(57)【要約】  本発明の目的は、M-CSF受容体阻害剤を有効成分として含有するMLL白血病及びMOZ白血病治療剤を提供することにある。また、M-CSF受容体の発現または活性を抑制し、白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法の提供も課題とする。さらにM-CSF受容体の発現量を測定する工程を含む、白血病の検査方法の提供も課題とする。本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意検討を行い、難治性急性白血病であるMLL白血病及びMOZ白血病を誘導する活性のある細胞（白血病幹細胞）において、M-CSF受容体（M-CSFR、CSF1R、c-FMS、CD115）の発現が高いこと、すなわちM-CSF受容体シグナルが白血病の発症に密接に結びついていることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
M-CSF受容体阻害剤を有効成分として含有する、MLL白血病またはMOZ白血病治療剤。
【請求項２】
M-CSF受容体阻害剤が、M-CSF受容体のチロシンリン酸化活性に対する阻害剤であることを特徴とする、請求項１に記載の白血病治療剤。
【請求項３】
M-CSF受容体阻害剤が、抗M-CSF受容体抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の白血病治療剤。
【請求項４】
M-CSF受容体阻害剤が、M-CSF受容体に対するアプタマーであることを特徴とする、請求項１に記載の白血病治療剤。
【請求項５】
M-CSF受容体阻害剤が、アンチセンスRNA又はdsRNAであることを特徴とする、請求項１に記載の白血病治療剤。
【請求項６】
M-CSF受容体阻害剤が、メシル酸イマチニブであることを特徴とする、請求項１に記載の白血病治療剤。
【請求項７】
M-CSF受容体がM-CSFR、CSF1R、ｃ-FMS、またはCD115のいずれかであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の白血病治療剤。
【請求項８】
M-CSF受容体阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象において白血病を治療または予防する方法。
【請求項９】
白血病治療剤の製造のためのM-CSF受容体阻害剤の使用。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、M-CSF受容体の発現を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）M-CSF受容体に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該M-CSF受容体と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該M-CSF受容体と結合する被検化合物を選択する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、M-CSF受容体の発現を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）M-CSF受容体遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該M-CSF受容体の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該M-CSF受容体の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、M-CSF受容体の発現を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）M-CSF受容体をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、M-CSF受容体の活性を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）M-CSF受容体を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるM-CSF受容体の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下させた被検化合物を選択する工程
【請求項１４】
白血病が、MLL白血病またはMOZ白血病であることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の医薬組成物のスクリーニング方法。
【請求項１５】
M-CSF受容体の発現量を測定する工程を含む、白血病の検査方法。
【請求項１６】
M-CSF受容体遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の検査方法に用いられる、白血病の検査薬。
【請求項１７】
M-CSF受容体を認識する抗体を含む、請求項１５に記載の検査方法に用いられる、白血病の検査薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、M-CSF（マクロファージコロニー刺激因子）受容体阻害剤を有効成分として含有するMLL白血病及びMOZ白血病治療剤、およびその利用に関する。また、M-CSF受容体の発現または活性を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法に関する。さらに、M-CSF受容体の発現量を測定する工程を含む、白血病の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液のがんである白血病は、白血病細胞の性質の分類から慢性骨髄性白血病と急性白血病に分けられ、急性白血病はさらに急性骨髄性白血病と急性リンパ性白血病に分類される。ヒト白血病では特異的な染色体転座が高頻度に見られ、その結果生じる融合タンパク質の発現が白血病発症に重要であることが示されている（非特許文献１）。MLL遺伝子は、急性骨髄性白血病と急性リンパ性白血病において高頻度に染色体転座の標的となり、４０遺伝子以上の様々な遺伝子と融合することが報告されている（非特許文献２−３）。MOZ遺伝子は、急性骨髄性白血病でみられる幾つかの染色体転座の標的となり、CBP,p300,TIF2などの遺伝子と融合することが報告されている（非特許文献４−８）。【０００３】
慢性骨髄性白血病では多くの場合t(9;22)転座が見られ、その結果生じるBCR (Breakpoint Cluster Region)-ABL(abelson strain of murine leukemia virus)融合タンパク質の発現が白血病発症に深く関与する（非特許文献９−１０）。近年、このBCR-ABLを標的としたイマチニブ（グリベック、ノバルティスファーム社、スイス）が慢性骨髄性白血病に有効であることが明らかとなり広く用いられてきている（非特許文献１１）。一方、現在の急性白血病の治療は化学療法が主体であるが、化学療法による寛解導入後にしばしば再発し、これが生存率に大きく関係する。急性白血病では全トランスレチノイン酸が一部の急性白血病（急性前骨髄性白血病）に有効であるが、その他の大部分の患者に有効な分子標的治療薬は未だない。特にMLL白血病（MLL融合遺伝子を発現する白血病）及びMOZ白血病（MOZ融合遺伝子を発現する白血病）は予後不良であることから、これらに有効な治療法の開発が求められていた。【０００４】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Look, A.T., Science (1997) 278, 1059-1064
【非特許文献２】Huret, J. L., et al., Leukemia (2001) 15, 987-989
【非特許文献３】Meyer, C., et al., Leukemia (2006) 20, 777-784
【非特許文献４】Borrow, J., et al., Nat. Genet. (1996) 14, 33-41
【非特許文献５】Carapeti, M., et al., Blood (1998) 91, 3127-3133
【非特許文献６】Liang, J., et al., Blood (1998) 92, 2118-2122
【非特許文献７】Chaffanet, M., et al., Genes Chromosomes Cancer (2000) 28, 138-144
【非特許文献８】Kitabayashi, I., et al., Leukemia (2001) 15, 89-94
【非特許文献９】Faderl, S. et al., N Engl J Med (1999) 341, 164-172
【非特許文献１０】Sawyers, CL., et al., N Engl J Med (1999) 340, 1330-1340
【非特許文献１１】Druker, BJ., et al., Nat. Med. (1996) 2, 561-566
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、M-CSF受容体阻害剤を有効成分として含有するMLL白血病及びMOZ白血病治療剤を提供することにある。また、M-CSF受容体の発現または活性を抑制し、白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法も課題とする。さらにM-CSF受容体の発現量を測定する工程を含む、白血病の検査方法の提供も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、難治性急性白血病であるMLL白血病（MLL融合遺伝子を発現する白血病）及びMOZ白血病（MOZ融合遺伝子を発現する白血病）におけるM-CSF受容体の役割について検討を行った。
まず、MLL白血病及びMOZ白血病を誘導する活性のある細胞（白血病幹細胞）において、M-CSF受容体の発現量を確認したところ、M-CSFR（図面中はCSF1Rと記載する）の発現が高い細胞（M-CSFRhigh細胞）及び低い細胞（M-CSFRlow/-細胞）が存在することが明らかとなった（図１A）。また、M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞はどちらも、同等レベルのMOZ-TIF2タンパク質を発現していることが明らかとなった（図1B）。
次に、M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞をセルソーターにより分離し、これらをマウスに移植し、白血病誘導活性を確認したところ、M-CSFRhigh細胞に、強い白血病誘導活性があり、M-CSFRlow/-細胞は白血病誘導活性が低いことが明らかとなった（図１CおよびD）。【０００７】
次に、LICを含むと考えられるM-CSFRhigh細胞を除去することにより白血病発症が抑制されるかどうかを、薬物誘導性FKBP-Fas自殺遺伝子およびEGFPを発現するトランスジェニックマウスにAMLを発症させることで判定した。その結果、未処理マウスにおいては、M-CSFRhigh細胞数の増加（図1G）、および脾腫（図1H）が確認され、白血病が発症した（図1I）が、AP20187二量体化剤を投与によりM-CSFR発現細胞を除去した（図1G）マウスでは、脾腫（図1H）および白血病発症（図1I）が抑制された。この結果から、M-CSFR発現細胞を除去することにより白血病発症を抑制できることが明らかとなった。この結果は、M-CSFRを標的とした治療が有効であることを示唆している。
次に、本発明者らはMLL-AF10誘導AMLマウスのBM中にもM-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞が存在し（図2A）、M-CSFRhigh細胞に強いLIC活性があることを見出した（図2B）。さらに、MOZ-TIF2誘導AMLマウスおよびMLL-AF10誘導AMLマウスのM-CSFRhigh細胞において、M-CSFRの下流のエフェクターであるSTAT5が特異的に活性化されていることを明らかにした（図2D）。
次に、本発明者らはセルソーターにより分離されたM-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞について、M-CSF/CSF1または複数サイトカインのいずれかの存在下におけるそのコロニー形成能について試験した。その結果、CSF1条件においてはM-CSFRhigh細胞のみコロニーを形成し（図２E）、複数サイトカイン条件においては、M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞が等しい数のコロニーを形成することが明らかとなった（図2F）。これにより、機能的M-CSFRがM-CSFRhigh細胞中で発現することが示唆された。
次に、M-CSFRの発現がMOZ融合遺伝子又はMLL融合遺伝子によりどのように制御されるかをM-CSFRの転写制御領域をルシフェラーゼ遺伝子に連結したレポーター遺伝子を用いて調べた。その結果、MOZ、MLL、およびその融合タンパク質がPU.1依存的な様式でM-CSFR転写を活性化することが明らかとなった（図３B〜D、図４）。
さらに、欠失変異体を用いた解析からPU.1の酸性アミノ酸に富む領域（DE領域）またはETSドメインは、PU.1とMOZまたはMLLとの結合にそれぞれ必要であり（図7Bおよび7C）、これらのドメインはどちらも、MOZ、MLL、MOZ-CBP、およびMLL-p300によるPU.1媒介転写の活性化に必要である（図7D）ことが明らかとなった。
次に、PU.1-/- (PU.1-ER)細胞にMOZ-TIF2又はMLL-AF10を発現させ、M-CSFRの発現をセルソーターで調べた。その結果、4-ヒドロキシタモキシフェンを添加してPU.1-ERを活性化するとM-CSFRの発現上昇が見られ、MOZ-TIF2及びMLL-AF10の発現によりこの発現上昇が顕著に増強されることが明らかとなった（図８）。
次に、PU.1欠損マウスの胎仔肝細胞にMOZ-TIF2及びMLL-AF10を発現させて、これをマウスに移植して白血病が発症するかどうかを調べた。その結果、MOZ-TIF2及びMLL-AF10による白血病の誘導にはPU.1が必須であることが明らかとなった（図３F〜I）。
また、MOZ-/-またはMLL-/-胎児肝細胞中ではM-CSFRの発現が損なわれていることが明らかとなった（図9Aおよび9B）。【０００８】
次に、MOZ-TIF2融合遺伝子及びMLL-AF10遺伝子により白血病を発症したマウスの骨髄細胞を、放射線照射した野生型マウスに移植し、移植後７日後からメシル酸イマチニブ（STI571；Glivec、グリベック(登録商標)）を投与し、白血病の治療効果を確認した。その結果、M-CSF受容体阻害剤の一つと考えられる、イマチニブはこれらの白血病モデルマウスにおいて発症を遅延させる効果があることが明らかとなった（図１０A〜D）。
さらに、本発明者らはM-CSFRhigh-LICはc-Kit+ Sca-1- CD16/32+ Mac-1low Gr-1+であること（図１１）、一部の正常なおよび悪性の幹細胞の特徴であるサイドポピュレーション（SP）の細胞が、MOZ-TIF2誘導AMLマウスのBM中に存在することを明らかにした（図１２A〜D）。また、MLL融合物およびMOZ融合物がPU.1と相互作用して受容体チロシンキナーゼM-CSFRの発現上昇を誘導し、これによって、2種類の経路が活性化されることによりAMLの早期発症を誘導することを、本発明者らは明らかにした（図10E）。【０００９】
即ち、本発明者らは、難治性急性白血病であるMLL白血病及びMOZ白血病を誘導する活性のある細胞（白血病幹細胞）において、M-CSF受容体（M-CSFR、CSF1R、c-FMS、CD115）の発現が高いこと、すなわちM-CSF受容体シグナルが白血病の発症に密接に結びついていることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。【００１０】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１７〕を提供するものである。
〔１〕M-CSF受容体阻害剤を有効成分として含有する、MLL白血病またはMOZ白血病治療剤。
〔２〕M-CSF受容体阻害剤が、M-CSF受容体のチロシンリン酸化活性に対する阻害剤であることを特徴とする、〔１〕に記載の白血病治療剤。
〔３〕M-CSF受容体阻害剤が、抗M-CSF受容体抗体であることを特徴とする、〔１〕に記載の白血病治療剤。
〔４〕M-CSF受容体阻害剤が、M-CSF受容体に対するアプタマーであることを特徴とする、〔１〕に記載の白血病治療剤。
〔５〕M-CSF受容体阻害剤が、アンチセンスRNA又はdsRNAであることを特徴とする、〔１〕に記載の白血病治療剤。
〔６〕M-CSF受容体阻害剤が、メシル酸イマチニブであることを特徴とする、〔１〕に記載の白血病治療剤。
〔７〕M-CSF受容体がM-CSFR、CSF1R、ｃ-FMS、またはCD115のいずれかであることを特徴とする、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の白血病治療剤。
〔８〕M-CSF受容体阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象において白血病を治療または予防する方法。
〔９〕白血病治療剤の製造のためのM-CSF受容体阻害剤の使用。
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、M-CSF受容体の発現を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）M-CSF受容体に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該M-CSF受容体と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該M-CSF受容体と結合する被検化合物を選択する工程
〔１１〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、M-CSF受容体の発現を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）M-CSF受容体遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該M-CSF受容体の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該M-CSF受容体の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
〔１２〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、M-CSF受容体の発現を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）M-CSF受容体をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
〔１３〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、M-CSF受容体の活性を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）M-CSF受容体を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるM-CSF受容体の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下させた被検化合物を選択する工程
〔１４〕白血病が、MLL白血病またはMOZ白血病であることを特徴とする、〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬組成物のスクリーニング方法。
〔１５〕M-CSF受容体の発現量を測定する工程を含む、白血病の検査方法。
〔１６〕M-CSF受容体遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、〔１５〕に記載の検査方法に用いられる、白血病の検査薬。
〔１７〕M-CSF受容体を認識する抗体を含む、〔１５〕に記載の検査方法に用いられる、白血病の検査薬。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】MOZ白血病発症マウスの骨髄細胞におけるM-CSFRの発現検討の結果を示す図である。(A) MOZ-TIF2誘導AMLマウス由来のBM細胞を、GFPおよびM-CSFRの発現についてFACSで解析した結果を示す図である。(B) M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞を、フローサイトメーターで選別した。抗MOZ抗体を用いた免疫ブロット解析によって、これらの細胞でのMOZ-TIF2の発現を調べた結果を示す写真である。(C, D) 示された数のM-CSFRhigh (C) 細胞およびM-CSFRlow/- (D) 細胞を、予め致死的に放射線照射したマウスに移植し、白血病発症による生存を調べた結果を示す図である。(E) M-CSFRプロモーター、EGFP、NGFR-FKBP-Fas自殺構築物の遺伝子構造、およびNGFR-FKBP-Fasの活性化機構を示す図である。トランスジェニック（Tg）マウスにおいて、AP20187二量体化剤への曝露によって、高レベルのM-CSFRを発現している細胞の条件除去を誘導することができる。(F〜I) MOZ-TIF2に感染させたTgマウス由来のBM細胞の移植によってAMLマウスを誘導し、AML TgマウスのBM細胞105個を予め致死的に放射線照射した野生型マウスに二次移植した結果を示す図および写真である。移植から7日後に、二次移植マウスをAP20187に曝露した。正常Tgマウス (F) ならびに未処置二次移植マウスおよびAP20187処置二次移植マウス (G) の、BM細胞中におけるGFPおよびM-CSFRの発現 (F, G) ならびに脾臓サイズ (H) を、移植から4週間後に解析した。未処置二次移植マウスおよびAP20187処置二次移植マウスの無白血病生存率を調べた（I)。
【図２】HoxA9の発現、STAT5のリン酸化、ならびに、M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞のコロニー形成活性の検討結果を示す図である。(A) MLL-AF10誘導AMLマウス由来の骨髄細胞を、GFPおよびM-CSFRの発現についてFACSで解析した結果を示す図である。(B, C) 示された数のセルソーターにより分離されたM-CSFRhigh (B) 細胞およびM-CSFRlow/- (C) 細胞を、予め致死的に放射線照射したマウスに移植し、無白血病生存率を調べた結果を示す図である。(D) M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞における、リン酸化STAT5（pSTAT5）、STAT5全体、リン酸化ERK（pERK）、およびPU.1の発現について、免疫ブロットにより解析した結果を示す写真である。(E, F) M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞を、M-CSF単独 (E)、またはSCF、IL3、IL6、およびエリスロポエチン (F) を含むメチルセルロース培地上でのコロニー形成能について試験した結果を示す図である。(G, H) M-CSFRhigh細胞、M-CSFRlow/-細胞、および正常BM細胞におけるM-CSFR (G) およびHoxA9 (H) の発現レベルを、定量的RT-PCRによって解析した結果を示す図である。(I, J) t(8;16)をもつAML患者由来の骨髄細胞 (I) およびt(9;11)をもつTHP-1細胞 (J) を10 ng/ml hM-CSF中で3日間培養し、M-CSFR発現についてFACSで試験した結果を示す図である。
【図３ＡＢＣ】(A) MOZ、MLL、およびPU.1上のタンパク質相互作用ドメインを示す図である。(B) M-CSFRプロモーターのAML1媒介性およびPU.1媒介性の転写に対する、MOZ、MOZ-CBP、およびMOZ-TIF2の効果を示す図である。SaOS2細胞に、M-CSFR-ルシフェラーゼおよび示されたエフェクターをトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、ルシフェラーゼ活性を解析した。(C) MLLとPU.1の相互作用。293T細胞を、FLAGタグ付きAML1、c-MYB、PU.1、C/EBPa、またはC/EBPeのいずれかと共にMLL-HAでトランスフェクションした結果を示す写真である。抗FLAG抗体（IP:FLAG）による免疫沈降物または細胞溶解物（Input）を、抗HA抗体、抗MLL抗体（N末端）、または抗FLAG抗体による免疫ブロットに供した。
【図３ＤＥ】(D) M-CSFRプロモーターのPU.1媒介転写に対するMLLおよびMLL融合物の効果を示す図である。(E) MSCV-GFP、MSCV-MOZ-TIF2-ires-GFP、またはMSCV-MLL-AF10-ires-GFPレトロウイルスに感染したPUER細胞を、100 nM 4-ヒドロキシタモキシフェン（4-HT）に2〜5日間曝露し、M-CSFRの発現についてFACSで解析した結果を示す図である。
【図３ＦＧＨＩＪ】(F〜H) E12.5 PU.1+/+およびPU.1-/-マウス胚同腹子の胎児肝細胞を、MOZ-TIF2 (F)、MLL-AF10 (G)、またはN-MYC (H) のいずれかに感染させて、放射線照射したマウスに移植した。マウスの無白血病生存を解析した結果を示す図である。(I、J) 正常なおよび融合MOZ/MLLタンパク質による転写調節のモデルを示す図である。MOZ融合物およびMLL融合物はM-CSFRの恒常的発現を刺激し、白血病を誘導する (I)。正常なMOZおよびMLLは、PU.1に結合することによりM-CSFR発現を制御し、正常な造血作用を調節する (J)。
【図４】CSF1RプロモーターのPU.1媒介転写に対する、MOZ、MLL、MOZ-CBP、およびMLL-p300の効果を示す図である。SaOS2細胞に、示されたエフェクターと共に、野生型CSF1R-ルシフェラーゼまたはPU.1結合部位を欠いたその変異体をトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後にルシフェラーゼ活性を解析した。
【図５】MOZ変異体とPU.1との相互作用を示す図及び写真である。(A) MOZの欠失変異体の構造を示す図である。(B) 293T細胞を、FLAGタグ付きPU.1と共に、HAタグ付きMOZの野生型および変異体でトランスフェクションした結果を示す写真である。抗FLAG抗体（IP:FLAG）による免疫沈降物または細胞溶解物（Input）を、抗HA抗体または抗FLAG抗体による免疫ブロットに供した。
【図６】(A) MLLの欠失変異体の構造を示す図である。(B) PU.1とMLLの欠失変異体との相互作用を示す写真である。293T細胞を、FLAGタグ付きPU.1と共に、HAタグ付きMLLの欠失変異体でトランスフェクションした。抗FLAG抗体（IP:FLAG）による免疫沈降物または細胞溶解物（Input）を、抗HA抗体または抗FLAG抗体による免疫ブロットに供した。(C) CSF1RプロモーターのPU.1媒介転写に対するMLL変異体の効果。SaOS2細胞を、PU.1およびMLL変異体と共に、CSF1R-ルシフェラーゼをトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後にルシフェラーゼ活性を解析した結果を示す図である。
【図７】(A) PU.1の欠失変異体の構造を示す図である。(B, C) PU.1変異体とMOZ (B) およびMLL (C) との相互作用を示す写真である。293T細胞を、FLAGタグ付きPU.1の野生型および変異体と共に、HAタグ付きMOZ (B) またはMLL (C) でトランスフェクションした。抗FLAG抗体（IP:FLAG）または細胞溶解物（Input）を含む免疫沈降物を、抗HA抗体または抗FLAG抗体による免疫ブロットに供した。(D) PU.1変異体の活性に対するMOZまたはMLLの効果を示す図である。SaOS2細胞に、PU.1、MOZ、MLL、MOZ-CBP、またはMLL-p300の野生型または変異体と共に、CSF1R-ルシフェラーゼをトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後にルシフェラーゼ活性を解析した。
【図８】MSCV-GFP、MSCV-MOZ-TIF2-ires-GFP、またはMSCV-MLL-AF10-ires-GFPレトロウイルスに感染したPUER細胞を、100 nM 4-ヒドロキシタモキシフェン（4-HT）に24時間または48時間曝露し、CSF1R mRNAの発現について定量的RT-PCRで解析した結果を示す図である。
【図９】E12.5 MLL+/+およびMLL-/-マウス胚同腹子 (A) ならびにE14.5 MOZ+/+およびMOZ-/-マウス胚同腹子 (B) の胎児肝細胞を、CSF1Rの発現についてFACSで解析した結果を示す図である。
【図１０】(A〜D) MOZ-TIF2 (A)、MLL-AF10 (B)、またはN-MYC (C) を有するAMLマウス由来のBM細胞（105個）を、放射線照射したマウスに移植した。メシル酸イマチニブを1日2回投与した。マウスの無白血病生存を解析した結果を示す図である。MOZ-TIF2誘導マウスの脾臓の大きさを、移植から3週間後に解析した結果を示す写真である (D)。(E) MLL融合タンパク質およびMOZ融合タンパク質によって誘導されたAMLの病理発生モデルを示す図である。MOZ融合物およびMLL融合物は、HoxおよびMeis1遺伝子ならびにM-CSFRの発現を上昇させて、AMLを誘導する。
【図１１】MOZ-TIF2誘導AMLマウス由来のBM細胞を、GFP、CSF1R、Mac-1、およびc-Kitの発現についてFACSで解析した結果を示す図である。
【図１２】(A) MOZ-TIF2誘導AMLマウス由来の骨髄細胞を、ベラパミルの存在下または非存在下においてHoechst 33342で染色し、SP細胞をFACSで解析した結果を示す図である。(B) AMLマウス由来の骨髄細胞を、抗CSF1R-PE、抗Mac1-PE-Cy7、およびHoechst 33342で染色した。GFP+ SP細胞（右パネル）およびGFP+非SP細胞を、CSF1RおよびMac1の発現について解析した結果を示す図である。(C, D) 示された数の流動選別された非SP細胞 (C) およびSP細胞 (D) を、予め致死的に放射線照射したマウスに移植し、無白血病生存率を調べた結果を示す図である。
【００１２】
〔発明の実施の形態〕
本発明者らは、難治性急性白血病であるMLL白血病及びMOZ白血病を誘導する活性のある細胞（白血病幹細胞）において、M-CSF受容体（M-CSFR、CSF1R、c-FMS、CD115）の発現が高いことを見いだした。本発明は、これらの知見に基づくものである。
本発明は、M-CSF受容体阻害剤を有効成分として含有するMLL白血病及びMOZ白血病治療剤に関する。【００１３】
本発明において「M-CSF受容体阻害剤」とは、M-CSF受容体の発現を阻害する物質であってもよいし、M-CSF受容体の活性を阻害する物質であってもよい。M-CSF受容体阻害剤は、好ましくはM-CSF受容体のチロシンリン酸化酵素活性を阻害する物質、またはM-CSFおよびM-CSF受容体の結合に対する阻害作用を有する物質である。本発明において、「M-CSF受容体」としては、M-CSFR、CSF1R、c-FMS、CD115を挙げることができる。本発明の阻害剤は複合体を構成している、各タンパク質の発現や活性を阻害するものであってもよい。【００１４】
本発明のM-CSF受容体阻害剤の例としては、チロシンリン酸化酵素活性阻害剤、抗M-CSF受容体抗体、抗M-CSF抗体、M-CSF受容体に対するアプタマー、M-CSF受容体に対するアンチセンスRNA、M-CSF受容体に対するdsRNAおよびM-CSF受容体に対するリボザイムを挙げることが出来る。また、M-CSF改変体、可溶性M-CSF受容体改変体あるいはM-CSF受容体又はM-CSFの部分ペプチド等のドミナントネガティブ体および、これらと同様のM-CSF受容体阻害活性を示す低分子物質が挙げられるが、特に限定されるものではない。チロシンリン酸化酵素活性阻害剤としては、メシル酸イマチニブ（グリベック（商標登録）、ノバルティスファーマ社、スイス）を例示することができる。本発明のM-CSF受容体阻害剤としては、チロシンリン酸化酵素活性阻害剤、好ましくは抗M-CSF受容体抗体、M-CSF受容体に対するアプタマー、M-CSF受容体に対するアンチセンスRNA、M-CSF受容体に対するdsRNAを挙げることが出来る。【００１５】
本発明で使用される抗M-CSF受容体抗体または抗M-CSF抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はM-CSF受容体またはM-CSFと結合することにより、M-CSFのM-CSF受容体への結合を阻害してM-CSF受容体の生物学的活性の細胞内への伝達（M-CSF受容体シグナル）を遮断する。また、この抗体は標的細胞に発現したM-CSF受容体と結合し、さらに該抗体のFc領域がナチュラルキラー細胞（NK細胞）やマクロファージなどのエフェクター細胞上のFc受容体と結合することで、細胞溶解シグナルが標的細胞へ伝達され標的細胞は死にいたる（抗体依存性細胞障害活性、ADCC活性：Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)。【００１６】
抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、M-CSF受容体またはM-CSFを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。【００１７】
具体的には、抗M-CSF受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトM-CSF受容体及びヒトM-CSFは、公知の文献（GenBank ACCESSION# NM_005211）に開示されたM-CSF受容体遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。本発明の方法に使用されるヒト由来のM-CSF受容体のcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該DNAがコードするM-CSF受容体のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。【００１８】
M-CSF受容体蛋白質は、本発明で用いられる抗M-CSF受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、いずれのM-CSF受容体を使用してもよい。本発明においてM-CSF受容体とは、受容体複合体、または複合体の各構成成分（蛋白質）を示すものとする。【００１９】
M-CSF受容体またはM-CSFの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の蛋白質を公知の方法で精製し、この精製蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、化学合成によって作製したM-CSF受容体蛋白質またはM-CSF蛋白質も感作抗原として用いてもよい。また、M-CSF受容体蛋白質またはM-CSF蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。【００２０】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。【００２１】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) 、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519 ）、MPC-11（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 ）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270  ）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133 ）等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C. 、Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。【００２２】
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。【００２３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000〜6000程度のPEG溶液を通常、30〜60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。【００２４】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。【００２５】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Bリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735参照）。【００２６】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。【００２７】
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。【００２８】
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159)等により全RNA を調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。【００２９】
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。【００３０】
目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。【００３１】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体、ヒト（human）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。【００３２】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。【００３３】
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework region）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。【００３４】
CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。【００３５】
キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体C領域が使用される。ヒト抗体C領域としては、Cγが挙げられ、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のC領域からなり、ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。【００３６】
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。【００３７】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。【００３８】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40)等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) 、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ）に従えば容易に実施することができる。【００３９】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546；Ward, E. S. et al. ,FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 ）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al. ,Science (1988) 240, 1041-1043 ）に従えばよい。【００４０】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al .,J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96/30394を参照）。【００４１】
複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。【００４２】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Veroなど、(2)両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3)昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。【００４３】
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。【００４４】
一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。【００４５】
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ）。【００４６】
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON530に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994)24, 131-138）。【００４７】
上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO 94-11523参照）。【００４８】
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。プロテインAカラムに用いる担体として、例えば、HyperD、POROS、SepharoseF.F.等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。【００４９】
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはHPLC（High performance liquid chromatography）に適用し得る。また、逆相HPLC（reverse phase HPLC）を用いてもよい。【００５０】
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はELISA等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、PBS(-)で適当に希釈した後、280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35ODとして算出する。また、ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6）で1μｇ/mlに希釈したヤギ抗ヒトIgG(TAG製）100μｌを96穴プレート（Nunc製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトIgG（CAPPEL製)100μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
洗浄後、5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG（BIO SOURCE製）100μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad製）を用いて405nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。【００５１】
本発明において「アプタマー」とはタンパク質やホルモンなどの各種分子と結合する核酸を意味する。M-CSF受容体アプタマーとはM-CSF受容体と結合する核酸を意味する。M-CSF受容体アプタマー阻害剤とはM-CSF受容体に結合して、M-CSFとM-CSF受容体の結合を阻害する核酸を意味する。M-CSF受容体アプタマーはRNAであってもDNAであってもよく、これらのRNAまたはDNAがM-CSF受容体に結合するものである限り特に限定はしない。また、リボース、リン酸骨格、核酸塩基、両末端部分に修飾が加えられた核酸であってもよく、これらの核酸がM-CSF受容体に結合するものである限り特に限定するものではない。核酸の形態は二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。【００５２】
アプタマーの長さは標的分子に特異的に結合するために必要な長さを有していれば特に限定はしないが、例えば、10〜200ヌクレオチド、好ましくは、10〜100ヌクレオチド、より好ましくは15〜80ヌクレオチド、さらに好ましくは15〜50ヌクレオチドのものである。
アプタマーはヌクレオチドで構成されたものだけで治療薬として使用することができるが、他の分子、例えば、ポリエチレングリコール、コレステロール、ペプチド、リポソーム、蛍光色素、放射性物質、毒素、他のアプタマーなどを結合させた形態で使用することもできる。本発明において、「アプタマー」はこのような他の分子を結合させたアプタマーも含まれる。【００５３】
本発明のアプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選別することができる。限定はしないが、例えば、SELEX法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）（Tuerk, C. and Gold, L., 1990, Science, 249: 505-510)により選別することができる。SELEX法は、1015程度の異なるヌクレオチド配列をもつ核酸プールを標的物質と混合し、標的物質に結合する、または、より強く結合する核酸を選別してくる方法である。選別された核酸はRT-PCRまたはPCRにより増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を10回程度繰り返すことにより、目的のアプタマーを取得することができる。【００５４】
アプタマーを医薬品として使用する場合、最小化および安定化する必要がある。具体的には、活性に影響しないヌクレオチドを削除することで最小化し、修飾を入れることで安定化する。天然型のRNAの血清中での半減期は数秒であるが、例えば、リボースの2'位をO-メチル化し両末端にinverted dTを結合することで、半減期が1週間以上に延びる。【００５５】
本発明の「M-CSF受容体に対するアンチセンスRNA」は、M-CSF受容体をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAがあげられる。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。【００５６】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、M-CSF受容体遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であるものと考えられる。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNA の長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。【００５７】
本発明で用いられる「M-CSF受容体に対するdsRNA」は、RNA干渉（RNAi）によりM-CSF受容体遺伝子発現を抑制する二重鎖RNAを意味する。RNA干渉は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNA（dsRNA）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3’末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA）を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC：RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子のmRNAを切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。【００５８】
本発明のdsRNAとしては、siRNAまたはshRNAを挙げることができる。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。また、shRNAは、1本鎖のRNAがヘアピン構造を介して2重鎖を構成しているsiRNAである。
dsRNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の相同性を有する。【００５９】
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
本発明の「M-CSF受容体に対するリボザイム」は、M-CSF受容体の発現や機能に影響を与える、触媒活性を有した核酸を意味し、M-CSF受容体ｍRNAを特異的に切断する核酸を含む。
さらに、M-CSF受容体の発現または活性を抑制するM-CSF受容体阻害剤は、後述のスクリーニング方法によっても得ることもできる。【００６０】
本発明において、「白血病」とは、白血病の症状、および白血病において合併して起こる症状を、抑制または予防することを意味する。
本発明において、「白血病」とは、腫瘍化した造血細胞が無制限に増殖して血液中に出現する疾患の総称である。白血病においては、腫瘍細胞が分化能を失ったものを急性白血病、腫瘍細胞が分化能を保っているものを慢性白血病と呼ぶ。また、腫瘍の起源となった細胞が骨髄系の細胞である場合は骨髄性白血病、またはリンパ球系の細胞である場合はリンパ性白血病と分類される。このことから白血病は大きくは急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia; AML）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia; CML）、急性リンパ性白血病（acute lymphoid leukemia; ALL）、慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia; CLL）の４種類に分類され、急性前骨髄球性白血病（APL）、非定型的白血病（AUL）、骨髄単球性白血病（AMMoL）、及び若年型慢性骨髄性白血病（JCML）もこれらの分類に含まれる。また、急性単球性白血病（AMoL）、慢性単球性白血病（CMoL）、赤白血病、好酸球性白血病、好塩基球性白血病、巨核芽球性白血病、形質細胞性白血病、緑色腫、慢性好中球性白血病、成人T細胞白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、hairy  cell  leukemia、及び前リンパ球性白血病も白血病の種類として挙げることができる。本発明においては、白血病の種類は特に限定されるものではないが、好ましくは難治性急性白血病であるMLL（Mixed Lineage Luekemia）融合遺伝子を発現する白血病（MLL白血病）又はMOZ（Monocytic Luekemia Zinc-finger）融合遺伝子を発現する白血病（MOZ白血病）を挙げることができる。【００６１】
MLL白血病では、AML、ALLで見られる特異的な染色体転座によりMLL遺伝子が他の遺伝子と融合し、転座相手はAF4,AF9やp300/CBPを含む40以上である。またAMLではFAB分類M4/M5（単球性白血病）に見られる。さらにHOX遺伝子群の発現上昇が知られている。
MOZ白血病では、AMLに見られる特異的な染色体転座によりMOZ遺伝子がp300/CBP、TIF2、ASXと融合する。また、FAB分類M4/M5（単球性白血病）に見られる。さらに、HOXA9、HOXA10、MEIS1、FLT3の発現上昇が知られている。【００６２】
本発明における白血病治療剤を含む薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる材料が添加されていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体が上記の白血病の治療効果を有する材料であってもよいし、当該治療効果を有さない材料であってもよく、上記の治療剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。また、白血病の治療効果を有さない材料であって、M-CSF受容体阻害剤と併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。【００６３】
製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。
本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル等のＨＬＢ６〜１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。【００６４】
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。【００６５】
本発明の薬剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。【００６６】
本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等、他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭである。【００６７】
また、本発明の薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。【００６８】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。【００６９】
また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。【００７０】
本発明は、M-CSF受容体の発現または活性を抑制し白血病を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法に関する。
本発明の「M-CSF受容体の発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。【００７１】
本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まず、M-CSF受容体に複数の被験化合物を接触させる。
本発明の方法に使用されるヒト由来のM-CSF受容体のcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該DNAがコードするM-CSF受容体のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、本発明の方法に使用されるM-CSF受容体には、上記の公知のM-CSF受容体と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、M-CSF受容体の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、M-CSF受容体の部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。【００７２】
本発明におけるM-CSF受容体の変異体としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、M-CSF受容体の変異体として挙げることができる。【００７３】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。【００７４】
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、M-CSF受容体と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、M-CSF受容体の生物学的機能や生化学的機能としては、チロシンリン酸化能（STAT5のリン酸化）等を挙げることができる。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。【００７５】
目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、M-CSF受容体の塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、またM-CSF受容体（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、M-CSF受容体と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるM-CSF受容体と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。【００７６】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いることにより、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。【００７７】
本発明の方法に使用されるM-CSF受容体の由来となる生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。【００７８】
第一の態様に用いられるM-CSF受容体の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
M-CSF受容体の精製は周知の方法で行うことができる。また、M-CSF受容体が発現している細胞としては、内在性のM-CSF受容体を発現している細胞、または外来性のM-CSF受容体を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のM-CSF受容体を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることが可能である。内在性のM-CSF受容体を発現している細胞が由来する生物種としては、特に制限はなく、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。また、上記外来性のM-CSF受容体を発現している細胞は、例えば、M-CSF受容体をコードするDNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。また、上記外来性のM-CSF受容体を有する細胞は、例えば、M-CSF受容体をコードするDNAを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のM-CSF受容体が導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。【００７９】
また、M-CSF受容体が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、M-CSF受容体をコードするDNAを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。【００８０】
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。被検化合物は特に制限されないが、M-CSF受容体特異的なチロシンリン酸化酵素活性を阻害する化合物を好ましい例として挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。【００８１】
また、本発明において「接触」は、M-CSF受容体の状態に応じて行う。例えば、M-CSF受容体が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、M-CSF受容体が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをM-CSF受容体が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた2ハイブリッド法を利用することも可能である。【００８２】
第一の態様では、次いで、M-CSF受容体と被験化合物との結合を検出する。検出方法としては、特に制限はない。M-CSF受容体と被験化合物との結合は、例えば、M-CSF受容体に結合した被験化合物に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識など定量的測定が可能な標識）によって検出することができる。また、M-CSF受容体に標識剤を結合することもできる。被験化合物またはM-CSF受容体を樹脂やチップなどに固定化して結合を検出することもできる。M-CSF受容体への被験化合物の結合により生じるM-CSF受容体の活性変化を指標に検出することもできる。
本態様では、次いで、M-CSF受容体と結合する被験化合物を選択する。選択された化合物にはM-CSF受容体の発現または活性を減少させる化合物が含まれ、M-CSF受容体の発現または活性を抑制することによって、白血病を治療または予防する効果を示すものと考えられる。【００８３】
本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まずM-CSF受容体を発現する細胞に被検化合物を接触させる。
第二の態様では、次いでM-CSF受容体の発現レベルを測定する。M-CSF受容体の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。【００８４】
また、該遺伝子からコードされるM-CSF受容体を含む画分を定法に従って回収し、該M-CSF受容体の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、M-CSF受容体に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、M-CSF受容体の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。M-CSF受容体に対する抗体については、上記に記載したものを用いることが出来る。【００８５】
第二の態様では、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該M-CSF受容体の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、M-CSF受容体の発現を減少させる化合物が含まれ、M-CSF受容体の発現を抑制することによって、白血病を治療または予防する効果を示すものと考えられる。【００８６】
本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、M-CSF受容体をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
第三の態様において、「機能的に結合した」とは、M-CSF受容体遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、M-CSF受容体遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、M-CSF受容体遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。【００８７】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）およびGFP遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、M-CSF受容体をコードするDNAもまた含まれる。
M-CSF受容体をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液は、第一の態様において述べた方法で調製することが可能である。【００８８】
第三の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被験試料を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc）の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
また、M-CSF受容体遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、第二の態様に記載された方法で行うことが出来る。【００８９】
第三の態様においては、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少または増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、M-CSF受容体遺伝子の発現レベルを減少させる化合物が含まれ、M-CSF受容体の発現を抑制することによって、白血病を治療または予防する効果を示すものと考えられる。【００９０】
本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず、M-CSF受容体遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる。
第四の態様では、次いで、上記M-CSF受容体の活性を測定する。M-CSF受容体の活性としては、チロシンリン酸化能等を挙げることができる。具体的には、STAT5のリン酸化を測定することによりM-CSF受容体の活性を測定することができる。次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下もしくは増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、M-CSF受容体の活性を低下させる化合物が含まれ、M-CSF受容体の活性を抑制することによって、白血病を治療または予防する効果を示すものと考えられる。【００９１】
本発明は、M-CSF受容体阻害剤を対象に投与する工程を含む、白血病を治療または予防する方法に関する。M-CSF受容体阻害剤の投与は、急性白血病治療における寛解導入療法、地固め療法、又は維持強化療法のいずれにおいて行なわれてもよい。
本発明の「M-CSF受容体の発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
本発明のM-CSF受容体阻害剤をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。製剤化する場合には、上記に記載の製剤上許容される材料を添加してもよい。【００９２】
本発明におけるすべての薬剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.001mgから100mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり0.1〜1000mg、好ましくは0.1〜50mgの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗M-CSF受容体抗体または抗M-CSF抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重1kgあたり１ヶ月（４週間）に0.5mgから40mg、好ましくは1mgから20mgを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。M-CSF受容体アプタマーの場合には、血中にフリーのアプタマーが存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重1kgあたり１ヶ月（４週間）に0.1mgから100mg、好ましくは0.1mgから40mgを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。ヒトに投与する場合には下記に記載の動物モデルを用いて、好ましい投与量、投与方法を検討し、その結果をもとに検討する。【００９３】
本発明は、白血病の検査方法に関する。該方法としては、M-CSF受容体を発現する細胞において、M-CSF受容体の発現量を測定する工程を含む、白血病の検査方法を挙げることが出来る。M-CSF受容体の発現量の測定は上記に記載の方法で行うことが可能である。
M-CSF受容体の発現量が増大した場合には、腫瘍化細胞においてチロシンリン酸化が促進されていると考えられ、M-CSF受容体の発現量を測定することで白血病が発症しているかどうかを検査することが可能であるものと考えられる。【００９４】
本発明は、白血病の検査薬に関する。
該検査薬における「M-CSF受容体と結合する物質」としては、M-CSF受容体蛋白質、M-CSF受容体遺伝子領域、M-CSF受容体mRNAと結合する物質であれば特に限定はなく、例えば、M-CSF受容体遺伝子領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはM-CSF受容体を認識する抗体を挙げることができる。このような、M-CSF受容体遺伝子領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとしては、例えば、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを挙げることが出来る。【００９５】
本発明の検査薬として使用する、オリゴヌクレオチドには、ポリヌクレオチドが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のM-CSF受容体をコードするDNAの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、M-CSF受容体遺伝子の発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明のM-CSF受容体タンパク質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするDNA等）として使用することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、DNAアレイの基板の形態で使用することができる。【００９６】
該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bp であり、好ましくは15bp〜30bpである。プライマーは、本発明のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。また、プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的とし、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。【００９７】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のM-CSF受容体DNAまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。【００９８】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。【００９９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの二本鎖DNA断片として作製することもできる。【０１００】
本発明の検査薬として使用する、抗体は上記のM-CSF受容体を認識する限り特に限定されないが、特異的にM-CSF受容体を認識する抗体であることが好ましい。抗M-CSF受容体抗体については上記に記載のものを例示することができる。【０１０１】
本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。【０１０２】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドまたは抗体以外に、上記に記載の製剤上許容される材料を含んでいてもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１０３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【０１０４】
〔実施例１〕
急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia；以下AMLと記載）のマウスモデルを作製するために、c-KIT+骨髄（BM）細胞をMSCV-MOZ-TIF2-ires-EGFPレトロウイルスに感染させ、致死的に放射線照射したマウスに移植した。AMLマウスモデルは、記載のように作製した（Yokoyama, A. et al., Cell (2005) 123, 207-18）。マウスは、Deguchiらの報告（Deguchi, K. et al., Cancer Cell (2003) 3, 259-271）の通り、移植から約2ヶ月後にAMLを発症した。限られた数のAMLマウス由来BM細胞を放射線照射したマウスに移植した場合には、これらのマウスは移植から3〜6週間後にAMLを発症したが、このことは、移植可能な白血病誘導細胞（leukemia-initiating cell；以下LICと記載）がAMLマウスのBM中に存在したことを示唆している（Huntly, B. J. et al., Cancer Cell (2004) 6, 587-96）。
LICを同定するために、本発明者らは、蛍光活性化細胞選別（FACS）解析によって、様々な細胞表面マーカーについてAMLマウスのBM細胞を調べ、AMLマウスのBM細胞中にM-CSFR（図面中はCSF1Rと記載する）high細胞およびM-CSFRlow/-細胞が存在することを見出した（図1A）。
M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞はどちらも、同等レベルのMOZ-TIF2タンパク質を発現していた（図1B）。そのLIC活性を測定するために、M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞をセルソーターによって単離し、限られた数（細胞10〜104個）を放射線照射したマウスに移植した。全ての移植マウスにおいてAMLを誘導するのに、M-CSFRhigh細胞100個で十分であった（図1C）。その反面、M-CSFRlow/-細胞103個の移植後にAMLを発症したマウスはおらず、M-CSFRlow/-細胞104個を移植した後にはわずか半数のマウスが遅発的にAMLを発症した（図1D）。このように、M-CSFRhigh細胞は、M-CSFRlow/-細胞と比べて100倍を上回る強度のLIC活性を示した。【０１０５】
〔実施例２〕
LIC活性を強く示すM-CSFR発現細胞を除去することにより白血病発症が抑制できるかどうかを判定するため、本発明者らは、M-CSFRプロモーターの制御下で薬物誘導性FKBP-Fas自殺遺伝子およびEGFPを発現するトランスジェニックマウス（Burnett, S. H. et al., J Leukoc Biol (2004) 75, 612-23）を使用した（図1E）。該トランスジェニックマウスにおいて、内在性M-CSFRの発現レベルはEGFPおよびFKBP-Fasの発現レベルに比例し（図1F）、AP20187二量体化剤（dimerizer）の注射によって、M-CSFR発現細胞の条件除去（conditional ablation）を誘導することができる（Burnett, S. H. et al., J Leukoc Biol (2004) 75, 612-23）。該トランスジェニックマウスのc-KIT+ BM細胞をMOZ-TIF2レトロウイルスに感染させ、致死量の放射線照射した野生型マウスに移植した。これらのマウスは移植から約2ヶ月後にAMLを発症し、そのBM細胞（105細胞/マウス）を、第二のレシピエントマウスに移植した。移植から7日後、Burnettら（Burnett, S. H. et al., J Leukoc Biol (2004) 75, 612-23）に記載されたようにAP20187をマウスに注射した。AP20187はAriad Pharmaceuticalsより贈与された。静注によって5日間毎日AP20187（10 mg/kg）を投与し、その後、以前に記載したように3日ごとに1 mg/kgのAP20187を投与した（Burnett, S. H. et al., J Leukoc Biol (2004) 75, 612-23）。移植から3週間後に、非処置マウスにおいてM-CSFRhigh細胞数の増加（図1G）および脾腫（図1H）が観察された。しかし、AP20187処置マウスにおいては、M-CSFRhigh細胞も脾腫も検出されなかった。移植から5〜6週間後に全ての非処置マウスはAMLを発症したが、AP20187処置マウスはいずれも発症しなかった（図1I）。これらの結果は、M-CSFR発現細胞を除去することにより白血病発症が抑制できることを示していて、M-CSFRを標的とした治療が有効であることを示唆している。【０１０６】
〔実施例３〕
次に、本発明者らは、MLL-AF10を用いてAMLマウスにおけるM-CSFR発現（DiMartino, J. F. et al., Blood (2002) 99, 3780-5）を調べ、MLL-AF10誘導AMLマウスのBM中にもM-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞が存在することを見出した（図2A）。移植の際、セルソーターにより分離されたM-CSFRhigh細胞は、M-CSFRlow/-細胞の10倍を上回る強度の白血病開始活性を示した（図2Bおよび2C）。M-CSFRの下流のエフェクターであるSTAT5およびERKは、様々な白血病および骨髄増殖性疾患において活性化される。本発明者らは、リン酸特異的な抗STAT5抗体および抗ERK抗体による免疫ブロット解析を用いて、MOZ-TIF2誘導AMLマウスおよびMLL-AF10誘導AMLマウス由来のM-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞におけるこれらのタンパク質のリン酸化状態を調べた。STAT5はM-CSFRhigh細胞においては高度にリン酸化されていたが、M-CSFRlow/-細胞においてはそうではなく（図2D）、一方、ERK1/2はM-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞の両方においてリン酸化されていた。これらの結果は、MOZ-TIF2誘導AMLマウスおよびMLL-AF10誘導AMLマウスのLICにおいて、STAT5が特異的に活性化されていることを示唆している。【０１０７】
〔実施例４〕
MOZ-TIF2誘導白血病細胞およびMLL-AF10誘導白血病細胞はメチルセルロース培地中でコロニーを形成できるので（Deguchi, K. et al., Cancer Cell (2003) 3, 259-71、DiMartino, J. F. et al., Blood  (2002) 99, 3780-5）、流動選別されたM-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞について、M-CSF/CSF1または複数サイトカインのいずれかの存在下におけるそのコロニー形成能について試験した。メチルセルロース培地におけるコロニー形成、FACS解析、および細胞分離は、記載のように実施した（Katsumoto, T. et al., Genes Dev (2006) 20, 1321-30）。本発明者らの予想通り、CSF1条件においてM-CSFRhigh細胞はコロニーを形成したがM-CSFRlow/-細胞は形成せず、これは、機能的M-CSFRがM-CSFRhigh細胞中で発現することを示唆している（図2E）。しかし、複数サイトカイン条件においては、M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞が等しい数のコロニーを形成した（図2F）。MLL転座およびMOZ転座が関与する白血病発症の両方について、HoxA9を含むAクラスターHox遺伝子の発現上昇が重要であることが知られている（Dou, Y. & Hess, J. L. Int J Hematol  (2008) 87, 10-8、Camos, M. et al., Cancer Res  (2006) 66, 6947-54）。HoxA9の発現がM-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞の両方において上昇していることが、定量的RT-PCR解析によって示された（図2H）。【０１０８】
〔実施例５〕
MOZ転座またはMLL転座を有するヒトAML細胞中でもM-CSFRの発現上昇が見られるかどうかを判定するために、本発明者らは、MOZ-CBPを発現するt(8;16)転座を有するAML患者由来のBM細胞（K.T. & E.T.、投稿中）における、およびMLL-AF9融合タンパク質を発現するt(9;11)転座を有するTHP-1細胞（Tsuchiya, S. et al., Int J Cancer  (1980) 26, 171-6、Odero, M. D. et al., Genes Chromosomes Cancer  (2000) 29, 333-8）におけるM-CSFR発現を調べた。t(8;16)を有するAML細胞（図2I）およびTHP-1細胞（図2J）の両方においてもM-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞が観察されたことが、FACS解析によって示された。
M-CSFRの単球特異的発現は、AML1、PU.1、およびC/EBPなどの転写因子によって調節されると報告されている（Zhang, D. E. et al., Mol Cell Biol  (1996) 16, 1231-40）。MOZは、C/EBPαやC/EBPεとは相互作用しないが、AML1およびPU.1とは相互作用してその標的遺伝子の転写を刺激することが、本発明者らにより見出されている（Kitabayashi, I. et al., Embo J  (2001) 20, 7184-96、Katsumoto, T. et al., Genes Dev (2006) 20, 1321-30）。M-CSFRプロモーター-ルシフェラーゼ構築物を用いたレポーター解析によって、MOZ、MOZ-CBP、およびMOZ-TIF2はPU.1の存在下でM-CSFRプロモーターを活性化させるが、AML1の存在下では活性化させないことが示された（図3B）。MLL媒介転写調節を調べるために、本発明者らは、AML1、PU.1、c-Myb、C/EBPα、およびC/EBPεを含む複数の造血転写因子とMLLとの相互作用を試験し、MLLがPU.1と特異的相互作用することを見出した（図3C）。MLLおよびMLL融合物もまた、M-CSFRプロモーターのPU.1依存的活性化を促進した（図3D）。MLL、MLL-p300、MOZ、およびMOZ-CBPは、PU.1結合部位を欠くM-CSFRプロモーター変異体（Zhang, D. E. et al., Mol Cell Biol  (1994) 14, 373-81）を活性化しなかった（図4）。これらの結果は、MOZ、MLL、およびその融合タンパク質がPU.1依存的な様式でM-CSFR転写を活性化することを示唆している。
免疫沈降、免疫ブロット、およびレポーター解析は、記載のように実施した（Aikawa, Y. et al., Embo J (2006) 25, 3955-65）。M-CSFRプロモーター（Zhang, D. E. et al., Mol Cell Biol (1994)  14, 373-81）をpGL4に組み込むことによって、M-CSFR-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を作製した。
PU.1はMOZのN末領域およびC末領域（図3Aおよび5）ならびにMLLのN末領域（図3Aおよび6B）と相互作用したことが、欠失解析によって示された。MLL欠失変異体を用いるレポーター解析によって、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性に必要な最もC末端側のSETドメインは、MLLによるM-CSFRの活性化には必要でないことが示された（図6C）。PU.1の酸性アミノ酸に富む領域（DE領域）またはETSドメインは、PU.1とMOZまたはMLLとの結合にそれぞれ必要であった（図7Bおよび7C）。DE領域およびETSドメインはどちらも、MOZ、MLL、MOZ-CBP、およびMLL-p300によるPU.1を介した転写の活性化に必要であった（図7D）。【０１０９】
〔実施例６〕
MOZ-TIF2またはMLL-AF10が内在性M-CSFRのPU.1依存的誘導を刺激するかどうかを試験するため、本発明者らは、PU.1-エストロゲン受容体融合タンパク質（PUER）を発現するPU.1-/-ミエロイド前駆体を用いた。PUER細胞は、4-ヒドロキシタモキシフェン（4-HT）への曝露によるPU.1活性の回復の際に、マクロファージへと分化することができる（Walsh, J. C. et al., Immunity (2002) 17, 665-76）。PUER細胞を、MSCV-MOZ-TIF2-ires-GFP、MSCV-MLL-AF10-ires-GFP、または対照レトロウイルスに感染させた。GFP+細胞を選別し、4-HTの存在下で培養した。4-HTへの曝露から5日後に、MOZ-TIF2またはMLL-AF10を発現する細胞の場合は、M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞の２つのピークが見られたが、ベクター対照細胞の場合はM-CSFRlow/-細胞のみが見られ、M-CSFRhigh細胞は見られないことが、FACS解析によって示された（図3E）。M-CSFR発現レベルにおける2つのピークは、上述したMOZ-TIF2誘導AMLマウスおよびMLL-AF10誘導AMLマウスにおいて観察されたものと類似していた。定量的RT-PCR解析によって、MOZ-TIF2およびMLL-AF10はどちらもPU.1誘導M-CSFR mRNAの発現を強く誘導したことが示された（図8）。【０１１０】
〔実施例７〕
MOZ-TIF2およびMLL-AF10により誘導されるAMLにPU.1が必須であるかどうかを判定するために、胎生12.5日の同腹子のPU.1+/+およびPU.1-/-胎児肝細胞をMOZ-TIF2、MLL-AF10、またはN-Myc用のレトロウイルスに感染させ、放射線照射したマウスに移植した。MOZ-TIF2またはMLL-AF10を発現するPU.1+/+細胞を有するマウスは移植の9〜15週間後にAMLを発症したが、PU.1-/-細胞を有するマウスは少なくとも6ヶ月間全く健康であった（図3Fおよび3G）。このように、PU.1はMOZ-TIF2誘導AMLおよびMLL-AF10誘導AMLの発症に必要である。対照的に、N-Mycを発現するPU.1-/-またはPU.1+/+細胞のいずれかを移植されたマウスは全て、移植から6〜10週間後にAMLを発症した（図3H）。
総合すると、これらの結果によって、MOZおよびMLLならびにそれらの白血病関連融合タンパク質はPU.1との結合を介してM-CSFRの転写を活性化することが示された。MOZ融合物およびMLL融合物は高レベルのM-CSFRの発現を恒常的に活性化することによりAMLを誘導する（図3I）。一方、正常なMOZおよびMLLは、M-CSFR発現を、正常な造血作用を調節するための適切なレベルに調節している可能性がある（図3J）。実際、MOZ-/-またはMLL-/-胎児肝細胞中ではM-CSFRの発現が損なわれていた（図9Aおよび9B）。
本発明の結果により、M-CSFRがMLLおよびMOZ白血病誘導における治療標的であり得ることが示唆される。M-CSFRは、チロシンキナーゼ阻害剤であるメシル酸イマチニブ（STI571；Glivec(登録商標)）に対する感受性を有することが報告されている（Taylor, J. R. et al., Oncogene  (2006) 25, 147-51、Dewar, A. L. et al., Cell Cycle (2005) 4, 851-3、Dewar, A. L. et al., Blood (2005) 105, 3127-32）。本発明者らは、マウスにおけるMOZ-TIF2誘導AMLおよびMLL-AF10誘導AMLに対するイマチニブの効果を試験した。イマチニブ（100 mg/kg）は1日2回経口投与した。イマチニブの経口投与は、融合タンパク質により誘導されるAMLの発症をどちらも遅延させたが（図10Aおよび10B）、N-MYC誘導AMLの進行には影響しなかった（図10C）。MOZ-TIF2誘導脾腫は、イマチニブを用いた処置によって阻害された（図10D）。【０１１１】
〔実施例８〕
本発明者らは、ここで、LICがM-CSFRhigh細胞中で高度に濃縮されたことを示した。M-CSFRhigh-LICはc-Kit+ Sca-1- CD16/32+ Mac-1low Gr-1+であったことが、FACS解析によって示された（図11）。一部の正常なおよび悪性の幹細胞の特徴であるサイドポピュレーション（SP）の細胞が、MOZ-TIF2誘導AMLマウスのBM中に存在した（図12A）。大部分のSP細胞はM-CSFRhigh細胞であったが、非SP細胞は、M-CSFRhigh細胞およびM-CSFRlow/-細胞の両方を含んでいた（図12B）。LICは、非SP画分と比較して、SP画分において約10倍濃縮されていた（図12Cおよび12D）。SP細胞の母集団が非常に小さかった（約0.12%）ので、SP画分中のLICの絶対数は小さく（1〜2%）、LICの大部分は非SP画分中に存在した。
AML1-ETO、PML-RARα、またはCBFβ-MYH11などの融合遺伝子が急性白血病を誘導するためには、受容体チロシンキナーゼ（例えばFLT3およびc-KIT）における点変異の活性化などの第二の変異が必要であることが示唆されている（Gilliland, D. G.., Semin Hematol (2002) 39, 6-11）。対照的に、MLL融合物およびMOZ融合物は単独で、AMLの急速発症を誘導することができる（Deguchi, K. et al., Cancer Cell (2003) 3, 259-71、Corral, J. et al., Cell (1996) 85, 853-61、Forster, A. et al., Cancer Cell (2003) 3, 449-58、Lavau, C. et al., Embo J (1997) 16, 4226-37）。Hox遺伝子およびHOX補因子であるMeis1の発現上昇はLICの誘導および維持にとって重要であるが、MLL白血病およびMOZ白血病の生物学的および臨床的な全ての特徴を反復するものではない（Dou, Y. & Hess, J. L., Int J Hematol (2008) 87, 10-8、Jin, G. et al., Blood (2007)  109, 3998-4005）。MLL融合物およびMOZ融合物がPU.1と相互作用して受容体チロシンキナーゼM-CSFRの発現上昇を誘導し、これによって、AMLの早期発症を誘導する2種類の経路が活性化されることを、本発明者らのデータは実証した（図10E）。また、これらの型の白血病の治療における新たな分子標的としてM-CSFRが有効であることを示した（図１F-I, 図１１A-D）。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明により、難治性急性白血病であるMLL白血病及びMOZ白血病を誘導する活性のある細胞（白血病幹細胞）において、M-CSF受容体（M-CSFR、CSF1R、c-FMS、CD115）の発現が高いことが明らかとなった。
すなわち、M-CSF受容体の発現またはシグナル活性を抑制する又はM-CSF受容体を発現する細胞を死滅させることにより、MLL白血病及びMOZ白血病を治療できるものと考えられる。本発明の白血病治療剤を利用することにより、MLL白血病及びMOZ白血病等の治療が行えるものと考えられる。また、M-CSF受容体の発現量を確認することで、白血病の診断が行えるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３ＡＢＣ】
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【図３ＤＥ】
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【図３ＦＧＨＩＪ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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