(57)【要約】本発明は、低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）を血液分析装置で生成する方法に関する。この方法は、血液サンプルの第１のアリコートを血液希釈剤と混合して、第１のサンプル混合物を形成し、第１のサンプル混合物を血液分析装置で分析し、赤血球の平均赤血球容積（ＭＣＶ）および赤血球濃度（ＲＢＣ）を得ること；血液サンプルの第２のアリコートを試薬系と混合して、第２のサンプル混合物を形成し、第２のサンプル混合物を血液分析装置で分析し、血液サンプルのヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を得ること；得られたＭＣＶ、ＲＢＣおよびＨｇｂを使用して平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を得ること；得られたＭＣＨＣを使用して低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）を得ること；および血液サンプルのＬＨＣＣ％を血液分析装置で報告することを含む。
2009524069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプルの低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）を血液分析装置で生成する方法であって、
（ａ）血液サンプルの第１のアリコートを血液希釈剤と混合して、第１のサンプル混合物を形成し、前記第１のサンプル混合物を前記血液分析装置で分析し、赤血球の平均赤血球容積（ＭＣＶ）および赤血球濃度（ＲＢＣ）を得ること；
（ｂ）前記血液サンプルの第２のアリコートを試薬系と混合して、第２のサンプル混合物を形成し、前記第２のサンプル混合物を前記血液分析装置で分析し、前記血液サンプルのヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を得ること；
（ｃ）前記ＭＣＶ、前記ＲＢＣおよび前記Ｈｇｂを使用して平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を得ること；
（ｄ）前記ＭＣＨＣの関数として前記低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）を得ること；および
（ｅ）前記血液サンプルの前記ＬＨＣＣ％を前記血液分析装置で報告すること
を含む方法。
【請求項２】
前記ＬＨＣＣ％が前記ＭＣＨＣのシグモイド関数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＨＣＣ％が、下記の式：
ＬＨＣＣ％＝１／（１＋（ＥＸＰ（ｄ＊（ｑ−ＭＣＨＣ））））＊１００
（式中、ｄおよびｑは定数である）
によって定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｄおよびｑがそれぞれ１．８および３０である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＨＣＣ％が、下記の式：
強調ＬＨＣＣ％＝ＳＱＲＴ（（１−（１／（１＋（ＥＸＰ（ｄ＊（ｑ−ＭＣＨＣ）））））））＊１００
（式中、ｄおよびｑは定数である）
によって定義される強調ＬＨＣＣ％である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｄおよびｑがそれぞれ１．８および３０である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）が低色素性赤血球百分率と線形相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）が前記ＭＣＨＣの非線形リスケーリングによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
鉄欠乏を検出する方法であって、
（ａ）血液サンプルを血液分析装置で分析し、赤血球の平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を得る工程；
（ｂ）前記ＭＣＨＣの関数として低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）を得る工程；
（ｃ）前記ＬＨＣＣ％を所定の鉄欠乏基準と比較する工程；および
（ｄ）前記ＬＨＣＣ％が前記所定の鉄欠乏基準を満たす場合に、鉄欠乏を示すことを報告する工程
を含む方法。
【請求項１０】
前記ＬＨＣＣ％が前記ＭＣＨＣのシグモイド関数である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＬＨＣＣ％が、下記の式：
ＬＨＣＣ％＝１／（１＋（ＥＸＰ（ｄ＊（ｑ−ＭＣＨＣ））））＊１００
（式中、ｄおよびｑは定数である）
によって定義される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｄおよびｑがそれぞれ１．８および３０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＬＨＣＣ％が、下記の式：
強調ＬＨＣＣ％＝ＳＱＲＴ（（１−（１／（１＋（ＥＸＰ（ｄ＊（ｑ−ＭＣＨＣ）））））））＊１００
（式中、ｄおよびｑは定数である）
によって定義される強調ＬＨＣＣ％である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｄおよびｑがそれぞれ１．８および３０である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／７６０，５２０号の、米国特許法第１１９（ｅ）条の下での利益を主張する。米国仮特許出願第６０／７６０，５２０号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新しい診断パラメーターである低ヘモグロビン濃度細胞百分率を生成する方法、および鉄欠乏の検出において使用されるその方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
鉄欠乏（ＩＤ）は、世界中各地で最もよく見られる単一欠乏状態である。鉄欠乏により、罹患者は肉体労働を行うことができなくなり、また、小児における成長および学習の両方が損なわれるので、鉄欠乏は経済的に重要である。
【０００４】
絶対的鉄欠乏（貧血を伴う場合でも、または、貧血を伴わない場合でも）、および機能的鉄欠乏（ＦＩＤ）は高頻度の臨床的状態であり、これらの患者は、鉄が不足した赤血球生成を有する。絶対的鉄欠乏は、体内総鉄含有量の低下として定義される。鉄欠乏が十分に重篤であり、赤血球生成を損ない、貧血の発症を引き起こすとき、鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）が生じる。機能的鉄欠乏は、体内の総鉄含有量が正常であるか、または上昇さえしているが、鉄が「閉じ込められ」、赤血球の産生のために利用できない状態を表す。この状態が、主として、血液透析を受けている慢性腎不全の患者、および慢性的炎症または慢性的感染症の患者において認められる。
【０００５】
鉄の状態を、血液学的指数および生化学的指数を使用して測定することができる。鉄状態のそれぞれのパラメーターが、異なる身体鉄区画における変化を反映し、また、鉄枯渇の異なるレベルで影響を受ける。具体的な鉄測定値には、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）、赤血球プロトポルフィリン、血漿鉄、トランスフェリン、トランスフェリン飽和レベル（ＴＳＡＴ）、血清フェリチン（ＳＦ）、ならびに、より近年では、可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）および赤血球分布幅（ＲＤＷ）が含まれる。
【０００６】
正常な鉄状態についての典型的な値は、ＳＦが１００±６０ｎｇ／ｍＬであり、Ｈｇｂが女性については１２〜１７ｇ／ｄＬであり、男性については１４〜１９ｇ／ｄＬである。鉄欠乏性貧血についての典型的な値は、ＳＦが２２ｎｇ／ｍＬ未満であり、Ｈｇｂが女性については１２ｇ／ｄＬ未満であり、男性については１３ｇ／ｄＬ未満である。
【０００７】
ヘモグロビン（Ｈｇｂ）が、どの他の鉄状態パラメーターよりも長く使用されている。ヘモグロビンは、貧血が発症すると、鉄欠乏の重篤度の量的尺度を提供する。ヘモグロビンの測定は便利かつ簡便なスクリーニング方法であり、妊娠期間または乳児期でのように、鉄欠乏の罹患率が高いときには特に有用である。ヘモグロビンを鉄状態の尺度として使用することの限界は、（様々な要因、例えば、ビタミンＢ１２欠乏症または葉酸欠乏症、遺伝的障害および慢性的感染症などにより、赤血球生成が制限され得るので）ヘモグロビンには特異性がないことであり、また、正常集団と、鉄欠乏集団との間での値における著しい重なりのために、ヘモグロビンは相対的に感度がないことである。鉄欠乏性貧血を特定するために、ヘモグロビンは鉄状態のより選択的な測定値と一緒に測定される。
【０００８】
平均赤血球容積（ＭＣＶ）における低下が、鉄欠乏が重篤になり、ほぼ同時に、貧血が発症し始めるときに生じる。平均赤血球容積は、サラセミアおよび慢性的疾患の貧血が除外されると、鉄欠乏のかなり特異的な指標である。８０ｆｌのカットオフ値が、成人における正常の下限として許容される。Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ血液分析装置（これは赤血球の光学的測定を使用する）で測定されたとき、鉄欠乏の血液サンプルが、低下した平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）および平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を有することが報告されている。しかしながら、インピーダンスに基づく血液分析装置（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ装置またはＳｙｓｍｅｘ装置など）によって測定されたときには、ＭＣＨＣは鉄欠乏について感度がなく、しかし、より特異的である（Ｂａｉｎ，  Ｂ．Ｊ．、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、１９９５年、第８章、１９７〜１９９頁）。赤血球分布幅（ＲＤＷ）が、近年では、貧血の分類のために他のパラメーターとの組合せで使用されている。赤血球分布幅は赤血球のサイズにおける変動を反映しており、赤血球不同症の微妙な程度を検出するために使用することができる。
【０００９】
最も一般的に使用される鉄状態パラメーターは現在、トランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）および血清フェリチン（ＳＦ）である。しかしながら、これらはともに、鉄状態の間接的な尺度である。トランスフェリンは、トランスフェリンが鉄を貯蔵部位から赤芽球前駆体に輸送する、２つの鉄結合部位を含有する輸送タンパク質である。ＴＳＡＴ（すなわち、鉄によって占められる総結合部位の割合）は、赤血球生成のために利用可能である鉄の尺度である。ＴＳＡＴは、血清鉄を総鉄結合能（ＴＩＢＣ）（循環トランスフェリンの測定値）により除し、１００を乗じることによって計算される。フェリチンは、主に細網内皮系内に含有される貯蔵タンパク質であり、若干量が血清に放出される。鉄過剰の状態のもとでは、フェリチンの産生が、血漿中の鉄における増大を打ち消すために増大する。したがって、血清中のフェリチンのレベルは、貯蔵されている鉄の量を反映する。
【表Ａ】
2009524069.tif 000003
【００１０】
慢性腎臓病の患者については、絶対的鉄欠乏が、ＴＳＡＴが２０％未満であり、ＳＦが１００ｎｇ／ｍｌ未満であるときに診断されることがある。機能的鉄欠乏は、鉄状態パラメーターが適切な鉄貯蔵を示すことがあるので、診断することがより困難である場合がある。ＦＩＤを定義する際には様々な基準があり、それらの１つが、上記の表に示されるように、腎臓病予後改善機構（Ｋ／ＤＯＱＩ）によって発表され（Ｅｋｎｏｙａｎ  Ｇ．ら、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ：ＤＯＱＩはＫ／ＤＯＱＩになる）、更新される（米国腎臓病財団：透析療法予後改善機構、Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．、２００１年１月、第３７巻（１号）、１７９〜１９４頁；Ａｎｅｍｉａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｅｐｏｅｔｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ、ＥＳＣＨＢＡＣＨ，  Ｊ．、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、第１３巻、１４１２〜１４１４頁、２００２年）。
【００１１】
トランスフェリン飽和を使用することの限界は、血清鉄の限界、すなわち、広い日周変動および低い特異性を反映する。ＴＳＡＴもまた、炎症性疾患では低下する。トランスフェリン飽和は、鉄状態の他の指標と組み合わせられた集団研究では一般に使用される。他方で、フェリチンは急性期の反応物であるので、その血清レベルは、慢性的炎症、感染、悪性腫瘍および肝臓疾患が存在する場合には上昇することがある。アルコールの消費もまた、血清フェリチンを独立して上昇させることが示唆されている。
【００１２】
近年、鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出において有用性を有するいくつかの新しい赤血球パラメーターおよび網状赤血球パラメーターが報告されている。これらのパラメーターのうちの２つが、Ｂａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０血液分析装置によって報告される低色素性赤血球百分率（これは％Ｈｙｐｏとして示される）およびＣＨｒ（網状赤血球ヘモグロビン含有量）である（非特許文献１）。低色素性赤血球百分率は、２８ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビン濃度を有する赤血球の割合として定義される。
【００１３】
網状赤血球は、寿命がわずかに１日〜２日にすぎない未成熟な赤血球である。これらが最初に骨髄から放出されるとき、そのヘモグロビン含有量の測定により、赤血球生成のために直ちに利用可能である鉄の量が提供され得る。これらの網状赤血球における正常未満のヘモグロビン含有量は、要求に対する不十分な鉄供給を示すものである。これらの網状赤血球におけるヘモグロビンの量はまた、成熟赤血球におけるヘモグロビンの量に対応する。ＣＨｒは、近年では数多くの研究において、鉄欠乏および機能的鉄欠乏についての検査として評価されており、非常に高感度かつ特異的であることが見出されている。しかしながら、正確な閾値は、閾値が、研究室および使用された装置に依存して変動するので、確立されていない。
【００１４】
エリスロポイエチンは、赤血球の産生を刺激することにおいて効果的であり、しかし、ヘモグロビンに結合するための十分な鉄供給がない場合、赤血球は低色素性になる（すなわち、ヘモグロビン含有量が低くなる）。したがって、鉄欠乏の状態では、骨髄を離れる赤血球の著しい割合が低いヘモグロビン含有量を有する。ヘモグロビン含有量が２８ｇ／ｄＬ未満である赤血球の割合を測定することによって、鉄欠乏を検出することができる。１０％を越える％Ｈｙｐｏは鉄欠乏と相関しており、したがって、鉄欠乏を検出するための診断基準として使用されている（非特許文献２）。
【００１５】
％Ｈｙｐｏは、光学的な細胞毎のヘモグロビン測定に基づくいくつかのＢａｙｅｒ血液分析装置での報告されるパラメーターである。％Ｈｙｐｏは、新鮮な全血サンプル（採血後４時間未満）を使用して測定されなければならない。貯蔵したとき、または、サンプルが古くなると、赤血球の膨潤のために、％Ｈｙｐｏ報告の誤った増大がもたらされる（非特許文献３）。
【００１６】
％ＨｙｐｏおよびＣＨｒに相関する２つの他のパラメーターが近年には報告されており、これらは、Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＥ−２１００血液分析装置によって報告されるＲＢＣ−ＹおよびＲｅｔ−Ｈｅである（非特許文献４；および非特許文献５）。ＲＢＣ−Ｙは成熟赤血球集団内の前方光散乱ヒストグラムの平均値であり、Ｒｅｔ−Ｈｅは、Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＥ−２１００血液分析装置での網状赤血球測定で得られる網状赤血球集団内の前方光散乱ヒストグラムの平均値である。
【００１７】
最も近年には、赤血球パラメーターならびに網状赤血球パラメーターのいくつかの関数が、鉄欠乏の検出において有用であるとＳｉｍｏｎ−Ｌｏｐｅｚによって同時係属中の米国特許出願第１１／５２４，６８２号に開示されている。これらには、ＭＣＶおよびＭＲＶの積関数として定義されるＲＢＣサイズ関数（ＲＳｆ）、ＭＣＶおよびＨｇｂの積関数として定義される容積−ヘモグロビン因子（ＶＨｆ）、ＭＣＶ、ＨｇｂおよびＲＤＷの積関数として定義される容積−ヘモグロビン／分布因子（ＶＨＤＷｆ）が含まれる。
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｄｉｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４８巻、７号、１０６６〜１０７６頁、２００２年
【非特許文献２】Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎａｅｍｉａ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｒｅｎａｌ  Ｆａｉｌｕｒｅ、Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ，  Ｆ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｙａｌｉｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第１９巻、２００４年５月（増刊第２号）、ガイドラインＩＩＩ．２、ｉｉ２２〜２４頁
【非特許文献３】Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎａｅｍｉａ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｒｅｎａｌ  Ｆａｉｌｕｒｅ、Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ，  Ｆ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｙａｌｉｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第１９巻、２００４年５月（増刊第２号）、付録Ｂ、ｉｉ３９〜４１頁
【非特許文献４】Ｍａｃｈｉｎ  Ｓ．Ｊ．ら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＥ−２１００、ＩＳＬＨ  ２００１  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ，  ＩＳＬＨ  ＸＩＶｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、２００１年
【非特許文献５】Ｔｈｏｍａｓ，  Ｃ．ら、Ａｎｅｍｉａ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００５年、１１号、１４〜２３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
ＣＨｒおよび％ＨｙｐｏはＢａｙｅｒ社の血液分析装置で提供されるだけであることが認識されている。したがって、この情報は多くの臨床研究室および病院のために利用することができない。鉄欠乏を、既知のパラメーター（例えば、ＣＨｒおよび％Ｈｙｐｏなど）に対する匹敵する臨床的正確性、感度および特異性をもって鉄欠乏を検出するための新しい診断指標を開発することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の要旨
１つの実施形態において、本発明は、低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）を血液分析装置で生成する方法に関する。この方法は、血液サンプルの第１のアリコートを血液希釈剤と混合して、第１のサンプル混合物を形成し、第１のサンプル混合物を血液分析装置で分析し、赤血球の平均赤血球容積（ＭＣＶ）および赤血球濃度（ＲＢＣ）を得ること；血液サンプルの第２のアリコートを試薬系と混合して、第２のサンプル混合物を形成し、第２のサンプル混合物を血液分析装置で分析し、血液サンプルのヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を得ること；得られたＭＣＶ、ＲＢＣおよびＨｇｂを使用して平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を得ること；得られたＭＣＨＣを使用して低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）を得ること；および血液サンプルのＬＨＣＣ％を血液分析装置で報告することを含む。
【００２０】
１つの実施形態において、ＬＨＣＣ％は、ＬＨＣＣ％＝１／（１＋（ＥＸＰ（ｄ＊（ｑ−ＭＣＨＣ））））＊１００（式中、ｄおよびｑは定数である）の式によって定義されるシグモイド関数である。１つの例示的な実施形態において、ｄおよびｑがそれぞれ１．８および３０である。別の実施形態において、強調ＬＨＣＣ％が提供され、これは、強調ＬＨＣＣ％＝ＳＱＲＴ（（１−（１／（１＋（ＥＸＰ（ｄ＊（ｑ−ＭＣＨＣ）））））））＊１００（式中、ｄおよびｑは定数である）の式によって定義される。
【００２１】
さらなる実施形態において、本発明は、鉄欠乏の検出において％Ｈｙｐｏと類似する診断能を両方が有するＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％を使用して鉄欠乏を検出する方法に関する。１つの実施形態において、この方法は、血液サンプルを血液分析装置で分析し、赤血球のＭＣＨＣを得る工程；ＭＣＨＣのシグモイド関数として定義されるＬＨＣＣ％を得る工程；ＬＨＣＣ％を所定のＬＨＣＣ％鉄欠乏基準と比較する工程；およびＬＨＣＣ％が所定のＬＨＣＣ％鉄欠乏基準を満たす場合に、鉄欠乏を示すことを報告する工程を含む。
【００２２】
本発明の利点が、本発明の例示的な実施形態を示す添付された図面と併せて理解される下記の説明から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、新しい診断パラメーターである低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）、および鉄欠乏の検出のために使用される方法を提供する。
【００２４】
本明細書中で使用される鉄欠乏の用語は、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏（ＦＩＤ）を包含する。絶対的鉄欠乏は、文献ではしばしば鉄欠乏として示され、低下した総鉄身体含有量として定義される。鉄欠乏が十分に重篤であり、赤血球生成を損ない、貧血の発症を引き起こすとき、鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）が生じる。潜在性の鉄欠乏は、鉄欠乏が存在し、しかし、未だ貧血が存在しないことを示す。他方で、機能的鉄欠乏では、身体の総鉄含有量が正常であるか、または上昇さえしており、しかし、鉄が赤血球の産生のために利用できない状態が規定される。この状態が、主として、血液透析を受けている慢性腎不全の患者において認められる。潜在性の機能的鉄欠乏は機能的鉄欠乏の前貧血状態を示す。上記で記載されたように、鉄欠乏の異なる形態を有する個体は、鉄が不足した赤血球生成の異なる程度を有する。
【００２５】
１つの態様において、本発明は、血液サンプルの低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）を血液分析装置で生成する方法を提供する。
【００２６】
１つの実施形態において、低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）は、下記の式：
ＬＨＣＣ％＝１／（１＋（ＥＸＰ（ｄ＊（ｑ−ＭＣＨＣ））））＊１００
（式中、ｄおよびｑは定数である）
によって定義される平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）のシグモイド関数である。１つの例示的な実施形態において、ｄおよびｑがそれぞれ１．８および３０である。
【００２７】
平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）は、赤血球あたりのヘモグロビン濃度としてもまた示され、ＭＣＨＣ＝（Ｈｇｂ／（ＲＢＣ＊ＭＣＶ））＊１０００（式中、Ｈｇｂは血液サンプルの総ヘモグロビン濃度であり、ＲＢＣは一般に赤血球数と呼ばれる血液サンプルにおける赤血球濃度である）の式によって定義される。自動化血液分析装置では、本明細書中下記で詳しく記載されるように、ＲＢＣおよびＭＣＶが典型的には、希釈された血液サンプルから測定され、Ｈｇｂが、溶解されたサンプル混合物を使用して測定される。ＭＣＨＣが、これらの直接に測定されたパラメーターから導かれる。そのうえ、ＭＣＨＣは、細胞を溶解することなく、赤血球容積測定、および個々の赤血球のヘモグロビンの光学的な細胞毎のヘモグロビン測定によって得ることができる。本発明の目的のために、ＭＣＨＣは、いずれかの方法を使用して得ることができる。
【００２８】
上記で記載されたように、低色素性赤血球百分率（％Ｈｙｐｏ）は、２８ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビン濃度を有する赤血球の割合として定義される。これらの赤血球は、Ｂａｙｅｒ社の血液分析装置での個々の赤血球のヘモグロビンの光学的な細胞毎のヘモグロビン測定によって検出される。％Ｈｙｐｏは、鉄欠乏を検出するための有効な診断基準として使用されている。５％未満の％Ｈｙｐｏが正常と見なされる。２つの異なる基準、より具体的には、５％を越える％Ｈｙｐｏ、および１０％を越える％Ｈｙｐｏが使用されている。１０％を越える％Ｈｙｐｏが、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を規定するためにより一般に使用されている（Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎａｅｍｉａ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｒｅｎａｌ  Ｆａｉｌｕｒｅ、Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ，  Ｆ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｙａｌｉｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第１９巻、２００４年５月（増刊第２号）、付録Ｂ、ｉｉ３９〜４１頁）。
【００２９】
図１Ａは、血液サンプルの赤血球内または赤血球ヘモグロビン濃度（ＣＨＣ）の分布を例示する。示されるように、血液サンプルにおける赤血球の赤血球ヘモグロビン濃度は典型的にはガウス分布を有し、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）がガウス曲線の中心に存在する。示されるように、低色素性赤血球がガウス曲線の左側テール部に分布する。
【００３０】
ＭＣＨＣの低下が鉄欠乏と相関づけられていると以前から報告されているが、しかしながら、一般には、ＭＣＨＣは、赤血球ヘモグロビン含有量における変化に対して不感性であると見なされている。新しい診断指標を、それらの容易に得ることができる血液学パラメーターに基づいて開発する際の長年にわたって感じられた必要性にもかかわらず、ＭＣＨＣは、鉄欠乏を検出するための臨床的な診断基準として使用されていない。
【００３１】
本明細書中下記の実施例において記載されるように、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液分析装置およびＢａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０血液分析装置でそれぞれ分析された２４７個の臨床での全血サンプルを伴う研究において、驚くべきことに、ＭＣＨＣが、鉄欠乏を検出するための％Ｈｙｐｏと類似した診断能を有すること、すなわち、鉄欠乏の血液サンプルを正常な血液サンプルから識別することが見出されている。
【００３２】
実施例において記載されるように、ＭＣＨＣの受信者動作特性（ＲＯＣ）分析が、１０％以上の％Ｈｙｐｏを、正常および鉄欠乏を分類するための基準として使用して２４７個の血液サンプルに対して行われた。より具体的には、１０％を越える％Ｈｙｐｏを有する１０５個のサンプルが鉄欠乏または陽性として特定され、１０％以下の％Ｈｙｐｏを有する１４２個のサンプルが正常または陰性として特定された。得られたＲＯＣ曲線が図２に示され、統計学的データが、ＡＵＣ、標準誤差（ＳＥ）、ｐ値および９５％信頼区間を含めて、表１に示される。
【００３３】
図２において、ｙ軸には、感度（真陽性率）がプロットされ、ｘ軸には、１００−特異性（偽陽性率）がプロットされる。識別が完全である試験は、真陽性率が１００％である場合（完全な感度）、左上隅を通過するＲＯＣ曲線を有する。識別が全くない試験についての理論的曲線は、左下隅から右上隅までの４５°の対角線である。曲線が左上隅に接近するほど、試験の全体的な正確性が大きくなる。そのうえ、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）もまた、診断試験の臨床的正確性の一般的な尺度である。ＡＵＣの値およびＲＯＣ曲線により、ＭＣＨＣが、鉄欠乏の血液サンプルを正常な血液サンプルから区別することにおいて％Ｈｙｐｏと類似する診断能を有したことが示された。
【００３４】
しかしながら、他方で、図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、ＭＣＨＣは％Ｈｙｐｏとの線形相関を有していない。図３Ｂに示されるように、ＭＣＨＣは％Ｈｙｐｏに対して非線形のＳ字型相関を有する。そのようなものとして、異常の範囲において、すなわち、１０％から約７５％の％Ｈｙｐｏの範囲において、ＭＣＨＣ値は患者の低色素性レベルまたは疾患の程度を反映していない。そのうえ、正常な血液サンプルおよび異常な血液サンプルのＭＣＨＣ値がかなり狭い範囲で変化することを容易に認めることができる。示されるように、これらの２４７個の血液サンプルは０％から約７５％までの広い％Ｈｙｐｏ範囲を有し、一方、これらのサンプルのＭＣＨＣ値は約２５ｇ／ｄＬから約３６ｇ／ｄＬまで変化するにすぎない。数値的分解能および線形相関がないことにより、臨床家がこのパラメーターを診断指標として理解し、使用することが困難になっている。
【００３５】
本発明の低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）は、鉄欠乏を検出することにおけるＭＣＨＣの診断能を依然として維持して、ＭＣＨＣの上記で記載された不完全さを解決するために開発される。
【００３６】
上記で記載されたように、血液サンプルにおける赤血球の赤血球ヘモグロビン濃度は典型的にはガウス分布を有する。ガウス曲線の左テール部の積分値が、低ヘモグロビン濃度を有する赤血球の割合を表し、この積分値はＳ字型の曲線として現れる。シグモイド関数は直線関係をＳ字型の曲線に変換することができること、または、逆に、シグモイド関数はまた、Ｓ字型の曲線をその変換により直線関係に戻すことができることが知られている。本発明の１つの実施形態において、シグモイド関数が、ＭＣＨＣと％Ｈｙｐｏの関係をシミュレーションするために、また、％Ｈｙｐｏと線形に相関するＭＣＨＣの関数を作成するために利用されている。
【００３７】
図４Ａは、これらの２４７個の臨床での全血サンプルの得られたＬＨＣＣ％（ＭＣＨＣのシグモイド関数）対％Ｈｙｐｏを示す。示されるように、ＬＨＣＣ％は％Ｈｙｐｏと実質的に線形に相関する。そのようなものとして、数学的には、ＭＣＨＣのこのシグモイド関数は、図１Ｂに示されるように、血液サンプルの低ヘモグロビン濃度赤血球の割合を反映する。換算係数を適用することによって、このシグモイド関数は百分率で表され、したがって、低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）として示される。
【００３８】
ＬＨＣＣ％を定義する式において、ｄおよびｑの定数は、異なる製造者により製造された異なる血液分析装置で得られたＭＣＨＣに依存して変化し得ることは特筆される。異なる血液分析装置で得られたＭＣＨＣが、使用された検出方法および試薬に依存して、ある範囲で変化することが知られている。本明細書中に記載されるｄおよびｑの値は本発明の限定として解釈してはならない。
【００３９】
非直線関係を上記で記載される直線関係に変換するプロセスは数学的には非線形リスケーリングと呼ばれる。シグモイド関数に加えて、他の好適な数学的関数（例えば、タンジェントおよびアークタンジェントなど）もまた、Ｓ字型の関係を直線関係に変換するために使用することができ、したがって、これらもまた、本発明の目的のために使用することができる。
【００４０】
さらなる実施形態において、本発明は、下記の式：
強調ＬＨＣＣ％＝ＳＱＲＴ（（１−（１／（１＋（ＥＸＰ（ｄ＊（ｑ−ＭＣＨＣ）））））））＊１００
（式中、ｄおよびｑは定数である）
によって定義される強調ＬＨＣＣ％を提供する。１つの例示的な実施形態において、ｄおよびｑがそれぞれ１．８および３０である。
【００４１】
強調ＬＨＣＣ％を定義する式において、標準的なシグモイド関数に加えて、平方根が、比較的低い値のＬＨＣＣ％を有する血液サンプルの中での、正常と、異常との区別を改善するために、％Ｈｙｐｏの下端に対応する領域における数値的分解能をさらに高めるために適用される。
【００４２】
図４Ｂは、これらの２４７個の臨床での全血サンプルの強調ＬＨＣＣ％（ＭＣＨＣのシグモイド関数）対％Ｈｙｐｏを示す。示されるように、強調ＬＨＣＣ％は％Ｈｙｐｏと実質的に線形に相関する。そのうえ、％Ｈｙｐｏの下端に対応する領域における数値的分解能が実質的に増大している。示されるように、垂直軸の下端において、強調ＬＨＣＣ％値の緩やかな増大を明瞭に認めることができる。
【００４３】
ＬＨＣＣ％を血液分析装置で生成する方法に関して、１つの例示的な実施形態において、この方法は、（ａ）血液サンプルの第１のアリコートを血液希釈剤と混合して、第１のサンプル混合物を形成し、第１のサンプル混合物を血液分析装置で分析し、赤血球の平均赤血球容積（ＭＣＶ）および赤血球濃度（ＲＢＣ）を得る工程；（ｂ）血液サンプルの第２のアリコートを試薬系と混合して、第２のサンプル混合物を形成し、第２のサンプル混合物を血液分析装置で分析し、血液サンプルのヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を得る工程；（ｃ）得られたＭＣＶ、ＲＢＣおよびＨｇｂを使用して平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を得る工程；（ｄ）ＭＣＨＣの関数として低ヘモグロビン濃度細胞百分率（ＬＨＣＣ％）を得る工程；および（ｅ）血液サンプルのＬＨＣＣ％を血液分析装置で報告する工程を含む。
【００４４】
血液分析装置での赤血球の測定において、血液サンプルは典型的には、サンプルチャンバーまたはサンプルバスにおいて希釈剤により実質的に希釈される。非収束型フローアパーチャーを用いたインピーダンス測定を使用する場合、血液サンプルは、例えば、６２５０：１の希釈比率により高度希釈され得る。非収束型フローセルが測定のために使用されるとき、希釈比率は実質的に小さくすることができる（例えば、２９０：１など）。赤血球の容積および形態を血液分析装置でのその測定の期間中に維持するために、等張性の希釈剤が、血液サンプルを希釈するために使用される。典型的には、希釈剤は１つまたは複数のアルカリ金属塩を含有する。市販されている様々な等張性の血液希釈剤を、血液サンプルを希釈するために使用することができる。好適な例には、米国特許第４，５２１，５１８号、同第４，５２８，２７４号、同第５，９３５，８５７号および同第６，７０６，５２６号に記載される希釈剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
導電性溶液に懸濁された粒子または血液細胞がフローセルまたはアパーチャーを通過するとき、電気的シグナル、すなわち、パルスをインピーダンスの増大のために測定することができる。このような電気的パルスが、血液サンプルの血液細胞の数を計数するために使用されている。他方で、パルスの形状、高さおよび幅は粒子の容積またはサイズに直接に関係づけられ、測定された細胞の容積に転換することができる。異なる容積を有する２つ以上の異なる血液細胞を含有するサンプルが測定されるとき、測定から得られるヒストグラムはこれらの血液細胞の容積分布を表すことができる。ＤＣインピーダンス測定デバイスを備える血液分析計による血液細胞の計数およびサイズ分類のために使用される検出方法および装置が、米国特許第２，６５６，５０８号、同第３，８１０，０１１号および同第５，１２５，７３７号（これらは本明細書によりその全体が参考として組み込まれる）に概略的に記載される。本明細書中において、表現「血液細胞のサイズ分類」は細胞容積の測定を示す。
【００４６】
あるいは、小角度光散乱測定もまた、血液細胞の計数およびサイズ分類のために使用することができる。本明細書中において、用語「小角度光散乱」は、入射光から１０°未満の範囲で測定される光散乱シグナルを示す。
【００４７】
細胞容積の測定では、細胞容積分布ヒストグラムが得られる。赤血球の測定について、得られたヒストグラムは赤血球分布ヒストグラムと呼ばれる。正常な血液サンプルについては、狭い十分に規定された赤血球分布（典型的には、ガウス分布）が得られる。臨床的に異常な血液サンプルについては、分布の様々な乱れが観測されている（例えば、高容積側または低容積側のいずれかへの分布の変化、非対称な分布、高容積側または低容積側のいずれかあるいは両側での集団拡大など）。平均赤血球容積（ＭＣＶ）および赤血球分布幅（ＲＤＷ）が赤血球分布ヒストグラムから計算される。
【００４８】
血液サンプルの総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）が典型的には、血液サンプルのアリコートを溶解試薬と混合することによって、自動化された血液分析装置で測定される。溶解試薬にさらしたとき、赤血球は完全に溶解され、ヘモグロビンがサンプル混合物に放出され、その後、ヘモグロビンは、溶解試薬におけるリガンドと反応したとき、クロモゲンを形成する。ヘモグロビンのクロモゲンがその後、所定の波長でＵＶ−ＶＩＳ分光法によって測定され、Ｈｇｂが測定値から計算される。Ｈｇｂを測定するために好適である１つの溶解試薬系は、等張性の血液希釈剤（例えば、米国特許第４，５２１，５１８号、同第４，５２８，２７４号、同第５，９３５，８５７号および同第６，７０６，５２６号に記載される希釈剤など）、および溶解試薬（例えば、米国特許第５，７６３，２８０号、同第５，８３４，３１５号および同第６，５７３，１０２号に記載される溶解試薬など）を含む（これらの特許は本明細書によりその全体が参考により組み込まれる）。あるいは、試薬系はまた、米国特許第５，８８２，９３４号（これは本明細書によりその全体が参考により組み込まれる）に記載されるような単一の溶解試薬であることが可能である。そのうえ、ヘモグロビンを測定するためにこの分野で知られている様々な溶解試薬を本発明の目的のために使用することができる。
【００４９】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液分析装置またはＧＥＮ＊Ｓ血液分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）では、血液サンプルの数個のアリコートが、異なる分析モードで同時に分析される。ＣＢＣモードでは、血液サンプルの第１のアリコートが希釈剤によって希釈されて、第１のサンプル混合物を形成し、赤血球および血小板がこの第１のサンプル混合物から測定される。同時に、血液サンプルの第２のアリコートが希釈剤および溶解試薬と混合されて、第２のサンプル混合物を形成し、ヘモグロビン濃度が、この第２のサンプル混合物を使用して測定される。とりわけ、様々な赤血球パラメーターがこれらの測定値から報告され、それらには、赤血球濃度（ＲＢＣ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）および平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）などが含まれる。これらの血液分析装置では、ＭＣＨＣが、ＭＣＶ、ＲＢＣおよびＨｇｂから計算される。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、鉄欠乏を、上記で定義されるＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％を使用して検出する方法を提供する。
【００５１】
より具体的には、この方法は、（ａ）血液サンプルを血液分析装置で分析し、血液サンプルのＭＣＨＣを得る工程；（ｂ）得られたＭＣＨＣを使用してＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％を得る工程；（ｃ）ＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％を所定の鉄欠乏基準と比較する工程；および（ｄ）ＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％が所定の鉄欠乏基準を満たす場合に、鉄欠乏を示すことを報告する工程を含む。
【００５２】
本明細書中に記載される所定の鉄欠乏基準はまた、本明細書中下記に記載される実施例において使用されるように、臨床的状態の診断のためのカットオフ値と一般に呼ばれることは特筆される。例えば、所定の鉄欠乏基準では、ＬＨＣＣ％がＬＨＣＣ％についてのカットオフ値よりも大きいならば、鉄欠乏が規定される。そのようなものとして、所定の鉄欠乏基準はそれぞれの関数に対して特異的である。例えば、所定の鉄欠乏基準は、所定のＬＨＣＣ％鉄欠乏基準または所定の強調ＬＨＣＣ％鉄欠乏基準として示すことができる。
【００５３】
実施例ではさらに、％Ｈｙｐｏとの比較で、鉄欠乏を検出するための上記で定義されるＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％を使用する本発明の方法が例示される。本研究では、２４７個の臨床での全血サンプルのＬＨＣＣ％値および強調ＬＨＣＣ％値が、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液分析装置から報告されたＭＣＨＣを使用して計算された。この場合、ＬＨＣＣ％が、ＬＨＣＣ％＝１／（１＋（ＥＸＰ（１．８＊（３０−ＭＣＨＣ））））＊１００の式によって定義され、強調ＬＨＣＣ％が、ＬＨＣＣ％＝ＳＱＲＴ（（１−（１／（１＋（ＥＸＰ（１．８＊（３０−ＭＣＨＣ）））））））＊１００の式によって定義された。
【００５４】
図４Ａおよび図４Ｂに例示されるように、得られたＬＨＣＣ％値および強調ＬＨＣＣ％値は、％Ｈｙｐｏの比較可能な範囲で、０から１００％の間に分布し、また、％Ｈｙｐｏと実質的に線形に相関する。
【００５５】
図４Ｂに示されるように、正常な血液サンプルの大多数が０％から約２７％の強調ＬＨＣＣ％値を有し、鉄欠乏サンプルの大多数が約２７％から１００％の広い範囲での強調ＬＨＣＣ％値を有する。改善された数値的分解能により、強調ＬＨＣＣ％は、臨床家が鉄欠乏サンプルを認識するために便利である。理解され得るように、低色素性赤血球の割合とのその実質的に線形の相関、および鉄欠乏サンプルについての広い分布範囲のために、この指数は、潜在的には患者の低色素性レベルを反映する場合があり、また、血色素減少症の重篤度を決定することを助けるために利用される場合がある。
【００５６】
鉄欠乏を検出するためのＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％の臨床的正確性が、実施例において記載されるようなこれらの２４７個の臨床での全血サンプルのＲＯＣ分析を使用して評価される。図５Ａおよび図５ＢはＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％のＲＯＣ曲線をそれぞれ示す。表１はＬＨＣＣ％のＲＯＣ分析の統計学的分析結果を示す。示されるように、ＡＵＣがＬＨＣＣ％については０．９６２であり、このことは、ＬＨＣＣ％が％Ｈｙｐｏと非常に相関することを示している。ＡＵＣの値およびＲＯＣ曲線は、ＬＨＣＣ％が、鉄欠乏を検出することにおいて％Ｈｙｐｏと類似する診断能を有することを示している。７．４５のカットオフを用いた場合、ＬＨＣＣ％は９３．３％の感度および９０．１％の特異性を有する。
【００５７】
図５Ｂに示されるように、強調ＬＨＣＣ％についてのＲＯＣ曲線はＬＨＣＣ％のＲＯＣ曲線と同じである。強調ＬＨＣＣ％のＲＯＣ分析の統計学的分析結果は、表１に示されるＬＨＣＣ％について得られた統計学的分析結果と同じである。２７．３％のカットオフを用いた場合、強調ＬＨＣＣ％は９３．３％の感度および９０．１％の特異性を有する。このことは、ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％がともに、鉄欠乏を検出することについて同じ臨床的正確性を有すること、また、両者が、鉄欠乏を検出することにおいて％Ｈｙｐｏと類似する診断能を有することを意味する。
【００５８】
上記から理解され得るように、ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％はともに、血液サンプルの低ヘモグロビン濃度赤血球の割合を直線的に表すことができるので、ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％はともに、ＭＣＨＣの診断能を改善している。
【００５９】
そのうえ、上記で記載されるように、図４Ｂにおいて垂直軸の下端で示されるように、強調ＬＨＣＣ％値の緩やかな増大を明瞭に認めることができる。このことは、亜異常状態（例えば、増大した低ヘモグロビン濃度赤血球を有し、それにもかかわらず、依然として前貧血段階にあるそのような血液サンプルなど）を特定するために、この診断指標の感度をさらに改善する。
【００６０】
そのようなものとして、本発明のＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％は、鉄欠乏を検出するための有効な指標として使用することができる。その実質的に改善された数値的分解能により、実現可能性が臨床的診断ツールに提供される。そのうえ、％Ｈｙｐｏに対するその実質的な線形相関は潜在的には、低色素性状態の定量的評価のために利用することができる。
【００６１】
上記で記載されるように、サンプルが古くなると、赤血球の膨潤のために、％Ｈｙｐｏ報告の誤った増大がもたらされるので、％Ｈｙｐｏは、採血後４時間未満の新鮮な全血サンプルを使用して測定されなければならない。対照的に、ＭＣＨＣは採血後２４時間で安定である。そのようなものとして、鉄欠乏を診断する目的のために、ＬＨＣＣ％を、％Ｈｙｐｏの分析において要求される時間枠のようなサンプル年齢の狭い時間枠によって制限されることなく、全血サンプルの日常的な血液学分析を使用して得ることができる。このことは、実質的な利点をサンプル取り扱いおよび作業フロー管理に関して血液学試験所に提供する。例えば、様々な商業的血液学試験所では、多くの全血サンプルが個々の診療所で採取され、分析のために試験所に送られる。そのような血液サンプルは採血後２４時間以上経ることが多い。これらのサンプルはもはや、％Ｈｙｐｏの分析には適していない。しかしながら、信頼できるＬＨＣＣ％を、これらの２４時間経った古いサンプルを用いて依然として得ることができる。
【００６２】
報告されたＨｇｂ、ＭＣＶおよびＲＢＣは、異なる装置製造者によって使用される検出方法および試薬に依存して、異なる血液分析装置の間ではわずかに変化することを理解しなければならない。結果として、ＭＣＨＣ（導かれたパラメーター）は、異なる血液分析装置の間で、ある程度変化する。したがって、カットオフ値、すなわち、本発明の方法におけるＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％についての対応する所定の鉄欠乏基準が、使用された血液分析装置に依存して変化し得る。そのうえ、Ｈｇｂ、ＭＣＶおよびＲＢＣ、ならびに、導かれたＭＣＨＣが、患者の人口統計、ならびに、特定の病院または施設（例えば、ガンセンターまたは腎臓透析センターなど）の臨床的拠点に依存して変化し得ることが知られている。そのようなものとして、本発明の目的のためのＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％についてのカットオフ値は、それぞれの病院、または、使用された血液分析装置について経験的に確認されなければならない。本明細書中に示される研究で得られたＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％についてのカットオフ値は本発明の方法の有用性を例示しており、本発明の限定として解釈してはならない。
【００６３】
ＭＣＨＣが、ハイスループット装置、および診療所で使用される小型装置の両方を含めて、すべての製造者によって製造されるすべての市販の血液分析装置での報告されたパラメーターであることを理解することができる。したがって、ＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％（本発明の方法を使用して鉄欠乏を検出するために必要とされる指数）をすべての市販の血液分析装置から得ることができる。
【００６４】
そのうえ、これらのパラメーターは、さらなるコストを伴うことなく、全血サンプルの日常的な血液学分析から得ることができるので、鉄欠乏を検出するためにＬＨＣＣ％または強調ＬＨＣＣ％を使用する本発明の方法は、時間を節約する低コストの方法である。
【００６５】
下記の実施例は本発明の例示であり、特許請求の範囲において定義されるような本発明の範囲を限定するものとしていかなる点でも解釈してはならない。様々な他の成分および割合が、前記の開示に従って用いられ得ることが理解される。
【実施例】
【００６６】
２４７個の臨床での全血サンプルを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎにおいて、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液分析装置およびＢａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０血液分析装置でそれぞれ分析した。すべての血液分析装置をそれらの標準的な操作条件のもとで操作し、製造者によって提供される校正用材料を操作者マニュアルおよび本研究のプロトコルに従って使用して校正した。
【００６７】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）では、サンプルを、ＣＢＣモードおよびＲｅｔｉｃモードを使用して分析した。血液サンプルの１．６μｌの第１のアリコートを６２５０：１の希釈比率によりＩｓｏｔｏｎ  ３Ｅによって希釈して、第１のサンプル混合物を形成し、これをＤＣインピーダンス測定によって測定して、赤血球パラメーターを得た。血液サンプルの２８μｌの第２のアリコートを６ｍｌのＩｓｏｔｏｎ  ３Ｅにより希釈し、その後、１ｍｌのＬｙｓｅ  Ｓ  ＩＩＩ  ｄｉｆｆと混合して、第２のサンプル混合物を形成した。第２のサンプル混合物の吸収を約５４０ｎｍで測定して、Ｈｇｂを得た。上記で記載されたすべての試薬がＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．の製造物であった。
【００６８】
それぞれの血液サンプルのＭＣＨＣを、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液分析装置で得た。ＭＣＨＣ対％Ｈｙｐｏの相関を図３Ａに示し、図３Ｂでは拡大スケールで示した。示されるように、ＭＣＨＣは％Ｈｙｐｏとの非直線性の相関を有する。
【００６９】
受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を、１０％を越える％Ｈｙｐｏを、正常および鉄欠乏を分類するための基準として使用して、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液分析装置で得られたＭＣＨＣに対して行った。より具体的には、１０％を越える％Ｈｙｐｏを有する１０５個のサンプルが鉄欠乏または陽性として特定され、１０％以下の％Ｈｙｐｏを有する１４２個のサンプルが正常または陰性として特定された。得られたＲＯＣ曲線が図２に示され、統計学的データが、ＡＵＣ、標準誤差（ＳＥ）、ｐ値および９５％信頼区間を含めて、表１に示される。ＡＵＣの値およびＲＯＣ曲線により、ＭＣＨＣが、鉄欠乏を検出することにおいて％Ｈｙｐｏと類似する診断能を有したことが示された。
【００７０】
ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液分析装置から報告されるＭＣＨＣを使用して計算した。この場合、ＬＨＣＣ％が、ＬＨＣＣ％＝１／（１＋（ＥＸＰ（１．８＊（３０−ＭＣＨＣ））））＊１００の式によって定義され、強調ＬＨＣＣ％が、強調ＬＨＣＣ％＝ＳＱＲＴ（（１−（１／（１＋（ＥＸＰ（１．８＊（３０−ＭＣＨＣ）））））））＊１００の式によって定義された。
【００７１】
図４Ａおよび図４Ｂは、得られたＬＨＣＣ％対％Ｈｙｐｏ、および強調ＬＨＣＣ％対％Ｈｙｐｏをそれぞれ示した。示されるように、ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％はともに、％Ｈｙｐｏとの実質的に線形の相関を有した。線形回帰分析を、ＬＨＣＣ％と、％Ｈｙｐｏとの間、および強調ＬＨＣＣ％と、％Ｈｙｐｏとの間で行った。得られた相関係数（ｒ）がそれぞれ０．８９３８および０．８９５０であった。
【００７２】
受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を、１０％を越える％Ｈｙｐｏを上記のような基準として使用して、ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％に対して行った。得られたＲＯＣ曲線が図５Ａおよび図５Ｂに示された。統計学的データは、ＡＵＣ、標準誤差（ＳＥ）、ｐ値および９５％信頼区間を含めて、ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％の両方について同じであり、表１に示される。
【００７３】
示されるように、ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％は％Ｈｙｐｏと非常に相関した。ＡＵＣの値およびＲＯＣ曲線により、ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％が鉄欠乏の検出において％Ｈｙｐｏと類似する診断能を有したことが示された。ＬＨＣＣ％および強調ＬＨＣＣ％についてのカットオフ値がＲＯＣ分析から得られた。７．４５のカットオフを用いた場合、ＬＨＣＣ％は９３．３％の感度および９０．１％の特異性を有した。２７．３％のカットオフを用いた場合、強調ＬＨＣＣ％は９３．３％の感度および９０．１％の特異性を有した。
【００７４】
表１．ＭＣＨＣおよびＬＨＣＣ％（％Ｈｙｐｏ＞１０％）のＲＯＣ分析の統計学的データ
【００７５】
【表１】
2009524069.tif 000004
本発明は、特に好ましい実施形態を参照して記載されている。しかしながら、様々な変化が、本発明の精神から逸脱することなく、行われ得ることが理解され、そのような変化は、添付された請求項の範囲に含まれることが意図される。本発明は詳細に記載されており、また、添付された図面において図により示されているが、これらは、本発明の範囲に対する限定として解釈してはならず、むしろ、その好ましい実施形態として解釈しなければならない。しかしながら、様々な改変および変化が、上記の明細書において記載されるような、また、添付された請求項およびその合法的均等物において定義されるような本発明の精神および範囲において行われ得ることが明らかである。本明細書中に引用されるすべての特許および他の刊行物は特に参考として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】図１Ａは、赤血球分布および低色素性赤血球の分布のグラフによる例示である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のＭＣＨＣのシグモイド関数によって表される、赤血球分布および低ヘモグロビン濃度赤血球の分布のグラフによる例示である。
【図２】図２は、実施例において記載されるように、ＭＣＨＣのＲＯＣ曲線である。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例において記載されるように、ＭＣＨＣ対％Ｈｙｐｏの相関を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｙ軸の目盛りが拡大された、図３ＡのＭＣＨＣ対％Ｈｙｐｏの相関を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例において記載されるように、ＬＨＣＣ％対％Ｈｙｐｏの相関を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例において記載されるように、強調ＬＨＣＣ％対％Ｈｙｐｏの相関を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例において記載されるように、ＬＨＣＣ％のＲＯＣ曲線である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例において記載されるように、強調ＬＨＣＣ％のＲＯＣ曲線である。
【図１Ａ】
2009524069.tif 000005
【図１Ｂ】
2009524069.tif 000006
【図２】
2009524069.tif 000007
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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