(57)【要約】  診断上の偽陽性を排除した新規なクラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いた簡便、迅速且つ精度の高いクラミドフィラ・キャビエの検出方法を提供する。  本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、クラミドフィラ・キャビエの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法を用いることにより、クラミドフィラ・キャビエ自体の定量も行うこともできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。以下同じ。）の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ（Chlamydophila caviae）遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号７〜３９から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号７〜１０及び配列番号２９〜３０から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１１〜１４及び配列番号３１〜３２から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１５〜１８及び配列番号３３〜３４から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１９〜２２及び配列番号３５〜３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号２３〜２６及び配列番号３７〜３８から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号６で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号２７〜２８及び配列番号３９から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するものである、
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー。
【請求項５】
配列番号１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号７〜１０及び配列番号２９〜３０から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１１〜１４及び配列番号３１〜３２から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１５〜１８及び配列番号３３〜３４から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１９〜２２及び配列番号３５〜３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号２３〜２６及び配列番号３７〜３８から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号６で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号２７〜２８及び配列番号３９から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するものである、
請求項４に記載のプライマー。
【請求項６】
プライマーを構成するヌクレオチドの数が１０〜５０個である、請求項４に記載のプライマー。
【請求項７】
標識物質で標識化された、請求項４に記載のプライマー。
【請求項８】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項７に記載のプライマー。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つ、クラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、クラミドフィラ・キャビエ検出用プローブ。
【請求項１０】
標識物質で標識化された、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１１】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１２】
５'末端がレポーター蛍光色素で標識化され、３'末端がクエンチャー色素で標識化された、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして用いることを特徴とする、クラミドフィラ・キャビエの検出方法。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出することを特徴とする、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
更に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを用いる、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを用い、更に試料中の核酸を鋳型として用いて核酸増幅反応を行い、該標識プローブから遊離された標識物質の標識を検出する、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１７】
下記工程を包含することを特徴とする、請求項１３に記載の検出方法、
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
（２）(１)で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて、クラミドフィラ・キャビエの有無を判定する。
【請求項１８】
下記のいずれかの場合に、被検試料が。クラミドフィラ・キャビエ陽性であると判定する、請求項１７記載の検出方法、
（１）電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、目的とする塩基対数のプライマー伸長産物の画分を確認し、目的とする塩基対数のプライマー伸長産物が確認された場合、
（２）電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認された場合。
【請求項１９】
プライマーが標識物質で標識化されており、当該標識プライマーを用いて試料中の核酸を鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する、請求項１３に記載の。クラミドフィラ・キャビエの検出方法。
【請求項２０】
核酸増幅連鎖反応を行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長産物の標識を測定する、請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを標識物質で標識化したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出することを特徴とする、請求項１３に記載の。クラミドフィラ・キャビエの検出方法。
【請求項２２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして含んでなる、クラミドフィラ・キャビエ検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅およびその検出系を利用した、クラミドフィラ・キャビエ（Chlamydophila caviae）を検出及び／又は同定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今日、性風俗の多様化や若者を中心とする日本人の性行動様式の変化にともない性感染症としてのクラミジア感染症の増加は著しい。【０００３】
クラミジア（Chlamydia）は、真核細胞の偏性細胞内寄生細菌である。それは宿主細胞で生育増殖し、細胞の細胞質に封入体（inclusion）を形成する。これらの性質が宿主の臨床的症状の原因となる。例えば、性器クラミジア感染症の原因菌はクラミジア・トラコマティス（Chlamydia.trachomatis）であり、主に男性では尿道炎、女性では子宮頚管炎を発症する。また、クラミドフィラ・キャビエはモルモットの封入体結膜炎（GPIC）の原因菌であるが、ヒトに対する病原性は今日まで確認さていない。【０００４】
一方、岡山大学の公文裕巳等によって、ヒトに感染したクラミジアの中には、クラミジア・トラコマティス以外のものが存在する可能性があること、そして、ヒトに感染するその第二のクラミジアが、クラミドフィラ・キャビエの可能性があることが示唆されている。（非特許文献１）。【０００５】
クラミドフィラ・キャビエは、1999年まではChlamidya psittaci GPIC isolateとして取り扱われていたが、近年のゲノム解析にもとづいたChlamidia属の分類再編成に伴い、独立した種となった。また、クラミドフィラ・キャビエは、Chlamydiaceae familyのなかで全ゲノムの解析が完了した４番目の種であり（非特許文献２）、特にヒトに広く感染するChlamydia peumoniaeとの比較解析が進められている。【０００６】
クラミジアの検出法としては、直接蛍光抗体染色（ＤＦＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）および酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）等の、抗原を検出する方法が開発されている。また、標識物質で標識したクラミジア・トラコマティスのリボソームRNAに相補的な１本鎖DNAを用いた、プローブハイブリダイゼーションにより、クラミジア・トラコマティスを検出する方法（非特許文献３）も開発されている。【０００７】
一方、より高感度な検出法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、PCR）、リガーゼ連鎖反応（Ligase Chain Reaction、ＬＣＲ）およびStandard Displacement Amplification（ＳＤＡ）などのＤＮＡ増幅技術が開発されている。例えば、ドメイカら（非特許文献４）、ボーウェンズら（非特許文献５）および米国特許第5,232,829号明細書（特許文献１）は、ＰＣＲと、それに続いて微量滴定、プレートハイブリダイゼーションを行い、クラミジア・トラコマティスを検出する方法を報告している。また、ＬＣＲと、それに続いて微粒子サンドイッチ免疫検定検出を行って、クラミジア・トラコマティスを検出する方法も報告されている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。しかし、これらの検出方法は、検出完了までに４〜６時間を要する。【０００８】
一方、クラミドフィラ・キャビエの検出としては、蛍光染色法とnested PCR法（従来のPCR法）が主であった。このうち蛍光染色法は、McCoy細胞やHeLa細胞等のクラミドフィラ・キャビエの宿主となる細胞に検体を接種培養した後、クラミジア科特異抗体で処理して観察するという方法である。この方法は、検出に約３日の時間を要し、感度・特異度も低いものであった。【０００９】
また、nested PCR法は感度が比較的低い為に、一定量までクラミジアを培養してからDNAを抽出してPCRを行う必要がある。しかし、上記したように、クラミジアを培養するには、McCoy細胞やHeLa細胞等のクラミドフィラ・キャビエの宿主となる細胞に検体を接種培養する必要があるが、それは大変な作業であり、且つ約４８〜７２時間を要する。そのため、培養から検出までに最低でも約3日が必要で、また検出の特異性も満足のいくものではなかった。【００１０】
ＰＣＲ、ＬＣＲおよびＳＤＡなどのＤＮＡ増幅技術は、現在多方面で利用されている技術である。それにもかかわらず、上記したように、これらの方法を応用した、クラミドフィラ・キャビエを特異的に検出する遺伝子検査法は、これまで確立されていない。一方で、上記したように、クラミドフィラ・キャビエがヒトへ感染する可能性があることが示唆されているため、クラミドフィラ・キャビエを簡便に且つ特異的に検出し得る方法の開発が望まれている現状にある。【００１１】
【非特許文献１】「子宮頸管炎患部から分離されたクラミジアの性状」、病原微生物検出情報月報（IASR）、 国立感染症研究所感染症情報センター、2004年8月、vol. 25, No.8, p.204-205
【非特許文献２】Read T. D. et al., Nucleic Acid Reserch, 2003, 31, 2134-2147
【非特許文献３】Warren R., et al.,Journal of Clinical Microbiology, 1993, 31, 1663-1666.
【非特許文献４】Domeika M. et al., Journal of Clinical Microbiology, 1994, 32, 2350-2352
【非特許文献５】Bauwens J. E. et al., Journal of Clinical Microbiology, 1993, 31, 3013-3106
【非特許文献６】Chernesky Max A. et al., Journal of Clinical Microbiology, 1994, 32, 2682-2685
【非特許文献７】Lee H. H. et al., Lancet, 1995, 345, 213-216
【非特許文献８】Bassiri M. et al., Journal of Clinical Microbiology, 1995, 33, 898-900）
【非特許文献９】F.Poly et al., J. Bacteriology, 2004, 186(14), p.4781-4795
【特許文献１】米国特許第５２３２８２９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、診断上の偽陽性を排除した新規なクラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー、及びこれを用いた簡便、迅速且つ精度の高いクラミドフィラ・キャビエの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は上記課題を解決する目的で成されたもので、以下の構成よりなる。
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。以下同じ。）の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー。
（３）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、クラミドフィラ・キャビエ検出用プローブ。
（４）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして用いることを特徴とするクラミドフィラ・キャビエの検出方法。
（５）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして含んでなる、クラミドフィラ・キャビエ検出用試薬キット。【００１４】
本発明者等は、現在までに決定されたクラミドフィラ・キャビエとその他の生物の各種遺伝子について、各種間の各遺伝子配列の相同性の理論的検証と実験的検証を重ねた。その結果、マイクロアレイ法を用いた方法により得られたクラミドフィラ・キャビエ由来の塩基配列の断片の中に、クラミドフィラ・キャビエの遺伝子配列に特異的にハイブリダイズし、クラミドフィラ・キャビエの検出に有用な塩基配列が存在することを見出した。【００１５】
そこで、これらの知見をもとに更に鋭意研究の結果、クラミドフィラ・キャビエに特異的なオリゴヌクレオチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列）を得、これらの塩基配列がクラミドフィラ・キャビエの検出に有用であることを見出した。そして更にこれらの配列をもとにクラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブを開発し、これらを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法を確立するに到った。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、クラミドフィラ・キャビエの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法を用いることにより、クラミドフィラ・キャビエ自体の定量も行うこともできる。【００１７】
更にヒトに感染性をもつ他のクラミジアでは反応しないという高い特異度も実現することができた。【００１８】
今後、クラミドフィラ・キャビエがヒトに感染して尿道炎や子宮頚管炎を引き起こす可能性について、疫学的な研究・検討が必要であることが予想されることからも、本発明は斯業に貢献するところ大なる発明である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例３で得られたリアルタイムＰＣＲ検出結果を示し、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットした検量線である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明に於いて、クラミドフィラ・キャビエ（Chlamydophila caviae）遺伝子とは、Chlamydophila caviaeの持つ全ゲノム配列における任意の塩基配列単位（領域）をいう。【００２１】
本発明に係るオリゴヌクレオチドとしては、配列表の、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる（以下、本発明のオリゴヌクレオチドと略記する場合がある。）。【００２２】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば、
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、更に好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は
（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド、
等が挙げられる。【００２３】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００２４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号７〜３９から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。【００２５】
配列番号１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号７〜１０及び配列番号２９〜３０から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。【００２６】
配列番号２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１１〜１４及び配列番号３１〜３２から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。【００２７】
配列番号３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１５〜１８及び配列番号３３〜３４から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。【００２８】
配列番号４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１９〜２２及び配列番号３５〜３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。【００２９】
配列番号５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号２３〜２６及び配列番号３７〜３８から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。【００３０】
配列番号６で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号２７〜２８及び配列番号３９から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。【００３１】
配列番号７〜３９から選択される塩基配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号７〜３９から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７〜３９から選択される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００３２】
また、配列番号７〜３９から選択される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号７〜３９から選択される塩基配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上を含有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００３３】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００３４】
上記の、本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の一部若しくは全部を有するオリゴヌクレオチドとは、具体的には、例えば本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、ハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００３５】
ここでいう「ハイストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば「50%ホルムアミド中で42〜70℃で、好ましくは60〜70℃でハイブリダイゼーションを行い、その後0.2〜2×SSC、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）中、25〜70℃で洗浄する。」という条件である。【００３６】
また、「ストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば「６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜70℃の温度の条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で洗浄する。」という条件である。【００３７】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の、一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドの例としては、例えば、
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、更に好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は
（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド、
等が挙げられる。【００３８】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００３９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する、相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００４０】
配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００４１】
また、配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上を含有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００４２】
本発明に係るクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとは、クラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。そのハイストリンジェントな条件及びストリンジェントな条件は、上記したとおりである。【００４３】
尚、本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行なって得られた、ウリジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、一つ若しくは複数のヌクレオチドが欠失、挿入或いは置換されたオリゴヌクレオチドであってもよい。一つ若しくは複数のヌクレオチドがイノシン（I）のような修飾ヌクレオチドであってもよい。【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドを得る方法としては、特に限定されないが、例えば自体公知の化学合成法により調製する方法が挙げられる。この方法では、ベクター等を用いる遺伝子操作法によりオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを得る方法（クローン化法）に比べ、容易、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能な方法である。【００４５】
例えば、ＤＮＡの合成に通常行われている、ＤＮＡシンセサイザーを用い、通常のホスホアミダイト法にてオリゴヌクレオチドを合成し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる常法により精製すれば、目的とする本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。【００４６】
また、オリゴヌクレオチドの合成を業者に委託して、業者から購入してもよい。【００４７】
本発明の目的を達成し得るオリゴヌクレオチドを探索（スクリーニング）する方法としては、FEMS Microbiology Letters 166: 63-70, 1998 あるいはSystematic and Applied Microbiology 24: 109-112, 2001などに示されているサブトラクション法、すなわち標的であるゲノムＤＮＡ由来ＤＮＡフラグメント群から、区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡ由来ＤＮＡフラグメント群と反応したものを除いて候補配列を濃縮する方法がある。【００４８】
また、標的であるゲノムＤＮＡ及び区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡからの増幅産物のディファレンシャルディスプレイを作製するといったアプローチ、すなわち任意にプライムされたポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）を利用する方法が考えられる（特願平11-155589号公報）。【００４９】
更に、いわゆるマイクロアレイ法と呼ばれる方法を利用することによっても、本発明の目的を達成しうるオリゴヌクレオチドを探索することができるし、本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。その方法の概略は以下の通りである。【００５０】
すなわち、例えばクラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡのショットガン・クローンを作製し、得られたショットガン・クローンからＤＮＡを精製する。次いで、そのショットガン・クローン由来の精製ＤＮＡを、ＰＣＲ等により増幅させた後、スライドガラス上に配置させて、常法によりマイクロアレイを作製する。別に、検出対象であるクラミドフィラ・キャビエ由来のゲノムＤＮＡを蛍光標識（標識１）したＤＮＡフラグメント群を作製する。一方、区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡを蛍光標識（標識２）したＤＮＡフラグメント群を別途に作製する。そして、標識１及び標識２の各々を同一反応系で用いる競合ハイブリダイゼーション法を行い、マイクロアレイ上の精製ＤＮＡと標識１及び標識２との反応性（結合性）を検定する。この検定により、標的であるクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡ由来フラグメント群（標識１）と、より特異的に反応する配列候補群を選定できる（例えば非特許文献９等の記載参照）。【００５１】
以上の方法により、目的の、クラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選別することができる。以下にマイクロアレイ法を用いた、本発明のオリゴヌクレオチドの選定方法の一例について詳説する。【００５２】
（１）クラミドフィラ・キャビエ由来精製ゲノムＤＮＡの調製
まず、クラミドフィラ・キャビエ由来精製ゲノムＤＮＡを得る。例えば常法によりクラミドフィラ・キャビエ菌株からＤＮＡを抽出・精製すればよい。また、業者にクラミドフィラ・キャビエ菌株からゲノムＤＮＡを抽出・精製を依頼し、それを入手してもよい。【００５３】
（２）Whole Genome Shotgun libraryの作製
クラミドフィラ・キャビエのWhole Genome Shotgun libraryの作製を行う方法の一例として、Venter et al., Science. 2001 Feb 16;291(5507):1304-1351 に記載のWhole Genome Shotgun法を改変した方法を、以下に説明する。【００５４】
まず、上記(1)で得られたクラミドフィラ・キャビエ由来精製ゲノムＤＮＡを、適当な緩衝液等で希釈した後、例えば濃度20%のグリセロール存在下で、5kPa〜9kPaの圧力下、ネビュライザーを用いて、約１〜１５分間処理し、ＤＮＡの断片化処理を行う。この処理により、目的とする500〜1000bpのサイズの画分（ＤＮＡ断片）を効率よく回収する事ができる。得られた画分を市販の抽出カラムを利用して精製する。【００５５】
その後、常法に従い、得られた画分（ＤＮＡ断片。目的のＤＮＡ断片を含む。）を、ライゲーションによってベクターＤＮＡに組み込み、組み換えＤＮＡ（クラミドフィラ・キャビエのWhole Genome Shotgun library）を得る。【００５６】
そのために用いられるベクターＤＮＡとしては、後で形質転換する宿主細胞が大腸菌の場合には、例えば、pBS[例えばpBSII sk+ベクター(Stratagene社)]、pQE-TRIプラスミド (Qiagen社製)、pBluescript、pET、pGEM-3Z、pGEX等のベクターが挙げられる。用いるベクターの種類によっては、ライゲーションの前に、予めＤＮＡ断片を、ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＤＮＡ断片の末端を平滑化処理してもよい。【００５７】
次いで、得られた組み換えＤＮＡを用いて、適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る。【００５８】
そのために用いられる宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia.coli）が挙げられ、好ましくはJM109、DH5α、TOP10等が挙げられる。この他、よりプラスミドやファージＤＮＡの導入効率の高い、Competent Cell（コンピテントセル）を用いても良い。例えば、E.coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ社製）等が挙げられる。【００５９】
宿主細胞の形質転換は、常法（例えば、D.M.Morrisonの方法（Method in Enzymology, 68, 326-331,1979）等）で行えばよい。また、市販のCompetent Cellを用いる場合には、その製品プロトコールに従って、形質転換を行えばよい。【００６０】
「目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組換えＤＮＡ」が導入された形質転換体を選別する方法として、例えば、形質転換のために用いたベクターの性質を利用する方法がある。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含有するベクターを用いた場合には、アンピシリンを含有する培地上で形質転換体を培養し、得られたクローンを選択することにより、目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組換えＤＮＡが導入された、形質転換体（クラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡ由来のWhole Genome Shotgun clone Library）が容易に得られる。【００６１】
（３）マイクロアレイ作製
続いて、下記の方法でマイクロアレイを作製する。【００６２】
すなわち、上記(2)で得られた形質転換体のLibrary（クラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡ由来のWhole Genome Shotgun clone Library）から、常法に従いＤＮＡを精製する。精製したＤＮＡを鋳型として用い、適当なプライマー[市販のプライマーで良い。例えばM13 Primer M1(タカラバイオ社製)及びプライマーM13 Primer RV(タカラバイオ社製)等]を用い、常法に従ってＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ増幅産物を精製する。次いで常法に従って、精製したＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ用スライドガラス上にスポットする。これにUV照射（60mJ〜300mJ/cm2）を行ない、スライドガラス上にＰＣＲ増幅産物（ターゲットのクラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡを含む）を固定して、マイクロアレイを作成する。【００６３】
（４）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
ｉ）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
例えばヘキシルアミノ-UTPを用いた間接標識法等の常法により、例えば上記(1)の方法で得られたクラミドフィラ・キャビエ由来精製ゲノムＤＮＡを標識物質で標識する。また、対照用ゲノム(例えばChlamydia psttaci等の、クラミドフィラ・キャビエ以外のクラミジア等)ＤＮＡを、上記のクラミドフィラ・キャビエ由来精製ゲノムＤＮＡを標識する標識物質とは異なる標識物質で標識する。【００６４】
上記のＤＮＡの標識に用いられる標識物質としては、通常この分野で用いられる標識物質が挙げられるが、汎用されている標識物質としては、Cy3（アマシャムバイオサイエンス株式会社商品名）、Cy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社商品名）、Alexa555（インビトロジェン社商品名）、Alexa647（インビトロジェン社商品名）等が挙げられる。【００６５】
例えば、Cy3やCy5を用いて上記ＤＮＡを標識する方法としては、DeRisi研究室（www.microarrays.org）が発表したプロトコールを改変した間接標識法が挙げられる。この方法は、まず、酵素伸長反応を行い、アミノ基をもつαUTPを分子内に取り込ませたＤＮＡ鎖を作成する。そしてそのＤＮＡ鎖のアミノ基に蛍光色素（サクシニイミド体）を化学的に結合させて、ＤＮＡを標識するという方法である。【００６６】
すなわち、まず、出発材料（クラミドフィラ・キャビエ由来精製ゲノムＤＮＡ又は対照用ゲノムＤＮＡ）を、常法に従い熱変性処理する。次いで、熱変性処理物に、DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTPの混合液、dTTP、Ha-dUTP、Klenow酵素を添加し、37℃で3時間程度の伸長反応を行う。得られた反応産物を限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機等を用いて完全に乾燥させる。次に、乾燥させた上記反応産物にNaHCO3 を加えて混合し、2〜3 分常温静置する。【００６７】
別にCy3（またはCy5）をDMSO に溶かしたものを調製（Cy-dye Solution Cy3、Cy-dye Solution Cy5）する。このCy-dye Solution Cy3を対照用ゲノム由来ＤＮＡを用いて得られた上記反応産物に加える。また、Cy-dye Solution Cy5をクラミドフィラ・キャビエＤＮＡを用いて得られた上記反応産物に加える。それぞれの反応産物を40℃で60 分程度、遮光下にインキュベートする。さらに、それぞれの反応産物に4M NH2OHを加え、攪拌後に15 分程度、遮光下にインキュベートして、それぞれのゲノム由来ＤＮＡの標識産物を得る。その後、得られた標識産物を、限外ろ過カラムにのせ、14000rpm で4 分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機で完全に乾燥させる。【００６８】
（ｉｉ）標識産物の断片化工程
上記(4)i)で得られた乾燥状態の各ゲノム由来ＤＮＡの標識産物に対して、0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液を調製したものを加え、懸濁混和させる。94℃で15 分間程度加熱処理し、100base〜300 base の、各ゲノム由来ＤＮＡの標識産物の、断片化生成物を得る（Cy3標識産物、Cy5標識産物）。【００６９】
得られたCy3標識産物及びCy5標識産物の各々を限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機等で完全に乾燥させる。【００７０】
次いで、このマイクロチューブに、salmon sperm DNA、formamide及びArrayHyb Hybridization bufferを加えて調製した試薬溶液を加え、上記で得た乾燥物を懸濁混和後、95℃で5 分程度インキュベートし、Cy3Cy5標識産物混合溶液（クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡのCy5標識産物の断片化生成物とChlamydia psttaci由来ゲノムＤＮＡのCy3標識産物の断片化生成物の混合溶液）を調製する。【００７１】
（５）マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション（アレイ上でのDNA-DNA hybridization）
次に、クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun cloneのマイクロアレイに対して、常法によりCy3Cy5標識産物のハイブリダイゼーションを行う。【００７２】
例えば、上記(3)の工程で得られた、クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun cloneのマイクロアレイ上に、上記(4)(ii)で調製したCy3Cy5標識産物混合溶液をのせ、65℃で8 時間以上、遮光下に反応させて、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをカバーグラスごと2×SSC-0.1%SDS 溶液に室温で浸し、カバーグラスをはずす。1×SSC、0.03％SDS溶液（60℃）で10 分間洗浄、0.2×SSC 溶液（42℃）で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液（室温）で約10 分間洗浄後、800prm で約5 分間遠心を行って乾燥させる。【００７３】
（６）蛍光強度の測定；シグナル検出から数量化まで
蛍光読み取りスキャナーを用いて、上記(5)で得られたマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定する。この際、Cy3及びCy5の、２チャンネルでの蛍光強度を測定して、蛍光検出データを得る。【００７４】
ハイブリダイゼーションに用いたCy5標識産物は、クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡを標識したＤＮＡフラグメント群であり、Cy3標識産物は対照用ゲノムＤＮＡを標識したＤＮＡフラグメント群である。そのため、マイクロアレイ上のあるスポットのCy3とCy5のそれぞれの蛍光強度を測定した結果、Cy3に対するCy5の蛍光強度比が高い場合には、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Cy5標識産物、すなわちクラミドフィラ・キャビエ由来のゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズしたということを示す。そして、そのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、クラミドフィラ・キャビエに対する特異性が高いと判断される。【００７５】
他方、あるスポットのCy3とCy5のそれぞれの蛍光強度を測定した結果、Cy3に対するCy5の蛍光強度比が低い場合は、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Cy3標識産物、すなわち対照用ゲノムＤＮＡとハイブリダイズしたことを示す。この場合と、Cy3及びCy5の蛍光の強さが同程度だった場合と、Cy3及びCy5のどちらの蛍光も検出されなかった場合には、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、クラミドフィラ・キャビエに対する特異性が低いと判断される。【００７６】
そこで、例えばマイクロアレイ上で検出されたCy3/Cy5の蛍光強度比（Ratio）を基に、散布図(スキャッタープロット)を作成する等して、結果を解析する。そして、クラミドフィラ・キャビエに特異的な配列のスクリーニングを行う。【００７７】
スクリーニングの結果、クラミドフィラ・キャビエに特異的なシグナルが得られた（Cy5の蛍光強度が強い場合）スポット（クローン）を選択する。このスポットのクローンが、目的のクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。【００７８】
次いで、通常この分野で用いられているシークエンサー等の機器を利用し、常法に従い、得られたクローンの塩基配列決定を行い、目的のオリゴヌクレオチドが得られたか確認してもよい。【００７９】
本発明に係るクラミドフィラ・キャビエ検出用プライマーとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するプライマーが挙げられる（以下、本発明のプライマーと記載する場合がある。）。【００８０】
また、本発明のプライマーは、ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲを含む）等の核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション等の条件に合わせて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドの中から、解離温度（Ｔｍ値）などを考慮して、適当な領域の適当な長さを選択して設計すればよい。【００８１】
好ましくはプライマー配列としての特異性を維持するために必要な塩基数と考えられている１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３５塩基、更に好ましくは１８〜２５塩基の長さを有しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００８２】
プライマーを設計するには、プライマー設計のために一般に用いられているソフトや、例えばプライマーデザイン用のWebツールPrimer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research.)等を用いればよい。【００８３】
本発明のプライマーに用いられる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、上記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明に於いて記載したものと同じである。【００８４】
本発明のプライマーの具体例としては、例えば配列番号７〜３９から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するものが挙げられる。【００８５】
本発明のプライマーの好ましい具体例としては、配列番号７〜２８から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は配列番号７〜２８から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００８６】
尚、配列番号７〜１０で表される塩基配列のプライマーは、配列番号１で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【００８７】
配列番号１１〜１４で表される塩基配列のプライマーは、配列番号２で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【００８８】
配列番号１５〜１８で表される塩基配列のプライマーは、配列番号３で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【００８９】
配列番号１９〜２２で表される塩基配列のプライマーは、配列番号４で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【００９０】
配列番号２３〜２６で表される塩基配列のプライマーは、配列番号５で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【００９１】
配列番号２７〜２８で表される塩基配列のプライマーは、配列番号６で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【００９２】
また、配列番号１で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号７〜１０で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号７（R08_4f_Fw1）：１４５位〜１６３位、
配列番号８（R08_4f_Rv1）：２８５位〜３０４位、
配列番号９（R08_4f_Fw2）：３６５位〜３８５位、
配列番号１０（R08_4f_Rv2）：５０９位〜５２９位。【００９３】
配列番号２で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１１〜１４で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１１（R08_3d_Fw1）：３７位〜５６位、
配列番号１２（R08_3d_Rv1）：１５４位〜１７１位。
配列番号１３（R08_3d_Fw2）：５７５位〜５９４位、
配列番号１４（R08_3d_Rv2）：７４３位〜７６４位。【００９４】
配列番号３で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１５〜１８で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１５（R12_2a_Fw1）：６２７位〜６４５位、
配列番号１６（R12_2a_Rv1）：７８７位〜８０６位。
配列番号１７（R12_2a_Fw2）：９６位〜１１７位、
配列番号１８（R12_2a_Rv2）：２１３位〜２３５位。【００９５】
配列番号４で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１９〜２２で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１９（R12_4h_Fw1）：２６１位〜２８０位、
配列番号２０（R12_4h_Rv1）：４３６位〜４６０位、
配列番号２１（R12_4h_Fw2）：４４位〜６６位、
配列番号２２（R12_4h_Rv2）：１７３位〜１９２位、
配列番号５で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号２３〜２６で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号２３（R10_1g_Fw1）：４８位〜６８位、
配列番号２４（R10_1g_Rv1）：２１９位〜２３８位。
配列番号２５（R10_1g_Fw2）：２４４位〜２６３位、
配列番号２６（R10_1g_Rv2）：４２４位〜４４３位。【００９６】
配列番号６で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号２７〜２８で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号２７（R10_12d_Fw1）：４１０３位〜４１２２位、
配列番号２８（R10_12d_Rv1）：４２２８位〜４２４８位、
尚、上記において、各配列番号の後の（  ）内に、本発明で命名したプライマーの名称を示す。【００９７】
本発明のプライマーを得る方法は、上記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。【００９８】
また、本発明のプライマーは、標識物質で標識されていてもよい。【００９９】
本発明のプライマーを標識する方法としては、この分野で通常行われているオリゴヌクレオチドの標識方法が挙げられ、標識物質ごとに適宜方法を選択すればよい。【０１００】
本発明のプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。【０１０１】
例えば、放射性同位体としては32P，33P，35S等、酵素としてはアルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等が、蛍光物質としてはAlexa555，Alexa647（インビトロジェン社）、Cyanine Dye系のCy3，Cy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、フルオレセイン等が、発光物質としてはAcridinium Esterを含む化学発光試薬等が挙げられる。【０１０２】
本発明のプライマーを放射性同位体により標識する方法としては、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般によく用いられているランダムプライマー法、ニックトランスレーション法、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼによる5'−末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた3'−末端標識法、ＲＮＡラベリング法等が挙げられる。【０１０３】
本発明のプライマーを酵素で標識する方法としては、アルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の、この分野に於ける常法である直接標識法が挙げられる。【０１０４】
本発明のプライマーを蛍光物質で標識する方法としては、例えばフルオレセイン標識したヌクレオチドをこの分野に於ける常法の標識手法によりプライマーに取り込ませる方法が挙げられる。また、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチド中に置換する方法（例えば、Nucleic Acids Res.,1986年, 第14巻, p.6115参照）でもヌクレオチドを蛍光物質で標識することができる。その場合、５位にリンカーアームを有するウリジンを特開昭60-500717 号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、そのデオキシウリジンを含有するオリゴヌクレオチドを合成し、次いでそのオリゴヌクレオチド鎖に蛍光物質を導入する方法もある（特開昭60-50717号公報）。【０１０５】
本発明のプライマーを発光物質で標識する方法及びビオチンで標識する方法としては、通常この分野で行われているヌクレオチドを発光標識又はビオチン標識する常法が挙げられる。【０１０６】
本発明に係るクラミドフィラ・キャビエ検出用プローブとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）を含有するプローブが挙げられる（以下、本発明のプローブと記載する場合がある。）。【０１０７】
本発明のプローブは、ＰＣＲ(リアルタイムＰＣＲを含む)等の核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション等の条件に合わせて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドから、解離温度（Ｔｍ値）などを考慮して、適当な領域の適当な長さを選択して設計すればよい。但し、プローブに十分な特異性を持たせたいのならば、プローブ配列としての特異性を維持するために必要な塩基数を考慮して設計することが望ましい。【０１０８】
例えば、核酸ハイブリダイゼーション法（例えばサザン・ハイブリダイゼーション等）等に用いるプローブとしては、１０〜７００塩基、好ましくは１００〜６００塩基、更に好ましくは２００〜５００塩基の長さを有しているものが好ましい。【０１０９】
また、例えばリアルタイムＰＣＲ増幅法（例えばTaqManTM法、Molecular Beacon法等）等に用いるプローブとしては、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜４０塩基、更に好ましくは２０〜３０塩基の長さを有しているものが好ましい。【０１１０】
本発明のプローブに用いられる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、上記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明に於いて記載したものと同じである。【０１１１】
本発明のプローブの好ましい具体例としては、例えば、配列番号７〜３９から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号７〜３９から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するプローブが挙げられる。【０１１２】
本発明のプローブのより好ましい具体例としては、配列番号２９〜３９から選択される配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドが挙げられる。【０１１３】
尚、配列番号２９〜３９から選択される塩基配列又はこれらに対する相補配列は、本発明のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されるオリゴヌクレオチドの塩基配列である。フォワードプライマーとリバースプライマーの組合せと、それを用いたＰＣＲにより増幅される塩基配列の配列番号を表１に併せて示す。例えば、配列番号２９で表される塩基配列は、配列番号７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅されると推測されるオリゴヌクレオチドの塩基配列であることを示す。【０１１４】
【表１】
2009099037.tif 000002
【０１１５】
本発明のプローブを得る方法は、上記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。【０１１６】
本発明のプローブは、標識物質で標識されていてもよい。【０１１７】
本発明のプローブを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。【０１１８】
本発明のプローブを標識物質で標識するために用いられる、標識物質の具体例及び標識方法としては、本発明のプライマーの標識方法の説明に記載した方法と同じ方法が挙げられる。【０１１９】
また、後述するリアルタイムＰＣＲによる検出法に於いて用いられる標識プローブとしては、本発明のプローブを、リアルタイムＰＣＲ法において通常用いられている標識物質で標識したものが挙げられる。例えば、5'末端がレポーター蛍光物質［カルボキシフルオレセイン（FAM）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、テトラクロロフルオレセイン(TET)等］で標識され、3'末端がクエンチャー色素[例えばカルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）等の蛍光物質、Black Hole Quencher色素（BHQ），4-((4-(dimethylamino) phenyl)azo)benzoic acid (DABCYL)等の非蛍光物質]で標識された本発明のプローブが挙げられる。【０１２０】
後述するTaqManTMリアルタイムＰＣＲによる検出法においても、上記した標識プローブを用いることができる。【０１２１】
本発明に係るクラミドフィラ・キャビエの検出に用いられる検体（specimen）としては、尿，尿道スワブ懸濁液、頚管スワブ研濁液、口腔スワブ懸濁液等の各種臨床検体が挙げられる。これら検体は、検出の前に予め検体中に存在する菌の濃縮、分離や、菌体からの核酸の分離、濃縮などの操作を前処理として行ってもよい。その方法としては、酵素、界面活性剤、アルカリ、熱による処理などがある。検体から単離、培養された培養菌体、これらより単離、精製された核酸、又は核酸増幅検出系等で増幅された核酸でもよい。【０１２２】
上記試料からＤＮＡを抽出・精製するには、検体からのクラミジアＤＮＡ抽出に用いられる常法に従って行えばよい。【０１２３】
例えば、下記の方法で行えばよい。
まず、試料中のクラミジアの細胞壁を破壊する必要がある。その方法としては、例えば菌体を試料とする場合には、例えばSDS等の界面活性剤や、グアニジンチオシアネート（GTC）等の蛋白変性剤で菌体を処理してクラミジアの膜構造を破壊する方法、又は菌体をガラスビーズ等によって物理的に破砕する方法等が挙げられる。【０１２４】
クラミジアの細胞壁を破壊した後、この分野で一般的なＤＮＡの調製法［フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿法、Rapid and simple method for purification of nucleic acids、J. Clin. Microbiol., 1990, Mar;28（3）, 495-503, Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa Jに記載された方法、イソプロパノールを用いて沈殿する方法等］によりＤＮＡの抽出及び精製を行えばよい。【０１２５】
ＤＮＡの抽出及び精製には、そのための様々なキットが市販されているので、それを用いてもよい。例えば（株）キアゲン製イオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic-tip等を用いてＤＮＡの抽出、精製を行えばよい。【０１２６】
本発明に係るクラミドフィラ・キャビエの検出方法としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）をプライマー又は／及びプローブとして用いる方法（本発明のプライマー又は／及びプローブを用いる方法）が挙げられる。【０１２７】
例えば、
（Ａ）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出する方法、
（Ｂ）本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして用いる方法、
等が挙げられる。以下に、夫々の方法について説明する。【０１２８】
（Ａ）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出する方法
（Ａ）の方法において、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行う方法としては、例えば、本発明のプライマーを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼ等による核酸増幅反応[例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法（Tsugunori Notomi et al., Nucleic Acid Res., 28, e63, 2000）、ICANTM（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（臨床病理, 51(11), 1061-1067, 2003, Nov）、LCR(ligase chain reaction)法（特開平4-211399号）、SDA(strand displacement amplification)法（特開平8-19394号）]を行ってプライマー伸長させる方法が挙げられる。これによりクラミドフィラ・キャビエの塩基配列の特定の領域の配列を増幅させることができるので、得られたプライマー伸長産物を測定することにより、クラミドフィラ・キャビエを検出することができる。【０１２９】
上記の核酸増幅反応を行う方法の中でも、ＰＣＲ法が最も一般的な方法として挙げられ、ＰＣＲ法の例としては、例えばリアルタイム増幅検出法（例えば米国特許第5210015号、米国特許第5538848号の記載参照）を用いることができる。また、リアルタイム増幅検出法による検出法の例として、例えばリアルタイムＰＣＲ検出法が挙げられる。【０１３０】
リアルタイムＰＣＲ検出法の例としては、TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第5538848号の記載参照）、MGB Eclipse Probe System法（例えば米国特許第5,801,155号の記載参照）、Molecular Beacons Probe Technology法（例えば米国特許第5925517号の記載参照）、LUX Fluorogenic Primer法（Invitrogen Corporation）、Quenching probe-ＰＣＲ（QP）法（例えば米国特許第6,492,121号の記載参照）等が挙げられる。【０１３１】
ＰＣＲ等の核酸増幅反応において用いられる本発明のプライマーの具体例は、上記したとおりである。【０１３２】
また、核酸増幅反応に用いられる、好ましいフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せとしては、上記表１で示される組合せが挙げられる。【０１３３】
表１において、例えば番号１の組み合わせは、「フォワードプライマーが配列番号７で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号８で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ。」を示す。【０１３４】
上記プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ等の核酸増幅反応に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常この分野で用いられているものを用いればよく、その条件、手法等は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、ＰＣＲ法の一般的なプロトコルに従って行えばよい。【０１３５】
核酸増幅反応で得られたプライマー伸長産物を検出する方法は、通常この分野で行われている常法で良く、限定されるものではない。【０１３６】
例えばTaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第5538848号の記載参照）、インターカレーター法、MGB Eclipse Probe System法（例えば米国特許第5,801,155号の記載参照）、Molecular Beacons Probe Technology法（例えば米国特許第5925517号の記載参照）、LUX Fluorogenic Primer法（Invitrogen Corporation）、Quenching probe-ＰＣＲ（QP）法（例えば米国特許第6,492,121号の記載参照）や、核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法等、様々な検出法が挙げられる。【０１３７】
これらのうち、一般によく用いられる方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。【０１３８】
（Ａ−１）TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（TaqManTMプローブ法）、
（Ａ−２）インターカレーター法、
(Ａ−３)核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、
(Ａ−４)標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法。【０１３９】
以下に、夫々の方法について説明する。
（Ａ−１）TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（TaqManTMプローブ法）
5'末端を例えばFAM等の蛍光色素（レポーター）で、3'末端を例えばTAMRA等のクエンチャー色素で標識したプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、目的の微量なＤＮＡを高感度且つ定量的に検出する方法である（例えば米国特許第5,538,848号の記載参照）。【０１４０】
すなわち、本法は、本発明のプライマーと、本発明のプローブの5'末端がレポーター蛍光色素で標識され、3'末端がクエンチャー色素で標識された標識プローブを用いて、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、該標識プローブから遊離された標識物質の標識を検出する方法である。【０１４１】
TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法の原理は以下の通りである。【０１４２】
この方法には、5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャー色素によってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光標識プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光標識プローブが5'端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングする方法であり、これにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。【０１４３】
また、TaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出法は、非特異的な増幅反応によるノイズの発生が非常に少ない。そのため、より特異的なターゲットの増幅・検出が可能となる点で、特に優れた方法である。【０１４４】
本発明に係るTaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出法に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーには、本発明のプライマーが用いられる。好ましいプライマーとしては、上記したＰＣＲ法等の核酸増幅反応において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましい組合せも上記したとおりである。【０１４５】
本発明に係るTaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出法に用いられる5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識したプローブに用いられるプローブとしては、上記した本発明のプローブであればよい。実際には、選択したフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せでリアルタイムＰＣＲを行った場合に得られると予測されるプライマー伸長産物の塩基配列を含有するプローブ、又は更にその配列から設計される塩基配列を含有するプローブが用いられる。【０１４６】
例えば、プライマーR08_3d_Fw1とプライマーR08_3d_Rv1を用いてリアルタイムＰＣＲを行う場合に用いられるプローブは、そのリアルタイムＰＣＲで増幅されると予想される配列番号２９で表される塩基配列の一部又は全部を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる（表１参照）。【０１４７】
５'末端を標識するレポーター蛍光物質としてはカルボキシフルオレセイン（FAM）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、テトラクロロフルオレセイン(TET)、Cy5、VIC等が挙げられるが、中でもFAMがよく用いられる。【０１４８】
３'末端を標識するクエンチャー色素としては、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）等の蛍光物質、Black Hole Quencher色素（例えばBHQ2），4-((4-(dimethylamino) phenyl)azo)benzoic acid (DABCYL)等の非蛍光物質が挙げられるが、中でもTAMRAがよく用いられる。【０１４９】
リアルタイムＰＣＲ検出法に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常のリアルタイムＰＣＲで用いられているものを用いればよく、リアルタイムＰＣＲの手法は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、リアルタイムＰＣＲの一般的なプロトコルに従って行えばよい。【０１５０】
本発明に係るTaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出法によるクラミドフィラ・キャビエの検出方法の一例として、上記した本発明の「プライマーR08_3d_Fw1」と「プライマーR08_3d_Rv1」を用いて、クラミドフィラ・キャビエを検出する場合を例にとって説明すると、以下の通りである。【０１５１】
まず、公知の方法により、クラミドフィラ・キャビエを検出すべき試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。【０１５２】
別に、例えばＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（R08_3d_Fw1）、及び配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（R08_3d_Rv1）を合成する。【０１５３】
また、R08_3d_Fw1とR08_3d_Rv1のプライマー対を用いたＰＣＲで増幅されると予想される配列番号２９の塩基配列から、プローブとして利用するための配列を設計し、この塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成する。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素のFAMを、3'末端にレポーター消光体のTAMRAを常法により結合し、蛍光標識プローブを得る。【０１５４】
上記で合成したR08_3d_Fw1をフォワードプライマーとして、R08_3d_Rv1をリバースプライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムＰＣＲを行う。【０１５５】
すなわち、各 0.1〜2μM、好ましくは各１μMのプライマーR08_3d_Fw1及びプライマーR08_3d_Rv1、100〜1000nMの蛍光標識プローブ、1.0〜4.0mM MgCl2、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%TritonX-100、夫々0.2mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位/mlのTaq DNA ポリメラーゼを含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。このＰＣＲ用反応液20μｌに精製ＤＮＡ試料1ngを加え、ＰＣＲ用試料を得る。【０１５６】
このＰＣＲ用試料を用い、リアルタイムＰＣＲ検出装置等を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の蛍光強度量を測定する。【０１５７】
この場合のクラミドフィラ・キャビエ検出方法としては、レポーター色素の蛍光が測定された場合に、被検試料中にクラミドフィラ・キャビエが存在する（陽性）と判定される。【０１５８】
また、リアルタイムＰＣＲ法では、検量線を作成することができるので、試料中のクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を得ることがでる。また、その数はクラミドフィラ・キャビエの数に比例するので、試料（被検試料）中のクラミドフィラ・キャビエの数も知ることができる。【０１５９】
検量線の作成方法は、リアルタイムＰＣＲ法において通常行われている常法に従えばよい。例えば、標準としてコピー数既知のクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡ試料を用い、希釈系列の濃度（コピー数）のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を調製する。次いで各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を用いて上記方法に従いリアルタイムＰＣＲを行い、レポーター色素の蛍光強度を測定する。各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲの各サイクル数（ｘ軸）に対する、測定した蛍光強度の測定値(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成する。次いで、蛍光強度が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引く。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の増幅曲線が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とする。次いで、リアルタイムＰＣＲに用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。【０１６０】
試料中のクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を定量するには、先ずクラミドフィラ・キャビエを検出すべき試料中からＤＮＡを分離精製した後、得られたＤＮＡ試料を用いて、同様にTaqManTMリアルタイムＰＣＲを行い、同様に増幅曲線を作成する。検量線を作成したときのThと得られた増幅曲線が交差したCt値を得る。そのCt値を検量線に当てはめることにより、試料中のクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。
（Ａ−２）インターカレーター法
公知のインターカレーターを利用してリアルタイムＰＣＲを行う、通常のインターカレーター法が利用できる。【０１６１】
例えば、本発明のプライマーと、インターカレーターを用い、通常のインターカレーター法を利用したリアルタイムＰＣＲを行う方法が挙げられる。【０１６２】
すなわち、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合して蛍光を発する試薬であり、励起光を照射すると蛍光を発する。ＰＣＲ反応によって増幅を繰り返してＤＮＡが増えると、インターカレーターがそのＤＮＡに取り込まれるので、プライマー伸長産物の生成量に比例して、ＤＮＡに取り込まれていく。そこで、インターカレーターに由来する蛍光強度を検出することにより、プライマー伸長産物の量を知ることができる。【０１６３】
但しインターカレーターは全ての二本鎖ＤＮＡに結合するので、得られた蛍光強度の測定結果を基に、必要に応じ、融解曲線を作成して、融解曲線分析を行う。すなわち、ＰＣＲ反応後にＰＣＲ反応液の温度を徐々に上げながら、インターカレーター由来の蛍光強度を測定する。最初はＰＣＲ増幅産物は二本鎖を形成しているので蛍光を発しているが、ＰＣＲ反応液の温度がある一定の温度に達すると一本鎖に解離するので、インターカレーター由来の蛍光強度は急激に低下する。この時の温度が融解温度（Ｔｍ値）であり、プライマー伸長産物の配列に固有の値である。融解曲線のピークが、目的とする特異産物のピークか、又は特異産物と非特異産物のピークかについては、このＴｍ値から判定することができる。【０１６４】
このインターカレーター法は、ＰＣＲの後に電気泳動を行う必要がないので、臨床検査の分野等において、迅速に検出を行う必要がある場合には、有効な方法である。【０１６５】
本発明に用いられるインターカレーターとしては、通常この分野で用いられているインターカレーターであれば、何でも用いることができるが、例えばSYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)、エチジウムブロマイド、フルオレン等がある。【０１６６】
本発明に係る「インターカレーター法を利用したクラミドフィラ・キャビエの検出方法」の例を説明すると、以下の通りである。【０１６７】
本発明のプライマーと、インターカレーター（例えばSYBRTM Green I）を用い、クラミドフィラ・キャビエを検出すべき試料（被検試料）から精製した精製ＤＮＡ試料を鋳型として用いて、Taq DNA ポリメラーゼ等のポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲを行う。そしてプライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするインターカレーター由来の蛍光強度を測定する。【０１６８】
次いで、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成する。これを用いて、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行い、ピークの検出を行う。一方、クラミドフィラ・キャビエのtype strain（基準株）を用いて同様の測定を行い、ピークの検出を行う。被検試料を用いて得られた結果、単一のピークが得られ、かつそのピークの位置がクラミドフィラ・キャビエの基準株を用いて得られたピークの位置と同じ位置に出現した場合に、被検試料はクラミドフィラ・キャビエ陽性（すなわち、クラミドフィラ・キャビエ菌、又はその遺伝子が存在する。以下同じ。と判定される。【０１６９】
又は、精製ＤＮＡ試料溶液の希釈系列を調製し、各希釈系列毎に、上記と同様にリアルタイムＰＣＲを行う、
また、インターカレーター法を利用した方法で得られた測定値をもとに、リアルタイムＰＣＲで行われる常法に従って、検量線を作成することもできるので、その検量線を用いて試料中にあるクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。【０１７０】
例えば、例えば、標準としてコピー数既知のクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡ試料を用い、希釈系列の濃度（コピー数）のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を調製する。次いで各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を用いて上記方法に従いリアルタイムＰＣＲを行い、インターカレーター由来の蛍光強度を測定する。各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲの各サイクル数（ｘ軸）に対する、蛍光強度の測定値（Rn、ｙ軸）をプロットした増幅曲線を作成する。次いで、上記と同じ方法でCt値を得る。そして、リアルタイムＰＣＲに用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。【０１７１】
試料中のクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を定量するには、先ずクラミドフィラ・キャビエを検出する試料中からＤＮＡを分離精製した後、得られたＤＮＡ試料について、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲを行い、同様に増幅曲線を作成する。検量線を作成したときのThと得られた増幅曲線が交差したCt値を得る。そのCt値を検量線に当てはめることにより、試料中のクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。【０１７２】
本発明に係る、インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲ検出法によるクラミドフィラ・キャビエの検出方法の一例として、上記した本発明の「プライマーR08_3d_Fw1」と「プライマーR08_3d_Rv1」を用いて、クラミドフィラ・キャビエを検出する場合を例にとって説明すると、以下の通りである。【０１７３】
まず、公知の方法により、クラミドフィラ・キャビエを検出すべき試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。【０１７４】
別に、例えばＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（R08_3d_Fw1）、及び配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（R08_3d_Rv1）を合成する。【０１７５】
合成したR08_3d_Fw1をフォワードプライマーとして、R08_3d_Rv1をリバースプライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムＰＣＲを行う。【０１７６】
すなわち、プライマーR08_3d_Fw1と、プライマーR08_3d_Rv1を各50〜2000nM、インターカレーター［例えばSYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)］を原液の約５〜100000倍希釈、1.0〜4.0mM MgCl2、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%TritonX-100、夫々0.2mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位/mlのポリメラーゼ（例えばTaq DNA ポリメラーゼ）を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。該ＰＣＲ用反応液に、クラミドフィラ・キャビエを検出すべき試料（被検試料）から精製した精製ＤＮＡ試料を加え、ＰＣＲ用試料とする。このＰＣＲ用試料を用い、リアルタイムＰＣＲ検出装置等を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にプライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBRTM Green Iの蛍光強度を測定する。【０１７７】
次いで、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成する。これを用いて、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行って、ピークの検出を行う。得られたピークが単一のピークであって、且つクラミドフィラ・キャビエのtype strainを用いて同様に測定を行って得られたピークの位置と同じ位置に出現したことが確認された場合に、被検試料はクラミドフィラ・キャビエ陽性と判定される。【０１７８】
更に、検量線を作成することによって、試料中のクラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を得ることができる。また、その数はクラミドフィラ・キャビエの数に比例するので、試料（被検試料）中のクラミドフィラ・キャビエの数も知ることができる。【０１７９】
（Ａ−３）核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法
この方法としては、例えば
「下記工程を包含することを特徴とする、クラミドフィラ・キャビエの検出方法、
（i）配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）として用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
（ii）(i)で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいてクラミドフィラ・キャビエの有無を判定する。」
が挙げられる。【０１８０】
核酸増幅反応の具体例は、上記したとおりである。【０１８１】
電気泳動を行い、その結果に基づいて、クラミドフィラ・キャビエの有無を判定する方法としては、例えば
（Ａ−３−１）目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長産物画分を確認することにより判定する方法、
（Ａ−３−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出する方法、
等が挙げられる。【０１８２】
電気泳動法の条件、操作方法等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。【０１８３】
以下に、（Ａ−３−１）及び（Ａ−３−２）の方法について説明する。【０１８４】
（Ａ−３−１）目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長産物画分を確認することにより判定する方法
例えば、まず本発明のプライマーから、適当なフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを選択し、それを用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行う。【０１８５】
次いで、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。予め、核酸増幅反応に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せから、増幅されるであろうプライマー伸長産物の大きさ（塩基対数）を予測しておく。そして、得られた電気泳動画分が予測された大きさのプライマー伸長産物に該当するか否かを、常法により確認すればよい。例えば、得られた電気泳動画分をエチジウムブロマイド等で染色して核酸種を視覚化するといった方法で、該画分を染色し、そのプライマー伸長産物の大きさを確認する等の方法が挙げられる。【０１８６】
（Ａ−３−１）の方法による具体的な判定方法としては、例えば上記表１に記載されたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。そして、使用したそのプライマーの組合せで増幅されると予想された塩基配列のオリゴヌクレオチド、又はその塩基対数の大きさの画分が確認された場合に、被検試料はクラミドフィラ・キャビエ陽性と判定する方法が挙げられる。【０１８７】
（Ａ−３−１）の方法の具体例を、下記表２にまとめて示す。【０１８８】
すなわち、例えば表２における番号１の方法とは「フォワードプライマーとして配列号７で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして
配列番号８で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１６０塩基対の画分又は配列番号２９で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。」である。【０１８９】
【表２】
2009099037.tif 000003
【０１９０】
（Ａ−３−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出する方法
例えば核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物について、電気泳動を行う。得られた電気泳動画分について、本発明のプローブを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行う。そして、該標識プローブの標識を検出することによって、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在が確認された場合に、その被検試料は、クラミドフィラ・キャビエ陽性と判定する方法が挙げられる。【０１９１】
用いられるプローブ及びプローブを標識する標識物質の具体例、並びにプローブの標識方法は、上記したとおりである。【０１９２】
その一例を示すと、次の通りである。【０１９３】
すなわち、上記した表１に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。予め、ＰＣＲに用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せで増幅されると予測される塩基配列（表２で「検出対象」の塩基配列）の一部又は全部を含有する塩基配列のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを調製しておく。電気泳動画分の該標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行う。そして、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在が確認された場合に、その被検試料はクラミドフィラ・キャビエ陽性と判定する方法、が挙げられる。【０１９４】
これらの方法の好ましい具体例を、下記表３にまとめて示す。【０１９５】
例えば、表３において、番号１の方法とは、「フォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号８で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について、配列番号２９で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。」である。【０１９６】
【表３】
2009099037.tif 000004
【０１９７】
（Ａ−３）の方法による本発明のクラミドフィラ・キャビエの検出方法の詳細を、例えばR08_3d_Fw1（配列番号１１）をフォワードプライマーとして用い、R08_3d_Rv1（配列番号１２）をリバースプライマーとして用いたＰＣＲ、及び電気泳動を行った後、目的とする塩基対数のプライマー伸長産物画分を確認する方法によって検出する場合（上記の（Ａ−３−１）、表２・番号３の方法）を例に挙げて説明すると、以下の通りである。【０１９８】
まず、公知の方法で、クラミドフィラ・キャビエの有無を検出する試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。【０１９９】
別に、ＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法で、R08_3d_Fw1（配列番号１１で表される配列からなるオリゴヌクレオチド）及びR08_3d_Rv1（配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）を合成する。【０２００】
プライマーR08_3d_Fw1及びプライマーR08_3d_Rv1を用い、ＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ後の反応液を、１.５％アガロースゲル電気泳動する。次いでエチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出する。また、分子量マーカーも反応液と同時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたＤＮＡ断片の長さを算出する。フォワードプライマーとしてR08_3d_Fw1、及びリバースプライマーとしてR08_3d_Rv1を用いたＰＣＲでは、クラミドフィラ・キャビエの塩基配列中の135塩基対のＤＮＡ断片（配列番号３１で表される配列を持つ。）が複製されると予測される（表２・番号３参照）。そこで、135塩基対の大きさの蛍光バンドが確認された場合に、被検試料はクラミドフィラ・キャビエ陽性と判定すればよい。【０２０１】
また本発明は、核酸増幅工程において、ＲＮＡ転写産物を利用した検出法を適用する事ができる。例えば、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）法（特許第2650159号）、３ＳＲ（self-sustained sequence replication）法（特公平7-114718号）、ＴＡＳ（transcription based amplification system）法（特表平2-500565号：国際公開WO88/10315号）、ＴＭＡ（transcription mediated amplification）法（特開平11-46778号）などが挙げられる。中でも逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用（逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させる。）を利用する一定温度核酸増幅法は、測定系を自動化する場合には適した方法である。【０２０２】
(Ａ−４)標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法、
（Ａ−４）の方法としては、本発明のプライマーを上記した方法で標識した標識プライマーを用い、被検試料中の核酸を鋳型として用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を検出・測定し、標識を検出できた場合には、その被検試料はクラミドフィラ・キャビエ陽性であると判定する方法が挙げられる。【０２０３】
この方法に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、上記のＰＣＲ法において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましい組合せも上記したとおりである。【０２０４】
上記方法の場合、核酸増幅反応を行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長産物の標識を測定し、標識を検出できた場合に、被検試料はクラミドフィラ・キャビエ陽性であると判定される。【０２０５】
遊離の標識プライマーを除く方法としては、核酸増幅反応反応を行って得られた反応物中のプライマー伸長産物を、核酸を沈殿させる常法（エタノール沈殿法、イソプロパノールを用いた沈殿法等）により沈殿させた後、沈殿しなかった遊離の標識プライマーを含有する上清を除去する方法等が挙げられる。【０２０６】
また、核酸増幅反応を行って得られた反応物を適当な条件下、ゲルクロマトグラフィーで処理して、プライマー伸長産物と遊離の標識プライマーを分離する方法、電気泳動法により分離する方法等も挙げられる。【０２０７】
（Ｂ）本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして用いる方法、
更に、本発明のクラミドフィラ・キャビエの検出方法として、本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出する方法が挙げられる。【０２０８】
具体的には、例えば下記のような方法が挙げられる。【０２０９】
（Ｂ−１）本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に結合させたものを捕捉プローブとして用い、被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、試料中のクラミドフィラ・キャビエ由来の核酸を固相上に固定化させる検出法（例えば、特開昭62-265999号の記載参照）。【０２１０】
この方法の場合、本発明のオリゴヌクレオチドあるいは固相担体が、標識物質で標識されていてもよい。【０２１１】
（Ｂ−２）標識されていない(B-1)の捕捉プローブと、本発明のプローブを標識した標識プローブを用い、被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、固相担体上に補足プローブとクラミドフィラ・キャビエ由来の核酸と標識プローブの複合体を形成させて、標識プローブの標識を測定するサンドイッチアッセイ（例えば、特開昭58-40099号の記載参照）を行う方法。【０２１２】
（Ｂ−３）ビオチンで標識した本発明のプローブを用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーション後、試料中のクラミドフィラ・キャビエ由来の核酸をアビジン結合担体で捕捉する方法。【０２１３】
尚、本発明のクラミドフィラ・キャビエの検出方法に用いられる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を阻害しないものを用いることができる。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。【０２１４】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。【０２１５】
また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などが用いられる。【０２１６】
本発明に係るクラミドフィラ・キャビエ検出用試薬キットとしては、「配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）又は／及びプローブ（本発明のプローブ）として含んでなるクラミドフィラ・キャビエ検出用試薬キット。」が挙げられる。【０２１７】
上記キットを構成する本発明のプライマー及び本発明のプローブの具体例は、上記した「本発明のプライマー」、「本発明のプローブ」についての説明に記載したとおりである。【０２１８】
本発明のプライマーは標識物質で標識されたものであってもよい。その標識物質の具体例は上記したとおりである。【０２１９】
本発明のプライマーを含んでなるキットには、フォワードプライマーとリバースプライマー対を含む組成も含まれる。プライマー対の好ましい組合せは、前記した通りである。【０２２０】
また、上記キットは、更に、本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして含んでいてもよい。【０２２１】
更に、本発明のキットとして、「配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つクラミドフィラ・キャビエ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）をプローブとして含んでなるクラミドフィラ・キャビエ検出用試薬キット。」が挙げられる。【０２２２】
該プローブは標識物質で標識されたものであってもよい。【０２２３】
これらのキットを構成する構成試薬の好ましい態様及び具体例は上記したとおりである。【０２２４】
尚、本発明のクラミドフィラ・キャビエの検出用試薬キットには、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。【０２２５】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。【０２２６】
また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（SYBRTM Green、エチジウムブロマイドなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などを含んでいてもよい。【０２２７】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。【０２２８】
尚、実施例で用いられる細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。
【実施例】
【０２２９】
実施例１．クラミドフィラ・キャビエゲノムＤＮＡ由来のクローンの選択
（１）クラミドフィラ・キャビエ由来ＤＮＡ試料の調製
Chlamydophila caviae（岡山大学SC10 株）は岡山大学医学部 公文 裕巳教授より供与された。常法で培養したChlamydophila caviae（岡山大学SC10 株）から、公知の方法で、精製ゲノムＤＮＡを取得した（以下、「クラミドフィラ・キャビエ由来精製ゲノムＤＮＡ」と記載する場合がある。）。得られたゲノムDNAを最終400ng／μL（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製したものを、「クラミドフィラ・キャビエ由来ＤＮＡ試料」として用いた。【０２３０】
（２）Whole Genome Shotgun libraryの作製
上記(1)で得られたクラミドフィラ・キャビエ由来ＤＮＡ試料24μgを材料として用い、以下の方法（Science. 2001 Feb 16;291(5507):1304-1351 Venter et al.に記載のWhole Genome Shotgun法を改変）で、Whole Genome Shotgun libraryの作製を行った。【０２３１】
まず、終濃度20%のグリセロール存在下で、クラミドフィラ・キャビエ由来ＤＮＡ試料を、5kPa〜9kPaの圧力下、ネビュライザー（インビトロジェン社製）を用いて、約10分間処理して、クラミドフィラ・キャビエ由来ＤＮＡ試料を断片化した。この処理により、目的とする500〜1000bpのサイズの画分（ＤＮＡ断片）を効率よく回収する事ができた。得られた画分を(株)キアゲン製の抽出カラムを利用して精製した。【０２３２】
次に、DNA Blunting Kit（タカラバイオ(株)製）を用い、T4 DNA Polymeraseの5'→3'polymerase活性と3'→5'exonuclease活性を利用して、得られたＤＮＡ断片の末端を平滑化した。このＤＮＡ断片と、平滑末端処理済みpBSII sk+ベクター(Stratagene社)とでライゲーション反応を行い、ＤＮＡ断片をpBSII sk+ベクター（ampｒ）に組み込んだ組み換えＤＮＡを作製した。【０２３３】
E. coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ(株)製）を用い、その製品プロトコールに従って、上記で得られた組み換えＤＮＡを用いてE. coli JM109 Competent Cellsの形質転換を行った。【０２３４】
得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリン、0.2 mM IPTG、40μg/ml X-Galを含むLB-寒天培地で培養した。白色コロニーをピックアップし、「目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組み換えＤＮＡ」が導入された、形質転換体のlibrary（クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun clone Library）を得た。【０２３５】
（３）マイクロアレイ作製
上記(2)で得られた形質転換体のLibrary（クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun clone Library）を用い、下記の方法でＰＣＲを行って、スライドガラス上に固定するプローブ材料を調製した。【０２３６】
まず、各１μMのプライマーM13 Primer M1（タカラバイオ(株)製）及びプライマーM13 Primer RV（タカラバイオ(株)製）、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% Triton X-100（トリトンX-100、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社商品名）、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０２３７】
上記(2)で得られた形質転換体（クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun clone ）のそれぞれから、常法に従いＤＮＡを精製した。この精製したＤＮＡ（後で行うＰＣＲの際、鋳型となる）をＰＣＲ用反応液20μlに懸濁添加したものを調製し、ＰＣＲ用試料とした。このＰＣＲ試料を用い、ＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200、MJ Research Inc.製）を使用して、下記の反応条件で30サイクル ＰＣＲを行った。【０２３８】
ＰＣＲ反応条件：
熱変性： ９４℃、０．５分
アニーリング：５５℃、１分
重合反応： ７５℃、０．５分。【０２３９】
得られたＰＣＲ増幅産物を精製後、固定化Buffer（終濃度3x SSC）と混合した。【０２４０】
スポットされるＰＣＲ増幅産物の終濃度が300ng/μLとなるように調整し、装置内の湿度を55%に設定したタイピング用装置（GTMAS Stamp II; 日本レーザ電子社製）を使用し、スライドガラス（CMT GAPS-II; Corning社製）上に、上記で得られたＰＣＲ産物をスポットした（スポット径150-250μm）。スポットが終了したスライドガラスをUVクロスリンカー（UV Stratalinker1800; Stratagene社製）に移し、150mJ/cm2のUV照射を行なって、ＰＣＲ増幅産物（目的のＤＮＡ）をスライドガラス上に固定化し、マイクロアレイ（クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun clone Libraryを材料としたマイクロアレイ、合計2900クローン）を作製した。【０２４１】
（４）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
（ｉ）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
BioPrime DNA labeling system（インビトロジェン社製）を利用し、標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識を行った。【０２４２】
まず、上記(1)で得られたクラミドフィラ・キャビエ由来精製ゲノムＤＮＡ 2μgに、製品中のrandom primer solution 20μLを混合した後、熱変性（９５℃、5分間）処理を行い、サンプル溶液を得た。別に、Chlamydia psttaci（cal-10株）から常法によりゲノムＤＮＡを抽出・精製し（対照用ゲノムＤＮＡ）、同様に処理を行い、サンプル溶液を得た。【０２４３】
次いで、得られたサンプル溶液夫々に、0.1M DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP（各5ｍM）の混合液 2μl、2.5ｍM dTTP 0.8μl、5ｍM Ha-dUTP 1.6μl、Klenow酵素(40U/μL) 1μlを添加し、total volume=50μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、37℃で3時間の伸長反応を行った。マイクロコンYM-30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5ml チューブにセットし、上記で得られた反応産物をカラムにのせ、14,000rpm で4 分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。【０２４４】
乾燥させた上記反応産物に50ｍM NaHCO3 を10μl 加え混合し、2〜3 分常温で静置した（以下、「反応産物溶液」と称する。）。【０２４５】
別に、１mg のCy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）またはCy3（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を105μL のDMSO に溶かしたものを調製した（Cy-dye Solution Cy5、Cy-dye Solution Cy3）。このCy-dye Solution Cy5 10μl をクラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡを用いて得られた上記反応産物溶液に加え、40℃で60 分インキュベート（遮光）した。また、Cy-dye Solution Cy3 10μl を対照用ゲノムＤＮＡ(Chlamydia psttaci由来)を用いて得られた上記反応産物溶液に加え、同様に40℃で60 分インキュベート（遮光）した。【０２４６】
さらに、インキュベート後の、夫々の上記反応産物溶液に、4M NH2OH（使う直前に作製する）を10μl 加え、攪拌後、15 分インキュベート（遮光）を行い、夫々の標識産物、すなわちクラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡをCy5で標識した標識産物、及びChlamydia psttaciゲノムをCy3で標識した標識産物を得た。【０２４７】
マイクロコンYM-30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5ml チューブにセットし、上記で得られた各ゲノムＤＮＡの標識産物をカラムにのせ、14,000rpmで４分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。【０２４８】
（iｉ）標識産物の断片化工程
上記(4)(i)で得られた乾燥状態の各ゲノムＤＮＡの標識産物に対して、終濃度が0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液40μLを調製したものを加え、懸濁混和させた。次いで94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base の、各ゲノムを材料とした標識産物の、断片化生成物を得た。【０２４９】
得られたCy5標識産物溶液及びCy3標識産物溶液の各々をマイクロコンYM-10（ミリポア社製）の限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分遠心した後、濃縮液を同一のマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。次いで、このマイクロチューブに以下の試薬を加え、懸濁混和させ、標識産物の乾燥物を溶解させた。【０２５０】
ArrayHyb Hybridization buffer（SIGMA社製）；40μL
salmon sperm DNA（10mg/mL）            ；0.5μL
formamide                               ；5μL
Total 40〜50μL
以上の操作により、クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡを材料としたCy5標識産物の断片化生成物と、Chlamydia psttaci由来の対照用ゲノムを材料としたCy3標識産物の断片化生成物の、Cy3Cy5標識産物混合溶液が得られた。【０２５１】
得られたCy3Cy5標識産物混合溶液を95℃で5 分インキュベートし、ハイブリダイゼーションまで70℃に保っておいた。【０２５２】
（５）マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション
上記(3)の工程で得られた、クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun cloneのマイクロアレイ上に、上記(4)(ii)で調製したCy3Cy5標識産物混合溶液を全てのせ、気泡が入らないようにカバーガラスをかぶせた。これをハイブリカセットにセットし、タッパーに蒸留水で湿らせたキムタオルをひいたものの上にのせて密閉し、遮光下に65℃で8 時間以上反応させてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをカバーガラスごと2×SSC-0.1%SDS 溶液に室温で浸し、溶液中でマイクロアレイを静かに揺らしてカバーガラスをはずした。次いで1×SSC、0.03％SDS溶液（60℃）で10 分間洗浄、 0.2×SSC 溶液（42℃）で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液（室温）で10 分間洗浄した後、新しい乾いたラックにマイクロアレイをすばやく移し、すぐに800prm で5 分間遠心を行って乾燥させた。【０２５３】
（６）蛍光強度の測定：シグナル検出から数量化まで
蛍光読み取りスキャナー GenePix 4000B(Axon Instruments Inc.製)を用いて、上記(5)で得られた、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定した。この際、Cy3標識産物とCy5標識産物を用いた競合ハイブリダイゼーションの結果を解析するため、２チャンネル、すなわち2ch(Cy3、Cy5)での蛍光を検出した。【０２５４】
蛍光シグナルの数量化は日立ソフト社製のDNASISTM-Array（ＤＮＡチップ発現イメージ解析ソフトウェア）を用い、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行った。また、信頼性限界ラインを定め、それ以下の領域のデータは扱わないようにして、正規化され信頼性のある蛍光強度（比）を求めた。【０２５５】
さらに、マイクロアレイ上で検出されたCy3/Cy5の蛍光強度比（Ratio）を基に、常法に従い、散布図(スキャッタープロット)解析を行った。【０２５６】
すなわち、あるマイクロアレイ上のスポットのCy3に対するCy5の蛍光強度比が高い場合には、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Cy5標識産物、即ちクラミドフィラ・キャビエ由来のゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズしたことを示す。他方、あるスポットのCy3に対するCy5の蛍光強度比が低い場合は、そのスポットのＤＮＡ断片は、クラミドフィラ・キャビエ由来のゲノムＤＮＡに対する特異性が低く、Cy3標識産物、すなわちChlamydia psttaci由来の対照用ゲノムＤＮＡとの交叉反応が観察された（Chlamydia psttaci由来の対照用ゲノムＤＮＡとハイブリダイズした）ことを示す。【０２５７】
この方法で、マイクロアレイの全てのスポットの蛍光強度比を算出し、蛍光強度が高く、且つCy3に対するCy5の蛍光強度比が高いスポットを選択した。【０２５８】
その結果、クラミドフィラ・キャビエ由来のゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズした６クローンを候補クローンとして選択した。【０２５９】
（７）候補クローンの塩基配列決定
次に、上記(6)で選択された、候補６クローンについて、下記の方法で塩基配列決定を行った。【０２６０】
すなわち、Big Dye Terminatorキット（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、製品プロトコールに従い以下の手順でシークエンス解析を行った。【０２６１】
候補ＤＮＡ（候補クローン）   ；2μL(100ng)
M13 Primer M1              ；1μL(5pmol)
premix                       ；8μL【０２６２】
上記の混合物に、総volume=20μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、ＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200、MJ Research Inc.製）を使用して、下記の反応条件で30サイクルのシークエンス反応を行った。
96℃ 2 min → (96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min)×25 →4℃
得られたシークエンス反応産物をQIAGEN社製ゲルろ過カラムで精製後、シークエンサー（BaseStation、MJ Research Inc.製）を用い、機器付属の手順書に従い候補配列すべてのシークエンス（塩基配列）解読を完了した。  【０２６３】
得られた候補クローン01〜06の塩基配列情報を、データベース（NCBI BLAST及びCHEMICAL ABSTRACT）を用い、クラミドフィラ・キャビエの基準株（type strain GenBank Acc No.AE015925）のゲノム配列と比較した。結果を、下記表４に示す。【０２６４】
表４において、「position」とは、各の候補クローンの塩基配列の、クラミドフィラ・キャビエの基準株（type strain GenBank Acc No.AE015925）のゲノム遺伝子の塩基配列上の位置を示す。【０２６５】
また、「ID」とは、本発明者が命名した、クローンID No.を示す。【０２６６】
【表４】
2009099037.tif 000005
【０２６７】
表４から明らかな如く、選択された候補クローン01〜06の各全ゲノム配列は、報告済みのクラミドフィラ・キャビエのtype strainのゲノム遺伝子の塩基配列との重複部分があった。【０２６８】
一方、選択された候補クローン01〜06の各全ゲノム配列は報告済みの、クラミドフィラ・キャビエの近縁種（クラミドフィラ・キャビエ以外のChlamydophila属あるいはChlamydia属）のゲノム遺伝子の塩基配列は重複部分がなかった。以上ことから、候補の６クローンの塩基配列は、クラミドフィラ・キャビエに特異性の高い配列領域であることが推定された。【０２６９】
実施例２．候補クローン０２のクラミドフィラ・キャビエ特異性評価
（１）本発明のプライマーの合成
まず、実施例１(7)で決定された表４記載の候補の６クローンのうち、候補クローン０２（クローンID=R08_3d）のシークエンス（塩基配列）の解析結果に基づき、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてＰＣＲに用いるためのプライマー配列、すなわち「5'−tcttcccgcctccttattct−3'」（配列番号１１。以下、「R08_3d_Fw1」と呼ぶ）及び「5'−gctgcttgtggggcaatc−3'」（配列番号１２。以下、「R08_3d_Rv1」と呼ぶ）を設計した。【０２７０】
尚、シークエンスの解析結果から得られた、候補クローン０２の塩基配列は、配列番号２で表されるものである。【０２７１】
次に、ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、設計したオリゴヌクレオチドを合成した。合成手法はＡＢＩ社マニュアルに従った。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液を５５℃で一夜加熱することにより実施した。【０２７２】
次いでファルマシア社製ＦＰＬＣを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、合成オリゴヌクレオチドを精製した。この合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。【０２７３】
（２）本発明のプローブの作製
R08_3d_Fw1及びR08_3d_Rv1をプライマーとして用いたＰＣＲで増幅されると予測される塩基配列は、配列番号３１で表される塩基配列（135塩基）である。そこで、配列番号３１で表される塩基配列から、プローブとして利用するための配列「5'− tcaacaagatattactgcggcaacacc−3'」を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した（配列番号４０。この配列を持つオリゴヌクレオチドプローブを、以下、R08_3d_FwRv1_FAMと記載する。）。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素FAMを、3'末端にレポーター消光体のTAMRAを結合し、本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブ（TaqManTMフルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を得た。【０２７４】
（３）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
下記表５に示す各細菌を、それぞれ常法に従って培養した後、公知の核酸精製手法を用いて精製ゲノムＤＮＡを取得した。【０２７５】
尚、表５に記載の各細菌は、すべて岡山大学医学部 公文 裕巳教授より供与された。【０２７６】
【表５】
2009099037.tif 000006
【０２７７】
得られたそれぞれの精製ＤＮＡを、最終１ng／μl（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。【０２７８】
（４）リアルタイムＰＣＲ
上記（１）で設計、合成したR08_3d_Fw1をフォワードプライマーとして、R08_3d_Rv1をリバースプライマーとして用い、下記の通りリアルタイムＰＣＲを行った。【０２７９】
（ｉ）ＰＣＲ用反応液の調製
各１μMのフォワードプライマーR08_3d_Fw1及びリバースプライマーR08_3d_Rv1、195nMの上記(2)で調製した蛍光標識プローブR08_3d_FwRv1_FAM、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０２８０】
（ｉｉ）リアルタイムＰＣＲ
上記(4)(i)で調製したＰＣＲ用反応液20μlに上記(3)で調製したＰＣＲ用ＤＮＡ試料１μL を加え、ＰＣＲ用試料とした。【０２８１】
このＰＣＲ用試料を、定量PCR反応用ガラスキャピラリーチューブ（ロシュ社製）に入れ、定量ＰＣＲ 専用サーマルサイクラー・検出器（LightCycler2.0、ロシュ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。【０２８２】
すなわち、95℃ で10分間保温の後、95℃で15秒間、60℃で１分間の反応を50サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の蛍光強度を測定した。尚、蛍光強度は、測定に用いたサーマルサイクラーの、測定に供したガラスキャピラリーチューブ毎に相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。【０２８３】
（５）結果
得られたリアルタイムＰＣＲの結果を表６にまとめた。【０２８４】
【表６】
2009099037.tif 000007
【０２８５】
表６において、蛍光シグナルが検出できた場合を「positive」（陽性）、蛍光シグナルが検出できなかった場合を「negative」（陰性）と表示した。【０２８６】
表６から明らかな如く、本発明のプライマーR08_3d_Fw1、及びプライマーR08_3d_Rv1を用い、またその増幅領域となる配列から設計された配列を有する標識オリゴヌクレオチドプローブ（本発明のプローブ）を用いたリアルタイムＰＣＲで、増幅されたプライマー伸長物の検出を行った結果、クラミドフィラ・キャビエ由来ゲノムＤＮＡ試料を鋳型として用いてＰＣＲを行った場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認でき、陽性（positive）と判定できた。これに対し、クラミドフィラ・キャビエ以外のクラミジア由来ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、同じプライマーの組合せを用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行った場合には、蛍光シグナルが確認できず、すべて陰性（negative）と判定された。【０２８７】
以上のことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行うことにより、クラミドフィラ・キャビエを特異的に検出することが出来ることが判る。また、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、細菌を単離する必要がなく、臨床材料をそのまま検出に用いることが可能である。そのため、従来の細菌を培養してから検出する方法では培養に数週間かかっていたクラミドフィラ・キャビエの検出を、長くても１日以内に終わらせることができることが判る。【０２８８】
実施例３．最小検出感度試験
リアルタイム検出法を利用し、候補クローン02配列（クローンID＝R08_3d）をターゲットとした場合の検出感度の検定を行った。【０２８９】
（１）本発明のプライマーの合成
実施例１（1）と同じ機器を用い、同様の操作でR08_3d_Fw2、及びR08_3d_Rv2のオリゴヌクレオチドを合成した。これをプライマーとして用いた。【０２９０】
（２）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
実施例１(1)と同様の方法で、クラミドフィラ・キャビエ（SC-10株）からクラミドフィラ・キャビエ由来精製ゲノムＤＮＡを取得した。【０２９１】
これを10mM Tris-HCl緩衝液に溶解し、吸光度を測定して試料中のＤＮＡ量を測定した。得られたＤＮＡ量を、濃度既知のクラミドフィラ・キャビエのtype strainのゲノムＤＮＡを試料として用いて、同様に吸光度を測定して得られた測定値と比較することにより、試料中のゲノムＤＮＡ量（ゲノムコピー数）を決定した。【０２９２】
次いで10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9を用いてＤＮＡ試料を105, 104, 103, 102, 10, 5コピー/μLの希釈系列に希釈したものを調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。【０２９３】
（３）リアルタイムＰＣＲ
（ｉ）ＰＣＲ用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマーR08_3d_Fw2及びプライマーR08_3d_Rv2を各300nM、SYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)を原液の30倍希釈（最終濃度は原液の30000倍希釈）、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX-100、各0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０２９４】
（ｉｉ）リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲにおける増幅ターゲットとなる鋳型ＤＮＡとして、上記(2)で調製したクラミドフィラ・キャビエ由来のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を用い、以下の方法で、インターカレーション法によるリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光強度の定量モニタリングを行った。【０２９５】
まず、上記(3)(i)で調製したＰＣＲ用反応液２０μＬに、上記(2)で調製したクラミドフィラ・キャビエ由来のＰＣＲ用ＤＮＡ試料１μＬ（１ng）を添加し、ＰＣＲ用試料とした。そのＰＣＲ用試料を、９６ 穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、TaqManTM  ＰＣＲ 専用サーマルサイクラー・検出器（ABI 7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製） を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。【０２９６】
すなわち、９５℃ で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃ で１分間の反応を４０サイクル繰り返し、プライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBRTM Green Iの蛍光強度を測定した。【０２９７】
尚、蛍光強度は、測定に供した９６穴反応プレート１プレート毎に、測定に用いたサーマルサイクラーの、相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。【０２９８】
（４）結果
得られた実験データから、リアルタイムＰＣＲ法において行われている常法に従って、検量線を作成した。【０２９９】
すなわち、各濃度のＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲのサイクル数（ｘ軸）に対するSYBRTM Green Iの蛍光量(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成した。次いで、蛍光量が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引いた。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の蛍光量が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とした。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とした。得られた検量線を図１に示す。【０３００】
図１において、得られた近似曲線の近似式は、
ｙ＝−３．７２０ｘ＋３８．２６、
Ｒ２＝０.９９８、
である。【０３０１】
以上の結果、まずリアルタイムＰＣＲで蛍光が検出されたことから、本発明に係るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、リアルタイムＰＣＲを行えば、クラミドフィラ・キャビエが検出できることが判った。【０３０２】
また、検量線が作成できたことより、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法によれば、クラミドフィラ・キャビエ自体の定量が可能であることが判った。【０３０３】
更に、図１から明らかな如く、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法では、クラミドフィラ・キャビエのゲノムＤＮＡが初期量として５コピー存在する条件でもクラミドフィラ・キャビエの検出が可能である事がわかる。【０３０４】
更にまた、リアルタイムＰＣＲ法を利用した場合では、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングするので、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができ、クラミドフィラ・キャビエの検出に有効である。【０３０５】
実施例４．その他の候補クローンのクラミドフィラ・キャビエ特異性評価
（１）本発明のプライマーの合成
実施例１(7)で決定された候補の６クローンのシークエンス（塩基配列）の解析結果に基づき、各々の候補クローンの塩基配列から、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてＰＣＲ増幅検出のためのプライマー配列を設計した。【０３０６】
次いで、実施例２(1)と同様の方法で、設計したリゴヌクレオチドを合成・精製した。この合成オリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして用いた。【０３０７】
各候補配列の名称、その候補クローンの塩基配列の配列番号、その候補クローンの塩基配列をもとに設計したプライマーの名称（発明者が命名した。）及びその塩基配列の配列番号、続いて行うＰＣＲにおいて用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを表７に併せて示す。また、各候補クローンのクローンID番号（発明者が命名した。）を、候補クローンの名称の下に、（  ）内に示す。【０３０８】
【表７】
2009099037.tif 000008
【０３０９】
（２）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
実施例２で使用した表５に記載の細菌のうち、Chlamydophila caviae  GPIC株）、Chlamydophila psttaci（Cal10）、Chlamydophila pneumoniae （TW183株）、Chlamydia trachomatis （D株(Serovar)）を用い、実施例１(1)と同様の方法で、精製ゲノムＤＮＡ試料を調製した。【０３１０】
また、各々のＤＮＡ試料を、最終濃度が104, 103コピー/μL（各クラミジアを検出するのに十分な量）になるように、10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）で調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。【０３１１】
（３）リアルタイムＰＣＲ
上記(1)で調製したプライマーを、上記表７の組み合わせで用い、各細菌由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いる以外は、実施例３(3)(ii)と同様の方法で、リアルタイムＰＣＲを行った。【０３１２】
（４）融解曲線解析
各ＤＮＡ試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。【０３１３】
（５）結果
結果を表８に示す。【０３１４】
【表８】
2009099037.tif 000009
【０３１５】
表中、例えば1.00E+04とは、DNA試料の濃度が104コピー／μLの場合を示す。【０３１６】
表８において、融解曲線解析でピークが確認できた場合を（＋）、ピークが確認できなかった場合を（−）でそれぞれ示す。【０３１７】
表８から明らかな如く、表８に記載された本発明のプライマーの組合せを用いてリアルタイムＰＣＲを行った結果、どの組合せを用いた場合でも、クラミドフィラ・キャビエ由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いてリアルタイムＰＣＲを行った場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認でき、陽性と判定できた。【０３１８】
これに対し、クラミドフィラ・キャビエ以外の近縁菌由来のＤＮＡを鋳型として用いて、上記記載のどの同じプライマーの組合せを用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行った場合には、該当する蛍光シグナルが確認できず、すべて陰性と判定できた。
以上のことから、本発明の検出方法によれば、偽陽性の出現を排除して、クラミドフィラ・キャビエを特異的に検出することができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０３１９】
本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する如き方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、クラミドフィラ・キャビエの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法でクラミドフィラ・キャビエの検出を行うことにより、診断上の偽陽性が排除可能となり、より高精度にクラミドフィラ・キャビエの検出及び診断を行うことができる。更に、本発明の検出方法を用いることにより、クラミドフィラ・キャビエ自体の定量も行うこともできるという効果を奏する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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