(57)【要約】本発明は、任意でおそらく細胞の断片も含有しうる、死細胞と生細胞の混合物から生細胞を分離する方法に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
死細胞から生細胞を分離する方法であって、死細胞を吸着させ、生細胞を単離することができる被覆されたマトリクスに、生細胞と死細胞を含む混合物を接触することを特徴とする方法。
【請求項２】
マトリクスの材料が、反応容器の壁上で固形状態で又はディップスティックとして存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マトリクスの材料が、細胞分離の開始時に液体又は分散物の状態で存在し、分離後、反応容器の壁に固定される若しくは吸着される、又は沈殿した状態若しくは懸濁した状態で存在することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
マトリクスの材料が、ポリアニオン構造を形成できるポリマー、コポリマー又はターポリマーであることを特徴とする上記請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ポリアニオン構造を形成できるポリマー、コポリマー又はターポリマーが、ポリカルボキシレート又はカルボキシル化ポリマーであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリアニオン構造を形成できるポリマー、コポリマー又はターポリマーが、ビニルメチルエーテル、無水マレイン酸、スチレン、直鎖若しくは分枝鎖のアルケン又はアクリル酸及びその誘導体に基づいたカルボキシル化ポリマーであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アクリル酸誘導体が、アルカノール部分構造において１〜１２の、好ましくは１〜６炭素原子を持つ分枝鎖又は直鎖のＣ1〜Ｃ12のアルキルアクリレート又はメタクリレートを具現化することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コポリマーが、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）
【化１】
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であることを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
コポリマーポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）が、部分的なアルキルエステルとして、好ましくはＣ1〜Ｃ6のアルキルエステル、特に好ましくはメチルエステルとして存在することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
反応容器が、ペトリ皿、細胞培養用皿、多穴プレート、細胞培養用のビン又はブロックであることを特徴とする請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
生細胞を分離するためのポリアニオン構造を形成できるポリマー、コポリマー又はターポリマーの使用。
【請求項１２】
死細胞及び任意でさらにさらなる細胞の残骸及びポリカチオン構造を有するポリマー、コポリマー又はターポリマーを含む複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞に加えて任意で死細胞、及び細胞の残骸のようなそのほかの成分を含有しうる混合物から生細胞を分離する改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞生物学の多数の分野で、細胞集団の単離及び精製は長い間、主なテーマであった。従って、真核細胞のエレクトロポレーションの間に、たとえば、その後の分析方法の多くを複雑にするような有意な細胞傷害性の影響が生じる。エレクトロポレーションの後だけでなく、細胞傷害性の条件下で実行される細胞の処理の後にも、一般に、生細胞から死細胞を直接分離するニーズが存在する。
【０００３】
長年、そのような細胞分離の方法は、とりわけ、大きさ及び密度に依存する密度遠心分離法、又は、たとえば、細胞の表面電荷を利用する連続流式電気泳動法に基づいた最新技術で知られている。
【０００４】
特異抗体による生細胞の分離及び単離に加えて、たとえば、細胞膜を介してリガンド、たとえば、アネキシンＶに結合し、それによってリガンド自体をたとえば、固形キャリアとしての磁気粒子にカップリングさせることができるアポトーシス細胞及び壊死細胞の傾向を利用する手順が最新技術で知られている。
【０００５】
さらに、たとえば、異なった物質と共同して密度勾配を形成する多数の密度遠心分離が長年知られている。これらの方法で使用することができる市販の物質は、とりわけ、フィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）、塩化セシウム又はデキストランである。
【０００６】
これらの物質は、もちろん細胞の分離に使用することができるとはいえ、それらは、本発明に係る課題にそれらを不向きにしてしまうような種々の深刻な欠点を有する。これらの短所は部分的には、使用される勾配物質への細胞の感受性と同様に、さらに高い浸透圧負荷又はイオン性負荷に対する細胞の感受性による。
【０００７】
従って、これらの方法の深刻な短所の１つは、毒性でありうる又は細胞の生存率に少なくとも不利でありうる勾配物質にかなりの時間、細胞をさらすということである。これは特に、勾配溶液が生理的溶液を代表しない、たとえば、フィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）又はデキストランに基づく場合である。最新技術で知られるように、フィコール（登録商標）は、細胞にとって毒性であり、さらに、変異原性である。パーコール（登録商標）は同様に細胞に損傷を与える。勾配分離で使用される濃度では、デキストランは、細胞に適用される浸透圧負荷の結果として細胞の損傷の原因となりうる。
【０００８】
他方、利用可能な代替物及び上述の方法も相当な短所を有し、それらは、たとえば、複数の処理工程を必要とし、非常に煩雑で、自動化するのが難しい。
【発明の開示】
【０００９】
従って、本発明の課題は、最新技術で知られる方法の短所を少なくともある程度回避し、特に時間がかかり、作業集約的な遠心分離工程に頼らず、特に可能性として最高の収率で生細胞を濃縮できる又は単離できる、生細胞の単離方法を提供することである。さらなる課題は自動化しやすい方法を提供することである。
【００１０】
前に記載された課題は、死細胞のみを固定化する又は吸着することができる表面を有するマトリクスに分離されるべき細胞、生細胞及び死細胞の双方を接触させる本発明で提案された方法によって解決される。
【００１１】
驚くべきことに、生細胞が吸着されないのに対して、ポリアニオン構造を有するポリマー、特にカルボン酸又はそのほかの酸、たとえば、スルホン酸又はリン酸の官能基を有するアニオン系ポリマーに死細胞は固定化されることが見い出された。
【００１２】
ここで使用される細胞材料は、有利に、たとえば、付着性細胞及び／又は浮遊細胞のような細胞種である。特に好ましいのは、たとえば、免疫細胞のような付着性一次細胞又は浮遊細胞である。
【００１３】
本発明に係る課題を解決するために好適なマトリクスは、原則としてアニオン構造を形成するポリマーすべてであり、そのためには、カルボキシル化されたポリマー、コポリマー又はターポリマーが好ましい。たとえば、スチレン、ビニルメチルエーテル、直鎖又は分枝鎖のアルケン類に基づいたコポリマー、たとえば、１−オクタデセン又はイソプロピレンとマレイン酸又はアクリル酸を使用することができ、そのためには、カルボキシル官能を任意で異なった程度にエステル化することができる。好ましいポリマーとして引用されるのは、たとえば、以下のアクリル酸アルキル：アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ビニル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸オクチル、アクリル酸デシル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ミリスチル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸セチル、アクリル酸ステアリル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸デシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ミリスチル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸セチルであり、その中で、アクリル酸メチルが特に好ましい。
【００１４】
アクリル酸又はメタクリル酸の分枝鎖又は直鎖のＣ1〜Ｃ12のアルキルエステルが好ましい。
【００１５】
本発明の意味の範囲内でのＣ1〜Ｃ12のアルキルエステルは、本来のアルカノール部分のアルキル部分構造において１〜１２の炭素原子を有するアルキルエステルを意味する。
【００１６】
一般に、本発明の意味の範囲内では、特に述べられない限り、Ｃ1〜Ｃ6のアルキル基が好ましい。Ｃ1〜Ｃ6のアルキル−又は一般に、アルキル若しくはアルキル残基−は、一般に、任意で１〜数個の同一でも異なっていてもよいハロゲン原子、好ましくはフッ素で置換することができる１〜６の炭素原子を持つ分枝鎖又は直鎖の炭化水素残基を意味する。例として、以下の炭化水素残基：メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル(イソプロピル）、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル−１，１−ジメチルエチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピル及び１−エチル−２−メチルプロピルが引用される。
【００１７】
例として特に引用されるのは、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、及びアクリル酸２−メチルヘキシル、又はマレイン酸アルキル、たとえば、特にマレイン酸メチルである。
【００１８】
さらに、そのホモポリマーの形態で又はコポリマーの成分として、たとえば、ポリスチレンスルホン酸又はポリスチレンリン酸によって表される、たとえば、スルホン酸基又はリン酸基を有するポリアニオン構造を形成するほかのポリマーを使用することも可能である。
【００１９】
これらのポリマー又はコポリマーによっても、スルホン酸基又はリン酸基の一部を任意でエステル化することができる。
【００２０】
さらに、ポリスチレンに基づくポリマーすべてのフェニル部分構造を任意で置換することができる。従って、任意で置換されたフェニル基は、アルキル基（上記で定義されたような）、ハロアルキル残基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）、ニトロ、シアノ基、−ＯＲ（Ｒが水素原子又はアルキル残基である）、−ＮＲＲ’（Ｒ及びＲ’が互いに独立してそれぞれの場合で、水素原子又はアルキル残基である）、−ＣＯＯＲ（Ｒが水素原子又はアルキル残基である）或いは−ＣＯＮＲ’Ｒ”（Ｒ’及びＲ”が独立して水素原子又はアルキル残基から選択される）から選択される１、２又は３の置換基によって任意で、互いに独立して置換されるフェニル基を意味する。最終的に、指名されたポリマー又はコポリマーすべての混合物も使用することができる。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、ポリアニオン構造を形成できるコポリマーは、スチレンとマレイン酸に基づいてカルボキシル化されたポリマーに特に代表される。その結果、コポリマーは、５〜９５重量％の、好ましくは２５〜９５重量％の、特に好ましくは５０〜９５重量％のマレイン酸単位を含む。
【００２２】
本発明のさらに好ましい実施態様では、ポリアニオン構造を形成できるコポリマーは、メチルビニルエーテルとマレイン酸に基づいてカルボキシル化されたポリマーに特に代表される。
【００２３】
マレイン酸／ビニルエーテルコポリマーの場合、ビニルアルキルエーテル部分構造及びマレイン酸部分構造も、アルキル残基（上記で定義されたような）、ハロアルキル残基、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ基、−ＯＲ（Ｒが水素原子又はアルキル残基である）、−ＮＲＲ’（Ｒ及びＲ’が互いに独立して、水素原子又はアルキル残基である）、−ＣＯＯＲ（Ｒが水素原子又はアルキル残基である）或いは−ＣＯＮＲ’Ｒ”（Ｒ’及びＲ”が独立して水素原子又はアルキル残基から選択される）から選択される−それぞれのモノマーに関連して−１、２、３、又は４の置換基で、任意に、互いに独立して置換することができる。
【００２４】
さらに、コポリマー、たとえば、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）
【化１】
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におけるカルボキシル基は、全体として又は部分的に、好ましくはメチル基によって任意でエステル化することができる。
【００２５】
また、好ましく使用されるのは、
ＭＷ：３，２５０，０００のポリ（イソブチレン−ａｌｔ−マレイン酸）；
マレイン酸５０重量％のポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸；
マレイン酸２５重量％のポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸；
マレイン酸１４重量％のポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸；
マレイン酸７重量％のポリイソプレン−ｇｒａｆｔ−マレイン酸；
モル比１：１のポリ（マレイン酸−１−オクタデック−１−エン）；
ＭＷ：１，２５０，０００のポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）；
部分的にメチルエステルとしてのポリスチレン−ａｌｔ−マレイン酸；ポリ（アクリル酸−ｃｏ−アクリル酸メチル）；
ポリスチレンスルホン酸である。
【００２６】
本発明によれば、１．０ｘ１０3〜２．５ｘ１０6、好ましくは１．０ｘ１０4〜２．２ｘ１０6、特に好ましくは１．９ｘ１０6〜２．１ｘ１０6の間の範囲にある分子量を持つポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）が使用される。
【００２７】
最も特に好ましくは、ＭＷ＝１，９８０，０００の分子量を持つポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）［ＣＡＳ番号２５１５３−４０−６］が使用される。
【００２８】
本発明に従って使用されるアニオン系の又はカルボキシル化されたポリマー又はコポリマーの調製は、最新技術で周知である。これらのポリマーは多数の技術的応用ですでに使用されているので、大体の場合、それらは市販されている。
【００２９】
さらに所望のポリマー又はコポリマーは、最新技術で周知の方法、たとえば、保護されたカルボキシル基を任意で有するモノマーによるラジカル重合によって調製することができる。
【００３０】
ポリアニオン系の又はカルボキシル化されたポリマーは、多数の方法で、たとえば、液体状態で好適な反応容器の周壁に塗布することができ、或いは、それらは、生細胞又は死細胞の混合物における懸濁液の形態で、又はいわゆるディップスティックの形態で存在することができる。
【００３１】
従って、ポリマー融解物によるコーティングは所望の官能化された層をもたらすこともできる。反応容器が射出成形によって調製されることを条件として、射出形成前の射出形成を意図された塊に添加剤として１以上のポリマーを添加する可能性もある。射出形成に先立って射出金型のすべて又は一部をポリマーで被覆し、それによって反応容器の形成後、所望のコーティングを得るという可能性も等しく存在する。
【００３２】
さらに、ポリアニオン構造を形成するポリマーの膜を反応容器の内壁に取り付け、たとえば、いわゆる圧伸法によって所望の幾何学形状をもたらすという可能性がある。さらに好ましいのは、好適な溶媒に溶解するポリアニオン系ポリマーによるコーティングである。
【００３３】
さらに、少なくとも１つのポリマーをいわゆる前駆体の形状で最初に溶液に導入し、そこから、分離手順の経過中に、アニオン基又はカルボキシル基の所望の構造を有するポリマーを先ず形成するという可能性がある。
【００３４】
さらに、−当業者に既知の好適なポリマーの選択によって−最新技術で既知の「湿式化学法」（たとえば、硫酸／過酸化水素）によって表面の所望の官能化を達成する、又は、当初非官能化反応容器の調製の後の常圧プラズマ処理によって、それを達成するさらなる可能性がある。
【００３５】
さらなる実施態様では、ポリアニオン構造を形成できるポリマーを混合物（上記を参照）に添加するのであれば、容器表面のコーティング又は誘導体化を省略することができる。そのとき、死細胞の結合は粘着性マトリクスでは起きないが、液相で直接起きる。このことは、死細胞とカルボキシル化ポリマーとを含む複合体をもたらし、それは、液体の又は分散されたマトリクスに付着することができる。次いで、アニオン系の又はカルボキシル化したポリマー自体は、たとえば、沈殿工程で液相から分離することができ、その後、液相に位置する生細胞を単離することができ、又は死細胞を伴うポリマーをたとえば、反応容器の壁に吸着させる。
【００３６】
すべての実施態様では、死細胞は溶液に存在するマトリクス上又はポリマー上に固定化されたままとなる一方で、生細胞は液相に残る。
【００３７】
従って、本発明に係る、生細胞を分離する方法は、作業工程の数を有意に減らすだけでなく、毒性物質の使用に頼らず、細胞を高い浸透圧負荷又はイオン負荷に供さないという点で細胞の穏やかな処理を確保することも可能にする。作業工程の数のかなりの減少によって、本発明に係る方法は、特に、遠心分離工程及び／又はろ過工程のような分離工程を省略することができる、いわゆる一工程法に有利に軽減することができる。時間要素に加えて、コストの高い消耗品、たとえば、遠心分離及び／又はろ過のカラムを節約することができる。
【００３８】
さらに、本発明に係る方法は、その単純な操作性のおかげで容易に自動化されるという利点を有する。
【００３９】
たとえば、本発明に係る方法は、以下のような原理で実行することができる。
【００４０】
好適な溶媒、たとえば、有機溶媒又は水性溶媒又は水性溶媒の混合物中で、上述のポリマー溶液の１つと共に、好適な反応容器、たとえば一般に、細胞培養用皿（多穴プレート、ブロック又は細胞培養用フラスコを使用することができる）をインキュベートする。混合物の固化温度と沸点の間にあるいずれの温度でもインキュベートを行うことができる。
【００４１】
好適な有機溶媒は、一般的な溶媒すべてであり、たとえば、ジクロロメタン、クロロホルム又はテトラヒドロ炭化水素のようなハロゲン化炭化水素類、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、グリコール又はグリセロールのようなアルコール類、ジエチルエーテル、グリム又はジグリム、アニソール、ＴＨＦ又はジオキサンのようなエーテル類、アセトン、メチルエチルケトン又はシクロヘキサノンのようなケトン類、酢酸エチルのようなエステル類、ＤＭＦ又はＨＭＰＴのような酸アミド類、或いはＤＭＳＯのようなスルホキシド類である。
【００４２】
さらに、水性溶媒が好適であり、好ましくは、アルカリ、偽アルカリ又はアルカリ土類の元素の水溶液のような塩の溶液、しかしながら、特に、硫酸アンモニウム水溶液である。
【００４３】
採用されるそれぞれのポリマー及び任意で、被覆される材料によって使用することができる、種々のさらに好適な溶媒は最新技術で既知であり、それぞれの溶解性挙動によって最も様々な濃度にてポリマー又はコポリマーを使用することができる。従って、たとえば、カルボキシル化ポリマーとしてポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）を使用する場合、１Ｍの硫酸アンモニウム水溶液中の２ｍｇ／ｍＬのコポリマーの溶液を有益に使用することができる。
【００４４】
さらに、前述の溶媒の混合物も当然使用することができる。
【００４５】
前述のポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）溶液を使用する場合、インキュベートは室温（１０〜３０℃、好ましくは２０℃）にて５分間の時間にわたって行うことができる。採用される及び被覆される材料によって、各時間間隔にわたるいずれかの範囲及び時間間隔ごとのいずれかの範囲にて温度も選択することができる。
【００４６】
次いで、溶液を除き、任意に高い温度（３０〜２００℃、好ましくは４０〜１００℃、特に好ましくは４０〜６０℃）にて、又は有意に長い間、減圧してそれ相応に下げた温度、たとえば、５０℃にて１２時間にわたって、そのように被覆された細胞培養用皿を乾燥させる。例示によって本明細書で提示される濃度データ、温度及び時間間隔は、使用されるそれぞれのポリマー及び溶媒及び任意で被覆される材料の性質に依存することができ、それぞれの条件に適合させることができ、幅広い限定にわたって変化することができることが理解される。
【００４７】
細胞分離の実行において、たとえば、エレクトロポレーションで得た細胞培養物を、血清含有の培養培地と混合し、前述の方法に従って被覆された細胞培養用皿に移し、好適な温度にて、有利には室温にて十分に長い時間インキュベートする。その後、細胞上清を取り出す。
【００４８】
この部分工程に関して、報告される温度及び時間は、使用されたそれぞれのコーティング材料及び培養培地に行きわたるそれぞれの条件、使用された細胞濃度、ｐＨ値などに依存しうることも理解可能である。
【００４９】
次いで単離された細胞をさらに継代することができる。
【００５０】
好適な判定方法、たとえば、フローサイトメトリーによって、及び保持された細胞又は非保持細胞の顕微鏡観察によって細胞の分析を行うことができる。
【００５１】
たとえば、フローサイトメトリーでは、たとえば、ヨウ化プロピジウムによる染色によって生細胞の分画及び死細胞を判定することができる。
本発明出願の不可欠な部分を具現化する図を以下に示す。
【００５２】
従って、本発明の主題は、死細胞を吸着させ、生細胞を単離することができる被覆されたマトリクスに生細胞と死細胞を含む混合物を接触させることを含む、死細胞から生細胞を分離する方法である。
【００５３】
本発明のさらなる側面は、マトリクス材料が反応容器の壁で、又はディップスティックとして固形状態で存在するという事実にある。
【００５４】
本発明のさらなる側面は、マトリクス材料が細胞分離の開始時から液体形態又は分散形態で存在し、分離後、反応容器の壁に固定される又は吸着される、或いは沈殿形態又は浮遊形態で存在するという事実にある。
【００５５】
本発明のさらなる側面は、マトリクス材料がポリアニオン構造を形成できるポリマー又はコポリマー又はターポリマーであるという事実にある。
【００５６】
本発明のさらなる側面は、ポリアニオン構造を形成できるポリマー又はコポリマー又はターポリマーがポリカルボキシレート又はカルボキシル化ポリマーであるという事実にある。
【００５７】
本発明のさらなる側面は、ポリアニオン構造を形成できるポリマー又はコポリマー又はターポリマーが、ビニルメチルエーテル、無水マレイン酸、スチレン、直鎖若しくは分枝鎖のアルケン又はアクリル酸及びその誘導体に基づいたカルボキシル化ポリマーであるという事実にある。
【００５８】
本発明のさらなる側面は、アクリル酸誘導体が、アルカノール部分構造において１〜１２の炭素原子を持つ分枝鎖又は直鎖のＣ1〜Ｃ12のアルキルアクリレート又はメタクリレートによって具現化されるという事実にある。
【００５９】
本発明のさらなる側面は、分枝鎖又は直鎖のアルキルアクリレート又はメタクリレートが、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル及びアクリル酸２−エチルヘキシルであるという事実にある。
【００６０】
本発明のさらなる側面は、ポリアニオン構造を形成できるポリマー又はコポリマー又はターポリマーがリン酸基を有するという事実にある。
【００６１】
本発明のさらなる側面は、ポリアニオン構造を形成できるポリマー又はコポリマー又はターポリマーがスルホン酸基を有するという事実にある。
【００６２】
本発明のさらなる側面は、スルホン酸基を持つポリマーが、ポリスチレンスルホン酸又はポリスチレンスルホン酸を持つコポリマー／ターポリマーであるという事実にある。
【００６３】
本発明のさらなる側面は、ポリアニオン構造を形成できるコポリマー又はターポリマーが、ポリスチレン及び無水マレイン酸に基づいたカルボキシル化ポリマーであるという事実にある。
【００６４】
本発明のさらなる側面は、コポリマーが、５〜９５重量％のマレイン酸単位を含むという事実にある。
【００６５】
本発明のさらなる側面は、コポリマーが、２５〜９５重量％のマレイン酸単位を含むという事実にある。
【００６６】
本発明のさらなる側面は、コポリマーが、５０〜９５重量％のマレイン酸単位を含むという事実にある。
【００６７】
本発明のさらなる側面は、ポリアニオン構造を形成できるコポリマー又はターポリマーが、メチルビニルエーテル及びマレイン酸に基づいたカルボキシル化ポリマーであるという事実にある。
【００６８】
本発明のさらなる側面は、コポリマーが、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）であるという事実にある。
【化２】
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【００６９】
本発明のさらなる側面は、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）コポリマーが、１．０ｘ１０3〜２．５ｘ１０6の範囲の分子量を有するという事実にある。
【００７０】
本発明のさらなる側面は、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）コポリマーが、１．０ｘ１０4〜２．２ｘ１０6の範囲の分子量を有するという事実にある。
【００７１】
本発明のさらなる側面は、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）コポリマーが、１．９ｘ１０6〜２．１ｘ１０6の範囲の分子量を有するという事実にある。
【００７２】
本発明のさらなる側面は、許容限度の範囲内で、ポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）コポリマーが、１．９８０ｘ１０6の分子量を有するという事実にある。
【００７３】
本発明のさらなる側面は、コポリマーポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）が、部分的なアルキルエステルとして、好ましくはＣ1〜Ｃ6のアルキルエステル、特に好ましくはメチルエステルとして存在するという事実にある。
【００７４】
本発明のさらなる側面は、反応容器が、ペトリ皿、細胞培養用皿、多穴プレート、細胞培養用のフラスコ又はブロックによって具現化されるという事実にある。
【００７５】
さらに、本発明は、細胞分離用の１以上の前述のポリマーに関するものであり、そのために、好ましくは、ポリアニオン構造を形成できる少なくとも１つのポリマー又はコポリマー又はターポリマーが生細胞の分離に使用され、それは特に好ましくは、ビニルメチルエーテル、無水マレイン酸、スチレン、直鎖若しくは分枝鎖のアルケン又はアクリル酸若しくはその誘導体に基づいたポリカルボキシレート又はカルボキシル化ポリマーである。
【００７６】
本発明のさらなる実施態様によれば、それは、アクリル酸誘導体の使用に関するものであり、これは、アルカノール部分構造において１〜１２の、好ましくは１〜６炭素原子を持つ分枝鎖又は直鎖のＣ1〜Ｃ12のアルキルアクリレート又はメタクリレートを有利に具現化し、そのためには、分枝鎖又は直鎖のアルキルアクリレート又はメタクリレートは、特に好ましくは、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル及びアクリル酸２−エチルヘキシルである。
【００７７】
本発明のさらなる側面によれば、ポリアニオン構造を形成できるポリマー又はコポリマー又はターポリマーは、リン酸基又はスルホン酸基を有し、そのために、スルホン酸基を有するポリマーは好ましくはポリスチレンスルホン酸又はポリスチレンスルホン酸を持つコポリマー／ターポリマーである。
【００７８】
本発明のさらなる側面では、採用されるポリアニオン構造を形成できるコポリマー又はターポリマーは、スチレン及び無水マレイン酸に基づいたカルボキシル化ポリマーであり、コポリマーは、好ましくは５〜９５重量％の、特に好ましくは２５〜９５重量％の、最も特に好ましくは５０〜９５重量％のマレイン酸単位を含む。
【００７９】
本発明のさらなる側面によれば、採用されるポリアニオン構造を形成できるコポリマー又はターポリマーは、メチルビニルエーテルとマレイン酸、好ましくはコポリマーポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）に基づくカルボキシル化ポリマーであり、
【化３】
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有利には、１．０ｘ１０3〜２．５ｘ１０6の範囲の、好ましくは１．０ｘ１０4〜２．２ｘ１０6の範囲の、特に好ましくは１．９ｘ１０6〜２．１ｘ１０6の範囲の分子量、最も特に好ましくは、許容限度の範囲内で１．９８０ｘ１０6の分子量を有する。
【００８０】
本発明のさらなる側面によれば、採用されるコポリマーポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）は、部分的なアルキルエステルとして、好ましくはＣ1〜Ｃ6のアルキルエステル、特に好ましくはメチルエステルとして存在する。
【００８１】
本発明の別の主題は、死細胞及び任意でさらに細胞成分及びポリアニオン構造を有するポリマー、コポリマー又はターポリマーを含む複合体に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
以下の実施例に基づいて本発明をさらに説明する。これらの実施例は、それを拘束することなく、本発明の有利な実施態様を単に具現化する。
【実施例】
【００８３】
Ｉ．様々なコポリマーの調製
１）ＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ、ジメチルスルホキシド）に溶解した１４重量％が無水マレイン酸分画を伴った５０ｍＬのポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸に、２５０ｍｇのＮ−（２−ヒドロキシエチルイミノジ酢酸）を加え、混合物を６０℃で４５分間加熱する。
【００８４】
ＤＭＳＯで１０倍に希釈した後、細胞分離用の反応容器を被覆するための、即時使用可の溶液が得られる。
【化４】
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【００８５】
２）ＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ、ジメチルスルホキシド）に溶解した５０重量％が無水マレイン酸分画を伴った５０ｍＬのポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸に、１．３ｇのＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノビス（メチルリン酸）を加え、混合物を６０℃で１時間加熱する。ＤＭＳＯで１０倍に希釈した後、細胞分離用の反応容器を被覆するための、即時使用可の溶液が得られる。
【化５】
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【００８６】
３）５０ｍｇ（０．８７７ミリモル）のＮ−Ｍｅ−ＰＶＡ（Ｎ−メチル−ポリビニルアミン）を２ｍＬの水に溶解し、１．３１ミリモルのブロモ酢酸（１８０ｍｇ、１．５当量）及び５０μＬのＴＥＡ（トリエチルアミン）を加えた後、１２時間振盪した。このように、細胞分離用の反応容器を被覆するための、即時使用可の溶液が得られる。
【００８７】
４）０．２ｇのポリビニルアルコール（ＭＷ：９０００〜１００００）を６３０ｍｇ（０．４５４ミリモル、０．８当量）のブロモ酢酸で処理し、１．２ｇのＫ2ＣＯ3（９．０８ミリモル、１．５当量）を加えた後、１２時間振盪した。細胞分離用の反応容器を被覆するための、即時使用可の溶液が得られる。
【００８８】
ＩＩ．コーティングの実行
１）２０ｍｇのポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）を１０ｍＬの脱イオン水に溶解した。ポリマーを完全に溶解した後、各ポリマー水溶液５０μＬを市販のポリプロピレン製６穴プレートにピペットで入れた。室温にて２０分間のインキュベート時間の後、ポリマー水溶液を容器からピペットで取り出した。次いで１２０μＬの水で容器を一回洗浄し、４０℃にて乾燥させた。
【００８９】
２）１Ｍの硫酸アンモニウム水溶液中のポリ（メチルビニルエーテル−ａｌｔ−マレイン酸）（２ｍｇ／ｍＬ）溶液４００μＬと共に室温（２０℃）にて５分間、細胞培養用皿をインキュベートした。次いで、溶液を取り除き、被覆された細胞培養用皿を５０℃にて１２時間乾燥させた。
【００９０】
ＩＩＩ．エレクトロポレーション後の細胞の分離
１）細胞の材料として浮遊細胞を用いた。２００，０００個のＫ５６２細胞（ヒト骨髄性白血病細胞株）を、２００μＬの血清を含まない培養培地で洗浄し、Ｋ５６２細胞の形質移入に関する会社の指示書に従って、バイオラッド（登録商標）社のエレクトロポレータにて、２００μＬの血清を含まない培養培地中でエレクトロポレーションを行った。１３．３％のＦＣＳを含有する培地４００μＬを加えた後、実施例ＩＩの２で記載したように被覆された６穴プレートのウエルに、こうして得られた混合物を移し、その後、血清を含有する培地１ｍＬを加えた。室温にて５分間のインキュベートの後、上清を取り出し、その解析を行った。
【００９１】
顕微鏡による解析は、被覆していないプレート（図２：第２の顕微鏡像）に比べて実施例ＩＩの２で（図１：第１の顕微鏡像）記載したように被覆された細胞培養用皿は、有意に多い死細胞及び細胞の残骸を固定化したことを示した。
【００９２】
フローサイトメトリーの結果を以下に示す：
生細胞の比率は、図３、４及び５に示されるヒストグラムにおける「ゲートＭ１」に基づいて算出した。
結果を以下の表１に示す。
【表１】
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【００９３】
実験結果から、生細胞の分画はエレクトロポレーション後、６４％から３６％に落ちるが、精製後の生細胞の比率は、６３％で、元々の値を今一度大体達成していることを知ることができる。
【００９４】
従って、精製された細胞集団は、エレクトロポレーション前の元々の細胞に質的に今一度匹敵する。
【００９５】
２）ここで、再び、細胞の材料として浮遊細胞を用いた。２００，０００個のＫ５６２細胞（ヒト骨髄性白血病細胞株）を、２００μＬの血清を含まない培養培地で洗浄し、Ｋ５６２細胞の形質移入に関する会社の指示書に従って、バイオラッド（登録商標）社のエレクトロポレータにて、２００μＬの血清を含まない培養培地中でエレクトロポレーションを行った。１３．３％のＦＣＳを含有する培地４００μＬを加えた後、実施例ＩＩの２で記載したように被覆された６穴プレートのウエルに、こうして得られた混合物を移し、その後、血清を含有する培地１ｍＬを加えた。室温にて５分間のインキュベートの後、上清を取り出し、その解析を行った。
【００９６】
図６に再現された顕微鏡像（第３）は、この実験においても、被覆された細胞培養用皿が、細胞の残骸に加えて死細胞を吸着し、保持したことを示す。
【００９７】
第１の実験で前に記載されたのと類似の方法でフローサイトメトリーによって生細胞の比率を割り出し、得られた結果を表２に示した。
【表２】
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【００９８】
実験結果から、エレクトロポレーション後、生細胞の分画は、７７％から３１％に落ちることを知ることができる。精製後、生細胞の比率は再び、有意に５６％に上昇した。この実験でも、細胞集団の質は、精製後有意に改善される。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、本発明に係る被覆されたプレートの図２（顕微鏡像）と比較した被覆していない細胞培養用皿（顕微鏡像）を示す。双方の皿は、生細胞及び死細胞の混合物とともにインキュベートした。次に上清を除いた。２つの顕微鏡像から、被覆されていない皿とは異なって、被覆された皿は、細胞の残骸と共に多数の吸着した死細胞を有することは明らかである。
【図２】本発明に係る被覆されたプレート（顕微鏡像）を示す。
【図３】図３〜図５は、フローサイトメトリー（ヨウ化プロピジウムで染色）の３つのヒストグラムを示す。図３は、未処理の細胞のヒストグラムを示す。
【図４】図４は、エレクトロポレーション後の細胞のヒストグラムを説明する。
【図５】図５は、本発明に従って精製した細胞の相当するヒストグラムを結論として示す。
【図６】図６は、前述の方法で処理した、死細胞及び細胞の残骸で被覆される、上清を除去した後の細胞培養用皿の顕微鏡像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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