(57)【要約】要約  哺乳動物の体細胞を培養する際、培地への血清の添加をできるだけ抑えるか又は血清を添加せずに哺乳動物の体細胞を効果的に増殖させることができる、哺乳動物体細胞用培地及びそれを構成するための添加剤が開示されている。内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを培地に配合することにより、培地が血清を全く又は少量しか含まない場合であっても、効果的に哺乳動物の体細胞を増殖させることができる。
2009084662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む、哺乳動物体細胞用培地。
【請求項２】
無血清又は低血清培地である請求項１記載の培地。
【請求項３】
内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドの培地中の濃度が0.01〜100μM、セロトニンレセプターに対する前記リガンドの培地中の濃度が0.1〜100μMである請求項１又は２記載の培地。
【請求項４】
内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びに内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の培地。
【請求項５】
内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩から成る群より選択される少なくとも１種であり、その培地中の濃度が0.25〜10μM、セロトニンレセプターに対する前記リガンドの培地中の濃度が0.25〜20μMである請求項１又は２記載の培地。
【請求項６】
セロトニンレセプターに対する前記リガンドが、セロトニン、その塩及びセロトニンレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培地。
【請求項７】
抗酸化剤をさらに含む請求項１ないし６のいずれか１項に記載の培地。
【請求項８】
前記抗酸化剤が、Ｎ−アセチルシステイン及びＬ−システインから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項７記載の培地。
【請求項９】
前記抗酸化剤の培地中の濃度が0.01mM〜10mMである請求項７又は８記載の培地。
【請求項１０】
動物血清アルブミンをさらに含む請求項１ないし９のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１１】
前記血清アルブミンの培地中の濃度が0.0001〜10重量％である請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１２】
成長因子をさらに含む請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１３】
前記成長因子が、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１２記載の培地。
【請求項１４】
培地中に含まれる前記成長因子が、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の２種類である請求項１３記載の培地。
【請求項１５】
前記成長因子の培地中の濃度が0.1〜100ng/mLである請求項１２ないし１４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１６】
内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む、哺乳動物体細胞用培地の添加剤。
【請求項１７】
内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びに内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項１６記載の添加剤。
【請求項１８】
セロトニンレセプターに対する前記リガンドが、セロトニン、その塩及びセロトニンレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項１６又は１７記載の添加剤。
【請求項１９】
抗酸化剤をさらに含む請求項１６ないし１８のいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項２０】
動物血清アルブミンをさらに含む請求項１６ないし１９のいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項２１】
成長因子をさらに含む請求項１６ないし２０のいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項２２】
水又は基礎培地に溶解することにより請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の培地を与える組成を有する請求項１６ないし２１のいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項２３】
請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の培地中で、哺乳動物体細胞を培養することを含む、哺乳動物体細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の体細胞を体外で培養する際に用いられる培地及び該培地を構成するための添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む哺乳類の多分化能を有する細胞とこれらの細胞が分化した細胞とを含む体細胞は、細胞治療や再生医療に用いることができる重要な細胞である。これらの細胞を培養して増殖させることは、細胞治療用の細胞の生産性や、これらの医療の研究の進行を促進する観点から重要である。【０００３】
体細胞は、通常、１０％程度の血清を添加した血清培地で増殖することが知られている。血清としては、通常、培養しようとする体細胞が由来する個体由来の血液、例えば、培養する体細胞を採取した患者の血液から得た自己由来の血清や、ウシ血清などの異種由来の血清が用いられる。【０００４】
しかし、自己由来の血清を用いる場合は、患者の血液を比較的大量に用いなければならないので、患者の負担が大きいという問題がある。また、異種由来の血清を用いる場合は、未知のウイルスやプリオンなどの感染性病原体が混入している可能性があるという問題がある。【０００５】
また、いずれの血清であっても、その成分が完全に解明されているわけではなく、用いる血清の起源や市販製品のロットにより含有成分が異なる可能性があるので、血清を大量に用いて培養する場合は、得られる培養細胞の品質を一定にすることが難しいという問題点もある。【０００６】
よって、血清を用いないか又はその使用量をできるだけ抑えた培地で体細胞を増殖させることが望まれている。【０００７】
特表平１１−５０６６１０号（特許文献１）には、最小必須培地、血清アルブミン、鉄源、インスリン及びグルタミンを含むヒト間葉系細胞用の無血清培地が開示されている。この無血清培地には、ヒト間葉系細胞の有糸核分裂促進活性を有するセロトニンを加えてもよいことが記載されている。しかし、セロトニンを加えた無血清培地で間葉系幹細胞を培養しても、増殖が比較的遅く、また、短期間で細胞の形質が変化して増殖性が低下するという問題があった。【０００８】
特表２００６−５０５２４８号（特許文献２）には、リゾリン脂質受容体、すなわち内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのリガンド、例えばリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）などを含む、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の分化を調節するための無血清培地が開示されている。ＬＰＡは、脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を抑制する効果（J. Biol. Chem. Vol.280, 15, 14656-14662 (2005)；非特許文献１）も知られている。また、ＬＰＡは細胞増殖促進効果を有することも知られている（Sci. STKE, Vol. 2005, Issue 292, pp. pe35, 12 July 2005；非特許文献２、American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. Vol. 34, pp. 274-285, 2006；非特許文献3）が、細胞増殖促進効果は血清含有培地で確認されたものであり、無血清培地又は１％以下の低血清培地での細胞増殖促進効果は知られていない。【０００９】
また、ＷＯ２００７／０８０９１９（特許文献３）には、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の無血清培地について記載されており、培養条件として、ＩＴＳ添加物（インスリン、トランスフェリン、セレン含有添加物）の他に塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が必須であることが記載されているが、添加する成長因子を３種以下にすると増殖性が低下するという問題があった。【００１０】
ヒトを含む哺乳類の多分化能を有する細胞の増殖には、サイトカインや成長因子が影響を与えることが知られている。例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などが挙げられる（Folia Histochemica Et Cytobiological Vol.44, No.4, pp. 215-に30, 2006；非特許文献６、J Cell Biochem. Vol.64, 2, pp. 278-94, 1997;非特許文献７）。【００１１】
In vitroでのヒトを含む哺乳類の体細胞の培養時に、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）は、アポトーシスを阻害することで細胞死を減らす効果があることが知られている（Molecular Human Reproduction Vol.8, No3.3, pp. 228-236, 2002；非特許文献８、J Leukoc Biol. Vol.76, No.1, pp. 152-61, 2004；非特許文献９）。【００１２】
【特許文献１】特表平１１−５０６６１０号公報
【特許文献２】特表２００６−５０５２４８号公報
【特許文献３】ＷＯ２００７／０８０９１９
【非特許文献１】J. Biol. Chem. Vol.280, 15, 14656-14662 (2005)
【非特許文献２】Sci. STKE, Vol. 2005, Issue 292, p.pe35, 12 July 2005
【非特許文献３】American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. Vol. 34, pp. 274-285, 2006
【非特許文献４】Science. Vol. 294，pp. 1875-1878，2001
【非特許文献５】J Biol Chem. Vol. 277, No.29, pp. 25851-25854, 2002
【非特許文献６】Folia Histochemica Et Cytobiological Vol.44, No.4, pp. 215-に30, 2006
【非特許文献７】J Cell Biochem. Vol.64, 2, pp. 278-94, 1997
【非特許文献８】Molecular Human Reproduction Vol.8, No3.3, pp. 228-236, 2002
【非特許文献９】J Leukoc Biol. Vol.76, No.1, pp. 152-61, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、哺乳動物の体細胞を培養する際、培地への血清の添加をできるだけ抑えるか又は血清を添加せずに哺乳動物の体細胞を効果的に増殖させることができる、哺乳動物体細胞用培地及びそれを構成するための添加剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを培地に配合することにより、培地が血清を全く又は少量しか含まない場合であっても、効果的に哺乳動物の体細胞を増殖させることができることを見出し、本発明を完成した。【００１５】
すなわち、本発明は、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む、哺乳動物体細胞用培地を提供する。また、本発明は、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む、哺乳動物体細胞用培地の添加剤を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の培地及び培地添加剤は、体細胞を培養する際に従来培地に添加されていた血清を用いないか又はその添加量を低減させた条件下で体細胞を効率的に増殖させることを可能にする。よって、血清を用いることにより発生していた問題、すなわち患者への負担、感染性病原体の混入などを解決することができる。また、血清を添加する場合でも、添加する血清のロット間のばらつきに起因する細胞の増殖性のばらつきを抑制することができる。さらに、血清としてヒト血清を用いても体細胞を効率的に増殖させることができる。また、本発明の培養方法により、血清の使用量を抑制して体細胞を培養することができるので、安定した品質の培養体細胞を提供することができる。よって、得られる培養体細胞は、感染性病原体の混入の問題が最小限に抑えられた、安定した品質の培養体細胞とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書において、「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞であり、ある目的に特化してそれ以外の細胞にはならない分化した細胞と、何種類かの異なった機能を持つ細胞に分化する能力を持った細胞とを含む。前者の細胞は、成体の機能性細胞であり、皮膚細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液系細胞、繊維芽細胞、肝臓細胞、軟骨細胞、脂肪細胞など生体内の各器官を形成する細胞を含む。後者は幹細胞とよばれ、上記の分化した細胞のうち少なくとも１種類以上の分化細胞へ分化転換することができる細胞であり、胚性幹細胞及び体性幹細胞を包含する。「体性幹細胞」は、何種類かの異なった機能を持つ細胞に分化する能力を有する幹細胞及び前駆細胞のうち、胚性幹細胞を除く細胞であり、誘導多機能幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞などを含む。【００１８】
本発明の培地中で培養される細胞としては、哺乳動物の体細胞であれば何ら限定されず、好ましい例として、線維芽細胞等の間葉系細胞、脂肪組織由来幹細胞や骨髄由来間葉系幹細胞等の体性幹細胞を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。【００１９】
本発明の培地には、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドが必須成分として含まれる。ここで、Ｅｄｇファミリーレセプターは、その遺伝子配列の相同性が高いＧタンパク質共役型のレセプターの一群であり、現在までにヒト、マウス、ヒツジなどの哺乳類でＥｄｇ−１からＥｄｇ−８までが同定されている（非特許文献４、５）。これらのうち、Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４及びＥｄｇ−７はＬＰＡレセプターとして機能し、Ｅｄｇ−１、Ｅｄｇ−３、Ｅｄｇ−５、Ｅｄｇ−６及びＥｄｇ−８はＳ１Ｐレセプターとして機能することが知られている。また、「レセプターに対するリガンド」とは、該レセプターと特異的に結合する物質であり、生体内に存在する天然のリガンドのみならず、アゴニストやアンタゴニストとして知られる天然又は合成された他の化合物をも包含する。【００２０】
Ｅｄｇファミリーレセプターに対するリガンド（以下、便宜的に「Ｅｄｇリガンド」と呼ぶことがある）としては、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びにＥｄｇファミリーレセプターのアゴニストからなる群より選択される１又は複数種の化合物が好ましい。【００２１】
Ｅｄｇファミリーレセプターのアゴニストとは、Ｅｄｇファミリーレセプターと結合してＬＰＡ及びＳ１Ｐと同様に作用する物質であり、例えばジヒドロスフィンゴシン１リン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、スフィンゴシルホスホリルコリン、アルキルＬＰＡアナログ、ＦＴＹ７２０などが挙げられる。【００２２】
ＬＰＡとは、下記の一般式（Ｉ）：
Ｒ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＰＯ４Ｈ２                    （Ｉ）
（式中、Ｒは、炭素数１０〜３０のアルキル基、炭素数１０〜３０のアルケニル基又は炭素数１０〜３０のアシル基である）
で表される化合物である。【００２３】
上記の式（Ｉ）のＲ基についてのアシル基の炭素数は、カルボニル基の炭素数を含まない。【００２４】
ＬＰＡの塩としては、従来公知の塩を用いることができ、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。【００２５】
ＬＰＡ又はＬＰＡの塩としては、例えば１−オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウム塩、ＬＰＡカリウム塩などが挙げられる。【００２６】
Ｅｄｇリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。【００２７】
本発明の培地は、さらに、セロトニンレセプターに対するリガンド（以下、便宜的に「セロトニンリガンド」と呼ぶことがある）を含む。セロトニンレセプターは主に中枢神経系にあるGタンパク質結合レセプターの一種である。セロトニンリガンドとしては、セロトニン、その塩及びセロトニンアゴニストから選択される１又は複数種の化合物が好ましい。セロトニンは、５−ヒドロキシトリプタミンともよばれ、神経伝達物質として作用することが知られている。セロトニンアゴニストとは、セロトニンレセプターと結合してセロトニンと同様に作用することが知られている物質であり、例えばイプサピロン、ゼロピン、ブスピロン、１−［２−（４−アミノフェニル）エチル］−４−（３−ビフルオロメチルフェニル）ピペラジン（ＰＡＤＤ）、Ｎ，Ｎ−ジプロピル−５−カルボキシアミドトリプタミン（ＤＰ−５ＣＴ）、α−メチル−５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＴ）、２−メチル−５−ＨＴなどが挙げられる。セロトニンの塩は、従来公知の塩を用いることができ、例えば塩酸塩などが挙げられる。【００２８】
セロトニンリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。【００２９】
培地中のＥｄｇリガンドの濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、通常、0.01〜100μM程度である。Ｅｄｇリガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩から成る群より選択される少なくとも１種である場合には、その培地中の濃度は、0.25〜10μMが好ましい。また、Ｅｄｇリガンドが、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）である場合には、その培地中の濃度は、0.01μM〜0.2μMが好ましい。また、培地中のセロトニンリガンドの濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.1〜100μMが好ましく、0.25〜20μMがさらに好ましい。【００３０】
本発明の培地は、抗酸化剤をさらに含むことが好ましい。抗酸化剤の好ましい例としては、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ｌ−システイン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及び２−メルカプトエタノールから成る群より選ばれる少なくとも１種、さらに好ましくは、Ｎ−アセチルシステイン及びＬ−システインから成る群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。これらの抗酸化剤は、アポトーシス阻害作用を有することが知られており、従って、培養細胞の維持、増殖に有効である。抗酸化剤は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。【００３１】
培地中の抗酸化剤の濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.01mM〜10mMが好ましく、さらに好ましくは0.1mM〜1mMである。【００３２】
本発明の培地は、動物血清アルブミンをさらに含むことが好ましい。アルブミンは、血清の主要成分であり、血液中では薬物の輸送等の役割を担っていることが知られている。動物血清アルブミンを含むことにより、培養細胞の増殖が一層促進される。動物血清アルブミンの好ましい例として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられる。これらのアルブミンは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。【００３３】
培地中のアルブミンの濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.0001〜１０重量％が好ましく、0.0001〜１重量％がさらに好ましい。【００３４】
本発明の培地は、成長因子をさらに含むことが好ましい。成長因子を含むことにより、培養細胞の増殖が一層促進される。成長因子の好ましい例としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等を挙げることができ、さらに好ましい例として、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）を挙げることができる。これらの成長因子自体は、いずれもこの分野において周知である。成長因子は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。特に、下記実施例に具体的に示されるように、成長因子として血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）と塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の２種類のみを含むものでも間葉系幹細胞の増殖が十分に達成されるので、間葉系幹細胞の培養に用いられる培地では、培地中に含まれる成長因子は、これら２種類の成長因子だけでも十分である。【００３５】
本発明の培地は、さらに、血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）に対するリガンド（ＰＤＧＦ）を含んでいてもよく、特に、間葉系幹細胞を培養する培地では、これを含むことが好ましい。ＰＤＧＦＲは、主に間葉系細胞にあるチロシンキナーゼ関連型受容体の一種であり、これに対するリガンドを含むことにより、間葉系幹細胞を効率良く細胞を増殖させることができる。ＰＤＧＦＲのリガンドとしては、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤなどが挙げられ、これらはいずれも周知である。ＰＤＧＦＲのリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。【００３６】
本発明の培地は、塩基性線維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ）に対するリガンド（ＦＧＦ）を含んでいてもよく、特に、間葉系幹細胞を培養する培地では、これを含むことが好ましい。ＦＧＦＲは、主に間葉系細胞に存在することが知られており、これに対するリガンドを含むことにより、間葉系幹細胞の寿命を改善させる。ＰＤＧＦＲのリガンドとしては、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）など、計20種以上存在することが知られている。例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−４などが挙げられる。特に、ｂＦＧＦは組織の形成に強く関与していることが知られている。これらはいずれも周知である。【００３７】
成長因子の濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.1〜100ng/mLが好ましく、1〜10ng/mLがさらに好ましい。【００３８】
本発明の培地は、界面活性剤をさらに含んでいてもよい。低濃度の界面活性剤を含むことにより、細胞膜への悪影響を減じる効果等があると考えられる。一方、高濃度の界面活性剤を培地に添加すると、細胞増殖阻害や細胞死の誘導をすることが知られている。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80等）、アルキルフェノキシポリエチレングリコール（商品名Triton X-100等）、アルキルフェニルポリエチレングリコール（商品名Triton X-114、NP-40等）の非イオン性界面活性剤が好ましい。界面活性剤は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。【００３９】
界面活性剤の濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、通常、0.1〜100ng/mLであり、好ましくは1〜10ng/mLである。【００４０】
本発明の培地は、通常の哺乳動物細胞用培地と同様に血清を含んでいてもよいが、Ｅｄｇリガンド及びセロトニンリガンドの両者を含むことにより、血清を含まないか低濃度でしか含まない培地であっても細胞を効率的に増殖させることができるので、培地が無血清培地又は低血清培地である場合に本発明の威力が最もよく発揮される。すなわち、本発明の培地における血清の含有量は、培地全量に対して０〜５重量％が好ましく、より好ましくは０〜１重量％である。なお、本明細書及び特許請求の範囲において、血清を含むがその含有量が５重量％以下、好ましくは１重量％の培地を低血清培地と呼ぶ。【００４１】
本発明の培地は、上記したＥｄｇリガンド及びセロトニンリガンド、好ましくは、さらに、上記した抗酸化剤、動物血清アルブミン、成長因子及び界面活性剤の１種以上を含むことを除き、公知の哺乳動物細胞用培地と同様でよい。従って、基本的に、公知の基礎培地、好ましくは無血清又は低血清基礎培地に、上記した２種類の必須成分、好ましくはさらに上記した好ましい成分の１種以上を添加することにより、本発明の培地を得ることができる。【００４２】
従来公知の無血清基礎培地としては、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２及びＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地などが挙げられる。【００４３】
本発明の培地は、さらに、哺乳動物細胞用培地に含ませることが周知である種々の添加剤を含んでいてもよい。このような周知の添加剤として、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類、及び炭素源や抗生物質等の他の添加剤を挙げることができる。【００４４】
アミノ酸類としては、グリシン、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン及びL-バリンを挙げることができる。【００４５】
無機塩類としては、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（III）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、硫酸亜鉛及びセレン酸を挙げることができる。【００４６】
ビタミン類としては、コリン、ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB3、ビタミンB4、ビタミンB5、ビタミンB6、ビタミンB7、ビタミンB12、ビタミンB13、ビタミンB15、ビタミンB17、ビタミンBh、ビタミンBt、ビタミンBx、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンF、ビタミンK、ビタミンM及びビタミンPを挙げることができる。【００４７】
これらの添加剤を哺乳動物細胞用の培地に添加すること自体は公知であり、各添加剤の添加量も公知の培地と同様でよく、また、ルーチンな試験により適宜設定することもできる。例えば、アミノ酸類の添加量は、通常、各アミノ酸毎に５mg/L〜５００mg/L程度、好ましくは１０mg/L〜４００mg/L程度であり、無機塩類の添加量は、通常、各無機塩類毎に0 mg/L〜10 g/L程度、好ましくは、0.01 mg/L〜7 g/L程度であり、ビタミン類の添加量は、各ビタミン毎に0.01 mg/L〜500 mg/L程度、好ましくは0.05 mg/L〜300 mg/L程度である。【００４８】
他の添加剤としては、(1)コルチコステロン、プロゲステロン等の増殖因子、(2)ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン及びカナマイシン等の抗生物質、(3)グルコース、ガラクトース、フルクトース及びスクロース等の炭素源、(4)マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル及びケイ素等の微量金属、並びにアデノシン 5'-一りん酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン及びラクトフェリン等の他の添加剤を挙げることができる。これらの添加剤の添加量も従来と同様でよく、また、各添加剤の目的に応じ、ルーチンな試験により適宜設定することもできる。通常、0.001 mg/L〜5 g/L、特に0.1〜3 g/L程度である。【００４９】
本発明の培地は、体細胞の増殖又は維持のための培養に用いることができる他、培養する細胞が幹細胞の場合には、幹細胞の分化誘導のために用いることもできる。幹細胞の分化誘導に用いる場合には、分化誘導剤がさらに添加される。分化誘導剤としては、サイトカイン（種々のインターロイキン、エリスロポエチン、トロンボポエチンなど）、コロニー刺激因子（例えばＧ−ＣＳＦなど）、ステロイドホルモン（デキサメタゾンなど）、インドール（インドメタシンなど）、チアゾリジン誘導体（ロシグリタゾンなど）などが挙げられる。これらの１又は複数種を用いることができる。分化誘導剤の添加量も従来と同様でよく、通常、培地全量に対して１×１０−１０〜１×１０−６重量％程度加えられる。【００５０】
本発明の培地は、上記した各種添加剤の１種又は複数種を含むことができ、通常、複数の添加剤を組み合わせて含む。【００５１】
本発明の培地中での哺乳動物体細胞の培養自体は、従来と同様な方法で行なうことができ、通常、３０〜３７℃の温度、及び５％ＣＯ２環境下、及び５〜２１％Ｏ２環境下で行なわれる。【００５２】
本発明はまた、上記した本発明の培地を構成するための添加剤をも提供する。従って、本発明の添加剤は、上記したＥｄｇリガンド及びセロトニンリガンドを含む。さらに、好ましくは、上記した好ましい各種成分を含む。さらに、上記した各種添加剤の１種又は複数種を含んでいてもよい。本発明の添加剤は、水又は基礎培地に溶解することにより、上記した本発明の培地を与える組成を有するものが簡便で好ましい。この場合には、添加剤に含まれる各種成分の配合比率は、培地における各成分の含有量の比率と同じになる。なお、基礎培地としては、従来から哺乳動物細胞の培養に用いられている、上記した各種培地が挙げられる。【００５３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、「％」は特に断りがない限り、「重量％」を意味し、各種添加物の濃度は、培地中での終濃度を意味する。従って、例えば、「２．５ｎｇ/ｍＬの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を加えた低血清培地Ｃ」は、ｂＦＧＦの低血清培地Ｃ中での終濃度が２．５ｎｇ/ｍＬになる量加えたことを意味する。
【実施例１】
【００５４】
実施例１：ヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＭＡＤＳ）の培養
（１−１）リガンドの製造
セロトニンリガンドとして、２．１ｍｇのセロトニン塩酸塩（Sigma社製）を１０ｍＬのＤＭＥＭ（LONZA社製）に溶解して、リガンド１（Ｓ−１）を製造した。  また、Ｅｄｇリガンドとして、２．３ｍｇの１−オレイルリゾホスファチジン酸ナトリウム塩（ＬＰＡ：CAYMAN社製）を１０ｍＬのＰＢＳに溶解して、リガンド２（Ｓ−２）を製造した。さらに、２．１ｍｇのセロトニン塩酸塩及び２．３ｍｇのＬＰＡを１０ｍＬのＰＢＳに溶解して、リガンド３（Ｓ−３）を製造した。【００５５】
（１−２）ｈＭＡＤＳの増殖
アミノ酸類（上記した全アミノ酸類）、無機塩類（上記した全無機塩類）、ビタミン類（上記した全ビタミン類）及び他の添加剤（アデノシン 5'-一りん酸、コルチコステロン、エタノールアミン、D-ガラクトース、D-グルコース、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン及びトランスフェリン）を含む培地に、７×１０−４％の２−メルカプトエタノール（２−Ｍｅ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシン（GIBCO社製）、０．５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２．５ｎｇ/ｍＬの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を加えた低血清培地Ｃを得た。【００５６】
低血清培地Ｃに、（１−１）で製造したＳ−１及び／又はＳ−２を様々な濃度で添加した低血清培地を得た。具体的には、以下の濃度でＳ−１及び／又はＳ−２を加えた。
低血清培地Ｃに０％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃに０.００１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，０．００１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃに０.０１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，０．０１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃに０.１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，０．１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃに１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃに１０％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，１０％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃに０．１％のＳ−１及び０％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃに０．１％のＳ−１及び０．００２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，０．００２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃに０．１％のＳ−１及び０．０２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，０．０２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃに０．１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，０．２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃに０．１％のＳ−１及び０．５％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，０．５％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃに０．１％のＳ−１及び１％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，１％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃに０．１％のＳ−１及び２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃに１％のＳ−１及び０％のＳ−２を添加した低血清培地（１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃに０％のＳ−１及び１％のＳ−２を添加した低血清培地（１％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃに１％のＳ−１及び１％のＳ−２を添加した低血清培地（１％  Ｓ−１，１％  Ｓ−２）。
なお、１％のＳ−１は約１０μM、１％のＳ−２は約５μMに相当する。【００５７】
ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、１％非必須アミノ酸（GIBCO社製）、７×１０−４％の２−ＭＥ、１００Ｕ／Ｌのペニシリン・ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、２．５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えて、従来の血清含有培地を得た（従来培地）。【００５８】
これらの培地１０ｍＬを、それぞれ直径１００ｍｍの培養皿に入れ、初期細胞数１０,０００細胞／ｍＬでｈＭＡＤＳを播種し、３７℃にて５％ＣＯ２環境下で培養を行った。【００５９】
培養開始から２１日の間の集団倍化数（ｎ）の変化を、細胞継代毎の細胞数を血球計測盤を用いて計測した結果から計算した。集団倍化数とは、細胞分裂が行われた回数（ｎ）のことである。細胞分裂では１つの細胞が２つに分裂するので、ｎ回の分裂が行われると細胞数は２ｎとなる。集団倍化数は、以下の式に基づいて求められる。
集団倍化数（ｎ）＝Ｌｏｇ（２）［（Ｐ１計測細胞数／Ｐ１播種細胞数）×（Ｐ２計測細胞数／Ｐ２播種細胞数）×・・・］
（上記の式中、Ｐ１、Ｐ２・・・は、第１継代、第２継代・・・を表す。）【００６０】
集団倍化数が１回多いことは、細胞数が２倍多いことを示し、２回多いことは、細胞数が４倍多いことを示すので、集団倍化数がｘ回多ければ細胞数は２ｘ倍多いことを示す。【００６１】
結果を、図１〜３に示す。
図１は、Ｓ−２の濃度を一定にした場合の集団倍化数の変化を示す。
図１では、従来培地（○）、低血清培地Ｃ（▲）、０．２％Ｓ−２（×）、０．２％  Ｓ−２，０．００１％  Ｓ−１（−）、０．２％  Ｓ−２，０．０１％  Ｓ−１（＊）、０．２％  Ｓ−２，０．１％  Ｓ−１（＋）、０．２％  Ｓ−２，１％  Ｓ−１（△）、及び０．２％  Ｓ−２，１０％  Ｓ−１（◆）の集団倍化数を示す。【００６２】
図２は、Ｓ−１の濃度を一定にした場合の集団倍化数の変化を示す。
図２では、従来培地（○）、低血清培地Ｃ（▲）、０．１％Ｓ−１（×）、０．１％  Ｓ−１，０．００２％  Ｓ−２（−）、０．１％  Ｓ−１，０．０２％  Ｓ−２（＊）、０．１％  Ｓ−１，０．２％  Ｓ−２（＋）、０．１％  Ｓ−１，０．５％  Ｓ−２（△）、０．１％  Ｓ−１，１％  Ｓ−２（◆）、及び０．１％  Ｓ−１，２％  Ｓ−２（◇）の集団倍化数を示す。【００６３】
さらに、上記の低血清培地Ｃに、Ｓ−３を１％加えた場合の結果を図３に示す。
図３では、従来培地（○）、低血清培地Ｃ（▲）、１％  Ｓ−１（◆）、１％  Ｓ−２（■）及び１％  Ｓ−３（●）の集団倍化数を示す。【００６４】
（１−３）ｈＭＡＤＳの脂肪細胞への分化
（１−２）の従来培地及び低血清培地ＣにＳ−３を加えた培地を用いて数継代維持した細胞を、２１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、脂肪細胞分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、５００μＭ  イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭデキサメタゾン、１μＭインスリン、１μＭロシグリタゾン）０．１ｍＬを含む９６穴培養プレートのウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２で１０日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。脂肪細胞への分化は、オイルレッドＯ染色により確認した。結果を、図４（Ａ）に示す。【００６５】
（１−４）ｈＭＡＤＳの骨細胞への分化
（１−２）の従来培地及び低血清培地ＣにＳ−３を加えた培地を用いて数継代維持した細胞を、１００００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、骨細胞分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、２００μＭ  アスコルビン酸、０．１μＭデキサメタゾン、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート）０．５ｍＬを含む２４穴培養プレートのウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２で１５日間培養することにより、骨細胞への分化誘導を行った。骨細胞への分化は、アリザリンレッドＳ染色により確認した。結果を、図４（Ｂ）に示す。【００６６】
図４の結果から、低血清培地ＣにＳ−３を加えた培地で培養したｈＭＡＤＳは、１０％血清を含む従来培地で培養した細胞と同程度に染色され、従って、同程度に脂肪細胞及び骨細胞に分化したことがわかる。よって、これらの培地で培養した細胞はいずれも、未分化性維持能を有しており、幹細胞としての分化能に差がないことがわかる。
また、（１−２）で用いたＦＣＳの代わりにヒト血清を用いても、図１〜４で示す増殖及び分化の傾向は変わらないことが確認された。
【実施例２】
【００６７】
実施例２：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の培養
（２−１）リガンドの製造
セロトニンリガンドとして、２．１ｍｇのセロトニン塩酸塩（Sigma社製）を１０ｍＬのＤＭＥＭ（LONZA社製）に溶解して、リガンド１（Ｓ−１）を製造した。  
また、Ｅｄｇリガンドとして、２．３ｍｇの１−オレイルリゾホスファチジン酸ナトリウム塩（ＬＰＡ：CAYMAN社製）を１０ｍＬのＰＢＳに溶解して、リガンド２（Ｓ−２）を、１．９ｍｇのスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ：CAYMAN社製）を１０ｍＬのＤＭＥＭに溶解して、リガンド２（Ｓ−２’）を製造した。
さらに、２．１ｍｇのセロトニン塩酸塩及び２．３ｍｇのＬＰＡを１０ｍＬのＰＢＳに溶解して、リガンド３（Ｓ−３）を製造した。【００６８】
（２−２）ｈＭＳＣの増殖
実施例１で調製した基礎培地からヒポキサンチン及びチミジン並びに一部の無機塩類（硫酸銅、硝酸鉄(III)、硫酸鉄、塩化マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸亜鉛）を除外した基礎培地に、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシン（GIBCO社製）及び０．５％のＦＣＳを加えた低血清培地Ｃ１を得た。また、前記基礎培地に、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシン（GIBCO社製）及び１．０％のＦＣＳを加えた低血清培地Ｃ２を得た。【００６９】
低血清培地Ｃ１に、（２−１）で製造したＳ−１及び／又は２を様々な濃度で添加した低血清培地を得た。具体的には、以下の濃度でＳ−１及び／又はＳ−２を加えた。
低血清培地Ｃ１に０％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃ１に０.００１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，０．００１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ１に０.０１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，０．０１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ１に０.１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，０．１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ１に１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ１に１０％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．２％  Ｓ−２，１０％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ１に０．１％のＳ−１及び０％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ１に０．１％のＳ−１及び０．００２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，０．００２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃ１に０．１％のＳ−１及び０．０２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，０．０２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃ１に０．１％のＳ−１及び０．２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，０．２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃ１に０．１％のＳ−１及び１％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，１％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃ１に０．１％のＳ−１及び２％のＳ−２を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−１，２％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃ１に１％のＳ−１及び０％のＳ−２を添加した低血清培地（１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ１に０％のＳ−１及び１％のＳ−２を添加した低血清培地（１％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃ１に１％のＳ−１及び１％のＳ−２を添加した低血清培地（１％  Ｓ−１，１％  Ｓ−２）、
低血清培地Ｃ１に０．５％のＦＣＳ、１％のＳ−１及び１％のＳ−２を添加した低血清培地（１％  Ｓ−３，１％  ＦＣＳ）。【００７０】
低血清培地Ｃ２に、（２−１）で製造したＳ−１及び／又は２’を様々な濃度で添加した低血清培地を得た。具体的には、以下の濃度でＳ−１及び／又はＳ−２’を加えた。
低血清培地Ｃ２に１％のＳ−１及び０．１％のＳ−２'を添加した低血清培地（０．１％  Ｓ−２'，１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ２に１％のＳ−１及び０．０２％のＳ−２'を添加した低血清培地（０．０２％  Ｓ−２'，１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ２に１％のＳ−１及び０．０１％のＳ−２'を添加した低血清培地（０．０１％  Ｓ−２'，１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ２に１％のＳ−１及び０．００２％のＳ−２'を添加した低血清培地（０．００２％  Ｓ−２'，１％  Ｓ−１）、
低血清培地Ｃ２に１％のＳ−１及び０．０００２％のＳ−２'を添加した低血清培地（０．０００２％  Ｓ−２'，１％  Ｓ−１）。【００７１】
１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン及び抗生物質を含むヒト間葉系幹細胞専用培地キット（hMSC Bullet Kit、LONZA社製）を、従来培地とした。【００７２】
これらの培地１０ｍＬを、それぞれ直径１００ｍｍの培養皿に入れ、初期細胞数１０,０００細胞／ｍＬでｈＭＳＣを播種し、３７℃にて５％ＣＯ２環境下で培養を行った。【００７３】
図５〜７については培養開始から１９日の間の集団倍化数（ｎ）の変化を、図８については培養開始から１８日の間の集団倍化数（ｎ）の変化を、細胞継代毎の細胞数を血球計測盤を用いて計測した結果を用いて計算した。結果を、図５〜８に示す。
図５は、Ｓ−２の濃度を一定にした場合の集団倍化数の変化を示す。
図５では、従来培地（○）、低血清培地Ｃ１（▲）、０．２％Ｓ−２（×）、０．２％  Ｓ−２，０．００１％  Ｓ−１（−）、０．２％  Ｓ−２，０．０１％  Ｓ−１（＊）、０．２％  Ｓ−２，０．１％  Ｓ−１（＋）、０．２％  Ｓ−２，１％  Ｓ−１（△）、０．２％  Ｓ−２，１０％  Ｓ−１（◆）、１％  Ｓ−１（□）、１％  Ｓ−２（■）及び１％  Ｓ−１，１％  Ｓ  −２（●）の集団倍化数を示す。【００７４】
図６は、Ｓ−１の濃度を一定にした場合の集団倍化数の変化を示す。
図６では、従来培地（○）、低血清培地Ｃ１（▲）、０．１％Ｓ−１（×）、０．１％  Ｓ−１，０．００２％  Ｓ−２（−）、０．１％  Ｓ−１，０．０２％  Ｓ−２（＊）、０．１％  Ｓ−１，０．２％  Ｓ−２（＋）、０．１％  Ｓ−１，１％  Ｓ−２（◆）、０．１％  Ｓ−１，２％  Ｓ−２（◇）、１％  Ｓ−１（□）、１％  Ｓ−２（■）及び１％  Ｓ−１，１％Ｓ−２（●）の集団倍化数を示す。【００７５】
さらに、上記の低血清培地Ｃ１に、Ｓ−３を１％加えた場合の結果を図７に示す。
図７では、従来培地（○）、低血清培地Ｃ１（▲）、１％  Ｓ−１（◆）、１％  Ｓ−２（■）１％  Ｓ−３（●）及び１％  Ｓ−３，１％  ＦＣＳ（◇）の集団倍化数を示す。【００７６】
図８は、Ｓ−１の濃度を一定にした場合の集団倍化数の変化を示す。
図８では、従来培地（○）、０．１％  Ｓ−２’，１％  Ｓ−１（△）、０．０２％  Ｓ−２’，１％  Ｓ−１（◆）、０．０１％  Ｓ−２’，１％  Ｓ−１（■）、０．００２％  Ｓ−２’，１％  Ｓ−１（◇）、０．０００２％  Ｓ−２’，１％  Ｓ−１（□）の集団倍化数を示す。【００７７】
（２−３）ｈＭＳＣの脂肪細胞への分化
（２−２）の従来培地及び１％  Ｓ−３，１％  ＦＣＳを用いて数継代維持した細胞を、２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、脂肪細胞分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、５００μＭ  イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭデキサメタゾン、１μＭインスリン、１μＭロシグリタゾン）０．１ｍＬを含む９６穴培養プレートのウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２で１４日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。脂肪細胞への分化は、オイルレッドＯ染色により確認した。結果を、図９（Ａ）に示す。【００７８】
（２−４）ｈＭＳＣの骨細胞への分化
（２−２）の従来培地及び１％  Ｓ−３，１％  ＦＣＳを用いて数継代維持した細胞を、３０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、骨細胞分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、２００μＭ  アスコルビン酸、０．１μＭデキサメタゾン、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート）０．５ｍＬを含む２４穴培養プレートのウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２で１４日間培養することにより、骨細胞への分化誘導を行った。骨細胞への分化は、アリザリンレッドＳ染色により確認した。結果を、図９（Ｂ）に示す。【００７９】
図９の結果から、１％  Ｓ−３，１％  ＦＣＳで培養したｈＭＳＣは、１０％血清を含む従来培地で培養した細胞と同程度に染色され、従って、同程度に、脂肪細胞及び骨細胞に分化したことがわかる。よって、これらの培地で培養した細胞はいずれも、未分化性維持能を有しており、幹細胞としての分化能に差がないことがわかる。
また、（２−２）で用いたＦＣＳの代わりにヒト血清を用いても、図５〜９で示す増殖及び分化の傾向は変わらないことが確認された。
さらに、Ｅｄｇリガンドとして、ＬＰＡの代わりにＳ１Ｐを用いても、分化の傾向は変わらないことが確認された。
【実施例３】
【００８０】
アミノ酸類（上記した全アミノ酸類）、無機塩類（上記した全無機塩類）、ビタミン類（上記した全ビタミン類）及び他の添加剤（アデノシン 5'-一りん酸、コルチコステロン、エタノールアミン、D-ガラクトース、D-グルコース、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン及びトランスフェリン）を含む培地に、７×１０−４％の２−ＭＥ、１００Ｕ／Ｌのペニシリン・ストレプトマイシン、０．５％ＦＣＳ、２．５ｎｇ/ｍＬｂＦＧＦ及び１％の（１−１）で製造したＳ−３を加えた低血清培地３（１％  Ｓ−３  ＬＳ）を得た。【００８１】
また、ＦＣＳを含まない以外は上記の低血清培地３と同様の組成で、無血清培地３（１％  Ｓ−３  ＳＦ）を得た。【００８２】
ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、１ｍｇ／Ｌの非必須アミノ酸（GIBCO社製）、７×１０−４％の２−ＭＥ、１００Ｕ／Ｌのペニシリン・ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、２．５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えて、従来の血清含有培地を得た（従来培地）。【００８３】
これらの培地１０ｍＬを、それぞれ直径１００ｍｍの培養皿に入れ、初期細胞数１０,０００細胞／ｍＬでｈＦＢを播種し、３７℃にて５％ＣＯ２環境下で培養を行った。【００８４】
培養開始から２２日の間の集団倍化数（ｎ）を、細胞継代毎の細胞数を血球計測盤を用いて計測した結果を用いて計算した。結果を、図１０に示す。
図１０では、従来培地（○）、１％  Ｓ−３  ＬＳ（●）及び１％  Ｓ−３  ＳＦ（▲）の集団倍化数を示す。
【実施例４】
【００８５】
実施例４：血清ロット差の軽減効果（ｈＭＳＣの培養）
（４−１）リガンドの製造
２．１ｍｇのセロトニン塩酸塩及び２．３ｍｇのＬＰＡを１０ｍｌのＰＢＳに溶解して、リガンド３（Ｓ−３）を製造した。【００８６】
（４−２）ｈＭＳＣの増殖
実施例１で調製した基礎培地からヒポキサンチン及びチミジン並びに一部の無機塩類（硫酸銅、硝酸鉄(III)、硫酸鉄、塩化マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸亜鉛）を除外した基礎培地に、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン・ストレプトマイシン（GIBCO社製）、及びロットの異なるＦＣＳを各々１．０％加えた低血清培地Ｃ２（ＦＣＳ１〜４）を得た。【００８７】
低血清培地Ｃ２（ＦＣＳ１〜４）に、（４−１）で製造した１％のＳ−３を添加して、低血清培地（１％  Ｓ−３，１％  ＦＣＳ（１〜４））を得た。【００８８】
ＤＭＥＭに、Ｌ−グルタミン、抗生物質、及び上記４種類のロットに対応するＦＣＳ（１〜４）を各々１０％加えて、従来の血清含有培地を得た（従来培地（ＦＣＳ１〜４））。【００８９】
これらの培地１０ｍＬを、それぞれ直径１００ｍｍの培養皿に入れ、初期細胞数１０,０００細胞／ｍＬでｈＭＳＣを播種し、３７℃にて５％ＣＯ２環境下で培養を行った。【００９０】
培養開始から１８日の間の集団倍化数（ｎ）の変化を、細胞継代毎の細胞数を血球計測盤を用いて計測した結果を用いて計算した。ＦＣＳのロットを変えた時の集団倍化数の変化を、図１１〜１４に示す。図１１〜１４では、従来培地（ＦＣＳ１〜４）を（○）で、低血清培地（１％  Ｓ−３，１％  ＦＣＳ（１〜４））を（●）で示した。【００９１】
また、従来培地（ＦＣＳ１〜４）及び低血清培地（１％  Ｓ−３，１％  ＦＣＳ（１〜４））を用いて、１４日間培養したときの集団倍化数（ｎ）を、まとめて図１５に示す。【００９２】
図１１〜１５の結果から、低血清培地（１％  Ｓ−３，１％  ＦＣＳ）では、１０％血清を含む従来培地と比較して、ＦＣＳの製造ロット差による細胞増殖への影響が低減していることがわかる。
【実施例５】
【００９３】
実施例５：ヒト血清での培養（ｈＭＳＣの培養）
（５−１）リガンドの製造
２．１ｍｇのセロトニン塩酸塩及び２．３ｍｇのＬＰＡを１０ｍｌのＰＢＳに溶解して、リガンド３（Ｓ−３）を製造した。【００９４】
（５−２）ｈＭＳＣの増殖
実施例１で調製した基礎培地からヒポキサンチン及びチミジン並びに一部の無機塩類（硫酸銅、硝酸鉄(III)、硫酸鉄、塩化マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸亜鉛）を除外した基礎培地に、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン・ストレプトマイシン（GIBCO社製）、及びロットの異なるヒト血清ＨＳを各々１．０％加えた低血清培地Ｃ３（ＨＳ１，２）を得た。【００９５】
低血清培地Ｃ３（ＨＳ１，２）に、（５−１）で製造した１％のＳ−３を添加して、低血清培地（１％  Ｓ−３，１％  ＨＳ（１，２））を得た。【００９６】
ＤＭＥＭに、Ｌ−グルタミン、抗生物質、及び上記２種類のロットに対応するヒト血清ＨＳ（１，２）を各々１０％加えて、従来の血清含有培地を得た（従来培地（ＨＳ１，２））。【００９７】
これらの培地１０ｍＬを、それぞれ直径１００ｍｍの培養皿に入れ、初期細胞数１０,０００細胞／ｍＬでｈＭＳＣを播種し、３７℃にて５％ＣＯ２環境下で培養を行った。【００９８】
培養開始から１８日の間の集団倍化数（ｎ）の変化を、細胞継代毎の細胞数を血球計測盤を用いて計測した結果を用いて計算した。ＨＳのロットを変えた時の集団倍化数の変化を、図１６，１７に示す。従来培地（ＨＳ１，２）を（○）で、低血清培地（１％  Ｓ−３，１％  ＨＳ（１，２））を（●）で示した。【００９９】
図１６，１７の結果から、ヒト血清を用いた低血清培地（１％  Ｓ−３，１％  ＨＳ）での培養も可能であることがわかる。
【実施例６】
【０１００】
実施例６：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の培養２
水中に、アミノ酸類（上記した全アミノ酸類）、無機塩類（硫酸銅、硝酸鉄(III)、硫酸鉄、塩化マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸亜鉛を除外した上記した全無機塩類）、ビタミン類（上記した全ビタミン類）及び他の添加剤（アデノシン 5'-一りん酸、コルチコステロン、エタノールアミン、D-ガラクトース、D-グルコース、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、トリヨードチロニン及びトランスフェリン）を含む基礎培地に１ｎｇ／ｍｌの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、２．５ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、０．０２重量％のヒト血清アルブミンおよび５００μＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン・ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社製）、及び１％の（１−１）で製造したＳ−３を加えた無血清増殖培地Ａを得た。【０１０１】
ＤＭＥＭに１００Ｕ／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを加えて、従来の血清含有培地を得た（従来培地Ａ）。【０１０２】
これらの培地１０ｍＬを、それぞれ直径１００ｍｍの培養皿に入れ、初期細胞数１５,０００細胞／ｍＬでｈＭＳＣを播種し、３７℃にて５％ＣＯ２環境下で培養を行った。【０１０３】
培養開始から１８日間の集団倍化数（ｎ）の変化を、継代培養毎の細胞数を血球計測盤を用いて計測した結果を用いて計算した。【０１０４】
結果を、図１８に示す。図１８に示されるように、本発明の無血清増殖培地Ａ中で培養すると、無血清であるにもかかわらず、また、成長因子を２種類しか含んでいないにも関わらず、集団倍加数は、血清を含む従来培地Ａで培養した場合と同等であった。【０１０５】
ｈＭＳＣの脂肪細胞への分化
従来培地Ａ及び無血清増殖培地Ａで数継代維持した細胞を、３００００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、脂肪細胞分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、５００μＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメタゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾン）０．３ｍＬを含む４８穴培養プレートのウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２で１４日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。脂肪細胞への分化は、オイルレッドＯ染色により確認した。【０１０６】
結果を図１９（Ａ）に示す。図１９（Ａ）に示されるように、本発明の無血清増殖培地Ａで細胞を数継代維持した後、分化誘導をかけた場合には、血清を含有する従来培地Ａで数継代維持した場合よりもやや少ないながらも、概ね従来培地と同程度に細胞が染色され、脂肪細胞への明らかな分化が確認された。【０１０７】
ｈＭＳＣの骨細胞への分化
従来培地及び無血清増殖培地Ａで数継代維持した細胞を、３０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、骨細胞分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、２００μＭのアスコルビン酸、０．１μＭのデキサメタゾン、１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート）０．７ｍＬを含む１２穴培養プレートのウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間培養することにより、骨細胞への分化誘導を行った。骨細胞への分化は、アリザリンレッドＳ染色により確認した。【０１０８】
結果を図１９（Ｂ）に示す。図１９（Ｂ）に示されるように、本発明の無血清増殖培地Ａで細胞を数継代維持した後、分化誘導をかけた場合には、血清を含有する従来培地Ａで数継代維持した場合と同程度に染色され、骨細胞への分化が確認された。
【実施例７】
【０１０９】
実施例７：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の培養３
水中に、アミノ酸類（上記した全アミノ酸類）、無機塩類（硫酸銅、硝酸鉄(III)、硫酸鉄、塩化マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸亜鉛を除外した上記した全無機塩類）、ビタミン類（上記した全ビタミン類）及び他の添加剤（アデノシン 5'-一りん酸、コルチコステロン、エタノールアミン、D-ガラクトース、D-グルコース、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、トリヨードチロニン及びトランスフェリン）を含む基礎培地に０．０２重量％のヒト血清アルブミンおよび５００μＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン・ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社製）、及び１％の（１−１）で製造したＳ−３を加えた無血清増殖培地Ｂを得た。【０１１０】
得られた無血清増殖培地Ｂ並びに実施例６で調製した無血清増殖培地Ａ及び従来培地Ａの各培地１０ｍＬを、それぞれ直径１００ｍｍの培養皿に入れ、初期細胞数２０,０００細胞／ｍＬでｈＭＳＣを播種し、３７℃にて５％ＣＯ２環境下で培養を行った。【０１１１】
培養開始から２１日間の集団倍化数（ｎ）の変化を、継代培養毎の細胞数を血球計測盤を用いて計測した結果を用いて計算した。【０１１２】
結果を、図２０に示す。図２０に示されるように、成長因子を含まない本発明の無血清培地Ｂ中で培養した場合でも、成長因子を含む本発明の無血清培地Ｂ中で培養した場合や従来培地Ａ中で培養した場合よりも集団倍化数は減少するが、細胞は増殖可能であった。【０１１３】
ｈＭＳＣの脂肪細胞への分化
従来培地Ａ又は無血清増殖培地Ａ若しくは無血清増殖培地Ｂで数継代維持した細胞を、３００００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、脂肪細胞分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、５００μＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメタゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾン）０．３ｍＬを含む４８穴培養プレートのウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２で１４日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。脂肪細胞への分化は、オイルレッドＯ染色により確認した。【０１１４】
結果を図２１（Ａ）に示す。図２１（Ａ）に示されるように、３種類の培地のそれぞれで継代維持した後分化誘導をかけた細胞は、同程度に染色され、成長因子を含まない本発明の無血清培地Ｂ中で継代維持した後に分化誘導かけた場合でも、血清を含む従来培地と同等に分化が確認された。【０１１５】
ｈＭＳＣの骨細胞への分化
従来培地Ａ又は無血清増殖培地Ａ若しくは無血清増殖培地Ｂで数継代維持した細胞を、３０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、骨細胞分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、２００μＭのアスコルビン酸、０．１μＭのデキサメタゾン、１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート）０．７ｍＬを含む１２穴培養プレートのウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間培養することにより、骨細胞への分化誘導を行った。骨細胞への分化は、アリザリンレッドＳ染色により確認した。【０１１６】
結果を図２１（Ａ）に示す。図２１（Ａ）に示されるように、無血清増殖培地Ａ若しくは無血清増殖培地Ｂで数継代維持した後、分化誘導をかけた細胞は、従来培地Ａで数継代維持した場合と同程度に染色され、骨細胞への分化が確認された。本発明の無血清増殖培地は、成長因子を含まない場合でも、骨細胞への分化能を維持することが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】実施例１で得られたヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＭＡＤＳ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図２】実施例１で得られたヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＭＡＤＳ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図３】実施例１で得られたヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＭＡＤＳ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図４】ヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＭＡＤＳ）の脂肪細胞への分化（Ａ）、及び骨細胞への分化（Ｂ）を示す。
【図５】実施例２で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図６】実施例２で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図７】実施例２で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図８】実施例２で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図９】ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の肪細胞への分化（Ａ）、及び骨細胞への分化（Ｂ）を示す。
【図１０】実施例３で得られたヒト繊維芽細胞（ｈＦＢ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図１１】実施例４で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図１２】実施例４で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図１３】実施例４で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図１４】実施例４で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図１５】実施例４で得られた、異なるロットのウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地で１４日間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数を示す図である。
【図１６】実施例５で得られた、ヒト血清を含有する培地で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図１７】実施例５で得られた、ヒト血清を含有する培地で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図１８】実施例６で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図１９】実施例６で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の脂肪細胞への分化（Ａ）、及び骨細胞への分化（Ｂ）を示す。
【図２０】実施例７で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の集団倍化数の変化を示すグラフである。
【図２１】実施例７で得られたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の脂肪細胞への分化（Ａ）、及び骨細胞への分化（Ｂ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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