいる少なくとも一つの遺伝子構築物を含む溶液を得る過程、
ｂ）過程ａ）で得られた溶液を動物に注射によって投与する過程、
ｃ）注射区域に電界を印加する過程、そして、
ｄ）後に血液全体を採取し、血清を分離する過程、
を含んでいる。
【００２１】
タンパク質毒素とは、動物、植物または細菌に由来する、毒作用を生み出し、一般的に抗原性の、あらゆる物質を意味する。「タンパク質毒素の免疫原断片」とは、免疫反応または免疫応答を誘発する能力を有する前記毒素のあらゆる断片を意味する。
【００２２】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドという用語は本明細書において区別なく用い、アミノ酸配列、またはアミノ酸配列を含む誘導体を指す。
【００２３】
本出願の意味における「後の採取」（過程（ｄ））とは、免疫付与を得るために必要不可欠な過程（ｃ）（電界の印加）の後、最少の経過時間で行われる採取を意味する。一般的には、この経過時間は電界の印加の少なくとも１５日後である。
【００２４】
本発明を実施するため、分子生物学、微生物学および遺伝子工学における多くの従来技術が用いられる。これらの技術はよく知られており、たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩ，１９９７（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ編）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  ｃｏｌｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  ＩおよびＩＩ、１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｅｔ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１９８４（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８６（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，１９８６（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ，１９８４，Ａ  Ｐｒａｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，１９８７（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５４およびＣｏｌ．１５５（それぞれ、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｗｕ編）で説明されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
過程ｃ）による注射区域に電界を印加する条件は、現在では当業者によく知られており、とりわけ、国際公開第９９／０１１５７号および国際公開第９９／０１１５８号の番号で１９９９年１月１４日に公開された国際出願に記載されている。当業者であればそれぞれのケースに応じてこれらの条件を適合できるものである。
【００２６】
好ましくは、電界は、１００マイクロ秒を越える長さのパルスで、０．１ヘルツと１０００ヘルツの間に含まれる周波数の１〜１０００００の矩形パルスの形で、１Ｖ／ｃｍと８００Ｖ／ｃｍの間に含まれる電界強度を有している。より好ましくは、電界は、１ミリ秒と５０ミリ秒の間に含まれる長さで、１ヘルツ〜１０ヘルツの周波数の１〜２０矩形パルスの形で、８０Ｖ／ｃｍと２５０Ｖ／ｃｍの間に含まれる電界強度を有している。
【００２７】
有利には、注射は皮内注射または筋肉内注射である。
【００２８】
好ましい実施態様によると、溶液の投与である過程ｂ）は、ヒアルロニダーゼのような細胞外基質の分解酵素を含有する溶液を注射する過程の後に行われる。実際この酵素は、筋肉の細胞外基質の主要な構成要素であるヒアルロン酸の分解を担う。したがって、ヒアルロニダーゼは、筋肉細胞に対するプラスミドの接近可能性を高めることを可能にする。好ましくは、０．１Ｕμｌ〜２Ｕμｌの間に含まれるヒアルロニダーゼを含有する、５μｌから２００μｌの間に含まれる溶液が注射される。より好ましくは、ＮａＣｌ中に０．４Ｕ／μｌのヒアルロニダーゼを含む約２５μｌの溶液が注射される。
【００２９】
有利には、毒素は、ボツリヌス菌、破傷風菌、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の毒素、リシン、ジフテリア毒素およびコレラ毒素で構成されるグループから選択される。
【００３０】
より有利には、前記毒素の免疫原断片はＣ末端断片（Ｈｃ）であり、該断片は、
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１である血清型Ａのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２である血清型Ｂのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３である血清型Ｃのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４である血清型Ｄのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５である血清型Ｅのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６である血清型Ｆのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７である血清型Ｇのボツリヌス菌毒素のＨｃ断片、および
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８である破傷風菌毒素のＨｃ断片
ならびに
それらの変異体
で構成されるグループから選択される。
【００３１】
好ましくは、ボツリヌス菌毒素ＡのＨｃ断片をコードする核酸は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７のもの、あるいはその変異体の一つである。
【００３２】
より広い意味では、タンパク質配列の「変異体」という用語は、アミノ酸またはヌクレオチドのレベルでのみ修飾を有している配列を意味し、機能に影響を与えて免疫原性を低下させることはない。同様に、「変異体」とは、本明細書でヌクレオチド配列について用いた場合、基準となるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味し、対応する配列は、基準となるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドとほぼ同一の構造および機能を有しているポリペプチドをコードしている。このほぼ同一のヌクレオチド配列が、基準のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドをコードしていることが望ましい。ほぼ同一のヌクレオチド配列と基準のヌクレオチド配列の間における同一性の割合は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９９％であることが望ましい。配列の比較は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの配列アラインメントのアルゴリズムを用いて行われた（たとえば、Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍａｐｓ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ．Ｌｏｎｄｏｎ：１９９５．ＩＳＢＮ  ０４１２−９９３９１−０またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｈｔｏ．ｕｓｃ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｅｑａｌｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照）。以下のパラメータで、バージョン１．１６のローカル・プログラムＳを用いた。「マッチ」：１、「ミスマッチペナルティー」：０．３３、「ギャップ開始ペナルティー」：２、「ギャップ伸長ペナルティー」：２。
基準となるヌクレオチド配列と「ほぼ同一の」ヌクレオチド配列は、
５０℃の、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡの中で基準のヌクレオチド配列とハイブリダイズし（５０℃の、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて洗浄）、
より好ましくは、５０℃の、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡの中で基準のヌクレオチド配列とハイブリダイズし（５０℃の、１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて洗浄）、
またさらに好ましくは、５０℃の、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡの中で基準のヌクレオチド配列とハイブリダイズし（５０℃の、０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて洗浄）、
好ましくは、５０℃の、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡの中で基準のヌクレオチド配列とハイブリダイズし（５０℃の、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて洗浄）、
さらに好ましくは、５０℃の、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡの中で基準のヌクレオチド配列とハイブリダイズし（６５℃の、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて洗浄）、
また、機能的に等価な遺伝子産物をコードする。
【００３３】
もう一つの好ましい実施態様によると、遺伝子構築物は、前記毒素の少なくとも一つの断片をコードする核酸の５’にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを含んでいる。
【００３４】
ＣＭＶのプロモーターの構造は、特にＨｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．５（６），１３６７−１３７１，１９８６）に記載されている。
【００３５】
もう一つの好ましい実施態様によると、遺伝子構築物は細胞外分泌シグナルをコードする配列を含んでいる。
【００３６】
これらの細胞外分泌シグナルは、当業者にはよく知られたものであり、該シグナルによって、高い抗体力価を得ることが可能となる。
【００３７】
好ましくは、細胞外分泌シグナルをコードする配列は、マウスのエリスロポエチンの細胞外分泌シグナルをコードする配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、およびヒトのアルカリフォスファターゼの細胞外分泌シグナルをコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、ならびにそれらの変異体の一つから選択される。
【００３８】
さらにもう一つの好ましい実施態様によると、遺伝子構築物は、プロモーターの５’に、ＫＯＺＡＫ配列と呼ばれる、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１である翻訳開始部位の核酸配列を含んでいる。
【００３９】
もう一つの新たな好ましい実施態様によると、前記毒素の少なくとも一つの断片をコードする核酸配列の少なくとも一つの開始コドンは、同一のアミノ酸をコードしている異なるコドンで置き換えられ、真核細胞における該コドンの頻度は、表１で定義しているように、ボツリヌス菌における頻度よりも高い。
【００４０】
【表１】
2009502880.tif 000002
【００４１】
ボツリヌス毒素はクロストリジウムの生物体によって天然に産生されるため、この生物体によって用いられる遺伝子コードは哺乳動物におけるタンパク質の良好な発現には必ずしも適合していない。したがって、本発明者は、コドンの最適化の技術にしたがって設計した合成遺伝子を用いた。つまり、真核細胞で最も頻度の高いｔＲＮＡ（運搬ＲＮＡ）に対応する同義コドンの利用である。
【００４２】
もう一つの好ましい実施態様によると、遺伝子構築物はさらに、少なくとも一つのサイトカインをコードする核酸を含んでいる。
【００４３】
有利には、過程（ａ）の溶液はサイトカインをコードする核酸を含むもう一つの遺伝子構築物を含んでおり、前記二つの遺伝子構築物が過程（ｂ）で同時投与される。
【００４４】
好ましくは、サイトカインをコードする核酸の配列は、
造血成長因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、
マウスのインターロイキン１２のｐ３５サブユニットをコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、
マウスのインターロイキン１２のｐ４０サブユニットをコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４、
マウスのインターロイキン４をコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５
および
ヒトのインターロイキン１０をコードするＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６
で構成されるグループから選択される。
【００４５】
もう一つの好適な実施態様によると、遺伝子構築物はさらに、グアニン塩基とシトシン塩基に富んだメチル化していない免疫活性化配列を含み、該配列のサイズは１０ヌクレオチドと１００００ヌクレオチドの間に含まれている。
【００４６】
ＣｐＧ配列と呼ばれるこのような配列は当業者にはよく知られたものである。本発明においては、免疫活性化配列は、毒素の断片をコードするプラスミドと共に投与されることになる特定のオリゴヌクレオチドでありうることも了解する必要がある（Ｍｕｔｗｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００３，９１，８９−１０３；Ｒ．Ｒａｎｋｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００２，２０，３０１４−３０２２）。
【００４７】
特に有利な一つの実施態様によると、抗血清は、少なくとも二つのタンパク質毒素に対するものであり、過程ａ）の溶液が少なくとも二つの遺伝子構築物の混合物を含み、前記構築物のそれぞれが、前記毒素の少なくとも一つの免疫原断片をコードする核酸を含んでいることを特徴としている。
【００４８】
好ましくは、動物は、マウス、ウサギ、ウマおよびブタから選択される。
【００４９】
特に好ましい実施態様によると、過程ｂ）および過程ｃ）は、過程ｄ）の前に少なくとも一回繰り返される。一般的には、これらの過程は、少なくとも１５日の間隔で、好ましくは少なくとも３週間の間隔で、特に好ましくは少なくとも一ヶ月の間隔で繰り返される。
【００５０】
より好ましくは、過程ｃ）は、前記毒素の組換え免疫原断片を動物に投与する前に行われる。一般的には、この投与は過程ｃ）の少なくとも１５日後に実施される。続いて、過程ｄ）で血清が分離される。
【００５１】
血清の分離は当業者に既知のあらゆる方法によって行うことができる。好ましくは、血清は過程ｄ）で遠心分離によって分離される。
【００５２】
第二の態様によると、本発明は、本発明の方法によって得ることのできるタンパク質毒素に対する抗血清を対象としており、該血清の抗毒素抗体の力価が１００以上であることと、該血清の中和力が１００以上であることを特徴としている。
【００５３】
抗体の力価は、希釈、たとえば１００分の１希釈からの血清の２倍希釈を行うことで判定することができ、次に、ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、所定の波長、たとえばペルオキシダーゼ／オルトフェニレンジアミン・システムを用いた場合には４９２ｎｍでの、希釈に応じた光学密度を示す曲線が得られる。抗体の力価は、未処理血清で少なくとも０．２の光学密度を示す希釈係数の逆数に対応している。
【００５４】
中和力すなわち中和力価の判定では、中和抗体の存在がマウスにおける致死試験によって判定される。たとえば、Ａ型のボツリヌス神経毒素を産生し、ｍｌあたりでマウス致死量の１０倍となるように調整する。次に、血清の希釈物を毒素の調製物と共にインキュベートし、マウスに注射する。それから、マウスの生存を数日にわたって観察する。結果はｍｌあたりの中和単位として表される（一中和単位はマウス致死量の１０倍を中和する血清の量に対応する）。
【００５５】
また、本発明は、哺乳動物における毒素の吸収に関わる毒作用を前記哺乳動物において中和することを目的とした予防用血清または解毒剤として利用するための、本発明による抗血清も対象としている。
【００５６】
本出願において、毒素の吸収は前記哺乳動物における細菌による汚染の結果として生じるものである。
【００５７】
さらに、本発明は、哺乳動物における毒素の吸収に関わる毒作用を予防または治療するための医薬品を製造するための、本発明による抗血清の利用方法も対象としており、該毒素は、ボツリヌス菌毒素、破傷風菌毒素、炭疽菌毒素、リシン、ジフテリア毒素およびコレラ毒素で構成されるグループから選択される。
【００５８】
また、本発明は、免疫学的試験における試薬として利用するための、本発明による抗血清も対象としており、該試験とはたとえば、これらに限定されるわけではないが、ＥＬＩＳＡ酵素免疫測定法、免疫ブロット、免疫発光測定法などである。これらのさまざまな免疫学的試験は当業者に既知であり、当業者は本発明による抗血清を該試験に適用することができる。
【００５９】
最後の態様によると、本発明は、哺乳動物における、ボツリヌス菌毒素、破傷風菌毒素、炭疽菌毒素、リシン、ジフテリア毒素およびコレラ毒素で構成されるグループから選択される毒素の吸収に関連する毒作用を予防または治療することを目的とした医薬品を製造するための、本発明による少なくとも一つの遺伝子構築物を含有する溶液の利用方法を対象としており、該利用方法は、前記医薬品が電気移動による投与を目的として製剤されることを特徴としている。
【００６０】
電気移動による投与に適用可能なエレクトロポレーションの条件、注射の方法および回数は上記で定義した通りである。
【００６１】
医薬品は、少なくとも一つの前記遺伝子構築物を含有する溶液から調製されるものであり、電気移動を可能にするためのカチオン性脂質の非存在下で製剤しなければならない。該医薬品は、当業者には既知の薬学的に許容可能なあらゆる賦形剤、たとえば、生理食塩水、リン酸緩衝液、グルコース緩衝液などの存在下で製剤してもよい。
【００６２】
好ましくは、本発明による利用方法は、溶液がさらに免疫活性化アジュバントを含有することを特徴としている。免疫活性化アジュバントの例としては、これらに限定されるわけではないが、フロイントアジュバントおよびミョウバンを挙げることができる。
【００６３】
以下の実施例および図面は本発明を例示する役割を果たすものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６４】
図面の説明
いくつかの図面における「＊」という記号は１００未満の抗体力価に対応するものである。
【００６５】
図１：電気移動の３週間後の、血清のＥＬＩＳＡアッセイ。１００分の１希釈からの血清の２倍希釈。
図２：電気移動の７０日後の、血清のＥＬＩＳＡアッセイ。１００分の１希釈からの血清の２倍希釈。
図３：電気移動の２１日から７０日後の、ＥＬＩＳＡアッセイで得られた抗体力価（抗体力価＝未処理血清で０．３のＯＤ４９０を示す希釈係数の逆数）。
図４：プラスミドｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＡおよびｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡを用いた、注射のみ／注射＋電気移動の比較。
図５：ＦｃＢｏＮＴＡ配列でのコドンの最適化の効果（ＦｃＢｏＮＴＡ／Ｆｃ＊ＢｏＮＴＡ）。
図６：抗体力価に対するヒアルロニダーゼの効果（プラスミドｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＡおよびｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ）。
図７：抗体力価に対するヒアルロニダーゼの効果（プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒ）。
図８：プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡおよびｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒを用いた、抗ＦｃＢｏＮＴＢ抗体の力価（注射＋電気移動）。
図９：プラスミドｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＥ、ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＥ、ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＥ−Ｍａｓｔｅｒ、ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＥ−Ｖａｒｉａｎｔを用いた、抗ＦｃＢｏＮＴＥ抗体の力価。
図１０：ＡＢＥにおける抗ＦｃＢｏＮＴＡ、抗ＦｃＢｏＮＴＢおよび抗ＦｃＢｏＮＴＥ抗体の力価（プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒ、ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＢ−ＭａｓｔｅｒおよびｐＶａｘＦｃ＊ＮＴＥ−Ｍａｓｔｅｒを用いた同時注射および電気移動：ＡＢＥ多価血清）。
図１１：ウサギにおける、抗ＦｃＢｏＮＴＡ抗体の力価。
図１２：マウスにおける、プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒの再注射を行う場合または行わない場合の抗ＦｃＢｏＮＴＡ抗体の力価（皮内注射は「ｉｄ．」、筋肉内注射は「ｉｍ．」）。
図１３：マウスにおける、プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡの再注射を行う場合または行わない場合の抗ＦｃＢｏＮＴＡ抗体の力価。
図１４：ｐＶａｘＦｃＮｏＮＴＡ（塗りつぶし）または血清型Ａのボツリヌス毒素のＨｃ断片のコドンが最適化された配列（プラスミドＡｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ、網掛け）を用いたときの、高い血清力価を得るためのコドン最適化の効果。
図１５：タンパク質分泌配列と組み合わされていない（Ｆｃ＊ＢｏＮＴＡ）または組み合わされた（分泌Ｆｃ＊ＢｏＮＴＡ、網掛けのバー）、ボツリヌス毒素Ａの断片をコードしている最適化された遺伝子配列を用いたときの、電気移動後の三つの時点で力価測定した、本発明の方法による抗血清の取得。
図１６：タンパク質分泌配列と組み合わされていない（Ｆｃ＊ＢｏＮＴＢ）または組み合わされた（分泌Ｆｃ＊ＢｏＮＴＢ）、ボツリヌス毒素Ｂの断片をコードしている最適化された遺伝子配列を用いたときの、電気移動後の三つの時点で力価測定した、本発明の方法による抗血清の取得。
図１７：−コドンが最適化されていない（ＦｃＢｏＮＴＥ）、
−コドンが最適化され、組み合わされていない、すなわちタンパク質分泌配列と組み合わされていない（Ｆｃ＊ＢｏＮＴＥ）、
−コドンが最適化され、組み合わされた、すなわちタンパク質分泌配列と組み合わされた（分泌Ｆｃ＊ＢｏＮＴＥ）、
ボツリヌス毒素Ｅの断片をコードしている最適化された遺伝子配列を用いたときの、電気移動後の三つの時点で力価測定した、本発明の方法による抗血清の取得。
【実施例】
【００６６】
Ｉ．材料および方法
−遺伝物質
本発明者は、以下ではＦｃＢｏＮＴＡと表記する、毒素の最も免疫原性を有する部分として知られた断片であるボツリヌス毒素ＡのＣ末端断片をコードするさまざまなプラスミド構築物を注射し、電気移動した。試験したさまざまな構築物とは以下のものである。
【００６７】
−ｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＡ：このプラスミドはＣＭＶプロモーターの制御下にあるＦｃＢｏＮＴＡ断片を含む。
【００６８】
−ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ：このプラスミドは、タンパク質の発現がマウスにおいて最適となるように配列が最適化されているＦｃＢｏＮＴＡ断片（Ｆｃ＊ＢｏＮＴＡと表記）を含む。実際、ボツリヌス菌およびマウスにおけるコドンの頻度は非常に異なっており、このことは、これら二種における運搬ＲＮＡのプールが異なっており、限定因子となる可能性があることを意味している。マウスにおいて最も頻度の高いコドンを用いて、最終的に同一のタンパク質をもたらすように配列を全体的に修飾した。Ｆｃ＊断片はＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【００６９】
−ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒ：このプラスミドは、マウスのエリスロポエチンの分泌シグナルと融合した、翻訳を促進するＫｏｚａｋ配列に後続するＦｃ＊ＢｏＮＴＡ断片を含んでいる。
【００７０】
−ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｖａｒｉａｎｔ：このプラスミドは、ヒトの分泌型アルカリフォスフォターゼの分泌シグナルと融合した、翻訳を促進するＫｏｚａｋ配列に後続するＦｃ＊ＢｏＮＴＡ断片を含んでいる。
【００７１】
−作業方法
これらのさまざまな構築物は、注射ごとに、
−前脛骨筋では１５０ｍＭ、３０μｌのＮａＣｌ内、
−皮内では１５０ｍＭ、１００μｌのＮａＣｌ内に
４０μｇの割合で、ＳＷＩＳＳマウスに注射し、電気移動させた。
【００７２】
いずれの場合にも、作業方法は次の通りである。マウスに麻酔をかけ（ケタミン／キシラジン混合物の腹腔内注射）、その後肢の毛を剃り、そしてプラスミド溶液を前脛骨筋または皮膚に注射した。次に、筋肉または皮膚を、発電機Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ  ＥＣ  ８３０に接続した二つの平板電極を用いて、周波数２Ｈｚ、２０ｍｓの矩形パルス８個の形で２００Ｖ／ｃｍの電界にかけた。必要であれば、ヒアルロニダーゼ溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ中に０．４Ｕ／μＬで２５μｌ）を、注射および電気移動の二時間前に前脛骨筋に注射する。
【００７３】
血液の採取（およそ１５０μｌ）は、麻酔したマウスの後眼窩穿刺によって行った。血清の力価測定のために、採取物を４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血漿を回収し、血清を−８０℃で保存した。
【００７４】
−抗ＦｃＢｏＮＴＡ、抗ＦｃＢｏＮＴＢおよび抗ＦｃＢｏＮＴＥ抗体の力価測定（ＥＬＩＳＡアッセイ）
マウスの血清において抗ＦｃＢｏＮＴＡ抗体（または抗ＦｃＢｏＮＴＢまたは抗ＦｃＢｏＮＴＥ抗体）を力価測定するためにＥＬＩＳＡ試験を行った。具体的には、組換えタンパク質ＦｃＢｏＮＴＡ、ＦｃＢｏＮＴＢまたはＦｃＢｏＮＴＥを９６ウェルプレートの底に置き、次に、そのプレートと血清をインキュベートした。抗体が血清中に存在すれば、該抗体はタンパク質に固定される。洗浄することによって、組換えタンパク質に固定しなかったすべての抗体を取り除き、そして次に、抗Ｆｃ抗体の存在を、マウスのビオチン化した抗Ｉｇ二次抗体と、ペルオキシダーゼと結合したストレプトアビジンとの組み合わせによって検出した。続いて、ペルオキシダーゼの基質を用いて視覚化し、４９２ｎｍでプレートを読み取ればよい。
【００７５】
抗体力価を判定するために、１００分の１希釈から血清の２倍希釈を行った。希釈に応じた、４９２ｎｍでの光学密度を示す曲線によって、未処理血清で０．３のＯＤ４９０を示す希釈係数の逆数に対応している抗体力価を判定することが可能となる。
【００７６】
−中和抗体の力価測定（致死試験）
中和抗体の存在はマウスにおける致死試験によって判定した。Ａ型のボツリヌス神経毒素を産生し、ｍｌあたりでマウス致死量の１０倍となるように調整する。次に、血清の希釈物を２ｍｌの毒素の調製物と共に３７℃で３０分間インキュベートし、腹腔内経路によってマウスに注射する（希釈ごとに２頭のマウス、マウスあたり１ｍｌ）。続いて、マウスの生存を四日間にわたって観察する。結果は、ｍｌあたりの中和単位で表される（一中和単位は、マウス致死量の１０倍を中和する血清の量に対応する）。
【００７７】
ＩＩ．追加実験
１）注射のみ／注射＋電気移動の比較
本発明者は、電気移動の効果を実証するために実験を行った。そのため、本発明者は、同一のプラスミド（ｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＡおよびｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ）を注射し、注射後の電気移動を行ったマウスと行わないマウスの群について得られた抗体の力価を比較した。
【００７８】
処理の３０日後に得られた抗体力価を図４に示している。
【００７９】
この実験の後、本発明者は、注射のみまたは注射＋電気移動によって得られたこれら抗体の中和力を試験した。つまり、本発明者は、マウスにおける中和試験、すなわち致死試験を行った。血清は４５日目に試験し、マウスの数を抑えるために同一条件にある血清を「プール」した。
【００８０】
表２に示した結果は、血清の各希釈と各条件について、マウスの全体数に対する生存したマウスの数を示している。ここから、マウスが生存する最も大きな希釈の逆数として中和力価が推定される。
【００８１】
【表２】
2009502880.tif 000003
【００８２】
このように、注射のみで得られた抗体に中和力がないのに対し、電気移動で得られた抗体では先の結果に匹敵する結果が見られる。
【００８３】
１）さまざまな比較
ａ）最適化の効果
本発明者は、電気移動を伴って投与された配列（図５）と電気移動を伴わずに投与された配列（図４）でのコドンの最適化の効果を比較した。
【００８４】
ＦｃＢｏＮＴＡ配列のコドンでの最適化によって、抗体力価が大幅に上昇することが観察される（斜め線に対するグレー）。
【００８５】
ｂ）電気移動を用いる方法におけるヒアルロニダーゼの効果
本発明者は、抗体力価に対するヒアルロニダーゼの効果を研究した。
プラスミドｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＡで得られた結果を図６に示している。
プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡで得られた結果を図６に示している。
プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒで得られた結果は図７に示している。
【００８６】
２）毒素Ｂおよび毒素Ｅ
本発明者は、毒素Ａと同一の手順に正確にしたがって行った。
４０μｇのプラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＢとｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＢ−Ｍａｓｔｅｒ（ＢｏＮＴＢのＣ末端断片＋Ｅｐｏの分泌シグナル＋Ｋｏｚａｋ配列）の注射＋電気移動。
【００８７】
採取は、注射および電気移動後の１５日目、３０日目および４５日目に実施した。
【００８８】
抗ＦｃＢｏＮＴＢ抗体の力価について得られた結果は図８に示している。
【００８９】
このように、プラスミドの電気移動によって抗ＦｃＢｏＮＴＢ抗体を得ることが可能である。
【００９０】
抗ＦｃＢｏＮＴＥ抗体の力価
毒素Ｅ（４０μｇのプラスミド）について同一の手順を行った。
【００９１】
本発明者は、
−ｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＥ：最適化していない、非分泌型Ｃ末端断片、
−ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＥ：（コドンを）最適化したＣ末端断片、
−ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＥ−Ｍａｓｔｅｒ：最適化したＣ末端断片＋ｍＥｐｏ分泌シグナル＋Ｋｏｚａｋ配列、
−ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＥ−Ｖａｒｉａｎｔ：最適化したＣ末端断片＋ｈＳｅＡＰ分泌シグナル＋Ｋｏｚａｋ配列、
を比較した。
【００９２】
採取は、１５日目、２８日目、４２日目に実施した。結果は図９に示している。
【００９３】
３）多価血清
本発明者は、複数のＣ末端断片、ＦｃＢｏＮＴＡ、ＦｃＢｏＮＴＢおよびＦｃＢｏＮＴＥをコードしている複数のプラスミドの同時注射＋電気移動を試験した。
【００９４】
三つのプラスミドは、マウスのＥｐｏの分泌シグナルとＫｏｚａｋ配列に後続するＣ末端断片をコードしている。
【００９５】
各プラスミドを４０μｇずつ、すなわち、各プラスミドを２０μｇずつマウスの各後肢に注射することで、後肢あたり合計で６０μｇのＤＮＡとした。
【００９６】
抗ＦｃＢｏＮＴＡ抗体の力価は図１０（Ａ）に示している。
抗ＦｃＢｏＮＴＢ抗体の力価は図１０（Ｂ）に示している。
抗ＦｃＢｏＮＴＥ抗体の力価は図１０（Ｅ）に示している。
【００９７】
４）ウサギにおける試験
本発明者は、ウサギにおいて５００μｇのプラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒの注射または注射＋電気移動を試験した。電気移動の条件は、１２５Ｖ／ｃｍ、２０ｍｓ、２Ｈｚの周波数の８個のパルスで、針電極を用いるものである。
【００９８】
結果は図１１に示している。
【００９９】
５）再注射の効果
本発明者は、マウスにおいて二回目の注射＋電気移動の効果を試験した。
−プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒを用いた、各筋肉内における０日目での二回の注射＋電気移動（注：ｉｍ．８０μｇ）（図１２）、
−各回ともプラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒを用いた、筋肉内における３週間の間隔を開けた二回の注射＋電気移動（注：ｉｍ．＋ｉｍ．４０μｇ）（図１２）、
−プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒを用いた、１回目の処理は皮内、２回目は筋肉内である、３週間の間隔を開けた二回の注射＋電気移動（注：ｉｄ．＋ｉｍ．４０μｇ）（図１２）、
−各回ともｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡを用いた、筋肉内における１ヶ月の間隔を開けた二回の注射＋電気移動（図１３）。
【０１００】
ＩＩＩ−結果
本発明者は、さまざまな構築物およびさまざまな作業方法を比較した（条件ごとに４頭のマウス）。
−注射のみ（注射＋電気移動）、
−４０μｇのｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＡの筋肉内での注射＋電気移動、
−４０μｇのｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ（最適化した配列）の筋肉内での注射＋電気移動、
−４０μｇのｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒ（最適化した配列＋マウスのエリスロポエチンの分泌シグナル＋Ｋｏｚａｋ配列）の筋肉内での注射＋電気移動、
−４０μｇのｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｖａｒｉａｎｔ（最適化した配列＋ヒトの分泌型アルカリフォスフォターゼの分泌シグナル＋Ｋｏｚａｋ配列）の筋肉内での注射＋電気移動、
−４０μｇのｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ（最適化した配列）の皮内での注射＋電気移動、
−ヒアルロニダーゼでの処理＋４０μｇのｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ（最適化した配列）の筋肉内での注射＋電気移動、
−処理なし。
【０１０１】
電気移動の３週間後に血清のＥＬＩＳＡアッセイを行って得られた結果を図１に示している。
【０１０２】
このように、本発明者は、説明したさまざまな条件で処理したマウスの全血清において三週間後から抗ＦｃＢｏＮＴＡ抗体を検出したのだが、未処理マウスの血清では検出しなかった。しかし、条件によって抗体力価が変化することに注目することができる。ヒアルロニダーゼで処理したマウスは、その他のマウスに対して高い抗体力価を有している。この酵素は、筋肉の細胞外基質の主要な構成要素であるヒアルロン酸の分解を担っている。したがって、ヒアルロニダーゼによって、筋肉細胞に対するプラスミドの接近可能性を向上させることが可能である。また、皮内での電気移動によって抗体を得ることも可能である。
【０１０３】
次に、採取を１５日間毎日実施し、注射の７０日後にＥＬＩＳＡアッセイで得られた結果を図２に示している。
【０１０４】
７０日目のＥＬＩＳＡアッセイの結果は、２１日目に得られたものに似ている。しかし、皮内の条件を除いたすべての条件で抗体力価が増加したことに注目することができる。これは、本発明者による、筋肉における発現動態が一年まで継続するのに対し、皮内での電気移動後のタンパク質の発現が１５日しか続かないという指摘によって説明することができる。
【０１０５】
動態に従った抗体力価についてより広く見るために、図３は、時間経過に従って、条件ごとに得られた力価をまとめてを示している。
【０１０６】
これらの結果は、それぞれの条件のマウスの血清における抗体力価に関する情報は与えてくれるが、これらの抗体の中和力に関しては情報を示していない。したがって本発明者は、マウスにおける中和試験、すなわち致死試験を実施した。４０日目に採取した血清を試験し、用いるマウスの数を抑えるために同一条件の血清を一つにした。
【０１０７】
表３に示した結果は、血清の各希釈と各条件について、処理したマウスの数に対する生存したマウスの数を示している。ここから、マウスが生存する最も大きい希釈の逆数として中和力価が推定される。
【０１０８】
【表３】
2009502880.tif 000004
【０１０９】
この試験の第一の結論は、プラスミドの電気移動によって得られた抗体が中和力を持つということである。
【０１１０】
第二の結論は、一定の条件下では非常に説得力のある中和力価が得られるということであり、特にｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒの条件では少なくとも１００００の中和力価が得られる。
【０１１１】
次に本発明者は電気移動の効果を実証するための実験を行った。そのため、本発明者は、同一のプラスミド（ｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＡまたはｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ）を注射し、注射後の電気移動を行ったまたは行わないマウスの群で得られた抗体力価を比較した。
【０１１２】
処理の３０日後に得られた抗体力価を、図４に示している。
【０１１３】
いずれの場合にも、注射のみの群と比べて、注射＋電気移動を行った群では、抗体力価の強い上昇が観察される。
【０１１４】
ＩＶ−結論
本発明者は、ボツリヌス毒素ＡのＣ末端断片、ＦｃＢｏＮＴＡをコードしているプラスミドの単純な注射および電気移動の後に、高い中和抗体力価を得た。この結果から、この単純な方法によって、治療用の一価または多価の抗ボツリヌス毒素の抗血清を得ることができると考えられる。実際、多価の抗血清は、複数のプラスミドを用いた遺伝子免疫法によって得ることができるのだが、それは、コトランスフェクションと共に電気移動技術を行うことで共発現が得られることが証明されているからである。そうでない場合には、多価の抗血清は、一価の抗血清を単純に混合することによって得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１：電気移動の３週間後の、血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図。
【図２】電気移動の７０日後の、血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図。
【図３】電気移動の２１日から７０日後のＥＬＩＳＡアッセイで得られた抗体力価を示す図。
【図４】プラスミドｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＡおよびｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡを用いた、注射のみ／注射＋電気移動の比較を示す図。
【図５】ＦｃＢｏＮＴＡ配列でのコドンの最適化の効果を示す図。
【図６】抗体力価に対するヒアルロニダーゼの効果を示す図（プラスミドｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＡおよびｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ）。
【図７】抗体力価に対するヒアルロニダーゼの効果を示す図（プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒ）。
【図８】プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡおよびｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒを用いた抗ＦｃＢｏＮＴＢ抗体の力価（注射＋電気移動）を示す図。
【図９】プラスミドｐＶａｘＦｃＢｏＮＴＥ、ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＥ、ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＥ−Ｍａｓｔｅｒ、ｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＥ−Ｖａｒｉａｎｔを用いた抗ＦｃＢｏＮＴＥ抗体の力価を示す図。
【図１０】ＡＢＥにおける抗ＦｃＢｏＮＴＡ、抗ＦｃＢｏＮＴＢおよび抗ＦｃＢｏＮＴＥ抗体の力価を示す図。
【図１１】ウサギにおける抗ＦｃＢｏＮＴＡ抗体の力価を示す図。
【図１２】マウスにおける、プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡ−Ｍａｓｔｅｒの再注射を行う場合または行わない場合の抗ＦｃＢｏＮＴＡ抗体の力価を示す図。
【図１３】マウスにおける、プラスミドｐＶａｘＦｃ＊ＢｏＮＴＡの再注射を行う場合または行わない場合の抗ＦｃＢｏＮＴＡ抗体の力価を示す図。
【図１４】ｐＶａｘＦｃＮｏＮＴＡまたは血清型Ａのボツリヌス毒素のＨｃ断片のコドンが最適化された配列を用いたときの、高い血清力価を得るためのコドン最適化の効果を示す図。
【図１５】タンパク質分泌配列と組み合わされていないまたは組み合わされた、ボツリヌス毒素Ａの断片をコードしている最適化された遺伝子配列を用いたときの、電気移動後の三つの時点で力価測定した、本発明の方法による抗血清の取得を示す図。
【図１６】タンパク質分泌配列と組み合わされていないまたは組み合わされた、ボツリヌス毒素Ｂの断片をコードしている最適化された遺伝子配列を用いたときの、電気移動後の三つの時点で力価測定した、本発明の方法による抗血清の取得を示す図。
【図１７】−コドンが最適化されていない、−コドンが最適化され、組み合わされていない、すなわちタンパク質分泌配列と組み合わされていない、−コドンが最適化され、組み合わされた、すなわちタンパク質分泌配列と組み合わされた、ボツリヌス毒素Ｅの断片をコードしている最適化された遺伝子配列を用いたときの、電気移動後の三つの時点で力価測定した、本発明の方法による抗血清の取得を示す図。
【図１】
2009502880.tif 000005
【図２】
2009502880.tif 000006
【図３】
2009502880.tif 000007
【図４】
2009502880.tif 000008
【図５】
2009502880.tif 000009
【図６】
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【図７】
2009502880.tif 000011
【図８】
2009502880.tif 000012
【図９】
2009502880.tif 000013
【図１０】
2009502880.tif 000014
【図１１】
2009502880.tif 000015
【図１２】
2009502880.tif 000016
【図１３】
2009502880.tif 000017
【図１４】
2009502880.tif 000018
【図１５】
2009502880.tif 000019
【図１６】
2009502880.tif 000020
【図１７】
2009502880.tif 000021
【配列表】
2009502880000001.xml
【国際調査報告】
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