(57)【要約】本発明は、癌を検出および診断するための方法を提供する。ある態様によれば、この診断方法は、癌細胞と正常細胞とを識別することが見出されたRASGEF1A遺伝子の発現レベルの決定を含む。さらに、本発明は、癌の治療において有用な治療物質をスクリーニングする方法、癌を治療するための方法、および癌に対して対象にワクチン接種するための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌または癌を発症する素因を診断するための方法であって、対象に由来する生物試料におけるRASGEF1A遺伝子の発現レベルを決定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該発現レベルが上昇している場合、該対象は癌に罹患しているか、または癌を発症するリスクがあることが示唆される、方法。
【請求項２】
発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10％高い、請求項1記載の方法。
【請求項３】
発現レベルが、以下からなる群より選択される方法のいずれかによって決定される、請求項1記載の方法：
(a)RASGEF1A遺伝子のmRNAを検出する段階；
(b)RASGEF1A遺伝子によってコードされるタンパク質を検出する段階；および
(c)RASGEF1A遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性を検出する段階。
【請求項４】
対象に由来する生物試料が上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
対象に由来する生物試料が癌細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
対象に由来する生物試料が癌上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
癌が、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
RASGEF1A遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する検出試薬を含むキット。
【請求項９】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法：
(a)試験物質を、RASGEF1Aポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
(b)該ポリペプチドと該試験物質との結合を検出する段階；および
(c)該ポリペプチドに結合する試験物質を選択する段階。
【請求項１０】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法：
(a)試験物質を、RASGEF1Aポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
(b)該ポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
(c)該試験物質の非存在下で検出される生物活性と比較して、該ポリペプチドの生物活性を抑制する試験物質を選択する段階。
【請求項１１】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法：
(a)試験物質の存在下で、RASGEF1Aポリペプチドまたはその断片をRASと接触させる段階；
(b)RAS活性を検出する段階；および
(c)該試験物質の非存在下で検出される活性と比較して、該RAS活性を低下させる試験物質を選択する段階。
【請求項１２】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法：
(a)試験物質を、RASGEF1A遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
(b)該RASGEF1A遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
(c)該試験物質の非存在下で検出されるレベルと比較して、該遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質を選択する段階。
【請求項１３】
細胞が、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、または精上皮腫に由来する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
以下の段階を含む、癌を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法：
(a)試験物質を、RASGEF1A遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階；
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
(c)該試験物質の非存在下で検出される発現または活性と比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低減させる試験物質を選択する段階。
【請求項１５】
癌が、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫からなる群より選択される、請求項9〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
活性成分として、請求項9〜15記載のいずれか一項記載の方法によって選択された薬学的有効量の作用物質および薬学的に許容される担体を含む、癌を治療または予防するための組成物。
【請求項１７】
RASGEF1A遺伝子によってコードされるポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたはsiRNAの薬学的有効量を含む、癌を治療または予防するための組成物。
【請求項１８】
siRNAが、SEQ ID NO：9または13のヌクレオチド配列を含むRASGEF1A遺伝子のセンス鎖を含む、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
siRNAが、一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有し、式中[A]は、SEQ ID NO：9または13の配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は、3〜23個のヌクレオチドからなるリボヌクレオチドループ配列であり、かつ[A']は、[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
RASGEF1Aポリペプチドに結合する抗体またはその断片の薬学的有効量を含む、癌を治療または予防するための組成物。
【請求項２１】
癌が、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫からなる群より選択される、請求項16〜20のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２】
請求項9〜15のいずれか一項記載の方法によって得られた物質を投与する段階を含む、対象において癌を治療または予防するための方法。
【請求項２３】
請求項16〜20のいずれか一項記載の組成物を対象に投与する段階を含む、対象において癌を治療または予防するための方法。
【請求項２４】
RASGEF1Aポリペプチドに結合する抗体またはその免疫学的活性断片の薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象において癌を治療または予防するための方法。
【請求項２５】
以下を含むワクチンを対象に投与する段階を含む、対象において癌を治療または予防するための方法：(a)RASGEF1Aポリペプチド、(b)該ポリペプチドの免疫学的活性断片、または(c)該ポリペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
RASGEF1Aポリペプチドもしくはその断片、該ポリペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターと、APCを接触させる段階を含む、抗腫瘍免疫を誘導するための方法。
【請求項２７】
APCを対象に投与する段階をさらに含む、請求項26記載の抗腫瘍免疫を誘導するための方法。
【請求項２８】
癌が、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫からなる群より選択される、請求項22〜27のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、癌を検出および診断するための方法、ならびに癌を治療および予防するための方法に関する。
【０００２】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、2005年7月28日に出願された米国特許仮出願第60/704,054号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
肝内胆管癌(ICC)は、原発性肝胆道癌の2番目に多いタイプである。その発病率は日本および西洋諸国、特に英国で増加しつつある(Shaib YH et al., J Hepatol 2004, 40：472-7；Taylor-Robinson SD et al., Lancet 1997, 350：1142-3；Kato I et al., Jpn J Clin Oncol 1990, 20：232-7)。最も一般的な肝臓悪性腫瘍である肝細胞癌は徹底的に研究され、様々な治療戦略の開発を通して、臨床的な進歩が実現された。しかしながら、ICCに関与している発癌プロセスは十分に理解されておらず、ICC患者の予後は不良なままである。治療の面では、腫瘍の外科的切除がこの疾患を克服するほぼ唯一の方法である(Okuda K et al., J Gastroenterol Hepatol 2002, 17：1056-63)が、進行した浸潤性ICCに罹患している患者から完全に癌細胞を除去することは、ほとんど不可能である。さらに、ICCに対する化学療法もまた、満足できるものではない。例えば、5-フルオロウラシルおよびゲムシタビンに基づいた治療計画の部分奏功率は20〜30％であるが、生存利益は示されていない(Gores GJ, Hepatology 2003, 37：961-9)。したがって、ICCに対する新規な治療法の開発は、切迫した問題である。
【０００４】
GTPアーゼのRasファミリーは、細胞表面受容体からのシグナルを統合し、かつ下流のエフェクター経路に伝達する際に重要な役割を果たしている。Rasタンパク質は、休止細胞においては主に不活性なGDP結合状態で存在する。これらは相互に変換可能であり、活性なGTP結合型と不活性なGDP結合型を行き来する(Hall A, Annu.Rev Cell Biol 1994, 10：31-54)。これらの活性は、GDP/GTP交換を刺激する調節タンパク質(GEFタンパク質)およびGTP加水分解を刺激する調節タンパク質(GAPタンパク質)との相互作用によって調整される。細胞外刺激によって活性化されると、グアニンヌクレオチド交換因子(GEF)はRasからのGDP遊離を促進して、GTPがRasと結合することが可能になる。このGTP結合Rasは、活性な立体構造を形成し、Raf、ホスホイノシチド3-キナーゼ、およびRalGDSなど下流のエフェクタータンパク質にシグナルを取り次ぐ(Campbell SL et al., Oncogene 1998, 17：1395-413；Quilliam LA et al., Bioessays 1995, 17：395-404)。いくつかのRasファミリーGTPアーゼが同定されたが、活性が明らかにされているRas GEFの数は限られており、例えばRasに対するSos、GRF、およびGRP、Rap1に対するC3G、CalDAG1、およびEpac、ならびにRalに対するRalGDSファミリーメンバーである(Quilliam LA et al., Bioessays 1995, 17：395-404；Bos JL, EMBO J 1998, 17：6776-82；de Rooij J et al., Nature 1998, 396：474-7；Ebinu JO et al., Science 1998, 280：1082-6；Gotoh T et al., J Biol Chem 1997, 272：18602-7；Kawasaki H et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95：13278-83)。
【０００５】
cDNAマイクロアレイ解析によって作製された遺伝子発現プロファイルは、従来の組織病理学的方法よりも個々の癌の性質に関してかなり詳細な内容を提供することができる。このような情報の有望な点は、新生物疾患を治療するための臨床的戦略を改善し、かつ新規な薬物を開発するためのその可能性にある(Petricoin EF et al., Nat Genet 2002, 32 Suppl：474-9)。この目的のために、本発明者らは、様々な組織由来の腫瘍の発現プロファイルをcDNAマイクロアレイによって解析した(Okabe H et al., Cancer Res 2001, 61：2129-37；Hasegawa S et al., Cancer Res 2002, 62：7012-7；Kaneta Y et al., Jpn J Cancer Res 2002, 93：849-56；Kaneta, Y. et al., Int J Oncol 2003, 23：681-91；Kitahara O et al., Cancer Res 2001, 61：3544-9；Lin Y et al. Oncogene 2002, 21：4120-8；Nagayama S et al., Cancer Res 2002, 62：5859-66；Okutsu J et al., Mol Cancer Ther 2002, 1：1035-42；Kikuchi T et al., Oncogene 2003, 22：2192-205)。
【０００６】
発癌のメカニズムを明らかにするように設計された研究により、ある種の抗腫瘍物質に対する分子標識の同定は既に容易になっている。例えば、翻訳後のファルネシル化に活性化が依存しているRasに関連した増殖シグナル伝達経路を阻害するために当初開発された、ファルネシルトランスフェラーゼの阻害物質(FTI)は、動物モデルにおいてRas依存性腫瘍を治療する際に効果的であることが示された(Sun J et al., Oncogene 1998, 16(11)：1467-73)。同様に、プロトオンコジーン受容体HER2/neuに拮抗することを目的に、抗腫瘍物質および抗HER2モノクローナル抗体であるトラスツズマブの組み合わせを用いたヒト臨床試験でも、癌患者の臨床反応および全生存率の改善が実現した(Molina MA et al., Cancer Res 2001；61(12)：4744-9)。最後に、bcr-ablチロシンキナーゼの構成的活性化が白血球の形質転換において非常に重要な役割を果たしている慢性骨髄性白血病を治療するために、bcr-abl融合タンパク質を選択的に不活性化するチロシンキナーゼ阻害剤STI-571が開発された。これらの種類の薬剤は、特定の遺伝子産物の発癌活性を抑制するように設計されている(O'Dwyer MEおよびDruker BJ, Curr Opin Oncol 2000；12(6)：594-7)。したがって、癌細胞において一般に上方制御されている遺伝子産物が、新規な抗腫瘍物質を開発するための潜在的な標的として役立つ可能性があることは明らかである。
【０００７】
CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTL)が、MHCクラスI分子上に提示される腫瘍関連抗原(TAA)由来のエピトープペプチドを認識し、かつ腫瘍細胞を溶解することがさらに実証された。TAAの最初の例としてMAGEファミリーが発見されて以来、他の多くのTAAが免疫学的アプローチを用いて発見された(Boon, Int J Cancer 1993, 54：177-80；Boon & van der Bruggen, J Exp Med 1996, 183：725-9；van der Bruggen et al., Science 1991, 254：1643-7；Brichard et al., J Exp Med 1993, 178：489-95；Kawakami et al., J Exp Med 1994, 180：347-52)。新しく発見されたTAAのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発にかけられている。これまでに発見されたTAAには、MAGE(van der Bruggen et al., Science 1991, 254：1643-7)、gp100(Kawakami et al., J Exp Med 1994, 180：347-52)、SART(Shichijo et al., J Exp Med 1998, 187：277-88)、およびNY-ESO-1(Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94：1914-8)が含まれる。その一方で、腫瘍細胞において特異的に過剰発現されることが実証された遺伝子産物は、細胞性免疫応答を誘導する標的として認識されることが示された。このような遺伝子産物には、p53(Umano et al., Brit J Cancer 2001, 84：1052-7)、HER2/neu(Tanaka et al., Brit J Cancer 2001, 84：94-9)、CEA(Nukaya et al., Int J Cancer 1999, 80：92-7)などが含まれる。
【０００８】
TAAに関する基礎的かつ臨床的な研究は著しく進歩しているにも関わらず(Rosenberg et al., Nature Med 1998, 4：321-7；Mukherji et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92：8078-82；Hu et al., Cancer Res 1996, 56：2479-83)、結腸直腸癌を含む腺癌の治療用には、限られた数の候補TAAしか現在は利用できない。癌細胞において大量に発現され、さらに癌細胞に発現が限られているTAAは、免疫療法の標的として有望な候補であろう。さらに、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する新しいTAAが同定されれば、様々なタイプの癌に対するペプチドワクチン接種法の臨床使用が後押しされると予想される(Boon et al., J Exp Med 1996, 183：725-9；van der Bruggen et al., Science 1991, 254：1643-7；Brichard et al., J Exp Med 1993, 178：489-95；Kawakami et al., J Exp Med 1994, 180：347-52；Shichijo et al., J Exp Med 1998, 187：277-88；Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94：1914-8；Harris, J Natl Cancer Inst 1996, 88：1442-55；Butterfield et al., Cancer Res 1999, 59：3134-42；Vissers et al., Cancer Res 1999, 59：5554-9；van der Burg et al., J Immunol 1996, 156：3308-14；Tanaka et al., Cancer Res 1997, 57：4465-8；Fujie et al., Int J Cancer 1999, 80：169-72；Kikuchi et al., Int J Cancer 1999, 81：459-66；Oiso et al., Int J Cancer 1999, 81：387-94)。
【０００９】
ある健常ドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)はペプチドに刺激されると、ペプチドに反応して有意なレベルのIFN-αを産生するが、51Cr放出アッセイ法ではHLA-A24またはHLA-A0201に拘束的な様式で腫瘍細胞に対して細胞傷害性を及ぼすことはまれであることが繰り返し報告されている(Kawano et al., Cancer Res 2000, 60：3550-8；Nishizaka et al., Cancer Res 2000, 60：4830-7；Tamura et al., Jpn J Cancer Res 2001, 92：762-7)。しかしながら、HLA-A24およびHLA-A0201はどちらも日本人集団ならびに白人集団に多いHLAアレルである(Date et al., Tissue Antigens 1996, 47：93-101；Kondo et al., J Immunol 1995, 155：4307-12；Kubo et al., J Immunol 1994, 152：3913-24；Imanishi et al., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1992, 1065；Williams et al., Tissue Antigen 1997, 49：129)。したがって、これらのHLAによって提示される癌の抗原ペプチドは、日本人および白人の癌の治療に特に有用な可能性がある。さらに、インビトロでの低親和性CTLの誘導は、通常ペプチドを高濃度で用いて、抗原提示細胞(APC)上にこれらのCTLを効果的に活性化する特異的ペプチド/MHC複合体を高レベルに生成させることによって起こることが公知である(Alexander-Miller et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93：4102-7)。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、癌細胞におけるRASGEF1A遺伝子の特異的発現パターンの発見に基づいている。
【００１１】
25例のICCにおける遺伝子のゲノム全域の発現プロファイルに関する以前の解析により、発現が通常上方制御されている1セットの遺伝子が同定された(Obama K et al., Hepatology 2005 Jun, 41(6)：1339-48)。本明細書においては、これらの遺伝子のうち、遺伝子RASGEF1A(RasGEFドメインファミリー、メンバー1A)に焦点をあわせる。RASGEF1A遺伝子の発現は、膀胱癌において亢進されており(PCT/JP2006/302684)、かつ乳癌においては抑制されている(WO 2005/28678)ことが、本発明者らによって検出された。本発明を通じて、RASGEF1A遺伝子は、肝内胆管癌(ICC)、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫を含む広範囲のヒト腫瘍において、頻繁に上方制御されていることもさらに明らかにされた。さらに、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、RAS活性を増強することも発見された。さらに、低分子干渉RNA(siRNA)によるRASGEF1A遺伝子の抑制が、ICC細胞の増殖抑制および/または細胞死をもたらすことから、この遺伝子が様々なタイプのヒト新生物に対する新規な治療標的として役立つ可能性がある。
【００１２】
本明細書において同定されるRASGEF1A遺伝子ならびにその転写産物および翻訳産物は、癌に対するマーカーとして、および癌遺伝子標的として診断に有用であり、これらの発現および/または活性を変更して、癌の症状を治療または緩和することができる。同様に、ある化合物に起因するRASGEF1A遺伝子発現の変化を検出することによって、癌を治療または予防するための作用物質として様々な化合物を同定することもできる。
【００１３】
したがって本発明は、組織試料のような対象由来の生物試料におけるRASGEF1A遺伝子の発現レベルを決定することにより、対象における癌に対する素因を診断または決定するための方法を提供する。この遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合、その対象は癌に罹患しているか、または癌を発症するリスクがあることが示唆される。正常対照レベルは、非癌組織から得た正常細胞を用いて決定することができる。
【００１４】
本発明において、好ましい癌はICCである。
【００１５】
本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照試料において検出されるRASGEF1A遺伝子の発現レベルを意味し、かつ正常対照レベルおよび癌対照レベルの両方を含む。対照レベルは、単一の参照集団に由来する単一の発現パターンまたは複数の発現パターンでよい。例えば、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースでよい。「正常対照レベル」とは、正常な健常個体において、または癌に罹患していないことが公知である個体集団において検出されるRASGEF1A遺伝子の発現レベルを意味する。正常な個体とは、癌の臨床症状が無い個体である。これに対して、「癌対照レベル」とは、癌に罹患している個体または集団において認められるRASGEF1A遺伝子の発現レベルを意味する。
【００１６】
試料中で検出されるRASGEF1A遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合、(その試料を得た)対象は癌に罹患しているか、または癌のリスクがあることが示唆される。
【００１７】
または、試料中のRASGEF1A遺伝子を含む遺伝子パネルの発現レベルを、同じ遺伝子パネルの癌対照レベルと比較することもできる。ある試料の発現レベルと癌対照レベルが類似している場合、(その試料を得た)対象は癌に罹患しているか、または癌のリスクがあることが示唆される。
【００１８】
本明細書において、例えば対照レベルと比較して、10％、25％、もしくは50％、または少なくとも0.1倍、少なくとも0.2倍、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、もしくは少なくとも10倍、もしくはそれ以上、遺伝子発現が増加または減少している場合、遺伝子発現レベルは「変更されている」とみなされる。RASGEF1A遺伝子の発現レベルは、例えば試料中の遺伝子転写物に対する核酸プローブのハイブリダイゼーション強度を検出することによって決定することができる。
【００１９】
本発明の文脈において、対象由来の組織試料は、試験対象、例えば癌を有することが公知であるか、または癌を有すると推測される患者から得られる任意の組織でよい。例えば、組織は上皮細胞を含んでよい。より具体的には、組織は癌上皮細胞でよい。
【００２０】
本発明はさらに、RASGEF1Aを発現する試験細胞を試験化合物と接触させ、かつRASGEF1A遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性を決定することによる、RASGEF1Aの発現もしくは活性を阻害または増強する化合物を同定するための方法を提供する。試験細胞は、癌上皮細胞のような上皮細胞でよい。試験化合物の非存在下で、対照レベルと比較して遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性が減少している場合、この試験化合物は癌の症状を軽減するのに使用され得ることが示唆される。
【００２１】
本発明はまた、RASGEF1A遺伝子の転写産物または翻訳産物に結合する少なくとも1種の検出試薬を含むキットも提供する。
【００２２】
本発明の治療方法には、アンチセンス組成物を対象に投与する段階を含む、対象において癌を治療または予防するための方法が含まれる。本発明の文脈において、アンチセンス組成物は、特定の標的遺伝子(すなわちRASGEF1A遺伝子)の発現を減少させる。例えば、アンチセンス組成物は、RASGEF1A遺伝子配列に相補的なヌクレオチドを含み得る。または、本発明の方法は、対象にsiRNA組成物を投与する段階を含み得る。本発明の文脈において、siRNA組成物は、RASGEF1A遺伝子の発現を減少させる。さらに別の方法において、対象における癌の治療または予防は、リボザイム組成物を対象に投与することによって実施され得る。本発明の文脈において、核酸に特異的なリボザイム組成物は、RASGEF1A遺伝子の発現を減少させる。実際に本発明者らは、RASGEF1A遺伝子に対するsiRNAの阻害効果を確認した。例えば、siRNAによる癌細胞の細胞増殖の阻害は、実施例のセクションにおいて実証され、これはRASGEF1A遺伝子が癌に対する好ましい治療標的として役立つという事実を支持する。
【００２３】
本発明はまた、ワクチンおよびワクチン接種方法も含む。例えば、対象において癌を治療または予防するための方法は、RASGEF1A遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはそのポリペプチドの免疫学的活性断片を含むワクチンを、その対象に投与する段階を含み得る。本発明の文脈において、免疫学的活性断片は、完全長の天然タンパク質より長さが短いが、完全長タンパク質によって誘導される免疫応答に類似した免疫応答を誘導するポリペプチドである。例えば、免疫学的活性断片は、少なくとも8アミノ酸残基の長さがあり、かつT細胞またはB細胞などの免疫細胞を刺激することができるべきである。免疫細胞の刺激は、細胞増殖、サイトカイン(例えばIL-2)の生成、または抗体産生を検出することによって測定することができる。
【００２４】
本明細書において説明する方法の1つの利点は、癌の顕性の臨床症状を検出する前に、疾患が同定されることである。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【００２５】
発明の詳細な説明
本明細書において使用される単語「a」、「an」、および「the」は、別段の具体的な指示が無い限り、「少なくとも1つ」を意味する。
【００２６】
ある物質(例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドなど)に関して使用される「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然の供給源においてそれ以外に含まれ得る少なくとも1種の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製された抗体とは、タンパク質(抗体)が由来する細胞もしくは組織供給源由来の糖質、脂質、もしくは他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合は、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない抗体を意味する。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、そこからポリペプチドが単離されるかまたは組換えにより作製される細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチドの調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドには、(乾燥重量で)約30％、20％、10％、または5％未満の異種タンパク質(本明細書においては「混入タンパク質」とも呼ばれる)を有するポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが組換えによって作製される場合も同様に、好ましくは培地を実質的に含まず、培地がタンパク質調製物の体積の約20％、10％、または5％未満であるポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、好ましくは化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質または他の化学物質が、タンパク質調製物の体積の(乾燥重量で)約30％、20％、10％、または5％未満であるポリペプチド調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が単離または精製されたポリペプチドを含むことは、例えばそのタンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色などに続く、シングルバンドの出現によって示すことができる。好ましい態様において、本発明の抗体は、単離または精製される。
【００２７】
cDNA分子などの「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技術によって作製された場合、他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含み得ない。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離または精製される。
【００２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、1つもしくは複数のアミノ酸残基が、修飾残基または対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣体などの非天然の残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマーに適用される。
【００２９】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を意味する。天然アミノ酸は、遺伝コードによってコードされているもの、ならびに細胞において翻訳後に修飾されたもの(例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリン)である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造(α炭素が、水素、カルボキシ基、アミノ基、およびR基に結合されている)を有するが、修飾されたR基または修飾された主鎖を有する化合物を意味する(例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム)。「アミノ酸模倣体」という語句は、異なる構造を有するが、通常のアミノ酸と同様の機能を有する化学化合物を意味する。
【００３０】
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB生化学命名法委員会により推奨される、一般に公知の三文字記号または一文字記号によって示され得る。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、別段の具体的な指示が無い限り、交換可能に使用され、かつアミノ酸と同様に、一般に認められている一文字表記によって示される。アミノ酸と同様に、これらは、天然の核酸ポリマーおよび非天然の核酸ポリマーの双方を包含する。
【００３２】
本発明は、様々な癌の患者由来の細胞におけるRASGEF1A遺伝子発現の増大の発見に一部基づいている。ヒトRASGEF1A遺伝子のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：1において示され、かつGenBankアクセッション番号AK095136としても入手可能である。本明細書においてRASGEF1A遺伝子は、ヒトRASGEF1A遺伝子、ならびに限定されないが、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、および雌ウシを含む他の動物のRASGEF1A遺伝子を包含し、かつ対立遺伝子変異体およびRASGEF1A遺伝子に対応するような他の動物中に存在する遺伝子が含まれる。
【００３３】
ヒトRASGEF1A遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2に示され、かつGenBankアクセッション番号BAC04491としても入手可能である。本発明において、RASGEF1A遺伝子によってコードされるポリペプチドは、「RASGEF1A」と呼ばれ、「RASGEF1Aポリペプチド」または「RASGEF1Aタンパク質」と呼ばれることもある。
【００３４】
本発明のある局面によれば、機能的等価物もまた、RASGEF1Aポリペプチドに含まれる。本明細書において、あるタンパク質の「機能的等価物」は、そのタンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。すなわち、RASGEF1Aタンパク質の生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的等価物として使用してもよい。このような機能的等価物には、1つまたは複数のアミノ酸が、RASGEF1Aタンパク質の天然のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加、または挿入されているものが含まれる。または、ポリペプチドは、それぞれのタンパク質の配列に対して少なくとも約80％の相同性(配列同一性とも呼ばれる)を有するアミノ酸配列を含むものでもよい。他の態様において、ポリペプチドは、RASGEF1A遺伝子の天然のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００３５】
「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、ある核酸分子が、典型的には核酸の複合混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが、他の配列には検出可能な程度にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況においては異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度pHにおける特定の配列の熱融点(Tm)より約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度下で)標的に相補的なプローブの50％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である(標的配列が過剰に存在するため、Tmでは50％のプローブが平衡状態で占有される)。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することによって実現してもよい。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの10倍である。以下のような例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が可能である：50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃でインキュベーション、または5×SSC、1％SDS、65℃でインキュベーションし、0.2×SSCおよび0.1％SDS中、50℃で洗浄。
【００３６】
一般に、タンパク質中の1つまたは複数のアミノ酸の改変は、そのタンパク質の機能に影響しないことが公知である。当業者は、単一のアミノ酸または低比率のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、または置換は、タンパク質の変更が同様の機能を有するタンパク質をもたらす「保存的改変」であることを認識すると考えられる。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。例えば、以下の8つのグループは、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含む。
1)アラニン(A)、グリシン(G)；
2)アスパラギン酸(d)、グルタミン酸(E)；
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4)アルギニン(R)、リシン(K)；
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；
7)セリン(S)、トレオニン(T)；および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。
【００３７】
このような保存的に改変されたポリペプチドは、本発明のRASGEF1Aタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はそれらに制限されず、それらがRASGEF1Aタンパク質の少なくとも1種の生物活性を保持している限り、RASGEF1Aタンパク質は非保存的改変を含む。さらに改変タンパク質は、多形変異体、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを排除しない。
【００３８】
さらに、本発明のRASGEF1A遺伝子は、RASGEF1Aタンパク質のこのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００３９】
他に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。
【００４０】
I. 癌の診断
I-1. 癌または癌を発症する素因を診断するための方法
RASGEF1A遺伝子の発現は、癌患者において特異的に増大していることが判明した。したがって、本明細書において同定される遺伝子、ならびにその転写産物および翻訳産物は、癌のマーカーとして診断に有用であり、かつ細胞試料中のRASGEF1A遺伝子の発現を測定することによって、癌を診断することができる。具体的に本発明は、対象におけるRASGEF1A遺伝子の発現レベルを決定することにより、対象における癌または癌を発症する素因を診断するための方法を提供する。
【００４１】
本発明の方法によって診断することができる癌には、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法は、ICCを診断するのに特に適している。
【００４２】
本発明の別の局面によれば、このような癌の少なくともいずれか1つを発症する素因である。
【００４３】
本発明の文脈において、「診断する」という用語は、予測および尤度解析を包含することが意図される。本発明の方法は、治療的介入、病期などの診断基準、ならびに疾患のモニタリングおよび癌のサーベイランスを含む治療様式に関する決断を下す際に臨床的に使用することを意図する。
【００４４】
本発明によって診断される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、および雌ウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
診断しようとする対象由来の生物試料を採取して、診断を実施することが好ましい。RASGEF1A遺伝子の目的の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を、判定のための生物試料として使用することができる。生物試料には、体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、生物試料は、上皮細胞、より好ましくは癌上皮細胞、または癌であると疑われる組織由来の上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要な場合には、細胞を得られた体組織および体液から精製し、その後生物試料として使用してもよい。
【００４６】
本発明によれば、RASGEF1A遺伝子の発現レベルは、対象由来の生物試料において決定される。発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて、転写(核酸)産物レベルで決定することができる。例えば、RASGEF1A遺伝子のmRNAは、ハイブリダイゼーション法(例えばノーザンハイブリダイゼーション)により、プローブを用いて定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。アレイの使用は、本発明のRASGEF1A遺伝子を含む複数の遺伝子(例えば、様々な癌特異的遺伝子)の発現レベルを検出するのに好ましい。当業者は、RASGEF1A遺伝子(SEQ ID NO：1；GenBankアクセッション番号AK095136)の配列情報を用いてこのようなプローブを調製することができる。例えば、RASGEF1A遺伝子のcDNAを、プローブとして使用してもよい。必要な場合には、プローブは、色素および同位元素など適した標識で標識してよく、遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイズされた標識の強度として検出することができる。
【００４７】
さらに、RASGEF1A遺伝子の転写産物は、増幅に基づく検出方法(例えばRT-PCR)により、プライマーを用いて定量することができる。このようなプライマーもまた、遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、実施例において使用されるプライマー(SEQ ID NO：5および6；またはSEQ ID NO：7および8)は、RT-PCRによる検出のために使用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
【００４８】
具体的には、本発明の方法のために使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件下で、RASGEF1A遺伝子のmRNAにハイブリダイズする。本明細書において使用される場合、「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融点(Tm)より約5℃低くなるようように選択される。Tmは、(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度下で)標的配列に相補的なプローブの50％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Tmでは50％のプローブが平衡状態で占有されている。典型的には、ストリンジェントな条件はpH7.0〜pH8.3で、塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01M〜1.0Mのナトリウムイオン(もしくは他の塩)であり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば10〜50ヌクレオチド)の場合は少なくとも約30℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約60℃である条件であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することによって実現してもよい。
【００４９】
または、翻訳産物が本発明の診断のために検出され得る。例えば、RASGEF1Aタンパク質の量を決定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を決定するための方法には、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでよい。さらに、抗体の任意の断片または改変体(例えば、キメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fvなど)も、その断片がRASGEF1Aタンパク質への結合能力を保持している限り、検出のために使用してもよい。タンパク質検出用のこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、かつ任意の方法を本発明において使用して、このような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【００５０】
RASGEF1A遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、染色の強度を、RASGEF1Aタンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析を介して観察してもよい。すなわち、強い染色が観察された場合、タンパク質の存在の増加、および同時にRASGEF1A遺伝子の高い発現レベルが示唆される。
【００５１】
さらに、翻訳産物は、その生物活性に基づいて検出することもできる。具体的に、本明細書において、RASGEF1Aタンパク質が、Rasヌクレオチド解離活性、RAS増強活性を有すること、および癌細胞の遊走に関与していることが実証された。したがって、RASGEF1Aタンパク質のこのような活性は、生物試料中に存在するRASGEF1Aタンパク質の指標として使用され得る。例えば、このような活性は、実施例に記載する方法に従って検出してもよい。
【００５２】
さらに、RASGEF1A遺伝子の発現レベルに加えて、他の癌関連遺伝子、例えばICCにおいて差次的に発現されることが公知である遺伝子の発現レベルも決定して、診断の精度を向上させることができる。
【００５３】
生物試料中のRASGEF1A遺伝子を含む癌マーカー遺伝子の発現レベルは、対応する癌マーカー遺伝子の対照レベルから、例えば10％、25％、もしくは50％上昇もしくは低下する；または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上まで上昇する；または少なくとも0.5倍、少なくとも0.2倍、少なくとも0.1倍、もしくはそれ以下まで低下する場合、上昇または低下しているとみなすことができる。
【００５４】
対照レベルは、疾患の状態(癌性または非癌性)が公知である対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物試料と同時に決定することができる。または、疾患の状態が公知である対象由来の試料中のRASGEF1A遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られる結果に基づき、統計学的方法によって、対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、予め試験された細胞由来の発現パターンのデータベースでもよい。さらに、本発明のある局面によれば、生物試料中のRASGEF1A遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較してもよい。患者由来の生物試料の組織型と同様の組織型由来の参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患の状態が公知である集団におけるRASGEF1A遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野において公知である任意の方法によって得てもよい。例えば、平均値±2S.D.または平均値±3S.D.の範囲を、標準値として使用してもよい。
【００５５】
本発明の文脈において、癌性ではないことが公知である生物試料から決定された対照レベルは「正常対照レベル」と呼ばれる。他方では、対照レベルが癌性の生物試料から決定される場合、これは「癌性対照レベル」と呼ばれる。
【００５６】
RASGEF1A遺伝子の発現レベルが、正常対照レベルと比較して上昇しているか、または癌性対照レベルと同様である場合、その対象は癌に罹患しているか、または癌を発症するリスクがあると診断され得る。さらに、複数の癌関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料と癌性参照間の遺伝子発現パターンの類似は、対象が癌に罹患しているか、または癌を発症するリスクがあることを示唆する。
【００５７】
試験生物試料の発現レベルと対照レベル間の差異は、対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して標準化することができる。細胞の癌性状態または非癌性状態によって発現レベルが異ならないことが公知である遺伝子である。例示的な対照遺伝子には、β-アクチン、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質P1が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
I-2. 癌治療の有効性の評価
正常細胞と癌性細胞との間で差次的に発現されるRASGEF1A遺伝子により、癌の治療の経過をモニターすることもまた可能となり、かつ癌を診断するための前述の方法は、癌治療の有効性の評価に適用することができる。具体的には、癌治療の有効性は、治療を受けている対象由来の細胞におけるRASGEF1A遺伝子の発現レベルを決定することによって評価することができる。望ましいならば、試験細胞集団は、様々な時点、治療前、治療中、および/または治療後に対象から採取される。RASGEF1A遺伝子の発現レベルは、例えば「I-1. 癌または癌を発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法に従って決定することができる。本発明の文脈において、検出された発現レベルと比較される対照レベルは、関心対象の治療に曝露されていない細胞におけるRASGEF1A遺伝子発現から決定されることが好ましい。
【００５９】
RASGEF1A遺伝子の発現レベルを、正常細胞または癌細胞を含まない細胞集団から決定される対照レベルと比較する場合、発現レベルの類似は、関心対象の治療が有効であることを示唆し、発現レベルの差異は、その治療の臨床転帰または予後があまり好ましくないことを示唆する。他方では、癌細胞または癌細胞を含む細胞集団から決定される対照レベルに対して比較が実施される場合、発現レベルの差異が有効な治療を示唆するのに対し、発現レベルの類似は、臨床転帰または予後があまり好ましくないことを示唆する。
【００６０】
さらに、治療前および治療後のRASGEF1A遺伝子の発現レベルを、本発明の方法に従って比較して、治療の有効性を評価することもできる。具体的には、治療後の対象由来の生物試料において検出される発現レベル(すなわち、治療後レベル)が、同じ対象から治療開始前に採取された生物試料において検出される発現レベル(すなわち、治療前レベル)と比較される。治療前レベルと比較して治療後レベルが低下している場合、関心対象の治療が有効であることが示唆されるのに対し、治療前レベルと比較して治療後レベルが上昇しているか、または同様である場合、臨床転帰または予後があまり好ましくないことが示唆される。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「有効な」という用語は、治療が、病的に上方制御されている遺伝子の発現の減少、病的に下方制御されている遺伝子の発現の増大、または対象における癌腫のサイズ、罹患率、もしくは転移能の低減をもたらすことを示す。関心対象の治療が予防的に適用される場合、「有効な」とは、治療が腫瘍の形成を遅延もしくは予防するか、または癌の少なくとも1種の臨床症状を遅延、予防、もしくは緩和することを意味する。対象における腫瘍の状態の評価は、標準的な臨床的プロトコールを用いて実施することができる。
【００６２】
さらに、治療の有効性は、癌を診断するための任意の公知の方法に関連して、決定することもできる。癌は、例えば徴候となる異常、例えば体重減少、腹痛、背痛、食欲低下、悪心、嘔吐、ならびに全身倦怠感、虚弱、および黄疸を同定することによって診断することができる。
【００６３】
I-3. 癌を有する対象の予後の評価
前述した癌を診断するための方法は、対象の癌の予後を評価するのに使用することもできる。したがって、本発明は、癌を有する対象の予後を評価するための方法も提供する。RASGEF1A遺伝子の発現レベルは、例えば「I-1. 癌または癌を発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法に従って決定することができる。例えば、様々な病期の患者由来の生物試料中のRASGEF1A遺伝子の発現レベルを、対象において検出されるこの遺伝子の発現レベルと比較するための対照レベルとして使用することができる。対象におけるRASGEF1A遺伝子の発現レベルと対照レベルを比較することによって、対象の予後を評価することができる。または、対象における発現レベルのパターンを経時的に比較することによって、対象の予後を評価することができる。
【００６４】
例えば、対象におけるRASGEF1A遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合、予後があまり好ましくないことが示唆される。逆に、発現レベルが正常対照レベルと比較して類似している場合は、対象の予後がより好ましいことが示唆される。
【００６５】
II. キット
本発明はまた、癌を検出するための試薬、すなわちRASGEF1A遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出することができる試薬も提供する。具体的には、RASGEF1A遺伝子の転写産物に特異的に結合するか、またはそれを同定する核酸である。例えば、RASGEF1A遺伝子の転写産物に特異的に結合するか、またはそれを同定する核酸には、RASGEF1A遺伝子転写産物の一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド(例えばプローブおよびプライマー)などが含まれる。または、抗体を遺伝子の翻訳産物を検出するための試薬として例示することができる。「I-1. 癌または癌を発症する素因を診断するための方法」の項目で前述したプローブ、プライマー、および抗体を、このような試薬の適切な例として挙げることができる。
【００６６】
さらに、翻訳産物をその生物活性に基づいて検出してもよい。実施例において示すように、RASGEF1Aタンパク質は、Rasヌクレオチド解離活性、RAS増強活性を有すること、および癌細胞の遊走に関与していることが実証された。したがって、Rasヌクレオチド解離アッセイ法、Ras活性または癌細胞の遊走の検出に必要な材料もまた、本発明に従ってRASGEF1A遺伝子の発現レベルを検出するための試薬として使用してもよい。
【００６７】
これらの試薬を前述の癌診断のために使用してもよい。これらの試薬を使用するためのアッセイ形式は、ノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAでよく、いずれも当技術分野において周知である。
【００６８】
検出試薬をキットの形態で一緒に包装してもよい。例えば検出試薬を、個別の容器に包装してもよい。さらに、検出試薬を検出に必要な他の試薬と共に包装してもよい。例えばキットは、検出試薬としての核酸もしくは抗体(固体マトリックスに結合されるか、もしくはマトリックスにそれらを結合するための試薬と共に別々に包装されるかのいずれかである)、対照試薬(陽性および/もしくは陰性)、および/または検出可能な標識を含み得る。アッセイ法を実施するための説明書(例えば、文書、テープ、VCR、CD-ROMなど)もキットに含まれてよい。
【００６９】
本発明のある局面として、癌を検出するための試薬を、多孔質ストリップのような固体マトリックス上に固定して、癌を検出するための少なくとも1つの部位を形成することができる。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが検出試薬(例えば核酸)を含む複数の部位を含んでよい。テストストリップは、陰性対照および/または陽性対照用の部位も含んでよい。または、対照部位は、テストストリップとは別のストリップ上に配置されてもよい。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定された検出試薬(例えば核酸)を含んでもよい。すなわち、第一の検出部位により多くの量を含み、次の部位により少ない量を含んでもよい。試験生物試料を添加した際、検出可能なシグナルを提示している部位の数が、試料中のRASGEF1A遺伝子の発現レベルの定量的な指標を提供する。検出部位は、適切に検出することができる任意の形状で形成されてよく、典型的には、テストストリップの幅にわたる棒または点の形状である。
【００７０】
III. スクリーニング方法
RASGEF1A遺伝子、この遺伝子もしくはその断片によってコードされるポリペプチド、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、この遺伝子の発現またはこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物活性を変更する作用物質をスクリーニングすることが可能である。このような作用物質は、癌を治療または予防するための薬剤として使用され得る。したがって、本発明は、RASGEF1A遺伝子、この遺伝子もしくはその断片によってコードされるポリペプチド、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、癌を治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００７１】
本発明のスクリーニング方法によって単離される物質は、RASGEF1A遺伝子の発現またはこの遺伝子の翻訳産物の活性を阻害すると予想される物質であり、したがって、例えば癌のような細胞増殖性疾患に起因する疾患を治療または予防するための候補である。このような作用物質は、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫の群より選択される癌を治療または予防すると予想される。すなわち、本発明の方法によってスクリーニングされる物質は、臨床的な利益を有するとみなされ、さらに動物モデルまたは試験用対象において癌細胞増殖を防止する能力について試験することができる。
【００７２】
本発明の文脈において、本発明のスクリーニング方法によって同定される物質は、任意の化合物、またはいくつかの化合物を含む組成物でよい。さらに、本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験物質は、単一の化合物または化合物の組み合わせでよい。化合物の組み合わせがこれらの方法において使用される場合、これらの化合物は、逐次的にまたは同時に接触させてよい。
【００７３】
任意の試験物質、例えば細胞抽出物、細胞培養上清液、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成の微小分子化合物(アンチセンスRNA、siRNA、リボザイムなどの核酸構築物を含む)、および天然化合物を、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。本発明の試験物質はまた、(1)生物ライブラリー、(2)空間的にアドレス可能なパラレルな固相ライブラリーまたは液相ライブラリー、(3)デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、(4)「1ビーズ1化合物」ライブラリー法、および(5)アフィニティークロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティークロマトグラフィー選別を使用する生物ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定されているが、他の4種のアプローチは、ペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12：145-67)。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出すことができる(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90：6909-13；Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91：11422-6；Zuckermann et al., J Med Chem 37：2678-85, 1994；Cho et al., Science 1993, 261：1303-5；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33：2059；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33：2061；Gallop et al., J Med Chem 1994, 37：1233-51)。化合物のライブラリーは、溶液中(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13：412-21を参照されたい)、またはビーズ上(Lam, Nature 1991, 354：82-4)、チップ上(Fodor, Nature 1993, 364：555-6)、細菌上(米国特許第5,223,409号)、胞子上(米国特許第5,571,698号、第5,403,484号、および第5,223,409号)、プラスミド上(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89：1865-9)、もしくはファージ上(Scott and Smith, Science 1990, 249：386-90；Devlin, Science 1990, 249：404-6；Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87：6378-82；Felici, J Mol Biol 1991, 222：301-10；米国特許出願第2002103360号)に提示され得る。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換されている化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる作用物質に含まれる。
【００７５】
さらに、スクリーニングされる試験物質がタンパク質である場合、そのタンパク質をコードするDNAを得るために、そのタンパク質のアミノ酸配列全体を決定し、そのタンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られるタンパク質のアミノ酸配列の一部を解析し、その配列に基づいてオリゴDNAをプローブとして調製し、かつそのプローブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングし、そのタンパク質をコードするDNAを得てもよい。得られるDNAは、癌を治療または予防するための候補である試験物質を調製する際に使用される。
【００７６】
III-1. タンパク質に基づくスクリーニング方法
本発明により、RASGEF1A遺伝子の発現は、癌細胞の増殖および/または生存に非常に重要であることが示唆された。したがって、この遺伝子によってコードされるポリペプチドの機能を抑制する物質は、癌細胞の増殖および/または生存を阻害し、かつ癌を治療または予防する際に使用されると考えられた。したがって本発明は、RASGEF1Aポリペプチドを用いて癌を治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００７７】
RASGEF1Aポリペプチドに加え、このポリペプチドの断片も、天然のRASGEF1Aポリペプチドの少なくとも1種の生物活性を保持している限り、本発明のスクリーニングのために使用され得る。
【００７８】
ポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドおよび断片がその生物活性の少なくとも1種を保持している限り、他の物質にさらに連結されてもよい。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。これらの種類の修飾は、付加的な機能を与えるため、またはポリペプチドおよび断片を安定化させるために実施してもよい。
【００７９】
本発明の方法に使用されるポリペプチドまたは断片は、従来の精製方法を経て天然のタンパク質として自然界から、または選択されたアミノ酸配列に基づく化学合成を通じて、得ることができる。例えば、合成のために採用することができる従来のペプチド合成方法には、以下のものが含まれる：
1)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
2)The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976；
3)Peptide Synthesis(日本語), Maruzen Co., 1975；
4)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日本語), Maruzen Co., 1985；
5)Development of Pharmaceuticals(第2巻)(日本語), Vol.14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
6)WO99/67288；ならびに
7)Barany G.およびMerrifield R.B., Peptides Vol.2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００８０】
または、タンパク質は、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学方法を採用することによって、得ることもできる(例えば、Morrison J., J Bacteriology 1977, 132：349-51；Clark-CurtissおよびCurtiss, Methods in Enzymology(Wu et al.編)1983, 101：347-62)。例えば最初に、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で(例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に)含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞中に形質転換し、次いでその宿主細胞を培養して、そのタンパク質を産生させる。より具体的には、RASGEF1Aポリペプチドをコードする遺伝子を、pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS、またはpCD8など外来遺伝子を発現させるためのベクター中に挿入することによって、その遺伝子を宿主(例えば動物)細胞などにおいて発現させる。発現のために、プロモーターを使用してもよい。一般に使用される任意のプロモーターを使用してもよく、例えばSV40初期プロモーター(Rigby、Williamson(編), Genetic Engineering, vol.3.Academic Press, London, 1982, 83-141)、EF-αプロモーター(Kim et al., Gene 1990, 91：217-23)、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 1991, 108：193)、 RSV LTRプロモーター(Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152：684-704)、SRαプロモーター(Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8：466)、CMV最初期プロモーター(Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84：3365-9)、SV40後期プロモーター(Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1：385-94)、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9：946)、およびHSV TKプロモーターなどが含まれる。RASGEF1A遺伝子を発現させるための宿主細胞中へのベクターの導入は、任意の方法、例えばエレクトロポレーション法(Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15：1311-26)、リン酸カルシウム法(Chen et al., Mol Cell Biol 1987, 7：2745-52)、DEAEデキストラン法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12：5707-17；Sussman et al., Mol Cell Biol 1985, 4：1642-3)、およびリポフェクチン法(Derijard B, Cell 1994, 7：1025-37)；Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5：22-30；Rabindran et al., Science 1993, 259：230-4)などに従って実施することができる。
【００８１】
RASGEF1Aタンパク質はまた、インビトロの翻訳システムを採用して、インビトロで産生してもよい。
【００８２】
試験物質と接触させるRASGEF1Aポリペプチドは、例えば精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、または他のポリペプチドと融合された融合タンパク質でよい。
【００８３】
III-1-1. RASGEF1Aポリペプチドに結合する作用物質の同定
あるタンパク質に結合する作用物質は、そのタンパク質をコードする遺伝子の発現またはそのタンパク質の生物活性を変更すると考えられる。したがって、ある局面として、本発明は、以下の段階を含む、癌を治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法を提供する：
(a)試験物質を、RASGEF1Aポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
(b)ポリペプチドと試験物質の結合を検出する段階；および
(c)ポリペプチドに結合する試験物質を選択する段階。
【００８４】
RASGEF1Aポリペプチドへの試験物質の結合は、例えばそのポリペプチドに対する抗体を使用する免疫沈降法によって検出することができる。したがって、このような検出の目的で、スクリーニングのために使用されるRASGEF1Aポリペプチドまたはその断片は、抗体認識部位を含むことが好ましい。スクリーニングのために使用される抗体は、調製方法が当技術分野において周知である、本発明のRASGEF1Aポリペプチドの抗原性領域(例えばエピトープ)を認識する抗体でよく、かつ任意の方法を本発明において使用して、このような抗体およびそれらの等価物を調製してもよい。
【００８５】
または、RASGEF1Aポリペプチドもしくはその断片は、ポリペプチドのN末端またはC末端に対する、特異性が明らかにされているモノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)をそのN末端またはC末端に含む融合タンパク質として発現され得る。市販されているエピトープ-抗体システムを使用することができる(Experimental Medicine 1995, 13：85-90)。例えば、β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)などとの融合タンパク質を、そのマルチクローニング部位を用いることにより発現できるベクターが市販されており、本発明のために使用することができる。さらに、エピトープに対する抗体を用いた免疫沈降法によって検出され得る非常に小さなエピトープを含む融合タンパク質もまた、当技術分野において公知である(Experimental Medicine 1995, 13：85-90)。RASGEF1Aポリペプチドまたはその断片の性質を変えないような数個〜数十個のアミノ酸からなるそのようなエピトープもまた、本発明において使用することができる。例には、ポリヒスチジン(His-タグ)、インフルエンザ凝集体HA、ヒトc-myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7-タグ)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSV-タグ)、E-タグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)などが含まれる。
【００８６】
グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)もまた、免疫沈降法によって検出される融合タンパク質の対応物として周知である。GSTがRASGEF1Aポリペプチドまたはその断片と融合されるタンパク質として使用され、融合タンパク質を形成する場合、この融合タンパク質は、GSTに対する抗体、またはGSTに特異的に結合する物質、すなわちグルタチオン(例えばグルタチオン-セファロース4B)などのいずれかを用いて検出することができる。
【００８７】
免疫沈降法において、(RASGEF1Aポリペプチドもしくはその断片それ自体、またはそのポリペプチドもしくは断片にタグ付加されたエピトープを認識する)抗体を、RASGEF1Aポリペプチドおよび試験物質の反応混合物に添加することにより、免疫複合体が形成される。試験物質がポリペプチドに結合する能力を有する場合、形成される免疫複合体は、RASGEF1Aポリペプチド、試験物質、および抗体からなると考えられる。これに対して、試験物質がこのような能力を欠いている場合、次いで形成される免疫複合体は、RASGEF1Aポリペプチドおよび抗体のみからなる。したがって、RASGEF1Aポリペプチドに対する試験物質の結合能力は、例えば形成された免疫複合体のサイズを測定することによって検討することができる。クロマトグラフィー、電気泳動などを含む、物質のサイズを検出するための任意の方法を使用することができる。例えば、マウスIgG抗体が検出に使用される場合、プロテインAまたはプロテインGセファロースを、形成された免疫複合体を定量するのに使用することができる。
【００８８】
免疫沈降法に関するより詳細な内容については、例えばHarlow et al., Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52を参照されたい。
【００８９】
さらに、RASGEF1Aポリペプチドもしくはその断片に結合する作用物質をスクリーニングするために使用されるRASGEF1Aポリペプチドまたはその断片は、担体に結合されてもよい。ポリペプチドに結合するのに使用され得る担体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ、好ましくは、上記の材料から調製された、市販されているビーズおよびプレート(例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど)が使用され得る。ビーズを使用する場合、これらはカラム中に充填されてよい。または、磁性ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより磁気を用いてビーズに結合させたポリペプチドおよび作用物質を容易に単離することが可能になる。
【００９０】
担体へのポリペプチドの結合は、化学的結合および物理的吸着などの常法に従って実施してもよい。または、ポリペプチドは、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して担体に結合され得る。さらに、担体へのポリペプチドの結合は、アビジンおよびビオチンの組み合わせのような相互作用する分子を用いて実施することもできる。
【００９１】
このような担体に結合したRASGEF1Aポリペプチドまたはその断片を使用するスクリーニングは、例えば担体に結合したポリペプチドに試験物質を接触させる段階、この混合物をインキュベートする段階、担体を洗浄する段階、ならびに担体に結合した作用物質を検出および/または測定する段階を含む。緩衝液が結合を阻害しない限り、緩衝液中、例えば限定されないが、リン酸緩衝液およびトリス緩衝液緩衝液中で、結合を実施してもよい。
【００９２】
このような担体に結合したRASGEF1Aポリペプチドまたはその断片および組成物(例えば、細胞抽出物、細胞溶解物など)が試験物質として使用されるスクリーニング方法では、このような方法は一般にアフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる。例えば、RASGEF1Aポリペプチドは、アフイニティーカラムの担体上に固定してよく、かつポリペプチドに結合することができる物質を含む試験物質をカラムに添加する。試験物質を添加した後、カラムを洗浄し、次いでポリペプチドに結合した物質を、適切な緩衝液を用いて溶出させる。
【００９３】
表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーは、本発明において結合した物質を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーが使用される場合、RASGEF1Aポリペプチドと試験物質との間の相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる(例えば、BIAcore、Pharmacia)。したがって、BIAcoreのようなバイオセンサーを用いてポリペプチドと試験物質との間の結合を評価することが可能である。
【００９４】
合成化学化合物、または天然物質バンクもしくはランダムペプチドファージディスプレイライブラリー中の分子の中から、担体上に固定された特定のタンパク質をそれらの分子に曝露させることによって、その特定のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法、およびタンパク質だけでなく化学化合物も単離する、コンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットスクリーニング方法(Wrighton et al., Science 1996, 273：458-64；Verdine, Nature 1996, 384：11-3)もまた、当業者には周知である。これらの方法もまた、RASGEF1Aタンパク質またはその断片に結合する物質(アゴニストおよびアンタゴニストを含む)をスクリーニングするために使用することができる。
【００９５】
試験物質がタンパク質である場合、例えばウェストウェスタンブロット解析(Skolnik et al., Cell 1991, 65：83-90)を本発明の方法に使用することができる。具体的には、RASGEF1Aポリペプチドに結合するタンパク質は、ファージベクター(例えばZAP)を用いて、RASGEF1Aポリペプチドに結合する少なくとも1種のタンパク質を発現することが予想される細胞、組織、器官、または培養細胞(例えばSSP25)から調製されるcDNAライブラリーを最初に調製し、そのcDNAライブラリーのベクターによってコードされるタンパク質をLBアガロース上で発現させ、発現されたタンパク質をフィルター上に固定し、精製および標識したRASGEF1Aポリペプチドを前述のフィルターと反応させ、かつRASGEF1Aポリペプチドの標識に従って、RASGEF1Aポリペプチドが結合したタンパク質を発現しているプラークを検出することによって、得ることができる。
【００９６】
放射性同位体(例えば、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酵素(例えば、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ)、蛍光性物質(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン)、およびビオチン/アビジンなどの標識物質を、本発明の方法においてRASGEF1Aポリペプチドの標識のために使用してもよい。タンパク質が放射性同位体で標識される場合、検出または測定は、液体シンチレーションによって実施することができる。または、タンパク質が酵素で標識される場合、酵素の基質を添加して、色の生成のような基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することによって、タンパク質を検出または測定することができる。さらに、蛍光物質が標識として使用される場合、蛍光光度計を用いて、結合したタンパク質を検出または測定してもよい。
【００９７】
さらに、タンパク質に結合したRASGEF1Aポリペプチドは、RASGEF1Aポリペプチド、またはRASGEF1Aポリペプチドに融合されているペプチドもしくはポリペプチド(例えばGST)に特異的に結合する抗体を使用することによって、検出または測定することができる。本発明のスクリーニングにおいて抗体を使用する場合、抗体は、好ましくは前述の標識物質の1つで標識され、標識物質に基づいて検出または測定される。または、RASGEF1Aポリペプチドに対する抗体を、標識物質で標識された二次抗体で検出される一次抗体として使用してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてRASGEF1Aポリペプチドに結合する抗体は、プロテインGカラムまたはプロテインAカラムを用いて検出または測定してもよい。
【００９８】
または、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を使用するツーハイブリッドシステムが使用され得る(「MATCHMAKER Two-Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one-Hybrid system」(Clontech)；「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(Stratagene)；参考文献「Dalton et al., Cell 1992, 68：597-612」および「Fields et al., Trends Genet 1994, 10：286-92」)。ツーハイブリッドシステムでは、RASGEF1Aポリペプチドまたはその断片は、SRF結合領域またはGAL4結合領域に融合され、かつ酵母細胞において発現される。RASGEF1Aポリペプチドに結合する少なくとも1種のタンパク質を発現することが予想される細胞から、発現された場合にそのライブラリーがVP16またはGAL4の転写活性化領域に融合されるように、cDNAライブラリーを調製する。次いで、cDNAライブラリーを前述の酵母細胞中に導入し、かつライブラリーに由来するcDNAを、検出された陽性クローンから単離する(RASGEF1Aポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、これら2種の結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンが検出可能になる)。cDNAにコードされるタンパク質は、上記で単離されたcDNAを大腸菌(E. coli)に導入し、かつタンパク質を発現させることによって、調製することができる。
【００９９】
レポーター遺伝子としては、HIS3遺伝子に加え、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを使用することができる。
【０１００】
このスクリーニングによって単離される作用物質は、RASGEF1Aポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの候補である。「アゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによって、そのポリペプチドの機能を活性化する分子を意味する。これに対して、「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによって、そのポリペプチドの機能を阻害する分子を意味する。さらに、このスクリーニングによってアンタゴニストとして単離される作用物質は、RASGEF1Aポリペプチドと分子(核酸(RNAおよびDNA)ならびにタンパク質を含む)とのインビボでの相互作用を阻害する候補である。
【０１０１】
III-1-2. RASGEF1Aポリペプチドの生物活性を検出することによる作用物質の同定
本発明により、RASGEF1A遺伝子の発現は、癌細胞の増殖および/または生存に非常に重要であることが示された。したがって、RASGEF1A遺伝子の翻訳産物の生物学的機能を抑制または阻害する作用物質は、癌を治療または予防するための候補として役立つとみなされる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、RASGEF1Aポリペプチドまたはその断片を用いて、癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供する：
(a)試験物質を、RASGEF1Aポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；および
(b)段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階。
【０１０２】
本発明のスクリーニング方法において指標として使用することができる、RASGEF1Aポリペプチドの1種の生物活性を有している限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに使用することができる。RASGEF1Aポリペプチドは、癌細胞の細胞増殖を促進する活性を有しているため、スクリーニングのための指標として使用することができるRASGEF1Aポリペプチドの生物活性には、ヒトRASGEF1Aポリペプチドのこのような細胞増殖活性が含まれる。例えば、ヒトRASGEF1Aポリペプチドを使用することができ、かつその断片を含みそれに機能的に等価なポリペプチドもまた使用することができる。このようなポリペプチドは、適切な細胞によって、内因的または外因的に発現され得る。
【０１０３】
本発明の方法において検出される生物活性が細胞増殖である場合、これは例えばRASGEF1Aポリペプチドまたはその断片を発現する細胞を調製し、試験物質の存在下でこれらの細胞を培養し、かつ細胞周期の測定などにより細胞増殖速度を決定することによって、ならびに実施例において説明するように(「材料および方法」を参照されたい)、創傷治癒活性の検出、マトリゲル浸潤アッセイ法の実施、およびコロニー形成活性の測定によって、検出することができる。
【０１０４】
本発明のある局面によれば、スクリーニングは、前述の段階(b)の後に、以下の段階をさらに含む：
c)試験物質の非存在下で検出される生物活性と比較して、ポリペプチドの生物活性を抑制する試験物質を選択する段階。
【０１０５】
このスクリーニングによって単離される作用物質は、RASGEF1Aポリペプチドのアンタゴニストの候補であり、したがってこのポリペプチドと分子(核酸(RNAおよびDNA)ならびにタンパク質を含む)とのインビボでの相互作用を阻害する候補である。
【０１０６】
本発明の別の局面として、RASGEF1Aポリペプチドのアゴニストの候補となる作用物質は、ポリペプチドの生物活性を指標として用いてスクリーニングすることができる。このような方法に従って、RASGEF1Aポリペプチドの生物活性を増強する作用物質が選択される。具体的には、スクリーニング方法は、前述の段階(b)の後に以下の段階をさらに含む：
c)試験物質の非存在下で検出される生物活性と比較して、ポリペプチドの生物活性を増強する試験物質を選択する段階。
【０１０７】
本明細書において、RASGEF1AポリペプチドがRASの活性を増強することが明らかにされた。したがって、RAS増強活性、すなわちRASGEF1Aポリペプチドの生物活性の1つを低下させる作用物質は、癌を治療または予防するために使用され得る。したがって、本発明は、癌を治療または予防するための作用物質をスクリーニングする方法もさらに提供する。このスクリーニング方法のある態様は、以下の段階を含む：
(a)RASGEF1Aポリペプチドまたはその断片およびRASを、試験物質の存在下で接触させる段階；
(b)RAS活性を検出する段階；ならびに
(c)試験物質の非存在下で検出される活性と比較して、RAS活性を低下させる試験物質を選択する段階。
【０１０８】
RAS活性は、当技術分野において公知の方法、例えばGDP検出(例えば、Hall BE et al., J Biol Chem 2001, 276：27629-37を参照されたい)またはRAS活性化アッセイ法によって測定することができる。本発明では、試験物質の存在下または非存在下での、RASGEF1AポリペプチドのRAS活性化活性を推定するために、例えばRASGEF1A遺伝子を発現する細胞の細胞溶解物を、試験化合物の存在下または非存在下で、GST-Ras融合タンパク質、GDP、およびGTPγSと共にインキュベートする。インキュベーション後、活性型RasまたはGTP-Rasを、21kDaの活性型RasまたはGTP-Rasを検出する抗Ras抗体を用いるウェスタンブロット解析によって検出する。活性型RasまたはGTP-Rasのプルダウンアッセイ法は、グルタチオンディスクを用いて実施することができる。市販されているRAS活性化アッセイキットも、本発明のスクリーニング方法のために使用することができる。例えば、「StressXpress(登録商標) RAS Activation Kit」(Stressgen Bioreagents Corp.)または「EZ-Detect TM Ras Activation Kit」(PIERCE Biotechnology)は、このアッセイ用のすべての要素、例えば抗RAS抗体、グルタチオンディスク、Raf1のRas結合ドメイン(RBD)を含むGST融合タンパク質、GDP、およびGTPγSを含む。さらに、Ras活性は、実施例において説明するように検出することができる(下記の「材料および方法」の「8. Rasヌクレオチド解離アッセイ法」および「9. Ras活性の解析」の項目を参照されたい)。
【０１０９】
III-2. ヌクレオチドに基づくスクリーニング方法
III-2-1. RASGEF1A遺伝子を使用するスクリーニング方法
上記で詳細に述べたように、RASGEF1A遺伝子の発現レベルを制御することによって、癌の発症および進行を制御することができる。したがって、癌の治療または予防において使用され得る作用物質は、RASGEF1A遺伝子の発現レベルを指標として使用するスクリーニングによって同定することができる。本発明の文脈において、このようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
(a)試験物質を、RASGEF1A遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
(b)RASGEF1A遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
(c)試験物質の非存在下で検出されるレベルと比較して、RASGEF1A遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質を選択する段階。
【０１１０】
RASGEF1A遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する作用物質は、RASGEF1A遺伝子を発現する細胞を試験物質と接触させ、次いでRASGEF1A遺伝子の発現レベルを決定することによって同定することができる。当然、同定は、単一の細胞の代わりに、この遺伝子を発現する細胞集団を用いて実施してもよい。作用物質の非存在下での発現レベルと比較して、作用物質の存在下で検出される発現レベルが低下している場合、その作用物質がRASGEF1A遺伝子の阻害物質であることが示されて、その作用物質が癌を阻害するのに有用であり、したがって、癌の治療または予防用に使用され得る候補物質である可能性が示唆される。
【０１１１】
遺伝子の発現レベルは、当業者に周知の方法によって推定することができる。RASGEF1A遺伝子の発現レベルは、例えば「I-1. 癌または癌を発症する素因を診断するための方法」の項目で前述した方法に従って決定することができる。
【０１１２】
このような同定のために使用される細胞または細胞集団は、RASGEF1A遺伝子を発現する限り、任意の細胞または任意の細胞集団でよい。例えば、細胞または集団は、ある組織に由来する上皮細胞でもよく、またはそれを含んでよい。または、細胞もしくは集団は、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫に由来するものを含む癌細胞由来の不死化細胞でもよく、またはそれらを含んでもよい。RASGEF1A遺伝子を発現する細胞には、例えば癌から樹立された細胞株(例えばSSP25)が含まれる。さらに、細胞または集団は、RASGEF1A遺伝子をトランスフェクトした細胞でもよく、またはそれを含んでもよい。
【０１１３】
本発明の方法は、前述の様々な作用物質のスクリーニングを可能にし、かつアンチセンスRNA、siRNAなどを含む機能的核酸分子をスクリーニングするのに特に適している。
【０１１４】
III-2-2. RASGEF1A遺伝子の転写調節領域を使用するスクリーニング方法
別の局面によれば、本発明は、以下の段階を含む方法を提供する：
(a)RASGEF1A遺伝子の転写調節領域およびその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と、試験物質を接触させる段階；
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階；ならびに
(c)試験物質の非存在下で検出されるレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる試験物質を選択する段階。
【０１１５】
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。スクリーニングのために必要なレポーター構築物は、遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいてゲノムライブラリーから転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントとして得ることができる、RASGEF1A遺伝子の転写調節領域を用いて調製することができる。
【０１１６】
転写調節領域は、例えばRASGEF1A遺伝子のプロモーター配列でよい。
【０１１７】
RASGEF1A遺伝子の調節配列(例えばプロモーター配列)に機能的に連結されているレポーター遺伝子をトランスフェクトした細胞を使用する場合、レポーター遺伝子産物の発現レベルを検出することにより、RASGEF1A遺伝子の発現を阻害または亢進するものとして作用物質を同定することができる。
【０１１８】
レポーター遺伝子としては、例えば当技術分野において周知のAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、HIS3遺伝子などを使用することができる。これらの遺伝子の発現を検出するための方法は、当技術分野において周知である。
【０１１９】
III-3. 個々の個体に適切な治療物質の選択
個体の遺伝子構成の差異により、様々な薬物を代謝する相対的な能力が異なる場合がある。対象中で代謝されて抗腫瘍物質として作用する物質は、癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから、非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの、対象の細胞における遺伝子発現パターンの変化を誘導することによって、顕在化することができる。したがって、本明細書において開示される癌細胞および非癌細胞間で差次的に発現されるRASGEF1A遺伝子により、選択された対象由来の試験細胞集団において、癌の推定上の治療的阻害物質または予防的阻害物質を試験して、その作用物質が対象において癌の適切な阻害物質であるかどうかを判定することが可能になる。
【０１２０】
個々の対象にとって適切な癌の阻害物質を特定するために、対象由来の試験細胞集団を候補治療物質に曝露し、かつRASGEF1A遺伝子の発現を決定する。
【０１２１】
本発明の方法の文脈において、試験細胞集団は、RASGEF1A遺伝子を発現する癌細胞を含む。好ましくは、試験細胞は上皮細胞である。
【０１２２】
具体的には、試験細胞集団は、候補治療物質の存在下でインキュベートしてよく、かつ試験細胞集団におけるRASGEF1A遺伝子の発現を測定し、1種または複数種の参照プロファイル、例えば癌性の参照発現プロファイルまたは非癌性の参照発現プロファイルと比較してもよい。
【０１２３】
癌を含む参照細胞集団と比較して試験細胞集団におけるRASGEF1A遺伝子の発現が減少している場合、その物質が治療能力を有することが示唆される。
【０１２４】
IV. 癌を治療または予防するための薬学的組成物
本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた物質、RASGEF1A遺伝子のアンチセンス核酸およびsiRNA、ならびにRASGEF1Aポリペプチドに対する抗体は、RASGEF1A遺伝子の発現またはRASGEF1Aポリペプチドの生物活性を阻害または抑制し、かつ細胞周期の調節および細胞増殖を阻害または混乱させる。したがって、本発明は、本発明のスクリーニング方法のいずれかによってスクリーニングされた物質、RASGEF1A遺伝子のアンチセンス核酸およびsiRNA、またはRASGEF1Aポリペプチドに対する抗体を含む、癌を治療または予防する組成物を提供する。本発明の組成物は、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫などの癌を治療または予防するのに使用され得る。
【０１２５】
これらの組成物は、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーなど他の哺乳動物に対する薬剤として使用してもよい。
【０１２６】
本発明の文脈において、以下に詳述する本発明の活性成分(スクリーニングされた作用物質、アンチセンス核酸、siRNA、抗体などを含む)に適した薬学的製剤には、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与(頬側および舌下を含む)、膣内投与もしくは非経口投与(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)、または吸入もしくは吹入による投与に適したものが含まれる。好ましくは、投与は静脈内である。製剤は任意で、個別の投薬単位で包装される。
【０１２７】
経口投与に適した薬学的製剤には、カプセル剤、マイクロカプセル剤、カシェ剤、および錠剤が含まれ、それぞれ所定量の活性成分を含む。適切な製剤には、散剤、エリキシル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、および乳剤も含まれる。活性成分は、任意で、ボーラス舐剤、またはペースト剤として投与される。または、必要に応じて、薬学的組成物は、水または他の任意の薬学的に許容される液体による滅菌溶液または滅菌懸濁液の注射剤の形態で、非経口的に投与され得る。例えば、本発明の活性成分は、一般に認められている薬物製造に必要とされる単位用量形態で、薬学的に許容される担体または媒体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、安定化剤、矯味剤、賦形剤、溶剤、保存剤、および結合剤などと混合することができる。このような製剤中に含まれる活性成分の量により、指定された範囲内の適切な投薬量が取得できるようになる。
【０１２８】
錠剤およびカプセル剤中に混合することができる添加剤の例には、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントゴム、およびアラビアゴムなどの結合剤；結晶セルロースのような賦形剤；トウモロコシデンプン、ゼラチン、およびアルギン酸などの膨張剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；スクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味剤；ならびにペパーミント、アカモノ(Gaultheria adenothrix)油、およびサクランボなどの矯味剤が含まれるが、これらに限定されない。錠剤は、任意で1種または複数種の製剤用成分と共に、圧縮または成形することによって製造してもよい。粉末または顆粒など易流動性の形態の活性成分を、任意で結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して、適切な機械中で圧縮することによって、圧縮錠剤を調製してもよい。不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械中で成形することによって、成形錠剤を製造してもよい。当技術分野において周知の方法によって、錠剤をコーティングしてもよい。錠剤を任意で、インビボでの活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。錠剤のパッケージは、各月に服用されるべき1つの錠剤を含んでよい。
【０１２９】
さらに、単位剤形がカプセル剤である場合、油などの液体担体を、前述の成分に加えてさらに含めることができる。
【０１３０】
経口用液体製剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形態でもよく、または使用前に水もしくは他の適切な溶剤を用いて溶解するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、懸濁化剤、乳化剤、非水性溶剤(食用油を含んでよい)、または保存剤など従来の添加剤を含んでよい。
【０１３１】
非経口投与用の製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象とするレシピエントの血液とその製剤を等張性にする溶質を含んでよい、水性および非水性の無菌注射液剤、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでよい水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。製剤を、単位投与用容器または複数回投与用容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアルに入れて提供してもよく、使用する直前に、無菌の液体担体、例えば生理食塩水、注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存してもよい。または、製剤を持続注入用に提供してもよい。用時溶解注射用の液剤および懸濁剤は、先に述べた種類の無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。
【０１３２】
さらに、注射用の無菌複合体は、注射に適した蒸留水のような溶剤を用いて、通常の薬物製造に従って製剤化することができる。D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムなどのアジュバントを含む、生理食塩水、グルコース、および他の等張性の液体が、注射用の水性液剤として使用され得る。これらは、アルコール、例えばエタノール；プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどの多価アルコール；ならびにポリソルベート80(商標)およびHCO-50などの非イオン性界面活性剤など適切な可溶化剤と組み合わせて使用することができる。
【０１３３】
ゴマ油またはダイズ油を、油性の液体として使用することができ、これは可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて使用してもよく、かつリン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、塩酸プロカインのような鎮痛剤、ベンジルアルコールおよびフェノールのような安定化剤、ならびに/または抗酸化剤と共に製剤化してもよい。調製した注射剤は、適切なアンプルに充填することができる。
【０１３４】
直腸投与用の製剤には、ココアバターまたはポリエチレングリコールなど標準的な担体を伴う坐剤が含まれる。口に、例えば口腔内または舌下に局所投与するための製剤には、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの風味付きの基剤中に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチン、グリセリン、スクロース、またはアラビアゴムなどの基剤中に活性成分を含む香錠が含まれる。活性成分を鼻腔内投与する場合、液体スプレーもしくは分散性の散剤、または滴剤の形態で使用され得る。滴剤はまた、1種もしくは複数種の分散剤、可溶化剤、または懸濁化剤を含む水性または非水性の基剤と共に製剤化することができる。
【０１３５】
吸入による投与の場合、組成物は、注入器、ネブライザー、加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の好都合な手段から都合よく送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体など適切な噴射剤を含み得る。加圧したエアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって、決定され得る。
【０１３６】
または、吸入もしくは吹入による投与の場合、組成物は、乾燥粉末組成物、例えば活性成分とラクトースまたはデンプンなど適切な粉末基剤との粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、単位剤形、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックに入れて提供されてもよく、散剤は、吸入器または注入器の補助によりこれらから投与され得る。
【０１３７】
他の製剤には、治療物質を放出する、埋め込み可能な器具および接着性のパッチが含まれる。
【０１３８】
所望の場合には、活性成分の持続放出を与えるように適合された、前述の製剤が使用され得る。薬学的組成物は、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存剤など他の活性成分も含んでよい。具体的に前述した成分に加えて、本発明の製剤は、該当する製剤のタイプを考慮して、当技術分野において慣例的な他の作用物質を含み得ること、例えば経口投与に適したものは矯味剤を含み得ることが、理解されるべきである。
【０１３９】
好ましい投薬単位製剤は、下記の「癌を治療または予防するための方法」の項目で挙げられるように、本発明の各活性成分またはその適切な分割量を有効量含むものである。
【０１４０】
IV-1. スクリーニングされた物質を含む薬学的組成物
本発明は、前述した本発明のスクリーニング方法によって選択された物質のいずれかを含む、癌を治療または予防するための組成物を提供する。
【０１４１】
本発明の方法によってスクリーニングされた物質は、直接投与してもよく、または上記に詳述した任意の従来の薬学的製剤方法に従って製剤化して、剤形にしてもよい。
【０１４２】
IV-2. siRNAを含む薬学的組成物
RASGEF1A遺伝子に対するsiRNA(以下「RASGEF1A siRNA」とも呼ぶ」を用いて、この遺伝子の発現レベルを低下させることができる。本明細書において、「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨ぐ二本鎖RNA分子を意味する。本発明の文脈において、siRNAは、上方制御されたマーカー遺伝子RASGEF1Aに対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。siRNAは、標的遺伝子のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方を含むように、すなわちヘアピン構造を含むヌクレオチドになるように構築される。
【０１４３】
RASGEF1A遺伝子のsiRNAは、標的mRNAにハイブリダイズする、すなわち通常は一本鎖のmRNA転写物と結合し、それによってmRNAの翻訳を妨害し、最終的にその遺伝子によってコードされるポリペプチドの産生(発現)を低減させるか、または阻害する。したがって、本発明のsiRNA分子は、ストリンジェントな条件下で、RASGEF1A遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズする能力によって、定義することができる。
【０１４４】
本発明の文脈において、siRNAの長さは、好ましくは500、200、100、50、または25ヌクレオチド未満である。より好ましくは、siRNAの長さは、19〜25ヌクレオチドである。RASGEF1A siRNAの例示的な標的核酸配列には、SEQ ID NO：9または13のヌクレオチド配列が含まれる。配列中のヌクレオチド「t」は、RNAまたはその誘導体においては「u」に置き換えられるはずである。したがって、例えば本発明は、ヌクレオチド配列5'-gagaauggcacagugaaga-3'(SEQ ID NO：9)または5'-caucuacuuccugcacaaa-3'(SEQ ID NO：13)を含む二本鎖RNA分子を提供する。siRNAの阻害活性を増強するために、ヌクレオチド「u」を標的配列のアンチセンス鎖の3'末端に付加することができる。付加される「u」の数は、少なくとも2個、一般には2〜10個、好ましくは2〜5個である。付加された「u」は、siRNAのアンチセンス鎖の3'末端で一本鎖を形成する。
【０１４５】
任意のヌクレオチド配列からなるループ配列をセンス配列とアンチセンス配列の間に配置して、ヘアピンループ構造を形成させることができる。したがって、本発明はまた、一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有するsiRNAも提供し、式中[A]は、RASGEF1A遺伝子のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列に対応するリボヌクレオチド配列である。好ましい態様において、[A]は、RASGEF1A遺伝子の配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は、3〜23個のヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ[A']は、[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である。領域[A]は[A']にハイブリダイズし、次いで領域[B]からなるループが形成される。ループ配列の長さは、好ましくは、3〜23ヌクレオチドでよい。例えば、ループ配列は、以下の配列からなる群より選択することができる(http：//www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)：
CCC、CCACC、またはCCACACC：Jacque JM et al., Nature 2002, 418：435-8。
UUCG：Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20：500-5；Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4)：1639-44。
UUCAAGAGA：Dykxhoorn DM et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003, 4：457-67。
【０１４６】
「UUCAAGAGA(DNAでは「ttcaagaga」)」は、特に適切なループ配列である。さらに、23ヌクレオチドからなるループ配列も、活性なsiRNAを提供する(Jacque J-M et al., Nature 2002, 418：435-8)。
【０１４７】
本発明の文脈において使用するのに適した例示的なヘアピンsiRNAには、RASGEF1A-siRNAの場合、
5'-gagaauggcacagugaaga-[B]-ucuucacugugccauucuc-3'(SEQ ID NO：9の標的配列に対する)；および
5'-caucuacuuccugcacaaa-[B]-uuugugcaggaaguagaug-3'(SEQ ID NO：13の標的配列に対する)が含まれる。
【０１４８】
適切なsiRNAのヌクレオチド配列は、Ambion社のウェブサイト(http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)から入手可能なsiRNA設計コンピュータプログラムを用いて設計することができる。コンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいてsiRNA合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
【０１４９】
siRNA標的部位の選択：
1．対象となる転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschlらは、5'および3'非翻訳領域(UTR)および開始コドン近傍(75ヌクレオチド以内)の領域が、調節タンパク質結合部位においてより富んでいる可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計しないことを推奨している。UTR-結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
2．潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、かつ他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を、考慮の対象から排除する。相同性検索は、BLAST(Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997, 25：3389-402; J Mol Biol 1990, 215：403-10.)を用いて実施することができ、これはNCBIサーバー上のwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で確認することができる。
3．合成に適した標的配列を選択する。Ambionでは、好ましくは数個の標的配列を遺伝子の長さに沿って選択して評価することができる。
【０１５０】
細胞にsiRNAを導入するための標準的な技術が使用され得る。例えば、RASGEF1AのsiRNAを、mRNA転写物に結合することができる形態で、細胞中に直接導入することができる。これらの態様において、本発明のsiRNA分子は、典型的には、アンチセンス分子に関して前述したように修飾される。他の修飾もまた可能である。例えば、コレステロールを結合したsiRNAは、改善された薬理学的特性を示した(Song et al., Nature Med 2003, 9：347-51)。
【０１５１】
または、siRNAをコードするDNAは、ベクター中に保有されてもよい(以下「siRNAベクター」とも呼ぶ)。このようなベクターは、例えば(DNA分子の転写により)両方の鎖の発現が可能になる様式でその配列に隣接している機能的に連結された調節配列(例えば、核内低分子RNA(snRNA)U6由来のRNAポリメラーゼIII転写単位またはヒトH1 RNAプロモーター)を有する発現ベクター中に標的RASGEF1A遺伝子配列をクローニングすることによって、作製することができる(Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20：500-5)。例えば、RASGEF1A遺伝子のmRNAに対するアンチセンスであるRNA分子は、第一のプロモーター(例えば、クローン化DNAのプロモーター配列3')によって転写され、RASGEF1A遺伝子のmRNAに対するセンス鎖であるRNA分子は、第二のプロモーター(例えば、クローン化DNAのプロモーター配列5')によって転写される。センス鎖およびアンチセンス鎖は、インビボでハイブリダイズして、RASGEF1A遺伝子の発現をサイレンシングするためのsiRNA構築物を生じる。または、2つの構築物を使用して、一本鎖siRNA構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製することもできる。この場合、二次構造、例えばヘアピンを有する構築物は、標的遺伝子のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方を含む単一の転写物として作製される。
【０１５２】
したがって、癌を治療または予防するための本発明の薬学的組成物は、siRNA、またはインビボでsiRNAを発現するベクターのいずれかを含む。
【０１５３】
細胞中にsiRNAベクターを導入するために、トランスフェクション促進剤を使用することができる。FuGENE6(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)、およびNucleofector(Wako pure Chemical)は、トランスフェクション促進剤として有用である。したがって、本発明の薬学的組成物は、このようなトランスフェクション促進剤をさらに含んでよい。
【０１５４】
IV-3. アンチセンス核酸を含む薬学的組成物
RASGEF1A遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸は、様々な癌細胞において上方制御されている遺伝子の発現レベルを低下させるのに使用することができ、癌の治療に有用であり、したがって本発明に包含される。アンチセンス核酸は、RASGEF1A遺伝子のヌクレオチド配列もしくはそれに対応するmRNAに結合し、それによってその遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/またはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害することによって、作用する。したがって、結果として、アンチセンス核酸は、RASGEF1Aタンパク質が癌細胞において機能するのを阻害する。本明細書において、「アンチセンス核酸」という語句は、標的配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドを意味し、かつ標的配列に完全に相補的なヌクレオチドだけでなく、1つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを含むヌクレオチドも含む。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、RASGEF1A遺伝子またはその相補的配列の少なくとも15個の連続的ヌクレオチドの範囲に渡って、少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは少なくとも80％またはそれ以上、より好ましくは少なくとも90％またはそれ以上、さらにより好ましくは少なくとも95％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野において公知のアルゴリズムを使用して、このような相同性を決定することができる。
【０１５５】
本発明のアンチセンス核酸は、遺伝子のDNAまたはmRNAに結合し、それらの転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害することにより、RASGEF1A遺伝子によってコードされるタンパク質を産生する細胞に対して作用し、最終的にそのタンパク質が機能するのを阻害する。
【０１５６】
本発明のアンチセンス核酸は、核酸に対して不活性である適切な基剤材料と混合することによって、リニメント剤またはバップ剤などの外用製剤に調剤することができる。
【０１５７】
また、必要に応じて、本発明のアンチセンス核酸は、賦形剤、等張化剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤などを添加することによって、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤、および凍結乾燥剤に製剤化することもできる。アンチセンス封入剤もまた、耐久性および膜透過性を高めるために使用することができる。例には、リポソーム、ポリ-L-リシン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、またはこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。これらは、以下の公知の方法によって調製することができる。
【０１５８】
本発明のアンチセンス核酸は、RASGEF1Aタンパク質の発現を阻害し、かつこのタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。さらに、本発明のアンチセンス核酸を含む発現阻害物質は、RASGEF1Aタンパク質の生物活性を阻害することができるという点で有用である。
【０１５９】
本発明のアンチセンス核酸には、修飾されたオリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、チオエート化オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を与えるために使用され得る。
【０１６０】
IV-4. 抗体を含む薬学的組成物
様々な癌において過剰発現されているRASGEF1A遺伝子の遺伝子産物の機能は、この遺伝子産物に結合するか、または別の方法でその機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。RASGEF1Aポリペプチドに対する抗体をこのような化合物として挙げることができ、かつ癌を治療または予防するための薬学的組成物の活性成分としてこれを使用することができる。
【０１６１】
本発明は、RASGEF1A遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体、またはこれらの抗体の断片の使用に関する。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、抗体を合成するために使用された抗原(すなわち、上方制御されたマーカーの遺伝子産物)またはそれに密接に関連した抗原とのみ相互作用(すなわち、結合)する、特異的な構造を有する免疫グロブリン分子を意味する。抗体を合成するために使用された抗原を含む分子、およびこの抗体によって認識される抗原のエピトープを含む分子を、それに密接に関連した抗原として挙げることができる。
【０１６２】
さらに、本発明の薬学的組成物において使用される抗体は、RASGEF1A遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体でもよい(例えば、抗RASGEF1A抗体の免疫学的活性断片)。例えば、抗体断片は、H鎖およびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結されているFab、F(ab')2、Fv、または単鎖Fv(scFv)でよい(Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988,  85：5879-83)。このような抗体断片は、パパインまたはペプシンのような酵素で抗体を処理することによって作製してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクター中に挿入し、かつ適切な宿主細胞中で発現させてもよい(例えば、Co MS et al., J Immunol 1994, 152：2968-76；Better M et al., Methods Enzymol 1989, 178：476-96；Pluckthun A et al., Methods Enzymol 1989, 178：497-515；Lamoyi E, Methods Enzymol 1986, 121：652-63；Rousseaux J et al., Methods Enzymol 1986, 121：663-9；Bird RE et al., Trends Biotechnol 1991, 9：132-7を参照されたい)。
【０１６３】
抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)のような様々な分子と結合させることによって、修飾してもよい。本発明は、このような修飾抗体を含む。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。このような修飾方法は、当技術分野において通常である。
【０１６４】
または、本発明のために使用される抗体は、RASGEF1Aポリペプチドに対する非ヒト抗体由来の可変領域およびヒト抗体由来の定常領域を有するキメラ抗体、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト抗体由来のフレームワーク領域(FR)および定常領域を含むヒト化抗体でよい。このような抗体は、公知の技術を用いて調製することができる。ヒト化は、げっ歯動物のCDRまたはCDR配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施することができる(例えば、Verhoeyen et al., Science 1988, 239：1534-6を参照されたい)。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体である。
【０１６５】
ヒトのフレームワークおよび定常領域に加えてヒト可変領域を含む完全ヒト抗体もまた、使用することができる。このような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を含む(例えば、Hoogenboom et al., J Mol Biol 1992, 227：381)。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって、作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第6,150,584号、第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、および第5,661,016号において説明されている。
【０１６６】
得られた抗体がヒトの身体に投与される場合(抗体治療)、免疫原性を減少させるために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
【０１６７】
前述のようにして得られた抗体を、均一になるまで精製してもよい。例えば、抗体の分離および精製は、一般のタンパク質に対して使用される分離および精製方法に従って実施することができる。例えば、抗体は、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などを適切に選択し併用することによって、分離および単離することができる(Antibodies：A Laboratory Manual. Ed HarlowおよびDavid Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフイニティーカラムとして使用することができる。使用される例示的なプロテインAカラムには、例えばHyper D、POROS、およびセファロースF.F(Pharmacia)が含まれる。
【０１６８】
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィーを除いて、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーなどが含まれる(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R.Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。クロマトグラフィーの方法は、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって実施することができる。
【０１６９】
V. 癌を治療または予防するための方法
癌細胞において生じる特異的な分子変化を対象とする癌治療は、進行癌の治療用のトラスツズマブ(ハーセプチン)、慢性骨髄性白血病用のメシル酸イマチニブ(グリベック)、非小細胞肺癌(NSCLC)用のゲフィチニブ(イレッサ)、ならびにB細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫用のリツキシマブ(抗CD20 mAb)などの抗腫瘍薬剤の臨床開発および規制認可を通して、確認された(Ciardiello F et al., Clin Cancer Res 2001, 7：2958-70, Review；Slamon DJ et al., N Engl J Med 2001, 344：783-92；Rehwald U et al., Blood 2003, 101：420-4；Fang G et al., Blood 2000, 96：2246-53)。これらの薬物は、臨床的に有効であり、かつ形質転換細胞のみを標的にするため、従来の抗腫瘍剤より耐容性がよい。したがって、このような薬物により、癌患者の生存および生活の質が改善されるだけでなく、分子を標的とする癌治療の概念が実証される。さらに、標的化薬物は、標準的な化学療法と組み合わせて使用された場合に、その有効性を高めることができる(Gianni L, Oncology 2002, 63 Suppl 1：47-56；Klejman A et al., Oncogene 2002, 21：5868-76)。したがって、将来の癌治療はおそらく、血管形成および侵襲性など腫瘍細胞の様々な特徴を対象とする標的特異的な作用物質と、従来の薬物を組み合わせることを伴うと考えられる。
【０１７０】
これらの調節的な方法は、(例えば、細胞を作用物質と共に培養することにより)エクスビボもしくはインビトロで、または別の方法として、(作用物質を対象に投与することにより)インビボで実施することができる。これらの方法は、差次的に発現される遺伝子の異常な発現またはそれらの遺伝子産物の異常な活性を打ち消すための治療法として、タンパク質もしくはタンパク質の組み合わせ、または核酸分子もしくは核酸分子の組み合わせを投与することを含む。
【０１７１】
遺伝子および遺伝子産物の発現レベルまたは生物活性が、(その疾患または障害に罹患していない対象と比較して)それぞれ上昇していることを特徴とする疾患および障害は、過剰発現された遺伝子の活性に拮抗する(すなわち、低下させるか、または阻害する)治療物質で治療することができる。活性に拮抗する治療物質は、治療的または予防的に投与することができる。
【０１７２】
したがって、本発明の文脈において使用され得る治療物質には、例えば(i)過剰発現されたRASGEF1A遺伝子のポリペプチド、またはその類似体、誘導体、断片、もしくは相同体；(ii)過剰発現された遺伝子もしくは遺伝子産物に対する抗体；(iii)過剰発現された遺伝子をコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸もしくは「機能障害性」である核酸(すなわち、過剰発現された遺伝子の核酸内への異種挿入に起因する)；(v)低分子干渉RNA(siRNA)；または(vi)調節物質(すなわち、阻害物質、過剰発現されたポリペプチドとその結合相手との相互作用を変更するアンタゴニスト)が含まれる。機能障害性のアンチセンス分子は、相同組換えによってポリペプチドの内因性機能を「ノックアウト」するのに使用される(例えば、Capecchi, Science 1989, 244：1288-92を参照されたい)。
【０１７３】
レベルの上昇は、(例えば生検組織から)患者の組織試料を採取し、かつRNAまたはペプチドのレベル、発現されたペプチド(または発現が変更された遺伝子のmRNA)の構造および/または活性についてインビトロでそれを分析することにより、ペプチドおよび/またはRNAを定量することによって、容易に検出することができる。当技術分野内で周知である方法には、(例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降法とそれに続くドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などによる)イムノアッセイ法、および/またはmRNAの発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ法(例えば、ノーザンブロットアッセイ法、ドットブロット法、インサイチューハイブリダイゼーションなど)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７４】
予防的投与は、疾患または障害が予防されるか、またはその進行が遅延されるように、疾患の顕性の臨床症状が発現する前に実施する。
【０１７５】
本発明の治療方法は、RASGEF1A遺伝子産物の1つまたは複数の活性を調節する物質と細胞を接触させる段階を含み得る。タンパク質活性を調節する物質の例には、核酸、タンパク質、このようなタンパク質の天然の同系リガンド、ペプチド、ペプチド模倣体、および他の小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
したがって、本発明は、RASGEF1A遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を低減させることによって、対象において癌の症状を治療もしくは緩和するか、または癌を予防するための方法を提供する。本発明の方法は、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫を治療または予防するのに特に適している。
【０１７７】
適切な治療物質を、癌に罹患しているか、または癌を発症するリスクがある(もしくは発症しやすい)対象に予防的または治療的に投与することができる。このような対象は、標準の臨床的方法を用いることによって、またはRASGEF1A遺伝子の異常な発現レベル(「上方制御」もしくは「過剰発現」)もしくはその遺伝子産物の異常な活性を検出することによって、特定することができる。
【０１７８】
本発明のある局面によれば、本発明の方法によってスクリーニングされた物質を、癌を治療または予防するために使用してもよい。当業者に周知の方法を使用して、例えば動脈内注射、静脈内注射、もしくは皮内注射として、または鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、もしくは経口投与として、患者に該物質を投与してもよい。該物質がDNAによってコード可能である場合、そのDNAを遺伝子療法用のベクターに挿入し、患者にそのベクターを投与して、療法を実施することができる。
【０１７９】
投薬量および投与方法は、治療しようとする患者の体重、年齢、性別、症状、状態、および投与方法によって異なる。しかしながら、当業者は、適切な投薬量および投与方法を規定どおりに選択することができる。
【０１８０】
例えば、RASGEF1Aポリペプチドに結合し、そのポリペプチドの活性を調節する物質の用量は、前述した様々な要因に依存するが、用量は一般に、正常なヒト成人(体重60kg)に経口投与される場合、1日当たり約0.1 mg〜約100 mg、好ましくは1日当たり約1.0 mg〜約50 mg、およびより好ましくは1日当たり約1.0 mg〜約20 mgである。
【０１８１】
正常なヒト成人(体重60kg)への注射の形態で作用物質を非経口的に投与する場合、患者、標的器官、症状、および投与方法によっていくらかの違いはあるものの、1日当たり約0.01 mg〜約30 mg、好ましくは1日当たり約0.1 mg〜約20 mg、およびより好ましくは1日当たり約0.1 mg〜約10 mgの用量を静脈内注射することが好都合である。他の動物の場合、適切な投薬量は、体重60kgに変換することによって、規定どおりに算出してもよい。
【０１８２】
同様に、本発明の薬学的組成物は、癌を治療または予防するために使用され得る。当業者に周知の方法を使用して、例えば動脈内注射、静脈内注射、もしくは皮内注射として、または鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、もしくは経口投与として、患者に組成物を投与してもよい。
【０１８３】
前述した各状態に対して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、1日当たり約0.1 mg/kg〜約250 mg/kgの範囲の用量で経口的に、または注射によって投与され得る。ヒト成人に対する用量範囲は、一般に約5 mg/日〜約17.5 g/日、好ましくは約5 mg/日〜約10 g/日、および最も好ましくは約100 mg/日〜約3 g/日である。錠剤、または個別の単位で提供される形態の他の単位剤形は、便宜的に、そのような投薬量で、またはその倍数量として効果的である量を含んでよく、例えば各単位は、約5 mg〜約500 mg、通常、約100 mg〜約500 mgを含む。
【０１８４】
使用される用量は、対象の年齢、体重、および性別、治療される厳密な疾患およびその重症度を含む、いくつかの要因に依存すると考えられる。同様に、投与経路も、状態およびその重症度に応じて異なってよい。任意の事象において、適切な投薬量および最適投薬量は、前述の要因を考慮して、当業者が規定どおりに算出してもよい。
【０１８５】
具体的には、RASGEF1A遺伝子に対するアンチセンス核酸は、患部に直接適用することによって、または疾患部位に到達するように血管中に注入することによって、患者に与えることができる。
【０１８６】
本発明のアンチセンス核酸誘導体の投薬量は、患者の状態に応じて適宜調整し、かつ所望の量で使用することができる。例えば、0.1 mg/kg〜100 mg/kg、好ましくは0.1 mg/kg〜50 mg/kgの用量範囲を投与することができる。
【０１８７】
VI. 癌に対するワクチン接種
本発明は、RASGEF1A遺伝子によってコードされるポリペプチド(すなわちRASポリペプチド)、該ポリペプチドの免疫学的活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを、対象に投与する段階を含む、該対象において癌を治療または予防するための方法に関する。本発明において、癌に対するワクチンとは、動物に接種された際に抗腫瘍免疫を誘導する能力を有する物質を意味する。
【０１８８】
このようなワクチンを投与すると、対象に抗腫瘍免疫が誘導される。本発明によれば、RASGEF1Aポリペプチドおよびその免疫学的活性断片は、RASGEF1A遺伝子を発現する癌細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得る、HLA-A24またはHLA-A*0201拘束性エピトープペプチドであることが示唆された。したがって、本発明はまた、RASGEF1A遺伝子によってコードされるポリペプチド(すなわちRASポリペプチド)、該ポリペプチドの免疫学的活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを対象に投与することによって、抗腫瘍免疫を必要とする該対象にそれを誘導するための方法にも関する。
【０１８９】
これらの方法は、ICC、膀胱癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、腎臓癌、軟部組織肉腫、膵臓癌、および精上皮腫を治療または予防するのに特に適している。
【０１９０】
一部の場合において、RASGEF1Aタンパク質またはその免疫学的活性断片は、T細胞受容体(TCR)に結合した形態、またはマクロファージ、樹状細胞(DC)、B細胞、もしくはPBMCなどのAPCによって提示された形態で投与され得る。DCの抗原提示能力は強力であるため、APCのうちではDCの使用が最も好ましい。
【０１９１】
一般に、抗腫瘍免疫は以下のような免疫応答を含む：
-腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
-腫瘍を認識する抗体の誘導、および
-抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
【０１９２】
したがって、ある種のタンパク質が、動物に接種された際にこれらの免疫応答のいずれか1つを誘導する場合、そのタンパク質は、抗腫瘍免疫を誘導する効果を有すると判定される。RASGEF1Aポリペプチドの任意のタンパク質断片が、本発明の方法の免疫学的活性断片として使用され得る。
【０１９３】
タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、インビボまたはインビトロで、そのタンパク質に対して宿主における免疫系の応答を観察することによって検出することができる。
【０１９４】
例えば、CTLの誘導を検出するための方法が周知である。具体的には、生体に侵入する外来物質は、APCの作用によって、T細胞およびB細胞に対して提示される。APCによって提示される抗原に抗原特異的な様式で応答するT細胞は、抗原による刺激によりCTLに分化し、次いで増殖する(これは、T細胞の活性化と呼ばれる)。したがって、ある種のペプチドによるCTL誘導は、APCを介してそのペプチドをT細胞に提示し、かつCTLの誘導を検出することによって評価することができる。さらに、APCは、CD4+T細胞、CD8+T細胞、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞を活性化する効果を有する。CD4+T細胞およびCD8+T細胞もまた、抗腫瘍免疫において重要であるため、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価することができる。
【０１９５】
APCとしてDCを用いてCTLの誘導作用を評価するための方法は、当技術分野において周知である。DCは、APCのうちで最も強力なCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。RASGEF1Aポリペプチドの断片が免疫学的に活性であるかどうか、および本発明の方法において使用することができるかどうかを判定するために、試験ポリペプチド(すなわち、RASGEF1Aポリペプチドの任意の断片)を最初にDCと接触させ、次いでDCをT細胞と接触させる。DCと接触させた後に、関心対象の細胞に対する細胞障害性効果を有するT細胞が検出される場合、その試験ポリペプチドが、細胞傷害性T細胞を誘導する活性を有することが示される。腫瘍に対するCTLの活性は、例えば51Crで標識された腫瘍細胞の溶解を指標として用いて、検出することができる。または、3H-チミジン取り込み活性またはLDH(ラクトースデヒドロゲナーゼ)放出を指標として用いて腫瘍細胞の損傷の程度を評価するための方法も周知である。
【０１９６】
DC以外では、APCとしてPBMCを使用してもよい。CTLの誘導は、GM-CSFおよびIL-4の存在下でPBMCを培養することによって亢進されることが報告されている。同様に、CTLは、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびIL-7の存在下でPBMCを培養することによって誘導されることも示された。
【０１９７】
これらの方法によってCTL誘導活性を有することが確認された試験ポリペプチドは、DC活性化効果およびそれに続くCTL誘導活性を有するポリペプチドであるとみなされる。したがって、腫瘍細胞に対するCTLを誘導するポリペプチドは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、そのポリペプチドとの接触を通じて、腫瘍に対するCTLを誘導する能力を獲得したAPCもまた、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、APCによるポリペプチド抗原の提示により、細胞傷害性を獲得したCTLもまた、腫瘍に対するワクチンとして使用することができる。APCおよびCTLに起因する抗腫瘍免疫を用いたこのような腫瘍の治療方法は、細胞性免疫療法と呼ばれる。
【０１９８】
一般に、細胞性免疫療法のためにポリペプチドを使用する場合、CTL誘導の効率は、異なる構造を有する複数のポリペプチドを組み合わせ、かつそれらをDCと接触させることによって上昇することが公知である。したがって、DCをタンパク質断片で刺激する場合、複数のタイプの断片の混合物を使用することが有利である。
【０１９９】
または、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することによって確認することもできる。例えば、あるポリペプチドに対する抗体が、そのポリペプチドで免疫化された実験動物において誘導される場合、および腫瘍細胞の増殖がこれらの抗体によって抑制される場合、そのポリペプチドは、抗腫瘍免疫を誘導する能力を有するとみなされる。
【０２００】
抗腫瘍免疫は、本発明のワクチンを投与することによって誘導され、抗腫瘍免疫の誘導は癌の治療および予防を可能にする。癌に対する療法または癌の発症の予防は、以下の段階、例えば癌細胞の増殖の阻害、癌の退縮、および癌発病の抑制のいずれかを含む。癌を有する個体の死亡率および罹患率の低下、血液中の腫瘍マーカーレベルの低下、癌に付随する検出可能な症状の緩和なども、癌の療法または予防に含まれる。このような治療効果および予防効果は、好ましくは統計学的に有意である。例えば、観察において、細胞増殖性疾患に対するワクチンの治療効果または予防効果が、ワクチン投与を伴わない対照と比較される場合、5％またはそれ以下の有意水準である。例えば、スチューデントのt検定、マン・ホイットニーU検定、またはANOVAを、統計学的解析のために使用してもよい。
【０２０１】
前述のRASGEF1Aポリペプチドもしくは免疫学的活性を有するその断片、またはそれらをコードするベクターは、アジュバントと組み合わせてよい。アジュバントとは、このポリペプチドまたは免疫学的活性を有する断片と一緒に(または連続的に)投与された場合、RASGEF1Aポリペプチドに対する免疫応答を増強する化合物を意味する。例示的なアジュバントには非限定的に、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバンなどが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と適切に組み合わせてもよい。このような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などが含まれる。さらにワクチンは、必要に応じて安定化剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤なども含んでよい。ワクチンは、全身的または局所的に投与することができる。ワクチン投与は、単回投与によって実施しても、または複数回投与によって追加免疫してもよい。
【０２０２】
本発明のワクチンとしてAPCまたはCTLを使用する場合、例えばエクスビボの方法によって腫瘍を治療または予防することができる。より具体的には、治療または予防を受ける対象のPBMCを採取し、それらの細胞をRASGEF1Aポリペプチドまたはその断片とエクスビボで接触させ、APCまたはCTLを誘導した後それらの細胞を対象に投与してもよい。APCは、ポリペプチドをコードするベクターをエクスビボでPBMC中に導入することによっても、誘導することができる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは、クローニングした後に投与することができる。標的細胞を障害する活性が高い細胞をクローニングし、増殖させることによって、細胞性免疫療法をより効果的に実施することができる。さらに、この様式で単離されたAPCおよびCTLは、それらの細胞が由来する個体に対してだけでなく、他の個体由来の同様のタイプの腫瘍に対する細胞性免疫療法のためにも使用され得る。
【０２０３】
さらに、RASGEF1Aポリペプチドまたはその免疫学的活性断片の薬学的有効量を含む、癌のような細胞増殖性疾患を治療または予防するための薬学的組成物が提供される。このような薬学的組成物は、抗腫瘍免疫を上昇させるために使用され得る。
【０２０４】
以下に、実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の材料、方法、および実施例は、本発明の局面を例示するに過ぎず、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。したがって、本明細書において説明されるものと同様または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができる。
【０２０５】
実施例
I. 材料および方法
1. 細胞株および組織標本
サル腎臓細胞株COS7およびマウス線維芽細胞細胞株NIH3T3を、American Type Culture Collection(ATCC)から入手した。ヒト胆管癌細胞株SSP25をJapanese Collection of Research Bioresources(JCRB)から入手した。細胞はすべて、以下のような適切な培地中で単層として培養した：COS7およびNIH3T3に対してはダルベッコ改変イーグル培地(Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO)；ならびにSSP25に対してはRPMI1640(Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO)。臨床的組織は、インフォームドコンセントを得て、肝切除を受けた患者の外科的標本から得た。
【０２０６】
2. RNA調製および半定量的RT-PCR
本発明者らは、レーザーマイクロビームによる顕微解剖技術を用いて、胆管癌細胞の純粋な集団、ならびに非癌性の胆管上皮を外科的標本から採取した。切片の調製、レーザーマイクロビームによる顕微解剖、全RNAの抽出、T7に基づく増幅を、以前に記載のように実施した(Nakamura T et al., Oncogene 2004, 23：2385-400)。ICCを有さない患者10名に由来する肝臓組織中の正常な肝内胆管上皮細胞の混合物を、普遍的な対照として調製した。製造業者のプロトコールに従ってTRIZOL試薬(Invitrogen)を用いて、培養細胞から全RNAを抽出した。抽出したRNAを、Superscript II逆転写酵素(Life Technologies)と共にポリdT12-18プライマー(Amersham Biosciences)を用いて、一本鎖cDNAに逆転写した。各一本鎖cDNAを後続のPCR増幅のために希釈した。標準的なRT-PCRは、GeneAmp PCRシステム9700(Perkin-Elmer)において、体積12μlのPCR緩衝液(TAKARA)中で実施し、変性のために94℃で4分間、続いて94℃で20秒間を25サイクル(ACTBの場合)または30サイクル(RASGEF1Aの場合)、53℃(ACTBの場合)または60℃(RASGEF1Aの場合)で30秒間、72℃で30秒間、増幅させた。プライマー配列は以下の通りであった；
ACTBに対して、5'-CAAGATGAGATTGGCATGG-3'(SEQ ID NO：3)および5'-TCTCCTTAGAGAGAAGTGG-3'(SEQ ID NO：4)；ならびに
RASGEF1Aに対して、5'-TTTGCACTTTCTGAGGTTCTAGC-3'(SEQ ID NO：5)および5'-GTCCTGCATTATGGTACAGCTTC-3'(SEQ ID NO：6)。
【０２０７】
3. ノーザンブロット解析
ヒト多組織ノーザンブロット(Clontech)を、32Pで標識されたRASGEF1A cDNAとハイブリダイズさせた。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を実施した。増感紙を用いて、ブロットのオートラジオグラフを-80℃で120時間撮影した。
【０２０８】
4. RASGEF1Aの細胞内局在
RASGEF1Aのコード領域全体(GenBankアクセッション番号AK095136(SEQ ID NO：1)、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列をコードする)を、プライマーのセット、5'-ATTGAATTCCGGCCAGAATGTTCCTGGAGC-3'(SEQ ID NO：7)および5'-AATCTCGAGGGCTCTGTTCAGAAGGGTGGTC-3'(SEQ ID NO：8)を用いてRT-PCRによって増幅し、かつpCAGGS-n3Fcベクター(pCAGGS-n3Fc-RASGEF1A)の割り当てられた酵素部位中にクローニングした。FLAGでタグ付加したRASGEF1Aを発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトしたNIH3T3細胞をチャンバースライド上に移した。トランスフェクション後24時間目に、培養細胞を、4％パラホルムアルデヒドを含むPBSで15分間固定し、次いで室温で2.5分間、0.1％ Triton X-100を含むPBSを用いて透過性にした。これらの細胞を、4℃で24時間、PBS中3％BSAで覆い、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックし、続いて一次抗体としての抗FLAG抗体(SIGMA F-3165)と共にインキュベートした。抗体を、基質を結合させた抗マウスIgG二次抗体(ICN/CappelおよびJackson Immuno Research)で蛍光染色した。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)で核を対比染色した。蛍光画像は、TCS-SP2スペクトル共焦点スキャンシステム(Leica)を用いて得た。
【０２０９】
5. コロニー形成アッセイ法
COS7細胞に、RASGEF1Aを発現するプラスミド(pCAGGS-n3Fc-RASGEF1A)をトランスフェクトした。アンチセンスRASGEF1Aプラスミド(pCAGGS-n3Fc-RASGEF1A(-))または偽プラスミド(pCAGGS-n3Fc-偽)を発現する細胞を、適切な濃度のジェネテシンと共に14日間インキュベートした。これらの細胞を、100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。製造業者のプロトコールに従って細胞計数キット(DOJINDO, kumamoto, Japan)を用いて、三つ組で細胞生存率を解析した。
【０２１０】
6. RASGEF1Aに対するsiRNA発現ベクターの構築
以前に記載されるように(Shimokawa T et al., Cancer Res 2003, 63：6116-20)、psiH1BX3.0ベクターのBbsI部位中に二本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることによって、siRNAを発現するプラスミドを調製した。対をなすオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りであった：
siRNA-Bに対して、5'-TCCCGAGAATGGCACAGTGAAGATTCAAGAGATCTTCACTGTGCCATTCTC-3'(SEQ ID NO：10)および5'-AAAAGAGAATGGCACAGTGAAGATCTCTTGAATCTTCACTGTGCCATTCTC-3'(SEQ ID NO：11)；
siRNA-Eに対して、5'-TCCCCATCTACTTCCTGCACAAATTCAAGAGATTTGTGCAGGAAGTAGATG-3'(SEQ ID NO：14)および5'-AAAACATCTACTTCCTGCACAAATCTCTTGAATTTGTGCAGGAAGTAGATG-3'(SEQ ID NO：15)；ならびに
siRNA-EGFPに対して、5'-TCCCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(SEQ ID NO：18)および5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(SEQ ID NO：19)。T4-ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した後、対をなすオリゴヌクレオチドを5分間煮沸し、続いてゆっくりと冷却することによってアニールして、二本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。RASGEF1Aの発現を、トランスフェクション後24時間目に半定量的RT-PCRによって検討した。本発明のために使用されるsiRNA配列を以下に示す。
【０２１１】
【表１】
2009505631.tif 000002
【０２１２】
7. 細胞生存性アッセイ法
10 cmディッシュに播種したSSP25細胞(1×106細胞/ディッシュ)に、Nucleofector(AMAXA)またはFuGENE6試薬(Roche Diagnostics)のいずれかを用いて、siRNAを発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、0.9 mg/mlのジェネテシンを添加した10％ウシ胎児血清を含む培地中で、2週間維持した。生存している細胞を、100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。別の実験では、細胞計数キット(DOJINDO, Kumamoto, Japan)を用いて、これらの生細胞を測定した。RASGEF1A発現に対する効果を解析するために、トランスフェクション後24時間目に細胞から全RNAを抽出し、半定量的RT-PCR解析に供した。
【０２１３】
8. Rasヌクレオチド解離アッセイ法
K-Ras(アミノ酸1〜188)、Ha-Ras(アミノ酸1〜188)、N-RAS(アミノ酸1〜189)、RASGEF1A、またはSosの触媒ドメイン(アミノ酸564〜1049)のコード領域全体を、pGEX-6P細菌発現ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)の適切なクローニング部位(BamHIおよびXhoI)中にクローニングした。GST融合タンパク質を、大腸菌(Escherichia coli)のBL21細菌株において発現させ、製造業者のプロトコールに従ってグルタチオン-セファロース4B樹脂(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて、細胞溶解物全体からこの組換えタンパク質を精製した。別の文献に記載されるように(Hall BE et al., J Biol Chem 2001, 276：27629-37)、Rasヌクレオチド解離アッセイ法を実施した。GST-Ras融合タンパク質は、20 mM Tris(pH8.0)、50 mM NaCl、1 mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、1 mMジチオスレイトール、および1 mM EDTAを含む緩衝液100 mlに溶かした40 pmolのRasを、400 pmolの[8-3H]標識GDP(12.4 Ci/mmol；Amersham Biosciences)と共に、恒温振とう水槽中、30℃で15分間インキュベートすることによって、[8-3H]標識グアノシン5'-二リン酸(GDP)と結合させた。この混合物20 mlを、20 mM Tris(pH8.0)、50 mM NaCl、1 mg/ml BSA、1 mMジチオスレイトール、5 mM MgCl2、および0.8 mM GTPgSを含む緩衝液20 ml中の組換えRASGEF1Aと共に、またはこれを伴わずに、30℃で15分間さらにインキュベートした。Sosの触媒ドメインは陽性対照としての機能を果たした。40 mlの氷冷した停止液(20 mM Tris(pH8.0)、50 mM NaCl、および15 mM MgCl2)を添加することによって反応を終結させ、かつこの混合物を四角形のP81ホスホセルロース紙(Upstate；カタログ番号20-134)上にスポットした。氷冷した停止液3 mlで2回洗浄し、フィルターをAlokaLSC-5100液体シンチレーションカウンター上に載せて、Rasと結合した[3H]-GDPの放射活性を測定した。
【０２１４】
9. Ras活性の解析
Rasの活性化を、供給業者のプロトコールに従いRas活性化アッセイキット(Upstate、カタログ番号17-218、ロット番号26220)を使用して、Raf-1プルダウンアッセイ法により測定した。具体的には、Raf-1のRBDを含むアガロースビーズ結合GST融合タンパク質を調製し、RASGEF1Aを発現するプラスミドまたは対照プラスミド(偽)をトランスフェクトしたCOS7細胞由来の溶解物と共に4℃で45分間インキュベートした。Raf-1に結合したタンパク質を沈殿させ、SDS-PAGEで分離し、続いて抗pan-Ras抗体(Upstate)を用いたウェスタンブロット法によって解析した。
【０２１５】
10. 創傷治癒およびマトリゲル浸潤アッセイ法
RASGEF1Aのコード領域全体(GenBankアクセッション番号；AK095136)を、プライマーのセット、5'-ATTGAATTCCGGCCAGAATGTTCCTGGAGC-3'(SEQ ID NO：7)および5'-AATCTCGAGGGCTCTGTTCAGAAGGGTGGTC-3'(SEQ ID NO；8)を用いてRT-PCRによって増幅し、pCAGGS-n3Fcベクターの適切な酵素部位中にクローニングした(pCAGGS-n3Fc-RASGEF1A)。RASGEF1Aを発現するCOS7細胞(COS7-RASGEF1A)および対照細胞(COS7-偽)は、pCAGGS-n3Fc-RASGEF1AプラスミドまたはpCAGGS-偽プラスミドをCOS7細胞にトランスフェクトすることによって樹立した。これらの細胞を、0.9 mg/mlジェネテシンを添加した培地中で維持し、トランスフェクション後2週間目に単一コロニーを選択した。RASGEF1Aの発現を、抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロット法によって確認した。製造業者のプロトコールに従って細胞計数キット(DOJINDO, Kumamoto, Japan)を用いて、三つ組で細胞増殖を解析した。創傷治癒遊走アッセイ法のために、細胞を6ウェルプレート中で2日間、コンフルエントになるまで増殖させ、プラスチック製のピペットの先端で、コンフルエントな単層を十字形に引っ掻いた。いくつかの傷付けた領域に、向きを示すために印を付けて観察し、次いで引っ掻いた後に指定した回数、phase-contact顕微鏡によって撮影した。細胞の浸潤を、孔径8μmのBD BioCoat(商標)マトリゲル(商標)浸潤チャンバー(BD Biosciences, San Jose, CA)を用いて検討した。36時間インキュベーションした後、遊走してチャンバーを通過したCOS7-RASGEF1A細胞およびCOS7-偽細胞の数を、顕微鏡下の5つの独立した視野において計数した。統計学的解析。統計学的有意性は、スチューデントのt検定によって決定した。
【０２１６】
II. 結果
1. 広範囲なヒト癌におけるRASGEF1A発現の増大
27,648個の遺伝子を含むゲノム全域のcDNAマイクロアレイを用いて、本発明者らは、25例のICCの発現プロファイルを解析し、セットされたカットオフフィルターを通過した、腫瘍において発現がしばしば上方制御されている52種の遺伝子を同定した。52種の遺伝子に加え、国立バイオテクノロジー情報センターのUnigeneデータベース(作成番号183)中のHs.125293のESTに対応する施設内アクセッション番号D4223の遺伝子が、正常な肝内胆管上皮と比較して、カットオフフィルターを通過した14例のICCのうち11例(78.6％)において2倍超、有意に上方制御されていることが判明した。本発明者らによって得られたマイクロアレイデータにおいて、D4223発現はまた、膀胱癌9例中8例(88.9％)、肺癌26例中16例(61.5％)、胃癌5例中4例(80％)、結腸直腸癌5例中3例(60％)、前立腺癌3例中1例(33.3％)、慢性骨髄性白血病44例中8例(18.2％)、腎臓癌5例すべて、軟部組織肉腫5例すべて(100％)、膵臓癌3例すべて(100％)、および精上皮腫3例すべて(100％)において、対応する非癌性の対照と比較して2倍超、増大した。続く半定量的RT-PCR解析により、マイクロアレイ解析に供されたICC13例のうち9例においてD4223発現が亢進していることが明らかになった(図1A)。ヒト成人の正常組織におけるD4223の発現レベルを評価するために、本発明者らは、D4223cDNAをプローブとして用いて多組織ノーザンブロット解析を実施し、脳、脊髄において中程度に発現され、かつリンパ節、副腎において弱く発現されるが、検討した19種の他の組織のどれにおいても発現されない、約3.3kbの転写物を特定した(図1B)。この遺伝子はRAS-GEFドメインを含むため、RASGEF1Aと最近名付けられた。推測されるRASGEF1Aアミノ酸配列とのホモロジー検索では、PDZ-GEF2と30％の一致を示し、PDZ-GEF1と29％の一致を示した。
【０２１７】
2. RASGEF1Aの細胞内局在
RASGEF1Aの細胞内局在を調査するために、本発明者らは、プラスミド(p3Xflag-RASGEF1A)のトランスフェクションにより、NIH3T3細胞においてFLAGでタグ付加したRASGEF1Aを発現させ(図2B)、免疫細胞化学的染色を実施した。免疫細胞化学的染色により、RASGEF1Aタンパク質が、トランスフェクトした細胞の細胞質中に局在することが明らかになった(図2A)。
【０２１８】
3. RASGEF1AとICC細胞の増殖との関連
コロニー形成アッセイ法を実施して、COS7細胞におけるRASGEF1Aの発癌活性を検討した。結果として、RASGEF1Aを発現するプラスミド(pCAGGS-n3Fc-RASGEF1A)をこれらの細胞にトランスフェクトした場合、対照プラスミド、pCAGGS-n3Fc-偽、またはpCAGGS-n3Fc-RASGEF1A(-)によるトランスフェクションと比較して、コロニーの数の有意な増加が観察された(図3Aおよび図3B)。細胞増殖における潜在的な役割をさらに評価するために、RASGEF1Aに特異的なsiRNAをネオマイシン耐性遺伝子と共に発現するプラスミドpsiH1BX-RASGEF1A-siBおよびプラスミドpsiH1BX-RASGEF1A-siEを調製した。これらのプラスミドのうちいずれか、または対照プラスミド(psiH1BX-siEGFP、psiH1BX-偽)を、SSP25 ICC細胞にトランスフェクトした。半定量的RT-PCRにより、対照プラスミドのトランスフェクションと比較して、RASGEF1A発現が、psiRNA-BX-RASGEF1A-siBおよびpsiH1BX-RASGEF1A-siEのトランスフェクションにより抑制されることが示された(図3C)。特に、トランスフェクトした細胞の著しい増殖遅延は、対照プラスミドをトランスフェクトした細胞と比較して、siRNA-BおよびsiRNA-Eによって阻害された(図3D)。これらのデータにより、RASGEF1Aの発現は、ICC細胞の増殖および/または生存にとって非常に重要であることが示唆される。
【０２１９】
4. RASGEF1AのRasヌクレオチド解離活性
RASEGF1Aは、推定上のRasGEFドメインを含んでいたため、そのGDP解離活性を検討した。組換えRASGEF1Aタンパク質を含む反応混合物、または含まない反応混合物のいずれかを続いて添加し、シンチレーションカウンターによりGDPの結合したRASを測定した。公知のRASGEFタンパク質であるSOSを陽性対照として使用した。SOSはGDP結合型K-RASを約40％減少させた。同様に、RASGEF1AはGDP結合型K-RASを約50％減少させた(図4A、左上のパネル)。H-RASおよびN-RASに結合したGDPもまた、それぞれ約40％および約80％解離した(図4A、右上のパネルおよび下のパネル)。これらのデータにより、RASEGF1Aが、検討した3種のRASタンパク質すべてに対するGDP解離活性を示すことが示唆される。
【０２２０】
5. RASGEF1AによるRASの活性化
RASGEF1Aが推定上のRASGEFドメインを含んでいたため、RASGEF1AがRASを刺激する活性を有するかどうかをさらに調査した。この活性は、外因性RASGEF1Aを発現するCOS7細胞および対照細胞を用いて測定した。pxFLAG-RASGEF1Aプラスミドをトランスフェクトした細胞由来の抽出物を、抗FLAG抗体を用いてイムノブロット解析したところ、トランスフェクトした細胞における外因性RASGEF1A発現が確認された(図4B、左上のパネル)。これらの細胞または対照細胞由来の抽出物を、RASのエフェクターである組換えRaf-1のプルダウンアッセイ法に供した。結果として、抗pan-Ras抗体を用いたイムノブロット解析によって測定したRaf-1のRBDと相互作用したRasの量は、RASGEF1A発現に応じて増加し(図4B、右上のパネル)、RASGEF1AによってRASの活性が増強されていることが示唆された。
【０２２１】
6. 癌細胞遊走に対するRASGEF1Aの作用
RASファミリータンパク質は、細胞遊走ならびに細胞増殖において重要な役割を果たすことが報告されている。したがって、癌細胞の遊走および浸潤へのRASGEF1Aの関与を検討した。外因性RASGEF1Aを発現するCOS7-RASGEF1A細胞および対照細胞(COS7-偽)を、創傷治癒アッセイ法のために樹立した。図5Aに示すように、COS7-RASGEF1A細胞は急速に遊走し、COS7-偽細胞より有意に速く創傷を塞ぎ、これはRASGEF1Aが細胞の遊走に関連していることを示唆する。さらに、浸潤に対するRASGEF1Aの作用を調査するため、マトリゲルを用いたトランスウェルアッセイ法を実施した。創傷治癒アッセイ法の結果と一致して、チャンバーの孔を通過したCOS7-RASGEF1A細胞の数は、COS7-偽細胞の数と比較して増加した(図5B)。どちらの細胞も同様の増殖速度を有していたため、これらのデータから、細胞遊走へのRASGEF1Aの関与が示唆される。
【０２２２】
III. 結果に関する考察
本発明者らは、本明細書において、ヒトICCにおけるRASGEF1Aの発現増大ならびにK-RAS、H-RAS、およびN-RASに対するそのグアニンヌクレオチド交換活性を実証し、これはその発現の増大が、ICCの発癌において何らかの非常に重要な役割を果たしていることを暗示する。これまでに、5つの構造的に保存された領域を有するコア触媒ドメインを共有するRas-GEFファミリーに属する約20種のメンバーが報告されている(Boguski MSおよびMcCornick F, Nature 1993, 366：643-54；Rebhun JF et al., J Biol Chem 2000, 275：13406-10)。他のRas-GEFメンバーと同様に、RASGEF1Aはこれら5つの保存領域を含んでいた。さらにそれは、コドン49およびコドン178の間にREM(Ras交換モチーフ)またはRasGEFNドメインを有していた。これは、GTP結合ポケットをこじ開ける大型のらせん状ヘアピン構造を安定化すると予想される。しかしながらRASGEF1Aは、Dbl相同(DH)ドメイン、プレクストリン相同(PH)ドメイン、EFハンド、システインに富むC1ドメイン、およびPDZドメインなど任意の付加的な保存ドメインを欠くため、SOS、GRF1、RasGRP、またはPDZ-GEFなどの他のメンバーとは異なる機能を発揮する可能性がある(Quilliam LA et al., Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 2002, 71：391-444)。本発明において、RASGEF1Aは、K-RAS、H-RAS、およびN-RASに対するグアニン-ヌクレオチド交換活性を有することが明らかにされた。他のRas-GEFのメンバーは、異なる範囲の基質を有する；例えば、SOS1は、K-RAS、H-RAS、N-RAS、R-RAS2、R-RAS3、およびRac1を調節するが、R-RASは調節しない；Ras-GRP2は、K-RAS、H-RAS、N-RAS、R-RAS、R-RAS2、Rap1A、Rap2Aを刺激するが、H-RASを刺激しない(Mitin N et al., Current Biology 2005, 15：R563-74)。したがってRASGEF1Aは、本研究において検討されていない基質を特異的に活性化する可能性もあり、かつRasシグナル伝達経路のクロストークに関与している可能性がある。
【０２２３】
最近の研究により、Rasシグナル伝達が、細胞の増殖および生存だけでなく、細胞の運動性および細胞接着にも関与していることが示された。活性なRasは、Raf/MEK/ERK経路、ならびにホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)/Akt経路、RalGDS/Ral経路、およびTiam1/Rac1経路を含む多様なシグナル伝達経路を刺激する複数の下流のエフェクターと相互作用し、かつそれらを調節する。Rasが媒介する細胞増殖におけるRaf/MEK/ERKの関与を示唆する証拠が増えつつある。Raf結合アッセイ法により、RASGEF1Aの存在下での活性化RASの増加が実証され、したがって下流のRaf/MEK/ERKは、RASGEF1A発現細胞において亢進されると予想される。一貫して、特異的siRNAの導入によりRASGEF1Aを抑制すると、ICC細胞の増殖は減少した、このことは増強されたRAF/MEK/ERKシグナル伝達が癌細胞に増殖促進効果を与えるという見解と一致する。RASGEF1Aの発癌活性を試験するための、COS7細胞およびNIH3T3線維芽細胞を用いたコロニー形成アッセイ法において、コロニーの数は、外因性RASGEF1Aを発現する細胞と対照とで違いはなかった。したがって、RASGEF1Aのみの導入は、COS7細胞またはNIH3T3線維芽細胞の形質転換を引き起こすには十分ではない可能性があると考えられる。しかしながら、RASGEF1Aの発癌活性は、組織および/または細胞型に依存性であることが示唆され、かつsiRNA実験により、ICCの細胞成長または増殖を維持するのにRASGEF1Aが不可欠であることが示された。したがって、そのグアニンヌクレオチド交換活性の阻害は、ICCに対する有望な治療選択肢である可能性がある。その増殖促進効果に加えて、Rasは様々なメカニズムによって細胞運動性において役割を果たすと報告されている。PI3キナーゼ活性の増強により、Rac1依存性の様式でβ4インテグリンを介して媒介された乳癌細胞の浸潤が増加した。PI3KはRacGEFも活性化し、かつ細胞運動性に関連するアクチン再構築および膜ラフリングを誘導する。さらに、RasはTiam1を増強し、結果として、遊走およびアクチン細胞骨格に関与するRac1の活性型が生じる。線維芽細胞では、H-RASの活性化が、細胞-細胞外マトリックスの接着において重要な役割を果たす細胞表面受容体であるインテグリンの活性を抑制する(Paul EH et al., Mol Biol Cell 2002, 13：2256-65；Sechler JL et al., J Cell Sci 2000, 113：1491-8)。本発明により、RASGEF1AがRASタンパク質を活性化すること、およびRASGEF1Aの外因性発現がマトリゲルアッセイ法における細胞運動性を向上することが開示された。RASGEF1Aによって運動性が高められるメカニズムを明らかにするにはさらなる調査が必要であるが、RASGEF1Aは、PI3KまたはTiam1の活性化を通じて細胞運動性を向上させることが示唆された。
【０２２４】
本発明者らは、K-Rasの変異の状態とRASGEF1A発現レベルの間の相関関係をさらに調査したが、それらの間にいかなる関係も発見できなかった(データ示さず)。RASGEF1Aの発現の増大が、K-Rasに加えてH-RasおよびN-Rasが活性化するため、K-Rasにおける変異と比較して、RASGEF1Aの蓄積がICCの発癌においてさらなる役割を有する可能性がある。siRNAによるRASGEF1Aの抑制が癌細胞の阻害をもたらすため、RASGEF1AはICCに対する有望な治療標的であり得る。
【０２２５】
産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクションおよびゲノム全域のcDNAマイクロアレイの組み合わせを用いた本明細書に記載の癌の遺伝子発現解析により、癌の予防および治療法に対する標的として、特定の遺伝子が同定された。これらの差次的に発現された遺伝子のサブセットの発現に基づいて、本発明は癌を同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
【０２２６】
本明細書に記載の方法はまた、癌の予防、診断、および治療用のさらなる分子標的の特定に有用である。本明細書において提供されるデータは、癌の包括的な理解の一助となり、新規な診断戦略の開発を促進し、かつ治療的薬物および予防的物質に対する分子標的を特定するための手がかりを提供する。このような情報は、腫瘍形成をより深く理解するのに寄与し、かつ癌を診断し、治療し、かつ最終的には予防するための新規な戦略を開発するための指標を提供する。
【０２２７】
本明細書において引用するすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により組み入れられる。
【０２２８】
さらに、詳細にその特定の態様を参照して本発明を説明したが、前述の記載は本質的に例示的かつ説明的であり、本発明およびその好ましい態様を例示すると意図されることを理解すべきである。ルーチンな実験法によって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正をその中で実施できることを、当業者は容易に認識すると考えられる。したがって本発明は、上記の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって定義されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】図1Aは、13種のICC組織、非癌性の胆管細胞の混合物、および5種の正常組織におけるD4223(RASGEF1A)遺伝子の発現を示す。RASGEF1A遺伝子に特異的なプライマーのセットを用いて、半定量的RT-PCRを実施した。β-アクチン(ACTB)遺伝子の発現は、定量の対照としての機能を果たした。図1Bは、D4223(RASGEF1A)遺伝子の多組織ノーザンブロット解析を示す。
【図２】RASGEF1Aの細胞内局在を示す。図2Aは、FLAGでタグ付加したRASGEF1Aを発現するプラスミドをトランスフェクトしたNIH3T3細胞を用いた、FLAGでタグ付加したRASGEF1Aの免疫細胞化学的蛍光染色の結果を示す。FLAGでタグ付加したタンパク質を抗FLAGマウス抗体で染色し、続いて、FITCと結合させたヤギ抗マウス二次抗体を用いて可視化した(右上のパネル)。DAPIを用いて、核を対比染色した(左上のパネル)。融合した画像を左下のパネルに示す。図2Bでは、これらの細胞におけるFlagでタグ付加したタンパク質の発現を、ウェスタンブロット解析によって解析した。
【図３】図3Aは、RASGEF1Aを発現するプラスミドをトランスフェクトしたCOS7細胞のコロニー形成アッセイ法を示す。pCAGGS-n3Fc-RASGEF1A、pCAGGS-n3Fc-RASGEF1A(-)、またはpCAGGS-n3Fc-偽をトランスフェクトした細胞をギムザ溶液で染色した。図3Bは、細胞計数キットを用いたMTTアッセイ法によって測定した細胞生存率を示す。図3Cは、siRNA(si-Bおよびsi-E)を発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞におけるRASGEF1A遺伝子の発現を示す。EGFP(siEGFP)を発現するプラスミドおよび偽プラスミド(偽)を対照として使用した。半定量的RT-PCRを実施して、siRNAの遺伝子サイレンシング効果を検討した。ACTB遺伝子の発現は、定量の対照としての機能を果たした。図3Dは、RASGEF1Aを抑制するように指定されたsiRNAの増殖抑制効果を示す。siRNAに応答したSSP25細胞の生存率を、細胞計数キットを用いて測定した。
【図４】図4Aは、K-Ras(左上のパネル)、Ha-Ras(右上のパネル)、およびN-RAS(下のパネル)のヌクレオチド解離アッセイ法の結果を示す。組換えGST(白の棒)、SOS(斜線の棒)、またはRASGEF1A(黒の棒)による処理後にRasと相互作用した[3H]-GDPを、そのような処理をせずに得られた結果(影を付けた棒)と比較した相対量である。図4Bは、RASGEF1AのRAS活性化活性を示す。pCAGGS-n3Fc-RASGEF1Aをトランスフェクトした細胞または偽プラスミドをトランスフェクトした細胞からの抽出物をGST-RafRBDプルダウンアッセイ法によって解析した。これらの細胞におけるRASGEF1Aの発現を、抗FLAG抗体を用いたイムノブロット解析によって検討した(左のパネル)。活性型のGTP結合Rasを、組換えRaf-1タンパク質を用いて沈殿させ、かつ抗pan-Ras抗体を用いたウェスタンブロット解析によって解析した(右のパネル)。
【図５】図5Aは、RASGEF1Aまたは偽ベクターをトランスフェクトしたCOS7細胞を用いた創傷治癒アッセイ法の結果を示す。引っ掻いた12時間後および24時間後に、遊走細胞の代表的な画像を撮影した。図5Bは、同じ細胞を用いたマトリゲル浸潤アッセイ法の結果を示す。マトリゲルを通って遊走する細胞の平均数を、5つの異なる視野において計数することによって決定した。実験を繰り返したところ、同様の結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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