(57)【要約】  本発明は、従来までのエフェクター細胞の機能測定法の様々な短所や課題を克服する新たな細胞機能測定法、及び当該測定のための測定キット並びに測定システムを提供することを目的とする。  本発明は、エフェクター細胞の数、性質及びその機能を、細胞の画像の解析が可能なセルベースドアッセイ装置等を用いて、同時に又は随時測定・解析することにより、従来法の組合せよりも優れた、詳細且つ信頼性の高いデータを得ることが可能となった。
2009110614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つ以上の細胞を容器の底面に配列させ、その底面に配列する細胞を蛍光又は発光シグナルを検出できるデジタルカメラでデジタル画像を撮像し、撮像されたデジタル画像から当該細胞の細胞表面及び／又は細胞内に含有及び／又は結合している物質を起源とする蛍光及び／又は発光シグナルを計測し、そのシグナルの当該細胞内での分布や強度を測定する工程を含むことを特徴とするリンパ球の細胞機能の測定方法であって、少なくとも：
ａ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、細胞を識別するステップ；
を含む測定方法。
【請求項２】
さらに、
ｂ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、細胞の傷害の有無を識別するステップを含む請求項１記載のリンパ球の細胞機能の測定方法。
【請求項３】
さらに、
ｃ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、細胞の産生する物質を検出するステップを含む請求項１に記載のリンパ球の細胞機能の測定方法。
【請求項４】
さらに、
ｃ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、細胞の産生する物質を検出するステップ；
ｄ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、その測定結果によって細胞同士の接着の有無を検出するステップ；
ｅ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、その測定結果によって細胞内分子の動態を検出するステップを含む請求項２に記載のリンパ球の細胞機能の測定方法。
【請求項５】
前記の細胞機能の測定が、血液、血液中の単核球分画またはリンパ球分画、またはそれらの培養物をエフェクター細胞として用いて測定されることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一つに記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項６】
前記のリンパ球が、ナチュラルキラー細胞または細胞傷害性Ｔ細胞のいずれか一種またはその両細胞であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一つに記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項７】
前記の容器が、マイクロプレート、マイクロタイタープレート、シャーレ、スライドグラス、フラスコからなる群から選ばれるいずれか一種である請求項１乃至４いずれか一つに記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項８】
前記の細胞を配列させる場所が、マイクロプレート内のマイクロウェルもしくはマイクロタータープレート内のウェルの底面であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一つに記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項９】
細胞識別および細胞の傷害、細胞の産生する物質、細胞同士の接着ならびに細胞内分子の動態の検出の各ステップのうち、少なくとも一種以上のステップが、特異抗体を用いた免疫化学的方法であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一つに記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項１０】
前記の細胞を識別する方法が、当該細胞の細胞表面及び／又は細胞内に特徴的に存在する分子を認識する方法であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一つに記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項１１】
前記の細胞を識別する方法が、主要組織適合性抗原クラスＩ分子上に提示されているペプチド分子を特異的に認識する方法であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一つに記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項１２】
前記の細胞の産生する物質が、サイトカイン及び／又は細胞殺傷成分であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一つに記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項１３】
前記のサイトカインがインターフェロンγであることを特徴とする請求項１２に記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項１４】
前記の細胞殺傷成分がパーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グラニュライシンからなる群から選ばれる分子の一種または二種以上であることを特徴とする請求項１２に記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項１５】
前記の細胞傷害の検出が、細胞死及び／又はアポトーシスの検出であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一つに記載のリンパ球の細胞機能測定方法。
【請求項１６】
少なくとも請求項１乃至１４項のいずれか１項に記載の方法を実施するために必要な試薬・器具を構成要素として含む細胞傷害活性測定用キット。
【請求項１７】
少なくとも一つ以上の細胞を容器の底面に配列させ、その底面に配列する細胞を蛍光又は発光シグナルを検出できるデジタルカメラでデジタル画像を撮像し、撮像されたデジタル画像から当該細胞の細胞表面及び／又は細胞内に含有及び／又は結合している物質を起源とする蛍光及び／又は発光シグナルを計測し、そのシグナルの当該細胞内での分布や強度を測定する機能を含むことを特徴とするリンパ球の細胞機能の測定システムであって、デジタル画像撮像手段と、撮像した画像を波長別に分光するフィルタと、分光した撮像データから輝度情報と位置情報と波長情報毎に格納するメモリと、撮像データを分析する中央演算部と、演算結果を表示する表示部を備え、
ａ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、細胞を識別する機能を備えるリンパ球の細胞機能の測定システム。
【請求項１８】
さらに、
ｂ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、細胞の傷害の有無を識別する機能を備える請求項１７記載のリンパ球の細胞機能の測定システム。
【請求項１９】
さらに、
ｃ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、細胞の産生する物質を検出する機能を備える請求項１７記載のリンパ球の細胞機能の測定システム。
【請求項２０】
さらに、
ｃ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、細胞の産生する物質を検出する機能と；
ｄ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、その測定結果によって細胞同士の接着の有無を検出する機能と；
ｅ）前記の蛍光及び／又は発光シグナルの分布や強度の測定結果を使用して、その測定結果によって細胞内分子の動態を検出する機能とを備える請求項１８記載のリンパ球の細胞機能の測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、リンパ球の細胞傷害活性を中心とする細胞機能を測定する方法、及びそのための測定用キット並びに測定システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
我々の体には異物を認識して排除する免疫機構が備わっている。外部から侵入した病原体や、生体内で生じた癌細胞等の異常な細胞は異物として認識され、様々な免疫系のメカニズムによって生体から排除される。このような免疫機能は、血液やリンパ液の流れに乗って全身をくまなく循環する白血球によって巧妙に制御されている。【０００３】
白血球のうち、いわゆる細胞性免疫の効果相（エフェクター・フェーズ）で主役を担うのがリンパ球である。リンパ球のうち、ナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と略す場合がある）や細胞傷害性Ｔ細胞（以下キラーＴ細胞と略す場合がある）等の、いわゆるエフェクター細胞と呼ばれる細胞群は、例えばウイルスに感染した細胞や癌細胞等、生体内の、自分自身の細胞に生じた異常を探知し、そしてその異常細胞を殺傷することによって排除する（例えば、非特許文献１）。【０００４】
エフェクター細胞がウイルス感染細胞や癌細胞を殺傷するメカニズムは複数報告されているが、特にＮＫ細胞とキラーＴ細胞の場合には、パーフォリンとグランザイム類を介した細胞傷害活性のメカニズムが重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献１参照）。これらのエフェクター細胞は、標的細胞に接着した後に、パーフォリンやグランザイム類等を放出する。パーフォリンは標的細胞の細胞膜に孔を開け、グランザイムがその孔を通して標的細胞内に注入される。ヒトのグランザイムには少なくともＡ，Ｂ，Ｈ，Ｍ，Ｋの５種類が存在するが、この内、グランザイムＢは、標的細胞内に存在するカスパーゼ３等のアポトーシス関連酵素を活性化することで標的細胞にアポトーシスを誘導し、そして最終的に標的細胞を死に到らしめるとされる。一方グランザイムＡは、その詳細な作用メカニズムは不明だが、少なくともカスパーゼ非依存的な経路によって標的細胞にアポトーシスを誘導するとされる。またパーフォリンとグランザイムと同時に、脂質結合性蛋白であるグラニュライシンも細胞外に放出される。グラニュライシンの作用メカニズムやその生理的意義にはまだ不明な点も多いが、標的細胞の細胞膜に直接結合することで標的細胞に細胞死を誘導する可能性が指摘されている（例えば、非特許文献２参照）。【０００５】
近年になって、このエフェクター細胞の機能を応用した免疫細胞療法が、癌の治療や予防に適用されている。その代表的なものに「ＬＡＫ療法」と「活性化リンパ球移入療法」がある（例えば、非特許文献３参照）。【０００６】
この内、「ＬＡＫ療法」は、体外に取り出したリンパ球をインターロイキン２等によって癌細胞殺傷能力が高まるように活性化し、その細胞を再度生体内に戻す療法である。実際にリンパ球をインターロイキン２存在下で培養すると、リンパ球中のＮＫ細胞のパーフォリン含有量が顕著に高まることが報告されている（例えば、非特許論文４）。また「活性化リンパ球移入療法」は、体外に取り出したリンパ球中のキラーＴ細胞を特異的に活性化させる免疫細胞療法だが、「ＬＡＫ療法」同様に、パーフォリン・グランザイム等による標的細胞殺傷能力を亢進させることが、治療効果を高める重要な要素となる。【０００７】
したがって、上記の免疫細胞療法を施行するにあたって、投与される治療用細胞のエフェクター細胞としての機能を、事前の検査で十分に確認しておくことが重要である。すなわち治療用細胞、それは純化された均一な細胞集団ではなく、ほとんどの場合は抗原特異性の異なる多様性に富んだリンパ球の集合であるが、少なくともその細胞集団の中に、目的とするエフェクター細胞がどの程度の比率で存在しているか、加えてそのエフェクター細胞が、実際にパーフォリンやグランザイムＢ等の殺傷成分を発現しているかどうか、その発現量がどの程度なのか、そして当該治療用細胞が、実際に標的となる癌細胞を殺傷する細胞傷害活性を有しているか否かを確認しておくことが重要である。さらに治療前後の、患者の血液中に存在するエフェクター細胞の比率やその機能を検査すること、また治療の経過に伴うそれらの変動を随時モニタリングすることは、治療効果を的確に把握するために重要であるのみならず、将来の適切な治療方針を決定する上でも極めて重要である。【０００８】
一方、生体本来が備える免疫機能は、免疫細胞療法による癌治療の場面に限らず、予防医学的な観点からも注目されている。特にＮＫ細胞が癌細胞を殺傷する機能はＮＫ活性とも呼ばれ、生体の免疫機能の代表的な指標の一つとして広く認知されている。【０００９】
ＮＫ活性は、一般的には、クロミウム遊離試験と呼ばれる検査やフローサイトメトリーによる細胞傷害活性試験によって評価されるが（例えば、非特許文献５参照）、その活性は年齢や生活習慣によって変動することが報告されており（例えば、非特許文献６参照）、さらにその活性が、ある種の健康食品やサプリメントの摂取等によって亢進することも報告されている（例えば、非特許文献７参照）。すなわちＮＫ活性は、今日では健康増進のバロメータとして、さらには生体の免疫機能に対する薬品、食品、サプリメント等の効果を確認するための手段としても重要な検査項目として位置付けられている。【００１０】
【非特許文献１】Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＪＨ，  Ｌｅｙ  ＴＪ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２０：３２３−３７０  （２００２）
【非特許文献２】Ｌｅｔｔａｕ  Ｍ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｈ，  Ｋａｂｅｌｉｔｚ  Ｄ，  Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｏ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔ，  １０８：  １０−１９  （２００７）
【非特許文献３】有賀、清水、高崎：  東京女子医科大学雑誌、７４：  ２９１−２９９（２００４）
【非特許文献４】Ｒｕｋａｖｉｎａ  Ｄ，  Ｌａｓｋａｒｉｎ  Ｇ，  Ｒｕｂｅｓａ  Ｇ，  Ｓｔｒｂｏ  Ｎ，  Ｍａｎｅｓｔａｒ  Ｄ，  Ｇｌａｖａｓ  Ｍ，  Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ  ＳＥ，  Ｐｏｄａｃｋ  ＥＲ，  Ｂｌｏｏｄ，  ９２：  ２４１０−２４２０  （１９９８）
【非特許文献５】Ｋｉｍ  ＧＧ，  Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＶＳ，  Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＡＤ，  Ｇｏｏｄｉｎｇ  Ｗ，  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ  ＴＬ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３２５：  ５１−６６  （２００７）
【非特許文献６】竹下・森本：  臨床病理、４３：  １０８７−１０９４（１９９５）
【非特許文献７】Ｎａｇａｏ  Ｆ，  Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ，  Ｍｕｔｏ  Ｔ，  Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｋ，  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ６４：  ２７０６−２７０８  （２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、エフェクター細胞の機能の測定は、生体の免疫能を知る上で重要な検査項目である。そして現状では様々な手法によってエフェクター細胞の活性が評価されている。しかし以下に述べるように、個々の検査内容には様々な短所や問題点が内在している。【００１２】
ＮＫ細胞の機能は、ＮＫ活性を測定するのが一般的である。すなわち被験者の末梢血等をエフェクター細胞とし、骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２細胞を標的細胞とし、各検査施設が独自に定めた比率でこれらの細胞を共培養し、そして一定時間後に、標的細胞であるＫ５６２細胞の傷害の程度を測定する。細胞傷害の測定は、クロミウム遊離試験によって評価されるのが一般的である。そしてその結果は、例えば末梢血中のリンパ球とＫ５６２細胞を１０：１の比率で混合して４時間培養し、そして培養４時間後の時点で、傷害を受けたＫ５６２細胞が全体の６０％であったとすると、ＮＫ活性が６０％であると定義する。【００１３】
しかしこの検査は、一般にＮＫ活性と称されるものの、実際の検査材料は、血液または単核球細胞を中心とする白血球の細胞集団である。そしてＮＫ細胞は、これらの検体中に、通常は十数パーセント程度かそれ以下しか含まれない。また各試験での検体中のＮＫ細胞数は一定ではない。加えて検体中に存在するＮＫ細胞は、数だけでなく、その機能面でも均質ではないと考えられる。例えば前述の非特許論文４には、ＮＫ細胞のパーフォリン含有量が、性別や年齢によって異なっていることが記されている。【００１４】
すなわちクロミウム遊離試験のような、従来のＮＫ活性評価とその測定結果は、検体中のＮＫ細胞数やその質の違いを考慮に入れず、単に標的細胞に生じる細胞死という最終結果を表わすものに過ぎない。よってＮＫ細胞数が多い検体は、一般に、より高いＮＫ活性値を示す傾向があり、逆にＮＫ細胞数が少ない検体は低いＮＫ活性値を示す傾向がある。また複数の検体を比較してＮＫ活性に違いが認められた場合、その違いがＮＫ細胞数の違いによるものか、個々のＮＫ細胞の機能に違いがあるためなのか、様々な可能性が考えられるが、上述の検査法ではその詳細を明らかにすることはできない。【００１５】
クロミウム遊離試験に加えて、フローサイトメトリーやＲＴ―ＰＣＲ等の別の手法を用いて、検査材料中のＮＫ細胞の比率やパーフォリン・グランザイムＢの発現量を解析することも可能である。しかしそれらの追加検査を行うには、より多くの時間と労力ならびに費用を要し、さらに検査に要する細胞量も多くなるため、例えば免疫細胞療法においては、検査に用いる細胞数が増えることで、本来の治療に用いるべき細胞数が減る、という不都合も生じることになる。【００１６】
一方、非特許文献５でも開示されているように、近年ではクロミウム遊離試験の代替法として、フローサイトメーターによる細胞傷害活性試験も開発されている。このフローサイトメーターでの試験では、複数の抗体と蛍光色素を適切に組み合わせることで、標的細胞に生じた細胞傷害の程度の測定と同時に、その検査に用いた検体中のＮＫ細胞の比率、またそのＮＫ細胞のグランザイムの発現頻度等を測定することも可能である。しかしそれらの複数の検査データは、例えば単位細胞あたりの細胞傷害活性を算出する等、ＮＫ活性を補正する場合には有用であるが、その一方で、いずれも個々に独立したデータであって、単にそれらのデータの集積や組合せだけでは、ＮＫ細胞と標的細胞間の相互作用の詳細や、個々の細胞に生じた細胞レベル・分子レベルでの現象の詳細を解析することは困難である。【００１７】
そもそもフローサイトメーターでの測定と解析において、測定時に保存され、また解析に使用されるデータは、細胞が装置内の流路を流れた時に検出された散乱光や蛍光強度等の数値データであり、それらの複数のパラメータをリストモードデータに変換したものを統計解析処理するのであって、細胞そのものを直接解析対象としているわけではない。よって解析ソフト上で様々な解析手法を駆使したとしても、解析できる現象とそのデータの精度には限度がある。例えば、前出の非特許文献５では、フローサイトメーターによって、ＮＫ細胞やＴ細胞と標的細胞との接着を解析する事例が開示されている。しかし散乱光や蛍光強度等の数値データとそのデータ解析手法の工夫だけで、細胞同士の接合を検出したり解析するのには限界があり、顕微鏡で細胞像を直接確認して解析する場合と比べて、その解析データの信頼性が劣ることは明らかである。またフローサイトメーターでは、その機器の特性として、測定対象とした個々の細胞を測定後に回収することは困難である。よって、仮に解析結果の信頼性に何らかの疑義が生じたとしても、もはや個々の細胞を回収して再測定することは極めて困難であり、実質的には解析結果の信頼性を後になって立証する術はない。【００１８】
一方、キラーＴ細胞の場合には、ＮＫ細胞と比べてその細胞数が少ないが故に、当該細胞の機能測定は極めて困難となり、生体内のある特定の細胞集団、例えば末梢血単核球中の当該細胞の頻度の測定しかできない場合も少なくない。特に、癌患者の末梢血中に検出される、ある特定の腫瘍抗原に対する特異的キラーＴ細胞の数は極めて微量であり、例えば、その検出頻度はキラーＴ細胞全体の０．１％、末梢血単核球画分中では０．０１％にも満たない場合が少なくない。このような状況では、通常の採血で回収できる腫瘍抗原特異的なキラーＴ細胞数は極めて微量であり、上述のクロミウム遊離試験やフローサイトメーターを用いた細胞傷害活性試験等を実施するための、必要最低限度の細胞数すら確保できず、結果として、標的癌細胞に対する細胞傷害活性を直接測定することもできない場合が多い。よって現状では、ほとんどの場合、ＭＨＣテトラマー法やＥＬＩＳＰＯＴ法等により、末梢血のキラーＴ細胞中の、ある特定の抗原に応答する特異的キラーＴ細胞の頻度の測定を限度とする検査しか行われない。【００１９】
そしてそのＭＨＣテトラマー法やＥＬＩＳＰＯＴ法による頻度測定ですら、測定対象となる細胞が微量であるが故に、データの信頼性や再現性の確保が困難である、と言わざるを得ない。例えばＭＨＣテトラマー法は、抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩ様分子との複合体を蛍光色素等で標識し、当該分子と結合するキラーＴ細胞をフローサイトメーターで検出して解析する方法であり、感染症研究分野では、ウイルス抗原を特異的に認識するキラーＴ細胞を検出するための代表的な手法の一つとして広く用いられている。しかしフローサイトメトリーでの解析では、例えば測定対象が測定する細胞の０．０１％にも満たないような微量の場合には、一般にデータの信頼性確保が困難となる。そして上述のように、データ解析の時点で仮に何らかの疑義が生じた場合、例えばあるドットプロット解析における、一つの細胞の存在を示すドットが、測定対象である細胞に由来するシグナルなのか、あるいは混入したノイズによるアーチファクトなのかということに疑問を持ったとしても、もはやその一つのドットを対象として再測定や再解析することは叶わない。【００２０】
一方、ＥＬＩＳＰＯＴ法は、特異抗原で活性化されたキラーＴ細胞が産生するインターフェロンγ（以下、ＩＦＮγと略す場合がある）やグランザイムＢ等を検出する方法であり、ＭＨＣテトラマー法と同様に、抗原特異的キラーＴ細胞を検出するための代表的手法の一つとして汎用されている。しかし、低頻度の細胞解析におけるデータの信頼性確保は、ＭＨＣテトラマー法同様に困難である。加えて、測定対象は、膜に点在するスポット、すなわち細胞が産生したＩＦＮγやグランザイムＢ等を酵素抗体法等で染色して可視化したスポットであって、やはり細胞を直接測定対象としているのではない。それらの物質が検出された場所（スポット）に、かつてその物質を産生した細胞が存在していたと解釈する。従って測定後に、反応の特異性に疑義が生じたとしても、そのスポットの位置に本当にその物質を産生した細胞が存在していたのかどうかを、後になって立証する術はない。【００２１】
以上のように現状のキラーＴ細胞の検査は、測定対象となる細胞を十分量確保することが困難であるが故に、その細胞の細胞傷害活性を直接評価することが難しく、さらにその細胞の頻度の測定ですら、信頼性や再現性の確保が容易ではないのが現状である。【００２２】
本発明は、上述のような、従来までのエフェクター細胞の機能測定法の短所や課題を克服するための、新たな細胞機能測定法を提供すること、及び当該測定を実施するためのキット並びにその測定システムを提供することを目的とする。すなわち本発明は、エフェクター細胞の、標的細胞に対する細胞傷害活性等の機能を詳細且つ網羅的に、かつ高い精度で測定するための新たな細胞機能測定法及び当該測定を実施するためのキット並びにその測定システムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
かかる問題を解決するために鋭意検討した結果、発明者らは、エフェクター細胞の機能を評価するためには、細胞傷害活性のメカニズム全体を検査対象として、エフェクター細胞が標的細胞を死滅させる際の様々な細胞生物学的な現象を、詳細且つ網羅的に解析することが不可欠であると考えるに至った。そして種々の細胞レベル、分子レベルでの現象を同時に、さらに必要に応じて随時測定しなければならないと考えた。加えて、低頻度の細胞の機能の測定に際して、そのデータの信頼性や再現性の確保のために、必要に応じて再解析することが可能な測定法でなければならないと考えた。そして最終的に、種々の細胞レベル、分子レベルでの現象を画像イメージとして取得し、それらの画像データを様々な解析手法を用いて解析する新たな細胞機能評価法を確立し、発明を完成するに至った。【００２４】
本発明の一態様は、例えば標準マイクロタイタープレート中でエフェクター細胞と標的細胞を任意の時間、任意の割合で混合して培養し、必要に応じて、複数の分子を蛍光標識抗体や蛍光物質等により標識し、その後、上記のプレート中の細胞の一つ一つの画像イメージの取得と解析が可能なセルベースドアッセイ装置を用いて、複数の分子の発現を同時に、また必要に応じて随時測定し、そしてそれらの測定結果を定性及び定量的に解析することを特徴とするエフェクター細胞評価法を提供するものである。【００２５】
ここで、標準マイクロタイタープレートの底は平底であることが望ましく、また、サンプルとなる細胞は、一つまたは複数のいずれでもよい。さらに、複数の細胞をサンプルとする場合は、前記平底の底面に単層で配置することが望ましい。【００２６】
すなわち本発明では、検体中の、目的とするエフェクター細胞の比率、細胞内にパーフォリン・グランザイムを発現するエフェクター細胞の比率、また個々のエフェクター細胞内のパーフォリン・グランザイム含有量等、従来までフローサイトメーター等を用いて測定していた項目と、個々のエフェクター細胞中のパーフォリン・グランザイム等の局在、並びにエフェクター細胞が標的細胞に遭遇することによって生じるパーフォリン・グランザイム等を含有する細胞内顆粒の細胞内動態等、従来までは蛍光顕微鏡やレーザー共焦点顕微鏡等で観察していた項目とを同時に測定する。加えて、エフェクター細胞の標的細胞への接着や、標的細胞でのアポトーシスに係る変化等の細胞生物学的な現象も、同一サンプル中で同時に測定する。これら複数のパラメータを同時に計測することで、エフェクター細胞の機能の詳細を網羅的に、かつ包括的に解析することが可能となる。【００２７】
具体的には、標的細胞の細胞傷害を測定して定量化する際に、当該現象が、例えばアポトーシスによるものなのかどうか、そして標的細胞へのエフェクター細胞の付着はどの程度なのか、エフェクター細胞の細胞質内に、標的細胞にアポトーシスを誘導せしめる殺傷成分、例えばグランザイムＢが発現しているか、そしてそのエフェクター細胞が標的細胞を殺傷せんがために、当該細胞内のグランザイムＢを含む細胞内顆粒を標的細胞との接着面に移動させているか否か、といった諸現象を同時に測定・解析する。さらに検体中に存在するエフェクター細胞の比率、グランザイムＢを発現するエフェクター細胞の比率、また個々のエフェクター細胞のグランザイムＢ発現量も同時に測定して解析する。すなわち本発明に係る方法によれば、エフェクター細胞の量と質、そしてその機能を詳細に、また同時に、かつ多面的に解析することが可能となり、それによって当該現象の特異性と妥当性を確認することが可能となる。【００２８】
さらに本発命は、細胞個々の画像データを取得し、そしてその画像データを解析対象とするため、上記のような、細胞の詳細な形態学的観察や解析が可能となることに加え、データ解析時に細胞一つ一つの画像を確認することで、検体の調製や測定時に混入した異物を発見したり、その異物に由来する疑陽性データを発見することが容易となる。そして当該疑陽性データを除いた真の陽性データのみで結果を再解析することが可能となる。このような疑陽性データの排除と再解析は、従来法であるクロミウム遊離試験やフローサイトメトリーによるＮＫ活性測定、またＭＨＣテトラマー法やＥＬＩＳＰＯＴ法でのキラーＴ細胞の頻度の測定では行うことのできない、当該発明の優れた特性の一つである。従ってキラーＴ細胞のような低頻度の細胞群を測定対象とする場合であっても、従来法と比べて、より信頼性の高い測定と解析を行うことが可能となる。【００２９】
あわせて本発明では、ある複数パラメータを測定して解析が終了した後であっても、必要に応じて、別のパラメータを加えて再測定し、再度データを解析し直すことが可能である。前述の例では、エフェクター細胞のグランザイムＢの発現を測定・解析する例を提示したが、本発明では、当該測定及び解析が終了した後に、改めて当該測定対象のエフェクター細胞が、別の殺傷成分であるグラニュライシンを発現しているか否かを調べたい場合、免疫学的に交差しない適切な抗体を用い、また光学的に検出可能で、かつ他のパラメータ測定に用いた蛍光色素等と分離測定可能な波長を有する標識色素を用いることで、マイクロタイタープレート中の同一細胞のグラニュライシンを染色し、他の複数パラメータとともに、改めて測定や解析をやり直すことが可能となる。このような利便性、すなわち同一検体を用いて、ある一連の測定と解析が終了した後に、別のパラメータを加えて再測定・再解析を行うことができるという利便性は、従来法にはない、本発明の優れた特性の別の一面である。従来法であるクロミウム遊離試験やフローサイトメトリーによるＮＫ活性測定、またＭＨＣテトラマー法やＥＬＩＳＰＯＴ法でのキラーＴ細胞の頻度の測定では、このような、同一検体での、新たなパラメータを加えた再測定・再解析は不可能である。【００３０】
上述のような測定・解析を行うための装置は、具体的には特定されないが、例えばオリンパス製のＲＳ−１００のような細胞イメージ解析装置等、細胞の蛍光顕微鏡画像を全自動で取得し、さらに蛍光輝度情報や細胞形態情報などを解析して数値化することで統計的なデータを得ることができるような装置であることが望ましい。すなわち当該測定装置は、例えば測定対象が、標準平底９６穴のマイクロタイタープレートのウェル底部に固着し、かつ、様々な蛍光標識を施した細胞単層であった場合、その９６穴マイクロタイタープレートを保持するために適合したステージを有し、そしてそのステージを移動させる手段を有し、また例えばＣＣＤカメラのようなデジタルカメラ、励起光を細胞に方向付ける光源、および細胞から放射された蛍光をデジタルカメラに方向付けるための手段を備え、さらにそのデジタルカメラからのデジタルデータを受信及び処理するためのコンピューターシステムを有するセルベースドアッセイ装置である。そして当該９６穴マイクロタイタープレートの全領域を画像描出し、この画像を解析して、個々の細胞の表面抗原や細胞内抗原の発現量等を定量解析することが可能な装置である。【００３１】
上述の装置は、少なくとも１０倍の対物レンズ、好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは４０倍以上の対物レンズを装備する高倍率蛍光光学系装置であって、細胞の内部構造を詳細に観察するための顕微鏡画像の取得が可能な装置であることが好ましい。また高感度検出のために、異なる励起波長と蛍光波長を持つ多くの蛍光分子を幅広く検出することが可能な光源と検出器を備えていることが好ましい。その際、同一検体で複数のパラメータの検出を行うためにも、複数の蛍光色素で多重染色した場合に、各々の色素ごとの蛍光強度を独立して精度よく測定するための光学的分離機能、光学フィルタ等を有していることが好ましい。そして、独立して同時に測定できる蛍光色素の数は少なくとも２種以上、望ましくは４種以上の色素を同時に用いることができる光学的測定機能を有する装置であることがさらに好ましい。【００３２】
そして上述の装置は、例えばＣＣＤカメラからのデジタルデータを受信して処理するためのコンピュータ手段を有するものであり、具体的にはデータを画像イメージとして保存し、必要に応じて当該画像イメージを加工し、また定量的に解析することができるような画像解析機能を搭載しているか、または外部の画像解析装置と連動して測定データを加工・解析できる装置であることが好ましい。加えて、例えば標準９６穴マイクロタイタープレート等の多数のウェルを有するプレートを使用した場合でも、測定時に自動的にアライメント及びフォーカスする機能を搭載することで、多様な処理を施した、より多くの細胞の画像イメージデータを、自動で高速に取得する機能を有する装置であればさらに好ましい。【００３３】
例えば、前述の非特許文献５では、イメージングフローサイトメーター装置を用い、散乱光や蛍光データからバーチャルな細胞像をディスプレイ上で再現し、あたかも顕微鏡画像による形態学的観察を行っているような解析事例が示されている。しかしこの論文で開示されている方法は、基本的にフローサイトメトリー手法を改変した方法であって、細胞の画像データを解析対象とする当該発明とは本質的に異なっている。すなわち本発明に係る方法では、ＣＣＤカメラ等で取得した細胞の画像イメージを測定・解析対象として保存し、そしてその画像データを様々な画像処理によって数値化データとして換算して統計解析等を行う。しかし上記の論文での測定方法は、従来までのフローサイトメトリーでの解析法、すなわちある特定の流路を連続的に流れる細胞にレーザー光等の光を照射した際の、個々の細胞が発生する散乱光や蛍光の強度を発光位置情報と共にデータとして保存し、その光学的データを様々な手法で解析する方法である。従って当該非特許文献に記載の方法は、細胞を直接観察し、その画像データを直接解析対象とする本発明とは本質的に異なる方法である。加えて、前述のように、フローサイトメトリーを用いた測定法であるが故に、疑陽性データの排除と再解析ができず、また同一検体での新たなパラメータを加えた再測定・再解析も不可能であり、この点からも、本発明に係る測定法とは本質的に異なる方法であると考えられる。【００３４】
なお、撮像装置としては、ＣＣＤイメージセンサを含むＣＣＤカメラの他にＣＭＯＳイメージセンサを用いることもでき、３００ｎｍ乃至８００ｎｍの蛍光を含む光を検出して、撮影対象物から発した光をレンズなどの光学系によって撮像素子の受光平面に結像させ、その像の光による明暗を電荷の量に光電変換し、それを順次読み出して電気信号に変換する。【００３５】
すなわち発明に用いる装置は、ＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサ等のイメージを撮像して測定・解析を行うための装置デジタル画像撮像手段と、撮像した画像を波長別に分光するフィルタと、分光した撮像データから輝度情報と位置情報と波長情報毎に格納するメモリと、撮像データを波長毎の光強度としてその波長対周波数のグラフを入手して分析する中央演算部と、演算結果を表示する表示部を備えるものである。【００３６】
発明の別の好ましい実施態様として、本発明は、標的細胞に生じた傷害を検出する方法として、細胞死を検出する方法乃至アポトーシスを検出する方法を提供するものである。【００３７】
細胞死の検出方法は特に限定されるものではないが、例えば常法に従って、ＰＩ（プロピジウムイオダイド）や７−ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシンＤ）等を用いて、生細胞と死細胞を識別する方法も用いることができる。【００３８】
一方、アポトーシスを検出する方法も特に限定されるものではないが、例えばアポトーシス初期段階で細胞に発現する特徴的な分子である活性型カスパーゼ３を測定対象として用いることができる。カスパーゼ３は、例えばエフェクター細胞から標的細胞内に注入されたグランザイムＢの作用によって切断されることで、細胞質内で活性型となるが、この活性型カスパーゼ３を特異抗体を用いて免疫染色により可視化することで、アポトーシスの発現を評価する。また標的となる癌細胞が上皮系細胞の場合には、サイトケラチン１８をアポトーシスの指標とすることもできる。サイトケラチン１８は、活性化されたカスパーゼ３（またはカスパーゼ７）により切断されるが、その切断されたサイトケラチン１８を免疫化学的に検出することで、標的細胞に生じたアポトーシスを検出することも可能である。【００３９】
またアポトーシスの検出には、上述のような免疫化学的手法に加えて、例えば活性型カスパーゼ３に特異的に結合する蛍光標識化合物や、カスペース３によって切断されることで蛍光発色するような特異的な基質等の化学物質を用いて、活性型カスパーゼ３の量や、その酵素活性を測定する方法でもよい。また蛍光標識したアネキシンＶを用いて、アポトーシス初期段階で細胞表面に露出するフォスファチジルセリンを検出する方法や、細胞核をＤＡＰＩ等の色素で染色することで、核の濃縮・断片化等のアポトーシス細胞に特徴的な形態学変化を指標として定量解析する方法を用いてもよい。【００４０】
そして本発明のある好ましい実施態様では、標的細胞そのもの、又は上述のような様々な指標によって選別された、何らかの傷害を受けた標的細胞や、アポトーシスを生じた標的細胞及び／又はアポトーシスに特徴的な分子を発現している標的細胞に、実際にエフェクター細胞が接着しているかどうかを確認する工程を含むことを特徴とするエフェクター細胞の機能測定法を提供する。エフェクター細胞と標的細胞との接着は、エフェクター細胞が標的細胞を殺傷するために不可欠な現象である。したがって経時的にこの現象を解析する工程を含むことによって、当該エフェクター細胞が、実際に標的細胞を識別して接着する能力を有する機能的な細胞であるか否かを確認することができる。  【００４１】
エフェクター細胞の特定には様々な方法を用いることができるが、当該エフェクター細胞に特徴的な分子の検出、例えばＮＫ細胞の場合には、ＮＫｐ４６やＮＫｐ３０等のＮＫ細胞の細胞表面に特徴的に発現する分子を利用して特定する方法を用いることができる。ただ検体によっては、これらの分子の発現が極端に低いために細胞の特定が困難な場合もあるので、例えばＣＤ５６陽性且つＣＤ３陰性の細胞を選択する等、他の複数の抗原分子を組み合わせて特定してもかまわない。【００４２】
また抗原特異的なキラーＴ細胞を識別するためには、主要組織適合性抗原クラスＩ分子上に提示されているペプチド抗原を検出する方法を用いるのが好ましく、具体的には蛍光標識ＭＨＣテトラマー分子等によって検出する方法が好ましい。しかし抗原によっては、当該ＭＨＣテトラマー分子を容易に作製できない場合もあるので、ＣＤ３陽性且つＣＤ８陽性の細胞を選別する等、他の複数の分子の発現の有無を指標に識別する方法を用いてもよい。【００４３】
さらに抗原特異的なキラーＴ細胞の識別には、特異抗原による刺激に応じて、当該抗原特異的キラーＴ細胞から産生される分子、あるいは特異抗原刺激に応じて発現量が変化する、当該抗原特異的キラーＴ細胞の細胞内の分子の発現量等を指標とすることもできる。具体的には、特異抗原の刺激による、キラーＴ細胞からのＩＦＮγ等のサイトカインの産生、または当該サイトカイン等の細胞内での蓄積、またパーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グラニュライシン等の細胞殺傷成分の細胞内での発現の亢進等を指標とすることができる。【００４４】
もし純化されたエフェクター細胞を用いることが可能であれば、上記の方法に加えて、例えばＧＦＰ等を発現させるための蛍光マーカー遺伝子、または蛍光分子そのものを直接当該細胞に取り込ませることで識別する方法、あるいは事前に特定の分子、例えば細胞分裂時にブロモデオキシウリジン等を細胞内に取り込ませ、その分子の発現の有無を指標としてエフェクター細胞を識別する方法を用いてもかまわない。【００４５】
一方、標的細胞は、例えば細胞のサイズの違い等、その形態学的な特徴だけでエフェクター細胞と識別可能であれば、特に蛍光分子等で標識する必要はない。しかし他細胞と識別する必要がある場合には、エフェクター細胞の標識と同様に、当該標的細胞に特徴的な分子を認識する抗体等を用いて蛍光標識すればよい。また標的細胞が上記のＫ５６２細胞のような株化細胞であれば、例えばＧＦＰ等を発現させるための蛍光マーカー遺伝子、または蛍光分子そのものを直接標的細胞に取り込ませることで標的細胞を標識して識別する方法、あるいは前述のように、例えばブロモデオキシウリジン等を細胞内に取り込ませて標識し、その分子の発現の有無を指標として標的細胞を識別する方法を用いてもかまわない。【００４６】
エフェクター細胞と標的細胞の接着を検出する方法は特に限定されない。例えば、画像データ中の標的細胞を一つ一つ観察し、実際にエフェクター細胞が付着する細胞の比率を計測するのが最も容易である。一方、マスキング・ツールを有する画像解析装置であれば、当該解析ツールを用いて解析を行ってもよい。その場合、例えば標的細胞の核乃至細胞膜を染色し、そして任意の標的細胞の、当該染色部位の外周に、その周囲に付着するリンパ球が含まれる程度の領域、画像上では標的細胞の細胞核乃至細胞膜の周囲の一定ピクセル外側に、細胞核乃至細胞膜の形状と相似形の領域を設定（マスク）し、その領域内にエフェクター細胞を起源とする蛍光シグナルが存在するかどうかを調べることで、エフェクター細胞が接着する標的細胞と、エフェクター細胞が接着していない標的細胞とを自動的に選別して計測することが可能となる。【００４７】
さらに本発明の別の好ましい実施態様では、エフェクター細胞の細胞内にある細胞殺傷成分の量と、その動態を確認する工程を含むことを特徴とするエフェクター細胞評価法を提供するものである。測定対象となるパーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グラニュライシンの量は、常法通りに特異抗体を用いて免疫蛍光染色を施し、その蛍光強度を測定して定量化することができる。また高倍率で解像度の高い画像を取得できれば、細胞内の顆粒数を計測して算出することもできる。【００４８】
一方、これら細胞殺傷成分のエフェクター細胞内での動態を解析する方法は特に限定されないが、上述と同様に、直接細胞の画像を観察して解析する方法及び画像解析装置による自動解析のどちらかの方法を用いることができる。すなわち、これらの殺傷成分を含む細胞内顆粒は、通常はエフェクター細胞内に比較的均一に分布しているが、エフェクター細胞と標的細胞とが接着すると、標的細胞内に注入される前段階として、細胞内細胞殺傷成分がその細胞接着面付近に集積する（例えば、前述の非特許論文２参照）。この現象を利用して、エフェクター細胞の殺傷成分の細胞内での動態を解析する。【００４９】
具体的には、細胞画像を直接観察し、標的細胞との接着面の周辺に細胞内顆粒を集積させているエフェクター細胞数を計測し、その比率を算出する方法があげられる。一方、画像解析機能を利用する場合には、例えばエフェクター細胞とその細胞内顆粒、及び標的細胞の核乃至細胞膜を染色した画像データを用い、上記と同じくマスキング・ツール等の解析手法を用い、当該画像データ上で、標的細胞の核の外周乃至細胞膜から等間隔ごとに拡がる任意のドーナツ型の領域を設定し、そのドーナツ型の領域内に含まれるエフェクター細胞の細胞内顆粒の数及び／又はその蛍光強度の分布を統計的に解析することで、標的細胞との接着面の周辺に細胞内顆粒を集積させているエフェクター細胞の比率を算出することができる。すなわち細胞内顆粒が細胞内に比較的均一に存在していれば、細胞内顆粒の分布は、標的細胞の細胞核乃至細胞膜からある一定のピクセルの範囲内に比較的幅広く分布する。しかし顆粒が標的細胞との接着面に集積していれば、その分布は上述の均一な場合と比べて、より核や細胞膜に近い位置に偏ることになる。この顆粒の分布の変化を統計的に解析することで、エフェクター細胞の細胞内顆粒の動態を解析することもできる。【００５０】
標的細胞の核や細胞膜を染色する方法は特に限定されないが、例えば核染色はＤＡＰＩ（４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）を用いることができる。また細胞膜の染色は、用いる標的細胞の種類に応じ、その細胞の細胞膜に特異的に発現している分子を染色する方法等を用いればよい。また上述の画像解析のためには、例えばエフェクター細胞との共培養の前に、ＰＫＨ−２６（シグマ製）のような親油性の蛍光物質を用いて標的細胞だけを蛍光標識する方法を用いてもかまわない。【００５１】
本発明の別の態様として、上述のような、エフェクター細胞及び／又は標的細胞に生じる様々な細胞レベル、分子レベルでの変化を測定するためのキットを提供するものである。当該キットは、細胞の共培養及び／又は様々なパラメータを測定する際に用いる細胞培養容器、及び細胞や分子を識別するための特異抗体と蛍光色素等の試薬から構成される。【００５２】
キットの構成要素の一つである細胞培養容器は、エフェクター細胞と標的細胞の培養に、また測定時には細胞を単層に配列させる場として用いられるが、いずれも、いわゆるマイクロタイタープレートやマイクロプレートと称する容器で、一般の細胞培養に用いられ、また免疫化学的手法による抗体染色処理等に使用できるものであればよい。また必ずしも細胞の培養と測定を同一の容器で行う必要はなく、例えば一つのキットに含まれる容器が、少なくとも培養用と測定用の２種以上の異なるものであってもよい。また測定装置が許容する範囲で、マイクロタイタープレートやマイクロプレートに限らず、シャーレ、あるいはスライドグラスやフラスコ等を用いてもよい。しかし同一条件で培養した細胞群に多様な条件で染色を施して多様な解析を行うことを想定した場合には、少なくとも測定用の容器は多ウェルのマイクロタイタープレートやマイクロプレートであることが望ましい。当該マイクロタイタープレートやマイクロプレートのウェル数も特に限定されるものではないが、例えば細胞培養等で汎用される６穴、１２穴、２４穴、４８穴、９６穴マイクロタイタープレートが好ましく、特に９６穴のウェルを有するマイクロタイタープレートやマイクロプレートが好ましい。【００５３】
上記のマイクロタイタープレートやマイクロプレートの材質は特に限定されないが、細胞の培養及び測定に際して、共に、市販の細胞培養用やＥＬＩＳＡ用の標準プラスティックプレート、またはガラス製のプレート等を用いることができる。これらのプレートの底面、すなわち細胞が接触する表面の材質や形状、表面の荷電状態等も特に限定されるものではない。必要に応じて、また蛍光測定の障害にならない範囲で、細胞の付着を補助するための分子、例えばコラーゲン等のタンパク質やポリＤリジン等の高分子化合物、またその他の物質で表面加工したものを用いることもできる。また前記のように、マイクロタイタープレートやマイクロプレートに限らず、シャーレ、スライドグラス、フラスコ等の別の容器を用いてもよいが、これらの容器も同様に、細胞の付着を補助するような素材や表面加工処理をしたものを用いることができる。【００５４】
測定に際しては、測定対象である細胞の剥離を防ぐために、細胞を測定用容器の底面に固着させる必要がある。特にリンパ球等、ほとんどのエフェクター細胞が浮遊系細胞であるために、細胞を容器の底面に固着させる操作は不可欠となる。その方法は特に限定されるものではないが、例えばマイクロタイタープレートやマイクロプレートを用いる場合には、細胞浮遊液を播種した後に、当該プレートを遠心処理して細胞を沈め、その後乾燥させることで、細胞をプレート底面に付着伸展させることができる。また蛍光測定の障害にならない範囲で、上記のような細胞の付着を補助するための表面加工処理をしたマイクロタイタープレートやマイクロプレートを用いることもできる。マイクロタイタープレートやマイクロプレート以外の容器、シャーレ、スライドグラス、フラスコ等の別の容器を用いる場合にも同様の方法で細胞を固着させることができる。【００５５】
一方、キットの構成要素の一つである試薬は、市販の抗体や試薬を用いることができる。例えばＮＫ細胞の識別用には、前述のようにＮＫｐ４６やＮＫｐ３０に対する特異抗体、又はＣＤ５６抗体とＣＤ３抗体の組合せ（例えば、いずれもベックマンコールター製）、またＭＨＣテトラマーの場合、例えばＨＬＡタイプがＡ０２０１型のＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的なキラー細胞の識別用には、例えばＰＥ標識Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）ＭＨＣテトラマー（ＭＢＬ製）等の市販の試薬を用いることができる。さらに細胞内の顆粒の識別には、やはり市販のパーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グラニュライシン各々に対する特異抗体を用いることができるし、サイトカインの検出にも市販の特異抗体を用いることができる。また細胞内のサイトカインを検出する際には、培養液中にタンパク輸送阻害剤を加え、細胞内にサイトカインを蓄積させる手順を用いることができるが、この目的のために使用されるタンパク輸送阻害剤としては、例えばモネンシンＡ、ブレフェルジンＡ等の市販の試薬を用いることができる。【００５６】
上述の特異抗体は、すでに蛍光色素が標識されている抗体を用いてもよいが、非標識の抗体とその抗体を特異的に認識する市販の蛍光標識二次抗体との組合せであってもよい。その際の蛍光色素は特に限定されるものではないが、少なくとも３種類の異なった分子を同時に識別するためのキットには、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｐｒｏｂｅｓ製の蛍光色素であれば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８、Ａｌｅｘａ    Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７の３種類の蛍光色素を標識した一次抗体乃至二次抗体を組み合わせることができる。【００５７】
細胞死やアポトーシスを識別するための試薬も特に限定されないが、当該キットには、例えば死細胞の識別用に、ＰＩ（プロピジウムイオダイド）や７−ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシンＤ）等を用いることができる。アポトーシスの検出には、例えばＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＡＰＯ  ＬＯＧＩＸ試薬のような、細胞内活性型カスパーゼに特異的に結合する蛍光標識試薬を用いてもよいし、活性型カスパーゼの作用により蛍光分子が遊離するような基質、例えばＢｉｏＶｉｓｉｏｎの７−ＡＦＣ結合基質等の試薬を用いてもよい。またアネキシンＶ検出用にＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ製のＦＩＴＣ標識アネキシンＶ等の蛍光標識試薬等を用いることができる。【００５８】
一方、免疫化学的にアポトーシスを検出する場合には、上述のように、例えば市販の活性型カスパーゼ３を特異的に認識する抗体や抗サイトケラチン１８抗体を用いることができる。抗体は、すでに蛍光色素で標識されている抗体を用いてもよいが、非標識の抗体とその抗体を特異的に認識する蛍光物質が結合する市販の二次抗体との組合せであってもよい。その際の蛍光色素の種類は特に限定されるものではない。
【発明の効果】
【００５９】
本発明に係る方法、また本発明に係るキットを用いることで、エフェクター細胞そのものの性質、及び同細胞が標的細胞を殺傷する際の複数の細胞レベル及び分子レベルでの現象を、同時及び／又は随時測定することが可能となる。そしてそれらの解析データを組み合わせることで、従来までの細胞傷害活性測定法単独や、その他の複数の試験検査を組み合わせた解析法と比べて、より信頼度の高い有用な検査データを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の実施例１に係るエフェクター細胞の機能測定法による画像解析における測定領域の設定方法の概要図であり、（Ａ）細胞の免疫染色画像の選定を示す概要図であり、（Ｂ）細胞核（メインオブジェクト）の認識を示す概要図であり、（Ｃ）細胞表面抗原の認識を示す概要図であり、（Ｄ）バーフォリンの認識を示す概要図であり、（Ｅ）細胞集団の設定を示す概要図であり、（Ｆ）画像ギャラリーでの測定対象の確認を示す概要図である。
【図２】本発明の実施例１ＰＢＭＣ中のパーフォリン陽性ＮＫ細胞の解析の一例。（Ａ）は本発明に係るエフェクター細胞の機能測定法による解析例であるグラフで、ＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性の細胞（ＮＫ細胞）を選択し、当該細胞群のパーフォリン陽性細胞の比率を算出したもの。（Ｂ）従来法によるフローサイトメーターで、ＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性の細胞を選択し、当該細胞群のパーフォリン陽性細胞の比率を算出したものである。
【図３】本発明の実施例１に係るエフェクター細胞の機能測定法によるパーフォリン陽性ＮＫ細胞の画像解析の一例のグラフと撮像である。（Ａ）のドットプロット中の矢印で示した任意のドット一点が、（Ｂ）での矢印で示した領域内の細胞の画像に対応する撮像である。
【図４】本発明の実施例２に係るエフェクター細胞の機能測定法によるＮＫ細胞の、パーフォリン含有顆粒の解析の一例を示す撮像と解析画像である。（Ａ）は任意に選択した１個のＮＫ細胞（パーフォリン陽性、ＣＤ５６陽性）であり、（Ｂ）は当該細胞の顆粒数解析時の顆粒検出方法の一例を示す解析画像である。
【図５】本発明の実施例３に係るエフェクター細胞の機能測定法によるＰＢＬとＫ５６２細胞の培養混合物の画像データの一例の撮像である。矢印はＫ５６２細胞を示し、一部の細胞の細胞質に活性型カスパーゼ３の発現が認められた。Δ印はＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）を示す。
【図６】本発明に係るエフェクター細胞の機能測定法によるアポトーシスを起したＫ５６２細胞に接着するＮＫ細胞の一例の撮像である。Δ印はＣＤ５６陽性のＮＫ細胞を示し、矢印は活性型カスパーゼ陽性のＫ５６２細胞を示す。
【図７】本発明の実施例４に係るエフェクター細胞の機能測定法によるＫ５６２細胞に接着するＮＫ細胞の一例の撮像である。矢印で示したＮＫ細胞のうち、ＮＫ（＊）のパーフォリン顆粒は、細胞質内に比較的均一に分布しているが、他の２つのＮＫ細胞では、Ｋ５６２細胞との細胞接着面へのパーフォリン顆粒の集積が認められる。
【図８】従来法による末梢血中のＭＡＧＥ−３特異的キラーＴ細胞の解析例の概要図と撮像を示す。（Ａ）はＭＨＣテトラマー法の解析チャートの一例、また（Ｂ）はＥＬＩＳＰＯＴ法での結果の一例で、当該特異的キラーＴ細胞群が産生したＩＦＮγのスポットを示す。
【図９】本発明の実施例４に係る方法でのＭＡＧＥ−３特異的キラーＴ細胞の解析の一例の概要図と撮像を示す。（Ａ）のヒストグラムは細胞内ＩＦＮγ陽性細胞の解析の一例を示す。（Ｂ）は、（Ａ）のヒストグラムでＩＦＮγ陽性の範囲のすべての細胞のイメージを示す。１６個の細胞イメージの内、左下のＸ印の部分は、実際に細胞の形態を示していないことからノイズと判断された。そして（Ｃ）は画像データ中のＸ印の部分に相当するイメージを示したが、誤って細胞と認識されていたのが矢印で示した部分であり、その部分が実際に非特異的な蛍光を放つノイズであることが再確認された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
以下に具体的な例を記載して発明の効果を説明する。
【実施例】
【００６２】
［実施例１］
健常人末梢血ＮＫ細胞のパーフォリン発現量の解析
健常人末梢血３０ｍＬを採取し、常法に従って、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ密度勾配遠心法によって末梢血単核球（以下ＰＢＭＣと略す場合がある）を分離調製した。得られたＰＢＭＣは、ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に懸濁し、フラスコ（ファルコン３１３６）に播種して３７℃で３０分間培養した後に、軽いピペティングによって浮遊細胞だけを回収し、約１，５００万個のリンパ球濃縮画分（以下ＰＢＬと略す場合がある）を得た。このＰＢＬを半分に分け、一方を本発明に係る細胞イメージ解析装置での測定用の検体とし、もう一方を従来法であるフローサイトメトリー法での測定用の検体とした。【００６３】
細胞イメージ解析用の検体は、平底９６穴マイクロプレート（コーニング３５９６）に１穴あたり１０万個の細胞を播種し、次にプレートを５０ｘｇで１０分間遠心処理した後に、上清を除いて３０分間風乾した。その後、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで３０分間固定した。洗浄後、細胞質内のパーフォリンをマウス抗ヒトパーフォリン・モノクローナル抗体（ＡＮＣＥＬＬ製）とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で染色し、またＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター製）とＲ−ＰＥ標識抗ヒトＣＤ５６抗体（ベックマンコールター製）を用いて、リンパ球の細胞表面抗原を標識した。その後、ＤＡＰＩで細胞核を染色し、染色後に細胞イメージ解析装置（オリンパス製ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ１００）を用い、ＰＢＬ中のＮＫ細胞（ＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性）の比率ならびにパーフォリン陽性細胞の比率を解析した。【００６４】
データ解析は以下の手順で行った。画像解析における測定領域の具体的な設定方法の概要を図１に示したが、図１（Ａ）の１０１は細胞表面抗原（ＣＤ３とＣＤ５６）を示し、１０２はパーフォリン、１０３は核を示すが、まずこれら染色処理を施した任意の細胞画像を複数選択した。次に、画像解析の際に細胞一つ一つを自動的に識別するために、核領域１０４、すなわちＤＡＰＩで染色された領域をメインオブジェクトとして認識するような領域を設定した（Ｂ）。その際、核領域の設定は、ＤＡＰＩ染色部分の面積の最大値と最小値および蛍光強度の閾値により設定し、また細胞密度が高く、細胞が込み合っているような場合は、ウオーターシェッドアルゴリズム手法によって核同士のくびれを認識することにより個々の細胞を認識するようにして領域を設定した。次に認識されたメインオブジェクト、すなわち個々の細胞核を中心とし、等間隔に存在するドーナツ型のエリア１０５と細胞すべてを網羅する領域１０７を作成した。ドーナツエリア作成においては、核最外線からのドーナツの最内線開始地点とドーナツ最外線である終点を自由に設定できるが、細胞の表面抗原（ＣＤ３とＣＤ５６）を測定対象とする際（Ｃ）には、エリア内に細胞膜１０６のすべて乃至少なくともその一部含まれる状態となる領域１０５のようなドーナツエリアを設定し、また細胞内のパーフォリン１０８を測定対象とする場合（Ｄ）には、細胞核１０９と細胞膜１１０を含む、細胞内をもれなく測定対象とするような領域１０７を設定した。エリアを設定した後に、各々のエリア内におけるＣＤ３、ＣＤ５６、パーフォリンの平均蛍光強度（エリア内の１ピクセルあたりの平均蛍光強度）もしくは最大蛍光強度（エリア内の１ピクセルあたりで最大の蛍光強度）により１細胞あたりのそれぞれの蛍光強度を解析した。解析にあたって、核の誤認識を排除するため、核のエリア（Ａｒｅａ）と例えばサーキュラリティーファクター等の細胞核（メインオブジェクト）の形状の記述ファクターにより細胞集団を特定するようなリージョン１１１を測定対象として選択し、ノイズを排除して解析データの精度を高めた（Ｅ）。また当該機器の解析ソフトのギャラリー機能（Ｆ）を用い、上記で選択したリージョン中の細胞個々の画像を確認し、混入した異物１１２や複数の細胞を一つの細胞として認識しているような誤認識１１３等が認められた場合には、データ解析対象から除外した。【００６５】
一方、フローサイトメーター用検体は、常法に従い、ＰＣ−５標識抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター製）とＲ−ＰＥ標識抗ヒトＣＤ５６抗体（ベックマンコールター製）を用いてリンパ球の細胞表面抗原を標識し、さらにマウス抗ヒトパーフォリン・モノクローナル抗体（ＡＮＣＥＬＬ製）とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター製）でパーフォリンを染色し、エピックスＸＬ（ベックマンコールター製）とＥｘｐｏ３２解析ソフト（ベックマンコールター製）を用いて、同じくＰＢＬ中のＮＫ細胞（ＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性）の比率ならびにパーフォリン陽性細胞の比率を解析した。【００６６】
その結果を図２と図３に示した。本発明に係る方法でトータル５，００８個のＰＢＬを解析した結果、ＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性細胞、すなわちＮＫ細胞は９５２個で、その比率は１９．０％であり、またこの９５２個のＮＫ細胞中のパーフォリン陽性細胞数は８９９個で、その比率は９４．４％であった（図２（Ａ））。この結果は、従来法であるフローサイトメーターで同一サンプルを測定した場合の結果、すなわちＮＫ細胞の比率が１９．３％で、同ＮＫ細胞中のパーフォリン陽性比率は９５．２％（図２（Ｂ））と同程度であり、本発明に係る方法が、たとえ複数の細胞が混在していても、従来のフローサイトメーター法と同等の精度で、特定の細胞を識別して計測することが可能であると確認された。【００６７】
さらに従来法であるフローサイトメーター法とは異なり、本発明に係る測定法では、細胞一つ一つの解析データを画像イメージとして保存しているため、ドットプロット分析でのグラフ中の一つ一つのドットが実際に細胞であるか否かを視覚的に確認することが可能であった。具体的には、図３に、ＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性の領域内の任意に選択したドット（Ａ）に対応する画像イメージを、（Ｂ）のディスプレイ上で表示させた一例を示したが、当該ドットに対応する細胞が、実際にパーフォリン顆粒を発現するＣＤ５６陽性のＮＫ細胞であることが確認された。すなわち仮に検体調製時や測定時に何らかの原因で異物等が混入した場合に、従来法ではそのような異物に起因するノイズと細胞を区別することが困難で、結果的に解析時に当該ノイズを排除することできなかったが、本発明に係る測定法では、グラフ上の全ドットの画像データを確認することが可能であり、仮に異物に起因するノイズを発見した場合には、そのノイズを省いて再度データ解析を行うことで、結果的により信頼性の高いデータ解析が可能となった。【００６８】
また当該機器ソフトが有するスポット検出機能を用い、ＮＫ細胞の細胞内パーフォリン陽性顆粒数を測定した。図４に、その解析の一事例を示したが、（Ａ）に示した細胞の原画像内のパーフォリン顆粒が、スポット検出機能によって複数のスポットとして認識され、そのスポットの総数が１７個であると計測された（Ｂ）。この方法を用いて、上記の検体の画像データよりＰＢＬ中のＮＫ細胞を選択し、その細胞内パーフォリン陽性顆粒数を測定した。また同時にパーフォリンの替わりに抗ヒトグランザイムＢ抗体を用いてグランザイムＢ顆粒を染色した検体を調製し、当該細胞の細胞内グランザイムＢ陽性顆粒数を測定した。それらの結果を表１に示したが、ＮＫ細胞一個あたりのパーフォリン顆粒数は平均で１７．２個であり、またグランザイムＢの顆粒数は１６．０個であった。以上の結果から、本発明に係る方法により、従来法と同様にＮＫ細胞の比率を容易に算出でき、且つより信頼度の高いデータ解析が可能となり、加えて当該細胞群の細胞傷害活性機能に直接関与する細胞内のパーフォリンやグランザイムＢ等の顆粒の発現状態をより詳細に解析することが可能となった。【００６９】
【表１】
2009110614.tif 000003
【００７０】
［実施例２］
健常人ＰＢＬによるＫ５６２細胞との混合培養における培養混合物解析
実施例１と同様の方法で、健常人末梢血より約２，０００万個のＰＢＬを得た。そして予め２万個／ウェルのＫ５６２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞株）を播種しておいたＵ底９６穴マイクロプレート（ファルコン３０７７）に、上記のＰＢＬを４０万個／ウェル播種して４時間両細胞を共培養した。培養終了後にマイクロプレートを５０ｘｇで１０分間遠心処理し、直ちに４％パラホルムアルデヒドを加えて３０分間細胞に固定処理を施した。その後、固定した細胞を半分に分け、一方を本発明に係る細胞イメージ解析装置での測定用の検体とし、もう一方を従来法であるフローサイトメトリー解析用の検体とした。【００７１】
細胞イメージ測定・解析用の検体は、平底９６穴マイクロプレート（コーニング３５９６）に播き直し、当該プレートを４５０ｘｇで１０分間遠心処理した後に、上清を除いて６０分間風乾した。その後、Ｒ−ＰＥ標識抗ヒトＣＤ５６抗体（ベックマンコールター製）とＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター製）の２つの抗体、またはＲ−ＰＥ標識抗ヒトＣＤ５６抗体（ベックマンコールター製）単独でＮＫ細胞を標識した。そして後者のＲ−ＰＥ標識抗ヒトＣＤ５６抗体単独でＮＫ細胞を標識した検体は、パーフォリンをマウス抗ヒトパーフォリン・モノクローナル抗体（ＡＮＣＥＬＬ製）とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて染色した。そして両検体とも共存するＫ５６２細胞のアポトーシスの有無を調べるために、ウサギ抗ヒト活性型カスパーゼ３ポリクローナル抗体（ＴＲＥＶＩＧＥＮ製）とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で染色した。その後ＤＡＰＩで細胞核を染色し、染色後に細胞イメージ解析装置（オリンパス製ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ１００）を用い、ＰＢＬ中のＮＫ細胞（ＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性）の比率の解析、ＮＫ細胞中のパーフォリン顆粒の発現、そしてＫ５６２細胞中の活性型カスパーゼ３陽性細胞の比率を計測した。一方、フローサイトメーターでの測定・解析用の検体は、［実施例１］と同様の方法で、ＰＣ−５標識抗ＣＤ３抗体とＲ−ＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体処理を施してＮＫ細胞を識別し、さらにウサギ抗ヒト活性型カスパーゼ３ポリクローナル抗体（ＴＲＥＶＩＧＥＮ製）とＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ベックマンコールター製）を用いて活性型カスパーゼ３を染色した。そして直ちにエピックスＸＬ（ベックマンコールター製）を用いて、ＰＢＬ中のＮＫ細胞（ＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性）の比率と、Ｋ５６２細胞中の活性型カスパーゼ３陽性細胞の比率を計測した。【００７２】
その結果、ＰＢＬ中のＣＤ５６陽性かつＣＤ３陰性のＮＫ細胞の比率は、本発明に係る測定・解析方法で８．７％、またフローサイトメーターでの測定・解析で８．６％とほぼ同程度であった。またＫ５６２細胞中の活性型カスパーゼ３陽性細胞の比率は、本発明に係る測定・解析方法で１６．０％、フローサイトメーターでの測定・解析方法で１６．９％と、同じくほぼ同様の発現率であった。【００７３】
図５に、本発明に係る測定・解析方法において、実際に解析に用いた画像データの一例、すなわち培養４時間後のＰＢＬとＫ５６２との培養混合物の画像の一例を示した。図に見られるように、培養混合物中には小型細胞（リンパ球等）と大型のＫ５６２細胞が混在し、そしてＣＤ５６分子が一部の小型細胞（ＮＫ細胞）の細胞膜に限局して発現している像が認められ、また活性型カスパーゼ３の発現が一部の大型細胞（Ｋ５６２細胞）の細胞質に限局して認められた。すなわち本発明に係る測定・解析方法では、取得した画像データを用いた形態学的な観察も可能であり、当該数値データの妥当性を形態学的に裏付けることが可能であった。【００７４】
［実施例３］
健常人ＰＢＬによるＫ５６２細胞へのアポトーシス誘導、細胞の付着並びに細胞内顆粒動態の解析
さらに図６に、実施例２で実際に解析に用いた他の画像データ例を示したが、実施例３では実施例2の結果を用いてＣＤ５６分子を発現するＮＫ細胞がアポトーシスを起したＫ５６２細胞に付着している像を容易に識別することが可能であった。任意のＫ５６２細胞３００個を選択し、活性型カスパーゼ３の発現とＮＫ細胞の付着を解析した結果、４７個の活性型カスパーゼ３陽性のＫ５６２細胞が確認され、その内１３個の活性型カスパーゼ３陽性Ｋ５６２細胞にＮＫ細胞が付着していることが確認された。また図７に示したように、Ｋ５６２細胞に付着する一部のＮＫ細胞（図７のＮＫ）の細胞内パーフォリン顆粒が、Ｋ５６２細胞との接着面に集積する像も確認され、細胞内に均質に顆粒が分布しているＮＫ細胞（図７内のＮＫ（＊）））と容易に識別することが可能であった。これらの画像データを用い、ＮＫ細胞が付着する任意のＫ５６２細胞５０個を選択し、それらのＫ５６２細胞に付着するＮＫ細胞内のパーフォリン顆粒を観察した結果、当該Ｋ５６２細胞に付着するＮＫ細胞数はトータルで６６個あり、その内パーフォリン顆粒がＫ５６２細胞との接着面に集積しているＮＫ細胞の総数は２５個で、測定したＮＫ細胞全体の３８％であった。【００７５】
［実施例４］
がん患者末梢血中のＭＡＧＥ−３特異的なキラーＴ細胞の検出
外科切除標本の免疫組織染色で腫瘍抗原のＭＡＧＥが陽性であった大腸癌患者（ＨＬＡ−Ａ２４０２）に、ＭＡＧＥ−３ペプチドを用いたペプチド樹状細胞ワクチン療法を行った。すなわち事前にＭＡＧＥ−３ペプチド（ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ）で処理した成熟自己樹状細胞の１千万個〜１億個を、一週間に一度、当該患者の鼠径部リンパ節の近傍の皮内に接種して、生体内でＭＡＧＥ−３特異的なキラーＴ細胞の誘導を行った。５回目の樹状細胞ワクチン接種の２日後に、接種部位にＭＡＧＥ−３に特異的と思われるＤＴＨ様皮膚反応が認められたため、ＭＡＧＥ−３特異的なキラーＴ細胞が誘導がされたと判断し、最後のワクチン接種の１週間後に、当該患者の末梢血を採取し、本発明に係る測定・解析法により、末梢血中のＭＡＧＥ−３特異的なキラーＴ細胞の有無を解析した。比較例として、同末梢血を検体とし、従来法であるＭＨＣテトラマー法およびＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて、同様に末梢血中のＭＡＧＥ−３特異的なキラーＴ細胞を解析した。【００７６】
具体的には、採取した末梢血より、前記と同様の方法でＰＢＭＣを調製し、一部のＰＢＭＣは直ちに凍結保存し、また一部のＰＢＭＣは、磁気マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）によってＣＤ１４陽性細胞もしくはＣＤ８陽性細胞を分取して凍結保存し、その後必要に応じてそれらを解凍して用いた。【００７７】
本発明に係る測定・解析は以下の手順で行った。まず凍結保存しておいたＣＤ１４陽性細胞を解凍し、その後、常法に従ってＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４存在下で５日間培養し、さらにＴＮＦαを加えて２日間培養することで成熟樹状細胞を誘導した。この成熟樹状細胞を１ｍＬあたり１０μｇの合成ＭＡＧＥ−３ペプチド（ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）中で２時間培養したものを抗原提示細胞として用いた。その後、この抗原提示細胞（２万個）と別途解凍しておいたＰＢＭＣ（２０万個）とを最終濃度で１０％のヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に懸濁した後に、Ｕ底の９６穴マイクロプレートに播種し、３７℃で２０時間培養した。その後、最終濃度で２μＭとなるようにモネンシンＡ（Ｓｉｇｍａ製）を加えてさらに４時間、合計で２４時間培養を続けた。培養終了後、５０ｘｇで１０分間遠心処理した後に４％パラホルムアルデヒドで細胞を３０分間固定し、そして固定細胞を洗浄した後に、その細胞をすべて平底の９６穴マイクロプレートに播種した。細胞を播種したマイクロプレートは直ちに４５０ｘｇで１０分間遠心処理し、６０分間風乾して細胞をプレートに固着させた。その後、細胞内ＩＦＮγをマウス抗ヒトＩＦＮγ抗体（ＢＤファーミンジェン製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて染色し、またＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター製）とＲ―ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８抗体（ベックマンコールター製）を用いてキラーＴ細胞を標識し、また細胞核をＤＡＰＩで染色した。染色後に細胞イメージ解析装置（オリンパス製ＣＥＬＡＶＩＥＷ    ＲＳ１００）を用い、ＣＤ３、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞中のＩＦＮγ産生細胞の比率を解析した。【００７８】
一方、ＭＨＣテトラマー法では、解凍したＰＢＭＣを材料とし、ＦＩＴＣ標識ＨＬＡ−Ａ２４０２用のＭＡＧＥ−３ペプチドＭＨＣテトラマー（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ製）ならびにＰＣ−５標識抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター製）とＰＥ−標識抗ヒトＣＤ８抗体（ベックマンコールター製）を用いて常法通りにＰＢＭＣを蛍光標識し、直ちにエピックスＸＬ（ベックマンコールター製）を用いて、当該ＰＢＭＣ中のＭＡＧＥ−３特異的キラーＴ細胞の比率を測定・解析した。ＥＬＩＳＰＯＴ法は、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ＳＥＴ（ＢＤ製）とＡＥＣ  ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ  ＳＥＴ（ＢＤ製）を用い、当該キットに記載された手順に従って抗原刺激によってキラーＴ細胞から産生されたＩＦＮγのスポットを検出し計測した。具体的には、予め分取・保存してあったＣＤ８陽性細胞（１０万個）と、上記と同様の手順で作製したＭＡＧＥ−３標識成熟樹状細胞（１万個）を抗原提示細胞として２４時間共培養したものを検体とし、検出されたＩＦＮγのスポット数を計測した。【００７９】
各々の試験法で計測した末梢血中のＭＡＧＥ−３特異的なキラーＴ細胞の比率を表２にまとめた。いずれの測定法でも、ＭＡＧＥ−３特異的キラーＴ細胞の比率は同程度であり、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）の１％以下と低値であった。しかしデータ解析過程において、当該発明に係る方法では、従来法と比べてより詳細なデータ解析が可能であった。【００８０】
【表２】
2009110614.tif 000004
【００８１】
図８に、従来法であるＭＨＣテトラマー法（Ａ）とＥＬＩＳＰＯＴ法（Ｂ）のデータの一例を示したが、いずれの方法でも細胞とノイズ（非特異的な陽性シグナル）との識別は不可能で、例えばＭＨＣテトラマー法（Ａ）でのドットプロットから、あるいはＥＬＩＳＰＯＴ法（Ｂ）でのスポット画像のいずれからも疑陽性データの有無を確認することはできなかったが、一方、本発明に係る測定法では、画像データの確認からノイズの検出は容易であった。図９に本発明に係る測定法でのデータ解析例を示したが、（Ａ）のヒストグラム上でＩＦＮγ陽性細胞の範囲に１６個の細胞が検出されたが、個々の細胞の画像（Ｂ）を確認すると、１つが細胞ではなくノイズによる擬陽性データと判断された。実際に当該ノイズ部分の周辺の画像（Ｃ）を再確認すると、非特異的蛍光を放つ異物が細胞として誤認識されていることが判明した。従ってトータル３，５２０個のキラーＴ細胞中の１５個（０．４３％）の細胞がＩＦＮγを産生する特異的キラー細胞であると判断された。以上のように、本法では疑陽性データを除くことが可能であり、たとえ測定対象となる細胞頻度が極めて低い場合であっても、従来法と比べてより信頼性の高いデータの解析が可能であると考えられた。
【発明の産業上の利用分野】
【００８２】
本発明は、ＮＫ細胞や抗原特異的キラーＴ細胞の機能の詳細を測定するための新たな細胞機能測定法と当該測定のためのキット並びに測定システムを提供するものである。本発明に係る方法で、また本発明に係るキット並びに測定システムを用いて細胞機能を測定して解析することで、例えば癌免疫細胞療法においては、患者一例一例のエフェクター細胞の機能を詳細にモニタリングすることが可能となる。また従来のＮＫ活性では解析できなかった、被験者の免疫応答の詳細をより簡便に、かつ多面的に測定することも可能となり、結果的として健康増進や疾病予防といった観点からは、より詳細で的確な情報を被験者に提供することが可能となる。また免疫機能を調節する食品や薬物等の有効性を確認する際にも、極めて有用なアッセイツールとなる。
【図１】
2009110614.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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