(57)【要約】  本発明は、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベートすることによりγ−アミノ酪酸を生成させるγ−アミノ酪酸の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベートすることによりγ−アミノ酪酸を生成させる、γ−アミノ酪酸の製造方法。
【請求項２】
前記液は、ｐＨを調製することなくインキュベートされる、請求項１記載のγ−アミノ酪酸の製造方法。
【請求項３】
前記粉砕物は、大麦糠である、請求項１又は２記載のγ−アミノ酪酸の製造方法。
【請求項４】
前記大麦糠は、大麦を搗精度３０〜４０％で精麦して得られる大麦糠である、請求項３記載のγ−アミノ酪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−アミノ酪酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大麦は健康食材として注目されているが、商品として流通するのは、大麦の種子から表層部が削り取られた剥皮大麦又は精白大麦であり、これらの製造過程では、副産物として大量の大麦糠が生じる。大麦糠は、主に家畜の飼料として利用されているが、その流通価格は非常に低いため、一部は廃棄処分されているのが現状である。【０００３】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、動植物界に広く分布しているアミノ酸の一種で、哺乳動物の脳や脊髄に存在する神経伝達物質である。γ−アミノ酪酸は、脳の血流を活発にし、酸素供給量を増加させ、脳細胞の代謝機能を亢進するため、脳卒中後遺症や脳動脈硬化症等による頭痛、耳鳴り、記憶障害、意欲低下等の改善に効果があるとされている。さらに最近では、γ−アミノ酪酸は、抗利尿ホルモンの分泌を抑制し、利尿作用を活性化するため、血圧を下げる効果があることにも注目されている。【０００４】
γ−アミノ酪酸は、グルタミン酸がグルタミン酸脱炭酸酵素と反応することによって生成され、補酵素としてピリドキサルリン酸が存在すれば、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が顕著に高まることが報告されている（特許文献１）。【０００５】
γ−アミノ酪酸の製造方法としては、乳酸菌（特許文献２）や麹菌（特許文献３）にグルタミン酸を加えて培養し、菌自身にγ−アミノ酪酸を生産させる方法、グルタミン酸を含む液に米胚芽又は胚芽を含む米糠を添加して、米胚芽に含まれるグルタミン酸脱炭酸酵素を利用してγ−アミノ酪酸を生成させる方法（特許文献４）、さらには、グルタミン酸を含む液に米糠と酵母を添加し、米糠に含まれるグルタミン酸脱炭酸酵素と酵母に含まれるピリドキサルリン酸とを利用し、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率を高めてγ−アミノ酪酸を生成させる方法（特許文献５）等が報告されている。【０００６】
【特許文献１】特開平９−２３８６５０号公報
【特許文献２】特開平７−２２７２４５号公報
【特許文献３】特開平１０−１６５１９１号公報
【特許文献４】特開２０００−２０１６５１号公報
【特許文献５】特開２００３−２４５０９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、乳酸菌や麹菌等の微生物を用いてγ−アミノ酪酸を製造するには、大型の培養設備が必要となり、培養期間についても少なくとも２〜３日を要するものであった。さらに、上記微生物を用いてγ−アミノ酪酸を製造する場合であっても、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率は十分に高いものとはいえず、効率面でさらなる改善が求められていた。【０００８】
また、米胚芽又は米糠に含まれるグルタミン酸脱炭酸酵素を利用してγ−アミノ酪酸を製造するには、反応液のｐＨを４．５〜６．５に調整する必要があり、この場合であってもグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率は上記微生物を用いてγ−アミノ酪酸を製造した場合には到底及ばないものであった。さらに、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率を上げるために補酵素であるピリドキサルリン酸を添加することが可能であるが、ピリドキサルリン酸は食品添加物としては認められておらず、食品向けのγ−アミノ酪酸の製造にピリドキサルリン酸を使用できないという問題点があった。【０００９】
そこで本発明の目的は、無細胞の系で、反応液のｐＨを調整することなく、かつ、ピリドキサルリン酸を使用することなく、短時間で大量のγ−アミノ酪酸を製造することにある。また本発明の目的は、グルタミン酸又はグルタミン酸塩からγ−アミノ酪酸への変換率が、乳酸菌等の微生物にγ−アミノ酪酸を生産させた場合と比べて優れているγ−アミノ酪酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明は、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベートすることによりγ−アミノ酪酸を生成させるγ−アミノ酪酸の製造方法を提供する。【００１１】
本発明者らは、大麦の粉砕物の水懸濁液にグルタミン酸又はグルタミン酸塩を加えて室温でインキュベートすると、短時間（少なくとも２時間）でγ−アミノ酪酸に効率よく変換されることを見出した。上記の製造方法は、ピリドキサルリン酸を使用しなくても、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が、乳酸菌にγ−アミノ酪酸を生産させた場合よりも優れている。【００１２】
上記液は、ｐＨを調製することなくインキュベートされることが好ましい。【００１３】
上記製造方法は、ｐＨを調製することなく、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベートするだけでγ−アミノ酪酸を製造できるため、乳酸菌等の微生物の培養に必要な特別な機械及び設備を必要としない。さらに、上記の製造方法は、反応液中に、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含んでいれば、他にはいかなる成分も必要としないため、反応液からのγ−アミノ酪酸の単離・精製が容易である。【００１４】
上記粉砕物は、大麦糠であることが好ましく、大麦を搗精度３０〜４０％で精麦して得られる大麦糠であることがより好ましい。【００１５】
大麦の粉砕物として、大麦糠、特に、搗精度３０〜４０％で精麦して得られる大麦糠を使用すれば、大麦の粉砕物の単位質量当たりのγ−アミノ酪酸の生成量が高まり、単位時間当たりのγ−アミノ酪酸の生産量及びグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率をさらに高めることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、反応液のｐＨを調整したり、反応液にピリドキサルリン酸を添加したりすることなく、無細胞の系でγ−アミノ酪酸を効率よく製造でき、乳酸菌にγ−アミノ酪酸を生産させた場合よりも、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への高い変換率を実現できる。また本発明によれば、乳酸菌等の微生物の培養に必要な特別な機械及び設備を必要とせず、簡易かつ短時間でγ−アミノ酪酸を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を使用した場合におけるγ−アミノ酪酸の生成量を比較したグラフである。
【図２】γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす反応温度の影響を示したグラフである。
【図３】γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす大麦糠の量の影響を示したグラフである。
【図４】γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす反応時間の影響を示したグラフである。
【図５】γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす大麦糠の搗精度の影響を示したグラフである。
【図６】各品種の大麦糠、小麦糠又は米糠を使用して無細胞系で生成されたγ−アミノ酪酸の量を示したグラフである。
【図７】大麦糠、小麦糠又は米糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成させた場合におけるグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率及び乳酸菌を培養してγ−アミノ酪酸を生成させた場合におけるグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率を示したグラフである。
【図８】麦芽を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成させた後の反応液のγ−アミノ酪酸濃度を示すグラフである。
【図９】γ−アミノ酪酸生成工程を経て製造された冷麦汁（試料１，２）及び当該工程を経ずに製造された冷麦汁（試料３，４）のγ−アミノ酪酸濃度及びグルタミン酸濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。【００１９】
本発明のγ−アミノ酪酸の製造方法は、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベートすることによりγ−アミノ酪酸を生成させることを特徴としている。【００２０】
本明細書における「大麦」とは、大麦種子のことであり、麦芽も含まれる。大麦の粉砕物の原料としては、例えば、はるな二条、ＣＤＣ  Ａｌａｍｏ、ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒ、ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ、りょうふうの種子を挙げることができる。グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への高い変換率を実現するためには、ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒの種子が特に適している。【００２１】
「大麦の粉砕物」とは、大麦を、例えば、精麦機、ピンミル、ハンマーミル、ボールミル等の粉砕機で粉状にしたものをいい、大麦糠も含まれる。【００２２】
上記のγ−アミノ酪酸の製造方法は、グルタミン酸又はグルタミン酸塩を加えた大麦の粉砕物の水懸濁液中で、大麦由来のグルタミン酸脱炭酸酵素がグルタミン酸を脱炭酸することによってγ−アミノ酪酸を生成させるものである。【００２３】
本発明のγ−アミノ酪酸の製造方法の実施形態としては、大麦の粉砕物を水に懸濁した後にグルタミン酸又はグルタミン酸塩を加えて溶解して得られる液、又は、グルタミン酸又はグルタミン酸塩の水溶液に大麦の粉砕物を懸濁させて得られる液、を４〜７０℃の条件下で２時間以上インキュベートしてγ−アミノ酪酸を生成させる方法を例示できる。【００２４】
上記の液は、ｐＨを調製する必要がなく、そのままインキュベートすればよい。【００２５】
インキュベートは、上記の液を振盪又は撹拌しながら行うことが好ましく、振盪又は撹拌の程度は、大麦の粉砕物が沈殿することなく、懸濁状態が維持される程度が好ましい。【００２６】
大麦の粉砕物としては、大麦糠が好ましく、大麦を搗精度３０〜４０％で精麦して得られる大麦糠であることがより好ましい。【００２７】
ここで搗精度とは、精麦の程度を表す数値（％）のことをいい、「削り取られる大麦の表層部（糠部分）の重量」を「大麦の重量」で除して、１００を乗じた値である。したがって、「搗精度３０〜４０％で精麦して得られる大麦糠」とは、糠部分が３０〜４０％で、削られずに残った大麦の中心部分が６０〜７０％であることを意味している。なお、「精麦」とは、大麦の表層部（糠部分）を削り取る作業のことをいう。【００２８】
上記の液には、大麦糠が５０〜１５０ｍｇ／ｍＬ含まれることが好ましく、１００〜１５０ｍｇ／ｍＬ含まれることがより好ましく、１４０〜１５０ｍｇ／ｍＬ含まれることがさらに好ましい。また、グルタミン酸又はグルタミン酸塩は、上記の液に、２．５〜４０ｍＭ含まれることが好ましく、５〜２０ｍＭ含まれることがより好ましく、１０〜２０ｍＭ含まれることがさらに好ましい。【００２９】
上記のγ−アミノ酪酸の製造方法で製造されたγ−アミノ酪酸は、上記の液を濾過又は遠心分離することによって大麦の粉砕物を取り除き、当業者であれば公知の方法によって、上記の液からγ−アミノ酪酸を精製できる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３１】
１．大麦糠を利用したγ−アミノ酪酸の生成条件
１）大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を使用したγ−アミノ酪酸の生成
脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒの種子を、搗精度が４０％となるように精麦して大麦の外層部の粉砕物（大麦糠）を得た。また、脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒの種子をミルで完全に粉砕することによって、大麦全粒の粉砕物を得た。こうして得られた大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を原料として用い、以下の方法でγ−アミノ酪酸の無細胞系での生成を試みた。【００３２】
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら４０℃で２４時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を以下の方法で定量した。【００３３】
まず、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（ミリポア社）又はＭｉｃｒｏｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−１０（分子量１００００；ミリポア社）に各反応液の上清（２００μＬ）をアプライし、限外濾過を行った。得られた濾液は、蒸留水で適宜希釈し、ＡｃｃＱ  Ｔａｇ法（ウォーターズ社）で誘導体化を行った。具体的には、蒸留水で希釈した限外濾過液（２０μＬ）に、６０μＬのＡｃｃＱ  Ｆｌｕｏｒｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ及び２０μＬのＡｃｃＱ  Ｆｌｕｏｒ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒを加えて混合し、５０℃で１０分間静置することによって誘導体化した。その後、得られた誘導体化サンプルを、以下の条件下、ＨＰＬＣで分析し、Ｅｍｐｏｗｅｒパーソナルソフトウェアー（ウォーターズ社）で解析することによりγ−アミノ酪酸の量を定量した。
・ＨＰＬＣシステム：２６９５セパレーションモジュール（ウォーターズ社）
・カラム：ＡｃｃＱ  Ｔａｇカラム（３．９ｍｍ×１５０ｍｍ）（ウォーターズ社）
・カラム温度：３９℃
・検出器：２４７５マルチλ蛍光検出器（Ｅｘ．２５０ｎｍ、Ｅｍ．３９５ｎｍ、ｇａｉｎ  １０；ウォーターズ社）【００３４】
図１は、大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を使用した場合におけるγ−アミノ酪酸の生成量を比較したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。【００３５】
その結果、大麦全粒の粉砕物を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は約０．６ｍＭであったのに対し、大麦糠を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は約２．４ｍＭであった。【００３６】
以上の結果より、大麦の粉砕物と、グルタミン酸ナトリウムと、水とを含む反応液を振盪しながら４０℃で２４時間インキュベートすることにより、反応液中にγ−アミノ酪酸を生成できることが明らかとなり、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成量は、大麦全粒の粉砕物よりも大麦糠を使用した方が顕著に高いことが示唆された。【００３７】
２）反応温度の検討
搗精度４０％の大麦糠（オオムギ品種ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒ）を原料として、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０又は７０℃の各反応温度で、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。【００３８】
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに大麦糠を５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら各反応温度で２４時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。【００３９】
図２は、γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす反応温度の影響を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。【００４０】
その結果、反応温度が１０℃以下又は５０℃以上では、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は１．５ｍＭ以下であったが、反応温度が２０〜４０℃の間では、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は２．４〜３．０ｍＭであった。【００４１】
以上の結果より、大麦糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成するには、反応温度が２０〜４０℃であることが好ましく、２０℃付近であることが特に好ましいことが示唆された。【００４２】
３）反応液に添加する大麦糠の量の検討
反応液中での大麦糠の濃度が２５、５０、１００又は１５０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、搗精度４０％の大麦糠（オオムギ品種ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒ）を使用し、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。【００４３】
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに大麦糠を２５、５０、１００又は１５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら４０℃で２４時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。【００４４】
図３は、γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす添加した大麦糠の量の影響を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。【００４５】
その結果、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は、添加した大麦糠の量にほぼ比例して上昇し、反応液中での大麦糠の濃度が５０ｍｇ／ｍＬ以下の場合には２ｍＭ以下であったが、１００ｍｇ／ｍＬの場合には約６ｍＭ、１５０ｍｇ／ｍＬの場合には約９ｍＭであった。【００４６】
以上の結果より、大麦糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成するには、反応液中での大麦糠の濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１５０ｍｇ／ｍＬ以上であることがより好ましいことが示唆された。【００４７】
４）反応時間の検討
搗精度４０％の大麦糠（オオムギ品種ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒ）を原料とし、反応時間を変えて、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。【００４８】
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに大麦糠を１５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、２０℃で振盪しながら２、４、６、１２、１８、２４、３６又は４８時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。【００４９】
図４は、γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす反応時間の影響を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。【００５０】
その結果、反応開始後２時間目であっても、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は約８ｍＭにまで上昇し、６時間目の約１１ｍＭをピークに、４８時間目にかけて約７ｍＭまで低下することが判明した。【００５１】
以上の結果より、大麦糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成するには、反応時間を６〜１２時間とすることが好ましく、６時間とすることがより好ましいことが示唆された。【００５２】
５）大麦糠の搗精度の検討
脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒの種子を、搗精度が１０、２０、３０、４０又は５０％となるように精麦して得られた各大麦糠又は大麦全粒の粉砕物（搗精度０％）を原料として、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。【００５３】
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに搗精度の異なる各大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を１５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、２０℃で振盪しながら６時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。【００５４】
図５は、γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす大麦糠の搗精度の影響を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。なお、グラフ中の搗精度０％の値は、大麦全粒の粉砕物を使用した場合のγ−アミノ酪酸の生成量を示している。【００５５】
その結果、搗精度が１０、２０又は５０％の大麦糠又は大麦全粒の粉砕物（搗精度０％）を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は５．６〜８．７ｍＭであったが、搗精度が３０〜４０％の大麦糠を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は１１ｍＭ以上であった。【００５６】
以上の結果より、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成に使用する大麦糠の搗精度を３０〜４０％にすることにより、γ−アミノ酪酸の生成量を高められることが示唆された。【００５７】
２．大麦糠によるγ−アミノ酪酸の生成と、小麦糠、米糠又は乳酸菌によるγ−アミノ酪酸の生成との比較
大麦糠として、オオムギ品種ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒ又はＣＤＣ  Ａｌａｍｏ由来の大麦糠を用い、搗精度が４０％となるように精麦して各大麦糠を調製した。小麦糠として、コムギ品種１ＣＷ由来の小麦糠を用い、搗精度が４０％となるように精麦して小麦糠を調製した。米糠として、イネ品種秋田こまち又はコシヒカリ由来の米糠を用い、搗精度が４０％となるように精米して各米糠を調製した。こうして得られた各品種の大麦糠、小麦糠又は米糠を原料として、以下の方法で無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。【００５８】
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに各品種の大麦糠、小麦糠又は米糠を１５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら２０℃で６時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。【００５９】
図６は、各品種の大麦糠、小麦糠又は米糠を使用して無細胞系で生成されたγ−アミノ酪酸の生成量を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。【００６０】
その結果、大麦糠を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は８．９〜１１ｍＭとなり、小麦糠（３．９ｍＭ）又は米糠（０．８〜２．９ｍＭ）を使用した場合と比較して顕著にγ−アミノ酪酸が生成されることが明らかとなった。また、大麦糠の中では、オオムギ品種ＣＤＣ  Ｆｉｂａｒ由来の大麦糠がγ−アミノ酪酸の生成に適していることが明らかとなった。【００６１】
次に、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  Ｌ１３）をグルタミン酸の存在下で培養してγ−アミノ酪酸を生成させ、上記の大麦糠、小麦糠又は米糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成させた場合と、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率を比較した。ここで、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率とは、生成したγ−アミノ酪酸のモル数を反応開始時又は培養開始時に添加したグルタミン酸のモル数で除して、１００を乗じた値のことである。なお、乳酸菌を用いたγ−アミノ酪酸の製造については、上野らの文献（生物工学会誌、２００７年、８５巻、ｐ．１０９−１１４）に記載されているデータを引用した。【００６２】
図７は、大麦糠、小麦糠又は米糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成させた場合におけるグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率及び乳酸菌を培養してγ−アミノ酪酸を生成させた場合におけるグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率を示したグラフである。【００６３】
その結果、大麦糠を使用した場合のグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率は、８９〜１１０％であり、小麦糠（３９％）若しくは米糠（８〜２９％）を使用した場合又は乳酸菌（８１％）を培養した場合の変換率と比較して高い値を示した。さらに、大麦糠を使用してγ−アミノ酪酸を生成させた場合の変換率は、わずか６時間の反応時間で認められた値であるのに対し、乳酸菌を培養してγ−アミノ酪酸を生成させた場合の変換率は、２日間培養した場合の変換率であるため、大麦糠で認められた変換率は、乳酸菌を培養した場合の変換率と比較した場合であっても顕著に高い値であることが示唆された。【００６４】
以上の結果より、大麦糠、グルタミン酸及び水を含む反応液をインキュベートすることによってγ−アミノ酪酸を製造する方法は、小麦糠、米糠又は乳酸菌を利用したγ−アミノ酪酸の製造方法よりも、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が高く、γ−アミノ酪酸の生成量についても、小麦糠又は米糠と比較して顕著に高いことが明らかとなった。【００６５】
３．麦芽を使用したγ−アミノ酪酸の生成
麦芽として、オオムギ品種りょうふう（北海道産）の麦芽を用い、以下の方法で無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブにりょうふう麦芽の粉砕物を５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら２０℃で８時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸及びグルタミン酸の量を定量した。なお、りょうふう麦芽の粉砕物５０ｍｇに対してグルタミン酸ナトリウム溶液を加える代わりに、グルタミン酸ナトリウムを含まない蒸留水を加え、振盪しながら２０℃で８時間インキュベートしたものを対照として用いた。【００６６】
図８は、インキュベート後の反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の濃度は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。その結果、麦芽を使用した場合にも、上述の大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を使用した場合と同様、γ−アミノ酪酸が生成されることが明らかとなった。【００６７】
４．γ−アミノ酪酸生成工程を備える大麦シロップ製造方法
大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベーションすることによりγ−アミノ酪酸を生成させる工程を備える大麦シロップ製造方法を試みた。【００６８】
脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ及びりょうふうの種子をミルで完全に粉砕し、２種類の粉砕物を得た。ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ又はりょうふうの粉砕物を用い、次のようにして大麦シロップ製造用の原料液を調製した。すなわち、粉砕物１４０ｇを収容する容器に７００ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら２０℃で６時間インキュベートした（γ−アミノ酪酸生成工程）。【００６９】
得られた原料液に所定量の下記添加成分を加えた後、６０℃で２４時間にわたって振盪することで大麦シロップを調製した。
（添加成分）
α-アミラーゼ溶液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ）：５．６ｍＬ、
アミラーゼ溶液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ）：５．６ｍＬ、
プロテアーゼ溶液（濃度５０ｍｇ／ｍＬ）：２．８ｍＬ、
プルラナーゼ原液：１４０μＬ。【００７０】
一方、比較例として、脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ又はりょうふうの種子の粉砕物を用い、γ−アミノ酪酸生成工程を実施しなかったことの他は、上記方法と同様にして大麦シロップを調製した。すなわち、粉砕物１４０ｇを収容する容器に１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加える代わりに、蒸留水７００ｍＬを加え、その後、上記添加成分を配合した後、６０℃で２４時間にわたって振盪することで大麦シロップを調製した。【００７１】
上記のようにして得られた４種類の大麦シロップ（試料１−４）について各種分析を以下の方法で行った。表１に結果を示す。
（１）色度の測定
ＥＢＣ標準法（European  Brewery  Convention編、Analytica  EBC  (4th  Ed)、1987）に従って大麦シロップの色度を測定した。
（２）シロップ中全窒素の測定
ケルダール法によってシロップ中全窒素を測定した。
（３）エキス濃度の測定
ＥＢＣ標準法に従って大麦シロップのエキス濃度を測定した。なお、ここでいうエキスとは、大麦種子の抽出物を意味し、例えば大麦種子中の糖成分やタンパク質成分の抽出物等が挙げられる。
（４）最終発酵度の測定
ＥＢＣ標準法に従って大麦シロップの最終発酵度を測定した。
（５）β−グルカンの濃度の測定
大麦シロップを水で７．５倍希釈した後に０．４５μｍフィルターで濾過し、この濾過物について２０℃の測定室において高速液体クロマトグラフを用いてβ−グルカンの濃度を測定した。
（６）粘度の測定
ウベローデ型粘度計を用いて２０℃における大麦シロップの粘度を測定した。
（７）ｐＨの測定
ｐＨ計を用いて約２０℃における大麦シロップのｐＨを測定した。【００７２】
【表１】
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【００７３】
上記４種類の大麦シロップにホップ０．５ｇ／２５０ｍＬをそれぞれ添加し、１０５℃で９０分間煮沸した後、Ｂｒｉｘが１１．０％になるように加水することによって冷麦汁を得た。冷麦汁に含まれるγ−アミノ酪酸及びグルタミン酸を定量した。表１に結果を示す。【００７４】
図９は、冷麦汁のγ−アミノ酪酸濃度及びグルタミン酸濃度を示したグラフである。その結果、大麦の粉砕物に含まれる澱粉質を糖化する工程に先立ち、γ−アミノ酪酸生成工程を実施することで、大麦シロップの種々の品質を維持したまま、γ−アミノ酪酸濃度を高めることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、反応液のｐＨを調整したり、反応液にピリドキサルリン酸を添加したりすることなく、無細胞の系でγ−アミノ酪酸を効率よく製造でき、乳酸菌にγ−アミノ酪酸を生産させた場合よりも、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への高い変換率を実現できる。また本発明によれば、乳酸菌等の微生物の培養に必要な特別な機械及び設備を必要とせず、簡易かつ短時間でγ−アミノ酪酸を製造できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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