(57)【要約】  虚血性イベントにおいて、梗塞した心臓組織に全梗塞領域に渡って酸素及び栄養を供給する新たな血管を成長させることによって虚血性心疾患を治療し、また、心筋細胞アポトーシスを阻止するための医薬組成物及び方法。この医薬組成物は、式（Ｉ）の骨格構造を有する化合物を活性成分として含有する。2009520684.tif 000005【選択図】  なし
2009520684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容可能な添加物と、有効量の、式（Ｉ）で表される骨格構造を有する化合物と、を含有し、
植物の抽出物を含有せず、
虚血性心疾患の治療用に製剤化されている医薬組成物。
【化１】
2009520684.tif 000004
【請求項２】
当該組成物の少なくとも９５質量％が、同定された化合物であり、
前記化合物が、置換なしの前記骨格構造自体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
当該組成物が虚血性心疾患の治療に有用である旨の情報が添付された、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
医薬品剤形に製剤化され、
容器に収納され、
前記情報が、前記容器に、又は前記容器内に含まれている添付文書若しくはパンフレットに表示されている、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記剤形が、錠剤、カプセル剤、注射剤、懸濁剤、液剤、散剤及びシロップ剤からなる群より選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
哺乳動物個体の虚血性疾患を治療する方法であって、
前記哺乳動物個体に、有効量の、式（Ｉ）の化合物又は前記化合物の機能的誘導体を投与するステップを含む方法。
【請求項７】
前記化合物又は機能的誘導体が、前記哺乳動物個体の梗塞した心臓組織における血行再建により治療効果を発揮する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記血行再建が、前記化合物又は機能的誘導体による処置後、２４〜７２時間以内に起こる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記虚血性疾患が虚血性心疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記虚血性疾患が冠動脈のアテローム性動脈硬化に起因する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物個体の梗塞心筋において血行を再建する方法であって、
式（Ｉ）の化合物又は前記化合物の機能的誘導体で前記梗塞心筋を処置するステップを含む方法。
【請求項１２】
前記化合物又は前記化合物の機能的誘導体が、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの発現をアップレギュレートする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物又は前記化合物の機能的誘導体が、前記梗塞心筋中の組織に直接注入される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物又は前記化合物の機能的誘導体が、経口投与を介して前記梗塞心筋中の組織に送達される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物又は前記化合物の機能的誘導体が、皮下注射、筋肉内注射又は静脈内注射を介して前記梗塞心筋中の組織に送達される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物個体がヒト患者である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記剤形が注射剤である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の医薬組成物と、容器と、前記医薬組成物の有用性に関する情報と、を含み、
前記情報に、前記医薬組成物が、虚血性心疾患に罹患しているか、又は罹患したことのあるヒトに有益であることが示されている医薬製品。
【請求項１９】
前記情報が、前記容器の外側表面に表示されている、請求項１８に記載の医薬製品。
【請求項２０】
前記情報が、前記容器に含まれているパンフレット又は添付文書に表示されている医薬製品。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００６年４月１３日に提出された米国仮出願第６０／７９１４６２号に対する優先権を主張するものであり、仮出願の内容は、参照されることにより本明細書の一部を構成する。本願は更に、２００５年１１月８日に提出されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００３２０２号及び第ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００３１９１号に対する優先権を主張するものであり、ＰＣＴ出願の内容は、参照されることにより本明細書の一部を構成する。
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、虚血性心疾患を治療するための医薬組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、虚血性イベントにおいて、梗塞した心臓組織に全梗塞領域に渡って酸素及び栄養を供給する新たな血管を成長させ、また、心筋細胞アポトーシスを阻止するための医薬組成物及び方法に関する。
【発明の背景】
【０００３】
冠動脈心疾患及び心梗塞を始めとする虚血性心疾患は、冠動脈による血液供給が不十分であるか、又は心臓の一部分への血液供給が妨害されることに起因する疾患であり、心筋細胞の損傷又は死滅を引き起こす。これは、世界中で男性及び女性の双方の主要な死因となっている。例えば、約１５０万人の米国人が毎年心臓発作を経験し（約２０秒毎に１回の心臓発作が起きていることになる）、何百万人もの米国人が虚血性心疾患を患っている。
【０００４】
梗塞後リモデリングが進行する間、梗塞した心臓組織への血管新生／血行再建は、収縮による代償に必要な組織成長に対応するには不十分であり、肥大しているが生存している心筋、特に梗塞巣の境界域に沿った心筋（危険な状態にある心筋細胞）のより大きな要求に対応することができない。肥大した筋細胞への酸素及び栄養の相対的な欠乏は、本来ならば生存可能な心筋の死滅における重大な病因的因子となる可能性があり、進行性の梗塞巣拡大及び線維性置換を引き起こす。それ故、危険な状態にある心臓の筋細胞を救出する最も直接的な方法が、酸素負荷に加えて、循環する幹細胞、栄養及び増殖因子が梗塞領域に送達されることを可能とする新たな血液供給を早期に確立することであるのは明らかである。速やかな血管形成による冠動脈血流の回復は、難治性虚血性心疾患の直接的かつ効果的な治療方法となるはずである。
【０００５】
虚血性血管疾患の他の治療法として、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ等の増殖因子を用いる血管形成療法が精力的に研究されてきたが、これらの因子は作用するのに何週間もかかり１〜６、他方、冠動脈閉塞による心筋壊死は数時間以内に極めて迅速に起こる５，７，８。予後においては、虚血状態にも関わらず線維組織が急速に成長し、この線維組織は、梗塞した心臓組織と置き換わり、新たに再生された筋細胞の置換の余地をほとんど残さない。これまでのところ、損傷を受けた冠動脈系の、新生血管による早期再構成を促進することが可能な、有効な薬物及び療法は存在しない。
【０００６】
従って、虚血性心疾患との闘いにおける血管形成の治療的価値を実現するために、虚血性イベントが起こったら直ちに、梗塞領域における新たな血管の早期成長を十分に促進し、冠動脈の血液循環を迅速に回復することが可能な生物学的特性を有する化合物が求められている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一目的として、虚血性心疾患を治療するための医薬組成物であって、式（Ｉ）の共通の骨格構造を有する１種又は２種以上の化合物、すなわち式（Ｉ）の骨格構造の様々な位置で１つ又は複数の水素原子を置換することにより誘導された化合物、を含有する医薬組成物が提供される。基本化合物、すなわち置換なしの式（Ｉ）の骨格構造自体は、血管形成を促進し、内皮アポトーシスを阻止することにより、虚血性心疾患の治療において強力で有益な治療効果を示し、結果的に、梗塞心筋における血行再建を引き起こし、また、更なる虚血性心筋細胞死を阻止する。以下、基本化合物を「Ｇａ」という。これらの化合物は当技術分野において既知であるが、上述の生物活性及び治療効果を有することは全く知られていない。実際、Ｇａが属するタンニンは従来、非活性成分と評価され、研究者たちは、生薬中の活性成分を同定する過程で、通常、タンニンを不要物として廃棄している。Ｇａは、天然資源から、特に植物から単離することができ、また、既存の、又は今後開発される合成技術を用いて、全合成又は半合成を通じて得ることができる。
【０００８】
【化１】
2009520684.tif 000003
【０００９】
式Ｉの骨格化合物（本明細書においてＧａともいう。）は、骨格化合物Ｇａと類似の生物活性が保持される限り、様々な位置に置換基を有してもよい。置換基は、水素原子の代わりに置換された原子又は原子団である。置換は、有機化学の分野で既知の方法により行うことができる。本明細書において、用語「式Ｉの化合物」は、骨格化合物自体、及び類似の生物活性を有する置換された変異種を包含する。
【００１０】
当業者には理解されるであろうが、上記の骨格化合物又はその置換された変異種は、存在可能な様々な異性体、すなわちラセミ体、エナンチオマー又はジアステレオマーの形態を取ってもよく、無機酸及び有機酸と塩を形成してもよく、また、Ｎ−オキシド、プロドラッグ、生物学的等価体等の誘導体を形成してもよい。「プロドラッグ」とは、親分子の望ましくない特性を改変又は除去するために一時的に用いられる１つ又は複数の特殊な保護基が結合していることにより不活性化されている形態の化合物を意味し、これは、投与されると、体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で代謝され、又は活性化合物に変換される。「生物学的等価体（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）」とは、原子又は原子団が、ほぼ類似した別の原子又は原子団と交換された結果生じる化合物のことである。生物学的等価体への置換の目的は、親化合物に類似の生物学的特性を有する新たな化合物を作り出すことである。生物学的等価体への置換は、物理化学又はトポロジーに基づくものであってもよい。既知の化合物（本明細書中で開示されているもの等）から適切なプロドラッグ、生物学的等価体、Ｎ−オキシド、薬学的に許容可能な塩、又は様々な異性体を製造することは、当技術分野の通常の技術の範囲内にある。従って、本発明では、上で開示の化合物の適切な異性体、塩及び誘導体のすべてが企図される。
【００１１】
本明細書において、用語「機能的誘導体」とは、上で開示の特定の化合物のプロドラッグ、生物学的等価体、Ｎ−オキシド、薬学的に許容可能な塩、又は様々な異性体を意味し、これは、１つ又は複数の点で、親化合物と比較して有利であってもよい。機能的誘導体の製造は容易でない可能性があるが、必要な技術のいくつかは当技術分野で周知のものである。様々なハイスループット化学合成法が利用可能である。例えば、コンビナトリアルケミストリーは化合物ライブラリーの急増をもたらし、効率の高い種々のバイオスクリーニング技術と結びついて、有用な機能的誘導体の効率的な発見及び単離を可能とする。
【００１２】
医薬組成物は、医薬品産業の当業者に既知の従来の手段により、錠剤、カプセル剤、注射剤、液剤、懸濁剤、散剤、シロップ剤等の適切な剤形に製剤化することができ、また、冠動脈心疾患又は心筋梗塞（ＭＩ）に罹患している哺乳動物個体に、適切な方法で投与することができる。製剤技術は本発明の一部を成すものではなく、それ故、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１３】
他の態様において、本発明は、哺乳動物個体において、虚血性心疾患（例えば、冠動脈のアテローム性動脈硬化）で死滅し、又は損傷を受けた心臓組織における血行再建を促進する方法を提供する。この方法は、有効量の、式（Ｉ）の化合物又はこの化合物の機能的誘導体を哺乳動物個体に投与するステップを含む。
【００１４】
更に他の態様において、本発明は、哺乳動物の病的状態を治療、改善又は治癒させる方法を提供する。ここで、病的状態は、医学分野の当業者が病的状態と判断したものであるが、梗塞心筋における早期の血行再建を促進する血管新生因子（ＶＥＧＦ及びＦＧＦ）の発現をアップレギュレートすること、及び／又は、梗塞した心臓におけるアポトーシス性の心筋細胞死を阻害して、更なる虚血傷害の進行性の拡大を阻止する抗アポトーシスタンパク質の発現を誘導し、梗塞サイズを制限すること、によって治療又は緩和することができる。この方法は、有効量の、式（Ｉ）の化合物又はこの化合物の機能的誘導体を哺乳動物に投与するステップを含む。
【００１５】
本発明を特徴付ける様々な新規な特徴は、本願書類に添付され、本願書類の一部を構成する特許請求の範囲に明示される。本発明、本発明の作用効果、及び本発明の使用により達成される特定の目的をより深く理解するためには、本発明の好適な実施形態が例示され、説明された、図面及び以下の説明を参照されたい。
【特定の実施形態の詳細な説明】
【００１６】
Ｉ．実験手順：
本発明で用いたプロトコールはすべて、米国国立衛生研究所により発行されたＴｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに準拠し、香港中文大学の動物実験倫理委員会により承認されたものである。
【００１７】
ダイコンソウからのＧａの単離：
以下に開示する実験のために、ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）という植物からＧａを得た。図１を参照する。８月に中国貴州省から植物を収集し、乾燥させ（１０ｋｇ）、室温下、３日間の７０％エタノール（１００Ｌ）浸出を２回行った。抽出物を混合し、噴霧乾燥し、固体残渣（１ｋｇ）を得た。固体残渣を１０リットルのＨ２Ｏ中に懸濁させ、次いで、クロロホルム（１０Ｌ）で２回、更にｎ−ブタノール（１０Ｌ）で２回分配し、対応する画分を得た。ｎ−ブタノール（ＧＪ−Ｂ）可溶性画分を濾過し、噴霧乾燥して、粉末画分を得た。ｎ−ＢｕＯＨ可溶性画分が、ＨＣＡＥＣ−ヒト冠動脈内皮細胞（クロネティクス社）の増殖を顕著に高め、ＭＩ動物モデルの梗塞領域における迅速な新血管形成を促すことが可能であることが示された。１０％メタノールで平衡化したセファデックスＬＨ−２０のカラムにｎ−ＢｕＯＨ可溶性画分をアプライし、メタノール水溶液で、その濃度を上昇させながら溶出し、７つの画分を分離した。画分３は、約５０％メタノールで溶出されたものであるが、梗塞心筋における顕著な血管形成を促す点で強力な活性を示した。タンニンを含有する上記画分３を用いて、ＭＩ動物モデルに対する治癒効果を試験した。この活性画分に含有される活性化合物の構造をＮＭＲ分析で決定した。もちろん、Ｇａは既知の天然の化合物であるので、他の植物から得てもよく、その場合でも十分な結果をもたらす。
【００１８】
動物、外科的処置：
体重２５０〜３００ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを用いた。適切に麻酔した後に、動物を左開胸し、心膜を開き、冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）を結紮した。試験群（６０匹のラットから成る、すなわちｎ＝６０）において、ＧａのＰＢＳ溶液（０．１ｍＬ。０．３ｍｇのＧａを含有する。）を、結紮した動脈の遠位部の心筋（推定される虚血領域）に結紮直後に注射した。対照群（ｎ＝６０）のラットの対応する位置に等量のＰＢＳを注射した。形態学的及び機能的評価のために、梗塞から２、７、１４及び３０日後に、各群の１５匹のラットを安楽死させた。偽群（ｎ＝６）では、左開胸し、心膜を開いたが、ＬＡＤの結紮を行わなかった。通常の対照群（ｎ＝６）では、ラットにいかなる外科的処置も施さなかった。
【００１９】
梗塞領域における新血管形成の測定：
梗塞後２日及び７日に屠殺したラットの左心室を摘出し、尖部から基部までを３枚の横断切片にスライスした。切片をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。組織切片標本において、光学顕微鏡を用いて高倍率視野（ＨＰＦ）（×４００）で梗塞領域内の血管の数を数えることにより、血管の密度を測定した。梗塞領域内の、重複しない無作為の８つのＨＰＦを用いて、各切片におけるすべての血管を数えた。各ＨＰＦ中の血管の数の平均を求め、ＨＰＦ当たり血管数で表した。盲検法で２人の実験員が血管を数えた。
【００２０】
パラフィン組織切片のＴＵＮＥＬアッセイによる筋細胞アポトーシスの測定：
ＴＵＮＥＬアッセイ法を用いて、単一細胞レベルのアポトーシスを切片上で検出した９。梗塞から７日後に、試験群及び対照群の双方からラット心筋梗塞組織切片を得た。一般的な脱パラフィン及び再水和を行った後、組織をプロテイナーゼＫ（ダコ）で１５分間消化し、ＴｄＴ（ロシュ）及びビオチン１６−ｄＵＴＰ（ロシュ）と共に３７℃で６０分間インキュベートした。ＳＰ−ＨＲＰ（ロシュ）を加えて２０分間インキュベートした後、ＴＵＮＥＬ染色をＤＡＢ（ダコ）で可視化した。ＤＡＢは核を染色した（ＤＮＡ断片は茶色に染色された）。組織切片を顕微鏡で、高倍率視野（×４００）で検査し、少なくとも１０個のＨＰＦ中で少なくとも１００個の細胞が数えられた。ＨＰＦ当たりアポトーシス筋細胞数をアポトーシス指数と呼ぶ。
【００２１】
心筋梗塞の評価：
梗塞後１４日に屠殺したラットの心臓を摘出し、尖部から基部までを３〜４枚の横断切片にスライスし、パラフィンに包埋した。各スライドから薄い切片（厚さ５μｍ）を切り取り、Ｈ＆Ｅ染色及びマッソントリクローム（シグマ、米国）で染色した。これにより、コラーゲンは青色に、心筋は赤色に標識される。すべてのスライドから得た上記切片を、コンピューター支援面積測定（ＩｍａｇｅＪ  １．３４Ｓ、Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ、国立衛生研究所、米国）を行うためにスクリーンに映し出した。心内膜及び心外膜の周径、並びに瘢痕の長さを、各切片について測定した。これらの測定値から、左心室の梗塞部分を算出し、瘢痕の長さと、切片の心室の心内膜及び心外膜の周径と、の比を百分率で表して、梗塞サイズを明らかにした９，１０，１１。
【００２２】
心エコー検査による心筋機能の評価：
実験開始前に、合計１１８匹のＳＤラットがベースラインの心エコー検査を受けた。Ｓ１０−ＭＨｚフェーズドアレイトランスデューサー及びＧＥ  ＶｉｎｇＭｅｄ  Ｖｉｖｉｄ７システムを用いて、制御麻酔下で心エコー検査を記録した。Ｍモード画像及び２次元（２Ｄ）心エコー検査画像を胸骨傍の長軸方向及び短軸方向から記録した。短軸像は、乳頭筋レベルのものであった。左室拡張末期（ＬＶＤＡ）及び左室収縮末期（ＬＶＳＡ）の面積を胸骨傍の長軸方向からプラニメーターで測り、ＬＶ拡張末期及びＬＶ収縮末期の容積（ＬＶＥＤＶ及びＬＶＥＳＶ）をＭモード法により算出した。ＬＶ駆出分画（ＬＶＥＦ）及び内径短縮率（ＦＳ）を２Ｄ短軸像におけるＬＶ断面積から導出した。ＥＦ＝［（ＬＶＥＤＶ−ＬＶＥＳＶ）／ＬＶＥＤＶ］×１００％；ＦＳ＝［（ＬＶＤＡ−ＬＶＳＡ）／ＬＶＤＡ］×１００％１２。心エコー検査の計算には標準公式を用いた。
【００２３】
生存関連遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析：
上で調製した梗塞心筋組織の小さな切片を切開直後に液体窒素に入れ、−８０℃で保存した。メーカーの説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０４、キアゲン、ドイツ）を用いて全ＲＮＡを単離し、ＲＮａｓｅフリーの水２０〜３０μＬに溶解し、−８０℃で保存した。分析を更に続ける前に、ホルムアルデヒド変性ＲＮＡゲル電気泳動（１．２％）を用いて、通常どおり、リボソームＲＮＡの完全性及びＤＮＡの混入をチェックした。タンパク質の混入及び全ＲＮＡの濃度は、ＯＤ２６０：ＯＤ２８０の比を分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ハンブルグ、ドイツ）で求めることにより評価した。
【００２４】
ウェスタンブロット分析：
上で調製した梗塞心筋組織の約５０ｍｇを液体窒素中で粉末に粉砕した。１ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ノニデットＰ−４０、１０％グリセリン、２００ｍＭ  ＮａＦ、２０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１０ｍｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１０ｍｇ／ｍＬ  アプロチニン、２００ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、及び１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム）を粉末に加え、３０分間氷上に置いた。タンパク質産生量をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣタンパク質アッセイキット（バイオラッド）により定量した。等量（１０ｇ）の全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分画し、ＰＶＤＦ膜（アマシャム、米国）に転写した。粉乳（ＰＢＳＴＭ）５％（質量／体積）を含有するＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）０．１％（体積／体積）を加えたリン酸緩衝生理食塩水を用いて、室温で３０分間、ブロットをブロックし、ラットリン酸化Ａｋｔ１（マウス、サンタクルーズ）又はラットＢｃｌ−２（マウス、シグマ  アルドリッチ）に特異的な一次抗体（ＰＢＳＴＭ中で１：１０００に希釈）を用いて、６０分間プローブした。ＰＢＳＴ中でよく洗浄した後、ブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（アマシャム  バイオサイエンス）（ＰＢＳＴＭ中１／１０００希釈、６０分間）でプローブし、ＰＢＳＴでよく洗浄し、化学発光により現像した。
【００２５】
生物統計：
形態計測データはすべて盲検的に収集した。結果は、各心臓から得られた平均測定値から算出した平均±ＳＤで示す。２つの測定値間の比較の統計的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて判定した。Ｐ＜０．０５の値は有意とみなした。
【００２６】
ＩＩ．梗塞心筋におけるＧａ誘導性の血行再建：
図２を参照する。組織学的研究により、梗塞から２日後に、中心域及び境界域を含む全梗塞領域に渡って、多くの血管が新たに形成されたことが明らかになった（図２の１、新生血管は赤色矢印で指し示している）。新生血管の一部は血球で満たされていたが、他の一部は未だ、血管再生過程の初期段階にあり、血球で満たされていない管腔様構造を呈していた。梗塞から２日後に１５個のＧａ処置心臓の１５枚のスライドの各々において無作為に選択した８つの視野から、Ｇａ処置心筋の梗塞領域における毛細血管密度を算出すると、血球で満たされているものがＨＰＦ当たり平均１８（１８±３．９）、管腔様構造のものがＨＰＦ当たり平均８（８±２．８）であった（図２の１）。対照的に、ＭＩ後２日の対照心筋の梗塞領域では、炎症細胞浸潤を伴う血管がそれほど多くは観察されなかった（ＨＰＦ当たり５±２．１）（図２の２）。ＭＩから７日後、Ｇａ処置心臓において、血球で満たされた新生血管が梗塞領域に渡って残存していた（１１±３．６）が、管腔様構造は観察されなかった（図２の３）。対照的に、対照標本では、梗塞から７日後に少数の血管しか見られず（３±１．２）、主として、線維組織による梗塞心筋の置換が観察された（図２の４）。ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット分析により、梗塞心筋における２４時間以内のＧａ誘導性血行再建が、対応する心臓組織中のＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの遺伝子発現のアップレギュレーションと同時に起こっていたことが明らかになった。Ｇａ処置心筋におけるＶＥＧＦ及びＦＧＦの発現は、対照群の非処置心筋における発現（図２の５及び６、Ｃ）と比較して、それぞれ１．８倍及び２．２倍に増加した（図２の５及び６、Ｔ）。
【００２７】
ＩＩＩ．Ｇａによる生存可能性の増大、及び梗塞サイズの減少：
図３を参照する。ＬＡＤ結紮から７日後、対照の梗塞周囲の辺縁部に沿った、危険な状態にある筋細胞（図３の１）は、心臓の遠位部の筋細胞と比較して、歪んだ不規則な形状を呈していた。対照的に、Ｇａ処置心臓の梗塞周囲の辺縁部の筋細胞は正常な形状を呈し（図３の２）、筋線維は、非処置心臓の筋線維ほど細くも薄くもなく、健常なままであった。ＴＵＮＥＬ染色により、Ｇａ処置した左心室心筋（図３の２）で検出されたアポトーシス筋細胞の数は、非処置対照と比較して約３分の１であることが判明した（高倍率視野当たり５．０４±０．７５に対して１．７０±０．１８、Ｐ＜０．００１、図３の１）。これらの相違は、梗塞周囲の辺縁部で特に顕著であり、アポトーシス核（茶色に染色されている。）は、対照心臓中の不規則形状の筋細胞で最も多かった。アポトーシス核のほとんどは、梗塞領域より遠位の筋細胞ではなく、梗塞周囲の辺縁部において観察された。更に、Ｇａ処置心臓の梗塞領域では、アポトーシス核がはるかに少ない筋細胞に囲まれたかなり高密度の毛細血管が見出された。対照的に、対照群の非処置心臓では、毛細血管の密度がはるかに低く、また、アポトーシス核がより多いことが観察された。これらの結果は、Ｇａ処置で誘導された血管形成により筋細胞及び内皮細胞の双方においてアポトーシス促進プロセス延長が阻止され、梗塞周囲の領域における生存筋細胞及び内皮細胞の生存可能性が高められ、結果的に心筋機能が改善されたことを示している。危険な状態にある生存筋細胞に対するＧａ誘導性の抗アポトーシス効果が抗アポトーシスタンパク質の発現を介したものか否かを判定するために、ウェスタンブロット分析を行った。危険な状態にある心臓組織においてＧａに誘導されたアポトーシス促進プロセス延長阻止が、重要な生存因子の遺伝子発現の増加と同時に起こっていたことが明らかになった。対照群の心臓組織（図の３及び４、Ｃ）と比較して、Ａｋｔ１（図３の３、Ｔ）及びＢｃｌ２（図３の４、Ｔ）の発現がそれぞれ３．３倍及び２．８倍増加した。
【００２８】
Ｇａにより誘導された、梗塞周囲の領域の生存筋細胞及び内皮細胞の生存可能性の増加が梗塞サイズの減少をもたらしたか否かを調べるために、異なる動物群の梗塞サイズを測定した。図３に示されるように、左心室の心筋におけるコラーゲン沈着又は瘢痕組織の割合の平均（マッソントリクローム染色により明らかにされたもの）は、梗塞後１４日の対照群のラット（図３の６）の３９．５３％と比較すると、Ｇａで処置されたラット（図３の５）において２７．４４％であり、これは、筋細胞及び内皮細胞の双方の生存可能性がＧａにより高められたことにより、左心室の前部自由壁における生存心筋の量が顕著に増加したことを示している。心エコー検査の測定値に示されているが、損傷を受けた冠動脈系のＧａ処置誘導性の再構成、及び梗塞サイズの減少は、顕著な機能改善を伴っていた。梗塞後７日及び１４日の非処置対照ＭＩ心臓と比較して、Ｇａ処置ＭＩ心臓の駆出分画（ＥＦ）は７日にかなり高く（５５．６８±２．６３対４９．６７±２．７８、Ｐ＝０．０３）、１４日に顕著に増加していた（６０．１１±２．６６対４８．２６±２．５５、Ｐ＝０．００１）。同様に、Ｇａ処置ＭＩ心臓の内径短縮率（ＦＳ）は７日にかなり高く（２７．３３±１．６３対２２．１７±１．６７、Ｐ＝０．０１）、１４日に顕著に増加していた（２９．８７±２．６６対２１．３５±２．０８、Ｐ＝０．００２）。
【００２９】
要約すると、以上の実験例は、Ｇａが、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの発現をアップレギュレートして、血液供給ネットワークを早期に再構成することができること、抗アポトーシスタンパク質Ａｋｔ１及びＢｃｌ２の発現を誘導して、危険な状態にある心筋細胞のアポトーシス死を阻止することができること、及び、虚血性イベントを経験した心臓の顕著な機能改善をもたらすことができることを示している。従って、Ｇａは、虚血性心疾患の治療において、血管新生療法用薬物として新たな地平を切り開くものである。
【００３０】
ＩＶ．医薬組成物の製造、及び哺乳動物の虚血性心疾患の治療における医薬組成物の使用：
有効な化合物が同定され、当該化合物の部分的又は実質的に純粋な調製物が、植物等の天然資源からの化合物の単離又は化学合成により得られれば、当産業の既存の方法又は今後開発される方法を用いて、種々の医薬組成物又は医薬製剤を部分的又は実質的に純粋な化合物から製造することができる。化合物から医薬製剤及び医薬品剤形（錠剤、カプセル剤、注射剤、シロップ剤を含むが、これらに限定されない。）を製造する特定の方法は、本発明の一部を成すものではなく、医薬品産業の当業者は、本発明の実施に、当産業において確立された１つ又は複数の方法を適用することができる。或いは、本発明の化合物をより適合させるために、当業者は従来の既存の方法を改変してもよい。例えば、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）の公式ウェブサイトが提供する特許又は特許出願のデータベースには、有効な化合物からの医薬製剤及び医薬製品の製造に関する豊富な情報が含まれている。有用な情報源としては、他に、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（編集：Ｓａｒｆａｒａｚ  Ｋ．Ｎｉａｚｉ、販売：Ｃｕｌｉｎａｒｙ  ＆  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｔｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）が挙げられる。
【００３１】
本願の明細書及び特許請求の範囲において、用語「植物抽出物」とは、抽出プロセスを介して植物の構成部分から得られる、天然化合物の混合物であって、全乾燥重量の少なくとも１０％が未同定化合物であるものを意味する。言い換えれば、植物抽出物は、植物から実質的に精製された同定済みの化合物を意味するものではない。抽出プロセスは、通常、所定の時間、溶媒（通常、水及び／又は有機溶媒）中に原料の植物構成部分を浸漬するステップを含む。抽出プロセスは、植物残滓から溶液を分離するステップと、次いで、溶液から溶媒を除去して、抽出物を得るステップと、を含んでもよく、更に、抽出物について、濃縮及び／又は部分精製を行ってもよい。用語「医薬品添加物」とは、薬剤に含有される成分のうち、薬理活性を示す成分以外のものを意味する。用語「有効量」とは、治療される個体において治療効果を引き出すのに十分な量を意味する。当業者には理解されることだが、有効投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、添加物の使用、及び他の治療上の処置との併用の可能性によって異なる。当業者は、当技術分野で既知の従来の方法を用いて、特定の状況における有効量を決定することができる。
【００３２】
Ｖ．参考文献：
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４．  Ｒｉｓａｕ  Ｗ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．１９９７；３８６：６７１−６７４．
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８．  Ｕｎｇｅｒ  ＥＦ，Ｓｈｏｕ  Ｍ，Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  ＣＤ，Ｈｏｄｇｅ  Ｅ，Ｊａｙｅ  Ｍ，Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＳＥ．Ｅｘｔｒａｃａｒｄｉａｃ  ｔｏ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎａｓｔｏｍｏｓｅｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｏｇｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３；２６４：Ｈ１５６７−１５７４．
９．  Ｋｏｃｈｅｒ  ＡＡ，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  ＭＤ，Ｓｚａｂｏｌｃｓ  ＭＪ，Ｔａｋｕｍａ  Ｓ，Ｂｕｒｋｈｏｆｆ  Ｄ，Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｈｏｍｍａ  Ｓ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＮＭ，Ｉｔｅｓｃｕ  Ｓ．Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｒｅｄｕｃｅｓ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００１；７：４３０−４３６．
１０．  Ｌｉｕ  ＹＨ，Ｙａｎｇ  ＸＰ，Ｎａｓｓ  Ｏ，Ｓａｂｂａｈ  ＨＮ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｅ，Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ  ＯＡ．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｅｗｉｓ  ｉｎｂｒｅｄ  ｒａｔｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７；２７２：Ｈ７２２−７２７．
１１．  Ｙａｎｇ  Ｆ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｙａｎｇ  Ｘ，Ｘｕ  Ｊ，Ｋａｐｋｅ  Ａ，Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ  Ｏ．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２；８７：５４７−５５５．
１２．  Ｄａｖａｎｉ  Ｓ，Ｍａｒａｎｄｉｎ  Ａ，Ｍｅｒｓｉｎ  Ｎ，Ｒｏｙｅｒ  Ｂ，Ｋａｎｔｅｌｉｐ  Ｂ，Ｈｅｒｖｅ  Ｐ，Ｅｔｉｅｖｅｎｔ  Ｊ−Ｐ，Ｋａｎｔｅｌｉｐ  Ｊ−Ｐ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ａｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｅｎｓｉｔｙ，ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｈｅａｒｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｒａｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐｌａｓｔｙ  Ｍｏｄｅｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００３；１０８：２５３ＩＩ−２５８．
【００３３】
好適な実施形態に当てはまる本発明の新規な基本的特徴を説明・指摘してきたが、当業者が、本発明の精神から逸脱することなく、例示の実施形態の外形及び細部において、様々な省略、置換及び変更を行うことができることは理解されるであろう。本発明は、例示にすぎない上述の実施形態により限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲で規定される保護範囲内で様々な点で改変することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の化合物の一製造例として、ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）という植物からＧａを単離するプロセスの概略を示す図である。
【図２】梗塞心筋における、Ｇａ処置後の早期の新血管形成の効果を示す図である。１：左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）結紮、Ｇａ注射後２日。２：対照心臓２日。３：ＬＡＤ結紮、Ｇａ注射後７日。４：対照心臓７日。５：ＲＴ−ＰＣＲ分析。６：ウェスタンブロット分析。５及び６は、Ｇａ処置した心臓組織において、ＶＥＧＦｂ及びＶＥＧＦｃの遺伝子発現が顕著にアップレギュレートしたことを示している（ＡはＶＥＧＦｂを、ＢはＶＥＧＦｃを、ＧはＧＡＰＤＨを、Ｃは対照群を、ＴはＧａ処置群を、Ｍは分子マーカーを表す）。
【図３】生存可能性及び梗塞サイズに対するＧａ誘導性の効果を示す図である。１：ＬＡＤ結紮後７日（対照）。２：ＬＡＤ結紮後７日（Ｇａ処置）。３：ウェスタンブロット分析。これは、Ｇａ処置によるリン酸化Ａｋｔ１の発現の増加を示している。４：ウェスタンブロット分析。これは、Ｇａ処置によるＢｃｌ２の発現の増加を示している。Ｃ及びＴは、それぞれ対照群及びＧａ処置群を表す。５：梗塞から２週間後のラット心筋の三重染色（対照）。６：梗塞から２週間後のラット心筋の三重染色（Ｇａ処置）。これは、梗塞サイズが顕著に減少し、前壁内の生存心筋の量が増加したことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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