(57)【要約】  本発明は、肺組織に局所送達するための持続作用製剤または持続治療域製剤の製造における、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の使用、ならびに肺組織において持続した治療域が達成されるように肺組織中の標的と結合する薬剤を被験者に投与するための方法に関する。前記製剤は肺組織に局所投与するためのものであり、また、前記方法は肺組織に局所投与することを含む。さらに、肺炎症または呼吸器疾患を治療、予防または抑制するための製剤または医薬の製造における、TNFR1のアンタゴニストの使用、ならびに前記疾患の治療方法をも開示する。また、肺炎症または呼吸器疾患を治療または予防するための送達装置（例えば、吸入器、鼻腔内送達装置）の製造における前記薬剤の使用、ならびに肺炎症または呼吸器疾患を治療または予防するための、前記薬剤を含む送達装置を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺組織に局所送達するための持続作用製剤または持続治療域製剤の製造における、肺組織中の標的と結合する薬剤の使用であって、薬剤の肺組織レベルの少なくとも50％が少なくとも約4時間にわたり維持されることを特徴とする、上記使用。
【請求項２】
低用量有効量の薬剤を肺組織に局所投与するための医薬の製造における、肺組織中の標的と結合する薬剤の使用であって、薬剤の肺組織レベルの少なくとも50％が少なくとも約4時間にわたり維持されることを特徴とする、上記使用。
【請求項３】
肺組織が肺臓である、請求項1または2に記載の使用。
【請求項４】
前記製剤または医薬中の薬剤量の少なくとも約1％の肺レベルが少なくとも4時間維持される、請求項3に記載の使用。
【請求項５】
前記薬剤が体循環に実質的に流入しない、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤が約1秒〜約12時間のin vivo血清半減期を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７】
前記製剤または医薬が約10mg/kg/日以下の用量を投与するためのものである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤が肺組織中の標的と結合するアンタゴニストである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用。
【請求項９】
前記薬剤が肺組織中の標的と結合する抗体フラグメントである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤が肺組織中の標的と結合するdAb単量体である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１１】
肺組織に局所送達するための1日用量製剤の製造における、肺組織中の標的と結合するドメイン抗体（dAb）の使用であって、薬剤の肺レベルの少なくとも50％が少なくとも約4時間にわたり維持されることを特徴とする、上記使用。
【請求項１２】
肺組織に局所送達するための製剤の製造における、肺組織中の標的と結合するドメイン抗体（dAb）の使用であって、有意なレベルのdAbが体循環に蓄積しないことを特徴とする、上記使用。
【請求項１３】
呼吸器疾患を治療または予防するための製剤の製造における、肺組織中の標的と結合するドメイン抗体（dAb）の使用であって、該製剤が肺組織に局所投与するためのものであり、有意なレベルのdAbが体循環に蓄積しないことを特徴とする、上記使用。
【請求項１４】
肺組織中の標的と結合するdAbを最高約10mgまで使用する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１５】
肺組織中の標的と結合するdAbを1mg〜10mg使用する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１６】
肺組織中の前記標的が肺炎症または肺疾患を媒介する、請求項11〜15のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１７】
呼吸器の疾患または症状を治療または予防するための、定量のドメイン抗体（dAb）製剤を被験者に供給する吸入器または鼻腔内送達装置であって、dAb製剤を含んでなり、最高10mgまでのdAbを含む1日分の定量を供給することを特徴とする、上記吸入器または鼻腔内送達装置。
【請求項１８】
肺に局所送達するための持続作用吸入式dAb製剤を供給することを目的とした、吸入器または鼻腔内送達装置の製造における、ドメイン抗体（dAb）製剤の使用。
【請求項１９】
薬剤の肺レベルの少なくとも50％が少なくとも約4時間にわたり維持される、請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
吸入器または鼻腔内送達装置が最高10mg/kg/日までの用量を供給するためのものである、請求項18または19に記載の使用。
【請求項２１】
吸入器または鼻腔内送達装置が最高10mg/日までの用量を供給するためのものである、請求項18に記載の使用。
【請求項２２】
前記dAb製剤が、肺炎症または肺疾患を媒介する肺組織中の標的と結合するdAbを含む、請求項18〜21のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２３】
肺組織中の標的が、TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、キマーゼ、FGF、フューリン、エンドセリン-1、エオタキシン類（例えば、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3）、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン類、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMPs、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TNFR1、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、およびαvβ8からなる群より選択される、請求項1〜16および22のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２４】
肺組織中の標的がTNFR1である、請求項23に記載の使用。
【請求項２５】
肺組織において持続した治療域を生じるように、肺組織中の標的と結合する薬剤を被験者に投与するための方法であって、有効量の該薬剤を該被験者の肺組織に局所投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２６】
肺組織において持続した治療域を生じるように、肺組織中の標的と結合する薬剤を被験者に投与するための方法であって、約1秒〜約12時間のin vivo血清半減期を有しかつ肺組織中の標的と結合する薬剤を選択し、有効量の該薬剤を該被験者の肺組織に局所投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２７】
前記薬剤が約1秒〜約12時間のin vivo血清半減期を有する、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
前記薬剤が体循環に実質的に流入しない、請求項25〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤が抗体の抗原結合フラグメントである、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬剤がFvフラグメントである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤がdAb単量体である、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
低用量の有効量を投与する、請求項25〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
有効量のTNFR1のアンタゴニストを、それを必要とする被験者に投与することを含んでなる呼吸器疾患の治療方法であって、該有効量が約10mg/kg/日を超えず、肺における炎症細胞のレベルが処置前レベルに対してp＜0.05で減少することを特徴とする、上記方法。
【請求項３４】
肺における炎症細胞のレベルが、気管支肺胞洗浄液、痰または気管支生検材料中の全細胞数により評価される、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
肺における炎症細胞のレベルが、気管支肺胞洗浄液、痰または気管支生検材料中のマクロファージ数および/または好中球数により評価される、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
TNFR1のアンタゴニストを前記被験者の肺組織に局所投与する、請求項33〜35のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
TNFR1のアンタゴニストを吸入または鼻腔内投与により肺組織に局所投与する、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
低用量の治療量を投与する、請求項36または37に記載の方法。
【請求項３９】
TNFR1のアンタゴニストを前記被験者に全身投与する、請求項33〜35のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
TNFR1のアンタゴニストを腹腔内または皮下に全身投与する、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
TNFR1のアンタゴニストが、それを投与した後、少なくとも8時間にわたり肺組織中に保持される、請求項36〜38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４２】
肺組織が肺臓である、請求項36、37または41に記載の方法。
【請求項４３】
TNFR1のアンタゴニストが体循環に実質的に流入しない、請求項36〜38、41および42のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４４】
TNFR1のアンタゴニストを約5mg/kg以下で1日1回投与する、請求項33〜43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４５】
TNFR1のアンタゴニストを約1mg/kg以下で1日1回投与する、請求項33〜43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４６】
肺における炎症細胞のレベルが、処置前レベルに対して、少なくとも約30％減少する、請求項33〜43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４７】
肺における炎症細胞のレベルが、処置前レベルに対して、少なくとも約50％減少する、請求項33〜43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４８】
肺における炎症細胞のレベルが、処置前レベルに対して、少なくとも約70％減少する、請求項33〜43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４９】
肺における炎症細胞のレベルが処置前レベルに対してp＜0.001で減少する、請求項33〜43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５０】
前記呼吸器疾患が、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球浸潤、環境肺疾患、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、隔膜の障害、換気過少、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸促進症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿肺症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、慢性気管支炎、気腫、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌症、胸水、塵肺症、肺細胞増多症（pneumocytosis）、肺放線菌症、肺胞蛋白症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺組織球症、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈性肺高血圧症、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、およびヴェーゲナー肉芽腫症からなる群より選択される、請求項33〜49のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５１】
前記呼吸器疾患が慢性閉塞性肺疾患または喘息である、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
TNFR1のアンタゴニストが、TNFR1に対する結合特異性を有するが実質的にTNFR1を作動させないポリペプチドドメインを含む、請求項33〜51のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリペプチドドメインが抗体または抗体フラグメントである、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
TNFR1のアンタゴニストが、TNFR1と結合しかつ腫瘍壊死因子α(TNFα)のTNFR1への結合を阻害するか、またはTNFαが結合するときTNFR1を介して媒介されるシグナル伝達を阻害するドメイン抗体(dAb)からなり、該dAbが免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインからなる群より選択される、請求項33〜51のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
前記dAbが、ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒトVHおよびヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒトVLからなる群より選択される、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記dAbのアミノ酸配列が、TAR2h-12 (配列番号1)、TAR2h-13 (配列番号2)、TAR2h-14 (配列番号3)、TAR2h-16 (配列番号4)、TAR2h-17 (配列番号5)、TAR2h-18 (配列番号6)、TAR2h-19 (配列番号7)、TAR2h-20 (配列番号8)、TAR2h-21 (配列番号9)、TAR2h-22 (配列番号10)、TAR2h-23 (配列番号11)、TAR2h-24 (配列番号12)、TAR2h-25 (配列番号13)、TAR2h-26 (配列番号14)、TAR2h-27 (配列番号15)、TAR2h-29 (配列番号16)、TAR2h-30 (配列番号17)、TAR2h-32 (配列番号18)、TAR2h-33 (配列番号19)、TAR2h-10-1 (配列番号20)、TAR2h-10-2 (配列番号21)、TAR2h-10-3 (配列番号22)、TAR2h-10-4 (配列番号23)、TAR2h-10-5 (配列番号24)、TAR2h-10-6 (配列番号25)、TAR2h-10-7 (配列番号26)、TAR2h-10-8 (配列番号27)、TAR2h-10-9 (配列番号28)、TAR2h-10-10 (配列番号29)、TAR2h-10-11 (配列番号30)、TAR2h-10-12 (配列番号31)、TAR2h-10-13 (配列番号32)、TAR2h-10-14 (配列番号33)、TAR2h-10-15 (配列番号34)、TAR2h-10-16 (配列番号35)、TAR2h-10-17 (配列番号36)、TAR2h-10-18 (配列番号37)、TAR2h-10-19 (配列番号38)、TAR2h-10-20 (配列番号39)、TAR2h-10-21 (配列番号40)、TAR2h-10-22 (配列番号41)、TAR2h-10-27 (配列番号42)、TAR2h-10-29 (配列番号43)、TAR2h-10-31 (配列番号44)、TAR2h-10-35 (配列番号45)、TAR2h-10-36 (配列番号46)、TAR2h-10-37 (配列番号47)、TAR2h-10-38 (配列番号48)、TAR2h-10-45 (配列番号49)、TAR2h-10-47 (配列番号50)、TAR2h-10-48 (配列番号51)、TAR2h-10-57 (配列番号52)、TAR2h-10-56 (配列番号53)、TAR2h-10-58 (配列番号54)、TAR2h-10-66 (配列番号55)、TAR2h-10-64 (配列番号56)、TAR2h-10-65 (配列番号57)、TAR2h-10-68 (配列番号58)、TAR2h-10-69 (配列番号59)、TAR2h-10-67 (配列番号60)、TAR2h-10-61 (配列番号61)、TAR2h-10-62 (配列番号62)、TAR2h-10-63 (配列番号63)、TAR2h-10-60 (配列番号64)、TAR2h-10-55 (配列番号65)、TAR2h-10-59 (配列番号66)、TAR2h-10-70 (配列番号67)、TAR2h-34 (配列番号68)、TAR2h-35 (配列番号69)、TAR2h-36 (配列番号70)、TAR2h-37 (配列番号71)、TAR2h-38 (配列番号72)、TAR2h-39 (配列番号73)、TAR2h-40 (配列番号74)、TAR2h-41 (配列番号75)、TAR2h-42 (配列番号76)、TAR2h-43 (配列番号77)、TAR2h-44 (配列番号78)、TAR2h-45 (配列番号79)、TAR2h-47 (配列番号80)、TAR2h-48 (配列番号81)、TAR2h-50 (配列番号82)、TAR2h-51 (配列番号83)、TAR2h-66 (配列番号84)、TAR2h-67 (配列番号85)、TAR2h-68 (配列番号86)、TAR2h-70 (配列番号87)、TAR2h-71 (配列番号88)、TAR2h-72 (配列番号89)、TAR2h-73 (配列番号90)、TAR2h-74 (配列番号91)、TAR2h-75 (配列番号92)、TAR2h-76 (配列番号93)、TAR2h-77 (配列番号94)、TAR2h-78 (配列番号95)、TAR2h-79 (配列番号96)、TAR2h-15 (配列番号97)、TAR2h-131-8 (配列番号98)、TAR2h-131-24 (配列番号99)、TAR2h-15-8 (配列番号100)、TAR2h-15-8-1 (配列番号101)、TAR2h-15-8-2 (配列番号102)、TAR2h-185-23 (配列番号103)、TAR2h-154-10-5 (配列番号104)、TAR2h-14-2 (配列番号105)、TAR2h-151-8 (配列番号 106)、TAR2h-152-7 (配列番号107)、TAR2h-35-4 (配列番号108)、TAR2h-154-7 (配列番号109)、TAR2h-80 (配列番号110)、TAR2h-81 (配列番号111)、TAR2h-82 (配列番号112)、TAR2h-83 (配列番号113)、TAR2h-84 (配列番号114)、TAR2h-85 (配列番号115)、TAR2h-86 (配列番号116)、TAR2h-87 (配列番号117)、TAR2h-88 (配列番号118)、TAR2h-89 (配列番号119)、TAR2h-90 (配列番号120)、TAR2h-91 (配列番号121)、TAR2h-92 (配列番号122)、TAR2h-93 (配列番号123)、TAR2h-94 (配列番号124)、TAR2h-95 (配列番号125)、TAR2h-96 (配列番号126)、TAR2h-97 (配列番号127)、TAR2h-99 (配列番号128)、TAR2h-100 (配列番号129)、TAR2h-101 (配列番号130)、TAR2h-102 (配列番号131)、TAR2h-103 (配列番号132)、TAR2h-104 (配列番号133)、TAR2h-105 (配列番号134)、TAR2h-106 (配列番号135)、TAR2h-107 (配列番号136)、TAR2h-108 (配列番号137)、TAR2h-109 (配列番号138)、TAR2h-110 (配列番号139)、TAR2h-111 (配列番号140)、TAR2h-112 (配列番号141)、TAR2h-113 (配列番号142)、TAR2h-114 (配列番号143)、TAR2h-115 (配列番号144)、TAR2h-116 (配列番号145)、TAR2h-117 (配列番号146)、TAR2h-118 (配列番号147)、TAR2h-119 (配列番号148)、TAR2h-120 (配列番号149)、TAR2h-121 (配列番号150)、TAR2h-122 (配列番号151)、TAR2h-123 (配列番号152)、TAR2h-124 (配列番号153)、TAR2h-125 (配列番号154)、TAR2h-126 (配列番号155)、TAR2h-127 (配列番号156)、TAR2h-128 (配列番号157)、TAR2h-129 (配列番号158)、TAR2h-130 (配列番号159)、TAR2h-131 (配列番号160)、TAR2h-132 (配列番号161)、TAR2h-133 (配列番号162)、TAR2h-151 (配列番号163)、TAR2h-152 (配列番号164)、TAR2h-153 (配列番号165)、TAR2h-154 (配列番号166)、TAR2h-159 (配列番号167)、TAR2h-165 (配列番号168)、TAR2h-166 (配列番号169)、TAR2h-168 (配列番号170)、TAR2h-171 (配列番号171)、TAR2h-172 (配列番号172)、TAR2h-173 (配列番号173)、TAR2h-174 (配列番号174)、TAR2h-176 (配列番号175)、TAR2h-178 (配列番号176)、TAR2h-201 (配列番号177)、TAR2h-202 (配列番号178)、TAR2h-203 (配列番号179)、TAR2h-204 (配列番号180)、TAR2h-185-25 (配列番号181)、TAR2h-154-10 (配列番号182)、およびTAR2h-205 (配列番号183)からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも90％相同である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
TNFR1のアンタゴニストが半減期延長成分をさらに含む、請求項52〜56のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５８】
半減期延長成分が、ポリアルキレングリコール成分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、またはin vivoで半減期を延ばすポリペプチドに対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
半減期延長成分が、血清アルブミンまたは新生児型Fc受容体に対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体もしくは抗体フラグメントがdAbである、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
半減期延長成分がポリエチレングリコール成分である、請求項59に記載の方法。
【請求項６２】
呼吸器疾患を治療するための方法であって、
呼吸器疾患の動物モデルにおいて、約10mg/kgを超えない量で1日1回投与したとき、有効性を示す腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1）のアンタゴニストを選択すること、ただし、気管支肺胞洗浄液中の全細胞数で評価される肺の細胞浸潤が未処置対照と比べてp＜0.05で抑制される場合に、該動物モデルでの有効性が認められること、および
有効量のTNFR1のアンタゴニストを、それを必要とする被験者に投与すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項６３】
前記動物モデルがC57BL/6雌マウスでの慢性閉塞性肺疾患(COPD)のタバコ煙誘発亜慢性モデルである、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記動物モデルが喘息またはCOPDの非ヒト霊長類モデルである、請求項62に記載の方法。
【請求項６５】
前記動物モデルでの肺の細胞浸潤が、未処置対照と比べて、少なくとも約30％抑制される、請求項62〜64のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６６】
前記動物モデルでの肺の細胞浸潤が、未処置対照と比べて、少なくとも約50％抑制される、請求項62〜64のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６７】
前記動物モデルでの肺の細胞浸潤が、未処置対照と比べて、少なくとも約70％抑制される、請求項62〜64のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６８】
TNFR1のアンタゴニストが、未処置対照と比べて、前記動物モデルでの肺の細胞浸潤をp＜0.001で抑制する、請求項62〜67のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６９】
TNFR1のアンタゴニストが、前記動物モデルにおいて未処置対照に対して気管支肺胞洗浄液中の全細胞数で評価される肺の細胞浸潤を、経口投与されるホスホジエステラーゼ4阻害剤よりも強く抑制する、請求項62〜68のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７０】
経口投与されるホスホジエステラーゼ4阻害剤がBAY 19-8004である、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
前記BAY 19-8004が10mg/kgの用量で1日2回投与される、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
前記呼吸器疾患が、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球浸潤、環境肺疾患、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、隔膜の障害、換気過少、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸促進症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿肺症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、慢性気管支炎、気腫、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌症、胸水、塵肺症、肺細胞増多症（pneumocytosis）、肺放線菌症、肺胞蛋白症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺組織球症、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈性肺高血圧症、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、およびヴェーゲナー肉芽腫症からなる群より選択される、請求項62〜71のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７３】
被験者がヒトであり、呼吸器疾患が慢性閉塞性肺疾患または喘息であり、10mg/日以下を投与する、請求項62〜71のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７４】
TNFR1のアンタゴニストが、TNFR1に対する結合特異性を有するが実質的にTNFR1を作動させないポリペプチドドメインを含む、請求項62〜73のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリペプチドドメインが抗体または抗体フラグメントである、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
TNFR1のアンタゴニストが、TNFR1と結合しかつ腫瘍壊死因子α(TNFα)のTNFR1への結合を阻害するか、またはTNFαが結合するときTNFR1を介して媒介されるシグナル伝達を阻害するドメイン抗体(dAb)からなり、該dAbが免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインからなる群より選択される、請求項62〜73のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７７】
前記dAbが、ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト重鎖可変ドメイン（VH）およびヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト軽鎖可変ドメイン（VL）からなる群より選択される、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
前記dAbのアミノ酸配列が、TAR2h-12 (配列番号1)、TAR2h-13 (配列番号2)、TAR2h-14 (配列番号3)、TAR2h-16 (配列番号4)、TAR2h-17 (配列番号5)、TAR2h-18 (配列番号6)、TAR2h-19 (配列番号7)、TAR2h-20 (配列番号8)、TAR2h-21 (配列番号9)、TAR2h-22 (配列番号10)、TAR2h-23 (配列番号11)、TAR2h-24 (配列番号12)、TAR2h-25 (配列番号13)、TAR2h-26 (配列番号14)、TAR2h-27 (配列番号15)、TAR2h-29 (配列番号16)、TAR2h-30 (配列番号17)、TAR2h-32 (配列番号18)、TAR2h-33 (配列番号19)、TAR2h-10-1 (配列番号20)、TAR2h-10-2 (配列番号21)、TAR2h-10-3 (配列番号22)、TAR2h-10-4 (配列番号23)、TAR2h-10-5 (配列番号24)、TAR2h-10-6 (配列番号25)、TAR2h-10-7 (配列番号26)、TAR2h-10-8 (配列番号27)、TAR2h-10-9 (配列番号28)、TAR2h-10-10 (配列番号29)、TAR2h-10-11 (配列番号30)、TAR2h-10-12 (配列番号31)、TAR2h-10-13 (配列番号32)、TAR2h-10-14 (配列番号33)、TAR2h-10-15 (配列番号34)、TAR2h-10-16 (配列番号35)、TAR2h-10-17 (配列番号36)、TAR2h-10-18 (配列番号37)、TAR2h-10-19 (配列番号38)、TAR2h-10-20 (配列番号39)、TAR2h-10-21 (配列番号40)、TAR2h-10-22 (配列番号41)、TAR2h-10-27 (配列番号42)、TAR2h-10-29 (配列番号43)、TAR2h-10-31 (配列番号44)、TAR2h-10-35 (配列番号45)、TAR2h-10-36 (配列番号46)、TAR2h-10-37 (配列番号47)、TAR2h-10-38 (配列番号48)、TAR2h-10-45 (配列番号49)、TAR2h-10-47 (配列番号50)、TAR2h-10-48 (配列番号51)、TAR2h-10-57 (配列番号52)、TAR2h-10-56 (配列番号53)、TAR2h-10-58 (配列番号54)、TAR2h-10-66 (配列番号55)、TAR2h-10-64 (配列番号56)、TAR2h-10-65 (配列番号57)、TAR2h-10-68 (配列番号58)、TAR2h-10-69 (配列番号59)、TAR2h-10-67 (配列番号60)、TAR2h-10-61 (配列番号61)、TAR2h-10-62 (配列番号62)、TAR2h-10-63 (配列番号63)、TAR2h-10-60 (配列番号64)、TAR2h-10-55 (配列番号65)、TAR2h-10-59 (配列番号66)、TAR2h-10-70 (配列番号67)、TAR2h-34 (配列番号68)、TAR2h-35 (配列番号69)、TAR2h-36 (配列番号70)、TAR2h-37 (配列番号71)、TAR2h-38 (配列番号72)、TAR2h-39 (配列番号73)、TAR2h-40 (配列番号74)、TAR2h-41 (配列番号75)、TAR2h-42 (配列番号76)、TAR2h-43 (配列番号77)、TAR2h-44 (配列番号78)、TAR2h-45 (配列番号79)、TAR2h-47 (配列番号80)、TAR2h-48 (配列番号81)、TAR2h-50 (配列番号82)、TAR2h-51 (配列番号83)、TAR2h-66 (配列番号84)、TAR2h-67 (配列番号85)、TAR2h-68 (配列番号86)、TAR2h-70 (配列番号87)、TAR2h-71 (配列番号88)、TAR2h-72 (配列番号89)、TAR2h-73 (配列番号90)、TAR2h-74 (配列番号91)、TAR2h-75 (配列番号92)、TAR2h-76 (配列番号93)、TAR2h-77 (配列番号94)、TAR2h-78 (配列番号95)、TAR2h-79 (配列番号96)、TAR2h-15 (配列番号97)、TAR2h-131-8 (配列番号98)、TAR2h-131-24 (配列番号99)、TAR2h-15-8 (配列番号100)、TAR2h-15-8-1 (配列番号101)、TAR2h-15-8-2 (配列番号102)、TAR2h-185-23 (配列番号103)、TAR2h-154-10-5 (配列番号104)、TAR2h-14-2 (配列番号105)、TAR2h-151-8 (配列番号 106)、TAR2h-152-7 (配列番号107)、TAR2h-35-4 (配列番号108)、TAR2h-154-7 (配列番号109)、TAR2h-80 (配列番号110)、TAR2h-81 (配列番号111)、TAR2h-82 (配列番号112)、TAR2h-83 (配列番号113)、TAR2h-84 (配列番号114)、TAR2h-85 (配列番号115)、TAR2h-86 (配列番号116)、TAR2h-87 (配列番号117)、TAR2h-88 (配列番号118)、TAR2h-89 (配列番号119)、TAR2h-90 (配列番号120)、TAR2h-91 (配列番号121)、TAR2h-92 (配列番号122)、TAR2h-93 (配列番号123)、TAR2h-94 (配列番号124)、TAR2h-95 (配列番号125)、TAR2h-96 (配列番号126)、TAR2h-97 (配列番号127)、TAR2h-99 (配列番号128)、TAR2h-100 (配列番号129)、TAR2h-101 (配列番号130)、TAR2h-102 (配列番号131)、TAR2h-103 (配列番号132)、TAR2h-104 (配列番号133)、TAR2h-105 (配列番号134)、TAR2h-106 (配列番号135)、TAR2h-107 (配列番号136)、TAR2h-108 (配列番号137)、TAR2h-109 (配列番号138)、TAR2h-110 (配列番号139)、TAR2h-111 (配列番号140)、TAR2h-112 (配列番号141)、TAR2h-113 (配列番号142)、TAR2h-114 (配列番号143)、TAR2h-115 (配列番号144)、TAR2h-116 (配列番号145)、TAR2h-117 (配列番号146)、TAR2h-118 (配列番号147)、TAR2h-119 (配列番号148)、TAR2h-120 (配列番号149)、TAR2h-121 (配列番号150)、TAR2h-122 (配列番号151)、TAR2h-123 (配列番号152)、TAR2h-124 (配列番号153)、TAR2h-125 (配列番号154)、TAR2h-126 (配列番号155)、TAR2h-127 (配列番号156)、TAR2h-128 (配列番号157)、TAR2h-129 (配列番号158)、TAR2h-130 (配列番号159)、TAR2h-131 (配列番号160)、TAR2h-132 (配列番号161)、TAR2h-133 (配列番号162)、TAR2h-151 (配列番号163)、TAR2h-152 (配列番号164)、TAR2h-153 (配列番号165)、TAR2h-154 (配列番号166)、TAR2h-159 (配列番号167)、TAR2h-165 (配列番号168)、TAR2h-166 (配列番号169)、TAR2h-168 (配列番号170)、TAR2h-171 (配列番号171)、TAR2h-172 (配列番号172)、TAR2h-173 (配列番号173)、TAR2h-174 (配列番号174)、TAR2h-176 (配列番号175)、TAR2h-178 (配列番号176)、TAR2h-201 (配列番号177)、TAR2h-202 (配列番号178)、TAR2h-203 (配列番号179)、TAR2h-204 (配列番号180)、TAR2h-185-25 (配列番号181)、TAR2h-154-10 (配列番号182)、およびTAR2h-205 (配列番号183)からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも90％相同である、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
TNFR1のアンタゴニストが半減期延長成分をさらに含む、請求項74〜78のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８０】
半減期延長成分が、ポリアルキレングリコール成分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、またはin vivoで半減期を延ばすポリペプチドに対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
半減期延長成分が、血清アルブミンまたは新生児型Fc受容体に対する結合部位を含む抗体または抗体フラグメントである、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
前記抗体もしくは抗体フラグメントがdAbである、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
半減期延長成分がポリエチレングリコール成分である、請求項80に記載の方法。
【請求項８４】
呼吸器疾患を治療するための方法であって、
呼吸器疾患の動物モデルにおいて、約10mg/kg以下の量で1日1回以下の頻度で投与したとき、有効性を示す腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1）のアンタゴニストを選択すること、ただし、気管支肺胞洗浄液中の全細胞数で評価される肺の細胞浸潤が未処置対照と比べてp＜0.05で抑制される場合に、該動物モデルでの有効性が認められること、および
有効量のTNFR1のアンタゴニストを、それを必要とする被験者の肺組織に局所投与すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項８５】
TNFR1のアンタゴニストが、投与後、肺組織に少なくとも8時間保持される、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
TNFR1のアンタゴニストを吸入により、または鼻腔内に投与する、請求項84または85に記載の方法。
【請求項８７】
前記肺組織が肺臓である、請求項84〜86のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８８】
TNFR1のアンタゴニストが体循環に実質的に流入しない、請求項84〜87のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８９】
前記動物モデルがC57BL/6雌マウスでの慢性閉塞性肺疾患(COPD)のタバコ煙誘発亜慢性モデルである、請求項84〜88のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９０】
前記動物モデルが喘息またはCOPDの非ヒト霊長類モデルである、請求項84〜88のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９１】
前記動物モデルでの肺の細胞浸潤が、未処置対照と比べて、少なくとも約30％抑制される、請求項84〜90のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９２】
前記動物モデルでの肺の細胞浸潤が、未処置対照と比べて、少なくとも約50％抑制される、請求項84〜90のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９３】
前記動物モデルでの肺の細胞浸潤が、未処置対照と比べて、少なくとも約70％抑制される、請求項84〜90のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９４】
TNFR1のアンタゴニストが、未処置対照と比べて、前記動物モデルでの肺の細胞浸潤をp＜0.001で抑制する、請求項84〜93のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９５】
TNFR1のアンタゴニストが、前記動物モデルにおいて未処置対照に対して気管支肺胞洗浄液中の全細胞数で評価される肺の細胞浸潤を、経口投与されるホスホジエステラーゼ4阻害剤よりも強く抑制する、請求項84〜94のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９６】
経口投与されるホスホジエステラーゼ4阻害剤がBAY 19-8004である、請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
前記BAY 19-8004が10mg/kgの用量で1日2回投与される、請求項96に記載の方法。
【請求項９８】
前記呼吸器疾患が、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球浸潤、環境肺疾患、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、隔膜の障害、換気過少、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸促進症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿肺症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、慢性気管支炎、気腫、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌症、胸水、塵肺症、肺細胞増多症（pneumocytosis）、肺放線菌症、肺胞蛋白症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺組織球症、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈性肺高血圧症、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、およびヴェーゲナー肉芽腫症からなる群より選択される、請求項84〜97のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９９】
被験者がヒトであり、呼吸器疾患が慢性閉塞性肺疾患または喘息であり、10mg/日以下を投与する、請求項84〜97のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１００】
TNFR1のアンタゴニストが、TNFR1に対する結合特異性を有するが実質的にTNFR1を作動させないポリペプチドドメインを含む、請求項84〜99のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ポリペプチドドメインが抗体または抗体フラグメントである、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
TNFR1のアンタゴニストが、TNFR1と結合しかつ腫瘍壊死因子α(TNFα)のTNFR1への結合を阻害するか、またはTNFαが結合するときTNFR1を介して媒介されるシグナル伝達を阻害するドメイン抗体(dAb)からなり、該dAbが免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインからなる群より選択される、請求項84〜99のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記dAbが、ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト重鎖可変ドメイン（VH）およびヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト軽鎖可変ドメイン（VL）からなる群より選択される、請求項102に記載の方法。
【請求項１０４】
前記dAbのアミノ酸配列が、TAR2h-12 (配列番号1)、TAR2h-13 (配列番号2)、TAR2h-14 (配列番号3)、TAR2h-16 (配列番号4)、TAR2h-17 (配列番号5)、TAR2h-18 (配列番号6)、TAR2h-19 (配列番号7)、TAR2h-20 (配列番号8)、TAR2h-21 (配列番号9)、TAR2h-22 (配列番号10)、TAR2h-23 (配列番号11)、TAR2h-24 (配列番号12)、TAR2h-25 (配列番号13)、TAR2h-26 (配列番号14)、TAR2h-27 (配列番号15)、TAR2h-29 (配列番号16)、TAR2h-30 (配列番号17)、TAR2h-32 (配列番号18)、TAR2h-33 (配列番号19)、TAR2h-10-1 (配列番号20)、TAR2h-10-2 (配列番号21)、TAR2h-10-3 (配列番号22)、TAR2h-10-4 (配列番号23)、TAR2h-10-5 (配列番号24)、TAR2h-10-6 (配列番号25)、TAR2h-10-7 (配列番号26)、TAR2h-10-8 (配列番号27)、TAR2h-10-9 (配列番号28)、TAR2h-10-10 (配列番号29)、TAR2h-10-11 (配列番号30)、TAR2h-10-12 (配列番号31)、TAR2h-10-13 (配列番号32)、TAR2h-10-14 (配列番号33)、TAR2h-10-15 (配列番号34)、TAR2h-10-16 (配列番号35)、TAR2h-10-17 (配列番号36)、TAR2h-10-18 (配列番号37)、TAR2h-10-19 (配列番号38)、TAR2h-10-20 (配列番号39)、TAR2h-10-21 (配列番号40)、TAR2h-10-22 (配列番号41)、TAR2h-10-27 (配列番号42)、TAR2h-10-29 (配列番号43)、TAR2h-10-31 (配列番号44)、TAR2h-10-35 (配列番号45)、TAR2h-10-36 (配列番号46)、TAR2h-10-37 (配列番号47)、TAR2h-10-38 (配列番号48)、TAR2h-10-45 (配列番号49)、TAR2h-10-47 (配列番号50)、TAR2h-10-48 (配列番号51)、TAR2h-10-57 (配列番号52)、TAR2h-10-56 (配列番号53)、TAR2h-10-58 (配列番号54)、TAR2h-10-66 (配列番号55)、TAR2h-10-64 (配列番号56)、TAR2h-10-65 (配列番号57)、TAR2h-10-68 (配列番号58)、TAR2h-10-69 (配列番号59)、TAR2h-10-67 (配列番号60)、TAR2h-10-61 (配列番号61)、TAR2h-10-62 (配列番号62)、TAR2h-10-63 (配列番号63)、TAR2h-10-60 (配列番号64)、TAR2h-10-55 (配列番号65)、TAR2h-10-59 (配列番号66)、TAR2h-10-70 (配列番号67)、TAR2h-34 (配列番号68)、TAR2h-35 (配列番号69)、TAR2h-36 (配列番号70)、TAR2h-37 (配列番号71)、TAR2h-38 (配列番号72)、TAR2h-39 (配列番号73)、TAR2h-40 (配列番号74)、TAR2h-41 (配列番号75)、TAR2h-42 (配列番号76)、TAR2h-43 (配列番号77)、TAR2h-44 (配列番号78)、TAR2h-45 (配列番号79)、TAR2h-47 (配列番号80)、TAR2h-48 (配列番号81)、TAR2h-50 (配列番号82)、TAR2h-51 (配列番号83)、TAR2h-66 (配列番号84)、TAR2h-67 (配列番号85)、TAR2h-68 (配列番号86)、TAR2h-70 (配列番号87)、TAR2h-71 (配列番号88)、TAR2h-72 (配列番号89)、TAR2h-73 (配列番号90)、TAR2h-74 (配列番号91)、TAR2h-75 (配列番号92)、TAR2h-76 (配列番号93)、TAR2h-77 (配列番号94)、TAR2h-78 (配列番号95)、TAR2h-79 (配列番号96)、TAR2h-15 (配列番号97)、TAR2h-131-8 (配列番号98)、TAR2h-131-24 (配列番号99)、TAR2h-15-8 (配列番号100)、TAR2h-15-8-1 (配列番号101)、TAR2h-15-8-2 (配列番号102)、TAR2h-185-23 (配列番号103)、TAR2h-154-10-5 (配列番号104)、TAR2h-14-2 (配列番号105)、TAR2h-151-8 (配列番号 106)、TAR2h-152-7 (配列番号107)、TAR2h-35-4 (配列番号108)、TAR2h-154-7 (配列番号109)、TAR2h-80 (配列番号110)、TAR2h-81 (配列番号111)、TAR2h-82 (配列番号112)、TAR2h-83 (配列番号113)、TAR2h-84 (配列番号114)、TAR2h-85 (配列番号115)、TAR2h-86 (配列番号116)、TAR2h-87 (配列番号117)、TAR2h-88 (配列番号118)、TAR2h-89 (配列番号119)、TAR2h-90 (配列番号120)、TAR2h-91 (配列番号121)、TAR2h-92 (配列番号122)、TAR2h-93 (配列番号123)、TAR2h-94 (配列番号124)、TAR2h-95 (配列番号125)、TAR2h-96 (配列番号126)、TAR2h-97 (配列番号127)、TAR2h-99 (配列番号128)、TAR2h-100 (配列番号129)、TAR2h-101 (配列番号130)、TAR2h-102 (配列番号131)、TAR2h-103 (配列番号132)、TAR2h-104 (配列番号133)、TAR2h-105 (配列番号134)、TAR2h-106 (配列番号135)、TAR2h-107 (配列番号136)、TAR2h-108 (配列番号137)、TAR2h-109 (配列番号138)、TAR2h-110 (配列番号139)、TAR2h-111 (配列番号140)、TAR2h-112 (配列番号141)、TAR2h-113 (配列番号142)、TAR2h-114 (配列番号143)、TAR2h-115 (配列番号144)、TAR2h-116 (配列番号145)、TAR2h-117 (配列番号146)、TAR2h-118 (配列番号147)、TAR2h-119 (配列番号148)、TAR2h-120 (配列番号149)、TAR2h-121 (配列番号150)、TAR2h-122 (配列番号151)、TAR2h-123 (配列番号152)、TAR2h-124 (配列番号153)、TAR2h-125 (配列番号154)、TAR2h-126 (配列番号155)、TAR2h-127 (配列番号156)、TAR2h-128 (配列番号157)、TAR2h-129 (配列番号158)、TAR2h-130 (配列番号159)、TAR2h-131 (配列番号160)、TAR2h-132 (配列番号161)、TAR2h-133 (配列番号162)、TAR2h-151 (配列番号163)、TAR2h-152 (配列番号164)、TAR2h-153 (配列番号165)、TAR2h-154 (配列番号166)、TAR2h-159 (配列番号167)、TAR2h-165 (配列番号168)、TAR2h-166 (配列番号169)、TAR2h-168 (配列番号170)、TAR2h-171 (配列番号171)、TAR2h-172 (配列番号172)、TAR2h-173 (配列番号173)、TAR2h-174 (配列番号174)、TAR2h-176 (配列番号175)、TAR2h-178 (配列番号176)、TAR2h-201 (配列番号177)、TAR2h-202 (配列番号178)、TAR2h-203 (配列番号179)、TAR2h-204 (配列番号180)、TAR2h-185-25 (配列番号181)、TAR2h-154-10 (配列番号182)、およびTAR2h-205 (配列番号183)からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも90％相同である、請求項103に記載の方法。
【請求項１０５】
TNFR1のアンタゴニストが半減期延長成分をさらに含む、請求項100〜104のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０６】
半減期延長成分が、ポリアルキレングリコール成分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、またはin vivoで半減期を延ばすポリペプチドに対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
半減期延長成分が、血清アルブミンまたは新生児型Fc受容体に対する結合部位を含む抗体または抗体フラグメントである、請求項106に記載の方法。
【請求項１０８】
前記抗体もしくは抗体フラグメントがdAbである、請求項107に記載の方法。
【請求項１０９】
半減期延長成分がポリエチレングリコール成分である、請求項107に記載の方法。
【請求項１１０】
ヒトTNFR1および別の生物種由来のTNFR1に対する結合特異性を有するdAb単量体を含んでなるリガンド。
【請求項１１１】
前記dAb単量体がヒトTNFR1および別の生物種由来のTNFR1のアンタゴニストである、請求項110に記載のリガンド。
【請求項１１２】
前記dAb単量体が、約10倍以下の差の親和性で、ヒトTNFR1および別の生物種由来のTNFR1と結合する、請求項110または111に記載のリガンド。
【請求項１１３】
前記dAb単量体が、約104M/s〜約105M/sの結合速度（on rate）で、ヒトTNFR1および別の生物種由来のTNFR1と結合する、請求項110〜112のいずれか1項に記載のリガンド。
【請求項１１４】
前記dAb単量体が、約10-3s-1〜約10-5s-1の解離速度（off rate）で、ヒトTNFR1および別の生物種由来のTNFR1と結合する、請求項110〜113のいずれか1項に記載のリガンド。
【請求項１１５】
別の生物種由来のTNFR1が、齧歯類TNFR1、ウサギTNFR1、イヌTNFR1、ブタTNFR1、ヒツジTNFR1、または非ヒト霊長類TNFR1である、請求項110〜114のいずれか1項に記載のリガンド。
【請求項１１６】
TNFR1と結合するdAbを含んでなるリガンドであって、該リガンドがTNFR1のアンタゴニストであり、該dAbのアミノ酸配列が配列番号216および配列番号433のいずれかに対して少なくとも90％相同である、上記リガンド。
【請求項１１７】
TNFR1に対する結合特異性を有するリガンドであって、TNFR1に対する結合特異性を示す結合部位をもつタンパク質成分を含んでなり、該タンパク質成分がTAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR3のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、上記リガンド。
【請求項１１８】
前記タンパク質成分が、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR1および/またはCDR2のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をさらに含む、請求項117に記載のリガンド。
【請求項１１９】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193またはTAR2h-131-194のアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつTAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR1配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR1配列を有する、上記リガンド。
【請求項１２０】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193またはTAR2h-131-194のアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつTAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR2配列を有する、上記リガンド。
【請求項１２１】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193またはTAR2h-131-194のアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつTAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR3配列を有する、上記リガンド。
【請求項１２２】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193またはTAR2h-131-194のアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつTAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR1またはCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR1配列およびCDR2配列を有する、上記リガンド。
【請求項１２３】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193またはTAR2h-131-194のアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつTAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR2またはCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR2配列およびCDR3配列を有する、上記リガンド。
【請求項１２４】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193またはTAR2h-131-194のアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつTAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR1またはCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR1配列およびCDR3配列を有する、上記リガンド。
【請求項１２５】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193またはTAR2h-131-194のアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつTAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR1、CDR2またはCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列を有する、上記リガンド。
【請求項１２６】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR1配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR1配列を含む、上記リガンド。
【請求項１２７】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR2配列を含む、上記リガンド。
【請求項１２８】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR3配列を含む、上記リガンド。
【請求項１２９】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのそれぞれCDR1およびCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR1およびCDR2配列を含む、上記リガンド。
【請求項１３０】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのそれぞれCDR2およびCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR2およびCDR3配列を含む、上記リガンド。
【請求項１３１】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのそれぞれCDR1およびCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR1およびCDR3配列を含む、上記リガンド。
【請求項１３２】
TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであって、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、TAR2h-131-511、TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194からなる群より選択されるdAbのそれぞれCDR1、CDR2およびCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む、上記リガンド。
【請求項１３３】
ヒトTNFR1と結合しかつヒトTNFR1のアンタゴニストであるdAbを含んでなるリガンドであって、TNFα誘発炎症またはTNFα誘発炎症性メディエーターを実質的に同程度に抑制するのに必要とされるエタネルセプト（etanercept）の用量の1/2以下の用量[mg/kg]で、該TNFα誘発炎症またはTNFα誘発炎症性メディエーターを抑制する、上記リガンド。
【請求項１３４】
前記リガンドが、TNFα誘発炎症またはTNFα誘発炎症性メディエーターを実質的に同程度に抑制するのに必要とされるエタネルセプト（etanercept）の用量の1/10以下の用量[mg/kg]で、該TNFα誘発炎症またはTNFα誘発炎症性メディエーターを抑制する、請求項133に記載のリガンド。
【請求項１３５】
前記リガンドが半減期延長成分をさらに含む、請求項110〜134のいずれか1項に記載のリガンド。
【請求項１３６】
治療または診断に使用するための、請求項110〜134のいずれか1項に記載のリガンド。
【請求項１３７】
肺組織に局所投与するための医薬の製造における、請求項110〜134のいずれか1項に記載のリガンドの使用。
【請求項１３８】
呼吸器疾患の治療用または予防用の医薬の製造における、請求項110〜134のいずれか1項に記載のリガンドの使用。
【請求項１３９】
有効量の請求項110〜134のいずれか1項に記載のリガンドを、それを必要とする被験者に投与することを含んでなる、呼吸器疾患の治療または予防方法。
【請求項１４０】
請求項110〜134のいずれか1項に記載のリガンドをコードする、単離されたまたは組換え核酸。
【請求項１４１】
請求項140に記載の組換え核酸を含有するベクター。
【請求項１４２】
請求項140に記載の組換え核酸または請求項141に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４３】
請求項142に記載の宿主細胞を、前記核酸またはベクターの発現をもたらす条件下で維持し、それによりリガンドを産生させることを含んでなる、リガンドの産生方法。
【請求項１４４】
前記リガンドを単離することをさらに含む、請求項143に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺組織に局所送達するための持続作用製剤または持続治療域（long therapeutic window）製剤の製造における、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の使用、ならびに肺組織において薬剤の治療域が持続するように被験者に肺組織中の標的と結合する薬剤を投与するための方法に関する。前記製剤は肺組織に局所投与するためのものであり、また、前記方法は肺組織に局所投与することを含む。さらに、肺炎症または呼吸器疾患を治療、予防または抑制するための製剤または医薬の製造における、TNFR1のアンタゴニストの使用、ならびに前記疾患の治療方法をも開示する。また、肺炎症または呼吸器疾患を治療または予防するための送達装置（例えば、吸入器、鼻腔内送達装置）の製造における前記薬剤の使用、ならびに肺炎症または呼吸器疾患を治療または予防するための、前記薬剤を含む送達装置を開示する。
【背景技術】
【０００２】
治療薬または診断薬として見込みのある多くの薬剤のin vivo使用は可能でない。治療または診断上の効力を生じるほどに十分に長いin vivo血清半減期をもつ比較的大型の薬剤は組織や器官を通過することができず、結果的に所望の部位での所望の治療または診断効果が得られないことが多い。より小さい薬剤は組織や器官に侵入することができるが、in vivo血清半減期がしばしば短く、体循環から急速にクリアランスされる。例えば、dAb単量体のin vivo血清半減期は30分ほどである（WO 2004/081026 A2の実施例9および13を参照されたい）。同様に、抗体の抗原結合フラグメント（特にFvフラグメント）のin vivo血清半減期も短く、そのため、それらは多くのin vivo治療・診断用途に適していない (Petersら, Science 286(5439):434 (1999))。さらに、そうした薬剤のin vivo血清半減期を引き延ばすような改変または修飾は、その薬剤の活性を低下させることがある。
【０００３】
薬剤の治療域が持続するように薬剤を（例えば、肺組織に）投与するための方法が求められている。
【０００４】
TNFと結合してその活性を中和する薬剤は、関節炎のようなある種の炎症状態に有効な治療薬であることが分かっている。しかし、TNFと結合する薬剤が、肺炎症または呼吸器疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)の治療に有効であることは実証されていない (例えば、van der Vaartら, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 172(4):465-9 (2005); Rennardら, Proc. Amer. Thorac. Soc, 2(Abstract Issue):A133, A541 (2005); Abdelhadyら, Proc. Amer. Thorac. Soc, 2(Abstract Issue):A133 (2005)を参照されたい)。さらに、エンブレル（ENBREL(登録商標)）（エタネルセプト(etanercept)；Immunex Corporation）のような、TNFαを標的とする治療薬はTNFR1とTNFR2に対する拮抗作用を示し、こうした薬剤の投与は免疫抑制およびそれに関連した副作用（例えば、重篤な感染症）を生じることがある。かかる副作用のため、これらの薬剤の使用は制限され、特に薬剤の投与が長期にわたる慢性疾患の場合がそうである (Kollias G.およびKontoyiannis D., Cytokine Growth Factor Rev., 13(4-5):315-321 (2002))。これに対して、TNFR1に特異的な拮抗作用を示す薬剤は副作用が低減していると考えられる。しかしながら、TNFR1を標的とすることは難しいことである。なんとなれば、かかる受容体をクラスター化させる薬剤は該受容体を介したシグナル伝達を活性化することがあり、このことはTNFのような炎症性メディエーターの生産へと導くからである。実際、TNFR1と結合する多価薬剤（例えば、抗TNFR1抗体）は、TNFR1のクラスター化およびTNFの非存在下でのシグナル伝達を引き起こし、一般にはTNFR1アゴニストとして使用される (例えば、Belkaら, EMBO, 14(6):1156-1165 (1995); Mandik-Nayakら, J. Immunol, 167:1920-1928 (2001)を参照されたい)。したがって、TNFR1と結合する多価薬剤は、たとえそれらがTNFαのTNFR1への結合をブロックするとしても、一般的にはTNFR1の有効なアンタゴニストではない。
【０００５】
TNFに拮抗する改善された薬剤、ならびにそのような薬剤を投与することにより肺炎症および肺疾患を治療する方法が求められている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、肺組織に局所送達するための持続作用製剤または持続治療域製剤の製造における、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の使用、または低用量有効量の前記薬剤を肺組織に局所投与するための医薬の製造における前記薬剤の使用であって、薬剤の肺組織レベルの少なくとも50％が少なくとも約4時間にわたり維持されることを特徴とする、上記使用に関する。好ましくは、前記製剤または医薬は肺への局所投与用である。好ましくは、前記製剤または医薬中の薬剤量の少なくとも約1％の肺レベルが、局所投与後少なくとも4時間にわたり維持される。さらに好ましくは、前記薬剤は体循環に実質的に流入しない。ある実施形態では、前記薬剤が約1秒〜約12時間のin vivo血清半減期を有する。他の実施形態では、前記製剤または医薬が約10mg/kg/日以下の用量を投与するためのものである。
【０００７】
本発明は、肺組織に局所送達するための1日用量製剤の製造における、肺組織中の標的と結合するドメイン抗体（dAb）の使用であって、薬剤の肺レベルの少なくとも50％が少なくとも約4時間にわたり維持されることを特徴とする、上記使用に関する。
【０００８】
本発明は、呼吸器疾患の治療または予防用の製剤の製造における、肺組織中の標的と結合するドメイン抗体（dAb）の使用に関し、前記製剤は肺組織への局所投与用であり、体循環に実質的に流入しない。一実施形態では、肺組織中の標的と結合するdAbを最高約10mgまで使用する。好ましくは、肺組織中の標的は肺炎症または肺疾患を媒介する。
【０００９】
本発明は、呼吸器の疾患または症状を治療または予防するための、一定量のドメイン抗体（dAb）製剤を被験者に供給する吸入器または鼻腔内送達装置に関し、前記吸入器または鼻腔内送達装置はdAb製剤を含んでなり、最高10mgまでのdAbを含む1日分の一定量を供給するものである。本発明はまた、肺に局所送達するための持続作用吸入式dAb製剤を供給することを目的とした、吸入器または鼻腔内送達装置の製造における、ドメイン抗体（dAb）製剤の使用に関する。
【００１０】
本発明はまた、肺組織において持続した治療域を生じるように、肺組織中の標的と結合する薬剤を被験者に投与するための方法であって、有効量の該薬剤を該被験者の肺組織に局所投与することを含んでなる、上記方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、肺組織において持続した治療域を生じるように、肺組織中の標的と結合する薬剤を被験者に投与するための方法であって、約1秒〜約12時間のin vivo血清半減期を有しかつ肺組織中の標的と結合する薬剤を選択し、有効量の該薬剤を該被験者の肺組織に局所投与することを含んでなる、上記方法に関する。
【００１２】
本発明で使用するのに適した薬剤は、TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、キマーゼ、FGF、フューリン、エンドセリン-1、エオタキシン類（例えば、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3）、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン類、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMPs、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TNFR1、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMBT、およびCD8からなる群より選択される、肺組織中の標的と結合することができる。
【００１３】
一実施形態において、本発明で使用するための薬剤はTNFシグナル伝達カスケードに含まれるタンパク質からなる群より選択される標的と結合することができる。好ましくは、このタンパク質標的は以下を含む群より選択される：TNFα、TNFβ、TNFR2、TRADD、FADD、カスパーゼ-8、TNF受容体関連因子(TRAF)、TRAF2、受容体相互作用タンパク質(RIP)、Hsp90、Cdc37、IKKα、IKKβ、NEMO、kBの阻害剤(IkB)、NF-kB、NF-kBエッセンシャルモジュレーター、アポトーシスシグナル調節キナーゼ-1(aSMase)、中性スフィンゴミエリナーゼ(nSMase)、ASK1、カテプシン-B、胚中心キナーゼ(germinal center kinase: GSK)、GSK-3、因子結合デスドメインタンパク質(FADD)、中性スフィンゴミエリナーゼ活性化と関連した因子(FAN)、FLIP、JunD、NF-kBキナーゼの阻害剤(IKK)、MKK3、MKK4、MKK7、IKKγ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ/Erkキナーゼキナーゼ(MEKK)、MEKK1、MEKK3、NIK、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)、PKC-ζ、Re1A、T2K、TRAF1、TRAF5、デスエフェクタードメイン(DED)、デスドメイン(DD)、細胞死誘導シグナリング複合体(DISC)、アポトーシスタンパク質の阻害剤(IAP)、c-Jun N末端キナーゼ(JNK)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、ホスホイノシチド-3OHキナーゼ(PI3K)、プロテインキナーゼA (PKA)、PKB、PKC、PLAD、PTEN、relホモロジードメイン(RHD)、really interesting new gene (RING)、ストレス活性化プロテインキナーゼ(SAPK)、TNFα変換酵素(TACE)、デスドメインタンパク質のサイレンサー(SODD)、およびTRAF関連NF-kBアクチベーター(TANK)。これらの好ましい標的に関しては、WO 04046189、WO 04046186およびWO 04046185を参照されたい(参照することにより本明細書に含める)。これらは細胞内標的をターゲッティングするための抗体単一可変ドメインの選択についての指針を提供する。
【００１４】
本発明は、肺炎症および/または呼吸器疾患を治療、抑制または予防するための医薬の製造におけるTNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド、dAb単量体）の使用に関する。
【００１５】
本発明はまた、肺炎症および/または呼吸器疾患を治療、抑制または予防するための方法であって、呼吸器疾患の動物モデルにおいて、約10mg/kg/日を超えない量で投与したとき、有効性を示す腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1）のアンタゴニストを選択すること（ただし、気管支肺胞洗浄液中の全細胞数で評価される肺の細胞浸潤が未処置対照と比べてp＜0.05で抑制される場合に、該動物モデルでの有効性が認められること）、および有効量のTNFR1のアンタゴニストを、それを必要とする被験者に投与する（例えば、肺組織に局所投与する）こと、を含んでなる上記方法に関する。
【００１６】
本発明の医薬、製剤および方法を用いて治療、抑制または予防される呼吸器疾患としては、以下が挙げられる：肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球浸潤、環境肺疾患、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、隔膜の障害、換気過少、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸促進症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿肺症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、慢性気管支炎、気腫、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌症、胸水、塵肺症、肺細胞増多症（pneumocytosis）、肺放線菌症、肺胞蛋白症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺組織球症、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈性肺高血圧症、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、ヴェーゲナー肉芽腫症、および非小細胞肺癌。
【００１７】
本発明はまた、本明細書に記載されるリガンドおよびdAbにも関する。
【００１８】
本発明はまた、TNFR1に対する結合特異性を示す結合部位をもつタンパク質成分を含んでなるリガンドであって、該タンパク質成分が本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR3のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、上記リガンドに関する。
【００１９】
ある実施形態では、前記リガンドは、TNFR1に対する結合特異性を示す結合部位をもつタンパク質成分を含んでなり、該タンパク質成分が本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR3のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含み、かつ本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR1および/またはCDR2のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
他の実施形態では、前記リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつ本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR1配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR1配列を有する。
【００２１】
他の実施形態では、前記リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつ本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR2配列を有する。
【００２２】
他の実施形態では、前記リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつ本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR3配列を有する。
【００２３】
他の実施形態では、前記リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつ本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR1またはCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR1配列とCDR2配列とを有する。
【００２４】
他の実施形態では、前記リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつ本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR2またはCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR2配列とCDR3配列とを有する。
【００２５】
他の実施形態では、前記リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつ本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR1またはCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR1配列とCDR3配列とを有する。
【００２６】
他の実施形態では、前記リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列とは25以下のアミノ酸位置で相違し、かつ本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR1、CDR2またはCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列を有する。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR1配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR1配列を有する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR2配列を有する。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR3配列を有する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR1およびCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR1およびCDR2配列を有する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR2およびCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR2およびCDR3配列を有する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR1およびCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR1およびCDR3配列を有する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンドであり、TNFR1と結合する該免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDR1、CDR2およびCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するそれぞれCDR1、CDR2およびCDR3配列を有する。
【００３４】
本発明はまた、本発明のリガンドのいずれかをコードする単離されたまたは組換え核酸に関する。他の実施形態では、本発明は本発明の組換え核酸を含有するベクターに関する。
【００３５】
本発明はまた、本発明の組換え核酸または本発明のベクターを含む宿主細胞にも関する。
【００３６】
本発明はまた、本発明の宿主細胞を、本発明の核酸またはベクターの発現に適する条件下で維持し、それによりリガンドを産生させることを含んでなる、リガンドの産生方法に関する。他の実施形態では、リガンドの産生方法がリガンドの単離をさらに含む。
【００３７】
発明の詳細な説明
本明細書中で用いる「アンタゴニスト」とは、標的（例えば、受容体タンパク質）と結合して該標的の機能（すなわち、1以上の機能）を阻害することができる薬剤（例えば、分子、化合物）をさす。例えば、受容体タンパク質のアンタゴニストは、該受容体タンパク質と結合して、該受容体タンパク質への天然リガンドまたはコグネイトリガンドの結合を阻害し、かつ/または該受容体タンパク質により媒介されるシグナル伝達を阻害しうる。例えば、腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1）のアンタゴニストは、TNFR1と結合して、TNFR1へのTNFαの結合を阻害し、かつ/またはTNFR1により媒介されるシグナル伝達を阻害する。アンタゴニストは、例えば、米国立癌研究所のケミカルレポジトリ（Chemical Repository of the National Cancer Institute）のような、分子のライブラリまたはコレクションをスクリーニングするか、あるいは他の好適な方法を用いることにより、同定することができる。好ましいアンタゴニストは本明細書に記載されるような「リガンド」である。
【００３８】
本明細書中で用いる「腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1）のアンタゴニスト」とは、TNFR1と結合してTNFR1の機能（すなわち、1以上の機能）を阻害することができる薬剤（例えば、分子、化合物）をさす。例えば、TNFR1のアンタゴニストは、TNFR1へのTNFαの結合を阻害し、かつ/またはTNFR1により媒介されるシグナル伝達を阻害しうる。したがって、TNFR1のアンタゴニストを用いると、TNFR1が媒介するプロセスおよび細胞応答（例えば、標準的なL929細胞毒性アッセイでのTNFα誘導細胞死）を阻害することができる。TNFR1のアンタゴニストは、例えば、小さな有機分子、天然産物、タンパク質、ペプチドまたはペプチドミメチックでありうる。TNFR1のアンタゴニストは、例えば、本明細書に記載されるような、米国立癌研究所のケミカルレポジトリ（Chemical Repository of the National Cancer Institute）などの、分子のライブラリまたはコレクションをスクリーニングするか、あるいは他の好適な方法を用いることにより、同定することができる。好ましいTNFR1のアンタゴニストは、本明細書に記載される抗体、抗体の抗原結合フラグメント、リガンドおよびdAbである。
【００３９】
本明細書中で用いる「リガンド」とは、所望の標的に対する結合特異性を有するドメインを含んでなるポリペプチドをさす。好ましくは、その結合ドメインは、所望の標的抗原（例えば、受容体タンパク質）に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、VH、VL、VHH）である。前記結合ドメインはまた、所望の標的抗原に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインの1以上の相補性決定領域(CDR)を、該結合ドメインが該標的抗原に対する結合特異性を有するように、適切なフォーマットで含むことができる。例えば、アフィボディ（affibody）、SpAスカフォールド、LDL受容体クラスAドメイン、またはEGFドメインのような、適当なタンパク質足場つまりスカフォールド（scaffold）または骨組みにCDRをグラフトする。さらに、前記リガンドは、本明細書に記載されるように、一価（例えば、dAb単量体）、二価（ホモ二価、ヘテロ二価）、または多価（ホモ多価、ヘテロ多価）であってよい。したがって、「リガンド」には以下のものが含まれる：dAbからなるポリペプチド；本質的にそのようなdAbからなるポリペプチド；dAb（またはdAbのCDRs）を適当なフォーマット（例えば、IgG様フォーマット、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2などの抗体フォーマット）でまたは適当なタンパク質足場または骨組み（例えば、アフィボディ、SpAスカフォールド、LDL受容体クラスAドメイン、またはEGFドメイン）に含むポリペプチド；第1の標的タンパク質、抗原またはエピトープ（例：TNFR1）と結合するdAb、および別の標的タンパク質、抗原またはエピトープ（例：血清アルブミン）と結合する第2のdAbを含む二重特異性リガンド；ならびに、本明細書に記載される多重特異性リガンド。前記結合ドメインは、所望の標的に対する結合部位を含むタンパク質ドメインであってもよく、例えば、タンパク質ドメインはアフィボディ、SpAスカフォールド、LDL受容体クラスAドメイン、EGFドメイン、およびアビマー（avimer）から選択される（例えば、米国特許出願公開第2005/0053973号、第2005/0089932号、第2005/0164301号を参照されたい）。
【００４０】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、抗体の他のV領域またはドメインから独立して、抗原またはエピトープと特異的に結合する抗体の可変領域(VH、VHH、VL)をさす。しかし、この用語を本明細書中で用いるとき、免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを含むフォーマット（例えば、ホモ多量体、ヘテロ多量体）で存在してもよい。この場合、他の可変領域または可変ドメインは、該免疫グロブリン単一可変ドメインによる抗原結合にとって必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の可変ドメインとは無関係に、抗原と結合する）。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の1以上の単量体を含む比較的大きなポリペプチドをも包含する。「ドメイン抗体」または「dAb」は、本明細書中で用いる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドは、本明細書中で用いる場合、哺乳類（好ましくはヒト）の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドをさすが、げっ歯類（例えば、WO 00/29004に記載され、その内容をそのまま参照することにより本明細書に含める）またはラクダ科動物のVHH dAbをも包含する。ラクダ科動物dAbは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む動物種から誘導される免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、もともと軽鎖を欠いた重鎖抗体VHHである。VHH分子はIgG分子の10分の1ほどの大きさであり、単一のポリペプチドとしてそれらは非常に安定しており、極端なpHおよび温度条件にも耐えることができる。
【００４１】
本明細書中で用いる「用量」とは、被験者に一度に全量（単位用量）を投与するか、または特定の時間間隔で2回以上に分けて投与する薬剤（例えば、TNFR1のアンタゴニスト）の量をさす。例えば、用量は1日(24時間)(1日用量)、2日間、1週間、2週間、3週間または1ヶ月間に（例えば、1回の投与で、もしくは2回以上の投与で）被験者に投与する薬剤（例えば、TNFR1のアンタゴニスト）の量をさす。投与間隔は所望の時間でありうる。
【００４２】
本明細書中で用いる「治療域」（therapeutic window）とは、高い確率で治療効力をもたらす、血漿中の、または薬物が局所投与される組織もしくは臓器（例えば、肺組織、肺臓）中の薬物（例えば、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）濃度の範囲をさす。
【００４３】
「相補的」  2つの免疫グロブリンドメインは、それらがコグネイト（cognate）のペアもしくはグループを形成する構造体のファミリーに属するか、またはそうしたファミリーから誘導され、かつこの特徴を保持している場合に、「相補的」である。例えば、抗体のVHドメインとVLドメインは相補的である。2つのVHドメインは相補的でなく、2つのVLドメインも相補的でない。相補的ドメインは免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバー中に見られ、例えばT細胞受容体のVαおよびVβ（またはγおよびδ）ドメインである。エピトープと結合するように作製しないかぎりエピトープとは結合しないタンパク質スカフォールドに基づくドメインのような、人工的なドメインは非相補的である。同様に、（例えば）免疫グロブリンドメインとフィブロネクチンドメインに基づく2つのドメインは相補的でない。
【００４４】
「免疫グロブリン」  これは抗体分子の免疫グロブリン折りたたみ特性（2つのβシートと、一般には、保存されたジスルフィド結合とを含む）を保持するポリペプチドのファミリーをさす。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系での広範な役割（例えば、抗体、T細胞受容体分子など）、細胞接着への関与（例えば、ICAM分子）、および細胞内シグナル伝達（例えば、PDGF受容体のような受容体分子）といった、in vivoでの細胞性および非細胞性相互作用の多くの面に関与している。本発明は、結合ドメインを保有するあらゆる免疫グロブリンスーパーファミリー分子に応用可能である。好ましくは、本発明は抗体に関する。
【００４５】
「ドメイン」  ドメインは、その三次構造をタンパク質の残部から独立して保持する、折りたたまれたタンパク質構造体である。一般的に、ドメインはタンパク質の個々の機能特性に関与しており、多くの場合、該タンパク質の残りの機能および/またはドメインの機能の低下なしに、他のタンパク質に付加したり、除去したり、転移させたりすることが可能である。単一抗体可変ドメインとは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む、折りたたまれたポリペプチドドメインを意味する。したがって、それは、完全な抗体可変ドメインおよび修飾された可変ドメイン（例えば、1以上のループが抗体可変ドメインの特徴でない配列で置換されたもの、トランケートされた、またはN-もしくはC-末端延長部を含む抗体可変ドメイン、あるいは全長ドメインの結合活性および特異性を少なくとも一部保持する可変ドメインの折りたたまれたフラグメント）を含む。
【００４６】
「レパートリー」  多様な変異体のコレクションであり、例えば、一次配列が異なるポリペプチド変異体のコレクションである。本発明で用いるライブラリーは、少なくとも1000のメンバーを含むポリペプチドのレパートリーを包含するものである。
【００４７】
「ライブラリー」  ライブラリーという語は、異種のポリペプチドまたは核酸の混合物をさす。ライブラリーは、それぞれが単一のポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーで構成される。この点で、ライブラリーはレパートリーと同じ意味である。ライブラリーメンバー間の配列の相違は、そのライブラリーに見られる多様性の一因となる。ライブラリーはポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形をとってもよいし、核酸のライブラリーで形質転換された生物または細胞（例えば、細菌、ウイルス、動物もしくは植物細胞）の形態をしていてもよい。好ましくは、個々の生物または細胞はただ1つのまたは限定された数のライブラリーメンバーを含有する。有利には、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、その核酸を発現ベクターに組み入れる。したがって、好適な態様では、ライブラリーが宿主生物の集団の形態をとり、各生物が核酸形態のライブラリーの単一メンバー（発現されてその対応するポリペプチドメンバーを生成する）を含有する発現ベクターを1コピー以上含んでなる。それゆえ、宿主生物の集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする可能性がある。
【００４８】
「抗体」  抗体（例えば、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE）またはフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、閉鎖型コンホメーション多重特異性抗体、ジスルフィド結合scFv、ダイアボディ）であり、天然で抗体を産生する生物種から誘導されたもの、組換えDNA技術により作製されたもの、血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されたものでありうる。
【００４９】
「二重特異性リガンド」  リガンドは本明細書中で定義される第1の免疫グロブリン単一可変ドメインと第2の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなり、該可変領域は2つの異なる抗原または同一抗原上の2つのエピトープ（通常、単一特異性の免疫グロブリンによって結合されない）と結合することができる。例えば、2つのエピトープは同一ハプテン上にあってもよいが、同一のエピトープではなく、単一特異性リガンドによって結合されるほどに隣接していない。本発明による二重特異性リガンドは、異なる特異性をもつ可変ドメインから成り、同じ特異性をもつ相互に相補的な可変ドメイン対を含まない。二重特異性リガンドおよび二重特異性リガンドの好適な作製方法は、WO 2004/058821、WO 2004/003019、およびWO 03/002609に開示されており、これらの公開された国際出願のそれぞれの全教示内容を参照することにより本明細書に含めるものとする。
【００５０】
「抗原」  本発明のリガンドにより結合される分子である。典型的には、抗原はin vivoで抗体応答を誘起することができる抗体リガンドにより結合される。それはポリペプチド、タンパク質、核酸、または他の分子でありうる。一般に、本発明による二重特異性リガンドは特定の抗原に対する標的特異性について選択される。通常の抗体およびそのフラグメントの場合には、可変ループ（L1、L2、L3およびH1、H2、H3）により規定される抗体の結合部位が抗原と結合することができる。
【００５１】
「エピトープ」  免疫グロブリンVH/VL対により通常結合される構造の単位である。エピトープは抗体に対する最小の結合部位を規定しており、したがって、抗体の特異性の標的に相当する。単一ドメイン抗体の場合には、エピトープが単独で可変ドメインにより結合される構造の単位を表す。
【００５２】
「普遍的フレームワーク」  Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)により定義されるような、配列が保存された抗体の領域に対応するか、またはChothiaおよびLesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917により定義されるような、ヒト生殖系免疫グロブリンレパートリーもしくは構造に対応する、単一抗体フレームワーク配列である。本発明は、超可変領域のみの変異にもかかわらず、事実上どのような結合特異性の誘導をも可能にすることが見出されている、単一のフレームワークまたはそのようなフレームワークのセットの使用を提供する。
【００５３】
「半減期」  リガンドの血清濃度が、例えばリガンドの分解および/または天然の作用機構によるリガンドのクリアランスもしくは封鎖のために、生体内で50％減少するのに要する時間である。本発明のリガンドはin vivoで安定化されており、それらの半減期は分解および/またはクリアランスもしくは封鎖に抵抗する分子と結合させることにより引き延ばされる。典型的には、そうした分子は天然に存在するタンパク質であって、それ自体がin vivoで長い半減期を有する。リガンドの機能的活性が半減期延長分子に特異的でない同様のリガンドよりも長期間にわたりin vivoで持続するならば、そのリガンドの半減期は増加したといえる。こうして、HSAおよび標的分子に特異的なリガンドが、HSAに対する特異性が存在しない同一のリガンド（つまりHSAと結合しないが、別の分子とは結合する）と比較される。例えば、それは標的分子上の第2のエピトープでありうる。典型的には、半減期は10％、20％、30％、40％、50％またはそれ以上増加する。半減期の2x、3x、4x、5x、10x、2Ox、3Ox、4Ox、50xまたはそれ以上の範囲の増加が可能である。これとは別に、またはこれに加えて、半減期の3Ox、4Ox、5Ox、6Ox、7Ox、80x、9Ox、10Ox、15Oxまでの範囲の増加が可能である。
【００５４】
「実質的に同一（または「実質的に相同」）」  第1のアミノ酸またはヌクレオチド配列が、第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一もしくは同等（例えば、類似の側鎖、同類アミノ酸置換）のアミノ酸残基またはヌクレオチドを十分な数で含み、その結果として第1および第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列が同様の活性をもつようになること。抗体の場合には、第2の抗体が同じ結合特異性を有し、かつその親和性の少なくとも50％を保持する。
【００５５】
本明細書中で用いる「低度のストリンジェンシー」、「中度のストリンジェンシー」、「高度のストリンジェンシー」、または「非常に高度のストリンジェンシー」とは、核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を表す。ハイブリダイゼーション反応を行うための指針は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができ、これをそのまま参照することにより本明細書に含めるものとする。水性および非水性の方法がその文献に記載されており、いずれも使用することができる。本明細書で言及される具体的なハイブリダイゼーション条件は次のとおりである：(1) 低度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中で約45℃、続いて0.2X SSC、0.1％ SDS中で少なくとも50℃で2回洗浄（低度のストリンジェンシー条件の場合、洗浄温度を55℃まで上げることができる）；(2) 中度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、6X SSC中で約45℃、続いて0.2X SSC、0.1％ SDS中で60℃にて1回以上洗浄；(3) 高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、6X SSC中で約45℃、続いて0.2X SSC、0.1％ SDS中で65℃にて1回以上洗浄；および好ましくは、(4) 非常に高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、0.5M リン酸ナトリウム、7％ SDS中で65℃、続いて0.2X SSC、1％ SDS中で65℃にて1回以上洗浄である。非常に高度のストリンジェンシー条件(4)が好適な条件であり、特に断らない限り、採用すべき条件である。
【００５６】
本明細書で言及される「競合する」とは、第1のエピトープのそのコグネイトのエピトープ結合ドメインへの結合が、そのコグネイトのエピトープ結合ドメインに第2のエピトープが結合するとき阻害されることを意味する。例えば、結合ドメインの物理的ブロックにより、またはエピトープに対する親和性もしくは結合力が低下するような結合ドメインの構造もしくは環境の変更により、結合を立体的に阻害することができる。
【００５７】
本明細書に記載の配列と類似した配列または相同な配列（例えば、少なくとも約70％の配列同一性）も本発明の一部である。ある実施形態では、アミノ酸レベルでの配列同一性は、約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上でありうる。核酸レベルでは、配列同一性は約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上でありうる。あるいはまた、核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件）下でその相補鎖とハイブリダイズする場合には、実質的同一性が存在する。核酸は細胞内にあっても、細胞溶解液中に存在しても、あるいは部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。
【００５８】
2つの配列間の「相同性」または「配列同一性」または「類似性」（本明細書ではこれらの用語を互換的に用いる）の計算は次のように行う。最適な比較のために配列をアライメントする（例えば、最適なアライメントのために第1および第2のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また、比較のために非相同配列を無視することができる）。好ましい実施形態では、比較のためにアライメントされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、一層好ましくは少なくとも60％、より一層好ましくは少なくとも70％、80％、90％、100％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列のある位置が、第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合には、それらの分子はその位置で同一である（本明細書で用いるアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と同等である）。2つの配列間の同一性パーセントは、これら2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、これらの配列により共有される同一位置の数の関数である。
【００５９】
アミノ酸およびヌクレオチド配列のアライメント、ならびに本明細書で定義される相同性、類似性または同一性は、デフォルトパラメーターを用いて、アルゴリズムBLAST 2 Sequencesにより決定することが好ましい (Tatusova, T.A.ら, FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999))。あるいはまた、有利には、配列アライメントのためにBLASTアルゴリズム(バージョン2.0)を、デフォルト値に設定されたパラメーターと共に用いる。BLASTアルゴリズムは、米国政府(「.gov」)の国立衛生研究所(National Institutes of Health) (「nih」)の国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information) (「.ncbi」)のworld wide webサイト(「www」)に、「/Blast/」の名称で、「blast_help.html」ファイルにて、詳しく説明されている。検索パラメーターは以下のように規定されており、有利には特定のデフォルトパラメーターに設定される。
【００６０】
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)はプログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxにより用いられる帰納的検索アルゴリズムである。これらのプログラムは、KarlinおよびAltschulの統計的方法（1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8）(上記の「blast_help.html」ファイルを参照)に少しの増強を加えて用い、有意性をそれらの検索結果に帰するものである。BLASTプログラムは、例えばクエリー配列に対する相同体を同定するために、配列類似性検索に適合するようにされている。これらのプログラムは一般にはモチーフスタイル検索には向いていない。配列データベースの類似性検索における基本的な論点の考察については、Altschulら (1994)を参照されたい。
【００６１】
国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトから利用可能な5つのBLASTプログラムは以下のタスクを実行する：
「blastp」は、アミノ酸クエリー配列をタンパク質配列データベースに対して比較する；
「blastn」は、ヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較する；
「blastx」は、ヌクレオチドクエリー配列（両方の鎖）の6つの読み枠での概念上の翻訳産物を、タンパク質配列データベースに対して比較する；
「tblastn」は、タンパク質クエリー配列を、6つの読み枠すべてで動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベース（両方の鎖）に対して比較する；
「tblastx」は、ヌクレオチドクエリー配列の6つの読み枠での翻訳産物を、ヌクレオチド配列データベースの6つの読み枠での翻訳産物に対して比較する。
【００６２】
BLASTでは以下の検索パラメーターが用いられる：
HISTOGRAM：  各検索のスコアに関するヒストグラムを表示する；デフォルトあり。（BLASTマニュアルのパラメーターHを参照）。
【００６３】
DESCRIPTIONS：  表示されたヒット配列に関する短いdescriptionsの数を特定数に制限する；デフォルト制限値は100のdescriptionsである。（マニュアルページのパラメーターVを参照）。
【００６４】
ALIGNMENTS：  高いスコアのセグメント対（HSP）が表示されているデータベース配列を特定数に制限する；デフォルト制限値は50である。この値より多数のデータベース配列が表示に関する統計的有意性の閾値を満たす場合（以下のEXPECTおよびCUTOFFを参照）、最高の統計的有意性を示すヒットのみを表示する。（BLASTマニュアルのパラメーターBを参照）。
【００６５】
EXPECT：  データベース配列に対するヒットを表示するための統計的有意性の閾値；デフォルト値は10であり、10回のマッチが、KarlinとAltschul（1990）の確率モデルに従って、偶然でも起こりうることを示す。マッチを示す統計的有意性がEXPECT閾値より大きい場合、このマッチは表示されない。EXPECT閾値が低いほど厳しい条件となり、マッチが表示される機会がより少なくなる。分数値は許容される。（BLASTマニュアルのパラメーターEを参照）。
【００６６】
CUTOFF：  高いスコアのセグメント対を表示するためのカットオフスコア。デフォルト値はEXPECT値から算出される（上記参照）。データベース配列に関してHSPが表示されるのは、HSPであるとする統計的有意性が、少なくとも、CUTOFF値に等しいスコアを有する単独HSPに帰せられるほど高い場合のみである。CUTOFF値が高いほど厳しい条件となり、マッチが表示される機会がより少なくなる。（BLASTマニュアルのパラメーターSを参照）。典型的には、有意性の閾値は、EXPECTを用いて、より感覚的に管理することができる。
【００６７】
MATRIX：  BLASTP、BLASTX、TBLASTNおよびTBLASTXのための代替のスコアリングマトリクスを指定する。デフォルトマトリクスはBLOSUM62である（Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22): 10915-9)。有効な代替マトリクスの選択はPAM40、PAM120、PAM250およびIDENTITYを含む。BLASTNについては利用可能な代替スコアリングマトリクスがない；BLASTNリクエストにMATRIXコマンドを指定すると、エラー応答が帰ってくる。
【００６８】
STRAND：  TBLASTN検索をデータベース配列のトップ鎖またはボトム鎖のみに制限する；またはBLASTN、BLASTXまたはTBLASTX検索をクエリー配列のトップ鎖またはボトム鎖上のリーディングフレームのみに制限する。
【００６９】
FILTER：  Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163に記載されるSEGプログラムによって決定される、組成の複雑性が低いクエリー配列のセグメントをマスクして除き、また、Claverie & States (1993) Computers and Chemistry 17:191-201に記載されるXNUプログラムによって、またはBLASTNに関しては、TatusovおよびLipmanのDUSTプログラム（NCBIのworld wide webサイトを参照）によって決定される、短周期の内部反復配列からなるセグメントをマスクして除く。フィルタリングは、統計的に有意であるが生物学的には意味のない出力（例えば、共通の酸性アミノ酸-、塩基性アミノ酸-またはプロリン-リッチ領域に対するヒット）をblast出力から排除し、データベース配列に対する特定のマッチングに利用可能なクエリー配列の生物学的により意味のある領域を残すことができる。
【００７０】
フィルタープログラムによって見出される低複雑配列は、ヌクレオチド配列中では文字「N」を用いて置換され（例えば、「N」を13回繰り返す）、タンパク質配列中では文字「X」を用いて置換される（例えば、「X」を9回繰り返す）。
【００７１】
フィルタリングはクエリー配列（またはその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングはBLASTNに関してはDUSTであり、他のプログラムに関してはSEGである。
【００７２】
SWISS-PROTに登録されている配列に適用される場合には、SEG、XNU、または両者によるマスクは通常行わない。フィルタリングが常に効果を生むとは期待すべきでない。さらに、配列全体がマスクされる場合があり、この場合は、フィルタリングされていないクエリー配列に対して表示されたマッチの統計的有意性は疑わしいと考えられる。
【００７３】
NCBI-gi：  登録名および／または遺伝子座名に加えて、NCBI gi識別子を出力に表示させる。配列比較は、「/BLAST」名で上記のNCBI world wide webサイトに提供される単純なBLAST検索アルゴリズムを用いて行うのが最も好ましい。
【００７４】
特に断らないかぎり、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、当分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学）の通常の知識を有する者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。分子的、遺伝学的および生化学的方法（一般的には、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい；これらを参照することにより本明細書に含める）、ならびに化学的方法については、標準方法を用いる。
【００７５】
本明細書に記載するように、タバコ煙により誘発される慢性閉塞性肺疾患(COPD)のマウス亜慢性モデルで、TNFR1と結合する、本質的にdAb単量体からなるTNFR1のアンタゴニストを投与する研究が実施された。この研究結果からは、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、TNFR1と結合するドメイン抗体(dAb)を含むもの）が呼吸器疾患（例えば、肺の炎症、急性肺疾患、慢性肺疾患(例：COPD)）を治療するのに有効な治療薬であることが明らかにされた。実際、本研究で試験したアンタゴニストは、TNFαと結合してそれを中和する高用量のホスホジエステラーゼ4阻害剤または可溶性TNFR1（ENBREL(登録商標)(エタネルセプト; Immunex Corporation)）よりも効果があった。研究したTNFR1のアンタゴニストは、前記モデルにおいて、全身投与（腹腔内注射）または鼻腔内投与による肺組織への局所投与を行ったとき、有効であった。
【００７６】
驚いたことに、本研究結果からは次のことがわかった。肺組織中の標的（例えば、TNFR1）と結合するアンタゴニストの局所投与は、延長半減期のアンタゴニスト(dAb単量体の流体力学的サイズおよびin vivo血清半減期を増加させるためにPEG化された、PEG化dAb単量体)の全身投与よりも、前記モデルにおいて肺の細胞浸潤を抑制するのに効果的であり、5倍多いアンタゴニストを全身投与したときでさえそうであった。モルに換算すると、局所投与dAb単量体に対して、延長半減期のアンタゴニスト(dAb単量体の流体力学的サイズおよびin vivo血清半減期を増加させるためにPEG化された、PEG化dAb単量体)を2.5倍多く全身投与した。
【００７７】
本明細書に記載するように、TNFR1と結合するdAb単量体を鼻腔内投与により肺組織に局所投与した後の薬物動態を調べる更なる研究を行った。この研究の結果から、肺組織への局所投与後に、dAb単量体は肺に長時間滞留し、肺でのdAb単量体の量は8時間にわたって実質的に変わらないことが明らかにされた。さらに、肺にdAb単量体を局所送達すると、血清中には低濃度のdAb単量体が短時間存在するにすぎなかった。具体的には、投与後1時間で約150ng/mlの最大レベルが血清中に検出されたが、5時間後には血清中にdAb単量体を一切検出できなかった。
【００７８】
こうした薬物動態研究の結果は予想外のことであり、次のことを実証している。すなわち、肺組織中の標的と結合する薬剤、例えば肺組織中の標的と結合する抗体もしくは抗体フラグメント（例：Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例：scFv、ジスルフィド結合Fv)、F(ab')2フラグメント、dAb）または肺組織中の標的のアンタゴニスト（例：リガンド、dAb単量体）を肺組織に局所投与すると、肺組織における該薬剤の持続した滞留時間のために、肺組織で持続した治療域（呼吸器疾患を治療、軽減、予防、または診断するため）が得られる、ということである。薬物動態研究の結果、ならびに肺組織への局所投与により得られる持続した治療域からは、COPDのマウスモデルで局所投与されたTNFR1のアンタゴニストが優れた効力を示したことにも説明がつく。さらに、低用量で局所投与したときに認められたdAb単量体の優れた効力、血清中に流入するdAb単量体の低い濃度、ならびに血清からのdAb単量体の急速なクリアランスからは、肺組織中の標的と結合する薬剤、例えば肺組織中の標的と結合する抗体フラグメント（例：Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例：scFv、ジスルフィド結合Fv)、F(ab')2フラグメント、dAb）が、他のタイプの治療薬よりも副作用（例えば、免疫抑制、毒性）を生じる可能性がかなり少ないことを示唆している。
【００７９】
更なる研究では、炎症促進物質TNFαによって肺の炎症を誘発させた。これらの研究の結果は、TNFR1のアンタゴニスト（TNFαの該受容体への結合を阻害する、またはTNFαの該受容体への結合を阻害しない、抗TNFR1 dAb）が、TNFαにより誘導される他の炎症性メディエーター（例えば、早期作用性好中球走化性因子であるKCおよびMIP-1、後期作用性ケモカインであるMCP-1および接着分子E-セレクチン）の増加を顕著に抑制し、肺の細胞浸潤を阻止したことを実証する。
【００８０】
本明細書に記載した研究は、肺組織中の標的と結合する薬剤、例えば抗体フラグメント（例：Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例：scFv、ジスルフィド結合Fv)、F(ab')2フラグメント、dAb）またはアンタゴニスト（例：リガンド、dAb単量体）が、肺炎症および/または呼吸器疾患を治療、軽減または予防するための優れた治療薬であり、あるいはイメージングのような診断にも有用であることを実証する。これらの結果はさらに、たとえdAb単量体のin vivo血清半減期が短いとしても、肺組織中の標的と結合するdAb、およびそのようなdAbを含むアンタゴニストを肺組織に局所投与すると、肺組織でのdAbの滞留時間が長いため、肺組織において持続した治療域が得られることをも実証する。こうして、肺組織中の標的と結合する、in vivo半減期の短い他の薬剤（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例：scFv、ジスルフィド結合Fv)、F(ab')2フラグメントのような抗体フラグメント）を肺組織に局所投与することにより、肺組織において持続した治療域（例えば、呼吸器疾患の治療、軽減、予防、または診断のため）を達成することができる。
【００８１】
一般的に、肺組織中の標的と結合する薬剤、例えば抗体フラグメント（例：Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例：scFv、ジスルフィド結合Fv)、F(ab')2フラグメント、dAb）、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体を肺組織に局所投与することで、肺組織において少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約7時間、少なくとも約8時間、少なくとも約9時間、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、または少なくとも約12時間の治療域を達成することが可能である。
【００８２】
肺組織中の標的と結合する薬剤の肺組織への局所投与
第一の態様において、本発明は、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を被験者に投与して、肺組織における持続した治療域（例えば、呼吸器疾患の治療、軽減、予防、または診断のため）を達成するための方法に関する。例えば、少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約7時間、少なくとも約8時間、少なくとも約9時間、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、または少なくとも約12時間の肺組織における治療域が達成される。本発明の第一の態様によれば、前記薬剤を被験者（例えば、ヒト）の肺組織に局所投与する。
【００８３】
肺組織中の標的と結合する薬剤、例えば抗体フラグメント（例：Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例：scFv、ジスルフィド結合Fv)、F(ab')2フラグメント、dAb）、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体を被験者の肺組織（例えば、肺臓）に局所投与するにあたって、任意の好適な方法を用いることができる。例えば、吸入または鼻腔内投与により薬剤を肺組織に局所投与しうる。吸入または鼻腔内投与の場合には、ネブライザー、吸入器、アトマイザー、エアゾール装置、ミスター(mister)、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、定量噴霧器、定量ミスター、定量アトマイザー、または他の好適な送達装置を用いて薬剤(TNFR1のアンタゴニスト、リガンド、dAb単量体)を投与することができる。
【００８４】
ある実施形態において、前記方法は、短いin vivo血清半減期を有しかつ肺組織中の標的と結合する、有効量の薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を被験者の肺組織に局所投与することを含む。本発明によれば、かかる薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を肺組織に局所投与することにより肺組織において持続した治療域を達成することができるが、こうした薬剤は血清中に実質的に滞留しないであろう。薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）のin vivo半減期が短いため、肺上皮を通過して血清に流入する薬剤は速やかに血清から排除され、それゆえ望ましくない作用（例えば、全身的な副作用）をもたらす濃度にまで蓄積することはないだろう。例えば、本発明の第一の態様で用いるのに好適な、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）は、そのin vivo血清半減期が約1秒〜約12時間、約12時間以下、約11時間以下、約10時間以下、約9時間以下、約8時間以下、約7時間以下、約6時間以下、約5時間以下、約4時間以下、約3時間以下、約2時間以下、約1時間以下、または約30分以下でありうる。本発明の第一の態様に従って投与するのに好適なアンタゴニストは、肺組織中の標的と結合するdAbを含んでなる。
【００８５】
本発明の第一の態様で使用するのに特に好ましい薬剤（例えば、アンタゴニスト）は、肺組織中の標的と結合するdAb単量体または抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例：scFv、ジスルフィド結合Fv)、F(ab')2フラグメント）である。dAb単量体のin vivo血清半減期は約30分である（WO 2004/081026 A2の実施例9および13を参照）。ところが、本明細書に記載するように、肺組織中の標的（例えば、TNFR1）と結合するdAb単量体の局所送達は、少なくとも8時間の肺組織における治療域をもたらした。同様に、抗体の抗原結合フラグメント（特にFvフラグメント）のin vivo血清半減期も短く、そのため多くのin vivo治療・診断用途には適していない (Petersら, Science 286(5439):434 (1999))。しかし、本明細書に記載した研究結果から明らかなように、肺組織中の標的と結合する抗体の抗原結合フラグメントを肺組織に局所投与すると、肺組織において持続した治療域（例えば、呼吸器疾患の治療、軽減、予防または診断のため）、例えば少なくとも8時間の治療域、を達成することができる。
【００８６】
本明細書に記載するとおり、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を肺組織に局所投与すると、肺組織（肺臓）において持続した治療域が達成される。ある実施形態では、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を肺組織に局所投与すると、肺組織（肺臓）において持続した治療域が達成されるが、かかる治療域は、投与の4時間後、5時間後、6時間後、7時間後、8時間後、9時間後、10時間後、11時間後、または12時間後に、投与した薬剤の全量の少なくとも約1％、少なくとも約1.25％、少なくとも約1.5％、少なくとも約1.75％、少なくとも約2％、少なくとも約2.25％、少なくとも約2.5％、少なくとも約2.75％、または少なくとも約3％が肺に存在することにより特徴づけられる。ある実施形態では、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を肺組織に局所投与すると、肺において持続した治療域が達成されるが、それは、投与の4時間後、5時間後、6時間後、7時間後、8時間後、9時間後、10時間後、11時間後、または12時間後に、投与した薬剤の全量の少なくとも約40％、少なくとも約35％、少なくとも約30％、少なくとも約25％、少なくとも約20％、少なくとも約15％、少なくとも約10％、または少なくとも約5％が肺全体(BALおよび肺組織)に存在することにより特徴づけられる。
【００８７】
他の実施形態では、肺組織中の標的と結合する薬剤を肺組織に局所投与すると、肺組織（肺臓）において持続した治療域が達成され、その際、薬剤の肺レベル（例えば、肺に局所投与した後1時間で達成される肺レベル）の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上が、少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約7時間、少なくとも約8時間、少なくとも約9時間、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、または少なくとも約12時間にわたり維持される。
【００８８】
本明細書に記載するように、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を肺組織に局所投与すると、肺組織（肺臓）において持続した治療域が達成されるが、該薬剤は体循環に実質的に流入しない。薬剤投与の5時間後に、薬剤の全投与量のせいぜい約2％以下、約1.75％以下、約1.5％以下、約1.25％以下、約1％以下、約0.75％以下、約0.5％以下、または約0.25％以下が血清中に存在するか、薬剤が血清中に実質的に存在しない場合、その薬剤は体循環に実質的に流入していない。ある状況では、本明細書に記載したように投与された薬剤は体循環に入ってもよいが、例えば速やかに体循環からクリアランスされるので、有意なレベルで蓄積しない。したがって、本発明は、肺組織中の標的と結合する薬剤を肺組織に局所投与するための方法であって、有意なレベルの薬剤が体循環中に蓄積することがない方法を提供する。体循環中の薬剤のレベルが有意でないとは、薬剤投与の5時間後に、薬剤の全投与量のせいぜい約2％以下、約1.75％以下、約1.5％以下、約1.25％以下、約1％以下、約0.75％以下、約0.5％以下、または約0.25％以下が血清中に存在するか、薬剤が血清中に実質的に存在しない場合である。
【００８９】
一般的には、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の「低用量有効量」のみを被験者の肺組織に局所投与する必要がある。低用量有効量とは、同じ効果を達成するために全身的に投与する必要がある同一薬剤の量（すなわち、全身的有効量）より少ない薬剤の量である。ある特定の実施形態では、低用量有効量は、全身的有効量の約80％以下、全身的有効量の約70％以下、全身的有効量の約60％以下、全身的有効量の約50％以下、全身的有効量の約40％以下、全身的有効量の約30％以下、全身的有効量の約20％以下、全身的有効量の約10％以下、または全身的有効量の約5％以下である。
【００９０】
本発明の第一の態様に従って肺組織に局所投与することができる適当な薬剤としては、肺組織中の標的と結合する抗体もしくは抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例：scFv、ジスルフィド結合Fv)、F(ab')2フラグメント、dAb）およびアンタゴニスト（例えば、リガンド、dAb単量体）のような薬剤が挙げられる。肺組織中の標的としては、例えば、TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、キマーゼ、FGF、フューリン、エンドセリン-1、エオタキシン類（例えば、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3）、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン類、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMPs、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TNFR1、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、Cmet、CD8などがある。
【００９１】
一実施形態において、標的はTNFシグナル伝達カスケードに含まれるタンパク質から選択される。好ましくは、このタンパク質標的は以下を含む群より選択される：TNFα、TNFβ、TNFR2、TRADD、FADD、カスパーゼ-8、TNF受容体関連因子(TRAF)、TRAF2、受容体相互作用タンパク質(RIP)、Hsp90、Cdc37、IKKα、IKKβ、NEMO、kBの阻害剤(IkB)、NF-kB、NF-kBエッセンシャルモジュレーター、アポトーシスシグナル調節キナーゼ-1(aSMase)、中性スフィンゴミエリナーゼ(nSMase)、ASK1、カテプシン-B、胚中心キナーゼ(germinal center kinase: GSK)、GSK-3、因子結合デスドメインタンパク質(FADD)、中性スフィンゴミエリナーゼ活性化と関連した因子(FAN)、FLIP、JunD、NF-kBキナーゼの阻害剤(IKK)、MKK3、MKK4、MKK7、IKKγ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ/Erkキナーゼキナーゼ(MEKK)、MEKK1、MEKK3、NIK、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)、PKC-ζ、Re1A、T2K、TRAF1、TRAF5、デスエフェクタードメイン(DED)、デスドメイン(DD)、細胞死誘導シグナリング複合体(DISC)、アポトーシスタンパク質の阻害剤(IAP)、c-Jun N末端キナーゼ(JNK)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、ホスホイノシチド-3OHキナーゼ(PI3K)、プロテインキナーゼA (PKA)、PKB、PKC、PLAD、PTEN、relホモロジードメイン(RHD)、really interesting new gene (RING)、ストレス活性化プロテインキナーゼ(SAPK)、TNFα変換酵素(TACE)、デスドメインタンパク質のサイレンサー(SODD)、およびTRAF関連NF-kBアクチベーター(TANK)。これらの好ましい標的に関しては、WO 04046189、WO 04046186およびWO 04046185を参照されたい(参照することにより本明細書に含める)。これらは細胞内標的を標的化するための抗体単一可変ドメインの選択についての指針を提供する。
【００９２】
肺組織中の標的と結合する薬剤、例えば抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例：scFv、ジスルフィド結合Fv)、F(ab')2フラグメント、dAb）、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体は、TNFR1と結合するアンタゴニスト（例えば、リガンド、dAb単量体）に関して本明細書中で詳述する方法のような、適当な方法で調製することができる。
【００９３】
ある実施形態において、本発明は、肺組織中の標的（例えば、TNFR1）と結合する薬剤に対して、被験者（例えば、ヒト）の肺組織において持続した治療域を提供するための方法に関し、短いin vivo血清半減期を有し（例えば、約12時間以下）、かつ肺組織中の標的（例えば、TNFR1）と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を選択し、選択した薬剤の有効量または低用量有効量を被験者の肺組織に局所投与することを含んでなる方法である。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明の第一の態様は、肺組織中の標的（例えば、TNFR1）と結合する薬剤（例えば、抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）に対して、被験者（例えば、ヒト）の肺組織において持続した治療域を提供するための方法に関し、有効量または低用量有効量の該薬剤を被験者の肺組織に局所投与することを含んでなる方法である。好ましくは、約10mg/kg/日以下の薬剤を投与する。例えば、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日、例えば約1mg/kg/日、約2mg/kg/日、約3mg/kg/日、約4mg/kg/日、約5mg/kg/日、約6mg/kg/日、約7mg/kg/日、約8mg/kg/日、約9mg/kg/日、または約10mg/kg/日の薬剤を投与する。他の好ましい実施形態、例えば薬剤がヒトの肺組織（肺臓）に局所投与される場合には、約10mg/日以下を投与する。例えば、そのような実施形態では、薬剤を約1mg/日〜約10mg/日（例えば、約10mg/日、約9mg/日、約8mg/日、約7mg/日、約6mg/日、約5mg/日、約4mg/日、約3mg/日、約2mg/日、または約1mg/日）の用量で肺組織に局所投与する。したがって、薬剤は約1μg/kg/日〜約200μg/kg/日（例えば、約10μg/kg/日、約20μg/kg/日、約30μg/kg/日、約40μg/kg/日、約50μg/kg/日、約60μg/kg/日、約70μg/kg/日、約80μg/kg/日、約90μg/kg/日、約100μg/kg/日、約110μg/kg/日、約120μg/kg/日、約130μg/kg/日、約140μg/kg/日、約150μg/kg/日、約160μg/kg/日、約170μg/kg/日、約180μg/kg/日、または約190μg/kg/日）の用量で肺組織に局所投与することができる。特定の実施形態では、約5μg/kg/日〜約3mg/kg/日、または好ましくは、約50μg/kg/日〜約500μg/kg/日を投与する。
【００９５】
製剤および医薬の製造のための、肺組織に使用され肺組織中の標的と結合する薬剤の使用
本発明の第一の態様はまた、肺組織への局所投与のための持続作用製剤もしくは持続治療域製剤の製造における、本明細書に記載した、肺組織中の標的（例えばTNFR1）と結合する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の使用に関する。肺組織中の持続治療域もしくは持続作用の期間は、少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約7時間、少なくとも約8時間、少なくとも約9時間、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、または少なくとも約12時間の期間であり得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、使用する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）は短いin vivo血清半減期を有し、肺組織中の標的と結合する。本発明に従い、こうした薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を肺組織に局所的に投与して、肺組織において持続治療域を作製することができるが、血清中に実質的に蓄積しないであろう。例えば、本発明の第一の態様における使用のための、肺組織中の標的と結合する適切な薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）は、約1秒〜約12時間、約12時間以内、約11時間以内、約10時間以内、約9時間以内、約8時間以内、約7時間以内、約6時間以内、約5時間以内、約4時間以内、約3時間以内、約2時間以内、約1時間以内、または約30分以内のin vivo血清半減期を有し得る。
【００９７】
本発明の第一の態様における使用のために特に好ましい薬剤（例えばアンタゴニスト）は、肺組織中の標的と結合するdAb単量体または抗体の抗原結合フラグメント（例えばFabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント(例えばscFvs、ジスルフィド結合したFv)、F(ab')2フラグメント）である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本発明は、肺組織（肺臓）への局所投与のための持続作用製剤もしくは持続治療域製剤の製造における、本明細書に記載した、肺組織中の標的（例えばTNFR1）と結合する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の使用に関し、ここで、薬剤の肺レベル（例えば投与後に達成されるレベル(例えば肺への局所投与1時間後に達成される肺レベル)）の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上が、少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約7時間、少なくとも約8時間、少なくとも約9時間、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、または少なくとも約12時間にわたり維持される。いくつかの実施形態において、本発明は、肺組織（肺臓）への局所投与のための持続作用製剤もしくは持続治療域製剤の製造における、本明細書に記載した、肺組織中の標的（例えばTNFR1）と結合する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の使用に関し、ここで、肺臓における持続作用期間もしくは持続治療域は、投与の4時間後、5時間後、6時間後、7時間後、8時間後、9時間後、10時間後、11時間後、または12時間後に、投与された薬剤の総量の少なくとも約40％、少なくとも約35％、少なくとも約30％、少なくとも約25％、少なくとも約20％、少なくとも約15％、少なくとも約10％、または少なくとも約5％が全体として（BALおよび肺組織）肺臓中に存在することによって特徴付けられる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本発明は、肺組織（肺臓）への局所投与のための持続作用製剤もしくは持続治療域製剤の製造における、本明細書に記載した、肺組織中の標的（例えばTNFR1）と結合する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の使用に関し、ここで、製剤中の薬剤の量（例えば製剤の単回投与において投与される量）の少なくとも約1％、少なくとも約1.25％、少なくとも約1.5％、少なくとも約1.75％、少なくとも約2％、少なくとも約2.25％、少なくとも約2.5％、少なくとも約2.75％、または少なくとも約3％の肺レベルが、（例えば製剤が投与された後）少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、または少なくとも12時間肺組織中に存在する。
【０１００】
好ましくは、本発明における使用のための薬剤は、（例えば持続作用製剤もしくは持続治療域製剤の場合）体循環中に実質的に流入しない。本明細書に記載する場合、（例えば製剤の単回投与において）薬剤が投与された5時間後に、血清中に（例えば製剤の単回投与において）投与された薬剤の総量の約2％以下、約1.75％以下、約1.5％以下、約1.25％以下、約1％以下、約0.75％以下、約0.5％以下、もしくは約0.25％以下が存在するか、または実質的に薬剤が存在しない場合に、薬剤は循環中に実質的に流入しない。場合によっては、本明細書に記載のように投与される薬剤は体循環中に流入しても良いが、例えば薬剤が体循環から速やかに除去されるために有意なレベルにまで蓄積しない。従って、本発明は、有意なレベルの薬剤が体循環中に蓄積しない、肺組織中の標的と結合する薬剤の肺組織への使用を提供する。（例えば製剤の単回投与において）薬剤が投与された5時間後に、血清中に（例えば製剤の単回投与において）投与された薬剤の総量の約2％以下、約1.75％以下、約1.5％以下、約1.25％以下、約1％以下、約0.75％以下、約0.5％以下、もしくは約0.25％以下が存在するか、または実質的に薬剤が存在しない場合に、体循環中の薬剤のレベルは有意ではない。
【０１０１】
本発明はまた、低用量で有効な量の薬剤の肺組織への局所投与のための医薬の製造における、本明細書に記載の、肺組織中の標的（例えばTNFR1）と結合する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の使用に関する。本明細書に記載のように、低用量で有効な量は、一般に有効な全身投与量の約80％以下、有効な全身投与量の約70％以下、有効な全身投与量の約60％以下、有効な全身投与量の約50％以下、有効な全身投与量の約40％以下、有効な全身投与量の約30％以下、有効な全身投与量の約20％以下、有効な全身投与量の約10％以下、または有効な全身投与量の約5％以下である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本発明は、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）を含有する、肺組織に局所投与するための持続作用製剤もしくは持続治療域製剤の製造方法、または肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の低用量で有効な量を肺組織に局所投与するための医薬の製造方法である。上記方法は、(1)肺組織中の標的と結合し、かつin vivo血清半減期が短い（例えば約12時間未満の）薬剤を選択し、そして(2)肺組織に局所投与するための持続作用製剤もしくは持続治療域製剤の製造のために、または低用量で有効な量の薬剤を肺組織に局所投与するための医薬の製造のために、選択された薬剤を使用する、ことを含む。
【０１０３】
本発明はまた、本明細書に記載の肺組織（肺臓）に局所投与するための持続作用製剤もしくは持続治療域製剤の製造において、または本明細書に記載の低用量で有効な量の薬剤の肺組織への局所投与のための医薬の製造において使用するための、本明細書に記載した、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）の使用に関し、製剤または医薬は、約10mg/kg/日以下の薬剤を投与するためのものである。例えば、製剤または医薬は、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日、例えば約1mg/kg/日、約2mg/kg/日、約3mg/kg/日、約4mg/kg/日、約5mg/kg/日、約6mg/kg/日、約7mg/kg/日、約8mg/kg/日、約9mg/kg/日、または約10mg/kg/日の投与のためのものであり得る。いくつかの実施形態において、製剤または医薬はヒトの肺組織（肺臓）への局所投与のためのものであり、そして製剤または医薬は約10mg/日以下を投与するためのものである。例えば、製剤または医薬は、約1mg/日〜約10mg/日（例えば10mg/日、9mg/日、8mg/日、7mg/日、6mg/日、5mg/日、4mg/日、3mg/日、2mg/日、または1mg/日）の投与量で薬剤を投与するためのものであり得る。従って、製剤または医薬は、約1μg/kg/日〜約200μg/kg/日（例えば約10μg/kg/日、約20μg/kg/日、約30μg/kg/日、約40μg/kg/日、約50μg/kg/日、約60μg/kg/日、約70μg/kg/日、約80μg/kg/日、約90μg/kg/日、約100μg/kg/日、約110μg/kg/日、約120μg/kg/日、約130μg/kg/日、約140μg/kg/日、約150μg/kg/日、約160μg/kg/日、約170μg/kg/日、約180μg/kg/日、または約190μg/kg/日）の投与量で薬剤を投与するためのものであり得る。特定の実施形態において、約5μg/kg/日〜約3mg/kg/日、または好ましくは約50μg/kg/日〜約500μg/kg/日が投与される。
【０１０４】
本明細書に記載の肺組織中の標的と結合する薬剤を用いて製造される製剤および医薬は、適切な方法を使用して被験者の肺組織（例えば肺臓）に局所投与することができる。例えば、薬剤は、吸入または鼻腔内投与を介して肺組織に局所投与され得る。吸入または鼻腔内投与のために、薬剤（TNFR1のアンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）は、ネブライザー、吸入器、アトマイザー、エアゾール噴霧器、ミスト噴霧器、乾燥粉末吸入器、計量投与吸入器、計量投与噴霧器、計量投与ミスト噴霧器、計量投与アトマイザー、または他の適切な送達デバイスを用いて投与することができる。
【０１０５】
例えば診断目的（イメージングなど）のために必要であれば、肺組織中の標的と結合する薬剤（例えば抗体フラグメント、アンタゴニスト、リガンド、dAb単量体）は、検出可能な標識を含むことができる。適切な検出可能標識、および薬剤の標識方法は当分野において周知である。適切な検出可能標識としては、例えば放射性同位体（例えばインジウム-111、テクネチウム-99mまたはヨウ素-131）、ポジトロン放出性標識（例えばフッ素-19）、常磁性イオン（例えばガドリニウム(III)、マンガン(II)）、エピトープ標識（タグ）、アフィニティー標識（例えばビオチン、アビジン）、スピンラベル、酵素、蛍光基または化学発光基が挙げられる。標識を使用しない場合、表面プラズモン共鳴または他の適切な方法によって複合体形成を決定することができる。
【０１０６】
肺炎および呼吸器疾患の治療、抑制または予防のためのTNFR1アンタゴニスト
第二の態様において、本発明は、有効量のTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）を、それを必要とする被験者（例えば哺乳動物、ヒト）に投与することを含む、肺炎および／もしくは呼吸器疾患の治療、抑制または予防方法に関する。本発明はまた、肺炎および／もしくは呼吸器疾患の治療、抑制または予防のための医薬の製造のためのTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）の使用、および活性成分としてTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）を含有する、肺炎および／もしくは呼吸器疾患を治療、抑制または予防するための医薬組成物に関する。本発明における使用のために適したTNFR1アンタゴニストは本明細書中に詳細に記載しており、小分子、新規化学物質、リガンド、dAb単量体などが挙げられる。
【０１０７】
本発明は、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド、dAb単量体）および製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物、および本発明のリガンドまたは組成物を使用する治療および診断方法を提供する。本発明の方法に従うアンタゴニストおよびリガンド（例えば二重特異性リガンド、多重特異性リガンド、dAb単量体）は、in vivoの治療的および予防的適用、in vivoの診断的適用などに使用することができる。
【０１０８】
TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、多重特異性リガンド、二重特異性リガンド、dAb単量体）の治療的および予防的使用は、有効量のTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、多重特異性リガンド、二重特異性リガンド、dAb単量体）を、ヒトなどの哺乳動物受容者または被験者に投与することを含む。
【０１０９】
例えば、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、多重特異性リガンド、二重特異性リガンド、dAb単量体）は、典型的には、肺炎が症状もしくは病状の一部である状態、急性呼吸器疾患、慢性呼吸器疾患、急性炎症性呼吸器疾患および慢性炎症性呼吸器疾患などの肺炎および／もしくは呼吸器疾患の予防、抑制または治療における使用を見出すであろう。例えば、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、多重特異性リガンド、二重特異性リガンド、dAb単量体）は、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患（例えば慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、気腫）、喘息（例えばステロイド抵抗性喘息）、肺炎（例えばブドウ球菌性肺炎などの細菌性肺炎）、過敏性肺炎、肺好酸球浸潤、環境肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓性塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、隔膜の障害、換気過小、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸促進症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿肺症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、気腫、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患（IPD）、インフルエンザ、非結核性抗酸菌症、胸水、塵肺症、肺細胞増多症（pneumocytosis）、肺炎、肺放線菌症、肺胞蛋白症（pulmonary alveolar proteinosis）、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺炎、肺組織球症（好酸球性肉芽腫）、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈性肺高血圧症（pulmonary veno-occlusive disease）、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、ヴェーゲナー肉芽腫症、および非小細胞性肺癌の治療、抑制または予防のために投与することができる。
【０１１０】
本出願において、用語「予防」とは、疾患の誘発に先立つ保護的組成物の投与を意味する。「抑制」とは、誘発事象の後であるが、疾患の臨床的出現に先立つ組成物の投与をいう。「治療」とは、疾患症状が明らかとなった後の保護的組成物の投与を意味する。
【０１１１】
有利には、二重もしくは多重特異性リガンドを用い、生体内での治療状況において相乗的に共同作用するサイトカインおよび他の分子を標的とすることができる。従って本発明は、2個以上の結合ドメイン（例えばdAb）の活性を相乗倍させる方法であって、一方のドメインがTNFR1もしくは肺組織中の他の標的と結合し、他方のドメインがサイトカインもしくは他の分子と結合するものであり、この2種以上の分子（例えばTNFR1およびサイトカイン）と結合できる二重または多重特異性リガンドを投与することを含む方法を提供する。例えば、本発明のこの態様は、VHドメインおよびVLドメイン、VHドメインのみおよびVLドメインのみの組み合わせに関する。
【０１１２】
治療における相乗作用は多くの方法で達成することができる。例えば、標的の組み合わせは、双方の標的がリガンドによって標的とされる場合にのみ治療的に活性であり得、一方の標的のみを標的とすることは治療的に有効ではない。別の実施形態においては、一方の標的単独ではやや低い、もしくは最小の治療効果をもたらすものであって良いが、第二の標的と共に用いると、その組み合わせによって治療効果が相乗的に増大する。
【０１１３】
呼吸器疾患の予防、抑制もしくは治療におけるTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、抗体もしくはその結合タンパク質、dAb単量体）の有効性をスクリーニングするために使用することができる動物モデル系が入手可能である。例えば、呼吸器疾患の適切な動物モデルとして、慢性閉塞性肺疾患モデル（Groneberg, DAら, Respiratory Research 5:18 (2004)を参照のこと）および喘息モデル（Coffmanら, J. Exp. Med. 201(12): 1875-1879 (2001)を参照のこと）が挙げられる。好ましくは、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンドまたはdAb単量体）は、マウスのタバコ煙誘発慢性閉塞性肺疾患モデル（例えば本明細書で開示する亜慢性モデル）、または適切な霊長類の喘息もしくは慢性閉塞性肺疾患のモデルで効果がある。より好ましくは、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンドまたはdAb単量体）は、マウスのタバコ煙誘発慢性閉塞性肺疾患モデル（例えば本明細書で開示する亜慢性モデル）で効果がある（WrightおよびChurg, Chest, 122:301-306 (2002)も参照のこと）。例えば、有効量のリガンドの投与によって、適切な対照と比較して、モデルにおけるCOPDの症状の発症を減少、遅延または予防することができる。従来技術においては、これらのモデルにおけるTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンドまたはdAb単量体）の使用、またはこれらが有効であることについて示唆されていない。
【０１１４】
一般に、本発明のアンタゴニスト（例えばリガンド）は、薬理学的に適切な担体と共に精製された形態で利用されるであろう。典型的には、これらの担体として、水性もしくはアルコール性／水性溶液、乳液もしくは懸濁液、生理食塩水および／もしくは緩衝媒体を含む任意の担体が挙げられる。非経口ベヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウムおよび乳酸加リンガー液が挙げられる。ポリペプチド複合体を懸濁状態に保つために必要な場合には、適切な生理的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩などの増粘剤から選択することができる。
【０１１５】
静脈内用ベヒクルには、リンガーブドウ糖をベースにしたものなどの、流動性があり、栄養素補給剤および電解質補給剤を含むものが挙げられる。抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤が存在していても良い（Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版）。持続性放出製剤を含む、種々の適切な製剤を利用することができる。
【０１１６】
本発明のアンタゴニスト（例えばリガンド）は、他の薬剤と別個に投与される組成物として、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。他の薬剤としては、以下のような種々の薬剤を挙げることができる：ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばホスホジエステラーゼ4の阻害剤）、気管支拡張剤（例えばβ2-アゴニスト、抗コリン作用性剤、テオフィリン）、短時間作用型β-アゴニスト（例えばアルブテロール、サルブタモール、バムブテロール、フェノテロール、イソエテリン、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、テルブタリンおよびトーンレート）、長時間作用型β-アゴニスト（例えばフォルモテロールおよびサルメテロール）、短時間作用型抗コリン作用性剤（例えば臭化イプラトロピウムおよび臭化オキシトロピウム）、長時間作用型抗コリン作用性剤（例えばチオトロピウム）、テオフィリン（例えば短時間作用型製剤、長時間作用型製剤）、吸入用ステロイド（例えばベクロメタゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾンおよびトリアムシノロン）、経口用ステロイド（たとえばメチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾロンおよびプレドニゾン）、短時間作用型β-アゴニストと抗コリン作用性剤との組み合わせ（例えばアルブテロール／サルブタモール／イプラトピウム、およびフェノテロール／イプラトピウム）、長時間作用型β-アゴニストと吸入用ステロイドとの組み合わせ（例えばサルメテロール／フルチカゾン、およびフォルモテロール／ブデソニド）および粘液溶解剤（例えばエルドステイン、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、グイアフェネシンおよびヨウ化グリセロール）、シクロスポリン、抗生物質、抗ウイルス剤、メトトレキセート、アドリアマイシン、シスプラチン（cisplatinum）、およびイムノトキシン。
【０１１７】
医薬組成物は、本発明のアンタゴニスト（例えばリガンド）と組み合わせて、種々の細胞毒性剤または他の薬剤の「カクテル」を、あるいは更に（異なる標的抗原もしくはエピトープを用いて選択されたリガンドなどの）特異性の異なる本発明のリガンドの組み合わせを含んでいても良い。組成物は投与前にプールされていてもされていなくても良い。
【０１１８】
TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）は、1以上の更なる治療剤もしくは活性薬剤と共に投与および／または製剤化することができる。TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）を更なる治療剤と共に投与する場合、TNFR1アンタゴニストは更なる薬剤の投与の前、同時、または後に投与することができる。一般に、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）および更なる薬剤は、治療効果の重複を提供するように投与される。
【０１１９】
本発明のアンタゴニスト（例えばリガンド）またはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。特定の治療的適用において、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅、または他の何らかの測定可能なパラメーターを達成するために十分な量を「治療に有効な量」と定義する。例えば、肺炎症および／または呼吸器疾患の治療のためには、St. George's Respiratory Questionnaireなどの適切な質問表で定量される（例えば4点の改善スコア）ような、喀痰阻害量、気管支生検炎症阻害量、呼吸困難阻害量、1秒間の強制呼気量（FEV(1)）増大量、健康状態改善増大量がある。
【０１２０】
これらの効果を達成するために必要な量は、疾患の重篤度、および患者自身の免疫系の全体的な状態に依存するであろうが、一般的には体重1kgあたり薬剤、アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）もしくはその結合タンパク質が0.005〜10.0mgの範囲であり、0.05〜2.0mg/kg/投与の投与量がより一般的に用いられる。特定の実施形態において、投与される量は約5μg/kg/投与〜約3mg/kg/投与、または好ましくは約50μg/kg/投与〜約500μg/kg/投与であろう。
【０１２１】
予防的適用のためには、本発明のリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、疾患の予防、阻害もしくは発症の遅延のため（例えば寛解もしくは静止を持続させる、または急性期を予防するため）に同様の用量、またはやや低用量で投与することもできる。熟練した臨床医であれば、疾患の治療、抑制もしくは予防のための適切な投与間隔を決定できるであろう。肺炎症もしくは呼吸器疾患の治療、抑制または予防のためにTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド）を投与する場合、1日に4回まで、週2回、週1回、2週間に1回、月1回、または2ヶ月に1回、例えば約10μg/kg〜約80mg/kg、約100μg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約70mg/kg、約1mg/kg〜約60mg/kg、約1mg/kg〜約50mg/kg、約1mg/kg〜約40mg/kg、約1mg/kg〜約30mg/kg、約1mg/kg〜約20mg/kg、約1mg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約5mg/kg、約10μg/kg〜約2.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kgまたは約10mg/kgの投与量で投与することができる。特定の実施形態において、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド）は、肺炎症もしくは呼吸器疾患の治療、抑制または予防のために、毎日、2日に1回、週1回、2週間に1回または月1回、約10μg/kg〜約10mg/kg（例えば約10μg/kg、約100μg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kgまたは約10mg/kg）の投与量で投与される。特定の実施形態において、約5μg/kg〜約3mg/kg、または好ましくは約50μg/kg〜約500μg/kgが投与される。
【０１２２】
TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド）はまた、肺炎症もしくは呼吸器疾患の治療、抑制または予防のために、約10mg、約9mg、約8mg、約7mg、約6mg、約5mg、約4mg、約3mg、約2mgまたは約1mgの日量または単位投与量で投与することができる。
【０１２３】
本明細書に記載した組成物を用いて実施する処置もしくは治療は、処置の前に存在した症状と比較して、またはそうした組成物で処置していない個体（ヒトまたはモデル動物）もしくは他の適切な対照における症状と比較して、1以上の症状が低減している（例えば臨床的評価スケールで少なくとも1点もしくは少なくとも10％）場合に「有効」と見なされる。症状は標的の疾患もしくは障害によって異なるが、熟練の臨床医または技術者によって測定することができる。このような症状は、例えば疾患もしくは障害の1以上の物理的指標（例えば肺組織中の細胞浸潤物、痰の生成、痰中の細胞浸潤物、呼吸困難、運動負荷試験、肺活量測定(例えば強制肺活量(FVC)、1秒間の強制呼気量(FEV(1)、FEV(1)/FVC))、疾患の悪化速度もしくは重篤度）をモニタリングすることによって、あるいは容認された臨床評価スケール、例えばSt. George's Respiratory Questionnaireによって測定することができる。適切な臨床評価スケールとしては、例えばFEV (1)に基づく気流の障害の重篤度 (「臨床的ガイドライン 12  慢性閉塞性肺疾患、一次的および二次的ケアにおける成人の慢性閉塞性肺疾患の管理（Clinical Guideline 12, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, Management of Chronic Obstructive Pulmonary  Disease in Adults in Primary and Secondary Care）」 National Institute for Clinical Excellence, London (2004))、最大呼気流量(PEF) (「喘息の管理における英国ガイドライン（British Guideline on the Management of Asthma）」 British Thoracic Society, Scottish Intercollegiate Guidelines Network, Revised Edition (2004))、米国胸動脈協会（the American Thoracic Society）（ATS）標準に基づくCOPD段階 (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152:S77-S120 (1995)、ATS標準に基づく喘息の障害分類(Am. Rev. Respir. Dis., 147:1056-1061 (1993)、または当分野において公知の他の容認された臨床評価スケールが挙げられる。疾患もしくは障害の症状の所与の臨床スケールでの1点以上のまたは少なくとも10％の持続的（例えば1日以上、好ましくはより長い）低減は、「有効な」処置であることを示す。同様に、本明細書に記載した組成物を用いて実施する予防は、1以上の症状の発症もしくは重篤度が、組成物で処置していない同様の個体（ヒトまたは動物モデル）における症状と比較して遅延、低減もしくは除去された場合に「有効」である。
【０１２４】
本発明に従うアンタゴニスト（例えばリガンド）を含有する組成物は、予防および治療状況において用い、哺乳動物における選択された標的細胞集団の変化、不活化、死滅もしくは除去を補助することができる。例えば、こうした組成物を使用して、肺における炎症細胞のレベルを低下させ、および／または肺の細胞浸潤を阻害することができる。
【０１２５】
本発明に従うアンタゴニスト（例えばリガンド）を含有する組成物はまた、肺における炎症性の刺激によって誘導されるサイトカイン、ケモカイン、細胞接着分子などの炎症性メディエーターのレベルを低下させるために使用することもできる。例えば、TNFR1のdAb単量体アンタゴニストは、(i)好中球遊走因子（chemoattractants）KCおよびMIP-1などの初期作用性メディエーターのレベルの炎症性刺激誘導型（例えばTNFα-誘導型）の増加を阻害し、および／または(ii)ケモカインMCP-1および接着分子E-セレクチンなどの後期作用性メディエーターのレベルの炎症性刺激誘導型（例えばTNFα-誘導型）の増加を阻害することができる。LTB4、GRO-a、IP-10、GM-CSF、反応性酸素種（ROS）、NOなどの他のメディエーターが影響を受け得る。
【０１２６】
本発明のリガンドは、保存のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体中で用時調製することができる。この技術は、伝統的な免疫グロブリンで有効であることが示されており、当分野で公知の凍結乾燥および用時調製技術を使用することができる。凍結乾燥および用時調製が抗体活性の消失の度合いに影響することがあり（例えば、伝統的免疫グロブリンを用いた場合、IgM抗体はIgG抗体よりも活性消失がより大きくなりがちである）、これを補うために使用レベルを上方修正しなければならないことがあり得ることが当業者には認識されるであろう。本発明のリガンドは、凍結乾燥して吸入のための乾燥粉末を形成し、その形態で投与することができる。
【０１２７】
本発明に係る医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に知られているもののいずれでも良い。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺、またはカテーテルを用いた直接的注入によるものを含め、任意の適切な方法であって良い。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬剤との併用状況、臨床医が考慮すべき禁忌（counterindications)および他のパラメーターに依存するであろう。投与は、指示により、局所的（例えば肺(pulmonary)投与、例えば鼻腔内投与による肺臓(lung)への局所送達）であっても、全身的であっても良い。
【０１２８】
特定の実施形態において、TNFR1アンタゴニストは、吸入によるもののような肺送達（例えば気管支内、鼻腔内もしくは口腔内吸入、点鼻）を介して、または全身的送達（例えば非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）によって投与される。好ましい実施形態において、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）は、吸入もしくは鼻腔内投与などの肺への投与（例えば気管支内、鼻腔内もしくは口腔内吸入、点鼻）を介して被験者に投与される。吸入のためには、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）は、ネブライザー、吸入器、アトマイザー、エアゾール噴霧器、ミスト噴霧器、乾燥粉末吸入器、計量投与吸入器、計量投与噴霧器、計量投与ミスト噴霧器、計量投与アトマイザー、または他の適切な送達デバイスを使用して投与することができる。
【０１２９】
本発明は、有効量のTNFR1アンタゴニストを、それを必要とする被験者に投与することを含む、肺炎症もしくは呼吸器疾患の治療、抑制または予防のための方法に関し、ここで上記有効量は約10mg/kg/日を超えず、好ましくは肺における炎症細胞のレベルは処置前レベルに対してp＜0.05で減少するか、あるいは炎症細胞の肺へのリクルートメントが処置前レベルに対してp＜0.05で阻害される。肺における炎症細胞のレベル、または炎症細胞の肺へのリクルートメントは、処置前レベルに対して少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％低下または阻害させることができる。
【０１３０】
好ましくは、本明細書の実施例に記載した方法を用いて統計的な解析を実施する。肺における炎症細胞のレベル、または炎症細胞の肺へのリクルートメントは、いくつかの実施形態においては処置前レベルに対してp＜0.001で低下または阻害させることができる。
【０１３１】
肺における細胞（例えば炎症細胞）のレベルは、BAL、痰もしくは生検（例えば気管支生検、肺生検）における全細胞もしくは示差的細胞計数（例えばマクロファージ細胞計数、好中球細胞計数、好酸球細胞計数、リンパ球細胞計数、上皮細胞計数）などの任意の適切な方法を用いて評価することができる。
【０１３２】
本発明はまた、以下の段階を含む、呼吸器疾患の治療方法に関する：
(1)呼吸器疾患の適切な動物モデルにおいて、約10mg/kgを超えない量で1日1回投与した場合に、有効性を示す腫瘍壊死因子受容体１（TNFR1）のアンタゴニストを選択し（ここで気管支肺胞洗浄における全細胞計数による評価で肺の細胞浸潤が未処置の対照と比較してp＜0.05で阻害されている場合に上記動物モデルでの有効性が認められる）、
(2)有効量のTNFR1の上記アンタゴニストをそれを必要とする被験者に（例えば肺組織に局所的に）投与する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本明細書記載の方法は、慢性閉塞性肺疾患（例えば慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、気腫）、喘息（例えばステロイド抵抗性喘息）、肺炎（例えばブドウ球菌性肺炎などの細菌性肺炎）、または肺の炎症を治療、抑制または予防するために用いられる。
【０１３４】
本発明はまた、本明細書に記載した肺の炎症もしくは呼吸器疾患の治療のための医薬または製剤の製造のための、本明細書に記載したTNFR1アンタゴニストの使用に関する。医薬は、全身的投与および／または肺組織への局所的投与のためのものであり得る。
【０１３５】
TNFR1のアンタゴニスト
TNFR1は、リガンドに結合する細胞外領域と、内在性のシグナル伝達活性を欠くが、シグナル伝達分子と会合し得る細胞内ドメインとを含む膜貫通型受容体である。TNFR1とこれに結合したTNFとの複合体は3本のTNFR1鎖および3本のTNF鎖を含む（Bannerら, Cell, 73(3) 431-445 (1993)）。TNFリガンドは、3本のTNFR1鎖によって結合した三量体として存在する（前掲）。3本のTNFR1鎖は受容体-リガンド複合体内で密接にクラスター形成し、このクラスター形成がTNFR1-介在型シグナル伝達の必須条件である。事実、抗TNFR1抗体などのTNFR1に結合する多価の薬剤は、TNFの不存在下でTNFR1のクラスター形成およびシグナル伝達を誘導することができ、一般にTNFR1アゴニストとして用いられる（例えばBelkaら, EMBO, 14(6):1156-1165 (1995); Mandik-Nayakら, J. Immunol, 167:1920-1928 (2001)を参照のこと）。従って、TNFR1と結合する多価の薬剤は、TNFαのTNFR1への結合を阻止するとしても、一般にTNFR1の有効なアンタゴニストではない。
【０１３６】
TNFR1の細胞外領域は、以下のものを含む：13個のアミノ酸のアミノ末端セグメント（配列番号213(ヒト)のアミノ酸1-13；配列番号215(マウス)のアミノ酸1-13）、ドメイン1（配列番号213(ヒト)のアミノ酸14-53；配列番号215(マウス)のアミノ酸14-53）、ドメイン2（配列番号213(ヒト)のアミノ酸54-97；配列番号215(マウス)のアミノ酸54-97）、ドメイン3（配列番号213(ヒト)のアミノ酸98-138；配列番号215(マウス)のアミノ酸98-138）、およびドメイン4（配列番号213(ヒト)のアミノ酸139-167；配列番号215(マウス)のアミノ酸139-167）、続いて膜近位領域（配列番号213(ヒト)のアミノ酸168-182；配列番号215(マウス)のアミノ酸168-183）。（例えばBannerら, Cell 73(3) 431-445 (1993)およびLoetscherら, Cell 61(2) 351-359 (1990)を参照のこと。）ドメイン2および3は結合リガンド（TNFβ、TNFα）と接触する。（Bannerら, Cell 73(3) 431-445 (1993)。）TNFR1の細胞外領域はまた、リガンド結合前アセンブリー（pre-ligand binding assembly）ドメインもしくはPLADドメインと呼ばれる領域（配列番号213(ヒト)のアミノ酸1-53；配列番号215(マウス)のアミノ酸1-53）も含んでいる（米国政府、WO 01/58953；Dengら, Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304 (2005)）。
TNFR1は、ドメイン4または膜近位領域（配列番号213のアミノ酸168-182；配列番号215のアミノ酸168-183）におけるTNFR1のタンパク分解を含む過程を通じてin vivoにおいて細胞表面から剥がされ(shed)、可溶性形態のTNFR1を産生する。可溶性TNFR1はTNFαと結合する能力を保持しており、従ってTNFαの活性の内在的阻害剤として機能する。
【０１３７】
本発明における使用のために適したTNFR1アンタゴニスト（例えば本明細書に記載のリガンド）は、腫瘍壊死因子受容体１（TNFR1；p55；CD120a）に対する結合特異性を有する。好ましくは、TNFR1アンタゴニストは腫瘍壊死因子２（TNFR2）に対する結合特異性を有しないか、あるいは実質的にTNFR2のアンタゴニストではない。アンタゴニスト（1nM、10nM、100nM、1μM、10μMまたは100μM）が標準的な細胞アッセイにおいてTNFα（100pg/ml）によって誘導されるTNFR2-介在型活性の約5％以下の阻害を生じている場合、TNFR1アンタゴニストは実質的にTNFR2のアンタゴニストではない。
【０１３８】
本発明における使用のために適したTNFR1アンタゴニストは、呼吸器疾患（例えば急性呼吸器疾患、慢性呼吸器疾患、急性炎症性呼吸器疾患、慢性炎症性呼吸器疾患）の治療のための有効な治療薬である（効果がある、治療効果を有する）。例えば、本発明における使用に適したTNFR1アンタゴニストは、有効量を投与した場合に呼吸器疾患のモデルにおいて有効である。一般に、有効量は、約1μg/kg〜約10mg/kgまたは約1mg/kg〜約10mg/kg（例えば約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、または約10mg/kg）である。呼吸器疾患の適切な動物モデルのいくつかが当分野で公知であり、ヒトにおける治療効果を予測するものとして当業者に認識されている。例えば、呼吸器疾患の適切な動物モデルとして、慢性閉塞性肺疾患モデル（Groneberg, DAら, Respiratory Research 5:18(2004)を参照のこと）、喘息モデル（Coffman RLら, J. Exp. Med. 201(12):1875-1879(2001)；Van Scott, MRら, J. App. Physiol. 96:1433-1444(2004)を参照のこと)、および肺線維症モデル（例えばVenkatesan, Nら, Lung 287:1342-1347(2004)）が挙げられる。好ましくは、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンドもしくはdAb単量体）は、マウスのタバコ煙誘発慢性閉塞性肺疾患モデル（例えば本明細書で開示する亜慢性モデル）、または喘息もしくは慢性閉塞性肺疾患の適切な霊長類モデル（例えばCoffman RLら, J. Exp. Med. 201(12):1875-1879(2001)；Van Scott, MRら, J. App. Physiol. 96:1433-1444(2004)を参照のこと）で有効である。より好ましくは、TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンドもしくはdAb単量体）はマウスのタバコ煙誘発慢性閉塞性肺疾患モデル（例えば本明細書で開示する亜慢性モデル）で有効である（WrightおよびChurg, Chest, 122:301-306(2002)も参照のこと）。例えば、有効量のリガンドの投与によって、モデルにおけるCOPDの症状の発症を適切な対照と比較して低下、遅延または予防することができる。従来技術には、これらのモデルにおけるTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンドもしくはdAb単量体）の使用について、またこれらが有効であることについての示唆がされていない。
【０１３９】
適切なTNFR1アンタゴニストは一価または多価であり得る。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは一価であり、TNFR1と相互作用する1つの結合部位を含む。一価のアンタゴニストは1個のTNFR1と結合し、受容体の活性化およびシグナル伝達につながり得る細胞表面上でのTNFR1の架橋またはクラスター形成を誘導しない。特定の実施形態において、TNFR1の一価のアンタゴニストはマウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合するか、あるいはヒトTNFR1との競合についてTAR2h-205と競合する。
【０１４０】
TNFR1の多価アンタゴニストは、TNFR1に対する特定の結合部位を2コピー以上含むか、あるいはTNFR1と結合する2以上の異なる結合部位を含み得る。例えば、TNFR1アンタゴニストは、TNFR1と結合する特定のdAbを2コピー以上、もしくはTNFR1と結合する2以上の異なるdAbを含む二量体、三量体または多量体であり得る。好ましくは、TNFR1の多価アンタゴニストは、標準的な細胞アッセイにおいてTNFR1を実質的にアゴナイズしない（TNFR1アゴニストとして作用しない）（すなわち、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μMもしくは5,000μMの濃度で存在する場合に、同アッセイにおいてTNFα(100pg/ml)によって誘導されるTNFR1-介在型活性の約5％以下となる）。
【０１４１】
TNFR1の適切な多価アンタゴニストは、TNFR1の所望のエピトープまたはドメインに対する2以上の結合部位を含み得る。例えば、TNFR1の多価アンタゴニストは、TNFR1の同じエピトープと結合する2以上の結合部位、またはTNFR1の異なるエピトープもしくはドメインと結合する2以上の結合部位を含み得る。一実施例において、TNFR1の多価アンタゴニストは、TNFR1の第一のエピトープと結合する第一の結合部位、およびTNFR1の第二の異なるエピトープと結合する第二の結合部位を含む。好ましくは、こうした多価アンタゴニストは、本明細書に記載された標準的なL929細胞毒性アッセイまたは標準的なHeLa IL-8アッセイにおいて、約1nM、もしくは約10nM、もしくは約100nM、もしくは約1μM、もしくは約10μMの濃度で存在する場合、TNFR1をアゴナイズしない。
【０１４２】
本発明における使用に適したいくつかのTNFR1アンタゴニストは、TNFR1と結合し、TNFR1へのTNFαの結合を阻害する。特定の実施形態において、こうしたTNFR1アンタゴニストはTNFR1への結合についてTAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10またはTAR2h-185-25と競合する。
【０１４３】
本発明における使用に適したいくつかのTNFR1アンタゴニストは、TNFR1に対するTNFαの結合を阻害しないが、TNFR1を介してメディエートされるシグナル伝達を阻害する。例えば、TNFR1アンタゴニストは、TNFR1を介したシグナル伝達に先立つTNFα-誘導型のTNFR1のクラスター形成を阻害し得る。このようなアンタゴニストはいくつかの利点を提供する。例えば、このようなアンタゴニストの存在下において、TNFαは細胞表面上に発現されたTNFR1と結合して細胞環境から除去され得るが、TNFR1介在型のシグナル伝達は活性化されないであろう。従って、TNFR1シグナル誘導型の更なるTNFαおよび他の炎症性メディエーターの産生は阻害されるであろう。同様に、TNFR1と結合し、TNFR1を介してメディエートされるシグナル伝達を阻害するが、TNFR1へのTNFαの結合を阻害しないTNFR1アンタゴニストは、内在的に産生される可溶性TNFR1のTNFα結合および阻害活性を阻害しないであろう。従って、このようなアンタゴニストを、それを必要とする哺乳動物に投与することによって、TNFα活性およびTNFR1活性をin vivoで阻害する内在性調節経路を補完することができる。
【０１４４】
特定の実施形態において、本発明における使用に適したTNFR1アンタゴニスト（例えばdAb単量体もしくはリガンド）は、TNFR1と結合し、TNFαの結合に際してTNFR1を介して仲介されるシグナル伝達を阻害する。このようなアンタゴニストは、TNFR1を介したシグナル伝達を阻害し得るが、TNFR1へのTNFαの結合および／またはTNFR1がシェディング（shedding）されて可溶性TNFR1を産生するのを阻害しない。従って、このようなアンタゴニストを、それを必要とする哺乳動物に投与することによって、TNFα活性およびTNFR1活性をin vivoで阻害する内在性調節経路を補完することができる。
【０１４５】
本発明における使用に適したある種のTNFR1アンタゴニスト（例えば化学化合物、新規化学物質、dAb単量体、リガンド）は、TNFR1と結合し、マウスTNFR1との結合についてTARm-21-23と競合するか、またはヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する。本発明における使用に適した別のTNFR1アンタゴニスト（例えば化学化合物、新規化学物質、dAb単量体、リガンド）は、TNFR1と結合し、TNFR1（例えばヒトおよび／もしくはマウスTNFR1）との結合について、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10、TAR2h-185-25、またはTAR2h-27-10と競合する。
【０１４６】
いくつかのアンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）は交差反応性があり、ヒトTNFR1、および医学的研究に使用され得る動物などの別の種由来のTNFR1と結合する。例えば、ヒトTNFR1およびマウスTNFR1と結合するdAb単量体である。このようなアンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）は、同じアンタゴニスト（例えばdAb単量体）を用いる臨床前および臨床研究を可能とする利点があり、適切な代理アンタゴニストを用いた臨床前研究を実施する必要が避けられる。交差反応性を有するアンタゴニストの好ましい例は、ヒトTNFR1、およびげっ歯類（例えばマウス、ラットもしくはモルモット）、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、または非ヒト霊長類（例えばカニクイザルもしくはアカゲザル）のTNFR1と結合する。
【０１４７】
一般に、本発明の交差反応性アンタゴニストは、ヒトTNFR1および別の種のTNFR1と類似の親和性（Kd）で結合する。好ましくは、dAb単量体などの交差反応性アンタゴニストは、ヒトTNFR1および別の種のTNFR1と、約100倍以下、約10倍以下、または約5倍以下の差の親和性で結合する。例えば、交差反応性dAb単量体は、ヒトTNFR1と1nMの親和性で結合し、またマウス、カニクイザルもしくはアカゲザルTNFR1と約10pM〜約100nM、約100pM〜約10nM、または約200pM〜約5nMの親和性で結合することができる。
【０１４８】
交差反応性アンタゴニスト、例えばdAb単量体は、ヒトTNFR1および他の種（例えば先の２つの段落で言及した非ヒトの種の一つ）のTNFR1と、約100倍以下、約10倍以下、もしくは約5倍以下の差の結合速度（Kon）で、および／または約100倍以下、約10倍以下、もしくは約5倍以下の差の解離速度（Koff）で結合することができる。例えば、アンタゴニストは、ヒトTNFR1および他の種のTNFR1の双方と約104M/s〜約105M/sのKonで、および／または約10-3s-1〜約10-5s-1のKoffで結合するdAb単量体であり得る。
【０１４９】
本発明において使用するのに適したTNFR1アンタゴニストとしてまた、TNFR1に対する結合特異性を有する抗体、またはその抗原結合フラグメント、例えばFabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメントもしくはFvフラグメント（例えばscFV）が挙げられる。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、例えばdAbまたは抗体の一価の抗原結合フラグメント（例えばFabフラグメント、Fab'フラグメント、もしくはFvフラグメント）のように一価である。
【０１５０】
好ましくは、TNFR1アンタゴニストは、本明細書に記載したようなリガンド（例えばdAb単量体）である。本明細書に記載したように、本発明における使用に適した好ましいTNFR1アンタゴニストには、TNFR1と結合し、TNFR1の機能を阻害するdAbが含まれる。しかしながら、「dAb」を含む代わりに、本発明における使用に適したTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド）は、TNFR1と結合するdAbのCDRを含むドメイン（例えば適切なタンパク質の足場もしくは骨格上にグラフトされたCDR、例えばアフィボディ(affibody)、SpA足場、LDL受容体クラスAドメインもしくはEGFドメイン）またはTNFR1に対する結合部位を含むタンパク質ドメインを含むことができ、例えば、ドメインはアフィボディ、SpAドメイン、LDL受容体クラスAドメイン、EGFドメイン、アビマー（avimer）から選択される。従って、本開示は全体としてdAbの代わりにこのようなドメインを用いたアンタゴニスト、リガンドおよび方法の開示を提供するものと解釈されるべきである。
【０１５１】
本発明の任意の態様に係るリガンド、並びにこうしたリガンドを構成する上で有用なdAb単量体を含め、TNFR1アンタゴニストは、好ましくはその標的に、表面プラスモン共鳴によって決定して300nM〜5pM（すなわち3×10-7〜5×10-12M）、好ましくは50nM〜20pM、もしくは5nM〜200pMもしくは1nM〜100pM、1×10-7M以下、1×10-8M以下、1×10-9M以下、1×10-10M以下、1×10-11M以下のKdで、および／または5×10-1s-1〜1×10-7s-1、好ましくは1×10-2s-1〜1×10-6s-1、もしくは5×10-3s-1〜1×10-5s-1、もしくは5×10-1s-1以下、もしくは1×10-2s-1以下、もしくは1×10-3s-1以下、もしくは1×10-4s-1以下、もしくは1×10-5s-1以下、もしくは1×10-6s-1以下のKoff速度定数で結合する。Kd速度定数はKoff/Konで規定される。更に、もしくはその代わりに、リガンド（例えばdAb単量体）は、中程度もしくは速いKonで、および遅いKoffでTNFR1と結合する。好ましくは、Konは約104M/s〜約105M/s、および／またはKoffは約10-3s-1〜約10-5s-1である。
【０１５２】
TNFR1と結合するリガンドおよびdAb単量体
本発明における使用に適したTNFR1の好ましいアンタゴニストは、有効量を投与した場合に呼吸器疾患のモデルにおいて有効なリガンドまたはdAb単量体である。一般に、有効量は約1mg/kg〜約10mg/kg（例えば約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、または約10mg/kg）である。特定の実施形態において、約5μg/kg〜約3mg/kg、または好ましくは約50μg/kg〜約500μg/kgを投与する。
【０１５３】
呼吸器疾患の適切な動物モデルのいくつかは当分野で公知であり、ヒトにおける治療効果を予測するものとして当業者に認識されている。例えば、呼吸器疾患の適切な動物モデルとして、慢性閉塞性肺疾患モデル（Groneberg, DAら, Respiratory Research 5:18 (2004)を参照のこと）、および喘息モデル（Coffmanら, J. Exp. Med. 201(12):1875-1879(2001)を参照のこと）が挙げられる。好ましくは、リガンドまたはdAb単量体は、本明細書に記載するタバコ煙誘発慢性閉塞性肺疾患のマウス亜慢性モデルにおいて効果がある。（WrightおよびChurg, Chest, 122:301-306(2002)も参照のこと。）例えば、有効量のリガンドの投与によって、モデルにおけるCOPDの症状の発症を、適切な対照と比較して低減、遅延または予防することができる。従来技術には、これらのモデルにおけるTNFR1アンタゴニスト（例えばリガンドもしくはdAb単量体）の使用について、またこれらが有効であることについて示唆されていない。
【０１５４】
一般に、適切なリガンド（例えばdAb単量体）は、表面プラスモン共鳴で決定して300nM〜5pM（すなわち3×10-7〜5×10-12M）、好ましくは50nM〜20pM、より好ましくは5nM〜200pM、最も好ましくは1nM〜100pM、例えば1×10-7M以下、好ましくは1×10-8M以下、より好ましくは1×10-9M以下、有利には1×10-10M以下、最も好ましくは1×10-11M以下のKd；および／または5×10-1s-1〜1×10-7s-1、好ましくは1×10-2s-1〜1×10-6s-1、より好ましくは5×10-3s-1〜1×10-5s-1、例えば5×10-1s-1以下、好ましくは1×10-2s-1以下、有利には1×10-3s-1以下、より好ましくは1×10-4s-1以下、更により好ましくは1×10-5s-1以下、最も好ましくは1×10-6s-1以下のKoff速度定数でTNFR1と結合する抗TNFR1 dAb単量体を含む（例えばこうしたdAbを含む二重特異性リガンド）（Kd＝Koff/Kon）。本発明における使用に適した特定のリガンドまたはdAb単量体は、表面プラスモン共鳴で決定して50nM〜20pMのKd、および5×10-1s-1〜1×10-7s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1と特異的に結合する。
【０１５５】
いくつかのリガンドまたはdAb単量体はTNFαのTNFR1への結合を阻害する。例えば、いくつかのリガンドまたはdAb単量体は、500nM〜50pM、好ましくは100nM〜50pM、より好ましくは10nM〜100pM、有利には1nM〜100pM；例えば50nM以下、好ましくは5nM以下、より好ましくは500pM以下、有利には200pM以下、最も好ましくは100pM以下の阻害濃度50（IC50）でTNFαのTNFR1への結合を阻害する。好ましくは、TNFR1はヒトTNFR1である。
【０１５６】
他のリガンドおよびdAb単量体は、TNFαのTNFR1への結合を阻害しないが、TNFR1を介して仲介されるシグナル伝達を阻害するためにアンタゴニストである。例えば、あるリガンドまたはdAb単量体は、TNFR1を介するシグナル伝達に先立つTNFα-誘導性TNFR1のクラスター形成を阻害することができる。例えば、特定の実施形態において、リガンドまたはdAb単量体はTNFR1と結合してTNFR1-仲介型のシグナル伝達を阻害し得るが、TNFαのTNFR1への結合を実質的に阻害しない。いくつかの実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は細胞表面上でのTNFα-誘導性のTNFR1の架橋もしくはクラスター形成を阻害する。このようなリガンドまたはdAb（例えば本明細書において記載するTAR2m-21-23）は、細胞表面のTNFR1をアンタゴナイズし得るが、内在性可溶性TNFR1の阻害活性を実質的に低下させないため、有利である。例えば、リガンドまたはdAbはTNFR1と結合できるが、受容体結合アッセイにおいて、TNFαのTNFR1への結合を約10％以下、約5％以下、約4％以下、約3％以下、約2％以下、または約1％以下阻害する。また、これらの実施形態において、リガンドまたはdAbは、標準的な細胞アッセイで、TNFα-誘導性のTNFR1の架橋および／もしくはTNFR1-介在型シグナル伝達を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％阻害する。このようなリガンドまたはdAb単量体は、これらの特性を有するアンタゴニストに関して本明細書で議論するように、いくつかの利点を提供する。従って、このようなリガンドまたはdAb単量体を、それを必要とする哺乳動物に投与することによって、TNFα活性およびTNFR1活性をin vivoで阻害する内在性の調節経路を補完することができる。
【０１５７】
リガンドは、本明細書に記載するように一価（例えばdAb単量体）であっても多価（例えば二重特異的、多重特異的）であっても良い。特定の実施形態において、リガンドはTNFR1と結合するdAb単量体である。TNFR1と結合するドメイン抗体単量体は、例えばモノクローナル抗体のような他の結合フォーマットと比較して占有体積（footprint）が小さい。従って、このようなdAb単量体はTNFR1の機能を選択的に阻止することができるが、TNFR1の他の機能を妨害しない。例えば、TNFR1と結合するdAb単量体はTNFR1をアンタゴナイズする（例えばTNFR1仲介型シグナル伝達を阻害する）ことができるが、TNFαのTNFR1への結合またはTNFR1のシェディング（shedding）を阻害しない。
【０１５８】
より特定の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合し、マウスTNFR1への結合についてTAR2m-21-23と競合するか、もしくはヒトTNFR1への結合についてTAR2h-205と競合するdAb単量体である。
【０１５９】
他の実施形態において、リガンドは多価であり、TNFR1と結合するdAb単量体を2個以上含む。多価リガンドは、TNFR1と結合する特定のdAbを2コピー以上含むか、TNFR1と結合する2種以上のdAbを含み得る。例えば、リガンドは、TNFR1と結合する特定のdAbを2コピー以上、もしくはTNFR1と結合する2種以上の異なるdAbを含む二量体、三量体または多量体であり得る。いくつかの実施例において、リガンドは、それぞれTNFR1と結合する特定のdAbを2もしくは3コピー含むホモ二量体またはホモ三量体である。好ましくは、多価リガンドは、標準的な細胞アッセイにおいてTNFR1を実質的にアゴナイズ（TNFR1のアゴニストとして作用）しない（すなわち、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μMもしくは5,000μMの濃度で存在する場合、アッセイにおいてTNFα(100pg/ml)によって誘導されるTNFR1-介在型活性の約5％以下となる）。
【０１６０】
特定の実施形態において、多価リガンドは、TNFR1の所望のエピトープもしくはドメインと結合する2種以上のdAb、またはTNFR1の所望のエピトープと結合する2コピー以上のdAbを含む。この型のリガンドはTNFR1と高い親和性で結合することができ、TNFR1を過剰発現するか、表面上にTNFR1を高密度で発現する細胞への結合が、dAb単量体のような他のリガンドフォーマットよりもより選択的であり得る。
【０１６１】
別の特定の実施形態において、多価リガンドは、TNFR1と結合する2種以上のdAb、または特定のdAbの2コピー以上を含む。この型の多価リガンドは、TNFR1単量体と低親和性で結合し得るが、受容体多量体（例えば受容体リガンド複合体において見られる三量体）と高親和性で結合し得る。従って、このフォーマットのリガンドを投与して、TNFR1-介在型シグナル伝達に必要な、互いに、および／もしくはリガンド（例えばTNFα）と共にクラスター形成し、または会合した受容体を効果的に標的とすることができる。
【０１６２】
好ましくは、リガンドまたはdAb単量体は、標準的なアッセイ（例えば本明細書に記載の標準的なL929もしくは標準的なHeLa IL-8アッセイ）において、500nM〜50pM、好ましくは100nM〜50pM、より好ましくは10nM〜100pM、有利には1nM〜100pM；例えば50nM以下、好ましくは5nM以下、より好ましくは500pM以下、有利には200pM以下、最も好ましくは100pM以下の中和量50（ND50）でTNFR1を中和（活性を阻害）する。別の実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は、TNFR1と結合し、標準的な細胞アッセイ（例えば本明細書に記載の標準的なL929もしくは標準的なHeLa IL-8アッセイ）において、＜100nMのND50でTNFR1の活性をアンタゴナイズし、＜10μMの濃度において、dAbはアッセイにおいて＜5％でTNFR1の活性をアゴナイズする。
【０１６３】
別の実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は、本明細書に記載のKd値でTNFR1と特異的に結合し、標準的なマウスのLPS/D-ガラクトサミン-誘導型敗血性ショックモデルにおける致死性を阻害する（すなわち、死亡を防ぐか、適切な対照と比較して少なくとも約10％死亡率を低下させる）。好ましくは、dAb単量体は、約5mg/kg、またはより好ましくは約1mg/kgを投与した場合、標準的なマウスLPS/D-ガラクトサミン-誘導型敗血性ショックモデルにおいて、適切な対照と比較して、致死性を少なくとも約25％、もしくは少なくとも約50％阻害する。
【０１６４】
特定の実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は、本明細書に記載した標準的L929アッセイもしくは標準的HeLa IL-8アッセイなどの標準的細胞アッセイにおいて、TNFR1を実質的にアゴナイズ（TNFR1のアゴニストとして作用）しない（すなわち1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μMもしくは5,000μMの濃度で存在した場合に、アッセイにおいてTNFα(100pg/ml)で誘導されるTNFR1-介在型活性の約5％以下となる）。
【０１６５】
別の実施形態において、リガンドは、腫瘍壊死因子受容体１(TNFR1, p55、 CD120a)と300nM〜5pMのKdで特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列もしくはdAbに対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む：TAR2h-12 (配列番号1)、 TAR2h-13 (配列番号2)、 TAR2h-14 (配列番号3)、 TAR2h-16 (配列番号4)、 TAR2h-17 (配列番号5)、 TAR2h-18 (配列番号6)、 TAR2h-19 (配列番号7)、 TAR2h-20 (配列番号8)、 TAR2h-21 (配列番号9)、 TAR2h-22 (配列番号10)、 TAR2h-23 (配列番号11)、 TAR2h-24 (配列番号12)、 TAR2h-25 (配列番号13)、 TAR2h-26 (配列番号14)、 TAR2h-27 (配列番号15)、 TAR2h-29 (配列番号16)、 TAR2h-30 (配列番号17)、 TAR2h-32 (配列番号18)、 TAR2h-33 (配列番号19)、 TAR2h-10-1 (配列番号20)、 TAR2h-10-2 (配列番号21)、 TAR2h-10-3 (配列番号22)、 TAR2h-10-4 (配列番号23)、 TAR2h-10-5 (配列番号24)、 TAR2h-10-6 (配列番号25)、 TAR2h-10-7 (配列番号26)、 TAR2h-10-8 (配列番号27)、 TAR2h-10-9 (配列番号28)、 TAR2h-10-10 (配列番号29)、 TAR2h-10-11 (配列番号30)、 TAR2h-10-12 (配列番号31)、 TAR2h-10-13 (配列番号32)、 TAR2h-10-14 (配列番号33)、 TAR2h-10-15 (配列番号34)、 TAR2h-10-16 (配列番号35)、 TAR2h-10-17 (配列番号36)、 TAR2h-10-18 (配列番号37)、 TAR2h-10-19 (配列番号38)、 TAR2h-10-20 (配列番号39)、 TAR2h-10-21 (配列番号40)、 TAR2h-10-22 (配列番号41)、 TAR2h-10-27 (配列番号42)、 TAR2h-10-29 (配列番号43)、 TAR2h-10-31 (配列番号44)、 TAR2h-10-35 (配列番号45)、 TAR2h-10-36 (配列番号46)、 TAR2h-10-37 (配列番号47)、 TAR2h-10-38 (配列番号48)、 TAR2h-10-45 (配列番号49)、 TAR2h-10-47 (配列番号50)、 TAR2h-10-48 (配列番号51)、 TAR2h-10-57 (配列番号52)、 TAR2h-10-56 (配列番号53)、 TAR2h-10-58 (配列番号54)、 TAR2h-10-66 (配列番号55)、 TAR2h-10-64 (配列番号56)、 TAR2h-10-65 (配列番号57)、 TAR2h-10-68 (配列番号58)、 TAR2h-10-69 (配列番号59)、 TAR2h-10-67 (配列番号60)、 TAR2h-10-61 (配列番号61)、 TAR2h-10-62 (配列番号62)、 TAR2h-10-63 (配列番号63)、 TAR2h-10-60 (配列番号64)、 TAR2h-10-55 (配列番号65)、 TAR2h-10-59 (配列番号66)、 TAR2h-10-70 (配列番号67)、 TAR2h-34 (配列番号68)、 TAR2h-35 (配列番号69)、 TAR2h-36 (配列番号70)、 TAR2h-37 (配列番号71)、 TAR2h-38 (配列番号72)、 TAR2h-39 (配列番号73)、 TAR2h-40 (配列番号74)、 TAR2h-41 (配列番号75)、 TAR2h-42 (配列番号76)、 TAR2h-43 (配列番号77)、 TAR2h-44 (配列番号78)、 TAR2h-45 (配列番号79)、 TAR2h-47 (配列番号80)、 TAR2h-48 (配列番号81)、 TAR2h-50 (配列番号82)、 TAR2h-51 (配列番号83)、 TAR2h-66 (配列番号84)、 TAR2h-67 (配列番号85)、 TAR2h-68 (配列番号86)、 TAR2h-70 (配列番号87)、 TAR2h-71 (配列番号88)、 TAR2h-72 (配列番号89)、 TAR2h-73 (配列番号90)、 TAR2h-74 (配列番号91)、 TAR2h-75 (配列番号92)、 TAR2h-76 (配列番号93)、 TAR2h-77 (配列番号94)、 TAR2h-78 (配列番号95)、 TAR2h-79 (配列番号96)、 TAR2h-15 (配列番号97)、 TAR2h-131-8 (配列番号98)、 TAR2h-131-24 (配列番号99)、 TAR2h-15-8 (配列番号100)、 TAR2h-15-8-1 （配列番号101)、 TAR2h-15-8-2 (配列番号102)、 TAR2h-185-23 (配列番号103)、 TAR2h-154-10-5 (配列番号104)、 TAR2h-14-2 (配列番号105)、 TAR2h-151-8 (配列番号106)、 TAR2h-152-7 (配列番号107)、 TAR2h-35-4 (配列番号108)、 TAR2h-154-7 (配列番号109)、 TAR2h-80 (配列番号110)、 TAR2h-81 (配列番号111)、 TAR2h-82 (配列番号112)、 TAR2h-83 (配列番号113)、 TAR2h-84 (配列番号114)、 TAR2h-85 (配列番号115)、 TAR2h-86 (配列番号116)、 TAR2h-87 (配列番号117)、 TAR2h-88 (配列番号118)、 TAR2h-89 (配列番号119)、 TAR2h-90 (配列番号120)、 TAR2h-91 (配列番号121)、 TAR2h-92 (配列番号122)、 TAR2h-93 (配列番号123)、 TAR2h-94 (配列番号124)、 TAR2h-95 (配列番号125)、 TAR2h-96 (配列番号126)、 TAR2h-97 (配列番号127)、 TAR2h-99 (配列番号128)、 TAR2h-100 (配列番号129)、 TAR2h-101 (配列番号130)、 TAR2h-102 (配列番号131)、 TAR2h-103 (配列番号132)、 TAR2h-104 (配列番号133)、 TAR2h-105 (配列番号134)、 TAR2h-106 (配列番号135)、 TAR2h-107 (配列番号136)、 TAR2h-108 (配列番号137)、 TAR2h-109 (配列番号138)、 TAR2h-110 (配列番号139)、 TAR2h-111 (配列番号140)、 TAR2h-112 (配列番号141)、 TAR2h-113 (配列番号142)、 TAR2h-114 (配列番号143)、 TAR2h-115 (配列番号144)、 TAR2h-116 (配列番号145)、 TAR2h-117 (配列番号146)、 TAR2h-118 (配列番号147)、 TAR2h-119 (配列番号148)、 TAR2h-120 (配列番号149)、 TAR2h-121 (配列番号150)、 TAR2h-122 (配列番号151)、 TAR2h-123 (配列番号152)、 TAR2h-124 (配列番号153)、 TAR2h-125 (配列番号154)、 TAR2h-126 (配列番号155)、 TAR2h-127 (配列番号156)、 TAR2h-128 (配列番号157)、 TAR2h-129 (配列番号158)、 TAR2h-130 (配列番号159)、 TAR2h-131 (配列番号160)、 TAR2h-132 (配列番号161)、 TAR2h-133 (配列番号162)、 TAR2h-151 (配列番号163)、 TAR2h-152 (配列番号164)、 TAR2h-153 (配列番号165)、 TAR2h-154 (配列番号166)、 TAR2h-159 (配列番号167)、 TAR2h-165 (配列番号168)、 TAR2h-166 (配列番号169)、 TAR2h-168 (配列番号170)、 TAR2h-171 (配列番号171)、 TAR2h-172 (配列番号172)、 TAR2h-173 (配列番号173)、 TAR2h-174 (配列番号174)、 TAR2h-176 (配列番号175)、 TAR2h-178 (配列番号176)、 TAR2h-201 (配列番号177)、 TAR2h-202 (配列番号178)、 TAR2h-203 (配列番号179)、 TAR2h-204 (配列番号180)、 TAR2h-185-25 (配列番号181)、 TAR2h-154-10 (配列番号182)、 TAR2h-205 (配列番号183)、 TAR2h-10 (配列番号184)、 TAR2h-5 (配列番号185)、 TAR2h-5d1 (配列番号186)、 TAR2h-5d2 (配列番号187)、 TAR2h-5d3 (配列番号188)、 TAR2h-5d4 (配列番号189)、 TAR2h-5d5 (配列番号190)、 TAR2h-5d6 (配列番号191)、 TAR2h-5d7 (配列番号192)、 TAR2h-5d8 (配列番号193)、 TAR2h-5d9 (配列番号194)、 TAR2h-5d10 (配列番号195)、 TAR2h-5d11 (配列番号196)、 TAR2h-5d12 (配列番号197)、 および TAR2h-5d13 (配列番号198)。
【０１６６】
別の実施形態において、リガンドは、腫瘍壊死因子受容体１(TNFR1、 p55、 CD120a)と300nM〜5pMのKdで特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、配列番号216〜配列番号433のいずれかのアミノ酸配列を有するdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１６７】
別の実施形態において、リガンドは、腫瘍壊死因子受容体１(TNFR1、 p55、 CD120a)と300nM〜5pMのKdで特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列もしくはdAbに対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む：TAR2m-14 (配列番号199)、 TAR2m-15 (配列番号200)、 TAR2m-19 (配列番号201)、 TAR2m-20 (配列番号202)、 TAR2m-21 (配列番号203)、 TAR2m-24 (配列番号204)、 TAR2m-21-23 (配列番号205)、 TAR2m-21-07 (配列番号206)、 TAR2m-21-43 (配列番号207)、 TAR2m-21-48 (配列番号208)、 TAR2m-21-10 (配列番号209)、 TAR2m-21-06 (配列番号210)、 および TAR2m-21-17 (配列番号211)。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、リガンドはTNFR1と結合するdAb単量体を含み、TNFR1（例えばマウスおよび／またはヒトTNFR1）への結合について本明細書に開示されたdAbのいずれかと競合する。
【０１６９】
本発明のリガンドは、TNFR1に対する結合特異性を有する非-免疫グロブリン結合部を含むことができ、好ましくはTNFR1の機能（例えばTNFαとの結合、TNFαとの結合後のシグナル伝達）を阻害することができるものであり、この非-免疫グロブリン結合部は、TNFR1と結合するVH、VLもしくはVHHのCDRを1、2または3個と、そして適切な足場（scaffold）を含む。特定の実施形態において、非-免疫グロブリン結合部は、TNFR1と結合するVH、VLもしくはVHHのCDR3を含むがCDR1またはCDR2を含まず、そして適切な足場を含む。別の実施形態において、非-免疫グロブリン結合部はTNFR1と結合するVH、VLもしくはVHHのCDR1およびCDR2を含むがCDR3を含まず、そして適切な足場を含む。別の実施形態において、非-免疫グロブリン結合部はTNFR1と結合するVH、VLもしくはVHHのCDR1、CDR2およびCDR3と適切な足場とを含む。好ましくは、これらの実施形態のリガンドのCDR（1個もしくは複数）は、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのCDRである。好ましくは、非-免疫グロブリン結合部は、本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDRを1個、2個または3個含む。別の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合するVH、VLもしくはVHHのCDR3のみを含む。非-免疫グロブリンドメインは、本明細書に記載した抗TNFR1 dAbの1個、2個もしくは3個のCDRに対して配列同一性を有する1以上の領域を含むアミノ酸配列を含み得る。例えば、非-免疫グロブリンドメインは、本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR1、CDR2および／またはCDR3と少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、または少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。更により好ましくは、非-免疫グロブリン結合部は、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193 および TAR2h-131-194のCDRの1個、2個または3個を含む。
【０１７０】
本発明はまた、TNFR1に対する結合特異性がある結合部位をもつタンパク質成分を含むリガンドに関し、該タンパク質成分は、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193 および TAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR3のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、TNFR1に対する結合特異性がある結合部位をもつタンパク質成分を含むリガンドにおいて、該タンパク質成分は本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR3のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有し、また、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR1および／またはCDR2のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をも含む。
【０１７２】
別の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、ここでIL-4と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列と25以下のアミノ酸位置で相違し、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR1配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR1配列を有する。
【０１７３】
別の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列は、本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列と25以下のアミノ酸位置で相違し、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR2配列を有する。
【０１７４】
別の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列は、本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列と25以下のアミノ酸位置で相違し、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR3配列を有する。
【０１７５】
別の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列は、本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列と25以下のアミノ酸位置で相違し、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR1もしくはCDR2配列に対してそれぞれ少なくとも50％の同一性を有するCDR1配列およびCDR2配列を有する。
【０１７６】
別の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列は、本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列と25以下のアミノ酸位置で相違し、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR2もしくはCDR3配列に対してそれぞれ少なくとも50％の同一性を有するCDR2配列およびCDR3配列を有する。
【０１７７】
別の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列は、本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列と25以下のアミノ酸位置で相違し、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR1もしくはCDR3配列に対してそれぞれ少なくとも50％の同一性を有するCDR1配列およびCDR3配列を有する。
【０１７８】
別の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列は、本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列と25以下のアミノ酸位置で相違し、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR1、CDR2もしくはCDR3配列に対してそれぞれ少なくとも50％の同一性を有するCDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列を有する。
【０１７９】
別の実施形態において、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンドであり、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR2配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR2配列を有する。
【０１８０】
別の実施形態において、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンドであり、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR3配列に対して少なくとも50％の同一性を有するCDR3配列を有する。
【０１８１】
別の実施形態において、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンドであり、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR1およびCDR2配列に対してそれぞれ少なくとも50％の同一性を有するCDR1およびCDR2配列を有する。
【０１８２】
別の実施形態において、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンドであり、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR2およびCDR3配列に対してそれぞれ少なくとも50％の同一性を有するCDR2およびCDR3配列を有する。
【０１８３】
別の実施形態において、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンドであり、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR1およびCDR3配列に対してそれぞれ少なくとも50％の同一性を有するCDR1およびCDR3配列を有する。
【０１８４】
別の実施形態において、本発明は、TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンドであり、該TNFR1と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、TAR2h-131-511、 TAR2h-131-193およびTAR2h-131-194などの本明細書に開示した抗TNFR1 dAbのCDR1、CDR2およびCDR3配列に対してそれぞれ少なくとも50％の同一性を有するCDR1、CDR2およびCDR3配列を有する。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、ヒトTNFR1と結合するdAbを含むリガンドは、ヒトTNFR1のアンタゴニストであり、ここでこのリガンドは、TNFα-誘導性炎症またはTNFα-誘導性炎症メディエーターを阻害するために必要なエタネルセプト（etanercept）（ENBREL、Immunex Corporation）の投与量の1/2以下、1/3以下、1/4以下、1/5以下、1/10以下、1/15以下、1/20以下、1/25以下、または1/30以下の投与量[mg/kg]で、実質的に同じか、同じ程度まで、上記TNFα-誘導性炎症またはTNFα-誘導性炎症メディエーターを阻害する。例えば、リガンドは、TNFα-誘導性の組織（例えば肺）への細胞流入、初期作用性好中球化学誘引物質KCおよびMIP-1、および後期作用性ケモカインMCP-1および接着分子E-セレクチンなどの炎症性メディエーターの産生、濃度もしくはレベルのTNFα-誘導性の上昇を、実質的に同じかまたは同じレベルの阻害を達成するために必要なエタネルセプト（ENBREL、Immunex Corporation）の投与量の1/2以下、1/3以下、1/4以下、1/5以下、1/10以下、1/15以下、1/20以下、1/25以下、または1/30以下の投与量[mg/kg]で阻害することができる。好ましくは、阻害のレベルは少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。
【０１８６】
dAb単量体は、任意の適切な免疫グロブリン可変ドメインを含むことができ、好ましくはヒト可変ドメインもしくはヒトのフレームワーク領域を含む可変ドメインを含む。特定の実施形態において、dAb単量体は本明細書に記載した普遍的フレームワークを含む。
【０１８７】
普遍的フレームワークは、VLフレームワーク（VλまたはVκ）、例えばヒト生殖細胞系列（germline）DPK1、 DPK2、 DPK3、 DPK4、 DPK5、 DPK6、 DPK7、 DPK8、 DPK9、 DPK10、 DPK12、 DPK13、 DPK15、 DPK16、 DPK18、 DPK19、 DPK20、 DPK21、 DPK22、 DPK23、 DPK24、 DPK25、 DPK26 もしくはDPK 28免疫グロブリン遺伝子セグメントによってコードされたフレームワークアミノ酸配列を含むフレームワークであり得る。必要に応じて、VLフレームワークは更にヒト生殖細胞系列Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、またはJκ5免疫グロブリン遺伝子セグメントによってコードされたフレームワークアミノ酸配列を含み得る。
【０１８８】
別の実施形態において、普遍的フレームワークは、VHフレームワーク、例えばヒト生殖細胞系列DP4、 DP7、 DP8、 DP9、 DP10、 DP31、 DP33、 DP38、 DP45、 DP46、 DP47、 DP49、 DP50、 DP51、 DP53、 DP54、 DP65、 DP66、 DP67、 DP68 またはDP69免疫グロブリン遺伝子セグメントによってコードされたフレームワークアミノ酸配列を含むフレームワークであり得る。必要に応じて、VHフレームワークは更にヒト生殖細胞系列JH1、 JH2、 JH3、 JH4、 JH4b、 JH5 および JH6免疫グロブリン遺伝子セグメントによってコードされたフレームワークアミノ酸配列を含み得る。
【０１８９】
特定の実施形態において、dAb単量体はDPK9VLフレームワーク、またはDP47、DP45およびDP38からなる群より選択されるVHフレームワークを含む。
【０１９０】
特定の実施形態において、dAb単量体は、ヒト生殖細胞系列の抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む1以上のフレームワーク領域を含むか、または1以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列がヒト生殖細胞系列の抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して合計5個までのアミノ酸の差異を含む。
【０１９１】
別の実施形態において、dAb単量体のFW1、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列の抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、またはFW1、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列は該ヒト生殖細胞系列の抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して合計10個までのアミノ酸の差異を含む。
【０１９２】
別の実施形態において、dAb単量体はFW1、FW2およびFW3領域を含み、該FW1、FW2およびFW3領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列の抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、dAb単量体はラクダ（Camelid）の免疫グロブリン可変ドメイン、またはラクダの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる免疫グロブリン可変ドメインに独特の1以上のフレームワークアミノ酸を含まない。
【０１９４】
核酸分子、ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載したリガンドをコードする単離された、および／または組換え核酸分子を提供する。本明細書において「単離された」と言及する核酸は、起源のゲノムDNAもしくは細胞内RNA（例えば細胞中もしくはライブラリーなどの核酸の混合物中に存在するもの）の核酸から分離された核酸であり、本質的に純粋な核酸、化学合成、生物学的および化学的方法の組み合わせによって製造される核酸、および単離されている組換え核酸を含み、本明細書記載の方法または他の適切な方法によって得られる核酸を含む（例えばDaugherty, B.L.ら, Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P.およびJ.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)を参照のこと）。
【０１９５】
本明細書において「組換え」と言及する核酸は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および／または制限酵素を使用したベクター中へのクローニングなどの人工的な組換えの方法に依存する手法によって産生される核酸を含む、組換えDNA法によって製造された核酸である。
【０１９６】
特定の実施形態において、単離された、および／または組換え核酸は、本明細書記載のリガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、該リガンドは、本明細書に開示するTNFR1と結合するdAbのアミノ酸配列と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１９７】
例えば、いくつかの実施形態において、単離された、および／または組換え核酸はTNFR1に対する結合特異性を有するリガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、該リガンドは、以下からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：TAR2m-15-8 (配列番号216)、TAR2m-15-12 (配列番号217)、TAR2m-15-2 (配列番号218)、TAR2m-15-5 (配列番号219)、TAR2m-15-6 (配列番号220)、TAR2m-15-9 (配列番号221)、Tar2h-131-1 (配列番号222)、Tar2h-131-2 (配列番号223)、Tar2h-131-3 (配列番号224)、Tar2h-131-4 (配列番号225)、Tar2h-131-5 (配列番号226)、Tar2h-131-6 (配列番号227)、Tar2h-131-7 (配列番号228)、Tar2h-131-8 (配列番号229)、Tar2h-131-9 (配列番号230)、Tar2h-131-10 (配列番号231)、Tar2h-131-11 (配列番号232)、Tar2h-131-12 (配列番号233)、Tar2h-131-13 (配列番号234)、Tar2h-131-14 (配列番号235)、Tar2h-131-15 (配列番号236)、Tar2h-131-16 (配列番号237)、Tar2h-131-17 (配列番号238)、Tar2h-131-18 (配列番号239)、Tar2h-131-19 (配列番号240)、Tar2h-131-20 (配列番号241)、Tar2h-131-21 (配列番号242)、Tar2h-131-22 (配列番号243)、Tar2h-131-23 (配列番号244)、Tar2h-131-24 (配列番号245)、Tar2h-131-25 (配列番号246)、Tar2h-131-26 (配列番号247)、Tar2h131-27 (配列番号248)、Tar2h131-28 (配列番号249)、Tar2h131-29 (配列番号250)、Tar2h131-30 (配列番号251)、Tar2h131-31 (配列番号252)、Tar2h131-32 (配列番号253)、Tar2h131-33 (配列番号254)、Tar2h131-34 (配列番号255)、Tar2h131-35 (配列番号256)、Tar2h131-36 (配列番号257)、Tar2h131-37 (配列番号258)、Tar2h131-38 (配列番号259)、Tar2h131-39 (配列番号260)、Tar2h131-40 (配列番号261)、Tar2h131-41 (配列番号262)、Tar2h131-42 (配列番号263)、Tar2h131-43 (配列番号264)、Tar2h131-44 (配列番号265)、Tar2h131-45 (配列番号266)、Tar2h131-46 (配列番号267)、Tar2h131-47 (配列番号268)、Tar2h131-48 (配列番号269)、Tar2h131-49 (配列番号270)、Tar2h-131-50 (配列番号271)、Tar2h-131-51 (配列番号272)、Tar2h-131-52 (配列番号273)、Tar2h-131-53 (配列番号274)、Tar2h-131-54 (配列番号275)、Tar2h-131-55 (配列番号276)、Tar2h-131-56 (配列番号277)、Tar2h-131-57 (配列番号278)、Tar2h-131-58 (配列番号279)、Tar2h-131-59 (配列番号280)、Tar2h-131-60 (配列番号281)、Tar2h-131-61 (配列番号282)、Tar2h-131-62 (配列番号283)、Tar2h-131-63 (配列番号284)、Tar2h-131-64 (配列番号285)、Tar2h-131-65 (配列番号286)、Tar2h-131-66 (配列番号287)、Tar2h-131-67 (配列番号288)、Tar2h-131-68 (配列番号289)、Tar2h-131-69 (配列番号290)、Tar2h-131-70 (配列番号291)、Tar2h-131-71 (配列番号292)、Tar2h-131-72 (配列番号293)、Tar2h-131-73 (配列番号294)、Tar2h-131-74 (配列番号295)、Tar2h-131-75 (配列番号296)、Tar2h-131-76 (配列番号297)、Tar2h-131-77 (配列番号298)、Tar2h-131-78 (配列番号299)、Tar2h-131-79 (配列番号300)、Tar2h-131-80 (配列番号301)、Tar2h-131-81 (配列番号302)、Tar2h-131-82 (配列番号303)、Tar2h-131-83 (配列番号304)、Tar2h-131-86 (配列番号305)、Tar2h-131-87 (配列番号306)、Tar2h-131-88 (配列番号307)、Tar2h-131-89 (配列番号308)、Tar2h-131-90 (配列番号309)、Tar2h-131-91 (配列番号310)、Tar2h-131-92 (配列番号311)、Tar2h-131-93 (配列番号312)、Tar2h-131-94 (配列番号313)、Tar2h-131-95 (配列番号314)、Tar2h-131-96 (配列番号315)、Tar2h-131-97 (配列番号316)、Tar2h-131-99 (配列番号317)、Tar2h-131-100 (配列番号318)、Tar2h-131-101 (配列番号319)、Tar2h-131-102 (配列番号320)、Tar2h-131-103 (配列番号321)、Tar2h-131-104 (配列番号322)、Tar2h-131-105 (配列番号323)、Tar2h-131-106 (配列番号324)、Tar2h-131-107 (配列番号325)、Tar2h-131-108 (配列番号326)、Tar2h-131-109 (配列番号327)、Tar2h-131-110 (配列番号328)、Tar2h-131-111 (配列番号329)、Tar2h-131-112 (配列番号330)、Tar2h-131-113 (配列番号331)、Tar2h-131-114 (配列番号332)、Tar2h-131-115 (配列番号333)、Tar2h-131-116 (配列番号334)、Tar2h-131-117 (配列番号335)、Tar2h-131-120 (配列番号336)、Tar2h-131-121 (配列番号337)、Tar2h-131-122 (配列番号338)、Tar2h-131-123 (配列番号339)、Tar2h-131-124 (配列番号340)、Tar2h-131-125 (配列番号341)、Tar2h-131-126 (配列番号342)、Tar2h-131-127 (配列番号343)、Tar2h-131-128 (配列番号344)、Tar2h-131-129 (配列番号345)、Tar2h-131-130 (配列番号346)、Tar2h-131-131 (配列番号347)、Tar2h-131-132 (配列番号348)、Tar2h-131-136 (配列番号349)、Tar2h-131-151 (配列番号350)、Tar2h-131-180 (配列番号351)、Tar2h-131-181 (配列番号352)、Tar2h-131-182 (配列番号353)、Tar2h-131-183 (配列番号354)、Tar2h-131-184 (配列番号355)、Tar2h-131-185 (配列番号356)、Tar2h-131-188 (配列番号357)、Tar2h-131-189 (配列番号358)、Tar2h-131-190 (配列番号359)、Tar2h-131-191 (配列番号360)、Tar2h-131-192 (配列番号361)、Tar2h-131-193 (配列番号362)、Tar2h-131-194 (配列番号363)、Tar2h-131-195 (配列番号364)、Tar2h-131-196 (配列番号365)、Tar2h-131-197 (配列番号366)、Tar2h-131-198 (配列番号367)、Tar2h-131-500 (配列番号368)、Tar2h-131-501 (配列番号369)、Tar2h-131-502 (配列番号370)、Tar2h-131-503 (配列番号371)、Tar2h-131-504 (配列番号372)、Tar2h-131-505 (配列番号373)、Tar2h-131-506 (配列番号374)、Tar2h-131-507 (配列番号375)、Tar2h-131-508 (配列番号376)、Tar2h-131-509 (配列番号377)、Tar2h-131-510 (配列番号378)、Tar2h-131-511 (配列番号379)、Tar2h-131-512 (配列番号380)、Tar2h-131-513 (配列番号381)、Tar2h-131-514 (配列番号382)、Tar2h-131-515 (配列番号383)、Tar2h-131-516 (配列番号384)、Tar2h-131-517 (配列番号385)、Tar2h-131-518 (配列番号386)、Tar2h-131-519 (配列番号387)、Tar2h-131-520 (配列番号388)、Tar2h-131-521 (配列番号389)、Tar2h-131-522 (配列番号390)、Tar2h-131-523 (配列番号391)、Tar2h-131-524 (配列番号392)、Tar2h-131-525 (配列番号393)、Tar2h-131-526 (配列番号394)、Tar2h-131-527 (配列番号395)、Tar2h-131-528 (配列番号396)、Tar2h-131-529 (配列番号397)、Tar2h-131-530 (配列番号398)、Tar2h-131-531 (配列番号399)、Tar2h-131-532 (配列番号400)、Tar2h-131-533 (配列番号401)、TAR2h-131-534 (配列番号402)、Tar2h-131-535 (配列番号403)、Tar2h-131-536 (配列番号404)、Tar2h-131-537 (配列番号405)、Tar2h-131-538 (配列番号406)、Tar2h-131-539 (配列番号407)、Tar2h-131-539 (配列番号408)、Tar2h-131-539 (配列番号409)、Tar2h-131-540 (配列番号410)、Tar2h-131-541 (配列番号411)、Tar2h-131-542 (配列番号412)、Tar2h-131-543 (配列番号413)、Tar2h-131-544 (配列番号414)、Tar2h-131-545 (配列番号415)、Tar2h-131-546 (配列番号416)、Tar2h-131-547 (配列番号417)、Tar2h-131-548 (配列番号418)、Tar2h-131-549 (配列番号419)、Tar2h-131-550 (配列番号420)、Tar2h-131-551 (配列番号421)、Tar2h-131-552 (配列番号422)、Tar2h-131-553 (配列番号423)、Tar2h-131-554 (配列番号424)、Tar2h-131-555 (配列番号425)、Tar2h-131-556 (配列番号426)、Tar2h-131-557 (配列番号427)、Tar2h-131-558 (配列番号428)、Tar2h-131-559 (配列番号429)、Tar2h-131-560 (配列番号430)、Tar2h-131-561 (配列番号431)、Tar2h-131-562 (配列番号432)、およびTar2h-131-563 (配列番号433)。
【０１９８】
別の実施形態において、本明細書に記載されたTNFR1に対して結合特異性を有するリガンドをコードする単離された、および／または組換え核酸であって、上記核酸は、以下からなる群より選択される抗TNFR1 dAbをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む：Tar2h-131 (配列番号434)、Tar2h-131-1(配列番号435)、Tar2h-131-2(配列番号436)、Tar2h-131-3(配列番号437）、Tar2h-131-4(配列番号438)、Tar2h-131-5(配列番号439)、Tar2h-131-6(配列番号440)、Tar2h-131-7(配列番号441)、Tar2h-131-8(配列番号442)、Tar2h-131-9(配列番号443)、Tar2h-131-10(配列番号444)、Tar2h-131-11(配列番号445)、Tar2h-131-12(配列番号446)、Tar2h-131-13(配列番号447)、Tar2h-131-14(配列番号448)、Tar2h-131-15(配列番号449)、Tar2h-131-16(配列番号450)、Tar2h-131-17(配列番号451)、Tar2h-131-18(配列番号452)、Tar2h-131-19(配列番号453)、Tar2h-131-20(配列番号454)、Tar2h-131-21(配列番号455)、Tar2h-131-22(配列番号456)、Tar2h-131-23(配列番号457)、Tar2h-131-24(配列番号458)、Tar2h-131-25(配列番号459)、Tar2h-131-26(配列番号460)、Tar2h131-27(配列番号461)、Tar2h131-28(配列番号462)、Tar2h131-29(配列番号463)、Tar2h131-30(配列番号464)、Tar2h131-31(配列番号465)、Tar2h131-32(配列番号466)、Tar2h131-33(配列番号467)、Tar2h131-34(配列番号468)、Tar2h131-35(配列番号469)、Tar2h131-36(配列番号470)、Tar2h131-37(配列番号471)、Tar2h131-38(配列番号472)、Tar2h131-39(配列番号473)、Tar2h131-40(配列番号474)、Tar2h131-41(配列番号475)、Tar2h131-42(配列番号476)、Tar2h131-43(配列番号477)、Tar2h131-44(配列番号478)、Tar2h131-45(配列番号479)、Tar2h131-46(配列番号480)、Tar2h131-47(配列番号481)、Tar2h131-48(配列番号482)、Tar2h131-49(配列番号483)、Tar2h-131-50(配列番号484)、Tar2h-131-51(配列番号485)、Tar2h-131-52(配列番号486)、Tar2h-131-53(配列番号487)、Tar2h-131-54 (配列番号488)、Tar2h-131-55 (配列番号489)、Tar2h-131-56 (配列番号490)、Tar2h-131-57 (配列番号491)、Tar2h-131-58 (配列番号492)、Tar2h-131-59 (配列番号493)、Tar2h-131-60 (配列番号494)、Tar2h-131-61 (配列番号495)、Tar2h-131-62 (配列番号496)、Tar2h-131-63 (配列番号497)、Tar2h-131-64 (配列番号498)、Tar2h-131-65 (配列番号499)、Tar2h-131-66 (配列番号500)、Tar2h-131-67 (配列番号501)、Tar2h-131-68 (配列番号502)、Tar2h-131-69 (配列番号503)、Tar2h-131-70 (配列番号504)、Tar2h-131-71 (配列番号505)、Tar2h-131-72 (配列番号506)、Tar2h-131-73 (配列番号507)、Tar2h-131-74 (配列番号508)、Tar2h-131-75 (配列番号509)、Tar2h-131-76 (配列番号510)、Tar2h-131-77 (配列番号511)、Tar2h-131-78 (配列番号512)、Ta
r2h-131-79 (配列番号513)、Tar2h-131-80 (配列番号514)、Tar2h-131-81 (配列番号515)、Tar2h-131-82 (配列番号516)、Tar2h-131-83(配列番号517)、Tar2h-131-86 (配列番号518)、Tar2h-131-87 (配列番号519)、Tar2h-131-88 (配列番号520)、Tar2h-131-89 (配列番号521)、Tar2h-131-90 (配列番号522)、Tar2h-131-91 (配列番号523)、Tar2h-131-92 (配列番号524)、Tar2h-131-93 (配列番号525)、Tar2h-131-94 (配列番号526)、Tar2h-131-95 (配列番号527)、Tar2h-131-96 (配列番号528)、Tar2h-131-97 (配列番号529)、Tar2h-131-99 (配列番号530)、Tar2h-131-100(配列番号531)、Tar2h-131-101 (配列番号532)、Tar2h-131-102 (配列番号533)、Tar2h-131-103 (配列番号534)、Tar2h-131-104 (配列番号535)、Tar2h-131-105 (配列番号536)、Tar2h-131-106 (配列番号537)、Tar2h-131-107 (配列番号538)、Tar2h-131-108 (配列番号539)、Tar2h-131-109 (配列番号540)、Tar2h-131-110 (配列番号541)、Tar2h-131-111 (配列番号542)、Tar2h-131-112 (配列番号543)、Tar2h-131-113 (配列番号544)、Tar2h-131-114 (配列番号545)、Tar2h-131-115 (配列番号546)、Tar2h-131-116 (配列番号547)、Tar2h-131-117 (配列番号548)、Tar2h-131-120 (配列番号549)、Tar2h-131-121 (配列番号550)、Tar2h-131-122 (配列番号551)、Tar2h-131-123 (配列番号552)、Tar2h-131-124 (配列番号553)、Tar2h-131-125 (配列番号554)、Tar2h-131-126 (配列番号555)、Tar2h-131-127 (配列番号556)、Tar2h-131-128 (配列番号557)、Tar2h-131-129 (配列番号558)、Tar2h-131-130 (配列番号559)、Tar2h-131-131 (配列番号560)、Tar2h-131-132 (配列番号561)、Tar2h-131-136(配列番号562)、Tar2h-131-151(配列番号563)、Tar2h-131-180 (配列番号564)、Tar2h-131-181 (配列番号565)、Tar2h-131-182 (配列番号566)、Tar2h-131-183 (配列番号567)、Tar2h-131-184 (配列番号568)、Tar2h-131-185 (配列番号469)、Tar2h-131-188 (配列番号570)、Tar2h-131-189 (配列番号571)、Tar2h-131-190 (配列番号572)、Tar2h-131-191 (配列番号573)、Tar2h-131-192 (配列番号574)、Tar2h-131-193 (配列番号575)、Tar2h-131-194 (配列番号576)、Tar2h-131-195 (配列番号577)、Tar2h-131-196 (配列番号578)、Tar2h-131-197 (配列番号579)、Tar2h-131-198 (配列番号580)、Tar2h-131-500 (配列番号581)、Tar2h-131-501 (配列番号582)、Tar2h-131-502 (配列番号583)、Tar2h-131-503 (配列番号584)、Tar2h-131-504 (配列番号585)、Tar2h-131-505 (配列番号586)、Tar2h-131-506 (配列番号587)、Tar2h-131-507 (配列番号488)、Tar2h-131-508 (配列番号489)、Tar2h-131-509 (配列番号590)、Tar2h-131-510 (配列番号591)、Tar2h-131-511 (配列番号592)、Tar2h-131-512 (配列番号593)、Tar2h-131-513 (配列番号594)、Tar2h-131-514 (配列番号595)、Tar2h-131-515(配列番号596)、Tar2h-131-516(配列番号597)、Tar2h-131-517 (配列番号598)、Tar2h-131-518 (配列番号599)、Tar2h-131-519 (配列番号600)、Tar2h-131-520 (配列番号601)、Tar2h-131-521 (配列番号602)、Tar2h-131-522 (配列番号603)、Tar2h-131-523 (配列番号604)、Tar2h-131-524 (配列番号605)、Tar2h-131-525 (配列番号606)、Tar2h-131-526 (配列番号607)、Tar2h-131-527 (配列番号608)、Tar2h-131-528(配列番号609)、Tar2h-131-529 (配列番号610)、Tar2h-131-530 (配列番号611)、Tar2h-131-531 (配列番号612)、Tar2h-131-532 (配列番号613)、Tar2h-131-533 (配列番号614)、Tar2h-131-534 (配列番号615)、Tar2h-131-535 (配列番号616)、Tar2h-131-536 (配列番号617)、Tar2h-131-537 (配列番号618)、Tar2h-131-538 (配列番号619)、Tar2h-131-539 (配列番号620)、Tar2h-131-540 (配列番号621)、Tar2h-131-541 (配列番号622)、Tar2h-131-542 (配列番号623)、Tar2h-131-543 (配列番号624)、Tar2h-131-544 (配列番号625)、Tar2h-131-545 (配列番号626)、Tar2h-131-546 (配列番号627)、Tar2h-131-547 (配列番号628)、Tar2h-131-548 (配列番号629)、Tar2h-131-549 (配列番号630)、Tar2h-131-550(配列番号631)、Tar2h-131-551 (配列番号632)、Tar2h-131-552 (配列番号633)、Tar2h-131-553 (配列番号634)、Tar2h-131-554 (配列番号635)、Tar2h-131-555 (配列番号636)、Tar2h-131-556 (配列番号637)、Tar2h-131-557 (配列番号638)、Tar2h-131-558 (配列番号639)、Tar2h-131-559 (配列番号640)、Tar2h-131-560 (配列番号641)、Tar2h-131-561 (配列番号642)、Tar2h-131-562 (配列番号643)、Tar2m-15-2(配列番号645)、Tar2m-15-5(配列番号646)、Tar2m-15-6(配列番号647)、Tar2m-15-8(配列番号648)、Tar2m-15-9(配列番号649)、およびTar2m-15-12(配列番号650)。好ましくは、ヌクレオチド配列同一性は、選択された抗TNFR1 dAbをコードするヌクレオチド配列の全長にわたって決定する。
【０１９９】
本発明はまた、本発明の組換え核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施形態において、ベクターは、本発明の組換え核酸に機能的に連結した1以上の発現調節エレメントまたは配列を含む発現ベクターである。本発明はまた、本発明の組換え核酸分子またはベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。適切なベクター（例えばプラスミド、ファージミド）、発現調節エレメント、宿主細胞および本発明の組換え宿主細胞の製造方法は当分野において周知であり、その例は本明細書において更に記載する。
【０２００】
適切な発現ベクターは、多くの成分、例えば複製起点、選択マーカー遺伝子、転写調節エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター）などの1以上の発現調節エレメント、および／または1以上の翻訳シグナル、シグナル配列もしくはリーダー配列等を含み得る。発現調節エレメントおよびシグナル配列は、存在する場合には、ベクターもしくは他の起源によって提供され得る。例えば、抗体鎖をコードするクローニングした核酸の転写および／もしくは翻訳調節配列を、発現を指令するために用いることができる。
【０２０１】
プロモーターは、所望の宿主細胞中での発現のために提供され得る。プロモーターは構成的であっても誘導性であっても良い。例えば、プロモーターは、抗体、抗体鎖もしくはその一部をコードする核酸に、該核酸の転写を指令するように機能的に連結することができる。種々の適切なプロモーターが、原核生物宿主（例えば大腸菌のためのlac、tac、T3、T7プロモーター）および真核生物宿主（例えばシミアンウイルス40初期もしくは後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）のために利用可能である。
【０２０２】
更に、発現ベクターは、典型的には、ベクターを運ぶ宿主細胞の選択のための選択マーカー、および、複製可能な発現ベクターの場合には複製起点を含む。抗生物質または薬剤耐性を付与する産物をコードする遺伝子は一般的な選択マーカーであり、原核生物細胞（例えばラクタマーゼ遺伝子(アンピシリン耐性)、テトラサイクリン耐性のためのTet遺伝子）および真核生物細胞（例えばネオマイシン(G418もしくはゲネチシン)、gpt(ミコフェノール酸)、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）で用いることができる。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は種々の宿主中でメトトレキセートを用いた選択を可能とする。宿主の栄養素要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えばLEU2、URA3、HIS3）は酵母における選択マーカーとしてしばしば用いられる。ウイルス（例えばバキュロウイルス）またはファージベクター、および宿主細胞のゲノム中に統合され得るベクター（例えばレトロウイルスベクター）も意図される。哺乳動物細胞および原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ドロソフィラ・シュニーダー(Drosophila Schnieder) S2細胞、Sf9）および酵母（P.メタノリカ(P. methanolica)、P.パストリス(P. pastoris)、S.セレビシエ(S. cerevisiae)）における発現のために適切な発現ベクターは当分野において周知である。
【０２０３】
適切な宿主細胞は、原核生物細胞（細菌細胞(大腸菌、B.スブチリス(B. subtilis)および／もしくは他の適切な細菌等)を含む）、真核生物細胞（例えば真菌もしくは酵母細胞(ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、アスペルギルス(Aspergillus) sp.、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)等)）、または他の下等真核生物細胞、および昆虫由来などの高等真核生物細胞（例えばドロソフィラ・シュニーダーS2細胞、Sf9昆虫細胞(WO 94/26087(O'Connor))、哺乳動物(例えばCOS-1(ATCCアクセッション番号CRL-1650)およびCOS-7(ATCCアクセッション番号CRL-1651)などのCOS細胞、CHO(例えばATCCアクセッション番号CRL-9096、CHO DG44 (Urlaub, G. およびChasin, LA., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980))), 293 (ATCC アクセッション番号CRL-1573)、HeLa (ATCC アクセッション番号CCL-2)、CV1 (ATCC アクセッション番号CCL-70)、WOP (Dailey, L.ら, J. Virol., 54:739-749 (1985)）、3T3、293T (Pear, W. S.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993))、NS0 細胞、SP2/0、HuT 78細胞等）、または植物（例えばタバコ）であり得る。（例えばAusubel, F.M. 等編, 「分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)を参照のこと。）いくつかの実施形態において、宿主細胞は単離された宿主細胞であり、多細胞生物（例えば植物または動物）の一部ではない。好ましい実施形態において、宿主細胞は非-ヒトの宿主細胞である。
【０２０４】
本発明はまた、本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞を、該組換え核酸の発現に適した条件下で維持し、それによって該組換え核酸を発現させてリガンドを製造することを含む、本発明のリガンド（例えば二重特異性リガンド、多重特異性リガンド）の製造方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は更にリガンドを単離することを含む。
【０２０５】
リガンドフォーマット
リガンドおよびdAb単量体は、一重もしくは多重特異性抗体または抗体フラグメントとして、あるいは一重もしくは多重特異性非-抗体構造中にフォーマットすることができる。適切なフォーマットとして、任意の適切なポリペプチド構造であって、抗体の可変ドメインまたはその1以上のCDRが、その構造上に抗原に対する結合特異性を付与するように組み込まれることができるものが挙げられる。種々の適切な抗体フォーマットが当分野で公知であり、例えばIgG様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／もしくは軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、上記のいずれかの抗原結合フラグメント（例えばFvフラグメント(例えば単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合Fv）、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント）、単一可変ドメイン（例えばVH、VL、VHH）、dAb、および上記のいずれかの改変体（例えばポリアルキレングリコール(例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール)もしくは他の適切なポリマーの共有結合による改変）等がある。単一可変ドメインおよびdAbのPEG化、これらの適切な調製方法、PEG化した単一可変ドメインおよびdAb単量体および多量体の延長したin vivo半減期、適切なPEG、PEGの好ましい流体力学的サイズ、およびPEG化した単一可変ドメインおよびdAb単量体および多量体の好ましい流体力学的サイズに関し、米国を指定して2003年6月30日に出願されたPCT/GB03/002804（WO 2004/081026）を参照のこと。PCT/GB03/002804（WO 2004/081026）の教示の全ては、上記に関する部分を含み、参照として本明細書に組み入れる。
【０２０６】
リガンドは、例えば(Gly4Ser)n（式中、n＝1〜8、例えば2、3、4、5、6または7）などの適切なリンカーを用い、所望のdAb単量体の二量体、三量体または多量体としてフォーマットすることができる。必要であれば、dAb単量体、二量体および三量体を含むリガンドを、CH2およびCH3ドメインの一方もしくは双方、および場合によってヒンジ領域を含む抗体のFc領域に連結することができる。例えば、単鎖ヌクレオチド配列としてFc領域に連結したリガンドをコードするベクターを用いてこうしたポリペプチドを調製することができる。
【０２０７】
リガンドおよびdAb単量体はまた、非-抗体マルチリガンド構造中に組み合わせて、および／またはフォーマットして、標的分子を同じ抗原と結合させ、それによって優れた親和性を提供する多価複合体を形成することができる。例えばSpAなどの天然の細菌受容体をCDRのグラフトのための足場として用いて、1以上のエピトープに特異的に結合するリガンドを作製することができる。この手法の詳細は米国特許第5,831,012号に記載されている。適切な他の足場としては、フィブロネクチンおよびアフィボディ(affibody)に基づくものが挙げられる。適切な手法の詳細はWO 98/58965に記載されている。他の適切な足場としては、van den Beukenら, J. Mol. Biol. 310:591-601 (2001)に記載されているようなリポカリンおよびCTLA4、また、例えば細菌GroELの環構造もしくは他のシャペロンポリペプチドに基づく、WO 00/69907（Medical Research Council）に記載されているものなどの足場が挙げられる。タンパク質の足場は組み合わせることができ、例えばCDRをCTLA4の足場にグラフトし、免疫グロブリンVHまたはVLドメインと共に用いてリガンドを形成することができる。同様に、フィブロネクチン、リポカリンおよび他の足場を組み合わせることができる。
【０２０８】
所望の任意のフォーマットを調製するために適切な種々の方法が当分野において公知である。例えば、抗体鎖およびフォーマット（例えばIgG様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／もしくは軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体）は、適切な発現構築物の発現および／または適切な細胞（例えばフォーマットをコードする組換え構築物を含有する組換え宿主細胞、ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ）の培養によって調製することができる。更に、抗体もしくは抗体鎖の抗原結合フラグメント（例えばFvフラグメント(例えば単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合Fv)、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント）などのフォーマットは、適切な発現構築物の発現によって、または例えばパパインもしくはペプシンを用いた抗体の酵素的分解によって調製することができる。
【０２０９】
リガンドは、例えばWO 03/002609（その教示全体を参照として本明細書に組み入れる）に記載されたように、二重特異性リガンドまたは多重特異性リガンドとしてフォーマットすることができる。二重特異性リガンドは、異なる結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。このような二重特異性リガンドは、重鎖および軽鎖ドメインの組み合わせを含み得る。例えば、二重特異性リガンドはVHドメインおよびVLドメインを含むことができ、これらは（例えばGly4Serなどの適切なリンカーを用いて）scFvの形態に共に連結するか、あるいは二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメント（例えばF(ab')2フラグメント）にフォーマットし得る。二重特異性リガンドは、抗原もしくはエピトープに協調的に結合する伝統的な2本鎖抗体の抗原結合部位を形成する相補的VH/VL対を含まない。その代わりに、二重フォーマットリガンドは、各々のVドメインが異なる結合特異性を有するVH/VL相補対を含んでいる。
【０２１０】
更に、二重特異性リガンドは、必要であれば1以上のCHまたはCLドメインを含み得る。また必要であればヒンジ領域ドメインも含み得る。ドメインのこのような組み合わせは、例えば、IgGもしくはIgM、またはそのフラグメント、例えばFv、scFv、FabもしくはF(ab')2分子などの天然の抗体を模倣することができる。VH、VL、CH1およびCLドメインを含むIgG分子の1本のアームなどの他の構造も考えられる。好ましくは、本発明の二重特異性リガンドは2つの可変ドメインのみを含むが、こうしたリガンドのいくつかが同じタンパク質中に一緒に組み込まれていても良く、例えばこのようなリガンドの2つがIgGもしくは多量体免疫グロブリン、例えばIgM中に組み込まれていても良い。あるいはまた、別の実施形態において複数の二重特異性リガンドを組み合わせて多量体を形成する。例えば、2種の異なる二重特異性リガンドを組み合わせて四重特異性の分子を作製する。当業者は、本発明の方法に従って作製された二重特異性リガンドの軽鎖および重鎖の可変領域が同じポリペプチド鎖上にあっても、あるいは異なるポリペプチド鎖上にあっても良いことを認識するであろう。可変領域が異なるポリペプチド鎖上にある場合、これらはリンカー、一般にはフレキシブルなリンカー（ポリペプチド鎖等）、化学的連結基、または当分野において公知の他の任意の方法を介して連結されていても良い。
【０２１１】
多重特異性リガンドは2以上のエピトープ結合特異性を有する。一般に、多重特異性リガンドは、dAbもしくはエピトープに対する結合部位を含む非-抗体タンパク質ドメイン（例えばアフィボディ(affibody)、SpAドメイン、LDL受容体クラスAドメイン、EGFドメイン、アビマー）などの2以上のエピトープ結合ドメインを含む。多重特異性リガンドは、本明細書において記載するように更にフォーマットされ得る。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、リガンドはIgG様のフォーマットである。このようなフォーマットはIgG分子の伝統的な4本鎖構造（2本の重鎖および2本の軽鎖）を有し、ここで1以上の可変領域（VHおよび／もしくはVL）が所望の特異性を有するdAbまたは単一可変ドメインで置換されている。好ましくは、可変領域（2個のVH領域および2個のVL領域）のそれぞれがdAbまたは単鎖の可変ドメインで置換されている。IgG様フォーマットに含まれるdAbもしくは単一可変ドメインは同じ特異性を有するか、あるいは異なる特異性を有することができる。いくつかの実施形態において、IgG様フォーマットは4価であり、1種、2種、3種または4種の特異性を有し得る。例えば、IgG様フォーマットは一重特異的であって、同じ特異性を有する4個のdAbを含むか；二重特異的であって、同じ特異性を有する3個のdAbと異なる特異性を有する別のdAbを含むか；二重特異的であって、同じ特異性を有する2個のdAbと、共通であるが前記と異なる特異性を有する2個のdAbを含むか；三重特異的であって、同じ特異性を有する第一および第二のdAb、異なる特異性を有する第三のdAb、および第一、第二および第三のdAbと異なる特異性を有する第四のdAbを含むか；あるいは四重特異的であって、それぞれ異なる特異性を有する4個のdAbを含むことができる。IgG様フォーマットの抗原結合フラグメント（例えばFab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv）を調製することができる。好ましくは、IgG様フォーマットまたはその抗原結合フラグメントはTNFR1を架橋しない。
【０２１３】
半減期延長フォーマット
TNFR1アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体、二量体もしくは多量体、二重特異性フォーマット、多重特異性フォーマット）は、in vivo血清半減期を延長するようにフォーマットすることができる。in vivo半減期の延長は、免疫グロブリン、特に抗体、および最も特殊にはdAbなどのサイズの小さい抗体フラグメントのin vivoにおける適用において有用である。このようなフラグメント（Fv、ジスルフィド結合Fv、Fab、scFv、dAb）は体内から速やかに除去され、このことが臨床応用を厳しく制限している。
【０２１４】
TNFR1アンタゴニストは、例えばポリアルキレングリコール基（例えばポリエチレングリコール(PEG)基）、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくは少なくともそのトランスフェリン結合部、抗体Fc領域との結合によって、または抗体ドメインへのコンジュゲーションによって、より大きな流体力学的サイズを有するようにフォーマットすることができる。いくつかの実施形態において、アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）はPEG化される。好ましくは、PEG化アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）は、PEG化されていない同じリガンドと実質的に同じ親和性でTNFR1と結合する。例えば、リガンドはPEG化されたdAb単量体であり得、ここでPEG化dAb単量体は、PEG化されていない形態のdAbの親和性と約1000倍以下、好ましくは約100倍以下、より好ましくは約10倍以下の差の親和性で、またはPEG化されていない形態と比較して実質的に変わらない親和性でTNFR1と結合する。
【０２１５】
dAb単量体などの小さいアンタゴニストは、抗体のより大きな抗原結合フラグメントとして、または抗体としてフォーマットする（例えばFab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFvとしてフォーマットする）ことができる。アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）の流体力学的サイズおよびその血清半減期は、本明細書に記載した、in vivoでの半減期を延長させる抗原もしくはエピトープと結合する結合ドメイン（例えば抗体または抗体フラグメント）にアンタゴニストをコンジュゲートまたは連結することによっても延長させることができる。例えば、アンタゴニスト（例えばリガンド、dAb単量体）は、抗血清アルブミンもしくは抗新生児型Fc受容体抗体または抗体フラグメント、例えば抗SAもしくは抗新生児型Fc受容体dAb、Fab、Fab'またはscFvに、あるいは抗SAアフィボディ(affibody)もしくは抗新生児型Fc受容体アフィボディ(affibody)にコンジュゲート、または連結させることができる。
【０２１６】
本発明に係るTNFR1結合リガンドにおける使用のために適したアルブミン、アルブミンフラグメントもしくはアルブミン変異体の例は、WO 2005/077042A2に記載されており、これを参照としてその全体を本明細書に組み入れる。特に、以下のアルブミン、アルブミンフラグメントもしくはアルブミン変異体を本発明において使用することができる。
【０２１７】
・配列番号1(WO 2005/077042A2に開示されたもの、この配列を参照として本明細書の開示中に組み入れる);
・WO 2005/077042 A2中の配列番号1のアミノ酸1-387を含むかこれからなるアルブミンフラグメントまたは変異体;
・以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むアルブミン、またはそのフラグメントもしくは変異体：
(a)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸54〜61;
(b)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸76〜89;
(c)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸92〜l00;
(d)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸170〜176;
(e)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸247〜252;
(f)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸266〜277;
(g)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸280〜288;
(h)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸362〜368;
(i)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸439〜447;
(j)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸462〜475;
(k)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸478〜486;および
(l)WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸560〜566。
【０２１８】
本発明に係るTNFR1結合リガンドにおける使用に適したアルブミン、フラグメントおよび類似体の更なる例はWO 03/076567 A2に記載されており、これを参照としてその全体を本明細書に組み入れる。特に、以下のアルブミン、フラグメントまたは変異体を本発明において使用することができる。
【０２１９】
・WO 03/076567 A2、例えば図３に記載されたヒト血清アルブミン（この配列情報を参照として本明細書の開示中に組み入れる）；
・585アミノ酸の非グリコシル化ポリペプチド単鎖からなり、分子量66,500のヒト血清アルブミン（HA）（Melounら, FEBS Letters 58:136 (1975); Behrensら, Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawnら, Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghettiら, J. Biol. Chem. 261:6747 (1986)を参照のこと）；
・Weitkampら, Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)に記載されたアルブミンの多型変異体もしくは類似体またはフラグメント；
・EP 322094に記載されたアルブミンフラグメントまたは変異体、例えばHA(1-373)、HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)、およびHA(1-419)および1-369ないし1-419の間のフラグメント；
・EP 399666に記載されたアルブミンフラグメントまたは変異体、例えばHA(1-177)およびHA(1-200)およびHA(1-X)（Xは178〜199の任意の数）間のフラグメント。
【０２２０】
（1以上の）半減期延長成分（例えばアルブミン、トランスフェリンおよびそのフラグメントおよび類似体）を本発明のTNFR1結合リガンドにおいて用いる場合、例えばTNFR1結合成分（例えば抗TNFR1 dAbまたは抗体フラグメント）への直接的融合によって、（例えば融合タンパク質をコードする単一のヌクレオチド構築物の使用によるような）適切な方法を用いてこれをコンジュゲートすることができ、この融合タンパク質はTNFR1結合成分のN-末端またはC-末端に位置する半減期延長成分と共に単一のポリペプチド鎖としてコードされる。あるいはまた、コンジュゲーションは、成分間にペプチドリンカー、例えばWO 03/076567A2またはWO 2004/003019に記載されているペプチドリンカー（これらのリンカーの開示は、本発明における使用のための例を提供する本明細書の開示に参照として組み入れる）を用いて達成することができる。
【０２２１】
典型的には、in vivoにおける血清半減期を延ばすポリペプチドは、in vivoで天然に生じ、生体内（例えばヒト）から不要な物質を除去する内在的メカニズムによる分解または除去に対して抵抗するポリペプチドである。例えば、in vivoにおける血清半減期を延ばすポリペプチドは、細胞外マトリクス由来のタンパク質、血液中に見られるタンパク質、血液脳関門もしくは神経組織中に見られるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚もしくは骨に局在するタンパク質、ストレスタンパク質、疾患に特異的なタンパク質、またはFcの輸送に関与するタンパク質から選択され得る。
【０２２２】
in vivoにおける血清半減期を延ばす適切なポリペプチドとして、例えばトランスフェリン受容体特異的リガンド-神経薬剤融合タンパク質（米国特許第5,977,307号を参照、この教示は参照として本明細書に組み入れる）、脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば可溶性トランスフェリン受容体）、インスリン、インスリン様成長因子１（IGF1）受容体、インスリン-様成長因子２（IGF2）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子X、α1-アンチトリプシンおよびHNF 1αが挙げられる。また血清半減期を延ばす適切なポリペプチドとして、α-1糖タンパク質（オロソムコイド；AAG）、α-1アンチキモトリプシン（ACT）、α-1ミクログロブリン（プロテインHC; AIM）、アンチトロンビンIII（AT III）、アポリポタンパク質A-1（Apo A-1）、アポリポタンパク質B（Apo B）、セルロプラスミン（Cp）、補体成分C3（C3）、補体成分C4（C4）、C1エステラーゼ阻害剤（C1 INH）、C反応性タンパク質（CRP）、フェリチン（FER）、ヘモペキシン（HPX）、リポタンパク質(a)（Lp(a)）、マンノース結合タンパク質（MBP）、ミオグロビン（Myo）、プレアルブミン（トランスサイレチン；PAL）、レチノール結合タンパク質（RBP）、およびリウマチ因子（RF）が挙げられる。
【０２２３】
細胞外マトリクス由来の適切なタンパク質としては、例えばコラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチンが挙げられる。コラーゲンは細胞外マトリクスの主要タンパク質である。約15種類の型のコラーゲン分子が現在知られており、体の異なる部位で見出されている。例えばI型コラーゲン（体内コラーゲンの90％を占める）は骨、皮膚、腱、靱帯、角膜、内臓に見られ、またII型コラーゲンは軟骨、脊柱盤、脊索、および眼の硝子体液中に見られる。
【０２２４】
血液由来の適切なタンパク質としては、例えば、血漿タンパク質（例えばフィブリン、α-2マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン(フィブリノーゲンＡ、フィブリノーゲンＢ等)、血清アミロイドタンパク質Ａ、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ-2-ミクログロブリン）、酵素および酵素阻害剤（例えばプラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、α-1-アンチトリプシンおよび膵臓トリプシンインヒビター）、免疫グロブリンタンパク質（例えばIgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫グロブリン軽鎖(κ/λ)）などの免疫系のタンパク質、輸送タンパク質（例えばレチノール結合タンパク質、α-1ミクログロブリン）、デフェンシン（例えばβ-デフェンシン1、好中球デフェンシン1、好中球デフェンシン2および好中球デフェンシン3）等が挙げられる。
【０２２５】
血液脳関門または神経組織中に見られる適切なタンパク質としては、例えばメラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体等が挙げられる。
【０２２６】
in vivoにおける血清半減期を延ばす適切なポリペプチドとしてまた、腎臓に局在するタンパク質（例えばポリシスチン、IV型コラーゲン、有機アニオン輸送体K1、ハイマン抗原）、肝臓に局在するタンパク質（例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、G250）、肺に局在するタンパク質（例えばIgAと結合する分泌成分）、心臓に局在するタンパク質（例えば拡張型心筋症に関連するHSP27）、皮膚に局在するタンパク質（例えばケラチン）、骨形成活性を示すタンパク質(例えばBMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8)であるトランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのサブセットである、形態形成タンパク質（BMP）などの骨特異的タンパク質、腫瘍特異的タンパク質（例えばトロホブラスト抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン(例えば肝臓および脾臓に見られるカテプシンB)）が挙げられる。
【０２２７】
適切な疾患特異的タンパク質としては、例えばLAG-3（リンパ球活性化遺伝子）を含む活性化T-細胞上のみで発現する抗原、オステオプロテゲリンリガンド（OPGL；Nature 402, 304-309 (1999)を参照）、OX40（活性化T細胞上で発現し、特にヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-1)-産生細胞においてアップレギュレートしているTNF受容体ファミリーのメンバー；Immunol. 165(1):263-70(2000)参照）が挙げられる。適切な疾患特異的タンパク質にはまた、例えば、CG6512 Drosophilaを含むメタロプロテアーゼ（関節炎／癌と関連）、ヒトパラプレギン、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、マウスftsH；および血管新生性増殖因子、例えば酸性線維芽細胞増殖因子（FGF-1）、塩基性線維芽細胞増殖因子（FGF-2）、血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子（VEGF/VPF）、トランスフォーミング増殖因子-α（TGFα）、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、アンギオゲニン、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-8（IL-8）、血小板由来内皮増殖因子（PD-ECGF）、胎盤増殖因子（P1GF）、ミドカイン血小板由来増殖因子-BB（PDGF）、およびフラクタルカインが挙げられる。
【０２２８】
in vivoにおける血清半減期を延ばす適切なタンパク質としてはまた、熱ショックタンパク質（HSP）などのストレスタンパク質が挙げられる。HSPは通常は細胞内に見られる。これらが細胞外に見られる場合、それは細胞が死んで内容物が漏出したことの指標である。このプログラムされていない細胞死（ネクローシス）は、トラウマ、疾患もしくは損傷の結果、細胞外HSPが免疫系からの応答を誘発する場合に生じる。細胞外HSPと結合させることによって、本発明の組成物を疾患部位に局在化させることができる。
【０２２９】
Fc輸送に関与する適切なタンパク質としては、例えばBrambell受容体（FcRBとしても知られる）が挙げられる。このFc受容体には2つの機能があり、いずれも送達のために非常に有用である。その機能とは、(1)胎盤を通しての母から子へのIgGの輸送、(2)IgGを分解から守ることによるその血清半減期の延長、である。受容体はIgGをエンドソームから再利用すると考えられる（Holligerら, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)を参照のこと）。
【０２３０】
薬物動態学的解析およびリガンドの半減期の決定のための方法には当業者は精通している。詳細は、Kenneth, A等：「医薬品の化学的安定性：薬剤師のためのハンドブック（Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists）」、およびPetersら, 「薬物動態学的解析：実用的アプローチ（Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach）」(1996)に見出すことができる。またtαおよびtβ半減期および曲線下面積（AUC）などの薬物動態学的パラメーターを記載した「薬物動力学（Pharmacokinetics）」 M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker出版、第二改訂増補版（Rev. ex edition）(1982)にも言及しておく。
【０２３１】
免疫グロブリンに基づくリガンドの調製
本発明に係る本明細書記載の結合剤、アンタゴニスト、リガンド、dAbは、これまでに確立され、scFv、「ファージ」抗体および他の操作された抗体分子の調製のための抗体操作の分野で用いられている技術に従って、調製することができる。抗体調製のための技術は、例えば以下の概説およびこれらに引用されている参考文献に記載されている：Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Pluckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wrightら, (1992) Crti. Rev. Immunol.12:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Carterら (1995) J. Hematother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Plueckthun, A. & Pack, P. (1997) Immunotechnology 3, 83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45,128-130。
【０２３２】
所望の特異性を有する抗体可変ドメインの選択のために用いられる適切な技術では、当分野で公知のライブラリーおよび選択方法が用いられる。ヒトＢ細胞から回収された再編Ｖ遺伝子を用いる天然のライブラリー (Marksら (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan ら (1996) Nature Biotech., 14: 309) は当業者に周知である。合成ライブラリー(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissimら (1994) EMBO J., 13: 692; Griffithsら (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruifら (1995) J. Mol. Biol., 248: 97)は、通常PCRを用いて免疫グロブリンＶ遺伝子をクローニングすることによって調製される。PCR過程におけるエラーによって、高度のランダム化につなげることができる。標的抗原もしくはエピトープに対してVHおよび／またはVLライブラリーを別個に選択することができ、この場合単一のドメイン結合を直接選択するか、または共に選択する。
【０２３３】
ライブラリーベクターシステム
本発明において使用するのに適した種々の選択システムが当分野において公知である。そのようなシステムの例を以下に記載する。
【０２３４】
バクテリオファージλ発現システムは、いずれも先に記載されているように（Huse等(1989) Science, 246: 1275; CatonおよびKoprowski(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinax等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8095; Persson等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:2432）、バクテリオファージプラークとして、もしくは溶原菌のコロニーとして直接スクリーニングすることができ、本発明において有用である。このような発現システムは最大でライブラリーの106個の異なるメンバーをスクリーニングするのに用いることができるが、これより大きな数（106メンバー数を超えるもの）のスクリーニングには実際には適さない。ライブラリーの構築において特に有用なものは選択ディスプレイシステムであり、これは核酸をそれが発現するポリペプチドに連結することを可能とする。本明細書において使用するように、選択ディスプレイシステムは、ジェネリックおよび／または標的リガンドを結合することによってライブラリーの個々のメンバーを適切なディスプレイ手段によって選択することを可能とするシステムである。
【０２３５】
大きなライブラリー中の所望のメンバーを単離するための選択プロトコルは、ファージディスプレイ技術に代表されるように、当分野において公知である。多様なペプチド配列が繊維状バクテリオファージの表面上にディスプレイされるこのようなシステム（ScottおよびSmith (1990) Science, 249: 386）は、標的抗原と結合する特異的抗体フラグメントのin vitroにおける選択および増幅のための抗体フラグメント（およびこれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーの作製に有用であることが明らかとなった（McCaffertyら, WO92/01047）。可変領域をコードするヌクレオチド配列を、大腸菌のペリプラズム空間にこれらを指向させるリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結すると、その結果得られる抗体フラグメントが、典型的にはバクテリオファージ外殻タンパク質（例えばpIIIまたはpVIII）との融合物としてバクテリオファージの表面上にディスプレイされる。あるいはまた、抗体フラグメントはλファージカプシド（ファージボディ）の外側にディスプレイされる。ファージを用いるディスプレイシステムの利点は、これらが生物学的システムであるため、細菌細胞中の選択されたライブラリーメンバーを含有するファージを単に増殖させることによって、選択されたライブラリーメンバーを増幅できることである。更に、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクター上に含まれるため、配列決定、発現および以降の遺伝的操作が比較的簡単である。
【０２３６】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築方法は当分野において周知である（McCaffertyら (1990) Nature, 348: 552; Kang ら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clacksonら (1991) Nature, 352: 624; Lowmanら (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burtonら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Changら (1991) J. Immunol., 147: 3610; Breitlingら (1991) Gene, 104: 147; Marksら (1991) 前掲; Barbasら (1992) 前掲; HawkinsおよびWinter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marksら, 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lernerら (1992) Science, 258: 1313, 参照として本明細書に組み入れる）。
特に有利なアプローチの1つはscFvファージライブラリーの利用であった（Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudhary ら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCaffertyら (1990) 前掲; Clacksonら (1991) Nature, 352: 624; Marksら (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Chiswell ら (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marksら (1992) J. Biol. Chem., 267）。バクテリオファージ外殻タンパク質上にディスプレイされたscFvライブラリーの種々の形態が記載されている。ファージディスプレイアプローチの改良についても、例えばWO96/06213およびWO92/01047 (Medical Research Councilなど)およびWO97/08320 (Morphosys)（これらを参照として本明細書に組み入れる）に記載されたように、公知である。
【０２３７】
ポリペプチドのライブラリーを作製するための他のシステムには、ライブラリーメンバーのin vitro合成のための無細胞酵素機構の使用がある。１つの方法においては、標的リガンドに対する選択およびPCR増幅を交互に行うことによってRNA分子を選択する(Tuerk および Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington および Szostak (1990) Nature, 346: 818)。同様の技術を用い、予め決定されたヒト転写因子と結合するDNA配列を同定することができる(Thiesen および Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry および Joyce (1992) Science, 257: 635; WO92/05258 および WO92/14843)。同様の方法で、大きなライブラリーを作製するための方法としてin vitro翻訳を用いてポリペプチドを合成することができる。一般的に安定化したポリソーム複合体を含むこれらの方法は、WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91/05058, および WO92/02536に更に記載されている。ファージを用いない別のディスプレイシステム、例えばWO95/22625 およびWO95/11922 (Affymax)に開示されたものなどは、ポリソームを用いて選択のためにポリペプチドをディスプレイする。
【０２３８】
更に別のカテゴリーの技術は、遺伝子とその遺伝子産物との連結を可能とする人工的コンパートメント中でのレパートリーの選択に関する。例えば、望ましい遺伝子産物をコードする核酸を油中水型エマルジョンによって形成されたマイクロカプセル中で選択することができる選択システムがWO99/02671、WO00/40712 および Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントをマイクロカプセル中に区画化し、次いで転写および／または翻訳してマイクロカプセル内で個々の遺伝子産物（RNAもしくはタンパク質）を産生する。次に所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを選別する。このアプローチによって、種々の手段で所望の活性を検出することによって目的の遺伝子産物が選択される。
【０２３９】
ライブラリー構築
選択を目的としたライブラリーは、当該分野で公知の技術（例えば、上記で説明したような技術）を用いて構築することができるか、またはメーカーから購入することもできる。本発明に有用なライブラリーは、例えば、WO99/20749に記載されている。一度ベクター系が選択され、目的のポリペプチドをコードする１以上の核酸配列がライブラリーベクター内にクローン化されれば、それを発現させる前に突然変異誘発処理することでクローン化された分子内に多様性を作り出すことができる。あるいは、上記のようにコードされたタンパク質を発現させて選択してから、突然変異誘発と付加的な選択ラウンドを行ってもよい。構造的に最適化されたポリペプチドをコードする核酸配列の突然変異誘発は、標準的な分子的方法によって行われる。特に有用なのは、ポリメラーゼ連鎖反応つまりPCR（Mullis and Faloona (1987) Methods Enzymol., 155: 335、参照により本明細書に組み込む）である。PCRは、熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼによって触媒される多サイクルのDNA複製を用いて、目的の標的配列を増幅する反応であって、当該分野では周知である。様々な抗体ライブラリーの構築がWinterら (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55およびそれに引用された文献中に記載されている。
【０２４０】
PCRは、鋳型DNA（少なくとも1fg；より実用的には1〜1000ng）および少なくとも25pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。プライマープールが非常に不均一な場合には、大量のプライマーを使用するのが有利であるが、それは、それぞれの配列を表す分子がプール内にほんの僅かしかなく、またプライマー量が増幅サイクルの後半で限られてくるからである。典型的な反応混合液は、2μlのDNA、25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、2.5μlの10×PCRバッファー1（Perkin-Elmer社, Foster City, CA）、0.4μlの1.25μM dNTP、0.15μl（または2.5ユニット）のTaq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer社, Foster City, CA）および脱イオン水を含み、総量25μlとする。ミネラルオイルが積層され、続いてPCRがプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて実行される。サイクル数だけでなく、実際にはPCRサイクルの各ステップの長さと温度も、ストリンジェンシーの必要条件に従って調整される。アニーリングの温度および時間は、プライマーが鋳型にアニールすることが予期される効率および許容されるべきミスマッチの程度の双方によって決定される。言うまでもなく、核酸分子を同時に増幅および突然変異誘発する場合には、少なくとも合成の第１ラウンドでミスマッチが必要である。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、当該分野の当業者の技量の範囲内にある。30℃〜72℃のアニーリング温度が使用される。鋳型分子の最初の変性は、通常92℃〜99℃で４分間行われ、続いて、変性（94〜99℃で15秒〜１分間）、アニーリング（前述のように決定された温度；１〜２分間）、および伸長（72℃で１〜５分間；増幅産物の長さによる）から成る２０〜４０サイクルが行われる。最後の伸長は、通常、72℃で４分間行う。その後、4℃での無制限のステップ（０〜２４時間）を行うことができる。
【０２４１】
単一可変ドメイン同士の結合
本発明に有用なドメインは、一度選択されれば、共有結合的および非共有結合的方法を含む当該分野で公知の様々な方法によって、結合することができる。例えば、scFv分子との関連で説明したように、好ましい方法は、ポリペプチドリンカーの使用を含む（Birdら, (1988) Science 242:423-426）。適切なリンカーについては、Birdら, Science 242, 423-426；Hudsonら, Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189；Hudsonら, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883に記載されている。リンカーは、フレキシブルであり、２つの単一ドメイン同士を相互作用させるものが好ましい。リンカーの一例は、(Gly4 Ser)n リンカー（式中、n=１〜８、例えば、２、３、４、５、または７）である。フレキシブル性がより少ない、ダイアボディーで使用されるリンカーも使用することができる（Holligerら, (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448）。一実施形態において、使用されるリンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域ではない。
【０２４２】
可変ドメインは、リンカー以外の方法を用いて結合することができる。例えば、天然の、または人工的に導入したシステイン残基を介してもたらされるジスルフィド架橋の使用が、VH-VH、VL-VL、またはVH-VL二量体を安定化させるために（Reiterら, (1994) Protein Eng. 7:697-704）、あるいは、可変ドメイン間の境界面を改造して「フィット(fit)」を改善し、それによって相互作用の安定性を向上させるために（Ridgewayら, (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhuら, (1997) Protein Science 6:781-788）利用される。免疫グロブリンの可変ドメイン、特に抗体VHドメイン同士を結合しまたは安定化させる他の技術を、必要に応じて使用することができる。
【０２４３】
リガンドの特徴解析
リガンド（例えば、dAb単量体、二重特異性リガンド）の特定の抗原またはエピトープへの結合は、当業者が精通している方法（ELISA法を含む）によって検証できる。本発明の好ましい実施形態では、前記結合は、モノクローナルファージELISAを用いて検証される。ファージELISAは、任意の適切な方法によって行うことができる。典型的なプロトコルを以下に示す。
【０２４４】
各選択ラウンドで作り出されるファージの集団は、所定の抗原またはエピトープとの結合についてELISAによってスクリーニングすることで、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定することができる。その後、これらの集団から単一感染細菌コロニー由来のファージをELISAによってスクリーニングして、「モノクローナル」ファージ抗体を同定することができる。また、可溶性抗体フラグメントを抗原またはエピトープとの結合についてスクリーニングすることも望ましい。これは、例えばC末端もしくはN末端タグに対する試薬を用いて、ELISAによって行うこともできる（例えば、Winterら (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55、およびそこで引用された文献を参照されたい）。
【０２４５】
選択されたファージモノクローナル抗体の多様性はまた、PCR産物のゲル電気泳動（Marksら, 1991, 上記；Nissimら, 1994, 上記）、プロービング（Tomlinsonら, 1992, J. Mol. Biol. 227, 776）、またはベクターDNAのシークエンシングによって評価することができる。
【０２４６】
リガンドの構造
可変ドメインが、例えば本明細書で説明したようなファージディスプレイ技術を用いて選択された、V遺伝子レパートリーから選択される場合、これらの可変ドメインは、本明細書で定義される特異的な一般(generic)リガンドによって認識され得るような、普遍的フレームワーク領域を含んでいる。普遍的フレームワーク、一般リガンド等の使用については、WO99/20749に記載されている。
【０２４７】
V遺伝子レパートリーを使用する場合、ポリペプチド配列の変異は、可変ドメインの構造ループ内に配置されることが好ましい。どちらの可変ドメインのポリペプチド配列も、各可変ドメインとその相補的な対との相互作用を増強するために、DNAシャッフリングまたは突然変異によって改変することができる。DNAシャッフリングは、当該分野で公知であり、例えば、Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391および米国特許第6,297,053号に記載されている（いずれの文献も、参照により本明細書中に組み込まれる）。他の突然変異誘発処理の方法は、当業者には周知である。
通常、リガンドの選択、調製およびフォーマット化に必要とされる核酸分子およびベクター構築物は、Sambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USAのような標準的なラボマニュアルで説明されているように構築し、かつ操作することができる。
【０２４８】
本発明に有用な核酸の操作は、通常、組換えベクターにおいて行われる。
【０２４９】
本明細書で使用する場合、ベクターとは、異種DNAをその発現および／または複製のために細胞内に導入するのに使用される、独立した個別のエレメントをいう。このようなベクターを選択し、または構築し、その後使用する方法は、当業者には周知である。細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体、およびエピソームベクターを含む数多くのベクターが公的に入手可能である。こうしたベクターは単純なクローニングおよび突然変異誘発のために使用することができ、あるいはまた、遺伝子発現ベクターが用いられる。本発明に有用なベクターは、所望のサイズ、典型的には0.25キロベース（kb）〜40kbまたはそれ以上の長さのポリペプチドコード配列を収容するように選択され得る。適切な宿主細胞をin vitroクローニング操作後に前記ベクターで形質転換する。各ベクターは、通常は、クローニング（または「ポリリンカー」）部位、複製起点、および少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含めて、種々の機能的成分を包含する。所定のベクターが発現ベクターであれば、それはさらに、１以上の次の成分を保持している：エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結部位およびシグナル配列。これらの成分が本発明のリガンドをコードする遺伝子に機能的に連結されるように、各成分はクローニング部位近辺に位置づけられる。
【０２５０】
通常、クローニングベクターおよび発現ベクターはいずれも、選択された１以上の宿主細胞内でベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。クローニングベクターでは一般的に、この配列は、宿主の染色体DNAとは無関係にベクターの複製を可能にする配列であり、複製起点または自律複製配列を含む。このような配列は、様々な細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミドpBR322由来の複製起点は大部分のグラム陰性細菌に適しており、2ミクロンプラスミド起点は酵母に適しており、また様々なウイルス起点（例えば、SV40、アデノウイルス）が哺乳動物細胞内のクローニングベクターに有用である。通常、複製起点は、それらが高レベルのDNAを複製できるCOS細胞のような哺乳動物細胞内で使用されない限り、哺乳動物発現ベクターには必要ない。
【０２５１】
都合の良いことに、クローニングベクターまたは発現ベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも呼ばれる）を包含することができる。本遺伝子は、選択培地中で生育する形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている。それ故、選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、その培地中では生存できない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を与えるタンパク質、栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または培地中で利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしている。
【０２５２】
本発明のリガンドをコードするベクターの複製は、大腸菌内で行うのが最も好都合なので、大腸菌選択マーカー（例えば、抗生物質アンピシリンに対する耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子）が使用される。これらは、pBR322のような大腸菌プラスミドまたはpUC18もしくはpUC19のようなpUCプラスミドから得ることができる。
【０２５３】
発現ベクターは、通常、宿主生物によって認識され、かつ目的のコード配列に機能的に連結されたプロモーターを含んでいる。このようなプロモーターは、誘導可能、または構成的であってもよい。「機能的に連結された」とは、上記構成要素が意図した様式でそれらを機能させる関係にある並列状態をいう。コード配列に「機能的に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。
【０２５４】
原核生物宿主での使用に適したプロモーターは、例えば、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系、およびtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。また、細菌系で使用するためのプロモーターは、通常、コード配列に機能的に連結されたシャイン‐ダルガノ配列を含む。
【０２５５】
好ましいベクターは、ポリペプチドライブラリーのメンバーに相当するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、一次および／もしくは二次抗原またはエピトープを用いた選択は、ポリペプチドライブラリーのメンバーを発現する単一クローンを個別に増殖および発現させることで、または任意の選択ディスプレイ系を使用することで、実行することができる。好ましい選択ディスプレイ系は、上記のように、バクテリオファージディスプレイである。ファージまたはファージミドベクター（例えば、pIT1またはpIT2）を使用することができる。本発明に有用なリーダー配列は、pelB、stII、ompA、phoA、blaおよびpelAを含む。一例として、大腸菌複製起点（二本鎖複製用）とファージ複製起点（一本鎖DNA生成用）とを有するファージミドベクターが挙げられる。このようなベクターの操作および発現は、当該分野では周知である（Hoogenboom and Winter (1992) 上記；Nissim et al. (1994)、上記）。簡単に言えば、前記ベクターは、ファージミドに選択性を付与するためのβ-ラクタマーゼ遺伝子、および発現カセットの上流にlacプロモーターを含む。前記発現カセットは、（N末端からC末端に向かって）pelBリーダー配列（発現したポリペプチドを細胞周辺腔に方向付ける）、マルチクローニング部位（ライブラリーメンバーのヌクレオチド対応物のクローニング用）、任意で１以上のペプチドタグ（検出用）、任意で１以上のTAG終止コドン、およびファージタンパク質pIIIから構成される。大腸菌の様々なサプレッサーおよび非サプレッサー株を使用し、また、グルコース、イソプロピルチオ‐β‐D‐ガラクトシド（IPTG）またはVCS M13のようなヘルパーファージを添加すると、該ベクターは、発現なしにプラスミドとして複製することができるか、または多量のポリペプチドライブラリーのメンバーのみを産生するか、またはファージ（その一部がその表面に少なくとも１コピーのポリペプチド‐pIII融合物を含む）を産生することができる。
【０２５６】
本発明のリガンドをコードするベクターの構築には、従来のライゲーション技術が使用される。単離したベクターまたはDNA断片を切断し、連結されるように調整し、所望の形態に再ライゲーションすると、必要なベクターが作製される。必要に応じて、構築されたベクター中に正しい配列が存在することを確認するための解析を公知の方法で行うことができる。発現ベクターの構築、in vitro転写産物の調製、宿主細胞内へのDNAの導入、そして発現および機能を評価する解析の実施に適した方法は、いずれも当業者には公知である。サザンもしくはノザン解析、ウェスタンブロッティング、DNA、RNAもしくはタンパク質のドットブロッティング、in situハイブリダイゼーション、免疫細胞化学法、または核酸もしくはタンパク質分子の配列解析のような従来の方法によって、サンプル中の遺伝子配列の存在が検出され、あるいはその増幅および／または発現が定量される。当業者であれば、必要に応じて、これらの方法をどのように改変できるかを、すぐに思いつくであろう。
【０２５７】
骨格
骨格は、免疫グロブリン分子に基づいてもよいし、または上記で説明したように、非免疫グロブリン由来であってもよい。本明細書で定義したような、好ましい免疫グロブリン骨格は、以下から選択されるものを１以上含んでいる：少なくとも（i）抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメイン、または（ii）抗体重鎖のCH1ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1およびCH2ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1、CH2およびCH3ドメインを含む免疫グロブリン分子；あるいは、抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメインと連結したサブセット（ii）のいずれか。ヒンジ領域ドメインをも含めることができる。このようなドメインの組合せは、例えば、IgGもしくはIgMのような天然の抗体、またはFv、scFv、FabもしくはF(ab')2分子のような抗体フラグメントを模倣することができる。当業者であれば、上記が全てを列挙したものではないことを理解するであろう。
【０２５８】
タンパク質スカフォールド
各エピトープ結合ドメインは、タンパク質スカフォールドと、該ドメインと１以上のエピトープとの特異的相互作用に関与する１以上のCDRとを含んでなる。有利には、本発明のエピトープ結合ドメインは３つのCDRを含む。適当なタンパク質スカフォールドは、免疫グロブリンドメインに基づくもの、フィブロネクチンに基づくもの、アフィボディ（affibody）に基づくもの、CTLA4に基づくもの、GroELのようなシャペロンに基づくもの、リポカリンに基づくもの、並びに細菌FcレセプターSpAおよびSpDに基づくもの、からなる群より選択されるもののいずれかを含む。当業者であれば、上記で列挙したものに限定されないことを理解するであろう。
【０２５９】
リガンドの構築に用いるためのスカフォールド
主鎖コンフォメーションの選択
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、全てがポリペプチド鎖について類似の折り畳み構造を共有している。例えば、抗体は、一次配列に関しては高度に多様化しているが、配列および結晶構造の比較から、予想に反して、抗体の６つの抗原結合ループのうち５つ（H1、H2、L1、L2、L3）は、主鎖コンフォメーションの数が限られているか、またはカノニカル構造をとることが明らかとなっている（Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothiaら (1989) Nature, 342: 877）。それ故、ループ長および重要な残基の解析により、大部分のヒト抗体で見られるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖コンフォメーションの予測が可能となった（Chothiaら (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinsonら (1995) EMBO J., 14: 4628; Williamsら (1996) J. Mol. Biol., 264: 220）。H3領域は、配列、長さ、および構造に関してはるかに多くの多様性がある（Dセグメントの使用に起因する）が、本領域はまた、短いループ長にわたり限られた数の主鎖コンフォメーションを形成し、これらは該ループおよび抗体フレームワーク内の重要な位置における特定の残基の長さおよび存在（つまり残基のタイプ）に左右される（Martinら (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shiraiら (1996) FEBS Letters, 399: 1）。
【０２６０】
リガンドおよび／またはドメインのライブラリーを設計することができるが、かかるライブラリーでは、メンバーの主鎖コンフォメーションが確実に判明するように特定のループ長および重要な残基が選択されている。都合の良いことに、これらは、自然界で見られる免疫グロブリンスーパーファミリー分子の真のコンフォメーションであり、上記のように、それらが非機能的となる可能性を最小限に抑える。生殖系列のＶ遺伝子セグメントは、抗体またはＴ細胞レセプターライブラリーを構築するのに適した１つの基本的なフレームワークとして役に立つ。他の配列も使用できる。変異が低頻度で起こる可能性があり、その結果少数の機能的メンバーはその機能に影響を及ぼさない程度に改変された主鎖コンフォメーションを有し得る。
【０２６１】
カノニカル構造理論はまた、リガンドによりコードされた異なる主鎖コンフォメーションの数を評価し、リガンド配列に基づいて主鎖コンフォメーションを予測し、かつカノニカル構造に影響を及ぼさない多様化のための残基を選択するのにも有用である。ヒトVκドメインでは、L1ループは４つのカノニカル構造のうちの１つを採ることができ、L2ループは単一のカノニカル構造を有し、また90％のヒトVκドメインはL3ループの４つまたは５つのカノニカル構造のうちの１つを採ることが公知である（Tomlinsonら(1995)、上記）。それ故、Vκドメイン単独において、異なるカノニカル構造を組み合わせて、ある範囲の異なる主鎖コンフォメーションを作り出すことができる。VλドメインがL1、L2およびL3ループに関して異なる範囲のカノニカル構造をコードしており、またVκおよびVλドメインが、H1およびH2ループに関していくつかのカノニカル構造をコードし得る任意のVHドメインとペアになりうると仮定すると、これら５つのループで見られるカノニカル構造の組合せの数は、膨大な数となる。このことは、主鎖コンフォメーションにおける多様性の生成が広範な結合特異性を生み出すのに必須でありうることを示唆している。しかしながら、たった１つの既知の主鎖コンフォメーションに基づいて抗体ライブラリーを構築することによって、予想に反して、主鎖コンフォメーションの多様性が実質的に全ての抗原を標的とするのに十分な多様性を生み出すのに必要ではないことがわかった。さらに驚いたことに、１つの主鎖コンフォメーションは、コンセンサス構造である必要はなく、１つの天然に存在するコンフォメーションを全ライブラリーの基礎として使用することができる。したがって、好ましい態様において、本発明の二重特異性リガンドは、単一の既知主鎖コンフォメーションを有する。
【０２６２】
選択される１つの主鎖コンフォメーションは、問題となる免疫グロブリンスーパーファミリーのタイプの分子間で一般的なものであることが好ましい。天然分子の相当数があるコンフォメーションを採ることが観察されている場合、そのコンフォメーションが一般的なものである。したがって、本発明の好ましい態様においては、免疫グロブリンドメインの各結合ループにおける種々の主鎖コンフォメーションの自然発生を別々に検討し、ついで、それらの種々のループの望ましい主鎖コンフォメーションの組合せを有する天然の可変ドメインを選択する。いずれも利用できないのであれば、それに最も近い等価物を選択することが可能である。異なるループの主鎖コンフォメーションの望ましい組合せは、所望の主鎖コンフォメーションをコードする生殖系列遺伝子セグメントを選択することによって生み出すことが好ましい。選択される生殖系列遺伝子セグメントは自然界で頻繁に発現しているものがより好ましく、それらは全ての天然の生殖系列遺伝子セグメントのなかで最も頻繁に発現していることが最も好ましい。
【０２６３】
リガンド（例えば、dAb）またはそのライブラリーを設計する際に、６つの抗原結合ルールのそれぞれについての異なる主鎖コンフォメーションの頻度を別個に検討することができる。H1、H2、L1、L2およびL3については、天然分子の抗原結合ループの20％〜100％で採用されている所与のコンフォメーションを選択する。通常、観察されるその頻度は、約35％以上（すなわち、35％〜100％）、理想的には、50％以上、さらには60％以上である。H3ループの大半はカノニカル構造を持たないので、カノニカル構造を示すループに一般的な主鎖コンフォメーションを選択することが好ましい。したがって、各ループについて、天然のレパートリーに最も頻繁に見られるコンフォメーションが選択される。ヒト抗体では、各ループで最も一般的なカノニカル構造（CS）は次のとおりである：H1−CS1（発現されるレパートリーの79％）、H2−CS3（46％）、L1−VκのCS2（39％）、L2−CS1（100％）、L3−VκのCS1（36％）（κ：λ比を70：30と仮定して計算、Hoodら (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133）。カノニカル構造を有するH3ループについては、残基94から残基101に塩橋を有する７残基のCDR3長(Kabatら (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)が最も一般的なように思われる。このコンフォメーションを形成するのに必要なH3長および重要な残基を有する少なくとも１６個のヒト抗体配列が、EMBLデータライブラリーに存在する。また、該タンパク質データバンクには、抗体モデル化の基礎として使用することのできる少なくとも２つの結晶構造(2cgrおよび1tet)が存在する。カノニカル構造のこの組合せのなかで最も高頻度に発現される生殖系列遺伝子セグメントは、VHセグメント3−23 (DP-47)、JHセグメントJH4b、VκセグメントO2/O12 (DPK9)、およびJκセグメントJκ1である。VHセグメントDP45およびDP38も適している。したがって、望ましい単一の主鎖コンフォメーションを有するライブラリーを構築するための基礎として、これらのセグメントを組み合わせで使用することができる。
【０２６４】
あるいは、分離した結合ループのそれぞれの異なる主鎖コンフォメーションの自然発生に基づいて１つの主鎖コンフォメーションを選択する代わりに、主鎖コンフォメーションの組合せの自然発生を、１つの主鎖コンフォメーションを選択するための基礎として用いる。例えば、抗体の場合には、抗原結合ループのいずれか２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てのカノニカル構造の組合せの自然発生が決定される。本発明では、選択されるコンフォメーションが天然の抗体に一般的なものであることが好ましく、それが天然のレパートリーにおいて最も頻繁に見られるものであることが最も好ましい。したがって、例えば、ヒト抗体では、５つの抗原結合ループH1、H2、L1、L2およびL3の天然の組合せを検討する場合、カノニカル構造の最も高頻度な組合せを決定し、その後、１つの主鎖コンフォメーションを選択するための基礎として、H3ループの最も一般的なコンフォメーションと組み合わせる。
【０２６５】
カノニカル配列の多様化
いくつかの既知の主鎖コンフォメーション、好ましくは１つの既知主鎖コンフォメーションを選択したら、本発明で使用するリガンド（例えば、dAb）またはライブラリーは、構造的および／または機能的多様性を有するレパートリーを作製するために分子の結合部位を変異させることによって、構築することができる。これは、変異体がその構造および／またはその機能において十分な多様性を保持し、結果的に、ある範囲の活性を提供できるように作製されていることを意味している。
【０２６６】
望ましい多様性は、通常、選択した分子を１以上の位置で変異させることによって生成される。変化させるべき位置は、ランダムに選ぶことが可能であり、好ましくは選び出される。ついで、存在するアミノ酸を任意のアミノ酸もしくはその類似体（天然物または合成物）で置換して、膨大な数の変異体を作り出すランダム化によって、或いは、存在するアミノ酸を特定のアミノ酸サブセットの１以上で置換して、より限定された数の変異体を作り出すことのいずれかによって、変異を達成することができる。
【０２６７】
このような多様性を導入するための様々な方法が報告されている。エラープローンPCR（Hawkinsら (1992) J. Mol. Biol., 226: 889）、化学的突然変異誘発（Dengら (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533）または細菌突然変異誘発株（Lowら (1996) J. Mol. Biol., 260: 359）は、前記分子をコードする遺伝子内にランダム突然変異を導入するのに利用することができる。選択した位置を突然変異させるための方法も当該分野では周知であり、当該方法は、PCRを用いてまたは用いずに、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドを使用することを含む。例えば、いくつかの合成抗体ライブラリーが、突然変異を抗原結合ループに標的化することにより作製されている。ヒト破傷風トキソイド結合性FabのH3領域は、一定範囲の新しい結合特異性を作り出すために、ランダム化されている(Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457)。ランダムまたは半ランダムなH3およびL3領域が、未突然変異フレームワーク領域を有する巨大ライブラリーを作り出すために、生殖系列V遺伝子セグメントに付加されている(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381；Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457；Nissimら (1994) EMBO J., 13: 692；Griffithsら (1994) EMBO J., 13: 3245；De Kruifら (1995) J. Mol. Biol., 248: 97)。このような多様化は、いくつかのまたは全ての他の抗原結合ループを包含するまでに拡張されている(Crameriら (1996) Nature Med., 2: 100；Riechmannら (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320,上記)。
【０２６８】
ループのランダム化は、H3だけで約1015以上の構造体を生じる可能性があり、他の５つのループについても同程度の数の変異体を生じる可能性があるので、最新の形質転換技術を用いても、または無細胞系を使用してさえも、全ての可能な組合せに相当するライブラリーを作製するのは事実上不可能である。例えば、今まで構築された最も大きなライブラリーの１つでは、6×1010の異なる抗体が生成されているが、これは、この設計のライブラリーに可能な多様性のほんの一部にすぎない(Griffithsら (1994)、上記)。
【０２６９】
分子の所望の機能の生成または改変に直接関与する残基のみを多様化することが好ましい。多くの分子に関して、機能とは標的に結合することであり、それ故、分子の全体的なパッキングまたは選択した主鎖コンフォメーションの維持にきわめて重要な残基を変えることは避けつつ、多様性を標的結合部位に集中させるべきである。
【０２７０】
抗体ドメインに適用するときのカノニカル配列の多様化
抗体に基づいたリガンド（例えば、dAb）では、標的との結合部位は、ほとんどの場合、抗原結合部位である。したがって、抗原結合部位の残基のみが変異していることが好ましい。これらの残基は、ヒト抗体レパートリーにおいて極めて多様であり、高分解能抗体／抗原複合体において接触することが知られている。例えば、L2では、50位および53位は天然の抗体において多様であり、抗原との接触が認められることが知られている。一方、従来の方法は、Kabatら (1991、上記)によって定義される、対応する相補性決定領域（CDR1）中の全ての残基（本発明で用いるライブラリーでは多様化されるのは２残基であるのに対して、およそ７残基）を多様化することであった。これは、ある範囲の抗原結合特異性を作り出す上で必要とされる機能的多様性の点で顕著な改良に相当する。
【０２７１】
実際、抗体の多様性は、２つの過程の結果であり、すなわち、ナイーヴ初期レパートリー（いわゆる生殖系列および結合多様性）を生成するための生殖系列V、DおよびJ遺伝子セグメントの体細胞組換えと、その結果再編成されるV遺伝子の体細胞超変異と、の結果である。ヒト抗体配列の解析により、初期レパートリーの多様性は抗原結合部位の中心部に集中しているが、体細胞超変異は、初期レパートリー中で高度に保存されている抗原結合部位の周辺領域にまで多様性を広げていることが判明した（Tomlinsonら (1996) J. Mol. Biol., 256: 813参照）。この相補性は、恐らく、配列空間を探すための有効な戦略として進化してきたもので、明らかに抗体に特有なものであるが、他のポリペプチドレパートリーにも容易に適用することができる。変異させる残基は、標的に対する結合部位を形成する残基のサブセットである。標的結合部位内の異なる（重複を含む）サブセットの残基を、必要に応じて、選択中の異なる段階で多様化させる。
【０２７２】
抗体レパートリーの場合には、抗原結合部位内の残基のいくつか（しかし全部ではない）が多様化される初期「ナイーヴ」レパートリーを作製することができる。ここで、本明細書で使用する場合、「ナイーヴ」とは、所定の標的をもたない抗体分子をいう。これらの分子は、免疫系がまだ多種多様な抗原刺激によって攻撃されていない胎児および新生児個体のように、免疫の多様化を受けていない個体の免疫グロブリン遺伝子によってコードされた分子と類似する。その後、このレパートリーは、ある範囲の抗原またはエピトープに対して選択される。必要に応じて、さらなる多様性が、初期レパートリーで多様化された領域外に導入されてもよい。この成熟したレパートリーは、改変された機能、特異性、または親和性について選択することが可能である。
【０２７３】
抗体結合部位内の残基のいくつかまたは全てが変異しているリガンドを構築するための結合ドメインのナイーヴレパートリーは、当該分野で公知である（WO 2004/058821、WO 2004/003019、およびWO 03/002609を参照）。「一次」ライブラリーは天然の初期レパートリーを模倣しており、その多様性は、生殖系列V遺伝子セグメントにおいて多様性である（生殖系列多様性）か、または組換え過程中に多様化される（結合多様性）抗体結合部位の中心部の残基に限定されている。多様化される残基には、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94およびL96が含まれるが、これらに限定されない。「体細胞」ライブラリーでは、多様性は、組換え過程中に多様化される（結合多様性）か、または高度に体細胞突然変異する残基に限定される。限定はしないが、それらの多様化される残基には、H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34およびL96が含まれる。前記ライブラリーにおいて多様化に適切なものとして上記に列挙した残基は全て、１以上の抗体／抗原複合体中で接触することが知られている。どちらのライブラリーにおいても、抗原結合部位内の全ての残基が変異するわけではないので、必要であれば、選択中に残りの残基を変異させることによって、さらなる多様性を組み込むことができる。当業者には、これらの残基（または抗原結合部位を含む付加的な残基）のいずれかの任意のサブセットを抗原結合部位の初期および／または後続の多様化に利用できることが、明らかであろう。
【０２７４】
本発明で使用するライブラリーの構築において、選択された位置の多様化は、一般的に、多くの可能性のあるアミノ酸（全２０種またはそのサブセット）を当該位置に取り込むことができるようにポリペプチドの配列を特定するコード配列を変更することにより、核酸レベルで達成される。IUPAC命名法を用いると、最も汎用的なコドンはNNKであり、これは全アミノ酸とTAG終止コドンをコードしている。NNKコドンは、好ましくは、必要な多様性を導入するために用いられる。同じ目的を達成する他のコドンも有用であり、それらには、さらなる終止コドンTAGおよびTAAの生成をもたらすNNNコドンが含まれる。
【０２７５】
ヒト抗体の抗原結合部位における側鎖の多様性の特徴には、特定のアミノ酸残基を好む顕著な偏り（バイアス）がある。VH、Vκ、およびVλ領域のそれぞれにおいて１０個の最も多様性である位置のアミノ酸組成を総合すると、側鎖の多様性の76％以上は、わずか７つの異なる残基（すなわち、セリン(24％)、チロシン(14％)、アスパラギン(11％)、グリシン(9％)、アラニン(7％)、アスパラギン酸(6％)、およびスレオニン(6％)）に由来している。主鎖に柔軟性を与えることのできる親水性残基および小型の残基に偏っているのは、恐らく広範囲の抗原またはエピトープに結合しやすくする表面の進化を反映しているためであり、これはまた、初期レパートリーにおいて必要とされる抗体の混乱状態を説明するのに役立つかもしれない。
【０２７６】
このアミノ酸の分布を模倣することが好ましいので、変異させるべき位置のアミノ酸の分布は、抗体の抗原結合部位で見られる分布を模倣することが好ましい。ある範囲の標的抗原に対する特定のポリペプチド（抗体ポリペプチドだけではない）の選択を可能にするアミノ酸の置換におけるそのような偏りは、どのようなポリペプチドレパートリーにも容易に適用される。変異させる位置のアミノ酸分布を偏らせる様々な方法があり（トリヌクレオチド突然変異誘発の使用を含む；WO97/08320参照）、中でも、好ましい方法は、合成が容易なことから、慣用の縮重コドンの使用である。縮重コドンの全ての組合せ（各位置において等しい比率で一重、二重、三重および四重の縮重を有する）によってコードされたアミノ酸プロファイルを天然のアミノ酸使用と比較することで、最も典型的なコドンを算出することができる。コドン(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)Cおよび(AGT)(AGC)(CT)（IUPAC命名法を用いると、それぞれDVT、DVCおよびDVY）は、望ましいアミノ酸プロファイルに最も近いコドンであり、それらは、22％のセリン、および11％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニンおよびシステインをコードしている。したがって、ライブラリーは、多様化される各位置にDVT、DVCまたはDVYコドンのいずれかを用いて構築することが好ましい。
【０２７７】
レセプター結合アッセイ
TNFR1へのTNFαの結合を阻害するTNFR1のアンタゴニストは、適当なレセプター結合アッセイで同定することができる。簡単に言えば、Maxisorpプレートを30mg/mlの抗ヒトFcマウスモノクローナル抗体（Zymed, San Francisco, USA）と共に一晩インキュベートする。ウェルを0.05％のTween-20を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。その後、PBS中の1％ BSAでブロッキングしてから、100ng/mlのTNFR1-Fc融合タンパク質（R&D Systems社, Minneapolis, USA）と共にインキュベートする。TNFR1のアンタゴニストを、洗浄したウェルに10ng/mlの最終濃度で添加されたTNFと共に混合する。TNF結合を検出するには、0.2mg/mlのビオチン化抗TNF抗体（HyCult biotechnology社, Uben, Netherlands）で処理し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Amersham Biosciences社, UK）の1:500希釈物で処理し、その後、TMB基質（KPL社,Gaithersburg, USA）と共にインキュベートする。この反応をHClの添加によって停止させ、吸光度を450nmで読み取る。TNFR1へのTNFαの結合を阻害するTNFR1のアンタゴニストは、TNF結合の減少、それゆえにTNFのみの対照と比較して吸光度の低下をもたらす。
【０２７８】
L929 細胞毒性試験
TNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド、dAb単量体）は、マウスL929線維芽細胞においてTNFで誘導される細胞毒性を抑制する能力により同定することができる（Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248）。簡単に言えば、マイクロタイタープレートにまいたL929細胞をTNFR1のアンタゴニスト、100pg/mlのTNFおよび1mg/mlのアクチノマイシンD（Sigma社, Poole, UK）と共に一晩インキュベートする。それから、[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム（Promega社, Madison, USA）と共にインキュベートした後、細胞の生存能力を490nmでの吸光度を読み取ることにより測定する。TNFR1のアンタゴニストは、細胞毒性を抑制するので、TNFのみの対照と比較して吸光度の増加をもたらす。
【０２７９】
HeLa IL-8アッセイ
TNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド、dAb単量体）は、ヒトHeLa細胞でTNFにより誘導されるIL-8の分泌を抑制する能力によって同定することができる（この方法は、HUVEC細胞におけるIL-1によるIL-8の誘導について記載するAkeson, L.らの方法((1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523)に準ずる；本明細書では、ヒトTNFαによる誘導が検討され、HUVEC細胞株の代わりにHeLa細胞が使用される）。簡単に言えば、マイクロタイタープレート上にまいたHeLa細胞を、TNFR1のアンタゴニストおよび300pg/mlのTNFと共に一晩インキュベートする。インキュベーション後、細胞を回収しないように上清を吸引し、IL-8濃度をサンドウィッチELISA法（R&D Systems社）または他の適当な方法を用いて測定する。TNFR1のアンタゴニストは、IL-8分泌を抑制するので、TNFのみの対照と比較するとより少ないIL-8が上清中に検出される。
【０２８０】
MRC-5 IL-8放出アッセイ
ヒトTNFR1のアンタゴニストは、以下のMRC-5細胞アッセイを用いて同定することができる。本アッセイは、MRC-5細胞でのTNFによるIL-8分泌の誘導に基づいており、Alceson, L.ら Journal of Biological Chemistry 271:30517-30523 (1996)に記載される方法（HUVECでのIL-1によるIL-8の誘導が記載される）に準ずるものである。簡単に言えば、MRC-5細胞をマイクロタイタープレート上にまき、その後、そのプレートをTNFR1のアンタゴニストとヒトTNFα（300pg/ml）と共に一晩インキュベートする。インキュベーション後、培養上清を吸引し、上清中のIL-8濃度をサンドウィッチELISA法（R&D Systems社）、または他の適当な方法によって測定する。TNFR1のアンタゴニストは、TNFαのみとインキュベートした対照ウェルと比較して、上清へのIL-8分泌の減少をもたらす。
【実施例】
【０２８１】
実施例１
肺組織に局所投与したTNFR1のアンタゴニストは、C57BL/6マウスにおける亜慢性COPDモデルで有効である
本実験では、TNFR1のアンタゴニスト（抗TNFR1 dAb単量体(TAR2m21-23)）およびTNFのアンタゴニスト（ENBREL（登録商標）（エタネルセプト(etanercept)；Immunex Corporation社））を、空気またはタバコの煙（TS）のそれぞれに暴露する１時間前に、経鼻投与により肺に局所投与した。11日間の連続的なTS曝露によって誘発される肺炎症指数のTS誘導変化に対する効果を、最終曝露の24時間後に検証した。抗TNF化合物（ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社）を対照として使用した。また、経口投与型ホスホジエステラーゼ４（PDE4）阻害剤（BAY 19-8004; lirimilast）を対照標準として他のグループでTS曝露１時間前と、TS曝露６時間後に投与した。
【０２８２】
方法：
・被検物質１：ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社）
・被検物質２：DOM1m（抗TNFR1 dAb単量体(TAR2m21-23)）
・被検物質３：BAY 19-8004（PDE4インヒビター）
被検物質１および２の媒体はクエン酸ナトリウム（pH 6.0）、100mM NaClとした。被検物質３の媒体は、水に溶解した0.5％カルボキシメチルセルロース（Sigma社, 製品番号C-4888, ロット番号87H0036）とした。１回分の投与量は5ml/kgとした。
【０２８３】
フルバリア（完全防護下）で飼育され、かつ受取り時に特定微生物未検出認証付きの雌マウス（C57BL/6株）(16〜20g) (Charles River社)を、５匹以下のグループで、アスペンチップの床敷を敷いたソリッド底の個別換気ケージ（IVC： Individually Ventilated Cage）に収容した。ケージ内環境（気流、温度、および湿度）をIVCシステム（Techniplast社）で制御した。
【０２８４】
プロトコル：
・グループの数：７
・グループサイズ：n＝10
・投薬量：グループ１〜４ではマウスあたり50μl、グループ１〜７では5ml/kg
・処理時間：グループ１〜４では１日目〜11日目にTSまたは空気曝露の１時間前、
グループ５〜７では曝露の１時間前と曝露の６時間後
実験プロトコルを表１に要約する。
【表１】
2009512672.tif 000002
【０２８５】
TS曝露：
マウス（曝露室あたり最大５匹）をタバコから発生したTSに曝露した（1R1型、ケンタッキー大学提供）。最初の曝露は、１日目に４本のタバコで行い、６／７日目までに１日あたり最大６本のタバコへの曝露に増加した。その後、11日目まで１日あたり６本のタバコに曝露した。増加率は、マウスの耐性を毎日観察することで調節した。マウスの対照グループは、各曝露日に同じ時間にわたり空気に曝露した（空気曝露対照）。
【０２８６】
健康状態のモニタリング：
実験開始前、曝露プロトコルの６日目および終了時にマウスの体重を測定した。全マウスを各被検物質の投与およびTS曝露の間と、それらの後にモニタリングした。
【０２８７】
最終手順：
マウスを麻酔剤の過剰投与（ペントバルビタールナトリウム、腹腔内に100mg/kg）で以下のようにして屠殺した。すなわち、全グループを11日目および最終TS曝露の24時間後に犠牲にした。全ての処理グループのマウスを以下のようにして処理した。すなわち、血液サンプルを鎖骨下動脈から採取し、微量遠心チューブに入れて4℃で一晩凝固させた。血餅を取り除き、残った流体を微量遠心機により2900rpmで６分間遠心した。その結果得られた上清の血清をデカントし、予想されるPK解析のために−40℃で保存した。気管支肺胞洗浄（BAL：bronchoalveolar lavage）を0.4mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて行った。BALから回収した細胞を総細胞数および示差細胞数で定量化した。肺を摘出し、液体窒素中で急速凍結させた後、予想されるPK解析のために−80℃で保存した。
【０２８８】
データ解析：
正規性の検定を本データに対して行った。検定結果が陽性（すなわち、正規分布）であった場合には、一元配置分散分析検定（one way ANOVA）を用いて予備的解析を行い、続いてボンフェローニの多重比較検定（Bonferroni's multiple comparisons test）を用いて対照グループと治療グループとを比較した。データが正規分布でなかった場合には、クラスカル・ウォリス検定（Kruskal-Wallis test）後にダンの多重比較検定（Dunn's multiple comparisons test）を用いた。p＜0.05のときにデータを有意とみなした。
【０２８９】
結果：
対照のTS／媒体グループは、空気／媒体グループと比較して、肺に細胞浸潤物を有していた（図１参照）。
【０２９０】
TSに曝露しかつ被検物質２（DOM1、抗TNFR1 dAb）で処理したグループは、TS曝露および対照処理グループと比較して、肺の細胞浸潤物の有意な減少を示した（図１）。すなわち、全細胞では72％（p＜0.001）、マクロファージでは74％（p＜0.001）、好中球では82％（p＜0.001）、リンパ球では86％（p＜0.05）、および上皮細胞では55％（p＜0.01）の抑制を示した。好酸球では82％の減少が見られたが、この変化は、本実験で観察された好酸球数では全体としてバラツキが見られたことから有意でなかった。
【０２９１】
被検物質３（PDE4インヒビター、BAY 19-8004）で処理したグループは、対照グループと比較して、肺の細胞浸潤物の有意な減少を示した（図１）。すなわち、全細胞では52％（p＜0.01）、マクロファージでは55％（p＜0.01）、好中球では55％（p＜0.001）、リンパ球では61％（p＜0.001）および好酸球では56％（p＜0.01）の抑制を示した。上皮細胞では46％の減少が見られたが、この変化は有意ではなかった。
【０２９２】
TSに曝露しかつ被検物質１（ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社））で処理したグループでは、いずれの細胞集団でも有意な減少が見られなかった。
【０２９３】
実施例２
全身投与したTNFR1のアンタゴニストは、C57BL/6マウスにおける亜慢性COPDモデルで有効である
本実験では、TNFR1のアンタゴニスト（ペグ化抗TNFR1 dAb単量体（流体力学的サイズおよびインビボ血中半減期を増加させるためにペグ化したTAR2m21-23））およびTNFのアンタゴニスト（ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社））を、最初のTS曝露の24時間前から48時間毎に腹腔内投与により全身投与した。11日間の連続的なTS曝露により誘発される肺炎症指数のTS誘導変化に対する効果を、最終曝露の24時間後に検証した。抗TNF化合物（ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社））を対照として用いた。
【０２９４】
方法：
・被検物質１：ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社）
・被検物質２：PEG DOM1m（流体力学的サイズを増加させかつin vivo血中半減期を延ばすために40kDaポリエチレングリコールでペグ化した抗TNFR1 dAb単量体(TAR2m21-23)）
両被検物質用の媒体を滅菌生理食塩水とし、また両被検物質の１回分の投与量を10ml/kgとした。
【０２９５】
フルバリアで飼育し、かつ受取り時に特定微生物未検出認証付きの雌マウス（C57BL/6株）(16〜20g) (Charles River社)を、５匹以下のグループで、アスペンチップの床敷を敷いたソリッド底の個別換気ケージ（IVC）に収容した。ケージ内環境（気流、温度、および湿度）をIVCシステム（Techniplast社）で制御した。
【０２９６】
プロトコル：
・グループの数：４
・グループサイズ：グループ１〜４に関してn＝10
・投薬量：グループ１〜４に関して10ml/kg
・処理時間：最初のTS曝露の24時間前に開始して48時間毎、
後続の用量をTS曝露の１時間前に投与
実験プロトコルを表２に要約する。TS曝露、健康状態のモニタリング、最終手順、およびデータ解析は、実施例１に記載したように行った。
【表２】
2009512672.tif 000003
【０２９７】
結果：
TSに曝露しかつ被検物質２（PEG DOM1m）で処理したグループは、TS曝露および対照処理グループと比較して、肺の細胞浸潤物の有意な減少を示した。すなわち、全細胞では60％（図２）、マクロファージでは63％、多型核細胞では66％、リンパ球では78％、および好酸球では55％の抑制を示した。上皮細胞では40％の減少が見られたが、この変化は有意でなかった。
【０２９８】
TSに曝露しかつ被検物質１（ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社））で処理したグループでは、いずれの細胞集団でも有意な減少は見られなかった。ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社）で処理しても、肺では総細胞数およびPMN細胞数の増加が起きた。
【０２９９】
実施例３
肺組織への局所投与後にTNFR1と結合する薬剤の薬物動態
本実験では、TNFR1と結合する薬剤（抗TNFR1 dAb単量体(TAR2m21-23)）を経鼻投与によって肺に局所投与し、その薬剤の薬物動態を評価した。
【０３００】
方法：
本実験では、20mMクエン酸ナトリウム（pH6.0）、100mM NaCl中のDOM1m（抗TNFR1 dAb単量体(TAR2m21-23)）を用いた。希釈剤はクエン酸ナトリウム（pH6.0）、100mM NaClとした。
【０３０１】
プロトコル：
全マウスに、加温した溶液の経鼻投与により、DOM1mを同日の１〜２時間以内に投与した。
【０３０２】
フルバリアで飼育し、かつ受取り時に特定微生物未検出認証付き雌マウス（C57BL/6株）(16〜20g) (Charles River社)を、５匹以下のグループで、アスペンチップの床敷を敷いたソリッド底の個別換気ケージ（IVC）に収容した。ケージ内環境（気流、温度、および湿度）は、IVCシステム（Techniplast社）で制御された。
【０３０３】
・グループ数：５
・グループサイズ：３
・投与量： 50μl（25μl／鼻孔）
・屠殺時間：投与後１時間、２時間、５時間、８時間、および24時間 
実験プロトコルを表３に要約する。
【表３】
2009512672.tif 000004
【０３０４】
健康状態のモニタリング：
マウスの体重を実験開始前に測定した。全マウスを各化合物の投与中、および投与後にモニターした。24時間グループのマウスについては、一定間隔で一晩中モニターした。
【０３０５】
最終手順：
マウスを麻酔剤の過剰投与（ペントバルビタール ナトリウム、腹腔内に100mg/kg）によって屠殺した。血液サンプルを鎖骨下動脈から採取し、微量遠心チューブに入れた後、4℃で一晩凝固させた。血餅を取り除き、残った流体を微量遠心機にて2900rpmで６分間遠心した。その結果得られた上清の血清をデカントし、新しいチューブに入れて、解析前に−40℃で凍結保存した。気管支肺胞洗浄（BAL）を0.4mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（注入と回収を３回繰り返した）を用いて集めた。BALを微量遠心機にて2700rpmで６分間遠心し、上清を取り出し、解析前に−40℃に保存した。細胞ペレットを適当量のPBSに再懸濁し、総細胞数を血球計算版で計測した。細胞の示差測定を可能にするためにサイトスピン（Cytospin）スライドを作製した。肺を摘出し、急速凍結した後、解析前に−80℃で保存した。乳鉢と乳棒を用いて、肺を液体窒素下で粉砕し、T-PER（登録商標）組織タンパク質抽出試薬（Tissue Protein Extraction Reagent）(Pierce社)に溶かして、Dounceホモジナイザーを用いて40ストロークでホモジナイズした。
【０３０６】
DOM1mを検出するためのELISA：
96ウェルのMAXISORPアッセイプレート（Nunc社）に、0.5μg/mlでPBSに溶解したmTNFR/Fc（R&D systems社）を100μl/ウェルで用いて、4℃にて一晩コーティングした。ウェルを0.05％のTween/PBSで３回、PBSで３回洗浄した。PBSに溶解した2％BSAを200μl/ウェルで加えて、プレートをブロッキングした。ウェルを洗浄した後、100μlのDOM1m標準液またはサンプルを加えた。プレートを１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、その後、結合したDOM1を、ニワトリ抗VH（1/500）と、それに続く抗ニワトリIGY HRPコンジュゲート(1/5000に希釈；Abcam社)を用いることによって検出した。各ウェルに100μlのSureBlue 1-Component TMB マイクロウェル ペルオキシダーゼ（KPL社, Gaithersburg, USA）溶液を加えてプレートを現像し、適当なシグナルが現れるまで（〜５分）プレートを室温に放置した。HClを加えて反応を停止し、450nmにおける吸光度を読み取った。
【０３０７】
結果：
BAL中のDOM1mレベルは１時間で最高値となり、その値は約14μg/mlであった（0.25mlのBAL流体中に約3.5μg）。これは、投与した物質の少なくとも17％（20μgの全投与量のうち3.5μg）が肺の気管支肺胞コンパートメントに存在することを意味している。より多くの物質が周辺組織内に存在する可能性があるが、この物質を回収することはできない。BALにおけるレベルは長時間高かったが、24時間にわたって緩やかな減少（24時間後には10分の1以下に減少）を示した。
【０３０８】
肺組織におけるDOM1mレベルは、投与後８時間まで比較的一定していたが、投与の24時間後には検出できなかった。投与後８時間で、肺組織におけるレベルは約0.35μgであった。８時間時点で肺に存在する全投与量に対するパーセンテージは約2％であった（全投与量は20μgであった）。BALレベルと合わせて考えると、検証した時点に全体として肺で検出される薬剤の最大レベルは、全投与量の少なくとも〜20％であった。
【０３０９】
血清中のDOMm1のレベルは、１時間で最大（約150 ng/ml）となり、急速に低下した。投与後５時間で、血清中のレベルは、約70 ng/mlとなったが、これは100ng/マウス（1.5mlの血液量）に相当する。投与後５時間の血清中に存在する全投与量に対するパーセンテージは約0.5％であった（全投与量は20μgであった）。DOM1mは、５時間後の血清中には検出できなかった。
【０３１０】
実施例４
カニクイザルTNFR1との交差反応性
カニクイザル（Macaca fascicularis）皮膚線維芽細胞株を用いて、抗ヒトTNFR1 dAbのカニクイザルTNFR1に対する交差反応を細胞ベースのTNFR1アッセイで検証した。カニクイザルTNFR1に対する交差反応は、代理薬を用いずに薬物動態研究および毒性研究を行えるので都合が良い。
【０３１１】
方法：
カニクイザル胚皮膚線維芽細胞（ウェルあたり5×103細胞）を抗ヒトTNFR1 dAbと共に37℃/5％ CO2で１時間インキュベートした。その後、200pg/ml（最終濃度）のヒトTNFを加え、プレートを37℃/5％ CO2で一晩インキュベートした。
【０３１２】
ヒトIL-8 DuoSet ELISAを用いて、細胞培養上清中のヒトIL-8の濃度を測定した。本アッセイはメーカーの使用説明書に従って行った。96ウェルのNunc Maxisorpアッセイプレートに、4μg/mlでPBSに溶解した検出抗体100μlをコーティングした。プレートを4℃で一晩インキュベートした。インキュベーションのステップとステップの間に、自動プレート洗浄機を用いて0.05％ tween/PBSで３回、PBSで３回、プレートを洗浄した。ウェルあたり200μlの1％ BSA/PBSを添加し、その後プレートを室温にて１時間インキュベートした。PBS中の0.1％ BSA/0.05％ Tween-20 90μlおよび細胞上清10μlを各ウェルに加え、PBSに溶解した0.1％ BSA/0.05％ Tween-20中の5ng/mlで開始するIL-8の標準曲線を含めた。100μlの検出抗体を20ng/ml（原液をPBS中の0.1％ BSA/0.05％ Tween-20で1:180に希釈）で各ウェルに添加した後、プレートを室温で２時間インキュベートした。100μlのストレプトアビジン‐HRP（原液をPBS中の0.1％ BSA/0.05％ Tween-20で1:200に希釈）を各ウェルに加えた。プレートを室温で２０分間インキュベートした。100μlのSureBlue 1-Component TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液をそれぞれのウェルに加えた後、青色を呈するまで室温に放置した。100μlの1M塩酸を加えて反応を停止させた。プレートの吸光度は、30分以内に450nmで読み取った。
【０３１３】
結果／結論：
TAR2h-131シリーズの抗ヒトTNFR1 dAbは、カニクイザル線維芽細胞によるTNF誘導IL-8放出を効果的にブロックできる。dAb TAR2h-131-511およびTAR2h-131-117は、カニクイザルアッセイでは、ヒトMRC-5アッセイで測定された効力（〜600pM）と比べると、わずかに高い効力（それぞれ303nMと330nM）を有していた。結論として、TAR2h-131シリーズのdAbはカニクイザルTNFR1と交差反応する。
【０３１４】
実施例５
TNFα誘導型肺炎症に対する肺送達された抗TNFR1 dAbの効果
抗TNFR1 dAbを、TNFαの経鼻送達１時間前に、経鼻投与によってマウスの肺に投与した。TNFα投与前に抗TNFR1 dAbを肺に前投薬する効果は、BAL中の好中球の数を測定することによって、BAL中の炎症性サイトカインKC、MIP-2およびMCP-1の濃度を定量することによって、またTNFα投与後の選択された時点における肺組織のE-セレクチンを定量することによって検証した。
【０３１５】
方法：
炎症性刺激は、0.1％BSAを含むPBS中の組換えマウスTNFαとした。
【０３１６】
抗TNFR1 dAbは、20nMクエン酸バッファー（pH6.0）中のTAR2m-21-23 (バッチBH31/01/06-1)とした。
【０３１７】
TNFα（マウスあたり1μg）を鼻腔内（i.n.）投与した。投与量は、マウスあたり50μl（20μg/ml）であった。抗TNFR1 dAb TAR2m-21-23（１mg／kg）も経鼻投与した。投与したdAbの量は、マウスあたり50μl（20gのマウスで0.4mg/ml）であった。
【０３１８】
フルバリアで飼育され、かつ受取り時に特定微生物未検出の認証付き雌マウス（C57BL/6株）(16〜20g) (Charles River社)を、５匹以下のグループで、アスペンチップの床敷を敷いたソリッド底の個別換気ケージ（IVC）に収容した。ケージ内環境（気流、温度、および湿度）をIVCシステム（Techniplast社）で制御した。
【０３１９】
処理グループ：
・グループ数：13
・グループサイズ：n＝5〜6
各グループのマウスに、TNFα投与の１時間前に、媒体またはdAbのいずれかを経鼻投与した。マウスをTNFα投与後の表４に挙げた所定の時間で屠殺した。
【表４】
2009512672.tif 000005
【０３２０】
処理の約３分前に、イソフルランの吸入による軽い麻酔を行った。媒体またはdAbを50μl/マウスの量で鼻腔内経路により注入した。マウスが回復してからホームケージに戻した。１時間後にTNFα（1μg/マウス）またはその媒体を同じ鼻腔内経路により投与した。dAbまたは媒体で処理したマウスのグループを、TNFα投与後、2、4、6、8、24および48時間の時点で屠殺した。
【０３２１】
マウスを過剰量の麻酔剤（ペントバルビタールナトリウム、腹腔内に100mg/kg）で殺した。気管にカニューレを挿入し、３つに分けた0.4mlのPBSを用いて気管支肺胞洗浄（BAL）を行った。洗浄液を遠心前に氷上に置いた。心臓および肺を一まとめにして摘出し、心臓を除いた後、肺を液体窒素で急速凍結した。洗浄液を遠心し、上清を250μlずつ４つに分けて、−40℃で保存した。細胞ペレットを40μlのPBSに再懸濁し、10μlの細胞懸濁液を90μlの「Kimura」または「Turks」染色剤に加え、血球計算板を用いて全湿性細胞を計測した。サイトスピンスライドを細胞懸濁液から調製し、示差細胞解析のため「ライト‐ギムザ（Wrights Giemsa）」染色を用いて染色した。細胞は、標準的な形態測定技術を用いて識別した。
【０３２２】
サンプル調製とELISA：
マウスTNFα、KC、MIP-2、MCP-1およびE-セレクチン用のELISAキットをR&D Systems社から購入した。未希釈のBAL上清サンプルを用いて、BAL中のサイトカインKC、MIP-2、およびMCP-1の濃度を測定した。BAL上清を１:100希釈し、BAL中のTNFαの濃度を測定した。
【０３２３】
凍結肺を融解し、10mM HEPES（pH 7.5）／0.5％ triton X-100／150mM NaCl／1mM EDTA／0.5mM AEBSF／プロテアーゼ阻害剤カクテル（1μg/ml ロイペプチン、1μg/ml アプロチニン、10μg/ml トリプシン‐キモトリプシン阻害剤、および1μg/ml ペプスタチン）を含む500μlの溶解バッファー中でホモジナイズした。肺ホモジネートの上清を希釈して、肺組織のE-セレクチン（1:50）濃度、およびTNFα（1:100）濃度を測定した。
【０３２４】
BALおよび肺ホモジネート上清の総タンパク質濃度は、Quantipro BCAキット（Sigma社）を用いて測定した。
【０３２５】
結果：
マウスTNFαの経鼻投与後に、BALおよび肺組織のTNFαの有意なレベルが、投与後２時間で検出された（図１１Aおよび１１B）。BALおよび肺組織の両TNFαの濃度は時間依存的様式で減少し、48時間までにベースライン（媒体処理）レベルに戻った。BAL中のレベルは、肺組織中のレベルよりも約10倍高かった。これらのデータは、TNFαの経鼻投与がサイトカインの有意な肺送達をもたらすことを立証している。しかしながら、検出されたTNFαの一部は内因性起源の可能性があるが、応答プロファイルはそれを示唆していない。
【０３２６】
1mg/kgの抗TNFR1 dAbの１時間前の投与は、検証した各時点を通してBALおよび肺組織のTNFα濃度に明らかな影響を及ぼさなかった。マウスTNFαの経鼻投与後のBALおよび肺組織のTNFα濃度の急速な増加にもかかわらず、BALの好中球数は、TNFα投与後１〜８時間の間、ベースラインを上回るほど有意には増加しなかった。しかしながら、TNFα投与後24および48時間で、BALの好中球が観察された（図１２）。24および48時間でのBAL好中球の増加は、抗TNFR1 dAbによって部分的に抑制された（それぞれ、26％および44％の抑制）。
【０３２７】
好中球の化学走性物質であるKCおよびMIP-2の濃度は、TNFα投与後２時間で有意に増加したが、両サイトカインともに時間依存的様式に減少し、24時間までにベース濃度に戻った（図１３Aおよび１３B）。BALのKCおよびMIP-2のこれらの増加は、抗TNFR1 dAbの前処理によって有意に減少した。
【０３２８】
また、BALのMCR-1および肺組織のE-セレクチンの濃度もTNFαによって有意に増加したが、ピーク増加は、BALのKCおよびMIP-2のそれよりも遅かった（２時間ではなく６時間）。BALのMCP-1および肺組織のE-セレクチンの濃度は、48時間までにベースレベルに戻った（図１３Cおよび１３D）。BALのKCおよびMIP-2の増加は、抗TNFR1 dAbの前処理によって有意に減少した。
【０３２９】
考察：
マウスTNFαのマウスへの経鼻投与は、肺TNFαの有意なレベルをもたらした。このレベルは、BALの好中球、BALのKC、MIP-2およびMCP-1、並びに肺組織のE-セレクチンの有意な増加を誘導した。BALの好中球は、約24時間まで増加しなかったが、48時間では上昇したままであった。ラットを用いた文献中の以前のデータでは、長期の好中球応答が立証されている。BALのKCおよびMIP-2のピーク増加は２時間の時点で、またBAL MCP-1および肺組織E-セレクチンのピーク増加は６時間あたりで観察された。KC、MIP-2、MCP-1およびE-セレクチンそれぞれの増加レベルは、TNRα投与の６時間後に検出された。
【０３３０】
マウスTNFα投与の１時間前の抗TNFR1 dAb（1mg/kg）での前処理により、BALの好中球およびKC、MIP-2およびMCP-1、並びに肺組織のE-セレクチンの増加が抑制された。これらのデータは、TNFR1レセプターがこのモデル動物において経鼻TNFαにより誘導される肺炎症の大部分を仲介していることを示唆している。
【０３３１】
実施例６
TNFα誘導型肺炎症に対する肺送達された抗TNFR1 dAbの各種投与量の効果
様々な投与量の抗TNFR1 dAbを、マウスの肺に鼻腔内経路でTNFαの経鼻投与１時間前に投与した。使用した抗TNFR1 dAbの投与量は、2.5mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg、0.03mg/kgおよび0.01mg/kgであった。抗TNFR1 dAbによる前投与の効果は、BAL中の炎症性サイトカインKC、MIP-2およびMCP-1の濃度、並びに肺組織のE-セレクチンを定量することによって検証した。
【０３３２】
方法：
炎症性刺激および被検物質については、実施例５に記載したものと同じである。TNFα（マウスあたり１μg）を鼻腔内(i.n.)経路で投与した。投与量はマウスあたり50μl（20μg/ml）である。2.5mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg、0.03mg/kgまたは0.01mg/kgの投与量の抗TNFR1 dAb TAR2m-21-23を鼻腔内経路で投与した。投与したdAbの容量は、マウスあたり50μlであった。
【０３３３】
マウスは、実施例５に記載したものと同じ株であり、かつ同様に収容した。
【０３３４】
処理グループ：
・グループサイズ:n＝4〜7
各グループのマウスに媒体またはdAb（2.5、1、0.3、0.1、0.03または0.01mg/kg）のいずれかをTNFα投与の１時間前に経鼻投与した。全グループをTNFα投与後６時間で屠殺した。
【０３３５】
マウスに実施例５と同じ方法を用いて投薬した。マウスをTNFαの経鼻投与後６時間で絞め、BAL細胞、BAL上清および凍結肺組織を実施例５に記載のように回収した。BALタンパク質、KC、MIP-2およびMIP-1、肺ホモジネート上清タンパク質およびE-セレクチンを実施例５に記載のように分析し、定量した。
【０３３６】
結果：
実施例５で示したように、TNFαの経鼻投与は、投与後６時間でBAL中のKC、MIP-2およびMCP-1並びに肺組織中のE-セレクチンの有意な濃度を誘導した。効力は炎症性メディエータ間で異なっていたが、抗TNFR1 dAbでの前処理（TNFαの１時間前）は、これらの炎症性メディエータの上昇を用量依存的様式で抑制した（表５）。
【表５】
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【０３３７】
抗TNFR1 dAbは、BALのKCを0.03mg/kg〜2.5mg/kg間の全ての投与量で同程度に抑制したが、0.01mg/kgでは不活性であった。同様に、抗TNFR1 dAbは、BALのMIP-2を0.1mg/kg〜2.5mg/kg間の全ての投与量で実質的に同程度に抑制したが、0.03mg/kgではやや低い抑制が認められ、また0.01mg/kgでは不活性であった。
抗TNFR1 dAbは、BALのMCP-1の阻害剤としてはあまり効力がなかった。なぜなら、0.3mg/kg〜2.5mg/kg間で有意な抑制が見られたものの、それ以下では見られなかったからである。肺組織のE-セレクチン濃度は、同様の様式で抑制された。すなわち、有意な抑制が0.3mg/kg〜2.5mg/kg間で、僅かな抑制が0.1mg/kgで観察され、それ以下では効果がなかった。
【０３３８】
考察：
マウスTNFαのマウスへの経鼻投与は、BAL好中球、BALのKC、MIP-2およびMCP-1、並びに肺組織のE-セレクチンの有意な増加を引き出した。これらの増加は、抗TNFR1 dAbにより用量依存的様式で有意に抑制された。抗TNFR1 dAbは、BAL MCP-1および肺組織E-セレクチンと比較すると、BALのKCおよびMIP-2に対してより強い抑制活性を有していた。これは、BALのKCおよびMIP-2のピーク増加がTNFα投与後に比較的すみやかに誘導されたのに対して、BAL MCP-1および肺組織E-セレクチンのピーク増加は遅かったからであると考えられる。
【０３３９】
本実験により、0.3mg/kg用量の抗TNFR1 dAbの経鼻投与は、BAL好中球、BALのKC、MIP-2およびMCP-1、並びに肺組織E-セレクチンのTNFα誘導増加を、TNFα投与後６時間で有意に抑制するが、0.3mg/kgが超最大用量（supra-maximal dose）ではないことが実証された
実施例８
鼻腔内経路で投与された抗TFR1 dAbのin vivo作用持続性
抗TNFR1 dAb（TAR2m-21-23）を、TNFαの経鼻投与前の様々な時間に、鼻腔内経路によってマウスの肺に投与した。抗TNFR1 dAbを肺に前投与する効果は、ELISAによりBAL中の炎症性サイトカインKC、MIP-2およびMCP-1を定量することによって、並びに肺組織中のE-セレクチンを定量することによって検証した。その結果を表６に示す。
【０３４０】
方法：
・炎症性刺激：組換えマウスTNFα
・被検物質１：TAR2m-21-23（バッチBH31/01/06-1）（抗TNFR1 dAb）
・組換えTNFα用の媒体：0.1％BSAを含むPBS
・TAR2m-21-23用の媒体：20nMクエン酸バッファー（pH6）
TNFαは、前の実施例で使用したように鼻腔内（i.n.）経路でマウスあたり1μgを投与した。鼻に投与した容量は、マウスあたり50μl（20μg/ml）とした。TAR2m-21-23の投与量は、鼻腔内経路で0.3mg/kgとした。鼻に投与した容量は、マウスあたり50μl（マウスが20gの場合0.4mg/ml）とした。
【０３４１】
使用したマウスとdAb調製：マウスは、前の実験プロトコルに記載したものと同じ株で、かつ同様に収容した。
【０３４２】
プロトコル：
処理グループ
・グループサイズ：n＝4〜7
・処理時間：各グループのマウスに、TNFα投与の１、２、４または６時間前に、媒体またはdAbのいずれかを用いて経鼻投与した。全グループをTNFα投与後６時間で屠殺した。
【０３４３】
・投薬と最終手順：前の実験と同じ方法を用いて上で詳述したようにマウスに投薬した。マウスをTNFαの経鼻投与後６時間で絞め、BAL細胞、BAL上清、および凍結肺組織を前の実験で詳述したように回収した。
【０３４４】
・サンプルの調製およびELISA：BALタンパク質、KC、MIP-2およびMIP-1、並びに肺ホモジネート上清タンパク質およびE-セレクチンを前の実験で詳述したように分析した。
【表６】
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【０３４５】
表６に示した結果は、TNFα投与１、２、４または６時間前のdAbの投与がTNFで誘導されるBALのKCおよびMIP-2を全てのdAb前投与時点で有意に抑制したことを示している。より良好な抑制は、より長い前投与時間で観察された。これは、経鼻投薬後、dAbがレセプターに結合するためには、１時間を越える時間が最適であることを示唆している。同様の方法で、TNFα投与１、２、４または６時間前におけるdAbの投与も、TNFにより誘導されるBALのMCP-1および肺組織のE-セレクチンを全てのdAb前投与時点で有意に抑制した。これらの結果は、抗TNFR1 dAbには６時間以上の作用持続性があることを示している。
【０３４６】
実施例９
鼻腔内経路で投与された、TNFR1と結合しかつTNFαとそのレセプターとの結合を抑制する抗TNFR1 dAbの、TNFα誘導型肺炎症に対する評価
前の実施例は、TNFR1と結合するがTNFαとTNFR1との結合を抑制しない抗TNFR1 dAb（「非競合型dAb」TAR2m-21-23）がTNFα誘導型肺炎症を有意に抑制したことを示している。本実験では、TNFR1と結合しかつTNFαとTNFR1との結合を抑制するdAb（「競合型dAb」TAR2m-15-12)もTNFα誘導型肺炎症を抑制する効果があることを立証する。
【０３４７】
方法：
・炎症性刺激：組換えマウスTNFα
・被検物質１：TAR2m-21-23（バッチBH31/01/06-1）（競合型抗TNFR1 dAb）
・被検物質２：TAR2m-15-12（非競合型抗TNFR1 dAb)
・組換えTNFα用の媒体：0.1％BSAを含むPBS
・dAb用の媒体：20nMクエン酸バッファー（pH6）
TNFαの用量は、前の実験で使用したように鼻腔内（i.n.）経路でマウスあたり1μgとした。鼻に投与した容量はマウスあたり50μl（20μg/ml）とした。
【０３４８】
TAR2m-21-23またはTAR2m-15-12の投与量は、鼻腔内経路で0.3、0.1および0.03mg/kgとした。鼻に投与した容量はマウスあたり50μl（マウスが20gの場合0.4mg/ml）とした。
【０３４９】
使用したマウスとdAb調製：マウスは、前の実験プロトコルに記載したものと同じ株で、かつ同様に収容した。dAbを上記のように処方した。
【０３５０】
プロトコル：
処理グループ
・グループサイズ：n＝4〜7
・処理時間：各グループのマウスに媒体またはdAbのいずれかをTNFα投与の１時間前に経鼻投与した。全グループをTNFα投与後６時間で屠殺した。
【０３５１】
・投薬および最終手順：前の実験と同じ方法を使用して上で詳述したようにマウスに投薬した。マウスをTNFαの経鼻投与後６時間で絞め、BAL細胞、BAL上清、および凍結肺組織を前の実験で詳述したように回収した。
【０３５２】
・サンプルの調製およびELISA：BALタンパク質、KC、MIP-2およびMIP-1、並びに肺ホモジネート上清タンパク質およびE-セレクチンを前の実験で詳述したように分析した。
【表７】
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【０３５３】
表７に示した結果は、前の実験と同様に、非競合型抗TNFR1 dAb（TAR2m-21-23）を用いた前処理（TNFαの１時間前）が炎症性メディエータであるBALのKC、MIP-2およびMCP-1、並びに肺組織のE-セレクチンの上昇を用量依存的に抑制したことを示している。同じように、競合型抗TNFR1 dAb (TAR2m-15-12)も炎症性メディエータであるBALのKC、MIP-2およびMCP-1、並びに肺組織のE-セレクチンの上昇を用量依存的に抑制した。
【０３５４】
TAR2m-15-12抗TNFR1 dAbは、TAR2m-21-23と比較して0.03mg/kgではBALのKCに対する有効性が僅かしかなく、またBALのMIP-2に対する有効性も0.1〜0.03mg/kgでは僅かしかなかった。TAR2m-15-12抗TNFR1 dAbは、BAL MCP-1に対して34％の抑制を示したTAR2m-21-23と比べて、0.1mg/kgでBAL MCP-1に対しては不活性であった。TAR2m-15-12抗TNFR1 dAbは、TAR2m-21-23と比べると、0.1mg/kgで肺組織のE-セレクチンに対してやや低い有効性を示した。
【０３５５】
in vitro効力は、TAR2m-21-23については〜1nM、TAR2m-15-12については〜5nMであった。さらに、TAR2m-21-23は、TAR2m-15-12よりも大きな親和性と遅い解離速度を有する。炎症性メディエータに対する有効性の差異は、減少した親和性および効力に起因している可能性がある。これは、TNFαとTNFR1との結合を抑制する、非競合型dAb（TAR2m-21-23）と競合型dAb TAR2m-15-12間に明白な差異がないことを示している。
【０３５６】
まとめ
表８は、TS誘導実験とTNF誘導実験の結果をまとめている。TSに曝露されかつペグ化抗TNFR1 dAbで処理されたグループ（10mg/kg）は、TSに曝露されかつ対照で処理されたグループと比較して、肺における細胞浸潤物の有意な減少（全細胞について62％の抑制）を示した。TS／ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社）（腹腔に10mg/kg）で処理したグループのいずれの細胞集団においても有意な減少は、観察されなかった。細胞浸潤物の有意な減少は、投与量を30mg/kg（腹腔）に増加した際に、TS／ENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社）処理グループで観察されたにすぎなかった。これは、ペグ化抗TNFR1 dAbと比較して、３倍を上回るENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社）の全身投与（mg/kg）が細胞集団の有意な減少を達成する上で必要であることを示している。
【０３５７】
TNFα誘導モデルでは、抗TNFR1 dAb処理グループ（経鼻で0.3mg/kg）は、TNFαで誘導されるMIP-2レベルの78％抑制を示す。MIP-2レベルの同様の抑制レベル（78％）は、10mg/kg（経鼻）で処理されたENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社）グループにおいて達成された。1mg/kg（経鼻）で処理されたENBREL（エタネルセプト；Immunex Corporation社）グループは、細胞流入のいかなる有意な減少も示さなかった。まとめると、このデータは、抗TNFR1 dAbと比較して、MIP-2の効率的な抑制を達成する上で３０倍を上回るENBREL (エタネルセプト; Immunex Corporation社)の経鼻投与（mg/kg）が必要であることを示している。
【表８】
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【０３５８】
本発明は、その好ましい実施形態について示し、また説明しているが、当業者であれば、形式上および細部において、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変化を加えることができることは理解できるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０３５９】
【図１】TNFR1のアンタゴニストが、タバコ煙誘発(TS)慢性閉塞性肺疾患(COPD)のC57BL/6マウスでの亜慢性モデルにおいて、肺組織に局所投与した場合には、他の治療薬よりもすぐれた効力を有することを示すプロットである。プロットは、実施例1に記載した実験の終了時のマウスの気管支肺胞洗浄液(BAL)中に存在する細胞の数を示す。個々のデータは本実験での各マウスについてのものであり、グループの平均（平均値；水平線）も示してある。これらの結果は、鼻腔内投与で肺に局所投与した抗TNFR1 dAb単量体（Dom1）が、未処置グループと比べて、BAL中の細胞の数を72％も減少させたことを示している。結果はまた、TNFを標的とする治療薬(ENBREL(登録商標)(エタネルセプト; Immunex Corporation))の肺への局所投与がBAL中の細胞の数に対して統計的に有意な効果を及ぼさなかったことをも示している。結果はさらに、鼻腔内投与で肺に局所投与した抗TNFR1 dAb単量体（Dom1）が、10mg/kgの高用量で1日2回(b.i.d.)経口投与したホスホジエステラーゼ4阻害剤(PDE4I, BAY 19-8004)よりもBALの細胞数を減少させるのに有効であったことを示している。TS、タバコ煙誘発；Veh、ビヒクル；ns、統計的に有意でない。
【図２】TNFR1のアンタゴニストが、タバコ煙誘発(TS)慢性閉塞性肺疾患(COPD)のC57BL/6マウスでの亜慢性モデルにおいて、全身的に投与した場合に、TNFを標的とする治療薬と比べてすぐれた効力を有することを示すプロットである。プロットは、実施例2に記載した実験の終了時のマウスのBAL中に存在する細胞の数を示す。個々のデータは本実験での各マウスについて示してあり、グループの平均（水平線）も示してある。これらの結果は、腹腔内投与で全身的に投与したPEG化抗TNFR1 dAb単量体（TNFR1）が、未処置グループと比べて、BAL中の細胞の数を減少させたことを示している。結果はまた、TNFを標的とする治療薬(ENBREL(登録商標)(エタネルセプト; Immunex Corporation))の全身投与がBALの細胞数を12％増加させたことも示しているが、この増加は統計的に有意でなかった。TS、タバコ煙誘発；Veh、ビヒクル；ns、統計的に有意でない；i.p.、腹腔内。
【図３】図1および2に示した特定のグループについてのデータを、前記モデルにおいて経口ステロイド（デキサメタゾン）が投与された実験の結果と共に、再プロットしたヒストグラムである。このヒストグラムは、鼻腔内投与（1mg/kgを1日1回(q.d.)投与）による肺への抗TNFR1 dAb単量体(DOM/ADS101-native (図1のDom1))の局所投与、ならびに腹腔内投与（10mg/kgを2日に1回(q.a.d.)投与）によるPEG化抗TNFR1 dAb単量体（DOM/ADS101-pegylated (図2のTNFR1）)の全身投与が、前記モデルにおいて、高用量（10mg/kgを1日2回(b.i.d.)経口投与）で投与したホスホジエステラーゼ4阻害剤(PDE4I)よりも効果的であったことを示している。このヒストグラムはまた、経口投与したステロイド（0.3mg/kgを1日2回経口投与）が前記モデルにおいてBALの細胞数を増加させたために有効でなかったことをも示している。
【図４】図1および2に示した特定の実験グループについてのBAL中のマクロファージ(4A)または好中球(4B)の異なった細胞数を示すヒストグラムである。図4Aは、鼻腔内投与（1mg/kgを1日1回(q.d.)投与）による肺への抗TNFR1 dAb単量体(DOM/ADS101-native (図1のDom1))の局所投与、ならびに腹腔内投与（10mg/kgを2日に1回(q.a.d.)投与）によるPEG化抗TNFR1 dAb単量体（DOM/ADS101-pegylated (図2のTNFR1）)の全身投与が、高用量（10mg/kgを1日2回(b.i.d.)経口投与）で投与したホスホジエステラーゼ4阻害剤(PDE4I)よりも、BAL中のマクロファージの数を減少させるのに効果的であったことを示している。同様に、図4Bは、鼻腔内投与（1mg/kgを1日1回(q.d.)投与）による肺への抗TNFR1 dAb単量体(DOM/ADS101-native (図1のDom1))の局所投与、ならびに腹腔内投与（10mg/kgを2日に1回(q.a.d.)投与）によるPEG化抗TNFR1 dAb単量体（DOM/ADS101-pegylated (図2のTNFR1）)の全身投与が、高用量（10mg/kgを1日2回(b.i.d.)経口投与）で投与したホスホジエステラーゼ4阻害剤(PDE4I)よりも、BAL中の好中球の数を減少させるのに効果的であったことを示している。
【図５】鼻腔内投与により肺組織に局所投与した後の、TNFR1と結合する薬剤(DOM1m (TAR2m21-23))の薬物動態研究の結果を示すグラフである（実施例3を参照）。このグラフは、肺組織中のDOM1mのレベルが投与後少なくとも8時間ほぼ一定のままであるが、BAL中のレベルは次第に減少していき、血清中のレベルは急速に低下して5時間後には検出不能となったことを示している。BALおよび血清中のDOM1mの最大レベルは投与後1時間で検出された（BALでは約14μg/ml、血清では約150ng/ml）。BAL中のレベルは長時間にわたり高い状態のままであり、24時間かけて徐々に低下した（24時間後には＞10倍の低下）。血清中のレベルは急速に低下して、5時間後にはDOM1mを血清中に検出できなかった。肺組織中のDOM1のレベルは投与後少なくとも8時間ほぼ一定していたが、投与してから24時間後には検出できなかった。
【図６Ａ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号1〜10）を示す。表示したアミノ酸配列はギャップを含まない連続配列である。記号〜は、相補性決定領域(CDR)の位置を示すために配列に挿入されたものである。CDR1は〜に挟まれており、CDR2は〜〜に挟まれており、CDR3は〜〜〜に挟まれている。
【図６Ｂ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号11〜19）を示す。
【図６Ｃ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号20〜28）を示す。
【図６Ｄ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号29〜37）を示す。
【図６Ｅ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号38〜46）を示す。
【図６Ｆ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号47〜55）を示す。
【図６Ｇ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号56〜64）を示す。
【図６Ｈ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号65〜73）を示す。
【図６Ｉ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号74〜82）を示す。
【図６Ｊ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号83〜92）を示す。
【図６Ｋ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号93〜101）を示す。
【図６Ｌ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号102〜110）を示す。
【図６Ｍ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号111〜119）を示す。
【図６Ｎ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号120〜128）を示す。
【図６Ｏ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号129〜137）を示す。
【図６Ｐ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号138〜146）を示す。
【図６Ｑ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号147〜155）を示す。
【図６Ｒ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号156〜164）を示す。
【図６Ｓ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号165〜173）を示す。
【図６Ｔ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号174〜182）を示す。
【図６Ｕ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号183〜192）を示す。
【図６Ｖ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号193〜198）を示す。
【図７Ａ】マウスTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号199〜209）を示す。表示したアミノ酸配列はギャップを含まない連続配列である。記号〜は、相補性決定領域(CDR)の位置を示すために配列に挿入されたものである。CDR1は〜に挟まれており、CDR2は〜〜に挟まれており、CDR3は〜〜〜に挟まれている。
【図７Ｂ】マウスTNFR1に対する結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号210および211）を示す。
【図８】図8Aは、ヒト（ホモ・サピエンス）TNFR1の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号212）を示す。図8Bは、ヒト（ホモ・サピエンス）TNFR1の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号213）を示す。
【図９】図9Aは、マウス（Mus musculus:ハツカネズミ）TNFR1の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号214）を示す。図9Bは、マウス（Mus musculus:ハツカネズミ）TNFR1の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号215）を示す。
【図１０Ａ】マウスTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号216〜221）、およびヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号222〜228）を示す。表示したアミノ酸配列はギャップを含まない連続配列である。記号〜は、相補性決定領域(CDR)の位置を示すために配列に挿入されたものである。CDR1は〜に、CDR2は〜〜に、そしてCDR3は〜〜〜に挟まれている。
【図１０Ｂ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号229〜241）を示す。
【図１０Ｃ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号242〜254）を示す。
【図１０Ｄ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号255〜267）を示す。
【図１０Ｅ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号268〜280）を示す。
【図１０Ｆ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号281〜293）を示す。
【図１０Ｇ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号294〜306）を示す。
【図１０Ｈ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号307〜319）を示す。
【図１０Ｉ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号320〜332）を示す。
【図１０Ｊ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号333〜345）を示す。
【図１０Ｋ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号346〜358）を示す。
【図１０Ｌ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号359〜371）を示す。
【図１０Ｍ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号372〜384）を示す。
【図１０Ｎ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号385〜396）を示す。
【図１０Ｏ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号397〜409）を示す。
【図１０Ｐ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号410〜422）を示す。
【図１０Ｑ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号423〜433）を示す。
【図１１】ビヒクル(veh)または抗TNFR1 dAb (1mg/kg)を鼻腔内（i.n.）投与してから1時間後にマウスTNFα(1mg/マウス)をi.n.投与した後の、気管支肺胞洗浄液(BAL)（図11A）または肺組織（図11B）中のTNFα濃度の時間依存的増加を示すグラフである。
【図１２】ビヒクルまたは抗TNFR1 dAb (1mg/kg)を予備投与（i.n.）してから1時間後にマウスTNFα(1mg/マウス)をi.n. 投与した後の、BAL好中球の時間依存的増加を示すグラフである。抗TNFR1 dAbの予備投与は、TNFαにより誘導される好中球の増加を部分的に阻止した。
【図１３】BAL KCレベル(13A)、BAL MIP-2レベル(13B)、BAL MCP-1レベル(13C)、または肺組織E-セレクチンレベル(13D)に対するマウスTNFαの時間依存的作用を示すグラフである。抗TNFR1 dAbを投与すると、TNFαにより誘導される増加が顕著に阻止された。
【図１４Ａ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号434〜439）を示す。表示した配列はギャップを含まない連続配列である。記号〜は、相補性決定領域(CDR)をコードする位置を示すために配列に挿入されたものである。CDR1は〜に、CDR2は〜〜に、そしてCDR3は〜〜〜に挟まれている。
【図１４Ｂ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号440〜445）を示す。
【図１４Ｃ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号446〜451）を示す。
【図１４Ｄ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号452〜457）を示す。
【図１４Ｅ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号458〜463）を示す。
【図１４Ｆ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号464〜469）を示す。
【図１４Ｇ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号470〜475）を示す。
【図１４Ｈ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号476〜481）を示す。
【図１４Ｉ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号482〜487）を示す。
【図１４Ｊ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号488〜493）を示す。
【図１４Ｋ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号494〜499）を示す。
【図１４Ｌ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号500〜505）を示す。
【図１４Ｍ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号506〜511）を示す。
【図１４Ｎ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号512〜517）を示す。
【図１４Ｏ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号518〜523）を示す。
【図１４Ｐ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号524〜529）を示す。
【図１４Ｑ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号530〜535）を示す。
【図１４Ｒ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号536〜541）を示す。
【図１４Ｓ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号542〜547）を示す。
【図１４Ｔ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号548〜553）を示す。
【図１４Ｕ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号554〜559）を示す。
【図１４Ｖ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号560〜565）を示す。
【図１４Ｗ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号566〜571）を示す。
【図１４Ｘ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号572〜577）を示す。
【図１４Ｙ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号578〜583）を示す。
【図１４Ｚ】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号584〜589）を示す。
【図１４Ａ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号590〜595）を示す。
【図１４Ｂ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号596〜601）を示す。
【図１４Ｃ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号602〜607）を示す。
【図１４Ｄ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号608〜613）を示す。
【図１４Ｅ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号614〜619）を示す。
【図１４Ｆ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号620〜625）を示す。
【図１４Ｇ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号626〜631）を示す。
【図１４Ｈ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号632〜637）を示す。
【図１４Ｉ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号638〜643）を示す。
【図１４Ｊ２】ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号644）、ならびにマウスTNFR1に対する結合特異性を有するヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号645〜650）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図６Ｒ】
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【図６Ｓ】
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【図６Ｔ】
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【図６Ｕ】
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【図６Ｖ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１０Ｐ】
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【図１０Ｑ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
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【図１４Ｌ】
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【図１４Ｍ】
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【図１４Ｎ】
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【図１４Ｏ】
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【図１４Ｐ】
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【図１４Ｑ】
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【図１４Ｒ】
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【図１４Ｓ】
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【図１４Ｔ】
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【図１４Ｕ】
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【図１４Ｖ】
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【図１４Ｗ】
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【図１４Ｘ】
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【図１４Ｙ】
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【図１４Ｚ】
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【図１４Ａ２】
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【図１４Ｂ２】
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【図１４Ｃ２】
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【図１４Ｄ２】
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【図１４Ｅ２】
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【図１４Ｆ２】
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【図１４Ｇ２】
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【図１４Ｈ２】
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【図１４Ｉ２】
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【図１４Ｊ２】
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【国際調査報告】
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2009512672.tif 000098
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