(57)【要約】  ヒトカテプシンＣ遺伝子またはその遺伝子産物の活性を調節する、粘膜過分泌阻害に使用するのに好適な物質の同定法。当該方法は、候補物質をヒトカテプシンＣ遺伝子またはその遺伝子産物と組み合わせ、遺伝子またはその遺伝子産物の活性に対する候補物質の効果を測定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトカテプシンＣ遺伝子またはその遺伝子産物の活性を調節する、粘膜過分泌阻害に使用するのに好適な物質の同定法であって、候補物質を前記遺伝子またはその遺伝子産物と組み合わせ、そして前記遺伝子またはその遺伝子産物の活性に対する候補物質の効果を測定することを含んでなる方法。
【請求項２】
ヒトカテプシンＣ遺伝子産物がカテプシンＣポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子またはその遺伝子産物に対する候補物質の効果をヒト気管支上皮細胞における杯細胞の形成によって測定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトカテプシンＣ遺伝子またはその遺伝子産物を阻害する化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項５】
抗炎症剤、気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤、充血除去剤または咳止め剤である他の薬剤物質を、所望により薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヒト組織の粘膜過分泌阻害医薬の製造における、ヒトカテプシンＣ遺伝子によってコード化されるポリペプチドと免疫反応性である抗体、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブの使用。
【請求項７】
呼吸系の炎症性または閉塞性疾患の処置用医薬の製造における、ヒトカテプシンＣ遺伝子によってコード化されるポリペプチドと免疫反応性である抗体、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブの使用。
【請求項８】
ヒト組織における粘膜過分泌を阻害する医薬の製造における、ヒトカテプシンＣ阻害剤の使用。
【請求項９】
呼吸系の炎症性または閉塞性疾患の処置用医薬の製造における、ヒトカテプシンＣ阻害剤の使用。
【請求項１０】
炎症性または閉塞性疾患が慢性閉塞性肺疾患、喘息、嚢胞性線維症または気管支拡張症である、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテプシンＣの活性を調節する物質または薬剤の同定、および異常な粘膜分泌に関連する疾患、とりわけ慢性閉塞性肺疾患および喘息のような呼吸系の炎症性または閉塞性疾患の処置における前記物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
粘膜過分泌は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および喘息を有する患者に見られる状態であり、気道の過剰な粘膜分泌に関連する。これはまた、粘液腺の形成、感染の受容性の増大、肺機能の低下、疾病率および死亡率が含まれ得る。喘息患者に見られる粘膜の「連結」よりもむしろ気道内腔に十分に粘膜が放出されるＣＯＰＤにおいてとりわけ問題である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在、ＣＯＰＤにおける粘膜過分泌を明らかに減少させる治療アプローチは存在しない。したがって、粘膜過分泌を阻害する薬剤の開発が必要とされている。
【０００４】
粘膜は重度に糖化されたアポプロテインを含んでおり、杯細胞の分泌顆粒に包まれている。杯細胞ムチンはＣＯＰＤおよび喘息における粘膜関連気道閉塞において重要であると考えられている：Jackson AD（2001) Trends in Pharmacological Sciences 22:39-45; Rogers DF（2004) Current Opinion in Pharmacology 4:241-250; Kim S and Nadel JA（2004) Treatment in Respiratory Medicine 3:147-159]。
【０００５】
カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）調節剤が杯細胞からの粘膜の分泌を阻害し、そしてそれ自体が粘膜過分泌の処置に有用であると、本発明によって提案する。事実、カテプシンＣが好中球およびマスト細胞におけるセリンプロテアーゼの活性化に関与しているため、ＣＴＳＣ阻害剤は呼吸器疾患における粘膜調節剤および抗炎症剤としての２つの効果を有し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はしたがって、かかる疾患の治療ターゲットとしてのＣＴＳＣ遺伝子および遺伝子産物、そしてＣＴＳＣまたはＣＴＳＣ遺伝子産物の活性を刺激または阻害するＣＴＳＣ調節剤、すなわちペプチド、ペプチド模倣物、小分子もしくは他の薬剤を含む候補化合物または薬剤であって、ＣＯＰＤおよび喘息のような呼吸系の炎症性または閉塞性疾患に関連する粘膜過分泌を阻害するのに治療的に有用であり得るものを同定するためのアッセイを提供する。
【０００７】
第１の局面において本発明は、ヒトカテプシンＣ遺伝子またはその遺伝子産物の活性を調節する、粘膜過分泌阻害に使用するのに好適な物質の同定法であって、候補物質を当該遺伝子またはその遺伝子産物と組み合わせ、遺伝子またはその遺伝子産物の活性に対する候補物質の効果を測定することを含んでなる方法に関する。
【０００８】
好ましくは前記遺伝子またはその遺伝子産物の活性に対する候補物質の効果を、ヒト気管支上皮細胞における杯細胞の形成によって測定する。
【０００９】
第２の局面において本発明は、ヒトカテプシンＣ遺伝子またはその遺伝子産物を阻害する化合物、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００１０】
第３の局面において本発明は、ヒト組織における粘膜過分泌阻害用医薬の製造のための、ヒトカテプシンＣ遺伝子によってコード化されるポリペプチドと免疫反応性である抗体、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）、またはポリヌクレオチドの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブの使用に関する。
【００１１】
第４の局面において本発明は、呼吸系の炎症性または閉塞性疾患の処置用医薬の製造のための、ヒトカテプシンＣ遺伝子によってコード化されるポリペプチドと免疫反応性である抗体、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブの使用に関する。好ましくは炎症性または閉塞性疾患は慢性閉塞性肺疾患、喘息、嚢胞性線維症または気管支拡張症である。
【００１２】
第５の局面において本発明は、ヒト組織、とりわけ肺における粘膜過分泌の阻害用医薬の製造における、ヒトカテプシンＣ阻害剤の使用に関する。
【００１３】
第６の局面において本発明は、呼吸系の炎症性または閉塞性疾患の処置用医薬の製造におけるヒトカテプシンＣ阻害剤の使用に関する。
【００１４】
本明細書および下記請求項を通じて、文脈が他の意味を必要としない限り、「含む」なる用語または「含んでいる」もしくは「含んでなる」のような変化形は、記載の整数またはステップ、または整数もしくはステップの群を含むが、他の整数またはステップ、または整数もしくはステップの群を除外しないことを意味するものと理解される。
【００１５】
上記の通り、第１の局面において本発明は、ヒトカテプシンＣ遺伝子またはその遺伝子産物の活性を調節する、粘膜過分泌阻害に使用するのに好適な物質の同定法であって、候補物質を当該遺伝子またはその遺伝子産物と組み合わせ、遺伝子またはその遺伝子産物の活性に対する候補物質の効果を測定することを含んでなる方法に関する。
【００１６】
カテプシンは酵素分類ＥＣ  ３．４．２２に属するシステインプロテアーゼのサブクラスである（Barrett, A. J., N. D. Rawlings, et al., Handbook of Proteolytic Enzymes. London, Academic Press）。それらはリソソーム、エンドソームおよび細胞外タンパク質分解に大きな役割を果たしており、そして多くの疾患プロセスに関与していることが知られている。
【００１７】
カテプシンＣは、翻訳後プロセッシング酵素としての機能が知られているパパインスーパーファミリーに由来するリソソームシステインプロテアーゼである。それはジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰ１）としても知られている。その発見はGutmanおよびFrutonによって、J. Biol. Chem.（1948) 174, 851-858において報告された。マウスにおける免疫およびある炎症性細胞の活性化に関与することが見出されている。ＣＴＳＣ遺伝子における機能の喪失変異は、いずれも患者の掌蹠角化症および重度の早発型歯周炎によって特徴付けられる常染色体劣性障害であるヒトのパピヨン−ルフェーブル症候群およびハイム−ムンク症候群を起こすことが示されている。
【００１８】
粘膜過分泌の処置における使用に好適である物質は、ヒトＣＴＳＣ遺伝子またはヒトＣＴＳＣ遺伝子産物の阻害剤である傾向がある。
【００１９】
ＣＴＳＣ遺伝子産物の活性を、例えば細胞を利用した方法、またはヒトカテプシンＣ遺伝子またはその遺伝子産物の活性に対する阻害効果を有する化合物を同定するスクリーニングアッセイ、または適当なレポータージーンアッセイによって測定することができる。
【００２０】
上記スクリーニング法は、例えばＣＴＳＣポリペプチドを発現する、例えば昆虫、哺乳類またはイースト細胞を製造し、次に得られた細胞を候補物質とインキュベートしてＣＴＳＣポリペプチドの機能的活性の阻害を測定することによって行うことができる。
【００２１】
ＣＴＳＣ調節剤のスクリーニングに好適なアッセイフォーマットは既知である。かかるフォーマットは、例えば組換えカテプシンＣおよび蛍光ペプチド物質を使用したプレートフォーマット蛍光利用酵素アッセイのようなハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に好適である。
【００２２】
本発明はまた、ヒトカテプシンＣ遺伝子またはその遺伝子産物を阻害する化合物、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００２３】
ＣＴＳＣ遺伝子によってコード化されるポリペプチドと免疫反応性である抗体（本明細書において「ヒトＣＴＳＣ抗体」と称する）、またはポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチド（本明細書において「ヒトＣＴＳＣアンチセンスオリゴヌクレオチド」と称する）を、ヒト組織における粘膜過分泌阻害用医薬の製造に使用することができる。
【００２４】
上記ヒトＣＴＳＣ抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、粘膜過分泌によって引き起こされるかまたは悪化させられる呼吸系の炎症性または閉塞性疾患の処置に使用することができる。
【００２５】
ヒトＣＴＳＣ阻害剤、ヒトＣＴＳＣ抗体およびヒトＣＴＳＣアンチセンスオリゴヌクレオチドを、以後「本発明の薬剤」と集合的に称する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明が適用可能な炎症性または閉塞性気道疾患および状態には、急性肺傷害（ＡＬＩ）、成人／急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺、気道もしくは肺疾患（ＣＯＰＤ、ＣＯＡＤもしくはＣＯＬＤ）、例えば慢性気管支炎もしくはそれらと関連する呼吸困難、気腫、ならびに他の薬剤治療、とりわけ吸入薬剤治療の結果としての気道過敏の悪化が含まれる。本発明はまた、嚢胞性線維症、気管支拡張症（炎症性疾患、障害もしくは先天性以上の結果としての気管支または細気管支の持続性および進行性膨張）および例えば急性、アラキン酸性、カタル性、クループ性、慢性または結核様気管支炎を含むあらゆるタイプまたは起源の気管支炎の処置に適用可能である。さらに、本発明が適用され得る炎症性または閉塞性気道疾患には、あらゆるタイプまたは起源の塵肺症（炎症性、一般的には職業性肺疾患、これは慢性または急性のいずれでもしばしば気道閉塞を伴い、そして度重なる粉塵の吸入によって発生する）、例えば、アルミニウム肺症、炭粉沈着症、石綿肺症、石肺症、ダチョウ塵肺症、鉄沈着症、珪肺症、タバコ症および綿肺症が含まれる。
【００２７】
本発明が適用可能な他の炎症性または閉塞性気道疾患には、内因性（非−アレルギー性）喘息および外因性（アレルギー性）喘息の両方、軽度の喘息、中程度の喘息、重度の喘息、気管支喘息、運動誘発性喘息、職業性喘息および下記細菌感染によって誘導される喘息を含むあらゆるタイプまたは起源の喘息が含まれる。喘息の処置はまた、喘鳴症状を示しており、そして大きな医療的関心の確立された患者カテゴリーであり初期または早期喘息としばしば同定される「喘鳴小児」と診断されたかまたは診断され得る例えば４または５歳以下の対象の処置を含むと理解される。（簡便には、この具体的な喘息状態は「喘鳴小児症候群」と称される。）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
ヒトＣＴＳＣポリペプチドを、あらゆる好適な常套の方法を使用して単離することができる。
【００２９】
ヒトＣＴＳＣポリヌクレオチドはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、そしてあらゆる好適な常套の方法を使用して得ることができる。例えば、それはヌクレオチドから、既知の方法および装置を使用した例えば自動固相合成のような化学合成を含む方法によって製造することができる。
【００３０】
ヒトＣＴＳＣ抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。かかる抗体を常套の方法を使用して製造することができる。精製抗原に対するポリクローナル抗体の製造法は十分に確立されている（Cooper and Paterson in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. Eds., John Wiley and Sons Inc., Chapter 11参照）。ヒトＣＴＳＣ抗体をヒトＣＴＳＣポリペプチドの検出またはその発現レベルの測定に、またはヒトＣＴＳＣポリペプチドのリガンド／抗リガンド結合活性の阻害に使用することができる。
【００３１】
ヒトＣＴＳＣアンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＤＮＡのアナログ、例えばＤＮＡのホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートアナログ、ＲＮＡ、ＲＮＡのアナログ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、常套の方法、例えば自動固相技術を使用して合成することができる。それは所望によりヒトＣＴＳＣ遺伝子の発現阻害に使用され得る。あるいは、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を標的遺伝子ノックダウンの具体的なツールとして使用することができる。ＲＮＡ干渉は遺伝子発現を阻害し、したがって遺伝子機能を探索するために使用する。この技術はS. M. Elbashir et al in Methods 26（2002) 199-213に記載されている。
【００３２】
ヒトＣＴＳＣポリヌクレオチドプローブは、上記ポリヌクレオチドまたはその相補体の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。プローブはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、そして常套の方法によって合成することができる。通常それは、１５〜５０オリゴヌクレオチドを含む、例えば検出可能なシグナルを提供するフルオロフォアで標識することができる合成オリゴヌクレオチドである。ヒトＣＴＳＣポリヌクレオチドプローブを、ヒトＣＴＳＣ遺伝子の存在または不在を検出するために、すなわち遺伝的以上を検出するために使用することができる。
【００３３】
例えば炎症性気道疾患における粘膜過分泌状態の阻害における本発明の薬剤の効果を、杯細胞化生または急性粘膜分泌の動物モデル、例えばマウスまたはラットモデルによって、例えばStevenson et al, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.（2005) 288: L514-L522; Singer et al, Nature Med.（2004) 10:193-196に記載されているとおりに示すことができる。
【００３４】
例えば炎症性気道疾患における炎症性状態の阻害における本発明の薬剤の効果を、気道炎症または他の炎症性状態の動物モデル、例えばマウスまたはラットモデルによって、例えばSzarka et al, J. Immunol. Methods（1997) 202:49-57; Renzi et al, Am. Rev. Respir. Dis.（1993) 148:932-939; Tsuyuki et al., J. Clin. Invest.（1995) 96:2924-2931; and Cernadas et al（1999) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20:1-8に記載されているとおりに示すことができる。
【００３５】
ＣＯＰＤのような白血球関連炎症性疾患の阻害または逆転における本発明の薬剤の効果を、疾患モデル、例えばラットまたはマウスにおけるリポポリサッカライド誘導性肺炎症モデルによって例えばDurie et al., Clin. Immunol. Immunopathol.（1994) 73: 11-18; and Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1992) 89: 9784-9788に記載されているモデルによって示すことができる。
【００３６】
本発明の薬剤はまた、本明細書に記載のもののような閉塞性または炎症性気道疾患の処置における、抗炎症剤、気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤、充血除去剤または咳止め剤のような他の薬剤物質と組み合わせて、例えばかかる薬剤の治療活性の増強剤として、またはかかる薬剤の必要量または潜在的副作用を減少させる手段として使用するための共治療剤として有用である。本発明の薬剤は固定医薬組成物における他の薬剤物質と混合することができ、あるいはそれは他の薬剤物質の前に、同時にまたは後に、個別に投与することができる。
【００３７】
したがって本発明は、上記本発明の薬剤と抗炎症剤、気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤、充血除去剤または咳止め剤との組合せ剤であって、前記本発明の薬剤および前記薬剤物質が同一または異なる医薬組成物である剤を含む。
【００３８】
適当な抗炎症剤には、ステロイド、とりわけグルココルチコステロイド、例えばブデソニド、ベクラメタゾンジプロピオネート、フルチカゾンプロピオネート、シクレソニドまたはモメタゾンフロエート、あるいはＷＯ  ０２／８８１６７、ＷＯ  ０２／１２２６６、ＷＯ  ０２／１００８７９、ＷＯ  ０２／００６７９（とりわけ実施例３、１１、１４、１７、１９、２６、３４、３７、３９、５１、６０、６７、７２、７３、９０、９９および１０１に記載のもの）、ＷＯ  ０３／３５６６８、ＷＯ  ０３／４８１８１、ＷＯ  ０３／６２２５９、ＷＯ  ０３／６４４４５、ＷＯ  ０３／７２５９２、ＷＯ  ０４／３９８２７およびＷＯ  ０４／６６９２０に記載のステロイド；グルココルチコイド受容体アゴニスト、例えばＤＥ  １０２６１８７４、ＷＯ  ００／００５３１、ＷＯ  ０２／１０１４３、ＷＯ  ０３／８２２８０、ＷＯ  ０３／８２７８７、ＷＯ  ０３／８６２９４、ＷＯ  ０３／１０４１９５、ＷＯ  ０３／１０１９３２、ＷＯ  ０４／０５２２９、ＷＯ  ０４／１８４２９、ＷＯ  ０４／１９９３５およびＷＯ  ０４／２６２４８に記載のもの；ＬＴＢ４アンタゴニスト、例えばＢＩＩＬ  ２８４、ＣＰ−１９５５４３、ＤＰＣ１１８７０、ＬＴＢ４  エタノールアミド、ＬＹ  ２９３１１１、ＬＹ  ２５５２８３、ＣＧＳ０２５０１９Ｃ、ＣＰ−１９５５４３、ＯＮＯ−４０５７、ＳＢ  ２０９２４７、ＳＣ−５３２２８およびＵＳ  ５４５１７００に記載のもの；ＬＴＤ４アンタゴニスト、例えばモンテルカスト、プランルカスト、ザフィルルカスト、アコレート、ＳＲ２６４０、Ｗｙ−４８，２５２、ＩＣＩ  １９８６１５、ＭＫ−５７１、ＬＹ−１７１８８３、Ｒｏ  ２４−５９１３およびＬ−６４８０５１；ＰＤＥ４阻害剤、例えばシロミラスト（Ａｒｉｆｌｏ（登録商標）  ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ロフルミラスト（Ｂｙｋ  Ｇｕｌｄｅｎ）、Ｖ−１１２９４Ａ（Ｎａｐｐ）、ＢＡＹ１９−８００４（Ｂａｙｅｒ）、ＳＣＨ−３５１５９１（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、Ａｒｏｆｙｌｌｉｎｅ（Ａｌｍｉｒａｌｌ  Ｐｒｏｄｅｓｆａｒｍａ）、ＰＤ１８９６５９／ＰＤ１６８７８７（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、ＡＷＤ−１２−２８１（Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａ）、ＣＤＣ−８０１（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＳｅｌＣＩＤ（ＴＭ）  ＣＣ−１０００４（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＶＭ５５４／ＵＭ５６５（Ｖｅｒｎａｌｉｓ）、Ｔ−４４０（Ｔａｎａｂｅ）、ＫＷ−４４９０（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ）、
【００３９】
およびＷＯ  ９２／１９５９４、ＷＯ  ９３／１９７４９、ＷＯ  ９３／１９７５０、ＷＯ  ９３／１９７５１、ＷＯ  ９８／１８７９６、ＷＯ  ９９／１６７６６、ＷＯ  ０１／１３９５３、ＷＯ  ０３／１０４２０４、ＷＯ  ０３／１０４２０５、ＷＯ  ０３／３９５４４、ＷＯ  ０４／０００８１４、ＷＯ  ０４／０００８３９、ＷＯ  ０４／００５２５８、ＷＯ  ０４／０１８４５０、ＷＯ  ０４／０１８４５１、ＷＯ  ０４／０１８４５７、ＷＯ  ０４／０１８４６５、ＷＯ  ０４／０１８４３１、ＷＯ  ０４／０１８４４９、ＷＯ  ０４／０１８４５０、ＷＯ  ０４／０１８４５１、ＷＯ  ０４／０１８４５７、ＷＯ  ０４／０１８４６５、ＷＯ  ０４／０１９９４４、ＷＯ  ０４／０１９９４５、ＷＯ  ０４／０４５６０７およびＷＯ  ０４／０３７８０５に記載のもの；Ａ２Ａアゴニスト、例えばＥＰ  ４０９５９５Ａ２、ＥＰ  １０５２２６４、ＥＰ  １２４１１７６、ＷＯ  ９４／１７０９０、ＷＯ  ９６／０２５４３、ＷＯ  ９６／０２５５３、ＷＯ  ９８／２８３１９、ＷＯ  ９９／２４４４９、ＷＯ  ９９／２４４５０、ＷＯ  ９９／２４４５１、ＷＯ  ９９／３８８７７、ＷＯ  ９９／４１２６７、ＷＯ  ９９／６７２６３、ＷＯ  ９９／６７２６４、ＷＯ  ９９／６７２６５、ＷＯ  ９９／６７２６６、  ＷＯ  ００／２３４５７、ＷＯ  ００／７７０１８、ＷＯ  ００／７８７７４、  ＷＯ  ０１／２３３９９、ＷＯ  ０１／２７１３０、ＷＯ  ０１／２７１３１、ＷＯ  ０１／６０８３５、ＷＯ  ０１／９４３６８、  ＷＯ  ０２／００６７６、ＷＯ  ０２／２２６３０、ＷＯ  ０２／９６４６２、ＷＯ  ０３／０８６４０８、ＷＯ  ０４／０３９７６２、ＷＯ  ０４／０３９７６６、ＷＯ  ０４／０４５６１８およびＷＯ  ０４／０４６０８３に記載のもの；アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト、例えばＷＯ  ０２／４２２９８に記載のもの；ならびにベータ−２アドレノセプターアゴニスト、例えばアルブテロール（サルブタモール）、メタプロテレノール、テルブタリン、サルメテロール、フェノテロール、プロカテロール、およびとりわけフォルモテロール、カルモテロールおよびその薬学的に許容される塩、およびＷＯ  ００７５１１４の遊離形または溶媒和物形式Ｉの化合物（当該文献を出典明示により本明細書の一部とする。）、
【００４０】
好ましくはその実施例に記載の化合物、とりわけ式
【化１】
2009512428.tif 000002
の化合物およびその薬学的に許容される塩、ならびにＥＰ  １４７７１９、ＥＰ  １４４０９６６、ＥＰ  １４６００６４、ＥＰ  １４７７１６７、  ＥＰ  １５７４５０１、ＪＰ  ０５０２５０４５、ＪＰ  ２００５１８７３５７、ＵＳ  ２００２／００５５６５１、ＵＳ  ２００４／０２４２６２２、ＵＳ  ２００４／０２２９９０４、ＵＳ  ２００５／０１３３４１７、ＵＳ  ２００５／５１５９４４８、ＵＳ  ２００５／５１５９４４８、ＵＳ  ２００５／１７１１４７、ＵＳ  ２００５／１８２０９１、ＵＳ  ２００５／１８２０９２、ＵＳ  ２００５／２０９２２７、ＵＳ  ２００５／２５６１１５、ＵＳ  ２００５／２７７６３２、ＵＳ  ２００５／２７２７６９、ＵＳ  ２００５／２３９７７８、  ＵＳ  ２００５／２１５５４２、ＵＳ  ２００５／２１５５９０、ＵＳ  ２００６／１９９９１、ＵＳ  ２００６／５８５３０、ＷＯ  ９３／１８００７、ＷＯ  ９９／６４０３５、ＷＯ  ０１／４２１９３、ＷＯ  ０１／８３４６２、ＷＯ  ０２／６６４２２、ＷＯ  ０２／  ７０４９０、ＷＯ  ０２／７６９３３、ＷＯ  ０３／２４４３９、ＷＯ  ０３／４２１６０、ＷＯ  ０３／４２１６４、ＷＯ  ０３／７２５３９、ＷＯ  ０３／９１２０４、ＷＯ  ０３／９９７６４、ＷＯ  ０４／１６５７８、ＷＯ  ０４／２２５４７、ＷＯ  ０４／３２９２１、ＷＯ  ０４／３３４１２、ＷＯ  ０４／３７７６８、ＷＯ  ０４／３７７７３、ＷＯ  ０４／３７８０７、ＷＯ  ０４／３９７６２、ＷＯ  ０４／３９７６６、ＷＯ  ０４／４５６１８    ＷＯ  ０４／４６０８３  、ＷＯ  ０４／８０９６４、ＷＯ  ０４／０８７１４２、ＷＯ  ０４／８９８９２、ＷＯ  ０４／１０８６７５、ＷＯ  ０４／１０８６７６、ＷＯ  ０５／３３１２１、ＷＯ  ０５／４０１０３、ＷＯ  ０５／４４７８７、ＷＯ  ０５／５８８６７、ＷＯ  ０５／６５６５０、ＷＯ  ０５／６６１４０、ＷＯ  ０５／７０９０８、ＷＯ  ０５／７４９２４、ＷＯ  ０５／７７３６１、ＷＯ  ０５／９０２８８、ＷＯ  ０５／９２８６０、ＷＯ  ０５／９２８８７、ＷＯ  ０５／９０２８７、ＷＯ  ０５／９５３２８、ＷＯ  ０５／１０２３５０、ＷＯ  ０６／５６４７１、ＷＯ  ０６／７４８９７またはＷＯ  ０６／８１７３の遊離形または塩形または溶媒和物形の式Ｉの化合物が含まれる。
【００４１】
適当な気管支拡張剤には、抗コリン作動薬または抗ムスカリン剤、とりわけ臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、チオトロピウム塩およびＣＨＦ  ４２２６（Ｃｈｉｅｓｉ）、およびグリコピロレート、ならびにＥＰ  ４２４０２１、ＵＳ  ３７１４３５７、ＵＳ  ５１７１７４４、ＷＯ  ０１／０４１１８、ＷＯ  ０２／００６５２、ＷＯ  ０２／５１８４１、ＷＯ  ０２／５３５６４、ＷＯ  ０３／００８４０、ＷＯ  ０３／３３４９５、ＷＯ  ０３／５３９６６、ＷＯ  ０３／８７０９４、ＷＯ  ０４／０１８４２２、ＷＯ  ０４／０５２８５およびＷＯ  ０５／０７７３６１に記載のものが含まれる。
【００４２】
適当な抗炎症性および気管支拡張性２重薬剤には、２重ベータ−２アドレノセプターアゴニスト／ムスカリンアンタゴニスト、例えばＵＳ  ２００４／０１６７１６７、ＵＳ  ２００４／０２４２６２２、ＵＳ  ２００５／１８２０９２、ＵＳ  ２００５／２５６１１４、ＵＳ  ２００６／３５９３３、ＷＯ  ０４／７４２４６、ＷＯ  ０４／７４８１２、ＷＯ  ０４／８９８９２およびＷＯ  ０６／２３４７５に記載のものが含まれる。
【００４３】
適当な抗ヒスタミン剤にはセチリジンヒドロクロライド、レボセチリジン、アセトアミノフェン、クレマスチンフマレート、プロメタジン、ロラチジン、デスロラチジン、ジフェンヒドラミンおよびフェキソフェナジンヒドロクロライド、アクチバスチン、アステミゾール、アゼラスチン、エバスチン、エピナスチン、ミゾラスチンおよびテフェナジン、ならびにＪＰ  ２００４１０７２９９、ＷＯ  ０３／０９９８０７およびＷＯ  ０４／０２６８４１に記載のものが含まれる。
【００４４】
他の有用な本発明の薬剤と抗炎症剤との組合せ剤は、ケモカイン受容体のアンタゴニスト、例えばＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２、ＣＣＲ−３、ＣＣＲ−４、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−６、ＣＣＲ−７、ＣＣＲ−８、ＣＣＲ−９およびＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、とりわけＣＣＲ−５アンタゴニスト、例えばシェーリング−プラウアンタゴニスト  ＳＣ−３５１１２５、ＳＣＨ−５５７００およびＳＣＨ−Ｄ、タケダアンタゴニスト、例えばＮ−［［４−［［［６，７−ジヒドロ−２−（４−メチルフェニル）−５Ｈ−ベンゾ−シクロヘプテン−８−イル］カルボニル］アミノ］フェニル］−メチル］テトラヒドロ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２Ｈ−ピラン−４−アミン−イウムクロライド（ＴＡＫ−７７０）、およびＪＰ  ２００４３５９６４１、ＵＳ  ６１６６０３７（とりわけ請求項１８および１９）、ＷＯ  ００／６６５５８（とりわけ請求項８）、ＷＯ  ００／６６５５９（とりわけ請求項９）、ＷＯ  ０４／０１８４２５およびＷＯ  ０４／０２６８７３に記載のＣＣＲ−５アンタゴニストとのものである。
【００４５】
本発明の薬剤は、あらゆる適当な経路、例えば経口的に、例えば錠剤またはカプセル剤の形態で；非経腸に、例えば静脈内で；局所的に、例えば軟膏またはクリームで；経皮的に、例えばパッチで；吸入によって；または鼻腔内で投与することができる。
【００４６】
本発明の薬剤を含む医薬組成物を、常套の希釈剤または賦形剤、そしてガレヌス製剤の分野で知られている技術を使用して製造することができる。したがって経口投与形態には、錠剤およびカプセル剤を含んでいてもよく、そして吸入用組成物にはエアロゾルまたは他の噴霧製剤または乾燥粉末製剤が含まれ得る。
【００４７】
組成剤がエアロゾル製剤を含んでいるとき、これは好ましくは、例えばヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）推進剤、例えばＨＦＡ１３４ａまたはＨＦＡ２２７、またはこれらの混合物を含み、そしてエタノールのような当該技術分野で知られている１種以上の共溶媒（２０重量％まで）、および／またはオレイン酸もしくはソルビタントリオレエートのような１種以上の界面活性剤、および／またはラクトースのような１種以上の充填剤を含んでいてもよい。組成物が乾燥粉末製剤を含んでいるとき、これは好ましくは、例えば１０ミクロンまでの特定の直径を有する式Ｉの化合物を、所望の粒子径分散を有するラクトースのような希釈剤または担体、およびステアリン酸マグネシウムのような湿気による製品パフォーマンスの低下から保護するための補助化合物を例えば０．０１〜１．５％と共に含んでいる。組成物が噴霧製剤を含んでいるとき、これは好ましくは、例えば水、エタノールもしくはプロピレングリコールのような共溶媒、および界面活性剤であり得る安定化剤を含むビークルに溶解または懸濁している式Ｉの化合物を含む。
【００４８】
本発明は、（ｉ）吸入形態、例えばエアロゾルまたは他の噴霧化組成物、または吸入用微粒子、例えば微粉化形態の本発明の薬剤、（ｉｉ）吸入形態の本発明の薬剤を含む吸入用医薬；（ｉｉｉ）吸入形態の本発明の薬剤を吸入デバイスと共に含む医薬品；および（ｉｖ）吸入形態の本発明の薬剤を含む吸入デバイスを含む。
【００４９】
本発明の実施において使用する本発明の薬剤の用量は、当然、例えば処置する具体的な状態、所望の効果および投与形態に依存して変化し得る。一般的に、吸入による投与について適当な日用量は、１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇのオーダーであり、経口投与について適当な日用量は０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇのオーダーである。
【００５０】
本発明を下記実施例によって説明する。実施例において使用されている略語は下記意味を有する：
Ａ                    アデノシン
ＡＬＩ                空気−液体界面
ＡＴＰ                アデノシントリホスフェート
ｂｐ                  塩基対
ＣＯ２                二酸化炭素
ｃＲＮＡ              相補的リボ核酸
ＣＴＳＣ              カテプシンＣ
Ｃ                    シトシン
ＤＭＳＯ              ジメチルスルホキシド
ｄｓ−ｃＤＮＡ        ２本鎖ｃＤＮＡ
ＥＬＬＡ              酵素結合レクチンアッセイ
Ｇ                    グアノシン
ＨＢＥＣ              ヒト気管支上皮細胞
ＩＬ１３              インターロイキン１３
ＩＭＳ                工業変性アルコール
ＬＦ                  リポフェクタミン２０００
ｍＲＮＡ              メッセンジャーリボ核酸
ＮＢＦ                中性緩衝化ホルマリン
Ｐ                    ホスフェート
ＰＢＳ                リン酸緩衝化食塩水
Ｐ２                  パッセージ２
ＲＮＡ                リボ核酸
ＲＴ−ＰＣＲ          逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＳ                ドデシル硫酸ナトリウム
ｓｉＲＮＡ            小干渉リボ核酸
Ｕ                    ウラシル
【実施例】
【００５１】
実施例１
「ジーンチップ」プロファイリングによるＣＴＳＣの同定
空気−液体界面で培養したとき、初代培養のヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を刺激して１４日間、粘膜産生杯細胞を含む多細胞層に分化させることができることは知られている：Atherton et al in  Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.（2003) 285: L730-L739。杯細胞の数を生理的および薬理学的アプローチを使用して操作することができる。この発見を、発現がＨＢＥＣモデルにおける杯細胞形成と相関する遺伝子をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチッププロファイリングによって同定するための実験戦略の基礎として使用する。
【００５２】
パッセージ２（Ｐ２）のＨＢＥＣ（ドナー１Ｆ１８１１および２Ｆ１５７８；Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得ることができる）を１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にインサートあたり８．２５×１０４細胞で播種し、液内培養のとおりに７日間維持し、次いでAtherton et al. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.（2003) 285: L730-L739に記載の通りに１４日間、空気−液体界面（ＡＬＩ）に曝露する。得られた多層気管支上皮組織における杯細胞密度をインターロイキン１３（ＩＬ１３；１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度を変化させるか、分化培地から上皮増殖因子を除去するか、または１ｎｇ／ｍｌのＩＬ１３の存在下でｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤ＳＢ−２０２１９０（Ｔｏｃｒｉｓ）およびＡＡＺ１０２を１μＭおよび１０μＭ、分化培地に加えることによって調節する。これらの各条件における杯細胞密度の変化を、ＩＬ１３が存在しない基本レベルの分化に対して比較する。０、７および１４日ＡＬＩでの細胞の６インサートに由来する全ＲＮＡのサンプルを、インサートの細胞をＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して溶解し、抽出し、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理し、そしてＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製して製造する。
【００５３】
単離ＲＮＡサンプルのゲノム野生型ＲＮＡ転写プロファイリングを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現プローブアレイを使用して行う。ＲＮＡサンプルをＴ（２４）Ｔ７プライマーの存在下での２本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）の合成のテンプレートとして使用する。尾状ｄｓ−ｃＤＮＡをアフィニティー樹脂カラムを使用して精製し、そして第２の鎖の合成をビオチニル化リボヌクレオチドの存在下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって行う。ＲＮ簡易精製の後、標識ｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓに一晩ハイブリダイズし、その後洗浄し、そしてストレプトアビジン共役フィコエリスリンで染色する。各ジーンチップをスキャンし、画像をＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）バージョン５（ＭＡＳ５）を使用して処理し、そして得られたファイル（．ＣＥＬファイル）をデータベースにアップロードする。全発現実験を同じ標的強度（１５０）に合わせる。
【００５４】
発現データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ６．２（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）にダウンロードし、データを可視化して異なる時点（例えば７日目）および異なる実験条件下（例えば１ｎｇのＩＬ−１３）でのＨＢＥＣの遺伝子発現プロファイルからプローブセットのリストを作成する。杯細胞形成および粘膜分泌に関与する遺伝子が豊富なプローブセットのリストを作成するために２つのアプローチを取る。
【００５５】
第１のアプローチでは、１３８７プローブセットの非重複リストを、各実験条件について連続時点（すなわち０日目および７日目、７日目および１４日目）と時間マッチ時点（例えば７日目ビークルに対するｍｌあたりの７日目  １ｎｇのＩＬ１３）のプローブセットのりストを比較して作成する。この非重複リストをさらに、リストの個々の遺伝子を１２の基準（例えばビークル０と比較して１ｎｇまたは１０ｎｇのＩＬ１３における上方制御）で評価するスコアリングシステムを使用して１８５プローブセットのリストに減少する。スコアリングシステムの基本は望ましいプロファイル（例えばＩＬ１３での上方制御）を有するプローブセットに加点し、望ましくないプロファイル（例えばＩＬ１３で上方制御が起こらない）プローブセットから減点することである。適用する１２の基準は下記のものである：
【００５６】
Ａ：ビークル０と比較して１ｎｇまたは１０ｎｇのＩＬ１３で７日目に上方制御
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点０とした。
ビークルと比較して＜１倍の変化は得点−１とした。
Ｂ：ビークル７と比較して１ｎｇまたは１０ｎｇのＩＬ１３で７日目に上方制御（時間マッチ対照）
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点０とした。
ビークルと比較して＜１倍の変化は得点−１とした。
Ｃ：ビークル１４と比較して１ｎｇのＩＬ１３で１４日目に上方制御（時間マッチ対照）
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点０とした。
ビークルと比較して＜１倍の変化は得点−１とした。
Ｄ：ビークル１４と比較して１０ｎｇのＩＬ１３で１４日目に下方制御（時間マッチ対照）
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜−１倍の変化は得点−１とした。
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点−１とした。
Ｅ：１ｎｇのＩＬ１３で７日目と比較して１ｎｇのＩＬ１３で１４日目に上方制御
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点１とした。
ビークルと比較して＜−２倍の変化は得点−１とした。
Ｆ：１０ｎｇのＩＬ１３と比較して１０ｎｇのＩＬ１３で１４日目に下方制御
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜−１倍の変化は得点−１とした。
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点−１とした。
【００５７】
Ｇ：１Ｆ１８８７ドナーと比較して２Ｆ１５７８ドナーで誇張（１ｎｇのＩＬ１３で７日目）
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点０とした。
ビークルと比較して＜１倍の変化は得点−１とした。
Ｈ：１Ｆ１８８７ドナーと比較して２Ｆ１５７８ドナーで誇張（１ｎｇのＩＬ１３で１４日目）
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点０とした。
ビークルと比較して＜１倍の変化は得点−１とした。
Ｉ：１ｎｇのＩＬ１３で７日目と比較して１ｎｇのＩＬ１３＋１０μＭのＳＢで７日目に下方制御
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜−１倍の変化は得点−１とした。
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点−１とした。
Ｊ：１ｎｇのＩＬ１３で１４日目と比較して１ｎｇのＩＬ１３＋１０μＭのＳＢで１４日目に下方制御
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜−１倍の変化は得点−１とした。
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点−１とした。
Ｋ：１ｎｇのＩＬ１３で７日目と比較して１ｎｇのＩＬ１３＋１μＭのＡＡＺで７日目に下方制御
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜−１倍の変化は得点−１とした。
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点−１とした。
Ｌ：１ｎｇのＩＬ１３で１４日目と比較して１ｎｇのＩＬ１３＋１μＭのＡＡＺで１４日目に下方制御
ビークルと比較して＜２倍の変化は得点２とした。
ビークルと比較して＜−１倍の変化は得点−１とした。
ビークルと比較して＞２倍の変化は得点−１とした。
【００５８】
全試験にわたって得点を合計し、遺伝子を最終スコアに基づいてランク付けする。−１５〜＋３７の範囲の得点を得て、そして切り捨ての閾値を＋２０と決定して、１８５プローブセットのリストを得る。リストをさらに、２倍未満の上方制御を示す全ての遺伝子を除外して１１０プローブセットに減少させる。
【００５９】
第２のアプローチでは、プローブセットのリストをドナー２Ｆ１５７８からの７日目時間マッチデータのみを使用して作成し、そしてｍＬあたり１ｎｇのＩＬ１３で２倍以上上方制御するが、ＩＬ１３の存在下で１０μＭのＳＢ２０２１９では下方制御される遺伝子についてプローブセットを同定する。この基準を満たす５０プローブセットが同定される。
【００６０】
２つのアプローチによって作成したプローブセットのリストを比較してアプローチ２によって作成された５０プローブセットの４４個は、アプローチ１によって同定されたプローブセットのリストに含まれていることが示される。かくして杯細胞形成／粘膜分泌に潜在的に関与する９３遺伝子に対応する１１６プローブセットのリストを同定する。
【００６１】
９３遺伝子のリストをさらに、バイオインフォマティクス・アノテーション（遺伝子オントロジー分類、経路割り当て）、文献アノテーション（生物機能）および主観的評価（薬剤能、アッセイ能、生物学的役割）の組合せを使用して精錬して、インビトロでの遺伝子ノックダウンおよび小分子阻害実験を使用する杯細胞形成および／または粘膜分泌における役割の実験的検証のための１０遺伝子のリストを作成する。
【００６２】
実施例２
ＣＴＳＣ遺伝子発現またはタンパク質活性の阻害が杯細胞形成を阻害することの同定
ノックダウンカテプシンＣ遺伝子発現のＩＬ１３分化ＨＢＥＣにおける杯細胞形成に対する効果を、２本鎖小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して試験する。配列ＮＭ＿００１８１４を標準配列として使用して、カテプシンＣ遺伝子を標的とし、３’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有する１９ｂｐのＲＮＡ２本鎖からなる４つのｓｉＲＮＡ２本鎖を設計し、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃによって合成する：
２本鎖１：ＧＧＡＧＡＡＡＵＧＵＵＣＡＵＧＧＵＡＵＵＵ（センス鎖）（配列番号０１）
５’−Ｐ−ＡＵＡＣＣＡＵＧＡＡＣＡＵＵＵＣＵＣＣＵＵ（アンチセンス鎖）（配列番号０２）
２本鎖２：ＧＣＡＡＵＧＡＡＧＣＣＣＵＧＡＵＧＡＡＵＵ（センス鎖）（配列番号０３）
５’−Ｐ−ＵＵＣＡＵＣＡＧＧＧＣＵＵＣＡＵＵＧＣＵＵ（アンチセンス鎖）（配列番号０４）
２本鎖３：ＣＵＡＡＵＡＧＧＣＵＣＵＡＣＡＡＧＵＡＵＵ（センス鎖）（配列番号０５）
５’−Ｐ−ＵＡＣＵＵＧＵＡＧＡＧＣＣＵＡＵＵＡＧＵＵ（アンチセンス鎖）（配列番号０６）
２本鎖４：ＣＣＵＵＡＡＧＡＡＵＵＣＵＣＡＧＧＡＡＵＵ（センス鎖）（配列番号０７）
５’−Ｐ−ＵＵＣＣＵＧＡＧＡＡＵＵＣＵＵＡＡＧＧＵＵ（アンチセンス鎖）（配列番号０８）
【００６３】
ｓｉＲＮＡ２本鎖をＨＢＥＣに、リポフェクタミン２０００（商標）を使用してトランスフェクトする。トランスフェクション培地を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ血清減少培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、ｓｉＲＮＡ２本鎖（５×最終濃度）およびリポフェクタミン２０００（商標）（５×最終濃度）を混合し、室温で３０分間インキュベートし、抗生物質を含まない分化培地（ＤＩＦＦ−ＡＢ培地；気管支上皮基礎培地およびＤｕｌｂｅｃｃｏｓ修飾イーグル培地［５０：５０］に気管支上皮増殖培地ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ［ウシ下垂体抽出物、インシュリン、ヒドロコルチゾン、全トランスレチノイン酸、トランスフェリン、エピネフリン、トリ−ヨードチロニンおよびヒト上皮増殖因子を推薦濃度で、ただしトリ−ヨードチロニンおよびゲンタマイシン／アムホテリシンＢを含まない］を加える、全てＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒから入手）で１：５に希釈した後ＨＢＥＣを加えて製造する。これらの実験について、ＨＢＥＣモデルの短縮版を使用し、ＨＢＥＣを液内培養のとおりに３日間維持し、そしてＡＬＩに６日間移動する。ＨＢＥＣドナー２Ｆ１５７８のパッセージ２（Ｐ２）株由来の細胞を、Atherton et al. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.（2003) 285: L730-L739に記載のとおりに約８５％コンフルエンスに培養し、その後トランスフェクションのために収穫する。トリプシン処理および遠心分離によって回収して、細胞をｍｌあたり１６．５×１０４細胞の濃度でｓｉＲＮＡ２本鎖（１０ｎＭ）およびリポフェクタミン２０００（商標）（ｍｌあたり１μｌ）を含むＤＩＦＦ−ＡＢ培地で再懸濁し、１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒインサートに播種する。１ｍｌのＨＢＥＣ／ＤＩＦＦ−ＡＢ培地／ｓｉＲＮＡ／リポフェクタミン２０００（商標）混合物を各インサートに入れ、そして１ｍｌのＤＩＦＦ−ＡＢ培地を各インサートの側底部に加える。２４時間後（液内培養１日目）、全培地を吸引し（先端および側底）、ｍｌあたり５０μｇのゲンタマイシンを含むがアンホテリシンＢを含まないＤＩＦＦ−ＡＢ培地（ＤＩＦＦ−ＡＢ＋Ｇ）を先端に０．５ｍｌおよび側底に１ｍｌ置換する。３日目に、ＤＩＦＦ−ＡＢ＋Ｇ培地を先端および側底表面から吸引し、ＨＢＥＣをＡＬＩで、ｍｌあたり１ｎｇのＩＬ１３を含むＤＩＦＦ−ＡＢ＋Ｇ培地で培養する。全細胞を３７℃、５％ＣＯ２および９５％相対湿度でインキュベートする。側底の培地を５日目および７日目に吸引し、ＩＬ１３を含むＤＩＦＦ−ＡＢ＋Ｇ培地１ｍｌで置換する。さらに先端表面を０．５ｍｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）でリンスして蓄積している細胞片／粘膜を除去する。細胞を上記の通り、３、５、７および９日目の全ＲＮＡ抽出のため、そして９日目の杯細胞組織学的分析のために収穫する。組織学のために、インサートを、１０％中性緩衝化ホルマリン（ＮＢＦ）０．５ｍｌを先端表面に加え、その後ＮＢＦ  １ｍｌを側底表面に加えて固定する。２４時間固定した後、インサートを分割し、等級工業変性アルコール（ＩＭＳ）およびクロロホルムでＲＡＬｗａｘに処理する。半分のインサートを両方、新鮮なＲＡＬｗａｘを使用してエッジに包埋する。パラフィンブロックを４５μｍに切断し、４５Ｍ１抗体（抗−ＭＵＣ５ＡＣ抗体、Ｌａｂ−Ｖｉｓｉｏｎ  Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓから入手）およびアルシアンブルー／ヘマトキシリンおよびエオシン（ＡＢ／Ｈ＆Ｅ）で、標準的な組織学的プロトコルに従って、ムチンの検出および核染色によって個々の細胞の区別が可能となるように染色する。染色したスライドを顕微鏡観察する。
【００６４】
ＣＴＳＣ  ｓｉＲＮＡ２本鎖１〜４は、ＣＴＳＣ遺伝子発現をトランスフェクト細胞で個別に、または組合せで（２．５ｎＭの各２本鎖を含むＳＭＡＲＴＰＯＯＬ、合計１０ｎＭ）、ＩＬ１３で処理したがトランスフェクション試薬に曝露していない細胞と比較して下方制御することを見出す。ＣＴＳＣレベルを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）によるＨＢＥＣから抽出した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって、下記プライマー対およびプローブセットを使用して測定する：
フォワードプライマー：５’−ＡＧＡＴＡＴＧＡＴＴＡＧＧＡＧＡＡＧＴＧ−３’（配列番号０９）
リバースプライマー：５’−ＴＣＴＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＴ−３’（配列番号１０）
プローブ：５’−ＦＡＭ−ＡＴＣＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＡＡＣ−３’（配列番号１１）
【００６５】
下記表１は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）分析によって測定したｍＲＮＡレベルをＩＬ１３のみで処理してトランスフェクトしていない細胞におけるレベルのパーセンテージとして表現した実験結果を示す：
【表１】
2009512428.tif 000003
＊括弧内に平均の標準誤差を示す。
【００６６】
ＣＴＳＣ  ｍＲＮＡレベルのノックダウンは、未トランスフェクト細胞と比較して９日の培養期間にわたって全４つのｓｉＲＮＡ２本鎖で見られる。２本鎖１および３がもっとも効果的にＣＴＳＣ  ｍＲＮＡレベルをノックダウンする。リポフェクタミン２０００（商標）のみで処理した細胞、またはシクロフィリンＢ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．）で処理した細胞のＣＴＳＣ  ｍＲＮＡレベルは顕著には変化しない。
【００６７】
ＣＴＳＣノックダウンの杯細胞形成に対する効果を、４５Ｍ１染色領域（上皮のμｍ２／μｍ）を測定し、ＩＬ１３処理細胞のパーセンテージとして表現することによって調査する。結果を下記表２に示す：
【表２】
2009512428.tif 000004
＊括弧内に平均の標準誤差を示す。
【００６８】
４つのｓｉＲＮＡ２本鎖（とＳｍａｒｔＰｏｏｌ）は各々顕著に上皮におけるＭＵＣ５ＡＣ染色領域を減少させ、これはＣＴＳＣ遺伝子発現の９日間にわたる減少が、４５Ｍ１によって測定したとおり杯細胞形成を阻害すること、そして杯細胞形成におけるＣＴＳＣの機能的役割を示している。
【００６９】
２本鎖１および３（もっとも効果的なｓｉＲＮＡ２本鎖と同定された）は濃度依存的に、ＣＴＳＣ  ｍＲＮＡを９日間にわたって、未処理細胞において観察されるもの以下のレベルにノックダウンする。２本鎖１について得られた結果を下記表３に示す：
【表３】
2009512428.tif 000005
＊括弧内に平均の標準誤差を示す。
【００７０】
上記実験に示すとおり、リポフェクタミン２０００（商標）のみで、またはシクロフィリンＢ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．）で処理した細胞におけるＣＴＳＣ  ｍＲＮＡのレベルは顕著には変化しない。さらに、ｓｉＲＮＡ２本鎖は用量依存的に、免疫組織化学的に上皮切片の４５Ｍ１染色領域、およびＴａｑＭａｎによって測定したＭＵＣ５ＡＣレベルを、未処理細胞と比較して減少させる。結果を下記表４に示す：
【表４】
2009512428.tif 000006
＊括弧内に平均の標準誤差を示す。
【００７１】
ＣＴＳＣタンパク質レベルに対する遺伝子発現のｓｉＲＮＡノックダウンの効果を、ｓｉＲＮＡ２本鎖１および３で処理した５、７および９日目のＨＢＥＣ由来の溶解物の、ヒト起源のカテプシンＣのカルボキシ末端の近くのペプチドマッピングに対する親和性精製ヤギポリクローナル抗体（抗体Ｔ１７［ｓｃ−５６４７］、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から）を使用したウェスタンブロッティングによって測定する。タンパク質製造のために、インサートを１ｍｌの冷ＰＢＳで側底部（×１）および先端部（×２）を洗浄し、ｔｉｍｅｐｏｉｎｔ各時点／ｓｉＲＮＡ濃度／対照のＨＢＥＣの２つのインサートを３０分間４℃で、１：１００に希釈したホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ）およびホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．６／１％  Ｔｒｉｔｏｎ、７５μｌで溶解する。両方のインサートからの溶解物を微小遠心管に入れて回収し、溶解物を１６，０００ｇで５分間遠心分離する。上清を回収し、１７μｌアリコートを４〜１２％  Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓ  ＮｕＰＡＧＥ（商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファーを使用して分析する。電気泳動後、ゲルをＨｙＢｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についての標準的なプロトコルを使用してウェスタンブロットする。ブロットをＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．）で６０分間室温でブロックし、１：１００に希釈したＴ１７抗体と６０分間室温でインキュベートする。０．０５％のツイーン２０を含むＰＢＳで１０分間、室温で４回洗浄した後、ブロットを１：２５００に希釈した抗ヤギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でインキュベートし、Ｔ１７抗体にハイブリダイズしたタンパク質バンドを可視化し、そして８４μｍの解像度での７００ｎｍで、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．）を使用して定量する。抗体はＩＬ１３処理ＨＢＥＣのウェスタンブロッティングで７ｋＤａ（ＣＴＳＣの軽鎖に対応する）付近のタンパク質バンドを検出し、これは５日目から９日目で強度が増加する。７ｋＤａバンドに加え、Ｔ１７抗体はＩＬ１３処理で強度が変化しない複数の他の高分子量バンドを検出する。これらの変化しないバンドの１つを内部対照として使用して、７ｋＤａバンドの強度をこれと比較した比として表現する。バンドはｓｉＲＮＡ処理ＨＢＥＣから、１０ｎＭ、３ｎＭおよび１ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で、５、７および９日目で溶解物の強度において減少する。０．３ｎＭのｓｉＲＮＡで、ノックダウンは５日目に見られるが、７および９日目に量において進行的に増加する。結果を下記表５に示す：
【表５】
2009512428.tif 000007
【００７２】
広スペクトルカテプシン阻害剤であるプロパン−１−スルホン酸｛４−［２−シアノ−７−（２，２−ジメチル−プロピル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イルメチル］−フェニル｝−アミド（本明細書において「化合物Ａ」）を、杯細胞形成に対する効果について、９日目モデルで、側底培地に０．１、１および１０μＭで、３、５および７日目に化合物を加えることによって試験する。杯細胞形成に対する効果をエピセリウムの単位長さあたり、４５Ｍ１およびＡＢ／ＰＡＳ染色によって組織学的に試験する。結果を下記表６に示す：
【表６】
2009512428.tif 000008
＊括弧内に平均の標準誤差を示す。
【００７３】
１０μＭではわずかな効果が見られ、０．１および１μＭでは効果が見られなかった。ＡＬＩでより長期間（６日目よりも１１日目）細胞を処理することによって１０μＭではより大きな阻害を示す。結果を下記表７に示す：
【表７】
2009512428.tif 000009
＊括弧内に平均の標準誤差を示す。
【００７４】
実施例３
ＣＴＳＣ遺伝子発現またはタンパク質活性の阻害が粘膜分泌を阻害することの同定
分化ＨＢＥＣにおけるムチン分泌に対するＣＴＳＣ発現のｓｉＲＮＡノックダウンの効果をＣＴＳＣ  ＳＭＡＲＴＰＯＯＬを使用して異なる濃度で（０．３〜１０ｎＭ）試験する。アデノシントリホスフェートをムチンムチン分泌促進剤として使用し、そして分泌されたムチンを、酵素結合レクチンアッセイを使用して測定する（ELLA; Kemp, Sugar and Jackson Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.(2004) 31: 446-455）。ＨＢＥＣ（ドナー２Ｆ１５７８由来のインサートあたり１６．５×１０４細胞）をトランスフェクトし、実施例２に記載の通りに９日目分化モデルを使用して培養する。９日目（ＡＬＩ６日目）にＨＢＥＣインサートを１００μＭ  ＡＴＰ−γＳに１０分間曝露し、上清を除去してＥＬＬＡ分析する。ＡＴＰ−γＳ誘導粘膜分泌は、全てのＣＴＳＣ  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＲＴＰＯＯＬ濃度で阻害されるが、シクロフィリンＢ  ｓｉＲＮＡまたはリポフェクタミン単独では効果がない。結果を下記表８に示す：
【表８】
2009512428.tif 000010
＊括弧内に平均の標準誤差を示す。
【００７５】
９日目モデルにおける粘膜分泌に対する化合物Ａの効果を、０．１％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む最少培地の先端表面に様々な濃度で化合物を（０．１〜１０μＭ）加え、３０分間３７℃でインキュベートし、その後１００μＭ  ＡＴＰ−γＳに１０分間曝露する。化合物Ａは用量依存的に粘膜分泌を阻害する。結果を下記表９に示す：
【表９】
2009512428.tif 000011
＊括弧内に平均の標準誤差を示す。
【国際調査報告】
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