(57)【要約】  本発明は、一般に診断の分野すなわちシリコンに関連したポリペプチドにおける試験系に関する。より正確には、本発明は、その一実施形態ではシリコンに接着するポリペプチドを同定しかつ分析するための試験系に関する。さらに、本発明は、新しく同定されたシリコンに接着するポリペプチドと、例えば哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための試験系におけるかかるタンパク質の各々の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法であって、
ａ）シリコン接着ポリペプチドを含有すると思われ、かつ場合によりシリコンを含有する試料を哺乳類から取得するステップと、
ｂ）前記試料を少なくとも１種のシリコンに接触させるステップと、
ｃ）ステップａ）および／またはｂ）からの前記シリコンに接着される前記ポリペプチドを単離するステップと、
ｄ）前記単離されたシリコン接着ポリペプチドを同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記試料が、注入シリコンに対して応答反応を示す哺乳類に由来する、シリコン、創傷液、および血清を覆うタンパク質性（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）フィルムから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｅ）哺乳類におけるシリコンに対する応答反応を検出するためのマーカーポリペプチドとして適するポリペプチドを同定するステップ
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｅ）が、
ｅ’）前記シリコンを被覆する前記タンパク質性フィルムから同定される前記タンパク質の分離から誘導されるポリペプチドパターンを創傷液または血清から溶出されるシリコン接着ポリペプチドの分離から誘導されるポリペプチドパターンと比較するステップと、
ｅ’’）前記パターン内の目的のスポットを選択しかつ分析するステップと、
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための試薬キットであって、原料、緩衝液および助剤ならびに請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法を実施するための物質を含む、試薬キット。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって同定されるシリコン接着ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能変異体であって、ここで前記ポリペプチドまたはその前記機能変異体がシリコンの表面に接着する、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項６または７に記載のポリペプチドまたはその機能変異体をコードするヌクレオチド配列あるいは前記核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９】
哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、脊髄関連タンパク質（Ｍｙｅｌｏｉｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、およびＰＲＯ２６１９からなる群から選択されるポリペプチドまたはその機能変異体の使用。
【請求項１０】
哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための方法であって、
ａ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体を含有すると思われる、診断対象の哺乳類に由来する試料を提供するステップと、
ｂ）前記試料中での前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその前記機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、
ｃ）前記哺乳類の前記シリコンに対する応答反応について、前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化から判定するステップと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記シリコン接着ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、およびＰＲＯ２６１９からなる群から選択されるかあるいは請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって同定されるポリペプチドまたはその機能変異体である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記シリコン接着ポリペプチドが、アイソタイプ対照、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ＩｇＥ−ＨＲＰ、ＩＧＡ−ＨＲＰ、ＡＭＢＰタンパク質前駆体、血漿−レチノール結合タンパク質、キニノゲン、好酸球ペルオキシダーゼ、線維芽細胞成長因子１１、ＴＧＦ−β、インテグリン−β４、Ｔ細胞受容体、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、凝固因子Ｖ、α−スペクトリン、単球化学走性タンパク質−２、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、補体Ｃ３、補体Ｃ２、補体Ｃ１ｓ、Ｃ反応性タンパク質、α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体、フォンヴィルブラント（Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ）因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、ラミニン、マトリックスメタロプロテアーゼ２、アポリポタンパク質４、アポリポタンパク質Ａｌ、セルロプラスミン、Ｔｈｙｒｅｏｔｙｒｅｉｎ、アルブミン、α２−マクログロブリン前駆体、ハプトグロビン１、αおよびβグロビン鎖、アクチン、ＨＳＰ６０、アポリポタンパク質Ｅ３、補体Ｃ２前駆体、補体Ｃ３前駆体、ヘモグロビン、トランスサイレチンからなる群から選択される少なくとも１種の追加のシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドまたはそれらの機能変異体とともに検出される請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記シリコン接着ポリペプチド、すなわち免疫グロブリンＧ、Ｃ反応性タンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、補体Ｃ３前駆体、および脊髄関連タンパク質１４またはそれらの機能変異体の存在または発現における変化が検出される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類に由来する前記試料が血清および／または創傷液であり、かつ前記試料は長期注入および医療器具のコーティングに適するシリコンの注入の前または後に回収される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
注入の前または後に同じ哺乳類から、あるいは医療用シリコンを全く注入することなく異なる哺乳類から取得される対照として、第２の試料を提供するステップをさらに含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項６または７に記載のシリコン接着ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する少なくとも１種の核酸の存在および量を検出するステップをさらに含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料をシリコンと前記ポリペプチドの前記シリコンへの接着を可能にする条件下で接触させるステップを含む、ステップａ）とステップｂ）との間のステップａ’）をさらに含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
原料、緩衝液、助剤、および請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法を実施するための物質を含む、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための診断キット。
【請求項１９】
哺乳類のシリコンに対する応答反応をモニターするための方法であって、
ａ）少なくとも１種のシリコンを前記哺乳類内に注入するステップと、
ｂ）請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法を用いて請求項６または請求項７に記載のシリコン接着ポリペプチドの存在または発現における変化を検出するステップと、
ｃ）場合によりステップｂ）を反復するステップと、
を含む、方法。
【請求項２０】
シリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドのシリコンに対する結合に干渉する物質をスクリーニングするための方法であって、
ａ）シリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉すると思われる物質を提供するステップと、
ｂ）シリコンを提供するステップと、
ｃ）シリコン接着ポリペプチドを提供するステップと、
ｄ）前記物質の存在下または不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着の分析により前記物質の干渉特性を分析するステップと、
を含み、
ここで、前記物質の存在下または不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着における変化がシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドのシリコンに対する結合に干渉する物質について示唆している、方法。
【請求項２１】
前記シリコン接着ポリペプチドが、請求項６または７に記載のポリペプチド、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、ＰＲＯ２６１９、請求項１〜４のいずれか一項によって同定されるポリペプチド、アイソタイプ対照、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ＩｇＥ−ＨＲＰ、ＩＧＡ−ＨＲＰ、ＡＭＢＰタンパク質前駆体、血漿−レチノール結合タンパク質、キニノゲン、好酸球ペルオキシダーゼ、線維芽細胞成長因子１１、ＴＧＦ−β、インテグリン−β４、Ｔ細胞受容体、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、凝固因子Ｖ、α−スペクトリン、単球化学走性タンパク質−２、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、補体Ｃ３、補体Ｃ２、補体ＣＩｓ、Ｃ反応性タンパク質、α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体、フォンヴィルブラント因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、ラミニン、マトリックスメタロプロテアーゼ２、アポリポタンパク質４、アポリポタンパク質Ａｌ、セルロプラスミン、Ｔｈｙｒｅｏｔｙｒｅｉｎ、アルブミン、α２−マクログロブリン前駆体、ハプトグロビン１、αおよびβグロビン鎖、アクチン、ＨＳＰ６０、アポリポタンパク質Ｅ３、補体Ｃ２前駆体、補体Ｃ３前駆体、ヘモグロビン、トランスサイレチンまたはそれらの機能変異体からなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞のシリコンに対する接着を検出するための方法であって、
ａ）哺乳類が有する細胞の血清または創傷液の試料を提供するステップと、
ｂ）シリコンを提供するステップと、
ｃ）前記シリコンに接着する前記血清または創傷液から細胞の量および数を分析するステップと、
を含む、方法。
【請求項２３】
請求項２０または２１に記載の方法によって同定される、シリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドのシリコンに対する結合に干渉する物質。
【請求項２４】
医薬組成物を作製するための方法であって、請求項２０または２１に記載の方法に基づく方法、および前記物質を医薬組成物中に調合するステップを含む、方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の物質を含有するかまたは請求項２４に基づいて作製される医薬組成物。
【請求項２６】
注入シリコンに対する有害反応を被る哺乳類を治療する方法であって、請求項２３に記載の物質または請求項２５に記載の医薬組成物の有効量を前記哺乳類に投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記有害反応が珪肺症および／またはシリコンに関連した線維症である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳類がヒトである、請求項１〜４、１０〜１７、２２、および２６または２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、診断の分野、すなわちシリコンに関連したポリペプチドにおける試験系に関する。より詳細には、本発明は、その一実施形態ではシリコンに接着するポリペプチドを同定しかつ分析するための試験系に関する。さらに、本発明は、新たに同定されたシリコンに接着するポリペプチドと、例えば哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための試験系におけるかかるタンパク質の各々の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
「シリコン」としても知られるジメチルシロキサンポリマーは、その生体適合性が仮定されることから医業において最も広範に用いられる無機生体材料である。それは、医療用チュービングシステム、注射器の潤滑剤、バイパス装置および移植蝸牛刺激装置のような能動的な医療器具のコーティングなどの多種多様な用途、ならびに関節置換およびアイレンズから脳室腹腔短絡術およびマンマリー注入に及ぶ受動的注入の作製において用いられる。
【０００３】
しかし、特に長期注入後、様々な局所性および全身性の副作用がシリコンに対する応答反応として報告されている。これらの現象は、例えばシリコンのマンマリー注入（ＳＭＩｓ）を有する女性において［スモーレイ  Ｄ．Ｌ．（Ｓｍａｌｌｅｙ  Ｄ．Ｌ．）、レビン  Ｊ．Ｊ．（Ｌｅｖｉｎｅ  Ｊ．Ｊ．）、シャンクリン  Ｄ．Ｒ．（Ｓｈａｎｋｌｉｎ  Ｄ．Ｒ．）、ホール  Ｍ．Ｆ．（Ｈａｌｌ  Ｍ．Ｆ．）およびスティーブンス  Ｍ．Ｖ．（Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｍ．Ｖ．）「Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｉｌｉｃａ  ａｍｏｎｇ  ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．」Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９６、５６７−５７４頁（１９９６年）］、無菌での脳室腹腔短絡術が奏功しない大部分の場合［ゴールドブラム  Ｒ．Ｍ．（Ｇｏｌｄｂｌｕｍ  Ｒ．Ｍ．）、ペリー  Ｒ．Ｐ．（Ｐｅｌｌｅｙ  Ｒ．Ｐ）、オドネル  Ａ．Ａ．（Ｏ’Ｄｏｎｅｌｌ  Ａ．Ａ．）、パイロン  Ｄ．（Ｐｙｒｏｎ  Ｄ．）およびヘジャーズ  Ｊ．Ｐ．（Ｈｅｇｇｅｒｓ  Ｊ．Ｐ．）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｅｌａｓｔｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｓｈｕｎｔｓ．」Ｌａｎｃｅｔ  ３４０、５１０−５１３頁（１９９２年）］、さらに様々なシリコンコーティングされた医療器具を持つ患者において［キンナリ  Ｔ．Ｊ．（Ｋｉｎｎａｒｉ  Ｔ．Ｊ．）、サロネン  Ｅ．Ｍ．（Ｓａｌｏｎｅｎ  Ｅ．Ｍ．）およびジェロ  Ｊ．（Ｊｅｒｏ  Ｊ．）「Ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｏｎ  ｔｙｍｐａｎｏｓｔｏｍｙ  ｔｕｂｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ  ６７、１５７−１６４頁（２００３年）］観察されている。
【０００４】
いわゆる生物のシリコンに対する局所反応は、大きさが変化しうる線維性結合組織被膜の形成によって特徴づけられる［シグロウ  Ｗ．（Ｓｉｇｇｅｌｋｏｗ  Ｗ．）、ファリディ  Ａ．（Ｆａｒｉｄｉ  Ａ．）、スピリタス  Ｋ．（Ｓｐｉｒｉｔｕｓ  Ｋ．）、クリンゲ  Ｕ．（Ｋｌｉｎｇｅ  Ｕ．）、ラス  Ｗ．（Ｒａｔｈ  Ｗ．）およびクロスターハルフェン  Ｂ．（Ｋｌｏｓｔｅｒｈａｌｆｅｎ  Ｂ．）「Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｃｕｐｓｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ．」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４、１１０１−１１０９頁（２００３年）］。長年にわたり線維症が進行することで、注入に関連する機能障害が誘発される。局所性副作用に続き、全身性の問題が生じることが多く、線維筋痛［バーミューレン  Ｒ．Ｃ．（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  Ｒ．Ｃ．）およびショルテ  Ｈ．Ｒ．（Ｓｃｈｏｌｔｅ  Ｈ．Ｒ．）「Ｒｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｇｅｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  ｐａｉｎ  ａｎｄ  ｆａｔｉｇｕｅ．」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ３０、２２６３−２２６７頁（２００３年）；シャンクリン  Ｄ．Ｒ．（Ｓｈａｎｋｌｉｎ  Ｄ．Ｒ．）、スティーブンス  Ｍ．Ｖ．（Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｍ．Ｖ．）、ホール  Ｍ．Ｆ．（Ｈａｌｌ  Ｍ．Ｆ．）およびスモーレイ  Ｄ．Ｌ．（Ｓｍａｌｌｅｙ  Ｄ．Ｌ．）「Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．」Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６９、１０２−１１８頁（２０００年）］や、リウマチ性疾患および他のタイプの結合組織疾患（ＣＴＤ）［ブリッジス  Ａ．Ｊ．（Ｂｒｉｄｇｅｓ  Ａ．Ｊ．）、コンレイ  Ｃ．（Ｃｏｎｌｅｙ  Ｃ．）、ワン  Ｇ．（Ｗａｎｇ  Ｇ．）、バーンズ  Ｄ．Ｅ．（Ｂｕｒｎｓ  Ｄ．Ｅ．）およびヴェイジー  Ｆ．Ｂ．（Ｖａｓｅｙ  Ｆ．Ｂ．）「Ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．」Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １１８、９２９−９３６頁（１９９３年）］や、さらに強皮症様の線維化症候群［ヴァルガ  Ｊ．（Ｖａｒｇａ  Ｊ．）、シューマッハ  Ｈ．Ｒ．（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  Ｈ．Ｒ．）およびジメネス  Ｓ．Ａ．（Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｓ．Ａ．）「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｍａｍｍｏｐｌａｓｔｙ  ｗｉｔｈ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｉｍｐｌａｎｔｓ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１１、３７７−３８３頁（１９８９年）；アップルトン  Ｂ．Ｅ．（Ａｐｐｌｅｔｏｎ  Ｂ．Ｅ．）およびリー  Ｐ．（Ｌｅｅ  Ｐ．）「Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｍａｍｍｏｐｌａｓｔｙ．」Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２０、１０５２−１０５４頁（１９９８年）］と診断されている長期のシリコン注入物を保有する患者に関して報告がなされている。
【０００５】
一般に全身性副作用が局所レベルに対する変化を反映すると考えられるが、クロストークなどは明らかにされていない。さらにより重要なことは、ヨーロッパおよび米国の双方における前向きコホート試験では、シリコン注入の効果がＣＴＤまたは他の自己免疫疾患の発症におけるリスク因子として確認することも否定することもできなかった［ヤノウスキー  Ｅ．Ｃ．（Ｊａｎｏｗｓｋｙ  Ｅ．Ｃ．）、クッパー  Ｌ．Ｌ．（Ｋｕｐｐｅｒ  Ｌ．Ｌ．）およびハルカ  Ｂ．Ｓ．（Ｈｕｌｋａ  Ｂ．Ｓ．）「Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ−ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．」Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４２、７８１−７９０頁（２０００年）；サンチェス−ゲレーロ  Ｊ．（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  Ｊ．）、コルディッツ  Ｇ．Ａ．（Ｃｏｌｄｉｔｚ  Ｇ．Ａ．）、カールソン  Ｅ．Ｗ．（Ｋａｒｌｓｏｎ  Ｅ．Ｗ．）、ハンター  Ｄ．Ｊ．（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｄ．Ｊ．）、スパイザー  Ｆ．Ｅ．（Ｓｐｅｉｚｅｒ  Ｆ．Ｅ．）およびリャン  Ｍ．Ｈ．（Ｌｉａｎｇ  Ｍ．Ｈ．）「Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ．」Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３２、１６６６−１６７０頁（１９９５年）］。
【０００６】
それに対し、ＳＭＩの保有者における結合組織疾患様の徴候が注入物の除去後に消失したことが示されている［ザズゴルニク  Ｊ．（Ｚａｚｇｏｒｎｉｋ  Ｊ．）、ピザ  Ｈ．（Ｐｉｚａ  Ｈ．）、カイザー  Ｗ．（Ｋａｉｓｅｒ  Ｗ．）、ベッテルハイム  Ｐ．（Ｂｅｔｔｅｌｈｅｉｍ  Ｐ．）、シュタイナー  Ｇ．（Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｇ．）、スモーレン  Ｊ．（Ｓｍｏｌｅｎ  Ｊ．）、ビーゼンバッハ  Ｇ．（Ｂｉｅｓｅｎｂａｃｈ  Ｇ．）およびマシェク  Ｗ．（Ｍａｓｃｈｅｋ  Ｗ．）「Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ．」Ｗｉｅｎ．Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１０８、７８１−７８７頁（１９９６年）］。さらに、ＳＭＩ周囲の被膜構造の発生に対して免疫学的機序が寄与することを示すことができた［ウォルフラム  Ｄ．（Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｄ．）、ライナー  Ｃ．（Ｒａｉｎｅｒ  Ｃ．）、ニダーエッガー  Ｈ．（Ｎｉｅｄｅｒｅｇｇｅｒ  Ｈ．）、ピザ  Ｈ．（Ｐｉｚａ  Ｈ．）およびウィック  Ｇ．（Ｗｉｃｋ  Ｇ．）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ａｒｏｕｎｄ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．」Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２３、８１−９１頁（２００４年）］。後者のレポートでは、これらの被膜内で遅延型過敏性反応が生じることが示された。
【０００７】
大部分の専門家が、シリコンに対する反応が持続性のある強度の弱い異物反応の１種であるが、それらのプロセスの根底にある機序が正確に知られていないという意見に同意している。シリコンに対する免疫応答の活性化については明らかにされていても、（ｉ）シリコン自体が抗原特性を有するか、（ｉｉ）ハプテンまたは担体として作用するか、（ｉｉｉ）免疫アジュバントを示すか、（ｉｖ）潜在的抗原（ｃｒｙｐｔｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）および「改変された自己（ａｌｔｅｒｅｄ  ｓｅｌｆ）」の暴露を促進する表面であるか、あるいは（ｖ）周囲組織内でのストレス応答を誘発するかについては定かではない。
【０００８】
それがシリコンに対する免疫反応における主要な因子として同定されていても、シリコンの表面上のタンパク質性フィルムの組成物に対する理解は乏しい。それはほぼ注入直後に注入シリコンの表面上で得られる［エルウィング  Ｈ．（Ｅｌｗｉｎｇ  Ｈ．）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９、３９７−４０６頁（１９９８年）］。フィルムを形成するタンパク質は、注入物と相互作用する最初の細胞である食細胞および線維芽細胞により認識される。
【０００９】
生体系内では、フロー条件、タンパク質の高次構造変化、タンパク質の競合的吸着、ならびに血液凝固および補体活性化における初期効果が、人工表面上でのタンパク質フィルムの形成に強く影響することを力説することは重要である（「フローマン（Ｖｒｏｍａｎ）効果」）［フローマン  Ｌ．（Ｖｒｏｍａｎ  Ｌ．）、アダムズ  Ａ．Ｌ．（Ａｄａｍｓ  Ａ．Ｌ．）、フィッシャー  Ｇ．Ｃ．（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｇ．Ｃ．）およびムノス  Ｐ．Ｃ．（Ｍｕｎｏｚ  Ｐ．Ｃ．）「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ  Ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ，Ｆａｃｔｏｒ−Ｘｉｉ，ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ａｔ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．」Ｂｌｏｏｄ  ５５、１５６−１５９頁（１９８０年）］。フィルムが複雑であることから、フィブリノーゲンＤドメインにおけるγ１９０〜２０２の潜在的な免疫原性のあるエピトープが［それらの表面上のＭＡＣ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を通じて］マクロファージを活性化可能であることがこれまで示されているにすぎない［フー  Ｗ．Ｊ．（Ｈｕ  Ｗ．Ｊ．）、イートン  Ｊ．Ｗ．（Ｅａｔｏｎ  Ｊ．Ｗ．）、ウガロヴァ  Ｔ．Ｐ．（Ｕｇａｒｏｖａ  Ｔ．Ｐ．）およびタン  Ｌ．（Ｔａｎｇ  Ｌ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｂｏｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．」Ｂｌｏｏｄ  ９８、１２３１−１２３８頁（２００１年）］。フィブリノーゲンのこのエピトープは、シリコン表面への接着時に限って暴露され、ＳＭＩの局所性副作用において重要な役割を果たす。応答として、活性化されたマクロファージがＴＮＦ−αを産生し、それにより、リンパ球が補充され、線維芽細胞の周囲組織への分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、増殖および移動が誘発される。線維症は、シリコン表面に接着したタンパク質と相互作用するリンパ球、線維芽細胞およびマクロファージにより常に持続される、シリコンに対する慢性炎症反応への周囲組織の応答として発症する。
【００１０】
線維性被膜形成に関する免疫仮説についてのさらなる証拠が、注入物周囲の結合組織被膜の組成物中に見出されうる。被膜形成における免疫組織学的レベルについては、類似の知見を有する極めて多数の研究において検討されている［ウィック  Ｇ．（Ｗｉｃｋ  Ｇ．）、ワグナー  Ｒ．（Ｗａｇｎｅｒ  Ｒ．）、クリマ  Ｇ．（Ｋｌｉｍａ  Ｇ．）およびウィルフリングセダー  Ｐ．（Ｗｉｌｆｌｉｎｇｓｅｄｅｒ  Ｐ．）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」カノ  Ｋ．（Ｋａｎｏ  Ｋ．）、モリ  Ｓ．（Ｍｏｒｉ  Ｓ．）、スギサキ  Ｔ．（Ｓｕｇｉｓａｋｉ  Ｔ．）およびトリス  Ｍ．（Ｔｏｒｉｓｕ  Ｍ．）編  ２３１−２４１頁（東京大学出版会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ  Ｐｒｅｓｓ）、東京（Ｔｏｋｙｏ）；１９８７年）ならびにガッビアーニ  Ｇ．（Ｇａｂｂｉａｎｉ  Ｇ．）、ヒルシェル  Ｂ．Ｊ．（Ｈｉｒｓｃｈｅｌ  Ｂ．Ｊ．）、リアン  Ｇ．Ｂ．（Ｒｙａｎ  Ｇ．Ｂ．）、スタトコフ  Ｐ．Ｒ．（Ｓｔａｔｋｏｖ  Ｐ．Ｒ．）およびマジュノ  Ｇ．（Ｍａｊｎｏ  Ｇ．）「Ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｏｒｇａｎ．Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３５、７１９−７３４頁（１９７２年）］。
【００１１】
マクロファージおよび線維芽細胞の表現型を有する細胞からなる滑膜様の多層の異形成が注入物に向けて形成されることが示されている。興味深いことに、これらの細胞は、ＳＭＩの表面上に大量の熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）のようなストレスタンパク質も発現する［ウォルフラム  Ｄ．（Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｄ．）、ライナー  Ｃ．（Ｒａｉｎｅｒ  Ｃ．）、ニダーエッガー  Ｈ．（Ｎｉｅｄｅｒｅｇｇｅｒ  Ｈ．）、ピザ  Ｈ．（Ｐｉｚａ  Ｈ．）およびウィック  Ｇ．（Ｗｉｃｋ  Ｇ．）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ａｒｏｕｎｄ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．」Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２３、８１−９１頁（２００４年）］。線維芽細胞の慢性増殖性炎症パターンが原因で、２年を超える注入期間後に密集した膠原線維症が生じている［シグロウ  Ｗ．（Ｓｉｇｇｅｌｋｏｗ  Ｗ．）、ファリディ  Ａ．（Ｆａｒｉｄｉ  Ａ．）、クリンゲ  Ｕ．（Ｋｌｉｎｇｅ  Ｕ．）、ラス  Ｗ．（Ｒａｔｈ  Ｗ．）およびクロスターハルフェン  Ｂ．（Ｋｌｏｓｔｅｒｈａｌｆｅｎ  Ｂ．）「Ｋｉ６７，ＨＳＰ７０  ａｎｄ  ＴＵＮＥＬ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｊ  Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ  １５、１３５５−１３６０頁（２００４年）］。結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）の分泌を通じての局所的な線維化プロセスのさらなる刺激が被膜内のγδ−Ｔ−細胞により媒介され［ワーカレマフ  Ｇ．（Ｗｏｒｋａｌｅｍａｈｕ  Ｇ．）、フォエルスター  Ｍ．（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ  Ｍ．）、クレーゲル  Ｃ．（Ｋｒｏｅｇｅｌ  Ｃ．）およびブラウン  Ｒ．Ｋ．（Ｂｒａｕｎ  Ｒ．Ｋ．）「Ｈｕｍａｎ  ｇａｍｍａ  ｄｅｌｔａ−Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＩＬ−１５  ａｎｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  １  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ  ｂｅｔａ−Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．」Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７０、１５３−１５７頁（２００３年）］、それは注入物周囲の結合組織被膜内にも見出された。さらに、マクロファージがγδ−Ｔ−細胞によって産生されるＴＮＦ−αによる正のフィードバックループを介して刺激される。
【００１２】
注入された原料に対する宿主応答の評価には、細胞および分子レベルの双方での応答に関して系統的で客観的な検討を行う必要がある。ハント（Ｈｕｎｔ）ら［ハント  Ｊ．Ａ．（Ｈｕｎｔ  Ｊ．Ａ．）、マクローリン  Ｐ．Ｊ．（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  Ｐ．Ｊ．）およびフラナガン  Ｂ．Ｆ．（Ｆｌａｎａｇａｎ  Ｂ．Ｆ．）「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １８（２２）、１４４９−１４５９頁（１９９７年）］は、試薬がまだ使用可能でない場合の技術と、継続的な適用が既存のアプローチを補助するものとして極めて重要であるとされるＤＮＡベースの技術を含む、細胞のマーカーまたは分子を試験するためのツールとしての抗体の発現を意図した現行の技術について記載している。
【００１３】
米国特許第４，０４８，２９８号明細書は固体二重抗体ラジオイムノアッセイ法を開示している。同特許は、抗原自体または例えばタンパク質との反応によって抗原物質に変換されうるハプテンのいずれかでありうる抗原物質の体液含量をアッセイするためのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法に関する。本発明は、アッセイで対象とされる体液中に存在すると思われる抗原物質に特異的な第１の抗体が存在する場合の二重抗体ＲＩＡ技術の新しくかつ改善された修飾に関する。しかし、二次抗体は抗原物質または分析物に特異的でないが、第１の抗体に特異的な抗体である。
【００１４】
国際公開第０２／４１０００号パンフレットは、膜結合マトリックスのメタロプロテアーゼに対するイムノアッセイ法について開示している。単純な手順および試薬を用いることで、ＭＴｌ−ＭＭＰを迅速に定量可能であるかまたはＭＴｌ−ＭＭＰの酵素活性を高感度および高精度で測定可能である。すなわち、抗−ＭＴｌ−ＭＭＰ抗体およびそれとともに用いられるべき試薬によりＭＴｌ−ＭＭＰを免疫学的に定量する方法の使用、すなわち、（ｉ）界面活性剤および／または還元剤の使用とともに細胞膜から放出されかつ／または可溶化されているＭＴｌ−ＭＭＰと、（ｉｉ）自ら可溶化されたＭＴｌ−ＭＭＰおよびそれとともに用いられるべき試薬ならびに固相ＭＴｌ−ＭＭＰからなる群から選択されるメンバーを免疫学的に定量する方法の使用により、ＭＴｌ−ＭＭＰを定量するかまたはＭＴｌ−ＭＭＰの酵素活性を測定することが可能になる。さらに、ＭＴｌ−ＭＭＰの発現プロモーターまたは阻害剤およびＭＴｌ−ＭＭＰの活性プロモーターまたは阻害剤がそれによりスクリーニングされうる。それ故、有用な薬剤に関する研究および開発が促進されうる。これらの試薬は癌および癌転移の検査においても有用である。
【００１５】
米国特許第５，３８９，５１８号明細書は、あるポリマー上、例えばシリコン上に堆積可能なフィブロネクチンおよびビトロネクチンの特定のドメインに特異的なモノクローナル抗体について記載している。これらの抗体はタンパク質のフィブロネクチンおよびビトロネクチンに結合可能であるとともに生物学的物質として役立ちうる。しかし、フィブロネクチンおよびビトロネクチンのシリコン表面に対する直接的結合については示されていない。
【００１６】
胸部へのシリコン注入は論争の歴史を有しており、食品医薬品局により使用についてはもはや認められていない。それらはシリコンゲルで充填された柔らかいシリコンゴムの外部被覆からなるものであった。胸部へのシリコン注入に関連する合併症についての事例報告が、強皮症およびリウマチ様症候群などの結合組織障害との関連を含めて極めて多い。
【００１７】
胸部注入のあらゆるタイプに明白な合併症は、出血および感染などの手術に関連した合併症を含む。注入物の寿命の後半では、主要な合併症は被膜拘縮および注入物の破裂（ｉｍｐｌａｎｔ  ｒｕｐｔｕｒｅ）を含む。しかし、無傷のシリコン注入物の外膜に対して類似の合併症が存在する。
【００１８】
いくつかの興味深い事柄が示されているが、これらの合併症の原因は不明のままである。例えば、シリコン注入物内部のゲルは重合形態である。未重合のシリコンが無傷のシリコン膜を通して周囲組織に流出しうる。この未重合のシリコンが被膜拘縮を担う線維化反応を刺激することが理論化されている。シリコンの無傷の膜を通しての流出ならびに注入物の破裂は肉芽腫の形成を伴う。にもかかわらず、無傷の注入物の表面すなわち「真の」表面を被覆する重合シリコンもまた、シリコンの流出を伴わなくても肉芽腫性または線維性の被膜を形成する可能性を有する。
【００１９】
現在、タンパク質とシリコンの間の相互作用についてはほとんど理解されていない。特定のシリコンであるオクタメチルシクロテトラシロキサン（Ｄ４）がフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンにおける変性および高次構造変化を誘発することが示されているが、免疫原性におけるそれらの関連性についての証拠は全くない［サン  Ｌ．（Ｓｕｎ  Ｌ．）、アレキサンダー  Ｈ．（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｈ．）、ラッタルーロ  Ｎ．（Ｌａｔｔａｒｕｌｏ  Ｎ．）、ブルメンタール  Ｎ．Ｃ．（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  Ｎ．Ｃ．）、リッチ  Ｊ．Ｌ．（Ｒｉｃｃｉ  Ｊ．Ｌ．）およびチェン  Ｇ．（Ｃｈｅｎ  Ｇ．）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ．」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １８、１５９３−１５９７頁（１９９７年）］。
【００２０】
タヴァッザーニ（Ｔａｖａｚｚａｎｉ）らは、ヒト単球由来のマクロファージのモデルを開発し、シリコンに誘発される炎症の機序について検討した。このモデルを用い、コラーゲンタイプＩとシリコンゲルの間の相互作用が細胞によるＩＬ−Ｉの分泌を誘発することが示された。しかし、コラーゲンのシリコンに対する結合特性については検討されなかった［タヴァッザーニ  Ｆ．（Ｔａｖａｚｚａｎｉ  Ｆ．）、シン  Ｓ．（Ｘｉｎｇ  Ｓ．）、ワデル  Ｊ．Ｅ．（Ｗａｄｄｅｌｌ  Ｊ．Ｅ．）、スミス  Ｄ．（Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．）およびボイントン  Ｅ．Ｌ．（Ｂｏｙｎｔｏｎ  Ｅ．Ｌ．）  「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｇｅｌ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．」Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．−Ｐａｒｔ  Ａ、７２、２、１６１−１６７頁（２００４年）］。
【００２１】
別の試験においては、ウォルフラム（Ｗｏｌｆｒａｍ）ら［ウォルフラム  Ｄ．（Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｄ．）、ライナー  Ｃ．（Ｒａｉｎｅｒ  Ｃ．）、ニダーエッガー  Ｈ．（Ｎｉｅｄｅｒｅｇｇｅｒ  Ｈ．）、ピザ  Ｈ．（Ｐｉｚａ  Ｈ．）およびウィック  Ｇ．（Ｗｉｃｋ  Ｇ．）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ａｒｏｕｎｄ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．」Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２３、８１−９１頁（２００４年）によると、シリコンがストリンジェントな局所性のＴ細胞免疫応答を誘発しかつ注入被膜内に位置するタンパク質が数種存在することが示された。これらのタンパク質は、（ａ）膠原性タンパク質の（プロ）コラーゲンタイプＩおよびＩＩＩ、コラーゲンタイプＩＶ、（ｂ）非膠原性タンパク質のテネイシン、フィブロネクチンおよびラミニン、ならびに（ｃ）熱ショックタンパク質６０を含む。しかし、これらのタンパク質のシリコンへの結合を示すデータは全く提供されていない。それに対し、シリコン表面から隔絶された被膜が検討された。筆者らは、例えば予め潜在性を示したエピトープの暴露後での、結果として生ずるタンパク質の免疫原としての機能についてのみ考察している。
【００２２】
バッコヴィッチ（Ｂａｃｋｏｖｉｃ）らは、注入物周囲の被膜形成に関する免疫学的基礎について検討した［Ａ．、オベライター  Ｂ．（Ｏｂｅｒｒｅｉｔｅｒ  Ｂ．）、デル・フラリ  Ｂ．（Ｄｅｌ  Ｆｒａｒｉ  Ｂ．）、ファン  Ｈ．Ｌ．（Ｈｕａｎｇ  Ｈ．Ｌ．）、ピザ  Ｈ．（Ｐｉｚａ  Ｈ．）、ウィック  Ｇ．（Ｗｉｃｋ  Ｇ．）「Ｊｏｉｎｔ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、２１−２４頁、２００５年９月、キール（Ｋｉｅｌ）、ドイツ  ｌｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１０、第６−８号、２００５年］。この試験では、インビボでＳＩを被覆するタンパク質性フィルムが分析されかつ１８３個のスポットからなるタンパク質セットが同定され、それから３種のタンパク質すなわちフィブロネクチン、ビトロネクチンおよび熱ショックタンパク質６０について言及された。さらなる詳細は全く提供されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
上記の進歩にもかかわらず、先行技術にはシリコン接着タンパク質およびタンパク質性フィルムの役割、特に細胞および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質とシリコンとの相互作用をさらに活用するための方法およびデバイスを提供し、かつシリコン表面に接着可能な新規のタンパク質を同定するという需要が依然として存在する。例えば上記のような局所性または全身性副作用を発現させやすく、これらの結果に対するモニター、予防および治療に適する方法の基礎となりうる個人を同定しようとする場合、対象のシリコンに対する反応に内在する機序に関してより十分に理解することは不可欠である。さらにより十分に理解することは、より高い生体適合性を有するシリコンを提供するための重要な役割も果たす。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、その第１の態様では、シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法であって、ａ）哺乳類に由来する、シリコン接着ポリペプチドを含有すると思われる、また場合によりシリコンを含有する試料を取得する、かつ／または提供するステップと、ｂ）前記試料を少なくとも１種のシリコンに接触させるステップと、ｃ）ステップａ）および／またはｂ）からの前記シリコンに接着される前記ポリペプチドを単離する、好ましくは溶出させるステップと、ｄ）前記単離されたシリコン接着ポリペプチドを同定するステップと、を含む、方法を提供する。
【００２５】
本発明は、そのさらなる態様では、シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための試薬キットであって、原料、緩衝液および助剤ならびに本発明に記載の方法を実施するための物質を含む、試薬キットに関する。
【００２６】
本発明は、そのさらなる態様では、ある方法を介してまたは本発明に記載のキットの使用により同定されるシリコン接着ポリペプチドを提供する。
【００２７】
好ましい一実施形態では、本発明は、本発明によって同定されるポリペプチドあるいはシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明によって同定されるシリコンとの結合に干渉する物質、ならびにそれら各々の使用に関する。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドあるいはシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明によって同定されるシリコンとの結合に干渉する物質、ならびに医薬担体を含有する医薬組成物に関する。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその機能変異体を提供する。
【００３０】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明に記載のポリペプチド、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその機能変異体をコードするヌクレオチド配列、あるいは前記核酸の相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３１】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は本発明に記載の核酸を含む組換えベクターを提供する。好ましいさらなる実施形態では、本発明は本発明に記載の核酸またはベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本発明に記載のポリペプチドを免疫学的に認識する抗体に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は医療で用いられる、本発明に記載のポリペプチド、核酸またはベクターまたは発現ベクターを提供する。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能変異体を免疫学的に認識する抗体に関する。
【００３３】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明は、有効用量の本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクター、本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、または本発明に記載の抗体、および医薬的に許容できる担体を含有する医薬組成物に関する。
【００３４】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクター、本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、または哺乳類のシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応を検出するための本発明に記載の抗体の使用に関する。
【００３５】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するためのポリペプチドの使用に関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、脊髄関連タンパク質（Ｍｙｅｌｏｉｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、およびＰＲＯ２６１９からなる群またはそれらの機能変異体から選択される。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための方法であって、ａ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体を含有すると思われる、診断対象の哺乳類に由来する試料を提供するステップと、ｂ）前記試料中で前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはそれらの前記機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、ｃ）前記哺乳類の前記シリコンに対する応答反応について、前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはそれらの機能変異体の存在または発現における変化から判定するステップと、を含む、方法に関する。
【００３７】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、原料、緩衝液、助剤、および本発明に記載の方法を実施するための物質を含む、哺乳類のシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応を検出するための診断キットに関する。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳類におけるシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応をモニターするための方法であって、ａ）少なくとも１種のシリコンを前記哺乳類に注入するステップと、ｂ）本発明に記載の方法またはキットを用いて本発明に記載のシリコン接着ポリペプチドの存在または発現における変化を検出するステップと、場合によりステップｂ）を繰り返すステップと、を含む、方法に関する。
【００３９】
本発明は、その別の好ましい態様では、少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドに干渉する物質をスクリーニングするための方法であって、ａ）シリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉すると思われる物質を提供するステップと、ｂ）シリコン、特に医療用シリコンを提供するステップと、ｃ）シリコン接着ポリペプチドを提供するステップと、ｄ）前記物質の存在下および不在下で前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着性の分析を通じて前記物質の干渉特性を分析するステップと、を含む、方法を提供し、ここで前記物質の存在下および不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着性における変化は、シリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドのシリコンに対する結合に干渉する物質を示唆している。
【００４０】
本発明は、その別の好ましい態様では、細胞のシリコンに対する接着性を検出するための方法であって、ａ）細胞を有する哺乳類の血清または創傷液の試料を提供するステップと、ｂ）シリコンを提供するステップと、ｃ）前記シリコンに接着する前記血清または創傷液に由来する細胞の量または数を分析するステップと、を含む、方法に関する。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、本発明は、注入シリコンに対する有害反応を被る哺乳類を治療する方法であって、本発明に記載の方法により同定されるシリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉する有効量の物質を前記哺乳類に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、本発明は、シリコンに対する応答反応を被る哺乳類の治療をモニターするための方法であって、ａ）本発明により同定されるシリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉する有効量の物質を前記哺乳類に投与するステップと、ｂ）前記哺乳類から試料を取得するステップと、ｃ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、を含む、方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明が以下により詳細に記載される前に、本明細書中に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬が変化しうることから本発明がこれらに限定されないことは理解されるべきである。本明細書で用いられる用語が、あくまで特定の実施形態を記載することを目的とし、本発明の範囲を限定するように意図されることはなく、あくまで添付の特許請求の範囲により限定されることになることも理解されるべきである。他に規定されない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明を目的として、本明細書中で挙げられるすべての参考文献はそれら全体が参照により援用される。
【００４４】
既に概説したように、先行技術には哺乳類のシリコンに対する応答反応において関与するポリペプチドを同定するという需要が存在する。これらのポリペプチドは、免疫応答の主要な活性剤としての役割を果たすと推定され、ここでは注入の失敗につながる線維症に関与している。したがって、それらの組成物およびそれらの堆積のダイナミクスについての詳細な分析が必要である。さらに、これらの同定されるポリペプチドであれば、シリコンに対する応答反応に関連し、診断用のかつ治療可能性のある標的分子として役立ちうる。
【００４５】
本明細書で用いられる「応答反応」という用語は、身体または細胞のシリコン、例えば医療用シリコンに対する生理的反応を意味するものとする。かかる反応は、身体の免疫系を含む免疫反応として現れる可能性があり、かつ局所性（すなわちシリコンとの接触部位またはその近傍）あるいは全身性（すなわち一般に身体、例えば血液、血清または他の液体などの中に見出される）の副作用、例えば注入シリコン、例えば注入ＳＭＩに対する応答として存在しうる［スモーレイ  Ｄ．Ｌ．（Ｓｍａｌｌｅｙ  Ｄ．Ｌ．）、レビン  Ｊ．Ｊ．（Ｌｅｖｉｎｅ  Ｊ．Ｊ．）、シャンクリン  Ｄ．Ｒ．（Ｓｈａｎｋｌｉｎ  Ｄ．Ｒ．）、ホール  Ｍ．Ｆ．（Ｈａｌｌ  Ｍ．Ｆ．）、およびスティーブンス  Ｍ．Ｖ．（Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｍ．Ｖ．）「Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｉｌｉｃａ  ａｍｏｎｇ  ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．」Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９６、５６７−５７４頁（１９９６年）］。局所性および全身性の副作用は、推定上、結合組織の線維性被膜（通常、異物としての肉芽腫の形成を伴う）、線維筋痛、結合組織疾患（例えば炎症）、および強皮症様の線維化症候群の形成をもたらす。シリコン注入に応答して生じる線維化プロセスが他の注入に無関係の線維化疾患におけるモデルであることは注目すべきであり、それについては（ｉ）壊死後性疾患、例えば肝硬変、（ｉｉ）炎症性疾患、例えば関節リウマチ、または（ｉｉｉ）特発性の形態、例えばデュピュイトラン拘縮（Ｄｙｐｕｙｔｒｅｎ’ｓ  ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）および（ｉｖ）一般的な異物反応（例えば注入物に対する反応）といった４つの異なるタイプが知られている。
【００４６】
本明細書で用いられる「過敏症」という用語は、哺乳類のシリコンに対する（過剰な）応答反応、例えば個体の特定のシリコンに応答した有害反応における特定のタイプを示し、一実施形態ではこの個体においてのみ見出されうるのに対し、他の個体であれば各応答（すなわち特定のシリコンに対する個々の応答）を全く示す可能性がないことになる。
【００４７】
本発明は、その好ましい態様では、シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法であって、ａ）哺乳類からシリコン接着ポリペプチドを含有すると思われ、また場合によりシリコンを含有する試料を取得する、かつ／または提供するステップと、ｂ）前記試料を少なくとも１種のシリコンに接触させるステップと、ｃ）ステップａ）および／またはｂ）から前記シリコンに接着される前記ポリペプチドを単離する、好ましくは溶出するステップと、ｄ）前記単離ポリペプチドを同定するステップと、を含む、方法を提供する。好ましくは、ポリペプチドは、ゲル電気泳動、より好ましくは二次元ゲル電気泳動を用いて最初に分離される。好ましくは、このステップの次に当業者に既知の染色手順、好ましくは銀染色が行われる。したがって、染色されたポリペプチドは、ポリペプチドの「スポットパターン」として検出可能となる。このパターンは、あるソフトウェアを用い、例えば対照パターンまたはデータベース、例えば２ＤゲルのＥｘＰａｓｙデータベースと適合されかつ比較される。好ましくは目的のポリペプチドスポットは取り出され、より好ましくは目的のポリペプチドスポットは手で取り出される。次いで、取り出されたポリペプチドスポットは、好ましくは消化され、質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いるペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ）による分析に適する断片が得られる。好ましくは、試料はＬＩＦＴ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳを用いてさらに分析される。より好ましくは、結果はそこで当業者に既知のウエスタンブロット分析を用いて確認される。
【００４８】
本明細書で用いられる「接着する」または「接着」という用語は、化合物、例えばポリペプチドが表面、例えばシリコンの表面に強く付着することを示す。この付着は、ポリペプチドとシリコンとの間の共有および非共有結合の双方によりなされうる。
【００４９】
本発明に記載の「ポリペプチド」という用語は、少なくとも１０個、好ましくは２０〜５０個、より好ましくは３０〜１００個といった所定の長さのアミノ酸鎖のアミノ酸を包含するペプチドまたはタンパク質を意味するものとし、ここでアミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結される。しかし、アミノ酸および／またはペプチド結合が機能類似体によって置き換えられている、かかるポリペプチドのペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）もまた本発明により包含される。大部分の好ましいポリペプチドは、ポリペプチドのシリコンに対する接着に機能的に関与するかまたは含まれるペプチドの一部である。
【００５０】
本明細書で用いられる「シリコン」という用語は、ヒト身体などの生理的環境下で用いられうるすべてのジメチルシロキサンポリマーを包含するものとする。通常、かかるシリコンは、生体適合性（すなわち身体の免疫応答を確実に誘発することが全くないかまたはほとんどない）を示し、また好ましくは高い生理的許容度を有する。かかるシリコンは「医療用シリコン」としても知られる。かかる医療用シリコンは、医療用注入、例えばシリコンのマンマリー注入などにおいて、または医療器具、例えばバイパス注入のためのコーティング剤として用いられうる。本発明に基づく使用に適するかかる医療用シリコンは当業者に既知である。医療用シリコンの好ましい例として、ヌシル（Ｎｕｓｉｌ）社（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ））により提供されるシリコンタイプＭＥＤ１５１１、ＭＥＤ４８６０、ＭＥＤ４２１１、ＭＥＤ３６０が挙げられる。
【００５１】
本発明の一態様に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、試料は、シリコン、尿、胸膜液または腹水、脳脊髄液、創傷液または血清を網羅するタンパク質性フィルムから選択される。好ましくは、前記試料は、シリコン、血清または創傷液を網羅するタンパク質性フィルムから選択される。好ましくは、前記創傷液はドレナージにより得られる。
【００５２】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、試料はシリコンに対する応答反応を示す哺乳類から得られる。
【００５３】
本発明と関連し、哺乳類は好ましくはヒトである。
【００５４】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、試料は、一般に以下のタイプ、すなわち（ｉ）壊死後性疾患、例えば肝硬変症、（ｉｉ）炎症性疾患、例えば関節リウマチ、（ｉｉｉ）特発性の線維化疾患、例えばデュピュイトラン拘縮（Ｄｕｐｕｙｔｒｅｎ’ｓ  ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）、（ｉｖ）異物反応のうちの１つの線維化疾患からなる群から選択される応答反応を示す哺乳類から得られる。かかる疾患により、結合組織の線維性被膜、線維筋痛、結合組織疾患、および強皮症様の線維化症候群の形成がもたらされうる。
【００５５】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法のさらなる好ましい実施形態では、結合組織の線維性被膜が免疫反応により形成される。
【００５６】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、創傷液または血清が追加のシリコン、好ましくは医療用シリコンとともに提供される。
【００５７】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、シリコンは未重合状態で提供される。本発明によって用いられる「未重合」という用語は、本質的に重合されないシリコン、例えば医療用シリコンの状態に関する。未重合シリコンは、通常、シリコン注入物（特に胸部注入物）における重合の副産物として生じ、かかる注入物に付随する問題の多くを引き起こすと考えられる。
【００５８】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、シリコンは当業者に既知の任意の医療用シリコンであってもよい。好ましくは、シリコンはヌシル（Ｎｕｓｉｌ）社（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ））によって提供されるシリコンタイプＭＥＤ１５１１、ＭＥＤ４８６０、ＭＥＤ４２１１、およびＭＥＤ３６０からなる群から選択される。
【００５９】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、ステップｄ）は当業者に既知の任意の方法を含む。好ましくは、ステップｄ）は、一次元または二次元電気泳動、ウエスタンブロット分析、タンパク質の量および／または存在の測定に適するタンパク質アッセイ、質量分析、修飾、例えば銀染色の分析、高度糖化最終産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ＡＧＥ）の形成、酸化、抗体アレイ、リガンドアレイ／アッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ、例えばＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）アッセイに適する方法から選択される方法を含む。
【００６０】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、方法はステップｅ）に哺乳類におけるシリコンに対する応答反応を検出するためのマーカーポリペプチドとして適切なポリペプチドを同定するステップをさらに含む。好ましくは、外殖されたシリコンを被覆するタンパク質性フィルムから溶出されるタンパク質が創傷液または血清から取得されるシリコン接着タンパク質と比較される。より好ましくは、２つの系から溶出されるタンパク質は一次元および／または二次元ゲル電気泳動により比較される。好ましくは、２つの系に由来するタンパク質が特定の波長で励起されうる異なる蛍光色素で標識されることにより、単一のゲルから別々の画像が得られる。にもかかわらず、放射性検出も行ってもよい。各々の標識は当業者に周知である。好ましくは、タンパク質のスポットパターンは当業者に既知のかかるパターンの分析に適する任意のソフトウェアで分析される。好ましくは、タンパク質のスポットパターンは「Ｄｅｃｙｄｅｒ」ソフトウェア（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で分析される。
【００６１】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、応答反応は哺乳類におけるシリコンに対する過敏性反応である。
【００６２】
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、ステップｅ）は、ｅ’）前記シリコンを被覆するタンパク質性フィルムから同定された前記タンパク質の分離から誘導されるポリペプチドパターンを創傷液または血清から溶出されたシリコン接着ポリペプチドの分離から誘導されるポリペプチドパターンと比較するステップと、ｅ’’）前記パターン内の目的のスポットを選択しかつ分析するステップと、を含む。好ましくは試料間のスポットの容量比がスポット分布全体の２標準偏差を超えた場合、タンパク質の堆積量は異なると考えられ、最も好ましくは容量比が５倍の閾値を超えた場合、スポットは系内にのみ存在するものとして規定される。
【００６３】
ステップａ）での本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは異なる蛍光色素でさらに標識されるかまたは放射性標識される。好ましくは、蛍光色素は特定の波長で励起可能である。当業者に既知の任意の蛍光色素が用いられる。好ましくは、蛍光色素は、７−アミノアクチノマイシンｄ（７−ＡＡＤ）、アクリジンオレンジ、アレクサ染料、アミノメチルクマリン−アセテート（ＡＭＣＡ）、Ｃｙ−染料、例えばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）−染料、例えば、ヘキスト３３３４２、ヘキスト３３２５８、「青色」蛍光、５，５’，６，６’テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチル−ベンズイミダゾリルカルボシアニンイオダイド（ＪＣ−Ｉ）、ペリジニン−クロロフィル−タンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ヨウ化プロピジウム、ローダミンレッド−Ｘ、フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）、アミノメチルクマリンアセテートスルホニルクロライドローダミン−誘導体（テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ））、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）からなる群から選択される。
【００６４】
ステップｅ’’）における本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、ポリペプチドのスポットパターンがシリコンから溶出されるポリペプチド由来のポリペプチドパターン内および創傷液または血清から溶出される分離されたシリコン接着ポリペプチドのポリペプチドにおけるポリペプチドパターン内に存在する全スポットを探索することにより分析される。
【００６５】
本発明に記載の方法の特定の好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【００６６】
本発明は、そのさらなる態様では、材料、緩衝液および助剤ならびに本発明に記載の方法を実施するための物質を含む、シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための試薬キットに関する。
【００６７】
本発明は、そのさらなる態様では、ある方法を通じてまたは本発明に記載のキットを用いることにより同定されるシリコン接着ポリペプチドに関する。
【００６８】
本発明は、そのさらなる態様では、本発明により同定されるポリペプチドあるいはシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明により同定されるシリコンに対する結合に干渉する物質、ならびにそれら各々の使用に関する。
【００６９】
本発明は、そのさらなる態様では、少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドあるいはシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明により同定されるシリコンに対する結合に干渉する物質、ならびに医薬担体を含有する医薬組成物に関する。
【００７０】
本発明は、そのさらなる態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドあるいはその機能変異体に関する。
【００７１】
本発明の意味では「機能変異体」という用語は、本発明のポリペプチドに機能的に関連する、すなわちシリコンに接着するポリペプチドの共通の構造的または機能的特徴を共有するポリペプチドを意味する。機能変異体の例として、オーソログ、すなわちヒト以外の生物、好ましくは例えばサル、ブタ、マウス、およびラットなどの非ヒト哺乳類に由来する対応するポリペプチドが挙げられる。機能変異体の他の例として、生物の異なる個体内または異なる器官内の遺伝子の異なる対立遺伝子によってコードされるポリペプチドが挙げられる。さらにポリペプチドについても、本発明のポリペプチドに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび／またはこれらのポリペプチド配列から誘導されるＤＮＡ配列に対して約７０％、好ましくは約８０％、特に約９０％、より好ましくは約９５％の配列相同性、特に配列同一性を有する前記用語によって包含されるものとする。付加、転置、置換、欠失、挿入または化学的／物理的修飾および／もしくは交換または約１〜６０個、好ましくは約１〜３０個、および最も好ましくは約１〜１５個のアミノ酸の範囲内にあるポリペプチドの一部が含まれる。したがって、機能変異体は、好ましくは前記ポリペプチドのシリコンに対する接着を担うタンパク質のドメインを包含しうる。
【００７２】
本発明に記載のポリペプチドの好ましい実施形態では、ポリペプチドまたはその機能変異体はシリコンの表面に接着する。
【００７３】
本発明に記載のポリペプチドに関する別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは融合タンパク質である。
【００７４】
本明細書で用いられる「融合タンパク質」は、ポリペプチドを天然に形成することのない少なくとも２種のポリペプチドからなるかまたはそれらを含む任意のポリペプチドを意味する。ＤＮＡレベルについては、２つ以上のコード配列がインフレームで融合される。融合タンパク質の各部分は、当業者に既知のリンカー（通常はペプチドリンカーまたは化学リンカー）により連結されかつ／または隔絶されうる。
【００７５】
本発明は、その別の態様では本発明に記載のポリペプチド、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４のいずれか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能変異体をコードするヌクレオチド配列あるいは前記核酸の相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００７６】
「機能変異体」という用語は、ストリンジェントな条件下で、誘導された参照配列またはその一部とハイブリダイズし、かつ本発明の各ペプチドに対して類似または同一の活性を示すＤＮＡ配列に対して相補的なすべてのＤＮＡ配列を示す。ハイブリダイゼーション条件は当業者に既知であり、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク州、６．３．１−６．３．６、１９９１年にて見出されうる。中程度のハイブリダイゼーション条件が、３０℃、２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、それに続く５０℃、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの中での洗浄に等価なものとして定義される。高度にストリンジェントな条件は、４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、それに続く６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの中での洗浄に等価なものとして定義される。
【００７７】
本発明に記載の核酸の好ましい実施形態では、核酸はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである。さらに、本発明の核酸分子はゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであり、かつ二本鎖または一本鎖、センス鎖および／またはアンチセンス鎖でありうる。これらの分子のセグメントは本発明の範囲内にあるとも考えられ、かつ例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されうるかまたは１種もしくは複数種の制限エンドヌクレアーゼを用いる処理により生成されうる。リボ核酸（ＲＮＡ）分子はインビトロ転写により生成されうる。
【００７８】
本発明の核酸分子は自然に存在する配列を有しうるか、または自然に存在するが遺伝子コードの縮重により生じる配列と異なる配列は同じペプチド（例えば配列番号１、２、３または４を有するペプチド）をコードする。さらに、これらの核酸分子はコード配列に限定されることはなく、例えばコード配列から上流または下流に位置する非コード配列の一部または全部を含みうる。
【００７９】
本発明の核酸分子は、インビトロで（例えばホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）に基づく合成により）合成されうるかまたは細菌または哺乳類の細胞などの細胞から取得されうる。核酸は、ヒトのものでありうるが、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、またはネコから誘導されるものでもありうる。核酸のこれらのタイプの範囲内でのヌクレオチドの組み合わせまたは修飾もまた包含される。
【００８０】
さらに、本発明の単離された核酸分子は、例えば天然状態で見出されることがないセグメントを包含しうる。したがって、本発明は、ベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）あるいは異種細胞のゲノム（または天然の染色体位置と異なる位置での相同細胞のゲノム）に組み込まれる組換え核酸分子を包含する。したがって、組換え核酸分子および使用については以下でさらに考察される。
【００８１】
さらに、本発明に記載の核酸は、マーカーまたは標識、例えばアフィニティータグ、抗原タグ、蛍光基、消光剤、放射性基、染料、重原子（窒素など）、酵素的に検出可能な基、酵素的に活性のある基などを有しうる。これらのすべてのマーカーまたは標識およびこれらを接着させるための各々の技術は当業者に周知である。
【００８２】
本発明は、その別の態様では、ストリンジェントな条件下で本発明に記載の核酸とハイブリダイズする核酸を提供する。
【００８３】
本発明は、その別の態様では、本発明に記載の核酸を含む組換えベクターに関する。
【００８４】
したがって、本発明は、別の実施形態では本発明の核酸分子を含むベクターに関する。かかるベクターは、導入される能力または核酸を細胞に導入する能力を有する。導入された核酸によりコードされるポリペプチドがベクターの導入時に細胞内で発現されることが好ましい。
【００８５】
本発明に記載の組換えベクターの好ましい実施形態では、組換えベクターは過剰発現および抑制ベクターの双方を含む組換え発現ベクターである。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、哺乳類人工染色体、ノックアウトまたはノックインコンストラクト、ウイルス、特にアデノウイルス、種痘ウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、レンチウイルス（チャン  Ｌ．Ｊ．（Ｃｈａｎｇ  Ｌ．Ｊ．）およびゲイ  Ｅ．Ｅ．（Ｇａｙ  Ｅ．Ｅ．）（２０００１年）Ｃｕｒｒ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ．１：２３７−２５１頁）、ヘルペスウイルス、特に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−Ｉ、カールソン  Ｗ．Ａ．（Ｃａｒｌｅｚｏｎ  Ｗ．Ａ．）ら（２０００年）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．）、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、カーター  Ｐ．Ｊ．（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．Ｊ．）およびサムルスキー  Ｒ．Ｊ．（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ．Ｊ．）（２０００年）Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｅｄ．６：１７−２７頁）、リノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フィロウイルスおよびそれらの組換えバージョン（例えば、コビンガー  Ｇ．Ｐ．（Ｃｏｂｉｎｇｅｒ  Ｇ．Ｐ．）ら（２００１年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２２５−３０頁を参照）、ビロゾーム、「ネーキッド（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡリポソーム、ならびに核酸コーティング粒子、特にゴールドスフィア（ｇｏｌｄ  ｓｐｈｅｒｅｓ）を含む。特に好ましいのはウイルスベクター様アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター（リンデマン（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ）ら（１９９７年）ＭｏＩ．Ｍｅｄ．３：４６６−７６頁およびスプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ら（１９９８年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５４９−５８頁）である。リポソームは、例えばリポソーム懸濁液の超音波処理による、通常、カチオン脂質、中性脂質および／またはアニオン脂質からなる小形の単層または多層小胞である。例えば、ＤＮＡはリポソームの表面にイオン化結合されるかまたはリポソーム内部に封入されうる。適切な脂質混合物は、当該技術分野で既知であり、例えばＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオクスプロピル（ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｐｒｏｐｙｌ）−３−トリメチルアンモニウムブロミド）およびＤＰＯＥ（ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン）を含有し、双方とも種々の細胞系において用いられている。
【００８７】
核酸コーティング粒子は、粒子の細胞への機械的導入を可能にするいわゆる「遺伝子銃」を用い、核酸を細胞に導入するための別の手段である。好ましくは、粒子自体は不活性であり、それ故に好ましい実施形態ではゴールドスフィアからなる。
【００８８】
本発明のさらなる態様では、本発明の核酸は原核生物および／または真核宿主細胞における発現を可能にする発現調節配列に作動的に連結される。上述の転写／翻訳調節因子は、限定はされないが、誘導および非誘導プロモーター、構成プロモーター、細胞周期調節プロモーター、代謝調節プロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、リプレッサーおよび当業者に既知でありかつ遺伝子発現を駆動するかそうでなければ調節する他の因子を含む。かかる調節因子は、限定はされないが、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに類するものにより転写されるプロモーター、例えばｓｎＲＮＡ  Ｕ６もしくはｓｃＲＮＡ  ７ＳＫ遺伝子に対するプロモーター、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ即初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期もしくは後期プロモーター、ウイルスプロモーターおよび例えばＮＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ、ＭＭＴＶもしくはＨＩＶに由来する活性化配列といったような構成的発現を誘導する調節因子を含み、それらは、例えばＣＵＰ−ｌプロモーター、ｔｅｔ−リプレッサー、例えばｔｅｔ−ｏｎもしくはｔｅｔ−ｏｆｆ系、ｌａｃ系、ｔｒｐ系で用いられるもの；組織特異的な発現を誘導する調節因子、例えばｃｄｃ２、ｃｄｃ２５ＣもしくはサイクリンＡのような細胞周期特異的な発現を誘導する調節因子；またはＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α−もしくはａ−交配因子のプロモーターといったような誘導発現を可能にする。
【００８９】
本明細書で用いられる「作動的に連結される」は、発現調節配列が目的のコード配列の発現を有効に調節するように遺伝子コンストラクトに組み込まれることを意味する。
【００９０】
同様に、本発明の核酸は、追加されるペプチド配列、例えばマーカーまたはレポーターとして機能する配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成しうる。マーカーおよびレポーター遺伝子の例として、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、（β−ガラクトシダーゼをコードする）ｌａｃＺ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。当業者は、本発明の実施に関連する多くの標準的手順と同様、有用な追加試薬、例えばマーカーまたはレポーターの機能に役立ちうる追加配列について理解するであろう。一般に、ハイブリッドペプチドは第１の部分および第２の部分を含むことになり、ここで第１の部分はシリコン接着ポリペプチドであり、第２の部分は例えば上記のレポーターまたはＩｇ定常領域もしくはＩｇ定常領域の一部、例えばＩｇＧ２ａ重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインである。他のハイブリッドであれば、精製および／または検出を容易にする抗原タグまたはＨｉｓタグを含みうる。組換え核酸分子は、異種のシグナル配列に作動的に連結されるシリコン接着ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も有しうる。かかるシグナル配列は、タンパク質を細胞内の異なる区画に誘導する可能性があり、当業者に周知である。好ましいシグナル配列は、生成されるタンパク質の分泌を促進する配列である。
【００９１】
本発明に記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを発現させるため、本発明に記載のポリペプチドのｃＤＮＡを、典型的には転写を誘導するための強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、および翻訳を開始させるためのリボソーム結合部位を有する発現ベクターにサブクローニングさせる。適切な細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のプロモーターは当該技術分野で周知であり、かつかかる発現系用のキットは市販されている。同様に、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞に対する真核生物の発現系は当該技術分野で周知であり、それも市販されている。真核生物の発現ベクターは、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターでありうる。
【００９２】
発現ベクターは、プロモーターに加え、典型的には、宿主細胞内でのシリコン接着ポリペプチドをコードする核酸の発現に必要なすべての追加成分を有する転写単位または発現カセットを有する。したがって、典型的な発現カセットは、シリコン接着ポリペプチドをコードする核酸配列に作動的に連結されるプロモーター、ならびに転写産物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルを有する。ならびにカセットの追加成分は、例えばエンハンサーを含みうる。発現カセットは、効率的な終結をもたらす構成遺伝子の下流にある転写終結領域も有するものである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られるかまたは異なる遺伝子から得られうる。
【００９３】
遺伝子情報を細胞に輸送するのに用いられる特定の発現ベクターは特に重要ではない。真核または原核細胞内での発現に用いられる従来ベクターのいずれかが用いられる場合がある。標準の細菌発現ベクターは、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系を含むが、有用に使用可能な当該技術分野で当業者により知られたものが多数存在する。
【００９４】
真核ウイルス由来の調節因子を有する発現ベクターが、典型的には真核発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクターにて用いられる。他の典型的な真核ベクターは、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、多角体プロモーター、または真核細胞内での発現に有効であることが示された他のプロモーターの誘導下で、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ．ｓｕｐ．＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ．ｓｕｐ．＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＩＲＥＳおよびタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターを含む。一部の発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの遺伝子増幅をもたらすマーカーを有する。あるいは、遺伝子増幅を含むことのない高収量の発現系もまた適切である。
【００９５】
発現ベクター内に典型的に含められる因子は、大腸菌内で機能するレプリコン、組換えプラスミドを内在させる細菌の選択を可能にする薬剤耐性をコードする遺伝子、およびプラスミドの非必須領域内の、真核生物の配列の挿入を可能にする固有の制限部位も含む。選択される特定の薬剤耐性遺伝子は重要でなく、当該技術分野で既知の多数の薬剤耐性遺伝子のいずれかが適切である。原核生物の配列は、場合により、それらが必要に応じて真核細胞内でのＤＮＡの複製に干渉することのないように選択される。
【００９６】
標準の形質移入方法を用いると、大量の受容体を発現する細菌、哺乳類、酵母または昆虫細胞系の作製が可能であり、それは次いで標準技術を用いて精製される。
【００９７】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の方法のいずれかの使用が可能である。これらは、リン酸カルシウムの形質移入、ポリブレン、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む。用いられる特定の遺伝子工学的方法により少なくとも１つの遺伝子が本発明に記載のシリコン接着ポリペプチドを発現可能な宿主細胞に十分に導入可能であることだけが必要である。
【００９８】
形質移入細胞は、発現ベクターが細胞内に導入された後、シリコン接着ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養可能であり、それは標準の技術を用いて培養物から回収される。例えば、細胞は機械的にまたは沈殿およびクロマトグラフィーステップを施す前の浸透圧衝撃により開烈される可能性があり、その性質および配列は回収されるべき特定の組換え材料に依存することになる。あるいは、組換えペプチドは組換え細胞が培養された培地から回収されうる。
【００９９】
本発明は、その別の態様では、本発明に記載の核酸またはベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明の目的のために用いられうる宿主細胞は、限定はされないが、例えば本発明のポリヌクレオチド分子を有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されうる細菌（例えば、大腸菌およびバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの原核細胞、例えば本発明の核酸分子を有する組換え酵母発現ベクターで形質転換されうる単純な真核細胞様酵母（例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ））、例えば本発明の核酸分子を有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染されうる、例えばＨｉ５細胞のＳｆ９のような昆虫細胞系、例えばプラスミドで感染されうるゼノパス卵母細胞、例えば組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染されうるかまたはシリコン接着ポリペプチドの核酸配列を有する組換えプラスミド発現ベクターで形質転換されうる植物細胞系、あるいは例えば哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）か哺乳類ウイルスに由来するもの（例えばアデノウイルス後期プロモーターおよび種痘ウイルス７．５Ｋプロモーター）かまたは細菌細胞に由来するもの（例えばｔｅｔ−ｏｎおよびｔｅｔ−ｏｆｆ系にて用いられるそれに結合するｔｅｔ−リプレッサー）を有する組換え発現コンストラクトで形質転換されうる哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｗｉ３８、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞）を含む。哺乳類から直接取得され、かつプラスミドベクターが形質移入されるかまたはウイルスベクターで感染される一次または二次細胞も宿主細胞として有用である。本発明の核酸を導入するのに用いられる宿主細胞および各ベクターに応じ、核酸は例えば染色体またはミトコンドリアＤＮＡ内に組み入れ可能であるか、例えばエピソームのような染色体外に維持可能であるか、あるいは細胞内にほんの一時的に含まれうる。
【０１００】
本発明は、その別の態様では、本発明に記載のポリペプチドおよび／またはタンパク質を免疫学的に認識する抗体を提供する。「抗体」という用語は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体とそれらの結合断片、特にＦｃ断片に加え、いわゆる「一本鎖抗体」（バード  Ｒ．Ｅ．（Ｂｉｒｄ  Ｒ．Ｅ．）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−６頁）、キメラ抗体、ヒト化抗体、特にＣＤＲ移植抗体、ならびに二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）または四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）（ホリンガー  Ｐ．（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．）ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−８頁）を含む。また、例えば本発明のペプチドに特異的に結合するファージディスプレイを含む技術により選択される免疫グロブリン様タンパク質が含まれる。好ましい抗体は、ペプチドのその各受容体に対する結合を担う部分に結合する。
【０１０１】
本発明は、別の好ましい実施形態では、配列番号ｌ、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能変異体を免疫学的に認識する抗体に関する。
【０１０２】
本発明は、その別の態様では、医療用途における本発明に記載のポリペプチド、核酸またはベクター、あるいは発現ベクターに関する。
【０１０３】
本発明は、その別の態様では、本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクター、あるいは本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、あるいは本発明に記載の抗体、ならびに医薬的に許容できる担体および／または他の適切な医薬助剤の有効用量を含有する医薬組成物に関する。
【０１０４】
例えば本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクターあるいは本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞あるいは本発明に記載の抗体（以下では単に「活性成分」と称される）のうちの少なくとも１つの内容物を有する薬剤の形態での医薬組成物の作製、ならびに本発明に記載のそれらの使用が標準の医薬技術および方法に従って行われる。このため、活性成分は、医薬的に許容できる担体および／または他の適切な医薬助剤とともに異なる徴候および投与の場所にとって適する医学的形態に作製される。
【０１０５】
したがって、医薬組成物は、望ましい放出速度、例えば迅速な発症および／または遅延または持続効果が得られるといった様式で作製されうる。したがって、医薬組成物は、軟膏、ゲル、パッチ、エマルジョン、ローション、フォーム、クリームまたは混合相もしくは両親媒性のエマルジョン系（油／水−水／油−混合相）、リポソーム、トランスフェルソーム、ペーストまたは粉末であってもよい。
【０１０６】
本発明によると、「助剤」という用語は、それが活性成分または患者と有害に反応しかつ／または相互作用することのない限り、任意の非毒性の固体または液体充填材、希釈材またはパッケージ材を意味することとする。例えば、液体の生薬助剤は、滅菌水、生理食塩水、砂糖水、エタノールおよび／またはオイルである。例えば、タブレットおよびカプセルを生成するための生薬助剤は、結合剤および充填材を含有しうる。
【０１０７】
さらに、本発明に記載の活性成分を全身性で用いられる薬剤の形態で用いてもよい。これらは注射可能物質および注入物質に属する非経口剤を含む。注射可能物質は、アンプルの形態でまたはいわゆる既成の注射可能物質、例えば既成の注射器または使い捨て注射器として存在し、さらに穴が密封されたボトルで提供される。注射可能物質の投与を、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）または皮内（ｉ．ｃ．）適用の形態で行ってもよい。特に注射にとって適する形態を、結晶懸濁液、溶液、ナノ粒子またはコロイド分散系、例えばハイドロソルなどとして作製してもよい。
【０１０８】
さらに注射可能な組成物を、等張性の水性希釈剤で溶解または分散される濃縮物として作製してもよい。注入物を、等張溶液、脂肪エマルジョン、リポソーム組成物、マイクロエマルジョンの形式で調製してもよい。注射可能物質のように、注入組成物についても希釈のための濃縮物の形式で調製してもよい。注射可能な組成物はまた、静止治療ならびに移動治療のいずれにしても、連続注入の形式、例えばミニポンプの形式で適用してもよい。
【０１０９】
本発明に記載の活性成分は、ミクロ担体またはナノ粒子、例えばポリ（メタ）アクリレート、ポリ乳酸塩、ポリグリコール酸塩、ポリアミノ酸またはポリエーテルウレタンをベースとする細かい分散粒子に結合可能である。非経口組成物はまた、例えば「多重単位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｕｎｉｔ）の原則」に基づいて本発明に記載の活性成分が細かく分割または分散された懸濁形態内にまたは結晶懸濁液として組み込まれる場合、あるいは「単一単位（ｓｉｎｇｌｅ  ｕｎｉｔ）の原則」に基づいて本発明に記載の活性成分が医薬形態、例えば結果的に注入されるタブレットまたはスティックに封入される場合、デポー製剤に修飾されうる。「単一単位」および「多重単位」の薬剤の場合でのこれらの注入物またはデポー剤は、いわゆる生体分解性ポリマー、例えば乳酸およびグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレートまたは多糖類などよりなることが多い。
【０１１０】
非経口剤を作製するための適切な助剤として、アクア・ステリリサータ（ａｑｕａ  ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔａ）、ｐＨの値に影響を与える物質、例えば有機および無機の酸と塩基およびそれらの塩など、ｐＨの値を調節するための緩衝物質、等張化剤、例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコースおよびフルクトースなど、界面活性剤または界面活性物質およびエマルゲーター（ｅｍｕｌｇａｔｏｒ）、例えばポリオキシエチレンソルビタン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎｅ）の部分脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））または例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））など、脂肪油、例えばピーナッツ油、大豆油、およびヒマシ油など、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、イソプロピルミリステートおよび中性油（Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標））など、高分子助剤、例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドン、溶解度促進添加剤、有機溶媒、例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールなど、あるいは複合体形成物質、例えばクエン酸塩および尿素など、防腐剤、例えば安息香酸ヒドロキシプロピルエステルおよび安息香酸メチルエステル、ベンジルアルコールなど、抗酸化剤、例えば亜硫酸ナトリウムなど、ならびに安定化剤、例えばＥＤＴＡなどが検討されうる。
【０１１１】
懸濁液中に本発明に記載の活性成分の硬化を回避するために増粘剤を添加するかまたは堆積物の混合を保証するためにテンシデを添加するかまたは例えばＥＤＴＡなどの複合体形成剤を添加することが可能である。活性成分複合体が、例えばポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）またはポリエチレングリコールソルビット（ｇｌｙｃｏｌｓｏｒｂｉｔｅ）脂肪酸エステルなどの異なるポリマーを用いて取得されうる。凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅｓ）を生成するため、足場形成剤（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えばマンニット、デキストラン、スクロース、ヒトアルブミン、乳糖、ＰＶＰまたはゼラチンなどが用いられる。
【０１１２】
各々に適切な医療形態は、医薬的／物理的技術に基づいて当業者に既知のマニュアルおよび手順に従って作製されうる。
【０１１３】
次いで本発明のさらなる態様は、本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクターまたは本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞あるいは本発明に記載の抗体、および医薬的に許容できる担体のうちの少なくとも１つの有効用量を含有する、個別に作製される医薬組成物に関する。この医薬組成物は、活性成分が上記の適切な医薬的に許容できる希釈剤または担体物質とともに持続性物質の形態でまたは前駆体として存在すると特徴づけられうる。
【０１１４】
本発明によると、上記の医薬組成物は、経口、直腸または非経口での使用を意図したタブレット、ドラジェ（ｄｒａｇｅｅｓ）、カプセル、液滴、坐剤、注射または注入のための組成物の形態で存在しうる。かかる投与形態およびそれらの作製は当業者に既知である。
【０１１５】
本発明は、その別の態様では、哺乳類のシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応、好ましくはヒトのシリコンに対する応答反応を検出するための、本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクター、または本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、あるいは本発明に記載の抗体の使用に関する。
【０１１６】
本発明は、その別の態様では、哺乳類におけるシリコンに対する下記の応答反応を検出するためのポリペプチドの使用に関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、およびＰＲＯ２６１９からなる群またはそれらの機能変異体から選択される。
【０１１７】
異なる哺乳類におけるシリコンに接着するポリペプチドの接着特性が考えられる応答反応の指標であることから、診断方法が、応答反応およびそれに関連した合併症または有害反応を受けやすいポリペプチドを同定することにより確立されうる。したがって、いくつかの候補、例えばシリコン接着ポリペプチドまたはシリコン接着ポリペプチドをコードする核酸、これらのポリペプチドおよび／または核酸を検出するための試験系の選択については、例えばかかるポリペプチドを例えば血清由来のシリコンの表面に接着させることによるかまたは例えばｒｔ−ＰＣＲなどの増幅方法を通じて築かれうる。
【０１１８】
したがって、本発明に記載のポリペプチドは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングのような免疫学的方法を含む当該技術分野で既知の方法を用いて検出可能である。好ましくは、一実施形態では、かかる試験系は、当業者に周知の方法であるＥＬＩＳＡ系に基づくものである。シリコン接着ポリペプチドを測定するために作製されたＥＬＩＳＡ系は実行しやすく、室温で長時間安定である。これらの試験を例えば診療所での「ポイント・オブ・ケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）」試験として用いるため、これであればエンドユーザに発送しやすいことになる。好ましくは、かかる試験系では血清が用いられる。さらに、ＥＬＩＳＡ系は多数の実験室における標準的な方法である。この組み合わせをとることで、現行の臨床ルーチンへの各々の統合が可能となる。
【０１１９】
本発明は、その別の態様では、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法であって、ａ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体を含有すると思われる、診断対象の哺乳類に由来する試料を提供するステップと、ｂ）前記試料中で前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、ｃ）前記哺乳類の前記シリコンに対する応答反応については少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化から判定するステップと、を含む、方法を提供する。
【０１２０】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、シリコン接着ポリペプチドは、本発明に記載のポリペプチド、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、およびＰＲＯ２６１９からなる群または本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法によって同定されたポリペプチドあるいはそれらの機能変異体から選択される。
【０１２１】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、シリコン接着ポリペプチドは、アイソタイプ対照、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ＩｇＥ−ＨＲＰ、ＩＧＡ−ＨＲＰ、ＡＭＢＰタンパク質前駆体、血漿−レチノール結合タンパク質、キニノゲン、好酸球ペルオキシダーゼ、線維芽細胞成長因子１１、ＴＧＦ−β、インテグリン−β４、Ｔ細胞受容体、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、凝固因子Ｖ、α−スペクトリン、単球化学走性タンパク質−２、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、補体Ｃ３、補体Ｃ２、補体Ｃ１ｓ、Ｃ反応性タンパク質、α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体、フォンヴィルブラント（Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ）因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、ラミニン、マトリックスメタロプロテアーゼ２、アポリポタンパク質４、アポリポタンパク質Ａ１、セルロプラスミン、Ｔｈｙｒｅｏｔｙｒｅｉｎ、アルブミン、α２−マクログロブリン前駆体、ハプトグロビン１、αおよびβグロビン鎖、アクチン、ＨＳＰ６０、アポリポタンパク質Ｅ３、補体Ｃ２前駆体、補体Ｃ３前駆体、ヘモグロビン、トランスサイレチンからなる群から選択される少なくとも１種の追加のシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドあるいはそれらの機能変異体とともに検出される。
【０１２２】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における好ましい実施形態では、シリコン接着ポリペプチドの免疫グロブリンＧ、Ｃ反応性タンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、補体Ｃ３前駆体、および脊髄関連タンパク質１４またはそれらの機能変異体の存在または発現における変化が検出される。好ましくは、シリコン接着ポリペプチドの免疫グロブリンＧ、Ｃ反応性タンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、補体Ｃ３前駆体、および脊髄関連タンパク質１４またはそれらの機能変異体の存在または発現における変化が検出される。シリコン接着ポリペプチドの免疫グロブリンＧ、Ｃ反応性タンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、補体Ｃ３前駆体、および脊髄関連タンパク質１４の存在または発現における変化の検出における組み合わせにより、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための感度、特異性、正および負の予測値が増加する。
【０１２３】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法におけるさらなる好ましい実施形態では、前記哺乳類由来の試料は血清および／または創傷液である。
【０１２４】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、試料は医療器具の長期注入およびコーティングに適するシリコンの注入の前または後に回収される。
【０１２５】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における好ましい実施形態では、本方法は、対照として第２の試料をさらに含み、ここで前記対照は注入の前または後に同じ哺乳類から取得されるかまたは医療用シリコンを全く注入することのない異なる哺乳類から取得される。
【０１２６】
シリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体を検出することを意図した、哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドまたはその機能変異体を免疫学的に認識するのに適する抗体が用いられる。
【０１２７】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法におけるさらなる好ましい実施形態では、ポリペプチドまたはその機能変異体は一次元または二次元ゲル電気泳動および／またはＥＬＩＳＡにより検出される。
【０１２８】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における好ましい実施形態では、本方法は本発明に記載のシリコン接着ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する少なくとも１種の核酸の存在または量を検出するステップをさらに含む。
【０１２９】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、前記核酸はＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはゲル電気泳動により検出される。
【０１３０】
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法におけるさらなる好ましい実施形態では、前記方法は、ステップａ）およびｂ）の間に前記ポリペプチドの前記シリコンに対する接着を可能にする条件下で前記試料をシリコンと接触させるステップを含むステップａ’）をさらに含む。
【０１３１】
本発明は、その別の態様では、原料、緩衝液、助剤、および本発明に記載の方法を実施するための物質を含む、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための診断キットに関する。
【０１３２】
本明細書で用いられる「診断キット」という用語は、本発明のポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、または抗体を含むかあるいは本発明の方法によって同定されるかまたは特徴づけられる試薬キットを意味するものとする。好ましくは、試薬キットは、科学的アッセイまたは診断アッセイまたはそれに類するものの実施に必要とされる反応緩衝液、保存溶液および／または残存試薬または原料をさらに含む。さらに、本発明のキットの各部分を、バイアル内またはボトル内で別々にあるいはコンテナ内またはマルチコンテナユニット内で組み合わせて詰め込んでもよい。
【０１３３】
本発明は、その別の態様では、哺乳類のシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応をモニターするための方法であって、ａ）少なくとも１種のシリコンを前記哺乳類に注入するステップと、ｂ）本発明に記載のシリコン接着ポリペプチドの存在または発現における変化を本発明に記載の方法またはキットを用いて検出するステップと、場合によりステップｂ）を反復するステップと、を含む、方法に関する。
【０１３４】
本発明は、さらに別の態様では、少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドに干渉する物質をスクリーニングするための方法であって、ａ）シリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉すると思われる物質を提供するステップと、ｂ）シリコン、特に医療用シリコンを提供するステップと、ｃ）シリコン接着ポリペプチドを提供するステップと、ｄ）前記物質の存在下または不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着の分析を通じて前記物質の干渉特性を分析するステップと、を含む、方法に関し、ここで前記物質の存在下または不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着における変化が、シリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドのシリコンに対する結合に干渉する物質を示唆している。
【０１３５】
本発明に記載の少なくとも１種のシリコン接着タンパク質ポリペプチドに干渉する活性物質をスクリーニングするための方法の一実施形態では、シリコン接着ポリペプチドは、本発明に記載のポリペプチド、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、ＰＲＯ２６１９、本発明によって同定されるポリペプチド、アイソタイプ対照、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ＩｇＥ−ＨＲＰ、ＩＧＡ−ＨＲＰ、ＡＭＢＰタンパク質前駆体、血漿−レチノール結合タンパク質、キニノゲン、好酸球ペルオキシダーゼ、線維芽細胞成長因子１１、ＴＧＦ−β、インテグリン−β４、Ｔ細胞受容体、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、凝固因子Ｖ、α−スペクトリン、単球化学走性タンパク質−２、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、補体Ｃ３、補体Ｃ２、補体Ｃ１ｓ、Ｃ反応性タンパク質、α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体、フォンヴィルブラント因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、ラミニン、マトリックスメタロプロテアーゼ２、アポリポタンパク質４、アポリポタンパク質Ａ１、セルロプラスミン、Ｔｈｙｒｅｏｔｙｒｅｉｎ、アルブミン、α２−マクログロブリン前駆体、ハプトグロビン１、αおよびβグロビン鎖、アクチン、ＨＳＰ６０、アポリポタンパク質Ｅ３、補体Ｃ２前駆体、補体Ｃ３前駆体、ヘモグロビン、トランスサイレチンからなる群またはそれらの機能変異体から選択される。
【０１３６】
本発明は、その別の態様では、細胞のシリコンに対する接着を検出するための方法であって、ａ）細胞を含有する哺乳類の血清または創傷液の試料を提供するステップと、ｂ）シリコンを提供するステップと、ｃ）前記シリコンに接着する前記血清または創傷液に由来する細胞の量または数を分析するステップと、を含む、方法を提供する。
【０１３７】
細胞の本発明に記載のシリコンに対する接着を検出するための方法の好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【０１３８】
細胞の本発明に記載のシリコンに対する接着を検出するための前記方法の好ましい実施形態では、シリコンは当業者に既知の任意の医療用シリコンでありうる。好ましくは、シリコンはヌシル（Ｎｕｓｉｌ）社（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ））によって提供される医療用シリコンタイプＭＥＤ１５１１、ＭＥＤ４８６０、ＭＥＤ４２１１、およびＭＥＤ３６０からなる群から選択される。
【０１３９】
本発明は、その別の態様では、シリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明に記載の方法により同定されるシリコンに対する結合に干渉する物質に関する。
【０１４０】
本発明は、そのさらなる態様では、本発明に記載の方法を含む、医薬組成物を生成するための方法、および前記物質を医薬組成物中に調合するための方法を提供する。
【０１４１】
本発明は、そのさらなる態様では、本発明に記載されるかまたは本発明によって生成される物質を含有する医薬組成物に関する。
【０１４２】
本発明は、その別の態様では、注入シリコンに対する有害反応を被る哺乳類を治療する方法であって、本発明に記載の方法を通じて同定されたシリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉する有効量の物質を前記哺乳類に投与するステップを含む、方法を提供する。好ましくは、シリコン接着ポリペプチドに干渉する前記有効量の物質は、当業者に周知の医薬組成物の形態で投与される。
【０１４３】
本発明に記載の注入シリコンに対する応答反応を被る哺乳類を治療する方法の好ましい実施形態では、有害反応は珪肺症および／またはシリコンに関連した線維症である。
【０１４４】
本発明は、その別の態様では、シリコンに対する応答反応を被る哺乳類の治療をモニターするための方法であって、ａ）本発明によって同定されたシリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉する有効量の物質を前記哺乳類に投与するステップと、ｂ）前記哺乳類から試料を取得するステップと、ｃ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、を含む、方法に関する。
【０１４５】
本発明に記載の注入シリコンに対する応答反応を被る哺乳類の治療をモニターするための方法における好ましい実施形態では、試料は哺乳類、好ましくはヒトの血清または創傷液である。
【０１４６】
本発明に記載の注入シリコンに対する応答反応を被る哺乳類の治療をモニターするための方法における好ましい実施形態では、シリコン接着ポリペプチドは、本発明に記載のポリペプチド、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、ＰＲＯ２６１９、本発明によって同定されるポリペプチド、アイソタイプ対照、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ＩｇＥ−ＨＲＰ、およびＩＧＡ−ＨＲＰ、ＡＭＢＰタンパク質前駆体、血漿−レチノール結合タンパク質、キニノゲン、好酸球ペルオキシダーゼ、線維芽細胞成長因子１１、ＴＧＦ−β、インテグリン−β４、Ｔ細胞受容体、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、凝固因子Ｖ、α−スペクトリン、単球化学走性タンパク質−２、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、補体Ｃ３、補体Ｃ２、補体Ｃ１ｓ、Ｃ反応性タンパク質、α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体、フォンヴィルブラント因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、ラミニン、マトリックスメタロプロテアーゼ２、アポリポタンパク質４、アポリポタンパク質Ａ１、セルロプラスミン、Ｔｈｙｒｅｏｔｙｒｅｉｎ、アルブミン、α２−マクログロブリン前駆体、ハプトグロビン１、αおよびβグロビン鎖、アクチン、ＨＳＰ６０、アポリポタンパク質Ｅ３、補体Ｃ２前駆体、補体Ｃ３前駆体、ヘモグロビン、トランスサイレチンからなる群またはそれらの機能変異体から選択される。
【０１４７】
ここで本発明は、添付の図面と関連して以下の実施例にてそれらに限定されることなくさらに記載されるものとする。本発明の目的として、本明細書中で言及されるすべての参考文献はそれら全体が参照により援用される。
【実施例】
【０１４８】
実施例１：様々なシリコンタイプに対するタンパク質の接着をインビボでスクリーニングするためのインビトロ系の作成
タンパク質の調製および分析の原理を図３に示す。
【０１４９】
１．生体外で溶出されるタンパク質
発明者は、美容を理由とする豊胸後に合併症を患う女性から外植されたＳＭＩｓ上に堆積したタンパク質を分析している。１３の外植されたＳＭＩｓを、オーストリア、インスブルック（Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ）のインスブルック医科大学（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ）（ＭＵＩ）、クリニック・フォー・プラスチック・アンド・リコンストラクティブ・サージェリー（Ｃｌｉｎｉｃ  ｆｏｒ  Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）から入手した。９つのＳＭＩにゲルおよび４つに生理食塩水を充填した。表面は、１１のＳＭＩは起伏があり、２つは滑らかであった。分析においては無傷の注入物すなわちシリコンの「ゲル流出」を伴わないものについてのみ検討した。それらを手術直後に無菌条件下で取得した。線維性被膜を手術室で除去し、ＳＭＩをプロテアーゼ阻害剤を補充したリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中の実験対象に移した。外植されたＳＭＩをＰＢＳ（３×ｌ５分）および蒸留水（５×１０分）、４℃で洗浄した。洗浄後、タンパク質のいずれかを、２Ｄ電気泳動により分析予定である場合、尿素溶解緩衝液［７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素（双方ともドイツ、バットゾーデン（Ｂａｄ  Ｓｏｄｅｎ）のカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から入手）、３０ｍＭトリス、４％  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．５］中に溶出させた。ウエスタンブロット分析においては、それらをＳＤＳ緩衝液（２％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  トリスＣｌ、１０％グリセリン、ｐＨ９．０）中に調製した。タンパク質濃度をビシンコニン酸のタンパク質アッセイ（米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））により測定し、タンパク質溶液を分析するまで−２０℃で凍結保存した。
【０１５０】
２．インビトロで溶出されるタンパク質
シリコンタイプＭＥＤ１５１１、ＭＥＤ４８６０、ＭＥＤ４２１１、ＭＥＤ３６０（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ）のヌシル（ＮＵＳＩＬ））が重合において有機溶媒または高温を有しないかまたは必要としないことから、それらを最初に試験した。それらの物理的特徴により、調節され標準化された条件を有する目的で用いる、実験室の研究にて通常用いられるポリスチレン製の平底プレートにそれらが適合した。試験対象のすべてのシリコンタイプが無制限のタイプであり、つまりそれらはシリコンの製造業者（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ）のヌシル（ＮＵＳＩＬ））により、長期注入物における製造者から認定された。それらはまた。ＳＭＩの製造および医療器具のコーティングにおいて広範に用いられるシリコンタイプを表した。他のシリコンタイプが発明者により将来的に試験されるように企画されており、試験の設計はそれらの化学組成物に基づいて調整されることになる。
【０１５１】
６ウェルのポリスチレンプレート（ドイツ、フリッケンハウゼン（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）のグライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））の１ウェルにつき未重合シリコン５ｍｌを添加し、シリコンをプレートの底部上に一様に分布させるため、その直後、プレートをシリコンタイプに応じて様々な時間遠心した（ＭＥＤ１５１１：３００×ｇで１０分；ＭＥＤ４８６０：１０００ｇで６０分；ＭＥＤ４２１１：１５０×ｇで１０分）。シリコンの硬化（３７℃および湿度９８％で３日）後、プレートを２００ミリジュールのＵＶ光（ＧｓＧｅｎｅ  ＵＶチャンバー、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）のバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））下で１２０秒間滅菌し、管内でタンパク質結合部位の飽和を可能にするため、豊胸手術の２日後に採取した創傷液（ＷＢＦ）とともにインキュベートした。ＷＢＦにプロテアーゼ阻害剤（シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手したペプスタチン、ロイペプチン、アプロチニン、最終濃度１μｇ／ｍｌ）を補充し、シリコンコーティングしたプレートとともに４日間インキュベートした。この時間内にシリコンの表面上でタンパク質の堆積が平衡に達する一方、自発的なタンパク質の分解が全く生じなかった。次いで、プレートをＰＢＳ中で洗浄し（１０×ｌ５分）、Ｈ２Ｏを４℃で蒸留し（５×１０分）、上記の生体外でのタンパク質の溶出と同様の方法でタンパク質を溶出した。図３は、インビトロでのタンパク質の吸着および分析におけるモデルを示す。
【０１５２】
３．生体外およびインビトロで溶出されたタンパク質の差別的分析
インビトロモデルが生体外の状況に対応するか否かを判定するため、発明者は一次元および二次元ゲル電気泳動により２つの系から溶出したタンパク質を比較した。差別的分析においては、発明者は感度のよい分析ツールを必要とし、それはＤＩＧＥ（商標）（スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｓａｌａ）のアマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））システムを用いる理由である。２つの系から得られるタンパク質を特定の波長で励起可能な異なる蛍光色素で標識した。この実験の設定により、発明者は単一のゲルから３つの別々の画像を取得でき、それによりゲル間のばらつきが大幅に低減され、スポットパターンの統計分析が向上した。タンパク質のスポットパターンを「Ｄｅｃｙｄｅｒ」ソフトウェア（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で分析した。試料間のスポットの容量比がスポット分布全体の２標準偏差を超える場合、タンパク質の堆積量は異なると考えられた。よりストリンジェントには、容量比が５倍の閾値を越える場合、それは生体外系またはインビトロ系のいずれかに限って存在するものとして規定された。このアプローチを用い、発明者はこれまで全部で１８４個のタンパク質スポットを検出した。これらのうちの１６３個のスポットは、両方の系内に同量で存在し、１３個のタンパク質が生体外にてより強力に結合し、５個がインビトロ系で存在し、かつ５個のスポットのみが系のいずれかにおいて特有であった。換言すると、インビボで堆積されたタンパク質の８９％は我々のインビトロ系でも堆積される。発明者は、質量分析を用いてタンパク質の残存する１１％の大部分を同定し、それらが主に細胞内タンパク質を表すことを見出した。これらの実験結果は、インビボで見出されるさらなるタンパク質が外科的処置の結果として周囲の損傷組織から生じることを示唆した。
【０１５３】
４．タンパク質の同定
２Ｄ電気泳動
インビトロおよび生体外で溶出したタンパク質を、主として二次元ゲル電気泳動（２Ｄ電気泳動）による分離後に分析した［アンダーソン  Ｌ．（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｌ．）およびアンダーソン  Ｎ．Ｇ．（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｎ．Ｇ．）「Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４、５４２１−５４２５頁（１９７７年）］。一次元分離においては、タンパク質を尿素溶解緩衝液［７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素（双方ともドイツ、バットゾーデン（Ｂａｄ  Ｓｏｄｅｎ）のカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から入手）、３０ｍＭトリス、４％  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．５］中に溶解させた。負荷に先立ち、タンパク質全体の２００μｇに再水和緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％  ＣＨＡＰＳ、１８ｍＭ  ＤＴＥ）を補充し、最終容量を３５０μｌとした。次いで、発明者は溶解緩衝液を添加し、１８ｃｍのＩＰＧストリップｐＩ３〜１１に対してタンパク質を負荷した。全体で５５０００Ｖｈｒｓにおいてタンパク質を泳動した（ＩＰＧｐｈｏｒ、アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。等電点電気泳動後、ストリップ上のタンパク質が減少し（２％ＤＴＴ、１５分）、その結果、アルキル化された（２．５％  ＩＡＡ、１５分）。二次元電気泳動を、１６℃、２０×２４ｃｍ勾配の９〜１６％ポリアクリルアミドゲル内、還元条件下で行った。２Ｄ電気泳動後、ゲルを固定し、ファーマー（Ｆａｒｍｅｒ）の方法に従って銀染色した［レイ  Ｗ．（Ｗｒａｙ  Ｗ．）、ブーリカス  Ｔ．（Ｂｏｕｌｉｋａｓ  Ｔ．）、レイ  Ｖ．Ｐ．（Ｗｒａｙ、Ｖ．Ｐ．）、およびハンコック  Ｒ．（Ｈａｎｃｏｃｋ  Ｒ．）  「Ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ．」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１８、１９７−２０３頁（１９８１年）］。
【０１５４】
パターンマッチングおよび質量分析
銀染色したタンパク質のスポットパターンを一致させ、「Ｍｅｌａｎｉｅ」ソフトウェア（バージョン４、スイス、バーゼル（Ｂａｓｅｌ）のスイス・インスティチュート・オブ・バイオインフォーマティクス（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ））を用いて２ＤゲルのＥｘＰａｓｙデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｈ２ｄ／）と比較した［ヒュー  Ｇ．Ｊ．（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｇ．Ｊ．）、フルティガー  Ｓ．（Ｆｒｕｔｉｇｅｒ  Ｓ．）、パケット  Ｎ．（Ｐａｑｕｅｔ  Ｎ．）、ラビエ  Ｆ．（Ｒａｖｉｅｒ  Ｆ．）、パスカリ  Ｃ．（Ｐａｓｑｕａｌｉ  Ｃ．）、サンチェス  Ｊ．Ｃ．（Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｊ．Ｃ．）、ジェームス  Ｒ．（Ｊａｍｅｓ  Ｒ．）、チソット  Ｊ．Ｄ．（Ｔｉｓｓｏｔ  Ｊ．Ｄ．）、ブジェルクヴィスト  Ｂ．（Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ  Ｂ．）、およびホホストラッヤ  Ｄ．Ｆ．（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ  Ｄ．Ｆ．）  「Ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｐ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．」  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １３、７０７−７１４頁（１９９２年）］。目的のスポットを手で切り取り、タンパク質をトリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）で消化し、ペプチドを質量分析（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ（商標）  ＴＯＦ／ＴＯＦ、ブルカーダルトニクス（マサチューセッツ州ビルリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）のＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ））により分析した。
【０１５５】
インゲル消化をシェブチェンコ（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ）らの記載のように行った［シェブチェンコ  Ａ．（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ａ．）、ウィルム  Ｍ．（Ｗｉｌｍ  Ｍ．）、ヴォルム  Ｏ．（Ｖｏｒｍ  Ｏ．）、およびマン  Ｍ．（Ｍａｎｎ  Ｍ．）  「Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｉｌｖｅｒ−ｓｔａｉｎｅｄ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ．」  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８、８５０−８５８頁（１９９６年）］。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦからのペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ）によって分析されたこれらの試料を、同じ標的からＬＩＦＴ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳを用いてさらに分析した。１試料当たり最大で３種の前駆体イオンをＭＳ／ＭＳ分析において選択した。ＰＭＦを反射モードで測定した後、ＬＩＦＴモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ測定を行った。ＰＭＦスペクトルを「Ｍａｓｃｏｔ」および「Ｐｒｏｆｏｕｎｄ」ソフトウェアで解釈した。正確な同定のためのカットオフ基準として、「Ｍａｓｃｏｔ」においては６４より高い確率スコア、「Ｐｒｏｆｏｕｎｄ」においては１．６５の確率スコアを用いた。
【０１５６】
ウエスタンブロットによる結果の確認
発明者は、質量分析およびデータベース検索から得られたデータを補い、確認するため、シリコンから溶出されたタンパク質のウエスタンブロットを行った。このため、発明者は、小さい（７×１０ｃｍ）均質の１２％ポリアクリルアミドゲルに負荷されたＳＤＳ緩衝液（２％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  トリスＣｌ、１０％グリセリン、ｐＨ９．０）中に溶出されたタンパク質を用いた。実行後、タンパク質をウェットブロッティング用チャンバー内の１２００ｍＡｈにおけるニトロセルロース膜上にブロットし、５％脱脂乳でブロッキングした。タンパク質の大部分に対する一次抗体ならびに適切な複合体をダコ（ＤＡＫＯ）から入手し、脊髄関連タンパク質（ＭＲＰ）８およびＭＲＰ１４に対するポリクローナルウサギ抗体は、親切にもＤｒ．クラウス・ケルクホフ（Ｄｒ．Ｃｌａｕｓ  Ｋｅｒｋｈｏｆｆ）（ドイツ、ミュンスター（Ｍｕｅｎｓｔｅｒ）のインスティチュート・オブ・エクスペリメンタル・ダーマトロジー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ））から贈られたものであり、我々自ら、クローンＩＩ−１３から、親和性クロマトグラフィーで精製したヒトＨＳＰ６０に対するモノクローナル抗体を産生した［シュー  Ｑ（Ｘｕ  Ｑ．）、シェット  Ｇ．（Ｓｃｈｅｔｔ  Ｇ．）、ザイツ  Ｃ．Ｓ．（Ｓｅｉｔｚ  Ｃ．Ｓ．）、フー  Ｙ．（Ｈｕ  Ｙ．）、グプタ  Ｒ．Ｓ．（Ｇｕｐｔａ  Ｒ．Ｓ．）、およびウィック  Ｇ．（Ｗｉｃｋ  Ｇ．）  「Ｓｕｒｆａｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｓｔｒｅｓｓｅｄ  ａｏｒｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．」  Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５、１０７８−１０８５頁（１９９４年）］。すべての抗体希釈物をＰＢＳ中、５％脱脂乳中で調製した。二次抗体のインキュベーション後、膜をＰＢＳで洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に対する化学発光基質を１分間添加した。膜を様々な時間、ＡＧＦＡＸ線フィルムに露光し、キュリックス（Ｃｕｒｒｉｘ）現像機内で現像した。
【０１５７】
５．同定されているタンパク質
最近まで、以下の４７種のタンパク質が、本発明との関連でシリコンに接着するものとして同定されている。
タンパク質名
アクチン
アルブミン
α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体
α２−マクログロブリン前駆体
ＡＭＢＰタンパク質前駆体
アポリポタンパク質Ａ１
アポリポタンパク質Ｅ３
Ｃ反応性タンパク質
凝固因子Ｖ
コラーゲンＩ
コラーゲンＩＶ
コラーゲンＶＩＩ
補体Ｃ１ｓ
補体Ｃ２前駆体
補体Ｃ３前駆体
好酸球ペルオキシダーゼ
フィブリノーゲン
線維芽細胞成長因子１１
フィブロネクチン
ハプトグロビン１
ヘモグロビン
ＨＳＰ６０
ＨＴ０１８
ＩｇＡ
免疫グロブリンＧ
インテグリンβ４
キニノゲン
ラミニン
マトリックスメタロプロテアーゼ２
単球化学走性タンパク質−２
脊髄関連タンパク質１４
脊髄関連タンパク質８
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ
血漿−レチノール結合タンパク質
ＰＲ０２６１９
プロコラーゲンＩＩＩ
Ｔ細胞受容体
ＴＧＦ−β
トランスサイレチン
ビトロネクチン
フォンヴィルブラント因子
α−スペクトリン
γ−グルタミルトランスフェラーゼ
４種の未知タンパク質
【０１５８】
さらに、２Ｄインビボ、２ＤインビトロおよびＥＬＩＳＡ（インビトロ）により同定された以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名              登録番号
免疫グロブリンＧ＊        ｇｉ｜４３２１９０５
Ｃ反応性タンパク質＊      ｐ０２７４１
脊髄関連タンパク質８＊    ｐ０５１０９
フィブロネクチン＊        ｐ０２７５１
ビトロネクチン＊          ｐ０４００４
コラーゲンＩ＊            ｇｉ｜４５０２９６１
プロコラーゲンＩＩＩ      ｑ５４１Ｐ８
ラミニン＊                ｇｉ｜２７８０４３４６
アクチン＊                ｇｉ｜１５２７７５０３
免疫グロブリンＡ＊        ｇｉ｜８６９９３０７
補体Ｃ３前駆体            ｐ０１０２４
【０１５９】
２ＤインビボおよびＥＬＩＳＡ（インビトロ）により同定された以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名              登録番号
脊髄関連タンパク質１４    ｐ０６７０２
脊髄関連タンパク質１４    ｐ０６７０２
コラーゲンＩＶ            ｇｉ｜１８０７１５
【０１６０】
２ＤインビトロおよびＥＬＩＳＡ（インビトロ）により同定された以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名                        登録番号
コラーゲンＶＩＩ＊                  ｇｉ｜６２７４０６
マトリックスメタロプロテアーゼ２＊  ｐ０８２５３
フォンヴィルブラント因子＊          ｐ０４２７５
熱ショックタンパク質６０            ｐ１０８０９
【０１６１】
抗体の使用が可能な場合の２Ｄインビボおよび／または２Ｄインビトロにより同定されたがＥＬＩＳＡにより検出されなかった以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名        登録番号
補体Ｃ１ｓ          ｐ０９８７１
補体Ｃ２前駆体＊    ｇｉ｜６７６１１
ＴＧＦ−β          ｐ０１１３７
Ｔ細胞受容体        ｇｉ｜６２４６５５４８
アルブミン          ｇｉ｜２８５９２
インテグリンβ４＊  ｇｉ｜２１３６１２０７
未知タンパク質１    ｇｉ｜３４５３３７７４
未知タンパク質２    ｇｉ｜２１７３９２９８
未知タンパク質３    ｇｉ｜２１７５４７７８
未知タンパク質４    ｇｉ｜７０２０５６９
【０１６２】
抗体を全く使用できない場合の２Ｄインビボおよび／または２Ｄインビトロにより同定された以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名                    登録番号
ハプトグロビン１                ｐ００７３８
アポリポタンパク質Ａ１          ｇｉ｜１７８７７７
トランスサイレチン              ｐ０２７６６
α２−マクログロブリン前駆体    ｐ０１０２３
ヘモグロビン                    ｇｉ｜５５６３５２１９
α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体  ｐ０２７６０
フィブリノーゲン＊              ｐ０２６７１
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ        ｇｉ｜５１３８９９９
ＨＴ０１８                      ｇｉ｜９９６３８５３
ＡＭＢＰタンパク質前駆体        ｇｉ｜１７９５１９
キニノゲン                      ｐ０１０４２
血漿−レチノール結合タンパク質  ｇｉ｜１９０８７０
凝固因子Ｖ                      ｐ１２２５９
ＰＲ０２６１９                  ｇｉ｜１１４９３４５９
好酸球ペルオキシダーゼ          ｇｉ｜３１１８３
線維芽細胞成長因子１１          ｇｉ｜２０１６０２１５
α−スペクトリン                ｇｉ｜１８９０７１
単球化学走性タンパク質−２    ｇｉ｜１９０５８０１
γ−グルタミルトランスフェラーゼ  ｇｉ｜３２８２０１４
アポリポタンパク質Ｅ３          ｇｉ｜１４８００９６
【０１６３】
同定されたシリコン接着タンパク質の分類
本発明により同定されたタンパク質は、それらの生物学的機能に関連して以下のように分類されうる。
１）官能基、炎症
Ｃ反応性タンパク質
補体Ｃ１ｓ
補体Ｃ２前駆体
免疫グロブリンＧ
脊髄関連タンパク質１４
脊髄関連タンパク質８
フォンヴィルブラント因子
ＩｇＡ
インテグリンβ４
補体Ｃ３前駆体
アポリポタンパク質Ａ１
アポリポタンパク質Ｅ３
α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体
ＨＳＰ６０
ＨＴ０１８
ＰＲ０２６１９
ＡＭＢＰタンパク質前駆体
Ｔ細胞受容体
２）官能基、線維症
凝固因子Ｖ
コラーゲンＩ
コラーゲンＩＶ
フィブロネクチン
ラミニン
コラーゲンＶＩＩ
フィブリノーゲン
線維芽細胞成長因子１１
キニノゲン
マトリックスメタロプロテアーゼ２
プロコラーゲンＩＩＩ
ビトロネクチン
３）官能基、炎症および線維症
ＴＧＦ−β
４）官能基、他
好酸球ペルオキシダーゼ
アクチン
アルブミン
α２−マクログロブリン前駆体
ハプトグロビン１
ヘモグロビン
トランスサイレチン
γ−グルタミルトランスフェラーゼ
単球化学走性タンパク質−２
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ
未知タンパク質１（配列番号１）
未知タンパク質２（配列番号２）
未知タンパク質３（配列番号３）
未知タンパク質４（配列番号４）
５．正常組織と線維化組織の間の識別に適するタンパク質
免疫グロブリンＧ
Ｃ反応性タンパク質
フィブロネクチン
コラーゲンＩ
プロコラーゲンＩＩＩ
補体Ｃ３前駆体
脊髄関連タンパク質１４
【０１６４】
シリコンに特異的に接着するタンパク質の特性
異なる選択された医療用シリコンタイプに生体外およびインビトロの双方で接着することが見出されたタンパク質を表１にまとめる。それらの相対的な存在度は、？：試験なし、０：不在、＋：存在、＋＋：豊富、＋＋＋：極めて豊富のように発現される。
【０１６５】
タンパク質は、異なるカテゴリー、すなわちアンカータンパク質、一次タンパク質セット、および二次タンパク質セットに分類されうる。最初の２つのカテゴリーのみが他の技術（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）により再確認されている。
【０１６６】
１．等しく強力な接着性あるタンパク質（アンカータンパク質）
これらのタンパク質は少なくとも「豊富」すなわち＋＋として規定され、試験対象のすべてのシリコンタイプに対して等しく接着性があるものとして存在した。７種の候補をこの群に含めた。それらに記号「＊」を付与する。
【０１６７】
２．一次タンパク質セット
このセットは２１種のタンパク質からなる。それらは含めるにあたり試験対象のシリコンタイプのすべてにおいて検出される必要があった。３つの下位分類であれば以下のように規定できる。
等しいが接着性の低いタンパク質
１４種のタンパク質がこの下位分類を構成し、それを「存在する」すなわち＋として規定した。それらに記号「▽」を付与する。
差異のあるシリコンタイプへの接着性のあるタンパク質
７種のタンパク質は、シリコンタイプＭＥＤｌ５１１、４８６０、４２１１、および３６０（ヌシル（Ｎｕｓｉｌ））に対する接着において有意な差異を示した。それらはあらゆる接着強度すなわち０、＋、＋＋および＋＋＋の分子を網羅した。それらに記号「■」を付与する。
未分類の接着特性のあるタンパク質
４種のタンパク質からなるこの群では２種のシリコンタイプのみに対して試験した。実験の奏功は接着性のクラス「存在する」（＋）を示した。これまでそれらは下位分類１（等しいが接着性の低いタンパク質）のメンバーである可能性が最も高いと思われる。それらに記号「□」を付与する。
【０１６８】
【表１】
2009524031.tif 000002
【０１６９】
３．二次タンパク質セット
このセットは１７種のタンパク質から構成された。それらは１つのシリコンタイプのみ（ＭＥＤ１５１１）の上で検出され、質量分析以外の技術によって確認されてはいない。以下の１３種のタンパク質がこのセットにおいて見出された。
ＡＭＢＰタンパク質前駆体
血漿−レチノール結合タンパク質
キニノゲン
好酸球ペルオキシダーゼ
線維芽細胞成長因子１１
ＴＧＦ−β
インテグリン−β４
Ｔ細胞受容体
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ
凝固因子Ｖ
α−スペクトリン
単球化学走性タンパク質−２
γ−グルタミルトランスフェラーゼ
【０１７０】
さらに、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）の未知タンパク質産物および「マスコット」により同定された仮想的なタンパク質が４種存在した。
登録番号：ｇｉ｜３４５３３７７４；質量：１１３６４２；未知タンパク質産物（配列番号１）
登録番号：ｇｉ｜２１７３９２９８、ｅｍｂ｜ＣＡＤ３８６９６．１；質量：１１７４９０；未知タンパク質産物（配列番号２）
登録番号：ｇｉ｜２１７５４７７８；質量：３８４５３；未知タンパク質産物（配列番号３）
登録番号：ｇｉ｜７０２０５６９；質量：１４００４；未知タンパク質産物（配列番号４）
【０１７１】
新規のタンパク質候補
上記のタンパク質の中に、シリコンに対する過敏症および続発性線維症との関連でこれまで言及していない数種のものが存在した。
１．脊髄関連タンパク質８
２．脊髄関連タンパク質１４
３．ＨＴ０１８
４．ＰＲＯ２６１９
５．登録番号：ｇｉ｜３４５３３７７４；質量：１１３６４２；未知タンパク質産物（配列番号１）
６．登録番号：ｇｉ｜２１７３９２９８、ｅｍｂ｜ＣＡＤ３８６９６．１；質量：１１７４９０；未知タンパク質産物（配列番号２）
７．登録番号：ｇｉ｜２１７５４７７８；質量：３８４５３；未知タンパク質産物（配列番号３）
８．登録番号：ｇｉ｜７０２０５６９；質量：１４００４；未知タンパク質産物（配列番号４）
【０１７２】
診断試験系
異なる患者におけるタンパク質のシリコンに対する接着における接着特性は、患者が発症しているかもしれない、想定される免疫反応およびそれに続発する線維化反応の指標であることが仮定される。この仮定が正しかった場合、発明者は診断方法を確立できたことになり、それにより線維性合併症になりやすいタンパク質が同定される。したがって、タンパク質分析を行った上で（実施例２および３を参照）、発明者は数種の候補を選択し、血清からシリコンの表面に補充されたこれらタンパク質を検出するための試験系を構築した。
【０１７３】
実際の利点
１）試験プロトコルはＥＬＩＳＡマイクロウェルプレートに基づく。この試験系は作製しやすく、室温で長時間安定である。これであればエンドユーザへの発送が容易となる。
２）試験系では血清が用いられる。さらに、ＥＬＩＳＡ系は多数の実験室における標準的な方法である。この組み合わせにより、現行の臨床ルーチンへの容易な組込みが可能になる。
【０１７４】
技術的詳細
ポリスチレンの９６ウェルの平底マイクロタイタープレートを医療用シリコンタイプ１５１１、４８６０および４２１１でコーティングした。９６ウェルのポリスチレンプレート（ドイツ、フリッケンハウゼン（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）のグライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））の１ウェルにつき未重合シリコン５０μｌを添加し、シリコンをプレートの底部上に一様に分布させるため、その直後、プレートをシリコンタイプに応じて様々な時間遠心した（ＭＥＤ１５１１：３００ｇで１０分；ＭＥＤ４８６０：１０００ｇで６０分；ＭＥＤ４２１１：１５０ｇで１０分）。シリコンの硬化（３７℃および湿度９８％で３日）後、プレートを２００ミリジュールのＵＶ光（ＧｓＧｅｎｅ  ＵＶチャンバー、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）のバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））下で１２０秒間滅菌した。滅菌後、シリコンコーティングした９６ウェルプレートを、一次的な豊胸手術を受ける前と後の患者由来の血清またはＳＭＩが交換された患者の血清とともにインキュベートした。すべての血清にロイぺプチン、ペプスタチンおよびアプロチニン（プロテアーゼ阻害剤、オーストリア、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）のシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））の１μｇ／ｍｌを補充し、０．２２μｍのフィルタを通して濾過し、１００μｌを無菌条件下で各ウェルに適用した。一部の実験では、適用に先立ち血清をＰＢＳで希釈した。５０時間後、余分なタンパク質をＰＢＳによる４×５分の洗浄で洗い流し、さらにプレート上の結合部位を、室温、ＰＢＳ中の２．５％  ＢＳＡ／０．１％トゥイーン２０で１００分間ブロッキングした。１ウェルにつきブロッキング溶液１５０μｌを適用した。ブロッキング後、様々な抗体をブロッキング溶液中の予め決定された最適な希釈物中に適用した。我々の初期のスクリーニングは２４の抗体からなるものであったが、以下の最適な作動希釈物（表２）中に適用される、我々の現行のリストを１２に削減した。
【０１７５】
【表２】
2009524031.tif 000003
【０１７６】
当然のことながら、ここで抗体のこのリストが最終リストでないことを言及することは重要である。それは発明者がシリコンの表面上に形成されるフィルムでのタンパク質分析において得る新たな実験結果によって増加することになる。一次抗体とともにインキュベートした後、プレートをＰＢＳで３×５分洗浄し、ＨＲＰと複合された適切な二次抗体を、室温での振とう下、１００μｌ／ウェルの容量で１２０分間適用した。直接標識した一次抗体とともにインキュベートしたウェルを、ＡＢＴＳの発色ステップまでＰＢＳ中で保持した。ウサギ抗−マウスＩｇＧ  ＨＲＰ、ダコ（ＤＡＫＯ）  Ｐ２６０、１：１０００およびブタ抗−ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ、ダコ（ＤＡＫＯ）  Ｐ３９９、１：１０００といった二次抗体を用いた。あらゆる希釈物をブロッキング溶液中で作製した。二次抗体の室温でのインキュベーション後、プレートをＰＢＳ／０．０２％トゥイーン中で３×５分および純粋なＰＢＳ中で２×５分洗浄した。ＨＲＰに対する標準のＡＢＴＳ  ＥＬＩＳＡの検出溶液を用い、結果を画像化した。４０分間発色させ、（分光学的測定時のシリコンコーティングの干渉を除外するため）溶液を新しい９６ウェルプレートに移し、吸収を４０５ｎｍで測定した。したがって、我々はタンパク質のシリコンへの接着性を測定するためのＥＬＩＳＡ系を構築している（図１）。
【０１７７】
発明者は、異なるブロッキング溶液を滴定することで、何とかバックグラウンドレベルを有意に低下させた。発明者は、タンパク質の存在におけるカットオフをアイソタイプ対照の２倍の吸光度値として定義した。バックグラウンド値は、２桁に及ぶ線形範囲、プローブ測定値の１％未満であった。試験系全体は高度に再現可能であり、堆積したタンパク質の半定量分析を可能にした。この系の主な利点は、多数の患者およびシリコン上に別々に堆積された様々なタンパク質の同時分析が比較的短時間で可能である点である。
【０１７８】
原理の証拠として（図２）、発明者は、患者１０名（線維性合併症を有する５名と有しない５名）、対照７名（年齢および性別が一致）および劇的な全身性の線維性合併症を誘発する液体シリコンの注入（！）を伴う患者１名において１２種のタンパク質候補を試験した。我々は、フィブロネクチン、ＣＲＰおよびＩｇＡの堆積と線維症との有意な正の相関および補体成分Ｃ３およびＩｇＧの堆積との負の相関を見出した。
【０１７９】
したがって、発明者は、原理の証拠として様々な患者からのタンパク質の堆積の異なるパターンに注目している。実際、発明者は、さらなる分析を行い、結果を患者の大規模コホートでの注入期間および局所性または全身性の合併症と相関させたかった。このため、発明者は試験系を迅速なスクリーニングおよびより大規模な臨床試験を可能にする３８４ウェル形式に調整している。さらに、分析における制限因子であることが多い血清の量が減少することで、コストが節約されるとともに複製の可能性に起因する再現性が向上する可能性がある。特定のタンパク質に対する一次抗体および適切なＨＲＰと複合した二次抗体を伴う検出系は上記と同様であるが、容量は少なめである（５０μｌ）。４０分間発色させ、（分光学的測定時のシリコンコーティングの干渉を除外するため）溶液を新しい３８４ウェルプレートに移し、「Ｖｉｃｔｏｒ」３８４ウェルプレートの分光光度計（米国ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）のパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））上で４０５ｎｍでの吸収を測定した。
【０１８０】
【表３】
2009524031.tif 000004
【０１８１】
無制限の（長期注入として認定された）シリコンタイプについては約２０種のさらなるタイプが存在するが、この分類は医療目的で用いられるシリコンのあらゆる一般的タイプを網羅している。
【０１８２】
１．バックグラウンド
シリコンに対して選択された候補よりなる規定のタンパク質アレイの接着特性において差異が、それはシリコンデバイスの結果的な有害作用の発生において観察されるばらつきに関与する可能性があった。この系は、患者のコホートにおける７種のタンパク質の堆積の同時分析を可能にした。それらは実施例１に記載のシリコンの表面上でのプロテオームのスクリーニングから選択された。
【０１８３】
遡及試験では、このタンパク質アレイの堆積パターンにより線維症を発症した患者と合併症のない患者がうまく区別された（図５）。興味深いことに、対照患者の中で、シリコンに対する応答として線維症を発症する患者に類似した堆積パターンを有する小群も同定された。この群が潜在的リスク、すなわちシリコンに対する強力な線維性の有害反応を受けやすいというリスクの有無を判定するため、フォローアップの前向き試験が現在行われている。
【０１８４】
２．方法
試験においては特に美容目的で豊胸手術をした９０名の女性を含めた。彼女らを、ベイカースコア（Ｂａｋｅｒ  Ｓｃｏｒｅ）（ＢＳ）により線維症を有する胸部結合組織の線維症患者（ＢＳ≧３；Ｎ＝４０；年齢中央値５１歳）および広範な線維症を有しない患者（ＢＳ＜３；Ｎ＝５０；年齢中央値４７歳）からなる２群に分けた。
【０１８５】
下記に挙げる７種の異なるタンパク質の堆積パターンをこのコホート試験で比較した。データを正規化するため、吸収値を公式ｘ’＝ｌｏｇ（ｘ＋ｌ）に従って変換した。コルモゴロフ−スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ）検定による試験によると、変換値は正規分布を有した。これらの実験では、バックグラウンド値はプローブ測定値の１％未満であり、検出の線形範囲は２桁にまで及んでいた。分析の間、線維性が弱い試験項目（ｓｔｕｄｙ  ｂｒａｎｃｈ）の内の小群（１８％、ｎ＝９）が線維症を患う患者が有するタンパク質の堆積特性に類似したものを有することが注目された。それらを「修正された対照」の独立群として分類した。この観察を、「Ｔｒｅｅｖｉｅｗ」クラスタリングソフトウェアを用いたデータのクラスタリングにより確認した。ソフトウェアにより、独立群内の対照患者のこれら１８％を線維症を患う患者とともにクラスタリングした。
【０１８６】
【表４】
2009524031.tif 000005
【０１８７】
薬剤を試験するための系
選択されたタンパク質候補のシリコンに対する選択接着は、過敏性反応の発生におけるその機能的関連性およびそれに付随する線維性合併症を示唆する。その結果、薬剤の使用によりタンパク質の接着への干渉を意図することができ、それによりシリコン表面への結合前にこれらのタンパク質に対する接着部位が被覆されるかまたは候補が捕捉された。したがって、発明者は、将来の薬剤のスクリーニング用途において以下の試験系を用いることを推奨する。それはポリスチレン３８４−マイクロウェルプレートに基づくものである。シリコンコーティングの原理は２．４．１．２と同様にほぼ一致する。唯一の差異は、各未重合シリコンに対し、１ウェル当たり５０μｌではなく１０μｌが適用された点である。１ウェル当たり適用される血清または任意の他のタンパク質溶液の量もまた有意に少なめであり、１ウェル当たり２０μｌに減少する。すべてのインキュベーション時間は同様のままである。
【０１８８】
インビトロでのシリコンに対する細胞接着
細胞接着実験においては、シリコンコーティングされたプレートの同一の系を用いた。上記のように、プレートを様々なシリコンタイプでコーティングし、ＷＢＦまたは血清とともに４日間インキュベートするかまたはしなかった。この期間後、プレートを洗浄し、血清を含有しないＤＭＥＭ培地内の５×１０４個の細胞／ｍｌの懸濁液を１ウェル当たり２ｍｌ添加した。様々な時点で、非接着細胞を軽くピペッティングして除去し、残存細胞を４％ホルムアルデヒド中に固定した。接着細胞の相対数をクリスタルバイオレットアッセイで判定した［ガイリット  Ｊ．（Ｇａｉｌｉｔ  Ｊ．）、クラルケ  Ｃ．（Ｃｌａｒｋｅ  Ｃ．）、ニューマン  Ｄ．（Ｎｅｗｍａｎ  Ｄ．）、トンネセン  Ｍ．Ｇ．（Ｔｏｎｎｅｓｅｎ  Ｍ．Ｇ．）、モゼッソン  Ｍ．Ｗ．（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ  Ｍ．Ｗ．）、およびクラーク  Ｒ．Ａ．（Ｃｌａｒｋ  Ｒ．Ａ．）「Ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｉｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｔｏ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｔ  ＲＧＤ  ｓｉｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ（ｖ）ｂｅｔａ３．」Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３２、１１８−１２６頁（１９９７年）］。クリスタルバイオレット溶液を添加し（２％エタノール中、０．２％  ｗ／ｖ）、室温で１０分間インキュベートした。プレートをより大型のビーカー内への浸漬により生水中で２回洗浄した。次いでそれらをペーパータオル上に逆さまにして排出し、１％  ＳＤＳを添加して染色液を可溶化した。プレートをオービタルシェーカー上でウェルの底部に濃い着色領域が全くなく色が一様になるまで撹拌し、各ウェルからの１％  ＳＤＳ溶液の吸光度を、ブランクとして１％  ＳＤＳを用いて５６２ｎｍで読み取った。溶液を古典的な分光測光により測定した。試験全体を６ウェルプレート上で行い、高スループットの用途のために９６ウェル形式に小型化することができた。図４は、線維芽細胞のシリコンコーティングされたプラスチックのウェルに対する接着について示す。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】タンパク質のシリコンに対する接着に対するＥＬＩＳＡ系の構成スキーム。９６ウェルプレートがシリコンでコーティングされ、記載のように滅菌された。次いでそれは（プロテアーゼ阻害剤を補充された）血清試料とともに４日間インキュベートされ、ＰＢＳおよび水で洗浄された。接着タンパク質が、特異的な一次抗体と、無着色の基質を特定の波長で測定される着色産物に変換する酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ）で標識された適切な二次抗体を用いて検出された。タンパク質の量は発色染料の強度に正比例した。アッセイは様々な他の形式で実施可能である。
【図２】ＳＭＩの注入時での線維性合併症を有する患者のスクリーニングにおける原理の証拠。図１に示されるＥＬＩＳＡの原理に従い、患者１０名（線維性合併症を有する５名と有しない５名）、対照７名（年齢および性別が一致）および劇的な全身性の線維性合併症を誘発する液体シリコンの注入を伴う患者１名において１２種のタンパク質候補が試験された。（Ａ）試験されたタンパク質候補を有するプレートの写真。緑の着色はタンパク質の存在度が高いことを示した。タンパク質の堆積におけるばらつきがあれば、一般に肉眼的に区別可能である。しかし、結果の正確な定量および統計分析のために各ウェルの吸収が測定された。（Ｂ）異なる患者群の統計分析。吸収が測定された後、値が各群につき平均±標準偏差として表された。コルモゴルフ・スミルノフ検定を用いて分布の正規性を試験し、ｔ−ｔｅｓｔを用いてｐ値を計算した。線維性合併症の発症とフィブロネクチン１、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）およびＩｇＡの堆積との有意な正の相関および補体成分Ｃ３およびＩｇＧの堆積との有意な負の相関が見出された。
【図３】生体外およびインビトロでのタンパク質の接着分析のアルゴリズム。生体外分析では、生理食塩水が充填された外殖されたＳＭＩが断片に切断され、洗浄され、接着タンパク質が（ウエスタンブロットまたは２Ｄ電気泳動／ＭＳのいずれかにおける）下流分析に適する緩衝液中に溶出された。インビトロ分析においては、新しい無傷で無菌の生理食塩水が充填されたＳＭＩから切断されたシリコンの標準化された断片がＷＢＦまたは血清とともに４日間インキュベートされた。次いで、それらは生体外で調製されたＳＭＩと正確に同じ方法で洗浄され、タンパク質が（ウエスタンブロットまたは２Ｄ電気泳動／ＭＳのいずれかにおける）下流分析に適する緩衝液中に溶出された。比較のため、すべてのタンパク質量が表面の単位当たりで正規化された。
【図４】包皮線維芽細胞の血清タンパク質でコーティングされたシリコンに対する接着。ヒト一次線維芽細胞が包皮用製剤から作製された。それらの表現型の均質性が判定された上で（データは示さず）、それらは標準条件下で培養された。９６ウェルプレートがシリコンでコーティングされる一方、コーティングされていないポリスチレンプレートが対照として採用された。いずれも血清とともに４日間インキュベートされ、さらにＰＢＳおよび水で洗浄された。次いで、線維芽細胞がシリコンでコーティングされたプラスチックウェル上とコーティングされていないプラスチックウェル上の双方に播種され、１５〜３００分の様々な時点で溶出された。線維芽細胞のシリコンでコーティングされたウェルに対する接着性がコーティングされていないウェルの場合よりも強力であること（２４０分後では統計的に有意であり（＊ｐ＜０．０５）、３００分後では極めて有意である（＊＊ｐ＜０．００１））が観察できた。これは血清由来のタンパク質のシリコンに対する選択的接着が線維芽細胞の接着を促進することを示した。
【図５】本方法の好ましい実施形態および本発明のキットに基づく遡及症例の対照試験。拡張型の線維症を有する患者（群１、ＢＳ≧３；Ｎ＝４０；年齢中央値５１歳、左バー）および拡張型の線維症を有しない患者（群２、ＢＳ＜３；Ｎ＝５０；年齢中央値４７歳）についてのＥＬＩＳＡによると、それらのうちの９名の患者（＝反応者、１８％；「訂正された対照」、右バー）が群１と同様の特性を示し、かつそれらのうちの４１名の患者（＝非反応者、中央バー）が示さなかったことが示される。
【図１】
2009524031.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2009524031.tif 000013
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