(57)【要約】  試料中のコレステロールの量の決定のための方法が提供される。本方法は、典型的には、試料のＨＤＬ及びＬＤＬコレステロール内容物の破壊を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のコレステロールの総量の決定のための電気化学的方法であって、該方法は、該試料と、
（ａ１）一以上の胆汁酸誘導体又はその塩を含有する界面活性物質；
（ｂ１）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ｃ１）コレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ１）補酵素；及び
（ｅ１）酸化又は還元されて生成物を形成し得る酸化還元剤
を含有する第一連の試薬とを反応させる工程、並びに
形成された生成物の量を電気化学的に検出する工程を包含する、方法。
【請求項２】
コレステロールエステル加水分解試薬（ｂ１）が、コレステロールエステラーゼ又はリパーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が、第二連の試薬と更に反応させられ、該試料のグリセリド含有量を決定する方法であって、該第二連の試薬が：
（ａ２）一以上の胆汁酸誘導体又はその塩を含有する界面活性物質；
（ｂ２）トリグリセリド加水分解試薬；
（ｃ２）グリセロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ２）補酵素；及び
（ｅ２）酸化又は還元されて生成物を形成し得る酸化還元剤
を含有し、
形成された生成物の量を電気化学的に検出する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一連及び／又は第二連の試薬が、更に還元酵素を含有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
酸化還元酵素が、ジアホラーゼ又はプチダレドキシン還元酵素である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
補酵素（ｄ１）及び／又は（ｄ２）が、ＴＮＡＤである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
酸化還元剤（ｅ１）及び／又は（ｅ２）が、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
試料が、第三連の試薬と更に反応させられ、該試料中の、高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの含有量を決定する、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
試料中の、低密度リポタンパク質（［ＬＤＬ］）に結合したコレステロールの含有量を、以下の式：
【数１】
2009520974.tif 000019
を用いて決定する工程を更に包含し、式中、［総コレステロール］が、該試料中のコレステロールの総濃度であり、［ＨＤＬ］が、高密度リポタンパク質粒子に結合したコレステロールの濃度であり、かつ、［トリグリセリド］が、該試料のトリグリセリド濃度であり、該濃度が、ｍＭ単位で測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料が、第一連、第二連及び第三連の試薬と実質的に同時に反応する、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試料が全血液であり、該試料を濾過して赤血球を取り除くステップを更に包含する、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
試料中のコレステロールの総量の決定のための電気化学的方法に用いる第一の試薬混合物であって、該第一の試薬混合物が、
（ａ１）一以上の胆汁酸誘導体又はその塩を含有する界面活性物質；
（ｂ１）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ｃ１）コレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ１）補酵素；
（ｅ１）酸化又は還元されて生成物を形成し得る酸化還元剤；
及び必要に応じて
（ｆ１）還元酵素
を含有し、該試薬（ａ１）乃至（ｆ１）が、請求項１、請求項２及び請求項４乃至請求項７のいずれか１項に規定された通りである、第一の試薬混合物。
【請求項１３】
試料中のトリグリセリドの量の決定のための電気化学的方法に用いる第二の試薬混合物であって、該第二の試薬混合物が、
（ａ２）一以上の胆汁酸誘導体又はその塩を含有する界面活性物質；
（ｂ２）トリグリセリド加水分解試薬；
（ｃ２）グリセロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ２）補酵素；
（ｅ２）酸化又は還元されて生成物を形成し得る酸化還元剤；
及び必要に応じて
（ｆ２）還元酵素
を含有し、該試薬（ａ２）乃至（ｆ２）が、請求項３乃至７のいずれか１項に規定された通りである、第二の試薬混合物。
【請求項１４】
試料の総コレステロール含有量を測定するためのキットであって、該キットは、
−  各セルが、作用電極、基準又は偽基準電極を有し、必要に応じて別個の対電極を有する、第一の電気化学的セル及び必要に応じて更なる電気化学的セル；
−  請求項１、２及び４乃至７のいずれか１項において規定された第一連の試薬であって、該第一連の試薬が、該第一の電気化学的セルに関連している、試薬；
−  電位を、該セル又は各セルに印加するための電源；並びに
−  該セル又は各セルの、生じた電気化学的反応を測定するための測定器具
を含む、キット。
【請求項１５】
試料の総コレステロール及びトリグリセリド含有量を測定するための請求項１４に記載のキットであって、該キットが、第二の電気化学的セル及びこれに関連する第二連の試薬を含み、該第二連の試薬が、請求項３乃至請求項７のいずれか１項に規定された通りである、キット。
【請求項１６】
第三の電気化学的セル及びこれに関連する第三連の試薬を含む、請求項１４又は請求項１５に記載のキットであって、第三連の試薬が、該試料中の、高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの含有量の決定のためのものである、キット。
【請求項１７】
第四のコントロール電気化学的セルを更に含む、請求項１４乃至請求項１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】
試料中の、低密度リポタンパク質（［ＬＤＬ］）に結合したコレステロールの含有量を、以下の式：
【数２】
2009520974.tif 000020
を用いて計算するための計算機を更に含み、式中、［総コレステロール］が、該試料中のコレステロールの総濃度であり、［ＨＤＬ］が、高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの濃度であり、かつ、［トリグリセリド］が、該試料のトリグリセリド濃度であり、該濃度が、ｍＭ単位で測定される、請求項１６又は請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記電気化学的セル又は各電気化学的セルの作用電極が、５０μｍ未満の少なくとも一の寸法を有する微小電極である、請求項１４乃至請求項１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
前記電気化学的セル又は各電気化学的セルが、容器又は部分的容器の形態であり、作用電極が、該容器又は部分的容器の壁部中にあり、前記連又は各連の試薬が、該容器又は部分的容器内に少なくとも部分的に含まれる乾燥形態の試薬混合物として提供される、請求項１４乃至請求項１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
ストリップ中に形成された少なくとも四の容器又は部分的容器を有する該ストリップを含む、請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載のキットであって、各容器又は部分的容器が、該ストリップの第一の表面において第一の開口部を有して試料が該容器又は部分的容器に入るのを可能にし、
各電気化学的セルの該作用電極が、該容器又は部分的容器の壁部中にあり、かつ
各電気化学的セルの該基準電極又は偽基準電極が、該ストリップの第一の表面の少なくとも一部の上に形成された基準又は偽基準電極層を含み、かつ
一の容器又は部分的容器が該第一連の試薬を含み、第二の容器又は部分的容器が該第二連の試薬を含み、第三の容器又は部分的容器が第三連の試薬を含む、
キット。
【請求項２２】
添付の図面を参照して実質的に本明細書中で後に記載されたとおりである、請求項１４乃至請求項２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
請求項１４乃至請求項２２のいずれか１項に規定されたキットを操作する方法であって、該方法は、
（ｉ）試料と前記電気化学的セル又は各電気化学的セルの試薬とを接触させる工程；
（ｉｉ）電位を該電気化学的セル又は各電気化学的セルに印加する工程；並びに
（ｉｉｉ）該電気化学的セル又は各電気化学的セルにおいて形成された生成物の量を、生じた電気化学的反応を測定することにより電気化学的に検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２４】
試料中のトリグリセリドの量の決定のための電気化学的方法であって、該方法は、該試料と、
（ａ２）一以上の胆汁酸誘導体又はその塩を含有する界面活性物質；
（ｂ２）トリグリセリド加水分解試薬；
（ｃ２）グリセロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ２）補酵素；
（ｅ２）酸化又は還元されて生成物を形成し得る酸化還元剤；
及び必要に応じて
（ｆ２）還元酵素
を含有する第二連の試薬とを反応させる工程、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出する工程を包含し、該試薬（ａ２）乃至（ｆ２）が、請求項３乃至請求項７のいずれか１項に規定された通りである、方法。
【請求項２５】
一以上の胆汁酸誘導体又はその塩の、試料中のコレステロールの総量の決定のため電気化学的方法においてリポタンパク質構造を破壊するための界面活性物質としての使用であって、該方法が、該試料と、
（ａ１）該一以上の胆汁酸誘導体又はその塩；
（ｂ１）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ｃ１）コレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ１）補酵素；及び
（ｅ１）酸化又は還元されて生成物を形成し得る酸化還元剤；
及び必要に応じて
（ｆ１）還元酵素
を含有する第一連の試薬とを反応させる工程、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出する工程を包含し、該試薬（ａ１）乃至（ｆ１）が、請求項１、請求項２及び請求項４乃至請求項７のいずれか１項に規定された通りである、使用。
【請求項２６】
一以上の胆汁酸誘導体又はその塩の、試料中のトリグリセリドの総量の決定のための電気化学的方法においてリポタンパク質構造を破壊するための界面活性物質としての使用であって、該方法が、該試料と、
（ａ２）該一以上の胆汁酸誘導体又はその塩；
（ｂ２）トリグリセリド加水分解試薬；
（ｃ２）グリセロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ２）補酵素；
（ｅ２）酸化又は還元されて生成物を形成し得る酸化還元剤；
及び必要に応じて
（ｆ２）還元酵素
を含有する第二連の試薬とを反応させる工程、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出する工程を包含し、試薬（ａ２）乃至（ｆ２）が、請求項３乃至請求項７のいずれか１項に規定された通りである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のコレステロールの量を決定するための方法に関する。本発明はまた、このような方法での使用のための試薬混合物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
高コレステロールに関連する障害の発生率、特に冠動脈疾患（ＣＡＤ）の発生率が増加する現在の趨勢では、有効な高コレステロール試験の需要が高まっている。多くの疫学的調査により、コレステロール又はアポＡ１含有量のいずれかの観点から測定された高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）が、ＣＡＤのリスクに対して、強力かつ独立に逆相関していることが実証された。ＣＡＤのリスクは、ＨＤＬ−コレステロールが１０ｍｇ／Ｌ減少するごとに２−３％増加すると言われている。従って、ＨＤＬ−コレステロール濃度がより高くなると、保護的であるとみなされる。逆に、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）濃度がより高くなると、有害作用を有するとみなされる。従って、コレステロール試験は、好ましくは、総コレステロールレベルを示すのみならず、ＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロールレベルの測定をも提供すべきである。
【０００３】
現在臨床医が利用できる試験手順では一般的に、試料が、そのような結果を得るために実験室試験施設に送られる必要がある。これは、患者から採られた試験試料と下された診断との間に、所望でない時間の遅延をもたらす。従って、体液（例えば、血液又は血漿）のコレステロール含有量を解析するための、単純、有効でかつ迅速な方法、特に、ポイント・オブ・ケアで結果を提供し得る方法が必要である。好ましい方法は、従って、専門的設備を用いないし、実行する熟練した技術者も必要としないであろう。更に、このような方法はいずれも、好ましくは、ＨＤＬに結合したコレステロールとＬＤＬに結合したコレステロールとを効率的に識別できるべきである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、試料中のコレステロールの総量の決定のための方法を提供し、この方法は、試料と、
（ａ１）一以上の胆汁酸誘導体又はその塩を含有する界面活性物質；
（ｂ１）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ｃ１）コレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ１）補酵素；
（ｅ１）酸化又は還元されて生成物を形成し得る酸化還元剤；
及び必要に応じて
（ｆ１）還元酵素
を含有する第一連の試薬とを反応させる工程、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出する工程を包含する。
【０００５】
好ましい実施形態では、本発明の方法はまた、試料のトリグリセリド含有量の測定、及び試料中の、高密度リポタンパク質に結合しているコレステロール（ＨＤＬコレステロール）の含有量の測定を提供する。これらの測定から、低密度リポタンパク質に結合したコレステロール（ＬＤＬコレステロール）の量が決定され得る。
【０００６】
試料のトリグリセリド含有量は、当該試料と、
（ａ２）一以上の胆汁酸誘導体又はその塩を含有する界面活性物質；
（ｂ２）トリグリセリド加水分解試薬；
（ｃ２）グリセロールデヒドロゲナーゼ；
（ｄ２）補酵素；
（ｅ２）酸化又は還元されて生成物を形成し得る酸化還元剤；
及び必要に応じて
（ｆ２）還元酵素
を含有する第二連の試薬と反応させること、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出することにより決定され得る。
【０００７】
疑義を回避するために、本明細書中で言及する試薬の「連」は、二以上の連続ステップを必要としない。従って、上記第一連の試薬は、例えば、試薬の単一混合物であり得、これは典型的には、単一の電気化学的ウェル中に提供される。同様に、上記第二連の試薬は、試薬の単一の混合物であり得、典型的には、別個の電気化学ウェル中に提供され得る。更なる連の試薬は、同様に、試薬の単一混合物であり得、典型的には、更なる別個の電気化学ウェル中に提供され得る。
【０００８】
従って、本発明は、コレステロール含有量を決定するための、単純な電気化学的試験を提供し、当該試験は、試料のＨＤＬコレステロール含有量及びＬＤＬコレステロール含有量の指標もまた提供し得る。電気化学的試験は、使用者の側に特に技術を要求せず、従って、訓練を受けていない人員により実行され得る。試験結果はまた、非常に素早く提供され、典型的には、数分以内に提供される。従って、本発明は、例えば、一滴の血液のみを用いて、患者のコレステロールレベルの、迅速だが詳細な解析を提供し得る、単純なポイント・オブ・ケアのコレステロール試験を提供する。
【０００９】
本発明はまた、試料中のコレステロールの総量の決定のための電気化学的方法において使用する第一の試薬混合物を提供し、該第一の試薬混合物は、上に記載された、構成成分（ａ１）乃至（ｅ１）を含有し、必要に応じて（ｆ１）を含有する。試料中のトリグリセリドの量の決定のための電気化学的方法において使用するための第二の試薬混合物もまた提供され、当該第二の試薬混合物は、上に記載された、構成成分（ａ２）乃至（ｅ２）を含有し、必要に応じて（ｆ２）を含有する。
【００１０】
本発明はまた、一以上の胆汁酸誘導体又はその塩の、試料中のコレステロールの総量の決定のための電気化学的方法におけるリポタンパク質構造を破壊するための界面活性物質としての使用を提供し、該方法は、当該試料と、上に記載の、構成成分（ａ１）乃至（ｅ１）を含有し、必要に応じて（ｆ１）を含有する第一連の試薬とを反応させる工程を包含する。一以上の胆汁酸誘導体又はその塩の、試料中のトリグリセリドの量の決定のための電気化学的方法における、リポタンパク質構造を破壊する界面活性物質としての使用もまた提供され、該方法は、当該試料と、上に記載の、構成成分（ａ２）乃至（ｅ２）を含有し、必要に応じて（ｆ２）を含有する第二連の試薬とを反応させる工程を包含する。
【００１１】
試料の総コレステロール含有量を測定するためのキットもまた提供され、このキットは、
−  各セルが、作用電極、基準電極又は偽基準電極を有し、必要に応じて別個の対電極を有する、第一の電気化学的セル及び必要に応じて更なる電気化学的セル；
−  上記第一の電気化学的セルと関連する、本明細書中に記載される第一連の試薬；
−  電位を上記セル又は各セルに印加するための電源；並びに
−  セル又は各セルの生じた電気化学的反応を測定するための測定器具
を含む。
【００１２】
キットはまた、好ましくは、第二の電気化学的セル及び当該第二の電気化学的セルと関連する第二連の試薬を含み、当該第二連の試薬は、試料のトリグリセリド含有量の測定を提供する。第三の電気化学的セル及びこれに関連する第三連の試薬もまた提供され得、当該第三連の試薬は、試薬中のＨＤＬコレステロールの含有量の決定のためのものである。
【００１３】
本発明のキットを操作する方法もまた提供され、該方法は、試料と電気化学的セル又は各電気化学的セルの試薬とを接触させる工程；電位を当該電気化学的セル又は各電気化学的セルに印加する工程；並びに生じた電気化学的反応を測定することにより当該電気化学的セル又は各電気化学的セル中で形成された生成物の量を電気化学的に検出する工程を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、患者のコレステロールプロファイルを決定する方法を提供する。典型的には、本発明は、試料の総コレステロール含有量に関する試験を提供し、好ましい実施形態では、トリグリセリド含有量及びＨＤＬコレステロール含有量の試験もまた提供される。これにより、試料のＬＤＬ含有量を、Ｆｒｉｅｄｗａｌｄ式を用いて計算することが可能となる。
【００１５】
（総コレステロール試験）
総コレステロール試験は、試料と、界面活性物質、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールデヒドロゲナーゼ、補酵素及び酸化還元剤を含有する第一連の試薬とを反応させる工程を伴う。好ましくは、還元酵素も用いられる。試料と試薬との混合物は、生じた酸化還元反応が検出され得るように、電気化学的セルの作用電極と接触される。電位がセルに印加され、生じた電気化学的反応（典型的には電流）が測定される。
【００１６】
体内で見られるコレステロールは、リポタンパク質に結合している。従って、コレステロールに接近するために、及び残存するアッセイ成分との反応を可能にするために、界面活性物質を用いてリポタンパク質構造を破壊することが必要である。本発明において用いられる界面活性物質は、胆汁酸誘導体又はその塩である。その理由は、これらがリポタンパク質を効率的に破壊することが見出されているからである。適切な胆汁酸誘導体の例としては、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］プロパン）、ＣＨＡＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰ及びデオキシＢＩＧＣＨＡＰが挙げられる。適切な塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられる。特に、タウロコール酸ナトリウム（ＮａＴＣ）及びタウロコール酸カリウム（ＫＴＣ）が、本発明で用いる胆汁酸誘導体の好ましい塩として言及され得る。
【００１７】
二以上の胆汁酸誘導体又はその塩の組合せもまた用いられ得る。例えば、ＣＨＡＰＳ単独での使用は、存在する酵素の沈殿を引き起こすこともあることが見出されている。従って、ＣＨＡＰＳと、この影響を有しない異なる界面活性物質（例えば、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ）との組合せは、有益であることが見出されている。好ましい実施形態では、ＣＨＡＰＳ及びデオキシＢＩＧＣＨＡＰは、１：１の比で用いられる。
【００１８】
存在する界面活性物質の総量は、コレステロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、５〜２００重量％、５０〜１６０重量％、５０〜１００重量％又は６０〜８５重量％であり、好ましくは７０〜８０重量％である。
【００１９】
一度リポタンパク質構造が破壊されると、遊離形態及びコレステロールエステル形態の両方のコレステロールが、反応に利用できるようになる。後のアッセイは、遊離コレステロールに関して試験するのみであるので、コレステロールエステルを、コレステロールエステル加水分解試薬を用いて加水分解し、遊離コレステロールを提供する。コレステロールエステル加水分解試薬は、コレステロールエステルをコレステロールに加水分解できる任意の試薬であり得る。上記試薬は、コレステロールとコレステロールデヒドロゲナーゼとの反応及びこのアッセイにおける後の任意のステップを妨害しない試薬であるべきである。好ましいコレステロールエステル加水分解試薬は、酵素（例えば、コレステロールエステラーゼ及びリパーゼ）である。適切なリパーゼは、例えば、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ又はｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ種由来のリパーゼである。必要に応じて添加物（例えば、安定剤又は保存剤）を含有する市販の酵素（例えば、Ｔｏｙｏｂｏ又はＡｍａｎｏから入手可能のもの）が用いられ得る。上記コレステロールエステル加水分解酵素は、コレステロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、１〜２０重量％、１〜１０重量％、好ましくは３〜７重量％の量で用いられる。
【００２０】
遊離コレステロールは、以下のアッセイに従って、コレステロールデヒドロゲナーゼと反応させ、コレステロールデヒドロゲナーゼの還元形態を提供する。
【００２１】
【化１】
2009520974.tif 000002
【００２２】
ＣｈＤは、コレステロールデヒドロゲナーゼである。アッセイにより生成された、還元された酸化還元剤の量は、電気化学的に検出され、これにより、試料の総コレステロール含有量の指標が提供される。更なる試薬もまた、適切な場合に、このアッセイに含まれ得る。
【００２３】
市販の任意の形態のコレステロールデヒドロゲナーゼが用いられ得る。例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼは、Ｎｏｃａｒｄｉａ種由来であり得る。コレステロールデヒドロゲナーゼは、試験される試料１００μｌ当たり０．１〜６０ｍｇ、１００μｌ当たり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは１００μｌ当たり０．５〜１０ｍｇの量で用いられ得る。
【００２４】
コレステロールエステル加水分解試薬として用いられる酵素及び／又はコレステロールデヒドロゲナーゼは、添加物（例えば、安定剤又は保存剤）を含有し得る。更に、各酵素は、化学的に修飾され得る。
【００２５】
典型的には、補酵素は、ＮＡＤ＋又はその類似体である。ＮＡＤ＋の類似体は、ＮＡＤ＋と共通の構造上の特徴を有し、コレステロールデヒドロゲナーゼの補酵素としても作用する化合物である。ＮＡＤ＋類似体の例としては、ＡＰＡＤ＋（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）；ＴＮＡＤ＋（チオ−ＮＡＤ）；ＡＨＤ＋（アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）；ＮａＡＤ＋（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）；ＮＨＤ＋（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）；及びＮＧＤ＋（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）が挙げられる。ＴＮＡＤ＋は、好ましい補酵素である。その理由は、ＴＮＡＤ＋が、アッセイにおいてより優れた成績を提供することが見出されているからである。補酵素は、コレステロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、０．５重量％〜３０重量％又は約５重量％〜３０重量％の量で用いられる。本明細書中で用いられる場合、ＴＮＡＤ＋とは、チオ−ＮＡＤ又はその塩（例えば、ＴＮＡＤＫ＋）をいう。
【００２６】
典型的には、酸化還元剤は、上に示されたアッセイに従って還元され得るものであるべきである。この場合、酸化還元剤は、補酵素から（又は下記の還元酵素から）電子を受容し得、電極に電子を伝達し得るものであるべきである。酸化還元剤は、分子であってもよいし、イオン性錯体であってもよい。酸化還元剤は、天然に存在する電子受容体（例えば、タンパク質）であってもよいし、合成分子であってもよい。酸化還元剤は、典型的には、少なくとも二の酸化状態を有するであろう。
【００２７】
好ましくは、酸化還元剤は、無機錯体である。この剤は、金属イオンを含み得、好ましくは少なくとも二のイオン価を有するであろう。特に、この剤は、遷移金属イオンを含み得、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル又はルテニウムのイオンが挙げられる。酸化還元剤は、荷電され得る（例えば、カチオン性であってもよいし或いはアニオン性であってもよい）。適切なカチオン性剤の例は、ルテニウム錯体（例えば、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋）であり、適切なアニオン性剤の例は、鉄錯体（例えば、Ｆｅ（ＣＮ）６３−）（フェリシアン化物）である。
【００２８】
用いられ得る錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸塩）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋及びそのキレート化アミン配位子誘導体（例えば、エチレンジアミン）、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）、フェロセニウム及び１以上の基（例えば、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ及び−ＣＯ２Ｈ）が二のシクロペンタジエニル環の一方又は両方中に導入されたその誘導体が挙げられる。好ましくは、無機錯体は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）、又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。酸化還元剤は、コレステロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、１〜６０重量％、５〜６０重量％、好ましくは２０〜６０重量％、３０〜６０重量％、好ましくは４０〜６０重量％の量で用いられる。
【００２９】
好ましい実施形態では、電気化学的アッセイで用いられる試薬混合物は、更に還元酵素を含有する。還元酵素は、典型的には、還元型ＮＡＤから電子を２個伝達し、酸化還元剤に電子を２個伝達する。従って、還元酵素の使用は、迅速な電子伝達を提供する。還元酵素はまた、上記反応がより素早く生ずるのを促進し得る。
【００３０】
用いられ得る還元酵素の例としては、ジアホラーゼ及びチトクロムＰ４５０還元酵素が挙げられ、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のチトクロム４５０ｃａｍ酵素系のプチダレドキシン還元酵素、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、ホウレンソウフェロドキシン還元酵素、ルブレドキシン還元酵素、アドレノドシキン還元酵素、硝酸還元酵素、チトクロムｂ５還元酵素、トウモロコシ硝酸還元酵素、テルプレドキシン（ｔｅｒｐｒｅｄｏｘｉｎ）還元酵素並びに酵母、ラット、ウサギ及びヒトのＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素が挙げられる。硝酸還元酵素が用いられる場合、好ましくはトウモロコシ硝酸還元酵素が用いられる。本発明において用いるのに好ましい還元酵素としては、ジアホラーゼ及びプチダレドキシン還元酵素が挙げられる。
【００３１】
還元酵素は、精製されたか又は単離された、組換えタンパク質であっても天然に存在するタンパク質であってもよい。還元酵素は、性能を改良するために（例えば、電子伝達を実行する速度又は基質特異性を最適化するために）変異していてもよい。
【００３２】
還元酵素は、コレステロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、１〜２０重量％、２〜２０重量％、好ましくは、３〜１５重量％、５〜１５重量％の量で用いられる。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、電気化学アッセイの全体スキームは、以下の通りである：
【００３４】
【化２】
2009520974.tif 000003
【００３５】
ＰｄＲ  −    は、プチダレドキシン還元酵素であり
ＣｈＤ  −    は、コレステロールデヒドロゲナーゼである。
【００３６】
一以上の更なる構成成分（例えば、賦形剤及び／又は緩衝剤及び／又は安定剤）もまた、第一連の試薬中に提供され得る。賦形剤は、好ましくは、試薬を安定化させるために提供され、乾燥試薬混合物が用いられる場合には必要に応じて、当該乾燥混合物に多孔性を提供するために提供される。適切な賦形剤の例としては、糖類（例えば、マンニトール、イノシトール及びラクトース）、グリシン並びにＰＥＧが挙げられる。グリシンが好ましい。緩衝剤もまた、最適な酵素活性に必要とされるｐＨを提供するために含められ得、当該必要とされるｐＨは、典型的には、約ｐＨ９である。例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）が用いられ得る。安定剤は、例えば、酵素安定性を高めるために添加され得る。適切な安定剤の例は、アミノ酸（例えば、グリシン）、エクトイン（ｅｃｔｏｉｎｅ）及びミオイノシトールである。
【００３７】
好ましい実施形態では、第一連の試薬は、胆汁酸誘導体又はその塩、コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ；コレステロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はその類似体；還元酵素；及び酸化還元剤を含有する。より好ましい実施形態では、試薬混合物は、ＣＨＡＰＳ、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ＴＮＡＤ＋、プチダレドキシン還元酵素及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋を含有する。
【００３８】
典型的には、総コレステロール試験は、試料と必要とされる全ての試薬とを単一ステップで接触させることを伴う。従って、第一連の試薬の全てを含有し、かつ、アッセイを実行するために試料と容易に接触され得る試薬混合物が提供される。
【００３９】
（トリグリセリド試験）
トリグリセリド試験は、試料と、界面活性物質、リパーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、補酵素及び酸化還元剤を含有する第二連の試薬とを反応させることを伴う。好ましくは還元酵素もまた用いられる。典型的には、第一連及び第二連の試薬は、別個の電気化学的セル中で、試料と接触される。試料と試薬との混合物は、生じた酸化還元反応が検出され得るように、電気化学的セルの作用電極と接触される。電位がセルに印加され、生じた電気化学的反応（典型的には、電流）が測定される。
【００４０】
コレステロールと同様に、トリグリセリドは、その天然の形態ではリポタンパク質に結合している。従って、界面活性物質はまた、トリグリセリド試験において、リポタンパク質を破壊し、トリグリセリドに接近するために用いられる。胆汁酸誘導体及びその塩は、この目的に有効な界面活性物質であることが見出されている。適切な胆汁酸誘導体の例としては、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、グルコデオキシコール酸、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］プロパン）、ＣＡＨＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰ及びデオキシＢＩＧＣＨＡＰが挙げられる。ＣＨＡＰＳが好ましい。二以上の胆汁酸誘導体又はそれらの塩の組合せもまた用いられ得る。用いられる界面活性物質の総量は、グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、５〜２００重量％、５０〜４０重量％、好ましくは１５〜３０重量％である。
【００４１】
遊離トリグリセリドは、トリグリセリド加水分解試薬と反応し、トリグリセリド一分子当たり、一分子のグリセロールが生成される。次いで、グリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼを用いて、定量的に検出される。トリグリセリド加水分解試薬は、トリグリセリドのグリセロールへの分解を生じ得る任意の試薬であり得るが、グリセロールデヒドロゲナーゼの作用を妨害しない。適切な物質は、酵素（例えば、リパーゼ）である。適切なリパーゼは、例えば、Ｔｏｙｏｂｏより市販されている。例えば、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ又はｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のリポタンパク質リパーゼが用いられ得る。トリグリセリド加水分解試薬は、グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、１００〜３００重量％、１００〜２５０重量％、好ましくは２００〜２５０重量％の量で用いられる。
【００４２】
生成されたグリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼと反応し、以下のアッセイに従ってグリセロールデヒドロゲナーゼの還元形態を提供する。
【００４３】
【化３】
2009520974.tif 000004
【００４４】
ＧｌＤＨは、グリセロールデヒドロゲナーゼである。アッセイにより生成された還元された酸化還元剤の量は、電気化学的に検出され、これにより試料の総トリグリセリド含有量の指標が提供される。更なる試薬もまた、適切な場合に、このアッセイに含まれ得る。
【００４５】
任意の市販の形態のグリセロールデヒドロゲナーゼが用いられ得る。例えば、グリセロールデヒドロゲナーゼは、Ｔｏｙｏｂｏから得られ得る。このような商業的に得られる酵素は、更に安定剤を含有し得る。グリセロールデヒドロゲナーゼは、試料１００μｌ当たり０．１〜４０ｍｇ、１００μｌ当たり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは１００μｌ当たり０．５〜２０ｍｇ、１００μｌ当たり０．５〜１０ｍｇの量で用いられ得る。グリセロールデヒドロゲナーゼ、及びトリグリセリド加水分解試薬として用いられる任意の酵素は、化学的に修飾され得る。
【００４６】
補酵素、酸化還元剤及び還元酵素として用いられる物質は、典型的には、総コレステロール試験に関して上に記載されたものと同一であり、デヒドロゲナーゼ酵素の量に対して同等の量が用いられる。従って、補酵素は、グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、０.５〜４０重量％又は５〜４０重量％の量で用いられる。酸化還元剤は、グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、１〜７０重量％、５〜６０重量％、好ましくは２０〜６０重量％、３０〜６０重量％、好ましくは４０〜６０重量％の量で用いられる。還元酵素は、グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には、１〜２０重量％、２〜２０重量％、好ましくは３〜１５重量％、５〜１５重量％の量で用いられる。上に記載された型の安定剤、賦形剤及び／又は緩衝剤もまた用いられ得る。トリグリセリド試験のための好ましい緩衝系は、水酸化カリウム及び塩化アンモニウムを有するＨＥＰＢＳ緩衝液（ｐＨ９）を含む。
【００４７】
トリグリセリドアッセイは、好ましくは、以下の通りである：
【００４８】
【化４】
2009520974.tif 000005
【００４９】
Ｄｉａ  −    は、ジアホラーゼであり
ＧｌＤＨ−    は、グリセロールデヒドロゲナーゼである。
【００５０】
好ましい実施形態では、第二連の試薬は、胆汁酸誘導体又はその塩；リパーゼ；グリセロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はその類似体；還元酵素；及び酸化還元剤を含有する。より好ましい実施形態では、試薬混合物は、ＣＨＡＰＳ、リパーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ＴＮＡＤ＋、ジアホラーゼ及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋を含有する。
【００５１】
典型的には、トリグリセリド試験は、試料と必要とされる全ての試薬とを単一ステップで接触させることを伴う。従って、第二連の試薬の全てを含有し、かつ、アッセイを実行するために試料と容易に接触され得る試薬混合物が提供される。
【００５２】
（ＨＤＬコレステロール試験）
ＨＤＬコレステロール試験は、第三連の試薬（典型的には、（総コレステロール試験についての）第一連の試薬と類似する）を用いる（ＬＤＬコレステロールよりもＨＤＬコレステロールに対する選択性を提供する試薬が用いられる点を除く）。
【００５３】
例えば、選択性は、試料と、非ＨＤＬリポタンパク質（典型的には、ＬＤＬ及びＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質））と複合体を形成し得る複合体化試薬とを反応させることにより提供され得る。複合体化試薬はまた、キロミクロン（ＣＭ）と複合体を形成し得る。一度複合体形態になると、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭは、酵素との反応に利用できず、従って、上に記載されたアッセイを妨害しない。このように、上記アッセイは、ＨＤＬ−コレステロール選択的である。
【００５４】
複合体化試薬は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ若しくはＣＭと、複合体（例えば、１：１複合体）を形成し得るか、又はより大きな凝集体（例えば、試料中で不溶性であり得る沈殿）を形成し得る。このような不溶性の沈殿は、電気化学的検出ステップを妨害しない。複合体化試薬の例としては、ポリアニオン、ポリアニオンと二価金属塩との組合せ、及びアポＢ含有リポタンパク質に結合し得る抗体が挙げられる。ポリアニオンは、ホスホタングステン酸及びその塩、デキストラン硫酸及びその塩、ポリエチレングリコール並びにヘパリン及びその塩より選択され得、典型的には、最大２００ｍＭ（例えば１０〜２００ｍＭ、例えば３０〜１５０ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭ）の量で、試薬混合物中に存在する。ホスホタングステン酸及びその塩は、好ましいポリアニオンである。二価金属塩としては、ＩＩＡ族金属（例えば、Ｍｇ及びＣａ）、並びにＭｎの塩が挙げられ、典型的には、試薬混合物中に、１０〜４００ｍＭ（例えば、３０〜３００ｍＭ、好ましくは５０〜２５０ｍＭ、又は１０〜２００ｍＭ、３０〜１５０ｍＭ又は５０〜１００ｍＭ）の量で存在する。Ｍｇは、好ましい金属である。アニオンは、典型的には、ハロゲン化物（例えば、塩化物）又は硫酸塩である。ＭｇＣｌ２及びＭｇＳＯ４は、好ましい二価金属塩である。
【００５５】
典型的には、ＨＤＬコレステロール試験は、試料と、必要とされる全ての試薬とを、単一ステップで接触させることを伴う。従って、第三連の全ての試薬を含有し、かつ、アッセイを実行するために試料と容易に接触され得る試薬混合物が提供される。典型的には、第一連、第二連及び第三連の試薬は、別個の電気化学的セル中で試料と接触される。
【００５６】
（ＬＤＬコレステロール測定）
試料の総コレステロール、トリグリセリド及びＨＤＬコレステロール含有量の測定を提供する上記三種の試験が完了すれば、ＬＤＬコレステロール含有量もまた、Ｆｒｉｅｄｗａｌｄ式：
【００５７】
【数１】
2009520974.tif 000006
【００５８】
を用いて算出され得、濃度はｍＭ単位で測定される。
【００５９】
三種の試験（総コレステロール、トリグリセリド及びＨＤＬコレステロール）が全て実行される本発明の好ましい実施形態では、上記試験は、逐次実行されても、同時に実行されても、いずれでもよい。同時に実行されるのが好ましい。典型的には、試料（例えば、一滴の血液）は、上記三種の電気化学的試験が同時に実行され得るように、三つ全ての連の試薬と、実質的に同時に接触される。これには、フルセットの結果（ＨＤＬ、ＬＤＬ及び総コレステロールの測定を含む）が非常に迅速に提供され得るという利点がある。
【００６０】
本発明に従う測定は、コレステロールを含有する任意の適切な試料で実行され得る。測定は、典型的には、全血又は血液構成成分（例えば、血清若しくは血漿）に対して実行される。本発明の方法での使用に好ましい試料は、血清及び血漿である。電気化学的測定が、全血で実行される場合、得られた測定は、ヘマトクリットに依存し得る。従って、測定は、理想的には、少なくとも部分的にはこの要素を説明するように調節されるべきである。或いは、赤血球が、アッセイを行う前に試料を濾過することにより、取り除かれ得る。
【００６１】
本発明の方法は、妨害物質について、得られた測定を補正するステップを更に包含し得る。このステップは、典型的には、試料と、界面活性物質、補酵素、酸化還元剤を含有し、必要に応じて還元酵素並びに所望の場合には緩衝剤、安定剤及び賦形剤を含有するコントロール連の試薬とを反応させることを伴う。典型的には、コントロール連の試薬は、酵素カスケードにおける構成成分の一つが欠けている点を除き、第一連、第二連及び第三連の試薬と同一の試薬であるか、又はそれらに非常に類似した試薬である。例えば、トリグリセリド及びコレステロールに反応性の酵素が、存在しない可能性がある。試料とコントロール試薬との反応、及び後の任意の電気化学的反応の測定により、当業者は、試料中の妨害物質による反応を決定することができる。妨害物質による反応は後に、総コレステロール、トリグリセリド及びＨＤＬコレステロール試験の測定から減算され、妨害物質の影響が低減又は排除された、より正確な結果を提供し得る。更に、試験された試料が、当該試験を失敗させるであろうような、任意のかなりの量の妨害物質を含有するはずである場合には、これはコントロール反応を用いて同定され得る。
【００６２】
（コレステロール試験を実行するためのキット）
本発明のキットは、一以上の電気化学的セルを有するデバイスを含み、各セルは、作用電極、基準電極又は偽基準電極を有し、必要に応じて、別個の対電極を有する。一連の試薬は、セルが所望の電気化学的試験を提供するように、一以上のセルと関連する。電気化学的セルと関連している試薬により、本発明者らは、試料が当該試薬と一度接触すると試薬と試料との混合物が当該電気化学的セルの作用電極と接触するように、当該試薬が位置していることを意味する。キットはまた、電位を各セルに印加するための電源及び各セルの生じた電気化学的反応を測定するための測定器具を含む。
【００６３】
本発明のデバイスは、典型的には、上に記載された第一連の試薬と関連する、少なくとも一の電気化学的セルを有する。従って、キットは、典型的には、少なくとも、試料の総コレステロール含有量の測定を提供する。或いは又は好ましくは更に、上記デバイスは、トリグリセリド含有量の測定が提供されるように、上に記載された第二連の試薬と関連する第二の電気化学的セルを備える。上に記載された第三連の試薬と関連する第三の電気化学的セルが、好ましくは存在し、その結果、キットにより、試料の、総コレステロール、トリグリセリド及びＨＤＬコレステロール含有量の測定が提供される。更なる好ましい実施形態はまた、上に記載されたＦｒｉｅｄｗａｌｄ式を用いて試料のＬＤＬコレステロール含有量を決定するための計算手段（典型的にはコンピュータープログラム）を含む。
【００６４】
典型的には、各連の試薬は、デバイス中、単一の試薬混合物の形態で提供される（即ち、一の試薬混合物が各連の試薬について提供される）。試薬混合物は、液状形態若しくは固形形態のいずれかで存在し得るが、好ましくは固形形態である。典型的には、試薬混合物は、デバイス中に挿入されるか又はデバイス上に置かれ、その一方で、適切な液体（例えば、水）中に懸濁／溶解され、次いで適所で乾燥される。物質をデバイス中／デバイス上で乾燥するこのステップは、当該物質を所望の位置に保持するのに寄与し、試薬が当該デバイスの一の電気化学的セルから別の電気化学的セルに移動するのを防止するのに寄与する。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥又はオーヴン乾燥（加熱）により実行され得る。試薬混合物は、当該試料が試薬混合物と接触する時に、電極との接触もまた生ずるように、典型的には、電極付近に位置する。
【００６５】
本発明の一実施形態では、電気化学的セル又は各電気化学的セルは、容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）の形態である。容器は、中に入れられる液体を含有できる限り任意の形状であり得る。例えば、容器は、円柱状であり得る。一般的に、容器は、底部及び当該底部を囲繞する壁部を含むであろう。この実施形態では、試薬混合物は、典型的には、容器の内に含まれ、可能性のある試薬混合物の各々が互いに離れていることが保証されるという更なる利点がある。従って、電気化学的セルが互いに非常に近接して位置する場合でさえ、各試験は、他の試薬混合物からの妨害なしで容易に実行され得る。好ましくは、試薬混合物を含有する電気化学的セルは、デバイス上の２ｃｍ２以下の面積（例えば、１．５ｃｍ２又は１ｃｍ２）内に位置する。
【００６６】
或いは、上記セル又は各セルは、部分的な容器の形態であり得る。この実施形態では、セルは、別個の基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に対して置かれた場合に部分的容器が基材と一緒になって容器を形成する。この実施形態では、上記部分的容器は、第一の開口部（ｏｐｅｎ  ｐａｒｔ）と第二の開口部とを接続する壁部を含む。第二の開口部は、容器を形成する基材に対して置かれ得、その結果、当該基材はこのように形成された容器の真正の底部を形成する。第二の開口部は、所望の場合には、透過性膜又は半透過性膜により覆われ得る。
【００６７】
各電気化学的セルが少なくとも一の微小電極を有することが好ましい。典型的には、作用電極は、微小電極である。本発明の目的のために、微小電極は、少なくとも一の、５０μｍを超えない作用寸法（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を有する電極である。本発明の微小電極は、大きさがマクロ（即ち、５０μｍより大きい）の寸法を有し得る。
【００６８】
電極の「作用寸法」は、作動中に試験溶液と接触している寸法である。更に、作用寸法は、真正の微小電極の典型的な反応に少なくとも部分的に対応する電気化学的反応を電極が有するようにする寸法である。特定の理論に縛られることを望むことなく、電極は、「ミクロ」特有の反応（電極への放射状の拡散）及び「マクロ」特有の反応（電極への半無限の拡散）の合計である電気化学的反応を有するとみなされ得る。本発明に関して、４ｃｐの粘度を有する溶液を用いて電位の印加の５秒後に電気化学的反応を決定する場合、「微小電極」は典型的には、その少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％が当該電極の「ミクロ」挙動により決定される反応を有するであろう。
【００６９】
電気化学的セルは、２電極系又は３電極系のいずれかであり得る。２電極系は、作用電極及び偽基準電極を含む。３電極系は、作用電極、基準電極及び別個の対電極を含む。本明細書中で用いられる場合、基準電極又は偽基準電極は、基準電位を提供できる電極である。偽基準電極は、対電極としても作動し、実質的に基準電位を混乱させることなく電流を通すことができる。
【００７０】
本発明の一実施形態に従う電気化学的セルは、図１に描写される。この実施形態では、作用電極５は、微小電極である。セルは、底部１及び壁部２を有する、容器又は入れ物の形態である。典型的には、容器の深さ（即ち、最上部から底部まで）は、２５〜１０００μｍであろう。一実施形態では、容器の深さは、５０〜５００μｍ（例えば、７５〜２５０μｍ、１００〜２５０μｍ）である。代替的実施形態では、容器の深さは、５０〜１０００μｍであり、好ましくは２００〜８００μｍであり、例えば３００〜６００μｍである。容器の長さ及び幅（即ち、壁部から壁部まで）は、又は円柱状の容器の場合には容器の直径は、典型的には０．１〜５ｍｍであり、例えば、０．５〜１．５ｍｍ（例えば、１ｍｍ）である。
【００７１】
容器の開口端（ｏｐｅｎ  ｅｎｄ）３は、部分的に不透過性の物質により覆われていてもよいし、反透過性又は透過性の物質（例えば、半透過性膜又は透過性膜）で覆われていてもよい。好ましくは、容器の開口端は、実質的に、半透過性又は透過性膜４で覆われている。膜４は、特に、埃又は他の混入物が容器内に入るのを防止する働きをする。
【００７２】
膜４は、試験される試料が通過し得る物質からできている。例えば、試料が血漿である場合、膜は、血漿に透過性であるべきである。膜はまた、好ましくは、タンパク質結合能力が低い。膜として用いるのが適切な物質としては、ポリエステル、硝酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスルホン、マイクロポーラスポリエーテルスルホンフィルム、ＰＥＴ、綿及びナイロン織布（ｎｙｌｏｎ  ｗｏｖｅｎ  ｆａｂｒｉｃｓ）、コーティングされたガラス繊維及びポリアクリロニトリル布が挙げられる。これらの布は、必要に応じて、親水性又は疎水性の処理を経て、その後に用いられ得る。膜の他の表面特徴もまた、所望の場合に変更され得る。例えば、水中での膜の接触角度を変更するための処理が、所望の試料が膜を通って流れるのを促進するために用いられ得る。膜は、一層、二層又はそれより多くの層の物質を含み得、その各々の層は、同一であっても異なっていてもよい。例えば、二層の異なる膜物質を備える従来の二重層膜が用いられ得る。
【００７３】
膜はまた、セルに入るのが望ましくない構成成分を濾過して除くために用いられ得る。例えば、一部の血液産物（例えば、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）及び／又はリンパ球）は、これらの粒子がセルに入らないようにこの様式で分離され得る。適切なろ過膜（血液ろ過膜が挙げられる）は、当該分野で知られている。血液ろ過膜の例は、Ｐａｌｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎのＰｒｅｓｅｎｃｅ  ２００及びＰＡＬＬ  ＢＴＳ  ＳＰ３００、Ｗｈａｔｍａｎ  ＶＦ２、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ＮＸ及びＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｘである。繊維ガラスフィルター（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  ＶＦ２）は、血漿を全血から分離し得、全血標本がデバイスに供給され、試験すべき試料が血漿である場合の使用に適当である。本発明のこの実施形態の目的のために、試料は、（試薬混合物と混合された場合に）作用電極と接触する物質である。一実施形態では、試料を含有する標本は、本発明のデバイスに供給され、当該標本は、膜を通して濾過され、その後、作用電極と接触する。例えば、標本は、全血であり得、上記方法は、（例えば、血液ろ過膜を用いて）赤血球を標本から取り除くステップを包含し得、その結果、例えば、血漿又は血清のみが、作用電極と接触する。この場合、試料は、血漿又は血清である。
【００７４】
本発明のこの実施形態の電気化学的セルは、作用電極５を備え、この作用電極５は、容器の壁部に位置する。作用電極は、例えば、容器の壁部を廻る連続帯の形態である。作用電極の厚さは、典型的には、０．０１〜５０μｍ、０．０１〜２５μｍ、好ましくは０．０５〜１５μｍ、例えば、０．１〜２０μｍである。より厚い作用電極（例えば、厚さ０．１〜５０μｍ、好ましくは厚さ５〜２０μｍの電極）もまた想定される。作用電極の厚さは、容器が底部上に置かれた場合の作用電極の鉛直方向の寸法である。作用電極は、好ましくは、炭素、パラジウム、金又は白金から、例えば導電性インクの形態で、形成される。導電性インクは、更なる物質（例えば、白金及び／又は黒鉛）を含有する修飾されたインクであり得る。二以上の層が、作用電極を形成するために用いられ得、層は、同一又は異なる物質で形成される。
【００７５】
セルはまた、例えば容器の底部、容器の壁部又は当該容器を囲繞するデバイス又は容器に近接するデバイスの領域に存在し得る偽基準電極を含み得る。他の物質もまた用いられ得るが、偽基準電極は、典型的には、Ａｇ／ＡｇＣｌから作製される。偽基準電極として用いるのに適切な物質は、当業者に知られているであろう。この実施形態では、セルは、２−電極系であり、この系では、偽基準電極は、対電極として及び基準電極としての両方で作用する。セルが基準電極及び別個の対電極を備える、代替的実施形態もまた想定され得る。
【００７６】
偽基準（又は基準）電極は、典型的には、作用電極５の表面積と同程度の大きさであるか若しくはこれより小さい表面積、又はこれより大きい表面積（例えば、実質的にこれより大きい表面積）を有する。典型的には、偽基準（又は基準）電極の表面積と作用電極の表面積との比は、少なくとも１：１であり、例えば少なくとも２：１であるか、又は少なくとも３：１である。好ましい比は、少なくとも４：１である。偽基準（又は基準）電極は、例えば、マクロ電極であり得る。好ましい偽基準（又は基準）電極は、０．０１ｍｍ以上（例えば、０．１ｍｍ以上）の寸法を有する。これは、例えば、０．１ｍｍ以上の直径であり得る。偽基準（又は基準）電極の典型的な面積は、０．００１ｍｍ２〜１００ｍｍ２、好ましくは０．０１ｍｍ２〜６０ｍｍ２、例えば、０．１ｍｍ２〜５０ｍｍ２である。作用電極と偽基準（又は基準）電極との間の最小距離は、例えば、１０〜１０００μｍである。
【００７７】
セルが作動できるように、電極は、絶縁物質６により、各々分離されなければならない。絶縁物質は、典型的にはポリマー（例えば、アクリル、ポリウレタン、ＰＥＴ、ポリオレフィン、ポリエステル）又は任意の他の安定な絶縁物質である。ポリカーボネート及び他のプラスチック及びセラミクスもまた、適切な絶縁物質である。絶縁層は、ポリマー溶液からの溶媒溜去により形成され得る。塗布後に固化する液体（例えば、ワニス）もまた用いられ得る。或いは、架橋可能なポリマー溶液（例えば、熱若しくはＵＶに曝すことにより架橋されるか、又は２成分の架橋可能な系の活性部分を一緒に混合することにより架橋される）が用いられ得る。適切な場合には誘電性インクもまた用いられ、絶縁層を形成し得る。代替的実施形態では、絶縁層がデバイスに積層される（例えば、熱的に積層される）。
【００７８】
電気化学的セルの電極は、任意の適切な手段で、必要とされる任意の測定器具に接続され得る。典型的には、電極は、それ自体が上記必要とされる測定器具に接続されるか又は接続され得る導電性トラックに接続されるであろう。
【００７９】
必要とされる試薬は、典型的には、図１の７に描写されるように容器の内部に含まれる。典型的には、試薬は、単一の試薬混合物の形態であり、液状形態で容器に挿入され、その後に乾燥され、組成物が固定化するのを促進する。好ましくは、試薬混合物は凍結乾燥される。試料の容器への導入の時、乾燥された物質は再懸濁され、試薬及び試料を含有する液体を形成し、当該液体は、容器の壁部に位置する作用電極と接触する。上記液体はまた、典型的には基準電極及び対電極（３電極系）又は偽基準電極（２電極系）と接触する。従って、電圧をセルに印加する時、電気化学的反応が生じ得、測定可能な反応（例えば、電流）が生み出され得る。典型的には、膜が容器上に存在する場合、ウェットアップ時間が提供され、その後、電圧が印加され、乾燥された物質の再懸濁を可能にする。明らかに、ウェットアップ時間は、用いられる特定のデバイスに依存するであろう。正確なウェットアップ時間は、従って、本発明の重要な特徴ではない。単に例として、２０秒のウェットアップ時間、又は１秒〜５分のウェットアップ時間が言及され得る。
【００８０】
容器は、例えば、一以上の小さな通気孔を、底部又は壁部に含み得る（図１には描写せず）。これらの孔により、試料が容器に入るとき、空気が当該容器から漏れることが可能になる。このような通気孔が存在しない場合、試料が開口端越しに流れるときには当該試料が容器に入らない可能性があるか、又は困難を伴わずには当該試料が当該容器に入らない可能性がある。通気孔は、典型的には、キャピラリー寸法を有し、例えば、通気孔は、およそ１〜６００μｍ（例えば１００〜５００μｍ）の直径を有し得る。試料が表面張力に起因して通気孔を通って容器を離れることが実質的に妨害されるように、通気孔は、十分に小さいものであるべきである。例として、１個〜４個の通気孔が存在し得る。
【００８１】
セルは、必要に応じて、作用電極及び基準電極に加えて、別個の対電極を備え得る。対電極を作製するのに適切な物質は、当業者に知られているだろう。Ａｇ／ＡｇＣｌは、適切な物質の例である。
【００８２】
代替的な電気化学的セルが、図２に描写される。この実施形態は、以下に記載の点を除き、図１で描かれ、上に記載されたものと同一である。この実施形態では、デバイスは、ストリップＳを備える。ストリップＳは、任意の形状及び大きさを有し得るが、典型的には、実質的に平坦な第一の表面６１、６２を有する。ストリップは、底部１及び壁部２により規定された容器１０を含む。デバイスは、更に、容器の壁部に作用電極５を有する電気化学的セルを備える。作用電極は、典型的には、微小電極である。
【００８３】
この実施形態のデバイスは、基準電極として作用しかつ対電極としても作用する偽基準電極を備える。或いは、別個の対電極及び基準電極が用いられ得る。偽基準（又は基準）電極は、ストリップ６１、６２の第一の表面上に存在する偽基準（又は基準）電極層８を備える。ストリップの第一の表面は、外部表面であり、即ち、それは、デバイスの外側に曝された表面であって、容器の内部に曝された表面ではない。典型的には、偽基準（又は基準）電極層は、実質的に容器又は部分的容器１０を囲繞する。図２に描写されるように、偽基準（又は基準）電極層が第一の開口部３の周囲と接触しないことが好ましい。典型的には、偽基準（又は基準）電極層は、第一の開口部の周囲から、少なくとも０．１ｍｍ、好ましくは少なくとも０．２ｍｍの距離にある。偽基準電極（又は基準）電極の少なくとも一部は、しかしながら、第一の開口部の周囲から、典型的には、５ｍｍ以下、例えば、２ｍｍ以下、例えば、１ｍｍ若しくは０．５ｍｍ以下、好ましくは０．４ｍｍ以下である。一実施形態では、偽基準電極（又は基準）電極は、容器又は部分的容器を、第一の開口部の周囲から０．０１〜１．０ｍｍ（例えば０．１〜０．５ｍｍ、又は０．２〜０．４ｍｍ）の距離で、実質的に囲繞する。或いは、この距離は、０．０１〜０．３ｍｍ又は０．４〜０．７ｍｍ又は０．４〜０．８ｍｍであり得る。
【００８４】
偽基準（又は基準）電極の厚さは、典型的には、作用電極の厚さと同程度であるか、又はそれよりも大きい。適切な厚さ最小値は、０．１μｍであり、例えば、０．５、１、５又は１０μｍである。適切な厚さ最大値は、５０μｍであり、例えば、２０又は１５μｍである。
【００８５】
偽基準（基準）電極８は、典型的には、作用電極５の表面積と同程度の（若しくは作用電極５の表面積よりも小さい）大きさの表面積又は作用電極５の表面積よりも大きい表面積（例えば、実質的に作用電極５の表面積よりも大きい表面積）を有する。典型的には、偽基準（又は基準）電極の表面積と作用電極の表面積との比は、少なくとも１：１（例えば、少なくとも２：１又は少なくとも３：１）、好ましくは少なくとも４：１である。偽基準（又は基準）電極は、例えば、マクロ電極であり得る。偽基準（又は基準）電極の表面積と作用電極の表面積との比が１：１より大きい場合、このことにより、偽基準（又は基準）電極で生ずる電気化学的反応が限流（ｃｕｒｒｅｎｔ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）でないことの保証が容易になる。偽基準（又は基準）電極の実際の面積は、例えば、０．００１ｍｍ２〜１００ｍｍ２又は０．０１ｍｍ２〜６０ｍｍ２（例えば０．１ｍｍ２〜５０ｍｍ２）である。
【００８６】
膜４は、任意の適切な付着手段９により（例えば、両面接着テープを用いて）、デバイスに付着され得る。典型的には、上記付着手段により、膜は、ストリップの第一の表面に、又は偽基準（若しくは基準）電極層に付着される。図２に描写される好ましい実施形態では、膜は、偽基準（又は基準）電極層８に、容器自体の周辺から離れた位置で付着される。更に、接着手段は、偽基準（又は基準）電極層からよりも容器の第一の開口部３から大きな距離にあり、その結果、容器に近接するか又はこれを囲繞する、偽基準（又は基準）電極層の表面の少なくとも一部は、膜を通過した試料に曝される。好ましくは、付着手段は、容器の周囲から、少なくとも０．２ｍｍ（例えば、少なくとも０．３ｍｍ又は少なくとも０．４ｍｍ）にある。
【００８７】
図２で描写された実施形態では、反応容量は、容器の底部１及び壁部２、ストリップ６１、６２の表面の一部、偽基準（又は基準）電極層８、付着手段９並びに膜４により規定される。この反応容量は、容器の容量、偽基準（又は基準）電極層の位置及び厚さ並びに付着手段９の位置及び厚さを変化させることにより変動し得る。好ましい反応容量は、少なくとも０．０５μｌ（例えば、少なくとも０．１μｌ又は０．２μｌ）である。反応容量が２５μｌ以下、好ましくは５μｌ以下（例えば、２μｌ以下又は１μｌ以下）であることが更に好ましい。典型的な反応容量は、約０．８μｌである。
【００８８】
図１及び図２に描写されたデバイスは、底部１を有する容器を備える。本発明の代替的な実施形態では、底部１は、存在しなくてもよく、その結果、第二の開口部が１に位置する。この実施形態では、デバイスは、部分的容器を備える。必要に応じて、透過性又は半透過性の膜（例えば、通気性ある疎水性膜（例えば、Ｐａｌｌ  ＦｉｌｔｒａｔｉｏｎによるＰａｌｌ  Ｖｅｒｓａｐｏｒ））が第二の開口部の上に置かれる。
【００８９】
本発明のデバイスにおいて用いられ得る電気化学的セルに関する更なる詳細が、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０５／００２５５７に見出され得る。この出願の内容は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００９０】
本発明のデバイスは、好ましくは、二以上（例えば、三又は四）の電気化学的セルを備える。四つの電気化学的セル１０をストリップＳ上に有する、この型のデバイスは、図３に描写される。各セルは、作用電極を備え、更に対電極を備え得る。好ましくは、図３に描写されるように、偽基準電極物質５の単一層が、ストリップ６１、６２の表面に提供され、各容器を囲繞し、ブランク領域１３が容器の周囲と偽基準電極層の縁部との間にあるようにする。電極は、導電性トラック１２を介して、必要とされる器具に接続される。
【００９１】
本発明のこの実施形態により、多くの測定を同時に取得することが可能になる。この実施形態の好ましい態様では、３つのセルが、上に記載された、第一、第二及び第三の試薬混合物に対応する試薬混合物を含む。第四のセルは、典型的にはコントロールセルである。コントロールセルは、トリグリセリド又はコレステロールに反応性である酵素試薬を含まず、典型的には上に記載されたコントロール連の試薬を含む。従って、コントロールセルの存在により、ユーザーは得られた結果を補正し、妨害物質に起因する誤差を低減又は排除することができる。
【００９２】
本発明のキットは、電気化学的セルを含むストリップＳ（例えば、図２に描写され、かつ上に記載されたもの）及び電子ユニット（例えば、手持ち式の携帯可能な電子ユニット）であって、ストリップＳとの電気的接触を形成し得るものを含む。電子ユニットは、例えば、電位を電極に提供するための電源、並びに電気化学的反応を検出するための測定器具及び必要とされる他の任意の測定器具を収容し得る。電子ユニットはまた、ＬＤＬコレステロール含有量を決定するための計算機を含み得る。一以上のこれらの系は、コンピュータープログラムにより作動され得る。
【００９３】
本発明のデバイスは、二つの絶縁物質の層の間に作用電極物質の層（例えば、黒鉛の層）を含む積層構造を形成することにより生産され得る。次いで、孔（又はいくつかの電気化学的セルが必要とされる場合には、いくつかの孔）がこの積層体を通してパンチされ（又はドリルされるか又はカットされ）、こうして容器の壁部を形成する。次いで、必要に応じて対電極を含む底部が、付加される。或いは、対電極は、容器の開口部を囲繞するか又はこれに近接する絶縁物質上の適切な物質の層に印刷することにより、提供され得る。容器の底部又は壁部に通気孔が望まれる場合には、これは任意の適切な技術により（例えば、孔をドリル若しくはパンチすることにより、又は底部として空気透過性膜を用いることにより）、形成され得る。図１及び図２に描写されたセルを生産するためのプロセスに関する全詳細は、上に言及された国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０５／００２５５７より得られ得る。
【００９４】
本発明のデバイスは、試料をデバイスに提供し、当該試料が試薬混合物と接触するのを可能にすることにより作動される。図３に描写された実施形態のデバイスは、望ましくは４つの電気化学的セルの全てを、小面積内に（例えば、約１ｃｍ２内に）含み、その結果、４つの電気化学的セルの全てが、少量の試料（例えば、一滴の血液）を提供することにより濡らされる。典型的には、ウェットアップ時間（単に例としては、ほぼ２０秒のウェットアップ時間）が提供され、試薬混合物が、試料中で溶解／懸濁されるのを可能にし、反応を生じさせる。試料／試薬混合物は、電気化学的反応が作用電極で生じ得るように、各セルにおいてこの電極と電気的に接触すべきである。
【００９５】
次いで、電位が各セルに印加され、典型的には、生じた電流が測定される。典型的には、電位は、反応のための適切な時間をおいた後に印加される。実際は、このような時間は、商業的なデバイスに適切であるように選択される。従って、決して限定されないが、典型的には、電位は、例えば、試料のデバイスへの提供後最大５分又は最大３分の時間の後に印加される。この期間は、好ましくは１秒〜１８０秒又は１０秒〜１８０秒（例えば、最大９０秒）、例えば１５秒〜１分、１５秒〜３０秒又はほぼ２０秒である。この好ましい範囲内の期間の使用は、ＨＤＬコレステロール試験が含まれる場合には、特に重要であり得る。短い時間枠の使用は、ＨＤＬに結合したコレステロールのみが測定により検出されることを保証する助けとなる。より長い期間が用いられる場合、非ＨＤＬリポタンパク質（例えば、ＬＤＬ）に結合した一部のコレステロールもまた反応し得、ＨＤＬ−コレステロール含有量の不正確な測定に繋がる。
【００９６】
典型的には、作用電極で検出されるはずの生成物がＲｕ（ＩＩ）である場合、セルに印加される電位は、−０．３〜０．３Ｖ（例えば、−０．１〜−０．３Ｖ又は０．１〜０．３Ｖ）である。検出されるはずの生成物がＲｕ（ＩＩＩ）である場合、セルに印加される電位は、−０．４Ｖ以下（例えば、−０．４〜−０．６Ｖ）であり得る。好ましくは、印加される電位は、０．１５Ｖ及び−０．４５Ｖである。好ましくは、セルに印加される電位は、０．１〜０．３Ｖであり、好ましくは、印加される電位は０．１５Ｖである。（本明細書中で言及される全ての電圧は、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対して値を付けられる）。好ましい実施形態では、電位はまず、正の印加電位（例えば、０．１〜０．２Ｖ）に、０．１〜１０秒の期間、より好ましくは１〜４秒の期間（例えば約１秒）にわたり、ステップされ、次いで、−０．４〜−０．６Ｖの負の印加電位に、第一の電位ステップで用いられた時間と等しい時間（例えば、更に１秒）にわたり、ステップされる。二つの電位ステップの使用により、電極汚れ（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｆｏｕｌｉｎｇ）についての補正及び電極面積の変化の最小化が、ＷＯ  ０３／０９７８６０（本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されているように、可能になる。異なる酸化還元剤が用いられる場合、印加される電位は、酸化／還元ピークが生ずる電位に従って変動し得る。
【実施例】
【００９７】
（実施例１）
底部１が膜（Ｐａｌｌ  Ｖｅｒｓａｐｏｒ）により形成された、図２に描写された４つの電気化学的セルを有する、図３に描写された型のデバイスを用いる。作用電極は炭素電極であり、偽基準電極はＡｇ／ＡｇＣｌ電極である。各セルの容積は、壁部、底部、接着剤及び膜４の底部表面により規定され、ほぼ０．８μｌである。試薬混合物を、各セルに挿入し、凍結乾燥し、その後、Ｗｈａｔｍａｎ  ＶＦ２膜をデバイスに４で付着させる。
【００９８】
用いる試薬混合物は、以下の通りである。試薬混合物のバッチは、以下に明記した割合を用いて、前もって作製する。
【００９９】
総コレステロール試験（０．６μｌを電気化学的セルに挿入）
０．１Ｍ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ９）
０．０５Ｍ  硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）
５％ｗ／ｖ  Ｓｉｇｍａ  ＣＨＡＰＳ
５％  Ｓｏｌｔｅｃ  ＶｅｎｔｕｒｅｓデオキシｂｉｇＣＨＡＰ
５％ｗ／ｖ  グリシン
１％ｗ／ｖ  イノシトール
１％ｗ／ｖ  エクトイン
８０ｍＭ  ヘキサミンルテニウム（ＩＩＩ）クロリド（Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３）
８．８ｍＭ  チオ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
４．２ｍｇ／ｍｌ  プチダレドキシン還元酵素（ＰｄＲ）、（活性８．６ｕ／ｍｇ）
３．３ｍｇ／ｍｌ  コレステロールエステラーゼ（ＣｈＥ）（活性１３６ｕ／ｍｇ）
６６ｍｇ／ｍｌ  コレステロールデヒドロゲナーゼ（ＣｈＤＨ）活性３９ｕ／ｍｇ）
【０１００】
トリグリセリド試験（０．７μｌを電気化学的セルに挿入）
０．１Ｍ  ＨＥＰＢＳ緩衝液（ｐＨ９）
０．０１Ｍ  塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）
１％ｗ／ｖ  Ｓｉｇｍａ  ＣＨＡＰＳ
１０％ｗ／ｖ  グリシン
１％ｗ／ｖ  エクトイン
８０ｍＭ  ヘキサミンルテニウム（ＩＩＩ）クロリド（Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３）
１７．６ｍＭ  チオ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
６．５ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ（活性１０ｕ／ｍｇ）
４５ｍｇ／ｍｌ  グリセロールデヒドロゲナーゼ（活性９０ｕ／ｍｇ）
１００ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ（活性３４ｕ／ｍｇ）
【０１０１】
ＨＤＬコレステロール試験(０．３μlを電気化学的セルに挿入)
０．１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８）
２％  ＭｇＣｌ２
２％  Ｂ６６
３％  グリシン
１％  ラクチトール
ラクトース  １％
１％  ヒドロキシエクトイン
２０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３
５ｍＭ  ＴＮＡＤ
６ｍｇ／ｍｌ  ＰｄＲ
１０ｍｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｐａｓｅ
ＣｈＤＨ  ２０ｍｇ／ｍｌ
【０１０２】
ブランク（０．６μｌを電気化学的セルに挿入）
０．１Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９）
０．０１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ
１％ｗ／ｖ  Ｓｉｇｍａ  ＣＨＡＰＳ
１０％ｗ／ｖ  グリシン
１％ｗ／ｖ  エクトイン
８０ｍＭ  ヘキサミンルテニウム（ＩＩＩ）クロリド（Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３）
１７．６ｍＭ  ＴＮＡＤ
６．５ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ（活性１０ｕ／ｍｇ）
４．２ｍｇ／ｍｌ  プチダレドキシン還元酵素（活性８．６ｕ／ｍｇ）
【０１０３】
未知のコレステロール含有量を有する多くの標本を、一連の実験でデバイスに供給する。２０秒のウェットアップ期間を経過させ、試料中の試薬の取り込み及び試薬と試料との間の反応を可能にする。次いで、＋０．１５Ｖの電位を、各セルに１秒間印加し、続いて、更に１秒間、−０．４５Ｖの電位を印加する。電流を測定し、総コレステロール、トリグリセリド又はＨＤＬコレステロールの量をそれぞれ計算する。
【０１０４】
（実施例２乃至１３）
実施例２乃至１３に用いた解析
Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＰＥＳ）ソフトウェア（Ｅｃｏ  Ｃｈｅｍｉｅ）ソフトウェアからの出力を、Ｓｐａｃｅ解析機から得られた適切な分析物（例えば、総コレステロール、トリグリセリド、脱脂血清（ｄｉｌｉｐｉｄａｔｅｄ  ｓｅｒｕｍ））の濃度を用いて解析した。各試料の読み取りの精度（％ＣＶ）を、式：
【０１０５】
【数２】
2009520974.tif 000007
【０１０６】
を用いたテンプレートで算出した。
ＳｔＤｅｖは、所定の試料からの結果の標準偏差であり、平均は、平均値である。
【０１０７】
総コレステロール試験
（実施例２）
種々の界面活性物質で調製した凍結乾燥センサー
いくつかの実験を、多くの異なる界面活性物質を有する、同一のベーシック酵素ミックスを用いて行った。ベーシック酵素ミックス分注用混合物は、以下のようにして調製した。ＭｇＳＯ４、グリシン、ミオ−イノシトール、エクトインを含有するＴｒｉｓ緩衝液を用いて、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３及びチオ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）、プチダレドキシン還元酵素（ＰｄＲ）、コレステロールエステラーゼ（ＣｈＥ）、界面活性物質を含有する溶液を作製し、この溶液を次に用いてコレステロールデヒドロゲナーゼ（ＣｈＤＨ）を含有する単一の溶液を作製した。
【０１０８】
最終ミックス中のおよその濃度：
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ９．０）
５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４
５％ｗ／ｖ  グリシン
１％ｗ／ｖ  ミオ−イノシトール
１％ｗ／ｖ  エクトイン
％の変動する界面活性物質（以下を参照のこと）
８０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３（７．５％  ＤＢＣの場合、ルテニウム濃度は４０ｍＭであった）
８．８ｍＭ  ＴＮＡＤ
４．２ｍｇ／ｍｌ  ＰｄＲ
３．３ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＥ
１００ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＤＨ
【０１０９】
最終分注用混合物中の試験した界面活性物質の濃度：
界面活性物質なし
５％  ＣＨＡＰＳ
５％  ＣＨＡＰＳＯ
５％  グルコデオキシコール酸
１０％  ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ）
７．５％  ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ）
９％  ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ）：１％  ＣＨＡＰＳ
７．５％  ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ）：２．５％  ＣＨＡＰＳ
５％  ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ）：５％  ＣＨＡＰＳ
２．５％  ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ）：７．５％  ＣＨＡＰＳ
１０％  ＣＨＡＰＳ
【０１１０】
凍結乾燥センサー：
上の混合物の０．６μｌアリコートを、手でウェルごとに分注した。分注するとすぐにセンサー中の溶液を凍結乾燥した。スクリーン印刷型センサー（ｓｃｒｅｅｎ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｓｅｎｓｏｒ）は、レーザードリルしたウェルを有していた。
【０１１１】
標準的な電気化学的試験プロトコール：
Ａｒｃａｒｅ両面接着テープ（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及びＰｅｔｅｘ延展膜（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いてセンサーを調製した。試料のアリコート（５μｌ）を、センサーごとにアプライした。用いた試料は、匿名化した血漿試料だった。センサーを、ＧＰＥＳソフトウェアにより制御されたマルチプレクサ（ＭＸ４５２、Ｓｔｅｒｎｈａｇｅｎ  Ｄｅｓｉｇｎ）に取り付けられたＡｕｔｏｌａｂ  ＰＧＳＴＡＴ  １２（Ｅｃｏ  Ｃｈｅｍｉｅ）を用いたクロノアンペロメトリーにより試験した。Ｔ＝０秒に、クロノアンペロメトリー試験を、Ａｕｔｏｌａｂに取り付けられたマルチプレクサを用いて開始した。反復酸化（５）を＋０．１５Ｖで１秒間行った。酸化の間には３０秒の遅延があり、この遅延により、ほぼ０、３０、６０、９０及び１２０秒で酸化が生じた。１秒での過渡電流値のデータを解析した。次いで、分析物濃度に対する電流の較正プロットを得るために、ある範囲の総コレステロール濃度を有する幾つかの異なる血漿試料に対して、この手順を反復した。種々のヒト血漿試料に関する総コレステロール濃度に対する酸化電流の、典型的な較正プロット（７．５％ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ）：２．５％  ＣＨＡＰＳを総コレステロールセンサーにおける界面活性物質として用いた）の例を、図４に示す。結果は、表１に示す。
【０１１２】
【表１】
2009520974.tif 000008
【０１１３】
（実施例３）
いくつかの実験を、同一のベーシック酵素ミックスを用いて行ったが、タウロコール酸（ＴＣ）のパーセンテージを変えて行った。ベーシック酵素ミックス分注用混合物を、以下のようにして調製した。ＭｇＳＯ４、マンニトールを含有するＨＥＰＢＳ緩衝液を用いて、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３及びＴＮＡＤ、ＰｄＲ、ＣｈＥ、界面活性物質を含有する溶液を作製し、この溶液を次に用いて、ＣｈＤＨを含有する単一の溶液を作製した。コレステロールエステラーゼの代わりにリパーゼを用いてリポタンパク質を破壊した。
【０１１４】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４
２．５％ｗ／ｖ  マンニトール
％の変動する界面活性物質（以下を参照のこと）
８０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３
１３．３ｍＭ  ＮＡＤ
１１．１ｍｇ／ｍｌ  ＰｄＲ
２０ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ
２００ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＤＨ
【０１１５】
最終分注用混合物中の試験した界面活性物質の濃度：
１％  タウロコール酸
５％  タウロコール酸
７．５％  タウロコール酸
１０％  タウロコール酸
１２．５％  タウロコール酸
１５％  タウロコール酸
【０１１６】
上記混合物のアリコート（０．３μｌ）をウェルごとに手で分注し、実施例２に記載のようにして凍結乾燥した。スクリーン印刷型センサーには、レーザードリルしたウェルがあった。
【０１１７】
センサーを、実施例２において記載されている標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述されているようにして試験した。結果を表２に示す。
【０１１８】
【表２−１】
2009520974.tif 000009
【０１１９】
【表２−２】
2009520974.tif 000010
【０１２０】
エステラーゼ（実施例２）及びリパーゼ（実施例３）の結果を、以下の表３において比較する。
【０１２１】
【表３】
2009520974.tif 000011
【０１２２】
（実施例４）
代替的な酸化還元剤
（ｉ）Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）
酵素ミックス分注用混合物を、以下のように調製した。グリシン、ＭｇＳＯ４、ミオ−イノシトール、エクトイン、ＣＨＡＰＳ、デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有するＴｒｉｓ緩衝液を用いて、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）、ＴＮＡＤ、ＰｄＲ、ＣｈＥ及びＣｈＤＨを含有する最終溶液を作製した。
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４
７００ｍＭ  グリシン
６０ｍＭ  ミオ−イノシトール
７０ｍＭ  エクトイン
８２ｍＭ  ＣＨＡＰＳ
５８ｍＭ  デオキシｂｉｇＣＨＡＰ
５０ｍＭ  Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）
９ｍＭ  ＴＮＡＤ
４ｍｇ／ｍｌ  ＰｄＲ
３．５ｍｇ／ｍｌ  コレステロールエステラーゼ
６５ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＤＨ
【０１２３】
上記混合物（０．３μｌ）を、各センサーに分注して凍結乾燥し、その後、ヒト血漿試料を用いて試験した。
センサーを、実施例２において記載されている標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述されているようにして試験した。典型的な較正プロットを図５に示す。図５は、種々のヒト血漿試料の総コレステロール濃度に対する酸化電流の較正プロット（Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］及び５％  ＣＨＡＰＳを総コレステロールセンサー中で、１４８．０ｎＡ／ｍＭのグラジエントで用いた）を示す。結果を表４に示す。
【０１２４】
（ｉｉ）フェリシアン化カリウム
酵素ミックス分注用混合物を、以下のようにして調製した。グリシン、ミオ−イノシトール、エクトイン、ＣＨＡＰＳ、デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有するＴｒｉｓ緩衝液を用いて、フェリシアン化カリウム、ＴＮＡＤ、ＰｄＲ、ＣｈＥ及びＣｈＤＨを含有する最終溶液を作製した。
【０１２５】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）
１７０ｍＭ  グリシン
１４ｍＭ  ミオ−イノシトール
１８ｍＭ  エクトイン
２０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ
３８ｍＭ  デオキシＢｉｇＣＨＡＰ
７５ｍＭ  フェリシアン化カリウム
９ｍＭ  ＴＮＡＤ
４ｍｇ／ｍｌ  ＰｄＲ
３．３ｍｇ／ｍｌ  コレステロールエステラーゼ
６６ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＤＨ
【０１２６】
上記混合物（０．３μｌ）を、各センサーに分注して凍結乾燥し、その後、ヒト血漿試料で試験した。
【０１２７】
センサーを、実施例１において記載されている標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述されているようにして試験した。結果を表４に示す。
【０１２８】
【表４】
2009520974.tif 000012
【０１２９】
（実施例５）
補酵素誘導体
（ｉ）ＴＮＡＤで調製した、凍結乾燥した総コレステロールセンサー
ＭｇＳＯ４及びマンニトールを含有するＴｒｉｓ緩衝液を用いて、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３及びＴＮＡＤ、ＰｄＲ、ＣｈＥ、タウロコール酸ナトリウムを含有する溶液を作製し、この溶液を次に用いて、ＣｈＤＨを含有する単一の溶液を作製した。
【０１３０】
０．３μｌアリコートの溶液をウェルごとに分注し、凍結乾燥した。
【０１３１】
Ａｒｃａｒｅ接着テープ及びＰｅｔｅｘ延展膜をセンサーに適用した。センサーを解凍血漿試料で試験した。脱脂血清（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ  ｓｅｒｕｍ）試料（Ｓｃｉｐａｃ）もまた試験した。ピペットを用いて各センサーにアプライした試料の容積は、５μｌであった。センサーを、Ａｕｔｏｌａｂ（ＰＧＳＴＡＴ  １２）及びマルチプレクサ（ＭＸ４５２、Ｓｔｅｒｎｈａｇｅｎ  Ｄｅｓｉｇｎ）を用いてクロノアンペロメトリーにより試験した。Ｔ＝０秒で、クロノアンペロメトリー試験を、Ａｕｔｏｌａｂに取り付けたマルチプレクサを用いて開始した。酸化電流は、＋０．１５Ｖで１秒間測定し、続いて還元電流を−０．４５Ｖで１秒間測定した。１秒での過渡電流値のデータを解析した。結果を表５に示す。
【０１３２】
（ｉｉ）ＴＮＡＤＫ＋で調製した凍結乾燥したセンサー
ベーシック酵素ミックスを以下のようにして調製した：
ＭｇＳＯ４、グリシン、ミオ−イノシトール、エクトイン、ＣＨＡＰＳ、デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有するＴｒｉｓ緩衝液を用いて、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、ＰｄＲ、ＣｈＥ、ＣｈＤＨを含有する溶液；及びＴＮＡＤＫ＋を含有する溶液の二種の溶液を作製し、次にこれらの溶液を合わせた。
【０１３３】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）
５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４
５％ｗ／ｖ  グリシン
１％ｗ／ｖ  ミオ−イノシトール
１％ｗ／ｖ  エクトイン
５％ｗ／ｖ  Ｃｈａｐｓ
５％ｗ／ｖ  デオキシｂｉｇＣＨＡＰ
８０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３
８．８ｍＭ  ＴＮＡＤＫ＋
４．２ｍｇ／ｍｌ  ＰｄＲ
３．３ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＥ
６６ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＤＨ
【０１３４】
凍結乾燥センサー：
０．４μｌアリコートをウェルごとに手で分注した。分注するとすぐにセンサー中の溶液を凍結乾燥させた。スクリーン印刷型センサーには、レーザードリルしたウェルがあった。
【０１３５】
センサーを、実施例２において記載された標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述したようにして試験した。酸化電流は、１４０秒の期間、１１の連続した時間間隔で、＋０．１５Ｖで１秒間測定し、続いて還元電流を−０．４５Ｖで１秒間測定した。酸化の間には１４秒の遅延があり、この遅延により、ほぼ０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６及び１４０秒で酸化が生じた。１秒での過渡電流値のデータを解析した。図６は、種々のヒト血清試料の総コレステロール濃度に対する酸化電流の較正プロットを示す。結果を表５に示す。
【０１３６】
【表５】
2009520974.tif 000013
【０１３７】
（実施例６）
臨床試験
酵素ミックス分注用混合物を、以下のようにして調製した。
ＭｇＳＯ４、グリシン、ミオ−イノシトール、エクトイン、ＣＨＡＰＳ、デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有するＴｒｉｓ緩衝液を用いて、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、ＴＮＡＤ、ＰｄＲ、ＣｈＥ及びＣｈＤＨ（ゼラチンフリー）を含有する溶液を作製した。
【０１３８】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４
５％ｗ／ｖ  グリシン
１％ｗ／ｖ  ミオ−イノシトール
１％ｗ／ｖ  エクトイン
３％ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ
３％ｗ／ｖ  デオキシｂｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ）
８０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３
８．８ｍＭ  ＴＮＡＤ
４．２ｍｇ／ｍｌ  ＰｄＲ
３．４ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＥ
６６．７ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＤＨ
【０１３９】
０．６μｌアリコートをウェルごとに手で分注した。分注するとすぐにセンサー中の溶液を凍結乾燥した。スクリーン印刷型センサーには、レーザードリルしたウェルがあった。
【０１４０】
センサーを、実施例２において記載されている標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述されているようにして試験した。
【０１４１】
公知の、臨床的に用いられかつ認可された方法との比較のために、同一の試料をＲａｎｄｏｘ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ解析機を用いて同時に試験した。結果を図７に示す。この結果は、本発明のセンサーを用いて得られた総コレステロール濃度と典型的な総コレステロール基準法（Ｒａｎｄｏｘ）を用いて測定した総コレステロール濃度との比較である。
【０１４２】
トリグリセリド試験
（実施例７）
種々の胆汁酸塩を用いた凍結乾燥トリグリセリドセンサー
酵素ミックスの調製：
ＮＨ４Ｃｌ、グリシン、エクトイン、界面活性物質、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３を含有するＨＥＰＢＳ緩衝液を用いて、ＴＮＡＤ、ジアホラーゼ、リパーゼを含有する溶液を作製し、この溶液を次に、上述の緩衝溶液と一緒に用いて、ＧｌｙＤＨを含有する単一溶液を作製した。
【０１４３】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ
１０％ｗ／ｖ  グリシン
１％ｗ／ｖ  エクトイン
１％  ＣＨＡＰＳ又はＮａＴＣ
８０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３
１８ｍＭ  ＴＮＡＤ
６．６ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ
４５ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｙＤＨ
１００ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ
【０１４４】
０．６μｌアリコートの酵素ミックスをウェルごとに分注した。分注するとすぐにセンサー中の溶液を凍結乾燥した。スクリーン印刷型センサーには、レーザードリルしたウェルがあった。
【０１４５】
センサーを、実施例２において記載されている標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述されているようにして試験した。種々のヒト血漿試料のトリグリセリド（ＴＲＧ）濃度に対する酸化電流の典型的な較正プロット（ＴＲＧセンサーにおいて１％のＮａＴＣを用いた）を図８に示す。結果を表６に示す。
【０１４６】
【表６】
2009520974.tif 000014
【０１４７】
（実施例８）
種々の濃度のＣＨＡＰＳを用いた分光試験
いくつかの実験を、同一のベーシック酵素ミックスを用いて遂行したが、用いたＣＨＡＰＳ濃度を変えた。ベーシック酵素ミックスは、以下の通りにして調製した：
【０１４８】
ＮＨ４Ｃｌ、エクトイン、％ｗ／ｖが変動するＣＨＡＰＳを含有するＨＥＰＢＳ緩衝液を用いて、フェリシアン化カリウム及びＮＡＤ、リパーゼ、ジアホラーゼを含有する溶液を作製し、この溶液を次に、上述の緩衝溶液と一緒に用いて、ＧｌｙＤＨを含有する単一の溶液を作製した。
【０１４９】
血漿の添加後のおよその濃度：
５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、０．０５Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
０．５％  エクトイン
０．５％又は１％  ＣＨＡＰＳ
４ｍＭ  フェリシアン化カリウム
１．５ｍｇ／ｍｌ  ＮＡＤ
５．６ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｙＤＨ
０．８ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ
１２．５ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ
【０１５０】
酵素混合物（各５０μｌ）を、血漿（５０μｌ）の添加により試験した。フェリシアン化物の吸光度の変化の速度は、Ｂｉｏｔｅｋプレート読み取り機で、４０５ｎｍ、動態周期（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｙｃｌｅ）、読み取りの間に５秒のタイムラグで５０回反復して測定した。結果を図９に示す。図９は、ＣＨＡＰＳ濃度に関する、トリグリセリド（ＴＲＧ）反応の完了の経時的なパーセンテージのプロットである。
【０１５１】
（実施例９）
代替的な酸化還元剤
酵素ミックス分注用混合物を、以下のようにして調製した。グリシン、ＮＨ４Ｃｌ、エクトイン、ＣＨＡＰＳを含有するＴｒｉｓ緩衝液を用いて、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）、ＴＮＡＤ、ジアホラーゼ、リパーゼ及びＧｌｙＤＨを含有する最終溶液を作製した。
【０１５２】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）
１．４Ｍ  グリシン
１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ
７３ｍＭ  エクトイン
１％ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ
２０ｍＭ  Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）
２２ｍＭ  ＴＮＡＤ
８ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ
１００ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ
５４ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｙＤＨ
【０１５３】
０．６μｌアリコートの酵素ミックスをウェルごとに分注した。分注するとすぐにセンサー中の溶液を凍結乾燥した。スクリーン印刷型センサーには、レーザードリルしたウェルがあった。
【０１５４】
センサーを、実施例２において記載されている標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述されているようにして試験した。図１０は、ＴＲＧセンサー中で［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］及び１％ＣＨＡＰＳを用いた、種々のヒト血漿試料のトリグリセリド（ＴＲＧ）濃度に対する酸化電流の典型的な較正プロットを示す。結果を表７に示す。
【０１５５】
【表７】
2009520974.tif 000015
【０１５６】
（実施例１０）
補酵素誘導体
（ｉ）ＮＡＤ及びＮＡＤ類似体を用いた凍結乾燥トリグリセリドセンサーの調製及び試験
ＨＥＰＢＳ緩衝液を用いて、ＮＨ４Ｃｌ、ラクトース、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、ＧｌｙＤＨ及びリパーゼを含有する溶液；ＮａＴＣ及びジアホラーゼを含有する溶液の二種類の溶液を作製し、これらの溶液を次に用いて、種々のＮＡＤ類似体を含有する単一の溶液を作製した。
【０１５７】
試験したＮＡＤ類似体：
ＡＰＡＤ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）。
ＡＨＤ（３−アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）。
ＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）
ＮＨＤ（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）
ＮａＡＤ（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）
ＮＡＤ。
【０１５８】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
９ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ
５％ｗ／ｖ  ラクトース
１％ｗ／ｖ  ＮａＴＣ
９０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３
２０ｍＭ  ＮＡＤ／ＮＡＤ類似体
６．６ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ
４５ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｙＤＨ
５０ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ
【０１５９】
０．３μｌアリコートの酵素ミックスをウェルごとに分注した。用いた電極シートには、パンチされたウェルがあり、カードを凍結乾燥した。
【０１６０】
Ａｒｃａｒｅ接着テープ及びＰｅｔｅｘ延展膜をセンサーに適用した。センサーをグリセロール水溶液（１０ｍＭ）で試験した。このストックグリセロール溶液を水で希釈し、１、３、５、７及び９ｍＭのグリセロール溶液を得た。ピペットを用いて各センサーにアプライした試料の容量は、５μｌであった。センサーを、Ａｕｔｏｌａｂ（ＰＧＳＴＡＴ  １２）及びマルチプレクサ（ＭＸ４５２、Ｓｔｅｒｎｈａｇｅｎ  Ｄｅｓｉｇｎ）を用いたクロノアンペロメトリーにより試験した。Ｔ＝０秒で、クロノアンペロメトリー試験を、Ａｕｔｏｌａｂに取り付けられたマルチプレクサを用いて開始した。酸化電流を＋０．１５Ｖで１秒間測定した。１秒での過渡電流値のデータを解析した。図１１は、ＡＰＡＤ補因子に関する種々のヒト血清試料のトリグリセリド（ＴＲＧ）濃度に対する酸化電流の較正プロットである。結果を表８に示す。
（ｉｉ）ＴＮＡＤＫの使用
ベーシック酵素ミックスを以下のようにして調製した：
ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、ＣＨＡＰＳ、スクロースを含有するＨＥＰＢＳ緩衝液を用いて、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、ジアホラーゼ、リパーゼ、ＧｌｙＤＨを含有する溶液；ＴＮＡＤＫ＋を含有する溶液の二種類の溶液を作製し、これらの溶液を次に合わせて、最終酵素ミックスを作製した。
【０１６１】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
１０ｍＭ  塩化アンモニウム
９％ｗ／ｖ  ＫＣｌ
１％ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ
１％ｗ／ｖ  スクロース
８０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３
１７．６ｍＭ  ＴＮＡＤＫ＋
６．５ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ
１００ｍｇ／ｍｌ  ＣｈＥ
４５ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｙＤＨ
【０１６２】
センサーを、実施例２において記載されている標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述されているようにして試験した。酸化電流を、１４０秒の期間、１１の連続する時間間隔で、＋０．１５Ｖで１秒間測定し、続いて、還元電流を−０．４５Ｖで１秒間測定した。酸化の間には１４秒の遅延があり、この遅延により、ほぼ０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６及び１４０秒で酸化が生じた。１秒での過渡電流値のデータを解析した。結果を表８に示す。
【０１６３】
【表８−１】
2009520974.tif 000016
【０１６４】
【表８−２】
2009520974.tif 000017
【０１６５】
（実施例１１）
臨床試験
酵素ミックス分注用混合物を以下のようにして調製した。
ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、ＣＨＡＰＳ、スクロースを含有するＨＥＰＢＳ緩衝液を用いて、最終酵素ミックスである、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、ジアホラーゼ、リパーゼ、ＧｌｙＤＨ及びＴＮＡＤＫ＋を含有する溶液を作製した。
【０１６６】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
１０ｍＭ  塩化アンモニウム
９％ｗ／ｖ  ＫＣｌ
１％ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ
１％ｗ／ｖ  スクロース
８０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３
１７．６ｍＭ  ＴＮＡＤＫ＋
６．５ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ
１００ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ
４５ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｙＤＨ
【０１６７】
０．６μｌアリコートをウェルごとに手で分注した。分注するとすぐにセンサー中の溶液を凍結乾燥した。スクリーン印刷型センサーには、レーザードリルしたウェルがあった。
【０１６８】
センサーを、実施例２において記載されている標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述されているようにして試験した。但し、センサーはフローセルを備えていた。
【０１６９】
公知の、臨床的に用いられかつ認可された方法との比較のために、同一の試料をＲａｎｄｏｘ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ解析機を用いて同時に試験した。結果を図１２に示す。図１２は、ＯＢセンサーを用いて得られたトリグリセリド（ＴＲＧ）濃度と典型的なＴＲＧ基準法（Ｒａｎｄｏｘ）を用いて測定されたトリグリセリド濃度との比較を示す。
【０１７０】
（実施例１２）
ＴＮＡＤ及びＧｅｎｚｙｍｅリパーゼ又は標準的なＴｏｙｏｂｏリパーゼのいずれかを用いた凍結乾燥トリグリセリドセンサーの調製及び試験
ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、ＣＨＡＰＳ及びスクロースを含有するＨＥＰＢＳ緩衝液を用いて、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、ＴＮＡＤ、ＧｌｙＤＨ及びリパーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ又はＧｅｎｚｙｍｅのいずれかからのもの）を含有する二種の溶液を作製した。これらの溶液を次に混合し、最終酵素ミックス溶液を得た。
【０１７１】
最終ミックスにおけるおよその濃度：
０．１Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
１０ｍＭ  塩化アンモニウム
９％ｗ／ｖ  ＫＣｌ
１％ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ
１％ｗ／ｖ  スクロース
８０ｍＭ  Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３
１７．６ｍＭ  ＴＮＡＤＫ＋
６．５ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ
１００ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ
４５ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｙＤＨ
【０１７２】
０．３μｌアリコートの酵素ミックスをウェルごとに分注した。分注するとすぐにウェル中の溶液を凍結乾燥した。用いた電極シートには、パンチされたウェルがあった。
【０１７３】
Ａｒｃａｒｅ接着テープ及びＰｅｔｅｘ延展膜をセンサーに適用した。センサーを、解凍血漿試料で試験し、脱脂血清（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ  ｓｅｒｕｍ）（Ｓｃｉｐａｃ）でもまた試験した。ピペットを用いて各センサーにアプライした試料の容量は、５μｌであった。センサーを、ＰＡＲＳＴＡＴポテンショスタット及びマルチプレクサ（ＭＸ４５２、Ｓｔｅｒｎｈａｇｅｎ  Ｄｅｓｉｇｎ）を用いたクロノアンペロメトリーにより試験した。Ｔ＝０秒で、クロノアンペロメトリー試験を、Ａｕｔｏｌａｂに取り付けられたマルチプレクサを用いて開始した。酸化電流を、＋０．１５Ｖで１秒間測定し、続いて、還元電流を−０．４５Ｖで１秒間測定した。１秒での過渡電流値のデータを解析した。結果を表９に示す。
【０１７４】
【表９】
2009520974.tif 000018
【０１７５】
（実施例１３）
（ｉ）ジアホラーゼ対ＰｄＲ電気化学
いくつかの実験を、ＰｄＲ又はジアホラーゼのいずれかを用いる同一のベーシック酵素ミックスを用いて遂行した。ベーシック酵素ミックスは、以下のようにして調製した：
【０１７６】
ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ  スクロース及びＣＨＡＰＳを含有するＨＥＰＢＳ緩衝液を用いて、ＮＡＤ及びフェリシアン化物を含有する溶液；ＧｌｙＤＨを含有する溶液；ＰｄＲ又はジアホラーゼを含有する溶液を作製した。これらの溶液を次に、緩衝溶液と一緒に、リパーゼに添加し、最終酵素ミックスを得た。
【０１７７】
混合物を「濡れている」電極上に分注した。
酵素ミックスを血漿の添加により試験した。
【０１７８】
血漿の添加後のおよその濃度：
５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、０．０５Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
４．５％ｗ／ｖ  ＫＣｌ
０．５％ｗ／ｖ  スクロース
０．５％ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ
４０ｍＭ  ヘキサアンミン（Ｈｅｘａａｍｉｎｅ）ルテニウム
６ｍｇ／ｍｌ  ＮＡＤ
２２．５ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｙＤＨ
３．３ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ又はＰｄＲ
５０ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ
【０１７９】
センサーを、実施例２において記載されている標準的な電気化学的試験プロトコールで詳述されているようにして試験した。但し、酸化電流は、１４０秒の期間、１４秒の連続した時間間隔で、＋０．１５Ｖで１秒間測定した。酸化の間には１４秒の遅延があり、この遅延のために、ほぼ０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６及び１４０秒で酸化が生じた。１秒での過渡電流値のデータを解析した。結果を図１３に示す。図１３は、ジアホラーゼ（Ｄｉａ）又はＰｄＲを有する溶液の平均的な電流を示す。Ｄｉａ又はＰｄＲに続く数字は、血漿試料のＴＲＧ濃度を示す。
【０１８０】
（ｉｉ）ジアホラーゼ／ＰｄＲ分光測定
いくつかの実験を、ジアホラーゼ又はＰｄＲのいずれかを用いた同一のベーシック酵素ミックスを用いて遂行した。ベーシック酵素ミックスを、以下のようにして調製した：
【０１８１】
ＮＨ４Ｃｌ及びＣＨＡＰＳを含有するＨＥＰＢＳ緩衝液を用いて、ＮＡＤ及びフェリシアン化物を含有する溶液；ＧｌｙＤＨを含有する溶液；ＰｄＲ又はジアホラーゼを含有する溶液を作製した。これらの溶液を次に、緩衝溶液と一緒に、リパーゼ又はエステラーゼに添加して、最終酵素ミックスを得た。
【０１８２】
血漿の添加後のおよその濃度：
５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、０．０５Ｍ  ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
０．５％  ＣＨＡＰＳ
４ｍＭ  フェリシアン化カリウム
１．５ｍｇ／ｍｌ  ＮＡＤ
５．６ｍｇ／ｍｌ  ＧｌｙＤＨ
０．８ｍｇ／ｍｌ  ジアホラーゼ又はＰｄＲ
１２．５ｍｇ／ｍｌ  リパーゼ又はエステラーゼ
【０１８３】
酵素混合物（各５０μｌ）を、血漿（５０μｌ）の添加により試験した。フェリシアン化物の吸光度の変化の速度を、Ｂｉｏｔｅｋプレート読み取り機で、４０５ｎｍ、動態周期、読み取りの間に５秒間のタイムラグで５０回反復して測定した。ジアホラーゼ又はＰｄＲとの最初の３０秒間の反応の、フェリシアン化物の吸光度の変化の初期速度（＋／−  ＳＤ）の結果を図１４に示す。
【０１８４】
本発明を、種々の具体的な実施形態及び実施例に関して記載してきた。しかし、本発明はこれらの具体的な実施形態及び実施例に決して限定されないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に従う電気化学的セルを描写する。
【図２】図２は、本発明に従う代替的な電気化学的セルを描写する。
【図３】図３は、複数の電気化学的実験を実行するための、本発明に従うデバイスを描写する。
【図４】図４は、７．５％ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ）：２．５％  ＣＨＡＰＳを総コレステロールセンサー中の界面活性物質として用いた、種々のヒト血漿試料の総コレステロール濃度に対する酸化電流の典型的な較正プロットの例を示す。
【図５】図５は、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］及び５％ＣＨＡＰＳを総コレステロールセンサー中で用いた、種々のヒト血漿試料の総コレステロール濃度に対する酸化電流の較正プロットを示す。
【図６】図６は、種々のヒト血清試料の総コレステロール濃度に対する酸化電流の較正プロットを示す。
【図７】図７は、本発明に従うセンサーを用いて得られた総コレステロール濃度と典型的な総コレステロール基準法（Ｒａｎｄｏｘ）を用いて測定された総コレステロール濃度との比較を示す。
【図８】図８は、１％  ＮａＴＣをＴＲＧセンサー中で用いた、種々のヒト血漿試料のトリグリセリド（ＴＲＧ）濃度に対する酸化電流の典型的な較正プロットを示す。
【図９】図９は、ＣＨＡＰＳ濃度に関する、トリグリセリド（ＴＲＧ）反応の完了の経時的なパーセンテージのプロットを示す。
【図１０】図１０は、［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］及び１％ＣＨＡＰＳをＴＲＧセンサー中で用いた、種々のヒト血漿試料のトリグリセリド（ＴＲＧ）濃度に対する酸化電流の典型的な較正プロットを示す。
【図１１】図１１は、ＡＰＡＤを補因子として用いた、種々のヒト血清試料のトリグリセリド（ＴＲＧ）濃度に対する酸化電流の較正（ｃｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）プロットを示す。
【図１２】図１２は、ＯＢセンサーを用いて得られたトリグリセリド（ＴＲＧ）濃度と典型的なＴＲＧ基準法（Ｒａｎｄｏｘ）を用いて測定されたトリグリセリド濃度との比較を示す。
【図１３】図１３は、ジアホラーゼ（Ｄｉａ）又はＰｄＲを有する溶液の平均電流を示す。Ｄｉａ又はＰｄＲに続く数字は、血漿試料のＴＲＧ濃度を示す。
【図１４】図１４は、ジアホラーゼ又はＰｄＲとの最初の３０秒間の反応の、フェリシアン化物の吸光度の変化の初期速度（＋／−  ＳＤ）の結果を示す。
【図１】
2009520974.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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