(57)【要約】本発明は、ヒトの患者における海馬硬化に関連する側頭葉癲癇（TLE-HS）の治療用薬剤としての5-HT3受容体拮抗剤の使用に関する。トロピセトロン、またはドラセトロンが好ましい化合物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの患者における海馬硬化に関連する側頭葉癲癇（TLE-HS）の治療用薬剤としての5-HT3受容体拮抗剤の使用。
【請求項２】
前記5-HT3受容体拮抗剤が、グラニセトロン、トロピセトロン、またはドラセトロンであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記5-HT3受容体拮抗剤が、5-HT3受容体に対して選択的であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
海馬硬化に関連する側頭葉癲癇（TLE-HS）に罹患するヒトの患者を治療する方法であって、治療有効量の5-HT3受容体拮抗剤の投与を含む方法。
【請求項５】
前記治療有効量が、体重1 kg当たり0.01 mg から約0.2 mgまでであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記治療は経口または非経口であることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤無反応性癲癇の治療に関し、さらに詳細には、海馬硬化に関連する側頭葉癲癇（TLE-HS）に関する。
【背景技術】
【０００２】
癲癇は、消耗性の癲癇発作が、脳における神経活動の上昇によって生ずる、ごく一般的な神経学的障害である。世界中で約4千万から5千万人が癲癇に冒されている。ヨーロッパでは、10万の人口当たり40から70人が冒されており、ヨーロッパの保健に対するコストは、合計、年間2百億ユーロになる。患者の約70%は適切な治療を受けているが、残りの30%は、現今の薬剤治療に対し、全く反応しないか、部分的にしか反応しない。薬剤無反応性癲癇患者に対する現今の治療は、それが適切であれば、脳の病的部分を切除するために侵襲的脳手術を含むことがある。このような手術のコストは、患者当たり5万から20万ドルの間を変動する。
【０００３】
癲癇発作は、脳のニューロンの興奮の増大によって生ずる。海馬硬化に関連する側頭葉癲癇（TLE-HS）を有する患者は、現今の癲癇用薬剤治療に反応しないので、その症状を緩和するために外科的切除を必要とする。TLE-HS患者の海馬では、いくつかの神経伝達システムが冒される。海馬の下部分野の興奮性グルタミン酸作動性ニューロンは変性するが、一方、大部分の抑制性GABA性ニューロンは比較的変性を免れる。また一方、最近の証拠から、これらの、正常時には抑制性のGABA性ニューロンは、TLEでは興奮性であることが示唆されている(非特許文献１参照）。したがって、これらのGABA性ニューロンが比較的保存されることは、TLEに関連する神経興奮を下げるのではなく、むしろ状態を悪化させることが考えられる。
【非特許文献１】Cohen et al., Science, 298, 1418-1421, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
TLE-HSの治療のための療法、および前記療法に使用される薬剤を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ヒト患者における海馬硬化関連側頭葉癲癇（TLE-HS）の治療用薬剤として、5-HT3受容体拮抗剤を使用することに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、TLE-HS患者の側頭葉組織において、グルタミン酸作動性およびGABA性両方のニューロンに関連する5-HT3受容体の広範な上向き調節が存在するという、本発明者による発見に基づく。この所見は、5-HT3受容体が、TLE-HSの治療標的となり得るという可能性を示唆する。
【０００７】
Balakrishnan et al. (Epilepsy & Behaviour, 1, 22-26(2000))は、ある特定の5-HT3受容体拮抗剤、オンダンセトロンが、ラットにおいて、最大電気ショック誘発発作に対し低用量で有効であることを示唆している。しかしながら、ラットモデルは、ヒトのTLE-HSとは無関係である。例えば、この動物モデルは、フェニトインに対して感受性を持つが、ヒトのTLEでは、フェニトインは十分ではない。いずれにしろ、オルダンステロンが観察された効果を発揮した理由に関して、明白な教示はない。さらに、オンダンステロンが比較的高い用量（> 2 mg/kg）で無効であるとする明白な教示がある。
【０００８】
5-HT3受容体拮抗剤は、嘔吐の治療用薬剤として広く生産されている。この化合物は、ほとんど副作用を示さないか、ごく軽微な副作用しか示さないので、慢性的投与には好適と考えられる。
【０００９】
5-HT3受容体拮抗剤の性質は、特に限定はされず、例えば、既知であり、他の医学的状態のために市販される5-HT3受容体拮抗剤から選ばれてもよい。好適な5-HT3受容体拮抗剤としては、グラニセトロン、トロピセトロン、およびドラセトロンが挙げられる。オンダンセトロンは、本発明の範囲から排除することが好ましい。
【００１０】
5-HT3受容体拮抗剤は、5-HT3受容体に対し選択的であることが好ましい。
【００１１】
本発明はさらに、治療量の5-HT3受容体拮抗剤の投与を含む、海馬硬化関連側頭葉癲癇（TLE-HS）に罹患するヒトの患者の治療法にも存する。
【００１２】
本発明はさらに、5-HT3受容体拮抗剤を、製薬学的に適用可能な、その担体と混ぜ合わせることを含む製薬学的処方にも存する。
【００１３】
患者に投与される用量は、通常、処方する医師によって決められるが、一般に、各患者の年齢、体重、および反応の外に、患者の症状の重度に従って変動する。しかしながら、多くの場合、治療的有効量は、嘔吐の治療に有効であることが知られるのと同じ範囲、例えば、体重1 kg当たり約0.01 mgから約0.2 mg、好ましくは、体重1 kg当たり0.02 mgから約0.1 mgで、単回投与または分割投与される。しかしながら、ある場合には、これらの限界を外れた用量を使用することが必要とされてもよい。
【００１４】
活性成分を、加工せず薬品のままで単独で投与することも可能ではあるが、製薬処方として提示するのが好ましい。本発明の処方は、製薬学的に適用可能な担体と共に処方した活性成分、および任意の他の治療成分（単数または複数）との組み合わせを含む。担体（単複）は、処方の他の成分と適合し、かつ、その服用者に対して有毒ではないという意味で「適用可能」でなければならない。
【００１５】
処方の単位用量は、1 mgから8 mgの活性成分を含むと好都合である。処方は、投与のためには1日当たり1回から6回、例えば、2回から4回であるのが好ましい（1日当たり2回が特に好都合である）。鼻腔投与または口腔投与、例えば、後述する、自己発射粉末投与処方に好適な処方は、0.001から0.2% w/w、例えば、約0.01% w/wの活性成分を含んでもよい。
【００１６】
処方は、経口、非経口（皮下、腹腔内、筋肉内、および静脈内を含む）、動脈内、局所、直腸内、鼻腔内、または口腔投与用として好適な剤形のものを含む。経口投与が好ましいが、重い症例ではIV投与が好ましい。
【００１７】
経口投与に好適な本発明の処方は、独立した単位剤形、例えば、それぞれが、指定量の活性成分を含むカプセル、散剤、錠剤、またはトローチ剤として；粉末または顆粒として；水溶液または非水溶液に溶解した溶液または縣濁液として；または、水中油乳液、または油中水乳液として存在してもよい。活性成分は、丸薬、舐剤、またはペーストとして存在してもよい。このような処方については、活性成分の溶剤中の希釈の範囲が適切であり、例えば、1%から99%、好ましくは5%から50%、より好ましくは10%から25%の希釈である。希釈のレベルに応じて、処方は、室温（約20℃の領域）で液体であるか、低融点の固体である。
【００１８】
直腸投与用処方は、活性成分、およびココアバターなどの担体を含む坐剤か、または、浣腸の形を取ってもよい。
【００１９】
非経口投与用に好適な処方としては、前述のように、溶液、縣濁液、または乳液が挙げられ、活性成分の滅菌水溶液製剤で、レシピエントの血液と等張であることが好ましい。
【００２０】
動脈内投与用に好適な処方としては、活性成分の滅菌水溶液製剤で、ミクロ結晶形、例えば、ミクロ結晶の水性縣濁液、またはミセルの分散液または縣濁液の形を取ってもよい。リポソーム処方または生物分解性ポリマー系も、活性成分の提示のために使用することが可能である。
【００２１】
局所投与に好適な処方としては、経皮デバイスが挙げられる。投与は、例えば、貯留物および多孔性膜タイプのパッチ、または、固相基質変種のパッチを用いて実行してもよい。いずれの場合でも、活性成分は、貯留物またはマイクロカプセルから、膜を通じて連続的に、患者の皮膚と接触する活性成分透過性接着剤に輸送される。活性成分は、調節された、指定の速度で、皮膚から吸収される。マイクロカプセルの場合、封入剤は、膜として機能してもよい。経皮デバイスは、通常、アクリル乳剤などの接着システムと共に、適切な溶媒システムに溶解した化合物を含む。処方は、活性剤の皮膚を通した吸収または浸透を強化する浸透剤を含むことが好ましい。そのような皮膚浸透剤の例として、ジメチルスルフォキシド、および関連の類縁体が挙げられる。
【００２２】
鼻腔または口腔投与に好適な処方としては、吸引または吸入に好適なもの、散剤、自己発射および噴霧処方、例えば、エロゾルおよび噴霧器が挙げられる。製剤は、分散された時に10から200 μmの範囲の粒径を持つことが好ましい。
【００２３】
このような処方は、粉末吸引デバイス、または自己発射粉末投与処方から発せられる、肺内投与用の微細磨砕粉末の形を取ってもよく、その際、活性成分は、微細磨砕粉末として、処方の、最大99.9% w/wを含んでもよい。
【００２４】
自己発射粉末投与処方は、固体活性剤の分散粒子、および、大気圧において18℃未満の沸点を有する液体噴霧剤を含むことが好ましい。一般に、噴霧剤は、処方の50から99.9% w/wを構成し、一方、活性成分は、処方の0.1から20% w/w、例えば、約2% w/wを構成する。
【００２５】
このような自己発射処方における製薬学的に適用可能な担体は、噴霧剤の外に、他の成分、特に、界面活性剤、または固体希釈剤、またはその両方を含んでもよい。界面活性剤は、活性成分粒子の凝集を阻止し、活性成分を縣濁状態に維持するので望ましい。特に貴重なのは、液性の、非イオン性界面活性剤、および固相の陰イオン性界面活性剤、またはそれらの混合物である。好適な、液性非イオン性界面活性剤は、10未満の親水性-親油性バランス（HLB、Journal of the Society of Cosmetic Chemists Vol. 1, pp.311-326 (1949)を参照されたい）を持つもの、特に、脂肪酸と、脂肪族多価アルコールとのエステルおよび部分的エステルである。液性非イオン性界面活性剤は、処方の0.01から最大20% w/wまで構成してもよい。ただし、処方の1% w/w未満を構成するのが好ましい。好適な固相陰イオン性界面活性剤としては、アルカリ金属、ジアルキルスルフォスクシネートおよびアルキルベンゼンスルフォン酸のアンモニウムおよびアミン塩が挙げられる。固相陰イオン性界面活性剤は、組成物の1% w/w未満であるのが好ましいが、処方の0.01から最大20% w/wまで構成してもよい。活性剤の密度が、噴霧剤の密度とはっきりと異なる、このような自己推進処方には、固相希釈剤を含めるのが有利である。さらに固相希釈剤は、活性成分を縣濁状態に維持するのを助ける。固相希釈剤は、活性剤の粒子の径と同じ桁の粒径を持つ微細な粉末の形を取ることが好ましい。好適な固相希釈剤としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および糖類が挙げられる。
【００２６】
本発明の処方は、活性成分が溶液として存在する、自己推進処方の形を取ってもよい。このような自己推進処方は、活性成分、噴霧剤、および共溶媒、および、さらにこれがあると有利であるが、抗酸化安定剤を含んでもよい。適切な共溶媒として、低級アルキルアルコール、およびそれらの混合物がある。共溶媒は、処方の20% w/w未満であることが好ましいが、処方の5から40%を構成してもよい。抗酸化安定剤は、活性成分の劣化を抑制するために、このような溶液処方に含められるのであるが、アルカリ金属のアスコルビン酸塩または次亜硫酸塩であると好都合である。抗酸化安定剤は、処方の、最大0.25% w/wの量として存在する。
【００２７】
本発明の処方は、噴霧器またはアトマイザーにおいて使用するためには、活性成分の水溶液、またはアルコール希釈液で、任意に滅菌した水溶液の形を取ってもよい。噴霧器またはアトマイザーでは、溶液の小滴から成る微細な霧を生み出すために加速気流が用いられる。このような処方は、通常、芳香剤、例えば、サッカリンナトリウムおよび揮発油を含む。このような処方には、メタ亜硫酸ナトリウムなどのバッファー剤、および界面活性剤を含めてもよい。処方はさらに、メチルヒドロキシベンゾエートなどの防腐剤を含むべきである。
【００２８】
鼻腔投与に好適な他の処方としては、20から500ミクロンの粒径を持つ粉末が挙げられ、投与は、嗅剤を摂取するやり方で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末容器から、鼻腔を通じて急速に吸引することによって行う。
【００２９】
前述の成分の外に、本発明の処方は、一つ以上の追加成分、例えば、希釈剤、バッファー、芳香剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、防腐剤、例えば、メチルヒドロキシベンゾエート（抗酸化剤を含む）、乳化剤などを含んでもよい。本発明の処方において使用するのに特に好ましい担体または希釈剤は、C18からC24の一不飽和脂肪酸、例えば、オレイン酸の低級アルキルエステル、例えば、オレイン酸エチルである。その他の好適な担体または希釈剤としては、カプリン酸またはカプリル酸エステル、またはトリグリセリド、またはそれらの混合物があり、例えば、商品名Miglyolの名の下で販売されるカプリル酸／カプリン酸トリグリセリドである。例えば、Migloyl 810が挙げられる。
【実施例】
【００３０】
次に、下記のデータを参照しながら、本発明を例を挙げて説明する。
【００３１】
1.  ヒト海馬における5-HT3受容体の発現
1.1  組織の選択
TLEに由来するHS患者の切除組織は、治療として側頭葉および海馬を切除された患者から得た。海馬硬化は、CA1-4および歯状回を含めた海馬下部領域における、ニューロン密度に関する神経病理学的分析によって確認された（さらに、ニューロン密度に対する5-HT3受容体の相対的発現の評価も可能である）。「コントロール」組織は、神経学的または精神科的障害無しに亡くなった患者から得られた（下記の表1を参照）。摘出組織の入手の速度に対し、「コントロール」組織を入手する際の、死後遅延を正確に「適合させる」ことは困難であることが認識される。しかしながら、二つのグループの間に「死後」遅延に差がでることを打ち消す試みとして、いくつかの切除脳組織は、「コントロール」組織が明らかに暴露される死後条件をできるだけ忠実に再現する環境の中に置かれた。
【００３２】
表１：患者の詳細
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a癲癇組織では、死後遅延とは、組織の外科的切除から凍結までの遅延に相当する。
【００３３】
1.2  オートラジオグラフィーによる5-HT3受容体の定量
5-HT3受容体結合レベルが、定量的受容体オートラジオグラフィー（Barnes, J.M., Ge, J., Parker, R.M.C., Barber, P.C., Barnes, N.M. (1996) J. Neurological Sci., 144, 119-127, 1996）によって、脳のサンプルにおいて定量された（「コントロール」およびTLE-HS患者）。手短に言うと、海馬凍結組織を、包埋媒体（OCTコンパウンド）で取り囲み、クライオスタットを用いて20 μm切片に薄切し、解凍してゼラチンをコートしたスライドガラスに載せた。切片は乾燥状態で、定量まで-80℃に保存した。
【００３４】
5-HT3受容体を定量するために、スライドに載せた海馬切片を、保存状態（-80℃）から取り出し、4℃に平衡させた（通常30-60分）。組織における内因性5-HTのレベルを下げるために、切片は、あらかじめ、4℃のHepes/Krebsバッファー(mM: Hepes, 50.0; NaCl, 118.0; KCl, 4.75; KH2PO4, 1.2; MgSO4, 1.2; CaCl2, 2.5; NaHCO3, 25.0; グルコース, 11.0; 最終pH7.4)中で30分インキュベートした。次に、切片を、新鮮なHepes/Krebsバッファー（4℃）に短時間浸すことによってスライドを洗浄し、グラニセトロン無添加（全体結合）、または添加(1 μM; 非特異的結合)の条件下に、0.5 nM [3H]-(S)-ザコプリド(78-83 Ci/mmol)を含むHepes/Krebsバッファーにおいて4℃で60分インキュベートした。インキュベーションの直後、組織切片を、Hepes/Krebsバッファー(4℃; 2 x 5分)で洗浄し、バッファー塩を除去するために蒸留水(4℃)に浸した（1秒）。切片を、乾燥冷気流中で速やかに乾燥させ、X線カセットにおいて、[3H]標準(Amersham)と共に、ハイパーフィルム-[3H](Amersham)に6から10週間暴露した。オートラジオグラフィーフィルムは、コダックLX24現像液(5分)、およびコダックUnifix（5分）において現像した。解像度を改善する試みとして、いくつかの組織切片は、乾燥後、あらかじめカバーガラス上で乾燥させておいた写真乳剤(K5またはG5、Ilford)に暴露させた。カバーガラス、組織切片を支持する顕微鏡スライドに一端を恒久的に固定させ、組織を傷めずに写真乳剤が現像され、かつ、写真乳剤でコートされたカバーガラスの、露光時の位置が再現可能となるようにした。写真乳剤は、D19 現像液（Kodak、5分）、およびAL4 定着液（Kodak、5分）で現像した。オートラジオグラフィーフィルムは、イメージ分析（MCID、Imaging Research Inc）を用い、[3H]標準（fmol/1 mgの組織に対する未処理の灰色部位の数値、Amersham）を参照することによって定量した。この「カバーガラス」技術を用いた実験では、5-HT3受容体の細胞分布に関しては、定性的情報しか得られなかった。
【００３５】
1.3  免疫組織化学によって評価された5-HT3受容体サブユニットの半定量的発現
異なる5-HT3受容体異性形（すなわち、異なるサブユニット組成を有する5-HT3受容体、例えば、ホモマーの5-HT3A受容体、およびヘテロマー5-HT3A/3B受容体(Brady, C.A., Stanford, I.M., Ali, I., Lin, L., Dubin, A.E., Hope, A.G., Barnes, N.M. (2001) Neuropharmacology, 41, 282-284)）の間では、外見上、薬理学的差はごく少ないので、5-HT3受容体発現の変化の分子的基盤を決めるために放射性リガンド・受容体オートラジオグラフィーを使用することはできない。したがって、免疫組織化学的技術を用いて、個々の5-HT3受容体サブユニットの発現の検出を評価した。もう一つの利益は、この後者の技術によって細胞解像度が実現されることである。
【００３６】
以前、ウェスタンブロットにおいて5-HT3Aサブユニットタンパク質を標識し、かつ、光学および電子顕微鏡レベルで脳および腸組織切片を標識するのに用いた選択的抗体(Morales, M., Bloom, F.E. (1997) J. Neurosci., 17, 3157-3167; Fletcher, S., Barnes, N.M. (1997) Br. J. Pharmacol., 122, 655-662; Fletcher, S., Lindstrom, J.M., McKernan, R.M., Barnes, N.M. (1998) Neuropharmacology, 37, 397-399; Michel, K., Zeller, F., Langer, R., Nekarda, H., Dover, T.J., Barnes, N.M., Schemann, M. (2005) Gastroenterology, 128, 1317-1326)によって、5-HT3Aサブユニットを標識した。5-HT3B受容体サブユニットは、ヒトの5-HT3B受容体を選択的に認識する抗体を用いて特定した（下記参照）。
【００３７】
海馬を含む、ヒトの、パラフィン包埋側頭葉切片（5μm）を、ミクロトームで薄切し、顕微鏡用スライドガラスに載せた。組織切片を、キシレンから、エタノールを経過し水まで通して再水和し、次に、内因性ペルオキシダーゼ活性を停止するために0.3%過酸化水素にインキュベートし、次いでPBS（1時間、室温、バッファーを10分置きに変え）にてインキュベートし、次いでPBS、プラスTriton-X-100 (TX100; 0.3%)、および正常ヤギ血清(3%)においてインキュベートした（1時間、室温）。5-HT3受容体サブユニットの免疫組織化学的検出のために、5-HT3Aサブユニット、または5-HT3Bサブユニットに対する抗体を用いた。両抗体ともウサギにおいて作製したので、二重標識実験を行うことはできなかった。組織を、PBS/TX100、および一次抗体を含む正常ヤギ血清(3%)においてインキュベートした。PBS/TX100を用いて洗浄後、組織を、ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG（1:200; Vector）と共に2時間インキュベートし、洗浄し、ABC試薬（Vector）と共に2時間インキュベートした。洗浄後、免疫活性を、褐色反応産物を生成する、ペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン（0.025%）によって視像化した。次に、組織を、一連のエタノール、次いでキシレンで濯ぐことによって脱水し、封入、免疫反応性細胞の視像化を可能とした（脳切片は、構造の特定を助けるために軽くヘマトキシリンで染色した）。
【００３８】
1.3a  ヒトの5-HT3Bサブユニットを選択的に認識する選択的ポリクロナール抗体の作製
ヒトの5-HT3B受容体サブユニット配列の、クローン化されたアミノ酸配列（h5-HT3Bタンパク質配列のアミノ酸341-358）から、ペプチド配列（18アミノ酸）を選抜した。このペプチド配列は、GenEMBL遺伝子データベース、およびSwissProtデータベースを用いてスクリーニングしたが、他の既知のクローン化された受容体または哺乳類タンパク質に対し目立った相同性を示さず、高い免疫原性を持つものと特定された。
【００３９】
このハプテンに対し、架橋剤、m-マレイミドベンゾイン酸N-ヒドロキシスクシニミド・エステルを用いて、末端のシステインにスカシ貝・ヘモシアニン(KLH)に接合した後、3匹の、ニュージーランド白色ウサギSPFにおいてポリクロナール抗体を作成した。免疫前血清の抽出後、動物を、Freundの完全アジュバントに溶解した前記ペプチドの最初の2回の注入（14日の間を空けて）、次いで、抗血清の力価を最大とするために、Freundの不完全アジュバントに溶解したペプチド溶液の、さらに、2週間おきの5回のブースター注入によって免疫化した。試験の血液採取は規則的に行い、抗体力価を監視するために、酵素免疫測定法（ELISA）を用いてスクリーニングした。全ての動物は免疫化に対し反応し、ペプチド特異的抗体を生産した。最後の免疫化注射の1週間後、動物を麻酔し、心臓穿刺によって最後の血液採取を行った。各血液採取後、血液を凝固させ、凝固塊は、4℃で一晩凝縮させた。血清を吸引し、最終的分離の前に縣濁細胞は全て沈殿させた。全ての血清に対し、アジ化ナトリウムを最終濃度が0.1% w/vのなるように加えた。免疫前および免疫後血清は、全て、使用時まで-80℃に保存した。
【００４０】
初回の実験から、血清は、ヒトの5-HT3Bサブユニット由来の抗原ペプチドの認識において高い力価を示し（ELISAによって評価）、かつ、さらに重要なことに、SDS-PAGE/ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学によってh5-HT3Bサブユニットを選択的に認識する能力に関して評価した際、望ましい特性を示すことが明らかにされた。
【００４１】
1.4  5-HT3受容体サブユニット発現ニューロンの表現型決定
5-HT3受容体サブユニット様免疫反応性を示す細胞は、標準的免疫組織化学技術を用いて表現型決定をすることが可能である。先ず、そのニューロンに関連する主要神経伝達物質（すなわち、グルタミン酸およびGABA）のための選択的マーカーを探求しなければならない。次に、表現型決定を行って、ニューロンのサブ集団による発現を定める（例えば、GABAニューロンは、ニューロペプチドおよびCa2+結合タンパク質の差別的発現に基づいて定められる、例えば、Freund, T.F., Buzsaki, G. (1996) Hippocampus, 6, 347-470を参照されたい）。
【００４２】
1.5  in situハイブリダイゼーションおよびRT-PCRによって評価される5-HT3受容体サブユニットmRNAの発現
5-HT3受容体サブユニットの発現は、in situハイブリダイゼーションおよびRT-PCR（ｍRNA転写物を検出するため、方法論の詳細については、Parker, R.M.C., Barnes, N.M. (1998) 「ｍRNA：in situおよびノーザン・ハイブリダイゼーションによる検出（”mRNA: detection by in situ and northern hybridization.”）」、In: Receptor binding techniques (Keen, K., Ed), Humana Press Inc., pp 239-273を参照されたい）を用いて確認された。適正なコントロールを用いると、これらの技術は、免疫組織化学に比べ、高度の選択性を示し、したがって、細胞レベル（in situハイブリダイゼーション）、および区域レベル（RT-PCR）の両レベルにおける5-HT3受容体サブユニット発現が確認され、結果に対する信頼性の増大が得られた。
【００４３】
5-HT3C受容体サブユニットを選択的に認識する抗体が無い場合では、in situハイブリダイゼーションおよびRT-PCR技術だけが、5-HT3Cサブユニット発現の評価を可能とする唯一の方法である。同様に、5-HT3Dおよび5-HT3E受容体サブユニットについては、少なくとも「正常な」ヒトの脳組織においては、これらのサブユニットはまだ検出されていない。
【００４４】
1.6  「コントロール」およびTLE-HS患者の海馬において発現される5-HT3受容体の薬理学
非神経学的および非精神科障害によって48時間以内に死亡した患者（「コントロール」患者）から得られたヒト海馬、および、TLE-HS患者から切除されたヒト海馬を、-80℃に急冷した。放射性リガンド結合ホモジェネートを形成するために、組織をバッファー(50 mM Tris, pH7.4)中で解凍し、次いで、Polytronブレンダーを用いて4℃でホモジェナイズした。次に、このホモジェネートを遠心（48,000 x g, 10分、4℃）し、得られたペレットをバッファーに再縣濁し、再度遠心した。1 ml当たり100 mgの元の組織湿潤重量の濃度として、ペレットをバッファーに再縣濁することによって、放射性リガンド結合ホモジェネートを調製した。放射性リガンド結合アッセイを、以前に報告した我々の方法と同様にして行った(Bufton et al., Neuropharmacology, 32, 1325-1331, 1993)。手短に言うと、チューブに、150 μlの競合薬剤、または溶剤（50 mM Tris, pH7.4、合計結合）、および100 μlの[3H]-グラニセトロン（約1-2 nM; NEN, 82 Ci mmol-1）を入れた。これら、同じものを3つずつ準備した(トリプリケート)。適切な組織ホモジェネートの分液(250μl)を加えて、結合を誘発した。結合は、室温で90分進行させ、その後、Whatman GF/Bフィルターによる急速な吸引ろ過、および洗浄で停止させ、次いで、フィルター上に残留する放射能を定量した。
【００４５】
1.7  免疫組織化学によって評価されるSERTの半定量的発現
「コントロール」患者から得られた海馬、または、TLE-HS患者から得られた切除組織をの、ヒトパラフィン包埋海馬切片（5 μm）をミクロトームで薄切し、顕微鏡用スライドガラスに載せた。組織切片を、キシレンから、エタノールを経過し水まで通して再水和し、次に、内因性ペルオキシダーゼ活性を停止するために0.3%過酸化水素にインキュベートし、次いでPBS（1時間、室温、バッファーを10分置きに変え）にてインキュベートし、次いでTriton-X-100 (TX100; 0.3%)、および正常ウシ血清(10%)を添加したPBS中でインキュベートした（1時間、室温）。5-HT輸送体、SERTの免疫組織化学的検出のために、組織を、一次モノクロナール抗体ST-51（支給抗体の希釈率1:5000; 市販の抗体供給業者MAb Technologies [www.mabtechnologies.com]）を含むTX100、正常ウシ血清(10%)添加PBS中で4℃で一晩インキュベートした。いくつかの実験では、抗体と、SERTとの相互作用を防ぐために（「ペプチドブロック」）、モノクロナール抗体を、あらかじめ免疫化用ペプチドとインキュベートした。PBS/TX100で洗浄後、組織を、ビオチン化ウマ抗マウスIgG（1:300; Vector）と共に2時間インキュベートし、洗浄し、ABC試薬（Vector）と共に2時間インキュベートした。洗浄後、免疫活性を、褐色反応産物を生成する、ペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン（0.025%）によって視像化した。次に、組織を、エタノールシリーズ、次いでキシレンで濯ぐことによって脱水し、封入し、免疫反応性細胞の視像化を可能とした（脳切片はさらに、構造の特定を助けるためにヘマトキシリンで軽く染色した）。
【００４６】
2.  実験結果
次に、付属の図面を参照しながら、実験結果を記述する。
【００４７】
2.1  受容体オートラジオグラフィーによって定量された「コントロール」海馬における5-HT3受容体の分布および発現レベル
「コントロール」（'Control'）のヒト海馬切片では、[3H]-(S)-ザコプリドの特異的結合部位のレベルは、著明な不均一性を示した（表2；図2）。もっとも高密度の特異的結合（グラニセトロン、1 μMの含有によって定義される）は、歯状回(DG)およびCA2分野に検出され（表2；図1、パネルA）、比較的低レベルの特異的結合が、他の海馬分野、および隣接脳領域に見られた。海馬形態全体を通じて、非特異的[3H]-(S)-ザコプリド結合（グラニセトロン、1 μMの存在によって定義される）は、背景以上にはほとんど観察されなかった。
【００４８】
表２：海馬硬化関連側頭葉癲癇（TLE-HS）患者、および「コントロール」患者における、ヒト海馬および隣接脳領域の各種領域に観察される[3H]-(S)-ザコプリド(0.5 nM)の特異的結合レベル（非特異的結合は、グラニセトロン; 1.0 μMの含有によって定義する）
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＊データは平均±S.E.M.を表す。n=9-10
【００４９】
「カバーガラス」技術の使用により、[3H]-(S)-ザコプリドの結合分布を、海馬形態内の個別細胞と直接比較しながら視認することが可能となった。歯状回では、[3H]-(S)-ザコプリド結合は明らかに異なるパターンを示し、最高レベルは、顆粒細胞の細胞体の上に見られた（図1、パネルC）。海馬のCA2分野では、[3H]-(S)-ザコプリド結合は錐体細胞層と関連していた。
【００５０】
2.2  受容体オートラジオグラフィーによって定量した、「癲癇」海馬における5-HT3受容体の分布および発現
癲癇患者（TLE-HS）の海馬組織は、「コントロール」患者のものと比べ、異なる [3H]-(S)-ザコプリド結合パターンを示した。歯状回では、[3H]-(S)-ザコプリドの特異的レベルは、ほとんど変化しないが（表2）、バンドの幅は著明に増加し（図1、パネルB）、「カバーガラス」技術の使用から、結合はさらに広がって、分子細胞層の全体幅を含むに至っていることが示された（図1、パネルE）。同様の所見が、図1のパネルDおよびFを比較することによっても得られる（明瞭な顆粒細胞層（パネルDにおいて括弧で表示される）が、「コントロール」患者の組織においてのみ明らかであることに注目）。海馬のCA2分野では、[3H]-(S)-ザコプリドの特異的結合は、依然として錐体細胞層と関連していたが（図1、パネルB）、一方、結合レベルは、約2倍に増加した（表2）。
【００５１】
「コントロール」組織の遭遇する死後条件を模倣するように意図された状態に暴露された「癲癇」組織における、[3H]-(S)-ザコプリドの特異的結合の相対的分布は、切除後直ちに処理された「癲癇」組織のものと同様であった。
【００５２】
2.3  免疫組織化学によって評価した「コントロール」海馬における5-HT3受容体サブユニットの発現
ヒト脳から得たパラフィン包埋海馬切片について、一定範囲の抗体濃度（1:50〜1:500）を用いて免疫組織化学を実行した。最適条件下では、全ての海馬CA分野の錐体細胞において、h5-HT3Aおよびh5-HT3Bサブユニット特異的免疫活性が明瞭に示された。ただし、両抗体とも、免疫反応は、CA1領域の錐体細胞において定性的に低かった（図2）。両抗体とも、免疫活性は、またしても、CA4内の大型ニューロン（GABA性インターニューロンの形態を示す）と関連していた（門分野、図2）。両抗体とも、軽い免疫反応が、歯状回の顆粒細胞に見られた（図2）。
【００５３】
一次抗体を、免疫血清に対して同じ希釈度で得られた非免疫ウサギ血清で置換し、その後、組織を同じ方法で処理しても、ヒトの海馬の隣接切片には免疫活性は外見上認められなかった（データ示さず）。
【００５４】
2.4  免疫組織化学によって評価した「癲癇」海馬における5-HT3受容体サブユニットの発現
比較的高レベルのh5-HT3Aおよびh5-HT3B免疫反応が、海馬のCA2分野に関連する、生存錐体細胞に検出された。このデータは、癲癇組織の生存ニューロンが、h5-HT3Aおよびh5-HT3Bサブユニットを発現し、さらにその発現は、コントロール組織に比べて比較的高いことを示す。
【００５５】
2.5  RT-PCRによって評価した「コントロール」海馬における5-HT3受容体サブユニットの発現
ヒト海馬組織における5-HT3Aおよび5-HT3Bサブユニットの発現を明らかにするために抗体を用いたが、それに加えて、h5-HT3A、またはh5-HT3Bサブユニット転写物のいずれかに対して特異的なプライマーによるRT-PCRを、ヒトの海馬サンプル（Hipp）、または、サブユニット(3A/3B)を異種として発現するHEK293細胞系統から得られた鋳型を用いて行い、適切なサイズの特異的産物を生成した。鋳型を持たないコントロール（NT）では産物が生成されなかった（図3）。
【００５６】
2.6  「コントロール」および「癲癇」患者の海馬において発現された5-HT3受容体の薬理学
「コントロール」およびTLE-HS海馬ホメジェネートにおいて、いくつかの薬剤が、同様の濃度で同様のpKi値を示して（表3）、[3H]-グラニセトロン結合部位を求めて競合した。これは、以前に定量された、ヒトの被殻における5-HT3受容体と相互作用を持つ、前記薬剤の有効濃度と一致していた（表3）。表の数値は、3回の独立実験で得られたpKi値の平均である（pKi平均値のパーセント標準誤差は2%未満）。このデータは、癲癇組織によって発現される5-HT3受容体が、コントロール組織において発現される受容体と、ほぼ近似的薬理学的性質を持つことを示す。これは、「正常の」5-HT3受容体に作用するように開発された薬剤は、本発明においても有効であることを強く示唆する点で重要である。
【００５７】
表３：「コントロール」海馬、およびTLE-HS患者の海馬における[3H]-グラニセトロン結合部位の薬理学
2009502768.tif 000004
1 [3H]-グラニセトロン結合部位の薬理学は、以前にヒトの被殻において記載されている(Bufton et al., Neuropharmacology, 32, 1325-1331, 1993)。
【００５８】
2.7  免疫組織化学によって評価されたSERTの半定量的発現
「コントロール」組織およびTLE-HS組織のいずれにおいても、特異的SERT免疫反応性は、微細な線維として（5-HTニューロンに特徴的な）、海馬のCA全分野を通じて明瞭に示された。この試験法は半定量的なものに過ぎないが、SERT免疫陽性線維の密度が、「コントロール」海馬組織に比べ、TLE-HS患者から得られた海馬組織においてより高いことが一貫して観察された。これは、TLE-HS患者の海馬における5-HTニューロンの神経支配が、「コントロール」海馬におけるものと、少なくとも同程度に豊富であるか、場合によってより高いことを裏づけ、これは、TLE-HS患者において5-HT3受容体を活性化する5-HTの濃度は、「コントロール」海馬に見られるものと少なくとも同程度であるか、恐らくそれよりも高いことを示す。5-HTレベルが下がったとすると、観察された5-HT3受容体の密度は、その5-HTレベルの低下を補償しようとして上昇したことも可能性としてあり得る（5-HT輸送体（SERT）は、5-HTニューロンの表現型マーカーである）。本発明の目的のためには、癲癇組織では、5-HT3受容体を活性化する必要がある。なぜなら、それらの受容体が5-HTによって活性化されなければ、拮抗剤（例えば、グラニセトロン）が無効となると考えられる。
【００５９】
一次抗体を、あらかじめ免疫化用ペプチドとインキュベートし（「ペプチドブロック」）、次に、免疫化用ペプチドと事前インキュベートしなかったモノクロナール抗体と同一希釈度で使用し、次いで、組織を同様に処理したが、ヒト海馬の隣接切片に、外見上、免疫反応性は認められなかった（データ示さず）。
【００６０】
3.  第II相臨床治験
Queen Elisabeth病院(大学病院、Birmingham NHSファウンデーション寄託)に関連する、約10名の、薬剤耐性側頭葉癲癇の成人患者で、癲癇組織の切除が予定される人々について、二日間、臨床観察およびEEGテレメトリを行った。患者の基礎状態が評価された後、5-HT3受容体拮抗剤（グラニセトロン、1 mg、1日2回）を、進行中の投薬に加えて、3ヶ月間与えた。患者は、発作日記をつけ、外来患者として追跡された（最初の1ヶ月は週に1回、その後の2ヶ月は月に1回）。追跡中、0、1、4、8、および12週において、患者を臨床的に検査し、その発作日記を、肝機能に関する血液検査と一緒に検閲した。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
実験結果は以下の対応する図と共に示す。
【図１】図1は、受容体オートラジオグラフィーによって評価した、「コントロール」患者（'Control'）、およびTLE-HS患者（TLE-HS）から得られたヒト海馬における、5-HT3受容体の発現を示す。  パネルAおよびBは、それぞれ、「コントロール」患者、および癲癇（TLE-HS）患者の海馬に結合する[3H]-(S)-ザコプリドの擬似カラーオートラジオグラムである。  パネルCおよびEは、それぞれ、「コントロール」患者および癲癇（TLE-HS）患者の、海馬歯状回(DG)の、「カバーガラス」暗視野オートラジオグラムである。  パネルDおよびFは、それぞれ、パネルCおよびEに対応する、コントロールおよびTLE-HS組織の組織学的染色である。
【図２】図2は、h5-HT3A、およびh5-HT3B受容体サブユニットの位置を定める免疫組織化学によって得た、「コントロール」患者から得られたヒト海馬における、5-HT3受容体の発現を示す。
【図３】図3は、h5-HT3A、およびh5-HT3BサブユニットmRNAを検出するRT-PCRによって得た、「コントロール」患者から得られたヒト海馬における、5-HT3受容体の発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月20日(2008.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの患者における海馬硬化に関連する側頭葉癲癇（TLE-HS）の治療用薬剤製造のための5-HT3受容拮抗剤の使用方法。
【請求項２】
前記5-HT3受容体拮抗剤が、グラニセトロン、トロピセトロン、またはドラセトロンであることを特徴とする、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
前記5-HT3受容体拮抗剤が、5-HT3受容体に対して選択的であることを特徴とする、請求項１に記載の使用方法。
【請求項４】
海馬硬化に関連する側頭葉癲癇（TLE-HS）の治療用薬剤であって、
5-HT3受容体拮抗剤を含有する治療用薬剤。
【請求項５】
前記5-HT3受容体拮抗剤が、グラニセトロン、トロピセトロン、またはドラセトロンであることを特徴とする、請求項４に記載の治療用薬剤。
【請求項６】
前記5-HT3受容体拮抗剤が、5-HT3受容体に対して選択的であることを特徴とする、請求項４に記載の治療用薬剤。
【国際調査報告】
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