(57)【要約】  アタキシア−オキュラー・アプラキシア２（ＡＯＡ２）に関連した多型を同定する方法が記載される。ＡＯＡ２に関連した多型は、センアタキシン（ＳＥＴＸ）遺伝子における特定の突然変異を含む。ＡＯＡ２を診断する方法および個体におけるＡＯＡ２に対する保有状態について評価する方法についても記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるアタキシア−オキュラー・アプラキシア２（ａｔａｘｉａ−ｏｃｕｌａｒ  ａｐｒａｘｉａ  ２）（ＡＯＡ２）に関連した遺伝子多型の有無について評価する方法であって、前記個体由来の試験試料の、センアタキシン（ｓｅｎａｔａｘｉｎ）（ＳＥＴＸ）遺伝子における少なくとも１つの目的の突然変異の存在について評価するステップを含み、ここで目的の前記突然変異が、
ａ）ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、
ｂ）ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴの２塩基挿入、
ｃ）ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｄ）ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｅ）ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う前記同じ位置での６塩基欠失、
ｆ）ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、
ｇ）ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡの２塩基挿入、
ｈ）ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、
ｉ）ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、
ｊ）ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、
ｋ）ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、
ｌ）ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｍ）ヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失、
ｎ）ヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、
ｏ）ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、および
ｐ）ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失、
からなる群から選択され、ここで少なくとも１つの目的の突然変異の存在がアタキシア−オキュラー・アプラキシア２に関連した遺伝子多型の存在を示唆する、方法。
【請求項２】
前記個体由来の前記試験試料がゲノムＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲノムＤＮＡが９ｑ３４を含む染色体９またはその断片を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験試料を評価するステップが前記センアタキシン遺伝子の全部もしくは断片を増幅するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試験試料を評価するステップが直接配列分析を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
個体におけるアタキシア−オキュラー・アプラキシア２（ＡＯＡ２）を診断する方法であって、前記個体由来の試験試料の、前記個体の前記センアタキシン（ＳＥＴＸ）遺伝子のうちの第１の対立遺伝子における少なくとも１つの目的の突然変異の存在について評価するステップを含み、目的の前記突然変異が、
ａ）ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、
ｂ）ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴでの２塩基挿入、
ｃ）ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｄ）ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｅ）ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う同じ位置での６塩基欠失、
ｆ）ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、
ｇ）ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡでの２塩基挿入、
ｈ）ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、
ｉ）ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、
ｊ）ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、
ｋ）ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、
ｌ）ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｍ）ヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失、
ｎ）ヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、
ｏ）ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、および
ｐ）ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失
からなる群から選択され、ここで前記センアタキシン遺伝子の前記第１の対立遺伝子における目的の突然変異の存在がアタキシア−オキュラー・アプラキシア２に関連した少なくとも１つの突然変異が前記センアタキシン遺伝子の前記第２の対立遺伝子内にも存在する場合、アタキシア−オキュラー・アプラキシア２を示唆する、方法。
【請求項７】
前記センアタキシン（ＳＥＴＸ）遺伝子の前記第１および前記第２の対立遺伝子の双方が、
ａ）ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、
ｂ）ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴでの２塩基挿入、
ｃ）ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｄ）ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｅ）ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う同じ位置での６塩基欠失、
ｆ）ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、
ｇ）ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡでの２塩基挿入、
ｈ）ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、
ｉ）ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、
ｊ）ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、
ｋ）ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、
ｌ）ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｍ）ヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失、
ｎ）ヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、
ｏ）ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、および
ｐ）ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失
からなる群から選択される少なくとも１つの目的の突然変異を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記センアタキシン遺伝子の前記第１および前記第２の対立遺伝子の双方が同じ突然変異を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記個体由来の前記試験試料がゲノムＤＮＡを含む請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲノムＤＮＡが９ｑ３４を含む染色体９またはその断片を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験試料を評価するステップが前記センアタキシン遺伝子の全部もしくは断片を増幅するステップを含む請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験試料を評価するステップが直接配列分析を含む請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
個体におけるアタキシア−オキュラー・アプラキシア２（ＡＯＡ２）に対する保有状態について評価する方法であって、前記個体由来の試験試料の、前記個体の前記センアタキシン（ＳＥＴＸ）遺伝子の第１および第２の対立遺伝子における目的の突然変異の存在について評価するステップを含み、ここで目的の前記突然変異が、
ａ）ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、
ｂ）ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴでの２塩基挿入、
ｃ）ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｄ）ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｅ）ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う同じ位置での６塩基欠失、
ｆ）ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、
ｇ）ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡでの２塩基挿入、
ｈ）ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、
ｉ）ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、
ｊ）ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、
ｋ）ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、
ｌ）ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、
ｍ）ヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失、
ｎ）ヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、
ｏ）ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、および
ｐ）ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失
からなる群から選択され、ここで前記センアタキシン遺伝子の前記第１の対立遺伝子における目的の前記突然変異の存在および前記センアタキシン遺伝子の前記第２の対立遺伝子におけるアタキシア−オキュラー・アプラキシア２に関連した任意の突然変異の不在がアタキシア−オキュラー・アプラキシア２に対する保有状態を示す、方法。
【請求項１４】
前記個体由来の前記試験試料がゲノムＤＮＡを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ゲノムＤＮＡが９ｑ３４を含む染色体９またはその断片を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試験試料を評価するステップが前記センアタキシン遺伝子の全部もしくは断片を増幅するステップを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験試料を評価するステップが直接配列分析を含む請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００６年１月２７日出願の米国仮特許出願第６０／７６２，８１５号の利益を主張するものである。上記出願の教示内容全体は参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アタキシア−オキュラー・アプラキシア２（ＡＯＡ２）または眼球運動失行（ｏｃｕｌｏｍｏｔｏｒ  ａｐｒａｘｉａ）タイプ２を有する運動失調は最近同定された常染色体劣性の小脳性運動失調である（ル・ベー  Ｉ．（Ｌｅ  Ｂｅｒ  Ｉ．）ら、Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．２００５年、５（５）：４１１−７頁）。ＡＯＡ２は、初期には９ｑ３４での遺伝子座に関連し（ボモント  Ｐ．（Ｂｏｍｏｎｔ  Ｐ．）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２０００年、８：９８６−９９０頁；ネメス  Ａ．Ｈ．（Ｎｅｍｅｔｈ  Ａ．Ｈ．）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２０００年、６７：１３２０−１３２６頁；ル・ベー  Ｉ．（Ｌｅ  Ｂｅｒ  Ｉ．）ら、Ｂｒａｉｎ  ２００４年、１２７：７５９−７６７頁；イザット  Ｌ．（Ｉｚａｔｔ  Ｌ．）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００４年、２５１：８０５−８１２頁；マハジュナー  Ｍ．（Ｍａｈａｊｎａｈ  Ｍ．）ら、Ｊ．Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００５年、２０（５）：５２３−５２５頁）、現在ではその遺伝子座でのセンアタキシン（ＳＥＴＸ）遺伝子における突然変異に関連している（モレイラ  Ｍ．Ｃ．（Ｍｏｒｅｉｒａ  Ｍ．Ｃ．）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００４年、３６（３）：２２５−２２７頁；ドゥケット  Ａ．（Ｄｕｑｕｅｔｔｅ  Ａ．）ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００５年、５７：４０８−４１４頁）。ＳＥＴＸ遺伝子における突然変異を含む、９ｑ３４遺伝子座における特定の突然変異が、常染色体優性の若年発症型筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ４）にも関連している（チャンス  Ｐ．Ｆ（Ｃｈａｎｃｅ  Ｐ．Ｆ．）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８年、６２：６３３−６４０頁；ラビン  Ｂ．Ａ．（Ｒａｂｉｎ  Ｂ．Ａ．）ら、Ｂｒａｉｎ  １９９９年、１２２：１５３９−１５５０頁；ブレア  Ｉ．Ｐ．（Ｂｌａｉｒ  Ｉ．Ｐ．）ら、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０００年、３：１−６頁；チェン  Ｙ．Ｚ．（Ｃｈｅｎ  Ｙ．Ｚ．）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００４年、７４：１１２８−１１３５頁）。さらに、ＡＯＡ２は、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）（Ａ−Ｔ）（チュン  Ｈ．Ｈ．（Ｃｈｕｎ  Ｈ．Ｈ．）およびＲ．Ａ．ガッティ（Ｒ．Ａ．Ｇａｔｔｉ）、ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ、２００４年、３：１１８７−１１９６頁）および眼球運動失行タイプ１（ＡＯＡ１）を伴う運動失調（ル・ベー  Ｉ．（Ｌｅ  Ｂｅｒ  Ｉ．）ら、Ｂｒａｉｎ  ２００３年、１２６：２７６１−２７７２頁）を含む他の常染色体劣性の小脳性運動失調（ＡＲＣＡ）といくらかの類似性を共有する。ＡＯＡ２を他の疾患、特にＡＬＳ４およびＡＯＡ１から区別するための手段に対する需要が残っている。
【０００３】
（発明の概要）
本発明は、個体におけるアタキシア−オキュラー・アプラキシア２（ＡＯＡ２）に関連した遺伝子多型の有無について評価する方法を対象とする。本発明の方法では、個体由来の試験試料はセンアタキシン（ＳＥＴＸ）遺伝子における少なくとも１つの目的の突然変異の存在について評価される。試験試料の評価が、センアタキシン遺伝子の全部もしくは断片の増幅および／または直接配列分析を含みうる標準的方法により行われうる。試験試料は、ゲノムＤＮＡ（例えば９ｑ３４を含む染色体９またはその断片を含むゲノムＤＮＡ）などの核酸を含む。目的の突然変異は、ヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失、ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴでの２塩基挿入、ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う同じ位置での６塩基欠失、ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡでの２塩基挿入、ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、およびヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失からなる群から選択される。目的のこれらの突然変異の少なくとも１つの存在は、アタキシア−オキュラー・アプラキシア２に関連した遺伝子多型の存在を示す。
【０００４】
さらに、本発明の方法は、上記の個体由来の試験試料における、個体のセンアタキシン遺伝子のうちの第１の対立遺伝子における少なくとも１つの目的の突然変異の存在の評価による、個体におけるアタキシア−オキュラー・アプラキシア２（ＡＯＡ２）を診断する方法を含む。センアタキシン遺伝子のうちの第１の対立遺伝子における目的の突然変異の存在は、アタキシア−オキュラー・アプラキシア２に関連した少なくとも１つの突然変異がセンアタキシン遺伝子のうちの第２の対立遺伝子においても存在する場合、アタキシア−オキュラー・アプラキシア２の徴候である。特定の実施形態では、ＳＥＴＸの第１および第２の対立遺伝子の双方は目的の突然変異の少なくとも１つを含みうる。
【０００５】
本発明の方法は、個体由来の試験試料における、個体のセンアタキシン遺伝子の第１および第２の対立遺伝子における上記の目的の突然変異の存在についての評価による、個体におけるアタキシア−オキュラー・アプラキシア２に対する保有状態を評価する方法にさらに関する。センアタキシン遺伝子のうちの第１の対立遺伝子における目的の突然変異の存在およびセンアタキシン遺伝子のうちの第２の対立遺伝子におけるアタキシア−オキュラー・アプラキシア２に関連した任意の突然変異の不在は、アタキシア−オキュラー・アプラキシア２に対する保有状態を示す。
【０００６】
本発明は、本発明の方法において有用なキットにさらに関する。
【０００７】
本発明の方法は、アタキシア−オキュラー・アプラキシア２を他の小脳性運動失調から区別するとともに疾患を患うかまたは疾患に対する保有者である個体を同定するための単純な手段を提供する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、アタキシア−オキュラー・アプラキシア２（ＡＯＡ２）に関連した遺伝子多型の存在または不在における個体を評価する方法ならびに個体におけるＡＯＡ２を診断する方法およびＡＯＡ２に対する保有状態の個体を評価する方法を提供する。本明細書で記載のように、出願人は、ＡＯＡ２に関連したセンアタキシン遺伝子（ＳＥＴＸ遺伝子）において目的の特定の突然変異を同定している。本明細書で記載のＳＥＴＸ遺伝子における突然変異は、ＳＥＴＸ遺伝子の核酸配列における改変物である（例えば、欠失、挿入、または転位）。ＳＥＴＸの配列内の突然変異の位置は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に関連して数えられる、すなわち改変されたヌクレオチドの数えられた位置はｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列におけるそのヌクレオチドの数である。ＳＥＴＸ遺伝子に関連したｍＲＮＡ配列は、２００４年３月１２日に更新されたＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ３６２７２８（配列番号１としても示される）にて示される。目的の突然変異は、以下の改変、すなわちヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失、ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴでの２塩基挿入、ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う同じ位置での６塩基欠失、ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡでの２塩基挿入、ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、およびヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失を含む。
【０００９】
本発明の方法では、個体由来の試験試料は、ＳＥＴＸ遺伝子における１つもしくは複数のこれら特定の突然変異（本明細書中で「目的の多型」または「ＡＯＡ２に関連した多型」とも称される）の存在について評価される。個体はヒト個体であり、任意の種族および胎児、幼児、若年者、青年、および成人を含む任意の年齢でありうる。情報を確認することが望ましいとして、代表的な個体が、過去にＡＯＡ２を有する者として診断されていない個体またはＡＯＡ２における保有者である個体、ならびにＡＯＡ２を有するかまたはＡＯＡ２における保有者であるというリスクがあると判定されている個体および初期にＡＯＡ２に罹患していると診断されている個体を含む。
【００１０】
試験試料は、個体由来の、ＳＥＴＸ遺伝子またはＳＥＴＸ遺伝子の断片、ＳＥＴＸ  ｍＲＮＡまたはＳＥＴＸ  ｍＲＮＡの断片、ＳＥＴＸ  ｃＤＮＡまたはＳＥＴＸ  ｃＤＮＡの断片を含む核酸を含有する試料である。本明細書で用いられる「断片」という用語は、遺伝子、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの一部がＳＥＴＸの断片としての同定に十分である長さのポリヌクレオチドであり、代表的な実施形態では断片がＳＥＴＸ遺伝子の１つもしくは複数のエクソンを含み、別の代表的な実施形態では断片がＳＥＴＸ遺伝子のエクソンの一部を含むことを示す。断片は、ＳＥＴＸ遺伝子のイントロン／エクソン接合部も含みうる。
【００１１】
試験試料は、個体由来の生物学的試料から調製される。生物学的試料は、ゲノムＤＮＡ（例えば染色体核酸）またはＲＮＡを有する、任意の供給元から得られる試料、例えば血液試料、羊水の試料、脳脊髄液の試料、あるいは皮膚、筋肉、口腔もしくは結膜粘膜、胎盤、胃腸管または他の器官に由来する組織試料でありうる。胎児の細胞または組織に由来する核酸の生物学的試料が、適切な方法、例えば（直接のまたは培養された）羊水穿刺または絨毛膜のサンプリングにより取得可能である。特定の実施形態では、染色体９またはその断片（例えば９ｑ３４を含む断片またはＳＥＴＸ遺伝子の１つもしくは複数のエクソンを含む断片）を有するゲノムＤＮＡを有する生物学的試料が用いられる。生物学的試料が試験試料として使用可能であり、あるいは、生物学的試料を処理することで核酸または核酸のコピー（例えばＳＥＴＸ遺伝子を含む核酸のコピー）に対するアクセスの向上が可能であり、次いで処理された生物学的試料は試験試料として使用可能である。例えば、一実施形態では、ｃＤＮＡは本方法にて用いられるｍＲＮＡを含む生物学的試料から調製される。あるいはまたはそれに加え、必要に応じて、増幅方法を用い、目的の多型の存在または不在についての評価における試験試料として用いられる生物学的試料中でＳＥＴＸ遺伝子の全部もしくは断片を含む核酸を増幅することが可能である。例えば、代表的な実施形態では、ＳＥＴＸ遺伝子のエクソンの各々は増幅可能である。
【００１２】
試験試料を評価することで、ＳＥＴＸ遺伝子における１つもしくは複数の目的の突然変異（目的の多型）が個体のＳＥＴＸ遺伝子（例えばＳＥＴＸ遺伝子の第１および第２の対立遺伝子）において存在するか否かが判定される。一般に、目的の多型の検出は、試験試料中で目的の多型を有する核酸の存在または不在を判定することにより行われうる。
【００１３】
第１の方法では、サザン分析、ノーザン分析、またはインサイチュハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション方法が用いられうる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、アウスベル  Ｆ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）（すべての付録を含む）を参照）。例えば、目的の多型の存在はゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡにおける核酸の核酸プローブに対するハイブリダイゼーションにより示されうる。本明細書で用いられる「核酸プローブ」がＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブである可能性があり、核酸プローブは本明細書に記載のように少なくとも１つの目的の多型を有しうる。例えば、プローブは、遺伝子、遺伝子断片（例えば１つもしくは複数のエクソン）、遺伝子を含むベクター、プローブまたはプライマーなどでありうる。
【００１４】
目的の多型の１つもしくは複数を検出するため、試験試料を少なくとも１つの核酸プローブに接触させることによりハイブリダイゼーション試料が形成される。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましいプローブが、ＳＥＴＸ遺伝子のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズ可能な標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、完全長の核酸分子またはその一部、例えば少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長でありかつストリンジェントな条件下で適切なｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドでありうる。ハイブリダイゼーション試料は、核酸プローブのＳＥＴＸ遺伝子のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で維持される。本明細書で用いられる「特異的ハイブリダイゼーション」は、（例えばミスマッチを全く伴わない）正確なハイブリダイゼーションを示す。特異的ハイブリダイゼーションは、上記のように、例えば高いストリンジェンシー条件下または中等度のストリンジェンシー条件下で行われうる。特に好ましい実施形態では、特異的ハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション条件は高いストリンジェンシーである。
【００１５】
次いで、特異的ハイブリダイゼーションは、使用可能な場合、標準的方法を用いて検出される。特異的ハイブリダイゼーションが核酸プローブと試験試料中のＳＥＴＸ遺伝子またはｍＲＮＡの間で行われる場合、核酸プローブ内に存在する多型は個体のＳＥＴＸ遺伝子内にも存在する。２つ以上の核酸プローブが、現在、本方法でも用いられうる。核酸プローブのうちのいずれか１つの特異的ハイブリダイゼーションは、本明細書中に記載の目的の多型の存在を示す。
【００１６】
ノーザン分析（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、アウスベル  Ｆ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、上記を参照）では、上記のハイブリダイゼーション方法を用いることで目的の多型の存在が同定される。ノーザン分析においては、ＲＮＡを含有する試験試料が適切な手段により個体由来の生物学的試料から調製される。上記の、核酸プローブと個体由来のＲＮＡの特異的ハイブリダイゼーションは、本明細書中に記載の目的の多型の存在を示す。
【００１７】
核酸プローブの使用の代表例として、例えば米国特許第５，２８８，６１１号および米国特許第４，８５１，３３０号を参照のこと。
【００１８】
あるいは、上記のハイブリダイゼーション方法においては核酸プローブの代わりにペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを用いてもよい。ＰＮＡはペプチド様の無機骨格、例えばＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位を有するＤＮＡ模倣体（ｍｉｍｉｃ）であり、ここでは有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴもしくはＵ）がメチレンカルボニルリンカーを介してグリシン窒素に付着している（例えばニールソン  Ｐ．Ｅ．（Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｐ．Ｅ．）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年５月、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１頁（１９９４年）を参照）。ＰＮＡプローブを、本明細書中に記載の目的の多型の１つもしくは複数を含むＳＥＴＸ遺伝子に特異的にハイブリダイズするように設計してもよい。ＰＮＡプローブのＳＥＴＸ遺伝子に対するハイブリダイゼーションは目的の多型の存在を示す。
【００１９】
本発明の別の方法では、ＳＥＴＸ遺伝子における突然変異または多型が制限部位の生成または除去をもたらす場合、制限消化による突然変異分析を用い、突然変異体のＳＥＴＸ遺伝子または目的の多型を有するＳＥＴＸ遺伝子を検出することが可能である。個体由来のゲノムＤＮＡを有する試料が用いられる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、試料中のＳＥＴＸ遺伝子の全部もしくは断片（および必要に応じてフランキング配列）を増幅することが可能である。ＲＦＬＰ分析が記載のように行われる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、上記を参照）。関連のＤＮＡ断片の消化パターンが、ＳＥＴＸ遺伝子における多型の存在または不在を示す。
【００２０】
直接配列分析を用い、ＳＥＴＸ遺伝子における目的の特異的多型を検出することも可能である。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含む試料が用いられ、ＰＣＲまたは他の適切な方法を用い、ＳＥＴＸ遺伝子の全部もしくは断片および／または必要に応じてそのフランキング配列を増幅することが可能である。ＳＥＴＸ遺伝子または遺伝子の断片（例えば１つもしくは複数のエクソン）、またはｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡの断片、またはｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片の配列が標準的方法を用いて決定される。遺伝子、遺伝子断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ断片の配列は、必要に応じ、ＳＥＴＸ遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの既知の核酸配列と比較される。次いで、目的の多型の存在が同定されうる。
【００２１】
対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用い、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを用いる増幅されたオリゴヌクレオチドのドットブロットハイブリダイゼーションの使用により、目的の多型の存在について検出することが可能である（例えばサイキ  Ｒ．（Ｓａｉｋｉ  Ｒ．）ら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））３２４：１６３−１６６頁を参照）。「対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド」（本明細書中で「対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ」とも称される）とは、ＳＥＴＸ遺伝子に特異的にハイブリダイズしかつ本明細書中に記載の目的の多型を有する約１０〜５０塩基対、好ましくは約１５〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドである。特定の多型に対して特異的な、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが標準的方法を用いて調製可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、上記を参照）。目的の多型を同定するため、ＤＮＡを含む試料が用いられる。ＰＣＲを用い、ＳＥＴＸ遺伝子の全部もしくは断片およびそのフランキング配列を増幅することが可能である。増幅されたＳＥＴＸ遺伝子（または遺伝子の断片）を有するＤＮＡは標準的方法を用いてドットブロットされ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、上記を参照）、ブロットはオリゴヌクレオチドプローブと接触される。次いで、増幅されたＳＥＴＸに対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションの存在が検出される。個体由来のＤＮＡに対する対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの特異的ハイブリダイゼーションが目的の多型の存在を示す。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用い、目的の多型の存在を検出することが可能である。ＦＲＥＴは１個の蛍光分子の放射が別分子の励起とカップリングされる場合の距離依存性の励起状態相互作用のプロセスである。共鳴エネルギー移動において典型的なアクセプターとドナーの対が、４−［［４−（ジメチルアミノ）フェニル］アゾ］安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）および５−［（２−アミノエチルアミノ］ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）よりなる。ＥＤＡＮＳは３３６ｎｍの光を用いた照明により励起され、光子を波長４９０ｎｍで放出する。ＤＡＢＣＹＬ部分がＥＤＡＮＳの２０オングストローム以内に位置する場合、この光子は効率的に吸収されることになる。ＤＡＢＣＹＬおよびＭＡＮＳは、目的の突然変異の１つの部位に近接しかつ／またはそれと重なる核酸に頭から尾までハイブリダイズするように設計された２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブに付着されることになる。次いで、融解曲線分析が適用される、すなわち変性、冷却、および再加熱のサイクルがオリゴヌクレオチドプローブと混合された試験試料に適用され、蛍光を継続的に監視することでＤＡＢＣＹＬ蛍光の低下またはＥＤＡＮＳ蛍光の増大（消光の低下）が検出される。２つのプローブが相互に近接してハイブリダイズされる状態にある間、ＦＲＥＴが極めて効率的なものになる。オリゴヌクレオチドプローブの物理的分離の結果、２つの染料がもはや近接しないことから非効率なＦＲＥＴがもたらされる。目的の突然変異の存在または不在が、試験試料から得られる蛍光強度特性をＳＥＴＸ遺伝子における既知の目的の突然変異を含む対照試料の蛍光強度特性と比較することによって評価されうる。
【００２３】
別の実施形態では、個体由来の標的核酸配列セグメントに対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用い、目的の多型を同定することが可能である。例えば、一実施形態では、オリゴヌクレオチドアレイを用いてもよい。オリゴヌクレオチドアレイは、典型的には異なる既知の位置における基質の表面に結合される複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。「Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（商標）」としても記述されるこれらのオリゴヌクレオチドアレイは、一般に当該技術分野、例えば米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ特許出願の国際公開第９０／１５０７０号パンフレットおよび国際公開９２／１００９２号パンフレットにて記載されている。これらのアレイは、一般に、フォトリソグラフィー方法と固相オリゴヌクレオチド合成方法の組み合わせを組み込む、機械的合成方法または光誘導的合成方法を用いて生成可能である。フォドール（Ｆｏｄｏｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７７頁（１９９１年）、ピルング（Ｐｉｒｒｕｎｇ）ら、米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願番号、国際公開第９０／１５０７０号パンフレットも参照）およびフォドール（Ｆｏｄｏｒ）ら、ＰＣＴ出願番号、国際公開第９２／１００９２号パンフレットおよび米国特許第５，４２４，１８６号（それら各々の教示内容全体は参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。機械的合成方法を用いるこれらのアレイを合成するための技術が、例えば米国特許第５，３８４，２６１号（それらの教示内容全体は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００２４】
一旦オリゴヌクレオチドアレイが調製されると、目的の核酸がアレイとハイブリダイズされ、多型について走査される。ハイブリダイゼーションおよび走査は、一般に、本明細書に加え、例えば公表されたＰＣＴ出願番号、国際公開第９２／１００９２号パンフレットおよび国際公開第９５／１１９９５号パンフレットならびに米国特許第５，４２４，１８６号（それらの教示内容全体は参照により本明細書中に援用される）に記載の方法によって行われる。つまり、１つもしくは複数の予め同定された多型マーカーを含む標的核酸配列が、周知の増幅技術、例えばＰＣＲにより増幅される。典型的には、これは多型から上流および下流の双方における標的配列の２つの鎖に対して相補的なプライマー配列の使用を含む。非対称ＰＣＲ技術もまた利用可能である。次いで、一般に標識を組み込む増幅された標的が適切な条件下でアレイとハイブリダイズされる。アレイのハイブリダイゼーションおよび洗浄の完了時、アレイを走査することで標的配列のハイブリダイズ対象のアレイ上の位置が判定される。走査から得られるハイブリダイゼーションデータは、典型的にはアレイ上の位置の関数としての蛍光強度の形式である。
【００２５】
アレイについては、例えば単一の多型の検出において主に単一の検出ブロックの観点で記載されているが、複数の検出ブロックを含むことから複数の特異的な多型の分析が可能である。他のアレンジでは、一般に、様々な最適な条件が標的のアレイに対するハイブリダイゼーションの間で使用可能なように、検出ブロックが単一のアレイ内部または複数の分離アレイ内にグループ化されうることが理解されるであろう。例えば、ゲノム配列のＧ−Ｃに富むストレッチ内に該当する多型の検出をＡ−Ｔに富むセグメント内に該当する多型の場合とは別に提供することが望ましい場合が多い。これは各状況におけるハイブリダイゼーション条件の別々の最適化を可能にする。
【００２６】
多型を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイの使用に関するさらなる記載が、例えば米国特許第５，８５８，６５９号および米国特許第５，８３７，８３２号（それらの教示内容全体は参照により本明細書中に援用される）において見出されうる。
【００２７】
核酸分析の他の方法を用い、目的の多型を検出可能である。代表的な方法が、例えば、手動による直接配列決定（チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１−１９９５頁；サンガー  Ｆ．（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ．）ら（１９７７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７頁；ビービス（Ｂｅａｖｉｓ）ら、米国特許第５，２８８，６４４号）；自動蛍光配列決定；一本鎖高次構造多型アッセイ（ＳＳＣＰ）；締付変性（ｃｌａｍｐｅｄ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（シェフィールド  Ｖ．Ｃ．（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｖ．Ｃ．）ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２３２−２３６頁）、移動度転位分析（オリタ  Ｍ．（Ｏｒｉｔａ  Ｍ．）ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２７６６−２７７０頁；ローゼンバウム（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ）およびライスナー（Ｒｅｉｓｓｎｅｒ）（１９８７年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１２７５頁；キーン（Ｋｅｅｎ）ら（１９９１年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、７：５頁；制限酵素分析（フラベル（Ｆｌａｖｅｌｌ）ら（１９７８年）Ｃｅｌｌ  １５：２５頁；ジーヴァー（Ｇｅｅｖｅｒ）ら（１９８１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５０８１頁）；ヘテロ二本鎖分析；化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）（コットン（Ｃｏｔｔｏｎ）ら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７−４４０１頁）；ＲＮアーゼ保護アッセイ（マイヤーズ  Ｒ．Ｍ．（Ｍｙｅｒｓ  Ｒ．Ｍ．）ら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２頁）；ヌクレオチドミスマッチ、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｍｕｔＳタンパク質を認識するポリペプチドの使用（例えば米国特許第５，４５９，０３９号を参照）；Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（商標）技術；および／または対立遺伝子に特異的なＰＣＲを含む。
【００２８】
これらの方法を用い、本明細書中に記載のＳＥＴＸ遺伝子における１つもしくは複数の目的の突然変異の存在を同定することが可能である。例えば、特定の実施形態では、本方法を用い、個体のＳＥＴＸ遺伝子の第１および第２の対立遺伝子の双方における１つもしくは複数の目的の多型の存在について評価することが可能である。「第１」および「第２」の対立遺伝子という用語は、２つの対立遺伝子に恣意的に適用される、すなわちいずれかの対立遺伝子が「第１」の対立遺伝子と表される場合があり、次いで他方の対立遺伝子が「第２」の対立遺伝子として表される。
【００２９】
本発明の特定の一実施形態では、試験試料の、ＳＥＴＸ遺伝子における突然変異の有無について評価する上記の方法は、個体におけるＡＯＡ２に関連した遺伝子多型の有無について評価するのに用いられる。目的の突然変異の少なくとも１つの存在（例えば、ヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失、ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴでの２塩基挿入、ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う同じ位置での６塩基欠失、ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡでの２塩基挿入、ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、またはヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失）がＡＯＡ２に関連した遺伝子多型の存在を示す。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、試験試料の、ＳＥＴＸ遺伝子における突然変異の有無について評価する上記の方法は、個体におけるＡＯＡ２を診断するのに用いられる。ＡＯＡ２が劣性の小脳性運動失調であることから、個体のＳＥＴＸ遺伝子の各対立遺伝子におけるＡＯＡ２に関連した突然変異の同定はＡＯＡ２の診断にとって必要である。２つの対立遺伝子は、既存の同じ突然変異を有するかまたは異なる突然変異を有する可能性があり、さらに２つ以上の突然変異が一方または両方の対立遺伝子において見出されうる。これらの方法では、少なくとも１つの目的の多型（ヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失、ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴでの２塩基挿入、ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う同じ位置での６塩基欠失、ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡでの２塩基挿入、ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、またはヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失）がＳＥＴＸ遺伝子の２つの対立遺伝子のうちの少なくとも１つ（「第１の」対立遺伝子）において見出される。さらに、ＡＯＡ２に関連した少なくとも１つの突然変異がＳＥＴＸ遺伝子の他方の対立遺伝子（「第２の」対立遺伝子）において存在する。第２の対立遺伝子において存在するＡＯＡ２に関連した突然変異は本明細書に記載の目的の多型でありうるか、あるいは第２の対立遺伝子において存在するＡＯＡ２に関連した突然変異はＡＯＡ２に以前に関連しているＳＥＴＸにおける突然変異、例えば下記の表１に示される突然変異でありうる。
【００３１】
【表１】
2009524440.tif 000002
【００３２】
対立遺伝子の一方または両方が表１に示される突然変異を有しうる一方、本発明の方法によるＡＯＡ２の診断においては本発明の方法が目的の多型の1つまたは複数が対立遺伝子の少なくとも一方または対立遺伝子の両方において存在することを必要とすることは注目されるべきである。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態では、試験試料の、ＳＥＴＸ遺伝子における突然変異の存在または不在を評価する上記の方法は、ＡＯＡ２における個体の保有状態を診断するのに用いられる。「保有状態」という用語は、個体がＳＥＴＸ遺伝子の単一の対立遺伝子における目的の突然変異を保有し、第２の対立遺伝子においてはＡＯＡ２に関連した突然変異が全く存在せず、それ故にこの劣性の小脳性運動失調における保有者と考えられることを示す。これらの方法では、少なくとも１つの目的の多型（ヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失、ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴでの２塩基挿入、ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う同じ位置での６塩基欠失、ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡでの２塩基挿入、ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、またはヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失）がＳＥＴＸ遺伝子の２つの対立遺伝子のうちの第１の対立遺伝子（「第１の」対立遺伝子）においてのみ見出される。さらに、ＳＥＴＸ遺伝子のうちの第２の対立遺伝子においてはＡＯＡ２に関連した突然変異が全く見出されない。
【００３４】
良性多型がＳＥＴＸ遺伝子の対立遺伝子の一方もしく両方にて存在しうることは注目される。
【００３５】
本発明は本発明の方法にて有用なキット（例えば試薬キット）にも関する。かかるキットは、例えばハイブリダイゼーションプローブもしくはプライマー（例えば標識プローブもしくはプライマー）、標識分子を検出するための試薬、（例えばＲＦＬＰ分析のための）制限酵素、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド、ＳＥＴＸもしくはＳＥＴＸの断片を含む核酸を増幅するための手段、またはＳＥＴＸの核酸配列を分析するための手段を含む、本明細書に記載の方法のいずれかにて有用な成分を含む。例えば一実施形態では、キットは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（商標）技術などのミクロスフィアに基づく技術を用いる目的の変異の分析に有用な成分を含む。本発明の好ましい実施形態では、キットは、目的の変異（ヌクレオチド４７９〜４８０のＴでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド４６３３〜４６３６での４塩基欠失、ヌクレオチド６１１４〜６１１５での２塩基欠失、ヌクレオチド６２９２での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド３６９〜３７２での４塩基欠失、ヌクレオチド２７４７〜２７４８のＡＴでの２塩基挿入、ヌクレオチド４２３４での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８１６での単一の塩基転位Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド４８７３〜４８７８でのＧＧの挿入に伴う同じ位置での６塩基欠失、ヌクレオチド４８９１〜４８９２のＧでの単一の塩基挿入、ヌクレオチド５３０１〜５３０２のＣＡでの２塩基挿入、ヌクレオチド５３０８〜５３１１での４塩基欠失、ヌクレオチド５５９１〜５５９２での２塩基欠失、ヌクレオチド５９５８での単一の塩基欠失、ヌクレオチド６４２２〜６４２３のＡでの単一の塩基挿入、またはヌクレオチド６８４８〜６８５１での４塩基欠失）の１つもしくは複数を検出するための成分を含む。
【００３６】
本発明は、以下の非限定の実施例にてより詳細に説明される。
【００３７】
（実施例）
実施例１：ＡＯＡ２に関連したＳＥＴＸ遺伝子における突然変異の同定
患者
ＳＥＴＸ遺伝子における目的の突然変異の存在について評価される患者は、予め運動失調と診断されていた個体を含んだ。患者により示されたＡＯＡ２の特徴は、一般に、１０〜２２歳での臨床徴候、四肢および胴体の運動に軽度の支障を来たした重度の歩行障害、変動しやすい（ｖａｒｉａｂｌｙ  ｐｒｅｓｅｎｔ）眼球運動失行、連続追視の障害およびサッカードの麻痺（ｓａｃｃａｄｅ  ｐａｌｓｙ）を含む眼科学的徴候；感覚運動および軸索消失を含む末梢神経障害；αフェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルの上昇；脚における腱反射神経の不在のうちの１つもしくは複数を含んだ。
【００３８】
突然変異スクリーニング
全血標本を患者から採取し、ＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ抽出法（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）のジェントラ・システムズ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．））を用いて抽出した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてゲノムＤＮＡを増幅し、次いでＰＣＲ産物を精製し、サイクルシークエンシングを行った。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３７３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを自動シークエンシングとして用いた。
【００３９】
ＳＥＴＸ遺伝子は、エクソン３内部で始まりエクソン２６まで続く８，０３１塩基対のコード領域を有する９２キロベース範囲の２７のエクソンからなる。ＳＥＴＸ遺伝子における目的の突然変異を評価するため、エクソンをコードするＳＥＴＸ全部の配列決定を行った。エクソンをコードするＳＥＴＸの配列決定を意図し、単一のプライマーとともに各エクソンおよびスプライス接合の高品質の配列決定を可能にするため、遺伝子を３１１塩基対〜５４９塩基対の範囲の大きさのアンプリコンに分解した。より小さいエクソン（エクソン３〜９および１１〜２５）をアンプリコンとして（スプライス接合部を含む）各エクソンを用いて増幅し、エクソン１０（４，１７５塩基対）および２６（７４６塩基対）を複数のアンプリコンを用いて増幅した。突然変異を逆鎖の配列決定により検証した。アンプリコンに対するプライマーを既知の欠失または挿入と重ならないように設計し、ＰＣＲのプライミング部位に作用するＤＮＡ変異体が対立遺伝子の脱落および偽正常の（ｆａｌｓｅ  ｎｏｒｍａｌ）結果をもたらすという可能性を最小にした。参照対照は、同定されたＳＥＴＸ配列の改変を有するゲノムＤＮＡ（正の対照）および／またはＳＥＴＸの改変を全く有しないゲノムＤＮＡ（正常対照）を含んだ。配列を配列番号１で示されるＳＥＴＸ  ｍＲＮＡ配列と比較した。
【００４０】
結果
ＡＯＡ２に関連したＳＥＴＸ遺伝子における数個の突然変異を同定した。それらを下記の表２に示す。
【００４１】
【表２】
2009524440.tif 000003
【００４２】
これらの突然変異の中の５つはホモ接合性であり、ＡＯＡ２の徴候に関連したホモ接合性突然変異の存在は、これらの突然変異がＡＯＡ２の存在に関連することを示した。突然変異の残りはヘテロ接合性であり、それらの突然変異を有する個体が１つの対立遺伝子においてＡＯＡ２の症候性があり、第２の対立遺伝子において存在する、ＡＯＡ２に関連した第２の突然変異も有したことからＡＯＡ２に関連していた。
【００４３】
本発明が特にその好ましい実施形態との関連で示され、記載されている一方、形態および詳細部における様々な変化が、添付の特許請求の範囲に規定されるように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくその中でなされうることが当業者により理解されるであろう。
【配列表】
2009524440000001.app
【国際調査報告】
2009524440.tif 000004
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