(57)【要約】  本発明は、一般式Ｉまたは一般式ＩＩ【化１】2009505956.tif 000005（式中、Ａは、Ｏ、Ｃ、ＮＨ、または、Ｓを表し;Ｂは、Ｏ、Ｃ、ＮＨ、または、Ｓを表し;ならびに、Ｒ２は、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨＯ、および‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＯＯＨ（ｎは３‐７を表す）から成る群から選ばれ；ただし、一般式Ｉでは、Ｒ１は、‐ＣＨ２‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ、および、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ（ｎは５‐１１を表す）から成る群から選ばれ、Ｘはフルオロフォアを表し；ならびに、一般式ＩＩでは、Ｒ１は、‐ＣＨ＝ＣＨ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３（ｎは９‐１５を表す）、‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３（ｎは１１‐１７を表す）、および、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３（ｎは１０‐１６を表す）から成る群から選ばれ；ならびに、Ｒ３は、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ、-、および、‐ＳＯ２‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ（ｎは０‐５）から成る群から選ばれ、Ｘはフルオロフォアを表す）の１つを有している酸化リン脂質に関連する。
2009505956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉまたは一般式ＩＩ
【化１】
2009505956.tif 000004
（式中、
Ａは、Ｏ、Ｃ、ＮＨ、または、Ｓを表し;
Ｂは、Ｏ、Ｃ、ＮＨ、または、Ｓを表し;ならびに、
Ｒ２は、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨＯ、および‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＯＯＨ（ｎは３‐７を表す）から成る群から選ばれ；ただし、
一般式Ｉでは、
Ｒ１は、‐ＣＨ２‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ、および、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ（ｎは５‐１１を表す）から成る群から選ばれ、Ｘはフルオロフォアを表し；ならびに、
一般式ＩＩでは、
Ｒ１は、‐ＣＨ＝ＣＨ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３（ｎは９‐１５を表す）、‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３（ｎは１１‐１７を表す）、および、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３（ｎは１０‐１６を表す）から成る群から選ばれ；ならびに、
Ｒ３は、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ、および、-ＳＯ２‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ（ｎは０‐５）から成る群から選ばれ、Ｘはフルオロフォアを表す）
の１つを有している、酸化リン脂質。
【請求項２】
Ａおよび／またはＢは酸素である、請求項１に記載の一般式Ｉの酸化リン脂質。
【請求項３】
Ｘは、ピレン、ペリレン、およびニトロベンズアクサジアゾールから成る群から選ばれるフルオロフォアであり、ピレンであることが好ましい、請求項１または２に記載の一般式Ｉの酸化リン脂質。
【請求項４】
1-(10-ピレンデカノイル)-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PyrGPC)であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の一般式Ｉの酸化リン脂質。
【請求項５】
1-(10-ピレンデカノイル)-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PyrOVPC)であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の一般式Ｉの酸化リン脂質。
【請求項６】
抗動脈硬化作用を有している酵素（好ましくはホスホリパーゼまたはＰＡＦ‐アセチルヒドラーゼ）の試料中の存在を決定するための、請求項１〜５の何れか１項に記載の一般式Ｉの酸化リン脂質の使用。
【請求項７】
抗動脈硬化作用を有している酵素の試料中の存在を決定するための方法であって、請求項１〜５の何れか１項に記載の一般式Ｉの酸化リン脂質を試料に添加する工程、および該試料をクロマトグラフィー（好ましくはＨＰＬＣ）分析する工程を含んでいる方法。
【請求項８】
Ａおよび／またはＢは酸素である、請求項１に記載の一般式ＩＩの酸化リン脂質。
【請求項９】
Ｘは、ピレン、ペリレン、ボロジアザインダセン（BODIPY（登録商標））、シアニン染料２、シアニン染料３、シアニン染料５、およびAlexa染料から成る群から選ばれるフルオロフォアを表す、請求項１または８の何れか１項に記載の一般式ＩＩの酸化リン脂質。
【請求項１０】
1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-PGPE)であることを特徴とする、請求項１、８または９の何れか１項に記載の一般式ＩＩの酸化リン脂質。
【請求項１１】
1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(Alexaフルーア647-カルボニル)-エタノールアミン(Alexa647-PGPE)であることを特徴とする、請求項１、８または９の何れか１項に記載の一般式ＩＩの酸化リン脂質。
【請求項１２】
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-POPE)であることを特徴とする、請求項１、８または９の何れか１項に記載の一般式ＩＩの酸化リン脂質。
【請求項１３】
1-パルミトイル-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-POVPE)であることを特徴とする、請求項１、８または９の何れか１項に記載の一般式ＩＩの酸化リン脂質。
【請求項１４】
抗動脈硬化作用を有している酵素（好ましくはホスホリパーゼまたはＰＡＦ-アセチルヒドラーゼ）の試料中の存在を決定するための、請求項１、請求項８〜１３の何れか１項に記載の一般式ＩＩの酸化リン脂質の使用。
【請求項１５】
抗動脈硬化作用を有している酵素の試料中の存在を決定するための方法であって、請求項１、請求項８〜１３の何れか１項に記載の一般式ＩＩの酸化リン脂質を試料に添加する工程、および該試料をクロマトグラフィー（好ましくはＨＰＬＣ）分析する工程を含んでいる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ＬＤＬの酸化修飾は、アテローム性動脈硬化症において重要な病原性の要因であると考えられている。いくつかの研究室の研究から、ｍｍＬＤＬによって引き起こされる生物学的作用は、主としてリン脂質を酸化した生成物に起因し得ることが明らかになった（Leitinger, N. ら (1999) PNAS 96, 12010-12015; Watson, A. D. ら (1995) J.Clin.Invest. 95, 774-782; Leitinger, N. ら (1997) Adv.Exp.Med.Biol. 433, 379-382; Loidl, A. ら (2003) J.Biol.Chem. 278, 32921-32928）。アテローム斑において前記生成物の量が増加し（Watson, A. D. ら(1997) J.Biol.Chem. 272, 13597-13607; Itabe, H. ら (1994) J.Biol.Chem. 269, 15274-15279）、病変を有するヒトおよびマウスにおいて酸化リン脂質に対する抗体の力価が上昇しているので（Horkko, S. ら (1999) J.Clin.Invest. 103, 117-128; Palinski, W. ら (1995) Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 15, 1569-1576; Palinski, W. ら (1996) J.Clin.Invest. 98, 800-814）、リン脂質分子の病理的関連性に注目が集まっている。
【０００２】
酸化リン脂質の同族系列における２つの主な代表化合物、すなわち1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（PGPC）、および、1-パルミトイル-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POVPC）に急速に興味が集まってきていた。アテローム性動脈硬化症ならびに他の慢性の炎症性疾患の発病に起因することがある血管壁の細胞における作用を、両方の脂質が選択的に活性化させるという発見により、前記脂質の重要性が強調される。両方の脂質は、ウサギのアテローム性動脈硬化症の病変部位において、３‐６倍に濃縮され、それぞれおよそ６２ｎｇ／ｍｇのPGPC大動脈湿重量および１１６ｎｇ／ｍｇのPOIVPC大動脈湿重量に相当すると立証されている（Subbanagounder, G. ら (2000) Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 20, 2248-2254）。
【０００３】
国際公開第０１／７５１７０号パンフレットにおいて、アテローム性動脈硬化症についての危険性を評価する方法が記載されている。この方法では、ＨＤＬを含んでいる生物試料を、酸化リン脂質と接触させ、酸化リン脂質の量、または酸化されていないリン脂質の量の変化を測定する。そして、酸化リン脂質の量が変化しなければ、アテローム性動脈硬化症についての危険性が示唆される。
【０００４】
既に述べられたように、酸化リン脂質は、アテローム性動脈硬化症の発病に関わっている。さらに、リポタンパク質と関連し、抗動脈硬化作用を有している酵素（例えば、ホスホリパーゼまたはＰＡＦアセチルヒドラーゼ）により、酸化リン脂質は、加水分解されて切断されることが知られている。
【０００５】
試料中の抗動脈硬化性の酵素の作用についての情報を集めるために使用することができる化合物を提供することが本発明の目的である。特に、上記酵素と、上記化合物との相互作用により、検出可能な生成物が得られるべきであり、この生成物により、試料に含まれる酵素の作用について結論を出すことができる。
【０００６】
この目的は、一般式Ｉまたは一般式ＩＩ
【０００７】
【化１】
2009505956.tif 000003
（式中、
Ａは、Ｏ、Ｃ、ＮＨ、または、Ｓを表し;
Ｂは、Ｏ、Ｃ、ＮＨ、または、Ｓを表し;ならびに、
Ｒ２は、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨＯ、および‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＯＯＨ（ｎは３‐７を表す）から成る群から選ばれ；ただし、
一般式Ｉでは、
Ｒ１は、‐ＣＨ２‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ、および、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ（ｎは５‐１１を表す）から成る群から選ばれ、Ｘはフルオロフォアを表し；ならびに、
一般式ＩＩでは、
Ｒ１は、‐ＣＨ＝ＣＨ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３（ｎは９‐１５を表す）、‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３（ｎは１１‐１７を表す）、および、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐ＣＨ３（ｎは１０‐１６を表す）から成る群から選ばれ；ならびに、
Ｒ３は、‐ＣＯ‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ、および、‐ＳＯ２‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｘ（ｎは０‐５を表す）から成る群から選ばれ、Ｘはフルオロフォアを表す）
の１つを有している酸化リン脂質により達成される。
【０００８】
好ましい実施の形態によれば、Ａおよび／またはＢは酸素を表す。
【０００９】
他の好ましい実施の形態によれば、一般式ＩにおけるＸは、ピレン、ペリレン、およびニトロベンズアクサジアゾール（nitrobenzaxadiazole）から成る群から選ばれるフルオロフォアであり、ピレンであることが好ましい。
【００１０】
他の好ましい実施の形態によれば、一般式ＩＩにおけるＸは、ピレン、ペリレン、ボロジアザインダセン（borodiazaindacene（BODIPY（登録商標）））、シアニン染料（cyanine dye）２、シアニン染料３、シアニン染料５、およびAlexa染料（アレクサ染料（Alexa dye））から成る群から選ばれるフルオロフォアを表す。
【００１１】
一般式Ｉに記載の酸化リン脂質の好ましい実施の形態は、次の化合物：
（ｉ）1-(10-ピレンデカノイル)-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（PyrGPC）、
（ｉｉ）1-(10-ピレンデカノイル)-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ‐3-ホスホコリン（PyrOVPC）
である。
【００１２】
一般式ＩＩに記載の酸化リン脂質の好ましい実施の形態は、次の化合物：
（ｉ）1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-ピロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-PGPE)、
（ｉｉ）1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(Alexaフルーラ（Fluor）647-カルボニル)-エタノールアミン(Alexa647-PGPE)、
（ｉｉｉ）1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-POPE)、
（ｉｖ）1-パルミトイル-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-POVPE)
である。
【００１３】
蛍光標識された本発明の酸化リン脂質は、抗動脈硬化作用を有している酵素の基質として使用することができると発見された。請求項に記載の化合物は、血液試料において、特に前記酵素の診断を下すことに役立つ。当該酵素を有する酸化リン脂質との相互作用に起因する蛍光標識された切断生成物を、ＨＰＬＣのようなクロマトグラフィー分析により、容易に、且つ、感度良く決定することができる。これによって、前記切断生成物は、試料に存在している酵素の作用についての情報を提供する。
【００１４】
従って、本発明の他の態様は、抗動脈硬化作用を有している酵素（好ましくはホスホリパーゼまたはＰＡＦ‐アセチルヒドラーゼ）の試料中の存在を決定するための、本発明の酸化リン脂質の使用に言及する。
【００１５】
本発明のもう１つ別の態様は、抗動脈硬化作用を有している酵素の試料中の存在を決定するための方法に言及する。なお、該方法は、本発明の酸化リン脂質を試料に添加する工程、そして試料をクロマトグラフィー（好ましくはＨＰＬＣ）分析する工程を含んでいる。
【００１６】
本発明は、以下の実施例、および添付の図面によってより詳細に説明されるであろう。
【００１７】
〔実施例〕
＜蛍光性の酸化リン脂質の合成＞
（1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-PGPE)の調製）
１「1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PGPC)の合成」
PGPC（図１Ａ、（１））を、ワトソン（Watson）ら（J.Biol.Chem. 272, 13597-13607, 1997）およびスバナゴンダー（Subbanagounder）ら（Free Radic.Biol.Med. 28, 1751-1761, 2000）による方法の、修飾版の方法により合成した。６ｍｌの無水ジクロロメタン中に、乾燥した1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（６２ｍｇ、１２５μｍｏｌ）、乾燥したグルタル酸無水物（７０ｍｇ、６１３μｍｏｌ、５ｅｑ）、およびＤＭＡＰ（p-(N,N’-ジメチルアミノ)ピリジン、７５ｍｇ、６１４μｍｏｌ、５ｅｑ）を含む溶液を、３５℃で一晩磁気により攪拌した。ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／２５％ＮＨ３(６５:３５:５、ｖ／ｖ／ｖ)を展開系として用いたＴＬＣを用いて、反応を観察し、ＭｅＯＨを３ｍｌ添加して止めた。１．８ｍｌのＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１:１、ｖ／ｖ）を用いて、結果として生じた混合物を一回洗浄した。有機相を蒸発させた後、４ｍｌのジエチルエーテルを用いて粉末化することにより、過剰のＤＭＡＰを除去した。上清を除去して、３２ｍｇのPGPCを得た（４２％、Ｒｆ＝０．０５）。
【００１８】
２「1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(PGPE)の合成」
１．４ｍｌのトルエン、および、０．５Ｍエタノールアミンを含んでいる４．３ｍｌの０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）の乳濁液において、ＰＬＤ（ホスホリパーゼＤ、２９ユニット）によるPGPC（９０ｍｇ、１４８μｍｏｌ）（図１Ａ、（１））のホスファチジル基転移反応により（図１Ａ、１段階）、PGPE（図１Ａ、（２））を得た。二相系の溶液を、３５℃で一晩攪拌した。ＴＬＣを用いて、反応を観察し、ＭｅＯＨを４．３ｍｌ添加して止めた。４３ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ）を用いて、生成物を抽出した。１１ｍｌのＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１:１、ｖ／ｖ）を用いて、有機相を２回洗浄し、過剰のエタノールアミンを除去した。そして有機相を蒸発させて、調製用のＴＬＣに供した。生成物を掻き取り、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１:４、ｖ／ｖ）を用いてシリカゲルから３回溶出させた。１つにまとめた抽出液を蒸発させて、所望の生成物を得た（３０．３ｍｇ、３６％、Ｒｆ＝０．３０）。
【００１９】
３「1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-PGPE)の合成」
１ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ）中に、BODIPY-SE(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-プロポニン酸スクシンイミジルエステル、０．９６ｍｇ、２．５μｍｏｌ)を含む溶液を磁気により攪拌し、この溶液に、PGPE（４．４ｍｇ、７．８μｍｏｌ、３ｅｑ）（図１Ａ、（２））およびトリエチルアミンｐ．ａ．（１０μｌ、７２μｍｏｌ、３０ｅｑ）を添加した（図１Ａ、２段階）。それから、フラスコ内に窒素を流し（フラッシュ）、フラスコを光から保護した。そして、結果として生じた溶液を室温で１時間攪拌した。ＴＬＣを用いて反応の進行状態を観察した。溶媒の体積が４００μｌに達するまで、窒素気流下において溶媒を除去した。調製用のＴＬＣを用いて、溶媒から脂質を精製した。紫外線光にさらして所望の化合物を可視化し、ＴＬＣプレートから所望の化合物を掻き取り、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１:４、ｖ／ｖ）を用いてシリカゲルから３回溶出させた。ロータリー型蒸発器を用いて、１つにまとめた抽出液から溶媒を除去させて、BODIPY-PGPE（１．７７ｍｇ、８５％、Ｒｆ＝０．２８）を得た（図１Ａ、（３））。
【００２０】
（1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(Alexa647-カルボニル)-エタノールアミン (Alexa647-PGPE)の調製）
Alexa647-PGPE（図１Ａ、（３））は、その頭部基にBODIPYの代わりにAlexa647-PGPEを含んでいること以外は、BODIPY-PGPEに相当する。Alexa647-SE（Alexaフルーラ647 カルボン酸スクシンイミジルエステル、０．５ｍｇ、０．４μｍｏｌ）およびPGPE（０．６８ｍｇ、１．２μｍｏｌ、３ｅｑ）を含む０．５ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ）に、トリエチルアミンｐ．ａ．（５μｌ、３６μｍｏｌ、９０ｅｑ）を添加して、室温で９０分間攪拌した後に、上記Alexa647-PGPEが得られた。反応混合物を完全に光から保護した。ＴＬＣ（RP-18 F254s; Merck, Darmstadt, Germany）を用いて、反応の進行状態を観察した。Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ／ｎ-プロパノール(２０:５７:２３、ｖ／ｖ／ｖ)を展開系として用いた調製用のＴＬＣを用いて、生成物を精製した。該生成物を掻き取り、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１:１、ｖ／ｖ）を用いて２回溶出させ、ＭｅＯＨを用いて１回溶出させた。窒素気流下において溶媒を除去して、Alexa647-PGPEを得た（０．２６μｍｏｌ、６５％、Ｒｆ＝０．８０）。
【００２１】
（1-パルミトイル-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-POVPE)の調製）
１「1-パルミトイル-2-(5-ジメトキシペンタノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンの合成」
５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＴＨＦ（２:５:３、ｖ／ｖ／ｖ）中に、5,5-ジメトキシペンタン酸メチルエステル（２２０ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）（図１Ｂ、（４））および水酸化ナトリウム（２５０ｍｇ、６．２５ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を含む溶液を、室温で９０分間攪拌した（図１Ｂ、１段階）。溶液を０℃に冷却した後、６ｍｌの１Ｎ ＨＣｌおよび適量の０．１Ｎ ＨＣｌを添加して、反応混合物をｐＨ２．１に酸性化させた。それからジクロロメタン（３×１５ｍｌ）を用いて抽出した。１つにまとめた有機抽出液を、水（２×１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の存在下において乾燥させた。所望の生成物（Ｒｆ＝０．３５）（図１Ｂ、（５））を含んでいる１０‐１５ｍｌを残して、溶媒を減圧下において除去し、その後残った溶媒をさらに精製せずにアシル化反応のためにすぐに使用した。1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（２０９ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）（図１Ｂ、（６））、ＤＣＣ（N,N’-ジクロロヘキシルカルボジイミド、２７０ｍｇ、１．３ ｍｍｏｌ、３ｅｑ）およびＤＭＡＰ（１６０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を、5,5-ジメトキシペンタン酸の溶液に加えた（図１Ｂ、２段階）。混合物の溶液を、窒素の存在下において室温で一晩攪拌した。ＴＬＣを用いて、反応を観察した。ＭｅＯＨを６ｍｌ添加した後、有機溶液を、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１:１、ｖ／ｖ）で２回洗浄した。溶媒を真空下において除去した。ベンゼン／エタノール（３:２、ｖ／ｖ）を添加した後に、わずかに残った水を蒸発させた。油状残留物を、溶媒としてＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／２５％ＮＨ３（６５:３５:５、ｖ／ｖ／ｖ）を用いた１２ｇシリカゲル上においてフラッシュ・クロマトグラフィーにかけて、1-パルミトイル-2-(5-ジメトキシペンタノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（図１Ｂ、（７））を得た（２４５ｍｇ、９１％、Ｒｆ＝０．１４）。ＰＧＰＣからＰＧＰＥへの変換に関して先程に述べたように、コリン脂質をホスファチジル基転移反応させて（図１Ａ、１段階を比較のこと）、エタノールアミンの類似体（図１Ｂ、（８））を得た（収率：６．２ｍｇ、６６％、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／２５％ＮＨ３（６５:３５:５、ｖ／ｖ／ｖ）の展開溶媒を用いたときのＲｆ＝０．２４）（図１Ｂ、３段階）。
【００２２】
２「1-パルミトイル-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-POVPE)の合成」
１ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ）中に、1-パルミトイル-2-(5-ジメトキシペンタノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（３．０ｍｇ、５．０μｍｏｌ）およびBODIPY-SE（１．９５ｍｇ、５．０μｍｏｌ、１ｅｑ）を含む溶液に、トリエチルアミンｐ．ａ．（１０μｌ、７２μｍｏｌ、１４ｅｑ）を加えた（図１Ｂ、４段階）。反応混合物の溶液を、室温で８０分間攪拌した。溶媒を真空下において除去して、さらに精製することなく、次の反応に適する1-パルミトイル-2-ジメトキシペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-BODIPY-プロピオニル)-エタノールアミンを得た（図１Ｂ、（９））。４００μｌのＴＨＦ／ＨＣｌ（１ Ｎ）を用いて、前述の安定した前躯体（２．０ｍｇ、２．３μｍｏｌ）をアセタール開裂することにより所望の生成物を放出させた（図１Ｂ、５段階）。２分後に、反応混合物を、ＮａＨＣＯ３を用いて中和させた。その後、１．２ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ）を有する生成物を抽出した。有機相を、３００μｌの水で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の存在下において乾燥させて、減圧下において蒸発させて１．６５ｍｇのBODIPY-POVPEを得た（８７％、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１５:５:０．１、ｖ／ｖ／ｖ）の展開系におけるＲｆ＝０．２２）（図１Ｂ、（１０））。
【００２３】
（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン（BODIPY-POPE）の調製）
BODIPY-SE（１．００ｍｇ、２．５７μｍｏｌ）、トリエチルアミンｐ．ａ．（１０μｌ、７２μｍｏｌ、２８ｅｑ）、およびPOPE（1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、５．５３ｍｇ、７．７０μｍｏｌ、３ｅｑ）を、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ）の１ｍｌ中に溶解させた。混合物の溶液を室温で６０分間攪拌し、それから窒素気流下において溶媒を除去した。５００μｌのＣＨＣｌ３/ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ）に、白色の油状残留物を溶解させた。調製用のＴＬＣを用いて、生成物を精製した。生成物を含んでいる蛍光性バンドを、プレートから掻き取り、ＣＨＣｌ３/ＭｅＯＨ（１:４、ｖ／ｖ）を用いて３回溶出させた。１つにまとめた抽出液を蒸発させて、所望の生成物を得た（１．３１ｍｇ、５１％、Ｒｆ＝０．５９）。
【００２４】
（1-(10-ピレンデカノイル)-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PyrGPC)の合成）
０．１Ｍ ＣａＣｌ２を含んでいる３ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）および３ｍｌのジエチルエーテル（過酸化物がない）の混合液中に、1,2-ビス(10-ピレンデカノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（４５ｍｇ、４７μｍｏｌ）（図３、（１１））を含む乳濁液を磁気により攪拌し、この溶液に、５０ユニットのＰＬＡ２（Naja naja venom）を添加した（図３、１段階）。反応混合物の溶液を、３５〜４０℃で一晩攪拌した。ジエチルエーテルを除去した後に、ＣＨＣｌ３/ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ）を用いて、水溶液から生成物を抽出した（３×５ｍｌ）。１つにまとめた有機画分を蒸発させ、残留水を高真空下において除去して、1-(10-ピレンデカノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（図３、（１２））および遊離しているピレンデカン酸の混合物（５０ｍｇ）を得た。ジエチルエーテルを用いて粉末化することで、遊離しているピレンデカン酸を除去した。真空下において溶媒を除去した後に、２５ｍｇの純粋なリゾリン脂質を得た（８８％、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（５０:３０:１０:５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の展開系におけるＲｆ＝０．１２）。３ｍｌの無水ジクロロメタン中に、グルタル酸無水物（１２ｍｇ、１０５μｍｏｌ、１１ｅｑ）および無水ＤＭＡＰ（４ｍｇ、３３μｍｏｌ、３ｅｑ）を含む溶液を、溶液のリゾリン脂質（６．０ｍｇ、９．８μｍｏｌ）に添加した（図３、２ａ段階）。反応物の溶液を３５〜４０℃で一晩攪拌した。未精製の生成物を、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６５:２５:４、ｖ／ｖ／ｖ）を用いた１０ｇシリカゲル上においてフラッシュ・クロマトグラフィーにかけて、PyrGPC（図３、（１４））を得た（２．２ｍｇ、３１％、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（５０:３０:１０:５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の展開系におけるＲｆ＝０．１８）。
【００２５】
（1-(10-ピレンデカノイル)-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PyrOVPC)の合成）
ＤＣＣ（２００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、５９ｅｑ）およびＤＭＡＰ（２００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１００ｅｑ）を含んでいる１０ｍｌのジクロロメタンにおいて、5,5-ジメトキシペンタン酸「酸（５）」を用いて、1-(10-ピレンデカノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（１０ｍｇ、１６μｍｏｌ）（図３、（１２））をアシル化した。反応混合物の溶液を、室温で一晩攪拌した（図３、２ｂ段階）。６ｍｌのＭｅＯＨを添加して反応を止めるまでに、ＴＬＣを用いて、反応の進行状態を観察した。結果として生じた溶液をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１:１、ｖ／ｖ）で２回洗浄し、溶媒を減圧下において除去した。未精製の生成物を、調製用のＴＬＣを用いて精製し、精製された生成物を掻き取り、４ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１:４、ｖ／ｖ）を用いて５回溶出させた。１ｍｌのＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１:１、ｖ／ｖ）を用いて、１つにまとめた有機画分（５ｍｌの体積に濃縮されている）を洗浄することにより、残留物のシリカゲルを除去した。溶媒を蒸発させることで、６ｍｇの1-(10-ピレンデカノイル)-2-(5-ジメトキシペンタノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（４９％、Ｒｆ＝０．１７）を得た（図３、（１５））。ＴＨＦ／ＨＣｌ（１ Ｎ）を用いてアセタール開裂することで反応中間体（５．６ｍｇ、７．４μｍｏｌ）の脱保護を行った。その後にＮａＨＣＯ３を用いて中和し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ）を用いて生成物を抽出した。有機相を２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の存在下において乾燥させ、減圧下において蒸発させることで、１．１ｍｇのPyrOVPC（２１％、Ｒｆ＝０．０５）を得た（図３、３段階）。
【００２６】
（質量分析）
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）質量分析法は、窒素レーザー（λ＝３３７ｎｍ、５Ｈｚにおいて稼動する）を備えたマイクロマス トフスペック２Ｅ（Micromass TofSpec2E）、およびタイム‐ラグフォーカシングユニット（time-lag focusing unit）に基づいて行われる。レーザーの出力を閾値よりも上にし、レーザーを照射することでイオンが生じた。加速電圧を２０ｋＶに設定し、そして、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）に含まれる適切な混合物を用いて外からキャリブレートしたリフレクトロンモードにおいてスペクトルを記録した。一般的に、マトリックス（2,5-ジヒドロキシ安息香酸、ｃ＝１０ｍｇ／ｍｌ、ＣＨ３ＣＮ／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（７０:３０、ｖ／ｖ））、検体物（ｃ＝０．０１-１ｍｇ／ｍｌ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２:１、ｖ／ｖ））、およびＮａＴＦＡ（ｃ＝１ｍｇ／ｍｌ、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（７０:３０、ｖ／ｖ））の溶液を、１０:１:０．５（v/v/v）の比率で混合する工程により、試料を調製した。混合物のアリコート（０．５μｌの量）を、試料プレート（ステンレススチール）に置き、空気により乾燥させた。５０‐１００ショットのスペクトルを平均化させて、信号対雑音比を改善した。この作業において検討された全ての質量電荷比ｍ／ｚ値を、任意のアイソトープ分布の最も強調されたピークに相当させた。BODIPY-POVPE、BODIPY-PGPE、およびBODIPY-POPEの質量スペクトルは、図２に示されている。PyrGPCおよびPyrOVPCの質量スペクトルは、図４に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】1-パルミトイル-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-PGPE)の合成を示す図である。
【図１Ｂ】1-パルミトイル-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ-3-ホスホ-N-(3-[4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン]-プロピオニル)-エタノールアミン(BODIPY-POVPE)の合成を示す図である。
【図２】BODIPY-POVPE、BODIPY-PGPE、およびBODIPY-POPEの質量スペクトルを示す図である。
【図３】1-(10-ピレンデカノイル)-2-グルタロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（PyrGPC）、および、1-(10-ピレンデカノイル)-2-(5-オキソバレロイル)-sn-グリセロ‐3-ホスホコリン（PyrOVPC）の合成を示す図である。
【図４】PyrGPCおよびPyrOVPCの質量スペクトルを示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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