(57)【要約】  本発明は、β−アラニルアミノ酸（例、カルノシン）またはその誘導体の効率的な製造を実現するための手段を提供する。具体的には、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸（例、ヒスチジン）またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸（例、β−アラニルヒスチジン）またはその誘導体を生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成することを特徴とする、β−アラニルアミノ酸（例、β−アラニルヒスチジン）またはその誘導体の製造方法；β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質、および前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドと、アミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成することを特徴とする、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の製造方法。
【請求項２】
β−アラニルエステルとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルと、アミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成することを特徴とする、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の製造方法である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸とからβ−アラニルアミノ酸を生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドと、アミノ酸とからβ−アラニルアミノ酸を生成することを特徴とする、β−アラニルアミノ酸の製造方法である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成することを特徴とする、β−アラニルヒスチジンの製造方法である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記酵素または酵素含有物が、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記微生物が、ロドトルラ属、トリメラ属、カンジダ属、クリプトコッカス属、エリスロバシディウム属、スフィンゴシニセラ属、およびアスペルギルス属に属する微生物であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記微生物が、下記（Ａ）〜（Ｈ）、（Ｋ）および（Ｌ）からなる群より選ばれるタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
【請求項８】
前記活性が、β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する活性である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記微生物が、下記（ａ）〜（ｈ）、（ｋ）〜（ｎ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された、形質転換微生物であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｋ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｌ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｍ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｎ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項１０】
前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｈ）、（Ｋ）および（Ｌ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
【請求項１１】
ロドトルラ属、トリメラ属、カンジダ属、クリプトコッカス属、およびエリスロバシディウム属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来し、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
【請求項１３】
前記活性が、β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する活性である、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１２に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
下記（ａ）〜（ｆ）、（ｍ）および（ｎ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｍ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｎ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項１６】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１４から１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−アラニルヒスチジン（カルノシン）等のβ−アラニルアミノ酸、またはその誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−アラニルアミノ酸の一つであるβ−アラニルヒスチジン（カルノシン）は、β−アラニンとヒスチジンよりなるジペプチドであり、ヒトを含む哺乳動物の筋肉、脳、心臓中に多く存在する。体内中の役割についてはまだ良く分かっていないが、ｐＨ調節作用、抗炎症作用、組織修復作用、免疫調節作用、抗酸化作用、抗タンパク糖化作用等が報告されている。【０００３】
カルノシンの製造法として、β−アラニンとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジン（すなわち、カルノシン）を生成する反応（βＡｌａ＋Ｈｉｓ→βＡｌａ−Ｈｉｓ）を触媒する酵素を用いる方法が知られている（非特許文献１、非特許文献２および特許文献１参照）。しかし、これらの酵素は、反応にあたりＡＴＰを必要とするものであった。【０００４】
一方、ウナギ筋肉由来イミダゾールジペプチドシンターゼが上記反応によりカルノシンなどのイミダゾールを含むジペプチドを合成することについて報告されている（非特許文献３参照）。この酵素はＡＴＰを必要としないが、カルノシンの合成効率が低かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２８７６２７号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｋａｐｅｒ  ＳＤ，Ｄａｓ  Ｓ，  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＦＤ．Ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｃａｒｎｏｓｉｎｅ−ｃａｒｎｏｓｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９７３  Ｄｅｃ；２１（６）：１４２９−４５．
【非特許文献２】Ｈｏｒｉｎｉｓｈｉ  Ｈ，Ｇｒｉｌｌｏ  Ｍ，Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ＦＬ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｎｏｓｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｕｌｂｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９７８  Ｏｃｔ；３１（４）：９０９−１９．
【非特許文献３】Ｔｓｕｂｏｎｅ  Ｓ，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｎ，  Ｏｋａｄａ  Ｓ，Ａｂｅ  Ｈ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ  Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ．Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００７  Ａｐｒ；１４６（４）：５６０−７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上記の従来技術に鑑み、カルノシン等のβ−アラニルアミノ酸、またはその誘導体の効率的な製造を実現するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意検討を重ね、その過程で、β−アラニンのエステルとヒスチジンとを基質としてカルノシンを生成する反応（βＡｌａＯＭｅ＋Ｈｉｓ→βＡｌａ−Ｈｉｓ）に着目し、係る反応を触媒する酵素保有微生物のスクリーニングを行った。また、こうして特定された酵素保有微生物から酵素タンパク質を精製し、更に遺伝的情報を特定した。さらに、得られた酵素タンパク質が、β−アラニンのエステルとヒスチジンとを基質としてカルノシンを生成する反応を触媒し得るのみならず、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する反応を全般的に触媒し得ることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、下記の〔１〕〜〔１８〕を提供するものである。
〔１〕β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドと、アミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成することを特徴とする、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の製造方法。
〔２〕β−アラニルエステルとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルと、アミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成することを特徴とする、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の製造方法である、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸とからβ−アラニルアミノ酸を生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドと、アミノ酸とからβ−アラニルアミノ酸を生成することを特徴とする、β−アラニルアミノ酸の製造方法である、〔１〕に記載の製造方法。
〔４〕β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成することを特徴とする、β−アラニルヒスチジンの製造方法である、〔１〕に記載の製造方法。
〔５〕前記酵素または酵素含有物が、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、〔１〕に記載の製造方法。
〔６〕前記微生物が、ロドトルラ属、トリメラ属、カンジダ属、クリプトコッカス属、エリスロバシディウム属、スフィンゴシニセラ属、およびアスペルギルス属に属する微生物であることを特徴とする、〔５〕に記載の製造方法。
〔７〕前記微生物が、下記（Ａ）〜（Ｈ）、（Ｋ）および（Ｌ）からなる群より選ばれるタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、〔５〕に記載の製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
〔８〕前記活性が、β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する活性である、〔７〕に記載の製造方法。
〔９〕前記微生物が、下記（ａ）〜（ｈ）、（ｋ）〜（ｎ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された、形質転換微生物であることを特徴とする、〔５〕に記載の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｋ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｌ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｍ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｎ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔１０〕前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｈ）、（Ｋ）および（Ｌ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔１〕に記載の製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
〔１１〕ロドトルラ属、トリメラ属、カンジダ属、クリプトコッカス属、およびエリスロバシディウム属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来し、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質。
〔１２〕下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
〔１３〕前記活性が、β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する活性である、〔１２〕に記載のタンパク質。
〔１４〕〔１２〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１５〕下記（ａ）〜（ｆ）、（ｍ）および（ｎ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｍ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｎ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔１６〕前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である、〔１５〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１７〕〔１４〕から〔１６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチド。
〔１８〕〔１７〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された、ＲｈＤｍｐＡ３（Ｒｈ３）およびそのホモログであるＳｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｉｖｏｒａｎｓ  Ｙ２株由来ＢａｐＡ（Ｙ２）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３株由来ＤｍｐＡ（ＰＨ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株由来ＤｍｐＡ（Ａｓ）のカルノシン生成活性およびカルノシン分解活性（Ｕ／ｍｌ）を示す図である。
【図２】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された、ＲｈＤｍｐＡ３（Ｒｈ３）およびそのホモログであるＳｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｉｖｏｒａｎｓ  Ｙ２株由来ＢａｐＡ（Ｙ２）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株由来ＤｍｐＡ（Ａｓ）のカルノシン生成活性およびカルノシン分解活性の比率（％）を示す図である。
【図３】図３は、種々のβ−アラニンエステルおよびβ−アラニンアミドを基質として用いた場合における、精製されたＲｈＤｍｐＡ酵素のカルノシン生成活性（％）を示す図である。  略号は、以下のとおりである。βＡｌａＯＭｅ：β−アラニンメチルエステルβＡｌａＯＥｔ：β−アラニンエチルエステルβＡｌａＯｔＢｕ：β−アラニン  ｔｅｒｔ−ブチルエステルβＡｌａＯＢｚｌ：β−アラニンベンジルエステルβＡｌａＮＨ２：β−アラニンアミド
【図４】図４は、種々のβ−アラニンエステルおよびβ−アラニンアミドを基質として用いた場合における、精製されたＲｈＤｍｐＡ酵素のカルノシン収率（ｖｓ  Ａｌａ−％）を示す図である。  略号は、図３と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について、
１．β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の製造方法
２．本発明で用いられる微生物
３．本発明で用いられる酵素
の順に説明する。
【００１２】
１．β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の製造方法
本発明のβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を製造する方法は、所定の活性を有する酵素の存在下で、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸（ジペプチド）またはその誘導体を生成する。すなわち、本発明の製造方法は、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成せしめるものである。
【００１３】
β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する酵素または酵素含有物とは、実質的に、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体との縮合反応を触媒する能力または活性を有する酵素または酵素含有物のことをいう。      
【００１４】
β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力としては、例えば、β−アラニルエステルとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力、β−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸とからβ−アラニルアミノ酸を生成する能力、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸の誘導体とからβ−アラニルアミノ酸の誘導体を生成する能力、β−アラニルエステルとアミノ酸とからβ−アラニルアミノ酸を生成する能力が挙げられる。
【００１５】
ここで、酵素反応において基質として用いられるβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドの構造、およびアミノ酸またはその誘導体の構造は、本発明の酵素により反応が触媒され得るものである限り特に限定されない。
【００１６】
具体的には、酵素反応において基質として用いられるβ−アラニルエステルは、式Ｉ：２ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＯＲで表される化合物であり、Ｒは、置換または無置換の炭化水素基を表し得る。
【００１７】
「置換または無置換の炭化水素基」の「炭化水素基」としては、例えば、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等のＣ１−６アルキル基）、シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−６シクロアルキル基）が挙げられる。
【００１８】
「置換の炭化水素基」の「炭化水素基」が有していてもよい「置換基」としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、上記のアルキル基、上記のシクロアルキル基、アリール基（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル）が挙げられる。
【００１９】
酵素反応において基質として用いられるβ−アラニルアミドは、式ＩＩ：２ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２）で表される化合物であり、Ｒ１、Ｒ２は、同一または異なって、水素原子、あるいは置換または無置換の炭化水素基を表し得る。ここで、「置換または無置換の炭化水素基」の「炭化水素基」および「置換基」は、上記したものと同様であり得る。
【００２０】
酵素反応において基質として用いられるアミノ酸は、アミノ基およびカルボキシル基の双方を有する化合物であり、例えば、ヒスチジン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、システイン、メチオニンが挙げられる。アミノ酸としては、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸が挙げられるが、α−アミノ酸、β−アミノ酸が好ましい。アミノ酸はさらに、Ｌ体とＤ体のいずれでもよいが、Ｌ−アミノ酸が好ましい。
【００２１】
酵素反応において基質として用いられる、アミノ酸の誘導体は、アミノ基を保持するように改変された誘導体であり得る。アミノ酸の誘導体は、例えば、上記のアミノ酸の側鎖が改変されている誘導体、または上記のアミノ酸のカルボキシル基が水素原子または上記の「置換基」で置換された誘導体（例、ヒスチジンのカルボキシル基が水素原子で置換された構造を有するヒスタミン）であり得る。上記のアミノ酸の側鎖が改変されている誘導体としては、例えば、上記のアミノ酸の側鎖が上記の「置換基」で置換された化合物、および上記のアミノ酸の側鎖中の任意の原子（例、水素原子）または任意の基が上記の「置換基」で置換された化合物が挙げられる。
【００２２】
一実施形態では、本発明の製造方法は、β−アラニルヒスチジンの製造方法であり得る。本発明のβ−アラニルヒスチジンを製造する方法（以下、「本発明のカルノシン製造方法」ともいう）は、所定のカルノシン生成活性を有する酵素の存在下で、β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する。すなわち、本発明のカルノシン製造方法は、β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、β−アラニルエステルとヒスチジンからβ−アラニルヒスチジンを生成せしめるものである。β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する能力を有する酵素または酵素含有物とは、実質的に、下記の化学式で表されるβ−アラニルエステルとヒスチジンとの縮合反応を触媒する能力または活性を有する酵素または酵素含有物のことをいう。
【化１】
2009139392.tif 000002
（反応式１）中、Ｒは置換または無置換の炭化水素基を表す。「置換または無置換の炭化水素基」の「炭化水素基」および「置換基」は、上記したものと同様であり得る。
【００２３】
酵素または酵素含有物を、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体に作用せしめる方法としては、当該酵素または酵素含有物と、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とを混合する方法が挙げられる。より具体的には、酵素または酵素含有物をβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体を含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いることができる。また、当該酵素含有物として当該酵素を生産する微生物を用いる場合には、当該酵素を生産する微生物を上記のように溶液中に添加して反応させる方法の他、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を生成・蓄積せしめ、培養液中にβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体を添加する方法などを用いてもよい。生成されたβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体は、常法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【００２４】
「酵素含有物」とは、当該酵素を含む混合物である。酵素含有物は、さらに１種類以上のその他の物質を含みうる。具体的には、微生物の培養など、酵素を生産する工程をその中において行った酵素含有混合物、又はそれをさらに必要に応じて後処理に供したものを、酵素含有物として用いることができる。当該その他の物質には、培地を構成する物質に加え、微生物の細胞、及び微生物の細胞の破片を含みうる。当該後処理としては、培養終了後の培養液からの培地の回収又は菌体の回収；菌体の破砕、溶菌及び凍結乾燥；粗精製等によるその他の物質の一部の除去；共有結合法、吸着法、包括法等による酵素又は酵素を含む構造体（例えば細胞）の固定化；及びこれらの組み合わせが挙げられる。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
【００２５】
また、当該酵素を含む微生物としては野生株を用いても良いし、本酵素を発現した遺伝子組換え株を用いてもよい。当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
【００２６】
β−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性のある酵素を生産できる野生株を用いる場合には、遺伝子組み換え株などを作製する手間なしに、より簡便にβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生産を行える点などで好適である。他方、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性のある酵素をより大量生成するように改変された変異株（例えば、前記酵素遺伝子を大量発現可能なように形質転換された遺伝子組み換え株）を用いれば、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の合成も大量により速く行うことが可能となり得る。すなわち、本発明の方法においては、微生物として、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性のある酵素、例えば、後述する本発明のタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物や、前記酵素遺伝子、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを発現可能なように形質転換された微生物も、用いることができる。野生株または変異株の微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、当該酵素を蓄積させて、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体に混合して、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成することができる。
【００２７】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成に関与せずに生成β−アラニルアミノ酸またはその誘導体を分解する酵素が存在することが多い。従って、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加することが可能である。添加量は、例えば０．１ｍＭから３００ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭの範囲で適宜定めることができる。
【００２８】
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよい。この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１〜１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は０．１〜５００ｇ／Ｌ程度である。なお、１Ｕは、５０ｍＭのβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸（例、ヒスチジン）またはその誘導体を含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて、２５℃の温度条件下で反応させた場合に、１分間により１μｍｏｌｅのβ−アラニルアミノ酸（例、β−アラニルヒスチジン）またはその誘導体を生成せしめる酵素量とする。
【００２９】
反応に用いられるアミノ酸またはその誘導体としては、Ｌ体とＤ体のいずれでもよいが、Ｌ−アミノ酸またはその誘導体が好ましい。
【００３０】
出発原料であるβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体の濃度は１ｍＭ〜２Ｍ、好ましくは２０〜６００ｍＭである。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
【００３１】
反応温度は５〜６０℃で、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成が可能であり、好ましくは１０〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ５〜１２で、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成が可能であり、好ましくはｐＨ６〜１１である。生成したβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体は、酵素菌体の除去、樹脂などによる脱塩の後、アルコール（メタノール、エタノールなど）を添加し、晶析せしめることができる。例えば、不純物を含むＬ−カルノシンの粗体の水溶液と、メタノールなどのアルコールとを混合して得られた混合溶液にＬ−カルノシンの種結晶を添加し、３０℃〜８０℃で１〜１０時間熟成させた後に該混合溶液にアルコールを更に加えることによって高純度化されたＬ−カルノシン結晶を析出させることができる（特開２００７−３１３２８）。
【００３２】
２．本発明で用いられる微生物
本発明に使用される微生物としては、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する微生物としては、例えば、ロドトルラ属、トリメラ属、カンジダ属、クリプトコッカス属、エリスロバシディウム属、スフィンゴシニセラ属、ピロコッカス属およびアスペルギルス属のそれぞれに属する微生物を挙げることができる。その具体例としては、ロドトルラ・エスピー、ロドトルラ・ミヌタ、トリメラ・エンセファラ、カンジダ・モギー、クリプトコッカス・フラバス、ロドトルラ・マリナ、ロドトルラ・オーランティアカ、エリスロバシディウム・ハセガウィアナム、スフィンゴシニセラ・ミクロシスチニヴォランス、ピロコッカス・ホリコシイ、アスペルギルス・オリゼ等をあげることができる。中でも好ましい微生物として下記の各菌株を挙げることができる。これらの菌株は、本発明者らが、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を高収率で生産する酵素の生産菌を検索した結果に選出した微生物である。下記の微生物のうち、（１）、（２）、（５）、（１１）、（１５）は、特に高い活性を有する。
【００３３】
（１）ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ）  ＩＦＯ０９３２（Ｙ１２９、ＡＪ５０１９）
（２）ロドトルラ・ミヌタ  ＩＦＯ０８７９（Ｙ１２７、ＡＪ５０１４）
（３）トリメラ・エンセファラ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ  ｅｎｃｅｐｈａｌａ）  ＩＦＯ０９２９３（Ｙ１５２、ＡＪ１４１５６、ＩＦＯ０４１２）
（４）ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ）  ＩＦＯ０３８７（Ｙ−３３−４、Ｙ２３４、ＡＪ４８６２）
（５）カンジダ・モギー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｏｇｉｉ）  ＩＦＯ０４３６（Ｉ．Ｇ．Ｃ．３４４２、Ｙ２４６、ＡＪ５１０４）
（６）クリプトコッカス・フラバス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）  Ｙ−３３−８  ＩＦＯ０７１０（Ｎｏ．４１、ＡＪ４８６４）
（７）ロドトルラ・ミヌタ  Ｋ−３８（Ｎｏ．５０、ＡＪ４８７３）
（８）ロドトルラ・ミヌタ  ＫＮ−３５（Ｎｏ．５１、ＡＪ４８７４、ＣＢＳ５７０６、ＩＦＯ１４３４）
（９）ロドトルラ・ミヌタ  ＫＮ−３６  ＣＢＳ５６９５（Ｎｏ．５２、ＡＪ４８７５、ＩＦＯ１４３５）
（１０）ロドトルラ・ミヌタ  ＡＹ−２４  ＡＪ４９５７（Ｎｏ．５９）
（１１）ロドトルラ・エスピー  ＡＹ−３０  ＡＪ４９５８（Ｎｏ．６０）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２０）
（１２）ロドトルラ・マリナ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）  ＮＰ−２−１０（Ｎｏ．６２、ＡＪ４９６５）
（１３）ロドトルラ・オーランティアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）  ＩＦＯ０７５４（Ｎｏ．６５、ＡＪ５０１１）
（１４）ロドトルラ・オーランティアカ  ６８−２５４  ＡＪ５１１９（Ｎｏ．７４）
（１５）エリスロバシディウム・ハセガウィアナム（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｈａｓｅｇａｗｉａｎｕｍ）  ＩＦＯ１０５８（Ｎｏ．９２、ＡＪ５２２８）
（１６）スフィンゴシニセラ・ミクロシスチニヴォランス（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｉｖｏｒａｎｓ）  Ｙ２（ＪＣＭ１３１８５）
（１７）ピロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）  ＯＴ３（ＪＣＭ９９７４、ＲＤＢ５９９０）；
（１８）アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ４０（ＮＢＲＣ  Ｇ０７−１３８−０１０）
【００３４】
ロドトルラ・エスピー  ＡＹ−３０  ＡＪ４９５８（Ｎｏ．６０）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に２００７年１１月６日付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４２９として寄託され、２００９年４月２４日付で国際寄託への移管が申請された。当該菌株に対しては受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２０が付与される。よって、ＩＰＯＤより分譲を受けることができる。
【００３５】
上記菌株のうち、ＩＦＯ番号が記載されているものは、財団法人発酵研究所（日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）に当初寄託された後、２００３年に独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に移された。よってＮＢＲＣより分譲を受けることができる。
【００３６】
上記菌株のうち、ＣＢＳ番号が記載されているものは、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅs（Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８  ３５８４  ＣＴ  Ｕｔｒｅｃｈｔ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．）から分譲を受けることができる。
【００３７】
上記菌株のうち、ＪＣＭ番号が記載されているものは、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（日本国埼玉県和光市広沢２−１）から分譲を受けることができる。
【００３８】
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
【００３９】
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００４０】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭化水素類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００４１】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸塩、硫酸マグネシウムなどの硫酸塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００４２】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００４３】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００４４】
３．本発明で用いられる酵素
本発明では、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する酵素が用いられる。本発明では、このような活性を有する酵素であれば、その由来、取得方法などの限定なく用いることができる。以下に、本発明の酵素タンパク質、その精製、遺伝子工学的な手法の利用などについて説明する。
【００４５】
（３−１）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する能力を有する微生物から入手することができる。例えば上述の本発明に使用される微生物の例として挙げた属の微生物、すなわちロドトルラ属、トリメラ属、カンジダ属、クリプトコッカス属、エリスロバシディウム属、スフィンゴシニセラ属、ピロコッカス属およびアスペルギルス属からなる群より選ばれる属に属する細菌などを利用できる。より具体的には上述した微生物株（１）〜（１８）を挙げることができる。
【００４６】
本発明のタンパク質を、上述の微生物から単離・精製する方法を説明する。
【００４７】
まず、微生物の菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。このようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、例えば硫安分画、透析、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、本発明のタンパク質を精製することができる。
【００４８】
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ２６／１０，１６／１０、ＨＰ、Ｍｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ５／５（いずれもファルマシア社（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させると当該酵素はｐＨ７．６の条件下で非吸着画分に回収される。
【００４９】
疎水性クロマトグラフィー用担体としては、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  １６／１０（ファルマシア社（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。
【００５０】
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、ＭｏｎｏＳ  ＨＲ（ファルマシア社（ＧＥヘルスケアサイエンス）製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。
【００５１】
ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００ｐｇ  １６／１０（いずれもファルマシア社（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製）が挙げられる。
【００５２】
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する実施例に示される方法等により、各画分のβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体生成活性を測定することにより、確認することができる。上記のようにして精製された本酵素の内部アミノ酸配列を、配列表の配列番号９、１０に示す。
【００５３】
本発明のタンパク質として、Ｎ末端アミノ酸配列として配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、内部アミノ酸配列として配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそのホモログを挙げることができる。より具体的には、下記（Ａ）〜（Ｌ）からなる群より選ばれるタンパク質が挙げられる。
【００５４】
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質
【００５５】
配列番号３、５、７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ロドトルラ・ミヌタ  ＩＦＯ０９３２（Ｙ１２９、ＡＪ５０１９）から、本発明者らが新規に単離し、そのアミノ酸配列を特定したものである。これらの配列番号３、５、７に記載のタンパク質は、いずれも、配列番号７に記載のアミノ酸配列をその一部に有するものである点で共通している。
【００５６】
本発明のタンパク質には、配列表の配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質も含まれる。具体的には、上記（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｊ）、（Ｌ）を挙げることができる。
【００５７】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、１若しくは数個のアミノ酸の変異を有する配列は、変異を有さない配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上のホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）またはアイデンティティー（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するものとすることができる。ただし、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｊ）、（Ｌ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、変異を含まない状態でのタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、β−アラニルエステルとヒスチジンとからβ−アラニルヒスチジンを生成する活性を有するタンパク質の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
尚、ここでいうホモロジーまたはアイデンティティーは、全長のアミノ酸残基数を分母として、比較する二つの配列のうち対応するアミノ酸残基が同一のものの数を分子として算出し、これに１００を乗じて得られる。また、ホモロジーまたはアイデンティティーの解析は、「Ｇｅｎｅｔｙｘ」（株式会社ゼネティックス）を用い、パラメーターを初期設定値として算出しても得られる。
【００５８】
上記（Ｂ）などに示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、上記（Ａ）などに示すアミノ酸配列中の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されるように改変されたアミノ酸配列をあらかじめ設計し、このアミノ酸配列に対応する塩基配列を発現させることによって得られる。
【００５９】
また、上記のような塩基の置換、欠失、および／または挿入等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列表の配列番号３、５、７、２１、２３、２５に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質が得られる。
【００６０】
アミノ酸の置換はまた、保存的置換であってもよい。アミノ酸の「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、及び硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、及びグリシンとアラニンとの間での置換であり得る。
【００６１】
（３−２）本発明のポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、形質転換体の作製および酵素の精製
（３−２−１）本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明は、上述したタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドは、上述したタンパク質を構成するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであるが、コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。具体的には、上述の（Ａ）〜（Ｌ）からなる群より選ばれるタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドの好ましい具体例としては、下記（ａ）〜（ｎ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００６３】
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号５５〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号９１〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｋ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｌ）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｍ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｎ）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−アラニルエステルまたはβ−アラニルアミドとアミノ酸またはその誘導体とからβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００６４】
配列表の配列番号１および配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ロドトルラ・ミヌタ  ＩＦＯ０９３２（Ｙ１２９、ＡＪ５０１９）より単離されたものである。なお、配列番号１の塩基配列のうちオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、３種類あり、それぞれ配列番号２、配列番号４、および配列番号６に示すとおりである（すなわち、配列番号１記載の塩基配列と、配列番号２、配列番号４、および配列番号６に示す塩基配列は同一であり、配列番号２、配列番号４、および配列番号６はそれぞれ異なるＯＲＦを示すために示したものである。）。３種類のＯＲＦとは、配列番号１の塩基番号４０〜１２３９の塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２参照）、塩基番号５５〜１２３９の塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号４参照）、塩基番号９１〜１２３９の塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号６参照）である。ＯＲＦによりコードされるタンパク質は、高いカルノシン生成活性を示すと推定される。尚、配列番号１の塩基配列と、配列番号２、４、６の各塩基配列は共通である。他方、配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドをエキソン領域として含み、かつイントロン領域をも含むゲノムＤＮＡである。このようなゲノムＤＮＡは、スプライシング能を有する所定の宿主細胞（例、酵母）中に導入されることにより、上記３種類のＯＲＦによりコードされるタンパク質を発現し得、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体を生成する活性を示し得る。
【００６５】
なお、以下に挙げる種々の遺伝子組換え技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの記載に準じて行うことができる。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、ロドトルラ・ミヌタなどのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、もしくはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）参照）又はハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、上記（３）の欄で説明したようにして精製された酵素に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、本発明により酵素遺伝子（配列番号１）の塩基配列が明らかになったので、これらの塩基配列に基づいてプライマーやハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、プローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、５'非翻訳領域及び３'非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本酵素のコード領域全長を増幅することができる。具体的には、５'側プライマーとしては配列番号１において塩基番号４０よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマー、塩基番号５５よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマー、塩基番号９１よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが挙げられる。また、３'側プライマーとしては塩基番号１２３９よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。
【００６７】
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機  ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００６８】
本発明の製造方法で用いることができる酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号１に記載のポリヌクレオチドのうちのＯＲＦもしくは配列番号３２に記載のポリヌクレオチド、または配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４のいずれかのポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１に記載のＯＲＦもしくは配列番号３２に記載のポリヌクレオチド、または配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カルノシン生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによっても、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドが得られる。
【００６９】
プローブは、例えば配列番号１、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号３２のいずれかに記載の塩基配列に基づいて常法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするポリヌクレオチドに応じて調節することができる。
【００７０】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、中でも好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。ストリンジェントな条件の別の例は、６×ＳＳＣ中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄である。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００７１】
ただし、上記のようにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドの場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、元となる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、上記（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号４０〜１２３９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００７２】
このような改変されたポリヌクレオチドは、従来知られている突然変異処理によって取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするポリヌクレオチド、例えば（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）のいずれかのポリヌクレオチドを、ヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および本酵素をコードするポリヌクレオチドを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００７３】
尚、配列表の配列番号１中のＯＲＦは後述するように３種類あり（配列番号２，４，６参照）、それぞれのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号３，５，７に示される。
【００７４】
（３−２−２）組換えポリヌクレオチド（発現ベクター）および形質転換体の作製、ならびに酵素の生成
上記（３−２−１）で説明したポリヌクレオチドを適当な宿主に導入し組換えポリヌクレオチドとし、得られる形質転換細胞（形質転換体）に該ポリヌクレオチドにより特定されるタンパク質を発現させることによっても、本発明で用いることができる酵素（以下、必要に応じて「β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素」あるいは「カルノシン生成酵素」と称する）を生成することができる。
【００７５】
ポリヌクレオチドにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、及びバチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア  スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。
【００７６】
ポリヌクレオチドを宿主に導入するのに用いる組換えポリヌクレオチドは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、導入しようとするポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモータとしては、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には該プロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを本発明のポリヌクレオチドに連結し、該プロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
【００７７】
組換えポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８，３２６（１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してポリヌクレオチドの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。
【００７８】
タンパク質を組換えポリヌクレオチド技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換細胞内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００７９】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００８０】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００８１】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００８２】
以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いてβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素を製造する方法を例として、より具体的に説明する。
【００８３】
β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージポリヌクレオチドのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ポリヌクレオチド配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
【００８４】
β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、γインターフェロン遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００８５】
これらの遺伝子とβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ポリヌクレオチドを利用すればよい。
【００８６】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい場合がある。このターミネーターとしては、ｒｒｎＢターミネーター、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
【００８７】
β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素またはβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、および／または挿入などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００８８】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００８９】
プロモータ、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素またはβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネーターの順に連結したポリヌクレオチド断片と、ベクターポリヌクレオチドとを連結して組換えポリヌクレオチドを得る。
【００９０】
該組換えポリヌクレオチドを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素またはβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
【００９１】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
【００９２】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００９３】
β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素またはβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００９４】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００９５】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００９６】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００９７】
以上、形質転換された大腸菌を例に挙げて、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素を製造する方法を説明したが、形質転換された酵母を用いる、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素の製造もまた、好ましい。酵母は培養が容易で、また、伝統的に食品製造に利用されているので安全である。形質転換された酵母を用いる場合、公知のプロモーターを利用できる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、Ｍα１、ＥＮＯ、ＴＰＩ、ＡＯＸ１が挙げられる。また、ＴＰＩターミネーター等の適切なターミネーターも利用できる。
【００９８】
具体的には、酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれもが利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしてはＹＥｐ２４、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０、ＹＩｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５等の発現ベクターが公知であり、本発明においても、酵母の形質転換に利用可能である。
【００９９】
例えば、プロモーター、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素またはβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネーターの順に連結したポリヌクレオチド断片と、ベクターポリヌクレオチドとを連結して組換えポリヌクレオチドが得られる。
【０１００】
該組換えポリヌクレオチドを用いて酵母を形質転換し、この酵母を培養すると、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素またはβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の酵母を使用することができる。酵母の培養は、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地、ＹＰＡＤ培地、ＳＣ培地等の公知の培地で行うことができる。形質転換を行う方法、形質転換体を選別する方法および得られた形質転換体を培養する方法の詳細は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素またはβ−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質の回収は、大腸菌について上述した方法と同様に行うことができる。
【実施例】
【０１０１】
以下、本発明を具体的に実施例にて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。なお実施例におけるカルノシンの定量は高速液体クロマトグラフィーにより行った。
１．（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）、カラム温度：４０℃、溶出液：０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4−Ｈ3ＰＯ4（ｐＨ２．１）／ＣＨ３ＣＮ＝１０／２、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ）により行った。
カルノシン以外のβＡｌａ−Ｘ定量も、高速液体クロマトグラフィーにより行った。
２．カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）、カラム温度：４０℃、溶出液：０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ２．１）／ＣＨ３ＯＨ＝２／１、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ【０１０２】
実施例１  カルノシン生成活性菌の菌体反応によるβＡｌａＯＭｅとＬ−Ｈｉｓからのカルノシン生成
グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、マルツエキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌを含む平板培地にＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０９３２、Ｔｒｅｍｅｌｌａ  ｅｎｃｅｐｈａｌａ  ＩＦＯ９２９３、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０３８７、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｏｇｉｉ  ＩＦＯ０４３６、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  Ｙ−３３−８  ＩＦＯ０７１０、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  Ｋ−３８  ＡＪ４８７３、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＫＮ−３５  ＣＢＳ５７０６、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＫＮ−３６  ＣＢＳ５６９５、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＡＹ−２４  ＡＪ４９５７、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．  ＡＹ−３０  ＡＪ４９５８（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４２９）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍａｒｉｎａ  ＮＰ−２−１０  ＡＪ４９６５、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  ＩＦＯ０７５４、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  ６８−２５４  ＡＪ５１１９、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｈａｓｅｇａｗｉａｎｕｍ  ＩＦＯ１０５８を塗布し、２５℃で２日間培養した。【０１０３】
得られた菌体をグルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ３ｇ／Ｌ、マルツエキス  ３ｇ／Ｌ、ペプトン  ５ｇ／Ｌを含む液体培地５０ｍＬにそれぞれ一白金耳接種し、５００ｍＬ容坂口フラスコで２５℃にて２４時間振とう培養した。培養後、培養物より菌体を遠心分離により集め、それぞれ２５ｍｌの生理食塩水にて洗浄、懸濁し、菌体懸濁液を調製した。【０１０４】
これら菌体懸濁液１００μＬと、基質液β−ＡｌａＯＭｅ  ２００ｍＭ，Ｌ−Ｈｉｓ  ２００ｍＭ，ＥＤＴＡ  ２０ｍＭ、ホウ酸緩衝溶液〔ｐＨ  ９．０〕  ２００ｍＭ  １００μＬとを混合し、２５℃で１５時間反応させた。反応終了後、カルノシンの生成量を測定した（表１）。【０１０５】
【表１】
2009139392.tif 000003
【０１０６】
その結果、各菌株において２．４５〜１９．３ｍＭのカルノシンが蓄積していた。このうち、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０９３２、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｏｇｉｉ  ＩＦＯ０４３６、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＡＹ−３０  ＡＪ４９５８、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｈａｓｅｇａｗｉａｎｕｍ  ＩＦＯ１０５８の５菌株は、１３．５ｍＭ以上の高いカルノシン生成活性を示していた。【０１０７】
実施例２  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株由来カルノシン生成酵素の精製
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株の可溶性画分からカルノシン生成酵素の精製を以下の通り行った。酵素活性は、β−ＡｌａＯＭｅとＬ−Ｈｉｓを基質としカルノシン生成活性を以下の条件で測定して評価した。【０１０８】
反応条件：１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ  ９．０）、５０ｍＭ  β−ＡｌａＯＭｅ、１００ｍＭ  Ｌ−Ｈｉｓ、１０μｌ酵素／１００μｌ反応液、２５℃で反応、１５分後のカルノシン生成量を測定。【０１０９】
（１）可溶性画分の調製
実施例１と同様の方法でＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株を培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）で洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に懸濁し、４℃で６０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、３０分間）により菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。【０１１０】
（２）硫安分画
上記の可溶性画分溶液に対して硫酸アンモニウムを３０％飽和になるよう加えた。これを遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、３０分間）し、上清を回収した。次に、得られた上清に対して硫酸アンモニウムを７０％になるよう加えた。これを遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、３０分間）し、沈殿を回収した。得られた沈殿を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に懸濁し、４℃で一晩５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）にて透析を行った。【０１１１】
（３）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ
上記の透析後溶液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ２６／１０（ファルマシア社（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製、ＣＶ＝５３ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０Ｍから０．５Ｍまで直線的に変化させて、８ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてカルノシン生成活性を検出したところ、約０．３Ｍ  ＮａＣｌ相当の画分にカルノシン活性のピークを検出した。【０１１２】
（４）疎水性クロマトグラフィー：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  １６／１０
カルノシン生成活性が検出された溶液を１．０Ｍ  硫酸アンモニウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に対して４℃で一晩透析した。得られた溶液を１．０Ｍ  硫酸アンモニウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  １６／１０（ファルマシア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供した。この操作によりカルノシン生成酵素は担体に吸着した。【０１１３】
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質を１．０Ｍ  硫酸アンモニウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１．０Ｍから０Ｍまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速でカルノシン生成酵素を溶出させた。得られた各溶出画分についてカルノシン生成活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ０．６〜０．７Ｍの溶出位置にカルノシン生成活性が認められた。【０１１４】
（５）ゲル濾過クロマトグラフィー：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ｐｇ  １６／６０
カルノシン生成酵素を含む画分をそれぞれ集めて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に対して透析した。得られた溶液を、限外ろ過膜ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．６）で平衡化されたゲルろ過Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００ｐｇ  １６／６０（ファルマシア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）社製、ＣＶ＝１２０ｍｌ）に供し、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。この操作により分子量約２３０ｋＤａと見積もられる位置でカルノシン生成活性が確認された。【０１１５】
（６）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５
得られた画分を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．６）で平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム  Ｍｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ  ５／５（ファルマシア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）社製、ＣＶ＝１ｍｌ）に供した。この操作により、カルノシン生成酵素は担体に吸着した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．６）により非吸着タンパク質を洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を直線的に０Ｍから０．５Ｍへ変化させて、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速でカルノシン生成酵素を溶出させた。各溶出画分についてカルノシン生成活性を測定し、ＮａＣｌ濃度が約０．３Ｍの溶出位置にカルノシン生成活性が認められた。【０１１６】
得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、活性画分には主に３０、１２ｋＤａの２本のバンドが認められ、どちらも活性プロフィールとＳＤＳ−ＰＡＧＥバンド強度のプロフィールが一致した。これら２本のバンドをカルノシン生成酵素の候補としてＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、アミノ酸配列解析に供した。【０１１７】
各精製段階における活性、収量、精製度などを、表２にまとめた。【０１１８】
【表２】
2009139392.tif 000004
【０１１９】
実施例３  カルノシン生成酵素のＮ末端および内部アミノ酸配列の決定
精製したカルノシン生成酵素画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、１２ｋＤａに相当するバンドを切り出し、２７残基分のＮ末端アミノ酸配列を下記表３の通り決定した（配列番号８）。また、３０ｋＤａに相当するバンドを切り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の試料をトリプシン処理し（ｐＨ８．０、３５℃、２０時間）、逆相ＨＰＬＣに供して断片ペプチドを分離した。分取したフラクションについて１２残基分のアミノ酸配列を下記表３の通り決定した（配列番号９）。３０ｋＤａ内部アミノ酸配列からは、有意な相同性を示すタンパク質の存在が認められなかったが、１２ｋＤａＮ末端アミノ酸配列は、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ由来ＤｍｐＡβサブユニットのＮ末端配列と７０％、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＣＩ３４３４由来ＢａｐＡβサブユニットのＮ末端配列と６７％の相同性を示した。【０１２０】
【表３】
2009139392.tif 000005
【０１２１】
実施例４  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株由来カルノシン生成酵素遺伝子のクローニング
（１）ｃＤＮＡの調製
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株をグルコース  １０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ３ｇ／Ｌ、マルツエキス  ３ｇ／Ｌ、ペプトン  ５ｇ／Ｌ、寒天  １５ｇ／Ｌを含む平板培地上に塗布し、２５℃で２日間培養した。得られた菌体をグルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ３ｇ／Ｌ、マルツエキス  ３ｇ／Ｌ、ペプトン  ５ｇ／Ｌを含む液体培地５０ｍＬに一白菌耳分に接種し、５００ｍＬ容坂口フラスコで２５℃にて２４時間振とう培養した。培養後、培養物より菌体を遠心分離により集めた。この菌体からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社)を用いて調製した。次に、得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて調製した。【０１２２】
（２）３’−ＲＡＣＥ法による、カルノシン生成酵素  βサブユニットの配列取得
決定したカルノシン生成酵素１２ｋＤａ  Ｎ末端アミノ酸配列をもとに、表４記載のミックスプライマーを合成した。【０１２３】
【表４】
2009139392.tif 000006
【０１２４】
作成したミックスプライマー、ＲｈＤｍｐＡ１２−ｆ（配列番号１０）とＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。得られたＤＮＡ断片を鋳型にして、同様にしてミックスプライマー、ＲｈＤｍｐＡ１２−ｆ２（配列番号１１）を用いたＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによる増幅を行った。得られたＤＮＡ断片をｐＴＡ２（ＴＡＫＡＲＡ社）にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ由来ＤｍｐＡβサブユニットのアミノ酸配列と４４％、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＣＩ３４３４由来ＢａｐＡβサブユニットのアミノ酸配列と４１％の相同性を示したことから、目的のカルノシン生成酵素の、βサブユニットの配列を取得したと考えられた。【０１２５】
（３）５’−ＲＡＣＥ法による、カルノシン生成酵素  αサブユニットのアミノ酸配列取得
３’−ＲＡＣＥ法によって決定された、カルノシン生成酵素βサブユニットの塩基配列を元に、表５記載の５’−ＲＡＣＥ用プライマーを合成した。【０１２６】
【表５】
2009139392.tif 000007
【０１２７】
作成したプライマー、ＲｈＤｍｐＡ１２−ｒ（配列番号１２）とＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。得られたＤＮＡ断片を鋳型にして、同様にしてプライマー、ＲｈＤｍｐＡ１２−ｒ２（配列番号１３）を用いたＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによる増幅を行った。得られたＤＮＡ断片をｐＴＡ２（ＴＡＫＡＲＡ社）にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ由来ＤｍｐＡ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＣＩ３４３４由来ＢａｐＡのαサブユニットと相同性を示した。しかし、翻訳開始点と考えられる配列が得られなかった為、得られた塩基配列を元に、表６記載の５’−ＲＡＣＥ用プライマーを合成した。【０１２８】
【表６】
2009139392.tif 000008
【０１２９】
作成したプライマー、ＲｈＤｍｐＡ３０−ｒ（配列番号１４）とＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。得られたＤＮＡ断片を鋳型にして、同様にしてプライマー、ＲｈＤｍｐＡ３０−ｒ２（配列番号１５）を用いたＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによる増幅を行った。得られたＤＮＡ断片をｐＴＡ２（ＴＡＫＡＲＡ社）にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ由来ＤｍｐＡαサブユニットのアミノ酸配列と４１％、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＣＩ３４３４由来ＢａｐＡαサブユニットのアミノ酸配列と３６％の相同性を示し、翻訳開始点と考えられる配列まで得られた。また、３０ｋＤａ内部アミノ酸配列と一致する配列が含まれることから、目的のカルノシン生成酵素の、αサブユニットの配列を取得したと考えられた。【０１３０】
（４）ＰＣＲによる、カルノシン生成酵素遺伝子の全長取得
５’−ＲＡＣＥ，３’−ＲＡＣＥによって取得した配列より、カルノシン生成酵素遺伝子の全長を増幅する、表７記載のプライマーを合成した。【０１３１】
【表７】
2009139392.tif 000009
【０１３２】
作成したプライマー、ＲｈＤｍｐＡ−Ｎｄｅｆ１（配列番号１６）とＲｈＤｍｐＡ−Ｈｉｎｄｒ（配列番号１７）を用いて、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。得られたＤＮＡ断片をｐＴＡ２（ＴＡＫＡＲＡ社）にクローニングし、塩基配列を決定したところ、配列番号１に記載の塩基配列を有することが確認された。決定したＮ末端、内部アミノ酸配列に対応する塩基配列を含む１２００ｂｐのＯＲＦが確認され、目的とするカルノシン生成酵素（ＲｈＤｍｐＡ）の全長を取得した。カルノシン生成酵素（ＲｈＤｍｐＡ）はＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ由来ＤｍｐＡ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＣＩ３４３４由来ＢａｐＡと同様に、ひとつのポリペプチドとして翻訳された後、αサブユニットとβサブユニットへ切断されると考えられる。決定したN末端配列から、αサブユニットは配列番号３記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニンから２７４番目のグリシンまでのアミノ酸配列からなり、βサブユニットは配列番号３記載のアミノ酸配列のうち２７５番目のセリンから４００番目のチロシンまでのアミノ酸配列からなると考えられる。Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ由来ＤｍｐＡ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＣＩ３４３４由来ＢａｐＡはともに、グリシンとセリンとの間でポリペプチドがαサブユニットとβサブユニットへと切断されると報告されており、本酵素もこれと一致している。
なお、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドをエキソン領域として含み、かつイントロン領域をも含むゲノムＤＮＡも単離した。単離されたゲノムＤＮＡの塩基配列を解析したところ、配列番号３２に記載の塩基配列を有することが明らかとなった。【０１３３】
実施例５  Ｅ．ｃｏｌｉでのカルノシン生成酵素の発現
（１）ベクターｐＳＦＮを用いた、カルノシン生成酵素発現プラスミドの構築
ｐＴＡ２（ＴＡＫＡＲＡ社）にカルノシン生成酵素遺伝子を連結したプラスミドを、ＮｄｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、カルノシン生成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これと同様にＮｄｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２００６／０７５４８６記載のベクターｐＳＦＮ（同公報実施例のｐＳＦＮ  Ｓｍ＿Ａｅｔ（特に、実施例１、６、１２参照のこと。））とをライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡと命名した。このプラスミドは配列番号１に記載の塩基配列のうち４０番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして１２３９番目まで翻訳することにより得られる、配列番号３記載のアミノ酸配列からなるカルノシン生成酵素を発現する。この時、カルノシン生成酵素のαサブユニットは配列番号３記載のアミノ酸配列のうち、１番目から２７４番目までのアミノ酸配列からなり、βサブユニットは配列番号３記載のアミノ酸配列のうち、２７５番目から４００番目までのアミノ酸配列からなると考えられる。【０１３４】
（２）ｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉでのカルノシン生成酵素発現
構築した発現プラスミドｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍｌに１白金耳接種し、３３℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌを集菌、洗浄し、１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に懸濁した。該菌体懸濁液を用いてカルノシン生成活性を測定した。カルノシン生成活性は、β−ＡｌａＯＭｅ、Ｌ−Ｈｉｓを基質とし以下の条件で測定した。【０１３５】
反応条件：１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ  ９．０）、５０ｍＭ  β−ＡｌａＯＭｅ、１００ｍＭ  Ｌ−ｈｉｓ、２０μｌ菌体懸濁液／２００μｌ反応液、２５℃で１５分間反応を行い、ＨＰＬＣでカルノシンの生成量を測定【０１３６】
測定した結果、ｐＵＣ１８を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）においてカルノシン生成活性は検出されなかったのに対して、ｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ導入株においては２．１５Ｕ／ｍｌのカルノシン生成活性が検出された。これにより、ＲｈＤｍｐＡ高発現プラスミドの構築と併せて、確かに目的とするカルノシン生成酵素をクローニングしたことも確認できた。【０１３７】
（３）他の翻訳開始点からのカルノシン生成酵素発現
配列番号１に記載の塩基配列のうち５５番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして１２３９番目までをコードするＯＲＦ（配列番号４参照）と、配列番号１に記載の塩基配列のうち９１番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして１２３９番目までをコードするＯＲＦ（配列番号６参照）をそれぞれ増幅する表８記載のプライマーを合成した。【０１３８】
【表８】
2009139392.tif 000010
【０１３９】
作成したプライマー、ＲｈＤｍｐＡ−Ｎｄｅｆ２（配列番号１８）とＲｈＤｍｐＡ−Ｈｉｎｄｒを用いて、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ  ＩＦＯ０８７９株ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。得られたＤＮＡ断片をｐＴＡ２（ＴＡＫＡＲＡ社）にクローニングし、塩基配列を決定したところ、目的の塩基配列を有することが確認された。得られたプラスミドをＮｄｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＮｄｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳＦＮベクターとライゲーションした。このライゲーション溶液でE．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ２と命名した。このプラスミドは配列番号１に記載の塩基配列のうち５５番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして１２３９番目まで翻訳することにより得られる、配列番号５記載のアミノ酸配列からなるカルノシン生成酵素を発現する。この時、カルノシン生成酵素のαサブユニットは配列番号５記載のアミノ酸配列のうち、１番目から２６９番目までのアミノ酸配列からなり、βサブユニットは配列番号５記載のアミノ酸配列のうち、２７０番目から３９５番目までのアミノ酸配列からなると考えられる。構築した発現プラスミドｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ２をE．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍｌに１白金耳接種し、３３℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌを集菌、洗浄し、１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．６）に懸濁した。該菌体懸濁液を用いてカルノシン生成活性を測定したところ、２．０９Ｕ／ｍｌのカルノシン生成活性を示した。【０１４０】
同様にして、ＲｈＤｍｐＡ−Ｎｄｅｆ３（配列番号１９）とＲｈＤｍｐＡ−Ｈｉｎｄｒを用いてＰＣＲによる増幅を行い、ｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ３を構築した。このプラスミドは配列番号１に記載の塩基配列のうち９１番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして１２３９番目まで翻訳することにより得られる、配列番号７記載のアミノ酸配列からなるカルノシン生成酵素子を発現する。この時、カルノシン生成酵素のαサブユニットは配列番号７記載のアミノ酸配列のうち、１番目から２５７番目までのアミノ酸配列からなり、βサブユニットは配列番号７記載のアミノ酸配列のうち、２５８番目から３８３番目までのアミノ酸配列からなると考えられる。構築した発現プラスミドｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ３をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍｌに１白金耳接種し、３３℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌを集菌、洗浄し、１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．６）に懸濁した。該菌体懸濁液を用いてカルノシン生成活性を測定したところ、２．５８Ｕ／ｍｌのカルノシン生成活性を示した。【０１４１】
実施例６  Ｅ．ｃｏｌｉでのＲｈＤｍｐＡホモログの発現
（１）ベクターｐＳＦＮを用いた、ＲｈＤｍｐＡホモログ発現プラスミドの構築
ＲｈＤｍｐＡ３（以下、必要に応じてＲｈ３と略す）のアミノ酸相同性検索を行った。比較的相同性の高い以下（ａ）〜（ｃ）の三種のホモログの発現を試みた：
（ａ）Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｉｖｏｒａｎｓ  Ｙ２株由来ＢａｐＡ（ＲｈＤｍｐＡと４０％のアミノ酸配列相同性；以下、必要に応じてＹ２と略す）；
（ｂ）Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３株由来ＤｍｐＡ（ＲｈＤｍｐＡと３５％のアミノ酸配列相同性；以下、必要に応じてＰＨと略す）；
（ｃ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株由来ＤｍｐＡ（ＲｈＤｍｐＡと４９％のアミノ酸配列相同性；以下、必要に応じてＡｓと略す）。【０１４２】
Ｙ２は、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｉｖｏｒａｎｓ  Ｙ２（ＪＣＭ  １３１８５）を理研バイオリソースセンターより取り寄せ、培養後にゲノムＤＮＡを抽出し鋳型として用いた。以下の表９に記載されるプライマーＹ２−ＮｄｅＩ−ｆ（配列番号２６）およびＹ２−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｒ（配列番号２７）を用いたＰＣＲにより、推定β−ペプチジルアミンペプチダーゼ遺伝子（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ番号：ＥＦ０４３２８３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＥＦ０４３２８３）を含むＤＮＡを増幅した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＲｈＤｍｐＡホモログ酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２００６／０７５４８６記載のベクターｐＳＦＮとをライゲーションした。このライゲーション溶液中でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＳＦＮ−Ｙ２−ＢａｐＡとした。【０１４３】
ＰＨは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３（ＪＣＭ９９７４、ＲＤＢ５９９０）由来のゲノムＤＮＡを理研バイオリソースセンターより取り寄せ、鋳型として用いた。以下の表９に記載されるプライマーＰＨ−ＮｄｅＩ−ｆ（配列番号２８）およびＰＨ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲにより、Ｄ−アミノペプチダーゼ遺伝子（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ番号：ＰＨ００７８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１４２０９６およびＢＡ０００００１）を含むＤＮＡ配列を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＲｈＤｍｐＡホモログ酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２００６／０７５４８６記載のベクターｐＳＦＮとをライゲーションした。このライゲーション溶液中でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＳＦＮ−ＰＨ−ＤｍｐＡとした。【０１４４】
Ａｓは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０ゲノムＤＮＡのＢＡＣクローンＢ０４３Ｇ０２（ＮＢＲＣ  Ｇ０７−１３８−０１０）をＮＢＲＣより取り寄せ、鋳型として用いた。以下の表９に記載されるプライマーＡｓ−ＮｄｅＩ−ｆ（配列番号３０）およびＡｓ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号３１）を用いたＰＣＲにより、Ｌ−アミノペプチダーゼ／Ｄ−エステラーゼ遺伝子（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ番号：ＡＯ０９０１３８００００７５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＭ＿００１８２５５３４）を含むＤＮＡ配列を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＲｈＤｍｐＡホモログ酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２００６／０７５４８６記載のベクターｐＳＦＮとをライゲーションした。このライゲーション溶液中でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＳＦＮ−Ａｓ−ＤｍｐＡとした。【０１４５】
【表９】
2009139392.tif 000011
【０１４６】
（２）ＲｈＤｍｐＡホモログのＥ．ｃｏｌｉでの酵素発現
構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍｌに１白金耳接種し、３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌを集菌、洗浄し、１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に懸濁した。該菌体懸濁液を用いてカルノシン生成活性、及びカルノシン分解活性を測定した。【０１４７】
カルノシン生成活性の測定は、β−ＡｌａＯＭｅ、Ｌ−Ｈｉｓを基質として、以下の条件により行った。
反応条件：１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ  β−ＡｌａＯＭｅ、１００ｍＭ  Ｌ−Ｈｉｓ、２０μｌ菌体懸濁液／２００μｌ反応液、２５℃で１５分間反応を行い、ＨＰＬＣでカルノシンの生成量を測定。【０１４８】
カルノシン分解活性の測定は、カルノシンを基質として以下の条件により行った。
反応条件：１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ  カルノシン、２０μｌ菌体懸濁液／２００μｌ反応液、２５℃で１５分間反応を行い、ＨＰＬＣでヒスチジンの生成量を測定。【０１４９】
測定した結果、ｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ導入株においては１．４Ｕ／ｍｌのカルノシン生成活性が検出された（図１）。ｐＳＦＮ−Ｙ２−ＢａｐＡ、ｐＳＦＮ−Ａｓ−ＤｍｐＡ導入株においても、約０．４Ｕ／ｍｌの活性が検出された。一方、カルノシン分解活性は、ｐＳＦＮ−Ｙ２−ＢａｐＡ導入株で強く（約０．４Ｕ／ｍｌ）、ｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ、ｐＳＦＮ−Ａｓ−ＤｍｐＡ導入株においては微弱であった（０．１Ｕ／ｍｌ以下）。また、ｐＳＦＮ−ＰＨ−ＤｍｐＡ導入株では、いずれの活性も検出限界以下であった。【０１５０】
（３）ＲｈＤｍｐＡホモログのカルノシン収率、ならびにカルノシン生成および分解の測定
（２）にて遺伝子発現が確認できたホモログｐＳＦＮ−Ｙ２−ＢａｐＡ、ｐＳＦＮ−ＡＳ−ＤｍｐＡ導入株と、ｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ３株について、カルノシン収率を測定した。その結果、ｐＳＦＮ−Ｙ２−ＢａｐＡにおいて２４％、ｐＳＦＮ−ＡＳ−ＤｍｐＡにおいて３１％の収率であったのに対し、ｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ３導入株においては６７％の収率でカルノシンが得られ、効率的にカルノシンを生成できることが明らかとなった（表１０）。また、カルノシン生成および分解の測定結果より、カルノシン生成の比活性だけでなく、生成活性と分解活性の比率が重要と考えられた（図２）。【０１５１】
【表１０】
2009139392.tif 000012
【０１５２】
実施例７  メチルエステル以外の基質を用いたカルノシン生成反応
ｐＳＦＮ−ＲｈＤｍｐＡ３株よりＲｈＤｍｐＡ酵素を精製した。その精製酵素を用いて、βＡｌａ−エステルまたはβＡｌａアミドを基質としたカルノシン生成反応を行った。カルノシン生成活性の測定は、βＡｌａエステルまたはβＡｌａアミド、Ｌ−Ｈｉｓを基質として以下の条件により行った。【０１５３】
活性測定反応条件：  １００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ  β−Ａｌａエステルまたはアミド、１００ｍＭ  Ｌ−Ｈｉｓ、０．１Ｕ／２００μｌ反応液、２５℃で１５分間反応を行い、ＨＰＬＣでカルノシンの生成量を測定。【０１５４】
収率測定反応条件：  １００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ  β−Ａｌａエステルまたはアミド、１００ｍＭ  Ｌ−Ｈｉｓ、２Ｕ／２００μｌ反応液、２５℃で１２０分間反応を行い、ＨＰＬＣでカルノシンの生成量を測定。【０１５５】
その結果、βＡｌａ−メチルエステル以外のエステルや、βＡｌａ−アミドも利用可能であることが明らかとなった（図３）。なお、収率は、βＡｌａ−メチルエステル、βＡｌａ−エチルエステルにて高かった（図４）。【０１５６】
実施例８  ヒスチジン以外のアミノ酸Ｘを基質として用いたβＡｌａ−Ｘ生成反応
実施例７にて精製した、ＲｈＤｍｐＡ精製酵素を用いて、様々なアミノ酸を基質としたβＡｌａ−Ｘ生成反応を行った。βＡｌａ−Ｘ生成活性の測定は、β−Ａｌａメチルエステル、アミノ酸Ｘを基質として以下の条件により行った。【０１５７】
活性測定反応条件：  １００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  β−Ａｌａメチルエステル、１００ｍＭ  Ｌ−アミノ酸Ｘ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＵ／２００μｌ反応液、２５℃で１０分間反応を行い、ＨＰＬＣで各βＡｌａ−Ｘの生成量を測定。
その結果、ヒスチジン以外のアミノ酸も基質として認識し得ることが明らかとなった。【０１５８】
【表１１】
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【０１５９】
実施例９  アミノ酸誘導体を基質として用いたβＡｌａ−Ｘ生成反応
実施例８と同様、様々なアミノ酸誘導体を基質としたβＡｌａ−Ｘ生成反応を行った。βＡｌａ−Ｘ生成活性の測定は、β−Ａｌａメチルエステル、アミノ酸誘導体Ｘを基質として以下の条件により行った。【０１６０】
活性測定反応条件：  １００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  β−Ａｌａメチルエステル、１００ｍＭ  Ｌ−アミノ酸Ｘ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＵ／２００μｌ反応液、２５℃で１０分間反応を行い、ＨＰＬＣで各βＡｌａ−Ｘの生成量を測定。【０１６１】
その結果、アミノ酸誘導体も基質として認識し得ることが明らかとなった。【０１６２】
【表１２】
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【０１６３】
実施例８および実施例９の結果より、ＲｈＤｍｐＡ酵素は、カルノシン生成酵素というよりもむしろ、β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の生成酵素であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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