(57)【要約】  本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）の新規マーカーを提供することを課題とし、より詳しくはＲＡ特異的に発現が増減しうるマーカーを提供することを課題とする。さらには、ＲＡの病因として、マーカーであるｍｉＲＮＡが関与するかを確認し、関与するｍｉＲＮＡを用いたＲＡ検査方法および治療剤を提供することを課題とする。  ＲＡ滑膜細胞中のｓｍａｌｌＲＮＡ発現プロファイルから、ＲＡ滑膜細胞に特異的に発現の増減が認められるｍｉＲＮＡ（例えばｍｉＲ１２４ａ）をマーカーとする。さらに、ｍｉＲＮＡ（例えばｍｉＲ１２４ａ）を有効成分とするＲＡ治療剤とする。
2010001632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチ特異的に発現抑制が認められる非コードＲＮＡからなる関節リウマチマーカー。
【請求項２】
前記非コードＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である請求項１に記載の関節リウマチマーカー。
【請求項３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、ｍｉＲ−１２４ａである請求項２に記載の関節リウマチマーカー。
【請求項４】
前記関節リウマチマーカーの塩基配列が、以下から選択される、請求項１または２に記載の関節リウマチマーカー：
１）UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA（配列番号１）；
２）上記１）に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドのうち、１〜２個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加または挿入されてなる塩基配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１に記載の関節リウマチマーカーを指標とする関節リウマチの検査方法。
【請求項６】
以下の工程を含む関節リウマチの検査方法：
１）請求項１〜４のいずれか１に記載の関節リウマチマーカーを指標とし、採取した生体検体中の関節リウマチマーカー（Ａ）を定量する工程；
２）上記定量して得た関節リウマチマーカー（Ａ）の定量値を、関節リウマチではない生体検体中の関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値と比較する工程。
【請求項７】
前記関節リウマチマーカー（Ａ）および前記関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値が、これらのマーカーとしてのオリゴヌクレオチド量である、請求項６に記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項８】
前記関節リウマチマーカー（Ａ）の定量値が、前記関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値よりも低い場合に、関節リウマチであると判断する、請求項６または７に記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項９】
以下より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、関節リウマチの治療剤：
１）UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA（配列番号１）；
２）上記１）に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドのうち、１〜２個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加または挿入されてなる塩基配列。
【請求項１０】
ｍｉＲ−１２４ａを構成するオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、関節リウマチの治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ（Rheumatoid Arthritis; ＲＡ）関連のマイクロＲＮＡに関し、更には該マイクロＲＮＡを指標とする関節リウマチの検査方法および該マイクロＲＮＡを有効成分として含む関節リウマチ治療剤に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２００８−１７４０７２号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
関節リウマチは、関節痛（関節滑膜炎）を引き起こす、慢性・全身性・進行性の原因不明の自己免疫疾患である。わが国においては、約７０万人以上が罹患している。関節リウマチはどの年齢のヒトでも発症するが、３０歳代から５０歳代で発症するヒトが多くみられる。【０００４】
関節リウマチの発症は遺伝的素因に環境因子が関与していると考えられているが、その病因は不明である。関節リウマチは、リンパ球のなかのＣＤ４＋細胞が主体の全身性の疾患であり、関節リウマチの病態は好中球、リンパ球やマクロファージなどの炎症性細胞の関節への浸潤とそれに伴う関節中の滑膜細胞の炎症性異常増殖、その後、軟骨の破壊や骨びらんを生じ、最終的には関節構造が破壊される。【０００５】
関節リウマチの診断には、リウマトイド因子（ＲＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３）や、抗環状シトルリン化ペプチド抗体（抗ＣＣＰ抗体）などがマーカーとして挙げられる。抗ＣＣＰ抗体は近年開発された関節リウマチの血清診断マーカーであり、それまでの診断方法と比べて優れた関節リウマチの診断方法といわれているが、十分に満足のできるものではない。特に発症早期の関節リウマチを的確に診断することは難しく、発症早期に関節リウマチを診断し、より早期に治療を開始することの重要性が明らかになってきている。【０００６】
関節リウマチは、多発性関節痛を主症状とするが、原因が特定されていない炎症性疾患である。関節リウマチでは滑膜の炎症性浸潤、滑膜細胞の増殖、重層化と血管新生を伴い、病態が進行していく。特に、滑膜細胞の異常増殖、活性化は、リウマチの主病変の一つと考えられており（Harriset et al., 1990, N. Eng. J. Med. 332, 1277-1289）、リウマチ患者の関節を調べると、滑膜絨毛の増殖や滑膜組織細胞の多層化等が認められ、滑膜細胞が異常増殖していることがわかる。しかしながら、関節リウマチの病態形成に重要な役割を果たす滑膜細胞のこのような機能過剰の原因は未だ十分解明されているとはいえず、滑膜細胞の異常増殖を抑制することが関節リウマチの治療において極めて重要であると考えられる。【０００７】
従来からの抗リウマチ薬の治療では関節炎の進行を完全に抑制することができず、無効例も多くみられる。また、近年開発された生物学的製剤（抗ＴＮＦα抗体）においても、無効例あるいは効果減弱例が認められることや高額な治療費を必要とすることなど、問題点が多い。これより、関節リウマチの病因を明らかにし、新たな診断法や治療法を開発することは、医学的、社会的に重要なことである。【０００８】
生物の遺伝子情報が解明されるにつれ、高等生物においてタンパク質をコードしていない非コードのＤＮＡの割合が高等生物ほど非常に多いことが判明され、ヒトでは全ＤＮＡの９８．３％が非コードのＤＮＡであるといわれている。また、ヒトでは全ゲノムの２／３からＲＮＡが転写されると推定されていることから、生物種の複雑さに応じて非コードＲＮＡの種類と量が増加すると推定され、非コードのＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」という。）が発見された。ｍｉＲＮＡは、１８〜２２塩基の非コードＲＮＡの総称で、ヒトの遺伝子の約１／３がｍｉＲＮＡで制御されていると考えられている。ｍｉＲＮＡのプロセシングについては既に各種報告がなされている。このｍｉＲＮＡは真核生物で発現し、高度に保存されており、ヒトでは約１０００種類あるものと推定されている。ｍｉＲＮＡに関し、低分子核酸の検出方法が特表２００６−５１０３７２号公報（特許文献１）に開示されている。【０００９】
ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現の制御において重要な役割を担っている。ｍｉＲＮＡは、核内ではＰｒｉ−ｍｉＲＮＡとしてＤＮＡから転写され、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）前駆体となる。ｄｓＲＮＡは細胞質内に移行し、Ｄｉｃｅｒの作用により成熟したｍｉＲＮＡが生成される。生成したｍｉＲＮＡはＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex)複合体に取込まれ、遺伝子機能制御に関与する。ｍｉＲＮＡは、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とよく似た作用を有するが、その作用は不明な点が多い。例えばＲＮＡｉは標的ＲＮＡを切断することにより翻訳を抑制するが、ｍｉＲＮＡの多くは標的ＲＮＡを切断せずに翻訳抑制すると考えられている。また、ｍｉＲＮＡは、発生、分化、細胞周期や癌疾患などに関与している可能性が報告され、例えば肺癌、結腸癌、胸部癌、前立腺癌、膀胱癌や膵臓癌患者の腫瘍組織では特定のｍｉＲＮＡからそれぞれの腫瘍タイプと正常サンプルとを識別できることが明らかとなっている（特許文献２）。【００１０】
しかし、ｍｉＲＮＡに関し、免疫系や免疫疾患に関する報告はごく僅かであり、関節リウマチに関する報告はまだみられない。
【特許文献１】特表２００６−５１０３７２号公報
【特許文献２】特表２００８−５１１６７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、関節リウマチの新規マーカーを提供することを課題とし、より詳しくは関節リウマチ特異的に発現が増減しうるマーカーを提供することを課題とする。さらには、関節リウマチの病因として、マーカーであるｍｉＲＮＡが関与するかを確認し、関与するｍｉＲＮＡを用いた関節リウマチの検査方法および関節リウマチ治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために関節リウマチの関節中の滑膜細胞（「ＲＡ滑膜細胞」ともいう。）中のｓｍａｌｌＲＮＡに着目し、鋭意研究を重ねた結果、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルから、ＲＡ滑膜細胞に特異的に発現の増減が認められるｍｉＲＮＡの存在を初めて見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．関節リウマチ特異的に発現抑制が認められる非コードＲＮＡからなる関節リウマチマーカー。
２．前記非コードＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である前項１に記載の関節リウマチマーカー。
３．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、ｍｉＲ−１２４ａである前項２に記載の関節リウマチマーカー。
４．前記関節リウマチマーカーの塩基配列が、以下から選択される、前項１または２に記載の関節リウマチマーカー：
１）UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA（配列番号１）；
２）上記１）に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドのうち、１〜２個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加または挿入されてなる塩基配列。
５．前項１〜４のいずれか１に記載の関節リウマチマーカーを指標とする関節リウマチの検査方法。
６．以下の工程を含む関節リウマチの検査方法：
１）前項１〜４のいずれか１に記載の関節リウマチマーカーを指標とし、採取した生体検体中の関節リウマチマーカー（Ａ）を定量する工程；
２）上記定量して得た関節リウマチマーカー（Ａ）の定量値を、関節リウマチではない生体検体中の関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値と比較する工程。
７．前記関節リウマチマーカー（Ａ）および前記関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値が、これらのマーカーとしてのオリゴヌクレオチド量である、前項６に記載の関節リウマチの検査方法。
８．前記関節リウマチマーカー（Ａ）の定量値が、前記関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値よりも低い場合に、関節リウマチであると判断する、前項６または７に記載の関節リウマチの検査方法。
９．以下より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、関節リウマチの治療剤：
１）UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA（配列番号１）；
２）上記１）に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドのうち、１〜２個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加または挿入されてなる塩基配列。
１０．ｍｉＲ−１２４ａを構成するオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、関節リウマチの治療剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の関節リウマチマーカーは、関節リウマチ特異的に発現の増減が認められる非コードＲＮＡであり、特に発現抑制が認められるｍｉ−ＲＮＡ（ｍｉＲ−１２４ａ）は、ＣＤＫ(cyclin-dependent kinase)２、ＣＤＫ６およびＭＣＰ１(MonocyteChemotactic Protein-1)のｍＲＮＡに直接作用する。このことから、本発明の関節リウマチマーカーである非コードＲＮＡは、細胞周期および炎症関連タンパク質の発現に関与することが確認された。本発明の関節リウマチマーカーである非コードＲＮＡの発現が抑制されることで、ＲＡ滑膜細胞に対してＣＤＫ２、ＣＤＫ６およびＭＣＰ１が作用し、関節リウマチの病態に関連するものと考えられる。本発明の非コードＲＮＡを構成するオリゴヌクレオチドは、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６およびＭＣＰ１の発現を制御し、これらのタンパク質に起因するＲＡ滑膜細胞の炎症および増殖を抑制し、関節リウマチ治療の有効成分として作用する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】関節リウマチ由来滑膜細胞（ＲＡ−ＦＬＳ）と変形性関節症由来滑膜細胞（ＯＡ−ＦＬＳ）でのｍｉ−ＲＮＡの発現パターンを示す図である。（参考例１）
【図２】ＲＡ−ＦＬＳにｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａまたは対照ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをトランスフェクションし、２４〜９６時間培養したときの細胞でのｍｉＲ−１２４ａの発現量を示す図である。（実施例１）
【図３】ＲＡ−ＦＬＳ、ＯＡ−ＦＬＳおよびＥ１１細胞、ＨｅＬａ細胞にｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションしたときの細胞増殖に及ぼす影響を示す図である（ＸＴＴ法）。（実験例１）
【図４】ＲＡ−ＦＬＳにｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションしたときの細胞増殖に及ぼす影響を示す図である。（実験例１）
【図５】ＲＡ−ＦＬＳまたはＥ１１細胞にｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションしたのち、ＲＡ−ＦＬＳについては９６時間、Ｅ１１細胞は７２時間培養時の培養状況を示す図である。（実験例１）
【図６】ＲＡ−ＦＬＳまたはＥ１１細胞の細胞周期に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例２）
【図７】ＲＡ−ＦＬＳの細胞周期に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例２）
【図８】ＲＡ−ＦＬＳのアポトーシスに及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例３）
【図９】ＲＡ−ＦＬＳのアポトーシスに及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例３）
【図１０】Ｅ１１細胞のアポトーシスに及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例３）
【図１１】各種ＲＡ−ＦＬＳとＯＡ−ＦＬＳのＣＤＫ２発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例４）
【図１２】各種ＲＡ−ＦＬＳとＯＡ−ＦＬＳのＣＤＫ２発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例４）
【図１３】各種ＲＡ−ＦＬＳのＣＤＫ２発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例５）
【図１４】ＣＤＫ２のｍＲＮＡ非コード３’領域に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例６）
【図１５】各種ＲＡ−ＦＬＳのＭＣＰ１発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例７）
【図１６】ＭＣＰ１のｍＲＮＡ非コード３’領域に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例８）
【図１７】ＲＡ−ＦＬＳ  ＲＡ２０細胞およびＥ１１細胞でのＣＤＫ６発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響を示す図である。（実験例９）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において、関節リウマチ（以下単に「ＲＡ」という場合もある。）とは、日本リウマチ学会総会および厚生労働省において定義される疾患をいう。関節の内部を覆っている結合組織として最も関節側にあるものを滑膜といい、関節内に生じたゴミを除去したり、関節液を分泌したりする役割を有する。関節リウマチの場合は、この滑膜に炎症が引き起こされ、初期には表層細胞の増殖がみられる。【００１７】
本発明では、関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（osteoarthritis, degenerativejoint disease; ＯＡ、以下単に「ＯＡ」という場合もある。）の滑膜細胞中のｓｍａｌｌＲＮＡに着目し、両者により発現量の異なるＲＮＡをさらに解析することで、本発明の非コードＲＮＡからなる関節リウマチマーカーを得た。前記関節リウマチマーカーは、関節リウマチ特異的に発現抑制が認められるｓｍａｌｌＲＮＡからなり、該ｓｍａｌｌＲＮＡは、塩基数が１８〜２００のオリゴヌクレオチドであり、好ましくは塩基数が１８〜５０であり、より好ましくは塩基数が１８〜２２の非コードのＲＮＡである。このようなオリゴヌクレオチドとして、ｍｉＲＮＡが挙げられ、より具体的にはｍｉＲ−１２４ａ（配列番号１）またはｍｉＲ−１２４が挙げられる。具体的には、以下の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドが挙げられ、ｍｉＲ−１２４は、配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１番目と２２番目のヌクレオチド（塩基U、A）が欠失したものである。
１）UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA（配列番号１）
２）上記１）に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドのうち、１〜２個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加または挿入されてなる塩基配列。【００１８】
本発明は、上記関節リウマチマーカーを指標とする関節リウマチの検査方法にも及ぶ。具体的には、被験者の滑膜細胞から上述した本発明の関節リウマチマーカーとしてのオリゴヌクレオチド量を定量することにより検査することができる。例えば、関節リウマチではないヒトの滑膜細胞中のマーカー量に対して、発現が抑制された本発明の関節リウマチマーカー、例えばｍｉＲ−１２４ａを検出することで、関節リウマチを検査することができる。発現抑制の程度は、特に限定されないが、関節リウマチを発現していない場合と比較して、例えば１／２以下に発現が抑制されている場合をいう。【００１９】
関節リウマチの検査方法としては、以下の工程を含む検査方法が挙げられる：
１）上記関節リウマチマーカーを指標とし、採取した生体検体中の関節リウマチマーカー（Ａ）を定量する工程；
２）上記定量して得た関節リウマチマーカー（Ａ）の定量値を、関節リウマチではない生体検体中の関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値と比較する工程。
ここで、関節リウマチマーカー（Ａ）に係る採取した生体検体とは、被験者から採取した検体が挙げられ、具体的には前記の例では関節リウマチの診断を所望する被験者の滑膜細胞を生体検体とすることができる。滑膜細胞は、自体公知の取得方法により得ることができる。関節リウマチマーカー（Ｂ）に係る関節リウマチではない生体検体とは、明らかに関節リウマチではないと判断されるものから得た生体検体であり、具体的には例えば変形性関節症患者から得た滑膜細胞が挙げられる。【００２０】
前記関節リウマチマーカー（Ａ）および前記関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値は、これらのマーカーとしてのオリゴヌクレオチド量を定量することにより、得ることができる。具体的には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法やstem-loop ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、本発明の関節リウマチマーカーが一定量に増幅されるまでのサイクル数を計測し、△Ｃｔ法により計測することができる。【００２１】
関節リウマチの検査に際しては、前記の例では前記関節リウマチマーカー（Ａ）の定量値が、前記関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値よりも低い場合に、被験者が関節リウマチであると判断することができる。【００２２】
本発明は、さらに以下の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、関節リウマチ治療剤にも及ぶ。具体的には、本発明の関節リウマチマーカーと実質的に同等の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有効成分として含む。その配列はｍｉＲ−１２４ａを構成するオリゴヌクレオチド（配列番号１）と実質的に同等であり、より具体的には以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。下記塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むのであれば、これらのオリゴヌクレオチドの前駆体を構成するオリゴヌクレオチドであっても良い。具体的には、例えばｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａまたはｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４を構成するオリゴヌクレオチドであってもよい。
１）UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA（配列番号１）
２）上記１）に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドのうち、１〜２個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加または挿入されてなる塩基配列。【００２３】
上述のオリゴヌクレオチドは、細胞周期および炎症関連タンパク質の発現に関与する。本発明の関節リウマチマーカーとしての非コードＲＮＡであるオリゴヌクレオチドの発現が抑制されることで、ＲＡ滑膜細胞に対して、炎症関連タンパク質であるＭＣＰ１、および細胞周期のＧ１期からＳ期にわたって機能するＣＤＫ２やＣＤＫ６が作用し、関節リウマチの病態に関連するものと考えられる。上述のオリゴヌクレオチドは、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６およびＭＣＰ１の発現を制御し、これらのタンパク質に起因するＲＡ滑膜細胞の炎症および増殖を抑制し、関節リウマチ治療のための有効成分として作用する。【００２４】
本発明の関節リウマチ治療剤は、有効成分としてのオリゴヌクレオチドを薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、安定化剤等とともに製剤化し、患者に投与することができる。この目的で用いる製剤用の助剤は、当業者に周知のものを利用することができる。本発明の関節リウマチ治療剤は、靜脈内投与、経口投与等、好ましい投与経路を設定して、望ましい治療効果を達成することが期待できる。また、本発明の関節リウマチ治療剤に用いられるオリゴヌクレオチドを治療遺伝子として、前述の治療用にデザインされた担体と併せて遺伝子治療用組成物を調製することができる。さらに、遺伝子治療用には、例えばアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いる方法など、自体公知の方法を利用することができる。
【実施例】
【００２５】
本発明の理解を助けるために、以下に本発明を完成するに至る参考例を示し、さらに実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。【００２６】
（参考例１）ＲＡ滑膜細胞中のｍｉＲＮＡの発現プロファイル
米国リウマチ学会の基準により診断されたＲＡおよび、対照としての変形性関節症（ＯＡ）の患者からインフォームドコンセントおよび倫理委員会を経て滑膜細胞を取得した（ＲＡ滑膜細胞（ＲＡ−ＦＬＳ）およびＯＡ滑膜細胞（ＯＡ−ＦＬＳ））。各細胞は、１０％ＦＣＳおよび４ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ培地で培養し、維持した。上記細胞から２００塩基以下のｓｍａｌｌＲＮＡを抽出し（mirVanaTMmiRNA Bioarrays, Ambion社製）、ｍｉＲＮＡ発現解析を行った。ｓｍａｌｌＲＮＡの抽出は自体公知の方法に従った。抽出した１５６種類のｍｉＲＮＡについてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R) MicroRNA Assays, Applied Biosystems社製）で△Ｃｔ法により定量を行った。【００２７】
その結果、ＲＡ−ＦＬＳとＯＡ−ＦＬＳにおいて発現量が２倍以上異なるｍｉＲＮＡが６種類検出され、内５種類はＲＡ−ＦＬＳで発現が亢進しており、１種類は発現が低下していることが確認された（表１、図１）。これらのうち、ＲＡ−ＦＬＳで低下しているｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４ａであった。【００２８】
【表１】
2010001632.tif 000003
【００２９】
（実施例１）ＲＡ−ＦＬＳでのｍｉＲＮＡの発現
３００ｐｍｏｌのｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａまたは対照のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（Ambion社）を１０μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen社）とともに１ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Invitrogen社）に加えた。その後混合物を径６０ｍｍのプレートに加え、室温にて２０分間保温した。その後、ＲＰＭＩ培地中のＲＡ−ＦＬＳ細胞浮遊液（１×１０５個／ｍｌ）をプレートに５ｍｌ播種し、その混合物をＣＯ２インキュベーター内で２４〜９６時間培養した。ｍｉＲ−１２４ａ特異的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R) MicroRNA Assays, Applied Biosystems社製）で、△Ｃｔ法により定量を行った。【００３０】
その結果、同量のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを加えた結果、対照のｍｉＲＮＡの発現量に比べて、ｍｉＲ−１２４ａの発現量は各培養時間において高いことが確認された（図２）。【００３１】
（実験例１）各種細胞増殖に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響
ｍｉＲ−１２４ａの各種細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。
実施例１と同様に３００ｐｍｏｌのｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａまたは対照のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（Ambion社）を、ＯＡ−ＦＬＳ（ｎ＝２）、ＲＡ−ＦＬＳ（ｎ＝４）、Ｅ１１細胞およびＨｅＬａ細胞の各細胞にトランスフェクションし、ＣＯ２インキュベーター内で２４〜９６時間培養したときの細胞増殖に及ぼす影響を調べた。【００３２】
Cell Proliferation Kit II (Roche Applied Science社製）を用いたＸＴＴ法による細胞増殖度の測定結果は、ＲＡ−ＦＬＳ、ＯＡ−ＦＬＳ、Ｅ１１およびＨｅＬａ細胞において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションしたときのほうが、明らかに抑制されることが確認された（図３）。【００３３】
トリパンブルー法により細胞数を計測した場合も、図４に示すように、ＲＡ−ＦＬＳ細胞においてｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションしたときのほうが、明らかに細胞増殖の抑制が認められた。【００３４】
また、培養９６時間後のＲＡ−ＦＬＳ細胞および培養７２時間後のＥ１１細胞の各細胞の増殖度を顕微鏡で観察したときの写真を図５に示した。この結果からも、各細胞についてｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションしたときのほうが、明らかに細胞の増殖が抑制され、特にＥ１１（付着性細胞）では剥離しつつあることが確認された。【００３５】
（実験例２）各種細胞の細胞周期に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響
ｍｉＲ−１２４ａの各細胞周期に及ぼす影響を調べた。
実施例１と同様に３００ｐｍｏｌのｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａまたは対照のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（Ambion社）を、ＲＡ−ＦＬＳおよびＥ１１細胞にトランスフェクションし、ＣＯ２インキュベーター内で７２時間培養したときの細胞周期に及ぼす影響を調べた。細胞周期（Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２期）は、ＰＩ／ＲＮａｓｅ染色（ベクトン・ディキンソン社）を用いて染色し、Modifitソフトウェア（ベクトン・ディキンソン社）を用いて解析した。【００３６】
その結果、７２時間培養後において、ＲＡ−ＦＬＳおよびＥ１１細胞ともに、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションしたときは、Ｇ１期の細胞が多く認められ、Ｇ２期／Ｓ期の細胞が少ないことが確認された（図６、図７）。【００３７】
（実験例３）細胞のアポトーシスに及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響
ｍｉＲ−１２４ａのＲＡ−ＦＬＳのアポトーシスに及ぼす影響を調べた。
実験例２において、ＲＡ−ＦＬＳについて、アネキシンＶおよびＰＩ染色によりアポトーシスを確認した。アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性を初期アポトーシスと判定した。アネキシンＶ染色は、MEBCYTOアポトーシス・キット（ＭＢＬ，医学生物学研究所製）を用いて行った。【００３８】
その結果、ＲＡ−ＦＬＳでは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションしたときのアポトーシスの程度は、対照と比べて有意差を認めなかったが（図８、図９）、Ｅ１１細胞ではアポトーシスを誘導することが確認された（図１０）。【００３９】
（実験例４）細胞のＣＤＫ２の発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響（１）
ｍｉＲ−１２４ａが細胞中のどのタンパク質に影響を与え、細胞周期をＧ１期で停止させ、細胞増殖を抑制しているかを検討した。そこで、Ｇ１期からＳ期にわたって機能するＣＤＫ２タンパク質に着目して検討を行った。ＲＡ−ＦＬＳ（５種）とＯＡ−ＦＬＳ（４種に）ついて、ＣＤＫ２タンパク質の発現をウエスタンブロッティング法により解析した。マウス型抗ヒトＣＤＫ２抗体クローンは、サンタクルーズ・バイオテクノロジー社製を用いた。タンパク質の発現を確認するためのハウスキーピングタンパク質として、アクチンについても発現量を確認した。各細胞について、ｍｉＲ−１２４ａの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定し、△Ｃｔ法により定量を行った。【００４０】
その結果、ＣＤＫ２の発現をウエスタンブロッティング法により解析したところ、ＲＡ−ＦＬＳの方がＯＡ−ＦＬＳに比べて濃いバンドが検出され、ＲＡ−ＦＬＳの方がＣＤＫ２の発現量が多いことが確認された（図１１）。また、各細胞についてｍｉＲ−１２４ａの発現レベルを確認したところ、ＲＡ−ＦＬＳの方がＯＡ−ＦＬＳに比べて低い発現であり、ｍｉＲ−１２４ａの発現のレベルが低いほど、ＣＤＫ２タンパク質の発現量が多い傾向が認められた（図１２）。このことから、ｍｉＲ−１２４ａはＣＤＫ２の発現に影響を及ぼし、ＲＡ−ＦＬＳではＣＤＫ２がＯＡ−ＦＬＳに比べて多いことからＲＡ−ＦＬＳは滑膜細胞の増殖が盛んに行われていることが示唆された。【００４１】
（実験例５）細胞のＣＤＫ２の発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響（２）
ＲＡ−ＦＬＳ細胞およびＥ１１細胞に、実施例１および実験例１と同様にｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションし、ＣＯ２インキュベーター内で７２時間培養したときのＣＤＫ２タンパク質の発現に及ぼす影響をウエスタンブロッティング法により調べた。【００４２】
その結果、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションした場合に、各細胞において対照に比べてＣＤＫ２の発現が抑制されることが確認された（図１３）。このことからも、ｍｉＲ−１２４ａが、ＣＤＫ２の発現に関与することが示唆された。【００４３】
（実験例６）ＣＤＫ２の発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響（３）
ＣＤＫ２のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）にｍｉＲ−１２４ａが直接作用してＣＤＫ２タンパク質の発現量を減少させるかどうかを検討した。ＣＤＫ２のＤＮＡの３’ＵＴＲをルシフェラーゼ発現ベクター（psiCHECK(TM) ベクター（Promega社））に組み込み、それをＥ１１細胞に導入して検討した。各種ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをトランスフェクションした系について、ルシフェラーゼの発現をルシフェラーゼ活性で測定した。対照として、ＣＤＫ２のＤＮＡの３’ＵＴＲの一部の遺伝子を改変させた系（変異型）、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを添加しない系、実施例１と同様に、対照のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと、他のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４６）を添加した系で、各々のルシフェラーゼ活性を測定した。【００４４】
ＣＤＫ２のＤＮＡは、GenBank accession No. AF512553に示すとおりであり、ＣＤＫ２天然型ＤＮＡの３’ＵＴＲ部分（5281-6439位）は、以下の配列番号に示す配列のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させた。
CDK2-F-XhoI：CTCGAGccctttcttccaggatgtga(5232-5251に基づく)（配列番号２）
CDK2-R-NotI：GCGGCCGCtgttcaccgtcagcactagc(6592-6573に基づく)（配列番号３）
ＣＤＫ２変異型ＤＮＡの３’ＵＴＲ部分は、以下の配列のプライマーを用いてＰＣＲ法により作製した。
CDK2-3'UTR-mut-F：tgaacttCGcttaaacactcaccttct（配列番号４）
CDK2-3'UTR-mut-R：tttaagCGaagttcagagggcccacc（配列番号５）【００４５】
ベクターに組み込まれている対照用のルシフェラーゼ活性を１として、各条件での測定結果を相対比で示した（図１４）。ＣＤＫ２天然型ＤＮＡの３’ＵＴＲを含む系にｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションした場合に、顕著にルシフェラーゼ活性が抑制されることが確認された。このことから、ＣＤＫ２の発現に際し、ｍｉＲ−１２４ａが直接ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの発現抑制に関与することが確認された。【００４６】
（実験例７）ＲＡ−ＦＬＳ細胞での炎症性タンパク質の発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響
実施例１および実験例１と同様にｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションした系および対照のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをトランスフェクションした系で、ＩＬ−８、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor;ＶＥＧＦ）、血管新生因子であるアンジオジェニン(angiogenin)、およびＭＣＰ１(Monocyte ChemotacticProtein-1)の発現に及ぼす作用を確認した。各因子の量は、ＥＬＩＳＡの系を用いて測定した。【００４７】
その結果、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションした系ではＩＬ−８では発現に有意差を認めなかったが、ＶＥＧＦの発現は増加傾向を示し、アンジオジェニンおよびＭＣＰ−１は、発現の減少傾向を示した（図１５）。【００４８】
（実験例８）ＭＣＰ１の発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響
実験例５と同手法により、Ｅ１１細胞でのＭＣＰ１タンパク質の発現に関し、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの作用をルシフェラーゼアッセイにより確認した。ＭＣＰ１のＤＮＡの３’ＵＴＲをルシフェラーゼ発現ベクター（psiCHECK(TM) ベクター（Promega社））に組み込み、それをＥ１１細胞に導入して検討した。３’ＵＴＲの対照として、ＭＣＰ１のＤＮＡの３’ＵＴＲの一部の遺伝子を変化させたものを用いた（変異型）。ＭＣＰ１天然型ＤＮＡの３’ＵＴＲを結合させた系と、ＭＣＰ１変異型ＤＮＡの３’ＵＴＲを結合させた系のものをＥ１１細胞に導入し、各種ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをトランスフェクションした系について、ルシフェラーゼ活性で調べた。対照として、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを添加しない系、実施例１と同様に、対照のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを添加した系で、各々のルシフェラーゼ活性を調べた。【００４９】
ＭＣＰ１のＤＮＡは、GenBank accession No. AF519531に示すとおりであり、ＭＣＰ１天然型ＤＮＡの３’ＵＴＲ（5596-5981位）の一部分を、以下の配列番号に示す配列のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させた。
MCP1-F-XhoI：CTCGAGtccccagacaccctgtttta (5648-5667位)（配列番号６）
MCP1-R-Not I：GCGGCCGCcaaaacatcccaggggtaga (5846-5827位)（配列番号７）
ＭＣＰ１変異型ＤＮＡの３’ＵＴＲ部分は、以下の配列のプライマーを用いてＰＣＲ法により作製した。
MCP1-3'UTR-mut-F ：acattatCGcttaagtaatgttaattc（配列番号８）
MCP1-3'UTR-mut-R ：cttaagCGataatgtttcacatcaac （配列番号９）【００５０】
ベクターに組み込まれている対照用のルシフェラーゼ活性を１として、各条件での測定結果を相対比で示した（図１６）。その結果、ＭＣＰ１天然型ＤＮＡの３’ＵＴＲの系にｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションした場合に、顕著なルシフェラーゼ活性の抑制がされることが確認された。このことから、ｍｉＲ−１２４ａが、ＭＣＰ１の発現に際し、直接ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの発現抑制に関与することが確認された。【００５１】
（実験例９）細胞のＣＤＫ６の発現に及ぼすｍｉＲ−１２４ａの影響（１）
ｍｉＲ−１２４ａが細胞中のどのタンパク質に影響を与え、細胞周期をＧ１期で停止させ、細胞増殖を抑制しているかを検討した。そこで、Ｇ１期からＳ期にわたって機能するＣＤＫ６タンパク質に着目して検討を行った。【００５２】
ＲＡ−ＦＬＳ（ＲＡ２０）細胞およびＥ１１細胞に、実施例１および実験例１と同様にｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションし、ＣＯ２インキュベーター内で７２時間培養したときのＣＤＫ６タンパク質の発現に及ぼす影響をウエスタンブロッティング法により調べた。マウス型抗ヒトＣＤＫ６抗体クローンは、セルシグナリングテクノロジー社（Cell Signaling Technology）製を用いた。タンパク質の発現を確認するためのハウスキーピングタンパク質として、アクチンについても発現量を確認した。【００５３】
その結果、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２４ａをトランスフェクションした場合に、各細胞において対照に比べてＣＤＫ６の発現が抑制されることが確認された（図１７）。以上の結果および実験例４〜６の結果より、哺乳動物のＧ１期進行とＳ期開始に関係する、ＣＤＫ６およびＣＤＫ２と呼ばれるサイクリン依存性キナーゼの発現が、ｍｉＲ−１２４ａの存在により抑制されることが確認でき、ｍｉＲ−１２４ａは、滑膜細胞の細胞周期を制御し、滑膜細胞の増殖を抑制しうることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上詳述したように、本発明の関節リウマチマーカーは、関節リウマチ特異的に発現の増減が認められる非コードＲＮＡである。特に関節リウマチ特異的に発現抑制が認められるｍｉ−ＲＮＡ（ｍｉＲ−１２４ａ）は、有効なマーカーとなりえる。関節リウマチ関連細胞では、ｍｉＲ−１２４ａの発現が低下していることから、ｍｉＲ−１２４ａを指標とする検査方法を提供することができる。【００５５】
さらに、本発明のマーカーとして機能しうるｍｉ−ＲＮＡであるｍｉＲ−１２４ａが減少することで、関節リウマチの病態に関連するものと考えられる。そこで、ｍｉＲ−１２４ａを含むオリゴヌクレオチドは、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６およびＭＣＰ１を抑制して、これらのタンパク質に起因するＲＡ滑膜細胞の炎症および増殖を抑制し、関節リウマチ治療の有効成分として作用しうる。このことから、ｍｉＲ−１２４ａを有効成分とし、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、安定化剤等とともに製剤化したものは、関節リウマチの治療剤として利用することができる。
【図２】
2010001632.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図５】
2010001632.tif 000016
【図６】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１７】
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【配列表】
2010001632000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月19日(2009.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
関節リウマチ特異的に発現抑制が認められるｍｉＲ−１２４ａからなる関節リウマチマーカー。
【請求項４】
前記関節リウマチマーカーの塩基配列が、以下から選択される、請求項３に記載の関節リウマチマーカー：
１）ＵＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡ（配列番号１）；
２）上記１）に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドのうち、１〜２個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加または挿入されてなる塩基配列。
【請求項５】
請求項３または４に記載の関節リウマチマーカーを指標とする関節リウマチの検査方法。
【請求項６】
以下の工程を含む関節リウマチの検査方法：
１）請求項３または４に記載の関節リウマチマーカーを指標とし、採取した生体検体中の関節リウマチマーカー（Ａ）を定量する工程；
２）上記定量して得た関節リウマチマーカー（Ａ）の定量値を、関節リウマチではない生体検体中の関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値と比較する工程。
【請求項７】
前記関節リウマチマーカー（Ａ）および前記関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値が、これらのマーカーとしてのオリゴヌクレオチド量である、請求項６に記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項８】
前記関節リウマチマーカー（Ａ）の定量値が、前記関節リウマチマーカー（Ｂ）の定量値よりも低い場合に、関節リウマチであると判断する、請求項６または７に記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項９】
以下より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、関節リウマチの治療剤：
１）ＵＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡ（配列番号１）；
２）上記１）に記載の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドのうち、１〜２個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加または挿入されてなる塩基配列。
【請求項１０】
ｍｉＲ−１２４ａを構成するオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、関節リウマチの治療剤。
【国際調査報告】
2010001632.tif 000021
2010001632.tif 000022
2010001632.tif 000023
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