(57)【要約】  二重鎖ＤＮＡ塩基配列の標的化ヌクレオチド交換のための、方法及びオリゴヌクレオチドであって、ドナーオリゴヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ又はＧと比較して、より高い結合親和性を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでおり、及び／又はドナーオリゴヌクレオチドが、第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合する、方法及びオリゴヌクレオチド。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖ＤＮＡ塩基配列の標的化改変のためのオリゴヌクレオチドであって、該二重鎖ＤＮＡ塩基配列が、第１のＤＮＡ塩基配列、及び第１のＤＮＡ塩基配列の相補物である第２のＤＮＡ塩基配列を含み、該オリゴヌクレオチドが、前記第１のＤＮＡ塩基配列へハイブリダイズすることができるドメインであって、前記第１のＤＮＡ塩基配列に関して少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含み、該オリゴヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ又はＧと比較して、より高い結合親和性を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つのセクションを含み、前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドへより強く結合することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記オリゴヌクレオチドが、独立して少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２つの修飾ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は１０の修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも２つのセクション、好ましくは少なくとも３つのセクションを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか一項にオリゴヌクレオチドにおいて、前記セクションが、３’末端、５’末端及び／若しくは前記ミスマッチの位置の周囲の近くに、又は３’末端、５’末端及び／若しくはミスマッチの位置の周囲にあることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記ミスマッチの位置の前記ヌクレオチドが修飾されないことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、好ましくは前記ミスマッチから２、３、４、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド内の、ミスマッチに隣接した位置にあることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、１０〜５００ヌクレオチド長であることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記修飾されたセクションが、ドメインであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、骨格が修飾されたヌクレオチド及び／又は塩基が修飾されたヌクレオチドから成る群から選択されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、
前記ヌクレオチドは、
ａ．シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、
ｂ．ロックされた核酸（ＬＮＡ）、
ｃ．ペプチド核酸（ＰＮＡ）、
ｄ．２’−Ｏ−メチル置換ヌクレオチド、
ｅ．メチルホスホネート置換ヌクレオチド、
ｆ．６−クロロ−２−メトキシアクリジン置換ヌクレオチド、
ｇ．２’−フルオロ−ＲＮＡ、
ｈ．２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、
ｉ．２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、
ｊ．トリシクロ−ＤＮＡ、
ｋ．Ｎ３−Ｐ５−ホスホラミデート置換ヌクレオチド、
ｌ．２，６−ジアミノプリン系ヌクレオチド、
ｍ．メチル化、プロピニル化、及びアミノ化したヌクレオチド、並びに
ｎ．スーパーＡ及びスーパーＴの内の少なくとも一種
から成る群から選択されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、
前記修飾ヌクレオチドは、
α−L−ＬＮＡ、
β−D−オキシ−ＬＮＡ、
β−D−チオ−ＬＮＡ、
α−L−オキシ−ＬＮＡ、
２’−Ｏ−メチル−２−アミノプリン、 
２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリン、
２’−Ｏ−メチル−３−デアザ−５−アザシチジン、
２’−Ｏ−メチル−５−フルオロウリジン、
２’−Ｏ−メチル−５−メチルシチジン、
２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、
２’−Ｏ−メチルイノシン、
２’−フルオロ−リボシチジン、
２’−フルオロ−リボウリジン、
２’−Ｏ−メトキシエチル−リボシチジン、
２’−Ｏ−メトキシエチル−リボウリジン、
２’−Ｏ−メトキシエチル−リボアデノシン、
２’−Ｏ−メトキシエチル−リボグアニン、
２’−Ｏ−アルキル−リボシチジン、
２’−Ｏ−アルキル−リボウリジン、
２’−Ｏ−アルキル−リボアデノシン、
２’−Ｏ−アルキル−リボグアニン、
２−アミノ−アデノシン、
２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド、
５−プロピニル−２’−デオキシシチジン
５−プロピニル−２’−デオキシウリジン
５−メチル−イソデオキシシチジン、
５−メチル−２’−デオキシシチジン、及び
N４−エチル−２’−デオキシシチジン
から成る群から選択されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、少なくとも１つ、２つ又は好ましくは少なくとも３つのホスホロチオエート結合を前記オリゴヌクレオチド中に含むような、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルに置換されたヌクレオチドであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドがＬＮＡであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記オリゴヌクレオチドが、前記ミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置された１つ又は複数のＬＮＡ残基を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、１つのＬＮＡが、前記ミスマッチから少なくとも１塩基対の位置で該ミスマッチの各側に置かれることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記オリゴヌクレオチドが、前記ミスマッチに隣接して配置されるか、又は該ミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置される、１つ又は複数の５−プロピニル化ヌクレオチド及び／又はＮ４−エチル−２’−デオキシシチジンを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、１つの５−プロピニル化ヌクレオチド又はＮ４−エチル−２’−デオキシシチジンが、前記ミスマッチの各側で該ミスマッチに隣接して、又は該ミスマッチから少なくとも１塩基対の位置で配置されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記５−プロピニル化ヌクレオチドが、５−プロピニル−２−デオキシシチジン及び／又は５−プロピニル−２−デオキシウラシル及び／又はＮ４−エチル−２’−デオキシシチジンであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ドナーオリゴヌクレオチドと二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列を組み合わせることを含む、二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列の標的化改変のための方法であって、該二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列が、第１のＤＮＡ塩基配列、及び該第１のＤＮＡ塩基配列の相補物である第２のＤＮＡ塩基配列を含み、前記ドナーオリゴヌクレオチドが、改変される前記二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列に関して、好ましくは前記第１のＤＮＡ塩基配列に関して、少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含み、前記オリゴヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ又はＧと比較して、より高い結合親和性を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むセクションを含み、該修飾ヌクレオチドが、標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質の存在下において、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記修飾ヌクレオチドが、請求項１〜１９の内のいずれか一項に記載されているオリゴヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、前記改変が、好ましくは植物細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞又は酵母細胞から成る群から選択される細胞内のものであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法において、前記タンパク質が細胞抽出物に由来することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、前記細胞抽出物が、植物細胞抽出物、真菌細胞抽出物、げっ歯類細胞抽出物、霊長類細胞抽出物、ヒト細胞抽出物又は酵母菌抽出物から成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２０又は２１に記載の方法において、前記改変が、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２１に記載の方法において、前記細胞が、真核生物細胞、植物細胞、ヒト以外の哺乳類細胞又はヒト細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法において、前記標的ＤＮＡが、真菌、細菌、植物、哺乳類又はヒト由来であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法において、前記二重鎖ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、線状ＤＮＡ、哺乳類人工染色体、バクテリア人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体ＤＮＡ、オルガネラ染色体ＤＮＡ、エピゾームＤＮＡ由来であることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法において、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾に用いられることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用であって、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾、ミスマッチ修復、遺伝子変異を含む（植物の）遺伝物質の標的化改変、標的化遺伝子修復及び遺伝子ノックアウトに用いられることを特徴とする使用方法。
【請求項３１】
二重鎖ＤＮＡ塩基配列の促進された標的化改変のためのオリゴヌクレオチドの使用であって、前記二重鎖ＤＮＡ塩基配列が、第１のＤＮＡ塩基配列及び該第１のＤＮＡ塩基配列の相補物である第２のＤＮＡ塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記第１のＤＮＡ塩基配列にハイブリダイズすることができるドメインであって、前記第１のＤＮＡ塩基配列に関して少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含み、前記オリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含むセクションを含み、該修飾ヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ又はＧと比較してより高い結合親和性を有し、前記修飾ヌクレオチドが、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合することを特徴とするオリゴヌクレオチドの使用方法。
【請求項３２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【請求項３３】
請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法により産生されることを特徴とする修飾された遺伝物質。
【請求項３４】
請求項３３に記載の修飾された遺伝物質を含むことを特徴とする細胞。
【請求項３５】
請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法により産生される植物若しくは植物の一部分、又は請求項３３に記載の前記遺伝物質を含む植物若しくは植物の一部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの標的細胞中への導入による、標的細胞におけるＤＮＡの特異的部位でのヌクレオチド配列の特異的且つ選択的改変のための方法に関する。本成果は、標的ＤＮＡの配列とオリゴヌクレオチドの配列が異なる場合には、標的ＤＮＡの配列がオリゴヌクレオチドの配列に変換できるようにする、１つ又は複数のヌクレオチドの標的化交換である。さらに特に、本発明は修飾オリゴヌクレオチドを使用する標的化ヌクレオチド交換に関する。本発明はさらにオリゴヌクレオチド及びキットに関する。本発明は本方法の応用にもまた関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子修飾は、生細胞の、又は細胞が一部分を形成する生物の、若しくは細胞が再生することができる生物の、１つ又は複数の遺伝子にコードされた生物学的特性を修飾する目的で、生細胞の遺伝物質中の変化を意図的に作成する過程である。これらの変化は、遺伝物質の一部分の欠失、外因性遺伝物質の追加又は遺伝物質の既存ヌクレオチド配列中の変化の形式をとることができる。真核生物の遺伝子修飾のための方法は２０年以上知られており、農業、ヒトの健康、食品品質及び環境保護の分野の改善のための、植物細胞、ヒト細胞及び動物細胞並びに微生物における広範囲での応用が明らかにされた。遺伝子修飾の一般的な方法は、細胞ゲノムへの外来性ＤＮＡ断片の添加から成り、次にそのことにより既存遺伝子によってコードされた特性に加えて、その細胞又はその生物へ新しい特性が付与されるだろう（ＤＮＡ断片の添加の結果として、既存遺伝子の発現が抑制される応用を含む）。外来性ＤＮＡ断片が挿入されるゲノム位置（及び従って発現の最終的なレベル）は制御されないので、並びに所望の効果が、もとのバランスのとれたゲノムによってコードされた天然の特性を超えて現われなければならないので、多くのそのような例は所望の特性を得るのに効果的であるが、それにもかかわらずこれらの方法はあまり正確ではない。これに反して、前もって定めたゲノムの遺伝子座におけるヌクレオチドの追加、欠失又は変換をもたらす遺伝子修飾の方法は、既存遺伝子の正確な修飾を可能にするだろう。
【０００３】
現在、真核生物の細胞における正確な標的化遺伝子変化の生成については、以下の２つの方法が既知である：相同組換えを介する遺伝子ターゲティング及びオリゴヌクレオチド依存性標的化ヌクレオチド交換。
【０００４】
相同組換えに基づいた方法は、ゲノムＤＮＡ中の天然に存在する二本鎖切断又はあらかじめ誘導された二本鎖切断が、切断に近接する隣接領域に対して或る程度のヌクレオチド配列相同性を有する任意の利用可能な鋳型ＤＮＡ断片を使用して、細胞によって修復されるという原理を利用する（非特許文献１、非特許文献２）。そのような細胞に必要とされる配列相同性を有するドナーＤＮＡを供給することによって、切断のいずれかの末端での相同組換えは正確な修復をもたらす可能性があり、それによってドナーＤＮＡの相同性領域間に人工的にデザインされた任意の修飾が既存の遺伝子座中に組み込まれるだろう。真核生物の細胞においては、配列の一部分が失なわれ、無関係なＤＮＡ塩基配列が組み込まれる可能性のある、それほど正確でない修復機構のために、この正確な切断修復はむしろ低い頻度で生じる。
【０００５】
オリゴヌクレオチド依存性標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ、時には、ＯＤＴＮＥ）は、合成オリゴヌクレオチド（ワトソン−クリック塩基対合特性においてはＤＮＡに類似しているが、化学的にはＤＮＡと異なってもよいヌクレオチド様部分の短いストレッチから成る分子）の真核生物細胞核への送達に基づく方法である（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。オリゴヌクレオチドの相同配列中にミスマッチヌクレオチドを意図的にデザインすることによって、ミスマッチヌクレオチドがゲノムＤＮＡ配列中に組み込まれてもよい。この方法は、既存の遺伝子座中の単一のヌクレオチド又は多くとも数ヌクレオチドの変換を可能にするが、既存の遺伝子中に遺伝子機能の破壊をもたらす終止コドンを作り出すため、又はタンパク質をコードする遺伝子に改変されたアミノ酸組成をもたらすコドン変化を作り出すために適用されてもよい（タンパク質工学）。
【０００６】
標的化ヌクレオチド交換は、植物細胞、動物細胞及び酵母細胞において記述されている。最初のＴＮＥ報告によれば、オリゴヌクレオチドがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子として合成され得る、いわゆるキメラを利用するものであり（非特許文献６、非特許文献７の第174頁）、それは染色体の標的部位で挿入されようにデザインされ得る、自己相補的なオリゴヌクレオチドから成っていた。キメラは、染色体標的で変異を導入するための鋳型を形成する、ミスマッチヌクレオチドを含んでいる。キメラを使用する最初の実施例は、ヒト細胞から生じた（非特許文献４総説の第321-326頁、非特許文献８を参照）。キメラの使用は植物種のタバコ、コメ、及びトウモロコシでさらに成功した（非特許文献９、非特許文献７の第174-184頁、非特許文献１０、非特許文献１１）。これらの研究は、除草剤抵抗性を付与する点変異の導入に基づいていた。ＴＮＥを研究するのに最も扱いやすい系は酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）であった（非特許文献１２）。酵母変異体の使用により、ＴＮＥで重要な役割を果たすと思われるいくつかの遺伝子（ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２及びＲＡＤ５４）が同定された。
【０００７】
ＴＮＥの代替的な方法は、特異的染色体突然変異を導入するために一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドを利用するものである。今までのところ、ｓｓオリゴヌクレオチドは、酵母細胞及びヒト細胞においてのみ調べられた（非特許文献１３、非特許文献１４の総説）。
【０００８】
ヒト細胞がＳ期において停止された場合、ＴＮＥの効率が増加し（非特許文献１５）、このことから効率的なＴＮＥが起こるためにはＤＮＡが開いた立体構造を有していなければならないことが示唆される。ｓｓオリゴヌクレオチドを使用するＴＮＥは、遺伝子修復の複製様式を介して起こることが提示されている。このような場合において、ｓｓオリゴヌクレオチドは複製フォークでアニールし、ラギング鎖の岡崎フラグメント間の娘鎖へと組み込まれるだろう。これによって、新しく複製されたＤＮＡ鎖のうちの１つにおいてミスマッチが生じる。ｓｓオリゴヌクレオチド中の変異は、親鎖におけるヌクレオチドを変換させることができるが、方向性のある修復の可能性は恐らく低い。これは、複製の最中のミスマッチ修復についての現在の見解が、娘鎖中のエラーを修復するために、親鎖が鋳型として使用されるという考えを推進するからである（非特許文献１６）。キメラオリゴヌクレオチドを使用するＴＮＥは、ＤＮＡ二重鎖の中へのキメラの挿入によって起こると考えられる。キメラＲＮＡ鎖は、標的配列の１つの鎖に結合する。このＲＮＡ／ＤＮＡ結合はＤＮＡ／ＤＮＡ相互作用よりも安定しており、二重鎖中のキメラの安定化を支援するだろう。遺伝子修正は、他の標的鎖に結合するキメラのＤＮＡ鎖によって実行され、結果として標的配列の１つの鎖中の塩基変化をもたらす。キメラの分解又は解離後に、標的中に結果として生じるミスマッチは、恐らくミスマッチ修復経路からのタンパク質によって解消されるが、これはまだ未確認である。
【０００９】
植物のような高等生物の細胞におけるＴＮＥの応用が直面する最も重大な問題は、これまでに報告されている低効率である。トウモロコシにおいて、（非特許文献１７)は、１×１０−４の変換頻度を報告した。タバコ（非特許文献１８）及びコメ（非特許文献１０）において、続いて行なわれた研究では、それぞれ１×１０−６及び１×１０−４の頻度が報告されている。これらの頻度はＴＮＥの実用化のためには、あまりにも低いままである。
【００１０】
正確なＤＮＡの複製は、ゲノム安定性の維持を仲介し、ＤＮＡ中に含まれる遺伝子情報が変異のない状態で１つの世代から次の世代へと受け渡されることを保証する、重要な基準の１つである。多くのエラーが、親ＤＮＡ鎖中の損傷から生じるか、又はＤＮＡ塩基と反応する薬剤（紫外線、環境有害物質）によって生じる。すべての生物は、これらの変異を防止又は修正するために安全装置を維持しなければならない。ミスマッチ修復系（ＭＭＲ）は、ＤＮＡ損傷の監視及び異なった配列間の組換えの防止において、ＤＮＡ複製の最中にもたらされたミスマッチ塩基又は不対塩基を認識して修正すると考えられ（非特許文献１９）、生細胞におけるＤＮＡ複製の忠実度に貢献する。
【００１１】
ＭＭＲは、複製の最中の切り出し／再合成過程によって新しく合成された鎖上の誤って組み込まれたヌクレオチドを認識して除去し、したがって鋳型鎖上に含まれている情報を回復させる（非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献１９）。このタイプの複製エラーは、自然に起こり、複製型ＤＮＡポリメラーゼ酵素複合体の３’−５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性によって時々検出されないか、又は鋳型鎖中の修飾ヌクレオチドによって引き起こされる（非特許文献１９）。ヒトＭＭＲタンパク質中の変異はマイクロサテライト配列の発生に結びつくことが発見されている（非特許文献１９）。マイクロサテライトは、最大３０回反復する１〜５塩基対のタンデム反復の遺伝子座である。これらの配列は、複製の最中のＤＮＡポリメラーゼのスリップを引き起こす場合があり、鋳型ＤＮＡ鎖又は新生ＤＮＡ鎖中の１つ又は複数のヌクレオチドの小さなループヘテロ二重鎖の形成をもたらす。これらのヘテロ二重鎖の除去の失敗は、続いて起こる各々の複製ラウンドにおいて異なるサイズの対立遺伝子を産生する。これらの対立遺伝子は、欠損ＭＭＲタンパク質と共に癌患者において存在することが示されている（非特許文献２４、非特許文献１９、非特許文献２５）。
【００１２】
ＭＭＲは、ＤＮＡ損傷の存在下において、細胞周期チェックポイント活性化及びアポトーシス開始経路への関連を介してＤＮＡ損傷シグナリングにも関与する（非特許文献２６）。ＭＭＲは多数の変異の蓄積を回避するためにアポトーシスを誘導し、したがってこの系が不在である場合について、抗腫瘍薬剤との相互作用の点から検討された。ＭＭＲ系が損なわれている患者は、腫瘍細胞の破壊における抗腫瘍物質による治療に対してそれほど効果的に反応せず、したがって薬物応答においてＭＭＲ系のアポトーシス誘導が重要であることが示された（非特許文献２７)。
【００１３】
したがってＭＭＲは、ゲノムの安定性の維持において２つの役割を有する：１）ミスマッチを認識及び補正すること、並びに２）変異の蓄積を防止するためにアポトーシスをシグナル伝達すること。
【００１４】
細菌のＭＭＲ系は３つの主要なタンパク質から成り、それらはＭｕｔＨＬＳタンパク質と呼ばれる。ＭｕｔＳはミスマッチ認識で必要とされるＡＴＰアーゼである。ＭｕｔＳはミスマッチ塩基ペアを結合する過程におけるＡＴＰを結合し、加水分解する（非特許文献２８）。ＡＴＰはミスマッチからのＭｕｔＳの遊離を促進する。ＭｕｔＬは、ＭｕｔＳとＭｕｔＨの間の結合の形成において、ミスマッチ修復の開始及び調整によりミスマッチ認識を支援する。このタンパク質のＮ−末端ドメインはＡＴＰアーゼドメインである（非特許文献２９）。ＭｕｔＬの各ドメインは、ＵｖｒＤヘリカーゼ活性及び二本鎖ＤＮＡを一本鎖形式へほどく能力を活性化するために、ＵｖｒＤヘリカーゼと相互作用する。この系の３番目のタンパク質、ＭｕｔＨは、ＭｂｏＩ及びＳａｕ３ＡＩと同様な認識部位のＤＮＡと結合しニックを入れる（非特許文献２８、非特許文献３０、非特許文献３１）。ＭｕｔＨは、協調的及び金属依存的（Ｍｇ２＋）様式で任意のＤＮＡを非特異的に結合する（非特許文献２８)。ＡＴＰとのＭｕｔＬの組み合わせ及び相互作用により、ＭｕｔＨは完全にメチル化されたＤＮＡへより強く特異的に結合する。
【００１５】
ＴＮＥは、とりわけ特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６におけるKmiecの様々な特許出願においても記述されている。特許文献１中で、未修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して得られる遺伝子改変の低効率は、主として反応混合物又は標的細胞中に存在するヌクレアーゼによるドナーオリゴヌクレオチドの分解の結果であると考えられることが検討される。この問題を改善するために、もたらされるオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼに対する耐性を与えるような修飾ヌクレオチドを組み込むことが提案されている。代表例は、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチル−アナログ又はロックされた核酸（ＬＮＡ）を有するヌクレオチドを含む。好ましくは、標的とされる塩基の周囲の中心部ＤＮＡドメインはそのままで、これらの修飾はオリゴヌクレオチドの末端に置かれる。更にこの公報には、変換するオリゴヌクレオチドと変換に関与するタンパク質の間の特異的な化学的相互作用が必要とされることが記述されている。改変過程に関与するタンパク質及びオリゴヌクレオチド置換基との化学的相互作用がまだ知られておらず、特許文献１の発明者らによれば予測することができないので、オリゴヌクレオチド中のＬＮＡ、ホスホロチオエート結合又は２’−Ｏ−メチルアナログの組み込み以外の修飾を使用してヌクレアーゼ耐性末端を産生するためのそのような化学的相互作用の効果を予測することは不可能である。
【００１６】
哺乳類においては、ＤＮＡメチル化の間の関係は細菌におけるほど単純ではない。ＤＮＡ複製の後に、哺乳類ＤＮＡは、親鎖中に一時的な鎖特異的ＣｐＧヘミメチル化を有する（非特許文献３２）。次に維持シトシンメチルトランスフェラーゼにより、ヘミメチル化されたＣｐＧ部位に対する完全なメチル化が回復される。
【００１７】
アクセプターＤＮＡの両方の鎖が脱メチル化される系において、ドナー鎖又はミスマッチを保有するアクセプター鎖に対する選択性は存在しないこともまた既知である。どちらのヌクレオチドも等しい確率で置換される(例えば、非特許文献３３を参照）。
【００１８】
ＯＤＴＮＥの現行方法の効率が比較的低いので（９０％のオリゴヌクレオチドの高送達率が報告されているにもかかわらず、先に述べられたように１０−６から１０−４の間である）、より効率的なＴＮＥのための方法への当技術分野における必要性がある。したがって本発明者らは、既存のＴＮＥ技術についての改善を立案した。
【００１９】
【特許文献１】国際公開第０１／７３００２号
【特許文献２】国際公開第０３／０２７２６５号
【特許文献３】国際公開第０１／８７９１４号
【特許文献４】国際公開第９９／５８７０２号
【特許文献５】国際公開第９７／４８７１４号
【特許文献６】国際公開第０２／１０３６４号
【特許文献７】国際公開第０１／９２５１２号
【特許文献８】国際公開第９２／２０７０２号
【特許文献９】国際公開第９２／２０７０３号
【特許文献１０】国際公開第９３／１２１２９号
【特許文献１１】米国特許第５，５３９，０８２号明細書
【特許文献１２】国際公開第９９／１４２２６号
【特許文献１３】国際公開第００／５６７４８号
【特許文献１４】国際公開第００／６６６０４号
【特許文献１５】国際公開第９８／３９３５２号
【特許文献１６】米国特許第６，０４３，０６０号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，２６８，４９０号明細書
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【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らはここで、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧのような対応する未修飾ヌクレオチドよりも、アクセプターＤＮＡにより強く結合できるヌクレオチドの、ＴＮＥのためのドナーオリゴヌクレオチド中への組み込みによって、ＴＮＥ率を有意に増加できることを見出した。理論により束縛されるものではないが、本発明者らは、ドナーオリゴヌクレオチド中への修飾ヌクレオチドの組み込みにより、ドナーオリゴヌクレオチドがアクセプターＤＮＡにより強く結合し、したがってＴＮＥの比率を増加すると考える。本発明者らはここで、ＴＮＥのために使用される細胞中の脱メチル化されたゲノムＤＮＡの使用は、改善された結合能力を有する修飾ヌクレオチドを（部分的に）含む合成オリゴヌクレオチドの使用と任意で組み合わせて、ＴＮＥ遂行のために改善された方法を提供することを見出した。
【００２１】
ゲノムＤＮＡの脱メチル化は、ＤＮＡ複製の前に生体物質の化学処理を介して、又はメチル化欠損変異体の使用を介して達成することができる。両方の方法により、脱メチル化された親ＤＮＡ鎖がもたらされる。脱メチル化されたゲノムＤＮＡ単独の使用、修飾された合成オリゴヌクレオチド単独の使用、又は両方の組み合わせは、二重鎖又は三重鎖のＤＮＡ構造をもたらし、そこでは親鎖中のミスマッチヌクレオチドの除去、及びオリゴヌクレオチド中にデザインされた計画的なミスマッチ塩基のゲノム中への続いて起こる安定した組み込みは、高い効率で達成される。
【００２２】
したがって本発明はまた、所望の標的化ヌクレオチド交換が、（部分）修飾オリゴヌクレオチドの使用によって達成できる発明の考察に基づいている。オリゴヌクレオチド修飾の場所、タイプ及び量（すなわち、修飾の状態）は、本明細書において以下に開示されるように変更することができる。
【００２３】
したがって１つの態様における本発明は、（（完全）修飾）オリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは植物細胞及び動物細胞又はヒト細胞に特異的な遺伝的変化を導入するために使用することができる。本発明は、生物医学研究の分野、農業、及び特異的に変異させた植物及び動物（ヒトを含む）の作製に適用可能である。本発明は、医学及び遺伝子治療の分野にも適用可能である。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドの配列は、標的鎖中に塩基変化を導入するミスマッチ塩基を含む一部分を除いて、標的鎖に相同である。ミスマッチ塩基は標的配列中へ導入される。ヌクレオチドの修飾（通常のＡ、Ｃ、Ｔ又はＧに比較される）の操作によって、及びより詳細には、ミスマッチを導入するオリゴヌクレオチドの修飾のタイプ、場所及び量の操作によって、及び／又は、オリゴヌクレオチドを挿入可能なＤＮＡ二重鎖の片方の鎖又は両方の鎖のメチル化の程度の操作によって、効率（すなわちＤＮＡ二重鎖中の所望の位置での所望のヌクレオチドの成功した組み込みの程度）を改善できる。
【００２５】
本発明の他の態様は、親鎖と比較して少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと親ＤＮＡ二重鎖を接触することによる、親ＤＮＡ鎖（第１の鎖、第２の鎖）の標的化改変のための方法に属し、この方法においては、ドナーオリゴヌクレオチドは、標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質の存在下において、親（アクセプター）鎖よりも高い結合能力を有するように特定の位置で修飾されたセクションを含み、及び／又は親鎖はより低度にメチル化される。
【００２６】
したがって、本発明の独創的な主旨は、未修飾の挿入オリゴヌクレオチドと比較した挿入オリゴヌクレオチド（時にはドナーと呼ばれる）の結合能力、及び／又は、ＤＮＡ二重鎖（時にはアクセプター鎖と呼ばれる）の片方の鎖又は両方の鎖の修飾（脱メチル化）の改善にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
１つの態様において、本発明は、二重鎖ＤＮＡ塩基配列の標的化改変のためのオリゴヌクレオチドに関する。二重鎖ＤＮＡ塩基配列は第１のＤＮＡ塩基配列及び第２のＤＮＡ塩基配列を含む。第２のＤＮＡ塩基配列は、第１のＤＮＡ塩基配列の相補物であり、二重鎖を形成するために第１のＤＮＡ塩基配列に対合する。オリゴヌクレオチドは、改変される二重鎖ＤＮＡ塩基配列に関して、少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含む。好ましくは、ドメインは、少なくとも１つのミスマッチを含む第１の鎖に対して相補的なオリゴヌクレオチドの一部分である。
【００２８】
好ましくは、ドメイン中のミスマッチは第１のＤＮＡ塩基配列に関してのものである。オリゴヌクレオチドは、第２のＤＮＡ塩基配列（の対応する一部分）よりも高い結合親和性を有する修飾された（代替ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを含んでいる）セクションを含む。特定の実施の形態において、第２のＤＮＡ塩基配列は、オリゴヌクレオチド上のセクション（の対応する一部分）よりも低程度にメチル化される。特定の実施の形態において、ドナー鎖と親鎖間のメチル化に基づいた区別ができないように、アクセプター鎖及び／又はオリゴヌクレオチドは、メチル化されないか、又は同程度までメチル化される。メチル化に関与する任意のメカニズムがもはや２つの鎖を区別することができないので、任意の鎖バイアスを削除し、標的化ヌクレオチド交換を統計過程で処理してもよい。この実施の形態において、任意のＴＮＥは、オリゴヌクレオチド中に組み込まれる修飾ヌクレオチド（ここで修飾はメチル化と等しくない）の効果から発達するだろう。
【００２９】
ミスマッチを含むドメイン、及び修飾ヌクレオチド（複数可）を含むセクションは、オーバーラップしていてもよい。したがって特定の実施の形態において、ミスマッチを含むドメインは、修飾が考慮されるセクションとは異なるオリゴヌクレオチド上の位置に配置される。特定の実施の形態において、上記ドメインは上記セクションを組み込む。特定の実施の形態において、上記セクションは上記ドメインを組み込むことができる。特定の実施の形態において、上記ドメイン及び上記セクションは、オリゴヌクレオチド上の同一の位置に配置され、同一の長さを有しており、すなわち、それらの長さ及び位置は一致する。特定の実施の形態において、上記ドメイン内に２つ以上の上記セクションがある場合がある。
【００３０】
本発明に関しては、これは、ＤＮＡ二重鎖中に組み込まれるミスマッチを含むオリゴヌクレオチドの一部分が、修飾されるオリゴヌクレオチドの一部分から異なる位置に置くことができることを意味する。特に、特定の実施の形態において、鎖のどれがミスマッチを含むか、及びどの鎖が鋳型としてミスマッチの補正に使用されることになっているかを、細胞の修復系（又は少なくともこの系と関連したタンパク質、又は少なくともＴＮＥに関与するタンパク質）が確定する。
【００３１】
特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つの修飾ヌクレオチドを含むセクションを含み、第２の鎖は、セクションの対応する部分よりも、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ少ないメチル化されたヌクレオチドを含む。特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチド上のセクションは、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の修飾ヌクレオチドを含むことができる。特定の実施の形態において、セクションは完全に修飾される。特定の実施の形態において、第２の鎖は、少なくともオリゴヌクレオチドの位置で（又は第１の鎖に相補的なセクションの長さにわたって）メチル化されない。
【００３２】
特定の実施の形態において、２つ以上のミスマッチは、同時に又は連続的のいずれかで導入することができる。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド上の隣接する場所又は離れた場所に２つ以上のミスマッチを包含することができる。特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドは、隣接又は遠隔の（すなわち非隣接の）２、３、４又はそれ以上のミスマッチヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、複数のミスマッチヌクレオチドを包含するために、さらなるドメイン及びセクションを含むことができ、特にいくつかのセクションを含むことができる。特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドは、アクセプター鎖に挿入される可能性のあるインサートを組み込んでもよい。そのようなインサートは６以上から最大１００ヌクレオチド長で変化してもよい。特定の実施の形態における類似した方法において、類似した長さの変動（１〜１００のヌクレオチド）の欠失を導入することができる。
【００３３】
本発明のさらなる態様において、オリゴヌクレオチドのデザインは以下によって達成することができる：
−アクセプター鎖、又は交換されるヌクレオチドの周囲の少なくとも１つの配列セクションの配列を決定する。これは、典型的には、好ましくはミスマッチの各々の側でミスマッチに隣接する少なくともほぼ１０ヌクレオチド程度、好ましくは１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド又は３０ヌクレオチドであり得る（例えばＧＧＧＧＧＧＸＧＧＧＧＧＧ、ここでＸはミスマッチである）；
−ミスマッチに隣接する１つ又は両方のセクションに対して相補的で、交換される所望のヌクレオチドを含むドナーオリゴヌクレオチドをデザインする（例えばＣＣＣＣＣＣＹＣＣＣＣＣＣ）；
−所望の位置での修飾を有するドナーオリゴヌクレオチドを（例えば合成によって）提供する。修飾は状況に依存して、大きく変化してもよい。実施例は、ＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＹＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍ、ＣｍＣＣｍＣＣｍＣＹＣｍＣＣｍＣＣｍＣ、ＣＣＣＣＣＣＹＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍ、ＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＹＣＣＣＣＣＣ、ＣＣＣＣＣＣｍＹＣｍＣＣＣＣＣ、ＣｍＣＣＣＣＣＹＣｍＣＣＣＣＣ、ＣｍＣＣＣＣＣＹＣＣＣＣＣＣｍ、ＣｍＣＣＣＣＣＹＣＣＣＣＣＣ等であり、ここで、Ｃｍは修飾ヌクレオチド残基を表わす。異なるアクセプター配列（例えばＡＴＧＣＧＴＡＣＸＧＴＣＣＡＴＧＡＴ）に関しては、上で概要を述べられたような可変的な修飾により、対応するドナーオリゴヌクレオチド（例えばＴＡＣＧＣＡＴＧＹＣＡＧＧＴＡＣＴＡ）をデザインすることができる；
−標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質、例えば、及び特に、細胞のミスマッチ修復機構において機能的なタンパク質の存在下におけるドナーオリゴヌクレオチドによりＤＮＡを修飾する。
【００３４】
オリゴヌクレオチドの送達は、核又は細胞質のいずれかに送達することができるエレクトロポレーション又は他の従来の技術を介して達成することができる。本発明の方法のインビトロ検査は、なかでも、特許文献３、特許文献２、特許文献４、特許文献７に記述されているように、無細胞系を使用して達成することができる。
【００３５】
本明細書において使用されるように、ＴＮＥに影響を及ぼすドナーオリゴヌクレオチドの能力は、ドナーオリゴヌクレオチド中に組み込まれる修飾ヌクレオチドのタイプ、場所及び量に依存する。この能力は、例えば、通常のヌクレオチド間の結合親和性（又は結合エネルギー（ギブスの自由エネルギー））を１で正規化すること（すなわちＡＴ及びＧＣの結合の両方に関しては、結合親和性が１で正規化される）によって、定量することができる。本発明のオリゴヌクレオチドに関しては、各修飾ヌクレオチドの相対的結合親和性（ＲＢＡ）は＞１である。これは以下のような数１式に例示される：
【００３６】
【数１】
2009520495.tif 000002
【００３７】
式中、ＲＢＡは総相対的結合親和性であり、ＲＢＡ（修飾）は、ｎヌクレオチド長の修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合親和性の合計であり、ＲＢＡ（未修飾）は、ｍヌクレオチド長の未修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合親和性の合計である。例えば、１００ｂｐオリゴヌクレオチドは、各々１．１の相対的な結合親和性で、１０の修飾を含んでいる。次に、総ＲＢＡは次の式：ＲＢＡ＝［（１０×１．１）＋（９０×１．０）］−（１００×１．０）＝１に等しい。
【００３８】
ＲＢＡの定義が原則として、比較されるヌクレオチド鎖長に非依存的であることに注目されたい。しかしながら異なる鎖のＲＢＡが比較される場合、鎖がほぼ同一の長さを有するか、又は同等の長さのセクションが採用されることが好ましい。ＲＢＡは、鎖上の修飾がグループ化できることを考慮に入れないことに注目されたい。したがって鎖Ｂと比較される特定の鎖Ａのより高度な修飾は、ＲＢＡ（Ａ）＞ＲＢＡ（Ｂ）を意味する。上流セクション及び下流セクションに関しては、対応する（局所的）ＲＢＡ値が定義され使用されてもよい。修飾ヌクレオチドの位置の効果を包含するために、重み付け係数をＲＢＡ値へ導入することができる。例えば、ミスマッチに隣接するドナーオリゴヌクレオチド上の修飾ヌクレオチドの効果は、ミスマッチから５ヌクレオチド離れた距離で配置された修飾ヌクレオチドよりも大きくなり得る。本発明の文脈において、ＲＢＡ（ドナー）＞ＲＢＡ（アクセプター）である。
【００３９】
特定の実施の形態において、ドナーのＲＢＡ値は、アクセプターのＲＢＡ値よりも少なくとも０．１大きくてもよい。特定の実施の形態において、ドナーのＲＢＡ値は、アクセプターのＲＢＡ値よりも少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５大きくてもよい。ＲＢＡ値は、分子モデル化、熱力学的測定等により、ヌクレオチドの修飾された結合親和性の従来の分析から導き出され得る。或いは、それらは、修飾鎖と未修飾鎖とのＴｍ値差の測定により決定することができる。或いはＲＢＡ値は、１セットのヌクレオチドのＴｍ値の計算のための従来の式を使用する計算若しくは測定、又は計算及び測定の組み合わせのいずれかによって、未修飾鎖と修飾鎖とのＴｍ値の差として表わすことができる。
【００４０】
本発明に記載のドナーオリゴヌクレオチドは、ドナーが標的ＤＮＡ鎖への親和性の増加を示すことでドナーの挿入がより容易になるように、ハイブリダイゼーション特性を改善するための修飾を含んでもよい。ドナーオリゴヌクレオチドは、三重鎖構造又は四重鎖構造を安定させるために、ヌクレアーゼに対してもより耐性を持つようにさらに修飾され得る。ドナーオリゴヌクレオチドの修飾は、ホスホロチオエート修飾、２−ＯＭｅ置換、ＬＮＡ（ロックされた核酸）の使用、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、リボヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドとアクセプター鎖との間のハイブリッドの安定性を修飾、好ましくは促進する他の塩基を含むことができる。
【００４１】
そのような修飾の中で特に有益なのは、ＰＮＡであり、それらはオリゴヌクレオチドのデオキシリボース骨格がペプチド骨格と置換される、オリゴヌクレオチドアナログである。そのようなペプチド骨格の１つは、アミド結合を経て結合するＮ−（２−アミノエチル）グリシンの反復単位から構築される。ペプチド骨格の各サブユニットは、核酸塩基（「塩基」とも呼ばれる）へ結合され、それは天然に存在する塩基、天然に存在しない塩基又は修飾塩基であってもよい。ＰＮＡオリゴマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかよりも高い親和性で、相補的なＤＮＡ又はＲＮＡへ配列特異的に結合する。したがって、もたらされるＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖又はＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、より高い融解温度（Ｔｍ値）を有する。さらに、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖又はＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＴｍ値は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖又はＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖よりも塩濃度に対してそれほど影響を受けない。ＰＮＡのポリアミド骨格は、酵素分解に対しても耐性が高い。ＰＮＡの合成は、例えば、特許文献８及び特許文献９に記述されており、それらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。他のＰＮＡは、例えば、特許文献１０及び１９９６年７月２３日に発行された特許文献１１において示され、それらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。さらに、多くの科学的な出版物には、ＰＮＡの特性及び用途だけでなく、それらの合成も記述される。例えば、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９、非特許文献３６の第1895頁及び第9677頁を参照されたい。
【００４２】
有益な修飾もスーパーＡ（Super A）及びスーパーＴ（Super T）として既知であり、ドイツのエポック・バイオサイエンス（Epoch Biosciences）社から入手可能である。これらの修飾ヌクレオチドがＤＮＡ二重鎖中の塩基の積み重ねを改善すると考えられる、ＤＮＡの主溝の中へとどまる付加的な置換基を含む（図４参照）。
【００４３】
有用な修飾は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）として既知の合成分子クラスからの１つ又は複数のモノマーも含む。ＬＮＡは、二環式及び三環式のヌクレオシドアナログ及びヌクレオチドアナログ、並びにそのようなアナログを含んでいるオリゴヌクレオチドである。ＬＮＡ及び関連したアナログの基本構造的及び機能的な特性は、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、及び特許文献１７を含む、様々な公報及び特許中に開示され、それらのすべては、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００４４】
本発明のドナーオリゴヌクレオチドはキメラとして、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ又はその組み合わせのセクションを含むものとしても作製することができる。
【００４５】
したがって特定の実施の形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、他の（任意に非メチル化した）修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【００４６】
特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対して耐性を持つ。これはオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼによる分解を防止するのに有利であり、ドナーオリゴヌクレオチドが標的（アクセプター分子）を発見できる可能性を大きくする。
【００４７】
下記の表１及び表１−１は、ＤＮＡ結合親和性の増加及び／又はヌクレアーゼ分解抵抗性の増加を示すヌクレオチドの選択を示す。
【００４８】
【表１】
2009520495.tif 000003
【００４９】
【表１−１】
2009520495.tif 000004
【００５０】
ホスホロチオエート結合
市販で入手可能なヌクレオチド修飾の多くは、遺伝子治療に対するアンチセンスの適用における使用のために開発されている。アンチセンス適用（「第一世代」アンチセンスオリゴヌクレオチド）に利用可能な最も単純で最も広く用いられているヌクレアーゼ耐性の化学作用は、ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾である。これらの分子において、硫黄原子は、オリゴヌクレオチドリン酸骨格の非架橋酸素を置換し（図３ａ）、エンドヌクレアーゼ活性及びエキソヌクレアーゼ活性に対する耐性をもたらす。遺伝子治療のためには、ホスホロチオエート／ホスホジエステルのキメラは、一般に、未修飾ＤＮＡの中心部コアと共に、５’末端及び３’末端の両方で１〜４つのＰＳに修飾されるヌクレオシド間結合を有する。しかしながら、ホスホロチオエート結合を、オリゴヌクレオチドの任意の所望の位置で組み込むことができる。
【００５１】
６−クロロ−２−メトキシアクリジン
どちらかの末端で又は配列中に６−クロロ−２−メトキシアクリジン分子を持つオリゴヌクレオチドは、二重らせんの中への効率的な挿入能を有する。６−クロロ−２−メトキシアクリジン基は、リン酸骨格の遊離水酸基のうちの１つに連結される（図３ｃ）。したがってアクリジン標識オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドハイブリッドの安定性の増加が重大である適用において使用することができる。３’末端への修飾の付加も、エキソヌクレアーゼ分解からオリゴヌクレオチドを保護する。これらのオリゴヌクレオチドは、三重鎖ヘリックス形成能及び、相対的な疎水性に起因して正常オリゴヌクレオチドよりも容易な膜通過能を有する。
【００５２】
メチルホスホネート
メチルホスホネートは、天然に存在する負に荷電したホスホジエステル結合の代わりに、メチルホスホネート結合を含んでいる核酸アナログである（図３ｂ）。これらのアナログは非イオン性かつ疎水性であり、受動拡散を介して哺乳類細胞により組み込まれる。それらの融解温度は、塩条件に対してそれほど影響を受けやすくはない。それらは、ｍＲＮＡのレベルで、ウイルス又は細胞の遺伝子発現を特異的に制御できる効果的なアンチセンス試薬であることが見出された。メチルホスホネートは、標準的なワトソン−クリック塩基対相互作用によって相補的な核酸と二重鎖ハイブリッドを形成する。メチルホスホネート骨格は、ヌクレアーゼ分解に対して完全に耐性である。
【００５３】
ロックされた核酸
ロックされた核酸（ＬＮＡ）は、アンチセンス遺伝子治療で使用される非常に興味深い特性を備えたＤＮＡアナログである。具体的には、ＬＮＡは、非常に高い生物安定性（低ターンオーバー）及び前例のない親和性（標的への非常に高い結合強度）と、正確な標的と不正確な標的を区別する能力（高い特異性）を兼ね備える。実際、ＬＮＡで記録された親和性増加は、先に報告された低値から中等値の範囲のすべてのアナログの親和性を追い越すものである。
【００５４】
ＬＮＡは、２’−酸素原子と４’−炭素原子との間のメチレン架橋によりリボースが構造的に制限されるＲＮＡアナログである（図４）。この架橋は、リボフラノース環の柔軟性を限定し、固定した二環式形成へと構造をロックする。このいわゆるＮ型（すなわち３’−エンド）コンフォーメーションは、ＬＮＡを含む二重鎖のＴｍ値の増加、並びに結果的に、より高い結合親和性及びより高い特異性をもたらす。ＮＭＲスペクトル研究は、ＬＮＡ糖のロックされたＮ型コンフォーメーションを実際に実証しただけでなく、ＬＮＡモノマーがＮ型コンフォーメーションに向かってそれらの隣接する未修飾ヌクレオチドをねじることができることを明らかにした。重要なことには、ＬＮＡの好ましい特性は、核酸アナログでしばしば観察されるように、他の重要な特性を犠牲にして成り立つというものではない。
【００５５】
ＬＮＡは、ＤＮＡアナログ集団を構成する他のすべての化学物質と自由に混合することができる。ＬＮＡ塩基は短い全ＬＮＡ配列、又はより長いＬＮＡ／ＤＮＡキメラとして、オリゴヌクレオチド中へと組み込むことができる。ＬＮＡは、内部、３’−位又は５’−位に配置することができる。しかしながら、それらの固定した二環式コンフォーメーションのために、ＬＮＡ残基は、時には核酸鎖のらせんのねじれを妨害する。したがって一般には、２つ又は複数の近接するＬＮＡ残基を有するオリゴヌクレオチドのデザインは、あまり好ましくない。好ましくは、ＬＮＡ残基は、らせんのねじれを妨害しない通常のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）のような少なくとも１つの（修飾された）ヌクレオチドにより隔てられる。
【００５６】
もともと開発されたＬＮＡモノマー（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマー）は、新しいＬＮＡモノマーへと修飾された（図４）。新規α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡは、３’エキソヌクレアーゼ活性に対する優れた安定性を示し、さらに性能の高いアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザインにおいては、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡよりも有力であり、用途が広い。特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４号において開示されるように、キシロ−ＬＮＡ及びＬ−リボ−ＬＮＡもまた使用することができる。
【００５７】
メチル化ヌクレオチド、プロピニル化ヌクレオチド及びアミノ化ヌクレオチド
シトシンＣ５原子のメチル化は天然に存在するＤＮＡのＣ−メチル化である（植物において５’−ｍＣＧ−３’及び５’−ｍＣＮＧ−３’、並びに原核生物において５’−ＣｍＣＮＧＧ−３’）。メチル化の生物学的機能とは別に、その化学的効果は、二重鎖形成のＴｍ値における１メチル化シトシン当たり１．３℃の上昇である。もっぱらオリゴヌクレオチドの二重鎖安定性を増加するために、オリゴヌクレオチド中にそのようなメチル化Ｃ残基（５−メチル−デオキシシトシン、図５ａ）を組み込んでもよい。
【００５８】
さらにより高い熱安定性が、Ｃ５位でのプロピニル基（三重結合を有する３−Ｃ鎖）により得られる（図５ｂ）。単一のＣ５−プロピニル−シトシン残基はＴｍ値を２．８℃、単一のＣ５−プロピニル−チミジン残基はＴｍ値を１．７℃増加する。
【００５９】
他の一般に記述されるヌクレオチド修飾（アンチセンスオリゴヌクレオチドの「第２の世代」）は、ＲＮＡ残基の２’−Ｏメチル化である。このメチル化は、エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を提供し、ＲＮＡヌクレオチドのうちのいずれかに対しても適用することができる。図５ｃにおいて、二重にメチル化された分子は、リボシル２’−Ｏ及びシトシンＣ５の両方でのメチル基を保有することが示される。この分子、２’−Ｏ−メチル−５−メチル−リボシチジン（２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−Ｃ）は、結合親和性の増加及びエキソヌクレアーゼ抵抗性の両方を有する。
【００６０】
最も高い熱安定性増加が、２’−アミノ化アデノシン残基について記述されてきた。これらのいわゆる２−アミノ−Ａ分子（図５ｄ）は外部に面する環での追加のＮＨ２基を保有し、アデニンがチミジンと３つの（２つではない）水素結合を形成することを可能にし、それは各々の単一の２−アミノ−Ａ残基についてＴｍ値を３．０℃増加する。
【００６１】
シクロヘキセン核酸
シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）は、五員フラノース環が六員環と置換されたヌクレオチドである（図６）。このことは、オリゴマーの高度の構造的な硬さをもたらす。ＣｅＮＡは、ＲＮＡ及びＤＮＡと安定した二重鎖を形成し、核酸分解に対して保護する。ＣｅＮＡのＲＮＡへの結合親和性がＤＮＡに対してよりもはるかに高いので、及びＣｅＮＡ／ＲＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅのＨ分解を活性化するので、この分子は治療上のアンチセンス研究に対する第一候補である。
【００６２】
本発明の特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドは、ミスマッチの位置で修飾され得る。ミスマッチを修飾することができるかどうかは、ドナー鎖とアクセプター鎖と間の親和性の差を使用して、標的化ヌクレオチド交換の正確なメカニズム又は細胞のＤＮＡ修復メカニズムに大いに依存するだろう。ミスマッチの傍又は周辺にある他の修飾位置の正確な場所の場合にも同じことが言える。しかしながら、本明細書において示された開示に基づいて、そのようなオリゴヌクレオチドは容易にデザインすることができ、本明細書において別に記述されるような適切なオリゴヌクレオチドに対する試験手順を考慮して検査した。特定の実施の形態において、ミスマッチの位置でヌクレオチドは修飾されない。特定の実施の形態において、修飾はミスマッチに対して近接し、好ましくはミスマッチから２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド又は７ヌクレオチド以内にある。特定の実施の形態において、修飾はミスマッチから下流の位置にある。特定の実施の形態において、修飾はミスマッチから上流の位置にある。特定の実施の形態において、修飾は、ミスマッチから１０ｂｐ〜１０ｋＢ、ミスマッチから好ましくは５０〜５０００ｂｐ、より好ましくは１００〜５００ｂｐにある。
【００６３】
ドナーとして使用されるオリゴヌクレオチドの長さは変化させることができるが、一般に１０〜５００ヌクレオチド長、好みにより１１〜１００ヌクレオチド長、好ましくは１５〜９０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜７０ヌクレオチド長、最も好ましくは３０〜６０ヌクレオチド長で変化させることができる。
【００６４】
１つの態様において、本発明は、ドナーオリゴヌクレオチドと二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列を組み合わせることを含む、二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列の標的化改変のための方法であって、二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列が、第１のＤＮＡ塩基配列、及び第１のＤＮＡ塩基配列の相補物である第２のＤＮＡ塩基配列を含み、ドナーオリゴヌクレオチドが、改変される二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列に関して、好ましくは第１のＤＮＡ塩基配列に関して、少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含み、ドナーオリゴヌクレオチドのセクションが、オリゴヌクレオチド中のその位置での未修飾ヌクレオチドと比較して、第１のＤＮＡ塩基配列に対してより高親和性を示すように修飾されており、及び／又は第２のＤＮＡが、標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質の存在下においてドナーオリゴヌクレオチドの対応するセクションよりも低メチル化度にメチル化される、二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列の標的化改変のための方法に関する。
【００６５】
本発明は、最も広範囲の形式で、ヒト、動物、植物、魚類、爬虫類、昆虫、真菌及び細菌等のすべての種類の生物に一般的に適用可能である。本発明は、ゲノムＤＮＡ、線状ＤＮＡ、人工染色体、核の染色体ＤＮＡ、オルガネラ染色体ＤＮＡ、ＢＡＣ、ＹＡＣに由来するＤＮＡのような、任意のタイプのＤＮＡの修飾に対して適用可能である。本発明は、エクスビボだけでなくインビボで行なうことができる。
【００６６】
本発明は、最も広範囲の形式で、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾等の多くの目的に対して適用可能である。
【００６７】
上述されるように、本発明は、本質的には、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾、ミスマッチ修復、遺伝子変異を含む（植物）遺伝物質の標的化改変、標的化遺伝子修復及び遺伝子ノックアウトのためのオリゴヌクレオチドの使用にも関する。
【００６８】
さらに本発明は、本明細書における他の部分で定義されるような、ＭＲＭの誘導が可能な、特にＴＮＥが可能なタンパク質と任意で組み合わせた、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。
【００６９】
さらに本発明は、本発明の方法によって得られる修飾された遺伝物質に、修飾された遺伝物質を含む細胞及び生物に、そのようにして得られる植物又は植物の一部分に関する。
【００７０】
特定の実施の形態において、例えばゲノムＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを含む培養物若しくはＴＮＥにさらされるゲノムＤＮＡを含む他の生体物質を、アザシチジンを使用する方法のような通常の脱メチル化処理にさらすことによって、ゲノムＤＮＡはＴＮＥの前に脱メチル化することができる。
【００７１】
本発明の特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドが１つ又は複数のＬＮＡ残基、好ましくはミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置された１つのＬＮＡ残基を含む場合、標的化ヌクレオチド交換率における有意な増加（２００〜８００％）が達成されることが見出された。好ましくはオリゴヌクレオチドは、ミスマッチのどちらかの側に、好ましくは各々は独立してミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置された２つ又は複数の、好ましくは２つのＬＮＡを含む。言いかえれば、本発明の好ましい実施の形態において、少なくとも１つ、好ましくは１つのＬＮＡは、ミスマッチの各側に、好ましくは独立してミスマッチから少なくとも１塩基対の位置にある。これは以下のように図式的に示すことができる：Ｌ−Ｎ−Ｍ−Ｎ−Ｌ、ここでＬ＝１つ又は複数の、好ましくは１つのＬＮＡ残基であり；Ｎは、Ｍの各側に独立して、１つの正常ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）、又はジヌクレオチド（すなわち２つのヌクレオチド）若しくはトリヌクレオチド（すなわち３つのヌクレオチド）であり；Ｍはミスマッチの位置を表わす。したがって、特定の好ましい実施の形態において、ミスマッチに隣接するＬＮＡ残基は、互いから３塩基対又は４塩基対で置かれる。
【００７２】
本発明の特定の他の実施の形態において、標的化ヌクレオチド交換率の有意な増加は、１つ又は複数の５−プロピニル化ヌクレオチドを使用して達成されることが見出された。プロピニル化ヌクレオチドは、ミスマッチに隣接した位置で配置されてもよいし、又はミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置されてもよい。好ましくはオリゴヌクレオチドは、好ましくはミスマッチのどちらかの側に配置された、好ましくは各々独立して隣接して又はミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置された、２つ又は複数の、好ましくは２つの５−プロピニル化ヌクレオチドを含む。言いかえれば、本発明の好ましい実施の形態において、少なくとも１つの、好ましくは１つの５−のプロピニル化ヌクレオチドは、ミスマッチの各側に、好ましくは独立してミスマッチに近接する位置で配置されるか、又はミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置される。これは以下のように図式的に示すことができる：Ｐ−Ｎ−Ｍ−Ｎ−Ｐ、ここで、Ｐ＝１つ又は複数の５−プロピニル化ヌクレオチド残基、好ましくは１つの５−プロピニル化ヌクレオチド残基であり；Ｎは、Ｍの各側に独立して、０若しくは１つの正常ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）又はジヌクレオチド（すなわち２つのヌクレオチド）若しくはトリヌクレオチド（すなわち３つのヌクレオチド）であり；Ｍはミスマッチの位置を表わす。したがって、特定の好ましい実施の形態において、ミスマッチに隣接する５−プロピニル化ヌクレオチド残基は、互いから１塩基対（すなわちミスマッチ自体）、２塩基対、３塩基対又は４塩基対で置かれる。特定の好ましい５−プロピニル化ヌクレオチドは、５−プロピニル−２−デオキシシチジン及び／又は５−プロピニル−２−デオキシウラシルである。５−プロピニル化ヌクレオチドは組み合わせて使用されてもよく、すなわち特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドは５−プロピニル−２−デオキシシチジン単独、５−プロピニル−２−デオキシウラシル単独又は両方の組み合わせのいずれかを含んでもよい。
【００７３】
本発明の特定の他の実施の形態において、標的化ヌクレオチド交換率の有意な増加は、Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジンを使用して達成されることが見出された。
【００７４】
Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジンはミスマッチに隣接した位置で配置されてもよいし、又はミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置されてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、好ましくはミスマッチのどちらかの側に配置され、好ましくは各々独立して隣接して又はミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置された、２つ又は複数の、好ましくは２つのＮ４−エチル−２’−デオキシシチジンを含む。言いかえれば、本発明の好ましい実施の形態において、少なくとも１つの、好ましくは１つのＮ４−エチル−２’−デオキシシチジンは、ミスマッチの各側に、好ましくは、独立してミスマッチに近接する位置で配置されるか、又はミスマッチから少なくとも１塩基対の距離で配置される。これは以下のように図式的に示すことができる：Ｄ−Ｎ−Ｍ−Ｎ−Ｄ、ここで、Ｄ＝１つ又は複数のＮ４−エチル−２’−デオキシシチジン残基、好ましくは１つのＮ４−エチル−２’−デオキシシチジン残基であり；Ｎは、Ｍの各側に独立して、０若しくは１つの正常ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）又はジヌクレオチド（すなわち２つのヌクレオチド）若しくはトリヌクレオチド（すなわち３つのヌクレオチド）であり；Ｍはミスマッチの位置を表わす。したがって、特定の好ましい実施の形態において、ミスマッチに隣接するＮ４−エチル−２’−デオキシシチジン残基は、互いから１塩基対（すなわちミスマッチ自体）、２塩基対、３塩基対又は４塩基対で置かれる。
【００７５】
理論により束縛されるものではないが、本明細書において他の部分で述べられるように、ＴＮＥの効率が、正常ＤＮＡと比較して特性を改変した新規ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中への組み込みによって改善できることを、出願人は確信する。ＴＮＥにとって重要であると考えられる特性は以下のとおりである：（１）ヌクレアーゼ抵抗性、その結果オリゴヌクレオチドは植物細胞中で損なわれないままであり、及び（２）高結合親和性、したがってオリゴヌクレオチドが相同標的を見つけて結合したままである可能性を増加する。同様に重要なこととして考慮される１つの他のパラメーターは、オリゴヌクレオチド二次構造を最小限にすることである。オリゴヌクレオチド自体の内部の小さな相補的な領域は、核へのオリゴヌクレオチド輸送、オリゴヌクレオチドの標的の発見又はＴＮＥ反応自体を阻害するヘアーピンループ構造をもたらすことが可能である。
【実施例】
【００７６】
タバコにおけるＡＬＳ遺伝子の標的化ヌクレオチド交換
タバコ芽の培養
この実施例のための原材料はタバコＳＲｌのインビトロの芽の培養物である。それらを、２５／２０℃（昼間／夜間）の温度、及び１６／２４時間の光周期の８０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の光量子束密度で、増殖チャンバー内のＭＳ２０培地中で、大きなガラスジャー（７５０ｍｌ容量）において無菌の条件下で増殖させる。ＭＳ２０培地は、２％（ｗ／ｖ）ショ糖含有、ホルモン無添加、及び０．８％のディフコ（Difco）アガー含有のムラシゲ−スクーグ基本培地（非特許文献４２）である。その芽を、３週間ごとに新しい培地へ継代培養する。
【００７７】
アザシチジンによる脱メチル化
プロトプラスト単離の２週間の前に、タバコのインビトロの芽の培養物を、標的遺伝子座ＤＮＡを脱メチル化するために、７５μｇ／ｍｌの５−アザシチジンを含むＭＳ２０培地上で継代培養する。
【００７８】
プロトプラスト単離
葉肉プロトプラストの単離のために、３〜６週間齢の芽の培養植物の完全に展開した葉を採取する。葉を、下層表皮を通って中央脈から外へ１ｍｍの薄い小片へと注意深くスライスする。スライスした葉を、３０分の前原形質分離処理のための４５ｍｌのＭＤＥ基本培地を含む大きな（１００ｍｍ×１００ｍｍ）シャーレへ移す。ＭＤＥ基本培地は、９００ｍｌの全容量中に、０．２５ｇのＫＣｌ、１．０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１３６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのポリビニルピロリドン（分子量１００００）、６ｍｇのナフタレン酢酸及び２ｍｇの６−ベンジルアミノプリンを含んでいた。溶液の浸透圧をソルビトールにより６００ｍＯｓｍ・ｋｇ−１へ調整し、ｐＨは５．７とした。
【００７９】
前原形質分離後に、５ｍｌの酵素ストックを各シャーレへ追加する。酵素ストックは、１００ｍｌ当たり、７５０ｍｇのセルラーゼオノズカＲ１０、５００ｍｇのドリセラーゼ及び２５０ｍｇのマセロザイムＲ１０から成り、ワットマン紙上でろ過し、フィルター滅菌する。シャーレを、細胞壁を消化するために、振盪なしで２５℃、暗中で一晩密閉してインキュベートする。
【００８０】
翌朝、シャーレをプロトプラストの放出のために穏やかに旋回する。プロトプラスト懸濁液を２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコの中へ５００μｍ及び１００μｍのふるいを通してろ過し、等容量のＫＣｌ洗浄液と混合し、及び１０分間８５×ｇで５０ｍｌのチューブ中で遠心分離する。ＫＣｌ洗浄液は、１リットル当たり２．０ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ及び浸透圧を５４０ｍＯｓｍ・ｋｇ−１にする量のＫＣｌから成っていた。
【００８１】
遠心分離沈殿から回収したプロトプラストを、ＭＬｍ洗浄液中で再懸濁し、１０ｍｌのガラス管中で１０分間８５×ｇでもう一度遠心分離する。ＭＬｍ洗浄培地は、正常濃度の２分の１でＭＳ培地（参照）の多量養素、１リットル当たり２．２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ及び浸透圧を５４０ｍＯｓｍ・ｋｇ−１にする量のマンニトールを含んでいた。
【００８２】
この第２の遠心分離工程の沈殿から回収されたプロトプラストを、ＭＬｓ洗浄培地中で再懸濁し、１０ｍｌのガラス管中で１０分間８５〜１００×ｇで再び遠心分離する。ＭＬｓ洗浄培地は、正常濃度の２分の１でＭＳ培地（参照）の多量養素、１リットル当たり２．２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ及び浸透圧を５４０ｍＯｓｍ・ｋｇ−１にする量のショ糖を含んでいた。
【００８３】
プロトプラストは浮遊バンドから回収され、等容量のＫＣｌ洗浄液中で再懸濁する。それらの密度を血球計数器を使用してカウントする。続いてプロトプラストを、５分間８５×ｇで１０ｍｌのガラス管中で再び遠心分離し、沈殿をエレクトロポレーション培地中で１ｍｌ当たり１×１０５プロトプラストの密度で再懸濁する。すべての溶液を無菌に保ち、すべての操作を無菌条件下で行う。
【００８４】
ＡＬＳ標的遺伝子及び一本鎖オリゴヌクレオチドのデザイン
タバコのアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）ＳｕｒＡ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０７６４４）におけるアミノ酸変換Ｐ１９４Ｑにより、ＡＬＳタンパク質は、スルホニル尿素除草剤のクロルスルフロンに対して非感受性になる。一本鎖オリゴヌクレオチドＮｔＡＬＳＰｌ９４Ｑは、ＴＮＥによってタバコＡＬＳ遺伝子で単一のヌクレオチド変化を導入するモデルとして使用することができる。
【００８５】
ＮｔＡＬＳＰ１９４Ｑ
５’  ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ  ３’［配列番号：１］
５’末端からの位置４８のミスマッチヌクレオチドに下線が引かれている。
【００８６】
プロトプラストエレクトロポレーション
エレクトロポレーション培地としてＰＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；０．２Ｍマンニトール、１５０ｍＭ  ＮａＣＬ；５ｍＭ  ＣａＣＬ２）及びエレクトロポレーション中の培地中での約１×１０６／ｍｌの密度のプロトプラストを使用して、エレクトロポレーションの設定は、パルスと培養の間の回復時間が１０分で、２５０Ｖ（６２５Ｖｃｍ−１）チャージ及び８００μＦキャパシタンスである。各エレクトロポレーションのために、約１〜２μｇのオリゴヌクレオチドを使用し、８００マイクロリットルのエレクトロポレーション当たり２０μｇのプラスミド＝２５μｇ／ｍｌである。
【００８７】
プロトプラスト再生及びクロルスルフロン選択
エレクトロポレーション処理後に、プロトプラストを回復させるために３０分間氷上に置く。次に１ｍｌ当たり１×１０５プロトプラストの密度で、Ｔ０培養培地中に再懸濁する。Ｔ０培養液は、９５０ｍｇのＫＮＯ３、８２５ｍｇのＮＨ４ＮＯ３、２２０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１８５ｍｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、８５ｍｇのＫＨ２ＰＯ４、２７．８５ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３７．２５ｍｇのＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、ヘラー培地（非特許文献４１）に従う微量養素、モレル−ウェットモア培地に従うビタミン（非特許文献４２）、２％（ｗ／ｖ）ショ糖、３ｍｇのナフタレン酢酸、１ｍｇの６−ベンジルアミノプリン及び浸透圧を５４０ｍＯｓｍ・ｋｇ−１にする量のマンニトールを含んでいた（１リットル当たり、ｐＨ５．７）。
【００８８】
次にＴ０培養液中に再懸濁したプロトプラストを、Ｔ０培養液中の１．６％のシープラーク（SeaPlaque）低融点アガロースの溶液の等容量と混合し、オートクレーブ滅菌後に水浴中３０℃で液体状態にしておく。混合後に、懸濁液を、５ｃｍのシャーレ中へ２．５ｍｌの一定分量で穏やかにピペットで移す。ディッシュを密閉し、暗中で２５／２０℃（１６／２４時間の光周期）でインキュベートする。
【００８９】
暗中で８〜１０日のインキュベーション後に、アガロース培地を６等分のパイ形部分へと切断し、２２．５ｍｌの液体ＭＡＰ１ＡＯ培地を各々含む１０ｃｍのシャーレへ移す。この培地は、９５０ｍｇのＫＮＯ３、８２５ｍｇのＮＨ４ＮＯ３、２２０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１８５ｍｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、８５ｍｇのＫＨ２ＰＯ４、２７．８５ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３７．２５ｍｇのＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、もとの濃度の１０分の１でムラシゲ−スクーグ培地（非特許文献４３）に従う微量養素、モレル−ウェットモア培地（非特許文献４２）に従うビタミン、６ｍｇのピルビン酸、各々１２ｍｇでリンゴ酸、フマル酸及びクエン酸、３％（ｗ／ｖ）ショ糖、６％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０３ｍｇのナフタレン酢酸及び０．１ｍｇの６−ベンジルアミノプリンから成っていた（１リットル当たり、ｐＨ５．７）。成功した塩基変換のコロニー選択の目的のために、４１ｎＭのクロルスルフロンも培地へ追加する。シャーレを、１６／２４時間の光周期で微小光（２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の光量子束密度）において２５／２０℃でインキュベートする。２週間後に、シャーレを強光（８０μＥ・ｍ−２・ｓ−１）へ移す。選択のこの期間の間に、大部分のプロトプラストは消滅した。オリゴヌクレオチドの作用を介して、除草剤に対する耐性を付与するように標的遺伝子中で塩基変化が起こったプロトプラストのみが、プロトプラストに由来するミクロコロニーへと分裂し増殖する。
【００９０】
単離の６〜８週間後に、プロトプラスト由来コロニーをＭＡＰ１培地へ移す。アガロースビーズは、この時までに、無菌の広口ピペットでミクロコロニーを移せるほど十分にばらばらになるか、そうでなければピンセットで個別に移す。ＭＡＰ１培地はＭＡＰ１ＡＯ培地と同様な組成であるが、６％（ｗ／ｖ）マンニトールの代わりに３％マンニトール、及び４６．２ｍｇ・ｌ−１ヒスチジン（ｐＨ５．７）を含む。ＭＡＰ１培地を０．８％（ｗ／ｖ）ディフコアガーで凝固させた。
【００９１】
この固形培地上での２〜３週間の増殖後に、１０ｃｍのシャーレ当たり５０コロニーで、コロニーを再生培地ＲＰへ移す。ＲＰ培地は２７３ｍｇのＫＮＯ３、４１６ｍｇのＣａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、３９２ｍｇのＭｇ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ、５７ｍｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２３３ｍｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２７１ｍｇのＫＨ２ＰＯ４、２７．８５ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３７．２５ｍｇのＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、公表された濃度の５分の１でムラシゲ−スクーグ培地（非特許文献４０）に従う微量養素、モレル−ウェットモア培地（Morel, G. and R. H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951）に従うビタミン、０．０５％（ｗ／ｖ）ショ糖、１．８％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．２５ｍｇのゼアチン及び４１ｎＭクロルスルフロンから成り（１リットル当たり、ｐＨ５．７）、並びに０．８％（ｗ／ｖ）ディフコアガーで凝固させる。
【００９２】
標的遺伝子のＰＣＲ増幅
ＤＮｅａｓｙキット（キアゲン（Qiagen）社）を使用して、ブタフェナシル耐性及びクロルスルフロン耐性のタバコのミクロコロニーから、ＤＮＡを単離する。次に、タバコの全ＤＮＡをＰＣＲ反応における鋳型として使用する。コドン１９４を含むこの遺伝子の７７６ｂｐ断片を増幅する、プライマー５’ＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＡＴ［配列番号２］及びプライマー５’ＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣ［配列番号３］を使用して、タバコＡＬＳ遺伝子中の標的化コドンの変換を検出する。
【００９３】
ヌクレオチド変換を証明するシークエンシング
除草剤耐性タバコカルス中のヌクレオチド変換は、そのようなカルスから得たＰＣＲ産物のシークエンシングによって確認される。タバコＡＬＳのＰ１９４コドンの変換（ＣＣＡからＣＡＡ）は、コドンの２番目の位置（Ｃ／Ａ）で二重のピークをもたらす。
【００９４】
以下の一本鎖オリゴヌクレオチドを、除草剤抵抗性をもたらすタバコＡＬＳ遺伝子中の点変異の産生について検査する。オリゴヌクレオチドは、標的化ヌクレオチド交換の効率を増加させる修飾ヌクレオチドを含む。
【００９５】
５’−ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ−３’［配列番号：４］
上記の標的オリゴヌクレオチドは７９ヌクレオチド長である。５’末端からの位置４８のオリゴヌクレオチド中のミスマッチに下線が引かれている。残りのオリゴヌクレオチドはＡＬＳ遺伝子と同一である。修飾オリゴヌクレオチドは塩基又は糖において改変される（その場合には配列中の改変されたヌクレオチドが示される）。或いは、ヌクレオチドを結合するリン酸結合も改変することができる。この場合には、そのような結合の位置を示すために、星印（＊）がヌクレオチド間に挿入される。
【００９６】
オリゴヌクレオチド１：モルホリノホスホロアミデート
Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ［配列番号：５］
モルホリノホスホロアミデート結合はリン酸骨格の修飾である。ＤＮＡ／モルホリノホスホロアミデートハイブリッドの作製がまだ可能ではないので、この実施形態においてオリゴヌクレオチド中のすべてのリン酸は修飾されている。
【００９７】
オリゴヌクレオチド２：２’−フルオロアラビノ核酸（小文字）
ｃａＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧａｃ［配列番号：６］
オリゴヌクレオチド３：６−クロロ−２−メトキシアクリジン修飾ヌクレオチド（アスタリスク、＊）
Ｃ＊ＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ＊［配列番号：７］
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧ＊ＴＴＧ＊ＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：８］
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣ＊Ｇ１ＴＴＧ＊Ｃ１ＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：９］
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣ＊ＧＴＴＧＣ＊ＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：１０］
Ｃ＊ＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧ＊ＴＴＧ＊ＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ＊［配列番号：１１］
Ｃ＊ＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣ＊Ｇ＊ＴＴＧ＊Ｃ＊ＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ＊［配列番号：１２］
Ｃ＊ＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣ＊ＧＴＴＧＣ＊ＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ＊［配列番号：１３］
オリゴヌクレオチド４：ホスホロチオエート結合（アスタリスク、＊）
Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊ＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ［配列番号：１４］
オリゴヌクレオチド５：メチルホスホネート結合（アスタリスク、＊）
Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ［配列番号：１５］
オリゴヌクレオチド６：αL−ＬＮＡ（小文字）
ＣａＡｃＡａＴａＧｇＡｇＴｔＴｃＣｔＧａＡａＡｇＣａＴｃＡｇＴａＣｃＴａＴｃＡｔＣｃＴａＣｇＴｔＧｃＡｃＴｔＧａＣｃＴｇＴｔＡｔＡｇＣａＡｃＡａＴｇＧｇＧａＣ［配列番号：１６］
ｃＡａＣａＡｔＡｇＧａＧｔＴｔＣｃＴｇＡａＡａＧｃＡｔＣａＧｔＡｃＣｔＡｔＣａＴｃＣｔＡｃＧｔＴｇＣａＣｔＴｇＡｃＣｔＧｔＴａＴａＧｃＡａＣａＡｔＧｇＧｇＡｃ［配列番号：１７］
オリゴヌクレオチド７：２’−Ｏ−メチルイノシン（Iで示す）
ＩＩＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＩＩ［配列番号：１８］
ＩＩＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＩＴＩＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＩＩ［配列番号：１９］
オリゴヌクレオチド８：２’−フルオロ−ＲＮＡ（Ｃ及びＵ）（Ｃ及びＵ／Ｔ残基に関して可能なもののみ、小文字で示す）
ｃＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡｃ［配列番号：２０］
ｃＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧｕＴＧｃＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡｃ［配列番号：２１］
オリゴヌクレオチド９：２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）（ＲＮＡヌクレオチド は小文字で示す）
ｃａＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧａｃ［配列番号：２２］
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧｕＴｇＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：２３］
ｃａＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧｕＴｇＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧａｃ［配列番号：２４］
オリゴヌクレオチド１０：N３−P５−ホスホロアミデート結合（アスタリスク、＊）
Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ［配列番号：２５］
オリゴヌクレオチド１１：２−アミノ−アデノシン（小文字）
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴａＣＧＴＴＧＣａＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：２６］
オリゴヌクレオチド１２：スーパーＡ（小文字）
ＣａａＣａａＴａＧＧａＧＴＴＴＣＣＴＧａａａａＧＣａＴＣａＧＴａＣＣＴａＴＣａＴＣＣＴａＣＧＴＴＧＣａＣＴＴＧａＣＣＴＧＴＴａＴａＧＣａａＣａａＴＧＧＧＧａＣ［配列番号：２７］
オリゴヌクレオチド１３：スーパーＴ（小文字）
ＣＡＡＣＡＡｔＡＧＧＡＧｔｔｔＣＣｔＧＡＡＡＡＧＣＡｔＣＡＧｔＡＣＣｔＡｔＣＡｔＣＣｔＡＣＧｔＴＧＣＡＣｔｔＧＡＣＣｔＧｔｔＡｔＡＧＣＡＡＣＡＡｔＧＧＧＧＡＣ［配列番号：２８］
オリゴヌクレオチド１４：５−メチル−イソデオキシシチジン（小文字）
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣｃＴＡｃＧＴＴＧｃＡｃＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：２９］
オリゴヌクレオチド１５：５−プロピニル−２−デオキシヌクレオシド（小文字）
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧｔＴｇＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：３０］
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣｇＴＴＧｃＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：３１］
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣｇｔＴｇｃＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：３２］
オリゴヌクレオチド１６：N４−エチル−２’−デオキシシチジン（小文字）
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧｔＴｇＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：３３］
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣｇＴＴＧｃＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：３４］
ＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣｇｔＴｇｃＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ［配列番号：３５］
本出願において使用される配列は、５’末端からカウントされ、修飾位置と共に、以下の表中で記載される。ｘとｘ＋１の間の骨格修飾はｘに位置付けられる。（位置４と位置５の間では、４として示される）。
【００９８】
【表２】
2009520495.tif 000005
【００９９】
【表２−１】
2009520495.tif 000006
【０１００】
【表２−２】
2009520495.tif 000007
【０１０１】
【表２−３】
2009520495.tif 000008
【０１０２】
【表２−４】
2009520495.tif 000009
【０１０３】
実施例Ａ：
様々なオリゴヌクレオチドデザインを、本明細書において別に記述されるような無細胞系を使用して検査した。本質的には、無細胞系は試験管中のＴＮＥ反応溶液である。そのような反応溶液は３つの成分を有する。（１）機能的カルベニシリン耐性遺伝子及び欠損カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド。終止コドンを生じるカナマイシン遺伝子（ＮＰＴＩＩ）中のコドン２２での点変異（ＴＡＴからＴＡＧ）。（２）ＴＮＥのために必要なすべてのタンパク質を含むシロイヌナズナからの総抽出タンパク質及び（３）カナマイシン終止コドンのＧをＣに変換するようにデザインしたミスマッチを保有するオリゴヌクレオチド（したがってカナマイシン遺伝子活性を回復させる）。これらの３つの成分を混合し、１時間インキュベートし、プラスミドＤＮＡを単離し、次に大腸菌へエレクトロポレーションする。カナマイシン耐性コロニー数は、規定のオリゴヌクレオチドのＴＮＥ活性の測定値である。カルベニシリン耐性コロニーの数は、エレクトロポレーション効率を計算するために使用される。
【０１０４】
下記の表３において、無細胞系を使用してＴＮＥ活性を検査したオリゴヌクレオチドが記載される。各実験において、正常ＤＮＡから作製されたオリゴヌクレオチドを使用する。修飾オリゴヌクレオチドのＴＮＥ活性は、１として任意に設定される正常ＤＮＡオリゴヌクレオチドと比較して、倍変化として示される。したがって、１以下の倍変化は修飾オリゴヌクレオチドが本分析中の正常ＤＮＡオリゴヌクレオチドよりも低く機能し、１以上の倍変化はオリゴヌクレオチドが改善されたＴＮＥ活性を示すことを意味する。
【０１０５】
【表３】
2009520495.tif 000010
【０１０６】
太字のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの位置を表わす。ＬＮＡはロックされた核酸、５ＰＣは５−プロパニル−２−デオキシシチジン、５ＰＵは５−プロパニル−２−デオキシウラシル、Ｎ４−ＥＤＣはＮ４−エチル−デオキシシチジンである。
【０１０７】
検査されたオリゴヌクレオチドはすべて、プラスミドでＧ：Ｇミスマッチを生じる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】標的化ヌクレオチド交換の概略図である。交換されるヌクレオチド（Ｘ）を含むアクセプター二重鎖ＤＮＡ鎖は、挿入されるヌクレオチド（Ｙ）を含むドナーオリゴヌクレオチド（ＮＮＮｍＮＮＮｍＹＮＮｍＮＮｍとして示される）に接触させられる。三重鎖構造は、ＴＮＥが可能な環境に、又は無細胞の酵素混合物又は無細胞の抽出物として既知のもののような、少なくともＴＮＥを行なうことを可能にするタンパク質をともなう環境にさらされるか、或いは接触させられる（なかでも（i.a.）特許文献４、特許文献１を参照）。
【図２】いくつかのデオキシリボシチジンアナログの化学構造を示した図である：（ａ）ホスホロチオエート結合；（ｂ）メチルホスホネート；（ｃ）６−クロロ−２−メトキシアクリジン基に結合された５’末端のヌクレオチド残基。
【図３】シトシンヌクレオチドとして示された、ロックされた核酸の異なるジアステレオ異性体の化学構造を示した図である：（ａ）β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、Ｃ４原子の「β」立体配置中に２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を有するもとのＬＮＡ構造；（ｂ）メチレン架橋中にＳ原子を有するβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ；（ｃ）Ｃ４原子の「α」位において２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を含む、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ。
【図４】スーパーＡ及びスーパーＴの構造を示した図である。
【図５】（ａ）５−メチル−デオキシシトシン；（ｂ）５−プロピニル−デオキシシトシン；（ｃ）２’−Ｏ−メチル−５−メチル−シトシン；（ｄ）２−アミノ−アデノシンの化学構造を示した図である。
【図６】シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）の化学構造を示した図である。
【図１】
2009520495.tif 000011
【図２】
2009520495.tif 000012
【図３】
2009520495.tif 000013
【図４】
2009520495.tif 000014
【図５】
2009520495.tif 000015
【図６】
2009520495.tif 000016
【配列表】
2009520495000001.xml
【国際調査報告】
2009520495.tif 000047
2009520495.tif 000048
2009520495.tif 000049
2009520495.tif 000050
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