(57)【要約】  パラスポリン−１の受容体がベクリン−１であることが見出された。当該知見に基づき、本発明は、細胞における細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルを測定することを含む細胞のパラスポリン−１に対する感受性の判定方法；ベクリン−１ポリペプチド等を含む、パラスポリン−１の細胞毒性の阻害剤；被検物質の存在下で、パラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度を評価することを含む、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質を探索する方法；ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む細胞死誘導剤；被検物質のベクリン−１ポリペプチドへの結合を評価することを含む細胞死を誘導し得る物質の探索方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルを測定すること、及び該発現レベルとパラスポリン−１に対する感受性との間の正の相関に基づき該細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定することを含む、細胞のパラスポリン−１に対する感受性の判定方法。
【請求項２】
ベクリン−１ポリペプチドの発現レベルの測定が、ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定するための剤。
【請求項４】
ベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、パラスポリン−１の細胞毒性の阻害剤。
【請求項５】
ベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を投与することを含む、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害する方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質を探索する方法：
（Ｉ）被検物質の存在下で、パラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度を評価すること、及び
（ＩＩ）パラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合を阻害した物質を、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質として選択すること。
【請求項７】
パラスポリン−１及びベクリン−１ポリペプチドを含む組合せ。
【請求項８】
ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む細胞死誘導剤。
【請求項９】
ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む抗腫瘍剤。
【請求項１０】
ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を細胞へ接触させることを含む、細胞死の誘導方法。
【請求項１１】
細胞が腫瘍細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む、細胞死を誘導し得る物質を探索する方法：
（Ｉ）被検物質のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度を評価すること、及び
（ＩＩ）ベクリン−１ポリペプチドに結合した被検物質を、細胞死を誘導し得る物質として選択すること。
【請求項１３】
（Ｉ）において用いられるベクリン−１ポリペプチドが、細胞膜上に発現されたベクリン−１ポリペプチドである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
細胞死の誘導において使用するためのベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１５】
腫瘍の予防又は治療において使用するためのベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１６】
哺乳動物に有効量のベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を投与することを含む、該哺乳動物における細胞死の誘導方法。
【請求項１７】
哺乳動物に有効量のベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラスポリン−１の受容体としてのベクリン−１の使用に関する。より詳細には、本発明は、ベクリン−１やベクリン−１に対する抗体を用いた、細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定するための方法及び剤、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害するための方法及び剤、細胞死誘導剤、抗腫瘍剤、細胞死を誘導し得る物質の探索方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）は胞子形成期にタンパク質性の封入体を生産する。この封入体は特定の昆虫の幼虫に毒性を示す（非特許文献１）。本発明者らはB. thuringiensisの封入体のラージスクリーニングから、哺乳動物細胞に毒性を示す毒素タンパク質を見出した（非特許文献２）。これらのタンパク質の細胞特異性や細胞毒性を含む生化学的な性質は非常に多様で、すなわち、ある毒素タンパク質は幅広い細胞株に対して毒性を示す一方、他の毒素は極めて限定的な細胞株に毒性を示すものであった（非特許文献２〜５）。これらのタンパク質は溶血活性を示さなかったので、哺乳動物細胞に毒性を示し、且つ溶血性を有するB. thuringiensisのCytタンパク質とは異なるものであった。【０００３】
パラスポリンタンパク質は一次構造の類似性から大きく4つのグループに分類でき、これまでに13種類のパラスポリンタンパク質が同定された(Web サイト参照  http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/)。それぞれのパラスポリンタンパク質の細胞に対する特異性や分子量は全く異なっている。【０００４】
パラスポリン−１は81-kDaの毒素前駆体としてB. thuringiensis A1190株により生産され、trypsin等のプロテアーゼ処理による部分分解により細胞毒性を示す。活性型であるパラスポリン−１は56-kDaと15-kDaのタンパク質からなる複合体であり、特異的な細胞毒素活性を示す（非特許文献１４）。ヒト子宮頸ガン細胞(human cervical carcinoma)であるHeLaやヒト前骨髄性白血病細胞であるHL-60はパラスポリン−１に対して高い感受性を示すが、ヒト正常子宮平滑筋細胞や大腸ガン細胞であるCaco-2はほとんど感受性を示さない。これまでに正常細胞株を含む15種類の細胞株のパラスポリンに対する感受性検査において、4細胞株で感受性が認められた。このことはパラスポリン−１が非常に高い細胞特異性を有する細胞毒素であることを示すものである（非特許文献１４）。パラスポリン−１はその毒性誘導過程において、細胞死誘導の引き金となるCa2+流入に伴う細胞質内遊離Ca2+の濃度上昇を誘発する。これはG-タンパク質の阻害剤であるスラミンにより抑制されたことから、パラスポリン−１の誘導するCa2+流入にはG-タンパク質を介した細胞内情報伝達系が関与するものと推定されている（非特許文献６）。さらに、パラスポリン−１処理されたHeLa細胞において、Poly(ADP-ribose) polymerase の分解やCaspase-3活性化（非特許文献６）のみならず、DNAのヌクレオソーム単位の分解やフォスファチジルセリンのトランスロケーションが認められることから、パラスポリン−１は標的細胞に対してアポトーシスを誘導する毒素である。【０００５】
パラスポリン−１は極めて限定的な細胞に対して毒性を示し、標的となる細胞にアポトーシスを誘導するので、パラスポリン−１の作用機構を理解することにより医薬品、細胞識別試薬、および細胞生物学の分野への応用が期待できる。特に毒素の受容体への結合は毒素作用において、最も根本的な反応であるためその同定は重要であると考えられる。しかしながら、パラスポリン−１の受容体は未だ同定されていない。【０００６】
一方、ベクリン−１はオートファジーに関連するタンパク質として同定された公知のタンパク質であり（非特許文献７）、ガン抑制因子として作動することが報告されている（非特許文献８〜１０）。さらに、ベクリン−１はアポトーシスを制御する因子であるBcl-2及びBcl-XLと相互作用する細胞内タンパク質であることが報告されている（非特許文献１１〜１３）。しかしながら、ベクリン−１タンパク質が細胞表面に露出し得ることや、ベクリン−１が受容体として機能し得ることは全く知られていない。
【非特許文献１】Schnepf, E. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 775-806 (1998)
【非特許文献２】Mizuki, E. et al., J. Appl. Microbiol. 86, 477-486 (1999)
【非特許文献３】Ito, A. et al., J. Biol. Chem. 279, 21282-21286 (2004)
【非特許文献４】Lee, D. W. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272, 218-223 (2000)
【非特許文献５】Yamashita, S. et al., Can J. Microbiol. 46, 913-919 (2000)
【非特許文献６】Katayama, H. et al., J. Biol. Chem. 282, 7742-7752 (2007)
【非特許文献７】Liang, H. X. et al., Nature 402, 672-676 (1999)
【非特許文献８】Atia, V. M. et al., Genomics 59, 59-65 (1999)
【非特許文献９】Qu, X. et al., J. Clin. Investig. 112, 1809-1820 (2003)
【非特許文献１０】Yue, Z. et al., Proc. Natl. Acad. U. S. A., b, 15077-15082(2003)
【非特許文献１１】Pattingre, S. et al., Cell, 122, 927-939 (2005)
【非特許文献１２】Liang, X. H. et al., J. Virol. 72, 8586-8596 (1998)
【非特許文献１３】Furuya, D. et al., Exp. Cell Res. 307, 26-40 (2005)
【非特許文献１４】Katayama, H. et al., J. Biochem. 137, 17-25 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記事情に鑑み、本発明は、パラスポリン−１の細胞毒性誘導において最も重要と考えられる標的細胞上のパラスポリン−１受容体を同定し、その受容体を標的とした新たな抗腫瘍薬や、そのスクリーニング方法、細胞識別のためのツール等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはパラスポリン−１の細胞特異性を説明するため、光反応性化学架橋剤（photo-reactive chemical cross linker）を用いてパラスポリン−１の受容体の検索と同定を行った。いくつかのパラスポリン−１の受容体候補タンパク質を２次元電気泳動により分離し、質量分析装置を利用したmass finger printing法により解析した結果、パラスポリン−１結合性タンパク質はベクリン−１であることが判明した。抗ベクリン−１抗体及びフローサイトメトリーを用いた分析から、細胞内タンパク質であると考えられていたベクリン−１は細胞膜の外側に局在し、抗ベクリン−１抗体により、パラスポリン−１のHeLa細胞への結合が阻害された。さらに、抗ベクリン−１抗体により細胞表面に露出されているベクリン−１の発現レベルを調べたところ、パラスポリン−１感受性細胞であるHeLa細胞では発現レベルが高く、パラスポリン−１非感受性細胞であるCaco-2や正常子宮平滑筋細胞では発現レベルが極めて低かった。抗ベクリン−１抗体（抗ペプチド抗体）はパラスポリン−１の細胞表面への結合を抑制し、パラスポリン−１の細胞毒性効果を阻害した。一方で、抗ベクリン−１抗体（全体）は単独で細胞毒性活性を示し、その細胞死にはパラスポリン−１と同じカスパーゼ−８の活性化が関わっていることが示唆された。以上の結果から、パラスポリン−１の受容体がベクリン−１であり、細胞表面に露出しているベクリン−１が細胞のパラスポリン−１感受性を決定する一つの因子であることを見出し、以下の発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下に関する。
［１］細胞における細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルを測定すること、及び該発現レベルとパラスポリン−１に対する感受性との間の正の相関に基づき該細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定することを含む、細胞のパラスポリン−１に対する感受性の判定方法。
［２］ベクリン−１ポリペプチドの発現レベルの測定が、ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて行われる、［１］記載の方法。
［３］ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定するための剤。
［４］ベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、パラスポリン−１の細胞毒性の阻害剤。
［５］ベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を投与することを含む、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害する方法。
［６］以下の工程を含む、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質を探索する方法：
（Ｉ）被検物質の存在下で、パラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度を評価すること、及び
（ＩＩ）パラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合を阻害した物質を、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質として選択すること。
［７］パラスポリン−１及びベクリン−１ポリペプチドを含む組合せ物。
［８］ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む細胞死誘導剤。
［９］ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む抗腫瘍剤。
［１０］ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を細胞へ接触させることを含む、細胞死の誘導方法。
［１１］細胞が腫瘍細胞である、［１０］記載の方法。
［１２］以下の工程を含む、細胞死を誘導し得る物質を探索する方法：
（Ｉ）被検物質のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度を評価すること、及び
（ＩＩ）ベクリン−１ポリペプチドに結合した被検物質を、細胞死を誘導し得る物質として選択すること。
［１３］（Ｉ）において用いられるベクリン−１ポリペプチドが、細胞膜上に発現されたベクリン−１ポリペプチドである、［１２］記載の方法。
［１４］細胞死の誘導において使用するためのベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
［１５］腫瘍の予防又は治療において使用するためのベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
［１６］哺乳動物に有効量のベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を投与することを含む、該哺乳動物における細胞死の誘導方法。
［１７］哺乳動物に有効量のベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の予防又は治療方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によりパラスポリン−１の受容体としてのベクリン−１の種々の用途が提供される。
本発明のパラスポリン−１に対する感受性の判定方法を用いれば、分子生物学的に明確に裏付けられたパラスポリン−１の受容体の発現レベルに基づき、客観的に種々の細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定することが出来る。
本発明のパラスポリン−１の細胞毒性の阻害剤を用いれば、パラスポリン−１により誘導される細胞死（アポトーシス）を強力に抑制することが可能である。
本発明の細胞死誘導剤を用いれば、細胞膜上又は膜画分中にベクリン−１ポリペプチドを発現している細胞に対して特異的に細胞死（アポトーシス）を誘導することが可能であり、細胞特異的抗腫瘍剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Alexa Fluor 488色素で標識したパラスポリン−１のHeLa細胞への結合。（Ａ）光学顕微鏡（A-C）及び蛍光顕微鏡(D-F)による観察。（Ｂ）フローサイトメーターによる観察。
【図２】パラスポリン−１感受性とパラスポリン−１の結合性との相関。（Ａ）各細胞株のパラスポリン−１感受性。（Ｂ）各細胞株の細胞表面へのパラスポリン−１の結合性。
【図３】SBED標識したパラスポリン−１によるパラスポリン−１受容体の探索と同定。（Ａ）ウエスタンブロッティングによるパラスポリン−１結合タンパク質の検出（一次元電気泳動）。（Ｂ及びＣ）二次元電気泳動によるパラスポリン−１結合タンパク質の分離。左パネル：コントロール（SBED標識BSA）。右パネル：SBED標識パラスポリン−１。
【図４】パラスポリン−１のHeLa細胞への結合に対する抗ベクリン−１抗体（上パネル）、抗TMOD-3抗体（中パネル）及び抗シトクロムＣ抗体（下パネル）の効果。
【図５】ベクリン−１の細胞膜への局在性。（Ａ）HeLa細胞表面上のベクリン−１発現のフローサイトメトリーによる解析。（Ｂ）ウエスタンブロットによるベクリン−１発現の解析。上パネル：細胞全体、下パネル：オルガネラを含む膜画分。
【図６】抗ベクリン−１抗体により誘導されるHeLa細胞の細胞死。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１．細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定するための方法及び剤
本発明は細胞のパラスポリン−１に対する感受性の判定方法を提供する。本発明の判定方法は、細胞における細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルを測定すること、及び該発現レベルとパラスポリン−１に対する感受性との間の正の相関に基づき該細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定することを含む。本発明の判定方法は、例えばパラスポリン−１を抗腫瘍薬として開発する際に、この抗腫瘍薬が有効な腫瘍と有効ではない腫瘍とを判別するために有用である。【００１２】
パラスポリン−１はB. thuringiensis A1190株より単離された公知のタンパク質である（Katayama, H. et al., J. Biochem. 137, 17-25 (2005)）。パラスポリン−１は、約81-kDaの前駆体として産生され、プロテアーゼ処理による部分分解により、約56-kDaのポリペプチドと約15-kDaのポリペプチドからなる複合体を形成する。この複合体がベクリン−１への結合活性を有しており、細胞表面上に発現されたベクリン−１に結合し、その細胞に対してアポトーシスによる細胞死を誘導する。本明細書において「パラスポリン−１」は、特に断りのない限りこの活性な複合体を意味する。【００１３】
「細胞のパラスポリン−１に対する感受性」とは、細胞がパラスポリン−１へ暴露されたときの、細胞死（特にアポトーシス）の誘導され易さの度合いをいう。「細胞がパラスポリン−１に対して感受性である」とは、細胞がパラスポリン−１へ暴露されたときに、細胞死（特にアポトーシス）が誘導されることを意味する。【００１４】
本発明の判定方法に用いられる細胞は哺乳動物の細胞である。哺乳動物としてはマウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。本発明の判定方法に用いられる細胞は、好ましくは、ヒト細胞である。【００１５】
本発明の判定方法に用いられる細胞には、培養細胞、生体から分離された細胞、生体から分離された組織中に含まれる細胞、生体内の細胞等が含まれる。本発明の判定方法に用いられる細胞は、腫瘍細胞又は非腫瘍細胞であり、好ましくは腫瘍細胞である。【００１６】
ベクリン−１は公知のタンパク質であり（Liang, H. X. et al., Nature 402, 672-676(1999)；Atia, V. M. et al., Genomics 59, 59-65 (1999)；Qu, X. et al., J. Clin. Investig. 112, 1809-1820 (2003)；Yue, Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A., b, 15077-15082 (2003)；Pattingre, S. et al., Cell, 122, 927-939 (2005)；Liang, X. H. et al., J. Virol. 72, 8586-8596 (1998)；Furuya, D. et al., Exp. Cell Res. 307, 26-40 (2005)）、そのアミノ酸配列やｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）配列も公知である。本発明に用いることが出来るベクリン−１は、上述の哺乳動物のベクリン−１である。ヒトベクリン−１のアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列が知られており（NCBI統合データベースAccession No. NP_003757, version NP_003757.1）、またそれをコードするヒトベクリン−１ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列として、配列番号１で表されるヌクレオチド配列が知られている（NCBI統合データベース Accession No. NM_003766, version NM_003766.2／コード領域：134-1486）。そのオルソログとしては、マウスベクリン−１[アミノ酸配列：配列番号４（NCBI統合データベース Accession No. NP_062530, version NP_062530.2）、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）ヌクレオチド配列：配列番号３（NCBI統合データベース Accession No. NM_019584, version NM_019584.3／コード領域：139-1485）]、ラットベクリン−１[アミノ酸配列：配列番号６（NCBI統合データベース Accession No. NP_446191, version NP_446191.1）、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）ヌクレオチド配列：配列番号５（NCBI統合データベース Accession No. NM_053739, version NM_053739.2／コード領域：225-1571）]等が知られている。【００１７】
細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルの測定は、通常生体外で行われる。【００１８】
ベクリン−１ポリペプチドの発現レベルは、ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、免疫化学的手法により測定することができる。免疫化学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウエスタンブロッティング、免疫組織染色等を挙げることができる。【００１９】
パラスポリン−１は細胞表面上に発現したベクリン−１に結合し、その細胞に対して細胞死を誘導する。従って、細胞全体におけるベクリン−１ポリペプチドの発現レベルよりも、細胞膜上（すなわち細胞表面上）又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルの方が、細胞のパラスポリン−１に対する感受性とよりよく相関する。従って、本発明の判定方法においては、細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルが、より好ましくは細胞膜上のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルが測定される。「膜画分」には、オルガネラを構成する膜及び細胞膜が含まれる。膜画分は細胞から遠心分離等の自体公知の方法により調製することが出来る。細胞膜上のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルの測定においては、フローサイトメトリー解析、免疫組織染色等の免疫化学的手法が好適に用いられる。膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルの測定においては、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウエスタンブロッティング等の免疫化学的手法が好適に用いられる。【００２０】
ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、ベクリン−１ポリペプチドやその抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents， Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、IgG又はIgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。【００２１】
次に、測定された細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルに基づいて、細胞のパラスポリン−１に対する感受性が判定される。後述の実施例に示すように、細胞における細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルが高い程、該細胞のパラスポリンに対する感受性も高くなる。上記判定は、このようなベクリン−１ポリペプチドの発現レベルとパラスポリン−１に対する感受性との間の正の相関に基づき行われる。【００２２】
一態様において、例えば、細胞が細胞膜上又は膜画分中にベクリン−１ポリペプチドを発現している場合には、該細胞はパラスポリン−１に対して感受性であると判定することが出来る。また、細胞が細胞膜上又は膜画分中にベクリン−１ポリペプチドを発現していない場合には、該細胞はパラスポリン−１に対して非感受性であると判定することが出来る。【００２３】
別の態様において、例えば、細胞膜上又は膜画分中にベクリン−１ポリペプチドを発現しておらず、パラスポリン−１に非感受性な細胞（ネガティブコントロール）及び細胞膜上又は膜画分中にベクリン−１ポリペプチドを発現しており、パラスポリン−１に感受性な細胞（ポジティブコントロール）を予め用意しておき、測定対象の細胞における細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルが、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較される。あるいは、細胞における細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルとパラスポリン−１に対する感受性との相関図を予め作成しておき、測定対象の細胞における細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチドの発現レベルをその相関図と比較してもよい。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。【００２４】
そして、ベクリン−１ポリペプチド発現レベルの比較結果より、測定対象細胞の細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチド発現レベルが相対的に高い場合には、該細胞のパラスポリン−１に対する感受性が相対的に高いと判定することができる。逆に、測定対象細胞の細胞膜上又は膜画分中のベクリン−１ポリペプチド発現レベルが相対的に低い場合には、該細胞のパラスポリン−１に対する感受性が相対的に低いと判定することができる。【００２５】
また、本発明は、上述のベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定するための剤（本発明の剤（Ｉ）と呼ぶ）を提供するものである。本発明の剤（Ｉ）は、細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定するためのキットであり得る。本発明の剤（Ｉ）を用いることにより、上述の方法により容易に細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定することができる。【００２６】
ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解し、約-20℃〜4℃で保存することができる。【００２７】
本発明の剤（Ｉ）は、ベクリン−１ポリペプチドの発現レベルの測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。【００２８】
例えば、本発明の剤（Ｉ）は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ELISAプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。【００２９】
２．パラスポリン−１の細胞毒性を阻害するための剤及び方法
上述のように、パラスポリン−１は標的細胞の細胞表面上のベクリン−１ポリペプチドへ結合し、該細胞に細胞死（特にアポトーシス）を誘導する。従って、ベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体の有効量を投与することにより、細胞表面上のベクリン−１ポリペプチドへのパラスポリン−１の結合が阻害され、パラスポリン−１の細胞毒性が阻害される。従って、本発明は、ベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、パラスポリン−１の細胞毒性の阻害剤（本発明の阻害剤）を提供するものである。【００３０】
本発明に用いることの出来るベクリン−１ポリペプチドは、上述の哺乳動物のベクリン−１ポリペプチドである。哺乳動物のベクリン−１ポリペプチドとしては、ヒトベクリン−１ポリペプチド（例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）、マウスベクリン−１ポリペプチド（例えば配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）、ラットベクリン−１ポリペプチド（例えば配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）等を挙げることが出来る。ベクリン−１ポリペプチドは、その遺伝子配列に基づき設計されたベクリン−１発現ベクターを導入した形質転換体を培養し、その培養物からカラムクロマトグラフィー等の周知の精製手段を用いて単離・精製することにより得ることが出来る。【００３１】
ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体としては、上記本発明の判定方法において用いることの出来る抗体と同様のものを用いることが出来るが、該抗体としては、ベクリン−１ポリペプチドとパラスポリン−１ポリペプチドとの特異的結合を阻害し得る抗体（中和抗体）が好ましい。また、本発明の阻害剤に用いる該抗体としては、該抗体をベクリン−１発現細胞に接触させたときに、該細胞に細胞死を誘導する活性を有しない抗体が好ましい。本発明の阻害剤に用いられる該抗体が認識するエピトープは、該抗体がパラスポリン−１の細胞毒性を阻害する限り、特に限定されない。パラスポリン−１の細胞毒性を強力に阻害し、ベクリン−１発現細胞に対して細胞死をほとんど誘導しない優れた抗体として、ヒトベクリン−１ポリペプチドのスレオニン７２（Ｔｈｒ７２）を含む部位をエピトープとして認識する抗体を挙げることが出来る。【００３２】
本発明の阻害剤は、上記のベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体に加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。【００３３】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００３４】
本発明の阻害剤中のベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約０．０１〜１００重量％である。【００３５】
一態様において、本発明の阻害剤はインビボで使用される。この場合、該阻害剤は、経口的又は非経口的に対象動物へ投与される。経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。【００３６】
本発明の阻害剤をインビボで使用する場合、本発明の阻害剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇである。【００３７】
本発明の阻害剤は、その有効成分が、パラスポリン−１の標的である細胞（ベクリン−１を細胞表面に発現する細胞）に送達されるように、上記哺乳動物に対して安全に投与される。【００３８】
また、別の態様において、本発明の阻害剤はインビトロで使用される。この場合、ベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体が、パラスポリン−１及びその標的細胞（ベクリン−１を細胞表面上に発現する細胞）を含む培地中へ投与（添加）される。【００３９】
本発明の阻害剤をインビトロで使用する場合、本発明の阻害剤の投与量は、有効成分の活性や種類等によって異なり一概に云えないが、通常、培地中の有効成分の最終濃度として約０．１〜５００μｇ／ｍｌである。【００４０】
ベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、パラスポリン−１の細胞表面上のベクリン−１ポリペプチドへの結合を阻害し、パラスポリン−１による細胞毒性の発現を阻害することができるので、本発明の阻害剤はパラスポリン−１により誘導され得る細胞死や中毒の予防・治療に有用である。また、本発明の阻害剤は、パラスポリン−１による細胞毒性発現のメカニズム解析に有用である。【００４１】
３．パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質の探索方法
本発明は、以下の工程を含む、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質を探索する方法（本発明の探索方法（Ｉ））を提供する：
（Ｉ）被検物質の存在下で、パラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度を評価すること、及び
（ＩＩ）パラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合を阻害した物質を、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質として選択すること。【００４２】
工程（Ｉ）は、被検物質の存在下でのパラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度を、被検物質の不在下でのパラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度と比較することを更に含み得る。【００４３】
本発明の探索方法（Ｉ）に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。【００４４】
上述の様に、パラスポリン−１は、約81-kDaの前駆体として産生され、プロテアーゼ処理による部分分解により、約56-kDaのポリペプチドと約15-kDaのポリペプチドからなる活性な（細胞毒性を有する）複合体を形成する。本発明の探索方法（Ｉ）においては、パラスポリン−１としてこの活性な複合体が好ましく用いられる。本発明の探索方法（Ｉ）において用いられるパラスポリン−１は、好ましくは単離及び精製されているものである。「単離及び精製」とは、目的物以外の化合物を除去する処理がなされていることを意味する。【００４５】
本発明の探索方法（Ｉ）においては、ベクリン−１ポリペプチドとして、上記本発明の阻害剤において用いることの出来るベクリン−１ポリペプチドと同様のものを用いることが出来る。一態様において、本発明の探索方法（Ｉ）において用いられるベクリン−１ポリペプチドは単離及び精製されているものである。また、別の態様において、ベクリン−１を天然で又は強制的に発現している細胞（好ましくは上述の哺乳動物の細胞）の細胞表面上に発現されたベクリン−１ポリペプチドが、本発明の探索方法（Ｉ）において用いられる。ベクリン−１を天然で発現している細胞は、ベクリン−１を潜在的に発現するものである限り特に限定されず、当該細胞として、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株などを用いることができる。ベクリン−１を天然で発現している細胞としては、例えば子宮頸癌細胞（HeLa細胞等）を挙げることが出来る。ベクリン−１を強制的に発現している細胞としては、ベクリン−１を発現し得る発現ベクターが導入された形質転換体等を挙げることができる。該ベクターにおいては、ベクリン−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に宿主細胞内で発現可能な態様で組み込まれている。【００４６】
工程（Ｉ）の評価は、通常適切な培養液又は緩衝液中で行われる。パラスポリン−１のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度は、当該分野で周知の相互作用解析方法、例えば、表面プラズモン共鳴、バインディングアッセイ（binding assay）、免疫学的手法等によって評価することができる。【００４７】
例えば、パラスポリン−１、ベクリン−１ポリペプチドのいずれか一方をチップ上に固定し、他方のポリペプチド及び被検物質を含有する溶液を該チップ上にロードすることにより被検物質の存在下で、パラスポリン−１とベクリン−１ポリペプチドとを接触させる。次いで、表面プラズモン共鳴法により、被検物質の存在下でベクリン−１ポリペプチドに対するパラスポリン−１の結合及び解離を測定し、被検物質を含有しないコントロール溶液をチップ上にロードした場合の結合及び解離と比較する。【００４８】
また、パラスポリン−１、ベクリン−１ポリペプチドのいずれか一方をプレート上に固相化し、適切な放射性同位体又は蛍光物質で標識した他方のポリペプチド及び被検物質を含有する溶液を該プレート中に添加することにより、被検物質の存在下で、パラスポリン−１とベクリン−１ポリペプチドとを接触させる。次いで、プレート上に結合した標識物質の量を指標に、被検物質の存在下でベクリン−１ポリペプチドに対するパラスポリン−１の結合を測定し、被検物質の不在下での該結合と比較する。【００４９】
或いは、適切な蛍光物質で標識したパラスポリン−１及び被検物質を含有する溶液を、ベクリン−１ポリペプチドを細胞表面上に発現した細胞へ添加することにより、被検物質の存在下で、パラスポリン−１とベクリン−１ポリペプチドとを接触させる。次いで、フローサイトメトリーにより、被検物質の存在下での細胞表面上のベクリン−１ポリペプチドへのパラスポリン−１の結合を測定し、被検物質の不在下での該結合と比較する。【００５０】
そして、結合及び解離の速度あるいは結合量についての比較結果に基づいて、パラスポリン−１とベクリン−１ポリペプチドとの結合を阻害する被検物質が、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質として選択される。【００５１】
本発明の探索方法（Ｉ）により得られる物質は、パラスポリン−１による細胞毒性の発現を阻害することができるので、パラスポリン−１により誘導され得る細胞死や中毒の予防・治療のための候補物質として有用である。また、本発明の探索方法（Ｉ）により得られる物質は、パラスポリン−１による細胞毒性発現のメカニズム解析に有用である。【００５２】
４．パラスポリン−１及びベクリン−１ポリペプチドを含む組合せ物
本発明はパラスポリン−１及びベクリン−１ポリペプチドを含む組合せ物（本発明の組合せ物）を提供する。本発明の組合せ物は、パラスポリン−１の細胞毒性を阻害し得る物質を探索するための試薬として有用である。【００５３】
一態様において、パラスポリン−１とベクリン−１ポリペプチドとは、分離された態様で本発明の組合せ物に含まれる。該態様においては、パラスポリン−１及びベクリン−１は、それぞれ異なる容器中に収容され、その複数の容器が１つのパッケージ中に収められる。【００５４】
別の態様において、パラスポリン−１とベクリン−１ポリペプチドとは、混合された態様で本発明の組合せ物に含まれ、組成物を構成する。【００５５】
本発明の組合せ物に含まれるパラスポリン−１は、本発明の探索方法（Ｉ）で使用可能なものと同様のものである。【００５６】
本発明の組合せ物に含まれるベクリン−１ポリペプチドは、本発明の探索方法（Ｉ）で使用可能なものと同様のものである。本発明の組合せ物に含まれるベクリン−１ポリペプチドは、好ましくは単離及び精製されたポリペプチドである。【００５７】
本発明の組合せ物を用いれば、容易に本発明の探索方法（Ｉ）を実施することが出来る。【００５８】
５．ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いる細胞死を誘導するための剤及び方法
後述の実施例に示すように、ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体の有効量を投与すると、該抗体は、標的細胞の細胞表面上のベクリン−１に結合し、パラスポリン−１を用いた場合と同様に該細胞に細胞死（特にアポトーシス）を誘導する。従って、ベクリン−１ポリペプチド又はベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体の有効量を投与することにより、細胞表面上のベクリン−１ポリペプチドへのパラスポリン−１の結合が阻害され、パラスポリン−１の細胞毒性が阻害される。【００５９】
本発明の剤（ＩＩ）の標的となる細胞は、細胞表面上にベクリン−１ポリペプチドを発現している細胞である。本発明の剤（ＩＩ）の標的となる細胞には、培養細胞、生体から分離された細胞、生体から分離された組織中に含まれる細胞、生体内の細胞等が含まれる。該細胞は、腫瘍細胞又は非腫瘍細胞であり、好ましくは腫瘍細胞である。【００６０】
本発明の剤（ＩＩ）に用いることの出来るベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体としては、上述の本発明の剤（Ｉ）に用いることの出来る抗体と同様のものを挙げることが出来る。該抗体としては、ベクリン−１発現細胞に接触したときに、該細胞に細胞死を誘導する活性を有する抗体が好ましい。本発明の剤（ＩＩ）に用いる該抗体が認識するエピトープは、該抗体が細胞死を誘導する活性を有する限り、特に限定されない。ベクリン−１ポリペプチドの全体を認識し得るポリクローナル抗体は、細胞死を誘導する活性が強力であるため、本発明の剤（ＩＩ）に好ましく用いられる。このようなポリクローナル抗体は、ベクリン−１ポリペプチドの全長アミノ酸配列を含むポリペプチドを、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの非ヒト哺乳動物が挙げられる。【００６１】
本発明の剤（ＩＩ）は、上記のベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体に加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。【００６２】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００６３】
本発明の剤（ＩＩ）中のベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約０．０１〜１００重量％である。【００６４】
一態様において、本発明の剤（ＩＩ）はインビボで使用される。この場合、該阻害剤は、経口的又は非経口的に対象動物へ投与される。経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。【００６５】
本発明の剤（ＩＩ）をインビボで使用する場合、本発明の剤（ＩＩ）の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇである。【００６６】
本発明の剤（ＩＩ）は、その有効成分が、標的となる細胞（ベクリン−１を細胞表面上に発現している細胞）に送達されるように、上記哺乳動物に対して安全に投与される。【００６７】
また、別の態様において、本発明の剤（ＩＩ）はインビトロで使用される。この場合、ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体が、標的となる細胞（ベクリン−１を細胞表面上に発現する細胞）を含む培地中へ投与（添加）される。【００６８】
本発明の剤（ＩＩ）をインビトロで使用する場合、本発明の剤（ＩＩ）の投与量は、有効成分の活性や種類等によって異なり一概に云えないが、通常、培養物中の有効成分の最終濃度として約０．１〜５００μｇ／ｍｌである。【００６９】
本発明の剤（ＩＩ）は抗腫瘍剤として、腫瘍（好ましくは細胞表面上にベクリン−１ポリペプチドを発現している腫瘍）の予防や治療に有用である。該腫瘍としては、子宮頸癌、胃癌、肺癌、大腸癌、脳腫瘍、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌、悪性リンパ腫等を挙げることが出来るがこれに限定されない。【００７０】
６．細胞死を誘導し得る物質の探索方法
上述のように、ベクリン−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体やパラスポリン−１が細胞表面上に発現されたベクリン−１ポリペプチドに結合することにより該細胞に対して細胞死（アポトーシス）を誘導する。従って、ベクリン−１ポリペプチドに結合し得る物質は、パラスポリン−１と同様にベクリン−１を細胞表面上に発現する細胞に対して細胞死を誘導し得る。従って、本発明は、以下の工程を含む、細胞死（アポトーシス）を誘導し得る物質を探索する方法（本発明の探索方法（ＩＩ））を提供するものである：
（Ｉ）被検物質のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度を評価すること、及び
（ＩＩ）ベクリン−１ポリペプチドに結合した被検物質を、細胞死を誘導し得る物質として選択すること。【００７１】
工程（Ｉ）は、被検物質のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度を、被検物質のベクリン−１以外のポリペプチド（コントロールポリペプチド）への結合の程度と比較することを更に含み得る。【００７２】
本発明の探索方法（ＩＩ）に供される被検物質は、探索方法（Ｉ）と同様にいかなる公知化合物及び新規化合物であってもよい。【００７３】
本発明の探索方法（ＩＩ）においては、探索方法（Ｉ）と同様のベクリン−１ポリペプチドを用いることが出来る。また、本発明の探索方法（ＩＩ）においては、探索方法（Ｉ）と同様に、ベクリン−１ポリペプチドとして、単離及び精製されたベクリン−１ポリペプチドや、ベクリン−１を天然で又は強制的に発現している細胞の細胞表面上に発現されたベクリン−１ポリペプチドが用いられる。【００７４】
工程（Ｉ）の評価は、通常適切な培養液又は緩衝液中で行われる。被検物質のベクリン−１ポリペプチドへの結合の程度は、探索方法（Ｉ）と同様に、当該分野で周知の相互作用解析方法、例えば、表面プラズモン共鳴、バインディングアッセイ（binding assay）、免疫学的手法等によって評価することができる。【００７５】
例えば、ベクリン−１ポリペプチドをチップ上に固定し、被検物質を含有する溶液を該チップ上にロードすることにより、被検物質とベクリン−１ポリペプチドとを接触させる。次いで、表面プラズモン共鳴法により、ベクリン−１ポリペプチドに対する被検物質の結合及び解離を測定し、コントロールペプチドをチップ上に固定した場合の被検物質のコントロールペプチドに対する結合及び解離と比較する。【００７６】
また、ベクリン−１ポリペプチドをプレート上に固相化し、適切な放射性同位体又は蛍光物質で標識した被検物質を含有する溶液を該プレート中に添加することにより、被検物質とベクリン−１ポリペプチドとを接触させる。次いで、プレート上に結合した標識物質の量を指標に、被検物質のベクリン−１ポリペプチドに対する結合を測定し、コントロールポリペプチドに対する結合と比較する。【００７７】
或いは、適切な蛍光物質で標識した被検物質を含有する溶液を、ベクリン−１ポリペプチドを細胞表面上に発現した細胞へ添加することにより、被検物質とベクリン−１ポリペプチドとを接触させる。次いで、フローサイトメトリーにより、被検物質の細胞表面上のベクリン−１ポリペプチドへの結合を測定し、ベクリン−１を発現していないコントロール細胞への被検物質の結合と比較する。【００７８】
そして、結合及び解離の速度あるいは結合量についての比較結果に基づいて、ベクリン−１ポリペプチドと結合した被検物質が、細胞死を誘導し得る物質（候補物質）として選択される。【００７９】
また、本発明の探索方法（ＩＩ）は、工程（ＩＩ）の後に、工程（ＩＩ）で選択された物質を、ベクリン−１を細胞表面上に発現している細胞と接触させ、該細胞に対して細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導した物質を、細胞死を誘導することが確認された物質として選択する工程を含んでいてもよい。被検物質とベクリン−１を細胞表面上に発現している細胞との接触は、培養培地中で行われる。培養培地は、細胞の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。細胞死の誘導は、ＴＵＮＮＥＬ法やＤＮＡラダーの検出等により評価することが出来る。【００８０】
本発明の探索方法（ＩＩ）により得られる物質は、新たな抗腫瘍剤の開発のための候補物質として有用である。【００８１】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００８２】
１．パラスポリン−１のHeLa細胞への結合
パラスポリン−１が標的細胞の表面に結合することを示すため、Alexa Fluor 488色素で標識したパラスポリン−１でHeLa細胞を処理し、抗Alexa Fluor 488色素抗体で免疫染色を行った。活性のあるパラスポリン−１で処理した細胞は蛍光抗体で染色できたが、コントロールや100℃で5分間処理した非活性パラスポリン−１では染色が確認できなかった(図１Ａ)。Alexa Fluor 488色素を標識したパラスポリン−１でHeLa細胞を処理した後、フローサイトメトリーを用いて細胞へのパラスポリン−１の結合を分析した(図１Ｂ)。活性のある標識パラスポリン−１では細胞の蛍光が増加した、この蛍光の増加は非標識パラスポリン−１を大過剰(標識パラスポリン−１の40倍)添加することにより消失した(図１Ｂ、左上パネル)。【００８３】
２．パラスポリン−１感受性の異なる細胞株への結合の比較
パラスポリン−１は細胞特異性の高い細胞毒素である。図２Ａにパラスポリン−１ (1 μg/ml)に対するHeLa、A549、Sawano及び正常子宮平滑筋細胞(UtSMC)の感受性を示した。細胞のパラスポリン−１感受性とパラスポリン−１の細胞膜への結合に相関性があることを示すため、異なる細胞での細胞に対するパラスポリン−１の結合性をフローサイトメトリーで分析した。HeLa細胞はパラスポリン−１依存性のピークのシフトが認められたが、他の細胞株ではほとんどピークシフトが認められなかった。【００８４】
３．光反応性化学架橋剤を用いたパラスポリン−１受容体の探索と同定
光反応性化学架橋剤(SBED)で標識したパラスポリン−１によりパラスポリン−１受容体の検索を行った。化学架橋の結果、パラスポリン−１と相互作用したタンパク質にはビオチン転移が生じるので、ウエスタンブロッティングによりビオチンが転移されたHeLa細胞のタンパク質を検索した。コントロールとしてSBED標識BSAを用いた。ウエスタンブロットの結果、パラスポリン−１依存的にビオチンが転移したタンパク質が認められた(図３Ａ、レーンＣ)。さらに、ビオチン転移が認められた一部のタンパク質は非標識パラスポリン−１を共存させることにより、ビオチン転位が明らかに消失することを確認した(図３Ａ、レーンＤ)。一次元電気泳動によりタンパク質を分離し、ビオチン転位が起きたタンパク質の同定を試みたが、タンパク質の分離が不十分であったため同定できなかった。そこで、２次元電気泳動によりさらに細胞のタンパク質を分離し、ビオチン転位が誘導されたタンパク質の検索を行った。HeLa細胞をSBED標識BSAとSBED標識パラスポリン−１で処理し、架橋反応を行った。処理した細胞から細胞膜を回収し、二次現電気泳動によりタンパク質を分離した。ビオチン転移タンパク質の検出はアビジンHRPを用いたウエスタンブロット法により行った(図３Ｂ)。二次元電気泳動の結果、pH6からpH8、分子量が37〜80kDaの範囲にパラスポリン−１に依存したビオチン転位が誘導されたタンパク質スポット(R1, R2)が認められた(図３Ｃ、右パネル)。R1とR2を二次元電気泳動により調製した。調製したタンパク質をマスフィンガープリンティング法により同定したところ、R1、R2はそれぞれ、トロポモジュリン−３(TMOD-3)及びベクリン−１であった。【００８５】
４．パラスポリン−１の細胞結合に対する抗体の阻害効果
マスフィンガープリンティング法により同定されたパラスポリン−１受容体候補タンパク質がパラスポリン−１受容体の機能を有することを確認するために、それぞれの候補タンパク質に対する抗体によるパラスポリン−１の細胞膜結合阻害の検討を行った。HeLa細胞を予め抗ベクリン−１抗体、抗シトクロムＣ抗体、抗TMOD-3抗体で処理した後、蛍光標識したパラスポリン−１のHeLa細胞への結合性をフローサイトメトリーで検出した。抗ベクリン−１抗体としては、Cell Signaling Technology社製のポリクローナル抗体を用いた。該ポリクローナル抗体は、ヒトベクリン−１のスレオニン７２の周辺残基に該当する合成部分ペプチド（ＫＬＨ抱合）をウサギに免疫することにより製造されたものである。パラスポリン−１のHeLa細胞への結合は抗ベクリン−１抗体で阻害が認められたが（図４Ａ）、抗TMOD-3抗体や抗シトクロムＣ抗体では認められなかった（図４Ｂ及びＣ）。また、パラスポリン−１のHeLa細胞への結合を阻害する抗ベクリン−１抗体は、パラスポリン−１のHeLa細胞に対する細胞毒性も部分的ではあるが阻害することができた。【００８６】
５．ベクリン−１の細胞膜への局在性
ベクリン−１が細胞膜上に存在することを示すため、抗ベクリン−１抗体（Cell Signaling Technology社製）でHeLa細胞を処理した後、蛍光抗体でHeLa細胞表面にある抗ベクリン−１抗体をフローサイトメトリーにより検出した。この結果、抗ベクリン−１抗体依存的に蛍光ピークのシフトが認められ、ベクリン−１がHeLa細胞の細胞表面に存在することが示唆された(図５Ａ)。次に、細胞構成物を超遠心により分画し、オルガネラを含む膜画分にベクリン−１が含まれるか否か、検討した。ベクリン−１の検出はWestern blotting により行った。実験はHeLa細胞だけでなく、パラスポリン−１感受性の異なる他の細胞株(Sawano, UtSMC)でも行った。細胞に存在するベクリン−１の含量は細胞株間で大きな違いが認められなかった (図５Ｂ、上パネル)。しかし、SawanoやUtSMCにおける膜画分に存在するベクリン−１はHeLa細胞と比較して低かった (図５Ｂ、下パネル)。【００８７】
６．抗ベクリン−１抗体の細胞毒性
ベクリン−１にパラスポリン−１が結合することにより、細胞死が誘導される。そこで、パラスポリン−１よりも親和性の高い抗ベクリン−１抗体にパラスポリン−１と同様の細胞毒性誘導効果が認められるか検討を行った。本試験に用いた抗ベクリン−１抗体は、Affinity Bioreagents社製のポリクローナル抗体を用いた。該ポリクローナル抗体は、ヒトベクリン−１タンパク質（全体）をウサギに免疫することにより製造されたものである。抗ベクリン−１抗体を希釈した後、HeLa細胞を抗体で37℃、20h処理した。細胞の生存率はMTT試薬による発色法により算出した。コントロール（免疫前ウサギ血清）では細胞生存率の低下は認められなかったのに対して、抗ベクリン−１抗体では細胞生存率の著しい減少が認められた (図６)が、結合領域が限定的なベクリン−１に対する上記抗ペプチド抗体（Cell Signaling Technology社製）では細胞死がほとんど誘導できなかった。【００８８】
考察
パラスポリン−１のタンパク質性の受容体がHeLa細胞膜上に存在することを示唆する実験結果がこれまでに得られていた。この試験において、光反応性化学化学架橋剤を用いることにより、細胞毒素パラスポリン−１の受容体がベクリン−１であることを同定した。【００８９】
パラスポリン−１に対する感受性の異なる細胞株の細胞膜表面へのパラスポリン−１結合性はパラスポリン−１感受性と高い相関性を示した。このことから、細胞株のパラスポリン−１感受性がパラスポリン−１の細胞表面への結合性、すなわち受容体の量、あるいは有無で決定されるものと推定された。高感受性細胞であるHeLa細胞のオルガネラを含む膜画分におけるベクリン−１の量は多く、感受性が低い細胞（SawanoやUtSMC）ではベクリン−１の量は少なかったが、HeLa、Sawano及びUtSMCの細胞全体におけるベクリン−１の存在量はほとんど変わらなかった。これらの結果はパラスポリン−１毒性の細胞選択性が細胞表面に存在するベクリン−１に依存することを示唆する。また、パラスポリン−１処理によりパラスポリン−１感受性細胞の細胞内カルシウム濃度上昇が誘導され、これが細胞毒性の引き金となることが示されている (Katayama, H. et al., J. Biol. Chem. 282, 7742-7752 (2007))。このことは細胞外に露出したパラスポリン−１の受容体として作動するベクリン−１が細胞外からのカルシウム流入機構を制御することを示唆する。【００９０】
ベクリン−１はオートファジーに関連するタンパク質として同定され、ガン抑制因子として作動する。さらに、ベクリン−１はアポトーシスを制御する因子であるBcl-2及びBcl-XLと相互作用する細胞内タンパク質であることが報告されている。しかしながら、ベクリン−１が細胞表面に露出することや、ベクリン−１が受容体として機能することは知られていない。従って、パラスポリン−１は未だに知られていないベクリン−１の新しい機能を示したと言える。ベクリン−１が細胞表面に存在する生理的意義は現段階では全く不明であるが、少なくともベクリン−１はオートファジーやアポトーシス誘導以外の細胞現象に関わっていると推定される。【００９１】
パラスポリン−１は細胞に対して選択的に毒性を示す毒素タンパク質であり、その受容体であるベクリン−１の細胞膜表面への局在がパラスポリン−１感受性細胞において認められた。さらに、抗ベクリン−１抗体でパラスポリン−１高感受性細胞であるHeLa細胞を処理することによりパラスポリン−１と同様にカスパーゼ−８を介するアポトーシス誘導が認められた。これらのことから、パラスポリン−１受容体であるベクリン−１の細胞膜局在性が細胞の種類を識別する一つのマーカーとして利用できることや細胞外に露出したベクリン−１を標的にした新しい抗腫瘍剤の開発が可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によりパラスポリン−１の受容体としてのベクリン−１の種々の用途が提供される。
本発明のパラスポリン−１に対する感受性の判定方法を用いれば、分子生物学的に明確に裏付けられたパラスポリン−１の受容体の発現レベルに基づき、客観的に種々の細胞のパラスポリン−１に対する感受性を判定することが出来る。
本発明のパラスポリン−１の細胞毒性の阻害剤を用いれば、パラスポリン−１により誘導される細胞死（アポトーシス）を強力に抑制することが可能である。
本発明の細胞死誘導剤を用いれば、ベクリン−１を発現している細胞に対して特異的に細胞死（アポトーシス）を誘導することが可能であり、細胞特異的抗腫瘍剤として有用である。
本出願は日本で出願された特願２００８−０９０１９０（出願日：２００８年３月３１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図４】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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