(57)【要約】  動物種によらず同一条件で安価かつ簡便に免疫グロブリンを検出または測定することを可能とする化合物、またはそれを用いた免疫ブロブリンの検出方法または測定方法を提供する。  標識剤を含む免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドを用いることにより、動物種によらず同一条件で安価且つ簡便に免疫グロブリンの検出または測定を行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識剤が結合しているペプチド又は標識剤を含むペプチドであって、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有することを特徴とするペプチド。
【請求項２】
上記免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドは、プロテインＡの部分ペプチド、プロテインＧの部分ペプチド、プロテインＨの部分ペプチド、プロテインＭの部分ペプチド、リウマチ因子の部分ペプチド、および補体の部分ペプチドからなる群から選択される、少なくとも１種のペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
上記プロテインＡの部分ペプチド、プロテインＧの部分ペプチド、プロテインＨの部分ペプチド、プロテインＭの部分ペプチド、リウマチ因子の部分ペプチド、および補体の部分ペプチドは、それぞれ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＭ、リウマチ因子および補体の部分ペプチドの改変体を含むことを特徴とする、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
上記免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドは、プロテインＧの部分ペプチドまたは当該部分ペプチドの改変体であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
上記標識剤は、放射性物質、酵素、補酵素、発光性物質、蛍光物質、および蛍光性蛋白からなる群から選択される、少なくとも１種の標識剤であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
上記標識剤は、３５Ｓ放射性標識メチオニン、ＨＲＰ、アルカリフォスフォターゼ、ビオチン、アクリジニウム誘導体、フルオレセイン、およびＧＦＰからなる群から選択される、少なくとも１種の標識剤であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
上記標識剤と上記ペプチドとの結合は、共有結合であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドを用いた免疫グロブリンの検出方法または測定方法。
【請求項９】
上記ペプチドを用いた免疫グロブリンの検出方法または測定方法は、
（ａ）固相に免疫グロブリンを含む溶液を接触させることにより、免疫グロブリンを固相上に直接的または間接的に結合または吸着させる工程と、
（ｂ）固相上に直接的または間接的に結合または吸着した免疫グロブリンに請求項１から７に記載のペプチドを接触させることにより、当該固相上に結合または吸着した免疫グロブリンと当該ペプチドとを結合させる工程と、
（ｃ）当該固相上に結合または吸着した免疫グロブリンに結合した当該ペプチドの量を測定する工程と、
を含むこと特徴とする、請求項８に記載の免疫グロブリンの検出方法または測定方法。
【請求項１０】
免疫グロブリンと接触させる固相に、予め免疫グロブリンと結合する抗原が固定化されていることを特徴とする請求項９に記載の検出方法または測定方法。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドを用いることを特徴とする、免疫グロブリンの検出キットまたは測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物種に関わらず同一条件のもとで安価かつ簡便に試料中の免疫ブロブリンを検出または測定することを可能とするペプチドを提供すること、または上記ペプチドを用いた免疫グロブリンの検出方法または測定方法、並びに上記ペプチドを用いた免疫グロブリンの検出キットまたは測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀に突入し、ヒトゲノム解読の終了が告げられた。これを受けて、免疫グロブリン型医薬（抗体医薬）をはじめ多種多様の医薬品の開発が盛んに行われるようになってきている。現在開発されている免疫グロブリン型医薬のほとんどは免疫グロブリンＧに属するＩｇＧ型抗体である。ＩｇＧ型抗体は特異的に抗原を認識する可変部位のＦａｂ領域と定常部位のＦｃ領域で構成されている。免疫グロブリン型医薬はＩｇＧ型抗体における可変部位の多様性を利用し、ある物質にのみ特異的に結合することにより生理活性を阻害したり、逆に活性を上げたりすることを可能としている。そのため副作用も少ない。【０００３】
免疫グロブリン型医薬の開発においてはまず始めに、抗原に対するスクリーニングなどの利便性の観点から、Ｆａｂ領域とＦｃ領域のすべてがマウスやラットなどヒト以外の動物に由来する免疫グロブリンからスタートする。しかしながら、免疫グロブリンを構成するすべての部位がヒト以外の動物種に由来する完全異種動物化免疫グロブリンである場合、ヒトへの投与の際に異物とみなされ、それに対する免疫グロブリンが産生されるなど、主に安全性の側面で大きな問題が生じることがある。そこで次に、抗原を認識するＦａｂ領域は異種動物由来のままで、定常部位のＦｃ領域はヒト由来に改変した、いわゆるキメラ型免疫グロブリンへ変換させる。それでも尚、安全性に対する問題を払拭することができない場合は、抗原を認識するＦａｂ領域の中でも抗原を認識するより狭い領域、つまり相補性決定領域のみ異種動物由来とし、他のＦａｂ領域とＦｃ領域はすべてヒト化させたヒト化免疫グロブリンへ変換する。最終的にはすべてヒト化させた完全ヒト化免疫グロブリンへと変換することも考えられる。このように完全異種動物化免疫グロブリンからキメラ免疫グロブリン、ヒト化免疫グロブリン、完全ヒト化免疫グロブリンへと変換させたとき、同一抗原であってもその抗原に対する結合の強さは変わってくる。しかしながら、それらの免疫グロブリンは動物種が異なっている、または動物種が混合しているために、同一の条件で抗原に対する結合性を比較することは困難である。さらに動物や細胞などを使ったバイオアッセイは煩雑であると共に定量を行うのは非常に難しく、同一条件で動物種の異なる免疫グロブリンの結合性や活性を測定することはできない。さらにはその結合の強さを絶対的な指標パラメーターで評価することも難しい。【０００４】
一方、特定疾患の診断や難治療性疾患の研究という観点に立って考えてみても、多種多様な免疫グロブリンを同一条件のもと同一の土俵で測定する基盤的テクノロジーが望まれている。一般的に、ある特定の疾患に対して研究を行う場合、または、医薬品などの治療のための研究を行ったりする場合には、その疾患に相当するモデル動物を作成して実験を行う。例えば、自己免疫疾患では自己免疫グロブリンの作用する抗原で免疫し、特異免疫グロブリンを誘発したモデル動物を使用する。しかしながら、作成したモデル動物で基礎的な自己免疫グロブリンの結合性や阻害活性のデータを蓄積した後に、それをヒトに移行する際に大きな障害がある。モデル動物の免疫グロブリンとヒトの免疫グロブリンとは動物種が異なるため同一であっても抗原に対する結合性や活性が異なり、同一条件のもと同一の土俵で免疫グロブリンの測定を行うことができない。そのため、両者の免疫グロブリンの対応付けや比較を行うことができないという大きな問題がある。【０００５】
加えて、特定疾患の診断において体液中の特異的免疫グロブリンを定量する場合、指標のスタンダードとなる他動物の免疫グロブリンと試料サンプルとを同一条件で評価する手法がないために、体液中の特異的免疫グロブリンの抗体価や活性を絶対的な指標パラメーターで置換して評価することは不可能である（非特許文献１および非特許文献２）。【０００６】
これを実現させる化合物として蛍光標識されたプロテインＡやプロテインＧなどがあるが、数万Ｄａのタンパク質であり失活しやすい、扱いが難しい、高価である、など種々の問題が考えられる。【０００７】
上記の理由から、動物種を問わず試料中の多種の免疫グロブリンを同一条件で安価且つ簡易に検出または測定することを可能とする化合物、または上記化合物を用いた免疫グロブリンの検出方法または測定方法が望まれている。
【非特許文献１】Kaisa Granfors, Matti K. Viljanen, and Auli Toivanen, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 14, No. 1, July 1981, p.6-14
【非特許文献２】Mark P. Hedger And Shyamani Hettiarachchi, Journal of Andrology, Vol. 15, No. 6, November/December 1994, p.583-590
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は動物種を問わず試料中の免疫ブロブリンを同一条件で安価且つ簡易に検出または測定することを可能とする化合物、または上記化合物を用いた免疫グロブリンの検出方法または測定方法ならびに上記化合物を用いた免疫グロブリンの検出キットまたは測定キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、試料中に含有された免疫グロブリンを、安価且つ簡便に、更に同一条件のもとでその免疫グロブリンを動物種によらず検出または測定する方法について鋭意検討を行った。その結果、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有する、標識されたペプチドを用いることで試料中の免疫グロブリンを安価且つ簡便に、そして、免疫グロブリンの動物種を問わず検出または測定しうることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の検出法または測定法を用いれば、ヒトの抗体価と他動物の抗体価を一度に測定することができるため、ある特定の動物の抗体価をスタンダードとした場合に、そのスタンダードの抗体価を指標としてヒトの抗体価を算出し、スタンダード以外の動物種の抗体価とヒトの抗体価を同じ土俵で比較することができる。【００１０】
即ち、本発明は安価且つ簡便な動物種を問わない免疫グロブリン検出法または測定法に関する。【００１１】
本発明における免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドとは、プロテインＡの部分ペプチド、プロテインＧの部分ペプチド、プロテインＨの部分ペプチド、プロテインＭの部分ペプチド、リウマチ因子の部分ペプチド、および補体の部分ペプチドのうち少なくとも１種のペプチドである。上記ペプチドはプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＭ、リウマチ因子、または補体の部分ペプチドを改変したペプチドであってもよい。【００１２】
ここで、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＭ、リウマチ因子、または補体の部分ペプチドを改変したペプチド、すなわち、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＭ、リウマチ因子、または補体の部分ペプチドの改変体とは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＭ、リウマチ因子、または補体の部分ペプチドのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもので、免疫グロブリンに結合する活性を有するものをいう。なお、上記の「アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」とは、公知の変異ポリペプチド作製法により任意に置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。好ましい変異は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加である。より好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。【００１３】
また、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体結合活性を有するペプチドの標識剤は、具体的に言えば放射性物質、酵素、補酵素、発光性物質、蛍光物質、または蛍光性蛋白質であり、この標識剤は免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体結合活性を有するペプチドに含まれた形であっても、共有結合で結合している形であっても良い。
【発明の効果】
【００１４】
本発明における、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体結合活性を有する、標識されたペプチドを用いた免疫グロブリンの検出法または測定法は、安価且つ簡便な方法であり、さらに、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体結合活性を有する標識されたペプチドは、動物種を問わず種々の免疫グロブリンに結合活性を有することから、同一の方法で多様な動物種の免疫グロブリンを測定または検出することができる。よって当該検出方法または測定方法は既存方法とは一線を画すものであり、病因物質や疾患マーカーの測定や難治療性疾患の病因追及など医療分野を筆頭に幅広い分野への利用が期待される。【００１５】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明における免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドとは、具体的に言えば、プロテインＡの部分ペプチド、プロテインＧの部分ペプチド、プロテインＨの部分ペプチド、プロテインＭの部分ペプチド、リウマチ因子の部分ペプチド、または補体の部分ペプチドである。このペプチドはプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＭ、リウマチ因子または補体の部分ペプチドの改変体であっても良い。好ましくはそのペプチドはプロテインＧの部分ペプチド、または当該部分ペプチドの改変体である。これらの免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドは単独で用いても良く、または組み合わせて用いても構わない。【００１７】
また、本発明における免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドの特徴としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ヤギ、ハムスター、モルモット、ウシ、およびニワトリなど全てではないが多くの動物種の免疫グロブリンに結合することが望ましい。尚且つ、免疫グロブリンの各クラス、および各サブクラスに結合活性を有する方が良い。但し、上記の動物種は代表例として示しただけであり、本発明はこれらに限定されるものではない。さらに本発明における免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドはすべての動物種の免疫グロブリンに結合することを特定しているわけでもない。【００１８】
本発明における標識剤は放射性物質、酵素、補酵素、発光性物質、蛍光物質、または蛍光性蛋白であり、さらに具体的には３５Ｓメチオニン、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリフォスフォターゼ、ビオチン、アクリジニウム誘導体、フルオレセイン、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光蛋白質）である。これらの標識剤は単独で用いても良く、または組み合わせて用いても構わない。【００１９】
放射性物質の標識剤としては放射性ヨウ素、放射性炭素、放射性硫黄、放射性水素または放射性リンで標識されたアミノ酸が代表例として挙げられる。【００２０】
酵素に関して、基質と反応して発光、蛍光または発色を誘導するアルカリフォスフォターゼや発光を誘導するＨＲＰを上記に記載したが、それ以外にも蛍光を発生させるガラクトシダーゼや、基質であるルシフェリンと反応して蛍光を発するルシフェラーゼなどが代表例として挙げられる。【００２１】
蛍光物質としてはＣｙｄｙ系、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、ＭＦＰ４８８、ローダミンなどが代表例として挙げられる。蛍光性蛋白質はＧＦＰの他にもＲＥＰ（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：赤色蛍光蛋白質）、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：黄色蛍光蛋白質）、ＣＦＰ（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：シアン色蛍光蛋白質）などが挙げられる。上記の標識剤は代表例として示したに過ぎず、本発明は特にこれら標識剤に限定されるものではない。【００２２】
上記標識剤以外にも免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドにペプチドのタグ配列を導入または融合すれば標識化できる。例えば、Ｓタグ配列ペプチドはＳプロテインと結合することによりＲＮＡを切断する触媒活性（ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＳ活性）を持つため、ＦＲＥＴにより消光されたｍＲＮＡを加えることで蛍光を発する。この公知の技術（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９６，  ｐ２０１９−２０２４，  １９９９年を参照）を利用すれば、このＳタグ配列ペプチドを標識剤として免疫グロブリンの検出または測定が可能である。【００２３】
本発明における、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有する、標識されたペプチドは種々の方法によって得られる。一般的に比較的短いペプチドは固相合成され、比較的長いペプチドは大腸菌などの菌による産生で合成される。最近では無細胞蛋白質合成系（Ｔｈｅ  ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．２７３，  ｐ４１３３−４１４０，  ２００６年を参照）でも長短のペプチドの合成は行われている。【００２４】
免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドが短い場合は、固相合成のビルディングブロックの１つとして目的の標識剤を付加させることができる。この方法には標識剤の制限はなく、ペプチドに含まれるアミノ基やチオール基を利用すれば、上記のすべての標識剤を付加または含ませることが可能であると思われる。もちろん、固相合成後に結合させても良い。またペプチド同士間やペプチドと標識剤間などをケミカルライゲイション法で連結して作成することも可能である（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｖｏｌ．１２８，  ｐ６６４０−６６４６，  ２００６年を参照）。【００２５】
次に免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドが比較的長い場合は、そのペプチドを菌によって産生した後に、アミノ基やチオール基を利用して放射性物質、酵素、補酵素、蛍光物質、または蛍光蛋白質で標識することができる。【００２６】
標識剤が酵素やペプチドタグや蛍光性蛋白の場合は遺伝子的操作を施し、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドに融合して標識することもできる。また標識剤が３５Ｓメチオニンのような本質的に天然アミノ酸と同じ場合は培養液中に天然アミノ酸の代わりに添加することで、標識することも可能である。【００２７】
他にも非天然アミノ酸導入法で標識する方法もある（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌ．３，  ｐ９２３−９２９，  ２００６年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．１０３，  ｐ９７８５−９７８９，  ２００６年を参照）。この方法では蛍光性物質や放射性物質など多くの側鎖修飾アミノ酸の蛋白質への導入が確認されている。ここでは代表的な免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有する、標識されたペプチドの作成法について記述したが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００２８】
本発明の免疫グロブリンの測定または検出の具体的方法として、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ―ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ：酵素結合免疫吸着測定法）のようなイムノアッセイを利用した検出方法または測定方法が考えられる。【００２９】
具体的な方法の１つとして次の方法が挙げられる。まず、免疫グロブリンを含む溶液をプレートまたはウェルなどの固相と接触させ、溶液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を固相上に結合または吸着させる。洗浄工程を経た後、適当な手法でブロッキングし、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有する、標識されたペプチドを添加する。最後に、洗浄工程を経た後、固相上の免疫グロブリンに特異的に結合した免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有するペプチドをその標識剤を利用して検出または測定することにより、溶液中の免疫グロブリンを検出または測定する。【００３０】
２つ目の方法として、抗原特異的な免疫グロブリンの検出方法または測定方法が挙げられる。始めに、適当な手法、例えばＢＳＡにコンジュゲートした抗原をプレートまたはウェルなどの固相と接触させることにより、直接的または間接的に抗原を固相上に結合または吸着させる。必要に応じて適当な方法でブロッキングした後、免疫ブロブリンを含む溶液を添加し、抗原に反応する免疫グロブリンを特異的に結合させる。洗浄操作を行った後に、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有する、標識されたペプチドを添加し、抗原特異的に結合した免疫グロブリンに対して結合させる。洗浄後、１つ目の方法と同様に標識剤を利用し抗原に結合した特異的免疫グロブリンを検出または測定する。【００３１】
標識剤を利用した免疫グロブリンの検出または測定は、直接的または間接的に放出される標識剤のシグナルを検出することによって可能となる。例えば上記の放射性物質、蛍光物質、および蛍光性蛋白質のような自らがシグナルを放出する化合物の場合、照射行為以外は他から物質を加えたり外的な影響を与えたりすることなしに、適当な装置を用いて直接的にシグナルの検出が可能である。一方、ＨＲＰ、アルカリフォスフォターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼのような酵素は外的刺激なしではシグナルを放たない。そのため各々の酵素に適した基質を適した条件の下で加え、発光や蛍光または発色のようなシグナルを放つように誘導する必要がある。また、シグナルの停止を行うこともある。標識剤が上記酵素の場合にはこのようにシグナルを誘導し、間接的に標識剤のシグナル検出を行う。同様に適当な装置を用いてシグナルを検出する。標識剤がビオチンの場合、ビオチンが特異的に結合するアビジン／ストレプトアビジンを利用するのが一般的である。蛍光色素、放射性物質、ＨＲＰ、アルカリフォスフォターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが付加または含まれたアビジン／ストレプトアビジンを用い免疫グロブリンに依存したシグナル放出を誘導する。【００３２】
本発明は免疫グロブリンを検出または測定すること以外にも免疫グロブリンの抗原の特定やエピトープマッピングへの適用も考えられる。例えば、９６穴プレートに種々の抗原を固定化し、免疫グロブリンを含む溶液を加えた後に、本発明の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有する標識されたペプチドで標識シグナルの検出を行えば、免疫グロブリンの抗原特定へも応用できる。免疫グロブリンのエピトープマッピングを行いたい場合にも同様に、９６穴プレートに選定された抗原を固定化し、上記と同様の操作を行えば良い。本手法は動物種を問わないために同一のキットでハイスループットの免疫グロブリンの抗原スクリーニングも可能とする。他にも免疫グロブリンと、ある細胞に発現しているレセプターとの相互作用を調べる際に、細胞に結合した免疫グロブリンを本発明の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に結合活性を有する標識されたペプチドを用いて検出することもできる。【００３３】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。【００３５】
（実施例１）
＜標識化プロテインＧ部分ペプチドの作成＞
マレイミド化されたＨＲＰ（３０ｍｇ）をリン酸緩衝液に溶解した。次に組み換え微生物菌株の産生によって得られた配列番号１に示したアミノ酸配列を有する、プロテインＧ由来の部分ペプチド（ＰＧＭＰ）（５０ｍｇ）（特願平９−５２６７３８号の記載を参照）をリン酸緩衝液に溶解し、ＨＲＰの溶液に加えた。その後、透析を行い、凍結乾燥して、ＨＲＰコンジュゲートされたＰＧＭＰを得た。
＜ヒトβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原に対するイムノアッセイ測定＞
配列番号２に記したアミノ酸配列を有するβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原（ｂＡＲ−Ｌ１）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートさせたＢＳＡ−Ｌ１を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し３μｇ／ｍＬに調製した。【００３６】
９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ）の各ウェルに１００μＬずつ加え３７度で１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で各ウェルを３００μＬで５回ずつ洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）にＢＳＡを溶解させたブロッキング液（１％  ＢＳＡ）を各ウェルに２００μＬずつ加え３７度で１時間静置し、ブロッキングを行った。【００３７】
次に、指標のスタンダードとする、Ｌｏｏｐ１抗原で免疫したウサギから精製したポリクローナル抗体を順次希釈し、検量線作成用の検体とした。拡張型心筋症患者の血清を検体として、検量線作成用の検体と適当に希釈した拡張型心筋症患者の血清検体とをブロッキングを行ったプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、３７度で１時間静置し、抗原―抗体反応を行った。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で各ウェルを３００μＬで５回ずつ洗浄した。【００３８】
最後に、生理食塩水に溶解した標識剤ＨＲＰでコンジュゲートしたＰＧＭＰ（１００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに１００μＬずつ加え１時間静置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で各ウェルを３００μＬで５回ずつ洗浄し、ＨＲＰの基質ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）を含む溶液（０．０００１％過酸化水素含有０．１％ＯＰＤのクエン酸溶液）を各ウェルに１００μＬ加えた。３７度で３０分静置した後、４Ｎ硫酸溶液を各ウェルに５０μＬ加えて反応停止させ、マイクロプレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定することにより、ヒトβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原に対するイムノアッセイ測定を行った。結果は表１に示した。【００３９】
（実施例２）
＜ヒトβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ２抗原に対するイムノアッセイ測定＞
配列番号３に記したアミノ酸配列を有するβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ２抗原（ｂＡＲ−Ｌ２）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートさせたＢＳＡ−Ｌ２を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し５０μｇ／ｍＬに調整した後、実施例１と同様に、プレートへの固定化、ブロッキングを行った。【００４０】
指標のスタンダードとして、Ｌｏｏｐ２抗原で免疫したウサギから精製したポリクローナル抗体を順次希釈し、検量線作成用の検体とする以外は、実施例１と同様にして、ヒトβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ２抗原に対するイムノアッセイ測定を行った。結果は表１に示した。【００４１】
【表１】
2009044650.tif 000002
【００４２】
（実施例３）
＜ウサギβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原に対するイムノアッセイ測定＞
配列番号２に記したアミノ酸配列を有するβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原（ｂＡＲ−Ｌ１）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートさせたＢＳＡ−Ｌ１を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し３μｇ／ｍＬに調整した後、実施例１と同様に、プレートへの固定化、ブロッキングを行った。【００４３】
検体としてＬｏｏｐ１抗原で免疫したウサギの血清検体を用いる以外は実施例１と同様にして、ウサギβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原に対するイムノアッセイを測定した。結果は表２に示した。【００４４】
（実施例４）
＜ウサギβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ２抗原に対するイムノアッセイ測定＞
配列番号３に記したアミノ酸配列を有するβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ２抗原（ｂＡＲ−Ｌ２）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートさせたＢＳＡ−Ｌ２を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し１０μｇ／ｍＬに調整した後、実施例２と同様に、プレートへの固定化、ブロッキングを行った。【００４５】
検体としてＬｏｏｐ２抗原で免疫したウサギの血清検体を用いる以外は実施例２と同様にして、ウサギβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ２抗原に対するイムノアッセイ測定を行った。結果は表２に示した。【００４６】
【表２】
2009044650.tif 000003
【００４７】
（実施例５）
＜コブタβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原に対するイムノアッセイ測定＞
配列番号２に記したアミノ酸配列を有するβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原（ｂＡＲ−Ｌ１）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートさせたＢＳＡ−Ｌ１を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し３μｇ／ｍＬに調整した後、実施例１と同様に、プレートへの固定化、ブロッキングを行った。【００４８】
検体としてＬｏｏｐ１抗原で免疫したコブタの血清検体を用いる以外は実施例１と同様にして、コブタβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原に対するイムノアッセイ測定を行った。結果は表３に示した。【００４９】
（実施例６）
＜コブタβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ２抗原に対するイムノアッセイ測定＞
配列番号３に記したアミノ酸配列を有するβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ２抗原（ｂＡＲ−Ｌ２）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートさせたＢＳＡ−Ｌ２を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し５０μｇ／ｍＬに調整した後、実施例２と同様に、プレートへの固定化、ブロッキングを行った。【００５０】
検体としてＬｏｏｐ２抗原で免疫したコブタの血清検体を用いる以外は実施例２と同様にして、コブタβ１-アドレノセプター抗体のβ１-アドレノセプターのＬｏｏｐ１抗原に対するイムノアッセイ測定を行った。結果は表３に示した。【００５１】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上のように、本発明にかかるペプチドおよび当該ペプチドを用いた免疫グロブリンの検出方法または測定方法を利用すれば、多様な動物種の免疫グロブリンを安価且つ簡便に測定または検出することができる。それゆえ、本発明は、病因物質および疾患マーカーの測定、または難治療性疾患の病因追及などに利用することができ、医療分野および医薬品分野などの幅広い分野で利用することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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