(57)【要約】本発明は、インビボおよびインビトロで核酸分子および/または他の薬学的物質を送達するために用いられるナノ輸送体および送達複合体を提供する。さらに、本発明は、インビボで安定であり、かつ、代謝障害に関連する標的RNAをサイレンシングする化学改変RNAサイレンシング物質（たとえば、siRNA）、および、該RNAサイレンシング物質を本発明のナノ輸送体に会合させて含む、送達複合体を特徴とする。特徴的なRNAサイレンシング物質および送達複合体は、疾患遺伝子、たとえば代謝障害に関係する遺伝子を標的とするために有効な治療物質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの官能表面基（functional surface group）に共役されたコアを含むナノ輸送体。
【請求項２】
コアがナノ粒子である、請求項1記載のナノ輸送体。
【請求項３】
ナノ粒子がデンドリマーである、請求項2記載のナノ輸送体。
【請求項４】
デンドリマーがポリリジンデンドリマーである、請求項3記載のナノ輸送体。
【請求項５】
コアがナノチューブである、請求項1記載のナノ輸送体。
【請求項６】
ナノチューブが単壁ナノチューブである、請求項5記載のナノ輸送体。
【請求項７】
ナノチューブが複壁ナノチューブである、請求項5記載のナノ輸送体。
【請求項８】
官能表面基が、脂質、細胞型特異的ターゲティング部分、蛍光分子、および電荷制御分子のうち少なくとも1つである、請求項1記載のナノ輸送体。
【請求項９】
ターゲティング部分が組織選択的ペプチドである、請求項8記載のナノ輸送体。
【請求項１０】
脂質がオレオイル脂質またはその誘導体である、請求項8記載のナノ輸送体。
【請求項１１】
NOP-7またはHBOLDである、請求項1記載のナノ輸送体。
【請求項１２】
核酸分子または薬学的物質に共役または会合している請求項1記載のナノ輸送体を含む、送達複合体。
【請求項１３】
核酸分子が、RNAサイレンシング物質、アンチセンス分子、プラスミド、およびリボザイムからなる群より選択される、請求項12記載の送達複合体。
【請求項１４】
RNAサイレンシング物質が、siRNA、miRNA、二官能オリゴヌクレオチド、およびshRNAからなる群より選択される、請求項13記載の送達複合体。
【請求項１５】
アンチセンス分子が抗RNAサイレンシングオリゴヌクレオチドである、請求項13記載の送達複合体。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが抗miRNAオリゴヌクレオチドである、請求項15記載の送達複合体。
【請求項１７】
ナノ輸送体が薬学的物質に共役または会合している、請求項12記載の送達複合体。
【請求項１８】
薬学的物質がポリヌクレオチド、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ペプチド、化学療法剤、および抗生物質の少なくとも1つである、請求項17記載の送達複合体。
【請求項１９】
請求項12記載の送達複合体を細胞に接触させて、それによって核酸分子を細胞に送達する段階を含む、インビトロで核酸分子または薬物を細胞に送達するための方法。
【請求項２０】
接触される細胞がヒト細胞である、請求項12記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子がRNAサイレンシング物質である、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
請求項12記載の送達複合体を細胞に接触させて、それによって薬学的物質を細胞に送達する段階を含む、インビボで核酸分子または薬学的物質を細胞に送達するための方法。
【請求項２３】
接触される細胞がヒト細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
核酸分子がRNAサイレンシング物質である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
RNAサイレンシング物質が、約1〜約10 mg/kgの有効量で送達される、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
センス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNAサイレンシング物質であって、
（a）アンチセンス鎖が標的特異的RNA干渉（RNAi）を指示するために標的mRNA配列と十分に相補的な配列を有する；
（b）対応する非改変siRNAと比較してインビボ安定性が増強されるように、1つより多い化学改変ヌクレオチドによって両末端で鎖が改変されている；かつ
（c）標的mRNAが代謝障害に関連する
、RNAサイレンシング物質。
【請求項２７】
アンチセンス鎖が標的RNAと会合した場合にA型へリックスの形成能を保持している、請求項26記載の物質。
【請求項２８】
鎖の5'末端および3'末端のヌクレオチドの少なくとも4〜5個が改変されている、請求項26記載のRNAサイレンシング物質。
【請求項２９】
改変ヌクレオチドが、2'-フルオロ改変リボヌクレオチド、2'-アミノ改変リボヌクレオチド、2'アルキル改変リボヌクレオチド、2'-O-メチルリボヌクレオチド、および骨格改変ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項26記載のRNAサイレンシング物質。
【請求項３０】
2'-フルオロ改変リボヌクレオチドが2'-フルオロウリジンおよび2'-フルオロシチジンである、請求項29記載のRNAサイレンシング物質。
【請求項３１】
骨格改変ヌクレオチドがホスホロチオエート基を含有する、請求項26記載のRNAサイレンシング物質。
【請求項３２】
アンチセンス鎖が、非標的mRNAと少なくとも1つのミスマッチを含む、請求項26記載のRNAサイレンシング物質。
【請求項３３】
siRNAであるRNAサイレンシング物質であって、siRNAの鎖が約5〜60ヌクレオチド長、約5〜18ヌクレオチド長、約25〜60ヌクレオチド長、および約18〜25残基長からなる群より選択される長さを有する、請求項26記載のRNAサイレンシング物質。
【請求項３４】
鎖の長さが約21〜23残基である、請求項33記載のsiRNA。
【請求項３５】
標的mRNAがApoB mRNAまたはRIP-140 mRNAである、請求項26記載のRNAサイレンシング物質。
【請求項３６】
ApoB変異をコードすることができる領域におけるApoB mRNAを標的とする、請求項35記載の物質。
【請求項３７】
siRNAがApoB mRNAおよび野生型ApoB mRNAを標的とする、請求項36記載の物質。
【請求項３８】
RIP-140変異をコードすることができる領域におけるRIP-140 mRNAを標的とする、請求項35記載の物質。
【請求項３９】
siRNAがRIP-140 mRNAおよび野生型RIP-140 mRNAを標的とする、請求項35記載の物質。
【請求項４０】
少なくとも1つの官能表面基に共役したコアを含むナノ輸送体に共役または会合した請求項26記載のRNAサイレンシング物質を含む送達複合体。
【請求項４１】
請求項26記載のRNAサイレンシング物質を細胞に接触させる段階を含む、インビトロで細胞におけるRNAサイレンシングを活性化する方法であって、該物質が、標的mRNAのRNAサイレンシングが起こるのに十分な量で導入され、それによって細胞におけるRNAサイレンシングを活性化する、方法。
【請求項４２】
少なくとも1つの官能表面基に共役したコアを含むナノ輸送体に共役または会合したsiRNAを含む送達複合体を細胞に接触させることによって、RNAサイレンシング物質が該細胞に導入される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
請求項23記載のRNAサイレンシング物質を生物に投与する段階を含む、生物におけるRNAサイレンシングを活性化する方法であって、該物質が、標的mRNAの分解が起こるのに十分な量で投与され、それによって生物におけるRNAサイレンシングを活性化する、方法。
【請求項４４】
RNAサイレンシング物質が、少なくとも1つの官能表面基に共役したコアを含むナノ輸送体に共役または会合したsiRNAを含む送達複合体に会合して投与される、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
RNAサイレンシング物質が静脈内経路または腹腔内経路によって投与される、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
代謝疾患または障害が肥満、糖尿病、および高コレステロールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝疾患または障害である、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
標的mRNAの分解が、標的mRNAに規定されるタンパク質が少なくとも10％減少するように起こる、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
請求項24記載のRNAサイレンシング物質を被験体に投与する段階を含む、被験体における標的mRNAに規定されるタンパク質の活性に関連する代謝疾患または障害を処置する方法であって、該RNAサイレンシング物質が、標的mRNAの分解またはタンパク質発現の抑制が起こるのに十分な量で投与され、それによって該タンパク質に関連する代謝疾患または障害を処置する、方法。
【請求項４９】
疾患または障害が、肥満、糖尿病、および高コレステロールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝疾患または障害である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
代謝疾患または障害が肥満であって、被験体の体重が、組成物の投与前の被験体の体重と比較して少なくとも5％減少する、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
代謝疾患または障害が糖尿病であって、被験体のグルコースレベルが、組成物の投与前の被験体のグルコースレベルと比較して少なくとも約5％低下する、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
代謝疾患または障害が高コレステロールであって、被験体のコレステロールレベルが、組成物の投与前の被験体のコレステロールレベルと比較して少なくとも5％減少する、請求項48記載の方法。
【請求項５３】
請求項36記載の送達複合体を被験体に投与する段階を含む、被験体における標的mRNAに規定されるタンパク質の活性に関連する代謝疾患または障害を処置する方法であって、該送達複合体が標的mRNAの分解が起こるのに十分な量で投与され、それによって、該タンパク質に関連する代謝疾患または障害を処置する、方法。
【請求項５４】
疾患または障害が、肥満、糖尿病、および高コレステロールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝疾患または障害である、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
代謝疾患または障害が肥満であって、被験体の体重が、組成物の投与前の被験体の体重と比較して少なくとも5％減少する、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
代謝疾患または障害が糖尿病であって、被験体のグルコースレベルが、組成物の投与前の被験体のグルコースレベルと比較して少なくとも約5％低下する、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
代謝疾患または障害が高コレステロールであって、被験体のコレステロールレベルが、組成物の投与前の被験体のコレステロールレベルと比較して少なくとも5％減少する、請求項53記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2006年1月26日に提出された "Nanotransporters for Efficient Delivery of Nucleic Acid and Other Pharmaceutical Agents," と題する米国特許出願第60/762,956号、2006年1月26日に提出された"RNA Interference Agents for Use in Therapy of Metabolic Disorders"と題する米国特許出願第60/762,951号、2006年1月26日に提出された"RNA Interference Agents for Use in Therapy"と題する米国特許出願第60/762,957号の恩典を主張する。これらの出願の全内容物は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
RNA干渉（RNAi）は、それによって二本鎖RNA（dsRNA）が相同なmRNAの配列特異的分解を誘導するプロセスである。RNAiは、シーエレガンス（Caenorhabditis elegans）（Fire et al., 1998（非特許文献1)）において初めて発見されたが、類似の現象が植物（転写後遺伝子サイレンシング[PTGS]）およびアカパンカビ（Neurospora crassa）（鎮圧現象）（Hammond et al., 2001（非特許文献2）；Sharp, 2001（非特許文献3）において論評）において報告されている。dsRNA誘発サイレンシング現象は進化的に多様な生物、たとえば線虫、植物、真菌、およびトリパノソーマに存在することが明白となった（Bass, 2000（非特許文献4）；Cogoni and Macino, 2000（非特許文献5）；Fire et al., 1998（非特許文献1）；Hammond et al., 2001（非特許文献2）；Ketting and Plasterk, 2000（非特許文献6）；Matzke et al., 2001（非特許文献7）；Sharp, 2001（非特許文献3）；Sijen and Kooter, 2000（非特許文献8）；Tuschl, 2001（非特許文献9）；Waterhouse et al., 2001（非特許文献10)）。ショウジョウバエ（Drosophila）の胚溶解物およびS2細胞抽出物における生化学研究は、それによってRNAiが作用する機構を解明するために始まった（Bernstein et al., 2001（非特許文献11）；Tuschl et al, 1999（非特許文献12）；Zamore et al., 2000（非特許文献13)）。
【０００３】
RNAiは、新規治療戦略としておびただしい可能性を有することが証明されたが、インビボで用いるために最適化されるRNAi物質がなおも必要である。別の目標は、特異的標的化部位または組織に対して治療的RNAi物質を効率的に展開させることである。したがって、非毒性で、免疫原性で生体分解性の送達系が必要である。
【０００４】
【非特許文献１】Fire et al., 1998
【非特許文献２】Hammond et al., 2001
【非特許文献３】Sharp, 2001
【非特許文献４】Bass, 2000
【非特許文献５】Cogoni and Macino, 2000
【非特許文献６】Ketting and Plasterk, 2000
【非特許文献７】Matzke et al., 2001
【非特許文献８】Sijen and Kooter, 2000
【非特許文献９】Tuschl, 2001
【非特許文献１０】Waterhouse et al., 2001
【非特許文献１１】Bernstein et al., 2001
【非特許文献１２】Tuschl et al, 1999
【非特許文献１３】Zamore et al., 2000
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、部分的に、RNAサイレンシング物質と共に他の核酸分子および/または薬学的物質の送達物質として用いるための新規ナノ輸送体の合成および処方に基づく。例示的な局面において、本発明のナノ輸送体は、少なくとも1つの官能表面基（functional surface group）が付着した中心コアを含む。例示的な態様において、ナノ輸送体のコアは、ナノ粒子（たとえば、デンドリマー、たとえばポリリジンデンドリマー）またはナノチューブ（たとえば、単壁ナノチューブまたは複壁ナノチューブ）である。官能表面基は、ナノ輸送体の官能性の増加能、たとえば細胞ターゲティング特異性の増加能、標的細胞へのナノ輸送体送達の増加能、および/または正確な生物機能の付与能に関して選択される。1つの態様において、官能表面基は、脂質、細胞型特異的ターゲティング部分、蛍光分子、および電荷制御分子の少なくとも1つである。本発明のRNAサイレンシング物質と共に他の核酸分子（たとえば、他のRNAサイレンシング物質（たとえば、siRNA、miRNA、shRNA）、アンチセンス分子、リボザイム等）および/または薬学的物質（たとえば、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、化学療法剤、および/または抗生物質）を、標的特異的送達のためにコアに機能的に連結（または共役もしくはそうでなければ会合）させることができる。
【０００６】
別の態様において、本発明は、核酸分子および/または薬学的物質に機能的に連結したナノ輸送体（たとえば、本発明のナノ輸送体）を細胞に接触させて、それによって核酸分子および/または薬学的物質を細胞に送達する段階を含む、核酸分子（たとえば、本発明のRNAサイレンシング物質（たとえばsiRNA)）および/または薬学的物質を細胞に送達するための方法を提供する。1つの態様において、接触される細胞はヒト細胞である。
【０００７】
他の局面において、本発明は、疾患および障害、たとえば代謝疾患または障害の処置において用いるための改善されたRNAサイレンシング物質を提供する。他の局面において、本発明は、ナノ輸送体、ならびにインビボでのRNAサイレンシング物質および他の核酸物質の標的化送達のために該ナノ輸送体を用いることを提供する。
【０００８】
1つの局面において、本発明は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む少なくとも1つの低分子干渉RNA（siRNA）に向けられ、（a）アンチセンス鎖は標的特異的RNA干渉（RNAi）を指示するために標的mRNA配列に対して十分に相補的である配列を有し；（b）鎖は、対応する非改変siRNAと比較してインビボ安定性が増強されるように、1つより多い化学改変ヌクレオチドによって双方の末端が改変され；および（c）アンチセンス鎖は、標的RNAと会合した場合にA型へリックスの形成能を保持する。
【０００９】
1つの態様において、鎖の5'末端および3'末端のヌクレオチドの少なくとも3〜6個が改変される。1つの態様において、鎖の5'末端および3'末端のヌクレオチドの少なくとも4〜5個が改変される。1つの態様において、改変ヌクレオチドは、2'-改変リボヌクレオチドおよび骨格改変ヌクレオチドである。2'-フルオロ改変リボヌクレオチドは、2'-フルオロウリジンおよび2'-フルオロシチジンである。1つの態様において、骨格改変ヌクレオチドは、ホスホロチオエート基を含有する。
【００１０】
1つの態様において、アンチセンス鎖と標的mRNA配列は、100％相補的である。1つの態様において、アンチセンス鎖と標的mRNA配列は、少なくとも1つのミスマッチを含む。1つの態様において、改変ヌクレオチドは、標的mRNA配列と塩基対を形成した場合に、アンチセンス鎖が正常な主溝を含むA型へリックス立体構造をとる能力を生じない。
【００１１】
1つの態様において、鎖の長さは約10〜50残基の間である。1つの態様において、鎖の長さは約18〜25残基であり、たとえば長さ21残基である。1つの態様において、鎖は、siRNAがオーバーハング末端を有するように、たとえばsiRNAが2-ヌクレオチドオーバーハング末端を有するように整列する。1つの態様において、siRNAは化学合成される。
【００１２】
1つの態様において、siRNAは、ApoB mRNAまたはRIP-140 mRNA、たとえばApoB変異をコードすることができる領域におけるApoB mRNA、ApoB mRNAおよび野生型ApoB mRNA、RIP-140変異をコードすることができる領域におけるRIP-140 mRNA、ならびに/またはRIP-140 mRNAおよび野生型RIP-140 mRNAを標的とする。
【００１３】
1つの局面において、本発明にはまた、本明細書において記載される任意のsiRNAを細胞に導入する段階を含む、細胞において標的特異的RNA干渉（RNAi）を活性化する方法が含まれ、siRNAは標的mRNAの分解が起こるのに十分な量で導入され、それによって細胞における標的特異的RNAiを活性化する。
【００１４】
1つの局面において、本発明にはまた、先行請求項のいずれか1つのsiRNAを生物に投与する段階を含む、生物における標的特異的RNA干渉（RNAi）を活性化する方法が含まれ、siRNAは標的mRNAの分解が起こるのに十分な量で導入され、それによって細胞における標的特異的RNAiを活性化する。
【００１５】
いくつかの態様において、標的mRNAの分解は、該標的mRNAに規定されるタンパク質が、少なくとも10％、たとえば少なくとも20％減少するように起こる。
【００１６】
1つの局面において、本発明には、先行請求項のいずれか1つのsiRNAを被験体に投与する段階を含む、被験体における標的mRNAに規定されるタンパク質の活性に関連する疾患または障害を処置する方法が含まれ、siRNAは標的mRNAの分解が起こるのに十分な量で導入され、それによってタンパク質に関連する疾患または障害を処置する。
【００１７】
本発明にはまた、代謝疾患が処置されるように、先行請求項のいずれかのsiRNAを投与する段階を含む、被験体における肥満、糖尿病、および高コレステロールからなる群より選択される少なくとも1つの代謝疾患または障害を処置するための方法が含まれる。いくつかの態様において、代謝疾患または障害は肥満であり、被験体の体重は、組成物の投与前の被験体の体重と比較して少なくとも5％減少する。いくつかの態様において、代謝疾患または障害は糖尿病であり、被験体のグルコースレベルは、組成物の投与前の被験体のグルコースレベルと比較して少なくとも約5％低下する。いくつかの態様において、代謝疾患または障害は高コレステロールであり、被験体のコレステロールレベルは、組成物の投与前の被験体のコレステロールレベルと比較して少なくとも5％減少する。
【００１８】
本発明の他の特色および長所は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は部分的に、核酸分子、たとえばRNAサイレンシング物質（たとえば、siRNA）の送達物質として用いるための、および/または薬学的物質を送達するための、新規ナノ輸送体の合成および処方に関する。例示的な局面において、本発明のナノ輸送体は、少なくとも1つの官能表面基が付着したナノ粒子またはナノチューブである、中心コアを含む。多数の官能表面基をコアに付着させることができる。官能表面基は、ナノ輸送体の官能性を増加させる能力に関して、たとえば細胞ターゲティング特異性を増加させる能力、標的細胞へのナノ輸送体の送達を増加させる能力、および/または正確な生物機能を付与する能力に関して選択される。
【００２０】
他の局面において、本発明は、少なくとも1つの化学改変RNAサイレンシング物質（たとえば、低分子干渉RNA分子（siRNA）のようなRNAi物質）が含まれるナノ輸送体、および該RNAサイレンシング物質を用いる方法（たとえば、研究および/または治療法）を特色とする。本発明には、センス鎖、アンチセンス鎖、または双方の3'末端および5'末端で化学改変されているRNAサイレンシング物質（たとえば、RNAi物質）が含まれる。そのようなRNAサイレンシング物質、およびそれらを組み入れるナノ輸送体は、たとえば、代謝障害、たとえば高コレステロール、糖尿病、および肥満の処置において有用である。
【００２１】
I．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。
【００２２】
本明細書において用いられる「ナノ粒子」という用語は、ナノメートルの次数で、たとえば約1〜約500ナノメートルの次数で、たとえば約10〜約100ナノメートルの次数で制御された寸法を有する粒子を指す。特定の態様において、ナノ粒子はデンドリマーである。
【００２３】
本明細書において用いられる「デンドリマー」という用語は、十分に定義された構造を有する高度分岐ポリマーを指す。本発明のデンドリマーには、中でも、以下が含まれるがこれらに限定されるわけではない：ポリリジンデンドリマー；ポリアミドアミン（PAMAM）PAMAM：アミン末端および/またはPAMAM：カルボン酸末端（たとえば、Dendritech, Inc., Midland, MIから入手可能）；ジアミノブタン(DAB)-DAB：アミン末端および/またはDAB：カルボン酸末端；PEGs：OH末端（Frechet et al. JACS 123:5908 (2001)）。
【００２４】
本明細書において用いられる「ナノチューブ」という用語は、外径約1〜約5 nmの中空の円柱状構造を指す。例示的なナノチューブはカーボンナノチューブである。特定の態様において、ナノチューブは単壁ナノチューブ、たとえば単チューブである。他の態様において、ナノチューブは複壁ナノチューブ、すなわち少なくとも1つの他のチューブがその中に抱埋されているチューブである。
【００２５】
本明細書において用いられる「ナノ輸送体」という用語は、制御された寸法、たとえば約1〜約1000ナノメートルの次数の直径または半径を有する多成分複合体を指す。1つの態様において、ナノ輸送体は、直径が約1〜約100ナノメートルである。別の態様において、ナノ輸送体は直径が約1〜約75ナノメートルである。別の態様において、ナノ輸送体は、直径が約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100ナノメートルである。特定の態様において、ナノ輸送体は、本明細書において定義されるナノ粒子と、本明細書において定義される少なくとも1つの官能表面基を含む。1つの態様において、ナノ輸送体は官能表面基約1〜約50個を含む。別の態様において、ナノ輸送体は官能表面基約1〜約25個を含む。別の態様において、ナノ輸送体は官能表面基約1〜約10個（たとえば、官能表面基1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個）を含む。特定の態様において、官能表面基は同じである。他の態様において、官能表面基の異なる組み合わせを用いる（たとえば、2、3、4、5、または6タイプの官能表面基、たとえばオレオイル脂質とコレステロールを用いる）。
【００２６】
本明細書において用いられる「送達複合体」（同様に干渉ナノ粒子または「iNOP」とも呼ばれる）という用語は、ナノ輸送体と核酸（たとえば、RNAサイレンシング物質）および/または薬学的物質との会合によって形成された複合体を指す。送達複合体は2つの部分またはサブユニットを有する：（1）ナノ輸送体（たとえば、少なくとも1つの官能基に共役されたコア）；および（2）RNAサイレンシング物質（たとえば、化学改変または非改変RNAサイレンシング物質、たとえば化学改変または非改変siRNA）。1つの態様において、送達複合体は直径が約1〜約5000ナノメートルである。別の態様において、送達複合体は直径が約1〜約1000ナノメートルである。別の態様において、送達複合体は、直径が約100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000ナノメートルである。
【００２７】
本明細書において用いられる「RNAサイレンシング」という用語は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」が起こる、RNA分子によって媒介される一群の配列特異的調節機構（たとえば、RNA干渉（RNAi）、転写遺伝子サイレンシング（TGS）、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）、鎮圧現象、共抑制、および翻訳抑制）を指す。RNAサイレンシングは、植物、動物、および真菌を含む多くのタイプの生物において観察されている。
【００２８】
「識別RNAサイレンシング」とは、たとえば双方のポリヌクレオチド配列が同じ細胞に存在する場合に、RNA分子が「第一の」または「標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害するが、「第二の」または「非標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害しない能力を指す。特定の態様において、標的ポリヌクレオチド配列は標的遺伝子に対応するが、非標的ポリヌクレオチド配列は非標的遺伝子に対応する。他の態様において、標的ポリヌクレオチド配列は標的対立遺伝子に対応するが、非標的ポリヌクレオチド配列は非標的対立遺伝子に対応する。特定の態様において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の調節領域（たとえば、プロモーターまたはエンハンサー要素）をコードするDNA配列である。他の態様において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子によってコードされる標的mRNAである。
【００２９】
本明細書において用いられる「標的遺伝子」という用語は、その発現が実質的に阻害または「サイレンシング」される遺伝子である。このサイレンシングは、RNAサイレンシングによって、たとえば標的遺伝子のmRNAの切断、または標的遺伝子の翻訳抑制によって、行うことができる。「非標的遺伝子」という用語は、その発現が実質的に阻害されない遺伝子である。1つの態様において、標的および非標的遺伝子のポリヌクレオチド配列（たとえば、標的および非標的遺伝子によってコードされるmRNA）は、1つまたは複数のヌクレオチドが異なりうる。別の態様において、標的および非標的遺伝子は、1つまたは複数の多形によって異なりうる。別の態様において、標的および非標的遺伝子は100％未満の配列同一性を共有しうる。別の態様において、非標的遺伝子は、標的遺伝子の相同体（たとえば、オルトログまたはパラログ）であってもよい。
【００３０】
「標的対立遺伝子」とは、その発現が選択的に阻害または「サイレンシング」される対立遺伝子である。このサイレンシングは、RNAサイレンシングによって、たとえばsiRNAによる標的遺伝子または標的対立遺伝子のmRNAの切断によって行うことができる。「非標的対立遺伝子」という用語は、その発現が実質的に阻害されない対立遺伝子である。特定の態様において、標的および非標的対立遺伝子は同じ標的遺伝子に対応しうる。他の態様において、標的対立遺伝子は標的遺伝子に対応し、非標的対立遺伝子は非標的遺伝子に対応する。1つの態様において、標的および非標的対立遺伝子のポリヌクレオチド配列は、1つまたは複数のヌクレオチドによって異なりうる。別の態様において、標的および非標的対立遺伝子は1つまたは複数の多形によって異なりうる。別の態様において、標的および非標的対立遺伝子は、100％未満の配列同一性を共有しうる。
【００３１】
本明細書において用いられる「多形」という用語は、異なる起源または被験体由来（しかし同じ生物由来）の同じ遺伝子配列を比較した場合に、同定または検出される遺伝子配列における変異（たとえば、欠失、挿入、または置換）を指す。たとえば、多形は、異なる被験体由来（しかし、同じ生物由来）の同じ遺伝子配列を比較した場合に同定されうる。そのような多形の同定は、当技術分野においてルーチンであり、方法論は乳癌の点突然変異を検出するために用いられる方法論と類似である。同定は、たとえば被験体のリンパ球から抽出した後に該多形領域に対して特異的なプライマーを用いて多形領域の増幅後のDNAから行うことができる。または、多形は、同じ遺伝子の2つの対立遺伝子を比較する場合に同定されうる。
【００３２】
生物における同じ遺伝子の2つの対立遺伝子間の配列の変異は、本明細書において「対立遺伝子多形」と呼ばれる。多形は、コード領域内のヌクレオチドで起こりうるが、遺伝子コードの縮重のためにアミノ酸配列における変化はコードされない。または、多形配列は特定の位置で異なるアミノ酸をコードしうるが、アミノ酸の変化はタンパク質の機能に影響を及ぼさない。多形領域はまた、遺伝子の非コード領域においても見られる。
【００３３】
本明細書において用いられる「RNAサイレンシング物質」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害または「サイレンシング」することができるRNAを指す。特定の態様において、RNAサイレンシング物質は、転写後サイレンシング機構を通してmRNA分子の完全なプロセシング（たとえば、完全な翻訳および/または発現）を防止することができる。RNAサイレンシング物質には、低分子の（＜50 b.p.）非コードRNA分子、たとえば対形成鎖を含むRNA二重鎖と共に、そのような低分子非コードRNAが生成されうる前駆体RNAが含まれる。例示的なRNAサイレンシング物質には、siRNA、miRNA、siRNA様二重鎖、および二機能オリゴヌクレオチドと共にその前駆体が含まれる。1つの態様において、RNAサイレンシング物質は、RNA干渉（RNAi）を誘発することができる。別の態様において、RNAサイレンシング物質は、翻訳抑制を媒介することができる。
【００３４】
「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボース糖に共有的に連結したプリンまたはピリミジン塩基を有する分子を指す。例示的なヌクレオシドには、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、およびチミジンが含まれる。さらなる例示的なヌクレオシドには、イノシン、1-メチルイノシン、シュードウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、リボチミジン、2N-メチルグアノシン、および2,2N,N-ジメチルグアノシン（「希少な」ヌクレオシドとも呼ばれる）が含まれる。「ヌクレオチド」という用語は、糖部分にエステル連結によって接合した1つまたは複数のホスフェート基を有するヌクレオシドを指す。例示的なヌクレオチドには、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸が含まれる。「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、5'および3'の炭素原子間のホスホジエステル連結によって共に接合されたヌクレオチドのポリマーを指す。
【００３５】
「RNA」、「RNA分子」、または「リボ核酸分子」という用語は、リボヌクレオチドのポリマーを指す。「DNA」、「DNA分子」、または「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。DNAおよびRNAは天然に合成されうる（たとえばそれぞれ、DNA複製またはDNAの転写によって）。RNAは、転写後改変されうる。DNAおよびRNAはまた、化学合成されうる。DNAおよびRNAは一本鎖（すなわちそれぞれ、ssRNAおよびssDNA）、または多重鎖（たとえばそれぞれ、二本鎖、すなわちdsRNAおよびdsDNA）となりうる。「mRNA」または「メッセンジャーRNA」とは、1つまたは複数のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を規定する一本鎖RNAである。この情報はリボソームがmRNAに結合するタンパク質合成の際に翻訳される。
【００３６】
本明細書において用いられる「希少なヌクレオチド」という用語は、めったに起こらない天然に存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、たとえばグアノシン、アデノシン、シトシン、またはウリジンではない天然に存在するリボヌクレオチドを含む、めったに起こらない天然に存在するヌクレオチドを指す。希少なヌクレオチドの例には、イノシン、1-メチルイノシン、シュードウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、リボチミジン、2N-メチルグアノシン、および2,2N,N-ジメチルグアノシンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００３７】
「ヌクレオチド類似体」、「変更されたヌクレオチド」、または「改変ヌクレオチド」という用語は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが含まれる非標準ヌクレオチドを指す。好ましいヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの特定の化学特性を変更するために任意の位置で改変されるが、なおもヌクレオチド類似体がその意図する機能を行う能力を保持している。好ましい改変ヌクレオチドの例には、2-アミノ-グアノシン、2-アミノアデノシン、2,6-ジアミノ-グアノシン、および2,6-ジアミノ-アデノシンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。誘導体化されてもよいヌクレオチドの位置の例には、5位、たとえば5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン、5-プロピルウリジン、5-プロペニルウリジン等；6位、たとえば6-(2-アミノ)プロピルウリジン；アデノシンおよび/またはグアノシンの8位、たとえば8-ブロモグアノシン、8-クロログアノシン、8-フルオログアノシン等が含まれる。ヌクレオチド類似体にはまた、デアザヌクレオチド、たとえば7-デアザ-アデノシン；O-およびN-改変（たとえば、アルキル化、たとえばN6-メチルアデノシンまたは当技術分野で公知のその他）ヌクレオチド；ならびにHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310において記載されるような他の複素環改変ヌクレオチド類似体が含まれる。
【００３８】
ヌクレオチド類似体はまた、ヌクレオチドの糖の位置で改変を含んでもよい。たとえば、2'-OH基は、Rが置換または非置換C1-C6アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール等である、H、OR、R、F、Cl、Br、I、SH、SR、NH2、NHR、NR2、COOR、またはORから選択される基によって置換されてもよい。他の起こりうる改変には、U.S. Patent Nos. 5,858,988および6,291,438において記載される改変が含まれる。
【００３９】
ヌクレオチドのホスフェート基はまた、ホスフェート基の1つまたは複数の酸素を硫黄（たとえば、ホスホロチオエート）に置換することによって、またはたとえばEckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2): 117-21、Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45、Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25、Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85、およびU.S. Patent No. 5,684,143において記載されるような、意図される機能をヌクレオチドに行わせる他の置換を作製することによって、改変してもよい。先に引用した特定の改変（たとえば、ホスフェート基の改変）は、好ましくはインビボまたはインビトロで該類似体を含むポリヌクレオチドの加水分解速度を減少させる。
【００４０】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体の短いポリマーを指す。「RNA類似体」という用語は、対応する非変更または非改変RNAと比較して少なくとも1つの変更または改変ヌクレオチドを有するが、対応する非変更または非改変RNAと同じまたは類似の特性または機能を保持するポリヌクレオチド（たとえば、化学合成ポリヌクレオチド）を指す。オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結を有するRNA分子と比較して、RNA類似体の加水分解がより低い割合で起こる連結によって連結してもよい。たとえば、類似体のヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミデート、および/またはホスホロチオエート連結を含んでもよい。例示的なRNA類似体には、糖および/または骨格改変リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドが含まれる。そのような変更または改変にはさらに、RNAの末端または内部（RNAの1つまたは複数のヌクレオチドで）のような部位への非ヌクレオチド材料の付加が含まれうる。RNA類似体は、RNAサイレンシング（たとえばRNA干渉）を媒介する（媒介する）能力を有する天然のRNAと十分に類似である必要があるのみである。例示的な態様において、オリゴヌクレオチドは、ロックト核酸（LNA）またはペプチド核酸（PNA）を含む。
【００４１】
本明細書において用いられる「結合強度」または「塩基対強度」という用語は、主に該ヌクレオチド（またはヌクレオシド類似体）間のH-結合、ファンデルワールス相互作用等により、オリゴヌクレオチド二重鎖（たとえば、RNAサイレンシング物質の鎖と標的mRNA配列とによって形成される二本鎖）の反対鎖上でのヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）の対の間の相互作用の強度を指す。
【００４２】
本明細書において用いられる「融解温度」または「Tm」という用語は、二本鎖ポリヌクレオチド分子の集団の半数が一本鎖に解離されるようになる温度を指す。
【００４３】
本明細書において用いられる「十分な相補性」または「十分な程度の相補性」とは、RNAサイレンシング物質がそれぞれ所望の標的RNAに結合するために、および標的mRNAのRNAサイレンシングを誘発するために十分である配列（たとえば、アンチセンス鎖において、mRNAターゲティング部分またはmiRNA動員部分）を有することを意味する。
【００４４】
本明細書において用いられる「RNA干渉」（「RNAi」）という用語は、標的RNAの選択的細胞内分解が起こるRNAサイレンシングの1つのタイプを指す。RNAiは、異物RNA（たとえば、ウイルスRNA）を除去するために細胞内において自然に起こる。天然のRNAiは、他の類似のRNA配列に対する分解機構を指示する遊離のdsRNAから切断された断片を通して進行する。RNAiおよび翻訳抑制はいずれもRISCによって媒介される。RNAiおよび翻訳抑制は天然に起こる、またはたとえば標的遺伝子の発現をサイレンシングするためにヒトの手によって開始されうる。
【００４５】
本明細書において用いられる「翻訳抑制」という用語は、mRNA翻訳の選択的阻害を指す。天然の翻訳抑制は、shRNA前駆体から切断されたmiRNAを通して進行する。RNAiおよび翻訳抑制はいずれもRISCによって媒介される。RNAiおよび翻訳抑制は天然に起こる、またはたとえば標的遺伝子の発現をサイレンシングするためにヒトの手によって開始されうる。
【００４６】
本明細書において用いられる「低分子干渉RNA」（「siRNA」）（当技術分野において「短い干渉RNA」とも呼ばれる）は、RNAサイレンシング（たとえば、RNA干渉または翻訳抑制）を指示または媒介することができるヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）約5〜60個を含むRNA（またはRNA類似体）を指す。好ましくは、siRNAは、約15〜30ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、より好ましくは約16〜25ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、さらにより好ましくは約18〜23ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、およびさらにより好ましくは約19〜22ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（たとえば、19、20、21、または22ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）を含む。「短い」siRNAという用語は、5〜23ヌクレオチド、好ましくは約21ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、たとえば19、20、21、または22ヌクレオチドを含むsiRNAを指す。「長い」siRNAという用語は、24〜60ヌクレオチド、好ましくは約24〜25ヌクレオチド、たとえば23、24、25、または26ヌクレオチドを含むsiRNAを指す。いくつかの状況において、短いsiRNAには、より短いsiRNAがRNAiの媒介能を保持する限り、19ヌクレオチドより少ない、たとえば16、17、または18ヌクレオチド、または5ヌクレオチド程度と少ないヌクレオチドが含まれてもよい。同様に、より長いsiRNAには、いくつかの状況において、より長いsiRNAがRNAiの媒介能を保持する限り、または翻訳抑制が短いsiRNAへのさらなるプロセシング、たとえば酵素プロセシングを有しない限り、26個より多いヌクレオチド、たとえば27、28、29、30、35、40、45、50、55、またはさらに60ヌクレオチドが含まれてもよい。
【００４７】
本明細書において用いられる、当技術分野において「低分子一時的RNA」（「stRNA」）とも呼ばれる「ミクロRNA」（miRNA）という用語も同様に、遺伝学的にコードされ（たとえば、ウイルス、哺乳動物、または植物ゲノムによって）、RNAサイレンシングを指示または媒介することができる低分子（10〜50ヌクレオチド）RNAを指す。「miRNA障害」は、miRNAの異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害を指すであろう。
【００４８】
本明細書において用いられる、RNAサイレンシング物質、たとえばsiRNAまたはRNAi物質の「アンチセンス鎖」という用語は、サイレンシングのためにターゲティングされる遺伝子のmRNAの約10〜50ヌクレオチド、たとえば約15〜30、16〜25、18〜23、または19〜22ヌクレオチドの部分と実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖または第一の鎖は、標的特異的サイレンシングを指示するために所望の標的mRNA配列と十分に相補的な、たとえばRNAi機構もしくはプロセス（RNAi干渉）によって所望の標的mRNAの破壊を誘発するために十分な相補性、または所望の標的mRNAの翻訳抑制を誘発するために十分な相補性を有する配列を有する。
【００４９】
RNAサイレンシング物質、たとえばsiRNAまたはRNAi物質の「センス鎖」または「第二の鎖」という用語は、アンチセンス鎖または第一の鎖と相補的である鎖を指す。アンチセンスおよびセンス鎖はまた、第一または第二の鎖と呼ばれることがあり、第一または第二の鎖は、標的配列に対して相補性を有し、それぞれの第二のまたは第一の鎖は、該第一または第二の鎖と相補性を有する。miRNA二重鎖中間体またはsiRNA様二重鎖には、サイレンシングのためにターゲティングされる遺伝子のmRNAの約10〜50ヌクレオチドの部分と十分な相補性を有するmiRNA鎖、およびmiRNA鎖と二重鎖を形成するために十分な相補性を有するmiRNA*鎖が含まれる。
【００５０】
本明細書において用いられる「ガイド鎖」という用語は、RISC複合体に入って標的mRNAの切断を指示するRNAi物質の鎖、たとえばsiRNA二重鎖またはsiRNA配列のアンチセンス鎖を指す。
【００５１】
操作されたRNA前駆体または操作された核酸分子の場合のような「操作された」という用語は、前駆体または分子の核酸配列の全てまたは一部がヒトによって作製または選択されているという点において、前駆体または分子が天然において見いだされないことを示す。作製または選択された後、配列は、細胞内の機構によって複製、翻訳、転写、またはそうでなければプロセシングされうる。このように、操作された核酸分子が含まれるトランスジーンから細胞内で産生されたRNA前駆体は、操作されたRNA前駆体である。
【００５２】
「単離核酸分子または配列」とは、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直ちに隣接する（1つは5'末端でおよびもう1つは3'末端で）コード配列の双方に直ちに隣接しない核酸分子または配列である。したがって、この用語には、ベクター、自立的に複製するプラスミドもしくはウイルス、または原核細胞もしくは真核細胞のゲノムDNAに組み入れられる、または他の配列とは無関係に異なる分子（たとえば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処置によって産生されたcDNAまたはゲノムDNA断片）として存在する組み換え型DNAまたはRNAが含まれる。同様に、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換え型DNAが含まれる。
【００５３】
本明細書において用いられる「単離されたRNA」（たとえば、「単離shRNA」、「単離siRNA」、「単離siRNA様二重鎖」、「単離miRNA」、「単離遺伝子サイレンシング物質」、または「単離RNAi物質」）という用語は、組み換え技術によって産生された場合に他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学合成された場合に化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないRNA分子を指す。
【００５４】
本明細書において用いられる「トランスジーン」という用語は、細胞に人工的に挿入されて、細胞から発達する生物のゲノムの一部となる任意の核酸分子を指す。そのようなトランスジーンには、トランスジェニック生物に対して部分的もしくは完全に異種である（すなわち異物である）遺伝子が含まれてもよく、または生物の内因性の遺伝子に対して相同な遺伝子を表してもよい。「トランスジーン」という用語はまた、トランスジェニック動物に対して部分的もしくは完全に異種である、すなわち異物である、またはトランスジェニック動物の内因性の遺伝子に対して同種であるが天然の遺伝子の位置とは異なる位置で動物のゲノムに挿入されるように設計されるトランスジェニック生物、たとえば動物において発現される1つまたは複数の操作されたRNA前駆体をコードする、1つまたは複数の選択された核酸配列、たとえばDNAが含まれる核酸分子を意味する。トランスジーンには、選択された配列に全て機能的に連結する、選択された核酸配列の発現にとって必要な、1つまたは複数のプロモーターおよびイントロンのような任意の他のDNAが含まれ、エンハンサー配列が含まれてもよい。
【００５５】
疾患または障害に「関係する」遺伝子には、その正常または異常な発現または機能が疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の少なくとも1つの症状をもたらすまたは引き起こす遺伝子が含まれる。
【００５６】
「発現の対立遺伝子特異的阻害」とは、たとえば双方の対立遺伝子が同じ細胞に存在する場合に、遺伝子の一方の対立遺伝子の発現を他方の対立遺伝子に対して有意に阻害できることを指す。たとえば、対立遺伝子は、1、2、3、または3個より多いヌクレオチドが異なりうる。いくつかの場合において、1つの対立遺伝子は、疾患の原因、たとえば優性の機能獲得変異に相関する疾患の原因に関連する。
【００５７】
本明細書において用いられる「代謝障害」という用語は、生理的機能を行うために必要な物質を体がどのように処理するかに影響を及ぼす任意の疾患または障害を指す。多くの代謝障害は特定の特徴を共有し、すなわち、それらはインスリン抵抗性、血糖の調節能の欠損、体重の増加、およびボディーマス指数の増加に関連する。代謝障害の例には、糖尿病および肥満と共に、血清コレステロールレベルの増加（たとえば、高コレステロール血症）が含まれる。
【００５８】
本明細書において用いられる「機能獲得変異」という用語は、該遺伝子によってコードされるタンパク質（すなわち、変異体タンパク質）がタンパク質（すなわち、野生型タンパク質）に通常関連しない機能を獲得して、疾患または障害を引き起こすまたは寄与する、遺伝子における任意の変異を指す。機能獲得変異は、コードされるタンパク質の機能に変化を生じる、遺伝子におけるヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの欠失、付加、または置換となりうる。1つの態様において、機能獲得変異は変異体タンパク質の機能を変化させる、または他のタンパク質との相互作用を引き起こす。別の態様において、機能獲得変異は、たとえば、変更された変異体タンパク質と正常な野生型タンパク質との相互作用によって、正常な野生型タンパク質の減少または除去を引き起こす。
【００５９】
「細胞または生物における遺伝子の機能を検査する」という句は、それから生じる発現、活性、機能、または表現型を検査するまたは試験する段階を指す。
【００６０】
本発明の様々な方法論には、値、レベル、特色、特徴、特性等を「適当な対照」として本明細書において互換的に呼ばれる「適切な対照」と比較する段階を伴う段階が含まれる。「適切な対照」または「適当な対照」とは、比較目的にとって有用な当業者に周知の任意の対照または標準である。1つの態様において、「適切な対照」または「適当な対照」とは、本明細書において記載されるように、RNAi方法論を行う前に決定される値、レベル、特色、特徴、特性等である。たとえば、転写速度、mRNAレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物活性、細胞特徴または特性、遺伝子型、表現型等は、本発明のRNAi物質を細胞または生物に導入する前に決定することができる。別の態様において、「適切な対照」または「適当な対照」とは、たとえば正常な形質を示す細胞または生物、たとえば対照のまたは正常な細胞または生物において決定された値、レベル、特色、特徴、特性等である。さらに別の態様において、「適切な対照」または「適当な対照」とは、既定の値、レベル、特色、特徴、特性等である。
【００６１】
本明細書において用いられる「処置」または「処置する」とは、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治癒、癒合、緩和、遅延、軽減、変更、治療、回復、改善、または影響を及ぼすことを目的として、障害を有する患者に対する治療物質（たとえば、RNAサイレンシング物質またはこれをコードするベクターもしくはトランスジーン）の適用もしくは投与、または障害を有する患者からの単離組織もしく細胞株に対する治療物質の適用もしくは投与として定義される。「処置」または「処置する」という用語はまた、本明細書において物質を予防的に投与する場合にも用いられる。「有効量」または「有効用量」という用語は、所望の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するために十分な量として定義される。「治療的有効量」という用語は、既に疾患を有する患者における疾患およびその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるために十分な量として定義される。「患者」という用語には、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物被験体が含まれる。
【００６２】
特に定義していなければ、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実践または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は説明するためであって、制限的であると意図されない。
【００６３】
本発明の様々な局面を以下の章においてさらに詳細に記載する。
【００６４】
II．ナノ輸送体
本発明は、様々な官能表面基が付着したコアを含むナノ輸送体を含む組成物、たとえば薬学的組成物を提供する。図1は、本発明の例示的なナノ輸送体の構築の図解である。この図から認められうるように、核酸分子、たとえばsiRNAはナノ輸送体のコアに共役することができる。いくつかの態様において、核酸分子、たとえばsiRNAは、ナノ輸送体を通して標的部位に送達される。
【００６５】
別の態様において、薬学的物質をナノ輸送体のコアに共役させることができる。いくつかの態様において、薬学的物質はナノ輸送体を通して標的部位に送達される。
【００６６】
a）ナノ輸送体のコア
例示的な態様において、ナノ輸送体のコアは、ナノ粒子またはナノチューブである。ナノチューブは単壁（「SWNT」）または複壁（「MWNT」）であってもよい。たとえば、S. Iijima et al., Nature, 363, 603 (1993)；S. Iijima, Nature, 354, 56 (1991)を参照されたい。SWNTは直径約1ナノメートルで、長さが約1〜約100ミクロンの単チューブである。MWNTはその中に少なくとも1つの他のチューブが埋もれているチューブである。
【００６７】
いくつかの態様において、ナノチューブは、フラーレン様構造の半球によって覆われた一端を有しうる。ナノチューブは、その独自の幾何学ならびに電子、機械、化学および熱特性のためにますます注目を集めている。本発明において用いられるナノチューブは、単壁または複壁であってもよい。
【００６８】
他の態様において、ナノ輸送体コアはナノ粒子である。本発明のナノ粒子には、デンドリマーが含まれるがこれらに限定されるわけではない。デンドリマーとは十分に定義された構築を有する高度分岐ポリマーである。デンドリマーは全てが1つまたは複数の分岐点を含有する反復単位のいくつかの層または「世代」を含む。
【００６９】
デンドリマーは、一般的に、少なくとも2つの反応基を有する単量体単位の縮合反応によって、たとえばコンバージェントまたはダイバージェント合成によって調製される。デンドリマーのコンバージェント合成は2つの段階で起こる：（1）分子の表面上で末端基の活性化、および（2）分岐単量体単位の付加。反応は、いくつかの反応部位を含有するコア分子で始まる。単量体単位は、コア分子と容易に反応して、デンドリマーの第一世代を形成する。しかし、単量体の末端基は保護され、別の単量体単位を付加する前に活性化されなければならない。このように、受動的な末端基を第二の反応によって除去して、次にさらなる単量体単位を付加する。得られたデンドリマーは、層状の分岐の秩序だった整列を含有する。
【００７０】
デンドリマーのコンバージェント合成は、デンドリマーの表面となるであろうものから始まる成長プロセスを伴う。ダイバージェント合成と同様に、コンバージェント合成は、ルーチンとして2つの段階を必然的に伴う：（1）内部世代に対する最も外側の基の付着、および（2）コア分子に対する内部世代の付着。1つの態様において、本発明のデンドリマーはダイバージェント合成によって合成される。別の態様において、本発明のデンドリマーはコンバージェント合成によって合成される。
【００７１】
それぞれのデンドリマーには、コア分子または「コアデンドロン」、1つまたは複数の層の内部デンドロン、および表面デンドロンの外層が含まれる。本明細書において用いられる「デンドロン」とは、デンドリマー世代を構築するために用いられる分岐分子である。デンドロンは、化学構造および分岐官能性が同じまたは異なりうる。デンドロンの分岐は化学的に反応性または受動性の官能基のいずれかを含有しうる。表面が化学反応基を含有する場合、それらの基は樹状の成長のさらなる伸長のために、またはたとえば様々な官能表面基の付着による樹状の分子表面の改変のために用いられうる。化学的に受動的な基は、疎水性対親水性末端の比率を調節するために、または特定の環境でのデンドリマーの溶解度を改善するために、樹状表面を物理的に改変するために用いることができる。
【００７２】
本発明のデンドリマーは、その「世代」に言及することによって記載される。本明細書において用いられる「生成物」とは、デンドリマーが受けた合成ラウンド数を指す。たとえば、開始または「コア」デンドロンはゼロ世代である。デンドロンのコアデンドロンへの第一の付加は第一世代である。デンドロンのコアデンドロンへの第二の付加は第二世代である等。世代への言及は、他の部分、たとえば様々な官能表面基との共役のために利用できる末端基の数に関する情報を提供することができる。他の態様において、デンドリマーは、コアデンドロンから放射状に終了する1つまたは複数（たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個）の分岐を含む。
【００７３】
特定の態様において、本発明のデンドリマーは、天然のアミノ酸（たとえば、ヒスチジン、リジン等）またはその合成誘導体を含む。1つの態様において、本発明のデンドリマーは、アミノ酸サブユニット約10〜約100個を含む。別の態様において、本発明のデンドリマーは、アミノ酸サブユニット約10〜約75個を含む。別の態様において、本発明のデンドリマーは、アミノ酸サブユニット約10〜約50個（たとえば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、または50サブユニット）を含む。
【００７４】
特定の態様において、デンドリマーは硫黄含有デンドリマー（すなわち、1つまたは複数の硫黄原子を含む）である。たとえば硫黄含有デンドリマーは、末端のチオール基で終了する分岐を含んでもよい。1つの態様において、デンドリマーは1つまたは複数の末端チオールを含む。好ましくはデンドリマーは、末端チオール1〜20個（たとえば、末端チオール2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30 個）を含む。より好ましくは、デンドリマーは、末端チオール16個を含む。例示的な硫黄含有デンドリマーを図39において描写する。
【００７５】
他の態様において、デンドリマーは、遊離のアミン基（たとえば、一級アミンまたは二級アミン）で終了する分岐を含む。1つの態様において、デンドリマーは1つまたは複数の末端一級アミンを含む。好ましくは、デンドリマーは、末端の一級アミン1〜20個（たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれより多い末端の一級アミン）を含む。より好ましくは、デンドリマーは、末端の一級アミン16個を含む。別の態様において、デンドリマーは60個またはそれより多い末端の一級アミンを含む（LDG5、図40を参照されたい）。
【００７６】
別の態様において、デンドリマーは1つまたは複数の末端二級アミンを含む。好ましくは、デンドリマーは、末端の二級アミン1〜20個（たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の末端の二級アミン）を含む。別の態様において、デンドリマーは32個の末端の二級アミンを含む（SLDG4、図41を参照されたい）。別の態様において、デンドリマーは、64個の末端二級アミンを含む（SLDG5、図42を参照されたい）。
【００７７】
別の態様において、デンドリマーは、1つまたは複数の末端カルボキシレートを含む。好ましくは、デンドリマーは、末端のカルボキシレート1〜20個（たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の末端のカルボキシレート）を含む。別の態様において、デンドリマーは末端のカルボキシレート8個を含む。
【００７８】
多くのデンドリマーは市販されている。本発明のデンドリマーには以下が含まれるがこれらに限定されるわけではない：中でも、ポリリジンデンドリマー；ポリアミノアミン（PAMAM）PAMAM：アミン末端および/またはPAMAM：カルボン酸末端（たとえば、Dendritech, Inc., Midland, MIから入手可能）；ジアミノブタン（DAB）-DAB：アミノ末端および/またはDAB：カルボン酸末端；PEGs：OH末端（Frechet et al. JACS 123:5908 (2001)）。1つの態様において、ポリリジンデンドリマーまたはその変種を用いる。
【００７９】
1つの態様において、ナノ輸送体のコアはポリリジン世代1（「LDG1」）である。LDG1の例示的な合成を図4Aに示す。別の態様において、ナノ輸送体のコアはポリリジン世代2（「LDG2」）である。LDG2の例示的な合成を図4Bに示す。さらに他の態様において、デンドリマーは高分子量デンドリマーである。たとえば、別の態様において、ナノ輸送体のコアはポリリジン世代1（「LDG3」）である。LDG3の例示的な合成を図4Cに示す。さらに別の態様において、ナノ輸送体のコアはポリリジンデンドリマー世代4（「LDG4」）である。LDG4の例示的な合成を図4Dに示す。
【００８０】
別の態様において、ナノ輸送体のコアは、低分子量ポリリジンデンドリマーを含むナノ粒子である。図5は低分子量ポリリジンデンドリマーの合成の例示的なスキームを描写する。
【００８１】
b）官能表面基
本発明の1つの局面において、様々な官能表面基をナノ輸送体のコアに共役させることができる。本明細書において用いられる「官能表面基」という用語は、コアに結合すると、ナノ輸送体の官能性を増加させる、たとえば細胞ターゲティング特異性を増加させる、標的細胞に対するナノ輸送体の送達を増加させる、および/または正確な生物機能を付与する分子を指す。本発明の官能表面基の例には、糖質、脂質、脂肪酸および誘導体、蛍光および電荷制御分子、ならびに細胞型特異的ターゲティング部分が含まれるがこれらに限定されるわけではない。図2は、多数の官能表面基が付着したナノ輸送体送達装置の図を描写する。本発明において、1つのタイプの官能表面基または多数のタイプの官能表面基がナノ輸送体のコアの表面上に存在してもよい。その上、同じまたは異なるタイプの多数の官能表面基（たとえば、脂質）がナノ輸送体のコアの表面に存在してもよい（たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100個またはそれより多い官能表面基）。好ましい態様において、6個または7個の官能表面基（たとえば、6個または7個のオレオイル脂質）を使用する。
【００８２】
i）脂質官能表面基
1つの態様において、官能表面基は脂質である。脂質は、脂肪酸、ロウ、グリセロールおよびトリアシルグリセロール、リン脂質、ならびにコレステロールが含まれる生体分子の主要なクラスである。いずれかの特定の理論に縛られることを望むわけではないが、ナノ輸送体のコアに脂質を付加すると、標的細胞に核酸分子または薬学的物質を送達するナノ輸送体の能力が増加すると考えられる。1つの態様において、脂質は長鎖脂肪酸（たとえば、オレオイル誘導体、たとえば図6Aを参照されたい、またはオレオイル酸誘導体、たとえば図7を参照されたい）である。別の態様において、脂質はポリエチレングリコール（PEG）誘導体である（たとえば図6Bを参照されたい）。別の態様において、脂質は、脂質官能表面基として用いるためのコレステロール誘導体（たとえば、図6C）である。たとえば、本発明のナノ輸送体は、コレステロール基1、2、3、もしくは4個を含んでもよく（たとえば図43を参照されたい）、または脂質基1、2、3、4、5、6、7、または8個と組み合わせたコレステロール基1、2、3もしくは4個を含んでもよい（たとえば、図44を参照されたい）。別の例示的な態様において、ナノ輸送体は、脂質1〜10個（たとえば、7個）、および末端の一級アミン1〜50個（たとえば、24個）と共にPEG基1〜10個（たとえば、脂質基4個）を含んでもよい（図49Aを参照されたい）。別の例示的な態様において、ナノ輸送体は、末端のカルボキシレート1〜10個（たとえば、8個）、および末端の一級アミン1〜50個（たとえば、17個）と共に、脂質基1〜10個（たとえば、脂質基7個）を含んでもよい（図49Bを参照されたい）。
【００８３】
本発明はまた、様々な脂質官能表面基の合成にも向けられる。本発明の脂質官能表面基は、当技術分野で一般的に公知の方法に従って調製することができる。1つの態様において、脂質官能表面基は図6A〜Cにおいて示される方法に従って調製される。図7は、本発明において用いられる別の脂質官能表面基であるオレオイル酸誘導体の合成を示す。1つの態様において、この鎖はナノ輸送体のコアに直接付着する。この鎖はまた、核酸分子または薬学的物質に直接付着してもよい。
【００８４】
脂質官能表面基を、低分子量ナノ粒子、たとえばデンドリマーに共役させることができる。低分子量ナノ粒子に共役させた脂質官能表面基の非制限的な例は、図5に認められうる。
【００８５】
当技術分野において公知の全ての脂質を、脂質官能表面基を作製するために用いることができると理解される。たとえば、陽イオン脂質、中性リン脂質、または負荷電脂質を用いてもよい。本発明の化合物と組み合わせることができる適切な陽イオン脂質種には、1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン（DOTAP）；N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、または他のN-(N,N-1-ジアルコキシ)-アルキル-N,N,N-トリ置換アンモニウム界面活性剤；トリメチルアンモニウム基がブタノイルスペーサーアームを通して、二本鎖（DOTBの場合）またはコレステロール基（ChOTBの場合）に接続している、1,2-ジオレオイル-3-(4'-トリメチルアンモニオ)ブタノイル-sn-グリセロール（DOBT）またはコレステロール(4'-トリメチルアンモニア)ブタノエート（ChOTB）；WO 93/03709において開示されている、DORI（DL-1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシエチルアンモニウム）またはDORIE（DL-1,2-O-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシエチルアンモニウム）（DORIE）、またはその類似体；1,2-ジオレオイル-3-スクシニル-sn-グリセロールコリンエステル（DOSC）；コレステロールヘミスクシネートエステル（ChOSC）；ドクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（DPPES）のようなリポポリアミン、またはU.S. Pat. No. 5,283,185において開示される陽イオン脂質；コレステロール-3β-カルボキシアミド-エチレントリメチルアンモニウムヨウ化物、1-ジメチルアミノ-3-トリメチルアンモニオ-DL-2-プロピルコレステロールカルボキシレートヨウ化物、コレステロール-3β-カルボキシアミドエチレンアミン、コレステロール-3β-オキシスクシナミドエチレントリメチルアンモニウムヨウ化物、1-ジメチルアミノ-3-トリメチルアンモニオ-DL-2-プロピル-コレステロール-3β-オキシスクシネートヨウ化物、2-[(2-トリメチルアンモニオ)-エチルメチルアミノ]エチル-コレステロール-3β-オキシスクシネートヨウ化物、3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]-コレステロール（DC-chol）、および3β-[N-(ポリエチレンイミン)-カルバモイル]コレステロールが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００８６】
他の例示的な陽イオン脂質には、コレステロール-3β-カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウムヨウ化物、1-ジメチルアミノ-3-トリメチルアンモニオ-DL-2-プロピル-コレステロールカルボキシレートヨウ化物、コレステロール-3β-カルボキシアミドエチレンアミン、コレステロール-3β-オキシスクシナミドエチレントリメチルアンモニウムヨウ化物、1-ジメチルアミノ-3-トリメチルアンモニオ-DL-2-プロピル-コレステロール-3β-オキシスクシネートヨウ化物、2-[(2-トリメチルアンモニオ)エチルメチルアミノ]-エチル-コレステロール-3β-オキシスクシネートヨウ化物、3β[N-(N',N'ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]-コレステロール（DC-chol）、および3β[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]-コレステロールが含まれる。
【００８７】
陽イオン脂質のほかに、他の脂質を使用してもよい。これらの脂質には、リゾホスファチジルコリン（1-オレオイルリゾホスファチジルコリン）がその例であるリゾ脂質、コレステロール、または、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）もしくはジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）を含む中性リン脂質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。適切な負荷電脂質種には、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジン酸、または類似のリン脂質類似体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００８８】
ii）色素
本発明の別の態様において、ナノ輸送体コアに付着した官能表面基は色素である。1つの態様に従って、色素はナノ輸送体が結合する位置で容易な検出を提供するための標識として作用する。本発明において用いるための色素は当技術分野において一般的に公知である。好ましい色素には、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミンレッド、およびオレゴングリーン514が含まれるがこれらに限定されるわけではない。蛍光色素の例は、Molecular Probes Catalog, 6th Ed., Richard Haugland, Edにおいて見いだされる。本発明の色素は、単独で、または1つもしくは複数の他の官能表面基と併用してコアに共役してもよい。
【００８９】
1つの態様において、脂質官能表面基および色素は、ナノ輸送体のコアに共役される。脂質官能表面基と色素とを、ナノ輸送体のコアに同時に共役させることができる。別の態様において、脂質官能表面基と脂質とは、ナノ輸送体のコアに連続的に付加される、たとえば脂質官能表面基または色素のいずれかを最初に共役させた後、他方をナノ輸送体のコアに共役させる。
【００９０】
図9は、脂質官能表面基および色素の双方がナノ輸送体のコアに共役している例示的なナノ輸送体を示す。図10は、ナノ粒子コア、脂質官能表面基、および色素を含む他の2つの例示的なナノ輸送体を示す。
【００９１】
iv）細胞型特異的ターゲティング部分
別の態様において、官能表面基は、細胞型特異的ターゲティング部分を含む。細胞型特異的ターゲティング部分を用いることによって、ナノ輸送体複合体を、異なる細胞型において識別することができる。したがって、細胞型特異的ターゲティング部分をナノ輸送体に付加することによって、ナノ輸送体に正確な生物機能を付与することができる。
【００９２】
多数の細胞型特異的ターゲティング部分が当技術分野において公知である。ターゲティング部分は、タンパク質、ペプチド、糖質、糖タンパク質、低分子、金属等であってもよい。ターゲティング部分は特異的細胞または組織を標的とするために用いてもよい。ターゲティング部分の例には、肺癌細胞特異的ペプチドTP H1299.1（Zhao, X, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15656）、肺腺癌細胞特異的ペプチドTP H2009.1（Oyama, T., et al., Cancer Lett., 2003, 202, 219）、および内皮細胞ターゲティングペプチドCNGRC（Arap, et. al., Science 1998, 279:377）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。そのようなターゲティング部分は、たとえば図12において認められうるように、MBHA樹脂を用いることによって、当技術分野において公知の方法を用いて合成することができる。
【００９３】
次に、細胞特異的ターゲティング部分を核酸分子、たとえばsiRNA、または薬学的物質に直接共役させることができる。図13は、肺細胞特異的ペプチドに対するsiRNAの共役を示す。同様に、この方法を用いてナノ輸送体のコアにペプチドを共役させることができる。
【００９４】
たとえば、図11において認められうるように、環状CNGRCをナノ輸送体、たとえばLDG4のコアに共役させることができる。さらに、脂質官能基、たとえばオレオイル誘導体をナノ輸送体のコアに共役させる。核酸分子は、標的細胞、たとえば内皮細胞に送達するためにナノ輸送体に共役する。このナノ輸送体の合成を図14において示す。本発明のナノ輸送体はさらに、核酸分子、たとえばsiRNAおよび/または薬学的物質を癌細胞に送達するために用いることができる。
【００９５】
1つの態様において、細胞型特異的ターゲティング部分は、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に対して特異的である（たとえば、トランスポータン、ペネトラチン、またはTatペプチド）。Tatペプチドによって官能化したLDG4コアを含む本発明の例示的なナノ輸送体を図47に示す。
【００９６】
v）電荷制御分子
別の態様において、官能表面基は電荷制御分子を含む。本明細書において用いられるように「電荷制御分子」とは、ナノ輸送体の全体的なイオン環境または実効電荷に関与する分子を指す。1つの態様において、電荷制御分子を加えることによって、ナノ輸送体とsiRNA分子との会合および送達複合体の形成が促進される。別の態様において、電荷制御分子を加えることによって、細胞への送達複合体の細胞内取り込みの改善が促進される。特定の態様において、電荷制御分子を、図37Aの式Iaにおいて示されるようにナノ輸送体に付着させ、それによって式Ibの改変ナノ輸送体を形成することができ、式中、nはナノ輸送体の表面に付着した脂質基の数であり、mは電荷制御分子またはナノ輸送体の実効電荷の数であり、およびRは電荷制御分子である。本発明のナノ輸送体と共に用いられる例示的な電荷制御分子を図37Bに示す。特定の態様において、電荷制御分子は同じ化学構造またはクラスである。他の態様において、mが1より大きい場合、異なる化学構造またはクラスの電荷制御分子の任意の組みあわせを用いてもよい。好ましい電荷制御分子は、H-Lys-OMeである。H-Lys-OMeによるナノ輸送体の例示的な改変を、図38に描写する。
【００９７】
改変ナノ輸送体の実効電荷（m）および/または脂質基の数は、標的とされる組織に応じて変化してもよい。1つの態様において、mによって正の実効電荷が得られる。別の態様において、mは正負電荷である。他の態様において、mは中性の実効電荷である。別の態様において、mは50未満の正の整数である（たとえば、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1）。別の態様において、nは50未満の正の整数である（たとえば、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1）。前記の脂質の任意の組み合わせを電荷制御分子の任意の組み合わせと共に使用してもよいと認識される。
【００９８】
vi）糖質
別の態様において、官能表面基は糖質を含む。1つの態様において、糖質は単糖類（たとえば、アルドース、ケトース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、アルドヘキソース、ケトペントース。アロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、エリスルロース、フルクトース、グルコサミン、リボース、ラムノース、ガラクトサミン、N-アセチルムラミン酸、N-アセチルムラミン酸、フコース等）である。別の態様において、糖質は多糖類（たとえば、ホモ多糖類（たとえば、セルロース）、またはヘテロ多糖類）である。別の態様において、糖質は二糖類（たとえば、蔗糖、乳糖、麦芽糖、セロビオース等）である。単糖類の任意のエピマーまたは他の立体異性体（たとえば、LまたはD異性体）を使用してもよい。例示的な糖質含有ナノ輸送体の合成は、二糖類9個（たとえば、HB-M9LD、図44を参照されたい）または二糖類26個（たとえば、HB-MLD、図44を参照されたい）を含んでもよい。
【００９９】
III．核酸分子
1つの態様において、核酸分子はナノ輸送体を通して標的細胞に送達される。本明細書において用いられる「核酸分子」という用語は、5'および3'の炭素原子の間のホスホジエステル連結によって共に接合されたヌクレオチドのポリマーを指す。核酸分子は一般的に当技術分野において公知であり、これには、RNAサイレンシング物質（たとえば、siRNA、化学改変siRNA、RNAi物質、miRNA、およびshRNA）、アンチセンス分子、リボザイム等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１００】
（a）RNAサイレンシング物質
特定の態様において、本発明は、RNAサイレンシング物質（たとえば、siRNAおよびshRNA）を特色とする。本発明のRNAサイレンシング物質は、センス鎖と相補的アンチセンス鎖（またはその一部）を含む二重鎖分子（または二重鎖構造を有する分子）であり、アンチセンス鎖はRNAサイレンシング機構（たとえば、RNAiまたは翻訳抑制）を媒介するために標的配列（たとえば、標的mRNA）と十分な相補性を有する。
【０１０１】
i）siRNA分子の設計
siRNA分子は、センス鎖と相補的なアンチセンス鎖とからなる二本鎖であり、アンチセンス鎖は本明細書において定義されるように、標的特異的RNA干渉（RNAi）を指示するために標的mRNA配列に対して十分な相補性を有し、すなわちsiRNAはRNAi機構またはプロセスによって標的mRNAの破壊を誘発するために十分な配列を有する。代わりの態様において、siRNAのアンチセンス鎖は、標的mRNAの翻訳抑制を指示するために標的mRNA配列に対して十分な相補性を有する。
【０１０２】
好ましくは、siRNAは約5〜60（たとえば、約10〜50）ヌクレオチド長であるかそれを上回り、すなわちそれぞれの鎖は5〜60（たとえば、10〜50）ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。より好ましくは、siRNA分子は、それぞれの鎖の長さが約16〜30、たとえば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）であり、鎖の1つは、標的領域と十分な相補性を有する。他の態様において、siRNAの長さはより短いかより長くてもよい。1つの態様において、siRNAは、それぞれの鎖の長さが約5〜15のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体（たとえば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチド）であり、鎖の1つは、標的領域に対して十分に相補的である。別の態様において、siRNAは長さ約30〜60のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体（たとえば、それぞれの鎖において35、40、45、50、55、または60ヌクレオチド、鎖の1つは標的領域に対して十分に相補的である）を有する。好ましくは鎖は、鎖の末端に塩基少なくとも1、2、または3個（例えば1〜5塩基）が存在するように整列するが、これは、鎖をアニーリングした場合に二重鎖の一方または双方の末端で残基1、2、または3個のオーバーハングが生じるように整列するわけではない（すなわち、それに対して相補的な塩基が反対鎖に存在しない）。特に好ましい態様において、二重鎖の少なくとも1つ（好ましくは双方の）の末端は、2ヌクレオチドのオーバーハング（たとえば、dTdTオーバーハング）を含む。
【０１０３】
一般的に、siRNAはたとえば以下のプロトコールを用いることによって、当技術分野において公知の任意の方法を用いて設計することができる。
【０１０４】
1．標的mRNAを選択して、該標的mRNA内に1つまたは複数の標的部位を同定する。これらの部位におけるmRNAの切断によって、mRNAの分解が起こり、対応するタンパク質の産生を防止する。変異体遺伝子の他の領域からの多形も同様に、ターゲティングに適している。
【０１０５】
好ましい態様において、標的配列はAAジヌクレオチド配列を含み；それぞれのAAおよび3'隣接の16個またはそれより多いヌクレオチドはおそらくsiRNA標的である。別の好ましい態様において、核酸分子は、たとえば標的mRNAの配列の開始コドンの少なくとも50〜100ヌクレオチド下流で始まる標的mRNA配列の領域から選択される。さらに、より低いG/C含有量（35〜55％）を有するsiRNAは55％より高いG/C含有量を有するsiRNAより活性が高い可能性がある。このように、1つの態様において、本発明には35〜55％のG/C含有量を有する標的配列が含まれるが、本発明はこの点に限定されない。
【０１０６】
2．siRNAのセンス鎖は、選択された標的部位の配列に基づいて設計される。好ましくは、センス鎖には、約19〜25ヌクレオチド、たとえば19、20、21、22、23、24 、または25ヌクレオチドが含まれる。より好ましくは、センス鎖には21、22、または23ヌクレオチドが含まれる。しかし、当業者は、長さ19ヌクレオチド未満または25ヌクレオチドより長いsiRNAも同様にRNAiを媒介するために機能しうることを認識するであろう。したがって、そのような長さのsiRNAもまたそれらがRNAiの媒介能を保持する限り、本発明の範囲に含まれる。より長いRNAi物質は、特定の哺乳動物細胞においてインターフェロンまたはPKR反応を誘発することが証明されているが、これらは望ましくない可能性がある。好ましくは、本発明のRNAi物質は、PKR反応を誘発しない（すなわち、十分に短い長さである）。しかし、より長いRNAi物質はたとえばPRK反応を生成することができない細胞型において、またはPKR反応が別の手段によってダウンレギュレートされたか低下した状況において有用となる可能性がある。
【０１０７】
本発明のsiRNA分子は、siRNAがRNAiを媒介することができるように標的部位と十分な相補性を有する。一般的に、標的遺伝子のRISC媒介切断をもたらすために標的遺伝子の一部と十分に同一であるヌクレオチド配列を含有するsiRNAが好ましい。したがって、好ましい態様において、siRNAのセンス鎖は、標的の一部と十分に同一である配列を有するように設計される。たとえば、センス鎖は標的部位に対して100％同一性を有してもよい。しかし、100％同一性は必要ない。80％より大きい同一性、たとえばセンス鎖と標的RNA配列との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％程度の同一性が好ましい。本発明は、RNAiの効率および特異性を増強するために特定の配列変化を認容することができるという長所を有する。1つの態様において、センス鎖は標的領域と4、3、2、1、または0個のミスマッチヌクレオチドを有し、他の鎖は第一の鎖と同一または実質的に同一である。その上、ヌクレオチド1個または2個の小さな挿入または欠失を有するsiRNA配列も同様に、RNAiを媒介するために有効となる可能性がある。または、ヌクレオチド類似体の置換または挿入を有するsiRNA配列は、阻害にとって有効となりうる。
【０１０８】
配列同一性は、配列比較および当技術分野において公知のアラインメントアルゴリズムによって決定される可能性がある。2つの核酸配列（または2つのアミノ酸配列）の％同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（たとえば、最適なアラインメントのために第一の配列または第二の配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置でのヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を比較する。第一の配列における位置が第二の配列における対応する位置と同じ残基で占有される場合、分子はその位置で同一である。2つの配列間の％同一性は、任意で、導入されたギャップの数および/または導入されたギャップの長さに関するスコアのペナルティを課した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一の位置の数/位置の総数×100）。
【０１０９】
2つの配列間の配列の比較および％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。1つの態様において、整列された配列の十分な同一性を有する一定部分に対してアラインメントを作成し、低い程度の同一性を有する部分に対しては作成しない（すなわち、局所的アラインメント）。配列の比較のために利用される局所的アラインメントアルゴリズムの好ましい非制限的な例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み入れられている。
【０１１０】
別の態様において、アラインメントは、適当なギャップを導入することによって最適化され、％同一性は整列させた配列の長さにわたって決定される（すなわち、ギャップありのアラインメント）。比較目的のためにギャップありのアラインメントを得るために、Altschul el al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402において記載されるようにギャップありBLASTを利用することができる。別の態様において、適当なギャップを導入することによってアラインメントを最適化して、整列された配列の全長にわたって％同一性を決定する（すなわち、大域的アラインメント）。配列の大域的比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いることができる。
【０１１１】
3．アンチセンス鎖配列は、所望の標的切断部位に対応するヌクレオチドが本質的に鎖の中央であるように設計される。たとえば、21ヌクレオチドのsiRNAを選択する場合、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、たとえばセンス鎖の5'末端から6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16位（すなわち、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16位）のヌクレオチドに存在する。22ヌクレオチドのsiRNAの場合、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、たとえば7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16位に存在する。23ヌクレオチドのsiRNAの場合、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、たとえば7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16位に存在する。24ヌクレオチドのsiRNAの場合、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、たとえば9、10、11、12、13、14、または16位に存在する。25ヌクレオチドのsiRNAの場合、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、たとえば9、10、11、12、13、14、15、16、または17位に存在する。中心から外れた位置に対応するヌクレオチドを移動させることは、いくつかの場合において、siRNAによる切断効率を低減させる可能性がある。そのような組成物、すなわちあまり効率的でない組成物は、第二の（非標的）mRNAのオフサイレンシングが検出される場合には用いることが望ましい可能性がある。
【０１１２】
センス鎖は、siRNAのアンチセンス鎖とセンス鎖との間に相補性が存在するように設計される。例示的な態様において、siRNAは、鎖がsiRNAの1つの末端または双方の末端でオーバーハング末端、たとえばヌクレオチド1、2、3、4、5個またはそれより多いオーバーハングを有するように設計される。例示的なオーバーハングは、デオキシヌクレオチドオーバーハング、たとえばdTdTテールである。
【０１１３】
4．siRNAのアンチセンスまたはガイド鎖は、ルーチンとしてセンス鎖と同じ長さであり、相補的ヌクレオチドが含まれる。1つの態様において、ガイドおよびセンス鎖は完全に相補的であり、すなわち整列またはアニーリングした場合に鎖は平滑末端である。別の態様において、siRNAの鎖は、1〜4ヌクレオチド、たとえば2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有するように対を形成することができる。オーバーハングは、標的遺伝子配列（またはその相補体）に対応するヌクレオチドを含みうる（またはそれから構成されうる）。または、オーバーハングはデオキシリボヌクレオチド、たとえばdT、ヌクレオチド類似体、または他の適切な非ヌクレオチド材料を含みうる（またはそれから構成されうる）。このように、別の態様において、核酸分子はTTのような2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有してもよい。オーバーハングヌクレオチドはRNAまたはDNAのいずれであってもよい。
【０１１４】
5．当技術分野における任意の方法を用いて、可能性がある標的を適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）と比較して、他のコード配列と有意な相同性を有する任意の標的配列を検討から除外する。そのような配列相同性検索の1つの方法は、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトで入手可能なBLASTとして知られる。
【０１１５】
6．評価のために基準に合致する1つまたは複数の配列を選択する。siRNAの設計および使用に関するさらなる全般的情報は、The Max-Plank-Institut fur Biophysikalishe Chemieのウェブサイトにおいて入手可能な「The siRNA User Guide」において認められよう。
【０１１６】
または、siRNAは、標的配列とハイブリダイズ（たとえば、400 mM NaCl、40 mM PIPES pH 6.4、1 mM EDTA、50℃または70℃で12〜16時間のハイブリダイゼーションの後に洗浄）することができるヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）を有するアンチセンスまたはガイド鎖として機能的に定義される可能性がある。さらに好ましいハイブリダイゼーション条件には、1×SSCにおいて70℃もしくは1×SSCにおいて50℃、50％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションの後に、0.3×SSCにおいて70℃での洗浄、または4×SSCにおいて70℃もしくは4×SSCにおいて50℃、50％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションの後に、1×SSCで67℃での洗浄が含まれる。長さが50塩基対未満であると予想されるハイブリッドに関するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Tm）より5〜10℃低くなければならず、Tmは以下の等式に従って決定される。長さが18塩基対未満のハイブリッドに関して、Tm（℃）＝2(A + T残基の数)＋4(G + C残基の数)である。長さが18〜49塩基対のハイブリッドに関して、Tm（℃）＝81.5 + 16.6(log10[Na+])＋0.41(％G＋C)−(600/N)であり、式中Nはハイブリッドにおける塩基の数であり、[Na+]はハイブリダイゼーション緩衝液におけるナトリウムイオンの濃度である（1×SSCに関して[Na+]＝0.165 M）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー条件のさらなる例は、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4において提供される。
【０１１７】
陰性対照siRNAは、選択されたsiRNAと同じヌクレオチド組成を有するが、適当なゲノムに対して有意な配列相補性を有しない。そのような陰性対照は、選択されたsiRNAのヌクレオチド配列のランダムスクランブリングによって設計してもよい；陰性対照が、適当なゲノムにおいて任意の他の遺伝子に対して相同性を確実に欠損するように、相同性検索を行うことができる。さらに、陰性対照siRNAは、有意な数の塩基ミスマッチを配列に導入することによって設計することができる。
【０１１８】
7．siRNAが変異体mRNA（たとえば、変異体huntingtin mRNA）を破壊する有効性を確認するために、ショウジョウバエに基づくインビトロmRNA発現系において、siRNAを変異体cDNA（たとえば、変異体huntingtin cDNA）と共にインキュベートしてもよい。32Pによって放射標識すると、新たに合成された変異体mRNA（たとえば、変異体huntingtin mRNA）は、アガロースゲルにおいてオートラジオグラフィーによって検出される。切断された変異体mRNAの存在は、mRNAヌクレアーゼ活性を示す。適切な対照には、siRNAを除去したものが含まれる。または、対照siRNAは先に記載されたように利用される。
【０１１９】
ii）miRNA
miRNAは、植物および動物の発達の際に転写後または翻訳後レベルで遺伝子発現を調節することができる約22ヌクレオチドの非コードRNAである。miRNAの1つの共通の特色とは、それらが全てプレmiRNAと呼ばれる約70ヌクレオチドの前駆体RNAステムループから、おそらくDicer、RNアーゼIII型酵素、またはその相同体によって切り出されることである。
【０１２０】
miRNA配列は、任意の天然に存在するmiRNAの配列と類似または同一となりうる（たとえば、The miRNA Registry; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004を参照されたい）。1000個を超える天然のmiRNAが今日まで同定されており、同時にそれらはゲノムにおいて予想される遺伝子全体の〜1％を含むと考えられている。多くの天然のmiRNAがプレmRNAのイントロンにおいて共にクラスタを形成しており、相同性に基づく検索（Pasquinelli et al., 2000；Lagos-Quintana et al., 2001；Lau et al., 2001；Lee and Ambros, 2001）、またはプリmiRNAのステムループ構造を形成する候補miRNA遺伝子の能力を予測するコンピューターアルゴリズム（たとえば、MiRScan、MiRSeeker）（Grad et al., Mol. Cell, 2003；Lim et al., Genes Dev., 2003；Lim et al., Science, 2003；Lai EC et al., Genome Bio., 2003）を用いてインシリコで同定することができる。オンライン登録により、公表された全てのmiRNA配列の検索可能なデータベースが提供される（The miRNA Registry at the Sanger Institute website; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004）。例示的な天然のmiRNAには、lin-4、let-7、miR-10、mirR-15、miR-16、miR-168、miR-175、miR-196、およびその相同体と共に、PCT国際公開番号WO 03/029459において記載されるショウジョウバエ、シーエレガンス、ゼブラフィッシュ、シロイヌナズナ（Arabidopsis thalania）、マウス、およびラットを含むヒトおよび特定のモデル生物からの他の天然のmiRNAが含まれる。
【０１２１】
天然に存在するmiRNAはインビボで内因性の遺伝子によって発現され、ヘアピンまたはステムループ前駆体（プレmiRNAまたはプリmiRNA）からDicerまたは他のRNアーゼによってプロセシングされる（Lagos-Quintana et al., Science, 2001；Lau et al., Science, 2001；Lee and Ambros, Science, 2001；Lagos-Quintana et al.,Curr. Biol., 2002；Mourelatos et al., Genes Dev., 2002；Reinhart et al., Science, 2002；Ambros et al., Curr. Biol., 2003；Brennecke et al., 2003；Lagos-Quintana et al., RNA, 2003；Lim et al., Genes Dev., 2003；Lim et al., Science, 2003）。miRNAは、二本鎖の二重鎖としてインビボで一過性に存在しうるが、遺伝子サイレンシングを指示するために1つの鎖のみがRISC複合体によって取り込まれる。特定のmiRNA、たとえば植物miRNAはその標的mRNAに対して完全なまたはほぼ完全な相補性を有し、したがって標的mRNAの切断を指示する。他のmiRNAはその標的mRNAに対して完全より低い相補性を有し、したがって、標的mRNAの翻訳抑制を指示する。miRNAとその標的mRNAとの相補性の程度が、その作用機序を決定すると考えられている。たとえば、miRNAとその標的mRNAとの間の完全またはほぼ完全な相補性により切断機構が予測されるが（Yekta et al., Science, 2004）、完全より低い相補性により翻訳抑制機構が予測される。特定の態様において、miRNA配列は、その異常な発現または活性がmiRNA障害に相関する、天然に存在するmiRNA配列の配列である。
【０１２２】
天然に存在するmiRNA前駆体（プレmiRNA）は、一般的に相補的である2つの部分を含む二重鎖ステム、およびステムの2つの部分を接続するループを形成する一本鎖を有する。典型的なプレmiRNAにおいて、ステムには1つまたは複数の隆起部分、たとえばステムの1つの部分において1ヌクレオチド「ループ」を作製する余分のヌクレオチド、および/またはステムの2つの部分と互いのハイブリダイゼーションにおいてギャップを作製する1つまたは複数の対形成していないヌクレオチドが含まれる。本発明の低分子ヘアピンRNA、または操作されたRNA前駆体は、これらの天然に存在するプレmiRNAに基づくが、所望のRNAi物質（たとえば、本発明のsiRNA）を送達するように操作された人工構築物である。プレmiRNAのステム配列を標的mRNAと相補的な配列に置換することによって、shRNAが形成される。shRNAは細胞の全遺伝子サイレンシング経路によってプロセシングされて、それによってRNAiを効率的に媒介する。
【０１２３】
標的遺伝子の翻訳抑制による転写後遺伝子サイレンシングが望ましい態様において、miRNA配列は標的遺伝子配列と部分的相補性を有する。特定の態様において、miRNA配列は、標的mRNA内（たとえば、標的mRNAの3'-UTR内）に分散する1つまたは複数の短い配列（相補性部位）と部分的相補性を有する（Hutvagner and Zamore, Science, 2002；Zeng et al., Mol. Cell, 2002；Zeng et al., RNA, 2003；Doench et al., Genes & Dev., 2003）。翻訳抑制の機構は協調的であることから、多数の相補性部位（たとえば、2、3、4、5、または6個）が特定の態様においてターゲティングされる可能性がある。
【０１２４】
iii）siRNA様分子
本発明のsiRNA様分子は、RNAiまたは翻訳抑制のいずれかによって遺伝子サイレンシングを指示するために標的mRNA配列と「十分に相補的」である配列を有する（すなわち配列を有する鎖を有する）。siRNA様分子は、siRNA分子と同じように設計されるが、センス鎖と標的RNAとの配列同一性の程度はmiRNAとその標的の間で観察される同一性の程度に近似する。一般的に、miRNA配列と対応する標的遺伝子配列の間の配列同一性の程度が減少すると、RNAiよりむしろ翻訳抑制によって転写後遺伝子サイレンシングを媒介する傾向が増加する。
【０１２５】
siRNA様二重鎖がRNAiまたは翻訳抑制を媒介する能力は、標的遺伝子配列と相補性部位でのサイレンシング物質のヌクレオチド配列との間の非同一ヌクレオチドの分布によって予測される可能性がある。1つの態様において、翻訳抑制による遺伝子サイレンシングが望ましい場合、ガイド鎖と標的mRNAとによって形成された二重鎖が中心の「隆起部分」を含有するように、少なくとも1つの非同一ヌクレオチドが相補性部位の中心位置に存在する（Doench JG et al., Genes & Dev., 2003）。別の態様において、2、3、4、5、または6個の隣接または非隣接の非同一ヌクレオチドが導入される。非同一ヌクレオチドは、それがウォブル塩基対（たとえば、G：U）またはミスマッチ塩基対（G：A、C：A、C：U、G：G、A：A、C：C、U：U）を形成するように選択されてもよい。さらに好ましい態様において、「隆起部分」は、siRNA様分子の5'末端から12位および13位のヌクレオチドに中心が存在する。
【０１２６】
iv）低分子ヘアピンRNA（shRNA）分子
特定の特色を有する態様において、本発明は、選択性が増強された標的配列（たとえば、標的mRNA）のRNAサイレンシングを媒介することができるshRNAを提供する。siRNAとは対照的に、shRNAはミクロRNA（miRNA）の天然の前駆体を模倣して、遺伝子サイレンシング経路の上部に入る。この理由から、shRNAは、天然の遺伝子サイレンシング経路全体の中に送られることによって、より効率的に遺伝子サイレンシングを媒介すると考えられている。
【０１２７】
shRNAの必須の要素には、二重鎖または二本鎖ステム部分を形成するようにアニーリングまたはハイブリダイズするために十分な相補性を有する第一の位置および第二の位置が含まれる。2つの部分は十分にまたは完全に相補的である必要はない。第一および第二の「ステム」位置は、shRNAの他の部分とアニーリングまたはハイブリダイズするためには不十分な配列相補性を有する配列を有する部分によって接続される。この後者の部分は、shRNA分子における「ループ」部分と呼ばれる。shRNA分子はプロセシングされて、siRNAを生成する。shRNAにはまた、1つまたは複数の隆起部分、すなわちステムの部分に小さいヌクレオチド「ループ」、たとえば1、2、または3つのヌクレオチドのループを作製する余分のヌクレオチドが含まれうる。ステム部分は同じ長さとなりうるか、または1つの部分に、たとえば1〜5ヌクレオチドのオーバーハングが含まれうる。オーバーハングヌクレオチドには、たとえばウラシル（U）、たとえば全てのUが含まれうる。そのようなUは特に、転写終了のシグナルを伝達するshRNAコードDNAにおけるチミジン（T）によってコードされる。
【０１２８】
本発明のshRNAにおいて、二重鎖ステムの1つの部分は、標的mRNAと相補的（またはアンチセンス）である核酸配列である。好ましくは、shRNAのステム部分の1つの鎖は、RNA干渉（RNAi）によって標的RNAの分解または切断を媒介するために標的RNA（たとえば、mRNA）配列と十分に相補的（たとえば、アンチセンス）である。このように、shRNAには、2つの部分を有する二重鎖ステムと、2つのステム部分を接続するループとが含まれる。アンチセンス部分は、ステムの5'または3'末端上に存在しうる。shRNAのステム部分は、好ましくは約15〜約50ヌクレオチド長である。好ましくは2つのステム部分は約18もしくは19ヌクレオチド長から約21、22、23、24、25、30、35、37、38、39、もしくは40ヌクレオチド長であり、またはそれを上回る。好ましい態様において、ステム部分の長さは21ヌクレオチドまたはそれより長くなるべきである。哺乳動物細胞において用いる場合、ステム部分の長さは、インターフェロン経路のような非特異的反応の誘発を回避するために約30ヌクレオチド未満であるべきである。非哺乳動物細胞において、ステムは30ヌクレオチドより長くなりうる。実際に、ステムには、標的mRNAと相補的なかなり大きい部分（最大で全mRNAおよび全mRNAを含む）が含まれうる。実際に、ステム部分には、標的mRNAと相補的なかなり大きい部分（最大で全mRNAおよび全mRNAを含む）が含まれうる。
【０１２９】
二重鎖ステムの2つの部分は、ハイブリダイズして二重鎖ステムを形成するために十分に相補的でなければならない。このように2つの部分は、十分にまたは完全に相補的となりうるが、その必要はない。さらに、2つのステム部分は、同じ長さとなりうるか、または1つの部分に1、2、3、もしくは4ヌクレオチドのオーバーハングが含まれうる。オーバーハングヌクレオチドには、たとえばウラシル（U）たとえば全てのUが含まれうる。shRNAにおけるループは、2、3、4、5、6、7、8、9ヌクレオチド長であるかまたはそれを上回り、たとえば15または20ヌクレオチド長でありうる。
【０１３０】
好ましいループは、「テトラループ」配列からなる、またはそれらを含む。例示的なテトラループ配列には、配列GNRA（式中、Nが任意のヌクレオチドであって、Rがプリンヌクレオチド、GGGG、およびUUUUである）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３１】
特定の態様において、本発明のshRNAには、前記の所望のsiRNA分子の配列が含まれるがこれらに限定されるわけではない。他の態様において、shRNAのアンチセンス部分の配列は、本質的に先に記載したとおりに、または一般的に標的RNA内から、たとえば翻訳開始の上流または下流の100〜200または300ヌクレオチドの領域から、18、19、20、21ヌクレオチドまたはそれより長い配列を選択することによって設計されうる。一般的に、配列は、5' UTR（非翻訳領域）、コード配列、または3' UTRを含む標的RNA（たとえば、mRNA）の任意の部分から選択することができる。この配列は任意で、2つの隣接するAAヌクレオチドを含有する標的遺伝子の領域の直後に続きうる。ヌクレオチド配列の最後の2つのヌクレオチドは、UUとなるように選択することができる。この21個程度のヌクレオチド配列を用いて、shRNAにおける二重鎖ステムの1つの部分を作製する。この配列は、たとえば酵素的に野生型プレmiRNA配列のステム部分を置換することができ、または合成される完全な配列に含められる。たとえば、野生型プレmiRNAから操作されたRNA前駆体構築物を構築するために制限酵素を用いて、たとえば、ステムループ操作RNA前駆体全体をコードする、または前駆体の二重鎖ステムに挿入される部分のみをコードするDNAオリゴヌクレオチドを合成することができる。
【０１３２】
操作されるRNA前駆体には、二重鎖ステムにおいて、インビボで産生されることが望ましいsiRNA、siRNA様二重鎖、またはmiRNAの21〜22個程度のヌクレオチド配列が含まれる。このように、操作されるRNA前駆体のステム部分には、その発現が低減または阻害される遺伝子のエキソン部分の配列に対応する少なくとも18または19ヌクレオチドの対が含まれる。ステムのこの領域に隣接する2つの3'ヌクレオチドは、操作されるRNA前駆体からのsiRNAの産生を最大限にするように、ならびにインビボおよびインビトロでRNAiによる翻訳抑制または破壊に関して対応するmRNAのターゲティングにおける得られたsiRNAの効力を最大限にするように選択される。
【０１３３】
特定の態様において、本発明のshRNAには、RISCへの流入を増強するためにmiRNA配列、任意で末端改変miRNA配列が含まれる。
【０１３４】
（v）二官能オリゴヌクレオチド係留体
他の態様において、本発明のRNAサイレンシング物質には、miRNAの細胞内動員にとって有用な二官能オリゴヌクレオチド係留体が含まれる。動物細胞は、広範囲のmiRNA、転写後または翻訳後レベルで遺伝子発現を調節することができる約22ヌクレオチドの非コードRNAを発現する。RISCに結合したmiRNAに結合してそれを標的mRNAに動員することによって、二官能オリゴヌクレオチド係留体は、たとえばアテローム性動脈硬化症プロセスに関係する遺伝子の発現を抑制することができる。オリゴヌクレオチド係留体を用いることはしばしば、特定の遺伝子の発現を抑制するために既存の技術に対していくつかの長所を提供する。第一に、本明細書に記載の方法によって、内因性の分子（豊富に存在することが多い）、miRNAがRNAサイレンシングを媒介することができ；したがって本明細書に記載の方法は、RNAサイレンシングを媒介するために外来分子（たとえば、siRNA）を導入する必要がない。第二にRNAサイレンシング物質、および特に連結部分（たとえば、2'-O-メチルオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド）を安定にして、ヌクレアーゼ活性に対して抵抗性にすることができる。その結果として、本発明の係留体を直接送達のために設計することができ、細胞内で所望の物質を作製するように設計された前駆体分子またはプラスミドを間接的に送達（たとえば、ウイルス）する必要性をなくすことができる。第三に、係留体およびそのそれぞれの部分は、特異的mRNA部位および特異的miRNAに適合するように設計することができる。設計は細胞および遺伝子産物特異的となりうる。第四に、本明細書に開示の方法によって、mRNAは無傷のままとなり、当業者は細胞自身の機構を用いて短いパルスでタンパク質合成を遮断することができる。その結果、これらのRNAサイレンシング法は非常に調節可能である。
【０１３５】
本発明の二官能オリゴヌクレオチド係留体（「係留体」）は、関心対象遺伝子の調節を誘導するために、それらがmiRNA（たとえば、内因性の細胞miRNA）を標的mRNAに動員するように設計される。好ましい態様において、係留体は式T−L−μを有し、式中TはmRNAターゲティング部分であり、Lは連結部分であり、およびμはmiRNA動員部分である。いかなる1つまたは複数の部分も二本鎖となりうる。しかし、好ましくはそれぞれの部分は一本鎖である。
【０１３６】
係留体内の部分は、式T−L−μにおいて描写されるように配置または連結させる（5'から3'方向に）ことができる（すなわち、ターゲティング部分の3'末端を連結部分の5'末端に連結して、連結部分の3'末端をmiRNA動員部分の5'末端に連結する）。または、該部分は係留体において以下のように配置または連結することができる：μ−T−L（すなわち、miRNA動員部分の3'末端を連結部分の5'末端に連結して、連結部分の3'末端をターゲティング部分の5'末端に連結する）。
【０１３７】
先に記載したように、mRNAターゲティング部分は、特異的標的mRNAを捕獲することができる。本発明に従って、標的mRNAの発現は望ましくなく、このようにmRNAの翻訳抑制が望ましい。mRNAターゲティング部分は、標的mRNAに有効に結合するために十分な大きさであるべきである。ターゲティング部分の長さは、部分的に標的mRNAの長さおよび標的mRNAとターゲティング部分との相補性の程度に応じて、大きく変化するであろう。様々な態様において、ターゲティング部分は、約200、100、50、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5ヌクレオチド長未満である。特定の態様において、ターゲティング部分は約15〜約25ヌクレオチド長である。
【０１３８】
先に記載したようにmiRNA動員部分は、miRNAと会合することができる。本発明に従って、miRNAは標的mRNAを抑制することができる任意のmiRNAであってもよい。哺乳動物は、250個を超える内因性のmiRNAを有すると報告されている（Lagos-Quintana et al. (2002) Current Biol. 12:735-739；Lagos-Quintana et al. (2001) Science 294:858-862；およびLim et al. (2003) Science 299: 1540）。様々な態様において、miRNAは当技術分野において認識される任意のmiRNAであってもよい。
【０１３９】
連結部分とは、ターゲティング部分の活性が維持されるようにターゲティング部分を連結することができる任意の物質である。連結部分は好ましくは、ターゲティング物質がそのそれぞれの標的と十分に相互作用することができるように十分数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド部分である。連結部分は、細胞mRNAまたはmiRNA配列とほとんどまたは全く配列相同性を有しない。例示的な連結部分には、1つまたは複数の2'-O-メチルヌクレオチド、たとえば2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルチミジン、2'-O-メチルグアノシン、または2'-O-メチルウリジンが含まれる。
【０１４０】
（b）識別的RNAサイレンシング物質
他の局面において、前記の任意のRNAサイレンシング物質は、それらが識別的RNAサイレンシングを行うことができるように設計されてもよい。たとえば、関連配列のRNAを識別するRNAサイレンシング物質（たとえば、siRNA）を設計してもよい。そのような物質は、標的mRNAをサイレンシングすることができるが（たとえば、疾患関連対立遺伝子多形に関連するmRNA）、関連する非標的mRNA（たとえば、疾患対立遺伝子に対応する野生型対立遺伝子に関連するmRNA）を実質的にサイレンシングすることができない。特定の態様において、識別RNAサイレンシングを行うことができるRNAサイレンシング物質は、標的mRNAにおいて対立遺伝子多形を有するワトソン-クリック塩基対を形成する（たとえば、一ヌクレオチド多形（SNP)）が、標的mRNA（たとえば、野生型）において対応するヌクレオチドとワトソン-クリック塩基対を形成せず、ミスマッチまたはウォブル塩基対を形成するヌクレオチドを含めることによって設計してもよい。たとえば、RNAサイレンシング物質は、ミスマッチ（たとえば、プリン：プリンミスマッチ）またはウォブルが、1つのヌクレオチドにおいてsiRNAと非標的mRNA（たとえば、野生型mRNA）との間に存在するように設計してもよい。群G：G、A：G、G：AおよびA：A対形成からプリン：プリン対形成が選択される。その上、1つのヌクレオチドでのsiRNAと標的mRNA（たとえば、変異体mRNA）との間のプリン：ピリミジン対形成は、1ヌクレオチド特異性を増強する。プリン：ピリミジン対形成は、たとえば群G：C、C：G、A：U、U：A、C：A、A：C、U：A、およびA：U対形成から選択される。
【０１４１】
他の態様において、RNAサイレンシング物質は、siRNAが多形を含むmRNAの対立遺伝子特異的切断を指示するように、対立遺伝子多形と反対に位置する改変塩基の導入によって、非標的mRNAと標的mRNAとを識別するように設計されてもよい。該方法は、参照により本明細書に組み入れられる、PCT国際公開番号WO 04/046324において記載されている。好ましい態様において、改変塩基は、5-ブロモ-ウリジン、5-ブロモ-シチジン、5-ヨード-ウリジン、5-ヨード-シチジン、2-アミノ-プリン、2-アミノ-アリル-プリン、6-アミノ-プリン、6-アミノ-アリル-プリン、2,6-ジアミノプリンおよび6-アミノ-8-ブロモ-プリンからなる群より選択される。例示的な態様において、改変塩基は、5-ブロモ-ウリジンまたは5-ヨード-ウリジンであり、たとえば点突然変異はアデニンである。別の例示的な態様において、改変塩基は2,6-ジアミノプリンであり、たとえば点突然変異はチミンである。
【０１４２】
（c）化学改変RNAサイレンシング物質
特定の局面において、本発明は新規RNAサイレンシング物質、たとえばセンス鎖とアンチセンス鎖とが含まれ、アンチセンス鎖が標的特異的RNA干渉（RNAi）を指示するために標的mRNA配列と十分に相補的な配列を有し、センス鎖および/またはアンチセンス鎖が化学改変ヌクレオチドによるヌクレオチドの置換によって改変されている、新規低分子干渉RNA（siRNA）を特色とする。1つの態様において、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は1つまたは複数の内部化学改変によって改変される。本明細書において定義されるように、「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端以外の任意の位置で起こるヌクレオチドである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内、または二重鎖もしくは二本鎖分子の鎖内で起こりうる。1つの態様において、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は5'末端および/または3'末端で改変される。1つの態様において、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、5'末端および3'末端の双方で改変される。本明細書において用いられる、5'または3'末端を参照して用いる場合の「末端で改変される」という用語は、最初と最後のヌクレオチドの10ヌクレオチド以内の任意のヌクレオチド、たとえば最初と最後のヌクレオチドの7ヌクレオチド以内の任意のヌクレオチドを指す。1つの態様において、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、少なくとも1つの内部ヌクレオチドの置換によって改変される。別の態様において、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個またはそれより多いヌクレオチドの置換によって改変される。別の態様において、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより多いヌクレオチドの置換によって改変される。さらに別の態様において、センス鎖および/またはアンチセンス鎖はヌクレオチドの全ての置換によって改変される。本発明の方法において使用されるRNAi物質において、1個程度少ないおよびオリゴヌクレオチドの全ヌクレオチド程度と多いヌクレオチドを改変することができる。いくつかの態様において、RNAi物質は、費用効果を維持しながら、所望のレベルのインビボ安定性および/または生物学的到達性を達成するために必要である数個の改変ヌクレオチドを含有するであろう。
【０１４３】
化学改変によって、非改変RNAi物質と比較して、または、RNAi物質を追跡するため、RNAi物質を精製するため、もしくはRNAi物質とそれが会合する細胞成分とを精製するために用いることができる標識と比較して、安定性の増加、たとえばインビボ安定性の増加または増強が起こる可能性がある。そのような化学改変はまた、細胞（または細胞抽出物もしくは生物）におけるRISC活性/RNAi反応性を増強するためにsiRNAの第一（プライミング）鎖を安定化するために、およびRNAi/遺伝子サイレンシングが進行することができる第二鎖のその後の受容のためのその細胞内半減期を改善するために用いることができる。改変はまた、RNAi物質の細胞取り込みおよび/またはRNAi物質の安定性のような特性を増強することができ、塩基対間の相互作用を安定化することができ、アンチセンスRNAi物質-標的RNA二重鎖の構造的完全性を維持することができる。RNAi物質の改変はまた、たとえばヌクレアーゼに対するsiRNAまたはmiRNA分子の抵抗性を増加するような改変などの、インビボ応用、特にヒトでの治療応用にとって重要な特性が、RNAi物質のRNAi活性を損なうことなく改善されるように設計することができる。特定の態様において、本発明の改変siRNA分子は、対応する非改変siRNAと比較して標的RNA阻害の効率を増強することができる。いくつかの態様において、改変ヌクレオチドは、標的RNA配列との塩基対形成の場合にアンチセンス鎖がA型へリックス立体構造をとる能力に影響を及ぼさず、たとえば標的RNA配列と塩基対形成した場合に正常な主溝を含むA型へリックス立体構造をとる能力に影響を及ぼさない。
【０１４４】
化学改変には一般的に、リボヌクレオチドに対する末端、糖、塩基および/または骨格の改変が含まれる（すなわち、ホスフェート-糖骨格に対する改変が含まれる）。
【０１４５】
1つの態様において、本発明のRNAi物質は1つまたは複数（たとえば、約1、2、3、または4個）の末端改変を含む。たとえば、siRNA分子の5'末端での改変は、たとえば5'-プロピルアミン基を含む。5'末端の改変にはまた、式Iによって記載されるような5'末端のホスフェート基が含まれてもよい：
2009524679.tif 000002
式中、それぞれのXおよびYは独立してO、S、N、アルキル、置換アルキル、またはアルキルハロであり、それぞれのZおよびWは独立してO、S、N、アルキル、置換アルキル、O-アルキル、S-アルキル、アルカリル、アラルキル、アルキルハロ、またはアセチルである。いくつかの態様において、W、X、Y、およびZは全てOではない。siRNA分子の3' OH末端に対する改変には、3'-ピューロマイシン、3'-ビオチン（たとえば、光切断型ビオチン）、ペプチド（たとえば、Tatペプチド）、ナノ粒子、ペプチド模倣体、有機化合物（たとえば、蛍光色素のような色素）、またはデンドリマーが含まれうるがこれらに限定されるわけではない。末端改変はセンス鎖、アンチセンス鎖または双方の上に存在してもよい。いくつかの態様において、5'改変はセンス鎖上にのみ存在する。
【０１４６】
別の態様において、本発明のRNAi物質は1つまたは複数（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれより多い）の糖改変ヌクレオチドを含んでもよい。例示的な糖改変には、式IIによって表される改変が含まれてもよい：
2009524679.tif 000003
式中、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11、およびR12はそれぞれ、独立してH、OH、アルキル、置換アルキル、アルカリル、またはアラルキル、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCN、O-アルキル、S-アルキル、N-アルキル、O-アルケニル、S-アルケニル、N-アルケニル、SO-アルキル、アルキル-OSH、アルキル-OH、O-アルキル-OH、O-アルキル-SH、S-アルキル-OH、S-アルキル-SH、アルキル-S-アルキル、アルキル-O-アルキル、ONO2、NO2、N3、NH2、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ONH2、O-アミノアルキル、O-アミノ酸、またはO-アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリルであり；R9はO、S、CH2、S=O、CHF、またはCF2であり、ならびにBはヌクレオシド塩基である。糖改変ヌクレオチドには、2'-フルオロ改変リボヌクレオチド、2'-OMe改変リボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、2'-アミノ改変リボヌクレオチド、および2'-チオ改変リボヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されるわけではない。糖改変ヌクレオチドはたとえば、2'-フルオロ-シチジン、2'-フルオロ-ウリジン、2'-フルオロ-アデノシン、2'-フルオロ-グアノシン、2'-アミノ-シチジン、2'-アミノ-ウリジン、2'-アミノ-アデノシン、2'-アミノ-グアノシン、または2'-アミノ-ブチリル-ピレン-ウリジンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。1つの態様において、糖改変ヌクレオチドは、2'-フルオロリボヌクレオチドである。いくつかの態様において、2'-デオキシリボヌクレオチドが存在する場合、これはアンチセンス鎖を参照する切断部位の上流またはアンチセンス鎖を参照する切断部位の下流である。2'-フルオロリボヌクレオチドはセンスおよびアンチセンス鎖に存在しうる。いくつかの態様において、2'-フルオロリボヌクレオチドは、あらゆるウリジンおよびシチジンである。他の態様において、2'-フルオロリボヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖、または双方の3'末端と5'末端のみに存在する。
【０１４７】
別の態様において、本発明のRNAi物質は1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）ヌクレオベース改変ヌクレオチドを含む。本発明において有用なヌクレオベース改変ヌクレオチドには、5'位で改変されたウリジンおよび/またはシチジン（たとえば、5-ブロモ-ウリジン、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-アミノ-アリル-ウリジン、5-ヨード-ウリジン、5-メチル-シチジン、5-フルオロ-シチジン、および5-フルオロ-ウリジン）、リボ-チミジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、4-チオ-ウリジン、8位で改変されたアデノシンおよび/またはグアノシン（たとえば、8-ブロモグアノシン）、デアザヌクレオチド（たとえば、7-デアザ-アデノシン）、O-およびN-アルキル化ヌクレオチド（たとえば、N6-メチルアデノシン）および非ヌクレオチド型塩基（たとえば、デオキシ-無塩基、イノシン、N3-メチル-ウリジン、N6,N6-ジメチル-アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオシド、およびリバビリンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１４８】
別の態様において、本発明のRNAi物質は、1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）骨格改変ヌクレオチドを含む。たとえば、骨格改変には、式IIIによって表される改変が含まれてもよい：
2009524679.tif 000004
式中、それぞれのR1およびR2は独立して、本明細書において記載される任意のヌクレオチドであり、それぞれのXおよびYは独立してO、S、N、アルキル、または置換アルキルであり、それぞれのZおよびWは独立してO、S、N、アルキル、置換アルキル、O-アルキル、S-アルキル、アルカリル、アラルキル、またはアセチルである。いくつかの態様において、W、X、Y、およびZは全てOではない。例示的な骨格改変ヌクレオチドは、ホスホロチオエート基またはホスホロジチオエートを含有する。別の態様において、本発明の骨格改変は、ホスホノアセテートおよび/またはチオホスホノアセテートヌクレオチド間連結を含む（たとえば、Sheehan et al., 2003, Nucleic Acids Research, 31, 4109-4118を参照されたい）。骨格改変はセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の双方内となりうる。いくつかの態様において、ヌクレオチド間連結のごく一部が一方または双方の鎖において改変される。他の態様において、ヌクレオチド間連結の全てが一方または双方の鎖において改変される。1つの態様において、改変されたヌクレオチド間連結は、一方または双方の鎖の3'末端と5'末端に存在する。
【０１４９】
別の態様において、本発明のsiRNA分子は、1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）クロスリンク、たとえばセンス鎖がsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖にクロスリンクするクロスリンクを含んでもよい。本発明において有用なクロスリンク剤は、当技術分野において一般的に公知のクロスリンク剤、たとえばソラレン、マイトマイシンC、シスプラチン、クロロエチルニトロソウレア等である。1つの態様において、本発明のクロスリンクは、ソラレンクロスリンクである。好ましくはクロスリンクは、アンチセンス鎖を参照する切断部位の下流に存在し、より好ましくはクロスリンクはセンス鎖の5'末端に存在する。
【０１５０】
別の態様において、本発明のRNAi物質は、アンチセンス鎖と標的mRNA配列とが1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）ミスマッチを含む配列を含む。いくつかの態様において、ミスマッチはアンチセンス鎖を参照する切断部位の下流であり、たとえばアンチセンス鎖の3'末端から1〜6ヌクレオチド内に存在する。別の態様において、核酸分子、たとえば本発明のRNAi物質は、隆起部分、たとえば二重鎖siRNAにおいて1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）対応のない塩基を含むsiRNA分子である。いくつかの態様において、隆起部分はセンス鎖に存在する。
【０１５１】
上記の任意の組み合わせを、本発明の改変RNAi物質を提供するために任意の組み合わせで用いることができると理解される。たとえば、いくつかの態様において、本発明には、siRNAが含まれ、センス鎖には1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）ホスホロチオエートヌクレオチド間連結および/または1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）2'-デオキシ、2'-O-メチル、および/または2'-フルオロ糖改変、および/または1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）塩基改変ヌクレオチド、および/またはセンス鎖の3'末端、5'末端、または3'末端と5'末端の双方での末端改変が含まれる。いくつかの態様において、本発明には、siRNAが含まれ、アンチセンス鎖には1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および/または1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）2'-デオキシ、2'-O-メチル、および/または2'-フルオロ糖改変、および/または1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）塩基改変ヌクレオチド、および/またはアンチセンス鎖の3'末端、5'末端、または3'末端と5'末端の双方での末端改変が含まれる。さらに他の態様において、本発明には、siRNAが含まれ、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方には1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）ホスホロチオエートヌクレオチド間連結および/または1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）2'-デオキシ、2'-O-メチル、および/または2'-フルオロ糖改変、および/または1つまたは複数の（たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多い）塩基改変ヌクレオチド、および/またはセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端、5'末端、または3'末端と5'末端の双方での末端改変が含まれる。
【０１５２】
本発明の改変RNAi物質（すなわち、二重鎖siRNA分子）は、5'末端、3'末端、5'末端と3'末端、および/または内部残基において、またはその任意の組み合わせにおいて改変されうる。RNAi物質改変は、たとえば末端改変、糖改変、ヌクレオベース改変、骨格改変となりえて、ミスマッチ、隆起部分、またはクロスリンクを含有しうる。同様に、3'末端、5'末端、または3'末端と5'末端および/または内部改変が含まれ、改変はたとえば、クロスリンク剤、ヘテロ官能クロスリンク剤等である。本発明のRNAi物質はまた、RNAi物質のインビボ薬理学的特性を改善する化学部分（たとえばコレステロール）によって改変されてもよい。
【０１５３】
本発明の特定の局面において、本発明の化学改変siRNAは「末端改変siRNA」である。すなわち、siRNAはセンスおよび/またはアンチセンス鎖の3'末端および5'末端の一方または双方で改変される。特定の態様において、化学改変siRNAはセンスおよびアンチセンス鎖の双方の3'末端および5'末端の双方で改変される。いくつかの態様において、センスおよび/またはアンチセンス鎖の3'末端および/または5'末端は、末端あたり2、3、または4個の改変ヌクレオチドが組み入れられるように（たとえば二重鎖内の、たとえば、5〜7末端ヌクレオチド内）末端改変される。いくつかの態様において、センスおよび/またはアンチセンス鎖の3'末端および/または5'末端は末端あたり2、3、または4個の2'-フルオロヌクレオチド、たとえば2'フルオロシチジンおよび/または2'フルオロウラシルが組み入れられるように（たとえば二重鎖内の、たとえば5〜7末端ヌクレオチド内）末端改変される。いくつかの態様において、センスおよび/またはアンチセンス鎖の3'末端および/または5'末端は、末端あたり2、3、または4個のヌクレオチド間連結がホスホロチオエート連結であるように（たとえば二重鎖内の、たとえば5〜7末端ヌクレオチド内）末端改変される。いくつかの態様において、改変には、本明細書において記載される任意の改変が含まれる。他の態様において、改変にはホスホロオエート連結が含まれる。さらに他の態様において、改変には2'-糖改変が含まれる。さらに他の態様において、改変には、2'-フルオロヌクレオチド改変が含まれる。さらに他の態様において、改変にはホスホロチオエート連結および2'-フルオロヌクレオチド改変の双方が含まれる。特異的改変には、ApoBを標的とする図21におけるsiRNAおよびSOD1を標的とする表1におけるsiRNAが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１５４】
（表１）例示的な化学改変siRNA（標的SOD1）
2009524679.tif 000005
改変キー：
2' FU/FC＝2'フルオロウラシル/フルオロシチジン
*＝ホスホロチオエート骨格の連結
-＝正常な骨格の連結
【０１５５】
他の局面において、RNAサイレンシング物質は、そのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる、当技術分野において記載される方法に従って改変してもよい（Amarzguioui et al., Nuc. Acids. Res., (2003) 31: 589-95；Chiu and Rana, RNA, (2003), 9: 1034-48；Chiu and Rana, MoLCell, (2002), 10: 549-61)；Morrissey et al., Nat. Biotech., (2005), 23: 2002-7）。1つの態様において、RNAサイレンシング物質は、コレステロールに共役させてもよい（たとえば、Soutschek, et al., Nature, (2004), 432: 173-8を参照されたい）。
【０１５６】
いくつかの態様において、本発明のRNAi物質はまた、核局在/核ターゲティングシグナルを含有してもよい。そのような改変は、本明細書に記載の他の改変の任意の組み合わせを含まずに、またはそれに加えて作製してもよい。核ターゲティングシグナルには、たとえばNLSシグナル配列ペプチドが含まれる分子に対する核局在をもたらすことができる任意の当技術分野において認識されるシグナルが含まれる。
【０１５７】
オリゴヌクレオチドRNAi物質は、酵素的に、または部分的/全有機合成によって産生されてもよい。1つの態様において、RNAi物質、たとえばsiRNAは化学的に調製される。RNAおよびDNA分子を合成する方法、特にVerma and Eckstein (1998) Annul Rev. Biochem. 67:99-134において記載される化学合成法は当技術分野において公知である。RNAは溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはその組み合わせによって混合物から精製することができる。または、RNAは、試料の処理による損失を回避するために精製無しまたは最小限として用いてもよい。または、RNA分子、たとえばRNAiオリゴヌクレオチドは、合成DNA鋳型または組み換え型細菌から単離されたDNAプラスミドからの酵素的転写によって調製することもできる。典型的に、T7、T3、またはSP6 RNAポリメラーゼ（Milligan and Uhlenbeck (1989) Methods Enzymol 180:51-62）のようなファージRNAポリメラーゼを用いる。RNAは保存のために乾燥させてもよく、または水溶液に溶解してもよい。溶液は、アニーリングを阻害するために、および/または一本鎖の安定化を促進するために緩衝液または塩を含有してもよい。
【０１５８】
1つの態様において、siRNAはインビボ、インサイチュー、またはインビトロで合成される。細胞の内因性のRNAポリメラーゼは、インビボもしくはインサイチューで転写を媒介してもよく、またはクローニングしたRNAポリメラーゼをインビボもしくはインビトロで転写のために用いることができる。インビボでのトランスジーンまたは発現構築物からの転写に関して、調節領域（たとえば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナー、およびアクセプター、ポリアデニル化）を用いてsiRNAを転写してもよい。阻害は、臓器、組織、または細胞型における特異的転写；環境条件の刺激（たとえば、感染、ストレス、温度、化学誘発物質）；および/または発達段階もしくは発育年齢での転写の操作によってターゲティングされてもよい。組み換え型構築物からsiRNAを発現するトランスジェニック生物は、構築物を接合体、胚幹細胞、または適当な生物に由来する別の多能性細胞に導入することによって産生してもよい。
【０１５９】
標的ならびに他の任意の調査されたRNAおよびタンパク質の発現レベルは、非転写核酸、および転写された核酸またはタンパク質の発現を検出するための周知の任意の多様な方法によって査定してもよい。そのような方法の非制限的な例には、RNAのRT-PCRの後にPCR産物のサイズ分離、核酸ハイブリダイゼーション法、たとえばノザンブロットおよび/または核酸アレイの使用、核酸増幅法、タンパク質を検出するための免疫学的方法、タンパク質精製法、およびタンパク質の機能または活性アッセイが含まれる。
【０１６０】
RNA発現レベルは、細胞、組織、または生物からmRNA/cDNA（すなわち、転写されたポリヌクレオチド）を調製することによって、およびmRNA/cDNAを、アッセイされた核酸またはその断片の相補体である参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって査定することができる。cDNAは任意で、多様なポリメラーゼ連鎖反応、または相補的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション前のインビトロ転写法を用いて増幅することができる；好ましくはこれは増幅されない。1つまたは複数の転写物の発現も同様に、転写物（複数）の発現レベルを査定するために定量的PCRを用いて検出することができる。
【０１６１】
（d）他の核酸分子
他の態様において、本発明の送達複合体において使用される核酸分子は、RNAサイレンシング物質以外の核酸分子である。特定の態様において、該核酸分子は、前記で考察した任意の化学改変を含んでもよい。
【０１６２】
（i）アンチセンスオリゴヌクレオチド
1つの態様において、本発明において使用される核酸分子は、標的mRNAまたは該mRNAの一部と相補的であるアンチセンス核酸分子、または該アンチセンス核酸分子をコードする組み換え型発現ベクターである。アンチセンス核酸分子は一般的に、1つまたは複数のヌクレオチド類似体を含んでもよい一本鎖DNA、RNA、またはDNA/RNA分子である。細胞において特定のタンパク質の発現をダウンレギュレートするためにアンチセンス核酸を用いることは、当技術分野において周知である（たとえば、Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986；Askari, F.K. and McDonnell, W.M. (1996) N. Eng. J. Med. 334:316-318；Bennett, M.R. and Schwartz, S.M. (1995) Circulation 92:1981-1993；Mercola, D. and Cohen, J.S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59；Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225；Wagner, R. W. (1994) Nature 372:333-335を参照されたい）。アンチセンス核酸分子は、標的mRNA配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み、したがってmRNAに水素結合することができる。mRNAの配列と相補的なアンチセンス配列は、mRNAのコード領域、mRNAの5'もしくは3'非翻訳領域、またはコード領域と非翻訳領域とを架橋する領域（たとえば5'非翻訳領域とコード領域との接合部）において見いだされる配列と相補的となりうる。好ましくは、アンチセンス核酸は、mRNAの3'非翻訳領域における開始コドンの前または開始コドンに及ぶ領域と相補的となるように設計される。
【０１６３】
標的mRNAの公知のヌクレオチド配列を考慮して、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリックの塩基対形成の規則に従って設計されうる。アンチセンス核酸分子は、mRNAの全コード領域と相補的となりうるが、より好ましくはmRNAのコードまたは非コード領域のごく一部に対してアンチセンスである。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的mRNAの翻訳開始部位周囲の領域と相補的となりうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、100、500、1000ヌクレオチド長であるかそれ以上となりうる。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ターゲティングされるmRNAの長さと同じまたはそれより長くてもよい。
【０１６４】
本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で公知の技法を用いて化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築することができる。たとえば、アンチセンス核酸（たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチドを用いて、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々な改変ヌクレオチドを用いて化学合成することができ、たとえばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸分子を生成するために用いることができる改変ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル) ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5- メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、ウィブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル) ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。細胞における発現を阻害するために、1つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【０１６５】
または、アンチセンス核酸は、その中にcDNAの全てまたは一部がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に産生することができる（すなわち、挿入された核酸から転写された核酸は、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス方向となるであろう）。関心対象の細胞においてアンチセンスRNA分子の発現を指示する、アンチセンス方向にクローニングされた核酸に機能的に連結された調節配列を選択することができ、たとえばアンチセンスRNAの構成的、組織特異的、または誘導型発現を指示する、プロモーターおよび/またはエンハンサーまたは他の調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、cDNA（またはその一部）をベクターにアンチセンス方向にクローニングすることを除き、組み換え型発現ベクターを構築するための標準的な組み換えDNA法に従って調製される。アンチセンス発現ベクターは、たとえば組み換え型プラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形となりうる。アンチセンス発現ベクターは標準的なトランスフェクション技術を用いて細胞に導入することができる。
【０１６６】
本発明のアンチセンス核酸分子は典型的に、細胞mRNAおよび/またはタンパク質をコードするゲノムDNAとハイブリダイズまたは結合して、それによりたとえば転写および/または翻訳を阻害することによってタンパク質の発現を阻害するように、被験体に投与されるかインサイチューで生成される。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するために通常のヌクレオチド相補性によって、またはDNA二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には二重らせんの主溝における特異的相互作用を通して行われうる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位への直接注射が含まれる。または、選択された細胞を標的とするようにアンチセンス核酸分子を改変して、その後全身投与することができる。たとえば全身投与の場合、アンチセンス分子は、たとえば細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することによって、選択された細胞表面上で発現された受容体または抗原に特異的にそれが結合するように改変することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書において記載されるベクターを用いて細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強いpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【０１６７】
（a）抗RNAサイレンシング物質オリゴヌクレオチド
1つの特定の態様において、前記のRNAサイレンシング物質（たとえば、miRNA分子）の1つまたは複数と相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してもよい。該抗miRNAオリゴヌクレオチドはDNAもしくはRNAオリゴヌクレオチドであってもよく、またはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの双方、もしくはその類似体を含んでもよい。好ましい態様において、該抗miRNAオリゴヌクレオチドは1つまたは複数の（たとえば、実質的に全ての）2'-O-メチルリボヌクレオチドを含む。そのような分子はmiRNA媒介サイレンシングの強力かつ非可逆的な阻害剤であり、したがって、インビトロおよびインビボの双方でRNAサイレンシングを調節するために有用である。インビボ方法論は、全般的RNAサイレンシング調節目的のために、および、RNAサイレンシング調節（たとえば、阻害）が望ましい治療応用において、有用である。たとえば、インスリン分泌は、少なくとも1つのmiRNAによって調節されることが示されており（Poy et al. 2004）、miRNAの役割も同様に、脊髄性筋萎縮（SMA；Mourelatos et al. 2002）に関係している。
【０１６８】
（ii）αアノマー核酸分子
さらに別の態様において、本発明において使用される核酸分子は、αアノマー核酸分子である。αアノマー核酸分子は、通常のβ単位とは反対に、鎖が互いに平行である相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641）。そのような核酸分子はまた、2'-o-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）またはキメラRNA-DNA類似体（Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330）を含みうる。
【０１６９】
（iii）リボザイム
さらに別の態様において、本発明において使用される核酸分子はリボザイムである。リボザイムは、大規模な二次構造を有し、それに対してそれらが相補的領域を有するmRNAのような一本鎖核酸を内因性に切断することができる触媒的RNA分子である。このように、リボザイム（たとえば、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591において記載）など）を用いて、mRNA転写物を触媒的に切断して、それによってmRNAの翻訳を阻害することができる。たとえばRCK（またはRCKオルトログもしくはRCK相互作用物質）コード核酸に対して特異性を有するリボザイムを、cDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。たとえば、活性部位のヌクレオチド配列が標的mRNAにおいて切断されるヌクレオチド配列と相補的であるテトラヒメナ（Tetrahymena）L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる。たとえばCech et al. U.S. Patent No. 4,987,071およびCech et al. U.S. Patent No. 5,116,742を参照されたい。または、標的mRNAを用いて、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的RNAを選択することができる。たとえば、Bartel, D. and Szostak, J. W. (1993) Science 261 : 1411- 1418を参照されたい。
【０１７０】
（iv）三重らせん分子
または、遺伝子発現は、標的細胞における遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成するために、標的遺伝子の調節領域と相補的なヌクレオチド配列を標的とすることによって阻害することができる。一般的にHelene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84；Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27- 36；およびMaher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15を参照されたい。
【０１７１】
（v）核酸ベクター
他の態様において、本発明の核酸分子はベクターであり、たとえば遺伝子産物（またはその一部）またはRNAサイレンシング物質をコードする核酸を含有する発現ベクターである。本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、それに対して連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。1つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは内部にさらなるDNAセグメントをライゲーションすることができる環状の二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターは、さらなるDNAセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされうるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製を行うことができる（たとえば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞に導入する際に宿主細胞のゲノムに組み入れて、それによって宿主ゲノムと共に複製させる。その上、特定のベクターは、それらが機能的に連結する遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般的に、組み換えDNA技術において有用な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形であることから互換的に用いられうる。しかし、本発明は、同等の機能を提供するウイルスベクター（たとえば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルス）のような発現ベクターのそのような他の形を含めると意図される。
【０１７２】
特定の局面において、本発明のベクターは、前記のRNAサイレンシング物質、たとえば低分子ヘアピンRNA（shRNA）をコードする。shRNAの転写は、ポリメラーゼIII（pol III）プロモーターで開始され、4-5チミン転写終了部位の2位で終了すると考えられる。発現されると、shRNAは3' UU-オーバーハングを有するステムループ構造に折りたたまれると考えられ；その後これらのshRNAの末端はプロセシングされて、shRNAを約21ヌクレオチドのsiRNA様分子に変換する。Brummelkamp et al. (2002), Science, 296, 550-553；Lee et al, (2002). 前記；Miyagishi and Taira (2002), Nature Biotechnol., 20, 497-500；Paddison et al. (2002), 前記；Paul (2002), 前記；Sui (2002) 前記；Yu et al. (2002), 前記。そのような発現構築物には、1つまたは複数の誘導型プロモーター、U6 snRNAプロモーターもしくはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーターのようなRNA Pol IIIプロモーターシステム、または当技術分野で公知の他のプロモーターが含まれてもよい。構築物には、RNAサイレンシング物質の1つまたは複数の鎖が含まれうる。双方の鎖を発現する発現構築物には、双方の鎖を連結するループ構造が含まれることができ、またはそれぞれの鎖は、同じ構築物内で異なるプロモーターから個別に転写されうる。それぞれの鎖はまた、異なる発現構築物から転写されうる。Tuschl (2002)、前記。
【０１７３】
IV．薬学的物質
1つの局面において、本発明は、ナノ輸送体を通して所望の標的、たとえば細胞または組織に薬学的物質の送達を提供する。本明細書において用いられる「薬学的物質」という用語は、薬学的活性を有する化合物を指す。本発明のナノ輸送体について用いるための薬学的物質の例には、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、化学療法剤、抗生物質等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
（a）抗体
特定の態様において、本発明の送達複合体において使用される薬学的物質は抗体である。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、ペプシンのような酵素によって抗体を処置することによって生成されうるF(ab)およびF(ab')2断片が含まれる。標的抗原に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを本発明の方法において使用してもよい。
【０１７４】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、標的抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の唯一の種を含有する抗体分子の集団を指す。このように、モノクローナル抗体組成物は典型的に、それが免疫反応する特定の標的抗原に対して1つの結合親和性を示す。
【０１７５】
ポリクローナル抗体は、適切な被験体を標的抗原または免疫原によってそれぞれ免疫することによって調製されうる。免疫した被験体における抗体力価は、固定された標的抗原を用いる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）のような標準的な技術によって経時的にモニターすることができる。望ましければ、抗体分子を哺乳動物から（たとえば、血液から）単離することができ、IgG分画を得るためにプロテインAクロマトグラフィーのような周知の技術によってさらに精製することができる。免疫後の適当な時期に、たとえば抗体力価が最高である時期に、抗体産生細胞を被験体から得て、これを用いてKohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497によって当初記載されたハイブリドーマ技術（同様にBrown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46；Brown et al. (1980) J. Biol. Chem .255:4980-83；Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31；およびYeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75を参照されたい）、より最近のヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72）、EBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）、またはトリオーマ技術のような標準的な技術によってモノクローナル抗体を調製することができる。
【０１７６】
モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するための技術は周知である（一般的にR. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980)；E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med, 54:387-402；M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36を参照されたい）。簡単に説明すると、不死化細胞株（典型的には骨髄腫）を、標的抗原によって免疫した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）に融合させて、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清を、標的抗原に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングする。
【０１７７】
リンパ球と不死化細胞株を融合するために用いられる多くの周知の任意のプロトコールを、モノクローナル抗体を生成する目的のために応用することができる（たとえば、G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052；Gefter et al. Somatic Cell Genet., 前記引用；Lerner, Yale J. Biol. Med., 前記引用；Kenneth, Monoclonal Antibodies、前記引用を参照されたい）。その上、当業者は、同様に有用でありうるそのような方法の多くの変法が存在することを認識するであろう。
【０１７８】
典型的に、不死化細胞株（たとえば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。たとえば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物によって免疫したマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞株に融合させることによって作製することができる。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培養培地（「HAT培地」）に対して感受性があるマウス骨髄腫細胞株である。多くの任意の骨髄腫細胞株、たとえばP3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653、またはSp2/O-Ag14骨髄腫細胞株を標準的な技術に従って融合パートナーとして用いることができる。これらの骨髄腫細胞株はATCCから入手可能である。典型的に、HAT感受性マウス骨髄腫細胞をポリエチレングリコール（「PEG」）を用いてマウス脾細胞に融合する。融合によって得られたハイブリドーマ細胞を、非融合および無効な融合骨髄腫細胞（非融合非細胞は形質転換されていないことから数日後に死滅する）を死滅させるHAT培地を用いて選択する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、たとえば標準的なELISAアッセイを用いて、標的抗原に結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出する。
【０１７９】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製するかわりに、組み換え型コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（たとえば、抗体ファージディスプレイライブラリ）を標的抗原によってスクリーニングすることによってモノクローナル抗体を同定して単離し、それによって標的抗原に結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することができる。ファージディスプライライブラリを生成およびスクリーニングするためのキットが市販されている（たとえば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01；およびStratagene SurfZAP(商標) Phage Display Kit, Catalog No. 240612）。さらに、抗体ディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングにおいて用いるために特に影響を受けやすい方法および試薬の例は、たとえば、Ladner et al. U.S. Patent No. 5,223,409；Kang et al. PCT国際公開番号WO 92/18619；Dower et al. PCT国際公開番号WO 91/17271；Winter et al. PCT国際公開番号WO 92/20791；Markland et al. PCT国際公開番号WO 92/15679；Breitling et al. PCT国際公開番号WO 93/01288；McCafferty et al. PCT国際公開番号WO 92/01047；Garrard et al. PCT国際公開番号WO 92/09690；Ladner et al. PCT国際公開番号WO 90/02809；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3 :81-85；Huse et al (1989) Science 246:1275-1281；Griffiths et al (1993) EMBO J 12:725- 734；Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896；Clarkson et al (1991) Nature 352:624-628；Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580；Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137；Barbas et al (1991) PNAS 88:7978-7982；およびMcCafFerty et al. Nature (1990) 348:552-554において見られる。
【０１８０】
（b）薬物部分
特定の態様において、本発明の送達複合体において使用される薬学的物質は薬物部分である。本明細書において用いられる「薬物部分」という用語は、当技術分野において認識される治療特性を有する低分子またはその活性部分を指す。例示的な薬物部分には、抗炎症剤、抗癌剤、抗感染症剤（たとえば、抗真菌、抗菌、抗寄生虫、抗ウイルス剤等）、および麻酔治療剤が含まれる。
【０１８１】
1つの例示的な態様において、薬物部分は、抗癌剤である。例示的な抗癌剤には、細胞増殖抑制剤、酵素阻害剤、遺伝子調節剤、細胞障害性ヌクレオシド、微小管結合物質、ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、抗血管心製剤等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。例示的な増殖抑制性抗癌剤には、アントラサイクリン系の薬物（たとえば、アドリアマイシン、シクロスポリン-A、クロロキン）、DNA合成阻害剤（たとえば、メソトレキセート、5-フルオロウラシル、ガンシクロビル）、DNAインターカレート剤またはクロスリンク剤（たとえば、ブレオマイシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、シスプラチン）、DNA-RNA転写調節因子（たとえば、アクチノマイシンD）のようなアルキル化剤が含まれる。例示的な細胞障害性ヌクレオシド抗癌剤には、たとえばアデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、5-フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスリジン、フトラフール、および6-メルカプトプリンが含まれる。例示的な抗癌性微小管結合物質には、タキソイド（たとえば、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン）が含まれる。例示的な抗癌性ホルモンおよびホルモンアンタゴニストには、コルチコステロイド（たとえば、プレドニゾン）、プロゲスチン（たとえば、ヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン）、エストロゲン（たとえば、ジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン（たとえば、タモキシフェン）、アンドロゲン（たとえば、テストステロン）、アロマターゼ阻害剤（たとえば、アミノグルテチミド）、17-(アリルアミノ)-17-デメトキシゲルダナマイシン、4-アミノ-1,8-ナフタリミド、アピゲニン、ブレフェルジンA、シメチジン、ジクロロメチレン-ジホスホン酸、リュープロリド（リュープロレリン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ピフィスリン-α、ラパマイシン、性ホルモン結合グロブリン、およびタプシガーギンが含まれる。
【０１８２】
（c）他の薬学的物質
先に記載した薬学的物質の代わりにまたはそれに加えて、本発明の送達複合体は、治療ペプチド（たとえば、インスリン）、生物反応改変剤、酵素、またはその断片を含んでもよい。例示的な生物反応改変剤には、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および凝固因子が含まれる。実際に、送達複合体は、治療物質またはペイロードがその作用様式を有しうるように、有効量で存在する場合に、組織、生きている細胞、および/または生物と反応するおよび/または影響を及ぼす、または生物学的空間、たとえば血液脳関門を横切る、任意の化合物または組成物を含んでもよい。活性物質の性質に応じて、活性物質は、細胞に導入された後のDNA、RNA、タンパク質、またはペプチドのように、生物学的空間、細胞表面、細胞において活性であるか、または活性を有すると理解される。
【０１８３】
生物学的活性物質の例には、DNA、cDNA、RNA（完全長のmRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、RNAi、siRNA、miRNA、デコイ）のような核酸、オリゴデオキシヌクレオチド（ホスホジエステル、ホスホチオエート、ホスホロアミダイト、および他の全ての化学改変）、オリゴヌクレオチド（ホスホジエステル等）、または直線および閉鎖環状プラスミドDNA；糖質、タンパク質、およびペプチド（たとえばサイトカイン（たとえば、NGF、G-CSF、GM-CSF）のような組み換え型タンパク質を含む、たとえば、細胞送達および輸送のためのペプチド、特異的受容体に対するペプチド、および血液脳関門を通過することができるペプチド）、酵素、ワクチン（たとえば、HBsAg、gp120）、ビタミン、プロスタグランジン、局所麻酔剤（たとえば、プロカイン）、抗マラリア剤（たとえば、クロロキン）、抗パーキンソン剤（たとえば、レバ-DOPA）のような血液脳関門を通過する必要がある化合物、アドレナリン受容体アンタゴニスト（たとえば、プロプラノロール）、抗新生物剤（たとえば、ドキソルビシン）、抗ヒスタミン剤、生体アミン（たとえば、ドーパミン）、抗うつ剤（たとえば、デシプラミン）、抗コリン作動薬（たとえば、アトロピン）、抗不整脈剤（たとえば、キニジン）、制吐剤（たとえば、クロロプリマミン）、および鎮痛剤（たとえば、コデイン、モルヒネ）のような薬物、またはトランスフェクション活性を増強するもしくは細胞内外でのDNAの寿命を延長させるシスプラチンのような低分子量薬が含まれるがこれらに限定されるわけではない。1つの例示的な態様において、送達複合体は、アマンタジンを含む（たとえば、図46を参照されたい）。
【０１８４】
V．送達複合体
（a）核酸分子：ナノ輸送体送達複合体
核酸分子、たとえばRNAサイレンシング物質（たとえば、本発明の新規化学改変RNAサイレンシング物質）は、本明細書において記載され、かつ/または当業者によって開発されうる、当技術分野において公知の任意の技術および/またはアプローチによってナノ輸送体に会合させる（すなわち機能的に連結させる）ことができる。いくつかの態様において、会合は共有結合、双極子相互作用、静電気力、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、および/または核酸をナノ輸送体に共役させることができる他の結合を伴ってもよい。
【０１８５】
1つの態様において、核酸分子、たとえばRNAサイレンシング物質、たとえばsiRNAを、たとえばリンカーを通してナノ輸送体のコアに共役させる。図14は、核酸分子、たとえばsiRNAを、連結部分を用いてナノ輸送体に共役させるための例示的な方法を示す。この図から認められうるように、スルホスクシニミジル-4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレートスルホスクシニミジル-4-(P-マレイミドフェニル)ブチレート（「スルホ-SMPB」）を用いて、核酸分子をナノ輸送体に共役させる。本明細書において用いられる「連結部分」とは、核酸分子、たとえばsiRNAをナノ輸送体に連結させることができる任意の部分を指す。当技術分野において公知の任意の連結部分を本発明において用いてもよい。本発明において有用な連結部分は、任意の二官能化合物、たとえば二官能マレイミド化合物、たとえばスルホスクシニミジル-4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレートを含んでもよい。
【０１８６】
核酸分子は、一般的に公知の方法によってナノ輸送体に会合または共役させてもよい。1つの態様において、核酸分子は、核酸分子をナノ輸送体と混合することによってナノ輸送体に会合する。別の態様において、核酸分子はナノ輸送体に共有結合する。
【０１８７】
いくつかの態様において、核酸分子は、イオン結合によってコアに会合する。例示的な態様において、ナノ輸送体のコアは低分子量ポリリジンデンドリマーであり、それにジオレオイルも付着することができる。図3は、上記の複合体（ジオレオイル-LDG3）とsiRNAとの相互作用を示す。1つの態様において、この複合体は、ジオレオイル-LDG3をsiRNAと混合することによって形成される。別の態様において、siRNAはLDG3分岐上のアミノ基を通してジオレオイル-LDG3複合体に共有的に共役する。
【０１８８】
ナノ輸送体のコアは、核酸分子、たとえばsiRNAおよび少なくとも1つの官能表面基と会合することができる任意の分子であってもよく、たとえばコアはジオレオイルLDG3であってもよい。例示的な態様において、ナノ輸送体のコアはナノチューブである。ナノチューブ-siRNA共役体は、先に記載した方法と類似の方法で形成することができる。図17はナノチューブ-siRNA共役体の合成を示す。
【０１８９】
さらに別の態様において、本発明のナノ輸送体はHBOLDである。HBOLDの構造は図18において認められうる。いずれかの特定の理論に縛られることを望むわけではないが、本発明のナノ輸送体、たとえばHBOLDは細胞に対して非毒性であると考えられる。
【０１９０】
図19において認められうるように、siRNAに共役したHBOLDナノ輸送体はFL83B（マウス肝細胞）細胞において非毒性であることが見いだされている。
【０１９１】
HBOLD構築物はまた、標的細胞へのRNAサイレンシング物質の送達において標準的なトランスフェクション物質と同程度に有効であることが見いだされた。特に、図20において認められうるように、HBOLD構築物は、肝細胞におけるApoBの発現のサイレンシングにおいて標準的なトランスフェクション試薬と類似の有効性を有した。
【０１９２】
（b）薬学的物質：ナノ輸送体送達複合体
特定の局面において、本発明は所望の標的、たとえば細胞または組織に、本発明のナノ輸送体を通した薬学的物質の送達を提供する。本明細書において用いられる「薬学的物質」という用語は、薬学的活性を有する化合物（たとえば、前記で同定された核酸分子以外の化合物）を指す。本発明のナノ輸送体と共に用いられる薬学的物質の例には、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、化学療法剤、抗生物質等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。薬学的物質は、本明細書において記載され、かつ/または当業者によって開発されうる、当技術分野で公知の任意の技術および/またはアプローチによってナノ輸送体に共役させることができる。いくつかの態様において、会合は、共有結合、双極子相互作用、静電気力、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力および/または薬学的物質をナノ輸送体に共役させることができる他の結合を伴ってもよい。
【０１９３】
VI．標的mRNA
1つの態様において、本発明の標的mRNAは細胞タンパク質（たとえば、核、細胞質、膜貫通、または膜会合タンパク質）のアミノ酸配列を規定する。別の態様において、本発明の標的mRNAは細胞外タンパク質（たとえば、細胞外マトリクスタンパク質または分泌タンパク質）のアミノ酸配列を規定する。本明細書において用いられる、タンパク質の「アミノ酸配列を規定する」という句は、mRNA配列が遺伝子コードの規則に従ってアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。以下のクラスのタンパク質を、説明目的のために記載する：発達タンパク質（たとえば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、Wingedへリックスファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン/リンフォカインおよびその受容体、増殖/分化因子およびその受容体、神経伝達物質およびその受容体）、腫瘍遺伝子コードタンパク質（たとえば、ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETSI、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIMI、PML、RET、SRC、TALI、TCL3、およびand YES）、腫瘍抑制因子タンパク質（たとえば、APC、BRCAl、BRCA2、MADH4、MCC、NFI、NF2、RBI、TP53、およびWTI）、ならびに酵素（たとえば、ACCシンターゼおよびオキシダーゼ、ACPデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプンシンターゼ、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、ライソザイム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物生長調節剤シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、RUBISCOs、トポイソメラーゼ、およびキシラナーゼ）。
【０１９４】
本発明の好ましい局面において、本発明の標的mRNA分子は、病態に関連するタンパク質のアミノ酸配列を規定する。たとえば、タンパク質は、病原体関連タンパク質（たとえば、宿主の免疫抑制、病原体の複製、病原体の伝搬、または感染の維持に関係するウイルスタンパク質）、または病原体の宿主への流入、病原体もしくは宿主による薬物代謝、病原体のゲノムの複製もしくは組み込み、宿主における感染の確立もしくは広がり、または病原体の次世代の集合を促進する宿主タンパク質であってもよい。あるいは、タンパク質は、腫瘍関連タンパク質、または自己免疫疾患関連タンパク質であってもよい。
【０１９５】
1つの態様において、本発明の標的mRNA分子は、内因性のタンパク質（すなわち、細胞または生物のゲノムに存在するタンパク質）のアミノ酸配列を明記する。別の態様において、本発明の標的mRNA分子は、組み換え型細胞または遺伝子改変生物において発現された異種タンパク質のアミノ酸配列を規定した。別の態様において、本発明の標的mRNA分子は、トランスジーン（すなわち、細胞のゲノムにおける異所に挿入された遺伝子構築物）によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を規定した。さらに別の態様において、本発明の標的mRNA分子は、細胞または細胞が由来する生物に感染することができる病原体ゲノムによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を規定する。
【０１９６】
そのようなタンパク質の発現を阻害することによって、該タンパク質の機能に関する貴重な情報および該阻害から得られる可能性がある治療的恩典が得られる可能性がある。
【０１９７】
A）代謝的遺伝子標的
本発明のナノ輸送体、たとえばHBOLDナノ輸送体は、関心対象の特異的遺伝子、すなわち高コレステロールレベル、肥満、および糖尿病を含む代謝障害に関連する遺伝子を標的とするために用いてもよい。1つの態様において、HBOLDナノ輸送体は、遺伝子特異的siRNA分子に会合し、これを用いてアポリポタンパク質B（ApoB）が含まれるがこれらに限定されるわけではない、コレステロール産生に関連する標的遺伝子をノックダウンまたはサイレンシングする。ApoBはカイロミクロンおよび低密度リポタンパク質（LDL）の主なアポリポタンパク質である。ApoBは、血漿において、消化管および肝臓においてそれぞれ合成される2つの主なイソ型、apoB-48およびapoB-100として見いだされる。
【０１９８】
apoBの腸管型（apoB-48）および肝臓型（apoB-100）は、1つの遺伝子および1つのmRNA転写物によってコードされる。ヒトapoBのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、GenBank record GI 4502152において見られる。本発明のナノ輸送体を、apoB-100、apoB-48、またはapoB-100とapoB-48の双方を含むapoB遺伝子のRNA配列に対応するsiRNAに共役させてもよい。apoBのヌクレオチド配列は以下の配列を含む。
2009524679.tif 000006
2009524679.tif 000007
2009524679.tif 000008
2009524679.tif 000009
2009524679.tif 000010
apoB-100の成熟ペプチドは、上記の配列のヌクレオチド210〜13817位によってコードされ、apoB-48の成熟ペプチドは、上記の配列のヌクレオチド210〜6665位によってコードされる。
【０１９９】
apoB遺伝子のサイレンシングはまた、異常なグルコース輸送（たとえば、糖尿病）、肥満、代謝の増加（たとえば、脂肪酸代謝）、および褐色脂肪の増加に関連する代謝障害を処置するために用いてもよい。ApoBタンパク質は、脂質に基づく疾患の候補標的遺伝子siRNA治療である。
【０２００】
別の態様において、ナノ輸送体は遺伝子特異的siRNAに会合し、核受容体相互作用タンパク質140（RIP140または核受容体相互作用タンパク質1 NRIP1）をノックダウンまたはサイレンシングすることによって、異常なグルコース輸送（たとえば、糖尿病）および肥満に関連する代謝障害を処置するために用いられる。
【０２０１】
RIP140は多くの核受容体の転写活性を阻害することができる共抑制因子である。RIP140は、大きさ約128 kDaのアミノ酸約1158個を含有する核タンパク質である。RIP140は、Lがロイシンであって、Xが任意のアミノ酸であるLXXLLモチーフによって核受容体に結合する（Heery et al., Nature, 387(6634):733-6, 1997）。LXXLLモチーフはRIP140配列において見いだされる。RIP140はまた、RIP140配列において見いだされるPXDLSモチーフによってヒストンデアセチラーゼおよびC末端結合タンパク質（CTBP）と相互作用する。ヒトRIP140のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、GenBank record GI 57232745において見られる。本発明のナノ輸送体は、RIP140のRNA配列を標的とするsiRNA分子に共役させてもよい。RIP140の配列は以下を含む。
2009524679.tif 000011
2009524679.tif 000012
RIP140成熟ペプチドは、上記の配列のヌクレオチド335〜3811位によってコードされ、apoB-48成熟ペプチドは、上記の配列のヌクレオチド210〜6665位によってコードされる。
【０２０２】
代謝疾患および障害に関連する他の遺伝子の例には、異常脂質血症（たとえば、肝X受容体（たとえば、LXRαおよびLXRβ（Genbackアクセッション番号NM.sub.-007121)）、ファルネソイドX受容体（FXR）（Genbankアクセッション番号NM.sub.--005123）、ステロール調節要素結合タンパク質（SREBP）、サイト-1 プロテアーゼ（SlP）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ（HMG補酵素Aレダクターゼ）、アポリポタンパク質（ApoB）、およびアポリポタンパク質（ApoE））の遺伝子、ならびに糖尿病に関連する遺伝子（たとえば、グルコース6-ホスファターゼ）が含まれる（たとえば、Forman et al., Cell 81:687 (1995)；Seol et al., Mol. Endocrinol. 9:72 (1995), Zavacki et al., PNAS USA 94:7909 (1997)；Sakai et al., Cell 85:1037-1046 (1996)；Duncan et al., J. Biol. Chem. 272:12778-12785 (1997)；Willy et al., Genes Dev. 9(9):1033-45 (1995)；Lehmann et al., J. Biol. Chem. 272(6):3137-3140 (1997)；Janowski et al., Nature 383 :728-731 (1996)；Peet et al, Cell 93:693-704 (1998)を参照されたい）。
【０２０３】
VII．処置法
本発明は、異常なまたは望ましくは標的遺伝子発現または活性に関連する障害のリスクを有する（もしくは感受性がある）または障害を有する被験体を処置する予防的および治療的方法の双方を提供する。本明細書において用いられる「処置」または「処置する」とは、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患に対する素因を治癒する、癒合する、緩和する、遅延する、軽減する、変更する、治療する、回復する、改善する、または影響を及ぼすことを目的として、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害に対する素因を有する患者に対する治療物質（たとえば、核酸分子および/または薬学的物質）の適用もしくは投与として、または患者からの単離組織もしくは細胞株に対する治療物質の適用もしくは投与として定義される。
【０２０４】
処置の予防的および治療的方法の双方に関して、薬理ゲノム学の分野から得られた知識に基づいて、そのような処置を具体的に作製または改変してもよい。本明細書において用いられる「薬理ゲノム学」とは、臨床開発中のおよび市場における薬物に対する遺伝子シーケンシング、統計学的遺伝学、および遺伝子発現分析のようなゲノム学技術の応用を指す。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子が薬物に対する患者自身の反応（たとえば、患者の「薬物反応表現型」、または「薬物反応遺伝子型」）をどのように決定するかを調べることを指す。このように、本発明の別の局面は、その個体の薬物反応遺伝子型に従って、本発明の核酸分子および/もしくは薬学的物質による、または標的核酸分子および/もしくは薬学的物質による個体の予防または治療的処置を作製するための方法を提供する。薬理ゲノム学によって、臨床医または医師は、処置によって最も恩典を受けるであろう患者に予防的または治療的処置をターゲティングすることができ、毒性の薬物関連副作用を経験するであろう患者の処置を回避することができる。
【０２０５】
a）予防的方法
1つの局面において、本発明は、被験体に治療物質（たとえば、核酸分子、および/または薬学的物質）を投与することによって、被験体における異常なまたは望ましくない標的遺伝子発現または活性に関連する疾患または病態を予防する方法を提供する。異常なまたは望ましくない標的遺伝子発現または活性によって引き起こされるまたは関与される疾患のリスクを有する被験体は、たとえば、本明細書に記載される診断または予後的アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定されうる。予防物質の投与は、疾患もしくは障害が予防されるまたはその進行が遅延するように、標的遺伝子の異常を特徴とする症状の発現の前に行われうる。標的遺伝子の異常のタイプに応じて、たとえば、標的遺伝子、標的遺伝子アゴニスト、または標的遺伝子アンタゴニスト物質を、被験体を処置するために用いることができる。本明細書に記載のスクリーニングアッセイに基づいて、適当な物質を決定することができる。
【０２０６】
b）治療法
本発明の別の局面は、治療目的のために標的遺伝子発現、タンパク質発現、または活性を調節する方法に関する。したがって、例示的な態様において、本発明の調節法は、標的遺伝子を発現することができる細胞と、標的遺伝子またはタンパク質（たとえば、該遺伝子によってコードされる、または該タンパク質のアミノ酸配列を規定するmRNAに対して特異的である）に対して特異的な治療物質（たとえば、核酸分子および/または薬学的物質）とを、標的タンパク質の発現または1つもしくは複数の活性が調節されるように接触させる段階を含む。これらの調節法はインビトロ（たとえば、細胞を物質と共に培養することによって）、またはインビボで（たとえば、被験体に物質を投与することによって）行うことができる。そのため本発明は、標的遺伝子ポリペプチドまたは核酸分子の異常なまたは望ましくない発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。標的遺伝子活性の阻害は、標的遺伝子が異常にアップレギュレートされている、および/または標的遺伝子活性の減少が有益な効果を有する可能性がある状況において望ましい。
【０２０７】
c）薬理ゲノム学
本発明の治療物質（たとえば、核酸分子および/または薬学的物質）は、異常なまたは望ましくない標的遺伝子活性に関連する障害を（予防的または治療的に）処置するために個体に投与することができる。そのような処置に関連して、薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型とその個体の外来化合物または薬物に対する反応との関係の研究）を検討してもよい。治療物質の代謝の違いは、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度の間の関係が変更されることによって、重度の毒性または治療失敗をもたらしうる。このように、医師または臨床医は、治療物質を投与するか否かを決定する場合および治療物質による処置の治療レジメを作成する場合に、関連する薬物ゲノム学研究において得られた知識を応用することを検討してもよい。
【０２０８】
薬理ゲノム学は、罹患した人における薬物素因の変更および異常な作用による薬物に対する反応における臨床的に有意な遺伝的変化を扱う。たとえば、Eichelbaum, M. et al. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11): 983-985およびLinder, M. W. et al. (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266を参照されたい。一般的に、2つのタイプの薬物遺伝子状態が識別されうる。遺伝子状態は、薬物が体に作用する様式を変更する単一の要因として伝搬され（薬物作用の変更）、または遺伝子状態は、体が薬物に作用する方法を変更する単一の要因として伝搬される（薬物代謝の変更）。これらの薬物遺伝子状態は、希少な遺伝的欠損または天然に存在する多形のいずれかとして起こりうる。たとえば、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ欠損（G6PD）は、主な臨床合併症が酸化剤（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取後およびソラマメ摂食後の溶血である、一般的な遺伝酵素病である。
【０２０９】
「ゲノム全体関連」として知られる薬物反応を予測する遺伝子を同定するための1つの薬物ゲノム学アプローチは、既に公知の遺伝子関連マーカーからなるヒトゲノムの高解像度マップ（たとえば、そのそれぞれが2つの変種を有するヒトゲノム上の多形または可変部位60,000〜100,000個からなる「二対立遺伝子」遺伝子マーカーマップ）に主に依存している。そのような高解像度遺伝子マップを、特定の観察された薬物反応または副作用に関連するマーカーを同定するためにフェーズII/III薬物臨床試験に参加している統計学的に有意な数の患者それぞれのゲノムのマップと比較することができる。または、そのような高解像度マップは、ヒトゲノムにおいて数千万個の公知の一ヌクレオチド多形（SNPs）の組み合わせから生成することができる。本明細書において用いられる「SNP」とは、一続きのDNAにおける一ヌクレオチド塩基に起こる共通の変化である。たとえば、SNPはDNA 1000塩基毎に1回発生する可能性がある。SNPは疾患のプロセスに関係する可能性があるが、その大多数は疾患に関連しない可能性がある。そのようなSNPsの発生に基づく遺伝子マップに基づいて、個体をその個々のゲノムにおけるSNPsの特定のパターンに基づいて遺伝子カテゴリに分類することができる。そのようにして、そのような遺伝的に類似の個体において共通でありうる形質を考慮に入れて、遺伝的に類似の個体の群向けに処置療法を調整することができる。
【０２１０】
または、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法を利用して薬物反応を予測する遺伝子を同定することができる。この方法に従って、薬物標的をコードする遺伝子が公知（たとえば、本発明の標的遺伝子ポリペプチド）である場合、その遺伝子の全ての一般的な変種を、集団においてかなり容易に同定することができ、遺伝子の他の型に対して1つの型を有することが特定の薬物反応に関連するか否かを決定することができる。
【０２１１】
実例となる態様において、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続の双方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（たとえば、N-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT 2）およびチトクロームP450酵素CYP2D6およびCYP2C19）の遺伝子多形の発見は、標準的な安全量の服用後に何人かの患者が予想される薬物効果を得ない理由、または過剰な薬物反応および重篤な毒性を示す理由に関する説明を提供した。これらの多形は集団において2つの表現型、すなわち広範な代謝体（EM）と不良な代謝体（PM）において発現される。PMの発生率は集団が異なれば異なる。たとえば、CYP2D6をコードする遺伝子は非常に多形性であり、PMにおいていくつかの変異が同定されており、それらは全て機能的CYP2D6の非存在に至る。CYP2D6およびCYP2C19の不良な代謝体は、標準用量を投与された場合に、かなり頻繁に過剰な薬物反応および副作用を経験する。代謝物が活性な治療部分である場合、そのCYP2D6形成代謝物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛作用に関して証明されているように、PMは治療反応を示さない。他の極端な例は、標準用量に反応しないいわゆる超急速代謝体である。最近、超急速代謝の分子的基礎がCYP2D6遺伝子増幅によるものであることが同定されている。
【０２１２】
または、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法を利用して薬物反応を予測する遺伝子を同定することができる。たとえば、本発明の治療物質を投与した動物の遺伝子発現により、毒性に関連する遺伝子経路のスイッチが入っているか否かの指標が得られうる。
【０２１３】
2つ以上の上記の薬理ゲノム学アプローチから生成された情報を用いて、個体における予防的または治療的処置のための適当な用量および処置療法を決定することができる。この知識は、投与または薬物選択に応用した場合に、有害反応または治療失敗を回避することができ、このように本明細書において記載されるように治療物質によって被験体を処置する場合に、治療または予防効率を向上させることができる。
【０２１４】
治療物質は、適当な動物モデルにおいて試験することができる。たとえば、本明細書において記載されるsiRNA（または発現ベクターもしくはこれをコードするトランスジーン）を、該物質による処置の有効性、毒性、または副作用を決定するために動物モデルにおいて用いることができる。または、そのような物質の作用機序を決定するために、治療物質を動物モデルにおいて用いることができる。たとえば、そのような物質による処置の有効性、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルにおいて該物質を用いることができる。または、そのような物質の作用機序を決定するために、動物モデルにおいて該物質を用いることができる。
【０２１５】
d）適応症
特定の局面において、本発明は、疾患を処置するための物質（たとえば、RNAサイレンシング物質）を送達するより有効な手段を提供することによって疾患を処置する改善された方法を提供する。たとえば、本発明は、標的遺伝子の発現がサイレンシングされるように、関連する疾患関連標的遺伝子（たとえば、機能獲得障害標的遺伝子）をターゲティングすることによって障害を処置するためのRNAサイレンシング物質を含む送達複合体を提供する。本発明の組成物は、神経障害、細胞増殖および/または分化障害、骨代謝に関連する障害、免疫障害、造血障害、心血管障害、肝障害、ウイルス疾患、疼痛、または代謝障害の1つまたは複数を制御するための新規治療物質として作用しうる。
【０２１６】
本発明の送達複合体は、被験体（たとえば哺乳動物、たとえばヒト）に低用量で投与する場合に意外にも有効である。特に、本発明の送達複合体は、臨床的に許容され治療的に入手可能な方法で疾患関連遺伝子（たとえば、内因性の疾患関連遺伝子）をサイレンシングするために、ごく少量のRNAサイレンシング物質を必要とするに過ぎない。特定の態様において、送達複合体は、RNAサイレンシング物質の約1〜約50 mg/kgの有効量を被験体に提供する用量で投与される。より好ましい態様において、送達複合体は、RNAサイレンシング物質の約1〜約10 mg/kgの有効量を被験体に提供する有効量で投与される。特に好ましい態様において、送達複合体は、RNAサイレンシング物質の約1〜約5 mg/kg（たとえば、5 mg/kg、4 mg/kg、3 mg/kg、2.5 mg/kg、1.25 mg/kg、1 mg/kg、またはそれ未満）を提供する有効量で被験体に投与される。
【０２１７】
（i）細胞増殖/分化障害
細胞増殖および/または分化障害の例には、癌、たとえば癌腫、肉腫、転移性障害または造血新生物障害、たとえば白血病が含まれる。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳腺、および肝臓起源の癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない多数の原発腫瘍タイプから生じうる。
【０２１８】
本明細書において用いられる「癌」、「過増殖」または「新生物」という用語は、自律生育能、すなわち、急速に増殖する細胞生育を特徴とする異常な状態または条件を有する細胞を指す。過増殖および新生物疾患状態は、病理的であると分類されてもよく、すなわち疾患状態を特徴とするもしくは構成する、または非病理的、すなわち正常から逸脱しているが疾患状態には関連しないと分類される可能性がある。この用語には、組織学タイプまたは浸潤性の段階によらず、全てのタイプの癌様成長もしくは腫瘍形成プロセス、転移組織もしくは悪性の形質転換細胞、組織、または臓器が含まれることを意味する。「病理的過増殖」細胞は、悪性の腫瘍成長を特徴とする疾患状態において起こる。非病理的過増殖細胞の例には、創傷治癒に関連する細胞の増殖が含まれる。
【０２１９】
「癌」または「新生物」という用語には、肺、乳腺、甲状腺、リンパ様、消化管、および泌尿器管に罹患するような、様々な臓器系の悪性物と共に、ほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および/または精巣癌、非小細胞肺癌、小腸の癌および食道癌のような悪性物が含まれる腺癌が含まれる。
【０２２０】
「癌腫」という用語は、当技術分野において認識され、呼吸器系の癌、消化器系の癌、泌尿器系の癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系の癌、および黒色腫が含まれる上皮または内分泌組織の悪性物を指す。例示的な癌腫には、頚部、肺、前立腺、乳腺、頭頚部、結腸および卵巣の組織から形成される癌が含まれる。この用語にはまた、癌肉腫が含まれ、たとえば癌腫様および肉腫様組織で構成される悪性腫瘍が含まれる。「腺癌」とは、腺様組織に由来する、または腫瘍細胞が認識可能な腺様構造を形成する癌を指す。「肉腫」という用語は、当技術分野において認識され、間葉由来の悪性腫瘍を指す。
【０２２１】
増殖障害のさらなる例には、造血新生物障害が含まれる。本明細書において用いられる「造血新生物障害」という用語には、たとえば骨髄、リンパ、もしくは赤血球系列、またはその前駆細胞から発生する造血起源の過形成/新生物細胞を伴う疾患が含まれる。好ましくは疾患は、分化が不良な急性白血病、たとえば正赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から発生する。さらに例示的な骨髄障害には、急性前骨髄性白血病（APML）、急性骨髄性白血病（AML）、および慢性骨髄性白血病（CML）（Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97において論評）が含まれるがこれらに限定されるわけではなく；リンパ様悪性疾患には、B系列ALLおよびT-系列ALLが含まれる急性リンパ芽球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病（PLL）、ヘアリーセル白血病（HLL）、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（WM）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。さらなる型の悪性リンパ腫には、非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫（ATL）、皮膚T-細胞リンパ腫（CTCL）、大顆粒リンパ球性白血病（LGF）、ホジキン病およびリード-スターンバーグ病が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２２２】
一般的に、本発明の組成物は、特定の増殖障害に関連する遺伝子を標的とするように設計される。標的化されうる増殖障害に関連するそのような遺伝子の例には、活性化ras、p53、BRCA-1、およびBRCA-2が含まれる。
【０２２３】
（ii）神経障害
標的化されうる他の特異的遺伝子は、筋萎縮性側索硬化症（ALS、たとえばスーパーオキサイドジスムターゼ-1（SOD1)）；ハンチントン病（たとえば、huntingtin）、パーキンソン病（parkin）に関連する遺伝子、および常染色体優性障害に関連する遺伝子である。
【０２２４】
特定の態様において、神経障害はポリグルタミン障害である。本明細書において用いられる「ポリグルタミン障害」とは、コード領域の5'末端の拡大(CAG)n反復配列を特徴とする（このように、コードされるタンパク質において拡大ポリグルタミン領域をコードする）任意の疾患または障害を指す。1つの態様において、ポリグルタミン障害は神経細胞の進行性の変性を特徴とする。ポリグルタミン障害の例には、ハンチントン病、1型脊髄小脳運動失調、2型脊髄小脳運動失調、3型脊髄小脳運動失調（マチャド-ジョセフ病としても知られる）、6型脊髄小脳運動失調、7型脊髄小脳運動失調、および歯状核赤核-痰瘡球萎縮が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２２５】
（iii）免疫障害
本発明の組成物は、多様な免疫障害、特に遺伝子の過剰発現または変異体遺伝子の発現に関連する障害を処置するために用いることができる。造血障害または疾患の例には、自己免疫疾患（たとえば、真性糖尿病、関節炎（リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、変形性関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳脊髄炎、特発性両側性進行性知覚神経聴覚消失、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫、慢性活動性肝炎、スティーヴンス-ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症）、移植片対宿主病、移植症例、ならびにアトピー性アレルギーのようなアレルギーが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２２６】
（iv）心血管障害
心臓障害または「心血管障害」を伴う障害の例には、心血管系、たとえば心臓、血管、および/または血液を伴う疾患、障害、または状態が含まれるがこれらに限定されるわけではない。心血管障害は、動脈圧の不均衡、心臓の機能悪化、またはたとえば血栓による血管の閉鎖によって引き起こされうる。そのような障害の例には、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈痙縮、うっ血性心不全、冠動脈疾患、弁疾患、不整脈、および心筋症が含まれる。
【０２２７】
本明細書に記載の方法によって処置される可能性がある障害には、既存の線維の崩壊および縮合を伴う細胞外マトリクスの産生および分解の不均衡に起因する障害のような、肝臓における線維様組織の蓄積に関連する障害が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２２８】
（v）ウイルス障害
さらに、本発明の分子は、B型肝炎、C型肝炎、単純ヘルペスウイルス（HSV）、HIV-AIDS、ポリオウイルス、および痘瘡ウイルスが含まれるがこれらに限定されるわけではないウイルス疾患を処置するために用いることができる。本発明の分子は、本明細書に記載されるように、発現されたウイルスの配列を標的とするように操作され、このようにウイルス活性および複製を改善する。本分子は、ウイルス感染組織の処置および/または診断において用いることができる。同様に、そのような分子は、肝細胞癌のようなウイルス関連癌の処置において用いることができる。
【０２２９】
（vi）代謝疾患および障害
代謝障害は、体が生理機能を行うために必要な物質をどのように処理するかに影響を及ぼす。多数の代謝障害が特定の特徴を共有し、すなわちそれらはインスリン抵抗性、血糖の調節能の欠損、体重増加、ボディーマス指数の増加に関連する。代謝障害の例には、糖尿病および肥満と共に血清コレステロールレベルの増加が含まれる。糖尿病の例には、1型真性糖尿病、2型真性糖尿病、糖尿病性ニューロパシー、末梢ニューロパシー、糖尿病性網膜症、糖尿病性潰瘍、網膜症潰瘍化、糖尿病性大血管症、および肥満が含まれる。処置を必要とする被験体の同定または選択は、当技術分野において認識された診断技能または技術を用いて当業者の開業医または研究者によって行われうる。
【０２３０】
1つの態様において、本発明には、本発明のナノ輸送体はRNAサイレンシング物質（たとえば、siRNA）と共役して、コレステロールの増加に関連する標的遺伝子をサイレンシングすることによってコレステロールを減少させる方法が含まれ、ここで、標的遺伝子を効率的にターゲティングすることができる送達複合体を形成する。1つの態様において、標的遺伝子はapoBである。apoB-100は内因性の血清コレステロールの輸送および送達に関与している（Davidson and Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193）。apoB-100含有リポタンパク質Lp(a)の血漿レベルの上昇は、高コレステロール血症が含まれる可能性があるアテローム性動脈硬化症およびその発現のリスクの増加に関連する（Seed et al., N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499）。さらに、ApoB-100含有リポタンパク質Lp(a)の血漿レベルの上昇は、高コレステロール血症が含まれてもよいアテローム性動脈硬化症およびその発現のリスクの増加に関連する（Seed et al., N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499）。本発明は、生理的に正常であると許容されるレベルと比較して増加したまたは高いコレステロールレベルを有する被験体にHBOLD共役siRNAを投与することによって血清コレステロールを低下させる方法を提供する。
【０２３１】
別の態様において、本発明には、肥満に関連する標的遺伝子をサイレンシングすることによって肥満を処置する方法が含まれる。肥満は、糖尿病、卒中、冠動脈疾患、高血圧症、高コレステロール、ならびに腎臓および胆嚢の障害によるヒトの疾病および死亡のリスクを増加させる。肥満はまた、いくつかのタイプの癌のリスクを増加させる可能性があり、変形性関節炎および睡眠時無呼吸症の発症の危険因子である可能性がある。肥満は、単独で、または糖尿病を含む他の代謝障害と共に本発明のsiRNA共役ナノ輸送体によって処置されうる。
【０２３２】
肥満被験体は、当業者の開業医または研究者によって肥満であると診断されている（または肥満であると診断されるであろう）被験体、たとえばヒト被験体である。肥満の診断において利用される好ましい検査には、被験体の体重（キログラム）をその身長（メートル）の二乗によって除することによって計算されるボディーマス指数（BMI）が含まれる。BMI 25〜29.9は体重過剰であると見なされ、30またはそれより高い値は肥満であると見なされる（出典：Centers for Disease Control and Prevention and National Heart, Lung, and Blood Institute）。腹囲、矢状直径、およびウエスト-ヒップ比は、皮膚および腹腔内部に沈着した脂肪量を推定する単純な測定である。男性で100 cm（39インチ）および女性で90 cm（35インチ）を超える腹囲は、心疾患のリスクの増加に関連する。皮脂厚計−ほとんどの脂肪は、皮膚の下に沈着される。この試験は、皮膚のすぐ下の脂肪を測定するが、腹部内に蓄積された脂肪を測定することはできない。水置換性試験（Water Displacement Test）−脂肪は浮遊性であるが他の体組織は浮遊性ではない。被験体がどれほどうまく浮くかを決定することはボディーマスに対する脂肪の推定比を提供する。
【０２３３】
肥満を処置するために送達複合体（たとえば、RNAサイレンシング物質を含む送達複合体）によってターゲティングされる可能性がある遺伝子の例は、RIP140である。Leonardsson et al. (2004) PNAS 101 :8437において記載されるように、マウスにおける遺伝子ノックアウトによるRIP140遺伝子の欠失によって、マウスに高脂肪食を与えた場合でさえも脂肪蓄積の欠損が起こった。
【０２３４】
別の態様において、本発明は、糖尿病またはインスリン調節に関連する標的遺伝子をサイレンシングすることによって、2型糖尿病を含む糖尿病を処置する方法を提供する。糖尿病には、2つの最も一般的なタイプの障害、すなわちI型糖尿病とII型糖尿病が含まれ、いずれも体がインスリンを調節できないことに起因する。インスリンは、血液中の血糖（グルコース）レベルの増加に反応して膵臓によって放出されるホルモンである。
【０２３５】
本明細書において用いられる「1型糖尿病」という用語は、膵臓が産生するインスリンが少なすぎて血糖レベルを適切に調節することができない場合に起こる慢性疾患を指す。1型糖尿病はまた、インスリン依存型真性糖尿病IDMM、若年性糖尿病およびI型糖尿病とも呼ばれる。1型糖尿病は、その後のインスリン欠損を伴う膵臓β細胞の進行性の自己免疫的破壊の結果を表す。
【０２３６】
「2型糖尿病」という用語は、しばしば体がインスリンに対して十分に反応しないために、膵臓が血中グルコースレベルを正常に維持するために十分なインスリンを作製しない場合に起こる慢性疾患を指す。2型糖尿病はまた、非インスリン依存型真性糖尿病NDDM、およびII型糖尿病とも呼ばれる。
【０２３７】
糖尿病は、耐糖能試験を行うことによって診断することができる。臨床的に、糖尿病はしばしばいくつかの基本的カテゴリに分けられる。これらのカテゴリの主な例には、自己免疫性真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病（1型NDDM）、インスリン依存型真性糖尿病（2型IDDM）、非自己免疫性真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病（2型NIDDM）、および若年発症成人型糖尿病（MODY）が含まれる。二次性と呼ばれるさらなるカテゴリは、糖尿病症候群の発症を引き起こす、または発症させるいくつかの同定可能な状態によってもたらされる糖尿病を指す。二次性カテゴリの例には、膵臓疾患、ホルモン異常によって引き起こされる糖尿病、薬物または化学物質誘発性糖尿病、インスリン受容体異常によって引き起こされる糖尿病、遺伝子症候群に関連する糖尿病、および他の原因の糖尿病（たとえば、Harrison's (1996) 14th ed., New York, McGraw-Hillを参照されたい）が含まれる。
【０２３８】
糖尿病はしばしば、食事、インスリン投与、および本明細書において記載される様々な投薬によって処置される。したがって、本発明のsiRNA会合ナノ輸送体はまた、代謝障害および糖尿病に一般的に関連する疼痛を処置するために一般的に用いられる物質と併用して投与してもよい。
【０２３９】
糖尿病被験体は、当業者の開業医または研究者によって糖尿病を有すると診断されている（または糖尿病を有すると診断されるであろう）被験体、たとえばヒト被験体である。糖尿病診断において利用される好ましい検査には、絶食時血漿中グルコース（FPG）試験、および耐糖能試験、たとえば75 g経口グルコース負荷試験（OGTT）が含まれる。糖尿病診断に関する例示的な基準を以下に述べる。
2009524679.tif 000013
‡ 中央の値は、グルコース寛容減損（IGT）、または絶食時グルコース障害（IFG）を示す。
* 糖尿病の診断は、翌日のFPG、2-h PG、またはランダム血漿グルコース（症状が存在する場合）の測定によって確認しなければならない。絶食は少なくとも8時間カロリー摂取がないこととして定義される。
† この試験は、水に溶解した無水グルコース75 gと同等量を含有するグルコース負荷を用いることを必要とする。2-h PG、グルコース負荷後2時間値
【０２４０】
インスリン抵抗性の被験体は、当技術分野の開業医または研究者によってインスリン抵抗性であると診断されている（またはインスリン抵抗性であると診断されるであろう）被験体、たとえばヒト被験体である。インスリン抵抗性の被験体は、たとえば該被験体における絶食時グルコースおよび/またはインスリンレベルを決定することによって同定することができる。好ましい態様において、インスリン抵抗性の被験体は110 mg/dL未満の絶食時グルコースレベルを有し、30 mU/Lより大きい絶食時インスリンレベルを有する。
【０２４１】
糖尿病を処置するために本発明の送達複合体（たとえば、標的特異的siRNAに会合したナノ輸送体）によってターゲティングされる遺伝子の例は、RIP140である。
【０２４２】
本発明はまた、レシピエント被験体を免疫的に刺激することなく、障害が処置される代謝障害を処置する方法も提供する。たとえば、RNAサイレンシング物質（たとえば、siRNA）をHBOLDナノ輸送体によって改変することによって、該RNAサイレンシング物質による処置を受けている代謝障害を有する被験体において、インターフェロン反応を低減または消失させることができる。このように、本発明の化学改変RNAサイレンシング物質を用いて代謝障害を処置する方法は、それがレシピエントにおける免疫刺激を迂回することから、他の治療に対して改善を提供する。
【０２４３】
VIII．スクリーニングアッセイ
本発明の方法はまた、可能性がある薬理学的物質を同定および/または特徴付けする、たとえば試験物質の集合体から新規薬理学的物質を同定する、ならびに/または公知の薬理学的物質の作用および/もしくは副作用の機構を特徴付けする方法において用いるために適している。
【０２４４】
このように、本発明はまた、以下を含む、少なくとも1つの標的タンパク質に作用する薬理学的物質を同定および/または特徴付けするための系に関する：（a）該標的タンパク質をコードする少なくとも1つの内因性の標的遺伝子を発現することができる真核細胞または真核非ヒト生物；（b）該少なくとも1つの内因性の標的遺伝子の発現を阻害する少なくとも1つの組成物（たとえば、RNAサイレンシング物質またはこれを含む送達複合体）；ならびに（c）該試験物質または該コレクションの薬理学的特性が同定および/または特徴付けされる、試験物質または試験物質のコレクション。さらに、先に記載した系は、好ましくは以下を含む：（d）標的タンパク質または標的タンパク質の変種もしくは変異型をコードする少なくとも1つの外因性の標的核酸であって、ここで、外因性の標的核酸の発現が、内因性の標的遺伝子の発現と比べて、組成物によって実質的にほとんど阻害されないように、外因性の標的核酸は核酸レベルで内因性の標的遺伝子とは異なる。
【０２４５】
本発明の試験化合物は、以下を含む、当技術分野において公知の組み合わせライブラリ法における多数の任意のアプローチを用いて得ることができる：生物ライブラリ；空間的に位置特定可能な平行固相または液相ライブラリ；逆重畳を必要とする合成ライブラリ法；1ビーズ1化合物ライブラリ法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法。生物ライブラリアプローチはペプチドライブラリに限定されるが、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子化合物ライブラリに応用可能である（Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145）。
【０２４６】
分子ライブラリの合成法の例は、当技術分野において、たとえばDeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90:6909；Erb et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:11422；Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678；Cho et al. (1993) Science 261 : 1303；Carrell et al. (1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059；Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233において見られる。
【０２４７】
化合物のライブラリは、溶液中（たとえば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ（Lam (1991) Nature 354:82-84）、チップ（Fodor (1993) Nature 364:555-556）、細菌（Ladner USP 5,223,409）、胞子（Ladner USP '409）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）、またはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249:386-390)；(Devlin (1990) Science 249:404-406)；(Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382)；(Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner、前記)）上に存在してもよい。
【０２４８】
好ましい態様において、ライブラリは天然物ライブラリ、たとえば細菌、真菌、または酵母培養物によって産生されるライブラリである。別の好ましい態様において、ライブラリは合成化合物ライブラリである。
【０２４９】
IX．ノックアウトおよび/またはノックダウン細胞または生物
本発明のsiRNA分子（または、ベクターもしくはこれをコードするトランスジーン）に関するさらに好ましい使用は、真核細胞、または真核非ヒト生物、好ましくは哺乳動物細胞または生物、および最も好ましくはヒト細胞、たとえばHeLaもしくは293のような細胞株、または齧歯類、たとえばラットおよびマウスにおいて行われる機能的分析である。標的特異的RNA干渉を指示するために標的mRNA配列と十分に相補的である適切なsiRNA分子を投与することによって、標的細胞、たとえば細胞培養または標的生物において特異的ノックアウトまたはノックダウン表現型を得ることができる。
【０２５０】
このように、本発明のさらなる主題は、細胞または生物が、標的遺伝子の発現を阻害することができるsiRNA分子をコードするDNAを含む少なくとも1つのベクターによってトランスフェクトされる、少なくとも1つの内因性の標的遺伝子の完全なまたは少なくとも部分的に欠損した発現を含む標的遺伝子特異的ノックアウトまたはノックダウン表現型を示す真核細胞または真核非ヒト生物である。本発明によって、RNAサイレンシング物質の特異性により、いくつかの異なる内因性の遺伝子の標的特異的ノックアウトまたはノックダウンが可能となることに注意すべきである。
【０２５１】
細胞または非ヒト生物、特にヒト細胞または非ヒト哺乳動物の遺伝子特異的ノックアウトまたはノックダウン表現型を、技法に対して分析的に、たとえば遺伝子発現プロフィールおよび/またはプロテオームの分析のような複雑な生理的プロセスの機能的および/または表現型分析において、用いてもよい。好ましくは、分析は、オリゴヌクレオチドに基づくチップを用いたハイスループット法によって行われる。
【０２５２】
X．薬学的組成物
本発明は、以下に記載されるように治療的処置のために上記の任意のナノ輸送体またはRNAサイレンシング物質を用いることに関する。したがって、本発明のナノ輸送体は、投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という言語には、薬学的投与に適合する生理食塩液、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。補助的活性化合物も同様に組成物に組み入れることができる。
【０２５３】
薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、非経口、たとえば静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸内投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれうる：注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩のような緩衝剤；ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性調節剤。pHは塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調節することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアルに封入することができる。
【０２５４】
注射での使用に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩液、静菌水、Cremophor EL(商標)（BASF, Parsippany, NJ）、またはリン酸緩衝生理食塩液（PBS）が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌的でなければならず、シリンジ操作性が容易な程度に流動性であるべきである。これは製造および保存条件で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体となりうる。適切な流動性はたとえば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサル等によって行うことができる。多くの場合において、等張剤、たとえば糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる物質、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされうる。
【０２５５】
滅菌注射用溶液は、先に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に適当な溶媒において必要量の化合物を組み入れて、必要に応じて濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、基本分散培地および先に列挙した必要な他の成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、予め濾過滅菌したその溶液からの活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２５６】
経口組成物には、一般的に不活性希釈剤または食用担体が含まれる。経口治療的投与の目的に関して、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、たとえばゼラチンカプセルの剤形で用いることができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして用いるための液体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合性の結合剤、および/またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の任意の成分、または類似の特性の化合物を含みうる：微晶質セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤；アルギン酸、Primogel、もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotesのような潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素のようなグライダント；蔗糖もしくはサッカリンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料のような着香料。
【０２５７】
吸入による投与の場合、化合物は、適切な推進剤、たとえば二酸化炭素のような気体を含有する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの剤形で送達される。そのような方法には、U.S. Patent No. 6,468,798において記載される方法が含まれる。
【０２５８】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によっても行うことができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透される障壁に対して適当な浸透剤を処方において用いる。そのような浸透剤は一般的に当技術分野において公知であり。これにはたとえば、経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤を用いることによって行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野において一般的に公知であるように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに処方される。
【０２５９】
化合物はまた、直腸内送達のために坐剤（たとえば、ココアバターおよび他のグリセリドのような通常の坐剤基剤と共に）または保持浣腸の剤形で調製することができる。
【０２６０】
化合物はまた、McCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38-9（ハイドロダイナミックトランスフェクション）；Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10（ウイルス媒介送達）；またはPutnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2), 151-160（Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325 (1996)の誤植）において記載される方法が含まれるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の方法を用いてトランスフェクションまたは感染によって投与することができる。
【０２６１】
化合物はまた、DNAワクチンのような核酸物質の投与に適した任意の方法によって投与することができる。これらの方法には、遺伝子銃、バイオインジェクター、およびスキンパッチと共に、U.S. Patent No. 6,194,389において開示される微粒子DNAワクチン技術のような無針法およびU.S. Patent No. 6,168,587において開示される粉末型ワクチンによる哺乳動物の経皮的無針ワクチン接種が含まれる。さらに、中でもHamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10において記載される鼻腔内送達が可能である。リポソーム（たとえば、U.S. Patent No. 6,472,375において記載されるように）および微小封入も同様に用いることができる。生体分解性のターゲティング可能な送達系も同様に用いることができる（たとえば、U.S. Patent No. 6,471,996において記載されるように）。
【０２６２】
1つの態様において、活性化合物は、インプラントおよび微小封入送達系を含む徐放性製剤のような、体からの急速な消失に対して化合物を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生体分解性の生体適合性のポリマーを用いることができる。そのような処方は標準的な技術を用いて調製することができる。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Incから購入することができる。リポソーム浮遊液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、たとえばU.S. Patent No. 4,522,811において記載されるように当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０２６３】
そのような化合物の毒性および治療効率は、たとえばLD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効である用量）の決定のような、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的技法によって決定されうる。毒性効果と治療効果の用量比が治療指数であり、比LD50/ED50として表記されうる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いる場合には、非感染細胞に対する起こりうる損傷を最小限にして、それによって副作用を低減するために、罹患組織部位に対してそのような化合物を標的化する送達系を設計するために注意すべきである。
【０２６４】
本発明の化合物（たとえば、siRNA、候補siRNA誘導体、改変siRNA等）（すなわち有効量）を含有する組成物の治療的有効量は、標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を少なくとも30％阻害する量である。特定の態様において、より高い割合の阻害、たとえば45、50、75、85、90％またはそれより高い阻害が好ましい可能性がある。例示的な用量には、被験体または試料の重量1キログラムあたりミリグラムまたはマイクログラム量（たとえば、約1μg/kg〜約500 mg/kg、約100μg/kg〜約5 mg/kg、または約1μg/kg〜約50μg/kg）の分子が含まれる。組成物は、約1〜10週間にわたって、たとえば2〜8週間、約3〜7週間、または約4、5、もしくは6週間にわたって週1回投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、これまでの処置、被験体の全身健康および/または年齢、および存在する他の疾患が含まれるがこれらに限定されるわけではない特定の要因が、被験体を有効に処置するために必要な用量および時期に影響を及ぼす可能性があることを認識するであろう。その上、組成物の治療的有効量による被験体の処置には、1回の処置または一連の処置が含まれうる。
【０２６５】
組成物の適当な用量は、調節されるべき発現または活性に関して組成物の効力に依存するとさらに認識される。本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、これらの分子の1つまたは複数を動物（たとえば、ヒト）に投与する場合、医師、獣医師、または研究者は、たとえば、比較的低用量を最初に処方して、適当な反応が得られるまでその後用量を増加させてもよい。さらに、任意の特定の被験体に関する特異的用量レベルは、使用される特異的化合物の活性、被験体の年齢、体重、全身健康、性別、および食事、投与時期、投与経路、排泄速度、任意の薬物併用、および調節されるべき発現または活性の程度を含む多様な要因に依存するであろうと理解される。
【０２６６】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて用いるための広範囲の用量を処方するために用いることができる。そのような化合物の用量は好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を示さないED50が含まれる循環中の濃度範囲内に存在する。用量は、用いる投与剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。本発明の方法において用いられる任意の化合物に関して、治療的有効量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養において決定されたIC50（すなわち症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）が含まれる循環中の血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方されてもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルはたとえば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０２６７】
薬学的組成物は、投与説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含まれうる。
【０２６８】
XI．投与法
本発明の組成物（たとえば、ナノ輸送体、RNAサイレンシング物質、または送達複合体）を導入する物理的方法には、組成物を含む溶液の注射、組成物によって覆われた粒子の衝突、または組成物の存在下での細胞膜の電気穿孔が含まれる。組成物が、核酸分子を含む場合、ウイルス粒子にパッケージングされるウイルス構築物は、発現構築物の細胞への効率的な導入および発現構築物によってコードされる核酸分子の転写の双方を達成するであろう。脂質媒介担体輸送、リン酸カルシウムのような化学物質媒介輸送等のような、核酸を細胞に導入するための当技術分野において公知の他の方法を用いてもよい。このように、核酸（たとえば、RNAサイレンシング物質）を、以下の活性の1つまたは複数を行う成分と共に導入してもよい：細胞による核酸の取り込みの増強、標的遺伝子の鎖のアニーリングの阻害、鎖の安定化、または阻害の増加。
【０２６９】
組成物は細胞に直接導入してもよく（すなわち、細胞内）、または生物の体腔、間質腔、循環中に細胞外導入してもよい。血管または血管外循環、たとえば血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、組成物が導入される部位である。
【０２７０】
標的遺伝子を有する細胞は、動物を含む任意の生物に由来するまたは含まれてもよい。脊椎動物が好ましい。脊椎動物の例には、魚類、哺乳動物、畜牛、ヤギ、ブタ、ヒツジ、齧歯類、ハムスター、マウス、ラット、霊長類、およびヒトが含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明の物質はヒトにおいて用いるために特に適している。
【０２７１】
特定の標的遺伝子および送達される組成物の用量に応じて、このプロセスは、標的遺伝子に関する部分的または完全な機能の喪失を提供する可能性がある。少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、または99％またはそれより多い標的細胞における遺伝子発現の低減または喪失は、その例である。遺伝子発現の阻害は、標的遺伝子からのタンパク質レベルおよび/またはmRNA産物レベルの非存在（または検出可能な減少）を指す。特異性とは、細胞の他の遺伝子に明白な効果を及ぼすことなく、標的遺伝子を阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞もしくは生物の外向きの特性（以下の実施例において表されるように）を調べることによって、またはRNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（RIA）、他のイムノアッセイ、および蛍光活性化細胞分析（FACS）のような生化学技術によって確認することができる。
【０２７２】
遺伝子発現量の定量によって、本発明に従って処置していない細胞または生物と比較して10％、33％、50％、90％、95％、または99％より大きい阻害の程度を決定することができる。注入材料がより低用量で、組成物の投与後の期間が長ければ、より小さい割合の阻害が起こる可能性がある（たとえば、少なくとも10％、20％、50％、75％、90％、または95％の阻害）。遺伝子発現の定量は、標的mRNAの蓄積または標的タンパク質の翻訳レベルで類似の量の阻害を示す可能性がある。例として、処置した生物に由来する細胞または組織における遺伝子産物の量を査定することによって、阻害効率を決定してもよく；阻害性の二本鎖RNAに関して用いられる領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによってmRNAを検出してもよく、または翻訳されたポリペプチドをその領域のポリペプチド配列に対して作製された抗体によって検出してもよい。
【０２７３】
組成物は、細胞あたり少なくとも1分子（たとえば、RNA少なくとも1コピー）の送達を可能にする量で導入されてもよい。より高用量（たとえば、少なくとも5、10、100、500、または1000コピー/細胞）の材料は、より有効な阻害を生じる可能性があり；低用量も同様に特異的応用にとって有用となる可能性がある。
【０２７４】
実施例
以下の材料、方法および実施例は、説明目的であることを意味し、制限的であると解釈されない。
【０２７５】
実施例1．例示的なナノ粒子の合成
様々なナノ粒子（たとえば、デンドリマー）を、本発明のナノ輸送体において用いるために合成することができる。例示的な高分子量または低分子量デンドリマーの合成を以下に記載する。
【０２７６】
a．高分子量ポリリジンデンドリマーの合成
tert-ブチル5-(メトキシカルボニル)-5-アミノペンチルカルバメートおよびtert-ブチル2-(カルボキシ)-エチルカルバメートを、DMFにおいてBOP、DIEAと共に室温で24時間反応させる。得られた産物は、その後の世代を作製するために用いられるデンドロンである。デンドロンを1.0 M NaOHおよび1,4-ジオキサンメタノールと共に反応させる。次に、その反応産物をDMFにおいて1,5-ジアミン、BOP、およびDIEAと共に室温で24時間反応させる。得られた複合体は、図4Aにおいて描写されるようにポリリジンデンドリマー世代1（「LDG1」）である。
【０２７７】
次に、LDG1を室温でTFAと共に30分間反応させる。得られた産物をデンドロン、BOP、DIEAと共にDMFにおいて室温で24時間反応させる。得られたこの反応産物は、図4Bにおいて描写されるポリリジンデンドリマー世代2（「LDG2」）である。上記の2つの反応段階を1回繰り返すと、第3世代のデンドリマー（「LDG3」、図4Cを参照されたい）を形成し、2回繰り返すと、第4世代のデンドリマー（「LDG4」、図4D）を形成する。
【０２７８】
b．低分子量ポリリジンデンドリマーの合成
反応の第一段階において、Fmoc-β-Ala-OHをHOBtおよびDICと共に室温で6時間反応させる。次に、この第一段階の産物をFmoc-Cys(Trt)-OHおよびHBTU/HOBtと共に室温で2時間反応させる。得られた産物をFmoc-Lys(Fmoc)-OHおよびHBTU/HOBtと共に室温でさらに2時間反応させる。この最終段階をさらに2回繰り返す。得られた産物を図5に示す。次に、MBHA樹脂を、94％TFA、2.5％水、2.5％EDC、および1％TISを含む溶液を用いて除去する。
【０２７９】
実施例2．例示的な官能表面基の合成
様々な官能表面基（たとえば、脂質官能表面基）を本発明のナノ輸送体において用いるために合成することができる。例示的な脂質官能表面基の合成を以下に記載する。
【０２８０】
図6Aにおいて見られるように、オレオイル誘導体を合成することができる。塩化オレオイルをEt3N、DMAP、およびTHF/CH2Cl2においてヒドロキシピロリジン-2,5-ジオンと反応させる。得られたオレオイル誘導体は脂質官能表面基として用いることができる。
【０２８１】
または、図6Bにおいて見られるように、PEG（ポリエチレングリコール）誘導体を、本発明によって用いるために合成することができる。PEGをCH2Cl2においてジヒドロフラン-2,5-ジオンと反応させてPEG誘導体を生じる。PEG誘導体は脂質官能表面基として用いることができる。
【０２８２】
他の態様において、コレステロール誘導体を、本発明と共に用いるために合成することができる（図6Cを参照されたい）。コレステロールをCH2Cl2においてジヒドロフラン-2,5-ジオンと反応させる。その反応産物を、DCCおよびCH2Cl2においてヒドロキシピロリジン-2,5-ジオンとさらに反応させると、本発明において脂質官能表面基として用いることができるコレステロール誘導体を生じる。
【０２８３】
さらに他の態様において、オレオイル酸誘導体を、本発明と共に用いるために合成することができる（図7を参照されたい）。プロパン-1,2,3-トリオールをTr-Cl、Et3N、およびDMAPと共に反応させる。次に、この反応産物を塩化オレオイルと反応させる。次に、85％HCOOHおよびEt2Oを用いてトリフェニルメチル保護基を除去する。得られた産物をEDCにおいて3-(2,5-ジオキソ-2H-ピロル-1(5H)-イル)プロパン酸と反応させると、所望のオレオイル酸誘導体を生じる。
【０２８４】
実施例3．例示的なナノ輸送体の合成
特定の態様において、本発明のナノ輸送体は、官能表面基（たとえば、脂質）をコア粒子（たとえば、ナノ粒子、たとえば低分子量デンドリマー）と組み合わせることによって合成することができる（図8を参照されたい）。例示的なナノ輸送体の合成を以下に記載する。
【０２８５】
a．フルオレセイン標識オレオイル-ポリリジンデンドリマー世代4の合成
1つの例示的な態様において、脂質（たとえば、オレオイル誘導体）および蛍光基（たとえば、フルオレセイン）をナノ粒子（たとえば、高分子量デンドリマー）に連結することによって、ナノ輸送体を合成する。たとえば図9において見られるように、トリエチルアミン、およびDMFにおいて、LDG4をLDG4対オレオイル誘導体1：8の比率でオレオイル誘導体と、およびLDG4対6-フルオレセインNHSエステル1：4の比率で6-フルオレセインNHSエステルと室温で24時間混合してもよい。この反応産物を洗浄、再沈殿、および透析によって精製する。
【０２８６】
b．LDG4コア、オレオイル誘導体脂質官能表面基、および環状の細胞型特異的ターゲティング部分を含むナノ輸送体の合成
1つの例示的な態様において、ナノ輸送体は、脂質および細胞型特異的ターゲティング部分をナノ粒子に連結させることによって合成される。たとえば、ナノ輸送体は、高分子量デンドリマーに連結させたオレオイル誘導体および環状CNGRC内皮細胞特異的ペプチドを含んでもよい（図11を参照されたい）。図12において示される反応の最初の2つの段階において認められうるように、環状ペプチドCNGRCを最初に、標準的な実践に従って環状にする。次に、環状部分をBOP、およびDIEAにおいてナノ輸送体（たとえば、HBOLDナノ輸送体）と反応させる。次に複合体をTFAによって洗浄して保護基を除去し、最終産物を得る。CKGGRAKDC細胞型特異的ターゲティング部分を使用する別のナノ輸送体の例示的な合成を図13に描写する。
【０２８７】
c．NOP7ナノ輸送体の合成
別の例示的な態様において、本発明において用いられる例示的なナノ輸送体（本明細書において、「NOP-7」、図26を参照されたい）は、化学合成されて、オレオイル脂質によって標識され、NMRおよび質量分析によって精製および特徴付けされた世代4のリジンデンドリマーである（図27および28を参照されたい）。動的光散乱実験により、NOP-7の平均直径が15 nmであることが示された（図29A）。
【０２８８】
実施例4．例示的なナノ輸送体の合成：RNAサイレンシング物質送達複合体
特定の例示的な態様において、本発明の送達複合体は、RNAサイレンシング物質（たとえばsiRNA）を二官能リンカーを用いて、ナノ輸送体において使用される官能表面基（たとえば、細胞特異的ターゲティングペプチド、たとえば肺特異的ペプチド）に共役させることによって合成することができる（図14を参照されたい）。
【０２８９】
1つの例示的な態様において、siRNAは、図15において描写される多数のクロスリンクした肺特異的ペプチドに共役される。siRNAを、それが改変肺細胞特異的ペプチドのクロスリンカー部分におけるシステインのチオール基と反応するように、スルホスクシニミジル-4-(P-マレイミドフェニル)ブチレート（Sulfo-SMPB）と反応させてもよい（図16を参照されたい）。
【０２９０】
別の例示的な態様において、siRNAはナノチューブに共役される。カーボンナノチューブを2.5 M HNO3において36時間還流する。反応混合物を30分間超音波処理した後、再度さらに36時間還流する。反応混合物をポリカーボネートフィルター（孔径100 nm）において濾過して、すすぎ、水に浮遊させる。次に、混合物を7000 RPMで5分間遠心する。産物をEDC、5-(5-アミノペンチル)チオウレイジルフルオレセイン、およびリン酸緩衝液と反応させる。得られた産物をEDC、N3-5'-ssRNA、およびリン酸緩衝液とさらに反応させる。この反応産物を脂質官能表面基とさらに反応させることができる。適切な脂質官能表面基の例には、オレオイルアミン（図17の反応の段階Cにおいて認められる）およびコレステロール（図17の反応の段階Dにおいて認められる）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。脂質官能表面基をEDCにおいてナノチューブに付着させる。N3-3'-アンチセンスRNAおよびEDCを、上記の反応からの産物に加える。最後に、得られた産物にセンスRNAを加えて、最終的なカーボンナノチューブ-siRNA共役体を生じる。
【０２９１】
別の例示的な態様において、送達複合体は（i）一級アミン45個を有するLDG5ナノ粒子、（ii）脂質官能表面基16個、および（iii）チオール共役siRNA 3個（図48A）を含む。別の例示的な態様において、送達複合体は、（i）一級アミン22個を有するLDG4ナノ粒子、脂質官能表面基7個、およびチオール共役siRNA 3個を含む（図48B）。
【０２９２】
（a）iNOP7送達複合体
別の例示的な態様において、上記のNOP-7ナノ輸送体をsiRNAと混合して「iNOP-y」と呼ばれる送達複合体を形成する。例示的なiNOP7送達複合体は、siRNAとNOP-7ナノ輸送体をHepes生理食塩液またはOpti-MEM培養培地（Invitrogen）において1：2（w/w）の比率で混合する段階、および室温で20分間インキュベートする段階によって調製された。動的光散乱実験により、siRNAをNOP-7に加えると、複合体の平均直径が〜200 nmに増加することが示された（図29B）。
【０２９３】
用いたApoB siRNA（表2を参照されたい）は、5'-ヒドロキシルを保護するためにシリルエーテルを用いて、および2'-ヒドロキシル（2'-ACE）（Dharmacon, Lafayette, CO, USA）を保護するために酸不安定なオルトエステルを用いて化学合成された。脱保護および精製後、siRNA鎖を記載のようにアニーリングした（Chiu and Rana. RNA, (2003), RNA, 9:1034-48）。ApoB siRNAは全てORFの10049〜10071位を標的とする。
【０２９４】
（表２）Apo-B siRNA
2009524679.tif 000014
注意：上付き文字FおよびSはそれぞれ、2'-O-フルオロ（F）およびホスホロチオエート骨格改変（SH）を有するヌクレオチド類似体を表す。
【０２９５】
実施例5：送達複合体によるapoB遺伝子発現のインビトロサイレンシング
a）HBOLDおよびsiRNAを含む送達複合体を用いるapoB遺伝子発現のインビトロサイレンシング
FL83B（マウス肝細胞）細胞におけるapoB mRNAサイレンシングを、siRNAに会合したHBOLDナノ輸送体を含む例示的な送達複合体を用いて試験した。転写アッセイにおいて用いられるHBOLD構築物の量には、0.25 μM HBOLD＝1.4μgおよび1μM HBOLD＝5.8μgが含まれた。さらに、TNXに関して1.4μgを用いて、L2Kを濃度2μg/mlで用いた。図20において示されるように、apoB標的化HBOLDナノ輸送体は、マウス肝細胞におけるapoBの転写の減少において有効であった。
【０２９６】
b）NOP-7およびsiRNA（「iNOP-7」）を含む送達複合体を用いるapoB遺伝子発現のインビトロサイレンシング
FL83B（マウス肝細胞）細胞におけるApoB mRNAサイレンシングを、先に記載した例示的なiNOP-7送達複合体を用いて試験した。
【０２９７】
FL83B（マウス肝細胞）細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）、100 U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したF12 Khangians改変培養培地（ATCC, USA）において5％CO2と共に37℃で維持した。細胞を通常通り継代して、70％コンフルエンシーでトランスフェクトするまで96ウェルおよび6ウェル培養プレートに16時間播種した。細胞にiNOP-7複合体1 ml/ウェルを37℃で2.5時間トランスフェクトした。培地を除去して抗生物質を含まない完全な増殖培地に交換して、さらに24時間インキュベートした。細胞の生存率を、CellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution細胞増殖アッセイを用いて、製造元（Promega, USA）の説明書に従ってMTSテトラゾリウム化合物の比色分析によって査定した。総RNAはRNeasyミニスピンカラムを用いて抽出し、DNアーゼI（Qiagen, USA）によって処置した後定量した。apoB mRNAレベルを査定するために、SYBRグリーン（Qiagen, USA）を用いてフォワードapoBプライマー
2009524679.tif 000015
およびリバースapoBプライマー
2009524679.tif 000016
によってリアルタイム定量的PCR（qPCR）を行った。次に、apoB mRNAレベルをフォワードGAPDHプライマー
2009524679.tif 000017
およびリバースGAPDHプライマー
2009524679.tif 000018
を用いてハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して標準化した。
【０２９８】
図30Aにおいて認められるように、NOP-7および非改変apoB siRNAを含有する例示的な送達複合体は、対照またはミスマッチsiRNAおよびNOP-7ナノ輸送体を含有する送達物質を処置した細胞と比較して、FL83B細胞におけるapoB mRNA発現をほぼ完全にサイレンシングした（＞90％）。siRNA輸送体として送達物質を用いるapoB mRNAサイレンシング効率は、非改変siRNAと複合体を形成したLipofectamine 2000をトランスフェクトした細胞の効率と類似であった。NOP-7およびapoBに対する化学改変siRNAを含む例示的な送達複合体は、NOP-7および非改変apoB siRNAを含む例示的な送達物質よりapoB mRNAのサイレンシングにおいて有効であった（図30A）。これらの結果は、NPO-7およびsiRNAを含む例示的な送達複合体がRNAi活性に負の影響を及ぼさないことを示している。
【０２９９】
FL83B細胞におけるapoB mRNAレベルの低減は、位相差顕微鏡（結果を示していない）および改変MTS細胞生存率アッセイ（図30B）によって確認したところ、送達複合体誘発細胞毒性のためではなかった。併せて考慮すると、これらの結果は、例示的な送達複合体が非毒性であり、siRNAを細胞に効率的に輸送することを証明する。
【０３００】
実施例6：apoB siRNA送達複合体を用いるコレステロールのインビボ減少
（a）HBOLDおよびsiRNAを含む送達複合体を用いるapoB遺伝子発現のインビボサイレンシング
本発明の例示的な送達複合体、すなわちsiRNAに共役したHBOLDをapoB遺伝子のサイレンシングおよびコレステロールレベルの減少におけるインビボ有効性に関して試験した。HBOLDに共役したapoB特異的siRNAのインビボ有効性を試験するために用いた構築物を図21に描写する。
【０３０１】
HBOLD/apoB-特異的siRNA（ApoB/HBOLD）のインビボ投与によって、apoBタンパク質発現の減少（図22において示されるように）と共に血漿コレステロールレベルの全体的な減少（図23において示されるように）が起こった。図23において記載されるように、apoB_HBOLDは、対照およびミスマッチApoBmm_HBOLD対照と比較して血漿コレステロールレベルを34.4％減少させることができた。コレステロールレベルの減少は、図24において示されるように、apoB遺伝子のサイレンシングに起因した。重要なことに、ApoBmm_HBOLDおよびapoB/HBOLDを含むHBOLD構築物の投与は、図25において示されるように、レシピエントにおけるインビボ免疫刺激を誘発しなかった。このように、ApoB_HBOLDはapoB発現のサイレンシング、およびレシピエントにおけるコレステロールレベルの減少においても有効でありのみならず、これは免疫刺激剤として作用しないことから安全であった。
【０３０２】
（b）iNOP-7送達複合体を用いるapoB遺伝子発現のインビボサイレンシング
別の例示的な態様において、送達複合体iNOP-7を、apoB遺伝子のサイレンシングおよびコレステロールレベルの減少におけるインビボ有効性に関して試験した。NOP-7と化学改変（CM）apoB siRNAまたはそのミスマッチ（MM）siRNAのいずれかとを含む送達複合体を、先に記載されるように調製した。
【０３０３】
6〜8週齢の雄性C57BL/6マウス（Charles River laboratories, USA）を病原体を含まない動物施設において12時間の照明サイクルで維持した。マウスに、リン酸緩衝生理食塩液pH 7.4（PBS）または例示的な送達物質複合体、すなわち化学改変（CM）apoB siRNAまたはそのミスマッチ（mm）siRNAのNOP-7複合体を、側方尾静脈から3日間連続して注射した。1日量1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、または5 mg/kgの送達複合体を全量0.15 mlにおいて送達した。最後の注射の24時間後、肝組織のapoB mRNAレベル、apoBタンパク質の血漿レベル、および総血漿コレステロールを測定した。血漿コレステロールは、製造元（Biodesign International, USA）の説明書に従って市販の酵素アッセイによって測定した。
【０３０４】
送達複合体による処置後の肝組織におけるapoB mRNAレベルを決定するために、小さい均一な組織試料を肝臓の3つの領域から採取した。総RNAをTrizolによって抽出して、DNアーゼIによって処置した後に定量した。apoB mRNAレベルは先に記載したようにqPCRによって決定した。apoBタンパク質レベルは、ポリクローナルヤギ抗apoB 100/48抗体（Santa Cruz, USA）を用いてウェスタンブロットによって決定した。次に、apoBタンパク質レベルを高感度化学発光（PerkinElmer Life Sciences, USA）によって検出した。対照として、フィブロネクチンをポリクローナルウサギ抗フィブロネクチン抗体（Sigma, USA）を用いてイムノブロットによって可視化した。
【０３０５】
ApoB mRNAは、対照マウスおよびミスマッチsiRNAを含有する送達複合体によって処置したマウスからの肝臓と比較して、化学改変siRNAを含有する送達複合体の1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、または5 mg/kgを処置したマウスからの肝組織において有意に低かった（それぞれ、51±3％、51±3％、および47±3％、動物n＝3〜4）（図32A）。マウス肝臓におけるapoB siRNAのガイド鎖の存在は、例示的な送達複合体によって処置したマウス肝臓から単離された総RNAのノザンブロット分析を行うことによって決定した。ガイド鎖は、最後の送達複合体注射の24時間後でも動物の肝臓に未だ存在した（図32B）。ガイド鎖の強いシグナルは、非改変siRNAと共に組み立てた送達複合体と比較して、送達複合体が化学改変siRNAを含有する場合に観察された（図32B）。これらの結果は、非改変siRNAがインビボでapoB mRNAを有効にサイレンシングしなかったという知見と相関する（Soutschek, J., et al., (2004). Nature 432, 173-8）。
【０３０６】
非改変または化学改変siRNA二重鎖をナノ輸送体NOP-7なしで注射した場合には、マウス肝臓に検出可能な量のsiRNAは見いだされなかった。siRNAガイド鎖のノザンブロットの結果と一致して、マウス肝臓におけるapoB mRNAの有意なノックダウンは、非改変または化学改変siRNAをナノ粒子なしに注射した場合には得られなかった（図31）。これらの結果は、送達複合体、すなわち、化学的に安定化されたRNAおよびNOP-7がインビボでのsiRNAの有効な送達にとって必須であったことを集合的に示している。
【０３０７】
apoB mRNAのサイレンシングがapoBタンパク質の血漿レベルの低減と相関するか否かを決定するために、apoB 100およびapoB 48レベルをイムノブロットによって測定した。化学改変siRNAおよびNOP-7を含有する送達複合体1.25〜5 mg/kgを注射すると、apoB 100およびapoB 48血清レベルはいずれも対照の＞70％まで減少したが（図33AおよびB）、フィブロネクチンレベルは影響を受けなかった。これらの結果は、化学改変siRNAと複合体を形成したNOP-7を含有する送達複合体がインビボでapoB発現を有効にサイレンシングしたことを示している。これらの送達複合体媒介サイレンシング活性は、RNAi治療応用に関して臨床的に実現可能な用量である1.25 mg/kg siRNAを必要とするに過ぎない。
【０３０８】
コレステロール代謝に及ぼすapoB mRNAサイレンシングの生理的効果を調べるために、総血漿コレステロールレベルを送達複合体の最後の注射の24時間後にマウスにおいて測定した。図34において示されるように、肝臓および血漿試料におけるapoB発現の送達複合体媒介サイレンシングは、総コレステロールの低減と相関した（34.4±7％）。コレステロールレベルは、対照処置を受けたマウス、または化学改変、ミスマッチsiRNA、およびNOP-7を含有する例示的な送達複合体によって処置したマウスにおいて不変であった（図34）。併せて、これらの知見は、送達複合体によるapoBのターゲティングが高コレステロール血症を有する患者におけるコレステロールレベルの低減に対する臨床的に有意な新規アプローチを提供しうることを証明する。
【０３０９】
実施例7．細胞に対して非毒性であるナノ輸送体および送達複合体
（a）非毒性であるHBOLDナノ輸送体
例示的なHBOLDナノ輸送体（図18を参照されたい）をFL83B細胞（マウス肝細胞）を用いるインビトロアッセイにおいて細胞毒性に関して試験した。細胞の生存率は、対照細胞の生存率の百分率として測定した。HBOLDは、異なる3つの濃度で細胞に対して毒性であるか否かに関してアッセイした。量には、0.25μM HBOLD = 1.4μg；1μM HBOLD = 5.8 μg；および3 μM HBOLD = 17.4μgが含まれた。さらに、TNXに関して1.4μgを用い、L2Kは2μg/mlの濃度で用いた。図19において示されるように、HBOLDナノ輸送体は、濃度0.25μMおよび1μMで細胞生存率に影響を及ぼさなかったことから、細胞に対して毒性ではなかった。
【０３１０】
（b）細胞に対して非毒性であるiNOP-7
注入されたNOP-7およびsiRNAを含む送達複合体に対する任意の非特異的免疫応答を査定するために、マウス肝組織をインターフェロン（IFN）誘発遺伝子、tetratricopeptide repeats 1を有するIFN誘発タンパク質（IFIT1）およびsignal transducer and activator of transcription 1（STAT1）の発現に関して査定した。PBS（対照）、NOP-7および改変apoB siRNAを含む送達複合体、またはNOP-7および改変apoB siRNAミスマッチを含む送達複合体によって処置したマウスから肝組織を得た。IFIT1およびSTAT1の発現を、以下のプライマーを用いて先に記載したようにqPCRによって測定した。
2009524679.tif 000019
【０３１１】
IFIT1およびSTAT1 mRNAレベルを、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して標準化した。さらに、血漿IFN-αレベルをサンドイッチELISAを用いて製造元（PBL biomedical Laboratories, USA）の説明書に従って最後の注射後24時間で定量した。双方のアッセイに関する陽性対照として、C57BL/6マウスの尾静脈側部にポリイノシン-ポリシチジル酸（ポリIC、全量0.125 ml）250μgを注射した。注射の6時間後、肝臓および血漿試料を採取した。
【０３１２】
NOP-7単独を含む送達複合体または化学改変siRNAとNOP-7とを含む送達複合体を注射したマウスは、肝臓におけるIFLT1およびSTAT1遺伝子の発現を変更させず、対照と比較して血漿中のIFN-αの放出も誘導しなかった（図35）。送達複合体の毒性に関する懸念に対処するために、全てのマウスを全身健康、飼料の摂取量、および体重変化に関して毎日モニターした。例示的な送達複合体による処置の最後に、マウスを屠殺して剖検した。apoBサイレンシングの標的組織である肝臓の組織切片を調製して、委員会によって認定された動物病理学者が毒性効果に関して個々に調べた。無処置（図36A）またはNOP-7のみ（図36B）のマウスからの組織に、および化学改変siRNAとNOP-7とを含む送達複合体（図36C）によって処置したマウスからの組織に組織学的な差は認められなかった。これらの結果は、例示的な送達複合体による処置が動物において免疫応答を誘発せず、明らかな毒性効果を引き起こさなかったことを証明する。
【０３１３】
他の態様
本発明を、その詳細な説明と共に記載してきたが、前述の記載は本発明を説明するためであって、添付の特許請求の範囲によって定義されるその範囲を制限すると意図されないと理解すべきである。他の局面、長所、および改変は添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０３１４】
さらに本出願を通して引用された全ての参考文献、特許、および特許出願の内容物は参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０３１５】
【図１】例示的なナノ輸送体の構築の図解である。
【図２】多数の官能表面基が付着した例示的なナノ輸送体送達装置の図解である。
【図３】ナノ輸送体ジオレイル-LDG3とsiRNAとの相互作用の図解である。
【図４】図4A〜4Dは、成分モノマーからポリリジンデンドリマー世代4（「LDG4」）（図4A）、LDG1（図4B）、LDG2（図4C）、およびLDG3（図4D）を産生するために用いた合成スキームを描写する。
【図５】低分子量ポリリジンデンドリマーを産生するために用いられる合成スキームの描写である。
【図６】図6A〜Cは、脂質官能表面基として用いるためのオレオイル誘導体（図6A）、ポリエチレングリコール（PEG）誘導体（図6B）、またはコレステロール誘導体（図6C）を産生するために用いられる合成スキームの描写である。
【図７】脂質官能表面基として用いるためのオレオイル酸誘導体を産生するために用いられる合成スキームの描写である。
【図８】低分子量ポリリジンデンドリマーを含むコアに共役させた脂質官能表面基を含むナノ輸送体の例である。
【図９】フルオレセイン標識オレオイルポリリジンデンドリマー世代4を産生するために用いられる合成スキームの描写である。
【図１０】図10A〜Bは、フルオレセイン標識オクチル-PEGポリリジンデンドリマー世代4（図10A）またはフルオレセイン標識コレステロールポリリジンデンドリマー世代4（図10B）を含むナノ輸送体の例である。
【図１１】核酸分子に共役した、LDG4コア、脂質官能表面基、および細胞型特異的ターゲティング部分を含むナノ輸送体の図解である。
【図１２】LDG4コア、オレオイル誘導体官能表面基、および環状CNGRCターゲティング部分を含むHBOLDナノ輸送体を産生するために用いられる合成スキームの描写である。
【図１３】LDG4コア、オレオイル誘導体官能表面基、および脂肪組織にsiRNAをターゲティングするための環状CKGGRAKDCターゲティング部分を含むHBOLDナノ輸送体を産生するために用いられる合成スキームの描写である。
【図１４】ナノ輸送体に対する核酸分子の共役の図解である。
【図１５】MBHA樹脂を用いる肺細胞特異的ペプチドの合成の描写である。
【図１６】肺細胞特異的ペプチドに共役したsiRNAの図解である。
【図１７】siRNAに共役したナノチューブコアを含むナノ輸送体を産生するために用いられる合成スキームの描写である。
【図１８】本発明の例示的なナノ輸送体の「HBOLD」の化学式を描写する。
【図１９】本発明のHBOLDナノ輸送体に曝露された細胞の生存率を示すインビトロ細胞障害性アッセイからの結果をグラフで描写する。
【図２０】HBOLD：siRNA送達複合体がApoB mRNAをサイレンシングすることができることを示す、インビトロ細胞アッセイからの結果をグラフで描写する。
【図２１】apoB siRNA：HBOLD送達複合体のインビボ効率を試験するために用いられる構築物を描写する。
【図２２】ApoB siRNAに曝露された細胞からのApoBタンパク質発現の低減を証明するウェスタンブロットからの結果を示す。
【図２３】ApoB siRNA：HBOLD送達複合体が血漿コレステロールレベルを低減させることができることを示す、血漿中の総コレステロールレベルをグラフによって描写する。
【図２４】本発明のHBOLD：siRNA送達複合体を用いたApoBのインビボサイレンシングからの結果をグラフによって描写する。
【図２５】本発明のApoB siRNA：HBOLDナノ輸送体を用いて免疫刺激の欠損を証明する、インビボアッセイからの結果をグラフによって描写する。
【図２６】本発明の例示的なオレオイル-リジンデンドリマーナノ輸送体である「NOP-7」の化学式を描写する。
【図２７】DMSO-d6におけるNOP-7の1H NMRスペクトルを描写する。
【図２８】NOP-7のMALDI-TOF MS分析の描写である。
【図２９】図29AおよびDは、NOP-7の平均直径（図29A）ならびにNOP-7およびsiRNAを含む送達複合体（「iNOP-7」）（図29B）を示す動的光散乱実験の結果のグラフによる描写である。
【図３０】図30AおよびBは、本発明のiNOP-7送達複合体の存在下または非存在下（「MOCK」）でインビトロで24時間処置したFL83B細胞のapoB mRNA発現レベル（図31A）および細胞生存率（図30B）をグラフによって描写する。「CM」は、化学改変siRNAを表すが、「UM」は非改変siRNAを表す。図30AにおけるapoB mRNAレベルおよび図30Bにおける細胞毒性レベルは、非トランスフェクト対照の百分率として表記される。それぞれの値は、代表的な2つの実験からの1試料あたり2個ずつの培養の平均値±SDを表す。
【図３１】対照と比較して非改変（「UM」）または化学改変（「CM」）siRNAによってインビボで処置したマウスにおける肝臓apoB mRNAレベルのグラフによる描写である。apoB mRNAレベルは、会合したナノ輸送体を欠損する5 mg/kg siRNAによってマウスを処置した24時間後に肝臓において測定した。
【図３２】図32AおよびBは、対照と比較して本発明の例示的なiNOP7送達複合体をインビボでターゲティングした後のマウスにおける肝臓apoB mRNAレベルを描写する。図32Aは、化学改変siRNA（「CM」）またはそのミスマッチ（「mm」）のいずれかを含有するiNOP-7の1.25mg/kg、2.5mg/kg、または5mg/kgによってマウスを処置した24時間後の肝臓におけるApoB mRNAを描写する。値は、3つの肝臓の領域からの組織試料（n＝動物4匹）の平均値±SDを表す。データは対照の百分率として表記する。図32Bは、ナノ輸送体NOP-7の存在下または非存在下での非改変（「UM」）、または化学改変（「CM」）siRNAによって処置したマウス肝臓から単離した総RNAのノザンブロット分析である。miR-122およびtRNAの検出を対照として用いた。
【図３３】図33AおよびBは、siRNAを含有するiNOP-7をマウスに注射後24時間での血漿中の肝臓apoBタンパク質レベルをグラフによって描写する。図33Aは、化学改変（「CM」）siRNAまたはそのミスマッチ（「mm」）のいずれかを含有するiNOP-7の5 mg/kgの最後の注射後24時間でのApoB 100およびApoB48タンパク質のウェスタンブロットを描写する。総タンパク質ローディングは、血漿のフィブロネクチンレベルを査定することによって確認した。図33BはiNOP-7の最後の注射後24時間でのマウスにおけるApoB 100およびApoB48タンパク質の血漿レベルに関する全てのウェスタンブロットの密度測定分析の結果を示す。データは対照の百分率として表記する（n＝動物4匹）。
【図３４】本発明の例示的なiNOP-7送達複合体によって処置したマウスにおける血漿コレステロールレベルをグラフによって描写する。血漿コレステロールレベルはiNOP-7の5 mg/kgの最後の注射後24時間で決定した。
【図３５】化学改変（「CM」）siRNAもしくはそのミスマッチ（「mm」）を含有するiNOP-7送達複合体、またはsiRNAを欠損するNOP-7ナノ輸送体（「MOCK」）の5 mg/kgによってマウスを処置した後24時間での血漿中のIFN-αレベルをグラフによって描写する。陽性対照として、マウス1匹にポリIC 250μgを注射して、IFN-αの血漿レベルを6時間後に査定した。各値は、各処置群からの血漿試料の平均値±SDを表す。
【図３６】図36A〜Cは、PBS対照（図36A）、NOP-7ナノ輸送体（図30B）、または化学改変apoB siRNAを含有するiNOP-7によって処置したマウスからのヘマトキシリン・エオジンによって染色した肝組織切片の顕微鏡写真である。
【図３７】図37AおよびBは、本発明の例示的な電荷制御分子（「R」）（図37B）および1つまたは複数の脂質（「n」は脂質の数である）と1つまたは複数の電荷制御分子（「m」は電荷制御分子の数である）とを含むナノ輸送体の一般構造式を描写する。
【図３８】末端カルボキシル16個を含むSLDG3Eを形成するために、電荷制御分子（H-Lys(Boc)-OMe）による例示的なナノ輸送体（スクシニル-LDG3）の改変を描写する。
【図３９】開始材料としてDeLDG4を用いて末端チオール16個を含む例示的な硫黄含有ナノ粒子の合成を描写する。
【図４０】末端の一級アミン64個を含む例示的なナノ粒子（LDG5）を描写する。
【図４１】図41AおよびBは、末端の二級アミン32個を含む例示的なナノ粒子（SLDG4）（図41B）およびLDG4からの該ナノ粒子の合成（図41A）を描写する。
【図４２】末端二級アミン64個を含む別の例示的なナノ粒子（SLDG5）を描写する。
【図４３】例示的なコレステロール改変ナノ粒子を描写する。
【図４４】コレステロールおよびオレオイル基によって改変された例示的なナノ粒子を描写する。
【図４５】例示的な糖質含有ナノ輸送体HB-M9LDおよびHB-MLDを描写する。
【図４６】オレオイル脂質7個およびアマンタジン薬物部分5個を含む例示的な送達複合体を描写する。
【図４７】Tatペプチドおよび末端の一級アミンを含む例示的なナノ輸送体を描写し、「m」はTatペプチドの数を表し、「n」は一級アミンの数を表す。
【図４８】図48AおよびBは、一級アミン45個、脂質基16個、およびチオール共役siRNA 3個を有するLDG5ナノ粒子（図48A）、ならびに（ii）LDG4ナノ粒子、一級アミン22個、脂質基7個、およびチオール共役siRNA 3個（図48B）を含む例示的な送達複合体を描写する。
【図４９】図49AおよびBは、（i）一級アミン24個、脂質基7個、およびPEG基4個を有するO7P1ナノ粒子（図49A）ならびに（ii）一級アミン17個、脂質基7個、および末端カルボキシレート8個を有するO7Cナノ粒子を含む例示的なナノ輸送体を描写する。
【図１】
2009524679.tif 000020
【図２】
2009524679.tif 000021
【図３】
2009524679.tif 000022
【図４Ａ】
2009524679.tif 000023
【図４Ｂ】
2009524679.tif 000024
【図４Ｃ】
2009524679.tif 000025
【図４Ｄ】
2009524679.tif 000026
【図５】
2009524679.tif 000027
【図６】
2009524679.tif 000028
【図７】
2009524679.tif 000029
【図８】
2009524679.tif 000030
【図９】
2009524679.tif 000031
【図１０】
2009524679.tif 000032
【図１１】
2009524679.tif 000033
【図１２】
2009524679.tif 000034
【図１３】
2009524679.tif 000035
【図１４】
2009524679.tif 000036
【図１５】
2009524679.tif 000037
【図１６】
2009524679.tif 000038
【図１７】
2009524679.tif 000039
【図１８】
2009524679.tif 000040
【図１９】
2009524679.tif 000041
【図２０】
2009524679.tif 000042
【図２１】
2009524679.tif 000043
【図２２】
2009524679.tif 000044
【図２３】
2009524679.tif 000045
【図２４】
2009524679.tif 000046
【図２５】
2009524679.tif 000047
【図２６】
2009524679.tif 000048
【図２７】
2009524679.tif 000049
【図２８】
2009524679.tif 000050
【図２９】
2009524679.tif 000051
【図３０】
2009524679.tif 000052
【図３１】
2009524679.tif 000053
【図３２】
2009524679.tif 000054
【図３３】
2009524679.tif 000055
【図３４】
2009524679.tif 000056
【図３５】
2009524679.tif 000057
【図３６】
2009524679.tif 000058
【図３７】
2009524679.tif 000059
【図３８】
2009524679.tif 000060
【図３９】
2009524679.tif 000061
【図４０】
2009524679.tif 000062
【図４１】
2009524679.tif 000063
【図４２】
2009524679.tif 000064
【図４３】
2009524679.tif 000065
【図４４】
2009524679.tif 000066
【図４５】
2009524679.tif 000067
【図４６】
2009524679.tif 000068
【図４７】
2009524679.tif 000069
【図４８】
2009524679.tif 000070
【図４９】
2009524679.tif 000071
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月26日(2008.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009524679000001.app
【国際調査報告】
2009524679.tif 000072
2009524679.tif 000073