(57)【要約】  本発明の１実施例による抗癌剤は配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。前記抗癌剤は大腸、膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平上皮細胞、リンパ細胞または白血球から由来する癌を抑制するのに使用することができる。【選択図】図１１
2009520812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む抗癌剤。
【請求項２】
前記抗癌剤は大腸癌を抑制するのに使用されることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
前記抗癌剤は膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平上皮細胞（squamous cell）、リンパ細胞または白血球から由来する癌を抑制するのに使用されることを特徴とする、請求項２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列またはこれらの類似体を患者に癌細胞増殖を抑制したり癌細胞死滅を増加させるための有効な量で投与して癌細胞増殖を抑制したり癌細胞死滅を増加させる方法。
【請求項５】
配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を患者に有効な量で投与することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列の類似体を患者に有効な量で投与することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記増殖が抑制されたり死滅が増加する癌細胞は大腸癌細胞であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記増殖が抑制されたり細胞死滅が増加する癌細胞は膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平上皮細胞、リンパ細胞または白血球から誘導される癌細胞であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその類似体及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む癌細胞増殖を抑制したり癌細胞死滅を増加させることを特徴とする薬学組成物。
【請求項１０】
前記薬学組成物は大腸癌を抑制するのに使用されることを特徴とする、請求項９に記載の薬学組成物。
【請求項１１】
前記抗癌剤は膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平上皮細胞、リンパ細胞または白血球から由来する癌を抑制するのに使用されることを特徴とする、請求項９に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫調節ペプチドに関する。好中球及びモノサイトのような食細胞で発現するホルミルペプチド受容体族（FPR）及びホルミルペプチド受容体-like１（FPRL１）は病原菌感染に対する宿主の防御において重要な役割を果たす（非特許文献１、２）。前記受容体は百日咳毒素-敏感性（pertussis toxin-sensitive）Gi蛋白質と結合することが知られている（非特許文献１、２）。FPRの活性化はGαiサブユニットからGβγサブユニットの分離を誘導し、βγ-サブユニットはホスホリパーゼCβまたはホスホイノシチド３-キナーゼの活性化を誘導する（非特許文献１、２）。このような分子の活性化は複雑な下流シグナリングを誘導して走化性移動、脱顆粒化及びスーパーオキシド生成のような細胞反応を多様化する。
【背景技術】
【０００２】
大部分の主要作用剤は複雑な免疫反応を誘発する多くの複雑な細胞シグナリングを誘導する。前記免疫反応中のほとんどが侵入病菌を除去するための宿主細胞の適した機能が必須的に必要であるが、いくつかの反応は免疫反応で好ましくない副作用になることもある。薬剤の開発分野において薬剤候補物質の副作用を減少させたり除去することが主要関心事である。このために選択的な免疫反応調節因子またはいくつかの接近経路を通じた選択的な拮抗剤（antagonists）を開発するための多くの研究が進められている（非特許文献３、４）。
【０００３】
FPRの様々な作用剤は内因性供給源（endogenous source）または人工合成で確認された（非特許文献１、２）。これらの例としては、バクテリアペプチド（N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine（fMLF））、HIV-外皮ドメイン（T２０及びT２１）、及び宿主-誘導性作用剤（host-derived agonists;AnnexinI及びAβ４２）（非特許文献５-７）などがある。以前に本発明者はモノサイト及び好中球のような白血球細胞を増加させるペプチドリガンド（Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH２）（以下、“WKYMVm”と言う）を発表した（非特許文献８-１１）。LeなどはWKYMVmがFPR（ホルミルペプチド受容体）及びFPRL１（ホルミルペプチド受容体-like１）に結合すると発表した（非特許文献１２）。WKYMVmは広い範囲の受容体に対して高い親和度を有する短いペプチドであるので、FPR-またはFPRL１-媒介されたシグナリングの研究に有用である。
【非特許文献１】Le, Y., Li, B., Gong, W., Shen, W., Hu, J., Dunlop, N. M., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2000) Immunol Rev. 177, 185-194.
【非特許文献２】Le, Y., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12, 91-105.
【非特許文献３】White, J. R., Lee, J. M., Young, P. R., Hertzberg, R. P., Jurewicz, A. J., Chaikin, M. A., Widdowson, K., Foley, J. J., Martin, L. D., Griswold, D. E., and Sarau, H. M. (1998) J. Biol. Chem. 273, 10095-10098.
【非特許文献４】Zagorski, J., and Wahl, S. M. (1997) J. Immunol. 159, 1059-1062.
【非特許文献５】Prossnitz, E. R., and Ye, R. D. (1997) Pharmacol. Ther. 74, 73-102.
【非特許文献６】Su, S. B., Gong, W. H., Gao, J. L., Shen, W. P., Grimm, M. C., Deng, X., Murphy, P. M., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (1999) Blood 93, 3885-3892.
【非特許文献７】Walther, A., Riehemann, K., and Gerke, V. (2000) Mol. Cell. 5, 831-840.
【非特許文献８】Baek, S. H., Seo, J. K., Chae, C. B., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1996) J. Biol. Chem. 271, 8170-8175.
【非特許文献９】Seo, J. K., Choi, S. Y., Kim, Y., Baek, S. H., Kim, K. T., Chae, C. B., Lambeth, J. D., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1997) J. Immunol. 158, 1895-1901.
【非特許文献１０】Bae, Y. S., Ju, S. A., Kim, J. Y., Seo, J. K., Baek, S. H., Kwak, J. Y., Kim, B. S., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 65, 241-248.
【非特許文献１１】Bae, Y. S., Kim, Y., Kim, Y., Kim, J. H., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 66, 915-922.
【非特許文献１２】Le, Y., Gong, W., Li, B., Dunlop, N. M., Shen, W., Su, S. B., Ye, R. D., and Wang, J. M. (1999) J. Immunol. 163, 6777-6784.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特異な受容体に対する選択的な免疫調節因子または選択的な拮抗剤を開発するための研究だけでなく、分子多様性をスクリーンする研究は小さい化合物から成っていて今まで非常に制限的に行われたので、新たな化合物を糾明しようとする継続的な要請があった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む抗癌剤を提供するためのものである。
【０００６】
前記抗癌剤は大腸、膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平上皮細胞、リンパ細胞または白血球から由来する癌を抑制するのに使用することができる。
【０００７】
本発明はまた、配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列またはこれらの類似体を患者に有効な量で投与して癌細胞増殖を抑制したり癌細胞死滅を増加させる方法を提供するためのものである。
【０００８】
配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列またはこれらの類似体は有効な量でこれを必要とする患者に投与される。
【０００９】
前記増殖が抑制されたり細胞死滅が増加する癌細胞は大腸癌細胞である。増殖が抑制されたり細胞死滅が増加する癌細胞は膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平上皮細胞、リンパ細胞または白血球から誘導される癌細胞であり得る。
【００１０】
本発明はまた、配列番号:４、配列番号:１１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその類似体及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦型体を含む癌細胞増殖を抑制したり癌細胞死滅を増加させる薬学組成物を提供するためのものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の他の特徴及び利点は添付した図面と共に下記詳細な説明によってより明白になる。
【００１２】
FPR（ホルミルペプチド受容体）及びFPRL１（ホルミルペプチド受容体-like１）は免疫反応で重要な役割を果たす。本発明はWKYMVmから誘導されたペプチドを提供する。多くのペプチドはFPRまたはFPRL１を刺激してカルシウムを増加させるが、WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号１１）及び６thD-Met置換ペプチドはFPRL１-発現細胞でのみカルシウムを増加させるが、FPR-発現細胞ではそうでない。１２５I-WKYMVmを使用した競争分析はFPR-発現細胞で多くの蛋白質がカルシウムを増加させる効果を有するだけでなく、WKGMVm（配列番号１）、WKRMVm（配列番号１１）及び６thD-Met置換ペプチドもFPRに対する結合で１２５I-WKYMVmと競争できるということを示した。ホスホリパーゼC-媒介されたカルシウムの増加とは異なって、WKGMVm、WKRMVm及び６thD-Met置換ペプチドはFPR-発現細胞で細胞外調節された蛋白質キナーゼ（ERK）及びAkt活性化を刺激することができる。WKYMVmペプチドはFPR細胞でCa２+及びERK経路を通じて脱顆粒化及び細胞の走化性を刺激する。しかし、WKGMVm、WKRMVm及び６thD-Met置換ペプチドは走化性移動の誘導によってのみFPR細胞を刺激し、脱顆粒化によっては刺激しない。重要な化学走性物質受容体としてFPRはリガンド特異的に互いに区別されるペプチドリガンドによって調節できるという事実が初めて知られた。
【００１３】
本発明の好ましい第１実施例によると、本発明のペプチドは配列番号:１乃至配列番号:２４からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号:１乃至配列番号:２４のペプチドから誘導される物質を含む。配列番号:１乃至配列番号:２４は次の通りである:
【００１４】
Trp-Lys-Gly-Met-Val-D-Met-NH２（WKGMVm;配列番号:１）、Trp-Lys-Tyr-Met-Gly-D-Met-NH２（WKYMGm;配列番号:２）Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Gly-NH２（WKYMVG;配列番号:３）、Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-NH２（WRYMVm;配列番号:４）、Trp-Glu-Tyr-Met-Val-D-Met-NH２（WEYMVm;配列番号:５）、Trp-His-Tyr-Met-Val-D-Met-NH２（WHYMVm;配列番号:６）、Trp-Asp-Tyr-Met-Val-D-Met-NH２（WDYMVm;配列番号:７）、Trp-Lys-His-Met-Val-D-Met-NH２（WKHMVm;配列番号:８）、Trp-Lys-Glu-Met-Val-D-Met-NH２（WKEMVm;配列番号:９）、Trp-Lys-Trp-Met-Val-D-Met-NH２（WKWMVm;配列番号:１０）、Trp-Lys-Arg-Met-Val-D-Met-NH２（WKRMVm;配列番号:１１）、Trp-Lys-Asp-Met-Val-D-Met-NH２（WKDMVm;配列番号:１２）、Trp-Lys-Phe-Met-Val-D-Met-NH２（WKFMVm;配列番号:１３）、Trp-Lys-Tyr-Met-Tyr-D-Met-NH２（WKYMYm;配列番号:１４）、Trp-Lys-Tyr-Met-（Phe/Trp）-D-Met-NH２（WKYM（F/W）m;配列番号:１５）、Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Glu-NH２（WKYMVE;配列番号:１６）、Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Val-NH２（WKYMVV;配列番号:１７）、Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Arg-NH２（WKYMVR;配列番号:１８）、Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Trp-NH２（WKYMVW;配列番号:１９）、Trp-Lys-Tyr-Met-Val-NH２（WKYMV;配列番号:２０）、Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH２（KYMVm;配列番号:２１）、Lys-Tyr-Met-Val-NH２（KYMV;配列番号:２２）、Tyr-Met-Val-D-Met-NH２（YMVm;配列番号:２３）及びMet-Val-D-Met-NH２（MVm;配列番号:２４）。
【００１５】
配列番号：１乃至配列番号：２４のペプチドは分離された形態または実質的に純粋な形態で存在する。
【００１６】
前記ペプチドはカルボキシル基において-NH２基に選択的に置換されたアミノ酸残基を含む。
【００１７】
本発明のペプチドは下記特性のうち少なくとも一つを有する：
（a）人間のモノサイトまたは好中球でスーパーオキシド生成を誘導する；
（b）人間末梢血モノサイトまたは好中球による細胞内カルシウム増加を誘導する；
（c）FPR（ホルミルペプチド受容体）またはFPRL１（ホルミルペプチド受容体-like１）に結合する；
（d）試験管内で人間のモノサイトまたは好中球の走化性移動を誘導する；
（e）FPR（ホルミルペプチド受容体）発現細胞またはFPRL１（ホルミルペプチド受容体-like１）発現細胞から脱顆粒化を誘導する；
（f）FPR（ホルミルペプチド受容体）またはFPRL１（ホルミルペプチド受容体-like１）の活性化を通じて細胞外信号-調節された蛋白質キナーゼリン酸化を促進する。
（g）FPR（ホルミルペプチド受容体）またはFPRL１（ホルミルペプチド受容体-like１）の活性化を通じてAktリン酸化を促進させる。
【００１８】
本発明の好ましい他の実施例によると、本発明は配列番号：１乃至配列番号：２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドまたは配列番号：１乃至配列番号：２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
前記ペプチドまたは物質を活性成分として含む医薬組成物は塩水、緩衝塩水、デキストロース、水、グリセロール及びエタノールより選択される医薬用希釈剤のうちの１種以上含むことができるが、希釈剤はこれらに限られない。
【００２０】
前記医薬組成物は投与目的及び疾病に応じて相異なるように適用できる。実質的に投与される活性成分の量は多様な関連要素、つまり、治療しようとする疾病、患者状態の程度、他の薬剤（例えば、走化性薬剤）と共同投与の要否、患者の年齢性別、体重、食べ物、投与時間、投与経路及び組成物の投与比率を考慮して決めなければならない。前記組成物は投与量及び投与経路が疾病の形態及び深刻性によって調節できるが、一日に１回または１〜３回に分けて投与できる。
【００２１】
本発明のペプチドまたは物質を含む組成物は経口または非経口で投与することができる。非経口投与は経口以外の投与経路、つまり、直腸、静脈、腹膜及び筋肉、動脈、経皮、鼻腔、吸入、眼球及び皮下を通じた薬剤投与を意味する。
【００２２】
前記ペプチドまたは物質を含む医薬組成物は経口投与形態、注入可能な溶液または局所製剤のようないかなる形態に製剤化することができる。製剤化は経口及び注入可能な投与（真正溶液、懸濁液またはエマルジョン）に適するように製造されるのが好ましく、錠剤、カプセル、軟質カプセル、水性薬剤、丸剤、顆粒などのような経口形態に製造することが最も好ましい。
【００２３】
前記製剤化で本発明のペプチドは賦形剤なく軟質カプセルに充填され、担持体と混合されたり希釈された後に適当な製剤に作られる。適した担持体の例としては、澱粉、水、塩水、リンガー液、デキストロースなどがある。
【００２４】
WRYMVm（配列番号:４）またはWKRMVm（配列番号:１１）のアミノ酸ペプチドはマウス腫瘍モデル、CT２６、EL４等の腫瘍成長を弱化させることがある。また、WRYMVmの腫瘍弱化効果は少量の投与量でも効果的に現れ、反対に投与量を高めることは効果的でない。WRYMVmは他の抗癌剤、ビンクリスチン（vincristine）と共に組み合わせて使用すると腫瘍の大きさを抑制し、生存率を高めるシナジー効果を示す。
【００２５】
本発明の他の実施例によると、白血球の数または活性化状態の変化を伴ったりそのような変化によって誘発される疾病を治療する方法を提供する。前記方法は配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を前記疾病の治療を必要とする宿主に治療に有効な量を投与することを含む。前記疾病はバクテリア、マイコプラズマ、酵母、カビ、ウイルスによる感染または炎症であり得る。
【００２６】
本発明の他の４実施例によると、白血球の数を増加させたり活性化状態を向上させる方法を提供する。前記方法は配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を白血球の数の増加または高い活性化状態を必要とする疾病の治療を要する宿主に治療に有効な量を投与することを含む。
【００２７】
本発明の他の実施例によると白血球での細胞外カルシウムの増加を誘導する方法を提供する。前記方法は配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を患者に治療に有効な量または予防のために誘導または脱感作が得られる量を投与することを含む。
【００２８】
本発明の他の実施例によると人間モノサイトまたは好中球によるスーパーオキシド生成を誘導する方法を提供する。前記方法は配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を患者に治療に有効な量または予防のために誘導または脱感作が得られる量を投与することを含む。
【００２９】
本発明の他の実施例によると、人間の末梢血単核細胞による走化性移動を誘導する方法を提供する。前記方法は配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を患者に治療に有効な量または予防のために誘導または脱感作が得られる量を投与することを含む。
【００３０】
本発明の他の実施例によるとFPR発現細胞またはFPRL１発現細胞での脱顆粒化を誘導する方法を提供する。前記方法は配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を患者に治療に有効な量または予防のために誘導または脱感作が得られる量を投与することを含む。
【００３１】
本発明の他の実施例によるとFPR発現細胞またはFPRL１発現細胞でのFPRまたはFPRL１に結合に対してWKYMVmとペプチドとの拮抗力を増加させる方法を提供する。前記方法は配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を患者に治療に有効な量または予防のために誘導または脱感作が得られる量を投与することを含む。
【００３２】
本発明の他の実施例によるとFPR発現細胞またはFPRL１発現細胞での細胞外信号によって調節される蛋白質キナーゼを増加させる方法を提供する。前記方法は配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を患者に治療に有効な量または予防のために誘導または脱感作が得られる量を投与することを含む。
【００３３】
本発明の他の実施例によるとFPR発現細胞またはFPRL１発現細胞でのAktを増加させる方法を提供する。前記方法は配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは配列番号：１乃至２４からなる群より選択されるアミノ酸配列のペプチドから誘導される物質を患者に治療に有効な量または予防のために誘導または脱感作が得られる量を投与することを含む。
【００３４】
前記実施例で治療される宿主または患者は感染によって誘発される疾病、特に、 サイトメガロウィルス感染、リューマチ性関節炎、ライム関節炎、痛風、敗血症、高熱、潰瘍性結腸炎、全腸炎、骨粗鬆症、歯周疾患、糸球体腎炎、慢性非感染性肺炎、類肉腫症、喫煙者の肺、肉芽腫型性、肝の繊維症、肺の繊維症、移植拒否、拒否反応、慢性骨髄白血病、急性骨髄白血病、腫瘍性疾病、気管支喘息、タイプIインシュリン依存性糖尿、動脈硬化症、粥状硬化症、乾癬、慢性Bリンパ球白血病、分類不能型兔疫不全症、播種性血管内凝固症、全身性硬化症、脳脊髓炎、肺炎、過IgE症候群、癌転移、癌成長、入養免疫療法、後天性呼吸困難症候群、敗血症、再潅流症候群、手術後炎症、器官移植または脱毛症を有する宿主や患者であり得る。
【００３５】
本発明は配列番号：１乃至配列番号：２４のアミノ酸配列を有するペプチドを符号化する分離されたヌクレオチドを提供する。
【００３６】
本発明は配列番号：１乃至配列番号：２４のアミノ酸配列を有するペプチドを符号化する分離されたヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００３７】
本発明は配列番号：１乃至配列番号：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【実施例】
【００３８】
本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。しかしながら、下記の実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【００３９】
実施例に使用された物質及び方法
物質
Fmocアミノ酸はミリポア（Millipore、Bedford、MA）で購入した。Rapidamide樹脂はデュポン社（Boston、MA）から購入した。末梢血単核細胞（PBMC）分離培地（Histopaque-１０７７）、シトクロムc及びfMLFはSigma（St.Louis、MO）から購入した。ペンタアセトキシメチルエステル（fura-２/AM）はMolecular Probes（Eugene、OR）から購入した。RPMI１６４０はLife Technologies（GrandIsland、NY）から購入した。透析されたウシの胎児血清及び補充されたウシの血清はHyclone Laboratories Inc.（Logen、UT）から購入した。PTX、GF１０９２０３X及びPD９８０５９はCalbiochem（San Diego、CA）から購入した。LY２９４００２はBIOMOL研究所（Polymouth Meeting、PA）から購入した。
【００４０】
ペプチドは固相法で合成した（８、９）。簡単に説明すると、ペプチドをrapidamide支持体樹脂上で合成して標準Fmoc/t-butyl法によって酸-不安定性リンカー（acid-labile linker）で組立てた。ペプチド組成はアミノ酸分析法で確認した（８）。
【００４１】
RBL-２H３、FPR-発現RBL-２H３及びFPRL１-発現RBL-２H３細胞は２０％FBS及び２００g/mlのG４１８で補充されたDMEMで培養した（１３）。
RPMI１６４０はInvitrogen Corp．（Carlsbad、CA）で購入した。希釈されたウシの胎児血清と補充されたウシの血清はHyclone Laboratories Inc．（Logan、UT）で購入した。CpG ODN（全てホスホロチオエートバックボーンを有する５'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-３'）はGenotech Inc．（Daejon、Korea）で合成された。
【００４２】
腫瘍細胞株（Tumor cell line）製造
CT２６、EL４を３７℃で２０％（vol/vol）熱活性化されたウシの胎児血清で補充されたRPMA１６４０培地で湿潤化された５％のCO２雰囲気で維持させた。動物試験のために冷凍貯蔵庫で再成長させた後、前記細胞を２〜５回継代培養した。ログ相（log phase）CT２６細胞を０．２５％のトリプシンと０．０３％のEDTAで組織培養フラスコから分離した。CT２６及びEL４を洗浄して注入する直前にPBSに再懸濁させた。
【００４３】
動物実験
特異な病原菌のない雄Balb/cマウス及びC５７/BL６マウスをヒョチャンバイオサイエンス（Hyo Chang Bioscience、大邱、韓国）で購入した。すべてのマウスはImmunomodulation Research Center（University of Ulsan、Korea）の動物施設所の特異的病原菌のない条件で維持し、６〜８週齢に使用した。CT２６及びEL４をBalb/cマウス及びC５７/BL６マウスの皮下（s．c．）にそれぞれ注入した（０日目）。WRYMVm（配列番号:４）及びCpGODNを６日目から４日ごとに全身（i．p．;２００μｌ）に注入した。対照群はPBSまたは１００μg/マウスのCpGODNを注入した。ビンクリスチンはペプチドまたはCpGODNを注入する８時間前に同一日付で腹腔（i．p．）注射で投与した。接種した後、２日ごとに腫瘍質量（tumor mass）をデジタルバリエルカリパー（Varier caliper）で測定した。腫瘍体積は長さ×幅×高さ×π/６で計算した。マウスが腫瘍で倒れたり死ぬ状態で犠牲になった日または腫瘍の幅（腫瘍がそれ以上小さくならない時の幅）が２０mmになった時を死亡日として記録した。
【００４４】
統計
測定結果を１０mice/groupの平均SEで表現した。図９乃至１２で*はビヒクル（PBS）処理された対照群に比べてp<０．０１を示し、**はp<０．０５を示す。
【００４５】
実施例１:好中球の分離
末梢穴白血球濃縮液の寄贈は韓国蔚山（ウルサン）赤十字血液センターから受けた。人間の好中球はデキストラン沈降法（dextran sedimentation）、赤血球の低浸透圧の細胞溶解（hypotonic lysis）及びリンパ球分離媒質勾配（lymphocyte separation medium gradient）の標準手続にじたがって分離した（９）。分離された人間好中球は直ちに使用された。
【００４６】
実施例２:人間好中球でのペプチドがスーパーオキシド生成に対する効果
WKYMVm、配列番号:１乃至２４のペプチド及びwkymvmの人間好中球でスーパーオキシド生成に与えるペプチドの活性を測定した。スーパーオキシド陰イオン生成をマイクロタイター９６-ウェルプレートELISAリーダーを使用してシトクロムcの還元を測定して定量した（Bio-Tekinstruments、EL３１２e、Winooski、VT）（１４）。人間の好中球（９６ウェルプレートの各ウェル糖１×１０６cells/１００μｌのRPMI１６４０培地）は３７℃で１分間５０Μmのシトクロムcと予め培養し、その後、表示された濃度のペプチドで培養した。スーパーオキシド生成は１分間隔で５分にわたって５５０nm光吸収の変化で測定した。少なくとも４回の独立した実験で各位置での活性アミノ酸を有するペプチドを選定した。これらの結果は表１に記載されている。
【００４７】
多様な濃度のWKYMVmペプチドで好中球を刺激すると、濃度-依存的な方法でスーパーオキシド生成を引きおこし、１００nMのペプチドで最大の活性を示した（データは省略）。WRYMVm（配列番号４）、WEYMVm（配列番号５）、WKFMVm（配列番号１３）及びKYMVm（配列番号２１）のようないくつかのペプチドは細胞でスーパーオキシド生成を刺激し、多くのペプチドは１００nMのペプチドでスーパーオキシド生成に対して弱い活性を示した。
【００４８】
【表１】
2009520812.tif 000003
【００４９】
１０μM濃度のスーパーオキシド生成に対するペプチドの効果をさらに測定し、その結果を表２に記載した。wkymvmを除いた全てのペプチドが１０μM濃度のWKYMVmのように強力にスーパーオキシドの生成を刺激した。その中でWKWMVm（配列番号１０）、WKFMVm（配列番号１３）及びWKYMVW（配列番号１９）はWKYMVmより強い活性を示した。
【００５０】
【表２】
2009520812.tif 000004
【００５１】
実施例３：FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞での[Ca２+]i増加に対するペプチドの効果
FPR-発現RBL-２H３細胞でWKYMVm、配列番号：１乃至２４のペプチド及びwkymvmのペプチドが[Ca２+]iの増加に与える活性を測定した。FPR-発現RBL-２H３細胞を１０μMのペプチドで刺激し、[Ca２+]iを測定した。[Ca２+]iの水準はfura-２/AMを使用してGrynkiewicz方法で蛍光測定して決めた（１５）。製造された細胞を新鮮な無血清RPMI１６４０培地で継続して攪拌しながら、５０分間３７℃で３μMのfura-２/AMで培養した。２×１０６細胞をCa２+のないLocke’s溶液（１５４mMのNaCl、５．６mMのKCl、１．２mMのMgCl２、５mMのHEPES、pH７．３、１０mMのブドウ糖及び０．２mMのEGTA）で各分析に用いられるように分取した。３４０nm及び３８０nmでの二重励起波長の蛍光変化及び５００nmの発光波長を測定して補正された蛍光率を[Ca２+]i．に変え、増加した[Ca２+]iピーク水準を測定した。その結果を表３及び図１Aに示した。データは３つの独立的な実験の代表値である。
【００５２】
【表３】
2009520812.tif 000005
【００５３】
FPR-発現RBL-２H３細胞でWKYMVmペプチドは濃度-依存的な方法で[Ca２+]i増加を誘導し、３００nMで最大活性を示した（データは省略する）。FPR細胞内で[Ca２+]i-増加活性に対するWKYMVmのEC５０は４７nMであった（表３）。本発明のペプチドの中でWHYMVm（配列番号：１０）、WKWMVm（配列番号：１３）及びWKFMVm（配列番号：１９）はWKYMVmペプチドに対抗してFPRにさらに増加した親和度を示したが、他のペプチドはWKYMVmほどの活性を示さなかった（表３）。特に、WKGMVm（配列番号：１）、WKYMGm（配列番号：２）及び６thD-Met置換されたペプチドはFPR-発現RBL-２H３細胞で２０μM処理時まで[Ca２+]iに影響を与えなかった（表３及び図１A）。N-末端またはC-末端が切断されたペプチドもまたFPR細胞で[Ca２+]i増加活性に対して不活性を示した（表３）。これらの結果は[Ca２+]i増加でFPRの活性化に対してTyr３及びD-Met６が重要であるという事実を示す。
【００５４】
WKYMVm、配列番号：１乃至２４のペプチド及びwkymvmが[Ca２+]i増加に与える効果をFPRL１-発現RBL-２H３細胞で測定した。FPRL１-発現RBL-２H３細胞を１０μMのペプチドで刺激して[Ca２+]iを決めた。[Ca２+]iの水準は前記と同様な方法で決めた。増加した[Ca２+]iの頂点水準を調査した。その結果は表４及び図１Bに示した。データは３つの独立した実験の代表値である。
【００５５】
FPRL１-発現RBL-２H３細胞でWKYMVmは１０nMの濃度で最大活性を示した（データは省略する）。FPRL１細胞で[Ca２+]i-増加活性に対するWKYMVmのEC５０は０．６nMであった（表４）。FPR細胞とは異なって、全てのペプチドがFPRL１細胞で[Ca２+]i-増加活性に対して活性を有することが示された（表４）。WRYMVm（配列番号：４）、WKWMVm（配列番号：１０）、WKFMVm（配列番号：１３）、WKYMYm（配列番号：１４）及びWKYM（F/W）m（配列番号：１５）のようないくつかのペプチドはFPRL１に対してさらに高い親和度を示した（表４）。FPR細胞で[Ca２+]i増加に影響を与えないWKGMVm（配列番号：１）、WKYMGm（配列番号：２）及び６thD-Met-置換ペプチドもFPRL１細胞で[Ca２+]i-増加活性を示すが、FPRL１に対して低い親和度を有することが示された（表４及び図１B）。N-末端またはC-末端が切断されたペプチドはFPRL１細胞で[Ca２+]i増加を向上させることが示された（表４）。これらの結果はFPRに対抗してFPRL１を活性化させ、その結果、[Ca２+]iを増加させるのにTyr３及びD-Met６が重要であるということを示す。
【００５６】
【表４】
2009520812.tif 000006
【００５７】
実施例４：FPRまたはFPRL１に[１２５I]WKYMVm結合に対するペプチドの効果
いくつかのペプチド（WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）、D-Met６置換ペプチド）がサイトゾル（cytosolic）カルシウム増加を誘導することができないという事実から、前記ペプチドがFPRに結合できるかどうかについて調査した。FPRまたはFPRL１に対する１２５I-標識されたWKYMVm結合の置換程度を調査した。標識されていないWKYMVmまたは配列番号：１乃至２４のペプチドの量を増加させたりまたはこれらペプチドが存在しないようにしてFPR-発現RBL-２H３細胞を[１２５I]WKYMVmと培養した。
【００５８】
リガンド結合分析を従来に知られた方法を変形して実施した（１６）。１２５I-標識されたWKYMVmはNEN Lifesciences（Boston、MA）から購入した。FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞を２４-ウェルプレートに対して各ウェル当り１×１０５細胞を接種して一夜培養した。ブロッキングバッファー（blocking buffer；３３mM HEPES、pH７．５、０．１％BSA in RPMI）で細胞を２時間ブロッキングした後、バインディングバッファー（PBS含有０．１％BSA）と共に５０μMの標識されていないペプチドが存在または存在しない状況で単一濃度の１２５I-標識されたWKYMVmを細胞に添加して継続して振り混ぜながら４℃で３時間培養した。その後、試料を冷たいバインディングバッファー及び２００μｌの溶解性バッファー（lysis buffer；２０mM Tris、pH７．５、１％ TritonX-１００）で５回洗浄した。常温で２０分溶解した後、溶解物を集めた。結合された１２５I-標識されたWKYMVmはγ-線計数器で放射性活性を測定した。
【００５９】
リガンド結合の分析結果は図２Aと図２Bに示した（図２A：FPR発現RBL-2H3細胞１、図２B：FPRL1-発現RBL-2H3細胞）。図２Aと図２Bに示したように、標識されていないWKYMVmだけでなく、WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）及びWKYMVmのD-Met６置換されたペプチドは濃度-依存的に[１２５I]WKYMVmの結合を妨害した。これらの結果はWKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）またはWKYMVmのD-Met６-置換ペプチドはFPRに結合はできるが、全てのペプチドがFPR-発現RBL細胞でサイトゾル カルシウム増加を誘導できるわけではないという事実を示す。
【００６０】
実施例５：FPRまたはRPRL１発現RBL-２H３細胞でERKリン酸化に対するペプチドの効果
i）ペプチドによる細胞刺激
培養されたRBL-２H３細胞を２×１０６細胞に分取して標識された濃度のWKYMVm及び本発明のペプチドで標識された時間だけ刺激した。FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞は多様な時間で１μMのWKYMVmで刺激した（図３A）。２つの細胞を１μMのWKYMVm処理前にビークルまたは１００ng/mlのPTX（２４時間）、５０μMのLY２９４００２（１５分）、５μMのGFX（１５分）、１０μMBAPTA/AM（６０分）または５０μMPD９８０５９（６０分）で予め培養した（図３B）。FPR-またはFPRL１-発現RBL２H３細胞を１０μMの本発明のペプチドで２分または５分間刺激した（図３C）。
【００６１】
前記刺激の後に細胞を無血清RPMIで洗浄し、溶解性バッファー（２０mM Hepes、pH７．２、１０％グリセロール、１５０MmのNaCl、１％のTritonX-１００、５０mMのNaF、１mMのNa３VO４、１０μg/mlのロイペプチン、１０μg/mlのアプロチニン、そして１mM のフッ化フェニルメチルスルホニル）で溶解した。分解剤-非溶解性物質を遠心分離（１２，０００Xg、１５分、４℃）してペレット化し、溶解性上層分液を除去して-８０℃で保管したり又は直ちに使用した。溶解物での蛋白質濃度をBradford蛋白質分析剤で測定した。
【００６２】
ii）電気泳動及び免疫ブロットの分析
各々の試料（３０gのペプチド）を１０％のSDS-PAGEで処理してリン酸化されたERKを抗-ホスホ-ERK抗体で免疫ブロットによって測定した。蛋白質試料は濃縮された試料バッファーを添加して電気泳動用に製造した。試料のうちの一部をLaemmliに記載されたバッファーシステムを使用して１０％のSDS-ポリアクリールアミドゲルによって分離した（１７）。
【００６３】
電気泳動に続いて抗-ERK２抗体でウェスタンブロット分析を実施して同一量の試料が実験に用いられたことを確認した。蛋白質をニトロセルロース膜にブロットさせた。前記ニトロセルロース膜を５％の無脂粉乳を含むTBS（Tris-buffered saline、０．０５％Tween-２０）と培養してブロッキングした。その後、膜をTBSで洗浄された抗-ホスホ-ERK抗体、抗-ホスホ-Akt抗体または抗-Akt抗体と共に培養した。PKCトランスロケーション分析でPKCアイソザイム-特異性である抗体を培養した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された１：５０００希釈された山羊抗-うさぎIgGまたは山羊抗-マウスIgG抗体と共に膜を培養した後、増加した化学発光検出システムを使用して抗原-抗体複合体を可視化した。
【００６４】
iii）結果
FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞のFPRまたはRPRL１を通じた細胞シグナリングに対するペプチドの効果を評価して、その結果を図３A乃至図３Bに示した。図３A乃至図３Cの結果は３回の独立した実験の代表値である。
【００６５】
いくつかのペプチドはFPRに結合はできるが、PLC-媒介されたカルシウムの増加を向上させることはできないために、GPCRsの下流でPLCに独立的な他のシグナリング（ERKsとAkt）に与える効果を検査した。FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞を１μMのWKYMVmで刺激すると、ERKsの一時的活性化を誘導し、各々ペプチド処理した後、２分または３分Ｇ経過した後、最大の活性を示した（図３A）。FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞をWKYMVm刺激の前に阻害剤で予め処理する場合、WKYMVm-誘導されたERKs活性化はPTX及びPD９８０５９に敏感であることが示され、このような現象がPTX-敏感性G-蛋白質及びMEK-依存性であることを示す（図３B）。a PI３K阻害剤（LY２９４００２）、PKC阻害剤（GF１０９２０３XまたはRo-３１-８２２０）またはカルシウムキレート剤（BAPTA/AM）の前処理はWKYMVm-誘導されたERK活性化に影響を与えない（図３B）。前記のような結果は、このような現象がPI３K、Ca２+及びPKC活性化と独立的であることを示唆する。したがって、WKYMVmが独立的なシグナリング経路を通じて[Ca２+]i増加及びERK活性化を誘導したかのように見られる。本発明のペプチドがERK活性化に与える効果を抗-ホスホ-ERKs抗体を利用したウェスタンブロットで検査した。サイトゾル性カルシウム増加活性とは異なってペプチド（WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）、WKYMVR（配列番号：１８）及びWKYMVE配列番号：１６）はFPR-発現RBL-２H３細胞でERKsリン酸化を刺激した（図３C）。前記ペプチドがPLC-媒介された[Ca２+]i増加活性に影響を与えることができないが、これは非常に興味深い結果である。FPRL１-発現RBL-２H３細胞をWKYMVm及び本発明のペプチドで刺激する場合、大部分のペプチドはFPRL１細胞でERKsリン酸化を誘発した（図３C）。この結果は全てのペプチドがFPRL１-発現細胞でサイトゾル性カルシウム増加を刺激できるという前の結果と相互関連がある（図１B）。
【００６６】
実施例６：FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞でのAktリン酸化に与えるペプチドの効果
走化性物質受容体の活性化はPI３Kを通じてAkt活性化を誘導することはよく知られている（１９）。前記ペプチドで細胞の刺激、電気泳動及び免疫ブロット分析は実施例５と同一に実施した。
【００６７】
FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞を多様な時間だけ１μMのWKYMVmで刺激した（図４A）。２つの細胞を１μMのWKYMVmで処理する前にビークルまたは１００ng/mlのPTX（２４時間）、５０μMのLY２９４００２（１５分）、５μMのGFX（１５分）、１０ΜmのBAPTA/AM（６０分）または５０μMのPD９８０５９（６０分）で予め培養した（図４B）。FPR-及びFPRL１-発現RBL２H３細胞を１０μMのWKYMVm及び本発明のペプチドで各々２分または５分間刺激した（図４C）。それぞれの試料（３０μgの蛋白質）を１０％のSDS-PAGEで処理し、リン酸化されたAktを抗-ホスホ-Akt抗体で免疫ブロット分析によって決めた。抗-Akt抗体でウェスタンブロット分析を実施して同一な量の試料が実験に用いられたことを確認した。この結果は図４A乃至図４Cに示した。図４の結果は３つの独立的な実験の代表値である。
【００６８】
WKYMVm刺激はFPR-及びFPRL１-発現RBL-２H３細胞で時間依存的にAktリン酸化を誘導した（図４A）。WKYMVm-誘導されたAktリン酸化はPTX、LY２９４００２に敏感であるが、GFX及びBAPTA/AMには敏感でなかった。これはPTX-敏感性G-蛋白質及びPI３K-依存性であることを示す（図４B）。WKYMVmだけでなく、本発明のペプチド（WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）、WKYMVE（配列番号：１６）及びWKYMVR（配列番号：１８））でFPR-発現RBL-２H３細胞を刺激すると、Aktリン酸化を誘導した（図４C）。WKYMVm及び本発明のペプチドはFPRL１-発現RBL-２H３細胞でAktリン酸化を刺激した（図４C）。これらの結果は２種類の形態の細胞でペプチドによるERKsリン酸化と相互関連がある（図３C）。WKYMVm-誘導されたERKs及びAkt活性化はPI３K活性化によって媒介されるので、WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE及びWKYMVRはFPRの下流でPI３K-媒介されたシグナリングを誘導するかのように見られる。
【００６９】
実施例７：エキサイトーシスに対するペプチドの効果
顆粒の分泌は肥満細胞で最も重要な作用である（２０）。WKYMVmの顆粒分泌に与える効果をβ-ヘキソサミニダーゼ分泌を測定して調べてみた（１８）。FPRまたはFPRL１を発現するRBL-２H３細胞（２×１０５/ウェル）を２４-ウェル組織培養プレートで一夜培養した。細胞をTyrode’sバッファー（１３７MmのNaCl、１２mMのNaHCO３、５．６mMのグルコース、２．７mMのKCl、１mMのCaCl２、０．５mMのMgCl２、０．４mMのNaH２PO４、０．１g/１００mlのBSA及び２５mM HEPES、pH７．４）で２回洗浄し、それぞれのペプチドで刺激した。多様な濃度のWKYMVmがFPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞で処理された（図５A）。１μMのWKYMVmを１０μM BAPTA/AMが存在または存在しない環境で２つの細胞株を刺激するのに使用した（図５B）。氷上にプレートを放置することによって刺激後２０分後に反応を終了させた。β-ヘキソサミニダーゼの培地への分泌は５０μｌの上層液または細胞溶解液を０．１Mのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH３．８）で３７℃、２時間２５μｌの５mMのp-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-グルコサミドで培養して測定した。培養末期に５０μｌの０．４MのNa２CO３を添加した。４０５nmでの吸光度を測定してその結果を図５A及び図５Bに示した。データは３回反復実施した３回の実験の代表値の平均値±S.E.である。数値（平均値±S.E.）は細胞に存在する全体のβ-ヘキソサミニダーゼに対する百分率で示した。
【００７０】
FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞を多様な濃度のWKYMVmで刺激すると濃度-依存的にβ-ヘキソサミニダーゼの放出を誘導した（図５A）。FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞において各々１００nMまたは１０nMのペプチドである時に最大の活性を示した（図５A）。サイトゾル性カルシウム増加はRBL-２H３のような肥満細胞で顆粒の分泌に非常に重要であると報告されている（１８、２０）。また、ペプチドの刺激前のBAPTA/AM処理による細胞内カルシウムのキレート化はWKYMVm-誘導された顆粒分泌をほとんど完全に阻害することも確認された（図５B）。
【００７１】
サイトゾル性カルシウム増加がWKYMVm（配列番号：１）及びWKYMVm（配列番号：１１）の多くの置換されたペプチドによって誘導されるが、これらの中でいくつか（WKGMVm、WKRMVm、D-Met６置換ペプチド）はそうではないという新たな発見から、RBL細胞での顆粒分泌に対する前記ペプチドの効果を調査した。１０μMの各々のペプチドをFPR-（図６A）またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞で処理した（図６B）。β-ヘキソサミニダーゼのペプチド-誘導された分泌は前記のように決めた。データは３回繰り返して実施した３回の実験の代表値の平均値±S.E.である。
【００７２】
FPR細胞をペプチド（WKYMVm、WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）、WKYMVE（配列番号：１６）、WKYMVR（配列番号：１８））で刺激する場合、WKGMVm-、WKRMVm-及びD-Met６-置換ペプチドを除いていくつかの置換ペプチドで顆粒分泌が観察された（図６A）。前記WKGMVm-（配列番号：１）、WKRMVm-（配列番号：１１）及びD-Met６-置換されたペプチドはFPR-発現RBL-２H３細胞では顆粒分泌に影響を与えなかった（図６A）。このような結果はWKGMVm-（配列番号：１）WKRMVm-（配列番号：１１）及びD-Met６-置換ペプチドがサイトゾル性カルシウム増加を誘導できないという前の結果と非常に相関関係が深い（図１A）。FPR-発現RBL-２H３細胞とは異なって、fMLFまたはwkymvmを除いた全てのペプチド（WKYMVm、WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）、WKYMVE（配列番号：１６）、WKYMVR（配列番号１８））はFPRL１-発現RBL-２H３細胞において顆粒分泌を刺激した（図６B）。これもまた、FPRL１-発現RBL-２H３細胞において前記ペプチドがサイトゾル性カルシウム増加を刺激するという以前の結果と相互関連がある（図１B）。
【００７３】
実施例８：細胞走化性に対するペプチドの効果
走化性分析は多重ウェルチャンバー（Neuroprobe Inc.，Gaithersburg，MD）を使用して実施した（１８）。ポリカーボネートフィルター（８μm pore size）をHEPES-バッファーRPMI１６４０培地で５０μg/mlのラットタイプIコラーゲンで予めコーティングした。乾燥コーティングされたフィルターを互いに異なる濃度のペプチドを含む９６-ウェルチャンバー上に放置した。FPRまたはFPRL１を発現するRBL-２H３細胞は１×１０６cells/mlの無血清RPMIの濃度でRPMIに懸濁され、２５μｌの懸濁液は９６-ウェル走化性チャンバーの上部ウェル上に放置された。３７℃で４時間培養した後、移動しなかった細胞をスクラッピングして除去し、フィルターを通過して移動した細胞を脱水及び固定し、ヘマトキシリン（hematoxylin（Sigma、St.Louis、MO））で染色した。前記ウェルで５個の無作為で選択されたHPF（high power fields、４００X）で染色された細胞を計数した。図７Aは前記走化性分析結果を示した図面である。ビークル、５０μMのLY２９４００２（１５分）及び５０μMのPD９８０５９（６０分）で予め処理された細胞を１μMのWKYMVmを使用した走化性分析に使用した。その結果を図７Bに示した。移動した細胞の数をHPF（４００X）で計数して測定した。データは各々２回実施した３回の独立した実験の平均値±SEで示された。
【００７４】
WKYMVmはモノサイト及び好中球のような食細胞の走化性移動ｇ誘導できるという事実は知られている（１１）。LeなどはFPRとFPRL１への結合を通じてWKYMVm-誘導された細胞の走化性を明らかにした（１２）。予想したようにWKYMVmはFPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞で鐘状の濃度依存的方法で走化性移動活性を示した（図７A）。WKYMVm-誘導された細胞走化性はLY２９４００２及びPD９８０５９に敏感であった（図７B）。このような結果はWKYMVm-誘導された細胞の走化性がPI３K-及びMEK-依存性であることを示唆する。WKYMVmはPI３K及びMEK活性を通じてFPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞の走化性移動を刺激する。
【００７５】
FPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞で細胞走化性についての本発明のペプチドの効果を測定した。多様な濃度の各々のペプチドをFPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞を利用した走化性分析に使用した。移動した細胞の数はHPF（high power fields、４００X）で計数して測定した。データは各々２回実施した２回の独立した実験の平均値±SEで示された。
【００７６】
FPR-発現RBL-２H３細胞で、WKYMVmだけでなく置換されたペプチド（WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）、WKYMVE（配列番号：１６）及びWKYMVR（配列番号：１８））も細胞走化性を誘導した（図８A）。置換されたペプチドによる走化性に必要な濃度はWKYMVmによる場合よりさらに高かった（図８B）。置換されたペプチド-誘導された走化性に関与するシグナリング経路で、PI-３キナーゼ及びMEK-媒介されたシグナリングの関与程度について試験した。FPR-発現RBL細胞がLY２９４００２またはPD９８０５９で前処理される場合、WKYMVm及び置換されたペプチド-誘導されたRBL細胞の移動はほとんど完全に阻害された（図７B及びデータは示さない）。FPRL１-発現RBL-２H３細胞でWKYMVm及び本発明のペプチド（WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）、WKYMVE（配列番号：１６）及びWKYMVR（配列番号：１８）はまた濃度-依存的に細胞走化性を誘導した（図８B）。
【００７７】
本発明でFPRが互いに異なるリガンドによって調節でき、互いに異なる細胞シグナリング及び作用をするという事実が初めて明らかになった。FPRのリガンド特異な調節を知るために多様なペプチド、表１に記載されたFPRに対する強力なリガンドを製造した。前記ペプチドのうち、WKGMVm-（配列番号：１）、WKRMVm-（配列番号：１１）及びD-Met６-置換ペプチドはPI-３キナーゼ-媒介されたAkt及びMEK-媒介されたERK活性化を誘導するすることでFPRに結合して細胞の走化性移動が行なわれる。これらペプチドはサイトゾル性のカルシウムの増加に効果を与えない。WKYMVmペプチドはERKs活性化だけでなく、サイトゾル性カルシウムの増加を刺激して走化性及び脱顆粒化されるようにするので、FPRは互いに異なるリガンドによって互いに異なって調節できるという事実を示唆する。
【００７８】
最近、いくつかの報告によるとGPCRsは互いに異なるリガンドによって調節できるという事実が記載されている（２１、２２）。GPCRのリガンド-特異な調節の過程で互いに異なるリガンドは受容体の互いに異なる形態的変化を誘導し、一定の効果分子またはG-蛋白質を有する受容体の選択的結合を誘導するということを示唆する。表３及び図１Aにおいて、WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）及びD-Met６置換ペプチドはFPR-発現RBL-２H３細胞でPLC-媒介されたサイトゾル性のカルシウムの増加を刺激できないことが分かる。しかし、これらペプチドはFPR-発現RBL-２H３細胞でERKs及びAktリン酸化を刺激した（図３C）。WKYMVm及び本発明のペプチド-媒介の細胞シグナリングでサイトゾル性カルシウムの増加はPLC-β活性化を通じてPIの加水分解によって誘導されるが、ERK及びAktリン酸化は各々MEK及びPI３キナーゼの活性化によって調節される。これらの結果からFPRにペプチドリガンドが結合するとFPRに形態的変化を誘導し、このような形態の変化はG-蛋白質-媒介のPLC-βまたはG-蛋白質-媒介のPI-３キナーゼと受容体の結合を提供する。サイトゾル性カルシウム増加を誘導できないいくつかの本発明のペプチド（WKGMVm（配列番号：１）、WKRMVm（配列番号：１１）及びD-Met６置換ペプチド）はPI-３キナーゼ-依存性経路を通じてERKsリン酸化を刺激できるために、前記ペプチドはFPRに結合してPI-３キナーゼ及びMEK-媒介されたシグナリングの活性化に必要な形態変化を誘導してRBL-２H３細胞の走化性移動が行われるようにするようである。
【００７９】
２つの互いに異なるホルミルペプチド受容体族（FPR及びFPRL１）は本質的な免疫反応で重要な役割を果たすと報告されている（１、２）。現在までいくつかのホルミルペプチドリポキシンA４を含む互いに異なるリガンド起源はFPRまたはFPRL１に結合すると報告されている（１）。LeなどはWKYMVmがFPR及びFPRL１に結合すると報告した（１２）。
【００８０】
本発明者らはTyr３またはD-Met６を他のアミノ酸で置換するとFPRのPLC-媒介のサイトゾル性カルシウム-増加活性を除去するが、FPRL１の場合にはそうではないことが分かった（図１）。これらの結果はTyr３及びD-Met６がFPRによるPLCの活性化には重要であるが、FPRL１による場合にはそうではないことを示す。このような結果からFPR及びFPRL１のリガンド結合位置が互いに異なることが分かる。
【００８１】
FPRを含むGPCRsはヘテロ三量体-G-蛋白質の結合を通じて細胞内シグナリングを誘導し、G-蛋白質の結合に関与する受容体の重要なアミノ酸残基を明らかにするための複数の研究が進められている（２３、２４）。FPRでMiettinenなどは３５突然変異FPRsを製造してG-蛋白質の結合及びFPRの細胞シグナリングについての突然変異程度を調査した。その結果、S６３、D７１、R１２３及びC１２４/C１２６がFPRに対するG-蛋白質結合に重要であることが示された（２４）。前記突然変異の中にはカルシウム可動化が調節できないR１２３A突然変異がfMLFによるERKsリン酸化を誘導することができた（２４）。また、保存された（D/E）RYモチーフ（DRC in FPR）を形成するAsp１２２及びArg１２３が受容体の不活性形態を安定化する水素結合ネットワークに関与すると仮定された（２４）。このような仮定で、受容体に対するリガンド結合は水素結合ネットワークの変形を誘導し、更に一定のアミノ酸残基、例えばDRYモチーフでのアルギニンがG-蛋白質と相互作用できるように露出される（２４）。WKGMVmのようないくつかのペプチドはERKsリン酸化を誘導するが、カルシウム可動化は誘導しないことが示された。WKYMVmまたはWKGMVm（配列番号：１）がFPRに結合すると受容体の互いに異なる形態変化を誘導するかどうか、つまり、WKYMVmがDRYモチーフの水素結合の変形をはじめとするFPRの形態的変化を誘導するが、WKGMVm（配列番号：１）が単にDRY水素結合に影響を与えずに受容体の特徴的な形態変化のみを誘導するかどうかを決めることが重要である。FPRL１の場合にDRYモチーフを含むが、（DRC in FPRL１）、G-蛋白質結合での役割は確認されなかった。この結果においてWKYMVmだけでなくWKGMVm（配列番号：１）もFPRL１-発現RBL細胞でカルシウム可動化を誘導した（図１B）。これらの結果はWKYMVmまたはWKGMVm（配列番号：１）がFPRまたはFPRL１でDRYモチーフの水素結合に影響を与えないことを示唆する。他の結合ポケットがペプチド結合に関与し、さらにFPRに対するWKYMVmまたはWKGMVm（配列番号：１）の互いに異なる結合パターンに関与する残基を知ることが重要である。
【００８２】
現在まで互いに異なる天然リガンドがFPRを互いに異なるように調節することは報告されていない。免疫界で顆粒化または走化性移動の互いに異なる調節はさらに限定された調節を必要とする。このような観点で本発明のようにFPRを互いに異ならせて調節するリガンドを明らかにすることが重要である。
【００８３】
実施例９:WRYMVmはCT２６-注入されたマウスで腫瘍成長を弱化させる
免疫調節ペプチドTrp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-CONH２（WRYMVm;配列番号:４）の抗腫瘍効果を評価するために、CT２６、大腸癌をBalb/cマウスモデルを利用して試験した。腫瘍質量は腫瘍細胞接種の６日後、２日ごとに大きさを測定した。図９A及び９Bに示されたように、２μg/マウスのWRYMVmが２２日目に成功的に腫瘍質量成長を抑制させた（PBS対照群に比べて５０％）。１００μg/マウスのCpGオリゴジオキシヌクレオチド（ODN）を比較テストしたが、CpGODN-処理された群は腫瘍成長に効果的な結果を示さなかった。このような結果はWRYMVm免疫調節ペプチドがCT２６腫瘍を有意性あるように抑制することを示す。
【００８４】
実施例１０:WRYMVmはEL４-注入マウスで腫瘍成長を弱化させる
他の腫瘍モデルEL４、リンパ細胞でのWRYMVmの抗腫瘍効果を試験した。EL４の腫瘍質量を形成するためにEL４（２×１０５cells/mouse）をC５７/BL６マウスの皮下（s．c．）に注入した。図１０A及び１０Bに示されているように、WRYMVmはEL４の腫瘍質量を抑制することができる。この結果はCT２６実験と相関性がある。したがって、WRYMVmはマウスモデルで腫瘍成長抑制効果を有することを確認することができる。
【００８５】
実施例１１:WRYMVmを少量投与するとCT２６モデルで最も効果的である
WRYMVmの効果的な腫瘍抑制投与量を確認するために０．１μg/mouse、０．２５μg/mouse及び１μg/mouseのWRYMVmをCT２６/Balb/cモデルに投与した。図１１A及び１１Bに示されているように、０．１μg/mouse処理された群は最も高い腫瘍抑制効果を示した。これに比べて１μg/mouse投与量では腫瘍抑制効果が低くなった。このような結果はWRYMVmの抗腫瘍性能が高濃度では脱減作されて非常に敏感であるということを強く示唆する。類似の現象が白血球の走化性移動でも容易に発見される。WRYMVmの標的収容体であるFPRL１が走化性移動に関与するという事実でWRYMVm-誘導された抗腫瘍効果は白血球浸潤（infiltration）現象によって誘導されると見られる。したがって、WRYMVm-誘導された抗腫瘍効果と白血球浸潤現状の直接的な関係を明らかにする必要がある。
【００８６】
実施例１２:WRYMVmとビンクリスチンを組み合わせて使用すると抗腫瘍効果を増加させる
WRYMVmの抗腫瘍効果を増加させるために抗癌剤であるビンクリスチンを組み合わせて使用した。ビンクリスチンは微小管恒常性（microtubul ehomeostasis）を破壊し、その結果、細胞死滅をもたらす。ビンクリスチンを使用することで免疫システムに対する腫瘍特異な抗原を提供することができる。したがって、ペプチド注入８時間前に２μg/mouseのビンクリスチンを腹腔（i．p．）注入した。ビンクリスチン単独処理群はWRYMVm-処理群と類似な腫瘍成長抑制パターンを示した（図１２A）。予想した通り、WRYMVmとビンクリスチンを共に処理すると最も効果的な抗腫瘍活性を示した。前記組み合わせ使用はWRYMVm単独またはビンクリスチン単独使用より１５％向上した。生存率でも類似の結果を示した（図１２B）。組み合わせ使用は単独使用に比べて有意性のある改善点を示さなかったが、組み合わせ使用処理群、WRYMVm-処理群及びビンクリスチン-処理群の３つの処理群は腫瘍成長を抑制することができた。これに比べてPBS対照群及びCpG ODNは死滅を防止することはできなかった。これから免疫調節ペプチドWRYMVmは坑癌活性を有すると言える。
【００８７】
前記WRYMVmは腫瘍成長を抑制することができる。したがって、WRYMVmはビンクリスチンと組み合わせてさらによく性能を発揮し、これはWRYMVmが他の薬剤と癌治療剤として使用することができることを示す。したがって、免疫細胞を調節するペプチド（short peptide）-誘導された坑癌効果は本発明で初めて得られたものである。
【００８８】
参照文献
１．  Le, Y., Li, B., Gong, W., Shen, W., Hu, J., Dunlop, N. M., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2000) Immunol Rev. 177, 185-194.
２．  Le, Y., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12, 91-105.
３．  White, J. R., Lee, J. M., Young, P. R., Hertzberg, R. P., Jurewicz, A. J., Chaikin, M. A., Widdowson, K., Foley, J. J., Martin, L. D., Griswold, D. E., and Sarau, H. M. (1998) J. Biol. Chem. 273, 10095-10098.
４．  Zagorski, J., and Wahl, S. M. (1997) J. Immunol. 159, 1059-1062.
５．  Prossnitz, E. R., and Ye, R. D. (1997) Pharmacol. Ther. 74, 73-102.
６．  Su, S. B., Gong, W. H., Gao, J. L., Shen, W. P., Grimm, M. C., Deng, X., Murphy, P. M., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (1999) Blood 93, 3885-3892.
７．  Walther, A., Riehemann, K., and Gerke, V. (2000) Mol. Cell. 5, 831-840.
８．  Baek, S. H., Seo, J. K., Chae, C. B., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1996) J. Biol. Chem. 271, 8170-8175.
９．  Seo, J. K., Choi, S. Y., Kim, Y., Baek, S. H., Kim, K. T., Chae, C. B., Lambeth, J. D., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1997) J. Immunol. 158, 1895-1901.
１０．  Bae, Y. S., Ju, S. A., Kim, J. Y., Seo, J. K., Baek, S. H., Kwak, J. Y., Kim, B. S., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 65, 241-248.
１１．  Bae, Y. S., Kim, Y., Kim, Y., Kim, J. H., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 66, 915-922.
１２．  Le, Y., Gong, W., Li, B., Dunlop, N. M., Shen, W., Su, S. B., Ye, R. D., and Wang, J. M. (1999) J. Immunol. 163, 6777-6784.
１３．  He, R., Tan, L., Browning, D. D., Wang, J. M., and Ye, R. D. (2000) J. Immunol. 165, 4598-4605.
１４．  Bae, Y. S., Bae, H., Kim, Y., Lee, T. G., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (2001) Blood 97, 2854-2862.
１５．  Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R. Y. (1986) J. Biol. Chem. 260, 3440-3450.
１６．  Hu, J. Y., Le, Y., Gong, W., Dunlop, N. M., Gao, J. L., Murphy, P. M., and Wang, J. M. (2001) J. Leukoc. Biol. 70, 155-1561.
１７．  King, J., and Laemmli, U. K. (1971) J. Mol. Biol. 62, 465-477.
１８．  Haribabu, B., Zhelev, D. V., Pridgen, B. C., Richardson, R. M., Ali, H., and Snyderman, R. (1999) J. Biol. Chem. 274, 37087-37092.
１９．  Franke, T. F., Yang, S. I., Chan, T. O., Datta, K., Kazlauskas, A., Morrison, D. K., Kaplan, D. R., and Tsichlis, P. N. (1995) Cell. 81, 727-736.
２０．  Jin, X., Shepherd, R. K., Duling, B. R., and Linden, J. (1997) J. Clin. Invest. 100, 2849-2857.
２１．  Thomas, W. G., Qian, H., Chang, C. S., and Karnik, S. (2000) J. Biol. Chem. 275, 2893-2900.
２２．  Palanche, T., Ilien, B., Zoffmann, S., Reck, M. P., Bucher, B., Edelstein, S. J., and Galzi, J. L. (2001) J. Biol. Chem. 276, 34853-34861.
２３．  Prossnitz, E. R., Quehenberger, O., Cochrane, C. G., and Ye, R. D. (1993) Biochem. J. 294, 581-587.
２４．  Miettinen, H. M., Gripentrog, J. M., Mason, M. M., and Jesaitis, A. J. (1999) J Biol. Chem. 274, 27934-27942.
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１Aと図１BはFPR-発現RBL-２H３細胞（図１A）またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞（図１B）で[Ca２+]iに対するWKYMVm、本発明のペプチド（WKGMVm（配列番号:１）、WKRMVm（配列番号:１１）、WKYMVE（配列番号:１６）、WKYMVR（配列番号:１８））またはfMLFの影響を示す図面である。
【図２】図２Aと図２BはWKYMVm、本発明のペプチド（WKGMVm（配列番号:１）、WKRMVm（配列番号:１１）、WKYMVE（配列番号:１６）、WKYMVR（配列番号:１８））及びfMLFによるFPRorFPRL１に結合された１２５I-標識されたWKYMVmの置換程度（displacement）を示す図面である。
【図３】図３A、図３B及び図３CはFPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞でのERKリン酸化に影響を与えるWKYMVm、本発明のペプチド（WKGMVm（配列番号:１）、WKRMVm（配列番号:１１）、WKYMVE（配列番号:１６）、WKYMVR（配列番号:１８））、fMLF及びwkymvmの効果を示す図面である。
【図４】図４A、図４B及び図４CはFPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞でAktリン酸化に影響を与えるWKYMVm、本発明のペプチド（WKGMVm（配列番号:１）、WKRMVm（配列番号:１１）、WKYMVE（配列番号:１６）、WKYMVR（配列番号:１８））、fMLF及びwkymvmの効果を示す図面である。
【図５】図５Aと図５BはWKYMVmが細胞内カルシウム増加を通じてFPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞でエキソサイトーシス（exocytosis）を刺激することを示す図面である。
【図６】図６Aと図６Bはペプチド-誘導された[Ca２+]iが増加する時にN-ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン（fMLF）のエキソサイトーシスに対するWKYMVm、本発明のペプチド（WKGMVm（配列番号:１）、WKRMVm（配列番号:１１）、WKYMVE（配列番号:１６）、WKYMVR（配列番号:１８））、fMLF及びwkymvmの効果を示す図面である。
【図７】図７Aと図７BはWKYMVmがPI３K及びMEK活性を通じてFPR-またはFPRL１-発現RBL-２H３細胞の走化性移動を刺激することを示す図面である。
【図８】図８Aと図８Bは走化性（chemotaxis）に影響を与えるWKYMVm、本発明のペプチド（WKGMVm（配列番号:１）、WKRMVm（配列番号:１１）、WKYMVE（配列番号:１６）、WKYMVR（配列番号:１８））、fMLF及びwkymvmの効果を示す図面である。
【図９】図９A及び図９BはWRYMVm（SEQIDNO:４）及びWKRMVm（配列番号:１１）がCT２６-注入されたマウスで腫瘍成長を弱化させることを示す図面である。
【図１０】図１０A及び図１０BはWRYMVm（配列番号:４）がEL４-注入されたマウスで腫瘍成長を弱化させることを示す図面である。
【図１１】図１１A及び図１１BはWRYMVm（配列番号:４）を少量投与する場合にCT２６モデルで最も効果的であることを示す図面である。
【図１２】図１２A及び図１２BはWRYMVm（配列番号:４）とビンクリスチン（vincristine）を組み合わせて使用する場合に抗腫瘍効果を向上させることを示す図面である。
【図１Ａ】
2009520812.tif 000007
【図１Ｂ】
2009520812.tif 000008
【図２Ａ】
2009520812.tif 000009
【図２Ｂ】
2009520812.tif 000010
【図３Ａ】
2009520812.tif 000011
【図３Ｂ】
2009520812.tif 000012
【図３Ｃ】
2009520812.tif 000013
【図４Ａ】
2009520812.tif 000014
【図４Ｂ】
2009520812.tif 000015
【図４Ｃ】
2009520812.tif 000016
【図５Ａ】
2009520812.tif 000017
【図５Ｂ】
2009520812.tif 000018
【図６Ａ】
2009520812.tif 000019
【図６Ｂ】
2009520812.tif 000020
【図７Ａ】
2009520812.tif 000021
【図７Ｂ】
2009520812.tif 000022
【図８Ａ】
2009520812.tif 000023
【図８Ｂ】
2009520812.tif 000024
【図９Ａ】
2009520812.tif 000025
【図９Ｂ】
2009520812.tif 000026
【図１０Ａ】
2009520812.tif 000027
【図１０Ｂ】
2009520812.tif 000028
【図１１Ａ】
2009520812.tif 000029
【図１１Ｂ】
2009520812.tif 000030
【図１２Ａ】
2009520812.tif 000031
【図１２Ｂ】
2009520812.tif 000032
【国際調査報告】
2009520812.tif 000033
2009520812.tif 000034
2009520812.tif 000035