(57)【要約】本発明は、非ヒト・トランスジェニック動物において免疫グロブリンの発現を増すための新規方法を提供する。例えば、本発明は、一つまたはいくつかのヒトまたはヒト化免疫グロブリントランス座位を発現するように遺伝子操作された動物における、ヒト化免疫グロブリンの生産を増強する方法を提供する。これは、アポトーシス抑制因子、すなわち、その発現が、動物のＢ細胞において特異的なＢ細胞特異的プロモーターによって駆動されるウサギｂｃｌ−２を過剰発現し、それによりＢ細胞の生存率を高めることによって実行することが可能である。本発明はさらに、外因性のＢ細胞、すなわち、任意の免疫グロブリントランスジーン座位を発現するＢ細胞の生存率を、トランスジーン座位を発現しない内因性Ｂ細胞の生存率を上回って選択的に高めるための方法に関する。
2009502203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５のウサギｂｃｌ−２ポリペプチドを含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号５の前記ｂｃｌ−２ポリペプチドが、異種アミノ酸配列に融合される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記異種アミノ酸配列が、エピトープ配列である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン配列である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記免疫グロブリン配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号５の前記ウサギｂｃｌ−２ポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を含む、ベクター、発現カセット、またはトランスジェニック発現構築物。
【請求項８】
前記ウサギｂｃｌ−２アポトーシス抑制因子の発現が、Ｂ−細胞特異的プロモーター／エンハンサーによって駆動される、請求項７に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項９】
前記Ｂ−細胞特異的プロモーター／エンハンサーが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ、ｍｂ−１、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖、および免疫グロブリンＪ−鎖遺伝子、またはそれらの改変体のプロモーター／エンハンサーからなる群より選択される、請求項８に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項１０】
請求項７に記載のベクター、発現カセット、またはトランスジェニック発現構築物によって形質転換された、単離された宿主細胞。
【請求項１１】
短期リンパ球生産を経験するトランスジェニック動物における免疫グロブリン、または免疫グロブリン鎖の発現を強化するための方法であって、該トランスジェニック動物を生産するために、短期リンパ球生産を経験する該トランスジェニック動物に、Ｂ−細胞特異的プロモーター／エンハンサーによって駆動されるアポトーシス抑制因子のトランスジーンを含む少なくとも一つのトランスジーン構築物を導入する工程を包含し、それによって、該トランスジーン構築物を保持するＢ−細胞のアポトーシスが抑制され、該免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖の生産が強化される、方法。
【請求項１２】
前記トランスジェニック動物が、ウサギ、鳥類、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、およびロバからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トランスジェニック動物がウサギである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｂ−細胞特異的プロモーター／エンハンサーが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ、ｍｂ−１、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖、および免疫グロブリンＪ−鎖のプロモーター、またはその改変体からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アポトーシス抑制因子が、ｂｃｌ−２、カスパーゼ−９−ＤＮ変異体、バキュロウィルスｐ３５、カスパーゼ−９Ｓ、ｃｒｍＡ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、Ｂ−Ｄ−ｆｍｋ、ｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１、ＸＩＡＰ、ＴＩＡＰ、ＫＩＡＰ、ＮＡＩＰ、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＡＰＩ１、ＡＰＩ２、ＡＰＩ３、ＡＰＩ４、ＨＩＡＰ１、ＨＩＡＰ２、ＭＩＨＡ、ＭＩＨＢ、ＭＩＨＣ、ＩＬＰ、ＩＬＰ−２、ＴＬＡＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｌｉｖｉｎ、ａｐｏｌｌｏｎ、ＢＲＵＣＥ、ＭＬＩＡＰ、ＳＯＤＤおよびＦＬＩＰ、ならびにそれらの変種からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
短期リンパ球生産を経験する前記トランスジェニック動物中に、外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖トランスジーン座位をコードする、少なくとももう一つのトランスジーンを導入する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖が、ヒト（化）免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖配列である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖のトランスジーン座位、および前記アポトーシス抑制因子のトランスジーンが、共に同じトランスジェニック発現ベクターの上に存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖のトランスジーン座位、および前記アポトーシス抑制因子のトランスジーンが、異なるトランスジェニック発現ベクターの上に存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記トランスジェニック発現ベクターのそれぞれが、同時に前記トランスジェニック動物中に導入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスジェニック発現ベクターのそれぞれが、連続的に前記トランスジェニック動物中に導入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
Ｂ−細胞特異的プロモーター／エンハンサーによって駆動されるアポトーシス抑制因子のトランスジーンを含む、少なくとも一つのトランスジーン構築物を含む、短期リンパ球生産を経験する、非ヒト・トランスジェニック動物。
【請求項２３】
Ｂ−細胞特異的プロモーター／エンハンサーによって駆動されるアポトーシス抑制因子のトランスジーン、および、少なくとも一つの外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖トランスジーン座位を含む、少なくとも一つのトランスジーン構築物を含む、短期リンパ球生産を経験する、非ヒト・トランスジェニック動物。
【請求項２４】
前記外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖が、ヒト（化）免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖配列である、請求項２３に記載の非ヒト・トランスジェニック動物。
【請求項２５】
ウサギ、鳥類、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、およびロバからなる群より選択される、請求項２２または２３に記載の非ヒト・トランスジェニック動物。
【請求項２６】
下記の順序：
ａ）免疫グロブリン、または免疫グロブリン鎖；
ｂ）自己切断ペプチド；
ｃ）アポトーシス抑制因子；および、任意に
ｄ）ａ）とｂ）の間にプロテアーゼ切断部位、
でポリペプチド配列を含む融合タンパクをコードするトランスジーンを含む、トランスジェニック発現構築物。
【請求項２７】
前記プロテアーゼ切断部位が、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびトレオニンプロテアーゼの部位からなる群より選択される、請求項２６に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項２８】
前記プロテアーゼ切断部位がフリン切断部位である、請求項２６に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項２９】
前記免疫グロブリン断片が、ヒト（化）免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の断片である、請求項２６に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項３０】
前記自己切断ペプチドが、ウィルスの２Ａ／２Ｂ、または２Ａ様／２Ｂペプチドから得られる、請求項２６に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項３１】
前記ウィルスが、ピコルナウィルス科ウィルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウィルスファミリー、ピコルナウィルス様昆虫ウィルスファミリー、およびＣ型ロタウィルスファミリーからなる群より選択される、請求項３０に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項３２】
前記ウィルスが、口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウィルス、およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウィルス（ＴａＶ）からなる群より選択される、請求項３１に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項３３】
前記アポトーシス抑制因子が、ｂｃｌ−２、カスパーゼ−９−ＤＮ変異体、バキュロウィルスｐ３５、カスパーゼ−９Ｓ、ｃｒｍＡ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、Ｂ−Ｄ−ｆｍｋ、ｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１、ＸＩＡＰ、ＴＩＡＰ、ＫＩＡＰ、ＮＡＩＰ、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＡＰＩ１、ＡＰＩ２、ＡＰＩ３、ＡＰＩ４、ＨＩＡＰ１、ＨＩＡＰ２、ＭＩＨＡ、ＭＩＨＢ、ＭＩＨＣ、ＩＬＰ、ＩＬＰ−２、ＴＬＡＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｌｉｖｉｎ、ａｐｏｌｌｏｎ、ＢＲＵＣＥ、ＭＬＩＡＰ、ＳＯＤＤおよびＦＬＩＰ、ならびにそれらの変種からなる群より選択される、請求項２６に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項３４】
前記アポトーシス抑制因子が哺乳類ｂｃｌ−２である、請求項２６に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項３５】
前記哺乳類ｂｃｌ−２が、ヒトｂｃｌ−２、マウスｂｃｌ−２、およびウサギｂｃｌ−２からなる群より選択される、請求項３４に記載のトランスジェニック発現構築物。
【請求項３６】
請求項２６に記載のトランスジェニック発現構築物によって形質転換された、単離された宿主細胞。
【請求項３７】
非ヒト・トランスジェニック動物の外因性Ｂ−細胞内で、外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖の発現を選択的に強化するための方法であって、下記の順序：
ａ）免疫グロブリン、または免疫グロブリン鎖；
ｂ）自己切断ペプチド；
ｃ）アポトーシス抑制因子；および、任意に
ｄ）ａ）とｂ）の間にプロテアーゼ切断部位、
でポリペプチド配列を含む融合タンパクをコードするトランスジーン構築物を、該動物中に導入する工程を含み、
それによって、該外因性Ｂ細胞の生存率、および外因性免疫グロブリンの生産を強化する、方法。
【請求項３８】
前記外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖が、ヒト（化）免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記プロテアーゼ切断部位が、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびトレオニンプロテアーゼの部位からなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記プロテアーゼ切断部位がフリン切断部位である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
自己切断ペプチドの前記遺伝子が、ウィルスの２Ａ／２Ｂ、または２Ａ様／２Ｂから得られる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記ウィルスが、ピコルナウィルス科ウィルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウィルスファミリー、ピコルナウィルス様昆虫ウィルスファミリー、およびＣ型ロタウィルスファミリーからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウィルスが、口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウィルス、およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウィルス（ＴａＶ）からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記アポトーシス抑制因子が、ｂｃｌ−２、カスパーゼ−９−ＤＮ変異体、バキュロウィルスｐ３５、カスパーゼ−９Ｓ、ｃｒｍＡ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、Ｂ−Ｄ−ｆｍｋ、ｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１、ＸＩＡＰ、ＴＩＡＰ、ＫＩＡＰ、ＮＡＩＰ、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＡＰＩ１、ＡＰＩ２、ＡＰＩ３、ＡＰＩ４、ＨＩＡＰ１、ＨＩＡＰ２、ＭＩＨＡ、ＭＩＨＢ、ＭＩＨＣ、ＩＬＰ、ＩＬＰ−２、ＴＬＡＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｌｉｖｉｎ、ａｐｏｌｌｏｎ、ＢＲＵＣＥ、ＭＬＩＡＰ、ＳＯＤＤおよびＦＬＩＰ、ならびにそれらの変種からなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記非ヒト・トランスジェニック動物が、げっ歯類、霊長類、ウサギ、鳥類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびロバからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
下記の順序：
ａ）免疫グロブリン、または免疫グロブリン鎖；
ｂ）自己切断ペプチド；
ｃ）アポトーシス抑制因子；および、任意に
ｄ）ａ）とｂ）の間にプロテアーゼ切断部位、
でポリペプチド配列を含む融合タンパクをコードする少なくとも一つのトランスジーン構築物を含み、それによって前記融合タンパクが発現される、非ヒト・トタンスジェニック動物。
【請求項４７】
前記動物が、げっ歯類、霊長類、ウサギ、鳥類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびロバからなる群より選択される、請求項４６に記載の非ヒト・トランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、短期のリンパ球生産を経過する動物において、Ｂ細胞の生存率を高めるための方法に関する。本発明はさらに、免疫グロブリンの生産を増すために、外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖トランスジーン座位を発現する、トランスジェニック動物のＢ細胞の生存率を高めるための方法に関する。本発明はさらに、トランスジーン座位を発現しない内因性Ｂ細胞よりも、任意の免疫グロブリントランスジーン座位を発現する外因性Ｂ細胞の生存率を選択的に高める方法であって、これを、トランスジーンによってコードされる免疫グロブリンを発現する外因性Ｂ細胞においてのみ任意のアポトーシス抑制因子を選択的に発現させるが、内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞では該選択的発現を行わせないことによって実現する方法に関する。この方法は、トランスジェニック動物の内因的に生産される免疫グロブリンよりも、トランスジーンによってコードされる産物（単数または複数）の発現および生産の増大を可能とする。本発明はさらに、新規アポトーシス抑制因子、ウサギｂｃｌ−２を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト・マウスキメラ抗体を発現するマウスの作製は、Ｐｌｕｓｃｈｋｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１５：２７−３７（１９９８）によって記載された。ヒトの免疫グロブリンポリペプチドを発現するマウスの作製は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：３５０−２（１９８９）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（１）：６５−９３（１９９５）；およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８（４）：４５５−８（１９９７）に記載された。ＢＡＣクローンによるトランスジェニックマウスの作製は、Ｙａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８５９−６５（１９９７）によって記載された。ヒトの抗体を発現するウシの作製は、Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０（９）：８８９−８９４（２００２）によって記載された。
【０００３】
動物におけるトランスジーン形成は、Ｗａｌｌ  ＲＪ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５７（１）：１８９−２０１（２００２）によって記載された。トランスジェニックウサギの作製は、Ｆａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ．４９：５８３−９４（１９９９）；およびＢｒｅｍら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４４：５６−６２（１９９６）によって記載された。トランスジェニックニワトリの生産は、Ｅｔｃｈｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６２：４３３−４５０（１９９７）；およびＰａｉｎら、Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｏｒｇａｎｓ  １６５（３−４）：２１２−９（１９９９）；およびＳｈｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６：１０５０−１０５３（１９９８）に記載された。
【０００４】
免疫グロブリン発現欠損ウサギが、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２７８３−２７９３（１９９３）；およびＬａｍｏｙｉ  Ｅ，ａｎｄ  Ｍａｇｅ  ＲＧ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：１１４９−１１６０（１９８５）によって記載された。ガンマ−グロブリン血症のニワトリが、Ｆｒｏｍｍｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５（１）：１−６（１９７０）；およびＢｅｎｅｄｉｃｔら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８８（２）：１９７−２０５（１９７７）によって記載された。
【０００５】
細胞からの動物のクローニングが、Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：３６９−３７４（１９９８）；Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１２５６−１２５８（１９９８）；Ｊ．Ｂ．Ｇｉｂｅｌｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：６４２−６４６（１９９８）；Ａ．Ｅ．Ｓｃｈｎｉｅｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２１３０−２１３３（１９９７）；およびＫ．Ｈ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６６（１９９６）によって記載された。ウサギの核転移クローニングが、Ｓｔｉｃｅら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ３９：６５７−６６４（１９８８）；Ｃｈａｌｌａｈ−Ｊａｃｑｕｅｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ８（４）：２９５−２９９（２００３）によって記載された。
【０００６】
ヒト（化）免疫グロブリン転位座位を発現する、非ヒト・トランスジェニック動物の生産、およびそのようなトランスジェニック動物からの抗体生産が、特許文献１、特許文献２ならびに特許文献３、特許文献４、および特許文献５に詳細に記載されている。キメラ哺乳類宿主における相同組み換えの例が、特許文献６に示される。胚にＤＮＡを導入する方法が、特許文献７に記載される。胚性幹細胞の維持および拡大が、特許文献８に記載される。
【０００７】
２Ａペプチド配列を含むウィルスタンパクの切断活性が、Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：７５４−７６２（１９９２）；Ｒｙａｎら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：２７２７−２７３２（１９９１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：１０２７−１０４１（２００１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：１０１３−１０２５（２００１）；Ｓｚｙｍａｃｚａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２（５）：５８９−５９４（２００４）に記載された。
【０００８】
これまで、アポトーシス抑制因子ｂｃｌ−２によって調節される細胞生存機構の相対的寄与に関する研究は、主にマウスで行われてきた。ｂｃｌ−２発現の、細胞生存率に及ぼす作用は、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、Ｃｅｌｌ，５７：７９−８８，（１９８９）；Ｓｔｒａｓｓｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６６：１７５−１８１，（１９９０）；Ｋｎｏｔｔら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１５（５）：３６５−３７１（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９１（３）：４７５−７８４（２０００）；Ｓｔｒａｓｓｅｒら、ＰＮＡＳ，８８：８６６１−８６６５，（１９９１）；およびＫｕｍａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５：１５３−１５９，（１９９９）に記載された。アポトーシス抑制因子ｂｃｌ−ｘＬ発現の細胞生存率に及ぼす作用は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（３）：３９９−４０９（１９９９）に記載された。
【０００９】
Ｂ細胞の発達、例えば、連続的および短期的Ｂリンパ球生産の機序が、Ｌａｎｎｉｎｇ  Ｄ，Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＢＡ，Ｋｎｉｇｈｔ，ＫＬ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ：ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＧＡＬＴ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ，Ａｌｔ  Ｆ．Ｗ．，Ｈｏｎｊｏ  Ｔ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ４４３（２００４）；およびＦｌａｊｎｉｋ  Ｍ．Ｆ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ：ｓｕｒｐｕｒｉｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｒｔｅｎｔｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６８８（２００２）に批判的に考察されている。
【００１０】
ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、およびウシのような比較的大型のトランスジェニック動物における抗体の生産は、抗体生産の見地からは歓迎すべきものであるから、Ｂ−細胞アポトーシス抑制因子を持ち、比較的大量の、トランスジーンコード産物を発現する、大型の創始動物の創出は極めて好ましい。しかしながら、Ｂ−細胞の発達は、連続的Ｂリンパ球生産によって特徴づけられる動物（例えば、マウス）に比べて、短期リンパ球生産を経験する動物種（例えば、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、およびウシ）では大きく異なっている。したがって、アポトーシス抑制因子が、連続的Ｂリンパ球生産を維持する、比較的広く調べられている動物に見られるように、短期リンパ球生産を経験する動物に使用しても、同様の成功を収めるかどうか、あるいは、アポトーシス抑制因子が、抗体生産および／または抗体アフィニティーにどのような影響を及ぼすかは不明である。
【特許文献１】国際公開第９２／０３９１８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／１２４３７号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，５４５，８０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８１４，３１８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５７０，４２９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４１６，２６０号明細書
【特許文献７】米国特許第５，５６７，６０７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４５３，３５７号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
一局面において、本発明は、新規アポトーシス抑制ポリペプチド、すなわち、配列番号５のウサギｂｃｌ−２ポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、異種アミノ酸配列に融合した、配列番号５のウサギｂｃｌ−２ポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。さらに別の実施態様では、この異種アミノ酸配列は、エピトープ配列である。別の実施態様では、この異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン配列である。さらに別の実施態様では、この免疫グロブリン配列は、免疫グロブロンのＦｃ領域である。本発明はまた、配列番号５のウサギｂｃｌ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。一局面において、本発明は、ウサギｂｃｌ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、ベクター、発現カセット、またはトランスジェニック発現構築物を提供する。別の局面において、本発明は、配列番号５のウサギｂｃｌ−２ポリペプチドをコードする核酸配列によって形質転換された、単離宿主細胞を提供する。さらに別の局面において、本発明は、ウサギｂｃｌ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、ベクター、発現カセット、またはトランスジェニック発現構築物によって形質転換された、単離宿主細胞を提供する。
【００１２】
ある局面では、任意のアポトーシス抑制遺伝子、例えば、ｂｃｌ−２、カスパーゼ−９−ＤＮ変異体、バキュロウィルスｐ３５、カスパーゼ−９Ｓ、ｃｒｍＡ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、Ｂ−Ｄ−ｆｍｋ、ｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１、ＸＩＡＰ、ＴＩＡＰ、ＫＩＡＰ、ＮＡＩＰ、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＡＰＩ１、ＡＰＩ２、ＡＰＩ３、ＡＰＩ４、ＨＩＡＰ１、ＨＩＡＰ２、ＭＩＨＡ、ＭＩＨＢ、ＭＩＨＣ、ＩＬＰ、ＩＬＰ−２、ＴＬＡＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｌｉｖｉｎ、ａｐｏｌｌｏｎ、ＢＲＵＣＥ、ＭＬＩＡＰ、ＳＯＤＤおよびＦＬＩＰ、ならびにそれらの変種からなる群より選択されるアポトーシス抑制因子を使用してもよい。ある特定の実施態様では、アポトーシス抑制遺伝子は、哺乳類ｂｃｌ−２遺伝子であってもよい。ある好ましい実施態様では、哺乳類ｂｃｌ−２遺伝子は、ヒトｂｃｌ−２、マウスｂｃｌ−２、および、配列番号６のウサギｂｃｌ−２からなる群より選択される。ある好ましい実施態様では、ｂｃｌ−２は、配列番号５のウサギｂｃｌ−２である。
【００１３】
一局面において、本発明は、Ｂ細胞特異的プロモーター／エンハンサーによって駆動され、したがってＢ細胞において特異的に発現されるアポトーシス抑制因子をコードする核酸分子を含む、トランスジェニック発現構築物を提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、下記の順序でポリペプチド配列を含む融合タンパクをコードするトランスジーンを含む、トランスジェニック発現構築物を提供する。その順序とは、ａ）免疫グロブリン、または免疫グロブリン鎖；ｂ）自己切断ペプチド；ｃ）アポトーシス抑制因子；および、任意にｄ）ａ）とｂ）の間にプロテアーゼ切断部位である。
【００１５】
本発明はさらに、短期リンパ球生産を経験するトランスジェニック動物における免疫グロブリン、または免疫グロブリン鎖の発現を強化する方法であって、短期リンパ球生産を経験するトランスジェニック動物中に、Ｂ−細胞特異的プロモーター／エンハンサーによって駆動されるアポトーシス抑制因子のトランスジーンを含む少なくとも一つのトランスジーン構築物を導入することを含み、それによって、前記トランスジーン構築物を保持するＢ−細胞のアポトーシスが抑制され、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖の生産が強化されることを特徴とする方法を提供する。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、短期リンパ球生産的トランスジェニック動物において、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖の発現を強化する方法であって、外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖トランスジーン座位をコードする、少なくとももう一つのトランスジーンを、該トランスジェニック動物中に導入することをさらに含む方法を提供する。この方法では、前記二つのトランスジーンは、共に同じトランスジーン発現ベクターの上に存在してもよいし、異なるトランスジーン発現ベクターの上に存在してもよい。後者の場合、異なるトランスジーン発現ベクターは、トランスジェニック動物に、同時か、または継時的かいずれかにおいて導入することが可能である。
【００１７】
本発明はさらに、非ヒト・トランスジェニック動物の外因性Ｂ−細胞において、外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖の発現を選択的に強化するための方法であって、外因性Ｂ細胞の生存率および外因性免疫グロブリンの生産が強化されるように、下記の順序でポリペプチド配列を含む融合タンパクをコードするトランスジーン構築物を、該動物中に導入することを含む方法を提供する。その順序とは、ａ）免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖；ｂ）自己切断ペプチド；ｃ）アポトーシス抑制因子；および、任意にｄ）ａ）とｂ）の間にプロテアーゼ切断部位である。
【００１８】
任意の局面において、前述のトランスジーン構築物または方法のいずれかに使用されるプロテアーゼ切断部位は、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびトレオニンプロテアーゼに対する部位からなる群より選択される。好ましい実施態様では、フリン切断部位が使用される。
【００１９】
本発明の全ての局面において、Ｂ−細胞特異的プロモーター／エンハンサーは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ、ｍｂ−１、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖、および免疫グロブリンＪ−鎖、またはそれらの改変体のプロモーター／エンハンサーから成る群から選んでもよい。特定の実施態様では、Ｂ−細胞特異的プロモーター／エンハンサーは、免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子プロモーター、またはその改変体である。
【００２０】
本発明の全ての局面において、好ましい外因性免疫グロブリン（単複）／免疫グロブリン鎖トランスジーン座位は、ヒト／ヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖配列である。
【００２１】
本発明の全ての局面において、本発明の自己切断ペプチドは、ウィルスの２Ａ／２Ｂ、または２Ａ様／２Ｂ配列から得ることが可能である。したがって、ウィルスは、ピコルナウィルス科ウィルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウィルスファミリー、ピコルナウィルス様昆虫ウィルスファミリー、およびＣ型ロタウィルスファミリーから成る群から選ばれてもよい。ウィルスはまた、口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウィルス、およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウィルス（ＴａＶ）から成る群から選ばれてもよい。
【００２２】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、前述のトランスジーン構築物を含む、非ヒト・トランスジェニック動物に関する。例えば、アポトーシス抑制因子のトランスジーンは、短期リンパ球生産を経験する動物に導入されるのが好ましい。そのような動物としては、例えば、ウサギ、鳥、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、およびロバが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。これらの短期リンパ球生産性動物はさらに、トランスジーン、例えば、免疫グロブリン（単複）／免疫グロブリン鎖トランスジーンを含んでもよい。一方、融合タンパクをコードするトランスジーンは、任意の非ヒト動物の中に導入することが可能である。
【００２３】
したがって、本発明の多くの局面において、特に指定しない限り、非ヒト動物は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、鳥（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、鵞鳥など）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ロバ、およびその他の農場動物からなる群より選択される。本発明のある局面では、非ヒトトランスジェニック動物は、生涯の早期において遺伝子再編成による抗体の多様化を事実上停止するか、または、生涯の最初の１ヶ月以内に抗体の多様化を事実上停止することが可能である。ある特定の実施態様では、非ヒト・トランスジェニック動物はウサギである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（定義）
別様に定義しない限り、本明細書で用いる技術および科学用語は、本発明の属する当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  １９９４）、および、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）から、本出願において使用される用語の多くについて一般的なガイドが得られる。
【００２５】
当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似の、または等価的な方法および材料で、本発明の実施において使用が可能な、たくさんのものに気が付くであろう。実際、本発明は、いかなる意味でも、ここに記載される方法および材料に限定されるものではない。本発明の目的のために、下記の用語は以下のように定義される。
【００２６】
「Ｂ細胞」は、免疫グロブリン遺伝子セグメントの再編成を経過し、ライフサイクルのある段階で免疫グロブリン遺伝子を発現することが可能な、Ｂ−系統細胞と定義される。このような細胞としては、早期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞などが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００２７】
「アポトーシス抑制因子」は、その関与する機序は問わず、その存在または発現が、標的細胞においてアポトーシスの低下をもたらす分子または物質を指す。アポトーシス抑制因子は、該抑制因子不在時におけるアポトーシスに比べ、標的細胞のアポトーシスを少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％下げることが好ましい。
【００２８】
本明細書で用いる「ヒトのＩｇ遺伝子転位座位または座位、またはセグメント」という用語は、ヒトＩｇ遺伝子座位、またはそのセグメントの天然の配列と、ヒトＩｇ遺伝子座位、またはそのセグメントの天然の配列の変性形の両方の外に、ヒトＩｇ遺伝子座位、またはそのセグメントの天然の配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド配列をコードする合成配列をも含む。この文脈において、「実質的に」とは、アミノ酸配列の同一性の程度が、好ましくは少なくとも約８５％−９５％、またはより好ましくは少なくとも約９０％−９５％、またはさらに好ましくは少なくとも約９５％、またはもっとも好ましくは少なくとも約９８％である。ある特定の実施態様では、ヒトのＩｇ遺伝子セグメントは、ヒトにおいて、免疫グロブリン分子の免疫原性を失わせる。この場合、「ヒトまたはヒト化免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖および／または軽鎖座位」、または「ヒト（化）Ｉｇ座位」は相互交換的に用いられる。
【００２９】
「ヒト抗体」および「ヒト免疫グロブリン」という用語は、完全にヒトの配列を含む抗体および免疫グロブリン分子を指すために用いられる。
【００３０】
本明細書で用いられる「ヒト化抗体」および「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、ヒトの免疫グロブリンポリペプチド配列（または、ヒトの免疫グロブリン遺伝子セグメントによってコードされるポリペプチド配列）の少なくとも一部を含む免疫グロブリン分子を意味する。本発明のヒト化免疫グロブリン分子は、ヒト化免疫グロブリン分子を生産するように遺伝子操作された、トランスジェニック非ヒト動物から単離することが可能である。このようなヒト化免疫グロブリン分子は、動物、または動物由来の細胞から調製された、非ヒト化免疫グロブリン分子に比べ、霊長類、特にヒトに対する免疫原性が低い。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体は、遺伝子転換動物において遺伝子転換および体性超突然変異を通じてさらに多様化される免疫グロブリン（単複）および抗体を含む。このようなヒト化Ｉｇまたは抗体は「ヒト的」ではない。なぜなら、ヒトによって天然に製造されたものではないが（なぜなら、ヒトは、遺伝子転換によって抗体レパートリーを多様化していない）、それでもなお、ヒト化Ｉｇまたは抗体は、その構造としてヒトのＩｇ配列を有するために、ヒトに対して免疫原性を持たないからである。
【００３１】
「トランスジーンまたはトランスジーン構築物」は、動物、または動物細胞において通常見られない天然または合成タンパクをコードする配列を有するＤＮＡ断片である。本明細書で用いる「トランスジーン構築物」という用語は、構造的な「対象遺伝子」、および遺伝子転送を促進する他の配列を含む、ポリヌクレオチド分子を指す。本発明は、下記の少なくとも二つの構築物を指す。１）Ｂ−細胞特異的プロモーターによって駆動される、ウサギｂｃｌ−２アポトーシス抑制因子のトランスジーン、および２）ヒトＩｇ座位−自己切断ペプチド−アポトーシス抑制因子のトランスジーン構築物である。
【００３２】
「トランスジェニック発現ベクターまたは発現構築物」とは、本発明の一つまたはいくつかのトランスジーン構築物の外に、非ヒト・トランスジェニック動物の特異的細胞における、対象トランスジーン（単複）の、時間的、細胞特異的、または強調的発現のいずれかのために必要な、他の調節的ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ断片を指す。
【００３３】
「ヒト（化）Ｉｇ座位−自己切断ペプチド−アポトーシス抑制因子のトランスジーン、またはトランスジーン構築物」とは、単一ｍＲＮＡに転写され、二つのポリペプチド、すなわち、後述する自己切断機序のために、ヒト（化）免疫グロブリン鎖とアポトーシス抑制因子とに翻訳される、トランスジーン構築物を指す。
【００３４】
本明細書で用いる「自己切断ペプチド」とは、そのペプチド配列そのものの中の二つのアミノ酸残基の間に生じる切断活性を伴うペプチド配列を指す。例えば、２Ａ／２Ｂペプチド、または２Ａ／２Ｂ様ペプチドでは、２Ａペプチドのグリシン残基と、２Ｂペプチドのプロリン残基との間に切断が起こる。これは、翻訳の際「リボソームスキップ機構」を通じて生ずるもので、この時、２Ａ／２Ｂペプチドの、２Ａグリシン残基と２Ｂプロリン残基の間のペプチド結合が、２Ｂペプチドの残りの部分の翻訳に影響を及ぼすことなく破壊される。このようなリボソームスキップ機構は、従来技術において周知であり、単一メッセンジャーＲＮＡによってコードされるいくつかのタンパクを発現するために、数種のウィルスによって使用されることが知られる。
【００３５】
「内因性Ｉｇ（免疫グロブリン）−発現Ｂ−細胞」と「内因性Ｂ−細胞」とは、相互交換的に使用され、その動物の内因性免疫グロブリン座位を発現するＢ−細胞を指す。
【００３６】
「外因性Ｉｇ（免疫グロブリン）−発現Ｂ−細胞」および「外因性Ｂ細胞」は、そのＢ−細胞の中に導入された外因性ヒト（化）Ｉｇ転位座位の生産的再編成を経験する、非ヒト動物のＢ−細胞を指す。ヒト（化）Ｉｇ座位は、独立した発現構築物として、または、さらにアポトーシス抑制因子をコードする同じ発現構築物の一部として、そのようなＢ−細胞に導入される。ヒト（化）Ｉｇ座位の生産的再編成は、該ヒト（化）Ｉｇ、およびトランスジーンによってコードされるアポトーシス抑制因子の発現をもたらす。その結果、外因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞におけるアポトーシスは抑制され、細胞の生存率は高められる。
【００３７】
「アポトーシス抑制遺伝子の、Ｂ−細胞特異的発現」とは、好ましくは免疫細胞内における、より好ましくはＢ−細胞における、アポトーシス抑制遺伝子の発現を意味する。免疫細胞、またはＢ−細胞におけるアポトーシス抑制遺伝子の特異的発現は、該アポトーシス抑制遺伝子の発現を駆動する、免疫特異的、または好ましくはＢ−細胞特異的プロモーターを用いて実現される。
【００３８】
「アポトーシス抑制因子の選択的発現」とは、トランスジェニック動物の本来の免疫グロブリンを発現する内因性Ｂ細胞ではなく、外因性Ｂ細胞において優先的に該アポトーシス抑制遺伝子産物を発現することを意味する。好ましくは、アポトーシス抑制因子の発現レベルは、内因性Ｂ細胞における発現に比べて、外因性Ｂ細胞において、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、さらに好ましくは少なくとも約１０倍、もっとも好ましくは少なくとも約５０倍である。
【００３９】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパクである。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示す一方、免疫グロブリンは、抗体、および、抗原特異性を欠如する、他の、抗体様分子の両方を含む。「抗体」という用語は、本明細書ではもっとも広い意味で用いられ、具体的には、ただし限定することなく、モノクロナール抗体（全長モノクロナール抗体を含む）、ポリクロナール抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および、所望の特異性を示す限りにおいて抗体断片を含む。
【００４０】
本明細書で用いる「Ｉｇ遺伝子セグメント」という用語は、動物およびヒトの生殖系列に存在し、Ｂ細胞において結合されて再編成Ｉｇ遺伝子を形成する、Ｉｇ分子の各種部分をコードするＤＮＡセグメントを指す。したがって、本明細書で用いるＩｇ遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、およびＣ領域遺伝子セグメントを含む。ＶＤＪまたはＶＪセグメントの機能的再編成によって、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の発現が得られる。
【００４１】
「抗体多様性」および「抗体レパートリー」という用語は、相互交換的に使用されるが、生物体が発現することが可能な全ての抗体特異性の合計を指す。
【００４２】
遺伝子再編成および遺伝子転換を経過する能力を持つＩｇ座位も、本明細書では、「機能的」Ｉｇ座位と呼ばれ、機能的Ｉｇ座位によって生成される多様性を持つ抗体も、本明細書では、「機能的」抗体、または、抗体の機能的「レパートリー」と呼ばれる。
【００４３】
本明細書で用いる「モノクロナール抗体」という用語は、Ｂ−細胞の単一クローンによって合成される抗体分子を指す。
【００４４】
本明細書で用いる「ポリクロナール抗体」という用語は、Ｂ−細胞集団によって合成される抗体分子集団を指す。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、相互交換的に使用され、単数または複数で用いられる場合、一般に、未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。したがって、例えば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、１本鎖および２本鎖領域を含む、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域を含む、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、１本鎖であってもよいが、より典型的には、２本鎖であるか、または１本鎖および２本鎖領域を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含むが、ただしこれらに限定されない。さらに、本明細書に用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む、３本鎖領域を指す。このような領域における複数鎖は、同じ分子から得られたものであってもよいし、あるいは異なる分子から得られたものであってもよい。これらの領域は、一つ以上の分子の全てを含んでもよいが、より典型的には、いくつかの分子の一領域のみを含んでもよい。３重螺旋領域の分子の一つはオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は、特にｃＤＮＡを含む。この用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、および、一つ以上の修飾塩基を含むＲＮＡを含む。したがって、安定性、またはその他の理由で修飾されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で意図される用語としての「ポリヌクレオチド」である。さらに、異常な塩基、例えば、イノシン、または修飾塩基、例えば、３Ｈ付加塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書で定義される用語「ポリヌクレオチド」の中に含まれる。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は、未修飾ポリヌクレオチドの、化学的、酵素的、および／または代謝的修飾形の全ての外に、ウィルス、および単純および複雑細胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形を包摂する。
【００４６】
本明細書で用いる「非ヒト（トランスジェニック）動物」という用語は、哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、非げっ歯類哺乳類、例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、およびロバ、および鳥（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、鵞鳥など）を含むが、ただしこれらに限定されない。本明細書で用いる「非霊長動物」という用語は、上に具体的に列挙した哺乳類を含む、ただしこれらに限定されない、霊長類以外の哺乳類を含むが、ただしこれらに限定されない。
【００４７】
「事実上遺伝子転換および／または体細胞超突然変異によって抗体多様性を形成し、一次抗体レパトリーを創出する動物」または「遺伝子転換動物」という語句、およびその文法的等価物は、抗体多様化の主要機序が、遺伝子再編成ではなく、遺伝子転換および／または超突然変異である、動物を指すのに用いられる。このような動物としては、ウサギ、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、鵞鳥など）、ウシ、およびブタが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。特に好ましい非ヒト動物はウサギおよびニワトリである。
【００４８】
「生涯の早期に抗体の遺伝子再編成を停止する」動物とは、免疫グロブリン遺伝子の再編成が、通常、生涯の最初の１ヶ月以内に停止する動物を意味する。そのような動物の例としては、ウサギ、鳥類（例えば、ニワトリ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、およびウマが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００４９】
（詳細な説明）
本発明は、少なくとも一部は、短期のリンパ球生産を経過する非ヒト・トランスジェニック動物における免疫グロブリン（免疫グロブリン鎖を含む）の生産が、該動物のＢ細胞においてアポトーシス抑制因子を発現することによって著明に増大させることが可能であるという認識に基づく。その結果、Ｂ細胞の生存率は向上し、免疫グロブリンの生産は上昇する。
【００５０】
本発明はさらに、新規アポトーシス抑制因子、ウサギｂｃｌ−２の特定にも基づく。したがって、一実施態様では、本発明は、非ヒト・トランスジェニック動物において、Ｂ−細胞特異的プロモーターを用い、該動物のＢ細胞においてウサギｂｃｌ−２を過剰発現させ、それによってＢ−細胞の生存率を上げることによって免疫グロブリン発現を増大させる方法に関する。
【００５１】
本発明はさらに、短期リンパ球生産を経験する非ヒト動物において、外因性Ｂ−細胞、すなわち、免疫グロブリントランスジーン座位を発現するＢ−細胞を、そのようなトランスジーン座位を発現しない内因性Ｂ−細胞の生存率を上回って、選択的に向上させる方法に関する。選択性は、外因性免疫グロブリン発現を、アポトーシス抑制因子の発現と結合することによって実現される。内因性Ｂ−細胞では、アポトーシス抑制因子は発現されず、したがって、アポトーシスは抑制されない。このような選択的発現によって、トランスジェニック動物の、内因的に生産される免疫グロブリンを上回る、トランスジーンによって発現される免疫グロブリンの優先的生産が実現される。
【００５２】
これまでｂｃｌ−２アポトーシス抑制因子（本明細書において最初に開示されたウサギの配列とは別の）の過剰発現は、主に、マウスで研究されているが、その場合、免疫化に対し、Ｂ−系統細胞および抗原特異的メモリーＢ細胞の寿命延長が原因と思われる、Ｂリンパ球、すなわち免疫グロブリン分泌細胞、および血清免疫グロブリンの過剰生産があり、そのために抗体反応が増幅され、延長されるＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、Ｃｅｌｌ，５７：７９−８８，（１９８９）；Ｓｔｒａｓｓｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６６：１７５−１８１，（１９９０）；Ｋｎｏｔｔら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１５（５）：３６５−３７１，（１９９６）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９１（３）：４７５−７８４（２０００）；Ｓｔｒａｓｓｅｒら、ＰＮＡＳ，８８：８６６１−８６６５，（１９９１）、およびＫｕｍａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５：１５３−１５９，（１９９９）。
【００５３】
標的Ｂ−細胞集団のアポトーシスは、常にＢ−細胞の発達過程を通じて起こっている。Ｂ−細胞発達については、様々の動物種の研究から、二つの主要戦略が特定されている。すなわち、マウスおよびヒトに見られる連続的Ｂリンパ球生産、および、ニワトリ、ウサギ、ヒツジ、およびウシに見られる短期Ｂリンパ球生産と、それに続く、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）における拡大である（Ｌａｎｎｉｎｇ  Ｄ，Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＢＡ，Ｋｎｉｇｈｔ，ＫＬ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ：ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＧＡＬＴ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ．Ａｌｔ  Ｆ．Ｗ．，Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．，Ｎｕｅｂｅｒｇｅｒ  Ｍ．Ｓ．，Ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ４４３（２００３）；および、Ｆｌａｊｎｉｋ  Ｍ．Ｆ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ：  ｓｕｐｒｉｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６８８，（２００２）に総覧される）。
【００５４】
連続的Ｂリンパ球生産が見られる動物種では、Ｂ−細胞は、主に、骨髄および胎児肝臓で発達し、免疫グロブリン遺伝子は、その場で、組み換えＶ（Ｄ）Ｊ接合過程を通じて多様化される。このような動物種の抹消血リンパ球の多くは、成獣においても、非多様化ＶＤＪおよびＶＪ遺伝子を有する、ＩｇＭ＋、ＩｇＤ＋、または未修飾Ｂ−細胞である。したがって、連続的Ｂリンパ球生産が行われる動物では、新規抗原特異性を持つ新しいＢ−細胞が連続的に生産されるので、あるＢ−細胞区画を速やかに生産しなければならないというプレッシャーは比較的少ない。
【００５５】
一方、Ｂリンパ球生産が短期間である、ＧＡＬＴ（腸管関連リンパ組織）動物種では、Ｂ−細胞の初期プールが、生涯の早い時期に卵黄嚢および脾臓などの組織で形成され、その免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子は、ＧＡＬＴにおいて多様化される。Ｂリンパ球生産停止は急速であるために、この初期のＢ−細胞区画は、生物学的に有効な特異性を持つ抗体を生成するために、急速に拡大し、多様化しなければならない。例えば、ニワトリ、ヒツジ、およびウシでは、Ｉｇ遺伝子の体細胞多様化は、誕生前にもう始まっている。その結果、例えば、ウサギ成獣の抹消血リンパ球のＶＤＪ遺伝子のほとんど全てが高度に多様化し、未修飾Ｂ−細胞を欠く。それでいて、ウサギ成獣は、以前に見たこともない抗原に対し一次抗体反応を誘発することさえ可能である。これは、ＧＡＬＴから抹消に移動するＢ−細胞は、一次Ｂ−細胞レパートリーを所有しており、そのために、仮令そのＶＤＪ遺伝子が既に多様化していても、これらの長命および／または自己再生的Ｂ−細胞は、機能的抗体レパートリーを維持することが可能だからである。さらに、ウサギの場合のように、外因性抗原刺激が、短期Ｂリンパ球生産を行う動物種では抗体レパートリーの多様化の駆動を助ける。
【００５６】
正常マウスでは、一次的Ｔ細胞依存性免疫反応の際、ＩｇＶ領域遺伝子の体性細胞突然変異が胚中心Ｂ−細胞に起こり、それによって、抗原に対し様々の親和性を持つ免疫グロブリンを発現するＢ−細胞変種が生成される。アフィニティーが向上された変種は、アポトーシスの抑制によって積極的に選択され、最終的に、このような高アフィニティーＢ−細胞が、抗原特異的メモリーＢ−細胞および抗体形成Ｂ−細胞集団の大部分を構成する。低アフィニティー受容体を持つＢ−細胞体は、このような抗原依存性生存シグナルを受け取ることができず、アポトーシスを経過する。メモリーおよび抗体形成Ｂ−細胞集団における、高アフィニティーＢ−細胞の、このような増加は、アフィニティー成熟と呼ばれる。
【００５７】
ｂｃｌ−２トランスジェニック動物では、ｂｃｌ−２の過剰発現によって、高アフィニティーＢ−細胞ばかりでなく、低アフィニティーＢ−細胞においてもアポトーシスが阻止される。ｂｃｌ−２過剰発現マウスは、過剰な数の、アフィニティー選択されないメモリーＢ−細胞を持つようになる。一方、ｂｃｌ−２マウスにおける、高アフィニティー骨髄抗体形成細胞の厳格な選択は、ｂｃｌ−２タンスジーンによって影響されないので、その数は、コントロールの比べて変わらない。
【００５８】
連続的Ｂリンパ球生産を経過する他の動物において、ｂｃｌ−２の過剰発現の、Ｂ−細胞生存率および発達に及ぼす作用は、マウスのものと同様と思われるが、短期Ｂリンパ球生産を経過する動物のメモリーおよび／または抗体形成Ｂ−細胞の発達におけるｂｃｌ−２の役割は不明である。
【００５９】
したがって、本発明は、特に短期Ｂリンパ球生産を行う動物、例えば、ウサギ、鳥類、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、およびロバなどの動物においてアポトーシス抑制因子を過剰発現させ、かつ、そのようなトランスジェニック動物においてＢ−細胞生存率を上げるための方法を主題とする。さらに、このような動物が、さらにＩｇ転位座位を発現する場合、Ｉｇ転位座位の発現も強化または延長され、かつこれらは比較的大型の動物であるから、その抗体収率もより大きくなる筈である。したがって、本発明は、Ｂ−細胞生存率を高めることによって、比較的高い量の外因性免疫グロブリンを生産する、比較的大型の創始動物を創出することを目的とする。
【００６０】
一局面では、本発明は、Ｂ−細胞の生存率を上げるために有用なトランスジーン構築物を主題とする。トランスジーン、またはトランスジーン構築物とは、動物、またはその動物の細胞内に、通常認められない、一つ、またはいくつかの、天然または合成のタンパクをコードする配列を有するＤＮＡ断片である。このＤＮＡ断片（単複）は、各種の技術、例えば、前核のマイクロインジェクション、トランスフェクション、核転移クローニング、精子介在遺伝子転移、精巣介在遺伝子転移などを含む技術によって動物のゲノムの中に導入してもよい。
【００６１】
一実施態様では、トランスジーン構築物は、アポトーシス抑制因子、すなわち、ウサギｂｃｌ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。「アポトーシス抑制因子をコードする核酸分子」とは、未修飾ＤＮＡ配列の外に、未修飾ＤＮＡ配列と同一の、ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列であるが、コドン縮重に基づいて異なるＤＮＡ配列を有する、任意のコード最適化ＤＮＡ配列も意味する。この概念は下記に詳細に議論される。別の実施態様では、トランスジーン構築物は、任意のアポトーシス抑制因子をコードする核酸分子を含む。アポトーシス抑制遺伝子、例えば、ウサギｂｃｌ−２遺伝子、またはヒトｂｃｌ−２遺伝子は、好ましくは、トランスジェニック動物のＢ−細胞において、免疫特異的プロモーター、好ましくはＢ−細胞特異的プロモーターによって発現される。したがって、アポトーシス抑制因子の発現は、好ましくはＢ−細胞のみにおいて強化され、非ヒト・トランスジェニック動物におけるＢ−細胞生存率の向上がもたらされる。「Ｂ−細胞特異的プロモーター」とは、通常、Ｂ−細胞において発現される遺伝子の発現を調節する、任意のＢ−細胞特異的遺伝子および／または変種、またはその遺伝子操作されたその部分のプロモーター／エンハンサー配列を意味し、その例として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ（また、Ｂ２９，またはＩｇベータとも呼ばれる）、ｍｂ−１（また、Ｉｇアルファとも呼ばれる）、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖、免疫グロブリンＪ−鎖などのプロモーター／エンハンサーが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。ある好ましい実施態様では、カッパ軽鎖のプロモーター／エンハンサーが、ウサギｂｃｌ−２アポトーシス抑制遺伝子のＢ−細胞特異的発現を駆動する。
【００６２】
さらに別の実施態様では、アポトーシス抑制因子をコードする核酸分子を含むトランスジーン構築物は、外因性免疫グロブリン、または免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖トランスジーン座位を含むトランスジーン構築物と同時発現される。この実施態様では、Ｉｇトランスジーン座位と、アポトーシス抑制因子のトランスジーンは、共に同じトランスジェニック発現ベクターの上に存在してもよいし、あるいは、二つの異なるトランスジェニック発現ベクターの上に存在してもよい。後者の場合、二つのトランスジェニック発現ベクターは、非ヒト・トランスジェニック動物に、同時に、または連続的に導入されてよい。
【００６３】
本発明はさらに、下記の順序でポリペプチド配列を含む融合タンパクをコードするトランスジーンを含む融合タンパクをコードするキメラトランスジーンを含むトランスジーン構築物を提供する。その順序とは、ａ）免疫グロブリン、または免疫グロブリン鎖；ｂ）自己切断ペプチド；ｃ）アポトーシス抑制因子；および、任意にｄ）ａ）とｂ）の間にプロテアーゼ切断部位である。この場合、アポトーシス抑制因子の発現は、後述の機序によって、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の発現にリンクまたは結合する。このトランスジーン構築物はまた、Ｉｇ座位−プロテアーゼ切断部位−自己切断部位−アポトーシス抑制因子構築物とも呼ばれる。この構築物では、免疫グロブリンから、例えば、ＩｇのＭ２エキソンからＦ２Ａ自己切断ペプチド配列の除去をやり易くするために、そうすることによってＦ２Ａペプチド配列の、シグナル伝達（したがって、Ｂ−細胞の発達）を阻害する可能性を防ぐために、プロテアーゼ切断部位が任意に付加される。プロテアーゼ切断部位は、構成的に発現される任意のプロテアーゼによって認識される。本発明において有用なプロテアーゼ切断部位としては、アスパラギン酸プロテアーゼ、シテインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびトレオニンプロテアーゼが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。好ましい実施態様では、プロテアーゼ切断部位は、フリン切断部位である。
【００６４】
前述のキメラトランスジーンは、自己切断ペプチド（例えば、２Ａペプチド、または２Ａ様ペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含む。トランスジーンにおいて免疫グロブリンコード配列と、アポトーシス抑制因子配列との間に自己切断ペプチドコード配列を挿入することによって、一つのメッセンジャーＲＮＡが生産される。しかしながら、このｍＲＮＡの翻訳は、このペプチドの自己切断機序によって、二つの別々のタンパクをもたらす。免疫グロブリン（単複）およびアポトーシス抑制因子である。したがって、アポトーシス抑制因子の発現は、ＶＤＪまたはＶＪセグメントの機能的再編成と結合することが可能である。
【００６５】
本発明のこのような一実施態様では、自己切断は、ピコルナウィルス科ウィルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウィルスファミリー、ピコルナウィルス様昆虫ウィルスファミリー、およびＣ型ロタウィルスファミリーを含むウィルスの、２Ａ／２Ｂペプチド、または２Ａ−様／２Ｂ配列によって仲介される。ピコルナウィルスファミリーは、腸管、鼻、心臓、およびアフタ疾患、および口蹄疫（ＦＭＤＶ）ウィルスを含む。ピコルナウィルス様昆虫ウィルスファミリーは、感染性軟化病ウィルス（ＩＦＶ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｃウィルス（ＤＣＶ）、急性ハチ麻痺ウィルス（ＡＢＰＶ）、およびコオロギ麻痺ウィルス（ＣｒＰＶ）、および昆虫ウィルスＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウィルス（ＴａＶ）などのウィルスを含む。Ｃ型ロタウィルスファミリーは、ウシ、ブタ、およびヒトのＣ型ロタウィルスを含む。さらに別の実施態様では、切断配列は、ポリオウィルス、ライノウィルス、コクサッキーウィルス、脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）、メンゴウィルス、豚テスコウィルス−１、またはＴｈｅｉｌｅｒのマウス脳炎ウィルス（ＴＭＥＶ）などのいずれかから得られる２Ａ−様／２Ｂ配列を含んでもよい。好ましい実施態様では、自己切断タンパク配列は、口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウィルス、またはＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウィルス（ＴａＶ）のいずれかの２Ａ／２Ｂペプチドである；Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：７５４−７６２（１９９２）；Ｒｙａｎら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：２７２７−２７３２（１９９１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：１０２７−１０４１（２００１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：１０１３−１０２５（２００１）；Ｓｚｙｍａｃｚａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２（５）：５８９−５９４（２００４）。このようにして、自己切断ペプチドを用いると、アポトーシス抑制遺伝子の発現は、外因性Ｂ−細胞において、Ｉｇ転位座位の発現とリンクまたは結合される。内因性Ｂ−細胞を上回る、外因性Ｂ−細胞の選択的生存は、内因性免疫グロブリン生産の低下を招くが、Ｉｇ転位座位にコードされるポリペプチド／タンパクの生産において対応する増加をもたらす。
【００６６】
ｂｃｌ−２は、アポトーシス抑制因子の原型と議論されるが、その他のアポトーシス抑制因子も、キメラトランスジーン構築物での使用のために含められる。そのようなアポトーシス抑制因子として、例えば、ただしこれらに限定されないが、カスパーゼ−９優勢陰性（カスパーゼ−９−ＤＮ）突然変異遺伝子、バキュロウィルスｐ３５、カスパーゼ−９Ｓ、ｃｒｍＡ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、Ｂ−Ｄ−ｆｍｋ、およびｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋ、その他のｂｃｌ−２族メンバー、例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１など、アポトーシス促進分子、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂａｄなどの抑制因子、「ＢＨ３ドメインのみ」分子、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、ＰＵＭＡ、Ｎｏｘａなどの抑制因子、ＩＡＰ（アポトーシスタンパクの抑制因子）のような他の内因性カスパーゼ抑制因子、例えば、ただしこれらに限定されない、ＸＩＡＰ、ＴＩＡＰ、ＫＩＡＰ、ＮＡＩＰ、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＡＰＩ１、ＡＰＩ２、ＡＰＩ３、ＡＰＩ４、ＨＩＡＰ１、ＨＩＡＰ２、ＭＩＨＡ、ＭＩＨＢ、ＭＩＨＣ、ＩＬＰ、ＩＬＰ−２、ＴＬＡＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｌｉｖｉｎ、ａｐｏｌｌｏｎ、ＢＲＵＣＥ、およびＭＬＩＡＰなど、死の受容体の下方調整に与るＳＯＤＤおよびＦＬＩＰのようなタンパク、およびそれらの変種が挙げられる。ある特定の実施態様では、アポトーシス抑制遺伝子は、哺乳類ｂｃｌ−２遺伝子であってもよく、好ましい実施態様では、哺乳類ｂｃｌ−２遺伝子は、ヒトｂｃｌ−２、マウスｂｃｌ−２、および、配列番号５のウサギｂｃｌ−２からなる群より選択される。ある好ましい実施態様では、配列番号５のウサギｂｃｌ−２が使用される。
【００６７】
本発明のさらに別の局面では、トランスジーンは、免疫グロブリン重鎖および／または免疫グロブリン軽鎖、またはその部分をコードする。座位は、生殖系統形か、または再編成形であってもよい。コード配列、またはその部分は、ヒトの免疫グロブリンをコードし、ヒト（化）抗体の発現をもたらしてもよい。
【００６８】
ヒト（化）抗体をコードするトランスジーンは、Ｉｇ座位、または、一つまたはいくつかのＩｇセグメント（例えば、ヒトＩｇのＶ、Ｄ、Ｊ、またはＣ遺伝子セグメント）を含む、Ｉｇ座位の大部分を含む。それとは別に、トランスジーンは、ヒト免疫グロブリン座位、またはその大部分である。このようなヒトＩｇ座位、またはこのような修飾Ｉｇ座位、または、Ｉｇ座位の修飾部分を含むトランスジーンは、本明細書では「ヒト（化）Ｉｇ転位座位」とも呼ばれるが、非ヒト・トランスジェニック動物において遺伝子再編成を受け、それによって、ヒトの免疫グロブリンポリペプチド配列の少なくとも一部を有する、抗体の多様化レパートリーを生産する。
【００６９】
免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子は、それぞれ個別の遺伝子によってコードされ、かつ、イントロン配列によって隔てられるいくつかのセグメントを含む。このようにして、ヒトの免疫グロブリン重鎖の遺伝子は、染色体１４の上に認められる。重鎖（ＶＨ）の可変域は、三つの遺伝子セグメント、Ｖ、Ｄ、およびＪセグメント、続いて、Ｃ領域をコードする複数の遺伝子を含む。Ｖ領域は、Ｃ領域から比較的大きなスペーサーで隔てられ、Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントをコードする個別の遺伝子もスペーサーによって隔てられる。
【００７０】
免疫グロブリン軽鎖には二つのタイプがある。κおよびλである。ヒトのκ軽鎖の遺伝子は染色体２に認められ、ヒトのλ軽鎖の遺伝子は染色体２２に認められる。抗体軽鎖の可変域は、それぞれ別々の遺伝子セグメントによってコードされるＶセグメントとＪセグメントを含む。κ軽鎖の生殖系統形では、約１００−２００個のＶ領域遺伝子が直線状に配置され、各遺伝子は、独自のリーダー配列、次いで約５個のＪ遺伝子セグメント、およびＣ領域遺伝子セグメントを持つ。Ｖ領域は全てイントロンによって隔てられ、Ｖ、Ｊ、およびＣ領域遺伝子セグメントについてもそれらを隔てるイントロンがある。
【００７１】
さらに、前述のトランスジーン構築物のいずれかを含むベクターは、さらに、ゲンタマイシン、ネオマイシン、またはカナマイシンなどの抗生物質選択マーカーをコードするＤＮＡ配列、および／または、発現ベクターの、他の通例成分を含んでもよい。
【００７２】
本発明は、短期リンパ球生産を経験する、非ヒト・トランスジェニック動物において免疫グロブリンの発現を強化する方法であって、短期リンパ球生産を経験するトランスジェニック動物に、Ｂ細胞特異的プロモーター／エンハンサーによって駆動されるアポトーシス抑制因子のトランスジーンを含む、少なくとも一つのトランスジーン構築物を導入することを含む方法を提供する。このために、トランスジーン構築物によってこのＢ−細胞のアポトーシスは抑制され、免疫グロブリン、または免疫グロブリン鎖の生産は強化される。本法のさらに別の実施態様では、短期リンパ球生産を経験する非ヒト・トランスジェニック動物は、さらに、外因性免疫グロブリン（単複）、または免疫グロブリン鎖トランスジーン座位を含んでもよい。これによって、比較的高い収率の外因性免疫グロブリンが得られ、これは、抗体の精製および生産を大いに単純化する。この場合、アポトーシス抑制因子は、同時にＩｇ転位座位を導入するトランスジーン発現構築物の一部として、または、異なるトランスジーン構築物に載せられて導入されてもよい。
【００７３】
本発明はさらに、非ヒト・トランスジェニック動物の外因性Ｂ細胞において、外因性免疫グロブリン（単複）／免疫グロブリン鎖の発現を選択的に強化するもう一つの方法であって、その外因性Ｂ−細胞では、外因性免疫グロブリン（単複）／免疫グロブリン鎖、およびアポトーシス抑制因子のトランスジーンの発現が連結される。それに呼応して、内因性Ｂ−細胞、すなわち、Ｉｇ転位座位を発現しないＢ−細胞では、アポトーシス抑制因子の発現がない。外因性免疫グロブリン転位座位の生産的再編成、および、外因性Ｂ−細胞生存率の増加のために、トランスジーンによってコードされる免疫グロブリンの生産は、内因性免疫グロブリン生産を上回る。このようにして、外因性Ｂ細胞の生存率は強化され、外因性免疫グロブリン（単複）／免疫グロブリン鎖生産も強化される。
【００７４】
本発明はさらに、アポトーシス抑制因子である、ウサギｂｃｌ−２のタンパク、ポリペプチド、またはペプチド配列をコードする核酸配列を提供する。ウサギｂｃｌ−２の任意の核酸配列は、やや異なる核酸配列を持つが、同じタンパクをコードする天然の変種によって表されてもよいことが考えられる。さらに、機能的に等価なコドンという用語は、本明細書では、同じタンパクをコードする複数のコドン、例えば、アルギニンまたはセリンに対する６個のコドンを指すのに用いられ、さらに、後述するように、生物学的に等価なアミノ酸をコードする複数のコドンを指す。
【００７５】
本発明に用いられる、ウサギｂｃｌ−２のＤＮＡセグメントは、生物学的に、機能的等価な修飾ポリペプチドおよびペプチドを含む。そのような配列は、核酸配列、およびコードされるタンパク内に天然に起こることが知られる、コドン冗長性および機能的等価性の結果として生じることがある。それとは別に、機能的に等価なタンパクまたはペプチドは、組み換えＤＮＡ技術の応用によって創出してもよく、その場合、交換されるアミノ酸の性質に関する考慮に基づいて、タンパク構造の変化を加工してもよい。例えば、タンパクの抗原性に改良を導入するため、そのタンパクを与えられる被験体の体内においてタンパクの毒性作用を緩和するため、または、そのタンパクを含む治療の効力を高めるために、部位指向性突然変異発生技術を応用して、ヒトによって設計された変化を導入してもよい。
【００７６】
遺伝子コードの縮重を考慮して、本発明は、ウサギｂｃｌ−２遺伝子、またはヒトｂｃｌ−２遺伝子のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約５０％、通常少なくとも約６０％、より一般的には約７０％、もっとも一般的には約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、もっとも好ましくは約９５％の配列同一性を有する配列を含む。これらはまた、コドン最適化配列とも呼ばれ、機能的に等価なコドンに関連して後述される。
【００７７】
生物学的に機能的等価という用語は、従来技術において周知であり、かつ、本明細書において詳しく定義される。したがって、アミノ酸レベルで、約７０％と約８０％の間、より好ましくは約８１％と約９０％の間、またはさらに好ましくは約９１％から９９％同一である配列同士は、タンパクの生物学的活性が維持されている限り、ウサギｂｃｌ−２ポリペプチドと機能的に等価と見なされる。
【００７８】
機能的に等価なコドンという用語は、同じアミノ酸をコードする複数のコドン、例えば、アルギニンまたはセリンに対する６個のコドンを指し、さらに、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンを指す。
【００７９】
下記は、等価な、場合によっては改善された第２世代分子を創出するための、タンパクのアミノ酸変化に基づく考察である。例えば、あるタンパク構造において、例えば、抗体の抗原結合領域、または基質分子に対する結合部位など、構造同士の相互結合能力に目立った損失を生ずることなく、あるアミノ酸を、別のアミノ酸に置換することが可能である。あるタンパクにおいて、そのタンパクの生物学的機能活性を定義するものはそのタンパクの相互作用能力とその性質であるから、タンパク配列、およびその基礎となるＤＮＡコード配列においていくつかのアミノ酸置換を実行しながら、なおかつ類似の性質を持つタンパクを生産することが可能である。したがって、後述するように、遺伝子のＤＮＡ配列について、その生物学的有用性または活性の目立った損失なしに様々な変化を実行してもよいことは本発明の考慮の対象となる。
【００８０】
そのような変化を実行する際、アミノ酸の水治療指数も考慮の対象としてよい。タンパクに対する相互作用性生物学的機能付与におけるアミノ酸の水治療指数の重要性は、従来技術において周知である（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の水治療性が相対的に高いことは、得られるタンパクの二次構造に貢献し、これが次にそのタンパクと他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定めると考えられている。
【００８１】
類似のアミノ酸の置換も、親水性に基づいて効果的に実行が可能であることも従来技術で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号は、引用によりこの特許を本明細書に含める、タンパクの局所の最大平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性に支配されるものであるが、そのタンパクの生物学的性質と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、アミノ酸残基に対し下記の親水性値が与えられている。すなわち、アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．±．１）；グルタミン酸塩（＋３．０±．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００８２】
アミノ酸は、同様の親水性値を有する別のアミノ酸と置換し、なおかつ、生物学的に等価で、免疫学的に等価なタンパクを生産することが可能であることが理解される。このような変更では、その親水性値が±．２以内である、アミノ酸同士の置換が好ましく、±．１以内のものが特に好ましく、±．０．５以内のものが、さらに特別に好ましい。
【００８３】
本明細書に略述するように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述の様々の特性を考慮した、例示の置換は当業者にはよく知られるが、例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；および、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。
【００８４】
本発明に従ってポリペプチドを調製するためのもう一つの実施態様は、ペプチドミメティックスの使用である。ミメティックスとは、タンパクの二次構造の要素を模倣するタンパク含有分子である（Ｊｏｈｎｓｏｎ  １９９３）。ペプチドミメティックスの使用を可能とする動作原理は、タンパクのペプチドバックボーンは、主に、アミノ酸の側鎖を、分子同士の相互作用、例えば、抗体および抗原の相互作用を促進するように方向づけるために存在するということである。あるペプチドミメティックスは、天然の分子と同様の分子間相互作用を許容することが期待される。これらの原理は、前述の原理と組み合わせて、アポトーシス抑制因子の天然の性質の多くを持ちながら、かつ特徴を改変および改良させて、第２世代分子を加工するために使用することが可能である。
【００８５】
したがって、ウサギｂｃｌ−２、およびウサギｂｃｌ−２の機能的に等価なポリペプチドをコードする変異核酸配列は、本発明においてアポトーシス抑制因子として有用である。
【００８６】
免疫系の、感染に対する保護能力は、多様な抗体レパートリーを創出するように特殊化した遺伝的機構に依存する。Ｂ−細胞における抗体コード遺伝子は、可変（Ｖ）域における結合部位の無数の組み合わせを可能とするやり方で集合される。このような機構から、１０１２を超える可能な結合構造が生まれると推定されている。ヒトを含む全ての動物において、抗体製造プロセスは、免疫グロブリン（Ｉｇ）座位の可変（Ｖ）、多様性（Ｄ），および接合（Ｊ）セグメントの再結合によって開始する。動物種に依存するが、この工程に続いて、抗体の多様な結合構造を作製するために、二つの全体的機構が使用される。
【００８７】
ある動物、例えば、ヒトおよびマウスでは、免疫グロブリン重鎖座位にＶ，Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの複数コピーが存在し、免疫グロブリン軽鎖座位にＶおよびＪ遺伝子セグメントの複数コピーが存在する。これらの動物における抗体多様性は、主に、遺伝子再編成、すなわち、遺伝子セグメント同士の様々な組み合わせによって生成され、再編成された重鎖可変域および軽鎖可変域を形成する。一方、別の動物（例えば、ウサギ、鳥類、例えば、ニワトリ、鵞鳥、およびアヒル、ヒツジ、ヤギ、およびウシ）では、遺伝子再編成は、抗体多様性の生成において比較的小さい役割しか果たしていない。例えば、ウサギでは、Ｖ遺伝子セグメントのごく少数、もっとも多くの場合、Ｖ−領域の３’末端のＶ遺伝子セグメントが、遺伝子再編成に使用されて、連続的ＶＤＪセグメントを形成する。ニワトリでは、唯一のＶ遺伝子セグメント（Ｄ領域に隣接するもの、または、「３’近位Ｖ遺伝子セグメント」）、１Ｄセグメント、および１Ｊセグメントが、重鎖再編成において使用され、軽鎖再編成では、唯一のＶ遺伝子セグメント（３’近位Ｖセグメント）および１Ｊセグメントが使用される。したがって、これらの動物では、接合多様化によって得られる、初回再編成可変域配列の間にはほとんど多様性はない。これら再編成Ｉｇ遺伝子のさらなる多様化は、遺伝子転換によってもたらされる。これは、再編成Ｉｇ遺伝子において、Ｖ遺伝子セグメントの上流由来の短い配列が、Ｖ遺伝子セグメント内の短い配列を置換するプロセスである。抗体配列のさらに別の多様化が、超突然変異によって生成される可能性がある。
【００８８】
免疫グロブリン（抗体）は、五つのクラス（それぞれ、免疫防御において異なる生物学的役割を持つＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）に分けられる。血中でもっとも大量に見られ、感染に対する反応が強力なのは、ＩｇＧクラスである。ヒトのＩｇＧクラスには、Ｆｃドメインを含む重鎖定常領域の構造によって定められる４種のサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４異性形）がある。抗体のＦ（ａｂ）ドメインは、抗原の上の特異的配列（エピトープ）に結合し、一方、抗体のＦｃドメインは、抗原を排除するために、免疫系の他の成分を招集し、活性化する。
【００８９】
天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンの、ヘテロテトラマー糖タンパクであり、二つの同一軽（Ｌ）鎖、および、二つの同一重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は、ジスルフィド共有結合（単複）によって重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリン異性形の間で変動する。各重鎖および軽鎖も、規則的に隔てられた鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間では、特定のアミノ酸残基が境界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００９０】
「可変」という用語は、可変ドメインのいくつかの部分が、配列において、抗体間で大きく異なっており、これが、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に用いられるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の様々なドメインを通じて一様に分布しているのではない。可変性は、軽鎖と重鎖両方の可変ドメインの、相補性決定領域（ＣＤＲ）、または超過変域と呼ばれる三つのセグメントに集中する。可変ドメインの内比較的高度に保存される部分は、枠組み構造領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、三つのＣＤＲによって接続される、四つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲ同士は、ＦＲ領域によって、互いにごく近接して保持され、かつ、他方鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に与る（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｓｔｈｅｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接与らないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性への抗体参加などの機能を発揮する。
【００９１】
ヒト−動物転位座位の創出は、多様で、高度のアフィニティーを持つヒト（化）（ポリクロナール）抗体を高い収率で発現するトランスジェニック動物の創出を可能とする。一般に、非ヒト動物における免疫グロブリン（Ｉｇ）座位のヒト化は、一つ以上のヒトＩｇ遺伝子セグメントを動物のゲノムに組み込み、それによってヒト（化）免疫グロブリン座位を創出することを含む。したがって、ヒト（化）Ｉｇ重鎖座位の創出は、動物ゲノムに対する、一つ以上のＶおよび／またはＤおよび／またはＪセグメント、および／またはＣ領域セグメントの組み込みを含む。同様に、ヒト化Ｉｇ軽鎖座位の創出は、動物ゲノムに対する、一つ以上のＶおよび／またはＪセグメント、および／またはＣ領域セグメントの組み込みを含む。
【００９２】
染色体位置とは無関係に、本発明のヒト（化）Ｉｇ座位は、非ヒト動物において遺伝子再編成および遺伝子転換および超突然変異を経過し、それによって、ヒト（化）Ｉｇ分子の多様なレパートリーを製造することを可能とする能力を有する。遺伝子再編成および遺伝子転換を経過する能力を持つＩｇ座位は、「機能的」Ｉｇ座位とも呼ばれ、機能的Ｉｇ座位によって生成される多様性を有する抗体は、「機能的」抗体、または、抗体分子の「機能的」レパートリーとも呼ばれる。
【００９３】
一局面において、抗体レパートリーの多様化が生涯の早期に停止する動物は、本発明において有用である。Ｂ−細胞は、造血幹細胞から発達する。抗原暴露前に、Ｂ−細胞は、一連の成熟工程を経過し、その最終産物は成熟Ｂ−細胞である。この細胞は、その細胞膜上に、他の細胞表面シグナル伝達分子と共に、独特の膜連結ＩｇＭおよび多くの場合ＩｇＤを発現する。ヒトでは、遺伝子再編成による抗体多様化が生涯に渡って見られるが、他の動物では、抗体レパートリーの多様化は、生涯の早期に、典型的には生涯の最初の１ヶ月以内に停止する。
【００９４】
本発明の一局面では、本発明のＤＮＡ構築物の投与が可能な動物として、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、非げっ歯類（例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、およびロバ）、および鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、鵞鳥など）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。本発明のＤＮＡ構築物の投与が可能な動物としては、「遺伝子転換動物」、すなわち、事実上、遺伝子転換および／または体性細胞超突然変異（例えば、ウサギ、鳥類、ウシ、ブタなど）によって抗体の多様性を創出する動物、および、抗体再編成が生涯の早期に、すなわち、典型的には、生まれて最初の１ヶ月以内に停止する動物（例えば、ウサギ、鳥類、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマなど）が挙げられる。
【００９５】
本発明のＤＮＡ構築物を投与することが可能な動物はさらに、前述の非ヒト動物の内の任意のもので、さらに外因性免疫グロブリン転位座位、好ましくは、ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖および／または免疫グロブリン軽鎖配列、またはその部分をコードするトランスジーンを担う動物を含む。このトランスジーン座位は、生殖系統形態であっても、再編成形態のいずれであってもよい。このトランスジーンは、ヒトまたはヒト化免疫グロブリン、またはその部分をコードするので、該遺伝子は、ヒト抗体の生成をもたらす。したがって、例えば、前述の方法を用いることによって、本発明に記載されるウサギｂｃｌ−２アポトーシス抑制因子を用い、非ヒト標的動物においてヒト化抗体の生産を強化することが可能である。
【００９６】
本発明によれば、ヒト（化）免疫グロブリンを製造することが可能なトランスジェニック動物は、動物のレシピエント細胞（単複）に、その内の一つがヒト（化）Ｉｇ座位を担う、前述のトランスジーンベクターの内の一つ以上を導入し、かつ、遺伝学的に修飾されたレシピエント細胞（単複）から動物を得ることによって作製される。
【００９７】
レシピエント細胞は、例えば、遺伝子転換および／または超突然変異によって抗体の多様性を生成する、非ヒト動物、例えば、鳥（例えば、ニワトリ）、ウサギ、ウシなどから得たものであってもよい。そのような動物では、免疫グロブリンの生産のためには、３’近位Ｖ遺伝子セグメントを用いるのが好ましい。トランスジーンベクターのＩｇ座位にヒトのＶ遺伝子セグメントを、動物の３’近位Ｖ遺伝子セグメントを置換するか、または、３’近位Ｖ遺伝子セグメントのごく近傍に設置することによって組み込むと、それによって、大多数の免疫グロブリンにおいてヒトのＶ領域ポリペプチド配列の発現が実現される。それとは別に、再編成済みＶ（Ｄ）Ｊセグメントを、トランスジーンベクターの免疫グロブリン座位のＪ座位に挿入してもよい。
【００９８】
対象遺伝子、すなわち、ヒト（化）Ｉｇ座位およびアポトーシス抑制遺伝子を含むトランスジーンベクターは、レシピエント細胞（単複）に導入し、次に、ランダム統合、または標的統合によってレシピエント細胞（単複）のゲノムと統合させてもよい。
【００９９】
ランダム統合の場合、ヒト（化）Ｉｇ座位を含むトランスジーンベクターは、標準的トランスジェニック技術を用いて、動物のレシピエント細胞中に導入することが可能である。例えば、トランスジーンベクターは、有精卵の前核の中に直接注入することが可能である。トランスジーンベクターはまた、卵細胞の受精前に、精子とトランスジーンベクターとを共同培養することによって導入することも可能である。トランスジェニック動物を、受精卵細胞から発生させることが可能である。トランスジーンベクターを導入するもう一つの方法は、胚性幹細胞をトランスフェクトし、次いで、その遺伝学的に修飾された胚性幹細胞を、発達中の胚に注入することによる。別法として、トランスジーンベクター（そのまま、または、支持的試薬と組み合わせて）を、直接発達中の胚の中に注入することも可能である。最終的に、トランスジェニック動物の少なくともいくつかの体性細胞のゲノムの中に組み込まれたヒト（化）Ｉｇトランスジーンを含む胚から、キメラトランスジェニック動物が生産される。
【０１００】
ある特定の実施態様では、ヒト（化）Ｉｇ座位を含むトランスジーンは、内因性免疫グロブリン遺伝子の発現が欠損した動物株から得られたレシピエント細胞（例えば、受精卵細胞、または発生途上の胚）のゲノムの中にランダムに組み込まれる。このような動物株を用いることによって、ヒト（化）トランスジーンＩｇ座位由来の免疫グロブリン分子の優先的発現が可能となる。このような動物の例としては、ＡｌｉｃｉａおよびＢａｓｉｌｅａウサギ株の外に、無ガンマグロブリン血症、および、免疫グロブリン・ノックアウトマウスが挙げられる。別法として、ヒト（化）免疫グロブリントランスジーンまたは座位を担うトランスジェニック動物を、内因性免疫グロブリンの発現が損なわれた動物株と交配させることも可能である。内因性Ｉｇ座位欠損、および、ヒト（化）トランスジーンＩｇ座位についてホモの子孫を得ることが可能である。
【０１０１】
標的性統合の場合、トランスジーンベクターは、適切な動物レシピエント細胞、例えば、胚性幹細胞、または既に分化を遂げた体性細胞の中に導入してもよい。その後、トランスジーンが動物のゲノムの中に組み込まれ、相同組み換えによって対応する内因性Ｉｇ座位が置換された細胞を、標準法によって選抜することが可能である。例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００４，Ｊｕｎｅ  ６を参照されたい。次に、選抜された細胞を、脱核した核転送ユニット細胞、例えば、卵細胞または胚性幹細胞、すなわち、全能性を持ち、機能的新生児を形成することが可能な細胞と融合させてもよい。融合は、十分に確立した従来技術に従って行われる。卵細胞の脱核および核転送も、注入ピペット使用のマイクロサージャリによって実行することが可能である。（例えば、Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９４：３６９を参照されたい）。次に、得られた卵細胞を、適切な媒体中で培養し、同期レシピエントに転送して、トランスジェニック動物を生成する。それとは別に、選抜された、遺伝学的に修飾された細胞を、発達中の胚に注入し、次いで、これを発達させて、キメラ動物とすることも可能である。
【０１０２】
さらに、本発明によれば、ヒト（化）免疫グロブリンを生産することが可能なトランスジェニック動物は、レシピエント細胞（単複）の中に、一つ以上の、前述の組み換えベクターを導入すること、その際、ベクターの一つは、内因性Ｉｇ遺伝子セグメントに側接する配列と相同な、５’および３’側接配列に連結しており、次いで、内因性Ｉｇ遺伝子セグメントが、相同組み換えによって、ヒトＩｇ遺伝子セグメントによって置換された細胞を選抜すること、および、その選抜された遺伝学的に修飾されたレシピエント細胞（単複）から動物を得ることによって作製することも可能である。
【０１０３】
トランスジーンベクターの標的挿入と同様、本法においてレシピエント細胞として使用するのに好適な細胞としては、胚性幹細胞、または既に分化した体性細胞が挙げられる。ヒトＩｇ遺伝子セグメントを担う組み換えベクターを、実行可能な任意の手段、例えば、トランスフェクションによって、そのようなレシピエント細胞中に導入することが可能である。その後、相同組み換えを介して、ヒトＩｇ遺伝子セグメントによって、対応するＩｇ遺伝子セグメントが置換された細胞を標準法によって選抜する。これらの遺伝学的に修飾された細胞は、トランスジェニック動物をクローンする際、核転移工程において核ドナー細胞として使用することが可能である。別法として、選抜された、遺伝学的に修飾された胚性幹細胞を、発達中の胚に注入し、次に、この胚を発達させてキメラ動物とすることも可能である。
【０１０４】
ある特定の実施態様では、本発明のトランスジーン構築物は、胚の時期にトランスジーンを直接胚に注入することによって、または、妊娠した母親、または卵を産む雌鳥の中にトランスジーンを注入することによって間接的にトランスジェニック動物の中に導入してもよい。その結果、外因性Ｂ−細胞ではアポトーシスが抑制されるため、トランスジェニック子孫では、抗原に対する免疫化に反応してヒト（化）抗体の生産増大が起こる。
【０１０５】
前記方法の内の任意の方法によって生産されるトランスジェニック動物は、本発明の別の実施態様を形成する。トランスジェニック動物は、ゲノムの中に、それからヒト（化）抗体の機能的レパートリーが生産される、少なくとも一つの、すなわち、一つ以上の、ヒト（化）Ｉｇ座位を有する。
【０１０６】
ある特定の実施態様では、本発明は、一つ以上のヒト（化）Ｉｇ座位、およびアポトーシス抑制遺伝子を発現するトランスジェニックウサギを提供する。本発明のトランスジェニックウサギは、ヒト（化）Ｉｇ座位を再編成し、遺伝子転換し、ヒト（化）抗体の機能的レパートリーを発現することが可能である。
【０１０７】
別の特定の実施態様では、本発明は、一つ以上のヒト（化）Ｉｇ座位、およびアポトーシス抑制遺伝子を発現するトランスジェニックニワトリを提供する。本発明のトランスジェニックニワトリは、ヒト（化）Ｉｇ座位を再編成し、遺伝子転換し、ヒト（化）抗体の機能的レパートリーを発現することが可能である。別の特定実施態様では、本発明は、一つ以上のヒト（化）Ｖ領域、およびウサギｂｃｌ−２アポトーシス抑制遺伝子を発現する、トランスジェニックマウスを提供する。ヒト（化）Ｖ領域は、非ヒト・スペーサ配列によって側接される、少なくとも二つのヒトＶ遺伝子セグメントを含む。このトランスジェニックマウスは、ヒトのＶ要素を再編成し、抗体の機能的レパートリーを発現することが可能である。
【０１０８】
抗原による免疫化によって、前記トランスジェニック動物おいて、同じ抗原に対するヒト（化）抗体の生産が実現される。
【０１０９】
本発明の好ましい実施態様は、ヒト（化）Ｉｇ座位を有するトランスジェニック動物を主題とするが、熟成したＩｇ座位、および熟成したポリクロナール抗血清を有するトランスジェニック動物も本発明の精神の中に含まれることを理解しなければならない。ヒト（化）ポロクロナール抗血清組成物と同様、熟成ポリクロナール抗血清組成物も、ヒトの個人に対する免疫原性は低下すると考えられる。
【０１１０】
多様化したヒト（化）免疫グロブリン分子を生産することが可能な非ヒト・トランスジェニック動物が一旦作製されたならば（さらに後述するように）、抗原に対するヒト（化）免疫グロブリンおよびヒト（化）抗体標本も、動物を、その抗原によって免疫化することによって簡単に入手することが可能である。トランスジェニック宿主動物を免疫化するためには、様々の抗原の使用が可能である。そのような抗原としては、微生物、例えば、ウィルス、および単細胞生物（例えば、細菌および真菌）で、生きているもの、衰弱させたもの、または死んだもの、微生物の断片、または微生物から単離した抗原分子が挙げられる。
【０１１１】
動物を免疫化するのに使用される好ましい細菌性抗原としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の精製抗原、例えば、５および８型カプセルポリサッカリド、毒性因子、例えば、アルファ−トキシンの組み換えバージョン、接着結合タンパク、コラーゲン結合タンパク、およびフィブリノーゲン結合タンパクが挙げられる。好ましい細菌性抗原としてはさらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロコッカス、エンテロバクター、および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の衰弱形、またはこれらの細菌細胞の培養上清が挙げられる。免疫化に使用が可能な、その他の細菌性抗原としては、精製リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、カプセル抗原、カプセルポリサッカリド、および／または、外膜タンパクの組み換え版、フィブロネクチン結合タンパク、エンドトキシン、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、エンテロコッカス、エンテロバクター、およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のエンドトキシンが挙げられる。
【０１１２】
真菌に対する抗体の生成に好ましい抗原としては、真菌またはその外膜タンパクの衰弱形が挙げられ、そのような真菌としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ，Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ，およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１１３】
ウィルスに対する抗体を生成するための免疫化に使用するのに好適な抗原としては、ウィルスのエンベロープタンパクおよび衰弱形が挙げられ、そのようなウィルスとしては、ＲＳウィルス（ＲＳＶ）（特に、Ｆ−タンパク）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、およびＨＳＶが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１１４】
癌の治療のための治療抗体は、トランスジェニック動物を、単離された腫瘍細胞または腫瘍細胞系統によって免疫化することによって生成することが可能である。そのような腫瘍関連抗原としては、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ抗原（これに対する抗体は、乳癌の治療に有用である）；ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、およびＣＤ５３抗原（これらに対する抗体は、Ｂ−細胞リンパ腫の治療に有用である）、（３）前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）（これに対する抗体は、前立腺癌の治療に有用である）、および、１７−１Ａ分子（これに対する抗体は、結腸癌の治療に有用である）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１１５】
抗原は、トランスジェニック宿主動物に対し、都合のよい任意の方法で、アジュバント付きで、または無しで投与することが可能であり、指定のスケジュールに従って投与することが可能である。
【０１１６】
免疫化後、免疫化されたトランスジェニック動物から得られた血清または乳汁を、抗原に対して特異的な、製剤等級のポリクロナール抗体の精製のために分画することが可能である。トランスジェニック鳥の場合、抗体は、卵黄を分画することによって作製することが可能である。濃縮された、精製免疫グロブリン分画は、クロマトグラフィー（アフィニティー、イオン交換、ゲルろ過など）、硫酸アンモニウムなどの塩、エタノールなどの有機溶媒、またはポリエチレングリコールなどのポリマーによる選択的沈殿によって得られてもよい。
【０１１７】
分画されたヒト（化）抗体は、ヒトの静注に好適な、非毒性、非発熱性媒体、例えば、滅菌バッファー生食液に溶解、または希釈されてもよい。
【０１１８】
投与のために使用される抗体製剤は、一般に、０．１から１００ｍｇ／ｍｌ、より一般的には１から１０ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリン濃度を有することを特徴とする。抗体製剤は、様々な異性形から成る免疫グロブリンを含んでもよい。別法として、抗体製剤は、ただ一つの異性形、またはいくつかの選ばれた異性形から成る抗体を含んでもよい。
【０１１９】
ヒト（化）モノクロナール抗体を作製するために、内因性免疫グロブリンを発現するＢ−細胞をあらかじめ欠損させておいた、免疫化トランスジェニック動物から脾臓細胞が単離される。単離された脾臓細胞は、形質転換細胞系統と細胞融合されてハイブリドーマの生産のために使用されるか、あるいは、抗体をコードするｃＤＮＡが、標準的分子生物学技術によってクローンされて、トランスフェクトされた細胞で発現される。モノクロナール抗体を作製する工程は、従来技術において十分に確立している。例えば、欧州特許出願公開第０５８３９８０Ａ１号（“Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｂｂｉｔｓ”）、米国特許第４，９７７，０８１号（“Ｓｔａｂｌｅ  Ｒａｂｂｉｔ−Ｍｏｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”）、国際公開第９７／１６５３７号（“Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”）、および欧州特許第０４９１０５７Ｂ１（“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｗｈｉｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ａｖｉａｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ”）を参照されたい。なお、これらの開示を、引用により本明細書に含める。クローンされたｃＤＮＡ分子から、モノクロナール抗体をインビトロで生産する方法が、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９（２０００），および、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，”Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，”Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：８７（１９９５）に記載されている。なお、これらの開示を引用により本明細書に含める。
【０１２０】
大抵の場合、抗体製剤は、例えば、薬品または酵素によって新たな修飾を付加されることなく動物から調製される、未修飾免疫グロブリン、すなわち、ヒト（化）抗体から成る。それとは別に、免疫グロブリン分画に対し、酵素消化（例えば、ペプシン、パパイン、プラスミン、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼなどによる）、加熱、および／または、さらに詳細な分画などの処置を施してもよい。
【０１２１】
本発明の実施態様は、Ｂ−細胞特異的プロモーターを用いてＢ−細胞において特異的に発現される、ウサギｂｃｌ−２アポトーシス抑制因子を含むトランスジーンを主題とする。もう一つの実施態様は、Ｉｇ座位−自己切断ペプチド−アポトーシス抑制因子のトランスジーンであって、アポトーシス抑制遺伝子の発現が、Ｉｇ座位の発現と結合しているトランスジーンを主題とする。ウサギｂｃｌ−２アポトーシス抑制因子を含む、前述の各種アポトーシス抑制遺伝子および従来技術で既知のものが、本実施態様で使用可能である。
【０１２２】
本発明のさらに別の実施態様は、前述のトランスジーン構築物を用いてＢ−細胞の生存率を強化するための方法を主題とする。ウサギｂｃｌ−２トランスジーン構築物を使用する場合、免疫グロブリン座位をコードするトランスジーンをさらに含むトランスジェニック動物にトランスジーンを導入し、Ｂ−細胞の生存率を特異的に強化することが可能である。Ｉｇ座位−自己切断ペプチド−アポトーシス抑制因子のトランスジーンを使用する場合、外因性Ｂ−細胞が選択的に生存し、トランスジーンによってコードされる遺伝子を盛んに生産する。選択性は、外因性免疫グロブリン発現を、アポトーシス抑制因子の発現と結合させることによって実現される。内因性Ｂ−細胞では、アポトーシス抑制因子は発現されず、したがってアポトーシスは抑制されない。このような選択的発現によって、トランスジェニック動物の内因的に生産される免疫グロブリンを上回って、所望のトランスジーン発現免疫グロブリンの優位な生産がもたらされる。このトランスジーン構築物においては、本明細書に記載されるか、または、従来技術で周知のアポトーシス抑制因子、自己切断ペプチド、または免疫グロブリン遺伝子の内の任意のものの使用が可能である。ある好ましい実施態様では、トランスジーンのＩｇ座位は、ヒト（化）免疫グロブリン／免疫グロブリン鎖転位座位である。
【０１２３】
本発明はさらに、細胞生存率を強化するのに有用な、新規アポトーシス抑制因子、ウサギｂｃｌ−２を提供する。
【０１２４】
本発明の一局面においては、このウサギｂｃｌ−２アポトーシス抑制因子を発現する、非ヒト・トランスジェニック動物は、前述の短期リンパ球生産Ｂ細胞発生を経過する動物であることが好ましく、そのような動物としては、例えば、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、およびウシなどの動物が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。これらの動物は比較的大型であるので、前述の方法を用いることによって、その抗体生産および収率も比較的高くなる。本発明のもう一つの局面では、Ｉｇ座位−自己切断ペプチド−アポトーシス抑制因子を発現する非ヒト・トランスジェニック動物は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、鵞鳥など）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ロバ、およびその他の農業動物を含む任意の動物である。さらに別の局面では、本発明の方法において使用されるトランスジェニック動物は、遺伝子転換動物か、または、生涯の早期に停止する遺伝子再編成によって抗体多様化を経過することが可能な動物のどちらかであってよい。好ましい実施態様では、非ヒト・トランスジェニック動物はウサギである。
【０１２５】
以上、トランスジーン構築物、そのトランスジーン構築物を含むベクター、および前述の方法によって作製されるトランスジェニック動物は、全て本発明の実施態様である。
【０１２６】
本発明は、下記の実施例によってさらに具体的に説明されるが、しかしいかなる意味でもそれらに限定されない。
【実施例】
【０１２７】
実施例１
ヒトｂｃｌ−２を有するアポトーシス抑制因子発現ベクターの構築
ウサギゲノムＢＡＣライブラリーをスクリーニングしたところ、ウサギ軽鎖Ｋ１遺伝子セグメントを含む、二つのＢＡＣが特定された（１７９Ｌ１および１９６Ｏ２；それぞれ、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセス番号：ＡＹ４９５８２７およびＡＹ４９５８２８）。
【０１２８】
Ｂ−細胞特異的アポトーシス抑制因子発現ベクターを構築するために、ＢＡＣ  ＡＹ４９５８２７を、大腸菌において相同組み換えによって修飾し（ＥＴクローニング：Ｅ．Ｃｈｉａｎｇ  Ｌｅｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７３，５６−６５（２００１）；Ｄａｉｇｕａｎ  Ｙｕら、ＰＮＡＳ  ９７，５９７８−５９８３（２０００）；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１５５５−１５５７（１９９９）；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，１３１４−１３１７（２０００））、ヌクレオチド１−１０７７９５および１４２８３２−２０５１４１を欠失させた。さらにウサギベータグロビンポリＡ配列に接続させた、ＡＹ４９５８２８から得られたカッパ１プロモーター（位置１１４２８４−１１４５７０）調節下の、合成ヒトｂｃｌ−２遺伝子が合成された。下流には、ＦＲＴ部位が隣接するゲンタマイシン選択カセットが、重複伸長ＰＣＲによって導入された。このｂｃｌ−２−ゲンタマイシンカセットは、修飾されたＡＹ４９５８２７ＢＡＣ（配列番号１）に対し５０ｂｐ相同性を有するプライマーによって増幅された。ＢＡＣ  ＡＹ４９５８２７の上のヌクレオチド１３４５７１−１３６０１９の配列が、ＥＴクローニングによってｂｃｌ−２−ゲンタマイシンカセット（配列番号１）に対して交換された。陽性クローンをゲンタマイシンによって選択し、制限酵素消化によって分析し、配列決定によって確かめた。次いで、ゲンタマイシンカセットは、ＦＬＰ−組み換えによって除去した。得られた構築物を用いて、トランスジェニック動物を生成した。
【０１２９】
実施例２
マウスｂｃｌ−２を有するアポトーシス抑制因子発現ベクターの構築
ウサギゲノムＢＡＣライブラリーをスクリーニングしたところ、ウサギ軽鎖Ｋ遺伝子セグメントを含む二つのＢＡＣが特定された（１７９Ｌ１および１９６Ｏ２；それぞれ、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセス番号：ＡＹ４９５８２７およびＡＹ４９５８２８）。
【０１３０】
Ｂ−細胞特異的アポトーシス抑制因子発現ベクターを構築するために、ＢＡＣ  ＡＹ４９５８２７を、大腸菌において相同組み換えによって修飾し（ＥＴクローニング：（Ｅ．Ｃｈｉａｎｇ  Ｌｅｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７３，５６−６５（２００１）；Ｄａｉｇｕａｎ  Ｙｕら、ＰＮＡＳ  ９７，５９７８−５９８３（２０００）；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１５５５−１５５７（１９９９）；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，１３１４−１３１７（２０００）、ヌクレオチド１−１０７７９５および１４２８３２−２０５１４１を欠失させた。さらにウサギベータグロビンポリＡ配列に接続させた、ＡＹ４９５８２８から得られたカッパ１プロモーター（位置１１４２８４−１１４５７０）調節下の、合成マウスｂｃｌ−２遺伝子が合成された。下流には、ＦＲＴ部位が隣接するゲンタマイシン選択カセットが、重複伸長ＰＣＲによって導入された。このｂｃｌ−２−ゲンタマイシンカセットは、修飾されたＡＹ４９５８２７ＢＡＣ（配列番号１）に対し５０ｂｐ相同性を有するプライマーによって増幅された。ＢＡＣ  ＡＹ４９５８２７の上のヌクレオチド１３４５７１−１３６０１９の配列が、ＥＴクローニングによってｂｃｌ−２−ゲンタマイシンカセットに対して交換された。陽性クローンをゲンタマイシンによって選抜し、制限酵素消化によって分析し、配列決定によって確かめた。次いで、ゲンタマイシンカセットは、ＦＬＰ−組み換えによって除去した。得られた構築物を用いて、トランスジェニック動物を生成した。
【０１３１】
実施例３
膜型ＩｇＭおよびＩｇＧ、２Ａ自己切断ペプチド、およびアポトーシス抑制因子から成る融合タンパクをコードするヒト（化）重鎖座位の構築
ウサギ免疫グロブリン重鎖座位配列を含むＢＡＣおよびフォスミドクローンを、定常、可変、および、接合遺伝子セグメント、または３’エンハンサー領域に対して特異的なプローブを用いて、ゲノムＤＮＡライブラリーから単離した。単離した、ＢＡＣおよびフォスミドＦｏｓ１５Ｂについて配列決定した（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：ＡＹ３８６６９５、ＡＹ３８６６９６、ＡＹ３８６６９７、ＡＹ３８６６９８）。ＡＹ３８６６９５のＪおよびＣμ領域、およびＡＹ３８６６９６のＣ（）領域を、ＥＴクローニングによって大腸菌における相同組み換えを通じてヒトの対応部分と交換した（Ｅ．Ｃｈｉａｎｇ  Ｌｅｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７３，５６−６５（２００１）；Ｄａｉｇｕａｎ  Ｙｕら、ＰＮＡＳ  ９７，５９７８−５９８３（２０００）；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１５５５−１５５７（１９９９）；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，１３１４−１３１７（２０００））。
【０１３２】
これら４個のＢＡＣは、インビトロライゲーションおよびＣｒｅ−仲介結合によって再結合されて、ヒトＪ、Ｃμ、およびＣ（）コード配列を有するウサギＩｇ座位を再構成した。
【０１３３】
ｂｃｌ−２の発現をＩｇＭおよびＩｇＧの発現とリンクさせるために、ｂｃｌ−２のコード配列を、Ｆ２Ａ自己切断ペプチドをコードする配列と共に、ＩｇＭおよびＩｇＧのＭ２膜エキソンのコード配列に融合させた。
【０１３４】
ＩｇＧ−Ｍ２−Ｆ２Ａ−ｂｃｌ−２融合タンパクをコードする配列を挿入するために、下記の構築物を作製した。相同組み換え用の配列は、ＢＡＣ  ＡＹ３８６６９６の配列に基づく。ＤＮＡ断片で、ＫｐｎＩ部位、ＣγＭ２の５０ヌクレオチドと同一の配列、Ｆ２Ａをコードする配列、ヒトｂｃｌ−２をコードする配列、ＦＲＴ５部位、およびＥｃｏＲＩ部位を（５’から３’に向けて）含む断片を合成した。プラスミドｐＳＣ１０１  ｒｐｓＬ−ｎｅｏ（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ）を鋳型として用いて、ｒｐｓＬ．Ｎｅｏカウンター選択カセットを増幅した。上流プライマーは、ＥｃｏＲＩおよびＦＲＴ５部位を含み、下流プライマーは、ＣγＭ２の下流５０ヌクレオチドと同一の配列、およびＸｈｏＩ部位を含んでいた。合成断片およびＰＣＲ増幅産物を連結し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに組み込み、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩによって開放した。連結カセット（配列番号２）は、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩによって開放し、大腸菌における相同組み換えに用いた。ＢＡＣ  ＡＹ３８６６９６およびプラスミドｐＳＣ１０１−ＢＡＤ−ｇｂａ−ｔｅｔｒａを含む大腸菌株ＤＨ１０Ｂに、カセットを導入し形質転換した後、リコンビナーゼＲｅｄα／βの発現を誘発した。次いで、カナマイシン耐性クローンを選抜し、制限酵素消化および部分的配列分析によって分析した。最後に、ＲｐｓＬＮｅｏ−耐性遺伝子を、Ｆｌｐ−仲介組み換えによってＢＡＣから除去した。
【０１３５】
得られたＢＡＣクローンを、ＩｇＭ−Ｍ２−Ｆ２Ａ−ｂｃｌ−２融合タンパクをコードする配列を挿入してさらに修飾した。相同組み換え用の配列は、ＢＡＣ  Ｙ３８６６９６の配列に基づく。プラスミドｐＳＣ１０１  ｒｐｓＬ−ｎｅｏ（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ）を鋳型として用いてｒｐｓＬ．Ｎｅｏ遺伝子を増幅した。プライマーは、ＩｇＧ−Ｍ２、および側接配列、ＦＲＴおよびＦＲＴ−２部位と同一の配列を含む（配列番号３）。増幅産物は、ＥＴクローニングによってＢＡＣ  ＡＹ３８６６９６に挿入した。次いで、選択カセットを、ＩｇＭ−Ｍ２−Ｆ２Ａ−ｂｃｌ−２融合タンパクをコードするＤＮＡ断片で置換する（配列番号４）。５’から３’に向かって、ＥｃｏＲＩ部位、ＦＲＴ部位、ＩｇＭ−Ｍ２をコードする配列、Ｆ２Ａ、およびｂｃｌ−２、ＦＲＴ２およびＥｃｏＲＩ部位をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（配列番号４）。この合成断片を、ＥｃｏＲＩで開放し、ＦＲＴ／ＦＲＴおよびＦＲＴ２／ＦＲＴ２部位間のＦｌｐ仲介組み換えによる、ｒｐｓＬ．Ｎｅｏ遺伝子の、ＩｇＭ−Ｍ２−Ｆ２Ａ−ｂｃｌ−２による交換のために用いた。陽性クローンは、制限分析によって特定し、さらに部分的配列決定によって分析した。
【０１３６】
得られたＢＡＣを、様々なＶ領域を含むＢＡＣと組み合わせた。ＢＡＣ同士は、連結または組み換えによって組み合わせることが可能である。得られた構築物は、トランスジェニック動物の作製のために用いた。
【０１３７】
実施例４
ヒト化重鎖免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウスおよびウサギの作製
ヒト化重鎖および軽鎖免疫グロブリン座位、およびアポトーシス抑制遺伝子を含むトランスジェニックウサギおよびマウスを、受精卵細胞の前核にＤＮＡを注入し、次いで、胚を代理母に転送することによって作製した。創始トランスジェニック動物はＰＣＲによって特定した。ヒト（化）免疫グロブリンＭおよびＧの発現は、ＥＬＩＳＡによって測定した。ヒト化ＩｇＧの発現は１０−２０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１３８】
実施例５
ヒト化重鎖ヘモグロビンを発現するトランスジェニックニワトリの作製
トランスジェニックニワトリは、精巣仲介遺伝子転送によって作製した。ＤＮＡ構築物（５０ｕｇ）を、５００ｕｌの０．９％ＮａＣｌに溶解した、２５０ｕｌのリポフェクション試薬（ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）と混ぜ合わせ、雄鶏の精巣に注入した。３から４週間後、トランスジェニック精子を有する雄鶏を、ＰＣＲ分析によって特定し、雌鶏と交配させた。トランスジェニック雛をＰＣＲによって特定した。ヒト化ＩｇＧの発現は１０−２０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１３９】
本開示を通じて引用した文献は全て、その中で引用した文献と共に、引用により本明細書に含めることを明言する。
【０１４０】
本発明をいくつかの実施態様を参照しながら具体的に説明したが、本発明はそれらの実施態様に限定されない。当業者であれば、様々な改変がすぐに実行可能であること、かつ、本発明の動作に実質的変化を加えること無く実施が可能であることを理解されるであろう。そのような改変は全て、本明細書に請求される本発明の範囲内にあることが特に指定して意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、ウサギのポリペプチド配列（配列番号５）と、他の動物種から得られた他のｂｃｌ−２分子（配列番号１１−２０）とのアミノ酸整列を示す。
【図２】図２：配列番号１。カッパ１Ｂ細胞特異的プロモーターの調節下における、合成ヒトｂｃｌ−２アポトーシス抑制因子ベクター。
【図３】図３：配列番号２。ウサギＩｇＧ  Ｍ２−自己切断ペプチドＦ２Ａ−ヒトｂｃｌ２融合タンパクＦＲＴ  ｒｐｓＬ−ｎｅｏＦＲＴをコードするＤＮＡ断片。
【図４】図４：配列番号３。ＦＲＴおよびＦＲＴ２部位が隣接するｒｐｓＬ−ｎｅｏをコードするＤＮＡ断片。
【図５】図５：配列番号４。ウサギＩｇＭ−Ｍ２−自己切断ペプチドＦ２Ａ−ＦＲＴおよびＦＲＴ２部位が隣接する、コドン最適化ヒトｂｃｌ２融合タンパクをコードするＤＮＡ断片。
【図６】図６：配列番号５。ウサギｂｃｌ−２ポリペプチド配列。
【図７】図７：配列番号６。ウサギＩｇＭ−Ｍ２−自己切断ペプチドＦ２Ａ−コドン最適化ヒトｂｃｌ２融合タンパクをコードするＤＮＡ断片。
【図８】図８：配列番号７。ウサギＩｇＭ−Ｍ２−自己切断ペプチドＦ２Ａ−ヒトｂｃｌ２融合タンパクをコードするＤＮＡ断片。
【図９】図９：配列番号８。ＩｇＧ−Ｍ２−自己切断ペプチドＦ２Ａ−コドン最適化ヒトｂｃｌ２融合タンパクをコードするＤＮＡ断片。
【図１０】図１０：配列番号９。ウサギＩｇＭ−Ｍ２−フリン切断部位−自己切断ペプチドＦ２Ａ−ヒトｂｃｌ２融合タンパクをコードするＤＮＡ断片。
【図１１】図１１：配列番号１０。ウサギＩｇＧ−Ｍ２−フリン切断部位−自己切断ペプチドＦ２Ａ−コドン最適化ヒトｂｃｌ２融合タンパクをコードするＤＮＡ断片。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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