(57)【要約】  本発明は、カスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することによって腫瘍細胞へ死を引き起こすことが可能な系に関し、その系はＩ．単一組成物中に組み合わされて、リナマラーゼによってリナマリンにもたらされる酵素活性を含んでなるシアン化物生成系、およびグルコースオキシダーゼ酵素による酸化活性を含んでなる酸化的ストレス誘導系、またはII．独立した組成物中に存在する、リナマラーゼによってリナマリンにもたらされる酵素活性を含んでなるシアン化物生成系、およびグルコースオキシダーゼ酵素によってもたらされる酸化活性を含んでなる酸化的ストレス誘導系を含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアン化物生成系と酸化的ストレス誘導系とを含んでなる、カスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することにより腫瘍細胞の死を引き起こすことが可能な系。
【請求項２】
請求項１に記載のカスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することにより腫瘍細胞の死を引き起こすことが可能な系が、
ａ．単一組成物中に組み合わされたシアン化物生成系および酸化的ストレス誘導系、または
ｂ．独立した組成物中に存在するシアン化物生成系および酸化的ストレス誘導系
を含んでなる系。
【請求項３】
前記シアン化物生成系が、リナマラーゼ−リナマリン系を含んでなる、請求項２に記載の系。
【請求項４】
前記酸化的ストレス誘導系が、グルコースオキシダーゼ酵素の活性を含んでなる、請求項２に記載の系。
【請求項５】
前記シアン化物生成系が、リナマラーゼ−リナマリン系を含んでなり、かつ前記酸化的ストレス誘導系が、グルコースオキシダーゼ酵素の活性を含んでなる、請求項２に記載の系。
【請求項６】
単一のウイルスまたは非ウイルスベクター中に組み合わされたリナマラーゼ遺伝子およびグルコースオキシダーゼ遺伝子を含んでなる、請求項２に記載の系。
【請求項７】
独立したウイルスまたは非ウイルスベクター中にリナマラーゼ遺伝子およびグルコースオキシダーゼ遺伝子を含んでなる、請求項２に記載の系。
【請求項８】
ウイルスまたは非ウイルスベクター中に導入されたリナマラーゼ遺伝子と、精製グルコースオキシダーゼタンパク質または前記タンパク質の類似体、断片もしくは誘導体とを含んでなる、請求項２．ａに記載の組成物。
【請求項９】
ウイルスまたは非ウイルスベクター中に導入されたリナマラーゼ遺伝子と、精製グルコースオキシダーゼタンパク質または前記タンパク質の類似体、断片もしくは誘導体とを含んでなる、請求項２．ｂに記載の組成物。
【請求項１０】
ウイルスまたは非ウイルスベクター中に導入されたグルコースオキシダーゼ遺伝子と、精製リナマラーゼタンパク質または前記タンパク質の類似体、断片もしくは誘導体とを含んでなる、請求項２．ａに記載の組成物。
【請求項１１】
ウイルスまたは非ウイルスベクター中に導入されたグルコースオキシダーゼ遺伝子と、精製リナマラーゼタンパク質または前記タンパク質の類似体、断片もしくは誘導体とを含んでなる、請求項２．ｂに記載の組成物。
【請求項１２】
精製グルコースオキシダーゼタンパク質および精製リナマラーゼタンパク質またはそれらのタンパク質の類似体、断片もしくは誘導体を含んでなる、請求項２．ａに記載の組成物。
【請求項１３】
精製グルコースオキシダーゼタンパク質および精製リナマラーゼタンパク質またはそれらのタンパク質の類似体、断片もしくは誘導体を含んでなる、請求項２．ｂに記載の組成物。
【請求項１４】
療法に用いるための、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
腫瘍の治療に用いられる医薬組成物を製造するための、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の医薬組成物、および薬学上許容される担体。
【請求項１７】
制御放出系をさらに含んでなる、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記タンパク質のいずれかまたは両方が腫瘍抗原に対する抗体に結合されている、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１９】
乳癌の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
肺癌の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
頭頸部癌の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
膵臓癌の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前立腺癌の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
結腸癌の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
黒色腫の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
骨肉腫の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
腺癌の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
白血病の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
膠芽腫の治療を目的とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記シアン化物生成系と酸化的ストレス誘導系との組合せを含んでなり、カスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することにより腫瘍細胞の死を引き起こすためのin vitroにおける方法。
【請求項３１】
前記シアン化物生成系が、リナマラーゼ−リナマリン系を含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記酸化的ストレス誘導系が、グルコースオキシダーゼ酵素の活性を含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記酸化的ストレス誘導系が、グルコースオキシダーゼ酵素の活性を含んでなり、かつ前記シアン化物生成系が、リナマラーゼ−リナマリン系を含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
リナマラーゼおよび／またはグルコースオキシダーゼ酵素遺伝子を含んでなる１つのベクター／複数のベクターが使用される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
精製リナマラーゼおよび／またはグルコースオキシダーゼタンパク質またはそれらのタンパク質の誘導体、類似体もしくは断片のいずれかが使用される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質のいずれかまたは両方のタンパク質が、制御放出系に挿入されている、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質のいずれかまたは両方のタンパク質が、腫瘍抗原に対して特異的な抗体に結合されている、請求項３４または３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、シアン化物生成系(cyanogenic system)と酸化的ストレス誘導系との間で確立された相乗活性を含む、腫瘍細胞を死滅させることができる組成物および方法に関する。
【０００２】
先行技術水準
リナマラーゼ−リナマリン系は、無害のリナマリン基質（ｌｉｎ，２−ヒドロキシ−イソブチロニトリル−β−Ｄ−グルコピラノシド）を変換して、アセトンシアノヒドリンとグルコースを生成することができるβ−グルコシダーゼをコードする植物起源の遺伝子（リナマラーゼ，ｌｉｓ）の利用に基づいている(Cortes, et al., 1998, Hughes, et al 1992; Cortes, et al., 2002)。アセトンシアノヒドリンは、６を上回るｐＨ、そして３０℃より高い温度では不安定であり、自然にアセトンとシアン化物に変換される(Selmar, et al., 1987)。リナマラーゼ遺伝子は、レトロウイルスベクター、（例えば、ネズミ白血病ウイルス，ＭＬＶ，誘導体）アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５誘導体）または非ウイルスベクター（プラスミドトランスフェクション）を用いて標的細胞に導入される。この遺伝子が哺乳類細胞で発現されるとリナマラーゼは細胞の外部に輸送され、そこでリナマラーゼがそのリナマリン基質と遭遇し、シアン化物が生成される(Cortes, et al., 2002)。シアン化物は、細胞膜を通って自由に拡散する能力を有し(Wisler, et al., 1991)、リナマラーゼを生成する細胞だけでなく周囲の細胞にも作用するため、この系は治療可能性を高める付随作用に関係している。シアン化物はシトクロムｃオキシダーゼ酵素と結合し、不活性化する能力を有し、酸化的リン酸化の電子伝達系を遮断し、ミトコンドリア呼吸機能に悪影響を及ぼす。これはミトコンドリア内での活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を増加させ、同時に、酸化的リン酸化によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）形態でのエネルギー生産を遮断する。
【０００３】
酸化的リン酸化の遮断によるＡＴＰの細胞内レベルの迅速な枯渇は壊死による細胞死を誘導する。しかしながら、この遮断によって起こる酸化的ストレスは限られているため、本発明では、この療法を、グルコースのグルコン酸への変換を触媒し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を発生させるグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）を用いた局所治療を併用した。Ｈ２Ｏ２の増加によって活性酸素種（ＲＯＳ）の発生が促進され、この活性酸素種の過剰が腫瘍細胞に悪影響を及ぼす。
【０００４】
これまで遺伝子療法におけるリナマラーゼ／リナマリン系の使用を記載している様々な文献が報告されてきた。また、グルコースオキシダーゼの細胞傷害効果もすでに記載されており、一方の酵素がグルコースオキシダーゼであり、もう一方のものがペルオキシダーゼである酵素−抗体コンジュゲートに基づいた悪性腫瘍に対する治療的組合せもある。
【０００５】
しかしながら、前の説明および知識に基づき、そして下記説明で明らかなように、本発明の技術は、ｌｉｓ／ｌｉｎとＧＯの両方の系の組合せについてはこれまでに記載されていないという事実に基づいている。前記相乗活性に基づき、リナマラーゼ／リナマリン系と組み合わせてグルコースオキシダーゼ系を使用すると、腫瘍細胞において得られる酸化的ストレスレベルが著しく高まるため、リナマラーゼ／リナマリン系の治療力は増強される。
【０００６】
よって、本発明の一態様では、ベクターを使用して、腫瘍細胞内にリナマラーゼ遺伝子とグルコースオキシダーゼ酵素を導入する。こうすることで腫瘍細胞を取り囲む領域に２つの系、シアン化物生成系ともう１つの酸化的ストレス誘導系を作り出し、それらの系が相乗的に作用することによって、カスパーゼ非依存性アポトーシスの活性化による腫瘍細胞の早期死滅をもたらす。
【０００７】
ｌｉｓ／ｌｉｎとＧＯの両方の系の組合せは、明確な相乗反応を起こし、一方では、シアン化物によって起こる酸化的リン酸化の遮断、もう一方では、グルコースオキシダーゼによってもたらされるＨ２Ｏ２、の結果としてＲＯＳを生成する。よって、酸化的ストレスが細胞死開始シグナルであることから、それを癌を治療するための戦略として用いる。
【０００８】
この技術の重要性は、両方の系の組合せでは、両方の系が別々に作用した際の応答の単なる足し算で観察される効果を十分に上回り、酸化的ストレスの生成において顕著な相乗効果をもたらすという事実に基づいている。ｌｉｓ／ｌｉｎ系を用いるだけでまたはＧＯを添加するだけで処置したときに腫瘍細胞で観察される死に対し、両方の系を組み合わせることで、腫瘍細胞死の明らかな時間前進が生じる。
【０００９】
この組合せは、さらに、ＡＩＦおよびＰＡＲＰ（ポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ）と無関係であるため、これまでに分かっているものとは異なる機構によって、死の種類を壊死からカスパーゼ非依存性アポトーシスへと切り替えもする。
【００１０】
本発明はさらに、グルコースオキシダーゼ系を含めることに関していくつかの可能性を提供する。加えて、グルコースオキシダーゼ遺伝子は、ウイルスまたは非ウイルスベクターを通じて腫瘍細胞に導入することができた。もう１つの考えられる改善は、制御放出系を利用してまたは腫瘍抗原に対する抗体に結合された組換えタンパク質の使用によって精製酵素を接種することである。
【００１１】
最も伝統的な療法、例えば化学療法および放射線療法が失敗に終わるのは、腫瘍細胞は、それらの腫瘍細胞を前記治療、特にカスパーゼ依存性アポトーシスにより死を促進する治療に対して抵抗性とする突然変異、例えば、カスパーゼ、ｐ５３などに対応する遺伝子における突然変異を蓄積するためである。そのため、腫瘍細胞が獲得する抵抗性に打ち勝つことができる新規療法、例えば本発明に記載のものなどのカスパーゼ非依存性死の一種を起こす系を開発する必要がある。細胞でのｌｉｓ／ｌｉｎ／ＧＯ療法併用系によって酸化的ストレスの驚くべき増加が起こり、それが迅速なミトコンドリアの断片化を引き起こすことが可能な戦略であり、カスパーゼ非依存性アポトーシスプロセスによる細胞死の誘導の際に集中するプロアポトーシス因子の放出を促進する。この系は腫瘍細胞の死に対する抵抗性についての起こり得る既知機構を抑制する。さらに、本発明の態様の１つは、アデノウイルスの局所注射に基づいているため、本発明は、活発に分裂している腫瘍細胞だけでなく、静止している大部分のものにも感染させることを可能にする。また、これには、癌による主な死亡原因である、腫瘍イニシエーターであり、転移および再発に関与していると思われている腫瘍幹細胞を感染させることも含まれる。さらに、シアン化物および過酸化物の生成は主として細胞外で起こるという事実から、本発明はin vivo感染率の低さを補う。同様に、本発明は、リナマラーゼを産生する細胞とその周囲の細胞の両方に作用することによって、いかなる腫瘍細胞も療法から免れられないようにする。
【００１２】
発明の説明
発明の簡単な説明
本発明の第１の態様は、カスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することによって腫瘍細胞の死を引き起こすことが可能な系に関し、その系は
ａ）単一組成物中に組み合わされた（combined）、リナマラーゼによってリナマリンにもたらされる酵素活性を含むシアン化物生成系、およびグルコースオキシダーゼ酵素によってもたらされる酸化活性を含む酸化的ストレス誘導系（以下、単一組成物）、または
ｂ）独立した組成物中に存在する、リナマラーゼによってリナマリンにもたらされる酵素活性を含むシアン化物生成系、およびグルコースオキシダーゼ酵素によってもたらされる酸化活性を含む酸化的ストレス誘導系（以下、本発明の組成物）
を含んでなる。
【００１３】
本発明の範囲内では、単一組成物は、シアン化物生成系および酸化的ストレス系における少なくとも必須の要素を（複数のベクター、タンパク質またはその他の形態で）含み、カスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することによって腫瘍細胞の死を引き起こすことができる組成物として理解される。
【００１４】
本発明の範囲内では、本発明の組成物は、少なくとも２種の組成物であって、それらのうちの少なくとも１種がシアン化物生成系における少なくとも１つの必須の要素を（１つのベクター、タンパク質またはその他の形態で）含み、もう１種のものが酸化的ストレス系の少なくとも１つの必須の要素を（１つのベクター、タンパク質またはその他の形態で）含み、それらの組合せがカスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することによって腫瘍細胞の死を引き起こす少なくとも２種の組成物として理解される。
【００１５】
本発明の範囲内では、単一組成物または本発明の組成物を区別せずに言及する場合には、本発明の組成物を指している。
【００１６】
本発明の好ましい態様では、本発明の組成物のシアン化物生成系は、リナマラーゼ−リナマリン系、すなわちリナマラーゼによって、反応基質として作用するリナマリンにもたらされる酵素活性を含んでなる。
【００１７】
本発明の別の態様では、本発明の組成物の酸化的ストレス誘導系は、グルコースオキシダーゼ酵素の活性、すなわちグルコースオキシダーゼ酵素によって、基質として作用するグルコースにもたらされる酸化活性を含んでなる。
【００１８】
本発明の第２の態様では、本発明の組成物のシアン化物生成系は、リナマラーゼ−リナマリン系を含み、かつ本発明の組成物の酸化的ストレス誘導系は、グルコースオキシダーゼ酵素を含んでなる。
【００１９】
本発明の第３の態様では、本発明の組成物は、単一のウイルスまたは非ウイルスベクター中に組み合わせてリナマラーゼ遺伝子およびグルコースオキシダーゼ遺伝子を含んでなる。
【００２０】
本発明の第４の態様では、本発明の組成物は、独立したウイルスまたは非ウイルスベクター中にリナマラーゼ遺伝子およびグルコースオキシダーゼ遺伝子を含んでなる。
【００２１】
本発明の第５の態様では、本発明の組成物は、ウイルスまたは非ウイルスベクター中に導入されたリナマラーゼ遺伝子と、精製グルコースオキシダーゼタンパク質または該タンパク質の類似体、断片もしくは誘導体とを含んでなる。
【００２２】
好ましい態様では、本発明の組成物は、ウイルスまたは非ウイルスベクター中に導入されたグルコースオキシダーゼ遺伝子と、精製リナマラーゼタンパク質または該タンパク質の類似体、断片もしくは誘導体とを含んでなる。
本発明のより好ましい態様では、本発明の組成物は、グルコースオキシダーゼタンパク質およびリナマラーゼタンパク質、またはこれらのタンパク質の類似体、断片もしくは誘導体とを含んでなる。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、精製グルコースオキシダーゼタンパク質および／または精製リナマラーゼタンパク質、ならびにこれらのタンパク質の類似体、断片もしくは誘導体と、これらのタンパク質を放出するための制御放出系とを含んでなる。
【００２４】
本発明のより好ましい実施形態では、本発明の組成物は、腫瘍抗原に対する抗体と結合された精製グルコースオキシダーゼ組換えタンパク質および／または精製リナマラーゼ組換えタンパク質、ならびにこれらのタンパク質の類似体、断片もしくは誘導体を含んでなる。
【００２５】
本発明の第６の態様は、シアン化物生成系および酸化的ストレス誘導系を含んでなる、カスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することによって腫瘍細胞の死を引き起こすことができるウイルスまたは非ウイルスベクターを含んでなる。
【００２６】
本発明の好ましい態様は、単一ベクター中に、天然もしくは遺伝子工学によって、リナマラーゼ遺伝子およびグルコースオキシダーゼ遺伝子またはそれらの任意の修飾物の組合せを含んでなる、カスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することによって腫瘍細胞の死を引き起こすことができるウイルスまたは非ウイルスベクターを含んでなる。
【００２７】
本発明のさらに別の態様では、独立したベクター中に、天然もしくは遺伝子工学によって、リナマラーゼ遺伝子およびグルコースオキシダーゼ遺伝子またはそれらの任意の修飾物を含んでなる少なくとも２つのウイルスまたは非ウイルスベクターを含んでなり、それらの組合せはカスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することによって腫瘍細胞の死を引き起こすことができる。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、リナマラーゼ遺伝子および／またはグルコースオキシダーゼ遺伝子を含んでなるアデノウイルスおよび／またはレトロウイルスベクターを含んでなる。
【００２９】
本発明の第７の態様では、それは腫瘍の治療を目的とする医薬組成物を製造するための本発明の１つのベクター／複数のベクターの使用を含んでなる。
【００３０】
本発明の好ましい態様では、療法に用いるための本発明の組成物に関する。
【００３１】
本発明のさらにより好ましい態様では、腫瘍を治療するための医薬組成物を製造するための本発明の組成物の使用に関する。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、上記医薬組成物のいずれかと薬学上許容される担体とに関する。
【００３３】
本発明の第８の態様では、限定されるものではないが、乳癌、肺癌、頭頸部癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫、骨肉腫、腺癌、白血病または膠芽腫の治療を目的とする医薬組成物を含んでなる。
【００３４】
本発明の第９の態様は、２つの系：シアン化物生成系と酸化的ストレス誘導系との組合せを含んでなる、カスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することによって腫瘍細胞の死を引き起こすことができるin vitroまたはin vivoにおける方法（以下、本発明の方法）を含んでなる。
【００３５】
本発明の好ましい態様では、本発明の方法のシアン化物生成系はリナマラーゼ−リナマリン系を含んでなる。
【００３６】
より好ましい態様では、本発明の方法の酸化的ストレス誘導系はグルコースオキシダーゼ酵素の活性を含んでなる。
【００３７】
本発明のさらにより好ましい態様では、本発明の方法の酸化的ストレス誘導系はグルコースオキシダーゼ酵素の活性を含んでなり、かつ本発明の方法のシアン化物生成系はリナマラーゼ−リナマリン系を含んでなる。
【００３８】
本発明のさらに別の態様では、本発明の組成物はいずれも本発明の方法の実施形態において使用される。
【００３９】
本発明の好ましい態様では、本発明の医薬組成物またはベクターはいずれも本発明の方法の実施形態のために使用される。
【００４０】
本発明の範囲内では、リナマラーゼタンパク質またはグルコースオキシダーゼタンパク質の類似体、誘導体もしくは断片は、本発明において主張する相乗作用をもたらし得るものとして理解される。
【００４１】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、単語「含んでなる」およびその変形は、説明に照らして当業者には明らかであろう本発明の他の態様を排除するものではない。
【００４２】
実施形態、実施例および次の図面の詳細な説明は、例として示しており、本発明を限定するものではない。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、いくつかある態様の中で特に、２つの系：シアン化物生成系と酸化的ストレス誘導系との間で確立された相乗活性を含んでなる、腫瘍細胞の治療を目的とする組成物および方法に関する。
【００４４】
前記シアン化物生成系は、リナマラーゼによって反応基質として作用するリナマリンにもたらされる酵素活性を含んでなる。前記酸化的ストレス誘導系は、グルコースオキシダーゼ酵素によって基質として作用するグルコースにもたらされる酸化活性を含んでなる。
【００４５】
特許請求の範囲に記載する系の活性によって引き起こされる酸化的ストレスの結果として起こるミトコンドリア動態を研究するために、Ｗ＆Ｗｌｉｓ細胞を、輸送シグナルペプチドによってミトコンドリアへと運ばれる１つの赤色蛍光タンパク質の遺伝子を含むプラスミド  ｐｄｓＲｅｄ２−ｍｉｔｏ(Clontech)で安定にトランスフェクトした。こうすることでリナマリンおよびグルコースオキシダーゼで処理した細胞のミトコンドリアを蛍光顕微鏡検査法により観察することが可能になった。その結果、未処理の細胞は繊維状ミトコンドリアパターンを示した（図１Ａ）が、リナマリンで処理した細胞では、このマトリックスはバラバラになり、点在パターンを得ている（図１Ｂおよび１Ｃ）ことが確認できた。この効果はリナマリンでの処理の４８時間後から観察され始め（図１Ｂ）、７２時間後により顕著になり、断片のわずかな膨張（図１Ｃ）が観察されている。グルコースオキシダーゼ単独での処理では、ミトコンドリアの大部分において構造的変化は起こらなかった（図１Ｄ）。しかしながら、リナマリン処理とグルコースオキシダーゼ処理の両方を組み合わせた場合には、２４時間後に膨張したミトコンドリアの点在パターンが観察され（図１Ｅ）、高い割合の細胞がアポトーシスの特徴を示す断片化された核形態で観察される（図１Ｆ）。４８時間後、基質に付着したままの少数の細胞はミトコンドリアの顕著な膨張を示した（図１Ｇ）。
【００４６】
ＭＴＴによる細胞生存の解析（生存細胞によるテトラゾリウムからのホルマザン結晶の形成の評価に基づく）では、リナマリンでの処理において、４８時間後に細胞の生存能力がリナマリン濃度に比例してわずかに低下し始めることを示した（図２Ａ）。しかしながら、生存の大幅な減少は９６時間の時点で初めて、高濃度のリナマリン（２００〜５００μｇ／ｍｌ）でのみ観察された。リナマリンとグルコースオキシダーゼとを用いる併用療法（combined therapy）を実施した場合には、高濃度のリナマリン（５００μｇ／ｍｌ）では２４時間後に細胞の生存能力が低下し始め、４８時間後には生存細胞は実質上ゼロである（図２Ｂ）。併用療法は系の攻撃性を高めて死をおよそ４８時間進め、こうしたことがより高い治療有効性をもたらすことになるということをこれは示している。
【００４７】
リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ療法の成功は、両方の系の組合せが酸化的ストレスの生成において相乗効果をもたらすという事実による。この仮説を確認するために、培地中に強力な抗酸化剤である１０ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加すると療法における細胞の挙動が観察されるが、他の濃度でも同じ結果が見られた。ＭＴＴによる細胞生存能力アッセイでは、ＮＡＣの添加はリナマラーゼ／リナマリン療法にいかなる影響も及ぼさなかった（図２Ｃ）が、ｌｉｓ／ｌｉｎ／ＧＯの組合せの場合には死の顕著な阻害が起こる（図２Ｄ）ことが観察できる。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウムを用いて死に関して同様の結果を得た（図４、表３）。
【００４８】
ＡＴＰ形態の細胞内エネルギーレベルは、ミトコンドリア電子伝達系の遮断が起こると低下するが、それはミトコンドリア電子伝達系が細胞の獲得エネルギーの不可欠な供給源であるためである。細胞内ＡＴＰレベルを解析すると、グルコースオキシダーゼの添加によって６時間後にＡＴＰの中等度の一時的な低下を引き起こした（図３Ａ）が、それは２４時間後には完全に元に戻り、それ以降におけるそのレベルは対照細胞と一致することが観察される。この効果は、細胞が過酸化物を解毒する能力を有するために短時間でグルコースオキシダーゼによる最大Ｈ２Ｏ２生成が起こるという事実と、グルコースオキシダーゼが血清タンパク質により経時的に不活性化されるという事実による。リナマリンの添加では、生成されたシアン化物によるシトクロムｃレベルでのミトコンドリア呼吸の遮断の結果としてＡＴＰの漸進的で迅速な枯渇が起こり、その枯渇は４８時間後にほぼ完了となる。両方の処理の組合せでは、グルコースオキシダーゼによる過酸化物の生成によって６時間後にレベルの初期低下が起こり、１２時間後にリナマリンでの処理と並行してＡＴＰレベルが下がり、そのレベルは両方の処理の相乗効果のために多少低くなっていることが観察された。これらの結果は、７２〜９６時間の間に起こるリナマリンによる死と、２４〜４８時間の間に起こるリナマリンとグルコースオキシダーゼとの組合せによる死との両方は、これらの時間間隔ではＡＴＰレベルは非常に低いことから、エネルギーとは無関係の機構により引き起こされるということを証明した。
【００４９】
併用療法において細胞外で生成されるＨ２Ｏ２レベル（図３Ｂ）を本発明においてさらに研究した。そのために、０．５ｍｇ／ｍｌのリナマリンでの処理において、５ｍＥＵ／ｍｌのグルコースオキシダーゼの存在下でまたは両方の処理の組合せにおいて４８時間の時点におけるＷ＆Ｗｌｉｓ細胞の培養培地中に存在するＨ２Ｏ２の量を分析したが、他の濃度を用いても良好な結果が得られた。リナマリンまたはグルコースオキシダーゼでの処理では対照（およそ２０μＭ）に対して細胞外Ｈ２Ｏ２濃度に大きな変化は起こらなかったが、両方の処理の組合せでは６５．９μＭの細胞外レベルで過酸化物の生成における相乗的な増加をもたらすことが観察された。このデータは、併用療法の成功は酸化的ストレスの生成における相乗効果によるものであるという仮説を裏付けている。
【００５０】
さらに、併用ｌｉｓ／ｌｉｎ／ＧＯ系は予想外にシアン化物（ｌｉｓ／ｌｉｎ）の特徴を示す壊死による死のパターンをＡＴＰ−非依存性アポトーシスへと変換し、さらにこのアポトーシスは細胞死を約４８時間さらに早めるため、この療法はより効果的である。アポプトソーム形成などの大部分のアポトーシス機構はＡＴＰ依存性であるため、本モデルにおける死に関与しているタンパク質を決定することが重要である。第一に、カスパーゼの関与について解析し、それを受けてアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムで標識するフローサイトメトリーによる死の解析を汎カスパーゼ阻害剤  Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）の存在下で（表４および図４）実施した。カスパーゼ阻害は併用ｌｉｓ／ｌｉｎ／ＧＯ療法にいかなる影響も及ぼさないことが観察されたため、アポトーシスがカスパーゼ非依存性であるということが結論付けられる。紫外線（１２．５Ｊ／ｍ２）を照射した（これによりカスパーゼ依存性アポトーシスによる典型的な死が起こる）細胞を対照として用いた。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）の添加により紫外線誘導アポトーシスの完全阻害が起こることがＤＮＡ含量の解析（表１）とアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムでの標識とにより（図４）確認された。
【００５１】
次に、併用系におけるＰＡＲＰ−１（ポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ）タンパク質の寄与を研究した。このタンパク質は、核内、そしてその活性化後に存在するＤＮＡに対する損傷を感知し、そのタンパク質はミトコンドリアへと転移し、そこでそのタンパク質がＡＩＦなどのアポトーシスタンパク質を活性化する(Hong, et al., 2004)。この経路は、ＲＯＳによって生じる可能性のあるアポトーシス機構の１つである。本発明の併用系におけるこのタンパク質の寄与を研究するために、特異的なＰＡＲＰ阻害剤、１，５−イソキノリンジオール（ＤＩＱ）（表５）を用いた。ｌｉｓ／ｌｉｎ／ＧＯによって起こるアポトーシスは、ＤＩＱにより阻害されないことから、ＰＡＲＰに依存するＡＩＦの活性化経路が介在しないことが観察された。
【００５２】
しかしながら、ＡＩＦの活性化はＰＡＲＰ−１非依存性である機構によって起こり得た(Cregan, 2004)。ＡＩＦはミトコンドリア中に存在するタンパク質であり、活性化すると、ＡＩＦは核へと転移し、そこでＡＩＦはアポトーシスを活性化する。ＡＩＦについての起こり得る転移を、療法で処理したＷ＆Ｗｌｉｓ細胞のＡＩＦに対して特異的な抗体を用いる免疫蛍光により解析した。ＧＯで処理した対照細胞は典型的にミトコンドリアのＡＩＦパターンを示し（図５Ａ）、それらをリナマリンおよびＧＯで処理する（図５Ｂ）と、ミトコンドリア繊維の断片化は起こるが、ＡＩＦはミトコンドリア中に残り、核へと転移しないことが観察された。これは、ｌｉｓ／ｌｉｎ／ＧＯ系がＡＩＦによって媒介される死とは無関係のアポトーシスを引き起こすことを証明している。
【００５３】
フローサイトメトリーによりアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムアッセイを並行して実施した。４８時間の時点で５ｍＥＵ／ｍｌのグルコースオキシダーゼと併用療法（５ｍＥＵ／ｍｌのＧＯおよび５００μｇ／ｍｌのリナマリン）を与えて系の死のパターンを解析し、続いて９６時間の時点で未処理の細胞と５００μｇ／ｍｌのリナマリンとともにインキュベートした細胞の対照について行った。さらに、別の細胞群を、１０ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を加えたことを除いて同じ条件に供した。次に、併用療法で処理した細胞を１００μＭのＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋの不在および存在下での４８時間の時点において調べ、続いて、同じ条件における紫外線での細胞の処理の対照について行った。最後に、３００μＭの１，５−イソキノリンジオール（ＤＩＱ）の不在および存在下での４８時間の時点において併用療法で処理した細胞を示され、これによりＰＡＲＰ−１を阻害しても死のパターンは変化しないことが観察される（図４）。
【００５４】
これらの結果に基づいて、併用ｌｉｓ／ｌｉｎ／ＧＯ療法によって引き起こされる死は、カスパーゼにもＰＡＲＰ−１にもＡＩＦにも依存しないアポトーシスの機構によって生じるということが結論付けられた。
【００５５】
患者における６つの膠芽腫（glioblastomas）から得られた外植片におけるリナマラーゼ／リナマリン系の適用性を評価して、患者における本発明の療法の使用可能性を研究した。第一に、リナマラーゼ遺伝子を運ぶアデノウイルス（ａｄｅｎｏｌｉｓ）による感染に対するこれらの外植片の感受性を研究した。そこで、これらの培養物をａｄｅｎｏｌｉｓに感染させ、リナマラーゼの発現を、リナマラーゼに対して特異的な抗体を用いた免疫蛍光により解析した（図６Ａ〜Ｆ）。６つの外植片のうち５つがａｄｅｎｏｌｉｓに有効に感染して、リナマリンの非常に活発な発現が起こり、それによって感染多重度（ＭＯＩ）１００で感染させた細胞の実質上１００％において細胞で繊維状凝集体ももたらされることを確認された。１つの外植片だけ（ＧＢ−ＬＰ−５、図６Ｅ）はＭＯＩ：１００で発現した細胞の５％未満であった。これは、これらの細胞がアデノウイルス受容体であるＣＡＲ（コクサッキー−アデノウイルス受容体）の低発現を示したことによる可能性がある。
【００５６】
１つの外植片（ＧＢ−ＬＰ−１）におけるｌｉｓ／ｌｉｎ療法の作用をさらに解析した。これらの細胞をａｄｅｎｏｌｉｓに感染させ（ＭＯＩ：０、１、１２、１００および５００）、５００μｇ／ｍｌリナマリン添加後の生存およびシアン化物の生成（それぞれ、図６Ｇおよび６Ｈ）を研究した。これらの細胞はａｄｅｎｏｌｉｓに有効に感染し、それによってそれらの細胞は、極めて低い感染多重度（ＭＯＩ：１）においても、リナマリンでの処理に対する感受性が強くなった。また、極めて高い感染多重度（ＭＯＩ：１００および５００）においても、ベクターによる毒性は検出されなかった。
【００５７】
グルコースオキシダーゼの毒性を、異なる量の精製酵素を腹腔内と静脈内に接種した体重約２０ｇのＳｗｉｓｓマウスにおいて評価した。動物の体重１ｇ当たり１ＥＵおよび０．５ＥＵの用量では、投与後最初の２４時間で致死効果を示した。しかしながら、体重１ｇ当たり０．２５〜０．１ＥＵ間の１日用量では、有害な影響は認められなかった。これによりこのタイプの動物における併用療法でのＧＯの最適用量範囲を定めることができた。
【００５８】
さらに、リナマリンの用量範囲を、リナマラーゼを安定に発現するＷ＆Ｗ腫瘍細胞（Ｗ＆Ｗｌｉｓ）を接種した体重２０ｇの免疫不全（ヌード）マウスにおいて評価した。腫瘍がおよそ５０ｍｍ３のサイズに達したときに、マウスを異なる濃度の腫瘍内リナマリン１日用量（動物の体重１ｇ当たり０．５ｍｇ；０．３５ｍｇ；０．２５ｍｇまたは０．１０ｍｇ  ｌｉｎ）で処理した。用量０．１ｍｇ  ｌｉｎ／ｇでは治療効果は認められなかった（ｎ＝４）（図７Ａ）が、０．２５ｍｇ  ｌｉｎ／ｇの場合には、処理第１０日を過ぎて、未処理の腫瘍に対して、処理した腫瘍の増殖の有意な減少が成し遂げられた（ｐ＝０．０５；ｎ＝６）（図７Ｂ）。リナマリン用量の増加は、治療結果を向上させるだけでなく、１日用量０．３５ｍｇ  ｌｉｎ／ｇの場合では処理第５日には４匹の動物のうち３匹に死をもたらし（図７Ｃ）、そして処理第４日〜第５日間には０．５ｍｇ  ｌｉｎ／ｇで処理した動物の総てに死をもたらした。
【００５９】
細胞培養物と同じように酸化的ストレスを高めることによってこれらの結果を改善する目的で、リナマリンでの処理とともに０．１ＥＵ／ｇのグルコースオキシダーゼを導入した。結果は総てのケースにおいて実質的に改善され（図７Ｄ〜７Ｆ）、高用量のリナマリン（０．３５ｍｇ  ｌｉｎ／ｇ、図７Ｆ）では毒性も減少した。最良の治療結果は、１日の処理を０．２５ｍｇ  ｌｉｎと０．１ＥＵ  ＧＯ／ｇとした場合に得られ、この場合には処理した腫瘍と未処理の腫瘍との差は処理第８日を過ぎて有意となった（図７Ｅ；ｐ＝０．０５；ｎ＝６）。実際には、他の濃度のグルコースオキシダーゼでも薬理学的に陽性の結果は得られた。これらの結果により、前記相乗活性はリナマラーゼ／リナマリン系の治療力の増強を実現するため、より効果的な薬理学的系であるということの確認ができる。
【００６０】
本発明によって行われる別のアプローチは、免疫不全マウスにおいて誘導されたＷ＆Ｗ細胞腫瘍におけるリナマラーゼ遺伝子を運ぶアデノウイルス（ａｄｅｎｏｌｉｓ）の使用である。１０６細胞をマウス（ｎ＝１８）の両脇腹に皮下接種した。一部の動物（ｎ＝８）にはリナマラーゼを既に発現しているＷ＆Ｗｌｉｓ細胞を与え、一方、他のもの（ｎ＝１０）にはＷ＆Ｗ細胞を接種し、腫瘍が発生した場合にのみ、その腫瘍にａｄｅｎｏｌｉｓを局所的に感染させた。Ｗ＆Ｗｌｉｓを接種した動物に対して、処理開始時点において最大の腫瘍（およそ５０ｍｍ３）に０．２５ｍｇ  ｌｉｎおよび０．１ＥＵ  ＧＯ／ｇで毎日処理した（図７Ｇおよび７Ｈ）。Ｗ＆Ｗ腫瘍を示している動物を１０９ＩＵのａｄｅｎｏｌｉｓでの感染サイクルで処理し、その後、０．２５ｍｇ  ｌｉｎおよび０．１ＥＵ  ＧＯ／ｇでの２日間の処理を行った（図７Ｉおよび７Ｊ）。腫瘍の進行を２日おきに評価した。それらの結果は、リナマラーゼ遺伝子を既に発現している腫瘍の場合では処理第７日を過ぎて（図７Ｇ）、そしてａｄｅｎｏｌｉｓでの感染の場合には処理第１１日を過ぎて（図７Ｉ）処理した腫瘍と未処理の腫瘍との間に有意差がある（ｐ＝００．５）ことが示され、これによりアデノウイルスでの処理の有効性が証明された。
【００６１】
免疫不全マウスの脇腹およびイヌにおいて誘導された膠芽腫においてその系をアッセイした。膠芽腫細胞を脳定位固定法によってイヌに移植し、それによって腫瘍を形成させ、それを特許請求の範囲に記載する方法で処理する。
【００６２】
本発明においてリナマラーゼ植物遺伝子を腫瘍細胞内に導入する手段としてプラスミド、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターを使用した。一度、前記遺伝子が癌性細胞内に入ると、その遺伝子は発現され、リナマラーゼ酵素が合成された。リナマラーゼ酵素は細胞外部に自然に分泌され、そこでその酵素はそのリナマリン基質と遭遇し、注射によって動物に導入されたリナマリンがグルコースとアセトンシアノヒドリンへと分解される反応を触媒した。このアセトンシアノヒドリンは自然に２つの化合物、アセトンと、腫瘍細胞の死に関与するシアン化物を生成した。しかしながら、シアン化物生成系と酸化的ストレス誘導系との組合せを含んでなる、カスパーゼ非依存性アポトーシスを活性化することによって腫瘍細胞の死を実行する他の方法も本発明の範囲内に入るであろう。さらに、発明の詳細な説明および表において用いたＬｉｎとＧＯの用量は、例示目的にのみ、本発明の可能性や有効性を確認するために記載したものであり、他の治療上有効な用量も本発明の範囲の一部をなすであろう。
【実施例】
【００６３】
発明の実施形態の例：
実施例１．本発明の一態様を実施するためにとられた主要なステップ
アデノウイルスベクターを用いてリナマラーゼ遺伝子を、そしてリナマリンを腫瘍内に導入している、in vitroで培養されたＷｏｄｉｎｓｋｙ  ＆  Ｗａｋｅｒ細胞系における療法の有効性の検証。
【００６４】
実施例２．リナマラーゼを安定に発現する細胞系の獲得
Ｗ＆Ｗイヌ膠芽腫細胞(Wodinsky, et al., 1969)を、ＣＭＶ（５８８ｂｐ）プロモーター、続いて、イントロンと、遺伝子ｅｐｏｌｉｓ（ヒトエリスロポエチンの排出の細胞外シグナルを伝達するリナマラーゼ）（１６２５ｂｐ）をクローニングしたポリクローン領域、その後、ＩＲＥＳ（５６８ｂｐ）および遺伝子ｐａｃ（ピューロマイシン耐性）（６０２ｂｐ）およびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを有するプラスミド  ｐＩＬＥ（６．９Ｋｂ）でトランスフェクトした。
【００６５】
トランスフェクションには陽イオン性脂質、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ(Invitrogene)を企業の指示に従って使用した。２μｇのＤＮＡ、１２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよび８μｌの試薬Ｐｌｕｓを使用した。リナマラーゼの安定発現種を１μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの選択により得、それをＷ＆Ｗｌｉｓと呼ぶことにし、残る試験に用いた。
【００６６】
実施例３．ＤＮＡ含量解析
２〜５ｘ１０５Ｗ＆Ｗｌｉｓ細胞を２５ｃｍ２フラスコに播種した。２４時間後、それらをリナマリン（５００μｌ／ｍｌ）およびグルコースオキシダーゼ（５ｍＥＵ／ｍｌ）で処理した。各アッセイに適応される時間が経過した後、細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その細胞沈殿物を４℃で３００μｌのＰＢＳに再懸濁した。続いて、攪拌下、−２０℃で７００μｌの無水エタノールをゆっくりと加えることによってそれらを固定した。さらに２４時間後、１％ウシ血清アルブミンを補給したＰＢＳで細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウムを終濃度２０μｇ／ｍｌに加え、それを室温で１時間インキュベートした。データ収集および解析を、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔプログラムを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(DB Bioscience)フローサイトメーターを用いて行った。
【００６７】
実施例４．アデノウイルスでの感染
１０５細胞（Ｗ＆Ｗおよび患者外植片）を、フラット面を備えたねじ式キャップ付き試験管(Nunc)に播種し、または５ｘ１０４細胞を２４−ウェルプレート中のカバースリップ上に播種し、それらを同時に、異なる感染多重度（ＭＯＩ：０；０．２；１；１０；１００または５００）においてａｄｅｎｏｌｉｓ(Crucell)に感染させた。試験管に播種した細胞では２４時間後に培地を換え、必要に応じて０．５ｍｇ／ｍｌのリナマリンを加えた。リナマリン添加後９６時間の時点でＭＴＴにより細胞生存能力アッセイを行った。カバースリップに播種した細胞は、感染の４８時間後に、リナマラーゼを検出するための免疫蛍光を実施するために処理をした。
【００６８】
実施例５．処理中のミトコンドリアの構造的変化の解析
療法中のミトコンドリアの構造的変化を研究するために、Ｗ＆Ｗ細胞およびＷ＆Ｗｌｉｓ細胞を、ミトコンドリアでのみ発現される赤色蛍光タンパク質の遺伝子を含むプラスミド  ｐＤｓＲｅｄ２−ｍｉｔｏ(Clontech, BD Bioscience)でトランスフェクトした。前節と同じようにトランスフェクションを行い、ネオマイシン耐性によってクローンを選択した（それぞれ、０．７５ｍｇ／ｍｌおよび１．５ｍｇ／ｍｌ）。前記タンパク質の安定発現クローン由来の細胞をマルチウェルプレート中カバースリップ（２．５ｘ１０４）上に播種し、リナマリン（５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌまたは５００μｇ／ｍｌ）およびグルコースオキシダーゼ（５ｍＥＵ／ｍｌ）で処理した。各試験に適したインキュベーション時間（２４時間、４８時間または７２時間）が経過した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。核をＴｏ−Ｐｒｏ−３(Molecular Probes)を用いて１／５００希釈で３０分間染色した。ミトコンドリアの構造的変化は、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  Ｓ１００  ＴＶ(Zeiss)倒立顕微鏡と連結したＲａｄｉａｎｃｅ２０００(BioRad)共焦点系を用いて観察し、赤色フィルターおよび青色フィルターで０．２μｍ離れた連続した３つの平面を撮影し、それらを組み合わせた。
【００６９】
実施例６．ＭＴＴによる細胞生存能力解析
細胞生存能力の指標となるミトコンドリアの酵素活性を、テトラゾリウム塩を用いることによって判定した。このアッセイでは、１試験管（ＨＣＮが抜け出るのを防ぐ、フラット面を備えたねじ式キャップ付き培養試験管；Nunc）当たり１０５細胞またはパラフィルムで閉じた２４−ウェルプレートの１ウェル当たり１０４細胞を播種した。インキュベーションの２４時間後、各試験に必要な濃度のリナマリン（５０〜５００μｇ／ｍｌの間）およびグルコースオキシダーゼ（５ｍＥＵ／ｍｌ）を補給した新鮮培養培地を加えた。それが適用されたアッセイでは、培地にＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）、１，５−イソキノリンジオール（３００μＭ）またはＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）を補給した。各試験に定められた時間（１２〜９６時間の間）の後に、培養培地を除去し、２００μｇ／ｍＬのＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾ−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を含む新鮮培地を加えた。インキュベーションの１．５時間後、培地を除去し、３ｍｌ（試験管の場合）または１ｍｌ（２４−ウェルプレートの場合）のジメチルスルホキシドを加えて、ホルマザンを溶かした。１０分間後、サンプルの５４０ｎｍでの吸光度を測定した。ＭＴＴは水性媒体に溶解するテトラゾリウム塩（黄色）であるが、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって水性媒体に不溶性の化合物であるホルマザン（紫色）に変換される。
【００７０】
実施例７．免疫蛍光
細胞を２４−ウェルプレート中のカバースリップ上に播種し、各試験の要件に従って処理した。各アッセイに適したインキュベーション時間の後、細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で３０分間またはメタノールを用いて−２０℃で１０分間固定した。続いて、サンプルを、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を補給したＰＢＳで１０分間透過処理し、０．１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳとともに、または０．０１％ＳＤＳおよび１０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳとともに３０分間インキュベートすることにより遮断した。その後、それらを一次抗体とともに室温で４５分間または４℃で一晩インキュベートした。使用した抗体は抗リナマラーゼ（１／２００、Monica Hughesによる供給品）および抗ＡＩＦ（１／５０、Cell Signaling Technology）であった。使用した二次抗体はフルオレセイン結合抗ウサギＩｇＧ（１／５０、Amersham Pharmacia Biotech）であった。続いて、Ｔｏ−Ｐｒｏ−３(Molecular Probes)の１／５００希釈物とともに３０分間インキュベートして、核を染色した。サンプルをＰＢＳで２回、そして蒸留Ｈ２Ｏで１回洗浄し、Ｍｏｗｉｏｌ−ＤＡＢＣＯまたはＰｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ(Invitrogen)封入剤を用いて顕微鏡用スライドに封入した。
【００７１】
実施例８．細胞外過酸化物濃度の測定
解析するサンプルを１ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ７．４で希釈した。次いで、３．７ＥＵ／ｍｌのペルオキシダーゼ(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)および０．１ｍｇ／ｍｌのオルト−ジアニシジン(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)を加えた。サンプルを室温で３０分間インキュベートし、４３６ｎｍでの吸光度を測定した。Ｈ２Ｏ２濃度は、Ｈ２Ｏ２の漸増濃度を用いて実施した標準直線より得られるデータの補間により得た。
【００７２】
実施例９．ＡＴＰの測定
１０５Ｗ＆Ｗｌｉｓ細胞を、フラット面を備えたねじ式キャップ付き試験管(Nunc)に播種した。２４時間後、培地を換え、必要に応じてリナマリン（５００μｇ／ｍｌ）およびグルコースオキシダーゼ（５ｍＥＵ／ｍｌ）を加えた。４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間または７２時間後、細胞を遠心分離し、Roche Applied Science社のＡＴＰ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＣＬＳ  IIの使用説明書に従って処理した。発光はＭｏｎｏｌｉｇｈｔ  ２０１０  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ(Analytical Luminescence Laboratory, San Diego)で解析し、相対発光量（ＲＬＵ）で表した。
【００７３】
実施例１０．フローサイトメトリーによる死の種類の解析（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＩＰ）
１０５Ｗ＆Ｗｌｉｓ細胞を、フラット面を備えたねじ式キャップ付き試験管(Nunc)に播種した。２４時間後、特定のケースにおいて、異なる量のリナマリン（５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌまたは５００μｇ／ｍｌ）およびグルコースオキシダーゼ（５ｍＥＵ／ｍｌ）を加えた。該当するアッセイでは、培地にＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）、１，５−イソキノリンジオール（３００ｍμＭ）またはＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）を補給した。各アッセイに定められた時間（３０時間、４８時間、７２時間または９６時間）の後に、細胞を沈殿させ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン処理した。それらを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞沈殿物を最初にＰＢＳで、その後結合バッファー（０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．４、１．４Ｍ  ＮａＣｌおよび２５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄した。それらの細胞を再び沈殿させ、５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよび２．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを補給した１００μｌの結合バッファーに再懸濁した。それらのサンプルを暗所で１５分間インキュベートした。データ収集および解析を、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔプログラムを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  フローサイトメーター(DB Bioscience)を用いて行った。初期アポトーシス細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣについてのみ陽性標識を示す細胞であると考えられ、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムの両方について陽性染色を示す場合には後期アポトーシスまたは壊死と考えられた。
【００７４】
実施例１１．患者膠芽腫外植片の初代培養物の獲得
実験動物からの腫瘍生検は、それらに処理を行うまで、２０％ＳＦＴを含むＭＥＭ培地中で４℃で維持した。それらのサンプルを無菌条件でおよそ１ｍｍ３サイズに切った。次いで、コラゲナーゼ（１０６ＥＵ／ｍｌ）、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．４、ファンギゾン（０．５μｇ／ｍｌ）およびＤＮアーゼ（０．０２％）を補給した、２０％ＳＦＴを含むＭＥＭを加え、室温で１６時間インキュベートした。その後、消化されていない大きな断片をデカンテーションにより除去し、細胞を遠心分離により回収した。培養物形成までそれらの細胞を、２０％ＳＦＴを含むＭＥＭに播種した。一度培養物が形成されたら、いくつかのステップの後にその培地を１０％ＳＦＴを含むＤＭＥＭと取り換えた。
【００７５】
実施例１２．免疫不全マウス腫瘍細胞を有する異種移植モデルにおける療法
体重およそ２０ｇの２ヶ月齢免疫不全（ヌード系統）無胸腺マウスを用いた。それらのマウスの両脇腹に１〜２ｘ１０６細胞（Ｗ＆ＷまたはＷ＆Ｗｌｉｓ）を、０．１％グルコースを含む完全ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムイオンを補給した）中５０μｌ量の注射により皮下接種した。腫瘍のサイズ（ｐｉ  π／６ｘ高さｘ幅ｘ長さ）はカリブレーター(calibrator)で測定した。
【００７６】
大群のマウス（ｎ＝８）に、上記のとおり１〜２ｘ１０６Ｗ＆Ｗｌｉｓ細胞を接種した。腫瘍が平均サイズ３０〜５０ｍｍ３に達したら、片脇腹の腫瘍を動物の体重１ｇ当たり０．２５ｍｇのリナマリンおよび０．１ＥＵのグルコースオキシダーゼで毎日処理した。未処理の腫瘍が約２０００ｍｍ３のサイズに達したら、動物を犠牲にし、処理の終了とした。データはスチューデントｔ検定により統計的に解析し、有意水準を５％とした。
【００７７】
リナマラーゼ遺伝子を有するアデノウイルスを用いた処理の場合、Ｗ＆Ｗ細胞を接種したマウス（ｎ＝１０）の腫瘍が３０〜５０％のサイズに達したら、処理サイクルを一方の脇腹に施した。そのサイクルの初日に、１０９ＩＵのａｄｅｎｏｌｉｓを接種し、シリンジを用いて腫瘍全体に分布させた。２４時間の時点において、０．２５ｍｇ／ｇのリナマリンに０．１ＥＵ／ｇのグルコースオキシダーゼを追加して用いて２日間の処理を施した。未処理の腫瘍が約２０００ｍｍ３のサイズに達するまでこのサイクルを繰り返した。動物を犠牲にし、処理の終了とした。データをスチューデントｔ検定により統計的に解析し、有意水準を５％とした。
【００７８】
表１．ヨウ化プロピジウムで標識するフローサイトメトリーによるＤＮＡ含量についての研究
【表１】
2009520773.tif 000002
【００７９】
表２．系の死の種類の特徴付け
【表２】
2009520773.tif 000003
【００８０】
表３．抗酸化剤の添加による死の阻害についての研究
【表３】
2009520773.tif 000004
【００８１】
表４．カスパーゼ阻害による死のパターンについての研究
【表４】
2009520773.tif 000005
【００８２】
表５．ＰＡＲＰ阻害による死のパターンについての研究
【表５】
2009520773.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】プラスミド  ｐｄｓＲｅｄ２−ｍｉｔｏのトランスフェクションによる赤色のミトコンドリアと、Ｔｏ−Ｐｒｏ−３を用いた染色による青色の核とを有する細胞の共焦点顕微鏡画像を示す図である。未処理の対照細胞（Ａ）、処理開始後４８時間（Ｂ）および７２時間（Ｃ）の時点でリナマリン（５００μｇ／ｍｌ）で処理した細胞、グルコースオキシダーゼ（５ｍＥＵ／ｍｌ）で処理した細胞（Ｄ）ならびに処理後２４時間（ＥおよびＦ）または４８時間（Ｇ）の時点でグルコースオキシダーゼ（５ｍＥＵ／ｍｌ）とリナマリン（５００μｇ／ｍｌ）との併用療法で処理した細胞についてのミトコンドリアパターンを表す画像を示す。
【図２（Ａ）】Ｗ＆Ｗｌｉｓ細胞のミトコンドリア活性による細胞生存／死の解析を示す図である。リナマリンで処理した細胞についての経時的生存率を示す。
【図２（Ｂ）】Ｗ＆Ｗｌｉｓ細胞のミトコンドリア活性による細胞生存／死の解析を示す図である。リナマリンおよび５ｍＥＵ／ｍｌのグルコースオキシダーゼで処理した細胞についての経時的生存率を示す。
【図２（Ｃ）】処理に抗酸化剤（１０ｍＭ  ＮＡＣ）を加えたときの細胞生存を示す図である。
【図２（Ｄ）】処理に抗酸化剤（１０ｍＭ  ＮＡＣ）を加えたときの細胞生存を示す図である。
【図３（Ａ）】細胞内ＡＴＰレベルの低下についての研究を示す図である。リナマリン（５００μｇ／ｍｌ）および／またはグルコースオキシダーゼ（５ｍＥＵ／ｍｌ）で処理したＷ＆Ｗｌｉｓ細胞において経時的に評価を行った。値は、各時点での２つの独立したサンプルについての、未処理の細胞から得られた値に対する相対発光量（ＲＬＵ）百分率の平均±標準偏差を示す。
【図３（Ｂ）】細胞外での過酸化水素の生成を示す図である。
【図４】アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムで標識するフローサイトメトリーによるＷ＆Ｗｌｉｓ細胞における系の死の種類の特徴付けを示す図である。
【図５】Ｗ＆Ｗｌｉｓ細胞における免疫蛍光によるＡＩＦ位置特定研究を示す図である。核はＴｏ−Ｐｒｏ−３で標識されている。細胞を５ｍＥＵ／ｍｌのグルコースオキシダーゼ（Ａ）で、またはグルコースオキシダーゼおよび５００μｇ／ｍｌのリナマリン（Ｂ）で処理した。
【図６】ａｄｅｎｏｌｉｓによる患者外植片細胞の感染についての研究を示す図である。ａｄｅｎｏｌｉｓに感染した患者の細胞  ＧＢ−ＬＰ−１（Ａ）、ＧＢ−ＬＰ−２（Ｂ）、ＧＢ−ＬＰ−３（Ｃ）、ＧＢ−ＬＰ−４（Ｄ）、ＧＢ−ＬＰ−５（Ｅ）およびＧＢ−ＲＣ−１（Ｆ）における免疫蛍光によるリナマラーゼの検出。５００μｇ／ｍｌのリナマリンの存在または不在下、異なる感染多重度（ＭＯＩ）においてａｄｅｎｏｌｉｓでの感染に対するＧＢ−ＬＰ−１細胞のＭＴＴによる生存率についての研究（Ｇ）。５００μｇ／ｍｌのリナマリンの存在下で異なるＭＯＩにおいて感染させたＧＢ−ＬＰ−１細胞におけるシアン化物の生成（μｇ／ｍｌ）（Ｈ）。グラフ（ＧおよびＨ）では３つの独立したサンプルの平均±標準偏差を示している。
【図７】免疫不全マウスにおける系の治療効果についての研究を示す図である。マウスにはＷ＆Ｗｌｉｓ細胞（Ａ〜Ｈ）またはＷ＆Ｗ細胞（ＩおよびＪ）を両脇腹に接種し、各マウスを、０．１ｍｇ／ｇのリナマリン（Ａ）、０．２５ｍｇ／ｇのリナマリン（Ｂ）および０．３５ｍｇ／ｇのリナマリン（Ｃ）で処理するか；または０．１ｍＥＵ／ｍｌのＧＯと、０．１ｍｇ／ｇのリナマリン（Ｄ）、０．２５ｍｇ／ｇのリナマリン（Ｅ）および０．３５ｍｇ／ｇのリナマリン（Ｆ）との併用療法で処理した。０．２５ｍｇ／ｇのｌｉｎおよび０．１ｍＥＵ／ｍｌのＧＯを用いたＷ＆Ｗｌｉｓ腫瘍の治療の有効性についての研究（Ｇ）ならびに群のマウスの１つの代表的な画像（Ｈ）。０．２５ｍｇ／ｇのｌｉｎおよび０．１ｍＥＵ／ｍｌのＧＯで処理した、Ｗ＆Ｗ腫瘍を有するマウスにおけるａｄｅｎｏｌｉｓを用いた併用療法についての研究（Ｉ）ならびに群のマウスの１つの代表的な画像（Ｊ）。グラフでは、経時的に、４匹のマウス（Ａ、Ｃ、ＥおよびＦ）、６匹のマウス（ＢおよびＤ）、８匹のマウス（Ｇ）および１０匹のマウス（Ｉ）のｍｍ３で表される体積の平均±標準誤差を示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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