(57)【要約】好ましい形態では、多孔質膜８の一方の面に接して第１溶液を流すことのできる第１反応室としての流路１０と、多孔質膜８を介して流路１０に対向し、多孔質膜８の他方の面に接して第２溶液を流すことのできる第２反応室としての流路１２が形成されている。流路１０内で多孔質膜８上には第１細胞が固定され、流路１２内で多孔質膜８上には第２細胞が固定されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内に配置された多孔質膜と、
前記多孔質膜の一方の面に接する第１溶液を収容し又は流すことのできる第１反応室と、
前記多孔質膜を介して第１反応室に対向し、前記多孔質膜の他方の面に接する第２溶液を収容し又は流すことのできる第２反応室と、
第１反応室内で前記多孔質膜上に固定された第１細胞と、
第２反応室内で前記多孔質膜上に固定され、第１細胞とは異なる第２細胞と、
を備えたバイオデバイス。
【請求項２】
前記多孔質膜は基体内部に配置されており、前記第１反応室は前記基体により形成され、前記多孔質膜の一方の面に沿って第１溶液を流すことのできる流路となっており、前記第２反応室も前記基体により形成され、前記多孔質膜の他方の面に沿って第２溶液を流すことのできる流路となっている請求項１に記載のバイオデバイス。
【請求項３】
前記第１、第２の反応室に該当する前記流路の深さが１ｍｍ以下である請求項２に記載のバイオデバイス。
【請求項４】
前記多孔質膜で細胞が固定されている面には細胞を培養するためのコーティングが施されている請求項１から３のいずれか一項に記載のバイオデバイス。
【請求項５】
第１細胞は肝実質細胞であり、第２細胞は内皮細胞であることにより人工臓器を構成している請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は人工肝臓などの人工臓器として、又は細胞による薬物代謝試験などに用いるためのバイオデバイスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体の化学工場にたとえられる肝臓は、判明しているだけで５００種類以上の代謝反応を行っているとされる。人工臓器の一例として、肝臓の機能を果たす人工肝臓の開発が進められているが、生体細胞を用いない人工的な装置で肝臓の機能を全面的に補うことは中長期的にみても極めて困難であり、生体の肝細胞を利用するしか手がないと考えられている。そのような生体細胞を利用した人工臓器は、生体細胞と人工装置の組み合わせであることからハイブリッド型の人工臓器と呼ばれる。従来の人工肝臓システムでは、ブタなどから取り出した肝組織を用いて肝機能を補助している（特許文献１参照。）。【０００３】
生体細胞を用いた人工臓器では、細胞を細胞培養培地中に懸濁させて装置中を循環させつつ、半透膜を介して血液又は血漿と接触させる方法（特許文献１参照。）や、繊維又は多孔質膜の表面や内部に細胞を固定して液体と接触させる方法がとられている（特許文献２参照。）。これらの人工臓器では利用される細胞は１種類のみである。【０００４】
肝臓は生体内では肝実細胞の他に、類洞内皮細胞などが規則正しく配列され、細胞間の信号伝達や体液の循環が肝臓の正常な機能を維持するために重要な役割を果たしていると考えられる。特に、肝実質細胞と類洞内皮細胞はそれぞれ列をなして互いに並行に並んでおり、それらの細胞列間は直接接触していない。それらの細胞列間にはディッセ腔と呼ばれる細胞外マトリックスがある。細胞外マトリックスでは、それぞれの細胞列の外側は、肝実質細胞側が胆管、類洞内皮細胞側が血管となっている。
【特許文献１】特表平１０−５０６８０６号公報
【特許文献２】特開２００６−２９６３６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
肝機能を有する人工肝臓システムを確立するためには、これらの細胞種の規則正しい配置と細胞外マトリックスの構築が重要である。薬物や栄養物は血管側から供給され、胆管側に排出される。培養した細胞を用いた人工肝臓システムへの取り組みもなされているが、安定した肝機能を発揮するシステムは構築できていない。また、肝細胞の培養そのものが難しく、その上、生体内の肝臓に近い組織を形成することはさらに困難であるため、長期間にわたって安定な肝機能を維持できる人工システムは構築できていない。【０００６】
本発明は、人工肝臓を初めとする人工臓器に限らず、２種類の生体細胞を利用して安定した機能を維持できるバイオデバイスを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、細胞外マトリックスの代替物として多孔質膜を利用し、その膜の両側に異なる細胞を固定して、多孔質膜を介して両側の細胞間で信号伝達や物質の交換又は移動を行わせるようにしたものである。【０００８】
すなわち、本発明のバイオデバイスは、容器内に配置された多孔質膜と、多孔質膜の一方の面に接する第１溶液を収容し又は流すことのできる第１反応室と、多孔質膜を介して第１反応室に対向し、多孔質膜の他方の面に接する第２溶液を収容し又は流すことのできる第２反応室と、第１反応室内で多孔質膜上に固定された第１細胞と、第２反応室内で多孔質膜上に固定され、第１細胞とは異なる第２細胞とを備えたものである。【０００９】
多孔質膜としては、ポリカーボネートやＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）のトラックエッチング膜、セルロース系、ナイロン系、グラスファイバー、ポリエーテル、フッ素樹脂、セラミック系などの多孔質膜を用いることができる。多孔質膜の厚さは数百μｍ以下が適当である。それより厚くなると両側の細胞間での物質交換や信号伝達の効率が低下する。【００１０】
本発明のバイオデバイスの好ましい一形態は、基体内に多孔質膜を備えて、多孔質膜の両側に沿って溶液を流すことができるようにしたチップ型デバイスである。そのようなチップ型デバイスでは、多孔質膜は基体内部に配置されており、第１反応室は前記基体により形成され、多孔質膜の一方の面に沿って第１溶液を流すことのできる流路となっており、第２反応室も前記基体により形成され、多孔質膜の他方の面に沿って第２溶液を流すことのできる流路となっている。【００１１】
第１、第２の反応室に該当する流路の深さが１ｍｍ以下であることが好ましい。流路は血管や尿管にあたるものであるので、これより深くする必要がないだけでなく、流路が深くなると濃度が薄くなるので不都合である。【００１２】
多孔質膜で細胞が固定されている面には細胞を培養するためのコーティングが施されていることが好ましい。コーティング物質としては、ゼラチン又はコラーゲンのほか、一般に足場剤として用いられるバイオマテリアルを用いることができる。【００１３】
このバイオデバイスを人工臓器として利用する一例は、第１の細胞が肝実質細胞で、第２の細胞が内皮細胞であるものである。多孔質膜により代替ディッセ腔と規則正しい細胞の配列を実現し、かつ細胞間の信号伝達も確保できる。さらに、多孔質膜の両側の反応室内の溶液は、血液及び胆汁と似た役割を果たし、代謝や薬物の取込み及び排出といった生体内に近い機能をもつバイオデバイスとなる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、多孔質膜を隔てて異種細胞を固定したことにより体液の流れや細胞同士の信号伝達など生体内に近い構成を簡単に実現することができる。【００１５】
また、基体内に流路をもつようにデバイス化すれば、細胞培養を行う空間を最適化した設計にできる他、流路を利用して連続的な送液や脈動を与えるなどの流体制御も可能になり、様々な系での研究が可能になり、組織形成に適した環境を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】第１の実施例を示す断面図である。
【図２Ａ】第２の実施例における上側基板の平面図である。
【図２Ｂ】第２の実施例における下側基板の平面図である。
【図３】第３の実施例を示す断面図である。
【図４】第３の実施例と比較例での肝機能発現を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（実施例１）
図１に第１の実施例としての流路をもつチップ型デバイスを流路に沿って切断した断面図として示す。【００１８】
このバイオデバイスは、基板４，６が接合されて基体２が構成されており、基板４，６間に多孔質膜８が挟み込まれチップ構造体となっている。基板４，６は特に材質は限定されないが、一例としてＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）（東レダウコーニング社の製品ＳＩＬＰＯＴ１８４）を用いた。多孔質膜８も特に限定はされないが、厚さが１００μｍのセルロース混合エステルメンブレン（ミリポア社の製品セルロース混合エステルメンブレンフィルター（ＲＡＷＰ））を用いた。【００１９】
基板４には多孔質膜８の一方の面に沿って第１の流路１０が形成され、流路１０の両端には基板４を貫通する液導入口１０ａと液排出口１０ｂが形成されている。基板６には多孔質膜８の他方の面に沿い、第１の流路１０に対向する位置に第２の流路１２が形成され、流路１２の両端には基板６を貫通する液導入口１２ａと液排出口１２ｂが形成されている。流路１０，１２はそれぞれの基板４，６に成型により形成された溝であり、幅１ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、流路長２０ｍｍ程度である。液導入口１０ａ，１２ａと液排出口１０ｂ，１２ｂはそれぞれの基板４，６に貫通孔加工を施すことにより形成された貫通穴である。【００２０】
第１の流路１０内では多孔質膜８上に第１の細胞として肝実質細胞が固定されて培養され、第２の流路１２内では多孔質膜８上に第２の細胞として内皮細胞が固定されて培養されている。【００２１】
この実施例のバイオデバイスの製造方法を示す。流路１０，１２及び貫通穴１０ａ，１０ｂ，１２ａ，１２ｂが形成された基板４，６を、流路１０，１２が対向するように配置し、間に多孔質膜８を挟み込んだ状態で貼り合わせることにより、基板４，６の接合体からなる基体内部に多孔質膜８を配置したチップ構造体を形成する。基板４，６を貼り合わせる際に、接合面を酸素プラズマにより処理することにより、強固な接着を得ることができる。【００２２】
次に多孔質膜８に細胞を固定して培養するが、このチップ構造体に細胞を導入する前に、チップ構造体をオートクレーブ等により滅菌処理した後、ゼラチンなどバイオマテリアル高分子材料を流路１０，１２に流し、流路１０，１２の内面と多孔質膜８をコーティングすることにより、多孔質膜８の膜面に目的とする細胞を培養しやすい状態にする。その後、それぞれの液導入口１０ａ，１２ａから流路１０側に肝実質細胞、流路１２側に内皮細胞を導入して固定し、その後培養することにより、この実施例のバイオデバイスを得ることができる。【００２３】
多孔質膜８に細胞を固定して培養する工程をさらに詳しく説明する。
（１）ゼラチンコート：
０．５ｇのゼラチンを５００ｍＬの純水（Milli-Q水）に溶解し、オートクレーブを用いて１２１℃、２気圧で２０分間静置してゼラチン溶液を調製する。シリンジを用いてそのゼラチン溶液をチップ構造体に注入し、冷蔵庫により４℃で２時間又はそれ以上静置する。【００２４】
チップ構造体内のゼラチン溶液は使用前に排出し、細胞を固定する際にはチップ構造体内を細胞培養に適した培地に替えて細胞を播種する。【００２５】
（２）チップ構造体の多層膜の膜面に細胞を固定する手順：
ペトリディッシュ上で培養している細胞をＰＢＳ（Phosphate Buffered Salts：リン酸バッファ塩溶液）で３回洗浄後、トリプシン溶液で剥離する。剥離した細胞を培地で懸濁し、４℃、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清液を除去し、チップ構造体の流路１０，１２の容量に応じた少量の培地に再懸濁する。シリンジを用いて細胞懸濁液をチップ構造体に注入し、多孔質膜８が細胞懸濁液の下側にくるような向きに置いて３時間、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内に静置する。【００２６】
細胞は重力により沈ませて多孔質膜８に接着させるので、多孔質膜８の上下ともそれぞれ膜面が細胞懸濁液の下側にくる状態で接着させることで、多孔質膜８の両側に細胞を接着させる。【００２７】
（実施例２）
図２Ａ及び図２Ｂは第２の実施例を示したものであり、図２Ａは上側の基板１４、図２Ｂは下側の基板６をそれぞれ流路２０，１２側から示したものである。下側の基板６は図１の実施例における基板６と同じである。上側の基板１４は図１の実施例における基板４とは異なり、流路２０の入口側が２つの入口流路２０−１，２０−２に分岐し、それぞれの入口流路２０−１，２０−２の端が貫通穴からなる液導入口２０−１ａ，２０−２ａにつながっている。入口流路２０−１は流路２０と同じ幅と深さをもち、入口流路２０−２は入口流路２０−１に比べて深さは同じであるが、幅が狭くなっている。【００２８】
上側の基板１４における流路２０及びその液導入口２０−１ａ，２０−２ａの構造を除いて、他の構成は図１の実施例のものと同じである。【００２９】
図２Ａ及び図２Ｂの実施例において、２つの液導入口２０−１ａ，２０−２ａのうち、幅広の入口流路２０−１につながる液導入口２０−１ａからは多孔質膜に細胞を固定する際の細胞懸濁液を導入し、幅狭の入口流路２０−２につながる液導入口２０−２ａからはこのバイオデバイスを使用する際の試薬を導入するのに使用する。【００３０】
（実施例３）
本発明で提案する構造の優位性を検証するため、実施例３として下記実験を実施した。実験用の反応容器は図３に示されるものである。上部が開口した有底の円筒状ウエル３０と、ウエル３０の開口部に着脱可能に嵌め込まれるインサート３２からなるものを使用する。インサート３２は開口部から底面に向かって直径が小さくなる逆円錐台状をなしており、底面が直径６.４ｍｍで多孔質膜の円形メンブレン３４となっている。メンブレン３４は厚さ１０〜２０μｍのＰＥＴからなるトラックエッチング多孔質膜である。トラックエッチング多孔質膜ではメンプレンに多数の微小貫通穴が形成されている。【００３１】
この実施例では、メンブレン３４の一方の面、すなわちインサート３２の内側となる面で図３では上側の面、には肝実質細胞３６としてヒト由来肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を５×１０4個程度播種し、メンブレン３４の他方の面には内皮細胞３８を播種した。【００３２】
この実施例３と比較するために、次の４種類の比較例を用意した。
（比較例１）
メンブレン３４の一方の面には肝実質細胞３６を播種したが、メンブレン３４の他方の面には内皮細胞３８を播種しなかったもの。【００３３】
（比較例２）
メンブレン３４の一方の面には肝実質細胞３６を播種したが、内皮細胞３８はメンブレン３４の他方の面ではなく、ウエル３０の底面上に播種したもの。【００３４】
（比較例３）
メンブレン３４の一方の面には肝実質細胞３６を播種せず、メンブレン３４の他方の面に内皮細胞３８を播種したもの。【００３５】
（比較例４）
メンブレン３４のいずれの面にも細胞を播種しなかったもの。【００３６】
このように用意した実施例３と比較例１〜４の反応容器を用いてアンモニア代謝能に差があるかどうかを検証するために、ウエル３０に２．０ｍＭ−ＮＨ4ＣＬを含む培地４０を７００μＬ入れ、インサート３２内にアンモニアを含まない培地４２を２００μＬ入れた。すなわち、図３の実施例の反応容器では、肝実質細胞３６はアンモニアを含まない培地４２と接し、内皮細胞３８はＮＨ4ＣＬを含む培地４０と接することになる。【００３７】
その状態で６時間培養し、両側の培地４０，４２のアンモニア量変化を測定した。その結果を図４に示す。図４の棒グラフの下の５×１０4cells又は５×１０5cellsはメンブレン３４の一方の面に播種した肝実質細胞３６の数を表しており、数値が記載されていないのは肝実質細胞３６を播種しなかったことを意味する。【００３８】
それぞれの反応容器には肝実質細胞３６の数ごとに３本ずつの棒グラフが示されている。３本の棒グラフの左端の"insert"と表示されているものはインサート３２内の培地４２（培養前はアンモニアを含んでいなかった培地）のアンモニア濃度、３本の棒グラフの中央で"bottom" と表示されているものはウエル３０内の培地４０（培養前は２．０ｍＭのアンモニアを含んでいた培地）のアンモニア濃度、そして３本の棒グラフの右端の"total"と表示されているものはインサート３２内の培地４２とウエル３０内の培地４０を合わせたときの全体のアンモニア濃度を表している。【００３９】
この実施例では、メンブレン３４の一方の面に播種された肝実質細胞３６と接するアンモニアを含んでいなかった培地４２は胆汁に相当し、メンブレン３４の他方の面に播種された内皮細胞３８と接するアンモニアを含んでいた培地４０は血液に相当する。【００４０】
比較例４はいずれの細胞も播種されていないので、アンモニア代謝能がない場合の結果を示している。もし、肝機能が機能していれば、もともとアンモニア濃度の高かったウエル３０内の培地４０のアンモニア濃度が減り、インサート３２内の培地４２側に分解・排出されることが期待される。【００４１】
図４の結果をみると、実施例３（図４中に「（実施例）」と表示してあるもの。）ではアンモニアの全量が減っているので、アンモニアの分解が起こっていると推定される。さらに、実施例３のうちの播種した肝実質細胞３６の数が５×１０4cellsの反応容器についてはウエル３０内の培地４０のアンモニア濃度が減り、インサート３２内の培地４２のアンモニア濃度が増えているので、アンモニアが培地４０から培地４２側へ排出されている現象が推定される。これは、アンモニアの分解と血液から胆汁へのアンモニアの排出という肝機能が発現していると推定される。比較例１〜３には肝機能の発現はみられない。【００４２】
なお、上記実施例で示した素材及び寸法は実験に用いた一例であり、本発明の構成を制限するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は人工肝臓などの人工臓器として利用することができるほか、細胞による薬物代謝試験などを行う反応容器としても利用することができる。
【符号の説明】
【００４４】
２      基体
４，６，１４      基板
８      多孔質膜
１０，１２，２０      流路
３４      メンブレン
３６      肝実質細胞
３８      内皮細胞
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年5月28日(2010.5.28)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体内部に配置された多孔質膜、前記基体により形成され、液導入口及び液排出口をもち、前記多孔質膜の一方の面に沿って溶液を流すことのできる流路となっている第１反応室、ならびに前記基体により形成され、前記液導入口及び液排出口とは異なる液導入口及び液排出口をもち、前記多孔質膜を介して第１反応室に対向し、前記多孔質膜の他方の面に沿って溶液を流すことのできる流路となっている第２反応室を備えたチップ構造体を用意し、
前記第１反応室の液導入口から第１細胞の懸濁液を導入し前記多孔質膜が懸濁液の下側にくるように静置して第１反応室内で前記多孔質膜上に第１細胞を固定する工程と、
前記第２反応室の液導入口から第２細胞の懸濁液を導入し前記多孔質膜が懸濁液の下側にくるように静置して第２反応室内で前記多孔質膜上に第１細胞とは異なる第２細胞を固定する工程と、
を備えたバイオデバイスの製造方法。
【請求項２】
前記第１、第２の反応室に該当する前記流路の深さが１ｍｍ以下である請求項１に記載のバイオデバイスの製造方法。
【請求項３】
前記多孔質膜で細胞が固定されている面には細胞を培養するためのコーティングが施されている請求項１又は２に記載のバイオデバイスの製造方法。
【請求項４】
第１細胞は肝実質細胞であり、第２細胞は内皮細胞であることにより人工臓器を構成している請求項１から３のいずれか一項に記載のバイオデバイスの製造方法。
【国際調査報告】
2009099066.tif 000008
2009099066.tif 000009
2009099066.tif 000010