(57)【要約】  補体成分ペプチドＣ３ａの配列の５５〜６４位に部分的に対応するペプチドは、アナフィラトキシン反応を回避しながら、ＩｇＥ若しくはＩｇＧ媒介性誘発を抑制することにより、並びに／又はＦｃεＲＩ及び／若しくはＦｃγＲ誘発性分泌反応を抑制することにより、マスト細胞及び好塩基性細胞媒介性疾患を予防及び治療することができる。粘膜型及び／若しくは漿膜型のマスト細胞並びに／又は好塩基球が、喘息、アレルギー性皮膚疾患、及び消化管アレルギーなどに関与する場合、これらのペプチドは、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
Ｘ１−Ａｓｐ−Ｘ２−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｘ３（配列番号３から１０）
（式中、
Ｘ１は、水素、低級アルカノイル、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ及びＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａからなる群から選択され；
Ｘ２は、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ及びＶａｌ−Ｖａ１からなる群から選択され；
Ｘ３は、Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ、及びＧｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２からなる群から選択される）；
又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩
（但し、Ｘ１が水素又は低級アルカノイルであり、Ｘ３がＡｒｇ又はＡｒｇ−ＮＨ２である場合は、Ｘ２はＶａｌ−Ｖａｌである）のアミノ酸配列を有するヒト補体Ｃ３ａのアミノ酸５５〜６４位の配列（配列番号２）に由来する、ペプチド。
【請求項２】
分泌反応が、（ｉ）ＩｇＥ又はＩｇＧ媒介性誘発、及び（ｉｉ）ＦｃεＲＩ又はＦｃγＲのクラスター形成からなる群から選択される刺激により誘発される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
【化１】
2009502904.tif 000015
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアナログ；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の化学的誘導体；及び
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）の塩
（但し、Ｚが末端カルボキシ酸、アミド、又はアルコールを表す）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｚがカルボキシ末端アミドである、請求項１から３までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｚがカルボキシ末端アミドである、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｚがカルボキシ末端アミドである、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
活性剤として請求項１から６までのいずれか一項に記載のペプチド、及び薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項８】
前記ペプチドが、配列番号３〜配列番号１４、並びにこれらのアナログ及び化学的誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
アレルギー性疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１から６までのいずれか一項に記載のペプチドの治療有効量、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、これにより前記アレルギー性疾患を予防又は治療する、上記方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、配列番号３〜配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アレルギー性疾患が、ＩｇＥ若しくはＩｇＧ媒介性（Ｉ型若しくはＩＩＩ型）過敏症及び／又はＦｃεＲＩ若しくはＦｃγＲ誘発性分泌反応に起因する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記アレルギー性疾患が、粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型により媒介される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、肺疾患、アレルギー性皮膚疾患、アレルギー結膜炎、消化管アレルギー、痙攣、吐き気、嘔吐、下痢、過敏性腸疾患、眼のアレルギー、口唇炎、外陰炎、及びアナフィラキシーからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記肺疾患が喘息である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型により媒介されるアレルギー性疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、それを必要とする対象に、ペプチドの治療有効量及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記ペプチドが、
【化２】
2009502904.tif 000016
（式中、
Ｘ１は、水素、低級アルカノイル、Ｃｙｓ、Ａｓｐ−Ｃｙｓ及びＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓから選択され；
Ｘ２は、水素、低級アルカノイル及びＬｙｓから選択され；
Ｘ３は、
【化３】
2009502904.tif 000017
から選択され；
Ｘ４は、（ｉ）Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｒ２−Ｌｅｕ−Ｒ３；及び（ｉｉ）Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｒ７から選択され；
Ｘ５又は配列は、低級アルカノイル及びＬｅｕから選択され；
Ｒ１は、芳香族アミノ酸残基から選択され；
Ｒ２は、Ｇｌｕ及びＬｙｓから選択され；
Ｒ３は、正に荷電するアミノ酸残基から選択され；
Ｒ４は、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され；
Ｒ５は、Ａｌａ及びＡｒｇから選択され；
Ｒ６は、Ａｒｇ及びＬｙｓから選択され；
Ｒ７は、ヒドロキシ（ＯＨ）、Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、及びＡｇｍ（アグマチン）から選択される）、
並びにこれらのアナログ、化学的誘導体及び薬学的に許容し得る塩からなる群から選択される、上記方法。
【請求項２０】
前記ペプチドが、
【化４】
2009502904.tif 000018
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のアナログ；
（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）の化学的誘導体；
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）の塩；
及び薬学的に許容し得る担体からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドが、配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなり、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項１９及び２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなり、場合によってはカルボキシ末端アミドを有する、請求項１９及び２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アレルギー性疾患が、ＩｇＥ若しくはＩｇＧ媒介性（Ｉ型若しくはＩＩＩ型）過敏症及び／又はＦｃεＲＩ若しくはＦｃγＲ誘発性分泌反応に起因する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記アレルギー性疾患が、消化管アレルギー、痙攣、吐き気、嘔吐、下痢、過敏性腸疾患からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補体Ｃ３ａのアミノ酸配列に由来するペプチドに関し、マスト細胞又は好塩基球により媒介されるアレルギー性疾患、特に喘息などの肺アレルギーの予防及び治療におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マスト細胞及び好塩基球は、炎症性及び即時型過敏反応において中心的な役割を果たす。マスト細胞及び好塩基球の原形質膜中に存在する１型Ｆｃεレセプター（ＦｃεＲＩ）のクラスター形成が、カップリングカスケードを開始し、ヒスタミン、セロトニン、プロテアーゼ、リウコトリエン及びいくつかのサイトカインを含む炎症伝達物質の分泌に至る。ＦｃεＲＩクラスター形成により開始されるシグナル伝達の分子機構は、ここ数年の間に集中的に研究されてきた。ｓｒｃファミリータンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のＬｙｎは、レセプター複合体のβサブユニットと相互作用し、ＦｃεＲＩのクラスター形成の結果、リン酸化と活性化を受ける。免疫レセプターのチロシンベースの活性化モティーフ（ＩＴＡＭ）−リン酸化したレセプターサブユニットへのＬｙｎの動員は、Ｓｙｋ  ＰＴＫの活性化を引き起こし、これはひいてはホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）の活性化、リン脂質イノシド−４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）の加水分解及び遊離サイトゾルの［Ｃａ２＋］ｉの一過性の増加を引き起こす。これは次にプロテインキナーゼＣの活性化を引き起こし、最終的に伝達物質の分泌に至る。
【０００３】
マスト細胞前駆細胞は単一系統を示し、異なる組織への遊走後に、２つの異なった表現型を生じ、漿膜空洞、皮膚及び気道に存在する、いわゆる漿膜（結合組織型）マスト細胞、並びに主として胃腸内粘膜の表面に見いだされる粘膜型マスト細胞を生じる。しかし、マスト細胞の組織依存的分化は可逆的であり、線維芽細胞由来の因子は、粘膜型のマスト細胞を漿膜型のマスト細胞に変えるが、ＩＬ−３は粘膜の表現型に有利である。組織分布の他に、これら細胞の細胞内顆粒の寿命及び伝達物質含有量も異なる。どちらの型もその細胞膜上にＦｃεＲＩを発現し、これらのクラスター形成は分泌反応を誘発する。
【０００４】
マスト細胞のＦｃεＲＩ媒介性誘発とは対照的に、マスト細胞活性化のペプチド作動性経路は、漿膜マスト細胞でのみ生じる。漿膜マスト細胞は、ラット腹膜又はヒト皮膚マスト細胞で実験的にモデル化される。ペプチド作動性刺激は、ポリアミン又はカチオン性ペプチド、たとえばサブスタンスＰ、若しくは補体活性化産物Ｃ３ａ及びＣ５ａに曝露させることにより誘発される（Ｍｏｕｓｌｉら，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍｃｏｌ  ２７：１−１１，１９９５）。後者の補体由来のアナフィラトキシンは、（漿膜）マスト細胞の分泌反応の最も強力なペプチド作動性活性化因子の１つである。これとは対照的に、ラットの好塩基球性白血病細胞系（ＲＢＬ−２Ｈ３）などの粘膜マスト細胞は、このようなカチオン性ペプチドに反応しない。Ｃ３ａ及び一部のその誘導体は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のＩｇＥ媒介性脱顆粒を抑制するが、Ｃ５ａはこの過程に影響を及ぼさないことが示された（Ｅｒｄｅｉら．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４３３−１４３９，１９９５；Ｅｒｄｅｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．６８：７９−８２，１９９９）。
【０００５】
Ｃ３ａは漿膜マスト細胞に対してアナフィラトキシンであるため、Ｃ３ａは抗アレルギー剤としての使用には適さない。すなわちＣ３ａはマスト細胞からメディエータの分泌を誘導できる。
【０００６】
本発明の出願人らの米国特許第６，６８２，７４０号では、粘膜マスト細胞のＩｇＥ媒介性誘発及び／又はＦｃεＲＩ誘発性分泌反応を抑制できるヒト補体由来ペプチドＣ３ａの配列の５０〜７７位、及びそのアナログに部分的に、又は完全に対応するペプチドを開示している。
【０００７】
好塩基性細胞及び漿膜型及び粘膜型双方のマスト細胞に媒介される脱顆粒を伴うアレルギー性疾患の予防又は治療に有用な、短いペプチド及びこれを含む組成物に対する必要性が存在している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明によって、ヒト補体成分Ｃ３ａの５５〜６４位におけるアミノ酸配列及びこのアナログに由来し、部分的に対応するあるペプチドは、粘膜型及び漿膜型双方のマスト細胞並びに好塩基性細胞のＦｃεＲＩ誘発性分泌反応の抑制に有効であり、付随する症状の緩和に有効であるが、Ｃ３ａのアナフィラトキシン作用を欠いていることが判明した。
【０００９】
これらのペプチドの抑制効果は、ＦｃεＲＩ刺激反応カップリングカスケードに近位の事象の抑制、たとえばＦｃεＲＩβサブユニット及びチロシンキナーゼＬｙｎのタンパク質リン酸化並びに遊離サイトゾルのカルシウムイオンの一過性の増加のような後期の事象の抑制をもたらすことが今回発見された。
【００１０】
ヒト補体成分Ｃ３ａの５５〜６４位のアミノ酸配列及びそのアナログに部分的に対応するＣ３ａ由来ペプチドは、受動全身アナフィラキシー及び動物モデルにおける喘息症状を緩和できることが今回初めて開示された。
【００１１】
本発明で開示された新規のペプチドは、配列：
【化１】
2009502904.tif 000002
を有する７７ｍｅｒのペプチド（配列番号１）である既知のヒト補体成分Ｃ３ａに由来する。
【００１２】
本発明は、細胞の分泌反応を抑制することでできる配列番号２に記載の配列：Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを有するヒト補体ペプチドＣ３ａの５５〜６４位のアミノ酸配列、並びにこれらのアナログ、化学的誘導体、及び塩に由来し、部分的に対応するペプチドに関し、細胞は粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び／又は好塩基性細胞であり、分泌反応は、（ｉ）ＩｇＥ若しくはＩｇＧ媒介性誘発及び／又は（ｉｉ）ＦｃεＲＩ若しくはＦｃγＲクラスター形成から選択される刺激により誘発される。
【００１３】
１つの態様において、本発明は、一般式Ｉ：
Ｘ１−Ａｓｐ−Ｘ２−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｘ３（配列番号３から１０）；
（式中、
Ｘ１は、水素、低級アルカノイル、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、及びＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａから選択され；
Ｘ２は、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ及びＶａｌ−Ｖａｌから選択され；
Ｘ３は、Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ、及びＧｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２から選択される
又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩（但し、Ｘ１が水素又は低級アルカノイルであり、Ｘ３がＡｒｇ又はＡｒｇ−ＮＨ２である場合は、Ｘ２はＶａｌ−Ｖａｌである）のアミノ酸配列を有するヒト補体Ｃ３ａのアミノ酸５５〜６４位の配列（配列番号２）に由来するペプチドを提供する。
【００１４】
本発明の新規のペプチドは、粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞の分泌反応を抑制することができる。刺激により誘発される分泌反応は、（ｉ）ＩｇＥ若しくはＩｇＧ媒介性誘発及び／又は（ｉｉ）ＦｃεＲＩ若しくはＦｃγＲのクラスター形成からなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、
【化２】
2009502904.tif 000003
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアナログ；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の化学的誘導体；及び
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）の塩
（但し、Ｚは、末端カルボキシ酸、アミド、又はアルコールを表す）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
用語Ｄ−Ａｌａは、アラニンのＤ−異性体立体配置を表す。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、本発明のペプチドは約８から約１２のアミノ酸残基を有する。特定の実施形態においては、本発明のペプチドは約８から約１０のアミノ酸残基を有する。
【００１７】
特定の実施形態によれば、このペプチドは、Ｚがカルボキシ末端アミドである配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する。ある実施形態によれば、前記ペプチドはＺがカルボキシ末端アミドである配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
いくつかの典型的な実施形態によれば、Ｚはアミドであり、ペプチドは、
【化３】
2009502904.tif 000004
からなる群から選択される。
【００１９】
別の態様によれば、本発明は、活性剤として本発明の原理によるヒト補体Ｃ３ａのアミノ酸５５〜６４位の配列、又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩に由来する少なくとも１つのペプチド、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物中の前記ペプチドは、配列番号３〜配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態においては、医薬組成物中の前記ペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は場合によってはカルボキシ末端アミドである。追加の実施形態においては、医薬組成物中の前記ペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は場合によってはカルボキシ末端アミドである。
【００２０】
さらなる態様によれば、本発明は、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療に有用な医薬の調製のための、少なくとも１つのペプチド、又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩、及び薬学的に許容し得る担体の使用を提供し、それらのペプチド、アナログ、化学的誘導体又は塩は、配列番号３〜配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態においては、このペプチドは、配列番号７又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は場合によってはカルボキシ末端アミドである。いくつかの実施形態によれば、アレルギー性疾患は、好塩基性細胞並びに／又は粘膜型及び／若しくは漿膜型マスト細胞媒介性疾患である。典型的な実施形態よれば、アレルギー性疾患は喘息である。
【００２１】
なおさらなる態様によれば、本発明は、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療の方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、活性剤として配列番号３〜配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含み、これによりアレルギー性疾患を予防又は治療する。特定の実施形態によれば、ペプチドは配列番号３から１４からなる群から選択される。特定の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号７又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は場合によってはカルボキシ末端アミドである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、アレルギー性疾患は、ＩｇＥ若しくはＩｇＧ媒介性（Ｉ型若しくはＩＩＩ型）過敏症及び／又はＦｃεＲＩ若しくはＦｃγＲ誘発性分泌反応に起因する。他の実施形態によれば、アレルギー性疾患は、粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型により媒介される。本発明の医薬組成物を用いて治療及び／又は予防できるアレルギー性疾患の例には、限定されるものではないが、季節性鼻炎及び副鼻腔炎を含むアレルギー性鼻炎；肺疾患、たとえば喘息；アレルギー性皮膚疾患、たとえばじんま疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、及び接触性皮膚炎；アレルギー性結膜炎；消化管アレルギー、たとえば食品又は薬剤に起因するこれらのアレルギー；痙攣；吐き気；嘔吐；下痢；過敏性腸疾患；眼のアレルギー；口唇炎；外陰炎；ブドウ膜炎；並びにアナフィラキシーが含まれる。典型的な実施形態によれば、アレルギー性疾患は喘息である。
【００２３】
別の態様によれば、本発明は、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型より媒介されるアレルギー性疾患を予防及び／又は治療する方法に関し、この方法は、それを必要とする対象に、活性剤として以下の配列：
【化４】
2009502904.tif 000005
［式中、
Ｘ１は、水素、低級アルカノイル、Ｃｙｓ、Ａｓｐ−Ｃｙｓ及びＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓから選択され；
Ｘ２は、水素、低級アルカノイル及びＬｙｓから選択され；
Ｘ３は、
【化５】
2009502904.tif 000006
から選択され；
Ｘ４は、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｒ２−Ｌｅｕ−Ｒ３及びＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｒ７から選択され；
Ｘ５は、低級アルカノイル及びＬｅｕから選択され；
Ｒ１は、芳香族アミノ酸残基から選択され；
Ｒ２は、Ｇｌｕ及びＬｙｓから選択され；
Ｒ３は、正に荷電するアミノ酸残基から選択され；
Ｒ４は、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択され；
Ｒ５は、Ａｌａ及びＡｒｇから選択され；
Ｒ６は、Ａｒｇ及びＬｙｓから選択され；
Ｒ７は、ヒドロキシ（ＯＨ）、Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、及びＡｇｍ（アグマチン）から選択される］
これらのアナログ、化学的誘導体、及び薬学的に許容し得る塩からなる群から選択されるペプチド、及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
【００２４】
追加の実施形態においては、ペプチドは、以下の配列；
【化６】
2009502904.tif 000007
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のアナログ；
（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）の化学的誘導体；及び
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）の塩からなる群から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは配列番号２５〜配列番号３１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端は、場合によってはカルボキシ末端アミドである。特定の実施形態においては、ペプチドは、以下の配列：
【化７】
2009502904.tif 000008
からなる群から選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、配列番号１５〜３１からなる群から選択されるペプチドを含む医薬組成物を用いて治療及び／又は予防されるアレルギー性疾患は、漿膜型マスト細胞及び／又は好塩基性細胞におけるＩｇＥ若しくはＩｇＧ媒介性（Ｉ型若しくはＩＩＩ型）過敏症及び／又はＦｃεＲＩ若しくはＦｃγＲ誘発性分泌反応に起因する。治療可能なアレルギー性疾患の例には、限定されるものではないが、消化管アレルギー、たとえば、食品又は薬剤により引き起こされるこれらのアレルギー、痙攣、吐き気、嘔吐、下痢、及び外陰炎が含まれる。米国特許第６，６８２，７４０号は、それを必要とする対象に、配列番号１５から３１のいずれか１つアミノ酸配列又はこれらのアナログ若しくは誘導体を有するペプチドを投与することを含む、粘膜型マスト細胞が含まれるＩｇＥ媒介性（Ｉ型）過敏症により引き起こされるアレルギー性疾患を治療する方法を開示することを理解するべきである。本発明は今回初めて、その必要性を有する対象に配列番号１５から３１のいずれか１つのアミノ酸配列又はこれらのアナログ若しくは誘導体を有するペプチドを投与することを含む、漿膜の型マスト細胞及び／又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー性疾患の治療又は予防する方法を開示する。
【００２７】
本発明のこれら実施形態及び他の実施形態は、以下の図、説明、実施例及び請求の範囲に関してさらに良く理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、ヒト補体Ｃ３ａのＣ末端配列、これらのアナログ、化学的誘導体、及び薬学的に許容し得る塩に基づく合成ペプチドに関する。このペプチドは、ＩｇＥ若しくはＩｇＧ媒介性（Ｉ型及びＩＩＩ型）過敏症及び／又はＦｃεＲＩ若しくはＦｃγＲ誘発性分泌反応を抑制するのに有用であり、この反応は粘膜型及び漿膜型両方のマスト細胞並びに好塩基性細胞により媒介される。
【００２９】
本発明のペプチドは、以下の配列番号２：
Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
に記載のヒト補体Ｃ３ａの５５〜６４位のアミノ酸配列
並びにこれらのアナログ、化学的誘導体及び薬学的に許容し得る塩に由来し、部分的に対応する。本発明のペプチドＣ末端は、遊離カルボキシ形態であってもよく、好ましくは、ペプチドの安定性を増強するために、たとえば生体で酵素切断に対するペプチドの耐性を増強するためにアミド化されてもよい。またカルボキシ末端は、ペプチドの溶解度を増すように修飾されてもよい。
【００３０】
本発明のペプチド
本発明は、マスト細胞及び好塩基性細胞のＦｃεＲＩ又はＦｃγＲ誘発性分泌反応並びに／又はＩｇＥ又はＩｇＧ媒介性（Ｉ型若しくはＩＩＩ型）過敏症を抑制するのに有用な新規のペプチドを提供する。マスト細胞は、粘膜型及び漿膜型マスト細胞を含む。
【００３１】
１つの態様において、本発明は、一般式Ｉ：
Ｘ１−Ａｓｐ−Ｘ２−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｘ３（配列番号３から１０）；
（式中、
Ｘ１は、水素、低級アルカノイル、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、及びＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａから選択され；
Ｘ２は、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ及びＶａｌ−Ｖａｌから選択され；
Ｘ３は、Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ、及びＧｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２から選択される
又はこれらのアナログ、化学的誘導体、若しくは薬学的に許容し得る塩
（但し、Ｘ１が水素又は低級アルカノイルであり、Ｘ３がＡｒｇ又はＡｒｇ−ＮＨ２である場合は、Ｘ２はＶａｌ−Ｖａｌである）のアミノ酸配列からなるヒト補体Ｃ３ａのアミノ酸５５〜６４（配列番号２）の配列に由来するペプチドを提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、
【化８】
2009502904.tif 000009
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアナログ；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の化学的誘導体；及び
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）の塩；
（但し、Ｚは、末端カルボキシ酸、アミド、又はアルコールを表す）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
用語Ｄ−Ａｌａは、アラニンのＤ−異性体立体配置を表す。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書で配列番号７に記載のペプチドＣ３ａ３２として同定されたペプチドで、ヒト補体ペプチドＣ３ａの５３〜６２位の配列に由来する１０ｍｅｒのペプチドあり、カルボキシ末端がカルボキシ末端アミドであり、配列：
Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＮＨ２のペプチドである。
【００３４】
別の実施形態においては、本発明のペプチドは、本明細書で配列番号１１に記載のペプチドＣ３ａ３１として同定されたペプチドで、ヒト補体ペプチドＣ３ａの５４〜６２位の配列に由来する９ｍｅｒのペプチドであり、カルボキシ末端がカルボキシ末端アミドであり、配列：
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＮＨ２
のペプチドである。
【００３５】
さらに別の実施形態においては、本発明のペプチドは、本明細書でＣ３ａ１４と表示した８ｍｅｒのペプチド、本明細書でＣ３ａ２９と表示した９ｍｅｒのペプチド、及び本明細書でＣ３ａ３５と表示した１１ｍｅｒのペプチドを含み、カルボキシ末端がカルボキシ末端アミドであり、配列：
【化９】
2009502904.tif 000010
を含む。
【００３６】
本発明は、本発明のペプチド、フラグメント、アナログ、及び化学的誘導体の塩を含む。本明細書中で用いられる「塩」という用語は、カルボキシル基の塩及びペプチド分子のアミノ基の酸添加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当分野で周知の手段により形成することができ、無機塩、たとえばアルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、三価鉄、二価鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン酸、二価のマンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛その他を含む。薬学的に許容し得る有機の無毒性塩基に由来する塩には、一級、二級及び三級アミンの塩、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、たとえばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルフォリン、Ｎ−エチルピペ、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルフォリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン、その他が含まれる。
【００３７】
たとえば、酸付加塩には、鉱酸との塩、たとえば酢酸、ベンゼンスルホ基、ベンゾイン、カンファースルホ基、クエン酸、エタンスルホ基、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ、マンデリン酸、メタン硫酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントチン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、その他との塩が含まれる。
【００３８】
「ペプチド」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ペプチド又は非ペプチド結合により一方を他方に結合した天然、非天然及び／又は化学修飾されたアミノ酸残基を包含することを意味する。アミノ酸残基は、当技術分野で周知であるように、明細書及び請求の範囲を通して、１文字コード又は３文字コードで示される。本発明の化合物は、直鎖及び環状のペプチド並びにそれらの誘導体及びアナログを含む。
【００３９】
「化学的誘導体」とは、本明細書中で用いられる場合、通常はペプチド分子の一部ではない別の化学的部分、たとえば遊離カルボキシ基のエステル及びアミド、遊離アミノ基のアシル及びアルキル誘導体、遊離ヒドロキシ基のエステル及びエーテルを含むペプチドを意味する。このような修飾は、ペプチドの標的にしたアミノ酸残基を、選択した側鎖又は末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることによりペプチドに導入することができる。
【００４０】
ペプチドアナログは、天然又は非天然のアミノ酸残基によるアミノ酸の置換及び／又は添加を含む。ペプチドアナログは、ペプチドミメティックを含む。ペプチドミメティック、すなわち「疑似ペプチド」は、ペプチドの生物学的活性を模倣するが、本質的に完全にはペプチドでない分子である。完全に、又は部分的に非ペプチドであるか否かに関係なく、本発明に記載の疑似ペプチドは、疑似ペプチドの基礎になるペプチドにおける残基の三次元配置に極めて近似した化学的部分の立体配置を提供する。この類似の活性部位構造の結果、疑似ペプチドはペプチドの生物学的活性に類似する生物系に及ぼす効果を有する。
【００４１】
ペプチドの塩、アナログ及び化学的誘導体は、安定性、溶解度などに関する限り、このペプチドの薬学的特性の修飾に好適に利用できる。
【００４２】
医薬組成物
本発明はさらに、本発明のペプチド、これらのアナログ、化学的誘導体、又は薬学的に許容し得る塩を、薬学的に許容し得る担体と共に含む医薬組成物を含む。
【００４３】
いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、ＦｃεＲＩ−βサブユニットは、ＦｃεＲＩと共にＦｃγＲのシグナル伝達又は活性化を変調又は調節することができる（たとえば、Ｄｏｍｂｒｏｗｉｃｚら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：５１７−５２９，１９９８を参照）。したがって、当技術分野で公知の様式でＦｃＲ亜型により媒介され、ＦｃεＲＩ−βサブユニットで変調されたマスト細胞及び／又は好塩基性細胞の分泌反応により引き起こされるアレルギー性疾患が本発明に含まれる。
【００４４】
他の考察は別として、本発明の新規の活性成分が、ペプチド、ペプチドアナログ、ペプチド誘導体、又はこれらの塩であるという事実は、処方物はこの型の化合物の送達に適切であるべきことを規定している。一般にペプチドは、胃酸又は腸内酵素による消化に感受性であるため経口投与には不適切であるが、本発明による組成物を経口投与できることが今初めて開示される。本発明の医薬組成物を、任意の適切な手段により、たとえば、局所的に、鼻腔内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、関節内に、病変内に又は非経口的に投与することができる。吸入による投与も本願発明の範囲内に包含される。
【００４５】
活性成分としての本発明のペプチドは、周知のように薬学的に許容し得て、活性成分と適合性の希釈剤又は賦形剤に溶解され、分散され、又は混合される。適切な担体又は賦形剤は、たとえば、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びこれらの組合せである。他の適切な担体は、当業者には周知である。さらに必要に応じて、組成物は少量の補助物質、たとえば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、結合剤（たとえば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、崩壊剤（たとえば、デンプングリコレートナトリウム、架橋結合したポビドン、架橋結合したカルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、増粘剤、抗酸化剤、その他を含むことができる。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、当該分野で周知の工程、たとえば通常の混合、溶解、顆粒化、粉砕、微粉砕、糖剤化、微粒子状化、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥工程により製造することができる。
【００４７】
本発明により使用する医薬組成物は、１つ又は複数の生理学的に受容可能な担体又は製剤中に活性成分の加工を容易にし、薬学的に用い得る助剤を含む賦形剤を用いて、通常の様式で製剤化することができる。適切な処方物は、選択される投与経路に依存する。
【００４８】
吸入による投与では、本発明による医薬組成物は、適切な噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素の使用を含むか若しくは含まない、加圧したパック又はネブライザからのエアロゾルスプレー提示の形態で送達することができる。加圧したエアゾールの場合、ある一定量を送達するため弁を備えることにより、投与量単位を決定することがでる。吸入器又は注入器における使用のための、たとえばゼラチンのカプセル剤及びカートリッジが処方でき、これはペプチドの粉末混合物及び適切な粉末基剤、たとえばラクトース又はスターチを含む。
【００４９】
経口投与可能な医薬組成物は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル及びゼラチン製のソフトな、密封されたカプセル並びに可塑剤、たとえばグリセロール又はソルビトールを含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、スターチのような結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤及び必要に応じて安定化剤と混合した活性成分を含むことができる。ソフトカプセル中では、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、若しくは液体ポリエチレングリコールのような適切な液体の中に溶解又は懸濁することができる。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与のための全ての処方物は、選択した投与経路に適切な投与量でなければならない。口腔内投与のためには、組成物は通常の様式で処方された錠剤又は舐剤形態をとり得る。
【００５０】
糖衣錠の核には、適切なコーティングが施される。この目的のためには、濃縮された糖溶液が使用され、これは必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤又は混合溶媒を含むこともできる。染料又は色素が、識別のために又は活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるために、錠剤又は糖剤コーティングに添加される場合もある。
【００５１】
注射用として、本発明の化合物は水溶液で、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、たとえばハンクの溶液、リンゲル液、又は生理緩衝食塩水に入れて処方することができる。経粘膜投与用には、浸透する障壁に対して適切な浸透剤が処方物で使用される。浸透剤には、たとえばポリエチレングリコールが当該分野で一般に知られている。
【００５２】
非経口投与用の医薬組成物は、水溶性形態の活性成分の水溶液を含む。さらにこの活性化合物の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製することができる。適切な天然又は合成の担体は、当分野において良く知られている（Ｐｉｌｌａｉら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５，４４７，２００１）。必要に応じて、またこの懸濁液は、活性成分の溶解度を増大させて非常に濃縮された溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は薬剤を含むことができる。或いは使用前に適切なビヒクル、たとえば無菌で発熱性物質を含まない水により再構成するために、活性成分は粉末の形態であることができる。
【００５３】
本発明の医薬組成物はまた、たとえば従来の座薬基剤（たとえばカカオバター又は他のグリセリド）を使用する坐剤又は滞留浣腸のような直腸用の組成物に処方することもできる。
【００５４】
本発明のコンテキストにおける使用に適する医薬組成物は、活性成分を意図した目的を達成するために有効な量で含む組成物を含む。より詳細には、「治療有効量」とは、治療する対象のアレルギー疾患の症状を予防、遅延、緩和又は改善するために有効な化合物の量を意味する。治療的有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５５】
本明細書に記載されているペプチド及びこれらのアナログ、誘導体、又は塩の毒性と治療有効性は、細胞培養又は実験動物で、標準的な製薬学的手順により、たとえば、対象ペプチドに関するＩＣ５０（５０％抑制を与える濃度）を測定することにより決定することができる。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用される投与量の範囲を処方する際に使用することができる。投与量は、使用された剤形及び利用された投与経路により変化し得る。正確な処方物、投与経路及び投与量は、患者の症状を考慮して個々の医師により選択され得る（たとえばＦｉｎｇｌら、１９７５、「治療薬の薬理学的基礎（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」，Ｃｈ．１  ｐ．１）。
【００５６】
治療する症状の重篤度に応じて、投薬はまた、徐放性組成物の１回の投与であり得、治療経過は数日から数週間まで、又は治癒が達成されるまで、又は疾病状態の軽減が得られるまで持続する。投与される組成物の量は、むろん、治療されている対象の免疫状態及び健康状態、疾病又は症状の重篤度、投与の様式、並びに他の関連する要素に依存する。
【００５７】
処方物及び投与方法は、例示を意図したもので制限を意図したものではない。本明細書で提供される開示を用いて、他の適切な処方物及び投与の様式を容易に考案できることが理解されるであろう。
【００５８】
発明のいくつかの実施形態によれば、Ｃ３ａ由来のペプチド又はアナログの治療的有効量は、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量である。好ましくは、本発明によるペプチド、誘導体又はアナログの投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇの範囲であり、より好ましくはペプチド、誘導体又はアナログの投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与量は、漸増する投与量であり得、したがって最初は低い投与量であり得て、適切な反応が達成されるまで、その後より高い投与量で投与され得ることは理解されるであろう。また、この組成物の投与量を、それぞれの投与で投与量の一部が投与される、治療期間の過程おける複数回投与で対象に投与することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチド並びにこれらの誘導体及びアナログは、修飾されたペプチドとして細胞に送達される。１つの実施形態では、本発明のペプチドは、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）に結合される。１つの好ましい実施形態では、ＣＰＰは、ショウジョウバエアンテナペデイア（ＡＮＴＰ）ドメイン又はそれらのフラグメントを含むアミノ酸配列である。
【００６０】
治療用途
本発明のペプチド、並びにこれらのアナログ、化学的誘導体及び塩を、哺乳動物でアレルギー疾患の予防又は療法的処置のための医薬組成物又は薬剤の製造に用いることができる。
【００６１】
本発明は、アナフィラトキシン作用を誘発することなく、粘膜型マスト細胞、漿膜型マスト細胞及び／又は好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型により媒介されるアレルギー性疾患の予防及び／又は治療の方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、活性剤として配列番号３から配列番号８からなる群から選択されるペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この疾患は、ＩｇＥ若しくはＩｇＧ媒介性（Ｉ型若しくはＩＩＩ型）過敏症及び／又はＦｃεＲＩ若しくはＦｃγＲ誘発性分泌反応に起因するアレルギー性疾患である。
【００６２】
本発明の医薬組成物により治療可能なアレルギー疾患の例には、限定されるものではないが、季節性鼻炎及び副鼻腔炎を含むアレルギー性鼻炎；肺疾患、たとえば気管支喘息；アレルギー性皮膚疾患、たとえばじんま疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、及び接触性皮膚炎；アレルギー性結膜炎；消化管アレルギー、たとえば食品又は薬剤に起因するこれらのアレルギー；痙攣；吐き気；嘔吐；下痢；過敏性腸疾患；及び眼のアレルギー、たとえばブドウ膜炎；口唇炎；外陰炎；並びにアナフィラキシーが含まれる。本発明はまた、ハチ毒その他を含むトキシンに曝されることにより誘発された症状を緩和又は治療するのに有用である。特定の実施形態においては、アレルギー性疾患は喘息である。
【００６３】
配列番号１５〜配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、粘膜マスト細胞が含まれるＩｇＥ媒介性（Ｉ型）過敏症の抑制に有用であるとして、本発明の出願人らにより米国特許第６，６８２，７４０号（その内容は、上述のごとく本明細書中に完全に参照として含まれる）に開示されている。これらのペプチドは、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞のＩｇＥ若しくはＩｇＧ及び／又はＦｃεＲ１若しくはＦｃγＲ誘発性分泌反応の抑制に有効であるであることが現在示されている。
【００６４】
したがって本発明はさらに、漿膜型マスト細胞及び好塩基性細胞からなる群から選択される細胞型によって媒介されるアレルギー性疾患を治療する方法に関し、この方法は、それを必要とする対象に、配列番号１５〜配列番号３１からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの治療的有効量を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００６５】
１つの実施形態では、漿膜マスト細胞及び／又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー性疾患を治療する方法で使用されるペプチドは、ヒト補体ペプチドＣ３ａの５６〜６４の配列由来の９ｍｅｒのペプチドで、配列番号２５に記載の本明細書でＣ３ａ７と表示した、配列：
Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
【００６６】
なおさらなる実施形態では、漿膜型マスト細胞及び／又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー性疾患を治療する方法で使用される本発明のペプチドは、ヒト補体ペプチドＣ３ａの５５〜６２の配列由来の８ｍｅｒのペプチドで、配列番号２６に記載の本明細書でＣ３ａ９と表示した、配列：
Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
【００６７】
別の実施形態においては、漿膜型マスト細胞及び／又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー疾患を治療する方法で使用される本発明のペプチドは、ヒト補体ペプチドＣ３ａの５５〜６１の配列由来の７ｍｅｒのアナログで、配列番号２７に記載の本明細書でＣ３ａ１１と表示した、配列：
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
【００６８】
いっそうさらなる実施形態においては、漿膜型マスト細胞及び／又は好塩基性細胞が含まれるアレルギー疾患を治療する方法で使用される本発明のペプチドは、１４ｍｅｒのＣ３ａ４、２０ｍｅｒのＣ３ａ５、１５ｍｅｒのＣ３ａ６、１０ｍｅｒのＣ３ａ１０であり、配列：
【化１０】
2009502904.tif 000011
又はこれらのアナログ、誘導体若しくは塩のペプチドである。
【００６９】
いくつかの好ましい実施形態では、配列番号２５から配列番号３１のいずれか１つに記載のペプチドのカルボキシ末端は、カルボキシ末端アミドである。
【００７０】
たとえば花粉症の治療のための、スプレー又はエアゾールの形態の医薬組成物は、花粉の飛散する季節にアレルギーの発症を予防するために、必要とする対象に投与するのに適切であり得る。さらに気管支粘膜表面は吸入されたアレルゲンに対する最初の接触部位であり、したがってスプレーで投与された本発明の抑制ペプチドに対するマスト細胞の反応には、非常に有効であり得ることはよく知られている。
【００７１】
漿膜マスト細胞の活性化を伴うアレルギー性疾患は、限定されるものではないがＩ型又はＩＩＩ型の即時型過敏反応、たとえば消化管アレルギー、痙攣、吐き気、嘔吐、及び下痢が含まれる。
【００７２】
本発明のペプチドは、単剤治療のような医薬組成物として又は他の治療薬、たとえば他の抗炎症剤との組合せにより投与することができる。併用療法は、同時に又は異なる時間に投与される単回用剤形又は複数回用剤形としての薬剤の投与を含むことができる。
【００７３】
ここで、本発明を以下の実施例で説明するが、これらによって制限されるものではない。
【実施例】
【００７４】
材料及び方法
試薬及び細胞培養培地。組織培養培地及び補充物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又はＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン及び抗ホスホチロシンＡｂ  ＰＴ−６６は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｋｆｔ．，Ｈｕｎｇａｒｙ）から購入した。２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸結合ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ１１−ＢＳＡ）、ＤＮＰコーティングビーズ及びマウスＤＮＰ特異的モノクローナルＡ２  ＩｇＥは、Ａｒｉｅｈ  Ｌｉｃｈｔ氏（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）の好意により供与を受けた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）結合抗マウスＩｇＧ及びＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、抗Ｌｙｎ  ＡｂはＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。増強された化学ルミネッセンス試薬（ＥＣＬ）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＫ）から購入し、ＳＤＳ−ゲル電気泳動に用いる材料は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。Ｆｌｕｏ−３  ＡＭ色素は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。Ｃ３ａ及びＣ５ａは、（Ｅｒｄｅｉら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４３３−１４３９，１９９５を参照）に記載のように単離した。
【００７５】
合成ペプチド及びタンパク質の標識化。ペプチド合成は、ＭＢＨＡ樹脂上で「Ｂｏｃ化学」（Ｍｅｒｉｆｉｅｌｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：１３８５−１３９０，１９６４）を利用する固相法により実施した。逆相ＨＰＬＣ及び質量分析によりペプチドを精製し、特性を決定した。Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ＮＪ，ＵＳＡ）により提供される使用説明書（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに関する標識プロトコル）によって与えられるように、ペプチドＣ３ａ９はＣｙ５を用いて、Ａ２ＩｇＥはＣｙ３を用いて標識した。
【００７６】
細胞。骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）は、Ｎａｇａｏらにより記載されたように（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１２：３３３−３３５，１９８１）、Ｂａｌｂ／ｃマウスから調製した。３週間後に、ほぼ９５％純粋なマスト細胞集団が得られ、フローサイトメトリーで測定して、ＦｃεＲＩ及び幹細胞因子レセプター（ｃ−キット）の高い発現が示された。
【００７７】
Ｒｅｕｂｅｎ  Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ博士（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）から入手したＲＢＬ−２Ｈ３細胞系を、５％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン及び抗生物質を補充したダルベッコの改変必須培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で維持した。実験のために、細胞をＤＭＥＭ中１０ｍＭ  ＥＤＴＡと共に１５分のインキュベーションによる剥離後に収集した。
【００７８】
ラット腹腔マスト細胞（ＲＰＭＣ）を、前述したように単離した（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：４９６０−４９６５，１９８１）。マスト細胞標本は、ＦｃεＲＩ表面発現のフローサイトメトリーモニタリングによる評価で、ほぼ９５％純粋であった。漿膜型マスト細胞の特異的活性化因子であるコンパウンド４８／８０が、単離したラット腹腔マスト細胞の総βヘキソサミニダーゼ含量の約５０％の放出を誘発した。
【００７９】
マスト細胞の分泌反応。ＦｃεＲＩクラスター形成による刺激作用に反応したマスト細胞による媒介物質の分泌を、記述したように分泌された顆粒性酵素βヘキソサミニダーゼの活性を測定することによりモニターした（Ｅｒｄｅｉら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４３３−１４３９，１９９５を参照）。抗原誘発性反応に及ぼすＣ３ａ及びその誘導体の効果を調べるために、ＤＮＰに特異的なＡ２  ＩｇＥの飽和濃度で感作したマスト細胞を、最適下限の抗原濃度（５ｎｇ／ｍｌ）に曝す前に、さまざまなペプチドの濃度範囲で、室温で５分間プレインキュベートした。
【００８０】
ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ−αの測定。このペプチドの非存在或いは存在下で、ＲＢＬ−２Ｈ３によるＦｃεＲＩクラスター形成に反応するＴＮＦ−αの分泌を、ラットＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を用いて測定した。
【００８１】
免疫沈降及びウエスタンブロット。マスト細胞を、１０ｃｍのペトリ皿に播種（７×１０６細胞／皿）し、一夜、３７℃でＤＭＥＭ中でＡ２ＩｇＥを用いて飽和した。細胞を洗浄後、５分間ペプチドで処理し、３７℃で２分間、５ｎｇ／ｍｌのＤＮＰ１１−ＢＳＡと共にインキュベートしてＦｃεＲＩをクラスター形成させた。反応を、ペトリ皿当たり５００μｌの細胞溶解緩衝液（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、１０％  グリセロール、１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル１：２００、ｐＨ  ７．４）により停止した。細胞を擦り取り、ポスト核上清のタンパク含量を、ＰＴ−６６ホスホチロシン特異的抗体でコーティングしたビーズ（試料当たり１０μｌビーズ）による沈殿の前に、ブラッドフォードアッセイを用いて等しい値に調整した。タンパク質を、２−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液により溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜上へエレクトロトランスファーして、表示した抗体を用いて発現し、ＥＣＬにより検出した。
【００８２】
遊離サイトゾルＣａ２＋イオン濃度のモニタリング。０．５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地中で、合計５×１０６のＩｇＥ感作細胞に、５μＭ  Ｆｌｕｏ−３／ＡＭ指示薬及び３０μｇ／ｍｌプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７を３７℃で３０分間ロードした。洗浄後、細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）を、２００μＭのＣ３ａ７又はＣ３ａ９ペプチドと共に３７℃で５分間インキュベートした。フローサイトメトリー記録開始後２０秒で、５ｎｇ／ｍｌの抗原（ＤＮＰ１１−ＢＳＡ）を細胞に添加し、遊離カルシウムイオン濃度の変化を、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒの時間分解モードで追跡調査した。データ収集及び解析は、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
【００８３】
走査レーザー共焦点顕微鏡。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を収集し、４℃で２５分間、５μＭのＣｙ３結合ＩｇＥと共にインキュベートするか又は、同時に２００μＭのＣｙ５結合Ｃ３ａ９ペプチドと共にもインキュベートした。洗浄後、細胞を氷上で２０分間、２％のパラホルムアルデヒドで固定し、次いで、０．１％のポリ−Ｌ−リシンでプレコートしたカバーガラスにマウントした。Ｃｙ３標識ＩｇＥ及びＣｙ５ペプチドからの蛍光シグナルを、緑色（５４３ｎｍヘリウムネオンレーザーによる励起）及び赤色（６３２ｎｍヘリウムネオンレーザーによる励起）Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５走査レーザー共焦点顕微鏡の光学チャネルで分析した。細胞を、０．５μｍ厚の５１２×５１２ピクセルセクションに光学的にスライスした。共局在性の指標として、蛍光強度間の相互相関係数の評価を、前述したように実施した（Ｖｅｒｅｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：６０１３−６０１８，２０００）。
【００８４】
フローサイトメトリー蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）測定。双方ともＲＢＬ−２Ｈ３細胞の表面に結合したＦＩＴＣ標識Ｃ３ａ９ペプチド（ドナー）及びＣｙ３標識ＩｇＥ（アクセプター）間のＦＲＥＴを測定し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＳｔａｒ  Ｐｌｕｓ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて評価した。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞は、Ｃｙ３−ＩｇＥの飽和濃度を用いて標識したが、ＦＩＴＣ−Ｃ３ａ９ペプチドは１５０μＭ、すなわち、機能的研究で用いたこのペプチドと同程度の量であった。
【００８５】
ＢＭＭＣに対するＣ３ａの共有結合性の架橋。ＢＭＭＣを洗浄し、Ｃ３ａ（５０μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中で１５〜２０×１０６細胞／試料当たり））と共に、室温で１０分間インキュベートした。５ｍＭの架橋結合試薬のビス−（スルホサクシンイミドイル）−スベラート（ＢＳ３，ＰＩＥＲＣＥ，ＩＬ，ＵＳＡ）と共にさらに室温で２０分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、溶解した。Ｃ３ａ特異的ポリクローナルウサギ抗体（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、免疫沈降に用いた。ウェスタンブロッティングを、Ｊｅａｎ  Ｐｉｅｒｒｅ  Ｋｉｎｅｔ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）の好意により供与を受けたＦｃεｅＲＩβ鎖特異的抗体により実施した。二次抗体として、ＨＲＰＯ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ，Ｆｒａｎｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｚｔｉｋａ  Ｋｆｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を用いた。検出はＥＣＬにより実施した。
【００８６】
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）測定。ＳＰＲ測定は、ＢＩＡＣＯＲＥ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて実施した。下記の配列を有するペプチドを合成して使用した：（１）ラット及びヒトＦｃεＲＩβ鎖の第１の細胞外ループ：それぞれＳＴＬＱＴＳＤＦＤＤＥＶＬＬＬＹＲＡＧＹＰＦ（配列番号３９）及びＳＶＬＤＩＳＨＩＥＧＤＩＦＳＳＦＫＡＧＹ（配列番号４０）；並びに（２）ラット及びヒトＦｃεＲＩβ鎖の第２の細胞外ループ：それぞれＮＮＳＡＹＭＮＹＣＫＤＩＴＥＤＤＧＣＦＶＴＳ（配列番号４１）及びＫＳＬＡＹＩＨＩＨＳＣＱＫＦＦＥＴＫＣＦＭＡＳ（配列番号４２）。
【００８７】
全てのペプチドを、そのＮ末端アミノ基でビオチン標識し、３０及び６０共鳴ユニット（ＲＵ）の範囲にわたる低密度で、ストレプトアビジンでコートしたセンサチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｓｗｅｄｅｎ）に結合した。蒸留水中で１０．５ｎＭから６５６ｎＭの範囲にわたる５つの異なる濃度のＣ３ａ及びＣ５ａ溶液を、２０μｌ／ｍｉｎの流量で注入した。チップ表面は、測定間で０．１ＭＨＣｌにより再生した。データは、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ  ３．０ソフトウェアを用いて解析した。観察された結合速度定数（ｋｏｂｓ）を、Ｃ３ａ濃度の関数としてプロットし、各プロットの勾配を結合の比速度定数（ｋｏｎ）と見なすのに対し、ｙ切片を解離速度定数（ｋｏｆｆ）と見なして、次いでＫｄをｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。
【００８８】
受動全身アナフィラキシー。マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を３００〜４００μｌのアベルチン（ａｖｅｒｔｉｎ）を用いて麻酔し、眼窩後（又は尾静脈）注射により、２００μｌのＰＢＳ中のＩｇＥクラスのＤＮＰ特異的モノクローナル抗体（ＳＰＥ−７，Ｓｉｇｍａ）を３μｇ注射した。２４時間後にマウスを３００〜４００μｌのアベルチンで麻酔し、鼻孔上へ置いたＰＢＳ中の約１００μｌの表示したペプチド（抑制性、配列番号１１、対照の配列番号３５の逆転させたペプチド又は配列番号３６のペプチドＧＡＫＤＧＮＥＹＩ−ＣＯＯＨ）溶液に曝した。これに続いて、眼窩後（又は尾静脈）注射で、抗原（２００μｌのＰＢＳ中、１００μｇのＤＮＰ誘導体化ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）又はＰＢＳのみを注射した。１．５分後に頚椎脱臼によりマウスを屠殺し、心臓穿刺を実施した。ここではヘパリンリンスの注射器を吸引に用いた。血液試料を、卓上遠心器で４℃で１０分間、８０００ｒｐｍで遠心した。競合的なＡＬＰアッセイ用のＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈプロトコルにより、ヒスタミンをアッセイした。
【００８９】
ペプチドの肺機能に及ぼす抑制効果。マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌、８週齢）を、最初に抗原（Ａｇ）卵白アルブミンのｉｐ注射により感作した。その後、１週間隔で約２０分間の、プレキシグラスチャンバ中でネビュライザーにより拡散した同じ抗原のエアゾールの吸入で、マウスを４回チャレンジした。２８日目に、マウスを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３に溶解し、上記のように拡散した試験するペプチドエアゾールで、最初に処置した。この結果エアゾールは、約１０から２０分間、動物に吸入された。吸入後、動物を２０分間、感作抗原（５％ＯＶＡ、ＰＢＳ中）（上記のように）の吸入により直ちにチャレンジした。この処置の終了後、マウスを直ちにプレチスモグラフィーを用いて、意識的、自由運動状態における肺機能について試験した。
【００９０】
気管支絞窄の程度を、マウスにおける増強されたポーズ及び気道抵抗に対するその関連、インピーダンス及び胸内圧によりモニターした。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料を、０．８ｍｌの氷冷生理的食塩水（×２）を注入する気管カニューレ処置後、ＢＡＬ液体を吸引することにより、これらのマウスから得た。これらの試験後に、ブレビタル（１ｍｇ／ｍｌ）の全身麻酔を用いてマウスを屠殺した。マウスの胸壁を開いて血液を回収し、肺を冷ＰＢＳで灌流して細胞学及び組織学に関して検査した。
【００９１】
（実施例１）
ヒトＣ３ａ由来のペプチド
下記に示す表１は、合成したペプチド、そのアミノ酸配列、質量分析データ及びネームコードのリストを提供する。ペプチドＣ３ａ１、Ｃ３ａ３、Ｃ３ａ５５、及びＧＡＫペプチド（配列番号３３から配列番号３６）を対照ペプチドとして使用した。表１にリストしたペプチドは、本明細書中に開示のように「Ｂｏｃ化学」を用いて合成した。そのほかに、全てのペプチドを、さらに別のアミド化されたペプチドとして調製した。ペプチド合成の方法は、限定することを意図したものではないことに留意すべきである。
【００９２】
【表１】
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【００９３】
（実施例２）
粘膜型マスト細胞の分泌反応に及ぼすペプチドの抑制能力
以前の実験で、本出願の発明者らは、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のＩｇＥ媒介性刺激作用の抑制に関与するＣ３ａ配列のモティーフを同定した（Ｅｒｄｅｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．６８：７９−８２，１９９９）。この結果は、補体−ペプチドのアナフィラトキシン及び走化活性を生じる上で極めて重要であることが知られているＣ３ａのＣ末端配列（残基６５〜７７）は、この抑制に含まれないことを明らかに示していた。しかし、残基５６〜６４（Ｃ３ａ７と命名したＣＣＮＹＩＴＥＬＲ）を含む上流の配列が含まれている。この配列のいくつかのアナログが現在合成され、このアナログのうちオクタペプチド、すなわちＣ３ａ９と命名したＤＣＣＮＹＩＴＲは、ＲＢＬ−２Ｈ３系の粘膜型マスト細胞のＦｃεＲＩ媒介性分泌を抑制する上で有効であることが示されている（図１）。ＩｇＥ感作細胞を、最適下限の（５ｎｇ／ｍｌ）抗原量を用いて刺激する前に５分間ペプチドと共にインキュベートし、次いで分泌された顆粒性酵素のβヘキソサミニダーゼ活性を測定した。図１Ａに、これらの細胞の反応に及ぼす、これらのペプチドにより生じた用量依存的抑制を示す。
【００９４】
粘膜型マスト細胞の分泌反応に及ぼすＣ３ａ３１、Ｃ３ａ３２、及びＣ３ａ３５と命名したペプチドの効果を図１Ｂに示す。図ＩＢで示すように、ペプチドＣ３ａ３１及びＣ３ａ３２は、ＲＢＬ−２Ｈ３からのＩｇＥ媒介性βヘキソサミニダーゼの分泌を抑制することが認められた。ペプチドＣ３ａ１１及びＣ３ａ１３を試験して、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のＩｇＥ依存性脱顆粒を抑制することが示された。
【００９５】
骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）を用いる同様の実験を実施した。Ｃ３ａは、同様にこれらの粘膜型マスト細胞のＩｇＥ媒介性分泌反応も抑制することが認められたが（表２）、Ｃ５ａは効果を示さなかった。表２で示すように、ＢＭＭＣの分泌反応に及ぼすペプチドＣ３ａ７及びＣ３ａ９の抑制効果はＲＢＬ−２Ｈ３細胞に及ぼす抑制効果に匹敵する。配列ＤＶＳＮＹＩＴＲの対照標準ペプチドは、どちらの系にも効果を示さなかった。
【００９６】
表２．ＲＢＬ−２Ｈ３、ＢＭＭＣ及びラット腹腔マスト細胞（ＲＰＭＣ）のＩｇＥ媒介性脱顆粒に及ぼす、Ｃ３ａ及びＣ３ａ由来のペプチドの抑制効果（ＩＣ５０、μＭ）。
【表２】
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脱顆粒アッセイに関して、最適下限の抗原量を用いた。
＊  Ｃ３は非感作細胞に添加された場合、粘膜型ＲＢＬ−２Ｈ３及びＢＭＭ細胞ではなく漿膜型ＲＰＭＣのみを刺激した。
【００９７】
（実施例３）
漿膜型マスト細胞の分泌反応に及ぼすペプチドの抑制能力
粘膜型マスト細胞はペプチド作動性刺激に非反応性であるが、漿膜型細胞はカチオン性分泌促進物質により刺激されることがずっと以前から知られていた。アナフィラトキシンペプチドＣ３ａ及びＣ５ａは、漿膜型マスト細胞により発現されたそのそれぞれのレセプターに結合することにより、細胞の分泌反応を開始する。このマスト細胞型に及ぼすペプチドの効果を調べるために、ＲＰＭＣを使用した。予想通り、やはりこれらの細胞はＣ５ａ及びＣ３ａに反応した（表２）。しかし、ペプチドＣ３ａ７又はＣ３ａ９をＩｇＥで感作したＲＰＭＣに添加し、５分後に最適下限の抗原量を用いて刺激した場合には、脱顆粒は抑制された（表２）。
【００９８】
（実施例４）
ペプチドＣ３ａ７又はＣ３ａ９は、ＦｃεＲＩ−クラスター形成で誘発されるＴＮＦ−αの分泌を抑制する
ＴＮＦ−α分泌を測定することにより、マスト細胞の遅延相反応に及ぼすペプチドの効果を測定した。この目的のために、Ｃ３ａ７又はＣ３ａ９の不在下又は存在下で、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を刺激した２４時間後に上清を取り、分泌されたサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図１Ｃに示すように、どちらのペプチドもこの炎症性サイトカインの放出を用量依存的に抑制した。単独で添加した場合、ペプチドは効果を示さなかった。
【００９９】
（実施例５）
Ｌｙｎ、ＰＩ−３Ｋ及びＦｃεＲＩのβサブユニットのチロシンリン酸化は、抑制ペプチドにより抑制される
図２Ａは、ＦｃεＲＩクラスター形成が誘発するいくつかの細胞内タンパク質のタンパク質チロシンリン酸化の増加が、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を抗原刺激前に２００μＭのＣ３ａ７（レーン３）又はＣ３ａ９（レーン４）に曝露した時、著しく減少することを示す。この結果及び以前の結果に基づき（図１）、ＦｃεＲＩ近位の事象を検討した。これらの事象は、ＦｃεＲＩβ及びγサブユニットのＩＴＡＭのｓｒｃファミリーＰＴＫ  Ｌｙｎによるリン酸化を含むことが知られている。図２Ｂで示すように、Ｃ３ａ７又はＣ３ａ９の存在下で細胞が抗原により刺激されたとき、Ｌｙｎのリン酸化は大幅に減少したが、対照ペプチドは効果を示さなかった。またＦｃεＲＩβ鎖のリン酸化も調べ、対照ペプチドで処理した細胞のリン酸化と比べて減少することが認められた（図２Ｂ）。ホスファチジルイノシドのリン酸化レベルを調節する酵素であり、したがって主要なカップリング要素であるＰＩ−３Ｋのチロシンリン酸化もまた、ペプチドＣ３ａ７及びＣ３ａ９に曝露後に減少することが認められた（図２Ｂ）。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のチロシンリン酸化タンパク質のパターンにおいて、これらのペプチドは単独ではいかなる変化を引き起こさなかった。
【０１００】
またＦｃεＲＩカップリングカスケードに及ぼすペプチドＣ３ａ３１の抑制作用も、ラット粘膜型のＲＢＬ−２Ｈ３系を用いて検討した。これらの実験の結果は、ペプチドＣ３ａ３１は、タンパク質チロシンキナーゼＬｙｎ及びＦｃεＲＩβ鎖のリン酸化を抑制することを示した。Ｌｙｎのリン酸化の抑制が１分後に認められ、ＰＡＧのリン酸化（ＰＡＧは、ｓｒｃファミリーキナーゼの調節に重要な役割を持つ）の抑制が３分後に認められた。しかし、またＣ３ａ３１が３分後にＬｙｎのリン酸化を増強することが示された。さらに、Ｃ３ａ３１は５分後にＤｏｋ−１リン酸化を抑制したが、８分後には効果を示さなかった。またＣ３ａ３１は、ＰＬＣγ−２のリン酸化を抑制した。
【０１０１】
（実施例６）
このペプチドは、抗原誘発性の［Ｃａ２＋］ｉの一過性上昇を抑制する。
［Ｃａ２＋］ｉの一過性上昇は、抗原で活性化された細胞で誘発される最も初期の事象の１つであるので、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞中でこの過程に及ぼすＣ３ａ７及びＣ３ａ９の効果を検討した。図３に示すように、抗原のチャレンジの５分前にペプチドＣ３ａ７又はＣ３ａ９を細胞に添加したとき、この過程は著しく抑制された。細胞外の培養液からのイオン流入に帰せられる［Ｃａ２＋］ｉの初期の急速な増加及び引き続く上昇したレベルの両方が抑制された。ペプチドが単独で添加された対照では、効果は決定され得ない。
【０１０２】
（実施例７）
Ｃ３ａはＦｃεＲＩβ鎖に結合する
ＢＭＭＣに対するＣ３ａの共有結合性の架橋。Ｃ３ａレセプターが粘膜型マスト細胞上で検出されなかったので、このペプチドは別の細胞膜成分との相互作用を介して、おそらくは１型Ｆｃεレセプターを介するペプチドの抑制効果を及ぼす可能性を検討した。以前の実験で、本発明者らは、ＩｇＥとＦｃεＲＩ間の相互作用のＣ３ａによる干渉を認めなかったので、Ｃ３ａは四量体ＦｃεＲＩ複合体のα鎖と相互作用しないと見なされた。β鎖を有するＩＴＡＭが、ＦｃεＲＩ反応の増幅因子として作用することが以前に報告されていたので、ＢＭＭＣ上のこの膜タンパク質とＣ３ａの相互作用を測定した。細胞をＣ３ａと共にインキュベート後、共有結合性の架橋剤、ＢＳ３−試薬を添加した。これに続いて細胞溶解し、ポリクローナルＣ３ａ特異的抗体を用いて免疫沈降した。タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＦｃεＲＩβ鎖特異的抗体を用いるウェスタンブロッティングにより解析した。図４Ａに示すように、ただ１つのタンパク質が認められたが（レーン１）、対照試料では何も分離されなかった（レーン２）。各成分に対して共有結合的に架橋結合した、すなわち一方ではＣ３ａに対して、及び他方ではβ鎖に対して架橋結合した複合体の特定の反応のために、約４５ｋＤａの質量を有するレーン１に現れるただ１つのバンドは、Ｃ３ａ（９ｋＤａ）及びβ鎖（３６ｋＤａ）の共有結合複合体である。これらの結果は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を用いて得られたわれわれの以前の結果と完全に一致するものである（Ｅｒｄｅｉら，１９９９、前掲書）。
【０１０３】
Ｃ３ａ及びＦｃεＲＩβ鎖間の相互作用の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）測定。Ｃ３ａとＦｃεＲＩのβ鎖との相互作用をさらに調べるために、ヒト及びラットの４回膜貫通型分子双方の第１及び第２細胞外ループの配列を有する固定化したオリゴペプチドを用いて、ＳＰＲ測定を実施した。ヒトＣ３ａ及び対照のＣ５ａを分析物として用いた。図４Ｂ及びＣに示すように、Ｃ３ａは、それぞれ２５０ｎＭ及び５２０ｎＭのＫｄ値を有するヒト及びラットのタンパク質双方の第１の細胞外ループに結合した。Ｃ３ａと細胞膜蛋白の第２の細胞外ループ間には相互作用は検出されなかった。Ｃ５ａは、いずれの試験したＦｃεＲＩβ鎖の配列とも反応しなかった。
【０１０４】
（実施例８）
Ｃ３ａ９は、無傷のＲＢＬ−２Ｈ３細胞上でＦｃεＲＩに結合したＩｇＥと共存している。
【０１０５】
無傷の細胞上でのＣ３ａ由来のペプチドとＦｃεＲＩに結合したＩｇＥ間の空間的な関係の詳細を可視化するために、共焦点レーザー走査顕微鏡測定をＲＢＬ−２Ｈ３細胞上のＣｙ３結合ＩｇＥ及びＣｙ５結合Ｃ３ａ９ペプチドを使用して実施した。Ｃｙ３とＣｙ５放出シグナル間のピクセルごと相互相関の解析（相互相関係数：≧０．５４）では、この細胞に結合したペプチドは、ＦｃεＲＩαサブユニットに結合したＩｇＥと共存していることを強く示している。これは全ての他の結果と一致し、このペプチドの相互作用部位が、マスト細胞の多サブユニットＦｃεＲＩレセプター複合体中に存在することを強く支持している（図４Ｄ）。さらに、またβ鎖を欠くヒト単球も共焦点蛍光顕微鏡で調べたが、検出可能なペプチドの結合は見いだされなかった。
【０１０６】
上記の結果は、ナノメートルのスケールでの接近を示すＦＲＥＴ測定の結果によりさらに裏づけられた。２４％の平均ＦＲＥＴ効率を示すフローサイトメトリー共鳴エネルギー転移（ＦＣＥＴ）効率のヒストグラム（図４Ｅ）は、ＦＩＴＣ−Ｃ３ａ９ペプチドとＲＢＬ−２Ｈ３細胞の表面に結合したＣｙ３−ＩｇＥ間の分子的接近を明確に示した。
【０１０７】
（実施例９）
受動全身アナフィラキシーの抑制
マウスにおけるＣ３ａ由来のペプチドの受動全身アナフィラキシーに及ぼす効果を検討した。図５で示すように、マウス血液中のヒスタミン濃度をアッセイでモニターしたとき、Ｃ３ａ３１アミドは、受動全身アナフィラキシーの症状を緩和することが認められた。Ｃ３ａ５５アミドと表示した逆転したペプチドは効果がなかった（図５）。対照群を、抗原ＤＮＰ−ＨＳＡの注射前に配列番号３６のアミノ酸配列ＧＡＫＤＧＮＥＹＩ−ＣＯＯＨを有する関連の無いペプチドで処置した。
【０１０８】
（実施例１０）
喘息モデルにおける、Ｃ３ａ由来のペプチドの抑制能力
肺機能を、最初の抗原（卵白アルブミン）注射による感作に曝露後、この抗原のエアゾール曝露に４回チャレンジした（又は曝されない、すなわち未処置の）マウスで、実験セクションに記載のようにアッセイした。動物を、抗原による最後の（通常は５回の）チャレンジの前に、緩衝液単独、ペプチドＣ３ａ３１を含む緩衝液又はＣ３ａ５５と表示した逆転したペプチドを含む緩衝液のいずれかのエアゾールに最終的に曝露した。図６Ａ〜Ｄは、ペプチドＣ３ａ３１の防御能力を示す。図６Ａは、未処置マウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示し；図６Ｂは、喘息にかかったマウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示し；図６Ｃは、抗原（卵白アルブミン）エアゾールのチャレンジ前に、ペプチドＣ３ａ３１により処置した「喘息にかかった」マウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示し；図６Ｄは、抗原チャレンジの前に、ペプチドＣ３ａ５５で処置した「喘息にかかった」マウスにおける肺気道抵抗の個々の値を示す。図６Ｅは、図６Ａ〜Ｄに示した結果の平均値及び標準偏差を示す。これらの結果は、Ｃ３ａ３１ペプチドは、喘息の動物モデルで抗原誘発性症状の緩和に有効であることを明解に示している。
【０１０９】
表３は、肺機能の分析に供されたマウスと同じプロトコルにより処置したマウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中に存在する細胞の分析結果を提供する。表３に示したように、ペプチドＣ３ａ３１による処置は、ＢＡＬで検出される細胞型に著しい影響を及ぼし、主として好中球の数を減少させた。
【０１１０】
表３．ペプチドエアゾールに対する曝露の、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中の細胞分布に及ぼす影響。
【表３】
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【０１１１】
これらの結果は、アレルギー関連症状の抑制に及ぼすＣ３ａ由来のペプチドの顕著な能力を明確に確立した。これは粘膜型及び漿膜型マスト細胞双方を調べる細胞培養、並びに喘息様の症状の同様な顕著な抑制を示すｉｎ  ｖｉｖｏモデルの動物で認められた。
【０１１２】
本明細書で上述して示したことがらに限定されるものではないことは当業者には理解されるであろう。本発明の範囲は、むしろ請求項により規定される。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１Ａ】ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のＩｇＥ媒介性分泌反応に及ぼすＣ３ａ部分に類似した配列を有する合成ペプチドの抑制能力を示す図である。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞から顆粒性酵素であるβ−ヘキソサミニダーゼのＩｇＥに媒介された放出に及ぼす、種々の濃度のＣ３ａ９又はＣ３ａ７の効果を示す図である。
【図１Ｂ】ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のＩｇＥ媒介性分泌反応に及ぼすＣ３ａ部分に類似した配列を有する合成ペプチドの抑制能力を示す図である。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞からのβ−ヘキソサミニダーゼのＩｇＥ媒介性放出に及ぼす、２５０μｇのＣ３ａ３１、Ｃ３ａ３２、又はＣ３ａ３５の効果を示す図である。
【図１Ｃ】ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のＩｇＥ媒介性分泌反応に及ぼすＣ３ａ部分に類似した配列を有する合成ペプチドの抑制能力を示す図である。ＲＢＬ−２Ｈ３によるＴＮＦ−αサイトカインの分泌に及ぼすＣ３ａ７及びＣ３ａ９の効果を示す図である。
【図２Ａ】Ｃ３ａ７及びＣ３ａ９によるＬｙｎ、ＦｃεＲＩ及びＰＩ−３Ｋのβサブユニットのチロシンリン酸化の抑制を示す図である。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の一般的なリン酸化パターンを示す図である。細胞全体の溶解物を抗アクチンを用いてイムノブロツト（最下列）して、等しい量のタンパク質がロードされたことを確かめた。
【図２Ｂ】Ｃ３ａ７及びＣ３ａ９によるＬｙｎ、ＦｃεＲＩ及びＰＩ−３Ｋのβサブユニットのチロシンリン酸化の抑制を示す図である。Ｌｙｎ、ＦｃεＲＩのβ鎖及びＰＩ−３Ｋのリン酸化を示す図である。細胞全体の溶解物を抗アクチンを用いてイムノブロツト（最下列）して、等しい量のタンパク質がロードされたことを確かめた。
【図３】ペプチドＣ３ａ７及びＣ３ａ９による、マスト細胞における遊離サイトゾルＣａ２＋イオンの抗原誘発性増加の抑制を示す図である。
【図４Ａ】高親和性ＩｇＥレセプターのβ鎖とＣ３ａの相互作用を示す図である。ＦｃεＲＩのβ鎖に特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティングによる、骨髄由来マスト細胞上でのＣ３ａとＦｃεＲＩのβ鎖の共有結合複合体の検出（レーン１）を示す図である。対照試料中（レーン２）には、Ｃ３ａは存在しなかった。
【図４Ｂ】高親和性ＩｇＥレセプターのβ鎖とＣ３ａの相互作用を示す図である。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）測定の結果を示す図である：ラットＦｃεＲＩβ鎖の第１の細胞外ループを表すビオチン化ペプチドをＳＰＲ−センサチップ上に固定化し、被検体として用いたＣ３ａとこれらのペプチドとの相互作用（すなわち結合及び分離）を、リアルタイムで追跡調査した。
【図４Ｃ】高親和性ＩｇＥレセプターのβ鎖とＣ３ａの相互作用を示す図である。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）測定の結果を示す図である：ヒトＦｃεＲＩβ鎖の第１の細胞外ループを表すビオチン化ペプチドをＳＰＲ−センサチップ上に固定化し、被検体として用いたＣ３ａとこれらのペプチドとの相互作用（すなわち結合及び分離）を、リアルタイムで追跡調査した。
【図４Ｄ】高親和性ＩｇＥレセプターのβ鎖とＣ３ａの相互作用を示す図である。Ｃｙ３−ＩｇＥ及びＣｙ５−Ｃ３ａ９を用いて蛍光標識したＲＢＬ−２Ｈ３細胞の共焦点顕微鏡像を示す図である。赤道部切片（上列）及び細胞の最上部での３つの光学用切片の合成（下列）を、代表的な細胞について示す。
【図４Ｅ】高親和性ＩｇＥレセプターのβ鎖とＣ３ａの相互作用を示す図である。ＦＩＴＣ−Ｃ３ａ９（ドナー）及びＲＢＬ−２Ｈ３細胞に結合したＣｙ３−ＩｇＥ（アクセプター）間での、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）効率のヒストグラムである。
【図５】受動全身アナフィラキシーに曝されたマウスにおける血液ヒスタミンレベルに及ぼす、Ｃ３ａ３１及びその対照のＣ３ａ５５と表示した逆転配列ペプチドの効果を示す図である。
【図６Ａ】マウス喘息モデルの肺機能で測定した、Ｃ３ａ５５と表示した逆転ペプチド対照と比較した、Ｃ３ａ３１の防御能力を示す図である。
【図６Ｂ】マウス喘息モデルの肺機能で測定した、Ｃ３ａ５５と表示した逆転ペプチド対照と比較した、Ｃ３ａ３１の防御能力を示す図である。
【図６Ｃ】マウス喘息モデルの肺機能で測定した、Ｃ３ａ５５と表示した逆転ペプチド対照と比較した、Ｃ３ａ３１の防御能力を示す図である。
【図６Ｄ】マウス喘息モデルの肺機能で測定した、Ｃ３ａ５５と表示した逆転ペプチド対照と比較した、Ｃ３ａ３１の防御能力を示す図である。
【図６Ｅ】マウス喘息モデルの肺機能で測定した、Ｃ３ａ５５と表示した逆転ペプチド対照と比較した、Ｃ３ａ３１の防御能力を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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