(57)【要約】  開示されているのは、ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート（PHAs）産生方法であって、好塩菌は無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができ、好塩菌を無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で培養し、乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生するPHAs産生方法、及び無機塩と単一有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)（PHAs）産生方法であって、好塩菌は無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができ、好塩菌を無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で培養し、乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生するPHAs産生方法。
【請求項２】
前記無機塩の濃度が0.2〜1.0Mである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate)（PHB）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記有機炭素源がグリセロールを含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記有機炭素源がn-プロパノール、プロピオン酸及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレート(polyhydroxyvalerate)(PHV)のコポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株（FERM BP-10995）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌。
【請求項８】
ハロモナス・エスピー KM-1株である、請求項７に記載の好塩菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好塩菌による生分解性プラスチックであるポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)（PHAs）の産生方法およびハロモナス属に属する好塩菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性プラスチックは、微生物などの作用により例えば土壌中に埋めた状態で分解されるため、環境破壊を防止する観点から注目されている。生分解性プラスチックは、通常の難分解性プラスチックよりも価格が高く、性能の点で劣っていたが、これらの欠点についても解消されて実用化の段階に入っており、使用量の増大に合わせて生分解性プラスチックの量産技術が求められている。【０００３】
生分解性プラスチックの一種であるポリヒドロキシアルカノエートは、ラルストニア属水素細菌、ラン藻、メタン資化細菌等広範囲の細菌により、ある種の栄養源（窒素やリンなど）が欠乏した条件で産生される。【０００４】
一方、好塩菌は、グルコースなどを主な炭素源とし、ペプトンや酵母エキスを少量含むpH7.5〜8.56の培地で菌体内に著量のPHBを蓄積することが報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【非特許文献１】Quillaguaman J.; Munoz M.; Mattiasson B.; Hatti-Kaul R.: “Optimizing conditions for poly(beta-hydroxybutyrate) production by Halomonas boliviensis LC1 in batch culture with sucrose as carbon source.” Appl Microbiol Biotechnol 2007 ; 74 ( 5 ) : 981-986
【非特許文献２】Quillaguaman J.; Hashim S.; Bento F.; Mattiasson B.; Hatti-Kaul R.: “Poly(beta-hydroxybutyrate) production by a moderate halophile, Halomonas boliviensis LC1 using starch hydrolysate as substrate.” J Appl Microbiol 2005 ; 99 ( 1 ) : 151-157
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、他の細菌が混入しても安定してPHAsを低コストで生産できる、PHAsの産生方法を提供することを目的とする。本発明はまた、ペプトンや酵母エキス等の複数の有機炭素・窒素源を含む培地を用いることが生育に必須ではなく、高塩濃度、高アルカリ条件下で生育でき、PHAsを産生できる好塩菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、商業的な屋外培養でコンタミがほとんどないことが知られている微細藻類スピルリナの効率的な培養方法を検討していたところ、ある条件下で好塩菌が唯一のコンタミ菌として生育することを認めた。【０００７】
この好塩菌は、pH8.8以上のアルカリ性、高濃度のナトリウムを含む培地で良好に生育するため他のバクテリア等のコンタミが極めて起こりにくいことが推定された。そこで各種の炭素源の資化性を調べるために菌体を培養し、PHAsの生産量を調べたところ著量のPHAsの蓄積を行うことが認められた。【０００８】
各種の炭素源とは、六単糖(グルコース、フラクトース)、五単糖(キシロース、アラビノース)、二糖(スクロース)、糖アルコール(マンニトール、ソルビトール)、酢酸、酢酸ナトリウム、エタノール、グリセロール、可溶性デンプン、n-プロパノール、プロピオン酸等であった。【０００９】
既知の文献において、好塩菌の培養に用いられる培地には、ペプトンや酵母エキスが必ず含まれており、主要な炭素源に加えて、これらの有機炭素・窒素源を少量用いることがPHAsの蓄積を向上させることが示されている(非特許文献１，２)。【００１０】
しかるに、本好塩菌は、ペプトンや酵母エキスは用いることなく、無機塩と単純な有機炭素源を加えた低コストな培地で培養可能であることを本発明者は確認した。従って、本発明の方法および好塩菌は実際の商業培養において有利であると言える。【００１１】
本発明者らは、ある種の好塩菌において、単一の有機炭素源を基質とする場合において、増殖を中心とする工程と、PHAs蓄積を中心とする工程を、自動的、連続的に変換して行い、高価な複数種の有機炭素・窒素源を含むペプトンや酵母エキス等を与えなくても著量のPHAsが蓄積されることを見出した。本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のPHAs産生方法及び好塩菌を提供するものである。
項１．ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)（PHAs）産生方法であって、好塩菌は無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができ、好塩菌を無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で培養し、乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生するPHAs産生方法。
項２．前記無機塩の濃度が0.2〜1.0 Mである、項１に記載の方法。
項３．前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate)（PHB）を含む、項１又は２に記載の方法。
項４．前記有機炭素源がグリセロールを含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートを含む、項１又は２に記載の方法。
項５．前記有機炭素源がn-プロパノール、プロピオン酸及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレート(polyhydroxyvalerate)(PHV)のコポリマーを含む、項１又は２に記載の方法。
項６．前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株（FERM BP-10995）である、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌。
項８．ハロモナス・エスピー KM-1株である、項７に記載の好塩菌。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の好塩菌によるPHAs産生方法によれば、PHAs生産に際し従来のようにペプトンや酵母エキス等の高価な有機炭素・窒素源を用いずともPHAsの蓄積を一段階の培養で、他のバクテリアのコンタミが起こりにくい環境で行うことができる。本発明において、好塩菌は、ペプトンや酵母エキス等の複数の有機炭素・窒素源を含む培地を用いることが生育に必須ではないため、例えば、グリセリンなどを含む塩濃度の高いBDF廃液の処理に用いることや、光合成できる微細藻類スピルリナなどとの混合培養の実施も可能である。【００１３】
また、糖などを基質として用いるとヒドロキシブチレートのホモポリマーを形成するが、n-プロパノール又はプロピオン酸を有機炭素源として用いて培養すると、ヒドロキシブチレートだけでなくヒドロキシバレレート13％程度まで構成要素として含むコポリマーの作成も可能である。【００１４】
地球に優しい燃料として利用がすすんでいるバイオディーゼルフュエル(BDF)の生産では、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ触媒を用いて、植物、動物油脂から脂肪酸メチルエステル(BDFの主体)を作製する方法が主流である。そのため、この手法によるアルカリを多く含んだ廃グリセロールの処理が問題となっている。しかしながら、これらの廃グリセロールからメタノール除去等をおこなえば、この好塩菌が炭素源として利用し、PHAsを生産することができる。【００１５】
さらに、高濃度の塩を含むアルカリ性廃液(漬け物廃液等)から不溶性有機物をろ過等によって除き、廃水処理を行うとともにPHAsを生産する場合にも、本好塩菌は有効に作用するものと推定される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株を各種炭素源で培養したときの菌体濁度OD600と培養時間を調べたグラフである。凡例に示す「%」はすべて、「w/v%」を示す(図２〜５においても同じ)。
【図２】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株を各種炭素源で培養したときに蓄積されたPHAsの割合（PHAs/乾燥菌体）と培養時間を示したグラフである。
【図３】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株を各種炭素源で培養したときに蓄積されたPHBの割合（PHAs/乾燥菌体）と培養時間を示したグラフである。
【図４】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株を、n-プロパノール又はプロピオン酸で培養したときに蓄積されたPHBおよびPHVの割合（PHAs/乾燥菌体）と培養時間を示したグラフである。
【図５】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株をグリセロール3 w/v %の炭素源で、異なるpH環境下で培養したときに蓄積されたPHBの割合（PHAs/乾燥菌体）と培養時間を示したグラフである。
【図６】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株を廃グリセロール(廃グリ)等で培養したときの培養時間と菌体濁度OD600を調べたグラフである。
【図７】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株を廃グリセロール等で培養したときの培養時間と菌体濁度OD600を調べたグラフである。培地にNaHCO3とNa2CO3を終濃度0.2M 加え、生育期間中のpHを一定にした。
【図８】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株を廃グリセロールで培養したときの培養時間と菌体濁度OD600を調べたグラフである。培地にSOT改2 pH9.40を用いて生育させた。
【図９】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株を廃グリセロールで培養したときの培養時間と培養液当たりのPHBの蓄積量を調べたグラフである。培地にSOT改2 pH9.40を用いて生育させた。
【図１０】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株をグルコースとキシロースを用いて培養したときの培養時間と菌体濁度OD600を調べたグラフである。培地にSOT改2 pH9.40を用いて生育させた。
【図１１】好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株をグルコースとキシロースで培養したときの培養時間と培養液当たりのPHBの蓄積量を調べたグラフである。培地にSOT改2 pH9.40を用いて生育させた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
好塩菌
本発明は、無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌を提供する。【００１８】
当該無機塩と当該有機炭素源は、後述するものと同じである。【００１９】
当該ハロモナス属に属する好塩菌は、前記培地中で乾燥菌体重量に対して、好ましくは25重量%以上、より好ましくは30重量%以上のPHAsを産生することができる。【００２０】
ハロモナス属とは、0.2M以上1.0M程度までの塩濃度を適とする好塩性有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。【００２１】
当該ハロモナス属に属する好塩菌は、0.2M以上1.0M程度までの塩濃度を適とする好塩性を示す細菌である。当該ハロモナス属に属する好塩菌としては、ペプトンや酵母エキス等の複数の有機炭素・窒素源を培養に必要としないものであり、pHが8.8以上、好ましくは8.8〜11で生育可能なものであって、前記培地中で乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができるものであれば特に限定されないが、好ましくはハロモナス・エスピー(Halomonassp.) KM-1株である。当該ハロモナス・エスピー KM-1株は、無機塩と単一の有機炭素源からなり、pHが8.8以上、好ましくは8.8〜11の培地で培養でき、当該培地中で乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することを特徴とする。当該ハロモナス・エスピー KM-1株はまた、16S rRNA遺伝子が配列表の配列番号１に示す塩基配列を有する。【００２２】
以下に、ハロモナス・エスピー KM-1株の菌学的性質を示す。【００２３】
SOT改培地(後述)を用い、37℃にて、24時間程度培養したコロニーの形状は、直径 1.0〜1.5 mm、ごく薄いオレンジ〜薄い肌色の色調であり、これを長期に冷蔵保存すると白っぽくなる。形は、円形、隆起状態は半レンズ状、周辺は波状、表面の形状はスムーズ、不透明であり、粘稠性がある。【００２４】
生育当初は薄いオレンジから薄い肌色だが、数日すると白っぽくなる。きれいな単一のコロニーを形成するのは難しく、画線培養の場合連続したコロニー群となりやすい。【００２５】
培地の殺菌条件は、オートクレーブ121 ℃ 15 min、又はろ過滅菌(0.2μm)、通常の培養には、20〜37℃で好気培養し、培養期間 12〜24時間である。生育に光は要求しない。保護剤にスキムミルク10%およびグルタミン酸ナトリウム1%を用い、5℃で保存する凍結乾燥法での保管が可能である。凍結乾燥法からの復元には、炭素源として酢酸ナトリウム1%を含むSOT改培地にて行う。また、30%グリセロール溶液を用いて、-80℃付近での凍結法による保管も可能である。【００２６】
当該ハロモナス・エスピーKM-1株は、16SリボゾームRNA配列による分析で、ハロモナス属ハロモナス・ニトリトフィルス(Halomonas nitritophilus)と特に相同性が高く、また、ハロモナス・ダキンゲンシス(Halomonas daqingensis)、ハロモナス・サリナ(Halomonas salina)、ハロモナス・アリメンタリア(Halomonas alimentaria)、ハロモナス・カンピサリス(Halomonas campisalis)、ハロモナス・デシデラタ(Halomonas desiderata)等との相同性も示された。【００２７】
当該ハロモナス・エスピー KM-1株は、平成19年７月10日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第6）に受託番号FERM P-21316として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はFERM BP-10995である。【００２８】
本発明者は、当該ハロモナス・エスピー KM-1株をスピルリナ菌株の培地から分離した。そして、この菌株の培養とPHAs生産の関連を観察した結果、誘導培養期はごく僅かなPHAs生産しか行わないが、対数増殖期後期になり、菌体密度が高く(OD600＝2.0以上)なると、菌体の増殖に数時間遅れて乾燥菌体当たり20重量％以上の著量のPHAsを菌体中に蓄積することが判明した。これらの工程は一連の菌体増殖の中で行われるため、特段の変更操作を必要としない(実施例  図１，２参照)。ハロモナス・エスピー KM-1株は、乾燥菌体当たり20重量％以上、条件により40〜95重量％のPHAsを含むことができる。 【００２９】
ハロモナス・エスピー KM-1株以外の当該好塩菌の具体例としては、例えば16SリボゾームRNA配列による分析から、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリアなどが挙げられる。【００３０】
尚、上述した細菌と同様の性質を有するハロモナス属に属する好塩菌であれば、ハロモナス・ニトリトフィルスや、ハロモナス・エスピー KM-1等に限らず、本発明の好塩菌によるPHAs産生方法を適用でき、本発明の好塩菌に含まれる。【００３１】
更に、当該ハロモナス属に属する好塩菌に遺伝子を導入することもできる。【００３２】
該遺伝子の導入は、導入する遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えDNAを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換することにより行なわれる。例えば宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に該遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びSD（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばATG）を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。かくして得られる所望の組換えDNAの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。【００３３】
PHAs産生方法
(a)培地
本発明における、好塩菌の培養は、無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源、好ましくは、無機塩と単一の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で行う。【００３４】
当該無機塩としては、リン酸塩、硫酸塩、及びナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。ナトリウムを含む培地成分としては、NaCl、NaNO3、NaHCO3、Na2CO3等が挙げられる。当該無機塩は複数であってもよく、当該無機塩の濃度は、総量で好ましくは0.2M〜2.5M、より好ましくは0.2〜1.0M、特に0.2〜0.5 M程度である。【００３５】
当該有機炭素源としては、六単糖(グルコース、フラクトース)、五単糖(キシロース、アラビノース)、二糖(スクロース)、糖アルコール(マンニトール、ソルビトール)、酢酸、酢酸ナトリウム、エタノール、グリセロール、可溶性デンプン、n-プロパノール、プロピオン酸等が挙げられ、好ましくは、エタノール、n-プロパノール、プロピオン酸、グルコース、キシロース、グリセロール、スクロースである。当該有機炭素源は単一もしくは複数であり、適切な濃度は炭素源により異なるが、例えばグリセロールの場合、培地中に0.1〜20w/v%、好ましくは2〜10w/v%含まれる。【００３６】
当該培地は、無機塩と有機炭素源以外の成分を一部含んでいてもよく、そのような成分としては、例えば廃グリセロールの場合、副次的な有機炭素源として脂肪酸、脂肪酸エステル、触媒由来のカリウム、ナトリウムなどの金属などが挙げられる。【００３７】
当該培地のpHは、5以上、好ましくはアルカリ条件、菌種により好ましくは8.8以上、特に8.8〜11であればよい。【００３８】
アルカリ条件かつ塩濃度の高い条件の培地で、好塩菌を培養するため、他のバクテリアのコンタミネーションの恐れがほとんどなく、また単一の安価な炭素源を用いて培養が行えるため、低コストでの培養が可能となる。【００３９】
バイオディーゼルフュエル(BDF)の生産に伴い、アルカリを多く含んだ廃グリセロールが排出されるが、これらの廃グリセロールからメタノール除去等を行ったものは、有機炭素源として上記培地に添加して使用することができる。廃グリセロールは、例えばグリセリンを350〜400mg/g程度、カリウムを41〜62mg/g程度含んでおり、廃グリセロール1 gを蒸留水に100mlに溶解したpHは10.3〜10.4程度である。培地への廃グリセロールの添加量は1〜20重量%、好ましくは3〜10重量%である。【００４０】
(b)培養方法
本発明の好塩菌を培養する方法としては、PHAsが生産される方法であれば特に制限されないが、培養の例を以下に挙げる。【００４１】
ハロモナス・エスピー KM-1株を含むハロモナス属に属する好塩菌は、5 ml程度の培地に植菌し、30〜37℃程度、攪拌速度120〜180rpmで１晩振盪前培養する。【００４２】
前培養した菌体を、三角フラスコ、発酵槽等に入った培地中に100〜1000倍程度に希釈し本培養する。本培養は20〜45℃で可能であるが、好ましくは30〜37℃で行う。【００４３】
必要な培養時間は、培地の条件により異なるが、培地の条件により最適な培養時間を適宜設定すれば、乾燥菌体重量あたり20重量%以上のPHAsを生産できる。【００４４】
(c)PHAs
本発明により生産されるPHAsは、ヒドロキシアルカノエート単位からなるポリマーであり、ヒドロキシアルカノエートは、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート等がある。また、PHAsは、すべて同じヒドロキシブチレートから構成されるホモポリマーであることが多い。n-プロパノール、プロピオン酸又はその塩を炭素源として培養することで、ヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレートからなるPHAsコポリマーを産生できる。この場合、ヒドロキシバレレートの含有量は0.5〜13%、好ましくは5〜13%である。【００４５】
菌体中に蓄積されたPHAsは、例えば菌体を破砕後、トリクロロエチレンで抽出するなどの常法に従い回収することができる。【００４６】
本発明で産生されるPHAsの含有量は乾燥菌体に対し20重量%〜95重量%であり、好ましくは50重量%〜95重量%である。PHBの含有量は乾燥菌体に対し20重量%〜95重量%であり、好ましくは50重量%〜80重量%である。【００４７】
ハロモナス・エスピー KM-1株で生産されるPHAsの数平均分子量(MN)は40万、重量平均分子量(MW)は56万ぐらいであるので、一般的な用途で十分に使用が可能である。また、他のハロモナス属に属する好塩菌でも類似するMN、MWのPHAsが得られ得る。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。【００４９】
本実施例では、微生物により産生される脂肪族ポリエステル系生分解性プラスチックであるポリヒドロキアルカノエート（PHAs）を産生する方法について詳述する。【００５０】
＜使用培地組成＞
国立環境研究所のSOT培地に炭素源を加えて使用した。
（培地名）SOT改（Spirulina platensisMedium改）
（培地組成）
NaHCO31.68 g                                       K2HPO450 mg
NaNO3 250 mg                                        K2SO4 100 mg
NaCl 100 mg                                          MgSO4・7H2O 20 mg
CaCl2・2H2O 4 mg                                    FeSO4・7H2O 1 mg
Na2 EDTA 8 mg                                      A5＋Co 溶液 0.1 ml
例  （酢酸ナトリウム 1.0g  炭素源として）
蒸留水に溶解し、100mlとする。
A5＋Co 溶液改
H3BO3 286 mg                                       MnSO4 ・7H2O 250 mg
ZnSO4・7H2O 22.2 mg                              CuSO4 ・5H2O 7.9 mg
Na2MoO4・2H2O 2.1 mg                            Co(NO3)6H2O 4.398mg
蒸留水 100 ml
滅菌の際には、上記培地組成を2種類に分け
SOT-A:  （NaHCO3 1.68 g    K2HPO450 mg/50 ml）2倍濃度水溶液
SOT-B：  (上記以外/50 ml)  2倍濃度水溶液
（プレート培養の場合  SOT-Bに終濃度1.5 w/v%のアガーを加える。）
を別々にオートクレーブ滅菌し、50度以下に冷却した後混合する。培地調整後のpHは、液体培養、プレート培養ともに、8.9±0.1となる。【００５１】
＜PHAs産生菌の選定＞
各種の単一の炭素源とナイルレッド0.5 μg/mlを含むプレートに植菌し、スクリーニングした。30℃にて、2日培養した。発生したコロニーを365 nmの紫外光下で蛍光発光させることで、PHAsを生産するハロモナス・エスピー KM-1株を選抜した（次の文献の定性的なPHB生産分析手法による。）。なお、この方法では定性的に数％以上PHAsを含む菌株を選抜できる。
Patricia Spiekermann; Bernd H. A. Rehm; Rainer Kalscheuer; Dirk Baumeister; A. Steinbuchel: “A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds” Archives of Microbiology 1999; 171(2), 73-80【００５２】
＜PHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株の16SリボゾームRNA配列分析結果＞
選抜したPHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株の16SリボゾームRNAを、PCR法により増幅し精製し、これをテンプレートとして、その配列を解析した。配列は配列表の配列番号１に記載しており、1535 bpである。【００５３】
＜PHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株のプレ培養＞
プレート培養より、16.5 mm径の試験管に5 ml上記の培地(それぞれの炭素源を1 w/v%を含む)を加え、37℃ で１晩振盪培養した。【００５４】
＜PHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株の培養、サンプルの回収など＞
プレ培養した菌体0.1 mlを、100 ml容の三角フラスコに入れた液体培地30 mlに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、30℃で振盪培養し、12時間後より、およそ12時間おきに培養液を1 ml回収して、OD600、乾燥菌体重量、及びPHAs含有量を測定した。培養液は、再度シリコセンをし、30℃で振盪培養を継続し、培養した。【００５５】
図１、２、３、４に、菌体濁度OD600、乾燥菌体重量あたりのPHAsの割合、乾燥菌体重量あたりのPHBの割合、n-プロパノール又はプロピオン酸を基質としたときの乾燥菌体重量あたりのヒドロキシブチレート及びヒドロキシバレレートの割合を、それぞれ培養時間に対して相対化してプロットした。
図２の乾燥菌体重量あたりのPHAsの割合の値(%)を以下の表に示す。【００５６】
【表１】
2009041531.tif 000002
【００５７】
図1より、スクロース、グルコース及び酢酸ナトリウムは、50時間程度、エタノール及びグリセロールは、60から70時間程度、n-プロパノール、プロピオン酸及び可溶性デンプンは、100時間以降にもっともOD600、菌体密度の高い時期がある。【００５８】
図２より、菌体密度の上昇に伴い、これに10時間程度遅れてPHAs量が増大する。乾燥菌体あたりのPHAs量は、最大に達したあとで減少に転じる。【００５９】
図３は、PHBのみの乾燥菌体あたりの量を示したもので、n-プロパノール及びプロピオン酸以外は図２のPHAsのグラフと同じである。【００６０】
図４は、n-プロパノール又はプロピオン酸を基質とした場合のヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレートの蓄積量を示したもので蓄積初期は若干ヒドロキシバレレートの割合が多い。この結果、生育時期により異なった性質のコポリマーを作製できることが示された。【００６１】
＜PHAs蓄積率測定＞
菌体内に蓄積されたPHAsの蓄積量を測定するため、次の文献の手法を用い以下の実験を行った。
Fanny Monteil-Riveraa; Aimesther Betancourta; Huu Van Trab; Abdessalem Yezzaa; Jalal Hawaria: “Use of headspace solid-phase microextraction for the quantification of poly(3-hydroxybutyrate) in microbial cells” Journal of Chromatography A 2007;1154(1-2):34-41【００６２】
上記培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、蒸留水で数回洗浄したのち乾燥させた。この乾燥菌体1〜3 mgに、3vol% H2SO4を含むメタノール0.2 mlを加え105℃で2時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム0.2 ml、蒸留水0.1 mlを加え、激しく攪拌した。1分間遠心分離したのち、クロロホルム層を2 μl分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、PHAsを分析した。ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートを含む標品を乾燥菌体と同様に処理、分析し、これを基準として乾燥菌体あたりのPHAs蓄積率(PHAs(g)/乾燥菌体重量(g)) を求めた。【００６３】
＜PHAsの平均分子量＞
前記ハロモナス・エスピー KM-1株の菌体内に蓄積されたPHAsの平均分子量を測定するため、以下の実験を行った。【００６４】
グリセリン1w/v%含む培養液を用いて培養した培養液を遠心分離し、上清を除き、蒸留水にて懸濁、再度遠心分離し、上清を除き、菌体のみとし、乾燥させた。この乾燥菌体5 mgに、クロロホルム0.5 mLを加え、70℃で2時間加熱し、PHAsを溶解した。遠心分離後、上澄みを濾過後、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（以下、GPCと称する）を用いて、平均分子量を測定した。【００６５】
菌体内に蓄積されたPHAsの分子量は、乾燥菌体重量あたりPHB含量50.0%を含むサンプルについて、MN 40万、MW 56万を示し、菌体内に蓄積されたPHBの平均分子量は、4〜5.6×105程度であることが判明した。【００６６】
従って、菌体の増殖開始から所望量のPHAs蓄積に至るまで連続して行っても、高分子のPHAsを得ることができると認められた。【００６７】
実施例２
＜ハロモナス・エスピー KM-1株の異なるpH環境下での培養＞
好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株をグリセロール3 w/v%の炭素源で、異なるpH環境下で培養したときに蓄積されたPHBの割合（PHAs/乾燥菌体）を測定した。緩衝成分であるSOT-A: （NaHCO3 1.68 g(0.2M)、K2HPO4 50 mg/50 ml）2倍濃度水溶液に対し、SOT-A’: （Na2CO3 2.12 g、K2HPO4 50 mg/50 ml）2倍濃度水溶液を加え、pH10、およびpH10.5の溶液を、pHメータで調整して作成し、これを同量のSOT-B 2倍濃度液と混合してそれぞれの培地とした。図５にそれぞれのPHBの割合を培養時間に対して相対化してプロットした。【００６８】
ハロモナス・エスピーKM-1株は、通常の培養条件のpH8.9のみならず、pH10及び10.5においても、pH8.9以上の菌体内でのPHAs蓄積速度を示し、また3 w/v%のグリセロールを資化できることが示された。【００６９】
実施例３
有機炭素源として有望なバイオディーゼルに副製する廃グリセロールの代表的な組成は以下の通りである。【００７０】
【表２】
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【００７１】
一般的なバイオディーゼル製造装置では、アルカリ触媒はメタノールへの溶解度が高いKOHが用いられる。【００７２】
実際の廃グリセロ-ルとして、京都市廃食油燃料化施設より、2008年5月1日に廃グリセロールサンプルをいただき、培養に用いた。【００７３】
上記と同様に、このサンプルのpHを測定すると、pH10.38であった。【００７４】
そこで、前記使用培地組成から、緩衝成分であるNaHCO3 16.8 g/lを除いた培地を作成し、これにそれぞれ、廃グリセロールを加えてハロモナス・エスピー KM-1株を培養した。コントロールとして、NaHCO3 を含む培地に精製グリセロール5重量%を含むものも加えた。培養方法等は上記方法と同じある。【００７５】
結果を、図６に示した。廃グリセロール1-20重量％まで含む培地で生育することが分かり、廃グリセロール5重量％の場合には、精製グリセロールより良い生育を示した。【００７６】
実施例４
培地組成として、緩衝成分であるNaHCO3 とNa2CO3は終濃度0.2Mとして以下の配合で調製し、他の成分はSOT改と同じとした培地を作成し、1重量%の廃グリセロールを加えた場合のハロモナス・エスピー KM-1株の生育を見た。培養方法等は上記方法と同じである。【００７７】
【表３】
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結果を図７に示した。いずれも、生育するが、pH9.40が一番生育がよい。また、生育後のpHはほぼ初発のpHと同等であった。【００７８】
実施例５
培地組成として、上記SOT改2 (pH9.40)を用い、廃グリセロールの濃度を、3重量%、5重量%、又は10重量%、本培養の温度を30℃と37℃でハロモナス・エスピー KM-1株を培養し、生育およびPHBの蓄積量を見た。【００７９】
結果を、図８、９に示した。生育は37℃の方が、30℃よりいいが、PHBの蓄積量についてはさほど変わらず。いずれも廃グリセロール3%の時に、培養時間33時間で、約2.5 mg/mlのPHBの蓄積を認めた。【００８０】
実施例６
培地組成として、上記SOT改2 (pH9.40)を用い、グルコースとキシロース濃度を、合わせた濃度が2 w/v%、本培養の温度を37℃でハロモナス・エスピー KM-1株を培養し、生育およびPHBの蓄積量を見た。【００８１】
結果を、図１０、１１に示した。生育はグルコースとキシロースを混合した方が良く、また、PHBの蓄積量については、グルコースと、グルコースとキシロースを混合したものはさほど変わらなかった。培養液に対して最大約2.8 mg/mlのPHBの蓄積を認めた
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の好塩菌によるPHAsの産生方法は、工業的なPHAsの産生に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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