(57)【要約】  センスＲＮＡ合成を行うための方法およびキットを提供する。核酸マイクロアレイを伴う遺伝子発現研究などの多様な研究および診断適用に、センスＲＮＡ分子を用いてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成するための方法であって：
（ａ）５’端および３’端を有する少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；
（ｂ）前記ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；
（ｃ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ配列部分を含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、ＲＮＡ部分が一本鎖のままであるようにアニーリングさせ；
（ｄ）前記一本鎖ＲＮＡ部分が二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖になるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールの３’端を伸長させ；
（ｅ）前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解し、それによって３’一本鎖ＤＮＡテールを露出し；
（ｆ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む一本鎖プロモーター・テンプレートを、前記３’一本鎖ＤＮＡテールにアニーリングさせ；
（ｇ）前記の少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートが、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させ；
（ｈ）そして前記の少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写を開始し、
それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ａ）が、５’および３’端を有する少なくとも１つのＲＮＡ分子を提供し；そして前記の少なくとも１つのＲＮＡ分子から少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
単数または複数の一本鎖ｃＤＮＡ分子の合成が、逆転写酵素の存在下で、１つまたは複数のＲＮＡ分子とプライマーを接触させる工程を含む、請求項２の方法。
【請求項４】
プライマーが、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
プライマーが、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む、請求項４の方法。
【請求項６】
プライマーの３’末端ヌクレオチドが、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼの基質ではないが、逆転写酵素によって伸長可能である、請求項４の方法。
【請求項７】
プライマーの３’末端ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項６の方法。
【請求項８】
プライマーが、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含み、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項４の方法。
【請求項９】
一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼで伸長不能であるように、３’端でブロッキングされている、請求項１の方法。
【請求項１０】
ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分が、ＲＮアーゼＨを用いて分解される、請求項１の方法。
【請求項１１】
一本鎖プロモーター・テンプレートが、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列からなる群より選択される第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、ならびにＴ７、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列からなる群より選択される第二のＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含み、前記の第一および第二のＲＮＡポリメラーゼ認識配列が異なる、請求項１の方法。
【請求項１２】
鎖置換を防ぐため、一本鎖プロモーター・テンプレートが、３’末端ヌクレオチド伸長を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
一本鎖プロモーター・テンプレートが、もっぱらＲＮＡで構成される、請求項１の方法。
【請求項１４】
一本鎖プロモーター・テンプレートが、もっぱらＤＮＡで構成される、請求項１の方法。
【請求項１５】
一本鎖プロモーター・テンプレートが、ＲＮＡおよびＤＮＡ両方で構成される、請求項１の方法。
【請求項１６】
一本鎖プロモーター・テンプレートのＤＮＡ部分が、単数または複数のｃＤＮＡ分子上の露出した３’一本鎖ＤＮＡテールにハイブリダイズし、そして前記プロモーター・テンプレートのＲＮＡ部分がハイブリダイズしないままである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
露出した３’一本鎖ＤＮＡテールが、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長される、請求項１の方法。
【請求項１８】
工程ｃ）からｇ）が、実質的に同時に行われる、請求項１の方法。
【請求項１９】
単数または複数の生じたｓＲＮＡ分子を逆転写し、それによって単数または複数の一本鎖ｃＤＮＡ分子を産生する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
単数または複数の生じたｓＲＮＡ分子に、ポリＡテールを付加する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２１】
核酸マイクロアレイを探査する（ｐｒｏｂｉｎｇ）ための方法であって：核酸マイクロアレイと、請求項１６の単数または複数のｃＤＮＡ分子を接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成するための方法であって：
（ａ）５’端および３’端を有する少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；
（ｂ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ配列部分を含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを、前記ｃＤＮＡ分子の３’端に、ＲＮＡ部分が一本鎖のままであるようにアニーリングさせ；
（ｄ）前記一本鎖ＲＮＡ部分が二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖になるように、前記ｃＤＮＡ分子の３’端を伸長させ；
（ｅ）前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解し、それによって３’一本鎖ＤＮＡテールを露出し；
（ｆ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む一本鎖プロモーター・テンプレートを、前記３’一本鎖ＤＮＡテールにアニーリングさせ；
（ｇ）前記の少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートが、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させ；
（ｈ）そして前記の少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写を開始し、
それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成する
工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための方法であって：
（ａ）５’端および３’端を有する少なくとも１つの第一周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；
（ｂ）前記の第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；
（ｃ）５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、ＲＮＡ部分が一本鎖のままであるようにアニーリングさせ；
（ｄ）前記一本鎖ＲＮＡ部分が二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖になるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールの３’端を伸長させ；
（ｅ）前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解し、それによって３’一本鎖ＤＮＡテールを露出し；
（ｆ）第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートを、前記３’一本鎖ＤＮＡテールにアニーリングさせ；
（ｇ）前記一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させ；
（ｈ）前記の第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、第一周期のＲＮＡ転写を開始して、少なくとも１つの第一周期ｓＲＮＡ分子を産生し；
（ｉ）前記の第一周期ｓＲＮＡ分子から、５’および３’端を有する少なくとも１つの第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成し、それによって二本鎖ｓＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖を形成し；
（ｊ）前記ｓＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖のｓＲＮＡ部分を分解し、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を残し；
（ｋ）第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが形成されるように、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子の前記の第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ；
（ｌ）そして、前記の第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、第二周期のＲＮＡ転写を開始して、少なくとも１つの第二周期ｓＲＮＡ分子を産生し、
それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行う
工程を含む、前記方法。
【請求項２４】
少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成するためのキットであって：少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレート；５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド；ならびに前記プロモーター・テンプレートおよび前記ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを用いて、ｓＲＮＡ分子を合成するための使用説明資料を含む、前記キット。
【請求項２５】
少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うためのキットであって：第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレート；５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド；前記の第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチド；ならびに前記プロモーター・テンプレート、前記ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドおよびプロモーター・オリゴヌクレオチドを用いて、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための使用説明資料を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
［０００１］本発明は、一般的に、核酸分子を合成するための組成物および方法に関する。
配列リスト
［０００２］コンピュータ読み取り可能型の配列リストおよび紙コピー（付随）は、その全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
［０００３］マイクロアレイ技術は、遺伝子発現プロフィールを生成し、そして分析するための強力なツールとなってきている。しかし、マイクロアレイ発現分析は、一般的に、多量のＲＮＡを要求し、これはしばしば入手不能である（Ｗａｎｇら，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４：３９４−４００（２００３）を参照されたい）。この問題を克服するため、いくつかのＲＮＡ増幅技術が開発されてきている。しかし、これらの技術は、一般的に、増幅バイアスとして知られる現象に苦しむ（例えば、米国特許第６，５８２，９０６号を参照されたい）。これらの場合、ＲＮＡ分子の増幅集団は、元来の試料に存在するＲＮＡ分子の集団に比例的に対応しない。
【０００３】
［０００４］例えば、Ｅｂｅｒｗｉｎｅおよび同僚らによって開示された方法において（例えば、Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１６６３（１９９０）；米国特許第５，５４５，５２２号；第５，７１６，７８５号；第５，８９１，６３６号；第５，９５８，６８８号；および第６，２９１，１７０号を参照されたい）、複合オリゴヌクレオチドが増幅に利用され、ここで複合オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロモーターおよびプライマーの両方を含めて提供される。複合オリゴヌクレオチドを用いて、最初のｍＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーが生成され、二本鎖であるｃＤＮＡを生成する、第二鎖合成が続く。ＲＮＡ増幅は、複合オリゴヌクレオチドのプロモーター部分を介して行われ、ｃＤＮＡの第二鎖から出発して転写が進行する。第二鎖が転写に用いられるため、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法は、最初のｍＲＮＡ配列に対してアンチセンスである増幅ＲＮＡを産生する。
【０００４】
［０００５］しかし、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法は、利用する酵素の不完全な進行性（すなわち、酵素が核酸分子に付着したままであることが不可能であること）、およびＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの配置のため、工程各々の間ずっと、３’バイアスを導入する（例えば、米国特許第６，５８２，９０６号および米国特許公報第ＵＳ２００３／０１０４４３２号を参照されたい）。例えば、第一鎖ｃＤＮＡを生じるために用いる複合オリゴヌクレオチドは、プロモーターをｃＤＮＡの５’端に置き、これはメッセージの３’端に対応する。このことは、ＲＮＡポリメラーゼがいくつかのテンプレートの転写を完了することが不可能である（おそらく、ポリＡテール領域が長いためか、またはテンプレート中の二次および三次構造による干渉のため）ことと組み合わされて、増幅されたアンチセンスＲＮＡ集団に３’バイアスを生じうる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼによる第二鎖ｃＤＮＡ合成が不完全であれば、これらのｃＤＮＡは機能するプロモーターを欠き、増幅された集団において、元来のＲＮＡ分子の提示の減少（またはおそらく完全な非存在）を生じるであろう。
【０００５】
［０００６］その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属米国特許出願第１０／９７９，０５２号は、ＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能であり、ＲＮＡポリメラーゼ認識部位を含む一本鎖プロモーター・テンプレートを、第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端に直接付着させるための方法を開示する。ＤＮＡポリメラーゼを用いて、プロモーター・テンプレートを二本鎖プロモーターに酵素的に変換した後、ＲＮＡポリメラーゼを添加することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を開始して、元来のＲＮＡ分子と同じ配向を有するセンスＲＮＡ（ｓＲＮＡ）分子の合成を生じる。該ｓＲＮＡ分子を逆転写し、そして第二周期ｃＤＮＡ分子にプロモーター・テンプレートを再付着させ、続いて二本鎖プロモーターに酵素的に変換した後、ＲＮＡポリメラーゼで第二周期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うことによって、さらなる周期のｓＲＮＡ合成を行ってもよい。
【０００６】
［０００７］同様に、その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属米国特許出願第１１／１５０，７９４号は、第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列および少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼで伸長不能な一本鎖プロモーター・テンプレートを、第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端に直接付着させるための方法を開示する。ＤＮＡポリメラーゼを用いて、プロモーター・テンプレートを、第一の二本鎖プロモーターおよび少なくとも第二の異なる二本鎖プロモーターに酵素的に変換した後、第一のプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを添加することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を開始して、ｓＲＮＡ分子の合成を生じる。ｓＲＮＡ分子を第二周期ｃＤＮＡ分子に逆転写し、そして第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて、第二の二本鎖プロモーターを形成し、そして第二のプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ転写を開始することによって、ｓＲＮＡ合成のさらなる周期を行ってもよい。２以上の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を有するプロモーター・テンプレートを使用すると、一本鎖プロモーター・テンプレートを再付着させ、そして続いて二本鎖プロモーターに酵素的に変換した後、各連続周期のｃＤＮＡ合成を行う必要を伴わずに、多数周期のｓＲＮＡ合成が可能になる。
【０００７】
［０００８］しかし、引き続き、ｓＲＮＡ分子を合成するための方法、特に非特異的増幅の発生率が低い方法を提供する必要がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
［０００９］本出願者らは、多様な核酸テンプレートからｓＲＮＡ分子を合成するための方法およびキットであって、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを介して、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む一本鎖プロモーター・テンプレートを、第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端に付着させる、前記方法およびキットを発明した。本出願者らは、こうした系の使用が、最小限の非特異的増幅を伴う、頑強なｓＲＮＡ増幅を提供することを発見した。
【０００９】
［００１０］したがって、本発明の１つの側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成するための方法であって：５’端および３’端を有する少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；前記ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、ＲＮＡ部分が一本鎖のままであるようにアニーリングさせ；前記一本鎖ＲＮＡ部分が二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖になるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールの３’端を伸長させ；前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解し、それによって３’一本鎖ＤＮＡテールを露出し；少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む一本鎖プロモーター・テンプレートを、前記３’一本鎖ＤＮＡテールにアニーリングさせ；前記の少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートが、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させ；そして前記の少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写を開始し、それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成する工程を含む、前記方法に関する。
【００１０】
［００１１］本発明の別の側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成するための方法であって：５’端および３’端を有する少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ配列部分を含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを、前記ｃＤＮＡ分子の３’端に、ＲＮＡ部分が一本鎖のままであるようにアニーリングさせ；前記一本鎖ＲＮＡ部分が二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖になるように、前記ｃＤＮＡ分子の３’端を伸長させ；前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解し、それによって３’一本鎖ＤＮＡテールを露出し；少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む一本鎖プロモーター・テンプレートを、前記３’一本鎖ＤＮＡテールにアニーリングさせ；前記の少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートが、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させ；そして前記の少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写を開始し、それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成する工程を含む、前記方法に関する。
【００１１】
［００１２］本発明の別の側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための方法であって：５’端および３’端を有する少なくとも１つの第一周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；前記の第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、ＲＮＡ部分が一本鎖のままであるようにアニーリングさせ；前記一本鎖ＲＮＡ部分が二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖になるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールの３’端を伸長させ；前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解し、それによって３’一本鎖ＤＮＡテールを露出し；第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートを、前記３’一本鎖ＤＮＡテールにアニーリングさせ；前記一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させ；前記の第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、第一周期のＲＮＡ転写を開始して、少なくとも１つの第一周期ｓＲＮＡ分子を産生し；前記の第一周期ｓＲＮＡ分子から、５’および３’端を有する少なくとも１つの第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成し、それによって二本鎖ｓＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖を形成し；前記ｓＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖のｓＲＮＡ部分を分解し、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を残し；第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが形成されるように、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子の前記の第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ；そして、前記の第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、第二周期のＲＮＡ転写を開始して、少なくとも１つの第二周期ｓＲＮＡ分子を産生し、それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行う工程を含む、前記方法に関する。
【００１２】
［００１３］本発明の別の側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための方法であって：５’端および３’端を有する少なくとも１つの第一周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し；前記の第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、ＲＮＡ部分が一本鎖のままであるようにアニーリングさせ；前記一本鎖ＲＮＡ部分が二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖になるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールの３’端を伸長させ；前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解し、それによって３’一本鎖ＤＮＡテールを露出し；第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、過剰な一本鎖プロモーター・テンプレートを、前記３’一本鎖ＤＮＡテールにアニーリングさせ；前記一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させ；前記の第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、第一周期のＲＮＡ転写を開始して、少なくとも１つの第一周期ｓＲＮＡ分子を産生し；前記の第一周期ｓＲＮＡ分子から、５’および３’端を有する少なくとも１つの第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成し、それによって二本鎖ｓＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖を形成し；前記ｓＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖のｓＲＮＡ部分を分解し、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子を残し；前記の過剰な一本鎖プロモーター・テンプレートを、前記の第二周期一本鎖ｃＤＮＡ分子の３’端にアニーリングさせ；前記の過剰なプロモーター・テンプレートが、第一のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの３’側の少なくとも第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記の第二周期ｃＤＮＡの３’端を伸長させ；そして、前記の第一または第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、第二周期のＲＮＡ転写を開始して、それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行い、そして多数のｓＲＮＡコピーを産生する工程を含む、前記方法に関する。
【００１３】
［００１４］いくつかの態様において、ｓＲＮＡ分子を使用可能な下流アッセイの数および種類が増加するように、生じたｓＲＮＡ分子にポリＡテールが付加される。好ましくは、ｓＲＮＡ分子は、下流アッセイで使用するため、ｃＤＮＡ分子に逆転写される。
【００１４】
［００１５］逆転写酵素の存在下で、ＲＮＡ分子をプライマーと接触させることによって、最初の一本鎖ｃＤＮＡ分子を提供してもよい。こうした逆転写プライマーには、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、またはその組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、逆転写プライマーは、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む。他の態様において、逆転写プライマーの３’末端ヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼの基質ではないが、逆転写酵素によって伸長可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。好ましい態様において、逆転写プライマーは、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含み、逆転写プライマーの３’末端ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
【００１５】
［００１６］本発明の別の側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成するためのキットであって：少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレート；５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド；ならびに前記プロモーター・テンプレートおよび前記ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを用いて、ｓＲＮＡ分子を合成するための使用説明資料を含む、前記キットに関する。
【００１６】
［００１７］本発明の別の側面は、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うためのキットであって：第一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の３’側の少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレート；５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド；前記の第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチド；ならびに前記プロモーター・テンプレート、前記ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドおよびプロモーター・オリゴヌクレオチドを用いて、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子の多数周期の合成を行うための使用説明資料を含む、前記キットに関する。
【００１７】
［００１８］いくつかの態様において、キットは：逆転写酵素；ＤＮＡ分子上に、３’オリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させるための酵素；ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖中のＲＮＡを分解するための酵素；および１以上のＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。
【００１８】
発明の詳細な説明
［００２１］本発明は、ｓＲＮＡ分子の合成のための方法およびキットに関する。用語「ｓＲＮＡ分子」、「ＲＮＡ分子」、「ＤＮＡ分子」、「ｃＤＮＡ分子」および「核酸分子」は、各々、単一の分子、単一種の複数の分子、および異なる種の複数の分子を含むよう意図される。該方法は、一般的に、少なくとも１つのｃＤＮＡ分子の３’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ；ＤＮＡ配列の５’側にＲＮＡ配列を含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを、該オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、ＲＮＡ配列、およびＤＮＡ配列の少なくとも部分が一本鎖のままであるようにアニーリングさせ；一本鎖ＤＮＡの部分が二本鎖ＤＮＡになり、そして一本鎖ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖になるように、該オリゴデオキシヌクレオチド・テールの３’端を伸長させ；該ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解して３’一本鎖ＤＮＡテールを露出し；少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む一本鎖プロモーター・テンプレートを、該３’一本鎖テールにアニーリングさせ；該一本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートが、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、該３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させ；そして該ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写を開始し、それによって、少なくとも１つのｓＲＮＡ分子を合成する工程を含む。本出願者らは、こうした方法が、最小限の非特異的増幅を伴う、ｓＲＮＡの頑強な線形増幅法を提供することを見出した。
【００１９】
［００２２］本発明の方法は、分子生物学の分野でルーチンの技術を利用する。一般的な分子生物学法を開示する基本的な教科書には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が含まれる。
【００２０】
［００２３］第一鎖ｃＤＮＡ分子の合成のための多くの方法および商業的キットが当該技術分野に周知である。例には、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ二本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、Ａｒｒａｙ  ５０ＴＭ、Ａｒｒａｙ  ３５０ＴＭおよびＡｒｒａｙ  ９００ＴＭ検出キット（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ、ペンシルバニア州ハットフィールド）、およびＣｙＳｃｒｉｂｅＴＭ後標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれる。図１を参照すると、関心対象の供給源由来のＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、非コードＲＮＡ）が、逆転写反応においてテンプレートとして用いられる（図１ａを参照されたい）。いかなる生物学的試料または環境試料で見られるビリオン、原核、および真核供給源も含めて、いかなる組織または細胞供給源から、ＲＮＡを得てもよい。好ましくは、供給源は真核組織であり、より好ましくは哺乳動物組織、最も好ましくはヒト組織である。本発明の方法は、例えばマイクロマニピュレーション、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）およびレーザー・マイクロダイセクション技術（Ｐｌａｙｅｒら，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｄｉａｇｎ．  ４：８３１（２００４）を参照されたい）を用いて、複雑な細胞試料から精製可能な、単一細胞を含む、少数の細胞からＲＮＡを増幅するのに特に適している。
【００２１】
［００２４］最初の逆転写反応には、いかなる逆転写酵素を用いてもよく、これには、熱安定性のＲＮアーゼＨ＋およびＲＮアーゼＨ−逆転写酵素が含まれる。好ましくは、ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素を用いる。
【００２２】
［００２５］第一鎖ｃＤＮＡ合成用のプライマーを商業的に得るかまたは合成して、そして当該技術分野に周知の技術を用いて精製してもよい。第一鎖ｃＤＮＡ合成用のプライマーには、３’ポリＡテールを含有するＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）にアニーリングする、一般的に、長さ約１０〜約３０ヌクレオチド、好ましくは長さ約１７〜約２４ヌクレオチドの範囲であり、３’端にオリゴｄＴテールを含む一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドが含まれる。関心対象のＲＮＡが天然には３’ポリＡテールを含有しない場合（例えばｍｉＲＮＡ）、ＡＴＰの存在下で、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）を用いて、ポリＡテールをＲＮＡ分子に付着させてもよい。ポリＡテール付加キットは、商業的に入手可能であり、そしてこうしたキットには、例えば、ポリ（Ａ）テール付加キット（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）が含まれる。３’ブロッキングされたＲＮＡは、例えばウシ腸アルカリホスファターゼまたはＲＮアーゼ３を用いて酵素的に処理して、テール付加を可能にしてもよい。
【００２３】
［００２６］あるいは、元来のｍＲＮＡ転写物各々の全長に沿った多様な位置にアニーリングする、一般的に、長さ約４〜約２０ヌクレオチド、好ましくは長さ約６〜約９ヌクレオチドの範囲のランダムプライマーを用いて、逆転写反応を開始してもよい。一般の当業者は、ランダムプライマーを使用すると、オリゴｄＴプライマーを用いて産生したものよりも、元来のｍＲＮＡ転写物各々の全長をよりよく表す、ｓＲＮＡ分子の産生を最終的に生じうることを認識するであろう。さらに、開示する方法の最初の工程でｃＤＮＡを生成するためにランダムプライマーを使用することは、分解されたＲＮＡまたは細菌由来のＲＮＡなどの、通常は増幅から除かれているであろうＲＮＡを用いて、増幅ｓＲＮＡ分子を産生することも可能であることを意味する。
【００２４】
［００２７］いくつかの態様において、逆転写プライマー（オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、または両方）は、一般的に、長さ約６〜約５０ヌクレオチド、好ましくは長さ約１０〜約２０ヌクレオチドの範囲の、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む。この５’特異的ヌクレオチド配列を第二周期ｃＤＮＡ合成のための開始部位として用いてもよい（図１ｇを参照されたい）。
【００２５】
［００２８］他の態様において、逆転写プライマー（オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、または両方）の３’末端ヌクレオチドは、リボヌクレオチドのように、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼの基質ではないが、逆転写酵素によって伸長可能な、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。こうしたプライマーは、末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）で伸長不能であり、そしてしたがって、図１ｂ〜１ｆに示す工程ではテール付加されず、そして増幅されないであろう。好ましい態様において、逆転写プライマーは、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含み、ここで逆転写プライマーの３’末端ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。
【００２６】
［００２９］第一鎖ｃＤＮＡ合成後、一般的に、生じた第一周期ｃＤＮＡ分子を精製する（図１ｂを参照されたい）。ｃＤＮＡ精製前に、ＲＮＡを分解しないことが好ましいが、ＲＮＡ分解後に精製されているｃＤＮＡは、本発明の方法において、等しくよく働く。ＲＮＡを分解するいかなる方法も用いてもよく、例えばＮａＯＨまたはＲＮアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ＋逆転写酵素の形で、または別個の酵素として供給してもよい）での処理がある。あるいは、第一周期ｃＤＮＡ分子をＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖から精製しつつ、ＲＮＡを損なわれないまま（ｉｎｔａｃｔ）放置してもよい。ＤＮＡ分子を精製するための多くの方法およびキットが存在し、これらには、例えばＭｉｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）が含まれる。第一鎖ｃＤＮＡ合成のために、３’末端ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、逆転写プライマーを用いる場合、ＤＮＡ精製を省いてもよい。これは、試料の損失を減少させ、そして増幅収率を増加させることも可能であり、これは、少数の細胞由来のＲＮＡを操作する際に、特に重要である。
【００２７】
［００３０］第一周期ｃＤＮＡ精製後、一般的に、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド・テールを、ｃＤＮＡ分子の３’端に付着させる（図１ｂを参照されたい）。こうしたオリゴデオキシヌクレオチド・テールを使用すると、特定の配列のみではなく、核酸分子の全集団が増幅可能になる。ＤＮＡにデオキシヌクレオチドを付着させるいかなる手段によって、オリゴデオキシヌクレオチド・テールを取り込んでもよい。好ましくは、適切なデオキシヌクレオチドの存在下で、末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ、または他の適切な酵素を用いて、オリゴデオキシヌクレオチド・テールをｃＤＮＡに付着させる。好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチド・テールは、ホモポリマー・テール（すなわちポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＣ、またはポリｄＴ）である。好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチド・テールは、一般的に、長さ約３〜５００を超えるヌクレオチド、好ましくは長さ約２０〜約１００ヌクレオチドの範囲のポリｄＡテールである。本出願者らは、ポリｄＡテールを用いると、非特異的増幅から生じるアーチファクトの数が減少することを見出した。
【００２８】
［００３１］ｃＤＮＡ分子の３’端への一本鎖オリゴヌクレオチド・テールの付着後、５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを、該３’オリゴデオキシヌクレオチド・テールにアニーリングさせる（図１ｃを参照されたい）。これは、３’オリゴデオキシヌクレオチド・テールおよびＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドの３’ＤＮＡ部分の少なくとも部分の間の相補的塩基対形成を通じて達成される。例えば、オリゴヌクレオチド・テールがポリｄＴテールであるならば、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドの３’ＤＮＡ部分は、その３’端に、一般的に、長さ約３〜５０を超えるヌクレオチド、好ましくは長さ約１０〜約３０ヌクレオチドの範囲の、一連のアデニン塩基を含有するであろう。配列が互いに相補的であると見なされるためには、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドの３’ＤＮＡ部分の特定のデオキシヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡ分子の３’端のオリゴデオキシヌクレオチド・テールの特定のヌクレオチド配列に完全に相補的である必要はないし、また、その長さが、正確にマッチする必要もない。必要なことは、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドが、ｃＤＮＡ分子の３’端のオリゴデオキシヌクレオチド・テールにアニーリング可能であるように、２つの配列間に十分な相補性があることであると、当業者は認識するであろう。
【００２９】
［００３２］いくつかの態様において、ｃＤＮＡ分子の３’端に一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させるのではなく、ＤＮＡ部分がランダムヌクレオチドを含む一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ分子にアニーリングさせる。ここでも、こうしたランダム混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを使用すると、特定の配列のみではなく、核酸分子の全集団が増幅されることが可能になる。複合オリゴヌクレオチドのランダムＤＮＡ部分は、一般的に、長さ約３〜５０を超えるヌクレオチド、好ましくは長さ約６〜約２０ヌクレオチドの範囲である。ｃＤＮＡ分子の３’端にハイブリダイズするブリッジ・オリゴヌクレオチドのみが、以下に記載するように、機能するＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの合成を生じるであろう。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、約３７℃〜約５５℃、より好ましくは４５℃〜約５０℃で行われる。
【００３０】
［００３３］３’ＤＮＡ部分（ランダムであってもまたは定義されていてもよい）に加えて、混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドは、３’オリゴデオキシヌクレオチド・テールへの混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドの３’ＤＮＡ部分のアニーリング後、一本鎖の（すなわち、アニーリングしていない）ままである、５’ＲＮＡ部分を含有する。５’ＲＮＡ部分は、一般的に、長さ約３〜５０を超えるヌクレオチド、好ましくは長さ約１０〜約３０ヌクレオチドの範囲である。好ましくは、５’ＲＮＡ部分の特定の配列は、いかなる既知の核酸配列にも実質的に相同ではないし、あるいは、実質的に自己相補的でも、または以下に記載する一本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートのいかなる部分にも相補的でない。
【００３１】
［００３４］ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドは、望ましい場合、ＤＮＡポリメラーゼで伸長不能であるように、３’端でブロッキングされていてもよい。こうしたものとして、ＲＮＡおよびＤＮＡ両方に依存性であるＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ逆転写酵素（例えばＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン））およびｄＮＴＰの添加は、ブリッジ・オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分が二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖になるように、ｃＤＮＡ分子の３’端で、一本鎖３’オリゴヌクレオチド・テールを伸長させるが、第二鎖ｃＤＮＡの合成を触媒しない（図１ｃを参照されたい）。合成中または合成後のいずれかに付着される末端ブロッキング基、化合物、または部分を含むことによるなど、ＤＮＡポリメラーゼでは伸長不能にする、いかなる手段によって、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドをブロッキングしてもよい。好ましくは、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドは、３’アミノ修飾因子、３’デオキシターミネーター、または３’ジデオキシターミネーターでブロッキングされる。適切なブロッカーは、本明細書に記載するもののいずれかに制限されてはならず、そしてＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させるのを妨げるであろう、いかなる部分を含んでもよい。
【００３２】
［００３５］ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成するための３’オリゴヌクレオチド・テールの伸長後、二重鎖のＲＮＡ部分（すなわちブリッジ・オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分）を、ＲＮアーゼで分解して、ｃＤＮＡ分子上の３’一本鎖ＤＮＡテールを露出させる（図１ｄを参照されたい）。好ましくは、ＲＮアーゼは、ＲＮアーゼＨであるが、ＲＮアーゼ１およびＲＮアーゼＡなどの他のＲＮアーゼを用いてもよい。逆転写酵素の一部として、または別個の酵素として、ＲＮアーゼを提供してもよい。ＲＮアーゼは、好ましくは、逆転写酵素およびブリッジ・オリゴヌクレオチドと実質的に同時に添加される（図１ｃを参照されたい）。
【００３３】
［００３６］ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分の分解後、一本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを、ｃＤＮＡ分子上の露出した３’一本鎖ＤＮＡテールに付着させる（図１ｅを参照されたい）。これは、一般的には、長さ約３〜５０を超えるヌクレオチド、好ましくは長さ約１０〜約３０ヌクレオチドの範囲である、露出した３’一本鎖ＤＮＡテールおよび一本鎖プロモーター・テンプレートの３’端に存在する一連の相補的ヌクレオチドの間の相補的塩基対形成を通じて達成される。
【００３４】
［００３７］一本鎖プロモーター・テンプレートは、５’端に、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有する。プロモーター・テンプレートは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡで構成されてもよいし、そして３’端でブロッキングされても、またはされなくてもよい。ＲＮＡおよびＤＮＡの両方で構成される場合、ｃＤＮＡ分子上の露出したＤＮＡテールにハイブリダイズするプロモーター・テンプレートの３’部分は、好ましくはＤＮＡであり、一方、５’のハイブリダイズしない部分はＲＮＡである。多数周期のｓＲＮＡ合成を行うため、プロモーター・テンプレートは、好ましくは、第一の認識配列の３’側に少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有する（すなわち、「タンデム・プロモーター・テンプレート」；図１ｃを参照されたい）（その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属米国特許出願第１１／１５０，７９４号を参照されたい）。用語「ＲＮＡポリメラーゼ認識配列」は、一本鎖および二本鎖両方のヌクレオチド配列を含むことが意図される。一本鎖型では、ヌクレオチド配列は、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの非テンプレート鎖に対応する。二本鎖型では、ヌクレオチド配列は、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターのテンプレートおよび非テンプレート鎖両方に対応する。ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される限り、いかなるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を用いてもよい。好ましくは、（単数または複数の）用いるＲＮＡポリメラーゼ認識配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどのバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識される。典型的なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列は、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号１）である。典型的なＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列は、ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ（配列番号２）である。典型的なＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列は、ＡＡＴＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ（配列番号３）である。ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートは、好ましくは、逆転写酵素、ブリッジ・オリゴヌクレオチドおよびＲＮアーゼと実質的に同時に（例えば同じ反応容器中で）添加される（図１ｃを参照されたい）が、各反応を別個に行ってもよい。
【００３５】
［００３８］付着後、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、図１ｃ由来の逆転写酵素は、ｃＤＮＡ分子上の露出した３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させて、そして一本鎖プロモーター・テンプレートを二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換する（図１ｅを参照されたい）。決定的なことに、ブロッキングされていないプロモーター・テンプレートであってさえ、反応中に伸長されない、これは逆転写酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および鎖置換活性を欠くためである。逆転写酵素の代わりに、または該酵素に加えて、すべて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および鎖置換活性を欠く、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オハイオ州クリーブランド）を用いて、ｃＤＮＡ分子上の露出した３’一本鎖ＤＮＡテールを伸長させ、そして一本鎖プロモーター・テンプレートを二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換してもよい。本系において、クレノウ酵素が、逆転写酵素／ＲＮアーゼ・プロモーター合成反応（単数または複数）の終了間際に（例えばプロモーター合成完了の約５分〜約１５分前）添加されると、テンプレートを伸長させずに、プロモーター・テンプレートをＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換することが示されてさえいる。こうしたＤＮＡポリメラーゼの使用は、逆転写酵素のみの使用に関連する取り込みエラーを防止するかまたは修正することも可能である。
【００３６】
［００３９］ブロッキングされていないプロモーター・テンプレートが、プロモーター合成反応（単数または複数）中に伸長されないことをさらに確実にするため、ブロッキングされていない一本鎖プロモーター・テンプレートの３’端にヌクレオチド伸長を含めてもよい。ｃＤＮＡ分子上の露出した３’一本鎖ＤＮＡテールに、プロモーター・テンプレートを付着させるのに用いた一連の相補的３’デオキシヌクレオチドの下流の、この３’末端ヌクレオチド伸長は、ブリッジ・オリゴヌクレオチドの残りのＤＮＡ部分の５’端に同一であり、一般的に、長さ約３〜約１０ヌクレオチドの範囲である、一連のヌクレオチドを含む。こうしたものとして、ブリッジ・オリゴヌクレオチドの残りのＤＮＡ部分の存在を別として、ｃＤＮＡ分子に結合するであろう３’伸長は、プロモーター合成中、プロモーター・テンプレートおよびブリッジ・オリゴヌクレオチドの残りのＤＮＡ部分の間に存在するギャップまたはニックへのアクセスを防止するよう機能する（図１ｅを参照されたい）。したがって、３’ヌクレオチド伸長を分解不能なＤＮＡポリメラーゼを合成反応（単数または複数）に用いる限り（例えばクレノウｅｘｏ−）、プロモーター合成中のいかなる潜在的な鎖置換も妨げられる。
【００３７】
［００４０］いくつかの態様において、一本鎖プロモーター・テンプレートから二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを酵素的に合成するのではなく、ＤＮＡ連結によって、テンプレート鎖および非テンプレート鎖を有する二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを、第一周期ｃＤＮＡ分子の３’端に付着させる（その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４３２５号を参照されたい）。二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターは、その５’端（非テンプレート鎖に比較して）に、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有する。多数周期のｓＲＮＡ合成を行うため、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターは、好ましくは、第一の認識配列の３’側に少なくとも第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有する（すなわち、「タンデム・プロモーター・テンプレート」）（その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属米国特許出願第１１／１５０，７９４号を参照されたい）。プロモーターの付着は、一般的に、長さ約３〜５０を超えるヌクレオチド、好ましくは長さ約１０〜約３０ヌクレオチドの範囲の、ｃＤＮＡ分子上の露出した３’一本鎖ＤＮＡテール、および相補的な一連のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの非テンプレート鎖の３’端のオーバーハング配列の間の、相補的塩基対形成によって促進される。適切に配置されると、露出した一本鎖ＤＮＡテールの３’端に、プロモーターのテンプレート鎖の５’端が連結されることによって、二本鎖プロモーターはｃＤＮＡ分子に付着する。連結反応において、いかなるＤＮＡリガーゼを用いてもよい。好ましくは、ＤＮＡリガーゼはＴ４  ＤＮＡリガーゼである。
【００３８】
［００４１］本発明の方法は、好ましくは、第二鎖ｃＤＮＡ合成の非存在下で行われるが、当業者は、ランダムプライマーを用いることによって、一本鎖プロモーター・テンプレートを二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに変換する間に、場合によって第二鎖ｃＤＮＡを合成してもよいことを認識するであろう。ランダムプライマーは、第一鎖ｃＤＮＡに沿った多様な位置でアニーリングし、そしてプロモーター合成中に、逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されるであろう。場合によって、多様な第二鎖ｃＤＮＡ断片を一緒に連結して、単一の第二鎖ｃＤＮＡ分子を形成してもよい。こうした第二鎖ｃＤＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写中に第一鎖ｃＤＮＡを安定化させ（すなわち二次および三次構造を取り除き）、より高い収率のｓＲＮＡ分子を生じることも可能である。
【００３９】
［００４２］一本鎖プロモーター・テンプレートの二本鎖ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターへの変換後、リボヌクレオチド、およびプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼの添加によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を開始する（図１ｆを参照されたい）。タンデム・プロモーター・テンプレートをｃＤＮＡ分子に付着させた場合（図１ｅを参照されたい）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、好ましくは、第一の５’プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて開始される（図１ｆを参照されたい）。これは、さらに詳細に以下に記載する第二周期ｓＲＮＡ合成を容易にする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うための方法およびキットが当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）およびＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ高収率転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれる。
【００４０】
［００４３］生じた第一周期ｓＲＮＡ分子を逆転写し（すなわち第二周期ｃＤＮＡ分子）、そして直前に記載したように、第二周期ｃＤＮＡ分子上にプロモーター・テンプレートを再付着させた後、二本鎖プロモーターに酵素的に変換し、そしてＲＮＡポリメラーゼを用いて第二周期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うことによって、さらなるｓＲＮＡ合成周期を行ってもよい。しかし、タンデム・プロモーター・テンプレートが第一周期ｃＤＮＡ分子に付着しており（図１ｅを参照されたい）、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、第一の５’プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて開始した場合（図１ｆを参照されたい）、プロモーター・テンプレートを再付着させ、そして二本鎖プロモーターを再合成する必要を伴わずに、さらなるｓＲＮＡ合成周期を行うことも可能である。（その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属米国特許出願第１１／１５０，７９４号を参照されたい）。
【００４１】
［００４４］まず、上述のように、ｓＲＮＡ分子を第一鎖ｃＤＮＡ分子に逆転写することによって、第一周期ｓＲＮＡ分子をまず第二周期の合成に供する（図１ｇを参照されたい）。例えば、オリゴｄＴにプライミングされた第一鎖ｃＤＮＡから産生されたｓＲＮＡ分子は、３’端にポリＡテールを再生するであろうし、これが第二周期のオリゴｄＴにプライミングされた第一鎖ｃＤＮＡ合成のプライミング部位として働くことも可能である。さらに、そしてランダム・プライミングされた第一鎖ｃＤＮＡから産生された第一周期ｓＲＮＡ分子に関しては、オリゴｄＴにプライミングされた第一鎖ｃＤＮＡ合成のため、３’ポリＡテールをｓＲＮＡ分子に付加してもよいし、または、再びランダムプライマーが仲介する逆転写を行って、第二周期ｃＤＮＡを産生してもよい。第二周期ｃＤＮＡ合成に、オリゴｄＴおよびランダムプライマーの組み合わせおよび混合物もまた、用いてもよい。
【００４２】
［００４５］図１ａに示す工程で用いる第一周期逆転写プライマーが、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む場合、第一周期ｓＲＮＡ分子は、その３’端に、定義した相補的ヌクレオチド配列を含有するであろう。この定義した（すなわち５’伸長の特定のヌクレオチド配列に「対応する」）ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、第二の逆転写プライマーを用いて、逆転写を開始してもよい（図１ｇを参照されたい）。定義したヌクレオチド配列を含有する第一周期ｓＲＮＡ分子のみが逆転写され、減少した非特異的増幅が生じるであろう。あるいは、第一周期ｃＤＮＡ合成に用いたオリゴｄＴプライマーおよび／またはランダムプライマー（または別の適切なプライマー）を用いて、この態様における第二周期の逆転写を開始してもよい。
【００４３】
［００４６］第二周期ｃＤＮＡ合成後、第一鎖ｃＤＮＡ分子の場合による精製前に、ＮａＯＨまたは好ましくはＲＮアーゼＨを用いて、ＲＮＡ鎖を分解する（図１ｈを参照されたい）。同様に、ＭＭＬＶなどのＲＮアーゼＨ＋逆転写酵素を用いてもよい。
【００４４】
［００４７］ＲＮＡ分解後、第二の異なる３’ＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドを、相補的塩基対形成を通じて、第二周期ｃＤＮＡ分子にアニーリングさせる（図１ｈを参照されたい）。この塩基対形成は、第二のＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを形成し、ここから、リボヌクレオチド、および第二のプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼの添加によって、第二周期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（すなわち第二周期ｓＲＮＡ分子）を開始する（図１ｉを参照されたい）。プロモーター・テンプレート内に、さらなる異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列を組み入れることによって、さらなる周期のｓＲＮＡ合成を、記載するように行ってもよい（例えば第三周期ｓＲＮＡ分子など）。さらに、工程間またはＲＮＡポリメラーゼの添加前に、当業者によく知られる方法を用いて、すべての酵素を熱不活化することによって、指数関数的でなく、線形の増幅を維持してもよい。こうした線形増幅は、遺伝子発現研究などの多様な下流適用によりよく適合する。別に明記されない限り、すべての酵素活性は、次の酵素操作前またはＲＮＡポリメラーゼを添加する前のいずれかで、終了されていることが理解されるべきである。
【００４５】
［００４８］いくつかの態様において、第二周期ｃＤＮＡ合成後に逆転写酵素を不活化し、そして第二の異なるＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせるのではなく、ＲＮアーゼＨを用いてＲＮＡ鎖を分解し、そして過剰な一本鎖タンデム・プロモーター・テンプレート（第一周期由来）の、第二周期ｃＤＮＡ分子の３’端への結合、ならびにまだ活性である逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によって、タンデム・プロモーターを再生する（その全体が本明細書に明確に援用される、本出願者らの同時係属米国特許出願第１１／１５０，７９４号を参照されたい）。次いで、第一または第二のプロモーターのいずれかを認識するＲＮＡポリメラーゼを添加することによって、第二周期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を開始してもよい。再び、逆転写酵素は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼを添加する直前に熱不活化されて、増幅の線形を維持する。当業者は、これらの態様における一本鎖プロモーター・テンプレートが、２つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列をタンデムに含有する必要がないことを認識するであろう。むしろ、プロモーター・テンプレートはタンデム・プロモーター・テンプレートの代わりに使用可能な、単一のＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有して、第一および第二周期のｓＲＮＡ分子を産生してもよい。
【００４６】
［００４９］ｍＲＮＡが典型的に用いられる任意の目的のために、本発明の方法によって産生されるｓＲＮＡ分子を直接用いてもよく、こうした目的には、遺伝子発現研究、遺伝子クローニング、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、および当業者によく知られる他の技術が含まれる。好ましくは、ｓＲＮＡ分子を、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、またはその組み合わせを用いて、ｃＤＮＡ分子に逆転写する。蛍光標識ヌクレオチドなどの、検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下で、直接、逆転写反応を行ってもよい。こうしたヌクレオチドには、Ｃｙ３およびＣｙ５で標識されたヌクレオチドが含まれる。
【００４７】
［００５０］あるいは、ｃＤＮＡ分子は、間接的に標識される。例えば、ビオチン化またはアミノアリルヌクレオチド（例えばアミノアリルＵＴＰ）の存在下で、逆転写反応を行って、その後、ＮＨＳエステル標識（例えばＣｙ色素）にカップリングしてもよい。好ましくは、３ＤＮＡＴＭデンドリマー技術（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ、ペンシルバニア州ハットフィールド）を用いて、ｃＤＮＡ分子を間接的に標識する。樹状試薬は、各々、その全体が本明細書に明確に援用される、Ｎｉｌｓｅｎら，  Ｊ．  Ｔｈｅｏｒ．  Ｂｉｏｌ．，  １８７：２７３（１９９７）；Ｓｔｅａｒｓら，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ３：９３（２０００）；ならびに、米国特許第５，１７５，２７０号；第５，４８４，９０４号；第５，４８７，９７３号；第６，０７２，０４３号；第６，１１０，６８７号；および第６，１１７，６３１号などの多様な米国特許にさらに記載される。
【００４８】
［００５１］また、ｓＲＮＡ分子をｃＲＮＡ増幅法で用いて、標識アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を産生してもよい。例えば、Ｅｂｅｒｗｉｎｅらの方法（例えば、各々、その全体が本明細書に明確に援用される、Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１６６３（１９９０）；米国特許第５，５４５，５２２号；第５，７１６，７８５号；第５，８９１，６３６号；第５，９５８，６８８号；および第６，２９１，１７０号を参照されたい）を用い、Ｔ７プロモーター・プライマーを用いて、ｓＲＮＡ分子を逆転写してもよい。第二鎖ｃＤＮＡ合成後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ転写を開始し、増幅ａｓＲＮＡ分子を産生する。標識ヌクレオチド（例えばＣｙ標識ヌクレオチド）を取り込むことによって、合成中に、こうしたａｓＲＮＡ分子を直接標識してもよいし、あるいは例えばビオチン化またはアミノアリルヌクレオチド（例えばアミノアリルＵＴＰ）を取り込み、その後、ＮＨＳエステル標識（例えばＣｙ色素）にカップリングすることによって、間接的に標識してもよい。
【００４９】
［００５２］本発明のｓＲＮＡ分子から産生された標識一本鎖ｃＤＮＡおよびａｓＲＮＡ分子は、遺伝子発現研究用の試薬として有用である。標識ｃＤＮＡおよびａｓＲＮＡ分子を、相補的ポリヌクレオチドを含有する核酸マイクロアレイにアニーリングさせてもよい（例えばプローブ）。本明細書において、「マイクロアレイ」は、スライド、チップ、膜、ビーズ、およびマイクロタイタープレートを含む、核酸プローブを含有する任意の固体支持体を含むよう意図される。商業的に入手可能なマイクロアレイの例には、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）、ＣｏｄｅＬｉｎｋＴＭマイクロアレイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（カリフォルニア州パロアルト）オリゴ・マイクロアレイ、およびＯｃｉＣｈｉｐＴＭマイクロアレイ（Ｏｃｉｍｕｍ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、インディアナ州インディアナポリス）が含まれる。
【００５０】
［００５３］本発明の方法および組成物を、キットの形で好適にパッケージング可能である。こうしたキットを多様な研究および診断適用で用いてもよい。例えば、本発明の方法およびキットを用いて、異なる細胞または組織、同じ細胞または組織の異なる下位集団、同じ細胞または組織の異なる生理学的状態、同じ細胞または組織の異なる発生段階、あるいは同じ組織の異なる細胞集団における１以上の遺伝子の発現の比較分析を容易にすることも可能である。こうした分析は、遺伝子発現のレベルにおける統計的に有意な相違を明らかにすることも可能であり、次いで、これを用いて、分析する細胞または組織に応じて、多様な疾患状態の診断を容易にすることも可能である。
【００５１】
［００５４］本発明にしたがって、非常に多様なキットを調製してもよい。例えば、キットには、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレート；ＤＮＡ配列の５’側にＲＮＡ配列を含む、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド；ならびに前記プロモーター・テンプレートおよび前記ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチドを用いて、ｓＲＮＡ分子を合成するための使用説明資料が含まれてもよい。さらなる周期のｓＲＮＡ合成を行うため、キットにはさらに、プロモーター・テンプレートの第二のＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチド、および適切な使用説明資料が含まれてもよい。使用説明資料は、典型的には、書かれたかまたは印刷された資料を含むが、こうしたものに限定されない。こうした使用説明を保存し、そしてこれらをエンドユーザーに伝えることが可能ないかなる媒体も、本発明によって意図される。こうした媒体には、限定されるわけではないが、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ  ＲＯＭ）等が含まれる。こうした媒体には、こうした使用説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスが含まれてもよい。
【００５２】
［００５５］本発明のキットには、以下の構成要素または試薬の１以上がさらに含まれてもよい：逆転写酵素（好ましくは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つもの）；ＲＮアーゼ阻害剤；ＤＮＡ分子上に３’オリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させるための酵素（例えば末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ）；ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖中のＲＮＡを分解するための酵素（例えばＲＮアーゼＨ）；および１以上のＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）。さらに、キットには、本発明の方法にしたがったｓＲＮＡ分子の合成と適合する、緩衝剤、プライマー（例えばオリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー）、ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ＲＮアーゼ阻害剤、ポリＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼ不含水、容器、バイアル、反応試験管等が含まれてもよい。構成要素および試薬を、適切な保存媒体を含む容器中で提供してもよい。
【００５３】
［００５６］ここで、本発明の方法にしたがった特定の態様が、以下の実施例中で記載されるであろう。実施例は、例示のみであり、そしていかなる点でも残りの開示を限定するように意図されない。
【実施例】
【００５４】
実施例
実施例１
一周期のｓＲＮＡ合成
１．第一鎖ｃＤＮＡ合成
［００５７］ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて精製した各ＲＮＡ試料に関して、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを氷上で調製した：
１〜８μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
２μｌのオリゴｄＴ配列特異的ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｖ−３’、ここでＶ＝Ｃ、ＧまたはＡデオキシリボヌクレオチド；配列番号４）
１μｌのランダム配列特異的ＲＴプライマー（ＲＮＡ質量にして２ｘ）（５’−ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ−３、ここでＮ＝ランダムに、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴデオキシリボヌクレオチド；配列番号５）
ＲＮアーゼ不含水で１１μｌに
［００５８］ＲＮＡ／プライマー混合物を、８０℃で１０分間加熱して、そして直ちに氷上で１〜２分間冷却した。次いで、混合物を９μｌのマスター混合物溶液と混合し、１ｘＲＴ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、各０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０Ｕ  Ｓｕｐｅｒａｓｅ−ＩｎＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）、および２００Ｕ  ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する最終体積２０μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして４２℃で２時間インキュベーションした。簡単に遠心分離した後、１ｘＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で反応を調整して１００μｌにした。
【００５５】
２．  ｃＤＮＡ精製
［００５９］製造者のプロトコルにしたがって、ＭｉｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、反応を精製した。簡潔には、製造者によって提供されるＰＢ緩衝液で、ｃＤＮＡ反応を６００μｌに調整した。ｃＤＮＡ反応をＭｉｎＥｌｕｔｅＴＭカラムに適用し、そして１分間微量遠心分離した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そして製造者に提供されたＰＥ緩衝液７５０μｌでカラムを洗浄した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そしてカラムを５００μｌの８０％エタノールで洗浄した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そしてふたを開けたままカラムを５分間微量遠心分離して樹脂を乾燥させた。カラムを清浄な１．５ｍｌの微量遠心管に入れ、そして製造者によって提供されたＥＢ緩衝液１０μｌとカラム膜を室温で２分間インキュベーションした。２分間の微量遠心分離によって、第一鎖ｃＤＮＡ分子を溶出させた。
【００５６】
３．第一鎖ｃＤＮＡのテール付加
［００６０］第一鎖ｃＤＮＡ分子を８０℃で１０分間加熱し、そして直ちに氷上で１〜２分間冷却した。次いで、１０μｌ中のｃＤＮＡ分子を１０μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘテール付加緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、０．０４ｍＭ  ｄＴＴＰ、および１５Ｕ末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナ州インディアナポリス）を含有する最終体積２０μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして３７℃で２分間インキュベーションした。８０℃で１０分間加熱することによって、反応を停止し、そして室温で１〜２分間冷却した。
【００５７】
４．  Ｔ７プロモーター合成
［００６１］１μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート  オリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＴ−３’；配列番号６）（１００ｎｇ／μｌ）および１μｌの３’アミノ修飾因子を含有するＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド（５’−ｒＵｒＡｒＧ  ｒＧｒＧｒＡ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＡｒＵｒＵ  ＣＧＡ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ−３’；配列番号７）（１００ｎｇ／μｌ）をオリゴｄＴテール付加ｃＤＮＡ分子に添加し、そして混合物を３７℃で１０分間インキュベーションして、鎖をアニーリングさせた。ブリッジ・オリゴヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドで構成される３’部分の上流のリボヌクレオチドで構成される５’部分を含有する。３’デオキシヌクレオチド部分は、ポリｄＴテール付加ｃＤＮＡ分子の３’端にアニーリングするように設計されている。ｃＤＮＡ分子がＭＭＬＶ逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されると、ブリッジ・オリゴヌクレオチドの５’リボヌクレオチド部分が、ＲＮアーゼＨによって分解されて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート・オリゴヌクレオチドの３’端がアニーリングするように設計されている、ｃＤＮＡ分子上の３’一本鎖テールが露出する（図１ｃ〜１ｅを参照されたい）。３’アミノ修飾因子は、プロモーター合成反応中、ブリッジ・オリゴヌクレオチドの伸長を防止する一方、ＭＭＬＶ逆転写酵素には５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および鎖置換活性が欠けていることから、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート・オリゴヌクレオチドもまた、反応中に伸長されないことが確実になる。
【００５８】
［００６２］次いで、テール付加ｃＤＮＡ分子／ブリッジ・オリゴヌクレオチド／プロモーター・テンプレート混合物を３μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、各０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２Ｕ  ＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する最終体積２５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離し、そして３７℃で３０分間インキュベーションした。６５℃で１５分間加熱することによって、反応を停止し、そして氷上に置いた。
【００５９】
５．  Ｔ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
［００６３］プロモーター合成反応の半分（１２．５μｌ）を３７℃で１０〜１５分間加熱して、Ｔ７プロモーター鎖を再アニーリングさせて、そして次いで、マスター混合物溶液１２．５μｌと混合して、１ｘ反応緩衝液、各７．５ｍＭのｒＮＴＰ、および２μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭ転写キット、Ａｍｂｉｏｎ）を含有する最終体積２５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして加熱されたふたを備えたサーモサイクラー中で、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。あるいは、３７℃の熱ブロック中で混合物を１５分間インキュベーションし、その後、空気ハイブリダイゼーション・オーブン中、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。この工程中、反応の蒸発および濃縮を回避することが必須である。
【００６０】
６．  ｓＲＮＡ精製および定量化
［００６４］ＲＮＡ清浄化のための製造者のプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ｓＲＮＡ分子を精製した。５０μｌ  ＲＮアーゼ不含水中、精製ｓＲＮＡ分子を２回溶出させて、そして０．１ｘＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０中、ＵＶ分光光度法によって、２６０／２８０の波長比で定量化した。
【００６１】
［００６５］１μｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１μｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、５０〜７５μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．５μｇの非特異的増幅産物が回収された。
【００６２】
実施例２
二周期のｓＲＮＡ合成
１．第一鎖ｃＤＮＡ合成
［００６６］ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて精製した各ＲＮＡ試料に関して、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを氷上で調製した：
１〜８μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
２μｌの第一周期オリゴｄＴ配列特異的ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｖ−３’、ここでＶ＝Ｃ、ＧまたはＡデオキシリボヌクレオチド；配列番号４）
１μｌの第一周期ランダム配列特異的ＲＴプライマー（ＲＮＡ質量にして２ｘ）（５’−ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ−３、ここでＮ＝ランダムに、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴデオキシリボヌクレオチド；配列番号５）
ＲＮアーゼ不含水で１１μｌに
［００６７］第一周期ＲＴプライマーは、第二周期ＲＴプライマーの結合部位として働く、特定のヌクレオチド配列を含有する５’伸長を含む（図１ｇを参照されたい）。ＲＮＡ／プライマー混合物を、８０℃で１０分間加熱して、そして直ちに氷上で１〜２分間冷却した。次いで、混合物を９μｌのマスター混合物溶液と混合し、１ｘＲＴ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、各０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０Ｕ  Ｓｕｐｅｒａｓｅ−ＩｎＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）、および２００Ｕ  ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する最終体積２０μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして４２℃で２時間インキュベーションした。簡単に遠心分離した後、１ｘＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で反応を調整して１００μｌにした。
【００６３】
２．  ｃＤＮＡ精製
［００６８］製造者のプロトコルにしたがって、ＭｉｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、反応を精製した。簡潔には、製造者によって提供されるＰＢ緩衝液で、ｃＤＮＡ反応を６００μｌに調整した。ｃＤＮＡ反応をＭｉｎＥｌｕｔｅＴＭカラムに適用し、そして１分間微量遠心分離した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そして製造者に提供されたＰＥ緩衝液７５０μｌでカラムを洗浄した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そしてカラムを５００μｌの８０％エタノールで洗浄した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そしてふたを開けたままカラムを５分間微量遠心分離して樹脂を乾燥させた。カラムを清浄な１．５ｍｌの微量遠心管に入れ、そして製造者によって提供されたＥＢ緩衝液１０μｌとカラム膜を室温で２分間インキュベーションした。２分間の微量遠心分離によって、第一鎖ｃＤＮＡ分子を溶出させた。
【００６４】
３．  第一鎖ｃＤＮＡのテール付加
［００６９］第一鎖ｃＤＮＡ分子を８０℃で１０分間加熱し、そして直ちに氷上で１〜２分間冷却した。次いで、１０μｌ中のｃＤＮＡ分子を１０μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘテール付加緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、０．０４ｍＭ  ｄＡＴＰ、および１５Ｕ末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する最終体積２０μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして３７℃で２分間インキュベーションした。８０℃で１０分間加熱することによって、反応を停止し、そして室温で１〜２分間冷却した。
【００６５】
４．  Ｔ７／Ｔ３プロモーター合成
［００７０］１μｌのＴ７／Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート  オリゴヌクレオチド（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  Ｔ−３’；配列番号８）（１００ｎｇ／μｌ）および１μｌの３’アミノ修飾因子を含有するＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド（５’−ｒＧｒＡｒＡ  ｒＡｒＵｒＵ  ｒＡｒＡｒＣ  ｒＣｒＣｒＵ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＵＡＡ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ−３’；配列番号９）（１００ｎｇ／μｌ）をオリゴｄＡテール付加ｃＤＮＡ分子に添加し、そして混合物を３７℃で１０分間インキュベーションして、鎖をアニーリングさせた。Ｔ７／Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートは、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列の５’側にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートを含有する。次いで、テール付加ｃＤＮＡ分子／ブリッジ・オリゴヌクレオチド／プロモーター・テンプレート混合物を３μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、各０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２Ｕ  ＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する最終体積２５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離し、そして３７℃で３０分間インキュベーションした。６５℃で１５分間加熱することによって、反応を停止し、そして氷上に置いた。
【００６６】
５．  Ｔ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
［００７１］プロモーター合成反応の半分（１２．５μｌ）を３７℃で１０〜１５分間加熱して、Ｔ７Ｔ３プロモーター鎖を再アニーリングさせて、そして次いで、マスター混合物溶液１２．５μｌと混合して、１ｘ反応緩衝液、各７．５ｍＭのｒＮＴＰ、および２μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭ転写キット、Ａｍｂｉｏｎ）を含有する最終体積２５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして加熱されたふたを備えたサーモサイクラー中で、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。あるいは、３７℃の熱ブロック中で混合物を１５分間インキュベーションし、その後、空気ハイブリダイゼーション・オーブン中、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。この工程中、反応の蒸発および濃縮を回避することが必須である。
【００６７】
６．  第一周期ｓＲＮＡの逆転写
［００７２］２５μｌの第一周期ｓＲＮＡを、１μｌの第二周期配列特異的ＲＴプライマー（５００ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＴＴ−３’；配列番号１０）と混合して、そして８０℃で１０分間加熱した。第二周期ＲＴプライマーは、第一周期ＲＴプライマーの５’伸長の特定のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含有する（図１ｇを参照されたい）。反応を直ちに２分間氷冷し、簡単に遠心分離し、そして氷上に戻した。１μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）および１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、そしてＲＴ反応を４２℃で１時間インキュベーションした。１μｌのＲＮアーゼＨ（２Ｕ／μｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、そして反応を３７℃で２０分間インキュベーションした。次いで、反応を６５℃でインキュベーションして、酵素活性を停止させた。
【００６８】
７．  Ｔ３プロモーター形成
［００７３］２μｌのＴ３プロモーター・オリゴヌクレオチド（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＡＧＧ  Ｇ−３’；配列番号１１）を第二周期ｃＤＮＡ反応に添加した。Ｔ３オリゴヌクレオチドは、最初のＴ７／Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートのＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列に相補的である。反応を３７℃で１０分間インキュベーションして、鎖をアニーリングさせた。
【００６９】
８．  Ｔ３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
［００７４］Ｔ３プロモーター合成反応を１９μｌのマスター混合物溶液と混合して、１ｘ反応緩衝液、各７．５ｍＭのｒＮＴＰ、および２μｌのＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭ転写キット、Ａｍｂｉｏｎ）を含有する最終体積２５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして加熱されたふたを備えたサーモサイクラー中で、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。あるいは、３７℃の熱ブロック中で混合物を１５分間インキュベーションし、その後、空気ハイブリダイゼーション・オーブン中、３７℃で４〜１６時間インキュベーションした。この工程中、反応の蒸発および濃縮を回避することが必須である。
【００７０】
９．  ｓＲＮＡ精製および定量化
［００７５］ＲＮＡ清浄化のための製造者のプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、第二周期ｓＲＮＡ分子を精製した。５０μｌ  ＲＮアーゼ不含水中、精製ｓＲＮＡ分子を２回溶出させて、そして０．１ｘＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０中、ＵＶ分光光度法によって、２６０／２８０の波長比で定量化した。
【００７１】
［００７６］１ｎｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１ｎｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、２５μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．５〜４μｇの非特異的増幅産物が回収された。
【００７２】
実施例３
［００７７］第一周期ｃＤＮＡ合成のため、非特異的オリゴｄＴプライマーのみを用いたことを除いて、実施例１に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。氷上で、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを調製した：
１〜８μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
２μｌの第一周期オリゴｄＴ  ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｖ−３’、ここでＶ＝Ｃ、ＧまたはＡ；配列番号１２）
ＲＮアーゼ不含水で１１μｌに
［００７８］１μｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１μｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、８〜１０μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．２μｇの非特異的増幅産物が回収された。
【００７３】
実施例４
［００７９］第一周期ｃＤＮＡ合成のため、非特異的ランダムプライマーのみを用いたことを除いて、実施例１に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。氷上で、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを調製した：
１〜８μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
１μｌの第一周期ランダムＲＴプライマー（ＲＮＡ質量にして２ｘ）（５’−ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ−３、ここでＮ＝ランダムに、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ；配列番号１３）
ＲＮアーゼ不含水で１１μｌに
［００８０］１μｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１μｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、３０〜３５μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．２μｇの非特異的増幅産物が回収された。
【００７４】
実施例５
［００８１］第一周期ｃＤＮＡ合成のため、オリゴｄＴ配列特異的プライマーのみを用いたことを除いて、実施例１に記載するように、各ＲＮＡ試料を増幅した。氷上で、以下のＲＮＡ／プライマー・ミックスを調製した：
１〜８μｌの総ＲＮＡ（２ｎｇを超えない）
２μｌの第一周期オリゴｄＴ  ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）（５’−ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｖ−３’、ここでＶ＝Ｃ、ＧまたはＡ；配列番号４）
ＲＮアーゼ不含水で１１μｌに
［００８２］１μｇの総ＲＮＡまたは水のみ（陰性対照）から出発して、複製物増幅を行った。１μｇの総ＲＮＡを増幅した後、平均して、８〜１０μｇの増幅ｓＲＮＡが回収され、これに対して、ＲＮＡの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、０．５μｇの非特異的増幅産物が回収された。
【００７５】
実施例６
Ｔ７プロモーター合成のゲル分析
１．  Ｔ７プロモーター合成
［００８３］１μｌの３’ポリｄＴ試験オリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＴＧＴ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−３’；配列番号１４）（５０ｎｇ／μｌ）を、１μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート・オリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＴ−３’；配列番号６）（１００ｎｇ／μｌ）および１μｌの３’アミノ修飾因子を含有するＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド（５’−ｒＵｒＡｒＧ  ｒＧｒＧｒＡ  ｒＧｒＡｒＡ  ｒＡｒＵｒＵ  ＣＧＡ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ−３’；配列番号７）（１００ｎｇ／μｌ）と合わせ、そして混合物を３７℃で１０分間インキュベーションして、鎖をアニーリングさせた。次いで、ポリｄＴ試験オリゴヌクレオチド／ブリッジ・オリゴヌクレオチド／プロモーター・テンプレート混合物を、２２μｌのマスター混合物溶液と混合し、１ｘポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、各０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２Ｕ  ＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する最終体積２５μｌにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして３７℃で３０分間インキュベーションした。反応を６５℃で１５分間加熱することによって反応を停止し、そして氷上に置いた。ＲＮアーゼＨを含めずに、複製対照混合物を調製した。
【００７６】
２．ゲル電気泳動
［００８４］５μｌのゲル装填緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）を各試料に添加し、そして２５ｂｐラダーと一緒に、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）１０％  ＴＢＥ尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に試料を装填した。ゲルを６５℃で３５分間泳動し、そしてＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間染色して、バンドを視覚化した（図２）。レーン４に示すように、逆転写酵素、ｄＮＴＰおよびＲＮアーゼＨの存在下での、３４量体のＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド（レーン１）、３０量体のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート・オリゴヌクレオチド（レーン２）および４８量体のポリｄＴ試験オリゴヌクレオチドの組み合わせは、予測される８４量体産物を生じ、Ｔ７プロモーターが、方法によって効果的に合成されたことを示した。ＲＮアーゼＨが反応に含まれない場合（レーン３）、Ｔ７プロモーターはまったく合成されなかった。
【００７７】
実施例７
［００８５］１以上の周期のｓＲＮＡ合成を行うためのキットを、以下の構成要素で組み立てた：
第一周期オリゴｄＴ配列特異的ＲＴプライマー（５０ｎｇ／μｌ）；
第一周期ランダム配列特異的ＲＴプライマー（２５０ｎｇ／μｌ）；
ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）；
Ｓｕｐｅｒａｓｅ−ＩｎＴＭ  ＲＮアーゼ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ）；
１０ｍＭ  ｄＡＴＰ；
１０ｘ反応緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）；
末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（７．５Ｕ／μｌ）；
ＲＮＡ／ＤＮＡ混成ブリッジ・オリゴヌクレオチド（１００ｎｇ／μｌ）；
Ｔ７／Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート（５０ｎｇ／μｌ）；
ｒＮＴＰミックス（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰ）（各７５ｍＭ）；
１０ｘＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）；
Ｔ７酵素ミックス（Ａｍｂｉｏｎ）；
第二周期配列特異的ＲＴプライマー（５００ｎｇ／μｌ）；
Ｔ３プロモーター・オリゴヌクレオチド（５０ｎｇ／μｌ）；
Ｔ３酵素ミックス（Ａｍｂｉｏｎ）；
ＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；および
Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【００７８】
［００８６］キット構成要素を用いた多数周期のｓＲＮＡ合成に関する、印刷した使用説明マニュアルとともに、番号をふったバイアル中に構成要素を入れ、そして容器中に入れた。
【００７９】
［００８７］本明細書記載の本発明は、特定の態様に関連して記載されてきているが、これらの態様は本発明の原理および適用の単なる例示であることを理解するものとする。したがって、例示態様に対して多くの修飾を行ってもよく、そして請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他のアレンジを考案してもよいことが理解されるものとする。
【００８０】
［００８８］特許刊行物および非特許刊行物両方の、本明細書に引用するすべての刊行物は、本発明が属する当該技術分野における当業者の技術レベルの指標である。これらの刊行物はすべて、個々の刊行物各々が具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いに、本明細書に完全に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１−１】［００１９］図１ａ〜１ｉは、本発明の方法記載の態様を示す略図である。
【図１−２】［００１９］図１ａ〜１ｉは、本発明の方法記載の態様を示す略図である。
【図１−３】［００１９］図１ａ〜１ｉは、本発明の方法記載の態様を示す略図である。
【図２】［００２０］図２は、本発明の方法によるＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター合成を示すゲルの写真である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009505663.tif 000007