(57)【要約】  コンデンシン複合体または関連タンパク質の一部を形成するタンパク質についてコードする遺伝子の発現レベルにおける変化に基づく、結腸直腸癌での差次的発現の分析方法であって、当該疾患の患者で生じ、当該癌の診断用並びにその予防および治療用のマーカーとして用いられる、分析方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から単離された生物学的サンプルにおいて、コンデンシン複合体の一部または該複合体と相互作用する他のタンパク質を形成する１以上のタンパク質コード遺伝子の発現レベルにおける変化を決定することを含んでなる、結腸直腸癌における差次的発現の分析方法であって、遺伝子発現レベルにおける変化が結腸直腸癌またはその前悪性状態の存在に関する診断に用いられる、分析方法。
【請求項２】
遺伝子が、ｈＣａｐ‐Ｅ、ｈＣａｐ‐Ｃ、ｈＣａｐ‐Ｄ２、ｈＣａｐ‐Ｄ３、ｈＣａｐ‐Ｇ、ｈＣａｐ‐Ｇ２、ｈＣａｐ‐Ｈ、ｈＣａｐ‐Ｈ２およびＫＩＦ４Ｆからなる群から選択される、請求項１に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルにおける変化が発現レベルにおける増加である、請求項１または２に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項４】
サンプルが、バイオプシーまたはいずれか他の抽出法により得られた細胞から単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項５】
分析されるサンプルがＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項６】
分析されるサンプルがＲＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項７】
決定がＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅またはいずれか他の核酸増幅法により行なわれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項８】
決定が、いずれかのメカニズムにより付着されたオリゴヌクレオチドで作製されたＤＮＡバイオチップを用いて行なわれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項９】
決定が、フォトリソグラフィーまたはいずれか他のメカニズムによりin situ合成されたオリゴヌクレオチドで作製されたＤＮＡチップを用いて行なわれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１０】
決定が、いずれかの標識方法を用いて標識された特異的プローブを用いてin situハイブリッド形成により行なわれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１１】
決定がゲル電気泳動により行なわれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１２】
決定が、膜への移動と特異的プローブとのハイブリッド形成により行なわれる、請求項１１に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１３】
決定がＮＭＲまたはいずれか他の診断画像技術により行なわれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１４】
決定が、常磁性ナノ粒子または抗体もしくはいずれか他の手段で官能化されたいずれか他のタイプの検出可能ナノ粒子を用いて、ＮＭＲまたはいずれか他の診断画像技術により行なわれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１５】
分析されるサンプルが、遺伝子またはそのフラグメントによりコードされたタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１６】
決定が特異的抗体とのインキュベーションにより行なわれる、請求項１５に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１７】
決定がウエスタンブロットにより行なわれる、請求項１６に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１８】
決定が免疫組織化学により行なわれる、請求項１６に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項１９】
決定がゲル電気泳動により行なわれる、請求項１５に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項２０】
決定がタンパク質チップの手段により行なわれる、請求項１５に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項２１】
決定がＥＬＩＳＡまたはいずれか他の酵素的方法により行なわれる、請求項１５に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項２２】
決定がＮＭＲまたはいずれか他の診断画像技術により行なわれる、請求項１５に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項２３】
決定が、常磁性ナノ粒子または抗体もしくはいずれか他の手段で官能化されたいずれか他のタイプの検出可能ナノ粒子を用いて、ＮＭＲまたはいずれか他の診断画像技術により行なわれる、請求項１５に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項２４】
１または複数の遺伝子の発現レベルにおける変化が、結腸直腸癌またはその前悪性状態の進行を予測するために、または該疾患の再発のリスクを予測するために用いられる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の結腸直腸癌における差次的発現の分析方法。
【請求項２５】
１または複数の遺伝子の発現レベルにおける変化を決定する上で必要な試薬および添加物を含んでなる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載された方法を行うためのキット。
【請求項２６】
請求項１〜２のいずれか一項で記載されているような、１以上の遺伝子の発現レベルにおける変化に対抗しうる化合物の能力の決定を含んでなる、結腸直腸癌の治療潜在力を有する化合物の分析方法であって、化合物が配列情報に従い作製された化合物、例えばアンチセンスまたはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡの不安定化および除去またはタンパク質へのその翻訳の欠損に基づくその他化合物である、分析方法。
【請求項２７】
請求項１〜２で記載されているような、１以上の遺伝子の発現レベルにおける変化に対抗しうる化合物の能力の決定を含んでなる、結腸直腸癌の治療潜在力を有する化合物の分析方法であって、化合物が常磁性ナノ粒子または熱励起ナノ粒子である、分析方法。
【請求項２８】
請求項１〜２のいずれか一項で記載されているような、１以上の遺伝子の発現レベルにおける変化に対抗しうる化合物の能力の決定を含んでなる、結腸直腸癌の治療潜在力を有する化合物の分析方法であって、化合物が、悪性細胞へ向けて単純、二元的またはモジュラー的に運ばれる特異的抗体および毒性化合物で官能化されたナノ粒子である、分析方法。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか一項の方法で特定された治療潜在力を有する化合物の有効量と１種以上の製薬上許容される賦形剤を含んでなる、医薬製剤。
【請求項３０】
結腸直腸癌またはそのいずれか前悪性状態の治療または予防用の医薬品の製造のための、請求項２６〜２８のいずれか一項の方法により特定された治療潜在力を有する化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、結腸直腸癌の診断のための基準として並びにその予防および治療に際して用いられる、該癌患者におけるコンデンシン複合体のタンパク質および関連タンパク質の過剰発現に基づく、差次的発現の分析のための方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
実際のところ、癌はスペインで二番目に多い死因である。癌の多くのタイプの中で、結腸直腸癌は突出しており、１９９９年データによると、男性で癌死の１１％および女性で１５％に関与していた。スペインにおいて、両性の概算年間新症例数は約１８，０００であり、うち死亡は１１，３００例である。直腸Ｓ状結腸部分の腫瘍を分類する際に多い誤りに起因して、結腸および直腸腫瘍は分析目的の１つとして通常扱われている。結腸直腸癌による死亡率は非常に高く、これは男性および女性の双方において二番目に多い癌の形であり、その傾向は年齢と共に高まる（年毎に男性で２．２％および女性で０．７％）。今日では死亡率は男性のほうが高いが、１９６０年代ではそれは女性のほうが高かった。
【０００３】
これらの腫瘍に関して、生存率が主に若年者で近年改善してきたことを考えると、死亡率データは該疾患の真の発生率を反映していない。問題の腫瘍が特定リスク群のスクリーニングに際してＳ状結腸鏡検査と完全結腸鏡検査の普遍的使用を正に受け入れやすいことから、死亡率の安定化に向けた傾向は早期診断で達成される治療改善を反映するかもしれない。
【０００４】
該疾患に罹患する累積的生涯リスクは、ライフスタイルおよび遺伝因子に応じて、５〜６％である。最も多い結腸直腸癌は散発型（９０％）であり、一部の症例では遺伝的素因の要素を有している：家族性腺腫ポリポーシス（０．０１％）および遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（５〜１０％）。後者はわずか数個の遺伝子で定まる家族性症候群に起因している。しかしながら、散発性癌に関与する遺伝子はこれから特定されねばならない。結腸直腸腫瘍は、１以上の変異または後成的事象から生じて、遺伝および環境双方の因子が関与した進行現象で続く、一連の分子事象の結果として展開していく。
【０００５】
一般的に言えば、結腸直腸癌に関して、症状は腸壁で進行した増殖段階になって通常やっと顕在化し、そのことから、このタイプの癌に関与するおよび／またはそれを示す新しい遺伝子および／または変異を特定し、該疾患の選択的および迅速分子診断を可能にして日常的臨床実務の一部を最終的に形成しうるような分析法の帰結的開発を促すことを要している。
【０００６】
これは、ヘルスケアコストの削減および待ち時間の短縮、陽性症例で新たな予後基準および治療アプローチの採択、並びにこれら遺伝子に関連した選択的療法の設計にもつながるであろう。
【０００７】
遺伝子ＳＭＣ２Ｌ１（ｈＣＡＰ‐Ｅとも称される、S.cerevisiaeのＳＭＣ２のヒトオーソログ）によりコードされるタンパク質は、遺伝子転写の調節に関する機能を行なえる染色体凝縮およびコンパクション複合体において、重要なタンパク質である（Hagstrom and Meyer,2003；Hirano,2002；Legagneux et al.,2004）。
【０００８】
このタンパク質は、１〜６と番号付けされた６タンパク質（ＳＭＣ１、ＳＭＣ２、ＳＭＣ３、ＳＭＣ４、ＳＭＣ５およびＳＭＣ６）を含んでなる、いわゆるＳＭＣタンパク質（“染色体の構造的維持”を意味する）のファミリーに属する。これらのタンパク質は、他のＳＭＣタンパク質とダイマー、および他のいわゆる非ＳＭＣタンパク質（２つのファミリー、ＨＥＡＴおよびクライシン（kleisin）に分けられる）と活性複合体を形成する。全体として、それらは、ゲノム修復に伴い、３種の主要複合体：コンデンシン（ヒトでは、２種の別々な複合体、コンデンシンＩおよびコンデンシンIIがある）、コヒーシンおよびｈＳＭＣ５‐ｈＳＭＣ６複合体を形成する（Hagstrom and Meyer,2003；Hirano,2002）。タンパク質およびそれらが異なる種で形成する複合体が表１および２で記載されている。
【０００９】
【表１】
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【表２】
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【００１０】
ＳＭＣ２Ｌ１はコンデンシンＩおよびII複合体の一部を形成している。両複合体ともクロマチンコンパクションに関する機能を発揮する（Hirano et al.,1994；Ono et al.,2004；Ono et al.,2003）。
【００１１】
コンデンシンＩ：ダイマーＳＭＣ２‐ＳＭＣ４（ｈＣＡＰ‐Ｅ‐ｈＣＡＰ‐Ｃ）、ＨＥＡＴサブユニットｈＣＡＰ‐Ｄ２／ＣＮＡＰ１およびｈＣＡＰ‐Ｇ、およびクライシンサブユニットｈＣＡＰ‐Ｈにより形成されている。ダイマーｈＣＡＰ‐Ｅ‐ｈＣＡＰ‐Ｃは間期細胞の細胞質に存在している（有糸分裂時以外）。有糸分裂が生じると、非ＳＭＣサブユニットはリン酸化を受け、ｈＣＡＰ‐Ｅ‐ｈＣＡＰ‐Ｃダイマーと相互作用し、複合体を形成して、核へ運ばれ、そこでそれらはＤＮＡと相互作用して、それをコンパクトにする（Hagstrom and Meyer,2003）。
【００１２】
コンデンシンII：ダイマーＳＭＣ２‐ＳＭＣ４（ｈＣＡＰ‐Ｅ‐ｈＣＡＰ‐Ｃ）、ＨＥＡＴサブユニットｈＣＡＰ‐Ｄ３およびｈＣＡＰ‐Ｇ、およびクライシンサブユニットｈＣＡＰ‐Ｈ２により形成されている。該複合体は間期細胞の核に存在し（図１Ａ）、遺伝子転写の調節に関与して、ある遺伝子のプロモーター領域をコンパクトにする上で役立つようである。このことが、内部核領域に相当する領域（図１Ａおよび１Ｂ）および染色体Ｒバンドとして、アセチル化ヒストン（例えば、リシンＫ３におけるアセチル化ヒストンＨ３）のような他の調節因子（図２および３）と共に、転写活性領域（転写調節、即ち転写活性化または抑制の領域）と関連したユークロマチン領域にコンデンシンを置くことになる。
【００１３】
これらのタンパク質をこのタイプの癌と関連づけた証拠は文献にない。しかしながら、コンデンシンと転写サイレント化および適正な染色体コンパクションとでリンクしている可能性は、それが癌で変わりうることを示唆している。ほとんどの癌は全体的高アセチル化と共に全体的ゲノム低メチル化を呈するが、ＣｐＧアイランドに富むある遺伝子プロモーター領域は高メチル化されて、該遺伝子がサイレント化される（転写されない）ことが示された。本発明では、これらのサイレント化プロセスにコンデンシンがどのように関与し、これらの複合体を形成するタンパク質および関連タンパク質がどのように過剰発現されるか、が記載されている。同様に、後成的変化の大部分が新生物化プロセスの非常に早い段階で生じると考えられるならば、この過剰発現も腺腫(adenomas)のような早期プロセスに特有であろう。
【発明の説明】
【００１４】
患者から単離された生物学的サンプルにおいて、コンデンシン複合体の一部または該複合体と相互作用する他のタンパク質を形成する１以上のタンパク質コード遺伝子の発現レベルにおける変化を決定することを含んでなる、結腸直腸癌における差次的発現(differential expression)の分析方法であって、遺伝子発現レベルにおける変化が結腸直腸癌またはその前悪性状態の存在に関する診断に用いられる方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１５】
特に、分析される遺伝子はｈＣａｐ‐Ｅ、ｈＣａｐ‐Ｃ、ｈＣａｐ‐Ｄ２、ｈＣａｐ‐Ｄ３、ｈＣａｐ‐Ｇ、ｈＣａｐ‐Ｇ２、ｈＣａｐ‐Ｈ、ｈＣａｐ‐Ｈ２およびＫＩＦ４Ｆからなる群の中から選択され、遺伝子の発現レベルにおける変化は発現レベルにおける増加である。
【００１６】
特に、上記サンプルはＤＮＡまたはＲＮＡであり、バイオプシーまたはいずれか他の抽出法により得られた細胞から単離される。
【００１７】
本発明の態様において、決定はＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅またはいずれか他の核酸増幅法により行なわれる。
【００１８】
本発明の他の態様において、いずれかのメカニズムで付着されたオリゴヌクレオチドにより作製されたＤＮＡバイオチップの手段により、あるいはフォトリソグラフィーまたはいずれか他のメカニズムでin situ合成されたオリゴヌクレオチドで作製されたＤＮＡバイオチップの手段により、決定が行なわれる。
【００１９】
本発明の他の態様において、いずれかの標識方法を用いて標識された特異的プローブを用いて、in situハイブリッド形成により決定が行なわれる。
【００２０】
本発明の他の態様において、決定はゲル電気泳動により行なわれる。場合により、測定は膜への移動と特異的プローブとのハイブリッド形成により行なわれる。
【００２１】
本発明の他の態様において、決定はＮＭＲまたはいずれか他の診断画像技術により行なわれる。
【００２２】
本発明の他の態様において、ＮＭＲまたはいずれか他の診断画像技術と、常磁性ナノ粒子または抗体もしくはいずれか他の手段で官能化されたいずれか他のタイプの検出可能ナノ粒子の使用により、決定が行なわれる。
【００２３】
場合により、分析されるサンプルは遺伝子またはそのフラグメントによりコードされたタンパク質である。
【００２４】
本発明の他の態様において、決定は特異的抗体とのインキュベーションにより行なわれる。場合により、決定はウエスタンブロットまたは免疫組織化学により行なわれる。
【００２５】
本発明の他の態様において、決定はタンパク質ゲル電気泳動により行なわれる。
【００２６】
本発明の他の態様において、決定はタンパク質チップを用いて行なわれる。
【００２７】
本発明の他の態様において、決定はＥＬＩＳＡまたはいずれか他の酵素法により行なわれる。
【００２８】
記載された遺伝子の１以上の発現レベルにおける変化が、結腸直腸癌またはその前悪性状態の進行を予測するために、または該疾患の再発のリスクを予測するために用いられる、結腸直腸癌での差次的発現の分析のための方法を提供することも、本発明の目的である。
【００２９】
遺伝子の発現のレベルにおける変化を決定する上で必要な試薬および添加物を含んでなる、差次的発現の分析のための方法を行なうためのキットを提供することも、本発明の目的である。
【００３０】
記載された遺伝子の１以上の発現レベルを減少させうる化合物の能力の決定を含んでなり、化合物が配列情報に従い作製された化合物、例えばアンチセンスまたはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡの不安定化および除去またはタンパク質へのその翻訳の欠損に基づくその他化合物である、結腸直腸癌の治療ポテンシャルに関する化合物の分析のための方法を提供することも、本発明の追加目的である。
【００３１】
記載された遺伝子の１以上の発現のレベルにおける変化に対抗しうる化合物の能力の決定を含んでなり、化合物が常磁性ナノ粒子または熱励起ナノ粒子である、結腸直腸癌の治療潜在力を有する化合物の分析のための方法を提供することも、本発明の追加目的である。
【００３２】
記載された遺伝子の１以上の発現のレベルにおける変化に対抗しうる化合物の能力の決定を含んでなり、化合物が、悪性細胞へ向けて単純、二元的またはモジュラー的に運ばれる特異的抗体および毒性化合物で官能化されたナノ粒子である、結腸直腸癌の治療潜在力を有する化合物の分析のための方法を提供することも、本発明の追加目的である。
【００３３】
上記の方法に従い特定された治療潜在力を有する化合物の有効量と１種以上の製薬上許容される賦形剤を含んでなる医薬製剤を提供することが、同様に本発明の目的である。
【００３４】
加えて、結腸直腸癌またはその前悪性状態の治療または予防用の医薬品の製造のために、上記の方法に従い得られた治療潜在力を有する化合物を用いることも、本発明の目的である。
【００３５】
本発明は、結腸直腸癌患者で観察されるコンデンシン複合体のタンパク質および関連タンパク質の過剰発現に基づいている。結腸直腸癌サンプルで特異的抗ｈＣＡＰ‐Ｅ抗体を用いたウエスタンブロット分析において、正常組織のサンプルと比較すると、その腫瘍段階にかかわらず、腫瘍過剰発現の発生率９０％（１８／２０）というように、ｈＣＡＰ‐Ｅの過剰発現をデータが示した（図４）。この過剰発現は結腸直腸癌腫瘍組織の全免疫組織化学分析でも観察された（図５）。
【００３６】
同様に、ｈＣＡＰ‐Ｅの発現は、結腸直腸腫瘍が由来する未分化細胞である、結腸陰窩(colon crypt)の多能性（幹）細胞でも特異的であることが観察された（図６）。多能性細胞が正常陰窩で上皮細胞（杯状細胞）へ変換されて上皮を形成すると、それは事実上消失し、そのためそれが細胞分化のマーカーとみなせることを、それらの発現パターンは示している。
【００３７】
表３は、段階別による、結腸直腸癌でのｈＣＡＰ‐Ｅの過剰発現のレベルを示している。
【表３】
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【００３８】
過剰発現の発生率（＋）は９０％（腫瘍２０例中１８例）であった。１症例のみは発現が正常以下（−）であると観察され、１症例では正常組織および腫瘍組織が同発現レベル（＝）を示した。
【００３９】
コンデンシン複合体を形成する他のタンパク質、例えばｈＣａｐ‐Ｃ、ｈＣａｐ‐Ｄ２、ｈＣａｐ‐Ｄ３、ｈＣａｐ‐Ｇ、ｈＣａｐ‐Ｇ２およびｈＣａｐ‐Ｈの発現レベルが、ｈＣａｐ‐Ｅの過剰発現が観察されたある腫瘍において、該複合体と相互作用する他の関連タンパク質、例えばＫＩＦ４Ａと共に、リアルタイムＰＣＲで同様に分析された。分析された全タンパク質が、正常組織のレベルと比較して、腫瘍組織で高い発現レベルを示すことを、結果は示した（図７）。したがって、コンデンシン複合体を構成する全タンパク質および該複合体と相互作用する他のタンパク質が腫瘍で過剰発現されている、と結論づけられる。
【００４０】
このように、コンデンシン複合体を形成するタンパク質およびそれと相互作用する他の関連タンパク質は、結腸直腸癌またはその前悪性状態のマーカーとして用いられ、可能性として診断マーカーおよび／または推奨結腸鏡検査用のマーカーとして作用する。
【００４１】
これらのタンパク質は、結腸陰窩の多能性幹細胞のマーカーとして、および細胞分化のマーカーとしても、双方で作用する。更に、これらのタンパク質は癌の組織学的マーカーにもなり、および／または画像分析システムでも有用となりうる。
【００４２】
加えて、これらのタンパク質は直接または間接治療標的となり、腫瘍標的抗癌治療に際してこれらタンパク質のいずれかとの相互作用またはそれらの発現レベルの調節を介して腫瘍に命中させることができる。
【００４３】
興味深いことに、コンデンシン複合体に存在する該タンパク質の発現レベルは細胞周期を通して変化せず、したがって有糸分裂時に変化しないことが、最近報告された（Takemoto et al.,2004）。そのため、高レベルでこれらのタンパク質が癌細胞でみられるという事実は、本発明で記載されているように、単純に腫瘍細胞の複製活性（有糸分裂）の増加に基づくというより、むしろ該疾患の進行による実際の相対的過剰発現に基づいている。
【００４４】
したがって、コンデンシン複合体を構成するタンパク質および該複合体と関連した他のタンパク質の発現レベルと結腸直腸癌の存在とには、それがどのような進行段階であろうと、完全な関連性があり、このことが、現在利用可能な方法を用いたのでは不可能な、その最も早期の段階でも該疾患を診断しうる、新規の分子ツールが利用できることを意味する、と本発明は示している。
【００４５】
参考文献
【表４】
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【好ましい態様の説明】
【００４６】
本発明の好ましい、但し排他的ではない態様が、以下で記載されている。
【００４７】
患者サンプル
結腸直腸癌と診断された患者２０例から正常および癌性組織のバイオプシーが行なわれた。外科的に得られたサンプルを液体窒素で直ちに凍結し、後におけるタンパク質およびＲＮＡの抽出のために−８０℃で保った。加えて、組織切片を免疫組織化学試験用に調製した。腫瘍の段階および分化度並びに早期の再発を調べる少なくとも３年間の追跡調査を含めた、臨床病理学的特徴を記録した。
【００４８】
ｈＣＡＰ‐Ｅの発現レベルの分析
ウエスタンブロット：ＲＩＰＡ溶解用緩衝液を用いて、標準法により正常および結腸直腸組織のサンプルからタンパク質を抽出した。９０μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで分別し、ニトロセルロース膜（BioRAD，ＵＳＡ）へ移し、ＴＢＳ‐Ｔ中５％ミルクで遮断し、遮断用溶液で１：２５００希釈された一次抗ｈＣＡＰ‐Ｅ抗体（Abcam，ＵＫ）、次いで１：５００希釈の二次抗ウサギ抗体（Dako Cytomation，Denmark）とハイブリッド形成させた。ＥＣＬキット（Amersham，ＵＳＡ）を用いて化学発光シグナルを検出し、腫瘍サンプルの発現レベルをそれらの正常対照物と比較した。最後に、付加コントロールとして用いられた抗アクチン抗体（Invitrogen，ＵＳＡ）とその膜を再ハイブリッド形成させた。図４からわかるように、すべての腫瘍サンプルが高いｈＣＡＰ‐Ｅ発現レベルを呈した。
【００４９】
免疫組織化学：結腸直腸癌患者の組織から採取された組織切片をキシレンで脱パラフィン化し、減量しながら連続的にエタノールおよび蒸留水でリンスした。各切片をｐＨ６のクエン酸緩衝液（マイクロ波により８００Ｗで５分間および４５０Ｗで１０分間）で処理し、内在ペルオキシダーゼをＨ２Ｏ２で遮断し、次いでそれらを一次抗ｈＣＡＰ‐Ｅ抗体（Abcam，ＵＫ）とハイブリッド形成させた。免疫組織化学のために、EnVision＋Dual Link Systemキット（Dako Cytomation，Denmark）を製造業者の指示に従い用いた。最後に、正常および癌性組織の各部分におけるｈＣＡＰ‐Ｅ発現レベルを比較した。図５は、ｈＣＡＰ‐Ｅ発現が正常組織よりも癌性組織で大きいことを示している。
【００５０】
コンデンシン複合体の他のタンパク質および関連タンパク質の発現レベルの分析
リアルタイムＰＣＲ：コンデンシン複合体の他のタンパク質および関連タンパク質に相当するｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲで定量し、その際に−８０℃で保たれた正常および結腸直腸組織のサンプルからTrizol（Invitrogen，ＵＳＡ）を用いて目的ＲＮＡを抽出した。High Capacity ｃＤＮＡ Archiveキット（Applied Biosystems，ＵＳＡ）を用いて１０μｇのＲＮＡをレトロ転写し、ｈＣＡＰ‐Ｃ、ｈＣＡＰ‐Ｄ２、ｈＣＡＰ‐Ｄ３、ｈＣＡＰ‐Ｇ、ｈＣＡＰ‐Ｇ２、ｈＣＡＰ‐ＨおよびＫＩＦ４Ｆについて各々TaqManＲ Gene Expression Assays（Applied Biosystems，ＵＳＡ）で増幅させた。増幅反応は7500 Real-Time ＰＣＲ SystemでTaqMan Universal ＰＣＲ Master Mix（両方ともApplied Biosystems，ＵＳＡ）を用いて行なった。△△ＣＴ法および該システム関連のプログラムを用いて各遺伝子の相対的ｍＲＮＡを定量した。試験を三重に行い、１８Ｓ  ｒＲＮＡを内在コントロールとして用い、同一患者からの正常組織および癌性組織の発現を比較した。図７が示しているように、分析されたすべての遺伝子について、コントロールサンプルと比較したときに、癌性サンプルは実質的に高いｍＲＮＡレベルを呈した。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】図１Ａは、やや白いクラスターで表される、間期細胞に存在するｈＣＡＰ‐Ｅを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヘテロクロマチンおよびユークロマチンを別々に示す、細胞核の電子顕微鏡写真である。
【図２】図２は、ユークロマチンに相当する染色体領域（Ｒバンド）における、ｈＣＡＰ‐Ｅの共存を示す。ｈＣＡＰ‐Ｅで染色され、Ｇバンドに対して染色された、同染色体が示されている。ヘテロクロマチンは暗い部分で特定され、それは図面の各々において右側のものである。
【図３】図３は、ｈＣＡＰ‐Ｅとアセチル化ヒストン４（Ｈ４Ａｃ）との共存、および中期染色体におけるＲバンド（染色体で明色バンド）を示す。
【図４】図４は、正常サンプル（Ｎ）および結腸直腸癌腫瘍から採取されたサンプル（Ｔ）における、ｈＣＡＰ‐Ｅのウエスタンブロット分析の結果を示す。アクチンがローディングコントロールとして用いられた。
【図５】図５は、特異的抗ｈＣＡＰ‐Ｅ抗体を用いた、結腸直腸組織の免疫組織化学分析に関する。写真は、正常陰窩に相当する部分（Ｎ）と、ｈＣＡＰ‐Ｅの大きな発現を呈した、結腸腺癌に相当する部分（Ｔ）とを示している。
【図６】図６は特異的抗ｈＣＡＰ‐Ｅ抗体を用いた正常結腸陰窩における免疫組織化学分析に関し、そこでは多能性幹細胞が杯状細胞よりもｈＣＡＰ‐Ｅに対して強い特異的染色を呈することが観察される。
【図７】図７は、コンデンシン複合体における他のタンパク質と関連タンパク質ＫＩＦ４ＡのリアルタイムＰＣＲ分析の結果を示す。分析されたサンプルはサンプル６７Ｔであり、これは、その対応正常サンプルと比較して、ｈＣＡＰ‐Ｅを過剰発現することが既に観察されている。分析は三重に行われ、リボソーム１８Ｓが内部コントロールとして用いられた。
【図２】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【国際調査報告】
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