(57)【要約】  二重鎖ＤＮＡ塩基配列の標的化ヌクレオチド交換のための方法及びオリゴヌクレオチドであって、ドナーオリゴヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ又はＧと比較して、より高い結合親和性を有する、プロピニル化されたプリン及び／又はピリミジンである、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでおり、及び／又はドナーオリゴヌクレオチドが、第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、第１のＤＮＡ塩基配列中で向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合する、二重鎖ＤＮＡ塩基配列の標的化ヌクレオチド交換のための方法及びオリゴヌクレオチド。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖ＤＮＡ塩基配列の標的化改変のためのオリゴヌクレオチドであって、該二重鎖ＤＮＡ塩基配列が、第１のＤＮＡ塩基配列、及び該第１のＤＮＡ塩基配列の相補物である第２のＤＮＡ塩基配列を含み、該オリゴヌクレオチドが、前記第１のＤＮＡ塩基配列に対してハイブリダイズすることができるドメインであって、前記第１のＤＮＡ塩基配列に関して少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含み、該オリゴヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ又はＧのヌクレオチドと比較して、より高い結合親和性を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つのセクションを含み、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合し、前記修飾ヌクレオチドがＣ７−プロピンプリン又はＣ５−プロピンピリミジンである、二重鎖ＤＮＡ塩基配列の標的化改変のためのオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記プリンが、アデノシン又はグアノシンであり、及び／又は前記ピリミジンがシトシン、ウラシル、又はチミジンである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記ピリミジン及び／又は前記プリンの少なくとも１０％が、好ましくは少なくとも５０％が、より好ましくは少なくとも７５％が、及び最も好ましくは少なくとも９０％が、各々のプロピニル化された誘導体に置き換わる、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記修飾ヌクレオチドがピリミジンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドがプリンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、独立して少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０の修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも２つのセクション、好ましくは少なくとも３つのセクションを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記セクションが、３’末端、５’末端の近く、又は３’末端、５’末端に位置し、且つ／或いはミスマッチの位置を含むか、又はミスマッチの位置に隣接する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記ミスマッチの位置の前記ヌクレオチドが修飾されない、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、前記ミスマッチに隣接した位置に、好ましくは前記ミスマッチの２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、又は１０ヌクレオチド内にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
１０〜５００ヌクレオチド長を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記（修飾された）セクションがドメインである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
ドナーオリゴヌクレオチドと二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列を組み合わせることを含む、二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列の標的化改変のための方法であって、該二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列が、第１のＤＮＡ塩基配列及び該第１のＤＮＡ塩基配列の相補物である第２のＤＮＡ塩基配列を含み、前記ドナーオリゴヌクレオチドが、改変される前記二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列に関して、好ましくは前記第１のＤＮＡ塩基配列に関して、少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含み、前記オリゴヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ又はＧと比較して、より高い結合親和性を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むセクションを含み、該修飾ヌクレオチドが、標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質の存在下で、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合し、前記修飾オリゴヌクレオチドが請求項１〜１２において定義される、二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列の標的化改変のための方法。
【請求項１４】
前記改変が、好ましくは植物細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞又は酵母細胞から成る群から選択される細胞内のものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が細胞抽出物に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞抽出物が、植物細胞抽出物、真菌細胞抽出物、げっ歯類細胞抽出物、霊長類細胞抽出物、ヒト細胞抽出物又は酵母菌抽出物から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記改変が、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、真核生物細胞、植物細胞、ヒト以外の哺乳類細胞又はヒト細胞である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的ＤＮＡが、真菌、細菌、植物、哺乳類又はヒト由来である、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記二重鎖ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、線状ＤＮＡ、哺乳類人工染色体、バクテリア人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体ＤＮＡ、オルガネラ染色体ＤＮＡ、エピゾームＤＮＡ由来である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾のための、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用であって、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾、ミスマッチ修復、遺伝子変異を含む（植物の）遺伝物質の標的化改変、標的化遺伝子修復及び遺伝子ノックアウトのための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２３】
二重鎖ＤＮＡ塩基配列の促進された標的化改変のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用であって、前記二重鎖ＤＮＡ塩基配列が、第１のＤＮＡ塩基配列及び該第１のＤＮＡ塩基配列の相補物である第２のＤＮＡ塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記第１のＤＮＡ塩基配列にハイブリダイズすることができるドメインであって、前記第１のＤＮＡ塩基配列に関して少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含み、前記オリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含むセクションを含み、該修飾ヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ又はＧと比較してより高い結合親和性を有し、前記修飾ヌクレオチドが、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第１のＤＮＡ塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合し、前記修飾ヌクレオチドがＣ７−プロピンプリン又はＣ５−プロピンピリミジンである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２４】
植物に対して除草剤抵抗性を提供する方法における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項２６】
請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法により産生される修飾された遺伝物質。
【請求項２７】
請求項２６に記載の、前記修飾された遺伝物質を含む細胞。
【請求項２８】
請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法により産生される植物若しくは植物の一部分、又は請求項２６に記載の前記遺伝物質を含む植物若しくは植物の一部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの標的細胞中への導入による、標的細胞におけるＤＮＡの特異的部位でのヌクレオチド配列の特異的且つ選択的改変のための方法に関する。本成果は、標的ＤＮＡの配列とオリゴヌクレオチドの配列が異なる場合には、標的ＤＮＡの配列がオリゴヌクレオチドの配列に変換できるようにする、１つ又は複数のヌクレオチドの標的化交換である。さらに詳細には、本発明は修飾オリゴヌクレオチドを使用する標的化ヌクレオチド交換に関する。本発明はさらにオリゴヌクレオチド及びキットに関する。本発明は本方法の応用にもまた関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子修飾は、生細胞の、又は細胞が一部分を形成する生物の、若しくは細胞が再生することができる生物の、１つ又は複数の遺伝子にコードされた生物学的特性を修飾する目的で、生細胞の遺伝物質中の変化を意図的に作成する過程である。これらの変化は、遺伝物質の一部分の欠失、外因性遺伝物質の追加又は遺伝物質の既存ヌクレオチド配列中の変化の形式をとることができる。真核生物の遺伝子修飾のための方法は２０年以上知られており、農業、ヒトの健康、食品品質及び環境保護の分野の改善のための、植物細胞、ヒト細胞及び動物細胞並びに微生物における広範囲での応用が明らかにされた。遺伝子修飾の一般的な方法は、細胞ゲノムへの外来性ＤＮＡ断片の添加から成り、次にそのことにより既存遺伝子によってコードされた特性に加えて、その細胞又はその生物へ新しい特性が付与されるだろう（ＤＮＡ断片の添加の結果として、既存遺伝子の発現が抑制される応用を含む）。外来性ＤＮＡ断片が挿入されるゲノム位置（及び従って発現の最終的なレベル）は制御されないので、並びに所望の効果が、もとのバランスのとれたゲノムによってコードされた天然の特性を超えて現われなければならないので、多くのそのような例は所望の特性を得るのに効果的であるが、それにもかかわらずこれらの方法はあまり正確ではない。これに反して、前もって定めたゲノムの遺伝子座におけるヌクレオチドの追加、欠失又は変換をもたらす遺伝子修飾の方法は、既存遺伝子の正確な修飾を可能にするだろう。
【０００３】
オリゴヌクレオチド依存性標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ、時には、ＯＤＴＮＥ）は、合成オリゴヌクレオチド（ワトソン−クリック塩基対合特性においてはＤＮＡに類似しているが、化学的にはＤＮＡと異なってもよいヌクレオチド様部分の短いストレッチから成る分子）の真核生物細胞核への送達に基づく方法である（非特許文献１; 非特許文献２; 非特許文献３）。オリゴヌクレオチドの相同配列中にミスマッチヌクレオチドを意図的にデザインすることによって、ミスマッチヌクレオチドがゲノムＤＮＡ配列中に組み込まれてもよい。この方法は、既存の遺伝子座中の単一のヌクレオチド又は多くとも数ヌクレオチドの変換を可能にするが、既存の遺伝子中に遺伝子機能の破壊をもたらす終止コドンを作り出すため、又はタンパク質をコードする遺伝子に改変されたアミノ酸組成をもたらすコドン変化を作り出すために適用されてもよい（タンパク質工学）。
【０００４】
標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）は植物、動物及び酵母菌の細胞において記述されている。最初のＴＮＥ報告では、染色体の標的部位での挿入がデザインされる自己相補的なオリゴヌクレオチドから成る、いわゆるキメラが利用された。キメラは、染色体標的での変異を導入するための鋳型を形成するミスマッチヌクレオチドを含む。ＴＮＥイベントを選び出すため、大部分の研究は、除草剤抵抗性に結びつく内在性遺伝子中への単一のヌクレオチド変化の導入を試みる。キメラ使用の最初の例は、ヒト細胞からであった（非特許文献４を参照）。キメラの使用は植物種のタバコ、米、及びトウモロコシにおいても成功した（非特許文献５; 非特許文献６; 非特許文献７）。しかしながら、キメラの活性は再現することが困難なことが明らかにされ、そのため一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドのＴΝＥ活性が検査された。これらは小麦細胞、酵母細胞及びヒト細胞においてより再現可能な結果を与えることが明らかにされた（非特許文献８; 非特許文献９; 非特許文献１０）。
【０００５】
いくつかの群は、総細胞抽出タンパク質を使用して、ＴΝＥも検出することができることを示した。ＴΝＥ活性のためのそのような分析は無細胞分析と呼ばれる（非特許文献１１; 非特許文献１２; 非特許文献１３; 非特許文献１４）。分析は以下のように準備する。２つの細菌の抗生物質抵抗性遺伝子（カナマイシン及びカルベニシリン）を含むプラスミドを、抗生物質抵抗性遺伝子のうちの１つ（例えばカナマイシン）が、単一のヌクレオチド（例えばＴＡＴからＴＡＧへ）の改変に起因するインフレーム終止コドンを含むように変異させる。次にこの変異させたプラスミドを、総細胞タンパク質、及び抗生物質抵抗性遺伝子中の終止コドンを修正するようにデザインされた一本鎖オリゴヌクレオチドと共にインキュベートする。ＴＮＥのために必要なタンパク質は細胞抽出物中に存在し、抗生物質抵抗性遺伝子中の終止コドンを改変するためにオリゴヌクレオチドを利用し、抵抗性表現型を回復させる。次にプラスミドＤＮＡを反応混合物から精製し、大腸菌（E.coli）に形質転換する。次に細菌をカナマイシンを含む培地にプレーティングするが、細菌コロニー数はＴＮＥ修復イベント数を表わす。エレクトロポレーションの効率は、カルベニシリンを含む培地上で増殖するコロニー数のカウントによって計算する。ＴＮＥ効率は、形質転換されたプラスミドの総数に対する修復されたプラスミドの比率を計算することによって定量できる。
【０００６】
そのような実験において、オリゴヌクレオチドはＴＡＧをＴＡＣに改変して、置換を生じさせる。さらに、無細胞系は単一のヌクレオチド挿入を作製するためにオリゴヌクレオチドを使用する可能性を研究するためにも使用することができる。抗生物質抵抗性遺伝子から単一のヌクレオチドを削除したフレームシフト変異を生じるプラスミドを作製することができる。無細胞分析において、この欠失はオリゴヌクレオチドによって仲介されるヌクレオチドの追加によって修復される。
【０００７】
植物のような高等生物の細胞におけるＴＮＥの応用が直面する最も重大な問題は、これまでに報告されている低効率である。トウモロコシでは、Zhu et al.（非特許文献１５）が、１×１０−４の変換頻度を報告した。タバコ（非特許文献６）及びコメ（非特許文献７）において、続いて行なわれた研究では、それぞれ１×１０−６及び１×１０−４の頻度が報告されている。これらの頻度はＴＮＥの実用化のためには、あまりにも低いままである。
【０００８】
正確なＤＮＡの複製は、ゲノム安定性の維持を仲介し、ＤＮＡ中に含まれる遺伝子情報が変異の無い状態で１つの世代から次の世代へと受け渡されることを保証する、重要な基準の１つである。多くのエラーが、親ＤＮＡ鎖中の損傷から生じるか、又はＤＮＡ塩基と反応する薬剤（紫外線、環境有害物質）によって生じる。すべての生物は、これらの変異を防止又は修正するために安全装置を維持しなければならない。ミスマッチ修復系（ＭＭＲ）は、ＤＮＡ損傷監視及び異なった配列間の組換えの防止において、ＤＮＡ複製の最中にもたらされたミスマッチ塩基又は不対塩基を認識して修正すると考えられ（非特許文献１６）、生細胞におけるＤＮＡ複製の忠実度に貢献する。
【０００９】
ＴＮＥは、とりわけ、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６におけるKmiecの様々な特許出願中に記述されている。特許文献１中で、未修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して得られる低効率の遺伝子改変は、主として反応混合物又は標的細胞中にあるヌクレアーゼによるドナーオリゴヌクレオチドの分解の結果であると考えられることが検討される。この問題を改善するために、もたらされるオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼに対する耐性を与えるような修飾ヌクレオチドを組み込むことが提案されている。代表的な例は、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチル−アナログ又はロックされた核酸（ＬＮＡ）を有するヌクレオチドを含んでいる。好ましくは、標的とされる塩基の周囲の中心部ＤＮＡドメインはそのままで、これらの修飾はオリゴヌクレオチドの末端に配置される。さらにこの公報には、変換するオリゴヌクレオチドと変換に関与するタンパク質の間に特異的な化学的相互作用が必要とされることが記述されている。改変過程に関与するタンパク質及びオリゴヌクレオチド置換基との化学的相互作用がまだ知られておらず、特許文献１の発明者らによれば予測することができないので、オリゴヌクレオチド中のＬＮＡ、ホスホロチオエート結合又は２’−Ｏ−メチルアナログの組み込み以外の修飾を使用してヌクレアーゼ耐性末端を産生するためのそのような化学的相互作用の効果を予測することは不可能である。
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０１／７３００２号
【特許文献２】国際公開第０３／０２７２６５号
【特許文献３】国際公開第０１／８７９１４号
【特許文献４】国際公開第９９／５８７０２号
【特許文献５】国際公開第９７／４８７１４号
【特許文献６】国際公開第０２／１０３６４号
【特許文献７】国際公開第０１／９２５１２号
【特許文献８】国際公開第９２／２０７０２号
【特許文献９】国際公開第９２／２０７０３号
【特許文献１０】国際公開第９３／１２１２９号
【特許文献１１】米国特許第５，５３９，０８２号
【特許文献１２】国際公開第９９／１４２２６号
【特許文献１３】国際公開第００／５６７４８号
【特許文献１４】国際公開第００／６６６０４号
【特許文献１５】国際公開第９８／３９３５２号
【特許文献１６】米国特許第６，０４３，０６０号
【特許文献１７】米国特許第６，２６８，４９０号
【非特許文献１】Alexeev and Yoon, Nature Biotechnol. 16: 1343, 1998
【非特許文献２】Rice, Nature Biotechnol. 19: 321, 2001
【非特許文献３】Kmiec, J. Clin. Invest. 112: 632, 2003
【非特許文献４】総説のRice et al. Nat. Biotech. 19: 321-326
【非特許文献５】Beetham et al. 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8774-8778
【非特許文献６】Kochevenko et al. 2003 Plant Phys. 132: 174-184
【非特許文献７】Okuzaki et al. 2004 Plant Cell Rep. 22: 509-512
【非特許文献８】Liu et al. 2002 Nuc. Acids Res. 30: 2742-2750
【非特許文献９】総説、Parekh-Olmedo et al. 2005 Gene Therapy 12: 639-646
【非特許文献１０】Dong et al. 2006 Plant Cell Rep. 25: 457-65
【非特許文献１１】Cole-Strauss et al. 1999 Nucleic Acids Res. 27: 1323-1330
【非特許文献１２】Gamper et al. 2000 Nucleic Acids Res. 28, 4332-4339
【非特許文献１３】Kmiec et al. 2001 Plant J. 27: 267-274
【非特許文献１４】Rice et al. 2001 40: 857-868
【非特許文献１５】Zhu et al.（2000 Nature Biotech. 18: 555-558）
【非特許文献１６】Fedier and Fink, 2004 Int. J Oncol. 2004; 24(4): 1039-47
【非特許文献１７】He & Seela, 2002 Nucleic Acids Res. 30: 5485-5496
【非特許文献１８】Froehler et al. 1993 Tetrahedron Letters 34: 1003-6
【非特許文献１９】Lacroix et al. 1999 Biochemistry 38: 1893-1901
【非特許文献２０】Ahmadian et al. 1998 Nucleic Acids Res. 26: 3127-3135
【非特許文献２１】Colocci et al. 1994 J. Am. Chem. Soc 116: 785-786
【非特許文献２２】Wagner et al. 1993 Science 260: 1510-1513
【非特許文献２３】Flanagan et al. 1996 Nature Biotech. 14: 1139-1145
【非特許文献２４】Meunier et al. 2001 Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 11: 117-123
【非特許文献２５】Patel, Nature, 1993, 365, 490
【非特許文献２６】Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497
【非特許文献２７】Egholm, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1895
【非特許文献２８】Knudson et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24, 494
【非特許文献２９】Nielsen et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 2287
【非特許文献３０】Egholm et al., Science, 1991, 254, 1497
【非特許文献３１】Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1895及び9677
【非特許文献３２】Sawano et al. 2000 Nucleic Acids Res. 28: e78
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＯＤＴＮＥの現行方法の効率が比較的低いので（９０％のオリゴヌクレオチドの高送達率が報告されているにもかかわらず、先に述べられたように１０−６から１０−４の間である）、より効率的なＴＮＥのための方法への当技術分野における必要性がある。したがって本発明者らは、既存のＴＮＥ技術についての改善を立案した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らはここで、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧのような対応する未修飾ヌクレオチドよりも、アクセプターＤＮＡにより強く結合できるヌクレオチドの、ＴＮＥのためのドナーオリゴヌクレオチド中への組み込みによって、ＴＮＥ率を有意に増加できることを見出した。理論により束縛されるものではないが、本発明者らは、ドナーオリゴヌクレオチド中への修飾ヌクレオチドの組み込みにより、ドナーオリゴヌクレオチドがアクセプターＤＮＡにより強く結合し、したがってＴＮＥの比率を増加すると考える。本発明者らは、Ｃ５−プロピンで修飾されたピリミジン及び／又はＣ７−プロピニルで修飾されたプリンを含むオリゴヌクレオチドが、ＴＮＥの効率を有意に改善することを見出した。
【００１３】
この目的のために、無細胞系中のＴＮＥの頻度に対する、プロピニル化されたヌクレオチドを組み込んだオリゴヌクレオチド使用の効果を調べた。そのようなオリゴヌクレオチドのＴＮＥ活性は、正常ＤＮＡから作製されたオリゴヌクレオチドのＴＮＥ活性と比較された。Ｃ５−プロピンピリミジン及び／又はＣ７−プロピニル化プリンを含むオリゴヌクレオチドは、無細胞分析において、置換及び挿入の両方についてのＴＮＥ効率を従来観察されていないレベルへと増加させることが見出された。プロピニル化されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、無細胞分析において、正常ＤＮＡから作製されたオリゴヌクレオチドと比較して、最大１０倍効率が高かった。オリゴヌクレオチド中のプロピニル化されたヌクレオチドの数の増加により、ＴＮＥ効率がさらに改善され得ることも見出された。さらに観察された改善は遺伝子座に依存しないことが見出され、Ｃ５−プロピンピリミジン及び／又はＣ７−プロピニル化プリンを含むオリゴヌクレオチドが、植物細胞及び動物細胞等において、種に依存しない様式でＴＮＥ頻度の促進を提供できることを示した。
【００１４】
したがって、本発明は、Ｃ５−プロピンで（部分的に）修飾されたピリミジンオリゴヌクレオチド、及び／又はＣ７−プロピンで修飾されたプリンオリゴヌクレオチドの使用により、所望の標的化ヌクレオチド交換が達成できるという独創的な考察に基づく。オリゴヌクレオチドの修飾の位置、タイプ、及び量（すなわち修飾の状態）は、本明細書中で以下に開示されるように変えることができる。
【００１５】
したがって１つの態様における本発明は、（Ｃ５−プロピンで（完全に）修飾されたピリミジン及び／又はＣ７−プロピンで修飾されたプリン）オリゴヌクレオチドを提供する。修飾されたｓｓ−オリゴヌクレオチドは植物細胞及び動物細胞又はヒト細胞に特異的な遺伝的変化を導入するために使用することができる。本発明は、生物医学研究の分野、農業、及び特異的に変異させた植物及び動物（ヒトを含む）の作製に適用可能である。本発明は、医学及び遺伝子治療の分野にも適用可能である。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドの配列は、標的鎖中に塩基変化を導入するミスマッチ塩基を含む一部分を除いて、標的鎖に相同である。ミスマッチ塩基は標的配列中へ導入される。ヌクレオチドの修飾（通常のＡ、Ｃ、Ｔ又はＧに比較される）の操作によって、及びより詳細には、ミスマッチを導入するオリゴヌクレオチドのプロピン修飾の場所及び量の操作によって、効率（すなわちＤＮＡ二重鎖中の所望の位置での所望のヌクレオチドの成功した組み込みの程度）を改善できる。
【００１７】
本発明の別の態様は、親鎖と比較して少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと親ＤＮＡ二重鎖を接触することによる、親ＤＮＡ鎖（第１の鎖、第２の鎖）の標的化改変のための方法に属し、この方法においては、ドナーオリゴヌクレオチドは、標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質の存在下において、親（アクセプター）鎖よりも高い結合能力を有するようにＣ５−プロピンで置換されたピリミジン及び／又はＣ７−プロピンで置換されたプリンにより修飾されたセクションを含む。
【００１８】
したがって、本発明の独創的な主旨は、未修飾の挿入オリゴヌクレオチドと比較して、プロピンで修飾されたｓｓ−オリゴヌクレオチドによる挿入オリゴヌクレオチド（時にはドナーと呼ばれる）の結合能力の改善にある。
【００１９】
１つの態様において、本発明は、二重鎖ＤＮＡ塩基配列の標的化改変のためのプロピン修飾オリゴヌクレオチドに関する。二重鎖ＤＮＡ塩基配列は第１のＤＮＡ塩基配列及び第２のＤＮＡ塩基配列を含む。第２のＤＮＡ塩基配列は、第１のＤＮＡ塩基配列の相補物であり、二重鎖を形成するために第１のＤＮＡ塩基配列に対合する。オリゴヌクレオチドは、改変される二重鎖ＤＮＡ塩基配列に関して、少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含む。好ましくは、ドメインは、少なくとも１つのミスマッチを含む第１の鎖に対して相補的なオリゴヌクレオチドの一部分である。
【００２０】
好ましくは、ドメイン中のミスマッチは第１のＤＮＡ塩基配列に関してのものである。オリゴヌクレオチドは、第２のＤＮＡ塩基配列（の対応する部分）よりも高い結合親和性を有する、修飾された（Ｃ５−プロピンで修飾されたピリミジン及び／又はＣ７−プロピンで修飾されたプリンを含む）セクションを含む。
【００２１】
ミスマッチを含むドメイン、及び修飾ヌクレオチド（複数可）を含むセクションは、オーバーラップしていてもよい。したがって特定の実施の形態において、ミスマッチを含むドメインは、修飾が考慮されるセクションとは異なるオリゴヌクレオチド上の位置に配置される。特定の実施の形態において、上記ドメインは上記セクションを組み込む。特定の実施の形態において、上記セクションは上記ドメインを組み込むことができる。特定の実施の形態において、上記ドメイン及び上記セクションは、オリゴヌクレオチド上の同一の位置に配置され、同一の長さを有しており、すなわち、それらの長さ及び位置は一致する。特定の実施の形態において、ドメイン内に２つ以上のセクションがある場合がある。
【００２２】
本発明に関しては、これは、ＤＮＡ二重鎖中に組み込まれるミスマッチを含むオリゴヌクレオチドの一部分が、修飾されるオリゴヌクレオチドの一部分から異なる位置に置くことができることを意味する。特に、特定の実施の形態において、鎖のどれがミスマッチを含むか、及びどの鎖が鋳型としてミスマッチの補正に使用されることになっているかを、細胞の修復系（又は少なくともこの系と関連したタンパク質、又は少なくともＴＮＥに関与するタンパク質）が確定する。
【００２３】
特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのプロピン修飾ヌクレオチドを含むセクションを含む。特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチド上のセクションは、４、５、６、７、８、９、又は１０以上のプロピン修飾ヌクレオチドを含むことができる。特定の実施の形態では、セクションは完全に修飾される。すなわち、オリゴヌクレオチド中の全てのピリミジンがＣ５−プロピンに置換される、及び／又は全てのプリンがＣ７−プロピンに置換される。特定の実施の形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの少なくとも１０％が、プロピニル化された対応物に置き換わる。特定の実施の形態では、ヌクレオチドの少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、及び場合によっては、好ましくは少なくとも９０％が、プロピニル化された対応物に置き換わる。
【００２４】
特定の実施の形態において、２つ以上のミスマッチは、同時に又は連続的のいずれかで導入することができる。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド上の隣接する場所又は離れた場所に２つ以上のミスマッチを包含することができる。特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドは、隣接又は遠隔の（すなわち非隣接の）２、３、４又はそれ以上のミスマッチヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、複数のミスマッチヌクレオチドを包含するために、さらなるドメイン及びセクションを含むことができ、特にいくつかのセクションを含むことができる。特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドは、アクセプター鎖に挿入される可能性のあるインサートを組み込んでもよい。そのようなインサートは６以上から最大１００ヌクレオチド長で変化してもよい。特定の実施の形態における類似した方法において、類似した長さの変動（１〜１００のヌクレオチド）の欠失を導入することができる。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、オリゴヌクレオチドのデザインは以下によって達成することができる：
−アクセプター鎖、又は交換されるヌクレオチドの周囲の少なくとも１つの配列セクションの配列を決定する。これは、典型的には、好ましくはミスマッチの各々の側でミスマッチに隣接する少なくともほぼ１０ヌクレオチド程度、好ましくは１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド又は３０ヌクレオチドであり得る（例えばＧＧＧＧＧＧＸＧＧＧＧＧＧ、ここでＸはミスマッチである）；
−ミスマッチに隣接する１つ又は両方のセクションに対して相補的で、交換される所望のヌクレオチドを含むドナーオリゴヌクレオチドをデザインする（例えばＣＣＣＣＣＣＹＣＣＣＣＣＣ）；
−所望の位置でのプロピン修飾を有するドナーオリゴヌクレオチドを（例えば合成によって）提供する。修飾は状況に依存して、大きく変化してもよい。実施例は、ＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＹＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍ、ＣｍＣＣｍＣＣｍＣＹＣｍＣＣｍＣＣｍＣ、ＣＣＣＣＣＣＹＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍ、ＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＣｍＹＣＣＣＣＣＣ、ＣＣＣＣＣＣｍＹＣｍＣＣＣＣＣ、ＣｍＣＣＣＣＣＹＣｍＣＣＣＣＣ、ＣｍＣＣＣＣＣＹＣＣＣＣＣＣｍ、ＣｍＣＣＣＣＣＹＣＣＣＣＣＣ等であり、ここで、Ｃｍはプロピン修飾ヌクレオチド残基を表わす。異なるアクセプター配列（例えばＡＴＧＣＧＴＡＣＸＧＴＣＣＡＴＧＡＴ）に関しては、上で概要を述べられたような可変的な修飾により、対応するドナーオリゴヌクレオチド（例えばＴＡＣＧＣＡＴＧＹＣＡＧＧＴＡＣＴＡ）をデザインすることができる；
−標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質、例えば、及び特に、細胞のミスマッチ修復機構において機能的なタンパク質の存在下におけるドナーオリゴヌクレオチドによりＤＮＡを修飾する。
【００２６】
理論により束縛されるものではないが、改善された結合親和性はオリゴヌクレオチドが標的を見出し、標的に結合したままである可能性を増加し、したがってＴＮＥ効率を改善すると考えられる。糖骨格又は塩基の多くの様々な化学的修飾は、改善された結合親和性を付与する。しかしながら本発明者らは、プロピン修飾オリゴヌクレオチドに焦点を合わせることを選択した。Ｃ５位にプロピニル基を有するピリミジンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、対応するピリミジン誘導体よりも安定な二重鎖及び三重鎖を形成する。７位に同様のプロピン置換基を有するプリンは、さらに安定な二重鎖を形成し、故に好ましい。したがって、特定の好適な実施の形態では、結合親和性をＣ５−プロピンピリミジンヌクレオチドよりもさらに大きな程度にまで高める７−プロピニルプリンヌクレオチド（８−アザ−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン及び８−アザ−７−デアザ−２’−デオキシアデニンの７−プロピニル誘導体）の使用により、効率はさらに増進される。そのようなヌクレオチドはとりわけ、非特許文献１７に開示されている。
【００２７】
プロピニル基は三重結合を有する三炭素鎖である。この三重結合は、ヌクレオチドの基本構造と共有結合し、ピリミジンのＣ５位及びプリンヌクレオチドの７位に位置する（図２)。シトシン及びチミジンの両方がＣ５−プロピニル基を有してもよく、それぞれＣ５−プロピニルシトシン及びＣ５−プロピニルチミジンとなる。Ｃ５−プロピニルシトシン残基は単独でＴｍ値を２．８℃上げ、Ｃ５−プロピニルチミジンは単独で１．７℃上げる（非特許文献１８; 非特許文献１９; 非特許文献２０; 非特許文献２１）。これは、Ｃ５位の１−プロピン基の疎水性に起因する。この疎水性はより優れた塩基の積み重ねも可能にするが、これはプロピン基が複素環塩基に対して平面的であるためである。
【００２８】
Ｃ５−プロピンで置換されたピリミジン基を含むオリゴヌクレオチドの改善された結合特性は、細胞過程を改変するために開発されてきた。Ｃ５−プロピン基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡと、より安定な二重鎖を形成し、遺伝子発現の抑制を増大させる（非特許文献２２; 非特許文献２３; 非特許文献２４）。これらの実験はさらに、このようなオリゴヌクレオチドには生物活性があり、細胞に許容可能であると実証した。ＴＮＥに関する技術において、Ｃ５−プロピンピリミジン修飾はＴＮＥで使用されるキメラ分子の代替として可能なオリゴヌクレオチド修飾のリストに挙げられた。しかしながら、当該技術分野において、Ｃ５−プロピンで修飾された一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドがＴＮＥの効率を現在見出された程に、有意に高めると示唆する指摘はこれまでにない。
【００２９】
オリゴヌクレオチドの送達は、核又は細胞質のいずれかに送達することができるエレクトロポレーション又は他の従来の技術を介して達成することができる。本発明の方法のインビトロ検査は、なかでも特許文献３、特許文献２、特許文献４、特許文献７に記述されているように、無細胞系を使用して達成することができる。
【００３０】
本明細書において使用されるように、ＴＮＥに影響を及ぼすドナーオリゴヌクレオチドの能力は、ドナーオリゴヌクレオチド中に組み込まれる修飾ヌクレオチドのタイプ、及び場所及び量に依存する。この能力は、例えば、通常のヌクレオチド間の結合親和性（又は結合エネルギー（ギブスの自由エネルギー））を１で正規化すること（すなわちＡＴ及びＧＣの結合の両方に関しては、結合親和性が１で正規化される）によって、定量することができる。本発明のオリゴヌクレオチドに関しては、各修飾ヌクレオチドの相対的結合親和性（ＲＢＡ）は＞１である。これは以下のような式に例示される：
【００３１】
【数１】
2009520498.tif 000002
【００３２】
式中、ＲＢＡは総相対的結合親和性であり、ＲＢＡ（修飾）は、ｎヌクレオチド長の修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合親和性の合計であり、ＲＢＡ（未修飾）は、ｍヌクレオチド長の未修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合親和性の合計である。例えば、１００ｂｐオリゴヌクレオチドは、各々１．１の相対的な結合親和性で、１０の修飾を含んでいる。次に、総ＲＢＡは次の式：ＲＢＡ＝［（１０×１．１）＋（９０×１．０）］−（１００×１．０）＝１に等しい。
【００３３】
ＲＢＡの定義が原則として、比較されるヌクレオチド鎖長に非依存的であることに注目されたい。しかしながら異なる鎖のＲＢＡが比較される場合、鎖がほぼ同一の長さを有するか、又は同等の長さのセクションが採用されることが好ましい。ＲＢＡは、鎖上の修飾がグループ化できることを考慮に入れないことに注目されたい。したがって鎖Ｂと比較される特定の鎖Ａのより高度な修飾は、ＲＢＡ（Ａ）＞ＲＢＡ（Ｂ）を意味する。上流セクション及び下流セクションに関しては、対応するＲＢＡ値が定義され使用されてもよい。修飾ヌクレオチドの位置の効果を包含するために、重み付け係数をＲＢＡ値へ導入することができる。例えば、ミスマッチに隣接するドナーオリゴヌクレオチド上の修飾ヌクレオチドの効果は、ミスマッチから５ヌクレオチド離れた距離で配置された修飾ヌクレオチドよりも大きくなり得る。本発明の文脈において、ＲＢＡ（ドナー）＞ＲＢＡ（アクセプター）である。
【００３４】
特定の実施の形態において、ドナーのＲＢＡ値は、アクセプターのＲＢＡ値よりも少なくとも０．１大きくてもよい。特定の実施の形態において、ドナーのＲＢＡ値は、アクセプターのＲＢＡ値よりも少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５大きくてもよい。ＲＢＡ値は、分子モデル化、熱力学的測定等により、ヌクレオチドの修飾された結合親和性の従来の分析から導き出され得る。或いは、それらは、修飾鎖と未修飾鎖とのＴｍ値差の測定により決定することができる。或いはＲＢＡ値は、１セットのヌクレオチドのＴｍ値の計算のための従来の式を使用する計算若しくは測定、又は計算及び測定の組み合わせのいずれかによって、未修飾鎖と修飾鎖とのＴｍ値の差として表わすことができる。
【００３５】
本発明に記載のドナーオリゴヌクレオチドは、ドナーが標的ＤＮＡ鎖への親和性の増加を示すことでドナーの挿入がより容易になるように、ハイブリダイゼーション特性を改善するためのさらなる修飾を含んでもよい。ドナーオリゴヌクレオチドは、三重鎖構造又は四重鎖構造を安定させるために、ヌクレアーゼに対してもより耐性を持つようにさらに修飾され得る。Ｃ５−プロピン置換ピリミジンドナーオリゴヌクレオチドの修飾は、ホスホロチオエート修飾、２−ＯＭｅ置換、ＬＮＡ（ロックされた核酸）の使用、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、リボヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドとアクセプター鎖との間のハイブリッドの安定性を修飾、好ましくは促進する他の塩基を含むことができる。
【００３６】
そのような修飾の中で特に有益なのは、ＰＮＡであり、それらはオリゴヌクレオチドのデオキシリボース骨格がペプチド骨格と置換される、オリゴヌクレオチドアナログである。そのようなペプチド骨格の１つは、アミド結合を経て結合するＮ−（２−アミノエチル）グリシンの反復単位から構築される。ペプチド骨格の各サブユニットは、核酸塩基（「塩基」とも呼ばれる）へ結合され、それは天然に存在する塩基、天然に存在しない塩基又は修飾塩基であってもよい。ＰＮＡオリゴマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかよりも高い親和性で、相補的なＤＮＡ又はＲＮＡへ配列特異的に結合する。したがって、もたらされるＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖又はＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、より高い融解温度（Ｔｍ値）を有する。さらに、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖又はＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＴｍ値は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖又はＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖よりも塩濃度に対してそれほど影響を受けない。ＰＮＡのポリアミド骨格は、酵素分解に対しても耐性が高い。ＰＮＡの合成は、例えば特許文献８及び特許文献９に記述されており、それらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。他のＰＮＡは、例えば特許文献１０及び１９９６年７月２３日に発行された特許文献１１において示され、それらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。さらに、多くの科学的な出版物には、ＰＮＡの特性及び用途だけでなく、それらの合成も記述される。例えば、非特許文献２５; 非特許文献２６; 非特許文献２７; 非特許文献２８; 非特許文献２９; 非特許文献３０; 非特許文献３１を参照されたい。
【００３７】
本発明のＣ５−プロピン置換ピリミジンオリゴヌクレオチドのさらに有益な修飾も、スーパーＡ（Super A）及びスーパーＴ（Super T）として既知であり、ドイツのエポック・バイオサイエンス（Epoch Biosciences）社から入手可能である。これらの修飾ヌクレオチドがＤＮＡ二重鎖中の塩基の積み重ねを改善すると考えられる、ＤＮＡの主溝の中へとどまる付加的な置換基を含む（図４を参照）。
【００３８】
さらなる有用な修飾は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）として既知の合成分子クラスからの１つ又は複数のモノマーも含む。ＬＮＡは、二環式及び三環式のヌクレオシドアナログ及びヌクレオチドアナログ、並びにそのようなアナログを含んでいるオリゴヌクレオチドである。ＬＮＡ及び関連したアナログの基本構造的及び機能的な特性は、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、及び特許文献１７を含む、様々な公報及び特許中に開示され、それらのすべては、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００３９】
本発明のドナーオリゴヌクレオチドはキメラとして、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ又はその組み合わせのセクションを含むものとしても作製することができる。
【００４０】
したがって特定の実施の形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、他の（任意に非メチル化した）修飾ヌクレオチドをさらに含む。
【００４１】
特定の実施の形態において、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対して耐性を持つ。これはオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼによる分解を防止するのに有利であり、ドナーオリゴヌクレオチドが標的（アクセプター分子）を発見できる可能性を大きくする。
【００４２】
本発明の特定の実施の形態において、ミスマッチの位置でオリゴヌクレオチドのヌクレオチドを修飾できる。ミスマッチを修飾することができるかどうかは、ドナー鎖及びアクセプター鎖間の親和性の差を使用する、標的化ヌクレオチド交換又は細胞のＤＮＡ修復機構の正確なメカニズムに大いに依存するであろう。ミスマッチの傍又は周辺にある他の修飾位置の正確な場所の場合にも同じことが言える。しかしながら、本明細書において示された開示に基づいて、そのようなオリゴヌクレオチドは容易にデザインすることができ、本明細書において別に記述されるような適切なオリゴヌクレオチドに対する検査手順を考慮して検査した。特定の実施の形態において、ミスマッチの位置でヌクレオチドは修飾されない。特定の実施の形態において、修飾は、ミスマッチに隣接した、好ましくは、ミスマッチから２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド又は７ヌクレオチド離れた位置にある。特定の実施の形態において、修飾はミスマッチから下流の位置にある。特定の実施の形態において、修飾はミスマッチから上流の位置にある。特定の実施の形態において、修飾は、ミスマッチから１０ｂｐ〜１０ｋＢ、ミスマッチから好ましくは５０ｂｐ〜５０００ｂｐ、より好ましくは１００ｂｐ〜５００ｂｐにある。
【００４３】
ドナーとして使用されるオリゴヌクレオチドの長さは変化させることができるが、一般に１０〜５００ヌクレオチド長、好みにより１１〜１００ヌクレオチド長、好ましくは１５〜９０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜７０ヌクレオチド長、最も好ましくは３０〜６０ヌクレオチド長で変化させることができる。
【００４４】
１つの態様において、本発明は、ドナーオリゴヌクレオチドと二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列を組み合わせることを含む、二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列の標的化改変のための方法に関し、二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列が、第１のＤＮＡ塩基配列、及び第１のＤＮＡ塩基配列の相補物である第２のＤＮＡ塩基配列を含み、ドナーオリゴヌクレオチドが、改変される二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列に関して、好ましくは第１のＤＮＡ塩基配列に関して、少なくとも１つのミスマッチを含むドメインを含み、ドナーオリゴヌクレオチドのセクションが、標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質の存在下において、オリゴヌクレオチドのその位置での未修飾ヌクレオチドと比較して、第１のＤＮＡ塩基配列に対してより高度な親和性を示すようにＣ５−プロピニル置換ピリミジンにより修飾されており、及び／又は第２のＤＮＡ塩基配列が、ドナーオリゴヌクレオチドの対応するセクションよりも低度にメチル化する、二重鎖アクセプターＤＮＡ塩基配列の標的化改変のための方法に関する。
【００４５】
本発明は、最も広範囲の形式で、ヒト、動物、植物、魚類、爬虫類、昆虫、真菌、細菌等のような生物のすべての種類に一般的に適用可能である。本発明は、ゲノムＤＮＡ、線状ＤＮＡ、人工染色体、核染色体ＤＮＡ、オルガネラ染色体ＤＮＡ、ＢＡＣ、ＹＡＣに由来したＤＮＡのような、任意のタイプのＤＮＡの修飾に対して適用可能である。本発明は、エクスビボだけでなくインビボで行なうことができる。
【００４６】
本発明は、最も広範囲の形式で、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾のための多くの目的に対して適用可能である。
【００４７】
上記したように、本発明は、本質的には、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾、ミスマッチ修復、遺伝子変異を含む（植物の）遺伝物質の標的化改変、標的化遺伝子修復及び遺伝子ノックアウトのための、オリゴヌクレオチドの使用にも関する。
【００４８】
さらに本発明は、本明細書における他の部分で定義されるような、ＭＲＭの誘導が可能な、特にＴＮＥを可能にするタンパク質と任意に組み合わせた、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。
【００４９】
さらに本発明は、本発明の方法によって得られた修飾された遺伝物質に、修飾された遺伝物質を含む細胞及び生物に、また、そのように得られる植物又は植物の一部分に関する。
【００５０】
本発明は特に、植物の除草剤抵抗性を提供するための、本発明のプロピン修飾オリゴヌクレオチドを使用するＴＮＥの方法の使用に関する。本発明は特に、除草剤、特にカナマイシン、グリフォサート及び／又はカルベニシリンに対する抵抗性が付与される植物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下実施例について詳細に説明する。
【実施例】
【００５２】
材料及び方法
Ｃ５−プロピンピリミジンを含んでいるオリゴヌクレオチドを、Trilink Biotech社又はジーンリンク（GeneLink）社から購入した。使用されるオリゴヌクレオチドの配列は以下に示される。実験において使用されるプラスミドは、カナマイシン耐性及びカルベニシリン耐性の両方を付与する遺伝子を含むｐＣＲ２．１（インビトロゲン（Invitrogen）社）の誘導体であった。インフレームの終止コドン及び欠失を、先に記述される（非特許文献３２）ように、カナマイシン及びカルベニシリン中へと導入した。プラスミドＫｍＹ２２ｓｔｏｐは、カナマイシンＯＲＦ中のコドンＹ２２でＴＡＴからＴＡＧへの変異を有する。一方、プラスミドＣｂＹ４４ｓｔｏｐは、カルベニシリンＯＲＦ中のコドンＹ４４でＴＡＣからＴＡＧへの変換を有する。プラスミドＫｍＹ２２．において、Ｙ２２コドンの３番目のヌクレオチド（ＴＡＴ）が、フレームシフトを与えるように削除された。
【００５３】
無細胞系において使用される、欠損カナマイシン遺伝子、欠損カルベニシリン遺伝子及びオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【００５４】
【表１】
2009520498.tif 000003
【００５５】
【表２】
2009520498.tif 000004
【００５６】
カナマイシン及びカルベニシリンのオープンリーディングフレームの関連配列及びコードされたアミノ酸が示される。先に記述された（非特許文献３２）ように、終止コドン（ＴＡＧ、＊）を生じる単一のヌクレオチド変異を導入した。実験において使用されるオリゴヌクレオチドの配列が示される。オリゴヌクレオチドＫ１〜Ｋ６は、ＫｍＹ２２ｓｔｏｐ及びＫｍＹ２２Δ変異を、代わりとなるチロシンをコードするコドン（ＴＡＣ）に回復するために使用された。同様に、オリゴヌクレオチドＣ１はＣｂＹ４４変異（ＴＡＧ）を、代わりとなるチロシンのコドン（ＴＡＴ）に変えるために使用された。各オリゴヌクレオチド中のミスマッチヌクレオチドに下線が引かれる。Ｙは５−プロピニルデオキシシチジン、Ｚは５−プロピニルデオキシウラシルとしてプロピン誘導ヌクレオチドが示される。カナマイシンＯＲＦ及びカルベニシリンＯＲＦ上のオリゴヌクレオチド結合領域に下線が引かれる。オリゴヌクレオチドＫ１〜Ｋ６は、カナマイシンコード配列に対して相補的である。一方、オリゴヌクレオチドＣ１は、カルベニシリン非コード鎖に対して相補的である。
【００５７】
無細胞分析は以下のように行なわれた。シロイヌナズナ（生態型Ｃｏｌ−０）から花芽を回収し、窒素下で破砕した。２００μｌのタンパク質単離緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ）を加えた。植物残屑を３０分間１４０００ｒｐｍでの遠心分離によって沈殿させて、上清を−８０℃で保存した。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅキット（モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社）を使用して測定した。典型的な単離により、およそ３〜４μｇ／μｌのタンパク質濃度がもたらされた。無細胞反応は、１μｇプラスミドＤＮＡ（ＫｍＹ２２ｓｔｏｐ又はＣｂＹ４４ｓｔｏｐ）、１００ｎｇのオリゴヌクレオチド、３０μｇの植物の総タンパク質、４μｌの剪断されたサケ精子ＤＮＡ（３μｇ／μｌ）、２μｌのプロテアーゼ阻害剤ミックス（５０×濃縮：完全ＥＤＴＡ不含有プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット、ロッシュ・ディアグノスティックス（Roche Diagnostics）社）、５０μｌの２×無細胞反応緩衝液（４００ｍＭトリスｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．４ｍＭスペルミジン、５０ｍＭ  ＡＴＰ、各２ｍＭのＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、各０．１ｍＭのｄＮＴＰ及び１０ｍＭ  ＮＡＤ）の成分を含み、水により総容量を１００μｌにした。混合物を１時間３７℃でインキュベートした。次にプラスミドＤＮＡを以下のように単離した。１００μｌのＨ２Ｏを容量を増加するために各反応溶液に対して加え、続いて２００μｌのアルカリ性緩衝フェノール（ｐＨ８〜１０）を加えた。混合物をボルテックスにより短時間撹拌し、次に３分間１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上部の水相を新しいチューブへ移し、次に２００μｌのクロロホルムを加えた。混合物をボルテックスにより短時間撹拌し、３分間１３０００ｒｐｍで遠心し、新しいチューブへ水相を移した。ＤＮＡを０．７容量２−プロパノールの追加によって沈殿させ、沈殿をＴＥ中で再懸濁した。共精製されたオリゴヌクレオチドを除去するために、ＤＮＡをキアゲン（Qiagen）社のＰＣＲ精製カラムを通してろ過し、３０μｌの最終容量でプラスミドＤＮＡを溶出した。２μｌのプラスミドＤＮＡを、１８μｌのＤＨ１０Ｂ（インビトロゲン社）エレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後に、ＳＯＣ培地中で１時間３７℃で細胞を回復させた。この期間後に、ＫｍＹ２２ｓｔｏｐ及びＫｍＹ２２．を用いた実験に関して、カナマイシンを１００μｇ／ｍｌの濃度で加え、細胞をさらに３時間インキュベートした。ＣｂＹ４４ｓｔｏｐを用いた実験に関しては、細胞は回復期間の直後に固形培地にプレートした。固形培地は１００μｇ／ｍｌのカナマイシン又はカルベニシリンを含んでいた。ＫｍＹ２２ｓｔｏｐ及びＫｍＹ２２．の実験に関しては、ＴＮＥイベント数を、カナマイシン培地上で検出し、エレクトロポレーション効率を、カルベニシリン培地上にプレートしたエレクトロポレーションの１０−４希釈及び１０−５希釈から得られたコロニー数のカウントによって計算した。ＣｂＹ４４ｓｔｏｐを用いて行われた実験に関しては、この選択条件は逆であった。ＴＮＥ効率を、形質転換細胞の総数でＴＮＥイベント数を割ることによって計算した。
【００５８】
結果
コドンが正しいアミノ酸を再びコードするように、ＫｍＹ２２ｓｔｏｐ及びＣｂＹ４４ｓｔｏｐのカナマイシンＯＲＦ又はカルベニシリンＯＲＦの中へ導入された終止コドン（ＴＡＧ）で、単一のヌクレオチド置換を生じさせるオリゴヌクレオチドのデザインを行なった。プラスミドＫｍＹ２２．では、オリゴヌクレオチドは単一ヌクレオチドを付加する、したがってＯＲＦを回復するようにデザインされた。Ｃ５−プロピンピリミジンの最適数を確立するために、一連のオリゴヌクレオチドを作成した。オリゴヌクレオチドＫ１は、ミスマッチヌクレオチドに隣接する２つのＣ５−プロピンピリミジンを含む。オリゴヌクレオチドＫ２では、全てのシトシンヌクレオチドは５−プロピニルデオキシシチジンに置き換わる。オリゴヌクレオチドＫ３では、全てのチミジンヌクレオチドは５−プロピニルデオキシウラシルに置き換わる。オリゴヌクレオチドＫ４及びオリゴヌクレオチドＣ４では、全てのピリミジンはＣ５−プロピンピリミジンに置き換わる。各実験において、未修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びＣ５−プロピン修飾オリゴヌクレオチドは並行して実行された。各実験で、正常ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して得たＴＮＥ効率を任意に１に設定し、続いてＣ５−プロピン修飾オリゴヌクレオチドのＴＮＥ効率を正常ＤＮＡオリゴヌクレオチドに対する倍増加（fold increase）として表わした。図３に示すように、本分析において、Ｃ５−プロピン修飾オリゴヌクレオチドは、正常ＤＮＡオリゴヌクレオチドよりも効率的に働く。置換及び挿入のいずれの効率も増進された。置換の全修復効率は挿入に対してよりも高かった。認められた促進は存在するＣ５−プロピンヌクレオチドの割合に依存する。２つの（Ｋ１）、７つの（Ｋ２）、又は５つの（Ｋ３）Ｃ５−プロピンピリミジンを含むオリゴヌクレオチド（２４量体）は全て、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに対して２〜３倍の増加を示した。しかし、修復効率における最大の増進（６〜１０倍）は、１２のピリミジンヌクレオチドの全てがＣ５−プロピンピリミジンに置き換わったオリゴヌクレオチド（Ｋ４及びＣ４）の使用において認められた。この効果は、ＫｍＹ２２．の修復に限定されず、Ｃ５−プロピン修飾オリゴヌクレオチドを使用した場合には、ＣｂＹ４４の終止コドンの修復も促進されることに留意することが大切である。
【００５９】
終止コドンの変換が起きたと仮定したコロニーからプラスミドを精製し、次に抗生物質抵抗性遺伝子をシークエンシングし、実際に終止コドンが変換されていることを確認した。
【００６０】
こうして、Ｃ５−プロピンピリミジンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、改善されたアンチセンス特性を有することが見出された。インビトロのＴＮＥ分析（無細胞分析）を用いることで、Ｃ５−プロピンピリミジンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、正常ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して得られたＴＮＥ効率と比較して、有意に高いレベルのＴＮＥを示すことが実証された。この促進は、１０倍にまでなる可能性があり、変換されるオリゴヌクレオチド配列又は遺伝子座とは無関係である。この促進は、ピリミジンに富む配列を標的にして、Ｃ５−プロピンピリミジンヌクレオチドの割合を最大限にすることによりさらに改善される。効率もまた、結合親和性をＣ５−プロピンピリミジンヌクレオチドよりもさらに大きい程度まで促進する、７−プロピニルプリンヌクレオチドの使用により、さらに同様に改善される（非特許文献１７）。プロピンプリンとピリミジンを組み合わせることで、全てのヌクレオチドが塩基上にプロピニル基を持つ、オリゴヌクレオチドの生産が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】標的化ヌクレオチド交換の概略図である。交換されるヌクレオチド（Ｘ）を含むアクセプター二重鎖ＤＮＡ鎖は、挿入されるヌクレオチド（Ｙ）を含むＣ５−プロピンピリミジン修飾ドナーオリゴヌクレオチド（ＮＮＮｍＮＮＮｍＹＮＮｍＮＮｍとして図式的に示される）に接触させられる。三重鎖構造は、ＴＮＥが可能な環境に、又は無細胞の酵素混合物又は無細胞の抽出物として既知のもののような、少なくともＴＮＥを行なうことを可能にするタンパク質をともなう環境にさらされるか、或いは接触させられる（なかでも特許文献４、特許文献１を参照）。
【図２】５−プロピニルデオキシチミジン、５−プロピニルデオキシシトシン、２’−デオキシ−７−プロピニル−７−デアザ−アデノシン、及び２’−デオキシ−７−プロピニル−デアザ−グアノシンの化学構造を示す図である。
【図３】無細胞分析を用いて測定した、Ｃ５−プロピンピリミジンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのＴＮＥ修復効率を示す図である。実験ごとに、正常ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用した修復効率を決定し、値を１に設定した。倍増加は、正常ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用した場合に得られた修復効率と比較して、Ｃ５−プロピンピリミジンを含むオリゴヌクレオチドの使用で見られる修復の増加を示している。同様の結果がプロピニル化されたプリンを使用した際にも得られた。
【図１】
2009520498.tif 000005
【図２】
2009520498.tif 000006
【図３】
2009520498.tif 000007
【配列表】
2009520498000001.xml
【国際調査報告】
2009520498.tif 000012
2009520498.tif 000013
2009520498.tif 000014
2009520498.tif 000015