(57)【要約】  正確かつ容易な血液凝固時間の延長原因の判定法の提供。  被検血漿中の血液凝固時間延長原因の判定法であって、（１）（ａ）被検血漿のみ、（ｂ）正常血漿のみ、及び（ｃ）被検血漿と正常血漿とを少なくとも１種の混合比で混合した試料の血液凝固時間を測定し、（２）縦軸を血液凝固時間、又は血液凝固時間の延長率、横軸を被検血漿又は正常血漿の混合比又は混合率として前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の測定結果をプロットして得られる折れ線グラフを描画した場合の折れ線下面積Ａと、前記（ａ）及び（ｂ）の測定結果のプロットを結ぶ線分下面積Ｂを求め、（３）面積Ｂに対する、面積Ａから面積Ｂを差し引いた面積（Ａ−Ｂ）の比率（（Ａ−Ｂ）／（Ｂ））：面積比Ｘ）を算出し、（４）凝固因子インヒビター陽性血漿について前記工程（１）〜（２）の操作を行い予め基準面積比Ｙを定め、（５）面積比Ｘと基準面積比Ｙとを対比し、Ｙ≦Ｘの場合に凝固因子インヒビター型と判定し、Ｙ＞Ｘの場合に凝固因子欠乏型と判定することを特徴とする判定法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検血漿中の血液凝固時間延長原因の判定法であって、
（１）（ａ）被検血漿のみ、（ｂ）正常血漿のみ、及び（ｃ）被検血漿と正常血漿とを少なくとも１種の混合比で混合した試料の血液凝固時間を測定し、
（２）縦軸を血液凝固時間又は血液凝固時間の延長率、横軸を被検血漿又は正常血漿の混合比又は混合率として前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の測定結果をプロットして得られる折れ線グラフを描画した場合の折れ線下面積Ａと、前記（ａ）及び（ｂ）の測定結果のプロットを結ぶ線分下面積Ｂを求め、
（３）面積Ｂに対する、面積Ａから面積Ｂを差し引いた面積（Ａ−Ｂ）の比率（（Ａ−Ｂ）／（Ｂ））：面積比Ｘ）を算出し、
（４）凝固因子インヒビター陽性血漿について前記工程（１）〜（２）の操作を行い予め基準面積比Ｙを定め、
（５）面積比Ｘと基準面積比Ｙとを対比し、Ｙ≦Ｘの場合に凝固因子インヒビター型と判定し、Ｙ＞Ｘの場合に凝固因子欠乏型と判定することを特徴とする判定法。
【請求項２】
凝固因子インヒビター陽性血漿についての基準面積比Ｙが、複数の健常人血漿の血液凝固時間について統計学的に求めた基準範囲の上限値を超え、かつ該上限値＋５０％以内の血液凝固時間を示す凝固因子インヒビター陽性血漿について求めたものである請求項１記載の判定法。
【請求項３】
健常人血漿の血液凝固時間についての基準範囲が、複数の健常人血漿の血液凝固時間を統計学的に処理して得た値である請求項２記載の判定法。
【請求項４】
請求項１の工程（２）で縦軸を血液凝固時間とする場合に前記面積Ａ及び面積Ｂについて、定数を差し引いた値を用いる請求項１記載の判定法。
【請求項５】
前記定数が、前記折れ線グラフを描画した場合の正常血漿の血液凝固時間のプロットから横軸に平行な補助線を描画した場合の該補助線下面積である請求項４記載の判定法。
【請求項６】
血液凝固時間がＰＴ（プロトロンビン時間）、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、ｄＰＴ（希釈ＰＴ）、ｄＡＰＴＴ（希釈ＡＰＴＴ）、ＫＣＴ（カオリン凝固時間）及びｄＲＶＶＴ（希釈ラッセル蛇毒時間）から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜５のいずれか１項記載の判定法。
【請求項７】
凝固因子インヒビターが、ループスコアンチグラント（ＬＡ）、第ＶＩＩＩ因子インヒビター、第ＩＸ因子インヒビター及び第Ｖ因子インヒビターから選ばれる少なくとも１種である請求項１〜６のいずれか１項記載の判定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液試料中の血液凝固時間の延長原因を判定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固試験は、活性化剤及び／又はＣａ２＋などを、検体又は検体混合物中に添加した時点から、検出可能なフィブリン塊が形成されるまでの時間（血液凝固時間、以下、単に凝固時間と言う場合もある。）を測定するもので、血液凝固反応系の異常の有無のスクリーニング、又は個別の因子の活性測定のために実施されている。典型的な例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン時間などがある。
ＰＴとは、被検血漿に組織トロンボプラスチン及びＣａ２＋の混合液を添加してから凝固するまでの時間であり、外因系凝固機序に関係する第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、プロトロンビン、フィブリノゲン等の凝固活性を総合的に検査するものである。また、ＡＰＴＴとは、被検血漿に十分量のリン脂質及び活性化剤（カオリン、無水ケイ酸、エラグ酸など）と適量のＣａ２＋を添加して凝固するまでの時間であり、内因性凝固機序に関係する第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、プロトロンビン、フィブリノゲン等の凝固活性を総合的に検査するものである。一般的に、これら血液凝固試験における異常とは、凝固時間が延長することを指す。血液凝固反応系の異常は、生体内での出血傾向又は血栓傾向（血液凝固傾向）の兆候を反映している。
該原因としては、１）血液凝固因子の欠乏又は低下、２）血液凝固系を構成する血液成分に対する抗体の存在、３）血液凝固時間測定試薬中の成分に対する抗体の存在、４）血液凝固系を構成する血液成分と血液凝固時間測定試薬中の成分との複合体に対する抗体の存在、５）血液凝固反応を阻害する薬剤の投与などが考えられる。【０００３】
しかし、単に、血液凝固時間の測定を行うだけでは、その原因が単純な凝固因子欠乏による活性低下なのか、血液凝固系を構成する成分又は血液凝固時間測定試薬中の成分等に対する抗体（インヒビター）の凝固反応阻止による活性低下なのかを鑑別することはできない。また、該原因の違いにより治療方針が異なるため、その鑑別は重要である。そこで、被検血漿に正常血漿を添加し、その血液凝固時間が補正される（正常化する）程度をグラフ化して判定する血液凝固補正試験（ミキシングテスト）が行われている（非特許文献１）。【０００４】
従来、ミキシングテストは、例えば次のようにして実施されている。
被検血漿に正常血漿を添加し、正常血漿の割合が０、２０、５０、８０、１００％となるように混合して調製した試料を準備し、ＡＰＴＴの測定を行う。その結果をグラフ（横軸：混和した正常血漿の割合又は被検血漿の割合（％）、縦軸：凝固時間（秒））にプロットし、該グラフの形状から視覚的に判定する。例えば、凝固因子欠乏の場合、少量の正常血漿の添加（図１（Ａ）では２０％）で凝固時間は大きく短縮して正常血漿の場合の値に近づくため、被検血漿と正常血漿のポイントを結んだ直線（破線）よりも下に凸のカーブを示す（図１（Ａ））。
凝固因子インヒビターが存在する場合は、正常血漿の添加割合を高くしても正常血漿中の該凝固因子を失活させるため、正常血漿の添加による凝固時間の改善度合いが小さく、上に凸のカーブを示す（図１（Ｂ））。【０００５】
しかし、検体によっては破線と同じような形状のグラフ（図１（Ｃ））となる場合があり、その場合は大変判定しづらく問題となっていた。
また、ミキシングテストは視覚的に判定するものであり、補正の程度を定量化する統一された方法はなく、最終的な判定は判定者に任せられているので、判定者の熟練度により判定結果が変わる可能性があることも問題であった。
更に測定する試薬の凝固因子インヒビターへの感受性の違いによっても判定結果が変わる可能性があった。特に、試薬の感受性に依存する凝固因子インヒビターとして、ループスアンチコアグラント（以下、ＬＡ）が知られている。ＬＡは個々の凝固因子に対するインヒビターではなく、リン脂質依存性の凝固反応を阻害する免疫グロブリンである。凝固反応にはリン脂質の存在が必須であるため、通常、多くの血液凝固測定試薬にはリン脂質が豊富に含まれている。ＬＡは、試薬中のリン脂質と反応して、これを消費し、結果的に凝固反応を阻害するため、ＰＴやＡＰＴＴのような凝固検査が異常となり発見されることが多い。しかし、ＬＡはリン脂質の種類（由来、リン脂質組成等）により反応強度が異なるため、使用する試薬によっても判定結果が異なることが知られている。【０００６】
判定者の熟練度によらず、判定を容易にするため、被検血漿の凝固時間をａ、被検血漿と正常血漿の５：５の混合比の凝固時間をｂ、正常血漿の凝固時間をｃとして、次のような判定方法も知られている（非特許文献２）。
１）（ａ＋ｃ）／２≦ｂ、２）（ｂ−ｃ）／ａ≧ｘ、３）ｂ−ｃ≧ｘ、４）ｂ／ｃ≧ｘ
上記判定方法１）は、グラフが上に凸であるか下に凸であるかを数値化しただけであり、視覚的な判定と結果は変わらない。判定方法２）はＲｏｓｎｅｒ  Ｉｎｄｅｘとも呼ばれ、特にＬＡを判定するのに有用な判定法とされており、ｘは０．１５が適当であるとされているが、その値はカオリン凝固時間（ＫＣＴ）で設定された値である。実際には、各施設で使用する試薬に適したｘの設定が必要であるが、設定法については不明瞭である（非特許文献３）。判定方法３）〜４）についても、各施設でｘの設定が必要であるが、その設定法については不明瞭であり、判定方法として十分とは言えない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】検査と技術，Ｖｏｌ．３４，ｎｏ．８，２００６年８月，ｐ７３５−７４２
【非特許文献２】臨床検査法提要第３２版，ｐ４４３
【非特許文献３】Ｔｈｒｏｍｂｏ．Ｈａｅｍｏｓｔ．Ｖｏｌ．５７，ｎｏ．２，１９８７，ｐ１４４−１４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、従来の方法では、カットオフ値の設定方法が不明瞭であり、凝固因子インヒビターが弱陽性の検体を見逃してしまう危険性があった。実際、本発明者らの検討では、ＬＡ弱陽性検体の場合にミキシングテストにて得られたグラフが下に凸になる例も認められた。また、ミキシングテストは測定する試薬の凝固因子インヒビターへの感受性の違いに大きく左右され、試薬によって測定結果が変わる可能性があった。さらに、目視による判定方法は、前記した如く、判定者の経験によるところが大きく、熟練度の違いによって判定結果が変わる危険性があった。
よって、試薬の凝固因子インヒビター感受性の強弱や判定者の熟練度の違いに左右されず、血液凝固時間の延長原因が凝固因子インヒビターの存在によるためか、凝固因子の欠乏によるためかについて、一定の判定結果を得るための判定方法の開発が強く望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ミキシングテストの結果を目視ではなくグラフ中の面積比の対比とし、さらにカットオフ値の設定も明確なものとした、次のような判定方法により前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、次の発明を提供するものである。
１．被検血漿中の血液凝固時間延長原因の判定法であって、
（１）（ａ）被検血漿のみ、（ｂ）正常血漿のみ、及び（ｃ）被検血漿と正常血漿とを少なくとも１種の混合比で混合した試料のリン脂質依存性の血液凝固時間を測定し、
（２）縦軸を血液凝固時間、又は血液凝固時間の延長率、横軸を被検血漿又は正常血漿の混合比又は混合率として前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の測定結果をプロットして得られる折れ線グラフを描画した場合の折れ線下面積Ａと、前記（ａ）及び（ｂ）の測定結果のプロットを結ぶ線分下面積Ｂを求め、
（３）面積Ｂに対する、面積Ａから面積Ｂを差し引いた面積（Ａ−Ｂ）の比率（（Ａ−Ｂ）／（Ｂ））：面積比Ｘ）を算出し、
（４）凝固因子インヒビター陽性血漿について前記工程（１）〜（２）の操作を行い予め基準面積比Ｙを定め、
（５）面積比Ｘと基準面積比Ｙとを対比し、Ｙ≦Ｘの場合に凝固因子インヒビター型と判定し、Ｙ＞Ｘの場合に凝固因子欠乏型と判定することを特徴とする判定法。
２．凝固因子インヒビター陽性血漿についての基準面積比Ｙが、複数の健常人血漿の血液凝固時間について統計学的に求めた基準範囲の上限値を超え、かつ該上限値＋５０％以内の血液凝固時間を示す凝固因子インヒビター陽性血漿について求めたものである前記１記載の判定法。
３．健常人血漿の血液凝固時間についての基準範囲が、複数の健常人血漿の凝固時間を統計学的に処理して得た値である前記２記載の判定法。
４．前記１の工程（２）で縦軸を凝固時間とする場合に前記面積Ａ及び面積Ｂについて、定数を差し引いた値を用いる前記１記載の判定法。
５．前記定数が、前記折れ線グラフを描画した場合の正常血漿の血液凝固時間のプロットから横軸に平行な補助線を描画した場合の該補助線下面積である前記４記載の判定法。
６．血液凝固時間がＰＴ（プロトロンビン時間）、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、ｄＰＴ（希釈ＰＴ）、ｄＡＰＴＴ（希釈ＡＰＴＴ）、ＫＣＴ（カオリン凝固時間）及びｄＲＶＶＴ（希釈ラッセル蛇毒時間）から選ばれる少なくとも１種である前記１〜５のいずれかに記載の判定法。
７．凝固因子インヒビターが、ループスコアンチグラント（ＬＡ）、第ＶＩＩＩ因子インヒビター、第ＩＸ因子インヒビター及び第Ｖ因子インヒビターから選ばれる少なくとも１種である前記１〜６のいずれかに記載の判定法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明方法によれば、従来判定が困難であった凝固因子インヒビターが弱陽性の血漿の判定も、より正確に行うことができる。また、本発明方法によれば、判定者の熟練度に影響されず、容易に正確な判定を行うことができる。従って、本発明方法によれば、血液凝固時間試験により凝固時間が延長した患者の正しい治療方針を決定できることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】従来法によるミキシングテストの結果を示す図である。（Ａ）は凝固因子欠乏型、（Ｂ）は凝固因子インヒビター型、（Ｃ）は原因が不明確なパターンを示す。
【図２】工程（２）の折れ線グラフ下面積の例を示す。
【図３】工程（２）の折れ線グラフ下面積の例を示す。
【図４】工程（３）の面積（Ａ−Ｂ）の例を示す（図２に対応）。
【図５】工程（３）の面積（Ａ−Ｂ）の例を示す（図３に対応）。
【図６】検体番号１に対して作図された折れ線グラフである。
【図７】検体番号４に対して作図された折れ線グラフである。
【図８】検体番号６に対して作図された折れ線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に用いる被検血漿としては、血液をそのまま用いるよりも血漿を用いることが好ましく、血小板除去血漿を用いることがさらに好ましい。これは血漿中に残存する血小板に由来するリン脂質により、ＬＡの様なリン脂質依存性の凝固因子インヒビターが陰性化する可能性を排除できるからである。
【００１４】
被検血漿との混合に用いる正常血漿は自家調製又は市販の正常血漿でよく、好ましくは血小板除去処理済みの正常血漿がよい。前記の血小板除去の方法は、公知の方法を用いればよく、例えば遠心分離や血小板除去フィルター処理などを用いることができる。市販品としては、Ｐｏｏｌｅｄ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｐｌａｓｍａ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ社製）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｐｏｏｒ  Ｐｌａｓｍａ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ社）、（ＬＡｔｒｏｌ（Ｔｒａｄｅ  Ｍａｒｋ）Ｎｏｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社）などが知られている。
【００１５】
凝固因子インヒビターとしては、ＬＡの他にも、第ＶＩＩＩ因子インヒビター、第ＩＸ因子インヒビター、第Ｖ因子インヒビターなどが知られており、これらに限定されるものではなく、対象とする凝固因子インヒビターに感受性を示す血液凝固時間測定試薬を用いれば本発明方法を適用することが可能である。
【００１６】
例えば、ＬＡを対象とする場合には、ＬＡに感受性を示すリン脂質依存性の血液凝固時間測定試薬であればいずれでもよく、ＰＴ、ＡＰＴＴ、ｄＡＰＴＴ、ｄＰＴ、ＫＣＴ、及びｄＲＶＶＴなどを測定する試薬が用いられている。また、第ＶＩＩＩ因子インヒビター、第ＩＸ因子インヒビターを対象とする場合にはＡＰＴＴ測定試薬など、第Ｖ因子インヒビターを対象とする場合にはＡＰＴＴ測定試薬やＰＴ測定試薬などが用いられている。前記試薬としてはいずれも市販品を使用できる。例えば、ＰＴ測定用試薬としては、例えばコアグピア（登録商標）ＰＴ−Ｓ（積水メディカル社製）、トロンボチェックＰＴプラス（シスメックス社製）、及びＳＴＡ試薬シリーズＰＴ（ロシュ社製）などが市販されている。ＡＰＴＴ測定用試薬としては、例えばコアグピア（登録商標）ＡＰＴＴ−Ｓ（積水メディカル社製）、トロンボチェックＡＰＴＴ−ＳＬＡ（シスメックス社製）及びＡＰＴＴリキッドＲＤ（ロシュ社製）などが市販されている。
【００１７】
一方、血液凝固試験の異常により欠乏又は低下が疑われる凝固因子としては、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲンやフォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）などが挙げられる。
【００１８】
本発明の判定法の工程（１）においては、（ａ）被検血漿のみ、（ｂ）正常血漿のみ、及び（ｃ）上記の如くして得られた混合試料の血液凝固時間を測定する。
被検血漿と正常血漿とを少なくとも１種の混合比で混合した試料を用いた血液凝固時間の測定（ミキシングテスト）におけるプロット数は、被検血漿及び正常血漿そのものを含み３点以上あればよいが、被検血漿と正常血漿との混合比の変動に伴う凝固時間の変動パターンを明瞭にするためには４点以上、さらに好ましくは５点以上がよい。尚、プロット数の上限に特に制限は無いが、経済性や測定時間を考慮すれば１０点以下が好ましく、７点以下がより好ましい。
【００１９】
凝固時間の延長率とは、正常血漿の凝固時間と被検血漿のみの場合の凝固時間の差を１とした場合の相対割合である。もちろん、該凝固時間の差を１００とした相対％等で表してもよい。
【００２０】
工程（２）は、（ａ）被検血漿のみの凝固時間、（ｂ）正常血漿のみの凝固時間、及び（ｃ）それらの混合液の凝固時間の測定結果を用い、縦軸を血液凝固時間又は血液凝固時間の延長率、横軸を被検血漿又は正常血漿の混合比又は混合率として前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の測定結果をプロットして得られる折れ線グラフを描画した場合の折れ線下面積Ａと、前記（ａ）及び（ｂ）の測定結果のプロットを結ぶ線分下面積Ｂを求める工程である。例えば、縦軸を凝固時間の延長率とした場合の折れ線グラフの例を、図２及び図３に示す（プロット数３、すなわち混合した液は１種の例）。ここで、面積（Ａ）は、例えば図２又は図３で示される四角形の面積である。図４は図２に対角線を加えた図であり、図５は図３に対角線を加えた図である。面積（Ｂ）は、図４又は図５のように対角線を斜辺とする直角三角形の面積である。尚、縦軸を血液凝固時間とする場合、前記面積Ａ及び面積Ｂは、そのままの値を使用してもよいが、双方から定数を差し引いた値を用いることもできる。該定数としては、例えば正常血漿の血液凝固時間のプロットから横軸に平行な補助線を描画した場合の該補助線下面積の値を用いることができる。
【００２１】
工程（３）は、被検血漿のみ、及び正常血漿のみの血液凝固時間又は凝固時間の延長率を結ぶ対角線を斜辺とする直角三角形の面積（Ｂ）に対する、折れ線グラフと横軸と縦軸とで作図される多角形の面積（Ａ）から前記三角形の面積を差し引いた面積（Ａ−Ｂ）の比率（（Ａ−Ｂ）／（Ｂ））：面積比Ｘ）を算出する工程である。尚、面積比は百分率で表してもよい。
【００２２】
図４の場合には面積（Ａ）は面積（Ｂ）より大きいから、（Ａ−Ｂ）／（Ｂ）は正の数になる。一方、図５の場合には、面積（Ａ）は面積（Ｂ）より小さいから、（Ａ−Ｂ）／（Ｂ）は負の数になる。
【００２３】
工程（４）は、カットオフ値を設定する工程である。
カットオフ値を設定するための試料としては、凝固因子インヒビターの検出感度を高めるため、健常人血漿における凝固時間に近い凝固時間を示す凝固因子インヒビター陽性血漿を使用することが望ましい。例えば、カットオフ値設定用試料の血液凝固時間は、複数の健常人血漿の血液凝固時間を統計学的に処理して得た健常人の基準範囲の上限値より大きく、上限値＋５０％以内であることが好ましく、より好ましくは＋２０％以内、さらに好ましくは＋１０％以内である。
また、前記範囲に入る凝固因子インヒビター陽性血漿であればいずれでもよく、弱陽性血漿を用いても良いし、強陽性血漿を正常血漿で段階的に希釈したものを用いてもよい。
前記、既知の凝固因子インヒビター陽性血漿としては、市販品を使用することもできる。例えばＬＡ陽性血漿の市販品としては、ＬＡｔｒｏｌ（Ｔｒａｄｅ  Ｍａｒｋ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社）、Ｌｕｐｕｓ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ社製）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｌｕｐｕｓ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ（Ｇｅｒｏｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ社）などが知られている。第ＶＩＩＩ因子インヒビターの市販品としては、Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  ＦＶＩＩＩ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｇｅｒｏｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ社）やＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｐｌａｓｍａ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ社）などが知られている。
但し、用いる試薬や測定機器等の違いを考慮してミキシングテストを実施する施設毎にカットオフ値（基準面積比Ｙ）を適宜設定してもよい。
【００２４】
なお、希釈試料の血液凝固時間測定試薬と健常人の血液凝固時間測定試薬は同一のものを用いる。例として、コアグピア（登録商標）ＡＰＴＴ−Ｓ（積水メディカル社製、以下試薬Ａ）及びトロンボチェックＡＰＴＴ−ＳＬＡ（シスメックス社製、以下試薬Ｂ）を用いた場合のＡＰＴＴの例を表１に示す。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
表１中、試薬Ａの場合には、カットオフ値設定用試料は、ＡＰＴＴが健常人の基準範囲３６．６秒よりも大きい３９．９秒を示す８倍希釈試料となる。試薬Ｂの場合には、ＡＰＴＴが健常人の基準範囲３５．７秒よりも大きい３５．８秒を示す８倍希釈試料となる。尚、健常人の基準範囲は、後述の如く、複数の健常人血漿の血液凝固時間を統計学的に処理して得たものが好ましい。
【００２７】
工程（５）は、凝固因子インヒビター型又は凝固因子欠乏型を判定する工程であり、面積比Ｘと基準面積比Ｙとを対比し、Ｙ≦Ｘの場合に凝固因子インヒビター型と判定し、Ｙ＞Ｘの場合に凝固因子欠乏型と判定することができる。判定は、数値により対比できるので、明確であり、熟練を必要としない。ここで凝固因子インヒビター型は、血液凝固時間の延長が前記の凝固因子インヒビターを原因とするものである。凝固因子欠乏型は、血液凝固時間の延長が、前記凝固因子の欠乏を原因とするものである。
【００２８】
前記の面積や面積比は、実際にグラフを作図するなどして算出しても良いが、同じ計算結果が得られるのであれば、その手段は問わない。即ち凝固時間の測定機器に該計算結果が得られるような機能を付加しておき、試料の測定結果から自動的に算出させてもよい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３０】
実施例１
（１）カットオフ値の設定用試料の決定
ＬＡ陽性血漿を正常血漿で４〜１６倍に希釈した検体を５０μＬずつ準備し、ＡＰＴＴ測定試薬５０μＬを添加し、３７℃に３分間加温した後、さらに塩化カルシウム液５０μＬを添加し、全自動血液凝固分析装置コアプレスタ（登録商標）２０００（積水メディカル社販売）を用いて、凝固時間を測定した。
ＬＡ陽性血漿としてはＬｕｐｕｓ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、正常血漿としてはＰｏｏｌｅｄ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｐｌａｓｍａ（ともにＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ社製）を用いた。また、ＡＰＴＴ測定試薬としては、コアグピア（登録商標）ＡＰＴＴ−Ｓ（積水メディカル社製、以下試薬Ａ）及びトロンボチェックＡＰＴＴ−ＳＬＡ（シスメックス社製、以下試薬Ｂ）を用いた。試薬の正常基準範囲は各試薬で測定した健常人４８名の測定値をもとに、凝固時間の平均値±２ＳＤで設定した。【００３１】
上記表１に示すように、試薬Ａでは１０倍希釈検体で３６．０秒と、正常基準範囲内（２６．５〜３６．６秒）となったため、カットオフ値の設定には８倍希釈検体を使用することとした。同様に、試薬Ｂでも１０倍希釈検体で３３．４秒と正常基準範囲内（２４．６〜３５．７秒）となったため、カットオフ値の設定には８倍希釈検体を使用することとした。【００３２】
（２）ミキシングテストの実施
（１）で用いた８倍希釈検体及び表２に示すようなＬＡ陽性血漿（検体番号１〜５）、凝固因子欠乏血漿（検体番号６〜７）、ワーファリン投与患者血漿（検体番号８〜１０）を用いて、以下の手順に従いミキシングテストを実施した。
被検血漿の割合が０、２０、５０、１００％となるように正常血漿と混合した試料を準備し、（１）に示したＡＰＴＴ測定試薬を用いて凝固時間を測定した。
次に、各々の凝固時間から被検血漿０％（正常血漿のみ）に対する凝固時間延長率を算出し、縦軸を凝固時間延長率、横軸を被検血漿の割合としてプロットし、折れ線グラフを作成した。
被検血漿１００％の凝固時間延長率と被検血漿０％（正常血漿のみ）の凝固時間延長率を結ぶ対角線と該折れ線グラフで作図される多角形の面積（図６、７、８）を、該折れ線グラフ下面積から該対角線を斜辺とする直角三角形の面積を差し引くことにより算出し、該対角線を斜辺とする直角三角形の面積に対する割合（面積比（％））を算出した（表２）。【００３３】
８倍希釈検体で算出された面積比（％）を各々の試薬のカットオフ値に設定し、該カットオフ値以上となる場合に凝固因子インヒビター型（以下、単に「インヒビター型」と表記することがある）、該カットオフ値未満の場合を凝固因子欠乏型（以下、単に「因子欠乏型」と表記することがある）と判定した。【００３４】
今回、測定ポイントが３ポイント（被検血漿の割合０、５０、１００％）の場合と、４ポイント（被検血漿の割合０、２０、５０、１００％）の場合の２通りの面積比（％）を算出し、各々“本発明３ｐｏｉｎｔ”、“本発明４ｐｏｉｎｔ”として表中に示した（表２、３）。【００３５】
【表２】
2009153964.tif 000004
【００３６】
比較例１（市販ＬＡ試薬での測定）
市販のＬＡ測定試薬であるＬＡテスト「グラディポア」（医学生物学研究所社製）及びスタクロットＬＡ（ロシュ社製）を用いて、上記と同じ検体（検体番号１〜５）について添付文書に従って測定を行った。
ＬＡテスト「グラディポア」は“凝固時間の比率”（被検血漿の凝固時間／正常血漿の凝固時間）を算出し、その比率が１．３以上となるものをＬＡ陽性、スタクロットＬＡは“凝固時間の差”（被検血漿の凝固時間−正常血漿の凝固時間）を算出し、その差が８秒以上のものをＬＡ陽性と判定した。【００３７】
比較例２（ミキシングテスト従来法による凝固時間の延長要因の判定）
（２）にて測定された結果を用いて、以下の式に当てはめ、計算を行った。
従来法１：（ａ＋ｃ）／２−ｂ
従来法２（Ｒｏｓｎｅｒ  Ｉｎｄｅｘ）：（ｂ−ｃ）／ａ
ａ：被検血漿の凝固時間（秒）
ｂ：被検血漿５０％の時の凝固時間（秒）
ｃ：被検血漿０％の時の凝固時間（秒）
従来法１では０以下になるときに「インヒビター型」と判定し、従来法２では、前記実施例１の（１）の８倍希釈検体での算出値以上となる場合に「インヒビター型」と判定した。【００３８】
実施例と比較例の結果の対比を表３に示した。ＬＡ強陽性検体（検体番号１〜３：グラディポア及びスタクロットともに陽性）を試薬Ａで測定した結果、発明法、従来法のどの算出法を用いて判定した場合でも「インヒビター型」と判定されたが、弱陽性検体（検体番号４〜５：グラディポア及びスタクロットの一方が陽性）の場合、従来法１では「インヒビター型」を検出することができなかった。さらに、ＬＡ陰性検体について確認したところ、凝固因子欠乏検体（検体番号６〜７）ではどの算出法でも「因子欠乏型」と判定された。しかし、ワーファリン投与検体（検体番号８〜１０）の場合、従来法２では検体番号９において「インヒビター型」となる擬陽性が認められたものの、本発明法（３ｐｏｉｎｔ，４ｐｏｉｎｔ）ではグラディポア及びスタクロットと同様に全て「因子欠乏型」と判定できた。これより、本発明法は特異的に「インヒビター型」を検出できることが判る。【００３９】
【表３】
2009153964.tif 000005
【００４０】
同様に、試薬Ｂを用いて測定した結果を表４及び表５に示した。ＬＡ強陽性検体（検体番号１〜３）での結果は、発明法、従来法のどの算出法を用いて判定した場合でも「インヒビター型」となるものの、グラディポアでＬＡ陰性と判定された弱陽性検体（検体番号４）において、３ｐｏｉｎｔ法と従来法１では「因子欠乏型」と判定された。しかし、測定ポイント数を４ｐｏｉｎｔに増やすことで「インヒビター型」と判定され、判定の精度を向上させられることが判明した。【００４１】
【表４】
2009153964.tif 000006
【００４２】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009153964.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月20日(2009.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検血漿中の血液凝固時間延長原因の判定法であって、
（１）（ａ）被検血漿のみ、（ｂ）正常血漿のみ、及び（ｃ）被検血漿と正常血漿とを少なくとも１種の混合比で混合した試料の血液凝固時間を測定し、
（２）縦軸を血液凝固時間又は血液凝固時間の延長率、横軸を被検血漿又は正常血漿の混合比又は混合率として前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の測定結果をプロットして得られる折れ線グラフを描画した場合の折れ線下面積Ａと、前記（ａ）及び（ｂ）の測定結果のプロットを結ぶ線分下面積Ｂを求め、
（３）面積Ｂに対する、面積Ａから面積Ｂを差し引いた面積（Ａ−Ｂ）の比率（（Ａ−Ｂ）／（Ｂ））：面積比Ｘ）を算出し、
（４）凝固因子インヒビター陽性血漿について前記工程（１）〜（２）の操作を行い予め基準面積比Ｙを定め、
（５）面積比Ｘと基準面積比Ｙとを対比し、Ｙ≦Ｘの場合に凝固因子インヒビター型と判定し、Ｙ＞Ｘの場合に凝固因子欠乏型と判定することを特徴とする判定法。
【請求項２】
凝固因子インヒビター陽性血漿についての基準面積比Ｙが、複数の健常人血漿の血液凝固時間について統計学的に求めた基準範囲の上限値を超え、かつ該上限値＋５０％以内の血液凝固時間を示す凝固因子インヒビター陽性血漿について求めたものである請求項１記載の判定法。
【請求項３】
健常人血漿の血液凝固時間についての基準範囲が、複数の健常人血漿の血液凝固時間を統計学的に処理して得た値である請求項２記載の判定法。
【請求項４】
請求項１の工程（２）で縦軸を血液凝固時間とする場合に前記面積Ａ及び面積Ｂについて、定数を差し引いた値を用いる請求項１記載の判定法。
【請求項５】
前記定数が、前記折れ線グラフを描画した場合の正常血漿の血液凝固時間のプロットから横軸に平行な補助線を描画した場合の該補助線下面積である請求項４記載の判定法。
【請求項６】
血液凝固時間がＰＴ（プロトロンビン時間）、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、ｄＰＴ（希釈ＰＴ）、ｄＡＰＴＴ（希釈ＡＰＴＴ）、ＫＣＴ（カオリン凝固時間）及びｄＲＶＶＴ（希釈ラッセル蛇毒時間）から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜５のいずれか１項記載の判定法。
【請求項７】
凝固因子インヒビターが、ループスアンチコアグラント（ＬＡ）、第ＶＩＩＩ因子インヒビター、第ＩＸ因子インヒビター及び第Ｖ因子インヒビターから選ばれる少なくとも１種である請求項１〜６のいずれか１項記載の判定法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、本発明は、次の発明を提供するものである。
１．被検血漿中の血液凝固時間延長原因の判定法であって、
（１）（ａ）被検血漿のみ、（ｂ）正常血漿のみ、及び（ｃ）被検血漿と正常血漿とを少なくとも１種の混合比で混合した試料のリン脂質依存性の血液凝固時間を測定し、
（２）縦軸を血液凝固時間、又は血液凝固時間の延長率、横軸を被検血漿又は正常血漿の混合比又は混合率として前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の測定結果をプロットして得られる折れ線グラフを描画した場合の折れ線下面積Ａと、前記（ａ）及び（ｂ）の測定結果のプロットを結ぶ線分下面積Ｂを求め、
（３）面積Ｂに対する、面積Ａから面積Ｂを差し引いた面積（Ａ−Ｂ）の比率（（Ａ−Ｂ）／（Ｂ））：面積比Ｘ）を算出し、
（４）凝固因子インヒビター陽性血漿について前記工程（１）〜（２）の操作を行い予め基準面積比Ｙを定め、
（５）面積比Ｘと基準面積比Ｙとを対比し、Ｙ≦Ｘの場合に凝固因子インヒビター型と判定し、Ｙ＞Ｘの場合に凝固因子欠乏型と判定することを特徴とする判定法。
２．凝固因子インヒビター陽性血漿についての基準面積比Ｙが、複数の健常人血漿の血液凝固時間について統計学的に求めた基準範囲の上限値を超え、かつ該上限値＋５０％以内の血液凝固時間を示す凝固因子インヒビター陽性血漿について求めたものである前記１記載の判定法。
３．健常人血漿の血液凝固時間についての基準範囲が、複数の健常人血漿の凝固時間を統計学的に処理して得た値である前記２記載の判定法。
４．前記１の工程（２）で縦軸を凝固時間とする場合に前記面積Ａ及び面積Ｂについて、定数を差し引いた値を用いる前記１記載の判定法。
５．前記定数が、前記折れ線グラフを描画した場合の正常血漿の血液凝固時間のプロットから横軸に平行な補助線を描画した場合の該補助線下面積である前記４記載の判定法。
６．血液凝固時間がＰＴ（プロトロンビン時間）、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、ｄＰＴ（希釈ＰＴ）、ｄＡＰＴＴ（希釈ＡＰＴＴ）、ＫＣＴ（カオリン凝固時間）及びｄＲＶＶＴ（希釈ラッセル蛇毒時間）から選ばれる少なくとも１種である前記１〜５のいずれかに記載の判定法。
７．凝固因子インヒビターが、ループスアンチコアグラント（ＬＡ）、第ＶＩＩＩ因子インヒビター、第ＩＸ因子インヒビター及び第Ｖ因子インヒビターから選ばれる少なくとも１種である前記１〜６のいずれかに記載の判定法。
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月3日(2010.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検血漿中の血液凝固時間延長原因の判定法であって、
（１）（ａ）被検血漿のみ、（ｂ）正常血漿のみ、及び（ｃ）被検血漿と正常血漿とを少なくとも１種の混合比で混合した試料の血液凝固時間を測定し、
（２）縦軸を血液凝固時間又は血液凝固時間の延長率、横軸を被検血漿又は正常血漿の混合比又は混合率として前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の測定結果をプロットして得られる折れ線グラフを描画した場合の折れ線下面積Ａと、前記（ａ）及び（ｂ）の測定結果のプロットを結ぶ線分下面積Ｂを求め、
（３）面積Ｂに対する、面積Ａから面積Ｂを差し引いた面積（Ａ−Ｂ）の比率（（Ａ−Ｂ）／（Ｂ））：面積比Ｘ）を算出し、
（４）凝固因子インヒビター陽性血漿について前記工程（１）〜（２）の操作を行い予め基準面積比Ｙを定め、
（５）面積比Ｘと基準面積比Ｙとを対比し、Ｙ≦Ｘの場合に凝固因子インヒビター型と判定し、Ｙ＞Ｘの場合に凝固因子欠乏型と判定することを特徴とする判定法。
【請求項２】
凝固因子インヒビター陽性血漿についての基準面積比Ｙが、複数の健常人血漿の血液凝固時間について統計学的に求めた基準範囲の上限値を超え、かつ該上限値＋５０％以内の血液凝固時間を示す凝固因子インヒビター陽性血漿について求めたものである請求項１記載の判定法。
【請求項３】
請求項１の工程（２）で縦軸を血液凝固時間とする場合に前記面積Ａ及び面積Ｂについて、定数を差し引いた値を用いる請求項１記載の判定法。
【請求項４】
前記定数が、前記折れ線グラフを描画した場合の正常血漿の血液凝固時間のプロットから横軸に平行な補助線を描画した場合の該補助線下面積である請求項３記載の判定法。
【請求項５】
血液凝固時間がＰＴ（プロトロンビン時間）、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、ｄＰＴ（希釈ＰＴ）、ｄＡＰＴＴ（希釈ＡＰＴＴ）、ＫＣＴ（カオリン凝固時間）及びｄＲＶＶＴ（希釈ラッセル蛇毒時間）から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜４のいずれか１項記載の判定法。
【請求項６】
凝固因子インヒビターが、ループスアンチコアグラント（ＬＡ）、第ＶＩＩＩ因子インヒビター、第ＩＸ因子インヒビター及び第Ｖ因子インヒビターから選ばれる少なくとも１種である請求項１〜５のいずれか１項記載の判定法。
【国際調査報告】
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