(57)【要約】  本発明は、ドナーマウス抗ヒトα９インテグリン抗体と比較して、活性および／または物性が改善されたヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、即ち、配列番号１に示されるアミノ酸配列または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、並びに、該抗体を用いた、ヒトα９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項２】
前記重鎖可変領域が、配列番号１または配列番号３１に示されるアミノ酸配列において：
１）配列番号１または配列番号３１の３４番目のメチオニン残基のロイシンまたはイソロイシンへの置換；
２）配列番号１または配列番号３１の６５番目のリジン残基及び６６番目のアスパラギン酸残基の、それぞれ、グルタミン及びグリシンへの置換；
３）配列番号１または配列番号３１の１０４番目のアスパラギン酸残基及び１０５番目のフェニルアラニン残基の、それぞれ、アラニン及びロイシン、アラニン及びトリプトファン、トリプトファン及びグルタミン酸、またはセリン及びトリプトファンへの置換
からなる群より選択される少なくとも１つの置換を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
前記軽鎖可変領域が、配列番号６１に示されるアミノ酸配列又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列において：
４）配列番号６１の２４番目のリジン残基のグルタミンまたはアルギニンへの置換
を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項３】
前記重鎖可変領域が、配列番号１または配列番号３１に示されるアミノ酸配列において：
２）配列番号１または配列番号３１の６５番目のリジン残基及び６６番目のアスパラギン酸残基の、それぞれ、グルタミン及びグリシンへの置換
を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
前記軽鎖可変領域が、配列番号６１に示されるアミノ酸配列において：
４）配列番号６１の２４番目のリジン残基のグルタミンまたはアルギニンへの置換
を有するアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項４】
前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１である、請求項１〜３のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項５】
前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、請求項１〜３のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項６】
前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、請求項１〜３のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチドおよび／または８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の宿主細胞を培養し、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を発現させる工程を包含する、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を生産する方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含む、関節リウマチの治療薬。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、関節リウマチを予防または処置するための方法。
【請求項１４】
関節リウマチを予防または処置するための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体に関する。詳細には、ヒトα９インテグリン蛋白質に結合してα９インテグリン依存性の細胞接着を阻害する活性を持ち、マウスＹ９Ａ２抗体と比較して、活性および／または物性が改善されたヒト化Ｙ９Ａ２抗体である。当該ヒト化抗体は、関節リウマチ等の自己免疫疾患、アレルギーや移植片拒絶反応等の免疫疾患、及びその他のα９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の診断、予防または治療薬として期待される。
【背景技術】
【０００２】
インテグリン（integrin）は細胞表面糖タンパク質のひとつで、主に細胞外マトリックス（コラーゲン、ラミニンなど）への細胞の接着やイムノグロブリンファミリーのメンバー(ICAM-1、VCAM-1など)の受容体として機能し、細胞外マトリックスからの情報伝達に関与する接着分子である。それにより、細胞は細胞外マトリックスよりシグナルを受け取り、分化、増殖、細胞死などが誘導される。インテグリンはα鎖とβ鎖の２つのサブユニットからなるヘテロダイマーであり、異なるα鎖、β鎖が存在し、多様な組み合わせがあり、インテグリンスーパーファミリーは２４種類存在する。インテグリンノックアウトマウスは、全てのサブユニットで致死的あるいは病的で、生命の維持に個々のインテグリンが必用であることが示唆されている。この事から、周辺の環境を細胞に伝え対応を促すインテグリンは、生命現象のあらゆる場面で機能しており、様々な病態に関与していると考えられる。【０００３】
このように生存に不可欠なインテグリンは病的状態でも役割を演じていると考えられ、阻害が病態改善に働くケースが示されている。例えば、血小板に特異的なインテグリンαIIｂβ３の阻害は、PCTA再狭窄治療薬アブシキシマブ（商品名：ReoPro；Eli Lilly社）として認可されている。また、α４β１（VLA4）阻害剤ナタリツマブ（商品名：Antegren；ELAN社）は多発性硬化症治療薬として認可されている。さらに、αｖβ３阻害剤Vitaxin（MEDIMMUNE社)も、その血管新生阻害作用、破骨細胞活性化阻害作用などから、現在治験が進んでいる状況にある。【０００４】
インテグリンα９β１はマクロファージ、NKT細胞、樹状細胞（Dendritic Cell）、好中球に発現しており、これら炎症細胞の浸潤や接着、骨吸収などに重要な役割を果しているとされる。また最近、破骨細胞の形成においてインテグリンα９β１の関与が報告されており、骨破壊への関与が示唆されている（非特許文献１）。そのリガンドとしては切断型オステオポンチン（Ｎ末OPN）、VCAM-1、Tenascin-Cなどが知られている。臨床においても、関節リウマチ患者の滑膜組織においてインテグリンα９β１の有意な上昇が認められている（非特許文献２）。【０００５】
したがって、α９インテグリン蛋白質に特異的に結合し、α９インテグリン依存の細胞接着を阻害する活性を有するモノクローナル抗体を開発することができれば、α９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の診断、予防または治療に有用であることが期待される。【０００６】
これまで、ヒトα９インテグリンに対して機能阻害作用を示す抗体としては、マウスモノクローナル抗体であるＹ９Ａ２（非特許文献３）、１Ｋ１１、２４Ｉ１１、２１Ｃ５及び２５Ｂ６（特許文献１）が報告されている。これらの抗体は、ヒトα９依存の細胞接着を抑制し得ることがin vitroの実験結果より示されているが、その中でも、Ｙ９Ａ２は、オステオポンチンやTenascin-Cのいずれに対する細胞接着をも阻害し、α９インテグリンに対する抗体医薬の候補として最も有望視されるものである。【０００７】
もっとも、Ｙ９Ａ２抗体は、マウスに抗原を免疫して作製されたマウス由来の抗体であるために、安全性（抗原性の惹起）及び有効性（半減期の短縮）の観点から、そのままヒトに投与することは現実的には不可能である。そこで、Ｙ９Ａ２抗体の活性を維持したまま、ヒト抗体のアミノ酸配列を持つ分子に変えるための改変、すなわち、ヒト化を行う必要がある。【０００８】
今日、ヒト化抗体の作製法としては、ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）らが考案した、相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記することがある）アミノ酸の移植を行う方法（非特許文献４）に基づくものが、最も一般的である。ここで、ＣＤＲアミノ酸のドナーとなる異種抗体からＣＤＲのアクセプターとなるヒト抗体に対して、ＣＤＲのみならず、ＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しているＣＤＲ外アミノ酸、いわゆるフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記することがある）も併せて移植することが、ドナー抗体の持つ本来の活性を再現するために重要であることも良く知られている（非特許文献４及び５）。【０００９】
しかし、ＣＤＲ移植に基づくヒト化抗体の作製においては、いくつかの課題が存在する。まず第一に、最も一般的な課題として、ドナー抗体の活性再現に必要なＦＲアミノ酸の選択を適切に行ったとしても、抗原への親和性や生物活性がドナー抗体のそれを上回るヒト化抗体を得ることが困難であることが挙げられる。【００１０】
近年、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体がモノクローナル医薬品として多数上市されているが、いずれについても有効投与量は体重１ｋｇあたり数ｍｇと極めて多量である。それ故、抗体医薬品は高価とならざるを得ず、結果として患者の経済的な負担や医療コストの増大を招いている。この抗体医薬の有効投与量を規定する主な要因としては、抗体の抗原に対する親和性や、体内に存在する抗原の量が挙げられる。このような観点から、特に抗体の抗原に対する親和性を向上させることは、投与量の低減に繋がり、結果として患者の経済的な負担や医療コストの低減にも繋がる極めて有益な改良であると言える。【００１１】
そこで、抗体の抗原に対する親和性向上を実現するために、抗体の可変領域内にアミノ酸置換を導入する方法が取られることが多い。しかし、抗体や抗原が異なれば、ＣＤＲアミノ酸の配列や立体構造、抗原−抗体相互作用に関わるアミノ酸の位置も変化するため、ＣＤＲとともに移植すべきＦＲアミノ酸の位置を、全ての抗体に適用可能なものとして規定することは事実上不可能である。【００１２】
また、別の課題として、ＣＤＲ移植に基づくヒト化抗体の作製においては、ドナーであるマウス抗体のＣＤＲアミノ酸全部を鋳型ヒト抗体に移植するのが一般的であるが、マウス抗体由来のＣＤＲアミノ酸配列は抗原との結合に重要である一方で、ヒトに対する抗原性を示すことがあり、しばしば抗イディオタイプ抗体を生じる原因ともなることが挙げられる。【００１３】
更に、抗体中のメチオニン残基が、抗体溶液の保存中に酸化を受け、しばしば、抗原との親和性低下の原因となることがある。この酸化を防止するために、酸素との接触を防止する方法や、溶液状態での保存を避けるなどの方法が取られることがあるが、根本的な解決方法となっているわけではない。【００１４】
すなわち、ヒト化抗体の作製において、ヒトにおける抗原性発生や抗体の安定性低下を回避しつつ、ドナー抗体よりも高い活性を付与するためには、適切なアクセプター抗体の選択や、置換すべきＣＤＲアミノ酸及びＦＲアミノ酸の選択が不可欠であり、これらには、相当の創意工夫と試行錯誤が必要とされる。
【特許文献１】WO 2006/075784
【非特許文献１】Journal of Bone and Mineral Research, 2006, 21: 1657-1665
【非特許文献２】The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115: 1060-1067
【非特許文献３】Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1996, 15: 664-672
【非特許文献４】Science, 239, 1534-1536 (1988)
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、ヒト化抗体作製に関する上記の諸課題を克服し、ドナーマウス抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｙ９Ａ２）と比較して、活性および／または物性が改善されたヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な物質・方法として下記（１）〜（１５）の発明を含むものである。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号６１に示されるアミノ酸配列又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（２）前記重鎖可変領域が、配列番号１または配列番号３１に示されるアミノ酸配列において：
１）配列番号１または配列番号３１の３４番目のメチオニン残基のロイシンまたはイソロイシンへの置換；
２）配列番号１または配列番号３１の６５番目のリジン残基及び６６番目のアスパラギン酸残基の、それぞれ、グルタミン及びグリシンへの置換；
３）配列番号１または配列番号３１の１０４番目のアスパラギン酸残基及び１０５番目のフェニルアラニン残基の、それぞれ、アラニン及びロイシン、アラニン及びトリプトファン、トリプトファン及びグルタミン酸、またはセリン及びトリプトファンへの置換
からなる群より選択される少なくとも１つの置換を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
前記軽鎖可変領域が、配列番号６１に示されるアミノ酸配列又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列において：
４）配列番号６１の２４番目のリジン残基のグルタミンまたはアルギニンへの置換
を有するアミノ酸配列からなる、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（３）前記重鎖可変領域が、配列番号１または配列番号３１に示されるアミノ酸配列において：
２）配列番号１または配列番号３１の６５番目のリジン残基及び６６番目のアスパラギン酸残基の、それぞれ、グルタミン及びグリシンへの置換
を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
前記軽鎖可変領域が、配列番号６１に示されるアミノ酸配列において：
４）配列番号６１の２４番目のリジン残基のグルタミンまたはアルギニンへの置換
を有するアミノ酸配列からなる、上記（２）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（４）前記重鎖可変領域が、配列番号１〜６０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域が、配列番号６１〜６３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、上記（１）に記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（５）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（６）前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（７）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
（９）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
（１０）上記（８）に記載のポリヌクレオチドおよび／または上記（９）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１１）上記（１０）に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
（１２）上記（１１）に記載の宿主細胞を培養し、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を発現させる工程を包含する、ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を生産する方法。
（１３）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含む、関節リウマチの治療薬。
（１４）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、関節リウマチを予防または処置するための方法。
（１５）関節リウマチを予防または処置するための医薬の製造における、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の使用。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、ドナーマウス抗ヒトα９インテグリン抗体と比較して、活性および／または物性が改善されたヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体が提供される。本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、ヒトα９インテグリンとその複数のリガンドとの相互作用の遮断を通じ、強力な抗炎症作用や骨破壊抑制作用を有するものであり、ヒトα９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】マウスＹ９Ａ２抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列である。
【図２】マウスＹ９Ａ２抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列である。
【図３】ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＨの一例であるＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５をコードする遺伝子を作製するためのオリゴＤＮＡの構成である。
【図４】ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＬの一例であるＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１をコードする遺伝子を作製するためのオリゴＤＮＡの構成である。
【図５】キメラＹ９Ａ２抗体とヒト化Ｙ９Ａ２抗体の例であるＲＹ９Ａ２ｖ５０１のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの結果である。
【図６】キメラＹ９Ａ２抗体とヒト化Ｙ９Ａ２抗体の例であるＲＹ９Ａ２ｖ８０１のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの結果である。
【図７】ＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体のＣＤＲの一部のアミノ酸残基までヒト由来のものと置換したヒト化抗体であるＲＹ９Ａ２ｖ１１０１１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ１１０１２抗体とキメラＹ９Ａ２抗体のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの結果である。
【図８】ＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体のＶＨのＣＤＲ中のメチオニン残基をロイシンに置換したＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｌ）０１抗体、イソロイシンに置換したＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｉ）０１抗体とキメラＹ９Ａ２抗体のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの結果である。
【図９】過酸化水素処理したキメラＹ９Ａ２抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｌ）０１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｉ）０１抗体（図中の凡例で（＋）を付したもの）と、過酸化水素処理していない各抗体（図中の凡例で（−）を付したもの）のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの結果である。
【図１０】大腸菌で発現させたＹ９Ａ２抗体Ｆａｂと、そのＶＨのＣＤＲ３中に２アミノ酸置換を導入した３種類の改変ＦａｂのＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの結果である。
【図１１】大腸菌で発現させたＹ９Ａ２抗体Ｆａｂと、そのＶＨのＣＤＲ３中に２アミノ酸置換を導入した１種類の改変ＦａｂのＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明について詳述する。
本発明者らは、マウス抗ヒトα９インテグリン抗体Ｙ９Ａ２のヒト化抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、Ｙ９Ａ２と比較して、活性および／または物性が改善された、複数のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体（以下、ヒト化Ｙ９Ａ２抗体またはＲＹ９Ａ２とも称する）を作製することに成功した。【００２０】
具体的には、まず、本発明者らは、Ｙ９Ａ２抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）及び軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲアミノ酸配列及び数ヶ所のＦＲアミノ酸を鋳型ヒト抗体に移植して、マウスＹ９Ａ２抗体と同程度の活性を有するヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体ＲＹ９Ａ２ｖ５０１及びＲＹ９Ａ２ｖ８０１を作製した。ＣＤＲは、カバット（Ｋａｂａｔ）らによる分類（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  ＮＩＨ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，  １９８７）に従って決定した。ＲＹ９Ａ２ｖ５０１及びＲＹ９Ａ２ｖ８０１のＶＨのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１及び配列番号３１である。ここで、ＲＹ９Ａ２ｖ８０１のＶＨは、ＲＹ９Ａ２ｖ５０１のＶＨのマウスＹ９Ａ２抗体由来のＦＲアミノ酸残基のうち４つのアミノ酸残基を、対応する鋳型ヒト抗体アミノ酸に置換したものである。両ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列は、配列番号６１に示されるものであり、両抗体共通である。【００２１】
さらに、本発明者らは、ヒト化抗体における抗原性発生の危険性や抗体の保存安定性の低下を回避しつつ、ヒトα９インテグリンに対する、オリジナルのマウスＹ９Ａ２抗体よりも高い親和性を有する抗体を作製するために、上記のヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ中のアミノ酸配列の置換を検討した。その結果、当該ヒト化抗体のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲにおける、以下のいずれかの置換が、オリジナルのマウスＹ９Ａ２抗体と比較して、ヒト化Ｙ９Ａ２抗体における活性および／または物性を改善するために好ましい置換であることが確認された。
１）ＶＨのＣＤＲ１中のメチオニン残基（ＶＨアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸残基）のロイシンまたはイソロイシンへの置換；
２）ＶＨのＣＤＲ２中のリジン残基及びアスパラギン酸残基（ＶＨアミノ酸配列の６５番目及び６６番目のアミノ酸残基）の、それぞれ、グルタミン及びグリシンへの置換；
３）ＶＨのＣＤＲ３中のアスパラギン酸残基及びフェニルアラニン残基（ＶＨアミノ酸配列の１０４番目及び１０５番目のアミノ酸残基）の、それぞれ、アラニン及びロイシン、アラニン及びトリプトファン、トリプトファン及びグルタミン酸、またはセリン及びトリプトファンへの置換；
４）ＶＬのＣＤＲ１中のリジン残基（ＶＬアミノ酸配列の２４番目のアミノ酸残基）のグルタミンまたはアルギニンへの置換。【００２２】
すなわち、好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、配列番号１〜６０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号６１〜６３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体である。【００２３】
また、好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、ＶＨのアミノ酸配列において上記２）の置換を有する場合、ＶＬのアミノ酸配列において上記４）の置換を有する。【００２４】
本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、本願明細書に開示される、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。具体的には、本発明の抗体の重鎖可変領域アミノ酸をコードする塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子断片、及び、本発明の抗体の軽鎖可変領域アミノ酸をコードする塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子断片を作製する。そして、この可変領域遺伝子をヒト抗体の適当なクラスの定常領域遺伝子と連結させてヒト化抗体遺伝子を作製する。次いで、このヒト化抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からヒト化抗体を得ることができる。【００２５】
上記の本発明の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸をコードする各可変領域遺伝子断片は、例えば、該重鎖及び軽鎖可変領域の塩基配列又は該重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。また、本発明の抗体の可変領域遺伝子断片を一旦取得すれば、この遺伝子断片の所定の部位に変異を導入することによって、本発明の他の抗体を取得することも可能である。このような変異導入方法としては、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５）等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。【００２６】
次いで、上記の可変領域遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子とを連結させてヒト化抗体遺伝子を作製する。使用されるヒト抗体の定常領域は、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてγ１、γ２、γ３またはγ４、軽鎖としてλまたはκ鎖の定常領域）も選択可能であり得るが、好ましくは、重鎖定常領域としてはヒトＩｇγ１が、また、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇκを用いることができる。【００２７】
このヒト化抗体遺伝子の作製につづく、ヒト化抗体遺伝子の発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、抗体の精製等については、当該分野で公知の種々の方法を使用してか、あるいは、ＷＯ２００７／１３９１６４またはＷＯ２００３／０２７１５１に記載される、ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体の作製方法を参照して行うことができる。【００２８】
上記のようにして得られたヒト化抗体遺伝子と連結される発現ベクターとしては、国際公開公報ＷＯ９４／２０６３２に記載のＡＧ−γ１やＡＧ−κ等の発現ベクターが使用できるが、ヒト化抗体遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されない。なお、発現ベクターとしてＡＧ−γ１あるいはＡＧ−κ等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有するものを利用すれば、これにヒト化抗体可変領域遺伝子を挿入するだけでヒト化抗体遺伝子を有する発現ベクターとなるため好ましい。また、発現ベクターにおいては、抗体の細胞外への分泌発現を促すためのリーダー配列を使用してもよく、このようなリーダー配列としては、Ｙ９Ａ２抗体に由来するリーダー配列や、別の抗体（例えば、ＷＯ２００７／１３９１６４に記載のヒト化抗オステオポンチン抗体）由来のリーダー配列を使用することができる。【００２９】
上記の発現ベクターは、例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓiｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リン酸カルシウム法等の使用により、培養細胞中に導入される。【００３０】
発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、２９３細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。【００３１】
上記培養後、培養上清中に蓄積された抗体は、各種のカラムクロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラムを用いたクロマトグラフィーにより精製することができる。【００３２】
得られたヒト化抗体のヒトα９インテグリンに対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ等の方法がある。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、α９インテグリンを発現させた細胞（例えば、ＳＷ４８０細胞）をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対してヒト化抗体を添加して反応させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識したヒトＩｇＧ抗体等の二次抗体を添加して反応させ、洗浄した後、発色基質（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＴＭＢ）を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することが出来る。【００３３】
更に、得られたヒト化抗体がヒトα９インテグリンに対する機能阻害活性を有しているか否かを評価する方法としては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３６３２８−３６３３４，１９９９に記載のヒトオステオポンチン分子に対するヒトα９インテグリン分子依存性細胞接着の阻害試験により確認することができる。すなわち、α９のリガンドの一つであるＮ末ＯＰＮ（オステオポンチンがトロンビンにより切断された後のＮ末端側フラグメント；以下、ｎＯＰＮと表記することがある）のＲＡＡ改変体（他のインテグリンとの反応を抑えるためにＲＧＤ配列をＲＡＡに改変したもの；以下、ｎＯＰＮ−ＲＡＡと表記することがある）をプレートに固定化し、ブロッキングを行う。各種抗体を添加した後、α９発現細胞を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。細胞をクリスタルバイオレットとメタノールを用いて固定・染色して、洗浄後、接着した細胞中の色素をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で抽出し、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定する。それにより抑制作用が確認されれば、当該抗体はα９インテグリンに対する機能阻害活性を有しているものと判断される。【００３４】
また、得られたヒト化抗体が酸化に対して耐性を有するか否かを評価する方法としては、例えば、過酸化水素水での抗体の処理を用いる方法がある。具体的には、抗体の溶液に、最終濃度０．４％の過酸化水素水を添加し、２５℃で４時間静置した後、ＰＢＳに透析して回収し、次いで、この抗体を、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによって非処理の抗体と活性を比較することによって、酸化耐性を評価することができる。【００３５】
このようにして得られた本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、関節リウマチ等の自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶反応等の免疫疾患、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患、癌等のα９インテグリンが病態形成に関与する疾患の治療に用いることができる。【００３６】
本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、好ましくは、関節リウマチ治療剤として用いることができる。これらの治療剤の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。【００３７】
上記製剤化に当たってのヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体等の添加量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。【００３８】
更に、本発明は、上記の重鎖及び軽鎖可変領域を含み、かつその活性を保持したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖ−Ｆｃ等のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体フラグメントをも包含する。【００３９】
ｓｃＦｖの作製に用いられ得る、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを連結させるためのリンカーとしては、本発明の抗体フラグメントが上述したような特性を有し得る限り特に限定されないが、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４７）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。また、当業者であれば、本発明に基づいて、当該ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体または抗体フラグメントと他のペプチドやタンパク質との融合抗体を作製することや、修飾剤を結合させた修飾抗体を作製することも可能である。融合に用いられる他のペプチドやタンパク質は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種ｔａｇペプチド、人工へリックスモチーフペプチド、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチドまたはタンパク質等が挙げられる。修飾に用いられる修飾剤は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。【００４０】
本発明はまた、本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子、及びそれを含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。【００４１】
本発明の発現ベクターは、本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする遺伝子、及び当該遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中で本発明の抗体又はそのフラグメントを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（Niwa H. et al., Gene, 108, 193-200, 1991）、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。【００４２】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。【００４３】
本発明はまた、本発明の遺伝子が導入された形質転換体を提供する。このような形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製できる。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換は、自体公知の方法により行われ得る。【００４４】
本発明はまた、本発明の遺伝子を宿主細胞に発現させること、即ち、このような形質転換体を用いることを含む、本発明の抗体又はそのフラグメントの生産方法を提供する。【００４５】
本発明の抗体又はそのフラグメントの生産において、形質転換体は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。【００４６】
形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。【００４７】
本発明の抗体又はそのフラグメントは、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。【００４８】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
市販のキットあるいは試薬を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。【００５０】
《実施例１：キメラＹ９Ａ２抗体の作製》
マウスＹ９Ａ２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子をヒトＩｇγ１遺伝子に、軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子をヒトＩｇκ遺伝子に連結してマウス−ヒトのキメラＹ９Ａ２抗体を作製した。手順は下記の通りである。【００５１】
まず、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）より提供された、マウスＹ９Ａ２抗体産生ハイブリドーマからＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）を用いてＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを鋳型とし、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ともにインビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡを鋳型として用い、カバット（Ｋａｂａｔ）らによるＶ領域及びＪ領域の配列の分類（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  ＮＩＨ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，  １９８７）を参照してデザインしたリーダー領域に対するプライマーとＪ領域に対するプライマーを用い、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）でＶＨ領域を増幅した。ここで用いた上記リーダー領域に対するプライマーとＪ領域に対するプライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列が付加されている。ＶＬについてもＶＨの場合と同様に、リーダー配列に合致するプライマーとＪ領域に合致するプライマーを用いて、ＶＬ遺伝子断片を得た。【００５２】
このようにして得たＶＨ、ＶＬ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ（ともにタカラバイオ社）で消化し、それぞれを、発現ベクターであるＡＧ−γ１、ＡＧ−κ（ＷＯ９４／２０６３２）と連結した。ＡＧ−γ１は、βアクチンプロモーター、ヒト免疫グロブリン定常領域γ１鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を持ち、γ１遺伝子の上流にあるＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列の間にマウスＹ９Ａ２抗体ＶＨ遺伝子を挿入することにより、キメラＹ９Ａ２抗体の重鎖を発現するプラスミドとなる。ＡＧ−κは、βアクチンプロモーター、ヒト免疫グロブリン定常領域κ鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を持ち、同じくκ遺伝子の上流にあるＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列の間にマウスＹ９Ａ２抗体ＶＬ遺伝子を挿入することにより、キメラＹ９Ａ２抗体の軽鎖を発現するプラスミドとなる。【００５３】
これらの発現プラスミドを常法により大腸菌に導入して形質転換クローンを得、それからＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ  ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔを及びＣＥＱ２０００オートシークエンサー（ともにＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて、クローニングされているＶＨ及びＶＬの塩基配列を解読した。当該ＶＨ及びＶＬの塩基配列を、それぞれ配列番号１２８及び配列番号１３０に示した。得られた配列をもとに決定したＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ、図１及び図２に示した。また、それぞれを、配列番号１２７及び配列番号１２９に示した。【００５４】
上記大腸菌クローンを大量培養して、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてキメラＹ９Ａ２抗体の重鎖発現プラスミド及び軽鎖発現プラスミドを精製し、それらを混合して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて細胞に導入することにより、キメラＹ９Ａ２抗体を一過性に発現させた。得られた培養上清に含まれるキメラＹ９Ａ２抗体濃度を、ヤギ由来抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社）とプロテインＡ−ＨＲＰ（ＺＹＭＥＤ社）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。この際、市販のヒトＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）の希釈系列を作製し、それを標準試料とした。次に、上記培養上清中のキメラＹ９Ａ２抗体を、プロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いてアフィニティ精製し、精製キメラＹ９Ａ２抗体を得た。精製キメラＹ９Ａ２抗体の濃度は、波長２８０ｎｍにおける吸光度が１．４の場合に１ｍｇ／ｍＬとして算出した。【００５５】
《実施例２：キメラＹ９Ａ２抗体とマウスＹ９Ａ２抗体の活性比較》
前項に記載の方法で調製した精製キメラＹ９Ａ２抗体について、マウスＹ９Ａ２抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社）との活性を比較するために、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３６３２８−３６３３４，１９９９に記載の細胞接着阻害試験を行った。すなわち、まずオステオポンチンがトロンビンにより切断されて生じるＮ末端側の断片（ｎＯＰＮ）に含まれるＲＧＤ配列をＲＡＡに置換した改変体（ｎＯＰＮ−ＲＡＡ）を固定化し、ブロッキングを行った後、マウスＹ９Ａ２抗体または精製キメラＹ９Ａ２抗体を添加した。続けてヒトα９インテグリン分子を発現させたＳＷ４８０細胞（以下、ＳＷ４８０／ｈα９細胞と表記することがある）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、クリスタルバイオレットとメタノールを用いて固定・染色して、洗浄後、接着した細胞中の色素をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で抽出し、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。【００５６】
その結果、表１に示したように、マウスＹ９Ａ２抗体及び精製キメラＹ９Ａ２抗体は、ほぼ同じＩＣ５０で、ｎＯＰＮ−ＲＡＡに対するＳＷ４８０／ｈα９細胞の接着を阻害する活性を持つことが判った。ＩＣ５０は、抗α９インテグリン抗体を添加しない場合に起こる細胞接着のレベルを基準としたときに、それを５０％抑制する抗α９インテグリン抗体の濃度として定義される。【００５７】
【表１】
2009088065.tif 000002
【００５８】
《実施例３：ヒト化Ｙ９Ａ２抗体遺伝子の作製》
マウスＹ９Ａ２抗体のＶＨ及びＶＬ中の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸の移植先となる鋳型ヒト抗体は、マウスＹ９Ａ２抗体のＶＨ、ＶＬのフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列に対して、それらと相同性の高いアミノ酸配列を持つヒト抗体のｇｅｒｍｌｉｎｅの中から選んだ。具体的には、鋳型ヒトＶＨとしてはＤＰ−８８にＪＨ６を組み合わせたもの、鋳型ヒトＶＬとしてはＤＰＫ−１にJκ４を組み合わせたものを選んだ。【００５９】
上記の鋳型ヒト抗体ＶＨ及びＶＬのＦＲに、マウスＹ９Ａ２のＶＨ及びＶＬから必要なアミノ酸配列を移植してヒト化抗体を作製した。具体的には、まずＶＨについては、前述の鋳型ヒト抗体ＶＨのＣＤＲアミノ酸配列及びＦＲアミノ酸の数カ所をマウスＹ９Ａ２抗体のＶＨ中の対応するアミノ酸配列で置換し、２種類のヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＨ、すなわち、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５及びＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８のアミノ酸配列をデザインし（それぞれ、配列番号１及び配列番号３１）、更に、それらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインした（それぞれ、配列番号６４及び配列番号９４）。ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８では、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５におけるマウスＹ９Ａ２抗体由来のＦＲアミノ酸残基のうちの４つが鋳型ヒト抗体のものに置換されている。【００６０】
ＶＬについては、前述の鋳型ヒト抗体ＶＬのＣＤＲアミノ酸配列をマウスＹ９Ａ２抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列で置換し、ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＬであるＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１のアミノ酸配列をデザインし（配列番号６１）、更に、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインした（配列番号１２４）。【００６１】
上記のＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８及びＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１をコードするＤＮＡ断片を作製するために、オリゴＤＮＡを材料としたＰＣＲによる全合成を行った。具体的には、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５については、それぞれ図３に示したように、ＶＨの全長をカバーするように６種類のオリゴＤＮＡ（配列番号１３１〜１３６に記載）に分けて合成し、それらを用いて次の手順でＰＣＲを行った。すなわち、まず６種類のオリゴＤＮＡを各々等量混合したものを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いて、９６℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３分のステップを１５サイクル繰り返した。次に、このＰＣＲ産物の１μＬを鋳型として用い、図３の太文字表記部分の配列を持つオリゴＤＮＡ（配列番号１３７及び１３８に記載）をプライマーとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９６℃で２０秒、７２℃で２分のステップを２５サイクル繰り返すことにより、ＶＨの全長を増幅した。ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８についても、概ね同様の方法で作製した。【００６２】
ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１の作製の場合は、図４に示した６本のオリゴＤＮＡ（配列番号１３９〜１４４に記載）を用いて、上記と同様に１５サイクルのＰＣＲを行った後、その増幅産物を鋳型として用い、図４の太文字表記部分の配列を持つオリゴＤＮＡ（配列番号１４５及び１４６に記載）をプライマーとして、上記と同様の２５サイクルのＰＣＲを行うことにより、ＶＬの全長を増幅した。【００６３】
上記のＶＨ、ＶＬともに、抗体のリーダー配列としては、ＷＯ２００７／１３９１６４に記載の、ヒト化抗オステオポンチンモノクローナル抗体と同じものを使用した。また、得られたＤＮＡ断片の両端には、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＢａｍＨＩ認識配列が付加されている。【００６４】
このようにして得たＶＨ及びＶＬのＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、それぞれ前述の発現ベクターＡＧ−γ１、ＡＧ−κと連結して定法により大腸菌に導入してクローニングし、得られた大腸菌クローンからＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型としてＧｅｎｏｍｅＬａｂ  ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔを及びＣＥＱ２０００オートシークエンサー（ともにＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて、クローニングされているＶＨ及びＶＬの塩基配列を解読することにより、デザイン通りの塩基配列を持つクローンを得た。これらのクローンを培養して、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、重鎖、軽鎖の発現プラスミドを精製した。【００６５】
精製した重鎖発現プラスミド、軽鎖発現プラスミドを混合して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて細胞に導入し、抗体を一過性に発現させた。この際、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５を挿入した重鎖発現プラスミドと、ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１を挿入した軽鎖発現プラスミドを組み合わせた場合に発現するヒト化Ｙ９Ａ２抗体をＲＹ９Ａｖ５０１抗体と命名し、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８を挿入した重鎖発現プラスミドと、ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１を挿入した軽鎖発現プラスミドを組み合わせた場合に発現するヒト化Ｙ９Ａ２抗体をＲＹ９Ａｖ８０１抗体と命名した。【００６６】
培養上清中に蓄積した各ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の濃度の測定及び、培養上清からの精製抗体の取得は、前述のキメラＹ９Ａ２抗体の場合と同じ方法で行った。【００６７】
《実施例４：α９インテグリン分子発現細胞との結合性確認》
前述の方法で発現させたＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体について、ヒトα９インテグリン分子に対する結合性をＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法によりキメラＹ９Ａ２抗体（以下、ｃＹ９Ａ２抗体と表記することがある）と比較した。すなわち、ヒトα９インテグリン分子を発現させたＳＷ４８０細胞をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、それに対して上記ｃＹ９Ａ２抗体またはＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体またはＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体を反応させた後、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社）を反応させ、ＴＭＢを加えて発色させた後、希硫酸を加えて反応を停止させ波長４５０ｎｍにおける吸光度を調べた。その結果、図５及び図６に示したようにＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体はｃＹ９Ａ２抗体と同等のヒトα９インテグリン分子結合性を持つことが確認された。【００６８】
《実施例５：ＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体の細胞接着阻害試験》
上記の精製ＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体、精製ＲＹ９Ａ２ｖ８０１抗体及びマウスＹ９Ａ２抗体について、細胞接着阻害試験による活性の比較を行った。表２に２回の試験の平均値を示した。【００６９】
【表２】
2009088065.tif 000003
【００７０】
表２に示したように、上記２種のヒト化抗体はマウスＹ９Ａ２と同等の細胞接着阻害活性を持つことが確認された。【００７１】
《実施例６：ＣＤＲの一部をヒト抗体の配列に改変したＲＹ９Ａ２抗体の作製》
上記２種のヒト化抗体について、さらに、ヒトでの抗原性出現の危険性を回避すべく、ヒト化抗体のＣＤＲ中のアミノ酸のヒト抗体アミノ酸への置換可能性を検討した。検討の結果、上記ヒト化抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の６５番目のリジンと６６番目のアスパラギン酸の、それぞれ、鋳型ヒト抗体ＤＰ−８８における同じ部位のグルタミンとグリシンへの置換、並びに、軽鎖可変領域（ＶＬ）の２４番目のリジンの、鋳型ヒト抗体のＤＰＫ１が属するＶκ１のｇｅｒｍｌｉｎｅに由来するグルタミンまたはアルギニンへの置換が、ヒト化抗体の活性の低下を伴うことない、適切な置換であることが見出された。【００７２】
具体的な手順としては、まず、前述のようにして作製したＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５のＤＮＡ及びＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１のＤＮＡを鋳型として、アミノ酸置換が可能なようにコドンを変更したプライマーを用いて、一般的に行われるＰＣＲを用いた変異導入を行った。得られた変異導入済みのＶＨ（ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ１１と命名した）及びＶＬ（グルタミンへの置換を含む方をＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１１と命名し、アルギニンへの置換を含む方をＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１２と命名した）のＤＮＡ断片を、前述と同様に発現ベクターＡＧ−γ１、ＡＧ−κと連結して、発現プラスミドを作製しＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて発現させた。ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ１１、ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１１及びＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１２のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１６、配列番号６２及び配列番号６３に、塩基配列を、それぞれ、配列番号７９、配列番号１２５及び配列番号１２６に示した。ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ１１とＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１１の組み合わせの発現で得られるヒト化抗体をＲＹ９Ａ２ｖ１１０１１抗体、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ１１とＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１２の組み合わせの発現で得られるヒト化抗体をＲＹ９Ａ２ｖ１１０１２抗体と命名した。発現上清中の抗体のヒトα９インテグリン分子への結合性をＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによりｃＹ９Ａ２抗体と比較した結果、図７に示したように、ｃＹ９Ａ２抗体と同等の結合性を維持していることが判った。【００７３】
《実施例７：ＲＹ９Ａ２ｖ１１０１１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ１１０１２抗体の細胞接着阻害試験》
上記のＲＹ９Ａ２ｖ１１０１１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ１１０１２抗体の発現上清から、前述と同様にプロテインＡカラムを用いて精製抗体を取得し、波長２８０ｎｍにおける吸光度に基づいて濃度を算出した。得られた精製ヒト化抗体とマウスＹ９Ａ２抗体について、細胞接着阻害試験により活性比較を行った結果を表３に示した（２回の試験の平均値）。【００７４】
【表３】
2009088065.tif 000004
【００７５】
表３に示したように、上記２種類のヒト化抗体ではマウスＹ９Ａ２抗体よりも２倍以上阻害活性が向上していることが判った。ＣＤＲのアミノ酸配列に由来する抗原性出現の危険性を低下させることを意図してアミノ酸置換を導入した結果、このような活性の向上が見られたことは、従来の知見からは予想できなかった効果であった。【００７６】
《実施例８：メチオニン残基を改変したＲＹ９Ａ２抗体の作製》
さらに、本発明者らは、ヒト化Ｙ９Ａ２抗体（ＲＹ９Ａ２）のメチオニン残基の酸化による保存安定性低下を回避すべく、ヒト化抗体のＣＤＲ中のメチオニン残基の置換可能性を検討した。【００７７】
具体的には、上記ヒト化抗体のＶＨのＣＤＲ１にある３４番目のメチオニン部分のアミノ酸置換体を作製した。まずは、抗原との結合性が低下しない置換アミノ酸を選択するために、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５のＤＮＡを鋳型として変異導入ＰＣＲを行うことにより、上記メチオニンのコドンを改変し２０種類のアミノ酸に置換したＶＨのＤＮＡを作製した。以下、前述の方法と同様に、これらを導入した発現プラスミドを作製し、ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１の軽鎖発現プラスミドと組み合わせて発現させた。ロイシンへの置換を含むＶＨをＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（Ｍ３４Ｌ）、イソロイシンへの置換を含むＶＨをＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（Ｍ３４Ｉ）と命名した。また、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（Ｍ３４Ｌ）とＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１の組み合わせで発現させたヒト化抗体をＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｌ）０１抗体、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（Ｍ３４Ｉ）とＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１の組み合わせで発現させたヒト化抗体をＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｉ）０１抗体と命名した。ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（Ｍ３４Ｌ）及びＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（Ｍ３４Ｉ）のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１１及び配列番号６に、塩基配列を、それぞれ、配列番号７４及び配列番号６９に示した。【００７８】
上記の発現で得られた上清を用いてＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによりｃＹ９Ａ２抗体との結合性の比較評価を行った。その結果、図８に示したように上記２種のヒト化抗体は、ｃＹ９Ａ２抗体と同等の抗原結合性を持つことを見出した。【００７９】
《実施例９：ＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｌ）０１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｉ）０１抗体の細胞接着阻害活性》
上記のＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｌ）０１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｉ）０１抗体の発現上清から、前述と同様にプロテインＡカラムを用いて精製抗体を取得し、波長２８０ｎｍにおける吸光度に基づいて濃度を算出した。得られた精製ヒト化抗体とマウスＹ９Ａ２抗体について、細胞接着阻害試験により活性比較を行った結果を表４に示した（２回の試験の平均値）。【００８０】
【表４】
2009088065.tif 000005
【００８１】
表４に示したように、上記２種類のヒト化抗体ではマウスＹ９Ａ２抗体よりも２倍程度阻害活性が向上していることが判った。抗体の安定性低下の回避を意図したアミノ酸置換でも、阻害活性が向上することは、当初の予測にはなかった好ましい効果であった。【００８２】
《実施例１０：ＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｌ）０１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｉ）０１抗体の酸化に対する耐性の確認》
前述のようにして作製したＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｌ）０１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｉ）０１抗体が、実際に酸化に対して耐性を持つことを下記の方法で調べた。まず、ｃＹ９Ａ２抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｌ）０１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｉ）０１抗体の溶液に、最終濃度０．４％の過酸化水素水を添加し、２５℃で４時間静置した後、ＰＢＳに透析して回収した。続いて、それぞれの抗体について、前述のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにより、過酸化水素水で処理していない抗体との比較解析を行った。その結果、図９に示したように、３４番目がメチオニンであるｃＹ９Ａ２抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体については、過酸化水素処理によって抗原への結合性が低下しているのに対して、ＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｌ）０１抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５（Ｍ３４Ｉ）０１抗体については、過酸化水素処理による結合性低下は見られなかった。【００８３】
以上のように、Ｙ９Ａ２抗体の場合、３４番目のメチオニンをロイシンまたはイソロイシンに改変することによって、ヒトα９インテグリン分子に対する親和性を維持したまま、酸化に対する耐性を付与できることを発見した。【００８４】
《実施例１１：Ｙ９Ａ２抗体のＦａｂの作製》
Ｙ９Ａ２抗体のＦａｂは以下のように大腸菌を用いて作製した。まず、Ｙ９Ａ２抗体のＶＨ及びＶＬ領域をＰＣＲで増幅し、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８，１−１０（２００５）に記載のｐＴｒｃ９９Ａ改変ベクターに導入し、Ｙ９Ａ２抗体Ｆａｂの発現プラスミドを得た。ｐＴｒｃ９９Ａ改変ベクターにはヒトＩｇγ１のＣＨ１ドメインの遺伝子及びヒトＩｇκドメインの遺伝子が導入されており、それぞれの上流にＶＨ、ＶＬドメインの遺伝子を導入することができる。またＶＨ及びＶＬの上流部分には分泌発現に必要なｐｅｌＢシグナルが付加されており、蛋白の発現はｔｒｃプロモーターとＬａｃＩリプレッサーにより制御されている。上記のＹ９Ａ２抗体のＦａｂの発現プラスミドを大腸菌ＪＭ８３株に導入し、３０℃で２ｘＹＴ培地で培養し１ｍＭのＩＰＴＧを添加した後、一晩培養してＦａｂを上清中に発現させた。この培養上清数１００ｍＬに含まれるＹ９Ａ２抗体のＦａｂを、プロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製し、波長２８０ｎｍでの吸光度に基づいて濃度を算出した。【００８５】
《実施例１２：Ｙ９Ａ２抗体のＦａｂへの変異導入》
さらに、本発明者らは、ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の活性を向上させるために、他のＣＤＲ中のアミノ酸残基の置換可能性を検討した。【００８６】
具体的には、まず、本発明者らは、抗原との結合に直接的には関与しないが、間接的に影響を与える可能性があるＣＤＲ中のアミノ酸残基として、ＶＨのＣＤＲ３中にある、Ｎ末端から１０４番目のアスパラギン酸と１０５番目のフェニルアラニンに着目した。これらの残基への着目は本発明者らの十分な経験と創意に基づくものであり、公知事実に基づいて容易に想到できるものではない。これらの残基をコードするコドン部分をＮＮＫに改変したプライマーと（ＮはＡまたはＴまたはＧまたはＣを意味し、ＫはＧまたはＴを意味する）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて、前述のマウスＹ９Ａ２抗体Ｆａｂの遺伝子の上記部位に変異を導入したプラスミドを作製した。このプラスミドを大腸菌に導入してクローニングし、おおよそ９００クローンについて個別にＦａｂを発現させた。上清中に分泌されたアミノ酸置換導入Ｆａｂの濃度は次のＥＬＩＳＡ法により算出した。すなわち、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ（ＢＥＴＨＹＬ社）抗体を固定化したＥＬＩＳＡプレートにＦａｂを含む培養上清を添加して反応させ、次にＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇκ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社）を結合させ、ＴＭＢ試薬を加えて発色させた後、希硫酸を加えて反応を停止させて波長４５０ｎｍにおける吸光度を調べた。濃度算出のための標準試料としては、前述の精製Ｙ９Ａ２抗体のＦａｂを用いた。【００８７】
次に、上記のアミノ酸置換導入Ｆａｂ発現上清を用いて、ヒトα９インテグリン分子に対する結合性を前述のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法により調べた。比較対照としてＹ９Ａ２抗体のＦａｂについても同時に測定を行った。その結果、Ｙ９Ａ２抗体の１０４番目と１０５番目のアミノ酸がそれぞれ、アラニンとロイシン、アラニンとトリプトファン、トリプトファンとグルタミン酸、セリンとトリプトファンに置換された４種類のクローンが、Ｙ９Ａ２抗体Ｆａｂよりも高い抗原結合活性を有することが確認された。これら４種類の置換体及びＹ９Ａ２抗体のＦａｂについてのＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの結果を図１０及び図１１に示した。【００８８】
《実施例１３：ＲＹ９Ａ２ｖ５０１のＶＨのＣＤＲ３アミノ酸置換体の作製》
前項に記載の検討において、Ｙ９Ａ２抗体Ｆａｂのヒトα９インテグリン分子への結合性が向上した４種類のアミノ酸置換をＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体のＶＨに導入した。アミノ酸置換の導入は、前述のＣＤＲアミノ酸置換と同様に、ＲＹ９Ａ２ｖ５０１のＶＨ遺伝子を鋳型として、コドンを変更したプライマーを用いたＰＣＲにより行った。アラニンとロイシン、アラニンとトリプトファン、トリプトファンとグルタミン酸、セリンとトリプトファンへの置換を導入したＶＨを、それぞれ、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（ＡＬ）、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（ＡＷ）、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（ＷＥ）、ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（ＳＷ）と命名し、それぞれのアミノ酸配列を、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号４に、塩基配列を、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８及び配列番号６７に記載した。【００８９】
これらのＶＨ断片を、前述と同様に発現ベクターＡＧ−γ１と連結して、重鎖発現プラスミドを作製し、ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１の軽鎖発現プラスミドと組み合わせて発現させた。得られた培養上清から、プロテインＡカラムを用いて４種類の精製抗体（アラニンとロイシン、アラニンとトリプトファン、トリプトファンとグルタミン酸、セリンとトリプトファンに置換したＶＨを含む抗体を、それぞれ、ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＡＬ）０１、ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＡＷ）０１、ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＷＥ）０１及びＲＹ９Ａ２ｖ５（ＳＷ）０１と命名した）を取得した。抗体濃度は波長２８０ｎｍでの吸光度に基づいて算出した。【００９０】
《実施例１４：２アミノ酸置換導入ＲＹ９Ａ２ｖ５０１抗体の細胞接着阻害試験》
前述のようにして作製した４種類のＲＹ９Ａ２抗体について、前述の細胞接着阻害試験を行った。２回の試験の平均値を表５に示した。ＩＣ５０の欄の（  ）内の数値は各ヒト化抗体と同時に測定したマウスＹ９Ａ２抗体の結果である。その結果、いずれのヒト化抗体もマウスＹ９Ａ２抗体と比較して阻害活性が向上した。特に、１０４番目と１０５番目をそれぞれアラニンとトリプトファンに置換したＲＹ９Ａ２ｖ５（ＡＷ）０１抗体及びトリプトファンとグルタミン酸に置換したＲＹ９Ａ２ｖ５（ＷＥ）０１抗体については、マウスＹ９Ａ２抗体と比較してＩＣ５０が２分の１以下の濃度であったことから、阻害活性が大きく向上していることが判った。【００９１】
【表５】
2009088065.tif 000006
【００９２】
《実施例１５：ＣＤＲアミノ酸置換を導入したＲＹ９Ａ２抗体の作製》
上記の結果から、ＲＹ９Ａ２における活性および／または物性を改善するために、以下のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲアミノ酸における置換が有効であることが確認された：１）ＶＨのＣＤＲ１中のメチオニン残基（ＶＨアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸残基）のロイシンまたはイソロイシンへの置換；２）ＶＨのＣＤＲ２中のリジン残基及びアスパラギン酸残基（ＶＨアミノ酸配列の６５番目及び６６番目のアミノ酸残基）の、それぞれ、グルタミン及びグリシンへの置換；３）ＶＨのＣＤＲ３中のアスパラギン酸残基及びフェニルアラニン残基（ＶＨアミノ酸配列の１０４番目及び１０５番目のアミノ酸残基）の、それぞれ、アラニン及びロイシン、アラニン及びトリプトファン、トリプトファン及びグルタミン酸、またはセリン及びトリプトファンへの置換；４）ＶＬのＣＤＲ１中のリジン残基（ＶＬアミノ酸配列の２４番目のアミノ酸残基）のグルタミンまたはアルギニンへの置換。【００９３】
この結果に基づいて、ＲＹ９Ａ２ｖ５０１及びＲＹ９Ａ２ｖ８０１のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲにおいて上記の置換のいずれかを導入した、ＶＨ及びＶＬアミノ酸をデザインした。これらのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（前述のＶＨ及びＶＬを含む）を以下の表６−１〜表６−３に示す。【００９４】
【表６−１】
2009088065.tif 000007
【００９５】
【表６−２】
2009088065.tif 000008
【００９６】
【表６−３】
2009088065.tif 000009
【００９７】
上記のＶＨ又はＶＬをコードするＤＮＡ配列を、前述のＤＮＡ合成方法又は変異導入方法を用いて作製し、これらのＤＮＡ配列を、前述と同様に発現ベクターＡＧ−γ１、ＡＧ−κにそれぞれ連結して、発現プラスミドを作製する。次いで、作製した重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて発現させる。培養上清中に蓄積した各ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の濃度の測定及び、培養上清からの精製抗体の取得は、前述と同様の方法で行う。【００９８】
《実施例１６：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の作製》
本発明者らによる相当の創意検討の結果、マウスＹ９Ａ２抗体よりも有意に優れた活性を有するヒト化Ｙ９Ａ２抗体として、以下の３種の抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体、ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体及びＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体を作製することに成功した。【００９９】
１．ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体
ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨ及びＶＬの塩基配列は、それぞれ配列番号１１９及び１２６に示される。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ８（配列番号３１）の、ＣＤＲ１中のメチオニン残基（ＶＨアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸残基）のロイシンへの置換、並びに、ＣＤＲ２中のリジン残基及びアスパラギン酸残基（ＶＨアミノ酸配列の６５番目及び６６番目のアミノ酸残基）のそれぞれグルタミン及びグリシンへの置換を有するものである。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＬは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１（配列番号６１）の、ＣＤＲ１中のリジン残基（ＶＬアミノ酸配列の２４番目のアミノ酸残基）のアルギニンへの置換を有するものである。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体の重鎖は、配列番号５６に示されるＶＨとヒトＩｇγ１定常領域とを連結して得られ、そのアミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれ、配列番号１４８及び配列番号１４９に示される。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体の軽鎖は、配列番号６３に示されるＶＬとヒトＩｇκ定常領域とを連結して得られ、そのアミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５５に示される。【０１００】
２．ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体
ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有し、ＶＬは、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する。ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨ及びＶＬの塩基配列は、それぞれ配列番号８９及び１２６に示される。ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＨは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（配列番号１）の、ＣＤＲ１中のメチオニン残基（ＶＨアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸残基）のロイシンへの置換、並びに、ＣＤＲ２中のリジン残基及びアスパラギン酸残基（ＶＨアミノ酸配列の６５番目及び６６番目のアミノ酸残基）のそれぞれグルタミン及びグリシンへの置換を有するものである。ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体のＶＬは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１（配列番号６１）の、ＣＤＲ１中のリジン残基（ＶＬアミノ酸配列の２４番目のアミノ酸残基）のアルギニンへの置換を有するものである。ＲＹ９Ａ２ｖ１１（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体の重鎖は、配列番号２６に示されるＶＨとヒトＩｇγ１定常領域とを連結して得られ、そのアミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれ、配列番号１５０及び配列番号１５１に示される。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体の軽鎖は、配列番号６３に示されるＶＬとヒトＩｇκ定常領域とを連結して得られ、そのアミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５５に示される。【０１０１】
３．ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体
ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体のＶＨは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、ＶＬは、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する。ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１のＶＨ及びＶＬの塩基配列は、それぞれ配列番号７１及び１２４に示される。ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体のＶＨは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＨｖ５（配列番号１）の、ＣＤＲ１中のメチオニン残基（ＶＨアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸残基）のイソロイシンへの置換、並びに、ＣＤＲ３中のアスパラギン酸残基及びフェニルアラニン残基（ＶＨアミノ酸配列の１０４番目及び１０５番目のアミノ酸残基）のそれぞれアラニン及びトリプトファンへの置換を有するものである。ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体のＶＬは、上記ＲＹ９Ａ２ＶＬｖ０１（配列番号６１）と同じである。ＲＹ９Ａ２ｖ５（ＩＡＷ）０１抗体の重鎖は、配列番号８に示されるＶＨとヒトＩｇγ１定常領域とを連結して得られ、そのアミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれ、配列番号１５２及び配列番号１５３に示される。ＲＹ９Ａ２ｖ１２（Ｍ３４Ｌ）０１２抗体の軽鎖は、配列番号６１に示されるＶＬとヒトＩｇκ定常領域とを連結して得られ、そのアミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれ、配列番号１５６及び配列番号１５７に示される。【０１０２】
上記の３種の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ断片を、前述と同様に発現ベクターＡＧ−γ１、ＡＧ−κと連結して発現プラスミドを作製し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて発現させ、前述と同様にプロテインＡカラムを用いて培養上清から各々の精製抗体を取得した。【０１０３】
《実施例１７：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のヒトα９インテグリンに対する結合性確認》
前述のように作製した３種類のヒト化Ｙ９Ａ２抗体およびｃＹ９Ａ２抗体について、実施例４と同様に、ＣＥＬＬ  ＥＬＩＳＡによりヒトα９インテグリンに対する結合性の確認を行った。その結果、改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体はいずれもキメラＹ９Ａ２抗体と同様、ヒトα９インテグリンに対する結合性を有することが確認できた。【０１０４】
《実施例１８：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のヒトｎＯＰＮに対する細胞接着阻害試験》
３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体について、マウスＹ９Ａ２抗体との活性を比較するために、実施例２に記載と同様の手順で細胞接着阻害試験を行った。【０１０５】
その結果を表７に示した。ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）は、抗α９インテグリン抗体を添加しない場合に起こる細胞接着のレベルを基準としたときに、それを５０％抑制する抗α９インテグリン抗体の濃度として定義される。マウスＹ９Ａ２抗体のＩＣ５０値の平均的は０．０３９μｇ／ｍＬであった。表７にはマウスＹ９Ａ２のＩＣ５０値を１とした場合のヒト化Ｙ９Ａ２抗体の比活性を示す。２〜３回の試験の平均値を表７に示した。３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体は、マウスＹ９Ａ２抗体と比較して４倍以上、細胞接着阻害活性が向上していることが判った。【０１０６】
【表７】
2009088065.tif 000010
【０１０７】
《実施例１９：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体のヒトＶＣＡＭ−１、ヒトＴｅｎａｓｃｉｎＣに対する細胞接着阻害試験》
３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体について、前述の細胞接着阻害試験に用いたｎＯＰＮ−ＲＡＡとは異なるリガンドを用いて検討を行った。具体的にはヒトＶＣＡＭ−１/Ｉｇ（Ｒ＆Ｄ社）、ヒトＴｅｎａｓｃｉｎＣのＲＧＤ配列をＲＡＡに置換した改変体ヒトＴｅｎａｓｃｉｎＣ−ＲＡＡを用いて同様に細胞接着阻害作用の検討を行なった。【０１０８】
２回の試験の平均値を表８に示した。マウスＹ９Ａ２抗体のヒトＶＣＡＭ−１、ヒトＴｅｎａｓｃｉｎＣ−ＲＡＡに対する細胞接着阻害活性ＩＣ５０値の平均値は、それぞれ、０．０７７μｇ／ｍＬ、０．０４１μｇ／ｍＬであった。表８にはマウスＹ９Ａ２抗体のＩＣ５０値を１とした場合のヒト化Ｙ９Ａ２抗体の比活性を示す。３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体は、用いるリガンドにより違いはあるが、マウスＹ９Ａ２抗体と同等以上の阻害活性を示すことが判った。【０１０９】
【表８】
2009088065.tif 000011
【０１１０】
《実施例２０：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の細胞遊走阻害試験》
３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体について、ＳＷ４８０／ｈα９細胞のｎＯＰＮ−ＲＡＡに対する遊走活性に対する阻害作用を検討した。実験は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ，１２：３２１４−３２２５，２００１に記載の細胞遊走阻害試験を基に若干の改変を加えて行った。すなわち、ｎＯＰＮ−ＲＡＡをトランスウェル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）の上層に固定化した後にプレートに取り付け、その後１０％ＦＣＳを含んだＦ１５培地を下層に加えた。上層にマウスＹ９Ａ２抗体またはヒト化Ｙ９Ａ２抗体をＳＷ４８０／ｈα９細胞と一緒に添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、トランスウェルの下層に遊走してきた細胞をＱＣＭ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ２４−ｗｅｌｌ  Ａｓｓａｙキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて定量化した。過剰量である１００μｇ／ｍＬのマウスＹ９Ａ２抗体を添加することにより阻害される遊走活性をα９依存的な遊走活性と定義し（１００％阻害）、各抗体の阻害率を表９に示す。【０１１１】
マウスＹ９Ａ２抗体では、５０μｇ／ｍＬでなければ有意な遊走阻害作用が見られないが、本発明者らによって作製された改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体では、５μｇ／ｍＬとマウスＹ９Ａ２抗体の１／１０の濃度で有意な阻害活性が見られた。なお、有意差検定は、抗体未添加のウェルに対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにて行なった。*: Ｐ＜０．０５、**: Ｐ＜０．０１。【０１１２】
【表９】
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【０１１３】
この有意な細胞遊走阻害作用は臨床有効濃度に直結しており、臨床有効濃度が１／１０になることは臨床において投与間隔の拡大（例えば、２週に１回投与が数ヶ月に１回投与になる、等）に繋がり、更に、５μｇ／ｍＬ程度の血中濃度維持であれば皮下注製剤の開発が可能となる。皮下注製剤は現在世界中で自己注射が認められており、慢性疾患においては、特に患者、医療機関双方に取って利便性が格段に向上する。このように本発明による生物学的活性の改善は、その治療有効性のみならず患者コンプライアンスの改善に大きく寄与するものである。【０１１４】
《実施例２１：改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体の熱安定性試験》
３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体およびマウスＹ９Ａ２抗体について、７０℃で２時間または１０時間インキュベートした後に、実施例１８に記載の細胞接着阻害試験を用いて熱安定性について評価を行った。【０１１５】
４回の実験の平均値を表１０に示した。熱処理をしない場合の細胞接着阻害活性を１００％として、熱処理した後の各抗体の活性残存率を示した。マウスＹ９Ａ２抗体では２時間で活性の低下が認められたが、３種類の改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体は１０時間インキュベートしても活性が８５％以上残っていた。このように、改良型ヒト化Ｙ９Ａ２抗体が極めて熱に対して安定である性質は、臨床開発製剤において室温保存可能な利便性の高い製剤の開発に繋がるといえる。【０１１６】
【表１０】
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【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、ドナーマウス抗ヒトα９インテグリン抗体と比較して、活性および／または物性が改善された抗体であり、ヒトα９インテグリンとその複数のリガンドとの相互作用の遮断を通じ、強力な抗炎症作用や骨破壊抑制作用を有するものであり、ヒトα９インテグリンが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療に有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００８−００４９７５（出願日：平成２０年１月１１日）および特願２００８−２８２４９６（出願日：平成２０年１０月３１日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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