(57)【要約】本発明の主題は、ヒト前立腺酸性ホスファターゼのアミノ酸２４０〜２９０のフラグメントに対応するペプチドである。本発明はまた、核酸、抗体、薬物、および診断、ならびにウイルス疾患、特にＨＩＶ疾患の治療および診断のためのこれらの使用およびペプチドの使用に関する。
2009524420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
Ｒ1−ＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫ−Ｒ2
（式中、
Ｒ1はＨ、ＹＧＩＨＫＱ、ＧＩＨＫＱ、ＩＨＫＱ、ＨＫＱ、ＫＱ、またはＱであり、
Ｒ2は、独立して、−ＣＯＯＨ、ＬＩＭＹ、ＬＩＭ、ＬＩ、Ｌであり、
但し、配列番号１８を除く）
のペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号１〜１２：
配列番号１（ＳＥＶＩ−１；ＰＡＰ２４７〜２８６）：
ＹＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ、
配列番号２（ＳＥＶＩ−２；ＰＡＰ２４８〜２８６）：
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ、
配列番号３（ＳＥＶＩ−３；ＰＡＰ２４９〜２８６）：
ＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ、
配列番号４（ＳＥＶＩ−４；ＰＡＰ２５０〜２８６）：
ＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ、
配列番号５（ＳＥＶＩ−５；ＰＡＰ２５１〜２８６）：
ＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ、
配列番号６（ＳＥＶＩ−６；ＰＡＰ２５２〜２８６）：
ＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ、
配列番号７（ＳＥＶＩ−７；ＰＡＰ２５３〜２８６）：
ＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ、
配列番号８（ＳＥＶＩ−８；ＰＡＰ２４８〜２８５）：
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭ、
配列番号９（ＳＥＶＩ−９；ＰＡＰ２４８〜２８４）：
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩ、
配列番号１０（ＳＥＶＩ−１０；ＰＡＰ２４８〜２８３）：
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬ、
配列番号１１（ＳＥＶＩ−１１；ＰＡＰ２４８〜２８２）：
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫ、
配列番号１２（ＳＥＶＩ−１２；ＰＡＰ２４９〜２８２）：
ＹＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫ
から選択されるアミノ配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ヒト前立腺酸性ホスファターゼのアミノ酸残基２４０〜２９０の任意のフラグメントであるペプチドであって、該ペプチドが、配列番号１８のペプチド（ＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩ）を除いて、細胞のウイルス感染を促進する、ペプチド。
【請求項４】
少なくとも１つの以下の改変：
−Ｎ末端および／またはＣ末端のアミノ酸の欠失であって、ここで、ペプチドが少なくとも３５アミノ酸からなる、欠失、
−Ｎ末端および／またはＣ末端の１０アミノ酸までの付加、
−５アミノ酸までのアミノ酸交換、
−３アミノ酸までの配列内のアミノ酸挿入または欠失
を含み、
ここで、改変ペプチドが、細胞のウイルス感染を促進する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
少なくとも２０アミノ酸を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記少なくとも１つの改変が、アシル化、アセチル化、非ペプチド高分子キャリア群への結合、アミド化、グリコシル化、細胞へのペプチドの取り込みが促進されるアダプタータンパク質への連結、酸化、疎水性基への連結、硫酸化、および／またはリン酸化から選択され、該修飾ペプチドが細胞のウイルス感染を促進する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
細胞のウイルス感染を促進する、レトロペプチド、インベルソペプチド、レトロ−インベルソペプチドであるペプチド、少なくとも１つのＤ型アミノ酸を含む変異形（ｖａｒｉａｎｔ）、ペプチド模倣物または請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドの多重合成によって得ることができるペプチド。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドの発現のための発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の発現ベクターを含む単離細胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項１２】
配列番号１８のアミノ酸配列を有するペプチド、請求項１１に記載の抗体、請求項８に記載の核酸、または請求項９に記載の発現ベクターを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドを含む薬物。
【請求項１３】
遺伝子療法のためのワクチンまたはベクターをさらに含む、請求項１２に記載の薬物。
【請求項１４】
注射液、点滴薬、スプレー、錠剤、座剤、クリーム、軟膏、またはゲルの形態の請求項１２または１３に記載の薬物。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド，請求項１１に記載の抗体，請求項８に記載の核酸、または請求項９に記載の発現ベクターを含む診断薬。
【請求項１６】
キャリアまたは支持体に共有結合した請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７】
ウイルス感染、前立腺機能障害、癌腫、または患者のウイルス感染に対する感受性の治療または診断のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド、請求項１１に記載の抗体、請求項８に記載の核酸、または請求項９に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１８】
前記ウイルス感染がレトロウイルスの１つである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ウイルス感染が、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、フォーミーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶまたはＨＣＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＭｕＬＶ、またはエボラによるウイルス感染である、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２０】
性交時に個体がウイルス、特にＨＩＶに感染する確率を決定するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項２１】
遺伝子療法のためにデザインしたウイルス、ウイルス粒子、ベクター、および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルスベースのワクチンの細胞への侵入を促進するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項２２】
ウイルスまたはウイルス粒子の単離のための請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞への遺伝子療法のためにデザインしたウイルス、ウイルス粒子、またはベクターで細胞を感染する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドの存在下で細胞をウイルス、ウイルス粒子、またはベクターとインキュベーションする工程を含む、方法。
【請求項２４】
ウイルスまたはウイルス粒子を単離する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドをキャリアまたは支持体に付着させる工程、ウイルスまたはウイルス粒子が付着したペプチドに結合する条件下で該キャリアまたは支持体を溶液と接触させる工程、該溶液から該キャリアまたは支持体を分離する工程、任意に、結合したウイルスまたはウイルス粒子を洗浄および溶離する工程、ならびに、任意に、ウイルスおよびウイルス粒子の結合数を決定する工程を含む、方法。
【請求項２５】
精子由来のペプチドのライブラリーおよび該ライブラリーの画分の調製を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、ペプチド、核酸、抗体、薬物、および診断、ウイルス疾患の治療および診断、ならびにｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法における診断方法、ウイルス単離技術、およびレトロウイルスベクターを使用した形質導入効率の改良のためのその使用である。
【０００２】
ＨＩＶ感染などのウイルス感染、特にＨＩＶ−１伝播に対する別の改良された薬物が必要とされ続けている。過去数年にＨＩＶに対する種々の薬物が開発されているにもかかわらず、ＨＩＶ感染は依然として世界的問題である。ＨＩＶによるＡＩＤＳのような多数のウイルス疾患の治療法は、依然として利用できない。ウイルスを研究および理解するための簡潔で有効な診断方法および実験ツールも必要である。
【０００３】
遺伝子療法アプローチは、しばしば、標的細胞（特に、幹細胞）、レトロウイルスベクターの形質導入効率の低さによって阻まれる。形質導入効率は、標的細胞への有効な遺伝子導入に極めて重要であり、形質導入効率は、通常、レトロウイルスベクターが幹細胞における遺伝子導入に使用される場合に低い。したがって、適切な細胞に遺伝子を首尾よく送達させるための改良されたレトロウイルス形質導入系も必要である。
【０００４】
本発明の根底にある問題は、ウイルス疾患および遺伝子療法に関連する上記問題を克服する、改良されたか別の薬物、診断ツール、および実験ツールを提供することである。
【０００５】
驚いたことに、本発明の根底にある問題は、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチド、核酸、抗体、薬物、診断、および使用によって解決される。
【０００６】
本発明のペプチドのアミノ酸配列は、式：
Ｒ1−ＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫ−Ｒ2
（式中、
Ｒ1はＨ、ＹＧＩＨＫＱ、ＧＩＨＫＱ、ＩＨＫＱ、ＨＫＱ、ＫＱ、またはＱであり、
Ｒ2は、独立して、−ＣＯＯＨ、ＬＩＭＹ、ＬＩＭ、ＬＩ、Ｌであり、
但し、配列番号１８のペプチドを除く）によって示される。
【０００７】
特に、本発明のペプチドは、配列番号１〜１２のペプチドである。
【０００８】
本発明のペプチドは、配列番号１８のペプチドを除く、細胞のウイルス感染を促進するヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ）のアミノ酸残基２４０〜２９０、より好ましくは残基２４７〜２８６のフラグメントである。番号付けは、その非プロセシング形態（プロ配列が含まれる）のタンパク質配列をいう。そのプロセシング形態のヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ；Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＰＰＡＰ＿ＨＵＭＡＮ、アクセッションＰ１５３０９）は、予測分子量が４１１２６Ｄａの３５４アミノ酸からなる（Ｖｉｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．；１９８８，Ｓｈａｒｉｅｆ  ＆  Ｌｉ；１９９２）。タンパク質ｈＰＡＰ自体およびこれをコード刷る核酸は、本発明の主題ではない。Ｄ．Ｇ．Ｍｃ  Ｎｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１，５１６１−５１６７（２００１）で、前立腺酸性ホスファターゼ由来のＴヘルパーエピトープの同定について報告している。本発明は、ｈＰＡＰフラグメントが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および他のエンベロープウイルスによる細胞感染を増強するアミロイド様線維構造を形成することができるという発見に基づく。
【０００９】
以下で、その線維状のアミロイド様形態の本発明のペプチドを、「ウイルス感染の精子増強剤」に関して、「ＳＥＶＩ」ペプチド、または簡潔に「ＳＥＶＩ」という。Ｈ2Ｏ、細胞培養培地、または従来の緩衝液（ＰＢＳなど）に溶解した場合、ＰＡＰフラグメントは、自発的または撹拌後にアミロイド様線維構造を形成する。一般に、ｈＰＡＰアミノ酸配列のアミノ酸２４０〜２９０の５１残基区域の部分的配列を有するペプチドは、本発明の主題である。好ましくは、ペプチドは、少なくとも１２、他の実施形態では、少なくとも２０、２５、３０、または３８アミノ酸を含む。ペプチドは、わずか５０、好ましくはわずか４７または４５アミノ酸を含む。配列番号１〜１２のアミノ酸配列のペプチドＳＥＶＩ１〜１２が特に好ましい。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つの以下の配列変異：
−Ｎ末端および／またはＣ末端のアミノ酸の欠失であって、ここで、ペプチドが少なくとも３０、好ましくは３５〜３８アミノ酸からなる、欠失、
−Ｎ末端および／またはＣ末端の１０アミノ酸まで、好ましくは１、２、３、または５アミノ酸の付加、
−５アミノ酸まで、好ましくは１、２、または３アミノ酸のアミノ酸交換であって、アミノ酸交換が保存的交換であることが好ましい、交換、
−３アミノ酸まで、好ましくは２または１アミノ酸の配列内のアミノ酸挿入または欠失
を有するＳＥＶＩペプチド由来のペプチドである。
【００１１】
保存的アミノ酸交換では、アミノ酸を、類似の性質を有する別のアミノ酸に置換する。保存的アミノ酸交換は、好ましくは、以下の群のいずれか１つに含まれる：
無極性側鎖を有するアミノ酸：Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｍ
極性側鎖を有する無電荷アミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
芳香族側鎖を有するアミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ
正電荷アミノ酸：Ｋ、Ｒ、Ｈ
負電荷アミノ酸：Ｄ、Ｅ。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つの以下の共有結合改変：
−好ましくはＮ末端でのアシル化、アセチル化、非ペプチド高分子キャリア群への結合、
−好ましくはＣ末端でのアミド化、非ペプチド高分子キャリア群への連結、
−好ましくはアミノ酸側鎖でのグリコシル化、
−細胞へのペプチドの取り込みを促進するアダプタータンパク質への連結または疎水性基、好ましくは脂質基、脂肪酸基、ダンシル基、カルボベンズオキシ基、またはｔ−ブチルオキシカルボニル基への連結、
−酸化、硫酸化、エステル化、ラクトン形成、および／またはリン酸化
を有する上記概説のＳＥＶＩペプチド由来のペプチドまたはその誘導体である。
【００１３】
好ましい高分子キャリア基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシアルキレングリコール、ポリソルベートエステル、マンナン、アミロペクチン、プルラン、自己会合疎水性化ポリサッカリドのヒドロゲルナノ粒子、ポリリジン、またはアルブミンである。
【００１４】
本発明の主題はまた、ＳＥＶＩペプチドのレトロペプチド、インベルソペプチド、またはレトロ−インベルソペプチドおよびＳＥＶＩペプチドの生物活性を有する多重合成によって得ることができるペプチドである。ペプチドは、少なくとも１つのＤ型アミノ酸ならびにイミノアミノ酸および稀なアミノ酸（ヒドロキシリジン、ホモセリン、およびオルニチンなど）を含み得る。本発明はまた、本発明のペプチド模倣物に関する。これらは、例えば、逆ペプチド結合またはエステル結合による１つまたは複数のペプチド結合の改変によって特徴づけられる。
【００１５】
本発明のペプチドは、細胞のウイルス感染を促進する。本明細書中で使用する場合、「ウイルス」は、例えば、遺伝子療法のためにデザインした核酸を含み得る天然に存在するウイルスおよびウイルス粒子ならびに人工のウイルスおよびウイルス粒子をいう。好ましい実施形態では、ウイルスは、レトロウイルスおよびレトロウイルス粒子（オンコウイルス、レンチウイルス、およびフォーミーウイルスなど）である。一般に、本発明のペプチドは、特に、複製コンピテントウイルスでの標的細胞の感染を増強するのに有用である。特異的ウイルスは、ＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス１型）、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ならびにオンコウイルス、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、およびフォーミーウイルスである。ペプチドはまた、ＨＩＶ−変異形（Ｘ４、Ｒ５、および二重細胞指向性（ｄｕａｌ−ｔｒｏｐｉｃ）変異形など）、分子ＨＩＶクローンおよびＨＩＶ−１サブタイプの感染を促進する。ペプチドはまた、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＭｕＬＶ、エボラ、ＨＩＶ−１、およびＭｕＬＶ由来の異種エンベロープタンパク質でシュードタイピングしたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはレトロウイルス粒子での感染を好む。したがって、本発明のペプチドは、レトロウイルスベースの遺伝子療法系の形質導入効率を増加させる。
【００１６】
本発明の他の好ましい実施形態では、ペプチドは、フラビウイルス（黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびブタ熱ウイルスなど）、トガウイルス（風疹ウイルスなど）、コロナウイルス（ＳＡＲＳウイルスなど）、カリシウイルス（ノーウォークウイルスおよびＥ型肝炎ウイルスなど）、ラブドウイルス（水疱性口内炎インディアナウイルスおよび狂犬病ウイルスなど）、パラミクソウイルス（ヒトパラインフルエンザウイルスＩ、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、およびヒト呼吸器合胞体ウイルスなど）、フィロウイルス（マールブルグウイルスおよびエボラウイルスなど）、オルソミクソウイルス（インフルエンザＡ／Ｂ／Ｃウイルスなど）、アレナウイルス（ラッサ熱ウイルスなど）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１および２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、７、および８など）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）、レオウイルス（ロタウイルスなど）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、脳心筋炎ウイルス、および口蹄疫ウイルスなど）、パポーバウイルス（ポリオーマウイルスおよび乳頭腫ウイルス（ｐａｐｐｉｌｏｍ  ｖｉｒｕｓ）など）、およびアデノウイルスでの感染を好む。
【００１７】
ペプチド活性を、例えば、ルシフェラーゼアッセイまたはＧＦＰ発現アッセイで測定することができる。好ましくは、例えば、１または５μｇ／ｍｌのペプチドは、ペプチドの非存在下での細胞へのウイルス感染と比較した場合、細胞へのウイルス感染を、２倍、より好ましくは３、５、または１０倍に増強する。低感染効率で標的細胞を感染させた場合、通常、ＳＥＶＩは、ウイルス感染率を桁違いに増強する。
【００１８】
本発明の主題はまた、本発明のペプチドをコードする核酸、本発明のペプチドのための発現ベクター（プラスミド、コスミド、およびウイルスベクターなど）である。
【００１９】
本発明の別の主題は、本発明のペプチドに対する特異的抗体の生成および使用である。好ましくは、これらの抗体を、治療薬として使用する。これらの抗体は、ＳＥＶＩペプチドの活性を遮断し、例えば、性感染ウイルス疾患、特に、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＨＢＶによって伝播される疾患のようなｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス粒子の伝播を妨害する。本発明の抗体は、血清からの単離またはモノクローナル抗体テクノロジーなどの公知の方法によって得ることができる。従来の方法は、実験動物に抗原を注射し、次いで、抗体形成後、血清からポリクローナル抗体を回収することである。モノクローナル抗体テクノロジーでは、無限に複製することができる骨髄腫細胞のような腫瘍細胞を、哺乳動物細胞と融合して、継続的に抗体を産生するハイブリドーマを得る。
【００２０】
ｈＰＡＰは、前立腺の上皮細胞中に合成され（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．；１９７６，Ｒｉｓｌｅｙ  ＆  ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ；１９８７，Ｈａｋａｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．；１９９３）、前立腺液中に分泌される（Ｖｉｈｋｏ；１９７８，Ｖｉｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．；１９７８ａ，１９７８ｂ）。ｈＰＡＰは、アルキルおよびアリールオルトリン酸モノエステル（ホスホチロシン（Ａｐｏｓｔｏｌ  ｅｔ  ａｌ．；１９８５；Ｖｉｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．；１９９３）およびヌクレオチド（Ｄｚｉｅｍｂｏｒ−Ｇｒｙｓｚｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．；１９７８）が含まれる）を加水分解し、リンペプチドおよびリンタンパク質などの高分子を脱リン酸化することも見出された（Ｗａｓｙｌｅｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．；１９８３，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．；１９８４）。その至適ｐＨがｐＨ４〜６であるので、ｈＰＡＰは、酸性ホスファターゼである。
【００２１】
５’末端では、ｃＤＮＡは３２アミノ酸のシグナルペプチドをコードする。未変性ｈＰＡＰは、２つの触媒的に不活性なサブユニットの二量体として存在し（Ｄｅｒｅｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．；１９７１，Ｌｕｃｈｔｅｒ−Ｗａｓｙｌ  ＆  Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  １９７４，Ｖｉｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．；１９７８）、これらのサブユニットは、互いに共有結合して活性酵素を形成する（Ｋｕｃｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．；１９９０）。
【００２２】
ｈＰＡＰは、精液中に大量に分泌される（Ｒoｎｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．；１９８１）。酵素濃度は、しばしば、前立腺癌患者で上昇し、腫瘍の進行に相関する（Ｃｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．；１９８０，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  １９８０，Ｖｉｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．；１９８０，１９８１，ａｎｄ  １９８５）。ｈＰＡＰは、前立腺特異的抗原が発見されるまで前立腺癌の主な診断マーカーであった。
【００２３】
ヒト精液中に大量のｈＰＡＰが存在するので、ｈＰＡＰは、生殖能力で生理学的役割を果たすことが示唆されている（Ｃｏｆｆｅｙ  ＆  Ｐｉｅｎｔａ  １９８７）。免疫反応性ｈＰＡＰは、白血球、腎臓、脾臓、胎盤、膵臓、肝臓、胃、顆粒球、好中球（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．；１９８０，Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．；１９８１，Ｙａｍ  ｅｔ  ａｌ．；１９８１，Ａｕｍuｌｌｅｒ  ＆  Ｓｅｉｔｚ，１９８５，Ｗａｈｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．；１９８５）、男性の肛門線および尿道腺（Ｋａｍｏｓｈｉｄａ  ＆  Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  １９９０）、十二指腸窩上皮（Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．；１９８７）、ならびに膵島細胞癌（Ｃｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．；１９７８）などのいくつかの非前立腺細胞および組織で見出されている。ｈＰＡＰの血清レベルは、健康な個体では非常に低いが（０〜５ｎｇ／ｍｌ）（Ｃｕｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．；１９９４）、悪性および良性の前立腺疾患でしばしば上昇する（Ｃｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．；１９８０，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  １９８０，Ｖｉｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．；１９８０，１９８１，ａｎｄ  １９８５）。そのようなものとして、ｈＰＡＰ血清レベルのための免疫アッセイは、前立腺癌の疾患の進行のモニタリングに有用である。
【００２４】
ＳＥＶＩペプチドはウイルスまたは細胞膜に結合し、細胞へのウイルスの侵入に不可欠な過程を活性化すると推測されている。したがって、本発明のペプチド、核酸、および抗体は、ウイルス感染、前立腺機能障害、癌腫、または患者のウイルス感染に対する感受性の治療薬または診断薬として有用である。本発明のペプチド、核酸、および抗体はまた、細胞への遺伝子送達または遺伝子療法アプローチのために使用されるレトロウイルスベクターの感染性を増強するのに有用である。これらは、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ）ならびにエボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、およびＢ型肝炎ウイルスのような他のエンベロープウイルスによる許容状態の標的細胞の感染を好む。本発明のペプチドは、ウイルス粒子の感染性または融合能力（非感染ＣＤ−４＋細胞へのＨＩＶ伝播を好む能力など）に対して劇的な増強効果を示す。ヒト血清中のｈＰＡＰが高濃度であり、それによりＳＥＶＩが高濃度であるので、ＳＥＶＩは、恐らく、ＨＩＶ血清陽性個体から健康な性交パートナーへのＨＩＶ伝播を容易にする。本発明のペプチドを、性交時のＨＩＶ−１伝播の確率についてのマーカーとして使用することができる。
【００２５】
したがって、広範な治療および診断への適用にペプチドを使用し、このペプチドは、細胞へのウイルスの侵入の実施および研究のための有益な実験ツールである。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態は、ウイルスベクター系に基づいた日常的な実験の実施または遺伝子治療アプローチのためのウイルス感染または形質導入効率の一般的増強剤としてのＳＥＶＩペプチドの使用である。ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への遺伝子療法のためにデザインされたレトロウイルスベクターの侵入を増強する。ペプチドを、遺伝子療法のためのベクターと組み合わせて投与し、標的細胞へのベクターの侵入を媒介することができる。ペプチドは、細胞へのウイルスの取り込みを促進するので、ペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏでも有用である。したがって、ペプチドは、ウイルスおよびその作用機構の研究のためのツールとして有用である。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、診断アプローチ、特に、ＨＩＶ−１のようなウイルスの診断アプローチのためのＳＥＶＩペプチドの使用である。ウイルス粒子は、ＳＥＶＩペプチドと相互作用する。したがって、ＳＥＶＩペプチドを使用して、ＨＩＶ感染したヒトまたはＳＩＶ感染した霊長類由来の血清、血液、血漿、精子、または組織のようなサンプルからウイルス粒子を単離することができる。ＨＩＶ−１診断における１つの重要な問題は、ＨＩＶ−１感染個体由来の血液または細胞サンプルからの直接的なウイルスの再単離である。日常的な診断方法と比較して、ＳＥＶＩの存在下で、首尾のよいウイルス単離を数回行うことが好ましい。好ましい方法は、結合親和性アッセイおよび安全な溶液を得るためにウイルスを含むと疑われるか含むことが知られている溶液からウイルスを定量的に取り出す方法である。かかる方法では、本発明のペプチドは、好ましくは、支持体またはカラムに共有結合している。
【００２８】
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、かかるポリヌクレオチドは、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＰＮＡから構成される。
【００２９】
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよび本発明のベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞に関する。
【００３０】
組換えまたは合成ＳＥＶＩペプチドを使用して、一般に、標的細胞へのレトロウイルス粒子（オンコウイルス、レンチウイルス、およびフォーミーウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスの侵入を増強することができる。ＳＥＶＩを、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ＭｕＬＶのＥｎｖタンパク質、ＨＢＶ  ＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）、エボラウイルススパイクタンパク質、または異なるＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ変異形由来のエンベロープタンパク質のような外来エンベロープ糖タンパク質（偽粒子（ｐｓｅｕｄｏｐａｒｔｉｃｌｅ））を保有するレトロウイルスコア粒子の感染／形質導入率の一般的増強剤としても使用することができる。ＳＥＶＩは、全ての分析したレトロウイルス粒子の感染率を好む（通常、約２〜５００倍）。これにより、特に、初代細胞での以前に実行できなかった感染実験を行うことが可能である。したがって、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験ツールとして有用である。
【００３１】
組換えまたは合成ＳＥＶＩペプチドを、診断アプローチ（すなわち、感染個体由来のＨＩＶ−１またはＳＩＶの単離）にも使用することができる。ＳＥＶＩは、検出可能なレトロウイルス感染の閾値を少なくとも１／２〜１／３に低下させる。したがって、ＳＥＶＩの存在下では、患者サンプル由来の首尾のよいウイルス再単離の感度は、ＳＥＶＩの非存在下よりも高い。ＳＥＶＩは、感染個体由来の複製コンピテントＨＩＶ−１の検出のためのＨＩＶ診断薬の検出限度を低下させる。例えば、ＳＥＶＩは、ＳＥＶＩを含まない細胞と比較して、指標細胞との同時培養によってＨＩＶ−１感染個体のＰＢＭＣからウイルスをより効率的に再単離可能である。ＳＥＶＩはまた、ＨＩＶ−１患者の無細胞サンプルからウイルスを効率的に再単離することが可能である。
【００３２】
組換えまたは合成ＳＥＶＩペプチドを使用して、レトロウイルスベクター系に基づいたｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法アプローチにおける遺伝子送達率を増強することもできる。遺伝子療法、特に幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のための感染性の高いレトロウイルスベクターの生成は困難な手順である。幹細胞のレトロウイルスベクターの形質導入効率も低い。しかし、ＳＥＶＩの存在下では、幹細胞および幹細胞株を、レトロウイルスベクターで効率良く形質導入することができ、それにより、ＳＥＶＩを含まないサンプルと比較して、より高い標的細胞への遺伝子送達効率を得ることができる。
【００３３】
ＳＥＶＩおよび／またはその誘導体をコードする発現ベクターを使用して、細胞株を一過性または安定にトランスフェクションし、組換えＳＥＶＩペプチドを産生し、これを細胞溶解物または上清から精製することができる。ＳＥＶＩおよび／または誘導体を特異的に認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して、前立腺癌およびＨＩＶ伝播の確率のマーカーとしてヒト血清または精液中のＳＥＶＩ濃度を測定することができる。ＳＥＶＩ特異的抗体を、医学的化合物として使用して、ヒト精子中のＳＥＶＩ活性を中和し、それにより、性交によるＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶ伝播を防止することもできる。
【００３４】
本発明のペプチドを、ペプチド合成、ペプチド配列のｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞からの精製方法、またはヒト精子から出発する精製方法によって得ることができる。好ましい方法では、精子由来の精液を、陽イオン交換クロマトグラフィおよび逆相クロマトグラフィに供する。
【００３５】
本発明のペプチドまたは抗体を、好ましくは、医学処方物で使用する。医学的処方物は、１つまたは複数の本発明のペプチドもしくは抗体またはペプチドの生理学的に許容可能な塩を含む。医学的処方物は、例えば、薬物の溶解性、安定性、または無菌性に寄与するか、体内への取り込み効率を増加させる薬学的に有用な賦形剤を含むことができる。
【００３６】
ペプチドまたは抗体を含む薬物の形態および組成は、投与経路に依存する。好ましくは、ペプチドまたは抗体が非分解条件下で標的部位に到達する生薬（ｇａｌｅｎｉｃ）処方物および適用形態を選択する。薬物を、注射液、点滴薬、スプレー、錠剤、座剤、クリーム、軟膏、ゲルとして局所投与することができる。ボーラスとしてか、長期にわたって繰り返して投与することが可能である。
【００３７】
実施例
本発明のペプチドを、ヒト精子から出発する精製方法によって得ることができた（実施例１）。このようにして得られたペプチドを、構造解明に供した。精製ペプチドの分子量を、エレクトロスプレー質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）によって決定した。ＡＢＩ４７３シークエンサーを使用したエドマン分解によって、未変性ペプチドの配列分析を行った（実施例２および３）。本発明のペプチド配列も化学合成し、合成によって調製されたペプチドの構造も解明した（実施例２および３）。これらの合成によって調製したＳＥＶＩペプチドは、インキュベーションと同時またはインキュベーション後にアミロイド様原繊維構造を形成する。これらのアミロイド様原繊維構造は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ’ｓ、ＶＳＶ、ＭｕＬＶ、およびエボラでの標的細胞の感染を依存的に活性化する（実施例４〜１７）。
【００３８】
本発明を、実施例によって、第１に、ヒト精液由来のペプチドライブラリー由来のペプチドフラグメントが生理学的に関連する濃度の標的細胞のＨＩＶ−１感染を好むことを証明する（実施例１および１６）。際立って、ＳＥＶＩペプチドは、撹拌と同時または撹拌後に溶液が混濁するようになり、沈殿が形成された場合に最も有効である（実施例４）。コンゴーレッドとの反応ならびに偏光を使用したその後の顕微鏡法（実施例５）および蛍光顕微鏡法を使用したこれらの沈殿ＳＥＶＩペプチドの実験により、沈殿ＳＥＶＩペプチドが原線維を形成することが示された。沈殿物がウイルス感染を促進する活性ペプチド形態を含むことが見出された（実施例４）。アルツハイマー病に関連するβ−アミロイド原線維がＨＩＶ−１感染を増強することが以前に示されている（Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．；２００２）。実際、電子顕微鏡法により、沈殿したＳＥＶＩペプチドが典型的な原線維からなることが確認された（実施例４）。予め形成した原線維でのシーディングにより、アミロイドタンパク質の自己集合を加速させることができることが示されている（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ；２００５）。本発明者らはまた、少数の活性ＳＥＶＩが「可溶性且つ非原線維の」ペプチドをＨＩＶ−１感染を増強する活性原線維に変換することを見出した（実施例４）。本発明は、実施例によって、共受容体の使用またはＨＩＶ−１サブタイプと無関係に合成ＳＥＶＩペプチドが依存的且つ非細胞傷害性に初代細胞および細胞株におけるＨＩＶ−１感染を促進することがさらに証明する（実施例４、６〜１７）。加えて、ＳＥＶＩはウイルス粒子および細胞との直接的相互作用によってＨＩＶ−１感染を２〜３倍に劇的に増強することが示された（実施例１４および１５）。本発明を、実施例によって、ＳＥＶＩはまた、ＨＩＶ−１以外のレンチウイルスベクター（すなわち、サル免疫不全ウイルスおよびオンコレトロウイルスＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス））での標的遺伝子の感染を好むことがさらに証明する（実施例１７）。ＳＥＶＩはまた、ＶＳＶ−Ｇシュードタイピング粒子の感染率を増加させ、ＳＥＶＩがウイルス形質導入を増強し、それにより、レトロウイルスベクター系に基づいた遺伝子療法アプローチを改良するための有用なツールであることが示された。ＳＥＶＩが、ＨＩＶ−１感染の検出閾値を１／３〜１／４に低下させるので、ＳＥＶＩはまた、ウイルス診断、特に遺伝子型および表現型の耐性試験のためのＨＩＶ−１感染個体からのＨＩＶ−１の単離のための有益なツールであり得る。
【００３９】
ＳＥＶＩペプチドを、クロマトグラフィ法およびＨＩＶ−１細胞感染アッセイの使用によってヒト精液から単離することができる。本発明のペプチドの生化学的特徴づけを、質量分析法および全アミノ酸の完全な配列分析によって行った。
【００４０】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。
【実施例１】
【００４１】
実施例１−ＨＩＶ−１感染促進ＳＥＶＩペプチドの単離
ヒト精子からの精製
ヒト精液由来のペプチドライブラリーの調製のために、２８３ｍｌヒト精子を、異なる健康なドナー（ｎ＞５０）から採取した。精子の採取のために、健康なボランティアは、５０〜１００ｍｌのプラスチック管に全精子を射精し、射精直後に精子を−２０℃で保存した。タンパク質およびペプチドの調製のために、精子および精漿を、解凍精子の４℃で１７，０００×ｇ（９６００ｒｐｍ）の遠心分離によって分離し、精漿を含む上清（ｓｎＡ）を４℃で保存した。次に、ペレットを、氷冷抽出緩衝液（１Ｍ酢酸、２０ｍＭアスコルビン酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  塩化ナトリウム（ｐＨ２．０）；１７，０００ｇで１０分間）で２回リンスし、上清ＢおよびＣを、上清Ａと共にプールした。プールした上清Ａ〜Ｃ（３８０ｍｌ）を、抽出緩衝液で７６０ｍｌまで希釈し、次いで、分子量カットオフが５０ｋＤａのポリスルホン膜（Ｓａｒｔｏｃｏｎ  ｕｌｔｒａｓａｒｔ  ＳＭ  １４６５０１Ｅ−ＳＧ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇoｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したダイアフィルトレーション（ＤＦ）緩衝液（０．１Ｍ酢酸、２ｍＭ  アスコルビン酸、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ３．０））で５Ｌに希釈した。この溶液を、６５分間で０．５ｌに再濃縮し、ＤＦ緩衝液で１Ｌに希釈し、次いで、ＤＦ緩衝液でダイアフィルトレーションを行って、６０分間で９．５Ｌの透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を得た。透過液は、５０ｋＤａ未満の全タンパク質およびペプチドを含み、これを、第１のクロマトグラフィ分離工程によって処理した。
【００４２】
陽イオン交換クロマトグラフィ：
第１の分離のために、陽イオン交換カラム（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＳＫ  ＳＰ  ６５０（Ｓ），Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ；粒子サイズ２０〜５０ミクロン；カラム体積８６０ｍｌ）を、水で平衡化し、０．５Ｍ  ＮａＯＨおよび０．５Ｍ  ＨＣｌでの馴化後にｐＨ２．５にした。透過物を水で２２Ｌに希釈し、ＨＣｌを使用してｐＨ２．５に調整し、伝導率は４．９３ｍＳ／ｃｍであった。次いで、馴化透過物を、陽イオン交換カラム（流速：２０ｍｌ／分）にロードした。水２９Ｌでの洗浄後（ｐＨ２．５）、ペプチド／タンパク質を、以下の緩衝液を使用して溶離した（図１Ａ）：
１．０．１Ｍ  クエン酸（ｐＨ３．６、体積：４．４Ｌ）
２．０．１Ｍ  酢酸＋０．１  Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５、体積：１．５Ｌ）
３．０．１Ｍ  リンゴ酸（ｐＨ５．０、体積：２．２Ｌ）
４．０．１Ｍ  マロン酸（ｐＨ５．６、体積：１．５Ｌ）
５．０．１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．６、体積：１．２Ｌ）
６．０．１Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．４、体積：１．５Ｌ）
７．１Ｍ  酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０、体積：１．８Ｌ）
８．水（ｐＨ７．０、体積：１．５Ｌ）
９．０．１Ｍ  ＮａＯＨ（ｐＨ１３、体積：３．０Ｌ）
【００４３】
緩衝液１〜６を使用して得た溶離物により、１〜６番の溶離物を得た。溶離物７〜９をプールし、プールした溶離物を、溶離物番号７と称する。
【００４４】
第１の逆相クロマトグラフィ：
第２の分離を、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィカラム（Ｃ１８、４７×直径３００ｍｍ、粒子サイズ１０〜２０ミクロン、孔サイズ３０ｎｍ、Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った（例として図１Ｂ中の溶離物７について示した）。各溶離物１〜７を、ＲＰＣ１８カラムに適用し、７回の異なる運転で分離し、以下の同一条件下での勾配溶離でペプチドを溶離した：
流速：４０ｍｌ／分
緩衝液Ａ：１０ｍＭ  ＨＣｌ
緩衝液Ｂ：Ａ＋８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル
勾配溶離：１００％Ａから６０％Ｂまでで４７．５分
６０％Ｂから１００％Ｂまでで２．５分。
【００４５】
５０ｍｌの画分を回収し、各運転により、４０ペプチドを含む画分を得た。全部で２８０フラクションが得られ、各画分から１．４ｍｌの精漿等価物に相当するアリコート（画分体積０．２５ｍｌ）を取り、その直後に凍結乾燥させた。元の画分を、さらなるクロマトグラフィ分離の前に、−２０℃で保存した。
【００４６】
画分の試験：
１．４ｍｌ精子等価物／ｍｌを含むｐＨプール７由来の凍結乾燥ペプチド画分を、１００単位／ｍｌ  ペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５１４０−１６３）を含む３３μｌの無ＦＢＳ（ウシ胎児血清；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃１０２７０−１０６）無Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃４１９６５−０３９）中に再構成した。４０００  Ｐ４−ＣＣＲ５細胞（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．；１９９４）を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を含む全体積が１００μｌで９６ウェルの平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；＃６５５１８０）に播種した。Ｐ４−ＣＣＲ５細胞は、ＨＩＶ−１受容体であるＣＤ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４を発現し、ＬＴＲ−ｌａｃＺ構築物を安定に含む。ＨＩＶ−１でのこれらの細胞の首尾のよい感染後、ウイルス性にコードされたＴａｔタンパク質が発現され、これは、ＬＴＲへの結合を介してウイルス遺伝子発現をトランス活性化する（Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．；１９９４）。したがって、Ｔａｔはまた、細胞がコードするＬＴＲ−ｌａｃＺの発現を活性化し、感染細胞中で酵素β−ガラクトシダーゼが産生される。酵素活性は、ウイルス感染性に直接比例する。翌日、培地を除去し、３０μｌの新たな培地および１０μｌの溶解したペプチド画分を添加した。３７℃で４時間のインキュベーション後、１０μｌのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３ストック（Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．；１９８６）を細胞に添加した。ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３を、リン酸カルシウム法を使用したプロウイルスＤＮＡでの２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって誘導した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＣａｌＰｈｏｓ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；＃６３１３１２）。ＨＩＶ−１ストックを、−８０℃で保存した。感染３日後、Ｔｒｏｐｉｘのβ−Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ；＃Ｔ１０２７）を使用してウイルス感染を検出した。細胞上清を破棄し、β−Ｇａｌ基質およびＰＢＳを含む４０μｌの１：１希釈β−Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ溶液を添加した。３０分のインキュベーション後、３５μｌの溶解細胞抽出物を、９６ウェルルピプレート（Ｎｕｎｃ；＃１３６１０１）にピペットし、照度計を使用して化学発光を検出した（ＯｒｉｏｎＩＩ，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。β−ガラクトシダーゼ活性を、相対光単位／秒（ＲＬＵ／ｓ）として得た。ポジティブコントロール（ペプチドを含まない感染細胞）中で得た値を１００％に設定し、全ての他の値を、（ペプチドの存在下での絶対ＲＬＵ／ｓ／ペプチドを含まない細胞から得た値の中央値）×１００によって計算した。ｐＨプール７由来の画分２９の存在下で、レポーター遺伝子活性は、ペプチドを含まない感染コントロール細胞と比較して、６．８倍を超えて増加した（図２ａ）。これらの結果は、精液がＨＩＶ−１感染に好ましい影響を及ぼす化合物を含むことを最初に証明している。ヒト集団におけるＨＩＶ−１伝播がＨＩＶ−１感染性交パートナーと健康な性交パートナーとの間の性的接触を介して優先的に起こるので、ヒト精子中のＨＩＶ−１活性化ペプチドの存在は重要な所見である。
【００４７】
ＨＩＶ−１活性化ペプチドを単離するために、画分２９〜３１を、クロマトグラフィ技術を使用してさらに精製した。
【００４８】
第２の逆相クロマトグラフィ：
第３の分離工程を、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィカラム（Ｃ１８、２０×直径２５０ｍｍ、粒子サイズ５ミクロン、孔サイズ３０ｎｍ、Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った（図１Ｃ）。プール７由来の画分２９〜３１をＲＰＣ１８カラムに適用し、ペプチドを、以下の条件を使用した勾配溶離で溶離した：
流速：７ｍｌ／分
緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ
緩衝液Ｂ：Ａ＋８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル
勾配溶離：１０％Ａ〜５０％Ｂまで５０分
６０％Ｂから１００％Ｂまで１分。
【００４９】
全部で７ｍｌの６０個の画分を回収し、０．５％のアリコート（３５μＬ）を凍結乾燥させた。
【００５０】
次いで、クロマトグラフィ０３０７１８−１の１．４ｍｌの精漿等価物に相当するアリコート（画分の０．５％）を、上に正確に記載したウイルス阻害アッセイで分析した。ペプチド画分４０〜４４の存在下で、ウイルス感染性は、コントロール細胞と比較して３〜４倍に増加した。（図１Ｄおよび図２Ｂ）。
【実施例２】
【００５１】
実施例２−ＨＩＶ感染活性化ペプチドの生化学分析
精製したペプチドおよび画分の質量分析を、製造者によって推奨された標準的条件を使用したＶｏｙａｇｅｒ  Ｄｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。エレクトロスプレーインターフェースを具備したＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ＩＩＩ四極質量分析計（Ｓｃｉｅｘ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）（ＥＳＩ−ＭＳ；図１Ｄを参照のこと）によって精製ペプチドの質量をさらに決定した。４７３Ａ気相シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、製造者によって推奨された標準的プロトコールを使用したフェニルチオヒダントインアミノ酸のオンライン検出を使用したエドマン分解によってペプチドを配列決定した。得られた配列のデータベースアラインメント（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース）は、ヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ；アクセッション番号Ｐ１５３０９）の前駆体（ｈＰＡＰ前駆体配列のアミノ酸残基２４７〜２８６（ナンバリングは、プロ配列を含むアミノ酸をいう））と１００％配列が同一であった。
【００５２】
以下のＰＡＰフラグメントは、質量および／または配列決定によってヒト精漿中で検出された。
配列番号１：ＰＡＰ（２４７〜２８６）
ＹＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ
（理論上の分子量４７１４，６  検出された分子量４７１５．３）
配列番号２：ＰＡＰ（２４８〜２８６）
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ（主なペプチド）
（理論上の分子量４５５１．４  検出された分子量４５５１．８）
配列番号３：ＰＡＰ（２４９〜２８６）
ＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ
（理論上の分子量４４９４．４）検出された分子量４５０７）
配列番号４：ＰＡＰ（２５０〜２８６）
ＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ
（理論上の分子量４３８１．２）検出された分子量４３８８）
配列番号５  ＰＡＰ（２５１〜２８６）
ＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ
（検出された分子量  ４２４４．１）
配列番号６  ＰＡＰ（２５２〜２８６）
ＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ
（検出された分子量  ４１１５．９）
配列番号７  ＰＡＰ（２５３〜２８６）
ＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ
（検出された分子量３９８７．８）
配列番号８：ＰＡＰ（２４８〜２８５）
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭ．．
（理論上の分子量４３８８．３  検出された分子量４３８６．２）
配列番号９：ＰＡＰ（２４８〜２８４）
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩ．．．
（理論上の分子量４２５７．１  検出された分子量４２５４．３）
配列番号１０：ＰＡＰ（２４８〜２８３）
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬ．．．．
（理論上の分子量４１４３．９  検出された分子量４１４１．９）
配列番号１１：ＰＡＰ（２４８〜２８２）
ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫ．．．．．
（理論上の分子量４０３０．７  検出された分子量４０２８．３）
配列番号１２：ＰＡＰ（２４７〜２８２）
ＹＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫ．．．．
（理論上の分子量４１９３．９  検出された分子量１９３．３）
【実施例３】
【００５３】
実施例３−従来のＦｍｏｃ化学を使用して、選択された線状ＰＡＰ／ＳＥＶＩペプチドの化学合成をｍｇ量で行った。分析逆相クロマトグラフィを使用して、合成ペプチドを精製し、その純度および同一性を、上記の方法および装置による質量および配列決定によって分析した。
【実施例４】
【００５４】
実施例４−活性化ＰＡＰ溶液中のアミロイド様原線維はＨＩＶ感染を増強する  
Ｎａｔｈａｎｉｅｌ  Ｌａｎｄａｕから好意的に提供を受けたＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、１０％ＦＢＳおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃２１８７５，０３４）中で培養した。ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７  細胞は、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたＬＴＲ−ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ）およびＬＴＲ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）構築物を含む。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＳＩＶでのＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞の増殖感染後、ウイルストランスアクチベータータンパク質Ｔａｔが発現され、これは、ＬＴＲとの相互作用によってＬｕｃおよびＧＦＰの発現をトランス活性化する。したがって、ＨＩＶ−１感染を、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性または生きている細胞中のＧＦＰ発現の測定によって検出することができる。プロウイルスＤＮＡでの２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによってＨＩＶ−１ストックを生成した（実施例１）。トランスフェクション１日後に、培地を除去し、新鮮なＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）を添加した。３０時間後に上清を含むウイルス粒子を回収し、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（ＮＩＨ試薬プログラム）を使用してウイルス濃度を測定した。
【００５５】
最初の実験では、ＨＩＶ−１感染の増強におけるＳＥＶＩの活性は非常に異なった。撹拌と同時または撹拌後に溶液が混濁するようになった場合にペプチドが最も有効であること、およびＳＥＶＩ溶液の濁度がＨＩＶ感染の増強で効率的であることに留意した。活性化ＳＥＶＩ溶液の混濁成分の性質を解明するために、５ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝化生理食塩水に含まれるＰＡＰ（２４８〜２８６）を、１０００ｒｐｍでの震盪によってインキュベーションした。３７℃で一晩のインキュベーション後、ペプチド溶液は混濁するようになり、原線維様構造が認められた。本ＳＥＶＩペプチド調製物の不溶性の原線維または可溶性部分がＨＩＶ−１感染を活性化するかどうかを分析するために、原線維様構造を、１００００ｇで５分間の遠心分離によって分離し、上清を回収し、ペレットを同量のＰＢＳ中に再溶解した。ＨＩＶ感染に及ぼすこれらの溶液の影響を分析するために、希釈物を、無ＦＢＳ  ＤＭＥＭを使用して９６ウェルプレート中に調製した。次に、５０，０００  ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、９６ウェルの平底プレート中に播種して総体積を５０μｌとし（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ）、１０μｌのペプチド希釈物を添加し、その後に体積４０μｌで１ｎｇのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３のｐ２４抗原を使用して感染させた（総体積１００μｌ）。３７℃で２日間のインキュベーション後、ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ；＃Ｅ１５０１）を使用した細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性の測定によってウイルス感染を決定した。簡潔に述べれば、細胞を再懸濁し、９６ウェルＶ型プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；＃６５１１８０）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞上清を除去し、残りの細胞ペレットを、３０μｌの１×ルシフェラーゼ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ；＃Ｅ１５３１）中に溶解した。２０μｌの溶解物を９６ウェルルミプレート（Ｎｕｎｃ；＃１３６１０１）に移した後、１００μｌのルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、照度計を使用して化学発光を検出し（実施例１を参照のこと）、相対光単位／秒（ＲＬＵ／ｓ）としてルシフェラーゼ活性を検出した。三連の感染由来の感染性の平均値を、ペプチドの非存在下で測定したもの（１００％）と比較して示す。図３Ａに示した結果は、活性な混濁ＳＥＶＩストック溶液および原線維用構造を含む再溶解ペレットのみが用量依存性にＨＩＶ−１感染を増強するのに対して、透明な上清は影響を示さなかったことを証明する。したがって、沈殿部分のみが活性なＨＩＶ−１増強形態を含む。
【００５６】
アルツハイマー病に関連するβ−アミロイド原線維がＨＩＶ−１感染を増強することが以前に示されている（Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ  ａｔ  ａｌ．，２００２）。混濁ＳＥＶＩ溶液がβ−アミロイド様原線維も含むことを解明するために、電子顕微鏡法を行った。図３Ｂに示した電子顕微鏡写真により、混濁したＨＩＶ活性化溶液がβ−アミロイド様原線維を含むのに対して、透明な上清および非活性化溶液中に原線維を検出することができないことが明らかとなった（図３Ｂデータ占めさず）。
【００５７】
アミロイドペプチドの自己集合を、予め形成した原線維の播種によって加速することができることが示されている（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。少数の活性化原線維含有ＰＡＰ（２４８〜２８６）が非集合ＰＡＰ（２４８〜２８６）溶液を活性原線維に変換して、ＨＩＶ完成を増強することも見出された（図３）。
【実施例５】
【００５８】
実施例５−活性ＳＥＶＩ溶液中のβ−アミロイド原線維の検出
５ｍｇ／ｍｌのＰＡＰ（２４８〜２８６）を含むリン酸緩衝化生理食塩水を、３７℃で一晩の１０００ｒｐｍでの震盪によってインキュベーションした。数滴の得られた活性化混濁オリゴペプチド溶液を、ポリリジンコーティングしたスライドに移し、タンパク質溶液を換気フード中にて風乾した。乾燥したタンパク質を、飽和コンゴーレッド溶液（８０％エタノールおよび２Ｍ  ＮａＣｌ中）で染色し、８０％エタノールで洗浄した。基準タンパク質およびペプチドとして、類似の濃度の可溶性の非インキュベーションＰＡＰ溶液（２４８〜２８６）およびヒトアルブミン溶液を同一のスライドに移し、同等に染色した。活性化ＰＡＰ（２４８〜２８６）ペプチドが典型的なコンゴーレッド染色を示したのに対して（図４、上のパネル）、非活性化ペプチドは、コンゴーレッドと全くまたはほとんど反応せず（図４、下のパネル）、アルブミンコントロールは青色を呈した（図４）。コンゴーレッドで染色した同一のスライドを、光学顕微鏡法および蛍光顕微鏡法によって試験した。偏光を使用した従来の光学顕微鏡法は、活性化ＰＡＰ（２４８〜２８６）の典型的な複屈折（二重屈折）効果を示したのに対して（図５Ａ）、非活性化ＳＥＶＩペプチド（図５Ｂ）およびアルブミンコントロール（図５Ｃ）は複屈折効果は認められなかった。コンゴーレッドでの染色および複屈折は、原線維形成の典型的な基準である（Ｎｉｌｓｓｏｎ；２００４）。さらに、従来の蛍光顕微鏡法により、可溶性非活性化ＰＡＰ（２４８〜２８６）（黒色、図６Ｂ）またはアルブミン（緑色、図６Ｃ）と対照的に、ＳＥＶＩ原線維の色および強度の顕著な相違（透明の橙色、図６Ａ）が認められた。コンゴーレッド染色および光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、またはＥＭ顕微鏡法を使用した活性化原線維含有ＰＡＰ（２５８〜２８６）溶液および非活性化透明ＰＡＰ（２５８〜２８６）溶液の間で認められた相違は、ＳＥＶＩ溶液がβ−アミロイド様原線維を含み、ＨＩＶ感染を活性化して有利に働くことが必須であることを明らかに示す。
【実施例６】
【００５９】
実施例６−ＨＩＶ−１感染に及ぼす異なるＳＥＶＩペプチドのＨＩＶ−１増強効果の決定
ＨＩＶ感染に及ぼす合成ＳＥＶＩペプチドの影響を分析するために、サンプルを、無ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中堅に再懸濁して、５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を生成し、これを１４００ｒｐｍ（１分あたりの回転数）にて３７℃で２０時間震盪し、混濁溶液を得た。ペプチド希釈物を、無ＦＢＳＤＭＥＭを使用して９６ウェルプレート中に調製した。次に、５０００  ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、９６ウェルの平底プレート中に播種して総体積を５０μｌ（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ）とし、１０μｌのペプチド希釈物を添加し、その後に体積４０μｌで３０ｐｇのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３のｐ２４抗原を使用して感染させた（総体積１００μｌ）。３７℃で２０時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ；＃Ｅ１５０１）を使用した細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性の測定によってウイルス感染を決定した。簡潔に述べれば、細胞を再懸濁し、９６ウェルＶ型プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；＃６５１１８０）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞上清を除去し、残りの細胞ペレットを、３０μｌの１×ルシフェラーゼ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ；＃Ｅ１５３１）中に溶解した。２０μｌの溶解物を９６ウェルルミプレート（Ｎｕｎｃ；＃１３６１０１）に移したのち、１００μｌのルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、照度計を使用して化学発光を検出し（上記を参照のこと）、相対光単位／秒（ＲＬＵ／ｓ）としてルシフェラーゼ活性を検出した。三連の感染由来の感染性の平均値を、ペプチドの非存在下で測定したもの（１００％）と比較して示す。
【００６０】
図７Ｂに示した全てのペプチドを、同一の条件下で溶解し、インキュベーションした。ＰＡＰフラグメント（２４８〜２８６）、ＰＡＰ（２５０〜２８６）、ＰＡＰ（２５１〜２８６）、ＰＡＰ（２５２〜２８６）、およびＰＡＰ（２５３〜２８６）は、ＨＩＶ−１感染を依存的に増強する。５０μｇ／ｍｌペプチドの存在下で、ＳＥＶＩを含むコントロール細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性は、約３０倍に増加した（図７Ａ）。対照的に、「スクランブルしたペプチド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」（ＰＡＰｓｃｒａｍ、ＳＥＶＩペプチドと同一のアミノ酸からなるが、アミノ酸配列内に無作為に分布する）、コントロールペプチドｃ１〜ｃ３、ならびにＣ末端およびＮ末端フラグメント（ＰＡＰ（２４８〜２６６）およびＰＡＰ（２６７〜２８６））は、ＨＩＶ−１感染に対する増強効果はなかった（図７Ａ）。このデータは、ＨＩＶ−１感染に対するＳＥＶＩの増強効果が特異的であることを示す。
【実施例７】
【００６１】
実施例７−ＨＩＶ−１に対するＳＥＶＩの促進効果は細胞型と無関係である。
ＨＩＶ−１感染に対する増強効果が使用した細胞型に依存するかどうかを分析するために、２０００個の接着ＴＺＭ−ｂｌ細胞（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．；２００２）またはＰ４−ＣＣＲ５細胞および５０００個のＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７懸濁細胞を、５０μｌの体積で播種した。翌日、１０μｌ  ＳＥＶＩ（原線維ＰＡＰ（２５０〜２８６））希釈物を添加し、細胞を１ｎｇのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３のｐ２４抗原で感染させて総体積を１００μｌとした。感染２日後、ＴＺＭ−ｂｌ細胞またはＰ４−ＣＣＲ５細胞のウイルス感染性を、Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用して検出した。簡潔に述べれば、上清を除去し、Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎを含むＰＢＳの４０μｌの１：１希釈物を細胞に添加した。Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎは、β−ガラクトシダーゼ基質および細胞を溶解させる成分を含む。ＲＴで３０分のインキュベーション後、３０μｌの細胞溶解物を、９６ウェルルミプレートに移し、照度計を使用して化学発光を検出した。ＳＥＶＩは、接着細胞（ＴＺＭ−ｂｌおよびＰ４−ＣＣＲ５）および懸濁細胞（ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７）においてＨＩＶ−１感染を用量依存性に促進した（図８）。０．４μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下で、ＨＩＶ感染は、ペプチドを含まないコントロールで得た感染率と比較して、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞で２．１倍、Ｐ４−ＣＣＲ５細胞で２．４倍、およびＴＺＭ−ｂｌ細胞で３．３倍に増強された。分析した最も高い濃度（１０μｇ／ｍｌ）では、３つ全ての細胞型のＨＩＶ感染は、１０倍を超えて増加した。ヒトＰＢＭＣおよびマクロファージでも類似の結果が得られた（図１１および１２）。これらのデータは、ＨＩＶ−１感染に対するＳＥＶＩの促進効果が使用した細胞型と無関係であることを示す。
【実施例８】
【００６２】
実施例８−ＳＥＶＩは、細胞生存性または内因性ＬＴＲ活性に影響を及ぼさない。
ＳＥＶＩが細胞に細胞傷害効果を発揮するか、または細胞増殖を刺激するのかどうかを分析するために、４０００個のＴＺＭ−ｂｌ細胞を、１００μｌの体積で９６ウェル平底プレートに播種した。翌日、培地を９０μｌの新鮮な培地と置換し、ＳＥＶＩ（原線維ＰＡＰ（２５０〜２８６））希釈物を添加し、最終体積を１００μｌとした。３日後、１０μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ；＃Ｍ２１２８）溶液を添加し、細胞を、３７℃で４時間インキュベーションした。生細胞では、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼが黄色のＭＴＴ塩を青色のホルマザン結晶に酸化する（Ｓｃｈｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．；１９８５）。１：１  エタノール／ＤＭＳＯへの結晶の溶解後、生細胞を含むサンプルは青色を呈するのに対して、死細胞由来のサンプルは透明である。光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、５６０／６５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定した。図９Ａに示すように、高濃度のＳＥＶＩを含むサンプル中での細胞生存度はペプチドによって影響を受けず、ペプチドが細胞傷害効果も細胞増殖の誘導も発揮しないことが示された。
ＳＥＶＩはＨＩＶ−１感染を増強しないが、その代わりに、ＬＴＲをコードする細胞を活性化して、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞またはＴＺＭ−ｂｌ／Ｐ４−ＣＣＲ５細胞中のｌｕｃまたはｌａｃＺ発現をそれぞれ駆動するかもしれない。これを分析するために、ＴＺＭ−ｂｌ細胞を、感染させていない異なる濃度のＳＥＶＩとインキュベーションし、内因性ＬＴＲ活性を、Ｇａｌ−Ｓｃｒｅｅｎキットを使用して、３ｄｐｉで測定した。ＬＴＲ活性は、分析した全てのサンプル中で等しく、ＳＥＶＩが実際にＨＩＶ−１感染を増強し、使用したレポーター細胞中の内因性ＬＴＲ活性を増加させないことが証明された。（図９Ｂ）。
【実施例９】
【００６３】
実施例９−ＰＡＰ誘導フラグメントがＨＩＶ−１感染率を増強する。
５０μｌ  ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）中に播種したＬＴＲ−ｌｕｃおよびＬＴＲ−ＧＦＰをコードする２０，０００個のＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、１０μｌの示した原線維ペプチド希釈物とインキュベーションし、０．３ｎｇのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３のｐ２４抗原で感染させ、総体積を１００μｌとした。２日後に、第１のＵＶ顕微鏡法（図１０Ａ）およびその後の同一サンプルの細胞溶解物のルシフェラーゼ活性の測定（図１０Ｂ）によってウイルス感染率を検出した（図１０Ｂ）。原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６）、ＰＡＰ（２５１〜２８６）、およびＰＡＰ（２５３〜２８６）は、ＮＬ４−３感染を依存的に促進する。ペプチドを含まないコントロールサンプルの感染後、約２．６％の細胞が、４４，４５７  ＲＬＵ／ｓのルシフェラーゼ活性に相当するＧＦＰを発現した（図１０）。２μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下で、平均感染率は、４．６％（６６，３２７  ＲＬＵ／ｓ）にほぼ倍増した。最も高濃度の５０μｇ／ｍｌでは、９９％を超える細胞が、ＨＩＶ−１に感染するようになった。これらのサンプルのルシフェラーゼ活性の中央値は、１，７０１，１５６  ＲＬＵ／ｓであり、これは、感染の３８倍増加に相当する（１，７０１，１５６  ＲＬＵ／ｓ÷コントロール細胞の４４，４５７  ＲＬＵ／ｓ）。本発明者らのデータは、ＰＡＰ誘導ペプチドがＨＩＶ−１感染細胞数を劇的に増強することを証明している。
【実施例１０】
【００６４】
実施例１０−ＳＥＶＩは、共受容体の使用と無関係にＰＢＭＣおよびマクロファージのＨＩＶ−１感染を促進する。
標的細胞を増殖感染するために、ＨＩＶ−１は、細胞表面上の第１のＣＤ４受容体および第２の分子（共受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４の１つ）を必要とする（Ｃｈａｎｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．；２００４）。厳格にＣＸＣＲ４（Ｘ４）向性を示すＨＩＶ−１  ＮＬ４−３を使用して、以前のデータを得た（Ｐａｐｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．；２００２）。ＳＥＶＩがＸ４およびＲ５向性ＨＩＶ−１での初代細胞の感染も促進するかどうかを分析するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における実験を行った。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（Ｍuｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．；２００２）を使用して、ＰＢＭＣを全血から得た。精製ＰＢＭＣを、２０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｓｔｒａｔｍａｎｎ）、および３μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（Ｏｘｏｉｄ；＃３０８５２８０１）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で３日間刺激した。次いで、ＰＢＭＣを、１２００ｒｐｍでの遠心分離によって沈殿させ、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２）中に再懸濁した。次に、５×１０5細胞を、５０μｌ  ＲＰＭＩに播種し、１０μｌのペプチド希釈物（原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６））を添加した。その後、細胞を、１０、１、および０．１ｎｇのＲ５向性ＨＩＶ−１  ００５−ｐｆ−１０３のｐ２４抗原（ａ）（Ｐａｐｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．；２００２）およびＸ４向性ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３  Ｌｕｃ（Ｈｅ  ａｔ  ａｌ．；１９９５）（ｂ）を感染させて、総体積を１００μｌとした。両ウイルスを、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって得、これらは、ｎｅｆの代わりにルシフェラーゼ遺伝子を含む。感染３日後、細胞をペレット化し、３０μｌルシフェラーゼ溶解緩衝液で溶解した。２０μｌの溶解物および１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、ルシフェラーゼ活性を検出した。ペプチド濃度の増加に伴うルシフェラーゼ活性の増加は、ＳＥＶＩが、Ｒ５（図１１Ａ）およびＸ４（図１１Ｂ）向性ウイルスによるＰＢＭＣの感染を用量依存性に促進したことを示す。例えば、１ｎｇのＲ５向性ＨＩＶ−１のｐ２４抗原または１０ｎｇのＸ４向性ＨＩＶ−１での感染後、１０μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩを含むサンプル由来のルシフェラーゼ活性（それぞれ、２８，５２０  ＲＬＵ／ｓまたは５８９，８４０  ＲＬＵ／ｓ）は、ペプチドを含まないコントロールサンプル由来のレポーター活性と比較して３４倍または２８倍増加した（それぞれ、８３０  ＲＬＵ／ｓまたは２０，８２０  ＲＬＵ／ｓ）。
【００６５】
マクロファージのＨＩＶ−１感染に及ぼすＳＥＶＩの影響を分析するために、５×１０5ＰＢＭＣを、５００μｌ  ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ）を含む４８ウェルディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；＃３５３０７８）に播種した。５日後、非接着細胞を慎重に洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦを含む４００μｌの新鮮な培地を添加した。２日後に培地を除去し、１３０μｌの新鮮な培地および２０μｌの原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６）希釈物を、分化マクロファージに添加し、次いで、表示量のＸ４向性ＮＬ４−３  Ｌｕｃ（ａ）およびＲ５向性００５ｐｆ１０３  Ｌｕｃ（ｂ）で感染させ、総体積を２００μｌとした。３日後、ルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、ウイルス感染を検出した。図１２に示すように、ＳＥＶＩは、使用した共受容体と無関係に、マクロファージのＨＩＶ−１感染も増強した。マクロファージにおいてＣＸＣＲ４発現を欠くので、Ｘ４向性ＮＬ４−３の全感染率（図１２Ｂ）は、Ｒ５向性（図１２Ａ）変異形を使用した得た全感染率（図１２Ａ）と比較して減少する。
【実施例１１】
【００６６】
実施例−１１。ＳＥＶＩはＨＩＶ−１の増殖感染の閾値を低下させる。
細胞培養物中のＨＩＶ−１の増殖感染を確立するために、１つの単一の感染事象が起こらなければならない。ＳＥＶＩがペプチドを含まない通常の条件下で起こらない標的細胞のＨＩＶ−１感染を可能にするかどうかを分析するために、標的細胞をＳＥＶＩとインキュベーションし、単一細胞を感染させるのに十分でないウイルス濃度で感染させた。前日に播種した４，０００個のＴＺＭ−ｂｌ細胞を、５０μｌ  ＤＭＥＭ、１０μｌの原線維ＰＡＰ（２５１〜２８６）希釈物中でインキュベートし、総体積１００μｌにてＨＩＶ−１  ＮＬ４−３（Ｘ４）およびＨＩＶ−１  ＮＬ４−３  ＹＵ−２（Ｒ５）で感染させた（Ｐａｐｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。０．６ｐｇおよび０．１ｐｇのｐ２４抗原は、４０μｌの１５，６２５または７８，１２５倍希釈ウイルスストック溶液に相当する。Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用して、３日後にウイルス感染を検出した。０．１および０．６ｐｇのＸ４およびＲ５向性ＨＩＶ変異形で感染させた細胞の平均β−ガラクトシダーゼ活性は、非感染細胞（ｎ）に類似し、ペプチドを含まないサンプル中で感染は起こらないことを示した（図１３Ａ）。対照的に、２μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩ以上の存在下では、使用した全濃度のウイルスについて感染を容易に検出することができた。ＰＢＭＣ（調製については上記を参照のこと）を少量のＨＩＶで感染させた場合、類似の結果が得られた。５×１０5ＰＨＡ／ＩＬ−２刺激ＰＢＭＣを、９６  ウェルディッシュ（５０μｌ；１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２）に播種し、１０μｌのＰＡＰ（２４８〜２８６）の２０μｇ／ｍｌストック溶液を添加し、次いで、表示のｐ２４抗原量のＮＬ４−３で感染させ、最終体積を１００μｌとした（最終ＳＥＶＩ濃度：２μｇ／ｍｌ）。感染１日後、細胞をペレット化してペプチドおよびウイルスを除去し、ＳＥＶＩを含まない２００μｌ  ＲＰＭＩ（２０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２）に再懸濁した。規定の時点で上清を回収し、新たな培地を添加した。ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡを使用して、ウイルス複製をアッセイした。ＳＥＶＩ含有細胞を１２０および１２ｐｇのｐ２４抗原で感染させた場合、ペプチドを含まないコントロール細胞よりも速い速度およびレベルでＨＩＶ−１を複製した（図１３Ｂ）。１．２ｐｇおよび０．１２ｐｇでのＰＢＭＣの感染後、ウイルスは、ＳＥＶＩを含むサンプルのみで複製されるが、ペプチドを含まないコントロール細胞では複製されなかった。ＰＢＭＣ細胞およびＴＺＭ−ｂｌ細胞で得たこれらのデータは、ＳＥＶＩが一定量のＨＩＶ−１で標的細胞を感染させることが可能であり、同一の実験条件下で全く感染性を示さないことを証明する。どのようにして効率的にＳＥＶＩがＨＩＶ感染性を活性化するのかを分析するために、ウイルスストック溶液の１０倍希釈物を使用した異なる量の原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６）の存在下でのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３の終点滴定を、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞で行った。ペプチドを含まないコントロール細胞中で検出可能なルシフェラーゼ活性が得られるＨＩＶ−１の最も高い希釈率は、１０4であった（表１）。しかし、０．４および２μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下で、ｌｏｇ５希釈物またはｌｏ��６希釈物を使用した場合、ＨＩＶ−１感染を検出することもできる。最も高いＳＥＶＩ濃度（１０μｇ／ｍｌ）でも、ｌｏｇ７希釈物によって増殖感染された。したがって、ＳＥＶＩは、ＨＩＶ−１感染の閾値を１／２〜１／３に劇的に低下させる。ヒト精子中のＨＩＶ活性化ペプチドは、性交時のＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の自然の伝播で重要な意味を有し得る。性交当たりのＨＩＶ−１の伝播率は、０．１％より低い。
【実施例１２】
【００６７】
実施例１２−ＳＥＶＩ媒介されたＨＩＶ−１感染の増加は絶対ウイルス感染性と相関する。
前の実験では、ＳＥＶＩの存在下での感染率の増加が高いほどウイルスの接種材料またはＭＯＩ（感染効率）が低くなることを証明した。この相関をより詳細に分析するために、１０μｌの原線維ＰＡＰ（２５１〜２８６）希釈物を４０００  ＴＺＭ−ｂｌ細胞（５０μｌ）に添加した。漸減濃度のＸ４向性ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３およびＲ５向性ＨＩＶ−１  ＹＵ２のｐ２４（Ｐａｐｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．；２００２）で感染させ、総体積を１００μｌとした。ｘ軸上の各ウイルス感染用量についてのペプチドを含まないコントロールサンプル中のＲＬＵ／ｓとして得た絶対感染性／β−ガラクトシダーゼ活性およびｙ軸上の各感染用量についての１０μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下での感染のｘ倍増加を加えた場合、絶対感染性とウイルス感染に対するＳＥＶＩの活性化効果との間の直接的相関を決定することができる（図１４）。絶対感染率が高いほど感染のＳＥＶＩ媒介増強効果は低くなり、その逆も同様であった。この相関を、高い比率の細胞（すなわち、５０％）が既にコントロールサンプル中で感染される場合、ＳＥＶＩは感染率を１００％に増強することができるだけであり、感染率の最大増加は２倍であるという事実によって部分的に説明することができる。対照的に、細胞を低ＭＯＩで感染させる場合（すなわち、コントロール細胞における感染率２％）、ＳＥＶＩは、ウイルス感染を数倍に増強することができる。
【実施例１３】
【００６８】
実施例１３−ＳＥＶＩは、いくつかのＸ４、Ｒ５、および二重向性ＨＩＶ−１変異形、分子ＨＩＶクローン、および異なるＨＩＶ−１サブタイプの感染を促進する。
いくつかのＨＩＶ−１変異形の感染に対する増強効果を検出するために、原線維ＰＡＰ（２５３〜２８６）希釈物を、１０μｌの体積で、前日に播種した５０μｌのＴＺＭ−ｂｌ細胞に添加した。ＮＬ４−３  Ｖ３組換えウイルス（Ｐａｐｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．；２００２）、その異なる共受容体の使用、および分子ＨＩＶクローン（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍから得た）を使用した感染を、約０．０１〜０．００１のＭＯＩを使用して行い、総体積を１００μｌとした。Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用して、ウイルス感染を測定した。ＳＥＶＩは、共受容体の選択またはサブタイプと無関係に、試験した全てのＨＩＶ−１変異形の感染を促進させた（図１５）。０．４μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下で、  ＨＩＶ−１  ＬＡＩまたは９３ｂｒ０２５−９は、ペプチドを含まないコントロール細胞よりも２．７倍または１．９倍の効率で細胞に感染した。より高い濃度では、ＳＥＶＩは、Ｐ５１−Ｓの場合、ペプチドを含まない感染コントロールと比較して、試験した全てのウイルスの感染をより刺激し、感染性は最大で３，０４５％であった。ＨＩＶ−１のＯ群単離物（Ｄｉｔｔｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．；１９９９）および種々のＨＩＶ−１サブタイプ（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｏｇｒａｍ）に及ぼすＳＥＶＩの影響を分析するために、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、異なる濃度のＳＥＶＩの存在下で異なるＭＯＩにて感染させた。表２に示すように、ＳＥＶＩは、試験した全てのＨＩＶ−１サブタイプ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）の感染を好み、コントロール細胞と比較したルシフェラーゼ活性の最大ｘ倍増加は、ＨＩＶ−１  ９２ＵＧ０２９で１５６であった。ＨＩＶ−１のＯ群単離物を試験した場合、類似の結果を得た（表３）。
【実施例１４】
【００６９】
実施例１４−作用機構
どのようにしてＳＥＶＩがＨＩＶ−１感染を促進するのかを除外するために、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質に基づいた細胞−細胞融合アッセイを行った（Ｐoｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．；１９９９）。ＳＩＶ−ＴａｔおよびＮＬ４−３  Ｅｎｖをコードする発現プラスミドでトランスフェクションした２９３Ｔ細胞を、９６ウェルディッシュに播種し、異なる濃度の原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６）とインキュベーションし、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞と同時培養し、総体積を１００μｌとした。２９３Ｔ細胞の細胞膜で発現したＨＩＶ−１  エンベロープタンパク質は、ＣＤ４および共受容体陽性ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞との融合を誘導する。２９３Ｔ細胞およびＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞が融合した場合、２９３Ｔは、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞の核に拡散してウイルスＴａｔタンパク質を発現し、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞コードＬＴＲ−ｌｕｃおよびＬＴＲ−ＧＦＰ遺伝子の発現をトランス活性化する。１日後、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性の測定およびＵＶ顕微鏡法の実施によってＨＩＶ−１  Ｅｎｖ媒介癒合率を検出した。ＳＥＶＩがＨＩＶ−１感染を強く促進する濃度でさえも、融合活性の増加は認められなかった（１０μｇ／ｍｌおよび０μｇ／ｍｌとの比較；図１６）。ＵＶ顕微鏡法により、ＧＦＰ発現細胞数は、全培養サンプルで類似していることが明らかとなった。たった約２％の細胞しかＧＦＰ陽性でないので、Ｅｎｖは過剰発現されなかった。
【実施例１５】
【００７０】
実施例１５−ＳＥＶＩはＨＩＶと相互作用し、細胞結合を促進する。
ＳＥＶＩはウイルス粒子を結合して、その感染性を増加させるか、ＨＩＶ−１感染に対する標的細胞の感受性を増強することができる。これらの可能性を区別するために、本発明者らは、ウイルスストックを種々の濃度の原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６）と少容量で５分間プレインキュベーションし、その後にウイルス／ＳＥＶＩ混合物を細胞培養物に添加し、それにより、５０倍に希釈した。比較のために、ＳＥＶＩを細胞培養物に直接添加し、その後に同一のウイルス用量で感染させた。結果は、感染効率の増加がウイルスの存在下でのＳＥＶＩの濃度にちょうど依存することを証明していた（図１７Ａ、左）。短期間のプレインキュベーション後のＨＩＶ−１／ＳＥＶＩ混合物の希釈により、ＳＥＶＩ媒介感染性の増強規模は全く減少しなかった。感染培養物の最終ペプチド濃度に関して、ウイルス感染性は５０倍に増強された（図１７Ａ、右）。これらのデータにより、ＳＥＶＩはウイルス粒子と直接相互作用することが示唆され、５分のインキュベーション後に大部分の結合が完了することを意味する。
【００７１】
どのようにしてＳＥＶＩがＨＩＶ−１感染を増強するのかをさらに評価するために、本発明者らは、ＴＺＭ−ｂｌ細胞を、原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６）の存在下または非存在下でウイルス粒子と３時間インキュベーションした。その後、強い洗浄によって非結合ウイルスを除去し、細胞に会合したｐ２４抗原の量を、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＳＥＶＩは、標的細胞へのＨＩＶ−１の結合を、用量依存様式で８倍まで増加させた（図１７Ｂ、左）。特に、ＳＥＶＩはＥｎｖを欠くＨＩＶ−１粒子の結合も増強するが、細胞会合した全ｐ２４レベルは、野生型ＨＩＶ−１粒子を使用して測定したレベルの約１／３０であった（図１７Ｂ、右）。これらの結果により、細胞表面へのウイルス粒子の結合の促進によってＳＥＶＩがＨＩＶ−１感染を増強することが示唆される。
【実施例１６】
【００７２】
実施例１６−ヒト精液由来のペプチド画分がＨＩＶ−１感染を促進する。
上記のように、各ドナーから得た２−３ｍｌの精子を分析スケールで調製し、得られた精漿調製物を、活性の決定前に単一の逆相クロマトグラフィ工程によって分離した。クロマトグラフィ条件を至適化するために、合成ＳＥＶＩペプチドの保持時間を決定し、精漿画分の分画および活性の決定について考慮した。
【００７３】
１ｍｌ精子等価物（Ｓｐ−Ｅｑ）を含むペプチド画分を、１００μｌ  ＤＭＥＭ（ストック溶液１０ｍｌ  Ｓｐ−Ｅｑ／ｍｌ）に溶解した。ストック溶液を、９６ウェルＵ型プレート中でＤＭＥＭにて５倍希釈し、１０μｌの希釈物を、前日に９６ウェル平底プレートに播種した５０μｌ  ＴＺＭ−ｂｌに添加した。その後、０．１ｎｇのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３のｐ２４抗原で感染させ、総体積を１００μｌとした。３日後、Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｋｉｔを使用して、感染性を測定した。元の精液中に存在する濃度に相当する濃度（１ｍｌ  Ｓｐ−Ｅｑ／ｍｌ）で、両ドナー由来の画分３０〜３４は、ＨＩＶ−１感染を劇的に増強した（例えば、ドナーＢ由来の画分３１は、コントロールサンプルと比較して、約１１倍の感染性を誘導した）（図１８）。際立って、いくつかのドナー由来のペプチド混合物の２００倍希釈物でさえも、ＨＩＶ−１感染を効率的に増強した（ドナーＡを参照のこと）。まとめると、本発明者らの結果は、十分にＨＩＶ−１感染を促進させるために必要な範囲内の濃度の活性ＳＥＶＩフラグメントがヒト精子中に存在することを強く示唆する。
【実施例１７】
【００７４】
実施例１７−ＳＥＶＩは、標的細胞のＳＩＶ、ＨＩＶ−２、ＭｕＬＶ、および偽粒子感染を増強する。
レンチウイルスのような他のレトロウイルスに及ぼすＳＥＶＩの影響を分析するために、本発明者らは、ＨＩＶ−２およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を試験した。全ウイルスストックを、プロウイルスＤＮＡでの２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。ＨＩＶ−２ＲＯＤ１０クローンをＫ．Ｓｔｒｅｂｅｌ（Ｃｌａｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．；１９８６）から入手し、アフリカミドリザル由来のＳＩＶａｇｍ−ｔａｎ１およびチンパンジー由来のＳＩＶｃｐｚ−ｔａｎ１を、Ｂ．Ｈａｈｎ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）から購入した。原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６）は、ＨＩＶ−２および異なるＳＩＶの感染率を用量依存性に増強した（図１９）。例えば、ＴＺＭ−ｂｌ細胞を２μｌのＨＩＶ−２で感染させた場合、５０μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩにより、ウイルス感染が２倍に増加した（図１９Ａ）。ＳＥＶＩはまた、ＴＺＭ−ｂｌ細胞においてはＳＩＶｍａｃおよびＳＩＶａｇｍ感染を好み（図１９Ｂ）、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞においてはＳＩＶｃｐｚ感染を好んだ（図１９Ｃ）。このデータは、ＳＥＶＩが異なる細胞株におけるＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶのような異なる霊長類レンチウイルスの感染性を増強することを示す。レンチウイルス感染に対するＳＥＶＩの刺激効果がレンチウイルスＥｎｖタンパク質に依存するかどうかを分析するために、本発明者らは、ｐＢＲＨＩＶ−１ＮＬ４．３およびｐＢＲＳＩＶｍａｃ２３９中のｅｎｖ遺伝子をＭｕＬＶ  ｅｎｖ遺伝子と置換して、細胞侵入を媒介するＭｕＬＶ  Ｅｎｖを発現する複製コンピテントＨＩＶ−１（ＭｕＬＶ−ＨＩＶ）およびＳＩＶｍａｃ２３９（ＭｕＬＶ−ＳＩＶ）を生成した（Ｇｕｎｄｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．；１９９８）。プールした原線維ＰＡＰフラグメントの存在下で、ＭｕＬＶ−ＨＩＶおよびＭｕＬＶ−ＳＩＶの感染率は劇的に増加した（図２０Ａ）。次に、本発明者らは、ＭｕＬＶ  エンベロープタンパク質を保有するＭｕＬＶ粒子の感染に及ぼすＳＥＶＩの影響を分析した。したがって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするｅｎｖ欠失ＭｕＬＶ（ｐＧＣ−ｓａｍ−ＥＮ−Ｌｕｃ３；Ｏ．Ｗｉｌｄｎｅｒ，Ｂｏｃｈｕｍ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供）を、ｐＧＣ−ｓａｍ−ＥＮ−Ｌｕｃ３およびｐｃＤＮＡ−ＭｕＬＶ−ｅｎｖでの２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションによってＭｕＬＶ  Ｅｎｖでシュードタイピングして、ＭＬＶ−ＭＬＶ粒子を得た。２〜５０μｇ／ｍｌの粒子の存在下で、ＭＬＶｐｐは、ＨＵＨ−７細胞（ＩＰＦ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ由来）、ＰＭ１細胞、およびＪｕｒｋａｔ細胞（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ）に、ＳＥＶＩを含まないコントロール細胞よりも平均して１０倍の効率で感染した（図２０Ｂ）。これらのデータは、ＳＥＶＩが遺伝子療法アプローチで広範に使用されるレンチウイルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ）およびオンコウイルス（ＭｕＬＶ）の両方の感染率／形質導入率を増強することを証明する。さらに、本発明者らは、ＳＥＶＩはまた、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質を保有するｅｎｖインタクトまたはｅｎｖ欠損��ＩＶ−１粒子の感染を増強することを示すことができた（図２１Ａ）。ＶＳＶ−Ｇタンパク質が細胞への有効な侵入を可能にするので、レトロウイルス遺伝子療法のベクターをシュードタイピングするためにＶＳＶ−Ｇ（Ｃｒｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．；２００５）が広範に使用されている。さらに、ＳＥＶＩはまた、エボラスパイクタンパク質を含むＨＩＶ−１粒子の感染を好んだ（Ｂａｒｉｂａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．；２００２；図２１Ｂ）。
【００７５】
表１．ＳＥＶＩの存在下でのＨＩＶ−１の終点滴定（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）。ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、９６ウェルプレートに５０μｌの体積で播種し、１０μｌのＳＥＶＩを添加し、その後、４０μｌのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３の１０倍希釈物で感染させた。ルシフェラーゼアッセイキットを使用して、３、５、および７ｄｐｉで増殖感染を測定した。絶対ルシフェラーゼ活性が非感染細胞から得たものより１００倍超高かった場合、細胞は増殖感染（ｐ）されたと見なした。括弧内の数字は、感染７日後の三連の実験由来の増殖感染されたウェル数を示す。
【００７６】
【表１】
2009524420.tif 000003
【００７７】
表２．ＳＥＶＩは、異なるＨＩＶ−１  Ｍサブタイプの感染を好む。５０μｌ  ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、１０μｌ  ＳＥＶＩ希釈物とインキュベーションし、その後、感染ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞の濾過上清由来の予備試験を行った低ＭＯＩのＨＩＶ−１Ｍ群単離物で感染させた。感染１、２、または３日後（列７を参照のこと）、ルシフェラーゼアッセイキットを使用して感染率を決定した。ペプチドを含まないコントロール感染（１００％）と比較した、それぞれ２５および５μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下での感染率を示す。コントロールサンプル中の絶対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｓ）を、列４に示す。２５μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下での感染のｘ倍増加を計算するために、ペプチドの存在下で得られた絶対ＲＬＵ／ｓ値を、ペプチドを含まない感染コントロール細胞由来のルシフェラーゼ活性で割った。データは、二連の感染に由来した。各行は、独立して由来するウイルスストックを使用した独立した実験を示す。Ｒ５：ＣＣＲ５向性変異形、Ｘ４：ＣＸＣＲ４向性変異形。
【００７８】
【表２】
2009524420.tif 000004
【００７９】
表３．ＳＥＶＩは、ＨＩＶ−１  Ｏ単離物の感染を好む。５０μｌ  ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、１０μｌ  ＳＥＶＩ希釈物とインキュベーションし、その後、感染ＰＭ１細胞（１６３９−１３４７０）またはＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞（Ｃａ９，ＭＶＰ５１８０）の濾過上清由来の低ＭＯＩの予備試験したＨＩＶ−１  Ｏ群単離物で感染させた。感染１、２、または３日後（列６を参照のこと）、ルシフェラーゼアッセイキットを使用して感染率を決定した。ペプチドを含まないコントロール感染（１００％）と比較した、それぞれ２５および５μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下での感染率を示す。コントロールサンプル中の絶対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｓ）を、列４に示す。２５μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下での感染のｘ倍増加を計算するために、ペプチドの存在下で得られた絶対ＲＬＵ／ｓ値を、ペプチドを含まない感染コントロール細胞由来のルシフェラーゼ活性で割った。データは、単一の感染に由来した。各行は、独立して由来するウイルスストックを使用した独立した実験を示す。Ｒ５：ＣＣＲ５向性変異形、Ｘ４：ＣＸＣＲ４向性変異形。
【００８０】
【表３】
2009524420.tif 000005
【００８１】
文献
Ａｄａｃｈｉ  Ａ，Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ  ＨＥ，Ｋｏｅｎｉｇ  Ｓ，Ｆｏｌｋｓ  Ｔ，Ｗｉｌｌｅｙ  Ｒ，Ｒａｂｓｏｎ  Ａ，Ｍａｒｔｉｎ  ＭＡ．「感染性分子クローンでトランスフェクションされたヒト細胞および非ヒト細胞における後天性免疫不全症候群関連レトロウイルスの産生」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９８６  Ａｕｇ；５９（２）：２８４−９１．
Ａｐｏｓｔｏｌ  Ｉ，Ｋｕｃｉｅｌ  Ｒ，Ｗａｓｙｌｅｗｓｋａ  Ｅ，Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  ＷＳ．「酸性ホスファターゼおよびアルカリホスファターゼの基質としてのホスホチロシン」、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｐｏｌ．  １９８５；３２（３）：１８７−９７．
Ａｕｍｕｌｌｅｒ  Ｇ，Ｓｅｉｔｚ  Ｊ．「酸性ホスファターゼの細胞化学および生化学ＶＩ：ヒト前立腺酸性ホスファターゼおよび白血球酸性ホスファターゼに対する免疫電子顕微鏡研究」、Ｐｒｏｓｔａｔｅ．１９８５；７（２）：１６１−９
Ｂａｒｉｂａｕｄ  Ｆ，Ｐｏｈｌｍａｎｎ  Ｓ，Ｌｅｓｌｉｅ  Ｇ，Ｍｏｒｔａｒｉ  Ｆ，Ｄｏｍｓ  ＲＷ．「単球由来樹状細胞に対するＤＣ−ＳＩＧＮの定量的発現分析およびウイルス伝播分析」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００２  Ｓｅｐ；７６（１８）：９１３５−４２．
Ｂｒｉｇｇｓ，Ｊ，Ａ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｎ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｉ．，Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ，Ｈ．Ｇ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｖｏｇｔ，Ｖ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．（２００４）．「ＨＩＶ−１におけるＧａｇタンパク質の化学量論」、Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１，６７２−６７５．
Ｃｈａｎｔｒｙ  Ｄ．「ＨＩＶの侵入および融合インヒビター」、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００４  Ｍａｙ；９（１）：１−７．Ｒｅｖｉｅｗ．
Ｃｈａｒｎｅａｕ  Ｐ，Ｂｏｒｍａｎ  ＡＭ，Ｑｕｉｌｌｅｎｔ  Ｃ，Ｇｕｅｔａｒｄ  Ｄ，Ｃｈａｍａｒｅｔ  Ｓ，Ｃｏｈｅｎ  Ｊ，Ｒｅｍｙ  Ｇ，Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ  Ｌ，Ｃｌａｖｅｌ  Ｆ．「多岐にわたるＨＩＶ−１単離物の単離およびエンベロープ配列：新規のＨＩＶ−１群の定義」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９４  Ｎｏｖ  １５；２０５（１）：２４７−５３．
Ｃｈｏｅ  ＢＫ，Ｐｏｎｔｅｓ  ＥＪ，Ｒｏｓｅ  ＮＲ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＭＤ．「膵島細胞癌におけるヒト前立腺酸性ホスファターゼの発現」、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｕｒｏｌ．１９７８  Ｊａｎ；１５（４）：３１２−８．
Ｃｈｏｅ  ＢＫ，Ｐｏｎｔｅｓ  ＥＪ，Ｄｏｎｇ  ＭＫ，Ｒｏｓｅ  ＮＲ．「ヒト前立腺酸性ホスファターゼの二重抗体免疫酵素アッセイ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９８０  Ｄｅｃ；２６（１３）：１８５４−９．
Ｃｌａｖｅｌ，Ｆ．，Ｇｕｙａｄｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｅｔａｒｄ，Ｄ．，Ｓａｌｌｅ，Ｍ．，Ｇｌｕｃｋｍａｎ，Ｊ．−Ｃ．ａｎｄ  Ａｌｉｚｏｎ，Ｍ．「ヒト免疫不全ウイルス２型の分子クローニングおよび多型」、Ｎａｔｕｒｅ  ３２４，６９１−６９５（１９８６）
Ｃｏｆｆｅｙ  ＤＳ，Ｐｉｅｎｔａ  ＫＪ．「前立腺の正常な成長および癌成長の制御の研究における新規の概念」  Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．１９８７；２３９：１−７３．Ｒｅｖｉｅｗ．
Ｃｒｏｎｉｎ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  ＸＹ，Ｒｅｉｓｅｒ  Ｊ．「シュードタイピングによるレンチウイルスベクターのトロピズム」、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ａｕｇ；５（４）：３８７−９８．Ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ｏｃｔ；５（５）：５３１．
Ｃｕｓａｎ  Ｌ，Ｇｏｍｅｚ  ＪＬ，Ｄｕｐｏｎｔ  Ａ，Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｐ，Ｌｅｍａｙ  Ｍ，Ｍｏｏｒｅ  Ｓ，Ｌａｂｒｉｅ  Ｆ．「前立腺癌の肺小結節への転移：併用療法およびその後のフルタミドの投薬中止の有益な効果」、Ｐｒｏｓｔａｔｅ．１９９４  Ｍａｙ；２４（５）：２５７−６１
Ｄｅｒｅｃｈｉｎ  Ｍ，Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  Ｗ，Ｇａｌｋａ  Ｍ，Ｂａｒｎａｒｄ  ＥＡ．「ヒト前立腺の酸性ホスホモノエステラーゼ。分子量、解離、および化学組成」、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９７１  Ｏｃｔ；２５０（１）：１４３−５４．
Ｄｉｔｔｍａｒ  ＭＴ，Ｚｅｋｅｎｇ  Ｌ，Ｋａｐｔｕｅ  Ｌ，Ｅｂｅｒｌｅ  Ｊ，Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ  ＨＧ，Ｇｕｒｔｌｅｒ  Ｌ．「カメルーン由来の一次ＨＩＶ１型Ｏ群単離物の共受容体要件」、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．１９９９  Ｍａｙ  ２０；１５（８）：７０７−１２．
Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ  Ｄ，Ｗａｈｅｅｄ  Ａ，Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ  Ｒ．「ヒト十二指腸窩上皮における非リソソーム顆粒中の前立腺型酸性ホスファターゼの証明」、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８７；８８（１）：４７−５２．
Ｄｚｉｅｍｂｏｒ−Ｇｒｙｓｚｋｉｅｗｉｃｚ  Ｅ，Ｆｉｋｕｓ  Ｍ，Ｋａｚｉｍｉｅｒｃｚｕｋ  Ｚ，Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  Ｗ．「プリン５’−ホスホヌクレオシドに対するヒト前立腺酸性ホスファターゼ活性」Ｂｕｌｌ  Ａｃａｄ  Ｐｏｌ  Ｓｃｉ  Ｂｉｏｌ．１９７８；２６（１２）：８１５−２１．
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＪＣ．「前立腺特異的酸性ホスファターゼ：前立腺疾患の診断における放射免疫アッセイの再評価」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９８０  Ｍａｒ；２６（３）：４３３−６．
Ｇｕｎｄｌａｃｈ  ＢＲ，Ｒｅｉｐｒｉｃｈ  Ｓ，Ｓｏｐｐｅｒ  Ｓ，Ｍｅａｎｓ  ＲＥ，Ｄｉｔｔｍｅｒ  Ｕ，Ｍａｔｚ−Ｒｅｎｓｉｎｇ  Ｋ，Ｓｔａｈｌ−Ｈｅｎｎｉｇ  Ｃ，Ｕｂｅｒｌａ  Ｋ．「弱毒化サル免疫不全ウイルスの生ワクチンによって誘導されたＥｎｖ非依存性防御」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｏｃｔ；７２（１０）：７８４６−５１．
Ｈａｋａｌａｈｔｉ  Ｌ，Ｖｉｈｋｏ  Ｐ，Ｈｅｎｔｔｕ  Ｐ，Ａｕｔｉｏ−Ｈａｒｍａｉｎｅｎ  Ｈ，Ｓｏｉｎｉ  Ｙ，Ｖｉｈｋｏ  Ｒ．「ノーザンブロット分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、およびモノクローナル抗体および二重特異性抗体を使用した免疫組織化学染色を使用した前立腺過形成および前立腺癌中のＰＡＰおよびＰＳＡ遺伝子発現の評価」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９３  Ｏｃｔ  ２１；５５（４）：５９０−７．
Ｈｅ  Ｊ，Ｌａｎｄａｕ  ＮＲ．「別のウイルス受容体を検出するためのヒト胎盤アルカリホスファターゼを発現する新規のヒト免疫不全ウイルス１型レポーターウイルスの使用」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９５  Ｊｕｌ；６９（７）：４５８７−９２．
Ｋａｍｏｓｈｉｄａ  Ｓ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｙ．「前立腺酸性ホスファターゼおよび前立腺特異的抗原の前立腺外局在化：総排泄腔腺上皮（ｃｌｏａｃｏｇｅｎｉｃ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）中の分布およびヒト肛門腺中の性依存性発現」、Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９０  Ｎｏｖ；２１（１１）：１１０８−１１．
Ｋｕｃｉｅｌ  Ｒ，Ｂａｋａｌｏｖａ  Ａ，Ｍａｚｕｒｋｉｅｗｉｃｚ  Ａ，Ｂｉｌｓｋａ  Ａ，Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  Ｗ．「前立腺ホスファターゼのサブユニットは活性なのか？前立腺酸性ホスファターゼの可逆的変性」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．１９９０  Ｏｃｔ；２２（２）：３２９−３４．
Ｌｅｅ  ＣＬ，Ｌｉ  ＳＳ，Ｃｈｕ  ＴＭ．「ヒト前立腺酸性ホスファターゼの免疫学的反応性を示すトリプシンフラグメント」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９８４  Ｎｏｖ  １；２２３（３）：８７１−７．
Ｌｕｃｈｔｅｒ−Ｗａｓｙｌ  Ｅ，Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  Ｗ．「ヒト前立腺酸性ホスファターゼのサブユニット構造」、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９７４  Ｏｃｔ  ９；３６５（２）：３４９−５９．
Ｍｕｎｃｈ  Ｊ，Ｓｔａｎｄｋｅｒ  Ｌ，Ｐｏｈｌｍａｎｎ  Ｓ，Ｂａｒｉｂａｕｄ  Ｆ，Ｐａｐｋａｌｌａ  Ａ，Ｒｏｓｏｒｉｕｓ  Ｏ，Ｓｔａｕｂｅｒ  Ｒ，Ｓａｓｓ  Ｇ，Ｈｅｖｅｋｅｒ  Ｎ，Ａｄｅｒｍａｎｎ  Ｋ，Ｅｓｃｈｅｒ  Ｓ，Ｋｌｕｖｅｒ  Ｅ，Ｄｏｍｓ  ＲＷ，Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ  ＷＧ，Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ  Ｆ．「濾過血液（Ｈｅｍｏｆｉｌｔｒａｔｅ）ＣＣケモカイン１［９−７４］は、ＣＣＲ５を有効に内在化し、初代Ｔ細胞およびマクロファージにおけるＲ５向性ヒト免疫不全ウイルス１型株の強力なインヒビターである」Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００２  Ａｐｒ；４６（４）：９８２−９０．
Ｎｉｌｓｓｏｎ  ＭＲ．「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアミロイド原線維形成を研究するための技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００４，３４，１５１−１６０．
Ｐａｐｋａｌｌａ  Ａ，Ｍｕｎｃｈ  Ｊ，Ｏｔｔｏ  Ｃ，Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ  Ｆ．「Ｎｅｆは、ウイルス共受容体のトロピズムと無関係にヒト免疫不全ウイルス１型の感染性および複製を増強する」Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００２  Ａｕｇ；７６（１６）：８４５５−９．
Ｐｏｈｌｍａｎｎ  Ｓ，Ｋｒｕｍｂｉｅｇｅｌ  Ｍ，Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ  Ｆ．「ヒト免疫不全ウイルス１型の初代単離物によるＢＯＢ／ＧＰＲ１５およびＢｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ３３の共受容体利用」Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．１９９９  Ｍａｙ；８０（Ｐｔ  ５）：１２４１−５１．
Ｒｉｓｌｅｙ  ＪＭ，Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ  ＲＬ．「Ｈ１核磁気共鳴分光法によって解明されたヒト前立腺酸性ホスファターゼの炭水化物部分の構造」Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８７  Ｎｏｖ  １；２５８（２）：４０４−１２．
Ｒｏｎｎｂｅｒｇ  Ｌ，Ｖｉｈｋｏ  Ｐ，Ｓａｊａｎｔｉ  Ｅ，Ｖｉｈｋｏ  Ｒ．「ゴナドトロピンが正常で受精率の低い男性へのクエン酸クロミフェン投与：血中ホルモンの変化および精液中の酸性ホスファターゼの活性化」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．１９８１  Ｊｕｎ；４（３）：３７２−８．
Ｓｃｈｉｆｆ  Ｄ，Ｃｈａｎ  Ｇ，Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ＭＪ．「神経細胞株Ｎ１１５およびＮＢＲ１０Ａにおけるビリルビン毒性」、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ．１９８５  Ｓｅｐ；１９（９）：９０８−１１．
Ｓｈａｒｉｅｆ  ＦＳ，Ｌｉ  ＳＳ．「ヒト前立腺酸性ホスファターゼ遺伝子の構造」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２  Ｍａｙ  １５；１８４（３）：１４６８−７６
Ｓｈａｗ  ＬＭ，Ｙａｎｇ  Ｎ，Ｂｒｏｏｋｓ  ＪＪ，Ｎｅａｔ  Ｍ，Ｍａｒｓｈ  Ｅ，Ｓｅａｍｏｎｄｓ  Ｂ．「前立腺酸性ホスファターゼの臓器特異性の免疫化学的評価」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９８１  Ｓｅｐ；２７（９）：１５０５−１２．
Ｖｉｈｋｏ  Ｐ，Ｋｏｎｔｔｕｒｉ  Ｍ，Ｋｏｒｈｏｎｅｎ  ＬＫ．「アフィニティクロマトグラフィおよび等電点電気泳動によるヒト前立腺酸性ホスファターゼの精製、パートＩ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９７８  Ｍａｒ；２４（３）：４６６−７０．
Ｖｉｈｋｏ  Ｐ．「アフィニティクロマトグラフィおよび等電点電気泳動によって精製した主要ヒト前立腺酸性ホスファターゼイソ酵素の特徴づけ、パートＩＩ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９７８  Ｏｃｔ；２４（１０）：１７８３−８７．
Ｖｉｈｋｏ  Ｐ，Ｋｏｓｔａｍａ  Ａ，Ｊａｎｎｅ  Ｏ，Ｓａｊａｎｔｉ  Ｅ，Ｖｉｈｋｏ  Ｒ．「ヒト血清中の前立腺特異的酸性ホスファターゼの迅速な放射免疫アッセイ」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９８０  Ｏｃｔ；２６（１１）：１５４４−７．
Ｖｉｈｋｏ  Ｐ，Ｌｕｋｋａｒｉｎｅｎ  Ｏ，Ｋｏｎｔｔｕｒｉ  Ｍ，Ｖｉｈｋｏ  Ｒ．「前立腺癌の診断および療法の追跡におけるヒト前立腺特異的酸性ホスファターゼの放射免疫アッセイの有効性」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８１  Ｍａｒ；４１（３）：１１８０−３．
Ｖｉｈｋｏ  Ｐ，Ｖｉｒｋｋｕｎｅｎ  Ｐ，Ｈｅｎｔｔｕ  Ｐ，Ｒｏｉｋｏ  Ｋ，Ｓｏｌｉｎ  Ｔ，Ｈｕｈｔａｌａ  ＭＬ．「ヒト前立腺酸性ホスファターゼをコードするｃＤＮＡの分子クローニングおよび配列分析」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８８  Ａｕｇ  ２９；２３６（２）：２７５−８１．
Ｖｉｈｋｏ  Ｐ，Ｋｕｒｋｅｌａ  Ｒ，Ｐｏｒｖａｒｉ  Ｋ，Ｈｅｒｒａｌａ  Ａ，Ｌｉｎｄｆｏｒｓ  Ａ，Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ  Ｙ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｇ．「ラット酸性ホスファターゼ：組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞による活性な分泌酵素の過剰発現、分子の性質、および結晶化」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９３  Ｆｅｂ  １；９０（３）：７９９−８０３．
Ｗａｈｅｅｄ  Ａ，Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ  ＲＬ．「培養ヒト細胞におけるリソソーム酸性ホスファターゼの生合成およびプロセシング」、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８５  Ｎｏｖ  １５；２４３（１）：２７４−８３．
Ｗａｓｙｌｅｗｓｋａ  Ｅ，Ｃｚｕｂａｋ  Ｊ，Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  ＷＳ．「ヒト前立腺酸性ホスファターゼのリンタンパク質ホスファターゼ活性」Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｐｏｌ．１９８３；３０（２）：１７５−８４．
Ｗｅｉ  Ｘ，Ｄｅｃｋｅｒ  ＪＭ，Ｌｉｕ  Ｈ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ａｒａｎｉ  ＲＢ，Ｋｉｌｂｙ  ＪＭ，Ｓａａｇ  ＭＳ，Ｗｕ  Ｘ，Ｓｈａｗ  ＧＭ，Ｋａｐｐｅｓ  ＪＣ．「融合インヒビター（Ｔ−２０）単剤療法を受けた患者における耐性ヒト免疫不全ウイルス１型の出現」、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００２  Ｊｕｎ；４６（６）：１８９６−９０５．
Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐ．「ヒトアミロイド形態およびその原線維ポリペプチドの局面」、ＦＥＢＳ  Ｊ．２００５；２７２，５９４２−５９４９．
Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ  ＷＭ，Ｆａｒｚａｎ  Ｍ，Ｊｏｙａｌ  ＪＬ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｋ，Ｂａｂｃｏｃｋ  ＧＪ，Ｉｓｒａｅｌ  ＤＩ，Ｓｏｄｒｏｓｋｉ  Ｊ，Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ  Ｔ．「β−アミロイド原線維によるエンベロープウイルス感染の刺激」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ｓｅｐ  ２０；２７７（３８）：３５０１９−２４．
Ｙａｍ  ＬＴ，Ｊａｎｃｋｉｌａ  ＡＪ，Ｌｉ  ＣＹ，Ｌａｍ  ＷＫ．「ヒト好中球中の「前立腺」酸性ホスファターゼの存在」、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｕｒｏｌ．１９８１  Ｊｕｌ；１９（１）：３４−８．
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】精液からのＳＥＶＩの精製。詳細については、実施例１および２を参照のこと。Ａ）９つの異なる緩衝液およびｐＨ条件を使用した陽イオン交換クロマトグラフィによるヒト精液のバッチ分画（プール画分Ｉ〜ＩＸ）。Ｂ）Ａ由来のプール画分７〜９を、ＲＰ−ＨＰＬＣに供し、得られた画分を、抗ウイルス活性またはプロプルス活性についてアッセイした。Ｐ４−ＣＣＲ５細胞を、ペプチドの存在下または非存在下でＨＩＶ−１  ＮＬ４−３に感染させた。ウイルス感染性を、Ｔｒｏｐｉｘ  のＧａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用した感染３日後の細胞抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定によって決定した。インレット（ｉｎｌｅｔ）中のクロマトグラムの影をつけた領域は、活性画分を示す。Ｃ）ｐＨプール７由来の画分２９〜３１を、ＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製し、得られた画分を、上記のように試験した。ＨＩＶ−１促進画分４３を、配列および質量分析を使用して分析した。記号：ｎ、非感染細胞；＋、ペプチドを添加せず。三連の感染由来の感染性の平均値（±ＳＤ）を、ペプチドの非存在下で測定した平均値（１００％）と比較して示す。Ｄ）１Ｃ由来の画分４３の質量分析および配列分析により、ＳＥＶＩフラグメントＰＡＰ  ２４８〜２８６の単離が明らかとなった。
【図２】精液由来のＳＥＶＩの精製。Ａ）ｐＨプール７をＲＰ−ＨＰＬＣに供し、得られた画分を、抗ウイルス活性またはプロウイルス活性についてアッセイした。Ｐ４−ＣＣＲ５細胞を、ペプチドの存在下または非存在下でＨＩＶ−１  ＮＬ４−３に感染させた。ウイルス感染性を、Ｔｒｏｐｉｘ  のＧａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用した感染３日後の細胞抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定によって決定した。インレット中のクロマトグラムの影をつけた領域は、活性画分を示す。Ｂ）ｐＨプール７由来の画分２９〜３１を、ＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製し、得られた画分を、上記のように試験した。ＨＩＶ−１促進画分４３を、配列および質量分析を使用して分析した。記号：ｎ、非感染細胞；＋、ペプチドを添加せず。三連の感染由来の感染性の平均値（±ＳＤ）を、ペプチドの非存在下で測定した平均値（１００％）と比較して示す。
【図３】ＳＥＶＩは原線維を形成する。ａ．ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞のＨＩＶ−１感染に及ぼす活性化合成ＳＥＶＩ、透明な上清、および溶解したペレットの影響。ｂ．一晩の震盪後のＳＥＶＩおよび対応する未処理ペプチドの電子顕微鏡写真。ｃ．活性化および非活性化ＳＥＶＩおよび５％〜９５％の両方の混合物によるＨＩＶ−１感染の増強。
【図４】活性化ＳＥＶＩペプチドは、原線維形成を示すコンゴーレッドで染色可能である。上および下のスライド：活性化沈殿ＳＥＶＩペプチド（Ａ）、非活性化可溶性ＳＥＶＩ（Ｂ）、およびアルブミン（Ｃ）の溶液を、ポリリジンコーティングしたスライドに移し、コンゴーレッドによって染色した。
【図５】活性化ＳＥＶＩペプチドは、偏光を使用した光学顕微鏡において典型的な原線維の複屈折効果（二重屈折）を示す。図４に示す同一のコンゴーレッド染色スライドを、顕微鏡法のために使用した：活性化沈殿ＳＥＶＩペプチド（Ａ）、非活性化可溶性ＳＥＶＩ（Ｂ）、およびアルブミン（Ｃ）の溶液。
【図６】活性化ＳＥＶＩペプチドは、蛍光顕微鏡法を使用して、色および強度の相違を顕著に示す。図４に示す同一のコンゴーレッド染色スライドを、顕微鏡法のために使用した：活性化沈殿ＳＥＶＩペプチド（Ａ）、非活性化可溶性ＳＥＶＩ（Ｂ）、およびアルブミン（Ｃ）の溶液。
【図７】いくつかの合成ＰＡＰフラグメントが、ＨＩＶ−１感染を刺激する。Ａ）凍結乾燥ペプチドを、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭに再懸濁し、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、１，４００ｒｐｍにて３７℃で２０時間インキュベーションした。４，０００個のＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、異なる濃度のＰＡＰフラグメントまたはコントロールペプチド（ｃ１〜ｃ３）とインキュベーションし、３０ｐｇのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３のｐ２４抗原で感染させ、総体積を１００μｌとした。２０時間後、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ウイルス感染を検出した。三連の感染由来の感染度の平均値（±ＳＤ）を、ペプチドの非存在下で測定した平均値（１００％）と比較して示す。Ｂ）分析したペプチド配列を示す。
【図８】ＨＩＶ−１感染に対するＳＥＶＩの刺激効果は、細胞型と無関係である。２０００個の接着ＴＺＭ−ｂｌ細胞またはＰ４−ＣＣＲ５細胞および５０００個のＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７懸濁細胞を、５０μｌの体積で播種した。翌日、１０μｌ  ＳＥＶＩ希釈物を添加し、細胞を１ｎｇのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３のｐ２４抗原で感染させて総体積を１００μｌとした。感染２日後、ＴＺＭ−ｂｌ細胞またはＰ４−ＣＣＲ５細胞のウイルス感染性を、Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用して検出し、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞のウイルス感染性をルシフェラーゼアッセイ試験を使用して検出した。三連の感染由来の感染の平均値を、ペプチドの非存在下で測定した平均値（１００％）と比較して示す。
【図９】ＳＥＶＩは、細胞生存度または内因性ＬＴＲ活性に影響を及ぼさない。Ａ）細胞傷害性アッセイ：４０００個のＴＺＭ−ｂｌ細胞を、１００μｌの体積で９６ウェル平底プレートに播種し、翌日、培地を９０μｌの新鮮な培地と置換し、ＳＥＶＩ希釈物を添加し、最終体積を１００μｌとした。３日後、１０μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液を添加し、細胞を、３７℃で４時間インキュベーションした。その後、凍結結晶を、１：１  エタノール／ＤＭＳＯに溶解し、５６０／６５０ｎｍのＯＤを測定した。六連のサンプル由来のＯＤの平均値±ＳＤを、ペプチドの非存在下で測定した平均値（１００％）と比較して示す。Ｂ）内因性ＬＴＲ活性：ペプチドとの３日間のインキュベーション後、Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用して、内因性ＬＴＲ活性を測定した。６サンプル由来のβ−ガラクトシダーゼ活性の中央値±ＳＤを示す。ＲＬＵ／ｓ：相対光単位／秒。
【図１０】ＰＡＰ由来ペプチドは、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞のＨＩＶ−１感染を劇的に増強する。５０μｌ  ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）中に播種したＬＴＲ−ｌｕｃおよびＬＴＲ−ＧＦＰをコードする２０，０００個のＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞を、１０μｌのペプチド希釈物とインキュベーションし、０．３ｎｇのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３のｐ２４抗原で感染させ、総体積を１００μｌとした。２日後に、ＵＶ顕微鏡法の実施（Ａ）または細胞溶解物のルシフェラーゼ活性の測定（Ｂ）によってウイルス感染率を検出した。  ＲＬＵ／ｓ：相対光単位／秒。
【図１１】ＳＥＶＩは、共受容体向性と無関係に、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１感染を増強する。５×１０5個のＰＨＡ／ＩＬ−２刺激末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、５０μｌ  ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２）中に播種した。１０μｌのペプチド希釈物を添加し、細胞を、１０、１、および０．１ｎｇのＲ５向性ＨＩＶ−１  ００５−ｐｆ−１０３（Ａ）（Ｐａｐｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）およびＸ４向性ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３  Ｌｕｃ（Ｂ）のｐ２４抗原で感染させ、総体積を１００μｌとした。感染３日後、細胞をペレット化し、３０μｌルシフェラーゼ溶解緩衝液で溶解した。２０μｌの溶解物および１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を検出した。ＲＬＵ／ｓ：相対光単位／秒。
【図１２】ＳＥＶＩは、マクロファージのＨＩＶ−１感染を促進する。５×１０5ＰＢＭＣを、５００μｌ  ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ）を含む４８ウェルディッシュに播種した。５日後、非接着細胞を慎重に洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦを含む４００μｌの新鮮な培地を添加した。２日後に培地を除去し、１３０μｌの新鮮な培地および２０μｌのペプチドを細胞に添加し、次いで、表示量のＸ４向性ＮＬ４−３  Ｌｕｃ（Ａ）およびＲ５向性００５ｐｆ１０３  Ｌｕｃ（Ｂ）で感染させ、総体積を２００μｌとした。３日後、ルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、ウイルス感染を検出した。三連の実験からデータを得、これを、平均値＋／−ＳＤ．ＲＬＵ／ｓ：相対光単位／秒で示す。
【図１３】ＳＥＶＩはＨＩＶ−１の増殖感染の閾値を低下させる。Ａ）前日に播種した４，０００個のＴＺＭ−ｂｌ細胞を、５０μｌ  ＤＭＥＭ、１０μｌのペプチド希釈物中でインキュベートし、総体積１００μｌにてＨＩＶ−１  ＮＬ４−３（Ｘ４）およびＨＩＶ−１  ＮＬ４−３  ＹＵ−２（Ｒ５）で感染させた（Ｐａｐｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。０．６ｐｇおよび０．１ｐｇのｐ２４抗原は、４０μｌの１５，６２５または７８，１２５倍希釈ウイルスストック溶液に相当する。Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用して、３日後にウイルス感染を検出した。三連の感染由来の中央値＋／−ＳＤを示す。ｎ、非感染細胞；ＲＬＵ／ｓ：相対光単位／秒。Ｂ）５×１０５ＰＨＡ／ＩＬ−２刺激ＰＢＭＣを、９６  ウェルディッシュ（５０μｌ；１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２）に播種し、１０μｌの２０μｇ／ｍｌストック溶液を添加し、次いで、表示のｐ２４抗原量のＮＬ４−３で感染させ、最終体積を１００μｌとした（最終ＳＥＶＩ濃度：２μｇ／ｍｌ）。感染１日後、細胞をペレット化してペプチドおよびウイルスを除去し、ＳＥＶＩを含まない２００μｌ  ＲＰＭＩ（２０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２）に再懸濁した。規定の時点で上清を回収し、新たな培地を添加した。ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して、ウイルス複製をアッセイした。値を、二連の感染の中央値で示す。
【図１４】ＳＥＶＩ媒介されたＨＩＶ−１感染の増加は絶対ウイルス感染性と相関する。１０μｌのＳＥＶＩ希釈物を４０００  ＴＺＭ−ｂｌ細胞（５０μｌ）に添加した。漸減濃度のＸ４向性ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３およびＲ５向性ＨＩＶ−１  ＹＵ２のｐ２４で感染させ、総体積を１００μｌとした。感染２日後、ウイルス感染性を、Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用して測定した。ペプチドを含まない各ウイルス希釈の三連の感染由来の絶対β−ガラクトシダーゼ活性（ＲＬＵ／ｓ）の中央値（ｘ軸）およびペプチドを含まない各コントロール感染と比較した１０μｇ／ｍｌ  ＳＥＶＩの存在下でのウイルス感染のｘ倍増加（ｙ軸）を示す。
【図１５】ＳＥＶＩは、Ｘ４、Ｒ５、および二重向性ＨＩＶ−１変異形、およびいくつかの分子ＨＩＶ−１クローンの感染を増強する。ペプチド希釈物を、１０μｌの体積で、前日に播種した５０μｌのＴＺＭ−ｂｌ細胞に添加した。ＮＬ４−３  Ｖ３組換えウイルス（Ｐａｐｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．；２００２）および分子ＨＩＶクローンを使用した感染を、約０．０１〜０．００１のＭＯＩを使用して行い、総体積を１００μｌとした。Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用して、ウイルス感染を測定した。三連の感染由来の感染性の平均値を、ペプチドの非存在下で測定した平均値（１００％）と比較して示す。
【図１６】ＳＥＶＩは、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ媒介細胞−細胞融合に影響を及ぼさない。ＳＩＶ−ＴａｔおよびＮＬ４−３  Ｅｎｖをコードする発現プラスミドでトランスフェクションした２９３Ｔ細胞を、９６ウェルディッシュに播種し、異なる濃度のＳＥＶＩとインキュベーションし、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞と同時培養し、総体積を１００μｌとした。１日後、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性の測定によってＨＩＶ−１  Ｅｎｖ媒介癒合率を検出した。三連の感染由来の中央値＋／−ＳＤを示す。ＲＬＵ／ｓ：相対光単位／秒。
【図１７】ＳＥＶＩはＨＩＶ−１粒子と相互作用し、細胞へのその結合を増強する。Ａ）ＳＥＶＩのＨＩＶ−１との相互作用。ＳＥＶＩを、少容量のウイルスストックとプレインキュベーションし、その後に細胞に添加するか（□）、ＳＥＶＩおよびＨＩＶ−１ストックを細胞に個別に添加した（■）。ウイルスストックとのインキュベーション中のＳＥＶＩ濃度を、左のパネルに示し、総細胞培養物に関連する濃度を右のパネルに示す。Ｂ）ＳＥＶＩは、細胞への野生型およびＥｎｖ欠損ウイルス粒子の結合を増強する。ｕ、非感染細胞。データを、平均値±  ｓ．ｄ．（ｎ＝３）で示す。
【図１８】ＳＥＶＩ含有ペプチド画分は、ＨＩＶ−１感染を促進する。精液由来のペプチド／タンパク質混合物を、単一の逆相クロマトグラフィによって分離した。ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３でのでのＴＺＭ−ｂｌ細胞の感染を、元の精液中に存在する濃度に相当するペプチド濃度（１ｍｌ精子等価物／ｍｌ）およびその５倍希釈物で行った。感染２日後の２つの代表的な精子ドナー由来のタンパク質／タンパク質画分の存在下での三連の感染から得た平均値（±ＳＤ）を、ペプチドを含まない感染（１００％）と比較して示す。コントロールサンプル中のＮＬ４−３感染の絶対感染は、約７０，０００  ＲＬＵ／であった。
【図１９】ＳＥＶＩは、ＨＩＶ−２およびＳＩＶの感染を好む。ＴＺＭ−ｂｌ細胞を、表示の量のＳＥＶＩの存在下で、２０および２μｌのＨＩＶ−２  ＲＯＤ１０（Ａ）または２０μｌのＳＩＶａｇｍｔａｎ１もしくはＳＩＶｍａｃ２３９（Ｂ）で感染させた。２日後、Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ａｓｓａｙを使用して感染性を決定した。感染２日後に、ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７におけるＳＩＶｃｐｚｔａｎ１感染性に及ぼすＳＥＶＩの影響を決定した（Ｃ）。角括弧内の値は、三連の実験由来のペプチドを含まないコントロールサンプル（０）の絶対感染率の中央値をＲＬＵ／ｓで示す。丸括弧内の数字は、ペプチドを含まないコントロールサンプル中の絶対レポーター酵素活性をＲＬＵ／ｓで示す。
【図２０】ＳＥＶＩは、マウス白血病ウイルスの感染を好む。Ａ）ＭｕＬＶ  ｅｎｖ  を発現する複製コンピテントＨＩＶ（ＭｕＬＶ−ＨＩＶ）またはＳＩＶ（ＭｕＬＶ−ＳＩＶ）に及ぼすＳＥＶＩの影響。１０μｌ  ＳＥＶＩ溶液を、５０μｌ  ＣＥＭＸ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞に添加し、その後、４０μｌの２９３Ｔトランスフェクション由来のウイルスストックで感染させた。感染２日後に、ルシフェラーゼアッセイキットを使用して、感染性を決定した。Ｂ）ＭｕＬＶ  Ｅｎｖ  でシュードタイピングしたＭｕＬＶ粒子に及ぼすＳＥＶＩの影響。ｅｎｖ欠損ルシフェラーゼ発現プロウイルスＭＬＶ  ＤＮＡ（ｐＧＣ−ｓａｍ−ＥＮ−Ｌｕｃ３；Ｏｌｉｖｅｒ  Ｗｉｌｄｎｅｒ，Ｂｏｃｈｕｍから提供）およびＭＬＶ  ｅｎｖ発現プラスミドでの２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションによってウイルスストックを生成した。標的細胞（ＨＵＨ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＰＭ１）を、５０μｌの体積で播種し、１０μｌのペプチドを添加した。その後、細胞を、４０μｌの非希釈ウイルスストックまたは１０倍希釈のウイルスストックで感染させた。感染２日後および３日後に、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を検出した。２つの独立した実験由来の各細胞株について得た中央値＋／−ＳＤで示す。
【図２１】ＳＥＶＩは、ＶＳＶ−Ｇおよびエボラ糖タンパク質保有ＨＩＶの感染を増強する。偽型産生のために、２９３Ｔ細胞を、ｅｎｖインタクト（Ｅ＋）またはｅｎｖ欠損（Ｅ＊）ルシフェラーゼ発現ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ  ｐＢＲＮＬ４−３−Ｌｕｃと共に、等量のエボラ糖タンパク質をコードする発現プラスミドＥＢＯＶ−ＧＰまたはＶＳＶのＧタンパク質をコードするｐＨＩＴ−ＶＳＶ−Ｇと同時トランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後に細胞培養物の上清を採取し、孔サイズが０．４μｍのフィルターに通し、等分し、−８０℃で保存した。Ａ）ＴＺＭ−ｂｌ細胞を、表示量の原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６）の存在下で、０．５または０．０５μｌのＶＳＶ−ＧシュードタイピングＥ＋およびＥ＊  ＨＩＶ−Ｌｕｃで感染させた。感染２日後にＧａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを使用して感染率を決定した。Ｂ）エボラｇｐシュードタイピング粒子に及ぼすＳＥＶＩの影響。２９３Ｔ細胞を、３×１０4／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、３７°Ｃにてｏ／ｎでインキュベーションした。感染前に、細胞から培地を完全に除去し、２倍濃縮したペプチド（原線維ＰＡＰ（２４８〜２８６）を含む５０μｌ培地と置換した。ペプチド添加直後に、エボラシュードタイピングウイルスの５０μｌ連続希釈物（１：非希釈；１０：１０倍希釈；５０：５０倍希釈）で感染した。感染１２時間後、培地を置換し、形質導入から７２時間後に製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）によって推奨されるように市販のキットを使用してルシフェラーゼ活性を決定した。
【図１】
2009524420.tif 000006
【図２】
2009524420.tif 000007
【図３】
2009524420.tif 000008
【図４】
2009524420.tif 000009
【図５】
2009524420.tif 000010
【図６】
2009524420.tif 000011
【図７】
2009524420.tif 000012
【図８】
2009524420.tif 000013
【図９】
2009524420.tif 000014
【図１０】
2009524420.tif 000015
【図１１】
2009524420.tif 000016
【図１２】
2009524420.tif 000017
【図１３】
2009524420.tif 000018
【図１４】
2009524420.tif 000019
【図１５】
2009524420.tif 000020
【図１６】
2009524420.tif 000021
【図１７】
2009524420.tif 000022
【図１８】
2009524420.tif 000023
【図１９】
2009524420.tif 000024
【図２０】
2009524420.tif 000025
【図２１】
2009524420.tif 000026
【国際調査報告】
2009524420.tif 000027
2009524420.tif 000028
2009524420.tif 000029
2009524420.tif 000030
2009524420.tif 000031
2009524420.tif 000032