(57)【要約】本発明は、生物体における細胞のアポトーシス状態を決めるのに有用な方法で、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された、動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが細胞のアポトーシス状態と相関する、方法、およびキットなどの製品を提供する。本発明の別の実施態様において、アポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定するためのインビボ診断法が提供される。この疾患としては、緑内障、黄班変性、増殖性網膜症、ニューロパシー、アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病および心疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
2009512700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における一つ以上の細胞のアポトーシス状態のインビボ判定法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、該カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該細胞のアポトーシス状態と相関する、方法。
【請求項２】
治療薬が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボ判定するための方法であって、以前に該治療薬によって治療されたことがあり、かつ、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤を導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該カスパーゼ親和性標識剤の存在が、該治療薬のアポトーシス調節能力と相関する、方法。
【請求項３】
前記方法は、前記治療薬が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
放射線治療が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボ判定するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該動物は以前に放射線で治療されたことがあり、該カスパーゼ親和性標識剤の存在が、該放射線のアポトーシス調節能力と相関する、方法。
【請求項５】
前記方法は、前記放射線治療が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定するためのインビボ診断法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無が、該疾患の有無と相関する、方法。
【請求項７】
前記疾患が、眼疾患、神経変性疾患、または心疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が、緑内障、黄班変性、増殖性網膜症、ニューロパシー、アルツハイマー病、多発性硬化症、またはハンチントン病である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも一つの治療薬または治療に対する疾患の感受性を評価するためのインビボ法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無を検出することを含み、該動物が以前に該治療薬または治療を受けたことがあり、該カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、少なくとも一つの治療薬または治療に対する該疾患の感受性と相関する、方法。
【請求項１０】
動物における癌治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある該動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関する、方法。
【請求項１１】
動物における白血病治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある該動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関する、方法。
【請求項１２】
動物における血液および骨髄疾患治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関する、方法。
【請求項１３】
一つ以上の化合物が、動物においてカスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するための方法であって、
少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを決定する工程であって、該動物はまた一つ以上の化合物と接触されている、工程、および、
該一つ以上の化合物が、該カスパーゼ活性を調節するかどうかを判定する工程を含む方法。
【請求項１４】
一つ以上の化合物が、動物においてアポトーシスを調節するかどうかを判定するための方法であって、
少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを決定する工程であって、該動物は一つ以上の化合物と接触されている、工程、および、
該一つ以上の化合物がアポトーシスを調節するかどうかを判定する工程を含む方法。
【請求項１５】
前記判定工程が、前記動物における親和性標識剤のレベルを、前記化合物に暴露されないコントロール動物と比較することを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記判定工程が、前記化合物に暴露される前の前記動物における親和性標識剤のレベルと、該動物が該化合物に暴露された後の親和性標識剤のレベルとを比較することを含む長期的な研究である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
検出が、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＴ、ＣＡＴ、ＰＥＴスキャン、シクチグラフィー（ｓｃｔｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ）、フローサイトメーター、レーザースキャニング・サイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー、発光マイクロプレートリーダー、発色マイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、発光顕微鏡、明視野顕微鏡、全身動物蛍光画像システム、全身動物発光画像システム、またはこれらの組み合わせを用いて実行される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
検出が、前記動物の体内に挿入されたウィンドウチェンバーを用いて行われる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
検出が、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、明視野顕微鏡、または発光顕微鏡を用いて行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
検出が、抽出、バイオプシー、静脈穿刺、切開、またはその他の適切な方法などによって、前記動物からサンプルを取り出すことによって実行、または確認され、検出は、該動物から取り出されたサンプルに対して行われる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出が、フローサイトメーター；レーザースキャニング・サイトメーター；蛍光マイクロプレートリーダー；発色マイクロプレートリーダー；蛍光顕微鏡；共焦点顕微鏡；明視野顕微鏡；発光マイクロプレートリーダー；または発光顕微鏡による、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記親和性標識剤の存在または豊富さが、前記動物の骨髄、胸腺、リンパ節、脾臓、または循環血において検出される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記親和性標識剤の存在または豊富さが、末梢血単球において検出される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、前記動物の組織、器官、または腫瘍に含まれる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記カスパーゼ親和性標識剤が、静脈内、血管内、腹腔内、硝子体内、眼球内、頭蓋内、胸膜内、胸腔内、筋肉内、肺内の注入、灌流、または洗浄投与によって前記動物に導入される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記動物が哺乳動物である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記カスパーゼ親和性標識剤が、式Ｉ：
Ｌ１−Ａ１−Ｘ１−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１’）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｆ    （Ｉ）
の化合物であり、式中、
Ｌ１は検出可能な基であり；
Ａ１は、直接結合、またはリンカーであり；
Ｘ１は、不在か、アミノ酸か、またはペプチドであり；および、
Ｒ１’は、アスパラギン酸側鎖、アスパラギン酸のエステル、該アスパラギン酸のアザペプチドエポキシド修飾、アザ−ペプチド・マイケルアクセプター、該アスパラギン酸の末端カルボキシル基のアルデヒド修飾、クロロメチルケトン基、またはアシルオキシ反応基を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出可能基がランタニド系列元素を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出可能基がポジトロンエミッターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出可能基が蛍光標識を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出可能基が放射性同位体を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出可能基が、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｅｕ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｒｅ、およびＴｃ、Ｉ  Ｂａ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ，６４Ｃｕ、フルオレセイン誘導体、スルフォローダミン誘導体、Ｃｙ染料誘導体、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、クマリン誘導体、Quantum Dot、３Ｈ、１４Ｃ、または３５Ｓを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
Ｘ１が、Ｖ、ＶＡ、ＹＶＡ、ＤＥＶ、ＬＥＥ、ＬＥＨ、ＶＤＶＡ、ＩＥＴ、ＷＨＥ、ＡＥＶ、Ａ、Ｖ、またはＥである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ１’が、ＣＨ２−ＣＯＯＨ、または−ＣＨ２ＣＯ２Ｒであり、式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはベンジル、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、またはＣＨ２Ｃ６Ｈ５である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記カスパーゼ親和性標識剤が、カルボキシフルオレセイン−バラニル−アラニル−アスパルチル（Ｏ−メチル）−フルオロメチルケトンである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記カスパーゼ親和性標識剤が細胞浸透性である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記カスパーゼ親和性標識剤が、活性触媒部位に共有結合することによって活性カスパーゼを阻害し、かつ、前記細胞内に保持される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
包装材料、一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤、注入用バッファー、および、インビボでアポトーシスレベルを定量するために該カスパーゼ親和性標識剤を使用するための説明書を含むアッセイキット。
【請求項４０】
前記一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤が、請求項２８〜３８のいずれか１項に記載の化合物を含む、請求項３９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この特許書面は、２００５年１０月21日に出願された米国出願第60/729,227号（この出願は、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
アネキシンＶおよびアネキシンＶ誘導体を用い、インビボにおけるアポトーシス検出および画像化の試みが為されている（例えば、非特許文献１；Ｂｅｌｈｏｃｉｎｅら、２００４；Ｒｅｄｄｙ，２００５；Ｂｏｅｒｍａｎら、２００５；Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６；Ｖａｎｄｅｒｈｅｙｄｅｎら、２００６；および、Ｃｏｒｓｔｅｎら、２００６を参照）。細胞原形質膜の正常組織の撹乱および変化に依存する新規化合物による他の試みも行われている（例えば、特許文献１および特許文献２を参照）。
【０００３】
従来記載される方法はどれも、アポトーシスの検出および画像化のために細胞浸透性プローブを用いていない。このこと、および他の不備のため、前述の方法は全て、いくつかの問題点を抱えることになり、その結果、背景ノイズが高くなり、ある種のアポトーシス腫瘍細胞に対する結合が欠如する。アネキシンＶは、細胞浸透性ではなく、いずれの組織に対しても浸透が遅く、高い背景ノイズを有し、かつ、初期のアポトーシス細胞を検出しない（非特許文献１；Ｂｅｌｈｏｃｉｎｅら、２００４；Ｂｏｅｒｓｍａら、２００５；Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６；Ｖａｎｄｅｒｈｅｙｄｅｎら、２００６；および、Ｃｏｒｓｔｅｎら、２００６）。背景ノイズが高くなってしまうのは、アネキシンＶが、正常で健康な骨髄由来細胞に積極的に結合するからである（Ｄｉｌｌｏｎ，２００１）。アネキシンＶは、必ずしも全ての腫瘍細胞に結合しないことが報告されている（Ｄｉｃｋｅｒ，２００５）。
【０００４】
Ｚｉｖ公刊物では（特許文献１および特許文献２）、発明人の化合物が、細胞壁の代謝回転を受けない細胞よりも、アポトーシス細胞の方に高速で蓄積することが報告されている。これによって、背景レベルが高くなり、アネキシンＶ同様、特異性が欠如する。危機的な細胞状態を要求することも、アポトーシスの初期段階にある細胞の検出を妨げる。
【０００５】
このようにして、インビボにおけるアポトーシス検出および画像化に関して従来記載される方法は、特異性および感度に欠け、高い背景ノイズに暴露される。アポトーシスに関与する特異的活性酵素およびプロテアーゼに対して結合する、高感度で、特異的な細胞恒久性抑制剤プローブの使用は従来記載されていない。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２４４８１２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２７６７５０号明細書
【非特許文献１】Ｋｉｅｔｓｅｌａｅｒら、Ｑ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ，（２００３）４７（４）３４９−３６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、生物体における細胞のアポトーシス状態のインビボ定量のための方法および製品が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（本発明のいくつかの実施態様の概要）
したがって、本発明のいくつかの実施態様は、インビボにおける、例えば、生物体、例えば、動物における細胞のアポトーシス状態を判定するのに有用な方法、およびキットなどの製品を提供する。
【０００８】
本発明は、インビボにおけるアポトーシス事象の検出および画像化を可能とする、上方調整カスパーゼおよびアポトーシス関連酵素に対して特異的に結合する、細胞恒久性プローブを提供する。
【０００９】
本発明のある実施態様は、動物における一つ以上の細胞のアポトーシス状態のインビボ判定法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤（caspase affinity labeling agent）が導入された動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、前記カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、細胞のアポトーシス状態と相関する、方法を提供する。
【００１０】
本発明のある実施態様は、治療薬が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボ判定するための方法であって、以前に該治療薬によって治療されたことがあり、かつ、以前に少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該カスパーゼ親和性標識剤の存在が、治療薬のアポトーシス調節能力と相関する、方法を提供する。本発明のある実施態様では、方法は、該治療薬が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する。
【００１１】
本発明のある実施態様は、放射線治療が、動物の一つ以上の細胞においてアポトーシスを調節するかどうかをインビボにおいて判定するための方法であって、以前に少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入されたことがある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該動物は以前に放射線治療を受けたことがあり、かつ、該カスパーゼ親和性標識剤の存在は、該放射線のアポトーシス調節能力と相関する、方法を提供する。本発明のある実施態様では、方法は、該放射線治療が、アポトーシスを増大させるか、または減少させるかを判定する。
【００１２】
本発明のある実施態様は、アポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定するためのインビボ診断法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された、動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在を検出することを含み、該少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無が、該疾患の有無と相関する、方法を提供する。
【００１３】
本発明のある実施態様では、該疾患として、眼疾患、例えば、緑内障、網膜疾患、例えば、黄班変性および増殖性網膜症；神経変性疾患、例えば、ニューロパシー、アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病など；および心疾患が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００１４】
本発明のある実施態様は、少なくとも一つの治療薬または治療に対する疾患の感受性を評価するためのインビボ法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入された動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の有無を検出することを含み、該動物が以前に該治療薬または治療を受けたことがあり、該カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、少なくとも一つの治療薬または治療に対する該疾患の感受性と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００１５】
本発明のある実施態様は、動物における癌治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００１６】
本発明のある実施態様は、動物における白血病治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００１７】
本発明のある実施態様は、動物における血液および骨髄疾患治療を監視するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、さらに治療薬または治療を受けたことのある動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、該治療薬または治療の効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００１８】
本発明のある実施態様は、化学ライブラリー中の一つ以上の化合物が、動物においてカスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、該ライブラリーの一つ以上の化合物と接触させられた動物の細胞において少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを定量すること、および、該一つ以上の化合物が該カスパーゼ活性を調節するかどうかを判定することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明のある実施態様は、化学ライブラリー中の一つ以上の化合物が、動物においてアポトーシスを調節するかどうかを判定するための方法であって、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤が導入され、該ライブラリーの一つ以上の化合物と接触させられた動物の細胞において、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤のレベルを定量すること、および、該一つ以上の化合物がアポトーシスを調節するかどうかを判定することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明のある実施態様では、該判定工程が、該動物における親和性標識剤のレベルを、該化合物に暴露されないコントロール動物と比較することを含む。
【００２１】
ある実施態様では、該判定工程が、該化合物に暴露される前と、該化合物に暴露された後の、該動物における親和性標識剤のレベルの比較から構成される、長期的な研究である。この場合、動物は、化合物に暴露される前に親和性標識剤に接触させられ、化合物に暴露されて後もう一度接触させられる。
【００２２】
本発明のある実施態様では、検出は、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＴ、ＣＡＴ、またはＰＥＴスキャン；フローサイトメーター；レーザースキャニング・サイトメーター；蛍光マイクロプレートリーダー；発光マイクロプレートリーダー、発色マイクロプレートリーダー；蛍光顕微鏡；共焦点顕微鏡；発光顕微鏡またはシンチグラフィー；明視野顕微鏡；全身動物蛍光画像システム（光学画像システム）；または、全身動物発光画像システム、またはこれらの組み合わせを用いて実行される。
【００２３】
本発明のある実施態様では、検出は、動物の体内に挿入されたウィンドウチェンバー（windowchamber）を用いて行われる。
【００２４】
本発明のある実施態様では、検出は、蛍光顕微鏡；共焦点顕微鏡；明視野顕微鏡、または発光顕微鏡を用いて行われる。
【００２５】
本発明のある実施態様では、検出は、抽出、バイオプシー、静脈穿刺、切開、またはその他の適切な方法によって動物からサンプルを取り出すことによって実行、または確認され、検出は、動物から取り出されたサンプルに対して行われる。
【００２６】
本発明のある実施態様では、検出は、フローサイトメーター；レーザースキャニング・サイトメーター；蛍光マイクロプレートリーダー；発色マイクロプレートリーダー；蛍光顕微鏡；共焦点顕微鏡；明視野顕微鏡；発光マイクロプレートリーダー；または発光顕微鏡を通じて行われる。
【００２７】
本発明のある実施態様では、親和性標識剤の存在または豊富さは、動物の骨髄、胸腺、リンパ節、脾臓、または、循環血において検出される。
【００２８】
本発明のある実施態様では、親和性標識剤の存在または豊富さは、末梢血単球（ＰＢＭＣ）において検出される。
【００２９】
本発明のある実施態様では、細胞は、動物の組織、器官、または腫瘍に含まれる。
【００３０】
本発明のある実施態様では、カスパーゼ親和性標識剤は、静脈内、血管内、腹腔内、硝子体内、眼球内、頭蓋内、胸膜内、胸腔内、筋肉内、肺内の注入、灌流、または洗浄投与によって動物に導入される。
【００３１】
本明細書で用いる動物という用語は、任意のタイプの生きている生物体、例えば、多細胞生物体を指す。本発明のある実施態様では、動物は哺乳動物である。本発明のある実施態様では、哺乳動物は、ヒトの男性または女性である。
【００３２】
本発明のある実施態様は、包装材料、および一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤、および、インビボでアポトーシスレベルを定量するためにカスパーゼ親和性標識剤を使用するための説明書を含むアッセイキットを提供する。
【００３３】
本発明のある実施態様では、カスパーゼ親和性標識剤は、式Ｉ：
Ｌ１−Ａ１−Ｘ１−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１’）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｆ    （Ｉ）
の化合物から成る細胞恒久性プローブである。
【００３４】
式中、Ｌ１は、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、または、他の、任意のランタニド系列元素（例えば、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、またはＬｕ）、または鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、レニウム（Ｒｅ）、またはテクネチウム（Ｔｃ）を含んでもよい検出可能な基である。この検出可能な基は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）検出、または発光またはシンチグラフィーにとって好適であってもよい。検出可能基は、例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴスキャン）、またはコンピュータ体軸断層撮影法（ＣＡＴスキャン）検出用として、ヨウ素（Ｉ）、またはバリウム（Ｂａ）であってもよい。検出可能基は、例えば、ポジトロン発射断層撮影法（ＰＥＴスキャン）用として、ポジトロンエミッター（例えば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、または６４Ｃｕ）であってもよい。検出可能基は、蛍光標識（例えば、フルオレセイン誘導体、スルフォローダミン誘導体、Ｃｙ染料誘導体、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、クマリン誘導体、Quantum Dot、または、例えば、直接、またはリンカーを介してアミノ基に付着させることが可能な任意の蛍光染料）であってもよい。検出可能基は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、または３５Ｓ）であってもよい。
【００３５】
Ａ１は、直接結合、または、単純に共有結合であってもよいリンカーである。この検出可能基は、ペプチドまたはアミノ酸の、Ｎ−末端アミノ基に直接付着されてもよい（例えば、アミド結合Ｌ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ）。Ａ１はまた、任意の数の、当該技術分野で周知のリンカークラスであってもよい。リンカーは、通常、炭素、窒素、酸素、または硫黄原子を含む、約４〜１８原子長を有する。
【００３６】
Ｘ１は、不在か、アミノ酸か、または、約１から１０個のアミノ酸を持つペプチド、例えば、約２から４個のアミノ酸持つペプチド（例えば、Ｖ、ＶＡ、ＹＶＡ、ＤＥＶ、ＬＥＥ、ＬＥＨ、ＶＤＶＡ、ＩＥＴ、ＷＨＥ、またはＡＥＶ）であってもよいペプチドである。式（Ｉ）の化合物において、Ｘ１は、天然のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｖ、またはＥ）であってもよい。式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１’は、メチレンカルボキシ（エタン酸）側鎖（ＣＨ２−ＣＯＯＨ）であってもよい。なぜなら、カスパーゼは、通常、ペプチド基質のＰ１位置にアスパラギン酸塩を有するからである。
【００３７】
Ｒ１’は、例えば、アスパラギン酸側鎖（ＣＨ２−ＣＯＯＨ）か、またはアスパラギン酸のエステル（例えば、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはベンジル、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、またはＣＨ２Ｃ６Ｈ５）である。あるカスパーゼ親和性標識プローブは、同じ標識、および１から５個のアミノ酸配列を含んでもよいが、アスパラギン酸のアザ−ペプチドエポキシド修飾（例えば、米国特許第７，０５６，９４７Ｂ２号を参照）、またはアザ−ペプチド・マイケルアクセプター（Ｅｋｉｃｉら、２００４）、該アスパラギン酸の末端カルボキシル基のアルデヒド修飾（ＨＣ＝Ｏ）、クロロメチルケトン基（ＣＨ２Ｃｌ）、またはアシルオキシ反応基（（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ａｒ、式中、Ａｒは、［２，６−（ＣＦ３）２］ベンゾエート、または、その、各種誘導体である）（Ｋｒａｎｔｚら、１９９１、およびＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９４）を利用してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
（詳細な説明）
本発明のある実施態様は、ヒトなどの生物体における細胞のアポトーシス状態を判定するのに有用な方法、およびキットなどの製品を提供する。
【００３９】
ある実施態様では、本発明は、ヒトなどの哺乳動物において、例えば、組織、器官、または腫瘍に含まれてもよい、一つ以上の細胞（例えば、全体生細胞）のアポトーシス状態のインビボ判定のための方法であって、１）被検体中に、例えば、静脈内、血管内、腹腔内、硝子体内、眼球内、頭蓋内、胸膜内、胸腔内、筋肉内、肺内の注入、灌流、または洗浄投与によって導入される、少なくとも一つのカスパーゼ親和性標識剤と、インビボで細胞を接触させること；および、２）少なくとも一つの親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、カスパーゼ親和性標識剤の存在または豊富さが、細胞のアポトーシス状態と相関する、方法を提供する。
【００４０】
本発明のある実施態様では、カスパーゼ親和性標識剤は、細胞浸透性プローブである。カスパーゼ親和性標識剤は、活性触媒部位に共有的に結合することによって活性カスパーゼを阻害してもよく、かつ、細胞内に保持されると考えられる。これらの、標識された膜恒久性プローブは、生細胞の細胞膜に浸透し、アポトーシス細胞内の活性カスパーゼ酵素に共有的に結合し、それによって、アポトーシスの特異的および高感度検出を可能とすると考えられる（Ｂｅｄｎｅｒら、２０００，Ｓｍｏｌｅｗｓｋｉら、２００１、およびＳｍｏｌｅｗｓｋｉら、２００２）。本発明のある実施態様では、カスパーゼ親和性標識剤は、式Ｉ：
Ｌ１−Ａ１−Ｘ１−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１’）Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｆ    （Ｉ）
の化合物である。
【００４１】
式中、Ｌ１は、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、または、他の、任意のランタニド系列元素（例えば、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、またはＬｕ）、または鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、レニウム（Ｒｅ）、またはテクネチウム（Ｔｃ）を含む検出可能な基である。この検出可能な基は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）検出、または発光またはシンチグラフィーにとって好適であってもよい。検出可能基は、例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴスキャン）、またはコンピュータ体軸断層撮影法（ＣＡＴスキャン）検出用として、ヨウ素（Ｉ）、またはバリウム（Ｂａ）であってもよい。検出可能基は、例えば、ポジトロン照射断層撮影法（ＰＥＴスキャン）用の、ポジトロンエミッター（例えば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ，または６４Ｃｕ）であってもよい。検出可能基は、蛍光標識（例えば、フルオレセイン誘導体、スルフォローダミン誘導体、Ｃｙ染料誘導体、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、クマリン誘導体、Quantum Dot、または、例えば、直接、またはリンカーによってアミノ基に付着させることが可能な任意の蛍光染料）であってもよい。検出可能基は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、または３５Ｓ）であってもよい。
【００４２】
Ａ１は、直接結合、または、単純に共有結合であってもよいリンカーである。この検出可能基は、ペプチドまたはアミノ酸の、Ｎ−末端アミノ基に直接付着されてもよい（例えば、アミド結合Ｌ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ）。Ａ１はまた、任意の数の、従来技術で周知のリンカークラスであってもよい。リンカーは、通常、炭素、窒素、酸素、または硫黄原子を含む、約４−１８原子長である。
【００４３】
Ｘ１は、不在か、アミノ酸か、または、約１から１０個のアミノ酸を持つペプチド、例えば、約２から４個のアミノ酸持つペプチド（例えば、Ｖ、ＶＡ、ＹＶＡ、ＤＥＶ、ＬＥＥ、ＬＥＨ、ＶＤＶＡ、ＩＥＴ、ＷＨＥ、またはＡＥＶ）であってもよいペプチドである。式（Ｉ）の化合物において、Ｘ１は、天然のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｖ、またはＥ）であってもよい。式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１’は、メチレンカルボキシ（エタン酸）側鎖（ＣＨ２−ＣＯＯＨ）であってもよい。なぜなら、カスパーゼは、通常、ペプチド基質のＰ１位置にアスパラギン酸塩を有するからである。
【００４４】
Ｒ１’は、アスパラギン酸側鎖（ＣＨ２−ＣＯＯＨ）か、またはアスパラギン酸のエステル（例えば、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはベンジル、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、またはＣＨ２Ｃ６Ｈ５）である。ある種のカスパーゼ親和性標識プローブは、同じ標識および１から５個のアミノ酸配列を含んでもよいが、アスパラギン酸のアザ−ペプチドエポキシド修飾（例えば、米国特許第７，０５６，９４７Ｂ２号を参照）、またはアザ−ペプチド・マイケルアクセプター（Ｅｋｉｃｉら、２００４）、該アスパラギン酸の末端カルボキシル基のアルデヒド修飾（ＨＣ＝Ｏ）、クロロメチルケトン基（ＣＨ２Ｃｌ）、またはアシルオキシ反応基（（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ａｒ、式中、Ａｒは、［２，６−（ＣＦ３）２］ベンゾエート、または、その、各種誘導体である）（Ｋｒａｎｔｚら、１９９１、およびＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９４）を利用してもよい。
【００４５】
下記の構造体は、式Ｉの化合物の例であるが、本発明は、これらの構造体に限定されない。「レポーター標識」という用語は、「検出可能基」と相互交換的に使用される。
【００４６】
一例は、活性カスパーゼの触媒部位のシステイン残基に結合すると考えられる、Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ修飾反応性末端である。
【００４７】
【化１】
2009512700.tif 000003
蛍光標識ＦＭＫカスパーゼリガンドの一例は、カルボキシフルオレセイン−バラニル−アラニル−アスパルチル（Ｏ−メチル）−フルオロメチル・ケトンである。
【００４８】
【化２】
2009512700.tif 000004
金属キレート標識ＦＭＫカスパーゼリガンドの一例は、Ｔｃ−バラニル−アラニル−アスパルチル（Ｏ−メチル）−フルオロメチル・ケトンである。
【００４９】
【化３】
2009512700.tif 000005
一旦フルオロメチルケトンペプチドが細胞内に侵入し、活性カスパーゼと接触すると、その配列が、触媒部位によって認識され、３工程プロセスを介して共有結合を形成すると考えられる。第一工程では、チオヘミケタル中間体の形成が起こると考えられる。
【００５０】
【化４】
2009512700.tif 000006
このチオヘミケタル中間体は再編成を経て、３員のスルフォニウム中間体を形成すると考えられる。
【００５１】
【化５】
2009512700.tif 000007
第２中間体は再編成して、最終的な、安定なチオエーテル付加物を与え、この付加物はアポトーシス細胞の中に保持されると考えられる。
【００５２】
【化６】
2009512700.tif 000008
下記の構造体は、反応性末端の、アザ−ペプチドエポキシド修飾の一例であり、反応性末端は、活性カスパーゼの触媒部位のシステイン残基に結合すると考えられる。
【００５３】
【化７】
2009512700.tif 000009
蛍光標識アザ−ペプチドエポキシド修飾カスパーゼリガンドの一例は、カルボキシフルオレセイン−バラニル−アラニル−アザアスパルチル（Ｏ−メチル）−エポキシドである。
【００５４】
【化８】
2009512700.tif 000010
金属キレート標識アザ−ペプチドエポキシド修飾カスパーゼリガンドの一例は、Ｔｃ−バラニル−アラニル−アザアスパルチル（Ｏ−メチル）−エポキシドである。
【００５５】
【化９】
2009512700.tif 000011
一旦アザ−ペプチドエポキシド修飾ペプチドが細胞内に侵入し、活性カスパーゼと接触すると、その配列が、触媒部位によって認識され、共有結合を形成するが、その際、活性部位のシステインが、３員環を求核的に攻撃して、アポトーシス細胞に残留することになる最終産物を形成すると考えられる。
【００５６】
【化１０】
2009512700.tif 000012
Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＯＰｈ修飾反応性末端は、活性カスパーゼの触媒部位のシステイン残基に結合すると考えられる。
【００５７】
【化１１】
2009512700.tif 000013
蛍光標識ＯＰｈカスパーゼリガンドの一例は、カルボキシフルオレセイン−バラニル−アラニル−アスパルチル（Ｏ−メチル）−ベンゾイルオキシメチルケトンである。
【００５８】
【化１２】
2009512700.tif 000014
金属キレートＯＰｈカスパーゼリガンドの一例は、Ｔｃ−バラニル−アラニル−アスパルチル（Ｏ−メチル）−ベンゾイルオキシメチルケトンである。
【００５９】
【化１３】
2009512700.tif 000015
合成後、薬剤は、好適な有機溶媒、例えば、アセトン、アセトニトリル、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、１，４−ジオキサン、またはテトラヒドロフランに溶解することによってさらに処理して、バイアルに納めてもよい。一旦溶解させたならば、薬剤は、次に、適切な、非水性または水性液体で希釈し、個々のバイアルに投下してもよい。個々のバイアルは、０℃未満に冷却し、１０から５００ミリトールの真空下−８０℃から＋１００℃で、液体窒素またはドライアイストラップを用いて、または用いずに凍結乾燥してもよい。次に、個別バイアルにキャップを被せ、−８０℃から２０℃の間で保存することが可能である。
【００６０】
インビボアポトーシス検出および画像化キットは、一本以上の、試薬（例えば、処理および凍結乾燥試薬）バイアル、および適切な注入用バッファー（例えば、１０×注入用バッファーの瓶）を含んでもよい。１０×注入用バッファーは、エンドトキシン非含有ＤＩ  Ｈ２Ｏにおける下記のレシピに従って調製されてもよい。
８７．６６ｇ／ＬのＮａＣｌ（１．５Ｍ）、６０．５３ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ＋４．８４ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．２Ｍリン酸塩）、ｐＨ６．９。
【００６１】
使用前、試薬は、ＤＭＳＯに溶解してもよく、直ちに、または、分液して、例えば、−２０℃未満で保存してもよい。この１０×注入用バッファーは、エンドトキシン非含有ＤＩ  Ｈ２Ｏにおいて１：１０に希釈し、フィルター滅菌し、７．４の最終ｐＨとしてもよい。試薬は、滅菌された１×注入用バッファーにおいて注入濃度に希釈されてもよい。試薬は、ｋｇ当たり０．１マイクロモルからｋｇ当たり１．０ミリモルにおいて動物に注入されてもよい。次に、試薬を、例えば、約５分から数時間動物の全身に循環させ、それからアポトーシスの検出および画像化を行ってもよい。
【００６２】
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物における一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍において、治療薬がアポトーシスを誘発するかどうかをインビボ判定するための方法であって、１）被検体を該治療薬で治療すること；２）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および３）細胞、組織、器官、または腫瘍において基Ｌの存在を検出することを含み、Ｌの存在が、該治療薬のアポトーシス誘発能力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００６３】
本発明のある実施態様はさらに、ヒトを含む哺乳動物における一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍において、治療薬がアポトーシスを緩和または抑制するかどうかをインビボ判定するための方法であって、１）被検体を該治療薬で治療すること；２）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および３）細胞、組織、器官、または腫瘍において基Ｌの存在を検出することを含み、Ｌの存在が、該薬剤がアポトーシスを緩和または抑制するかどうかと、負の相関をすることを特徴とする、方法を提供する。
【００６４】
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物における一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍において、放射線治療がアポトーシスを誘発するかどうかをインビボ判定するための方法であって、１）被検体を放射線で治療すること；２）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および３）細胞、組織、器官、または腫瘍において基Ｌの存在を検出することを含み、Ｌの存在が、該治療薬のアポトーシス誘発能力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００６５】
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物における一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍において、放射線がアポトーシスを緩和または抑制するかどうかをインビボ判定するための方法であって、１）被検体を放射線で治療すること；２）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および３）細胞、組織、器官、または腫瘍において基Ｌの存在を検出することを含み、Ｌの存在が、該治療薬がアポトーシスを緩和または抑制するかどうかと、否定的な意味で相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００６６】
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物中の一つ以上の全体生細胞、組織、器官、または腫瘍におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定するためのインビボ診断法であって、１）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および２）細胞、組織、器官、または腫瘍において基Ｌの存在を検出することを含み、Ｌの存在が、疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００６７】
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物の網膜内の一つ以上の全体生細胞におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定することによって黄班変性および増殖性網膜症を診断するためのインビボ診断法であって、１）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および２）網膜において基Ｌの存在を検出することを含み、Ｌの存在が、疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００６８】
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物中の一つ以上の網膜グリア細胞におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定することによって緑内障を診断するためのインビボ診断法であって、１）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および２）網膜グリア細胞において基Ｌの存在を検出することを含み、Ｌの存在が、疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００６９】
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物の心臓組織内の一つ以上の全体生細胞におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定することによって心疾患における損傷量を評価するためのインビボ診断法であって、１）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および２）心臓組織において基Ｌの存在を検出することを含み、Ｌの存在が、該疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００７０】
本発明のある実施態様は、ヒトを含む哺乳動物の神経組織および脳内の一つ以上の全体生細胞および神経細胞におけるアポトーシスの存在によって特徴づけられる疾患の有無を判定することによって神経変性疾患における損傷量を評価するためのインビボ診断法であって、１）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および２）神経組織において基Ｌの存在を検出することを含み、Ｌの存在が、該疾患の有無と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００７１】
本発明のある実施態様は、哺乳動物における疾患の、治療薬または治療に対する感受性を評価するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該疾患の感受性と相関する、方法であって、１）哺乳動物に、治療薬または治療を施すこと、２）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および３）細胞、組織、器官、または腫瘍において親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、該存在または豊富さが、感受性と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００７２】
本発明のある実施態様は、癌治療を監視するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該治療の効力と相関する、方法であって、１）被検体に、治療薬または治療を施すこと、２）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および３）細胞、組織、器官、または腫瘍において各親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、アポトーシスの存在または豊富さが、効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００７３】
本発明のある実施態様は、白血病の治療を監視するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該治療の効力と相関する、方法であって、１）被検体に、治療薬または治療を施すこと、２）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；および３）骨髄、胸腺、リンパ節、脾臓、および循環血において親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、アポトーシスの存在または豊富さが、効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００７４】
本発明のある実施態様は、血液および骨髄疾患治療を監視するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該治療の効力と相関する、方法であって、１）被検体に、治療薬または治療を施すこと、２）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；３）血液を抽出し、末梢血単球（ＰＢＭＣ）を調製すること、および、４）細胞において親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、アポトーシスの存在または豊富さが、治療効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００７５】
本発明のある実施態様は、白血病治療を監視するための方法で、アポトーシス活性の存在、またはアポトーシス活性のレベルが、ヒトを含む哺乳動物における該治療の効力と相関する、方法であって、１）被検体に、治療薬または治療を施すこと、２）被検体にカスパーゼ親和性標識剤を導入すること；３）血液を抽出し、末梢血単球（ＰＢＭＣ）を調製すること、および、４）該細胞において親和性標識剤の存在または豊富さを検出することを含み、アポトーシスの存在または豊富さが、治療効力と相関することを特徴とする、方法を提供する。
【００７６】
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、哺乳動物においてカスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するための方法であって、
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、および、
被検体を、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること、および、
化合物がカスパーゼ活性を調節したかどうかを判定するために、被検体における親和性標識剤のレベルを、化合物に暴露されないコントロール被検体と比較することを含む、方法を提供する。
【００７７】
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、ヒトを含む哺乳動物においてアポトーシスを誘発するかどうかを判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させること、および、
被検体を、アポトーシス親和性標識剤に接触させること、および、
化合物が、アポトーシスを誘発するかどうかを判定するために、被検体における親和性標識剤のレベルを、化合物に暴露されないコントロール被検体と比較することを含む、方法を提供する。
【００７８】
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、ヒトを含む哺乳動物においてアポトーシスを緩和するかどうかを判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させること、および、
被検体を、アポトーシス親和性標識剤に接触させること、および、
化合物が、アポトーシスを緩和するかどうかを判定するために、被検体における親和性標識剤のレベルを、化合物に暴露されないコントロール被検体と比較することを含む、方法を提供する。
【００７９】
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、哺乳動物においてカスパーゼ活性を調節するかどうかについて長軸的に判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させる前に、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること；および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、次に、
被検体をカスパーゼ親和性標識剤に接触させること；および、
化合物が、カスパーゼ活性を調節するかどうかを判定するために、化合物に対する暴露前の被検体における親和性標識剤のレベルを（化合物に対する暴露後の被検体における親和性標識剤のレベルと）比較することを含む、方法を提供する。
【００８０】
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、ヒトを含む哺乳動物においてアポトーシスを誘発するかどうかを判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させる前に、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること；および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、次に、
被検体をカスパーゼ親和性標識剤に接触させること；および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および、
化合物が、カスパーゼ活性を誘発するかどうかを判定するために、化合物に対する暴露前の被検体における親和性標識剤のレベルを（化合物に対する暴露後の被検体における親和性標識剤のレベルと）比較することを含む、方法を提供する。
【００８１】
本発明のある実施態様は、例えば、化学ライブラリー内の一つ以上の化合物が、ヒトを含む哺乳動物においてアポトーシスを緩和するかどうかを判定するための方法であって、
被検体を、一つ以上の化合物に接触させる前に、カスパーゼ親和性標識剤に接触させること；および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および
ヒトを含む哺乳動物を、一つ以上の化合物に接触させること、次に、
被検体をカスパーゼ親和性標識剤に接触させること；および、
被検体における親和性標識剤のレベルを定量すること、および、
化合物が、カスパーゼ活性を下げるかどうかを判定するために、化合物に対する暴露前の被検体における親和性標識剤のレベルを（化合物に対する暴露後の被検体における親和性標識剤のレベルと）比較することを含む、方法を提供する。
【００８２】
本発明のある実施態様では、検出は、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＴ、ＣＡＴ、ＰＥＴスキャン、またはシンチグラフィー；フローサイトメーター；レーザースキャニング・サイトメーター；蛍光マイクロプレートリーダー；発光マイクロプレートリーダー、発色マイクロプレートリーダー；蛍光顕微鏡；共焦点顕微鏡；発光顕微鏡；明視野顕微鏡；全身動物蛍光画像システム（光学画像システム）；または、全身動物発光画像システムを用いて実行される。
【００８３】
本発明のある実施態様では、検出は、直接観察のために、試験被検体の体内に挿入されたウィンドウチェンバーを用いて行われる。
【００８４】
本発明のある実施態様では、検出は、蛍光顕微鏡；共焦点顕微鏡；明視野顕微鏡、または発光顕微鏡を用いて行われる。
【００８５】
本発明のある実施態様では、検出は、試験被検体からサンプルを取り出すことによって、例えば、抽出、バイオプシー、静脈穿刺、切開、またはその他の適切な方法によって実行、および／または確認され、検出は、フローサイトメーター；レーザースキャニング・サイトメーター；蛍光マイクロプレートリーダー；発色マイクロプレートリーダー；蛍光顕微鏡；共焦点顕微鏡；明視野顕微鏡；発光マイクロプレートリーダー；または発光顕微鏡によって行われる。
【００８６】
本発明のある実施態様は、１）一つ以上のカスパーゼ親和性標識剤；２）１０×注入用バッファー；および３）インビボにおけるアポトーシスレベル定量用化合物を用いるための説明書を含む包装材料を含む、アッセイキットなどのキットを提供する。
【００８７】
以上本発明は、様々の、特定の、好ましい実施態様および技術を参照しながら説明された。しかしながら、本発明の精神および範囲の内に留まりながら、多くの変更および修飾の実行が可能であることを理解しなければならない。
【実施例】
【００８８】
（実施例１）
マウスのウィンドウチェンバー・モデルを用い、ＳＣＫ乳腺腫瘍について、三酸化砒素（ＡＴＯ）および熱による照射治療後の腫瘍におけるアポトーシス誘発レベルを評価した。腫瘍の目視のために用いたウィンドウチェンバーは、Ａ／Ｊマウスの皮膚襞の上に設置した。２×１０５個のＳＣＫ乳腺癌細胞を、この皮膚襞の中に注入した。腫瘍を７から９日間増殖させた。試験マウスでは、２０Ｇｙ、８ｍｇ／ｋｇのＡＴＯを照射し、２時間後、腫瘍を４１．５℃で６０分加熱した。コントロールマウスは、照射または加熱処理をせず、ＡＴＯの代わりにプラシーボを注入した。
【００８９】
腫瘍を７日間増殖させた後、先ず、試験マウスを２０Ｇｙで照射した。その直後に、ＡＴＯの腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注入を行った。ＡＴＯは、水に溶解し、５％ｗ／ｖデキストロース含有のＰＢＳにおいて、８ｍｇ／ｋｇ濃度の溶液として注入した。２時間後、腫瘍を４１．５℃で６０分加熱した。コントロールマウスには、５％デキストロース含有ＰＢＳのＩ．Ｐ．注入を行った。
【００９０】
治療前、腫瘍を、コントロールマウスと、表示された試験マウスにおいて調べた。ウィンドウチェンバー越しに撮影された、ＳＣＫ乳腺腫瘍の、低倍率明視野画像複合写真から、全ての腫瘍に低レベルの出血が明らかにされた（図１）。
【００９１】
治療３時間後、低倍率明視野画像複合写真から、コントロールマウスでは、持続的な低レベルの出血が、試験マウスでは高レベルの出血が示された（図２）。これは治療の効力を実証する。２４時間後、コントロールマウスでは、同じレベルの出血が見られ、治療を受けた試験マウスでは、出血レベルが増加し続けた（図３）。
【００９２】
コントロールおよび試験マウスの尾部静脈に、インビボアポトーシス検出試薬、ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを注入することによってアポトーシスを検出した。５２μｇのＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを含む、処理済試薬バイアルを、５０μＬのＤＭＳＯに溶解した。この溶液を、２００μＬの滅菌１×注入用バッファーを加えて希釈した。この希釈試薬について、４０μＬ（８．３μｇ）を、尾部静脈からＩ．Ｖ．注入し、マウスの体内を３０分間循環させた。各腫瘍におけるアポトーシスレベルは、４８８ｎｍの励起波長およびＦＩＴＣフィルターを用い、ウィンドウチェンバー越しに高倍率で直接目視で定めた。
【００９３】
コントロールマウスには、プラシーボ注入後ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを与えた。これらのマウスでは、急速に増殖する腫瘍から予想されるように、低レベルのアポトーシスが示された（図４）。ＡＴＯ治療を受けた試験マウスには、ＡＴＯ治療の３時間後、および２４時間後にＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを与え、アポトーシスを、前述のように評価した。３時間後、図５に見られるように、アポトーシスのレベルに確実な増加が見られた。２４時間後、アポトーシスレベルはさらに高くなった（図６）。
【００９４】
別の一組のマウスにおいて、腫瘍を７日間増殖させた。コントロールマウスには、前述のようにプラシーボ注入を行い、試験マウスには、前述のようにＡＴＯ注入を行った。２４時間後、全てのマウスに、前述のようにＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫのＩ．Ｖ．注入を行った。インビボにおけるアポトーシス検出・画像試薬を、各マウスの体内に３０分循環させた。腫瘍関連アポトーシスのインビボ画像化後、チェンバーから腫瘍をトリプシン液に掻き落とすことによって、腫瘍組織をウィンドウチェンバーから収集し、これを、１０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼおよび５μｇ／ｍｌのコラゲナーゼと共に３０分攪拌し、７０μＭ細胞用篩を用いてこの縣濁液をろ過した。次に、ウィンドウチェンバーから得られた細胞集団におけるアポトーシスの分析のために、フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳ口径フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、サンホセ、カリフォルニア州）を用いて行った。データは全て、事象獲得を１０，０００事象に設定して得られた。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏサイトメーターソフトウェアを用いて分析した。結果は、アポトーシスの２倍の増加を示した。すなわち、コントロールマウスは１８％のアポトーシス細胞を有し、試験マウスは３９％のアポトーシス細胞を有していた（図７）。
【００９５】
（実施例２）
ＡＴＯ治療前後において、ＦＳａＩＩマウス線維肉腫に対する、三酸化砒素（ＡＴＯ）の効力を、ウィンドウチェンバーを通じて評価するために、ｎｕ／ｎｕマウスを用いて長軸実験を行った。
【００９６】
背部皮膚片チェンバー（ＤＳＦＣ）を、下記のように、ｎｕ／ｎｕマウスの背部に外科的に埋め込んだ。埋め込み処置は全て、滅菌視野を保持するために層流フード内で行った。皮膚は、ベタジンで二度洗浄し、乾燥させた。丸窓（９ｍｍ）を含む、一方の滅菌チェンバー片を、背部皮膚襞の一側に設置した。３本の接続ネジ用の孔を、皮膚襞に貫通させ、同様の窓を持つ、もう一つのチェンバー片と接続した。次に、このアッセンブリを、チェンバー片スペーサを介在させた状態で、ネジで堅く締め合わせた。ＤＳＦＣウィンドウ内の皮膚襞から、円形の皮膚組織および筋膜を注意深く切り取り、対向する皮膚襞の横紋筋に隣接する皮下組織の血管を露出した。ＤＳＦＣウィンドウ内部の外傷辺縁に、抗生物質軟膏（亜鉛バシトラシン／ポリミキシンＢ硫酸塩／ネオマイシン硫酸塩）を用いた。露出組織を覆うために、ガラスウィンドウをチェンバーに設置し、スナップ型Ｃ−リングによって固定した。次に、反対側のＤＳＦＣウィンドウで外科的外傷処置を繰り返し、両方のウィンドウ越しに、筋膜および血管から成る、きわめて薄い透明層（組織を通過する、顕微鏡光の透過を促進するために創出された）が見えるようにした。最後に、チェンバーを皮膚に縫合した。
【００９７】
術後、動物たちは、３２℃に維持された加湿恒温器内の障壁ケージに、食物および水を自由に得られる状態で収容された。感染のリスクを最小にするために、マウスには全て、ＤＳＦＣ埋設後および実験を通じて、その飲用水にアモキシシリン（５ｍＬの水当たり２５０ｍｇ）を加えた。
【００９８】
Ｃ−リングおよびガラスカバースリップを一時的に外すことによって、チェンバーの一側に腫瘍細胞を植えつけた。１０μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）に縣濁した１×１０５ＦＳａＩＩマウス線維肉腫細胞を筋膜の上に添加し、ウィンドウを、前述のように組織の上に戻して封鎖した。術後２４時間細胞をチェンバー内部に置いた。マウスは、毎日、一般的健康状態ばかりでなく、血管の存在、腫瘍の進行、および、チェンバー皮膚相互作用についてもチェックした。Ｃ−リングおよびガラスカバースリップを外し、かつ、麻酔したマウスのチェンバーを、改造顕微鏡ステージに取り付けることによって腫瘍の画像を撮影した。
【００９９】
血管新生阻害剤および投与：三酸化砒素（ＡＴＯ）は、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＴｒｉｓｅｎｏｘという商品名の下にＣｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（シアトル、ワシントン州）から元々販売されているものを購入した。注入対象のマウスを体重測定し、ＡＴＯを、マウスの体重キログラム当たり８．０ｍｇＡＴＯの用量でＩＰ注入した。
【０１００】
インビボアポトーシス検出試薬カルボキシフルオレセイン−バラニル−アラニル−アスパルチル（Ｏ−メチル）−フルオロメチル・ケトン（ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）、調製および投与：５２μｇのＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを含む、処理済試薬バイアルを５０μＬのＤＭＳＯに溶解した。この溶液を、２００μＬの滅菌１×注入用バッファーを加えて希釈した。この希釈試薬について、７０μＬ（１２．０μｇ）を、尾部静脈からＩ．Ｖ．注入し、マウスの体内を４５分間循環させた。各腫瘍におけるアポトーシスレベルは、４８８ｎｍの励起波長およびＦＩＴＣフィルターを用い、ウィンドウチェンバー越しに１０×倍率で直接目視で定めた。
【０１０１】
結果：腫瘍は、９日間増殖させた。ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを注入し、４５分間循環させた。ＤＦＳＣ  Ｃ−リングおよびガラスカバーを外し、マウスを顕微鏡にセットした。ＦＩＴＣフィルターの下に４８８ｎｍ励起を用いて１０×写真を撮影した（図８）。この写真は、腫瘍におけるアポトーシスの欠如を示す。次に、同じマウスに、前述のようにＡＴＯを注入した。ＡＴＯに３時間作動させ、次いで、マウスにもう一度ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを注入した。４５分後、再び、マウスを顕微鏡にセットし、腫瘍を撮影した（図９）。この写真は、マウスの腫瘍における著明なアポトーシスレベルを示す。
【０１０２】
最終結論：インビボアポトーシス検出試薬（ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）のＩＶ注入は、動物の生体組織におけるアポトーシスのインビボ検出に有効である。さらに、この試薬には副作用がないので、同じ動物で長期的な研究を行うために使用することも可能である。この方法は、正常であるか、または悪性の生体組織において抗癌剤活性を高い信頼度で明らかにするための新規で、貴重な方法を体現する。
【０１０３】
（実施例３）
本プロジェクトの目的は、モルフィン介在性アポトーシスの検出を可能とするインビボ動物モデルを開発することであった。モルフィンを含む薬剤の乱用は、培養細胞においてアポトーシスを誘発することが示されている。アポトーシスは、様々な複雑な経路を通じて起動され、カスパーゼという名前のシステインプロテアーゼの活性化をもたらす。アポトーシスは、薬剤の有害作用、例えば、モルフィンなどの薬剤の乱用の理解のために重要である。アポトーシスの検出のために複数の技術があるが、それらの技術は、一般に、細胞を、その天然の環境から取り出すことに限定される。この機械的な処理は、アポトーシスを誘発するので、陽性結果を誇張する可能性のあることが知られる。本実験の目的は、モルフィンによって誘発されるアポトーシス検出用のインビボモデルを開発することである。
【０１０４】
モルフィンの作用を調べるために、治療に応じてマウスを４群に分割した。１群にはプラシーボを与え、第２群には、細胞を刺激するためにＬＰＳを与え、第３群にはモルフィンを与え、第４群には、モルフィンおよびＬＰＳを与えた。マウスにそれぞれの治療を施した後、ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫをＩＶ注入した。５２μｇのＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを含む、処理済バイアルを５０μＬのＤＭＳＯに溶解した。この溶液を、２００μＬの滅菌１×注入用バッファーを加えて希釈した。この希釈試薬について、４０μＬ（８．３μｇ）を、尾部静脈からＩＶ注入し、マウスの体内を４５分間循環させた。
【０１０５】
異なる治療群から、脾臓、肝臓、胸腺、およびＣＮＳ組織を分離し、冷凍してガラススライドにマウントした。この様々の細胞タイプを、１×１０６細胞／ｍＬとなるように調整し、蛍光顕微鏡による分析のためにガラススライド上でサイトスピンする。切片を写真撮影し、アポトーシス陽性細胞カウントのためにＭｅｔａＭｏｒｐｈ分析プログラムによって分析した。カウント数は、統計ソフトウェアによって分析した。モルフィンは、脾臓および胸腺においてＬＰＳ誘発性アポトーシスを統計学的に強化した（それぞれ、ｐ＝０．０１２および０．００１８）。肝臓および中枢神経系においてアポトーシスの増加が検出されたが、それらは、統計学的に有意ではなかった。モルフィン単独ではアポトーシスを誘発しなかった。定量結果を表１に要約する。
【０１０６】
結論：免疫細胞におけるモルフィン介在性のインビトロアポトーシスに関して従来公表されている報告とは対照的に、本実験は、モルフィン単独はアポトーシスを有意に誘発しないことを示す。一方、モルフィンは、脾臓、骨髄、および肝臓組織で検出されたＬＰＳ活性化細胞のアポトーシスを強化した。
【０１０７】
表１は、脾臓、胸腺、肝臓、およびＣＮＳにおいて、ＬＰＳ、モルフィン、およびモルフィン＋ＬＰＳによって誘発されるアポトーシスの定量結果の要約である。インビボアポトーシスの検出は、８．３μｇのＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫの静脈内注入、および４５分間のインキュベーション時間によって行った。異なる治療群から、脾臓、肝臓、胸腺、およびＣＮＳ組織を分離し、ガラススライドにマウントした。切片を写真撮影し、アポトーシス陽性細胞カウントのためにＭｅｔａＭｏｒｐｈ分析プログラムによって分析した。カウント数は、統計ソフトウェアによって分析した。
【０１０８】
表１
【０１０９】
【化１４】
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（文献）
【０１１０】
【化１５】
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【０１１１】
【化１６】
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【０１１２】
【化１７】
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本明細書に引用される公刊物および特許文書は全て、参照により、あたかもそれらが参照により個別に含められるのと同様に、本明細書に含められる。
【０１１３】
以上本発明は、様々の特異的な、および好ましい実施態様を参照しながら説明されてきた。しかしながら、本発明の精神および範囲の中に留まりながら、多くの変更および修正を実行することが可能であることを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ウィンドウチェンバー越しに撮影された、ＳＣＫ乳腺腫瘍の、低倍率明視野複合画像。各マウスに２×１０５ＳＣＫ腫瘍細胞を注入した。腫瘍を７日間増殖させた。低レベルの出血が、コントロールと試験の両マウスに見られた。
【図２】ウィンドウチェンバー越しに撮影された、ＳＣＫ乳腺腫瘍の、低倍率明視野複合画像。コントロールマウスにはプラシーボを注入し、試験マウスには８．０ｍｇ／ｋｇの三酸化砒素（ＡＴＯ）を注入した。ＡＴＯ治療を受けたマウスでは出血レベルの増大を見ることができる。写真は、治療完了の３時間後に撮影された。
【図３】ウィンドウチェンバー越しに撮影された、ＳＣＫ乳腺腫瘍の、低倍率明視野複合画像。コントロールマウスにはプラシーボを注入し、試験マウスには８．０ｍｇ／ｋｇのＡＴＯを注入した。ＡＴＯ治療を受けたマウスでは、出血レベルの増大を見ることができ、治療３時間後の写真と比べると、時間経過と共に出血量も増加していた。写真は、治療完了の２４時間後に撮影された。
【図４】蛍光検出のために、蛍光フィルターによる４８８ｎｍ励起を用いた高倍率写真。マウスには２×１０５ＳＣＫ腫瘍細胞を注入した。腫瘍を７日間増殖させた。次に、マウスに対し、治療前に、８μｇのアポトーシス検出試薬ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを、尾部静脈を通じて静脈内（Ｉ．Ｖ．）注入した。試薬を、３０分間マウスの体内に循環させ、次いで、４００ｎｍ励起によって写真撮影した。結果は、急速に増殖するＳＣＫ腫瘍から予想されるように、低レベルのアポトーシスを示す。
【図５】蛍光検出のために、蛍光フィルターによる４８８ｎｍ励起を用いた高倍率写真。マウスに８．０ｍｇ／ｋｇのＡＴＯを注入した。ＡＴＯ治療の３時間後、マウスに対し、８μｇのＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを尾部静脈を通じて静脈内に注入した。試薬を、３０分間マウスの体内に循環させ、次いで、４００ｎｍ励起によって写真撮影した。結果は、高レベルのアポトーシスを示す。
【図６】蛍光検出のために、蛍光フィルターによる４８８ｎｍ励起を用いた高倍率写真。マウスに８．０ｍｇ／ｋｇのＡＴＯを注入した。ＡＴＯ治療の２４時間後、マウスに対し、８μｇのＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを尾部静脈を通じて静脈内に注入した。試薬を、３０分間マウスの体内に循環させ、次いで、４８８ｎｍ励起によって写真撮影した。結果は、より高レベルのアポトーシスを示す。
【図７】各マウスに２×１０５ＳＣＫ腫瘍細胞を注入した。腫瘍を７日間増殖させた。コントロールマウスにはプラシーボを注入し、試験マウスには８．０ｍｇ／ｋｇのＡＴＯを注入した。治療の２４時間後、８μｇのＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫを、尾部静脈を通じて静脈内に注入した。試薬を、３０分間マウスの体内に循環させ、次いで、腫瘍を摘出した。腫瘍を分離し、細胞を分散させた。次に、この細胞をフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー分析から、試験マウスでは、アポトーシス誘発率が３９％であったが、一方、コントロールマウスでは、アポトーシス誘発率が僅か１８％であることが示された。
【図８】ｎｕ／ｎｕマウスのＤＳＦＣにおけるＦＳａＩＩ腫瘍のアポトーシス画像。ＡＴＯ注入前で、１２．０μｇのＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫの尾部静脈による静脈内注入４５分後におけるアポトーシスの１０×写真撮影。ほとんどアポトーシスを見ることができない。
【図９】図８と同じ腫瘍。ＡＴＯ（８．０ｍｇ／ｋｇ）注入３時間後におけるアポトーシスの１０×写真撮影。１２．０μｇのＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫの尾部静脈による静脈内注入４５分後。腫瘍内部のアポトーシスの増加が明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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