(57)【要約】  ヒト血液に由来する重合したヘモグロビンを含む溶液及び懸濁液を開示する。溶液及び懸濁液は、細胞培養液、酵素（プロテアーゼなど）、及び／又はバッファーを含んでいてよい。溶液及び懸濁液を調製するプロセスも開示する。溶液及び懸濁液を、膵島などの哺乳動物の細胞を単離する方法、哺乳動物の組織及び臓器を保存する方法、哺乳動物の細胞の単離後に、その回復を助ける方法、哺乳動物の細胞を維持する方法、哺乳動物の細胞を増殖させる方法、並びに糖尿病を有する哺乳動物を治療する方法において用いることができる。
2009524436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）哺乳動物の血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）酵素を含む溶液。
【請求項２】
酵素がプロテアーゼである、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
プロテアーゼがコラゲナーゼである、請求項２に記載の溶液。
【請求項４】
細胞培養液をさらに含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項５】
細胞培養液がＲＰＭＩである、請求項４に記載の溶液。
【請求項６】
酵素がコラゲナーゼである、請求項５に記載の溶液。
【請求項７】
バッファーをさらに含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項８】
重合したヘモグロビンがヒト血液由来であり、ピリドキシル化されている、請求項１に記載の溶液。
【請求項９】
細胞培養液をさらに含む、請求項８に記載の溶液。
【請求項１０】
酵素がコラゲナーゼであり、細胞培養液がＲＰＭＩである、請求項９に記載の溶液。
【請求項１１】
溶液が酸素化されている、請求項１に記載の溶液。
【請求項１２】
酸素化されている、請求項４に記載の溶液。
【請求項１３】
酸素化されている、請求項１０に記載の溶液。
【請求項１４】
（ａ）哺乳動物の血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）細胞培養液を含む溶液。
【請求項１５】
細胞培養液がＲＰＭＩである、請求項１４に記載の溶液。
【請求項１６】
酸素化されている、請求項１４に記載の溶液。
【請求項１７】
（ａ）哺乳動物由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）１つ又は複数の酵素を混合することを含む、請求項１に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項１８】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）プロテアーゼを混合することを含む、請求項２に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項１９】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）コラゲナーゼを混合することを含む、請求項３に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２０】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、（ｂ）１つ又は複数の酵素、及び（ｃ）細胞培養液を混合することを含む、請求項４に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２１】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、（ｂ）１つ又は複数の酵素、及び（ｃ）ＲＰＭＩを混合することを含む、請求項５に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２２】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、（ｂ）コラゲナーゼ、及び（ｃ）ＲＰＭＩを混合することを含む、請求項６に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２３】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、（ｂ）１つ又は複数の酵素、及び（ｃ）バッファーを混合することを含む、請求項７に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２４】
（ａ）ヒト血液由来の重合し、ピリドキシル化したヘモグロビン、及び（ｂ）１つ又は複数の酵素を混合することを含む、請求項８に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２５】
ヒト血液由来の重合し、ピリドキシル化したヘモグロビン、（ｂ）１つ又は複数の酵素、及び（ｃ）細胞培養液を混合することを含む、請求項９に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２６】
ヒト血液由来の重合し、ピリドキシル化したヘモグロビン、（ｂ）コラゲナーゼ、及び（ｃ）ＲＰＭＩを混合することを含む、請求項１０に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２７】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）１つ又は複数の酵素を混合し、その後、混合液をＯ２ガスと接触させることを含む、請求項１１に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２８】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、（ｂ）１つ又は複数の酵素、及び（ｃ）細胞培養液を混合し、その後、混合液をＯ２ガスと接触させることを含む、請求項１２に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項２９】
（ａ）ヒト血液由来の重合し、ピリドキシル化したヘモグロビン、（ｂ）コラゲナーゼ、及び（ｃ）ＲＰＭＩを混合し、その後、混合液をＯ２ガスと接触させることを含む、請求項１３に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項３０】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）細胞培養液を混合することを含む、請求項１４に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項３１】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）ＲＰＭＩを混合することを含む、請求項１５に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項３２】
（ａ）ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）細胞培養液を混合し、その後、混合液をＯ２ガスと接触させることを含む、請求項１６に記載の溶液を調製するための方法。
【請求項３３】
臓器全体を、（ａ）哺乳動物の血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）細胞培養液を含む溶液と接触させることを含む、哺乳動物の臓器全体を保存する方法。
【請求項３４】
臓器が、ヒト肝臓、ヒト肺、又はヒト腎臓である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が全文、本明細書に組み入れられる、２００６年１月２４日出願の米国出願第６０／７６１６６３号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本出願は、細胞生物学の分野に関する。特に、本出願は、細胞及び組織の単離、培養、及び移植に有用な溶液、懸濁液、方法、及びプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞、組織、及び臓器の移植は、多くの疾患を処置するのに、非常に将来性がある。例えば、膵島の移植は、インスリン依存性糖尿病を逆転することができる。残念なことに、この手順は、島が供給不足であること、及び移植後の島の機能が徐々に喪失することによって妨げられている。島の単離の結果が不一致であることで、島の移植の広範囲な臨床上の適用が主に制限されていた。以下の米国特許は、膵島を単離、培養、及び／又は移植する、知られている方法を記載している：第６５０６５９９号、第６５６２６２０号、第６７８３９６４号、及び第６８１５２０３号。
【０００４】
単離後の島の収量、生存能、及び機能に影響を及ぼす様々な要因の中では、虚血時間が特に重要である。虚血の長さは、島の単離の結果と反比例する。ミトコンドリアの抗酸化の防御を損なうことによって、虚血により、細胞は、酸化ストレスに対してより感受性になる。虚血の組織にＯ２を供給することは、再潅流傷害のために両刃の剣であることが示されている。ミトコンドリアが生成する活性酸素種（ＲＯＳ）が、このタイプの傷害で重大な役割を果たしている。単離手順の間の、膵島に対する酸化ストレスは十分に記述されており、抗酸化剤を使用すれば酸化損傷から島を保護することが示されている。ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸（ＨＴＫ）、及びウィスコンシン大学（ＵＷ）溶液などの臓器保存液は、虚血の有害効果から膵臓の組織を保護するようにデザインされているが、虚血自体を防いではくれない。
【０００５】
好適なＯ２レベルを維持することは、臓器の保存、膵島の単離、及び細胞培養の間に、虚血損傷及び再潅流傷害を防ぐのに重要であると思われる。実際、ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）などの人工の酸素担体は、２層法（ＴＬＭ）においてＵＷ溶液で膵臓を保存する間に用いる場合に、島の単離及び移植の結果に有益な効果がある。人工の酸素運搬体は、Ｏ２に結合し、Ｏ２を輸送し、取り出すことができる合成の溶液である。人工の酸素運搬体は、もともと血液の代替として開発されたが、ＰＦＣベースの製品のどれも臨床用の使用に認可されておらず、臨床試験ではアナフィラキシー反応が観察された。さらに、ＰＦＣは、疎水性であり、水溶液で維持するのが困難であるという不都合がある。
【０００６】
ＰｏｌｙＨｅｍｅなどの、ヘモグロビンベースのＯ２担体（ＨＢＯＣ）は、水溶性である。その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第６４９８１４１号は、代表的なＨＢＯＣの調製を記載している。ＰＦＣとは対照的に、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンは、赤血球のＯ２飽和曲線に類似したＯ２飽和曲線を与える。ＰｏｌｙＨｅｍｅの第Ｉ相及び第ＩＩ相試験では、アナフィラキシー反応は観察されていない。以下に記載するＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐは、ＨＢＯＣの別の一例である。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビン、及びＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの両方とも、本質的にテトラマーフリー（ｔｅｔｒａｍｅｒ−ｆｒｅｅ）であり、実質的にストロマフリー（ｓｔｒｏｍａ−ｆｒｅｅ）であり、重合し、ピリドキシル化した、ヒト血液に由来するヘモグロビンである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞、組織、及び臓器の単離、培養、及び移植に有用な、ＨＢＯＣ含有溶液及び懸濁液が必要とされている。本特許出願は、そのような溶液及び懸濁液、並びにそれらを作製するプロセス及びそれらを用いる方法を記載するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヘモグロビンベースのＯ２担体（ＨＢＯＣ）を含む溶液、これらの溶液を作製するための方法、並びに、動物、最も好ましくはヒトからの、細胞、組織、及び組織の成分を単離するためにこのような溶液を使用するための方法を提供する。本発明は、細胞、組織、及び臓器の単離、培養、及び移植において使用するための溶液及び懸濁液を、特に提供する。
【０００９】
一態様では、本発明の溶液は、（ａ）哺乳動物由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）１つ又は複数の酵素を含む。特定の一態様では、重合したヘモグロビンはヒト血液由来であり、酵素は、コラゲナーゼなどのプロテアーゼである。別の一態様では、溶液は、ＲＰＭＩ若しくはＣＭＲＬ又は同様の市販若しくは自社製の培養液などの、細胞培養液をさらに含む。
【００１０】
第２の態様では、本発明の溶液は、（ａ）哺乳動物由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）細胞培養液を含む。
【００１１】
さらなる態様では、本発明の溶液は、ヒト血液由来の、重合し、ピリドキシル化したヘモグロビンを含む。さらに、溶液は酸素化されていてよい。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、（ａ）哺乳動物の血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ１）哺乳動物の造血細胞、又は（ｂ２）哺乳動物の膵臓組織若しくは哺乳動物の島細胞、のいずれかを含む懸濁液を提供する。特定の態様では、懸濁液は、ＲＰＭＩ若しくはＣＭＲＬ又は同様の市販若しくは自社製の培養液などの細胞培養液、及び／又は、プロテアーゼ、例えばコラゲナーゼを含めた酵素をさらに含むことができる。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明の溶液及び懸濁液を用いた多数の方法を提供する。例えば、本発明は、細胞を本発明の溶液と接触させることを含む、膵臓の島細胞などの哺乳動物の細胞を単離する方法を提供する。本発明は、本発明の方法にしたがって単離した膵島の有効量を、哺乳動物に移植するステップを含む、糖尿病を有する哺乳動物を治療する方法も提供する。さらに、本発明は、哺乳動物の組織を保存し、哺乳動物の細胞の単離後のその細胞回復を助け、哺乳動物の細胞を維持し、哺乳動物の細胞を増殖させる方法を提供し、これら方法は全て、哺乳動物の細胞又は組織を本発明の溶液と接触させることを含む。このような方法では、細胞又は組織は、本発明の溶液と接触した後も依然として生存可能であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、ドナーの管理、臓器の獲得、並びに哺乳動物の細胞、組織、及び／又は臓器の輸送及び貯蔵及び移植の間、哺乳動物の細胞、組織、及び／又は臓器の生存能を維持する方法を提供し、方法は細胞、組織、及び／又は臓器を、本発明の溶液と接触させることを含む。このような方法には、例えば、臓器を本発明の溶液で潅流した後、これらの臓器を移植するために回収することを含む。特定の一態様では、本発明は、（ａ）哺乳動物の血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）細胞培養液を含む溶液と臓器全体を接触させることを含む、哺乳動物の臓器全体を保存する方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、前述の溶液及び懸濁液を調製する方法を提供する。
【００１６】
本発明の特定の好ましい実施形態は、以下の、ある好ましい実施形態、及び特許請求の範囲の、より詳しい記載から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、血液、最も好ましくはヒト血液由来の重合したヘモグロビン、及び酵素、最も好ましくはタンパク質分解性酵素を含む溶液を提供する。本発明は、前記溶液を調製するための方法、並びに、動物の臓器及び組織、最も好ましくはヒトの臓器及び組織からの、細胞、組織、及び組織の成分、最も好ましくは膵島を単離するために前記溶液を用いるための方法をさらに提供する。本発明は、前記細胞、組織、及び組織の成分の懸濁液、好ましくは、膵島、最も好ましくはヒト膵島の懸濁液も提供する。
【００１８】
本発明は、例えば、同じ又は異なる種の別の哺乳動物中に移植するための、哺乳動物の身体から除去した哺乳動物の臓器全体を保存する方法をさらに提供する。これらの方法は、臓器全体を、（ａ）哺乳動物の血液由来の重合したヘモグロビン、及び（ｂ）細胞培養液を含む溶液と接触させることを含む。本発明は、あらゆる哺乳動物の臓器を保存するために用いてもよく、ヒツジの、ヒトの、及び非ヒトの霊長動物の臓器が好ましい。重合したヘモグロビンの溶液及び細胞培養液を用いて保存してもよい臓器の例には、肺、腎臓、肝臓、及び心臓がある。臓器は、或いは、皮膚、例えば、事故の犠牲者から患者に移植する顔面の皮膚であってもよい。好ましくは、溶液及び臓器全体を、移植前に約０℃から約４℃までの温度で維持する。
【００１９】
一実施形態では、本特許出願の対象である、溶液、懸濁液、方法、及びプロセスは、重合したヘモグロビンを含み、又は伴うものである。好ましくは、重合したヘモグロビンは、ヒト血液由来である。移植用に臓器を保存するのに用いるのに、好ましいヘモグロビンは、臓器のドナーの種と一致し、これは典型的には、ヒト又は他の霊長動物の臓器である。
【００２０】
本明細書で用いられる、「ヘモグロビン」の語は、哺乳動物からのヘモグロビン（好ましくは、ウシ、ヒツジ、又はヒトのヘモグロビン、より好ましくはヒトヘモグロビン）、合成ヘモグロビン、組換えの手段によって得られたヘモグロビン、ヘモグロビンを天然に生成するか又はヘモグロビンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成するように操作された細胞系から得られたヘモグロビン、突然変異体の形態で得られたヘモグロビン、及び化学的に修飾された形態のヘモグロビンを意味する。本発明のヘモグロビンは、それだけには限定されないが、ヘモグロビンＡ、（α２β２）、ヘモグロビンＡ２、（α２δ２）、及び胎児性ヘモグロビン（α２γ２）、並びにこれらの混合物を含めたヘモグロビン種を含む。
【００２１】
本明細書で用いられる「重合したヘモグロビン」の句は、それが生理学的に適格な酸素運搬体として働くことができるように重合しているヘモグロビンを意味し、ヘモグロビンの分子又は４量体のサブユニット間の分子架橋の配置により、天然又は４量体のヘモグロビンに関して、得られた重合した分子のサイズ及び重量の増大がもたらされる。例えば、重合したヘモグロビンは、例えばヒトの肺において、ヘモグロビンの酸素化の部位で優勢な酸素分圧で酸素を吸収することができ、結合した酸素を同じ生物体の組織に生命維持的な量で放出することができる。重合したヘモグロビンは、例えば、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第５９９８３６１号で論じられているように、グルタルアルデヒド又はラフィノースとの処置によって得ることができる。重合したヘモグロビンは、例えば、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第６４９８１４１号にも記載されている。
【００２２】
ヒト血液由来の重合したヘモグロビンは、米国特許第６４９８１４１号に記載されているように、ピリドキシル化されていてもよく、又はされていなくてもよい。ピリドキシル化は、重合したヘモグロビンのｐ５０を望ましい範囲まで変調するのに用いることができる。したがって、例えば、ヒト血液由来のヘモグロビン、及び重合したヘモグロビンを含む溶液のｐ５０を用いることが、正常なヒト血液の範囲内であるのに望ましい場合は、米国特許第６４９８１４１号に記載されているように、ヘモグロビンがピリドキシル化されていることが好ましい。
【００２３】
ある実施形態では、重合したヘモグロビンはＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐであってよく、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐはヒト血液由来の重合したヘモグロビンの一例である。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐは、本質的にテトラマーフリーであり、実質的にストロマフリーである、重合した、ピリドキシル化されたヒト血液由来のヘモグロビンである。ある実施形態では、本明細書に開示する溶液は、ヒト血液由来の重合したヘモグロビン、及び以下の少なくとも１つ：バッファー、細胞培養液、又は酵素（例えばプロテアーゼ）を含む。本明細書に開示する溶液は、ヒト血液由来の重合したヘモグロビンの他に、これらの１つ、２つ、又は３つを含んでいてよい。本発明の溶液は、ヘモグロビンの保存剤として働くための、アスコルビン酸などの還元剤も含むことができる。さらに、溶液は酸素化されていてもよく、又はされていなくてもよい。
【００２４】
本明細書で用いられる「バッファー」は、特に、溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）に関して、溶液における特定の化学種の添加又は枯渇に対して、化学種の濃度における変化を最小にするように働く、溶液などの系を意味する。バッファーの例は、当業者にはよく知られている。
【００２５】
本明細書で用いられる「細胞培養液」の語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞の培養、維持、増殖、及び／又は成長に適する培地を意味する。本発明の溶液で用いることができる細胞培養液の例は、参照として組み入れられる、米国特許第６６７０１８０号及び第６７３０３１５号に開示されている。当業者であれば、本発明の溶液で有用な細胞培養液のタイプは、それに対して溶液を用いるべきである細胞、組織、及び  又は臓器のタイプに基づいて選択することができることを認めるであろう。例えば、本明細書で記載するように、細胞が膵島である場合、細胞培養液はＲＰＭＩであってよい。イーグルの最小培地、ダルベッコ改変イーグル培地、及び当業者には知られている他のものを含む、代替の細胞培養液は市販されており（例えば、ＧＩＢＣＯ、Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州、及びＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州から）、本明細書に記載する本発明の成分の範囲内にある。
【００２６】
本明細書で用いられる「プロテアーゼ」（又は「タンパク質分解性酵素」）は、タンパク質におけるペプチド結合の分解を触媒する酵素を意味する。コラゲナーゼが、プロテアーゼの一例である。プロテアーゼの他の例は当業者にはよく知られており、それだけには限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、フューリン、ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、並びにこれらの混合物、例えば、パンクレアチン、及びリベラーゼ（ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｉｔｉｃｕｍ）からのコラゲナーゼイソ型Ｉ及びＩＩ、及びバチルス  サーモプロテオリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からのサーモリシンの、精製した酵素のブレンド）を含む。
【００２７】
本明細書で用いられる「酵素的に生成された」は、本発明にしたがって重合したヘモグロビンと組み合わせて供給される酵素、特に、細胞外マトリックスタンパク質の消化に有用なタンパク質分解性の酵素、及びｉｎ  ｖｉｖｏで組織又は臓器の統一性を維持するのに関与する他のタンパク質の作用を意味する。
【００２８】
本明細書に開示する懸濁液は、哺乳動物、好ましくはヒト、血液、及び（ｂ１）哺乳動物の造血細胞、又は（ｂ２）哺乳動物の膵臓組織、若しくは哺乳動物の膵島のいずれかに由来する重合したヘモグロビンを含む。懸濁液は、細胞培養液、及び／又は酵素（プロテアーゼなど）をさらに含んでいてよい。さらに、懸濁液は、酸素化されていてもよく、又はされていなくてもよい。「造血細胞」は、哺乳動物の血液内に見られる細胞を意味し、白血球（例えば、単球及びリンパ球）、血小板、及び赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））を含む。
【００２９】
ある実施形態では、本発明の溶液及び／又は懸濁液を、様々な条件下で、細胞、組織、及び／又は臓器の生存能を維持するための様々な方法で用いることができる。例えば、これらを、膵島などの哺乳動物の細胞を単離する方法で用いることができる。さらに、これらを、哺乳動物の組織を保存する方法、哺乳動物の細胞の単離後のその細胞回復を助ける方法、細胞培養条件に細胞を維持する方法、及び細胞を増殖させる方法で用いることができる。さらに、これらを、本発明の溶液及び／又は懸濁液と膵島を接触させることを含む、糖尿病を有する哺乳動物を治療する方法で用いることができる。例えば、膵島を、本発明の溶液を用いてドナー患者から単離し、レシピエント患者中に移植することができる。別の一例では、本発明の溶液を、身体における（屍体などにおける）、及び身体外の（例えば、輸送中若しくは移植手術中）、細胞、組織、及び／又は臓器の生存能を維持するのに用いることができる。さらに、本発明の溶液を用いて、臓器を回収する前に本発明の溶液で臓器を潅流することにより、臓器移植の成功率を向上させることができる。
【００３０】
重合したヘモグロビンを含む好ましい溶液は、水性であり、重合したヘモグロビン約５〜１５ｇ／ｄＬ、より好ましくは重合したヘモグロビン約８〜１２ｇ／ｄＬ、最も好ましくは重合したヘモグロビン約９〜１１ｇ／ｄＬを含むように配合されている。特に好ましい溶液は、重合したヘモグロビン約１０ｇ／ｄＬを含んでいる。
【００３１】
重合したヘモグロビンを含む好ましい溶液は、ｐＨ約７〜８、より好ましくは約７．５〜７．９、最も好ましくは約７．３〜７．６を有するように配合されている。
【００３２】
重合したヘモグロビン及び細胞培養液を含む好ましい溶液は、上記の量のヘモグロビン、及び約０．５Ｘから２Ｘまでの細胞培養液（この場合、１Ｘの培地は１Ｘ  ＲＰＭＩに等しい濃度である）を含む。より好ましい重合したヘモグロビン／細胞培養液の溶液は、約１Ｘの細胞培養液を含む。
【００３３】
重合したヘモグロビン、及び酵素、好ましくはプロテアーゼ、例えば、コラゲナーゼ又はリベラーゼの溶液は、上記の量のヘモグロビン、及び酵素約０．１〜１０ｍｇ／ｍＬを含むように配合される。好ましい溶液は、酵素約０．５〜５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは酵素約０．７５〜１．２５ｍｇ／ｍＬを含むように配合される。特に好ましい溶液は、酵素約１ｍｇ／ｍＬを含む。
【００３４】
重合したヘモグロビン、細胞培養液、及び酵素の溶液は、上記に記載したこれらの成分の量を含み、上記に記載したｐＨ範囲内であるように配合される。
【００３５】
本発明の溶液及び懸濁液を調製するためのプロセスも、本明細書に開示する。一般に、溶液及び懸濁液は、これらの成分を混合することにより調製することができる。溶液及び懸濁液の酸素化は、例えば、十分な時間、溶液及び懸濁液を通して１００％Ｏ２ガスを通気することによって、又はその他の方法で溶液及び懸濁液をＯ２ガスと接触させることによって実現することができる。
【００３６】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態、及びその様々な使用を説明するものである。これらは説明の目的だけのために述べるものであり、本発明を限定するものと理解してはならない。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
重合したヘモグロビン溶液の調製
ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンの添加、又は非添加の、コラゲナーゼを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養液を、以下のように調製した。ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養液と配合した１０ｇ／ｄＬ  Ｐｏｌｙ  ＳＦＨ−Ｐを含む溶液（「ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液」）は、膵島単離用に、Ｎｏｒｈｆｉｅｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｅｖａｎｓｔｏｎ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によって調製された。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液を、米国特許第６４９８１４１号の実施例１に記載されている手順を改変することによって調製した。より詳しくは、米国特許第６４９８１４１号の実施例１を、最初からＴａｎｋ８におけるステップまでたどった。Ｔａｎｋ９で開始し、手順は以下の通りであった。ヒト血液由来の重合したヘモグロビン（ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ）を、約７ｇ／ｄＬに濃縮し、溶液のｐＨを０．１Ｍ  ＨＣｌで７．３０と７．６０の間に調節した。この溶液を１２ｇ／ｄＬ  ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐに濃縮した。２．５ｇ／Ｌアスコルビン酸及び注射用水（「ＷＦＩ」）を含む十分量の１０Ｘ  ＲＰＭＩ溶液を加えて、１０ｇ／ｄＬ  ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ、１Ｘ  ＲＰＭＩ、及び０．２５ｇ／Ｌアスコルビン酸を含む最終のＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液を生成した。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液のｐＨは、７．３０と７．６０の間であると確認された。次いで、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液を滅菌ろ過し、２５０ｍＬを５００ｍＬバッグに無菌的に移した。バッグは半分だけ満たして、使用時における溶液の酸素化（バッグ内で）を単純化させた。充填したバッグを、２〜８℃で貯蔵した。
【００３８】
アスコルビン酸２．５ｇ／Ｌを含む１０Ｘ  ＲＰＭＩ溶液を、以下の通りに調製した。Ｃｅｌｌｇｒｏ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ヴァージニア州）から得た、ＮａＨＣＯ３を含まないＲＰＭＩ  １６４０粉末、フェノールレッド、及びＬ−グルタミンを注射用水に加えて、１Ｘ  ＲＰＭＩ  １６４０の１０倍濃縮の濃度を得た（下記を参照されたい）。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）から得た７．５％ＮａＨＣＯ３を加えて２６７ｍＬ／Ｌの濃度を得た。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから凍結溶液として受領した２００ｍＭ  Ｌ−グルタミンを解凍し、１０２．５ｍＬ／Ｌの濃度となるように加えた。さらに、アスコルビン酸を、最終濃度２．５ｇ／Ｌとなるように加えた。
【００３９】
（実施例２）
２Ａ．
酸素化及び３７℃で保持中の、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンのメトヘモグロビンへの変換及び酸素化の比率を決定するために実験を行った。コントロールとして、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンのサンプル１００ｍＬを、圧縮空気（２１％Ｏ２）又は圧縮酸素（９９．４％Ｏ２）を利用して８５％以上のオキシヘモグロビン（Ｏ２Ｈｂ）に酸素化した。パーセント酸素飽和度は、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＩＬ−４８２又はＩＬ−６８２によって使用されるものなどのコオキシメトリー（ｃｏｏｘｉｍｅｔｒｙ）によって測定することができる。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンサンプルを、次いで、３７℃に加熱し、この温度で２０分以上保持する。２０分の保持時間の後、サンプルを、コオキシメトリーを利用して試験して、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）変換の量を決定する。
コオキシメトリーの結果：
【表１】
2009524436.tif 000003
【表２】
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【００４０】
ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビン１００ｍＬを８５％以上のＯ２Ｈｂに酸素化するのに（約２１％Ｏ２を含む圧縮空気を用いて）約４５分を要した。或いは、圧縮酸素（９９．４％Ｏ２）を用いて、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ  １００ｍＬを、約１５分で８５％以上のＯ２Ｈｂに酸素化することもできた。上記に示した結果は、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンを酸素化するプロセスは、ヘモグロビンのＭｅｔＨｂ型への大幅な変換をもたらさなかったことを確証した。しかし、酸素化に用いた方法は、一旦ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンを３７℃に加熱して形成すると、ＭｅｔＨｂのパーセントに影響を及ぼした。圧縮空気を用いる第１の方法は、圧縮酸素を用いるのに比べて（ＭｅｔＨｂ９．３％）、より高いＭｅｔＨｂへの変換（ＭｅｔＨｂ１７．６％）をもたらした。形成したＭｅｔＨｂの量は、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンを酸素化するのにかかった時間の量、若しくは３７℃に維持した時間、又は両方に正比例した。少量の酸素化したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンがＭｅｔＨｂ型に変換したにも関わらず、島細胞に酸素を運搬することができるＨｂはかなりの量（７９．７％）残存していた。
【００４１】
２Ｂ．
コラゲナーゼ若しくはリベラーゼがＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンを妨害するのか、又は生成物の劣化を引き起こすのかを決定するためにも、実験を行った。
【００４２】
これらの実験では、基準サンプルとして最初のサンプルを採取し、コオキシメトリー及びＨＰＬＣ（サイズ排除）によって分析した。４〜８℃の、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンのサンプル１００ｍＬを、Ｏ２Ｈｂ８５．０％以上に酸素化した。次いでコオキシメトリーのサンプルを、酸素化の間、約１５分間隔で採取して、経時的な酸素化の度合いを決定した。オキシヘモグロビンレベルが一旦、Ｏ２Ｈｂ８５．０％以上であったら、コオキシメトリー及びＨＰＬＣのサンプルを分析して、生成物及びＭｅｔＨｂレベルに対する影響を決定した。一旦、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンが酸素化されたら、試験すべき酵素の１つ（コラゲナーゼ又はリベラーゼ）を４〜８℃のＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビン（１ｍｇ／１ｍＬ）に加え、この温度で１０分間保持した。４〜８℃で１０分後、コオキシメトリー及びＨＰＬＣのサンプルを、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンの変性、及びメトヘモグロビンの変換に対して評価した。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビン／酵素の溶液を３７〜３９°に加熱し、この温度を約２０分間維持した。次いで、コオキシメトリー及びＨＰＬＣのサンプルを、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンの変性、及びメトヘモグロビンの変換に対して試験した。ＨＰＬＣ分析を用いて、各ポリマー種を代表するピークの面積の積分における経時の違いに対して分析することによって、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合体の変性を決定した。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【００４３】
各ピークに対する積分面積がこのように一定であったことから、コラゲナーゼ及びリベラーゼは、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンを妨害せず、又はＨＰＬＣ分析によって評価されたように生成物の変性を引き起こさないことが実証された。
【００４４】
２Ｃ．
膵島細胞の収集で用いるための、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンを補ったＲＰＭＩの適合性を評価するために、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンに対するＲＰＭＩの効果を確立するための実験をさらに行った。
【００４５】
ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンのＲＰＭＩ  １６４０との実験的試験用に、４〜８℃のＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンのサンプル１００ｍＬを、８５．０％以上のＯ２Ｈｂに酸素化した。コオキシメトリーのサンプルを、酸素化の度合いに関して評価した。一旦、オキシヘモグロビンレベルが８５．０％以上になったら、重量モル浸透圧濃度のサンプルをコントロールとして評価した。次いで、４〜８℃で、ＲＰＭＩ  １６４０を、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビン（１ｇ／１００ｍＬ）に加え、完全に混合して均一にした後、混合液の重量モル浸透圧濃度を決定した。
【００４６】
これらの手順により高浸透圧性の溶液が得られたので、ＲＰＭＩ（１０．１０ｇ／１．０Ｌ）のバッファー溶液を配合した。バッファー溶液を用いて、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビン２００ｍＬの４体積洗浄（ダイアフィルトレーション）を行った。ダイアフィルトレーション完了時に、サンプルのコオキシメトリー及び重量モル浸透圧濃度を試験した。
【表９】
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【表１０】
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【００４７】
ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンにＲＰＭＩを添加することで、６００ｍｍｏｌ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度がもたらされた。この様式でＲＰＭＩ培地とともに用いたＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビンは、島細胞に負の影響を及ぼす可能性のある高浸透圧性の溶液をもたらした。したがって、この溶液は島細胞の回収には不適切である。しかし、アスコルビン酸を含むバッファー溶液中にＲＰＭＩを配合し、ダイアフィルトレーションに用いた場合、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ重合したヘモグロビン＋ＲＰＭＩの得られた溶液の重量モル浸透圧濃度は２６８ｍｍｏｌ／ｋｇであった。溶液の重量モル浸透圧濃度をわずかに調節すれば、この混合液は、島細胞の回収で用いるのに許容できる。
【００４８】
（実施例３）
島の単離
コラゲナーゼを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養液を用いて、実施例１に記載した通りに調製したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐを添加し、又は添加せずに、実験動物（ラット）から膵島を単離した。動物に関わる動物手順は全て、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈとＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ＣｈｉｃａｇｏのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＣＣ）のガイドラインにしたがって行った。体重１７５〜２００ｇの間のオスＬｅｗｉｓラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）を、島用の膵臓ドナーとして用いた。動物を、気化器及びマスク（Ｖｉｋｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｍｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州）を用いて、イソフルラン吸入によって麻酔した。実験グループは２群：ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｇ群（コラゲナーゼを含むＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液、ｎ＝ラット４０匹）、及びコントロール群（コラゲナーゼを含むＲＰＭＩ  １６４０培地、ｎ＝ラット４０匹）であった。
【００４９】
ラットの島の単離を、以前にＬａｃｙ＆Ｋｏｓｔａｎｏｖｓｋｙ（１９６７年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１６巻、３５〜３９頁）に記載され、Ａｖｉｌａら（２００３年、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１２巻、８７７〜８８１頁）に記載されている温虚血モデルを用いて改変された、従来の技術にしたがって行った。簡潔に述べると、動物を麻酔した後、開腹切開術を行い、その後、胸腔中に切り込みを入れ、大量出血により安楽死させるために心臓を切断した。腹腔を閉じ、ガーゼで覆いをし、３０分放置した後、膵臓を潅流した。
【００５０】
ＸＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液（処置）又はＲＰＭＩ  １６４０培地（コントロール）のいずれかで再構成して最終濃度１ｍｇ／ｍＬとし、処置及びコントロールの両方を、１５分間、１００％Ｏ２で溶液を通気することによって酸素化した。重合したヘモグロビンの安定性に対するコラゲナーゼの効果を、ＨＰＬＣ分析によって決定した。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液を、４℃及び３７℃で、酸素化の前及び後に、異なる条件下で、コラゲナーゼとともに又はそれなしでインキュベートした。ＨＰＬＣ分析では、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐのいかなる変性も明らかにならなかった。さらに、様々な酸素化時間の後、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及び一酸化炭素ヘモグロビン（ＣＯＨｂ）の形成を分析した。著しいＭｅｔＨｂ又はＣＯＨｂの形成は見られなかった。
【００５１】
酸素化した酵素溶液を、胆管経由で、及び膵臓を膨張するための主な膵管中に注射した。次いで、膵臓を切開し、各々の膵臓を、それぞれ潅流溶液７．５ｍＬを有する５０ｍＬのコニカルチューブに配置した。この後、１８分間、３７℃の水浴でインキュベートした（消化段階）。このステップの後、各々の膵臓をチューブにおいて穏やかに撹拌し、冷ＲＰＭＩ  １６４０培地で洗浄し、５００ｍＬビーカー中に移した。フィコールの非連続的な密度勾配（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ヴァージニア州）によって、島を外分泌組織から精製した。この手順では、島／外分泌組織の混合物をフィコールの密度勾配にアプライし、次いで、１５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、勾配の島細胞の部分を、フィコール勾配の中間層から目視検査によって同定し、手選した。次いで、単離した島を洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含みグルタミンを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地で２４時間、３７℃で培養した。
【００５２】
Ｏ２張力及びｐＨを、血液ガス分析器（ＡＢＬ／７００  Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）を用いて、消化の前及び後に膵臓潅流培地において測定した（ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ及びコントロール）。Ｏ２張力は、消化段階の前は、潅流溶液（膨張した膵臓を含む）において、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの方がコントロールに比べて高かった（表ＩＩＩ）。さらに、ＰｏｌｙＳＦＨ−ＰのｐＨは、生理学的範囲内の値を維持したが、コントロール群では、ｐＨは消化段階の間に著しく降下した（表ＩＩＩ）。処置及びコントロールの溶液の緩衝能は同様であると決定されており、これらの結果は緩衝能における違いの結果ではない（データは示さず）。
【表１１】
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【００５３】
表ＩＩＩでは、消化前及び後の、酸素飽和度測定値（Ｏ２及びｐＨ）を、潅流培地（ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液（「ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ」）及びＲＰＭＩ  １６４０培地（「コントロール」））に対して示してある。値は、平均値±ＳＥＭ、１グループあたりｎ＝ラット１２匹。＊ｐ＝０．０１；＊＊ｐ＝０．００９；†ｐ＝０．００６；††ｐ＝０．００１；＊＊＊ｐ＝０．００９。
【００５４】
（実施例４）
島の収量、生存能、及び機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
実施例３に記載するような、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐを含む、又は含まないコラゲナーゼＩＸ／ＲＰＭＩ  １６４０溶液を用いた島の単離の結果を、収量、生存能、及び島細胞の機能に対して分析した。島の収量を決定するために、それぞれの代表するサンプルからのジチゾン染色した島を、実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ、ＩＬ）下で計数した。島の生存能を、トリパンブルー色素（Ｓｉｇｍａ）で染色することによって評価した。表面の２５％を超えて染色された島を、死滅とみなした。生存対死滅の島を、それぞれのサンプルで評価し、１サンプルあたり最小５０個の島を計数した。
【００５５】
細胞の死滅を、以下の通りにさらに特徴付けた。アポトーシス細胞死のレベルを、生存細胞フルオレセイン活性カスパーゼ−３染色キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）を用いて測定した。これらのアッセイでは、１群あたり１２００個の島のアリコートを計数し、培地（１０％ＦＢＳ及び１０％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補ったＲＰＭＩ  １６４０）３００μＬ入りエッペンドルフチューブ４本に分割した。カスパーゼ−３用蛍光色素（ＦＩＴＣ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ；チューブ１本あたり１μＬ）を各群のチューブ２本中に加え、他の２本のチューブはコントロールとして非処置のままにしておいた。チューブを、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、１１００ｒｐｍで１分間遠心することにより懸濁液からペレット化し、上清を除去した。次いで、ペレット化した細胞を、製造元の指示にしたがってキットにおける洗浄バッファーを用いて再懸濁し、遠心及び再懸濁によってこのバッファーで２回洗浄した。次いで、細胞を、洗浄バッファー１００μＬに再懸濁し、各チューブの内容物を、黒色マイクロタイタープレートの個々のウェル中に移した。蛍光プレートリーダー（ＧＥＮｉｏｓ、Ｔｅｃａｎ  ＵＳ  Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ、ノースカロライナ州）で、励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３５ｎｍを用いて、蛍光強度を測定した。
【００５６】
様々な量（５、８、及び１２ｍＭ）のグルコースでインキュベートすることによって、島細胞の機能をアッセイした。グルコースで刺激する間の細胞内２価カルシウムイオン濃度を、２波長励起蛍光顕微鏡で標準の広視野の蛍光画像を用いて、単離した島における機能評価のために測定した。これらのアッセイでは、３７℃で２５分間、５μＭ  Ｆｕｒａ−２／ＡＭを含む、２ｍＭグルコース（ＫＲＢ２）を補ったＫｒｅｂｓ溶液で島をインキュベートすることによって、島にカルシウム特異的な色素（Ｆｕｒａ−２／ＡＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）をロードした。ロード後、島を、倒立落射蛍光顕微鏡（ＴＥ−２０００Ｕ、Ｎｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．）上に搭載した温度制御した潅流チャンバー（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｐａｏｌａ、カンザス州）中に配置し、３７℃で、５％ＣＯ２を通気したＫＲＢ２バッファー（ｐＨ７．４）を絶えず流す（速度２．５ｍＬ／分）ことによって潅流した。様々なグルコース濃度（５、８、及び１４ｍＭ）を含むＫｒｅｂｓバッファーを島に投与し、各々１５分間、得られた蛍光を追跡し、その間ＫＲＢ２ですすいだ。各サンプルに対して、１０ｘ〜２０ｘの対物レンズで、複数の島を画像化した。Ｆｕｒａ−２の２波長の励起を、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍ（励起波長）に設定し、蛍光を５１０ｎｍ（発光波長）で検出した。蛍光を、Ｍｅｔａｆｌｕｏｒ／Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像化獲得物及び分析ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ペンシルベニア州）を用いて分析し、高速度、高分解能電荷結合素子（Ｒｏｐｅｒ  Ｃａｓｃａｄｅ  ＣＣＤ、Ｔｕｃｓｏｎ、アリゾナ州）を用いて画像を収集した。Ｃａ２＋レベルの推定を、ｉｎ  ｖｉｖｏのキャリブレーション方法を用いて達成した。両群間の細胞内Ｃａ２＋のパーセント変化を、各群に対して、グルコース刺激後の最大の増加から基底の（２ｍＭグルコース）Ｃａ２＋レベルを差し引くことによって計算した。
【００５７】
Ｋ＋−ＡＴＰチャネルの阻害物質であるトルブタミドの存在下、これらの島細胞において細胞内カルシウムイオン濃度も評価した。これらの実験では、２ｍＭグルコースを含むＫｒｅｂｓの潅流培地に最終濃度１００μＭでトルブタミドを潅流培地に加え、基底（２ｍＭグルコース）を上回るグルコース刺激の非存在下で島細胞を潅流するのに用いた。これらの測定は、以上に記載したように、島上で行った。
【００５８】
島細胞の機能も、グルコース誘発性のインスリン分泌に対して評価した。静的なグルコースのインキュベーションを用いて、実施例１に記載したように、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下又は非存在下で単離した島間で、グルコース誘発性のインスリン分泌を比較した（刺激指数、ＳＩ）。本明細書で用いられるＳＩは、刺激されたインスリン分泌対基底のインスリン分泌の比によって定義した。簡潔に述べると、各実験に対して、同様のサイズ（約１００μｍ）の、手で採取した島５個の群を、１２ウェルプレートの５個の異なるウェルに配置し（反復５回）、次いで、３０分間、低グルコース濃度（最終グルコース濃度１．６ｍＭ）のＫｒｅｂｓバッファー１ｍＬでプレインキュベートし、その後、上清を回収し、廃棄した。次いで、島を、１時間、３７℃及び５％ＣＯ２で、低グルコースのＫｒｅｂｓ（最終グルコース濃度１．６ｍＭ）でインキュベートし、顕微鏡下で、ウェルからいかなる島も除去しないように注意しながら上清を回収した。Ｋｒｅｂｓ−高グルコース溶液（最終グルコース濃度１６．７ｍＭ）を加え、９０分間、これらの条件下で島をインキュベートして同じステップを繰り返した。上清を回収し、ラットインスリンに免疫学的に特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンから入手）を用いた後の測定用に、−２０℃で凍結した。全サンプルを２回測定した。
【００５９】
Ｏ２の存在下で単離することにより、特にミトコンドリア膜及び細胞膜で、活性酸素種（ＲＯＳ）が島細胞の機能的統合性を損なうポテンシャルが作り出されたが、このポテンシャルは、とりわけＲＯＳ−過酸化によってかく乱され得た。実施例１で開示したようにＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下又は非存在下で単離された島細胞の機能的統合性を、ミトコンドリア膜の統合性を分析することによりさらに評価した。これらのアッセイでは、負に荷電したミトコンドリア膜中に選択的に統合し、ミトコンドリア膜電位のプローブとして用いることができる疎水性の陽イオンである蛍光色素ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）を用いて、ミトコンドリア膜のポテンシャルを評価した。Ｒｈ１２３を予めロードした細胞では膜電位は上昇し（過分極）、これは、機能している島細胞においてグルコース刺激後に生じ、より多くのＲｈ１２３のミトコンドリア膜における濃縮を引き起こし、色素分子の凝集及び蛍光シグナルの低減（消光）をもたらす。Ｒｈ１２３は、以前に記載されている通りに用いた（Ｚｈｏｕら、２０００年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、２７８巻、Ｅ３４０〜Ｅ３５１頁）。簡潔に述べると、島を、３７℃で２０分間、２ｍＭグルコースを含み、１０μｇ／ｍＬ  Ｒｈ１２３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）を補ったＫｒｅｂｓ溶液でインキュベートし、次いで、倒立落射蛍光顕微鏡（ＴＥ−２０００Ｕ、Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｃ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ニューヨーク州）上に搭載した温度制御した潅流チャンバー（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）中に配置した。島を、３７℃で、５％ＣＯ２を通気したＫｒｅｂｓバッファー（ｐＨ７．４）を絶えず流して（速度２．５ｍｌ／分）潅流した。次いで、島を１４ｍＭグルコースで刺激し、蛍光における変化を、グルコース刺激１５分後に測定した。Ｒｈ１２３の蛍光を、励起波長として５４０及び発光波長として５９０を用いて決定し、電荷結合素子カメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｃａｓｃａｄｅ  ＣＣＤ）で画像を収集した。グルコース刺激前の５分間の間に記録した平均蛍光強度に対して、データを標準化した。両方の島単離群（すなわち、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下又は非存在下で単離したもの）間の蛍光強度におけるパーセント変化を、各群に対して、１４ｍＭグルコース刺激後の蛍光強度から基底の蛍光強度を差し引いた最大の低下として計算した。
【００６０】
さらに、Ｒｈ１２３を用いて、ミトコンドリアの形態における変化に対して、島細胞をアッセイした。これらのアッセイでは、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ及びコントロール群からの島を、１５分間、２．５μＭ  Ｒｈ１２３を含むＫｒｅｂｓバッファーでインキュベートし、６０Ｘ水浸対物レンズを装着したＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を用いて可視化した。励起及びＲｈ１２３発光に用いたアルゴン−クリプトンレーザーからの４８８ｎｍのラインを、ＬＰ５０５フィルタを通して検出した。蛍光の強度及び分布を用いて、これら島細胞におけるミトコンドリアの統一性を形態学的に特徴付けた。
【００６１】
ＲＯＳが引き起こす損傷の別のアッセイは、グルタチオン（ＧＳＨ）レベルの低減をアッセイすることによる酸化ストレスの評価であった。これらのアッセイは、モノクロロビマン（ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉｍａｎｅ）（ｍｃｂｍ）法を用いて、単離１２時間後の島細胞に対して行った（Ａｖｉｌａら、２００３年、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１２巻、８７７〜８８１頁）。簡潔に述べると、５００個の島を、１２ウェルプレートの１ウェルにおいて、１０μＬ  ｍｃｂｍ（最終濃度５０ｍＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含むＣＭＲＬ培養液５ｍＬで、３７℃で３０分間培養した。島を回収し、ｐＨ７．５のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  ＴＲＩＳバッファー５００μＬに再懸濁し、次いで超音波処理した。超音波処理した島細胞混合液を遠心して、上清の残骸を除去し、残骸を除去した上清からの蛍光を、蛍光プレートリーダー（ＧＥＮｉｏｓ  Ｔｅｃａｎ  ＵＳ  Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ、ノースカロライナ州）を用いて励起波長３８０ｎｍ及び発光波長４７０ｎｍで検出した。
【００６２】
ＲＯＳによる脂質過酸化からの細胞膜の損傷を、酸化損傷のマーカーとして用いた。実施例１に記載したようにＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下又は非存在下で単離した島における脂質過酸化の度合いを、脂質過酸化の生成物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を検出することによって決定した。ＭＤＡレベルを、Ｙａｇｉ（１９９８年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１０８巻、１０１〜１０６頁）の方法にしたがって、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）を用いて評価した。簡潔に述べると、０．１Ｍ  ＨＣｌ、０．６７％ＴＢＡ、１０％リンタングステン酸、及び７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（全てＳｉｇｍａより入手）を含む反応混合液を調製した。島５００個を、７００μＬＰＢＳで超音波処理して細胞可溶化物にした。１５０００ｒｐｍで遠心分離して可溶化物から残骸を除去した後、上清５００μＬを抽出し、反応混合液８７５μＬと混合し、次いで９５〜９８℃で１時間煮沸した。このプロセスの後、ＭＤＡを抽出し、他の化合物の妨害を避けるために、サンプルを冷却し、ｎ−ブタノール７５０μＬと混合した。短時間遠心した後、この上清１００μＬを抽出し、蛍光を９６ウェルプレート上フルオロメーター（ＧＥＮｉｏｓ、Ｔｅｃａｎ  ＵＳ  Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ、ノースカロライナ州）で、励起波長５３０／２５、及び発光波長５７５／１５で、２回評価した。サンプルを、様々な濃度（２、４、及び８ｍＭ）で調製したＭＤＡスタンダード（Ｓｉｇｍａより入手）と比較してアッセイした。
【００６３】
これらの実験の結果を、図１〜９に示す。図１は、島の収量に対するＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐを用いたラット膵臓の潅流の結果を示し、これはコントロール群と比べた場合に単離後の島の収量に有意な影響がなかった（それぞれ、２０７±３３対１７２±３２島／ラット、ｐ＝０．４６）。
【００６４】
一方、島の生存能に対する結果は、驚くべきことに、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐを含まないコントロールのコラゲナーゼ／ＲＰＭＩ  １６４０培地に比べて、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下で調製した島において生存能が有意に増大したことを示していた（図１）。
【００６５】
細胞の生存能がアポトーシスによって損なわれる度合いを評価するためのカスパーゼ３の実験では、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐで潅流した膵臓から単離した島は、より低いカスパーゼ３活性によって検出されたように、コントロールに比べてより少ないアポトーシス細胞を示していた（図２）。
【００６６】
ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下における島の単離の島細胞機能に及ぼす影響を評価することを目指した実験に目を向けると、様々な濃度のグルコースで刺激した後で島における細胞内Ｃａ２＋レベルが増大することによって、グルコースに対する島の反応性の改善が示された（図３Ａ）。試験したグルコースの３濃度全て（５、８、及び１４ｍＭ）において、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置した島は、コントロールよりも用量反応の様式において有意に高い細胞内Ｃａ２＋値を示した（図３Ｂ）。さらに、トルブタミド（ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネルの阻害薬）の添加によって、これらのチャネルにおけるミトコンドリアのＡＴＰ調節が回避された場合、両群間で細胞内Ｃａ２＋レベルにおける有意な相違は存在しなかったことが示された（図４Ａ及びＢ）。
【００６７】
最後に、グルコース刺激に反応したインスリンの分泌は、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下でラット膵臓から単離した島細胞でコントロール群に比べて有意に増大した（図５）。
【００６８】
島の単離の間にＲＯＳが存在したか否か、また、これらの種がどの程度島細胞に酸化損傷を引き起こしたかを評価するための実験の結果を、図６及び７に示す。ミトコンドリア膜電位の測定により、コントロール群におけるものよりもＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐによる島の機能的統合性が優れていることが示された（図６Ａ及び６Ｂ）。それは、グルコース刺激（１４ｍＭ）に対する反応の結果、ダメージを受けなかった電気化学ポテンシャルを表す、Ｒｈ１２３蛍光における変化（低下）のパーセント値の増大によって示される。さらに、コントロール群からの島におけるミトコンドリアは、腫大し、断片化したように見えるように形態学的評価され、核周囲のＲｈ１２３での染色の低減を示し、染色の連続性が失われていた。これとは対照的に、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置は、島細胞のミトコンドリアの形態の改善を示し、腫大及び断片化は低減し、核周囲の染色は増大した（図７）。これらの結果は、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下の島の単離と一致しており、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの非存在下で単離したコントロール群ではＲＯＳが産生する酸化損傷が少ないことを示している。
【００６９】
ＰｏｌｙＳＦＨ−ＰによるＯ２の送達が酸化ストレス又は損傷を増大したのか否かを、実施例１で開示したように単離した島細胞におけるＧＳＨ及びＭＤＡレベルをアッセイすることによって確認した。酸素化したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐは、グルタチオンレベルを低減しなかった（ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐに対して７．１±２．９ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質、及びコントロールに対して６．８±２．４；ｐ＝０．９３）。同様に、ＭＤＡレベルによって測定した脂質の過酸化は、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ及びコントロール群の間で有意差がなく（それぞれ、１．８±０．９ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質対６．２±２．４；ｐ＝０．１９）、より高レベルのＯ２が存在しても酸化ストレスの増大がなかったことが指摘された。
【００７０】
前述の観察より、驚くべきことに、虚血の膵臓をＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐで管内潅流することにより、ミトコンドリアの統一性の維持に関連する島の生存能及び機能は改善し、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下で膵島を単離しても単離した島における酸化ストレスの増大をもたらさなかったことが指摘された。
【００７１】
これらの結果は、膵島の単離においてＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐを用いる重要な利点を説明している。これらの結果は、虚血条件下でアポトーシス細胞死の主な原因となるミトコンドリアは、酸素化したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下で機能及び統一性の改善を維持することを実証した。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置した島に対するＯ２の利用能がより高いことは、コントロールに比べて潅流培地におけるＯ２張力が高いことによって示された。Ｏ２基質がミトコンドリアで利用可能であることが、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ群からの島に観察される生存能の改善の一因である可能性がある。島は、島の単離及び移植手順の間、著しい酸化ストレスに曝される。驚くべきことに、酸素化されたＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの形態で提供されるＯ２の増大は、ミトコンドリアの分析によって評価されるように、上記に示すような構造上及び機能上両方で、ＲＯＳの著しい生成をもたらさなかった。実際、上記に示した結果は、ミトコンドリアの機能及び統一性は酸素化したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置によって改善され、グルコースが刺激するインスリンの分泌の改善及び細胞死の低減の両方をもたらしているという結果を支持するものである。
【００７２】
上記に示した結果は、酸素化したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐを使用することによってもたらされるＯ２利用能の増大によって、島がアポトーシスから保護されることを示しており、このことはコントロール群におけるものよりも低いレベルのカスパーゼ３が測定されたことによって示された。この結果は、主に、ミトコンドリアのメディエータをサイトゾル中に放出することによって、低酸素症がアポトーシスを開始することを示す所見と一致している。ミトコンドリアの機能的統合性は、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置した島で優れており、そこではグルコース刺激反応性の膜の電気化学ポテンシャルが改善していた。機能的統合性は、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置した島においてミトコンドリアの構造が保存されることによって補完され、それはミトコンドリアの腫大の低減及びさらなる伸長によって決定された。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置した島における核周囲の局在化の改善を表す、ミトコンドリア染色の増強も観察された。
【００７３】
前述の結果は、単離した島のｉｎ  ｖｉｔｒｏの機能は、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐを虚血の膵臓に管内投与することによって改善したことも指摘している。静的なグルコースチャレンジに反応して、コントロールに比べてＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置した島で、より高い刺激指数が得られた。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置した島に対する機能の増強は、グルコースに反応したより高い細胞内Ｃａ２＋レベルによって支持されていた。これらの結果は、島のミトコンドリアが、β細胞でインスリンを分泌するのに必要であるサイトゾルのＣａ２＋を増大する能力は、酸素化したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの非存在下よりも存在下で単離した島で大きいことを実証している。この改善の特異性は、島を、Ｋ＋−ＡＴＰチャネルの阻害薬であるトルブタミドの存在下でインキュベートした実験で示された。これらの条件下では、細胞は脱分極し、カルシウムレベルは上昇し、インスリン分泌を直接促進する。トルブタミドの添加後、グルコースに対する細胞内Ｃａ２＋反応は、両群間で同様であった。これらの結果は、ＰｏｌｙＳＦＨ−ＰによってＯ２を供給したことによって、グルコースに反応してインスリンを分泌するプロセスにおいてミトコンドリアの経路が保護されたことを示唆している。
【００７４】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果は全て、酸素化したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在下で単離した膵島は、酸素化したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐなしで単離した島よりも、構造的及び機能的に優れているという結果を支持するものであった。
【００７５】
（実施例５）
島の収量、生存能、及び機能のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
島の機能を、糖尿病の胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）の腎臓被膜下の移植によって、実施例１で述べたように処置した動物を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価した。ただし、これらの動物を外来性の感染を防ぐために「バリア」室に配置した層流フード下に収容し、手術を行ったことが異なっている。
【００７６】
これらの動物に、２２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量のストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ）の、単回の腹腔内（ＩＰ）注射によって、糖尿病を誘発した。尾静脈から採取した食後血中グルコースレベルが、３回又はそれを超えて＞３００ｍｇ／ｄＬであった後に、処置動物に糖尿病を誘発したとみなしたが、これは、一般的に、注射後最大７２時間後に起こった。
【００７７】
移植のために、気化器及びマスク（Ｖｉｋｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。これらの実験では、島を単離してすぐに、培養しないで移植した。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ／ＲＰＭＩ溶液処置した膵臓（ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ）又はＲＰＭＩ  １６４０培地処置した膵臓（コントロール）からの島２５０個を、Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒら（１９９９年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、９７巻、１７３〜１８０頁）に記載してあるように各マウス中左腎臓被膜下に移植した。この手順を用いれば、２５０匹の虚血ラットの島の移植は、５０％未満のレシピエントにおいて糖尿病を逆転することが期待された。移植の成功は、２００ｍｇ／ｄＬ未満までの糖血症の低減によって定義した。正常血糖のレシピエントは、移植５〜７週間後に移植片保有腎の腎摘出術を受けた。高血糖への後戻りは、生来の膵臓の自発的な回復というより、むしろ島の移植片機能を間接的に証明するものと解釈した。
【００７８】
移植片の機能を、移植１週間後に腹腔内グルコース／アルギニン負荷試験（ＩＰＧ／ＡＴＴ）を用いて、正常血糖を達成するのに必要とされる遅滞期によっても評価した。簡潔に述べると、これらのアッセイでは、無作為に選択した正常血糖動物の代表的なサンプルを用いて、グルコース（２ｍｇ／ｋｇ体重）及びアルギニン（３ｍｇ／ｋｇ）を０．５ｃｃ腹腔内（ＩＰ）注射した（ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐにはｎ＝５、及びコントロールにはｎ＝３；コントロール群では４匹の動物のみが正常血糖を達成した）。血中グルコースレベルを、注射後、連続した時間点（０、５、１５、３０、４５、及び６０分）に尾部穿刺によって検出した。
【００７９】
これらの実験の結果を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定及びＰｅａｒｓｏｎのカイ二乗検定を用いて統計学的に評価し、ｐ値＜０．０５を統計学的に有意であるとみなした。
【００８０】
前述の実験の結果から、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ又はコントロールの島を移植した治癒マウスのパーセント値は同様であった（それぞれ、１０匹中６匹、及び９匹中４匹、ｐ＝０．４）ことが明らかになった。驚くべきことに、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐで処置した島を移植したマウスは、正常血糖を達成し、コントロール群からの島を移植したマウスよりも有意に短時間で糖尿病を逆転した（図８）。さらに、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置した島を与えたマウスは、より良好な移植片の機能を示し、ＩＰＧ／ＡＴＴの間のグルコースレベルは低かった（図９）。
【００８１】
これらの結果は、ＩＰＧ／ＡＴストレス試験に対する反応が良好だったこと、及び移植後に正常血糖に到達する遅延時間が短縮されたことによって示されるように、虚血ラットの膵臓をＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ潅流することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏの島の移植片の機能が改善したことを指摘していた。これらのｉｎ  ｖｉｖｏの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されたＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ処置した島の機能の改善を確認するものであった。
【００８２】
特にβ細胞集団に対するＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ潅流の効果を決定するために、分画のβ細胞の生存能を、Ｉｃｈｉｉら（２００５年、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、５巻、１６３５〜１６４５頁）の方法を用いて評価した。この方法は、β及び非β細胞の、細胞膜の安定性及びミトコンドリア膜の安定性を評価することを伴うものであった。これらの実験では、島を解離し、細胞を以下の色素で染色した：７−アミノアクチノマイシンＤ（７ａａｄ、細胞膜の安定性に特異的）、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ、ミトコンドリアの膜の安定性）、及びニューポートグリーン（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｇｒｅｅｎ）（ＮＧ、ＮＧの高い集団はβ細胞であり、ＮＧの低い集団は非β細胞であった）。アクターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）２ｍＬにおいて１条件あたり１０００個の島を、３７℃で７分間インキュベートし、その後穏やかにピペッティングすることによって単一の細胞の懸濁液を作製した。次いで、細胞を、ＰＢＳ溶液中、３７℃で３０分間、１ｕＭ  ニューポートグリーンＰＤＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＴＭＲＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５ｕｇ／ｍＬの７ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア、及びＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、カリフォルニア州）によるＬＳＲを用いて分析した。ＮＧに対するゲーティングを、側方散乱及びＦＬ１によって行った。
【００８３】
これらの実験の結果を、図１０に図示する。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐは、β及び非β両方の細胞の統一性を改善した。島細胞の機能上の生存能の評価では、島におけるβ細胞は非β細胞よりも虚血損傷を受けやすく、したがって培養液における酸素化したＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐの存在からの恩恵を大いに受ける。
【００８４】
ある特定の、現在において好ましい本出願の実施形態を本明細書に記載したが、本出願が関係する当業者であれば、記載される実施形態の変形及び修正を本出願の精神及び範囲から逸脱せずに行うことができることが明らかであろう。したがって、本出願は、本明細書に続く特許請求の範囲及び、適用可能な法律の規則によって必要とされる程度のみに制限されることが企図される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】単離２４時間後の、両群からの島の生存能を、平均値±ＳＥＭで表したパーセント値で示す図である。各群に対して、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ単離（ｎ＝９）、コントロール単離（ｎ＝９）である。＊ｐ＝０．０４７。
【図２】１群あたりｎ＝３の単離数の、単離２４時間後の、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐから及びコントロール群からの島で測定した、アポトーシスに対するマーカーとしてのカスパーゼ３のレベルを示す図である。カスパーゼ３のレベルは、コントロール群よりもＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ群において有意に低い。＊ｐ＝０．０１１。
【図３Ａ】基底状態（２ｍＭ）及び刺激状態（５、８、又は１４ｍＭ）のグルコース条件下における２つの代表的な島の細胞内カルシウムレベルの測定値としての、レシオメトリック（ｒａｔｉｏ−ｍｅｔｒｉｃ）値（Ｆｕｒａ２／ＡＭ）における変化を示す図である。
【図３Ｂ】ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ及びコントロール群からの島（１群あたりｎ＝２５個の島）における、グルコース刺激（グルコース濃度５、８、又は１４ｍＭ）に反応した細胞内カルシウム変化のパーセント値を示す図である。平均値±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５。
【図４Ａ】トルブタミド（１００μＭ）添加後の、基底グルコース（２ｍＭ）条件下の２つの代表的な島における細胞内カルシウムレベルの測定値としてのレシオメトリック値（Ｆｕｒａ２／ＡＭ）における変化を示す図である。
【図４Ｂ】平均値±ＳＥＭで表した、トルブタミド（１００μＭ）添加後の両群からの島における（１グループあたりｎ＝２５個の島）基底グルコース濃度（２ｍＭ）下の細胞内カルシウムレベルに対する曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。ｐ＝０．１８３。
【図５】刺激指数（ＳＩ）として表し、平均値±ＳＥＭで表した、グルコースチャレンジに反応した島のインスリン分泌を示す図である。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ単離（ｎ＝５）、コントロール単離（ｎ＝５）、＊ｐ＝０．０３。
【図６Ａ】基底（２ｍＭ）及びグルコース刺激の条件（１４ｍＭ）下の２つの代表的な島におけるミトコンドリアの内膜の外側のローダミン１２３（Ｒｈ１２３）蛍光のレベルを示す図である。蛍光が徐々に低減しているのは、膜のポテンシャルを間接的に測定するとともに、Ｒｈ１２３が膜中に組み入れられることを意味している。
【図６Ｂ】平均値±ＳＥＭで表した、ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ及びコントロール群からの島（１群あたりｎ＝２５個の島）における、ミトコンドリアのポテンシャルのパーセント変化を示す図である。ｐ＜０．０５。
【図７】ミトコンドリアの形態を示す図である。ミトコンドリアをＲｈ１２３色素で染色した。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ及びコントロール群からの個々の島からの２つの代表的な画像（共焦点の再構成）を示す。画像は最大値投影であり、切片の厚さは１μｍである。島における細胞核は、「ｎ」の文字で識別してある。ミトコンドリアの形態及び核周囲の分布は、コントロールにおけるよりもＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ群で優れているように見える。コントラストのバランスをとって、ミトコンドリアの形態の詳細を明らかにしてある。スケールバーは５μｍである。
【図８】マウスにおける島の移植後、正常血糖に到達するまでの日数（遅延時間）を示す図である。ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐマウス（ｎ＝６）及びコントロールマウス（ｎ＝４）。＊ｐ＝０．０２。
【図９】ＰｏｌｙＳＦＨ−Ｐ（ｎ＝５）及びコントロール（ｎ＝３）からの島を移植した後、正常血糖に到達したマウスの代表的サンプルにおける腹腔内グルコース／アルギニン負荷試験（ＩＰＧ／ＡＴＴ）の結果を示す図である。値は、平均血中グルコースレベル±ＳＥＭを示している。ｐ＝０．０３。
【図１０】単離した島細胞の集団からのβ及び非β細胞に特異的な染色を施した、生存能を示すグラフである。細胞を、１群あたりｎ＝３で、細胞膜の安定性（７ａａＤ）、β細胞（ニューポートグリーン（ＮＧ）高集団をゲーティング）対非β細胞（ＮＧ低集団）における、ミトコンドリア膜の安定性（ＴＭＲＥ）に対してアッセイした。＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．００１；†ｐ＜０．００１；††ｐ＜０．００１。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図７】
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【国際調査報告】
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