(57)【要約】  本発明は、栄養要求性マーカーを有さない酵母細胞に外来遺伝子を導入する方法を目的とする。本発明は、酵母細胞にターゲットとする栄養要求性を付与しそして発現を目的とする遺伝子を導入する方法を提供する。この方法は、所定の配置で、発現を目的とする遺伝子の発現カセット、酵母選択マーカーのカセット、およびターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の両側の領域に相同である２つの相同組換えフラグメントを含むフラグメントで酵母細胞を形質転換する工程を含む。この方法によれば、酵母細胞からターゲットとする栄養要求性を支配する遺伝子が欠失されて発現を目的とする遺伝子が導入され、さらに形質転換酵母細胞から酵母選択マーカーが除去される。
2009139349.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞にターゲットとする栄養要求性を付与し、そして発現を目的とする遺伝子を導入する方法であって
（ａ）該発現を目的とする遺伝子の発現カセット、該ターゲットとする栄養要求性とは異なる栄養要求性を支配し、そしてカウンターセレクションが可能である酵母選択マーカーのカセット、および相同組換えのための２つの領域を含むフラグメントで該異なる栄養要求性マーカーが付与された酵母細胞を形質転換する工程であって、
該フラグメントにおいて、
該相同組換え領域の上流側が、該酵母細胞中のターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の上流（５’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの上流（５’末端側）に配置され、そして下流側が、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの下流（３’末端側）に配置され、
該酵母選択マーカーのカセットが、該酵母選択マーカーおよび該酵母選択マーカーの上流（５’末端側）に、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と相同である反復領域を含み、そして
該酵母選択マーカーのカセットが、該発現カセットと該相同組換え領域の下流側の領域との間に配置されており、
それにより、第一の相同組換えが生じる、工程；
（ｂ）該異なる栄養要求性を有さない形質転換酵母を選択する工程であって、該形質転換酵母は、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子が欠失され、そして該発現を目的とする遺伝子および該酵母選択マーカーカセットが導入されている、工程；
（ｃ）該（ｂ）で選択された形質転換酵母において、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と該反復領域との間で第二の相同組換えを生じる工程；および
（ｄ）該異なる栄養要求性を有するようになった形質転換酵母を選択する工程であって、それにより、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子および該異なる栄養要求性支配遺伝子が欠失されてそれらの要求性を有し、かつ該発現を目的とする遺伝子が導入されている形質転換酵母が得られる、工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記酵母細胞に前記異なる栄養要求性を付与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異なる栄養要求性遺伝子マーカーがウラシル要求性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酵母細胞に繰り返し遺伝子を導入する方法であって、
請求項１から３のいずれかの方法により生成された、栄養要求性支配遺伝子が欠失されかつ発現を目的とする遺伝子が導入された形質転換酵母細胞を、該形質転換酵母細胞で欠失されている栄養要求性支配遺伝子および発現を目的とするさらなる遺伝子を含むベクターでさらに形質転換する工程を含む、方法。
【請求項５】
酵母細胞にターゲットとする栄養要求性を付与しかつ発現を目的とする遺伝子を導入するためのベクターであって、
該遺伝子の発現カセット、該ターゲットとする栄養要求性とは異なる栄養要求性を支配する遺伝子である酵母選択マーカーのカセット、および相同組換えのための２つの領域を含むフラグメントを含み、
該フラグメントにおいて、
該相同組換え領域の上流側が、該酵母細胞中の該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の上流（５’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの上流（５’末端側）に配置され、そして下流側が、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの下流（３’末端側）に配置され、
該酵母選択マーカーのカセットが、該酵母選択マーカーおよび該酵母選択マーカーの上流（５’末端側）に、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と相同である反復領域を含み、そして
該酵母選択マーカーのカセットが、該発現カセットと該相同組換え領域の下流側の領域との間に配置されている、
ベクター。
【請求項６】
前記異なる栄養要求性がウラシル要求性である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
酵母細胞に発現を目的とする遺伝子を導入する方法であって、
（ｉ）該発現を目的とする遺伝子の発現カセット、酵母選択マーカーのカセット、および相同組換えのための２つの領域を含むフラグメントで該酵母細胞を形質転換する工程であって、
該フラグメントにおいて、
該相同組換え領域の上流側が、該酵母細胞中のターゲットとする遺伝子座の上流（５’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの上流（５’末端側）に配置され、そして下流側が、該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの下流（３’末端側）に配置され、
該酵母選択マーカーのカセットが、該酵母選択マーカーおよび該酵母選択マーカーの上流（５’末端側）に、該相同組換え領域の下流側の領域が相同である該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と相同である反復領域を含み、そして
該酵母選択マーカーのカセットが、該発現カセットと該相同組換え領域の下流側の領域との間に配置されており、
それにより第一の相同組換えが生じ、該ターゲットとする遺伝子座が欠失される一方該発現を目的とする遺伝子および該酵母選択マーカーカセットが該酵母細胞に導入される、工程；および
（ii）該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と該反復領域との第二の相同組換えを生じさせる工程であって、それにより形質転換された酵母細胞から該酵母選択マーカーが除去される、工程
を含む、方法。
【請求項８】
酵母細胞に発現を目的とする遺伝子を導入するためのベクターであって、
該発現を目的とする遺伝子の発現カセット、酵母選択マーカーのカセット、および相同組換えのための２つの領域を含むフラグメントを含み、
該フラグメントにおいて、
該相同組換え領域の上流側が、該酵母細胞中のターゲットとする遺伝子座の上流（５’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの上流（５’末端側）に配置され、そして下流側が、該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの下流（３’末端側）に配置され、
該酵母選択マーカーのカセットが、該酵母選択マーカーおよび該酵母選択マーカーの上流（５’末端側）に、該相同組換え領域の下流側の領域が相同である該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と相同である反復領域を含み、そして
該酵母選択マーカーのカセットが、該発現カセットと該相同組換え領域の下流側の領域との間に配置されている、
ベクター。
【請求項９】
β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素を発現するように組み換えられたセルロース分解性実用酵母。
【請求項１０】
前記β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素が、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、およびセロビオヒドロラーゼの組み合わせである、請求項９に記載のセルロース分解性実用酵母。
【請求項１１】
エタノールを製造する方法であって、
請求項９または１０に記載のセルロース分解性実用酵母と、セルロース系物質とを反応させてエタノールを得る工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母細胞に遺伝子を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀を迎え、資源および環境の問題はますます深刻になりつつある。石油を代表とする化石資源の枯渇問題に起因して、再生可能資源の導入、省エネルギー化、そして温室ガス削減に向けて、バイオマスの大幅導入が極めて大きな課題となっている。【０００３】
さらに、有限な資源から商品を大量に生産しこれを大量に消費し廃棄する一方通行のシステムを改め、産業構造を持続的な発展を可能とする形に変換する必要がある。【０００４】
これらの課題に対して未利用バイオマス資源の有効利用が注目を集めている。その一つにバイオエタノールへの変換プロセスの開発がある。バイオエタノールとはバイオマスから得られるエタノールのことであり、有史以来直接燃焼させることでエネルギー利用されてきた木質系バイオマス資源を、酵母などの微生物によりいったんエタノールの形に液化してからエネルギー利用しようとするものである。これにより、エネルギー変換効率の向上、輸送の利便性などエネルギーとしての利用幅が広がると考えられている。【０００５】
酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、多様な化学物質の生産、および燃料としての利用のためのエタノールの生産のために使用されている。現在、エタノールは、主にデンプン（アミロース）から作られているが、酵母は、アミロースを分解する酵素を持たないためデンプンを分解できない。よって、現状は、デンプンを加熱してアミラーゼを作用させることでグルコースまで分解し、生じたグルコースを酵母により発酵させてエタノールを製造している。また、農産廃棄物や古紙などの主な主成分であるセルロースもセルラーゼを作用させることで分解産物としてグルコースが生成される。酵母はアミロースおよびセルロース共に分解する酵素を持たないが、酵母がこれらの酵素を持つことができれば糖化→発酵という二段階のステップを一段階にすることができる。【０００６】
アミロースを分解する酵素およびセルロースを分解する酵素をその細胞表層に提示または分泌して発現することを可能にする酵母サッカロマイセス・セレビシエ酵母を作製することにより、糖質原料から直接エタノール発酵できる酵母を育種してきた。それにより、アミロース、セルロースそれぞれからエタノールを発酵できる酵母の育種に成功している（特許文献１〜３）。また、酵母サッカロマイセス・セレビシエはキシロースを代謝することができないが、キシラン分解酵素であるトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）由来キシラナーゼ２（ＸＹＮＩＩ）およびアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来β−キシロシダーゼ（ＸｙｌＡ）を表層提示し、かつキシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子（ともにピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来）ならびにキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子（サッカロマイセス・セレビシエ由来）を発現するサッカロマイセス・セレビシエが作製され、この酵母を用いて樺材のキシランからエタノールを生産する試みもなされている（非特許文献１）。【０００７】
特許文献１〜３および非特許文献１には、サッカロマイセス・セレビシエMT8-1株を宿主とした組換え酵母の効果が示されている。このMT8-1株は、５種類の栄養要求性を有し、種々の遺伝子操作を行うのに非常に扱いやすいため、種々の機能を有する酵母の育種に用いられてきた。しかし、MT8-1株は、アルコール発酵能力、アルコール耐性、耐酸性、耐熱性などの面で脆弱であり、実用化の点で好ましくない。【０００８】
実用酵母は、アルコール発酵能力、アルコール耐性、耐酸性、耐熱性が高く、アルコールの製造に望ましい。しかし、実用酵母は、遺伝子操作を行う上で必要な栄養要求性マーカーを有さず、遺伝子操作を行うことが困難であった。【０００９】
実用酵母では優性薬物耐性マーカーが有用である。なぜなら当該マーカーは、宿主に変異させることを必要としないからである。しかし、薬物耐性マーカーにはいくつかの欠点がある。薬物耐性マーカーの形質転換効率は、通常、栄養要求性マーカーに比較して低い。また、薬物耐性により選択された形質転換コロニーには、通常、薬物耐性に対して自然に変異が起こることによる非形質転換コロニーや集団の大部分よりも耐性である細胞が混入する。特定のリコンビナーゼが隣接して逆選択マーカー遺伝子上に配置されている細菌hisGまたはloxP配列を欠失させる方法もまたしばしば用いられている。しかし、この方法を多数回使用することによって形質転換効率の低下が起こる。なぜなら、この方法によって、hisGまたはloxP配列が染色体上に１コピー残ってしまうからである（非特許文献２）。【００１０】
この問題を回避するために、ＰＣＲ仲介シームレス遺伝子欠失を利用したマーカーリサイクル法が開発された（非特許文献３）。非特許文献３には、サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４０（ＭＡＴａ）およびＢＹ４７４３（ＭＡＴα）株を用いて酵母染色体上のＨｉｓ３の近辺配列に対して相同な配列およびＵＲＡ３を含むフラグメントと酵母染色体上のＨｉｓ３との乗り換えを行ってＨｉｓ３を染色体から欠失させ、次いで、さらに酵母染色体内の反復配列を利用した相同組換えが生じ、ＵＲＡ３が酵母染色体上に残ることなく回収される旨が記載されている。このマーカーリサイクル法は、宿主ゲノム中に余計な遺伝子配列およびリサイクルマーカーを残すことなく遺伝子を欠失させることができる。実用酵母で分子育種する場合、この技術は有用であるが、続けて遺伝子破壊を行うには長い時間がかかり、また栄養要求性マーカーを獲得することに限定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際特許出願公開第０２／４２４８３号公報
【特許文献２】国際特許出願公開第０３／０１６５２５号公報
【特許文献３】国際特許出願公開第０１／７９４８３号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】S. Katahiraら, Applied and Environmental Microbiology, 2004年, 70巻, 5407-5414頁
【非特許文献２】DavidsonおよびSchiestl, Curr. Genet., 2000年, 38巻, 188-190頁
【非特許文献３】R. Akadaら, Yeast, 2006年, 23巻, 399-405頁
【非特許文献４】Appl. Microbiol. Biotech., 2002年, 60巻, 469-474頁
【非特許文献５】Applied and Environmental Microbiology, 2002年, 68巻, 4517-4522頁
【非特許文献６】Tajimaら, Yeast, 1985年, 1巻, 67-77頁
【非特許文献７】Roseら, Methods in Yeast genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY 1990年
【非特許文献８】Akadaら, Biotechniques, 2000年, 28巻, 668-70, 672, 674頁
【非特許文献９】P. N. Lipkeら, Mol. Cell. Biol., 1989年8月, 9(8), 3155-65頁
【非特許文献１０】Y. Fujitaら, Applied and Environmental Microbiology, 2002年, 68巻, 5136-41頁
【非特許文献１１】Fujitaら, Appl. Environ. Microbiol., 2004年, 20巻, 1207-1212頁
【非特許文献１２】Takahashiら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001年, 55巻, 454-462頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、栄養要求性マーカーを有さない酵母細胞に外来遺伝子を導入する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、酵母細胞にターゲットとする栄養要求性を付与し、そして発現を目的とする遺伝子を導入する方法を提供し、この方法は、
（ａ）該発現を目的とする遺伝子の発現カセット、該ターゲットとする栄養要求性とは異なる栄養要求性を支配し、そしてカウンターセレクションが可能である酵母選択マーカーのカセット、および相同組換えのための２つの領域を含むフラグメントで該異なる栄養要求性が付与された酵母細胞を形質転換する工程であって、
該フラグメントにおいて、
該相同組換え領域の上流側が、該酵母細胞中のターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の上流（５’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの上流（５’末端側）に配置され、そして下流側が、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの下流（３’末端側）に配置され、
該酵母選択マーカーのカセットが、該酵母選択マーカーおよび該酵母選択マーカーの上流（５’末端側）に、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と相同である反復領域を含み、そして
該酵母選択マーカーのカセットが、該発現カセットと該相同組換え領域の下流側の領域との間に配置されており、
それにより、第一の相同組換えが生じる、工程；
（ｂ）該異なる栄養要求性を有さない形質転換酵母を選択する工程であって、該形質転換酵母は、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子が欠失され、そして該発現を目的とする遺伝子および該酵母選択マーカーカセットが導入されている、工程；
（ｃ）該（ｂ）で選択された形質転換酵母において、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と該反復領域との間で第二の相同組換えを生じる工程；および
（ｄ）該異なる栄養要求性を有するようになった形質転換酵母を選択する工程であって、それにより、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子および該異なる栄養要求性支配遺伝子が欠失されてそれらの要求性を有し、かつ該発現を目的とする遺伝子が導入されている形質転換酵母が得られる、工程
を含む。【００１５】
１つの実施態様では、上記方法は、上記酵母細胞に上記異なる栄養要求性を付与する工程をさらに含む。【００１６】
本発明はさらに、酵母細胞に繰り返し遺伝子を導入する方法を提供し、この方法は、
上記酵母細胞にターゲットとする栄養要求性を付与しかつ発現を目的とする遺伝子を導入する方法により生成された、栄養要求性支配遺伝子が欠失されかつ発現を目的とする遺伝子が導入された形質転換酵母細胞を、該形質転換酵母細胞で欠失されている栄養要求性支配遺伝子および発現を目的とするさらなる遺伝子を含むベクターでさらに形質転換する工程を含む。【００１７】
本発明はまた、酵母細胞にターゲットとする栄養要求性を付与しかつ発現を目的とする遺伝子を導入するためのベクターを提供し、このベクターは、
該遺伝子の発現カセット、該ターゲットとする栄養要求性とは異なる栄養要求性を支配する遺伝子である酵母選択マーカーのカセット、および相同組換えのための２つの領域を含むフラグメントを含み、
該フラグメントにおいて、
該相同組換え領域の上流側が、該酵母細胞中の該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の上流（５’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの上流（５’末端側）に配置され、そして下流側が、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの下流（３’末端側）に配置され、
該酵母選択マーカーのカセットが、該酵母選択マーカーおよび該酵母選択マーカーの上流（５’末端側）に、該ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と相同である反復領域を含み、そして
該酵母選択マーカーのカセットが、該発現カセットと該相同組換え領域の下流側の領域との間に配置されている。【００１８】
上記方法およびベクターの１つの実施態様では、上記異なる栄養要求性はウラシル要求性である。【００１９】
さらに、本発明は、酵母細胞に発現を目的とする遺伝子を導入する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）該発現を目的とする遺伝子の発現カセット、酵母選択マーカーのカセット、および相同組換えのための２つの領域を含むフラグメントで該酵母細胞を形質転換する工程であって、
該フラグメントにおいて、
該相同組換え領域の上流側が、該酵母細胞中のターゲットとする遺伝子座の上流（５’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの上流（５’末端側）に配置され、そして下流側が、該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの下流（３’末端側）に配置され、
該酵母選択マーカーのカセットが、該酵母選択マーカーおよび該酵母選択マーカーの上流（５’末端側）に、該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と相同である反復領域を含み、そして
該酵母選択マーカーのカセットが、該発現カセットと該相同組換え領域の下流側の領域との間に配置されており、
それにより第一の相同組換えが生じ、該ターゲットとする遺伝子座が欠失される一方該発現を目的とする遺伝子および該酵母選択マーカーカセットが該酵母細胞に導入される、工程；および
（ii）該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と該反復領域との第二の相同組換えを生じさせる工程であって、それにより形質転換された酵母細胞から該酵母選択マーカーが除去される、工程
を含む。【００２０】
本発明はまた、酵母細胞に発現を目的とする遺伝子を導入するためのベクターを提供し、このベクターは、
該発現を目的とする遺伝子の発現カセット、酵母選択マーカーのカセット、および相同組換えのための２つの領域を含むフラグメントを含み、
該フラグメントにおいて、
該相同組換え領域の上流側が、該酵母細胞中のターゲットとする遺伝子座の上流（５’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの上流（５’末端側）に配置され、そして下流側が、該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域と相同でありそして該発現カセットの下流（３’末端側）に配置され、
該酵母選択マーカーのカセットが、該酵母選択マーカーおよび該酵母選択マーカーの上流（５’末端側）に、該ターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域のさらに下流（３’末端側）の領域と相同である反復領域を含み、そして
該酵母選択マーカーのカセットが、該発現カセットと該相同組換え領域の下流側の領域との間に配置されている。【００２１】
本発明はさらに、β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素を発現するように組み換えられたセルロース分解性実用酵母を提供する。【００２２】
上記セルロース分解性実用酵母の１つの実施態様では、上記β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素は、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、およびセロビオヒドロラーゼの組み合わせである。【００２３】
本発明はまた、エタノールを製造する方法を提供し、この方法は、上記セルロース分解性実用酵母と、セルロース系物質とを反応させてエタノールを得る工程を含む。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、栄養要求性マーカーを有さない酵母細胞であっても外来遺伝子を好都合に導入できる。本発明の方法は、酵母細胞への栄養要求性マーカーの付与と外来遺伝子の導入とを同時に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−１】ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）の破壊およびβ−グルコシダーゼ遺伝子の組み込みのマーカーリサイクル遺伝子導入用に用いたプラスミドpBlue HU-BGL13の構築の手順の前半部を示す模式図である。
【図１−２】ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）の破壊およびβ−グルコシダーゼ遺伝子の組み込みのマーカーリサイクル遺伝子導入用に用いたプラスミドpBlue HU-BGL13の構築の手順の後半部を示す模式図である。
【図２】ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）の破壊およびβ−グルコシダーゼ遺伝子の組み込みの手順を示す模式図である。
【図３】ＨＩＳ３遺伝子破壊およびβ−グルコシダーゼ細胞表層提示遺伝子発現カセットの組み込みが生じたか否かを調べるコロニーＰＣＲで使用したプライマーおよびその増幅領域を示す模式図と併せて、このコロニーＰＣＲの結果を表す電気泳動写真を示す。
【図４】５−ＦＯＡ培地による選択によって取得した形質転換体ではＵＲＡ３マーカーが除去されていることを調べるコロニーＰＣＲで使用したプライマーおよびその増幅領域を示す模式図と併せて、このコロニーＰＣＲの結果を表す電気泳動写真を示す。
【図５】NBRC1440/HU-BGL13およびNBRC1440による発酵におけるセロビオースおよびエタノール量の経時変化を示すグラフである。
【図６】ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）マーカーを有し、かつセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ２）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpIHGP3-CBH AGの模式図である。
【図７】ウラシル遺伝子（ＵＲＡ３）マーカーを有し、かつエンドグルカナーゼ（ＥＧＩＩ）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK406 EGの模式図である。
【図８】NBRC1440/HU-BGL13/pIHGP3-CBH/pGK406 EG、NBRC1440/HU-BGL13/pGK406 EG、およびNBRC1440/HU-BGL13による、セルロースから生成されるエタノール量の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントの構築および使用）
本発明においては、酵母細胞内のターゲットとする遺伝子を破壊するためのフラグメントに、該酵母細胞での発現を目的とする遺伝子の発現カセットが間に挿入されているフラグメントが用いられる。このフラグメントを、便宜上、本明細書では、「遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメント」ともいう。このフラグメントは、ターゲットとする遺伝子を破壊して欠失させ、かつ発現を目的とする遺伝子を組み込んで導入するために使用される。「遺伝子破壊」とは、宿主における遺伝子の発現を不能にすることをいい、染色体上から遺伝子を欠失させることを含む。この欠失は、遺伝子が発現されるのに必要な領域かつ大きさが欠失されればよく、必ずしも遺伝子を構成する配列全体が欠失されなくてもよい。「遺伝子組み込み」とは、宿主で発現されるようにその染色体上に組み込まれることをいう。「遺伝子の導入」とは、細胞の中に遺伝子が導入され、発現されることを意味する。
【００２７】
上記遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントは、相同組換えのための２つの領域を、発現を目的とする遺伝子の発現カセットの両側に含む。遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントは、相同組換えのための２つの領域の間に、発現を目的とする遺伝子の発現カセットを１つまたは複数含み得る。フラグメントは、必要に応じてリンカーも含み得る。この相同組換えのための領域（単に「相同組換え領域」ともいう）とは、酵母細胞中のターゲットとする遺伝子の両側（すなわち、上流（５’末端側）および下流（３’末端側））にある領域とそれぞれ相同なフラグメントをいう。
【００２８】
「ターゲットとする遺伝子」は、酵母細胞においてその発現が望ましくない任意の遺伝子であり得る。遺伝子操作上有用な栄養要求性を有さない実用酵母においては、当該栄養要求性を支配する遺伝子であり得る。
【００２９】
上記発現カセットは、酵母細胞での発現を目的とする遺伝子、プロモーターおよびターミネーターを含む。発現を目的とする遺伝子は、その種類を問わない。例えば、各種酵素のようなタンパク質をコードする遺伝子であり得る。プロモーターまたはターミネーターは、発現を目的とする遺伝子自身のものであっても、別に付加してもよい。プロモーターおよびターミネーターとしては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド３’−リン酸）などのプロモーターおよびターミネーターを利用し得るが、プロモーターおよびターミネーターの選択は、目的の遺伝子の発現に依存し、当業者によって適宜選択され得る。必要に応じて、さらなる発現を調節する因子（例えば、エンハンサー）などをさらに含み得る。発現カセットは、この遺伝子の発現の目的に応じて、必要な機能配列（例えば、以下に詳述するような細胞表層提示技術、分泌シグナルなど）をさらに含むこともできる。発現カセットは、必要に応じてリンカーも含み得る。
【００３０】
上記相同組換え領域の上流側が、ターゲットとする遺伝子座の上流（５’末端側）の領域と相同でありそして発現カセット（複数ある場合は上流側の）の上流（５’末端側）に配置され、そして下流側が、このターゲットとする遺伝子座の下流（３’末端側）の領域と相同でありそして発現カセット（複数ある場合は下流側の）の下流（３’末端側）に配置され得る。
【００３１】
本明細書中で塩基配列に対して「相同」な領域とは、参照する領域の塩基配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９７％、なおより好ましくは少なくとも９８％、さらに好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも１００％同一である配列を有する領域をいう。好ましくは、この「相同な領域」は、参照する領域に由来する。
【００３２】
相同組換え領域の長さは特に限定されない。相同組換えが生じるのに適した長さであることが好ましい。したがって、少なくとも４０塩基対であり得る。
【００３３】
遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントは、酵母選択マーカーをさらに含む。これにより、形質転換酵母の選抜が容易になり得る。この酵母選択マーカーとしては、形質転換酵母細胞の選択に通常使用され得るマーカーが挙げられ、多くの場合、栄養要求性が利用され得る。ターゲットとする遺伝子座が栄養要求性を支配する遺伝子（すなわち、酵母の生育に必要な栄養を酵母自身によって生成できるようにする遺伝子）であれば、酵母選択マーカーは、ターゲットとする栄養要求性とは異なる栄養要求性を支配する遺伝子であり、カウンターセレクションが可能なマーカーである。「カウンターセレクションが可能な」とは、その遺伝子の欠損または破壊を選択することが可能であることをいう。
【００３４】
酵母選択マーカーは、形質転換された酵母から除去されることが望ましい。このために、ターゲットとする遺伝子座の下流の配列が利用され得る。理解を容易にするために、図２を参照して説明する。遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントにおいて、酵母選択マーカー（図２の最上段のフラグメント中の「ＵＲＡ３」）は、上記相同組換え領域の下流側の領域（図２中の最上段のフラグメント中の点を有する帯で表される領域）が相同である領域（図２中の「Parental chromosome」（親染色体）中の点を有する帯で表される領域）のさらに下流（３’末端側）の領域（図２中の「Parental chromosome」（親染色体）中の黒の太い矢印で表される領域）に相同である反復領域（本明細書中では、単に「反復領域」ともいう；図２中の最上段のフラグメント中の黒の太い矢印で表される領域）を上流（５’末端側）に有するカセットの形態をとる。すなわち、酵母選択マーカーのカセットは、酵母選択マーカー（図２の最上段のフラグメント中の「ＵＲＡ３」）および当該酵母選択マーカーの上流（５’末端側）に反復配列（図２中の最上段のフラグメント中の黒の太い矢印で表される領域）を含む。さらに、この酵母選択マーカーカセットは、上記発現カセットの下流（３’末端側）でありそして上記相同組換え領域の下流側の領域の上流（５’末端側）に配置されている。フラグメントにおいては、ターゲットとする遺伝子座の下流に直列に存在する２つの配列が、酵母選択マーカーを挟んで本来の位置と反対の位置（本来の下流側がマーカーに対して上流、本来の上流側がマーカーに対して下流）で存在し得る。
【００３５】
上記反復領域は、相同組換えが可能な任意の長さであり得る。好ましくは、約４０ｂｐ以上の長さである。上記相同組換え領域の下流側の領域は、最終的に酵母選択マーカーと共に除去されるのが妨害されない程度の長さであることが好ましい。本実施例では、操作上の好ましさのため、反復領域および相同組換え領域の下流側の領域はともに４０ｂｐの長さを採用しているが、これに限定されない。
【００３６】
遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントは、ベクターに組み込まれ得る。ＤＮＡの取得を容易にする点からは、大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましく、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製起点(Ori)とColE1の複製起点とを有し、さらに大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）および酵母選択マーカー（上で説明）を有することがさらに好ましい。
【００３７】
形質転換は、当業者に周知の方法で実施され得る。具体的には、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。フラグメント自体が宿主の染色体と相同組換えを起こして染色体に取り込まれれば、いかなる方法も使用され得る。形質転換は、プラスミドのようなベクターに組み込まれた形態から、あるいは線状フラグメントの形態にして細胞に導入されてもよい。
【００３８】
遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントで酵母細胞を形質転換すると、このフラグメントと酵母細胞のゲノムとの間で相同組換え領域による相同組換えが生じて、ターゲットとする遺伝子座が破壊されて欠失し、発現を目的とする遺伝子、さらに反復領域と共に酵母選択マーカーが挿入される。このため、酵母選択マーカーおよび下流側の相同組換え領域を挟んで両側に、相同領域（反復領域および上記相同組換え領域の下流側の領域が相同であるターゲット遺伝子座中の領域のさらに下流（３’末端側）の領域；ともに、図２の「Transformed chromosome」（形質転換染色体）中、黒の太い矢印で表される領域で表される）が配置される。さらに、これらの相同領域が相同組換えを生じ、それらの間の酵母選択マーカーが除去されて、発現を目的とする遺伝子のみを染色体上に残す。一旦、形質転換を行うと、まず第一の相同組換えによるターゲットとする遺伝子座の破壊ならびに発現を目的とする遺伝子および酵母選択マーカーの挿入が生じ、そしてそのまま培養していると、続いて第二の相同組換えによる該酵母選択マーカーの除去が生じる。
【００３９】
本発明によれば、酵母細胞に栄養要求性を付与し、そして発現を目的とする遺伝子を導入することが可能となる。したがって、本発明は、栄養要求性を本来持たない酵母への外来遺伝子の導入に好適に用いられ得る。本発明によれば、栄養要求性のない酵母であっても、遺伝子導入のマーカーに適した栄養要求性が付与されるので、発現を目的とする遺伝子が導入された形質転換細胞の選択が可能となる。栄養要求性のない酵母としては、例えば、実用酵母が挙げられる。
【００４０】
酵母細胞に栄養要求性を付与し、そして発現を目的とする遺伝子を導入するには、ターゲットとする遺伝子座として、栄養要求性支配遺伝子が用いられる。この「ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子」は、形質転換が意図される酵母細胞が有していない栄養要求性を支配する遺伝子であり得る。このような栄養要求性は、形質転換体を選抜するためのマーカーとして利用できる任意の栄養要求性を含む。栄養要求性およびこの栄養要求性を支配する遺伝子（本明細書では、単に「栄養要求性支配遺伝子」ともいう）としては、以下が挙げられる（括弧内に対応する栄養要求性支配遺伝子を示す）：ウラシル要求性（例えば、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５）、トリプシン要求性（例えば、ＴＲＰ１）、ロイシン要求性（例えば、ＬＥＵ２）、ヒスチジン要求性（例えば、ＨＩＳ３）など。これらの遺伝子配列情報は当業者に入手可能であり（例えば、Saccharomyces Genome Database http://www.yeastgenome.org/のデータベースから）、これらの遺伝子配列情報を用いて、上記遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントを調製するためのプライマーを設計し得る。
【００４１】
また、形質転換酵母の選抜をより容易にするために、酵母選択マーカーとして、栄養要求性マーカーが利用され得る。この場合、ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子とは異なる栄養要求性を支配する遺伝子が利用され得る。マーカーとしては、異なる栄養要求性を支配する遺伝子を形質転換酵母の選択マーカーとして利用するには、形質転換が意図される酵母細胞がこの異なる栄養要求性を有する必要がある。この異なる栄養要求性を有する酵母細胞を形質転換材料として用いても、あるいは、形質転換前に酵母にこの異なる栄養要求性を付与してもよい。実用酵母のような栄養要求性を有しない酵母の場合は、この異なる栄養要求性を付与する。例えば、栄養要求性マーカーとしては、カウンターセレクションが可能なマーカーが望ましく、ウラシル要求性遺伝子（例えばＵＲＡ３）およびリジン要求性遺伝子（例えばＬＹＳ２）が挙げられる。酵母への栄養要求性の付与の操作の容易性および酵母選択マーカーとしての利用性を考慮すると、異なる栄養要求性として、好ましくは、ウラシル要求性遺伝子であるＵＲＡ３が利用され得る。
【００４２】
異なる栄養要求性マーカーの付与は、該栄養要求性を支配する遺伝子の破壊によって行われ得る。ウラシル要求性を付与する場合、例えば、ウラシル要求性変異株（例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＴ−８株）から獲得したｕｒａ３−断片を実用酵母の正常ｕｒａ３遺伝子と乗り換えさせることにより、実用酵母の正常ｕｒａ３遺伝子の破壊を行い得る。ｕｒａ３遺伝子破壊株は、ｕｒａ３正常株（野生型酵母または通常実用酵母）が５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地で生育できないが、ｕｒａ３遺伝子破壊株は生育できることを利用して、マーカーの有無を容易に同定または選抜することができる。ｌｙｓ２遺伝子破壊株の場合は、ｌｙｓ２正常株（野生型酵母または通常実用酵母）がα−アミノアジピン酸を含む培地で生育できないが、ｕｒａ３遺伝子破壊株は生育できることを利用して、マーカーの有無を容易に同定または選抜することができる。栄養要求性を支配する遺伝子の破壊および栄養要求性支配遺伝子変異株の選択的分離の手法は、利用する栄養要求性に応じて使用され得る。
【００４３】
ターゲットとする遺伝子座が栄養要求性支配遺伝子であり、そして上記酵母選択マーカーとして異なる栄養要求性支配遺伝子を利用する場合、形質転換酵母の選択のために、異なる栄養要求性の表現型が形質転換酵母の選択に利用され得る。例えば、ウラシル要求性支配遺伝子（例えばＵＲＡ３）を酵母選択マーカーとして利用するには、形質転換を意図する酵母を予めウラシル要求性にした上で形質転換を行い、ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子が欠失して発現を目的とする遺伝子が導入された形質転換酵母の選択のために、ウラシル要求性支配遺伝子が発現していること（すなわちウラシル要求性なしとの表現型）を利用し、そして酵母選択マーカー（ウラシル要求性支配遺伝子）の回収（すなわち、形質転換酵母からのウラシル要求性支配遺伝子の除去）の確認のために、上述の５−ＦＯＡを用いる選抜（すなわち、ウラシル要求性ありとの表現型）が利用され得る。したがって、最終的には、ターゲットとする栄養要求性支配遺伝子および異なる栄養要求性支配遺伝子が欠失してそれらの要求性を有し、かつ発現を目的とする遺伝子が導入された酵母が生成される。
【００４４】
本発明によれば、酵母細胞に対して付与された栄養要求性マーカーを、さらなる遺伝子操作に利用することができる。したがって、本発明によって調製された、発現を目的とする遺伝子が導入された形質転換酵母に対して、当該形質転換酵母の栄養要求性マーカーを利用して、さらに遺伝子を導入することができる。例えば、すぐ上の段落に記載のように、ウラシル要求性支配遺伝子（例えばＵＲＡ３）を酵母選択マーカーとして利用した場合には、形質転換酵母に付与された栄養要求性には、ウラシル要求性も含まれる。
【００４５】
したがって、本発明によれば、酵母細胞に繰り返し遺伝子を導入する方法が提供される。上記遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントで形質転換された酵母（栄養要求性支配遺伝子が欠失されかつ発現を目的とする遺伝子が導入された酵母）をさらに形質転換し得る。このような形質転換には、形質転換酵母細胞で欠失されている栄養要求性支配遺伝子および発現を目的とするさらなる遺伝子を含むベクターが用いられ得る。発現を目的とするさらなる遺伝子は、上記遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントで形質転換された酵母に導入された遺伝子と同じであっても、または異なっていてもよい。また、形質転換酵母細胞で欠失されている栄養要求性支配遺伝子および発現を目的とするさらなる遺伝子を含むベクターには、発現を目的とするさらなる遺伝子を２つ以上（それぞれ同じまたは異なる遺伝子であり得る）含んでいてもよい。
【００４６】
発現ベクターは、目的の酵素の構造遺伝子を発現させるために、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列を含んでいることが望ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド３’−リン酸）などのプロモーターおよびターミネーターを利用し得るが、プロモーターおよびターミネーターの選択は、目的の酵素遺伝子の発現に依存し、当業者によって適宜選択され得る。オペレーター、エンハンサーなどについても、当業者によって適宜選択され得る。例えば、ＧＡＰＤＨプロモーターとＧＡＰＤＨターミネーターとを含むプラスミド（例えば、pYGA2270、pYE22m、pBG211など）、ＰＧＫプロモーターとＰＧＫターミネーターとを含むプラスミド（例えば、Yip-PGKp-YAP1 (TOYOBO)など）、ＧＡＰプロモーターとＧＡＰターミネーターとを含むプラスミド（例えば、pYGA2270、pYE22m、pBG211など）、などが用いられ得る。
【００４７】
ベクターは、マルチコピー型および染色体組込み型がある。どの型のベクターにどの遺伝子を組込むかは、当業者が適宜決定すればよい。導入を目的とする遺伝子は、同一のベクターに組込まれてもよく、それぞれ異なるベクターに組込まれてもよい。
【００４８】
酵母への遺伝子構築物の導入とは、細胞の中に遺伝子構築物を導入し、発現させることを意味する。遺伝子構築物の導入の方法としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなど、当業者に公知の種々の方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。導入される遺伝子構築物は、プラスミドの形態で、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。
【００４９】
遺伝子構築物が導入された形質転換酵母は、選択マーカー（例えば、上述した栄養要求性マーカー）で選択され得る。発現されたタンパク質の活性を測定することによりさらに確認され得る。
【００５０】
また、形質転換酵母細胞で欠失されている栄養要求性支配遺伝子および発現を目的とするさらなる遺伝子を含むベクターでの形質転換後に栄養要求性が喪失した実用酵母において、上記の遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントを利用した遺伝子導入法を再度行って栄養要求性マーカーの付与と発現を目的とする遺伝子の導入とを可能にし得る。
【００５１】
（β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素を発現するセルロース分解性実用酵母）
本発明によれば、産業上利用性が高いが、遺伝子操作を行う上で必要な栄養要求性マーカーを有さない実用酵母に対しても、遺伝子導入が可能になる。
【００５２】
「実用酵母」とは、従来エタノール発酵に用いられる任意の酵母（例えば、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母など）をいう。実用酵母の中でも、高いエタノール発酵能および高いエタノール耐性を有し、遺伝学的にも安定した清酒酵母が好ましい。「実用酵母」は、高いエタノール耐性を有する酵母であり、好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる酵母である。さらに耐酸性、耐熱性などを有することが好ましい。さらに好ましくは、凝集性であり得る。例えば、このような性質を有する実用酵母としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構により入手可能であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１４４０株（ＭＡＴα、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性あり）およびＮＢＲＣ１４４５株（ＭＡＴａ、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性なし）が挙げられる。
【００５３】
実用酵母は、エタノールに極めて高い耐性を有するため、単糖を生産した後、そのままエタノール発酵に供することができる。中でも、各種培養ストレスに強いことから、厳密な制御が難しく過酷な培養条件になる場合もある工業生産においても安定した細胞増殖を示す点で好ましい。また実用酵母は多倍体となるため、相同染色体に複数の遺伝子構築物（発現ベクター）を組み込むことが可能であり、その結果一倍体であることが多い実験室酵母に組み込む場合に較べて、目的タンパク質の発現量が高くなる。
【００５４】
実用酵母は、多くの場合原栄養体であって形質転換体を選抜するための適切な栄養要求性マーカーを有しない。本発明によれば、実用酵母（特に、栄養要求性を有しない酵母であって、エタノール耐性の高い（好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる）酵母）に、目的の遺伝子を導入するに適した特定の栄養要求性マーカーを付与し、かつ目的の遺伝子を導入することができる。遺伝子破壊および遺伝子組み込みフラグメントによって付与される栄養要求性マーカーとしては、その遺伝子操作上の利用から、ウラシル要求性、トリプシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性などが挙げられるがこれらに限定されない。ウラシル要求性に関しては、上述したように、ウラシル要求性変異株（例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＴ−８株）から獲得したｕｒａ３−断片を実用酵母の正常ｕｒａ３遺伝子と乗り換えさせることによって付与することもできる。したがって、遺伝子操作の効率を考慮すると、ターゲットとする栄養要求性をウラシル要求性以外の栄養要求性を選択し（例えば、トリプシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性など）、この遺伝子を破壊するようにフラグメントを設計することが好ましい。ウラシル要求性変異株のｕｒａ３−断片との実用酵母の正常ｕｒａ３遺伝子との乗り換えによりウラシル要求性を獲得した実用酵母を、ウラシル要求性支配遺伝子を上記選択酵素マーカーカセットに含み、そしてターゲットとする栄養要求性（例えば、トリプシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性など）を付与するように設計した遺伝子破壊および遺伝子組み込みフラグメントで形質転換することで、ターゲットとする栄養要求性に加えてウラシル要求性を獲得し、かつ所望の遺伝子が導入された形質転換実用酵母が得られる。
【００５５】
以下、実用酵母での発現について産業上利用性の高いβ１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素の発現カセットの作製について説明する。
【００５６】
本発明における「β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素」は、β１，４−グルコシド結合を切断することができる酵素であれば、特に制限はない。代表的には、セルロース分解酵素が挙げられ、好ましくは、エンドβ１，４−グルカナーゼ（以下、単に「エンドグルカナーゼ」という）、セロビオヒドロラーゼ、グルカン１，４−βエンドグルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼなどであり得る。エンドグルカナーゼは、通常、セルラーゼと称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖を生じる。セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離し、グルカン１，４−βエンドグルコシダーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してグルコースを遊離する。β−グルコシダーゼは、セルロースの非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。カルボキシメチルセルラーゼは、セルロース鎖のグルコース残基のところどころにカルボキシメチル基を導入し可溶化した誘導体であるカルボキシメチルセルロースなどの非結晶性セルロースを分解する酵素である。
【００５７】
β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素は、任意のセルロース分解酵素生産菌に由来する酵素であり得る。セルロース分解酵素生産菌としては、代表的には、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、およびアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)）、クロストリディウム属（例えば、クロストリディウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)、セルロモナス属（例えば、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)およびセルロモナス・ウダ(Cellulomonas uda)）、シュードモナス属（例えば、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescence)）などに属する微生物が挙げられる。
【００５８】
より具体的には、実用酵母にて発現させるセルロース分解酵素としては、アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、ＥＧＩＩ）、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、ＣＢＨ２）が用いられ得る。
【００５９】
セルロースを分解してグルコースを生産するために、エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとの組み合わせがセルロースと反応可能となるように、実用酵母を組換え作製すればよい。本発明によれば、実用酵母を、これらの酵素の１種のみを大量に発現（同種の複数の遺伝子を発現）できるようにも、および／または２種以上の異なる酵素の組み合わせを発現するようにも、組換え作製できる。したがって、セルロースを分解してグルコースを生産するために、これらの酵素のそれぞれ１種のみを発現できるように組換え作製したそれぞれの実用酵母を組み合わせて、あるいは２種以上を発現する実用酵母を組み合わせて、エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとがセルロースに対して作用し得るようにすればよい。例えば、２種以上の組み合わせとしては、（１）エンドグルカナーゼとβ−グルコシダーゼとを組み合わせるか、（２）セロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとを組み合わせるか、（３）エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとを組み合わせることができる。これらの組み合わせにより、効率よくセルロースが分解され、グルコースが生産され得る。
【００６０】
発現を目的とする酵素の遺伝子は、該酵素を産生する微生物から、既知の配列情報に基づいてプライマーまたはプローブを設計してＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法などによって取得し得る。
【００６１】
酵素が細胞表層に提示された微生物を作出する方法としては、（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して細胞表層に提示する方法、（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して細胞表層に提示する方法、および（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を介して細胞表層に提示する方法があるが、これらに限定されない。細胞表層工学の技術は、例えば、特許文献１〜３（特に特許文献３）に記載される。
【００６２】
用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の性凝集タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン（ＧＰＩアンカーとして使用）、Ｆｌｏ１タンパク質（Ｆｌｏ１タンパク質は、Ｎ末端側のアミノ酸長を種々改変して、ＧＰＩアンカーとして使用し得る：例えば、Ｆｌｏ４２、Ｆｌｏ１０２、Ｆｌｏ１４６、Ｆｌｏ３１８、Ｆｌｏ４２８など；非特許文献４：なお、Ｆｌｏ１３２６とは、全長Ｆｌｏ１タンパク質を表す）、Ｆｌｏタンパク質（ＧＰＩアンカー機能を有さず凝集性を利用する、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇ；非特許文献５）、ペリプラズム局在タンパク質であるインベルターゼ（ＧＰＩアンカーを利用しない）などが挙げられる。
【００６３】
まず、（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法について説明する。ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元付近で切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
【００６４】
ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
【００６５】
ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列が特に有用である。
【００６６】
したがって、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的とする酵素をコードするＤＮＡ配列に置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的の酵素を細胞表層に提示するための組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的の酵素をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。このようなＤＮＡを酵母に導入して発現させることによって細胞表層に提示された酵素は、そのＣ末端側が表層に固定されている。
【００６７】
次に、（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法について説明する。細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメイン、ＦＬＯタンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００６８】
この細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）と目的の酵素とを結合することにより、細胞表層に酵素が提示される。目的の酵素の種類により、細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に酵素を結合させる、（２）Ｃ末端側に酵素を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる酵素を結合させることができる。本発明においては、（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素をコードする遺伝子−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子；（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素をコードする遺伝子；あるいは（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素をコードする第一の遺伝子−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素をコードする第二の遺伝子（但し、第一の遺伝子と第二の遺伝子とは同じでも異なっていてもよい）、を作成することにより、細胞表層に目的の酵素を提示するための組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、一部のみ存在してもよいが、存在しなくてもよい。また、凝集機能ドメインを用いる場合は、ドメインの長さを調節しやすいため（例えば、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇのいずれかを選択できる）、より適切な長さで酵素を細胞表層に提示できる点で、ならびに酵素のＮ末端またはＣ末端のどちらの側でも結合させることが可能な点で、非常に有用である。
【００６９】
次に、（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を利用する方法について説明する。この場合は、目的とする酵素を、ペリプラズム遊離型タンパク質との融合タンパク質として細胞表層に発現させ得ることに基づく。ペリプラズム遊離型タンパク質としては、例えば、インベルターゼ（Ｓｕｃ２タンパク質）が挙げられる。目的の酵素は、これらのペリプラズム遊離型タンパク質に応じて、適宜Ｎ末端またはＣ末端側に融合され得る。
【００７０】
酵母にて酵素を細胞外に分泌して発現させる方法は、当業者には周知である。上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡに、目的の酵素の構造遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作成し、酵母に導入すればよい。
【００７１】
酵母の細胞内にて遺伝子を発現させる方法もまた当然、当業者には周知である。この場合、上記細胞表層提示技術や上記分泌シグナルを用いることなく、目的の構造遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作成し、酵母に導入すればよい。
【００７２】
上記の各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。例えば、分泌シグナル配列と目的酵素の構造遺伝子との結合は、部位特異的突然変異法を用いて行うことができる。この方法を用いることにより、正確な分泌シグナル配列の切断および活性な酵素の発現が可能である。
【００７３】
発現カセットは、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列を含んでいることが望ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド３’−リン酸）などのプロモーターおよびターミネーターを利用し得るが、プロモーターおよびターミネーターの選択は、目的の酵素遺伝子の発現に依存し、当業者によって適宜選択され得る。オペレーター、エンハンサーなどについても、当業者によって適宜選択され得る。
【００７４】
上記発現カセットを含む遺伝子破壊および遺伝子組み込みフラグメントを用いる実用酵母の形質転換については上で説明したとおりである。酵素を表層提示するように発現カセットを設計すると、これらの酵素を表層提示する実用酵母が得られ得る。
【００７５】
上記発現カセットが組み込まれて発現を目的とする遺伝子が導入された実用酵母は、上で説明したように、酵母選択マーカー（例えば、上述した栄養要求性マーカー）で選択され得る。さらに、発現されたタンパク質の活性を測定することによって確認され得る。タンパク質が細胞表層に固定されていることは、例えば、抗タンパク質抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。
【００７６】
本発明によれば、エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとを組み合わせて発現する実用酵母を作製できる。例えば、β−グルコシダーゼの発現カセットを含み、ヒスチジン要求性を付与し、そしてウラシル要求性支配遺伝子（例えばＵＲＡ３）の酵母選択マーカーカセットを含むように、遺伝子破壊および遺伝子組み込みフラグメントを設計する。実用酵母はウラシル要求性を付与しておく。次いで上記フラグメントでウラシル要求性を付与した実用酵母を形質転換する。形質転換実用酵母の選抜については上述した通りに行い得る。この段階で、実用酵母は、ウラシル要求性およびヒスチジン要求性が付与され、そしてβ−グルコシダーゼ遺伝子が導入されている。次いで、ウラシル要求性選択マーカーを含むエンドグルカナーゼの発現ベクターおよびヒスチジン要求性選択マーカーを含むセロビオヒドロラーゼの発現ベクターを構築し（マーカーと発現遺伝子との組み合わせは逆であってもよい）、これらの発現ベクターを用いて上記形質転換酵母をさらに形質転換すると、最終的にエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼを組み合わせて発現する実用酵母が得られる。あるいは、ウラシル要求性選択マーカーまたはヒスチジン要求性選択マーカーを含み、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼを発現するように構築されたベクターで、上記ウラシルおよびヒスチジンマーカーが付与された形質転換酵母をさらに形質転換することもできる。上述したように、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが表層提示するまたは分泌するように、これらの発現カセットを構築することができる。ヒスチジン要求性選択マーカーと同様に、トリプシン要求性選択マーカー（例えば、ＴＲＰ１）またはロイシン要求性選択マーカー（例えば、ＬＥＵ２）もまた、実用酵母へのマーカー付与に利用でき、上記のセルラーゼを発現する実用酵母の組換え作製に用いることができる。
【００７７】
（エタノールの製造）
本発明によれば、上記β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素を発現する、好ましくは表層提示する、セルロース分解性実用酵母を用いてエタノールを製造する方法が提供される。この方法は、β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素を細胞表層に発現するように組み換えられたセルロース分解性実用酵母と、セルロース系物質とを反応させてエタノールを得る工程を含む。該セルロース分解性実用酵母によって、該セルロース系物質中のセルロースからグルコースが得られ、そして該生成したグルコースを用いてエタノールが生成される。
【００７８】
用語「セルロース系物質」は、本明細書中においては、セルロースを含有する任意の物質、産物、および組成物をいう。用語「セルロース」とは、β１，４−グルコシド結合によりグルコピラノースが連なった繊維状高分子をいうが、その誘導体または塩、あるいは分解により重合度が低下したものもまた含む。例えば、セルロースがカルボキシメチル化されたカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸膨潤セルロースなども含まれる。結晶性セルロース（例えば、アビセル）もまた利用可能である。セルロースは、産業上の廃棄物（例えば、紙の製造または再生において生じる紙粕、農業上収穫されずにまたは食品製造上廃棄される木材の木質部や草本性植物の茎葉部・皮部など（特に非可食部））中にも存在し得、これらもまた、「セルロース系物資」に含まれる。
【００７９】
木材の木質部、ならびに草本性植物の茎葉部および皮部は、セルロースを主成分の１つとする植物細胞壁成分を含み得る。植物細胞壁は、通常、セルロースに加え、ヘミセルロースおよびリグニンを成分に含む。植物種（特に、木材であるかまたは草本性であるか）または植物の生育程度などに依存してそれらの成分の含有量は変動し得るが、セルロースを含む限りいずれの種でも生育程度でも用いられ得る。
【００８０】
したがって、セルロース系物質としては、上述した植物細胞壁成分を含有する任意の物質および廃棄物および産物もまた挙げられる。不溶性食物繊維もまた、「植物細胞壁成分含有物」に含まれる。上述した木材の木質部や草本性植物の茎葉部・皮部に加え、これらの部分から加工したもの（例えば、コーンファイバー）も含むが、本発明は、廃棄される不要物を用いることが再利用の点で好ましい。
【００８１】
セルロース系物質（特に廃棄物中のセルロース繊維）は、例えば特許文献３の記載に基づいて、無触媒水熱法を用いて、例えば、適当な長さのセルロース単位あるいはオリゴ糖を形成する、あるいは繊維間（例えば、セルロース間）の架橋が外れ、セルロース分解酵素が作用し易くなるように、処理してもよい。
【００８２】
木材の木質部や草本性植物の茎葉部および皮部は、好ましくは、リグニンのような非糖化部を除去した後に、本発明の方法において利用され得る。
【００８３】
上記方法では、該セルロース分解性実用酵母は、セルロースを分解してグルコースを生産することができるように添加され得る。エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとの組み合わせがセルロースと反応可能となるように、実用酵母を組換え作製すればよい。本発明によれば、実用酵母を、これらの酵素の１種のみを大量に発現できるようにも、および／または２種以上の異なる酵素の組み合わせを発現するようにも、組換え作製できる。したがって、セルロースを分解してグルコースを生産するために、これらの酵素のそれぞれ１種のみを発現できるように組換え作製したそれぞれの実用酵母を組み合わせて、あるいは２種以上を発現する実用酵母を組み合わせて、エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとがセルロースに対して作用し得るようにすればよい。例えば、２種以上の組み合わせとしては、（１）エンドグルカナーゼとβ−グルコシダーゼとを組み合わせるか、（２）セロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとを組み合わせるか、（３）エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとを組み合わせることができる。これらの組み合わせにより、効率よくセルロースが分解され、グルコースが生産され得る。
【００８４】
本発明によれば、例えば、β−グルコシダーゼ（特にアスペルギルス・アクレアータス由来のＢＧＬ１）、エンドグルカナーゼ（特にトリコデルマ・リーセイ由来のＥＧＩＩ）、およびセロビオヒドロラーゼ（特にトリコデルマ・リーセイ由来のＣＢＨ２）のそれぞれあるいはこれらの２種以上が細胞表層に発現されるように組み換えられている実用酵母が提供される。このような酵母は、エタノール製造用酵母として好適である。
【００８５】
セルロース系物質からのエタノールの製造のために、セルロース分解性に加え、キシロース資化性をさらに利用することもできる。キシロースは、セルロースを主成分の１つとする植物細胞壁成分に含まれるヘミセルロースから、酵素分解により得られる。キシロース資化性のために、キシロース資化性遺伝子および／またはキシラン分解酵素をコードする遺伝子を発現する実用酵母を別に作製するかまたはセルロース分解性実用酵母に該遺伝子をさらに発現させることによって、ヘミセルロースに由来するキシロースをもエタノール発酵に利用し得る。ヘミセルロースを分解する酵素（例えば、キシラン分解酵素）が実用酵母の細胞表層に提示していることが好ましい。キシラン分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ（特にトリコデルマ・リーセイ由来のＸＹＬＩＩ）およびβ−キシロシダーゼ（アスペルギルス・オルゼ由来のＸｙｌＡ）が挙げられる。キシロース資化性遺伝子としては、キシロース代謝系酵素の遺伝子、例えば、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子（ともにピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来）ならびにキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子（サッカロマイセス・セレビシエ由来）が挙げられる。
【００８６】
例えば、キシラン分解（ヘミセルロース分解）およびキシロース資化性の両方を有する実用酵母を作製するために、キシラナーゼ（特にトリコデルマ・リーセイ由来のＸＹＬＩＩ（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ６９５７４；Ｓ５１９７５））およびβ−キシロシダーゼ（アスペルギルス・オルゼ由来のＸｙｌＡ（ＩＮＳＤアクセッション番号ＡＢ０１３８５１））を細胞表層に発現し、かつキシロース資化性遺伝子（特に、ピチア・スチピチス由来のキシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子ＸＹＬ１（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５９４６５）、ピチア・スチピチス由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子であるＸＹＬ２（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５５３９２）、およびサッカロマイセス・セレビシエ由来のキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子であるＸＫＳ１（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ８２４０８））を発現するように実用酵母を組み換え調製し得る。このために、上記の遺伝子破壊および遺伝子組み込みのためのフラグメントを利用した遺伝子導入法を利用し得る。
【００８７】
本発明の方法で使用される組換え実用酵母は、好ましくは、担体に固定される。そのことにより、再使用が可能となる。
【００８８】
組換え実用酵母を固定する担体および方法は、当業者が通常用いる担体および方法が用いられ、例えば、担体結合法、包括法、架橋法などが挙げられる。
【００８９】
組換え実用酵母を固定する担体としては、多孔質体が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォームなどの発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは、用いる微生物およびその大きさを考慮して決定され得るが、実用酵母の場合、50〜1000μｍが好ましい。
【００９０】
また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは立方体が好ましい。大きさは、用いる微生物により決定すればよいが、一般には、球状の場合、直径が2〜50ｍｍ、立方体状の場合、2〜50ｍｍ角が好ましい。
【００９１】
本発明の方法に使用される組換え実用酵母は、発酵に供する前に好気的条件下で培養することにより、その数を増加させ得る。培地は、選択培地であっても非選択培地であってもよい。培養時の培地のｐＨは、好ましくは約4.0〜約6.0、最も好ましくは約5.0である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは約0.5〜約６ppm、より好ましくは約１〜約４ppm、最も好ましくは約2.0ppmである。また、培養時の温度は、約20〜約45℃、好ましくは約25〜約35℃、最も好ましくは約30℃であり得る。培養時間は、菌体濃度が10g/l以上になるまで培養することが好ましく、約20〜約50時間程度であり得る。
【００９２】
本発明の方法では、セルロース分解性実用酵母、および基質としてセルロース系物質を用いて、通常エタノール発酵を行う条件下で発酵させて、エタノールを生産させる。キシラン分解（ヘミセルロース分解）および／またはキシロース資化性の実用酵母もまた、上記発酵の際に添加し得る。セルロース分解性実用酵母がまた、キシラン分解（ヘミセルロース分解）および／またはキシロース資化性をさらに有し得る。この発酵工程の形式としては、回分（バッチ）工程、流加回分工程、繰り返し回分工程、連続工程などが挙げられるが、これらのいずれであってもよい。また、発酵時の温度は、約30〜35℃であり得る。
【００９３】
発酵の進行とともに上記の発酵条件が変化するので、これらを一定の範囲に調節することが好ましい。発酵の経時変化は、例えば、ガスクロマトグラフ、ＨＰＬＣなどの当業者が通常用いる手段でモニターすればよい。
【００９４】
組換え実用酵母のセルロースの糖化および発酵によるエタノールの製造を促進するために、セルラーゼ酵素をさらに添加してもよい。市販のセルラーゼ酵素が使用可能である。
【００９５】
発酵工程終了後、エタノールを含む培地を発酵槽から抜き取り、例えば、遠心分離機による分離操作および蒸留操作などの当業者が通常用いる分離工程によって、エタノールが単離される。
【００９６】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００９７】
（材料）
サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440（MATα）株を独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手し、そして形質転換、染色体ＤＮＡの調製、およびβ−グルカン（セロビオース）またはリン酸膨潤セルロース（非結晶性セルロース）からのエタノール発酵のそれぞれのための宿主として使用した。【００９８】
サッカロマイセス・セレビシエMT8-1（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）株をＵＲＡ３変異増幅用鋳型として使用した（非特許文献６）。【００９９】
大腸菌ＤＨ５α株をプラスミドの構築および増幅のために使用した。大腸菌は、100mg/mLアンピシリンを含有するルリア−ベルターニ培地（10g/Lトリプトン、5g/L酵母エキス、5g/L塩化ナトリウム）中で増殖させた。【０１００】
酵母細胞を、合成デキストロース（ＳＤ）培地（6.7g/Lのアミノ酸以外の酵母窒素源（yeast nitrogen base without amino acids）［Difco社製］と適切な補充物を含む；20g/Lのグルコースが単一炭素源として添加されている）および酵母エキス・ポリペプトン・デキストロース（ＹＰＤ）培地（10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、20g/Lのグルコースを含む）中で、３０℃にて好気培養した。発酵後、この酵母を、酵母エキス・ポリペプトン・セロビオース（YPCellobiose）培地（10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50g/Lのセロビオースを含む）に３０℃にて嫌気的に接種した。【０１０１】
５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）培地は以下のように調製した。50mg/Lウラシル酸および２％（w/v）寒天を添加したウラシルドロップアウト合成デキストロース（ＳＤ）培地（非特許文献７）をオートクレーブ処理し、６５℃を維持した。ＦＯＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に100mg/mLの濃度で溶解し、約６５℃の上記オートクレーブした培地に添加し、ＦＯＡの最終濃度を1mg/mLとした。【０１０２】
（ＰＣＲ）
全てのＰＣＲ増幅は、KOD-Plus-DNAポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて実施した。以下のプライマーを用いた：HIS3-966 XbaI（配列番号１：１位から８位までの塩基配列はXbaI制限酵素部位に相当する）；HIS3-1c（配列番号２：１位から２４位までの全塩基配列は融合ＰＣＲのための重複配列に相当する）；HIS3URA3-2 AscI（配列番号３：１位から２４位までの塩基配列は融合ＰＣＲのための重複配列、２５位から３２位までの塩基配列はAscI制限酵素部位、３３位から７２位までの塩基配列はＨＩＳ３遺伝子座から複写される反復配列（４０ｂｐ；図１中の黒の太い矢印で表される領域）、そして７３位から８９位までの塩基配列はＵＲＡ３増幅のためのアニーリング配列に相当する）；HIS3-40Uc XbaI（配列番号４：１位から８位までの塩基配列はXbaI制限酵素部位、９位から４８位までの塩基配列はＨＩＳ３遺伝子座から複写される短い配列（４０ｂｐ；図１中の点を有する帯で表される領域）、そして４９位から６８位までの塩基配列はＵＲＡ３増幅のためのアニーリング配列に相当する）；HIS3-239c（配列番号５；ＨＩＳ３遺伝子の上流（５’末端側）領域の配列より設計）；HIS3-124（配列番号６；ＨＩＳ３遺伝子の下流（３’末端側）領域の配列より設計）；HIS3 β-Glu check（配列番号７；β−グルコシダーゼ遺伝子の配列より設計）；HIS3 β-Glu check2（配列番号８；β−グルコシダーゼ遺伝子の配列より設計）；β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ１）の表層提示発現カセット調製用プライマー対  GAPDH AscI（配列番号９：２位から１０位までの塩基配列はAscI制限酵素部位に相当する）およびGAPDH AscI Rev（配列番号１０：２位から１０位までの塩基配列はAscI制限酵素部位に相当する）；ＢＧＬ１遺伝子断片取得用プライマー対  bgl1プライマー１（配列番号１１）およびbgl1プライマー２（配列番号１２）；ΔＵＲＡ３断片取得用プライマー対  URA3 delete（配列番号１３）およびURA3 Δr（配列番号１４）；セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ２）表層提示発現カセット調製用プライマー対  R.ory s.s. XmaI（配列番号１５）およびCBH XbaI Rev（配列番号１６）；pIHGP3作製のためのＧＡＰＤＨプロモーター、マルチクローニングサイト、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片の取得用プライマー対  XYL2c-XhoI(F)（配列番号１７）およびXYL2c-NotI(R)（配列番号１８）；エンドグルカナーゼ（ＥＧ２）表層提示発現カセット調製用プライマー対  EG NheI Fw（配列番号１９）およびEG XmaI Rev（配列番号２０）；pGK406作製のためのＰＧＫプロモーター取得用プライマー対（配列番号２１および配列番号２２）；pGK406作製のためのＰＧＫターミネーター取得用プライマー対（配列番号２３および配列番号２４）；pGK406作製のためのマルチクローニングサイト取得用プライマー対（配列番号２５および配列番号２６）。【０１０３】
（コロニーＰＣＲ）
コロニーＰＣＲを非特許文献８に記載の通りに実施した。ＰＣＲ増幅は94℃にて５分から開始し、次いで、94℃にて20秒、50℃にて30秒、および68℃にて２分の30サイクルを用いて実施した。【０１０４】
（酵母形質転換）
酵母形質転換は、YEAST MAKER酵母形質転換システム（Clontech Laboratories, Palo Alto, California, USA）を用いて酢酸リチウムによって実施した。【０１０５】
（実施例１：遺伝子破壊および遺伝子組み込みフラグメントを含むプラスミドの構築）
ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）の破壊およびβ−グルコシダーゼ遺伝子の組み込みのマーカーリサイクル遺伝子導入用に用いたプラスミドpBlue HU-BGL13の構築のスキームを図１に示す（図１−１に、プラスミドpBlue HU-BGL13の構築の前半部であるＨＩＳ３欠失フラグメントのＰＣＲ生成を示し、図１−２に、後半部であるＨＩＳ３欠失フラグメントおよびβ−グルコシダーゼ発現カセットとベースプラスミドとの連結を示す）。【０１０６】
ＨＩＳ３欠失フラグメントのＰＣＲ生成のために、以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、HIS3-966 XbaI（配列番号１；Forward）およびHIS3-1c（配列番号２；Reverse）プライマーを用いて、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いてＨＩＳ３上流配列を増幅した；
ＰＣＲ２、HIS3URA3-2 AscI（配列番号３；Forward）およびHIS3-40Uc XbaI（配列番号４；Reverse）プライマーを用いて、鋳型としてｐＲＳ４０６プラスミド（Stratagene社）を鋳型として用いてＵＲＡ３増幅した；
ＰＣＲ３，HIS3-966 XbaI（配列番号１；Forward）およびHIS3-40Uc XbaI（配列番号４；Reverse）プライマーを用いて、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合することにより約2.1kbの融合フラグメントを増幅した。【０１０７】
得られたフラグメント（図１−１）は、サッカロマイセス・セレビシエＮBRC1440株の染色体ＤＮＡ中に存在するＨＩＳ３下流（３’末端側）に隣接する短い領域（４０ｂｐ領域：図中のＨＩＳ３下流の点を有する帯で表される領域）とさらに下流（３’末端側）に隣接する短い領域（４０ｂｐ領域：図中の黒の太い矢印で示される領域）をＵＲＡ３マーカーの両側に配置し（上流側に黒の太い矢印で示される領域、下流側に点を有する帯で表される領域）、さらにＨＩＳ３上流（５’末端側）に隣接する領域もまた含む。【０１０８】
得られた融合フラグメントをXbaIによって切断し、そしてpBluescript II SK＋（タカラバイオ社）のXbaI部位に導入した。得られたプラスミドをpBlue HUと命名した（図１−２）。【０１０９】
他方、β−グルコシダーゼ発現カセットを、以下のように調製した。まず、アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ１）の細胞表層提示のためのプラスミドpIBG13を以下のようにして構築した。アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）遺伝子をコードする2.5kbp NcoI-XhoI DNAフラグメントを、プラスミドpBG211（京都大学より贈与戴いた）を鋳型として使用し、bgl1プライマー１（配列番号１１；Forward）およびbgl1プライマー２（配列番号１２；Reverse）のプライマー対を用いてＰＣＲによって調製した。このＤＮＡフラグメントをNcoIおよびXhoIで消化し、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列をコードする遺伝子およびα−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域（非特許文献９）を含有する細胞表層発現プラスミドpIHCS（非特許文献１０）のNcoI-XhoI部位に挿入した。得られたプラスミドをpIBG13と命名した。【０１１０】
次に、GAPDH AscI（配列番号８；Forward）およびGAPDH AscI Rev（配列番号９；Reverse）プライマーを用いて、pIBG13を鋳型として用いてＰＣＲ増幅を行った。これにより、サッカロマイセス・セレビシエ由来グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列（ｓ．ｓ．）、アスペルギルス・アクレタス由来β−グルコシダーゼ遺伝子、α−アグルチニンの３２０アミノ酸をコードする領域の３’側半分（ＡＧ）、および446bpの３’−フランキング領域、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＧＡＰＤＨターミネーターを含むフラグメント（β−グルコシダーゼ発現カセット）が得られた（図１−２）。【０１１１】
このβ−グルコシダーゼ発現カセットをAscIによって切断し、そしてpBlue HUのAscI部位に導入した。得られたプラスミドをpBlue HU-BGL13と命名した（図１−２）。図中のpBlue HU-BGL13の矢印で示される部分は、ＨＩＳ３遺伝子を破壊するマーカーリサイクル部である。【０１１２】
（実施例２：実用酵母へのＵＲＡ３マーカーの付与）
上記実験室酵母サッカロマイセス・セレビシエMT8-1株は、ウラシル要求性（ＵＲＡ３−）変異株である。このMT8-1株のゲノムから、URA3 delete（配列番号１３；Forward）およびURA3 Δr（配列番号１４；Reverse）のプライマー対を用いてＰＣＲによって増幅することにより、ΔＵＲＡ３フラグメントをクローニングした。このフラグメントをサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440（MATα）株に形質転換し、そして形質転換株を上記のように５−ＦＯＡ培地によって選択した。【０１１３】
（実施例３：ヒスチジン遺伝子が欠失しおよびβ−グルコシダーゼ遺伝子が組み込まれた実用酵母の作製）
ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）破壊およびβ−グルコシダーゼ遺伝子の組み込みのスキームを図２に示す。図２中の略語および帯により表される遺伝子配列は図１と同様である。【０１１４】
実施例１で得られたpBlue HU-BGL13は、ターゲティングされるＨＩＳ３遺伝子座の近接領域（親染色体の中の黒の太い矢印で示される領域）から複写される４０ｂｐの反復配列（フラグメントの中の黒の太い矢印で示される領域）をβ−グルコシダーゼ細胞表層提示発現カセットの下流（３’末端側）にして、逆選択ＵＲＡ３マーカーおよび該マーカーの上流および下流に相同組換え配列を含むＨＩＳ３遺伝子破壊用フラグメントに挿入されている構築物を含む（図２の最上段に示される模式図）。【０１１５】
プラスミドpBlue HU-BGL13を制限酵素XbaIを用いて直線状にして、実施例２で作製したＵＲＡ３マーカーが付与された（すなわち、ウラシル要求性の）サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株を形質転換し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。この構築物が上記実用酵母NBRC1440の染色体に組み込まれると同時にＨＩＳ３遺伝子破壊が生じ、β−グルコシダーゼ細胞表層提示遺伝子発現カセットとＵＲＡ３マーカーおよびその両側の反復配列とが染色体内に組み込まれる（図２の上から１番目の縦向きの矢印のすぐ下に示される模式図）。【０１１６】
得られた形質転換体においてＨＩＳ３遺伝子破壊およびβ−グルコシダーゼ細胞表層提示遺伝子発現カセットの組み込みが生じたか否かをコロニーＰＣＲによって確認した。このコロニーＰＣＲの結果を表す電気泳動写真を、このコロニーＰＣＲで使用したプライマーおよびその増幅領域を示す模式図と併せて図３に示す。【０１１７】
ＨＩＳ３遺伝子の存在について、HIS3-124（配列番号６；Forward）およびHIS3-239c（配列番号５；Reverse）のプライマー対を用いて増幅の有無を調べた（図３の上側の模式図）。β−グルコシダーゼ細胞表層提示遺伝子発現カセットの存在について、HIS3-124（配列番号６；Forward）およびHIS3 β-Glu check（配列番号７；Reverse）のプライマー対を用いて増幅の有無を調べた（図３の下側の模式図）。【０１１８】
図３の電気泳動写真において、レーン１はHIS3-124（配列番号６；Forward）およびHIS3 β-Glu check（配列番号７；Reverse）のプライマー対を用いた形質転換体のコロニーＰＣＲの結果、レーン２はHIS3-124（配列番号６；Forward）およびHIS3-239c（配列番号５；Reverse）のプライマー対を用いた形質転換体のコロニーＰＣＲの結果、レーンＣ１はHIS3-124（配列番号６；Forward）およびHIS3 β-Glu check（配列番号７）のプライマー対を用いたNBRC1440親株のコロニーＰＣＲの結果、そしてレーンＣ２はHIS3-124（配列番号６；Forward）およびHIS3-239c（配列番号５；Reverse）のプライマー対を用いたNBRC1440親株のコロニーＰＣＲの結果を示している。両側の「Ｍ」のレーンは、生じたフラグメントの長さの指標である。HIS3-124（配列番号６；Forward）およびHIS3-239c（配列番号５；Reverse）のプライマー対を用いたNBRC1440親株のコロニーＰＣＲでは、１．０ｋｂのバンドが見られたのに対し（レーンＣ２）、HIS3-124（配列番号６；Forward）およびHIS3 β-Glu check（配列番号７；Reverse）のプライマー対を用いた形質転換体のコロニーＰＣＲでは、１．３ｋｂのバンドが見られた（レーン１）。このことにより、ＨＩＳ３遺伝子が欠失（破壊）された代わりに、β−グルコシダーゼ細胞表層提示遺伝子発現カセットが正しく挿入されていると判断した。【０１１９】
上記形質転換体のβ−グルコシダーゼ活性を測定すると、25.7U/g（細胞湿質量；３つの独立実験の平均値）であった。この値は、実験室株MT8-1での値21.3U/g（非特許文献１０）を約２０％上回った。【０１２０】
引き続き、この形質転換体を３０℃にて２４時間、ＹＰＤ培地中で増殖させた。次いで５−ＦＯＡ培地プレート上で1.0×107細胞／200μLまで増殖させた。５−ＦＯＡ培地プレート上で増殖した全てのコロニーは、ウラシル要求性（Ｕｒａ−）の表現型であり、これを選択した。【０１２１】
コロニーＰＣＲによっても、５−ＦＯＡ培地による選択によって取得した形質転換体でＵＲＡ３マーカーが除去されていることを確認した。このコロニーＰＣＲの結果を表す電気泳動写真を、このコロニーＰＣＲで使用したプライマーおよびその増幅領域を示す模式図と併せて図４に示す。【０１２２】
HIS3 β-Glu check2（配列番号８；Forward）およびHIS3-239c（配列番号５；Reverse）のプライマー対を用いるコロニーＰＣＲを行った（図４の模式図）。このコロニーＰＣＲでは、染色体上のβ−グルコシダーゼ遺伝子の存在とＵＲＡ３マーカーの除去とを調べた。【０１２３】
図４の電気泳動写真において、レーン１は５−ＦＯＡ培地による選択前の形質転換体（ウラシルドロップアウト選択株；その後のＹＰＤ増殖を行っていない）のコロニーＰＣＲの結果、レーン２は５−ＦＯＡ培地による選択後の形質転換体（その後のＹＰＤ増殖を行った株）のコロニーＰＣＲの結果、そしてレーンＣはＮＢＲＣ１４４０親株のコロニーＰＣＲの結果を示している。「Ｍ」のレーンは、生じたフラグメントの長さの指標である。５−ＦＯＡ培地による選択前の形質転換体のコロニーＰＣＲでは、２．７ｋｂのバンドが見られたのに対し（レーン１）、５−ＦＯＡ培地による選択後の形質転換体のコロニーＰＣＲでは、１．６ｋｂのバンドが見られた（レーン２）（レーンＣではバンドは見られなかった）。全ての５−ＦＯＡ耐性コロニーは４０ｂｐの反復配列を含んでおり、確かにＵＲＡ３マーカーが切除されていることが判明した。【０１２４】
上記コロニーＰＣＲの結果からは、５−ＦＯＡ培地による選択後の形質転換体は、ＵＲＡ３マーカーは除去されるがβ−グルコシダーゼは残存していると判断できた。５−ＦＯＡ培地プレート上で増殖した形質転換体では、ＵＲＡ３マーカーの両側にある反復配列により生じた相同組換え（図２の上から２番目の縦向きの矢印のすぐ下に示される模式図）のため、形質転換により導入されたはずのＵＲＡ３マーカーが染色体上から除去され（図２の最下段に示される模式図）、ウラシル栄養要求性（Ｕｒａ−）の表現型を示していた。【０１２５】
したがって、５−ＦＯＡによる選択により、ＨＩＳ３遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子が欠失しかつβ−グルコシダーゼ遺伝子が組み込まれた実用酵母株が取得でき、これを「NBRC1440/HU-BGL13」と命名した。【０１２６】
また、本実施例において４０ｂｐの反復間で生じた組換え頻度は、3.6×10-6と算定できた。この頻度は、非特許文献３で報告されている2.9×10-6に比べてわずかに高かった。【０１２７】
（実施例４：形質転換実用酵母を用いたセロビオースからのエタノール発酵）
実施例３で最終的に得られた形質転換体（「NBRC1440/HU-BGL13」）を、必須アミノ酸を添加したＳＤ培地中で２４時間好気的に前培養し、次いで３０℃にて４８時間ＹＰＤ培地中で培養した。培養上清と細胞ペレットとを４℃にて１０分間６，０００×ｇの遠心分離によって分離し、分離した細胞ペレットを、50g/Lのセロビオースを単独炭素供給源として含有するYPCellobiose培地に接種した。続く発酵は３０℃にて嫌気的に実施した。発酵開始時には細胞濃度を75g/L（湿潤細胞）に調整した。発酵中のエタノールおよびセロビオース濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣ分析は、屈折率（ＲＩ）検出器（L-2490 RI detector、日立製作所）を用いることによって実施した。分離に用いたカラムは、Shim-pack SPR-Pb Column（島津製作所）であった。移動相として0.6mL/分の流速の水を用いてＨＰＬＣを８０℃にて操作した。【０１２８】
この結果を図５に示す。図５は、NBRC1440/HU-BGL13およびNBRC1440による発酵におけるセロビオースおよびエタノール量の経時変化を示すグラフである。図５において、右の縦軸はエタノール濃度（g/L）、左の縦軸はセロビオース濃度（g/L）、そして横軸は経過時間（時間）を表す。黒丸はNBRC1440のセロビオース濃度、白丸はNBRC1440/HU-BGL13のセロビオース濃度、黒三角はNBRC1440のエタノール濃度、そして白三角はNBRC1440/HU-BGL13のエタノール濃度を表す。NBRC1440/HU-BGL13は、図５に示されるように、セロビオースからグルコースへの加水分解およびグルコースからエタノールへの発酵生成を同時に行っていた。【０１２９】
50g/Lセロビオースは、75g/Lの細胞濃度では１６時間で完全に枯渇した。そして生成されたエタノール収量は、消費セロビオース１ｇ当たり0.49gであった。これは、Embden-Meyerhof経路の等式を用いて算定すると、９６％の理論収率に相当した（消費糖１ｇ当たり0.51gのエタノールが生成として算定）。発酵の間、培地へのグルコースの蓄積はなかった。【０１３０】
（実施例５：セロビオヒドロラーゼ表層提示染色体組み込み用プラスミドの構築）
ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）マーカーを有し、かつセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ２）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpIHGP3-CBH2を構築した。このプラスミドの模式図を図６に示す。図６中、「HIS3」はヒスチジン遺伝子、「HIS3 pro」はＨＩＳ３プロモーター、「HIS3 term」はＨＩＳ３ターミネーター、「GAPDH pro」はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、「s.s.」は、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、「CBH2」は、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ２遺伝子、そして「GAPDH term」はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼターミネーター、を表す。【０１３１】
リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列とｃｂｈ２遺伝子とα-アグルチニン遺伝子の3’側半分の領域をコードする2816kbp ＤＮＡフラグメントを、鋳型としてpFCBH2w3（非特許文献１１）を用い、R.ory s.s. XmaI（配列番号１５；Forward）およびCBH XbaI Rev（配列番号１６；Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲによって調製した。【０１３２】
pUGP3（非特許文献１２）を鋳型として、XYL2c-XhoI(F)（配列番号１７；Forward）およびXYL2c-NotI(R)（配列番号１８；Reverse）のプライマー対を用いて、ＧＡＰＤＨプロモーター、マルチクローニングサイト（SalI, XbaI, BamHI, SmaI, XmaI）、ＧＡＰＤＨターミネーターをコードする遺伝子配列をＰＣＲ増幅した。その断片をpRS403（Stratagene）のXhoI/NotIサイトに導入してプラスミドpIHGP3を得た。【０１３３】
上記2816kbp ＤＮＡフラグメントをXmaIおよびXbaIで消化し、GAPDHプロモーターとGAPDHターミネーターを含むプラスミドpIHGP3のXmaI部位とXbaI部位との間に挿入し、ＨＩＳ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列をコードする遺伝子、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ２）遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含むプラスミドが得られた。得られたプラスミドをpIHGP3-CBH2 AGと命名した（図６）。【０１３４】
（実施例６：エンドグルカナーゼ表層提示染色体組み込み用プラスミドの構築）
ウラシル遺伝子（ＵＲＡ３）マーカーを有し、かつエンドグルカナーゼ（ＥＧＩＩ）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK406 EGを構築した。このプラスミドの模式図を図７に示す。図７中、「URA3」はウラシル遺伝子、「URA3 pro」はＵＲＡ３プロモーター、「URA3 term」はＵＲＡ３ターミネーター、「PGK pro」はホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、「s.s.」は、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、「ＡＧ」は、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、そして「PGK term」はホスホグリセリン酸キナーゼターミネーターを表す。【０１３５】
リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列とEG２遺伝子とα-アグルチニン遺伝子の3’側半分の領域をコードする2719kbp DNAフラグメントを、鋳型としてpEG23u31H6（非特許文献１０）を用い、EG NheI Fw（配列番号１９；Forward）およびEG XmaI Rev（配列番号２０；Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲによって調製した。【０１３６】
２つのＤＮＡ断片、ＰＧＫプロモーターおよびＰＧＫターミネーターを、サッカロマイセス・セレビシエBY4741ゲノムＤＮＡを鋳型として、それぞれ設計したＰＧＫプロモーター用プライマー対（配列番号２１；Forwardおよび配列番号２２；Reverse）およびＰＧＫターミネーター用プライマー対（配列番号２３；Forwardおよび配列番号２４；Reverse）を用いてＰＣＲ増幅した。マルチクローニングサイトを、設計したマルチクローニングサイト用プライマー対（配列番号２５；Forwardおよび配列番号２６；Reverse）をアニーリングすることにより調製した。ＰＧＫプロモーターをXhoIおよびNheIで、マルチクローニングサイトをNheIとBglIIで、ＰＧＫターミネーターをBglIIおよびNotIでそれぞれ消化し、pTA2ベクター（TOYOBO, Osaka, Japan）のXhoI−NotI部位にクローニングした。得られたベクターをXhoIおよびNotIで消化し、その断片をpRS406（Stratagene）へクローニングし、得られたベクターをpGK406とした。【０１３７】
上記2719kbp ＤＮＡフラグメントをNheIおよびXmaIで消化し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＧＫターミネーターを含むプラスミドpGK406のNheI部位とXmaI部位との間に挿入し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列をコードする遺伝子、エンドグルカナーゼ（ＥＧＩＩ）遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＰＧＫターミネーターを含むプラスミドが得られた。得られたプラスミドをpGK406 EGと命名した（図７）。【０１３８】
（実施例７：３種類のセルラーゼを細胞表層に提示する形質転換実用酵母の作製）
実施例６で作製したプラスミドｐＧＫ４０６  ＥＧを制限酵素StuIで切断して直線状にし、NBRC1440/HU-BGL13（実施例３で最終的に得られた形質転換体であり、ＨＩＳ３遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子が欠失しかつβ−グルコシダーゼ遺伝子が組み込まれた実用酵母株）を形質転換し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。ｐＧＫ４０６  ＥＧでの形質転換により、NBRC1440/HU-BGL13の破壊されたＵＲＡ３マーカー遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/HU-BGL13/pGK406 EG」と命名した。【０１３９】
さらに、実施例５で作製したプラスミドｐＩＨＧＰ３−ＣＢＨ２  ＡＧを制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/HU-BGL13/pGK406 EGを形質転換し、ヒスチジン・ウラシルドロップアウト（ヒスチジンおよびウラシル不含培地）プレート上でヒスチジンおよびウラシル要求性を持たない株を選択した。同様に、ｐＩＨＧＰ３−ＣＢＨ２  ＡＧでの形質転換により、NBRC1440/HU-BGL13/pGK406 EGの破壊されたＨＩＳ３マーカー遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/HU-BGL13/pIHGP3-CBH AG/pGK406 EG」と命名した。【０１４０】
（実施例８：形質転換実用酵母を用いたセルロースからのエタノール発酵）
形質転換実用酵母NBRC1440/HU-BGL13/pIHGP3-CBH AG/pGK406 EG、NBRC1440/HU-BGL13/pGK406 EG、およびNBRC1440/HU-BGL13を用いてセルロースからのエタノール発酵について比較試験した。【０１４１】
酵母を、必須アミノ酸を添加したＳＤ培地中で２４時間好気的に前培養し、次いで３０℃にて４８時間ＹＰＤ培地中で培養した。培養上清と細胞ペレットとを４℃にて１０分間６，０００×ｇの遠心分離によって分離し、細胞ペレットを得た。【０１４２】
この細胞ペレットを、10g/Lのリン酸膨潤セルロース、20g/Lの酵母エキス、10g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.05％（w/v）二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種した。続く発酵は３０℃にて嫌気的に実施した。発酵開始時には細胞濃度を75g/L（湿潤細胞）に調整した。発酵中のエタノール濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣ分析は、屈折率（ＲＩ）検出器（L-2490 RI detector、日立製作所）を用いることによって実施した。分離に用いたカラムは、Shim-pack SPR-Pb Column（島津製作所）であった。移動相として0.6mL/分の流速の水を用いてＨＰＬＣを８０℃にて操作した。【０１４３】
この結果を図８に示す。図８は、NBRC1440/HU-BGL13/pIHGP3-CBH AG/pGK406 EG、NBRC1440/HU-BGL13/pGK406 EG、およびNBRC1440/HU-BGL13によるセルロースを材料とする発酵で生成されるエタノール量の経時変化を示すグラフである。図８において、左の縦軸はエタノール濃度（g/L）、そして横軸は経過時間（時間）を表す。黒丸はNBRC1440/HU-BGL13/pIHGP3-CBH AG/pGK406 EG、黒三角はNBRC1440/HU-BGL13/pGK406 EG、そして黒四角はNBRC1440/HU-BGL13のエタノール濃度を表す。特に、３種類のセルラーゼを細胞表層に提示する形質転換実用酵母NBRC1440/HU-BGL13/pIHGP3-CBH AG/pGK406 EGが、最も優れたエタノール生成を示した（図８）。【０１４４】
したがって、本実施例において、セルロース分解能を有し、セルロースからエタノールを生成できる実用酵母が得られたことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明によれば、アルコールの製造に望ましいが、栄養要求性を有さないため遺伝子操作性に乏しい実用酵母に対しても、外来遺伝子を導入することができる。本発明の方法は、酵母への栄養要求性マーカーの付与と外来遺伝子の導入とを同時に行うので、この付与されたマーカーを利用してさらに外来遺伝子を導入することもできる。例えば、本発明の方法を用いることにより、３種類のセルラーゼを表層提示する形質転換実用酵母を作製することができるので、過酷な培養条件になる場合もある工業規模での培養においても、植物バイオマスからのエタノールの製造が可能になる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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