(57)【要約】  ポリヌクレオチドを修復し、それにより例えば増幅反応における改良された忠実度及び／又は収量で前記ポリヌクレオチドを複製することが可能である方法及び組成物が提供される。これは、リガーゼとＮＡＤ＋又はＡＴＰから選択される補助因子とを含む反応混合物の使用、並びにエンドヌクレアーゼＶＩの不在下で前記ポリヌクレオチドを前記反応混合物とともに温置することを包含する。反応混合物は、ＡＰエンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼをさらに含有し得る。使用される場合、これらの酵素は、高温に耐久する能力に従って選択され得る。例えば、前記反応混合物は、好熱性ではない酵素が使用され得る場合、ポリヌクレオチド合成反応の前に使用され得る。修復が迅速に効果を発揮し、長時間の温置が一般的に不利ではないので、酵素混合物中での温置の秒、分又は時間に関して、修復反応は時間に左右されない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガーゼと、及び補助因子としてのＮＡＤ＋又はＡＴＰの少なくとも１つとを含む反応混合物中でエンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏ）ＶＩの不在下でポリヌクレオチドを温置すること；並びに
複製された又は増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させること
を含む、損傷を受けたポリヌクレオチドを修復することによって、前記複製された又は増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させるための方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、天然源、保存された生物材料、法医学的証拠、生物由来の古代材料、組織生検及び化学合成からなる群から選択される源から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
損傷が、脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基（ＡＰ）部位、変異誘発されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、ニック、ギャップ、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−タンパク質架橋、ＤＮＡ−ＲＮＡ架橋及びＲＮＡ−ＲＮＡ架橋から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リガーゼが、耐熱性リガーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
リガーゼが、Ｔａｑリガーゼ及びイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼから選択され、並びに補助因子がＮＡＤ＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
反応混合物が、Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
反応混合物が、ポリメラーゼ及び少なくとも１つのＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのＡＰエンドヌクレアーゼが、イー・コリ、ヒト又はサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種から取得可能なエンドヌクレアーゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのＡＰエンドヌクレアーゼが、イー・コリＥｎｄｏＩＶである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、イー・コリポリメラーゼ及び古細菌ポリメラーゼ又はこれらの変異体からなる群から選択される、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１１】
古細菌ポリメラーゼが、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標）、９°Ｎｏｒｔｈ、ＫＯＤ又はＰｗｏポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ポリメラーゼが、ポリメラーゼのＹファミリーのメンバーである、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１３】
ポリメラーゼが、イー・コリｐｏｌＩＶ、イー・コリｐｏｌＶ、ヒトｐｏｌカッパ、ヒトｐｏｌイータ、ＳｓｏＤｐｏ４、ＳａｃＤｂｈ、Ｓｃｅｐｏｌゼータ及びヒトｐｏｌイオタから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
反応混合物が、Ｔ４ピリミジン二量体グリコシラーゼをさらに含む、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１５】
反応混合物が、［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）をさらに含む、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１６】
反応混合物が、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ及びＣｈｏの少なくとも１つをさらに含む、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１７】
反応混合物が、ＥｎｄｏＶＩＩＩ、ＥｎｄｏＶ又はＥｎｄｏＩＩＩの少なくとも１つをさらに含む、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１８】
反応混合物が、ＵＤＧ及びＡａｇをさらに含む、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＣＲ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅及び全ゲノム増幅からなる群から選択される手段によって増幅が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドがＲＮＡであり、及び増幅がＲＴ−増幅である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、及び反応混合物が、１０ないし１０００μＬ中の１ないし１０００ｎｇのＤＮＡへ添加される、１ないし１００単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ、０．０５ないし０．２５単位のイー・コリＰｏｌＩ及び５ないし５００単位のＴａｑリガーゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドの増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応において５０ヌクレオチドないし１００，０００ヌクレオチドの大きさの範囲で単位複製配列を産生することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
収量又は忠実度の少なくとも１つを増大させるために、反応混合物中でポリヌクレオチドを温置することが単一温度で達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
単一温度が室温であり、及び温置時間が１時間未満である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
単一温度が４℃であり、及び温置時間が約８ないし１２時間である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
酵素の少なくとも１つがリガーゼであり、ポリヌクレオチドの複製を増大させるためにポリヌクレオチド調製物への添加用に調合されている１つ又はそれ以上の酵素と、及びそれらの使用のための説明書とを含む、キット。
【請求項２７】
組成物の不在下で複製されたポリヌクレオチドと比べて、複製されたポリヌクレオチドの収量及び忠実度の少なくとも１つの増大を提供するために、単一温度でポリヌクレオチドとともに温置するためのリガーゼ、ポリメラーゼ、及びＥｎｄｏＶＩを含まないＡＰエンドヌクレアーゼの有効量を含む、組成物。
【請求項２８】
増幅前混合物中で使用するために、容積１０ないし５００μＬ中で、ＡＰエンドヌクレアーゼが１ないし１００単位の濃度で存在し、ポリメラーゼが０．０５ないし５単位で存在し、及びリガーゼが５ないし５００単位で存在する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
１ないし１０００ｎｇＤＮＡの増大された複製に適した、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
ＡＰエンドヌクレアーゼが、ＩＩ型ＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
ＡＰエンドヌクレアーゼが、イー・コリＥｎｄｏＩＶである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ポリメラーゼが、イー・コリｐｏｌＩである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｔ４ピリミジン二量体グリコシラーゼをさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｆｐｇをさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ及びＣｈｏの少なくとも１つをさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３６】
ＥｎｄｏＶＩＩＩ、ＥｎｄｏＶ又はＥｎｄｏＩＩＩの少なくとも１つをさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３７】
ＵＤＧ及びＡａｇの少なくとも１つ、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項２７に記載の組成物によってポリヌクレオチド断片中の配列エラーを修復すること；及び
ポリヌクレオチド断片をクローニング又は配列決定すること
を含む、ポリヌクレオチド断片をクローニングし又は配列決定するための方法。
【請求項３９】
ベクター中へのクローニングのために、組成物が、ポリヌクレオチド断片を平滑末端化することが可能である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
複製又は増幅されたポリヌクレオチドの収量を増大させるための方法であり、
（ａ）プライマーの少なくとも第一の対及び第二の対（ポリヌクレオチドとハイブリッドを形成したときにプライマーの第二の対は、プライマーの第一のセット内に入れ子状態にされる。）を得ること；
（ｂ）ポリヌクレオチドを請求項２７に記載の組成物へ供すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドをプライマーの前記第一のセットで増幅すること；
（ｄ）（ｃ）の産物をプライマーの第二セットで増幅すること；及び
（ｅ）増幅されたポリヌクレオチドの増大された収量を得ること
を含む、前記方法。
【請求項４１】
組成物が、リガーゼ、ポリメラーゼ、ｐｄｇ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｆｐｇ、及び場合によってＵＤＧを含む、請求項３８又は請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
リガーゼがＴａｑＤＮＡリガーゼであり、ポリメラーゼがイー・コリＰｏｌＩであり、ＰＤＧがＴ４ｐｄｇであり、並びにＥｎｄｏＩＶ、ＥｎｄｏＶＩＩＩ、Ｆｐｇ、及び場合によってＵＤＧがイー・コリから得られる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ポリヌクレオチドを配列決定するための方法であり、
（ａ）ポリヌクレオチドを請求項２７に記載の組成物と接触させること；及び
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを配列決定すること
を含む、前記方法。
【請求項４４】
断片化されたＤＮＡを複製又は増幅するための方法であり、
（ａ）断片化されたＤＮＡを請求項２７に記載の組成物と接触させること；
（ｂ）組換え形質転換受容性タンパク質を場合によって添加すること；及び
（ｃ）前記断片化されたＤＮＡを増幅又は複製すること
を含む、前記方法。
【請求項４５】
組換え形質転換受容性タンパク質が、ＲｅｃＡ又はベータタンパク質である、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ポリヌクレオチドの複製、より具体的には増幅は、例えば遺伝子の特性を研究するために、分子生物学において一般的に使用されている。ポリヌクレオチドが何らかの方法で損傷された場合に、複製上の問題が生じる。
【０００２】
例として、米国特許第５，０３５，９９６号は、修飾されたヌクレオチドｄＵＴＰを増幅反応において使用するポリメラーゼ連鎖反応増幅反応の夾雑を調節するための方法を記載している。本方法は、ウラシルを含有するＰＣＲ産物を除去し、その後のＰＣＲ反応物をの夾雑を防止するために、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を使用する。米国特許公開第２００４−００６７５５９Ａ１号も、増幅及び使用の前に、プライマーＤＮＡ中の修飾された塩基、例えば単位複製配列中へ組み込むためのｄＵＴＰに依存している。次いで、単位複製配列は、例えばＵＤＧ及びエンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏ）ＩＶを添加することによって断片化されることが可能である。
【０００３】
ホットスタート核酸増幅と呼ばれる１つの増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中の誤プライミングを低下させるために使用されてきた。ホットスタート増幅の１つの種類において、ポリメラーゼによる伸長の防止は、ＰＣＲ反応中に、封鎖された３’末端を有するＰＣＲプライマーが存在することに依存している（例えば、米国公開第２００３−０１１９１５０号参照）。プライマーは、３７℃超で活性のある耐熱性３’−５’エキソヌクレアーゼによって封鎖解除される。従って、エキソヌクレアーゼが３７℃超で３’末端の封鎖を解除したときに、ポリメラーゼは、ＰＣＲプライマーを伸長するのみである。一方、Ｔａｑポリメラーゼは、封鎖された後、増幅温度で活性化される。
【０００４】
Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２２１６−２２２０（１９９４）は、増幅中のみにＴａｑポリメラーゼを使用することに対する改良として、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼを使用することを記載している。Ｇｈａｄｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．は、損傷された部位又は脱塩基部位によって停止されていない変異体Ｔａｑポリメラーゼを報告した（Ｇｈａｄｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（６）：７５５−９（２００４））。
【０００５】
ＤＮＡが実質的に損傷を受けている場合、従来の増幅技術が危ういことが報告されている（Ｄｉ  Ｂｅｒｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ１６（２００２））。ＤＮＡヌクレアーゼを含有する環境及び微生物への曝露から得られるＤＮＡの分解及び／又は断片化は、法医学、診断検査及び定型的な増幅においてしばしば問題となっており、増幅産物の忠実度及び収量に影響を及ぼす。さらに、保存され、凍結され又は化石化された絶滅した生物又は極めて希少な生物から得られたＤＮＡを分析している研究者も、分解されたＤＮＡの問題に直面する。
【０００６】
Ｆｒｏｍｅｎｔｙ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１１）：ｅ５０（２０００）及び国際公報第ＷＯ／０１５１６５６は、エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏ）ＩＩＩによる処理が、長時間のＰＣＲの収量を改良することを報告した。しかしながら、Ｆｒｏｍｅｎｔｙは、ＥｘｏＩＩＩを使用した場合に、５００塩基対未満のＤＮＡに関する低下した単位複製配列の収量も報告した。ＥｘｏＩＩＩの使用と関連した問題の１つは、ＥｘｏＩＩＩがテンプレート及びプライマーを分解することである。
【０００７】
Ｄｉ  Ｂｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（４）：ｅ１６（２００２）は、二本鎖ＤＮＡの架橋された領域間で一本鎖ＤＮＡの短い領域を増幅するための前処理としての、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４リガーゼ）及びイー・コリポリメラーゼの使用を記載した。
【０００８】
損傷を受けたＤＮＡの増幅に対する別のアプローチは、米国公開第２００３−００７７５８１号に記載されている。分解された核酸と相同な配列を有する分解されていない核酸に、分解された核酸がハイブリッド形成された。次いで、分解された核酸の領域をヌクレオチド前駆体で充填した。次に、重合酵素及び／又は連結酵素を使用して、断片化された鎖を共有結合した。
【０００９】
損傷を受けたＤＮＡの増幅を改良するための調製物は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ及びＱｂｉｏｇｅｎｅ（現ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ），Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡから市販されている。これらの調製物の組成物は、記載されてはいないが、ＥｘｏＩＩＩは、前記調製物中に含有されることが想定される。
【００１０】
イー・コリＤＮＡＰｏｌＩと増幅前修復のためのＴ４リガーゼとの組み合わせの使用が他者により報告されている（Ｐｕｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：８５７（１９９８））。しかしながら、Ｐｕｓｃｈらによると、増幅前産物は、増幅の開始前に精製されなければならない。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の一実施形態において、リガーゼと、及び補助因子としてのＮＡＤ＋又はＡＴＰのうちの少なくとも１つとを含む反応混合物中で、エンドヌクレアーゼＶＩ（ＥｎｄｏＶＩ）の不在下でポリヌクレオチドを温置することを含み得る、損傷を受けたポリヌクレオチドを修復することによって、複製された又は増幅された産物の忠実度及び収量の少なくとも１つを増大させるための方法が提供される。ポリヌクレオチドは、保存された生物材料、法医学的証拠品、生物由来の古代材料及び組織生検材料由来を含む何れかの天然源又は合成源に由来し得る。ポリヌクレオチドに対する損傷の例は、脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基（ＡＰ）部位、化学的に修飾されたヌクレオチド、ニック、ギャップ及びＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−タンパク質架橋、ＤＮＡ−ＲＮＡ架橋又はＲＮＡ−ＲＮＡ架橋のうちの少なくとも１つを含むことが可能である。
【００１２】
本方法の一例において、リガーゼは、耐熱性リガーゼである。ＴａｑＤＮＡリガーゼは、補助因子としてＮＡＤ＋を使用する耐熱性リガーゼの一例である。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼは、補助因子がＮＡＤ＋であるリガーゼの別の例である。前記リガーゼを含有する反応混合物の他の成分は、Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体、ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼのうちの１つ又はそれ以上を含み得る。前記反応混合物中で使用するためのポリメラーゼの例は、Ｔａｑポリメラーゼ、イー・コリポリメラーゼ又は古細菌ポリメラーゼ若しくはその変異体を含む。古細菌ポリメラーゼ又はこれに由来するキメラポリメラーゼの例は、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標）、９°Ｎｏｒｔｈ、ＫＯＤ及びＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ並びにＰｗｏのうちの１つ又は以上を含む。前記反応混合物中で使用するための他のポリメラーゼの例は、イー・コリｐｏｌＩＶ、イー・コリｐｏｌＶ、ヒトｐｏｌカッパ、ヒトｐｏｌイータ、Ｓｓｏ  Ｄｐｏ４、Ｓａｃ  Ｄｂｈ、Ｓｃｅ  ｐｏｌゼータ、及びヒトｐｏｌイオタ等のポリメラーゼのＹファミリーのメンバーを含む。
【００１３】
前記反応混合物中で使用するためのエンドヌクレアーゼの例は、ファージＴ４、イー・コリ、ヒト及びサーマス種の何れか由来の少なくとも１つのエンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つを含み得る。前記反応混合物はさらに、次のもの、すなわちＴ４ピリミジン二量体グリコシラーゼ、［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ、Ｃｈｏ、ＥｎｄｏＶ、ＥｎｄｏＩＩＩ、ＥｎｄｏＶＩＩＩ、ＵＤＧ、ラムダベータタンパク質、ＲｅｃＡ及びＡａｇから選択される１つ又はそれ以上の酵素を含み得る。
【００１４】
本発明の一実施形態において、改良された収量は、ＰＣＲ増幅、ヘリカーゼ依存的増幅、転写仲介性増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅及び全ゲノム増幅からなる群から選択される手段によって、ポリヌクレオチドを複製した後に達成される。ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、増幅は、ＲＴ増幅であり得る。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、反応混合物は、１０ないし１０００μＬの反応容積中の１ないし１０００ｎｇのＤＮＡへ添加されるイー・コリＥｎｄｏＩＶの１ないし１００単位、イー・コリｐｏｌＩの０．０５ないし０．２５単位及びＴａｑリガーゼの５ないし５００単位を含み得る。
【００１５】
出発するポリヌクレオチド調製物の濃度の約５０％未満が、反応混合物の不在下で取得可能な複製された産物の少なくとも同様の量を提供する場合に、改良された又は増大された収量が決定される。好ましくは、改良は再現可能であるべきである。すなわち、複製産物試料の約７５％又はそれ以上が改良を示すことを意味する。さらに、場合により、前記方法のさらなる特徴は、温置の単一温度で改良された結果を達成できることである。
【００１６】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドの増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応において５０ヌクレオチドないし１００，０００ヌクレオチドの大きさの範囲で単位複製配列を産生できる方法が提供される。
【００１７】
本発明の一実施形態において、酵素の少なくとも１つがリガーゼであり、ポリヌクレオチドの複製を（上述のとおり）増大させるためにポリヌクレオチド調製物へ添加するために調合されている１つ又はそれ以上の酵素と、これらの使用のための説明書とを含むキットが提供される。
【００１８】
本発明の一実施形態において、組成物の不在下で複製されたポリヌクレオチドと比べて、複製されたポリヌクレオチドの収量及び忠実度の少なくとも１つの増大を提供するための、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＥｎｄｏＶＩを含まないＡＰエンドヌクレアーゼの有効量を含むが、組成物が提供される。組成物の一例において、ある酵素の濃度は次のとおりである。すなわち、増幅前混合物中で使用するために、容積１０ないし１０００μＬ中のＡＰエンドヌクレアーゼ１ないし１００単位、ポリメラーゼ０．０５ないし５単位及びリガーゼ５ないし５００単位である。
【００１９】
組成物中の具体的な酵素の例は、ＡＰエンドヌクレアーゼ、より具体的にはＩＩ型ＡＰエンドヌクレアーゼ、より具体的にはイー・コリＥｎｄｏＩＶを含む。ポリメラーゼは、イー・コリｐｏｌＩによって例示される。さらに、次の酵素の少なくとも１つが前記組成物中にさらに含まれ得る。Ｔ４ピリミジン二量体グリコシラーゼ、［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ、Ｃｈｏ、ＥｎｄｏＶ、ＥｎｄｏＩＩＩ、ＥｎｄｏＶＩＩＩ、ＵＤＧ、ＲｅｃＡ、ラムダベータタンパク質及びＡａｇ。
【００２０】
本発明の一実施形態において、複製された又は増幅されたポリヌクレオチドの収量を増大するための方法であり、（ａ）プライマーの第一の対及び第二の対の少なくとも１つを取得すること（プライマーの前記第二の対は、ポリヌクレオチドとハイブリッドを形成した場合に、プライマーの第一のセット内で入れ子状態になる。）、（ｂ）前記ポリヌクレオチドを上述の組成物へ供すること、（ｃ）前記ポリヌクレオチドをプライマーの第一のセットで増幅すること、（ｄ）（ｃ）の産物をプライマーの第二のセットで増幅すること、並びに（ｅ）増幅されたポリヌクレオチドの増大した収量を得ることを含む、前記方法が提供される。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態において、上述等の組成物によってポリヌクレオチド断片中の配列エラーを修復することを含む、ポリヌクレオチド断片をクローニングするための方法が提供される。本組成物は、ポリヌクレオチド断片を平滑末端化するという有利な特性を有し得、この特性のために、ベクター中へ断片をクローニングする上で一工程が不要となる。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態において、配列決定前にポリヌクレオチドを上述の組成物と接触させることを含む、ポリヌクレオチドを配列決定するための方法が提供される。配列の結果の質は、一般に、感度及び正確性に関して改良される。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態において、断片化されたＤＮＡを複製又は増幅する方法であり、（ａ）断片化されたＤＮＡを上述の組成物と接触させること、（ｂ）組換え形質転換受容性タンパク質を場合により添加すること、及びｃ）断片化されたＤＮＡを増幅又は複製することを包含する、前記方法が提供される。組換え形質転換受容性タンパク質の例は、例えばラムダファージ由来のＲｅｃＡ及びベータタンパク質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の実施形態は、ポリヌクレオチドを複製するための、又はより具体的には増幅するための方法における改良を提供する。複製された又は増幅されたポリヌクレオチドの収量及び忠実度のうちの少なくとも１つを増大させることは、本実施形態において例示されているように、選択された修復酵素を含有する反応混合物の不在下で、必要とされるポリヌクレオチドの５０％の複製又は増幅後にポリヌクレオチドの検出可能な収量を得ることと関連する。「忠実度」は、本実施形態において例示されているように、エラー率が、選択された修復酵素を含有する反応混合物の不在下での場合を下回る複製に関する。
【００２５】
本発明の方法は、酵素を含有する反応混合物を利用する。損傷の複数の種類が疑われる場合、酵素の組み合わせは、実施例において使用されている特異的なカクテルによって示されているように作ることができる。ポリヌクレオチドに対する損傷が知られている場合、酵素の好ましいカクテルは、実施例において説明されるように選択され得る。損傷の性質が不明である場合、酵素の汎用混合物を使用することが可能である。一般的に、１つの工程で酵素を一緒に添加することは、酵素を順次に添加することを除外するものではない。
【００２６】
ポリヌクレオチド複製がポリメラーゼ依存的増幅をもたらす場合、長さ約５００塩基未満（１００塩基対未満まで短くなる。）の短い単位複製配列又は５００塩基対を超え若しくは約５０ｋｂにも及ぶ、長い単位複製配列が（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及びｑＰＣＲ増幅に関して）増幅され得る。増幅の他の種類は、多様な範囲の大きさの単位複製配列を生じることが可能である。例えば、ポリヌクレオチドは、１００塩基ほどの小さいサイズ又は全ゲノムほどの大きなサイズ（ヒトの場合、３０億塩基）を有する。このような増幅方法の例には、全ゲノム増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）及びヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）がある。ポリヌクレオチド合成の他の種類には、配列決定反応等のプライマー伸長反応がある。前記方法の実施形態は、分子生物学研究において、及び、例えば法医学的分析において見出されるような断片化された及び損傷を受けたＤＮＡを分析することを含む、応用生物学において問題を解決する上で、古代源由来のＤＮＡを分析することが望ましい生物考古学において、生物事業のバーコード（Ｂａｒｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）に必要とされるような、環境試料由来のＤＮＡを分析することが望ましい分類学のため、及び疾病への感受性又は状態を決定するための組織生検などの診断アッセイのために広範な用途を有する。他の使用には、高い忠実度の配列決定、遺伝子集合、断片分析並びにクローニングのための一工程複製及び連結が含まれる。
【００２７】
源及び損傷の程度
単離された多くのポリヌクレオチド又はインビトロで複製された多くのポリヌクレオチドは、ある程度損傷を受けている。ポリヌクレオチドの損傷は、個々のヌクレオチドの化学的修飾又はポリヌクレオチド骨格の破壊から生じ得る。ポリヌクレオチドは、ホルムアルデヒド及びエタノールなどの化学物質、環境因子、極端な温度、酸化、乾燥及び紫外線光等の多岐にわたる源からの損傷を受ける。損傷の多様な種類には、（ａ）例えば熱、エタノール中のポリヌクレオチドの保存、及びＨ２Ｏ若しくはｐＨの極限等の環境中の因子への曝露によって生じた脱プリン塩基性又は脱ピリミジン塩基性損傷、（ｂ）例えば脱アミノ化、アルキル化及び酸化によって生じた個々のヌクレオチドの修飾、（ｃ）例えば熱、エタノール中でのポリヌクレオチドの保存及びＨ２Ｏ若しくはｐＨの極限等の環境中の因子への曝露によって生じたニック及びギャップ、（ｄ）例えばホルムアルデヒド、光又は環境因子によって生じた架橋、（ｅ）例えばポリメラーゼによるヌクレオチドの誤取り込みによって生じた誤って組み合わさったＤＮＡ、及び（ｆ）ＤＮＡの断片化が含まれる。
【００２８】
損傷は、保存された組織、乾燥された標本又は環境へ曝露されたポリヌクレオチドにおいてより著しい。損傷は、試料又はその源又はその調製物の老朽化結果として生じ得る。さらに、損傷は、高温工程を包含するＰＣＲ増幅中に生じるなど、ポリヌクレオチド合成のための方法の適用中に生じ得る。それゆえ、ほとんどのポリヌクレオチドは、ある程度の損傷を受けている。増幅中に損傷を受ける見込みが増すので、より長い単位複製配列を分析する場合に、この損傷の有する影響はより大きい。
【００２９】
ポリヌクレオチドは、多様な方法で損傷を持続することが可能である。異なるポリヌクレオチド調製物は、例えばインビトロでのポリヌクレオチド調製物の保存又は取り扱い、ポリヌクレオチドを含有する原核細胞、古細菌又は真核細胞がどのように保存されているか、及びポリヌクレオチドが抽出される細胞の特徴に依存して、損傷の異なる種類を受ける。合成ポリヌクレオチドは、化学合成の間に損傷を持続し得る。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」という用語は特に、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを指す。
【００３１】
「修復酵素」とは、特に、ポリヌクレオチドの修復の過程に関与する好冷性、中温性又は好熱性の酵素を指す。例えば、修復酵素は、結合においてポリヌクレオチドの破損を誘導し、これによりポリヌクレオチドの損傷を受けた領域の除去又は単一ヌクレオチドの除去を促進し得る。リガーゼ及びポリメラーゼ等の合成上の役割を有する酵素も修復酵素である。本発明の実施形態において、１つ又はそれ以上の選択された修復酵素が、反応混合物中に提供される。損傷を受けたＤＮＡは、ＤＮＡの複製及び／又は増幅を増大させるために、反応混合物へ供される。「増大させる」とは、修復酵素の不在下で観察される比と比較して、出発材料に対する複製された産物又は増幅された産物の改良された比を得ることを指す。
【００３２】
ＤＮＡ修復酵素は、科学文献に記載されており、例えば、Ｗｏｏｄ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５７７（１−２）：２７５−８３（２００５）及びＥｉｓｅｎ，Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ｈａｎａｗａｌｔ，Ｐ．Ｃ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４３５（３）：１７１−２１３（１９９９）を参照されたい。ヒト修復酵素のリストは、以下の表１に提供されている。表１には記載されていないが、列挙されている酵素の相同体及び機能的に関連した他の酵素が、修復酵素の記述に含まれる。上述の酵素は全て、天然、組換え又は合成であり得る。酵素は全て、幾つもの活性を有する天然の又はインビトロで作製されたキメラタンパク質であり得る。保存された配列モチーフを共有し、類似の酵素活性を有する関連酵素を同定するためのデータベースを検索する方法は、当業者に公知である。例えば、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｃｏｍ）は、保存されたドメインデータベースを提供する。例えば、データベースがＥｎｄｏＩＶの相同体に関して検索される場合、７４個の配列の一致が得られる（リガーゼに関しては、図６Ａ−１ないし６Ａ−９及び６Ｂ−１ないし６Ｂ−２も参照されたい。）。
【００３３】
損傷を受けたＤＮＡを修復するための酵素混合物中で使用される「ポリヌクレオチド切断酵素」とは、特に、修復酵素の１クラスを指し、塩基除去修復に必要とされるＡＰエンドヌクレアーゼ、グリコシラーゼ及びリアーゼを含む。
【００３４】
損傷を受けた塩基は、デオキシリボース糖部分と塩基の間のＮ−グリコシル結合を加水分解するＤＮＡグリコシラーゼ酵素によって除去されることが可能である。例えば、イー・コリのグリコシラーゼであるＵＤＧエンドヌクレアーゼは、脱アミノ化されたシトシンを修復するのに対し、イー・コリ由来の２つの３−ｍＡｄｅグリコシラーゼ（ＴａｇＩ及びＴａｇＩＩ）は、アルキル化剤による損傷を修復する。
【００３５】
損傷を受けた塩基のグリコシラーゼによる除去の産物は、正確に置換されなければならない脱プリン塩基部位又は脱ピリミジン塩基部位（ＡＰ部位）である。これは、ＡＰ部位に隣接する糖ホスファート骨格に切れ目を入れるエンドヌクレアーゼによって達成されることが可能である。脱塩基糖は除去され、ポリメラーゼ／リガーゼ活性によって、新たなヌクレオチドが挿入される。これらの修復酵素は、原核細胞及び真核細胞中で見出される。本発明において適用可能な幾つかの酵素は、１分子中にグリコシラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有する。脱塩基部位は、ＡＰエンドヌクレアーゼ及び／又はＡＰリアーゼによって認識及び切断されることが可能である。クラスＩＩのＡＰエンドヌクレアーゼは、ＡＰ部位で切断して、ポリヌクレオチドの重合化に使用されることが可能である３’ＯＨを残す。さらに、ＡＰエンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドの重合化を阻害する３’ＯＨへ付着される部分を除去することが可能である。例えば、３’ホスファートは、イー・コリのＥｎｄｏＩＶによって３’ＯＨへ変換されることが可能である。ＡＰエンドヌクレアーゼは、グリコシラーゼとともに作用することが可能である。
【００３６】
グリコシラーゼ基質の例には、ウラシル、ヒポキサンチン、３−メチルアデニン（３−ｍＡｄｅ）、ホルムアミドピリミジン、７，８−ジヒドロ−８−オキシグアニン及びヒドロキシメチルウラシルが含まれる。ＤＮＡ中のウラシルの存在は、重硫酸塩、亜硝酸、又は自発性脱アミノ化によるシトシンの誤組み込み又は脱アミノ化により生じ得る。ヒポキサンチンは、一般に、亜硝酸又は自発性脱アミノ化によるアデニンの脱アミノ化により生じる。これに関連して、３−ｍＡｄｅは、アルキル化剤の産物である。ホルムアミドピリミジン（ＦＡＰＹ）（７−ｍＧｕａ）は、ＤＮＡのメチル化剤の共通産物である。７，８−ジヒドロ−８オキソグアニンは、グアニンの変異原性酸化産物である。ガンマ照射は、４，６−ジアミノ−５−ＦＡＰＹを生じる。ヒドロキシメチルウラシルは、チミジンに対するイオン化照射又は酸化的損傷によって作られる。
【００３７】
損傷のこれらの異なる種類は、上述の及び表１中の種類のグリコシラーゼを使用して修復され得る。
【００３８】
修復酵素の別の種類はリアーゼである。この酵素は、ポリヌクレオチド中のホスホジエステル結合を破壊することができる。
【００３９】
ＡＰエンドヌクレアーゼの例は、４つのクラスに属する。
（Ｉ）は、３’→３’−ＯＨ＋５’−Ｐ−を切断し、グリコシラーゼ活性と関連している。
（ＩＩ）は、５’→３’−ＯＨ＋５’−Ｐを切断する。
（ＩＩＩ）は、３’→３’−Ｐ＋５’−ＯＨを切断する。
（ＩＶ）は、５’→３’−Ｐ＋５’−ＯＨを切断する。
【００４０】
協調した様式で又は順次に組み合わされる協調されたＡＰエンドヌクレアーゼ又はリアーゼ及びグリコシラーゼ活性を有すると思われる幾つもの酵素が単離されてきている。
【００４１】
複製又は増幅反応において収量又は忠実度の少なくとも１つを増大させる上での使用に適していることが、ここに明らかとなったポリヌクレオチド切断酵素の例には、何れかの生物又はウィルスに由来する酵素の以下の種類が含まれるが、これらに限定を加えるものではない。すなわち、１）イー・コリＥｎｄｏＩＶ、ＴｔｈＥｎｄｏＩＶ及びヒトＡＰエンドヌクレアーゼ等のＡＰエンドヌクレアーゼ、２）ＵＤＧ、イー・コリＡｌｋＡ及びヒトＡａｇ等のグリコシラーゼ、３）イー・コリＥｎｄｏＩＩＩ、イー・コリＥｎｄｏＶＩＩＩ、イー・コリＦｐｇ、ヒトＯＧＧ１及びＴ４ピリミジン二量体グリコシラーゼ（Ｔ４ｐｄｇ）等のグリコシラーゼ／リアーゼ並びに４）イー・コリＥｎｄｏＶ等のリアーゼである。
【００４２】
（Ｅｘｏ  ＩＩＩとも呼ばれる）ＥｎｄｏＶＩは、通常の反応条件下において数時間で、ポリヌクレオチド中の損傷を受けた対象領域の外側に位置するポリヌクレオチドの大部分を分解できることが知られており、それゆえ、損傷を受けたポリヌクレオチドを処理するために本酵素混合物中に含まれるべきではない。
【００４３】
本明細書において「ポリメラーゼ」とは、ポリメラーゼ活性を有する酵素を指すが、他の活性を有しても良い。修復及び複製反応を通じて、同一のポリメラーゼを使用してもよく、又は本方法の異なる段階で、異なるポリメラーゼを使用してもよい。
【００４４】
ポリメラーゼの例には、ＴａｑＤＮＡ等及びサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼなどの耐熱性細菌ポリメラーゼ並びにＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標）及びＰｆｕ等の古細菌ポリメラーゼ；Ｂｓｔポリメラーゼ等のより耐熱性が低い酵素、サーモミクロビウム・ロゼウム（ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）ポリメラーゼ及び（ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ及びＴ４ポリメラーゼ等の）ファージポリメラーゼ等の中温性ポリメラーゼ、イー・コリｐｏｌＩＶ、イー・コリｐｏｌＶ、ヒトｐｏｌカッパ、ヒトｐｏｌイータ、ＳｓｏＤｐｏ４、ＳａｃＤｂｈ、Ｓｃｅｐｏｌゼータ、ヒトｐｏｌイオタ等のイー・コリｐｏｌＩ及びイー・コリｐｏｌＩＩＹファミリー（ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：１１０２−１１１１（２００６）；Ｖａｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ５：２１０（２００６）；Ｏｈｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．８：７−８（２００１）、Ｇｏｏｄｍａｎ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：１７−５０（２００２））又はこれら由来の変異体、誘導体若しくは修飾物が含まれる。誘導体の例には、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）酵素（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）及び、二本鎖結合タンパク質を１つ又は数個の源から得られるポリメラーゼ配列と組み合わせる他のポリメラーゼが含まれる。
【００４５】
本明細書に記載されている酵素混合物中で使用される「リガーゼ」とは、ポリヌクレオチドの一本鎖の５’末端をポリヌクレオチドの別の一本鎖の３’末端へ連結する酵素を指す。このようなリガーゼは、実質的に全ての真核細胞、原核細胞及び古細菌細胞中で見出され、幾つかのバクテリオファージ及びウィルス中でも見出され得る。適切なリガーゼの例には、９°Ｎリガーゼ、イー・コリリガーゼ、Ｔ４リガーゼ及びＴａｑリガーゼがある。他のリガーゼには、ＬＩＧＡ（ＮＰ−４１６９０６．１）、ＴｔｈＤＮＡＬＧＳ（ＡＡＡ２７４８６．１）、ＬＩＧ３（ＮＭ−０１３９７５）及びＬＩＧ４（ＮＭ−００２３１２）がある。
【００４６】
本発明において有用性を有し得る他のリガーゼ又はリガーゼ様タンパク質は、これらの公知のリガーゼと少なくとも６個の連続したアミノ酸を共有する何れかの酵素が、本発明の実施形態に従って、修復混合物中に含まれ得るデータベース（図６Ａ−１ないし６Ａ−９並びに図６Ｂ−１及び６Ｂ−２を参照）を検索するためにＴ４リガーゼ若しくはイー・コリリガーゼを使用するＢｌａｓｔ検索によって明らかにされる。
【００４７】
一切の補助因子の不在下で、ＥｘｏＩＩＩと組み合わされるリガーゼの公表された使用（米国公開第２００５−００２６１４７号）とは対照的に、リガーゼを含む酵素混合物中にＮＡＤ＋又はＡＴＰが必要とされることが本発明において発見された。より具体的には、Ｔａｑリガーゼ及びイー・コリリガーゼはＮＡＤ＋を必要とするのに対し、Ｔ４リガーゼ及び９°ＮリガーゼはＡＴＰを必要とする。
【００４８】
ある種のリガーゼ、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから市販されており（２００５ないし２００６年のカタログの１０７ないし１１７ページが参照により組み入れられる（リガーゼに関しては１０２ないし１０８ページ）。）、米国仮出願第６０／７１７，２９６号及び国際公報第ＷＯ２００５／０５２１２４号に記載されている。さらに、耐熱性修復酵素は、増幅前混合物中の耐熱性修復酵素と互換的に使用されることが可能である。耐熱性酵素は、４０℃超又はより具体的には６５℃若しくはそれ以上で活性を保持する。
【００４９】
本方法の実施形態は、ポリヌクレオチド配列の複製、増幅又は他の合成反応から得られる産物の収量若しくは忠実度を改良する。これは、例えば損傷を受けたポリヌクレオチドが事前温置混合物中で、及び／又は増幅中に酵素の調製物で処理された場合に達成され得る。
【００５０】
上記事前温置が有益であり得る増幅プロトコールとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，４５５，１６６号及び第５，４７０，７２３号）；ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＡＤ）（米国公開第２００４−００５８３７８−Ａ１号）；転写仲介性増幅（ＴＭＡ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８（１９９０））；インビボでのローリングサークルＤＮＡ複製から適応させたインビトロＤＮＡ増幅において使用するための、配列の複数コピーを生成するローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、Ｆｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４６４１−４６４５（１９９５）、Ｌｕｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７−１５９４（１９９６）、Ｌｉｚａｒｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２２５−２３２（１９９８））、及び全ゲノム増幅法（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：６５−６７（２００２））が挙げられる。
【００５１】
「汎用」酵素混合物は、複製又は増幅の前又は間に、損傷を受けたポリヌクレオチドを一般的に修復するための反応混合物において有用であることがここに見出された。本実施形態によると、所定の状況では特異的な有利な組み合わせが存在する。
【００５２】
汎用酵素混合物は、リガーゼ及びＮＡＤ＋若しくはＡＴＰ等の補助因子を含有する。混合物は、好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、ＡｃｃｕＴａｑ  ＬＡ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）又はその他の何れかの慣用のＴａｑ緩衝液等の適切な緩衝液内で上述のようなポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む。様々な例示的実施形態において、汎用酵素混合物は、イー・コリＰｏｌＩ又はＴａｑポリメラーゼと、及び中温性ＥｎｄｏＩＶ、例えばイー・コリＥｎｄｏＩＶ又は好熱性ＥｎｄｏＩＶ、例えばＴｔｈＥｎｄｏＩＶなどのＡＰエンドヌクレアーゼと、及びイー・コリリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ又は９°Ｎリガーゼ等の古細菌リガーゼとを含有する。特定の実施形態において、酵素混合物は、増幅前又は増幅中に、１０ないし１０００μＬの反応容積で、１ないし１０００ｎｇのＤＮＡを修復するのに適した１ないし１００単位のＥｎｄｏＩＶ、０．０５ないし０．２５単位のイー・コリＰｏｌＩ、及びＴａｑＤＮＡリガーゼの５ないし５００単位を含有する。上述の汎用混合物において明記されている温度範囲以外の、エンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼに対する濃度範囲が、使用される酵素及び反応温度とともに変動し得ることは理解される。しかしながら、濃度範囲は、実施例に記載されているアッセイを使用して容易に解明することができる。例えば、ラムダＤＮＡの標準的な調製物は、実施例１にしたがって熱処理することができる。次に、ＤＮＡは、リガーゼ及び補助因子を含有する一連の酵素混合物へ供されることが可能である。混合物中の前記酵素に対する好ましい濃度を決定するために、さらなる酵素が滴定される。このように、ＤＮＡ修復は最適化することが可能である。各試料の増幅後、増幅されたＤＮＡの量は、検査酵素に対する好ましい濃度範囲を明らかにするゲル電気泳動によって決定することができる。
【００５３】
汎用酵素混合物は、ポリヌクレオチド増幅又は他の合成の前又は間に使用することができる。
【００５４】
実施例において説明されるように、損傷の種類に応じて、ＤＮＡ損傷の性質に応じたさらなる修復酵素を汎用酵素混合物に補充することが望ましい場合があり得る。特定のポリヌクレオチドを修復するための個々の修復酵素又は修復酵素の混合物の適切性を決定するために、前記修復酵素又は修復酵素の混合物の有用性は、実施例及び図面に記載されているアッセイを使用して決定することが可能である。
【００５５】
ポリヌクレオチドに対する一般的な損傷又は特異的な損傷の修復
（ａ）一般的な損傷
ポリヌクレオチド中の損傷の性質を決定することは、時間がかかる。ポリヌクレオチドに対する損傷の何らかの形態が疑われる場合、例えば、ポリヌクレオチドがほとんど増幅されない場合、障害を同定する必要性がないことが好ましい。これらの状況において、改良された増幅が得られるかどうかを決定するために、上述のような酵素の汎用混合物が利用され得る。改良が、汎用混合物を使用することで十分な場合、さらなる作用は必要ではない。改良が十分ではない場合、好ましい結果が得られるまで、本明細書に記載されている混合物へさらなる酵素を添加することができる。アッセイ全体は、９６ウェル皿等の単一反応容器中で達成され得る。皿中の各微小ウェルは、汎用混合物に加えて、以下に概略されている損傷の各クラスに対処するように選択された酵素を含む異なる酵素混合物に対して利用可能である。
【００５６】
ＤＮＡの一般的な損傷又未知の損傷の修復のために酵素を選択するためのプロトコールは、図１２（流れ図）及び実施例に記載されているアッセイ中に提供されている。
【００５７】
（ｂ）特異的な損傷
（ｉ）ＡＰ部位
塩基の喪失は、自発性ＤＮＡ損傷の最も一般的な形態である。ポリメラーゼ及びポリメラーゼベースの技術は、これらの脱塩基部位の存在によって不利な影響を受ける。プライマー伸長反応の有効性は、ポリヌクレオチド中に見出される全ての脱塩基部位を修復することによって増強される。これは、一実施形態において、脱塩基部位でホスファート骨格を切断するＥｎｄｏＩＶ活性によって達成される。これは、切断された脱塩基部位に対して５’のＤＮＡ断片上に伸長可能な３’ＯＨを残す。これは、切断された脱塩基部位に対して３’のＤＮＡ断片上にデオキシリボース−５’−ホスファート（ｄＲ５Ｐ）も残す。ポリメラーゼは、遊離３’ＯＨから伸長し、切断された脱塩基部位を正しいヌクレオチドと置換することができる。ｄＲ５Ｐは、哺乳動物ｐｏｌベータ又は哺乳動物ｐｏｌベータの８ＫｄのＮ末端部分等のｄＲ５Ｐを特異的に標的化する酵素によって（Ｄｅｔｅｒｄｉｎｇ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：１０４６３−７１（２０００））、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ等のある種のポリメラーゼ中に存在するフラップエンドヌクレアーゼ活性によって又はＦＥＮＩ等の別個のフラップエンドヌクレアーゼによって除去され得る。ｄＲ５Ｐの除去は、フラップエンドヌクレアーゼ活性によるこの群の下流の切断によっても生じ得る。ｄＲ５Ｐの除去及び３’ＯＨに隣接する５’ホスファートの生成の後、リガーゼは、ニックを封着し、修復を終了し得る（実施例１ないし３参照）。
【００５８】
（ｉｉ）修飾されたヌクレオチド
（ａ）チミジン二量体
光は、ピリミジン二量体の形成を誘導することによってＤＮＡを損傷することが可能である。ピリミジン二量体は、ＴａｑＤＮＡ等のＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ伸長反応を遮断して、ＤＮＡ増幅を阻害する（Ｗｅｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（８）：１５７８−７９（１９９６））。その結果、増幅前又は増幅中にピリミジン二量体を修復することが望ましい。これは、ピリミジン二量体グリコシラーゼ／リアーゼ（Ｖａｎｄｅ  Ｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３２）：２０２７６−２０２８４（１９９８））を汎用酵素混合物へ添加することによって達成されることが可能である。ＤＮＡ骨格は、ピリミジン二量体に対して５’で切断され、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能な３’ヒドロキシル部分を残す。ある実施形態において、３’ヒドロキシルでの伸長及びＤＮＡ伸長の間に生成される障害含有フラップのその後の形成及び切断は、ニックを封着できる酵素によって封着されるニックをもたらす。フラップの切断は、伸長ポリメラーゼ、例えばイー・コリポリメラーゼＩによって、又はフラップエンドヌクレアーゼの作用によって達成されることが可能である（Ｘｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２７）：２０９４９−２０９５５（２０００）、Ｌｉｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：５８９−６１５（２００４））。
【００５９】
（ｂ）酸化的損傷、アルキル化及び脱アミノ化  
損傷を受けた塩基の反対側の望ましくないヌクレオチド組み込みのために、ＤＮＡ増幅産物中に誤りが導入され得る（Ｇｉｌｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．７２：４８−６１（２００３）、Ｈｏｆｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：４７９３−９（２００１））。これらの誤りは、同一試料を何度も増幅し、クローニングし及び配列決定した後に発見され得る。塩基損傷による誤りは、ＵＤＧ等の、変異原性ＤＮＡの一般的種類の１つを除去する酵素による試料処理の前及び後に配列データを比較することによっても同定することが可能である（Ｈｏｆｒｅｉｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：４７９３−９（２００１））。しかしながら、ＵＤＧによる処理は、プライマー伸長によるＤＮＡ増幅を阻害する脱塩基部位をＤＮＡ内に作出する。これによって、ＤＮＡ試料が、ＵＤＧ処理の後の増幅を受けなくなる場合があり得る。次いで、このＡＰ部位は、リガーゼ並びに好ましくはＡＰエンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼも含有する反応混合物によって修復されることが可能である。ウラシルの除去により、増幅反応において本来この部位で停止されるポリメラーゼが、ＤＮＡを増幅し続けることが可能となる。例えば、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ活性は、ウラシルを含有するＤＮＡテンプレート上で阻害される。ウラシルを除去する能力によってポリメラーゼは増強された有効性を有することが可能となる。
【００６０】
これに対して、リガーゼ及びポリメラーゼを含む酵素混合物とともにＵＤＧを含めることは、ポリヌクレオチドの複製又は増幅の産物の収量及び忠実度を増大させるために首尾よく使用され得ることが本明細書で示されている。実施例１２ないし１４は、ＵＤＧを含む多様な有益な酵素混合物の記述を提供する。
【００６１】
酸化的損傷の産物である修飾されたヌクレオチドは、Ｆｐｇ又はｈＯＧＧによってポリヌクレオチドから除去され、封鎖されたポリヌクレオチドがＥｎｄｏＩＶ等のＡＰエンドヌクレアーゼにより修復可能である封鎖されたポリヌクレオチドを残すことも可能である。
【００６２】
複製又は増幅の前に、ポリヌクレオチドへの酸化的損傷を修復するための酵素前処理の有効性は、複製されたポリヌクレオチド産物の改善された忠実度が、リガーゼ、ポリメラーゼ、ＥｎｄｏＩＶ及びＦｐｇを含有する酵素混合物を使用して示される実施例９において説明されている。
【００６３】
シトシンがウラシルへ、グアニンがキサンチンへ又はアデニンがヒポキサンチンへ変換されているアルキル化された塩基又は脱アミノ化された塩基等の修飾された他のヌクレオチドは、ミスコードを生じる。修飾されたこれらのヌクレオチドの除去が望ましい。修飾されたこれらの塩基は、上に論述されているＵＤＧによって、又は実施例１０に記載されているＡｌｋＡ若しくはＡａｇによって除去されることが可能である。
【００６４】
（ｉｉｉ）架橋
ホルムアルデヒド及び巨大な付加物から生じる損傷並びにＤＮＡ−タンパク質架橋を形成する化学的に修飾された塩基をもたらす損傷を修復するために、さらなるヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）タンパク質（Ｍｉｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：３０００−３００９（２００５）、Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８５（１１）：１０８３−１０９９（２００３）、Ｓａｎｃａｒ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６５：４３−８１（１９９６））を使用することが可能である。５’末端において、及び場合によって、損傷を受けた部位の周囲の３’末端において切り込みを作るために、イー・コリＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、変異体ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ又はＣｈｏのうちの少なくとも１つ（Ｍｏｏｌｅｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４６７−７２（２００２））を使用することが可能である。これらの酵素の特性及び精製プロトコールについての詳細は、Ｚｏｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：４１９６−４２０５（２００４）から取得することが可能である。修復過程は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼを用いることによって、及び場合によりフラップエンドヌクレアーゼを用いることによって完了されることが可能である。
【００６５】
ＮＥＲ酵素がＤＮＡを切断するが、プライマー伸長を阻害するＤＮＡ上の封鎖された３’末端を残す場合には、５’切り込み部位に３’ヒドロキシルが生成することが有用であり得る。一例は、ＮＥＲ酵素がＤＮＡを切断し、３’リン酸を残した場合である。これは、３’ホスファートが、例えばイー・コリＥｎｄｏＩＶによって除去されなければ、公知のＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではない。
【００６６】
ＮＥＲ酵素がＤＮＡ障害に対して５’及び３’を切断する場合には、新たに放出されるオリゴヌクレオチドがＤＮＡから解離するときに損傷が除去される。ポリメラーゼは、ニックを残すＤＮＡの切り出された領域を単に充填することが可能であり、次に、修復を完了するようにリガーゼが封着する。ある種の事例では、ポリメラーゼはＤＮＡを充填した後、残りのＤＮＡ鎖を置換し続け得る。これらの状況では、フラパーゼ活性を有する酵素によって、リガーゼが封着することができるニックが形成可能となる。ＮＥＲ酵素が損傷に対して５’のみを切断する場合には、ポリメラーゼは好ましくは、損傷を過ぎるまで元のＤＮＡ鎖を置換し、その地点でフラパーゼは、ＤＮＡフラップを切断して連結可能なニックを作出する。フラパーゼは、ＤＮＡ障害に到達する前及び後に活性であり得る。好ましくは、ポリメラーゼ及びフラパーゼ活性は、連結可能なニックを残すＤＮＡ障害を最終的に置換及び除去して、ＤＮＡテンプレートを修復するように作用する。上述のアプローチの有効性の一例は、実施例７に提供されている。
【００６７】
（ｉｖ）ニック、ギャップ及び誤対合されたポリヌクレオチド
ＤＮＡ骨格中のニック及びギャップは、末端切断されたプライマー伸長産物及び一本鎖領域の望ましくないハイブリッド形成によるキメラの形成をもたらし得る。ヘテロ二本鎖ＤＮＡは、多重テンプレートＰＣＲにおいて及び均一テンプレートＰＣＲにおいて問題となり得る（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．＆  Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：６７６−６８１（２０００）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（９）：２０８３−２０８８（２００２）、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．＆  Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６８４７−６８５０（１９９７））。例えば、キメラは、誤対合部位で形成されることが可能である。
【００６８】
汎用酵素混合物内に含有されるヘテロ二本鎖部位（Ｔ７ＥｎｄｏＩ及びその変異体）で認識及び切断する酵素を場合により、リガーゼ及びポリメラーゼと一緒に組み合わせた効果は、ＤＮＡ中のニック、ギャップ、ヘテロ二本鎖及びキメラの修復をもたらすことにより、ポリヌクレオチドの複製及び増幅反応の収量及び忠実度を増大させる。実施例８は、上に例示されているＴ７ＥｎｄｏＩ及びリガーゼを使用する有益な効果を示す。Ｔ７エンドヌクレアーゼ又は変異体：ＤＮＡ比の有用な範囲は、ヘテロ二本鎖切断反応における非特異的切断の有害な効果を最小化するためにＤＮＡリガーゼ活性を含めることによって拡張することができる。このアプローチは、ＤＮＡの定量化を必要とせず、Ｌｏｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：６７６−６８１（２０００）、及びＳｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６８４７−６８５０（１９９７）によって必要とされるＰＣＲ反応後に余分な工程を回避する。
【００６９】
幾つかのポリヌクレオチドに関して、損傷の性質は公知であり得る。実例として、酵素の混合物は、特異的な損傷を修復するために、上述の（ｂ）章に従って選択されることが可能である。損傷が未知であり、又は源が混合されている場合、実施例を含む本明細書中に記載されている汎用混合物を使用し得る。
【００７０】
ＤＮＡマイクロアレイ
ＤＮＡマイクロアレイは、ＤＮＡ試料を分析するために使用される強力な方法である（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：３７６−３８０（１９９４）、Ｋｏｚａｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２（７）：７５３−９（１９９６））。まず、損傷を受けたＤＮＡを修復することが、損傷を受けたＤＮＡのマイクロアレイ分析から得られる情報の量及び質に対して有益である。
【００７１】
実施例及び図面の考察
増幅後の産物の収量の増大が、損傷全般に対して、及び特異的損傷源に対して示されている。図１Ａないし１Ｄ、および４（熱損傷）、２Ａないし２Ｂ（クエン酸塩）、８Ａないし８Ｃ（紫外線照射）、１２、３、５及び１７（ＤＮＡ、環境ＤＮＡ、保存されたオキアミＤＮＡ及びアナグマＤＮＡに対する一般的な損傷）及び９Ａないし９Ｂ（望ましくないヘテロ二本鎖形成へ供される）並びに異なる温度での異なる温置時間の影響（図１３及び１４）で示される。忠実度の増大が、図１０Ａないし１０Ｂ及び１１で示される。図６Ａ−１ないし６Ａ−９、６Ｂ−１及び６Ｂ−２は、Ｔａｑリガーゼ及びＴ４リガーゼ配列と相同な配列の詳細を示している。図７は、Ｔｔｈ  ＥｎｄｏＩＶに関するＤＮＡ配列を記載し、図１８−１ないし１８−２は、プラスミドｐＮＥＢ０．９２０に関する配列を記載する。図１５は、単位複製配列を生成するための増幅に適したテンプレートを形成するために、断片化された複数のＤＮＡを修復することが可能であることを示している。クローニング及び形質転換のための修復混合物の利点が図１５及び１６に示されている。
【００７２】
実施例１及び図１Ａないし１Ｄは、テンプレートＤＮＡが損傷のある閾値を超えて損傷を受ける（例、約９０秒間の熱処理）と、ＰＣＲ増幅から得られた単位複製配列収量が実質的に負の影響を受けることを示している（図１Ａ参照）。増幅に対するこの損傷の効果は、増幅前に、ＤＮＡを酵素の混合物とともに温置することによって元に戻され、単位複製配列収量が増大し得る（図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄ参照）。さらに、記載されている酵素混合物を添加することによって、推定される「非損傷」ＤＮＡの単位複製配列収量を増大させることが可能である場合、実際にＤＮＡは、損傷を受けたと考えられる。
【００７３】
実施例１は、ＤＮＡの増幅に対する酵素混合物の効果が、ＡＰエンドヌクレアーゼ又はリガーゼの単一の種類に依存的ではなく、複数の別の源に由来するエンドヌクレアーゼ又はリガーゼを使用できることを示している。例えば、耐熱性ＴｔｈＥｎｄｏＩＶは、イー・コリＥｎｄｏＩＶと同程度に有効であることが発見され、イー・コリリガーゼは耐熱性Ｔａｑリガーゼと同程度に有効であった。
【００７４】
実施例２及び図２Ａないし２Ｂは、低ｐＨの存在下で誘導されるＤＮＡ損傷の別の種類（脱プリン化）の増幅収量に対する負の効果を示している。さらに、本実施例は、ＤＮＡの増幅に及ぼす酵素の混合物の効果が、ポリメラーゼの単一の種類に依存的ではなく、むしろ複数の別の源に由来するポリメラーゼを使用できることを示している。例えば、イー・コリＰｏｌＩは、増大した収量を生じるために、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ又はＴａｑ及びＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの混合物によって置換されることが可能である。
【００７５】
実施例３及び図３は、増幅収量の増大が、短い（２００ｂｐ）断片で観察され得ることを示している。実際、１００塩基程度の短いサイズから１００ｋｂ程度の長いサイズまでのＤＮＡテンプレートサイズの幅広い範囲に対して、増幅収量の増大が観察できるはずである。
【００７６】
図３は、未精製形態での（例えば、それ自体が保存されている生物体の細胞内での）保存を通じてＤＮＡが損傷を受けた場合でさえ、増幅収量は、増幅前に酵素の混合物を添加することによって有意に増大する。酵素の混合物は、増幅前にテンプレートＤＮＡへ添加されたが、増幅の間に又は増幅前工程の間に耐熱性均等物である酵素の混合物とともにテンプレートＤＮＡが温置される場合には、同様の収量効果が見られ得る。
【００７７】
実施例４及び図４は、リガーゼ単独が単位複製配列収量を増大させ得るが、ＡＰエンドヌクレアーゼを添加することが、収量をさらに増大させることを示す。リガーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼが増幅前に使用された場合に、本実施例において最良の結果が観察された。さらに、本実施例は、修復がＤＮＡの大きさに依存しないことを示す。例えば、５ｋｂ及び１０ｋｂの単位複製配列を用いて、同様の結果が得られた。
【００７８】
実施例５及び図５は、増幅由来の増大した収量が、ＮＡＤ＋依存的又はＡＴＰ依存的酵素であり得るリガーゼを使用して達成され得ること、及びこの効果は、リガーゼの単一源に限定されずに達成され得ることを示している。図５は、事前温置混合物中にさらなる酵素を加えずに使用された場合でさえ、Ｔａｑリガーゼ及びＴ４リガーゼが何れも、増幅収量を増大させる上で効果的であることを示している。この効果は、リガーゼが、（耐熱性であれば）増幅混合物へ添加される場合にも起こると考えられる。図５は、自然の状態で、多様な損傷因子に曝露されている土壌試料から直接得られた環境ＤＮＡを増幅する場合の本アプローチの利点も示す。
【００７９】
図６Ａ−１ないし６Ａ−９、６Ｂ−１及び６Ｂ−２並びに７は、酵素の普遍的混合物（損傷そのものに関する具体的な知識なしに、損傷を受けたポリヌクレオチドへ広く適用できるので、このように命名されている。）中で使用される酵素又は該酵素をコードする配列に関する記述である。本実施例は、ＤＮＡに関するものであるが、より一般的には、ポリヌクレオチドの増幅又は複製が想定される。一般に、増幅が改良されることが明らかとなっている条件は、全ての場合において明示的に述べられていない場合でさえ、一般に、ポリヌクレオチドの複製の増大に適用することが可能である。
【００８０】
本明細書で引用される全ての参考文献、並びに２００５年１０月２０日に出願された米国出願第１１／２５５，２９０号及び２００４年１０月２１に出願された米国仮出願第６０／６２０，８９６号、２００５年１月２４日に出願された第６０／６４６，７２８号及び２００５年４月２１日に出願された第６０／６７３，９２５号は、参照により組み入れられる。
【００８１】
実施例
【実施例１】
【００８２】
熱処理によって損傷を受けたＤＮＡ由来の単位複製配列収量の増大
増幅前にＤＮＡを修復するための選択された試薬の使用を最適化するためのアッセイを開発した。
【００８３】
熱損傷の多様な程度の生成
ＤＮＡ損傷の多様な量を熱処理により誘導した。これは、次のとおり達成した。ＰＥ２７００サーマルサイクラー中にて、それぞれ９９℃で３０秒間、６０秒間、９０秒間、１２０秒間及び１８０秒間熱処理するために、０．５ｍｇ／ｍＬのラムダＤＮＡ１００μＬ（ＮＥＢ＃Ｎ３０１１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を別個のチューブ中へ分注した。前処理なしで増幅するためのテンプレートとして、試料を使用した。
【００８４】
損傷を受けた残りのＤＮＡを、次のとおり、酵素の混合物によって前処理した。次の混合物中において、室温で１０分間、損傷を受けたＤＮＡテンプレートを温置した。
【００８５】
ＤＮＡ（５ｎｇ、２ｎｇ及び１ｎｇ）；
１００μＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ＃Ｍ０４４７、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ＃Ｎ−７００４，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；
８０単位のＴａｑリガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０８，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）又はイー・コリリガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０５Ｓ）４０ないし１００単位；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（イー・コリｐｏｌＩ）（ＮＥＢ＃Ｍ０２０９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ（ＮＥＢ＃Ｍ０３０４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）又はＴｔｈＥｎｄｏＩＶ１０単位；
９６μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ＃Ｂ９００４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。
【００８６】
反応の終了時に、試料を氷へ移した後、増幅した。
【００８７】
ＤＮＡ増幅反応
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１１９７−１２０７（２００４）の方法に従って、次のプライマー：ＣＧＡＡＣＧＴＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧ（Ｌ７２−５Ｒ）（配列番号１）及びＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣ（Ｌ３０３５０Ｆ）（配列番号２）を使用して、ラムダのＤＮＡ増幅を実施した。
【００８８】
増幅混合物４μＬを上述の修復混合物９６μＬへ添加した。増幅混合物は、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液中の１００μＭ  ｄＮＴＰ、５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、０．１単位のＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ、５×１０−１１ＭのプライマーＬ７２−５Ｒ及び５×１０−１１ＭのプライマーＬ３０３５０Ｆを含有した。
【００８９】
全ての酵素保存緩衝液効果を補正するために、修復酵素が反応から除外された場合には、その保存緩衝液の適切な容積を反応物へ添加した。全ての事例で、増幅反応は、次のパラメータ、すなわち９５℃で２０秒間を１周期の後、９４℃で５秒間、次に、７２℃で５分間を２５周期を使用するサーマルサイクラー中で実施した。増幅される単位複製配列の大きさは、５ｋｂであった。
【００９０】
１％アガロースゲル電気泳動によって、ＤＮＡ（５ｋｂ）の増幅の結果を決定した。６×添加染色剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１，ｐｐ．５．４−５．１７）を１００μＬの増幅反応物へ添加した。次に、この溶液２０μＬをアガロースゲルへ、サイズ標準物質としての２ログラダー（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇとともに添加した。
【００９１】
各試料に対して増幅された量を、ゲル電気泳動によって比較し、結果を図１ＡないしＤに示した。熱処理後であるが、増幅の前に、酵素の混合物で試料を処理した場合に、増幅収量の有意な増大が達成された（図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄ）。
【実施例２】
【００９２】
酵素混合物での前処理後の低ｐＨによって誘導された脱塩基部位を有するＤＮＡから得られる増大した単位複製配列収量
脱塩基部位から生じる損傷の多様な程度の発生
損傷を受けたＤＮＡの修復の程度をアッセイするために、まずＤＮＡ損傷の多様な量を酸性ｐＨによって誘導した。これは、以下のように達成した。
【００９３】
Ｉｄｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（３２）：８２７６−８３（１９９３）によって記載されているとおり、ＤＮＡを脱プリン化した。ラムダＤＮＡ（ＮＥＢ＃Ｎ３０１１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）をエタノール沈殿した。０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、脱プリン化緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．０）中に再懸濁し、７０℃で０、２０、４０、８０、１２０、及び１６０分間温置した。次に、試料をエタノール沈殿し、０．０１Ｍトリス、０．００１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に再懸濁した。緩衝液対照で較正した後、ＤＮＡを含有する溶液のＡ２６０を測定することによって、ＤＮＡ濃度を決定した。
【００９４】
酵素混合物によるＤＮＡの前処理
次の混合物中で、室温で１０分間、損傷を受けたＤＮＡを温置した。
【００９５】
ＤＮＡ（低ｐＨ処理の１２０分後の損傷を受けたＤＮＡ２．５ｎｇ）；
１００μＭＮＴＰ；
１ｍＭＮＡＤ＋
８０単位のＴａｑリガーゼ；
０．１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ又は０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）又は０．１単位のＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）Ｐｏｌ（ＮＥＢ＃Ｍ０２５４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）０．００２単位；
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；  
９６μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【００９６】
室温で１０分間、上述の混合物を温置した後、増幅前に氷へ移した。
【００９７】
ＤＮＡ増幅反応
実施例１に記載されているように増幅を実施し、５ｋｂの単位複製配列を得た。脱塩基部位を含有するラムダＤＮＡを酵素の混合物で処理することによって、陰性対照（図２Ａ）と比較して、単位複製配列収量が増大した。異なる酵素混合物を使用する一連の前処理に関する結果を図２Ｂに示す。酵素混合物は、ポリメラーゼ（イー・コリＰｏｌＩ又はＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標））に関して変動した。
【実施例３】
【００９８】
保存料中での保存後の未変性生物から抽出されたＤＮＡの増大した単位複製配列収量
Ｂｕｃｋｌｉｎ，Ａ．＆  Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｄ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．３０（３）：８７９−８８２（２００４）に記載されているとおり、メガニクチファネス・ノルベギカ（Ｍｅｇａｎｙｃｔｉｐｈａｎｅｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃａ）（オキアミ）からゲノムＤＮＡを単離した。オキアミをエタノール中で約５年間保存した。
【００９９】
酵素の混合物によるオキアミＤＮＡの前処理は、次のとおり実施した。
【０１００】
Ｍ．ノルベギカゲノムＤＮＡ５０ｎｇ；
１００μＭｄＮＴＰ；
１ｍＭＮＡＤ＋；
Ｔａｑリガーゼ４０単位；  
０．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、０．２単位のＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ、又はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．０５単位及びＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）０．００１単位を含有するＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）混合物；
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；
９６μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１０１】
増幅工程に進行する前に、室温で１５分間、本反応物を温置した。
【０１０２】
ＤＮＡ増幅反応
Ｂｕｃｋｌｉｎ，Ａ．＆  Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｄ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．３０（３）：８７９−８２（２００４）に記載されているとおり、増幅プライマーは５２Ｆ及び２３３Ｒに相当し、２００ｂｐの単位複製配列を生成した。
【０１０３】
５２Ｆ：ＴＴＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡ（配列番号３）
２３３Ｒ：ＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＣＧ（配列番号４）
プライマーを０．５μＭの最終濃度になるように、各ｄＮＴＰを２００μＭの最終濃度になるように添加した。次に、５０：１のＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）混合物（反応物へ添加された５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び０．１単位のＶｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ）１μＬを各反応物へ添加し、１００μＬの最終容積にした。
【０１０４】
対照反応物（レーン１）については、ＥｎｄｏＩＶ、Ｔａｑリガーゼ又は前処理ポリメラーゼを添加しなかった。容積を適宜調整した。修復酵素が省略された反応では、緩衝液効果を調節するために、酵素保存緩衝液の適切な容積を対照へ添加した。
【０１０５】
サイクリング条件は次のとおり、すなわち９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間及び７２℃で１分４０秒間を４０周期であった。上述のとおり、２５μＬ（反応物の１／４）を調製し、１％アガロースゲルに添加し、電気泳動し、可視化した。
【０１０６】
上述の酵素混合物を使用する試料の事前温置後に、オキアミゲノムＤＮＡ由来の増大した単位複製配列収量を観察した（図３）。
【実施例４】
【０１０７】
熱によって損傷を受けたＤＮＡ由来の大きな（１０ｋｂの）単位複製配列の増大した収量
熱によって損傷を受けたＤＮＡを、実施例１に記載されているとおりに調製した。ラムダＤＮＡを９９℃まで１８０秒間加熱した。
【０１０８】
酵素の混合物による損傷を受けたＤＮＡの前処理は、次のとおり実施した。
【０１０９】
ラムダＤＮＡ（１８０秒間熱処理したＤＮＡ１μｇ）；
１００μＭｄＮＴＰ；
１ｍＭＮＡＤ＋；
Ｔａｑリガーゼ８０単位；
イー・コリＰｏｌＩ０．１単位
イー・コリＥｎｄｏＩＶ１００単位；
９６μＬの容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１１０】
増幅前に混合物を１０分間温置した。
【０１１１】
以下に明記される場合を除き、ＤＮＡ増幅は、実施例１に記載のとおり実施した。上述の事前温置混合物９６μＬへプライマーを添加した。実施例１におけるＬ７２−５ＲをプライマーＬ７１−１０Ｒ（配列ＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＣＧＴＣＣＣＣＡＧＧ）（配列番号５）に置き換えた。ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラープログラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）は、９５℃で２０秒間を１周期、９５℃で５秒間、７２℃で１０分間を２５周期、次いで７２℃で１０分間を１周期であった。単位複製配列の大きさは、１０ｋｂであった。
【０１１２】
以下の例外を除き、実施例１に記載されているとおりにＤＮＡを可視化した。６×添加緩衝液２０μＬを１００μＬの増幅反応物へ添加した。この溶液１０μＬを、Ｈ２Ｏ及び１×添加緩衝液で１００μＬになるように希釈した。これを、２０μＬずつ各レーンへ添加した。ゲルは０．８％アガロースゲルであった。結果は、図４に示されている。
【実施例５】
【０１１３】
（土壌試料から抽出された）環境ＤＮＡ由来のＤＮＡの改良された増幅収量
ＭｏＢｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡキット（カタログ番号１２８００−５０）を使用して、環境ＤＮＡを土壌から単離した。
【０１１４】
リガーゼによるＤＮＡの前処理
土壌から単離された環境ＤＮＡ０．６μｇ並びに以下の（ａ）及び（ｂ）に記載されている２つのリガーゼのうちの１つを含有する１００μＬの最終容積によって、反応混合物が形成された。次に、室温で１５分間、この反応混合物を温置した。
【０１１５】
（ａ）１×Ｔａｑリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及びＴａｑリガーゼ８０単位
（ｂ）１×Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及びＴ４リガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０２，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）８００単位。
【０１１６】
以下に記載されている増幅反応において、反応混合物１μＬを使用した。
【０１１７】
ＤＮＡ増幅反応
ＤＮＡ増幅は、プライマーＧＧＧＧＧＸＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡ（配列番号６）及びＧＧＧＧＧＸＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（配列番号７）（Ｍ＝Ｃ若しくはＡ、Ｙ＝Ｃ若しくはＴ、Ｘ＝８−オキソ−グアニン）を使用して実施した。これらのプライマーは、１．６Ｋｂの単位複製配列の大きさを有する１６ＳｒＤＮＡを標的とする。
【０１１８】
５０μＬの反応物は、各プライマー１０ｐｍｏｌ、修復された環境ＤＮＡ１μＬ、２００μＭｄＮＴＰ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液及び１．２５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有した。次のサイクリングパラメータを使用して、増幅を実施した。９４℃で５分間を１周期、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で１分４０秒間を３２周期、次いで７２℃で５分間を１周期。
【０１１９】
実施例１に記載されているように、ゲル電気泳動を実施した。結果は、図５に示されている。
【実施例６】
【０１２０】
紫外線光により損傷を受けたＤＮＡの増大した単位複製配列収量
ＤＮＡ修復の有効性をアッセイするための条件を決定するために、５０μｇのラムダＤＮＡ（ＮＥＢ＃Ｎ３０１１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に希釈し、５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、３６Ｊ／ｍ２の紫外線光で０、１０、２０、３０、４０及び５０秒間照射した。
【０１２１】
酵素の混合物による損傷を受けたＤＮＡの前処理は、次のとおり実施した。
【０１２２】
次の混合物中において、室温で１５分間、損傷を受けたＤＮＡを温置した。
【０１２３】
ＤＮＡ（０、１０、２０、３０、４０、又は５０秒間損傷を受けたラムダＤＮＡ５０ｎｇ）；
２００μＭｄＮＴＰ；
１ｍＭＮＡＤ＋；
４００単位のＴａｑリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；
８０単位又は１０単位の（Ｔ４  ＥｎｄｏＶとも呼ばれる。）Ｔ４  ＰＤＧ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液
５０μＬになるように、容積を水で調整。
【０１２４】
１５分間の温置の後、５０μＬの反応混合物を増幅溶液５０μＬへ添加した。増幅溶液は、各プライマー（実施例１に記載のＬ７２−５Ｒ及びＬ３０３５０Ｆ又はＬ７２−２Ｒ（ＤＮＡ配列は、ＣＣＡＴＧＡＴＴＣＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＧであった。）（配列番号８））４０ｐｍｏｌ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２００μＭ  ｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２６７，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、及び５０μＬの最終容積にするためのＨ２Ｏからなった。５０μＬの修復反応物を５０μＬの増幅溶液と組み合わせることによって、１００μＬの最終容積が得られた。
【０１２５】
１００μＬの溶液をサーマルサイクラー中へと配置した。Ｌ７２−５Ｒ及びＬ３０３５０Ｆのプライマーの組み合わせに関しては、９４℃で５分間を１周期、９４℃で３０秒間、５８℃で６０秒間、及び７２℃で４分間を３０周期、７２℃で５分間を１周期であった。
【０１２６】
Ｌ７２−２Ｒ及びＬ３０３５０Ｆのプライマーの組み合わせに関しては、９４℃で５分間を１周期、９４℃で３０秒間、５８℃で６０秒間、及び７２℃で２分間を３０周期、７２℃で５分間を１周期であった。
【０１２７】
臭化エチジウムを使用して、１．８％アガロースゲル上で、増幅産物の存在を可視化した。２ログラダー（ＮＥＢ＃Ｎ３２００Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のサイズ標準物質を含有するレーンに対して、全てのバンドの大きさを比較した。結果は、図８に示されている。
【実施例７】
【０１２８】
ヌクレオチド切除修復タンパク質ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ及びＵｖｒＣを使用するＤＮＡの増大した単位複製配列収量
ヌクレオチド切除修復に関与するタンパク質を含有する酵素混合物を使用して、試料の事前温置後に、オキアミゲノムＤＮＡ由来の増大した単位複製配列収量を決定した。
【０１２９】
酵素の混合物による保存されたＤＮＡの前処理は、次のとおり実施する。
【０１３０】
保存されたＤＮＡを次の混合物中で４ないし３７℃で１ないし１８０分間温置する。
【０１３１】
ＤＮＡ：Ｍ．ノルベギカゲノムＤＮＡ５０ｎｇ；
１００μＭｄＮＴＰ；
１ｍＭＡＴＰ；
Ｔａｑリガーゼ４００単位；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０ｎＭイー・コリＵｖｒＡ、２５０ｎＭイー・コリＵｖｒＢ（又は変異体ＵｖｒＢ＊）、＋又は−５０ｎＭイー・コリＵｖｒＣ；
９６μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１３２】
＊変異体ＵｖｒＢに関しては、Ｚｏｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：４１９６−４２０５（２００４）を参照されたい。
【０１３３】
ＤＮＡ増幅反応は、実施例３に記載されているとおりに実施される。
【実施例８】
【０１３４】
ヘテロ二本鎖の酵素切断によって少なくとも１つの鎖において誤ったヌクレオチドを除去した後のＤＮＡの増大した配列精度
実験条件
Ａ．ＴａｑリガーゼをＴ７ＥｎｄｏＩへ添加することが、ＤＮＡを無作為に分解せずに、ＤＮＡ調製物中でＴ７ＥｎｄｏＩの増大した濃度の使用を可能にすることを示した。
【０１３５】
本アッセイは、Ｔ７ＥｎｄｏＩの増大する量とともに十字型構造を含有するスーパーコイルＤＮＡを処理することに依存する。
【０１３６】
Ｔ７ＥｎｄｏＩ（ＮＥＢ＃Ｍ０３０２，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）０、１．６、３．１、６．２、１２．５、２５、５０、１００、２００又は４００単位を、ｐＵＣ（ＡＴ）（Ｇｕａｎ，Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：４３１３−４３２２（２００４））１μｇおよび１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ＃Ｂ７００２Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からなる５０μＬの反応物へ添加した。プラスミドｐＡＴ２５ｔｅｔＡをｐＵＣ（ＡＴ）の代わりに使用することが可能である（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：１６９−１７８（１９９７）及びＢｏｗａｔｅｒ，Ｒ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：９２６６−９２７５（１９９４））。反応の別のセットを同時に準備し、１ｍＭＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｎ−７００４，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び（ＮＥＢ＃Ｍ０２０８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）の原液を１００μ／μＬの濃度で使用する）Ｔａｑリガーゼ１００単位の添加とともに、上述の同一構成成分を使用した。全ての反応物を３７℃で６０分間温置した。
【０１３７】
０．９％ＴＢＥアガロースゲル上で反応物を泳動することによって結果を分析し、臭化エチジウムで染色し、紫外線光を使用して可視化した（図９Ａ及び９Ｂ参照）。Ｔ７ＥｎｄｏＩを有さないｐＵＣ（ＡＴ）プラスミドは、スーパーコイル型（下部バンド）及び弛緩した環状型（上部バンド）に相当する２つのバンドをゲル上で生じた。
【０１３８】
Ｔ７ＥｎｄｏＩは、スーパーコイル型ｐＵＣ（ＡＴ）を弛緩した環状型及び直鎖型へ分解し、直鎖型は、スーパーコイル型及び弛緩した環状型に対して中間を走行した。あるＴ７ＥｎｄｏＩ：ＤＮＡの比で、Ｔ７ＥｎｄｏＩが非特異的酵素活性によってＤＮＡを分解したことを示すスメアが生じた。Ｔａｑリガーゼの存在は、使用可能なＴ７ＥｎｄｏＩ：ＤＮＡ比を有意に増大させた。この比は、Ｔ７ＥｎｄｏＩを国際公報第ＷＯ２００５／０５２１２４号に記載されているＴ７ＥｎｄｏＩ変異体と置換することによってさらに改良される。
【０１３９】
Ｂ．ＰＣＲ反応からヘテロ二本鎖を除去するための方法Ａの使用
土壌からのＤＮＡの単離及び精製されたＤＮＡの増幅は、５単位のＴ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体を場合によって添加しながら、実施例５に記載されているとおりに実施する。Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体を添加されているときには、さらなる増幅周期（３７℃で１５分間を１周期）を付加する。最後の工程は、Ｔ７エンドヌクレアーゼに、形成された全てのヘテロ二本鎖を切断させることである。
【０１４０】
ゲル電気泳動は、実施例１に記載されているとおり実施する。Ｌｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．＆  Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：６７６−６８１（２０００）に記載されているとおり、ヘテロ二本鎖ＤＮＡをゲル上で可視化する。Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体の存在下でヘテロ二本鎖ＤＮＡが存在しないことは、リガーゼとともにＴ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体の効果を示す。
【０１４１】
単位の定義は、本明細書中に引用されているＮＥＢカタログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中の各酵素に関する産物の記述とともに記載されている。例えば、Ｔ７ＥｎｄｏＩ又はその変異体に関する単位の定義は、スーパーコイルプラスミド１μｇの９０％超を、５０μＬの反応容積中の９０％超の直鎖ＤＮＡへと３７℃で１時間変換するために必要な酵素の量である。
【０１４２】
リガーゼの存在下で、ＤＮＡの非特異的な切断を増大させずに、Ｔ７ＥｎｄｏＩ：ＤＮＡを増大させることが可能である。
【実施例９】
【０１４３】
酸化的損傷後のＤＮＡ増幅反応の配列の正確性の増大
酸化的損傷を伴うＤＮＡの作製
酸化的損傷へ供されたＤＮＡは、ｐＷＢ４０７（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６１３９−４７（２００３））であった。既に記載されているとおりに（Ｓａｔｔｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７６（１）：２６−３（２０００））、メチレンブルー（ＭＢ）と可視光との組み合わせを使用して、損傷を誘発した。プラスミドＤＮＡ（蒸留水中の２００μｇ／ｍＬ）を、パラフィルム伸縮性材料上に滴下した（５０μＬ滴）。０ないし５０（０、３、６、１２．５、２５及び５０）μｇ／ｍＬの範囲に及ぶ最終濃度になるように、ＭＢを滴へ添加した（１００μＬ最終容積）。これらのパラフィルム片を有するプレートを氷上に配置し、１×１００Ｗの電球で８分間照明を当てた。ＭＢ光で処理されたＤＮＡを沈殿させ、乾燥させた後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）５０μＬ中に再懸濁した。２６０ｎｍでの光の吸光度によって、最終的なＤＮＡ濃度を測定した。
【０１４４】
ＤＮＡ増幅条件
プライマー３１６−１３８（ＴＧＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣ（配列番号９））及び３１６−１３７（ＣＧＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡ（配列番号１０））を使用して、ｌａｃＺを含有するｐＷＢ４０７の一部を増幅した。プライマー３１６−１３８及び３１６−１３７はそれぞれ、既に記載されているプライマーＫｆｄ−２９及びＨ３Ｂｌａ３４（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６１３９−４７（２００３））をベースにした。１００μＬのＰＣＲ反応物は、テンプレートＤＮＡ１０ｎｇ又は５０ｎｇの何れかを含有し、及び各プライマー４０ｐｍｏｌを場合によって含有した。利用されるサイクリング条件は、増幅に使用される耐熱性ポリメラーゼによって変動した。
【０１４５】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６７Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用するときのサイクリング条件は、９４℃で５分間を１周期の初期変性工程、次いで９４℃で３０秒間、５８℃で６０秒間、及び７２℃で３分３０秒間を３０周期、並びに最後に７２℃で５分間を有した。
【０１４６】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｆ−５３０Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用するときのサイクリング条件は、９８℃で３０秒間を１周期、次いで９８℃で１０秒間、６２℃で３０秒間、及び７２℃で１分３０秒間を３０周期、並びに最後に７２℃で５分間を有した。
【０１４７】
１．６％アガロースゲルに反応物２５μＬを添加することによって反応産物を分析し、調製し、電気泳動し、上述のとおり可視化した。使用されるマーカーは、２ログＤＮＡラダー（ＮＥＢカタログ番号Ｎ３２００Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）であった。
【０１４８】
増幅の正確性の測定
ｐＷＢ４０７テンプレートからのＤＮＡ増幅の正確性を、Ｂａｒｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）及びＫｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６１３９−４７（２００３）によって記載されるとおりに測定した。酸化的損傷の異なる量へ供したプラスミドｐＷＢ４０７から、ｌａｃＺ遺伝子を含有する単位複製配列を作製した。上述のとおり、メチレンブルーを使用して、酸化的損傷を実施した。上述のとおりテンプレート５０ｎｇを使用して、ＰＣＲ反応を実施した。サイクリング後、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ１０単位を各１００μＬのＰＣＲ反応物へ添加し、３７℃で２時間温置した。この工程は、元のテンプレートプラスミドを排除した。次に、得られた増幅産物をフェノール／クロロホルムで抽出し、イソプロパノールを使用して沈殿させた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１，ｐｐ．６．２５，Ａ８．１２−Ａ８．２４）。沈殿した産物をＨ２Ｏ中に再懸濁し、製造元（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によって推奨される条件を使用して、制限エンドヌクレアーゼＳｔｙＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断した。６５℃に２０分間加熱することによって、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｔｙＩ酵素を失活させることによって、ＤＮＡ消化反応を停止した。短いＤＮＡ断片を除去するために、ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、制限消化産物を精製した。
【０１４９】
合計５０μＬの修復反応混合物は、ｐＷＢ４０７単位複製配列１０又は５０ｎｇ±メチレンブルー温置物を含有した。修復反応物は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭＮＡＤ＋、２００μＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）及び多様な修復酵素混合物を含有した。
【０１５０】
５０μＬの合計容積中で個別に又は多様な組み合わせで使用される修復酵素混合物は、次のとおりであった。
【０１５１】
０．４単位のＦｐｇ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２４０Ｓ，Ｎｅｗ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；  
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；
１ｍＭＮＡＤ＋；
１００μＭｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１５２】
反応物を２５℃で１５分間温置した。温置後、ＰＣＲ混合物（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、２００μＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）及び２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６７Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）又はＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ１単位の何れか）５０μＬを５０μＬの修復反応物へ添加し、この新たな溶液をＰＣＲ用の温熱サイクリング条件へ供した。これらの反応物由来の単位複製配列を精製し、上述の他の単位複製配列に関して記載されているとおり、制限酵素で消化した。
【０１５３】
単位複製配列をｐＷＢ４０７プラスミド中へクローニングした。制限エンドヌクレアーゼＳｔｙＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、南極ホスファターゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８９Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１単位／ＤＮＡμｇとともに３７℃で３０分間温置することによって、プラスミドｐＷＢ４０７を調製した。脱リン酸化したｐＷＢ４０７ベクター骨格をアガロースゲル電気泳動により精製した。ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してゲル抽出を実施した。
【０１５４】
消化された単位複製配列を、３０μＬの反応物中の調製されたｐＷＢ４０７プラスミド中へ、約０．１μｇのベクターＤＮＡ及び約０．５μｇの単位複製配列を使用して連結した。製造元（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって推奨される条件に従い、Ｔ４リガーゼを使用して連結を実施した。連結産物をイー・コリ系ＷＢ４４１中へと電気穿孔した（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｇｅｎｅ１１２：２９−３５（１９９２））。使用される選択された指示薬プレートは、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び８０μｇ／ｍＬのＸｇａｌを含有するＬＢプレートであった。播種の前に、栄養分の豊かなブロス中で細菌を３７℃で１時間温置し、アンピシリン耐性を発現させた。リガーゼ処理を欠失する対照形質転換物は、コロニーをまったく生成しなかった。３７℃で１日、及び２５℃で１又は２日後、青色に関してコロニーをスコア化した。結果は、図１０Ａないし１０Ｂ及び１１に示されている。
【実施例１０】
【０１５５】
脱アミノ化損傷後のＤＮＡ増幅反応の配列の正確性の増大
脱アミノ化されたＤＮＡの発生
脱アミノ化へ供されたＤＮＡは、ｐＷＢ４０７（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：６１３９−６１４７（２００３））である。Ｙａｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７７（４）：２６４０−５０（２００３）に記載されているとおり、亜硝酸による無作為な変異原性を使用して、損傷を発生させる。亜硝酸は、ＤＮＡ中のグアニンをキサンチンへ、シトシンをウラシルへ、及びアデニンをヒポキサンチンへ脱アミノ化することが可能である。
【０１５６】
プラスミドＤＮＡ（２ｍｇ）を１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）中の０．７ＭＮａＮＯ２で処理する。氷冷１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）４容積の添加によって、様々な時点で反応を終結させる。プラスミドＤＮＡをアルコール沈殿させ、乾燥させた後、ＴＥ緩衝液１００μＬ中に再懸濁する。
【０１５７】
脱アミノ化された塩基を修復するための前処理反応
５０μＬの合計容積中で個別に又は多様な組み合わせで使用される修復酵素混合物は、次のとおりである。
【０１５８】
（ａ）
１単位のヒトＡａｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＥｎｄｏＩＩＩ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６８Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＥｎｄｏＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄｏ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＵＤＧ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８０Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄｏ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；
１ｍＭＮＡＤ＋；
１００μＭｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１５９】
（ｂ）
２単位のＥｎｄｏＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＵＤＧ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８０Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄｏ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；
１ｍＭ  ＮＡＤ＋；
１００μＭ  ｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１６０】
（ｃ）
２単位のＥｎｄｏＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；
１ｍＭＮＡＤ＋；
１００μＭｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１６１】
（ｄ）
１単位のヒトＡａｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＥｎｄｏＩＩＩ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６８Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；
１ｍＭＮＡＤ＋；
１００μＭｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１６２】
（ｅ）
１単位のヒトＡａｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＵＤＧ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８０Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑリガーゼ；  
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；  
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；  
１ｍＭのＮＡＤ＋；
１００μＭｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１６３】
（ｆ）
１単位のヒトＡａｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２単位のＥｎｄｏＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；
２００単位のＴａｑリガーゼ；
０．１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ；
１０単位のイー・コリＥｎｄｏＩＶ；
１ｍＭＮＡＤ＋；
１００μＭｄＮＴＰ；
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液。
【０１６４】
実施例９に記載されているとおり、増幅反応条件及び増幅正確性測定を実施する。
【実施例１１】
【０１６５】
単位の定義
好熱性リガーゼの単位
一単位は、４５℃で１５分間に、５０μＬの合計反応容積中において、ＢｓｔＥＩＩ消化されたラムダＤＮＡ１μｇの５０％連結を付与するのに必要な酵素の量として定義される。Ｔａｑリガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから市販されている。
【０１６６】
中温性リガーゼの単位
一単位は、１６℃で３０分間に、２０μＬの合計反応容積中において、ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたラムダＤＮＡの５０％連結を付与するのに必要な酵素の量として定義される。イー・コリリガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから市販されている。
【０１６７】
ＡＰエンドヌクレアーゼの単位
一単位は、３７℃で１時間に、１０μＬの全反応容積中において、単一ＡＰ部位を含有する３４マーのオリゴヌクレオチド二本鎖１ｐｍｏｌを切断するのに必要とされる酵素の量として定義される。
【０１６８】
中温性ポリメラーゼの単位
一単位は、３７℃で３０分間に、５０μＬの合計反応容積中において、［３Ｈ］−ｄＴＴＰを含む３３μＭｄＮＴＰ及び７０μｇ／ｍＬ変性ニシン精子ＤＮＡを用いた場合に、酸不溶性材料中にｄＮＴＰ１０ｎｍｏｌを組み込む酵素の量として定義される。
【０１６９】
好熱性ポリメラーゼの単位
一単位は、７５℃で３０分間に、５０μＬの合計反応容積中において、［３Ｈ］−ｄＴＴＰを含む２００μＭ  ｄＮＴＰ及び２００μｇ／ｍＬ活性型ウシ胸腺ＤＮＡを用いた場合に、酸不溶性材料中にｄＮＴＰ１０ｎｍｏｌを組み込む酵素の量として定義される。好熱性ポリメラーゼ−Ｔａｑポリメラーゼ及び古細菌ポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから市販されている。
【０１７０】
好熱性ＵＤＧ、Ｆｐｇ、ＥｎｄｏＩＩＩ及びＥｎｄｏＶＩＩＩのための単位の定義は、列挙される中温性の等価物（ＮＥＢカタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に関するものと同一である。
【０１７１】
【表１】
2009512438.tif 000002
2009512438.tif 000003
2009512438.tif 000004
【実施例１２】
【０１７２】
配列決定反応の感度を増大させるためにＤＮＡ配列決定反応において使用する前のＤＮＡの修復
配列決定反応の感度とは、配列決定前に正確な配列を有するテンプレートＤＮＡの量が、低下したバックグラウンドノイズ及び増大したシグナルを生じることを意味するものとする。これによって、より長い及び／又はより完全な配列の読み取りが可能となる。配列読み取りの改良された忠実度は、さらなる利点である。以下に記載されているような修復混合物の有益な使用が、配列決定方法に関して一般的に観察され得る。例えば、配列決定法には、４５４配列決定、単一分子配列決定、サンガー配列決定及びマクサム−ギルバート配列決定がある。
【０１７３】
ＤＮＡ修復の前及び後に、２つのＤＮＡ試料をＤＮＡ配列決定に供する。２つのＤＮＡ試料を４０秒間紫外線処理し（実施例６参照）、２５μｇ／ｍＬメチレンブルーの存在下でラムダＤＮＡを光へ曝露する。
【０１７４】
ＤＮＡ配列決定反応における使用の前に、修復酵素の活性を可能にする条件下で、配列決定されるべきＤＮＡを１つ又はそれ以上の修復酵素と接触させる。例えば、配列決定のための０．５μｇのテンプレートＤＮＡを、１×濃度になるようにＮＥＢ  Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液と混合し（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液の１×濃度は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００を含有する。）、室温で１５分間ＤＮＡ修復酵素（２００単位のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、１単位のＴ４ｐｄｇ、１５単位のＥｎｄｏＩＶ、２．５単位のＥｎｄｏＶＩＩＩ、０．１単位のＦｐｇ、及び必要に応じて０．５単位のイー・コリＵＤＧ）とともに温置する。修復されたＤＮＡを、配列決定のために即時使用するか、又はＤＮＡ配列決定前に、市販のキット（例えばＱｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡキット）を使用して精製及び濃縮する。配列決定反応は、古典的なサンガー配列決定反応によって、又は米国公開第２００５／０１００９３２号、米国特許第６，８９７，０２３号、又はＭａｒｇｕｌｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３７（７０５７）：３７６−８０（２００５）に記載の方法によって実施され得る。
【０１７５】
修復混合物による事前温置の結果、配列決定反応の感度及び結果の忠実度が改善される。
【実施例１３】
【０１７６】
損傷を受けたＤＮＡを修復するための多重酵素修復混合物は単一の温度において効果的である
紫外線で３０秒間照射することによって、ラムダＤＮＡを処理した（実施例６参照）。事前修復を行い又は行わずに、紫外線処理されたラムダＤＮＡから５キロベースの単位複製配列を増幅するために、Ｌ７２−５Ｒ（配列番号１）及びＬ３０３５０Ｆ（配列番号２）プライマーを選択した。ＤＮＡ修復混合物は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、及び５０％グリセロール中の、２００単位／μＬのＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位／μＬのイー・コリＰｏｌＩ、１単位／μＬのＴ４ｐｄｇ、１５単位／μＬのＥｎｄｏＩＶ、０．５単位／μＬのイー・コリＵＤＧ、２．５単位／μＬのＥｎｄｏＶＩＩＩ、及び０．１単位／μＬのＦｐｇを含有した。１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、１００μＭｄＮＴＰ、及び０．５ｍＭＮＡＤ＋を各々含有するサーモサイクラーチューブへ、３０秒間紫外線処理されたラムダＤＮＡ５０ｎｇを添加した。修復酵素混合物１μＬを、８本のチューブのうちの４本へ添加し、全てをＨ２Ｏで４７μＬの最終容積にした。修復酵素を含有する２本のチューブと、酵素を欠失する２本のチューブとを、室温で１５分間温置した。残りの溶液を４℃で一晩温置した。表記温置時間の後、プライマー（１μＭ）、ｄＮＴＰ（１００μＭ）及び２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを各サーモサイクラーチューブへ添加し、９５℃で２分間を１周期、９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で５分間を２５周期、７２℃で５分間を１周期、及び４℃で保持するプログラムを実行するＭｙＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中に溶液を配置した。各反応物２５μＬを１％アガロースゲルで分析した。
【０１７７】
修復を活性化するために複数の異なる温度を使用することを必要とした他者の知見（米国公開第２００６／００１４１５４号）とは異なり、紫外線による損傷を受けたＤＮＡを上述の修復混合物とともに、室温で１５分間又は４℃で一晩温置すると、正確な大きさの増幅産物が生じた（図１３Ａ及び１３Ｂ）。
【実施例１４】
【０１７８】
複数のウラシルを含有するプラスミドＤＮＡの修復、及びＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用する増幅
イー・コリＣＪ２３６からプラスミドｐＮＥＢ０．９２Ｕを精製した（ＮＥＢ＃Ｅ４１４１Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。配列を図１８に示す。イー・コリＣＪ２３６は、ｄＵＴＰａｓｅ及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを欠失しているので、本プラスミドは、その配列を通じて無作為に分布されたウラシルを含有する。古細菌ポリメラーゼＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼは、ウラシル含有テンプレートによって阻害される。事前修復を行い又は行わずに、プライマーＳ１２２４Ｓ（ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ）（配列番号１２）及びＳ１２３３Ｓ（ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ）（配列番号１３）を使用して、ｐＮＥＢ０．９２ＵＤＮＡ由来の９２０塩基の単位複製配列の増幅を実施した。ＤＮＡ修復混合物は、２００単位／μＬのＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位／μＬのイー・コリＰｏｌＩ、１単位／μＬのＴ４  ｐｄｇ、１５単位／μＬのＥｎｄｏＩＶ、０．５単位／μＬのイー・コリＵＤＧ、２．５単位／μＬのＥｎｄｏＶＩＩＩ、及び０．１単位／μＬのＦｐｇを含有し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０％グリセロール中に保存した。０．５ｎｇ  ｐＮＥＢ０．９２Ｕ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液、１００μＭ  ｄＮＴＰ、及び０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋を各々含有する４本のサーモサイクラーチューブのうちの２本へ、修復酵素混合物１μＬを添加した。全てＨ２Ｏで４５μＬの最終容積にした。反応溶液を、室温で１５分間温置した後、プライマー（最終濃度：０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（最終濃度：１００μＭ）及び１単位のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを各チューブへ添加した。９５℃で２分間を１周期、９５℃で１０秒間、６５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５周期、７２℃で５分間を１周期、次いで４℃で保持というプログラムを実行するＭｃＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー中へ溶液を配置した。各反応物２５μＬを１％アガロースゲルで電気泳動することによって検討した。
【０１７９】
ウラシルを除去せずにＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用してｐＮＥＢ０．９２Ｕから増幅すると、わずかに検出可能な望ましい大きさの産物が生じた。ｐＮＥＢ０．９２Ｕを修復混合物で処理すると、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して本プラスミドから生じた単位複製配列の量が有意に増大した（図１４）。
【実施例１５】
【０１８０】
ＤＮＡ断片由来の増大した単位複製配列収量
本反応におけるテンプレートは、平均的な大きさが約４５ヌクレオチドの２０の重複する合成一本鎖オリゴヌクレオチドのセットであった。オリゴヌクレオチド配列を以下に示す。
【０１８１】
ＮＥＢオリゴ３１６−２１９番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＧＡＡＡＣＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＣＴＴＴＣＣＧＧＧＣＧＡＴＡＣＣ
（配列番号１４）
ＮＥＢオリゴ３１６−２２０番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＣＧＧＣＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＧＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＧＡＡＡ
（配列番号１５）
ＮＥＢオリゴ３１６−２２１番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＡＴＴＧＡＴＧＧＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＡＡ
（配列番号１６）
ＮＥＢオリゴ３１６−２２２番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＣＡＴＧＴＴＴＴＣＡＴＡＧＣＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣＡＴＡＣＡＧＴＴＣＧＣＧ
（配列番号１７）
ＮＥＢオリゴ３１６−２２３番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＣＧＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＧＴＡＴＧＴＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＧＡＡ
（配列番号１８）
ＮＥＢオリゴ３１６−２２４番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＧＣＴＡＴＡＣＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＴＴ
（配列番号１９）
ＮＥＢオリゴ３１６−２２７番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＡＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴ
（配列番号２０）
ＮＥＢオリゴ３１６−２２８番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＣＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＴＴＡＡＴＣＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧＧＴ
（配列番号２１）
ＮＥＢオリゴ３１６−２２９番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＧＣＧＡＣＣＧＡＴＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＧＣＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＧＣ
（配列番号２２）
ＮＥＢオリゴ３１６−２３０番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＣＡＧＣＡＣＣＧＧＡＴＧＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＧＴＴＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＡＴＣＴＴＣ
（配列番号２３）
ＮＥＢオリゴ３１６−２３３番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＧＡＴＣＡＴＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡ
（配列番号２４）
ＮＥＢオリゴ３１６−２３４番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＴＴＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＧＣＧＣＧＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣＧ
（配列番号２５）
ＮＥＢオリゴ３１６−２３７番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＡＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡ
（配列番号２６）
ＮＥＢオリゴ３１６−２３８番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＴＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧ
（配列番号２７）
ＮＥＢオリゴ３１６−２３９番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＣＡＧＧＡＴＡＡＣＣＣＧＡＡＡＡＡＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＧＡＴ
（配列番号２８）
ＮＥＢオリゴ３１６−２４０番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＡＴＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＣＧＧＧＣＴ
（配列番号２９）
ＮＥＢオリゴ３１６−２４７番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＡＣＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＡＧＣＣＴＧ
（配列番号３０）
ＮＥＢオリゴ３１６−２４８番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＴＴＡＡＴＡＡＴＣＡＣＧＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣＧＣＧＴＴＣＡＧＧＣＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡ
（配列番号３１）
ＮＥＢオリゴ３１６−２６５番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＴＡＡＣＧＴＧＡＴＴＡＴＴＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＴＴＧＴＧＡＣＣＣＡＴＧＣＧＴＧＣＧＡＴＧ
（配列番号３２）
ＮＥＢオリゴ３１６−２６６番（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）：
ＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＣＡＣＧＣＡＴＧＧＧ
（配列番号３３）
集合反応は、集合工程及び増幅工程という２つの部分からなる。集合工程については、標準的な反応物は５０μＬであり、各オリゴ７０ｎＭ、１００μＭｄＮＴＰ、０．５ｍＭＮＡＤ＋、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、２ｍＭＭｇＣｌ２、及び５０ｍＭＮａＣｌを含有した。対照反応物には、酵素は添加されなかった。第一の実験反応物は、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４ｐｄｇ、及び２０単位のＥｎｄｏＩＶも含有した。反応物の第二のセットは、第一の反応物中で使用される酵素及び、１：１のベータタンパク質：ヌクレオチドモル比で添加されるラムダベータタンパク質（Ｋｍｉｅｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１２６３６−１２６３９（１９８１）、Ｒｙｂａｌｃｈｅｎｋｏ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１７０５６−１７０６０（２００４））を含有した。第三の反応物セットは、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４ｐｄｇ、２０単位のＥｎｄｏＩＶ、０．３ｍＭ  ＡＴＰ、及び３：１のモル比のヌクレオチド：ＲｅｃＡを含有した。ＲｅｃＡは、イー・コリ由来であった（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２４９Ｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。第四の反応物セットは、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４ｐｄｇ、２０単位のＥｎｄｏＩＶ、０．３ｍＭＡＴＰ、３：１のモル比のヌクレオチド：ＲｅｃＡ、及び１：１のモル比のベータタンパク質：ヌクレオチドを含有した。各反応物中のグリセロール含有量を調節した。反応混合物を、室温で３０分間温置した。
【０１８２】
室温で温置した後、２００μＭｄＮＴＰ、５００ｎＭのオリゴヌクレオチド３１６−２１９及び３１６−２６６、６ｍＭＭｇＳＯ４、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ１単位、及び１００μＬの最終容積にするための１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液を使用して、集合反応物５μＬを増幅した。反応物を混合し、ＭｙＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中に配置し、次の温熱サイクラータッチダウンプログラム、すなわち９４℃で２分間（１周期）、９４℃で３０秒間、７２℃ないし６２℃（１周期当たり１℃低下）で３０秒間、７２℃で４５秒間（１０周期）、９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で４５秒間（２０周期）、７２℃で５分間（１周期）、及び４℃で保持を使用した。各反応を二つ組で実施した。１０×試料緩衝液１１μＬを各試料へ添加し、電気泳動のための１％アガロースゲルへ、２５μＬを添加した。
【０１８３】
結果を図１５に示す。集合反応物が修復タンパク質の添加を含有しない場合には、増幅工程後に増幅産物は検出されなかった。しかしながら、修復タンパク質が集合反応物中に添加された場合には、増幅工程由来の正確な６２０ｂｐの単位複製配列を含有した。ラムダベータタンパク質及び／又はイー・コリＲｅｃＡを含めることによって、単位複製配列収量はさらに増大した。ＤＮＡテンプレートが断片から構成されるシステムにおいて、ＤＮＡ修復タンパク質を含めることによって、単位複製配列を生じる能力を促進することが結論付けられた。さらに、前記ＤＮＡ修復タンパク質の幾らかが、ＤＮＡ組換えに関与することが知られている場合には、この効果は増大される。
【実施例１６】
【０１８４】
イー・コリへの損傷を受けたプラスミドＤＮＡによる増大した形質転換効率性
プラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０９１３７）を１％アガロースゲルへ適用し、臭化エチジウムの存在下で、プラスミドがゲル中へ移動するまで電気泳動を行った。ゲル中のＤＮＡを２５４ｎｍの紫外線光へ６０秒間供した。紫外線曝露の間、ｐＵＣ１９プラスミドを含有するゲルプラグを切り出した。Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ゲルプラグからプラスミドを抽出した。それぞれ０．５ｍＭ及び１００μＭまでＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ製品＃Ｎ−７００４，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びｄＮＴＰ（ＮＥＢ＃Ｎ０４４７Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）が添加された１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ＃Ｂ９００４Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中の、５０単位のイー・コリＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢＭ０２０５Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４  ｐｄｇ及び２０単位のＥｎｄｏＩＶで、２５μＬの最終容積中の紫外線照射されたＤＮＡ又は照射されていないＤＮＡ３０ｎｇを処理した。室温で１５分間、反応物を温置した後、ＤＮＡを使用してイー・コリＤＨ−５アルファ（ＮＥＢ＃Ｃ２９９１Ｈ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を形質転換した。対照として、紫外線照射されたＤＮＡ及び照射されていないＤＮＡを両者とも、添加された酵素のない状態で上述のとおり処理した。修復酵素で処理され又は処理されなかった紫外線照射されたプラスミドＤＮＡ及び照射されていないプラスミドＤＮＡにより、ＤＨ５アルファ細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡの存在下で、イー・コリに熱ショックを与えることによって、形質転換を実施した。イー・コリ及びプラスミド５０μＬを氷上で３０分間温置した後、４２℃で３０秒間温置した。次に、形質転換反応物を氷上で２分間放置した後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上に細胞を播種した。各形質転換物の異なる希釈を有するＬＢアガープレートを３７℃インキュベータ中に一晩放置し、プラスミドの形質転換効率性を決定した。
【０１８５】
紫外線照射に供され修復されていなかったプラスミドｐＵＣ１９は、修復酵素混合物で処理された損傷を受けていないｐＵＣ１９プラスミドと比較して、形質転換効率性が有意に低下した（図１６参照）。
【実施例１７】
【０１８６】
ＰＣＲ、クローニング又は固定に必要なその後の連結のためのＤＮＡの同時修復及び平滑末端化
ＤＮＡライブラリは、環境、組織、又は細胞培養物から共通して作製される（Ｂｒａｄｙ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７０（１１）：６８６５−６８７０（２００４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｂｏｋｅｎ，ＮＪ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５：“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”（２００４）、Ｃｏｕｔｏｉｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（６９（１）：４９−５５（２００３）、米国特許第６，４４４，４２６号）。これらのライブラリは、超音波処理、酵素処理又は噴霧によって望ましい源からＤＮＡを剪断し、ＤＮＡ末端を調製し、混合物をオリゴヌクレオチド又はプラスミドＤＮＡと連結することによって、定型的な操作で作製される（Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ａ．Ｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１（２０）：６８２０−６８３２（２００１））。オリゴヌクレオチドへの連結によって、連結されたオリゴと相補的なＤＮＡ配列を含有するアレイ上で、その後のＰＣＲ又は固定を行うことが可能である。プラスミドへの連結によって、異種性の宿主中での伝播が可能となる。最近ライブラリが使用されているのは、染色質の免疫沈降においてである（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２（２４）：８６０３−８６０８（２００５）、Ｒｅｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２４５−２５６（２００２）、及びＯｄｏｍ，Ｄ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１３７８−１３８１（２００４））。平滑末端の連結のためのＤＮＡ末端を調製することの一環として、研究者は、しばしば、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼを使用する。しかしながら、本実施例では、精製、調整及び保存の間にＤＮＡが獲得し得る損傷を修復することが可能であるのみならず、平滑末端も作製することが可能な酵素混合物が提供される。本酵素混合物は、リガーゼ及び校正ポリメラーゼ及び酵素活性を可能にするために必要な全ての補助因子を含む。好ましくは、混合物は、リガーゼ、校正ポリメラーゼ、脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ、ＵＤＧ、ＦＰＧ、及びＴ４ｐｄｇからなる。
【０１８７】
一例として、染色質免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、既に記載されているとおり、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５又はＥ２Ｆ６に対する抗体を使用して、ＨｅＬａ細胞ＤＮＡにおいて実施される（Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ａ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１（２０）：６８２０−６８３２（２００１））。ＣｈＩＰで濃縮されたＤＮＡのクローニングは、既に記載されているとおりである（Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ａ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１（２０）：６８２０−６８３２（２００１）、ｈｔｔｐ：／／ｍｃａｒｄｌｅ．ｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｆａｒｎｈａｍ）。ＤＮＡを平滑末端化するためのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ単独の使用は、少なくともリガーゼと校正ポリメラーゼとの組み合わせを含有する酵素混合物によって置換される。例えば、０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋及び１００μＭｄＮＴＰの補充された１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液中で、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリポリメラーゼＩ、２０単位のイー・コリエンドヌクレアーゼＩＶ、５単位のＴ４ＰＤＧとともに、室温で１５分間、ＤＮＡを温置する。連結工程の前に、平滑末端化され及び修復されたＤＮＡを７５℃で２０分間温置することによって、イー・コリポリメラーゼＩを不活性化することが可能である。
【０１８８】
校正ポリメラーゼと少なくとも１つのリガーゼとの混合物は、プライマー若しくはプラスミドの何れかへのその後の連結のために、ＤＮＡ末端を平滑末端化することが可能である。
【実施例１８】
【０１８９】
ＤＮＡ断片由来の増大した単位複製配列収量。増幅、ＤＮＡ配列決定、マイクロアレイ分析及びハイブリダイゼーション分析等の下流工程のための、断片化されたＤＮＡ由来のより大きなＤＮＡ片の生成
５ないし１０００μＬの最終容積中の標準反応緩衝液及び必要な全ての補助因子中のイー・コリＲｅｃＡ（ＮＥＢ＃Ｍ０２４９Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、Ｗｅｓｔ，Ｓ．Ｃ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，  ６０３−６４０（１９９２））及び／又はラムダベータタンパク質（Ｒｙｂａｌｃｈｅｎｋｏ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（４９）：１７０５６−１７０６０（２００４）、Ｋｍｅｉｃ，Ｅ．，＆  Ｈｏｌｌｏｍａｎ，Ｗ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（２４）：１２６３６−１２６３９（１９８１））等の組換え／ＤＮＡアニーリング能の高いタンパク質とともに、０．１ないし１０００ｎｇの断片化されたＤＮＡを温置する。標準的な反応緩衝液の一例は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、２ｍＭＭｇＣｌ２、及び５０ｍＭＮａＣｌである。ＲｅｃＡを使用する場合には、１ｍＭ  ＡＴＰが標準的な反応に含まれる。ＲｅｃＡ及び／又はベータタンパク質との温置と同時に又は温置の後に、少なくともＤＮＡリガーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性及び必要な全ての補助因子、すなわちＡＴＰ、ＮＡＤ＋及びｄＮＴＰからなる修復混合物とも、ＤＮＡを接触させる。修復混合物は、４００単位のＴａｑＤＮＡリガーゼ及び０．１単位のイー・コリＰｏｌＩを含有し、さらに、５単位のＴ４ｐｄｇ、２０単位のＥｎｄｏＩＶ、０．５単位のイー・コリＵＤＧ、２．５単位／μＬのＥｎｄｏＶＩＩＩ及び／又は０．１単位のＦｐｇが添加される。修復タンパク質との温置の前に、ＤＮＡ断片は熱変性され得、温度は３９℃未満まで低下され得る。例えば、反応緩衝液中のＤＮＡを、９８℃に５分間加熱した後、３９℃未満に冷却し得る。標準的な反応容積は、５ないし１０００μＬであり、温置時間は、４ないし３７℃で１ないし６０分である。典型的には、０．５：１ないし５：１のヌクレオチド：タンパク質モル比で、ＲｅｃＡ又はベータタンパク質を使用する。
【０１９０】
上述の方法に対する改変には、ＲｅｃＡ及び／又はベータタンパク質を耐熱性の等価物と置換することが含まれる。これらのタンパク質の幾つかの例は、ｔｔＲｅｃＡ（Ｋａｔｏ  Ｒ，＆  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ  Ｓ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９（３）：５９２−６０１（１９９９））、Ｔａｑ  ＲｅｃＡ、Ｔｍａ  ＲｅｃＡ、及びＡｐｙ  ＲｅｃＡ（Ｗｅｔｍｕｒ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９（４１）：２５９２８−３５（１９９４））である。耐熱性タンパク質の使用は、耐熱性ＲｅｃＡ又はベータ様タンパク質が、変性工程中にＤＮＡと混合されることが可能であることを意味する。タンパク質活性に必要な全ての補助因子も含まれる。さらに、上記修復酵素は、変性の前又は後に添加される。耐熱性組換えタンパク質（ＲｅｃＡ又はベータ様タンパク質）に関して、前記タンパク質を反応混合物へ４５ないし７５℃で１ないし６０分間添加して、非耐熱性修復タンパク質の添加前に３９℃未満の温度で最適な活性にすることが可能であることに留意されたい。
【０１９１】
次に、修復されたＤＮＡは、その後の工程、例えばＰＣＲにおいて使用されることが可能である。例えば、検査系として、超音波を使用してヒトゲノムＤＮＡを断片化し、大きさを分画して、約２００ｂｐにクラスター化される平均的な断片の大きさを付与する。大きさで分画された材料５００ｎｇを上述のとおり処理する。損傷を受けていないヒトゲノムＤＮＡから１、２及び４ｋｂの単位複製配列を確実に発生させるプライマーを使用するＰＣＲ反応において、この修復された材料５ないし１００ｎｇの滴定を使用する。プライマーセットの例は、
ＤＮＭＴ−Ｒ：
ＧＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡＴＡＣＴ（配列番号３４）、
ＤＮＭＴ−１Ｆｂ：
ｃｃｔｃａｔｔｔｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｔａｔｃｔ（配列番号３５）、
ＤＮＭＴ−２Ｆｃ：
ｃｃｔｇａａａｃａａｇｇｔｔｇｔｇｇｃａｔａｇｃ（配列番号３６）、及び
ＤＮＭＴ−４Ｆｂ：
ｇａｇｔｇａｇｔｔｇａａａｇｔｇｃｔｃｃａｔａｃａ（配列番号３７）
である。
【０１９２】
断片化されたＤＮＡを用いて、同じテンプレートの滴定を実施する。修復されていないＤＮＡ及び修復されたＤＮＡを比較すると、修復されたテンプレートは、紫外線光及び臭化エチジウムで可視化されるアガロースゲル上で可視的単位複製配列をテンプレートＤＮＡの少なくとも２倍低い量で生じさせた。
【０１９３】
少なくともリガーゼ活性及びポリメラーゼ活性とともにＲｅｃＡ及び／又はベータタンパク質様活性を使用することによって、修復されていないＤＮＡと比べて、より低いテンプレート量で、ＰＣＲ単位複製配列が検出される。
【実施例１９】
【０１９４】
ＤＮＡ損傷の修復後の保存されたアナグマ組織試料からのＤＮＡの増幅
現代の材料とは異なり、古代の骨から抽出されるＤＮＡは、様々な損傷の種類を示す。損傷の最も汎用種類は、一本鎖の破損によって生じる断片化であり、これは、照射及び活性酸素種等の非酵素的攻撃に加えて、抽出されたＤＮＡの平均分子長を低下させる（Ｈｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（７）：１３０４−７（１９９６））。古代のＤＮＡ（ａＤＮＡ）の損傷を修復することは、抽出されたＤＮＡの有用性を向上させるのに重要である。
【０１９５】
Ｐａａｂｏ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６（６）：１９３９−４３（１９８９）に記載されているとおり、古代のＤＮＡを抽出した。事前修復を行い又は行わずに、プライマーＣＢＦ１（ＣＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＴＡＣ）（配列番号３８）及びＣＢＲ１（ＧＧＡＧＣＧＡＧＡＧＧＴＡＣＡＣＧＴ）（配列番号３９）を使用して、３３０ｂｐのアナグマＤＮＡ（約４４，０００年経たもの）の増幅を実施した。ＤＮＡ修復混合物は、２００単位／μＬのＴａｑＤＮＡリガーゼ、０．１単位／μＬのイー・コリＰｏｌＩ、１単位／μＬのＴ４  ｐｄｇ、１５単位／μＬのＥｎｄｏＩＶ、０．５単位／μＬのイー・コリＵＤＧ、２．５単位／μＬのＥｎｄｏＶＩＩＩ及び０．１単位／μＬのＦｐｇを含有し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０％グリセロール中で保存した。２μＬのａＤＮＡ、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ緩衝液、１００μＭｄＮＴＰ、及び０．５ｍＭＮＡＤ＋を各々含有する４本のサーモサイクラーチューブのうちの２本へ、修復酵素混合物１μＬを添加した。全てをＨ２Ｏで４５μＬの最終容積にした。反応溶液を室温で１５分間温置した後、プライマー（最終濃度０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（最終１００μＭ）及び１単位のＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼを各々へ添加した。９８℃で３０秒間を１周期、９８℃で１０秒間、５８℃で２０秒間及び７２℃で２０秒間を３０周期、７２℃で５分間を１周期、次いで４℃で保持というプログラムを実行するＭｃＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中へ溶液を配置した。修復されたＰＣＲ増幅されたＤＮＡ及び対照のＰＣＲ増幅されたＤＮＡ（修復なし）を、入れ子状態のプライマーを使用する第二のＰＣＲ増幅において直ちに使用した。入れ子状態のプライマーとの増幅反応は、１×Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（カタログ番号Ｍ０２７０Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、先行工程の増幅物２μＬ、及び０．２μＭの終濃度のプライマーＣＢ  Ｆ１（ＣＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＴＡＣ）（配列番号４０）及びＣＢ  Ｆ３（ＧＣＣＣＣＡＴＧＣＡＴＡＴＡＡＧＣＡＴＧ）（配列番号４１）を使用した。反応容積全体は５０μＬであった。１％アガロースゲルへ各反応物５μＬを適用することによって反応物を分析し、調製し、電気泳動し及び上述のとおり可視化した。
【０１９６】
プライマー５’−ＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＡＡＡ−３’（配列番号４３）及び５’−ＡＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＧＧ−３’（配列番号４４）を使用するＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により、アナグマ骨試料中のミトコンドリアＤＮＡの量を概算した。
【０１９７】
増幅されたＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定法において即時使用し、又はＤＮＡ精製及び濃縮へ供した。精製後、ＤＮＡをＤＮＡ配列決定へ供する（実施例１２参照）。
【０１９８】
入れ子状態のＰＣＲにおいて、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼを使用するアナグマＤＮＡからの増幅は、１試料（ＣＢ３Ａ）中で望ましい単位複製配列の大きさの検出可能な産物を生じた。修復混合物による処理は、試料ＣＢ３Ｂから別の単位複製配列を生じた。処理された及び処理されていないアナグマＤＮＡ（ＣＢ３Ｂ試料）からの単位複製配列の配列分析は、Ｈｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（７）：１３０４−７（１９９６）に記載されているＤＮＡ修飾と関連したＰＣＲ増幅誤差を除去するために、修復混合物による処理が有意に役立ったかどうかを明らかにする。
【０１９９】
修復酵素混合物によるアナグマＤＮＡテンプレートの処理によって、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼは、望ましい単位複製配列をより効果的に生じ、ＰＣＲ増幅誤差を除去することが可能となった（図１７）。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１Ａ】図１Ａないし１Ｄは、指定された酵素との事前温置後の、熱損傷を受けたラムダＤＮＡ由来の増大した単位複製配列収量を示す。  図１Ａは、異なる程度まで熱により損傷を受けたＤＮＡテンプレート、及び０秒間、３０秒間、６０秒間、９０秒間、１２０秒間又は１８０秒間の９９℃での熱処理による先行する損傷後に、熱処理されたラムダＤＮＡ５ｎｇ、２ｎｇ及び１ｎｇが増幅された、ラムダＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅に及ぼす本損傷の効果を示す。損傷を受けたＤＮＡは、増幅前に酵素処理へ供されなかった。増幅の量は、電気泳動後に決定され、１２０秒間の熱処理によって実質的に低下することが発見された。ゲル上の第一レーンは、２ログラダーのサイズ標準物質（ＮＥＢ＃Ｎ３２００、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇを含有する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ラムダＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅の際に、Ｔａｑリガーゼ、イー・コリＥｎｄｏＩＶ及びイー・コリＰｏｌＩを使用する、熱損傷を受けたラムダＤＮＡ由来の増大した単位複製配列収量を示す。図１Ａに記載のとおりＤＮＡを熱損傷したが、損傷を受けたＤＮＡを増幅前に酵素処理へ供した。Ｔａｑリガーゼ、イー・コリＥｎｄｏＩＶ及びイー・コリＰｏｌＩによる１０分間の前処理反応後の増幅の結果を示す。単位複製配列収量は、完全に増大したが、特に１２０秒間及び１８０秒間熱損傷を受けたＤＮＡで顕著であった。ゲル上の第一及び最後のレーンは、２ログラダーのサイズ標準物質（ＮＥＢ＃Ｎ３２００、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇを含有する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｔａｑリガーゼ、ＴｔｈＥｎｄｏＩＶ及びイー・コリＰｏｌＩを使用する、熱損傷を受けたラムダＤＮＡ由来の増大した単位複製配列収量を示す。増幅は、図１Ｂに従って実施されたが、増幅前の酵素処理は、イー・コリＥｎｄｏＩＶの替わりにサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＥｎｄｏＩＶを含有した。サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）リガーゼ、ＴｔｈＥｎｄｏＩＶ及びイー・コリＰｏｌＩによる１０分間の前処理反応後の増幅の結果を示す。単位複製配列収量は、完全に増大したが、特に１２０秒間及び１８０秒間熱損傷を受けたＤＮＡで顕著であった。第一レーンのみが、分子量マーカーラダーを含有する。
【図１Ｄ】図１Ｄは、イー・コリリガーゼ、イー・コリＥｎｄｏＩＶ及びイー・コリＤＮＡｐｏｌＩを使用する、熱損傷を受けたラムダＤＮＡ由来の増大した単位複製配列収量を示す。増幅は、図１Ｂに従って実施されたが、増幅前の酵素処理は、Ｔａｑリガーゼの替わりにイー・コリリガーゼを含有した。９９℃へ１８０秒間供されるラムダＤＮＡをテンプレートとして使用した。使用されるテンプレートＤＮＡの量を各レーンの上に示す。５ｋｂの単位複製配列の収量は、テンプレート量の各々に関して、酵素前処理によって増大する。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、単位複製配列収量に及ぼすテンプレートＤＮＡのクエン酸緩衝液（ｐＨ５）の処理の効果を示す。図２Ａは、ラムダＤＮＡがクエン酸緩衝液（ｐＨ５）中で７０℃へ０、２０、４０、８０、１２０、及び１６０分間加熱されたラムダＤＮＡの５ｋｂセグメントの増幅の結果を示す。クエン酸塩処理された各試料５０ｎｇ、１０ｎｇ及び５ｎｇを増幅し、得られた産物をゲル上で可視化し、増幅の程度を決定した。ＤＮＡは、増幅前に、選択された酵素で処理されなかった。右の最後のレーンは、２ログラダー１μｇを含有する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、何れのポリメラーゼが酵素混合物中で使用されたかに関わらず、ラムダＤＮＡの５ｋｂ単位複製配列の収量が増大することを示す。増幅前に、クエン酸塩により１２０分間損傷を受けたラムダＤＮＡを多様な酵素で処理した。レーン１：１μｇの２ログラダー（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。レーン２：前処理なし。レーン３：Ｔａｑリガーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及びイー・コリＥｎｄｏＩＶによる前処理。レーン４：Ｔａｑリガーゼ、イー・コリＰｏｌＩ、及びイー・コリＥｎｄｏＩＶによる前処理。レーン５：Ｔａｑリガーゼ、Ｔａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ混合物、及びイー・コリＥｎｄｏＩＶによる前処理。
【図３】図３は、オキアミのエタノール保存された試料から抽出され、多様なポリメラーゼのうちの１つ、リガーゼ及び増幅収量を増大させるＡＰエンドヌクレアーゼを含有する酵素混合物で前処理されたオキアミゲノムの２００ｂｐセグメントの増幅の結果を示す。レーン１：酵素によるオキアミＤＮＡの前処理なし。レーン２：Ｔａｑリガーゼ、イー・コリＥｎｄｏＩＶ、及びＴａｑポリメラーゼによるオキアミＤＮＡの前処理。レーン３：Ｔａｑリガーゼ、イー・コリＥｎｄｏＩＶ、及びＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼによるオキアミＤＮＡの前処理。レーン４：Ｔａｑリガーゼ、イー・コリＥｎｄｏＩＶ、及び５０：１のＴａｑ：Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼによるオキアミＤＮＡの前処理。
【図４】図４は、熱損傷を受けたＤＮＡ由来の１０ｋｂの単位複製配列の収量の増大を示す。１８０秒間熱損傷を受けたＤＮＡを、酵素混合物で前処理した後に増幅した。レーン１：２ログラダーのサイズ標準物質（ＮＥＢ＃Ｎ３２００、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇ。レーン２：Ｔａｑリガーゼ、イー・コリＥｎｄｏＩＶ、及びイー・コリＰｏｌＩによる前処理。レーン３：Ｔａｑリガーゼ及びイー・コリＥｎｄｏＩＶによる前処理。レーン４：Ｔａｑリガーゼによる前処理。レーン５：対照−未処理のＤＮＡ。
【図５】図５は、リガーゼによる前処理が、環境中のＤＮＡ（土壌試料抽出物）由来の単位複製配列収量を増大させることを示す。レーン１：２ログラダーのサイズ標準物質（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。レーン１：酵素による前処理なし。レーン２：Ｔ４リガーゼによる前処理。レーン３：酵素による前処理なし。レーン４：Ｔａｑリガーゼによる前処理。
【図６Ａ−１】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−２】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−３】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−４】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−５】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−６】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−７】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−８】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ａ−９】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ｂ−１】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図６Ｂ−２】イー・コリＤＮＡリガーゼ（Ａ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ）を使用する、ＮＣＢＩでのＢｌａｓｔ  Ｐ検索。
【図７】Ｔｔｈ  ＥｎｄｏＩＶのＤＮＡ配列（配列番号１１）。
【図８Ａ】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、ラムダＤＮＡを使用する単位複製配列収量に及ぼす紫外線光の効果を示す。図８Ａ：ラムダＤＮＡは、最長５０秒間紫外線照射に供され、生成された２ｋｂの単位複製配列の収量のわずかな低下が示される。
【図８Ｂ】図８Ｂ：ラムダＤＮＡは、最長５０秒間紫外線照射に供され、５ｋｂの単位複製配列の収量の低下が示される。
【図８Ｃ】図８Ｃ：紫外線照射後の５ｋｂの単位複製配列の収量に及ぼす、ラムダＤＮＡへ添加された多様な反応混合物の効果が示される。レーン２ないし７は、反応混合物の不在下での対照である。レーン８ないし１３は、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ＋Ｔ４ｐｄｇ１０単位を添加することの増大した有利な効果を示す。レーン１４ないし１９は、リガーゼ、ポリメラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼ＋Ｔ４  ｐｄｇ８０単位を添加することに関する増大した有利な効果を示す。レーン１及び２０：２ログラダーのサイズ標準物質（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。
【図９Ａ】図９Ａ及び９Ｂは、Ｔ７ＥｎｄｏＩへのリガーゼの添加が、産物の分解されていないＥｎｄｏＩ：ＤＮＡ比の有用な範囲を拡大することを示す。各レーンに対して示されるとおり、多様な量で、Ｔａｑリガーゼ及びＴ７ＥｎｄｏＩをスーパーコイルのＤＮＡへ添加した。図９Ａは、Ｔａｑリガーゼが添加されていないが、Ｔ７ＥｎｄｏＩの増大する量が使用されている対照である。スーパーコイルのＤＮＡは、Ｔ７ＥｎｄｏＩの１２．５ないし２５単位で、多様なサイズの断片へと主に切断される。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｔ７ＥｎｄｏＩの２００単位においてさえ、リガーゼの不在下では存在しない直鎖ＤＮＡに相当する明確なバンドが存在するように、Ｔａｑリガーゼの１００単位の添加が、Ｔ７ＥｎｄｏＩの存在下で非特異的切断由来のＤＮＡをどのように保護するかを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び１０Ｂは、酸化的に損傷を受けたＤＮＡ由来の単位複製配列収量又は損傷を受けていないテンプレートに及ぼす修復酵素処理の効果を示す。  図１０Ａは、損傷を受けていないテンプレートであるｐＷＢ４０７への修復酵素の添加が、単位複製配列収量に何ら効果がないことを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、メチレンブルーの存在下ですでに温置された、損傷を受けたテンプレートであるプラスミドｐＷＢ４０７へのＦｐｇの添加が、収量に及ぼす一貫性のない効果を付与することを示す。Ｆｐｇの存在下又は不在下でのＴａｑリガーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ、及びイー・コリＥｎｄｏＩＶの添加は、単位複製配列収量を一貫して増大させる。
【図１１】図１１は、修復酵素による処理の後の損傷を受けたＤＮＡからの増大したＰＣＲ反応忠実度を示す。ＰＣＲの前の損傷を受けていないテンプレートであるプラスミドｐＷＢ４０７の修復酵素処理は、忠実度に有意な効果がない。メチレンブルーとともに温置された損傷を受けたテンプレートであるプラスミドｐＷＢ４０７の、Ｆｐｇ単独での処理又はＴａｑリガーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ及びイー・コリエンドヌクレアーゼにもよる処理は、ＰＣＲの忠実度を増大させる。忠実度の測定結果は、以下に論議されるように、ｌａｃＺを含有する単位複製配列をクローニングした後の白色コロニー数対青色コロニー数である。白色コロニーの割合が高ければ高いほど、エラー率は大きくなる。
【図１２】図１２は、損傷を受けたＤＮＡを処理するための、又は忠実度若しくは収量のうちの少なくとも１つを増大させるための流れ図を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ及び１３Ｂは、室温で１５分間又は４℃で一晩、複数の酵素の修復混合物とともに温置された、３０秒間の紫外線照射で損傷を受けたＤＮＡの５ｋｂ断片に関して、単位複製配列の収量がどのように増大するかを示す。図１３Ａ：室温での温置：レーン１：２ログラダーＤＮＡ分子量標準物質。レーン２及び３：室温で１５分間、複数の酵素の修復混合物なしで温置された２つの反応物。レーン４及び５：修復混合物とともに室温で１５分間温置された反応物は、期待される５ｋｂの単位複製配列を有する。
【図１３Ｂ】図１３Ｂ：４℃での温置  レーン１：２ログラダーＤＮＡ分子量標準物質  レーン２及び３：複数の酵素の修復混合物なしで、４℃で一晩温置された２つの反応物  レーン４及び５：修復混合物とともに４℃で一晩温置された反応物は、期待される５ｋｂの単位複製配列を有する。
【図１４】図１４は、修復酵素混合物による室温で１５分間の処理及び古細菌ポリメラーゼを使用するＰＣＲ増幅後のウラシル含有プラスミド由来の増大した単位複製配列収量を示す。レーン１及び２は、ｖｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを使用するｐＮＥＢ０．９２ＵのＰＣＲ増幅産物を示す。９２０ｂｐに弱く見えるバンドが存在する。レーン３及び４は、修復酵素混合物で処理されたｐＮＥＢ０．９２Ｕ由来のＰＣＲ増幅産物を示す。
【図１５】図１５は、６２０塩基対の増幅されたＤＮＡに相当するバンドが同定されるアガロースゲルを示す。４８ヌクレオチド以下の２０個の重複する一本鎖オリゴヌクレオチドから、６２０ｂｐの単位複製配列を得た。レーン１：２ログＤＮＡ分子量標準物質（ＮＥＢ＃Ｎ３２００Ｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。レーン２：集合工程中に４００単位のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４ｐｄｇ及び２０単位のＥｎｄｏＩＶとともに温置された２０個のオリゴヌクレオチド。レーン３：集合工程中に４００単位のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４ｐｄｇ及び２０単位のＥｎｄｏＩＶ、及びラムダベータタンパク質とともに温置された２０個のオリゴヌクレオチド。レーン４：集合工程中に４００単位のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４ｐｄｇ、２０単位のＥｎｄｏＩＶ及びイー・コリＲｅｃＡとともに温置された２０個のオリゴヌクレオチド。レーン５：集合工程中に４００単位のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、０．１単位のイー・コリＰｏｌＩ、５単位のＴ４ｐｄｇ、２０単位のＥｎｄｏＩＶ、ラムダベータタンパク質及びＲｅｃＡとともに温置された２０個のオリゴヌクレオチド。レーン６：対照、集合工程中に修復酵素が添加されない２０個のオリゴヌクレオチド。
【図１６】図１６は、細胞を形質転換するために、選択マーカーを含有するＤＮＡが使用されるときに得られるコロニーの数によって決定される、照射されていないＤＮＡ（−）及び照射されたＤＮＡ（＋）に及ぼすＤＮＡ修復処理の効果を示す。
【図１７】図１７は、異なる入れ子状態のプライマー対を使用する増幅反応２セット後の、古代アナグマのＤＮＡ由来の単位複製配列の改良された収量を示す。遺伝子マップは、プライマー対Ｆ１−Ｒ１、Ｆ１−Ｒ２及びＦ１−Ｒ４の位置を示す。ゲルの上には、１セットの数が提供され（８８、７９、１０、１１、１８６８及び１３１４）、各試料中のミトコンドリアＤＮＡの概算量を表す。レーン３Ａ及び３Ｂは、最多のＤＮＡを含有する。＋／−は、修復混合物が、Ｆ１−Ｒ１を使用する第一増幅前に使用されたかどうかを示す。レーン３Ｂにおいて、修復のない場合には存在しない、修復されたアナグマのＤＮＡに相当する鋭いバンドが観察された。
【図１８−１】図１８は、プラスミドｐＮＥＢ０．９２Ｕに関するＤＮＡ配列（配列番号４２）を示す。
【図１８−２】図１８は、プラスミドｐＮＥＢ０．９２Ｕに関するＤＮＡ配列（配列番号４２）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ａ−３】
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【図６Ａ−４】
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【図６Ａ−５】
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【図６Ａ−６】
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【図６Ａ−７】
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【図６Ａ−８】
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【図６Ａ−９】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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