(57)【要約】  ＣＭＰＤの発症に関連する新たな変異遺伝子、特に、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性にもかかわらずＣＭＰＤを発症する患者が有するＣＭＰＤの発症に関連する新たな変異遺伝子ならびにＣＭＰＤを評価する評価方法を提供する。ヒト由来生体試料中のＪＡＫ２遺伝子またはＥＰＯＲ遺伝子における下記変異を検出することにより、慢性骨髄増殖性疾患の可能性を評価する。（ａ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１１６番目のＧのＡへの変異、（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１２１番目〜２１２６番目のヌクレオチド残基の欠失、（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列における、１６４１番目のＣのＧへの変異。
2009060804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）〜（iii）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸からなる変異型核酸
（ｉ）下記（ａ）および（ｂ）のいずれか一方の変異を有するＪＡＫ２遺伝子または前記変異を有するその断片からなる核酸
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１１６番目のＧのＡへの変異
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１２１番目〜２１２６番目のヌクレオチド残基の欠失
（ii）下記（ｃ）の変異を有するＥＰＯＲ遺伝子または前記変異を有するその断片からなる核酸
（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列における、１６４１番目のＣのＧへの変異
（iii）前記（i）の核酸および（ii）の核酸の少なくとも一方に相補的な塩基配列からなる核酸
【請求項２】
下記（Ｉ）または（II）のいずれか一方のポリペプチドからなる変異型ポリペプチド。
（Ｉ）下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方の変異を有するＪＡＫ２タンパク質または前記変異を有するその断片からなるポリペプチド
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４１番目のＡｒｇのＬｙｓへの変異
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４３番目のＧｌｕおよび５４４番目のＡｓｐの欠失
（II）下記（Ｃ）の変異を有するＥＰＯＲタンパク質または前記変異を有するその断片からなるポリペプチド
（Ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列における、５０２番目のＰｒｏのＡｒｇへの変異
【請求項３】
請求の範囲１記載の変異型核酸を含む、慢性骨髄増殖性疾患のマーカー。
【請求項４】
請求の範囲２記載の変異型ポリペプチドを含む、慢性骨髄増殖性疾患のマーカー。
【請求項５】
生体試料中の核酸およびポリペプチドの少なくとも一方の変異を検出することにより、慢性骨髄増殖性疾患の可能性を評価する評価方法であって、
下記（Ｘ）および（Ｙ）のいずれか一方の工程を含むことを特徴とする評価方法。
（Ｘ）  前記試料中における請求の範囲１記載の変異型核酸の有無を検出する工程
（Ｙ）  前記試料中における請求の範囲２記載の変異型ポリペプチドの有無を検出する工程
【請求項６】
前記（Ｘ）工程において、前記試料中の核酸について、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を検出する、請求の範囲５記載の評価方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１１６番目のＧのＡへの変異
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１２１番目〜２１２６番目のヌクレオチド残基の欠失
（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列における、１６４１番目のＣのＧへの変異
【請求項７】
前記（Ｘ）工程において、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、請求の範囲１記載の変異型核酸にハイブリダイズ可能なプローブを使用し、
前記プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションにより、前記変異を検出する、請求の範囲５記載の評価方法。
【請求項８】
前記（Ｘ）工程において、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、請求の範囲１記載の変異型核酸にハイブリダイズ可能なプライマーを使用し、
前記試料中の核酸を鋳型とした核酸増幅反応により、前記変異を検出する、請求の範囲５記載の評価方法。
【請求項９】
前記プライマーが、その３’領域に、前記変異塩基または前記変異塩基に相補的な塩基を有する、請求の範囲８記載の評価方法。
【請求項１０】
前記（Ｙ）工程において、前記試料中のポリペプチドについて、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を検出する、請求の範囲５記載の評価方法。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４１番目のＡｒｇのＬｙｓへの変異
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４３番目のＧｌｕおよび５４４番目のＡｓｐの欠失
（Ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列における、５０２番目のＰｒｏのＡｒｇへの変異
【請求項１１】
前記（Ｙ）工程において、請求の範囲２記載の変異型ポリペプチドを抗原とする抗体を使用し、前記抗体と前記試料中のポリペプチドとの抗原抗体反応により、前記変異を検出する、請求の範囲５記載の評価方法。
【請求項１２】
前記試料が、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異が陰性の生体試料である、請求の範囲５記載の評価方法。
【請求項１３】
慢性骨髄増殖性疾患を評価するための評価用キットであって、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、請求の範囲１記載の変異型核酸にハイブリダイズ可能なプローブ、
および、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、請求の範囲１記載の変異型核酸にハイブリダイズ可能なプライマー
のいずれか一方を含むことを特徴とする評価用キット。
【請求項１４】
慢性骨髄増殖性疾患を評価するための評価用キットであって、
請求の範囲２記載の変異型ポリペプチドを抗原とする抗体を含むことを特徴とする評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄増殖性疾患（chronic  myeloproliferative  disorder；ＣＭＰＤ）に関連する新たな変異型核酸およびＣＭＰＤの評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な疾患について、遺伝子解析による診断が試みられている。この方法によれば、例えば、特定の遺伝子について特定の変異の有無を解析することで、発症の有無や発症の可能性を評価できる。このため、あらゆる疾患について、その発症との関連性を示す遺伝子変異の同定が行われている。【０００３】
真性多血症（polycythemia  vera；ＰＶ）、本態性血小板血症（essential  thrombocythemia；ＥＴ）、特発性骨髄線維症(idiopathic  myelofibrosis；ＩＭＦ）等の慢性骨髄増殖性疾患（ＣＭＰＤ）については、ＪＡＫ２（Janus  kinase２）遺伝子における特定の変異が、疾患に関連性のある変異として報告されている（非特許文献１〜４）。この変異は、ＪＡＫ２タンパク質の６１７番目のバリン（Ｖ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換する変異（ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ）であり、ＪＡＫ２遺伝子のＪＨ２領域に存在し、ｅｘｏｎ１２の７３番目のグアニン、すなわち、イントロンを除くＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の配列においては２３４３番目のグアニンが、チミンに置換されている。そして、この変異は、造血細胞の増加につながるＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路の活性化を引き起こすといわれており、実際に、西洋諸国においては、ＰＶ患者の６５〜９９％、ＥＴ患者の２３％〜７２％、および、ＩＭＦ患者の３５％〜５７％が、変異ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆを有していることが報告されている。【０００４】
しかしながら、患者の中には、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性を示すにもかかわらず、ＣＭＰＤを発症する場合がある。特に、日本人と西洋人とでは、例えば、ＰＶ患者やＥＴ患者等において、血栓事象、出血事象、急性白血病への移行等の臨床的特徴が異なり、また、日本人のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陽性患者がＣＭＰＤを発症する確率が、西洋人と比較して低いことが報告されている。
【非特許文献１】Tefferi  A.  Hematology  Am  Soc  Hematol  Educ  Program.  2006;  240-245.
【非特許文献２】Baxter  EJ,  Scott  LM,  Campbell  PJ,  et  al.  Lancet.  2005;  365:  1054-1061.
【非特許文献３】Kralovics  R,  Passamonti  F,  Buser  AS,  et  al.  N  Engl  J  Med.  2005;  352:  1779-1790.
【非特許文献４】Levine  RL,  Wadleigh  M,  Cools  J,  et  al.  Cancer  Cell.  2005;  7:  387-397.
【発明の開示】
【０００５】
そこで、本発明は、ＣＭＰＤに関連する新たな変異遺伝子、特に、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性の患者におけるＣＭＰＤに関連する新たな変異遺伝子、ならびに、その検出によりＣＭＰＤを評価するＣＭＰＤ評価方法の提供を目的とする。
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の変異型核酸は、下記（ｉ）〜（iii）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸からなることを特徴とする。
（ｉ）下記（ａ）および（ｂ）のいずれか一方の変異を有するＪＡＫ２遺伝子または前記変異を有するその断片からなる核酸
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１１６番目のＧのＡへの変異
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１２１番目〜２１２６番目のヌクレオチド残基の欠失
（ii）下記（ｃ）の変異を有するＥＰＯＲ遺伝子または前記変異を有するその断片からなる核酸
（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列における、１６４１番目のＣのＧへの変異
（iii）前記（i）の核酸および（ii）の核酸の少なくとも一方に相補的な塩基配列からなる核酸
【０００７】
本発明の変異型ポリペプチドは、下記（Ｉ）または（II）のいずれか一方のポリペプチドからなることを特徴とする。
（Ｉ）下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方の変異を有するＪＡＫ２タンパク質または前記変異を有するその断片からなるポリペプチド
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４１番目のＡｒｇのＬｙｓへの変異
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４３番目のＧｌｕおよび５４４番目のＡｓｐの欠失
（II）下記（Ｃ）の変異を有するＥＰＯＲタンパク質または前記変異を有するその断片からなるポリペプチド
（Ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列における、５０２番目のＰｒｏのＡｒｇへの変異
【０００８】
本発明のＣＭＰＤのマーカーは、本発明の変異型核酸または本発明の変異型ポリペプチドを含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のＣＭＰＤ評価方法は、生体試料中の核酸およびポリペプチドの少なくとも一方の変異を検出することにより、ＣＭＰＤの可能性を評価する評価方法であって、下記（Ｘ）および（Ｙ）のいずれか一方の工程を含むことを特徴とする。
（Ｘ）前記試料中における本発明の変異型核酸の有無を検出する工程
（Ｙ）前記試料中における本発明の変異型ポリペプチドの有無を検出する工程
【００１０】
本発明の評価用キットは、ＣＭＰＤを評価するための評価用キットであって、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、本発明の変異型核酸にハイブリダイズ可能なプローブ、および、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、本発明の変異型核酸にハイブリダイズ可能なプライマーのいずれか一方を含むことを特徴とする。また、本発明の評価用キットは、本発明の変異型ポリペプチドを抗原とする抗体を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ヒトＪＡＫ２（Janus  kinase２）遺伝子およびヒトＥＰＯＲ（erythropoietin  receptor）遺伝子において、ＣＭＰＤに関連する新たな変異を見出し、本発明に到った。本発明の変異型核酸やその発現産物である変異型ポリペプチドは、ＣＭＰＤと関連することからＣＭＰＤのマーカーとして使用できる。そして、これを検出することによって、ＣＭＰＤ発症の可能性を評価することが可能となる。特に、これらの変異は、従来報告されているＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆが陰性であるＣＭＰＤ患者において検出されたことから、本発明の変異型核酸や変異型ポリペプチドの検出によって、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆの検出では評価できなかったＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性の患者についても、ＣＭＰＤ発症の可能性を評価することが可能となった。このため、例えば、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆと本発明における変異とを組み合わせて検出することにより、より一層正確な評価が可能になる。したがって、本発明は、臨床医療の分野等において、極めて有用な技術といえる。なお、本発明における変異ならびに変異と疾患との関連性は、本発明者らが初めて見出したものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、ＪＡＫ２遺伝子の模式図ならびに変異部位を示す図である。
【図２】図２は、前記実施例１における、ＥＰＯＲ遺伝子の模式図ならびに変異部位を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、慢性骨髄増殖性疾患（ＣＭＰＤ）としては、例えば、特発性骨髄線維症（idiopathic  myelofibrosis；ＩＭＦ）、原発性骨髄線維症（primary  myelofibrosis；ＰＭＦ）等の骨髄線維症（myelofibrosis  with  myeloid  metaplasia；ＭＭＭ）、真性赤血球増加症、真性多血症（ＰＶ）、続発性絶対的赤血球増加症、二次性多血症（secondary  absolute  polycythemia）、ストレス赤血球増加症、ストレス多血症（stress  polycythemia）等の赤血球増加症，多血症（polycythemia）、本態性血小板血症（essential  thrombocythemia；ＥＴ）、好酸球増加症候群（hyper  eosinophilic  syndrome：ＨＥＳ）等があげられる。【００１４】
＜変異型核酸およびマーカー＞
本発明の変異型遺伝子は、前述のように、下記（ｉ）〜（iii）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸からなることを特徴とする。
（ｉ）下記（ａ）および（ｂ）のいずれか一方の変異を有するＪＡＫ２遺伝子または前記変異を有するその断片からなる核酸
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１１６番目のＧのＡへの変異
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１２１番目〜２１２６番目のヌクレオチド残基の欠失
（ii）下記（ｃ）の変異を有するＥＰＯＲ遺伝子または前記変異を有するその断片からなる核酸
（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列における、１６４１番目のＣのＧへの変異
（iii）前記（i）の核酸および（ii）の核酸の少なくとも一方に相補的な塩基配列からなる核酸【００１５】
本発明者らによって新たに見出された遺伝子の変異（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、（ａ）ヒトＪＡＫ２遺伝子の置換変異、（ｂ）ヒトＪＡＫ２遺伝子の欠失変異、および、前記（ｃ）ＥＰＯＲ遺伝子の置換変異である。前記配列番号１の塩基配列は、ＪＡＫ２遺伝子のＤＮＡ配列（センス鎖）であり、イントロンを除いたｃＤＮＡ配列である。前記配列番号１の塩基配列において、塩基ｔが塩基ｕである配列は、ＪＡＫ２遺伝子のイントロンがスプライシングされた成熟ｍＲＮＡの配列である。前記配列番号１の塩基配列において、４９５番目〜３８９３番目の領域がＣＤＳである。前記ＣＤＳの塩基配列を配列番号３に示す。ＪＡＫ２遺伝子の配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４９７２に登録されている。他方、前記配列番号４の塩基配列は、ＥＰＯＲ遺伝子のＤＮＡ配列（センス鎖）であり、イントロンを除いたｃＤＮＡ配列である。前記配列番号１の塩基配列において、塩基ｔが塩基ｕである配列は、ＥＰＯＲ遺伝子のイントロンがスプライシングされた成熟ｍＲＮＡの配列である。前記配列番号４の塩基配列において、１３７番目〜１６６３番目の領域がＣＤＳである。前記ＣＤＳの塩基配列を配列番号６に示す。配列番号６において、１〜７２番目の塩基配列が、ＥＰＯＲタンパク質のシグナル部分のコード配列であり、７３〜１５２７番目の塩基配列が、成熟ＥＰＯＲタンパク質のコード配列である。ＥＰＯＲ遺伝子の配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０００１２１に登録されている。【００１６】
本発明の変異型核酸が翻訳された際には、前記（ａ）の変異により、ＪＡＫ２タンパク質の全長アミノ酸配列における５４１番目のＡｒｇはＬｙｓに変換され、前記（ｂ）の変異により、ＪＡＫ２タンパク質の全長アミノ酸配列における５４３番目のＧｌｕおよび５４４番目のＡｓｐは欠失する。また、本発明の変異型核酸が翻訳された際には、前記（ｃ）の変異により、ＥＰＯＲタンパク質の全長アミノ酸配列における５０２番目のＰｒｏはＡｒｇに変換される。以下、前記（ａ）の変異を、「Ｒ５４１Ｋ」または「ＪＡＫ２Ｒ５４１Ｋ」、前記（ｂ）の変異を、「Ｅ５４３−Ｄ５４４  ｄｅｌ」または「ＪＡＫ２Ｅ５４３−Ｄ５４４  ｄｅｌ」、前記（ｃ）の変異を、「Ｐ４７８Ｒ」または「ＥＰＯＲＰ４７８Ｒ」ともいう。【００１７】
前記（ａ）〜（ｃ）において、配列番号１または４の塩基配列は、ＪＡＫ２遺伝子またはＥＰＯＲ遺伝子における新たな変異の部位を特定するための記載であって、本発明の変異型核酸の配列は、それぞれの全長配列に限定されるものではない。したがって、本発明の変異型核酸は、前述のいずれかの変異を有する限りにおいて、配列番号１または４の塩基配列からなる全長遺伝子であってもよいし、その部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。具体例としては、例えば、配列番号３や配列番号６に示すＣＤＳやその部分配列からなるポリヌクレオチドもあげられる。前記（ｉ）の断片としては、例えば、配列番号１に記載の塩基配列において、２１１６番目の塩基（Ａ）を含む５〜１０，０００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられ、好ましくは、８〜１，０００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、より好ましくは、１０〜１００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。また、前記（ii）の断片としては、例えば、配列番号４に記載の塩基配列において、２１２１番目〜２１２６番目のヌクレオチド残基の欠失を含む５〜１０，０００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられ、好ましくは、８〜１，０００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、より好ましくは、１０〜１００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。また、本発明の変異型核酸は、例えば、ＪＡＫ２遺伝子のアンチセンス鎖またはその断片からなる核酸でもよいし、ＥＰＯＲ遺伝子のアンチセンス鎖またはその断片からなる核酸であってもよい。この場合、本発明の変異型核酸としては、前記（iii）に示すように、前記（ｉ）の核酸および（ii）の核酸の少なくとも一方に相補的な塩基配列からなる核酸があげられる。【００１８】
また、本発明における変異型核酸には、前述のいずれかの変異を有する限りにおいて、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子、配列番号３に示すイントロン配列を含まない塩基配列からなる遺伝子、それらの断片、および、配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子、配列番号６に示すイントロン配列を含まない塩基配列からなる遺伝子またはそれらの断片だけなく、例えば、イントロンを含む遺伝子、その断片または、それらの相補的塩基配列からなる核酸であってもよい。【００１９】
さらに、本発明の変異型核酸は、ＤＮＡには限られず、例えば、ＲＮＡであってもよい。本発明の変異型核酸が変異型ＲＮＡの場合、例えば、前述のように、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６の塩基配列において、「ｔ」は「ｕ」であってもよい。【００２０】
また、前記変異型核酸は、例えば、前記試料に元来含まれるＤＮＡまたはＲＮＡでもよい。また、ＤＮＡは、例えば、前記試料に元来含まれるＤＮＡからＰＣＲ等の核酸増幅法によって合成されたＤＮＡでもよいし、前記試料に元来含まれるＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）等により合成したｃＤＮＡであってもよい。【００２１】
つぎに、本発明の慢性骨髄増殖性疾患マーカーは、本発明の変異型核酸を含むことを特徴とする。前述のように、本発明の変異型核酸における変異は、慢性骨髄増殖性疾患の発症と関連性を示すことから、本発明の変異型核酸は、慢性骨髄増殖性疾患のマーカーとして使用できる。このため、後述するように、例えば、その存在の有無を検出することによって、前記疾患の発症および発症可能性を評価することができる。【００２２】
＜変異型ポリペプチド＞
本発明の変異型ポリペプチドは、前述のように、下記（Ｉ）または（II）のいずれか一方のポリペプチドからなることを特徴とする。この変異型ポリペプチドは、例えば、前述の本発明の変異型核酸の発現産物である。
（Ｉ）  下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方の変異を有するＪＡＫ２タンパク質または前記変異を有するその断片からなるポリペプチド
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４１番目のＡｒｇのＬｙｓへの変異
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４３番目のＧｌｕおよび５４４番目のＡｓｐの欠失
（II）  下記（Ｃ）の変異を有するＥＰＯＲタンパク質または前記変異を有するその断片からなるポリペプチド
（Ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列における、５０２番目のＰｒｏのＡｒｇへの変異【００２３】
本発明者らによって新たに見出されたポリペプチドの変異（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ、（Ａ）ヒトＪＡＫ２タンパク質の置換変異、（ｂ）ヒトＪＡＫ２タンパク質の欠失変異、および、前記（ｃ）ＥＰＯＲタンパク質の置換変異である。前記配列番号２のアミノ酸配列は、ＪＡＫ２タンパク質のアミノ酸配列であり、この配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４９７２に登録されている。前記配列番号５のアミノ酸配列は、ＥＰＯＲタンパク質のアミノ酸配列であり、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０００１２１に登録されている。前記配列番号５において、１〜２４番目のアミノ酸配列が、ＥＰＯＲタンパク質のシグナル配列であり、２５番目〜５０８番目がシグナル配列を除く成熟ＥＰＯＲタンパク質の配列である。【００２４】
前記（Ａ）〜（Ｃ）において、配列番号２または５のアミノ酸配列は、変異の部位を特定するための記載であって、本発明の変異型ポリペプチドの配列は、それぞれの全長配列に限定されるものではない。したがって、本発明の変異型ポリペプチドは、前述のいずれかの変異を有する限りにおいて、配列番号２または５のアミノ酸配列からなる全長ポリペプチド（タンパク質）であってもよいし、その部分配列からなるポリペプチド断片であってもよい。また、具体例として、配列番号５の２５〜５０８番目の成熟ＥＰＯＲタンパク質や、その部分配列からなるポリペプチド断片もあげられる。【００２５】
つぎに、本発明の慢性骨髄増殖性疾患マーカーは、本発明の変異型ポリペプチドを含むことを特徴とする。前述のように、本発明の変異型ポリペプチドにおける変異は、慢性骨髄増殖性疾患の発症と関連性を示すことから、本発明の変異型ポリペプチドは、慢性骨髄増殖性疾患のマーカーとして使用できる。このため、後述するように、その存在の有無を検出することによって、前記疾患の発症および発症可能性を評価することができる。【００２６】
＜ＣＭＰＤ評価方法＞
本発明のＣＭＰＤ評価方法は、生体試料中の核酸およびポリペプチドの少なくとも一方の変異を検出することにより、ＣＭＰＤの可能性を評価する評価方法であって、下記（Ｘ）および（Ｙ）のいずれか一方の工程を含むことを特徴とする。
（Ｘ）  前記試料中における本発明の変異型核酸の有無を検出する工程
（Ｙ）  前記試料中における本発明の変異型ポリペプチドの有無を検出する工程【００２７】
本発明においては、本発明の変異型核酸および変異型ポリペプチドのいずれの検出を行ってもよい。本発明の変異型核酸または変異型ポリペプチドが検出された際には、例えば、ＣＭＰＤである、もしくは、ＣＭＰＤの可能性があると判断でき、検出されなかった場合には、例えば、ＣＭＰＤの可能性が低い、もしくは、可能性がないと判断できる。なお、本発明の変異型核酸を検出する方法および変異型ポリペプチドを検出する方法は、いずれも特に制限されず、従来公知の変異の検出方法が採用できる。【００２８】
本発明に供する試料は、特に制限されないが、例えば、白血球細胞等の血球試料、全血試料、骨髄試料等があげられる。また、前記試料は、例えば、ヒトまたはヒトを除く哺乳類等の生体試料であることが好ましい。【００２９】
以下に、（Ｘ）工程および（Ｙ）工程のそれぞれについて説明するが、これらは一例であって、本発明を制限するものではない。【００３０】
（第１の実施形態）
第１の実施形態として、前記（Ｘ）工程、すなわち、前記試料中における本発明の変異型核酸の有無を検出する工程の一例について説明する。【００３１】
前記試料中における変異型核酸の有無は、例えば、前記試料中の核酸について、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を検出することによって行うことができる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１１６番目のＧのＡへの変異
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列における、２１２１番目〜２１２６番目のヌクレオチド残基の欠失
（ｃ）配列番号４に記載の塩基配列における、１６４１番目のＣのＧへの変異【００３２】
前記変異の検出は、いずれか一つについて行ってもよいし、二つ以上または全てについて行ってもよい。また、前記（ａ）と（ｂ）の変異は、ともに検出することが好ましい。【００３３】
前記変異は、例えば、前記変異を含む領域に特異的にハイブリダイズ可能なプローブを用いて、前記プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションを行うことによって検出できる。この場合、前記プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイズが確認された際には、変異を有すると判断でき、ハイブリダイズが確認されなかった際には、変異を有さないと判断できる。前記プローブとしては、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、前記変異を含む変異型核酸にハイブリダイズ可能なプローブがあげられる。このような検出方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｔｍ解析法等があげられる。【００３４】
また、前記変異は、例えば、前記変異を含む領域に特異的にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて、前記試料中の核酸を鋳型とした核酸増幅反応を行うことにより検出できる。この場合、核酸増幅反応により増幅産物が得られた際には、変異を有すると判断でき、増幅産物が得られなかった際には、変異を有さないと判断できる。前記プライマーとしては、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、前記変異を含む変異型核酸にハイブリダイズ可能なプライマーがあげられる。このような方法としては、例えば、ＡＳＰ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）−ＰＣＲ法等があげられる。この場合、前記プライマーとしては、例えば、その３’領域、特に３’末端または３’末端から１塩基目もしくは２塩基目の部位に、前記変異塩基または前記変異塩基に相補的な塩基を有するプライマーを使用することが好ましい。【００３５】
この他にも、前記試料中の核酸について、検出目的の変異が生じる部位を含む領域を増幅させ、増幅産物の全塩基配列を解析するＤｉｒｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、前記増幅産物を温度勾配カラム中でＨＰＬＣを行い、溶出される時間によって変異の有無を検出するＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ＨＰＬＣ法等があげられる。【００３６】
前記核酸増幅方法は、何ら制限されず、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  acid  sequence  based  amplification）法、ＴＭＡ（Transcription−mediated  amplification）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法等があげられる。なお、核酸増幅反応の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。【００３７】
（第２の実施形態）
第２の実施形態として、前記（Ｙ）工程、すなわち、前記試料中における本発明の変異型ポリペプチドの有無を検出する工程の一例について説明する。【００３８】
前記試料中における変異型ポリペプチドの有無は、例えば、前記試料中のポリペプチドについて、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を検出することによって行うことができる。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４１番目のＡｒｇのＬｙｓへの変異
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列における、５４３番目のＧｌｕおよび５４４番目のＡｓｐの欠失
（Ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列における、５０２番目のＰｒｏのＡｒｇへの変異【００３９】
前記変異の検出は、いずれか一つについて行ってもよいし、二つ以上または全てについて行ってもよい。また、前記（Ａ）と（Ｂ）の変異は、ともに検出することが好ましい。【００４０】
ポリペプチドにおける変異は、例えば、本発明の変異型ポリペプチドを抗原とする抗体を使用し、前記抗体と前記試料中のポリペプチドとの抗原抗体反応により検出できる。この場合、前記抗体と前記試料中のポリペプチドとの抗原抗体反応が確認された際には、変異を有すると判断でき、抗原抗体反応が確認されなかった際には、変異を有さないと判断できる。抗体の種類は、特に制限されず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等が使用できる。抗原抗体反応の手法としては、制限されず、イムノブロッティング法、免疫細胞化学法等があげられる。【００４１】
＜ＣＭＰＤ評価用キット＞
本発明のＣＭＰＤ評価用キットとしては、例えば、本発明の変異型核酸の検出に利用できる第１の評価用キットと、本発明の変異型ポリペプチドの検出に利用できる第２の評価用キットがあげられる。【００４２】
本発明の第１の評価用キットは、前述のように、慢性骨髄増殖性疾患を評価するための評価用キットであって、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって且つ本発明の変異型核酸にハイブリダイズ可能なプローブ、および、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つの変異を含むポリヌクレオチドまたはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって且つ本発明の変異型核酸にハイブリダイズ可能なプライマーのいずれか一方を含むことを特徴とする。また、本発明の第２の評価用キットは、前述のように、本発明の変異型ポリペプチドを抗原とする抗体を含むことを特徴とする。これらの本発明の評価用キットを使用することにより、本発明のＣＭＰＤ評価方法を簡便且つ容易に行うことができる。なお、プライマー、プローブおよび抗体は、前述と同様である。【００４３】
前記本発明の第１の評価用キットの構成は、特に制限されないが、例えば、さらに、核酸増幅に必要な、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、各種添加剤等を含んでもよい。また、本発明の第２の評価用キットの構成も、特に制限されないが、例えば、さらに、前記抗体を検出するための二次抗体や、抗体に付加した標識を検出するための酵素や基質等を含んでもよい。また、本発明の評価用キットは、さらに使用説明書を含んでもよい。
【実施例】
【００４４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。【００４５】
［実施例１］
公知の基準で診断したＰＶ患者（ｎ＝５２）、ＥＴ患者（ｎ＝５５）、ＩＭＦ患者（ｎ＝３）、ＣＭＰＤ−ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ（ＣＭＰＤ−Ｕ）患者（ｎ＝１５）および好酸球増加症候群（hyper  eosinophilic  syndrome：ＨＥＳ）（ｎ＝５）の計１３０名の患者から、ゲノムＤＮＡを調製した。また、健常者からゲノムＤＮＡを調製した。なお、患者のゲノムＤＮＡは、患者より採取した骨髄のバフィーコートから、健常者のゲノムＤＮＡは、健常者より採取した末梢血顆粒球から、それぞれＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商品名、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。なお、健常者ゲノムＤＮＡは、正常コントロールとして使用し、変異分析装置（アークレイ社製）を用いて、変異や多型の分析を行った。【００４６】
患者１３０人のゲノムＤＮＡについて、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆの変異を解析するために、常法（Baxter  EJ，et  al．Acquired  mutation  of  the  tyrosine  kinase  JAK2  in  human  myeloproliferative  disorders．Lancet．2005;365:1054-1061）にしたがって、ＡＳＰ−ＰＣＲ法ならびにＤｉｒｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法を行った。そして、ＰＣＲ産物を、TOPO  TA  cloning  kit（商品名；Invitrogen社製）を用いて、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクターに導入し、得られた組換えプラスミドのシークエンスにより、前記ＰＣＲ産物の配列を確認した。【００４７】
前述の分析により、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆは、５２人のＰＶ患者のうち３１人（５９．６％）、５５人のＥＴ患者のうち２８人（５０．９％）、３人のＩＭＦのうち１人（３３．３％）、１５人のＣＭＰＤ−Ｕ患者のうちの５人（３３．３％）、５人のＨＥＳ患者のうちの１人（２０％）で確認された。この結果から、前述のように、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陽性の日本人ＰＶ患者の発症率（５９．６％）は、西洋人の発症率（６５〜９９％）と比較して低いことが確認された。【００４８】
続いて、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性であるＣＭＰＤ患者のゲノムＤＮＡについて、変異の解析を行った。その結果、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性ＰＶ患者から、配列番号１における２１１６番目（配列番号３のＣＤＳにおける１６２１番目）のヌクレオチド残基でＧがＡに置換され（ＪＡＫ２Ｒ５４１Ｋ）、配列番号１における２１２１〜２１２６番目（配列番号３のＣＤＳにおける１６２５〜１６３０番目）のヌクレオチド残基（計６ｂｐ）が欠失している変異（ＪＡＫ２Ｅ５４３−Ｄ５４４  ｄｅｌ）が確認された。【００４９】
図１に、ＪＡＫ２遺伝子の部分領域の模式図ならびにシークエンス結果を示す。図１において、矢印は、新たに見出された変異（ＪＡＫ２Ｒ５４１Ｋ  Ｅ５４３−Ｄ５４４  ｄｅｌ）の位置を示す。図１において、左側の塩基配列が、野生型対立遺伝子の配列であり、右側の塩基配列が、変異型対立遺伝子の配列である。また、下線部を付したコドンが変異の生じるコドンである。図１に示すように、ＪＡＫ２Ｒ５４１ＫおよびＪＡＫ２Ｅ５４３−Ｄ５４４  ｄｅｌは、ＪＡＫ２遺伝子のエクソン１２（非転写領域のエクソン１および２を含めた場合は、エクソン１４）内であって、ＳＨ２ドメインとＰｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ１ドメインとの間に存在する新規の変異である。この変異は、既に報告されている欠失変異と隣接していた（Scott  LM，et  al．JAK2  exon  12  mutations  in  polycythemia  vera  and  idiopathic  erythrocytosis.  N  Engl  J  Med.  2007;356:459-468.）。なお、配列番号１における２１１６番目のＧがＡに置換されることで、配列番号２における５４１番目のアミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）からリジン（Ｌ）に変換される。健常者からは、これらの変異ＪＡＫ２Ｒ５４１Ｋ、ＪＡＫ２Ｅ５４３−Ｄ５４４  ｄｅｌは検出されなかった。【００５０】
変異が検出された一人の患者について、臨床的特徴を下記表１に示す。その結果、下記表１に示すように、この患者はＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性ＰＶ患者であるが、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陽性患者と同様に、ＰＶに典型的な臨床的特徴を示していることが確認できた。【００５１】
【表１】
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【００５２】
つぎに、前記ＣＭＰＤ患者について、ＥＰＯＲ遺伝子の全シークエンスを行った。その結果、２人のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性ＥＴ患者から、配列番号３における１６４１番目（配列番号６のＣＤＳにおける１５０５番目）のヌクレオチド残基でＣがＧに置換された変異（ＥＰＯＲＰ５０２Ｒ）が確認された。【００５３】
図２に、ＥＰＯＲ遺伝子の部分領域の模式図ならびにシークエンス結果を示す。太い矢印は、新たに見出された変異（ＥＰＯＲＰ４７８Ｋ）の位置を示し、Ｙは、遺伝子におけるチロシン残基の位置を示す。図中の塩基配列が、野生型対立遺伝子の配列であり、下線部のコドンが変異の生じるコドンであり、ＣＣＣがＣＧＣに変異する。同図に示すように、ＥＰＯＲＰ５０２Ｒは、プロリンからアルギニンに変換される。この変異は、ＥＰＯＲ遺伝子の細胞質ドメインのネガティブ調整領域であるエクソン８に存在する新規の変異である。なお、配列番号３における１６４１番目のＣがＧに置換されることで、配列番号４における５０２番目のアミノ酸残基は、プロリンからアルギニンに変換される。健常者からは、この変異ＥＰＯＲＰ５０２Ｒは検出されなかった。【００５４】
以上のように、ＪＡＫ２Ｒ５４１Ｋ、ＪＡＫ２Ｅ５４３−Ｄ５４４  ｄｅｌ、および、ＥＰＯＲＰ５０２Ｒは、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性ＣＭＰＤ患者から見出されたことから、これらの変異の検出によれば、これまで評価ができなかったＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性の検体についても、ＣＭＰＤの可能性を評価することが可能になる。なお、これらの変異は、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性ＣＭＰＤ患者から新たに見出されたことから、二次変異には該当しないと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
以上のように、本発明の変異型核酸やその発現産物である変異型ポリペプチドは、ＣＭＰＤと関連することからＣＭＰＤのマーカーとして使用できる。そして、これを検出することによって、ＣＭＰＤ発症の可能性を評価することが可能となる。特に、これらの変異は、従来報告されているＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆが陰性であるＣＭＰＤ患者において検出されたことから、本発明の変異型核酸や変異型ポリペプチドの検出によって、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆの検出では評価できなかったＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性の患者についても、ＣＭＰＤ発症の可能性を評価することが可能となった。したがって、本発明は、臨床医療の分野等において、極めて有用な技術といえる。なお、本発明における変異ならびに変異と疾患との関連性は、本発明者らが初めて見出したものである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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