(57)【要約】1つの局面において本発明は、選択されたバイオマーカー産物レベルに対応するデータを提供し、かつデータを公式に適用して試験個体が1つもしくは複数の結腸直腸病変、または1つもしくは複数のサブタイプの結腸直腸病変を有するか否かに関する指標を提供することによって、試験個体における1つもしくは複数の結腸直腸病変、または1つもしくは複数のサブタイプの結腸直腸病変（1つの態様において結腸直腸癌）を試験する方法である。いくつかの局面において、本方法はコンピュータに基づき、コンピュータはデータを公式に適用する。他の局面において、コンピュータシステムは、プロセッサに、試験個体が結腸直腸病変を有するか否かの指標をユーザーに提供させる指令で構成される。いくつかの態様においてコンピュータ可読媒体を含む、選択されたバイオマーカー産物に対応するデータを測定するためのキットも含まれる。1つまたは複数の結腸直腸病変の処置の治療有効性をモニターするためのキットおよび方法も含まれる。2009512440.tif 000232
2009512440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、試験対象における1つまたは複数の結腸直腸病変を試験する方法：
（a）試験対象から単離されたおよび／または試験対象に由来する試料における少なくとも2つのバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータを提供する段階であって、バイオマーカーが、BCNP1、CD163、CDA、MS4A1、BANK1、およびMGC20553からなる群より選択される遺伝子である、段階；ならびに
（b）（i）1つまたは複数の病変を有する参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物のレベルを表すデータセット、および
（ii）1つまたは複数の病変を有しない参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセット
に基づく公式を該データに適用し、それによって試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供する段階。
【請求項２】
以下の段階を含む、試験対象における1つまたは複数の結腸直腸病変に関して試験するためのコンピュータに基づく方法：
バイオマーカーが、BCNP1、CD163、CDA、MS4A1、BANK1、およびMGC20553からなる群より選択される遺伝子である、試験対象から単離されたおよび／または試験対象に由来する試料における少なくとも2つのバイオマーカーのそれぞれの産物レベルを表すデータをコンピュータに入力する段階；ならびに
コンピュータに、
（i）1つまたは複数の病変を有する参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物のレベルを表すデータセット、および
（ii）1つまたは複数の病変を有しない参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセット
に基づく公式を該データに適用させて、それによって試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供する段階。
【請求項３】
公式が以下の式を有する、請求項1または2記載の方法：
V＝C＋ΣβiXi
式中、Vは試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiはバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、βiは係数であり、およびCは定数である。
【請求項４】
公式が以下の式を有する、請求項1または2記載の方法：
V＝C＋Σβij(Xi/Xj)
式中、Vは試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiはバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、Xjはバイオマーカーのj番目のバイオマーカーの産物レベルであり、i番目のバイオマーカーはj番目のバイオマーカーではなく、βijは係数であり、およびCは定数である。
【請求項５】
公式がロジスティック回帰によって導き出される、請求項1または2記載の方法。
【請求項６】
試料が血液、リンパ液、およびリンパ系組織からなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
試料における産物がRNAである、請求項1または2記載の方法。
【請求項８】
試料が血清低減血液試料、赤血球低減血液試料、血清低減赤血球低減血液試料、溶解血液の非分画細胞試料、および分画血液試料からなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項９】
試料における産物がRNAであり、データが該RNAに由来するcDNA、EST、および／またはPCR産物のレベルを表す、請求項1または2記載の方法。
【請求項１０】
包装を含み、かつ少なくとも2つのプライマーセットを含むキットであって、それぞれのセットが、バイオマーカーの1つまたは複数のRNA産物と相補的なポリヌクレオチドの少なくとも一部の選択的増幅によって増幅産物を生成することができ、バイオマーカーが、BCNP1、CD163、CDA、MS4A1、BANK1、およびMGC20553からなる群より選択される遺伝子であり、ならびにプライマーセットのそれぞれのセットが該群の異なるバイオマーカーに対して選択的である、キット。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドが全RNA、mRNA、DNA、cDNA、およびESTからなる群より選択される、請求項10記載のキット。
【請求項１２】
プローブのそれぞれが、増幅産物のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかと選択的にハイブリダイズすることができる、2つまたはそれより多いオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項10記載のキット。
【請求項１３】
熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、ヌクレオチド三リン酸、および酵素緩衝液からなる群より選択される2つまたはそれより多い成分をさらに含む、請求項10、11、または12記載のキット。
【請求項１４】
試験対象から単離されたおよび／または試験対象に由来する試料における増幅産物のレベルを表すデータに公式を適用するための指示によって暗号化されるコンピュータ可読媒体をさらに含むキットであって、公式が、
（i）1つまたは複数の結腸直腸病変を有する参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物のレベルを表すデータセット、および
（ii）1つまたは複数の病変を有しない参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセット
に基づき、それによって試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供する、請求項10、11、12、または13記載のキット。
【請求項１５】
公式が以下の式を有する、請求項14記載のキット：
V＝C＋ΣβiXi
式中、Vは試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiはバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、βiは係数であり、およびCは定数である。
【請求項１６】
公式が以下の式を有する、請求項14記載のキット：
V＝C＋Σβij(Xi/Xj)
式中、Vは試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiはバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、Xjはバイオマーカーのj番目のバイオマーカーの産物レベルであり、i番目のバイオマーカーはj番目のバイオマーカーではなく、βijは係数であり、およびCは定数である。
【請求項１７】
試料が血液、リンパ液、およびリンパ系組織からなる群より選択される、請求項14、15、または16記載のキット。
【請求項１８】
試料が血清低減血液試料、赤血球低減血液試料、血清低減赤血球低減血液試料、溶解血液の非分画細胞試料、および分画血液試料からなる群より選択される、請求項14、15、または16記載のキット。
【請求項１９】
コンピュータによって実行され、試験対象から単離されたおよび／または試験対象に由来する試料における少なくとも2つのバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータに公式を適用する場合に動作可能な、コンピュータ可読媒体に保存された指示を有するコンピュータ可読媒体であって、バイオマーカーが、BCNP1、CD163、CDA、MS4A1、BANK1、およびMGC20553からなる群より選択される遺伝子であり、公式が、
（i）1つまたは複数の結腸直腸病変を有する参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセット、および
（ii）1つまたは複数の病変を有しない参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセット
に基づき、それによって試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供する、コンピュータ可読媒体。
【請求項２０】
公式が以下の式を有する、請求項19記載のコンピュータ可読媒体：
V＝C＋ΣβiXi
式中、Vは試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiはバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、βiは係数であり、およびCは定数である。
【請求項２１】
公式が以下の式を有する、請求項19記載のコンピュータ可読媒体：
V＝C＋Σβij(Xi/Xj)
式中、Vは試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiはバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、およびXjはバイオマーカーのj番目のバイオマーカーの産物レベルであり、i番目のバイオマーカーはj番目のバイオマーカーではなく、βijは係数であり、およびCは定数である。
【請求項２２】
公式がロジスティック回帰によって導き出される、請求項19記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項２３】
試料が血液、リンパ液、およびリンパ系組織からなる群より選択される、請求項19記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項２４】
試料における産物がRNAである、請求項19記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項２５】
試料が血清低減血液試料、赤血球低減血液試料、血清低減赤血球低減血液試料、溶解血液の非分画細胞試料、および分画血液試料からなる群より選択される、請求項19記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項２６】
試料における産物がRNAであり、データが該RNAに由来するcDNA、EST、および／またはPCR産物のレベルを表す、請求項19記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項２７】
以下を含む、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供するためのコンピュータシステム：
プロセッサー；および
実行された場合にプロセッサーがユーザーに指標を提供する指示で構成されたメモリーであって、指示が、試験対象から単離されたおよび／または試験対象に由来する試料における少なくとも2つのバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータに公式を適用する段階を含み、バイオマーカーが、BCNP1、CD163、CDA、MS4A1、BANK1、およびMGC20553からなる群より選択される遺伝子であり、ならびに公式が、
（i）1つまたは複数の病変を有する参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物のレベルを表すデータセット、および
（ii）1つまたは複数の病変を有しない参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセット
に基づき、それによって試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供する、メモリー。
【請求項２８】
公式が以下の式を有する、請求項27記載のシステム：
V＝C＋ΣβiXi
式中、Vは試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiはバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、βiは係数であり、およびCは定数である。
【請求項２９】
公式が以下の式を有する、請求項27記載のシステム：
V＝C＋Σβij(Xi/Xj)
式中、Vは試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiはバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、およびXjはバイオマーカーのj番目のバイオマーカーの産物レベルであり、i番目のバイオマーカーはj番目のバイオマーカーではなく、βijは係数であり、およびCは定数である。
【請求項３０】
公式がロジスティック回帰によって導き出される、請求項27記載のシステム。
【請求項３１】
試料が血液、リンパ液、およびリンパ系組織からなる群より選択される、請求項27記載のシステム。
【請求項３２】
試料における産物がRNAである、請求項27記載のシステム。
【請求項３３】
試料が血清低減血液試料、赤血球低減血液試料、血清低減赤血球低減血液試料、溶解血液の非分画細胞試料、および分画血液試料からなる群より選択される、請求項27記載のシステム。
【請求項３４】
試料における産物がRNAであり、データが該RNAに由来するcDNA、EST、および／またはPCR産物のレベルを表す、請求項27記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示は、バイオマーカー産物レベルに対応するデータを対象における疾患状態に相関させるための装置、キット、およびコンピュータに基づく方法に関する。
【０００２】
優先権に関する主張
本出願は、35 U.S. C. §119(e)の下で、いずれもその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、2005年10月21日に提出された米国特許出願第60/729,055号、および2006年1月12日に提出された米国特許出願第60/758,418号に対する優先権の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
背景
結腸直腸癌は、米国における癌関連死の第二位である（11）。毎年、約150,000人の人々が結腸直腸癌であると診断され、この疾患のために60,000人もの人が死亡する。ほとんどの癌が、癌が処置しにくい状態で検出されることから、診断された中で、ほぼ半数が5年以内に死亡すると予測される。初期段階で癌が検出された患者の場合、5年生存率は90％より大きくなりうる。米国癌学会は、年齢50歳およびそれより上のアメリカ人は全て、結腸直腸癌に関して定期的にスクリーニング検査を受けることを推奨している。残念なことに、現在利用できるスクリーニング技術は、非常に費用が高い、および／または非常に侵襲性が高い、またはいくつかの症例では十分に正確ではないことから、疾患に関する検査を受けているのはこの集団のごく一部に過ぎない。
【０００４】
ほとんどの結腸直腸癌は、ポリープと呼ばれる小さい非癌様（良性）細胞塊として始まる。時間が経つにつれて、これらのポリープのいくつかは癌様となる。個体が歳をとるにつれてポリープの発生率は増加する。年齢60歳を超える人々の50％は少なくとも1つのポリープを有すると推定される。
【０００５】
ポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変を同定する重要性は、特定のタイプのポリープが癌様であるか、または癌を発症するリスクの増加を示している点である。特定のサブタイプのポリープを除去すると、結腸直腸癌を発症するリスクが有意に低減することが示されている。したがって、早期の除去を可能にするためまたは不要な手順を防止するために、ポリープおよび／または特定のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変をスクリーニングするための試験は、結腸直腸癌（12）の発生を顕著に低減させて、医療に対する現在の費用を減少させる。
【０００６】
ポリープを同定するために現在利用されているスクリーニング技術には、1）便潜血試験（FOBT）；2）軟性S字結腸鏡検査；3）二重撮像バリウム注腸（DCBE）；および4）結腸鏡検査が含まれる。時に、これらの試験の2つまたはそれより多くを併用して用いる。年齢50歳より上で、平均リスク集団に属すると考えられている男性における結腸直腸癌に関するスクリーニングのために現在推奨される標準には、年1回のFOBT、5年ごとのS字結腸鏡検査、10年ごとの結腸鏡検査、および5年ごとのDCBEが含まれる。家族の1人または複数が結腸直腸癌を有する高リスク集団の場合、FOBTまたはS字結腸鏡検査の追跡調査として、2年毎の結腸鏡検査が推奨される。
【０００７】
これらの試験のそれぞれは、有意な短所を有する。FOBT試験は、非侵襲的な手順ではあるが、試験前の有意な食事制限および他の制限を必要とし、感受性は低い。S字結腸鏡検査および結腸鏡検査は、それらが腸腔の直接可視化を伴うことからより感度が高いが、S字結腸鏡は部分的に可視化できるに過ぎず、結腸鏡検査は、進行した腺腫の約12％を見逃すことが知られている。S字結腸検査および結腸鏡検査はいずれも高レベルの不快感を引き起こす非常に侵襲性の高い手順であり、多くの患者はこれらの推奨されるスクリーニング手順を受けない傾向がある。また、S字結腸鏡検査および結腸鏡検査は費用が高く、手順を受けた結果として生じる合併症を有する可能性がある。
【０００８】
このように、1つまたは複数の結腸直腸病変の存在を示すために集団のより広い試験を可能にするために、および推奨されるプロトコールに対するより大きい遵守を確保するために、侵襲性が最小である改善された試験が必要である。今日まで、この必要性にもかかわらず、結腸直腸病変を試験するための有用な分子バイオマーカーの同定における進歩は非常にわずかであった。最近の努力は、DNAに基づくバイオマーカー法に集中している（例えば、Shuber et al. 米国特許出願第2005-0260638A1号（特許文献1）；またはLofton-Day et al. WO2005/001142（特許文献2）を参照されたい）。
【０００９】
このように、結腸直腸病変に関する非侵襲性の試験において用いるためのバイオマーカーの同定は、当技術分野における積年の要求を満たす。
【００１０】
【特許文献１】Shuber et al. 米国特許出願第2005-0260638A1号
【特許文献２】Lofton-Day et al. WO2005/001142
【発明の開示】
【００１１】
概要
当技術分野において利用可能な技術とは対照的に、本明細書に記述される本発明は、結腸直腸病変にこれまで関連していないバイオマーカーを同定し、その遺伝子発現レベルは、単独または併用して測定されかつ任意で該レベルを測定に変換するための式に応用されて、結腸直腸病変の可能性の指標を与える。
【００１２】
本発明は、血液特異的バイオマーカーのような新規の結腸直腸病変特異的バイオマーカー、ならびに前癌様もしくは癌様病変のような結腸直腸病変の試験において用いるための方法、組成物、およびキットを開示する。この使用は、本明細書においてさらに記述され、例示される多様な方法において行われうる。
【００１３】
本発明の1つの局面に従って、以下の段階を含む、試験対象における1つまたは複数の結腸直腸病変に関して試験する方法が提供される：（a）試験対象からの試料における1つまたは複数のバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータを提供する段階；および（b）データが（i）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する対象、または（ii）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない対象のいずれの特徴を示すかを確認し、それにより、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供する段階。
【００１４】
本発明のもう1つの局面に従って、以下の段階を含む、試験対象における1つまたは複数の結腸直腸病変に関して試験するための、コンピュータに基づく方法が提供される：バイオマーカーがBCNPl、CD163、CDA、MS4A1、BANKl、およびMCG20553からなる群より選択される遺伝子である、試験対象から単離されたおよび／または試験対象に由来する試料における1つまたは複数のバイオマーカーのそれぞれの産物レベルを表すデータをコンピュータに入力する段階；およびデータが（i）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する対象、または（ii）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない対象のいずれの特徴を示すかをコンピュータに確認させ、それにより、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供する段階。
【００１５】
本発明のさらにもう1つの局面に従って、バイオマーカーがBCNPl、CD163、CDA、MS4A1、BANKl、およびMCG20553からなる群より選択される遺伝子である、試験対象から単離されたおよび／または試験対象に由来する試料における1つまたは複数の各バイオマーカーの1つまたは複数の産物レベルを表すデータが、（i）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する対象、または（ii）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない対象のいずれの特徴を示すかを確認し、それにより、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供することに関する指示を含む、コンピュータ可読媒体が提供される。
【００１６】
本発明のさらにもう1つの局面に従って、プロセッサと、プロセッサにユーザーに指標を提供させる指示によって形成されたメモリーとを含む、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供するためのコンピュータシステムであって、バイオマーカーがBCNPl、CD163、CDA、MS4A1、BANKl、およびMCG20553からなる群より選択される遺伝子であり、試験対象から単離されたおよび／または試験対象に由来する試料における1つまたは複数の各バイオマーカーの1つまたは複数の産物レベルを表すデータが、（i）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する対象、または（ii）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない対象のいずれの特徴を示すかを確認し、それにより、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供する段階を指示が含む、コンピュータシステムが提供される。
【００１７】
以下に記述される本発明の好ましい態様におけるさらなる特徴に従って、試料における産物はRNAである。
【００１８】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、試料における産物はRNAであるが、データは、RNAに由来するcDNA、ESTおよび／またはPCR産物を表す。
【００１９】
本発明のさらにもう1つの局面に従って、包装を含み、1つまたは複数のプライマーセットを含むキットであって、そのそれぞれのセットが、BCNPl、CD163、CDA、MS4A1、BANKl、およびMCG20553からなる群より選択される遺伝子であるバイオマーカーの1つまたは複数のRNA産物と相補的なポリヌクレオチドの少なくとも一部の選択的増幅によって、増幅産物を生成することができ、かつプライマーセットの各セットが異なるバイオマーカーに対して選択的である、キットが提供される。
【００２０】
以下に記述される本発明の好ましい態様におけるさらなる特徴に従って、相補的ポリヌクレオチドは、全RNA、mRNA、DNA、cDNA、およびESTからなる群より選択される。
【００２１】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、1つまたは複数のバイオマーカーは少なくとも2つのバイオマーカーである。
【００２２】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、プローブのそれぞれは、増幅産物のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに対して選択的にハイブリダイズすることができる。
【００２３】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、キットは、以下からなる群より選択される2つまたはそれより多い成分をさらに含む：熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、ヌクレオチド三リン酸、および酵素緩衝液。
【００２４】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、キットは、試験対象から単離されたおよび／または試験対象に由来する試料における増幅産物レベルを表すデータが、（i）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する対象、または（ii）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない対象のいずれの特徴を示すかを確認し、それにより、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を提供するための指示によって暗号化されたコンピュータ可読媒体をさらに含む。
【００２５】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、データが、（i）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する対象、または（ii）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない対象のいずれの特徴を示すかを確認する段階は、（i）1つまたは複数の病変を有する参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセット、および（ii）1つまたは複数の病変を有しない参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセットに基づく公式を、データに適用する段階を含む。
【００２６】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、データが、（i）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する対象、または（ii）1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない対象のいずれの特徴を示すかを確認する段階は、（i）1つまたは複数の結腸直腸病変を有する対象の参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセット、または（ii）1つまたは複数の結腸直腸病変を有しない対象の参照集団の各対象におけるバイオマーカーのそれぞれの1つまたは複数の産物レベルを表すデータセットに、データが密接に関連するか否かを確認する段階を含む。
【００２７】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、式は、V＝C＋ΣβiXiであり、式中Vは試験対象が結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiは試料中のバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、βiは係数であり、およびCは定数である。
【００２８】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、公式は式：V＝C＋Σβij(Xi/Xj)を有し、式中Vは試験対象が結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiはバイオマーカーのi番目のバイオマーカーの産物レベルであり、およびXjは試料中のバイオマーカーのj番目のバイオマーカーの産物レベルであり、i番目のバイオマーカーはj番目のバイオマーカーではなく、βijは係数であり、およびCは定数である。
【００２９】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、公式は、ロジスティック回帰、直線回帰、ニューラルネットワーク、および主成分分析からなる群より選択される方法によって導き出される。
【００３０】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、試料は、血液、リンパ液、およびリンパ系組織からなる群より選択される。
【００３１】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、試料は、血清低減血液試料、赤血球低減血液試料、血清低減赤血球低減血液試料、溶解血液の非分画細胞試料、および分画血液試料からなる群より選択される。
【００３２】
本発明のさらなる局面に従って、それぞれの単離ポリヌクレオチドが、表2に記載されるバイオマーカーから選択されるバイオマーカーに選択的にハイブリダイズし、かつ組成物がバイオマーカーの少なくとも2つの発現レベルを測定するために用いられる、2つまたはそれより多い単離ポリヌクレオチドの集合を含む組成物が提供される。
【００３３】
以下に記述される本発明の好ましい態様におけるさらなる特徴に従って、それぞれの単離ポリヌクレオチドは、膜結合転写因子プロテアーゼ部位1（MBTPSl）；MGC45871；ムスケリン1（MKLNl）；nipped-B 相同体（NIPBL）；アシルペプチドヒドロラーゼ（APEH）；FLJ23091；MGC40157；およびプロテインホスファターゼ1 調節サブユニット2（PPP1R2）からなる群より選択されるバイオマーカーに選択的にハイブリダイズし、かつ組成物はバイオマーカーの少なくとも2つの発現レベルを測定するために用いられる。
【００３４】
本発明のなおさらなる局面に従って、それぞれの単離ポリヌクレオチドが、（a）表2に記載されるバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのRNA産物、および／または（b）（a）と相補的なポリヌクレオチド配列、に選択的にハイブリダイズし、かつ組成物がバイオマーカーの少なくとも2つのRNA発現レベルを測定するために用いられる、2つまたはそれより多い単離ポリヌクレオチドの集合を含む組成物が提供される。
【００３５】
以下に記述される本発明の好ましい態様におけるさらなる特徴に従って、それぞれの単離ポリヌクレオチドは、（a）膜結合転写因子プロテアーゼ部位1（MBTPSl）；MGC45871；ムスケリン1（MKLNl）；nipped-B 相同体（NIPBL）；アシルペプチドヒドロラーゼ（APEH）；FLJ23091；MGC40157；およびプロテインホスファターゼ1 調節サブユニット2（PPP1R2）からなる群より選択されるバイオマーカーのRNA産物、および／または（b）（a）と相補的なポリヌクレオチド配列、に選択的にハイブリダイズし、かつ組成物はバイオマーカーの少なくとも2つのRNA発現レベルを測定するために用いられる。
【００３６】
本発明のなおさらなる局面に従って、それぞれの単離ポリヌクレオチドが、（a）表3に記載されるRNA配列、および／または（b）（a）と相補的なポリヌクレオチド配列、に選択的にハイブリダイズする、2つまたはそれより多い単離ポリヌクレオチドの集合を含む組成物が提供される。
【００３７】
本発明のさらなる局面に従って、表4および／または表6に記載されるバイオマーカー特異的プライマーの2つまたはそれより多いセットの集合を含む組成物が提供される。
【００３８】
本発明のなおさらなる局面に従って、表4に記載される2つまたはそれより多いポリヌクレオチドプローブを含む組成物が提供される。
【００３９】
以下に記述される本発明の好ましい態様におけるさらなる特徴に従って、ポリヌクレオチドは定量的RT-PCR（QRT-PCR）において有用である。
【００４０】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、単離ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖RNAを含む。
【００４１】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、単離ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖DNAを含む。
【００４２】
本発明のなおさらなる局面に従って、それぞれの単離タンパク質が、表2に記載されるバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合し、かつ組成物が、バイオマーカーの少なくとも2つの発現レベルを測定するために用いられる、2つまたはそれより多い単離タンパク質の集合を含む組成物が提供される。
【００４３】
以下に記述される本発明の好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、それぞれの単離タンパク質は、膜結合転写因子プロテアーゼ部位1（MBTPSl）；MGC45871；ムスケリン1（MKLNl）；nipped-B 相同体（NIPBL）；アシルペプチドヒドロラーゼ（APEH）；FLJ23091；MGC40157；およびプロテインホスファターゼ1 調節サブユニット2（PPP1R2）からなる群より選択されるバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合し、かつ組成物は、バイオマーカーの少なくとも2つの発現レベルを測定するために用いられる。
【００４４】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、単離タンパク質は表5に記載されるタンパク質から選択される。
【００４５】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、単離タンパク質はリガンドである。
【００４６】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、リガンドは抗体またはその断片である。
【００４７】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、抗体はモノクローナル抗体である。
【００４８】
本発明のなおさらにさらなる局面に従って、（a）個体の試料において表2に記載されるバイオマーカーからなる群より選択される1つまたは複数のバイオマーカーのRNA産物レベルを決定する段階；および（b）試料におけるRNA産物レベルを対照と比較する段階であって、個体と対照とのあいだのRNA産物の発現の差の検出により、個体における1つまたは複数の結腸病変が示される段階を含む、個体における1つまたは複数の結腸病変を診断または検出する方法が提供される。
【００４９】
以下に記述される本発明の好ましい態様におけるさらなる特徴に従って、（a）個体の試料において、表2に記載されるバイオマーカーからなる群より選択される1つまたは複数のバイオマーカーのRNA産物レベルを決定する段階；および（b）試料におけるRNA産物レベルを対照と比較する段階を含む、個体における1つまたは複数の結腸病変を診断または検出する方法は、（a）個体の試料において膜結合転写因子プロテアーゼ部位1（MBTPSl）；MGC45871；ムスケリン1（MKLNl）；nipped-B 相同体（NIPBL）；アシルペプチドヒドロラーゼ（APEH）；FLJ23091；MGC40157；およびプロテインホスファターゼ1 調節サブユニット2（PPP1R2）からなる群より選択される1つまたは複数のバイオマーカーのRNA産物レベルを決定する段階、ならびに（b）試料におけるRNA産物レベルを対照と比較する段階であって、個体と対照とのあいだのRNA産物の発現の差の検出により、個体における1つまたは複数の結腸病変が示される段階をさらに含む。
【００５０】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、試料は全血を含む。
【００５１】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、試料は全血1滴を含む。
【００５２】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、試料は、溶解されている血液を含む。
【００５３】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、決定する段階の前に、本方法は試料からRNAを単離する段階を含む。
【００５４】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、RNA産物レベルを決定する段階は、定量的RT-PCR（QRT-PCR）を用いる段階を含む。
【００５５】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、QRT-PCRは、1つもしくは複数のRNA産物、またはその相補体にハイブリダイズするハイブリダイズプライマーを含む。
【００５６】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、プライマーは、長さが15〜25ヌクレオチドである。
【００５７】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、1つまたは複数のRNA産物のそれぞれのレベルを決定する段階は、1つまたは複数の転写物に対応する第一の複数の単離ポリヌクレオチドを、第二の複数の単離ポリヌクレオチドを含むアレイにハイブリダイズさせる段階を含む。
【００５８】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、第一の複数の単離ポリヌクレオチドは、RNA、DNA、cDNA、PCR産物、またはESTを含む。
【００５９】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、アレイは、RNA、DNA、cDNA、PCR産物、またはESTを含む複数の単離ポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、アレイ上の第二の複数の単離ポリヌクレオチドは、表2のバイオマーカーの1つまたは複数に対応するポリヌクレオチドを含む。
【００６１】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、対照は、1つまたは複数の結腸病変を有しない個体に由来する。
【００６２】
本発明のもう1つの局面に従って、任意の1つの組成物と使用説明書とを含む、1つまたは複数の結腸病変を診断または検出するためのキットが提供される。
【００６３】
本発明のなおもう1つの局面に従って、プライマーセットのそれぞれが、試験対象におけるバイオマーカーの定量的発現レベルを検出するために用いられる、（a）それぞれの第一のプライマーセットが伸長産物を作製するためにバイオマーカーの1つと相補的なRNA、cDNA、またはESTと選択的にハイブリダイズすることができる配列を含み、第二のセットのプライマーのそれぞれが伸長産物と選択的にハイブリダイズすることができる、表2から選択される唯一のバイオマーカーと相補的な二本鎖DNAを生じる、バイオマーカー特異的プライマーの少なくとも2つの対、（b）逆転写酵素活性を有する酵素、（c）熱安定性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、および（d）標識手段、を含む1つまたは複数の結腸病変を診断または検出するためのキットが提供される。
【００６４】
以下に記述される本発明の好ましい態様におけるさらなる特徴に従って、それぞれのプライマーセットが試験対象におけるバイオマーカーの定量的発現レベルを検出するために用いられる、（a）バイオマーカー特異的プライマーのそれぞれのセットが表2から選択される特有のバイオマーカーと相補的である二本鎖DNAを産生する、少なくとも2セットのバイオマーカー特異的プライマーと、酵素とを含む、1つまたは複数の結腸病変を診断または検出するためのキットはさらに、（a）バイオマーカー特異的プライマーのそれぞれのセットが膜結合転写因子プロテアーゼ部位1（MBTPSl）；MGC45871；ムスケリン1（MKLNl）；nipped-B 相同体（NIPBL）；アシルペプチドヒドロラーゼ（APEH）；FLJ23091；MGC40157；およびプロテインホスファターゼ1 調節サブユニット2（PPP1R2）からなる群より選択される特有のバイオマーカーと相補的な二本鎖DNAを産生し、それぞれの第一のセットのプライマーが、伸長産物を作製するためにバイオマーカーの1つと相補的なRNA、cDNA、またはESTと選択的にハイブリダイズすることができる配列を含み、それぞれの第二のセットのプライマーが伸長産物と選択的にハイブリダイズすることができる、バイオマーカー特異的プライマーの少なくとも2つのセット；（b）逆転写酵素活性を有する酵素；（c）熱安定性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素；ならびに（d）標識手段、を含む。
【００６５】
本発明のなおもう1つの局面に従って、（a）個体からの試料における、表2に記載のバイオマーカーのセットからなる群より選択される1つまたは複数のバイオマーカーのタンパク質産物レベルを決定する段階；および（b）試料におけるタンパク質産物レベルを対照と比較する段階であって、個体と対照とのあいだのタンパク質産物の発現の差の検出により、個体における1つまたは複数の結腸病変が示される段階を含む、個体における1つまたは複数の結腸病変を診断または検出するための方法が提供される。
【００６６】
以下に記述される本発明の好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、個体の試料における表2に記載のバイオマーカーからなる群より選択される1つまたは複数のバイオマーカーのタンパク質産物レベルを決定する段階を含む、個体における1つまたは複数の結腸病変を診断または検出するための方法は、個体の試料における、膜結合転写因子プロテアーゼ部位1（MBTPSl）；MGC45871；ムスケリン1（MKLNl）；nipped-B 相同体（NIPBL）；アシルペプチドヒドロラーゼ（APEH）；FLJ23091；MGC40157；およびプロテインホスファターゼ1 調節サブユニット2（PPP1R2）からなる群より選択される1つまたは複数のバイオマーカーのタンパク質産物レベルを決定する段階、ならびに（b）試料におけるタンパク質産物レベルを対照と比較する段階であって、個体と対照とのあいだのタンパク質産物の発現の差の検出により、個体における1つまたは複数の結腸病変が示される段階、をさらに含む。
【００６７】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、タンパク質産物レベルは、抗体またはその断片を用いて決定される。
【００６８】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、抗体は、表5に記載される抗体の群から選択される。
【００６９】
記述される好ましい態様におけるなおさらなる特徴に従って、抗体はモノクローナル抗体である。
【００７０】
本発明のさらなる局面に従って、それぞれの単離ポリヌクレオチドが、表12に記載されるバイオマーカーから選択されるバイオマーカーに選択的にハイブリダイズし、組成物が少なくとも2つのバイオマーカーの血液中での発現レベルを測定するために用いられる、2つまたはそれより多い単離ポリヌクレオチドの集合を含む組成物が提供される。
【００７１】
本発明のなおさらなる局面に従って、2つまたはそれより多い単離タンパク質の集合を含む任意の1つの組成物と、使用説明書とを含む、1つまたは複数の結腸病変を診断または検出するためのキットが提供される。
【００７２】
本発明は、特に、血液のような代用組織におけるバイオマーカー分析によって、前癌様および癌様病変のような結腸直腸病変に関して試験する有効かつ非侵襲的な方法を提供することによって、現在公知の構成の短所に取り組んで成功している。
【００７３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなると考えられる。しかし、本明細書の詳細な説明から、当業者に様々な変更および改変が明らかとなると考えられるが、それらも本発明の趣旨および範囲に含まれることから、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、説明のために限って与えられると理解すべきである。
【００７４】
詳細な説明
（A）概要
1つの局面において、本発明は、1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する、または1つもしくは複数のサブタイプの結腸直腸病変を有するとして試験対象を分類するため選択されたバイオマーカーの1つまたは複数の産物レベルに対応するデータに適用することができる公式／分類子を作製する方法を開示する。同様に、その産物レベルが、1つもしくは複数の結腸直腸病変または1つもしくは複数のサブタイプの結腸直腸病変に関して対象を試験するために有用であるバイオマーカーも開示される。同様に、1つまたは複数の結腸直腸病変に関して対象を試験するためにバイオマーカーの産物レベルを表すデータに公式を適用するための説明書を含む、コンピュータ可読媒体も開示される。同様に、公式をバイオマーカー産物データに適用することによって、1つまたは複数の結腸直腸病変を試験対象が有する確率の指標をユーザーに提供するための指示によって形成されたコンピュータシステムが開示される。
【００７５】
本発明は、バイオマーカー産物の定量を可能にするためにRNAバイオマーカー産物と特異的にハイブリダイズすることができるバイオマーカー産物リガンドを提供する。バイオマーカー産物リガンドは、当業者に公知の様々な方法の任意の1つにおいて、直接的および／または間接的な定量を可能にする。バイオマーカーRNA産物またはそこから誘導されたポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができるバイオマーカー産物リガンドは、様々な組成物の任意の1つを有してもよい。例えば、バイオマーカーRNA産物のようなバイオマーカー産物の特異的リガンドは、ポリヌクレオチド（例えば、RNA産物またはそこから誘導されるポリヌクレオチドの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチド）、またはポリペプチド（例えば、RNA産物またはそこから誘導されるポリヌクレオチドの少なくとも一部に対して特異的な抗体またはアフィニティ選択ポリペプチド）であってもよい。1つの態様において、バイオマーカーRNA産物および／またはポリヌクレオチド産物を定量するために特異的および／または選択的にハイブリダイズすることができるプローブである、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドリガンドが開示される。そのようなプローブには、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）のような技術において有用なプローブが含まれ、例えばSYBR（登録商標）グリーンと共に、またはTaqMan（登録商標）もしくは分子ビーコン技術を用いてもよい。1つの態様においては、試験対象から単離または誘導された、バイオマーカーRNA産物またはそこから誘導されるポリヌクレオチドのレベルを測定するためにアレイにスポットされうる核酸プローブとして有用であるポリヌクレオチドである。もう1つの態様において、RNA産物の発現を測定において用いるためのアレイが企図される。
【００７６】
もう1つの態様において、バイオマーカーRNA産物および／またはバイオマーカーRNA産物に対応するポリヌクレオチドを特異的に増幅することができるバイオマーカー特異的プライマーセットであるポリヌクレオチドリガンドが開示される。
【００７７】
さらに、1つまたは複数の結腸直腸病変を処置または予防するための治療物質をスクリーニングするために同定されたバイオマーカーの産物をスクリーニングする方法が開示される。
【００７８】
同定されたバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせの産物の遺伝子発現差異を検出およびモニターするために用いることができるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドリガンドのキットも同様に、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標を可能にするためにコンピュータ可読媒体が含まれるキットと同様に提供される。1つまたは複数の結腸直腸病変に関して試験するための公式を作製する方法も同様に提供される。
【００７９】
1つまたは複数の結腸直腸病変を処置または予防するための治療標的をスクリーニングするためのバイオマーカー産物レベルの測定／モニタリングもさらに開示される。1つまたは複数の結腸直腸病変に関して試験対象を試験するための公式を作製する方法も同様に提供される。
【００８０】
同様に分類子を作製することによってバイオマーカーの組み合わせを試験する方法も開示される。分類子は、1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する、または1つもしくは複数のそのサブタイプを有する対象、および1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない対象を含む参照集団を超えてバイオマーカーのRNAおよび／またはタンパク質産物の発現レベルを表すデータに、1つまたは複数の数学的モデルを適用することによって作製される。分類子は、1つまたは複数の結腸病変サブタイプを有する確率に関して対象を試験するために有用である公式を作製するために、単独で、または組み合わせて用いることができる。同様に、曲線下面積（AUC）、感度および／または特異度に基づいて分類子をさらに選択する方法も開示される。1つまたは複数の選択された分類子を用いて公式を作製して、次に、公式に含めるための分類子を選択することができる。分類子は、試料におけるバイオマーカーの1つまたは複数のRNA産物および／または1つまたは複数のタンパク質産物レベルを測定すること、および数学的モデルに入力するために該測定に起因するデータを用いることによって生成される。公式を作製するためにデータを生成するのに用いられる同じ方法が、診断目的で公式に含めるために試験対象からのデータを作成するのに用いられる方法である必要はないことに注意されたい。
【００８１】
本発明の他の局面は本明細書において開示される。
【００８２】
（B）定義
本発明の実施は、特に明記していなければ当業者に周知である分子生物学、微生物学の技術、および組み換えDNA技術を用いると考えられる。そのような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Harnes & S.J. Higgins, eds., 1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984)；およびa series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Short Protocols In Molecular Biology, (Ausubel et al., ed., 1995)を参照されたい。本明細書において上記のおよび下記の、本明細書において言及した全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８３】
以下の書面での説明において用いられる特定の用語に関して、以下の定義が提供される。
【００８４】
本明細書において用いられるように、「5'末端」は、mRNAの第一のヌクレオチドから始まるmRNAの最初の1000ヌクレオチドまたは1/3までのmRNAの末端を指す（mRNAの完全長にはポリAテールは含まれない）。遺伝子の「5'領域」は、遺伝子の5'末端に存在するポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖）を指し、これには存在する場合5'非翻訳領域、および遺伝子の5'タンパク質コード領域が含まれるがこれらに限定されるわけではない。5'領域は長さが8ヌクレオチドまたはそれ以上でありかつ長さが1000ヌクレオチドまたはそれ以下である。5'領域の他の可能性がある長さには、10、20、25、50、100、200、400、および500ヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００８５】
本明細書において用いられるように、「3'末端」は、mRNAの最後の1000ヌクレオチドまたは1/3までのmRNAの末端を指し、3'末端ヌクレオチドは、存在する場合ポリ-Aテールに隣接するコード領域または非翻訳領域のその末端ヌクレオチドである。すなわち、mRNAの3'末端には、存在する場合ポリ-Aテールが含まれない。遺伝子の「3'領域」は、遺伝子の3'末端内にまたは3'末端に存在するポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖）を指し、存在する場合遺伝子の3'非翻訳領域、および3'タンパク質コード領域が含まれるがこれらに限定されるわけではない。3'領域は長さが8ヌクレオチドまたはそれ以上でありかつ長さが1000ヌクレオチドまたはそれ以下である。3'領域の他の可能性がある長さには、10、20、25、50、100、200、400、および500ヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において用いられるように、遺伝子の「内部コード領域」は、本明細書において定義される遺伝子の5'領域と3'領域のあいだに存在するポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖）を指す。「内部コード領域」は、長さが8ヌクレオチドまたはそれ以上であり、かつ長さが1000ヌクレオチドまたはそれ以下である。「内部コード領域」のその他の可能性がある長さには、10、20、25、50、100、200、400、および500ヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されるわけではない。5'、3'および内部コード領域は重なり合わず、隣接していてもよいが必須ではなく、対応する遺伝子の完全長までであってもよいが必須ではない。
【００８６】
本明細書において用いられるように、ポリペプチドの「アミノ末端」領域は、mRNA分子の5'末端内または5'末端に存在するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるポリペプチド配列を指す。本明細書において用いられるように、「アミノ末端」領域は、ポリペプチドの最初のアミノ酸から開始してポリペプチドの最初のアミノ酸300個または1/3までのポリペプチドのアミノ末端を指す。ポリペプチドの「アミノ末端領域」は、長さが3アミノ酸またはそれ以上であり、かつ長さが350アミノ酸またはそれ以下である。ポリペプチドの「アミノ末端」領域の他の可能性がある長さには、5、10、20、25、50、100、および200アミノ酸が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００８７】
本明細書において用いられるように、ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域は、mRNA分子の3'末端内または3'末端に存在するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるポリペプチド配列を指す。本明細書において用いられるように、「カルボキシ末端」領域は、ポリペプチドの最後のアミノ酸から開始してポリペプチドのアミノ酸300個または1/3までのポリペプチドのカルボキシ末端を指す。「3'末端」には、存在する場合ポリAテールは含まれない。ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域は、長さが3アミノ酸またはそれ以上であり、かつ長さが350アミノ酸またはそれ以下である。ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域の他の可能性がある長さには、5、10、20、25、50、100、および200アミノ酸が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００８８】
本明細書において用いられるように、ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」は、本明細書において定義されるように、ポリペプチドのアミノ末端領域とカルボキシ末端領域のあいだに存在するポリペプチド配列を指す。ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」は、長さが3アミノ酸またはそれ以上であり、かつ長さが350アミノ酸またはそれ以下である。ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」の他の可能性がある長さには、5、10、20、25、50、100、および200アミノ酸が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ポリペプチドのアミノ末端、カルボキシ末端、および内部ポリペプチド領域は重なり合わず、隣接していてもよいが必須ではなく、対応する遺伝子の完全長までであってもよいが必須ではない。
【００８９】
本明細書において用いられるように、「増幅された」という用語は、核酸配列に適用される場合、特定の核酸配列の1つまたは複数のコピーが、いくつかの態様においてポリメラーゼ連鎖反応法（Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155:335）によって鋳型核酸から生成されるプロセスを指す。「ポリメラーゼ連鎖反応」すなわち「PCR」は、特異的鋳型核酸配列を増幅するための方法を指す。いくつかの態様において、PCR反応は、反復する温度サイクルのシリーズを伴い、典型的に容積50〜100μlにおいて行われる。PCR反応において行われるサイクル数には、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60サイクルが含まれうる。反応混合物は、dNTP（4つのデオキシヌクレオチドdATP、dCTP、dGTP、およびdTTPのそれぞれ）、プライマー、緩衝液、DNAポリメラーゼ、および核酸鋳型を含む。PCR反応は、第一のプライマーが核酸鋳型配列の1つの鎖における領域と相補的な配列を含み、相補鎖の合成をプライミングし、第二のプライマーが標的核酸配列の第二の鎖における領域と相補的な配列を含み、相補鎖の合成をプライミングする、ポリヌクレオチドプライマーセットを提供する段階、および（i）鋳型配列内に含まれる標的核酸配列に増幅のために必要なプライマーをアニールする段階、（ii）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成する、プライマーを伸長させる段階、のPCRサイクル段階を許容する条件で鋳型依存的重合化物質として核酸ポリメラーゼを用いて核酸鋳型配列を増幅する段階を含みうる。「ポリヌクレオチドプライマーセット」、「PCRプライマーセット」、または「プライマーセット」は、2、3、4個またはそれより多いプライマーを含みうる。いくつかの態様において、第一のサブセットのプライマーを利用して1つの産物を増幅し、次にそのより小さいバージョンを増幅するために第一のサブセットのプライマー産物にハイブリダイズする第二のサブセットのプライマーを用いるプライマーセットを用いて、ネステッドPCRが起こりうる。1つの態様において、エキソ-Pfu DNAポリメラーゼを用いてPCR反応における核酸鋳型を増幅する。他の増幅法には、リガーゼ連鎖反応（LCR）、ポリヌクレオチド特異的に基づく増幅（NSBA）、または当技術分野で公知の他の任意の方法が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００９０】
1つの局面において、「アレイ」には、発現されたゲノムDNAの領域に全体としてまたは部分的に、および／または連続的にまたは不連続に対応するオリゴヌクレオチドおよび／またはcDNA（例えばEST）のような特異的なセットのプローブが含まれ、プローブは支持体に局在する。1つの態様において、プローブは本発明のバイオマーカーRNA産物の内部コード領域の5'末端または3'末端に対応しうる。当然、1つの遺伝子の5'末端の混合物を、同じまたは類似のバイオマーカーRNA産物レベル測定を得るために、もう1つの遺伝子の3'末端と組み合わせて標的またはプローブとして用いてもよい。
【００９１】
本明細書において用いられるように、参照タンパク質様物質の「類似体」には、参照タンパク質様物質と類似または同一の機能を保有するが、参照タンパク質様物質と類似または同一のアミノ酸配列を含まず、かつ／または参照タンパク質様物質と類似または同一の構造を保有しない任意のタンパク質様物質が含まれる。第二のタンパク質様物質と類似のアミノ酸配列を有するタンパク質様物質は以下の少なくとも1つである：（a）第二のタンパク質様物質のアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質様物質；（b）セグメントが長さ少なくとも5隣接アミノ酸残基、少なくとも10隣接アミノ酸残基、少なくとも15隣接アミノ酸残基、少なくとも20隣接アミノ酸残基、少なくとも25隣接アミノ酸残基、少なくとも40隣接アミノ酸残基、少なくとも50隣接アミノ酸残基、少なくとも60隣接アミノ酸残基、少なくとも70隣接アミノ酸残基、少なくとも80隣接アミノ酸残基、少なくとも90隣接アミノ酸残基、少なくとも100隣接アミノ酸残基、少なくとも125隣接アミノ酸残基、または少なくとも150隣接アミノ酸残基を有する、第二のタンパク質様物質をコードするヌクレオチド配列の少なくともセグメントに、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質様物質；および（c）第二のタンパク質様物質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質様物質。第二のタンパク質様物質と類似の構造を有するタンパク質様物質は、第二のタンパク質様物質と類似の二次、三次、または四次構造を有するタンパク質様物質を指す。タンパク質様物質の構造は、ペプチドシークエンシング、X線結晶学、核磁気共鳴、円偏光二色性、および結晶学電子顕微鏡検査が含まれるがこれらに限定されるわけではない当業者に公知の方法によって決定されうる。
【００９２】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の％同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第一のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸またはヌクレオチドの位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が、第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である。2つの配列間の％同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の重なり合う位置の数／位置の総数×100％）。1つの態様において、2つの配列は同じ長さである。
【００９３】
2つの配列間の％同一性の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。2つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877において改変されたKarlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のNBLAST、およびXBLASTプログラムに組み入れられている。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、例えばスコア＝100、ワード長＝12のNBLASTヌクレオチドプログラムパラメータセットによって行うことができる。BLASTタンパク質検索は本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、例えばスコア-50、ワード長＝3のXBLASTプログラムパラメータセットによって行うことができる。比較目的のためにギャップを導入したアラインメントを得るために、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402において記述されるようにGapped BLASTを利用することができる。またはPSI-BLASTを用いて分子間の遠縁関係を検出する繰り返し検索を行うことができる（同書）。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを用いることができる（例えば、NCBIのウェブサイトを参照されたい）。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムのもう1つの好ましい非制限的な例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重み付き残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いることができる。
【００９４】
2つの配列間の％同一性は、ギャップを許容するか、または許容せずに、先に記述される技術と類似の技術を用いて決定することができる。％同一性の計算にあたって、典型的に正確なマッチのみを計数する。
【００９５】
本明細書において用いられるように、非タンパク質様分子の文脈における「類似体」という用語は、第一の有機または無機分子と類似または同一の機能を保有し、第一の有機分子または無機分子と構造的に類似である第二の有機または無機分子を指す。「類似体」という用語には、そのコア構造が第一の分子のコア構造と同じであるかまたは厳密に類似しているが、化学または物理的改変を有する分子が含まれる。「類似体」という用語には、他の原子または分子に連結することができる第一の分子のコポリマーが含まれる。「生物活性類似体」という用語と「類似体」とは本明細書において、第一の有機または無機分子の実質的に同じアゴニストまたはアンタゴニスト効果を示す有機または無機分子を含めるように互換的に用いられる。
【００９６】
本明細書において用いられるように、「ヌクレオチド類似体」は、五炭糖および／またはリン酸エステルの1つまたは複数が、そのそれぞれの類似体に置換されているヌクレオチドを指す。例としてのリン酸エステル類似体には、存在する場合には任意の関連する対イオンを含む、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェート等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。DNA/RNAリン酸エステルおよび／または糖リン酸エステル骨格が異なるタイプの連結によって置換されているポリヌクレオチド類似体に重合化されうるヌクレオベース単量体も同様に、「ヌクレオチド類似体」の定義に含まれる。ヌクレオベース部分が非通常である、すなわちG、A、T、U、またはCの1つとは異なるヌクレオチドも、さらに「ヌクレオチド類似体」に含まれる。一般的に、非通常ヌクレオベースは、隣接する反対方向のポリヌクレオチド鎖上に存在する少なくとも1つのヌクレオベース部分と水素結合形成能を有する、または非相互作用非干渉塩基を提供すると考えられる。
【００９７】
「抗体」という用語はまた、抗体の抗原結合断片を含む。本明細書において用いられるように、抗体の「抗原結合断片」（または単純に「抗体の一部」、または「断片」）という用語は、本発明のバイオマーカーの遺伝子の1つによってコードされるポリペプチドに対して特異的結合能を保持する完全長の抗体の1つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合断片」という用語に含まれる結合断片の例には、（i）VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価の断片であるFab断片；（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片であるF(ab')2断片；（iii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の1つの腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片；（v）VHドメインからなるdAb断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；および（vi）単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VLおよびVHは異なる遺伝子によってコードされるが、それらを組み換え法を用いて、VLおよびVH領域が対を形成して一価の分子（一本鎖Fv（scFv）として知られる；例えばBird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）を形成する1つのタンパク質鎖としてそれらを作製可能にする合成リンカーによって接合することができる。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合断片」という用語に含まれると意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の通常の技術を用いて得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。いくつかの態様において、抗体は単一特異的、例えばモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。「単一特異的抗体」という用語は、特定の標的、例えばエピトープに対して1つの結合特異性および親和性を示す抗体を指す。この用語には、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」が含まれ、これらは本明細書において用いられるように、1つの分子組成物の抗体またはその断片の調製物を指す。
【００９８】
本明細書において用いられるように、アレイに関連して「付着する」および「スポットする」という用語には、核酸またはタンパク質アレイを形成するために基質上に核酸またはタンパク質様物質を沈着または局在させるプロセスが含まれうる。1つの態様において、スポットされる基質は、共有結合、水素結合、またはイオン相互作用によってアレイ上に付着または局在する。
【００９９】
本明細書において用いられるように、「バイオマーカー」という用語は、その産物が測定され、疾患に相関されうる遺伝子を指す。バイオマーカーは、病変を有する対象および病変を有しない対象から単離されたおよび／またはそれに由来する対応する試料における、測定可能に異なるレベルで存在する１つまたは産物（例えば、非スプライシングRNA、mRNA、および／またはポリペプチド）をコードする遺伝子を指す。バイオマーカーは、RNA産物に転写されるDNA分子であってもよい。または、バイオマーカーはタンパク質産物に翻訳される、またはDNA産物に逆転写されるRNA分子であってもよい。
【０１００】
本明細書において用いられるように、「血液核酸試料」または「血液ポリヌクレオチド試料」は、血液に由来するポリヌクレオチドを指し、これには全血、血清低減全血、溶解血液（赤血球除去血液）、遠心溶解血液（血清除去赤血球除去血液）、血清除去全血または末梢血白血球（PBLs）、血液からのグロビン低減RNA、または当業者によって理解される血液の任意の可能性がある分画から単離されるおよび／またはそれに由来するポリヌクレオチドが含まれうる。血液ポリヌクレオチド試料は、RNA、mRNA、またはmRNAに対応する核酸、例えば試料から単離されたRNAに由来するcDNAもしくはESTを指しうる。血液ポリヌクレオチド試料にはまた、RNA、mRNA、またはcDNAに由来するPCR産物が含まれうる。
【０１０１】
本明細書において用いられるように、「公式」という用語には、1つまたは複数の分類子、または分類子の組み合わせが含まれ、分類子という用語は数学的モデルの出力を記述するために用いられる。
【０１０２】
本明細書において用いられるように、「結腸直腸病変」という用語は、直腸および／または結腸の病変の1つまたは複数のタイプまたはサブタイプのいかなるものも含む。「結腸直腸病変」には、前癌様ポリープ、癌様ポリープ、癌様となるリスクを有するポリープ、未知の癌関連状態のポリープが含まれる。理解されるように、いくつかの場合において、本発明の態様に従う対象は、そのそれぞれが同じまたは異なるタイプまたはサブタイプのポリープである1つまたは複数の結腸直腸病変をいずれかの時期に有しうる。結腸直腸病変は、例えば当技術分野において公知の様々な方法の任意の1つにおいて分類されてもよい。1つの態様において、「ポリープ」または「結腸直腸ポリープ」には、当技術分野において理解されるように、細胞および／もしくは組織の異常な成長、ならびに／または結腸もしくは直腸に突出する可能性がある細胞および／もしくは組織の成長が含まれる。ポリープはさらに、当業者によって理解されるように、ポリープの形態；癌様ポリープに発展するポリープのリスク等を含む様々な要因に従って定義されうる。1つの態様において、ポリープは、以下を含む様々なサブタイプに分類することができる：過形成；管状腺腫；絨毛性線腫；管状絨毛性線腫；過形成；高度異形成および癌。任意の1つの個体および／またはポリープに関して、1つまたは複数のポリープサブタイプの記述を適用することができる。もう1つの態様において、（7）結腸直腸癌も同様に様々なカテゴリーに細分類することができる。なおもう1つの態様において、記載のサブタイプの1つまたは複数を、様々なパラメータの任意の1つに従って1つのカテゴリーにひとまとめにすることができる。または、記載のサブタイプの1つまたは複数を、様々なパラメータの任意の1つに従ってさらに細分類することができる。なおもう1つの態様において、記載のサブタイプの1つまたは複数を様々なパラメータの任意の1つに従って1つのカテゴリーにひとまとめにすることができる。または、記載のサブタイプの1つまたは複数を様々なパラメータの任意の1つに従ってさらに細分類することができる。例えば、1つの態様において、管状腺腫ポリープは、腺腫ポリープの直径に従ってさらに分類することができる。例えば直径がl mm、2 mm、3 mm、4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm、10 mm、11 mm、12 mm、13 mm、14 mmまたは15 mmより大きい腺腫ポリープが起こりうる。なおもう1つの例において、結腸直腸癌は、理解されるように疾患の進行に従ってさらに細分類することができる。例えば、結腸直腸癌は、デュークまたは改変デューク分類を用いて細分類することができる。改変デューク分類は結腸直腸癌を異なる4つの進行期A〜Dに分類する。A期は、結腸および／または腸管の粘膜に浸潤するがそれ以上は浸潤しない腫瘍を示す。B1期は、結腸および／または腸壁の固有筋層（筋層）に浸潤するが、その中までは浸潤しない腫瘍を示す。B2期は、結腸および／または腸壁の固有筋層の中まで浸潤する腫瘍を示す。C1期腫瘍は、結腸および／または腸壁の固有筋層に浸潤するが、その中までは浸潤せず、リンパ節における結腸直腸癌の病変的証拠が認められる。C2期腫瘍は、腸壁の固有筋層の中まで浸潤し、リンパ節に結腸直腸癌の病変的証拠が認められる。最後にD期は、リンパ節を超えて他の臓器に腫瘍が広がっていることを示す。なおもう1つの態様において、結腸直腸癌はTNM分類を用いて細分類することができる。TNM分類に従って、I期〜IV期までの4つの進行期が存在し、それぞれは腫瘍、節、および転移に関する状態を反映する：腫瘍は以下のように細分される；T1：腫瘍は粘膜下に浸潤する、T2：腫瘍は固有筋層に浸潤する、T3：腫瘍は固有筋層を通過して漿膜下組織、または結腸周囲もしくは直腸周囲組織に浸潤する、およびT4：腫瘍は他の臓器または構造に直接浸潤する、および／または穿孔する。節は以下のように細分される；N0は限局的なリンパ節転移がないことを示す。N1は、局所リンパ節1〜3個における転移を示す。N2は4個またはそれより多い局所リンパ節における転移を示す。転移は以下のように分類される；M0は遠隔転移が存在しないことを示し、M1は遠隔転移が存在することを示す。このように、TNM分類に従うI期の場合、腫瘍はT1N0M0またはT2N0M0のように分類することができ；癌は広がり始めているがまだ内層に留まっている。II期はT3N0M0またはT4N0M0であり、癌は結腸または直腸近傍の他の組織に広がっているが、まだ内層に達していない。III期には全てのT、N1〜2、およびM0が含まれ、癌はリンパ節に広がっているが体の遠位部分まで運ばれていない。IV期には、任意のT、任意のNおよびM1が含まれ、癌は転移して他の臓器、おそらく肺または肝臓に運ばれている。
【０１０３】
本明細書において用いられるように、「高リスクポリープ」という用語は、当業者によって理解されるように、癌を発症するリスクがより高いまたは既に癌様であると考えられるサブタイプのポリープを示し、これには、癌になる傾向があるポリープまたは癌の素因となるポリープおよび癌様ポリープが含まれ、「低リスクポリープ」には、他の全てのタイプのポリープが含まれる。例えば、結腸直腸癌の70〜90％は、腺腫様ポリープから生じ、このように高リスクポリープと見なされる。腺腫様ポリープはさらに、以下を含むサブタイプに分類されうる：約4％の悪性疾患の可能性を有することが示唆されている管状腺腫；約16％の悪性疾患の可能性を有することが示唆されている管状絨毛性線腫；および約21％の悪性疾患の可能性を有することが示唆されている絨毛性線腫。さらに、高度異形成は悪性能を増加させた。1つの態様において、「高リスクポリープ」であるポリープは管状絨毛性線腫、絨毛性線腫、高度異形成、および管状腺腫であり、同様に癌様であって局在するポリープおよび末梢血において既に播種されているポリープを含む癌様であるポリープが含まれる。この態様において、「低リスクポリープ」には、任意の他のポリープ形態が含まれる。もう1つの態様において、「高リスクポリープ」であるポリープは、管状絨毛性線腫、絨毛性線腫、高度異形成および管状腺腫であって、既に癌様であるポリープは含まれない。ポリープの大きさもまた癌に発達するリスクと相関する。例えば、直径10 mmより大きいポリープは大きいポリープであると考えられ、悪性疾患に対するより大きい可能性を有する。直径2 cmより大きいポリープは悪性になる可能性50％を有する。Zauber (2004) Gastroenterology; 126(5): 1474を参照されたい。もう1つの態様において、「高リスクポリープ」は、管状絨毛性線腫、絨毛性線腫、高度異形成、および管状腺腫を含み、管状腺腫ポリープの直径は10 mmより大きく、残りのポリープ形態は「低リスクポリープ」であると見なされる。
【０１０４】
本明細書において用いられるように、「化合物」および「作用物質」という用語は互換的に用いられる。
【０１０５】
本明細書において用いられるように、「対照」または「対照試料」という用語には、１つもしくは複数のポリープを有する、または１つもしくは複数のサブタイプのポリープを有することを含む、1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する、結腸直腸病変を有しない、ポリープを有しない、または１つもしくは複数のサブタイプのポリープを有しないと診断されている対象または対象の群から単離されたおよび／またはそれに由来する1つまたは複数の試料が含まれうる。対照または対照試料という用語はまた、1人または複数の対象の1つまたは複数の試料に由来するデータの集合も指しうる。
【０１０６】
DNAに関する「コード領域」は、RNAをコードするDNAを指す。
【０１０７】
RNAに関する「コード領域」は、タンパク質をコードするRNAを指す。
【０１０８】
本明細書において用いられるように、1つまたは複数のバイオマーカーに関連する「データ」という用語、または「バイオマーカーデータ」という用語は一般的に、試料におけるバイオマーカーの産物の絶対的および／または相対的な量（レベル）を反映するデータを指す。本明細書において用いられるように、1つまたは複数のバイオマーカーに関連して「データセット」という用語は、対象の参照集団におけるバイオマーカーのパネルの1つまたは複数のバイオマーカー産物のそれぞれのレベルを表すデータセットを指す。データセットは、本発明の公式／分類子を生成するために用いることができる。1つの態様に従って、データセットは、参照集団の各個体に関するパネルのそれぞれのバイオマーカー産物に関するデータを含む必要はない。例えば、公式に適用されるデータセットの状況において用いる場合の「データセット」は、1つまたは複数の参照集団における各個体のそれぞれのバイオマーカーの産物レベルを表すデータ指しうるが、理解されるように、同様に1つまたは複数の参照集団のそれぞれにおける個体の99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、またはそれ未満に関するそれぞれのバイオマーカー産物レベルを表すデータを指すことができ、なお公式に適用するための目的にとって有用でありうる。
【０１０９】
本明細書において用いられるように、タンパク質様物質（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および抗体）の文脈における「誘導体」という用語は、アミノ酸残基置換、欠失、および／または付加の導入によって変更されているアミノ酸配列を含むタンパク質様物質を指す。本明細書において用いられるように、「誘導体」という用語はまた、すなわちタンパク質様物質に対する任意のタイプの分子の共有結合により改変されているタンパク質様物質を指す。例えば、抗体は、例えばグリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質溶解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質に対する連結等によって改変されてもよい。タンパク質様物質の誘導体は、化学的切断、アセチル化、ホルミル化、チュニカマイシンの代謝的合成等が含まれるがこれらに限定されるわけではない当業者に公知の技術を用いて化学改変によって産生されてもよい。さらに、タンパク質様物質の誘導体は1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含んでもよい。タンパク質様物質の誘導体は、それが由来するタンパク質様物質と類似または同一の機能を保有する。
【０１１０】
本明細書において用いられるように、非タンパク質様誘導体の文脈における「誘導体」という用語は、第一の有機または無機分子の構造に基づいて形成された第二の有機または無機分子を指す。有機分子の誘導体には、例えばヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシル、またはアミン基の付加または欠失によって改変された分子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。有機分子はまた、エステル化、アルキル化、および／またはリン酸化されてもよい。
【０１１１】
本明細書において用いられるように、結腸直腸病変に関連して「試験する」、「診断」、および「スクリーニング」という用語は、試験対象が1つまたは複数の病変を有する可能性（確率）を決定するプロセスを指し、これには本発明の1つまたは複数の局面によって含まれる試験法と共に従来の医学的な診断技術の双方が含まれる。結腸直腸病変を試験するための従来の医学的診断技術には、身体検査および病歴、内科評価、ならびにFOBT、S字結腸鏡検査、および結腸鏡検査が含まれうる適当な臨床検査が含まれる。1つの態様において、「結腸直腸病変の診断」は、2つの選択肢のあいだの決定を指す：例えば（i）個体が、結腸直腸病変を有する、1つもしくは複数のサブタイプの結腸直腸病変を有する、または1つもしくは複数のポリープを有する、および（ii）個体が、結腸直腸病変を有しない、1つもしくは複数のポリープを有しない、または1つもしくは複数のサブタイプのポリープを有しない。もう1つの態様において、診断には、個体が結腸直腸病変を有するとして特徴づけることができるか否かに関して十分な程度の確実性で決定することができないという選択肢が含まれうる。1つの状況において、「十分な程度の確実性」は、制限の結果として、試験が不確定であることを示唆する範囲内に結果が入る場合の技術、装置、または測定における制限のようないかなる制限も考慮に入れる。試験が不確定であることを示唆する範囲は、用いられる装置、試薬、および技術の特定の制限に依存すると考えられる。もう1つの状況において、「十分な程度の確実性」は、試験の感度および／または特異度に関する医学的必要条件に依存する。より具体的に、十分な程度の確実性には、50％より大きい感度および／または特異度、60％より大きい感度および／または特異度、70％より大きい感度および／または特異度、80％より大きい感度および／または特異度、90％より大きい感度および／または特異度、ならびに100％の感度および／または特異度が含まれる。
【０１１２】
本明細書において用いられるように、「正常」は、結腸直腸病変を有しない個体または個体の群を指す。いくつかの態様において、結腸直腸病変を有しない個体または個体の群の診断は、通常の診断法を用いて決定される。いくつかの態様において、個体または個体群はいかなる他の疾患も診断されていない。本発明に従って「正常」はまた、正常な個体から単離された試料を指し、これには正常な個体から単離された血液、全RNAまたはmRNAが含まれる。正常な個体から採取された試料には、試料が採取された時期で結腸直腸病変を有しない個体から採取された試料が含まれうる。
【０１１３】
本明細書において用いられるように、「発現差異」という用語は、1つまたは複数のバイオマーカーの産物の発現レベルにおける差を指す。例えば、「発現差異」という用語は、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する対象と有しない対象からの試料のあいだでの1つまたは複数のバイオマーカーのRNAレベルの差を指しうる。バイオマーカーRNA産物レベルの差は、「発現差異」の量またはレベルを直接または間接的に測定することによって決定することができ、同様に試料または参照集団のあいだで本発明のバイオマーカーがコードするタンパク質の異なるレベルが含まれうる。「発現差異」は、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する、または有しない参照対象／集団のあいだでの1つまたは複数のバイオマーカー産物レベルの比として決定することができ、比は1.0に等しくない。集団のあいだの発現差異はp-値の関数として統計学的に有意であると決定することができる。統計学的有意性を決定するためにp-値を用いる場合、バイオマーカー、p-値は好ましくは0.2未満である。もう1つの態様において、バイオマーカーは、p-値が0.15、0.1、0.05、0.01、0.005、0.0001未満等である場合に差異的に発現されていると同定される。比に基づいて発現差異を決定する場合、第二の試料と比較した場合に第一の試料における発現レベルの比が1.0より大きいまたは1.0未満である場合に、バイオマーカー産物は差異的に発現されている。例えば、1.0より大きい比には、例えば1.1、1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20等より大きい比が含まれる。1.0未満の比には、例えば0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05等未満の比が含まれる。本発明のもう1つの態様において、バイオマーカー産物は、第二の集団の発現レベルの平均値と比較した第一の集団の発現レベルの平均値の比が1.0より大きいまたはそれ未満である場合に差異的に発現される。例えば、1.0より大きい比には、1.1、1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20等より大きい比が含まれ、1.0未満の比には、例えば0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05等未満の比が含まれる。本発明のもう1つの態様において、バイオマーカー産物は、第二の集団の平均値と比較した第一の試料における発現レベルの比が1.0より大きいまたはそれ未満である場合に差異的に発現され、これには1.1、1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20等より大きい比、または1未満の比、例えば0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05未満の比が含まれる。
【０１１４】
「差異的に増加した発現」または「上方制御」は、対照より少なくとも10％もしくはそれより高い、例えば20％、30％、40％、または50％、60％、70％、80％、90％高い、またはそれより高い、および／または1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍高いまたはそれより高いバイオマーカー産物レベルを指す。
【０１１５】
「差異的に減少した発現」または「下方制御」は、対照より少なくとも10％もしくはそれより多い、例えば20％、30％、40％、または50％、60％、70％、80％、90％低い、またはそれより低い、および／または0.9倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍またはそれより低いバイオマーカー産物レベルを指す。
【０１１６】
例えば、上方制御されたまたは下方制御された遺伝子には、正常な個体と比較して1つまたは複数の結腸直腸病変を有すると特徴づけられた個体から単離された血液中の産物（例えば、mRNAまたはタンパク質）の発現レベルの増加または減少を有する遺伝子がそれぞれ含まれる。もう1つの例において、上方制御または下方制御された遺伝子には、異なるタイプの結腸直腸病変または結腸直腸病変の集合を有する個体と比較して1つのタイプの結腸直腸病変または結腸直腸病変の集合をそれぞれ有する個体から単離された血液中の産物（例えば、mRNAまたはタンパク質）の発現レベルの増加または減少をそれぞれ有する遺伝子が含まれる。
【０１１７】
例えば、上方制御された遺伝子には、対照試料と比較して試験試料におけるバイオマーカー産物レベルの増加を有する遺伝子が含まれる。
【０１１８】
本明細書において用いられるように、「ハイブリダイゼーション差異」という用語は、ある形質を有しない第二の個体または複数の個体から単離されたおよび／またはそれに由来する核酸またはその誘導体の、相補的核酸標的に対するハイブリダイゼーションと比較して、該形質を有する第一の個体または複数の個体からの試料から単離されたおよび／またはそれに由来する核酸またはその誘導体の、相補的核酸標的に対するハイブリダイゼーションの定量的レベルの差を指す。「ハイブリダイゼーション差異」は、第二の試料と比較して第一の試料のハイブリダイゼーションレベルの比が1.0に等しくないことを意味する。例えば、第二の試料と比較した、標的に対する第一の試料のハイブリダイゼーションレベルの比は、1.1、1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20より大きい、または1未満、例えば0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05である。ハイブリダイゼーション差異はまた、ハイブリダイゼーションが1つの試料において検出可能であるがもう1つの試料では検出可能でない場合にも存在する。
【０１１９】
本明細書において用いられるように、「薬物有効性」という用語は、薬物の有効性を指す。「薬物有効性」は通常、薬物によって処置された、または処置されている患者の臨床反応によって測定される。薬物は、望ましい臨床結果を達成する場合、例えば本明細書に記述される1つまたは複数の結腸直腸病変を反映する遺伝子発現の変化および遺伝子発現パターンを達成する場合に、高い程度の有効性を有すると見なされる。吸収される薬物量を用いて、患者の反応を予測してもよい。一般的な規則は、薬物の用量を増加させると、最大の望ましい効果が達成されるまで患者においてより大きい効果が認められることである。最大点に達した後により多くの薬物を投与すると、通常、副作用が増加すると考えられる。
【０１２０】
本明細書において用いられるように、「有効量」という用語は、1つもしくは複数の結腸直腸病変の進行および／または重症度を低減もしくは予防するために；1つもしくは複数の結腸直腸病変の発症、発生の再発を防止するために；またはもう1つの治療の予防効果もしくは治療効果を増強もしくは改善するために、十分である化合物の量を指す。
【０１２１】
本明細書において用いられるように、タンパク質様物質の文脈における「断片」という用語は、もう1つのポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも5隣接アミノ酸残基、少なくとも10隣接アミノ酸残基、少なくとも15隣接アミノ酸残基、少なくとも20隣接アミノ酸残基、少なくとも25隣接アミノ酸残基、少なくとも40隣接アミノ酸残基、少なくとも50隣接アミノ酸残基、少なくとも60隣接アミノ酸残基、少なくとも70隣接アミノ酸残基、少なくとも80隣接アミノ酸残基、少なくとも90隣接アミノ酸残基、少なくとも100隣接アミノ酸残基、少なくとも125隣接アミノ酸残基、少なくとも150隣接アミノ酸残基、少なくとも175隣接アミノ酸残基、少なくとも200隣接アミノ酸残基、または少なくとも250隣接アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。特定の態様において、タンパク質またはポリペプチドの断片は、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持する。もう1つの態様において、タンパク質またはポリペプチドの断片は、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも2、3、4、または5つの機能を保持する。いくつかの態様において、抗体の断片は、抗原に対する免疫特異的結合能を保持する。
【０１２２】
本明細書において用いられるように、「融合タンパク質」という用語は、第一のタンパク質もしくはポリペプチド、またはその機能的断片、類似体、もしくは誘導体のアミノ酸配列、および異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（すなわち、第一のタンパク質、またはその断片、類似体、もしくは誘導体とは異なる第二のタンパク質、またはその断片、類似体、もしくは誘導体）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。１つの態様において、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに融合した予防または治療物質を含む。本態様に従って、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、異なるタイプの予防物質または治療物質であってもよく、そうでなくてもよい。
【０１２３】
本明細書において用いられるように、本発明の「遺伝子」には、血液において発現される遺伝子、血液および非血液組織において発現される遺伝子、血液において差異的に発現される遺伝子、非血液細胞において発現される遺伝子、造血起源の細胞ではない細胞において発現される遺伝子、リンパ球、顆粒球、白血球、好塩基球等を含む血液において見いだされる細胞の特異的サブタイプにおいて発現される遺伝子等が含まれうる。遺伝子は免疫応答遺伝子、または免疫応答に関係しない遺伝子でありうる。特に、免疫応答遺伝子は、外来抗原に対する細胞反応を制御する主要組織適合性抗原複合体における遺伝子である。本発明の遺伝子にはまた、末梢血に導入された外来抗原に反応して差異的に調節される遺伝子が含まれうる。
【０１２４】
本明細書において用いられるように、「遺伝子発現パターン」または「遺伝子発現プロフィール」は、本発明のバイオマーカーの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個、それより多く、または全てを含む本発明の2つまたはそれより多いバイオマーカーの発現レベルのパターンを示す。遺伝子発現パターンまたは遺伝子発現プロフィールは、任意の公知の技術を用いて本発明のバイオマーカーの産物の発現レベルの測定から決定することができる。例えば、本発明のバイオマーカーのRNA産物の発現を測定するための技術には、PCRに基づく方法（逆転写-PCR、PCR、QRT-PCRを含む）および非PCRに基づく方法と共にマイクロアレイ分析が含まれる。本発明のバイオマーカーのタンパク質産物レベルを測定するために、技術には、密度測定ウェスタンブロッティングおよびELISA分析が含まれる。
【０１２５】
本明細書において用いられるように、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸との配列特異的非共有結合相互作用、例えば標的核酸配列とアレイ上の核酸メンバーとの相互作用を指す。
【０１２６】
本明細書において用いられるように、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識されるヒト免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α（IgA1およびIgA2）、γ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子と共に、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」（約25 Kd、またはアミノ酸214個）は、NH2末端での可変領域遺伝子（アミノ酸約110個）およびCOOH-末端でのκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。完全長の免疫グロブリン「重鎖」（約50 Kdまたはアミノ酸446個）も同様に、可変領域遺伝子（アミノ酸約116個）および上記の定常領域遺伝子の1つ、例えばγ（アミノ酸約330個をコードする）によってコードされる。
【０１２７】
本明細書において用いられるように、治療的処置に関する場合の「併用して」という用語は、1つより多いタイプの治療法（例えば、1つより多い予防物質および／または治療物質）を用いることを指す。「併用して」という用語を用いることは、治療法（例えば、予防物質および／または治療物質）が対象に投与される順序を限定しない。第一の治療法（例えば、第一の予防物質または治療物質）は、第二の治療法（例えば、第二の予防物質または治療物質）を対象に投与する前（例えば、5分、15分、30分、45分、1 hour, 2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間前）、投与と同時、または投与後（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間後）に投与することができる。
【０１２８】
本明細書において用いられるように、「1つまたは複数の結腸直腸病変を示す」とは、対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する、または有しうる確率の決定を指す。1つの局面において、試験対象のバイオマーカー産物に対応するデータに公式を適用することによって、試験対象が、1つまたは複数の結腸直腸病変を有しない対象と比較して1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を決定することができる。もう1つの態様において、発現パターンが結腸直腸病変を有しない患者より、結腸直腸病変を有する患者においてよりしばしば有意に見いだされれば、発現パターンは、1つもしくは複数のポリープ、または1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変を示しうる（最小で70％、75％、80％、85％、90％、95％等の信頼レベルを設定する日常的な統計的方法を用いて決定されるように）。いくつかの態様において、疾患を示す発現パターンは、疾患を有する患者において少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、またはそれより多くにおいて見いだされ、疾患を有しない患者の10％未満、8％未満、5％未満、2.5％未満、または1％未満において見いだされる。「結腸直腸病変を示す」はまた、当業者によって理解されるように、クラス予測のための統計的アルゴリズムを用いて1つまたは複数の結腸直腸病変を有しない個体の対照発現パターンと比較して、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する個体の対照発現パターンによってより適切に類別する発現パターンを示すことができ、例えばSilicon Genetics（例えば、GeneSpring（商標））によって提供されるプログラムのような市販のプログラムを参照されたい。
【０１２９】
本明細書において用いられるように、核酸に関して用いる場合の「単離された」または「精製された」とは、天然に存在する配列がその正常な細胞（例えば、染色体）環境から切り離されている、または非天然環境において合成される（例えば、人工的に合成された）ことを意味する。このように、「単離された」または「精製された」配列は、無細胞溶液に存在してもよく、または異なる細胞環境に置かれてもよい。「精製された」という用語は、配列が存在する唯一のヌクレオチドであることを意味するわけではなく、それが天然に会合している非ヌクレオチド材料を本質的に含まず（約90〜95％純粋）、このように単離された染色体とは区別されることを意味する。
【０１３０】
本明細書において用いられるように、タンパク質様物質（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または抗体）の状況において「単離された」および「精製された」という用語は、細胞材料を実質的に含まない、かついくつかの態様においてそれが由来する細胞もしくは組織源からの異種タンパク質様物質（すなわち、混入タンパク質）を実質的に含まない、または化学合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質様物質を指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、そこから単離または組み換えにより産生される細胞の細胞成分からタンパク質様物質が分離されているタンパク質様物質の調製物が含まれる。このように、細胞材料を実質的に含まないタンパク質様物質には、異種タンパク質様物質（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または抗体；「混入タンパク質」とも呼ばれる）を約40％、30％、20％、10％、または5％（乾燥重量により）未満有するタンパク質様物質の調製物が含まれる。タンパク質様物質が組み換えにより産生される場合、同様にいくつかの態様において、これは培養培地を実質的に含まず、すなわち培養培地はタンパク質調製物の容積の約20％、10％、または5％未満を表す。タンパク質様物質が化学合成によって産生される場合、いくつかの態様において、これは化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわちタンパク質様物質は、タンパク質様物質の合成に関係する化学前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、タンパク質様物質のそのような調製物は、対象タンパク質様物質以外の化学前駆体または化合物を約30％、20％、10％、5％（乾燥重量により）未満有する。いくつかの態様において、本明細書において開示されるタンパク質様物質は単離される。
【０１３１】
本明細書において用いられるように、「単離されるおよび／または由来する」試料には、対象におけるその天然の環境から切り離されている試料が含まれ、同様にさらに改変または変更されている試料が含まれる。例えば、試料には、組織、リンパ液、体液、血液、RNA、タンパク質、mRNA、血清低減血液、赤血球低減血液、血清低減赤血球低減血液、溶解血液の非分画細胞、グロビン低減mRNA、cDNA、PCR産物等が含まれうる。
【０１３２】
本明細書において用いられるように、RNAに関する場合の「レベル」または「発現レベル」は、QRT-PCRのようなハイブリダイゼーションまたは測定によって決定されるように、所定の核酸の測定可能な量（絶対量または相対量のいずれか）を指し、これには、SYBR（登録商標）グリーンおよびTaqMan（登録商標）技術を用いることが含まれ、これは試料における遺伝子の産物量に直接比例して対応する。RNAに関する場合の発現レベルはまた、PCRのサイクル数が10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60サイクルに限定されるPCRによって決定した場合の所定の核酸の測定可能な量を指しうる。RNAに関する場合の発現レベルはまた、用いる全RNAの量が、100 ng；50 ng、25 ng；10 ng；5 ng；1.25 ng；0.05 ng；0.3 ng；0.l ng；0.09 ng；0.08 ng；0.07 ng；0.06 ng；または0.05ngであるQRT-PCRにおいて用いられる全RNA、またはcDNAの量と比較して決定された所定の核酸の測定可能な量を指しうる。核酸の発現レベルは、当技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。マイクロアレイ分析に関して、発現レベルは、当技術分野において周知の方法に従って1人または複数の個体から単離されたRNAに対応する核酸を用いるハイブリダイゼーション分析によって測定される。標識はRNAに取り込まれうる、またはハイブリダイゼーションをモニターするために理解されるもう1つの方法で用いられうる。用いる標識は、発光標識、酵素標識、放射活性標識、化学標識、または物理的標識でありうる。いくつかの態様において、標的および／またはプローブ核酸は蛍光分子によって標識される。好ましい蛍光標識には、フルオレセイン、アミノクマリン酢酸、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、テキサスレッド、シアニン3（Cy3）、およびシアニン5（Cy5）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。RNAに関する場合の発現レベルはまた、全RNAが10μg；5μg；2.5μg；2μg；1μg；0.5μg；0.1μg；0.05μg；0.01μg；0.005μg；0.001μg等であるマイクロアレイハイブリダイゼーションにおいて用いられる全RNAまたはcDNAの量と比較して決定された所定の核酸の測定可能な量を指しうる。
【０１３３】
本明細書において用いられるように、「リガンド」は、もう1つの分子に結合する分子である。「ポリヌクレオチドリガンド」は、バイオマーカーおよび／またはその誘導体の産物に特異的および／または選択的にハイブリダイズするリガンドである。ポリヌクレオチドリガンドは、バイオマーカーのRNAおよび／またはタンパク質産物に特異的および／または選択的にハイブリダイズすることができ、バイオマーカー産物レベルの測定を可能にする。ポリヌクレオチドリガンドは、オリゴヌクレオチド、cDNA、DNA、RNA、PCR産物、合成DNA、合成RNA、および／または改変ヌクレオチドの様々な任意の組み合わせが含まれるがこれらに限定されるわけではない任意の様々なタイプの分子であってもよい。
【０１３４】
本発明のリガンドにはまた、例えばRNA産物および／またはタンパク質産物のいずれかを含むバイオマーカー産物レベルの検出または測定を可能にする、バイオマーカー産物に特異的または選択的に結合する「ポリペプチドリガンド」が含まれうる。ポリペプチドリガンドには、足場ペプチド、直線状ペプチド、または環状ペプチドが含まれてもよい。好ましい態様において、ポリペプチドリガンドは抗体である。抗体はヒト抗体、キメラ抗体、組み換え型抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体でありうる。抗体は無傷の免疫グロブリン、例えばIgA、IgG、IgE、IgD、IgM、またはそのサブタイプでありうる。抗体は機能的部分（例えば生物学的機能または化学機能を有する化合物）に共役することができ、これは第二の異なるポリペプチド、治療薬、細胞傷害剤、検出可能部分、または支持体であってもよい。ポリペプチドリガンド、例えば本発明の抗体は、バイオマーカー遺伝子の1つによってコードされるポリペプチドと高い親和性および特異性で相互作用する。例えば、ポリペプチドリガンドは、バイオマーカー遺伝子の1つによってコードされるポリペプチドに、親和性定数少なくとも107 M-1、好ましくは少なくとも108 M-1、109M-1、または1010 M-1で結合する。ポリヌクレオチドリガンドとタンパク質リガンドは、開示のバイオマーカータンパク質産物レベルを測定するために、標準的な技術分野の知識に従って、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、タンパク質マイクロアレイ分析等のような技術を実施するために用いてもよい。
【０１３５】
「mRNA」は、遺伝子と相補的なRNAを意味する；mRNAには、タンパク質コード領域が含まれ、同様に5'末端および3'非翻訳領域（UTR）が含まれてもよい。
【０１３６】
本明細書において用いられるように、「大部分」という用語は、組成物の全メンバーの50％より多い（例えば、51％、60％、70％、80％、90％、または100％まで）ことを表す数を指す。アレイを参照する場合、「大部分」という用語は、アレイの固体基板に安定に会合している全核酸メンバーの50％より多い（例えば、51％、60％、70％、80％、90％、または100％まで）ことを意味する。
【０１３７】
1つもしくは複数の結腸直腸病変または1つもしくは複数のサブタイプの結腸直腸病変の処置は、本明細書において、疾患自身、疾患の症状および／または進行を妨げるための医学的援助を提供することであると定義される。処置にはまた、1つまたは複数の結腸直腸病変を除去する段階が含まれ、症状を軽減して、クオリティオブライフを改善するために役立つ待機的治療法が含まれる。処置にはまた、ポリープ形成を低減または防止する段階、ポリープの分化または形態の変化を低減または防止する段階が含まれ、同様に発生、再発、および発症が含まれうる。
【０１３８】
本明細書において用いられるように、「mRNAの完全性」は、組織試料または試料のいずれかからのmRNA抽出物の質を指す。1つの態様において、良好な完全性を有するmRNA抽出物は、当技術分野で周知の方法、例えばRNAのアガロースゲル電気泳動（例えば、Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology）によって調べた場合に分解していないように思われる。好ましくは、mRNA試料は、そこから抽出される試料の遺伝子発現レベルを真に表すために、良好な完全性（例えば、分解されるのは、mRNAの10％未満、いくつかの態様において5％未満、またはいくつかの態様において1％未満である）を有する。
【０１３９】
本明細書において用いられるように、「核酸」および「核酸分子」は「ポリヌクレオチド」という用語と互換的であり、一般的に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは非改変RNAもしくはDNA、改変RNAもしくはDNA、またはその任意の組み合わせであってもよい。「核酸」には、一本鎖および二本鎖核酸が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において用いられるように、「核酸」という用語には、1つまたは複数の改変塩基を含む、先に記述したようなDNAまたはRNAが含まれる。このように、安定性のためにまたは他の理由のために改変された骨格を有するDNAまたはRNAは、「核酸」である。本明細書において用いられる「核酸」という用語は、核酸のそのような化学的、酵素的、または代謝的改変型と共に、ウイルスおよび例えば単純な細胞および複雑な細胞を含む細胞の特徴であるDNAおよびRNAの化学形態を含む。「核酸」または「核酸配列」にはまた、一本鎖もしくは二本鎖のRNAもしくはDNAの領域、またはその任意の組み合わせが含まれてもよく、本発明のいくつかの態様に従う発現された配列タグ（ESTs）が含まれうる。ESTは、cDNAを作製するためにmRNAの領域を逆転写することによって作製された遺伝子の発現された配列の一部（すなわち、配列の「タグ」）である。
【０１４０】
本明細書において定義されるように、「核酸アレイ」は、核酸メンバーのそれぞれが特有の予め選択された支持体領域に局在する、支持体上に局在する複数の核酸（または「核酸メンバー」）を指す。1つの態様において、核酸メンバーは支持体表面に付着して、核酸メンバーはDNAである。もう1つの態様において、核酸メンバーは、cDNAおよび／またはオリゴヌクレオチドのいずれかである。もう1つの態様において、支持体上に局在する核酸メンバーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されるcDNAである。本明細書において用いられる「核酸」という用語は「ポリヌクレオチド」という用語と互換的である。もう1つの好ましい態様において、「核酸アレイ」は、サザンおよび／またはノーザンブロット技術において用いられる、ニトロセルロースまたは他の膜に付着した複数の特有の核酸を指す。
【０１４１】
本明細書において用いられる「アレイにハイブリダイゼーションするための核酸試料」は、相補的塩基対形成相互作用を含む非共有結合相互作用のセットを通して、相補的配列のアレイに結合した核酸に結合することができる試料から単離されたおよび／または試料に由来する核酸として定義される。アレイにハイブリダイゼーションするための核酸試料は、遺伝子またはその一部に対応する単離核酸配列、試料から単離された全RNAまたはmRNAのいずれかでありうる。1つの態様において、アレイにハイブリダイズするための核酸試料は血液核酸試料（全血、溶解血液、血清低減、赤血球低減血液、または末梢血白血球（PBLs）を含む）である。いくつかの態様においては、核酸試料は、ヒト血液からの、およびいくつかの態様においてRNAまたはmRNA抽出物からの、一本鎖または二本鎖のDNA、RNA、またはDNA-RNAハイブリッドである。
【０１４２】
本明細書において用いられるように、「アレイ上の核酸メンバー」または「核酸メンバー」には、アレイ上に固定されて、相補的塩基対形成相互作用を含む非共有結合相互作用のセットを通して相補的配列の核酸プローブまたは試料に結合することができる核酸が含まれる。本明細書において用いられるように、核酸メンバーまたは標的には、天然（すなわち、A、G、C、またはT）、または改変塩基（7-デアザグアノシン、イノシン等）が含まれてもよい。さらに、核酸における塩基は、ハイブリダイゼーションを妨害しない限り（すなわち、標準的なストリンジェントなまたは選択的なハイブリダイゼーション条件下で、核酸標的がなおもその相補的配列に特異的に結合する限り）ホスホジエステル結合以外の連結によって接合されてもよい。このように、核酸メンバーは、構成塩基がホスホジエステル連結よりむしろペプチド結合によって接合されるペプチド核酸であってもよい。1つの態様において、アレイに結合した「標的」配列の通常の核酸アレイは、ヒト全ゲノム、例えばAffymetrixチップを表すことができ、表1、表2、表11、もしくは表12に記載される遺伝子の1つもしくは複数からなるもしくはそれらを含むバイオマーカーもしくは単離バイオマーカー、または遺伝子プローブ（例えば、表4）を従来のアレイに適用する。もう1つの態様において、アレイに結合した配列は、本発明に従うバイオマーカーまたは単離バイオマーカーとなりえて、全細胞RNAがアレイに適用される。
【０１４３】
本明細書において用いられるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、2つまたはそれより多い、好ましくは3つより多いデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確な大きさは多くの要因に依存し、次にこれはオリゴヌクレオチドの最終的な機能および使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、長さが約8〜約1,000ヌクレオチドであってもよい。8〜100ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは本発明において有用であるが、好ましいオリゴヌクレオチドは長さが約8〜約15塩基、長さが約8〜約20塩基、長さが約8〜約25塩基、長さが約8〜約30塩基、長さが約8〜約40塩基、または長さが約8〜約50塩基の範囲である。
【０１４４】
本明細書において用いられるように、「患者」、「個体」、または「対象」は哺乳動物を指し、いくつかの態様においてヒトである。
【０１４５】
本明細書において用いられるように、「ペプチド」という用語は、長さがアミノ酸50個またはそれより短いポリペプチドを指す。
【０１４６】
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される塩」という句には、本発明の方法を用いて同定された化合物に存在する可能性がある酸性または塩基性基の塩が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本質的に塩基性である化合物は、様々な無機酸および有機酸と広範な塩を形成することができる。そのような塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するために用いることができる酸は、硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、およびパモン酸塩（すなわち、1,1'-メチレン-ビス-(2-ヒドロキシ-3-ナフトエート)）が含まれるがこれらに限定されるわけではない、非毒性の酸付加塩、すなわち薬学的に許容される陰イオンを含む塩を形成する酸である。アミノ部分が含まれる化合物は、上記で言及した酸のほかに様々なアミノ酸と薬学的に許容される塩を形成する可能性がある。本質的に酸性である化合物は、様々な薬理学的に許容される陽イオンと塩基性塩を形成することができる。そのような塩の例には、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、特にカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、リチウム、亜鉛、カリウム、および鉄塩が含まれる。
【０１４７】
本明細書において用いられるように、「ポリヌクレオチド」は、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、またはDNA-RNA二本鎖ハイブリッド等のような、長さが8ヌクレオチドより長い一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド」という用語には、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の化学的もしくは生化学的に改変された、非天然、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型であるリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、典型的にRNAもしくはDNAにおいて見いだされる可能性があるように、糖とホスフェート基、または改変もしくは置換された糖またはホスフェート基を含みうる。ポリヌクレオチドはメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような、改変ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。
【０１４８】
本明細書において用いられるように、RNA産物レベルの測定を可能にする、「バイオマーカーのRNA産物（「バイオマーカーRNA産物」）および／またはバイオマーカーRNA産物に対応するポリヌクレオチドに特異的および／または選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドリガンド」が開示される。
【０１４９】
ポリヌクレオチドリガンドは、オリゴヌクレオチド、cDNA、DNA、RNA、PCR産物、合成DNA、合成RNA、および／または改変ヌクレオチドの様々な任意の組み合わせが含まれるがこれらに限定されるわけではない、様々な任意のタイプの分子であってもよい。
【０１５０】
本明細書において用いられるように、「タンパク質様物質」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド等を指す。
【０１５１】
本明細書において用いられるように、「によってコードされるポリペプチド、またはそのタンパク質産物」とは、遺伝子から転写されたmRNAのタンパク質コード領域の翻訳後に得られたアミノ酸配列を指す。理解されるように、本発明の遺伝子（バイオマーカー）のそれぞれに関する1つまたは複数のmRNAヌクレオチド配列は、http://www.ncbi.nlm.nih.govにおいて見いだされるNCBIデータベースのような公共のデータベースを用いて同定することができる。例えば、表2および表12において同定されたそれらのバイオマーカーの代表的なmRNA種を、そのヒトGenbankアクセッション番号（それぞれ、表3および表13を参照されたい）と共に提供し、対応するポリペプチド配列はタンパク質アクセッション番号（それぞれ、表3および表13を参照されたい）によって同定される。これらのGenbankアクセッション番号は、バイオマーカーの産物の配列を提供する。タンパク質またはタンパク質の断片を用いて宿主動物を免疫する場合、タンパク質の多数の領域が、タンパク質上の所定の領域または三次元構造に対して特異的に結合する抗体の産生を誘導する可能性があり、これらの領域または構造はエピトープまたは抗原性決定基と呼ばれる。本明細書において用いられるように、「抗原性断片」は、1つまたは複数のエピトープを含むポリペプチドの一部を指す。エピトープは、抗原からの直線状の配列を本質的に含む直線状エピトープ、または他の配列によって遺伝的に離れているが、ポリペプチドリガンドに関する結合部位で構造的に互いに近づく配列を含むコンフォメーションエピトープでありうる。「抗原性断片」は、長さがアミノ酸5000、1000、500、400、300、200、100、50、25、20、10、または5個であってもよい。
【０１５２】
本明細書において用いられるように、「予防する」、「予防している」および「予防」という用語は、本発明の方法に従って同定された1つもしくは複数の化合物の投与、またはそのような化合物およびもう1つの治療法の組み合わせの投与に起因するポリープまたはポリープのサブタイプを含む結腸直腸病変の発生、再発、形成、成長または悪性転換の予防を指す。
【０１５３】
本明細書において用いられるように、「プライマー」という用語は、精製制限消化物（purified restriction digest）において天然に存在する、または合成によって産生されるか否かによらず、すなわちヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼのような誘導物質の存在下、ならびに適した温度およびpHで、核酸鎖と相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件に置かれた場合に、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよく、誘導物質の存在下で所望の伸長産物の合成をプライミングするために十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、および用いる方法、ならびに同様に所望のプライミングの特異性または選択性（すなわち、ポリヌクレオチドの所定の配列に関して特異的または選択的である合成の開始点として作用するために）を含む多くの要因に依存すると考えられる。例えば、試験の実施のために、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的に、15〜25ヌクレオチドを含むが、さらなるヌクレオチドを含んでもよいと共により少ないヌクレオチドを含んでもよい。さらに、いくつかの場合において、プライマーは、高いGC含有量を有するように選択することができ、SNPを含まない領域に結合するように選択することができ、RNAのイントロン／エキソン接合部等に及ぶように選択することができる。プライマーの適当な長さおよび／または特徴の決定に関係する他の要因は、当業者に容易に公知である。
【０１５４】
本明細書において用いられる「バイオマーカー特異的プライマーセット」または「プライマーセット」は、本発明のバイオマーカーの1つまたは複数のRNA産物の一部と相補的な二本鎖DNAを産生するための、1つのプライマーがセンス鎖の合成をプライミングして、第二のプライマーがアンチセンス鎖の合成をプライミングする、ポリヌクレオチドプライマーのセットを指す。例えば、プライマーには、伸長産物を作製するために、本発明のバイオマーカーの領域と相補的なRNA、cDNA、またはESTと選択的にハイブリダイズすることができる配列である第一のプライマー、および本発明のバイオマーカーまたは本発明のバイオマーカーの産物の領域と相補的な二本鎖DNAを産生するために用いられる、伸長産物と選択的にハイブリダイズすることができる第二のプライマーが含まれうる。本発明には、バイオマーカーのRNA産物レベルを測定するために有用なプライマーが含まれる。表4、表6、表14、表16、および表17は、本発明のプライマーの代表的な種を提供する。バイオマーカー特異的プライマーセットは、バイオマーカーの1つまたは複数のRNA産物と相補的なポリヌクレオチドの一部のみを選択的に増幅して、他のバイオマーカーと相補的なポリヌクレオチドの部分を増幅しないように選択することができる。
【０１５５】
本明細書において用いられるように、「プローブ」という用語は、オリゴヌクレオチドおよびその類似体を意味し、標的配列のヌクレオチド塩基との水素結合相互作用を通してポリヌクレオチド標的配列を認識する一連の化学種を指す。プローブまたは標的配列は一本鎖もしくは二本鎖RNAであってもよく、一本鎖もしくは二本鎖DNA、またはDNA塩基とRNA塩基の組み合わせであってもよい。プローブは長さが少なくとも8ヌクレオチドであり、完全な遺伝子の長さより短い。プローブは標的遺伝子の完全な長さより短い限り、長さが10、20、30、50、75、100、150、200、250、400、500ヌクレオチド、および2000ヌクレオチドまでであってもよい。いくつかの態様において、プローブはマイクロアレイに結合した標的配列として用いることができる。いくつかの態様において、プローブは定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）のために用いることができ、蛍光体、消光剤、副溝の結合試薬、またはPCR増幅の際にプローブの検出を可能にする他の物質を組み入れるような改変が含まれうる。プローブはまた、検出タグおよび消光剤分子の双方、例えばTaqman（登録商標）およびMolecular Beacon（登録商標）プローブを有するように改変することができる。本発明には、本発明のバイオマーカーのRNA産物の発現を測定するために有用なプローブが含まれる。例えば、表4、表6、表14、および表17は、QRT-PCRにとって有用な本発明のプローブのいくつかの代表的な種を提供する。
【０１５６】
オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、一般的にアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる、RNAもしくはDNA、またはRNAもしくはDNAの類似体であってもよい。そのようなRNAまたはDNAの類似体は、2-'O-アルキル糖改変、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、3'-チオホルムアセタール、スルホン、スルファメートおよびニトロキシド骨格改変、ならびに塩基部分が改変されている類似体を含むがこれらに限定されない。さらに、オリゴマーの類似体は、糖部分が改変されている、またはもう1つの適した部分に置換されて、それによってモルホリノ類似体およびペプチド核酸（PNA）類似体が含まれるがこれらに限定されるわけではないポリマーが得られる、ポリマーであってもよい（Egholm, et al. Peptide Nucleic Acids (PNA)--O1igonucleotide Analogues with an Achiral Peptide Backbone, (1992)）。
【０１５７】
プローブはまた、任意のオリゴヌクレオチド類似体タイプの混合物または本来のDNAもしくはRNAとの混合物であってもよく、同様にリンカー種が含まれてもよい。同時に、オリゴヌクレオチドおよびその類似体は単独または1つもしくは複数のさらなるオリゴヌクレオチドもしくはその類似体と共に用いてもよい。
【０１５８】
本明細書において用いられるように、「バイオマーカーの産物」または「バイオマーカー産物」という用語は、組織試料、リンパ試料、リンパ組織試料、もしくは血液試料、またはバイオマーカーに対応する血液試料の分画（すなわち、遺伝子もしくは遺伝子要素から転写された、または遺伝子もしくは遺伝子要素から転写されたRNAから翻訳された）を含む、試料から単離されたおよび／またはそれに由来するRNA種またはタンパク質種（RNAまたはタンパク質種には多数のコピーが含まれうる）を指す。表3および表13を参照されたい。RNAはプレmRNA、mRNA、mRNAのスプライシング変種等であってもよい。タンパク質は、その本来の状態であってもよく、または様々な方法の任意の1つにおいて翻訳後プロセシングされてもよい。
【０１５９】
本明細書において用いられるように、「の複数」または「のセット」は、2つまたはそれより多く、例えば2個またはそれより多く、3個またはそれより多く、4個またはそれより多く、5個またはそれより多く、6個またはそれより多く、7個またはそれより多く、8個またはそれより多く、9個またはそれより多く、10個またはそれより多いことを指す。
【０１６０】
本明細書において用いられるように、「予め選択された領域」、「既定の領域」、または「特有の位置」は、核酸をその上に沈殿させるために用いられることが意図されたまたは意図される基板上の局在領域を指し、そうでなければ本明細書において代わりに「選択領域」または単に「領域」と呼ばれる。予め選択された領域は任意の簡便な形状、例えば円形、方形、楕円形、楔形等を有してもよい。いくつかの態様において、予め選択された領域は、約1 cm2より小さく、より好ましくは1 mm2より小さく、さらにより好ましくは0.5 mm2より小さく、およびいくつかの態様において0.1 mm2より小さい。「予め選択された領域」、「既定の領域」、または「特有の位置」での核酸メンバーは、その同一性（例えば、配列）が、領域でのその位置または特有の位置のために決定されうるメンバーである。
【０１６１】
本明細書において用いられるように、「予防物質」および「複数の予防物質」という用語は、ポリープの形成、発達、再発、または発症を防止するために用いることができる任意の化合物（複数）を指す。特定の他の態様において、「予防物質」という用語は、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物を指す。特定の他の態様において、「予防物質」という用語は、1つまたは複数のポリープまたはポリープのサブタイプを含む1つまたは複数の結腸直腸病変の発症、発達、および／または進行、または悪性転換を防止または妨害するために有用であることが知られている、用いられている、または現在用いられている、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物以外の物質を指す。
【０１６２】
本明細書において用いられるように、「予防的有効量」という句は、1つもしくは複数のポリープもしくはポリープのサブタイプを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変の発生、再発、発症、進行、もしくは悪性転換の防止が起こるため；1つもしくは複数のポリープもしくはポリープのサブタイプを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変の進行および／または重症度の低減もしくは改善が起こるため；またはポリープもしくはポリープのサブタイプを含む結腸直腸病変が結腸直腸癌に進行することの防止が起こるために十分である治療法（例えば、予防物質）の量を指す。
【０１６３】
本明細書において用いられるように、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共に連結されるアミノ酸の鎖を指すために互換的に用いられる。特定の態様において、タンパク質は、ペプチド結合によって共に連結されたアミノ酸200個未満、175個未満、150個未満、125個未満、100個未満、50個未満、45個未満、40個未満、35個未満、30個未満、25個未満、20個未満、15個未満、10個未満、または5個未満で構成される。もう1つの態様において、タンパク質は、ペプチド結合によって共に連結される少なくとも200個、少なくとも250個、少なくとも300個、少なくとも350個、少なくとも400個、少なくとも450個、少なくとも500個またはそれより多くのアミノ酸で構成される。
【０１６４】
「タンパク質コード領域」は、ポリペプチドをコードするmRNAの部分を指す。
【０１６５】
本明細書において用いられるように、「参照集団」または「試験集団」は、1つまたは複数の分類子を開発するために用いられる「対照試料」の1つまたは複数の集団を指す。1つの態様において、1つの参照集団を亜集団に分割することができる。もう1つの態様において、2つまたはそれより多い参照集団を用いることができる。いくつかの場合において、1つもしくは複数の結腸直腸病変、1つもしくは複数のポリープ、または1つもしくは複数のポリープのサブタイプを有する個体と、同じ結腸直腸病変、1つもしくは複数のポリープ、または1つもしくは複数のポリープのサブタイプを有しない個体とを区別するための分類子を開発することができる。いくつかの場合において、第一の参照集団は、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する個体を含み、第二の参照集団は1つまたは複数の結腸直腸病変を有しない個体を含むと考えられる。「参照集団」または「試験集団」は、通常の診断技術を用いて決定されるように、1つもしくは複数のポリープ、または1つもしくは複数のポリープのサブタイプを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変を有すると診断された多くの個体、および結腸直腸病変を有しない、1つもしくは複数のポリープを有しない、または1つもしくは複数のポリープのサブタイプを有しない個体からの対照試料を含みうる。いくつかの態様において、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する個体の集団は、1つのサブタイプのポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを有する個体を含めるように選択することができることに注意されたい。他の態様において、1つまたは複数の結腸直腸病変を有しない個体には、他の疾患または複数の疾患であると診断されている個体が含まれうる。もう1つの態様において、1つまたは複数の結腸直腸病変を有しない個体には、他の癌であると診断された個体が含まれうる。1つの態様において、「参照集団」または「試験集団」は、各形質の亜群からの「対照試料」のほぼ同等の数を含む（例えば、この場合、該形質は結腸直腸病変の存在に関する状態を決定する）。もう1つの態様において、「参照集団」の各形質の亜群（例えば、結腸直腸病変を有する、または有しない）は、他の形質、例えば年齢、性別、薬物の状態等に関して類似の分布を有する。
【０１６６】
本明細書において用いられるように、本発明によって含まれるタンパク質の文脈における「選択的に結合する」という用語は、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗体の任意の2つの特異的相互作用を指し、相互作用は他の任意のペプチド、タンパク質、ポリペプチド、および抗体と比較して、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、および抗体の任意の2つのあいだで優先的に起こる。例えば、2つの分子がタンパク質分子である場合、第一の分子上の構造は、他のタンパク質よりむしろ第二の分子上の構造を認識して結合する。「選択的に結合する」、「選択的に結合する」という用語が本明細書において用いられる場合、ある分子が非特異的分子に結合する場合より少なくとも2倍大きい親和性で、好ましくは少なくとも10倍、20倍、50倍、100倍、またはそれより高い親和性で、分子がその特異的結合パートナーに結合することを意味する。
【０１６７】
本明細書において用いられるように、「選択的ハイブリダイゼーション」は、ポリヌクレオチドと、本発明のバイオマーカーのRNAまたはタンパク質産物とのあいだで起こるハイブリダイゼーションを指すことができ、ハイブリダイゼーションは、問題のゲノムにおける他の遺伝子のRNA産物に対して優先して本発明のバイオマーカーのRNA産物に結合するように起こる。好ましい態様において、「選択的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、70％より大きい、80％より大きい、90％より大きい、および最も好ましくは100％の選択性でハイブリダイズする（すなわち、他のRNA種との交叉ハイブリダイゼーションは好ましくは30％未満、20％未満、10％未満で起こる）ポリヌクレオチドである。当業者に理解されるように、本発明のバイオマーカーのRNA産物に「選択的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、長さおよび組成を考慮に入れることによって決定することができる。
【０１６８】
本明細書において用いられるように、「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」は、2つの核酸配列が実質的に相補的である（少なくとも14〜25ヌクレオチドの枝に対して少なくとも約65％の相補的、好ましくは少なくとも約75％相補的、より好ましくは少なくとも約90％相補的である）場合に起こるハイブリダイゼーションを指しうる。参照により本明細書に組み入れられる、Kanehisa, M., 1984, Nucleic acids Res., 12:203を参照されたい。その結果、一定の程度のミスマッチが容認されると予想される。そのようなミスマッチは、モノ、ジ、またはトリヌクレオチドのように小さくてもよい。または、ミスマッチの領域は、中断されない一連の4つまたはそれより多いヌクレオチドにおいてミスマッチが存在する領域として定義されるループを含みうる。多数の要因が2つの核酸のハイブリダイゼーション、例えば標的核酸配列に対するアレイ上の核酸メンバーのハイブリダイゼーションの有効性および選択性に影響を及ぼす。これらの要因には、核酸メンバーの長さ、ヌクレオチド配列、および／または組成、ハイブリダイゼーション温度、緩衝液の組成、および核酸メンバーがハイブリダイズするために必要である領域における立体妨害の可能性が含まれる。核酸の長さと、核酸が標的配列にアニールする効率および精度の双方のあいだに正の相関が存在する。特に、より長い配列は、短い配列より高い融解温度（TM）を有し、所定の標的配列内で反復される可能性が低く、それによって非特異的ハイブリダイゼーションを最小限にする。ハイブリダイゼーション温度は核酸メンバーのアニール効率と反比例して変化する。同様に、ハイブリダイゼーション混合物における有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度は、アニーリング効率と反比例して変化するが、ハイブリダイゼーション混合物における塩濃度の増加はアニーリングを促進する。ストリンジェントなアニーリング条件において、より長い核酸はより許容される条件で十分であるより短い核酸より効率的にハイブリダイズする。
【０１６９】
本明細書において用いられるように、「スポットする」または「付着する」とは、核酸が共有結合、水素結合、またはイオン相互作用によって固体基板上に安定に結合するように核酸メンバーを基板上に沈着させて核酸アレイを形成するプロセスを指す。
【０１７０】
本明細書において用いられるように、「安定に会合する」とは、アレイが典型的に分析される条件（すなわち、ハイブリダイゼーション、洗浄、および／またはスキャニング等の1つまたは複数の段階のあいだ）で、アレイに安定に会合する他の全ての核酸、または固体基板上の他の全ての予め選択された領域と比較して、核酸がその特有の予め選択された位置を保持するように、共有結合、水素結合、またはイオン相互作用によってアレイを形成するように固体基板に安定に結合する核酸を指す。
【０１７１】
本明細書において用いられるように、アレイに関する「基板」または「支持体」は、オリゴヌクレオチドまたはcDNAメンバーを支持するまたは局在させることができる材料を指す。支持体は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、チューブ、球体、ビーズ、容器、毛細管、パッド、スライス、被膜、プレート、スライドガラス、チップ等として存在する、生物学的、非生物学的、有機もしくは無機の支持体、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。しばしば、基板はシリコンまたはガラス表面、(ポリ)テトラフルオロエチレン、(ポリ)ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ナイロン66もしくはニトロセルロースのような荷電膜、またはその組み合わせである。1つの態様において、支持体はガラスである。いくつかの態様において、基板の少なくとも1つの表面は実質的に平坦でありうる。いくつかの態様において、支持体はカルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオール等が含まれるがこれらに限定されるわけではない反応基を含みうる。1つの態様において、支持体は光学的に透明である。
【０１７２】
本明細書において用いられるように、「標準的なストリンジェントな条件」という用語は、同一性の領域が少なくとも10ヌクレオチドを含む配列のあいだで少なくとも95％、および好ましくは少なくとも97％同一性が存在する場合に限って、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。1つの態様において、配列を42℃で終夜インキュベートした後ストリンジェントな条件で、配列がハイブリダイズした後、ストリンジェントな洗浄（65℃で0.2×SSC）を行う。洗浄のストリンジェンシーの程度は、温度、pH、イオン強度、二価の陽イオン濃度、洗浄の容積および期間を変化させることによって変化させることができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブの融解温度より低い様々な温度でハイブリダイゼーションを行うことによって変化させてもよい。プローブの融解温度は、以下の式を用いて計算してもよい。
【０１７３】
長さが14〜70ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブの場合、セ氏での融解温度は以下の式を用いて計算してもよい：Tm＝81.5＋16.6(log [Na+])＋0.41(分画G＋C)−(600/N)、式中Nはオリゴヌクレオチドの長さである。
【０１７４】
例えば、ハイブリダイゼーション温度は、約1 MのNa+濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液において68℃から42℃まで5℃ずつ減少させてもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターをハイブリダイゼーション温度で2×SSC、0.5％SDSによって洗浄してもよい。これらの条件は、50℃より高い「中程度にストリンジェントな」条件、および50℃より低い「低ストリンジェントな」条件であると見なされる。「中程度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが55℃で行われる場合である。「低ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが45℃で行われる場合である。
【０１７５】
ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含む溶液において行われる場合、融解温度は以下の等式を用いて計算してもよい：Tm＝81.5＋16.6(log[Na+])＋0.41(分画G＋C)−(0.63％ホルムアミド)−(600/N)、式中Nはプローブの長さである。
【０１７６】
例えば、ハイブリダイゼーションは、温度42℃でホルムアミドを含む6×SSCのような緩衝液において行ってもよい。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液におけるホルムアミドの濃度は、プローブに対する相同性レベルが減少したクローンを同定するために50％から0％まで5％ずつ低減させてもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターを6×SSC、0.5％SDSにおいて50℃で洗浄してもよい。これらの条件は、25％より高いホルムアミドでは「中程度にストリンジェントな」条件であると見なされ、25％より低いホルムアミドでは「低ストリンジェントな」条件であると見なされる。「中程度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが30％ホルムアミドで行われる場合である。「低ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが10％ホルムアミドで行われる場合である。
【０１７７】
本明細書において用いられるように、核酸配列に関する「有意にマッチする」は、2つの核酸配列が、当技術分野において周知の比較法を用いて、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、および好ましくは少なくとも90％同一性を示すことを意味する（すなわち、Altschul, S.F. et al., 1997, Nucl. Acids Res., 25:3389-3402；Schaffer, A.A. et al., 1999, Bioinformatics 15:1000-1011）。本明細書において用いられるように、「有意なマッチ」は、当技術分野において日常的なアラインメント法を用いて最大に整列させた場合に、配列が、少なくとも65％、および好ましくは少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、および好ましくは少なくとも90％同一性を示す限り、非隣接、または散在する同一のヌクレオチドを含む。
【０１７８】
本明細書において用いられるように、「相乗的」という用語は、本明細書に記述される方法の1つを用いて同定された化合物と、もう1つの治療法（例えば物質）との併用を指し、これは治療法の相加効果より有効である。いくつかの態様において、そのような他の治療法は、1つもしくは複数のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変を防止、処置、または改善するためであったか、または現在そのためである。治療法（例えば、予防または治療物質）の併用の相乗効果によって、ポリープまたはサブタイプのポリープを含む結腸直腸病変を有する個体に対して、1つもしくは複数の治療法のより低い投与を用いることができ、および／または該治療法のより回数の少ない投与が可能となる。治療法（例えば、予防または治療物質）のより低い用量を利用できること、および／または治療法を投与する回数がより少ないことは、ポリープまたはサブタイプのポリープを含む結腸直腸病変の予防または処置における該治療法の有効性を低減させることなく、個体に対する該物質の投与に関連する毒性を低減させる。さらに、相乗効果によってポリープまたはサブタイプのポリープを含む結腸直腸病変の予防または処置における治療法（例えば、物質）の有効性が改善されうる。最後に、治療法（例えば、予防物質または治療物質）の併用の相乗効果は、いずれかの治療法単独の使用に関連する有害または望ましくない副作用を回避または低減させる可能性がある。
【０１７９】
本明細書において用いられるように、「治療物質」または「物質」は、ポリープまたはサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変を有する個体からの試料において差異的に発現されているポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の発現を増加または減少させる化合物を指す。本発明は、1）結腸直腸病変の形成を防止する、2）結腸直腸病変の進行または悪性転換を低減、遅延、または消失させる、および／または3）患者に投与した場合に、患者の1つまたは複数の結腸直腸病変を示す核酸またはポリペプチドの1つまたは複数の発現プロフィールを、正常な個体により類似するプロフィールまで回復する、「治療物質」を提供する。さらに、「治療物質」および「複数の治療物質」という用語は、結腸直腸病変、ポリープ、またはサブタイプのポリープの処置または予防において用いることができる任意の化合物（複数）を指す。特定の態様において、「治療物質」という用語は、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物を指す。他の態様において、「治療物質」という用語は、結腸直腸病変、ポリープ、またはサブタイプのポリープを処置または予防するために有用であることが知られている、予防するために用いられた、または現在用いられている、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物以外の物質を指す。
【０１８０】
本明細書において用いられるように、「治療的有効量」という用語は、ポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変を処置するため；ポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変を予防するため；ポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変が結腸直腸癌に悪性転換および／または進行することを防止するため、結腸直腸病変、ポリープ、または1つもしくは複数のサブタイプのポリープの退縮を引き起こすため、またはもう1つの治療法（例えば、治療物質）の治療効果（複数）を増強もしくは改善するために、十分な治療法（例えば、治療物質）の量を指す。特定の態様において、治療的有効量は、本発明のバイオマーカー産物の遺伝子発現を調節する治療法（例えば、治療物質）の量を指す。いくつかの態様において、治療法（例えば、治療物質）の治療的有効量は、リン酸緩衝生理食塩液（「PBS」）のような対照治療物質と比較して、本発明のバイオマーカー産物の遺伝子発現を少なくとも 5％、好ましくは少なくとも 10％、少なくとも 15％、少なくとも 20％、少なくとも 25％、少なくとも 30％、少なくとも 35％、少なくとも 40％、少なくとも 45％、少なくとも 50％、少なくとも 55％、少なくとも 60％、少なくとも 65％、少なくとも 70％、少なくとも 75％、少なくとも 80％、少なくとも 85％、少なくとも 90％、少なくとも 95％、または少なくとも100％調節する。
【０１８１】
本明細書において用いられるように、「処置する」、「処置」、および「処置している」という用語は、本発明の方法に従って同定された1つまたは複数の化合物の投与、または本発明に従って同定された1つもしくは複数の化合物ともう1つの治療法との併用に起因する、ポリープの形成、1つもしくは複数のサブタイプのポリープの形成を含む1つまたは複数の結腸直腸病変の予防、1つもしくは複数の結腸直腸病変の発達、再発、発症、または悪性転換、およびポリープまたはそのサブタイプを含む1つまたは複数の結腸直腸病変の進行および／または重症度の低減または改善を指す。
【０１８２】
本明細書において用いられるように、「組織核酸試料」は、組織、例えばポリープ組織、結腸組織、直腸組織、リンパ系組織等から単離されたおよび／またはそれに由来する核酸を指す。いくつかの態様において、組織核酸試料は、全RNA、mRNAであり、RNAに対応する核酸、例えばcDNAである。組織核酸試料にはまた、全RNA、mRNA、またはcDNAに由来するPCR産物が含まれうる。
【０１８３】
（C）本発明において用いるための試料
本発明において用いるための試料には試験対象および／または対照となる対象から単離されうるおよび／または由来しうる、および1つまたは複数のバイオマーカー産物を含む、様々なタイプの分子、細胞、および／または組織のいずれか１つを指す。試料は任意の液体、細胞、または組織から単離されうるおよび／または由来しうる。試料はまた、主に血液細胞を含む任意の液体および／または組織から単離されたおよび／またはそれに由来する試料でありうる。
【０１８４】
個体から単離されたおよび／またはそれに由来する試料を、遺伝子発現産物、特に1つまたは複数の結腸直腸病変を有するまたは有しない個体において差異的に発現される遺伝子発現産物に関してアッセイすることができる。1つの態様において、試料は液体試料、リンパ試料、リンパ組織試料、または血液試料である。1つの態様において、試料は末梢血から単離されるおよび／またはそれに由来する。または、試料は、様々なタイプのリンパ系組織の任意の1つを含む代わりの起源から単離されるおよび／または由来してもよい。
【０１８５】
血液から単離されるおよび／またはそれに由来する試料の例には、全血試料、血清低減全血、血清除去血液、ならびに血清除去赤血球除去血液が含まれる。
【０１８６】
本明細書において特に明記していなければ、任意の個体から得られた試料を本発明の方法に従って用いてもよい。そのような試料が本発明の方法に従って得られ、利用されてもよい個体の例には、1つまたは複数の結腸直腸病変を有することが疑われる個体、1つまたは複数の結腸直腸病変を有すると診断された個体、1つまたは複数の結腸直腸病変を有すると診断されていない個体、1つまたは複数の結腸直腸病変を有しないことが確認された個体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１８７】
さらなる態様において、そこから試料が得られてもよい個体は、1つまたは複数の結腸直腸病変を有するか否かわかっていない試験対象である。もう1つの態様において、試料が得られる可能性がある個体は、1つまたは複数の結腸直腸病変を有するか否かわかっていない試験対象である。
【０１８８】
血液
本発明の1つの局面において、血液試料は当技術分野において周知の方法に従って個体から得られる。血液試料は、個体、例えば1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する対象、1つもしくは複数の結腸直腸病変を有することが疑われる対象、または1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない対象から得てもよい。いくつかの態様において、個体の皮膚に行う単純な針穿刺（pin prick）から血液1滴を採取する。血液は、当業者に公知の技術を用いて、特に当技術分野において公知の静脈切開法を用いて、個体の体の任意の部分（例えば、指、手、手首、腕、脚、足、足首、胃および首）から得てもよい。
【０１８９】
採取される血液量は、採取部位、本発明の方法にとって必要な量、および個体の快適さに応じて変化すると考えられる。しかし、本発明の1つの態様の1つの長所は、本発明の方法を実行するために必要な血液量が非常に少なく、試料を得るためにより侵襲的な手順を必要としない点である。例えば、いくつかの態様において、必要であるのは血液1滴であるに過ぎない。血液1滴は、例えば単純な針穿刺によって得ることができる。いくつかの態様において、表1、表2、表11および表12における遺伝子の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個または全ての発現を検出するために十分である任意の量の血液が採取される。そのため、いくつかの態様において、採取される血液量は1 mlもしくはそれ未満、0.5 mlもしくはそれ未満、0.1 mlもしくはそれ未満、または0.01 mlもしくはそれ未満である。しかし、本発明は、そのような態様に限定されない。いくつかの態様において、より多くの血液が入手でき、いくつかの態様において本発明の方法を行うためにより多くの血液を用いることができる。そのため、様々な特定の態様において、0.001 ml、0.005 ml、0.01 ml、0.05 ml、0.1 ml、0.15 ml、0.2 ml、0.25 ml、0.5 ml、0.75 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、10 ml、15 ml またはそれより多くの血液を対象から採取する。もう1つの態様において、血液0.001 ml〜15ml、0.01 ml〜10 ml、0.1 ml〜10 ml、0.1 ml〜5 ml、1〜5 mlを個体から採取する。さらなる態様において、血液0.001〜100 ml、好ましくは0.01〜50 ml、より好ましくは0.01〜25 ml、および最も好ましくは0.01〜1 mlを個体から採取する。
【０１９０】
本発明のいくつかの態様において、血液はK3/EDTA試験管（例えば、Becton Dickinsonから）内に保存される。もう1つの態様において、米国特許第6,617,170号（参照により本明細書に組み入れられる）において開示されるような安定化剤を含む血液を保存するための試験管を利用することができる。もう1つの態様において、PreAnalytiX, a Qiagen/BD社によって提供されるPAXgene（商標）血液RNAシステムを用いて血液を採取してもよい。なおもう1つの態様において、Applied Biosystemsによって提供されるTempus（商標）血液RNA採血管を用いてもよい。Tempus（商標）採血管は、全血採取のためにRNA安定化試薬を含む密閉式の真空プラスチック試験管を提供する。
【０１９１】
採取された血液は、いくつかの態様において、直ちにまたは1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、もしくは6時間以内に利用されるか、または任意で、本発明の方法に従って用いるまで、4℃、もしくは-20℃のような温度で保存される。いくつかの態様において、血液試料の一部は、初回に本発明に従って用いられるが、血液試料の1つまたは複数の残りの部分（またはその分画）は、後に使用するために一定期間保存される。長期保存の場合、凍結温度（例えば、-60℃より低い）での保存のような当技術分野において周知の保存法を用いることができる。いくつかの態様において、血液の保存に加えて、または血液の保存の代わりに、血漿、血清、単離された核酸、またはタンパク質を当技術分野で公知の方法に従って後に使用するために一定期間保存する。
【０１９２】
1つの局面において、当技術分野において周知の静脈切開法に従って個体から全血を得る。全血には、そのまま用いることができる血液が含まれ、血清または血漿が除去または低減されている血液が含まれ、残りの血液試料からのRNAまたはmRNAは、当技術分野において周知の方法に従って単離されている（例えば、いくつかの態様において、300〜800×gで5〜10分間の穏やかな遠心を用いて）。特定の態様において、対象から得られた全血（すなわち、非分画血）を溶解緩衝液（例えば、溶解緩衝液（1 L）：0.6 g EDTA；1.0 g KHCO2、8.2 g NH4ClをpH 7.4に調節したもの（NaOHを用いて））と混合して、試料を遠心し、細胞沈降物を保持して、当技術分野において公知の方法に従ってRNAおよびmRNAを抽出する（「溶解血液」）（例えば、Sambrookらを参照されたい）。1つの態様において、非分画全血を用いることは、血液内の細胞タイプを分離するための費用と時間のかかるプロセスを回避することから、有益であり、好ましい（Kimoto, 1998, Mol. Gen. Genet 258:233-239；Chelly J et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:2617-2621；Chelly J et al., 1988, Nature 333:858-860）。
【０１９３】
本発明のいくつかの態様において、個体から採取した全血は、試料からバイオマーカーの産物を単離する前に分画（すなわち成分に分離）される。1つの態様において、血液は血清を除去（例えば血清を低減）される。もう1つの態様において血液は血漿が除去（または血漿が低減）される。なお他の態様において、血液は、赤血球が除去または低減される。いくつかの態様において、赤血球低減は赤血球細胞を選択的に溶解することによって行われる。他の態様において、赤血球の除去または低減は、赤血球を溶解して、残りの細胞をさらに分画することによって行われる。なお他の態様において、赤血球の除去または低減が行われるが、残りの細胞はさらに分画されない。他の態様において、血球細胞は、当技術分野において公知の他の技術を用いて、個体から採取された全血から分離される。例えば、個体から採取された血液をFicoll-Hypaque（Pharmacia）勾配遠心に供することができる。特に、Ficoll-Hypaque勾配遠心は、本発明の方法に従って用いることができる末梢血白血球（PBLs）を単離するために有用である。
【０１９４】
非限定的な例として、マクロファージは以下のように得ることができる。血液をシリンジに採取した後に、Ficoll-Hypaque勾配遠心によって、単核球細胞を対象の末梢血から単離する。組織培養皿を対象自身の血清またはAB+ヒト血清によって予めコーティングして、37℃で1時間インキュベートする。非接着細胞をピペッティングによって除去する。冷（4℃）1 mM EDTAのリン酸緩衝生理食塩液溶液を、培養皿に残っている接着細胞に加えて、培養皿を室温で15分間放置する。細胞を回収してRPMI緩衝液によって洗浄し、RPMI緩衝液に浮遊させる。マクロファージ-コロニー刺激因子（M-CSF）と共に37℃でインキュベートすることによって、増加したマクロファージ数を得ることができる。マクロファージの検出および分離を促進するために、Mac-1のようなマクロファージ特異的表面マーカーに対する抗体を、そのような分子に親和性化合物を共役させることによって標識することができる。用いることができる親和性化合物には、ビオチン、フォトビオチン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコエリスリン（PE）、または当技術分野で公知の他の化合物が含まれるがこれらに限定されるわけではない。次に、様々な細胞ソーティング法、アフィニティクロマトグラフィー、およびパニングのような、当技術分野において公知の技術によって、そのような抗体に結合しない細胞から、標識抗体を含む細胞を分離する。
【０１９５】
血球細胞は、蛍光活性化セルソーター（FACS）を用いてソーティングすることができる。蛍光活性化セルソーティング（FACS）は、細胞を含む粒子を、粒子の蛍光特性に基づいて分離するための公知の方法である。例えば、Kamarch, 1987, Methods Enzymol 151:150-165を参照されたい。個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起によって、小さい電荷が起こり、これによって混合物から正の粒子および負の粒子を電磁的に分離することができる。特定の血球細胞の細胞表面上に存在する血球細胞抗原性決定基を検出するために用いられる抗体またはリガンドを、FITCまたはフィコエリスリンのような蛍光体によって標識する。細胞を蛍光標識抗体またはリガンドと共に、標識抗体またはリガンドを細胞に結合させるために十分な期間インキュベートする。細胞をセルソーターに通過させて、対象細胞を他の細胞から分離する。FACSソーティングされた粒子を、分離を促進するためにマイクロタイタープレートの個々のウェルに直接沈着させることができる。
【０１９６】
磁気ビーズも同様に、本発明のいくつかの態様において血球細胞を分離するために用いることができる。例えば、血球細胞を、磁気ビーズ（直径0.5〜100 m）に対するその結合能に基づいて粒子を分離するための方法である磁気活性化細胞ソーティング（MACS）技術を用いて、ソーティングすることができる。細胞-固相表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、有用な多様な改変を磁気ミクロスフェアに行うことができる。次に、選択されたビーズを物理的に操作するために磁場を適用する。特定の態様において、血球細胞表面マーカーに対する抗体を磁気ビーズに共役させる。次にビーズを血球細胞培養物と混合して結合させる。細胞を磁場の中に通過させて、対象の血球細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。次に、これらの細胞を単離することができる。
【０１９７】
いくつかの態様において、培養皿の表面を抗体によってコーティングして、これを用いてパニングと呼ばれる方法によって血球細胞を分離してもよい。別々の培養皿を、特定の血球細胞に対して特異的な抗体によってコーティングすることができる。関心対象の血球細胞特異的抗体によってコーティングした培養皿に、細胞を加えることができる。十分にすすいだ後、培養皿に結合して残っている細胞は、関心対象血球細胞マーカーを発現する細胞であると考えられる。細胞表面抗原性決定基またはマーカーの例には、Tリンパ球およびナチュラルキラー細胞に関するCD2、Tリンパ球に関するCD3、白血球に関するCD11a、Tリンパ球に関するCD28、Bリンパ球に関するCD19、Bリンパ球に関するCD20、Bリンパ球に関するCD21、Bリンパ球に関するCD22、Bリンパ球に関するCD23、白血球に関するCD29、単球に関するCD14、血小板に関するCD41、血小板に関するCD61、顆粒球に関するCD66、顆粒球に関するCD67、ならびに単球およびマクロファージに関するCD68が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１９８】
全血は白血球、血小板、赤血球等のような細胞タイプに分離することができ、そのような細胞タイプは本発明の方法に従って用いることができる。白血球は、標準的な技術を用いて顆粒球および非顆粒球にさらに分離することができ、そのような細胞を本発明の方法に従って用いることができる。顆粒球は、標準的な技術を用いて、好中球、好酸球、および好塩基球のような細胞タイプに分離することができ、そのような細胞を本発明の方法に従って用いることができる。標準的な技術を用いて、非顆粒球をリンパ球（例えば、Tリンパ球およびBリンパ球）および単球に分離することができ、そのような細胞を本発明の方法に従って用いることができる。標準的な技術を用いて、Tリンパ球をBリンパ球から分離することができ、かつヘルパーT細胞を細胞傷害性T細胞から分離することができ、そのような細胞は本発明の方法に従って用いることができる。分離された血球細胞（例えば、白血球）を、本発明の方法において用いる前に標準的な技術によって凍結することができる。
【０１９９】
（D）RNA調製
本発明の1つの局面において、RNAは本発明のバイオマーカーのRNA産物を測定するために個体から単離される。RNAは1つもしくは複数のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変を有すると診断された個体、1つもしくは複数の結腸直腸病変を有しない個体、1つもしくは複数のポリープもしくはポリープのサブタイプを有しない個体、または試験対象の試料から単離される。
【０２００】
いくつかの態様において、RNAは以下のプロトコールによって赤血球が除去された血液から単離される。溶解緩衝液を血液試料に、溶解緩衝液3に対して血液1の割合で加える（溶解緩衝液（1 L）：0.6 g EDTA；1.0 g KHCO2、8.2 g NH4ClをpH 7.4に調節したもの（NaOHを使用））。試料を混合して透明になるまで氷中に5〜10分間入れる。溶血試料を4℃、1000 rpmで10分間遠心して、上清を吸引する。沈降物を溶解緩衝液5 mlに浮遊させて、4℃、1000 rpmで10分間再度遠心する。沈降した細胞をTRIzol（登録商標）（GIBCO/BRL）を用いて、当初の血液試料10 ml毎にTRIzol（登録商標）約6 mlの割合でホモジナイズして十分にボルテックス撹拌する。試料を室温で5分間放置する。TRIzol（登録商標）1 mlあたりクロロホルム1.2 mlを用いてRNAを抽出する。試料を4℃、12,000×gで5分間遠心して、上層を採取する。上層にイソプロパノールをTRIzol（登録商標）1 mlに対して0.5 mlの割合で加える。試料を-20℃で終夜、または-20℃で1時間放置する。公知の方法に従ってRNAを沈降させて、RNA沈降物を空気乾燥させて、沈降物をDEPC処理ddH2Oに浮遊させる。RNA試料はまた、75％エタノールにおいて保存することができ、ここで試料は輸送のために室温で安定である。
【０２０１】
他の局面において、最初に血液をPAXgene（商標）採血管に採取して、次にPreAnalytiX、a Qiagen/BD companyによって提供されたPAXgene（商標）血液RNA単離システムを用いてRNAを単離することによって、RNAを調製する。もう1つの態様において、RNAは、任意の公知の安定化溶液（例えば、PAXgene（商標）採血管またはTEMPUS（登録商標）採血管）にまず血液を採取した後、当業者に公知の任意の方法を用いてRNAを単離することによって調製される。
【０２０２】
他の局面において、グロビン低減または除去RNAが調製される。1つの態様において、RNAをまず単離して、次に当技術分野で公知の任意の技術の1つを用いてグロビンmRNAを除去するために処置する。例えば、グロビンRNAに対して特異的なDNAプライマーおよび／またはプローブをハイブリダイズさせて、RNAse Hを利用してグロビンmRNAを選択的に分解することができる。他の態様において、RNAは、RNA単離段階の際にグロビンRNAを除去するように単離される（例えば、常磁性粒子に付着させたグロビンプライマーおよび／またはプローブを用いてグロビンRNAを選択的に除去することによって、グロビンRNAを低減させる）。
【０２０３】
本発明の他の局面において、RNAは、オリゴdTに基づく精製法、Qiagen（登録商標）RNA単離法、LeukoLOCKT全RNA単離システム、AmbionのMagMAX-96血液技術、Promega（登録商標）ポリA mRNA単離システム等のような、RNA（全RNAまたはmRNA等の単離を含む）を単離するための1つまたは複数の公知の市販のキットを用いて調製される。
【０２０４】
RNAの純度および完全性は、260/280 nmでの吸光度およびアガロースゲル電気泳動後の紫外線のもとでの検査を行うことによって評価されうる。いくつかの態様において、RNAの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer 6000 RNA Nano Chipのようなより感度の高い技術を用いて評価される。
【０２０５】
（E）本発明のバイオマーカー
1つの局面において、本発明は、バイオマーカーの産物または複数の産物の発現レベルの測定が1つまたは複数の結腸直腸病変の存在を示している、バイオマーカーとバイオマーカーの組み合わせを提供する。
【０２０６】
表1は、本発明の1つの局面のバイオマーカーの一覧である。それぞれのバイオマーカーはマイクロアレイアッセイを用いて、ポリープを有するまたは有しない個体からの試料において差異的に発現される。表はHugo遺伝子名、記号、およびLocus Link ID；RNAおよびタンパク質アクセッション番号を提供し、同様にポリープを有する個体の測定レベルの平均値と、ポリープを有しない個体の測定レベルの平均値のp値（観察された発現差異に関する統計学的有意性を表す）および変化倍率の測定が含まれる。
【０２０７】
表2は、表1に記載した遺伝子の選択であり、本発明のバイオマーカーに関する遺伝子の記号および関連するLocus Link IDを記載する。表はまた、ポリープを有しない個体と比較して、ポリープを有する個体における遺伝子発現差異の変化倍率および方向を提供する。記述されるように、ポリープを有する個体と有しない個体のあいだでの遺伝子発現の差は、ノンパラメントリックウィルコクソン-マン-ホイットニー検定またはパラメトリックt検定を用いて同定することができる。検定の結果も同様に表2に示す。
【０２０８】
表11は、実施例2において記述されるように、マイクロアレイを用いて高リスクポリープを有しない（すなわち低リスクポリープを有する、または病変を全く有しない）個体と比較して「高リスクポリープ」を有する個体からの試料において差異的に発現されたと同定された遺伝子を示す。表は、遺伝子名、遺伝子ID、代表的なヒトRNAアクセッション番号を提供し、同様に高リスクポリープ個体と低リスクポリープ個体の双方の変動係数（標準化強度の平均値で除した標準化強度の標準偏差）と共に、p値、（低リスクポリープを有する個体の平均値と比較した高リスクポリープを有すると分類された個体の平均値とのあいだの）変化倍率を提供する。1列はAffySpot IDであり、2列は変化倍率、3列はp値、4列はCV（変動係数）（高リスクポリープ）、5列はCV（低リスクポリープ）、6列は遺伝子ID、7列はHUGO遺伝子記号、8列はヒトRNAアクセッション番号、および9列は遺伝子の説明である。
【０２０９】
表12は、結腸直腸癌を有する個体と結腸直腸癌を有しない個体の試料におけるQRT-PCRによる発現差異に関して試験したバイオマーカー48個を示す。バイオマーカー48個をQRT-PCRを用いて試験した。表は、それぞれのバイオマーカーに関する遺伝子記号、Locus Link ID、および遺伝子の説明を提供する。表にはまた、p値（観察された発現差異に関する統計学的有意性を表す）、結腸直腸癌を有する個体の測定レベルの平均値と結腸直腸癌を有しない個体の測定レベルの平均値とのあいだの変化倍率の測定、および結腸直腸癌を有する個体と結腸直腸癌を有しない個体の発現差異の方向が含まれる。
【０２１０】
本発明の他のバイオマーカーを明細書に記述する。このように、本発明は、上記の目的のそれぞれに対して、これらのバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせの発現を測定するために当業者に公知の方法を用いることを含む。
【０２１１】
当業者によって理解されるように、Locus Link IDを用いて本発明のバイオマーカーの全てのRNA産物および全てのタンパク質産物の配列を決定することができる。
【０２１２】
（F）バイオマーカーの組み合わせ
1つの態様において、本発明のバイオマーカーの組み合わせには、表1、表2、表11、または表12に記載されるバイオマーカーの任意の組み合わせが含まれる。例えば、上記の任意の表における遺伝子m個中、サブセットnの起こりうる組み合わせの数は、一般式を用いてFeller, Intro to Probability Theory, Third Edition, volume 1, 1968, ed. J. Wileyにおいて記述される。
m!/(n)!(m-n)!
【０２１３】
例えば、nが2であって、mが8である場合、バイオマーカーの組み合わせの数は、
2009512440.tif 000003
個の特有の遺伝子2個の組み合わせである。これらの遺伝子2個の組み合わせのそれぞれの遺伝子発現の測定は、患者が1つまたは複数の結腸直腸病変を有するか否かを決定するために独立して用いることができる。mが8でnが3であるもう1つの特定の態様において、8!/3!(8-3)!個の特有の遺伝子3個の組み合わせが存在する。これらの特有の遺伝子3個の組み合わせのそれぞれは、患者が1つまたは複数の結腸直腸病変を有するか否かを決定するためのモデルとして独立して役立ちうる。
【０２１４】
（G）1つまたは複数の分類子に起因する公式を作製することによるバイオマーカーの組み合わせの試験
本発明はさらに、1つもしくは複数の結腸直腸病変、または1つもしくは複数のサブタイプの結腸直腸病変の試験能に関して、表1、表2、表11、もしくは表12からのバイオマーカー、またはそのサブセットの組み合わせを試験する手段を提供する。同様に、1つまたは複数の結腸直腸病変または1つもしくは複数のサブタイプの結腸直腸病変の有無に関して個体を試験する能力に関して試験される組み合わせを評価する方法も提供される。バイオマーカーの組み合わせを試験して分類子を作製するために、本発明の数学的モデルを用いることができる。本発明の数学的モデルは、バイオマーカーまたはその選択されるサブセットの全ての組み合わせからのバイオマーカーのそれぞれの選択される組み合わせを試験するために用いることができる。
【０２１５】
いくつかの態様において、組み合わせとして試験されるバイオマーカーをさらに選択することが有用である。1つの態様において、個々のバイオマーカーが2つの表現型形質亜群を区別しうる基準としてのp値に基づいて、個々のバイオマーカーを選択することができる。このように、1つの態様において、p値が0.2、0.1、0.5未満である；0.1未満、0.05未満、0.01未満、0.005未満、0.001未満、0.0005未満、0.0001未満、0.00005未満、0.00001未満、0.000005未満、0.000001未満等であるバイオマーカーを、モデルに入力することによって組み合わせて試験するために選択する。本発明者らはまた驚くべきことに、0.2より大きいp値を示した（およびこのように、有用な個々のバイオマーカーであると通常見なされないと考えられる）バイオマーカーでさえも、2つの表現型形質亜群を区別するために含まれるバイオマーカーの組み合わせの能力を有意に増加させることを見いだした。他の態様において、組み合わせて試験するためにモデルに入力するためのバイオマーカーは、2つの表現型形質亜群のあいだでのバイオマーカー産物の発現差異の変化倍率に基づいて選択される。血液中の変化倍率の差異を測定する場合、変化倍率の差は非常に小さくなりえて、このようにいくつかの態様において、分類子に入力するためのバイオマーカーサブセットの選択は、変化倍率が1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.125、1.15、1.175、1、1.2、1.225、1.25、1.275、1.30より大きい、1.3より大きい、1.4より大きい、1.5より大きい、1.6より大きい、1.7より大きい、1.8より大きい、1.9より大きい、2.0より大きい、2.1より大きい、2.2より大きい、2.3より大きい、2.4より大きい、2.5より大きい、2.6より大きい、2.7より大きい、2.8より大きい、2.9より大きい、3.0より大きい、3.1より大きい、3.2より大きい、3.3より大きい、3.4より大きい、3.5より大きい、4.0より大きい等である、変化倍率の差異に基づく。なお他の態様において、組み合わせて試験するためのバイオマーカーのサブセットを選択するために、表現型形質亜群内で個人におけるバイオマーカー産物の発現レベルを表すデータの変動性として変動係数も同様に考慮に入れることができる。いくつかの態様において、当業者によって理解されるように、p値、変化倍率、変動係数を含む要因の組み合わせに基づいてバイオマーカーを選択することは有益である。いくつかの態様において、バイオマーカーデータに起因するp値に基づいて、先に述べたようにバイオマーカーを最初に選択して、次に、バイオマーカーデータから決定された変化倍率の差異に基づいてバイオマーカーの亜選択を選択する。他の態様において、変化倍率の差異に基づいてバイオマーカーを最初に選択した後、p値に基づいて亜選択を行う。いくつかの態様において、1つまたは複数の選択基準およびその後の階級付けを用いることによって、モデルに入力するための階級付けされたバイオマーカーの上位2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、30％、40％、50％またはそれより多い選択が可能となる。いくつかの態様において、選択されるバイオマーカーの望ましい数は、4,000；3,000；2,000；1,000；900；800；700；600；500；400；300；200；190；180；170；160；150；140；130；120；110；100；90；80；70；60；50；40；30；20；または10個でありうる。他の態様に���いて、先に記述した選択基準は、モデルにおいて用いるために選択されたバイオマーカーの望ましい数に基づいて設定することができる。理解されるように、個々に同定されたバイオマーカーまたは個々に同定されたバイオマーカーのサブセットの全てを選択することができ、バイオマーカーの有用な組み合わせを同定するために、選択されたバイオマーカーの起こりうる全ての組み合わせを試験することができる。もう1つの態様において、バイオマーカーのサブセットを選択して、バイオマーカーの有用な組み合わせを同定するために、そのサブセットからの2つのバイオマーカー、そのサブセットからの3つのバイオマーカー、そのサブセットからの4つのバイオマーカー、そのサブセットからの5つのバイオマーカー、そのサブセットからの6つのバイオマーカー、そのサブセットからの7つのバイオマーカー、そのサブセットからの8つのバイオマーカー、そのサブセットからの9つのバイオマーカー、またはそのサブセットからの10のバイオマーカーの起こりうる全ての組み合わせを試験することができる。組み合わせて試験するために個々の選択されたバイオマーカーの数を決定するための、およびバイオマーカーの起こりうる組み合わせの数を選択するための選択基準は、モデルに起因する分類子を計算および評価するために利用しうるバイオマーカーデータおよび／またはコンピュータ資源を得るために利用しうる資源に依存すると考えられる。
【０２１６】
次に、数学モデルによって生成された分類子は、分類子を生成するために用いられる集団の2つの表現型形質（すなわち、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する、または有しない）の1つに関して分類子が各個体を正確に呼び出す能力を決定することによって評価されうる。好ましい態様において、モデルを導き出すために用いられる訓練集団の個体は、モデルを試験するために用いられる訓練集団の個体とは異なる。当業者によって理解されるように、これによって、表現型形質の特徴付けが不明な個体を適切に特徴付けする能力に関する組み合わせの能力を予測することが可能になる。
【０２１７】
数学的モデルに入力されるデータは、評価されるバイオマーカー産物の発現レベルを表す任意のデータでありうる。本発明に従って有用な数学的モデルには、教師ありまたは教師なし学習技術を用いるモデルが含まれる。本発明の好ましい態様において、選択される数学的モデルは、本発明のバイオマーカーの起こりうる組み合わせのそれぞれを評価するために「訓練集団」と共に教師あり学習を用いる。本発明の1つの態様において、用いられる数学的モデルは、以下から選択される：回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、ニューラルネットワーク、クラスタリングモデル、主成分分析、最近傍分類子分析、線形判別分析、正規母集団判別分析、サポートベクトルマシン、意志決定樹図、遺伝子アルゴリズム、バギングを用いる分類子最適化、ブースティングを用いる分類子最適化、ランダムサブスペース法を用いる分類子最適化、射影追跡法、遺伝子プログラミング、および重み付き投票。好ましい態様において、ロジスティック回帰モデルを用いる。もう1つの好ましい態様において、ニューラルネットワークモデルを用いる。
【０２１８】
本発明の数学的モデルをデータに適用した結果、1つまたは複数のバイオマーカーを用いて1つまたは複数の分類子が生成されると考えられる。いくつかの態様において、所定の目的（例えば、全てが十分なAUCおよび／または感度および／または特異度を有する）にとって満足のゆく多数の分類子を作製する。例えば、いくつかの態様において、1つより多い分類子を利用する公式を生成する。例えば、一連の分類子（例えば、最初に分類子Aの結果を得て、次に、分類子Bの結果を得て、例えば分類子Aは、病変を非病変と識別する；次に分類子Bは、病変が結腸直腸癌であるか結腸直腸癌でないかを決定する）を利用する公式を生成することができる。もう1つの態様において、1つより多い分類子の結果の重み付けに起因する公式を生成することができる。例えば、それぞれの分類子の結果にスコア1を与えて、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率の指標は、所定の公式の選択された分類子のそれぞれのスコアの合計の結果である。起こりうるその他の分類子の組み合わせおよび重み付けは理解され、本明細書に含まれる。
【０２１９】
生成された分類子を用いて、未知対象または試験対象を試験することができる。1つの態様において、ロジスティック回帰によって生成された等式からの結果は、個体が1つもしくは複数の結腸直腸病変を有するか、または「正常な」個体であるかという質問に答えるものである。本発明のなおもう1つの態様において、先の質問に対する答えは、確定できない答えであってもよい。
【０２２０】
本発明の1つの態様において、それぞれの分類子は、当業者に公知の方法を用いて訓練集団のそれぞれの個体を適切に特徴付けするか否かに関して評価される。例えば、クロスバリデーション、Leave One outクロスバリデーション（LOOCV）、n-foldクロスバリデーション、開示される標準的な統計法を用いるジャックナイフ分析を用いて、分類子を評価することができる。本発明のもう1つの態様において、それぞれの分類子は、分類子を生成するために用いられない訓練集団の個体を適切に特徴付けするか否かに関して評価される。
【０２２１】
1つの態様において、訓練集団のそれぞれの個体を適切に特徴付けするか否かに関して分類子を評価するために用いられる方法は、分類子の感度（TPF、真の陽性分画）および1−特異度（TNF、真の陰性分画）を評価する方法である。1つの態様において、分類子を試験するために用いられる方法は、生成された等式の結果の感度および特異度の双方を評価するためのいくつかのパラメータを提供する受信者動作特性（「ROC」）である。受信者動作特性（「ROC」）を用いる1つの態様において、ROC面積（曲線下面積）を用いて等式を評価する。0.5、0.6、0.7、0.8、0.9より大きいROC面積が好ましい。好ましいROC面積スコア1.0は、感度100％および特異度100％の双方を有することを示す。いくつかの態様において、分類子は、スコアに基づいて選択される。例えば、用いられる採点システムが、ROC曲線下面積によって決定される受信者動作特性（ROC）曲線スコアである場合、いくつかの態様において、0.95、0.9、0.85、0.8、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、または0.45より大きいスコアを有する分類子を選択する。他の態様において、特異度が分類子の使用にとって重要である場合、感度の閾値を設定して、選択される特異度に基づいて分類子の等級付けを行う。例えば、0.95、0.9、0.85、0.8、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、または0.45より大きい特異度に関するカットオフで分類子を選択することができる。同様に、特異度の閾値を設定して、0.95、0.9、0.85、0.8、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、または0.45より大きい感度に基づいて等級付けされる分類子を選択することができる。このように、いくつかの態様において、上位10位の分類子、上位20位の分類子、または上位100位の分類子のみを選択する。
【０２２２】
当業者によって理解されるように、数学的モデルによって決定された組み合わせおよび分類子の有用性は、モデルに入力するためのデータを生成するために用いられる集団の表現型に依存すると考えられる。特定の態様の例を本明細書においてより詳しく記述する。
【０２２３】
（H）数学的モデルに入力するための集団
入力のために用いられる集団は、統計学的に有意な得られた分類子が得られるように選択しなければならない。いくつかの態様において、参照または訓練集団には対象10〜30人が含まれる。もう1つの態様において、参照集団は対象30〜50人を含む。なお他の態様において、参照集団にはそれぞれが50〜100、100〜500、500〜1000、または1000人より多い対象を含む2つまたはそれより多い集団が含まれる。参照集団には2つまたはそれより多い亜集団が含まれる。好ましい態様において、亜集団の表現型形質特徴は、1つまたは複数の結腸直腸病変の存在に関する診断を除き類似しており、例えば亜集団内の分布は亜集団の年齢および性別に関して類似している。同様に、亜集団はほぼ同数であること好ましい。本明細書に記載の方法は、集団のあらゆるメンバーからのデータを用いることを必要としない代わりに、問題となる集団のサブセットからのデータに依存する可能性があることを理解すべきである。
【０２２４】
例えば、任意のポリープを有する、または任意のポリープを有しない個体を同定するために有用なバイオマーカーを同定するための数学的モデルに入力するための参照または試験集団に関して、参照集団は、ポリープを有する個体（第一の亜集団）およびポリープを有しない個体（第二の亜集団）を含む。ポリープを有する、またはポリープを有しない亜集団を特徴付けする目的のために、直腸指診、便潜血試験、硬性S字結腸鏡、軟性S字結腸鏡、バリウム注腸撮像法、結腸鏡検査、および組織学検査を含む、任意の確認された方法を用いることができる。好ましくは、その診断が確定した個人のみを参照集団の一部として利用する。
【０２２５】
もう1つの態様において、高リスクポリープを有するまたは有しない個体を同定するために有用なバイオマーカーを同定するために、参照集団は、高リスクポリープを有する個体（第一の亜集団）と、高リスクポリープを有しない個体（第二の亜集団）とを含み、高リスクポリープは以下のとおりである：管状絨毛性線腫、絨毛性線腫、癌、高度異形成、および10 mmより大きい管状腺腫。高リスクポリープを有するまたは有しない亜集団を特徴付けする目的のために、直腸指診、便潜血試験、硬性S字結腸鏡、軟性S字結腸鏡、バリウム注腸撮像法、結腸鏡検査、および組織学検査を含む任意の確認された方法を用いることができる。
【０２２６】
なおもう1つの態様において、結腸直腸癌の初期段階を有するまたは有しない個体を同定するために有用なバイオマーカーを試験するために、参照集団は、例えば他のタイプの結腸直腸癌（例えば、後期）を有する個体と比較して局所結腸直腸癌を有する個体を含みうる。
【０２２７】
もう1つの態様において、高リスクポリープを有する個体または有しない個体を同定するために有用なバイオマーカーを同定するために、参照集団は、高リスクポリープ（第一の亜集団）および高リスクポリープを有しない個体（第二の亜集団）を含み、高リスクポリープは以下のとおりである：管状絨毛性線腫；絨毛性線腫；癌；高度異形成；および管状腺腫。
【０２２８】
（I）結腸直腸病変を試験するための分類子を同定するための数学的モデルに入力するためのデータ
数学的モデルに入力するためのデータは、本発明のバイオマーカーの産物レベルを表すデータである。そのため、データは、mRNAおよび／またはタンパク質のいずれかを含む本発明のバイオマーカーの産物の発現レベルの基準である。
【０２２９】
本発明の1つの態様において、測定される本発明のバイオマーカーのRNA産物は、mRNAおよびmRNAの全てのスプライシング変種を含むRNA産物の集団である。本発明のもう1つの態様において、測定される産物は、血液において発現される全てのmRNA産物である。本発明のなおもう1つの態様において、測定される産物には、血液において発現されるmRNAの1つまたは複数の特異的スプライシング変種が含まれる。本発明のなおもう1つの態様において、測定される産物は、表3または表13に記載のRNA産物である。
【０２３０】
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物も同様に、本発明の範囲に含まれる。本発明を実施するために、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の測定を、1つまたは複数の結腸直腸病変に関して試験する目的で用いることができる。より詳しくは、任意のポリープを有するまたは有しない個体において差異的に発現されるバイオマーカーのタンパク質産物の集団の測定は、試験の目的にとって有用であり、本発明に含まれる。
【０２３１】
本発明の1つの態様において、タンパク質産物は、表1、表2、表11、または表12に記載のバイオマーカーから翻訳される産物である。もう1つの態様において、タンパク質産物は、血液において発現される産物である。本発明のなおもう1つの態様において、タンパク質産物は、表3または表13に記載のタンパク質に対応する産物である。
【０２３２】
なおもう1つの態様において、バイオマーカーのタンパク質産物およびRNA産物の組み合わせの発現レベルを反映するデータを用いる。当業者によって理解されるように、入力データの他の組み合わせを利用して、本発明に従って有用な分類子を生成することができる。
【０２３３】
他の態様において、当業者によって理解されるように、集団の各メンバーにおける各バイオマーカーを反映するデータは、分類子の作製を許容するために各参照集団の十分なメンバーに関するデータが存在する限り、必要ではない。例えば集団のメンバーの99％、95％、90％、85％、80％、または75％におけるバイオマーカーを表すデータは、所定の状況において十分でありうる。
【０２３４】
（J）数学的モデル
本明細書に記述される方法によって用いられる式は一般的に以下の式を含んでもよい。
V＝C＋Σβif(Xi)＋Σβijf(Xi, Xj)＋Σβijkf(Xi, Xj, Xk)＋…
式中、Vは、対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す値であり、Xiは試験対象からの試料におけるi番目のバイオマーカーの1つまたは複数の産物レベルであり、βiはi番目のバイオマーカーのみを含む項に関する係数であり、βijは、i番目およびj番目のバイオマーカーの関数である項の係数であり、βijkは、i番目、j番目、およびk番目のバイオマーカーの関数である項の係数であり、ならびにCは定数である。4つまたはそれより多いバイオマーカーに依存する項などの、さらに他の項が本公式に含まれてもよい。
【０２３５】
「示す」は、Vが実際の確率でありうる（0〜1までの数字）、またはVは、そこから確率を容易に誘導しうる数量でありうることを意味する。
【０２３６】
様々なバイオマーカーの発現レベルに依存する様々な形の関数f(Xi, Xj…)が存在する。例えば、関数はそれらの発現レベルにおける多項式であってもよく、すなわちその数の累乗された様々なバイオマーカーの積を含んでもよい。例には、XiXj2、XiXjXk、(XiXj)1/2、XiXj＋XiXkが含まれる。関数はさらに、もしくは代替的に発現レベルの対数、指数、またはさらに他の関数を含んでもよい。
【０２３７】
特定の態様において、f(Xi, Xj…)は、バイオマーカーの発現レベルの比に依存し、すなわちf(Xi, Xj…)＝Xi/Xjである。
【０２３８】
回帰モデル
いくつかの態様において、本発明において同定されたバイオマーカーのいくつかまたは全てに関する発現データを、1つまたは複数の結腸直腸病変を診断するために有用な分類子を同定するために、ロジスティック回帰モデルまたは直線回帰モデルのような、しかしこれらに限定されない回帰モデルにおいて用いる。回帰モデルは、分類子を生成するために、表1、表2、表11、または表12において同定された2つまたはそれより多いバイオマーカーの様々な組み合わせを試験するために用いられる。回帰モデルの場合、その結果である分類子は、等式におけるバイオマーカーのそれぞれの発現を表すデータに、回帰モデルによって生成された重み付き係数を乗じる、所定の表現型の有無を表す従属変数Yを提供する等式の形である。生成された分類子は、試験対象からの発現データを分析するために用いることができ、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を示す結果を提供する。一般的に、対象の多数の回帰等式は以下のように書くことができる。
Y＝α+β1X1＋β2X2＋…＋βkXk＋ε
式中Yは、従属変数であり、第一の亜群に関連する生物学的特色（例えば、1つまたは複数の結腸直腸病変の有無）の存在（Yが正である場合）または非存在（Yが負である場合）を示す。このモデルは、従属変数Yが、k個の説明変数（参照集団における第一および第二の亜群における対象から、選択された遺伝子（例えば、バイオマーカー）k個に関して測定された特徴値）に加え、様々な明記されない省略因数を含む誤差の項に依存することを言っている。上記のモデルにおいて、パラメータβ1は、従属変数Y（例えば、重み付き因数）上の第一の説明変数X1の効果を測定して、他の説明変数定数を保持する。同様に、β2は、Y上の説明変数X2の効果を与え、残りの説明変数を一定に保持する。
【０２３９】
ロジスティック回帰モデルは、直線回帰の非一次変換である。ロジスティック回帰モデルはしばしば、「ロジット」モデルと呼ばれ、
ln[p/(1-p)]＝α＋β1X1＋β2X2＋…＋βkXk＋ε、または
[p/(1-p)]＝expαexpβ1X1expβ2X2×…×expβkXkexpε
として表すことができ、式中
αおよびεは、定数であり、
lnは自然対数logeであり、e＝2.71828であり、
pは事象Yが起こる確率であり、p(Y＝1)、
p/(1-p)は「オッズ比」であり、
ln[p/(1-p)]は対数オッズ比または「ロジット」であり、および
モデルの他の全ての変数は、先に記述した一般的な直線回帰等式と同じである。αおよびεの項を1つの定数に重ねることができることは当業者によって認識されると考えられる。実際に、好ましい態様において、αおよびεを表すために1つの項が用いられる。「ロジスティック」分布はS字状の分布関数である。ロジット分布は、推定確率（p）が0〜1のあいだに入るように拘束する。
【０２４０】
本発明のいくつかの態様において、ロジスティック回帰モデルは、最大尤度推定（MLE）によって適合される。言い換えれば、係数（例えば、α、β1、β2…）は、最大尤度によって決定される。尤度は、条件付き確率（例えば、P(Y|X)、Xが与えられた場合のYの確率）である。尤度関数（L）は、試料データセットにおいて起こる従属変数値（Y1、Y2、…、Yn）の特定のセットを観察する確率を測定する。これは従属変数の積の確率として書かれる。
L＝Prob(Y1*Y2***Yn)
【０２４１】
尤度関数がより高ければ、試料においてYsを観察する確率はより高くなる。MLEは、可能な限り大きい尤度関数（LL＜0）の対数、または可能な限り小さい尤度関数の対数の-2倍（-2LL）を作製する係数（α、β1、β2、…）を発見する段階を伴う。MLEにおいて、パラメータのいくつかの最初の推定値α、β1、β2、…を作製する。次に、これらのパラメータ推定値を考慮してデータの尤度を算する。パラメータ推定値を改善して、データの尤度を再計算する。パラメータ推定値が大きく変化しなくなるまで（例えば、確率の変化0.01未満または0.001未満）このプロセスを繰り返す。ロジスティック回帰および適合ロジスティックロジスティック回帰モデルの例は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Hastie, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York, 2001, pp. 95-100において見いだされる。
【０２４２】
ニューラルネットワーク
もう1つの態様において、本発明のバイオマーカーのそれぞれに関して測定された発現を用いて、ニューラルネットワークを訓練することができる。ニューラルネットワークは、二段階回帰または分類モデルである。ニューラルネットワークはバイナリまたは非バイナリでありうる。ニューラルネットワークは、重みをつけた層によって出力単位の層に接続された入力単位（およびバイアス）の層が含まれる層化構造を有する。回帰の場合、出力単位の層には、典型的に1つのみの出力単位が含まれる。しかし、ニューラルネットワークは、多数の定量的反応を継ぎ目なく取り扱うことができる。そのため、ニューラルネットワークを適用して、2つより多い（すなわち、2つより多い表現型形質）集団を識別するバイオマーカーを同定することができる。1つの特定の例において、ニューラルネットワークは、1つまたは複数の結腸直腸病変に対して特異的なバイオマーカーのそれらの組み合わせを同定するために、表1、表2、表11、または表12におけるバイオマーカーの産物からの発現データを用いて訓練することができる。その結果、訓練されたニューラルネットワークを用いて、1つまたは複数の結腸直腸病変に関して試験するために有用なバイオマーカーの組み合わせを直接同定することができる。いくつかの態様において、EasyNN-Plusバージョン4.0gソフトウェアパッケージ（Neural Planner Software Inc.）において見いだされるニューロン10個の1つの隠れた層（隠れた単位10個）を含む逆伝播ニューラルネットワーク（例えば、Abdi, 1994, 「A neural network primer」, J. Biol System. 2, 247-283を参照されたい）を用いる。
【０２４３】
ニューラルネットワークは、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、 Duda et al., 2001, Pattern Classification, Second Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York；およびHastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer- Verlag, New Yorkにおいて記述される。
【０２４４】
特異値分解（SVD）および主成分分析（PCA）
特異値分解（SVD）および主成分分析（PCA）は、多変量データの分析のための一般的な技術であり、本発明者らは遺伝子発現データがSVD/PCAを用いる分析に十分に適していることを見いだした。SVD、または同等に、この場合PCAは、以下のように定義される。
【０２４５】
特異値分解（SVD）および主成分分析（PCA）は、多変量データの分析のための一般的な技術であり、本発明者らは遺伝子発現データがSVD/PCAを用いる分析に十分に適していることを見いだした。SVD、または同等に、この場合PCAは、以下のように定義される。
【０２４６】
Gが階数rのm×n個の遺伝子発現行列であって、m≧nであるとすると、r≦nとなり、ここで、mは行列のデータの行であり、nは列である。マイクロアレイデータの場合、gijはj番目のアッセイにおけるi番目のバイオマーカーの1つまたは複数の産物のレベルである。Gのi番目の行の要素はn次元ベクトルbiを形成し（bはバイオマーカーである）、これを本発明者らはi番目のバイオマーカーの転写反応と呼ぶ。または、Gのj番目の列の要素は、m次元ベクトルajを形成し、これを本発明者らはj番目のアッセイの発現プロフィール（または遺伝子発現プロフィール）と呼ぶ。
【０２４７】
Gの特異値分解のための等式は以下の通りである。
G＝USVT
式中、Uはm×n行列であり、Sはn×n直交行列であり、VTも同様にn×n行列である。Uの列は左特異ベクトル{uk}と呼ばれ、アッセイ発現プロフィールの正規直交基礎を形成し、i＝jの場合ui・uj＝1であり、それ以外の場合ui・uj＝0である。VTの行は、右特異ベクトルの要素{vk}を含み、遺伝子転写反応の正規直交基礎を形成する。Sの要素は直交上での唯一の非ゼロであり、特異値と呼ばれる。このように、S＝diag(s1…sn)である。さらに、1≦k≦rの場合sk＞0であり、(r＋1)≦k≦nの場合si＝0である。慣例的に、特異ベクトルの順序は、特異値の高から低へのソーティングによって決定され、最高の特異値はS行列の上左指標に存在する。平方の対称な行列Xに関しては特異値分解は対角化と、または固有値問題の解と同等である。
【０２４８】
他の数学的モデル
上記のパターン分類および統計的技術は、1つまたは複数の結腸直腸病変を診断または検出するために有用な分類子を構築するために用いることができるモデルのタイプの単なる例に過ぎず、例えばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられるpages 211-256 of Duda and Hart, Pattern Classification and Scene Analysis, 1973, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkにおいて記述されるクラスタリング；主成分分析（参照により本明細書に組み入れられる、Jolliffe, 1986, Principal Component Analysis, Springer, New Yorkを参照されたい）；最近傍分類子分析（例えばDuda, Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc；およびHastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New Yorkを参照されたい）；線形判別分析（例えばDuda, Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc；およびHastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York；Venables & Ripley, 1997, Modern Applied Statistics with s-plus, Springer, New Yorkを参照されたい）；サポートベクトルマシン（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Cristianini and Shawe-Taylor, 2000, An Introduction to Support Vector Machines, Cambridge University Press, Cambridge, Boser et al, 1992, "A training algorithm for optimal margin classifiers, in Proceedings of the 5th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theory, ACM Press, Pittsburgh, PA, pp. 142-152；Vapnik, 1998, Statistical Learning Theory, Wiley, New Yorkを参照されたい）である。
【０２４９】
コンピュータの実行
本明細書に記述される方法は、好ましくは適切にプログラムされたコンピュータによって実行される。本明細書に記述される方法と共に用いるためのコンピュータシステムは、本明細書においてさらに記述されるように、データを受け取って処理するように形成され、単プロセッサまたはマルチプロセッサコンピュータシステムであってもよい。適したコンピュータシステムの例には、メインフレームコンピュータ、ミニコンピュータ、パーソナルコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ノートブックコンピュータ、携帯型コンピュータ、パーソナルデジタルアシスタント、携帯電話、セットトップボックス、マイクロプロセッサに基づく家庭用電化製品、プログラム可能な家庭用電化製品等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。さらに、本発明の方法は、ネットワーク接続されたコンピュータ、CPUクラスタ、ワークステーション、およびいわゆるメインフレームコンピュータにおいて実施されてもよい。コンピュータシステムはローカルアセスコンピュータ、遠隔アクセスコンピュータシステム（例えば、サーバー）、または両者の組み合わせであってもよい。用途および目的に応じて、コンピュータシステムは「インターネット」[ワールドワイドウェブ(WWW)]にアクセスしてもよく、またはアクセス可能であってもよい。コンピュータシステムは孤立システムであってもよく、またはネットワークを通して互いに伝達可能な多数のデバイスを含む配置システムであってもよいと認識されると考えられる。用途および目的に応じて、コンピュータシステムは静的または移動可能なコンピュータシステムであってもよい。当業者は、本発明の任意の局面を実施するために適したコンピュータシステムを選択する、得る、および利用するための必要な知識および熟練を有すると考えられる。
【０２５０】
したがって、様々な方法および公式が、コンピュータプログラム指示の形で実行され、同様に本明細書に記述されるようにコンピュータ上で実行されることは本明細書の記述と一貫する。プログラムの指示を表現するための適したプログラミング言語には、C, C++、FORTRAN77またはFORTRAN90のようなFORTRANの態様、Java、Visual Basic、Perl、Tcl/Tk、JavaScript、およびADAからなる群より選択される1つまたは複数の言語が含まれるがこれらに限定されるわけではない。方法の様々な局面は互いに異なるコンピュータ言語で書かれてもよく、そのような言語は特定の用途にとって好ましく、様々な局面は、所定のコンピュータ上で利用可能な適当なシステムレベルツールによって互いに伝達されると理解される。
【０２５１】
コンピュータプログラムの指示は、実行のあいだコンピュータメモリに保存されて、CD-Rom、CD-R、CD-RW、フラッシュメモリ、メモリーカード、メモリースティック、DVD-Rom、USB-スティック、光ディスク、または大容量ネットワーク保存ドライブのような、しかしこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の様々な形状のコンピュータ可読媒体にさらに保存されてもよい。このように、コンピュータプログラムの指示はCD-Romのような移動可能な媒体によってユーザーに送達されうること、同様にウェブインターフェースを通してインターネットからのダウンロードによってコンピュータネットワークによって送達されうることは本発明の通常の実施と一貫する。
【０２５２】
図1は、本明細書に記述される方法を実施するために適した一般的な目的のコンピュータシステム100の略図である。自蔵単位として示されるが必ずしもそのように限定されないコンピュータシステム100は、少なくとも1つのデータ処理ユニット（CPU）102、典型的に高速ランダムアクセスメモリと共に非揮発性メモリの双方が含まれる（1つまたは複数の磁気ディスクドライブのような）が、単純なフラッシュメモリであってもよいメモリー104、ユーザーインターフェース108、任意でディスクコントローラー112によって制御されるディスク110、および他のコンピュータと共に他のデバイスとの伝達のための、少なくとも1つの光ネットワークまたは他の伝達インターフェースカード114を含む。少なくとも、CPU102、メモリー104、ユーザーインターフェース108、存在する場合はディスクコントローラー、およびネットワークインターフェースカードは、少なくとも1つの伝達バス106を通して互いに伝達する。
【０２５３】
メモリー104は、典型的に基本システムサービスを提供するためのオペレーティングシステム140；データを見て操作するための、試験対象を診断する目的のための公式を評価するためのユーザーレベルプログラムのようなアプリケーションプログラム152；コンピュータプログラムを書くことを補助するための著作ツール；ファイルシステム142、ユーザーインターフェース108を通してユーザーとの伝達を取り扱うためのユーザーインターフェースコントローラー144、任意で、マイクロアレイデータおよび他の情報を保存するための1つまたは複数のデータベース146、任意でデータのディスプレイを制御するためのグラフィックコントローラー148、および任意で数学的操作を行うことを専門とするフローティングポイントコプロセッサー150が含まれる、手順およびデータを保存する。本発明の方法はまた、図1には示されていないが1つまたは複数の動的に連結されたライブラリに含まれるが、メモリー104もしくはディスク110のいずれかに保存され、またはネットワークインターフェース接続114を通してアクセス可能な機能を利用してもよい。
【０２５４】
ユーザーインターフェース108は、ディスプレイ128、マウス126、キーボード130を含んでもよい。図1において異なる成分として示されるが、これらのユーザーインターフェース成分の1つまたは複数を携帯型コンピュータのような態様において互いに組み入れることができる。ディスプレイ128は、ブラウン管（CRT）、またはアクティブマトリクスもしくはTFT態様に基づくLCDのようなフラットスクリーンディスプレイであってもよく、または共役低分子もしくはポリマーのような光を放射する有機分子に基づくエレクトロルミネッセントディスプレイであってもよい。図1において示されないユーザーインターフェースの他の態様には、例えばキーパッド上のいくつかのボタン、カードリーダー、専用のタッチデバイスを有するもしくは有しないタッチスクリーン、トラックパッド、トラックボール、音声認識ソフトウェアと共に用いられるマイクロフォン、その任意の組み合わせ、または許可されていないユーザーがシステム100に保存されているデータおよびプログラムにアクセスすることを禁止する、指紋センサーもしくは網膜スキャナのようなセキュリティデバイスが含まれる。
【０２５５】
システム100はまた、シリアルもしくはUSBポートに接続される専用のプリンターケーブルを通して直接、またはワイヤレスで、もしくはネットワーク接続を通してプリンター（示していない）のような出力デバイスに接続してもよい。
【０２５６】
データベース146は、任意で、データベースにおけるデータ量がメモリー104に効率よく保存されるには大きすぎる場合、代わりにディスク110に保存してもよい。データベースはまた、部分的に、ネットワークインターフェース接続114を通してコンピュータシステム100と伝達する1つまたは複数の遠隔コンピュータに代わりに保存されてもよい。
【０２５７】
ネットワークインターフェース134は、ケーブルおよびモデムを通して、インターネットもしくはローカルエリアネットワークに、またはイーサネット、ファイアワイヤ、USB接続、もしくはデジタル署名ラインに接続してもよい。好ましくは、コンピュータネットワーク接続はワイヤレスであり、例えばCDMA、GSM、GPRS、ブルーツース、または802.11 a、802.11b、もしくは802.11gのような標準を利用する。
【０２５８】
異なるデバイスおよび位置を超えたシステム10の成分の様々な態様、形状、および分布は、本明細書に記述される方法の実施と一致すると理解されると考えられる。例えば、ユーザーは、データが本明細書に記述される公式に従って分析される、試験対象からのデータを受け入れて、ネットワーク接続を超えてもう1つのデバイスまたは位置にそのデータを伝達する携帯式態様を用いてもよい。そのような分析の結果を他の位置に保存することができ、および／または携帯式態様にさらに伝達して戻すことができる。そのような形状において、試験対象からのデータを受け入れる行為には情報を入力するユーザーの行為が含まれうる。ネットワーク接続には、例えばヘルスケアプロバイダでの遠隔部位でのウェブに基づくインターフェースが含まれうる。または、システム10は、試験対象からのデータを受け入れて、本明細書においてさらに記述されるように公式にデータを入力して、結果を生成し、これをユーザーに表示することによって、データを分析する携帯式デバイスのようなデバイスでありうる。次に、結果をワイヤレスインターフェースのようなネットワークインターフェースによって遠隔地に伝達し戻すことができる。システム100はさらに、ユーザーが、ヘルスケアプロバイダもしくは診断施設のようないくつかの他の団体、または患者に、分析結果を直接e-メールによって送信できるように形成されてもよい。
【０２５９】
（K）試験対象を試験、スクリーニング、または診断するための本発明のバイオマーカーの使用
当業者によって理解されるように、1つまたは複数のバイオマーカーの同定を用いて、試験対象（「試験対象」）におけるバイオマーカー（遺伝子）産物の発現を測定することによって、試験対象内のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変の試験、スクリーニング、または診断を行うことができる。
【０２６０】
1つの態様において、試験対象からの結果を、結腸直腸病変を有する、ポリープを有する、1つもしくは複数のサブタイプのポリープを有する1人もしくは複数の個体、および／またはいかなる結腸直腸病変も有しない、いかなるポリープも有しない、結腸直腸ポリープの1つもしくは複数の特異的サブタイプを有しない1人もしくは複数の個体からの結果でありうる、対照と比較する。
【０２６１】
もう1つの態様において、試験対象のバイオマーカー産物の発現を反映するデータを本発明の公式に入力して、それによって試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有するか否かを決定することができる。結腸直腸病変に関して試験する能力に関してバイオマーカーの組み合わせを試験する場合、同定されたバイオマーカーの組み合わせを用いて個体を診断する場合と同じ公式を用いる必要はない。試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する確率を決定するために、本発明のバイオマーカー産物（RNAおよび／またはタンパク質を含む）を表すデータを本発明の公式に入力する。本発明のバイオマーカーのRNAおよびタンパク質産物のいずれかの発現レベルを測定するために公知の任意の技術を用いて、データを生成することができる。
【０２６２】
1つの態様において、公式を用いることによって、試験対象がポリープを有するか、またはポリープを有しないかを決定することができる。例えば、モデルとしてロジスティック回帰を用いると、Yはポリープの予測因子として用いられ、式中Y＞0であれば、ポリープを有すると診断され、Y＜0であれば、ポリープを有しないと診断される。なおもう1つの態様において、診断が確定できないという第3のカテゴリーの予測も同様に含まれうる。例えば、バイオマーカー（δ）の遺伝子発現を測定するために用いられる方法論において固有の標準偏差を決定することができる。Y＜δであるが＞0である場合、またはY＞-δであるが＜0である場合、試験結果は確定できないと見なされる。
【０２６３】
（L）本発明のバイオマーカー産物を測定するために用いられるポリヌクレオチド
本発明のバイオマーカーのRNA産物に対して特異的または選択的に結合することができるポリヌクレオチドは、バイオマーカーの発現レベルを測定するために用いられる。例えば、オリゴヌクレオチド、cDNA、DNA、RNA、PCR産物、合成DNA、合成RNA、または本発明のバイオマーカーのRNA産物の1つもしくは複数に特異的および／または選択的にハイブリダイズする、天然に存在する、もしくは改変ヌクレオチドの他の組み合わせは、本発明に従って有用である。
【０２６４】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチド、cDNA、DNA、RNA、PCR産物、合成DNA、合成RNA、または本発明のバイオマーカーのRNA産物の1つもしくは複数に特異的かつ選択的にハイブリダイズする天然に存在するもしくは改変ヌクレオチドの他の組み合わせが用いられる。
【０２６５】
（M）本発明のアレイハイブリダイゼーションのバイオマーカーのRNA産物を測定するための技術
本発明の1つの態様において、本発明のバイオマーカーのRNA産物を測定するために用いられるポリヌクレオチドは、本発明の1つの局面に従うアレイを含むように支持体上に局在する核酸メンバーとして用いることができる。核酸メンバーの長さは8〜1000ヌクレオチド長の範囲となりえて、本発明のバイオマーカーのRNA産物に対して特異的となるように選択される。1つの態様において、これらのメンバーは、本発明のバイオマーカーのRNA産物に対して選択的である。核酸メンバーは、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、および／またはcDNAから増幅されたオリゴヌクレオチドまたはPCR産物であってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは長さが約20〜30ヌクレオチドである。ESTはいくつかの態様において、長さが100〜600ヌクレオチドである。アレイ上のプローブとして本発明のバイオマーカーの発現された領域の一部を利用することができることは当業者によって理解されると考えられる。より詳しくは本発明の遺伝子と相補的なオリゴヌクレオチド、および／または本発明の遺伝子に由来するcDNAまたはESTは有用である。オリゴヌクレオチドに基づくアレイに関して、プローブとして有用な対象遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドの選択は、当技術分野において十分に理解されている。より詳しくは、標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする領域を選択することが重要である。オリゴヌクレオチドのTm、GC含有百分率、二次構造の程度、および核酸の長さのような要因は重要な要因である。例えば米国特許第6,551,784号を参照されたい。
【０２６６】
記述されるように、マイクロアレイを用いて、1つもしくは複数の結腸直腸病変、1つもしくは複数のポリープ、または1つもしくは複数のサブタイプのポリープ、を有するまたは有しない個体において差異的に発現される遺伝子を同定および選択することができ、これを用いて本発明のバイオマーカーを用いてポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを診断または検出することができる。マイクロアレイを用いて差異的に発現されたと同定された遺伝子は表1および表11に見ることができる。
【０２６７】
核酸アレイの構築
本発明の方法において、実質的に支持体表面に安定に会合した核酸メンバーのアレイを、1つまたは複数の相補的核酸メンバーがアレイ上の特有の位置で標的核酸と特異的にハイブリダイズする相補的核酸メンバー／標的複合体のハイブリダイゼーションパターンを産生するために十分なハイブリダイゼーション条件で標的核酸を含む試料に接触させる。ハイブリダイズする標的核酸の同一性は、アレイ上の核酸メンバーの位置に関して決定することができる。
【０２６８】
核酸メンバーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および逆転写（RT）のような確立された技術を用いて産生してもよい。これらの方法は、当技術分野において現在公知の方法と類似である（例えば、PCR Strategies, Michael A. Innis (Editor), et al. (1995) and PCR: Introduction to Biotechniques Series, C. R. Newton, A. Graham (1997)を参照されたい）。増幅された核酸は、当技術分野で周知の方法（例えば、カラム精製またはアルコール沈殿）によって精製される。核酸は、プライマー、およびそれが所望の核酸の合成のあいだに産生された不完全な産物を実質的に含まないように単離されている場合、純粋であると見なされる。いくつかの態様において、精製核酸はまた、分子の特異的結合活性を妨害またはそうでなければ隠す可能性がある混入物質を実質的に含まないと考えられる。
【０２６９】
本発明の1つの局面に従うアレイは、異なる核酸20個/cm2を超える密度で支持体の1つの表面に付着する複数の核酸を含み、核酸のそれぞれは、同一でない予め選択された領域（例えば、マイクロアレイ）における支持体の表面に付着する。アレイ上で会合した各試料は、以下により詳細に記述されるように、公知の同一性の、通常、公知の配列の核酸組成を含む。考えられる任意の基板を本発明に使用することができる。
【０２７０】
1つの態様において、支持体の表面に付着する核酸はDNAである。好ましい態様において、支持体の表面に付着する核酸はcDNAまたはRNAである。もう1つの好ましい態様において、支持体の表面に付着する核酸はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって合成されたcDNAである。いくつかの態様において、本発明に従うアレイにおける核酸メンバーは、長さが少なくとも10、25、または50ヌクレオチドである。1つの態様において、核酸メンバーは長さが少なくとも150ヌクレオチドである。いくつかの態様において、核酸メンバーは長さが1000ヌクレオチド未満である。より好ましくは核酸メンバーは、長さが500ヌクレオチド未満である。
【０２７１】
本発明のアレイにおいて、核酸組成物は支持体の表面に安定に会合する。1つの態様において、支持体は、柔軟なまたは堅固な支持体であってもよい。「安定に会合した」とは、それぞれの核酸メンバーが、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で支持体に対して特有の位置を維持することを意味する。そのため、試料は支持体表面に非共有結合的にまたは共有結合的に安定に会合する。非共有結合的会合の例には、非特異的吸着、静電気的相互作用に基づく結合（例えば、イオン対相互作用）、疎水性相互作用、水素結合相互作用、支持体表面に共有結合的に付着した特異的結合対メンバーを通しての特異的結合等が含まれる。共有結合の例には、核酸と堅固な支持体表面上に存在する官能基（例えば、--OH）とのあいだに形成された共有結合が含まれ、官能基は以下により詳細に記述するように、天然に存在してもよく、または導入された連結基のメンバーとして存在してもよい。
【０２７２】
それぞれの組成物に存在する核酸の量は、アレイが用いられるアッセイの際に標的核酸配列の適当なハイブリダイゼーションおよび検出を提供するために十分であると考えられる。一般的に、アレイの支持体に安定に会合した各核酸メンバーの量は、少なくとも約0.001 ngであり、好ましくは少なくとも約0.02 ng、およびより好ましくは少なくとも約0.05 ngであり、量は1000 ngまたはそれより高い量であってもよいが、通常約20 ngを超えないと考えられる。核酸メンバーが全体的な円形の寸法を含むスポットで支持体上に「スポット」される場合、「スポット」の直径は一般的に約10〜5,000μmの範囲であり、通常約20〜2,000μmおよびより通常約100〜200μmの範囲であると考えられる。
【０２７３】
対照核酸メンバーは、ゲノムDNA、ハウスキーピング遺伝子、ベクター配列、植物核酸配列、陰性および陽性対照遺伝子等に対応するオリゴヌクレオチドまたは核酸を含む核酸メンバーを含むアレイ上に存在してもよい。対照核酸メンバーは、その機能が、対象となる特定の「重要な」遺伝子が発現されているか否かを識別せず、むしろ発現のバックグラウンドまたは基礎レベルのような他の有用な情報を提供する、較正または対照遺伝子である。
【０２７４】
他の対照核酸をアレイにスポットして、これを標的発現対照核酸として用いて、それに対してプローブが向けられる標的以外の試料における核酸に対する非特異的結合または交叉ハイブリダイゼーションをモニターする。このように、ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼーションが特異的であるか否かを示す。例えば、標的が存在する場合、完全にマッチしたプローブはミスマッチプローブより一貫して明るくなければならない。さらに、全ての対照ミスマッチが存在する場合、ミスマッチプローブは変異を検出するために用いられる。
【０２７５】
マイクロアレイの使用
本発明に従う核酸アレイは、1つまたは複数の標的核酸配列（すなわち、本発明のバイオマーカーのRNA産物のような）を含む試料における核酸をアッセイするために用いることができる。本発明のアレイは、ポリープ、または1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変の試験、スクリーニング、および／または診断のために、または治療標的のスクリーニング等のために用いることができる。
【０２７６】
アレイはまた、本発明のバイオマーカーの発現パターンに対する特定の活性物質の効果のような、薬物開発および研究のための大規模発現スクリーニングにおいて有用であり、この場合、そのような情報は薬物の有効性および毒性、環境モニタリング、疾患の研究等を明らかにするために用いられる。
【０２７７】
アレイは、結腸病変、または1つもしくは複数のサブタイプの結腸病変を診断する手段として、少なくとも1つの、より好ましくはこれらの配列の組み合わせを用いて作製されうる。
【０２７８】
標準的な試料の選択は、当業者によって十分に理解され、これには、ポリープを有しない個体である1人または複数の正常な個体から単離されたRNAと相補的な試料が含まれると考えられる。
【０２７９】
アレイとのハイブリダイゼーションのための核酸試料の調製
本発明に従ってアレイにハイブリダイズするための試料は、いくつかの態様において、血液からの全RNAに由来する。もう1つの態様において、アレイに関する標的は血液からのmRNAに由来する。
【０２８０】
核酸試料は、1つまたは複数のタイプの化学結合を通して、通常、相補的塩基対形成を通して、通常、水素結合形成を通して、相補的配列の核酸メンバーに結合することができる。
【０２８１】
本明細書において用いられるように、「mRNA転写物に由来する核酸」または「mRNAに対応する核酸」は、mRNA転写物またはその小配列の合成が最終的に鋳型として作用する核酸を指す。このように、mRNAから逆転写されたcDNA、そのcDNAから増幅されたDNA、増幅されたDNAから転写されたRNA等は全て、mRNA転写物に由来または対応し、そのような由来または対応する産物の検出は、試料における当初の転写物の存在および／または量に比例することを示している。このように、適した核酸試料には、遺伝子または複数の遺伝子のmRNA転写物、mRNAから逆転写されたcDNA、cDNAから転写されたcRNA、遺伝子または複数の遺伝子から増幅されたDNA、増幅されたDNAから転写されたRNA等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において用いられる核酸試料は、いくつかの態様において血液に由来する。核酸は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば逆転写またはPCRを用いてヒト血液から合成された一本鎖または二本鎖DNA、RNA、またはDNA-RNAハイブリッドでありうる。
【０２８２】
最も単純な態様において、そのような核酸試料は、血液試料から単離されたmRNA（例えば、cDNA）に対応する全mRNAまたは核酸試料を含む。もう1つの態様において、全mRNAを、例えば酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルム抽出法を用いて、所定の試料から単離して、ポリA+ mRNAをオリゴdTカラムクロマトグラフィーによって、または(dT)n磁気ビーズによって単離する（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed. Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1987)を参照されたい）。好ましい態様において、全RNAはTRIzol（登録商標）試薬（GIBCO/BRL, Invitrogen Life Technologies, Cat. No. 15596）を用いて抽出される。RNAの純度および完全性は260/280 nmでの吸光度、およびアガロースゲル電気泳動後の紫外光のもとでの検査によって評価される。
【０２８３】
いくつかの態様において、例えばごく限られた量の試料（例えば血液1滴）を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの前に核酸試料を増幅することが望ましい。当業者はどのような増幅法を用いても、定量的結果が望ましい場合には、増幅された核酸の相対的頻度を維持するまたは制御する方法を用いるために注意が必要であることを認識すると考えられる。「定量的」増幅法は当業者に周知である。例えば、定量的PCRは同じプライマーを用いて対照配列の公知の量を同時に増幅する段階を伴う。これはPCR反応を較正するために用いられてもよい内部標準を提供する。次に、高密度アレイには、増幅された核酸を定量するために内部標準に対して特異的なプローブが含まれてもよい。定量的PCRに関する詳細なプロトコールは、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N. Y., (1990)において提供される。
【０２８４】
他の適した増幅法には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Innis, et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Application. Academic Press, Inc. San Diego, (1990)）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば、Wu and Wallace, 1989, Genomics, 4:560；Landegren, et al., 1988, Science, 241:1077およびBarringer, et al., 1990, Gene, 89:117を参照されたい）、転写増幅（Kwoh, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86: 1173）、および自立的配列複製（Guatelli, et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０２８５】
特に好ましい態様において、核酸試料mRNAは、逆転写酵素、オリゴdTからなるプライマー、およびファージT7プロモーターをコードする配列によって逆転写されて、一本鎖DNA鋳型を提供する。第二のDNA鎖はDNAポリメラーゼを用いて重合化される。二本鎖cDNAの合成後、T7 RNAポリメラーゼを加えて、RNAをcDNA鋳型から転写する。各1つのcDNA鋳型からの転写の連続ラウンドにより、RNAの増幅が起こる。インビトロ転写法は、当業者に周知であり（例えば、Sambrook、前記を参照されたい）、この特定の方法は、Van Gelder, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 1663-1667によって詳細に記述されており、彼らは、本方法に従うインビトロ増幅が様々なRNA転写物の相対的頻度を保護することを証明する。その上、Eberwine et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3010-3014は、当初の開始材料の106倍より大きい増幅を得るためにインビトロ転写による増幅2ラウンドを用いる、それによって生物試料が限られている場合であっても発現のモニタリングを許容するプロトコールを提供する。
【０２８６】
核酸試料または核酸プローブの標識
核酸試料は、本発明のアレイに対するハイブリダイゼーションを検出することができるように標識される。分子に付着される、または組み入れられるいかなる分析的に検出可能なマーカーも、本発明において用いてもよい。分析的に検出可能なマーカーは、分析的に検出および定量される任意の分子、部分、または原子を指す。
【０２８７】
本発明において用いるために適した検出可能な標識には、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電子的、光学的、または化学的手段によって検出されうる任意の組成物が含まれる。本発明において有用な標識には、標識ストレプトアビジン共役体による染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Dynabeads（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射標識（例えば、3H、125I、35S、14C、または32P）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAにおいて一般的に用いられる他の酵素）、および金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズのような比色標識が含まれる。そのような標識の使用を教示する特許には、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；および第4,366,241号が含まれる。
【０２８８】
そのような標識を検出する手段は、当業者に周知である。このように、例えば、放射標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出してもよく、蛍光マーカーは放射された光を検出するために光検出器を用いて検出してもよい。酵素標識は典型的に、酵素に基質を提供する段階、および基質上の酵素の作用によって産生される反応産物を検出する段階によって検出され、比色標識は、着色された標識を単に可視化することによって検出される。
【０２８９】
当業者に周知の任意の多数の手段によって、標識を組み入れてもよい。しかし、1つの態様において、標識は試料核酸の調製における増幅段階の際に同時に組み入れられる。このように、例えば標識プライマーまたは標識ヌクレオチドによるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、標識された増幅産物を提供すると考えられる。好ましい態様において、先に記述されたように標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識UTPおよび／またはCTP）を用いる転写増幅は、転写された核酸に標識を組み入れる。
【０２９０】
または、標識は当初の核酸試料（例えば、mRNA、ポリA mRNA、cDNA等）に、または増幅が完了した後の増幅産物に直接加えてもよい。標識を核酸に付着させる手段は当業者に周知であり、これには例えば、核酸のキナーゼ処置の後に、試料核酸を標識（例えば、蛍光体）に接合する核酸リンカーのその後の付着（ライゲーション）によるニック翻訳、または末端標識（例えば標識RNAによる）が含まれる。
【０２９１】
もう1つの態様において、蛍光改変はシアニン色素、例えばCy-3/Cy-5 dUTP、Cy-3/Cy-5 dCTP（Amersham Pharmacia）、またはアレクサ色素（Khan,et al, 1998, Cancer Res. 58:5009-5013）によって行われる。
【０２９２】
1つの態様において、比較のために用いられる2つの核酸試料は、識別可能な検出シグナルを産生する異なる蛍光色素によって標識され、例えば正常な腸管細胞から作製された核酸試料をCy5によって標識して、腸管組織細胞から作製された核酸をCy3によって標識する。差異的に標識された標的試料を同じマイクロアレイに同時にハイブリダイズさせる。好ましい態様において、標識核酸試料は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えばエタノール精製またはカラム精製によって精製される。
【０２９３】
もう1つの態様において、核酸試料には、マイクロアレイから生成されたシグナルを標準化するために、マイクロアレイ上の対照プローブにハイブリダイズする1つまたは複数の対照分子が含まれると考えられる。1つの態様において、標識された標準化核酸試料は、先に記述したようにマイクロアレイにスポットされる対照オリゴヌクレオチドと完全に相補的である核酸配列である。もう1つの態様において、標識された標準化核酸試料は、先に記述されたマイクロアレイにスポットされる対照オリゴヌクレオチドと99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％または75％相補的である核酸配列である。ハイブリダイゼーション後の標準化対照から得られたシグナルは、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、「読み取り」効率、および完全なハイブリダイゼーションシグナルをアレイによって変動させる可能性がある他の要因における変動、の制御を提供する。1つの態様において、アレイにおける他の全てのプローブから読み取られるシグナル（例えば、蛍光強度）を、対照プローブからのシグナル（例えば蛍光強度）によって除して、それによって測定を標準化する。
【０２９４】
好ましい標準化核酸試料は、試料に存在する他の核酸試料の長さの平均値を反映するように選択されるが、それらは長さの範囲を含めるように選択される。標準化対照はまた、アレイにおける他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選択することができるが、1つの態様において、1つまたは少数の標準化プローブのみを用いて、それらは、十分にハイブリダイズして（すなわち二次構造を有せず、自己ハイブリダイズしない）アレイ上の任意の核酸にマッチしないように選択される。
【０２９５】
標準化プローブは、ハイブリダイゼーション効率における空間的変動を制御するために、アレイにおける任意の位置で、またはアレイを通して多数の位置に局在する。1つの態様において、標準化対照は、中央と共にアレイの角または縁に存在する。
【０２９６】
ハイブリダイゼーション条件
核酸ハイブリダイゼーションは、試料と相補的核酸メンバーとが相補的塩基対形成を通して安定なハイブリッド二本鎖を形成することができる条件で核酸試料を提供する段階を伴う。次に、ハイブリッド二本鎖を形成しない核酸を洗浄して除去し、残ったハイブリダイズした核酸を、典型的に付着した検出可能な標識の検出を通して検出する。一般的に、核酸は温度を増加させること、または核酸を含む緩衝液の塩濃度を減少させることによって変性すると認識される。低ストリンジェントな条件（例えば、低い温度および／または高い塩）では、ハイブリッド二本鎖（例えば、DNA：DNA、RNA：RNA、またはRNA：DNA）は、アニールした配列が完全に相補的でない場合でも形成されると考えられる。このように、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーで低減される。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高い温度またはより低い塩）では、ハイブリダイゼーションが成功するためには、より少ないミスマッチを必要とする。
【０２９７】
本発明は、Digハイブリダイゼーションミクス（Boehringer）を含むハイブリダイゼーション条件、または例えばAusubel et al.、前記およびSambrook et al.、前記において記述されるようなホルムアミドに基づくハイブリダイゼーション溶液を提供する。
【０２９８】
ハイブリダイゼーション条件を最適にする方法は当業者に周知である（例えば、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N. Y., (1993)を参照されたい）。
【０２９９】
ハイブリダイゼーション後、非ハイブリダイズ標識または非標識核酸を支持体表面から、簡便に洗浄によって除去し、それによって基質表面上にハイブリダイズした標的核酸のパターンを生成する。多様な洗浄条件が当業者に公知であり、用いることができる。標識、ハイブリダイズオリゴヌクレオチドおよび／または核酸の得られたハイブリダイゼーションパターンは、多様な方法で可視化または検出してもよく、試験核酸の特定の標識に基づいて特定の検出法が選択され、代表的な検出手段には、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、光放射測定等が含まれる。
【０３００】
画像獲得およびデータ分析
先に記述したようにハイブリダイゼーションおよび任意の洗浄段階および／またはその後の処置の後、得られたハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションの検出または可視化において、標識の強度またはシグナル値は、検出されるのみならず定量され、そのことはハイブリダイゼーションのそれぞれのスポットからのシグナルが測定されて、ハイブリダイゼーションパターンにおけるアレイ上の特定のスポットにハイブリダイズするそれぞれの末端標識標的のコピー数の計数または絶対値を得るために、公知の数の末端標識核酸によって放出されるシグナルに対応する単位値と比較されることを意味する。
【０３０１】
アレイに対するハイブリダイゼーションから収集されたデータを分析する方法は当技術分野において周知である。例えば、ハイブリダイゼーションの検出が蛍光標識を伴う場合、データ分析には、収集されたデータから基板の位置の関数として蛍光強度を決定する段階、域外値、すなわち既定の統計分布から外れたデータを除外する段階、および残りのデータから試験核酸の相対的結合親和性を計算する段階が含まれうる。得られたデータは、会合するオリゴヌクレオチドおよび／または核酸と、試験核酸とのあいだの結合親和性に従って各領域の強度が変化する画像として表示される。
【０３０２】
以下の検出プロトコールは、各試料が異なる蛍光色素によって標識される、比較される2つの試料の同時分析のために用いられる。
【０３０３】
マイクロアレイのそれぞれの要素を第一の蛍光色に関して走査する。各アレイ成分での蛍光強度は、試料におけるその遺伝子の発現レベルに比例する。走査操作を第二の蛍光標識に関して繰り返す。2つの蛍光強度の比は、2つの試料における相対的遺伝子発現レベルの非常に正確かつ定量的な測定を提供する。
【０３０４】
好ましい態様において、固定された核酸配列の蛍光強度を、Cy3およびCy5蛍光体にとって適したレーザー励起源および干渉フィルターを備えた注文製の共焦点顕微鏡によって撮影した画像から決定する。各蛍光体に関して異なる走査を1ピクセルあたり225μm2の分解能および65,536グレイレベルで行う。ハイブリダイゼーション領域を同定するための画像の分割、2つの蛍光画像のあいだの強度の標準化、および各標的での標準化平均蛍光値の計算は記述されたとおりである（Khan, et al, 1998, Cancer Res. 58:5009-5013. Chen, et al, 1997, Biomed. Optics 2:364-374）。画像の標準化を用いて、異なる2つの蛍光による異なる標識および検出効率を補正する。これは、アレイ上にスポットされた内部対照遺伝子のセットのシグナル強度比を1の値に釣り合わせることによって得られる。
【０３０５】
もう1つの好ましい態様において、アレイはCy3およびCy5チャンネルにおいて走査され、異なる16ビットTIFF画像として保存される。画像を取り込んで、アレイ上の各スポットからのハイブリダイゼーション強度データを捕獲するためのグリッディングプロセスが含まれるソフトウェアによって分析する。各スポットの蛍光強度およびバックグラウンドを差し引いたハイブリダイゼーション強度を収集して、Cy3に対するCy5の測定された平均強度の比を計算する。直線回帰アプローチを標準化のために用いて、測定されたCy5対Cy3強度のスキャッタープロットが勾配1を有するはずであると仮定する。比の平均値を計算して、これを用いてデータを設計し直して勾配を1に調節する。1に等しくない発現比は、遺伝子発現差異の指標として用いられる。
【０３０６】
特定の態様において、試料中の1つまたは複数の核酸配列の転写レベル（およびそれによって発現レベル）を定量することが望ましい場合、核酸試料は、遺伝子もしくは複数の遺伝子のmRNA転写物の濃度またはmRNA転写物（複数）に由来する核酸の濃度が、その遺伝子の転写レベル（従って発現レベル）に比例する試料である。同様に、ハイブリダイゼーションシグナル強度は、ハイブリダイズした核酸の量に比例することが好ましい。比例性は比較的厳密であることが好ましいが（例えば、転写速度の倍加によって、試料核酸プールにおけるmRNA転写物の倍加およびハイブリダイゼーションシグナルの倍加が起こる）、比例性はより緩やかで非線形ともなりえて、それでもなお意味のある結果を提供することができることを当業者は認識すると考えられる。このように、例えば試料mRNA濃度の5倍の差によってハイブリダイゼーション強度の3倍〜6倍の差が起こるアッセイは、ほとんどの目的にとって十分である。より正確な定量が必要である場合、適当な対照を行って、試料調製において導入される変動および本明細書に記述されるハイブリダイゼーションを補正する。さらに、「標準物質」mRNA試料の連続希釈液を用いて、当業者に周知の方法に従って検量線を調製する。当然、転写物の有無の単純な検出が望ましい場合、入念な対照または検量線は必要ではない。
【０３０７】
例えば、アレイ上の核酸メンバーがハイブリダイゼーション後標識されない場合、このことは、核酸メンバーを含む遺伝子がいずれの試料にも発現されていないことを示す。核酸メンバーが単色で標識されている場合、標識された遺伝子は1つの試料に限って発現されたことを意味する。アレイを含む核酸メンバーの2色による標識は、遺伝子が双方の試料において発現されたことを示す。細胞あたり1度発現された遺伝子でさえも検出される（100,000分の1の感度）。比較される2つの試料における発現強度の差は、発現差異を示し、2つの試料の強度の比は1.0に等しくなく、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2.0、3.0、4.0等より大きいか、または0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2等未満である。
【０３０８】
PCR
本発明の1つの局面において、本発明のバイオマーカーのRNA産物の発現レベルは、最初に逆転写酵素（RT）を用いることによって試料からバイオマーカーのRNA産物を増幅することによって測定することができる。組み合わせて、または第二の反応段階として、次に、逆転写された産物をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅することができる。本発明の1つの態様に従って、PCRは当業者によって理解されるように、QRT-PCRでありうる。
【０３０９】
試料からの全RNAまたはmRNAを鋳型として用いて、本発明のバイオマーカーの転写された部分に対して特異的なプライマーを用いて逆転写を開始する。RNAをcDNAに逆転写させる方法は周知であり、Sambrook et al., 1989、前記において記述されている。プライマーの設計は市販のソフトウェア（例えば、Primer Designer 1.0, Scientific Sofware等）を利用して行うことができる。次に、逆転写の産物をPCRの鋳型として用いる。
【０３１０】
PCRは、関心対象の標的配列を増幅するために熱安定性のDNA依存的DNAポリメラーゼによって触媒される多数のDNA複製サイクルを用いることによって、特定の核酸配列を急速に増幅するための方法を提供する。PCRは、増幅される核酸、増幅される配列に隣接する2つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝液、および塩の存在を必要とする。
【０３１１】
PCRの方法は当技術分野において周知である。PCRは、参照により本明細書に組み入れられる、Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335において記述されるように行われる。PCRは、鋳型DNA（少なくとも1 fg；より通常1〜1000 ng）およびオリゴヌクレオチドプライマー少なくとも25 pmolを用いて行われる。典型的な反応混合物には、DNA 2 ml、オリゴヌクレオチドプライマー25 pmol、10 H PCR緩衝液1（Perkin-Elmer, Foster City, CA）2.5 ml、1.25 mM dNTP 0.4 ml、Taq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Foster City, CA）0.15 ml（または2.5単位）、および全量を25 mlにするための脱イオン水が含まれる。鉱油を重層してプログラム可能なサーマルサイクラーを用いてPCRを行う。
【０３１２】
PCRサイクルのそれぞれの段階の長さおよび温度と共にサイクル数は、実質的にストリンジェントな必要条件に従って調節される。アニール温度およびタイミングは、それによってプライマーが鋳型にアニールすると予想される効率と、許容されるミスマッチの程度の双方によって決定される。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適にできることは、中程度の当業者の十分に知識内である。30℃〜72℃のアニーリング温度を用いる。鋳型分子の初回変性は通常、92℃〜99℃で4分間で起こり、その後変性（94〜99℃で15秒〜1分）、アニーリング（先に考察された温度で1〜2分間）、および伸長（72℃で1分間）からなる20〜40サイクルを行う。最終伸長段階は一般的に72℃で4分間行い、4℃で不定の（0〜24時間）段階が後に続いてもよい。
【０３１３】
QRT-PCR（定量的リアルタイムRT-PCR）も同様に、遺伝子発現レベルの定量的測定を提供するために行われる。逆転写PCRと同様に、QRT-PCR逆転写およびPCRは2段階で行うことができ、またはPCRと組み合わせた逆転写を同時に行うことができる。Taqman（Perkin-Elmer, Foster City, CA）のような市販のキットが存在するこれらの技術の1つを、転写物特異的アンチセンスプローブによって行う。このプローブはPCR産物（例えば、遺伝子に由来する核酸断片）に対して特異的であり、オリゴヌクレオチドの5'末端と複合体を形成した消光剤および蛍光レポータープローブと共に調製される。異なる蛍光マーカーを異なるレポーターに付着させて、1回の反応で2つの産物を測定することができる。Taq DNAポリメラーゼを活性化させる場合、これはその5'-3'エキソヌクレアーゼ活性のために、鋳型に結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。消光剤の非存在下では、レポーターは蛍光を発する。レポーターにおける色の変化は、それぞれの特異的産物の量に比例して、蛍光計によって測定される；したがって、それぞれの色の量を測定してPCR産物を定量する。PCR反応は、多くの個体に由来する試料が同時に処理され、測定されるように、96ウェルプレート、384ウェルプレート等において行うことができる。Taqmanシステムはゲル電気泳動を必要としないというさらなる長所を有し、標準曲線と共に用いる場合には定量が可能である。
【０３１４】
PCR産物を定量的に検出するために有用な第二の技術は、市販のQuantiTect SYBR Green PCR（Qiagen, Valencia California）のようなインターカレート色素を用いることである。QRT-PCRは、PCR段階の際にPCR産物に取り込まれて、PCR産物の量に比例して蛍光を産生する蛍光標識としてSYBRグリーンを用いて行われる。
【０３１５】
TaqmanおよびQuantiTect SYBRシステムはいずれも、RNAの逆転写後に用いることができる。逆転写は、PCR段階と同じ反応混合物において行うことができるか（1段階プロトコール）、またはPCRを利用する増幅の前に逆転写を最初に行うことができる（2段階プロトコール）。
【０３１６】
さらに、Molecular Beacons（登録商標）を含む、mRNA発現産物を定量的に測定するための他のシステムが公知であり、これは蛍光分子と消光分子とを有するプローブを利用し、プローブは、ヘアピン型の場合に蛍光分子が消光され、ハイブリダイズすると蛍光が増加するように、ヘアピン構造を形成することができ、遺伝子発現の定量的測定が得られる。
【０３１７】
RNA発現を定量的に測定するためのさらなる技術には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、Qβレプリカーゼ（例えば、国際特許出願番号PCT/US87/00880を参照されたい）、等温増幅法（例えば、Walker et al. (1992) PNAS 89:382-396を参照されたい）、鎖置換増幅（SDA）、修復鎖反応、非対称定量的PCR（例えば、米国特許出願第20030134307A1号を参照されたい）、およびFuja et al., 2004, Journal of Biotechnology 108:193-205において記述される多重ミクロスフェアビーズアッセイが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０３１８】
遺伝子発現レベルは、核酸配列増幅（NASBA）および3SRを含む転写に基づく増幅システム（TAS）を用いて試料からRNAを増幅することによって測定することができる。例えば、Kwoh et al (1989) PNAS USA 86:1173；国際特許出願番号WO 88/10315；および米国特許第6,329,179号を参照されたい。NASBAにおいて、核酸は通常のフェノール／クロロホルム抽出、熱変性、溶解緩衝液による処置、ならびにDNAおよびRNAを単離するためのミニスピンカラム、またはRNAの塩化グアニジニウム抽出を用いて増幅のために調製してもよい。これらの増幅技術は、標的特異的配列を有するプライマーのアニーリングを伴う。重合化後、DNA/RNAハイブリッドをRNアーゼHによって消化して、二本鎖DNA分子を再度熱変性させる。いずれの場合においても、一本鎖DNAは、第二の標的特異的プライマーを加えた後重合化を行うことによって十分に二本鎖となる。次に、二本鎖DNA分子を、T7またはSP6のようなポリメラーゼによって多重に転写する。等温サイクル反応において、RNAを二本鎖DNAに逆転写して、T7またはSP6のようなポリメラーゼによって一度転写する。得られた産物は、切断型または完全であれ、標的特異的配列を示す。
【０３１９】
いくつかの技術を用いて増幅産物を分離してもよい。例えば、増幅産物を、通常の方法を用いて、アガロース、アガロース-アクリルアミド、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離してもよい。Sambrook et al, 1989を参照されたい。電気泳動を行うことなくPCR産物を定量的に検出するためのいくつかの技術も同様に本発明に従って用いてもよい（例えば、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990)を参照されたい）。例えば、クロマトグラフィー技術を使用して分離を行ってもよい。本発明において用いてもよい多くの種類のクロマトグラフィー：吸着、分配、イオン交換、および分子ふるい、HPLC、ならびにカラム、ペーパー、およびガスクロマトグラフィー（Freifelder, Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 2nd ed., Wm. Freeman and Co., New York, N. Y., 1982）を含む技術を用いるための多くの特殊な技術が存在する。
【０３２０】
分離方法論のもう1つの例は、様々なタイプの低分子リガンドとのPCR反応において用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを共有結合的に標識することによって行われる。1つのそのような分離において、異なるリガンドがそれぞれのオリゴヌクレオチドに存在する。リガンドの1つに特異的に結合する分子、おそらく抗体、またはリガンドがビオチンである場合にはアビジンを用いて、96ウェルELISAプレートのようなプレートの表面をコーティングする。そのように調製されたプレートの表面にPCR反応を適用すると、PCR産物は表面に特異的に結合する。非結合試薬を除去するためにプレートを洗浄後、第一のリガンドに結合する第二の分子を含む溶液を加える。この第二の分子はいくつかの種類のレポーターシステムに連結する。第二の分子は、PCR産物が産生されて、それによってオリゴヌクレオチドプライマーが最終的なPCR産物に組み入れられる場合に限ってプレートに結合する。次に、PCR産物の量を、ELISA反応が検出および定量されるように市販のプレートリーダーにおいて検出および定量する。本明細書に記述されるようなELISA様システムは、C-Track商標名としてRaggio Italgene companyによって開発されている。
【０３２１】
増幅産物は、関心対象核酸配列の増幅を確認するために可視化されなければならない。1つの典型的な可視化法は、エチジウムブロミドによるゲルの染色およびUV光の下での可視化を伴う。または、増幅産物が放射標識または蛍光標識ヌクレオチドによって完全に標識されている場合、増幅産物をX線フィルムに露出して、または適当な刺激スペクトルの下で可視化した後分離してもよい。
【０３２２】
1つの態様において、可視化は間接的に行われる。増幅産物の分離後、標識された核酸プローブを対象となる増幅核酸配列に接触させる。1つの態様において、プローブを発色団に共役させるが、放射標識してもよい。もう1つの態様において、結合対の他のメンバーが検出可能な部分を有する、抗体またはビオチンのような結合パートナーにプローブを共役させる。
【０３２３】
もう1つの態様において、検出は標識プローブとのサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションによって行う。サザンブロッティングに関係する技術は、当業者に周知であり、分子プロトコールに関する多くの標準的な本において見いだされると考えられる。Sambrook et al, 1989、前記を参照されたい。簡単に説明すると、増幅産物をゲル電気泳動によって分離する。次に、ゲルを、ニトロセルロースのような膜に接触させて、核酸の移入および非共有結合を許容する。次に、膜を、標的増幅産物とハイブリダイズすることができる発色団共役プローブと共にインキュベートする。検出は、x線フィルムへの膜の露出またはイオン放射検出装置によって行う。
【０３２４】
前述の1つの例は、核酸の自動電気泳動および移入のための装置および方法を開示する、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,279,721号において記述される。装置は、ゲルの外部操作を行うことなく電気泳動およびブロッティングを許容して、理想的には、本発明に従う方法を実行するために適している。
【０３２５】
本発明の1つの態様には、本発明のバイオマーカーの発現を測定するために用いることができる、表4、6、16、または17におけるプライマーおよびプローブが含まれる。
【０３２６】
ヌクレアーゼ保護アッセイ
本発明のもう1つの態様において、ヌクレアーゼ保護アッセイ（リボヌクレアーゼ保護アッセイおよびS1ヌクレアーゼアッセイの双方を含む）を用いて本発明のバイオマーカーのRNA産物を検出および定量することができる。ヌクレアーゼ保護アッセイにおいて、アンチセンスプローブ（例えば、放射標識または非同位元素による標識）は、溶液中でRNA試料にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、一本鎖、非ハイブリダイズプローブおよびRNAをヌクレアーゼによって分解する。アクリルアミドゲルを用いて残りの保護された断片を分離する。典型的に、溶液ハイブリダイゼーションは、膜に基づくハイブリダイゼーションより効率的であり、ブロットハイブリダイゼーションが最大で20〜30μgであるのと比較すると、試料RNA 100μgまで適合させることができる。
【０３２７】
リボヌクレアーゼ保護アッセイは最も一般的なタイプのヌクレアーゼ保護アッセイであり、RNAプローブを用いることを必要とする。オリゴヌクレオチドおよび他の一本鎖DNAプローブはS1ヌクレアーゼを含むアッセイに限って用いることができる。一本鎖アンチセンスプローブは、典型的にヌクレアーゼによる、プローブと標的間のハイブリッドの切断を防止するために標的RNAと完全に相同でなければならない。
【０３２８】
ノーザンブロット
標準的なノーザンブロットアッセイはまた、当業者に公知のノーザンハイブリダイゼーション技術に従って、RNA転写物の大きさを確認するため、選択的にスプライシングされたRNA転写物を同定するため、および本発明のバイオマーカーのRNA産物の相対量を同定するために用いることができる。ノーザンブロットにおいて、RNA試料を最初に、変性条件でのアガロースゲルにおける電気泳動によって大きさによって分離する。次にRNAを膜に転写して、クロスリンクさせ、標識プローブとハイブリダイズさせる。ランダムプライミング、ニック翻訳、またはPCR生成されたDNAプローブ、インビトロ転写RNAプローブ、およびオリゴヌクレオチドを含む、非同位元素または高比活性放射標識プローブを用いることができる。または、ごく部分的な相同性を有する配列（例えば、異なる種からのcDNAまたはエキソンを含んでもよいゲノムDNA断片）をプローブとして用いてもよい。標識プローブ、例えば完全長の一本鎖DNAまたはそのDNA配列の断片のいずれかを含む放射標識cDNAは、長さが少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、または少なくとも100の連続ヌクレオチドであってもよい。プローブは、当業者に公知の任意の異なる多くの方法によって標識することができる。これらの試験のために最も一般的に用いられる標識は、放射活性要素、酵素、紫外光に曝露されると蛍光を発する化学物質、およびその他である。多くの蛍光材料が公知であり、標識として利用することができる。これらには、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、AMCAブルー、およびルシファーイエローが含まれるがこれらに限定されるわけではない。特定の検出材料は、ヤギにおいて調製され、イソチオシアネートを通してフルオレセインに共役される抗ウサギ抗体である。タンパク質はまた、放射活性要素または酵素によって標識することができる。放射活性標識は現在利用可能な任意の計数手順によって検出することができる。同位元素の非制限的な例には、3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131Iおよび186Reが含まれる。酵素標識も同様に有用であり、現在利用可能な比色、分光測光、蛍光分光測光、電流滴定、または気体定量技術のいずれかによって検出することができる。酵素はカルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等のような架橋分子との反応によって、選択された粒子に共役される。当業者に公知のいかなる酵素も利用することができる。そのような酵素の例には、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼに加えペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれるがこれらに限定されるわけではない。米国特許第3,654,090号、第3,850,752号、および第4,016,043号は、代わりの標識材料および方法の開示に関する例として参照される。
【０３２９】
(N) 本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を測定するための技法
抗体に基づく方法
標準的な技法を利用して、試料中に存在する関心対象の1つまたは複数のタンパク質の量を決定することもできる。例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、免疫細胞化学などの例えば免疫測定法を用いる標準的な技法を使用して、試料中に存在する関心対象の1つまたは複数のタンパク質の量を決定することができる。関心対象のタンパク質の検出に好ましい作用物質は、関心対象のタンパク質に結合し得る抗体であり、1つの態様においては検出可能な標識を有する抗体である。
【０３３０】
そのような検出法では、当業者に周知の技法を用いて、解析しようとする試料のタンパク質を容易に単離することができる。タンパク質の単離法は、例えば、Harlow and Lane(Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1988))に記載される方法などであってよい。
【０３３１】
いくつかの態様において、関心対象の1つまたは複数のタンパク質を検出する方法は、タンパク質特異的抗体との相互作用によるその検出を含む。例えば、本明細書に記載のように、関心対象のタンパク質に対する抗体を利用することができる。抗体は、当業者に周知の標準的な技術を利用して作製することができる。例えば、本願の第15.13.2項、およびそのような抗体作製技法のより詳細な考察に関しては、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第20040018200号の第5.2項を参照されたい。簡潔に説明すると、そのような抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。例えば、無傷の抗体または抗体断片(例えば、FabまたはF(ab')2)を用いることができる。いくつかの態様において、抗体はヒトまたはヒト化抗体である。
【０３３２】
表5および表15は、本発明のバイオマーカーのタンパク質を検出するために用いられる抗体を示す、本発明の1つの態様における表である。
【０３３３】
例えば、関心対象のタンパク質に特異的な抗体または抗体断片を用いて、そのタンパク質の存在を定量的にまたは定性的に検出することができる。これは、例えば免疫蛍光技法によって達成することができる。抗体(またはその断片)はさらに、関心対象のタンパク質のインサイチュー検出のために、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法などで組織学的に使用することができる。インサイチュー検出は、患者から組織標本(例えば、生検標本)を採取し、タンパク質に対する標識抗体をそれに加えることによって達成することができる。抗体(または断片)は、生体試料上に標識抗体(または断片)を重層することによって加え得る。そのような手順を用いることで、試料内での関心対象のタンパク質の存在ばかりでなく、その分布、細胞(例えば、腸細胞およびリンパ球)中でのその存在をも決定することが可能となる。そのようなインサイチュー検出を行うために、多種多様な周知の組織学的方法(染色手順など)を利用することができる。
【０３３４】
関心対象のタンパク質の免疫測定法は典型的に、生体試料を関心対象のタンパク質を同定し得る検出可能に標識された抗体と共にインキュベートする段階、および当技術分野で周知のいくつかの技法のいずれかにより、結合した抗体を検出する段階を含む。以下により詳細に論じるように、「標識された」という用語は、例えば抗体に対する検出可能な物質の結合(すなわち、物理的な連結)による、抗体の直接的な標識を指してよく、また直接標識されている別の試薬との反応性による抗体の間接的な標識を指してもよい。間接的な標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いる一次抗体の検出が含まれる。
【０３３５】
例えば、生体試料をニトロセルロースなどの固相支持体もしくは担体、または細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定化し得る他の支持体と接触させ、それに固定化することができる。次いで、適切な緩衝液で支持体を洗浄し、その後検出可能に標識されたフィンガープリント遺伝子特異的な抗体で処理し得る。次に、固相支持体に対して緩衝液で2回目の洗浄を行い、非結合抗体を除去し得る。次いで、支持体上の結合した標識の量を従来の手段により検出することができる。
【０３３６】
タンパク質性作用物質との関連における「固相支持体または担体」とは、抗原または抗体を結合し得る任意の支持体を意味する。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、ならびに磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、本発明の目的ではある程度可溶性であってよく、または不溶性であってもよい。支持体材料は、結合している分子が抗原または抗体に結合し得る限り、実質的に考えられるあらゆる構造形態をとってよい。したがって、支持体の形態は、ビーズのような球状でもよく、または試験管の内面もしくは棒の外面のような円筒形でもよい。または、表面は、シートや試験条片などのように平面であってもよい。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者であれば、抗体または抗原の結合に適した多くの他の担体を知っており、または日常的な実験を用いてそれらを確認することができると考えられる。
【０３３７】
特定の抗体を検出可能に標識し得る方法の1つは、抗体を酵素に連結することによるものであり、酵素免疫測定法(EIA)で使用する(Voller, A., 「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)」, 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD)；Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31:507-520；Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol. 73:482-523；Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL；Ishikawa, E. et al., (eds.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo)。抗体に結合している酵素は、例えば、分光光度測定、蛍光測定、または視覚的手段によって検出することができる化学的部分を生じるような様式で、適切な基質、1つの態様においては発色基質と反応することになる。抗体を検出可能に標識するために用いることができる酵素には、これらに限定されないが、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α-グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。検出は、酵素の発色基質を使用する比色法によって達成することができる。検出はまた、同様に調製した標準物質と比較した、基質の酵素反応の程度の視覚的な比較によって達成することもできる。
【０３３８】
検出はまた、他の様々な免疫測定法のいずれかを用いて達成することができる。例えば、抗体または抗体断片を放射標識することによって、放射性免疫測定法(RIA)を用いて関心対象のタンパク質を検出することが可能となる(例えば、参照により本明細書に組み入れられるWeintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照されたい)。放射性同位体(例えば、125I、131I、35S、または3H)は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。
【０３３９】
抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識抗体を適切な波長の光に曝露した際に、その存在を蛍光により検出することができる。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド(phthaldehyde)、およびフルオレスカミンがある。
【０３４０】
抗体はまた、152Euまたはランタニド系の他のものなどの蛍光発光金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)のような金属キレート基を用いて抗体に結合することができる。
【０３４１】
抗体はまた、これを化学発光化合物に結合することによって、検出可能に標識することもできる。次いで、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することによって、化学発光タグ化抗体の存在を決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０３４２】
同様に、生物発光化合物を用いて、本発明の抗体を標識することができる。生物発光は生物系で見られる化学発光の一種であり、触媒タンパク質によって化学発光反応の効率が増大する。発光の存在を検出することにより、生物発光タンパク質の存在を決定する。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
【０３４３】
タンパク質アレイ
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物に特異的におよび／または選択的に結合するポリペプチドを、タンパク質アレイ上に固定化することができる。タンパク質アレイを手段として用いて、例えば、本発明のバイオマーカーのポリペプチドタンパク質産物の存在に関して、個体試料(単離細胞、組織、リンパ液、リンパ組織、血液、滑液、血清、生検試料など)を試験することができる。タンパク質アレイはまた、例えば本発明のバイオマーカーによってコードされるポリペプチドに結合する、抗体さらには他のリガンドを含み得る。
【０３４４】
ポリペプチドアレイを作製する方法は、例えば、De Wildt et al., 2000, Nature Biotech. 18:989-994；Lueking et al., 1999, Anal. Biochem. 270:103-111；Ge, 2000, Nuc. Acids Res. 28:e3；MacBeath and Schreiber, 2000, Science 289:1760-1763；WO 01/40803およびWO 99/51773A1；ならびに米国特許第6,406,921号に記載されている。アレイ用のポリペプチドは、例えば、例えばGenetic MicroSystemsおよびAffymetrix(米国、カリフォルニア州、サンタクララ)またははBioRobotics(英国、ケンブリッジ)から市販されているロボット装置を用いて、高速でスポットすることができる。アレイの基材は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、例えば表面修飾ガラスなどのガラスであってよい。アレイはまた、多孔性基材、例えばアクリルアミド、アガロース、または別のポリマーを含み得る。
【０３４５】
例えばアレイは、例えばDe Wildt、前記に記載されているような抗体のアレイであってよい。ポリペプチドリガンドを産生する細胞を、アレイ形式でフィルター上で増殖させることができる。ポリペプチドの産生を誘導し、発現した抗体を細胞の位置でフィルターに固定化する。アレイの各アドレスにおける結合程度に関する情報を、例えばコンピュータ・データベース中に、プロファイルとして保存することができる。
【０３４６】
1つの態様において、アレイは、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのタンパク質産物のアレイである。1つの局面において、本発明は、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する、アレイに結合した抗体を提供する。
【０３４７】
(O) タンパク質の産生
標準的な組換え核酸法を用いて、本発明のポリペプチドまたは抗体(例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物)を発現させることができる。一般的には、ポリペプチドをコードする核酸配列を核酸発現ベクター中にクローニングする。当然のことながら、タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合には、発現ベクター中に、例えば同じまたは異なる細胞中で発現する同じまたは異なるベクター中に各鎖をクローニングしなければならない。タンパク質が十分に小さい場合、すなわちタンパク質が50アミノ酸未満のペプチドである場合には、自動化有機合成法を用いてタンパク質を合成することができる。本発明のバイオマーカーの5'領域、3'領域、または内部コード領域を含むポリペプチドを、本発明のバイオマーカーの5'領域、3'領域、または内部コード領域に対応するヌクレオチド配列のみを含む核酸発現ベクターから発現させる。本発明のバイオマーカーのタンパク質産物、または本発明のバイオマーカーの5'領域、3'領域、もしくは内部コード領域によってコードされるポリペプチドに対する抗体を作製する方法。
【０３４８】
ポリペプチドを発現する発現ベクターは、ポリペプチドまたはその断片をコードするセグメントに加えて、関心対象の核酸に機能的に連結した、例えばプロモーターを含む調節配列を含み得る。多くの適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、本発明の組換え構築物を作製するために商業的に入手可能である。一例として、以下のベクターが提供されている。細菌用：pBs、ファージスクリプト、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene、米国、カリフォルニア州、ラホーヤ)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、およびpRIT5(Pharmacia、スウェーデン、ウプサラ)。真核生物用：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXTI、pSG(Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL(Pharmacia)。1つの好ましい種類の好ましいライブラリーはディスプレイライブラリーであり、これについては以下に記載する。
【０３４９】
当業者に周知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチド、および適切な転写／翻訳制御シグナルを含むベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技法、合成技法、およびインビボ組換え／遺伝的組換えが含まれる。例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(2001)、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載されている技法を参照されたい。CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子からプロモーター領域を選択することができる。適切な2つのベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特定の名称の付いた細菌プロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP、およびtrcが含まれる。真核生物プロモーターには、CMV最初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来LTR、マウスメタロチオネイン-I、および当技術分野で公知の様々な組織特異的プロモーターが含まれる。特定の態様において、プロモーターは誘導性プロモーターである。他の態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。さらに他の態様において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。
【０３５０】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、例えば大腸菌(E．coli)のアンピシリン耐性遺伝子およびS. セレビシエ(S． cerevisiae)栄養要求性マーカー(URA3、LEU2、HIS3、およびTRPl遺伝子など)、ならびに下流の構造配列の転写を指示するための高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、特に、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)などの糖分解酵素、a-因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始および終結配列を付加して、いくつかの態様では、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列を付加して、適切な相で構築する。任意に、本発明の核酸は、例えば発現した組換え産物の安定化または精製の単純化など、所望の特徴を付与するN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。有用な細菌発現ベクターは、任意には機能的なプロモーターによる操作可能な読み取り相で、本発明のポリヌクレオチドを適切な翻訳開始および終結シグナルと共に挿入することによって構築する。ベクターは、1つまたは複数の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、必要に応じて宿主内での増幅をもたらす複製起点を含む。形質転換に適した原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ならびにシュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)属内の様々な種が含まれるが、好みにより他のものを使用することもできる。
【０３５１】
代表的かつ非限定的な例として、有用な細菌発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌複製起点を含み得る。そのような市販のベクターには、例えば、pKK223−3(Pharmacia Fine Chemicals、スウェーデン、ウプサラ)およびpGEM1(Promega、米国、ウィスコンシン州、マディソン)が含まれる。
【０３５２】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変された宿主細胞を提供する。例えば、そのような宿主細胞は、公知の形質転換、トランスフェクション、または感染法を用いて宿主細胞内に導入された本発明の核酸を含み得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変された宿主細胞を提供し、そのようなポリヌクレオチドは、細胞内でポリヌクレオチドの発現を駆動する、宿主細胞にとって異種の調節配列と機能的に結合している。
【０３５３】
本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供し、この場合核酸は、公知の形質転換、トランスフェクション、または感染法を用いて宿主細胞内に導入されている。宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞などの下等真核生物宿主細胞のような真核生物宿主細胞であってよく、または宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞であってよい。組換え構築物の宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって行うことができる(Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986))。無細胞翻訳系を使用して、本発明のDNA構築物に由来するRNAを用いて、そのようなタンパク質を生成することもできる。
【０３５４】
任意の宿主／ベクター系を用いて、表3および／または表13に収載するものを含む、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の1つまたは複数を発現させることができる。原核生物および真核生物宿主との使用に適したクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook et al.によってMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。最も好ましい宿主細胞は、特定のポリペプチドを通常では発現しないか、またはそのようなポリペプチドを低い天然レベルで発現する宿主細胞である。
【０３５５】
特定の態様においては、誘導性調節エレメントの制御下で本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように宿主細胞を操作するが、その場合、内因性遺伝子の調節配列は相同組換えによって置換することができる。本明細書に記載するように、遺伝子ターゲティングを用いて、遺伝子の既存の調節領域を、異なる遺伝子から単離した調節配列、または遺伝子工学法によって合成した新規の調節配列と置換することができる。そのような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、足場付着領域、負の調節エレメント、転写開始部位、調節タンパク質結合部位、または前記配列の組み合わせからなり得る。または、タンパク質の輸送もしくは分泌特性を強化もしくは改変するポリアデニル化シグナル、mRNA安定エレメント、スプライス部位、リーダー配列、またはタンパク質もしくはRNA分子の機能もしくは安定性を変更または改善する他の配列を含む、生成されたRNAまたはタンパク質の構造または安定性に影響を及ぼす配列を、ターゲティングにより置換する、除去する、付加する、またはさもなくば改変することができる。
【０３５６】
本発明の宿主はまた、酵母または他の真菌であってもよい。酵母では、構成的または誘導性プロモーターを含むいくつかのベクターを用いることができる。総説に関しては、Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13 (1988)；Grant et al., 1987, 「Expression and Secretion Vectors for Yeast」, Methods Enzymol. 153:516-544；Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3 (1986)；Bitter, 1987, 「Heterologous Gene Expression in Yeast」, Methods Enzymol. 152:673-684；およびStrathern et al. (eds), The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II (1982)を参照されたい。
【０３５７】
潜在的に適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス(Kluyveromyces)株、カンジダ(Candida)、または異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株が含まれる。潜在的に適切な細菌株には、大腸菌(Escherichia coli)、霊菌(Serratia marescans)などの腸内細菌科、枯草菌などの桿菌、ネズミチフス菌、シュードモナス菌、または異種タンパク質を発現し得る任意の細菌株が含まれる。タンパク質を酵母または細菌で作製する場合、機能的なタンパク質を得るために、例えば適切な部位でのリン酸化または糖鎖付加により、そこで産生されたタンパク質を修飾することが必要となり得る。公知の化学法または酵素法を用いて、そのような共有結合を達成することができる。
【０３５８】
種々の哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例には、Gluzman, 1981, Cell 23:175 (1981)によって記載されているサル腎線維芽細胞のCOS-7株などのサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト腎293細胞、ヒト表皮A431細胞、ヒトColo205細胞、3T3細胞、CV-1細胞、正常二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞株、初代移植片、HeLa細胞、マウスL細胞、BHK、HL-60、U937、HaK、C127、3T3、またはJurkat細胞、および適合性ベクターを発現し得る他の細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終結配列、ならびに5'隣接非転写配列を含む。
【０３５９】
タンパク質の発現に使用した微生物細胞は、凍結融解の反復、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来法によって破壊することができる。細菌培養物中に産生された組換えポリペプチドは、細胞ペレットから最初に抽出し、その後、1回または複数回の塩析、水性イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー段階を行うことによって通常単離される。いくつかの態様では、鋳型核酸はまた、ポリペプチドタグ、例えばペンタ-またはヘキサ-ヒスチジンをコードする。
【０３６０】
当技術分野で周知の技法を用いて、組換えタンパク質を単離することができる。例えばScopes (Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1994))は、組換え(および非組換え)タンパク質を精製するためのいくつかの一般的な方法を提供している。その方法には、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、選択的沈殿、透析、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。
【０３６１】
(P) 1つまたは複数の結腸直腸病変の予防、治療、または改善に使用するための化合物を同定する方法
バイオマーカーの発現または活性を調節する化合物を同定する方法
本発明は、本発明のバイオマーカーの産物に結合する化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた、本発明のバイオマーカーの産物の発現および／または活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。そのような方法によって同定された化合物は、ポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む結腸直腸病変を研究するための1つまたは複数の動物モデルの開発に有用である。さらに、そのような方法によって同定された化合物は、1つもしくは複数のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、および／または改善するための予防および治療用組成物の開発におけるリード化合物として有用である。そのような方法は、潜在的予防薬および治療薬のインビボでの試験に関する労力および多大な費用を、本明細書に記載するインビトロおよびエクスビボ法によって同定された化合物に効率よく集中させる点で特に有用である。
【０３６２】
本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物を同定する方法であって、(a) 本発明の1つもしくは複数のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはその断片、または本発明の1つもしくは複数のバイオマーカーのRNA産物もしくはその断片を発現する細胞を試験化合物と接触させる段階；および(b) タンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分に結合する試験化合物の能力を決定し、その結果、化合物がタンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、RNA部分に結合する場合に、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物が同定される段階を含む方法を提供する。細胞は例えば、原核細胞、酵母細胞、ウイルス細胞、または哺乳動物起源の細胞であってよい。タンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分に結合する試験化合物の能力の決定は、タンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分に対する試験化合物の結合を複合体中の標識化合物を検出することによって決定できるように、例えば試験化合物を放射性同位体または酵素標識と結合することによって達成することができる。例えば、試験化合物を125I、35S、14C、または3Hで直接または間接的に標識し、放射線放出の直接計数により、またはシンチレーション計数により放射性同位体を検出することができる。または、試験化合物を例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識し、適切な基質の生成物への変換を決定することにより酵素標識を検出することができる。特定の態様において、アッセイは、本発明の1つもしくは複数のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはその断片、または本発明の1つもしくは複数のバイオマーカーのRNA産物もしくはその断片を発現する細胞を、そのタンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分と結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成する段階、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる段階、およびタンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分と相互作用する試験化合物の能力を決定する段階を含み、タンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分と相互作用する試験化合物の能力を決定する段階は、公知の化合物と比較してタンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定する段階を含む。
【０３６３】
タンパク質産物またはタンパク質断片に対する試験化合物の結合は、直接または間接的に決定することができる。特定の態様において、アッセイは、本発明の1つもしくは複数のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはその断片、または本発明の1つもしくは複数のバイオマーカーの1つもしくは複数のRNA産物もしくはその一部を、そのタンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分と結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成する段階、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる段階、およびタンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分と相互作用する試験化合物の能力を決定する段階を含み、タンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分と相互作用する試験化合物の能力を決定する段階は、公知の化合物と比較してタンパク質産物、タンパク質断片、RNA産物、またはRNA部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定する段階を含む。当技術分野で周知の技法を用いて、試験化合物と、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはその断片、または本発明のバイオマーカーのRNA産物もしくはその一部分との結合を決定することができる。
【０３６４】
本発明の上記アッセイ法のいくつかの態様では、本発明のバイオマーカーのRNA産物もしくはその一部、またはその標的分子を固定化して、RNA産物もしくはRNA部分、標的分子、またはその両方の非複合体形態からの複合体形態の分離を容易にすると共に、アッセイの自動化に適応させることが望ましい場合がある。本発明の上記アッセイ法の2つ以上の実施形態では、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはその断片、またはその標的分子を固定化して、一方または双方のタンパク質の非複合体形態からの複合体形態の分離を容易にすると共に、アッセイの自動化に適応させることが望ましい場合がある。本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはその断片に対する試験化合物の結合は、反応物を含めるのに適した任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が含まれる。1つの態様では、一方または双方のタンパク質を基材に結合させ得るドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical；ミズーリ州、セントルイス)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いでこれを試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質または本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはその断片と混合し、複合体形成を促す条件下で(例えば、塩およびpHについて生理的条件で)混合物をインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して非結合成分を除去し、複合体形成を例えば上記のように直接または間接的に測定する。または、複合体を基材から解離することもでき、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはその断片の結合レベルを、標準的な技法を用いて決定することができる。
【０３６５】
本発明のスクリーニングアッセイでは、タンパク質を基材上に固定化する他の技法を用いることもできる。例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはその断片、または標的分子を、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。当技術分野で周知の技法(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals；イリノイ州、ロックフォード)を用いて、本発明のバイオマーカーまたは標的分子のビオチン化タンパク質産物をビオチン-NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)から調製し、ストレプトアビジン被覆96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定化することができる。または、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはその断片と反応する抗体でプレートのウェルを誘導体化し、抗体の結合によりタンパク質をウェル中に捕捉することもできる。そのような複合体を検出する方法には、GST固定化複合体について上記したものに加えて、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出、および本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはその断片、または標的分子に付随する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【０３６６】
試験化合物に対する本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはその断片の相互作用または結合はまた、そのようなタンパク質またはタンパク質断片をツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイトタンパク質」として用いて決定することもできる(例えば、米国特許第5,283,317号；Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232；Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054；Bartel et al. (1993) Bio/Techniques 14:920-924；Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696；およびWO 94/10300を参照されたい)。
【０３６７】
本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物を同定する方法であって、(a) 本発明の1つまたは複数のバイオマーカーのタンパク質またはRNA産物を発現する細胞を試験化合物と接触させる段階；(b) (a)中に存在するタンパク質またはRNA産物の量を決定する段階；および(c) (a)中の量を、試験化合物と接触させていない対応する対照細胞中に存在する量と比較し、その結果、タンパク質またはRNA産物の量が対照中の量と比較して変化した場合に、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物が同定される段階を含む方法を提供する。特定の態様において、発現レベルは、本明細書に記載のアッセイ(例えば、マイクロアレイまたはQRT-PCR)または当業者に周知のアッセイを利用することにより測定された対照での発現レベルと比較して5%、10%、15%、25%、30%、40%、50%、5〜25%、10〜30%、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1〜10倍、または5〜25倍変化する。別の態様において、そのような方法は、細胞中に存在する本発明のバイオマーカーの少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、1〜3種、1〜5種、1〜8種、すべて、または任意の組み合わせのタンパク質またはRNA産物の量を決定する段階、およびその量を対照中に存在する量と比較する段階を含む。
【０３６８】
本明細書に記載の細胞に基づくアッセイで利用する細胞は、当技術分野で公知の技法を利用して、本発明のバイオマーカーを発現するように操作することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる「Recombinant Expression Vectors and Host Cells」という名称の米国特許第6,245,527号の第III項を参照されたい。または、本発明のバイオマーカーを内因的に発現する細胞を用いることもできる。例えば、腸細胞を用いることができる。
【０３６９】
特定の態様では、「正常」個体、または1つもしくは複数の結腸直腸病変を有する個体から腸細胞を単離し、試験化合物の存在下または非存在下で様々な時間(すなわち、30分、1時間、5時間、24時間、48時間、および96時間)インキュベートする。予防薬または治療薬をスクリーニングする場合には、本発明のバイオマーカーの完全な配列またはその機能的部分のクローンを用いて細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞を、試験化合物の存在下または非存在下で様々な時間(すなわち、1、2、3、5、7、10、または14日間)培養する。インキュベーション後、細胞から標的核酸試料を調製し、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する個体で差次的に発現する核酸配列に対応する核酸プローブにハイブリダイズさせる。核酸プローブは、当技術分野で周知であり本明細書に記載する方法に従って、例えば放射性標識で標識する。ハイブリダイゼーションは、例えばAusubel et al.、前記またはSambrook et al.、前記に記載されているように、ノーザンブロットによって行う。本明細書で定義する、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する試料のRNAと比較した、正常由来のアレイ上の試料に対する標的の差次的ハイブリダイゼーションは、差次的に発現する特定の核酸配列に対応するRNAの発現レベルを示す。試験化合物の存在下でのインキュベーション段階による標的配列の発現レベルの変化により、対応するポリープバイオマーカー特異的核酸配列の発現を増加または減少させる化合物が示される。
【０３７０】
本発明はまた、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物を同定する方法であって、(a) 無細胞抽出物(例えば、腸細胞抽出物)を、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーのタンパク質またはRNA産物をコードする核酸配列および試験化合物と接触させる段階；(b) (a)中に存在するタンパク質またはRNA産物の量を決定する段階；および(c) (a)中の量を、試験化合物と接触させていない対応する対照に存在する量と比較し、その結果、タンパク質またはRNA産物の量が対照中の量と比較して変化した場合に、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物が同定される段階を含む方法を提供する。特定の態様において、発現レベルは、本明細書に記載のアッセイ(例えば、マイクロアレイまたはQRT-PCR)または当業者に周知のアッセイを利用することにより測定された対照試料での発現レベルと比較して5%、10%、15%、25%、30%、40%、50%、5〜25%、10〜30%、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1〜10倍、または5〜25倍変化する。別の態様において、そのような方法は、抽出物中に存在する本発明のバイオマーカーの少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、1〜3種、1〜5種、1〜8種、すべて、または任意の組み合わせのタンパク質またはRNA産物の量を決定する段階、およびその量を対照中に存在する量と比較する段階を含む。
【０３７１】
特定の態様では本発明のバイオマーカーのRNA産物の量を決定し、他の態様では本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の量を決定するが、さらに他の態様では本発明のバイオマーカーのRNAおよびタンパク質産物の量を決定する。本発明のバイオマーカーのRNAまたはタンパク質産物の量を決定するための標準的な方法および組成物を利用することができる。そのような方法および組成物は、上記に詳述してある。
【０３７２】
バイオマーカーの発現または活性を調節する化合物を同定するためのキット
特定の態様では、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて、キットを利用して本発明のバイオマーカーのタンパク質またはRNA産物の量を決定する。そのようなキットは、本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、すべて、または任意の組み合わせの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種のタンパク質またはRNA産物の発現を測定するのに必要な材料および試薬を含む。特定の態様において、キットは、(1) 血液からRNAを精製するための試薬；(2) 試験核酸を作製するためのプライマー；(3) dNTPおよび／またはrNTP(予め混合したものまたは別々のもの)、任意に一意的に標識された1つまたは複数のdNTPおよび／またはrNTP(例えば、ビオチン化またはCy3もしくはCy5タグ化dNTP)を含む；(4) 蛍光色素の化学活性誘導体などの合成後標識試薬；(5) 逆転写酵素、DNAポリメラーゼなどの酵素；(6) 種々の緩衝液媒体、例えばハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液；(7) スピンカラムなどのような標識プローブ精製試薬および成分；および(8) タンパク質精製試薬；(9) シグナル発生および検出試薬、例えばストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ複合体、化学蛍光または化学発光基質などのような、種々の方法で使用する1つまたは複数のさらなる試薬をさらに含み得る。特定の態様において、キットは、対照として使用するための予め標識され品質管理されたタンパク質およびまたはRNA転写産物(いくつかの態様においてはmRNA)を含む。
【０３７３】
いくつかの態様において、キットはQRT-PCRキットである。他の態様において、キットは核酸アレイおよびタンパク質アレイである。本発明によるそのようなキットは少なくとも、本発明のタンパク質または核酸メンバーが結合したアレイ、およびその実装手段を含む。または、本発明のタンパク質または核酸メンバーはアレイ上に予め実装されてもよい。
【０３７４】
特定の態様において、本発明のバイオマーカーのRNA産物を測定するキットは、RNA産物の発現を測定するのに必要な材料および試薬を含む。例えば、マイクロアレイまたはQRT-PCRキットを用いることができ、これは、本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、すべて、または任意の組み合わせのRNA産物のレベルを測定するのに必要な試薬および材料のみを含む。またはいくつかの態様において、キットは、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせのRNA産物のレベルを測定するのに必要な材料および試薬に限定されない材料および試薬を含み得る。例えば、マイクロアレイキットは、本発明のバイオマーカー以外の少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、またはそれ以上の遺伝子のRNA産物のレベルを測定するのに必要な試薬および材料に加えて、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせのRNA産物のレベルを測定するのに必要な試薬および材料を含み得る。特定の態様において、マイクロアレイまたはQRT-PCRキットは、本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、すべて、または任意の組み合わせ、および本発明のバイオマーカーではない1種、2種、3種、4種、5種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、55種、60種、65種、70種、75種、80種、85種、90種、95種、100種、125種、150種、175種、200種、225種、250種、300種、350種、400種、450種、もしくはそれ以上の遺伝子、または本発明のバイオマーカーではない1〜10種、1〜100種、1〜150種、1〜200種、1〜300種、1〜400種、1〜500種、1〜1000種、25〜100種、25〜200種、25〜300種、25〜400種、25〜500種、25〜1000種、100〜150種、100〜200種、100〜300種、100〜400種、100〜500種、100〜1000種、もしくは500〜1000種、もしくはそれ以上の遺伝子のRNA産物のレベルを測定するのに必要な試薬および材料を含む。
【０３７５】
核酸マイクロアレイキットでは、キットは一般に、支持体表面に結合したまたは配置されたプローブを含む。プローブは、検出可能な標識で標識することができる。特定の態様において、プローブは、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせの5'領域、3'領域、内部コード領域、エキソン、イントロン、エキソン接合部、またはエキソン・イントロン接合部に特異的である。マイクロアレイキットは、アッセイの実施、およびアッセイを実施して得られたデータを解釈し解析する方法に関する説明書を含み得る。キットはまた、ハイブリダイゼーション試薬、および／またはプローブが標的核酸配列にハイブリダイズした場合に発生するシグナルを検出するのに必要な試薬を含み得る。一般に、マイクロアレイキットの材料および試薬は1つまたは複数の容器に入っている。キットの各成分は一般に、その適切な容器に入っている。
【０３７６】
QRT-PCRキットでは、キットは一般に、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせの特定のRNA産物(例えば、エキソン、イントロン、エキソン接合部、およびエキソン・イントロン接合部)に特異的な予め選択したプライマーを含む。QRT-PCRキットはまた、核酸の逆転写および／または増幅に適した酵素(例えば、Taqなどのポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素)、ならびに逆転写および増幅の反応混合物に必要なデオキシヌクレオチドおよび緩衝液を含み得る。QRT-PCRキットはまた、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせに特異的なバイオマーカー特異的プライマーセットを含み得る。QRT-PCRキットはまた、バイオマーカー特異的プライマーセットを用いて、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせから増幅された配列に特異的なバイオマーカー特異的プローブを含み得る。プローブは、検出可能な標識(例えば、蛍光標識)で標識してもよく、またはしなくてもよい。いくつかの態様においては、多重化を意図する場合、プローブを検出可能な異なる標識(例えば、FAMまたはHEX)で標識すると役に立つ。QRT-PCRキットの各成分は一般に、その適切な容器に入っている。したがって、これらのキットは一般に、それぞれ個々の試薬、酵素、プライマー、およびプローブに適した別々の容器を含む。さらに、QRT-PCRキットは、アッセイの実施、およびアッセイを実施して得られたデータを解釈し解析する方法に関する説明書を含み得る。
【０３７７】
抗体に基づくキットでは、キットは例えば、(1) 関心対象のタンパク質(例えば、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせのタンパク質産物)に結合する一次抗体(支持体に結合していてもよく、またはしていなくてもよい)、および任意に(2) タンパク質または一次抗体に結合し、検出可能な標識(例えば、蛍光標識、放射性同位体、または酵素)と結合した異なる二次抗体を含み得る。抗体に基づくキットはまた、免疫沈降を行うためのビーズを含み得る。抗体に基づくキットの各成分は一般に、その適切な容器に入っている。したがって、これらのキットは一般に、各抗体に適した別々の容器を含む。さらに、抗体に基づくキットは、アッセイの実施、およびアッセイを実施して得られたデータを解釈し解析する方法に関する説明書を含み得る。
【０３７８】
レポーター遺伝子に基づくアッセイを行って、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物を同定することもできる。特定の態様において、本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物を同定する方法であって、(a) 化合物を、本発明のバイオマーカーの調節エレメント(例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント)に機能的に連結したレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を発現する細胞と接触させる段階；(b) レポーター遺伝子の発現を測定する段階；および(c) (a)中の量を、試験化合物と接触させていない対応する対照細胞中に存在する量と比較し、その結果、発現したレポーター遺伝子の量が対照細胞中の量と比較して変化した場合に、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物が同定される段階を含む方法を提供する。この態様によれば、細胞はバイオマーカーを天然に発現してもよく、またはバイオマーカーを発現するように操作してもよい。別の態様において、本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物を同定する方法であって、(a) 化合物を、無細胞抽出物、および本発明のバイオマーカーの調節エレメント(例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント)に機能的に連結したレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物と接触させる段階；(b)レポーター遺伝子の発現を測定する段階；および(c) (a)中の量を、試験化合物と接触させていない対応する対照中に存在する量と比較し、その結果、発現したレポーター遺伝子の量が対照中の量と比較して変化した場合に、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物が同定される段階を含む方法を提供する。
【０３７９】
当業者に周知の任意のレポーター遺伝子を、本発明の方法に従って用いるレポーター遺伝子構築物中で用いることができる。レポーター遺伝子とは、その存在(例えば、RT-PCR、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ELISAなどによる)または活性によって容易に検出可能なRNA転写産物またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。レポーター遺伝子の非限定的な例を表10に収載する。当業者に周知の任意の方法により、レポーター遺伝子を得ることができ、エレメントのヌクレオチド配列を決定することができる。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば文献またはGenBankなどのデータベースから得られ得る。または、レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源の核酸から作製し得る。特定のレポーター遺伝子をコードする核酸を含むクローンが入手できないものの、レポーター遺伝子の配列が知られている場合には、レポーター遺伝子をコードする核酸を化学合成するか、または適切な供給源(例えば、cDNAライブラリー、またはレポーター遺伝子を発現している任意の組織もしくは細胞から作製したcDNAライブラリー、またはそのような組織もしくは細胞から単離した核酸、好ましくはポリA+ RNA)からPCR増幅によって得ることができる。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列が決定された時点で、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列をヌクレオチド配列の操作について当技術分野で周知の方法、例えば組換えDNA技法、部位特異的突然変異誘発、PCRなどを用いて操作して(例えば、いずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY、およびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載されている技法を参照されたい)、異なるアミノ酸配列を有するレポーター遺伝子を作製すること、例えばアミノ酸の置換、欠失、および／また挿入を作製することができる。
【０３８０】
本発明に従って、本発明のバイオマーカーの1つもしくは複数、すべて、または任意の組み合わせを天然でまたは通常発現する細胞を、本明細書に記載の方法において用いることができる。または、当技術分野において周知の技法を用いて、本発明のバイオマーカーの1つもしくは複数、すべて、または任意の組み合わせ、またはレポーター遺伝子を発現するように細胞を操作し、これを本明細書に記載の方法において用いることができる。そのような技法の例には、これらに限定されないが、リン酸カルシウム沈殿(例えば、Graham & Van der Eb, 1978, Virol. 52: 546を参照されたい)、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中への核酸の封入、および核内への核酸の直接マイクロインジェクションが含まれる。
【０３８１】
特定の態様において、本明細書に記載の方法において用いる細胞は、腸細胞または細胞株、リンパ球(TまたはBリンパ球)、単球、好中球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、赤血球、または血小板である。好ましい態様において、本明細書に記載の方法において用いる細胞は腸細胞である。別の好ましい態様において、本明細書に記載の方法において用いる細胞はリンパ球である。別の態様において、本明細書に記載の方法において用いる細胞は、供給源、例えば組織に由来する不死化細胞株である。
【０３８２】
核酸の翻訳、および任意にしかし好ましくは転写を可能にする任意の無細胞抽出物を、本明細書に記載の方法に従って用いることができる。無細胞抽出物は、任意の種起源の細胞から単離することができる。例えば、無細胞翻訳抽出物は、ヒト細胞、培養マウス細胞、培養ラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、またはライムギ胚から単離し得る(例えば、Krieg & Melton, 1984, Nature 308:203、およびDignam et al., 1990 Methods Enzymol. 182:194-203を参照されたい)。または、無細胞翻訳抽出物、例えばウサギ網状赤血球溶解物およびコムギ胚芽抽出物は、例えばPromega(ウィスコンシン州、マディソン)から購入することができる。好ましい態様において、無細胞抽出物はヒト細胞から単離された抽出物である。特定の態様において、ヒト細胞はHeLa細胞、リンパ球、または腸細胞もしくは細胞株である。
【０３８３】
本発明のバイオマーカーのRNAおよび／またはタンパク質産物の発現レベルを調節する能力に加えて、少なくとも場合によっては、化合物は本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を調節することが望ましい場合がある。したがって、本発明は、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を調節する化合物を同定する方法を含む、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物を同定する方法を提供する。そのような方法は、(a) 本発明の1つまたは複数のバイオマーカーのタンパク質産物を発現する細胞を試験化合物と接触させる段階；(b) タンパク質産物の活性レベルを決定する段階；および(c) その活性レベルを試験化合物と接触させていない対応する対照細胞中の活性レベルと比較し、その結果、(a)中の活性レベルが対照細胞中の活性レベルと比較して変化した場合に、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物が同定される段階を含み得る。特定の態様において、活性レベルは、本明細書に記載のアッセイ(例えば、マイクロアレイまたはQRT-PCR)または当業者に周知のアッセイを利用することにより測定された対照での発現レベルと比較して5%、10%、15%、25%、30%、40%、50%、5〜25%、10〜30%、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1〜10倍、または5〜25倍変化する。別の態様において、そのような方法は、細胞中に存在する本発明のバイオマーカーの少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも12種、少なくとも15種、1〜5種、1〜10種、5〜10種、5〜15種、もしくは10〜15種、もしくはそれ以上、もしくはすべて、または任意の組み合わせのタンパク質産物の活性レベルを決定する段階、およびその活性レベルを対照中に存在する活性レベルと比較する段階を含む。
【０３８４】
本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物を同定する方法であって、(a) 無細胞抽出物を、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーのタンパク質産物をコードする核酸および試験化合物と接触させる段階；(b) タンパク質産物の活性レベルを決定する段階；および(c) その活性レベルを試験化合物と接触させていない対応する対照中の活性レベルと比較し、その結果、(a)中の活性レベルが対照中の活性レベルと比較して変化した場合に、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物が同定される段階を含む方法を提供する。特定の態様において、活性レベルは、本明細書に記載のアッセイ(例えば、マイクロアレイまたはQRT-PCR)または当業者に周知のアッセイを利用することにより測定された対照での活性レベルと比較して5%、10%、15%、25%、30%、40%、50%、5〜25%、10〜30%、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1〜10倍、または5〜25倍変化する。別の態様において、そのような方法は、試料中に存在する本発明のバイオマーカーの少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、1〜3種、1〜5種、1〜8種、すべて、または任意の組み合わせのタンパク質産物の活性レベルを決定する段階、およびその活性レベルを対照中に存在する活性レベルと比較する段階を含む。
【０３８５】
標準的な技法を利用して、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性レベルを決定することができる。当技術分野で周知の技法を用いて決定できる本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性。
【０３８６】
化合物の生物活性を利用する方法
1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する能力に関して試験すべき化合物(便宜上、本明細書では「リード」化合物と称する)が同定され次第、この化合物をさらに精査することができる。例えば、本方法により同定された化合物を、ポリープ形成の許容される動物モデルにおいて、インビボでさらに試験することができる。さらに、本方法により同定された化合物を、その特異性に関して解析することもできる。化合物のそのようなさらなる精査のための技法は当業者に周知である。
【０３８７】
1つの態様において、リード化合物の効果は、標的細胞の細胞増殖または生存度を測定することによりアッセイすることができる。そのようなアッセイは、ポリープ形成に関与する細胞型の代表的な細胞(例えば、腸細胞；胃腸系の異なる部分から単離した細胞など)を用いて実施し得る。または、患者の細胞を培養する代わりに、細胞株の細胞を用いてリード化合物をスクリーニングしてもよい。
【０３８８】
当技術分野で周知の多くのアッセイを用いて、リード化合物に対する曝露後の患者細胞または細胞株の生存度および／または増殖を評価することができる；例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン(BrdU)取り込み(例えば、Hoshino et al., 1986, Int. J. Cancer 38, 369；Campana et al., 1988, J. Immunol. Meth. 107:79を参照されたい)または(3H)-チミジン取り込み(例えば、Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403；Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367-73を参照されたい)を測定することにより、直接細胞計数により、癌原遺伝子(例えば、fos、myc)または細胞周期マーカー(Rb、cdc2、サイクリンA、D1、D2、D3、Eなど)のような既知遺伝子の転写、翻訳、または活性の変化を検出することによりアッセイすることができる。そのようなタンパク質およびRNA(例えば、mRNA)ならびに活性のレベルは、当技術分野で周知の任意の方法により決定することができる。例えば、タンパク質は、市販の抗体を用いて、ウェスタンブロッティングまたは免疫沈降などの免疫学に基づく公知の方法により定量し得る。mRNAは、当技術分野で周知であり常用的な方法を用いて、例えばノーザン解析、RNase保護、逆転写を伴うポリメラーゼ連鎖反応を用いて定量し得る。細胞生存度は、トリパンブルー染色、または当技術分野で公知の他の細胞死もしくは生存マーカーを用いて評価することができる。特定の態様においては、細胞ATPのレベルを測定して細胞生存度を決定する。分化は、例えば形態の変化に基づいて視覚的に評価することができる。
【０３８９】
動物モデル
化合物は、ヒトで使用する前に、適切な動物モデル系で試験することができる。そのような動物モデル系には、これらに限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが含まれる。当技術分野で周知の任意の動物系を用いることができる。特定の態様において、化合物はマウスモデルで試験する。化合物は反復して投与することができる。
【０３９０】
許容される動物モデルを使用して、1つまたは複数の結腸直腸病変の予防、治療、および／または改善に関して、上記の方法により同定された化合物の有効性を決定することができる。
【０３９１】
毒性
本発明に従って同定された化合物の毒性および／または有効性は、例えばLD50(集団の50%に致死的な用量)およびED50(集団の50%に治療上有効な用量)を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準的な薬学的手順によって決定することができる。本発明に従って同定された化合物の細胞毒性を評価するために用い得る細胞および細胞株には、これらに限定されないが、末梢血単核細胞(PBMC)、Caco-2細胞、およびHuh7細胞が含まれる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。本発明に従って同定された化合物で、高い治療指数を示すものが好ましい。本発明に従って同定された化合物で毒性副作用を示すものを用いることも可能であるが、未感染細胞の潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を軽減するために、このような薬剤を罹患組織の部位を標的化する送達系を設計するよう注意を払うべきである。
【０３９２】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、本発明に従って同定された化合物の、ヒトで使用するための用量範囲の設定に用いることができる。このような薬剤の用量は、毒性をほとんど伴わずにED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。使用する剤形および利用する投与経路に応じて、用量はこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で用いるいかなる薬剤についても、治療上有効な用量は最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養物で決定されたIC50(すなわち、症状の最大半量阻害を達成する化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を設定し得る。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０３９３】
同族体または類似体の設計
所望の生物活性を示す化合物は、有用な薬理活性を有する同族体または類似体を開発または設計するためのリード化合物として用いることができる。例えば、リード化合物が同定された時点で、分子モデリング技法を用いて、より有効であり得る化合物の変種を設計することができる。分子モデリングシステムの例は、CHARMおよびQUANTAプログラム(Polygen Corporation、マサチューセッツ州、ウォルサム)である。CHARMは、エネルギー最小化および分子力学機能を行う。QUANTAは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、および解析を行う。QUANTAにより、分子の互いに対する挙動のインタラクティブな構築、修飾、視覚化、および解析が可能となる。
【０３９４】
いくつかの論文が、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを概説しており、そのようなものとしては、Rotivinen et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166；Ripka, 1998, New Scientist 54-57；McKinaly and Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122；Perry and Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989)；Lewis & Dean, 1989, Proc. R. Soc. Lond. 236:125-140 and 141-162；Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090などがある。化学物質のスクリーニングを行い、グラフィックに示す他のコンピュータプログラムが、BioDesign, Inc.(カリフォルニア州、パサディナ)、Allelix, Inc.(カナダ、オンタリオ州、ミシサーガ)、およびHypercube, Inc.(オンタリオ州、ケンブリッジ)などの企業から入手できる。これらは主に、特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するよう設計されているが、同定された任意の領域に特異的な薬物を設計するように適合化することができる。類似体および同族体は、生物活性の上記のスクリーニングを用いて、関心対象のタンパク質(すなわち、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物)に対する結合に関して試験することができる。または、スクリーニングにおいて生物活性がほとんどないと確認されたリード化合物を用いて、生物活性を有する化合物の類似体および同族体を設計することも可能である。
【０３９５】
化合物
本明細書に記載の方法により試験し、同定され得る化合物には、これらに限定されないが、Aldrich(1001 West St. Paul Ave., Milwaukee, WI 53233)、Sigma Chemical(P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178)、Fluka Chemie AG(Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs, Switzerland(Fluka Chemical Corp. 980 South 2nd Street, Ronkonkoma, NY 11779))、Eastman Chemical Company, Fine Chemicals(P.O Box 431, Kingsport, TN 37662)、 Boehringer Mannheim GmbH(Sandhofer Strasse 116, D-68298 Mannheim)、Takasago(4 Volvo Drive, Rockleigh, NJ 07647)、SST Corporation(635 Brighton Road, Clifton, NJ 07012)、Ferro(111 West Irene Road, Zachary, LA 70791)、Riedel-deHaen Aktiengesellschaft(P.O. Box D-30918, Seelze, Germany)、PPG Industries Inc., Fine Chemicals(One PPG Place, 34th Floor, Pittsburgh, PA 15272)を含む任意の市販供給源から得られる化合物が含まれる。さらに、本発明の方法を用いて、微生物、真菌、植物、または動物抽出物を含む任意の種類の天然産物をスクリーニングすることができる。
【０３９６】
合成または天然化合物の大きなライブラリーに由来する化合物をスクリーニングすることも可能である。糖類、ペプチド、および核酸に基づく化合物のランダム合成および定方向合成のために、現在では多くの手段が用いられている。合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co.(英国、コーンウォール州、トレビレット)、Comgenex(ニュージャージー州、プリンストン)、Brandon Associates(ニューハンプシャー州、メリマク)、およびMicrosource(コネチカット州、ニューミルフォード)を含むいくつかの企業から市販されている。希少化学物質ライブラリーは、Aldrich(ウィスコンシン州、ミルウォーキー)から入手可能である。コンビナトリアルライブラリーは入手可能であり、調製もされる。または、細菌、真菌、植物、および動物抽出物形態の天然化合物のライブラリーも、例えばPan Laboratories(ワシントン州、ボセル)またはMycoSearch(ノースカロライナ州)から入手することができ、または当技術分野で周知の方法により容易に作製することができる。さらに、天然および合成により作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段により容易に修飾される。
【０３９７】
さらに、小分子試験化合物を含む試験化合物の多様なライブラリーを使用することも可能である。本発明の方法を用いてスクリーニングするライブラリーは、様々な化合物種を含み得る。本発明の方法に従ってスクリーニングし得るライブラリーの例には、これらに限定されないが、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー(diversomer)；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；炭水化物ライブラリー；ならびに小分子ライブラリー(いくつかの態様においては、有機小分子ライブラリー)が含まれる。いくつかの態様において、スクリーニングするライブラリー中の化合物は核酸またはペプチド分子である。非限定的な例において、ペプチド分子はファージディスプレイライブラリー中に存在し得る。他の態様においては、化合物の種類には、これらに限定されないが、非天然アミノ酸、例えばD-アミノ酸、α-アミノリン酸およびα-アミノリン酸などのアミノ酸のリン類似体、または非ペプチド結合を有するアミノ酸を含むペプチドを含むペプチド類似体、ホスホロチオエートおよびPNAなどの核酸類似体、ホルモン、抗原、合成または天然薬物、オピエート、ドーパミン、セロトニン、カテコールアミン、トロンビン、アセチルコリン、プロスタグランジン、有機分子、フェロモン、アデノシン、スクロース、グルコース、ラクトース、ならびにガラクトースが含まれる。ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーもまた、本発明のアッセイで用いることができる。
【０３９８】
特定の態様において、コンビナトリアルライブラリーは、これらに限定されないが、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、およびベンゾジアゼピンを含む有機小分子ライブラリーである。別の態様において、コンビナトリアルライブラリーは、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ベンゾジアゼピン；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；または炭水化物ライブラリーを含む。コンビナトリアルライブラリーはそれ自体が市販されている。例えば、ライブラリーは、例えばSpecs and BioSpecs B.V.(オランダ、ライスワイク)、Chembridge Corporation(カリフォルニア州、サンディエゴ)、Contract Service Company(ロシア、モスクワ領域、ドルゴプルドヌイ)、Comgenex USA Inc.(ニュージャージー州、プリンストン)、Maybridge Chemicals Ltd.(Cornwall PL34 OHW, United Kingdom)、Asinex(ロシア、モスクワ)、ComGenex(ニュージャージー州、プリンストン)、Ru, Tripos, Inc.(ミズーリ州、セントルイス)、ChemStar, Ltd(ロシア、モスクワ)、3D Pharmaceuticals(ペンシルベニア州、エクストン)、およびMartek Biosciences(メリーランド州、コロンビア)から商業的に入手することができる。
【０３９９】
好ましい態様においては、ライブラリーの化合物がより細胞に取り込まれやすいように、ライブラリーを予め選択する。例えば、化合物が細胞内に入る可能性を増強する、これらに限定されないが大きさ、親油性、親水性、および水素結合などの特定のパラメータに基づいて化合物を選択する。別の態様においては、三次元または四次元コンピュータ計算プログラムにより化合物を解析する。
【０４００】
本発明の方法に従って用いるためのコンビナトリアル化合物ライブラリーは合成してもよい。薬理活性、生物活性、または他の活性についてスクリーニングし得る有機小化合物の大きな収集物、すなわちライブラリーの作製に向けられた合成法に大きな関心が寄せられている。巨大なコンビナトリアルライブラリーを作製するために適用される合成法は、溶液中または固相中、すなわち支持体上で行う。固相合成では、過剰の試薬を添加し各反応段階後に洗浄除去することが容易に行えるため、複数段階の反応を行うこと、および反応を高収率で完了させることが容易になる。固相コンビナトリアル合成はまた、単離、精製、およびスクリーニングを改善しやすい。しかし、より慣例的な液相化学によって、固相化学よりも広範な有機反応が支持される。
【０４０１】
本発明のコンビナトリアル化合物ライブラリーは、その全体が参照により本明細書に組み入れられるKilcoinらの米国特許第6,190,619号に記載されている装置を用いて合成することができる。米国特許第6,190,619号は、複数の別々の化合物の平行合成用またはコンビナトリアル化合物ライブラリー用に複数の反応器を保持できる合成装置について開示している。
【０４０２】
1つの態様において、コンビナトリアル化合物ライブラリーは溶液中で合成し得る。その全体が参照により本明細書に組み入れられるBogerらの米国特許第6,194,612号に開示される方法は、コンビナトリアルライブラリーの液相合成の鋳型として有用な化合物を特徴とする。鋳型は、液体／液体抽出または固体／液体抽出を用いて未反応物質から反応生成物を容易に精製できるよう設計される。鋳型を用いてコンビナトリアル合成によって作製される化合物は、いくつかの態様においては有機小分子である。ライブラリー中のいくつかの化合物は、非ペプチドまたはペプチドの効果を模倣し得る。コンビナトリアル化合物ライブラリーの固相合成とは対照的に、液相合成では、多段階固相合成の個々の段階をモニターするための特殊な手順を用いる必要がない(Egner et al., 1995, J.Org. Chem. 60:2652；Anderson et al., 1995, J. Org. Chem. 60:2650；Fitch et al., 1994, J. Org. Chem. 59:7955；Look et al., 1994, J. Org. Chem. 49:7588；Metzger et al., 1993, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 32:894；Youngquist et al., 1994, Rapid Commun. Mass Spect. 8:77；Chu et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:5419；Brummel et al., 1994, Science 264:399；およびStevanovic et al., 1993, Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:431)。
【０４０３】
本発明の方法に有用なコンビナトリアル化合物ライブラリーは、支持体上で合成することができる。1つの態様では、スプリット合成法、すなわち合成中に支持体を分離および混合する手順を用いて、化合物ライブラリーを支持体上で合成する(例えば、Lam et al., 1997, Chem. Rev. 97:41-448；Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926、およびそれらの中で引用された参考文献を参照されたい)。最終ライブラリー中の各支持体は、実質上1種の化合物がその表面に結合している。各支持体に1種の産物が結合している、コンビナトリアルライブラリーを支持体上で合成する他の方法は、当業者に公知である(例えば、Nefzi et al., 1997, Chem. Rev. 97:449-472を参照されたい)。
【０４０４】
本発明のいくつかの態様では、リンカーを介して化合物を支持体に結合させることができる。リンカーは支持体の構成要素でありかつ一部であってよく、または支持体上で合成されるかもしくは合成後に支持体に結合される非構成要素であってもよい。リンカーは、支持体に化合物の結合点を提供するばかりでなく、リンカーの性質に応じて異なる条件下で分子の異なる基が支持体から切断されるようにするためにも有用である。例えば、リンカーはとりわけ求電子的に、求核的に、光により、酵素的に、金属により、還元条件下で、または酸化的条件下で切断され得る。好ましい態様においては、化合物のハイスループットスクリーニングの前に化合物を支持体から切断する。
【０４０５】
ライブラリーが、各化合物がアドレスまたは識別子を有する化合物のアレイまたはマイクロアレイを含む場合、化合物は、例えば陽性試料と個々の試験アッセイに適用した元の化合物リストとを相互参照することによって解明することができる。
【０４０６】
ライブラリーがペプチドまたは核酸ライブラリーである場合には、ペプチドまたは核酸の直接配列決定によって化合物の配列を決定することができる。そのような方法は当業者に周知である。
【０４０７】
化合物の新たな特徴づけには、いくつかの物理化学的技法を用いることができる。そのような技法の例には、これらに限定されないが、質量分析、NMR分光法、X線結晶解析、および振動分光法が含まれる。
【０４０８】
(Q) 1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するための同定化合物の使用
本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する方法であって、本発明の方法に従って同定された1つまたは複数の化合物をそれを必要とする対象に投与する段階を含む方法を提供する。好ましい態様において、個体はヒトである。
【０４０９】
1つの態様において、本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する方法であって、本発明の方法に従って同定された1つもしくは複数の化合物の予防または治療有効量の用量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む方法を提供する。特定の態様においては、本発明の方法に従って同定された化合物は、そのような化合物が1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために以前に用いられたことがある場合は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために投与しない。別の態様においては、本発明の方法に従って同定された化合物は、そのような化合物が1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために用いることが示唆されている場合は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために投与しない。別の態様において、本発明の方法に従って同定された化合物は、本発明の1種のバイオマーカーのみのタンパク質またはRNA産物に特異的に結合し、ならびに／またはその発現および／もしくは活性レベルを変化させる。別の態様において、本発明の方法に従って同定された化合物は、そのような化合物が表2または6のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、もしくはそれ以上、もしくはすべて、または任意の組み合わせのタンパク質またはRNA産物に結合し、ならびに／またはその発現および／もしくは活性を変化させる場合には、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために投与しない。さらに別の態様において、本発明の方法に従って同定された化合物は、本発明のバイオマーカーの少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも10種、少なくとも15種、またはそれ以上のタンパク質またはRNA産物に結合し、ならびに／またはその発現および／もしくは活性レベルを変化させる。
【０４１０】
本発明はまた、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善する方法であって、本明細書に記載のスクリーニング法を利用して同定された化合物の1つまたは複数、および1つまたは複数の他の治療(例えば、予防薬または治療薬および手術)を、それを必要とする対象に施す段階を含む方法を提供する。特定の態様において、そのような治療は、1つまたは複数の結腸直腸病変の予防、治療、または改善に現在用いられている、用いられていた、または有用であることが知られている(これらに限定されないが、本明細書に収載する予防薬または治療薬を含む)。本発明の併用療法の治療(例えば、予防薬または治療薬)は、順次または同時に施すことができる。特定の態様において、本発明の併用療法は、本発明に従って同定された化合物、およびそのような化合物と同じ作用機序を有する少なくとも1つの他の治療を含む。別の特定の態様において、本発明の併用療法は、本発明の方法に従って同定された化合物、およびそのような化合物と異なる作用機序を有する少なくとも1つの他の治療(例えば、予防薬または治療薬)を含む。本発明の併用療法は、化合物と共に機能して相加または相乗効果を有することによって、本発明の化合物の予防または治療効果を改善する。本発明の併用療法は、治療(例えば、予防薬または治療薬)に付随する副作用を軽減する。
【０４１１】
併用療法の予防薬または治療薬は、同じ薬学的組成物中に含めて対象に投与することができる。または、併用療法の予防薬または治療薬は、別々の薬学的組成物として対象に同時に投与することができる。予防薬または治療薬は、同じまたは異なる投与経路によって対象に投与し得る。
【０４１２】
特定の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本明細書に記載のアッセイで同定された1つまたは複数の化合物を含む薬学的組成物を個体、いくつかの態様においてはヒトに投与する。本発明によれば、薬学的組成物はまた、1つまたは複数の予防薬または治療薬を含み得る。いくつかの態様において、そのような薬剤は、1つまたは複数の結腸直腸病変の予防、治療、または改善に現在用いられている、用いられていた、または有用であることが知られている。
【０４１３】
(R) 本発明の化合物
1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、および／または改善するために、本発明の方法に従って用い得る化合物の代表的な非限定的な例を以下に詳述する。
【０４１４】
第1に、そのような化合物には、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質またはRNA産物の発現または活性を下方制御し得るアンチセンス、リボザイム、または三重らせん化合物が含まれ得る。そのような化合物について、以下の亜項で詳述する。
【０４１５】
第2に、そのような化合物には、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質もしくはRNA産物の発現、または本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を調節し得る抗体組成物が含まれ得る。特定の態様において、抗体組成物は、本発明のバイオマーカーのタンパク質もしくはRNA産物の発現、または本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を下方制御する。そのような化合物について、以下の亜項で詳述する。
【０４１６】
第3に、そのような化合物には、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物が含まれ得る。本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するための、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を模倣するように選択されたペプチドまたはペプチド模倣体の使用を包含する。さらに、そのような化合物には、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質もしくはRNA産物の発現、または本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を調節し得るドミナントネガティブポリペプチドが含まれ得る。
【０４１７】
本方法はまた、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するための、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の誘導体、類似体、および断片の使用を包含する。特に本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するための、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の1つまたは複数のドメインを含む、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の断片の使用を包含する。別の特定の態様において、本発明は、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物、または融合もしくはキメラタンパク質産物(ペプチド結合を介して異種タンパク質配列に連結されたタンパク質、断片、類似体、または誘導体を含む)として発現されたそのようなタンパク質の類似体、誘導体、もしくは断片の使用を包含する。
【０４１８】
特定の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも15種、またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。他の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の1つもしくは複数、またはその断片、類似体、もしくは誘導体を投与する。他の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、また改善するために、本発明のタンパク質産物に特異的に結合する1つまたは複数の抗体を投与する。他の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、1つまたは複数のドミナントネガティブポリペプチドを投与する。
【０４１９】
アンチセンス、リボザイム、三重らせん組成物
標準的な技法を利用して、本明細書に記載の方法の一部として使用するための、表2もしくは6に収載する遺伝子または表2もしくは6に収載する遺伝子の転写産物の1つまたは複数と反応するアンチセンス、三重らせん、またはリボザイム分子を作製することができる。最初に、アンチセンス核酸分子、すなわち関心対象のポリペプチドをコードするセンス核酸に相補的な、例えば二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的またはmRNA配列に相補的な分子を作製するために、標準的な技法を利用することができる。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合し得る。アンチセンス核酸は、コード鎖全体またはその一部のみ、例えばタンパク質コード領域(すなわちオープンリーディングフレーム)のすべてまたは一部に相補的であってよい。アンチセンス核酸分子は、関心対象のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域のすべてまたは一部に対してアンチセンスであってもよい。非コード領域(「5'および3'非翻訳領域」)とは、コード領域に隣接し、かつアミノ酸に翻訳されない5'および3'配列である。
【０４２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50ヌクレオチド長、またはそれ以上の長さであってよい。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手順を用いて、化学合成および酵素連結反応により構築することができる。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増すように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増すように設計された種々の修飾ヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸の作製に用い得る修飾ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。または、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを用いて、生物学的に作製することもできる(すなわち、挿入核酸から転写されるRNAは、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス方向となる)。
【０４２１】
アンチセンス核酸分子は、それが関心対象のポリペプチドをコードする細胞mRNAとハイブリダイズまたは結合して、それによって例えば転写および／または翻訳を阻害することにより発現を阻害するように、対象に投与するまたはインサイチューで生成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補性によってもよいし、または例えばDNA二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用によってもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織、例えば関節(例えば、膝、腰、肘、および指関節)部位における直接注射が含まれる。または、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように修飾し、その後全身投与することもできる。例えば、全身投与のためには、選択された細胞(例えば、T細胞または腸細胞)表面上に発現される受容体または抗原にアンチセンス分子が特異的に結合するように、例えば細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより、アンチセンス分子を修飾することができる。アンチセンス核酸分子はまた、以下に記載のベクター、例えば遺伝子治療用ベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子を強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下に配置したベクター構築物が好ましい。
【０４２２】
関心対象のアンチセンス核酸分子は、α-アノマー核酸分子であってよい。α-アノマー核酸分子は、通常のα単位とは異なり鎖が相互に平行に走行する、相補的RNAとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultier et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6625-6641)。アンチセンス核酸分子はまた、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330)を含み得る。
【０４２３】
リボザイムとは、それらが相補的な領域を有するmRNAなどの一本鎖核酸を切断することのできる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子であり、これもやはり標準的な技法を用いて作製することができる。したがって、リボザイム(例えば、ハンマーヘッドリボザイム(Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334:585-591に記載されている))を用いてmRNA転写産物を触媒切断して、それによりmRNAによってコードされるタンパク質の翻訳を阻害することできる。関心対象のポリペプチドをコードする核酸分子に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示するcDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計し得る。例えば、Cech et al. 米国特許第4,987,071号；およびCech et al. 米国特許第5,116,742号において、活性部位のヌクレオチド配列が切断すべきヌクレオチド配列に対して相補的である、テトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる。または、関心対象のポリペプチドをコードするmRNAを用いて、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することもできる。例えば、Bartel and Szostak, 1993, Science 261:1411-1418を参照されたい。
【０４２４】
三重らせん構造もまた、周知の技法を用いて作製することができる。例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の調節領域(例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞において遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることにより、関心対象のポリペプチドの発現を阻害することができる。一般的には、Helene, 1991, Anticancer Drug Des. 6(6):569-84；Helene, 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36；およびMaher, 1992, Bioassays 14(12):807-15を参照されたい。
【０４２５】
種々の態様において、核酸組成物は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を作製することができる(例えば、Hyrup et al., 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23を参照されたい)。本明細書で用いる「ペプチド核酸」または「PNA」という用語は、デオキシリボースリン酸骨格が擬ペプチド骨格で置換され、4種類の天然核酸塩基のみが保持されている核酸模倣体、例えばDNA模倣体を指す。PNAの中性骨格は、低イオン強度の条件下でDNAおよびRNAへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。PNAオリゴマーの合成は、Hyrup et al., 1996、前記；Perry-O'Keefe et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675に記載されている標準的な固相ペプチド合成手順を用いて行うことができる。
【０４２６】
PNAは例えば、例えばその安定性または細胞取り込みを増強するために、PNAに親油性基もしくは他の補助基を付加することにより、PNA-DNAキメラの形成により、またはリポソームもしくは当技術分野で公知の他の薬物送達技法を用いて修飾することができる。例えば、PNAとDNAの有利な特性を兼ね備え得るPNA-DNAキメラを作製することができる。このようなキメラにより、PNA部分が高い結合親和性および特異性を提供しつつ、例えばRNAse HおよびDNAポリメラーゼなどのDNA認識酵素がDNA部分と相互作用することが可能になる。PNA-DNAキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数、および配向に関して選択される適切な長さのリンカーを用いて連結し得る(Hyrup, 1996、前記)。PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup, 1996、前記、およびFinn et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63に記載されている通りに行うことができる。例えば、標準的なホスホラミダイトカップリング化学および修飾ヌクレオシド類似体を用いて、DNA鎖を支持体上で合成し得る。5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシ-チミジンホスホラミダイトなどの化合物を、PNAとDNAの5'末端との間の連結として用いることができる(Mag et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:5973-88)。次いでPNA単量体を段階的様式で結合させて、5'PNA部分および3'DNA部分を有するキメラ分子を作製する(Finn et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63)。または、5'DNA部分および3'PNA部分を有するキメラ分子を合成することもできる(Peterser et al., 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124)。
【０４２７】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド(例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的化するための)、または細胞膜(例えば、Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556；Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652；WO 88/09810を参照されたい)もしくは血液脳関門(例えば、WO 89/10134を参照されたい)を介した輸送を促進する薬剤などの他の付属基を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol et al., 1988, Bio/Techniques 6:958-976を参照されたい)または挿入剤(例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549を参照されたい)で修飾することもできる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤などに結合することができる。
【０４２８】
抗体組成物
1つの態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物に特異的に結合する抗体を個体、いくつかの態様においてはヒトに投与する。別の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物に特異的に結合する抗体の任意の組み合わせを対象、いくつかの態様においてはヒトに投与する。特定の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物に特異的に結合する1つまたは複数の抗体を、他の種類の治療と組み合わせて対象、いくつかの態様においてはヒトに施す。
【０４２９】
本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物に特異的に結合する1つまたは複数の抗体は、当業者に公知である種々の送達系を用いて、対象、いくつかの態様においてはヒトに投与することができる。例えば、そのような抗体は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルに封入して投与することができる。例えば、米国特許第5,762,904号、米国特許第6,004,534号、およびWO 99/52563を参照されたい。さらに、そのような抗体は、抗体を発現し得る組換え細胞、または抗体を発現し得るレトロウイルスベクター、他のウイルスベクター、もしくは非ウイルスベクターを用いて投与することができる。
【０４３０】
本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物に特異的に結合する抗体は、任意の公知の供給源から得ることができる。例えば、表5に、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の1つまたは複数に特異的な市販抗体のリストを提供する。または、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物に特異的に結合する抗体は、抗体の合成に関する当技術分野で公知の任意の方法により、特に化学合成により、またはいくつかの態様においては組換え発現技法により作製することができる。
【０４３１】
抗体には、これらに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv(scFv)(例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。本明細書において用いる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性断片、すなわち抗原結合部位を含む分子を指す。免疫グロブリン分子は、任意の種(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはサブクラスであってよい。免疫グロブリン分子の免疫活性断片の例には、抗体をペプシンまたはパパインなどの酵素で処理して作製され得るF(ab)断片(VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片)、およびF(ab')2断片(ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価断片)が含まれる。免疫活性断片にはまた、これらに限定されないが、Fd断片(VHおよびCH1ドメインからなる)、Fv断片(抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなる)、dAb断片(VHドメインからなる；Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)、および単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。抗原に特異的に結合する抗体は、抗体の合成に関する当技術分野で公知の任意の方法により、特に化学合成により、またはいくつかの態様においては組換え発現技法により作製することができる。
【０４３２】
抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な方法により作製することができる。例えば、これらに限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む種々の宿主動物にヒト抗原を投与して、ヒト抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生成を誘導することができる。宿主種に応じて免疫応答を増大させるために種々のアジュバントを用いることができ、このようなアジュバントには、これらに限定されないが、フロイントのアジュバント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルブム(corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。このようなアジュバントもまた当技術分野で周知である。
【０４３３】
「単一特異性抗体」という用語は、特定の標的、例えばエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。この用語にはモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技法、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技法を用いて調製することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第RE 32,011号、第4,902,614号、第4,543,439号、第4,411,993号、および第4,196,265号；Kennett et al (eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press (1980)；ならびにHarlow and Lane (eds.), Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)を参照されたい。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であって、例えばHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(これらの参考文献は、その全体が参照により組み入れられる)に教示される技法を含むハイブリドーマ技法を用いて作製することができる。組換え技法により抗体の作製を可能にする他の技法(例えば、Stratacyte、カリフォルニア州、ラホーヤから入手可能な市販の系を含む、William D. Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281；L. Sastry et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5728-5732；およびMichelle Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology, 3: 1-9 (1990)に記載の技法)を利用して、モノクローナル抗体を構築することも可能である。本明細書で用いる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって作製された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指すものであり、それを作製する方法を指すものではない。
【０４３４】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を作製しスクリーニングする方法は常用的であり、当技術分野で周知である。簡潔に説明すると、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物をマウスに免疫化し得、免疫応答が検出された、例えばそのタンパク質に特異的な抗体がマウス血清中に検出された時点で、マウス脾臓を摘出して脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を周知の技法により任意の適切な骨髄腫細胞、例えばATCCから入手可能な細胞株SP20由来の細胞と融合する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローニングする。さらに、RIMMS(複数部位の反復免疫)技法を用いて動物を免疫化してもよい(Kilptrack et al., 1997, Hybridoma 16:381-9、その全体が参照により組み入れられる)。次いで、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含む腹水は、陽性ハイブリドーマクローンをマウスに免疫化することにより作製することができる。
【０４３５】
したがって、本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体を作製する方法を提供し、いくつかの態様においてこのハイブリドーマは、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を免疫化したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、次いで融合から得られたハイブリドーマを、そのタンパク質またはタンパク質断片と結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることにより作製する。
【０４３６】
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の特定のエピトープを認識する抗体断片は、当業者に公知の任意の技法により作製することができる。例えば、本発明のFabおよびF(ab')2断片は、パパイン(Fab断片を生成する)またはペプシン(F(ab')2断片を生成する)などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により生成することができる。F(ab')2断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のCH1ドメインを含む。さらに、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することができる。
【０４３７】
ファージディスプレイ法においては、機能的抗体ドメインが、これをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示される。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列を、動物cDNAライブラリー(例えば、罹患組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー)から増幅する。VHおよびVLドメインをコードするDNAをPCRによりscFvリンカーで再結合し、ファージミドベクターにクローニングする。このベクターを大腸菌にエレクトロポレーションし、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で用いられるファージは典型的に、fdおよびM13を含む繊維状ファージであり、VHおよびVLドメインは通常、組換えによりファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかに融合させる。特定の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕獲された抗原を用いて、選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するために用い得るファージディスプレイ法の例には、Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough et al. , 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic et al., 1997, Gene 187:9-18；Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280；PCT出願第PCT/GB91/O1 134号；WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401、およびW097/13844；ならびに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号、および第5,969,108号に開示されている方法が含まれ；これらはそれぞれ、その全体が参照によりそ本明細書に組み入れられる。
【０４３８】
上記の参考文献に記載されるように、ファージの選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、これを用いてヒト抗体を含む全抗体または任意の他の所望の抗原結合断片を作製し、例えば以下に記載する通りに、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主で発現させることができる。組換えによりFab、Fab'、およびF(ab')2断片を作製する技法もまた、WO 92/22324；Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869；Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34；およびBetter et al., 1988, Science 240:1041-1043(これらの参考文献は、その全体が参照により組み入れられる)に開示されている方法などの当技術分野で公知の方法を用いて使用することができる。
【０４３９】
全抗体を作製するには、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するための隣接配列を含むPCRプライマーを用いて、scFvクローン中のVHまたはVL配列を増幅し得る。当業者に公知のクローニング技法を利用して、PCR増幅したVHドメインをVH定常領域、例えばヒトγ4定常領域を発現するベクターにクローニングし、またPCR増幅したVLドメインをVL定常領域、例えばヒトκまたはλ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。いくつかの態様において、VHまたはVLドメインを発現するベクターは、EF-1aプロモーター、分泌シグナル、可変ドメイン用のクローニング部位、定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含む。VHおよびVLドメインはまた、必要な定常領域を発現する1つのベクターにクローニングしてもよい。次いで、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株に同時トランスフェクションして、当業者に公知の技法を用いて、全長抗体、例えばIgGを発現する安定したまたは一過性の細胞株を作製する。
【０４４０】
ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途に関しては、ヒト抗体またはキメラ抗体を用いることが好ましい場合がある。完全なヒト抗体は、ヒト対象の治療処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の種々の方法により作製することができる。米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；ならびにWO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、W098/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741もまた参照されたい；これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０４４１】
抗体は、トランスジェニック動物によって作製することも可能である。特に、ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現し得ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為にまたは相同組換えによりマウス胚性幹細胞に導入し得る。または、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、JH領域のホモ接合性欠失は内因性抗体産生を妨げる。改変した胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞にマイクロインジェクションして、キメラマウスを作製する。次いでキメラマウスを交配し、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を作製する。このトランスジェニックマウスに、選択した抗原、例えば本発明のポリペプチドのすべてまたは一部を、通常の様式で免疫化する。免疫化したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて、その抗原に対するモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスによって保持されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の間に再編成し、その後クラススイッチおよび体細胞変異を起こす。したがって、このような技法を用いて、治療上有用なIgG、IgA、IgM、およびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの技術の総説については、Lonberg and  Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術、ならびにそのような抗体を作製するための手順の詳細な考察については、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 98/24893、WO 96/34096、およびWO 96/33735号；ならびに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、および第5,939,598号を参照されたい。さらに、選択した抗原に対するヒト抗体を上記と類似の技術を用いて提供するよう、Abgenix, Inc.(カリフォルニア州、フリーモント)およびGenpharm(カリフォルニア州、サンノゼ)などの企業に依頼することができる。
【０４４２】
米国特許第5,849,992号は、例えば、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現する方法について記載している。乳汁特異的プロモーター、および関心対象の抗体をコードする核酸、および分泌のためのシグナル配列を含む導入遺伝子を構築する。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌により産生される乳汁は、その中に分泌された関心対象の抗体を含む。抗体は乳汁から精製することができ、または用途によっては直接乳汁を用いることもできる。
【０４４３】
キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるMorrison, 1985, Science 229:1202；Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214；Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；ならびに米国特許第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号、および第6,331,415号を参照されたい。
【０４４４】
ヒト化抗体とは、所定の抗原と結合することができ、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク、および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRを含む抗体またはその変種もしくは断片である。ヒト化抗体は、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン(すなわち、ドナー抗体)のものに対応し、かつフレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメイン(Fab、Fab'、F(ab').sub.2、Fabc、Fv)の実質的にすべてを含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのFcの少なくとも一部を含む。通常、抗体は軽鎖、および重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含む。抗体はまた、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含み得る。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含む免疫グロブリンの任意のクラス、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む任意のアイソタイプから選択され得る。ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される場合には、通常は定常ドメインは補体結合定常ドメインであり、またクラスは典型的にIgG1である。そのような細胞傷害活性が所望されない場合、定常ドメインはIgG2クラスのものであってよい。ヒト化抗体は、2つ以上のクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含んでもよく、所望のエフェクター機能を最適化するための特定の定常ドメインの選択は、当技術分野における通常の技術の範囲内である。ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は正確に親配列に対応する必要はなく、例えば、ドナーCDRまたはコンセンサスフレームワークは少なくとも1つの残基の置換、挿入、または欠失により突然変異を生じて、その部位におけるCDRまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたは移入抗体に対応しなくてもよい。しかし、そのような変異は広汎なものではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75%、より多くの場合には90%、ほとんどの場合には95%超が、親FRおよびCDR配列の残基に対応する。ヒト化抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができ、そのような技法には、これらに限定されないが、CDR移植(EP 239,400；WO 91/09967；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号）、張り合わせまたは再表面形成(EP 592,106およびEP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814；ならびにRoguska et al. , 1994, PNAS 91:969-973)、鎖シャフリング(米国特許第5,565,332号)、ならびに例えば米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、WO 9317105、Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25、Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13(5):353 - 60、Morea et al., 2000, Methods 20(3):267-79、Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-84、Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9(10):895-904、Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s - 5977s、Couto et al., 1995, Cancer Res. 55(8):1717-22、Sandhu JS, 1994, Gene 150(2):409-10、およびPedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235(3):959-73に開示された技法が含まれる。多くの場合、フレームワーク領域のフレームワーク残基をCDRドナー抗体由来の対応する残基で置換して、抗原結合を変化させる、好ましくは改良する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周���の方法により、例えば、CDRとフレームワーク残基の相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定すること、および配列比較により特定位置の独特なフレームワーク残基を同定することによって確認する(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるQueen et al.、米国特許第5,585,089号；およびRiechmann et al.、1988, Nature 332:323を参照されたい)。
【０４４５】
単一ドメイン抗体、例えば軽鎖を欠く抗体は、当技術分野で周知の方法により作製することができる。それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられるRiechmann et al., 1999, J. Immuno. 231:25-38；Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3):253-263；Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4):277-302；米国特許第6,005,079号；ならびにWO 94/04678、WO 94/25591、およびWO 01/44301を参照されたい。
【０４４６】
さらに、抗原に特異的に結合する抗体を利用して、当業者に周知の技法を用いて、抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製することができる(例えば、Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7(5):437-444；およびNissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438を参照されたい)。そのような抗体は、単独でまたは他の治療と組み合わせて、1つまたは複数の結腸直腸病変の予防、治療、または改善に用いることができる。
【０４４７】
本発明は、抗原に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、高ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。
【０４４８】
ポリヌクレオチドを得て、当技術分野で公知の任意の方法によりポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。公知の抗体をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができ、すなわち特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、抗体をコードする核酸が作製されるように組み立てる。抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドは、化学合成したオリゴヌクレオチドから組み立てることができ(例えば、Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242に記載される通り)、これは簡潔に説明すると、抗体、その断片または変種をコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、それらオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびに連結されたオリゴヌクレオチドのPCRによるその後の増幅を伴う。
【０４４９】
または、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源の核酸から作製してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手できなくても、その抗体分子の配列が公知であれば、免疫グロブリンをコードする核酸は化学合成することができる、または適切な供給源(例えば、抗体cDNAライブラリー、または本発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から作製したcDNAライブラリー、もしくはそれから単離した核酸、いくつかの態様においてはポリA+ RNA)からその配列の3'および5'末端にハイブリダイズし得る合成プライマーを用いてPCR増幅することにより、もしくは例えば抗体をコードするcDNAクローンをcDNAライブラリーから同定するための、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングすることにより取得することができる。次いで、PCRにより作製された増幅核酸を、当技術分野で周知の方法を用いて複製可能なクローニングベクター中にクローニングし得る。
【０４５０】
抗体のヌクレオチド配列が決定されたならば、ヌクレオチド配列の操作に関する当技術分野で周知の方法、例えば組換えDNA技法、部位特異的突然変異誘発、PCRなど(例えば、いずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al.,  1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載される技法を参照されたい)を用いて抗体のクレオチド配列を操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製し、例えばアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を創出することができる。
【０４５１】
本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその断片(いくつかの態様においては、重鎖または軽鎖可変ドメインを含むが、必ずしも必要ではない)をコードするポリヌクレオチドが得られた時点で、抗体分子の産生用のベクターを、当技術分野で周知の技法を用いて組換えDNA技術により作製することができる。
【０４５２】
1つの好ましい態様において、モノクローナル抗体は哺乳動物において産生させる。クローン抗体またはその抗原結合断片を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(例えばKaufman and Sharp (1982, Mol. Biol. 159:601-621)に記載されているようなDHFR選択マーカーと共に用いられる、Urlaub and Chasin (1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)に記載のdhfr- CHO細胞を含む)、リンパ球細胞株、例えばNS0骨髄腫細胞およびSP2細胞、COS細胞、ならびにトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物に由来する細胞が含まれる。例えば、細胞は乳腺上皮細胞である。
【０４５３】
多様な免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞中でベクターの複製を調節する配列(例えば、複製起点)および選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有し得る。選択マーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が容易になる(例えば、米国特許第4,399,216号、第4,634,665号、および第5,179,017号を参照されたい)。例えば、典型的に選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、G418、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(メトトレキセート選択／増幅と共にdhfr−宿主細胞で使用する)およびneo遺伝子(G418選択用)が含まれる。
【０４５４】
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組換え発現のための例示的な系では、抗体重鎖および抗体軽鎖を両方コードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによりdhfr- CHO細胞に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖および軽鎖遺伝子はそれぞれ、遺伝子の高レベル転写を駆動するためにエンハンサー／プロモーター調節エレメント(CMVエンハンサー／AdMLPプロモーター調節エレメントまたはSV40エンハンサー／AdMLPプロモーター調節エレメントのように、例えばSV40、CMV、アデノウイルスなどに由来する)と機能的に連結されている。組換え発現ベクターはまた、メトトレキセート選択／増幅を用いて、ベクターで形質転換されたCHO細胞の選択を可能にするDHFR遺伝子を有し得る。選択された形質転換宿主細胞を、抗体重鎖および軽鎖の発現が可能となるよう培養し、培養液から無傷の抗体を回収する。標準的な分子生物学的技法を用いて組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクションし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養液から抗体を回収する。例えば、いくつかの抗体は、プロテインAまたはプロテインGを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。
【０４５５】
Fcドメインを含む抗体に関しては、抗体産生系は好ましくは、Fc領域がグリコシル化された抗体を合成する。例えば、IgG分子のFcドメインは、CH2ドメイン内のアスパラギン297でグリコシル化される。このアスパラギンは、二分岐型オリゴ糖による修飾部位である。このグリコシル化は、Fcg受容体および補体C1qにより媒介されるエフェクター機能に必要であることが実証されている(Burton and Woof, 1992, Adv. Immunol. 51 :1-84；Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76）。好ましい態様において、Fcドメインは、アスパラギン297に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系で産生させる。Fcドメインはまた、他の真核生物翻訳後修飾を含み得る。
【０４５６】
抗体分子が組換え発現により産生されたならば、免疫グロブリン分子を精製するための当技術分野で公知の任意の方法により、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインAクロマトグラフィー後の特定抗原に対する親和性によるアフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ分離カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差により、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準的技法により、抗体分子を精製することができる。さらに、抗体またはその断片を、精製を容易にするための当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合させてもよい。
【０４５７】
遺伝子治療技法
遺伝子治療とは、発現されたまたは発現可能な核酸を対象に投与することによって行う治療を指す。当技術分野で利用可能な遺伝子治療の方法のいかなるものも、本発明に従って用いることができる。例示的な方法を以下に記載する。
【０４５８】
特定の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーに対する1つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを遺伝子治療として投与する。他の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物に特異的に結合する1つまたは複数の抗体をコードするヌクレオチドを含む1つまたは複数の核酸分子を遺伝子治療として投与する。他の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーのタンパク質産物、またはその類似体、誘導体、もしくは断片をコードするヌクレオチドを含む1つまたは複数の核酸分子を遺伝子治療として投与する。さらなる他の態様においては、1つまたは複数の結腸直腸病変を予防、治療、または改善するために、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物の1つまたは複数のドミナントネガティブポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む1つまたは複数の核酸分子を遺伝子治療として投与する。
【０４５９】
遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。使用できる組換えDNA技術の分野で一般的に公知の方法は、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. NY；およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
【０４６０】
1つの局面において、本発明の組成物は、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物に特異的に結合する1つまたは複数の抗体をコードする核酸配列であって、適切な宿主において1つまたは複数の抗体を発現する発現ベクターの一部である核酸配列を含む。特に、このような核酸配列は、抗体に機能的に連結されたプロモーターであって、誘導性または構成的、任意には組織特異的であるプロモーターを有する。
【０４６１】
別の局面において、本発明の組成物は、本発明の1つまたは複数のバイオマーカーの1つまたは複数のタンパク質産物のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸配列であって、適切な宿主においてドミナントネガティブポリペプチドを発現する発現ベクターの一部である核酸配列を含む。特に、そのような核酸配列は、ドミナントネガティブポリペプチドに機能的に連結されたプロモーターであって、誘導性または構成的、任意には組織特異的であるプロモーターを有する。別の特定の態様においては、ドミナントネガティブコード配列および任意の他の所望の配列に、ゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域が隣接した核酸分子を使用し、こうしてドミナントネガティブ核酸の染色体内発現が提供される(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。
【０４６２】
患者への核酸の送達は直接的であってよく、この場合は患者を核酸もしくは核酸運搬ベクターに直接曝露し、または核酸の送達は間接的であってよく、この場合は細胞をまずインビトロで核酸によって形質転換し、次いでこれを患者に移植する。これらの2つのアプローチは、それぞれインビボまたはエクスビボ遺伝子治療として知られている。
【０４６３】
特定の態様においては、核酸配列をインビボで直接投与し、そこでその配列が発現してコードされる産物が産生される。これは、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかにより、例えば適切な核酸発現ベクターの一部としてこれを構築し、例えば欠陥もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いる感染により(米国特許第4,980,286号)、または裸のDNAの直接注射により、または微粒子銃(例えば、遺伝子銃；Biolistic、Dupont)を用いて、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤で被覆して、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセルへの封入、または核に入ることが知られているペプチドに連結して投与することにより、受容体媒介エンドサイトーシスを受けやすいリガンドに連結して投与することにより(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)(受容体を特異的に発現する細胞型を標的化するために用いることができる)など、それが細胞内に入るように投与することによって達成することができる。別の態様においては、リガンドが、エンドソームを破壊して核酸がリソソーム分解されないようにする膜融合ウイルスペプチドを含む、核酸-リガンド複合体を形成することができる。さらに別の態様においては、細胞特異的取り込みおよび発現のために、特定の受容体を標的化することによって、核酸をインビボで標的化することができる(例えば、1992年4月16日付のWO 92/06180(Wu et al.)；1992年12月23日付のWO 92/22635(Wilson et al.)；1992年11月26日付のWO92/20316(Findeis et al.)；1993年7月22日付のWO 93/14188(Clarke et al.)；1993年10月14日付のWO 93/20221(Young)を参照されたい)。または、核酸を細胞内に導入し、相同組換えにより発現のために宿主細胞DNA内に取り込むことができる(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；およびZijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。
【０４６４】
例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNA内への組み込みに必要でないレトロウイルス配列を除去するように改変されている。遺伝子治療で用いる関心対象の抗体または関心対象のタンパク質もしくはその断片をコードする核酸配列を1つまたは複数のベクター中にクローニングし、これによって患者への遺伝子の送達が促進される。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細はBoesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302に見出すことができ、これは幹細胞を化学療法に対してより耐性にする目的で、造血幹細胞にmdr1遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用について記載している。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例証する他の参考文献には以下がある：Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Kiem et al., 1994, Blood 83:1467-1473；Salmons and Gunzberg, 1993, Human. Gene Therapy 4:129-141；およびGrossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114。
【０４６５】
アデノウイルスは、遺伝子治療で使用できる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、気道上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは天然で気道上皮に感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利点を有する。Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の総説を提示している。Bout et al., 1994, Human. Gene Therapy 5:3-10は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルス使用の他の例は、Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434；Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155；Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234；WO94/12649；およびWang, et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783に見出すことができる。好ましい態様では、アデノウイルスベクターを使用する。
【０４６６】
アデノ随伴ウイルス(AAV)もまた、遺伝子治療での使用が提唱されている(Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300；米国特許第5,436,146号)。
【０４６７】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により、組織培養の細胞に遺伝子を導入することを含む。通常、導入方法は細胞への選択マーカーの導入を含む。次に細胞を選択下に置いて、導入遺伝子を取り込み発現している細胞を単離する。次いで、これらの細胞を患者に送達する。
【０４６８】
この態様では、核酸を細胞に導入後、得られた組換え細胞をインビボで投与する。このような導入は、これらに限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、微小核体媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含む、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。細胞への外来遺伝子の導入に関しては当技術分野において多くの技法が知られており(例えば、Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；Cline. 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92を参照されたい)、レシピエント細胞の必要な発達機能および生理学的機能が破壊されない限り、本発明に従って用いることができる。この技法は細胞への核酸の安定した導入を提供するはずであり、その結果核酸は細胞により発現可能となり、好ましくは遺伝性でその細胞子孫により発現され得る。
【０４６９】
得られた組換え細胞は、当技術分野で公知の種々の方法により患者に送達することができる。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞または前駆細胞)および／または腸細胞は、好ましくは静脈内投与する。使用予定の細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定され得る。
【０４７０】
遺伝子治療の目的で核酸を導入できる細胞は、任意の所望の利用可能な細胞型を包含し、これには上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、腸細胞、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞、；血液細胞、例えばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球など；種々の幹細胞または前駆細胞、特に例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるような造血幹細胞または前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０４７１】
好ましい態様において、遺伝子治療に用いる細胞は患者の自己のものである。
【０４７２】
遺伝子治療において組換え細胞を用いる1つの態様においては、関心対象の抗体または関心対象のタンパク質もしくはその断片をコードする核酸配列を、それらが細胞またはその子孫によって発現され得るように細胞に導入し、次いで治療効果をもたらすために組換え細胞をインビボで投与する。特定の態様では、幹細胞または前駆細胞を使用する。インビトロで単離でき維持できる任意の幹細胞および／または前駆細胞は、本発明のこの態様に従って使用できる可能性がある(例えば、1994年4月28日付のWO 94/08598；Stemple and Anderson, 1992, Cell 71:973-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:29；およびPittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771を参照されたい)。
【０４７３】
関心対象の抗体、関心対象のタンパク質またはその断片をコードする核酸配列の発現を制御するために用いることのできるプロモーターは、構成的、誘導性、または組織特異的であってよい。非限定的な例には、SV40初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42)；βラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731)またはtacプロモーター(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25)などの原核生物発現ベクター；Scientific American, 1980, 242:74-94の「Useful Proteins from recombinant bacteria」もまた参照されたい；ノパリン合成酵素プロモーター領域(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120)を含む植物発現ベクター；Gal4プロモーターなどの酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント、ADC(アルコール脱水素酵素)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性を有するエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646；Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)；膵臓β細胞において活性を有するインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)、リンパ系細胞において活性を有する免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658；Adames et al., 1985, Nature 318:533-538；Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣、乳房、リンパ系、および肥満細胞において活性を有するマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495)、肝臓において活性を有するアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276)、肝臓において活性を有するα-フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648；Hammer et al., 1987, Science 235:53-58)；肝臓において活性を有するα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel.1:161-171)、骨髄細胞において活性を有するβ-グロビン遺伝子制御領域(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340；Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94)；脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性を有するミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712)；骨格筋において活性を有するミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314:283-286)、ならびに視床下部において活性を有するゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)が含まれる。
【０４７４】
特定の態様においては、遺伝子治療の目的で導入する核酸は、コード領域に機能的に連結された誘導性プロモーターを含み、その結果、核酸の発現は転写の適切な誘導因子の有無を制御することにより制御可能である。
【０４７５】
(S) 薬学的組成物
本発明の方法を用いて同定された生物活性化合物または薬学的に許容されるその塩を、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する患者、いくつかの態様においてはヒトを含む哺乳動物に投与することができる。特定の態様では、化合物または薬学的に許容されるその塩を、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する患者、いくつかの態様においてはヒトを含む哺乳動物に投与する。別の態様では、化合物または薬学的に許容されるその塩を、1つまたは複数の結腸直腸病変に対する予防措置として患者、いくつかの態様においてはヒトを含む哺乳動物に投与する。これらの態様においては、患者は小児、成人、または高齢者であってよく、「小児」とは24ヶ月齢から18歳の対象、「成人」とは18歳以上の対象、および「高齢者」とは65歳以上の対象である。
【０４７６】
患者に投与する場合、化合物または薬学的に許容されるその塩は、任意に薬学的に許容される媒体を含む組成物の成分として投与する。組成物は、経口投与すること、または任意の他の簡便な経路により、例えば点滴もしくはボーラス注射により、上皮もしくは粘膜内層(例えば、口腔粘膜、直腸、および腸管粘膜など)を介した吸収により投与することができ、別の生物活性薬剤と共に投与することができる。投与は全身性または局所的であってよい。種々の送達系、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルへの封入などが公知であり、化合物および薬学的に許容されるその塩を投与するために用いることができる。
【０４７７】
投与方法には、これらに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸内、吸入、または特に耳、鼻、眼、もしくは皮膚への局所的投与が含まれる。投与方法は実施者の判断に任される。ほとんどの場合、投与の結果、化合物または薬学的に許容されるその塩が血流中に放出される。
【０４７８】
特定の態様では、化合物または薬学的に許容されるその塩を局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、これらに限定されないが例えば、手術中の局所注入により、例えば手術後に創傷包帯と組み合わせた局所適用、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはシラスティック膜などの膜を含む多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン状物質または線維でできた埋込物により達成され得る。特定の態様において、化合物は胃腸系の1つまたは複数の部分に局所投与する。
【０４７９】
特定の態様では、化合物または薬学的に許容されるその塩を、脳室内、くも膜下腔内、および硬膜外注射を含む任意の適切な経路によって胃腸系に導入することが望ましい場合がある。脳室内注射は、例えばオンマヤ槽などの槽に接続した脳室内カテーテルによって容易になり得る。
【０４８０】
例えば、吸入器もしくは噴霧器を用いて、かつエアロゾル化剤と共に製剤化することにより、またはフッ化炭素もしくは合成肺サーファクタント中での灌流により、肺投与を用いることもできる。特定の態様では、化合物および薬学的に許容されるその塩を、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの媒体を用いて、坐剤として製剤化することができる。
【０４８１】
別の態様では、化合物および薬学的に許容されるその塩を、小胞、特にリポソーム中に含めて送達することができる(Langer, 1990, Science, 249:1527-1533；Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and  Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)；Lopez-Berestein、同書、pp. 317-327を参照されたい；一般的には同書を参照されたい)。
【０４８２】
さらに別の態様では、化合物および薬学的に許容されるその塩を徐放系で送達することができる(例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release、前記、 vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい)。Langer, 1990, Science 249:1527-1533による総説で考察されている他の徐放系を用いることも可能である。1つの態様では、ポンプを使用し得る(Langer、前記；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい)。別の態様では、高分子材料を用いることができる(Medical Applications of Controlled Release, Langer and  Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and  Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい；Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105もまた参照されたい)。さらに別の態様では、徐放系を化合物または薬学的に許容されるその塩の標的RNAの近傍に配置することができ、これにより全身用量の一部しか必要でなくなる。
【０４８３】
本明細書に記載の化合物は、投与に適した薬学的組成物中に組み入れることができる。そのような組成物は典型的に、活性化合物および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的活性物質にそのような媒体および薬物を使用することは、当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物中でのその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み入れることができる。
【０４８４】
本発明は、関心対象のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するための薬学的組成物を調製する方法を含む。そのような方法は、薬学的に許容される担体を、関心対象のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する薬剤と共に製剤化することを含む。そのような組成物は、さらなる活性薬剤をさらに含み得る。したがって本発明は、薬学的に許容される担体を、関心対象のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する薬剤および1つまたは複数のさらなる活性化合物と共に製剤化することによる、薬学的組成物を調製する方法をさらに含む。
【０４８５】
本発明の薬学的組成物は、意図する投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜、および直腸内投与が含まれる。静脈内投与が好ましい。非経口、皮内、または皮下適用に用いる溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など、抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸など、緩衝液、例えば酢酸、クエン酸、またはリン酸など、および等張性調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースなど。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調節し得る。非経口用調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回用量バイアル中に封入することができる。
【０４８６】
注射用途に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液、および滅菌注射溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF；ニュージャージー州、パーシッパニー)、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれる。いずれの場合においても、組成物は無菌でなければならず、容易に注射が可能な程度まで流動性であるべきである。組成物は製造および貯蔵条件下で安定でなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロプレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆剤を用いて、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤を用いて維持することができる。微生物作用の抑制は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成し得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより達成し得る。
【０４８７】
滅菌注射溶液は、活性化合物(例えば、ポリペプチドまたは抗体)の必要量を、必要に応じて上記に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に組み入れ、その後滅菌濾過することにより調製することができる。一般的には、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上記に列挙したもののうち必要な他の成分を含む滅菌媒体に組み入れることにより調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥である。
【０４８８】
経口用組成物は一般的に、不活性希釈剤または可食担体を含む。これらはゼラチンカプセル中に封入するか、または圧縮して錠剤にすることができる。経口による治療投与を目的とする場合、活性化合物は賦形剤と共に組み入れ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用し得る。経口用組成物はまた、口腔洗浄液として用いるために液体担体を用いて調製してもよく、この場合、液体担体中の化合物は経口的に適用され、うがいして吐き出されるかまたは飲み込まれる。
【０４８９】
薬学的に適合する結合剤および／または補助物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれかまたは類似の性質の化合物を含み得る：結合剤、例えば微晶質セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなど；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトースなど、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル(Primogel)、もしくはコーンスターチなど；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステロート(Sterote)など；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素など；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリンなど；または香料添加剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなど。
【０４９０】
吸入によって投与する場合、化合物は、適切な噴霧剤、例えば二酸化炭素などの気体を含む加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達する。
【０４９１】
経粘膜または経皮手段による全身投与も可能である。経粘膜または経皮投与するには、障壁を透過するのに適した浸透剤を製剤中で使用する。そのような浸透剤は当技術分野で一般的に公知であり、例えば経粘膜投与の場合、これには界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤を用いて達成し得る。経皮投与するには、活性化合物を、当技術分野で一般的に公知である軟膏剤(ointment)、軟膏剤(salve)、ゲル、またはクリームに製剤化する。
【０４９２】
化合物はまた、直腸送達のために、坐剤(例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの従来の座剤基剤と共に)または停留浣腸の形態で調製してもよい。
【０４９３】
1つの態様おいては、活性化合物を、埋込剤およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、体内からの迅速な排出から化合物を防御する担体と共に調製する。例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することも可能である。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて、感染細胞に標的化するリポソームを含む)もまた、薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載されているような当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０４９４】
投与の簡便性および用量の均一性のため、用量単位形態で経口または非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で用いる用量単位形態とは、治療しようとする個体に対して単位用量として適している、物理的に分離した単位を指す；各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果をもたらすように算出された規定量の活性化合物を含む。本発明の用量単位形態の規格は、活性化合物の特有の特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびに個体を治療するためのそのような活性化合物の配合技術における限界に直接依存して決まる。
【０４９５】
抗体に関しては、好ましい用量は、0.1 mg/kg〜100 mg/kg体重(より好ましくは、0.1〜20 mg/kg、0.1〜10 mg/kg)である。一般的に、部分的ヒト抗体および完全ヒト抗体は、他の抗体よりも人体での半減期が長い。したがって、より低い用量およびより少ない投与頻度が可能となる場合が多い。脂質付加などの修飾を用いて抗体を安定化し、取り込みおよび組織透過(例えば、胃腸系への)を増強することができる。抗体の脂質付加の方法は、Cruikshank et al. (1997, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193)により記載されている。
【０４９６】
特定の態様において、タンパク質またはポリペプチドの有効量(すなわち有効用量)は約0.001〜30 mg/kg体重、好ましくは約0.01〜25 mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜20 mg/kg体重、さらにより好ましくは約0.1〜1.0 mg/kg、1〜10 mg/kg、2〜9 mg/kg、3〜8 mg/kg、4〜7 mg/kg、または5〜6 mg/kg体重である。
【０４９７】
当業者であれば、疾患または障害の重症度、以前の治療、個体の健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、個体を効果的に治療するために必要な用量に影響を及ぼし得ることを理解すると考えられる。さらに、治療有効量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体による個体の治療には、単回治療が含まれてよく、または好ましくは一連の治療が含まれ得る。
【０４９８】
上記の化合物に加えて、本発明は、関心対象の核酸またはポリペプチドの発現または活性を調節する小分子の使用を包含する。小分子の非限定的な例には、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む)、モル当たり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モル当たり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モル当たり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態が含まれる。
【０４９９】
小分子薬剤の適切な用量は、通常の技法を有する医師、獣医、または研究者の理解の範囲内のいくつかの要因に依存することが理解される。小分子の用量は、例えば治療を受ける個体または試料の同一性、大きさ、および状態に応じて、さらには該当する場合には組成物の投与経路、および実行者が望む、小分子が本発明の核酸またはポリペプチドに及ぼす効果に応じて異なる。例示的な用量には、個体または試料の重量1キログラム当たりミリグラムまたはマイクログラム量の小分子(例えば、約1マイクログラム/キログラム〜約500ミリグラム/キログラム、約100マイクログラム/キログラム〜約5ミリグラム/キログラム、または約1マイクログラム/キログラム〜約50マイクログラム/キログラム)が含まれる。小分子の適切な用量は、調節しようとする発現または活性に関する小分子の効力に依存することがさらに理解される。そのような適切な用量は、本明細書に記載のアッセイを用いて決定することができる。本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するためにこれらの小分子の1つまたは複数を個体(例えば、ヒト)に投与する場合、医師、獣医、または研究者は、例えばまず比較的低用量を処方し、続いて適切な応答が得られるまで用量を上げていくことができる。さらに、任意の特定の動物対象に対する特定の用量レベルは、使用する特定化合物の活性、対象の年齢、体重、健康状態、性別、および食習慣、投与時間、投与経路、排泄率、任意の薬物の組み合わせ、ならびに調節しようとする発現または活性の程度を含む種々の要因に依存することが理解される
【０５００】
薬学的組成物は、投与に関する説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー中に含めることができる。
【０５０１】
(T) キット
本発明は、本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも12種、少なくとも15種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのタンパク質およびRNA産物の発現を測定するためのキットを提供する。そのようなキットは、そのようなタンパク質およびRNA産物の発現を測定するのに必要な材料および試薬を含む。特定の態様において、キットは、(1) 血液からRNAを精製するための試薬；(2) 試験核酸を作製するためのバイオマーカー特異的プライマーセット；(3) dNTPおよび／またはrNTP(予め混合したものまたは別々のもの)、任意に一意的に標識された1つまたは複数のdNTPおよび／またはrNTP(例えば、ビオチン化またはCy3もしくはCy5タグ化dNTP)を含む；(4) 蛍光色素の化学活性誘導体などの合成後標識試薬；(5) 逆転写酵素、DNAポリメラーゼなどの酵素；(6) 種々の緩衝液媒体、例えばハイブリダイゼーション、洗浄、および／または酵素緩衝液；(7) スピンカラムなどのような標識プローブ精製試薬および成分；ならびに(8) タンパク質精製試薬；(9) シグナル発生および検出試薬、例えばストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ複合体、化学蛍光または化学発光基質などのような、種々の方法で使用する1つまたは複数のさらなる試薬をさらに含み得る。特定の態様において、キットは、対照として使用するための、試料(例えば、血液)から単離されたまたは合成された、予め標識され品質管理されたタンパク質およびまたはRNAを含む。いくつかの態様において、キットは、少なくとも1つのバイオマーカーの産物のレベルを表すデータを用いる式を有し、試験対象が1つもしくは複数のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変を有する可能性の指標を生成するコンピュータ可読媒体を含み得る。コンピュータ可読媒体の式は、第(G)項に概説した方法を用いて作成することができる。
【０５０２】
いくつかの態様において、キットはPCRキットまたはリアルタイムPCRキットおよび／またはQRT-PCRキットである。他の態様において、キットは核酸アレイおよびタンパク質アレイである。本発明によるそのようなキットは少なくとも、本発明のタンパク質または核酸メンバーが結合したアレイ、およびその実装手段を含む。または、本発明のタンパク質または核酸メンバーはアレイ上に予め実装されてもよい。
【０５０３】
1つの態様において、QRT-PCRキットは以下のものを含む：(a) それぞれ本発明のバイオマーカーの組み合わせ内のバイオマーカーを増幅するために用いられる、2つまたはそれ以上のバイオマーカー特異的プライマーセット；(b) 緩衝液および逆転写酵素を含む緩衝液；(c) 1つまたは複数の耐熱性ポリメラーゼ；ならびに(d) Sybr(登録商標)グリーン。別の態様において、本発明のキットは(a) 参照対照RNAおよび／または(b) 混入対照RNAを含み得る。別の態様において、キットはまた、少なくとも1つのバイオマーカーの産物のレベルを表すデータを用いる式を有し、試験対象が1つもしくは複数のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変を有する可能性の指標を生成するコンピュータ可読媒体を含む。コンピュータ可読媒体の式は、第(G)項に概説した方法を用いて作成することができる。
【０５０４】
本発明は、1つもしくは複数のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変の試験、検出、スクリーニング、診断、モニタリング、および予後診断に有用であるキットを提供する。例えば、本発明の特定の態様において、キットはフォワードおよびリバースプライマーからなり、フォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ表1、2、11、または12中に特定された群より選択される単一の異なるバイオマーカーに対応するmRNA種のすべての発現を定量するように設計されている。特定の態様において、プライマーセットの少なくとも一方のプライマーは、mRNA種のエキソン接合部にまたがるように設計されている。
【０５０５】
本発明は、試料中の本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのタンパク質またはRNA産物の発現レベルに基づく、1つまたは複数のタイプまたはサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変の試験、検出、スクリーニング、診断、モニタリング、および予後診断に有用なキットを含む。
【０５０６】
本発明は、試料中の本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのタンパク質またはRNA産物の発現に基づいて、個体が受けている1つまたは複数の治療の有効性をモニターするのに有用なキットを含む。
【０５０７】
本発明は、試料中の本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのタンパク質またはRNA産物の発現に基づいて、個体が治療に応答するかどうかを決定するのに使用するキットを含む。
【０５０８】
本発明は、試料中の本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのRNA産物の発現を測定するためのキットを含む。特定の態様において、そのようなキットは、本発明のバイオマーカーのRNA産物の発現を測定するのに必要な材料および試薬を含む。例えば、ポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変を検出するためのマイクロアレイまたはQRT-PCRキットを作製することができ、これは本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのRNA産物のレベルを測定するのに必要な試薬および材料のみを含む。または、いくつかの態様において、キットは、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのRNA産物のレベルを測定するのに必要な材料および試薬に限定されない材料および試薬を含み得る。例えば、マイクロアレイキットは、本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのRNA産物のレベルを測定するのに必要な試薬および材料に加えて、1つまたは複数の結腸直腸病変と必ずしも関係しないかつそれを示唆しないRNA産物のレベルを測定するのに必要な試薬および材料を含み得る。特定の態様において、マイクロアレイまたはQRT-PCRキットは、本発明のバイオマーカーの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせ、および本発明のバイオマーカー以外の1種、2種、3種、4種、5種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、55種、60種、65種、70種、75種、80種、85種、90種、95種、100種、125種、150種、175種、200種、225種、250種、300種、350種、400種、450種、もしくはそれ以上の遺伝子、または本発明のバイオマーカー以外の1〜10種、1〜100種、1〜150種、1〜200種、1〜300種、1〜400種、1〜500種、1〜1000種、25〜100種、25〜200種、25〜300種、25〜400種、25〜500種、25〜1000種、100〜150種、100〜200種、100〜300種、100〜400種、100〜500種、100〜1000種、500〜1000種の遺伝子のRNA産物のレベルを測定するのに必要な試薬および材料を含む。
【０５０９】
核酸マイクロアレイキットでは、キットは一般に、支持体表面に結合したまたは配置されたプローブを含む。プローブは、検出可能な標識で標識することができる。特定の態様において、プローブは、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせのRNA産物のエキソン、イントロン、エキソン接合部、またはエキソン・イントロン接合部に特異的である。マイクロアレイキットは、アッセイの実施、およびアッセイを実施して得られたデータを解釈し解析する方法に関する説明書を含み得る。特定の態様において、キットは、1つもしくは複数のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変を検出または診断するための説明書を含む。キットはまた、ハイブリダイゼーション試薬、および／またはプローブが標的核酸配列にハイブリダイズした場合に発生するシグナルを検出するのに必要な試薬を含み得る。一般に、マイクロアレイキットの材料および試薬は1つまたは複数の容器に入っている。キットの各成分は一般に、その適切な容器に入っている。別の態様において、キットはまた、少なくとも1つのバイオマーカーの産物のレベルを表すデータを用いる式を有し、試験対象がポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変または結腸直腸病変のサブタイプを有する可能性の指標を生成するコンピュータ可読媒体を含む。コンピュータ可読媒体の式は、第(G)項に概説した方法を用いて作成することができる。
【０５１０】
QRT-PCRキットでは、キットは一般に、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせの特定のRNA産物(例えば、エキソン、イントロン、エキソン接合部、およびエキソン・イントロン接合部)に特異的な予め選択したプライマーを含む。QRT-PCRキットはまた、核酸の逆転写および／または増幅に適した酵素(例えば、Taqなどのポリメラーゼ)、ならびに逆転写および増幅の反応混合物に必要なデオキシヌクレオチドおよび緩衝液を含み得る。QRT-PCRキットはまた、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、もしくはすべて、または任意の組み合わせのRNA産物に特異的なプローブを含み得る。プローブは、検出可能な標識(例えば、蛍光標識)で標識してもよく、またはしなくてもよい。QRT-PCRキットの各成分は一般に、その適切な容器に入っている。別の態様において、キットはまた、少なくとも1つのバイオマーカーの産物のレベルを表すデータを用いる式を有し、試験対象がポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つもしくは複数の結腸直腸病変または結腸直腸病変のサブタイプを有する可能性の指標を生成するコンピュータ可読媒体を含む。コンピュータ可読媒体の式は、第(G)項に概説した方法を用いて作成することができる。
【０５１１】
したがって、これらのキットは一般に、それぞれ個々の試薬、酵素、プライマー、およびプローブに適した別々の容器を含む。さらに、QRT-PCRキットは、アッセイの実施、およびアッセイを実施して得られたデータを解釈し解析する方法に関する説明書を含み得る。特定の態様において、キットは、1つもしくは複数のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変を診断または検出するための説明書を含む。
【０５１２】
特定の態様において、キットはQRT-PCRキットである。そのようなキットは、96ウェルプレート、ならびにSYBRグリーン検出に必要な試薬および材料を含み得る。キットは、β-アクチンを用いて結果を正規化できるような試薬および材料を含み得る。キットはまた、水、リン酸緩衝生理食塩水、およびファージMS2 RNAなどの対照を含み得る。さらにキットは、アッセイの実施、およびアッセイを実施して得られたデータを解釈し解析する方法に関する説明書を含み得る。特定の態様において、説明書は、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせのRNA産物のレベルを、例えば5倍〜10倍異なる2つの濃度で調べるべきであることを記載している。
【０５１３】
抗体に基づくキットでは、キットは例えば、(1) 関心対象のタンパク質(例えば、本発明のバイオマーカーの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、すべて、または任意の組み合わせのタンパク質産物)に結合する一次抗体(支持体に結合していてもしていなくてもよい)；および任意に(2) タンパク質または一次抗体に結合し、検出可能な標識(例えば、蛍光標識、放射性同位体、または酵素)と結合した異なる二次抗体を含み得る。抗体に基づくキットはまた、免疫沈降を行うためのビーズを含み得る。抗体に基づくキットの各成分は一般に、その適切な容器に入っている。したがって、これらのキットは一般に、各抗体に適した別々の容器を含む。さらに、抗体に基づくキットは、アッセイの実施、およびアッセイを実施して得られたデータを解釈し解析する方法に関する説明書を含み得る。特定の態様において、キットは、1つもしくは複数のポリープまたは1つもしくは複数のサブタイプのポリープを含む1つまたは複数の結腸直腸病変を診断または検出するための説明書を含む。別の態様において、キットは、コンピュータ可読媒体の形式でデータを式に当てはめるための指示を含み、そのようなコンピュータ可読媒体はそのような指示を含む。そのようなコンピュータ可読媒体はまた、アッセイを実施して得られたデータを解釈し解析するための指示を含み得る。
【０５１４】
(U) SNP
一塩基多型(SNP)とは、異なる個体のゲノムにおける特定位置での一塩基変化である。SNPは、ゲノムDNAのコード領域および非コード領域の両方に見出される。スコア付け可能な表現型は小数ではあるが、SNPはヒトゲノムにわたって多数見出される(Cooper et al., Hum Genet 69:201-205, 1985)。SNPは遺伝子中に頻繁に見出される安定な遺伝子変化であり、生物において認められる広範な表現型変化に寄与する。一塩基多型(SNP)は、多くの遺伝病および表現型特性を同定する上での予測値となり得る。例えば、遺伝性乳癌と関連したSNPのように、特定のSNPが疾患原因となる変異をもたらすことが知られている(Cannon-Albright and Skolnick, Semin. Oncol. 23:1-5. 1996）。
【０５１５】
SNPは、当業者に周知のいくつかの方法によって生物のDNA中に同定することができ、そのような方法にはこれらに限定されないが、DNA配列決定により、PCR産物を増幅しそのPCR産物を配列決定することにより、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA)により、二重コードOLAにより、一塩基伸長アッセイにより、対立遺伝子特異的プライマー伸長により、またはミスマッチハイブリダイゼーションによりSNPを同定することが含まれる。
【０５１６】
本発明は、1つまたは複数の結腸直腸病変のない個体と比較して、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する個体の血液中で差次的に発現される遺伝子の選択物を同定したことで、1つまたは複数の結腸直腸病変と特異的に関連したSNPを同定するための、SNPをスクリーニングするより集中的かつ効率的な方法を提供する。本発明の1つの局面において、スクリーニングしようとするSNPの選択物は、表2および6に収載する遺伝子中に見出されるSNPである。本発明の別の局面においては、上記の方法を用いて、新たなSNPを疾患関連バイオマーカー中に同定することができる。
【０５１７】
特に、本発明は、本明細書において同定したバイオマーカー中のSNPのみをスクリーニングすることにより、1つまたは複数の結腸直腸病変と関連したSNPを同定する方法に重点を置く。本明細書に開示する方法を用いて同定されるSNPは、簡便な診断マーカーとなる。
【０５１８】
より具体的には、1つまたは複数の結腸直腸病変を有する個体が、SNP遺伝子座において1つまたは複数の結腸直腸病変のない個体と異なる多型を有する場合に、SNPをポリープ関連SNPと見なす。さらに、SNPの特定の多型が、1つまたは複数の結腸直腸病変をもたない個体よりも1つまたは複数の結腸直腸病変を有する個体において統計的に有意に高頻度で存在することが認められる場合に、特定のSNPを1つまたは複数の結腸直腸病変に特徴的であると見なす。統計的有意性の指標には、p <0.05、p <.001、p < .01、およびp <.10が含まれる。本方法は、1つまたは複数の結腸直腸病変の診断または検出に関して、SNPの診断価値を決定する方法を含む。
【０５１９】
当然のことながら、好ましい試料は血液であるが、これらの方法は、上皮細胞、頬側細胞、毛髪、唾液、組織細胞などを含むDNAを採取できる任意の試料を包含する。組織および／または血液試料を採取および保存するための種々の利用可能な方法が存在する。これらの選択肢により、組織および血液試料を、遺伝子型解析のために試料からゲノムDNAを回収するのに適した形態で保存し、運搬することが可能となる。DNA試料は、ワットマン紙、ガスリーカード、チューブ、スワブ、ろ紙、スライド、または他の容器を含む種々の固体媒体上に採取して保存することができる。例えば、全血をろ紙上に採取する場合には、これを乾燥させて室温で保存することができる。
【０５２０】
血液試料は、例えば血清除去血液試料、赤血球除去血液試料、血清除去および赤血球除去血液試料、溶解血液試料、細胞型に分画していない血液試料、および溶解血液試料の未分画細胞試料を含む様々な種類の血液試料のいずれか1つであってよい。血液試料の例を、以下の実施例の項の実施例1に記載する。
【０５２１】
本発明の別の局面において、ポリープ関連SNPは、ゲノムDNAの代わりに、表2および6に収載するポリープバイオマーカー遺伝子のRNA転写産物から同定することができる。1つの態様においては、所与の疾患または障害を有するおよび有さない個体の血液などの試料からRNAを単離し、これらのポリープバイオマーカー遺伝子によってコードされる転写産物をcDNAに逆転写する。cDNAを増幅し、解析して、ポリープバイオマーカー遺伝子中のSNPの存在を決定する。次いで1つまたは複数の結腸直腸病変を有する個体と1つまたは複数の結腸直腸病変をもたない個体とで差次的に発現されるポリープ関連バイオマーカー遺伝子中に同定されたSNPのそれぞれの分布を比較することによって、ポリープ関連SNPを同定し得る。本態様のさらなる変形では、SNPの存在に関してcDNAを解析する代わりに、疾患特異的バイオマーカー遺伝子のRNA転写産物またはそれらの増幅産物を、SNPの存在に関して解析する。
【０５２２】
ポリープバイオマーカー遺伝子を含むゲノムDNAの解析は、コード領域および調節領域中のSNPを同定する可能性を有し、後者は遺伝子の発現レベルの変化に寄与し得る。cDNAコードSNPの解析は、ポリープバイオマーカー遺伝子のコード領域中のSNPのみを同定する可能性を有し、これはタンパク質に基づくポリープ形成機構を解釈する上で役立ち得る。cDNAコードSNPを解析する方法は、患者および非患者由来の試料中のバイオマーカーのレベルを同定するために用いる、本明細書に記載の逆転写PCR反応で作製されたcDNAを解析することによって行い得る。
【０５２３】
ポリープ関連SNPは、当業者に周知のいくつかの方法によりポリープバイオマーカー遺伝子のDNA中に同定することができ(例えば、米国特許第6,221,592号および第5,679,524号を参照されたい)、そのような方法にはこれらに限定されないが、PCRまたはDNA増幅、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA)(Landegren et al., Science 241:1077, 1988)、二重コードOLA、ミスマッチハイブリダイゼーション、質量分析、一塩基伸長アッセイ、(US6,638,722)、対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づくRFLP検出(Kan and Dozy, Lancet ii: 910-912, 1978)、固定化オリゴヌクレオチド(Saiki et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:6230-6234, 1989)またはオリゴヌクレオチドアレイ(Maskos and Southern, Nucl Acids Res 21:2269-2270, 1993)を含む、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション(Wallace et al., Nucl Acids Res 6:3543-3557, 1978)、対立遺伝子特異的PCR(Newton et al., Nucl Acids Res 17:2503-16, 1989)、ミスマッチ修復検出(MRD)(Faham and Cox, Genome Res 5;474-482, 1995)、MutSタンパク質の結合(Wagner et al., Nucl Acids Res 23:3944-3948, 1995)、一本鎖DNA高次構造多型検出(Orita et al., Genomics 5:874-879, 1983)、ミスマッチ塩基対でのRNAase切断(Myers et al., Science 230:1242, 1985)、ヘテロ二重鎖DNAの化学的切断(Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:4397-4401, 1988)または酵素的切断(Youil et al., Proc Natl Acad Sci USA 92:87-91、1995)、対立遺伝子特異的プライマー伸長に基づく方法(Syvanen et al., Genomics 8:684-692, 1990)、遺伝子のビット解析(GBA)(Nikiforov et al., Nuci Acids Res 22:4167-4175, 1994)、ならびに当技術分野で周知の標準的な手順を用いる放射性および／または蛍光DNA配列決定によるSNPの同定が含まれる。
【０５２４】
ポリープバイオマーカー遺伝子中のポリープ関連SNPを同定するためにSNPのサブセットをスクリーニングする本方法はまた、DNAの非PCR法を包含する。これらの方法には、欧州特許出願第320,308号に開示されるリガーゼ連鎖反応(「LCR」)、PCT特許出願第PCT/US87/00880号に記載されるQβレプリカーゼ、等温増幅法、Walker et al. (Nucleic Acids Res 20(7):1691-1696, 1992)、米国特許第5,712,124号、第5,648,211号、および第5,455,166号に記載される鎖置換増幅(SDA)、環状プローブ反応、核酸配列に基づく増幅(NASBA)および3SR、Kwoh et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:1173-77、1989；PCT特許出願 WO 88/10315など、1989を含む転写に基づく増幅、英国特許出願第GB2,202,328号およびPCT特許出願第PCT/US89/01025号、Davey et al.、欧州特許出願第329,822号、Miller et al.、PCT特許出願 WO 89/06700に記載されるような他の増幅法、Frohman, PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications，Academic Press，N.Y., 1990に記載される「race」および「片側PCR(商標)」、Wu et al., Genomics 4:560-569, 1989に記載される、得られた「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下での2つ(またはそれ以上)のオリゴヌクレオチドの連結に基づく方法が含まれる。
【０５２５】
一般的には、使用するポリメラーゼが耐熱性であることを意図するが、非耐熱性ポリメラーゼもまた本開示の状況において使用することができる。本開示の状況において用い得る例示的なポリメラーゼおよび核酸修飾酵素には、OmniBase配列決定酵素、Pfu DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、配列決定等級、TaqBeadホットスタートポリメラーゼ、AmpliTaq Gold、Vent DNAポリメラーゼ、Tub DNAポリメラーゼ、TaqPlus DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼの耐熱性DNAポリメラーゼ；DNAポリメラーゼI、クレノウ断片、エキソヌクレアーゼマイナス、DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼI大(クレノウ)断片、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼのDNAポリメラーゼ；AMV逆転写酵素およびM-MLV逆転写酵素の逆転写酵素；T4 DNAリガーゼ、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼが含まれる。
【０５２６】
プライマーに取り込まれた、増幅中に増幅産物に取り込まれた、またはプローブに結合された認識部分は、増幅された分子の同定において有用である。いくつかの異なる標識をこの目的にために用いることができ、例えば以下のようなものがある：フルオロフォア、発色団、放射性同位体、酵素タグ、抗体、化学発光、電気発光、アフィニティー標識など。当業者であれば、これらおよび本明細書において言及していない他のフルオロフォアもまた、本開示において首尾よく使用できることを認識すると考えられる。アフィニティー標識の例には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：抗体、抗体断片、受容体タンパク質、ホルモン、ビオチン、DNP、またはアフィニティー標識に結合し、増幅された遺伝子の分離に使用できる任意のポリペプチド／タンパク質分子。酵素タグの例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、またはペルオキシダーゼなどの酵素が含まれる。さらに、相補的核酸を含む試料との特異的なハイブリダイゼーションを同定するために、比色指標基質を用いて、ヒトの目に可視であるかまたは分光光度的な検出手段を提供することができる。これらの例はすべて当技術分野において一般的に公知であり、当業者であれば、本開示が上記の例に限定されないことを認識すると考えられる。以下のフルオロフォアは、本開示において有用であることが特に意図される：Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カスケードブルー、Cy2、Cy3、Cy5、6-FAM、フルオレセイン、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッド。
【０５２７】
本開示の状況において、開示の方法のDNA増幅産物が、SNPを検出するために、DNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いて解析され得ることが具体的に意図される。次いで、増幅DNA産物を、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブを含むDNAチップまたはDNAマイクロアレイの上を通過させ得る。増幅DNAがマイクロアレイまたはDNAチップにハイブリダイズし得るまたはし得ないことにより、試料中に存在する転写産物をコードするバイオマーカー遺伝子中に存在するSNPの特徴づけが容易になる。
【０５２８】
以下の非限定的な実施例により、本発明を例証する。
【０５２９】
実施例
実施例1
未分画全血からのRNA単離
(a) 遠心分離し溶解した血液(血清除去、赤血球除去血液試料)
末梢全血10 mlをEDTA Vacutainerチューブ(Becton Dickinson、ニュージャージー州、フランクリンレイクス)中に採取し、処理するまで氷上で保存した(6時間以内)。遠心分離して、血液試料を血漿(バフィーコートを含む)と赤血球層に分離した。血漿を除去し、低張緩衝液(1.6 mM EDTA、10 mM KHCO3、153 mM NH4Cl、pH 7.4)を3:1量比で添加して赤血球を溶解した。混合物を遠心分離して細胞ペレットを得て、これを製造業者の説明書に従ってTRIzol(登録商標)試薬(Invitrogen Corp.、カリフォルニア州、カールズバッド) 1.0 mlおよびクロロホルム0.2 ml中に溶解してホモジナイズした。遠心分離後、イソプロパノールを水相に1:1比で添加し、-20℃で沈殿させた。次いで遠心分離してRNAペレットを得て、これを実験用途用の水に再懸濁した。RNAの質を、Agilent 2100バイオアナライザRNA 6000 Nano Chipで製造業者の指定通りに評価し、RNAの量をBeckman-Coulter DU640分光光度計で260 nmの吸光度により決定した。
【０５３０】
(b) 溶解血液
全血10 mlを、Vacutainerまたは所望する任意のより小さな容積の容器中に採取する。溶解緩衝液3 対 血液1の割合で、溶解緩衝液を血液試料に直接添加する(血液試料は血清が除去されていない)(溶解緩衝液(1 L) 0.6 g EDTA；1.0 g KHCO2、8.2 g NH4Cl、ｐH7.4に調整(NaOHを使用))。試料を混合し、透明になるまで氷上に5〜10分間置く。溶解した試料を1000 rpm、4℃で10分間遠心分離し、上清を吸引除去する。ペレットを溶解緩衝液5 mlに再懸濁し、再度1000 rpm、4℃で10分間遠心分離する。最初の血液試料10 mlにつきTRIzol(GIBCO/BRL)約6 mlの割合でTRIzolを用いて、ペレット化した細胞をホモジナイズし、十分にボルテックスする。試料を室温で5分間放置する。TRIzol 1 mlにつきクロロホルム1.2 mlを用いて、RNAを抽出する。試料を12,000 x g、4℃で5分間遠心分離し、上層を回収する。上層に対して、TRIzol 1 mlにつき0.5 mlの割合でイソプロパノールを添加する。試料を-20℃で一晩、または-20℃で1時間放置する。公知の方法に従ってRNAをペレット化し、RNAペレットを風乾し、ペレットをDEPC処理ddH2Oに再懸濁する。RNA試料はまた75%エタノール中で保存することもでき、この場合、試料は運搬用に室温で安定である。
【０５３１】
(c) 血清除去全血から
全血10 mlをVacutainer中に採取し、2,000 rpm(800 g)、4℃で5分間遠心し、血漿層を除去する。最初の血液試料10 mlにつきTRIzol(GIBCO/BRL)約6 mlの割合でTRIzolを用いて、残りの血液試料をホモジナイズし、十分にボルテックスする。試料を室温で5分間放置する。TRIzol 1 mlにつきクロロホルム1.2 mlを用いて、RNAを抽出する。試料を12,000 x g、4℃で5分間遠心分離し、上層を回収する。上層に対して、TRIzol 1 mlにつき0.5 mlの割合でイソプロパノールを添加する。試料を-20℃で一晩、または-20℃で1時間放置する。公知の方法に従ってRNAをペレット化し、RNAペレットを風乾し、ペレットをDEPC処理ddH2Oに再懸濁する。RNA試料はまた75%エタノール中で保存することもでき、この場合、試料は運搬用に室温で安定である。
【０５３２】
(d) 全血から
全血10 mlをVacutainer中に採取し、最初の血液試料10 mlにつきTRIzol(GIBCO/BRL)約6 mlの割合でTRIzolを用いて細胞をホモジナイズし、十分にボルテックスする。試料を室温に5分間放置する。TRIzol 1 mlにつきクロロホルム1.2 mlを用いて、RNAを抽出する。試料を12,000 x g、4℃で5分間遠心分離し、上層を回収する。上層に対して、TRIzol 1 mlにつき0.5 mlの割合でイソプロパノールを添加する。試料を-20℃で一晩、または-20℃で1時間放置する。公知の方法に従ってRNAをペレット化し、RNAペレットを風乾し、ペレットをDEPC処理ddH2Oに再懸濁する。RNA試料はまた75%エタノール中で保存することもでき、この場合、試料は運搬用に室温で安定である。
【０５３３】
(e) PAXgene(商標)を用いて全血から
全血2.5 mlをPAXgene(商標)血液RNAチューブ中に採取し、PAXgene(商標)血液RNAキット手順の説明書に従って処理する。簡潔に説明すると、血液をPAXgene(商標)チューブ中に少なくとも2時間保存した後、血液試料を遠心分離し、上清を廃棄する。供給される緩衝液BR1 360μlを残りの試料に添加し、試料をスピンカラムにピペットで移し、遠心分離してその後多数回の洗浄段階により洗浄し、最終的に溶出し保存する。
【０５３４】
(f) PAXgene(商標)およびその後のグロビン除去を用いて全血から
上記の(d)に記載したようにPAXgene(商標)から単離したRNAを、次に「グロビン除去手順(Globin Reduction Protocol)」という表題のAffymetrix(登録商標)テクニカルノートに記載される通りに処理して、グロビンmRNAを選択的に除去する。α1、α2、およびβグロビン種に特異的なオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液と共にインキュベートし、RNAse Hを用いてグロビンmRNAの分解を特異的に標的化し、Affymetrix製のcRNA精製カラムを用いてグロビンmRNAを除去する。
【０５３５】
実施例2
標的核酸の調製およびハイブリダイゼーション
(a) 1つまたは複数の結腸直腸病変の存在と共に差次的に発現される遺伝子
全RNA(5μg)を標識し、ポリープを有するまたは有さない個体から同様に調製した他の試料と共にAffymetrix U133Plus 2.0 GeneChips(Affymetrix；カリフォルニア州、サンタクララ)にハイブリダイズさせ、製造業者の説明書に従ってハイブリダイズさせた。簡潔に説明すると、全RNA 5μgを、プロモータープライマーキット(Affymetrix、P/N 900375)に供給されるGeneChip T7-オリゴ(dT)プライマーによるcDNA合成に使用した。cDNAをcDNA Cleanupスピンカラムで精製し、次いでEnzo(登録商標) BioArray(商標) High Yield(商標) RNA転写産物標識キットによるビオチン標識cRNAの合成に供した。標識cRNAをIVT cTNA Cleanupスピンカラムを用いてさらに精製し、分光光度計を用いて260 nmでの吸光度により定量した。次いでcRNA 20μgをハイブリダイゼーション混合物に添加し、混合物をプローブアレイカートリッジに供した。約16時間のハイブリダイゼーション後、アレイをAffymetrix流体ステーション400で洗浄した。次いでアレイを、Affymetrix(登録商標) GeneChip(登録商標)スキャナーでスキャンした。
【０５３６】
各アレイに関して包括的トリム平均シグナル強度値を500に調整することにより決定した倍率を用いて、ハイブリダイゼーションシグナルをAffymetrix GCOSソフトウェア(バージョン1.1.1)でスケール化し、これをGeneSpringバージョン7.2(Silicon Genetics；カリフォルニア州；レッドウッドシティ)に取り込んだ。次いでシグナル強度の中心を各チップの50パーセンタイルに合わせ、それぞれ個々の遺伝子に関しては、全試料セットの中央値強度に合わせた。各試料群の少なくとも80%において、GCOSソフトウェアにより存在または境界と判定された遺伝子のみを、さらなる解析に使用した。差次的に発現される遺伝子を、1) ノンパラメトリックなウィルコクソン・マン・ホイットニーノンパラメトリック検定(P<0.05)、2) パラメトリックなt検定(P <0.05)、および／または3) 教師なし解析法を用いて同定した(14)。教師なし解析においては、シグナル強度フィルター処理遺伝子を用いて、試料の少なくとも15%において平均値から発現レベルが少なくとも2倍(増加または減少)した遺伝子を選択した。各比較において階層的クラスタ分析を行い、同定された各遺伝子セットの試料間のスピアマン相関を用いる相関分析を、GeneSpring v6.0での平均重心連結法による類似度として評価した。多くの実験による結果を解析し、結果をまとめたリストを表1に提供する。
【０５３７】
(b) 高リスクポリープの存在と共に差次的発現される遺伝子
高リスクポリープを有すると診断された患者より、実施例1に記載した通りに、遠心分離し溶解した血液(すなわち、血清除去、赤血球除去血液試料)から全RNAを単離した。オリゴ-dTプライマー1μgを、全量10μl中で各試験個体の全RNA 10μgと、70℃まで10分間加熱し、氷上で冷却することによりアニールさせた。個体は、高リスクポリープサブタイプの1つまたは複数を有すると診断された(大腸内視鏡検査において、以下のタイプの1つまたは複数であると同定されるポリープを認めた結腸直腸病変：腺管絨毛腺腫；絨毛腺腫；癌；高度異形成；および直径が10 mm超である管状腺腫)。手順は、その他の点では上記の実施例2(a)に記載した通りに行った。
【０５３８】
多くの実験による結果を解析し、結果をまとめたリストを表11に提供する。
【０５３９】
実施例3
定量リアルタイムPCR(QRT-PCR)
表2に開示する表1中の遺伝子の選択物において、QRT-PCRを行った。QRT-PCRは、Qiagen製のSYBR(登録商標)グリーンキット(製品番号204143)を用いて、および／またはApplied Biosystems PCR試薬キット(Cat 4334973)を用いて行った。単位複製配列を、Prism 7500装置(Applied Biosystems)を用いてリアルタイムで検出した。
【０５４０】
Applied Biosystems製のHigh-Capacity cDNA Archiveキット(製品番号4322171)を用いて、その中で利用される手順に従って、まず逆転写を行った。
【０５４１】
より具体的には、本明細書において前述のように精製したRNAを、逆転写酵素緩衝液、dNTP、ランダムプライマー、および逆転写酵素と共にインキュベートし、25℃で10分間およびその後37℃で2時間インキュベートし、得られた混合物を定量PCRの開始産物として利用した。
【０５４２】
逆転写から得られたcDNAを、QuantiTect SYBR(登録商標)グリーンPCRマスターミックスと共に規定通りにインキュベートし、マグネシウム濃度の調整は行わなかった。ウラシル-N-グリコシラーゼは添加しなかった。本発明の遺伝子に特異的な5μMフォワードプライマーおよびリバースプライマーを添加し、ABI PRISM 7700/ABI GeneAmp 5700/iCycler/DNA Engine Opticonを利用する標準的な手順に従って、反応物をインキュベートしモニターした。利用したプライマーを表6に示す。使用できるプライマーの他の例を表4に開示する。候補バイオマーカーのフォワードおよびリバースプライマーは、「PrimerQuest」を用いて設計した。Integrated DNA Technologies、アイオワ州、コーラルビルから入手できるツール。表6に、表2の遺伝子のうちの8つ、すなわちMBTPS1(膜結合転写因子プロテアーゼ部位1)、MGC45871、MKLN1(ムスケリン1)、NIPBL(Nipped-B相同体(ショウジョウバエ))、APEH(アシルペプチドヒドロラーゼ)、FLJ23091、MGC40157、およびPPP1R2(プロテインホスファターゼ1、調節(阻害剤)サブユニット2)に関するプライマーセットを収載する。標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子(β-アクチン、ACTB)の段階希釈測定物をアッセイして、値が直線範囲内であること、および増幅効率が標的とACTBに関してほぼ等しいことを確認した。ACTBは、本研究において対照と疾患群との間で統計的有意差が認められなかったことから、ハウスキーピング遺伝子として選択した(データは示さず)。熱解離における融解温度[Tm]およびアガロースゲルでの試験から、各反応ウェル中の特定のPCR増幅およびプライマー-ダイマー形成の欠如が確認された。
【０５４３】
個々の標的遺伝子の解析については、各遺伝子とACTBハウスキーピングとの間のCt値の変化を、ΔCt = Ct(標的遺伝子) - Ct(ハウスキーピング遺伝子)として算出した。
【０５４４】
実施例4
TaqMan(登録商標)
QRT-PCRはまた、Qiagen製のQuantiTect(商標)プローブRT-PCRシステム(製品番号204343)を、関心対象の遺伝子に対応するTaqMan(登録商標)二重標識プローブおよびプライマーと組み合わせて用いて行うことができる。TaqMan(登録商標)プローブおよびプライマーは、Applied Biosystems Assays-On-Demand(商標)に注文することができる。
【０５４５】
二重標識プローブは、フルオロフォアとクエンチャーの両方を含む。蛍光レポーターとクエンチャーが近接しているとレポーターが蛍光を発することはできないが、PCR伸長段階においてTaq DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によりフルオロフォアが遊離すると、それにより蛍光が発せられる。したがって、蛍光量は生じるPCR産物の量と相関する。表2に開示する遺伝子と共に利用できるTaqMan(登録商標)プローブの例を、表6および／または4に示す。
【０５４６】
実施例5
ロジスティック回帰を用いるバイオマーカーの組み合わせの同定
表2からの8つの遺伝子の選択物を以下のように選択した：MBTPS1、MGC45871、MKLN1、NIPBL、APEH、MGC40157、PPP1R2、およびFLJ23091。選択した8つの遺伝子の対の組み合わせを試験して、1つまたは複数の結腸直腸病変をスクリーニングする対の各組み合わせの能力を決定した。麻酔の前および手術の前に、ラベンダートップBD Vacutainerチューブ中に血液試料を採取した。最初に血清を除去し、次いで赤血球を優先的に溶解するために、残りの試料を溶解緩衝液3 対 血液1の割合で低張溶解緩衝液(溶解緩衝液(1 L) 0.6 g EDTA；1.0 g KHCO2、8.2 g NH4Cl、ｐH7.4に調整(NaOHを使用))で処理し、全血由来のRNAを調製した。試料を遠心分離し、試料の未分画細胞からRNAを抽出した。
【０５４７】
結腸直腸病変(すなわち、1つまたは複数のサブタイプのポリープ)を有すると診断された患者68名(n=68)および1つまたは複数の結腸直腸病変がないと診断された対照個体110名(n=110)において、リアルタイム定量PCRを行った。最初にcDNAを調製し、その後ABI試薬を用いてPCRを行う2段階手順を用いて、QRT-PCRを行った。本実施例では、8つのバイオマーカーの「比」のΔCtを含む行列を用いて、参照訓練データセット(AJ36h)を作成した。ΔCtの行列を作成するために使用した比は、各比が1つの上方制御遺伝子および第2の下方制御遺伝子からなることを必要とすることによりさらに制約し、ΔCtは上方制御遺伝子のCtから下方制御遺伝子のCtを差し引くことにより作成した。MBTPS1、MGC45871、MKLN1、NIPBLは、上方制御遺伝子であると同定された(すなわち、ポリープと非ポリープ個体を比較した場合)(図3)。APEH、MGC40157、PPP1R2、FLJ23091は、下方制御遺伝子であると同定された(図3)。遺伝子対比率法の利点には、a) 個体間のばらつきが軽減されること、b) プレート間の技術上の差異を最小限にすることを保証するために、個体試料の解析を参照なしで行えること、c) 任意の信頼性のある方法(マイクロアレイ、リアルタイムPCRなど)を使用できること、d) データ収集に利用するプラットフォームに依存しないこと、e) ハウスキーピング遺伝子を必要としないこと(試料量の投入量に比較的依存しない)、f) マイクロアレイ発現プロファイルの長所が簡単な臨床試験に結びつくこと、およびg) 疾患の識別が高度に正確であることが含まれる。
【０５４８】
病変のない対象110名(女性／男性：55名／54名、1名は情報なし、年齢は23〜83歳で平均年齢は57歳)および結腸直腸病変があると診断された対象68名(女性／男性：22名／45名、1名は情報なし、年齢は38〜82歳で平均年齢は57歳)を含む全部で178名の対象に対してアッセイした上記の8つの遺伝子の、記載したようなおよび上記のように制約した考えられ得る各比のΔCt値を含む参照(訓練)データセット(AJ36h)を構築した。同定された病変のタイプには、管状腺腫21例(31%)、過形成病変18例(27%)、および高リスク病変(絨毛形態)7例(10%)、ならびに他の軽微なポリープ22例(32%)が含まれる(表7を参照されたい)。
【０５４９】
ロジスティック回帰(15-18)を用いて、参照データ訓練セットAJ36hによるΔCt値の考えられ得るすべての組み合わせに対する2値変数Y(0=対照(病変なし)、1=疾患(病変あり))の従属を解析した。P=患者試料が「罹患」と診断される確率とすると、関数X=ロジット(p)は以下のように定義することができる。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = b0 + b1ΔCt1 + b2ΔCt2 + … + bnΔCtn  （式1）
【０５５０】
X≧閾値であるならば、Y=1(診断=「罹患」)であり、X<閾値であるならば、Y=0(診断=「対照」)である。Xと実験測定値｛ΔCti、iは試料を表す｝との間の関係を定義する(実験)係数｛bi｝を、最大尤度(ML)適合法により得た。いくつかの異なる市販のソフトウェアプログラム：MedCalc(MedCalc Software、ベルギー、マリアケルク)およびXL-Stat(Addinsoft Software、フランス、パリ)を用いて、同一の｛bi｝値が得られた。次いでROC曲線解析を用いて、上記したような比のすべての組み合わせを試験した上で、比の各組み合わせの識別能力を評価した(19-21)。比の各組み合わせから、式1の形式の式を得た。ROC=0.72を与えた上位10位の最良の式を、各式に同等の順位づけを与える式で用いて、その後の盲検試験予測を行った。
【０５５１】
交差検定
WEKA(www.cs.waikato.ac.nz/~ml/weka/index.html)を用いて、データセットAJ36h(178試料訓練セット)で交差検定を行った(22)。2つの異なる交差検定図式を用いた。WEKA MetaAnalysis関数を用いて、データセットAJ36hの100個のブートストラップ反復推定値を構築した。新たなデータセットのそれぞれを、SimpleLogistic分類器で解析した。次いで、得られた100個のロジスティック方程式のそれぞれを、10分割交差検定により解析した。すべての式の結果を平均化した(「ブートストラップ凝集」)。
【０５５２】
前向き(盲検)試験
臨床試料80例の盲検セットを試験した。試験セットは、対照40例および1つまたは複数の結腸直腸病変を有する(任意のタイプの1つまたは複数のポリープを有する)対象40例からなった。盲検試験に用いた試験対象はいずれも、各比を上方制御遺伝子(結腸直腸病変を結腸直腸病変なしと比較した場合)と下方制御遺伝子(結腸直腸病変を結腸直腸病変なしと比較した場合)の組み合わせとして選択する、バイオマーカーの比「比」の考えられ得る各組み合わせの分類子を作成するために用いたものではない。MBTPS1、MGC45871、MKLN1、NIPBLは、上方制御遺伝子であると同定された(すなわち、ポリープと非ポリープ個体を比較した場合)(図3)。APEH、MGC40157、PPP1R2、FLJ23091は、下方制御遺伝子であると同定された(図3)。
【０５５３】
年齢、性別、および病変学者の報告を含む、この盲検試験における対象に関する医学的情報を、表7にまとめる。試料をQ RT-PCRのため単一の96ウェルプレートに供し、8つの遺伝子のそれぞれを3つ組で測定した。
【０５５４】
各盲検試料の測定値を、最初の計算、2値論理ゲート、および「コミッティマシーン」票決からなる以下のアルゴリズムを用いて評価した。最初の計算：ロジット関数Xiを、参照データセットAJ36hに対してROC面積=0.72を与えた式(I=1〜N)のそれぞれに関して計算する。論理ゲート：Xi<jの閾値(jは式番号を表す)であるならば、式#jに関して盲検試料にスコアSi = -1が与えられる。Xi≧jの閾値であるならば、式#jに関して盲検試料にスコアSi = +1が与えられる。コミッティマシーンによる票決(23)：診断に用いた10個のロジット式によるスコアに対して票決する。定義により、票決=ΣSiである。票決≦0であるならば、試料は「病変なし」と判定され、票決>0であるならば、試料は「罹患または病変あり」と判定される。
【０５５５】
最良の式は、図4に示すようにROC面積0.72を与える。ROC=0.72を与えた上位10位の式を盲検試験予測に用いた。表8は、10個の式のパラメータを収載する。
【０５５６】
WEKAのSimpleLogistic関数を用いて、交差検定を行った。データセットAJ36hの100個のブートストラップ反復推定値を構築し、それぞれWEKA SimpleLogistic関数で解析した。得られた100個のロジスティック方程式のセットを、10分割交差検定に供した。次いですべての式の結果を平均化し、ROC面積=0.06、全体的精度65%、感度(TPF) 41%、特異度(TNF) 83%が得られた。
【０５５７】
盲検試料の予測
試料80例(病変のない試料40例および結腸直腸病変を有する試料40例)のさらなるセットにおいて、盲検試験を行った。参照データセットAJ36hによる10個の最良のロジット式に対してコミッティ票決して、「結腸直腸病変存在」または「結腸直腸病変非存在(対照)」の状態を予測した。盲検試料のセットに関して、感度(真の陽性率、TPF)は43%(17/40)であり、特異度(真の陰性率、TNF)は80%(32/40)であり、全体的精度は61%(49/80)である(表9)。
【０５５８】
現時点で好ましい実施例であると考えられるものを参照して本発明を説明したが、本発明が開示の実施例に限定されないことが理解されるべきである。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲の範囲内に含まれる種々の変更および同等の配置を網羅することが意図される。
【０５５９】
出版物、特許、および特許出願はいずれも、個々の出版物、特許、または特許出願が詳細にかつ個別に参照によりその全体が組み入れられることが示されるのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０５６０】
実施例6
ロジスティック回帰を用いるバイオマーカーの組み合わせの試験、および1つもしくは複数のタイプの結腸直腸病変または1つもしくは複数の病変をスクリーニングするためのそのような組み合わせの適用
以下を含む7つ遺伝子の選択物を選択した：LIMドメイン含有脂肪腫優先転座パートナー(LPP)(LIM domain containing preferred translocation partner in lipoma (LPP)) 遺伝子ID 4026；シチジンデアミナーゼ(CDA) 遺伝子ID 978；肉腫抗原NY-SAR-48(MCG20553) 遺伝子ID 93323；セリン(またはシステイン)プロテイナーゼインヒビター、クレードE(ネキシン、1型プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター)、メンバー2(SERPINE 2) 遺伝子ID 5270；B細胞新規タンパク質1(BCNP1) 遺伝子ID 199786；仮想タンパク質MGC45871(MGC45871) 遺伝子ID 359845；膜結合転写因子プロテアーゼ、部位1(MBTPS1) 遺伝子ID 8720。遺伝子は表1または他の同様の実験から選択した。
【０５６１】
臨床上の論題‐ポリープ 対 病変なし
任意のタイプのポリープを有する対象185名およびポリープのない対象239名の全体に対してアッセイした上記の7つの遺伝子のΔCt値を含む参照(訓練)データセットを構築した。
【０５６２】
ロジスティック回帰を用いて、参照データセットによるΔCt値に対する2値変数Y(0=対照、1=疾患)の従属を解析した。P=患者試料が「罹患」と同定される確率とすると、関数X=ロジット(p)は以下のように定義することができる。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = b0 + b1ΔCt1 + b2ΔCt2 + … + bnΔCtn  （式1）
【０５６３】
X≧閾値であるならば、Y=1(診断=「ポリープあり」)であり、X<閾値であるならば、Y=0(診断=ポリープなし)である。Xと実験測定値｛ΔCti、iは試料を表す｝との間の関係を定義する(実験)係数｛bi｝を、最大尤度(ML)適合法により得た。いくつかの異なる市販のソフトウェアプログラム：MedCalc(MedCalc Software、ベルギー、マリアケルク)およびXL-Stat(Addinsoft Software、フランス、パリ)を用いて、同一の｛bi｝値が得られた。次いでROC曲線解析を用いて、組み合わせの識別能力を評価した。最良の式では以下の遺伝子(LPP；CDA；MBTPS1；SERPINE2；BCNP1)を使用し、この式は以下のように示される。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = -4.9104 - 0.4278ΔCtMGC20553 - 0.6164ΔCtCDA + 0.8230ΔCtMBTPS1 + 0.3961ΔCtSERPINE2 + 0.1641ΔCtBCNP1は、ROC=0.73を与え、感度は80%であり、特異度は50%であった。
【０５６４】
臨床上の論題‐高リスク病変 対 その他
7つのバイオマーカーの同様の選択物を用いるが、今回は、「高リスク」ポリープを有する対象129名および高リスクと分類されないポリープを有するかまたは病変のない対象295名の全体に対してアッセイした上記の7つの遺伝子のΔCt値を有する参照(訓練)データセットに対して試験を行った。対象は、以下の分類のポリープ：腺管絨毛腺腫；絨毛腺腫；高度異形成、および管状腺腫ポリープの直径が10 mm超である管状腺腫、ならびに癌の1つを有する場合に、「高リスクポリープ」を有すると分類された。
【０５６５】
ロジスティック回帰を用いて、参照データセットによるΔCt値に対する2値変数Y(0=対照、1=疾患)の従属を解析した。P=患者試料が「罹患」と同定される確率とすると、関数X=ロジット(p)は以下のように定義することができる。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = b0 + b1ΔCt1 + b2ΔCt2 + … + bnΔCtn  （式1）
【０５６６】
X≧閾値であるならば、Y=1(診断=「高リスクポリープあり」)であり、X<閾値であるならば、Y=0(診断=高リスクポリープなし)である。Xと実験測定値｛ΔCti、iは試料を表す｝との間の関係を定義する(実験)係数｛bi｝を、最大尤度(ML)適合法により得た。いくつかの異なる市販のソフトウェアプログラム：MedCalc(MedCalc Software、ベルギー、マリアケルク)およびXL-Stat(Addinsoft Software、フランス、パリ)を用いて、同一の｛bi｝値が得られた。次いでROC曲線解析を用いて、組み合わせの識別能力を評価した。最良の式では以下の遺伝子(CDA；MGC20553；MBTPS1；SERPINE2；BCNP1；)を使用し、この式は以下のように示される。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = -5.2981 - 0.5433ΔCtCDA - 0.4958ΔCtMGC20553 + 0.8551ΔCtMBTPS1 + 0.3554ΔCtBCNP1 + 0.2438ΔCtSERPINE2
ROC=0.74を与え、感度は83%であり、特異度は46%であった。
【０５６７】
臨床上の論題‐癌 対 その他
最終的に、癌性ポリープを有する対象80名および他のタイプのポリープを有するかまたは病変のない対象344名の全体に対してアッセイした上記の7つの遺伝子のΔCt値を含む参照(訓練)データセットを用いて、同様の7つの遺伝子を組み合わせて試験した。
【０５６８】
ロジスティック回帰を用いて、参照データセットによるΔCt値に対する2値変数Y(0=対照、1=疾患)の従属を解析した。P=患者試料が「罹患」と同定される確率とすると、関数X=ロジット(p)は以下のように定義することができる。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = b0 + b1ΔCt1 + b2ΔCt2 + … + bnΔCtn  （式1）
【０５６９】
X≧閾値であるならば、Y=1(診断=「癌性ポリープあり」)であり、X<閾値であるならば、Y=0(診断=癌性ポリープなし)である。Xと実験測定値｛ΔCti、iは試料を表す｝との間の関係を定義する(実験)係数｛bi｝を、最大尤度(ML)適合法により得た。いくつかの異なる市販のソフトウェアプログラム：MedCalc(MedCalc Software、ベルギー、マリアケルク)およびXL-Stat(Addinsoft Software、フランス、パリ)を用いて、同一の｛bi｝値が得られた。次いでROC曲線解析を用いて、組み合わせの識別能力を評価した。最良の式では以下の遺伝子(MGC20553、CDA、MBTPS1、SERPINE2、MGC45871；BCNP1)を使用し、この式は以下のように示される。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = -12.9149 - 0.5378ΔCtCDA - 0.5398ΔCtMGC20553 + 1.0386ΔCtMBTPS1 + + 0.7405ΔCtBCNP1 + 0.4002ΔCtMGC45871 + 0.2074ΔCtSERPINE2
ROC=0.83を与え、感度は90%であり、特異度は55%であった。
【０５７０】
臨床上の論題‐高リスク病変 対 その他
高リスクポリープを有する対象252名および他のタイプのポリープを有するかまたは病変のない対象272名の全体に対してアッセイした上記の7つの遺伝子のΔCt値を含む参照(訓練)データセットを構築した。この場合、高リスクポリープとは、腺管絨毛腺腫、絨毛腺腫、高度異形成、および管状腺腫‐ポリープの直径にかかわらないを意味する。
【０５７１】
ロジスティック回帰を用いて、参照データセットによるΔCt値に対する2値変数Y(0=対照、1=疾患)の従属を解析した。P=患者試料が「罹患」と同定される確率とすると、関数X=ロジット(p)は以下のように定義することができる。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = b0 + b1ΔCt1 + b2ΔCt2 + … + bnΔCtn  （式1）
【０５７２】
X≧閾値であるならば、Y=1(診断=「高リスクポリープあり」)であり、X<閾値であるならば、Y=0(診断=高リスクポリープなし)である。Xと実験測定値｛ΔCti、iは試料を表す｝との間の関係を定義する(実験)係数｛bi｝を、最大尤度(ML)適合法により得た。いくつかの異なる市販のソフトウェアプログラム：MedCalc(MedCalc Software、ベルギー、マリアケルク)およびXL-Stat(Addinsoft Software、フランス、パリ)を用いて、同一の｛bi｝値が得られた。次いでROC曲線解析を用いて、組み合わせの識別能力を評価した。最良の式では以下の遺伝子(MGC20553；CDA；MBTPS1；SERPINE2；BCNP1；)を使用し、この式は以下のように示される。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = -3.5819 - 0.7625ΔCtCDA - 0.6117ΔCtMGC20553 + 1.15ΔCtMBTPS1 + 0.2174ΔCtBCNP1 + 0.2439ΔCtSERPINE2
ROC=0.76を与え、感度は82%であり、特異度は52%であった。
【０５７３】
実施例7
結腸直腸癌の存在をスクリーニングするためのバイオマーカー。バイオマーカーの組み合わせと共に用いるための分類子の導出、および結腸直腸癌の存在を決定するためのそのような分類子の適用
結腸直腸癌を有する個体と結腸直腸癌を有さない個体とを識別し得るとして、1つまたは複数のマイクロアレイ解析(データは示さず)より同定された遺伝子の選択物において、QRT-PCRを行った。QRT-PCRに選択した遺伝子のいくつかは、結腸直腸癌と診断された個体由来の試料61例および結腸直腸癌を有さない個体由来の試料532例を含む試料593例にわたる、中国の3地域から収集された試料で行われたマイクロアレイデータから選択した(データは示さず)。他の遺伝子は、北アメリカおよび／またはアジアの個体を用いた他の同様のマイクロアレイ実験から選択した。結腸直腸癌を有さない個体は、乳癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌を有する個体と、結腸直腸癌ではない他のサブタイプの結腸直腸病変を有する個体の混合物であった。
【０５７４】
結腸直腸癌を有する個体の集団および結腸直腸癌を有さない個体の集団にわたり、それぞれ個々の遺伝子においてQRT-PCRを行った。QRT-PCR実験は、Qiagen製のSYBR(登録商標)グリーンキット(製品番号204143)を用いて、および／またはApplied Biosystems PCR試薬キット(Cat 4334973)を用いて、および／またはQuantiTect(登録商標)プローブPCRキット(Qiagen、カタログ番号204345)を用いてTaqManアッセイを用いて行った。関心対象の各遺伝子についてTaqMan(登録商標)プローブを作製し、FAMおよびBiosearch Technologies製のBlack Hole Quencher(登録商標)で標識した。β-アクチンを二重アッセイにおけるハウスキーピング遺伝子として使用し、HEXおよびBlack Hole Quencher(登録商標)を用いて標識した。単位複製配列を、Prism 7500装置(Applied Biosystems)を用いてリアルタイムで検出した。試験した集団にわたる各遺伝子のQRT-PCRの結果を表12に示す。
【０５７５】
表12に記載されるバイオマーカーの考えられ得るすべての組み合わせを試験する代わりに、他の態様では、0.05未満のp値を有するバイオマーカーの考えられ得るすべての組み合わせを選択し、バイオマーカーの組み合わせのすべてまたは一部を試験することができる。選択した組み合わせを試験して同定された代表的な分類子について以下に論じる。
【０５７６】
結腸直腸癌を有する個体58名および結腸直腸癌を有さない個体57名にわたり、表12に同定された遺伝子のうち28個に関してQRT-PCRを用いて、表12に同定されたバイオマーカーの2遺伝子の組み合わせすべてに関して分類子を導出した。利用した遺伝子28個は以下の遺伝子記号によって表され、本明細書においてさらに詳述する：OSBPL1O、LOC283130、BANK1、COBLL1、MGC24039、C9orf85、BLNK、BCNP1、PDE3B、AKAP13、WDFY1、CDA、AGTRAP、ACTR2、UTS2、MS4A1、SPAP1、ANK3、KIAA1559、GBP5、MGC20553、CEACAM1、HIST1H4H、PRG1、BRD2、LTBP3、MAP4K3、およびNIPA2。リアルタイムRT-PCRに利用したプライマーを、表16にさらに記載する。2遺伝子の選択組み合わせに関して導出された分類子は、以下のように示される。
表A：組み合わせが比の形式であり、バイオマーカーが表12から選択した28個の遺伝子から選択される、2遺伝子組み合わせの選択物に関して得られた分類子を示す表。結果として得られた分類子のROC面積を示し、感度(記載のカットオフでの感度)および特異度(記載のカットオフでの特異度)も示す。定数、および選択した2遺伝子比の係数も記載する。
【０５７７】
【表Ａ】
2009512440.tif 000004
【０５７８】
それぞれの2遺伝子組み合わせについて記載するように、特異度(感度を90%に設定した場合)および感度(特異度を90%に設定した場合)に加えて、ROC面積を提供する。記載の感度および特異度を作成するために利用したカットオフを、右側2列に提供する。2遺伝子組み合わせのそれぞれの分類子は、一般的に以下のように記載することができる。
X(結腸直腸癌を有する) = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = b0 + b1(ΔCt1 - ΔCt2)
式中、b0は係数と見なされ、b1は比の係数として記載される。
【０５７９】
実施例8
また、表12に同定されたバイオマーカーの9個の選択物の考えられ得るすべての組み合わせに関して、分類子を導出した。組み合わせの分類子を作成する上で使用するデータは、実施例7に記載したものと同じ、結腸直腸癌を有する個体58名および結腸直腸癌を有さない個体57名で試験した9個の遺伝子のそれぞれについてリアルタイムRT-PCRを用いて取得した。利用した遺伝子9個は以下の遺伝子記号によって表され、本明細書においてさらに詳述する：CDA、MGC20553、MS4A1、BCNP1、BANK1、GBP5、OSBPL1O、SPAP1、LOC283130。リアルタイムRT-PCRに利用したプライマーを、表16にさらに記載する。得られた分類子の選択物を、以下の表Bに記載する。
【０５８０】
【表Ｂ】
2009512440.tif 000005
上記の分類子は、一般的に以下の式で表すことができる。
X(結腸直腸癌を有する可能性) = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = b0 + b1ΔCt1 + b2ΔCt2 + … + bnΔCtn
【０５８１】
上記したのは、選択した遺伝子の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または全9個の組み合わせに関する選択された分類子である。曲線下面積を示す(ROC面積)。定数b0、および試験試料に関して記載の遺伝子のΔCtに適用するために選択された分類子に必要な各バイオマーカーの係数(例えば、bn)もまた提供する。当然のことながら、係数が記載されていない場合、そのバイオマーカーは分類子に必要ではない。さらに感度および特異度を各分類子に関して決定することができ、これらは閾値設定に応じて異なる。
【０５８２】
遺伝子9個の組み合わせのすべての結果を図5に図示する。
【０５８３】
実施例9
記載のバイオマーカーの産物のレベルに対応するデータにロジスティック回帰を適用することにより、表12に同定されたバイオマーカーの考えられ得るすべての組み合わせを試験する。結腸直腸癌を有するまたは結腸緒腸癌を有さないと診断された個体の集団について、表12に記載される遺伝子のそれぞれにおいてQRT-PCRを行う。2つの集団の各個体に関する各遺伝子に対応するRNAのΔCtを含む行列を構築し、本明細書に記載の技法を用いて、表12に収載するバイオマーカー(個々に統計的に有意であるか有意でないかを問わない)の考えられ得る各組み合わせについて分類子を導出する。各分類子について、ROC曲線をプロットし、曲線下面積を決定する。バイオマーカーの特定の意図する用途の特定の感度および特異度要件に応じて、分類子を選択する(例えば、結腸直腸癌の見逃しを少なくするために、高い感度を有して偽陰性を減らすことを所望する場合がある)；(または、低い偽陽性をもたらす高い特異度もまた、さらなる不必要な医学的介入のコストを軽減し得るため、望ましい)。試験個体における結腸直腸癌を試験する分類子の有用性を実証するために、得られた分類子の1つまたは複数で盲検試験を行う。1つまたは複数の分類子を適用して個体を試験し、試験対象が結腸直腸癌を有する可能性を決定する。
【０５８４】
実施例10
導出された分類子を使用する、表12中の遺伝子の組み合わせの1つの盲検試験
アンキリン反復配列を有するB細胞足場タンパク質(BANK1)、B細胞新規タンパク質1(BCNP1)、シチジンデアミナーゼ(CDA)、膜貫通4ドメイン、サブファミリーA、メンバー1(MS4A1)、およびFERMドメイン含有3(MGC20553 aka FRMD3)を包含する5遺伝子の組み合わせを選択して、さらなる盲検試料試験を続行した。
【０５８５】
実施例7に詳述した結腸直腸癌を有する対象57名および結腸直腸癌を有さない対象58名の全体に対してアッセイした上記の5つの遺伝子のΔCt値を含む参照(訓練)データセットを構築した。
【０５８６】
ロジスティック回帰を用いて、参照データセットによるΔCt値に対する2値変数Y(0=対照、1=疾患)の従属を解析した。P=患者試料が「結腸直腸癌を有する」と同定される確率とすると、関数X=ロジット(p)は以下のように定義することができる。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = b0 + b1ΔCt1 + b2ΔCt2 + … + bnΔCtn  （式1）
【０５８７】
X≧閾値であるならば、Y=1(診断=「結腸直腸癌を有する」)であり、X<閾値であるならば、Y=0(診断=結腸直腸癌を有さない)である。Xと実験測定値｛ΔCti、iは試料を表す｝との間の関係を定義する(実験)係数｛bi｝を、最大尤度(ML)適合法により得た。いくつかの異なる市販のソフトウェアプログラム：MedCalc(MedCalc Software、ベルギー、マリアケルク)およびXL-Stat(Addinsoft Software、フランス、パリ)を用いて、同一の｛bi｝値が得られた。次いでROC曲線解析を用いて、組み合わせの識別能力を評価した。選択した遺伝子(BANK1、BCNP1、CDA、MS4A1、およびMGC20553)を用いて分類子を導出したが、これは以下のように示される。
X = ロジット(P) = ln(P/(1-P)) = -5.1338 - 0.8399(ΔCtCDA) - 0.3314(ΔCtMGC20553) - 0.3245(ΔCtMS4A1) + 1.0903(ΔCtBCNP1) + 0.7842(ΔCtBANK1)は、曲線下面積0.883±0.032を与えた。以下のように試験カットオフ点を調製することにより、感度または特異度を調製することができる。
2009512440.tif 000006
カットオフ-1.1を用いることで、感度98.3%および特異度50.9%が得られる。
【０５８８】
結腸直腸癌を有さない個体15名および結腸直腸癌を有する個体6名からなるスコアリング集団を用いて、最初の盲検試験を行った。この盲検試験では、ペナンの1地域から選択された個体を利用した。最初の盲検試験では、感度100%および特異度43%が得られた。非結腸直腸患者31名および結腸直腸患者23名の第2スコアリング集団(第1スコアリング集団と重複しない)を用いて、2回目の盲検試験を、行った。患者試料は、アジアの異なる3地域から収集した。試験により、感度100%(結腸直腸癌を有する試料がすべて適切に同定された)および特異度47%(結腸直腸癌のない試料の約半数が適切に同定された)が得られた。結腸直腸癌患者15名および非結腸直腸癌患者16名を含む、北アメリカの2つの診療所から得た試料を利用して最後の盲検試験を行い、感度88%および特異度33%が得られた。
【０５８９】
実施例11
結腸直腸癌の存在のスクリーニングに特に有用である分類子を導出するための6つのバイオマーカー(BCNP1、CD163、CDA、MS4A1、BANK1、MCG20553)の選択、および結腸直腸癌の存在を決定するための選択された組み合わせを用いる分類子の適用
1つまたは複数のマイクロアレイ解析から同定された遺伝子、BCNP1、CD163、CDA、MS4A1、BANK1、MCG20553の選択物(表12および表11から選択)において、QRT-PCRを行った。QRT-PCRデータは、結腸直腸癌を有する個体60名および結腸直腸癌を有さない個体59名の試料109例の遠心分離し溶解した血液由来のRNA試料において、ごく最近収集した。QRT-PCRは、QuantiTect(登録商標)プローブPCRキット(Qiagen、カタログ番号204345)を用いて、二重TaqManアッセイを用いて行った。関心対象の各遺伝子についてTaqMan(登録商標)プローブを作製し、FAMおよびBiosearch Technologies製のBlack Hole Quencher(登録商標)で標識した。β-アクチンを二重アッセイにおけるハウスキーピング遺伝子として使用し、HEXおよびBlack Hole Quencher(登録商標)を用いて標識した。ΔCt(Ct関心対象の遺伝子 - Ctβ-アクチン)を算出した。
【０５９０】
試験した集団にわたる各遺伝子の平均QRT-PCR結果の結果を以下の表Cに示す。対照集団および結腸直腸癌(CRC)を有する集団における各遺伝子の平均ΔCt(Ct遺伝子 - Ctβ-アクチン)を示し、集団によるデータ間の標準偏差(SD)もまた示す。各遺伝子のp値を個々に示す。各遺伝子の対照試料のΔCtと各遺伝子のCRC試料のΔCtとの間のΔCtの変化をΔΔCtとして示し、標準偏差を示す。それぞれ個々のマーカーの変化倍率もまた示す。
【０５９１】
【表Ｃ】
2009512440.tif 000007
【０５９２】
結腸直腸癌を有する個体60名および結腸直腸癌を有さない個体59名を含む集団にわたる、6つのバイオマーカーのそれぞれに対応する個々のQRT-PCRデータの行列を、上記と同様の方法を用いて作成した。データの行列を用いて、考えられ得る各組み合わせのデータにロジスティック回帰を適用することにより、6つのバイオマーカーの考えられ得るすべての組み合わせに関する分類子を作成した。組み合わせのすべておよび各組み合わせを作成するバイオマーカーのリストを、以下の表Dに記載する。得られた各分類子のROC曲線を測定して、導出された各分類子が、結腸直腸癌を有する試験患者を適切に同定する能力を決定した。特定の感度(所定の特異度における)および特異度(所定の感度における)を、ROC曲線から決定することができる。この解析から得られた分類子を表Eに示し、これらの分類子の結果を図5に図示する。
【０５９３】
表D
各組み合わせを、1〜63の独特の組み合わせ番号として記載する。記載した遺伝子の下の列に数字の1が存在することは、作成された分類子にその遺伝子が存在することを示す。
【０５９４】
【表Ｄ】
2009512440.tif 000008
2009512440.tif 000009
【０５９５】
好ましい態様においては、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する可能性を提供する目的で、試験対象から単離したまたは試験対象に由来する試料中の6つのバイオマーカーのうちの2つの任意の組み合わせの産物のレベルを表すデータを、本明細書においてさらに記載する式に入力する。特定の他の態様においては、6つのバイオマーカーのうちの3つ、4つ、または5つの任意の組み合わせの産物のレベルを表すデータを、本明細書においてさらに記載する式に入力する。6つのバイオマーカーの全6つの産物のレベルを表すデータを式に入力して、試験対象が1つまたは複数の結腸直腸病変を有する可能性を提供することもまた、本明細書に記載する方法と一致する。
【０５９６】
表E
6つのバイオマーカーの考えられ得る各組み合わせから得られた分類子を記載する。組み合わせ番号は、表Dに記載した組み合わせと対応する。組み合わせに寄与する遺伝子数を記載し、バイオマーカーの係数を列内に記載する。係数として0が記載されている場合、このバイオマーカーは得られた分類子に寄与しない。曲線下面積(ROC面積)を記載し、90%特異度における感度および90%感度における特異度もまた記載する。
【０５９７】
【表Ｅ】
2009512440.tif 000010
2009512440.tif 000011
2009512440.tif 000012
【０５９８】
QRT-PCRに利用したプライマーおよびプローブを、表17にさらに記載する。
【０５９９】
実施例12
6つのバイオマーカー(BCNP1、CD163、CDA、MS4A1、BANK1、MCG20553)を用いる1つまたは複数の結腸直腸病変に関する試験対象の試験
個体200名の参照集団を用いて、試験対象を試験するために用いる式を作成する。そのような個体のうち100名は、大腸内視鏡検査により結腸直腸癌を有することが確認される。残りの個体100名は、大腸内視鏡検査により結腸直腸癌をスクリーニングして、結腸直腸癌に関して陰性であることが確認される。個体200名それぞれの血液試料を採取し、単離した各血液試料から全RNAを単離する。各試料由来のRNAをオリゴdTプライマーを用いて逆転写し、全mRNAに対応するcDNAを得る。血液試料に由来する試料のそれぞれにおいて6つの遺伝子のそれぞれについてQRT-PCRを行い、β-アクチン対照を参照して各遺伝子のΔCtを作成する。集団にわたるデータのすべのデータ行列を作成する。以下の方法のそれぞれを用いて分類子を作成する(a) ロジスティック回帰、(b) 線形回帰、(c) ニューラルネットワーク、および(d) 主成分分析。分類子のそれぞれからなる式であって、各分類子自体に等価の重みづけを与える式を作成する(すなわち、各分類子を試験対象に適用した場合に、その結果から試験対象が結腸直腸病変を有するかどうかの指標が得られ、次に、例えば4つの分類子のうち3つから試験対象が結腸直腸病変を有すると示唆される場合に、式の結果から試験対象が結腸直腸病変を有すると示唆されるように、各分類子の結果を集計する)。
【０６００】
試験対象から血液試料を単離する。血液試料由来の全RNAを単離し、オリゴdTプライマーを用いてcDNAを導出する。試料中の6つの遺伝子のそれぞれにおいてQRT-PCRを行い、β-アクチン対照を参照して各遺伝子についてΔCtを作成する。試験対象の試料によるデータを4つの分類子からなる式に入力し、各分類子の結果を4つの分類子の合計の結果と共に決定して、試験対象が結腸直腸病変、特に結腸直腸癌を有するかどうかの指標を提供する。
【０６０１】
本明細書において番号で参照した参考文献の全引用
2009512440.tif 000013
2009512440.tif 000014
2009512440.tif 000015
2009512440.tif 000016
【０６０２】
本明細書において引用した特許、特許出願、および公開済みの参考文献はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０６０３】
当業者であれば、本発明が目的を達成し、言及した結果および利点、ならびに本明細書に特有の目的、結果、および利点を得るために十分に適していることを容易に理解すると考えられる。本実施例は、本明細書に記載した方法、手順、処理、分子、および特定の化合物と共に、現時点で好ましい態様を代表するものあり、例示であって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、特許請求の範囲の範囲によって規定される本発明の精神内に包含されるその中での変更および他の使用を考えつくと思われる。
【０６０４】
本発明を特にその好ましい態様に関して示し記載してきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更がその中でなされ得ることを当業者は理解すると考えられる。
【０６０５】
表の簡単な説明
表1は、（CD-Rにおいて本明細書に提供される）以下のサブタイプのポリープ：過形成；管状腺腫；絨毛性線腫；管状絨毛性線腫；過形成；高度異形成および結腸直腸癌の1つまたは複数が含まれうる、任意のタイプの結腸直腸ポリープの1つまたは複数を有する、または有しない個体からの試料において差異的に発現されたと同定された遺伝子を示す。この表は、Hugo遺伝子名称（二番目の列）、記号、およびLocus Link ID；ヒトRNAおよびタンパク質アクセッション番号；p値（記載のバイオマーカーによってコードされるRNAを測定することによって決定される、観察された発現差異の統計学的有意性を表す）、および結腸直腸病変の1つまたは複数のタイプを有する個体の平均測定レベルと、結腸直腸病変を有しない個体の平均測定レベルのあいだの変化倍率の測定値を提供する。列1はAffySpot IDであり、列2は遺伝子記号、列3は遺伝子ID、列4はp値、列5はヒトRNAアクセッション番号、列6はヒトタンパク質アクセッション番号、列7は変化倍率、および列8は遺伝子の説明である。
【０６０６】
表2は、表1に記載された遺伝子の選択である。この表は遺伝子の記号、Locus Link ID、および遺伝子の説明を提供する。この表にはまた、p値（観察された発現差異の統計学的有意性を表す）、マン・ホイットニー値（結腸直腸病変を有するまたは有しない、差異のある試料の統計学的有意性を表すためのもう1つの測定である）、ポリープを有する個体の測定レベルの平均値とポリープを有しない個体の測定レベルの平均値との変化倍率の測定、ならびに結腸直腸病変を有する、および結腸直腸病変を有しない個体のあいだでの発現差異の方向性が含まれる。
【０６０７】
表3は、結腸直腸ポリープを有するまたは有しない個体の試料において差異的に発現されたと同定されたバイオマーカーの様々な種のヒトRNAアクセッション番号およびヒトタンパク質アクセッション番号を提供する。この表は、遺伝子記号および遺伝子の説明を提供する。
【０６０８】
表4は、表2において開示されたバイオマーカーのRNA産物を測定するために本発明において有用なプライマーおよびTaqMan（登録商標）プローブの例の選択肢を提供する。
【０６０９】
表5は、表2において同定された遺伝子のタンパク質産物に関して市販されている抗体に対する参照を提供する。
【０６１０】
表6は、1つまたは複数のポリープを有する、または有しない個体からの試料における実施例3において認められたように表2からの遺伝子（バイオマーカー）のRNA産物の発現差異を測定するためのRT-PCRを行うために用いられるプライマー配列を示す。この表はまた、調べたバイオマーカーに対応する遺伝子記号およびRNAアクセッション番号を提供する。
【０６１１】
表7は、結腸直腸ポリープの存在について試験する能力に関して選択されたバイオマーカーを試験するために、実施例5に記載されるように用いられる患者の表現型情報の要約を提供する。試料の大きさ、生物、年齢、およびポリープのサブタイプ（病変報告書によって決定される）を含むパラメータが記載される。
【０６１２】
表8は、実施例5において記述されるように結腸直腸ポリープの存在に関して試験するために0.72のROC面積が得られる選択された8個のバイオマーカーMBTPSl、MGC45871、MKLNl、NIPBL APEH、MGC40157、PPP1R2、FLJ23091に対応するデータと共に用いるための選択された分類子を記載する。選択された遺伝子8個のQRT-PCRの結果を図3に示す。
【０６１３】
表9は、表8において記される分類子からなる公式を適用した場合の、実施例5において記述された盲験試験の結果を提供する。
【０６１４】
表10は、1つまたは複数の型の結腸直腸病変を予防または処置するために用いられる化合物を同定するために用いてもよいレポーター遺伝子およびレポーター遺伝子産物の特性の一覧である。
【０６１５】
表11は、（CD-Rにおいて本明細書に提供する）実施例2において記述されるマイクロアレイを用いて高リスクポリープを有しない（すなわち、低リスクポリープを有するか、または病変を全く有しない）個体と比較して「高リスクポリープ」を有する個体からの試料において差異的に発現されたと同定された遺伝子を示す。この表は、遺伝子の名称、遺伝子のID、代表的なヒトRNAアクセッション番号を提供し、同様にp値、変化倍率（低リスクポリープを有する個体の平均値と比較して高リスクポリープを有すると分類された個体の平均値として）と共に、高リスクポリープ個体と低リスクポリープ個体の双方に関する変動係数（標準化強度の平均値によって除した標準化強度の標準偏差）を提供する。列1はAffySpot IDであり、列2は変化倍率、列3はp値、列4はCV（変動係数）（高リスクポリープ）、列5はCV（低リスクポリープ）、列6は遺伝子ID、列7はHUGO遺伝子記号、列8はヒトRNAアクセッション番号および列9は遺伝子の説明である。
【０６１６】
表12は、結腸直腸癌を有する個体および結腸直腸癌を有しない個体からの試料におけるQRT-PCRによる発現差異に関して試験したバイオマーカー48個を示す。バイオマーカー48個をQRT-PCRを用いて試験した。この表は、それぞれのバイオマーカーに関する遺伝子の記号、LocusLink ID、および遺伝子の説明を提供する。この表にはまた、p値（観察された発現差異の統計学的有意性を表す）、結腸直腸癌を有する個体の測定レベルの平均値と結腸直腸癌を有しない個体の測定レベルの平均値とのあいだの変化倍率の測定、および結腸直腸癌を有する個体と結腸直腸癌を有しない個体のあいだの発現差異の方向性が含まれる。
【０６１７】
表13は、表12において結腸直腸癌を有するまたは結腸直腸癌を有しない個体からの試料において差異的に発現されたと同定された様々な種のバイオマーカーのヒトRNAアクセッション番号およびヒトタンパク質アクセッション番号を提供する。この表は遺伝子記号および遺伝子の説明を提供する。
【０６１８】
表14は、実施例6、7、8、または9において記述されるように、表12において開示されるバイオマーカーの1つまたは複数のRNA産物を測定するために有用なプライマーおよびTaqMan（登録商標）プローブの例の選択肢を提供する。
【０６１９】
表15は、表12において同定されたバイオマーカーのタンパク質産物を測定するために市販されている抗体に対する参照を提供する。
【０６２０】
表16は、バイオマーカーの1つまたは複数のRNA産物を定量するために表12において記述された遺伝子に関して用いられているプライマーの選択を示す。
【０６２１】
表17は、実施例11において用いられたプライマーおよびTaqMan（登録商標）プローブを示す。
【０６２２】
表
表1は、本明細書の表17の後かつ配列表の前に記載する。
【０６２３】
【表２】
2009512440.tif 000017
【０６２４】
【表３】
2009512440.tif 000018
2009512440.tif 000019
2009512440.tif 000020
【０６２５】
【表４】
2009512440.tif 000021
2009512440.tif 000022
2009512440.tif 000023
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【０６２６】
【表５】
2009512440.tif 000025
2009512440.tif 000026
【０６２７】
【表６】
2009512440.tif 000027
【０６２８】
【表７】
2009512440.tif 000028
*1試料は情報なし
【０６２９】
【表８】
2009512440.tif 000029
【０６３０】
【表９】
2009512440.tif 000030
【０６３１】
【表１０】
2009512440.tif 000031
【０６３２】
表11は、本明細書の表17および1の後かつ配列表の前に記載する。
【０６３３】
【表１２】
2009512440.tif 000032
2009512440.tif 000033
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【０６３４】
【表１３】
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2009512440.tif 000037
【０６３５】
【表１４】
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【０６３６】
【表１５】
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【０６３７】
【表１６】
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【０６３８】
【表１７】
2009512440.tif 000047
【０６３９】
【表１】
2009512440.tif 000048
2009512440.tif 000049
2009512440.tif 000050
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【０６４０】
【表１１】
2009512440.tif 000184
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【図面の簡単な説明】
【０６４１】
本発明を、以下の図面に関連して記述する。
【図１】本明細書に記述される特定の方法を実施するための例示的なコンピュータシステムを示す。
【図２】実施例2において記述されるように、結腸直腸ポリープが同定されていない対照23人および結腸直腸ポリープを有する対象22人からの血清低減赤血球低減血液から単離されたRNAのハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子発現プロフィールの比較である。結腸直腸ポリープを有する患者は、過形成；管状腺腫；絨毛性線腫；管状絨毛性線腫；過形成；高度異形成および結腸直腸癌を含むポリープのサブタイプの1つまたは複数を有しうる；遺伝子発現プロフィールを、有意に（P＜0.001）差異的に発現された遺伝子86個の発現に従ってクラスタとして分類した。グレースケールにおいて認められるように、数人の個体は誤って分類され（すなわち、適当な括弧の下で異なるグレースケールに示されている）、域外値と見なされる。それぞれの列は、1つの試料の遺伝子発現プロフィールを示し、それぞれの行は、試料のそれぞれにおける1つの遺伝子の発現レベルを表す。行内のそれぞれの帯の色は、相対的遺伝子発現レベルを示す（グレースケールは、低い発現から高い発現までの発現レベルを表す）。図2から得られた遺伝子リストを表1に示す。
【図３】実施例5において記述されるように、マイクロアレイ分析を用いて統計学的に有意な発現差異を証明する遺伝子から選択された上方制御遺伝子4個（A）および下流の下方制御遺伝子（B）に関して、QRT-PCRによって試験した血液のmRNAレベルを示す。QRT-PCR結果を、結腸直腸病変を有しないと診断された対照個体78人（n＝78）と比較して、結腸直腸病変（すなわち結腸直腸ポリープの1つまたは複数のサブタイプ）を有すると診断された患者50人（n＝50）のあいだで試験した。比較（Ct）法に基づく変化倍率を用いた。マン・ホイットニー試験を2群のあいだの統計分析に用いた。0.05未満のf値を示した結果は、統計学的に有意であると見なされ、調べたmRNAレベルに対応する遺伝子が、2つの患者集団（結腸直腸病変を有する患者と結腸直腸病変を有しない患者）のあいだで差異的に発現されることを示唆している。四角内の線は中央値を示す。四角は25パーセンタイルと75パーセンタイルのあいだの間隔を記す。上下の線は10パーセンタイルから90パーセンタイルの間隔を指し、・は10パーセンタイルと90パーセンタイルの外側のデータポイントを示す。
【図４】図3において試験されかつ示されたバイオマーカー8個の対の組み合わせから選択されたバイオマーカーの組み合わせに関するROC曲線を描写する。実験の詳細は実施例5において記述されるとおりである。表1において同定されたバイオマーカーの選択の組み合わせを試験して、その組み合わせが、表1のバイオマーカーを用いて個々に得ることができる場合より有効に1つまたは複数の結腸直腸病変に関して試験対象をスクリーニングできるか否かを決定した。実施例3において記述されるQRT-PCRを行って、表1からの個々のバイオマーカーの選択群のRNA産物レベルを測定した。選択されたバイオマーカーの組み合わせを、選択された組み合わせのQRT-PCR結果にロジスティック回帰分析を適用することによって試験して、得られたロジスティック回帰等式（ロジット関数）に関するROC曲線を決定した。パネル（A）−試験したデータセットの1つ（AJ36h）に関するロジット関数のROC曲線（ROC面積0.72）。この関数はWEKA（ROC面積0.66）におけるSimple Logistic operatorによって回復した。
【図５】表12において描写され、実施例8においてさらに記述される遺伝子から選択される遺伝子9個の全ての起こりうる組み合わせの分析結果のグラフ出力結果を描写する。遺伝子1、2、3、4、5、6、7、8、または9個全てのそれぞれの起こりうる組み合わせに関するROC面積、感度（特異度を90％閾値で設定する）、および特異度（感度を90％閾値で設定する）のグラフ描写を示す。さらなる詳細を実施例8に記述する。
【図６】実施例11においてさらに記述されるように遺伝子6個の起こりうる全ての組み合わせの分析結果のグラフ出力結果を描写する。実施例11において記した遺伝子1、2、3、4、5、および6個全てのそれぞれの起こりうる組み合わせに関するROC面積、感度（特異度を90％閾値で設定する）、および特異度（感度を90％閾値で設定する）のグラフ描写を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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