(57)【要約】  本発明は、核酸結合タンパク質の検出方法および核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法の提供を目的とする。本発明によれば、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法が提供される。
2009093667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる、方法。
【請求項２】
構造変化が、二つの核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体が、二つの核酸二本鎖がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
下記工程を含んでなる、請求項３に記載の方法：
（ｉ）核酸結合タンパク質と、核酸二本鎖Ａと、核酸二本鎖Ｂとを接触させる工程（ここで、核酸二本鎖Ａは二つの核酸一本鎖（以下、それぞれ「核酸Ａ１」および「核酸Ａ２」とする）からなり、核酸二本鎖Ｂは二つの核酸一本鎖（以下、それぞれ「核酸Ｂ１」および「核酸Ｂ２」とする）からなる）；および
（ｉｉ）核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する工程。
【請求項５】
工程（ｉｉ）において、核酸Ａ１と核酸Ｂ１とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｃ）および／または核酸Ａ２と核酸Ｂ２とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｄ）の量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉ）において、核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂの少なくとも一つが核酸結合タンパク質の結合部位を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸Ａ１が第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖からなり、核酸Ａ２が前記第一のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖からなり、核酸Ｂ１が前記第二のヌクレオチド配列に対応する配列および第四のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖からなり、核酸Ｂ２が前記第三のヌクレオチド配列に対応する配列および第四のヌクレオチド配列に対応する配列を有する核酸一本鎖からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
核酸Ａ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｂ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｂ１のヌクレオチド配列における、核酸Ａ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ａ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｂ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および
核酸Ｂ２のヌクレオチド配列における、核酸Ａ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基
から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体が、二つの核酸二本鎖部分が可逆的に鎖交換するように構成されてなる複合体（一体型核酸複合体）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
下記工程を含んでなる、請求項１０に記載の方法：
（ｉｉｉ）核酸結合タンパク質と、一体型核酸複合体Ｅとを接触させる工程（ここで、一体型核酸複合体Ｅは、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｇと核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｈとを含んでなり、核酸複合体Ｇは二つの核酸一本鎖含有体（以下、それぞれ「核酸Ｇ１」および「核酸Ｇ２」とする）を含んでなり、核酸複合体Ｈは二つの核酸一本鎖含有体（以下、それぞれ「核酸Ｈ１」および「核酸Ｈ２」とする）を含んでなる）；および
（ｉｖ）一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する工程
（ここで、
核酸Ｇ１が、末端部分１と、第五のヌクレオチド配列と、末端部分３とからなり、第五のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分１が、第五のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分３が連結されてなる核酸一本鎖含有体であり、
核酸Ｇ２が、末端部分２と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分３に対応する部分とからなり、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分２が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分３に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体であり、
核酸Ｈ１が、末端部分１に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列と、末端部分４とからなり、第六のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分１に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分４が連結されてなる核酸一本鎖含有体であり、
核酸Ｈ２が、末端部分４に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分２に対応する部分とからなり、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分４に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分２に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体である）。
【請求項１２】
末端部分がポリヌクレオチドであり、
末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され；並びに
末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｖ）において、一体型核酸複合体Ｅの量を測定することにより一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｖ）において、核酸Ｇ１および核酸Ｈ１を含んでなり、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｉと、核酸Ｇ２および核酸Ｈ２を含んでなり、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｊとを含んでなる一体型核酸複合体Ｆの量を測定することにより一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つのみが核酸結合タンパク質の結合部位を有する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸Ｇ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｈ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｇ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および
核酸Ｈ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基
から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて有する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
核酸Ｇ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｇ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｈ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；または
核酸Ｈ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基
から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて有する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
構造変化の程度が、蛍光共鳴エネルギー転移を利用して測定される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
核酸が、ＤＮＡである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
核酸結合タンパク質が、転写因子である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸結合タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
マルチプレックスで行われる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
被験物質存在下および非存在下において、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法を行う、核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法。
【請求項２４】
被験物質の標的となる核酸結合タンパク質とは結合しない核酸からなる核酸複合体の構造変化の程度を測定することをさらに含んでなる、請求項２３に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
末端配列において結合し得る核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとを含んでなる、キット（ここで、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂは請求項４において定義された内容と同義である）。
【請求項２６】
一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆを含んでなる、キット（ここで、一体型核酸複合体Ｅは請求項１１に、一体型核酸複合体Ｆは請求項１４において定義された内容と同義である）。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、核酸結合タンパク質の検出方法およびキットに関する。本発明は、更に、核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸結合タンパク質は、転写因子や染色体構造タンパク質、ＤＮＡ修復酵素、ＲＮＡ加工に関わる酵素、あるいはポリメラーゼなど、細胞内において非常に重要な機能を担っている分子であり、核酸結合タンパク質の挙動を解析することは、生命活動を理解する上で重要な意味があると考えられている。また、核酸結合タンパク質はその機能の重要性から、医薬品や機能性食品等の開発の標的として注目されるようになってきている。【０００３】
近年の技術の進歩により、核酸結合タンパク質を検出する種々の方法がこれまでに開発されている。【０００４】
一般に、核酸結合タンパク質の検出には、ゲルシフト法やフットプリント法が用いられているが、これらの方法は電気泳動を伴うために、時間及び操作が煩雑であるという問題がある。【０００５】
タンパク質が結合した場合にのみ結合する二種類のＤＮＡプローブを利用したホモジニアスな核酸結合タンパク質の検出方法（米国特許６，５４４，７４６号公報、Heyduk, T., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20(2) 171-176）は、ＤＮＡプローブの設計が煩雑であり、さらに、離れた二箇所の配列に結合しうるＤＮＡ結合タンパク質にしか使用できないという問題がある（Wang, J., et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33(2) e23、Jantz, D., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20(2) 126-127）。【０００６】
エキソヌクレアーゼＩＩＩを利用した核酸結合タンパク質検出方法（非特許文献２）は、弱い結合の核酸結合タンパク質の検出が困難であり、また、医薬品等の薬物スクリーニングに利用した場合、薬剤のエキソヌクレアーゼＩＩＩ活性に対する影響を考慮することが必要であり、さらに、エキソヌクレアーゼＩＩＩ近縁のタンパク質の活性に影響する薬剤のスクリーニングはできないという問題がある。【０００７】
蛍光相関分光法を利用した核酸結合タンパク質検出法（Kobayashi, T., et al. (2004) Anal. Biochem. 332(1) 58-66）は、核酸単独と核酸に核酸結合タンパク質が結合した複合体の大きさの差を検出するものであり、小さな核酸結合タンパク質では十分なシグナル／ノイズ比が得られない問題がある。さらに、この方法には特殊な機器が必要であるため汎用性に問題がある。【０００８】
このように、種々の検出方法が開発されてきたにもかかわらず、多検体を迅速、かつ簡便に処理する方法は報告されておらず、核酸結合タンパク質を標的とする医薬品や機能性食品等のスクリーニングに応用可能な方法の開発が強く求められている。
【発明の概要】
【０００９】
一般に、完全に相補的な二本鎖の核酸からなる核酸二本鎖は非常に安定であり、このような核酸二本鎖同士が相互作用し、構造変化することはない。しかし、それぞれの末端に一本鎖部分を有する核酸二本鎖同士は、その一本鎖部分を介して他の核酸二本鎖と結合し、構造変化が生じることが知られている。本発明者らは、このような核酸二本鎖間の構造変化が、核酸結合タンパク質の結合により阻害されることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１０】
本発明は、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法、および核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明によれば、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法（以下、「本発明による検出方法」という）が提供される。
【００１２】
本発明によれば、また、被験物質存在下および非存在下において、本発明の検出方法を行う、核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法（以下、「本発明によるスクリーニング方法」という）が提供される。
【００１３】
本発明によれば、さらに、末端配列において結合し得る核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとを含んでなるキット、または一体型核酸複合体Ｅもしくは一体型核酸複合体Ｆを含んでなるキット（以下、「本発明によるキット」という）が提供される。
【００１４】
本発明は、電気泳動が不要であり、汎用機器でホモジニアスアッセイが可能であり、エキソヌクレアーゼＩＩＩなどの酵素が不要であり、またタンパク質結合部位に蛍光導入やニックなどの不自然な構造が不要である点で有利である。本発明はまた、例えば、ループ、ロイシンジッパー、Ｚｎフィンガー等のＤＮＡ結合モチーフを持つＤＮＡ結合タンパク質をはじめとする、ＤＮＡ結合タンパク質一般に広く適用可能である点で有利である。本発明はさらに、レポーターアッセイで評価することが困難な核酸結合タンパク質（例えば、テロメア結合タンパク質等の構造タンパク質）を標的とする阻害剤または促進剤についてもスクリーニングすることができる点で有利である。このように、本発明は、阻害剤等の新規医薬品や健康食品等の探索や同定に応用可能な点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、および核酸Ｂ２の構造の一態様を具体的に示した図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、および核酸Ｈ２の構造の一態様（一体型核酸複合体Ｅ）を具体的に示した図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、および核酸Ｈ２の構造の一態様（一体型核酸複合体Ｆ）を具体的に示した図である。
【図２】図２は、組み換えヒトＮＦκＢｐ５０の濃度と蛍光値の関係を示す図である。
【図３】図３は、デコイオリゴを用いて組み換えヒトＮＦκＢｐ５０の結合を阻害した時の蛍光値を示す図である。
【図４】図４は、組み換えヒトＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）  タンパク質が結合した時の蛍光値を示す図である。
【図５】図５は、組み換えヒトＳＰ１タンパク質が結合した時の蛍光値を示す図である。
【図６】図６は、組み換えヒトＴＲＦ２タンパク質（Ｎ末端欠損体）の核酸への結合を検出した結果を示す図である。
【図７】図７は、ミスマッチ導入と検出感度との関係を示す図である。棒の上の数値は、それぞれの核酸セットにおいてタンパク質未添加時の蛍光値を１００としたときの相対蛍光値を示している。
【図８】図８は、ミスマッチ導入と検出感度との関係を示す図である。棒の上の数値は、それぞれの核酸セットにおいてタンパク質未添加時の蛍光値を１００としたときの相対蛍光値を示している。
【図９】図９は、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡとＳＰ１  ＤＮＡの蛍光強度を、オーロチオグルコース無添加時の蛍光値に対する相対蛍光値で示した図である。
【図１０】図１０は、一体型複合体を利用したＮＦ−κＢ（ｐ５０）検出を示した図である。ＮＦ−κＢ  ＤＮＡとＳＰ１  ＤＮＡの蛍光強度を、タンパク質無添加に対する相対蛍光値で示した。
【図１１】図１１は、マルチプレックス系におけるＮＦ−κＢとＳＰ１の結合を検出した結果を示した図である。ＮＦ−κＢ  ＤＮＡとＳＰ１  ＤＮＡの蛍光強度を、タンパク質無添加に対する相対蛍光値で示した。
【図１２】図１２は、一体型核酸複合体を利用した検出の一態様を具体的に示した図である。星印は蛍光標識を、黒丸は消光標識を、白丸および白四角は変異を、灰色実線は核酸タンパク質結合配列をそれぞれ示した。
【図１３】図１３は、タンパク質がタンパク質結合配列に結合できないようにするための変異の導入の一態様を具体的に示した図である。
【図１４】図１４は、タンパク質がタンパク質結合配列に結合できないようにするための変異の導入の一態様を具体的に示した図である。
【発明の具体的な説明】
【００１６】
定義
本願明細書において、「核酸」としては、ＤＮＡ、ＲＮＡのみならず、修飾核酸や核酸類似体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）やＬＮＡ（Locked nucleic acid））が挙げられるが、好ましくはＤＮＡである。
【００１７】
本願明細書において、「核酸二本鎖」は、２つの核酸分子が互いの相補鎖として結合しているものを意味する。
【００１８】
本願明細書において、「核酸一本鎖」は、他の核酸分子の相補鎖として結合していない核酸分子を意味し、例えば、核酸分子の一部が核酸分子内でハイブリダイズし、二本鎖部分を有するような核酸分子も「核酸一本鎖」に含まれる。また、核酸一本鎖は、他の核酸一本鎖と直接、あるいは他の配列（例えば、リンカー配列）等を介して、直列的に結合されていてもよい。
【００１９】
本願明細書において「相補的」とは、各々の配列を構成する塩基間で水素結合が形成されることを意味し、具体的には、アデニンに対してチミンが対合し、チミンに対してアデニンが対合し、グアニンに対してシトシンが対合し、シトシンに対してグアニンが対合することを意味する。本願明細書において「相補性」とは、比較される配列間における相補的な塩基対の割合を意味する。本明細書において示した「相補性」の数値はいずれも、一方のヌクレオチド配列と、もう一方のヌクレオチド配列の相補鎖との間の相同性として、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
【００２０】
本願明細書において「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外とはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件下で標的核酸の塩基配列とハイブリダイズできる核酸としては、標的核酸の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する塩基配列からなる核酸が挙げられる。ストリンジェントな条件は、当業者であれば適宜決定することができ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））、例えば、塩濃度０．１ｍＭ〜３Ｍ、温度１０〜８０℃の条件、好ましくは、塩濃度１ｍＭ〜１Ｍ、温度２０〜７０℃の条件をいう。
【００２１】
本願明細書において「連続する」ヌクレオチドの個数は、各ヌクレオチド配列とこれに対応するヌクレオチド配列とが結合（好ましくは、ハイブリダイズ）することができるかぎり特に限定されないが、連続するヌクレオチドからなるヌクレオチド配列の各ヌクレオチド配列に対する割合が、好ましくは、１５％以上、より好ましくは、２０％以上、さらに好ましくは、２５％以上、特に好ましくは、３０％以上である。
【００２２】
本願明細書において「Ｔｍ値」とは、本発明の方法が実施される反応条件下において（例えば、核酸濃度、塩濃度、ｐＨ等で規定）、比較される二つの一本鎖核酸のうち、５０％が二本鎖を形成する温度を意味する。Ｔｍ値は、例えば、温度変化に伴う紫外線吸収量の変化、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ等の二本鎖ＤＮＡ検出試薬、蛍光エネルギー転移の蛍光値変化等を利用して算出することができるが、より簡便には、公知のアルゴリズムを用いて計算することができる（例えば、Markham NR and Zuker M(2005)Nucleic Acids Research 33 W577-W581）。
【００２３】
本願明細書において「ミスマッチ」とは、アデニン／チミン塩基対およびグアニン／シトシン塩基対以外の塩基対、あるいは対応する塩基のない状態（バルジ）を意味する。
【００２４】
核酸複合体
本発明によれば、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法が提供される。
【００２５】
ここで、「構造変化」とは、好ましくは、核酸複合体における、核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換である。核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換とは、核酸二本鎖を形成するヌクレオチド鎖の相補鎖が、別の核酸二本鎖を形成するヌクレオチド鎖と入れ替わることを意味する。核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換は、不可逆的であっても、可逆的であってもよく、使用する核酸複合体の構造に基づく。
【００２６】
少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体としては、二つの核酸二本鎖がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体；第一の態様）と二つの核酸二本鎖部分が可逆的に鎖交換するように構成されてなる複合体（一体型核酸複合体；第二の態様）とが挙げられる。第一の態様の核酸複合体と第二の態様の核酸複合体について、以下に説明する。
【００２７】
第一の態様の核酸複合体
本発明の第一の態様によれば、二つの核酸二本鎖（核酸二本鎖Ａ、核酸二本鎖Ｂ）がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体）の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法が提供される。
【００２８】
核酸二本鎖Ａは、核酸一本鎖である核酸Ａ１と核酸一本鎖である核酸Ａ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ｂと結合し得る核酸二本鎖である。
【００２９】
核酸二本鎖Ｂは、核酸一本鎖である核酸Ｂ１と核酸一本鎖である核酸Ｂ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ａと結合し得る核酸二本鎖である。
【００３０】
核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２はそれぞれ、以下のように設計することができる。
・核酸Ａ１：第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ａ２：第一のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ１：第二のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ２：第三のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列に対応する配列を有する核酸一本鎖。
【００３１】
例えば、まず、目的の核酸結合タンパク質に基づいて、核酸Ａ１を設計した後、核酸Ａ１に基づいて、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２を順次設計することができる。
【００３２】
核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２については、核酸二本鎖複合体における核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換が不可逆的に行われるように設計することができる。
【００３３】
核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、および核酸Ｂ２の具体的な構造の一態様を、図１Ａに示す。
【００３４】
第一乃至第四のヌクレオチド配列（ポリヌクレオチド）およびそれらに対応する配列（ポリヌクレオチド）は、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂをそれぞれ形成することができれば特に限定されず、任意の配列を選択することができる。例えば、核酸Ａ１における第一のヌクレオチド配列は、核酸Ａ２における第一のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。また、核酸Ｂ１における第四のヌクレオチド配列は、核酸Ｂ２における第四のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
【００３５】
第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【００３６】
第四のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【００３７】
各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
【００３８】
第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【００３９】
第四のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第四のヌクレオチド配列に対応する配列は、第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【００４０】
第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【００４１】
第四のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【００４２】
第一乃至第四のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列は、核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとが核酸二本鎖複合体を形成することができるかぎり特に限定されず、任意の配列を選択することができる。例えば、核酸二本鎖Ａにおける第二のヌクレオチド配列は、核酸二本鎖Ｂにおける第二のヌクレオチド配列に対応する配列とは結合（好ましくは、ハイブリダイズ）するが、核酸二本鎖Ａにおける第三のヌクレオチド配列や、核酸二本鎖Ｂにおける第三のヌクレオチド配列に対応する配列や、他の核酸二本鎖Ａにおける第二のヌクレオチド配列とは結合（好ましくは、ハイブリダイズ）しない配列を選択することができる。また、核酸二本鎖Ａにおける第三のヌクレオチド配列は、核酸二本鎖Ｂにおける第三のヌクレオチド配列に対応する配列とは結合（好ましくは、ハイブリダイズ）するが、核酸二本鎖Ａにおける第二のヌクレオチド配列や、核酸二本鎖Ｂにおける第二のヌクレオチド配列に対応する配列や、他の核酸二本鎖Ａにおける第三のヌクレオチド配列とは結合（好ましくは、ハイブリダイズ）しない配列を選択することができる。さらに、核酸二本鎖Ａにおける第二のヌクレオチド配列および第三のヌクレオチド配列、並びに核酸二本鎖Ｂにおける第二のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、それぞれ、核酸分子内では結合（好ましくは、ハイブリダイズ）しない配列を選択することができる。
【００４３】
第二のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。一方、第二のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列とはそれぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満の相補性を有するように選択することができる。また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列とはそれぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満の相補性を有するように選択することができる。
【００４４】
第三のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。一方、第三のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とはそれぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満の相補性を有するように選択することができる。また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とはそれぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満の相補性を有するように選択することができる。
【００４５】
各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
【００４６】
第二のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。一方、第二のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列および／または第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列および／または第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下である。また、第三のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列および／または第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列および／または第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下である。
【００４７】
第三のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。一方、第三のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列および／または第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列および／または第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下である。また、第二のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列および／または第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列および／または第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下である。
【００４８】
第二のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。一方、第二のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上低くなるように選択することができる。また、第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上低くなるように選択することができる。
【００４９】
第三のヌクレオチド配列は、第三のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。一方、第三のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上低くなるように選択することができる。また、第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上低くなるように選択することができる。
【００５０】
第一乃至第四のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列は、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂから、核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄを形成する構造変化が生ずるかぎり特に限定されず、任意の配列を選択することができる。例えば、核酸Ａ１における第一のヌクレオチド配列は、核酸Ｂ１における第四のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。また、核酸Ａ２における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、核酸Ｂ２における第四のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
【００５１】
第一のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【００５２】
第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【００５３】
各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
【００５４】
第一のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第四のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【００５５】
第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第四のヌクレオチド配列に対応する配列は、第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【００５６】
第一のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【００５７】
第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、第四のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【００５８】
核酸二本鎖Ａの末端配列として、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列は、核酸二本鎖Ａの片端に両方があってもよいし、両端にそれぞれあってもよい。核酸二本鎖Ｂの末端配列として、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、核酸二本鎖Ｂの片端に両方があってもよいし、両端にそれぞれあってもよい。好ましくは、核酸二本鎖Ａの末端配列として、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列が、核酸二本鎖Ａの片端に両方あり、核酸二本鎖Ｂの末端配列として、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列が、核酸二本鎖Ｂの片端に両方がある場合である。
【００５９】
核酸二本鎖Ａにおける二本鎖部分（第一のヌクレオチド配列と第一のヌクレオチド配列に対応する配列との対合部分）の塩基対の長さは、核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄを形成する構造変化が阻害されなければ特に限定されず、例えば、５塩基対〜１０００塩基対とすることができるが、好ましくは、１０塩基対〜１００塩基対、より好ましくは、１５塩基対〜５０塩基対である。
【００６０】
核酸二本鎖Ｂにおける二本鎖部分（第四のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との対合部分）の塩基対の長さは、核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄを形成する構造変化が阻害されなければ特に限定されず、例えば、５塩基対〜１０００塩基対とすることができるが、好ましくは、１０塩基対〜１００塩基対、より好ましくは、１５塩基対〜５０塩基対である。
【００６１】
核酸二本鎖Ａにおける一本鎖部分（第二のヌクレオチド配列および第三のヌクレオチド配列）の塩基の長さは、本発明の核酸二本鎖複合体を形成することができれば特に限定されず、例えば、３塩基〜１０００塩基とすることができるが、好ましくは、５塩基〜１００塩基、より好ましくは、１０塩基〜３０塩基である。
【００６２】
核酸二本鎖Ｂにおける一本鎖部分（第二のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列に対応する配列）の塩基の長さは、本発明の核酸二本鎖複合体することができれば特に限定されず、例えば、３塩基〜１０００塩基とすることができるが、好ましくは、５塩基〜１００塩基、より好ましくは、１０塩基〜３０塩基である。
【００６３】
本願発明によれば、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂの少なくとも一つが核酸結合タンパク質の結合部位を有する。
【００６４】
核酸結合タンパク質の結合部位は、核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの二本鎖部分、一本鎖部分、および核酸二本鎖複合体の分岐部分から選択される少なくとも一箇所に、少なくとも一種のタンパク質結合部位が存在するが、好ましくは、二本鎖部分である。転写因子のように特定の塩基配列を認識して結合するタンパク質の場合には、その認識配列とその周辺配列を含む。
【００６５】
核酸二本鎖複合体は、核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとがそれぞれの末端配列において互いに結合し、かつヌクレオチド鎖交換などの構造変化が生ずる限り、結合の様式は特に限定されるものではないが、好ましくは、ハイブリダイゼーションにより結合させることができる。
【００６６】
核酸二本鎖複合体において核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂ間のヌクレオチド鎖交換を生じさせるためには、核酸二本鎖Ａの３’末端配列（第二のヌクレオチド配列）と核酸二本鎖Ｂの５’末端配列（第二のヌクレオチド配列に対応する配列）とが結合し、および／または核酸二本鎖Ａの５’末端配列（第三のヌクレオチド配列）と核酸二本鎖Ｂの３’末端配列（第三のヌクレオチド配列に対応する配列）とが結合するように、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂを準備することが好ましい。
【００６７】
本発明の好ましい態様では、核酸二本鎖Ａの３’末端配列と核酸二本鎖Ｂの５’末端配列とがハイブリダイズし、および／または核酸二本鎖Ａの５’末端配列と核酸二本鎖Ｂの３’末端配列とがハイブリダイズするように、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂを設計する。
【００６８】
形成された核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄが安定して存在するためには、核酸二本鎖Ｃと核酸二本鎖Ｄとが結合しないように、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂを準備することが好ましい。
【００６９】
本発明の好ましい態様では、核酸Ａ１と核酸Ｂ１とが結合してできる一本鎖配列と、核酸Ａ２と核酸Ｂ２とが結合してできる一本鎖配列とが、ハイブリダイズしないように、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂを設計する。
【００７０】
本発明の好ましい態様によれば、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との相補性が７０％以上であり、および／もしくは、第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が７０％以上であり、並びに／または、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列との相補性、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列との相補性、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が、それぞれ、５０％未満である、本発明による検出方法が提供される。
【００７１】
本発明の好ましい態様によれば、また、第一のヌクレオチド配列が、第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるか、もしくは、第四のヌクレオチド配列が、第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなり、および／または、第一のヌクレオチド配列に対応する配列が、第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるか、もしくは、第四のヌクレオチド配列に対応する配列が、第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなり、並びに／あるいは、第二のヌクレオチド配列が第三のヌクレオチド配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第二のヌクレオチド配列が第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第二のヌクレオチド配列に対応する配列が第三のヌクレオチド配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第二のヌクレオチド配列に対応する配列が第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第三のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第三のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第三のヌクレオチド配列に対応する配列が第二のヌクレオチド配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４であり、第三のヌクレオチド配列に対応する配列が第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含む場合には、そのヌクレオチドの個数は最大で４である、本発明による検出方法が提供される。
【００７２】
本発明の好ましい態様によれば、さらに、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との間のＴｍ値、および／もしくは、第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上高く、並びに／または、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列との間のＴｍ値、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列との間のＴｍ値、第二のヌクレオチド配列に対応する配列と第三のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上低い、本発明による検出方法が提供される。
【００７３】
第二の態様の核酸複合体
本発明の第二の態様によれば、二つの核酸二本鎖部分が可逆的に鎖交換するように構成されてなる複合体（一体型核酸複合体Ｅ、一体型核酸複合体Ｆ）の構造変化の程度を測定することを含んでなる方法が提供される。
【００７４】
一体型核酸複合体Ｅは、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｇと核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｈとを含んでなる。
【００７５】
核酸複合体Ｇは、核酸一本鎖含有体である核酸Ｇ１と核酸一本鎖含有体である核酸Ｇ２とを含んでなり、かつ、末端配列において核酸複合体Ｈと結合し得る核酸複合体である。
【００７６】
核酸複合体Ｈは、核酸一本鎖含有体である核酸Ｈ１と核酸一本鎖含有体である核酸Ｈ２とを含んでなり、かつ、末端配列において核酸複合体Ｇと結合し得る核酸複合体である。
【００７７】
一体型核酸複合体Ｆは、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｉと核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｊとを含んでなる。
【００７８】
核酸複合体Ｉは、核酸一本鎖含有体である核酸Ｇ１と核酸一本鎖含有体である核酸Ｈ１とを含んでなり、かつ、末端配列において核酸複合体Ｊと結合し得る核酸複合体である。
【００７９】
核酸複合体Ｊは、核酸一本鎖含有体である核酸Ｇ２と核酸一本鎖含有体である核酸Ｈ２とを含んでなり、かつ、末端配列において核酸複合体Ｉと結合し得る核酸複合体である。
【００８０】
一体型核酸複合体Ｅは、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとの間の鎖交換反応により、新たに、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとを含んでなる一体型核酸複合体Ｆに変換される。また、一体型核酸複合体Ｆも、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとの間の鎖交換反応により、新たに、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとを含んでなる一体型核酸複合体Ｅに変換される。このような一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の構造変化は可逆的に繰り返される。
【００８１】
核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２はそれぞれ、以下のように設計することができる。
・核酸Ｇ１：末端部分１と、第五のヌクレオチド配列と、末端部分３とからなり、第五のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分１が、第五のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分３が連結されてなる核酸一本鎖含有体。
・核酸Ｇ２：末端部分２と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分３に対応する部分とからなり、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分２が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分３に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体。
・核酸Ｈ１：末端部分１に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列と、末端部分４とからなり、第六のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分１に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分４が連結されてなる核酸一本鎖含有体。
・核酸Ｈ２：末端部分４に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分２に対応する部分とからなり、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分４に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分２に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体。
【００８２】
例えば、まず、目的の核酸結合タンパク質に基づいて、核酸Ｇ１を設計した後、核酸Ｇ１に基づいて、核酸Ｇ２、核酸Ｈ２、核酸Ｈ１を順次設計することができる。
【００８３】
核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２については、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、および核酸Ｈ２からなる一体型核酸複合体が鎖交換反応によって可逆的な構造変化を繰り返すように設計される。
【００８４】
核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、および核酸Ｈ２の具体的な構造の一態様を、図１Ｂ（一体型核酸複合体Ｅの具体的な構造の一態様）および図１Ｃ（一体型核酸複合体Ｆの具体的な構造の一態様）に示す。
【００８５】
核酸複合体が鎖交換反応によって可逆的な構造変化を繰り返すようにするために、例えば、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２において、鎖交換が行われる配列（第五のヌクレオチド配列、第五のヌクレオチド配列に対応する配列、第六のヌクレオチド配列、第六にヌクレオチド配列に対応する配列）のそれぞれの両端に鎖交換の進行を停止させ、逆転させるための末端部分を付加することができる。
【００８６】
ここで「末端部分」とは、２つの二本鎖部分の間で行われている鎖交換の進行を停止させ、逆転させることができれば特に限定されず、ポリヌクレオチドであってもよいし、鎖交換が行われる２つのヌクレオチド鎖の末端同士を結合するようなリンカー（例えば、鎖交換が行われる２つのヌクレオチド鎖の末端とリン酸ジエステル結合によって結合されるアルキル鎖等）であってもよいし、最末端にこのようなリンカーが導入されたポリヌクレオチドであってもよい。末端部分は、好ましくは、ポリヌクレオチドである。
【００８７】
末端部分がポリヌクレオチドである場合について、以下に説明する。
【００８８】
末端部分がポリヌクレオチドである場合は、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｇ２をそれぞれ核酸一本鎖として提供することができる。
【００８９】
一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の可逆的な構造変化は以下のように起こる。まず、（１）第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において５’→ ３’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列の３’末端で停止され、および／または、第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第六のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が、第六のヌクレオチド配列の５’末端で停止されると（一体型核酸複合体Ｅの形成）、鎖交換の向きが変わる。次いで（２）第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換、および／または、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列に対応する配列において５’→ ３’方向の鎖交換が進行する。次いで（３）第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列の５’末端で停止され、および／または、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列に対応する配列において５’→ ３’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端で停止されると（一体型核酸複合体Ｆの形成）、鎖交換の向きが変わる。次いで（４）第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において５’→ ３’方向の鎖交換、および／または、第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第六のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が進行し、再び（１）〜（４）が繰り返される。
【００９０】
第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において５’→ ３’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列の３’末端で停止され、および／または、第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第六のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が、第六のヌクレオチド配列の５’末端で停止され、鎖交換の向きが変わるためには、
末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されるように設計することができる。
【００９１】
末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で形成される安定性が高い塩基対群、および末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で形成される安定性が高い塩基対群は、末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列との間の安定性が低い塩基対群、および末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間の安定性が低い塩基対群よりも、熱力学的に安定であるように設計することができる。
【００９２】
また、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列において３’→ ５’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列の５’末端で停止され、および／または、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列からなる核酸二本鎖が形成される鎖交換であって、第五のヌクレオチド配列に対応する配列において５’→ ３’方向の鎖交換が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端で停止され、鎖交換の向きが変わるためには、
末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されるように設計することができる。
【００９３】
末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で形成される安定性が高い塩基対群および末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で形成される安定性が高い塩基対群は、末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列との間の安定性が低い塩基対群および末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間の安定性が低い塩基対群よりも、熱力学的に安定であるように設計することができる。
【００９４】
熱力学的な安定性は、使用される塩基対から当業者であれば適宜決定することができる。
【００９５】
「安定性が低い塩基対群」とは、対合すべき箇所において熱力学的に不安定であるため対合できない塩基対を含むことから、相補鎖が形成されない二本鎖の対応部分同士を意味する。
【００９６】
「安定性が高い塩基対群」（塩基対群Ｈ）は、「安定性が低い塩基対群」（塩基対群Ｌ）よりも熱力学的に安定であれば特に制限されないが、例えば、安定性が高いＧＣ塩基対およびＡＴ塩基対の割合（好ましくは、ＧＣ塩基対の割合）が塩基対群Ｌよりも多い塩基対群にすることができる。また、塩基対群Ｌは、塩基対群Ｈよりも熱力学的に不安定であれば特に制限されないが、例えば、安定性が低いＧＧ塩基対、ＧＴ塩基対、ＧＡ塩基対、ＴＴ塩基対、ＡＡ塩基対、ＴＣ塩基対、ＡＣ塩基対、ＣＣ塩基対、バルジ塩基（対応する塩基がない塩基）等の割合が塩基対群Ｈよりも多い塩基対群とすることができる。
【００９７】
塩基対群Ｌは、２つの二本鎖部分の間で行われている鎖交換の進行を止めることができれば特に限定されず、少なくとも１個、好ましくは、２〜３個、より好ましくは、４個以上（例えば、４〜１０個、４個〜末端部分の塩基長）の塩基からなる塩基対群とすることができる。より好ましくは、塩基対群Ｌは、少なくとも連続した２〜４個の安定性が低い塩基対を含んでなる塩基対群である。
【００９８】
塩基対群Ｈは、２つの二本鎖部分の間で行われている鎖交換が停止され、その進行方向を変えることができれば特に限定されず、例えば、２個以上、好ましくは、３個以上（例えば、３〜１０個、３個〜末端部分の塩基長）の塩基からなる塩基対群とすることができる。より好ましくは、塩基対群Ｈは、少なくとも連続した２〜４個の安定性が高い塩基対を含んでなる塩基対群である。
【００９９】
末端部分１〜４のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列は、上記のような一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の可逆的な構造変化が可能であれば特に限定されず、任意の配列を選択することができる。
【０１００】
例えば、末端部分１のヌクレオチド配列は、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。末端部分２のヌクレオチド配列は、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。末端部分３のヌクレオチド配列は、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。末端部分４のヌクレオチド配列は、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
【０１０１】
末端部分１のヌクレオチド配列は、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０１０２】
末端部分２のヌクレオチド配列は、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０１０３】
末端部分３のヌクレオチド配列は、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０１０４】
末端部分４のヌクレオチド配列は、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０１０５】
各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
【０１０６】
末端部分１のヌクレオチド配列は、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列は、末端部分１のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０１０７】
末端部分２のヌクレオチド配列は、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列は、末端部分２のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０１０８】
末端部分３のヌクレオチド配列は、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列は、末端部分３のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０１０９】
末端部分４のヌクレオチド配列は、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列は、末端部分４のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０１１０】
末端部分１のヌクレオチド配列は、末端部分１に対応する部分のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【０１１１】
末端部分２のヌクレオチド配列は、末端部分２に対応する部分のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【０１１２】
末端部分３のヌクレオチド配列は、末端部分３に対応する部分のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【０１１３】
末端部分４のヌクレオチド配列は、末端部分４に対応する部分のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【０１１４】
一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆにおいて、末端部分（ポリヌクレオチド）１〜４のヌクレオチド配列とそれらに対応するヌクレオチド配列の塩基対の長さは、可逆的な構造変化が阻害されなければ特に限定されず、例えば、３塩基〜５０塩基とすることができるが、好ましくは、５塩基〜３０塩基、より好ましくは、１０塩基〜３０塩基、さらにより好ましくは、１０塩基〜２０塩基である。
【０１１５】
核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２については、また、一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つの一体型核酸複合体のみが核酸結合タンパク質の結合部位を有するように設計される。
【０１１６】
本発明は、核酸二本鎖間の構造変化が、核酸結合タンパク質の結合により阻害されることを利用するものであるが、一体型核酸複合体においては、鎖交換の前後ではタンパク質結合配列は変わらない。例えば、核酸複合体Ｇ（核酸Ｇ１／核酸Ｇ２）がタンパク質結合配列を有する場合は、核酸複合体Ｉ（核酸Ｇ１／核酸Ｈ１）と核酸複合体Ｊ（核酸Ｇ２／核酸Ｈ２）にもタンパク質結合配列が存在することになる。この場合、一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆのいずれにも核酸結合タンパク質が結合することとなる。本発明を利用してタンパク質の結合を検出するためには、核酸結合タンパク質がいずれか一方の一体型核酸複合体にのみ結合するように設計する。
【０１１７】
塩基配列を認識して結合するような核酸結合タンパク質は、その認識部位に変異があると結合が阻害される。従って、本発明によれば、一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つのみが核酸タンパク質結合配列を有し、他の一体型核酸複合体が核酸タンパク質結合配列を有さないようにするため、例えば、タンパク質結合配列に変異を導入することができる。このような変異としては、核酸タンパク質が、目的の核酸複合体の結合配列以外には結合しないような変異とすることができる。具体的な構造の一態様を、図１３に示す。
【０１１８】
例えば、一体型核酸複合体Ｅにおいて、核酸複合体Ｇのうち、核酸Ｇ１および核酸Ｇ２のいずれのタンパク質結合部位には変異を導入せず、核酸複合体Ｈのうち、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２のいずれにも変異を導入した場合、核酸結合タンパク質は、核酸複合体Ｇと、場合によっては、核酸複合体Ｈには結合することができる。しかし、一体型核酸複合体Ｅが構造変化して、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとが形成されると、核酸複合体Ｉは核酸Ｈ１に、核酸複合体Ｊは核酸Ｈ２にそれぞれ変異を有することになるので、一体型核酸複合体Ｆにはタンパク質が結合することができないこととなる。
【０１１９】
このように、変異は、いずれかの核酸一本鎖とその相補鎖（例えば、第五のヌクレオチド配列／第五のヌクレオチド配列に対応する配列、第六のヌクレオチド配列／第六のヌクレオチド配列に対応する配列、第五のヌクレオチド配列／第六のヌクレオチド配列、第五のヌクレオチド配列に対応する配列／第六のヌクレオチド配列に対応する配列）に少なくとも１個ずつ導入される。
【０１２０】
変異は、好ましくは、タンパク質結合配列に、より好ましくは、タンパク質結合配列のうちタンパク質との結合に深く関わる塩基に導入される。タンパク質結合配列のうちタンパク質との結合に深く関わる塩基については、核酸タンパク質ごとに知られている。タンパク質との結合に深く関わる塩基は、Ｘ線解析等によって決定されたタンパク質−核酸複合体の構造から決定することもできる。あるいは、ＴＦＳＥＡＲＣＨ（http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCHJ.html）等のデータベースにより検索可能な高度に保存された塩基から推測することもできる。
【０１２１】
変異の位置は、鎖交換が阻害されず、かつ、核酸結合タンパク質の結合が阻害されるように決定することができる。例えば、相補鎖間でずらして導入する（すなわち、各箇所で一方の鎖の塩基にのみ変異を導入する）こともできるし、同じ箇所に導入することもできる。また、同じ箇所に変異が導入される場合は、ミスマッチとなるような変異を導入することも、マッチとなる変異を導入することができる。しかし、鎖交換の効率を低下させないためには、変異は、相補鎖において、変異箇所をずらして導入されることが好ましい。
【０１２２】
変異の種類としては、核酸結合タンパク質の結合を阻害することができれば特に限定されず、目的の核酸結合タンパク質とその認識配列に応じて適宜決定することができるが、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入等が挙げられ、好ましくは、置換である。
【０１２３】
変異の数は、核酸結合タンパク質の結合を阻害することができれば特に限定されず、目的の核酸結合タンパク質とその認識配列に応じて適宜決定することができるが、例えば、一本鎖に１〜１０個であり、好ましくは１〜５個、より好ましくは２〜５個である。
【０１２４】
変異が導入された核酸は、公知の方法に従って合成することができる。
【０１２５】
変異の代わりに、タンパク質と結合しない人工塩基を導入することもできる。
【０１２６】
一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つのみが核酸タンパク質結合配列を有し、他の一体型核酸複合体が核酸タンパク質結合配列を有さないようにするためには、例えば、タンパク質が結合できないような構造となるような変異を導入することもできる。具体的な構造の一態様を、図１４に示す。
【０１２７】
この場合、鎖交換が途中で阻害されるような変異を導入することにより、完全なタンパク質結合部位は、鎖交換の前後においてどちらか一方にしか存在しないこととなる。  
【０１２８】
第五または第六のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列は、一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の可逆的な構造変化が可能であれば特に限定されず、任意の配列を選択することができる。
【０１２９】
例えば、核酸Ｇ１における第五のヌクレオチド配列は、核酸Ｇ２における第五のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。また、核酸Ｈ１における第六のヌクレオチド配列は、核酸Ｈ２における第六のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
【０１３０】
第五のヌクレオチド配列は、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０１３１】
第六のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０１３２】
各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
【０１３３】
第五のヌクレオチド配列は、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、第五のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０１３４】
第六のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第六のヌクレオチド配列に対応する配列は、第六のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０１３５】
第五のヌクレオチド配列は、第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【０１３６】
第六のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【０１３７】
また、核酸Ｇ１における第五のヌクレオチド配列は、核酸Ｈ１における第六のヌクレオチド配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。また、核酸Ｇ２における第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、核酸Ｇ２における第六のヌクレオチド配列に対応する配列と結合（好ましくは、ハイブリダイズ）する配列を選択することができる。
【０１３８】
第五のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、特に好ましくは、９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０１３９】
第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０１４０】
各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。なお、後述するように、検出感度の向上を目的として、ミスマッチを導入してもよい。
【０１４１】
第五のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第六のヌクレオチド配列は、第五のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０１４２】
第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、第六のヌクレオチド配列に対応する配列は、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０１４３】
第五のヌクレオチド配列は、第六のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【０１４４】
第五のヌクレオチド配列に対応する配列は、第六のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上高くなるように選択することができる。
【０１４５】
一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆにおいて、第五のヌクレオチド配列および第五のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに第六のヌクレオチド配列および第六のヌクレオチド配列に対応する配列の塩基対の長さは、可逆的な構造変化が阻害されなければ特に限定されず、例えば、５塩基対〜１００塩基対とすることができるが、好ましくは、８塩基対〜５０塩基対、より好ましくは、１０塩基対〜３０塩基対である。
【０１４６】
核酸結合タンパク質の結合部位は、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体の二本鎖部分、あるいは一体型核酸複合体の分岐部分に、少なくとも一種のタンパク質結合部位が存在するが、好ましくは、二本鎖部分、より好ましくは、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との二本鎖部分、および／もしくは、第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との二本鎖部分、または、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との二本鎖部分、および／もしくは、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との二本鎖部分である。転写因子のように特定の塩基配列を認識して結合するタンパク質の場合には、その認識配列とその周辺配列を含む。
【０１４７】
一体型核酸複合体は、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２が互いに結合し、かつ鎖交換による可逆的な構造変化が生ずる限り、結合の様式は特に限定されるものではないが、好ましくは、ハイブリダイゼーションにより結合させることができる。
【０１４８】
一体型核酸複合体は、一本の核酸の分子内高次構造でもよいし、二本以上の核酸からなる多量体であってもよい。例えば、核酸Ｇ１の５’末端と核酸Ｇ２の３’末端とは、リン酸ジエステル結合により結合し、核酸Ｇ１と核酸Ｇ２とが一本鎖となっていてもよい。核酸Ｇ１の３’末端と核酸Ｈ１の５’末端とは、リン酸ジエステル結合により結合し、核酸Ｇ１と核酸Ｈ１とが一本鎖となっていてもよい。核酸Ｈ１の３’末端と核酸Ｈ２の５’末端とは、リン酸ジエステル結合により結合し、核酸Ｈ１と核酸Ｈ２とが一本鎖となっていてもよい。核酸Ｈ２の３’末端と核酸Ｇ２の５’末端とは、リン酸ジエステル結合により結合し、核酸Ｇ２と核酸Ｈ２とが一本鎖となっていてもよい。例えば、一体型核酸複合体は以下のような構造をとることができる。
【化１】
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【０１４９】
本発明の好ましい態様によれば、一体型核酸複合体であって、
核酸Ｇ１が、末端部分１と、第五のヌクレオチド配列と、末端部分３とからなり、第五のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分１が、第五のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分３が連結されてなる核酸一本鎖であり、
核酸Ｇ２が、末端部分２と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分３に対応する部分とからなり、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分２が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分３に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖であり、
核酸Ｈ１が、末端部分１に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列と、末端部分４とからなり、第六のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分１に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分４が連結されてなる核酸一本鎖であり、
核酸Ｈ２が、末端部分４に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分２に対応する部分とからなり、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分４に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分２に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖であり、
末端部分１〜４とそれらに対応する部分がポリヌクレオチドであって、
末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が低い塩基対群（例えば、２〜１０塩基対）が形成され、かつ末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が低い塩基対群（例えば、２〜１０塩基対）が形成され；および
末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群（例えば、２〜１０塩基対）が形成され、かつ末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群（例えば、２〜１０塩基対）が形成され；並びに
末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が低い塩基対群（例えば、２〜１０塩基対）が形成され、かつ末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が低い塩基対群（例えば、２〜１０塩基対）が形成され；および
末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群（例えば、２〜１０塩基対）が形成され、かつ末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群（例えば、２〜１０塩基対）が形成され、
一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つのみが核酸タンパク質結合配列を有するように変異が導入された（ここで、変異は、タンパク質結合配列に、相補鎖間でずらして導入され、変異の数は、１〜５個である。）
一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなる、本発明による検出方法が提供される。より好ましい態様としては、構造変化の程度が、蛍光共鳴エネルギー転移を利用して測定される、本発明による検出方法が提供される。
【０１５０】
核酸結合タンパク質
本願明細書において、「核酸結合タンパク質」は、核酸に結合するタンパク質であれば特に限定されず、例えば、転写因子、構造タンパク質、修復酵素、分岐結合タンパク質、組み換え酵素、ポリメラーゼ、ＲＮＡ結合タンパク質、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断酵素等が挙げられる。
【０１５１】
転写因子としては、例えば、ＴＦＩＩＩＤ、ＮＦκＢ、ｐ５３やＡＰ１等が挙げられる。
【０１５２】
構造タンパク質としては、例えば、テロメアＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヒトＴＲＦ１、ＴＲＦ２、ＰＯＴ１等）等が挙げられる。
【０１５３】
修復酵素はミスマッチ結合タンパク質であり、例えば、大腸菌ＭｕｔＳ、ヒトＭＳＨ２、ＭＳＨ６等が挙げられる。
【０１５４】
分岐結合タンパク質としては、例えば、大腸菌ＲｕｖＡが挙げられる。
【０１５５】
組換えに関わる酵素としては、例えば、大腸菌ＲｅｃＡ、酵母Ｒａｄ５１等が挙げられる。
【０１５６】
ポリメラーゼとしては、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
【０１５７】
ＲＮＡ結合タンパク質としては、例えば、スプライソソーム複合体に含まれるＵ１ｓｎＲＮＰ、Ｕ２ｓｎＲＮＰ、Ｕ６ｓｎＲＮＰ、あるいはポリＡ結合タンパク質、ＲＮＡ修飾酵素、ＲＩＳＣ複合体等が挙げられる。
【０１５８】
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としては、大腸菌ＳＳＢ、ヒトＲＰＡ等が挙げられる。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂの少なくとも一方の一本鎖部分に結合し、核酸二本鎖複合体の形成を阻害する。
【０１５９】
ＤＮＡまたはＲＮＡ切断酵素としては、例えば、制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等）、ニッキング酵素、Ｄｉｃｅｒ等が挙げられる。一本鎖あるいは二本鎖の切断によって核酸二本鎖複合体の形成あるいはその後の構造変化が阻害される。
【０１６０】
核酸結合タンパク質は、精製されたものを使用してもよいし、細胞抽出液を使用してもよい。
【０１６１】
検出方法
第一の態様
末端に一本鎖部分を有する核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂは、それぞれの末端配列が互いに結合して核酸二本鎖複合体が形成され、続いて、構造変化が生じ、新たな核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄが形成される。新たに形成された核酸二本鎖Ｃおよび核酸二本鎖Ｄは、それらの末端配列において互いに結合して複合体を形成することはない。しかし、核酸結合タンパク質が核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂに結合すると、このような核酸二本鎖複合体の形成や、続く新たな核酸二本鎖の形成が阻害される。従って、核酸と核酸結合タンパク質との結合は、核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を指標にして、具体的には、核酸二本鎖および／または核酸二本鎖複合体の量を指標として、検出することができる。
【０１６２】
核酸と核酸結合タンパク質との結合は、下記工程を実施することにより検出することができる：
（ｉ）核酸結合タンパク質と、核酸二本鎖Ａと、核酸二本鎖Ｂとを接触させる工程；および
（ｉｉ）核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する工程。
【０１６３】
具体的には、工程（ｉｉ）において、核酸Ａ１と核酸Ｂ１とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｃ）および／または核酸Ａ２と核酸Ｂ２とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｄ）の量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定することができる。
【０１６４】
測定した量を、核酸結合タンパク質の非存在下での核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの量と比較する工程を更に含んでいてもよい。この場合、核酸結合タンパク質の存在下での核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの形成量が、核酸結合タンパク質の非存在下での形成量を下回る場合に、核酸結合タンパク質が核酸に結合すると判定できる。
【０１６５】
また、工程（ii）において、核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定することもできる。
【０１６６】
測定した量を、核酸結合タンパク質の非存在下での核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量と比較する工程を更に含んでいてもよい。この場合、核酸結合タンパク質の存在下での核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量が、核酸結合タンパク質の非存在下での量を上回る場合に、核酸結合タンパク質が核酸に結合すると判定できる。
【０１６７】
ここで、「核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量」は、核酸二本鎖複合体における核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量も含まれる。
【０１６８】
本発明による第一の態様の検出方法において「接触させる工程」は、核酸二本鎖Ａ、核酸結合タンパク質および核酸二本鎖Ｂは、全てを同時に混合してもよいし、核酸二本鎖Ａと核酸結合タンパク質を混合した後に核酸二本鎖Ｂを加えてもよい。
【０１６９】
本発明による第一の態様の検出方法において、構造変化は、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂのうち、いずれか一方の核酸二本鎖を他方の核酸二本鎖に対して過剰量とすることにより効率を上げることができる。また、構造変化が起こるのを阻害しない適切な配列を選択することにより、等量でも十分な効率の構造変化を起こすことができる。
【０１７０】
第二の態様
一体型核酸複合体Ｅは、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとが互いに結合して核酸複合体が形成されたものである。一体型核酸複合体Ｆは、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとが互いに結合して核酸複合体が形成されたものである。一体型核酸複合体Ｅは、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとの間の鎖交換反応により、新たに、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとからなる一体型核酸複合体Ｆに変換される。また、一体型核酸複合体Ｆも、核酸複合体Ｉと核酸複合体Ｊとの間の鎖交換反応により、新たに、核酸複合体Ｇと核酸複合体Ｈとからなる一体型核酸複合体Ｅに変換される。このような一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の構造変化は可逆的に繰り返される。しかし、核酸結合タンパク質が核酸複合体Ｇ、核酸複合体Ｈ、核酸複合体Ｉ、あるいは核酸複合体Ｊのいずれかに結合すると、このような可逆的な構造変化は阻害され、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆのいずれかの構造で安定化される。
【０１７１】
この時、一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとが異なる値を示すような標識（例えば、核酸Ｇ１と核酸Ｇ２、核酸Ｇ１と核酸Ｈ１、核酸Ｇ１と核酸Ｈ２、核酸Ｇ２と核酸Ｈ１、核酸Ｇ２と核酸Ｈ２、あるいは核酸Ｈ１と核酸Ｈ２にそれぞれ、例えば、蛍光標識と消光標識をする）をすると、構造の安定化に伴い、標識の値も安定化（すなわち、標識の値の上昇または低下）される。
【０１７２】
従って、核酸と核酸結合タンパク質との結合は、一体型核酸複合体の構造変化の程度を指標にして、具体的には、一体型核酸複合体Ｅあるいは一体型核酸複合体Ｆの量を指標として、検出することができる。第２の態様の検出の一態様を図１２に示す。
【０１７３】
核酸と核酸結合タンパク質との結合は、下記工程を実施することにより検出することができる：
（ｉｉｉ）核酸結合タンパク質と、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆとを接触させる工程；および
（ｉｖ）一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する工程。
【０１７４】
具体的には、工程（ｉｖ）において、目的の一体型核酸複合体の量を測定することにより核酸複合体の構造変化の程度を測定することができる。
【０１７５】
例えば、核酸結合タンパク質が核酸複合体Ｇまたは核酸複合体Ｈに結合するように設計した場合、一体型核酸複合体Ｅの量から核酸に結合された核酸結合タンパク質の量を判定することができる。あるいは、核酸結合タンパク質が核酸複合体Ｉまたは核酸複合体Ｊに結合するように設計した場合、一体型核酸複合体Ｆの量から核酸に結合された核酸結合タンパク質の量を判定することができる。
【０１７６】
本発明による第二の態様の検出方法において「接触させる工程」は、一体型核酸複合体Ｆまたは一体型核酸複合体Ｇと核酸結合タンパク質とは、同時に混合することができる。
【０１７７】
本発明による第二の態様の検出方法によれば、予め調製しておいた核酸複合体とタンパク質を混合するだけでよいことから、操作ステップの減少や煩雑さによる操作ミスを低減するなどの操作性の向上が期待できる点で有利である。
【０１７８】
本発明による検出方法において、核酸結合タンパク質は、そのエフェクター分子（タンパク質）ととともに接触させてもよい。
【０１７９】
本発明による検出方法によれば、得られた核酸の形成量から、核酸と核酸結合タンパク質との結合能を算出することもできる。
【０１８０】
本発明による検出方法によれば、結合配列が知られていない核酸結合タンパク質について、本願発明の検出方法を利用して特定の配列に結合することができるか否かを判定することにより、核酸結合タンパク質の結合配列を決定することができる。
【０１８１】
本発明による検出方法によれば、結合されるタンパク質が知られていない配列について、本願発明の検出方法を利用して被験タンパク質が目的の配列に結合することができるか否かを判定することにより、目的の結合配列に結合する核酸結合タンパク質を同定することができる。
【０１８２】
本発明による検出方法において、構造変化は触媒を必要とする反応ではないが（例えば、第一の態様であれば、それぞれの末端に、互いに結合することができる一本鎖部分を有する核酸二本鎖を接触させれば起こる）、例えば、大腸菌のＲｕｖＢタンパク質などの触媒を用いて反応を促進することもできる。
【０１８３】
本発明による検出方法は、ハイブリダイゼーションを促進させる物質（例えば、ポリエチレングリコールやデキストラン硫酸等）の存在下で行ってもよい。また、タンパク質やＤＮＡの吸着防止や保護効果のある物質（例えば、ウシ血清アルブミン、無関係なＤＮＡ等）の存在下で行ってもよい。
【０１８４】
本願発明による検出方法は、使用される核酸結合タンパク質に適した温度で行うことができる。ＤＮＡ結合タンパク質の検出は、一般的には２０℃〜３０℃で行われるが、好熱性のタンパク質の場合はより高温で行うことができる。
【０１８５】
核酸二本鎖、核酸二本鎖複合体、核酸複合体の量を測定する方法としては、当業者に知られている原理や方法であればいずれも使用でき、例えば、放射性標識、蛍光標識、電気泳動、蛍光共鳴エネルギー転移などを利用した方法が挙げられる。好ましくは、蛍光標識や蛍光共鳴エネルギー転移を利用した方法、より好ましくは、過剰な標識を除去するための洗浄操作や電気泳動を必要としないアッセイを可能とする蛍光共鳴エネルギー転移を利用した方法により、核酸二本鎖、核酸二本鎖複合体、核酸複合体の量を測定することができる。
【０１８６】
第一の態様によれば、例えば、核酸Ａ１の５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｂ１の３’末端は前記蛍光物質を消光する物質で標識することができる。この場合、核酸Ａ１が核酸二本鎖Ａを形成している時は蛍光を発するが、核酸Ａ１が核酸Ｂ１とハイブリダイズし、新たに核酸二本鎖Ｃを形成すると、核酸Ｂ１の標識によって消光されることから、蛍光値を測定することにより、容易に核酸二本鎖Ａの量を測定することができる。
【０１８７】
また、核酸Ａ１の５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ａ２の３’末端を前記蛍光物質を消光できる物質で標識することができる。この場合、核酸Ａ１が核酸二本鎖Ａを形成している時は消光されるが、核酸Ａ１が核酸Ｂ１とハイブリダイズし、新たに核酸二本鎖Ｃを形成すると、蛍光を発することができることから、蛍光値を測定することにより、核酸二本鎖Ｃの量を測定することができる。
【０１８８】
核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２のうち、いずれの核酸が標識されてもよく、標識の位置は、核酸の内部であっても末端であってもよいが、好ましくは、末端である。
【０１８９】
第二の態様によれば、例えば、核酸Ｇ１のうち、第五のヌクレオチド配列の３’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｇ２のうち、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端は前記蛍光物質を消光する物質で標識することができる。この場合、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｇを形成している時は消光されるが、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｉを形成すると、核酸Ｇ１の標識によって蛍光を発することから、蛍光値を測定することにより、容易に一本鎖核酸複合体Ｅまたは一本鎖核酸複合体Ｆの量を測定することができる。消光物質と蛍光物質は入れ替えることもできる。
【０１９０】
また、核酸Ｇ１のうち、第五のヌクレオチド配列の３’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｈ２のうち、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端は前記蛍光物質を消光できる物質で標識することができる。この場合、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｇを形成している時は消光されるが、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｉを形成すると、蛍光を発することができることから、蛍光値を測定することにより、容易に一本鎖核酸複合体Ｅまたは一本鎖核酸複合体Ｆの量を測定することができる。消光物質と蛍光物質は入れ替えることもできる。
【０１９１】
さらに、核酸Ｇ１のうち、第五のヌクレオチド配列の５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｈ２のうち、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端は前記蛍光物質を消光できる物質で標識することができる。この場合、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｇを形成している時は蛍光を発することができるが、核酸Ｇ１が核酸複合体Ｉを形成すると、消光することから、蛍光値を測定することにより、容易に一本鎖核酸複合体Ｅまたは一本鎖核酸複合体Ｆの量を測定することができる。消光物質と蛍光物質は入れ替えることもできる。
【０１９２】
核酸Ｇ１（好ましくは、第五のヌクレオチド配列）、核酸Ｇ２（好ましくは、第五のヌクレオチド配列に対応する配列）、核酸Ｈ１（好ましくは、第六のヌクレオチド配列）、核酸Ｈ２（好ましくは、第六のヌクレオチド配列に対応する配列）のうち、いずれの核酸が標識されてもよく、標識の位置は、核酸の内部であっても末端であってもよいが、構造変化の前後で標識の距離の差異が大きくなるような位置であることが好ましい。
【０１９３】
蛍光標識としては、例えば、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａシリーズ（モレキュラープローブ社）、蛍光緑色タンパク質（ＧＦＰ）等が挙げられるが、好ましくは、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａシリーズである。
【０１９４】
消光物質としては、例えば、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（モレキュラープローブ社）等が挙げられ、使用される蛍光物質に応じて、適宜選択することができる。
【０１９５】
蛍光共鳴エネルギー転移は消光ではなく、蛍光波長のシフトとしても利用することができる。この蛍光エネルギー転移は、蛍光分光光度計、リアルタイムＰＣＲ装置あるいは蛍光プレートリーダーなどの汎用される装置で測定することができる。
【０１９６】
ミスマッチの導入
ヌクレオチド鎖交換反応において、ヌクレオチド配列にミスマッチが導入されると鎖交換効率が低下することが知られている（Panyutin IG et al. J. Mol. Biol. 1993 230 413-424）。しかし、本発明者らは、核酸複合体に用いられる核酸にミスマッチを導入することにより、鎖交換効率を大きく低下させることなく、核酸結合タンパク質による鎖交換反応の抑制効果を増強できることを見出した（実施例４）。また、ミスマッチの導入を利用して核酸結合タンパク質の検出を行うと、Ｓ／Ｎ比が向上することも見出された（実施例４）。
【０１９７】
ミスマッチ導入により鎖交換反応の抑制効果が増強され、また、Ｓ/Ｎ比が向上することは、本発明による検出方法やスクリーニング方法において、少量のタンパク質でアッセイが可能となるため、コストを削減できる点で有利である。特に、生体内のタンパク質の検出においては、貴重な試料を節約できるとともに、測定範囲が広がることで詳細な解析が可能となる点で有利である。
【０１９８】
ミスマッチは、鎖交換反応において交換後に相補鎖となる核酸鎖の間にミスマッチが存在するように導入される。
【０１９９】
例えば、核酸二本鎖複合体の場合、核酸Ａ１のヌクレオチド配列（好ましくは、第一のヌクレオチド配列）における、核酸Ｂ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；核酸Ｂ１のヌクレオチド配列（好ましくは、第四のヌクレオチド配列）における、核酸Ａ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；核酸Ａ２のヌクレオチド配列（好ましくは、第一のヌクレオチド配列に対応する配列）における、核酸Ｂ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および核酸Ｂ２のヌクレオチド配列（好ましくは、第四のヌクレオチド配列に対応する配列）における、核酸Ａ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて導入することができる。
【０２００】
この場合、ミスマッチの導入位置は、鎖交換が行われる配列であれば、鎖交換効率を大きく損なわないかぎり特に制限されないが、好ましくは、核酸タンパク質結合配列以外の配列である。
【０２０１】
この場合、ミスマッチの数は、鎖交換効率を大きく損なわない限り特に制限されないが、例えば、第一のヌクレオチド配列は第四のヌクレオチド配列と、第四のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列と、第一のヌクレオチド配列に対応する配列は第四のヌクレオチド配列に対応する配列と、第四のヌクレオチド配列に対応する配列は第一のヌクレオチド配列に対応する配列と、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数で導入することができる。
【０２０２】
この場合、ミスマッチを形成する塩基は、核酸二本鎖複合体において、核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２のいずれの核酸にも単独でまたは組み合わせて導入することができるが、好ましくは、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との間、および／または第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との間、より好ましくは、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との間、および第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との間にミスマッチが形成されるように導入される。
【０２０３】
この場合、ミスマッチを形成する塩基は、鎖交換前の相補鎖間でずらして導入することもできるし、同じ箇所に導入することもできるが、好ましくは、鎖交換前の相補鎖において、同じ箇所に導入される。
【０２０４】
核酸二本鎖複合体の場合の好ましい態様としては、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との間、および第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との間に、第一のヌクレオチド配列と第四のヌクレオチド配列との相補性および第一のヌクレオチド配列に対応する配列と第四のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数のミスマッチが導入される。
【０２０５】
一体型複合体の場合、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列（好ましくは、第五のヌクレオチド配列）における、核酸Ｈ１のヌクレオチド配列あるいは核酸Ｇ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；核酸Ｇ２のヌクレオチド配列（好ましくは、第五のヌクレオチド配列に対応する配列）における、核酸Ｈ２のヌクレオチド配列あるいは核酸Ｇ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；核酸Ｈ１のヌクレオチド配列（好ましくは、第六のヌクレオチド配列）における、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列あるいは核酸Ｈ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および核酸Ｈ２のヌクレオチド配列（好ましくは、第六のヌクレオチド配列に対応する配列）における、核酸Ｇ２のヌクレオチド配列あるいは核酸Ｈ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて導入することができる。
【０２０６】
この場合、ミスマッチの導入位置は、鎖交換が行われる配列であれば、鎖交換効率を大きく損なわないかぎり特に制限されないが、好ましくは、核酸タンパク質結合配列以外の配列である。
【０２０７】
この場合、ミスマッチの数は、鎖交換効率を大きく損なわない限り特に制限されないが、例えば、第五のヌクレオチド配列は第六のヌクレオチド配列と、第六のヌクレオチド配列は第五のヌクレオチド配列と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列は第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列は第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、第五のヌクレオチド配列は第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列は第五のヌクレオチド配列と、第六のヌクレオチド配列は第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列は第六のヌクレオチド配列と、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数を導入することができる。
【０２０８】
この場合、ミスマッチを形成する塩基は、核酸複合体において、核酸Ｇ１、核酸Ｇ２、核酸Ｈ１、核酸Ｈ２のいずれの核酸にも単独でまたは組み合わせて導入することができるが、好ましくは、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との間、および／もしくは第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間、または、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間、および／もしくは第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間、より好ましくは、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との間、および第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間、または、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間、および第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間にミスマッチが形成されるように導入されることが好ましい。ここで、ミスマッチを形成する塩基は、可逆的な構造変化が、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆのうち、タンパク質結合配列を有さない一体型核酸複合体に寄るように導入されることが好ましい。従って、一体型核酸複合体Ｅがタンパク質結合配列を有するように設計されている場合は、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間、および／もしくは第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間にミスマッチが形成されるように導入されることが好ましい。
【０２０９】
一体型複合体の場合の好ましい態様として、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との間、および第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間に、第五のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列との相補性および第五のヌクレオチド配列に対応する配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数のミスマッチ、並びに、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列に対応する配列との間、および第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との間に、第五のヌクレオチド配列と第五のヌクレオチド配列との相補性および第六のヌクレオチド配列と第六のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性が、それぞれ、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは、９５％以上、さらにより好ましくは、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上の相補性を有するような数のミスマッチが導入される。
【０２１０】
マルチプレックス検出
本願発明の検出方法によれば、複数の核酸複合体を用いて、核酸結合タンパク質の核酸への結合を複数同時に検出することができる（マルチプレックス検出）。
【０２１１】
マルチプレックス検出は、核酸結合タンパク質の阻害剤などのスクリーニングにおいてその効率を上げることができる。標的以外のタンパク質への影響は、副作用の原因となるため、できるだけ早い段階で影響が小さいことを確認する必要がある。マルチプレックス検出によれば、薬剤の標的タンパク質への効果を調べると同時に、他のタンパク質への影響も調べることが可能になる。
【０２１２】
マルチプレックス検出は、また、細胞内に存在する複数のタンパク質への結合活性を測定することできるため、細胞内で起きている生命現象をより詳細に把握することができる。マルチプレックス検出によれば、翻訳後修飾や他のタンパク質との相互作用で核酸結合活性が変化することが知られている核酸結合タンパク質について、より詳細な知見を得ることができる。
【０２１３】
マルチプレックスな検出方法において使用される核酸の配列は、複数の核酸複合体が独立して構造変化が生ずるかぎり特に限定されず、一つの核酸複合体に係る反応系の各核酸の配列については、他の反応系の核酸同士の結合や核酸複合体の構造変化に影響を与えないように設計することができる。
【０２１４】
核酸二本鎖複合体を使用するマルチプレックス検出について、例えば、各反応系における第一乃至第四のヌクレオチド配列およびそれらに対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列は、以下のように設計することができる。
【０２１５】
各反応系における第一のヌクレオチド配列は、該第一のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０２１６】
各反応系における第四のヌクレオチド配列は、該第四のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０２１７】
各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。
【０２１８】
各反応系における第一のヌクレオチド配列は、該第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、該第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０２１９】
各反応系における第四のヌクレオチド配列は、該第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列は、該第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０２２０】
各反応系における第一のヌクレオチド配列は、該第一のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。
【０２２１】
各反応系における第四のヌクレオチド配列は、該第四のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。
【０２２２】
各反応系における第二のヌクレオチド配列は、該第二のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。一方、各反応系における第二のヌクレオチド配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との相補性が、それぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満、特に好ましくは２０％未満となるように選択することができる。また、各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との相補性が、それぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満、特に好ましくは２０％未満となるように選択することができる。
【０２２３】
各反応系における第三のヌクレオチド配列は、該第三のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。一方、各反応系における第三のヌクレオチド配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との相補性が、それぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満、特に好ましくは２０％未満となるように選択することができる。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列との相補性、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との相補性が、それぞれ５０％未満、より好ましくは３０％未満、特に好ましくは２０％未満となるように選択することができる。
【０２２４】
各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。
【０２２５】
各反応系における第二のヌクレオチド配列は、該第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、該第二のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０２２６】
一方、各反応系における第二のヌクレオチド配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列および第三のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列のいずれかの相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。また、各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列および第三のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列のいずれかの相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。加えて、各反応系における第三のヌクレオチド配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。さらに、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列は、各反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。
【０２２７】
各反応系における第三のヌクレオチド配列は、該第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、該第三のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０２２８】
一方、各反応系における第三のヌクレオチド配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列のいずれかの相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列に対応する配列、並びに他の反応系における核酸のヌクレオチド配列のいずれかの相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。加えて、各反応系における第二のヌクレオチド配列は、各反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、各反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。さらに、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列は、各反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続するヌクレオチドを含んでいてもよいが、そのヌクレオチドの個数は、最大で４個、好ましくは、３個以下、より好ましくは、２個以下である。
【０２２９】
各反応系における第二のヌクレオチド配列は、該第二のヌクレオチド配列に対応する配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。一方、各反応系における第二のヌクレオチド配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列のＴｍ値、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上低くなるように選択することができる。また、各反応系における第二のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第三のヌクレオチド配列や、第三のヌクレオチド配列に対応する配列のＴｍ値、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上低くなるように選択することができる。
【０２３０】
各反応系における第三のヌクレオチド配列は、該第三のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。一方、各反応系における第三のヌクレオチド配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列とのＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上低くなるように選択することができる。また、各反応系における第三のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第二のヌクレオチド配列や、第二のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値、他の反応系における核酸のヌクレオチド配列とのＴｍ値が、それぞれ、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上低くなるように選択することができる。
【０２３１】
各反応系における第一のヌクレオチド配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０２３２】
各反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上の相補性を有するように選択することができる。
【０２３３】
各反応系における各ヌクレオチド配列と７０％以上の相補性を有する配列は、好ましくは、各ヌクレオチド配列の相補配列である。
【０２３４】
各反応系における第一のヌクレオチド配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第四のヌクレオチド配列は、同一反応系における第一のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０２３５】
各反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。また、各反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列の相補配列の連続する少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも２０個、特に好ましくは、少なくとも２５個、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなるように選択することができる。
【０２３６】
各反応系における第一のヌクレオチド配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列との間のＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。
【０２３７】
各反応系における第一のヌクレオチド配列に対応する配列は、同一反応系における第四のヌクレオチド配列に対応する配列とのＴｍ値が、反応温度より５℃以上、好ましくは、１０℃以上、より好ましくは、１５℃以上、さらに好ましくは、２０℃以上、特に好ましくは、２５℃以上高くなるように選択することができる。
【０２３８】
一体型核酸複合体を使用するマルチプレックス検出については、他の反応系の影響が少ないため、当業者であれば、使用されるヌクレオチド配列（例えば、第五のヌクレオチド配列、第六のヌクレオチド配列、末端部分１〜４のヌクレオチド配列、およびこれらに対応する配列）を適宜選択することができる。
【０２３９】
マルチプレックスな検出方法において使用される標識は、他の核酸二本鎖複合体の構造変化と十分に区別でき、かつ十分な蛍光共鳴エネルギー転移を得られるかぎり特に限定されないが、好ましくは、フルオレセイン（蛍光物質）とＤＡＢＣＹＬ（消光物質）との組み合わせ、Ｃｙ３（蛍光物質）とＢＨＱ１（消光物質）との組み合わせである。
【０２４０】
複数の反応において使用される核酸結合タンパク質の結合部位は、異なるタンパク質の結合部位であってもよいし、同じタンパク質の異なる結合部位であってもよい。
【０２４１】
異なるタンパク質の場合、たとえば、タンパク質の阻害剤スクリーニングにおいて、このタンパク質と近縁であるが阻害効果を望まないタンパク質を同時にアッセイすることで、特異性の高い薬剤の取得が容易になる。
【０２４２】
また、同じタンパク質の異なる結合部位へのタンパク質結合を同時に測定することで、そのタンパク質の核酸への結合特性をより詳細に知ることができる。
【０２４３】
スクリーニング方法
第一の態様
核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂに核酸結合タンパク質が結合すると、核酸二本鎖複合体の形成や、続く新たな核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの形成が阻害される。従って、被験物質の存在下および非存在下において、本願発明の検出方法を実施し、構造変化の程度を比較することにより、被験物質が核酸結合タンパク質の核酸への結合を阻害したか否か、または促進したか否かを判定することができる。
【０２４４】
被験物質の存在下での核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの形成量が、被験物質の非存在下での形成量を上回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合阻害剤と判定できる。また、被験物質の存在下での核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量が、被験物質の非存在下での量を下回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合阻害剤と判定できる。
【０２４５】
一方、被験物質の存在下での核酸二本鎖Ｃおよび／または核酸二本鎖Ｄの形成量が、被験物質の非存在下での形成量を下回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合促進剤と判定できる。また、被験物質の存在下での核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量が、被験物質の非存在下での量を上回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合促進剤と判定できる。
【０２４６】
第二の態様
一体型核酸複合体Ｅ、一体型核酸複合体Ｆのいずれかに核酸結合タンパク質が結合すると、一体型核酸複合体Ｅと一体型核酸複合体Ｆとの間の構造変化が阻害され、いずれかの一体型核酸複合体に核酸結合タンパク質が結合された状態で安定化される。従って、被験物質の存在下および非存在下において、本願発明の検出方法を実施し、核酸結合タンパク質が結合されるように設計された一体型核酸複合体の量を比較することにより、被験物質が核酸結合タンパク質の核酸への結合を阻害したか否か、または促進したか否かを判定することができる。
【０２４７】
被験物質の存在下での一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆの量が、被験物質の非存在下での量を下回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合阻害剤と判定できる。また、被験物質の存在下での一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆの量が、被験物質の非存在下での量を上回る場合に、該被験物質を、核酸結合タンパク質の結合促進剤と判定できる。
【０２４８】
本発明によるスクリーニング方法において、「被験物質」は、阻害剤または促進剤としてのあらゆる候補物質を意味するが、好ましくは、低分子化合物である。
【０２４９】
本発明によるスクリーニング方法は、被験物質が、標的の核酸結合タンパク質の結合に作用するのであって、核酸への非特異的な作用によって鎖交換に影響を与えたのではないことを確認するために、標的の核酸結合タンパク質とは結合しない核酸セットを、陰性コントロールとして使用できることが確認された（実施例５）。
【０２５０】
具体的には、本発明によるスクリーニング方法において、被験物質の標的となる核酸結合タンパク質とは結合しない核酸からなる核酸複合体の構造変化の程度を測定すること、をさらに含んでなることができる。
【０２５１】
陰性コントロールの検出方法としては、第一の態様の検出方法であっても、第二の態様の検出方法であってもよい。目的のスクリーニングが、第一の態様の検出方法を使用している場合に、第二の態様の検出方法を、あるいは、目的のスクリーニングが、第二の態様の検出方法を使用している場合に、第一の態様の検出方法を使用してもよいが、目的のスクリーニングと同じ検出方法を使用することが好ましい。
【０２５２】
本発明によるスクリーニング法は、ゲルシフトアッセイ法等を用いなくても、簡便かつ迅速に、被験物質の阻害効果を測定できる点で有利である。
【０２５３】
キット
本発明によれば、本発明による検出方法または本発明によるスクリーニング方法を実施するための検出キットが提供される。
【０２５４】
第一の態様
本発明による検出キットとしては、本発明による検出方法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出するためのキットであって、末端配列において結合し得る核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この核酸二本鎖は標識したものであってもよい。この検出キットは、目的の核酸結合タンパク質を更に含んでいてもよい。また、この検出キットは、核酸二本鎖複合体の構造変化の阻害の程度を測定することにより核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する。従って、所望により、核酸二本鎖複合体の構造変化の阻害の程度を測定するための種々の試薬、例えば、反応用緩衝液、陽性標準物質、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０２５５】
本発明による検出キットとしては、また、本発明によるスクリーニング方法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、核酸結合タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングするためのキットであって、末端配列において結合し得る核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この核酸二本鎖は標識したものであってもよい。この検出キットは、目的の核酸結合タンパク質を更に含んでいてもよい。また、この検出キットは、核酸二本鎖複合体の構造変化の阻害の程度を測定することにより核酸結合タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングする。従って、所望により、核酸二本鎖複合体の構造変化の阻害の程度を測定するための種々の試薬、例えば、反応用緩衝液、陽性標準物質、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。また、陰性コントロールとして使用するための核酸二本鎖や一体型核酸複合体を更に含むことができる。
【０２５６】
第二の態様
本発明による検出キットとしては、本発明による検出方法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出するためのキットであって、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この一体型核酸複合体は標識したものであってもよい。この検出キットは、目的の核酸結合タンパク質を更に含んでいてもよい。また、この検出キットは、一体型核酸複合体の構造変化の阻害の程度を測定することにより核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する。従って、所望により、一体型核酸複合体の構造変化の阻害の程度を測定するための種々の試薬、例えば、反応用緩衝液、陽性標準物質、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０２５７】
本発明による検出キットとしては、また、本発明によるスクリーニング方法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、核酸結合タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングするためのキットであって、一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この一体型核酸複合体は標識したものであってもよい。この検出キットは、目的の核酸結合タンパク質を更に含んでいてもよい。また、この検出キットは、一体型核酸複合体の構造変化の阻害の程度を測定することにより核酸結合タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングする。従って、所望により、一体型核酸複合体の構造変化の阻害の程度を測定するための種々の試薬、例えば、反応用緩衝液、陽性標準物質、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。また、陰性コントロールとして使用するための核酸二本鎖や一体型核酸複合体を更に含むことができる。
【０２５８】
第二の態様のキットは、操作性の向上に加え、試薬コンポーネントの減少によるコスト削減が期待できる点で有利である。
【実施例】
【０２５９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【０２６０】
実施例１：ＮＦκＢ  ｐ５０を用いた結合量の検討
ＮＦκＢ  ｐ５０はループ型（Ｒｅｌファミリー）に属するＤＮＡ結合配列を持つ転写因子であり、ＮＦκＢ結合配列（例えば、５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’）に結合することが知られている。【０２６１】
（１）二本鎖の調製
５’末端を６−ＦＡＭで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−０１−５Ｆと合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−１４、３’末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−０２−３Ｄと合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−１３をそれぞれ２０μＬの二本鎖形成溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  （ｐＨ７．９）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５  ％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）中に混合して、加熱変性とアニーリングによって末端に一本鎖を持つ二本鎖０１Ｆ／１４および０２Ｄ／１３を調製した。合成オリゴヌクレオチドは全て２０ｐｍｏｌ使用した。なお、以後すべての標識については、日本バイオサービス社に合成を依頼して作製されたものを使用した。【０２６２】
加熱変性とアニーリングは以下の温度条件で行った。
95℃ 120秒 - 90℃ 30秒 - 85℃ 90秒 - 80℃ 90秒 - 77℃ 90秒 - 75℃ 90秒 - 72℃ 90秒 - 70℃ 90秒 - 67℃ 90秒 - 65℃ 90秒 - 62℃ 90秒 - 60℃ 90秒 - 57℃ 90秒 - 55℃ 90秒 - 52℃ 90秒 - 50℃ 90秒 - 47℃ 90秒 - 45℃ 90秒 - 42℃ 90秒 - 40℃ 90秒 - 37℃ 90秒 - 35℃ 90秒 - 32℃ 90秒 - 30℃ 90秒【０２６３】
使用した各配列は以下の通りである。
【表１】
2009093667.tif 000004
【０２６４】
下線部はＮＦκＢ結合配列であり、斜体は二本鎖において一本鎖になる配列である。【０２６５】
（２）ＮＦκＢ  ｐ５０結合の検出
０．２８ｐｍｏｌの二本鎖０１Ｆ／１４と各濃度の組み換えヒトＮＦκＢ  ｐ５０（プロメガ社）を２０μＬの反応溶液（１２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９  、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１１％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０６％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５  ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μＭ  ＺｎＳＯ４）中に混合し、２５℃で３０分間反応させた。その後氷上で５分間静置し、ＮＦκＢ結合溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）で希釈した２．８μＬ（０．２８ｐｍｏｌ）の二本鎖０２Ｄ／１３を加えた後、３０℃で１１分間反応させた。蛍光値の測定は、リアルタイムＰＣＲ装置ロータージーン２０００（コルベットライフサイエンス社）を用いた。【０２６６】
その結果、ＮＦκＢ  ｐ５０濃度に依存して蛍光値が上昇した（図２）。【０２６７】
０１Ｆ／１４は、ＮＦｋＢ−０１−５Ｆに導入された６−ＦＡＭによって蛍光を発する。しかし、０１Ｆ／１４を０２Ｄ／１３と混合して構造変化が生じ、新たに完全な二本鎖０１Ｆ／０２Ｄ  （ＮＦｋＢ−０１−５ＦとＮＦｋＢ−０２−３Ｄ）と１３／１４（ＮＦｋＢ−１３とＮＦｋＢ−１４）が形成されると、６−ＦＡＭはＮＦｋＢ−０２−３ＤのＤＡＢＣＹＬによって消光される。一方、ＮＦκＢ  ｐ５０が結合すると上記の構造変化が阻害されることから、ＮＦκＢ  ｐ５０濃度に依存して蛍光値は上昇すると考えられる。【０２６８】
以上のことから、上記の方法によれば、蛍光値を測定することにより、ＮＦκＢ  ｐ５０結合による構造変化を検出できることが確認された。【０２６９】
実施例２：デコイオリゴのＮＦκＢ  ｐ５０結合量への影響
（１）二本鎖の調製
５’末端を６−ＦＡＭで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−０１−５Ｆと３‘末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−１４−０３Ｄ、合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−０２と合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−１３をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖０１Ｆ／１４Ｄおよび０２／１３を実施例１と同様の条件で調製した。【０２７０】
また、ＮＦκＢ結合配列を持つ合成オリゴヌクレオチドＮＦｃｐｔ０１とＮＦｃｐｔ０２、ＮＦκＢ結合配列を持たない合成オリゴヌクレオチドＡＰｃｐｔ０１とＡＰｃｐｔ０２をそれぞれ混合して、デコイオリゴ二本鎖ＮＦｃｐｔとＡＰｃｐｔを実施例１と同様の条件で調製した。ＮＦｃｐｔは、ＮＦκＢ結合配列を含むため、他のＮＦκＢ結合配列を含むＤＮＡへのＮＦκＢタンパク質の結合を阻害するが、ＡＰｃｐｔは、ＮＦκＢ結合配列を含まないため、他のＮＦκＢ結合配列へのＮＦκＢタンパク質の結合を阻害しない。【０２７１】
使用した各配列は、以下の通りである。
【表２】
2009093667.tif 000005
【０２７２】
下線部はＮＦκＢ結合配列であり、斜体は二本鎖０１Ｆ／１４Ｄおよび０２／１３において一本鎖になる配列である。【０２７３】
（２）ＮＦκＢ  ｐ５０結合の検出
１．６８ｐｍｏｌのデコイオリゴ二本鎖と０．４２ｐｍｏｌの二本鎖０１Ｆ／１４Ｄ、および１．５８ｐｍｏｌの組み換えヒトＮＦκＢ  ｐ５０（プロメガ社）、０．４２ｐｍｏｌの二本鎖０２／１３を３４．２μＬのＮＦκＢ反応溶液中（実施例１と同じ）に混合した後、３０℃で２１分間反応させた。蛍光値の測定はリアルタイムＰＣＲ装置ロータージーン２０００（コルベットライフサイエンス社）を用いた。【０２７４】
その結果、ＮＦκＢ結合阻害剤であるデコイオリゴ二本鎖（ＮＦｃｐｔ）の添加により、ＮＦκＢ  ｐ５０の添加により低下した蛍光値が上昇するが、ＮＦκＢ結合配列を持たないデコイオリゴ二本鎖（ＡＰｃｐｔ）の添加によっては、同様な蛍光値の上昇は認められなかった（図３）。【０２７５】
０１Ｆ／１４Ｄは、ＮＦｋＢ−０１−５Ｆに導入された６−ＦＡＭがＮＦｋＢ−１４−３Ｄに導入されたＤＡＢＣＹＬによって消光される。しかし、０１Ｆ／１４Ｄを０２／１３と混合して構造変化が生じ、新たに完全な二本鎖０１Ｆ／０２（ＮＦｋＢ−０１−５ＦとＮＦｋＢ−０２）と１３／１４Ｄ（ＮＦｋＢ−１３とＮＦｋＢ−１４−３Ｄ）が形成されると、６−ＦＡＭはＤＡＢＣＹＬから十分に離れるため蛍光を発する（図３：ＮＦκＢ  ｐ５０なし）。ここで、ＮＦκＢ  ｐ５０を添加すると上記の構造変化が阻害されるため、蛍光値は低下する（図３：ＮＦκＢ  ｐ５０添加）。しかし、さらにＮＦｃｐｔが添加されると、ＮＦκＢ  ｐ５０の合成オリゴヌクレオチドへの結合が阻害され、構造変化も阻害されるため、蛍光値は高くなる（図３：ＮＦκＢ  ｐ５０＋ＮＦｃｐｔ添加）。一方、ＡＰｃｐｔが添加されても、ＮＦκＢ  ｐ５０の結合は阻害されず、構造変化も阻害されないため、蛍光値は低下する（図３：ＮＦκＢ  ｐ５０＋ＡＰｃｐｔ添加）。【０２７６】
以上のことから、蛍光値を測定することにより、ＮＦκＢ結合配列をもつデコイオリゴ二本鎖（ＮＦｃｐｔ）による特異的なＮＦκＢ  ｐ５０の結合阻害を検出できることが確認された。従って、上記の方法は、核酸結合タンパク質の阻害剤のスクリーニングに使用できることが示された。【０２７７】
実施例３−１：ヒトＡＰ１タンパク質の結合試験
ＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）はロイシンジッパー型のＤＮＡ結合モチーフを持つ転写因子であり、ＡＰ１結合配列（例えば、５’−ＴＧＡＧＴＣＡ−３’）に結合することが知られている。【０２７８】
（１）二本鎖の調製
合成オリゴヌクレオチドＡＰ−０１−５Ｃ５とＡＰ−０４−３ＢＨ、ＡＰ−０２とＡＰ−０３、ＳＰ１−０１−５Ａ５とＳＰ１−０４−３ＢＨ３、ＳＰ１−０２とＳＰ１−０３をそれぞれハイブリダイズさせ、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＡＰ０１Ｃ／０４Ｂ、ＡＰ０２／０３、ＳＰ０１Ａ／０４ＢおよびＳＰ０２／０３を実施例１と同様の条件で調製した。【０２７９】
ＡＰ０１Ｃ／０４ＢとＡＰ０２／０３はＡＰ１結合配列を持つが、ＳＰ０１Ａ／０４ＢとＳＰ０２／０３はＡＰ１結合配列を持たない。【０２８０】
使用された各配列は、以下の通りである。
【表３】
2009093667.tif 000006
【０２８１】
ＡＰ１結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
【表４】
2009093667.tif 000007
【０２８２】
二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。下線はＳＰ１結合配列である。【０２８３】
（２）ＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）結合の検出
６０ｆｍｏｌの二本鎖ＡＰ０１Ｃ／０４ＢあるいはＳＰ０１Ａ／０４Ｂと１．５  ｐｍｏｌの組み換えヒトＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）  （プロメガ社）を３０μＬの反応溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９  、５３ｍＭ  ＫＣｌ、０．１７ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．６ｍＭ  ＤＴＴ、１２％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５  ％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、１．３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．６７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３３ｍＭ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）中に混合し、２５℃で３０分間反応させた。その後氷上で５分間静置し、ＮＦκＢ結合溶液で希釈した３μＬ（６０ｆｍｏｌ）の二本鎖ＡＰ０２／０３あるいはＳＰ０２／０３をそれぞれ加えた後、３０℃で２時間反応させた。蛍光値の測定は、リアルタイムＰＣＲ装置ロータージーン２０００（コルベットライフサイエンス社）を用いた。【０２８４】
実施例３は、実施例２と同様に、タンパク質の結合による構造変化の阻害効果を蛍光値の低下によって検出するものである。ただし、蛍光物質として実施例２の６−ＦＡＭに代わりＣｙ５あるいはＡｌｅｘａ６４７を用い、消光物質としてＤＡＢＣＹＬの代わりにＢＨＱ３を用いた。【０２８５】
その結果、ＡＰ１結合配列をもつ二本鎖（ＡＰ０１Ｃ／０４ＢとＡＰ０２／０３）を使用した場合は、ＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）の添加による蛍光値の低下、すなわちＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）による構造変化の阻害が観察された（図４）。しかし、ＳＰ１結合配列をもつ二本鎖（ＳＰ０１Ａ／０４ＢとＳＰ０２／０３）を使用した場合は、ＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）を添加しても蛍光値の低下、すなわちＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）による構造変化の阻害は認められなかった（図４）。【０２８６】
実施例３−２：ヒトＳＰ１タンパク質の結合検出試験
ＳＰ１はＺｎフィンガー型のＤＮＡ結合モチーフを持つ転写因子であり、ＳＰ１結合配列（例えば、５’−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ−３’）に結合することが知られている。【０２８７】
（１）二本鎖の調製
二本鎖の調製は、実施例３と同様に行った。【０２８８】
（２）ＳＰ１結合の検出
６０ｆｍｏｌの二本鎖ＡＰ０１Ｃ／０４ＢあるいはＳＰ０１Ａ／０４Ｂと１．６５ｐｍｏｌの組み換えヒトＳＰ１（プロメガ社）を３０μＬの反応溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９  、５３．０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．６ｍＭ  ＤＴＴ、１３．０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５６％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、０．３６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０３ｎＭ  ＺｎＳＯ４、０．７２  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．５）中に混合し、２５℃で３０分間反応させた。その後氷上で５分間静置し、ＮＦκＢ結合溶液で希釈した３μＬ（６０  ｆｍｏｌ）の二本鎖ＡＰ０２／０３あるいはＳＰ０２／０３をそれぞれ加えた後、３０℃で４時間反応させた。蛍光値の測定は、リアルタイムＰＣＲ装置ロータージーン２０００（コルベットライフサイエンス社）を用いた。【０２８９】
その結果、ＳＰ１結合配列をもつ二本鎖（ＳＰ０１Ａ／０４ＢとＳＰ０２／０３）を使用した場合は、ＳＰ１の添加による蛍光値の低下、すなわちＳＰ１による構造変化の阻害が観察された（図５）。しかし、ＡＰ１結合配列をもつ二本鎖（ＡＰ０１Ｃ／０４ＢとＡＰ０２／０３）を使用した場合は、ＳＰ１を添加しても蛍光値の低下、すなわちＳＰ１による構造変化の阻害は認められなかった（図５）。【０２９０】
実施例３−３：ＴＲＦ２タンパク質の結合実験
ＴＲＦ２は、Ｃ末端側にＭｙｂタイプのヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフからなるＤＮＡ結合ドメインを持つテロメアＤＮＡ結合タンパク質であり、テロメアＤＮＡ（５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’の繰り返し）に結合してテロメア構造を形成するタンパク質として知られている。【０２９１】
（１）組換えヒトＴＲＦ２ΔＢの作製
ＴＲＦ２ΔＢは、ＴＲＦ２のＮ末端にある塩基性ドメインを欠損させた組換えヒトＴＲＦ２タンパク質（Ｎ末端欠損体）である。【０２９２】
ヒト培養細胞株（ＩＨＷ０９０８４（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨＬＡ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐより入手））から抽出したｍＲＮＡを基に調製したｃＤＮＡから、ＴＲＦ２の全長を含むｃＤＮＡを取得した。このｃＤＮＡを鋳型として、アミノ酸配列の４５番目から５００番目に相当するＤＮＡ領域をＰＣＲ法を用いて増幅した。得られたＤＮＡ断片にヒスタグ配列を付加し、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入して、Ｂａｃｍｉｄを得た。Ｂａｃｍｉｄを昆虫細胞（Ｓｆ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より入手））にトランスフェクションしてウィルスを作製した。得られたウイルスをＳｆ９に感染させ、組換えヒトＴＲＦ２ΔＢを発現させた。ＴＲＦ２ΔＢは、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製した。タンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でウシ血清アルブミンを基準に算出した。【０２９３】
（２）二本鎖の調製
合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ−０６と５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ−０１−５Ｃ３を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖Ｔ０１Ｃ／０６を実施例１と同様の条件で調製した。Ｔ０１Ｃ／０６はＴＲＦ２結合配列を持つ。【０２９４】
合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ−１６と５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ−１３−５Ｃ３を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖Ｔ１３Ｃ／１６を実施例１と同様の条件で調製した。Ｔ１３Ｃ／１６はＴＲＦ２結合配列を持たない。【０２９５】
合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ−０５と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ−０２−３Ｂ１を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖Ｔ０２Ｂ／０５を実施例１と同様の条件で調製した。Ｔ０２Ｂ／０５はＴＲＦ２結合配列を持つ。【０２９６】
合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ−１５と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ−１４−３Ｂ１を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖Ｔ１４Ｂ／１５を実施例１と同様の条件で調製した。Ｔ１４Ｂ／１５はＴＲＦ２結合配列を持たない。【０２９７】
使用された配列は以下の通りである。
【表５】
2009093667.tif 000008
【０２９８】
ＴＲＦ２結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
【表６】
2009093667.tif 000009
【０２９９】
下線部はＴＲＦ２結合配列を示すが、網掛けの部分に変異があるため、ＴＲＦ２は結合することができない。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。【０３００】
（３）ＴＲＦ２結合の検出
１００ｆｍｏｌのＴ０１Ｃ／０６あるいはＴ１３Ｃ／１６と１μｇのＴＲＦ２ΔＢを反応溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、２０μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。その後、Ｔ０１Ｃ／０６、Ｔ１３Ｃ／１６に、１００ｆｍｏｌのＴ０２Ｂ／０５、Ｔ１４Ｂ／１５をそれぞれ加えて５０μＬとした後、２５℃で６０分間反応させた。Ｃｙ３の蛍光値の測定は、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いた。【０３０１】
その結果、ＴＲＦ２結合配列を持つＤＮＡセット（Ｔ０１Ｃ／０６とＴ０２Ｂ／０５）では、Ｔ０１Ｃ／０６とＴ０２Ｂ／０５とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、Ｔ０１Ｃ／０２Ｂに変換されることによる蛍光値の低下が、ＴＲＦ２ΔＢの添加により抑制された（図６）。一方、ＴＲＦ２結合配列に変異を導入したＤＮＡセット（Ｔ１３Ｃ／１６とＴ１４Ｂ／１５）では、Ｔ１３Ｃ／１６とＴ１４Ｂ／１５とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、Ｔ１３Ｃ／１４Ｂに変換されることによる蛍光値の低下が、ＴＲＦ２ΔＢの添加により抑制されなかった（図６）。【０３０２】
このように、本発明の方法は、代表的なＤＮＡ結合モチーフであるループ、ロイシンジッパー、Ｚｎフィンガーを持つＤＮＡ結合タンパク質の結合阻害を検出することができた。また、テロメアＤＮＡ結合タンパク質の結合阻害を検出することができた。従って、本発明は、核酸結合タンパク質一般に広く使用可能であることが示された。【０３０３】
また、本発明による方法は、使用する蛍光物質にも制限がないことを示された。本発明によれば、さまざまな種類の蛍光物質を使用することができるため、例えば、薬剤となる化合物が蛍光を発するものである場合に、化合物の蛍光が障害とならないような蛍光標識を選択することが可能である。【０３０４】
実施例４：ミスマッチ導入による検出感度の確認試験
４−１．ＳＰ１を用いた試験
（１）二本鎖の調製
５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０５−５Ｃ３と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０８−３Ｂ１を混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＳＰ０５Ｃ／０８Ｂを実施例１と同様の条件で調製した。また、合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０６とＳＰ１−０７、ＳＰ１−２１とＳＰ１−２２、ＳＰ１−２３とＳＰ１−２４をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＳＰ０６／０７、ＳＰ２２／２１、ＳＰ２４／２３を実施例１と同様の条件で調製した。これらの二本鎖は、ＳＰ１の結合配列を持つ。【０３０５】
使用された配列は以下の通りである。
【表７】
2009093667.tif 000010
【０３０６】
ＳＰ１結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。網掛けは、ＳＰ１−２１とＳＰ１−２３についてはＳＰ１−０８−３Ｂ１に対してミスマッチとなる塩基を、ＳＰ１−２２とＳＰ１−２４についてはＳＰ１−０５−５Ｃ３に対してミスマッチとなる塩基をそれぞれ示した。【０３０７】
（２）鎖交換抑制効果の確認
４０ｆｍｏｌのＳＰ０５Ｃ／０８Ｂと２．５ｐｍｏｌの組み換えヒトＳＰ１（プロメガ社）を反応溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、１５μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。８０ｆｍｏｌのＳＰ０６／０７、ＳＰ２２／２１、ＳＰ２４／２３、ＳＰ１−０７、ＳＰ１−２１、ＳＰ１−２３のいずれかを加えて５０μＬとした後、２５℃で１２０分間反応させて、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いて、Ｃｙ３の蛍光値を測定した。【０３０８】
その結果、ＳＰ０５Ｃ／０８ＢとＳＰ０６／０７とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、ＳＰ０５Ｃ／０６に変換されることによる蛍光値の上昇が、ＳＰ１の添加により抑制された（図７）。ＳＰ０６／０７の代わりにＳＰ２２／２１、ＳＰ２４／２３を使用した場合も同様の結果が得られた（図７）。【０３０９】
また、ＳＰ０５Ｃ／０８ＢとＳＰ１−０７とが三量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、二量体０８Ｂ／０７と単量体ＳＰ１−０５−５Ｃ３が形成されることによる蛍光値の上昇が、ＳＰ１の添加により抑制された（図７）。ＳＰ１−０７の代わりにＳＰ１−２１、ＳＰ１−２３を使用した場合も同様の結果が得られた（図７）。【０３１０】
ここで、ＳＰ１タンパク質の添加による蛍光値の抑制は、ＳＰ０５Ｃ／０８Ｂに対してミスマッチが存在しないＳＰ０６／０７やＳＰ１−０７に比べて、ミスマッチが存在するＳＰ２２／２１、ＳＰ２４／２３、ＳＰ−２１、ＳＰ−２３を加えた場合に非常に大きいことが確認された。【０３１１】
以上のことから、ミスマッチ導入は、ＳＰ１タンパク質の添加による鎖交換抑制作用を増強し、タンパク質未添加時と添加時の蛍光値の比を大きくすることが確認された。【０３１２】
４−２．ＮＦ−κＢに関する試験例
（１）二本鎖の調製
５’末端をフルオレセインで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−０１−５Ｆと３’末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−１４−３Ｄを混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＮＦ０１Ｆ／１４Ｄを実施例１と同様の条件で調製した。また、合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−０２とＮＦｋＢ−１３、ＮＦｋＢ−２１とＮＦｋＢ−２６、ＮＦｋＢ−４９とＮＦｋＢ−５０をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＮＦ０２／１３、ＮＦ２６／２１、ＮＦ５０／４９を実施例１と同様の条件で調製した。これらの二本鎖は、ＮＦ−κＢの結合配列を持つ。【０３１３】
使用された配列は以下の通りである。
【表８】
2009093667.tif 000011
【０３１４】
ＮＦ−κＢ結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。網掛けは、ＮＦｋＢ−２１とＮＦｋＢ−４９についてはＮＦｋＢ−１４−３Ｄに対してミスマッチとなる塩基を、ＮＦｋＢ−２６とＮＦｋＢ−５０についてはＮＦｋＢ−０１−５Ｆに対してミスマッチとなる塩基をそれぞれ示した。【０３１５】
（２）鎖交換抑制効果の確認
１００ｆｍｏｌのＮＦ０１Ｆ／１４Ｄと５００ｐｍｏｌの組み換えヒトＮＦ−κＢ（ｐ５０）（プロメガ社）を反応溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、１５μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。２００ｆｍｏｌのＮＦ０２／１３、ＮＦ２６／２１、ＮＦ５０／４９のいずれかを加えて５０μＬとした後、３７℃で１２０分間反応させて、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いて、フルオレセインの蛍光値を測定した。【０３１６】
その結果、ＮＦ０１Ｆ／１４ＤとＮＦ０２／１３とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、ＮＦ０１Ｆ／０２に変換されることによる蛍光値の上昇が、ｐ５０の添加により抑制された（図８）。ＮＦ０２／１３の代わりにＮＦ２６／２１、ＮＦ５０／４９を使用した場合も同様の結果が得られた（図８）。【０３１７】
ここで、ＮＦ−κＢ（ｐ５０）タンパク質の添加による蛍光値は、ＮＦ０１Ｆ／１４Ｄに対してミスマッチが存在しないＮＦ０２／１３との組み合わせでは蛍光値の低下が約３０％であったのに対し、ＮＦ０１Ｆ／１４Ｄに対してミスマッチが存在するＮＦ２６／２１、ＮＦ５０／４９との組み合わせでは、蛍光値が５０％以上低下した（図８）。【０３１８】
以上のことから、ミスマッチ導入は、ＮＦ−κＢ（ｐ５０）タンパク質の鎖交換抑制作用を増強し、タンパク質未添加時と添加時の蛍光値の比を大きくすることが確認された。【０３１９】
実施例５：陰性コントロールを使用したスクリーニング系の検討
核酸結合タンパク質の阻害剤などのスクリーニングを行う際には、被験物質が標的の核酸結合タンパク質の結合に作用するのであって、核酸への非特異的な作用によって鎖交換に影響を与えるのではないことを確認する必要がある。そこで、標的とする核酸結合タンパク質が結合しない核酸セットを陰性コントロールとして使用したスクリーニング系について検討した。【０３２０】
ＮＦ−κＢを阻害することが知られているオーロチオグルコース（Ａｕｒｏｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｅ）（Yang et al. FEBS letters 1995 361 89-96）を被験物質として使用した。また、ＮＦ−κＢが結合しない核酸セットを陰性コントロールとして使用した。【０３２１】
（１）二本鎖の調製
合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−４２と５’末端をフルオレセインで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−３１−５Ｆ、合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−４１と３’末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−３２−３Ｄをそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖３１Ｆ／４２および３２Ｄ／４１を実施例１と同様の条件で調製した。３１Ｆ／４２および３２Ｄ／４１は、ＮＦ−κＢの結合配列を持つ。【０３２２】
合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０８と５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０５−５Ｃ３、合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０７と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０６−３Ｂ１をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖０５Ｃ／０８および０６Ｂ／０７を実施例１と同様の条件で調製した。０５Ｃ／０８および０６Ｂ／０７は、ＳＰ１の結合配列を持つ。【０３２３】
使用された配列は以下の通りである。
【表９】
2009093667.tif 000012
【０３２４】
ＮＦ−κＢ結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
【表１０】
2009093667.tif 000013
【０３２５】
ＳＰ１結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。【０３２６】
（２）オーロチオグルコースによるＮＦ−κＢ（ｐ５０）阻害効果の検出
３１Ｆ／４２と０５Ｃ／０８の混合液（それぞれ５０ｆｍｏｌ）に、０〜５ｎｍｏｌのオーロチオグルコースおよび０．５ｐｍｏｌの組み換えヒトＮＦκＢ  ｐ５０（プロメガ社）を加え、さらに３２Ｄ／４１と０６Ｂ／０７の混合液（それぞれ２００ｆｍｏｌ）を加えて混合し、２５℃で３０分間反応させた。反応溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）の最終液量は５０μＬである。蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いて、フルオレセインとＣｙ３の蛍光値を測定した。フルオレセインは４８５ｎｍで励起して、５３５ｎｍの蛍光を測定した。Ｃｙ３は５３５ｎｍで励起して、５９５ｎｍで測定した。【０３２７】
その結果、ＮＦ−κＢオリゴの相対蛍光値は、ＮＦ−κＢを阻害するオーロチオグルコースの濃度に依存して低下した。一方で、オーロチオグルコースの添加は、ＳＰ１オリゴの相対蛍光値はほとんど影響されなかった（図９）。このことから、オーロチオグルコースがＮＦ−κＢ（ｐ５０）の核酸への結合を阻害する作用があることを確認すると同時に、鎖交換自体には影響を与えないことを確認することができた。【０３２８】
このように、本発明のスクリーニング法によれば、ゲルシフトアッセイ法等を用いなくても、簡便かつ迅速に、被験物質の阻害効果を測定できることが確認された。【０３２９】
実施例６：ＮＦ−κＢ  ｐ５０を用いた結合量の検討（一体型核酸複合体）
（１）四量体の調製
合成オリゴオリゴヌクレオチドＮ−Ｃｄ−Ｕ２ｍ４（Ｃ４）とＮ−Ｂｃ−Ｌ２ｍ５（Ｂ５）、および５’末端から３０塩基目のチミンにフルオレセイン標識した合成オリゴヌクレオチドＮ−Ａｂ−Ｕ２−３０Ｆ（Ａｆ）と５’末端から２０塩基目のチミンにＤａｂｃｙｌ標識した合成オリゴヌクレオチドＮ−Ｄａ−Ｌ２−２０Ｄ（Ｄｄ）を混合して一体型四量体Ａｆ／Ｂ５／Ｃ４／Ｄｄを調製した。Ｎ−Ａｂ−Ｕ２−３０ＦとＮ−Ｄａ−Ｌ２−２０Ｄを混合して二量体Ａｆ／Ｄａを形成し、消光参照品とした。４種類のＤＮＡを同時に混合する以外は、実施例１と同じ条件で行った。【０３３０】
デコイＤＮＡとして、合成オリゴヌクレオチドＮＦｃｐｔ０１とＮＦｃｐｔ０２、ＮＦｃｐｔ０３とＮＦｃｐｔ０４をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＮＦ０１／０２、ＮＦ０３／０４を実施例１と同様の条件で調製した。ＮＦ０１／０２はＮＦ−κＢ結合配列を持つが、ＮＦ０３／０４はＮＦ−κＢ結合配列に変異が導入されている。【０３３１】
使用された配列は以下の通りである。
【表１１】
2009093667.tif 000014
【表１２】
2009093667.tif 000015
【０３３２】
鎖交換する部分を下線で示した。ＮＦ−κＢ結合配列を網掛けで示した。【０３３３】
（２）ＮＦ−κＢ（ｐ５０）結合の検出
５０ｆｍｏｌのＡｆ／Ｂ５／Ｃ４／Ｄｄと４８４ｆｍｏｌの組み換えヒトＮＦ−κＢ（ｐ５０）（プロメガ社）を反応溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、５０μＬ）中に混合して２５℃で３０分間反応させた後、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いてフルオレセインの蛍光値を測定した（励起４８５ｎｍ、検出５３５ｎｍ）。デコイＤＮＡは１ｐｍｏｌ添加した。タンパク質による蛍光値の変化は、Ａｆ／Ｄｄの蛍光値を差し引いたバックグランド補正蛍光値で評価した。【０３３４】
その結果、Ａｆ／Ｂ５／Ｃ４／Ｄｄの蛍光値はＮＦ−κＢ（ｐ５０）の添加により抑制された。さらに、ＮＦ−κＢ結合配列をもつデコイＤＮＡ（ＮＦ０１／０２）を添加すると、蛍光値が回復した。一方で、ＮＦ−κＢ結合配列に変異を導入したデコイＤＮＡ（ＮＦ０３／０４）を添加しても、蛍光値の回復は見られなかった（図１０）。【０３３５】
以上のことから、上記の方法によれば、蛍光値を測定することにより、核酸結合タンパク質の配列特異的な結合を検出できることが確認された。【０３３６】
実施例７：マルチプレックス検出系の検討
マルチプレックス検出系を検討するため、ＮＦ−κＢ（ｐ５０）、ＳＰ１のＤＮＡへの結合を同時に検出し、さらに、ＮＦ−κＢ（ｐ５０）阻害剤（デコイオリゴ）による特異的な阻害効果を検出した。【０３３７】
（１）二本鎖の調製
合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−４２と５’末端をフルオレセインで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−３１−５Ｆ、合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−４１と３’末端をＤＡＢＣＹＬで標識した合成オリゴヌクレオチドＮＦｋＢ−３２−３Ｄをそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖３１Ｆ／４２および３２Ｄ／４１を実施例１と同様の条件で調製した。３１Ｆ／４２および３２Ｄ／４１は、ＮＦ−κＢの結合配列を持つ。【０３３８】
合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０８と５’末端をＣｙ３で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０５−５Ｃ３、合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０７と３’末端をＢＨＱ１で標識した合成オリゴヌクレオチドＳＰ１−０６−３Ｂ１をそれぞれ混合して、末端に一本鎖を持つ二本鎖０５Ｃ／０８および０６Ｂ／０７を実施例１と同様の条件で調製した。０５Ｃ／０８および０６Ｂ／０７は、ＳＰ１の結合配列を持つ。【０３３９】
合成オリゴヌクレオチドＮＦｃｐｔ０１とＮＦｃｐｔ０２を混合し、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＮＦ０１／０２を実施例１と同様の条件で調製した。ＮＦ０１／０２は、ＮＦ−κＢ結合配列を持つ。【０３４０】
合成オリゴヌクレオチドＳＰｃｐｔ０１とＳＰｃｐｔ０２を混合し、末端に一本鎖を持つ二本鎖ＳＰ０１／０２を実施例１と同様の条件で調製した。ＳＰ０１／０２は、ＳＰ１結合配列を持つ。【０３４１】
使用された配列は以下の通りである。
【表１３】
2009093667.tif 000016
【０３４２】
ＮＦ−κＢ結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
【表１４】
2009093667.tif 000017
【０３４３】
ＳＰ１結合配列を下線で示した。二本鎖において一本鎖となる配列を斜体で示した。
【表１５】
2009093667.tif 000018
【０３４４】
ＮＦ−κＢ結合配列を下線で示した。
【表１６】
2009093667.tif 000019
【０３４５】
ＳＰ１を下線で示した。【０３４６】
（２）タンパク質結合の検出
３１Ｆ／４２と０５Ｃ／０８の混合液（それぞれ４０ｆｍｏｌ）、８００ｆｍｏｌのデコイ（ＮＦ０１／０２あるいはＳＰ０１／０２）、タンパク質混合液（２．５ｐｍｏｌの組み換えヒトＳＰ１と０．１２５  ｐｍｏｌの組み換えヒトＮＦκＢ  ｐ５０）を反応溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、１５μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。３２Ｄ／４１と０６Ｂ／０７の混合液（それぞれ８０  ｆｍｏｌ）を加えて５０μＬとした後、２５℃で１２０分間反応させて、蛍光プレートリーダーＵｌｔｒａ（テカン社）を用いて、フルオレセインとＣｙ３の蛍光値を測定した。フルオレセインは４８５ｎｍで励起して、５３５ｎｍの蛍光を測定した。Ｃｙ３は５３５ｎｍで励起して、５９５ｎｍで測定した。【０３４７】
その結果、３１Ｆ／４２と３２Ｄ／４１とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、３１Ｆ／３２Ｄに変換されることによる蛍光値の低下が、タンパク質混合物（ＮＦ−κＢ（ｐ５０）＋ＳＰ１）の添加により上昇した（図１１；ＮＦ−κＢ）。
０５Ｃ／０８と０６Ｂ／０７とが四量体を形成し、分岐移動を経て完全な鎖交換が行われ、０５Ｃ／０６Ｂに変換されることによる蛍光値の低下が、タンパク質混合物（ＮＦ−κＢ（ｐ５０）／ＳＰ１）の添加により上昇した（図１１；ＳＰ１）。【０３４８】
ここで、ＮＦ０１／０２は、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡの相対蛍光値のみを低下させることが確認された。また、ＳＰ０１／０２はＳＰ１  ＤＮＡの相対蛍光値のみを低下させることが確認された（図１１；ＳＰ１）。【０３４９】
以上のことから、この検出系によれば、混合されたタンパク質をそれぞれ検出できるだけでなく、特定のタンパク質のみを阻害する薬剤のスクリーニングが可能であることが示された。
【図１Ａ】
2009093667.tif 000020
【図１Ｂ】
2009093667.tif 000021
【図１Ｃ】
2009093667.tif 000022
【図２】
2009093667.tif 000023
【図３】
2009093667.tif 000024
【図４】
2009093667.tif 000025
【図５】
2009093667.tif 000026
【図６】
2009093667.tif 000027
【図７】
2009093667.tif 000028
【図８】
2009093667.tif 000029
【図９】
2009093667.tif 000030
【図１０】
2009093667.tif 000031
【図１１】
2009093667.tif 000032
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2009093667000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月23日(2010.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなり、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体が、二つの核酸二本鎖がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体）であり、構造変化が、二つの核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換である、方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
下記工程を含んでなる、請求項１に記載の方法：
（ｉ）核酸結合タンパク質と、核酸二本鎖Ａと、核酸二本鎖Ｂとを接触させる工程（ここで、核酸二本鎖Ａは二つの核酸一本鎖（以下、それぞれ「核酸Ａ１」および「核酸Ａ２」とする）からなり、核酸二本鎖Ｂは二つの核酸一本鎖（以下、それぞれ「核酸Ｂ１」および「核酸Ｂ２」とする）からなる）；および
（ｉｉ）核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する工程。
【請求項５】
工程（ｉｉ）において、核酸Ａ１と核酸Ｂ１とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｃ）および／または核酸Ａ２と核酸Ｂ２とからなる核酸二本鎖（核酸二本鎖Ｄ）の量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉ）において、核酸二本鎖Ａおよび／または核酸二本鎖Ｂの量を測定することにより核酸二本鎖複合体の構造変化の程度を測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂの少なくとも一つが核酸結合タンパク質の結合部位を有する、請求項１および４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸Ａ１が第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖からなり、核酸Ａ２が前記第一のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖からなり、核酸Ｂ１が前記第二のヌクレオチド配列に対応する配列および第四のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖からなり、核酸Ｂ２が前記第三のヌクレオチド配列に対応する配列および第四のヌクレオチド配列に対応する配列を有する核酸一本鎖からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
核酸Ａ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｂ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｂ１のヌクレオチド配列における、核酸Ａ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ａ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｂ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および
核酸Ｂ２のヌクレオチド配列における、核酸Ａ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基
から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて有する、請求項１および４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体の構造変化の程度を測定することを含んでなり、少なくとも二つの核酸二本鎖部分を有する核酸複合体が、二つの核酸二本鎖部分が可逆的に鎖交換するように構成されてなる複合体（一体型核酸複合体）であり、構造変化が、二つの核酸二本鎖間のヌクレオチド鎖交換である、方法。
【請求項１１】
下記工程を含んでなる、請求項１０に記載の方法：
（ｉｉｉ）核酸結合タンパク質と、一体型核酸複合体Ｅとを接触させる工程（ここで、一体型核酸複合体Ｅは、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｇと核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｈとを含んでなり、核酸複合体Ｇは二つの核酸一本鎖含有体（以下、それぞれ「核酸Ｇ１」および「核酸Ｇ２」とする）を含んでなり、核酸複合体Ｈは二つの核酸一本鎖含有体（以下、それぞれ「核酸Ｈ１」および「核酸Ｈ２」とする）を含んでなる）；および
（ｉｖ）一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する工程
（ここで、
核酸Ｇ１が、末端部分１と、第五のヌクレオチド配列と、末端部分３とからなり、第五のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分１が、第五のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分３が連結されてなる核酸一本鎖含有体であり、
核酸Ｇ２が、末端部分２と、第五のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分３に対応する部分とからなり、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分２が、第五のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分３に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体であり、
核酸Ｈ１が、末端部分１に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列と、末端部分４とからなり、第六のヌクレオチド配列の５’末端に末端部分１に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列の３’末端に末端部分４が連結されてなる核酸一本鎖含有体であり、
核酸Ｈ２が、末端部分４に対応する部分と、第六のヌクレオチド配列に対応する配列と、末端部分２に対応する部分とからなり、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の５’末端に末端部分４に対応する部分が、第六のヌクレオチド配列に対応する配列の３’末端に末端部分２に対応する部分が連結されてなる核酸一本鎖含有体である）。
【請求項１２】
末端部分がポリヌクレオチドであり、
末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
末端部分１の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分１に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分２の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分２に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され；並びに
末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず、かつ末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成されず；および／または
末端部分３の３’末端のヌクレオチド配列と末端部分３に対応する部分の５’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成され、かつ末端部分４の５’末端のヌクレオチド配列と末端部分４に対応する部分の３’末端のヌクレオチド配列との間で安定性が高い塩基対群が形成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｖ）において、一体型核酸複合体Ｅの量を測定することにより一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｖ）において、核酸Ｇ１および核酸Ｈ１を含んでなり、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｉと、核酸Ｇ２および核酸Ｈ２を含んでなり、核酸二本鎖部分を有する核酸複合体Ｊとを含んでなる一体型核酸複合体Ｆの量を測定することにより一体型核酸複合体の構造変化の程度を測定する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
一体型核酸複合体Ｅおよび一体型核酸複合体Ｆのいずれか一つのみが核酸結合タンパク質の結合部位を有する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸Ｇ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｈ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｇ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；および
核酸Ｈ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基
から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて有する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
核酸Ｇ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｇ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｇ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；
核酸Ｈ１のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ２のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基；または
核酸Ｈ２のヌクレオチド配列における、核酸Ｈ１のヌクレオチド配列に対する１以上のミスマッチ塩基
から選択されるミスマッチ塩基を単独でまたは組み合わせて有する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
構造変化の程度が、蛍光共鳴エネルギー転移を利用して測定される、請求項１および４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
核酸が、ＤＮＡである、請求項１および４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
核酸結合タンパク質が、転写因子である、請求項１および４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸結合タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１および４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
マルチプレックスで行われる、請求項１および４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
被験物質存在下および非存在下において、請求項１および４〜２２のいずれか一項に記載の方法を行う、核酸結合タンパク質の結合阻害剤または促進剤のスクリーニング方法。
【請求項２４】
被験物質の標的となる核酸結合タンパク質とは結合しない核酸からなる核酸複合体の構造変化の程度を測定することをさらに含んでなる、請求項２３に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
末端配列において結合し得る核酸二本鎖Ａと核酸二本鎖Ｂとを含んでなる、キット（ここで、核酸二本鎖Ａおよび核酸二本鎖Ｂは請求項４において定義された内容と同義である）。
【請求項２６】
一体型核酸複合体Ｅまたは一体型核酸複合体Ｆを含んでなる、キット（ここで、一体型核酸複合体Ｅは請求項１１に、一体型核酸複合体Ｆは請求項１４において定義された内容と同義である）。
【国際調査報告】
2009093667.tif 000036
2009093667.tif 000037
2009093667.tif 000038