(57)【要約】本発明は、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃを使用した、消化管および他の癌の再発の予後を診断するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、を含み、それによって、癌治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項２】
癌治療を受ける対象の生存の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、を含み、それによって、癌治療を受ける前記対象の生存の予後を診断する、方法。
【請求項３】
消化管癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から消化管の組織試料を得るステップと、
前記消化管の組織試料と、前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃに特異的に結合する抗体とを接触させるステップと、
免疫組織化学的アッセイにおいて、前記抗体を使用してチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃを検出することによって、前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記試料内の前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、
を含み、
前記対照試料内の量に対する前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、前記対象において前記消化管癌が再発することを示し、前記対照試料内の前記量に対する前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の減少は、前記対象において前記消化管癌が再発しないことを示し、それによって、消化管癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項４】
胃癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、
を含み、
前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、前記対象において前記胃癌が再発することを示し、前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の減少は、前記対象において前記胃癌が再発しないことを示し、それによって、胃癌の治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項５】
大腸癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、を含み、
ｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、前記対象において前記大腸癌が再発することを示し、それによって、大腸癌の治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項６】
大腸癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するＳｈｃの比率を決定するステップと、
前記Ｓｈｃの比率と、対照試料内に存在する対照Ｓｈｃの比率とを比較するステップと、
を含み、
前記試料内のＳｈｃの比率が低い場合、前記対象において大腸が再発することを示し、前記試料内のＳｈｃの比率が高い場合、前記対象において大腸が再発しないことを示し、それによって、大腸癌の治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項７】
大腸癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物を決定するステップと、
前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物と、対照試料内の対照ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物とを比較するステップと、を含み、
前記試料内のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が多い場合、前記対象において前記大腸癌が再発することを示し、前記試料内のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が少ない場合、前記対象において前記大腸癌が再発しないことを示し、それによって、大腸癌の治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項８】
前記方法は、前記対象から得られた前記試料の形態学的分析とともに行われる、請求項１乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記試料は、組織または細胞からなる群から選択される、請求項１、２、および４乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記試料は、胃組織、小腸組織、および大腸組織からなる群から選択された組織試料である、請求項１、２、および４乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記癌は、胃癌および大腸癌からなる群から選択される、請求項１乃至３のうちの１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記癌は、胃癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌は、大腸癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌は、ステージＩの胃癌またはステージＩＩの胃癌である、請求項１乃至４のうちの１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記癌は、ステージＩＩの大腸癌またはステージＩＩＩの大腸癌である、請求項１乃至３または５乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐ６６−Ｓｈｃの量だけが決定される、請求項１乃至４のうちの１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量だけが決定される、請求項１乃至４のうちの１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐ６６−Ｓｈｃおよびチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の両方の量が決定される、請求項１乃至４のうちの１つに記載の方法。
【請求項１９】
Ｓｈｃの数学的関係が決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
決定される前記Ｓｈｃの数学的関係は、前記Ｓｈｃの比率である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
決定される前記Ｓｈｃの数学的関係は、前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップは、ｐ６６−Ｓｈｃまたはチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）に特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む、請求項１、２、および４乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
前記決定するステップは、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリ、ＥＬＩＳＡ、および質量分析からなる群から選択される手法の使用を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｐ６６−Ｓｈｃの量は、核酸レベルで決定される、請求項１、２、４、または５のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸の量は、定量ＰＣＲおよび発現アレイ分析からなる群から選択された手法を使用して決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象は、ヒトである、請求項１乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）ｐ６６−Ｓｈｃに特異的に結合する検出可能な抗体と、（ｂ）チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）に特異的に結合する検出可能な抗体と、（ｃ）消化管組織または消化管細胞を単離させるための試薬と、（ｄ）使用説明書と、を含む、請求項１乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法を行うためのキット。
【請求項２８】
癌細胞が侵襲的であるかどうかを決定するための方法であって、
前記細胞内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、を含み、それによって、前記癌細胞が侵襲的であるかどうかを決定する、方法。
【請求項２９】
前記癌細胞は、消化管癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌細胞は、組織試料内に存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料は、組織試料であり、胃組織、小腸組織、および大腸組織からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｐ６６−Ｓｈｃの量だけが決定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量だけが決定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｐ６６−Ｓｈｃおよびチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の両方の量が決定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
Ｓｈｃの数学的関係が決定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
決定される前記Ｓｈｃの数学的関係は、前記Ｓｈｃの比率である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
決定される前記Ｓｈｃの数学的関係は、前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）およびｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップは、ｐ６６−Ｓｈｃまたはチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）に特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記決定するステップは、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリ、ＥＬＩＳＡ、および質量分析からなる群から選択される手法の使用を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
対象における消化器癌を治療するための治療計画の有効性を評価する方法であって、
ａ）前記治療計画の少なくとも一部を前記対象に施す前に前記対象から得られた第１の試料内に存在する、前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、
ｂ）前記治療計画の少なくとも一部を施した後に前記対象から得られた第２の試料内に存在する、前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量とを比較するステップを含み、
前記第２の試料に対して、前記第１の試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量が少ない場合、前記治療計画が消化管癌の治療に有効であることを示し、前記第２の試料に対して、前記第１の試料内に存在するｐ６６−Ｓｈｃの量が多い場合、前記治療計画が前記対象における消化管癌の治療に有効であることを示す、方法。
【請求項４１】
対象における大腸癌を治療するための治療計画の有効性を評価する方法であって、
ａ）前記治療計画の少なくとも一部を前記対象に施す前に前記対象から得られた第１の試料内に存在する、前記Ｓｈｃの比率と、
ｂ）前記治療計画の少なくとも一部を施した後に前記対象から得られた第２の試料内に存在する、前記Ｓｈｃの比率とを比較するステップを含み、
前記第１の試料に対して、前記第２の試料内に存在するＳｈｃの比率が高い場合、前記治療計画が大腸癌の治療に有効であることを示し、前記第１の試料に対して、前記第２の試料内に存在するＳｈｃの比率が低い場合、前記治療計画は、前記対象における大腸癌の治療に有効ではないことを示す、方法。
【請求項４２】
対象における大腸癌を治療するための治療計画の有効性を評価する方法であって、
ａ）前記治療計画の少なくとも一部を前記対象に施す前に前記対象から得られた第１の試料内に存在する、前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物と、
ｂ）前記治療計画の少なくとも一部を前記対象に施した後に前記対象から得られた第２の試料内に存在する、前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物とを比較するステップを含み、
前記第１の試料に対して、前記第２の試料内に存在するＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が少ない場合、前記治療計画が大腸癌の治療に有効であることを示し、前記第１の試料に対して、前記第２の試料内に存在するＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が多い場合、前記治療計画が前記対象における大腸癌の治療に有効ではないことを示す、方法。
【請求項４３】
前記治療計画は、手術、放射線、ホルモン治療、抗体治療、タンパク質チロシンキナーゼ抑制剤による治療、セリン／スレオニンキナーゼ抑制剤、成長因子、サイトカイン、および化学療法からなる群から選択される治療計画を含む、請求項４０、４１、または４２のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項４４】
前記方法は、前記対象から得られた前記試料の形態学的分析とともに行われる、請求項４０、４１、または４２のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項４５】
癌細胞の侵襲性を調整することができる化合物を選択する方法であって、
消化管癌細胞と、試験化合物とを接触させるステップと、
前記試験化合物の、前記癌細胞内の前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を調整する能力を決定するステップと、を含み、それによって、癌細胞の侵襲性を調整することができる化合物を識別する、方法。
【請求項４６】
前記癌細胞は、消化管癌細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記試験化合物の、前記癌細胞内の前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の発現および／または活性を増加する能力、および／または前記細胞内の前記ｐ６６−Ｓｈｃの発現および活性を減少させる能力は、前記化合物が、消化管癌細胞の侵襲性を軽減させることを示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
癌治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内の変異ＴＰ５３の有無を決定するステップと、
前記対象から得られた前記試料内に存在する前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記変異ＴＰ５３の有無と、対照試料内に存在する変異ＴＰ５３の有無とを比較するステップと、
前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、を含み、それによって、癌の治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項４９】
前記試料内のｐ６６−Ｓｈｃの量の増加および変異ＴＰ５３の存在は、前記対象において癌が再発することを示す、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料内のｐ６６−Ｓｈｃの量の増加および変異ＴＰ５３の非存在は、前記対象において前記癌が再発しないことを示す、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６０／７６０，９００号（２００６年１月２０日出願）に対する優先権を主張するものであり、出願の内容は参照することによりその全体が本願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
正常な細胞および癌に冒された細胞の広範囲にわたる分子生物学的研究によって、細胞の成長および分裂に関わるシグナル伝達における異常によって癌が生じること、また、発癌性遺伝子の発現によって生成されるタンパク質が、細胞の成長および分裂を制御していることが明らかになった。すなわち、成長因子、成長因子受容体、細胞チロシンおよびセリン／スレオニンキナーゼおよびホスファターゼ、Ｒａｓタンパク質、アダプタタンパク質、転写因子などが、細胞内のシグナル伝達に関係し、細胞増殖において重要な役割を果たしていることが報告されている（例、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６，１−１３、Ｈａｈｎ  Ｗ．Ｃ．ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｒ．Ａ．（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（５）：３３１−４１、Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｐ．  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１（６８３５）：３５５−６５を参照のこと）。
【０００３】
例えば、Ｒａｓによる細胞内のシグナル伝達は、シグナル伝達物質が、たとえばＥｒｂＢ２のような成長因子受容体に結合したときに生じ、それによって、受容体上にチロシンのリン酸化が生じる。受容体は、Ｓｈｃ（Ｓｒｃホモロジおよびコラーゲンタンパク質）内のチロシン３１７をリン酸化し、次いで、Ｇｒｂ２−（成長因子受容体−結合タンパク質−２）ＳＯＳ複合体によって認識される。その結果、ＳＯＳは、Ｒａｓを活性化させ易くすると思われる細胞膜に転座され、（例、Ｂａｔｚｅｒ，Ａ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４（８）：５１９２−２０１；Ｂｕｄａｙ，Ｌ．ａｎｄ  Ｊ．Ｄｏｗｎｗａｒｄ（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３：６１１−６２０；Ｆｅｉｇ，Ｌ．Ａ．（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６（２）：２０４−１１；Ｋａｒｉｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔ．Ｈｕｎｔｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ５（７）：７４７−５７；Ｍｅｙｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４（５）：３２５３−６２；Ｓｅｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｅ．Ｇ．Ｋｒｅｂｓ（１９９５）Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ９（９）：７２６−３５；Ｓｅｇａｔｔｏ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８（８）：２１０５−１２；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．，Ｃ．Ｋ．Ｗａｔｔｓ，ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｍｕｓｇｒｏｖｅ（１９９３）Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４７（１−６）：９９−１０６）を参照のこと）ＤＮＡ合成、細胞増殖、および分化の促進に至る。
【０００４】
さらに、Ｓｈｃ、Ｓｈｃアンチセンス、種々のＳｈｃドミナントネガティブコンストラクトに微量注入された抗体を使用したいくつかの研究では、ＥＧＦレセプタ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＩＧＦ−ＩおよびＨＧＦによってシグナリングするための、機能Ｓｈｃへの依存度を示している（例、Ｎｏｌａｎ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７２（５）：８２８−３；Ｘｉｅ，Ｙ．，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９５  １０（１２）：２４０９−２４１３；Ｐｅｌｉｃｃｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０（８）：１６３１−８；Ｓａｓａｏｋａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍｉ  ２６９（１８）：１３６８９−９４；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １０（１）：６１−７１；および、Ｓｏｎｇ，Ｒ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１（７）：２０７６−４０８１を参照のこと）。Ｓｈｃには、それぞれ６６、５２、および４６ｋＤａのｐ６６、ｐ５２、およびｐ４６の３つのイソ型がある（例、Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２（５）：７６７−７８；Ｐｅｌｉｃｃｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０（１）：９３−１０４；Ｒｏｚａｋｉｓ−Ａｄｃｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３６０（６４０５）：６８９−９２を参照のこと）。ｐ６６  Ｓｈｃのイソ型は、ｐ５２またはｐ４６  Ｓｈｃのイソ型には見られない、固有のＮ末端ドメイン（ＣＨ２）を含む（Ｐｅｌｉｃｃｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０（１）：９３−１０４）。ｐ５２およびｐ４６  Ｓｈｃとは対照的に、ｐ６６  Ｓｈｃは、一般的に、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化するのではなく、むしろＭＡＰキナーゼおよびｃ−ｆｏｓに対する成長因子の能力を実際に抑制する（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６（４）：７０６−１６；Ｐａｃｉｎｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４：１７４７−５７；Ｔｒｉｎｅｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：３８７２−８）。加えて、ｐ６６  Ｓｈｃは、酸化的ストレスに対するアポトーシス感作体である（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０２（６７５９）：３０９−３１３；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５（５５６４）：２４５０−２４５２；Ｏｒａｓｉｎｉ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（２４）：２５６８９−２５６９５；Ｐａｃｉｎｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４（４）：１７４７−１７５７；Ｐｕｒｄｏｍ，ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ９（５）：２０６−２１０；およびＴｒｉｎｅｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１（２４）３８７２−３８７８）。このようなストレスは、成長因子経路の慢性的な活性化によって、好中球およびマクロフ���ージの浸潤によって、および／または低酸素の腫瘍の新血管形成によって発生する場合がある（Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｒｅｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３（５）：３２３−３２７；Ｉｒａｎｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５（５３０６）：１６４９−１６５２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
消化管癌などの癌と診断された患者の場合、外科的および内科的な腫瘍学者は、現在では、レベルＤ１の外科的切除しか処置されていない早期癌の患者が、疾患を再発する適当な可能性（約２０％）に対して、侵襲レベルＤ２の手術によって、および現在の治療標準（ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．（２００１）Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４５：７２５−７３０）としての一部によって採用された有害な化学放射線療法によってもたらされ得る、最小の起こり得る利益のバランスをとらなければならない。再発性疾患が現れそうな患者を識別する予後マーカは、この臨床的治療法の決定を補助および向上させる。
【０００６】
したがって、特に早期ステージの癌患者の外科的およびアジュバント治療の有効性および程度を管理する予後指標のための分野では緊急を要する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量で、および／またはＳｈｃの数学的関係（例、Ｓｈｃの比率および／またはＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物）で、癌（例、消化管癌）治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断できること、また、癌治療を受ける対象の生存の予後を診断できることの発見に、少なくとも部分的に基づくものである。特に、出願人は、胃癌治療を受ける対象から得られた試料内の、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはＳｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加が、対象における癌の再発と相互に関連すること、および胃癌治療を受ける対象から得られた試料内の、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはＳｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少が、対象における癌の無再発と相互に関連にすることを初めて実証した。同様に、胃癌治療を受ける対象から得られた試料内の、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはＳｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加が、対象の死亡と相互に関連すること、および胃癌治療を受ける対象から得られた試料内の、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはＳｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少が、対象の生存と相互に関連することを初めて実証した。
【０００８】
出願人は、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、ｐ６６−Ｓｈｃの量の増加が、対象における癌の再発と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、ｐ６６−Ｓｈｃの量の減少が、対象における癌の無再発と相互に関連することも初めて実証した。同様に、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、ｐ６６−Ｓｈｃの量の増加が、対象の死亡と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、ｐ６６−Ｓｈｃの量の減少が、対象の生存と相互に関連することを初めて実証した。加えて、出願人は、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの数学的関係が低いこと、すなわちＳｈｃの比率が低いことが、対象における癌の再発と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの比率が高いことが、対象における癌の無再発と相互に関連することを初めて実証した。同様に、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの数学的関係が低いこと、すなわちＳｈｃの比率が低いことが、対象の死亡と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの比率が高いことが、対象の生存と相互に関連することを初めて実証した。さらに、出願人は、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの数学的関係が高いこと、すなわちＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が多いことが、対象の死亡と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が少ないことが、対象の死亡と生存に関連することも初めて実証した。
【０００９】
また、対象から得られた試料内の、変異または蓄積したＴＰ５３の存在と相まって、高レベルのｐ６６−Ｓｈｃが、対象における癌の再発と相互に関連することも始めて実証した。同様に、対象から得られた試料内の、変異または蓄積したＴＰ５３の非存在と相まって、高レベルのｐ６６−Ｓｈｃが、対象における癌の再発のしにくさと相互に関連することを始めて実証した。
【００１０】
したがって、本発明は、癌治療を受ける対象（例、ヒト）における癌の再発の予後を診断するための方法を提供する。本方法は、対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、上述のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、それによって、癌治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する。
【００１１】
別の側面では、本発明は、癌治療を受ける対象（例、ヒト）の生存の予後を診断するための方法を提供する。本方法は、対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、上述のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、それによって、癌治療を受ける対象の生存の予後を診断する。
【００１２】
さらに別の側面では、本発明は、消化管癌の治療を受ける対象（例、ヒト）における癌の再発の予後を診断するための方法を提供する。本方法は、対象から消化管の組織試料を得るステップと、消化管の組織試料と、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃに特に特異的に結合する抗体とを接触させるステップと、抗体および免疫組織化学的アッセイを使用してチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃを検出することによって、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、対照試料内の量に対する試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、対象において消化管癌が再発することを示し、対照試料内の量に対する試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の減少は、対象において消化管癌が再発しないことを示し、それによって、消化管癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する。
【００１３】
別の側面では、本発明は、胃癌の治療を受ける対象（例、ヒト）における癌の再発の予後を診断するための方法を提供する。本方法は、対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、上述のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、対象において胃癌が再発することを示し、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の減少は、対象において胃癌が再発しないことを示し、それによって、胃癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する。
【００１４】
別の側面では、本発明は、大腸癌の治療を受ける対象（例、ヒト）における癌の再発の予後を診断するための方法を提供する。本方法は、対象から得られた試料内に存在するｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、上述の量と、対照試料内のｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、ｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、対象において大腸癌が再発することを示し、それによって、大腸癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する。
【００１５】
さらに別の側面では、本発明は、大腸癌の治療を受ける対象（例、ヒト）における癌の再発の予後を診断するための方法を提供する。本方法は、対象から得られた試料内のＳｈｃの比率を決定するステップと、上述のＳｈｃの比率と、対照試料内の対照Ｓｈｃの比率とを比較するステップとを含み、試料内のＳｈｃの比率が低い場合、対象の大腸が再発することを示し、試料内のＳｈｃの比率が高い場合、対象の大腸が再発しないことを示し、それによって、大腸癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する。
【００１６】
別の側面では、本発明は、大腸癌の治療を受ける対象（例、ヒト）における癌の再発の予後を診断するための方法を提供する。本方法は、対象から得られた試料内のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物を決定するステップと、ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物と、対照試料内の対照ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物とを比較するステップとを含み、試料内のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が多い場合、大腸癌が再発することを示し、試料内のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が少ない場合、大腸癌が再発しないことを示し、それによって、大腸癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する。
【００１７】
本発明の一実施態様では、本方法は、対象から得られた試料の形態学的分析とともに行われる。
【００１８】
一実施形態では、試料は、組織（例、胃組織、小腸組織、または大腸組織）または細胞からなる群から選択される。
【００１９】
一実施形態では、癌は、胃癌（例、ステージＩの胃癌またはステージＩＩの胃癌）である。
【００２０】
一実施形態では、癌は、大腸癌（例、ステージＩＩの大腸癌またはステージＩＩＩの大腸癌）である。
【００２１】
一実施形態では、ｐ６６−Ｓｈｃの量だけが決定される。一実施形態では、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量だけが決定される。
【００２２】
さらに別の実施形態では、ｐ６６−Ｓｈｃおよびチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の両方の量が決定される。一実施形態では、Ｓｈｃの数学的関係が決定される。一実施形態では、決定されるＳｈｃの数学的関係は、Ｓｈｃの比率である。別の実施形態では、決定されるＳｈｃの数学的関係は、ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物である。
【００２３】
一実施形態では、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）およびｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップは、ｐ６６−Ｓｈｃまたはチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）に特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む。このような実施形態では、決定ステップは、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリ、ＥＬＩＳＡ、および質量分析からなる群から選択された手法の使用を含む場合がある。別の実施形態では、ｐ６６−Ｓｈｃの量は、核酸レベルで決定される。このような実施形態では、核酸の量は、定量ＰＣＲおよび発現アレイ分析からなる群から選択された手法を使用して決定される。
【００２４】
別の側面では、本発明は、癌細胞が侵襲的であるかどうかを決定するための方法を提供する。本方法は、細胞内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、上述のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、それによって、癌細胞が侵襲的であるかどうかを決定する。
【００２５】
一実施形態では、癌細胞は、消化管癌細胞である。
【００２６】
一実施形態では、癌細胞は、組織試料（例、胃組織試料、小腸組織試料、または大腸組織試料）内に存在する。
【００２７】
さらに別の側面では、本発明は、対象の消化器癌（例、大腸または胃癌）を治療するための治療計画の有効性を評価する方法を提供する。本方法は、治療計画の少なくとも一部を対象に施す前に対象から得られた第１の試料内に存在する、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、治療計画の少なくとも一部を施した後に対象から得られた第２の試料内に存在する、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量とを比較するステップを含み、第２の試料に対して、第１の試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量が少ない場合、治療計画が消化管癌の治療に有効であることを示し、第２の試料に対して、第１の試料内に存在するｐ６６−Ｓｈｃの量が著しく多い場合、治療計画が対象の消化管癌の治療に有効であることを示す。
【００２８】
別の側面では、本発明は、対象の消化管癌（例、大腸癌）を治療するための治療計画の有効性を評価する方法を提供する。本方法は、治療計画の少なくとも一部を対象に施す前に対象から得られた第１の試料内に存在する、Ｓｈｃの比率と、治療計画の少なくとも一部を施した後に対象から得られた第２の試料内に存在する、Ｓｈｃの比率とを比較するステップを含み、第１の試料に対して、第２の試料内に存在するＳｈｃの比率が高い場合、治療計画が大腸癌の治療に有効であることを示し、第１の試料に対して、第２の試料内のＳｈｃの比率が低い場合、治療計画は、対象の大腸癌の治療に有効ではないことを示す。
【００２９】
別の側面では、本発明は、対象の消化管癌（例、大腸癌）を治療するための治療計画の有効性を評価する方法を提供する。本方法は、治療計画の少なくとも一部を対象に施す前に対象から得られた第１の試料内に存在する、ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物と、治療計画の少なくとも一部を対象に施した後に対象から得られた第２の試料内に存在する、ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物とを比較するステップを含み、第１の試料に対して、第２の試料内に存在するＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が少ない場合、治療計画が大腸癌の治療に有効であることを示し、第１の試料に対して、第２の試料内のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が多い場合、治療計画が対象の大腸癌の治療に有効ではないことを示す。
【００３０】
一実施形態では、治療計画は、手術、放射線、ホルモン治療、抗体治療、タンパク質チロシンキナーゼ抑制剤による治療、セリン／スレオニンキナーゼ抑制剤、成長因子、サイトカイン、および化学療法からなる群から選択された治療計画を含む。別の実施形態では、本方法は、対象から得られた試料の形態学的分析とともに行われる。
【００３１】
別の側面では、本発明は、消化管癌細胞の侵襲性を調整することができる化合物を選択する方法を提供する。本方法は、消化管癌細胞と、試験化合物とを接触させるステップと、試験化合物の、消化管癌細胞内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を調整する能力を決定するステップとを含み、それによって、消化管癌細胞の侵襲性を調整することができる化合物を識別する。
【００３２】
一実施形態では、試験化合物の、癌細胞内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の発現および／または活性を増加する能力、および／または細胞内のｐ６６−Ｓｈｃの発現および活性を減少させる能力は、化合物が、消化管癌細胞の侵襲性を軽減させることを示す。
【００３３】
本発明は、本発明の方法とともに使用するキットをさらに提供する。キットは、ｐ６６−Ｓｈｃに特異的に結合する検出可能な抗体、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）に特異的に結合する検出可能な抗体、消化管組織または消化管細胞を単離させるための試薬、および使用説明書のうちの１つ以上を含む場合がある。
【００３４】
別の側面では、癌治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法を提供する。本方法は、対象から得られた試料内の変異ＴＰ５３の有無を決定するステップと、対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、変異ＴＰ５３の有無と、対照試料内に存在する変異ＴＰ５３の有無とを比較するステップと、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、それによって、癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する。
【００３５】
一実施形態では、試料内のｐ６６−Ｓｈｃの量の増加および変異ＴＰ５３の存在は、対象において癌が再発することを示す。別の実施形態では、試料内のｐ６６−Ｓｈｃの量の増加および変異ＴＰ５３の無存在は、対象において癌が再発しないことを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量で、および／またはＳｈｃの数学的関係で、癌（例、消化管癌）治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断することができること、また、癌治療を受ける対象の生存の予後を診断できることの発見に、少なくとも部分的に基づくものである。特に、出願人は、胃癌治療を受ける対象から得られた試料内の、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはＳｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加が、対象における癌の再発と相互に関連すること、および胃癌治療を受ける対象から得られた試料内の、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはＳｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少が、対象における癌の無再発と相互に関連にすることを初めて実証した。同様に、癌治療を受ける対象から得られた試料内の、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはＳｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加が、対象の死亡と相互に関連すること、および癌治療を受ける対象から得られた試料内の、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはＳｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少が、対象の生存と相互に関連することを初めて実証した。
【００３７】
出願人は、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、ｐ６６−Ｓｈｃの量の増加が、対象における癌の再発と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、ｐ６６−Ｓｈｃの量の減少が、対象における癌の無再発と相互に関連することも初めて実証した。同様に、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、ｐ６６−Ｓｈｃの量の増加が、対象の死亡と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、ｐ６６−Ｓｈｃの量の減少が、対象の生存と相互に関連することを初めて実証した。加えて、出願人は、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの数学的関係が低いこと、すなわちＳｈｃの比率が低いことが、対象における癌の再発と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの数学的関係が高いこと、すなわちＳｈｃの比率が高いことが、対象における癌の無再発と相互に関連することを初めて実証した。同様に、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの数学的関係が低いこと、すなわちＳｈｃの比率が低いことが、対象の死亡と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの数学的関係が高いこと、すなわちＳｈｃの比率が高いことが、対象の生存と相互に関連することを初めて実証した。さらに、出願人は、大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの数学的関係が高いこと、すなわちＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が多いことが、対象の死亡と相互に関連すること、および大腸癌治療を受ける対象から得られた試料内の、Ｓｈｃの数学的関係が低いこと、すなわちＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が少ないことが、対象の死亡と生存に関連することも初めて実証した。
【００３８】
また、対象から得られた試料内の、変異または蓄積したＴＰ５３の存在と相まって、高レベルのｐ６６−Ｓｈｃが、癌の再発および対象の死亡と相互に関連することも始めて実証した。同様に、対象から得られた試料内の、変異または蓄積したＴＰ５３の無存在と相まって、高レベルのｐ６６−Ｓｈｃが、対象の生存または癌の再発のしにくさと相互に関連することを始めて実証した。
【００３９】
したがって、本願明細書では、対象における癌の再発およびまたは生存の予後を診断するための方法、試薬、およびキット、ならびに、消化管癌細胞が侵襲的であるかどうかを決定するための方法、対象の消化管癌を治療するための治療計画の有効性を評価する方法、消化管癌の対象を治療するための方法、および消化管癌細胞の侵襲性を調整することができる化合物を選択する方法が提供される。
【００４０】
本願明細書に示される、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の変化、および／またはＳｈｃの数学的関係の変化は、胃および／または大腸癌試料内で識別されたものであるが、本発明の方法は、胃および／または大腸癌の予後、診断、特徴付け、治療、および予防に対する使用に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法は本願明細書に記述されたあらゆる癌に適用することができる。
【００４１】
本開示のこれらの、および他の種々の側面を以下のサブセクションにおいて詳細に説明する。
【００４２】
Ｉ．定義
【００４３】
本願明細書で使用する場合、以下のそれぞれの用語は、本セクション内でその用語に関連付けられた趣意を有する。
【００４４】
本願明細書で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その項目の文法的な目的物のうちの１つ、または２つ以上（すなわち少なくとも１つ）のことである。一例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００４５】
「腫瘍」または「癌」という用語は、当技術分野で既知であり、無制限増殖、不滅、転移能、急成長、および増殖速度などの、発癌性の細胞に特有の特性、および特定の特徴的形態を有する細胞が（例えば、対象に）存在することである。癌細胞は、しばしば腫瘍の形態であるが、このような細胞は、対象に単独で存在するか、または白血病細胞のような非腫瘍形成性の癌細胞である場合がある。本願明細書で使用する場合、「癌」という用語は、前癌状態の、および悪性の癌を含む。癌には、これに限定されないが、胃癌、結腸直腸癌、皮膚癌（例、黒色腫または基底細胞癌）、肺癌、頭部および頸部の癌、気管支癌、膵癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、口腔または咽頭の癌、肝癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的な組織の癌などが挙げられる。一実施形態では、癌は、消化管癌である。別の実施形態では、癌は、性ホルモン独立癌であり、例えば、この癌は、乳癌、前立腺癌、および／または卵巣癌ではない。
【００４６】
本願明細書で使用する場合、「腫瘍細胞」または「癌細胞」とは、腫瘍内の、または腫瘍に由来する癌性細胞である。腫瘍または癌細胞は、血管細胞のような、他の腫瘍内に存在する非癌性の細胞とは異なる。
【００４７】
本願明細書で使用する場合、「消化管癌」または「ＧＩ癌」とは、消化管器官または胃腸管、すなわち口腔、食道、胃、十二指腸、小腸、結腸または大腸、直腸、および肛門のうちのいずれかの癌である。本願明細書で使用する場合、消化管癌という用語は、膵臓、肝臓、および胆嚢の癌も含む。
【００４８】
「胃癌（ｇａｓｔｒｉｃまたはｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）」または「胃腫瘍形成（ｇａｓｔｒｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」という用語は、本願明細書で使用する場合、胃の腺癌、リンパ腫、間質腫瘍、扁平上皮細胞腫瘍、腺扁平上皮癌、カルチノイド、および平滑筋肉腫を含む。本願明細書で使用する場合、胃癌とは、胃の内壁（粘膜）において生じる腫瘍、胃の下部（幽門）、胃の中央部（本体）、胃の上部（噴門）において発現する腫瘍、および、胃の２つ以上の部分で発現する腫瘍のことでもある。胃癌は、別の線源（例、大腸）からの「転移」か、または「原発性」（胃細胞起源の腫瘍）である場合がある。例えば、胃癌は、食道または小腸に転移する場合があり、また、胃壁を通って、隣接するリンパ節および器官（例、肝臓、膵臓、および大腸）に及ぶ可能性がある。胃癌は、身体（例、肺、卵巣、骨）の他の部分に転移する可能性がある。
【００４９】
胃癌は、ステージ０乃至ＩＶに分類することができる。「ステージ０」の胃癌は、「上皮内癌」とも称され、胃壁の粘膜層の内壁だけにしか見られない腫瘍である。「ステージＩの胃癌」は、癌が転移した場所によって、「ステージＩＡ」および「ステージＩＢ」に分類される。ステージＩＡでは、癌が胃壁の粘膜層を通って完全に転移している。ステージＩＢでは、癌が、胃壁の粘膜層を通って完全に転移して、腫瘍に近い最高６つのリンパ節に見られるか、または癌が胃壁の筋層に完全に転移している。「ステージＩＩの胃癌」では、癌が、胃壁の粘膜層を通って完全に転移して、腫瘍に近い７つ乃至１５のリンパ節に見られるか、または胃壁の筋層に完全に転移して、腫瘍に近い最高６つのリンパ節に見られるか、あるいはリンパ節または他の器官には転移していないが、胃壁の漿膜層に転移している。「ステージＩＩＩの胃癌」は、癌が転移した場所によって「ステージＩＩＩＡ」および「ステージＩＩＩＢ」に分類される。ステージＩＩＩＡでは、癌が、胃壁の筋層に転移し、腫瘍に近い７つ乃至１５のリンパ節に見られるか、または胃壁の漿膜層に転移し、腫瘍に近い１乃至６つのリンパ節に見られるか、あるいはリンパ節または身体の他の部分には転移していないが、胃に隣接する器官に転移している。ステージＩＩＩＢでは、癌が、胃壁の漿膜層に転移し、腫瘍に近い７つ乃至１５のリンパ節に見られる。「ステージＩＶの胃癌」では、癌が、胃に隣接する器官に転移し、少なくとも１つのリンパ節に転移しているか、または１５を超えるリンパ節に転移しているか、あるいは身体の他の部分に転移している。
【００５０】
本願明細書で使用する場合、「大腸癌」または「結腸直腸癌」とは、大腸または結腸の内壁に生じる腫瘍のことである。全てではないが、これらの癌の大部分は、結腸ポリープから発現する。同様に、「大腸癌」という用語は、大腸の癌腫、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、黒色腫、および肉腫のことである。
【００５１】
結腸直腸癌は、ステージ０乃至ＩＶに分類することができる。「ステージ０」の結腸直腸癌は、大腸または直腸の最内の内壁にしか見られない。上皮内癌は、ステージ０の結腸直腸癌の別名である。「ステージＩ」の結腸直腸癌とは、大腸または直腸の内壁に成長した腫瘍のことである。腫瘍は、大腸の外壁に到達していないか、または大腸の外側に広がっていない。「Ｄｕｋｅ’ｓ  Ａ」は、ステージＩの結腸直腸癌の別名である。「ステージＩＩ」の結腸直腸癌では、腫瘍が、大腸または直腸の壁により深く広がるか、またはこれを通って広がる。腫瘍は、組織付近まで侵入している場合があるが、癌細胞は、リンパ節に転移していない。「Ｄｕｋｅ’ｓ  Ｂ」は、ステージＩＩの結腸直腸癌の別名である。「ステージＩＩＩ」の結腸直腸癌とは、リンパ節の近くに転移しているが、身体の他の部分には転移していない腫瘍のことである。「Ｄｕｋｅ’ｓ  Ｃ」は、ステージＩＩＩの結腸直腸癌の別名である。「ステージＩＶ」の結腸直腸癌では、腫瘍が、肝臓または肺のような身体の他の部分に転移している。「Ｄｕｋｅ’ｓ  Ｄ」は、ステージＩＶの結腸直腸癌の別名である。
【００５２】
本願明細書で使用する場合、「生存」とは、癌の治療を受けた対象の寿命が継続することである。一実施形態では、生存とは、腫瘍が再発できないことである。本願明細書で使用する場合、「再発する」または「再発」という用語は、腫瘍に対して一次治療が施された対象において、腫瘍または癌性細胞が再生することである。腫瘍は、最初に発生した部位または身体の別の部分において再発する場合がある。一実施形態では、再発する腫瘍は、対象が治療を受けた元の腫瘍と同一タイプのものである。例えば、対象が胃腫瘍であり、その治療を受けた後に別の胃腫瘍が発現した場合は、その腫瘍が再発している。加えて、癌は、最初に発生した場所とは異なる器官または組織において再発する場合がある。例えば、対象が胃腫瘍であり、その治療を受けた後に別の胃腫瘍が発現した場合も、やはりその腫瘍が再発している。
【００５３】
本願明細書で使用する場合、「侵襲的」という用語は、腫瘍または癌細胞に関して、対象において、または当該の侵襲的な腫瘍から得られた細胞において再発する傾向のある腫瘍のことである。
【００５４】
本願明細書で使用する場合、「量」という用語は、細胞または試料内に存在するｐ６６−Ｓｈｃまたはリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）のいずれかに関して、（ａ）単位体積あたりの分子、モル、または重量で測定される絶対量か、または（ｂ）例えば０乃至５の数値的評価によって示される相対量のことである。
【００５５】
本願明細書で使用する場合、「Ｓｈｃの数学的関係」は、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃのあらゆる数学的変化および／またはあらゆる数学的相互作用（例えば、細胞または試料内に存在するＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃの量）を含む。チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の数学的変化とは、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの数値的量のあらゆる変化のことで、本発明の方法を容易にするものであり、また、これに限定されないが、その量の平方根、その量のｌｏｇ  ｎ（ここで、ｎは任意の整数または分数）、任意の数（整数または分数）によるその量の乗算、および／またはその量へ／からの任意の数（整数または分数）の加算または減算を含む。チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の数学的相互作用とは、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）およびｐ６６−Ｓｈｃの数値的量のあらゆる相互作用のことで、本発明の方法を容易にするものであり、また、これに限定されないが、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量とｐ６６−Ｓｈｃの量と生成物（本願明細書では「ＰＹ６６−Ｓｈｃ生成物」と称する）、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量とｐ６６−Ｓｈｃの量との正比、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量とｐ６６−Ｓｈｃの量との加重平均、および／またはチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量とｐ６６−Ｓｈｃの量とを含む多項式の比率を含む。
【００５６】
対象から得られた細胞または試料における、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係は、「変化する」（「増減する」、またはチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの正常量よりも「多くまたは少なく」なる）、および／または、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係が、それぞれ対照量および／または量の評価に用いたアッセイの標準誤差よりも多いまたは少ない場合は、正常のＳｈｃの数学的関係である。対象から得られた細胞または試料における、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係は、対照量、および／または対照Ｓｈｃの数学的関係および試料量、および／またはＳｈｃの数学的関係が、それぞれチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量よりも、および／またはＳｈｃの数学的関係よりも、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも３倍、４倍、または５倍多いか、または少ない場合、対照量よりも、および／または対照Ｓｈｃの数学的関係よりも「多い」または「少ない」とみなすことができる。
【００５７】
本願明細書で使用する場合、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの「対照量」という用語は、癌にかかっていない対象から得られた細胞または試料、侵襲的な腫瘍から得られた細胞または試料、または非侵襲的な腫瘍から得られた細胞または試料における、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量のことである。この「対照量」は、例えば、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃを発現すること、例えば高レベル、中間レベル、低レベルのタンパク質を発現することが分かっている、細胞または組織内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの平均量を計算することによって決定することができる。
【００５８】
同様に、本願明細書で使用する場合、「対照Ｓｈｃの数学的関係」という用語は、癌にかかっていない対象から得られた細胞または試料、侵襲的な腫瘍から得られた細胞または試料、または非侵襲的な腫瘍から得られた細胞または試料における、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の数学的関係のことである。「対照のＳｈｃ数学的関係」は、例えば、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃを発現すること、例えば高レベル、中間レベル、低レベルのタンパク質を発現することが分かっている、細胞または組織内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の平均的な数学的関係を計算することによって決定することができる。
【００５９】
チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの「高レベルの発現および／または活性」とは、試験試料における発現レベルおよび／または活性のことであり、発現および／または活性の評価に用いたアッセイの標準誤差よりも大きく、対照試料（例、癌にかかっていない健康な対象から得られた試料）におけるチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現レベルおよび／または活性の少なくとも２倍であることが好ましく、３倍、４倍、５倍、または１０倍以上であることがより好ましく、また、いくつかの対照試料におけるチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの平均発現レベルおよび／または活性であることが好ましい。
【００６０】
チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの「低レベルの発現および／または活性」とは、試験試料における発現レベルおよび／または活性のことであり、発現および／または活性の評価に用いたアッセイの標準誤差よりも小さいが、対照試料（例えば、Ｓｈｃタンパク質の予後能力のための検証基準として役立つ追跡情報によって、消化管または乳癌のパネルに対して、情報直接的または間接的に較正された試料）におけるチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現レベルおよび／または活性の少なくとも２倍であることが好ましく、３倍、４倍、５倍、または１０倍以上であることがより好ましく、また、いくつかの対照試料におけるチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの平均発現レベルおよび／または活性であることが好ましい。
【００６１】
本願明細書で使用する場合、「抗体」は、一例として、自然発生的形態の抗体（例、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）、および一本鎖抗体、キメラおよびヒト化抗体、および多重特異的抗体のような組み換え抗体、ならびに上述した全ての抗体の断片および誘導体（断片および誘導体は、少なくとも１つの抗原性結合部位を有する）を含む。抗体誘導体は、抗体に共役させたタンパク質または化学的な部分を含むことができる。
【００６２】
本願明細書で使用する場合、「既知の標準」または「対照」とは、ｐ６６−Ｓｈｃリン酸化Ｓｈｃ、および変異ＴＰ５３の有無に関して、適用可能な量および／または数学的関係のうちの１つ以上のことである。既知の標準は、再発性腫瘍および非再発性腫瘍、および／または侵襲的または非侵襲的な腫瘍の、当該の量および／または科学的関係の特性を反映することが好ましい。既知の標準を生成するための試薬には、これに限定されないが、侵襲性であることが分かっている腫瘍から得られた腫瘍細胞、非侵襲性であることが分かっている腫瘍から得られた腫瘍細胞、および状況に応じて標識化した抗体が挙げられる。既知の標準には、組織培養細胞系（これに限定されないが、特定のＳｈｃタンパク質を発現するように、特定のＳｈｃタンパク質を発現しないように、チロシンキナーゼを発現するように、または成長因子を発現するように操作された細胞系を含む）、あるいは一定量のＰＹ−Ｓｃｈまたはｐ６６−Ｓｈｃを構成的に含むか、または（例えば、変化させた環境に晒すことによって）操作して（このような変化させた環境には、これに限定されないが、成長因子、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、抗体、種々の薬品および代謝拮抗剤、および細胞外マトリクスが挙げられる）、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃを発現させることができる、腫瘍異種移植片が挙げられる。細胞系は、ペレットとしてパラフィン内に直接固定して包埋された、分析用のガラススライド上に直接載置されるか、またはアガロースのようなマトリクス中に懸濁した後にパラフィン上に固定して包埋されて、組織試料として分割および処理することができる。標準は、Ｓｈｃタンパク質の予後能力のための検証基準として役立つ追跡情報によって、消化管または乳癌のパネルに対して、情報直接的または間接的に較正しなければならない。
【００６３】
「ｐ６６−Ｓｈｃ」とは、「Ｓｃｈ」で示されるアダプタタンパク質の６６ｋＤａのイソ型のことである。
【００６４】
「リン酸化Ｓｈｃ」とは、リン酸化されたそのアミノ酸残基側鎖のうちの少なくとも１つを有する、「ＳｈｃＡ」で示されるアダプタタンパク質のことである。一実施形態では、Ｓｈｃのチロシン残基は、リン酸化される（「チロシンリン酸化Ｓｈｃ」）。このような残基には、例えば、チロシン残基３１７が挙げられる。別の実施形態では、Ｓｈｃの残基がリン酸化され（「チロシンリン酸化Ｓｈｃ」）、このような残基には、例えばチロシン残基２３９、２４０が挙げられる。上述の残基番号は、ヒトＳｈｃの５２ｋＤａのイソ型のタンパク質内のこれらのアミノ酸の位置であることに留意されたい。ネズミＳｈｃに対する付番方式では、チロシンアミノ酸３４９、３５０、および４２７は、それぞれマウスの２３９、２４０、および３１７に対応する。
【００６５】
ＳｈｃＡ遺伝子は、それらのＮ末端において異なる、ｐ４６−Ｓｈｃ、ｐ５２−Ｓｈｃ、およびｐ６６−Ｓｈｃで示される３つのイソ型のヒトＳｈｃを生じる。ヒトＳｈｃのヌクレオチドおよび、アミノ酸配列は、既知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｇｉ：３４１４７７２５、およびｇｉ：５２６９３９２０に見出すことができ、それぞれの内容は参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる。
【００６６】
本願明細書で使用する場合、「ＴＰ５３」は、細胞増殖の規定内に含まれる腫瘍抑制タンパク質ｐ５３のことであり、これは当技術分野で既知である。ヒトＴＰ５３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、既知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｇｉ：８４００７３７およびｇｉ：８４００７３８に見出すことができる。
【００６７】
本願明細書で使用する場合、「変異ＴＰ５３」という用語は、遺伝子突然変異があるか、または例えば突然変異などの、タンパク質の生物活性を変化させる欠失のあるＴＰ５３タンパク質のことであり、例えば、ＴＰ５３の発現を妨げるか、または機能的な不活性のＴＰ５３を生成する場合がある。「変異ＴＰ５３」という用語は、無調節の（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ＴＰ５３タンパク質、例えば、他のタンパク質または遺伝子における突然変異または欠失（例、ＰＩ３’キナーゼまたはＰＴＥＮにおける突然変異）によって、その生物活性または発現が下方制御されたＴＰ５３タンパク質も包含する。上述した全ての実施形態では、得られるタンパク質は、ＴＰ５３として抗原的に認識可能でないＴＰ５３タンパク質である。
【００６８】
「一次治療」とは、本願明細書で使用する場合、腫瘍のある対象の最初の治療のことである。一次治療には、これに限定されないが、手術、放射線、ホルモン治療、化学療法、免疫治療、血管新生治療、および生体モジュレータによる治療が挙げられる。
【００６９】
本願明細書で使用する場合、「対象」とは、哺乳類のようなあらゆる動物であり、これに限定されないが、ヒト、マウス、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、および他の家畜およびペット類が挙げられる。
【００７０】
癌は、癌の少なくとも１つの症状が予想された場合に、または軽減、終結、減速、または防止する場合に「治療される」。本願明細書で使用する場合、癌は、癌の再発または転移を減少、減速、遅延、または防止する場合にも「治療される」。
【００７１】
キットは、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃを検出するための、少なくとも１つの試薬（例、プローブ）を含むあらゆる製品（例、パッケージまたは容器）であり、この製品は、本発明の方法を行うためのユニットとして宣伝、配布、または販売されている。
【００７２】
ＩＩ．本発明の用法
本発明は、癌（例、胃癌または大腸癌のような消化管癌）の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法を提供する。これらの方法は、対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、その量と、対照試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含む。本発明は、癌（例、消化管癌）治療を受ける対象の生存の予後を診断するための方法であって、対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、その量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含む方法も提供する。
【００７３】
本発明は、癌（例、胃癌または大腸癌のような消化管癌）の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、対象から消化管の組織試料を得るステップと、消化管の組織試料と、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃに特異的に結合する抗体とを接触させるステップと、上述の抗体および免疫組織化学的アッセイを使用して、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、対照試料内の量に対する試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、対象において癌が再発することを示し、対照試料内の量に対する試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の減少は、対象において癌が再発しないことを示す、方法も提供する。
【００７４】
本発明の方法は、当業者によって使用される他の方法とともに行って、癌治療を受ける対象の癌の再発および／または生存の予後を診断することができる。例えば、本発明の方法は、対象から得られた試料の形態学的または細胞学的分析とともに行うことができる。細胞学的方法は、分子マーカ自体によって、他のマーカとともに、および／またはＳｈｃマーカとともに、他の分子マーカの免疫組織化学的または免疫蛍光による検出（および適切な場合は、計量）を含む場合がある。他の方法には、インシトゥＰＣＲによる、または組織を抽出してリアルタイムＰＣＲによって他のマーカを数量化することによる、他のマーカの検出が挙げられる。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、ポリメラーゼ連鎖反応として定義される。
【００７５】
本発明の一実施形態（一実施態様）では、ｐ６６−Ｓｈｃの量だけが、決定される。別の実施形態では、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量だけが決定される。さらに別の実施形態では、ｐ６６−Ｓｈｃおよびチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の両方の量が決定される。別の実施形態では、Ｓｈｃの数学的関係が決定される。一実施形態では、決定されるＳｈｃの数学的関係は、Ｓｈｃの比率である。別の実施形態では、決定されるＳｈｃの数学的関係は、ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物である。本発明のキットおよび方法において、ｐ６６−Ｓｈｃおよびチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の両方の量が決定されたとき、および／またはＳｈｃの数学的関係が決定されたとき、その量は、単一反応混合物（すなわち、異なる蛍光プローブのような試薬を使用して）、または別個の反応混合物のいずれかの、同一タイプの対照試料における正常量と比較することができる。
【００７６】
全般的に、癌治療を受ける対象における、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係と、対照試料における、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係との間の差異は、できる限り大きいことが好ましい。この差異は、量および／または数学的関係を決定するための方法の検出限界と同程度に小さくなる場合もあるが、この差異は、少なくとも評価方法の標準誤差よりも大きいことが好ましく、少なくとも評価方法の標準誤差よりも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、１００倍、５００倍、１０００倍を越える差異であることが好ましい。
【００７７】
対照（例、非癌性の）組織におけるチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係の変化は、種々の方法で評価することができる。一実施形態では、非癌性であると思われる細胞における、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係を評価することによって、また、上述の正常量のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／または正常なＳｈｃの数学的関係と、癌性である疑いのある細胞における、量およびＳｈｃの数学的関係とを比較することによって、この量が評価される。例えば、腹腔鏡検査または他の医療処置によって、器官の一部分に腫瘍の存在が認められたときには、正常量のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃは、その器官の非罹患部分を使用して評価することができ、この正常量は、その器官の罹患部分（すなわち腫瘍）における、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と比較することができる。代替的に、および特に本願明細書に記述された方法のルーチンパフォーマンスによって利用可能となる更なる情報として、「正常」量のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／または正常なＳｈｃの数学的関係に対する集団平均値を使用することができる。他の実施形態では、「正常」量のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／または「正常」なＳｈｃの数学的関係は、癌にかかっていない対象から得られた対象の試料、対象において癌が発病する前に対象から得られた対象の試料、アーカイブされた対象の試料などにおける、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を評価することによって決定することができる。好適な実施形態では、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係は、上述のように決定される。
【００７８】
また、治療計画（例えば、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン治療、または対象における癌の治療に有用な他の治療手法）の有効性を評価するための方法も提供される。これらの方法では、一対の試料（治療計画が施されない第１の試料、および治療計画の少なくとも一部が施される第２の試料）における、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量が評価される。第２の試料に対して、第１の試料におけるチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量が少ない場合、その治療計画が癌治療に有効であることを示す。第２の試料に対して、第１の試料におけるチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量が多い場合も、その治療計画が対象における消化管癌に有効であることを示す。同様に、一対の試料（治療計画が施されない第１の試料、および治療計画の少なくとも一部が施される第２の試料）における、Ｓｈｃの数学的関係（例、Ｓｈｃの比率）が評価される。第１の試料に対して、第２の試料におけるＳｈｃの比率が高い場合、その治療計画が対象における癌治療（例、大腸癌）に有効であることを示す。第１の試料に対して、第２の試料におけるＳｈｃの比率が低い場合、その治療計画が対象における癌治療（例、大腸癌）に有効でないことを示す。また、一対の試料（治療計画が施されない第１の試料、および治療計画の少なくとも一部が施される第２の試料）における、Ｓｈｃの数学的関係（例、ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物）も評価することができる。第１の試料に対して、第２の試料におけるＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が少ない場合、その治療計画が対象における癌治療（例、大腸癌）に有効であることを示す。第１の試料に対して、第２の試料におけるＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が多い場合、その治療計画が対象における癌治療（例、大腸癌）に有効でないことを示す。  
【００７９】
本発明は、消化管癌細胞が侵襲的であるかどうかを決定するための方法も提供する。本方法は、細胞内のリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、その量と、対照試料（「定義」の項で定義される）内に存在するリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、それによって、消化管癌細胞が侵襲的であるかどうかを決定する。  
【００８０】
本発明の方法は、消化管癌細胞の侵襲性を調整する、すなわち減少させることができる化合物の選択にも使用することができる。本方法では、消化管癌細胞と試験化合物とを接触させ、試験化合物の、癌細胞内のリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を調整する能力が決定され、それによって、消化管癌細胞の侵襲性を調整することができる化合物を選択する。
【００８１】
本願明細書に記述された方法を使用することで、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の発現および／または活性を調整する、すなわち減少させる分子を識別するために、種々の分子（特に細胞膜を通過することができるほどに十分小さな分子を含む）をスクリーニングすることができる。そのように識別された化合物は、対象における癌細胞の侵襲性を抑制するために対象に提供して、対象における癌の再発を防止するか、または対象における癌を治療することができる。
【００８２】
したがって、本発明は、以下の第Ｖ項に記述されているように、癌（例、消化管癌）の患者を治療するための方法も含む。
【００８３】
チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量および／または活性への促進または抑制効果を有する薬剤またはモジュレータを対象に（予防的または治療的に）投与して、対象における癌（例、消化管癌）を治療することができる。このような治療とともに、腫瘍のファーマコプロテオミクス（ｐｈａｒｍａｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）およびファーマコホスホプロテオミクス（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）（すなわち、腫瘍のプロテオーム／ホスホプロテオーム、およびその腫瘍の外来化合物または薬品に対する反応の研究）を考慮する場合がある。腫瘍環境（成長因子、細胞外接触、腫瘍癌遺伝子の活性化、または腫瘍抑制遺伝子の不活性化などを含む）は、分子機構（プロテオームおよびホスホプロテオーム）が、薬理的活性薬品の作用に適していない場合に、治療が失敗する可能性がある。したがって、腫瘍のファーマコプロテオーム（ｐｈａｒｍａｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ）およびファーマコホスホプロテオームｐｈａｒｍａｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ）は、個々の腫瘍のプロテオームおよびホスホプロテオームの考慮を踏まえて、予防薬または治療上の処置に対して、効果的な薬剤（例えば薬品）を選択できるようにする。さらに、このようなファーマコプロテオミクスおよびファーマコホスホプロテオミクスを用いて、適切な適用量および治療計画を決定することができる。したがって、対象におけるチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量および／または活性を決定し、それによって、対象の治療または予防治療のための適切な薬剤を選択することができる。実施例は、これに限定されないが、成長因子受容体（モノクローナル抗体およびハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎｅ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ；ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）のようなチロシンキナーゼ抑制剤）、ホルモン受容体（タモキシフェンおよび他のＳＥＲＭＳ；アロマターゼ阻害薬）、ＳＲＣ族のような細胞内チロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ、タンパク質チロシンホスファターゼ、およびタンパク質セリン／スレオニンホスファターゼを標的とした薬剤を含む。
【００８４】
本発明は、癌治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する方法も提供する。本方法は、対象から得られた試料内の変異ＴＰ５３の有無を決定するステップと、対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、変異ＴＰ５３の有無と、対照試料内に存在する変異ＴＰ５３の有無とを比較するステップと、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、それによって、癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する。一実施形態では、試料内のｐ６６−Ｓｈｃの量の増加および変異ＴＰ５３の存在は、対象において癌が再発することを示す。別の実施形態では、試料内のｐ６６−Ｓｈｃの量の増加および変異ＴＰ５３の非存在は、対象において前記癌が再発しないことを示す。
【００８５】
ＩＩＩ．試料を採取して、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃレベル、および／または数学的関係を検出／数量化するための方法
本発明の方法に有用に試料には、あらゆる組織、細胞、生検、またはチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃを発現する体液の試料が挙げられる。一実施形態では、試料を、組織、細胞、全血、結成、血漿、口腔スクレイプ、唾液、髄液、尿、便、または気管支肺胞洗浄液とする場合がある。好適な実施形態では、組織試料は、胃組織試料、小腸組織試料、大腸組織試料である。
【００８６】
身体試料は、例えば生検の使用、領域のかきとりまたは拭き取り、または体液を吸い出すための針の使用などの、当技術分野で既知の様々な手法によって対象から得ることができる。種々の本体試料を採集するための方法は、当技術分野で既知である。特定の実施形態では、身体の試料は、消化管組織試料を含む。
【００８７】
ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃタンパク質を検出および数量化するための好適な組織試料は、新鮮なもの、凍結させたもの、または当業者に既知の方法によって固定したものとすることができる。好適な組織試料は、更なる分析のために、分割して顕微鏡スライド上に配置することが好ましい。別様には、固体試料、すなわち組織試料は、可溶化および／または均質化した後に、可溶性抽出物のように分析することができる。
【００８８】
一実施形態では、新鮮に採取された生検試料は、例えば液体窒素またはジクロロジフルオロメタンを使用して凍結される。凍結試料は、例えばＯＣＴを使用して分割するために載置され、低温保持装置内で連続的に分割される。連続切片は、ガラス顕微鏡スライド上に採集される。免疫組織化学的な染色の場合、切片がスライドに定着するように、例えばクロムミョウバン、ゼラチン、またはポリ−Ｌ−リジンによってコーティングすることができる。別の実施形態では、試料は、分割する前に固定して包埋される。例えば、組織試料は、例えばホルマリン内に固定し、連続的に脱水して、例えばパラフィン内に包埋することができる。
【００８９】
試料が得られると、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはＴＰ５３タンパク質の検出および数量化に好適な、当技術分野で既知のあらゆる方法を（核酸レベルか、または好ましくはタンパク質レベルのいずれかで）使用することができる。このような方法は、当技術分野で既知であり、これに限定されないが、ウエスタンブロット法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ（例、増幅ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光法、フローサイトメトリ、免疫細胞化学、質量スペクトロメトロメトリック分析（例、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、およびＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、核酸ハイブリダイゼーション技法、核酸逆転写法、および核酸増幅法が挙げられる。特定の実施形態では、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃタンパク質は、例えば、米国特許公報第２００４／００３３５４２号および第２００５／０００４００８号（これらの内容は参照することにより本願明細書に組み込まれる）に記載されているような、これらのタンパク質を特異的に結合する抗体を使用して、タンパク質レベルで検出される。他の実施形態では、ＴＰ５３の有無は、例えば、アミノ酸２１乃至２５間のエピトープまたはＴＰ５３を認識するＤＯ−７抗体（Ｖｏｊｔｅｓｅｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  １５１：２３７）、またはＴＰ５３の配座依存エピトープを認識するＰａｂ２４０（Ｌｅｇｒｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：３６８９；Ｖｏｊｔｅｓｅｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０：３８９）のような、例えばこのプロテインに結合する抗体を使用して決定される。
【００９０】
試料は、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはＴＰ５３を抗体結合に利用し易くするために、修飾を必要とする場合がある。免疫細胞化学的または免疫組織化学的方法の特定の側面では、スライドは、前処理バッファに移送され、状況に応じて、抗原の接触性を高めるように加熱される場合がある。前処理バッファにおける試料の加熱は、迅速に細胞の脂質二重層を崩壊させ、抗原（新鮮な標本となる場合があるが、一般的に固定標本では生じない）（すなわち、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃタンパク質、および／またはＴＰ５３）をより抗体結合させ易くする。「前処理バッファ」および「調製バッファ」という用語は、本願明細書において代替可能に使用され、特に、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３タンパク質をより抗体結合させ易くすることによって、免疫染色のための細胞学的または組織学的試料の調整に使用されるバッファのことである。前処理バッファは、ｐＨ特異性食塩水、ポリマー、洗浄剤、または例えばエチルオキシル化されたアニオン性または非イオン物質界面活性剤のような非イオン性またはアニオン性界面活性剤、アルカノアートまたはアルコキシル酸塩、またはこれらの混合したもの、あるいは胆汁酸塩を使用したものを含む場合がある。前処理バッファは、０．１％乃至１％デオキシコール酸の溶液、ナトリウム塩、またはラウレスナトリウム−１３−カルボン酸塩（例、Ｓａｎｄｏｐａｎ  ＬＳ）、および／またはエトキシ化したアニオン錯体とする場合がある。いくつかの実施形態では、前処理バッファをスライドストレージバッファとして使用する場合もある。
【００９１】
ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３タンパク質をより抗体結合させ易くするためのあらゆる方法を、本発明の実施に使用することができ、当技術分野で既知の抗原回復法を含む。例えば、Ｂｉｂｂｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｃｔａ．Ｃｙｔｏｌ．４６：２５−２９；Ｓａｑｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｇｎ．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２７：３６５−３７０；Ｂｉｂｂｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．２５：８−１１（これらの内容は参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００９２】
ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３タンパク質の利用し易さを高める前処理の後に、試料は、例えば過酸化水素のようなペルオキシダーゼ遮断試薬などの、適切な遮断剤を使用して遮断される場合がある。いくつかの実施形態では、試料は、抗体の非特異的結合を防止するように、タンパク質遮断試薬を使用して遮断される場合がある。タンパク質遮断試薬は、例えば、精製されたカゼインを含む場合がある。抗体、特に、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、またはＴＰ５３に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、次いで、試料によって培養される。当業者は、より正確な予後または診断が、場合によっては、患者試料内のＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃの両方を検出ことによって得られる場合もあると理解されよう。したがって、特定の実施形態では、ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃのそれぞれに向けられた少なくとも２つの抗体が使用される。１つ以上の抗体が使用される場合、これらの抗体は、個々の抗体試薬として逐次的に、または抗体のカクテルとして同時に、単一の試料に添加することができる。別様には、個々の抗体を同一患者から得られた別個の試料に添加して、得られたデータをプールすることができる。
【００９３】
抗体結合を検出するための手法は、当技術分野で既知である。ＰＹ−Ｓｈｃ、ｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３への抗体結合は、抗体結合のレベルに対応し、それに応じて、ＰＹ−Ｓｈｃ、ｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３タンパク質の発現レベルに対応する、検出可能なシグナルを発生する化学試薬を使用することによって検出することができる。本発明の免疫組織化学または免疫細胞化学法のうちの１つでは、抗体結合は、標識化ポリマーに共役される二次抗体を使用することによって検出される。標識化ポリマーには、これに限定されないが、ポリマー酵素複合体が挙げられる。これらの複合体内の酵素は、一般的に、抗原抗体結合部位での沈着物の触媒に使用され、それによって、対象のバイオマーカの発現レベルに対応する細胞の染色が得られる。特定の対象の酵素には、これに限定されないが、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）が挙げられる。
【００９４】
本発明のある特定の免疫組織化学または免疫細胞化学法では、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃタンパク質への抗体結合は、二次抗体に共役されるＨＲＰ標識ポリマーを使用することによって検出される。抗体結合は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体に結合する種特異的なプローブ試薬、および種特異的なプローブ試薬に結合する、ＨＲＰに共役されたポリマーを使用することによって検出することもできる。スライドは、あらゆるクロマゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）（例、３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ））を使用して、抗体結合のために染色され、ヘマトキシリンによって、また状況に応じて、水酸化アンモニウムまたはＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０のような青味剤によって対比染色される。他の好適なクロマゲンには、例えば、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）が挙げられる。本発明のいくつかの側面では、スライドは、細胞検査技師および／または病理学者によって顕微鏡で観察され、細胞染色、例えば蛍光染色（すなわち、ＰＹ−Ｓｈｃまたはｐ６６−Ｓｈｃの発現）を評価する。別様には、試料は、自動顕微鏡によって、または、陽性染色細胞の識別を容易にするコンピュータソフトウェアを用いて要員が観察することができる。
【００９５】
抗体結合の検出は、抗ＰＹ−Ｓｈｃ、ｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３抗体を検出可能な物質に結合させることによって容易することができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発行物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例には、ルミノールが挙げられる。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。また、好適な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈが挙げられる。
【００９６】
本発明の一実施形態では、凍結試料は、上述のように調整した後に、例えばトリスバッファ生理食塩水を使用して適切な濃度に希釈したＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃに対して、抗体によって染色される。一次抗体は、ビオチン化抗免疫グロブリン内でスライドを培養することによって検出することができる。このシグナルは、状況に応じて、抗原のジアミノベンジジン沈殿を使用して増幅および視覚化することができる。さらに、スライドは、状況に応じて、例えばヘマトキシリンによって対比染色して、細胞を視覚化することができる。
【００９７】
別の実施形態では、固定および包埋された試料は、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３に対して、抗体によって染色され、凍結切片に対して上述のように対比染色される。加えて、試料は、状況に応じて、抗体染色を視覚化するために、薬剤で処理してシグナルを増幅する場合がある。例えば、ビオチニル−チラミドのペルオキシダーゼ触媒による沈着を使用することができるが、これは、その後ペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＣＳＡ）Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ））と反応する。
【００９８】
組織ベースのアッセイ（すなわち免疫組織化学）は、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３の検出および数量化の好適な方法である。一実施形態では、変異ＴＰ５３の有無は、免疫組織化学によって決定される場合がある。一実施形態では、ＴＰ５３の免疫組織化学的な分析は、変異ＴＰ５３の欠如した細胞が染色されないように、低濃度の抗ＴＰ５３抗体（例、ＤＯ−７）を使用する。別の実施形態では、変異ＴＰ５３の有無は、変異ＴＰ５３の欠如した細胞が濃密に染色されるように、高濃度の抗ＴＰ５３抗体（例、ＤＯ−７）を使用する、免疫組織化学的な方法を使用して決定される。染色しない細胞は、変異ＴＰ５３を含み、抗原的に認識可能なＴＰ５３タンパク質の生成に失敗したか、またはＴＰ５３のレベルを調整する経路が、（例えば、ＰＩ３’キナーゼにおける突然変異の活性化、または脂質ホスファターゼＰＴＥＮにおける突然変異の活性化によって）調節されていない細胞のいずれかであり、無視してよいＴＰ５３タンパク質の定常状態発現がもたらされる。
【００９９】
当業者は、本発明の方法の実施に使用される特定の抗体の濃度は、結合に対する時間、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３のための抗体の特異度のレベル、および試料調製の方法などの因子によって変化することが認識されよう。さらに、複数の抗体が使用されるときには、必要な濃度は、抗体が、例えばカクテルとして同時に、または個々の抗体試薬として逐次的に提供される順序に影響を受ける場合がある。さらに、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３への抗体結合に使用される検出の化学的性質も、所望のシグナル対ノイズ比を生成するように最適化されなければならない。
【０１００】
本発明の一実施形態では、プロテオーム法（例、質量分析）は、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３タンパク質の検出および数量化に使用される。例えば、マトリクスに関連したレーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）、またはタンパク質結合チップへの血清のような生物学的試料のアプリケーションを伴う、表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析装置（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．，Ｊｒ．，ｅｔ  ａ；．（２００２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ２：５４９；Ｌｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４８：１２９６；Ｌａｒｏｎｇａ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉｓ  Ｍａｒｋｅｒｓ  １９：２２９；Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ，Ｅ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）３５９：５７２；Ａｄａｍ，Ｂ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：３６０９；Ｔｏｌｓｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８４：８４５；Ｘｉａｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：６０２９）を使用して、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３タンパク質を検出および数量化することができる。質量分析法は、例えば、米国特許第５，６２２，８２４号、第５，６０５，７９８号、および第５，５４７，８３５号に記載されており、それぞれの内容は参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【０１０１】
他の実施形態では、ｐ６６−Ｓｈｃの発現は、核酸レベルで検出される。さらに他の実施態様では、ＴＰ５３の有無は、核酸レベルで決定される。発現を評価するための核酸ベースの手法は、当技術分野で既知であり、例えば、身体試料内のｐ６６−Ｓｈｃ  ｍＲＮＡおよび／またはＴＰ５３  ｍＲＮＡのレベルを決定するステップを含む。多くの発現検出法では、単離ＲＮＡを使用する。ｍＲＮＡの単離に対して選択しないあらゆるＲＮＡ単離手法は、ｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはＴＰ５３を発現する細胞からのＲＮＡの生成に用いられる（例、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，（１９８７−１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。加えて、多数の組織試料を、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５号）の単一ステップのＲＮＡ単離プロセスのような、当業者に既知の手法を使用して容易に処理することができる。
【０１０２】
「プローブ」という用語は、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３（例えば、ｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはＴＰ５３ヌクレオチド転写物、またはＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３タンパク質）に選択的に結合できる、あらゆる分子のことである。プローブは、当業者によって合成するか、または適切な生物学的調製から導出することができる。プローブは、特に標識化されるようにデザインされている場合がある。プローブとして用いることができる分子の例には、これに限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられる。
【０１０３】
単離ｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイ（これに限定されないが、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析、およびプローブアレイを含む）に使用することができる。ｍＲＮＡレベルの検出のための方法は、単離ｍＲＮＡと、ｐ６６−Ｓｈｃ  ｍＲＮＡにハイブリッド化することができる核酸分子（プローブ）とを接触させるステップを含む。核酸プローブは、例えば、長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドであり、厳しい条件下でｐ６６−Ｓｈｃ  ｍＲＮＡまたはｐ６６−ＳｈｃゲノムＤＮＡに特異的にハイブリッド化するに十分なオリゴヌクレオチドのような、完全長ｃＤＮＡまたはその一部とすることができる。
【０１０４】
一実施形態では、ｍＲＮＡは、固体表面上に固定され、例えば、アガロースゲル上でｍＲＮＡを動かし、ｍＲＮＡをそのゲルからニトロセルロースのような膜へ移送することによって、プローブと接触させる。別の実施形態では、プローブは、固体表面上に固定され、ｍＲＮＡは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイ内で、プローブと接触させる。当業者は、既知の検出方法を、ＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３   ｍＲＮＡのレベルの検出に容易に適合させることができる。
【０１０５】
試料内のｐ６６−Ｓｈｃ、および／またはＴＰ５３  ｍＲＮＡのレベルを検出するための代替方法は、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号に記述された実験的な実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３）、自律配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，８５４，０３３号）、または他の核酸増幅法による核酸増幅のプロセスと、その後の、当業者に既知の手法を使用した増幅分子の検出とを含む。これらの検出スキームは、このような分子がごく少数しか存在しない場合、特に核酸分子の検出に有用である。本発明の特定の側面では、ｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはＴＰ５３の発現は、定量的な蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎＴＭシステム）によって評価される。このような方法は、一般的に、ｐ６６−Ｓｈｃに特異的であるオリゴヌクレオチドプライマの対を用いる。既知の配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマをデザインするための方法は、当技術分野で既知である。
【０１０６】
ｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはＴＰ５３  ｍＲＮＡの発現レベルは、（ノーザン、サザン、ドットのようなハイブリダイゼーション分析に用いられているような）膜ブロット、またはマイクロウェル、試料管、ゲル、ビード、またはファイバ（あるいは、結合核酸を含むあらゆる固体担体）を使用して観察することができる。米国特許第５，７７０，７２２号、第５，８７４，２１９号、第５，７４４，３０５号、第５，６７７，１９５号、および第５，４４５，９３４号（参照することにより本願明細書に組み込まれる）を参照のこと。ｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはＴＰ５３の発現の検出は、溶液内の核酸プローブを使用するステップも含む場合がある。
【０１０７】
本発明の一実施形態では、マイクロアレイを使用して、ｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはＴＰ５３の発現を検出する。マイクロアレイは、異なる実験間の再現性から、この目的に特に適している。ＤＮＡマイクロアレイは、１つの方法を、多数の遺伝子の発現レベルの同時測定に提供する。それぞれのアレイは、固体担体に取り付けられた再現可能なパターンの捕捉プローブから構成される。標識化ＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補的プローブにハイブリッド化され、その後レーザー走査によって検出される。アレイ上のそれぞれのプローブに対するハイブリダイゼーション強度が決定され、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量的な値に変換される。米国特許第６，０４０，１３８号、第５，８００，９９２号、第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号、および第６，３４４，３１６号を参照のこと（これらは参照することにより本願明細書に組み込まれる）。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料内の多数のＲＮＡの遺伝子発現プロファイルの決定に特に有用である。
【０１０８】
チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の数学的関係は、本発明の方法を使用して、癌治療を受ける対象における癌の再発のリスク、癌治療を受ける患者の生存、癌細胞が侵襲的であるかどうか、癌治療のための治療計画の有効性などの計算に使用することができ、当業者に既知の回帰分析法を含む場合がある。例えば、好適な回帰モデルには、これに限定されないが、ＣＡＲＴ（例、Ｈｉｌｌ，Ｔ，ａｎｄ  Ｌｅｗｉｃｋｉ，Ｐ．（２００６）「ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”  ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｔｕｌｓａ，ＯＫ）、Ｃｏｘ（例、ｗｗｗ．ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ−ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏ．ｕｋ）、指数、正規および対数正規（例、ｗｗｗ．ｏｂｇｙｎ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｍｒｇ／ｓｔａｔｓｂｏｏｋ／ｓｔｓｕｒｖａｎ．ｈｔｍｌ）、ロジスティック（例、ｗｗｗ．ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌｏｇｉｓｔｉｃ＿ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、パラメトリック、ノンパラメトリック、セミパラメトリック（例、ｗｗｗ．ｓｏｃｓｅｒｖ．ｍｃｍａｓｔｅｒ．ｃａ／ｊｆｏｘ／Ｂｏｏｋｓ／Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）、線形（例、ｗｗｗ．ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌｏｇｉｓｔｉｃ＿ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、または加法（例、ｗｗｗ．ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ＿ａｄｄｉｔｉｖｅ＿ｍｏｄｅｌ）が挙げられる。
【０１０９】
一実施形態では、回帰分析は、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を含む。別の実施形態では、回帰分析は、Ｓｈｃの数学的関係を含む。さらに別の実施形態では、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係の回帰分析は、更なる臨床的および／または分子的な共変量を含む場合がある。このような臨床的共変量には、これに限定されないが、結節状態、腫瘍ステージ、腫瘍グレード、腫瘍サイズ、治療体制（例、化学療法および／または放射線治療）、臨床転帰（例、再発、疾患特異的生存、治療不全）、および／または診断後の経過時間、治療開始後の経過時間、および／または治療完了後の経過時間に対する関数としての臨床転帰が挙げられる。分子的な共変量には、これに限定されないが、更なる分子マーカ値、例えば、ＴＰ５３、ＰＳＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＨＥＲ２などが挙げられる。
【０１１０】
別の実施形態では、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＰＹ−Ｓｈｃおよび／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の数学的関係、および変異ＴＰ５３の有無は、本発明の方法を使用して、癌治療を受ける対象における癌の再発のリスク、癌治療を受ける患者の生存、癌細胞が侵襲的であるかどうか、癌治療のための治療計画の有効性などの計算に使用することができ、当業者に既知の回帰分析法を含む場合がある。例えば、好適な回帰モデルには、これに限定されないが、ＣＡＲＴ（例、Ｈｉｌｌ，Ｔ，ａｎｄ  Ｌｅｗｉｃｋｉ，Ｐ．（２００６）「ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｔｕｌｓａ，ＯＫ）、Ｃｏｘ（例、ｗｗｗ．ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ−ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏ．ｕｋ）、指数、正規および対数正規（例、ｗｗｗ．ｏｂｇｙｎ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｍｒｇ／ｓｔａｔｓｂｏｏｋ／ｓｔｓｕｒｖａｎ．ｈｔｍｌ）、ロジスティック（例、ｗｗｗ．ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌｏｇｉｓｔｉｃ＿ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、パラメトリック、ノンパラメトリック、セミパラメトリック（例、ｗｗｗ．ｓｏｃｓｅｒｖ．ｍｃｍａｓｔｅｒ．ｃａ／ｊｆｏｘ／Ｂｏｏｋｓ／Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）、線形（例、ｗｗｗ．ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌｏｇｉｓｔｉｃ＿ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、または加法（例、ｗｗｗ．ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ＿ａｄｄｉｔｉｖｅ＿ｍｏｄｅｌ）が挙げられる。
【０１１１】
一実施形態では、回帰分析は、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を含む。別の実施形態では、回帰分析は、Ｓｈｃの数学的関係を含む。さらに別の実施形態では、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量、および／またはＳｈｃの数学的関係、および／または変異ＴＰ５３の有無の回帰分析は、更なる臨床的および／または分子的な共変量を含む場合がある。このような臨床的共変量には、これに限定されないが、結節状態、腫瘍ステージ、腫瘍グレード、腫瘍サイズ、治療体制（例、化学療法および／または放射線治療）、臨床転帰（例、再発、疾患特異的生存、治療不全）、および／または診断後の経過時間、治療開始後の経過時間、および／または治療完了後の経過時間に対する関数としての臨床転帰が挙げられる。分子的な共変量には、これに限定されないが、更なる分子マーカ値、例えば、Ｋｉ６７、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ホスホＡＫＴ、Ｒａｓの突然変異状態、ＰＩ３’キナーゼ、ＰＴＥＮ、およびＡＴＭなどが挙げられる。
【０１１２】
ＩＶ．キット
本発明は、癌（例、消化管癌）治療を受ける対象の癌の再発または生存の予後を診断するための、組成物およびキットも提供する。これらのキットは、ｐ６６−Ｓｈｃに特異的に結合する検出可能な抗体、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）に特異的に結合する検出可能な抗体、染色のために消化管組織試料を採取および／または調製するための試薬、および使用説明書のうちの１つ以上を含む。
【０１１３】
本発明のキットは、状況に応じて、本発明の方法の実行に有用な更なる構成要素を含む場合がある。一例として、本キットは、相補的核酸のアニーリングに、または抗体と抗体が特異的に結合するタンパク質との結合に好適な液体（例、ＳＳＣバッファ）と、１つ以上の試料区画と、本発明の方法の性能および消化管組織の特異的制御／標準を記述した教材とを含む場合がある。
【０１１４】
Ｖ．治療方法
本発明は、癌（例、消化管癌）である、またはその危険性のある対象（例、ヒト）の予防法および治療方法の両方をさらに提供する。本願明細書で使用する場合、対象の「治療」には、癌、癌の症状、または癌のリスク（または癌への感染性）を、治す、阻害する、癒す、緩和する、軽減する、変質させる、治療する、良くする、改善するための、または癌に作用させるための、対象への治療剤の適用または投与、または癌である、癌の症状がある、またはその危険性（感染性）のある対象から得られた細胞または組織への治療剤の適用または投与を含む。本願明細書で使用する場合、「治療剤」または「化合物」は、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を調整することができる、あらゆる化合物または薬剤を含む。このような化合物には、これに限定されないが、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、ホルモン、サイトカイン、ポリペプチド、ＲＮＡ干渉剤（例、ｓｉＲＮＡ分子）、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１１５】
本願明細書に記述されるように、対象における胃癌の再発、および／または胃癌による対象の死亡は、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少、および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の増加と相互に関連する。上述のように、癌の発生によって、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量には幾らかの変化があるが、これらの変化が、癌性の状態を誘導する、保持する、および促進する場合もある。したがって、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少によって特徴付けられる癌（例、胃癌）は、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の発現および活性を増加させることによって治療することができる。
【０１１６】
本願明細書に記述されるように、対象における大腸癌の再発、および／または大腸癌による対象の死亡は、ｐ６６−Ｓｈｃの量の増加、および／またはＳｈｃの比の減少、および／またはＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物の増加と相互に関連する。上述のように、癌の発生によって幾らかの変化があるが、これらの変化が、癌性の状態を誘導する、保持する、および促進する場合もある。したがって、ｐ６６−Ｓｈｃの量の増加、および／またはＳｈｃの比の減少、および／またはＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物の増加は、ｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を増加させることによって、および／またはＳｈｃの比率および／またはＰＹ６６−Ｓｈｃ生成物を減少させることによって治療することができる。
【０１１７】
よって、本発明の別の側面は、癌（例、消化管癌）を罹患している対象を治療するための方法に関する。これらの方法は、ＰＹ−Ｓｈｃの発現および／または活性を増加させるに効果的な量の、ＰＹ−Ｓｈｃの発現および／または活性を増加させることができる化合物を対象に投与するステップを含む。チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の発現および／または活性を増加させるために使用し、それによって癌を治療または防止することができる化合物には、抗体（例、共役抗体）、小分子、ＲＮＡ干渉剤（例、ｓｉＲＮＡ分子）、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。このような化合物は、例えば、下述するスクリーニングアッセイを使用して識別することができる。
【０１１８】
本発明の別の側面は、癌（例、消化管癌）を罹患している対象を治療するための方法に関する。これらの方法は、ｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を減少させるに効果的な量の、ｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を減少させることができる化合物を対象に投与するステップを含む。ｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を減少させるために使用し、それによって癌を治療または防止することができる化合物には、抗体（例、共役抗体）、ホルモン、サイトカイン、成長因子、小分子、ＲＮＡ干渉剤（例、ｓｉＲＮＡ分子）、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。このような化合物は、例えば、下述するスクリーニングアッセイを使用して識別することができる。
【０１１９】
加えて、ＴＰ５３は、ｐ６６−Ｓｈｃを安定させ、それによって、ｐ６６−Ｓｈｃの細胞内のレベルを増加させることが知られている（Ｔｒｉｎｅｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：３８７２−３８７８）。したがって、ＴＰ５３の発現および／または活性を減少させることができる効果的な量の化合物を対象に投与することによって、癌（例、胃または大腸癌）の再発を防止すること、および／または癌（例、胃または大腸癌）である対象の生存を促進することができる。
【０１２０】
ＶＩ．スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレータ、すなわち候補物質、試験化合物、または薬剤（例、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、小分子、または他の薬品）を識別するための方法（本願明細書では「スクリーニングアッセイ」とも称される）も提供し、このモジュレータは、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を調整することによって、癌細胞（例、消化管癌細胞）の侵襲性を調整する。このようなアッセイは、一般的に、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃと、１つ以上のアッセイ構成要素との間の反応を含む。他の構成要素は、試験化合物自体か、または試験化合物と、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの自然結合パートナーとを組み合わせたもののうちのいずれかである場合がある。本願明細書に記載されているようなアッセイによって識別される化合物は、例えば、癌細胞（例、胃癌細胞のような消化管癌細胞）の侵襲性の調整（例、抑制、改善、処理、または防止）に有用となり得る。
【０１２１】
本発明のスクリーニングアッセイに使用される試験化合物は、自然および／または合成化合物の系統的ライブラリを含む、あらゆる利用可能なソースから得ることができる。試験化合物は、当技術分野で既知の組み合わせライブラリ法における多数の手法のうちのいずれかによって得ることもでき、次のようなものが挙げられる。生物学的ライブラリ、ペプトイドライブラリ（ペプチドの機能を有する分子のライブラリであるが、酵素分解に対して耐性があっても、なお生物活性を残す、斬新な非ペプチドバックボーンを有する。例、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５を参照のこと）、空間的にアドレス可能な並列固相または溶液相ライブラリ、逆畳み込みが必要な合成ライブラリ法、「ワンビーズワンコンパウンド」ライブラリ法、および親和性クロマトグラフィセレクションを使用した合成ライブラリ法。生物学的ライブラリおよびペプトイドライブラリ法は、ペプチドライブラリに限定されるが、他の４つの手法は、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマ、または小分子ライブラリに適用可能である。（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）
【０１２２】
分子ライブラリを合成するための方法の例は、次のような従来技術に見出すことができる。ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９、Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ． Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３、Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９、Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１、およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ． ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０１２３】
化合物のライブラリは、溶液内（例、Ｈｏｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）に、またはビーズ上（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）に、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）に、細菌および／または芽胞上（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２２３，４０９号）に、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ，前掲）に存在する場合がある。
【０１２４】
本発明のスクリーニング法は、癌細胞（例、消化管癌細胞）と、試験化合物とを接触させるステップと、試験化合物が、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を調製する能力を決定するステップとを含む。チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性は、本願明細書に記述されるように決定することができる。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明は、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの基質またはその生物活性部分である、スクリーニング候補物質または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの基質またはその生物活性部分に結合する、スクリーニング候補物質または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。試験化合物がマーカに直接結合する能力を決定するステップは、例えば、化合物のマーカへの結合が、複合体内の標識化マーカを検出することによって検出できるように、化合物と、放射性同位元素または酵素標識とを結合させることによって達成することができる。例えば、化合物（例、マーカ基質）は、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的に、および電波放射の直接計数またはシンチレーション計数によって検出された放射性同位元素で標識化することができる。別様には、アッセイ構成要素は、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、またはルシフェラーゼで、および適切な基質から生成物への変換の決定によって検出された酵素標識で酵素的に標識化することができる。
【０１２６】
本発明は、さらに、上述のスクリーニングアッセイによって識別される斬新な薬剤に関する。したがって、本発明の範囲内で、適切な動物モデルにおいて本願明細書に記述されるように識別される薬剤をさらに使用するためのものである。例えば、本願明細書に記述されるように識別された、チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を調整することができる薬剤を、動物モデルに使用して、当該の薬剤の有効性、毒性、または副作用の決定、またはその薬剤による治療を行うことができる。別様には、本願明細書に記述されるように識別された薬剤を、動物モデルに使用して、当該の薬剤の作用の機構を決定することができる。さらに、本発明は、上述した治療のための上述のスクリーニングアッセイによって識別された、斬新な薬剤の用法に関する。
【０１２７】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、限定するものとして解釈されるべきでない。本出願の全体にわたって引用される全ての参考文献、図、特許、および公開された特許出願書の内容は、参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１２８】
実施例１
早期ステージ（ステージＩおよびステージＩＩ）の胃癌を有する患者の原発性腫瘍におけるＰＹ−Ｓｈｃは、無再発および疾患特異的生存の両方に有意な防護効果がある
【０１２９】
ステージＩおよびステージＩＩの腫瘍を有する患者から得られた胃腫瘍試料内のＰＹ−Ｓｈｃの統計分析は、早期ステージの疾患（ステージＩおよびＩＩ）を呈した後にその疾患が再発したか、または死亡した患者の原発性腫瘍において、発現が減少する（およびｐ６６−Ｓｈｃの発現が増加する）傾向を強く示した。
【０１３０】
ＰＹ−Ｓｈｃ対疾患特異的死亡（図１）のドットプロットによれば、約１．１のカットポイントで、良好な予後の高ＰＹ−Ｓｈｃを有した患者と、不良な予後で低ＰＹ−Ｓｈｃを有した患者とが明確に分かれた。一変量ロジスティック回帰分析では、高ＰＹ−Ｓｈｃに強力な防護効果があった。高ＰＹ−Ｓｈｃスコアの患者の死亡する可能性は、低ＰＹ−Ｓｈｃスコアの患者の１／６倍であった（Ｐ＝０．０３）。高ＰＹ−Ｓｈｃまたは低ＰＹ−Ｓｈｃの患者に対するカプラン−マイヤー生存プロットは、結果において、これらの差異を明確に視覚化している。ｐ６６−Ｓｈｃは、同様の予後能力を示した（表１および２を参照のこと）。
【０１３１】
連続変数として、ＰＹ−Ｓｈｃには、統計的有意性に向かう傾向がある疾患特異的生存（ＤＳＳ）に対して強い保護能力があった（０乃至５のスケールを使用して、ＰＹ−Ｓｈｃのスコアにおける１単位増加に対して０．３９のＲＲ、または０．００９フルスケール：１００倍のＲＲ）（Ｐ＝０．１１）。ｐ６６−Ｓｈｃは、非常に危険（スコアにおける１単位増加に対して１．６のＲＲ、または１０フルスケール）（Ｐ＝０．０６）であった。同様の能力が無再発生存（ＲＦＳ）に対して見られた。（表１および２を参照のこと）。
【０１３２】
【表１】
2009524048.tif 000002
【０１３３】
＊ステージＩおよびＩＩの組み合わせ；ＲＲは、ロジスティック回帰から計算される相対的なリスク；Ｈｉ／Ｌｏ二分法のためのＰＹ−Ｓｈｃのカットポイントは１．１であった。
【０１３４】
【表２】
2009524048.tif 000003
【０１３５】
＊ｎは患者数であり、７／５８は、５８人の患者のうち７人が再発したことを示す。ＲＦＳ％、ＤＳＳ％は、それぞれ疾病が再発せずに生存、または病死せずに生存している患者の割合である。Ｐは、Ｈｉ／Ｌｏ二項変数のログランク一変量分析に与えられる。ＰＹ−Ｓｈｃ  Ｈｉ、Ｌｏは、それぞれ原発性腫瘍が、ＰＹ−Ｓｈｃに対して高い（≧１．１）か、または低い（＜１．１）スコアであった患者である。ｐ６６−Ｓｈｃ  Ｈｉ、Ｌｏは、それぞれ原発性腫瘍が、ｐ６６−Ｓｈｃに対して高い（≧２．２）か、または低い（＜２．２）スコアであった患者である。
【０１３６】
実施例２
ステージＩの胃癌患者における癌の再発および疾患生存の予後指標としてのＰＹ−ＳｈｃおよびＰ６６−Ｓｈｃ
ステージＩの胃癌患者における癌の再発および疾患生存の予後指標としてのＰＹ−ＳｈｃおよびＰ６６−Ｓｈｃ胃癌における予後マーカに対する最も大きな臨床的必要性は、ステージＩの疾患の患者に関係する。これらの患者に対しては、外科的および医学的腫瘍学者は、現在では、Ｄ１レベルの解剖および外科的切除しか処置されていないステージＩの患者が、疾患を再発する適当な可能性（約２０％）に対して、Ｄ２レベルの侵襲性の解剖によって、および現在の治療標準（ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．（２００１）Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４５：７２５−７３０）としての一部によって採用された有害な化学放射線療法によってもたらされ得る、最小の起こり得る利益のバランスをとらなければならない。再発性疾患が現れそうなステージＩの患者を識別する予後マーカは、この臨床的治療法の決定を補助および向上させる。
【０１３７】
上記実施例では、ステージＩの胃癌患者の原発性腫瘍内のＰＹ−Ｓｈｃは、無再発および疾患特異的生存の両方に有意な防護効果があった。ＰＹ−Ｓｈｃは、ステージＩの疾患を呈した後にその疾患が再発したか、または死亡した患者の原発性腫瘍において、発現が減少する傾向を強く示した。
【０１３８】
ＰＹ−Ｓｈｃ対疾患特異的死亡（図３）のドットプロットによれば、以前に設定された１．１のカットポイントで、良好な予後の高ＰＹ−Ｓｈｃを有した患者と、不良な予後の低ＰＹ−Ｓｈｃを有した患者とが明確に分かれた。一変量ロジスティック回帰分析では、高ＰＹ−Ｓｈｃに強力な防護効果があった。いかなる高ＰＹ−Ｓｈｃスコアの患者も、これらの疾患で死亡しなかった（図３のカプラン−マイヤー線図を参照のこと）。ｐ６６−Ｓｈｃは、同様の予後能力を示した。
【０１３９】
連続変数として、ＰＹ−Ｓｈｃには、疾患特異的生存に対して極めて強い保護能力があった（０乃至５のスケールで、ＰＹ−Ｓｈｃのスコアにおける１単位増加に対して０．１５のＲＲ、または０．００００８フルスケール：１３，０００倍のＲＲ）（Ｐ＝０．０５）。ＲＦＳに関しては、二分されたＰＹ−Ｓｈｃには、統計学的に有意な非常に強い保護能力があった（０．０８のＲＲ：１２倍のＲＲ）（Ｐ＝０．０４）（表３および４を参照のこと）。
【０１４０】
【表３】
2009524048.tif 000004
【０１４１】
＊ＲＲは、ロジスティック回帰から計算される相対リスク；Ｈｉ／Ｌｏ二分法に対するＰＹ−Ｓｈｃのカットポイントは１．１であった。＊＊低ＰＹ−Ｓｈｃカテゴリは、ＤＳＤを完全に予測した。
【０１４２】
【表４】
2009524048.tif 000005
【０１４３】
早期ステージの胃癌患者の原発性腫瘍におけるＰＹ−Ｓｈｃは、全生存に有意な防護効果があると思われる。ＰＹ−Ｓｈｃ（ｐ６６−Ｓｃｈではない）は、早期ステージ（ステージＩおよびＩＩ）を呈した後に死亡した患者の原発性腫瘍において、著しく減少した。
【０１４４】
連続変数として、ＰＹ−Ｓｈｃには、統計的有意性に極めて接近した強い保護能力があった（０乃至５のスケールで、ＰＹ−Ｓｈｃのスコアにおける１単位増加に対して０．６２のＨＲ、または０．０９２フルスケール：１１倍のＨＲ）（Ｐ＝０．０５５）。
【０１４５】
ＰＹ−Ｓｈｃ対死亡のドットプロットによれば、約１．５のカットポイントで、良好な予後で高ＰＹ−Ｓｈｃを有した患者（８５％、１７／２０人生存）と、不良な予後で低ＰＹ−Ｓｈｃを有した患者（４４％、１４／３２人生存）とが明確に分かれた（Ｐ＝０．００３）。一変量Ｃｏｘ比例ハザード分析では、高ＰＹ−Ｓｈｃに強力な防護効果があった。高ＰＹ−Ｓｈｃスコアの患者の死亡する可能性は、低ＰＹ−Ｓｈｃスコアの患者の１／５倍であった（Ｐ＝０．００１８）。腫瘍グレード、化学療法、および放射線療法に対して調整した後の多変量Ｃｏｘ分析では、ＰＹ−Ｓｈｃ（ＨＲ＝０．２２、Ｐ＝０．０１５）および腸腫瘍タイプ（ＨＲ＝０．３８、Ｐ＝０．０４６）だけが、生存の有意な予知因子として保持された。上述のデータの統計学的な分析を下記に示す。
要約統計（ソフトウェアパッケージ、Ｓｔａｔａバージョン８を用いた全出力）：
【０１４６】
変数のディクショナリ：
．ｄｅｓｃｒｉｂｅ  ｐｙａｖｅｒｂ  ｐ６６ａｖｅ  ｔｔｙｐｅｎ  ｓｔａｇｅｎ  ｇｒａｄｅ  ｃｔｈｅｒ  ｒｔｈｅｒ  ｄｓｄ  ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１４７】
【数１】
2009524048.tif 000006
【０１４８】
変数および臨床情報の要約：
．  ｓｕｍ  ｐｙａｖｅｒｂ  ｐｙｒｂ  ｐｙｒｌ  ｐ６６ａｖｅ  ｓｕｒｖｄａｙｓ  ｄｓｄ  ｅｔｈｅｒ  ｒｔｈｅｒ  ｇｒａｄｅ  ｓｔａｇｅｎ  ｔｔｙｐｅｎ
【０１４９】
【数２】
2009524048.tif 000007
【０１５０】
実施例３
Ｓｈｃマーカと臨床病理学的特性との相関
全ての利用可能なマーカおよび臨床情報の相関分析を以下に示す。ＰＹ−Ｓｈｃは、全生存（ｄｓｄ）と逆相関を示すことに注目されたい。他の有意な相関には陰影を付してある。相関の有意性は、複数の比較に対して調整されなかった（減じられなかった）ことに留意されたい。テーブルは、それぞれの相関係数でのそれぞれのＰ値と±の相関係数を示す。
【０１５１】
．ｐｗｃｏｒｒ  ｐｙａｖｅｒｂ  ｐ６６ａｖｅ  ｔｔｙｐｅｎ  ｓｔａｇｅｎ  ｇｒａｄｅ  ｃｔｈｅｒ  ｒｔｈｅｒ  ｓｕｒｖｄａｙｓ  ｄｓｄ，  ｓｉｇ  
【０１５２】
【数３】
2009524048.tif 000008
【０１５３】
実施例４
Ｓｈｃマーカの関数としての全死亡の分析
ＰＹ−Ｓｈｃ（ｐ６６−Ｓｃｈではない）は、早期ステージ（ステージＩおよびＩＩ）を呈した後に死亡した患者において、著しく減少した。図４は、何らかの原因による死亡の関数として、ステージＩおよびＩＩの胃癌におけるＰＹ−Ｓｈｃスコアの分布を示す図である。
【０１５４】
．ｔｔｅｓｔ  ｐｙａｖｅｒｂ  ｉｆ  ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｄｓｄ！＝．＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．，ｂｙ（ｄｓｄ）
【０１５５】
【数４】
2009524048.tif 000009
【０１５６】
．Ｄｒ．Ｌｉｓ：          ｔｔｅｓｔ  ｐｙｒｌ  ｉｆ  ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｄｓｄ！＝．＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．，ｂｙ（ｄｓｄ）
【０１５７】
【数５】
2009524048.tif 000010
【０１５８】
．Ｄｒ．Ｂａｇｄａｓａｒｙａｎ：ｔｔｅｓｔ  ｐｙｒｂ  ｉｆ  ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｄｓｄ！＝．＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．，ｂｙ（ｄｓｄ）
【０１５９】
【数６】
2009524048.tif 000011
【０１６０】
Ｄｒ．ＬｉｓとＤｒ．Ｂａｇｄａｓａｒｙａｎのスコアとの間に目立った相関があることに留意されたい。
【０１６１】
．ｐｗｃｏｒｒ  ｐｙａｖｅ  ｐｙｒｂ  ｐｙｒｌ  ｄｓｄ  ｓｕｒｖｄａｙｓ，ｓｉｇ
【０１６２】
【数７】
2009524048.tif 000012
【０１６３】
ｔｔｅｓｔ  ｐ６６ａｖｅ  ｉｆ  ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｄｓｄ！＝．＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．，ｂｙ（ｄｓｄ）
【０１６４】
【数８】
2009524048.tif 000013
【０１６５】
実施例５
連続変数として、ＰＹ−Ｓｈｃには強い保護能力がある
連続変数として、ＰＹ−Ｓｈｃには、統計的有意性に極めて接近した強い保護能力がある（０乃至５のスケールで、ＰＹ−Ｓｈｃのスコアにおける１単位増加に対して０．６２のＨＲ、または０．０９２フルスケール：１１倍のＨＲ）（Ｐ＝０．０５５）。
【０１６６】
．ｓｔｃｏｘ  ｐｙａｖｅｒｂ  ｉｆ  ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｄｓｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１６７】
【数９】
2009524048.tif 000014
【０１６８】
実施例６
カットポイント変数としてのＰＹ−Ｓｈｃ
上述のように、死亡の関数としてのＰＹ−Ｓｈｃのドットプロットによれば、適切かつ有用なカットポイントは、約０．１５のＰＹ−Ｓｈｃ値と推定することができる。このカットポイントでは、高ＰＹ−Ｓｈｃの患者の８５％が生存したが、低ＰＹ−Ｓｈｃの患者は１５％しか生存しなかった（Ｐ＝０．００３）。
【０１６９】
ｔａｂ  ｄｓｄ  ｐｙｃｐ  ｉｆ  ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｐｙａｖｅｒｂ！＝．＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｃｈｉ２  ｃｏｌ
【０１７０】
【数１０】
2009524048.tif 000015
【０１７１】
高ＰＹ−Ｓｈｃまたは低ＰＹ−Ｓｈｃの腫瘍を有する患者間の生存の差異は、それらのカプラン−マイヤー生存のグラフから容易に理解することができる（一変量ログランク分析によるＰ＝０．００３）（図６）。
【０１７２】
詳細：一変量ログランク分析
．ｓｔｓ  ｔｅｓｔ  ｐｙｃｐ  ｉｆ  ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：  ｄｓｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：                    ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１７３】
【数１１】
2009524048.tif 000016
【０１７４】
一変量Ｃｏｘ比例ハザード分析では、ＰＹ−Ｓｈｃに強力な防護効果があった。高ＰＹ−Ｓｈｃスコアの患者の死亡する可能性は、高ＰＹ−Ｓｈｃスコアの患者の１／５倍であった（Ｐ＝０．００１８）。
【０１７５】
一変量分析の詳細：
．ｓｔｃｏｘ  ｐｙｃｐ  ｉｆ  ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ  ｄ：ｄｓｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１７６】
【数１２】
2009524048.tif 000017
【０１７７】
多変量Ｃｏｘ分析では、ＰＹ−Ｓｈｃ（ＨＲ＝０．２２、Ｐ＝０．０１５）および腸腫瘍タイプ（ＨＲ＝０．３８、Ｐ＝０．０４６）だけが、モデルにおいて優位性を保持した。
【０１７８】
ベースモデルは、ＰＹ−Ｓｈｃ以外の全ての潜在的な共変量を含めた後に、最下位から始めて、Ｐ値＞０．１５の共変量を除くことによって見出される。
．  ｓｔｃｏｘ  ｃｔｈｅｒ  ｒｔｈｅｒ  ｇｒａｄｅ  ｔｔｙｐｅｎｓ  ｓｔａｇｅｎ  ｉｆ  ｐｙａｖｅｒｂ！＝．＆ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｄｓｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１７９】
【数１３】
2009524048.tif 000018
【０１８０】
最下位の共変量をドロップする：放射線治療：
．ｓｔｃｏｘ  ｅｔｈｅｒ  ｇｒａｄｅ  ｔｔｙｐｅｎｓ  ｓｔａｇｅｎ  ｉｆ  ｐｙａｖｅｒｂ！＝．＆ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｄｓｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１８１】
【数１４】
2009524048.tif 000019
【０１８２】
次に下位の共変量をドロップする：グレード
ｓｔｃｏｘ  ｃｔｈｅｒ  ｔｔｙｐｅｎｓ  ｓｔａｇｅｎ  ｉｆ  ｐｙａｖｅｒｂ！＝．＆ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｎｏｌｏｇ  
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｄｓｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１８３】
【数１５】
2009524048.tif 000020
【０１８４】
上述のものは、最終的なベースモデルである：Ｐ＜０．１５で有意な全ての共変量
このモデルにＰＹ−Ｓｈｃを加える：
ｓｔｃｏｘ  ｐｙｃｐ  ｃｔｈｅｒ  ｔｔｙｐｅｎｓ  ｓｔａｇｅｎ  ｉｆ  ｐｙａｖｅｒｂ！＝．＆ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｄｓｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１８５】
【数１６】
2009524048.tif 000021
【０１８６】
最下位の共変量をドロップする：化学療法
．ｓｔｃｏｘ  ｐｙｃｐ  ｔｔｙｐｅｎｓ  ｓｔａｇｅｎ  ｉｆ  ｐｙａｖｅｒｂ！＝．＆ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｄｓｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１８７】
【数１７】
2009524048.tif 000022
【０１８８】
次に下位の共変量をドロップする：腫瘍ステージ
およびＤｉｆｆｕｓｅ（ｔｔｙｐｅｎｓ２）、Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ（ｔｔｙｐｅｎｓ３）、および他の全て、ほぼ未知（ｔｔｙｐｅｎｓ１）に分類した腫瘍タイプ：
．ｓｔｃｏｘ  ｐｙｃｐ  ｔｔｙｐｅｎｓｌ  ｔｔｙｐｅｎｓ２  ｔｔｙｐｅｎｓ３  ｉｆ  ｐｙａｖｅｒｂ！＝．＆ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ  ＿ｄ：  ｄｓｄ  
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ  ＿ｔ：  ｓｕｒｖｄａｙｓ  
注：共線により、ｔｔｙｐｅｎｓｌはドロップした
【０１８９】
【数１８】
2009524048.tif 000023
【０１９０】
最も有意でないＤｉｆｆｕｓｅ（２）および共線形（１）をドロップする：
．ｓｔｃｏｘ  ｐｙｃｐ  ｔｔｙｐｅｎｓ３  ｉｆ  ｐｙａｖｅｒｂ！＝．＆ｓｔａｇｅｎ＜４＆ｓｕｒｖｄａｙｓ！＝．＆ｄｓｄ！＝．，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｄｓｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｓｕｒｖｄａｙｓ
【０１９１】
【数１９】
2009524048.tif 000024
【０１９２】
実施例１乃至６の要約：
早期ステージの胃癌患者の原発性腫瘍におけるＰＹ−Ｓｈｃは、全生存に有意な防護効果があると思われる。ＰＹ−Ｓｈｃ（ｐ６６−Ｓｃｈではない）は、早期ステージ（ステージＩおよびＩＩ）を呈した後に死亡した患者において、著しく減少した。
【０１９３】
連続変数として、ＰＹ−Ｓｈｃには、統計的有意性に極めて接近した強い保護能力があった（０乃至５のスケールで、ＰＹ−Ｓｈｃのスコアにおける１単位増加に対して０．６２のＨＲ、または０．０９２フルスケール：１１倍のＨＲ）（Ｐ＝０．０５５）。
【０１９４】
ＰＹ−Ｓｈｃ対死亡のドットプロットによれば、約１．５のカットポイントで、良好な予後で高ＰＹ−Ｓｈｃを有した患者（８５％、１７／２０人生存）と、不良な予後で低ＰＹ−Ｓｈｃを有した患者（４４％、１４／３２人生存）とが明確に分かれた（Ｐ＝０．００３）。一変量Ｃｏｘ比例ハザード分析では、高ＰＹ−Ｓｈｃに強力な防護効果があった。高ＰＹ−Ｓｈｃスコアの患者の死亡する可能性は、低ＰＹ−Ｓｈｃスコアの患者の１／５倍であった（Ｐ＝０．００１８）。腫瘍グレード、化学療法、および放射線療法に対して調整した後の多変量Ｃｏｘ分析では、ＰＹ−Ｓｈｃ（ＨＲ＝０．２２、Ｐ＝０．０１５）および腸腫瘍タイプ（ＨＲ＝０．３８、Ｐ＝０．０４６）だけが、生存の有意な予知因子として保持された。
【０１９５】
実施例７
大腸腫瘍マイクロアレイを使用した、ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌の患者における疾患特異的生存および無再発生存の分析
本研究の目的は、患者の人口学的特性および疾患特性に加えて、Ｓｈｃタンパク質の能力を評価すること、再発までの期間および大腸癌による疾患特異的死亡までの期間を予測することであった。
【０１９６】
Ｓｈｃ  Ｔｅｓｔのブラインド検証（ｂｌｉｎｄｅｄ  ｖａｒｉｄａｔｉｏｎ）を、ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌の患者から得られた、アーカイバルＲＩＨ  Ｃｏｌｏｎ  Ａｒｒａｙ標本上で行った。データは、患者の性別、年齢、グレード、リンパの侵襲状態、および疾患のステージに関して収集した。疾患のステージおよびリンパに侵襲状態は、患者間に同様に分布していたので、リンパの侵襲は、全ての分析に含めなかった。死亡した日付、死亡までのフォローアップ時間、生存状態、再発状態、および疾患の再発までの期間を、全ての患者に対して収集した。データは、それぞれのパラメータに対して０乃至５の範囲での、ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃの染色の平均スコアとして与えられた。加えて、Ｓｈｃの比率は、両方の試験結果が利用可能な場合に、ｐ６６−Ｓｈｃに対するＰＹ−Ｓｈｃの正比として計算した。ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物（０乃至５の範囲）は、両方の結果が利用可能であった場合に、ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃの直接生成物として計算した。
【０１９７】
１３０人の患者に関するデータは、ＲＩＨ  Ｃｏｌｏｎ  Ａｒｒａｙから全ての分析に対して用いた。１３０人の患者のうち、１９人の患者（１４．６％）が疾患で死亡し、１８人の患者（１３．９％）が疾患を再発した。高グレードの疾患を有する１６人の患者を除いて、残りの患者は低グレードの疾患であった。大部分の患者（１１５／１３０；８８．５％）は、ステージＩＩの疾患であった。下記は、ＤＳＳおよびＲＦＳの分析による結果の一部である。
【０１９８】
無再発生存率（ＲＦＳ）および疾患特異的生存（ＤＳＳ）が本分析の中心であった。無再発生存率は、大腸癌の初期診断から、最初の疾患の再発までの期間（月）として定義した。疾患特異的生存は、疾患特異的死亡までの患者のフォローアップ期間（月）として定義した。
【０１９９】
患者の人口学的特性および疾患特性の中のＳｈｃパラメータに有意な差異があった場合には、それぞれのＳｈｃパラメータの要約統計を、ＲＦＳおよびＤＳＳに対して計算して評価した。ＲＦＳおよびＤＳＳ期間の分析は、全ての予後およびＳｈｃ因子によって階層化した一変量Ｋ−Ｍ（カプラン−マイヤー）分析を使用して行った。イベント分析の多変量期間は、Ｃｏｘ  ＰＨ回帰を使用して行い、ベースライン予後因子およびＳｈｃパラメータの予測能力を調査した。
【０２００】
複数の一変量Ｋ−Ｍおよび多変量Ｃｏｘ  ＰＨ回帰モデルおよび線図は、疾患特異的死亡の期間および無再発生存の期間を分析するために、Ｓｈｃパラメータのそれぞれのカットオフポイントを導くように行った。複数のバリエーションの後、それらの最大尤度の値およびログランクのｐ値に基づいて、以下のカットポイントを選択した。
【０２０１】
【数２０】
2009524048.tif 000025
【０２０２】
これらの分析の結果は、疾患特異的生存および無再発生存の両方におけるＳｈｃ  ＴｅｓｔＴＭの予測能力を実証する。高ハザード比率は、疾患特異的生存および無再発生存における高ｐ６６−Ｓｈｃおよび低Ｓｈｃの比率に関連した。
【０２０３】
疾患特異的生存
疾患特異的生存に関して、平均ｐ６６−Ｓｈｃは、その疾患で生存した患者のもの（１．８４±０．９３）よりも、その疾患で死亡した患者のもの（２．３７±１．０２）の方が著しく高かった（Ｐ＝０．０３）Ｓｈｃの平均比率は、その疾患で生存した患者のもの（２．８８±３．１３）よりも、その疾患で死亡した患者のもの（１．９８±１．１２）の方が著しく低かった（Ｐ＝０．０３）。疾患のステージは、ステージＩＩＩの癌に関連する高い死亡発生率の一変量Ｋ−Ｍ分析において、有意な層化予後因子であることが分かった。ｐ６６−Ｓｈｃ、Ｓｈｃの比率、およびＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物は、全て、一変量Ｋ−Ｍ分析において、有意な層化因子であることが分かった。ｐ６６−Ｓｈｃ値が大きい患者は、高い死亡率と関係していた。同様に、ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物値が大きい患者は、高い死亡率と関係していた。一方で、Ｓｈｃの比率値が小さい患者は、高い死亡率と関係していた。
【０２０４】
多変量モデルは、年齢、性別、グレード、ステージ、およびＳｈｃパラメータを含めて実行した。年齢は優位な因子ではなく、また、推定のハザード比（ＨＲ）がこれらのモデルの全てにおいて１に近かったので、最終的なモデルではこのパラメータを考慮しなかった。疾患のグレードが、これらのモデルの大部分において有意ではなかったが、推定のＨＲは１とはかなり異なっていたので、最終的なモデルにおいて考慮した。疾患のステージおよび性別は、モデルの大部分において有意であった。疾患のステージのハザード比は、４乃至７の間であることが分かった。この値は、ステージＩＩからステージＩＩＩへの疾患の悪化により、ハザードが４乃至７倍増加したことを示す（表５を参照のこと）。ｐ６６−Ｓｈｃは、一変量および多変量モデルの両方において有意であることが分かった。一変量および多変量モデルにおける１．８２および２．３６の推定ハザード比は、ハザードが、上述のｐ６６−Ｓｈｃの結果において２単位以上増加したことを示す。ｐ６６−ｓｈｃのカテゴリを包含することで、連続的なｐ６６−Ｓｈｃ値ベースのモデルと一致する高ハザード比（一変量および多変量モデルにおいて、それぞれ２．４８および３．２２）も提供した。ＰＹｐ６６−ＳｈｃおよびＳｈｃの比率、一変量および多変量モデルにおける有意な因子でもあった。ＰＹｐ６６−Ｓｈｃにおけるハザード比（一変量および多変量モデルにおいて、それぞれ１．７７および２．３０）の方向は、ｐ６６−Ｓｈｃのものと同一であったが、一方で、Ｓｈｃの比率（一変量および多変量モデルにおいて、それぞれ０．６２および０．５５）の方向は逆、すなわち、ハザードは、Ｓｈｃの比率の単位増加とともに減少する。ＰＹ−Ｓｈｃは、連続的またはカテゴリフォーマットのいずれかにおいては有意でなかった。疾患のステージは、多変量モデルの多くにおいて有意な因子であった。性別も、これらのモデルの多くにおいて有意であった。
【０２０５】
【表５】
2009524048.tif 000026
【０２０６】
無再発生存
無再発生存に関して、平均ｐ６６−Ｓｈｃは、その疾患で生存した患者のもの（１．８６±０．９２）よりも、その疾患で死亡した患者のもの（２．４１±１．０４）の方が著しく高かった（Ｐ＝０．０２）。Ｓｈｃの平均比率は、その疾患で生存した患者のもの（２．８７±３．１３）よりも、その疾患で死亡した患者のもの（２．０１±１．１６）の方が著しく低かった（Ｐ＝０．０４）。疾患のステージは、ステージＩＩＩの癌に関連する高い死亡発生率の一変量Ｋ−Ｍ分析において、有意な層化予後因子であることが分かった。ｐ６６−Ｓｈｃ、Ｓｈｃの比率、およびＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物は、全て、一変量Ｋ−Ｍ分析において、有意な層化因子であることが分かった。ｐ６６−Ｓｈｃ値が大きい患者（Ｈｉｇｈに分類される）は、高い死亡率と関係していた。同様に、ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物値が大きい患者は、高い死亡率と関係していた。一方で、Ｓｈｃの比率値が小さい患者は、高い死亡率と関係していた。
【０２０７】
多変量モデルは、年齢、性別、グレード、ステージ、およびＳｈｃパラメータを含んで実行した。モデルのいずれかにおいて、年齢は有意な因子ではなく（また、ＨＲが１に近かった）ので、最終的なモデルでは考慮しなかった。疾患のグレードは、これらのモデルの大部分において有意ではなかったが、推定のＨＲは１とはかなり異なったので、最終的なモデルにおいて考慮した。疾患のステージおよび性別は、これらのモデルの大部分において有意であった。疾患のステージのハザード比は、４乃至６．５０の間であることが分かった。この値は、ステージＩＩからステージＩＩＩへの疾患の悪化により、ハザードが４乃至６．５０倍増加することを示す（表６を参照のこと）。ｐ６６−Ｓｈｃは、一変量および多変量モデルの両方において有意であることが分かった。一変量および多変量モデルにおける１．８２および２．３６の推定ハザード比は、ハザードが、上述のｐ６６−Ｓｈｃの結果において２単位以上増加したことを示す。ｐ６６−ｓｈｃのカテゴリを包含することで、連続的なｐ６６−Ｓｈｃ値ベースのモデルと一致する高ハザード比（一変量および多変量モデルにおいて、それぞれ２．４８および３．２２）も提供した。ＰＹｐ６６−ＳｈｃおよびＳｈｃの比率、一変量および多変量モデルにおける有意な因子でもあった。ＰＹｐ６６−Ｓｈｃにおけるハザード比（一変量および多変量モデルにおいて、それぞれ１．７７および２．３０）の方向は、ｐ６６−Ｓｈｃのものと同じであったが、一方で、Ｓｈｃの比率（一変量および多変量モデルにおいて、それぞれ０．６２および０．５５）の方向は逆、すなわち、ハザードは、Ｓｈｃの比率の単位増加とともに減少する。ＰＹ−Ｓｈｃは、これらのモデルの連続的またはカテゴリフォーマットのいずれかにおいては有意でなかった。疾患のステージは、多変量モデルの多くにおいて有意な因子であった。性別も、これらのモデルの多くにおいて有意であった。
【０２０８】
【表６】
2009524048.tif 000027
【０２０９】
表７および８は、それぞれ、疾患特異的生存および無再発生存による患者特性の分布、および疾患特異的生存によるＳｈｃパラメータを要約したものである。
【０２１０】
【表７】
2009524048.tif 000028
【０２１１】
【表８】
2009524048.tif 000029
【０２１２】
【表９】
2009524048.tif 000030
【０２１３】
上記の要約統計から、正規性の仮定を満たすかどうかに基づいて、ｐ値を、ｔ検定およびＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を使用して計算した。異なる試験に対するｐ値を、表９および１０に示す。
【０２１４】
【表１０】
2009524048.tif 000031
【０２１５】
【表１１】
2009524048.tif 000032
【０２１６】
実施例８
種々の腫瘍タイプにおけるＳｈｃの量
種々の腫瘍タイプにおけるＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃの量は、本願明細書に記述されるように決定した。結果を下記の表１１に示す。
【０２１７】
【表１２】
2009524048.tif 000033
【０２１８】
【表１３】
2009524048.tif 000034
【０２１９】
実施例９
侵襲的な癌細胞内のｐ６６−ＳｈｃおよびＴＰ５３の分析
理論に束縛されるものではないが、侵襲的な癌細胞（例、乳癌細胞）を識別する高レベルのＰＹ−Ｓｈｃおよび低レベルのｐ６６−Ｓｈｃの能力を説明する、提案された腫瘍成長の機構モデルは、発現時に高酸化的ストレスであり、侵襲的な腫瘍細胞が、ストレス誘発性アポトーシスを回避する強い選択的な圧力を発生させる。ストレス誘発性アポトーシスには、機能性ｐ６６−Ｓｈｃが必要であるが、ＴＰ５３にも依存する（Ｔｒｉｎｅｉ他、前掲）。したがって、酸化的ストレスのアポトーシスの圧力は、例えばＥｒｋおよびｃ−ＦＯＳにシグナリングする受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、ｐ６６−Ｓｈｃが媒介するフィードバックの下方制御を回避することによって、またはアポトーシスを生じさせる他の因子（例、成長因子のシグナリングによって生じる因子、ミトコンドリア活性、宿主の炎症性細胞による浸潤）の発現を変化させたものによって、および腫瘍の脈管形成の成功に応えての低酸素組織の欠陥の再灌流によって、下方制御されたｐ６６−Ｓｈｃおよび加法制御されたＴＰ５３のいずれかを有する、侵襲的な腫瘍細胞が功を奏するように選択する。
【０２２０】
例えば、変異ＴＰ５３を、従来の低濃度の抗ＴＰ５３を用いたＩＨＣ（ＩｍｍｕｎｏＨｉｓｔｏＣｈｅｍｉｃａｌ：免疫組織化学的）アッセイによって評価した場合（そのうちの約６０％は、実際には正常なＴＰ５３であり、アポトーシスでの無益な試みにおいて蓄積されていると考えられる（例、Ａｓｋｍａｌｍ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｃｔａ．Ｏｎｃｏｌｏｇ  ４３：２３５を参照のこと））、低レベルのｐ６６−Ｓｈｃに関連する蓄積されたＴＰ５３の大部分は、正常なＴＰ５３となるものであり、予後におけるハザードとはならない。一方で、高濃度の抗ＴＰ５３を使用してＴＰ５３を評価する場合（ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９７：１８０８）、通常乃至低レベルのＴＰ５３を含む細胞を暗く染色する。しかし、いかなるこれらの同じ細胞も、従来の低濃度の抗ＴＰ５３抗体で染色しない。次いで、染色されないままの細胞は、おそらくは（抗原的に認識可能な）ＴＰ５３が合成されないようにする突然変異によって、「ゼロ」ＴＰ５３を発現する。上述したように（ＭｃＣａｂｅ他、前掲）、この方法では、２４％の原発性乳癌は、「突然変異体」ＴＰ５３ゼロ腫瘍として識別された（さらに１２％の蓄積ＴＰ５３を有した）。したがって、これらのＴＰ５３ゼロ腫瘍の大部分、およびＴＰ５３ゼロの予後能力の全ては、通常および／または高レベルのｐ６６−Ｓｈｃを発現する腫瘍内に存在する。
【０２２１】
したがって、例えばナイーブ乳癌のような癌、すなわち全身のアジュバント療法を受けない乳癌の場合、ｐ６６−Ｓｈｃを下方制御するための選択的な圧力は、腫瘍細胞が、別の機構を見つけて酸化的ストレス誘発性アポトーシスをバイパスする場合に軽減される。このような機構には、例えば、抗アポトーシス因子（Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬなど）の上方制御、またはＰＩ３’キナーゼ、ＰＴＥＮ、またはＴＰ５３のようなプロアポトーシス因子の下方制御、すなわち、ＰＩ３’キナーゼ内の活性か突然変異、およびＰＴＥＮ内の不活性突然変異（それぞれ、ＭＤＭ２がＴＰ５３を下方制御できるようにするＡＫＴ活性を増加させる）が挙げられる。
【０２２２】
例えば、ＰＩ３’キナーゼは、ＡＫＴのリン酸化を引き起こし、また、正常に機能したときにＭＤＭ２のリン酸化を減じるＡＫＴの活性化（リン酸化）を減じるＰＴＥＮによって平衡され、それによって、ＭＤＭ２が、細胞質から、ＭＤＭ２がタンパク質分解のためにＴＰ５３を標的とする核まで移動しないようにする。したがって、活性ＰＴＥＮは、ＴＰ５３の蓄積、故にアポトーシスの蓄積を助力する。次いで、ＰＩ３’キナーゼの活性化突然変異、またはＰＴＥＮの不活性化突然変異によって、ＡＫＴをＰ−ＡＫＴに過活性化させて、ＴＰ５３のレベルがほぼゼロになる。（ＰＩ３’キナーゼ内の活性化突然変異は、大腸癌の約３０％に生じる（Ｓａｍｕｅｌｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：５５４）。）ＰＩ３’キナーゼおよびＰＴＥＮ突然変異体は、高濃度の抗ＴＰ５３抗体アッセイを使用して、ＴＰ５３ゼロ腫瘍として現れる場合がある。ＴＰ５３の突然変異体自体ではない間は、機能的および予後的に、それらは区別できない。この区別は、ＰＩ３’キナーゼ−ＡＫＴ−ＭＤＭ２の経路の分子標的の候補である患者の識別に重要である。
【０２２３】
ＴＰ５３は、乳癌の内の１２乃至４０％において変異していることが報告されている（Ｏｌｉｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２：１１５７−１１６７）。遺伝子配列分析を使用した研究では、ＴＰ５３の突然変異の発生が１６％乃至４０であることを報告している。ＤＯ−７モノクローナル抗体を使用した代表的なＩＨＣ分析では、ＴＰ５３ゼロの突然変異体は見出されない（すなわち、いかなる抗原的に検出可能なＴＰ５３タンパク質も生成されない）。ＴＰ５３ゼロの突然変異体は、ナンセンス突然変異か、または挿入／欠失またはスプライシングエラーを伴う突然変異になりがちである。ＩＨＣを陽性で行い、かつ実際の遺伝子配列が行われた２６６人の患者のある研究では（Ａｓｋｍａｌｍ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌｏｇ  ４３：２３５）、ＩＨＣは、ＴＰ５３の突然変異の４８％（２２／４４）を検出した。ＩＨＣ陽性の５４の６１％（３２／４４）が、非変異ＴＰ５３を有した。いくつかの部位での突然変異は、予後のハザードの程度に差異を生させるので、これは、ＴＰ５３の機能の低下の程度の変化を反映する。ｐ６６−Ｓｈｃ媒介アポトーシスは、酸化的ストレスに応じて、活性ＴＰ５３に強く依存することが示された（Ｔｒｉｎｎｅｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１（２４）：３８７２−７８）。したがって、ナイーブ乳癌における正常および／または高レベルのｐ６６−Ｓｈｃは、ＴＰ５３の発現を遮断したか、または機能不活性のＴＰ５３を生成した突然変異によって、ＴＰ５３の発現を減じた。機能不活性のＴＰ５３は、細胞内に蓄積する傾向によって検出することができる（従来のＩＨＣによって、または高濃度の抗ＴＰ５３を使用して染色した細胞内に全く存在させないこと（ＭｃＣａｂｅ他、前掲）によって過剰発現される）。特に活性受容体チロシンキナーゼに結合するときに、ＰＩ３’キナーゼまたはＰＴＥＮ内の突然変異によって下方制御されたＴＰ５３は、高抗ＴＰ５３ＩＨＣ手法を使用して、陰性のＴＰ５３として現れる。
【０２２４】
それでも、正常なＴＰ５３は、酸化的ストレス誘発性のＤＮＡ損傷に応じた、または（ＴＰ５３の安定化による）酸化的ストレス自体に応じた、いくつかの腫瘍細胞内に蓄積する場合がある。これは、ＩＨＣ分析による「偽陽性」のＴＰ５３の突然変異をやや頻繁に生じさせる。このような「偽陽性」のＴＰ５３は、予後のハザードではなく、またｐ６６−Ｓｈｃのレベルに依存しないか、または残りの正常な細胞機構が、無駄に恒常的死亡の達成を試みるときに、低レベルのｐ６６−Ｓｈｃの発現と実際に選択的に相関する。
【０２２５】
上述の分析に基づくと、ＴＰ５３の予後能力のほとんど全てが、通常乃至高レベルのｐ６６−Ｓｈｃ発現に関連付けられるものと考えられる。これを試験するために、ＴＰ５３のレベル（蓄積された高レベルのＴＰ５３を検出するようにデザインされた、抗ＴＰ５３の量を使用して決定される）は、ＢＣＣＡ  Ｖ６の乳癌腫瘍のマイクロアレイデータセット（ＴＭＡ）におけるｐ６６−ＳｈｃおよびＤＳＳ（疾患特異的生存）に関して分析した（Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：ＬＢ２０１）。
【０２２６】
ＢＣＣＡ  ０１−０１１  Ｖ６の胸部ＴＭＡからのｐ６６−Ｓｈｃのスコアは、フラクショナルランクに変換した。変数はｐ６６ｂｉとして定義し、ここで、ｐ６６−Ｓｈｃのフラクショナルランクが０．５未満であればｐ６６ｂｉ＝１であり、ｐ６６−Ｓｈｃのフラクショナルランクが０．５以上であればｐ６６ｂｉ＝２である。ＴＰ５３の染色は、ＤＯ−７を使用した従来の方法によって行われ、陰性、弱い、または強い染色を有するものとして、ＧＰＥＣにおいてスコアした。これらは、陰性ならば０に、それ以外ならば１に再コード化される。染色された腫瘍（３０７）のうち、８％が弱いＴＰ５３の染色を示し、８％が強いＴＰ５３の染色を示した。
【０２２７】
ＴＰ５３を蓄積して疾患特異的生存を予測する能力は、まず、ｐ６６−Ｓｈｃのレベルの関数として、ＴＰ５３のログランク分析によって評価し、次いで、ソフトウェアＳＴＡＴＡ  ８を使用した、一変量および多変量Ｃｏｘ比例ハザード分析によって評価した。
【０２２８】
全母集団に対して、ＴＰ５３の蓄積の有無によって階層化した疾患特異的生存曲線は、全ての腫瘍に対するものを図２０Ａに、低ｐ６６−Ｓｈｃの腫瘍に対するものを図２０Ｂに、高ｐ６６−Ｓｈｃの腫瘍に対するものを図２０Ｃに示す。高レベルのｐ６６−Ｓｈｃを有する患者の場合、「変異」ＴＰ５３を蓄積した患者は、ＴＰ５３の蓄積の無い患者よりもはるかに悪い結果であった（Ｐ＝０．００００３、表１２を参照のこと）。これに対して、低レベルのｐ６６−Ｓｈｃを有する患者の場合は、ＴＰ５３が蓄積された患者は、ＴＰ５３の蓄積の無い患者よりもわずかに悪い結果であり、この悪い結果では、有意性は得られなかった（Ｐ＝０．６）（図２０Ｂ）。しかし、低ｐ６６−Ｓｈｃの患者における診断後の早い段階（６年未満）では、優位傾向があった（Ｐ＝０．２６）。他のＴＰ５３の研究と一致して、事実上、ＴＰ５３の特定のハザードの全ては、９年よりも前に観察される（図２０Ａおよび２０Ｃ）。
【０２２９】
Ｃｏｘ比例ハザードの一変量分析によって、ＴＰ５３の蓄積に関する全てのハザードが、高レベルのｐ６６−Ｓｈｃを有する患者に見られ、これらの患者は、その疾患によって死亡するリスクの高さは２倍未満であった（全母集団よりも１００倍大きな有意性がある）（表１２）。リスクにおけるこの差異は、多変量Ｃｏｘモデルにおいても保持された（ＨＲ＝９、Ｐ＝０．００１、高ｐ６６−Ｓｈｃを有する患者におけるＴＰ５３に対して、ＰＹ−Ｓｈｃ、結節状態、Ｈｅｒ−２、および共変量としてのＫｉ６７に対して調整）。
ＴＰ５３を蓄積した４６人の患者のうち、３２人（７０％）は、低ｐ６６−Ｓｈｃに関連していた。これは、ＩＨＣ測定によるＴＰ５３の蓄積に対して発行されている６０％の偽陽性率（非変異ＴＰ５３）よりもわずかしか大きくなかった。
【０２３０】
【表１４】
2009524048.tif 000035
【０２３１】
侵襲的な腫瘍を識別するためのｐ６６−Ｓｈｃの能力を説明するモデルと一致して、ＴＰ５３の蓄積に関連するほぼ全てのハザードが、腫瘍が高レベルのｐ６６−Ｓｈｃを有する患者内に見出された。さらに、モデル予測、およびＩＨＣアッセイによる変異ＴＰ５３の推定に対して偽陽性である比率に関して発行されたデータの両方と一致して、ＴＰ５３の蓄積の対部分には、いかなる予後的価値も無く、また低レベルのｐ６６−Ｓｈｃに関連していた。したがって、ｐ６６−ＳｈｃおよびＴＰ５３の独立予測値によって、患者のリスクをより正確に予測することができ、それによって、臨床医の治療法の決定を補助する。
【０２３２】
上述の分析の詳細は後述する。
．ｓｔｓ  ｔｅｓｔ  ｐ５３ｂｉ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｅｖｅｎｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍ  ＿ｔ：ｔｏｔａｌ＿ｆｏ
【０２３３】
【数２１】
2009524048.tif 000036
【０２３４】
．ｓｔｓ  ｔｅｓｔ  ｐ５３ｂｉ  ｉｆ  ｐ６６ｂｉ！＝．
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｅｖｅｎｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｔｏｔａｌ＿ｆｏ
【０２３５】
【数２２】
2009524048.tif 000037
【０２３６】
．ｓｔｓ  ｔｅｓｔ  ｐ５３ｂｉ  ｉｆ  ｐ６６ｂｉ＝＝ｌ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｅｖｅｎｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｔｏｔａｌ＿ｆｏ
【０２３７】
【数２３】
2009524048.tif 000038
【０２３８】
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｅｖｅｎｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｔｏｔａｌ＿ｆｏ
【０２３９】
【数２４】
2009524048.tif 000039
【０２４０】
．＊ＴＰ５３の予後／予測能力の全ては、高ｐ６６−Ｓｈｃの腫瘍内に存在する（上位５０％のｐ６６−Ｓｈｃスコア）
．ｄｉｓｐｌａｙ  ｃｈｉ２ｔａｉｌ（１，１７．６４）
．００００２６６９
．＊Ｃｏｘ分析
．ｓｔｃｏｘ  ｐ５３ｂｉ  ｉｆ  ｐ６６ｂｉ！＝．，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ  ＿ｄ：  ｅｖｅｎｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ  ＿ｔ：ｔｏｔａｌ＿ｆｏ
【０２４１】
【数２５】
2009524048.tif 000040
【０２４２】
．ｓｔｃｏｘ  ｐ５３ｂｉ  ｉｆ  ｐ６６ｂｉ＝＝ｌ，ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｅｖｅｎｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｔｏｔａｌ＿ｆｏ
【０２４３】
【数２６】
2009524048.tif 000041
【０２４４】
．  ｓｔｃｏｘ  ｐ５３ｂｉ  ｉｆ  ｐ６６ｂｉ  ＝  ＝  ２，  ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：  ｅｖｅｎｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｔｏｔａｌ＿ｆｏ
【０２４５】
【数２７】
2009524048.tif 000042
【０２４６】
実施例１０
ｐ６６−ＳｈｃおよびＴＰ５３は、どちらも早期ステージの大腸癌における疾患再発および疾患特異的生存に対する強力かつ独立した予後マーカである
【０２４７】
ＴＰ５３は、早期ステージの大腸癌のうちの４０乃至６０％において変異する（Ｉａｃｏｐｅｔｔａ  Ｂ  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ（２００３）２１：２７１−２７６；Ｌａｎｅ  ＤＰ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：１５−１６；Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ，２３：７５１８−７５２８）。しかし、機能的に、ＰＩ３キナーゼ（１１０ｋＤａサブユニット）における突然変異（結腸直腸癌のうちの３０％、Ｓａｍｕｅｌｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ）、またはＰＴＥＮ（結腸直腸癌のうちの１８％、Ｎａｓｓｉｆ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３（２）：６１７−２８）は、同様にＴＰ５３の発現が低く、したがって、約８０％以上の無調節の（機能しない）ＴＰ５３の頻度をもたらす。こうした予後のハザードのすべては、主に高ｐ６６−Ｓｈｃの腫瘍に見出される。実際に、図７において上述したＲＩＨ大腸データセットにおける、蓄積されたＴＰ５３の発現の分析および高レベルのｐ６６−Ｓｈｃとの関連は、これと一致する。
【０２４８】
下記の表１３に示されるように、最低６０％のｐ６６−Ｓｈｃスコアも有する腫瘍の中で、ほぼ２倍のｐ５３陽性腫瘍が存在するにもかかわらず、１４のうち１０の関連する蓄積したｐ５３は、最高レベルのｐ６６−Ｓｈｃを発現した腫瘍の４０％内に存在した。
表１３．大腸癌による大部分の疾患特異的死亡は、腫瘍も高レベルのｐ６６−Ｓｈｃを発現したＴＰ５３を蓄積した患者において生じる
定義：ｐ５３、ＴＰ５３が蓄積した＝１；蓄積せず＝０。ｐ６６ｑｕｉｎｔ、トラクショナルランクによる五分位数（１乃至５）におけるｐ６６−Ｓｈｃのスコアがｙｅｓ＝１；ｎｏ＝０。ｄｓｄ、疾患特異的死亡がｙｅｓ＝１；ｎｏ＝０。
Ｓｔａｔａによる計算：
．ｔａｂ  ｐ５３  ｐ６６ｑｕｉｎｔ
【０２４９】
【表１５】
2009524048.tif 000043
【０２５０】
表３．ｐ６６−ＳｈｃおよびＴＰ５３は、早期ステージの大腸癌における悪い結果の強力かつ独立した予後マーカである。
定義：ｐ６６ｓ、連続的な０乃至１のスケールに変換したｐ６６−Ｓｈｃのスコア。ｐ５３、表２にあるようなＴＰ５３のスコア。ｓｅｘｎ、女性は１；男性は２。ｓｔａｇｅ、ステージＩＩの疾患はＳｔａｇｅ＝２；ステージＩＩＩの疾患は３。ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｓｔａｔｕｓ、疾患が再発した場合は１、しなかった場合は０。ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｔｉｍｅｍｔｈ、再発または最終接触までの月数。
．ｓｔｃｏｘ  ｐ６６ｓ  ｐ５３  ｓｅｘｎ  ｓｔａｇｅ  ｉｆ  ｓｔａｇｅ！  ＝９，  ｎｏｌｏｇ
ｆａｉｌｕｒｅ＿ｄ：ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｓｔａｔｕｓ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ＿ｔ：ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｔｉｍｅｍｔｈｓ
【０２５１】
【表１６】
2009524048.tif 000044
【０２５２】
これらの分析によれば、ｐ６６−ＳｈｃもＴＰ５３も、早期ステージの大腸癌における疾患再発に対する、非常に強力で独立した予後マーカである。同様な分析においても、ｐ６６−ＳｈｃもＴＰ５３も、疾患特異的死亡に対する、非常に強力で独立した予後マーカであることを実証している。
【０２５３】
したがって、（高）ｐ６６−Ｓｈｃは、無調節のＴＰ５３によって腫瘍を識別しているので、大腸癌においてハザードである。よって、これらの患者は、細胞障害性化学療法に十分反応しないが、タキソールには良好に反応する（ＴＰ５３は、タキソール媒介の細胞死に関与しない）。したがって、ｐ６６−Ｓｈｃのレベルは、これらの患者のうちの８０％において高くなる。故に、高ｐ６６−Ｓｈｃは、変異（下方制御）ＴＰ５３とほぼ等しく、したがって、高ｐ６６−Ｓｈｃは、予後のハザード、一般的な無調節のＴＰ５３に対する代用マーカとして現れる。
【０２５４】
同等物
当業者は、単にルーチン実験を用いて、本願明細書に記載された本発明の特定の実施態様には多くの同等物があることを認識または確認することが可能であろう。このような同等物は、以下の請求項によって包含されるよう意図されたものである。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】Ｓｈｃマーカを使用した、ステージＩおよびステージＩＩの胃癌患者における、ＰＹ−Ｓｈｃ対ＲＦＳ％（再発せず生存している患者の割合）、およびＤＦＳ％（病死しない患者の割合）のドットプロットの図である。
【図２】高ＰＹ−Ｓｈｃまたは低ＰＹ−Ｓｈｃスコアを有する、ステージＩおよびステージＩＩの胃癌患者のカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図３】ＰＹ−Ｓｈｃスコアを使用した、ステージＩおよびステージＩＩの胃癌患者におけるＲＦＳ％およびＤＦＳ％のカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図４】何らかの原因による死亡の関数として、ステージＩおよびステージＩＩの胃癌におけるＰＹ−Ｓｈｃスコアのドットプロットの図である。
【図５】何らかの原因による死亡の関数として、ステージＩおよびステージＩＩの胃癌におけるｐ６６−Ｓｈｃスコアのドットプロットの図である。
【図６】高ＰＹ−Ｓｈｃまたは低ＰＹ−Ｓｈｃスコアの腫瘍を有する、ステージＩおよびステージＩＩの胃癌患者の全生存間の差異を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図７】ｐ６６−Ｓｈｃの関数として、ステージＩおよびステージＩＩの胃癌患者の疾患特異的生存を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。縦座標は、一部の生存する患者としての疾患特異的生存である。横座標は、診断後の月数である。ｐ６６ｂｉ＝０は、ｐ６６−Ｓｈｃスコア＜＝２．５であり、ｐ６６ｂｉ＝１は、ｐ６６−Ｓｈｃスコア＞２．５乃至５である。打ち切りデータは、曲線上に垂直ハッシュマークで示す。
【図８】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者の腫瘍グレードの関数として、疾患特異的死亡までの期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図９】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者の腫瘍ステージの関数として、疾患特異的死亡までの期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１０】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者のＰＹ−Ｓｈｃスコアの関数として、疾患特異的死亡までの期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１１】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者のｐ６６−Ｓｈｃスコアの関数として、疾患特異的死亡までの期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１２】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物のスコアの関数として、疾患特異的死亡までの期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１３】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者のＳｈｃの比率スコアの関数として、疾患特異的死亡までの期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１４】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者の腫瘍グレードの関数として、無再発生存の期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１５】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者の腫瘍ステージの関数として、無再発生存の期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１６】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者のＰＹ−Ｓｈｃスコアの関数として、無再発生存の期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１７】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者のｐ６６−Ｓｈｃスコアの関数として、無再発生存の期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１８】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物のスコアの関数として、無再発生存の期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図１９】ステージＩＩおよびステージＩＩＩの大腸癌患者のＳｈｃの比率スコアの関数として、無再発生存の期間を示すカプラン−マイヤー生存プロットの図である。
【図２０】全ての腫瘍の全母集団に対するＴＰ５３の蓄積の有無によって階層化した、カプラン−マイヤー生存プロットの図（図２０Ａ）、低ｐ６６−Ｓｈｃの腫瘍の全母集団に対するＴＰ５３の蓄積の有無によって階層化した、カプラン−マイヤー生存プロットの図（図２０Ｂ）、高ｐ６６−Ｓｈｃの腫瘍の全母集団に対するＴＰ５３の蓄積の有無によって階層化した、カプラン−マイヤー生存プロットの図（図２０Ｃ）である。
【図１】
2009524048.tif 000045
【図２】
2009524048.tif 000046
【図３】
2009524048.tif 000047
【図４】
2009524048.tif 000048
【図５】
2009524048.tif 000049
【図６】
2009524048.tif 000050
【図７】
2009524048.tif 000051
【図８】
2009524048.tif 000052
【図９】
2009524048.tif 000053
【図１０】
2009524048.tif 000054
【図１１】
2009524048.tif 000055
【図１２】
2009524048.tif 000056
【図１３】
2009524048.tif 000057
【図１４】
2009524048.tif 000058
【図１５】
2009524048.tif 000059
【図１６】
2009524048.tif 000060
【図１７】
2009524048.tif 000061
【図１８】
2009524048.tif 000062
【図１９】
2009524048.tif 000063
【図２０】
2009524048.tif 000064
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月17日(2009.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
性ホルモン非依存性癌治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、を含み、それによって、癌治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項２】
性ホルモン非依存性癌治療を受ける対象の生存の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、を含み、それによって、癌治療を受ける前記対象の生存の予後を診断する、方法。
【請求項３】
消化管癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から消化管の組織試料を得るステップと、
前記消化管の組織試料と、前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃに特異的に結合する抗体とを接触させるステップと、
免疫組織化学的アッセイにおいて、前記抗体を使用してチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃを検出することによって、前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記試料内の前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、
を含み、
前記対照試料内の量に対する前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、前記対象において前記消化管癌が再発することを示し、前記対照試料内の前記量に対する前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の減少は、前記対象において前記消化管癌が再発しないことを示し、それによって、消化管癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項４】
胃癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、
を含み、
前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の減少および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、前記対象において前記胃癌が再発することを示し、前記試料内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量の増加および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量の減少は、前記対象において前記胃癌が再発しないことを示し、それによって、胃癌の治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項５】
大腸癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、を含み、
ｐ６６−Ｓｈｃの量の増加は、前記対象において前記大腸癌が再発することを示し、それによって、大腸癌の治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項６】
大腸癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するＳｈｃの比率を決定するステップと、
前記Ｓｈｃの比率と、対照試料内に存在する対照Ｓｈｃの比率とを比較するステップと、
を含み、
前記試料内のＳｈｃの比率が低い場合、前記対象において大腸が再発することを示し、前記試料内のＳｈｃの比率が高い場合、前記対象において大腸が再発しないことを示し、それによって、大腸癌の治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項７】
大腸癌の治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内に存在するＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物を決定するステップと、
前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物と、対照試料内の対照ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物とを比較するステップと、を含み、
前記試料内のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が多い場合、前記対象において前記大腸癌が再発することを示し、前記試料内のＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が少ない場合、前記対象において前記大腸癌が再発しないことを示し、それによって、大腸癌の治療を受ける前記対象における癌の再発の予後を診断する、方法。
【請求項８】
前記方法は、前記対象から得られた前記試料の形態学的分析とともに行われる、請求項１乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記試料は、組織または細胞からなる群から選択される、請求項１、２、および４乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記試料は、胃組織、小腸組織、および大腸組織からなる群から選択された組織試料である、請求項１、２、および４乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記癌は、胃癌および大腸癌からなる群から選択される、請求項１乃至３のうちの１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記癌は、胃癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌は、大腸癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌は、ステージＩの胃癌またはステージＩＩの胃癌である、請求項１乃至４のうちの１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記癌は、ステージＩＩの大腸癌またはステージＩＩＩの大腸癌である、請求項１乃至３または５乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐ６６−Ｓｈｃの量だけが決定される、請求項１乃至４のうちの１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量だけが決定される、請求項１乃至４のうちの１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐ６６−Ｓｈｃおよびチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の両方の量が決定される、請求項１乃至４のうちの１つに記載の方法。
【請求項１９】
Ｓｈｃの数学的関係が決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
決定される前記Ｓｈｃの数学的関係は、前記Ｓｈｃの比率である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
決定される前記Ｓｈｃの数学的関係は、前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップは、ｐ６６−Ｓｈｃまたはチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）に特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む、請求項１、２、および４乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
前記決定するステップは、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリ、ＥＬＩＳＡ、および質量分析からなる群から選択される手法の使用を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｐ６６−Ｓｈｃの量は、核酸レベルで決定される、請求項１、２、４、または５のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸の量は、定量ＰＣＲおよび発現アレイ分析からなる群から選択された手法を使用して決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象は、ヒトである、請求項１乃至７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
性ホルモン非依存性癌細胞が侵襲的であるかどうかを決定するための方法であって、
前記細胞内のチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップと、を含み、それによって、前記癌細胞が侵襲的であるかどうかを決定する、方法。
【請求項２８】
前記癌細胞は、消化管癌細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌細胞は、組織試料内に存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料は、組織試料であり、胃組織、小腸組織、および大腸組織からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｐ６６−Ｓｈｃの量だけが決定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量だけが決定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｐ６６−Ｓｈｃおよびチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の両方の量が決定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
Ｓｈｃの数学的関係が決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
決定される前記Ｓｈｃの数学的関係は、前記Ｓｈｃの比率である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
決定される前記Ｓｈｃの数学的関係は、前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）およびｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップは、ｐ６６−Ｓｈｃまたはチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）に特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記決定するステップは、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリ、ＥＬＩＳＡ、および質量分析からなる群から選択される手法の使用を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
対象における消化器癌を治療するための治療計画の有効性を評価する方法であって、
ａ）前記治療計画の少なくとも一部を前記対象に施す前に前記対象から得られた第１の試料内に存在する、前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、
ｂ）前記治療計画の少なくとも一部を施した後に前記対象から得られた第２の試料内に存在する、前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量とを比較するステップを含み、
前記第２の試料に対して、前記第１の試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の量が少ない場合、前記治療計画が消化管癌の治療に有効であることを示し、前記第２の試料に対して、前記第１の試料内に存在するｐ６６−Ｓｈｃの量が多い場合、前記治療計画が前記対象における消化管癌の治療に有効であることを示す、方法。
【請求項４０】
対象における大腸癌を治療するための治療計画の有効性を評価する方法であって、
ａ）前記治療計画の少なくとも一部を前記対象に施す前に前記対象から得られた第１の試料内に存在する、前記Ｓｈｃの比率と、
ｂ）前記治療計画の少なくとも一部を施した後に前記対象から得られた第２の試料内に存在する、前記Ｓｈｃの比率とを比較するステップを含み、
前記第１の試料に対して、前記第２の試料内に存在するＳｈｃの比率が高い場合、前記治療計画が大腸癌の治療に有効であることを示し、前記第１の試料に対して、前記第２の試料内に存在するＳｈｃの比率が低い場合、前記治療計画は、前記対象における大腸癌の治療に有効ではないことを示す、方法。
【請求項４１】
対象における大腸癌を治療するための治療計画の有効性を評価する方法であって、
ａ）前記治療計画の少なくとも一部を前記対象に施す前に前記対象から得られた第１の試料内に存在する、前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物と、
ｂ）前記治療計画の少なくとも一部を前記対象に施した後に前記対象から得られた第２の試料内に存在する、前記ＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物とを比較するステップを含み、
前記第１の試料に対して、前記第２の試料内に存在するＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が少ない場合、前記治療計画が大腸癌の治療に有効であることを示し、前記第１の試料に対して、前記第２の試料内に存在するＰＹｐ６６−Ｓｈｃ生成物が多い場合、前記治療計画が前記対象における大腸癌の治療に有効ではないことを示す、方法。
【請求項４２】
前記治療計画は、手術、放射線、ホルモン治療、抗体治療、タンパク質チロシンキナーゼ抑制剤による治療、セリン／スレオニンキナーゼ抑制剤、成長因子、サイトカイン、および化学療法からなる群から選択される治療計画を含む、請求項３９、４０、または４１のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項４３】
前記方法は、前記対象から得られた前記試料の形態学的分析とともに行われる、請求項３９、４０、または４１のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項４４】
癌細胞の侵襲性を調整することができる化合物を選択する方法であって、
消化管癌細胞と、試験化合物とを接触させるステップと、
前記試験化合物の、前記癌細胞内の前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの発現および／または活性を調整する能力を決定するステップと、を含み、それによって、癌細胞の侵襲性を調整することができる化合物を識別する、方法。
【請求項４５】
前記癌細胞は、消化管癌細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記試験化合物の、前記癌細胞内の前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）の発現および／または活性を増加する能力、および／または前記細胞内の前記ｐ６６−Ｓｈｃの発現および活性を減少させる能力は、前記化合物が、消化管癌細胞の侵襲性を軽減させることを示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
癌治療を受ける対象における癌の再発の予後を診断するための方法であって、
前記対象から得られた試料内の変異ＴＰ５３の有無を決定するステップと、
前記対象から得られた前記試料内に存在する前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量を決定するステップと、
前記変異ＴＰ５３の有無と、対照試料内に存在する変異ＴＰ５３の有無とを比較するステップと、
前記チロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの量と、対照試料内に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）および／またはｐ６６−Ｓｈｃの対照量とを比較するステップとを含み、前記試料内のｐ６６−Ｓｈｃの量の増加および変異ＴＰ５３の存在は、前記対象において癌が再発することを示し、記試料内のｐ６６−Ｓｈｃの量の増加および変異ＴＰ５３の非存在は、前記対象において前記癌が再発しないことを示す、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
「腫瘍」または「癌」という用語は、当技術分野で既知であり、無制限増殖、不滅、転移能、急成長、および増殖速度などの、発癌性の細胞に特有の特性、および特定の特徴的形態を有する細胞が（例えば、対象に）存在することである。癌細胞は、しばしば腫瘍の形態であるが、このような細胞は、対象に単独で存在するか、または白血病細胞のような非腫瘍形成性の癌細胞である場合がある。本願明細書で使用する場合、「癌」という用語は、前癌状態の、および悪性の癌を含む。癌には、これに限定されないが、胃癌、結腸直腸癌、皮膚癌（例、黒色腫または基底細胞癌）、肺癌、頭部および頸部の癌、気管支癌、膵癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、口腔または咽頭の癌、肝癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的な組織の癌などが挙げられる。一実施形態では、癌は、消化管癌である。別の実施形態では、癌は、性ホルモン非依存性癌であり、例えば、この癌は、乳癌、前立腺癌、および／または卵巣癌ではない。
【国際調査報告】
2009524048.tif 000065
2009524048.tif 000066