(57)【要約】  本発明は、一価抗体、該抗体を作製する方法およびその療法的使用に関する。特に、本発明は、免疫グロブリン重鎖、ならびに免疫グロブリン軽鎖およびＦｃ分子を含む融合タンパク質を含む、ヘテロ二量体ポリペプチドを提供する。
2009512453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有または非共有相互作用で融合タンパク質に連結されている免疫グロブリン重鎖を含むヘテロ二量体ポリペプチドであって、前記融合タンパク質が免疫グロブリン軽鎖およびＦｃ分子を含み、前記重鎖および前記融合タンパク質がそれらのＮ末端およびＣ末端に関して同一に方向付けられており、そして前記へテロ二量体ポリペプチドがターゲット受容体に特異的に結合可能である、前記へテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２】
前記重鎖がタグ化部分をさらに含む、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項３】
前記タグ化部分が：ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ストレプトアビジン結合ペプチド、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ｍｉｃ−タグ、およびＦＬＡＧ−タグからなる群より選択される、請求項２記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項４】
前記タグ化部分がヘキサ−ヒスチジン・タグを含む、請求項３記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項５】
前記相互作用がジスルフィド結合を介しているか、または二量体化ドメインを介している、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項６】
前記二量体化ドメインが、前記重鎖のＣＨ３領域、および融合タンパク質の前記ＦｃのＣＨ３領域に位置する、請求項５記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項７】
ヘテロ二量体ポリペプチドの形成が増進されるように、前記重鎖のＦｃ領域および／または前記融合タンパク質のＦｃ分子が突然変異している、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項８】
前記重鎖および前記融合タンパク質が互いに構造的に対称であるように、前記融合タンパク質のＦｃ部分のヒンジ領域が修飾されている、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項９】
前記ヒンジ領域が、アミノ酸挿入、欠失、または置換によって修飾されている、請求項８記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ヒンジ領域の配列が天然存在または非天然存在である、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１１】
重鎖および融合タンパク質のヒンジ領域のいずれかまたは両方が修飾されている、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１２】
前記重鎖および前記融合タンパク質が、対を形成しないシステイン残基をまったく含有しない、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンがＩｇＧである、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＩｇＧが：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項１３記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１５】
前記ターゲット受容体の活性に拮抗する、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ターゲット受容体が、そのサブユニットのオリゴマー化によって活性化される受容体である、請求項１５記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１７】
前記オリゴマー化が、少なくとも二量体、三量体、または四量体を形成する、請求項１５記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１８】
前記オリゴマー化が、少なくとも４つのサブユニットを含むオリゴマーを形成する、請求項１５記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記受容体が：ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、サイトカイン受容体、受容体チロシンキナーゼ、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、ＡＴ１受容体、組織因子、およびインテグリンからなる群より選択されるメンバーである、請求項１５記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２０】
前記受容体がＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである、請求項１９記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２１】
前記メンバーが：ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＮＧＦＲ、Ｔｒｏｙ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＯＸ４０、ＡＩＴＲ、ＣＤ３０、ＨｖｅＡ、４−１ＢＢ、ＤＲ３、ＣＤ２７、ＬＴβＲ、ＲＡＮＫ、ＴＷＥＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＤＲ６、ＯＰＧ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２からなる群より選択される、請求項２０記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２２】
前記受容体が受容体チロシンキナーゼである、請求項１９記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２３】
前記受容体チロシンキナーゼが：成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＦＧＦ受容体およびＥＧＦ受容体からなる群より選択される、請求項２２記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＥＧＦ受容体が：ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４からなる群より選択される、請求項２３記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２５】
前記受容体がインターロイキン受容体である、請求項１９記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２６】
前記インターロイキン受容体が：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５、ＩＬ７、ＴＳＬＰ、ＬＩＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３およびＩＬ−３１からなる群より選択されるインターロイキンの受容体である、請求項２５記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２７】
前記重鎖および前記融合タンパク質のアミノ酸配列が、完全にヒトであるか、ヒト化されているか、またはキメラである、請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２８】
前記ターゲット受容体の活性をアゴナイズしない、請求項１５記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチドおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、組成物。
【請求項３０】
配列番号９に示すアミノ酸配列を含む第一のポリペプチドおよび配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む第二のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項３１】
（ａ）配列番号１１、１２および１３からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９０％同一であるＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖、ならびに
（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域およびＦｃを含む融合タンパク質であって、前記軽鎖が：配列番号１８、１９および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９０％同一であるＣＤＲを含む、前記融合タンパク質
を含むヘテロ二量体ポリペプチドであって、ＴＮＦＲ１に結合し、そしてその活性を阻害することが可能である、前記へテロ二量体ポリペプチド。
【請求項３２】
Ｆｃ分子に融合した免疫グロブリン軽鎖を含む、ポリペプチド。
【請求項３３】
前記軽鎖が、ヒンジ領域を介して、前記Ｆｃ分子に融合している、請求項３２記載のポリペプチド。
【請求項３４】
共有または非共有相互作用で免疫グロブリン重鎖に連結されている請求項３２記載のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項３５】
免疫グロブリン重鎖をコードする第一の核酸および融合タンパク質をコードする第二の核酸を含むベクターであって、前記融合タンパク質が、免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域、およびＦｃ分子を含み、前記の第一の核酸および前記の第二の核酸が、同じ部位または異なる部位で、前記ベクターに挿入される、前記ベクター。
【請求項３６】
前記の第一の核酸が、タグ化部分に融合した免疫グロブリン重鎖をコードする、請求項３５記載のベクター。
【請求項３７】
請求項３５または３６記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３８】
少なくとも２つのベクターを含む、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞であって、前記ベクターの少なくとも１つが、少なくとも免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列を含み、そして前記ベクターの少なくとも別の１つが、免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域およびＦｃ分子を含む、少なくとも融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、前記宿主細胞。
【請求項３９】
宿主細胞において、ヘテロ二量体ポリペプチドを産生するための方法であって、前記へテロ二量体ポリペプチドが、場合によってタグ化部分と融合した、免疫グロブリン重鎖を含み、前記重鎖が、免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域、およびＦｃ分子を含む融合タンパク質に連結されており、前記重鎖および前記融合タンパク質がそれらのＮ末端およびＣ末端に関して同一に方向付けられており、そして前記へテロ二量体ポリペプチドがターゲット受容体に特異的に結合可能であり、前記方法が：
（ａ）前記免疫グロブリン重鎖をコードする第一の核酸および前記融合タンパク質をコードする第二の核酸で、前記宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクションし、そして
（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖および前記融合タンパク質が、前記形質転換宿主細胞において、別個に産生されるように、前記の第一の核酸および前記の第二の核酸を発現させる
工程を含む、前記方法。
【請求項４０】
前記重鎖および前記融合タンパク質が、前記宿主細胞において発現され、そしてターゲット受容体に結合可能なヘテロ二量体ポリペプチドとして、該細胞から分泌される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記の第一および第二の核酸が、単一のベクター中に存在する、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記の第一および第二の核酸が、異なるベクター中に存在する、請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞が原核または真核である、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物細胞が：ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄細胞株、およびＷＩ３８細胞からなる群より選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記重鎖および前記融合タンパク質が、不溶性型で産生され、そして可溶化され、そして溶液中で再フォールディングを可能にされて、ターゲット受容体に特異的に結合可能なヘテロ二量体ポリペプチドを形成する、請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
Ｆｃ分子に融合した免疫グロブリン軽鎖を含む融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項４８】
サブユニットのオリゴマー化によって活性化されるターゲット受容体によって仲介される状態を有する被験体を治療する方法であって、前記被験体に、有効量の請求項１記載のヘテロ二量体ポリペプチドを投与することを含み、前記ヘテロ二量体ポリペプチドが、前記ターゲット受容体の少なくとも１つのサブユニットに特異的に結合可能であり、それによって前記オリゴマー化に拮抗する、前記方法。
【請求項４９】
前記オリゴマー化が、二量体、三量体、または四量体を形成する、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記ターゲット受容体が：ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、サイトカイン受容体、受容体チロシンキナーゼ、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、ＡＴ１受容体、組織因子、およびインテグリンからなる群より選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記ターゲット受容体が、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
前記ターゲット受容体が：ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＮＧＦＲ、Ｔｒｏｙ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＯＸ４０、ＡＩＴＲ、ＣＤ３０、ＨｖｅＡ、４−１ＢＢ、ＤＲ３、ＣＤ２７、ＬＴβＲ、ＲＡＮＫ、ＴＷＥＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＤＲ６、ＯＰＧ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２からなる群より選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記ターゲット受容体が受容体チロシンキナーゼである、請求項４８記載の方法。
【請求項５４】
前記受容体チロシンキナーゼが：成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＦＧＦ受容体およびＥＧＦ受容体からなる群より選択される、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記ＥＧＦ受容体が：ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４からなる群より選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記ターゲット受容体がインターロイキン受容体である、請求項４８記載の方法。
【請求項５７】
前記ターゲット受容体、前記インターロイキン受容体が：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＴＳＬＰ、ＬＩＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３およびＩＬ−３１からなる群より選択されるインターロイキンの受容体である、請求項４８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
［０００１］本出願は、本明細書に援用される２００５年１０月２１日出願の米国仮出願第６０／７２９，３０４号の優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
［０００２］モノクローナル抗体は、癌、炎症性疾患およびウイルス感染を含む多くの適用のための療法分子の、ますます重要な種類となってきている。循環中のサイトカインまたは細胞表面上の受容体などのターゲットに特異的に結合することによって、抗体は、特定の生化学的工程を遮断するかまたは活性化するかいずれかを行うことも可能である。さらに、外来生物または癌細胞などのターゲットへの結合に際して、抗体はまた、免疫系から、他のエフェクター細胞をターゲットに補充することも可能であり、これがターゲットの破壊を導きうる。
【０００３】
［０００３］大部分の組換え抗体は、ＩｇＧ形式：柔軟なヒンジ領域によってＦｃ断片に連結された２つの抗原結合断片（Ｆａｂ）アームを持つ「Ｙ」型分子で用いられる。ＩｇＧの二価の性質は、Ｆａｂなどの一価の抗体に勝るいくつかの機能的利点を提供する。第一に、アビディティー効果によって、２つの抗原結合部分を有するＩｇＧは、一価Ｆａｂ分子よりもより緊密にターゲットに結合する。これは、典型的には、結果としてｉｎ  ｖｉｖｏでのはるかにより高い活性につながりうる。次に、Ｆａｂ断片と比較して、ＩｇＧは、大きい分子サイズを有することで腎臓におけるクリアランスが妨げられること、およびＦｃ領域が新生受容体（ＦｃＲｎ）に結合可能であり、サルベージ経路を用いて、内皮におけるタンパク質分解が回避されることの両方の結果、哺乳動物においてより長い血清半減期を有する（Ｊｕｎｇｈａｎｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．  １６（１）：２９−５７（１９９７））。
【０００４】
［０００４］さらに、ＩｇＧはまた、細胞表面上のリガンド受容体を架橋することによって、生物学的リガンドの機能を模倣することも可能である。例えば、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）に類似の抗Ｆａｓ抗体は、多くの細胞種において、Ｆａｓが仲介するアポトーシスを活性化しうる。別の例は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞受容体を活性化するのに一般的に用いられる（すなわちアゴニスト性抗体である）抗ＣＤ３抗体である。現在、ＴＲＡＩＬが仲介するアポトーシスを誘導可能であるため、ＴＲＡＩＬ受容体に対するいくつかのアゴニスト性抗体が、有望な抗癌剤として開発中である。これらのアゴニスト性抗体の生物学的機能は、ＩｇＧ形式の二価性に依存する。
【０００５】
［０００５］Ｆａｂ断片などの、同じ抗体の一価型は、典型的にはアゴニスト性抗体として働くことができない。
［０００６］しかし、特定の療法的ターゲット、例えば、ＴＮＦ受容体およびＴＮＦ受容体ファミリーの他のメンバーには、抗体架橋による細胞表面受容体の活性化は望ましくない。ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ヒトにおいて、多くの生理学的および病理生理学的状態において、重要な役割を果たすことが示されてきており、このため、特に抗体に基づく療法による、薬剤介入に魅力的なターゲットとなっている。しかし、純粋にアンタゴニスト性である、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに対する抗体を開発するのは困難である。この困難さは、主に、特に、完全ＩｇＧなどの二価抗体に関しては、アンタゴニスト性およびアゴニスト性両方の抗体を有する潜在的なリスクがあることによる。
【０００６】
［０００７］Ｆａｂなどの抗体の一価型は、アゴニスト活性は持たないが、半減期が短いため、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するのは実際的でない。この問題を克服するため、当該技術分野において、血清アルブミンなどの大きい分子にＦａｂを融合させること、およびＦａｂのＰＥＧ化によるなどを含む、いくつかの戦略が開発されてきている（Ｌｅｏｎｇ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  １６（３）：１０６−１９（２００１））。しかし、生物活性が減少し、そしてＰＥＧ分子が腎臓に集積するため、これらのアプローチは最適には程遠い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
［０００８］したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで長い半減期を有するがアゴニスト活性を含まないアンタゴニスト性抗体を開発する改善された方法に関する、かなりの必要性が依然としてある。本発明は、一価抗体として機能するヘテロ二量体ポリペプチドを提供することによって、この必要性を達成する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
［０００９］本発明は、部分的に、一価抗体が、２つの抗原結合ドメインを有する完全免疫グロブリン分子などの多価抗体（例えば二価抗体）よりも、アゴニスト性である可能性がより低いという観察に基づく。本発明はまた、哺乳動物細胞において、免疫グロブリン重鎖が、軽鎖と二量体化しなければ、細胞から分泌不能であるという別の観察も利用する。
【０００９】
［００１０］したがって、１つの態様において、本発明は、共有または非共有相互作用で融合タンパク質に連結されている免疫グロブリン重鎖を含むヘテロ二量体ポリペプチドであって、該融合タンパク質が免疫グロブリン軽鎖およびＦｃ分子を含み、該重鎖および該融合タンパク質がそれらのＮ末端およびＣ末端に関して同一に方向付けられており、そして該へテロ二量体ポリペプチドがターゲット受容体に特異的に結合可能である、前記へテロ二量体ポリペプチドを提供する。別の側面において、重鎖および融合タンパク質間の相互作用は、ジスルフィド結合を伴う。
【００１０】
［００１１］別の側面において、ヘテロ二量体ポリペプチド中の免疫グロブリン重鎖は、限定されるわけではないが、ヘキサ−ヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、ストレプトアビジン結合ペプチド、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ｍｉｃ−タグ、およびＦＬＡＧ−タグを含む、タグ化部分をさらに含む。
【００１１】
［００１２］別の側面において、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域および融合タンパク質のＦｃ領域は、ヘテロ二量体ポリペプチドをより効率的に形成するため、システインなどの遊離チオール化合物および二量体化ドメインを含めて、重鎖および融合タンパク質間の相互作用を支持するかまたは増進するように突然変異していてもよい。特に、重鎖または融合タンパク質のホモ二量体化は、それぞれ、これらの間のヘテロ二量体形成よりも支持されない。
【００１２】
［００１３］別の側面において、融合タンパク質のＦｃ部分中のヒンジ領域は、ヘテロ二量体を形成する重鎖および融合タンパク質が互いに構造的に対称であるように、修飾されている。特に、ヒンジ領域は、アミノ酸挿入、欠失、または置換によって修飾されていてもよい。こうした修飾によって、ヒンジ領域は、少なくとも１アミノ酸残基、少なくとも２アミノ酸残基、少なくとも３アミノ酸残基、少なくとも４アミノ酸残基、少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、または少なくとも１０アミノ酸残基、長くなっていてもまたは短くなっていてもよい。さらに、こうした修飾によって、ヒンジ領域は、すべて包括的に、少なくとも１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、または１〜２０アミノ酸残基、長くなっていてもまたは短くなっていてもよいし、あるいは、重鎖および融合タンパク質間の相互作用、ならびにヘテロ二量体ポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない限り、より長くても短くてもよい。別の態様において、また、ヒンジ領域中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基が、限定されるわけではないが、例えばグルタミン酸をアスパラギン酸で、アルギニンをリジンまたはグルタミンで、グルタミンをアスパラギンで置換することを含めて、類似のアミノ酸残基で置換されていてもよい。さらに別の側面において、ヒンジ領域は、天然存在または非天然存在であってもよい。ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのものとは異なるクラスまたはサブクラスの抗体由来の完全ヒンジ領域を含んでもよい。
【００１３】
［００１４］本発明の別の態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、対を形成しないシステイン、すなわちジスルフィド結合に関与しないシステインをまったく含有しない。対を形成しないシステインの存在は、適切なフォールディングに、そしてしたがってタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼす可能性もあるため、当業者は、対を形成しないシステインを持たないヘテロ二量体ポリペプチドを作製することを正しく認識するであろう。
【００１４】
［００１５］本発明の別の側面において、ヘテロ二量体ポリペプチド中の免疫グロブリン重鎖および融合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する。
【００１５】
［００１６］本発明のさらに別の側面において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、ターゲット受容体または細胞表面分子に特異的に結合可能であり、そしてその活性に拮抗することが可能である。
【００１６】
［００１７］本発明の１つの態様において、ターゲット受容体には、サブユニットが同じ分子（すなわちホモオリゴマー化）であろうと、または異なる分子（すなわちヘテロオリゴマー化）であろうと、そして二量体、三量体、四量体、またはより高次の多量体であろうと、その活性が、サブユニットのオリゴマー化によって仲介される受容体が含まれる。
【００１７】
［００１８］別の態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドのターゲット受容体には、限定されるわけではないが、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、サイトカイン受容体、受容体チロシンキナーゼ、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、ＡＴ１受容体、組織因子、およびインテグリンが含まれる。さらに別の態様において、ターゲット受容体には、限定されるわけではないが、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）、ＴＮＦＲ２（ｐ７５）、ＮＧＦＲ、Ｔｒｏｙ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＯＸ４０、ＡＩＴＲ、ＣＤ３０、ＨｖｅＡ、４−１ＢＢ、ＤＲ３、ＣＤ２７、ＬＴβＲ、ＲＡＮＫ、ＴＷＥＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＤＲ６、ＯＰＧ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２を含む、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーが含まれる。
【００１８】
［００１９］別の態様において、ターゲット受容体には、限定されるわけではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＴＳＬＰ、ＬＩＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３およびＩＬ−３１を含む、インターロイキン受容体が含まれる。
【００１９】
［００２０］本発明のさらに別の態様において、ヘテロ二量体ポリペプチドの免疫グロブリン配列は、完全にヒトであるか、ヒト化されているか、またはキメラである。
［００２１］別の態様において、本発明は、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、組成物を提供する。
【００２０】
［００２２］さらに別の態様において、本発明のヘテロ二量体ポリペプチド、またはその薬学的組成物は、サブユニットのオリゴマー化によって活性化されるターゲット受容体によって仲介される状態を有する被験体を治療するのに用いられ、この治療は、該被験体に、有効量の本発明のヘテロ二量体ポリペプチドを投与することを含み、該ヘテロ二量体ポリペプチドは、該ターゲット受容体の少なくとも１つのサブユニットに特異的に結合可能であり、それによって該オリゴマー化に拮抗する。別の側面において、このオリゴマー化は、二量体、三量体、または四量体、あるいはより高次の多量体の複合体を形成する。さらに別の側面において、本発明は、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、サイトカイン受容体、受容体チロシンキナーゼ、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、ＡＴ１受容体、組織因子、およびインテグリンの少なくとも１つのメンバーをターゲットとする、ヘテロ二量体ポリペプチドを提供する。さらに別の側面において、ターゲット受容体には、限定されるわけではないが、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＮＧＦＲ、Ｔｒｏｙ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＣＤ４０、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＯＸ４０、ＡＩＴＲ、ＣＤ３０、ＨｖｅＡ、４−１ＢＢ、ＤＲ３、ＣＤ２７、ＬＴβＲ、ＲＡＮＫ、ＴＷＥＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＤＲ６、ＯＰＧ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２が含まれる。本発明の別の側面において、ターゲット受容体のオリゴマー化は、リガンド誘導性であってもまたはなくてもよい。
【００２１】
［００２３］別の態様において、本発明は、免疫グロブリン重鎖をコードする第一の核酸および融合タンパク質をコードする第二の核酸を含むベクターであって、該融合タンパク質が、免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域、およびＦｃ分子を含み、第一の核酸および第二の核酸が、同じ部位または異なる部位（単数または複数）で、該ベクターに挿入される、前記ベクターを提供する。別の側面において、第一の核酸は、タグ化部分に融合した免疫グロブリン重鎖をコードする。
【００２２】
［００２４］別の態様において、本発明は、直前の段落に記載するような、第一および第二の核酸を含むベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
［００２５］さらに別の側面において、本発明は、少なくとも２つのベクターを含む、形質転換またはトランスフェクション宿主細胞であって、該ベクターの少なくとも１つが、少なくとも免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列を含み、そして該ベクターの少なくとも別の１つが、免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域およびＦｃ分子を含む、少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、前記宿主細胞を提供する。
【００２３】
［００２６］別の態様において、本発明は、宿主細胞において、ヘテロ二量体ポリペプチドを産生するための方法であって、該へテロ二量体ポリペプチドが、場合によってタグ化部分と融合している免疫グロブリン重鎖を含み、該重鎖が、免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域、およびＦｃ分子を含む融合タンパク質に連結されており、該重鎖および該融合タンパク質がそれらのＮ末端およびＣ末端に関して同一に方向付けられており、そして該へテロ二量体ポリペプチドがターゲット受容体に特異的に結合可能であり、該方法が：（ａ）該免疫グロブリン重鎖をコードする第一の核酸および該融合タンパク質をコードする第二の核酸で、宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクションし、そして（ｂ）該免疫グロブリン重鎖および該融合タンパク質が、該形質転換宿主細胞において、別個に産生されるように、第一の核酸および第二の核酸を発現させる工程を含む、前記方法を提供する。別の側面において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、宿主細胞において発現され、そしてターゲット受容体に結合可能なヘテロ二量体ポリペプチドとして、該細胞から分泌される。別の側面において、第一および第二の核酸は、１つの単一ベクター中に、あるいは別個の、独立の、または異なるベクター中に、存在する。さらに別の側面において、第一の核酸を宿主細胞に形質転換して重鎖を作製してもよいし、そして融合タンパク質を別個の宿主細胞に形質転換して融合タンパク質を作製してもよい。第二の核酸で形質転換する宿主細胞は、第一の核酸で形質転換する宿主細胞と同じかまたは異なる細胞または細胞株であってもよい。さらに別の側面において、宿主細胞は原核または真核である。さらに別の側面において、宿主細胞は哺乳動物細胞であり、これには、限定されるわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄細胞株、およびＷＩ３８細胞が含まれる。さらに別の態様において、重鎖および融合タンパク質は、不溶性型で産生され、そして可溶化され、そして溶液中で再フォールディングを可能にされて、ターゲット受容体に特異的に結合可能なヘテロ二量体ポリペプチドを形成する。
【００２４】
［００２７］別の態様において、本発明は、Ｆｃ分子に融合した免疫グロブリン軽鎖を含む融合タンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、Ｆｃ分子に融合した免疫グロブリン軽鎖を含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００２５】
［００２８］さらに別の態様において、本発明は、単一の抗原結合ドメインを含み、そして軽鎖がＦｃ分子でさらに延長されて、融合タンパク質を生じている、免疫グロブリンの半分の分子、すなわち二鎖分子を提供する。別の側面において、抗原結合領域は、融合タンパク質の重鎖および／または軽鎖部分の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む。
【００２６】
［００２９］さらに別の態様において、本発明は、Ｆｃ分子に融合した免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドを提供する。別の側面において、軽鎖は、ヒンジ領域を介して、Ｆｃ分子に融合している。
【００２７】
［００３０］１つの態様において、本発明は、配列番号９に示すアミノ酸配列を含む第一のポリペプチドおよび配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む第二のポリペプチドを含む、ＴＮＦＲ１をターゲットとする、ヘテロ二量体ポリペプチドを提供する。別の側面において、ヘテロ二量体ポリペプチドは、（ａ）配列番号１１、１２および１３からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖、ならびに（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域およびＦｃを含む融合タンパク質であって、該軽鎖が：配列番号１８、１９および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるＣＤＲを含む、前記融合タンパク質を含み、そしてＴＮＦＲ１に結合し、そして該受容体の活性に拮抗することが可能である。
【００２８】
［００３１］さらに別の態様において、本発明は、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。
［００３２］さらに別の態様において、本発明は、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００２９】
［００３３］さらに別の態様において、本発明は：配列番号１１、１２および１３からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖、ならびに／あるいは免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域およびＦｃを含む融合タンパク質であって、該軽鎖が：配列番号１８、１９および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるＣＤＲを含む、前記融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００３０】
［００３４］さらに別の態様において、本発明は、自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法であって、配列番号９に示すアミノ酸配列を含む第一のポリペプチドおよび配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む第二のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体ポリペプチド、またはその薬学的組成物の有効量を、該被験体に投与することを含む、前記方法を提供する。別の側面において、本発明は、限定されるわけではないが、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、クローン病、ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎を含む自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法であって、（ａ）配列番号１１、１２および１３からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖、ならびに（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、ヒンジ領域およびＦｃを含む融合タンパク質であって、該軽鎖が：配列番号１８、１９および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるＣＤＲを含む、前記融合タンパク質を含み、そしてＴＮＦＲ１に結合し、そして該受容体の活性に拮抗することが可能である、ヘテロ二量体ポリペプチド、またはその薬学的組成物の有効量を、該被験体に投与することを含む、前記方法を提供する。
【００３１】
発明の詳細な説明
［００４２］本開示全体で、多様な刊行物、特許および公開特許出願が、同定する引用によって言及される。これらの刊行物、特許および公開特許出願の開示は、本開示に援用される。
【００３２】
一般的な技術
［００４３］本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の範囲内の分子生物学、免疫学、生化学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、組換えＤＮＡの慣用的技術を使用するであろう。
【００３３】
用語の定義
［００４４］本明細書全体で用いる用語は、特定の場合に別に限定されない限り、以下のように定義される。
【００３４】
［００４５］明細書および請求項で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに単数形を指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「ベクター（ａ  ｖｅｃｔｏｒ）」には、その混合物を含めて、複数のベクターが含まれる。
【００３５】
［００４６］用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖、環状、または分枝鎖であってもよく；修飾されたアミノ酸を含んでもよく；そして非アミノ酸によって中断されてもよい。該用語はまた、例えばグリコシル化を介して修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。本明細書において、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然あるいは合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシン、ならびにＤ−およびＬ−光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド擬似体が含まれる。
【００３６】
［００４７］ポリペプチドおよび核酸の両方の場合で、同一性パーセントを、視覚的検査によって決定してもよい。また、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ，  ２：４８２（１９８１））によって修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３（１９７０））の並列法を用いて、同一性パーセントを決定してもよい。特に、コンピュータプログラム、例えば、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：３８７（１９８４）もまた参照されたい）から入手可能な、ＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン１０．ｘを用いることによって、同一性パーセントを決定する。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含有する）、ならびにアミノ酸に関する、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ３５３−３５８（１９７９）に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １４：６７４５（１９８６）の加重アミノ酸比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３０（アミノ酸）または５０（ヌクレオチド）のペナルティ、および各ギャップ中の各記号に対するさらに１（アミノ酸）または３（ヌクレオチド）のペナルティ；（３）末端ギャップに対するペナルティなし；および（４）長いギャップに対する最大ペナルティなし、が含まれる。配列比較の当業者によって用いられる、他のプログラムもまた使用可能である。
【００３７】
［００４８］本明細書において、「融合タンパク質」は、少なくとも２つのポリペプチドを含有するタンパク質を指し、そのうち第一のポリペプチドは、通常、別個のタンパク質として存在しており、そして通常は第一のポリペプチドの一次構造の一部ではないか、または第一のポリペプチドとシス立体配置に配置されていない、少なくとも第二のポリペプチドと一つにされて、融合タンパク質を形成するか；あるいは、これらは通常、同じタンパク質中に存在してもよいが、融合タンパク質においては、新たな配置に置かれる。ペプチド領域が望ましい関係でコードされる核酸を作製し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、もしくは宿主細胞において、翻訳することによって、または化学合成によって、あるいは両方の方法論によって、融合タンパク質を生成してもよい。
【００３８】
［００４９］タンパク質、特にターゲット受容体複合体の「オリゴマー化」は、本明細書において、リガンド誘導に依存していてもまたはしていなくてもよい、例えば、二量体、三量体、または四量体を形成するための、別個のポリペプチド、またはサブユニットまたは単量体の会合を指す。膜ターゲット受容体の性質に応じて、サブユニットのオリゴマー化は、ホモオリゴマー化（同じ種類の少なくとも２つのサブユニットの会合、例えばｐ５５の三量体を形成するＴＮＦＲ１またはｐ５５におけるようなもの）またはヘテロオリゴマー化（少なくとも１つが、他のもの（単数または複数）と異なる、少なくとも２つのサブユニットの会合、例えばＩＬ−１５受容体αサブユニット、ＩＬ−２受容体βサブユニット、およびＩＬ−２受容体γサブユニットを含む三量体を形成する、ＩＬ−１５受容体複合体におけるようなもの）であってもよい。
【００３９】
［００５０］用語「連結された」、「融合した」または「融合」は、本明細書において、交換可能に用いられる。これらの用語は、組換えおよび／または化学的コンジュゲート化手段を含む、いかなるものでもよい手段によって、２つの化学的要素または構成要素を一緒に連結することを指す。融合タンパク質におけるポリペプチドの読み枠は、融合したセグメント全体で、連続して作られるが、セグメントは、例えば、インフレーム・リンカー配列によって、物理的または空間的に分離されていてもよい。
【００４０】
［００５１］ポリペプチドの関連において、「配列」は、ポリペプチドにおけるＮ末端からＣ末端方向のアミノ酸の順序であり、配列中で互いに隣接する残基は、ポリペプチドの一次構造において連続している。
【００４１】
［００５２］用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に用いられる。これらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドいずれか、あるいはその類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。
【００４２】
［００５３］本明細書において、「発現」は、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（また、転写物とも称される）が、続いて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、まとめて、遺伝子産物と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来するならば、真核細胞における発現には、ｍＲＮＡのスプライシングが含まれてもよい。
【００４３】
［００５４］「ベクター」は、宿主細胞内にそして／または宿主細胞間で、挿入された核酸分子をトランスファーする、核酸分子、特に自己複製性の核酸分子である。該用語には、主に細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入（例えば染色体組込み）のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能する複製ベクター、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。やはり含まれるのは、記載するような機能の１より多くを提供するベクターである。
【００４４】
［００５５］「発現ベクター」は、適切な宿主細胞内に導入された際、転写されそしてポリペプチドに翻訳されることが可能なポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、望ましい発現産物を生じるように機能可能な発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を示す。
【００４５】
［００５６］用語「有効量」は、本明細書において、望ましい生物学的または生理学的効果を生じるであろうポリペプチド、例えばヘテロ二量体ポリペプチドの量を指す。当該技術分野に知られるであろうように、疾患、障害または状態を防止する単数または複数の予防的方法に加えて、こうした疾患、障害、または状態を治療する方法において、有効量の療法剤が必要である。したがって、治療法、ならびに疾患、障害または状態に関連する症状を改善する方法に関して、「有効量」は、「療法的有効量」と同義に用いられる。こうした方法において、「状態を有する被験体」または「必要がある被験体」は、疾患、障害または状態、特に、本開示に記載するような、ターゲット受容体のオリゴマー化によって仲介される状態の症状を示すか、これらを発展させるリスクがあるか、またはこれらを有すると診断された、任意の動物、例えばヒトである。
【００４６】
［００５７］用語「Ｆｃ」、「Ｆｃ分子」、「Ｆｃ領域」、または「Ｆｃドメイン」は、天然ＦｃおよびＦｃ変異体分子および配列を含む。広義には、用語「Ｆｃ」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するよう用いられる。Ｆｃ変異体および天然Ｆｃの場合、用語「Ｆｃドメイン」には、完全抗体から消化されたかまたは他の手段によって産生された、単量体型（例えば、互いに相互作用して、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドを形成する前の、重鎖または融合タンパク質の軽鎖部分におけるようなもの）または多量体型（例えば、本発明のヘテロ二量体ポリペプチド、または完全ＩｇＧ分子におけるようなもの）の分子が含まれる。用語「天然Ｆｃ」は、完全抗体の消化から生じる、非抗原結合性断片の配列を含む、単量体型または多量体型いずれであってもよい分子または配列を指す。天然Ｆｃの元来の免疫グロブリン供給源は、例えば、ヒト起源であり、そして限定されるわけではないが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２を含む、免疫グロブリンのいずれであることも可能である。天然Ｆｃは、単量体ポリペプチドで構成され、共有結合（例えばジスルフィド結合）または非共有相互作用によって連結されて、二量体型または多量体型になることも可能である。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて１〜４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １０：４０７１−４０７９（１９８２）を参照されたい）。用語「天然Ｆｃ」は、本明細書において、単量体型、二量体型、および多量体型の総称である。用語「Ｆｃ変異体」は、天然Ｆｃから修飾されているが、サルベージ受容体、ＦｃＲｎの結合部位をなお含む、分子または配列を指す。ＷＯ  ９７／３４６３１およびＷＯ  ９６／３２４７８は、典型的なＦｃ変異体とともに、サルベージ受容体との相互作用を記載し、そして本明細書に完全に援用される。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を含む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要でない構造的特徴または生物学的活性を提供するために取り除くことも可能な部位を含む。用語「Ｆｃ変異体」はまた、２つの免疫グロブリン鎖の二量体化、例えば、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドを形成するための、重鎖および融合タンパク質の二量体化を増進するドメインを含む、天然Ｆｃも含む。こうしたドメインには、限定されるわけではないが、遊離チオ含有化合物、例えばシステイン残基、ならびにどちらも完全に本明細書に援用される、米国特許第５，８０７，７０６号および米国公報第２００３／００７８３８５号に記載されるような多量体化ドメインが含まれる。
【００４７】
［００５８］用語「ヒンジ領域」は、一般的に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６〜Ｐｒｏ２３０に渡ると定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２２：１６１−２０６（１９８５））。重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初のシステイン残基および最後のシステイン残基を同じ位に配置することによって、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域を、ＩｇＧ１配列と並列させてもよい。ヒンジ領域は、天然存在または非天然存在であってもよく、限定されるわけではないが、本明細書に完全に援用される米国特許第５，６７７，４２５号に記載されるような改変されたヒンジ領域が含まれる。ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのものと異なるクラスまたはサブクラスの抗体に由来する完全ヒンジ領域を含んでもよい。
【００４８】
［００５９］用語「タグ化部分」は、本明細書において、本発明の重鎖に融合しており、例えば組換え的に産生された際に、該タグ化部分を含有しない、混合物中の他の構成要素からの、こうした重鎖を含むヘテロ二量体ポリペプチドの分離および／または精製を促進するよう補助する、ポリペプチドまたはペプチドを指す。
【００４９】
［００６０］用語「拮抗する」または「拮抗すること」は、本明細書において、ターゲット受容体などの、関心対象の会合タンパク質の生物学的活性を遮断するか、遅らせるか、防止するか、減少させるか、阻害するか、弱めるか、または何らかの方式でこれに干渉することを指す。用語「アンタゴニスト」または「アンタゴニスト性」は、関心対象のタンパク質の生物学的活性に拮抗する化合物を指す。
【００５０】
［００６１］用語「アゴナイズ」、「アゴニスト」および「アゴニスト性」は、本明細書において、直接または間接的に、サイトカイン生物学的活性またはサイトカイン受容体活性化を実質的に誘導するか、促進するか、または増進することが可能な分子を指すかまたは記載する。
【００５１】
［００６２］用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、そして具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および望ましい生物学的活性をなお示す限り、抗体断片を含む。用語「モノクローナル抗体」は、均質の（本質的に同一の）抗体集団を有する抗体組成物を指す。該用語は、種、例えばヒト、ネズミ、マウス、または抗体の供給源に関して限定されず、あるいは作製された方式によって限定されない。例えば、該用語には、例えばハイブリッド、改変、キメラ、またはヒト化など、どのように下位分類されるかにかかわらず、モノクローナル抗体を生じる、ハイブリドーマ以外の方法論によって産生されたモノクローナル抗体が含まれる。さらに、該用語には、モノクローナル抗体の産生中に天然に生じる変異体が含まれる。該用語には完全免疫グロブリンが含まれる。用語「ヒト化抗体」は、本明細書において、典型的には、非ヒト（例えばネズミ）抗体の可変領域、または少なくともその相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト抗体由来の残りの免疫グロブリン部分を含む、操作された抗体、すなわちキメラ抗体を指す。キメラ抗体およびさらなる操作されたモノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３（１９８８）；Ｌｉｕら，  ＰＮＡＳ，  ８４：３４３９（１９８７）；Ｌａｒｒｉｃｋら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７：９３４（１９８９）；ならびにＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ，  ＴＩＰＳ，  １４：１３９（１９９３年５月）に記載されるものが含まれる。こうしたヒト化抗体は、既知の技術によって調製可能であり、そして抗体をヒトに投与した際、減少した免疫原性の利点を提供する。
【００５２】
［００６３］句「特異的に結合する」は、本明細書において、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドを含む抗体、およびタンパク質、例えばターゲット受容体の間の結合反応を指し、この反応は、タンパク質および他の化学種の不均質な集団における、該タンパク質の存在の決定要因となる。したがって、指定されるイムノアッセイ条件下で、特定のタンパク質に結合した抗体は、試料中に存在する他のタンパク質に、有意な量では結合しない。こうした条件下でのタンパク質への特異的結合は、その特定のタンパク質に対する特異性に関して選択された抗体を必要としうる。多様なイムノアッセイ形式を用いて、特定のタンパク質と選択的に結合する抗体を選択してもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを日常的に用いて、タンパク質と選択的に免疫反応性である抗体を選択する。選択的結合を決定するために使用可能なイムノアッセイ形式および条件の説明に関しては、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ニューヨーク（１９８８）を参照されたい。
【００５３】
ヘテロ二量体ポリペプチド
［００６４］本発明のヘテロ二量体ポリペプチドは、サイトカイン受容体またはケモカイン受容体のリガンド誘導性活性、例えばＴＮＦＲ１またはｐ５５のＴＮＦ誘導性活性に拮抗するための新規アプローチを提供する。特に、ヘテロ二量体ポリペプチドは、重鎖、およびＦｃドメインにさらに融合した軽鎖の、二鎖構造を含む、一価ＩｇＧを含む。したがって、完全ＩｇＧの二価四鎖構造に比較して、ＩｇＧのこの新規の型は、二鎖分子であり、１つの抗原結合部分しか持たない。この分子の重鎖は、標準的ＩｇＧにおけるのと同じである。しかし、軽鎖は、ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域由来の配列との融合によって、さらに延長されている。単に、本発明の例示のため、そしていかなる点でも本発明の範囲を限定することなく、実施例項に記載するように、マウスＴＮＦＲ１に対して向けられる一価ＩｇＧを構築した。分子モデリングに基づいて、ヒトＩｇＧ軽鎖、およびヒトＩｇＧ重鎖のＦｃドメインで構成される融合タンパク質（ＬＣ／Ｆｃ（ｈｕＩｇＧ１））の上部ヒンジ領域中の最初の５残基を、軽鎖およびＦｃの間の接合点で欠失させて、融合接合点を越えた、２つの鎖間の対称的構造を形成した。図５。全体として、この分子のＦｃ領域はＩｇＧに同一であり、そしてしたがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長い血清半減期を含めて、完全ＩｇＧ分子と類似のエフェクター機能を有すると期待される。
【００５４】
［００６５］κまたはλ軽鎖配列いずれかを用いて、４つのヒトＩｇＧアイソタイプすべてのＩｇＧの一価型が作製可能である。軽鎖構築物における接合点配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４形式で異なるであろう。図１に示すように、重鎖をコードするＤＮＡ構築物および融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を哺乳動物細胞内に導入した際、成熟タンパク質産物の２つの型：二鎖一価ＩｇＧ（すなわちヘテロ二量体ポリペプチド）および融合タンパク質ホモ二量体のみが、トランスフェクションされた細胞から分泌可能である。重鎖ホモ二量体は、軽鎖を欠くため、分泌不能である。生じたヘテロ二量体ポリペプチドは、図２に示すように、重鎖構築物上に存在するペプチドタグ、例えばＨｉｓタグを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、融合タンパク質二量体から分離可能である。
【００５５】
［００６６］特に、分子のＦａｂおよびＦｃセグメントを連結するリンカー／ヒンジ領域において、他の変異を設計してもよい。重鎖リンカー配列および軽鎖Ｆｃ融合鎖リンカー配列両方の長さを変動させる（本明細書に記載するリンカーより長いものおよび短いもの両方）と、改変された特性を有する分子が生じると予測され、このうちいくつかは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの療法分子の薬力学的振る舞いに著しい影響を有する可能性もある。
【００５６】
使用
［００６７］一般的に、本発明はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで使用可能な、障害または疾患を治療するかまたは予防するために、ヘテロ二量体ポリペプチドを用いる方法も提供する。本発明で治療されることが意図される疾患には、限定されるわけではないが、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの少なくとも１つのメンバー、例えばＴＮＦＲ１（ｐ５５）またはＴＮＦＲ２（ｐ７５）の活性化によって少なくとも仲介されるものが含まれる。これらの疾患には、限定されるわけではないが、自己免疫疾患が含まれる。本明細書において、自己免疫疾患は、被験体の体が、被験体自身の体の構成要素に対して、不都合な影響を伴って、機能異常な免疫応答を生じる、疾患状態または症候群を記載する。これには、すべての抗原、アレルゲンまたは主要組織適合（ＭＨＣ）抗原に対する特異性を持つ抗体を産生するＢ細胞の産生が含まれうるし、あるいは自己構成要素を認識し、そして炎症を引き起こすサイトカインを産生する受容体を所持するＴ細胞の産生が含まれうる。自己免疫疾患の例には、限定されるわけではないが、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、関節リウマチ、真性糖尿病、悪性貧血、自己免疫胃炎、乾癬、ベーチェット病、ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、自己免疫甲状腺炎、自己免疫卵巣炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多腺性内分泌障害、スティル病、ランバート−イートン筋無力症候群、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、自己免疫精巣炎、自己免疫ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群および強直性脊椎炎が含まれる。
【００５７】
［００６８］さらに、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドが使用可能なターゲット受容体には、そのサブユニットのオリゴマー化によって活性化されるものが含まれる。したがって、本発明によって意図されるターゲット受容体には、限定されるわけではないが、例えばＬｏｃｋｓｌｅｙら，  Ｃｅｌｌ，  １０４：４８７−５０１（２００１）に記載されるものを含むＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、例えばＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，  Ｃｅｌｌ，  １０３：２１１−２２５（２０００）に記載されるものを含む受容体チロシンキナーゼ、例えばＰｉｎら，  ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２７２：２９４７−２９５５（２００５）に記載されるものを含むＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、例えばＨｏｇａｒｔｈ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １４：７９８−８０２（２００２）に記載されるものを含むＦｃ受容体（ＦｃＲ）、例えばＤｅｃｈｅｎｄら，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，  ２４：５７１−５７９（２００４）に記載されるものを含むＡＴ１受容体、例えばＨｏｕｓｔｏｎ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ６：１５９−１７４（２００２）に記載されるものを含む組織因子、および例えばＬｉら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３００：７９５−７９８（２００３）に記載されるものを含むインテグリンが含まれる。
【００５８】
薬学的組成物
［００６９］注射による投与、経口、肺、鼻、経皮または他の型の投与のため、本発明の薬学的組成物を作製してもよい。一般的に、本発明は、本発明の化合物の有効量を、薬学的に許容しうる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと一緒に含む薬学的組成物を含む。こうした組成物には、多様な緩衝液内容物（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）および膨張性物質（例えばラクトース、マンニトール）などの添加剤；ポリ酢酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物への、またはリポソームへの物質の取り込みが含まれる。ヒアルロン酸もまた用いてもよく、そしてこれは、循環中の持続期間を促進する効果を有しうる。こうした組成物は、本タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼしうる。例えば、本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１８版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．  １８０４２，  １４３５−１７１２（１９９０）を参照されたい。組成物は液体型で調製可能であるし、または凍結乾燥型などの乾燥粉末であってもよい。移植可能持続放出配合物もまた意図され、経皮配合物も同様である。
【００５９】
［００７０］本明細書で使用に意図されるのは、本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１８版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．  １８０４２（１９９０）の第８９章に一般的に記載される、経口固体投薬型である。固体投薬型には、錠剤、カプセル、丸剤、トローチまたはロゼンジ、カシェーまたはペレットが含まれる。また、リポソームまたはプロテイノイド被包を用いて、例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されるようなプロテイノイド微小球体のような本組成物を配合してもよい。リポソーム被包を用いてもよいし、そしてリポソームを多様なポリマーで誘導体化してもよい（例えば米国特許第５，０１３，５５６号）。療法剤のためのありうる固体投薬型の説明は、本明細書に援用される、Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｋ．，  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  Ｇ．Ｓ．  ＢａｎｋｅｒおよびＣ．Ｔ．  Ｒｈｏｄｅｓ監修（１９７９）の第１０章に提供される。一般的に、配合物には、本発明の化合物、ならびに胃の環境に対する保護および腸における生物学的活性物質の放出を可能にする、不活性成分が含まれる。
【００６０】
［００７１］やはり特に意図されるのは、上記の本発明の化合物の経口投薬型である。必要な場合、経口送達が有効であるように、化合物を化学的に修飾してもよい。一般的に、意図される化学的修飾は、化合物分子自体への少なくとも１つの部分の付着であり、この部分が、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸から血流への取り込みを可能にする。やはり望ましいのは、化合物の全体の安定性の増加、および体内の循環時間の増加である。本発明において、共有結合したビヒクルとして有用な部分もまた、この目的のために使用可能である。こうした部分の例には：ＰＥＧ、エチレングリコールおよびポリエチレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンならびにポリプロリンが含まれる。例えば、ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよびＤａｖｉｓ，  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，  ＨｏｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ監修，  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク州ニューヨーク，  ３６７−３８３（１９８１）；  Ｎｅｗｍａｒｋら，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４：１８５−１８９（１９８２）を参照されたい。使用可能な他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。薬学的使用に好ましいのは、上に示すように、ＰＥＧ部分である。
【００６１】
［００７２］経口送達投薬型には、本発明の療法化合物の吸収を増進するキャリアーとして、ナトリウムＮ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリレート（ＳＮＡＣ）などの修飾脂肪族アミノ酸の塩を用いることもまた可能である。ＳＮＡＣを用いたヘパリン配合物の臨床的有効性が、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって行われた第ＩＩ相臨床試験において立証されている。米国特許第５，７９２，４５１号、”Ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ”を参照されたい。
【００６２】
［００７３］本発明の化合物は、約１ｍｍの粒子サイズの顆粒またはペレットの形で、細かい多量微粒子として配合物に含まれていてもよい。カプセル投与のための物質の配合はまた、粉末、軽く圧縮されたプラグとしてであってもよいし、または錠剤としてであってさえよい。療法剤を圧縮によって調製してもよい。
【００６３】
［００７４］着色剤およびフレーバー剤は、すべて含まれてもよい。例えば、タンパク質（または誘導体）を、配合して（例えばリポソームまたは微小球体被包によって）、そして次いで、食用製品、例えば着色剤およびフレーバー剤を含有する冷蔵飲料内にさらに含めてもよい。
【００６４】
［００７５］本発明の化合物の体積を不活性物質で希釈するかまたは増加させてもよい。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンが含まれてもよい。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む、特定の無機塩を、充填剤として用いてもよい。いくつかの商業的に入手可能な希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
【００６５】
［００７６］療法剤を固体投薬型に配合する際に、崩壊剤を含むことも可能である。崩壊剤として用いる物質には、限定されるわけではないが、デンプンに基づく商業的崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂを含む、デンプンが含まれる。グリコール酸デンプンナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然海綿およびベントナイトはすべて使用可能である。崩壊剤の別の型は、不溶性の陽イオン交換樹脂である。粉末化粘剤は、崩壊剤として、そして結合剤として使用可能であり、そしてこれらには、寒天、カラヤゴムまたはトラガカントゴムなどの粉末化粘剤が含まれることも可能である。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた、崩壊剤として有用である。
【００６６】
［００７７］結合剤を用いて、療法剤をともに保持して、硬い錠剤を形成することも可能であり、そして結合剤にはアラビアゴム、トラガカントゴム、デンプンおよびゼラチンなどの天然産物由来の物質が含まれる。他のものには、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はどちらも、療法剤を顆粒化するため、アルコール性溶液中で使用可能である。
【００６７】
［００７８］配合プロセス中の粘着を防止するため、療法剤の配合中に抗摩擦剤（ａｎｔｉｆｒｉｃｔｉｏｎａｌ  ａｇｅｎｔ）を含むことも可能である。療法剤およびダイ壁の間に、層として潤滑剤を用いることも可能であり、そしてこれらには、限定されるわけではないが：マグネシウム塩およびカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスが含まれることも可能である。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、多様な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００および６０００などの可溶性潤滑剤もまた使用可能である。
【００６８】
［００７９］配合の間の薬剤の流動特性を改善し、そして圧縮の間の再配置を補助しうる、流動促進剤を、添加することも可能である。流動促進剤には、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和ケイアルミン酸が含まれることも可能である。
【００６９】
［００８０］水性環境への本発明の化合物の溶解を補助するため、界面活性剤を湿潤剤として添加することも可能である。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムおよびジオクチルスルホン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤が含まれることも可能である。陽イオン性界面活性剤も使用可能であり、そしてこれには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれることも可能である。界面活性剤として配合物中に含まれることも可能な、潜在的な非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴル４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の配合物中に、単独でまたは異なる比の混合物として存在することも可能である。
【００７０】
［００８１］添加剤もまた、化合物の取り込みを増進するため、配合物に含まれることも可能である。潜在的にこの特性を有する添加物は、例えば、脂肪酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【００７１】
［００８２］徐放配合物が望ましい可能性もある。拡散または浸出機構いずれかによる放出を可能にする不活性マトリックス、例えば粘剤に、本発明の化合物を取り込むことも可能である。ゆっくり変性するマトリックス、例えばアルギン酸塩、多糖もまた、配合物中に取り込み可能である。本発明の化合物の徐放の別の型は、Ｏｒｏｓ療法系（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法により、すなわち、浸透圧効果によって、単一の小さい開口部を通じて、水が進入するのを可能にし、そして薬剤が押し出されるのを可能にする半透膜中に、薬剤が封入される。いくつかの腸溶性コーティングもまた、遅延放出効果を有する。
【００７２】
［００８３］他のコーティングを配合に用いることも可能である。これらには、コーティングパン中で適用可能な、多様な糖が含まれる。療法剤をフィルムコーティング錠剤中に提供することもまた可能であり、そしてこの例で用いる物質は２群に分けられる。第１群は、非腸溶物質であり、そしてメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコール類が含まれる。第２群は、通常、フタル酸のエステルである、腸溶物質からなる。
【００７３】
［００８４］物質の混合を用いて、最適なフィルムコーティングを提供することも可能である。パンコーティング器具中または流動化ベッド中または圧縮コーティングによって、フィルムコーティングを行うことも可能である。
【００７４】
［００８５］肺送達型。やはり本明細書に意図されるのは、本発明のタンパク質（またはその誘導体）の肺送達である。タンパク質（または誘導体）は、吸入されつつ哺乳動物の肺に送達され、そして肺上皮裏打ちを横断して血流に入る（これに関する他の報告には、Ａｄｊｅｉら，  Ｐｈａｒｍａ．  Ｒｅｓ．，  ７：５６５−５６９（１９９０）；  Ａｄｊｅｉら，  Ｉｎｔ’ｌ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−１４４（１９９０）、酢酸ロイプロリド；  Ｂｒａｑｕｅｔら，  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １３（５）：ｓ  １４３−１４６（１９９０）エンドセリン−１；  Ｈｕｂｂａｒｄら，  Ａｎｎａｌｓ  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．，  ３：２０６−２１２（１９８９）アルファ１−アンチトリプシン；  Ｓｍｉｔｈら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ８４：１１４５−１１４６（１９８９）アルファ１−プロテイナーゼ；  Ｏｓｗｅｉｎら，  ”Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｓｙｍｐ．  Ｒｅｓｐ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，  コロラド州キーストーン（１９９０年３月）組換えヒト成長ホルモン；  Ｄｅｂｓら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４０：３４８２−３４８８（１９８８）インターフェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子アルファ；ならびにＰｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる）。
【００７５】
［００８６］本発明の実施に使用が意図されるのは、療法製品の肺送達のために設計された広範囲の機械的デバイスであり、限定されるわけではないが、ネブライザー、定量吸入器、および粉末吸入器が含まれ、これらはすべて当業者に周知である。本発明の実施に適した商業的に入手可能なデバイスのいくつかの特定の例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，  Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイスに製造されるＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー；  Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、コロラド州エングルウッドに製造されるＡｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー；  Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパークに製造されるＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器；およびＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ベッドフォードに製造されるＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【００７６】
［００８７］こうしたデバイスはすべて、本発明の化合物の分配に適した配合物の使用を要する。典型的には、各配合物は、使用するデバイスの種類に特異的であり、そして療法に有用な希釈剤、アジュバントおよび／またはキャリアーに加えて、適切な噴霧剤物質の使用を伴うことも可能である。
【００７７】
［００８８］本発明の化合物は、遠位肺への送達を最も有効にするため、最も好適には、１０μｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒子サイズの微粒子型で調製されるべきである。
【００７８】
［００８９］薬学的に許容しうるキャリアーには、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、およびソルビトールなどの炭水化物が含まれる。配合物中で使用する他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣが含まれることも可能である。天然界面活性剤または合成界面活性剤も使用可能である。ＰＥＧも使用可能である（タンパク質または類似体の誘導体化における使用を別としても）。シクロデキストランなどのデキストランも使用可能である。胆汁酸塩および他の関連増進剤も使用可能である。セルロースおよびセルロース誘導体も使用可能である。緩衝配合物中の使用などで、アミノ酸も使用可能である。
【００７９】
［００９０］また、リポソーム、微小カプセルまたは微小球体、封入複合体、または他の種類のキャリアーの使用も、意図される。
［００９１］ジェットネブライザーまたは超音波ネブライザーいずれかのネブライザーでの使用に適した配合物は、典型的には、溶液１ｍｌあたり、約０．１〜２５ｍｇの生物学的活性タンパク質の濃度で、水に溶解された本発明の化合物を含むであろう。配合物はまた、緩衝剤および単糖も含むことも可能である（例えばタンパク質安定化および浸透圧制御のため）。エアロゾルを形成する際、溶液の噴霧化によって引き起こされるタンパク質の表面誘導性凝集を減少させるかまたは防止するため、ネブライザー配合物はまた、界面活性剤を含有することも可能である。
【００８０】
［００９２］定量吸入デバイスで使用する配合物は、一般的に、界面活性剤の補助で、噴霧剤中に懸濁された本発明の化合物を含有する、細分割粉末を含むであろう。噴霧剤は、この目的に使用される慣用的物質いずれであることも可能であり、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはヒドロカーボンがあり、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはその併用が含まれる。適切な界面活性剤には、三オレイン酸ソルビタンおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸はまた、界面活性剤としても有用でありうる。
【００８１】
［００９３］粉末吸入デバイスから分配するための配合物は、本発明の化合物を含有する、細分割乾燥粉末を含み、そしてまた、デバイスからの粉末の分散を容易にする量、例えば配合物の重量の５０〜９０％で、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはキシリトールなどの充填剤を含むことも可能である。
【００８２】
［００９４］鼻送達型。本発明の化合物の鼻送達もまた意図される。鼻送達は、鼻への療法産物の投与後、肺に産物が沈着する必要を伴わずに、タンパク質が直接血流に通過することを可能にする。鼻送達のための配合物には、デキストランまたはシクロデキストランを用いたものが含まれる。他の粘膜を渡る輸送を介した送達もまた意図される。
【００８３】
［００９５］頬側送達型。本発明の化合物の頬側送達もまた意図される。頬側送達配合物が、ペプチドを用いた使用のため、当該技術分野に知られる。
投薬量
［００９６］上述の状態を治療するための方法に伴う投薬措置は、薬剤の作用を修飾する多様な要因、例えば患者の年齢、状態、体重、性別および食餌、何らかの感染の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因を考慮して、主治医によって決定されるであろう。一般的に、一日措置は、体重キログラムあたり、本発明の化合物の０．１〜１０００マイクログラム、好ましくはキログラムあたり０．１〜１５０マイクログラムの範囲内であるべきである。
【００８４】
［００９７］本発明の他の側面および利点は、以下の例示的実施例を考慮すると、さらに理解されるであろう。
【実施例】
【００８５】
実施例
抗ｐ５５一価抗体の構築
［００９８］マウスｐ５５ＴＮＦＲを免疫原として用いて、１４Ｄ２と称されるハムスター抗ｐ５５ＴＮＦＲ抗体を生成した。エドマン分析によって決定されるような、精製１４Ｄ２のＮ末端配列から推定した５’端配列に対する縮重プライマー、およびハムスターＩｇＧ１重鎖のＣＨ１ドメインをコードする配列に相補的な３’プライマーを用いて、１４Ｄ２ハイブリドーマ細胞から得た総ＲＮＡから、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をクローニングした。以下のプライマー：
【００８６】
【化１】
2009512453.tif 000003
【００８７】
を用いて、１４Ｄ２  ＶＬを増幅することによって、１４Ｄ２  ＶＬ−ｈｕ軽鎖κ融合体を作製した。
［００９９］ｈｕ  κ軽鎖定常配列の配列を含有するベクター内に、単位複製配列をサブクローニングした。以下のプライマー：
【００８８】
【化２】
2009512453.tif 000004
【００８９】
ならびにテンプレート：１４Ｄ２ＶＬ−ｈｕ  κＬＣおよびｈｕ  ＩｇＧ１を用いて、重複伸長によって、１４Ｄ２ＶＬ−ｈｕ  κＬＣ−ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ融合体を一緒にスプライシングした。
【００９０】
［００１００］それぞれ５’および３’にＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位を付加するため、以下のプライマー：
【００９１】
【化３】
2009512453.tif 000005
【００９２】
で１４Ｄ２  ＶＨを増幅して、哺乳動物発現ベクターにおいて、ｈｕＩｇＧ１−Ｈｉｓ６定常配列のすぐ上流に１４Ｄ２ＶＨを連結することによって、１４Ｄ２ＶＨ−ｈｕＩｇＧ１−Ｈｉｓ６融合体を構築した。
【００９３】
抗ｐ５５一価抗体の産生
［００１０１］ＣＯＳ−ＰＫＢ細胞を、１４Ｄ２ＶＨ−ｈｕＩｇＧ１−Ｈｉｓ６融合タンパク質（配列番号９）を含有する発現プラスミド、および１４Ｄ２ＶＬ−ｈｕ  κＬＣ−ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１０）を含有する発現プラスミドで、ＤＥＡＥ−デキストラン法によって、同時にトランスフェクションした。次いで、細胞を低ＩｇＧ培地（０．５％）中、３４℃、１０％ＣＯ２でインキュベーションした。トランスフェクションの７日後に、細胞培養上清を採取した。
【００９４】
ポリペプチド精製
［００１０２］０．２μフィルターを通じて、細胞培養上清をろ過した。ろ過した上清をＨｉＴＲＡＰ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に適用した。１００ｍＭグリシンｐＨ２．７／１５０ｍＭ  ＮａＣｌによって、タンパク質を溶出させた。溶出液を、ＰＢＳに対して透析し、そして以下のように、ＨｉｓＴＲＡＰ  ＨＰキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて金属キレートすることによってさらに精製した：透析した試料を、Ｎｉ＋であらかじめチャージしたＨｉｓＴｒａｐカラムに適用し、ＰＢＳでカラムを洗浄し、イミダゾールの段階勾配（２０、４０、６０、１００、３００、５００ｎＭ）で溶出させる。ピーク分画を収集し、そしてＰＢＳに対して透析する。結果を図２に示す。
【００９５】
ウェスタンブロット
［００１０３］還元および非還元条件下で、５００ｎＭイミダゾール分画から溶出したポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、次いで、ナイロン膜にトランスファーし、そしてＨＲＰコンジュゲート化抗ポリヒスチジン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ  ７０５８）またはヤギ抗ヒト・カッパ軽鎖抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ７１６４）を用いたウェスタンブロットに供した。結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。
【００９６】
Ｌ９２９アッセイ
［００１０４］マウスＬ９２９細胞ターゲットと、細胞傷害性剤としてネズミまたはヒトＴＮＦを用いた、細胞溶解性アッセイにおいて、上記の抗ｐ５５一価抗体の生物学的活性を試験した。クリスタルバイオレット指示薬によって、細胞死を評価した（Ｍｏｈｌｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ，  １５１（３）：１５４８−１５６１（１９９３））。簡潔には、９６ウェル・トレイ（Ｃｏｓｔａｒ）中、総体積１００μｌの培地中で、２ｘ１０４  Ｌ９２９細胞をプレーティングし、そして５％ＣＯ２大気中、３７℃で一晩インキュベーションした。次いで、使用済みの培地を取り除き、そして抗体の連続希釈の存在下または非存在下、１ｎｇ／ｍｌ  μＴＮＦを含有する培地を添加した。アクチノマイシンＤ（５ｍｇ／ｍｌ）がすべてのウェルに存在した。このアッセイにおいて１００％細胞溶解を生じる、１ｎｇ／ｍｌの一定量のＴＮＦを、先の実験から決定した。１２時間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてメタノール／水（１／４）中の０．５％クリスタルバイオレット１００ｍｌで１０分間染色した。プレートを再蒸留水で洗浄し、そして指示薬を２％デオキシコール酸ナトリウムで可溶化した。すべてのアッセイを３つ組で行った。マイクロプレート読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  カリフォルニア州パロアルト）中で、５７０〜６３０ｎｍの吸光度（Ａ）を決定した。結果を図４に示す。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】［００３５］図１は、二鎖一価ＩｇＧの設計を図解する。左に図解するのは、２つの哺乳動物発現構築物であり、一方（上部）は重鎖をコードし、そして他方（下部）は、Ｆｃ分子に融合した軽鎖を含む融合タンパク質である。重鎖および軽鎖は、１４Ｄ２と称される抗マウスｐ５５ＴＮＦＲ一価ＩｇＧに由来する。３つのありうるタンパク質産物を右に図示する。示すように、重鎖ホモ二量体は分泌不能である。Δヒンジは、最初の５つのアミノ酸（ＥＰＫＳＣ）が欠失していることを除いて、ヒンジと同じである。
【図２】［００３６］図２は、ＣＯＳ細胞における、１４Ｄ２一価ＩｇＧの産生および精製の結果を示す。略語：Ｓ、上清；ＦＴ、フロースルー；Ｗ、洗浄；ＥＬ、溶出。
【図３Ａ】［００３７］図３Ａは、３００ｍＭイミダゾール分画における一価ＩｇＧの分子特性を示す。還元および非還元条件下での３００ｍＭイミダゾール分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図３Ｂ】［００３８］図３Ｂは、抗軽鎖−ＨＲＰ抗体（左）および抗ポリＨｉｓ−ＨＲＰ抗体（右）を用いた、３００ｍＭイミダゾール分画のウェスタンブロットによる、一価ＩｇＧの分子特性を示す。各バンドの分子内容物を矢印で強調する。
【図４】［００３９］図４は、Ｌ９２９細胞を用いた、ＴＮＦが仲介する細胞溶解アッセイの結果を示す。１４Ｄ２抗マウスｐ５５ＴＮＦＲ抗体を一価ＩｇＧ１およびハムスター−ヒトＩｇＧ１キメラとして再フォーマットした。Ｌ９２９細胞における、ＴＮＦが仲介する殺細胞をブロッキングする能力に関して、両抗体を試験した。抗ＫＬＨ抗体を対照として用いた。
【図５】［００４０］図５は、実施例に記載するような、ｐ５５に対して向けられる一価抗体、１４Ｄ２のアミノ酸配列を示す：Ｈｉｓ６でタグ化された重鎖（上部）およびＦｃ単量体に融合した軽鎖を含む融合タンパク質（下部）。
【図６】［００４１］図６は、ｐ５５に対して向けられるモノクローナル抗体、１４Ｄ２の重鎖（上部）および軽鎖（下部）の可変配列を示す。各可変ドメインにおけるＣＤＲ（相補性ドメイン領域）およびＦＲ（フレームワーク領域）の位置および配列は示すとおりである。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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