(57)【要約】  本発明は、一般式（Ｉ）の６−チオグアノシン三リン酸の類縁化合物類に関する。一般式（Ｉ）の化合物において、糖成分における破線の結合は、一重又は二重結合であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５は、互いに等しい、又は異なっており、一般式−（Ｉｎｔ）ｍ−Ｔｅｒを有し、ｍは、０から１２であり、Ｉｎｔ及びＴｅｒは、内部及び末端構成ブロックであり、Ｉｎｔは、式（ＩＩ）からなる群から選択され；Ｔｅｒは、式（ＩＩＩ）からなる群から選択される。Ｘは、芳香族環内の炭素又は窒素原子を表し、Ｙは、酸素又は硫黄原子を表し、さらなる基Ｑ、１つ又は複数の基Ｑｉ（Ｑｉは、１つ又はいくつかの前記の基が環の任意の不飽和成分に結合していてもよいことを示す）は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２、−ＣＯ−ＣＨ３、−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓ−ＣＨ３、−ＳＯ２−ＣＨ３、−ＣＮ、−ＮＯ２又はハロゲン元素からなる群から選択され、Ｒ５は、式（ＩＶ）及びその金属及びアンモニウム塩であってもよく、ｎは、０から５であり、或いは酸素又はリンは、窒素、硫黄、メチレン基又はそれらの誘導体で部分的又は完全に置き換えられている。本発明は、また、医療分野における上記化合物の使用、並びにそれらの調製方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）の化合物
【化１】
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（式中、糖成分における破線の結合は、一重又は二重結合であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５は、互いに等しい、又は異なっており、一般式−（Ｉｎｔ）ｍ−Ｔｅｒを有し、ｍは、０から１２であり、Ｉｎｔ及びＴｅｒは、内部及び末端構成ブロックであり、Ｉｎｔは、
【化２】
2009502776.tif 000108
からなる群から選択され、Ｔｅｒは、
【化３】
2009502776.tif 000109
からなる群から選択され、
Ｘは、芳香族環内の炭素又は窒素原子を表し、Ｙは、酸素又は硫黄原子を表し、さらなる基Ｑ、１つ又は複数の基Ｑｉ（Ｑｉは、１つ又はいくつかの前記の基が環の任意の不飽和成分に結合していてもよいことを示す）は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２、−ＣＯ−ＣＨ３、−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓ−ＣＨ３、−ＳＯ２−ＣＨ３、−ＣＮ、−ＮＯ２又はハロゲン元素からなる群から選択され、
Ｒ５は、
【化４】
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及びその金属及びアンモニウム塩であってもよく、ｎは、０から５であり、或いは酸素又はリンは、窒素、硫黄、メチレン基又はそれらの誘導体で部分的又は完全に置き換えられている）。
【請求項２】
Ｉｎｔは、
【化５】
2009502776.tif 000111
からなる群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｔｅｒは、
【化６】
2009502776.tif 000112
からなる群から選択される請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物は、標識されている請求項１から３までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
一般式（Ｉａ）を有する請求項１から４までのいずれか一項に記載の化合物
【化７】
2009502776.tif 000113
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５は、互いに等しい、又は異なっており、一般式−（Ｉｎｔ）ｍ−Ｔｅｒを有し、ｍは、０から１２であり、Ｉｎｔ及びＴｅｒは、内部及び末端構成ブロックであり、Ｉｎｔは、
【化８】
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からなる群から選択され、Ｔｅｒは、
【化９】
2009502776.tif 000115
からなる群から選択され、
さらなる基Ｑ、１つ又は複数の基Ｑｉ（Ｑｉは、１つ又はいくつかの前記の基が環の任意の不飽和成分に結合していてもよいことを示す）は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２又はハロゲン元素からなる群から選択される）。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物の糖成分は、以下の糖成分又は糖類似成分からなる群から選択される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の化合物。
【化１０】
2009502776.tif 000116
【請求項７】
Ｒ３又はＲ４は、
【化１１】
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から選択され、Ｑは、−ＯＨ（ＦＡＭ）又は−Ｎ（ＣＨ３）２（ＴＡＭＲＡ）から選択される請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化１２】
2009502776.tif 000118
【請求項９】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化１３】
2009502776.tif 000119
【請求項１０】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化１４】
2009502776.tif 000120
【請求項１１】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化１５】
2009502776.tif 000121
【請求項１２】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化１６】
2009502776.tif 000122
【請求項１３】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化１７】
2009502776.tif 000123
【請求項１４】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化１８】
2009502776.tif 000124
【請求項１５】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化１９】
2009502776.tif 000125
【請求項１６】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化２０】
2009502776.tif 000126
【請求項１７】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化２１】
2009502776.tif 000127
【請求項１８】
以下の構造を有する請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【化２２】
2009502776.tif 000128
【請求項１９】
一般式（ＩＩ）を有する請求項１から５までのいずれか一項に記載の化合物
【化２３】
2009502776.tif 000129
（式中、ｎ＝１、２又は３であり、ｍは、０から５であり、Ｉｎｔは、
【化２４】
2009502776.tif 000130
からなる群から選択され、
Ｔｅｒは、
【化２５】
2009502776.tif 000131
からなる群から選択され、Ｘは、芳香族環内の炭素又は窒素原子を表し、Ｙは、酸素又は硫黄原子を表し、さらなる基Ｑ又は基Ｑｉ（ｉは、Ｑが結合できる環の任意の不飽和成分の位置を示す）は、−ＣＨ３、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−ＣＨ３、−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓ−ＣＨ３、−ＳＯ２−ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２又はハロゲン元素からなる群から選択される）。
【請求項２０】
Ｔｅｒは、
【化２６】
2009502776.tif 000132
からなる群から選択される請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
ｎは、１〜３である請求項１９又は２０に記載の化合物。
【請求項２２】
ｎは、３である請求項１９から２１までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
ｎは、１である請求項１９から２１までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
ｎは、２である請求項１９から２１までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
以下の一般式を有する請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の化合物。
【化２７】
2009502776.tif 000133
【請求項２６】
以下の一般式を有する請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の化合物。
【化２８】
2009502776.tif 000134
【請求項２７】
以下の一般式を有する請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の化合物。
【化２９】
2009502776.tif 000135
【請求項２８】
以下の一般式を有する請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の化合物。
【化３０】
2009502776.tif 000136
【請求項２９】
以下の一般式を有する請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の化合物。
【化３１】
2009502776.tif 000137
【請求項３０】
以下の一般式を有する請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の化合物。
【化３２】
2009502776.tif 000138
【請求項３１】
以下の一般式を有する請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の化合物。
【化３３】
2009502776.tif 000139
【請求項３２】
以下の一般式を有する請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の化合物。
【化３４】
2009502776.tif 000140
【請求項３３】
前記化合物は、２’，３−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ、ＦＡＭ−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ、ＴＡＭＲＡ−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ、アスパラギン酸−２’，３’−ＥＤＡ−６−Ｔｈｉｏ−ＧＴＰ、グルタミン酸−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ、スレオニン−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ、セリン−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ、２’，３’，５’，Ｏ−トリアセチル−Ｎ−２−（アセチル−６”−アミノヘキシル）−グアノシン、２’，３’，５’−トリアセチル−Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオ−ＧＭＰ、Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオ−ＧＭＰ、Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオ−ＧＴＰ、Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオ−ＧＴＰ、Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−スレオニン−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−セリン−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アミノブチル）−６−チオ−ＧＴＰ、Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ブチル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−ブチル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−ブチル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−スレオニン−ブチル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−ブチル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−スレオニン−ブチル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−セリン−ブチル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アミノプロピル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グアニジノ−プロピル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−プロピル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−プロピル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−スレオニン−プロピル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−セリン−プロピル）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アミノ−２−ブテン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グアニジノ−２−ブテン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−２−ブテン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−２−ブテン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−スレオニン−２−ブテン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−セリン−２−ブテン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アミノ−２−ブチン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グアニジノ−２−ブチン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−２−ブチン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−２−ブチン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−スレオニン−２−ブチン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−セリン−２−ブチン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アミノ−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グアニジノ−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−スレオニン−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン、Ｎ−２−（６”−セリン−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシンからなる群から選択される請求項１から９までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３４】
活性成分としての請求項１から３３までのいずれか一項に記載の化合物の少なくとも１種と、１つ又は複数の医薬として許容し得る共助剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項３５】
免疫抑制薬を調製するための請求項１から３３までのいずれか一項に記載の化合物又は請求項３４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３６】
免疫抑制薬は、移植臓器の拒絶又は移植後腎障害の防止用である請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
免疫系が関与する病状を治療する医薬品を調製するための、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の化合物又は請求項３４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３８】
炎症性慢性腸疾患、自己免疫腸症、活動性慢性肝炎、リウマチ様関節炎、スティル病、全身性紅斑性狼瘡、後天性溶血性貧血症、特発性血小板減少症、結節性多発性動脈炎、血管炎、多発性血管炎、多発性筋炎、重症筋無力症、類肉腫症、リポイド腎炎、多発性硬化症、皮膚筋炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、再発性多形紅斑、慢性光線性皮膚炎、壊疽性皮下、紅色ひこう疹、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚血管炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、面皰様類天疱瘡からなる群から選択される１つ又は複数の病状を治療する医薬品を調製するための、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の化合物又は請求項３４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３９】
炎症性慢性腸疾患は、クローン病、潰瘍性直腸炎、不確定大腸炎からなる群から選択される請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
放射線療法、コルチコステロイド又は細胞毒性薬に追加される、請求項３５から３９までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
癌を治療する医薬品を調製するための、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の化合物又は請求項３４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４２】
Ｒａｃｌ／Ｖａｖ系による式（Ｉ）の化合物の結合特性を評価するプローブとしての、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の化合物又は請求項３４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４３】
治療法及び／又は処置法における請求項１から３３までのいずれか一項に記載の化合物又は請求項３４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４４】
治療法及び／又は処置が、移植臓器の拒絶及び移植後腎障害、免疫系が関与する病状、クローン病、潰瘍性直腸炎、不確定大腸炎のような炎症性慢性腸疾患、又は自己免疫腸症、活動性慢性肝炎、リウマチ様関節炎、スティル病、全身性紅斑性狼瘡、後天性溶血性貧血症、特発性血小板減少症、結節性多発性動脈炎、血管炎、多発性血管炎、多発性筋炎、重症筋無力症、類肉腫症、リポイド腎炎、多発性硬化症、皮膚筋炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、再発性多形紅斑、慢性光線性皮膚炎、壊疽性皮下、紅色ひこう疹、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚血管炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、面皰様類天疱瘡、腎臓、心臓、肺、膵臓及び肝臓移植を含む臓器移植の後の免疫抑制療法を含む群の１種又は複数種に向けられる請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
グアノシン環の２位における−ＮＨ−Ｒ基の導入は、
ａ）トリ−Ｏ−アセチル−イノシンのＮＨ成分を保護する工程と、
ｂ）酸化的グアノシン開環及びＯ−脱保護を行う工程と、
ｃ）グアノシン閉環を行い、ＣＳ２を使用することによりＳＨ基をグアノシン環の２位に導入する工程と、
ｄ）過剰の脂肪族ジアミンを使用することによって、２位のＳＨ基をアミノリンカーに置き換える工程と
を含む請求項１から３３までのいずれか一項に記載の化合物を調製するための方法。
【請求項４６】
ｅ）アセチル化によってリボースＯＨ基及び一級アミン基を保護する、さらなる工程を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ｆ）ローソン試薬を使用することにより、Ｃ＝Ｏ基をチオール化する、さらなる工程を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
添付の式及び図面を参照しながら実質的に本明細書に記載されている化合物。
【請求項４９】
添付の式及び図面を参照しながら実質的に本明細書に記載されている使用。
【請求項５０】
添付の式及び図面を参照しながら実質的に本明細書に記載されている方法。
【請求項５１】
添付の式及び図面を参照しながら実質的に本明細書に記載されている治療法及び／又は処置。
【請求項５２】
添付の式及び図面を参照しながら実質的に本明細書に記載されている医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、６−チオグアノシン三リン酸の類縁化合物、医療分野におけるそれらの使用、及びそれらの調製方法に関する。
【０００２】
特に、本発明は、例えば、移植臓器の拒絶及び移植後腎障害の予防のための、且つ例えばクローン病、潰瘍性直腸炎、不確定大腸炎のような炎症性慢性腸疾患、又は自己免疫腸症、活動性慢性肝炎、リウマチ様関節炎、スティル病、全身性紅斑性狼瘡、後天性溶血性貧血症、特発性血小板減少症、結節性多発性動脈炎、血管炎、多発性血管炎、多発性筋炎、重症筋無力症、類肉腫症、リポイド腎炎、多発性硬化症、皮膚筋炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、再発性多形紅斑、慢性光線性皮膚炎、壊疽性皮下、紅色ひこう疹、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚血管炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、面皰様類天疱瘡の如き免疫系が関与する病状の治療、並びに概して放射線療法、コルチコステロイド及び他の細胞毒性薬に追加される、免疫抑制治療における免疫抑制薬としての６−チオグアノシン三リン酸の類縁化合物の治療的使用に関する。後者は、臓器移植（腎臓、心臓、肺、膵臓及び肝臓移植）後の免疫抑制療法をも含む。
【背景技術】
【０００３】
炎症免疫応答に関与する細胞は、炎症部位で生存することが可能であるが、当該応答の完了後に、細胞の大多数は、臓器の恒常性を維持するために「死滅」しなければならない（Ｂｏｉｓｅ、１９９５）。無制御のリンパ球増殖は、炎症性慢性病状の発生を引き起こし得るため、免疫系は、アポトーシス（プログラム細胞死）という名称の過程によって活性化リンパ球の減少を制御する。これは、粘膜固有層細胞のアポトーシス耐性が腸レベルで慢性炎症応答を起こし得るため、粘膜の免疫系に対して特別な重要性を帯びよう（Ｔｉｅｄｅ、２００３）。
【０００４】
粘膜免疫系の活性化は、クローン病の発病機原において主要な役割を果たす。特に、Ｔリンパ球及びマクロファージによって生成される炎症誘発性サイトカイン、特にインターロイキン−６（ＩＬ−６）及びインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、アポトーシスに対するＴリンパ球耐性を引き起こすことができ、それが、次に、リンパ球の腸蓄積を誘発し、持続的な疾患を確立する（Ｔｉｅｄｅ、２００３）。
【０００５】
リンパ球活性は、２つのシグナル、即ちＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）への抗原の特異的結合及びＣＤ２８のような膜貫通タンパク質によって表される第２の共刺激シグナルによって開始する（Ｍａｌｔｚｍａｎ、２００３）。ＣＤ２８との共刺激は、活性化Ｔリンパ球のインビトロの生存を高めることが示された。実際、ＣＤ２８は、Ｔリンパ球生存に対する外因性因子として作用するインターロイキン−２（ＩＬ−２）の生成の増強、及びアポトーシスに耐性を示すＴリンパ球の内因的能力を誘発する（Ｂｏｉｓｅ、１９９５（既出））。これは、ＣＤ２８作用が、ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子という名称の抗アポトーシス遺伝子の発現に付随するために生じる（Ｋｈｏｓｈｎａｎ、２０００；Ｎｏｂｅｌ、１９９６）。
【０００６】
図１に示されるように、アポトーシスの阻害が生じる工程を以下にまとめる。
ＣＤ２８は、「アダプター」タンパク質の複合体及びＶａｖという名称の分子と共にその細胞質部分を介して作用する（Ｆｒａｕｗｉｒｔｈ、２００２）。
Ｖａｖは、Ｒａｃ１という名称の他の分子に対するグアノシンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）として作用する（Ｆｒａｕｗｉｒｔｈ、２００２）。
小さいＧＴＰアーゼであるＲａｃ１は、そのようにして、ＧＤＰに結合した不活性状態とＧＴＰに結合した活性状態とを切り換える（Ｆｒａｕｗｉｒｔｈ、２００２）。
活性化Ｒａｃ１は、次に、ＭＥＫリン酸化を介して、（Ｉ−κＢαのような）ＮＦ−κＢ抑制タンパク質をリン酸化するキナーゼ（ＩＫＫ）の活性化をもたらす（Ｍａｒｉｎａｒｉ、２００２）。
したがって、ＮＦ−κＢは、サイトソル中で不活性型にこれ以上保持されず、核に転位し、そこでｂｃｌ−ｘＬ発現を誘発することができる（Ｋｈｏｓｈｎａｎ、２０００）。
さらに、活性化Ｒａｃ１は、ＳＴＡＴファミリー（シグナル変換器及び転写の活性化体）に属するタンパク質、即ちＳＴＡＴ−３の活性化を刺激して、核へのその転位、及びＳＴＡＴ−３依存性遺伝子の対応する発現を誘発する（Ｆａｒｕｑｉ、２００１）。特に、ＳＴＡＴ−３は、ｂｃｌ−ｘＬ発現を誘発して、アポトーシスに対する耐性、及びクローン病の過程の間炎症粘膜におけるＴリンパ球の蓄積に寄与する（Ｍｕｄｔｅｒ、２００３）。一方、ＳＴＡＴ−３は、クローン病の患者において着実に活性化されるが、健康な志願者ではそうでないことが腸Ｔリンパ球の研究によって指摘された（Ｌｏｖａｔｏ  ２００３）。
【０００７】
Ｒａｃ１は、ＲｈｏＡ及びＣｄｃ４２とともに、グアノシンヌクレオチドを結合させ、多くの細胞応答を調節することが可能であることを特徴とする小さいＧタンパク質のスーパーファミリーであるＲｈｏファミリーに属する。それらは、ＧＤＰに結合したときの不活性状態からＧＴＰがＧＤＰの代わりになる活性状態に循環する。この反応は、（Ｖａｖのように）ＧＥＦという名称のグアノシンヌクレオチド交換因子に支えられる。ＧＴＰとの結合は、Ｒａｃ１及び他のＧＴＰアーゼがそれらのエフェクターに結合することを可能にする構造変化を誘発する。ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）と呼ばれる他のタンパク質の作用は、これらの小さいＧタンパク質の本質的なＧＴＰアーゼ活性を刺激し、それらのＧＤＰ結合不活性状態に戻す。概してすべてのＧＴＰアーゼがＲｈｏファミリーに属するＲａｃ１は、この場合は遺伝子ｂｃｌ−ｘＬの遺伝子発現の変化を刺激して、この場合はＮＦ−κＢ及びＳＴＡＴ−３（Ｖａｎ  Ａｅｉｓｔ、１９９７）のような転写因子の活性を調節するため、有糸分裂誘発過程、増殖及び侵襲性において重要な役割を果たす（Ｖａｎ  Ａｅｉｓｔ、１９９７）。
【０００８】
アザチオプリンは、当該活性成分の作用機構は未知であるが、クローン病の免疫抑制治療の「絶対基準（Ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」と見なされている。しかし、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成の抑制並びにＴ及びＢリンパ球機能の下方制御によるプリンヌクレオチド生合成（Ｔｉｅｄｅ  ２００３）は、アザチオプリンの主要な治療的機構であると想定される。
【０００９】
Ｔリンパ球レベルで作用するアザチオプリンの作用の新しい機構が最近示された。アザチオプリンは、活性化Ｔリンパ球のインビトロでのアポトーシスを誘発すること、及びアザチオプリンによる治療は、ＩＢＤ患者の循環及び固有層Ｔリンパ球の両方のアポトーシスを引き起こすことが明らかになった後に、具体的な分子機構が指摘された（Ｔｉｅｄｅ  ２００３）。
【００１０】
要点は、薬物の真の機能的代謝物質を表す６−チオグアノシン三リン酸（６−チオＧＴＰ）代謝物質で示される。具体的には、６−チオＧＴＰは、ＧＴＰの代わりにＲａｃ１に直接結合して、その活性化を阻止する。同じファミリーに属する他のＧＴＰアーゼは、６−チオＧＴＰによって阻害されないため、当該阻止は、Ｒａｃ１に極めて特異的であり、この特異性は、外部ロックがＲａｃ１タンパク質の構造に関連づけられることを示唆する。Ｒａｃ１グアノシンヌクレオチド交換因子ｖａｖの蓄積が認められたという事実は、Ｒａｃ１活性を達成するための補償機構と一致している。
【００１１】
Ｒａｃ１の活性化の阻止は、Ｒａｃ１そのものによって通常誘発されるＮＦ−κＢ及びＳＴＡＴ−３の阻止、そしてｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで検出されるｂｃｌ−ｘＬ遺伝子発現の阻止をもたらすことになる。したがって、アザチオプリンは、Ｒａｃ１活性を調節することによって、ＣＤ２８によって媒介される抗アポトーシス共刺激シグナルをアポトーシス促進シグナルに切り換える。
【００１２】
この新しい作用機構は、利益及び臨床応答が４ヶ月より早期の治療では観察されなかったような臨床応答を引き出すのに長い治療時間を必要とする。アザチオプリンの治療効果の良く知られた「遅れ」を説明することができる。これは、６−チオＧＴＰが、Ｒａｃ１に通常結合されるＧＴＰと比較して、Ｒａｃ１に対する親和性が２０分の１であるという事実による。したがって、アザチオプリン治療は、高ステロイド投与物の同時及び長時間投与を必要とし、骨粗鬆症、糖尿病、白内障のような顕著な副作用を有する。
【００１３】
上記に鑑み、既に知られている化合物と比較して、より迅速且つ効果的な治療応答を引き出す新しい免疫抑制薬を自由に使用することが望まれる。
【００１４】
本発明によれば、Ｒａｃ１を阻害することが可能であり、Ｒａｃ１に対するより強い親和性、Ｒａｃ１活性のより高度な抑制、アザチオプリン治療の遅延効果と比較して強い免疫抑制力及び作用を有すること、並びに最良の治療効果を特徴とする新しい６−チオＧＴＰ類縁体薬物類が調製された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明の一目的は、一般式（Ｉ）の６−チオグアノシン三リン酸の類縁化合物類を提供することである。
【化１】
2009502776.tif 000003
（式中、糖成分における破線の結合は、一重又は二重結合であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５は、互いに等しい、又は異なっており、一般式−（Ｉｎｔ）ｍ−Ｔｅｒを有し、ｍは、０から１２であり、Ｉｎｔ及びＴｅｒは、内部及び末端構成ブロックであり、Ｉｎｔは、
【化２】
2009502776.tif 000004
からなる群から選択され、Ｔｅｒは、
【化３】
2009502776.tif 000005
からなる群から選択され、
Ｘは、芳香族環内の炭素又は窒素原子を表し、Ｙは、酸素又は硫黄原子を表し、さらなる基Ｑ、１つ又は複数の基Ｑｉ（Ｑｉは、１つ又はいくつかの前記の基が環の任意の不飽和成分に結合していてもよいことを示す）は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２、−ＣＯ−ＣＨ３、−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓ−ＣＨ３、−ＳＯ２−ＣＨ３、−ＣＮ、−ＮＯ２又はハロゲン元素からなる群から選択される）。
【００１６】
或いは、Ｒ５は、
【化４】
2009502776.tif 000006
及びその金属及びアンモニウム塩であってもよく、ｎは、０から５であり、或いは酸素又はリンは、窒素、硫黄、メチレン基又はそれらの誘導体で部分的又は完全に置き換えられている。
【００１７】
いくつかの実施形態（特に、Ｒ５は、ＨＯ−［ＰＯ３］ｎであり、及びその金属及びアンモニウム塩であり、ｎは、０から５であり、或いは酸素又はリンは、窒素、硫黄、メチレン基又はそれらの誘導体で部分的又は完全に置き換えられている実施形態（ただし、それらに限定されない））において、ＴＥＲは、
【化５】
2009502776.tif 000007
からなる群から選択されてもよい。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物を、特に、
【化６】
2009502776.tif 000008
から選択されるＲ３又はＲ４で標識することができる。
（式中、Ｑは、−ＯＨ（ＦＡＭ）又は−Ｎ（ＣＨ３）２（ＴＡＭＲＡ）から選択される）。
【００１９】
また、式（Ｉ）の化合物の糖成分を以下の糖成分又は糖類似成分からなる群から選択することができる。
【化７】
2009502776.tif 000009
【００２０】
本発明の化合物は、一般式（Ｉａ）及び／又は（Ｉ）から誘導される一般式（ＩＩ）であってもよく、Ｒ１は、［−ＳＨ］であり（グアノシン成分は、ケト−エノール互変異性シフトすることにより、［＝Ｓ］になり得ることが理解される）、Ｒ２は、［−Ｈ］であり、Ｒ５は、［−（ＰＯ３）ｎ−ＯＨ］であり、Ｒ３及びＲ４の一方は、［−ＯＨ］であり、Ｒ３及びＲ４の他方は、［−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｉｎｔｍ−Ｔｅｒ］である（どちらの変種も同じ混合物で提供される。即ち、［−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｉｎｔｍ−Ｔｅｒ］：は、同じであるが、分子の一部は、Ｒ３に結合した［−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｉｎｔｍ−Ｔｅｒ］を有し、Ｒ４がＯＨであり、分子の他の部分は、Ｒ４に結合した［−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｉｎｔｍ−Ｔｅｒ］を有し、Ｒ３がＯＨである）。
【化８】
2009502776.tif 000010
（式中、ｎ＝１、２又は３であり、ｍは、０から５であり、Ｉｎｔは、
【化９】
2009502776.tif 000011
からなる群から選択され、Ｔｅｒは、
【化１０】
2009502776.tif 000012
からなる群から選択され、Ｘは、芳香族環内の炭素又は窒素原子を表し、Ｙは、酸素又は硫黄原子を表し、さらなる基Ｑ又は基Ｑｉ（ｉは、Ｑが結合できる環の任意の不飽和成分の位置を示す）は、−ＣＨ３、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−ＣＨ３、−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓ−ＣＨ３、−ＳＯ２−ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２、−ＣＮ、−ＮＯ２又はハロゲン元素からなる群から選択される）。
【００２１】
式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（ＩＩ）の本発明のいくつかの実施形態において、Ｔｅｒは、
【化１１】
2009502776.tif 000013
からなる群から選択される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、以下に記載される化合物である。
【化１２】
2009502776.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５は、互いに等しい、又は異なっており、一般式−（Ｉｎｔ）ｍ−Ｔｅｒを有し、ｍは、０から１２であり、Ｉｎｔ及びＴｅｒは、内部及び末端構成ブロックであり、Ｉｎｔは、
【化１３】
2009502776.tif 000015
からなる群から選択され、Ｔｅｒは、
【化１４】
2009502776.tif 000016
からなる群から選択され、
さらなる基Ｑ、１つ又は複数の基Ｑｉ（Ｑｉは、１つ又はいくつかの前記の基が環の任意の不飽和成分に結合していてもよいことを示す）は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２又はハロゲン元素からなる群から選択される）。
【００２３】
また、式（Ｉ）の化合物の糖成分を以下の糖成分又は糖類似成分からなる群から選択することができる。
【化１５】
2009502776.tif 000017
【００２４】
式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（ＩＩ）の化合物を、特に、
【化１６】
2009502776.tif 000018
から選択されるＲ３又はＲ４で標識することができる。
（式中、Ｑは、−ＯＨ（ＦＡＭ）又は−Ｎ（ＣＨ３）２（ＴＡＭＲＡ）から選択される）。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（ＩＩ）の化合物は、以下に記載される化合物である。
２’，３−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ、ＩＤ：０５Ｂ−０
【化１７】
2009502776.tif 000019
ＦＡＭ−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ
【化１８】
2009502776.tif 000020
ＴＡＭＲＡ−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ
【化１９】
2009502776.tif 000021
アスパラギン酸−２’，３’−ＥＤＡ−６−Ｔｈｉｏ−ＧＴＰ、ＩＤ：０５Ｂ−１
【化２０】
2009502776.tif 000022
グルタミン酸−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ、ＩＤ：０５Ｂ−２
【化２１】
2009502776.tif 000023
スレオニン−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ、ＩＤ：０５Ｂ−３  
【化２２】
2009502776.tif 000024
セリン−２’，３’−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ
【化２３】
2009502776.tif 000025
２’，３’，５’，Ｏ−トリアセチル−Ｎ−２−（アセチル−６”−アミノヘキシル）−グアノシン
【化２４】
2009502776.tif 000026
２’，３’，５’−トリアセチル−Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン（Ｖ４）［ＴＷ１  １０７／７］
【化２５】
2009502776.tif 000027
Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン
【化２６】
2009502776.tif 000028
Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオグアノシン、ＩＤ：０５Ａ−０
【化２７】
2009502776.tif 000029
Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオグアノシン、ＩＤ：０５Ａ−１
【化２８】
2009502776.tif 000030
Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオ−ＧＭＰ
【化２９】
2009502776.tif 000031
Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオ−ＧＭＰ、ＩＤ：０５Ａ−２
【化３０】
2009502776.tif 000032
Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオ−ＧＴＰ
【化３１】
2009502776.tif 000033
Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオ−ＧＴＰ、ＩＤ：０５Ａ−３
【化３２】
2009502776.tif 000034
Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−ヘキシル）−６−チオグアノシン
【化３３】
2009502776.tif 000035
Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−ヘキシル）−６−チオグアノシン
【化３４】
2009502776.tif 000036
Ｎ−２−（６”−スレオニン−ヘキシル）−６−チオグアノシン
【化３５】
2009502776.tif 000037
Ｎ−２−（６”−セリン−ヘキシル）−６−チオグアノシン
【化３６】
2009502776.tif 000038
Ｎ−２−（６”−アミノブチル）−６−チオ−グアノシン、ＩＤ：０５Ｃ−０
【化３７】
2009502776.tif 000039
２−Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ブチル）−６−チオグアノシン、ＩＤ：０５Ｃ−１
【化３８】
2009502776.tif 000040
２−Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ブチル）−６−チオ−ＧＭＰ、ＩＤ：０５Ｃ−２
【化３９】
2009502776.tif 000041
２−Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ブチル）−６−チオ−ＧＴＰ、ＩＤ：０５Ｃ−３
【化４０】
2009502776.tif 000042
Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−ブチル）−６−チオグアノシン
【化４１】
2009502776.tif 000043
Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−ブチル）−６−チオグアノシン
【化４２】
2009502776.tif 000044
Ｎ−２−（６”−スレオニン−ブチル）−６−チオグアノシン
【化４３】
2009502776.tif 000045
Ｎ−２−（６”−セリン−ブチル）−６−チオグアノシン
【化４４】
2009502776.tif 000046
Ｎ−２−（６”−アミノプロピル）−６−チオグアノシン
【化４５】
2009502776.tif 000047
Ｎ−２−（６”−グアニジノ−プロピル）−６−チオグアノシン
【化４６】
2009502776.tif 000048
Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−プロピル）−６−チオグアノシン
【化４７】
2009502776.tif 000049
Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−プロピル）−６−チオグアノシン
【化４８】
2009502776.tif 000050
Ｎ−２−（６”−スレオニン−プロピル）−６−チオグアノシン
【化４９】
2009502776.tif 000051
Ｎ−２−（６”−セリン−プロピル）−６−チオグアノシン
【化５０】
2009502776.tif 000052
Ｎ−２−（６”−アミノ−２−ブテン）−６−チオグアノシン
【化５１】
2009502776.tif 000053
Ｎ−２−（６”−グアニジノ−２−ブテン）−６−チオグアノシン
【化５２】
2009502776.tif 000054
Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−２−ブテン）−６−チオグアノシン
【化５３】
2009502776.tif 000055
Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−２−ブテン）−６−チオグアノシン
【化５４】
2009502776.tif 000056
Ｎ−２−（６”−スレオニン−２−ブテン）−６−チオグアノシン
【化５５】
2009502776.tif 000057
Ｎ−２−（６”−セリン−２−ブテン）−６−チオグアノシン
【化５６】
2009502776.tif 000058
Ｎ−２−（６”−アミノ−２−ブチン）−６−チオグアノシン
【化５７】
2009502776.tif 000059
Ｎ−２−（６”−グアニジノ−２−ブチン）−６−チオグアノシン
【化５８】
2009502776.tif 000060
Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−２−ブチン）−６−チオグアノシン
【化５９】
2009502776.tif 000061
Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−２−ブチン）−６−チオグアノシン
【化６０】
2009502776.tif 000062
Ｎ−２−（６”−スレオニン−２−ブチン）−６−チオグアノシン
【化６１】
2009502776.tif 000063
Ｎ−２−（６”−セリン−２−ブチン）−６−チオグアノシン
【化６２】
2009502776.tif 000064
Ｎ−２−（６”−アミノ−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン
【化６３】
2009502776.tif 000065
Ｎ−２−（６”−グアニジノ−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン
【化６４】
2009502776.tif 000066
Ｎ−２−（６”−アスパラギン酸−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン
【化６５】
2009502776.tif 000067
Ｎ−２−（６”−グルタミン酸−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン
【化６６】
2009502776.tif 000068
Ｎ−２−（６”−スレオニン−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン
【化６７】
2009502776.tif 000069
Ｎ−２−（６”−セリン−２，４−ヘキサジン）−６−チオグアノシン
【化６８】
2009502776.tif 000070
【００２６】
本発明のさらなる化合物を、参照表題を示して開示する。
【化６９−１】
2009502776.tif 000071
【化６９−２】
2009502776.tif 000072
【化６９−３】
2009502776.tif 000073
【化６９−４】
2009502776.tif 000074
【化６９−５】
2009502776.tif 000075
【化６９−６】
2009502776.tif 000076
【化６９−７】
2009502776.tif 000077
【化６９−８】
2009502776.tif 000078
【化６９−９】
2009502776.tif 000079
【化６９−１０】
2009502776.tif 000080
【化６９−１１】
2009502776.tif 000081
【００２７】
本発明による化合物を有利には医療分野で使用することができる。したがって、本発明の他の目的は、活性成分としての上記式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つと、当業者に知られており、医薬技術で現在使用されている１つ又は複数の医薬として許容し得る共助剤又は賦形剤とを含む医薬組成物である。
【００２８】
本発明の一目的は、免疫抑制薬の調製のための化合物、その使用、及びその治療及び医学的使用を提供することである。本発明の一目的は、本発明の化合物及び組成物、及び以下の治療方法及び／又は療法；移植臓器（例えば、腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓移植）の拒絶及び移植後腎障害の予防、及び例えばクローン病、潰瘍性直腸炎、不確定大腸炎のような炎症性慢性腸疾患、又は自己免疫腸症、活動性慢性肝炎、リウマチ様関節炎、スティル病、全身性紅斑性狼瘡、後天性溶血性貧血症、特発性血小板減少症、結節性多発性動脈炎、血管炎、多発性血管炎、多発性筋炎、重症筋無力症、類肉腫症、リポイド腎炎、多発性硬化症、皮膚筋炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、再発性多形紅斑、慢性光線性皮膚炎、壊疽性皮下、紅色ひこう疹、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚血管炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、面皰様類天疱瘡の如き免疫系が関与する病状の治療、並びに概して放射線療法、コルチコステロイド及び他の細胞毒性薬に追加される、免疫抑制治療におけるそれらの使用を提供することである。また、本発明による化合物を有利には癌の治療のための医薬品の調製に使用することができる。
【００２９】
本発明は、さらに、特に
【化７０】
2009502776.tif 000082
から選択されるＲ３又はＲ４を有する式（Ｉ）の標識化合物の使用に関する。
（式中、Ｑは、Ｒａｃｌ／Ｖａｖ系による式（Ｉ）の化合物の結合特性の評価のためのプローブとして−ＯＨ（ＦＡＭ）又は−Ｎ（ＣＨ３）２（ＴＡＭＲＡ）から選択される）。
【００３０】
さらなる態様によれば、本発明は、式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（ＩＩ）の化合物を調製するための方法であって、グアノシン環の２位における−ＮＨ−Ｒ基の導入は、
ａ）トリ−Ｏ−アセチル−イノシンのＮＨ成分を保護する工程と、
ｂ）酸化的グアノシン開環及びＯ−脱保護を行う工程と、
ｃ）グアノシン閉環を行い、ＣＳ２を使用することにより、ＳＨ基をグアノシン環の２位に導入する工程と、
ｄ）過剰の脂肪族ジアミンを使用することによって、２位のＳＨ基をアミノリンカーに置き換える工程とを含む方法に関する。該方法は、ｅ）アセチル化によってリボースＯＨ基及び一級アミン基を保護するさらなる工程、及びさらにｆ）ローソン試薬を使用することにより、Ｃ＝Ｏ基をチオール化するさらなる工程をさらに含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
次に、添付の図面の図を特に参照しながら、好ましい実施形態に従って、限定ではなく例示を目的として本発明を説明する。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
２−置換−６−チオ−グアノシンヌクレオチドを調製するための方法
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−１−［（２−メトキシエトキシ）メチル］イノシンの調製
（Ｋｏｈｙｏｍａら、２００３）
【化７１】
2009502776.tif 000083
イノシン２’，３’，５’−トリアセテート（４ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、溶液を支持塩基としてのジイソプロピルエチルアミンの存在下で０℃にて１．４ｍｌ（１２．２ｍｍｏｌ）の２−メトキシエトキシメチルクロリドで処理した。１時間後、反応物を水で失活させた。溶液を３０分間撹拌し、その後クロロホルムを添加した。水層をクロロホルムで抽出し、一緒にして洗浄した有機層を濃縮乾固した。その反応物から、クロマトグラフィー精製（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ、５０：１）後に３．９３ｇ（８．２ｍｍｏｌ、８０％）の２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−１−［（２−メトキシエトキシ）メチル］イノシンを得た。
【００３３】
５−アミノ−１−β−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミドの調製（Ｋｏｈｙｏｍａら、２００３）
【化７２】
2009502776.tif 000084
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−１−［（２−メトキシエトキシ）メチル］イノシン（３．５ｇ、７．３ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのメタノールに溶解した溶液にアンモニア水溶液（２８％、２０ｍｌ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮し、脱保護ヌクレオシド（２．４４ｇ、６．９ｍｍｏｌ、９５％）を得た。この生成物をさらに精製することなく次の工程に使用した。
ヌクレオシド（２．４４ｇ、６．９ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの水酸化ナトリウム水溶液（０．２Ｍ）とともに１時間還流させ、室温まで冷却し、ＨＣｌ（６Ｍ）で中和し、濃縮乾固した残渣をエタノールに溶解し、不溶性材料から濾過し、濃縮乾固した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、３：１）により粗製物を精製して、１．３２ｇ（５．１１ｍｍｏｌ、７０％）の５−アミノ−１−β−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミドを得た。
【００３４】
２−メルカプトイノシンの調製（Ｉｍａｉら、１９７１）
【化７３】
2009502776.tif 000085
５−アミノ−１−β−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド（１．３ｇ、５ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、１８ｍｌ（１５ｍｍｏｌ）のフェニル−イソチオシアネートを徐々に添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で２時間還流させた。溶液を室温まで冷却し、沈殿を濾過によって回収し、ジエチルエーテルで洗浄した。得られた生成物のピリジニウム塩を水酸化ナトリウム水溶液（１５％、４０ｍｌ）に溶解した。溶液を６０℃で３０分間加熱し、真空下で濃縮した。次いで、メタノールを添加し、溶液を冷蔵庫に一晩維持した。２０時間後、沈殿した無色プリズムを濾過によって回収して、１．２ｇ（８０％）の２−メルカプトイノシンを得た。
【００３５】
代替的な調製方法によれば、水酸化ナトリウム（１ｇ、２５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのメタノールに溶解した溶液に化合物−アミノ−１−β−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド（１．３ｇ、５ｍｍｏｌ）を３０℃で添加した。二硫化炭素（１．９ｇ、２５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液をオートクレーブにて１８０℃で３時間加熱した。混合物を室温まで冷却し、沈殿を濾別し、低温メタノールで洗浄し、水から再結晶させて、１．１ｇ（３．８ｍｍｏｌ、７５％）の２−メルカプトイノシンを得た。
【００３６】
Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−グアノシンの調製
【化７４】
2009502776.tif 000086
２−メルカプトイノシン（１ｇ、３ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの水に溶解し、０℃まで冷却した。超音波照射後に透明溶液を得た。過酸化水素（１ｍｌ、９ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら２０分間以内で添加した。０℃で１時間撹拌した後、ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、出発化合物がイノシン−２−スルホン酸のナトリウム塩に完全に酸化されたことを示した。さらに精製することなく、得られた溶液を過剰の１，６−ジアミノヘキサン（２０ｇ、２００ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を１５５℃で２．５時間還流させた。過剰の１，６−ジアミノヘキサンを真空蒸留によって除去して、橙色の残渣を得た。カラムクロマトグラフィー（シリカゲルＰＲ−１８、１００％水から１００％メタノールまでの直線勾配）による粗製物の精製後にＮ−２−（６”−アミノヘキシル）−グアノシン（０．８５ｇ、２２ｍｍｏｌ、５０％）を得た。
【００３７】
２’，３’，５’−トリアセチル−Ｎ−２−（６”−アセトアミド−ヘキシル）−グアノシンの調製（Ｏｓｔｅｒｍａｎｎら、１９９９）
【化７５】
2009502776.tif 000087
ヌクレオシド（２２０ｍｇ、０．５７５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの乾燥ピリジンに溶解した溶液を１ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）の無水酢酸とともにアルゴン雰囲気下で室温にて１５時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をＣＨＣｌ３（１０ｍｌ）とＣＨ３ＯＨ（２ｍｌ）の混合物に溶解した。この溶液をシリカゲル上に充填し、ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（５：１）で溶出して、２８４．７ｍｇ（０．５２ｍｍｏｌ、９０％）の完全保護ヌクレオシドを得た。
【００３８】
２’，３’，５’−トリアセチル−Ｎ−２−（６”−アセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシンの調製
【化７６】
2009502776.tif 000088
ジオキサン（２００ｍｌ）を完全保護ヌクレオシド（５．０３ｇ、９．１３ｍｍｏｌ）に添加した。８ｇ（１９．８ｍｍｏｌ）のローソン試薬を添加した後、懸濁液を８０℃で２時間激しく撹拌した。最初は不透明な反応混合物が１０分後に透明になった。溶液を室温で冷却し、溶媒を真空蒸留によって蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨＣｌ３）によって粗生成物を精製して、２’，３’，５’−トリアセチル−Ｎ−２−（６”−アセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン（２．９２ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）を５５％の収率で得た。
【００３９】
（実施例２）
リボース修飾６−チオ−グアノシン三リン酸の類縁体を調製するための方法
６−チオ−グアノシン三リン酸の調製（Ｌｕｄｗｉｇ、１９８１）
【化７７】
2009502776.tif 000089
アルゴン雰囲気下で、６−チオ−グアノシン（１ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）を６ｍｌのリン酸トリメチルに溶解した。溶液を０℃まで冷却し、１．３ｍｌのルチジンを添加した。１０分後、０．４ｍｌ（４．４ｍｍｏｌ）のオキシ塩化リンを溶液に注意深く添加した。１時間後、過剰のＰＯＣｌ３を１０分間以内で真空下で除去した。
【００４０】
次いで、最初に形成された中間体リン酸ジクロロの溶液を、ピロリン酸トリ−ｎ−ブチルアンモニウム（１７ｍｌ、１００ｍＭ）をジメチルホルムアミドに溶解した溶液で処理した。２時間後、１００ｍｌの０．２５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝剤を添加することによって反応物を失活させた。イオン交換クロマトグラフィーによる精製によって、６−チオ−グアノシン三リン酸（０．５ｇ、１ｍｍｏｌ、３０％）を得た。
【００４１】
２’／３’−ＥＤＡ−６−チオ−グアノシン三リン酸の調製
【化７８】
2009502776.tif 000090
化合物の乾燥トリブチルアンモニウム塩（０．５ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのジメチルホルムアミド中５００ｍｇのカルボニルジイミダゾールで処理した。得られた混合物を０℃で６時間撹拌し、室温まで昇温し、０．２ｍｌのメタノール、及び続いて０．３ｍｌのエチレンジアミンを添加した。
【００４２】
得られた析出物を遠心沈降させ、水に溶解した。三リン酸部分に生じた中間体ホスホラミデートを分解するために、溶液をｐＨ２に調整した。１８時間後、ｐＨを７．５に調整し、続いて溶媒を減圧下で除去した。イオン交換クロマトグラフィーによる粗製物の精製によって、１１６ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、８０％）の２’／３’−ＥＤＡ−６−チオ−グアノシン三リン酸を得た。
【００４３】
ＴＡＭＲＡ−２’／３’−ＥＤＡ−６−チオ−グアノシン三リン酸の調製
【化７９】
2009502776.tif 000091
ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（１ｍｇ、２μｍｏｌ）を２００μｌの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、１ｍｇ（３μｍｏｌ）の２’／３’−ＥＤＡ−６−チオ−グアノシン三リン酸を５００μｌの１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５）に溶解した溶液に室温で添加した。２時間後、反応混合物をメタノールで失活させた。逆相ＨＰＬＣによる反応混合物の処理の後にＴＡＭＲＡ標識生成物を収率７０％（２．４ｍｇ、１．４μｍｏｌ）で得た。
【００４４】
（実施例３）
２−置換６−チオ−グアノシンヌクレオチドの合成
Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン（１０）の調製
【化８０】
2009502776.tif 000092
アンモニアをメタノール（７０ｍｌ）に溶解した７Ｍ溶液を完全保護ヌクレオシド９（１．１５ｇ、１．９７ｍｍｏｌ）に添加した。溶液を室温で２０時間撹拌した。溶媒を蒸留によって除去して、オフホワイトの残渣を得た。粗製Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン（１０）（０．８５ｇ、１．８ｍｍｏｌ、９５％）をさらに精製することなく使用した。
【００４５】
Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオグアノシン（１１）の調製
【化８１】
2009502776.tif 000093
ヌクレオシド１０（０．１ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＮＨ３／Ｈ２Ｏ（３０％）に溶解した溶液を８０℃で９０分間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残渣を水（２ｍｌ）に溶解した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲルＰＲ−１８、１００％水から１００％メタノールまでの直線勾配）による粗製物の精製後に、Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオグアノシン（１１）（０．８０ｇ、２．０ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【００４６】
Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオグアノシン（１２）の調製
【化８２】
2009502776.tif 000094
Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオグアノシン（１１）（０．０９１ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解し、得られた溶液を、支持塩基として作用する３９μｌ（０．２３ｍｍｏｌ）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミンの存在下で、室温にて０．３４ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）の塩酸トリアゾール−１−カルボキサミジンで処理した。２時間後、反応混合物を蒸発させて乾燥状態とした。逆相クロマトグラフィー（シリカゲルＰＲ−１８、１００％Ｈ２Ｏから１００％ＡＣＮまでの直線勾配）による粗製物の精製によって、０．９２ｇ（０．２１ｍｍｏｌ、９０％）のＮ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオグアノシン（１２）を得た。
【００４７】
Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオグアノシン−５’−一リン酸（１３）の調製
【化８３】
2009502776.tif 000095
アルゴン雰囲気下で、ヌクレオシド９（０．３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を３ｍｌリン酸トリメチルに溶解した。溶液を０℃まで冷却し、０．３ｍｌのルチジンで処理した。
【００４８】
１０分後、０．１５ｍｌ（１．１ｍｍｏｌ）のオキシ塩化リンを注意深く添加した。１時間後、過剰のＰＯＣｌ３を真空中で１０分間以内で除去した。
【００４９】
１００ｍｌの０．２５Ｍ（ｐＨ７．５）重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝剤を添加することによって溶液を失活させた。イオン交換クロマトグラフィーによる精製によって、Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン−５’−一リン酸を得た。生成物を５ｍｌのＮＨ３／Ｈ２Ｏ（３０％）に溶解し、８０℃で９０分間撹拌した。続いて、溶媒を真空中で除去した。イオン交換クロマトグラフィーによる粗製物の精製後に、Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオグアノシン−５’−一リン酸（１３）（０．１７ｇ、０．３６ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
【００５０】
Ｎ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオグアノシン−５’−一リン酸（１４）の調製
【化８４】
2009502776.tif 000096
Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−６−チオグアノシン−５’−一リン酸（１３）（０．０５３ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を０．８ｍｌの水と０．５ｍｌのＤＭＦとの混合物に溶解した。続いて、支持塩基として作用する１８μｌ（０．１１ｍｍｏｌ）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミンの存在下で室温にて溶液を０．１６ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）の塩酸トリアゾール−１−カルボキサミジンで処理した。１６時間後、反応混合物を濃縮して乾燥状態とした。逆相クロマトグラフィー（シリカゲルＰＲ−１８、１００％Ｈ２Ｏから１００％ＡＣＮまでの直線勾配）による粗製物の精製によって、０．０３７ｇ（０．０７２ｍｍｏｌ、６５％）のＮ−２−（６”−グアニジノ−ヘキシル）−６−チオグアノシン−５’−一リン酸（１４）を得た。
【００５１】
（実施例４）
リボース修飾６−チオ−ＧＴＰ類似体の合成
アスパラギン酸−２’／３’−ＥＤＡ−６−チオ−グアノシン三リン酸（４）の調製
【化８５】
2009502776.tif 000097
Ｂｏｃ／ｔＢｕ保護アスパラギン酸のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（２．８ｍｇ、７μｍｏｌ）を２００μｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、化合物１（５ｍｇ、７μｍｏｌ）を５００μｌの１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５）に溶解した溶液に室温で添加した。１６時間後、反応混合物をメタノールで失活させた。逆相ＨＰＬＣによる反応混合物の処理後に、アスパラギン酸誘導体４を７０％の収率（３．６ｍｇ、４．９μｍｏｌ）で得た。
【００５２】
グルタミン酸−２’／３’−ＥＤＡ−６−チオ−グアノシン三リン酸（５）の調製
【化８６】
2009502776.tif 000098
Ｂｏｃ／ｔＢｕ保護グルタミン酸のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（２．９ｍｇ、７μｍｏｌ）を２００μｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、化合物１（５ｍｇ、７μｍｏｌ）を５００μｌの１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５）に溶解した溶液に室温で添加した。１６時間後、反応混合物をメタノールで失活させた。逆相ＨＰＬＣによる反応混合物の処理後に、グルタミン酸標識生成物５を７０％の収率（３．７ｍｇ、４．９μｍｏｌ）で得た。
【００５３】
スレオニン−２’／３’−ＥＤＡ−６−チオ−グアノシン三リン酸（６）の調製
【化８７】
2009502776.tif 000099
Ｂｏｃ保護スレオニンのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（２．３ｍｇ、７μｍｏｌ）を２００μｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、化合物１（５ｍｇ、７μｍｏｌ）を５００μｌの１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５）に溶解した溶液に室温で添加した。１６時間後、反応混合物をメタノールで失活させた。逆相ＨＰＬＣによる反応混合物の処理後に、スレオニン誘導体６を７０％の収率（３．４ｍｇ、４．９μｍｏｌ）で得た。
【００５４】
（実施例５）
ヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球においてアポトーシスを誘発する５つの新しい合成６−チオ−ＧＴＰ−誘導体の能力の分析
使用した物質：
アザチオプリン
６−メルカプトプリン
Ｖ１＝ＢＭＢ２０＝ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ
Ｖ２＝ＴＷＩ３５／１＝Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−グアノシン
Ｖ３＝ＴＷＩ７１／２＝２’，３’，５’，ｏ−トリアセチル−Ｎ−２−（アセチル−６”−アミノヘキシル）−グアノシン
Ｖ４＝ＴＷＩ１０７／７＝２’，３’，５’−トリアセチル−Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン
Ｖ５＝ＢＭＢ＝ＴＡＭＲＡ−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰ
Ｖ３及びＶ４は、水に不溶であったため、Ｖ３をエタノールで復元し、Ｖ４をメタノールで復元した。
【００５５】
プロトコル：
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配溶液を用いて４つのバフィーコートからのヒト抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。製造者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって提供されたプロトコルに従って、免疫磁気微小ビーズに結合したＣＤ４モノクローナル抗体を用いて、ＰＢＭＣをさらに精製した。ＣＤ３（０．０４μｇ／ｍｌ）に対する被覆抗体及び可溶性ＣＤ２８抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ；１  ｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツＷｉｅｓｂａｄｅｎ）；４０Ｕ／ｍｌ）により、Ｔリンパ球を完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン＋３ｍＭ  Ｌ−グルタミン）中で３、４又は５日間にわたって刺激した。アザチオプリン、６−メルカプトプリン、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４又はＶ５を５μＭの最終濃度で０日目にＴ細胞培養に添加した。これらのＴリンパ球におけるアポトーシスの誘発を測定するために、細胞をＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析では、アネキシンＶ  ＦＩＴＣアポトーシス検出キットＩ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用してアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで染色することによってアポトーシス細胞を検出した。手短に述べると、Ｔ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ペレットをアネキシンＶ結合緩衝剤（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に細胞１０６個／ミリリットルの濃度で再懸濁させた。アネキシンＶ  ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムを添加した（細胞１０５個毎に５μｌ）。ＦＡＣＳ分析の前に、サンプルを穏やかに混合し、室温で１５分間暗所に温置した。
【００５６】
結果：
アネキシン陽性、ヨウ化プロピジウム陰性細胞（黒色バー）は、早いアポトーシス細胞の割合を示す。アネキシン陽性、ヨウ化プロピジウム陽性細胞（白色バー）は、遅いアポトーシス又は壊死細胞を示す。
アポトーシスの誘発＝（指定処理後のアポトーシス細胞の割合）−（未処理細胞のアポトーシスの割合）
Ｖ１、Ｖ２及びＶ３を４つの独立した実験で試験した。Ｖ４及びＶ５を２つの独立した実験で試験した。
【００５７】
結論：
我々の第１の結果では、Ｖ１及びＶ５は、ＣＤ３／ＣＤ２８共刺激Ｔリンパ球においてアポトーシスを誘発することが可能であることが示された。Ｖ２、Ｖ３及びＶ４は、アポトーシスを誘発することができなかった。アポトーシスのＶ１及びＶ５媒介誘発をアポトーシスのアザチオプリン又は６−メルカプトプリン媒介誘発と比較すると、Ｖ１及びさらにＶ５媒介効果の方が明白で、早いことが認められた（図２〜４）。
【００５８】
（実施例５）
６−チオ−グアノシン三リン酸の２’／３’−メチレノアミノカルバマート誘導体の調製
【化８８】
2009502776.tif 000100
６−チオ−ＧＴＰ１（０．２ｍｍｏｌ）の乾燥トリブチルアンモニウム塩を４ｍｌのジメチルホルムアミド中２００ｍｇのカルボニルジイミダゾールで処理した。得られた混合物を０℃で６時間撹拌し、室温に昇温し、続いて８０μｌのメタノールを添加した。１０分後、２ｍｍｏｌの適切なメチレノ−アミン及び２ｍｌのトリエチルアミンを反応混合物に添加した。溶液を室温で一晩撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。残渣を３０ｍｌの水に溶解し、三リン酸部分に生じた中間体ホスホラミデートを分解するために、混合物をｐＨ１に調整した。２０分後、溶液をｐＨ７．５に調整し、析出物を濾別し、溶媒を真空中で除去した。得られた粗製物をイオン交換クロマトグラフィー、続いて逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【００５９】
（実施例６）
２’／３’−メチレノアミノカルバマート−６−チオ−グアノシン三リン酸誘導体２ａ
【化８９】
2009502776.tif 000101
一般手順による３−チエニル−メチルアミン（２２６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）と化合物１の反応によって、イオン交換クロマトグラフィー及び続く逆相ＨＰＬＣによる精製の後に、化合物２ａ（０．５８ｍｍｏｌ、２９％）を得た。
【００６０】
２’／３’−メチレノアミノカルバマート−６−チオ−グアノシン三リン酸誘導体２ｂ
【化９０】
2009502776.tif 000102
一般手順による（１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチルアミン（２５０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）と化合物１の反応によって、イオン交換クロマトグラフィー及び続く逆相ＨＰＬＣによる精製の後に、化合物２ｂ（０．６６ｍｍｏｌ、３３％）を得た。
【００６１】
（実施例７）
６−チオ−グアノシン三リン酸の２’／３’−カルバマート誘導体の調製
【化９１】
2009502776.tif 000103
化合物１の乾燥トリブチルアンモニウム塩（０．２ｍｍｏｌ）を４ｍｌのジメチルホルムアミド中２００ｍｇのカルボニルジイミダゾールで処理した。得られた混合物を０℃で６時間撹拌し、室温に昇温し、続いて８０μｌのメタノールを添加した。１０分後、２ｍｍｏｌの適切なアミン及びＴＨＦ中２ｍｌの１Ｍカリウムヘキサメチルジシラジド（ＫＨＭＤＳ）を溶液に注意深く添加した。溶液を室温で１時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。残渣を３０ｍｌの水に溶解し、三リン酸部分に生じた中間体ホスホラミデートを分解するために、混合物をｐＨ１に調整した。２０分後、溶液をｐＨ７．５に調整し、析出物を濾別し、溶媒を真空中で除去した。得られた粗製物をイオン交換クロマトグラフィー、続いて逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【００６２】
（実施例８）
図５及び６に関連して、アポトーシスに関する少なくとも３つの実験データセットの概要を以下に示す。ここで、化合物Ｄのいくつかは、アポトーシスを誘発することが可能であった。Ｂ０は、アポトーシス誘発についての最有力候補薬物であった。２つの事項をこれらの結果において考察する必要がある。
アポトーシスの負の誘発は、処理群より未処理群に多くのアポトーシス細胞が存在したことを意味する。この現象は、ときどき現れ、ある種の統計的ばらつきによって説明できる。
薬物６−チオ−ＧＴＰは、平均して、これらの実験においてアポトーシスを誘発することができなかった。一般に、６−チオ−ＧＴＰは、Ｔ細胞においてアポトーシスを誘発するための正の対照である。これらの実験において、正の対照は、さほど十分に機能しなかった。これは、実験が、異なる提供者の血液から新たに単離された初代Ｔ細胞を用いてしばしば行われるという事実によって説明できる。人によってはアザチオプリン療法に対する感受性がないことが良く知られている。このように、いくつかの提供者のＴ細胞は、６−チオ−ＧＴＰ誘発アポトーシスに対して耐性を示し得る。しかし、いずれの場合も、Ｂ０及び化合物Ｄのいくつかは、アポトーシスを誘発することが可能であり、それらが候補薬物であることを示唆していた。
【００６３】
また、Ｄ群誘導体を選別するために代替的な方法を実施した（図８）。Ｄ群誘導体で処理されたＴ細胞中のカスパーゼ−３／７の活性を分析することに決定した。アネキシンＶ／ＰＩ染色と比較して、この新しい方法は、いくつかの利点を有すると言えよう。
プロトコルがより容易である。したがって、個々の誤差の可能性がより小さい。
カスパーゼ−３の活性の向上は、アポトーシスに極めて特異的である。したがって、この方法は、アポトーシスの検出の感度か極めて高い。壊死細胞の干渉的影響がない。
測定が２回行われる。このように、内部対照が存在する。
【００６４】
カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標））を用いた。このアッセイは、カスパーゼ依存発光シグナルに基づく。プロトコル：ＣＤ４＋Ｔ細胞を磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）によって、ヒト血液から単離した。９６ウェルプレート中ＣＤ３（０．０４μｇ／ｍｌ）に対する被覆抗体及び可溶性ＣＤ２８抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（商標）；１μｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）（ドイツＷｉｅｓｂａｄｅｎ）；４０Ｕ／ｍｌ）により、Ｔリンパ球を完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン＋３ｍＭ  Ｌ−グルタミン）中で３日間にわたって刺激した。細胞を異なるＤ群誘導体で処理するか、又は未処理のままとした。培養の３日目に、カスパーゼ−３／７アッセイを実施した。２５μｌのカスパーゼ−Ｇｌｏ３／７試薬を各ウェルに加えた。プローブを２分間にわたって穏やかに混合し、室温で３０分間温置した。最後に、各プローブの１００μｌを白色の壁付９６ウェルルミノメータプレートに移し、プレート読取ルミノメータで分析した。添加試薬は、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７の特異的基質を含有する。活性化カスパーゼ−３によるこの基質の開裂は、ルシフェラーゼ反応をもたらす。発光は、存在するカスパーゼ活性の量に比例する（図８）。
【００６５】
（実施例８）
２’／３’−カルバマート−６−チオ−グアノシン三リン酸誘導体３ａ
【化９２】
2009502776.tif 000104
一般手順による３−アミノピリミジン（１９０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）と化合物１の反応によって、イオン交換クロマトグラフィー及び続く逆相ＨＰＬＣによる精製の後に、化合物３ａ（０．０７６ｍｍｏｌ、３．８％）を得た。
【００６６】
（実施例９）
２’／３’−カルバマート−６−チオ−グアノシン三リン酸誘導体３ｂ
【化９３】
2009502776.tif 000105
一般手順による３−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（３０６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）と化合物１の反応によって、イオン交換クロマトグラフィー及び続く逆相ＨＰＬＣによる精製の後に、化合物３ｂ（０．１１ｍｍｏｌ、５．５％）を得た。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】アポトーシス阻害の作用及びアザチオプリンの作用機構のスキームを示す図である。
【図２】３日後のＶ１＝ＢＭＢ２０＝ＥＤＡ−６−Ｔｈｉｏ−ＧＴＰ、Ｖ２＝ＴＷＩ  ３５／１＝Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−グアノシン、Ｖ３＝ＴＷＩ７１／２＝２’，３’，５’，ｏ−トリアセチル−Ｎ−２−（アセチル−６”−アミノヘキシル）−グアノシン、Ｖ４＝ＴＷＩ１０７／７＝２’，３’，５’−トリアセチル−Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｖ５＝ＢＭＢ＝ＴＡＭＲＡ−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰによるヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるアポトーシス誘発を示す図である。
【図３】４日後のＶ１＝ＢＭＢ２０＝ＥＤＡ−６−Ｔｈｉｏ−ＧＴＰ、Ｖ２＝ＴＷＩ  ３５／１＝Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−グアノシン、Ｖ３＝ＴＷＩ７１／２＝２’，３’，５’，ｏ−トリアセチル−Ｎ−２−（アセチル−６”−アミノヘキシル）−グアノシン、Ｖ４＝ＴＷＩ１０７／７＝２’，３’，５’−トリアセチル−Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｖ５＝ＢＭＢ＝ＴＡＭＲＡ−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰによるヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるアポトーシス誘発を示す図である。
【図４】５日後のＶ１＝ＢＭＢ２０＝ＥＤＡ−６−Ｔｈｉｏ−ＧＴＰ、Ｖ２＝ＴＷＩ  ３５／１＝Ｎ−２−（６”−アミノヘキシル）−グアノシン、Ｖ３＝ＴＷＩ７１／２＝２’，３’，５’，ｏ−トリアセチル−Ｎ−２−（アセチル−６”−アミノヘキシル）−グアノシン、Ｖ４＝ＴＷＩ１０７／７＝２’，３’，５’−トリアセチル−Ｎ−２−（６”−チオアセトアミド−ヘキシル）−６−チオグアノシン、Ｖ５＝ＢＭＢ＝ＴＡＭＲＡ−ＥＤＡ−６−チオ−ＧＴＰによるヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるアポトーシス誘発を示す図である。
【図５】アポトーシスの誘発を示す図である。バフィーは、遠心によって得ることが可能であり、白血球及び血小板を含有する血液の部分である「バフィーコート」を意味する。この場合、バフィーコートを使用して、実験のための単球を単離した。「バフィー１ｖｏｍ０８／０３／０５」は、「２００５年３月８日のバフィーコート１」を意味する。Ｖ１及びＶ３を４つの独立した実験で４回試験し、Ｖ２及びＶ５を２つの個別的な実験で２回試験した。例えば、Ｖ１を０８／０３／２００５（０８／０３／２００４と記載されている場合は、０８／０３／２００５の誤りである）に２回試験し、２２／０４／２００５に２回試験した。
【図６】図５にまとめられている化合物の生物活性の結果を示す図である。
【図７】本発明のさらなる化合物のリスト、並びに分子のいくつかを特定するのに使用されたある種の速記に対する手掛かりを提供する図である。いくつかの化合物は、異なる鏡像異性体を有し、図７における描写は、本文に記載されているのと異なる鏡像異性体を示すことがある。
【図８】カスパーゼグラフである：未処理細胞の発光値を１００％カスパーゼ活性と定義づけた。それらの特異的な発光値により、処理細胞のカスパーゼ活性をそれに応じて計算した。カスパーゼ活性ｘの誘発［％］＝カスパーゼ活性ｘ［％］−カスパーゼ活性ｕｎｔｒｅａｔｅｄ［％］。３つの異なる実験の平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差＝標準偏差／ラジカル（ｎ））が提示されている。このグラフの概要：６−チオ−ＧＴＰは、（正の対照として）カスパーゼ活性を誘発することが可能であった。０５Ｂ−０も非常に効果的であった。アネキシンＶ／Ｐｌ−染色に関する先のデータと一致して、０５Ｂ−１は、０５Ｂ−０より効果が小さかった。Ｄ群に関しては、誘導体０６Ｄ−１３、０６Ｄ−１４、及び（それらより劣るが）０６Ｄ−２２は、有望であった。
【００６８】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図６−１２】
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【図６−１３】
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【図６−１４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８】
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【国際調査報告】
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