(57)【要約】１種より多い除草剤に対して耐性である改良した植物に関連する方法及び組成物を提供する。特に本発明はグリホセートに耐性であり、そして少なくとも１種のＡＬＳ阻害剤に耐性である植物、及びその使用方法を提供する。グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物はグリホセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、本発明の植物はＧＡＴポリペプチド及びＨＲＡポリペプチドを発現する。雑草を制御する方法、向上した植物収量、及び、増大した形質転換効率を提供する。
2009505654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
耕作区域における雑草を制御するための方法であって、
ａ）下記：
ｉ）植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、グリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、
ｉｉ）該植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を含む作物の種子又は苗木を区域に植栽する工程；
ｂ）任意の作物、作物の部分、雑草又はそれらの耕作区域に対し、第１の除草剤有効量及び第２の除草剤有効量を少なくとも含む除草剤の組合せを適用する工程であって、ここで該除草剤の組合せはグリホセートを含まず、そしてここで該第１及び該第２の除草剤の該有効量は該作物及び対照雑草により許容される、工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１の除草剤がＡＬＳ阻害剤を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第２の除草剤が第２のＡＬＳ阻害剤を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１のＡＬＳ阻害剤の有効量が約０．１〜約５０００ｇ  ａｉ／ヘクタールを含む請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記第１のＡＬＳ阻害剤の有効量が約０．５〜約３５０ｇ  ａｉ／ヘクタール又は約１〜約１５０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記第２のＡＬＳ阻害剤の有効量が約０．１〜約５０００ｇ  ａｉ／ヘクタール、約０．５〜約３５０ｇ  ａｉ／ヘクタール又は約１〜約１５０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含む請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記第１のポリヌクレオチドがグリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のポリヌクレオチドがグリホセート−耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ又はグリホセート−耐性グリホセートオキシドレダクターゼをコードする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドが突然変異したアセトラクテートシンターゼポリペプチドを含む請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記突然変異したアセトラクテートシンターゼポリペプチドがＨＲＡを含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記除草剤の組合せが、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート、イミダゾリノン及びスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンよりなる群から選択されるＡＬＳ阻害剤を含む請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＬＳ阻害剤が下記：
ａ）アジムスルフロン；
ｂ）クロリムロン−エチル；
ｃ）メトスルフロン−メチル；
ｄ）ニコスルフロン；
ｅ）リムスルフロン；
ｆ）スルホメツロン−メチル；
ｇ）チフェンスルフロン−メチル；
ｈ）トリベヌロン−メチル；
ｉ）アミドスルフロン；
ｊ）ベンスルフロン−メチル；
ｋ）クロルスルフロン；
ｌ）シノスルフロン；
ｍ）シクロスルファムロン；
ｎ）エタメトスルフロン−メチル；
ｏ）エトキシスルフロン；
ｐ）フラザスルフロン；
ｑ）フルピルスルフロン−メチル；
ｒ）ホラムスルフロン；
ｓ）イマゾスルフロン；
ｔ）ヨードスルフロン−メチル；
ｕ）メソスルフロン−メチル；
ｖ）オキサスルフロン；
ｗ）プリミスルフロン−メチル；
ｘ）プロスルフロン；
ｙ）ピラゾスルフロン−エチル；
ｚ）スルホスルフロン；
ａａ）トリアスルフロン；
ｂｂ）トリフロキシスルフロン；
ｃｃ）トリフルスルフロン−メチル；
ｄｄ）トリトスルフロン；
ｅｅ）ハロスルフロン−メチル；
ｆｆ）フルカルバゾン；
ｇｇ）プロカルバゾン；
ｈｈ）クロランスラン−メチル；
ｉｉ）フルメツラム；
ｊｊ）ジクロスラム；
ｋｋ）フロラスラム；
ｌｌ）イマザモックス；
ｍｍ）ビスピリバク；
ｎｎ）ピリフタリド；
ｏｏ）ピリベンゾキシム；
ｐｐ）ピリチオバク；
ｑｑ）ピリミノバク−メチル；
ｒｒ）イマザピル；
ｓｓ）イマゼタピル；
ｔｔ）イマザキン；
ｕｕ）イマザピク；
ｖｖ）イマザメタベンズ−メチル；
ｗｗ）イマザモックス；
ｘｘ）フルセトスルフロン；
ｙｙ）メトスラム；
ｚｚ）ペノクスラム；及び、
ａａａ）ピロクスラム；
よりなる群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記除草剤の組合せが少なくともトリアジン又はホスフィン酸を含む請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の除草剤及び前記第１の除草剤が異なる作用機序を有する請求項１、２、４又は７〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の除草剤及び前記第１の除草剤が同じ作用機序を有する請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記除草剤の組合せが、少なくとも第３の除草剤の有効量を含む請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の除草剤が、前記雑草又は前記作物へ、発芽前、発芽後、又は、発芽前及び後に適用され；そして、
前記第２の除草剤が、該雑草又は該作物へ、発芽前、発芽後、又は、発芽前もしくは後に適用される、請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１及び前記第２の除草剤が共に適用されるか、別個に適用される請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも前記第１及び前記第２の除草剤が均質な顆粒ブレンドを含む請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が更に、殺真菌剤、殺線虫剤、成長調節剤、毒性緩和剤、アジュバント、殺虫剤及びこれらの任意の組合せよりなる群から選択される農薬を適用する工程を更に含む、請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記農薬が、前記雑草又は前記作物へ発芽前、発芽後、又は、発芽前及び後に適用される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記農薬が、前記第１の除草剤、前記第２の除草剤、又は該第１及び該第２の除草剤と共に、又は別個に適用される、請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の除草剤がスルホニル尿素を含み、そして前記第２の除草剤がＡＬＳ阻害剤を含む、請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の除草剤がスルホニル尿素を含み、そして前記第２の除草剤がイミダゾリノンを含む、請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１又は前記第２の除草剤が毒性緩和作用を与える、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１又は前記第２のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、配列番号７２に示すエンハンサー配列の少なくとも１コピーに作動可能に連結している、請求項１〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記作物が双子葉植物である、請求項１〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記双子葉植物が大豆、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、観葉植物、果物、野菜、テンサイ又はシロイヌナズナである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記植物が単子葉植物である、請求項１〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記単子葉植物がトウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、モロコシ、サトウキビ、スイッチグラス又はライムギである請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記作物がトウモロコシであり、そして前記第１の除草剤がＶ７段階以降に適用される請求項１記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｂ）を工程（ａ）の前に少なくとも１回実施する請求項１記載の方法。
【請求項３３】
耕作区域における雑草を制御するための方法であって、
ａ）耕作区域における環境状態を評価する工程；
ｂ）第１の除草剤の有効量及び第２の除草剤の有効量を少なくとも含む除草剤の組合せの有効量を選択する工程であって、ここで該除草剤の組合せはグリホセートを含まず、かつ該第１及び該第２の除草剤の有効量は作物及び対照雑草により許容される、工程；ならびに、
ｃ）作物、作物の部分、種子又は該作物の耕作区域に該除草剤の組合せを適用する工程であって、ここで該作物は植物を含み、該植物は：
ｉ）該植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、グリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、
ｉｉ）該植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を有する、工程；
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記第１の除草剤がＡＬＳ阻害剤を含む請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の除草剤が第２のＡＬＳ阻害剤を含む請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記第１又は前記第２のＡＬＳ阻害剤の有効量が約０．１〜約５０００ｇ  ａｉ／ヘクタールを含む請求項３４又は３５記載の方法。
【請求項３７】
前記第１又は前記第２のＡＬＳ阻害剤の有効量が約１〜約１５０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含む請求項３４又は３５記載の方法。
【請求項３８】
前記第１又は前記第２のＡＬＳ阻害剤の有効量が約０．５〜約３５０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含む請求項３４又は３５記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のポリヌクレオチドがグリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする請求項３３〜３８の何れか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドが突然変異したアセトラクテートシンターゼポリペプチドを含む請求項３３〜３８の何れか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記突然変異したアセトラクテートシンターゼポリペプチドがＨＲＡを含む請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記除草剤の組合せが、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート、イミダゾリノン及びスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンよりなる群から選択されるＡＬＳ阻害剤を含む請求項３３〜４１の何れか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡＬＳ阻害剤が下記：
ａ）アジムスルフロン；
ｂ）クロリムロン−エチル；
ｃ）メトスルフロン−メチル；
ｄ）ニコスルフロン；
ｅ）リムスルフロン；
ｆ）スルホメツロン−メチル；
ｇ）チフェンスルフロン−メチル；
ｈ）トリベヌロン−メチル；
ｉ）アミドスルフロン；
ｊ）ベンスルフロン−メチル；
ｋ）クロルスルフロン；
ｌ）シノスルフロン；
ｍ）シクロスルファムロン；
ｎ）エタメトスルフロン−メチル；
ｏ）エトキシスルフロン；
ｐ）フラザスルフロン；
ｑ）フルピルスルフロン−メチル；
ｒ）ホラムスルフロン；
ｓ）イマゾスルフロン；
ｔ）ヨードスルフロン−メチル；
ｕ）メソスルフロン−メチル；
ｖ）オキサスルフロン；
ｗ）プリミスルフロン−メチル；
ｘ）プロスルフロン；
ｙ）ピラゾスルフロン−エチル；
ｚ）スルホスルフロン；
ａａ）トリアスルフロン；
ｂｂ）トリフロキシスルフロン；
ｃｃ）トリフルスルフロン−メチル；
ｄｄ）トリトスルフロン−メチル；
ｅｅ）ハロスルフロン−メチル；
ｆｆ）フルカルバゾン；
ｇｇ）プロカルバゾン；
ｈｈ）クロランスラン−メチル；
ｉｉ）フルメツラム；
ｊｊ）ジクロスラム；
ｋｋ）フロラスラム；
ｌｌ）イマザモックス；
ｍｍ）ビスピリバク；
ｎｎ）ピリフタリド；
ｏｏ）ピリベンゾキシム；
ｐｐ）ピリチオバク；
ｑｑ）ピリミノバク−メチル；
ｒｒ）イマザピル；
ｓｓ）イマゼタピル；
ｔｔ）イマザキン；
ｕｕ）イマザピク；
ｖｖ）イマザメタベンズ−メチル；
ｗｗ）イマザモックス；
ｘｘ）フルセトスルフロン；
ｙｙ）メトスラム；
ｚｚ）ペノクスラム；及び、
ａａａ）ピロクスラム；
よりなる群から選択される請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記第２の除草剤及び前記第１の除草剤が同じか又は異なる作用機序を有する請求項３３〜４３の何れか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の除草剤が、前記雑草又は前記作物へ発芽前、発芽後、又は、発芽前及び後に適用され；そして、
前記第２の除草剤が、該雑草又は該作物へ発芽前、発芽後、又は、発芽前及び後に適用される、請求項３３〜４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１及び前記第２の除草剤が共に適用されるか、別個に適用される請求項３３〜４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも前記第１及び前記第２の除草剤が均質な顆粒ブレンドを含む請求項３３〜４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が更に、殺真菌剤、殺線虫剤、成長調節剤、毒性緩和剤、アジュバント、殺虫剤又はこれらの任意の組合せよりなる群から選択される農薬を適用する工程を更に含む、請求項３３〜４７の何れか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１又は前記第２のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが配列番号７２に示すエンハンサー配列の少なくとも１コピーに作動可能に連結している、請求項３３〜４８の何れか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記作物が双子葉植物である、請求項３３〜４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記双子葉植物が大豆、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、観葉植物、果物、野菜、テンサイ又はシロイヌナズナである、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記植物が単子葉植物である、請求項３３〜３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記単子葉植物がトウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、モロコシ、サトウキビ、スイッチグラス、ライムギである請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
耕作区域における雑草を制御するための方法であって、
ａ）下記：
ｉ）植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、グリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、
ｉｉ）植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を含む作物の種子又は苗木を該区域に植栽する工程；
ｂ）該作物、作物の部分、雑草又はそれらの耕作区域に対し、第１及び第２のＡＬＳ阻害剤の有効量を少なくとも含む除草剤の組合せを適用する工程であって、ここで、
ｉ）該除草剤の組合せの有効量が雑草を制御し；
ｉｉ）該第１のＡＬＳ阻害剤の有効量は、該第１のＡＬＳ阻害剤に曝露されていない対照作物と比較した場合、単独で適用されたときに該作物により許容されず；そして、
ｉｉｉ）該第２のＡＬＳ阻害剤の有効量は毒性緩和作用をもたらすのに十分であり、ここで該毒性緩和作用は、該第１のＡＬＳ阻害剤を単独で適用した場合の該作物の耐性と比較して、該第１及び該第２のＡＬＳ阻害剤の適用時に作物の耐性の増大を提供する、工程；
を包含する、方法。
【請求項５５】
少なくとも前記第１又は前記第２のＡＬＳ阻害剤がスルホニル尿素を含む請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記第２のＡＬＳ阻害剤がスルホニル尿素を含み、そして前記第１のＡＬＳ阻害剤がイミダゾリノンを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
前記除草剤の組合せが更にグリホセートを含む請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
耕作区域における雑草を制御するための方法であって、
ａ）耕作区域における環境状態を評価する工程；
ｂ）少なくとも第１及び第２のＡＬＳ阻害剤の有効量を含む除草剤の組合せを選択する工程であって、ここで該組合せの有効量は雑草を制御し、そして該第１のＡＬＳ阻害剤の有効量は、該第１のＡＬＳ阻害剤を適用されていない対照作物と比較した場合、単独で適用されたときに該作物により許容されず、そして、該第２のＡＬＳ阻害剤の有効量は、毒性緩和作用をもたらすのに十分であり、ここで該毒性緩和作用は、該第１のＡＬＳ阻害剤を単独で適用した場合の該作物の耐性と比較して、該第１及び該第２のＡＬＳ阻害剤の適用時に、作物の耐性の増大を提供する、工程；ならびに、
ｃ）作物、作物の部分、種子又は該作物の耕作区域に該除草剤の組合せを適用する工程であって、ここで該作物は植物を含み、該植物は：
ｉ）該植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、グリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、
ｉｉ）該植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を有する、工程；
を包含する、方法。
【請求項５９】
少なくとも前記第１又は前記第２のＡＬＳ阻害剤がスルホニル尿素を含む請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記第２のＡＬＳ阻害剤がスルホニル尿素を含み、そして前記第１のＡＬＳ阻害剤がイミダゾリノンを含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
耕作区域における雑草を制御するための方法であって、
ａ）下記：
ｉ）植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、グリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、
ｉｉ）植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を含む作物の種子又は苗木を該区域に植栽する工程；
ｂ）任意の作物、作物の部分、雑草又はそれらの耕作区域に対し、下記：
ｉ）グリホセート、イマザピル、クロリムロン−エチル、キザロホップ及びホメサフェンを含む除草剤の組合せ、ここで該有効量は該作物及び対照雑草により許容される、除草剤の組合せ；
ｉｉ）グリホセート、イマザピル、クロリムロン−エチル、キザロホップ及びホメサフェンを含む除草剤の組合せ、ここで該有効量は該作物及び対照雑草により許容される、除草剤の組合せ；又は、
ｉｉｉ）グリホセート、クロリムロン−エチル及びチフェンスルフロン−メチルを含む除草剤の組合せ、ここで該有効量は該作物及び対照雑草により許容される、除草剤の組合せ；
よりなる群から選択される除草剤の組合せの有効量を適用する工程；
を包含する、方法。
【請求項６２】
前記作物が、大豆、トウモロコシ又はワタである請求項６１の方法。
【請求項６３】
部分（ｂ）（ｉ）の除草剤の組合せの有効量が、約１１１０〜約１１３０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含むグリホセートを含み；イマザピルの有効量が約７．５〜約２７．５ｇ  ａｉ／ヘクタールを含み；クロリムロン−エチルの有効量が約７．５〜約２７．５ｇ  ａｉ／ヘクタールを含み；キザロホップの有効量が約５０〜約７０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含み；そしてホメサフェンの有効量が約２４０〜約２６０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６４】
グリホセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は、コードするポリヌクレオチド及びＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするＡＬＳ阻害剤を含む植物であって、該ポリヌクレオチドは下記：
（ａ）植物における発現を駆動するプロモーター；及び、
（ｂ）配列番号１、７２、８５、８８又は８９に示すエンハンサー配列又は配列番号１、７２、８５、８８又は８９と少なくとも９０％の配列同一性を有するエンハンサー配列の少なくとも１コピー、ここで該エンハンサー配列は転写レベルをモジュレートするもの；
に作動可能に連結しており、
ここで、該植物は該エンハンサー配列に作動可能に連結している該ポリヌクレオチドを含まない対照植物の生育を阻害するのに有効なレベルで適用されるグリホセート又はＡＬＳ阻害剤に対して耐性である、植物。
【請求項６５】
グリホセートに対する耐性を与える前記ポリヌクレオチドがグリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードしている請求項６４記載の植物。
【請求項６６】
グリホセートに対する耐性を与える前記ポリヌクレオチドがグリホセート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ又はグリホセート耐性グリホセートオキシドレダクターゼをコードする請求項６４記載の植物。
【請求項６７】
前記ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドがＨＲＡを含む請求項６４記載のトランスジェニック植物。
【請求項６８】
前記ポリヌクレオチドが配列番号７２に示すエンハンサー配列の少なくとも３コピーに作動可能に連結している請求項６４〜６７の何れか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６９】
前記プロモーターがユビキチンプロモーターである請求項６４〜６７の何れか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７０】
前記エンハンサーが前記プロモーターに対して異種である請求項６４〜６８の何れか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７１】
前記プロモーターがトウモロコシユビキチンプロモーター又はシロイヌナズナユビキチンプロモーターである請求項６４〜７０の何れか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７２】
前記作物が双子葉植物である、請求項６４〜７１の何れか１項に記載の植物。
【請求項７３】
前記双子葉植物が大豆、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、観葉植物、果物、野菜、テンサイ又はシロイヌナズナである、請求項７２記載の植物。
【請求項７４】
前記植物が単子葉植物である、請求項６４〜７０の何れか１項に記載の植物。
【請求項７５】
前記単子葉植物がトウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、モロコシ、サトウキビ、スイッチグラス又はライムギである請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
グリホセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、又は、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで該ポリヌクレオチドは下記：
（ａ）植物における発現を駆動するプロモーター；及び、
（ｂ）配列番号１、７２、８５、８８又は８９に示すエンハンサー配列又は配列番号１、７２、８５、８８又は８９と少なくとも９０％の配列同一性を有するエンハンサー配列の少なくとも１コピー、ここで該エンハンサー配列は転写をモジュレートし、そして該エンハンサー配列は該プロモーターに対して異種であるもの；
に作動可能に連結しており、
ここで、該発現カセットはそれを含有する植物に対してグリホセート耐性又はＡＬＳ阻害剤耐性を付与するものであり、ここで該植物は、該発現カセットを含まない対照植物の生育を阻害するのに有効なレベルで適用されるグリホセート又は該ＡＬＳ阻害剤に対して耐性である、発現カセット。
【請求項７７】
グリホセートに対する耐性を与える前記ポリヌクレオチドがグリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードしている請求項７６記載の発現カセット。
【請求項７８】
グリホセートに対する耐性を与える前記ポリヌクレオチドがグリホセート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ又はグリホセート耐性グリホセートオキシドレダクターゼをコードする請求項７６記載の発現カセット。
【請求項７９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号７２に示すエンハンサー配列の少なくとも３コピーに作動可能に連結している請求項７６〜７８の何れか１項に記載の発現カセット。
【請求項８０】
前記プロモーターがユビキチンプロモーターである請求項７６〜７９の何れか１項に記載の発現カセット。
【請求項８１】
前記エンハンサーが前記プロモーターに対して異種である請求項７６〜７９の何れか１項に記載の発現カセット。
【請求項８２】
前記プロモーターがシロイヌナズナユビキチンプロモーター又はトウモロコシユビキチンプロモーターである請求項８１記載の発現カセット。
【請求項８３】
前記ポリペプチドが配列番号４５に示す配列を含む請求項７６〜８３の何れか１項に記載の発現カセット。
【請求項８４】
前記発現カセットがグリホセートに対する耐性を付与するポリヌクレオチド及びＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む請求項７６〜８３の何れか１項に記載の発現カセット。
【請求項８６】
前記ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドがＨＲＡを含む請求項７６又は８４に記載の発現カセット。
【請求項８７】
グリホセート耐性を付与する第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドで形質転換されているワタを選択する方法であって、該方法が、形質転換されたワタカルスをグリホセート及び／又はＡＬＳ阻害剤除草剤に曝露させながら、それを生育させる工程を含む、方法。
【請求項８８】
グリホセート耐性を付与する前記ポリペプチドがＧＡＴを含み、そして前記ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドがＨＲＡを含む、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
前記カルスをリットル当たり５０〜２００マイクログラムの濃度でクロルスルフロンを含有する培地に曝露しながら、該カルスを生育させる、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
前記カルスを４５０μＭまでの濃度でグリホセートを含有する培地に曝露しながら、該カルスを生育させる、請求項８８記載の方法。
【請求項９１】
耕作区域における雑草を制御するための方法であって、
ａ）下記：
ｉ）植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、グリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、
ｉｉ）植物において活性なプロモーターに作動可能に連結した、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を含む作物の種子又は苗木を圃場に植栽する工程；
ｂ）該作物、作物の部分、該作物の種子又はその耕作区域に対し除草剤有効量を適用する工程であって、ここで該有効量は該作物及び対照雑草により許容されるものであること、ここで該除草剤は、グリホセートでも、クロリムロン−エチルでも、リムスルフロンでも、トリベヌロン−メチルでも、チフェンスフロン−メチルでもない、工程；
を包含する、方法。
【請求項９２】
前記除草剤が下記：
（ｉ）スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン；
（ｉｉ）トリアゾロピリミジン；
（ｉｉｉ）ピリミジニル（チオ）ベンゾエート；
（ｉｖ）イミダゾリノン；
（ｖ）トリアジン；及び、
（ｖｉ）ホスフィン酸；
よりなる群から選択される請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
作物を含む圃場における雑草を制御するための方法であって、
ａ）下記：
ｉ）グリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、
ｉｉ）ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を含む作物の種子又は苗木を該圃場に植栽する工程；
ｂ）該圃場の任意の作物及び雑草に対し、ＡＬＳ阻害剤を含む第１の除草剤の有効量及び殺真菌剤、殺線虫剤、殺虫剤、毒性緩和剤又はアジュバントよりなる群から選択される少なくとも１つの追加的農薬の有効量を適用する工程；
を包含し、
ここで該ＡＬＳ阻害剤除草剤の該有効量は該作物により許容され；そして、
ここで組合せの有効量は該第１及び該第２のポリペプチドの両方を発現しない対照植物により許容されない、方法。
【請求項９４】
工程（ｂ）を工程（ａ）の前に少なくとも１回実施する請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
植物の形質転換効率を向上させるか、単コピー組み込み事象を増大させるか、又は、形質転換効果を増大させるための方法であって、
ａ）グリホセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むカセットを該植物に導入する工程であって、ここで、該ポリヌクレオチドは該植物において活性なプロモーターに作動可能に連結しており、かつ配列番号１、７２、８５、８８又は８９に示すエンハンサー配列又は配列番号１、７２、８５、８８又は８９と少なくとも９０％の配列同一性を有するエンハンサー配列の少なくとも１コピーに作動可能に連結しており、ここで該配列は転写をモジュレートする、工程；
ｂ）適切な除草剤の有効濃度に該植物を接触させる工程；及び、
ｃ）該ポリヌクレオチドを発現する植物を選択する工程；
を包含する、方法。
【請求項９６】
前記カセットが目的のポリヌクレオチドを更に含む請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
グリホセートに対する耐性を付与する前記ポリペプチドがＧＡＴポリペプチドを含むか、前記ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドがＨＲＡを含む、請求項９５又は９６記載の方法。
【請求項９８】
雑草を制御するための方法であって、
ａ）下記：
ｉ）グリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、
ｉｉ）ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を発現する作物の種子又は苗木を区域に植栽する工程；
ｂ）該作物、作物の部分、該作物の種子又は耕作下の区域に対し、除草剤の有効量を適用する工程であって、ここで該有効量は下記：
ｉ）第１の対照作物、作物の部分、種子又は耕作区域に適用した場合に該第１の対照作物により許容されない量、ここで該第１の対照作物はグリホセートに対する耐性を付与する該第１のポリヌクレオチドを発現し、そしてＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする該第２のポリヌクレオチドを発現しないもの；
ｉｉ）第２の作物、作物の部分、種子又は耕作区域に適用した場合に第２の対照作物により許容されない量、ここで該第２の対照作物は該第２のポリヌクレオチドを発現し、かつ該第１のポリヌクレオチドを発現しないもの；ならびに、
ｉｉｉ）工程（ｂ）の作物、作物の部分、種子又はその耕作区域に適用した場合に許容される量；
を含む、工程；
を包含する、方法。
【請求項９９】
耕作区域における雑草を制御するための方法であって、
ａ）耕作区域における環境状態を評価する工程；
ｂ）除草剤の有効量を選択する工程であって、ここで該除草剤の有効量は下記：
ｉ）第１の対照作物、作物の部分、種子又は耕作区域に適用した場合に該第１の対照作物により許容されない量、ここで該第１の対照作物はグリホセートに対する耐性を付与する第１のポリヌクレオチドを発現し、かつＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを発現しないもの；
ｉｉ）第２の作物、作物の部分、種子又は耕作区域に適用した場合に第２の対照作物により許容されない量、ここで該第２の対照作物は該第２のポリヌクレオチドを発現し、かつ該第１のポリヌクレオチドを発現しないもの；および、
ｉｉｉ）目的の作物、目的の作物の部分、目的の作物の種子又はその耕作区域に適用した場合に許容される量、ここで該目的の作物はグリホセートに対する耐性を付与できる該ポリペプチドをコードする該第１のヌクレオチド配列；及び該ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする該第２のヌクレオチド配列を発現するもの；
を含む、工程；
ｃ）目的の作物、目的の作物部分、雑草又はそれらの耕作区域に該除草剤の有効量を適用する工程；
を包含する、方法。
【請求項１００】
耕作区域における雑草を制御するための方法であって、該方法は：
ａ）作物種子又は作物苗木を該区域に植栽する工程であって、ここで該作物種子又は作物苗木は下記成分；
ｉ）該作物種子又は作物苗木において活性なプロモーターに作動可能に連結したグリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、
ｉｉ）該作物種子又は作物苗木において活性なプロモーターに作動可能に連結したＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド；
を含む、工程；
ｂ）任意の作物、作物の部分、雑草又は耕作区域又はこれ等の組み合わせに対し、相乗作用的有効量のグリホセート及び相乗作用的有効量のスルホニル尿素除草剤又はこれ等の農業上適する塩の少なくとも１つを含む除草剤組成物の有効量を適用する工程であって、ここで下記：
ｉ）該グリホセートの相乗作用的有効量は、該スルホニル尿素除草剤の非存在下で該雑草を制御するために必要なグリホセートの量より低値であること；
ｉｉ）該スルホニル尿素除草剤の相乗作用的有効量は、グリホセートの非存在下で該雑草を制御するために必要な該スルホニル尿素の量より低値であること；及び、
ｉｉｉ）これ等の組合せ；
のうちの少なくとも１つであり；そして、
ここで該除草剤組成物の有効量は、該作物種子又は作物苗木により許容され、そして該耕作区域の該雑草を制御する、工程；
を包含する、方法。
【請求項１０１】
前記第１のポリヌクレオチドがグリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドがＨＲＡを含む突然変異したアセトラクテートシンターゼポリペプチドを含む請求項１００又は１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記スルホニル尿素除草剤がメトスルフロン−メチル、クロロスルフロン及びトリアスルフロンよりなる群から選択される請求項１００、１０１又は１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記グリホセートを発芽前、発芽後、又は、発芽前及び後に前記雑草又は作物植物に適用し；そして、
前記スルホニル尿素除草剤を発芽前、発芽後、又は、発芽前及び後に該雑草又は作物植物に適用する、請求項１００、１０１、１０２又は１０３記載の方法。
【請求項１０５】
前記グリホセート及びスルホニル尿素除草剤を共に適用するか、別個に適用する請求項１００〜１０４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
工程（ｂ）を工程（ａ）の前に少なくとも１回実施する請求項１００記載の方法。
【請求項１０７】
前記除草剤組成物が硫酸アンモニウム系アジュバントを含む請求項１００〜１０６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記除草剤組成物がピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート除草剤の有効量を含む請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
前記ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート除草剤がビスピリバク又は農業上適するその塩を含む請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
前記作物植物が双子葉植物である請求項５４、５８、６１、９１、９３、９８又は１００記載の方法。
【請求項１１１】
前記双子葉植物が大豆、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、観葉植物、果物、野菜、テンサイ又はシロイヌナズナである、請求項１１０記載の方法。
【請求項１１２】
前記作物植物が単子葉植物である請求項５４、５８、６１、９１、９３、９８又は１００記載の方法。
【請求項１１３】
前記単子葉植物がトウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、モロコシ、サトウキビ、スイッチグラス又はライムギである請求項１１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は分子生物学の分野にある。より詳しくは、本発明は、グリホセートに対する耐性を付与する配列の発現を少なくとも１つの別の除草剤耐性遺伝子の発現と組み合わせることにより付与される多重除草剤耐性に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
商業的作物生産において、作物植物の圃場から望ましくない植物（即ち「雑草」）を容易かつ迅速に除去することが望ましい。理想的な処理は、圃場全体に適用できるが望ましくない植物のみを排除し作物植物は無害のままとするものである。１つのそのような処理システムにおいては、除草剤耐性作物植物の圃場上に除草剤を噴霧した場合に作物植物は繁茂し続けるが非除草剤耐性雑草は殺傷されるか重度の損害を受けるように除草剤に対して耐性である作物植物を使用する。理想的には、そのような処理システムは柔軟性と経済性の最良の可能な組合せを雑草制御がもたらすように除草剤の特性を変動させるという利点を有することになる。例えば、個々の除草剤は圃場において異なる寿命を有し、そして一部の除草剤は持続性を示し、そして圃場適用後比較的長期に渡って有効となるが、他の除草剤は急速に分解して他の物質及び／又は非活性化合物となる。理想的な処理システムは特定の状況に対して育成者が適宜除草剤を選択できるように種々の除草剤の使用を可能にするものである。
【０００３】
特定の除草剤に対する作物の耐性は、適切な除草剤代謝酵素及び／又は非感受性の除草剤標的をコードする遺伝子を操作して作物内に入れることにより付与することができる。一部の場合において、これ等の酵素、及びそれらをコードする核酸は植物を起源とする。他の場合においては、それらは微生物のような他の生物から誘導する。例えば共に非特許文献１に記載されているＰａｄｇｅｔｔｅら、（１９９６）Ｎｅｗ  ｗｅｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）ｇｅｎｅ及びＶａｓｉｌ（１９９６）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｒｏｐｓを参照できる。実際、トランスジェニック植物を操作することにより種々の生物から種々の除草剤耐性遺伝子、例えばラットチトクロームＰ４５０７Ａ１及び酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０オキシドレダクターゼのキメラ蛋白をコードする遺伝子を発現させている（非特許文献２）。除草剤に対する耐性を付与する他の遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、即ちネイティブの配列内の突然変異がそれを発現する植物に対して多種の除草剤に対する抵抗性を付与することがわかっており、そして、種々の植物に導入されているもの（例えば非特許文献３参照）；グルタチオン還元酵素及びスーパーオキシドジスムターゼ（非特許文献４）；及び種々のホスホトランスフェラーゼに関する遺伝子（非特許文献５）が包含される。
【０００４】
広範に研究されている除草剤の１つは一般的にはグリホセートと称されているＮ−ホスホノメチルグリシンである。グリホセートは酵素５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（「ＥＰＳＰシンターゼ」又は「ＥＰＳＰＳ」とも称されている）、即ち、芳香族アミノ酸、ホルモン及びビタミンの生産のための生合成経路の一部である酵素の阻害の為に、広葉及び芝型の植物の両方を殺傷する広範なスペクトルの除草剤である。修飾されたアグロバクテリウムＣＰ４ＥＰＳＰＳの導入により商業的に実行可能なレベルのグリホセート耐性を示すグリホセート耐性トランスジェニック植物が作製されている。この修飾された酵素は葉緑体にターゲティングされ、そこでは、グリホセートの存在下であっても、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びシキメート−３−ホスフェートからＥＰＳＰを合成し続ける。ＣＰ４グリホセート耐性大豆トランスジェニック植物は現在商業的に使用されている（例えばＭｏｎｓａｎｔｏから商品名「Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）」の下に販売されている）。
【０００５】
商業的作物生産のための有利な他の除草剤はグルホシネート（ホスフィノトリシン）及びアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）化学系、例えばスルホニル尿素を包含する。グルホシネートは葉緑体のグルタメートシンターゼ酵素に対して作用する広範なスペクトルの除草剤である。ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス由来のｂａｒ遺伝子を担持するグルホシネート耐性トランスジェニック植物が作製されている。ｂａｒ遺伝子によりコードされる酵素はＮ−アセチル化活性を有し、そしてグルホシネートを修飾して無毒化する。グルホシネート耐性植物は現在商業的に使用されている（例えばＢａｙｅｒから商品名「Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｌｉｎｋ（登録商標）」の下に販売されている）。スルホニル尿素除草剤はアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）をブロックすることにより高等植物の生育を阻害する。ＡＬＳにおいて特定の突然変異を含有している植物はスルホニル尿素を包含するＡＬＳ除草剤に対して耐性である。即ち、例えばスルホニル尿素除草剤、例えばシンクロニー（クロリムロン−エチル＋チフェンスルフロン−メチルの混合物）は大豆スルホニル尿素除草剤に対する大豆の生来の耐性を増強する形質を含有するＳＴＳ（登録商標）大豆（シンクロニー耐性大豆）種のようなＡＬＳ除草剤耐性植物と組み合わせて使用することができる。
【０００６】
多くの除草剤耐性作物植物が現在市販されているが、多くの市販除草剤及び除草剤／作物の組合せに関して生じる問題点の１つは、個々の除草剤が典型的には一般的雑草種に対して不完全な活性スペクトルを有している点である。しばらくの間使用されていた大部分の個々の除草剤について、除草剤耐性雑草種及びバイオタイプの集団は更に拡大している（例えば非特許文献６；非特許文献７参照）。１種より多い除草剤に対して耐性であるトランスジェニック植物が報告されている（例えば特許文献１参照）。しかしながら、作物生産、雑草制御の選択肢、残存雑草制御の期間の各特長における向上及び収穫量向上がなお必要とされている。
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２５１５号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｃｒｏｐｓ，ｅｄ．Ｄｕｋｅ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ）ｐｐ．５４−８４及びｐｐ．８５−９１
【非特許文献２】Ｓｈｉｏｔａら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９４）１０６：１７
【非特許文献３】Ｈａｔｔｏｒｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９５）２４６：４１９
【非特許文献４】Ａｏｎｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９５）３６：１６８７
【非特許文献５】Ｄａｔｔａら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２）２０：６１９
【非特許文献６】Ｔｒａｎｅｌ及びＷｒｉｇｈｔ、Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）５０：７００−７１２
【非特許文献７】Ｏｗｅｎ及びＺｅｌａｙａ、Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ．（２００５）６１：３０１−３１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特に、優勢な雑草種並びに好ましい作物種の局地的及び地域的な変動のために、特定の地域、地形及び／又は局地の必要性に合致することができる作物保護及び雑草管理の専用的なシステムの必要性が存続している。例えば、圃場における雑草制御の為に必要な除草剤の適用回数；圃場における雑草制御に必要な除草剤の量；作物を生産するために必要な耕作の量を低減することができる作物保護及び雑草管理の方法；及び／又は除草剤耐性雑草の発達及び／又は出現を遅延又は防止するプログラムの必要性が存続している。特定の除草剤の組合せのターゲティングされた使用を可能にする作物保護及び雑草管理の方法の必要性が存続している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
１種より多い除草剤又は除草剤のクラス又はサブクラスに対して耐性である改良した植物に関する方法及び組成物が提供される。組成物はグリホセート少なくとも１つの他の除草剤又は除草剤のクラス又はサブクラスに対して耐性である植物、並びにその使用方法を包含する。別の化合物はグリホセートへの耐性を付与することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物を含む。１つの非限定的な実施形態において、組成物はＧＡＴ（グリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現し、そして少なくとも１つの別の除草剤に対して耐性である植物を含む。一部の実施形態においては、本発明の植物はＧＡＴポリペプチド及びＨＲＡポリペプチドを発現する。
【０００９】
本発明の植物を使用する耕作区域における雑草を制御するための方法を提供する。更に又、形質転換の改良した方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は１種より多い除草剤又は除草剤のクラス又はサブクラスに対して耐性である植物を作製し、そして使用するための方法及び組成物を提供する。一部の実施形態においては、グリホセート及び少なくとも１つの他の除草剤（又は除草剤のクラス又はサブクラス）又は他の薬品（又は他の薬品のクラス又はサブクラス）の両方に対して耐性である植物を提供する。そのような植物は、例えば多数の除草剤による処理を行う作物植物の生育の方法において使用できる。即ち、本発明は除草剤又は除草剤の組合せ（例えば異なる活性様式を介して作用する除草剤の組合せ；即ち２、３、４種又はそれより多い除草活性様式を有する混合物の適用）又は少なくとも１つの除草剤と少なくとも１つの他の薬品、例えば殺真菌剤、殺虫剤、植物成長調節剤等との組合せによる処理に対して耐性である改良した植物を提供する。この態様において、本発明は雑草を選択的に制御する改良した作物植物生育方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の植物はグリホセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。以下詳細に考察する通り、そのような植物は本明細書においては「グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物」と称する。
【００１１】
本発明の植物は除草剤に対する改変された耐性を示し、そしてそのため、植物を顕著に損傷する比率における除草剤の適用を可能にし、そして更に、通常適用されるよりも低濃度であるがなお雑草を選択的に制御し続ける混合物の適用を可能にする。更にまた、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は除草剤ブレンド技術と組み合わせて使用することができるため、化学農薬の適用を生産者に対してより簡便、経済的及び効果的なものとする。グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性作物の場合は、ブレンド技術は、例えば、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性作物に関連して特定の問題を解決するために設計された専用の混合物の送達を可能にする乾燥顆粒形態において、ＡＬＳ除草剤の容易に製剤される作物保護生成物を提供する。本発明の植物により可能となる頑健なＡＬＳ耐性を付加することにより、ＡＬＳ除草剤の利用が更に可能となり、除草剤への作物応答が排除される。本明細書開示のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性作物と組み合わせた、これ等の独特な選択的除草剤を提供することがここで企画され、変化し続ける除草剤制御の要求に対応できるよう専用化することができた。この突破口により今回、増大した雑草スペクトル、特定された残存活性を与える能力、雑草の耐性に対抗するかこれを遅延させるための第２の活性様式（グリホセート、グルホシネート等を補完する）を包含する改良した雑草管理の為に専用化できるＡＬＳ阻害剤ブレンドを包含する多数の除草剤ブレンドが可能となり、同時に、発芽前又は発芽後の何れか又は両方用として設計できるものが新しく提供される。ブレンドは又、スペクトルホール（ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｈｏｌｅ）を埋めるための第３又は第４の作用機序を有する追加的除草剤のような通常の標記使用比率における他農薬を追加又はタンクミックス（ｔａｎｋ  ｍｉｘ）する能力、或いは更に、殺真菌剤、殺虫剤、植物成長調節剤等を包含することにより追加的適用に関連する経費を節約する能力を与える。以下に詳細に考察する通り、本発明の方法は特定の地区又は領域に対して専用化することができる。形質転換の改良した方法も提供される。
【００１２】
Ｉ．グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物
ａ．グリホセート耐性
グリホセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物を提供する。グリホセートへの耐性を付与する種々の配列を本発明の方法及び組成物において使用することができる。
【００１３】
１つの実施形態において、グリホセート耐性の機序はトランスフェラーゼ活性を有するポリヌクレオチドの発現により与えられる。本明細書においては、「トランスフェラーゼ」ポリペプチドはアセチルＣｏＡからアセチル基をグリホセートのＮに転移させるか、プロピニルＣｏＡのプロピニル基をグリホセートのＮに転移させるか、又は、グリホセートアナログ及び／又はグリホセート代謝産物、例えばアミノメチルホスホン酸のアセチル化を触媒する能力を有する。この活性を試験するための方法は、例えば、米国特許公開２００３／００８３４８０、米国特許公開２００４／００８２７７０及び２００４年４月２９日出願の米国特許出願１０／８３５，６１５、ＷＯ２００５／０１２５１５、ＷＯ２００２／３６７８２及びＷＯ２００３／０９２３６０に開示されている。１つの実施形態において、トランスフェラーゼポリペプチドはグリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ「ＧＡＴ」ポリペプチドを含む。
【００１４】
本明細書においては、ＧＡＴポリペプチド又は酵素はグリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性（「ＧＡＴ」活性）、即ちグリホセートのアセチル化を触媒する能力を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、グリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドはアセチルＣｏＡからアセチル基をグリホセートのＮに転移させることができる。更に又、一部のＧＡＴポリペプチドはプロピオニルＣｏＡのプロピオニル基をグリホセートのＮに転移させる。一部のＧＡＴポリペプチドは又グリホセートアナログ及び／又はグリホセート代謝産物、例えばアミノメチルホスホン酸のアセチル化を触媒することができる。ＧＡＴポリペプチドは例えばＧＡＴポリペプチドを相互に整列した場合の配列類似性の点における、それら相互間の構造的類似性を特徴としている。例示されるＧＡＴポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチドは当該分野で知られており、特に例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる２００１年１０月２９日出願の米国特許出願１０／００４，３５７、２００３年４月３０日出願の米国特許出願１０／４２７，６９２、及び、２００４年４月２９日出願の米国特許出願１０／８３５，６１５に開示されている。一部の実施形態においては、本発明の植物を作製する場合に使用されるＧＡＴポリペプチドは配列番号５、１４、１１、８、２１、２７、１７、２４、３０、３５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、３９、４２、４５又は５４に示すアミノ酸配列を含む。これらの配列の各々は２００４年４月２９日出願の米国特許出願１０／８３５，６１５にも開示されている。一部の実施形態においては、これ等のポリペプチドをコードする対応するＧＡＴポリヌクレオチドが使用され；これ等のポリヌクレオチド配列は配列３、１２、９、６、１９、１５、２５、２２、２８、３３、４、７、１０、１３、１６、１８、２０、２３、２６、２９、３２、３４、３６、３８、４１、４４、４３、５６、３１、３７、４０、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３又は６４に示される。これらの配列の各々は２００４年４月２９日出願の米国特許出願１０／８３５，６１５にも開示されている。本明細書において別途詳述する通り、ＧＡＴポリヌクレオチド及び他の知られた除草剤耐性ポリヌクレオチド及びそれらによりコードされるポリペプチドのフラグメント及び変異体の使用もまた本発明に包含される。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物はＧＡＴポリペプチド、即ち、アセチルＣｏＡからアセチル基をグリホセートのＮに転移するグリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する。即ち、グリホセートで処理されている本発明の植物はグリホセートの代謝産物であるＮ−アセチルグリホセート（「ＮＡＧ」）を含有する。即ち、本発明は又、ＮＡＧを含有する植物並びにＧＡＴ遺伝子を含有する（即ちＧＡＴポリペプチドを発現する）植物をグリホセートで処理することによるＮＡＧの製造方法を提供する。Ｎ−アセチルグリホセートの存在は、植物における活性なＧＡＴ遺伝子の存在に関する診断用マーカーとして機能することができ、そして、当該分野で知られた方法、例えば質量スペクトルにより、又は免疫試験により評価することができる。一般的に、グリホセートで処理されているＧＡＴ遺伝子含有植物におけるＮＡＧのレベルはＧＡＴ遺伝子の活性及び植物を処理するために用いたグリホセートの量に相関している。
【００１６】
本発明の植物は多数のＧＡＴポリヌクレオチド（即ち少なくとも１、２、３、４、５又は６以上）を含むことができる。多数のＧＡＴポリヌクレオチドを使用する場合、ＧＡＴポリヌクレオチドは異なる速度論的パラメーターを有するＧＡＴポリペプチドをコードしてよく、即ちより低値のＫｍを有するＧＡＴ変異体をより高値のｋｃａｔを有するものと組み合わせることができる。一部の実施形態においては、異なるポリヌクレオチドを葉緑体移行配列又は他のシグナル配列にカップリングすることにより異なる細胞コンパートメント、細胞内小器官におけるポリペプチドの発現又はポリペプチド１つ以上の分泌をもたらしてよい。
【００１７】
ＧＡＴポリヌクレオチドによりコードされるＧＡＴポリペプチドは以前に発見されている酵素と比較して向上した酵素活性を有してよい。酵素活性は従来の速度論的パラメーターであるｋｃａｔ、ＫＭ及びｋｃａｔ／ＫＭを用いて特性化することができる。ｋｃａｔは特に高基質濃度におけるアセチル化速度の尺度として考えることができ；ＫＭはＧＡＴ酵素のその基質（例えばアセチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ及びグリホセート）に対する親和性の尺度であり；そしてｋｃａｔ／ＫＭは基質親和性と触媒速度の両方を考慮した触媒効率の尺度である。ｋｃａｔ／Ｋｍは基質濃度が少なくとも部分的に律速となる状況において特に重要である。一般的に、より高値のｋｃａｔ又はｋｃａｔ／ＫＭを有するＧＡＴはより低値のｋｃａｔ又はｋｃａｔ／ＫＭを有する別のＧＡＴよりもより高効率の触媒である。より低値のＫＭを有するＧＡＴはより高値のＫＭを有する別のＧＡＴよりも高効率の触媒である。即ち、あるＧＡＴが別のＧＡＴよりも高効率であるかどうかを調べるために、２酵素の速度論的パラメーターを比較することができる。ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／ＫＭ及びＫＭの相対的重要性はＧＡＴが機能することが期待される程度、例えばグリホセートに関するＫＭと相対比較した場合の予測されるグリホセート有効濃度に応じて変動する。ＧＡＴ活性は又、限定しないが、安定性、阻害に対する感受性、又は他の分子による活性化等を包含する多くの機能的特徴の何れかの点において特徴づけることができる。
【００１８】
即ち、例えば、ＧＡＴポリペプチドは以前に発見された酵素よりもグリホセートに対して低値のＫＭ、例えば、１ｍＭ、０．９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．７ｍＭ、０．６ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ又以下を有してよい。ＧＡＴポリペプチドは以前に発見された酵素よりもグリホセートに対して高値のｋｃａｔ、例えば少なくとも５００ｍｉｎ−１、１０００ｍｉｎ−１、１１００ｍｉｎ−１、１２００ｍｉｎ−１、１２５０ｍｉｎ−１、１３００ｍｉｎ−１、１４００ｍｉｎ−１、１５００ｍｉｎ−１、１６００ｍｉｎ−１、１７００ｍｉｎ−１、１８００ｍｉｎ−１、１９００ｍｉｎ−１又は２０００ｍｉｎ−１以上のｋｃａｔを有してよい。本発明において使用するためのＧＡＴポリペプチドは以前に発見された酵素よりもグリホセートに対して高値のｋｃａｔ／ＫＭ、例えば少なくとも１０００ｍＭ−１ｍｉｎ−１、２０００ｍＭ−１ｍｉｎ−１、３０００ｍＭ−１ｍｉｎ−１、４０００ｍＭ−１ｍｉｎ−１、５０００ｍＭ−１ｍｉｎ−１、６０００ｍＭ−１ｍｉｎ−１、７０００ｍＭ−１ｍｉｎ−１又は８０００ｍＭ−１ｍｉｎ−１以上のｋｃａｔ／ＫＭを有してよい。ＧＡＴ酵素の活性は例えばｐＨ及び塩濃度により影響され；適切な試験方法及び条件は当業者の知る通りである（例えばＷＯ２００５０１２５１５参照）。このような改良した酵素は、酵素活性（即ちｋｃａｔ、ＫＭ又はｋｃａｔ／ＫＭ）が低値である場合に特定の除草剤又は除草剤の組合せ及び／又は他の農薬の使用が植物への損傷をもたらす圃場において作物を生育させる方法において特に使用してよい。
【００１９】
グリホセート耐性植物は又、全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，２４８，８７６；５，６２７，０６１；５，８０４，４２５；５，６３３，４３５；５，１４５，７８３；４，９７１，９０８；５，３１２，９１０；５，１８８，６４２；４，９４０，８３５；５，８６６，７７５；６，２２５，１１４；６，１３０，３６６；５，３１０，６６７；４，５３５，０６０；４，７６９，０６１；５，６３３，４４８；５，５１０，４７１；Ｒｅ．３６，４４９；ＲＥ３７，２８７Ｅ；及び５，４９１，２８８；及び国際出願ＷＯ９７／０４１０３；ＷＯ００／６６７４６；ＷＯ０１／６６７０４；及びＷＯ００／６６７４７により詳述されている通り、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の高値のレベルをもたらす能力を増大させるように植物を修飾することにより作製することもできる。グリホセート耐性は又全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，７７６，７６０及び５，４６３，１７５により詳述される通り、グリホセートオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を発現する植物に付与することもできる。更に又、グリホセート耐性植物はグリホセートに対する耐性を付与する天然に存在する突然変異の選択を介して発生させることもできる。
【００２０】
本発明の方法及び組成物は優れたグリホセート耐性を有する植物及び植物外植片を作製するための当該分野で知られたグリホセートに対する耐性を付与する配列（即ち同じか又は異なる様式を介して作用する配列）の何れかの組合せを使用することができる。
【００２１】
ｂ．アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤耐性
グリホセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そして更にＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物を提供する。本明細書においては、「ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチド」とは、植物において発現された場合に少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤に対して耐性を付与する何れかのポリペプチドを含む。種々のＡＬＳ阻害剤が知られており、例えばスルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート及び／又はスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤が包含される。その他のＡＬＳ阻害剤も知られており、本明細書において別途開示する。当該分野で知られる通り、ＡＬＳ突然変異は、スルホニル尿素、イミラゾリノン、トリアゾロピリミジン及びピリジミニル（チオ）ベンゾエートに対する耐性に関して異なるクラスに分類され、以下の特徴、即ち（１）これ等の群４種全てに対する広範な耐性；（２）イミダゾリノン及びピリミジニル（チオ）ベンゾエートに対する耐性；（３）スルホニル尿素及びトリアゾロピリミジンに対する耐性；及び（４）スルホニル尿素及びイミダゾリノンに対する耐性を有する突然変異が包含される。
【００２２】
種々のＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドを使用できる。一部の実施形態においては、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリヌクレオチドはＡＬＳポリペプチドにおいて１アミノ酸変化をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド突然変異を含有する。特定の実施形態においては、変化はアセトラクテートシンターゼの７つの実質的に保存された領域の１つにおいて起こる。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＨａｔｔｏｒｉら、（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ及びＧｅｎｏｍｅｓ  ２４６：４１９−４２５；Ｌｅｅら、（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：１２４１−１２４８；Ｍａｚｕｒら、（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．４０：４４１−４７０；及び米国特許５，６０５，０１１を参照できる。ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドは、例えばＡＬＳのＳｕＲＡ又はＳｕＲＢ遺伝子座によってコードできる。特定の実施形態においては、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドはＣ３ＡＬＳ突然変異体、ＨＲＡＡＬＳ突然変異体、Ｓ４突然変異体又はＳ４／ＨＲＡ突然変異体又はこれらの任意の組合せを含む。ＡＬＳにおける異なる突然変異は異なる除草剤及び除草剤のグループ（及び／又はサブグループ）に対する耐性を付与することが解っており；例えばＴｒａｎｅｌ及びＷｒｉｇｈｔ（２００２）Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５０：７００−７１２を参照できる。更に又、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，６０５，０１１、５，３７８，８２４、５，１４１，８７０及び５，０１３，６５９も参照できる。更に又、大豆ＨＲＡ配列を含む配列番号６５；トウモロコシＨＲＡ配列を含む配列番号６６；シロイヌナズナＨＲＡ配列を含む配列番号６７；及びワタにおいて使用されるＨＲＡ配列を含む配列番号８６も参照できる。ＡＬＳにおけるＨＲＡ突然変異は本発明の１つの実施形態において特に使用される。突然変異は野生型蛋白と比較して少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤の化学的特徴に対して耐性であるアセトラクテートシンターゼポリペプチドの生産をもたらす。例えば、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドを発現する植物は、該当対照植物に対して損傷をもたらす除草剤の用量よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２５、１５０、２００、５００又は１０００倍高値のスルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート及び／又はスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤の用量に耐性となる場合がある。一部の実施形態においては、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドは多くの突然変異を含む。更に又、ＡＬＳ阻害剤ポリペプチドを有する植物はグリホセートに対して耐性を付与する天然に存在する突然変異の選択を介して発生させることができる。
【００２３】
一部の実施形態においては、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドはスルホニル尿素及びイミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与する。スルホニル尿素及びイミダゾリノン除草剤はアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）としても知られているアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）をブロックすることにより、高等植物の生育を阻害する。例えば、ＡＬＳにおける特定の突然変異（例えばＳ４及び／又はＨＲＡ突然変異）を含有する植物はスルホニル尿素除草剤に対して耐性である。スルホニル尿素耐性植物及びイミダゾリノン耐性植物の作製は全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，６０５，０１１；５，０１３，６５９；５，１４１，８７０；５，７６７，３６１；５，７３１，１８０；５，３０４，７３２；４，７６１，３７３；５，３３１，１０７；５，９２８，９３７；及び５，３７８，８２４；及び国際出願ＷＯ９６／３３２７０により詳述されている。特定の実施形態においては、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドはスルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼ（スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼとしても知られている）又はイミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼ（イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼとしても知られている）を含む。
【００２４】
グリホセートに対する耐性を付与する配列少なくとも１つ及びＡＬＳ阻害剤に対する耐性を付与する配列少なくとも１つを含む本発明の植物は本明細書においては、「グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物」と称する。ＧＡＴポリペプチド少なくとも１つ及びＨＲＡポリペプチド少なくとも１つを含有する本発明の植物は本明細書においては、「ＧＡＴ−ＨＲＡ植物」と称する。
【００２５】
ｃ．別の除草剤耐性
一部の実施形態においては、グリホセート及び少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤除草剤に対する増強された耐性、並びに、少なくとも１つの追加的除草剤に対する耐性を有する植物を提供する。特定の実施形態においては、追加的除草剤に対する耐性は追加的除草剤に対する耐性を付与するポリペプチド少なくとも１つの発現によるものである。一部の実施形態においては、本発明の組成物（例えば植物）は、本発明の植物が少なくとも２、３、４、５、６又は７種以上の異なる型の除草剤に対して耐性となり得るように、少なくとも１種の除草剤に対する耐性を付与する２、３、４、５、６、７種以上の形質を含んでよい。即ち、２種より多い除草剤に対して耐性である本発明の植物は、異なる活性様式及び／又は異なる活性部位を有する除草剤に対して耐性であってよい。一部の実施形態においてはこれらの形質の全てがトランスジェニックな形質であり、他の実施形態においてはこれ等の形質の少なくとも１つがトランスジェニックではない。
【００２６】
これ等の実施形態の一部において、各除草剤耐性遺伝子は異なる除草剤又は除草剤のクラス又はサブクラスに対する耐性を付与する。これ等の実施形態の一部においては、少なくとも２種の除草剤耐性遺伝子が、同じ除草剤に対するか、又は、除草剤の同じクラス又はサブクラスのメンバーに対する耐性を付与する。従って、発現されれば追加的除草剤に対する耐性を付与することができる少なくとも１つの追加的除草剤耐性ポリヌクレオチドを更に含む、グリホセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する植物が更に提供される。そのような追加的除草剤は限定しないが、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤、例えばキザロホップ−Ｐ−エチル、合成オーキシン、例えばキンクロラック、プロトポルフィリノーゲン（ＰＰＯ）阻害剤除草剤（例えばスルフェントラゾン）、色素合成阻害剤除草剤、例えばヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ阻害剤（例えばメソトリオン又はスルコトリオン）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ又はフィトエンデサチュラーゼ阻害剤、例えばジフルフェニカン又は色素合成阻害剤を包含する。本発明は本発明の目的（即ちグリホセートへの、そして少なくともＡＬＳ阻害剤に対する除草剤耐性）が達成される限り、除草剤の作用機序には制約されないものと理解しなければならない。対象となる追加的除草剤は本明細書において別途記載する。
【００２７】
一部の実施形態においては、本発明の組成物は更に、酵素グルタミンシンターゼを阻害する除草剤、例えばホスフィノトリシン又はグルホシネートに対する耐性を付与するポリペプチドを含む。グルタミンシンターゼ（ＧＳ）は大部分の植物細胞の発達及び生存の為に必要な必須の酵素であると考えられ、そしてＧＳの阻害剤は植物細胞に対して毒性である。グルホシネート除草剤は植物におけるＧＳの阻害による毒性作用に基づいて開発されている。これ等の除草剤は非選択性であり；即ちそれらは存在する植物の異なる種の全ての生育を阻害する。外因性ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼを含有する植物の開発は全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，９６９，２１３；５，４８９，５２０；５，５５０，３１８；５，８７４，２６５；５，９１９，６７５；５，５６１，２３６；５，６４８，４７７；５，６４６，０２４；６，１７７，６１６；及び５，８７９，９０３に記載されている。この活性を有する突然変異したホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼもまた開示されている。
【００２８】
更に別の実施形態において、本発明の組成物はプロトックス（ｐｒｏｔｏｘ）（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）を阻害する除草剤に対する耐性を付与するポリペプチドを含む。プロトックスは全ての植物の生存の為に必要であるクロロフィルの生産の為に必要である。プロトックス酵素は種々の除草剤化合物の標的として機能する。これ等の除草剤は又存在する植物の異なる種の全ての生育を阻害する。これ等の除草剤に対して耐性である改変されたプロトックス活性を含有する植物の開発は、全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，２８８，３０６；６，２８２，８３７；及び５，７６７，３７３；及び国際出願ＷＯ０１／１２８２５に記載されている。
【００２９】
更に別の実施形態において、本発明の組成物は除草剤耐性の別の様式が関与するポリペプチドを含んでよい。例えば、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼはパラヒドロキシフェニルピルベート（ＨＰＰ）をホモゲンチセートに変換する反応を触媒する酵素である。この酵素を阻害し、そして、ＨＰＰからホモゲンチセートへの変換を抑制するために酵素に結合する分子は除草剤として有用である。特定の除草剤に対してより耐性である植物は全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，２４５，９６８；６，２６８，５４９；及び６，０６９，１５５；及び国際出願ＷＯ９９／２３８８６に記載されている。この活性を有する突然変異ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼもまた開示する。
【００３０】
ｄ．除草剤耐性を付与する配列のフラグメント及び変異体
内容に応じて、「フラグメント」という用語はポリヌクレオチドの一部分又はそれによりコードされるアミノ酸配列、即ち蛋白の一部分を指す。ポリヌクレオチドのフラグメントは元の蛋白の生物学的活性を保持しており、そのため除草剤に対する耐性を付与する蛋白フラグメントをコードしてよい。即ち、ヌクレオチド配列のフラグメントは少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、及び完全長までの除草剤耐性ポリペプチドコードポリヌクレオチドの範囲であってよい。
【００３１】
除草剤耐性ポリペプチドの生物学的活性部分をコードする除草剤耐性ポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも完全長除草剤耐性ポリペプチド中の少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０，２００又は２５０個の隣接するアミノ酸、又は存在するアミノ酸の総数までをコードすることになる。除草剤耐性ポリペプチドの生物学的に活性な部分は除草剤耐性ポリヌクレオチドの一部分を単離すること、除草剤耐性ポリペプチドのコードされた部分を発現させること（例えばインビトロの組み換え発現による）及び除草剤耐性ポリペプチドのコードされた部分の活性を試験することにより、作製することができる。除草剤耐性ポリヌクレオチドのフラグメントであるポリヌクレオチドは完全長除草剤耐性ポリヌクレオチド中の少なくとも１６、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００又は１，４００個の隣接するヌクレオチド、又は存在するヌクレオチドの総数までをコードすることになる。
【００３２】
「変異体」という用語は実質的に同様の配列を指す。ポリヌクレオチドに関しては、変異体は５’及び／又は３’末端における欠失（即ちトランケーション）；ネイティブのポリヌクレオチドの内部の部位１つ以上におけるヌクレオチド１つ以上の欠失及び／又は付加；及び／又は、ネイティブのポリヌクレオチドの部位１つ以上におけるヌクレオチド１つ以上の置換を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書においては、「ネイティブの」ポリヌクレオチドアポリペプチドはそれぞれ天然に存在するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドの場合は、保存的変異体は遺伝子コードの縮重のために、除草剤耐性ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列を包含する。このような天然に存在する対立遺伝子変異体はよく知られた分子生物学的手法の使用により、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はハイブリダイゼーション手法により、発見することができる。変異体ポリヌクレオチドは又、例えば部位指向性突然変異誘発又は「シャフリング」を用いることにより発生されたもののような合成誘導されたポリヌクレオチドを包含する。一般的に、特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書に別途記載する配列アライメントプログラム及びパラメーターにより測定した場合に特定のポリヌクレオチドに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する。
【００３３】
特定のポリヌクレオチド（即ちレファレンスポリヌクレオチド）の変異体は又、変異体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとレファレンスポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性の比較により評価することもできる。何れかの２つのポリペプチドの間のパーセント配列同一性は本明細書に別途記載する配列アライメントプログラム及びパラメーターを用いて計算できる。本発明のポリヌクレオチドの何れかの所定の対をそれらがコードする２つのポリペプチドにより共有されるパーセント配列同一性の比較により評価する場合、２つのコードされたポリペプチドの間のパーセント配列同一性は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性である。
【００３４】
「変異体」蛋白は蛋白のＮ末端及び／又はＣ末端におけるアミノ酸１つ以上の欠失（所謂トランケーション）；蛋白の内部の部位１つ以上におけるアミノ酸１つ以上の欠失及び／又は付加；及び／又は蛋白の部位１つ以上におけるアミノ酸１つ以上の置換によりネイティブ及び／又はもとの蛋白から誘導された蛋白を意味する。本発明により包含される変異体蛋白は生物学的に活性であり、即ち、それらは本明細書に記載する通り所望の除草剤耐性活性を保有し続けている。本発明の除草剤耐性ポリヌクレオチドの生物学的に活性な変異体は本明細書に別途記載する配列アライメントプログラム及びパラメーターを用いて測定した場合ネイティブの蛋白のアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有することになる。除草剤耐性ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチドから、僅か１〜１５アミノ酸残基、僅か１〜１０、例えば６〜１０、僅か５、僅か４、３、２又は更には１アミノ酸残基のみ異なっていてよい。変異体除草剤耐性ポリペプチド並びにそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドは当業者の知る通りである。
【００３５】
除草剤耐性ポリペプチドはアミノ酸の置換、欠失、トランケーション及び挿入を包含する種々の状態において改変してよい。そのような操作のための方法は一般的に当該分野で知られている。例えば、除草剤耐性ポリペプチドンのアミノ酸配列変異体及びフラグメントはコードするポリヌクレオチドにおける突然変異により製造できる。突然変異誘発及びポリヌクレオチドの改変のための方法は当該分野で良く知られている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許４，８７３，１９２；Ｗａｌｋｅｒ及びＧａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びそこで引用されている参考文献を参照できる。目的の蛋白の生物学的に活性に影響しないアミノ酸置換に関する指針は参考として本明細書に援用されるＤａｙｈｏｆｆら、（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ及びＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに記載されている。保存的置換、例えばあるアミノ酸を同様の性質を有する別のものと交換してよい。当業者の知る通り、除草剤耐性ポリペプチドの活性は慣用的なスクリーニング試験により評価できる。即ち、例えば実施例１に説明する通り、又は、インビトロ試験、例えばＧＡＴポリペプチドによるグリホセートからのＮ−アセチルグリホスフェートの生成を用いながら、トランスジェニック植物が除草剤への増大した耐性を有するかどうかを調べることにより、活性を評価できる（例えばＷＯ０２／３６７８２参照）。
【００３６】
変異体ポリヌクレオチド及びポリペプチドは又、ＤＮＡシャフリングのような突然変異誘発及び組み換え誘発の操作法から誘導された配列及び蛋白を包含する。そのような操作法を用いれば、１つ以上の異なる除草剤耐性ポリペプチドコード配列を操作して所望の特性を保有する新しい除草剤耐性ポリペプチドを作製することができる。このような態様において、かなりの配列同一性を有し、そしてインビトロ又はインビボで相同組み換えすることができる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から組み換えポリヌクレオチドのライブラリを作製する。例えば、この方法を用いながら、目的のドメインをコードする配列モチーフを除草剤耐性ポリペプチドと他の知られた遺伝子との間でシャッフルすることにより、向上した目的特性、例えば酵素の場合は増大したＫｍを有する蛋白をコードしている新しい遺伝子を得てよい。このようなＤＮＡシャフリングに関する方策は当該分野で知られている。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅら、（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；及び米国特許５，６０５，７９３及び５，８３７，４５８を参照できる。
【００３７】
２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の配列の関係を説明するために以下の用語、即ち（ａ）「レファレンス配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」及び（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」を使用する。
【００３８】
（ａ）本明細書においては、「レファレンス配列」とは、配列比較のための根拠として使用される定義された配列である。レファレンス配列は特定の配列のサブセット又は全体；例えば完全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメント、又は、完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列であってよい。
【００３９】
（ｂ）本明細書においては、「比較ウィンドウ」はポリヌクレオチド配列の隣接した特定のセグメントを参照するものであり、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列は、レファレンス配列（付加又は欠失（即ちギャップ）を含まない）と比較して、２ポリヌクレオチドの最適アライメントに関して、付加又は欠失を含んでよい。一般的に、比較ウィンドウは少なくとも２０個の隣接ヌクレオチド長であり、そして場合により３０、４０、５０、１００以上であることができる。当業者の知る通り、ポリヌクレオチド配列におけるギャップの取り込みによるレファレンス配列との高い類似性を回避するためには、ギャップペナルティーを典型的には導入し、マッチ数から差し引く。
【００４０】
比較のための配列のアライメントの方法は当該分野で良く知られている。即ち、何れかの２配列の間のパーセント配列同一性の測定は数学的アルゴリズムを使用しながら達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例はＭｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら、（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的アライメントアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の全般的アライメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８のサーチフォーローカルのアライメント方法；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７に記載の通り変更されたＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。
【００４１】
これ等の数学的アルゴリズムのコンピューター実行は、配列同一性を調べるための配列の比較の為に利用できる。そのような実行は、限定しないがＰＣ／遺伝子プログラム（入手元Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）におけるＣＬＵＳＴＡＬ；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ１０（入手元Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）におけるＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）及びＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを包含する。これ等のプログラムを使用したアライメントはデフォルトパラメーターを用いながら実施できる。ＣＬＵＳＴＡＬ  プログラムはＨｉｇｇｉｎｓら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔら、（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇら、（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ８：１５５−６５；及びＰｅａｒｓｏｎら、（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１に詳細に説明されている。ＡＬＩＧＮ  プログラムは上出Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（１９８８）のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する場合にＡＬＩＧＮプログラムではＰＡＭ１２０のウエイト残存表、ギャップ長ペナルティー１２及びギャップペナルティー４を使用できる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは上出のＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）アルゴリズムに基づいている。ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施することにより本発明の蛋白をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴ蛋白検索を実施することにより本発明の蛋白又はポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップ付アライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載の通りＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中）を利用することができる。或いは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中）を使用することにより分子間の隔たった関係を検出する反復検索を実施することができる。上出Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）参照。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用する場合は、それぞれのプログラム（例えばヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、蛋白についてはＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメーターを使用できる。ＢＬＡＳＴソフトウエアはＮＣＢＩウエブサイトにおいて公的に入手できる。アライメントは又、手作業の検査により行ってもよい。
【００４２】
特段の記載が無い限り、本明細書に記載する配列の同一性／類似性はＧＡＰＶｅｒｓｉｏｎ１０を用いながら、以下のパラメーター、即ち、ＧＡＰ  Ｗｅｉｇｔ５０及びＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ３及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用いたヌクレオチド配列に関する％同一性及び％類似性；ＧＡＰ  Ｗｅｉｇｔ８及びＬｅｎｇｔｈＷｅｉｇｈｔ２及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いたアミノ酸配列に関する％同一性及び％類似性；又はその何れかの同等のプログラムを用いて得られた値を指す。「同等のプログラム」とは、問題の何れかの２配列に関して、ＧＡＰＶｅｒｓｉｏｎ１０により発生した対応するアライメント比較した場合に同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のマッチ及び同一のパーセント配列同一性を有するアライメントを発生させる何れかの配列比較プログラムを意図している。
【００４３】
ＧＡＰはマッチ数を最大とし、ギャップ数を最小とする２つの完全な配列のアライメントを発見するために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３のアルゴリズムを使用している。ＧＡＰは全ての可能なアライメント及びギャップ位置を考慮し、そして、最大数のマッチ塩基及び最小ギャップとなるアライメントを発生させる。これによりマッチ塩基の単位におけるギャップクリエーションペナルティー及びギャップエクステンションペナルティーの条件が得られる。ＧＡＰはそれが挿入する各ギャップについてマッチのギャップクリエーションペナルティー数を獲得しなければならない。０より大きいギャップエクステンションペナルティーを選択した場合、ＧＡＰは更に挿入された各ギャップにつき、ギャップ長×ギャップエクステンションペナルティーを獲得しなければならない。蛋白配列に関するＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＶｅｒｓｉｏｎ  １０におけるデフォルトギャップクリエーションペナルティー値及びギャップエクステンションペナルティー値はそれぞれ８及び２である。ヌクレオチド配列に関しては、デフォルトギャップクリエーションペナルティーは５０であるが、デフォルトギャップエクステンションペナルティーは３である。ギャップクリエーション及びギャップエクステンションのペナルティーは０〜２００よりなる整数の群から選択された整数として表示できる。即ち、例えば、ギャップクリエーション及びギャップエクステンションのペナルティーは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５以上であることができる。
【００４４】
ＧＡＰは最良のアライメントのファミリーの１つのメンバーを与える。このファミリーには多くのメンバーが存在してよいが、他のメンバーの何れもより良好な品質を有さない。ＧＡＰはアライメントに関するメリットの４つの数字、即ち、Ｑｕａｌｉｔｙ、Ｒａｔｉｏ、Ｉｄｅｎｔｉｔｙ及びＳｉｍｉｌａｒｉｔｙを表示する。Ｑｕａｌｉｔｙは配列を整列するために最大化される基準値である。ＲａｔｉｏはＱｕａｌｉｔｙをより短いセグメント中の塩基の数で割ったものである。Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙは実際にマッチする文字のパーセントである。Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙは同様である文字のパーセントである。ギャップの向かいにある文字は無視される。文字の対のスコアリングマトリックス値がＳｉｍｉｌａｒｉｔｙ閾値の０．５０より大きいかこれと等しい場合にはＳｉｍｉｌａｒｉｔｙがスコアリングされる。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＶｅｒｓｉｏｎ  １０において使用されるスコアリングマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【００４５】
（ｃ）本明細書においては、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列に関する「配列同一性」又は「同一性」とは、特定の比較ウィンドウに渡って最大の一致となるように整列した場合に同様となる２配列内の残基を参照する。蛋白を参照しながら配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一でない残基の位置は、アミノ酸残基が同様の化学的特性（例えば電荷又は疎水性）を有する別のアミノ酸残基に置換されており、そしてそのため分子の機能的特性を変化させない保存的アミノ酸置換により異なる場合が多い。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は置換の保存的性質について補正するために上方修正してよい。そのような保存的置換により異なる配列は「配列類似性」又は「類似性」を有すると言ってよい。この修正を行うための手段は当該分野で良く知られている。典型的には、ここでは、完全ではなくむしろ部分的なミスマッチとして保存的置換をスコアリングすることにより、パーセンテージ配列同一性を増大させる。即ち、例えば同一アミノ酸がスコア１を与えられ、そして非保存的置換がスコア０を与えられる場合、保存的置換は０と１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア環は例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行される通り計算される。
【００４６】
（ｄ）本明細書においては、「配列同一性のパーセンテージ」とは比較ウィンドウに渡って最適に整列された配列２つを比較することにより求められる値を意味し、この場合比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２配列の最適アライメントについてレファレンス配列（付加及び欠失（即ちギャップ）を有さない）と比較した場合に付加又は欠失を含んでいてよい。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じている位置の数を求めることによりマッチ位置の数を得ること、比較のウィンドウ内の位置の総数でマッチ位置数を割ること、及び、その結果を１００で割ることにより配列同一性のパーセンテージを得ること、により計算する。
【００４７】
「ポリヌクレオチド」という用語の使用はＤＮＡを含むポリヌクレオチドに限定する意図はない。当該分野で知られる通り、ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せを含むことができる。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは天然に存在する分子及び合成アナログの両方を包含する。即ち、ポリヌクレオチドはまた全ての形態の配列、例えば限定しないが、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステムループ構造等を包含する。
【００４８】
ｅ．除草剤耐性
「除草剤」とは、植物に一次的又は永久的な傷害をもたらす化学物質である。本発明の種々の方法及び組成物において使用できる除草剤の非限定的な例は本明細書において別途詳述する。除草剤は植物内に取り込ませてよく、或いは、植物又はその細胞に取り込ませることなく植物上で作用してよい。「活性成分」とは、その植物毒性の主因となり、そして製品ラベル上の活性成分として識別される除草剤製剤中の化学物質である。製品ラベル情報は米国環境保護局から入手でき、そしてｏａｓｐｕｂ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｐｅｓｔｌａｂｌ／ｐｐｌｓ．ｏｗｎのＵＲＬにおいてオンラインで更新されており；製品ラベル情報は又ｗｗｗ．ｃｄｍｓ．ｎｅｔのＵＲＬにおいてもオンラインで入手できる。「酸換算量」は除草活性を有する親の酸としての比率又は量を表示する。例えば２，４−Ｄ酸が製剤された製品中の活性成分としてナトリウム又はアミンの塩又はエステルの形態で製剤される場合が多い。広範に使用されているエステル製剤のガロン当たりの活性酸換算量は３．８ｌｂａ．ｅ．／ガロン（約０．４５４ｋｇａ．ｅ．／Ｌ）であるのに対し、ガロン当たりの活性成分は６．０ｌｂａｉ／ガロン（約０．７１７ｋｇ  ａｉ／Ｌ）である。本明細書においては、「農薬」とは農業の範囲において使用される何れかの化学物質である。
【００４９】
「除草剤耐性の」又は「耐性の」又は「作物耐性」とは、除草剤又は本明細書で使用する他の化学処理剤の範囲においては、特定の除草剤又は除草剤のクラス又はサブクラス又は他の化学物質又は他の化学物質のクラス又はサブクラスで処理された植物又は他の生物が該当する対照植物と比較した場合にその処理の後に有意な損傷を示さないか、低減された損傷を示すことを意味する。植物は特定の除草剤又は化学物質に対して天然に耐性であってよく、又は、植物は例えば育種又は遺伝子操作のような人的介入の結果として除草剤耐性であってよい。「除草剤耐性ポリペプチド」とはそれを発現する植物又は他の生物に対して除草剤耐性を付与する（即ち植物又は他の生物を除草剤耐性とする）ポリペプチドであり、そして「除草剤耐性ポリヌクレオチド」は除草剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば、スルホニル尿素耐性ポリペプチドはそれを発現する植物又は他の生物に対してスルホニル尿素除草剤に対する耐性を付与するものであり、イミダゾリノン耐性ポリペプチドはそれを発現する植物又は他の生物に対してイミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与するものであり；そして、グリホセート耐性ポリペプチドはそれを発現する植物又は他の生物に対してグリホセートに対する耐性を付与するものである。
【００５０】
即ち、植物は、除草剤又は他の化学物質に対して、該当対照植物と比較した場合に、それが対照植物により示される損傷よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又は１０００％低値である損傷を示す場合に耐性となる。この態様において、除草剤又は他の化学物質に対して耐性である植物は該当対照植物と比較して「向上した耐性」を示す。除草剤又は他の化学物質の処理に起因する損傷は当業者により適当と考えられる植物の生育又は健康状態の何れかのパラメーターを評価することにより試験される。損傷は個々の植物又は植物群の目視による検査により、及び／又は、適当なパラメーターの統計学的分析により、試験することができる。即ち、損傷は例えば植物の草丈、植物の重量、葉の色、葉の長さ、開花、肥沃度、穂形成、収穫量、種子生産等のようなパラメーターを評価することにより試験してよい。損傷はまた、発達の特定の段階（例えば穂形成、開花又は花粉飛散）までの経過時間、又は、特定の化学物質及び／又は除草剤による処理から植物が回復するまでの経過時間を評価することにより試験してもよい。
【００５１】
そのような試験を行う場合、統計学的分析又は定量的比較を行ってよいように損傷の特定の程度に特定の数値を割り付けてよい。損傷の特定の程度を説明する値の範囲の使用は当該分野で知られており、何れかの適当な範囲又は尺度を使用してよい。例えば、除草剤傷害スコア（耐性スコアとも称される）を表７に記載する尺度を使用しながら実施例１に説明するとおり割り付けることができる。この尺度において、９の格付けは除草剤処理が作物に対して作用を有さないこと、即ち、除草剤処理の後に作物の減少又は傷害が観察されなかったことを示す。即ち、この尺度において、９の格付けは作物が除草剤による損傷を示さなかったこと、従って作物が除草剤に対して耐性であることを示す。上記した通り、除草剤耐性はまた、該当対照植物が尺度上で低値のスコアを示す場合、又は、該当対照植物の群が対象植物の群よりも除草剤処理への応答において統計学的に低値のスコアを示す場合には本尺度における別の格付けにより示される。
【００５２】
除草剤又は他の化学物質により生じる損傷は植物が除草剤により処理された後の種々の時点において試験できる。頻繁には、損傷は対照植物が最大損傷を示す概ねの時期において試験する。場合により、損傷は、除草剤又は他の化学物質により処理されていない対照植物が、処理を行った時点の大きさ又は段階と比較して測定可能に生育及び／又は発達するまでの時間経過の後に試験する。損傷は被験植物が除草剤により処理された後、種々の時点において、例えば１２時間又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、又は３週間、４週間又はそれより長時間において試験できる。如何なる試験の時期も、それが被験及び対照植物の処理への応答における相違の検出を可能とする限り、適当である。
【００５３】
除草剤は、それが植物に対する作用を有さない場合、又は、植物が後に回復できる程度の作用をそれが有する場合、又は、それが有害ではあるが例えば雑草に対する特定の除草剤の影響により相殺される作用を有する場合は、植物を「有意に損傷」させない。即ち、例えば、作物植物は、該当対照植物（例えば未処理の作物植物）と比較して植物の健康状態及び／又は生産性の指標となる少なくとも１つの適当なパラメーターにおいて５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の低下を示す場合に、除草剤又は他の処理により「有意に損傷」されない。植物の健康状態及び／又は生産性の指標となる適当なパラメーターは、例えば、植物の草丈、植物の重量、葉の長さ、特定の発達段階までの経過時間、開花、収穫量、種子生産等を包含する。パラメーターの評価は目視による検査により、及び／又は何れかの適当なパラメーターに統計学的分析により行うことができる。比較は目視による検査によるか、及び／又は統計学的分析により行ってよい。従って、作物植物は、それが少なくとも１つのパラメーターにおいて低下を示すが、その低下は一次的な性質のものであり、そして植物は１週間、２週間、３週間、４週間又は６週間以内に完全に回復する場合は、除草剤又は他の処理により「有意に損傷」されない。
【００５４】
逆に、該当対照植物（例えば未処理の同種雑草）と比較して植物の健康状態及び／又は生産性を示す少なくとも１つの適当なパラメーターにおいて５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１５０％、１７０％超の低下を示す場合、植物は除草剤又は他の処理により有意に損傷を受けている。即ち、植物は、少なくとも１つのパラメーターにおいて低下を示し、そして植物が１週間、２週間、３週間、４週間又は６週間以内に完全に回復しない場合は、有意に損傷されている。
【００５５】
除草剤又は他の化学物質の処理に起因する植物の損傷は当業者による目視による検査により試験することができ、そして適当なパラメーターの統計学的分析により評価できる。評価される植物は「被験植物」と称する。典型的には、該当対照植物は除草剤耐性について評価される植物（即ち「被験植物」）と同じ除草剤耐性ポリペプチドを発現するが、除草剤により処理されていないものである。例えば、グリホセート及びＡＬＳ阻害剤に対する耐性を付与する本発明の除草剤耐性植物の評価においては、該当対照植物はこれ等の配列を発現するが除草剤により処理されない植物となる。一部の状況においては、対照植物は、評価される植物（即ち「被験植物」）と同じ除草剤処理に付されているが、被験植物において目的の除草剤に対する耐性を与えるように意図される酵素を発現しないものである。当業者は該当被験植物、対照植物及び処理の選択を包含する目的植物の除草剤耐性を試験するための適当なコントロールされた実験を設計し、実施し、そして評価することができる。
【００５６】
即ち、本明細書においては、「被験植物又は植物細胞」とは目的の遺伝子少なくとも１つに関して遺伝子的改変が行われているものであるか、又は、そのように改変された植物又は細胞から後継されており、そして改変を含んでいる植物又は植物細胞である。遺伝子的改変は育種により、又は形質転換により植物内に導入してよい。「遺伝子的改変」は遺伝子的改変を含有しない植物の表現型とは異なる表現型を植物に付与する遺伝子又はその突然変異を意味するものとする。
【００５７】
「対照」又は「対照植物」又は「対照植物細胞」は対象植物又は植物細胞の表現型における変化を測定するための基準点（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｉｎｔ）を与えるものであり、そして何れかの適当な植物又は植物細胞であってよい。対照植物又は植物細胞は例えば（ａ）野生型の植物又は細胞、即ち、対象植物又は細胞をもたらす遺伝子的改変のための出発物質としての同じ遺伝子型のもの；（ｂ）出発物質と同じ遺伝子型であるがヌルコンストラクト（ｎｕｌｌ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（即ちマーカー遺伝子を含むコンストラクトのような目的の形質に対して知られた作用を有さないコンストラクト）で形質転換されている植物又は植物細胞；（ｃ）対象植物又は植物細胞の子孫内の非形質転換分離株である植物又は植物細胞；（ｄ）対象植物又は植物細胞と遺伝子的に同一であるが、対象植物又は植物細胞と同じ処理（例えば除草剤処理）に曝露されない植物又は植物細胞；（ｅ）目的遺伝子が発現されない条件下における対象植物又は植物細胞自身；又は（ｆ）例えば除草剤又は除草剤及び／又は他の化学物質の組合せのような特定の処理に自身が曝露されていない条件下における対象植物又は植物細胞自身、を含んでよい。一部の例においては、該当対照植物又は対照植物細胞は、対象植物又は植物細胞とは異なる遺伝子型を有してよいが、対象植物又は細胞をもたらす遺伝子的改変のための出発物質の除草剤感受性特性を共有してよい（例えばＧｒｅｅｎ（１９９８）Ｗｅｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：４７４−４７７；Ｇｒｅｅｎ及びＵｌｒｉｃｈ（１９９３）Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４１：５０８−５１６参照）。一部の例においては該当対照トウモロコシ植物はＮＫ６０３事象（Ｎｉｅｌｓｏｎら、（２００４）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ及びＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１９：４２１−４２７及びＲｉｄｌｅｙら、（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ及びＦｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０：７２３５−７２４３）、エリート堅質茎部近親育種植物（ｅｌｉｔｅ  ｓｔｉｆｆ  ｓｔａｌｋ  ｉｎｂｒｅｄ  ｐｌａｎｔ）、Ｐ３１６２植物（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｉ−Ｂｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、３９Ｔ６６植物（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｉ−Ｂｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）又は３４Ｍ９１植物（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｉ−Ｂｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含む。一部の場合において、適切な対照大豆植物は「Ｊａｃｋ」大豆植物である（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｅｅｄ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。
【００５８】
本発明の植物はグリホセートに対する耐性を付与するポリペプチド及びＡＬＳ阻害剤に対する耐性を付与する他のポリペプチド少なくとも１つを発現する。本発明の植物は該当対照植物と相対比較して少なくとも１つの向上した特性、例えば向上した除草剤耐性、低減した倒伏性、増大した草丈、短縮した成熟までの期間、及び、向上した収穫量を示す。植物は該当対照植物との統計学的有意差を示す場合に向上した特性を有するものであり、その場合、その差は対照植物を超えた向上点を示す方向にある。例えば、植物は、それが対照植物と比較して統計学的に有意である収穫量の増大を示すか、及び／又は、それが除草剤処理に起因する損傷の低減を示す場合に、向上した特性を有する。そのような試験のための手法は当該分野で知られている。何れかの適当な統計学的分析、例えばＡＮＯＶＡ（市販パッケージをＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，１００  ＳＡＳ  Ｃａｍｐｕｓ  Ｄｒｉｖｅ，Ｇａｒｙ，ＮＣから入手可能）を使用してよい。
【００５９】
ｆ．植物
本明細書においては、「植物」という用語は、植物細胞、植物のプロトプラスト、植物を再生できる原料となりえる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物集塊物、外植片、及び、植物又は植物の部分、例えば胚、花粉、卵、種子、葉、花、枝、果実、仁、耳弁、穂軸、殻、茎、根、根端、葯等の内部において未損傷である植物細胞を包含する。殻粒は種を生育又は再生産する以外の目的のために商業的生産者により生産された成熟種子を意味する。再生植物の子孫、変異体及び突然変異体もまた、それらの部分が導入されたポリヌクレオチドを含んでいれば、本発明の範囲に包含される。即ち、本発明は本発明の植物により生産されたトランスジェニック種子を提供する。
【００６０】
本発明は何れかの植物種、例えば限定しないが単子葉植物及び双子葉植物の形質転換の為に使用してよい。目的の植物種の例は、限定しないがコーン（Ｚｅａ  ｍａｙｓ，本明細書においては「トウモロコシ」とも称する），アブラナ種（例えばＢ．ｎａｐｕｓ，Ｂ．ｒａｐａ，Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種子油原料として有用なアブラナ種（「キャノーラ」とも称する）、亜麻（ｌｉｎｕｍ  ｓｐｐ．）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ，Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、雑穀類（例えばトウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、サフラワー（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、カンショ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカデミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉホルｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、エンバク、オオムギ、野菜類、果物、観葉植物（花卉）、サトウキビ、針葉樹、シロイヌナズナを包含する。
【００６１】
野菜類はトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えばＬａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、サヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウマメ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｓｐｐ．）及びＣｕｃｕｍｉｓ属のメンバー  例えばキュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）及びマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）を包含する。観葉植物はアザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、ラッパスイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）及びキクを包含する。
【００６２】
何れの樹木も使用することができる。本発明を実施する場合に使用してよい針葉樹は例えばマツ類、例えばテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄｄ）、スラッシュマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）及びモントレーマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）；ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；ベイツガ（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）；アカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；モミ類、例えばシルバーモミ（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ）及びバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ）；及びヒマラヤスギ例えばベイスギ（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ）及びアラスカイエローシーダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）を包含する。硬材の樹木もまた使用でき、例えばトネリコ、アスペン、ブナ、シナノキ、カバノキ、ブラックチェリー、クルミ、トチノキ、アメリカクリ、ハクヨウ、ミズキ、ニレ、エノキ、ヒッコリー、モチノキ、ハリエンジュ、モクレン、カエデ、オーク、ポプラ、レッドアルダー、アメリカハナズオウ、ロイヤルキリ、サッサフラス、スイートガム、スズカケノキ、ヌマミズキ、ヤナギ。イエローポプラを包含する。
【００６３】
特定の実施形態においては、本発明の植物は作物植物（例えばコーン（「トウモロコシ」とも称する）、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、ダイズ、ワタ、サフラワー、ピーナツ、モロコシ、コムギ、アワ、タバコ等）である。
【００６４】
他の目的植物は目的の種子、種油植物及びマメ植物を与える殻粒植物である。目的の種子は殻粒種子、例えばコーン、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、ライムギ等を包含する。種油植物はワタ、ダイズ、サフラワー、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナツ等を包含する。マメ植物はインゲンマメ及びエンドウマメを包含する。インゲンマメはグア、ローカストビーン、コロハ、ダイズ、四季マメ（ｇａｒｄｅｎ  ｂｅａｎｓ）、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、ヒラマメ、ヒヨコマメ等を包含する。
【００６５】
他の目的植物はＰｏａ，Ａｇｒｏｓｔｉｓ，Ｆｅｓｔｕｃａ，Ｌｏｌｉｕｍ及びＺｏｙｓｉａ属由来のシバクサ類、例えばイチゴツナギを包含する。別のシバクサ類はＰａｎｉｃｏｉｄｅａｅのサブファミリーに由来する。シバクサ類は更に、限定しないがブルーグランマ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ（Ｈ．Ｂ．Ｋ．）Ｌａｇ．Ｅｘ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）；バッファローグラス（Ｂｕｃｈｌｏｅ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｓ（Ｎｕｔｔ．）Ｅｎｇｅｌｍ．）；スプレンダークリーピングレッドフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  ｓｓｐ．Ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）；レッドフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ）；コロニアルベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｎｕｉｓ  Ｓｉｂｔｈ．）；クリーピングベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｈｕｄｓ．）；フェアウェイホイートグラス（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｃｒｉｓｔａｔｕｍ（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ．）；ハードフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ  Ｔｈｕｉｌｌ．）；ケンタッキーブルーグラス（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  Ｌ．）；ペレニアルライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ  Ｌ．）；ラフブルーグラス（Ｐｏａ  ｔｒｉｖｉａｌｉｓ  Ｌ．）；サイドオーツグラマ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ  Ｍｉｃｈｘ．Ｔｏｒｒ．）；スムースブロメグラス（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ  Ｌｅｙｓｓ．）；トールフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ  Ｓｃｈｒｅｂ．）；アニュアルブルーグラス（Ｐｏａ  ａｎｎｕａ  Ｌ．）；アニュアルライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌａｍ．）；レッドトップ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ  Ｌ．）；ニホンシバ（Ｚｏｙｓｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）；バミューダグラス（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ；Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｓｐｐ．Ｌ．Ｃ．Ｒｉｃｈ；Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｔｒａｎｓｖａａｌｅｎｓｉｓ）；シーショアパスパラム（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｖａｇｉｎａｔｕｍ  Ｓｗａｒｔｚ）；ゾイシアグラス（Ｚｏｙｓｉａ  ｓｐｐ．Ｗｉｌｌｄ；Ｚｏｙｓｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ及びＺ．ｍａｔｒｅｌｌａ  ｖａｒ．ｍａｔｒｅｌｌａ）；バヒアグラス（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ  Ｆｌｕｇｇｅ）；カーペットグラス（Ａｘｏｎｏｐｕｓ  ａｆｆｉｎｉｓ  Ｃｈａｓｅ）；センチピードグラス（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ  ｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅｓ  Ｍｕｎｒｏ  Ｈａｃｋ．）；キクユグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｃｌａｎｄｅｓｉｎｕｍ  Ｈｏｃｈｓｔ  Ｅｘ  Ｃｈｉｏｖ）；ブラウントップベント（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｎｕｉｓ、別名Ａ，ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ）；ベルベットベント（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｎｉｎａ）；多年生ライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）；及びセントオーガスチングラス（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ  ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ  Ｗａｌｔ．Ｋｕｎｔｚｅ）を包含する。別の目的のイネ科植物類はスイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）を包含する。
【００６６】
ｇ．形質のスタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）及び追加的な目的形質
一部の実施形態においては、本発明の植物においてグリホセート耐性及びＡＬＳ阻害剤耐性を付与するポリヌクレオチドは分子スタック（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔａｃｋ）内に入るように操作することができる。別の実施形態においては、分子スタックは更に第３の除草剤に対する耐性を付与する追加的ポリヌクレオチド少なくとも１つを含む。そのような配列は本明細書において別途記載する。１つの実施形態において、配列はグリホシネートに対する耐性を付与し、そして特定の実施形態においては、配列はｐａｔを含む。
【００６７】
他の実施形態において、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は目的の形質１つ以上を含み、そして、更に特定の実施形態において、植物は、形質の所望の組合せを有する植物を作製するために目的ポリヌクレオチド配列の何れかの組合せとスタックされる。形質とは、本明細書においては、特定の配列又は配列群から誘導された表現型をさす。例えば、除草剤耐性ポリヌクレオチドは農薬及び／又は殺虫活性を有するポリペプチド、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒性蛋白（米国特許５，３６６，８９２；５，７４７，４５０；５，７３７，５１４；５，７２３，７５６；５，５９３，８８１；Ｇｅｉｓｅｒら、（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９；Ｌｅｅら、（２００３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：４６４８−４６５７（Ｖｉｐ３Ａ）；Ｇａｌｉｔｚｋｙら、（２００１）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５７：１１０１−１１０９（Ｃｒｙ３Ｂｂ１）及びＨｅｒｍａｎら、（２００４）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５２：２７２６−２７３４（Ｃｒｙ１Ｆ）記載）、レクチン（Ｖａｎｄａｍｍｅら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８２５，ｐｅｎｔｉｎ（米国特許５，９８１，７２２記載）などをコードする何れかの他のポリヌクレオチドとスタックしてよい。発生する組合せはまた、目的ポリヌクレオチドの何れか１つの複数のコピーを包含することができる。
【００６８】
一部の実施形態においては、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ちＧＡＴ及びＨＲＡを含む植物）の除草剤耐性ポリヌクレオチドを他の除草剤耐性形質とスタックすることにより、更に向上した特性を有する本発明のトランスジェニック植物を作製してよい。そのような実施形態において使用できる他の除草剤耐性ポリヌクレオチドは、作用の別の様式によりグリホセートへ、又は、ＡＬＳ阻害剤への耐性を付与するもの、例えば米国特許５，７７６，７６０及び５，４６３，１７５により詳細に記載されているグリホセートオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を包含する。グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物の除草剤耐性ポリヌクレオチド（即ち例えばＧＡＴ及びＨＲＡ配列）と組み合わせることができる他の形質は、例えば米国特許６，２４８，８７６  Ｂｌ；５，６２７，０６１；５，８０４，４２５；５，６３３，４３５；５，１４５，７８３；４，９７１，９０８；５，３１２，９１０；５，１８８，６４２；４，９４０，８３５；５，８６６，７７５；６，２２５，１１４  Ｂｌ；６，１３０，３６６；５，３１０，６６７；４，５３５，０６０；４，７６９，０６１；５，６３３，４４８；５，５１０，４７１；Ｒｅ．３６，４４９；ＲＥ３７，２８７Ｅ；及び５，４９１，２８８；及び国際出願ＷＯ９７／０４１０３；ＷＯ００／６６７４６；ＷＯ０１／６６７０４；及びＷＯ００／６６７４７により詳細に記載されているより高レベルの５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を生産する能力を植物に付与するポリヌクレオチドから誘導されたものを包含する。グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物の除草剤耐性ポリヌクレオチド（即ち例えばＧＡＴ及びＨＲＡ配列）と組み合わせることができる他の形質は、米国特許５，６０５，０１１；５，０１３，６５９；５，１４１，８７０；５，７６７，３６１；５，７３１，１８０；５，３０４，７３２；４，７６１，３７３；５，３３１，１０７；５，９２８，９３７及び５，３７８，８２４；及び国際出願ＷＯ９６／３３２７０により詳細に記載されているスルホニル尿素及び／又はイミダゾリノンに対する耐性を付与するものを包含する。
【００６９】
一部の実施形態においては、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物の除草剤耐性ポリヌクレオチド（即ち例えばＧＡＴ及びＨＲＡ配列）は例えばパラヒドロキシフェニルピルベート（ＨＰＰ）をホモゲンチセートに変換する反応を触媒する酵素であるヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼとスタックしてよい。この酵素を阻害し、そしてこの酵素に結合することによりＨＰＰからホモゲンチセートへの変換を抑制する分子は除草剤として有用である。植物におけるそのような除草剤に対する耐性を付与する形質は、米国特許６，２４５，９６８Ｂ１；６，２６８，５４９；及び６，０６９，１１５；及び国際出願ＷＯ９９／２３８８６に記載されている。グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物の除草剤耐性ポリヌクレオチド（即ち例えばＧＡＴ及びＨＲＡ配列）とスタックできる適当な除草剤耐性形質の他の例は、アルコキシアルカノエートジオキシゲナーゼポリヌクレオチド（例えばＷＯ２００５／１０７４３７に記載の通り、２，４−Ｄ及び他のフェノキシオーキシン除草剤並びにアリールオキシフェノキシプロピオネート除草剤に対する耐性を付与すると報告されている）及び例えばＨｅｒｍａｎら、（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４７５９−２４７６７に記載されているジカンバ耐性ポリヌクレオチドを包含する。
【００７０】
グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ちＧＡＴ及びＨＲＡ植物）の除草剤耐性ポリヌクレオチドと組み合わせることができる除草剤耐性形質の他の例は、米国特許５，９６９，２１３；５，４８９，５２０；５，５５０，３１８；５，８７４，２６５；５，９１９，６７５；５，５６１，２３６；５，６４８，４７７；５，６４６，０２４；６，１７７，６１６；及び５，８７９，９０３に記載されているような、外因性ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドにより付与されるものを包含する。外因性ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼを含有する植物は酵素グルタミンシンターゼを阻害するグルホシネート除草剤に対する向上した耐性を示すことができる。グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ちＧＡＴ及びＨＲＡ植物）の除草剤耐性ポリヌクレオチドと組み合わせることができる除草剤耐性形質の他の例は、米国特許６，２８８，３０６Ｂ１；６，２８２，８３７Ｂ１；及び５，７６７，３７３；及び国際公開ＷＯ０１／１２８２５に記載されているような、改変されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（プロトックス）活性を付与するポリヌクレオチドにより付与されるものを包含する。そのようなポリヌクレオチドを含有する植物はプロトックス酵素をターゲティングする種々の除草剤（「プロトックス阻害剤」とも称する）の何れかに対する向上した耐性を示すことができる。
【００７１】
グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ちＧＡＴ及びＨＲＡ植物）の除草剤耐性ポリヌクレオチドと組み合わせることができる除草剤耐性形質の他の例は、例えばトウモロコシ植物又はヒメムカシヨモギのような植物において除草剤少なくとも１つへの耐性を付与するものを包含する。除草剤耐性雑草は当該分野で知られており、そして特定の除草剤に対するそれらの耐性が多様である植物である。例えばＷＳＳＡ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ９−１２，２００４において提示されたＧｒｅｅｎ及びＷｉｌｌｉａｍｓ（２００４）Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｒｎ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）Ｉｎｂｒｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｎｉｃｏｓｕｌｆｕｒｏｎ及びＭｅｓｏｔｒｉｏｎｅのポスター；Ｇｒｅｅｎ（１９９８）Ｗｅｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：４７４−４７７；Ｇｒｅｅｎ及びＵｌｒｉｃｈ（１９９３）Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ４１：５０８−５１６を参照できる。これ等の耐性を担っている形質を、育種によるか、又は他の方法を介して、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ちＧＡＴ及びＨＲＡ植物）の除草剤耐性ポリヌクレオチドと組み合わせることにより本発明の植物並びにその使用方法が得られる。
【００７２】
この態様において、本発明はグリホセート及び他のＡＬＳ阻害剤化学物質に対してより耐性である植物を提供し、そして更に、上記した形質の各々が付与する耐性の相手である除草剤に対してより耐性である植物を提供する。従って、本発明は、本発明の植物が耐性である相手の除草剤少なくとも１つ、例えばグリホセート、ＡＬＳ阻害剤化学物質、ＡＬＳ阻害剤化学物質の混合物、又は、グリホセートとＡＬＳ阻害剤化学物質の混合物により目的の区域（例えば圃場又は耕作区域）を処理することを含む作物を生育させるため（即ち耕作区域において雑草を選択的に制御するため）の方法を提供する。一部の実施形態においては、本発明の方法は更に本発明の植物が耐性である相手の別の除草剤による処理を含む。そのような実施形態においては一般的に、本発明の方法は作物を有意に損傷させることなく雑草の選択的制御を可能にする。本明細書においては、「耕作区域」とは植物を生育させることが望まれる何れかの領域を包含する。そのような耕作区域は、限定しないが、植物を栽培する圃場（例えば作物圃場、芝地圃場、樹木圃場、管理森林、果物及び野菜の栽培圃場等）、温室、生育チャンバー等を包含する。
【００７３】
除草剤耐性形質は又、種々の所望の形質の組合せ、例えば動物用飼料の為に望ましい形質、例えば高い油脂含有量（例えば米国特許６，２３２，５２９）；バランスの取れたアミノ酸含有量（例えばホルドチオニン（ｈｏｒｄｏｔｈｉｏｎｉｎ）（米国特許５，９９０，３８９；５，８８５，８０１；５，８８５，８０２；及び５，７０３，４０９；米国特許５，８５０，０１６）；オオムギの高リジン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：９９−１０６；及びＷＯ  ９８／２０１２２）及び高いメチオニン蛋白（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７１：３５９；及びＭｕｓｕｍｕｒａら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  ｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３））；向上した消化性（例えば変更された貯蔵蛋白（米国特許出願１０／０５３，４１０，２００１年１１月７日出願）；及びチオレドキシン（米国特許出願１０／００５，４２９，２００１年１２月３日出願））；を更に含む本発明の植物を生産するために他の形質少なくとも１つと組み合わせることができ；これ等の開示は参考として本明細書に援用される。所望の形質の組合せは又ＬＬＮＣ（低リノレン酸含有量；例えばＤｙｅｒら、（２００２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：２２４−２３０参照）及びＯＬＣＨ（高オレイン酸含有量；例えばＦｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｙａら、（２００５）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５３：５３２６−５３３０参照）を包含する。
【００７４】
目的の除草剤耐性形質は又他の望ましい形質、例えばフモニジム解毒遺伝子（米国特許５，７９２，９３１）、無毒性及び疾患抵抗性遺伝子（Ｊｏｎｅｓら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓら、（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）及び改質された油脂類（例えば脂肪酸脱飽和遺伝子（米国特許５，９５２，５４４；ＷＯ９４／１１５１６）；改質された澱粉（例えばＡＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、澱粉シンターゼ（ＳＳ）、澱粉分枝鎖化酵素（ＳＢＥ）及び澱粉脱分枝鎖酵素（ＳＤＢＥ））；及び重合体又はバイオプラスチック（例えば米国特許５，６０２，３２１；ベータ−ケトチオラーゼ、ポリヒドロキシブチレートシンターゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７）はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進する））のような加工生産物へのプロセシングの為に望ましい形質と組み合わせることができ；これ等の開示は参考として本明細書に援用される。更に又、雄性繁殖性（例えば米国特許５，５８３，２１０参照）、茎強度、開花時期のような作物学的な形質、又は細胞周期調節又は遺伝子ターゲティングのような形質転換技術の形質（例えばＷＯ  ９９／６１６１９、ＷＯ  ００／１７３６４及びＷＯ  ９９／２５８２１）を与えるポリヌクレオチドと除草剤耐性ポリヌクレオチドを組み合わせることもでき；これ等の開示は参考として本明細書に援用される。
【００７５】
別の実施形態においては、目的の除草剤耐性形質はＲｃｇ１配列又はその生物学的に活性な変異体又はフラグメントと組み合わせることができる。Ｒｃｇ１配列はコーンにおけるアントラクノース茎腐朽抵抗性遺伝子である。例えば参考として本明細書に援用される米国特許出願１１／３９７，１５３，１１／３９７，２７５及び１１／３９７，２４７を参照できる。
【００７６】
これ等のスタックされた組合せは何れかの方法、例えば限定しないが何れかの従来法又はＴｏｐＣｒｏｓｓ法により植物を育種すること、又は遺伝子形質転換により、作製できる。植物を遺伝子的に形質転換することにより配列をスタックする場合、目的のポリヌクレオチド配列は何れかの時点において、及び何れかの順序において組み合わせることができる。例えば、所望の形質１つ以上を含むトランスジェニック植物を標的として使用することにより後の形質転換により別の形質を導入できる。形質は形質転換カセットの何れかの組合せにより与えられる目的のポリヌクレオチドとの同時形質転換プロトコルにおいて同時に導入できる。例えば、２配列を導入する場合、２配列は別個の形質転換カセット内に含有させる（トランス）か、又は、同じ形質転換カセット内に含有させる（シス）ことができる。配列の発現は同じプロモーターによるか、異なるプロモーターにより駆動できる。特定の場合において、目的のポリヌクレオチドの発現を抑制する形質転換カセットを導入することが望ましい場合がある。これは植物における形質の所望の組合せを発生させる他の抑制カセット又は過剰発現カセットの何れかの組合せと組み合わせてよい。更に又、ポリヌクレオチド配列は部位特異的組み換え系を用いて所望のゲノム位置においてスタックすることも可能であると認識される。例えばすべて参考として本明細書に援用されるＷＯ９９／２５８２１、ＷＯ９９／２５８５４、ＷＯ９９／２５８４０、ＷＯ９９／２５８５５及びＷＯ９９／２５８５３を参照できる。
【００７７】
植物における脂肪酸組成を改質すること、植物におけるアミノ酸含有量を改変すること、植物の病原体防御機構を改変することを包含する表現型の種々の変化が有利である。これ等の結果は植物における異種産物の発現又は内因性産物の発現増大をもたらすことにより達成できる。或いは、結果は、植物における内因性産物１つ以上、特に酵素又はコファクターの発現の低減をもたらすことにより達成できる。これ等の変化は形質転換された植物の表現型の変化をもたらす。
【００７８】
目的遺伝子は作物の発達に関与する経済市場及びその関心を反映している。作物及び関連市場は変動し、そして開発途上国が世界市場に参加するに従って、新しい作物及び技術も発生することになる。更に又、作物学的形質及び特性、例えば収穫量及び雑種強勢の理解が増大するに従い、形質転換のための遺伝子の選択も相応に変化することになる。目的の遺伝子の一般的範疇は、例えば情報に関与する遺伝子、例えば亜鉛フィンガー、伝達に関与するもの、例えばキナーゼ、及びハウスキーピングに関与するもの、例えばヒートショック蛋白を包含する。トランスジーンのより特定の範疇は例えば作物学、昆虫抵抗性、疾患抵抗性、除草剤抵抗性、不稔性、殻粒特性及び商業用産物のために重要な形質をコードする遺伝子を包含する。目的の遺伝子は一般的に油脂、澱粉、炭水化物又は栄養の代謝に関与するもの、並びに、仁の大きさ、スクロース負荷等に影響するものを包含する。作物額的に重要な形質、例えば油脂、澱粉及び蛋白の含有量は伝統的な育種方法を用いることに加えて、遺伝子的に改変することもできる。改質はオレイン酸、飽和及び不飽和油脂の含有量の増大、リジン及びイオウの濃度の増大、必須アミノ酸の提供及び澱粉の改質を包含する。
【００７９】
コード配列の誘導体はコードされたポリペプチドにおける予め選択されたアミノ酸のレベルを増大するための部位指向性突然変異誘発により行うことができる。例えば、オオムギ高リジンポリペプチド（ＢＨＬ）をコードする遺伝子は１９９６年１１月１日出願の米国特許出願０８／７４０，６８２及びＷＯ９８／２０１３３のオオムギキモトリプシン阻害剤から誘導され、これ等の開示は参考として本明細書に援用される。他の蛋白はメチオニンリッチ植物蛋白、例えばヒマワリ種子（Ｌｉｌｌｅｙら、（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｏｄｓ及びＡｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，ｅｄ．Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ），ｐｐ．４９７−５０２；参考として本明細書に援用される）；コーン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７１：３５９；共に参考として本明細書に援用される）；及びコメ（Ｍｕｓｕｍｕｒａら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３，参考として本明細書に援用される）から得られるものを包含する。他の作物学的に重要な遺伝子はラテックス、Ｆｌｏｕｒｙ２、成長因子、種子貯蔵因子及び転写因子をコードする。
【００８０】
昆虫抵抗性遺伝子は多大な収穫量停滞をもたらす害虫、例えばネクイハムシ、ネキリムシ、アワノメイガ等に対する抵抗性をコードする場合がある。そのような遺伝子は例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒性蛋白遺伝子（米国特許５，３６６，８９２；５，７４７，４５０；５，７３６，５１４；５，７２３，７５６；５，５９３，８８１；及びＧｅｉｓｅｒら、（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９）等を包含する。
【００８１】
疾患抵抗性形質をコードする遺伝子は脱毒性遺伝子、例えばフモノシンに対するもの（米国特許５，７９２，９３１）；無毒性（ａｖｒ）及び疾患抵抗性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２；及びＭｉｎｄｒｉｎｏｓら、（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）等を包含する。
【００８２】
不稔性遺伝子もまた発現カセット内にコードすることができ、物理的な脱穂の代替を与える。そのような態様において使用される遺伝子の例は雄性組織好適遺伝子及び雄性不稔性表現型を有する遺伝子、例えば米国特許５，５８３，２１０に記載のＱＭを包含する。他の遺伝子はキナーゼ及び雄性又は雌性の何れかの配偶体の発生に対して毒性である化合物をコードするものを包含する。
【００８３】
殻粒の品質は油脂の量及び種類、飽和及び不飽和、必須アミノ酸の品質と量、及び、セルロースの量のような形質に反映される。コーンにおいては、改質されたホルドチオニン蛋白が米国特許５，７０３，０４９，５，８８５，８０１，５，８８５，８０２及び５，９９０，３８９に記載されている。
【００８４】
商業的な形質もまた例えばエタノール生産のための澱粉を増大させるか、蛋白の発現をもたらす遺伝子上にコードさせることができる。形質転換植物の他の重要な用途は米国特許５，６０２，３２１に記載されているような重合体及びバイオプラスチックの生産である。β−ケトチオラーゼ、ＰＨＢａｓｅ（ポリヒドロキシブチレートシンターゼ）及びアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼのような遺伝子（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７参照）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進する。
【００８５】
外因性の生産物は植物の酵素及び生産物並びに原核生物及び他の真核生物を包含する他の原料を包含する。そのような生産物は、酵素、コファクター、ホルモン等を包含する。蛋白、特に植物の栄養価を向上させるための向上したアミノ酸分布を有する改質された蛋白の量を増大することができる。これは増強されたアミノ酸含有量を有するそのような蛋白の発現により達成される。
【００８６】
ＩＩ．ポリヌクレオチドコンストラクト
特定の実施形態において、方法及び組成物において使用される除草剤耐性ポリヌクレオチド１つ以上は植物又は他の目的生物における発現のための発現カセット中に提供することができる。カセットは除草剤耐性ポリヌクレオチドに作動可能に連結した５’及び３’調節配列を包含する。「作動可能に連結」とは２つ以上のエレメントの間の機能的連結を意味することを意図している。例えば、目的のポリヌクレオチドと調節配列（例えばプロモーター）の間の作動可能な連結は目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結したエレメントは隣接しても、隣接しなくてもよい。２つの蛋白コード領域の連結を指すために用いる場合は、「作動可能に連結」とはコード領域が同じ読み枠内にあることを意図している。エンハンサーの作用を指すために使用する場合は、「作動可能に連結した」とは特定のポリヌクレオチド又は目的のポリヌクレオチドの発現をエンハンサーが増大させることを意味する。ポリヌクレオチド又は目的のポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、コードされたポリペプチドはより高値のレベルにおいて生産される。
【００８７】
カセットは更に、生物に同時形質転換されるべき追加的遺伝子少なくとも１つを含有してよい。或いは、追加的遺伝子は多数の発現カセット上に提供することができる。そのような発現カセットは調節領域の転写調節下とされるべき除草剤耐性ポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限部位及び／又は組み換え部位を有する。発現カセットは更に他の遺伝子、例えば他の選択可能なマーカー遺伝子を含有してよい。カセットが１つより多いポリヌクレオチドを含有する場合、カセット内のポリヌクレオチドは同じ方向、又は異なる方向に転写されてよい（「発散性（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）」転写とも称する）。
【００８８】
除草剤耐性ポリヌクレオチドを含む発現カセットは、転写の５’−３’方向に、目的の植物又は他の生物において機能的な、転写及び翻訳開始領域（即ちプロモーター）、除草剤耐性ポリヌクレオチド（例えばＧＡＴポリヌクレオチド、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリヌクレオチド、ＨＲＡポリヌクレオチド又はこれらの任意の組合せ等）および転写及び翻訳終止領域（即ち終止領域）を包含することになる。従って、そのような発現カセットを有する植物も提供される。調節領域（即ちプロモーター、転写調節領域及び翻訳終止領域）及び／又は除草剤耐性ポリヌクレオチドは宿主細胞に対して、又は、互いに、ネイティブ（または、類似的）であってよい。或いは調節領域及び／又は本発明の除草剤耐性ポリヌクレオチドは宿主細胞に対して、又は、互いに、異種であってよい。本明細書においては、配列に言及する場合の「異種」とは、外来種起源であるか、又は、同じ種に由来する場合は意図的人的介入により組成及び／又はゲノム遺伝子座においてそのネイティブの形態から実質的に変更されている配列である。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結しているプロモーターは、ポリヌクレオチドの誘導元の種とは異なる種に由来するか、又は、同じ（または、類似）種に由来する場合は、片方又は両方がその元の形態及び／又はゲノム遺伝子座から実質的に変更されているか、又はプロモーターは、作動可能に連結したポリヌクレオチドに対してネイティブのプロモーターではない。
【００８９】
異種プロモーターを用いながらポリヌクレオチドを発現することが最適であるが、ネイティブのプロモーター配列も使用してよい。そのようなコンストラクトは植物又は植物細胞中のコードされたポリペプチドの発現レベル及び／又は発現パターンを変化させることができる。コードされたポリペプチドの発現レベル及び／又は発現パターンはまたコンストラクトの部分である別の調節エレメント、例えばエンハンサーの結果として変化させてもよい。即ち、植物又は細胞の表現型はネイティブのプロモーターを使用してもなお改変することができる。
【００９０】
終止領域は転写開始領域に対してネイティブであってよく、目的の作動可能に連結した除草剤耐性ポリヌクレオチドに対してネイティブであってよく、植物宿主に対してネイティブであってよく、又は、別の原料（即ち外来性又は異種）からプロモーター、目的の除草剤耐性ポリヌクレオチド、植物宿主又はこれらの任意の組合せに誘導されてよい。好都合な終止領域はオクトピンシンターゼ及びノパリンシンターゼ終止領域のようにＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミドから得ることができ、或いは、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ遺伝子のような植物遺伝子から得ることもできる又Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら、（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら、（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；及びＪｏｓｈｉら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照できる。
【００９１】
多くのプロモーターが本発明の実施において使用でき、目的のポリヌクレオチド配列のネイティブのプロモーターも包含される。プロモーターは所望の結果に基づいて選択できる。目的のポリヌクレオチドは植物における発現の為に構成的、組織好適、又は他のプロモーターと組み合わせることができる。
【００９２】
そのような構成的プロモーターは例えばＷＯ  ９９／４３８３８及び米国特許６，０７２，０５０に開示されているＲｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター及び他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）；コメアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）；トウモロコシアクチンプロモーター；ユビキチンプロモーター（例えばＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９；Ｃａｌｌｉｓら、（１９９５）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３９：９２１−３９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら、（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許５，６５９，０２６）参照）、を包含する。他の構成的プロモーターは例えば米国特許５，６０８，１４９；５，６０８，１４４；５，６０４，１２１；５，５６９，５９７；５，４６６，７８５；５，３９９，６８０；５，２６８，４６３；５，６０８，１４２；及び６，１７７，６１１に開示されている。一部のプロモーターはそれらがネイティブの５’未翻訳領域及び／又は他のエレメント、例えばイントロンと連携して使用された場合に向上した発現を示す。例えばトウモロコシユビキチンプロモーターはトウモロコシユビキチン遺伝子の第１イントロンを包含するユビキチン遺伝子の５’未翻訳領域の少なくとも一部分に沿って目的ポリヌクレオチドの上流に位置する場合が多い。
【００９３】
化学物質調節プロモーターは外因性化学物質調節物質の適用を介して植物内の遺伝子発現をモジュレートするために使用できる。目的に応じて、プロモーターは化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学物質誘導プロモーターであってよく、又は、プロモーターは化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学物質抑制プロモーターであってよい。化学物質誘導プロモーターは当該分野で知られており、そして限定しないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤により活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、発芽前除草剤として使用される疎水性親電子化合物により活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、及びサリチル酸により活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターを包含する。他の目的の化学物質調節プロモーターはステロイド応答性プロモーター（例えばＳｃｈｅｎａら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０４２１−１０４２５及びＭｃＮｅｌｌｉｓら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４（２）：２４７−２５７に記載のグルココルチコイド誘導プロモーター）及びテトラサイクリン誘導及びテトラサイクリン抑制プロモーター（例えばＧａｔｚら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７及び米国特許５，８１４，６１８及び５，７８９，１５６参照）を包含しこれ等は参考として本明細書に援用される。
【００９４】
組織好適プロモーターは特定の植物組織内の増強された除草剤耐性ポリペプチド発現をターゲティングするために使用できる。組織好適プロモーターはＹａｍａｍｏｔｏら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎら、（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌら、（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔら、（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐら、（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉら、（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏら、（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａら、（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０；及びＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａら、（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（３）：４９５−５０５を包含する。このようなプロモーターは必要に応じて弱化した発現の為に修飾することができる。
【００９５】
葉部好適プロモーターは当該分野で知られている。例えばＹａｍａｍｏｔｏら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋｗｏｎら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：３５７−６７；Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｇｏｔｏｒら、（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３：５０９−１８；Ｏｒｏｚｃｏら、（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；及びＭａｔｓｕｏｋａら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０を参照できる。
【００９６】
根部好適プロモーターは知られており、そして文献から入手される多くのものから選択するか、又は、種々の適合種から新規に単離することができる。例えばＨｉｒｅら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２０（２）：２０７−２１８（ダイズ根部特異的グルタミンシンターゼ遺伝子）；Ｋｅｌｌｅｒ及びＢａｕｍｇａｒｔｎｅｒ（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１０）：１０５１−１０６１（サヤインゲンのＧＲＰ１．８遺伝子における根部特異的制御エレメント）；Ｓａｎｇｅｒら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４（３）：４３３−４４３（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのマンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）遺伝子の根部特異的プロモーター）；及びＭｉａｏら、（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１）：１１−２２（ダイズの根部及び根結節部に発現される細胞質ゾルグルタミン合成酵素（ＧＳ）をコードする完全長ｃＤＮＡクローン）を参照できる。更に又、窒素固定非マメ科植物Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ及び関連する非窒素固定非マメ科植物Ｔｒｅｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ由来のヘモグロビン遺伝子から単離された２つの根部特異的プロモーターが記載されているＢｏｇｕｓｚら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２（７）：６３３−６４１も参照できる。これ等の遺伝子のプロモーターをβ−グルクロニダーゼレポーター遺伝子に連結し、そして非マメ科のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ及びマメ科のＬｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓの両方に導入し、そして両方の場合共に、根部特異的プロモーター活性は温存された。Ｌｅａｃｈ及びＡｏｙａｇｉ（１９９１）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの高度に発現されたｒｏｌＣ及びｒｏｌＤ根部誘導遺伝子のプロモーターの分析を記載している（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）７９（１）：６９−７６参照）。これ等のプロモーターにおいてはエンハンサーと組織好適ＤＮＡ決定基が解離していると結論している。Ｔｅｅｒｉら、（１９８９）はｌａｃＺへの遺伝子融合を使用することにより、オクトピンシンターゼをコードするＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴ−ＤＮＡ遺伝子が根端の表皮において特に活性であること、及び、ＴＲ２’遺伝子が未損傷の植物においては根特異的であり、そして葉組織における創傷により刺激されることを明らかにしており、これ等は殺虫性又は殺幼虫性の遺伝子と共に使用するための特性の特に望ましい組合せである（ＥＭＢＯ  Ｊ．８（２）：３４３−３５０参照）。ｎｐｔＩＩ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）に融合したＴＲ１’遺伝子は同様の特性を示している。別の根部好適プロモーターはＶｆＥＮＯＤ−ＧＲＰ３遺伝子プロモーター（Ｋｕｓｔｅｒら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９（４）：７５９−７７２）；及びｒｏｌＢプロモーター（Ｃａｐａｎａら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５（４）：６８１−６９１を包含する。又米国特許５，８３７，８７６；５，７５０，３８６；５，６３３，３６３；５，４５９，２５２；５，４０１，８３６；５，１１０，７３２；及び５，０２３，１７９を参照できる。
【００９７】
「種子好適」プロモーターは「種子特異的」プロモーター（種子貯蔵蛋白のプロモーターのような種子発生中に活性なプロモーター）並びに「種子発芽」プロモーター（種子の発芽中に活性であるプロモーター）の両方を包含する。参考として本明細書に援用されるＴｈｏｍｐｓｏｎら、（１９８９）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １０：１０８を参照できる。このような種子好適プロモーターは限定しないがＣｉｍｌ（サイトカイン誘導メッセージ）；ｃＺ１９Ｂｌ（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）；ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ）を包含する（参考として本明細書に援用されるＷＯ  ００／１１１７７及び米国特許６，２２５，５２９参照）。ガンマゼインは内乳特異的プロモーターである。グロブリン１（Ｇｌｂ−１）は代表的な胚特異的プロモーターである。双子葉植物の場合、種子特異的プロモーターは限定しないがマメβ−ファセオィン、ナピン、β−コングリシン、大豆レシチン、クルシフェリン等を包含する。単子葉植物の場合、種子特異的プロモーターは限定しないがトウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ガンマゼイン、ワキシー、シュランケン−１、シュランケン−２、グロブリン−１等を包含する。ｅｎｄ１及びｅｎｄ２遺伝子由来の種子好適プロモーターが開示されている参考として本明細書に援用されるＷＯ００／１２７３３も参照できる。
【００９８】
別の目的プロモーターはＳＣＰｌプロモーター（ＵＳ  ６，０７２，０５０）、ＨＢ２プロモーター（ＵＳ  ６，１７７，６１１）及びＳＡＭＳプロモーター（ＵＳ２００３０２２６１６６及び配列番号８７及びその生物学的に活性な変異体及びフラグメント）を包含し；これ等は各々参考として本明細書に援用される。更に又、本明細書において別途考察するとおり、種々のエンハンサーをこれ等のプロモーターと共に使用することができ、例えばユビキチンイントロン（即ちトウモロコシユビキチンイントロン１（例えばＮＣＢＩ配列Ｓ９４４６４参照）、オメガエンハンサー又はオメガプライムエンハンサー（Ｇａｌｌｉｅら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）２３７−２５６及びＧａｌｌｉｅら、Ｇｅｎｅ（１９８７）６０：２１７−２５）又は３５Ｓエンハンサーが挙げられ；これ等の各々が参考として本明細書に援用される。
【００９９】
発現カセットはまた形質転換した細胞の選択のための選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子は形質転換した細胞又は組織の選択の為に利用される。マーカー遺伝子は抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、並びに除草剤化合物、例えばグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン及び２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性を付与する遺伝子を包含する。別の選択可能なマーカーは表現型マーカー、例えばβ−ガラクトシダーゼ及び蛍光蛋白、例えば緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）（Ｓｕら、（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８５：６１０−９及びＦｅｔｔｅｒら、（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：２１５−２８）、シアン蛍光蛋白（ＣＹＰ）（Ｂｏｌｔｅら、（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１７：９４３−５４及びＫａｔｏら、（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２９：９１３−４２）及び黄色蛍光蛋白（ＰｈｉＹＦＰ  、Ｅｖｒｏｇｅｎより入手、Ｂｏｌｔｅら、（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１７：９４３−５４参照）を包含する。別の選択可能なマーカーに関しては、一般的にＹａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６３１４−６３１８；Ｙａｏら、（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２；Ｂａｒｋｌｅｙら、（１９８０）  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ，ｐｐ．１７７−２２０；Ｈｕら、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：５５５−５６６；Ｂｒｏｗｎら、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４９：６０３−６１２；Ｆｉｇｇｅら、（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５２：７１３−７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：５４００−５４０４；Ｆｕｅｒｓｔら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：２５４９−２５５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４８０−４８３；Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１９１７−１９２１；Ｌａｂｏｗら、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９５２−３９５６；Ｂａｉｍら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５０７２−５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３；Ｈｉｌｌｅｎ及び−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂら、（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ���．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔら、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｖａら、（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９；Ｈｌａｖｋａら、（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２１−７２４を参照できる。このような開示は参考として本明細書に援用される。選択可能なマーカー遺伝子に関する上記リストは限定的なものではない。ＧＡＴ遺伝子及び／又はＨＲＡ遺伝子を含む如何なる選択可能なマーカー遺伝子も本発明において使用できる。
【０１００】
例えば開始メチオニンＡＴＧコドンに直接隣接し、そしてその顆粒にある１つ又は２つのＧ／Ｃリッチコドン（例えばＧＣＧ又はＧＣＴ）をポリペプチドコード配列内に挿入することにより、植物又は植物細胞内における本発明のポリペプチドの発現レベルを増大させる方法が当該分野で知られている。適宜、ポリヌクレオチドは形質転換された植物内の増大した発現の為に最適化してよい。即ち、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドコード配列内において、植物により低頻度で利用されるコドン１つ以上を、植物により高頻度で利用されるコドン１つ以上の代替とし、そして修飾されたコード配列を植物又は植物細胞内に導入し、そして、修飾されたコード配列を発現させながら、合成することができる。宿主好適コドン使用の考察に関してはＣａｍｐｂｅｌｌ及びＧｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照できる。植物好適遺伝子を合成するための方法は当該分野で知られている。例えば参考として本明細書に援用される米国特許５，３８０，８３１及び５，４３６，３９１及びＭｕｒｒａｙら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照できる。そのような修飾を含む実施形態も本発明の特徴である。
【０１０１】
別の配列修飾は細胞宿主内の遺伝子発現を増強させることが知られている。これ等には擬似ポリアデニル化シグナル、エクソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様リピート及び遺伝子発現に有害と考えられる他のこのような十分特性化された配列をコードする配列の排除が包含される。配列のＧ−Ｃ含有量は、宿主細胞内で発現される既知遺伝子を比較対象としながら計算される通り、所定の細胞宿主に対して平均レベルに調節してよい。可能であれば配列は予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避すべく修飾する。ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサーのような「エンハンサー」もまた使用してよく（例えばＢｅｎｆｅｙら、（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１６８５−９６参照）、或いは、他のエンハンサーを使用してもよい。例えば、配列番号１、７２、７９、８４、８５、８８又は８９に示す配列又はその生物学的に活性な変異体又はフラグメントも使用できる。本明細書と同時に出願した米国実用新案出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ及びＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」も参照でき、参照により全体が本明細書に組み込まれる。「プロモーター」という用語は転写開始領域を含むＤＮＡの調節領域を意味することを意図しており、これは一部の実施形態においては特定のコード配列に関する適切な転写開始部位においてＲＮＡ合成を開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導することができるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターは更に転写に影響する別の調節エレメント、例えば限定しないがイントロン、５’未翻訳領域及びエンハンサーエレメントに作動可能に連結することができる。本明細書においては、「エンハンサー配列」、「エンハンサードメイン」、「エンハンサーエレメント」又は「エンハンサー」は、適切なプロモーターに作動可能に連結した場合に、作動可能に連結した目的ポリヌクレオチドの転写のレベルをモジュレートすることになる。エンハンサードメインの生物学的に活性なフラグメント又は変異体は、適切なプロモーターに作動可能に連結した場合に転写のレベルをモジュレート（増大又は低減）する生物学的活性を保持している。
【０１０２】
エンハンサードメインに対するポリヌクレオチド又はプロモーターのフラグメントは少なくとも約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約５００ヌクレオチドから完全長までの本発明のエンハンサードメインに関する本発明のヌクレオチド配列の範囲となってよい。別の実施形態においては、エンハンサードメインのフラグメントは約５０〜約１００ヌクレオチド、１００〜約１５０ヌクレオチド、１５０〜約２００ヌクレオチド、２００〜約２５０ヌクレオチド、約２５０〜約３００ヌクレオチド、約３００〜約３５０ヌクレオチド、約３５０〜約４００ヌクレオチド、約４００〜約４５０ヌクレオチド、約４５０〜約５００ヌクレオチド、約５００〜約５３５ヌクレオチドの長さを含む。一般的に、本発明の特定のポリヌクレオチドの変異体は本明細書に別途記載する配列アライメントプログラム及びパラメーターにより測定した場合にその特定のポリヌクレオチドに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有することになる。エンハンサー又はプロモーターの生物学的に活性な変異体は、僅か１〜１５核酸残基、僅か１〜１０、例えば６〜１０、僅か１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は更には１核酸残基の分だけその配列から異なっていることができる。このような活性変異体及びフラグメントは転写をモジュレートし続けることになる。
【０１０３】
エンハンサードメイン又はその活性な変異体及びフラグメントの複数のコピーはプロモーターに作動可能に連結できる。特定の実施形態においては、キメラ転写調節制御領域はエンハンサードメインを少なくとも１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー以上有する。更に別の実施形態においては、使用するエンハンサードメインは配列番号５に示す配列番号を含まない。更に、エンハンサーは何れかの方向（即ちセンス又はリバース）に方向付けることができる。
【０１０４】
プロモーターとエンハンサードメインの間の距離はキメラ転写調節領域が所望の態様において目的の作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写を指向し続ける限り、変動することができる。例えば、エンハンサードメインは少なくとも約１００００〜約１５０００、約１００００〜約９０００、約９０００〜約８０００、約８０００〜約７０００、約７０００〜約６０００、約６０００〜約５０００、約５０００〜約４０００、約４０００〜約３０００、約３０００〜約２０００、約２０００〜約１０００、約１０００〜約５００、約５００〜約２５０、約２５０〜プロモーターに直接隣接する位置にあることができる。更に又、エンハンサーの１つ以上のコピーをプロモーターの上流（５’）に位置づけることができ、或いは、エンハンサーの１つ以上のコピーをプロモーターの３’に位置させることができる。特定の実施形態においては、プロモーターの３’に位置する場合は、エンハンサーはターミネーター領域の下流になる。更に別の実施形態においては、エンハンサー１つ以上を５’又は３’方向（配列番号１又は７２に示す）に、又は、３’→５’の方向に配置させることができる。
【０１０５】
多数のエンハンサーを使用する場合、エンハンサーは、発現に対する所望の影響が達成されるようにプロモーターに関してコンストラクトを位置付けることができる。例えばエンハンサーは相互に直接隣接するか、又は少なくとも１〜１００、１００〜３００、３００〜５００、５００〜１０００ヌクレオチド隔たっていることができる。
【０１０６】
本発明において使用されるエンハンサーはＤＮＡコンストラクト内において第１及び第２のプロモーターの間に、そしてそれらに作動可能に連結して位置付けることができる。そのような実施形態において、エンハンサーは発散方向から第１及び第２のプロモーターの両方の発現におけるモジュレーションを可能にする。このようなＤＮＡコンストラクトの非限定的な例は、５’→３’又は３’→５’の方向へ、目的の第１のポリヌクレオチドが第１のプロモーターに作動可能に連結し、これが本発明のエンハンサーの少なくとも１コピーに作動可能に連結し、これが第２のプロモーターに作動可能に連結し、これが目的の第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結している。特定の実施形態においては、エンハンサー配列は第１及び第２のエンハンサー配列とは異種である。他の実施形態においては、第１のプロモーターはＡＬＳ阻害剤をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結しており、そして第２のプロモーターはグリホセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している。そのようなポリヌクレオチドは本明細書に別途開示する。
【０１０７】
発現カセットは更に５’リーダー配列を含有してよい。そのようなリーダー配列は翻訳を増強するように作用できる。翻訳リーダーは当該分野で知られており、そしてピコルナウィルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）；ポチウィルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）リーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウィルス）（Ｇａｌｌｉｅら、（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６５（２）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシドワーフモザイクウィルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０）及びヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウィルスのコート蛋白ｍＲＮＡ由来の未翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウィルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅら、（１９８９）、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２３７−２５６）；及びトウモロコシ退緑モトルウィルス（ｍａｉｚｅ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）リーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌら、（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）を包含する。更に又、Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら、（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８も参照できる。
【０１０８】
発現カセットを作製する場合、配列が適切な方向にあり、そして適宜、適切な読み枠内にあるように、種々のポリヌクレオチドフラグメントを操作してよい。この目標のためには、アダプター又はリンカーを用いてフラグメントを連結してよく、又は、他の操作を行うことにより好都合な制限部位、余分な物質の除去、例えば制限部位の除去などを可能にしてよい。この目的のためには、インビトロの突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば移入及び転換を行ってよい。本発明において使用する標準的な組み換えＤＮＡ及び分子クローニングの手法は当該分野で良く知られており、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（「Ｍａｎｉａｔｉｓ」としても知られている）により詳述されている。
【０１０９】
一部の実施形態においては、目的のポリヌクレオチドは発現の為に葉緑体にターゲティングされる。この態様において、目的のポリヌクレオチドが葉緑体に直接挿入されない場合は、発現カセットは更に、葉緑体に目的の遺伝子産物を指向させるための一過性ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードする核酸を含有することになる。このような一過性ペプチドは当該分野で知られている。例えばＶｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら、（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら、（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１を参照できる。
【０１１０】
葉緑体ターゲティング配列は当該分野で知られており、そしてリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）（ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ  Ｓｉｌｖａ  Ｆｉｌｈｏら、（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９−７８０；Ｓｃｈｎｅｌｌら、（１９９Ｉ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５−３３４２）；５−（エノールピルビル）シキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（Ａｒｃｈｅｒら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）：７８９−８１０）；トリプトファンシンターゼ（Ｚｈａｏら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１−６０８７）；プラストシアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）：２０３５７−２０３６３）；コリスメートシンターゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７−２７４５７）；及び集光性葉緑素ａ／ｂ結合蛋白（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａら、（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６−１４９９９）の葉緑体小型サブユニットを包含する。更に又、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら、（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら、（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１も参照できる。
【０１１１】
葉緑体の形質転換のための方法は当該分野で知られている。例えばＳｖａｂら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ及びＭａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ及びＭａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：６０１−６０６を参照できる。方法は選択可能なマーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガン送達及び相同組み換えを介した色素体ゲノムへのＤＮＡのターゲティングに基づいている。更に又、色素体形質転換は、核コード及び色素体指向のＲＮＡポリメラーゼの組織好適発現によるサイレント色素体媒介トランスジーンのトランス活性化により達成できる。このような系はＭｃＢｒｉｄｅら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５において報告されている。
【０１１２】
葉緑体にターゲティングすべき目的のポリヌクレオチドは植物の核とこの小器官との間のコドンの使用における差に相当するように葉緑体における発現に関して最適化してよい。この態様において、目的のポリヌクレオチドは葉緑体好適コドンを用いて合成してよい。例えば参考として本明細書に援用される米国特許５，３８０，８３１を参照できる。
【０１１３】
「遺伝子」とは、特定の蛋白を発現するポリヌクレオチド、一般的には例えばコード配列（即ち特定の蛋白をコードする配列の部分）に先行（５’非コード配列）及び後続（３’非コード配列）する調節配列を包含する。「ネイティブ遺伝子」とは一般的に自身の調節配列を伴って天然に存在する遺伝子を指す。「トランスジーン」とは、形質転換操作法によりゲノム内に導入されている遺伝子を刺す。従って、「トランスジェニック植物」とは、トランスジーンを含有する植物であり、トランスジーンの特定の植物内への導入が形質転換によるか、育種によるかは問われず；即ち、最初に形質転換された植物の子孫はこの定義に包含される。
【０１１４】
ＩＩＩ．導入方法
本発明の植物は植物内にポリペプチド又はポリヌクレオチドを導入することにより発生させる。「導入する」とは植物の細胞の内部に配列が接触可能となるような態様においてポリヌクレオチド又はポリペプチドを植物に提供することを意味する。本発明の方法は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを少なくとも１つの植物細胞の内部に接触可能とするのみである植物内に配列を導入するために特定の方法に依存していない。植物内にポリヌクレオチド又はポリペプチドを導入するための方法は当該分野で知られており、そして限定しないが、安定な形質転換方法、一過性の形質転換方法、ウィルス媒介性の方法及び育種が包含される。
【０１１５】
「安定な形質転換」とは植物内に導入されたヌクレオチドコンストラクトが植物のゲノム内に組み込まれ、そしてその子孫により継承され得るという意味を意図している。「一過性の形質転換」とはポリヌクレオチドが植物内に導入され、そして植物のゲノムに組み込まれないか、又はポリペプチドが植物内に導入されるという意味を意図している。
【０１１６】
形質転換プロトコル並びにポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列を植物に導入するためのプロトコルは形質転換の為にターゲティングされる植物又は植物細胞の型（即ち単子葉又は双子葉）により変動してよい。植物細胞にポリペプチド及びポリヌクレオチドを導入するための適当な方法はマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら、（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら、（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６，アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許５，５６３，０５５及び米国特許５，９８１，８４０）、直接的な遺伝子移行（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）、及びバリスティック粒子加速（例えば、米国特許第４，９４５，０５０；米国特許５，８７９，９１８；米国特許５，８８６，２４４；及び、５，９３２，７８２；Ｔｏｍｅｓら、（１９９５）ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ、及びＯｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅら、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６参照）；及びＬｅｃｌ形質転換（ＷＯ  ００／２８０５８）を包含する。更に又Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら、（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ及びＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅら、（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ及びＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈら、（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａら、（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（コメ）；Ｋｌｅｉｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；米国特許第５，２４０，８５５；５，３２２，７８３；及び、５，３２４，６４６；Ｋｌｅｉｎら、（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら、（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；永久公開識別子ＩＰＣＯＭ００００３３４０２Ｄ，ＩＰＣＯＭ００００３３４０２Ｄ、及びＩＰＣＯＭ００００３３４０２Ｄの下に「ＩＰ．ｃｏｍ」により電子的に公開され、そして「ＩＰ．ｃｏｍ」ウエブサイトで入手可能なプロトコル（メンカ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４；米国特許５，７３６，３６９（穀物）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ  Ｗｅｔら、（１９８５）、Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎら、（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８及びＫａｅｐｐｌｅｒら、（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（フィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）−媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら、（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５及びＣｈｒｉｓｔｏｕ及びＦｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３（コメ）；Ｏｓｊｏｄａら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（トウモロコシ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ使用）を参照でき；これら全ては参考として本明細書に援用される。
【０１１７】
特定の実施形態においては、除草剤耐性又は他の望ましい配列は種々の一過性の形質転換の方法を用いて植物に提供できる。そのような一過性の形質転換の方法は限定しないが、植物内への直接のポリペプチド又はその変異体及びフラグメントの導入、又は、植物内への転写産物の導入を包含する。そのような方法は例えばマイクロインジェクション又は粒子衝突を包含する。例えば全て参考として本明細書に援用されるＣｒｏｓｓｗａｙら、（１９８６）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：１７９−１８５；Ｎｏｍｕｒａら、（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４４：５３−５８；Ｈｅｐｌｅｒら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：２１７６−２１８０及びＨｕｓｈら、（１９９４）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０７：７７５−７８４を参照できる。或いは、除草剤耐性ポリヌクレオチドは当該分野で知られている手法を用いて植物内に一過性に形質転換することができる。そのような手法はウィルスベクター系及び後のＤＮＡ放出を妨害する態様におけるポリヌクレオチドの沈殿を包含する。即ち、粒子結合ＤＮＡからの転写が起こりえるが、それが放出されてゲノム内に組み込まれる頻度は大きく低下する。そのような方法はポリエチルイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ＃Ｐ３１４３）でコーティングされた粒子の使用を包含する。
【０１１８】
他の実施形態においては、ポリヌクレオチドはウィルス又はウィルス核酸に植物を接触させることにより植物内に導入してよい。一般的に、そのような方法ではヌクレオチドコンストラクトをウィルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に取り込ませる。目的のポリペプチドを先ずウィルスポリ蛋白の部分として合成してよく、これを後にインビボ又はインビトロの蛋白分解によりプロセシングすることにより所望の組み換え蛋白を生成してよいと認識される。更に又、有用なプロモーターはウィルスＲＮＡポリメラーゼによる転写の為に利用されるプロモーターを包含してよい。植物内にポリヌクレオチドを導入し、そしてそれによりコードされるポリペプチド、例えばウィルスＤＮＡ又はＲＮＡを発現するための方法は当該分野で知られている。例えば参考として本明細書に援用される米国特許５，８８９，１９１、５，８８９，１９０、５，８６６，７８５、５，５８９，３６７、５，３１６，９３１、及びＰｏｒｔａら、（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２０９−２２１を参照できる。
【０１１９】
植物ゲノムの特定の位置におけるポリヌクレオチドのターゲティングされた挿入のための方法は当該分野で知られている。１つの実施形態において、所望のゲノム位置におけるポリヌクレオチドの挿入は部位特異的組み換え系を用いながら達成される。例えば全て参考として本明細書に援用されるＷＯ９９／２５８２１、ＷＯ９９／２５８５４、ＷＯ９９／２５８４０、ＷＯ９９／２５８５５及びＷＯ９９／２５８５３を参照できる。慨すれば、ポリヌクレオチドは、非組換え誘発性（ｎｏｎ−ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）組み換え部位２つに挟まれた転移カセット内に含有させることができる。適切なリコンビナーゼが提供され、そして転移カセットを標的部位において組み込む。これにより目的のポリヌクレオチドが植物ゲノムの特定の染色体位置において組み込まれる。
【０１２０】
形質転換された細胞は従来の方法に従って生育させることにより植物としてよい。例えばＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ５：８１−８４を参照できる。次にこれ等の植物を生育させ、そして同じ形質転換系統又は異なる系統を用いて受粉させ、そして得られる所望の表現型特性の構成的発現を有する子孫を発見する。２世代以上を生育させることにより所望の表現型特性の発現が安定に維持され、継承されているかを確認してよく、そして次に種子を収穫することにより所望の表現型特性の発現が達成されていることを確認してよい。この態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、例えば本発明の発現カセットを自身のゲノム内に安全に取り込んだ状態で保有する形質転換された種子（「トランスジェニック種子」とも称する）を提供する。
【０１２１】
特定の実施形態においては、目的のポリペプチド又はポリヌクレオチドを植物細胞内に導入する。その後、導入された本発明の配列を有する植物細胞を当該分野で知られた方法、例えばサザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析又は表現型分析を用いて選択する。上記した実施形態により改変又は改質された植物又は植物の部分を植物内のポリペプチドの濃度及び／又は活性をモジュレートするために十分な時間、植物形成条件下において生育させる。植物形成条件は当該分野で良く知られており、本明細書において別途簡単に考察する。
【０１２２】
目的ポリペプチドのレベル及び／又は活性は形質転換された植物において蛋白又はＲＮＡの発現を指向することができるポリヌクレオチドを使用することによりモジュレートしてよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは生物におけるゲノムヌクレオチド配列を改変又は突然変異させるための方法において使用できるポリヌクレオチドコンストラクトを設計するために使用してよい。そのようなポリヌクレオチドコンストラクトは、限定しないが、ＲＮＡ：ＤＮＡベクター、ＲＮＡ：ＤＮＡ突然変異ベクター、ＲＮＡ：ＤＮＡ修復ベクター、混合デュプレックスオリゴヌクレオチド、自己相補ＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び組み換え誘発性オリゴヌクレオチドを包含する。このようなヌクレオチドコンストラクト及び使用方法は当該分野で知られている。米国特許５，５６５，３５０；５，７３１，１８１；５，７５６，３２５；５，７６０，０１２；５，７９５，９７２；及び５，８７１，９８４を参照することができ；これらはすべて参考として本明細書に援用される。更に又、ＷＯ  ９８／４９３５０、ＷＯ  ９９／０７８６５、ＷＯ  ９９／２５８２１及びＢｅｅｔｈａｍら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：８７７４−８７７８も参照することができ；これらはすべて参考として本明細書に援用される。
【０１２３】
従って、本発明の方法は、ゲノム内へのポリヌクレオチド全体の取り込みには依存せず、細胞内へのポリヌクレオチドの導入の結果として植物又はその細胞が改変されるのみであることが認識される。本発明の１つの実施形態において、ゲノムは細胞内へのポリヌクレオチドの導入の後にゲノムを改変してよい。例えば、ポリヌクレオチド又はその何れかの部分を植物のゲノム内に取り込んでよい。本発明のゲノムの改変は、限定しないが、ゲノム内のヌクレオチドの付加、欠失及び置換を包含する。本発明の方法はヌクレオチドの何れかの特定数の付加、欠失及び置換に依存していないが、そのような付加、欠失及び置換は少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
【０１２４】
本発明の植物は、何れかの適当な方法、例えば育種により生産してよい。植物の育種は目的の特定の植物系統内に所望の特性（例えば安定に取り込まれたトランスジーン又は目的の遺伝子変異体又は遺伝子改変）を導入するために使用できる。血統の育種は、２つの遺伝子型、例えば目的のエリート系統と、目的のエリート植物系統を補う所望の特性１つ以上を有する（即ち目的のポリヌクレオチドを安定に取り込んでいる、目的のポリペプチドのモジュレートされた活性及び／又はレベルを有する等）１つの他のエリート近親血統系統の交配により開始される。２つの元の親が所望の特性を提供しない場合は、他の原料を育種集団内に包含させることができる。血統方法（ｐｅｄｉｇｒｅｅ  ｍｅｔｈｏｄ）においては、優秀な植物を自殖させ、後続する雑種世代において選択する。後続する雑種世代において、ヘテロ接合条件は自家受粉及び選択の結果として同種系統を優先させる。血統育種方法においては典型的には、自殖及び選択の後続雑種世代５世代以上、例えばＦ１→Ｆ２；Ｆ２→Ｆ３；Ｆ３→Ｆ４；Ｆ４→Ｆ５等を実施する。十分な量の近親交配の後、後続雑種世代は発生した近親種子を増大させる働きを有する。特定の実施形態においては、近親系統はその遺伝子座の約９５％以上でホモ接合の対立遺伝子を含む。当該分野で知られた種々の手法を使用することにより育種（例えば戻し交配）プロセスを促進及び加速させることができ、例えば加速された昼夜サイクルの温室又は生育チャンバーの使用、所望の子孫を発見するための分子マーカーの分析等を包含する。
【０１２５】
戻し交配の変換を作製するために使用する以外に、戻し交配はまた目的のエリート系統を改質するための血統育種及び改質されたエリート系統を用いて作製された雑種と組み合わせて使用することができる。前記した通り、戻し交配はドナー親である１つの系統から全体的には良好な作物上の特性を有するが所望の形質を欠いている反復親と称される近親への特定の望ましい形質１つ以上の移入の為に使用できる。しかしながら、同じ方法を用いて子孫を反復親の遺伝子型に誘導しつつ、早期に戻し交配を停止させること及び自殖及び選択を進行させることにより非反復親の多くの要素を維持することができる。例えばＦ１、例えば市販の雑種を作製する。この市販の雑種をその親系統の１つと戻し交配することによりＢＣ１又はＢＣ２を作製してよい。子孫は、新しく発生した近親が反復親の属性の多くを、そしてなお、非反復親の望ましい属性の幾つかを有するように自殖及び選択する。この方法は新しい雑種及び育種における使用のための反復親の価値及び強度を増幅させる。
【０１２６】
従って、本発明の実施形態は、所望の形質（例えば除草剤耐性）を付与する突然変異遺伝子又はトランスジーン少なくとも１つを含むドナー植物に目的の近親系統由来の植物を交配する工程、所望の形質を付与する突然変異遺伝子又はトランスジーンを含むＦ１子孫植物を選択する工程、及び、選択されたＦ１子孫植物を目的の近親系統の植物に戻し交配する工程を含む目的の近親系統の戻し交配変換を行う方法である。この方法は更に、目的の近親系統の分子マーカープロファイルを得る工程、及び、分子マーカープロファイルを使用することにより所望の形質及び目的近親系統の分子マーカープロファイルを有する子孫植物を選択する工程を含んでよい。同様の態様において、本方法は、所望の形質を付与する突然変異遺伝子又はトランスジーンを含むＦ１雑種種子を作製するために異なる植物と目的の近親系統の所望の形質変換を交配する最終工程を付加することによりＦ１雑種種子を作製するために使用してよい。
【０１２７】
反復選択は植物の集団を改良する植物育種プログラムにおいて使用される方法である。方法は子孫を形成するために相互に交配受粉する個々の植物を必要とする。子孫を生育させ、優秀な子孫を何れかの数の選択方法により選択し、それには、個々の植物、半同胞（ｈａｌｆ−ｓｉｂ）子孫、完全同胞（ｆｕｌｌ−ｓｉｂ）子孫、自殖子孫及びトップ交配が包含される。選択された子孫は相互に交差受粉させることにより別の集団の子孫を形成する。この集団を植栽し、再度、優秀な植物を選択して相互に交差受粉させる。反復選択は周期性のプロセスであり、従って、所望通りの多数回繰り返すことができる。反復選択の目的は集団の形質を向上させることである。次に向上した集団を育種材料の原料として使用することにより、雑種において使用されるべき、又は、合成の栽培変種植物のための親として使用されるべき、近親系統を得ることができる。合成の栽培変種植物は数種の選択された近親の相互交配により形成される結果的な子孫である。
【０１２８】
分子マーカー増強選択と連携して使用する場合には集団選抜法が有用な手法である。集団選抜法の場合は固体由来の種子は表現型及び／又は遺伝子型に基づいて選択する。次にこれ等の選択された種子をバルク（ｂｕｌｋ）にし、次世代の生育の為に使用する。バルク選択（ｂｕｌｋ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）はバルク区画内で植物集団を生育させることを必要とし、これにより、植物が自己受粉し、種子をバルクで収穫し、次にバルクで収穫した種子の試料を用いることにより次世代を植栽する。自殖受粉の代わりに、指向性受粉を育種プログラムの一部として使用できる。
【０１２９】
突然変異育種はエリート系統に新しい形質を導入するために使用できる多くの方法の１つである。自発的に起こる、又は、人工的に誘導された突然変異は植物育種者に多様性の有用な入手元となる。人工的突然変異誘発の最終目的は所望の特性のための突然変異の比率を増大させることである。突然変異比率は温度、長期種子貯蔵、組織培養条件、放射線照射、例えばＸ線、ガンマ線（例えばコバルト６０又はセシウム１３７）、中性子、（原子炉内のウラン２３５の核分裂の産物）、ベータ照射（リン３２及び炭素１４のような放射性同位体から発射される）、又は、紫外線照射（好ましくは２５００〜２９００ｎｍ）又は化学的突然変異誘発物質（例えば塩基のアナログ（５−ブロモ−ウラシル）、関連化合物（８−エトキシカフェイン）、抗生物質（ストレプトニグリン）、アルキル化剤（イオウマスタード、窒素マスタード、エポキシド、エチレンアミン、スルフェート、スルホネート、スルホン、ラクトン）、アジド、ヒドロキシルアミン、亜硝酸又はアクリジンを包含する多くの異なる手段により増大させることができる。突然変異誘発により所望の形質が観察された後、次にその形質を、戻し交配のような伝統的育種手法を用いて既存の生殖細胞質内に取り込ませてよい。突然変異育種の詳細は参考として本明細書に援用されるＰｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｆｅｈｒ、１９９３  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。更に又、他の系統内で発生させた突然変異を、そのような突然変異を含むエリート系統の戻し交配変換をもたらすために使用してよい。
【０１３０】
ＩＶ．発現をモジュレートする方法
一部の実施形態においては、ポリペプチドの活性及び／又はレベルをモジュレート（即ち増大又は低減）する。ポリペプチドの活性及び／又はレベルの増大は植物にポリペプチドを提供することにより達成できる。本明細書において別途記載する通り、植物にポリペプチドを提供するための多くの方法が知られており、例えば限定しないが、植物へのポリペプチドの直接の導入、所望の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドコンストラクトの植物への導入（一過性又は安定的）が包含される。更に又、本発明の方法は蛋白又はＲＮＡの発現を形質転換植物内で指向することができないポリヌクレオチドを使用する場合があることも認識される。即ち、ポリペプチドのレベル及び／又は活性はポリペプチドをコードする遺伝子又はそのプロモーターを改変することによりモジュレートしてよい。例えばＫｍｉｅｅの米国特許５，５６５，３５０；Ｚａｒｌｉｎｇ等のＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照できる。従って、突然変異が遺伝子の発現を増大させるか、コードされるポリペプチドの活性を増大させるような遺伝子における突然変異を担持した突然変異誘発された植物が提供される。
【０１３１】
他の実施形態においては、ポリペプチドの活性及び／又はレベルは、ポリペプチドのレベル又は活性を阻害するポリヌクレオチドを植物内に導入することにより、低減又は排除する。ポリヌクレオチドは対応するメッセンジャーＲＮＡの翻訳を防止することにより直接、又は、蛋白をコードする遺伝子の転写又は翻訳を阻害するポリヌクレオチドをコードすることにより間接的に、ポリペプチドの発現を阻害してよい。植物内の遺伝子の発現を阻害又は排除するための方法は当該分野で良く知られており、そして何れかのそのような方法を本発明において使用することにより植物内での遺伝子の発現を阻害してよい。本発明の他の実施形態においては、ポリペプチドの活性は、そのポリペプチドの活性を阻害するポリペプチドをコードする配列で植物細胞を形質転換することにより低減又は排除する。他の実施形態においては、ポリペプチドの活性はポリペプチドをコードする遺伝子を破壊することにより低減又は排除してよい。本発明は、目的の遺伝子において突然変異を担持する突然変異誘発された植物を包含し、ここでその突然変異は、遺伝子発現を低減するか、又はコードされるポリペプチドの活性を阻害する。
【０１３２】
特定の遺伝子の活性の低減（遺伝子サイレンシング又は遺伝子抑制としても知られている）は植物における遺伝子操作の幾つかの特徴に関して望ましい。遺伝子サイレンシングのための多くの方法が当該分野で良く知られており、例えば限定しないが、アンチセンス手法（例えば、Ｓｈｅｅｈｙら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８８０５−８８０９；及び米国特許第５，１０７，０６５号；同第５，４５３，５６６号；及び同第５，７５９，８２９号参照）；同時抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）（例えばＴａｙｌｏｒ（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：１２４５；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．８（１２）：３４０−３４４；Ｆｌａｖｅｌｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３４９０−３４９６；Ｆｉｎｎｅｇａｎら、（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８８３−８８８；及びＮｅｕｈｕｂｅｒら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４：２３０−２４１）；ＲＮＡ干渉（Ｎａｐｏｌｉら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９；米国特許第５，０３４，３２３号；Ｓｈａｒｐ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１３９−１４１；Ｚａｍｏｒｅら、（２０００）Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３；及びＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｕｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１５５０２−１５５０７）、ウィルス誘導遺伝子サイレンシング（Ｂｕｒｔｏｎら、（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：６９１−７０５；及びＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏ．２：１０９−１１３）；標的−ＲＮＡ−特異的リボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１）；ヘアピン構造（Ｓｍｉｔｈら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：３１９−３２０；ＷＯ  ９９／５３０５０；ＷＯ  ０２／００９０４；ＷＯ  ９８／５３０８３；Ｃｈｕａｎｇ及びＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：４９８５−４９９０；Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋら、（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７２３−１７３１；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ及びＨｅｌｌｉｗｅｌｌ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４：２９−３８；Ｐａｎｄｏｌｆｉｎｉら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００３０１７５９６５；Ｐａｎｓｔｒｕｇａら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３０：１３５−１４０；Ｗｅｓｌｅｙら、（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２７：５８１−５９０；Ｗａｎｇ及びＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５：１４６−１５０；米国特許出願２００３０１８０９４５；及びＷＯ０２／００９０４、これらはすべて参考として本明細書に援用される）；リボザイム（Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅら、（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１５２５；及びＰｅｒｒｉｍａｎら、（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：２５３）；オリゴヌクレオチド媒介ターゲティング修飾��例えばＷＯ  ０３／０７６５７４及びＷＯ  ９９／２５８５３）；Ｚｎ−フィンガーターゲティング分子（例えばＷＯ  ０１／５２６２０；ＷＯ  ０３／０４８３４５；及びＷＯ  ００／４２２１９）；トランスポゾンタグ付け（Ｍａｅｓら、（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４：９０−９６；Ｄｈａｒｍａｐｕｒｉ及びＳｏｎｔｉ（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７９：５３−５９；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：２６５−２７４；Ｐｈｏｇａｔら、（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．２５：５７−６３；Ｗａｌｂｏｔ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２：１０３−１０７；Ｇａｉら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：９４−９６；Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅら、（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５３：１９１９−１９２８；Ｂｅｎｓｅｎら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：７５−８４；Ｍｅｎａら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１５３７−１５４０；及び米国特許第５，９６２，７６４号）；これらの各々が参考として本明細書に援用され；そして当該分野で知られた他の方法及び上記方法の組合せが包含される。
【０１３３】
目的のポリヌクレオチドに関するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部分に相補的であるアンチセンスコンストラクトを構築できることが認識される。アンチセンスヌクレオチドは対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構築する。アンチセンス配列の修飾は、配列が対応するｍＲＮＡにハイブリダイズしてその発現を妨害する限り、行ってよい。この態様において、対応するアンチセンス配列に対して少なくとも７０％、最適には８０％、より最適には８５％の配列同一性を有するアンチセンスコンストラクトを使用してよい。更に又、アンチセンスヌクレオチドの部分を使用して標的遺伝子の発現を破壊してよい。一般的に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド以上の配列を使用してよい。
【０１３４】
ポリヌクレオチドは又植物における内因性遺伝子の発現を抑制するためにセンス方向で使用してよい。センス方向でポリヌクレオチドを使用しながら植物における遺伝子発現を抑制するための方法は当該分野で知られている。方法では一般的に、内因性遺伝子の転写産物に対応するポリヌクレオチドの少なくとも一部分に作動可能に連結した植物中の発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトで植物を形質転換する。典型的には、そのようなヌクレオチド配列は内因性遺伝子の転写産物の配列とかなりの配列同一性、一般的には約６５％、８５％又は９５％より高値の配列同一性を有する。参考として本明細書に援用される米国特許第５，２８３，１８４号及び同第５，０３４，３２３号を参照できる。即ち、多くの方法を用いてポリペプチドの活性を低減又は排除してよい。１つより多い方法を用いることにより単一のポリペプチドの活性を低減してよい。更に又、方法の組合せを使用することによりポリペプチドの活性を低減又は排除してよい。
【０１３５】
１つの実施形態においてポリヌクレオチドの発現は、直接的には例えば植物におけるポリヌクレオチド又はポリペプチド又は既知代謝産物のレベルを試験することにより（例えばＧＡＴ遺伝子を含有する植物中のＮ−アセチルグリホセート（「ＮＡＧ」）のレベルを試験することにより）、又は間接的には例えばそれを含有する植物をポリペプチドにより付与される形質、例えば除草剤抵抗性に関して評価することにより、測定してよい。
【０１３６】
Ｖ．雑草を制御する方法
耕作区域における雑草を制御するため、耕作区域における除草剤抵抗性雑草の発達又は出現を防止するため、作物を生産するため、及び作物の安全性を向上させるための方法を提供する。「制御すること」及びそれから派生する用語、例えば「雑草を制御すること」とは生育、発芽、繁殖及び／又は増殖を抑制すること；及び／又は雑草の殺傷、除去、破壊又は他の態様においてその発生及び／又は活性を減衰させることの１つ以上を指す。
【０１３７】
本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤植物は除草剤に対して改質された耐性を示し、そしてそのため、対照植物には有意な損傷を与えるような比率における除草剤１つ以上の適用を可能にし、そして更に通常適用されるよりも低濃度における除草剤の組合せの適用を可能にしつつ、なお選択的に雑草を制御できる。更に又、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は除草剤ブレンド技術と組み合わせて使用でき、そしてこれにより化学的農薬の適用を生産者にとってより好都合、経済的及び効果的なものとする。
【０１３８】
本発明の方法は本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性作物種子又は植物を耕作区域に植栽すること、及び、特定の実施形態においては、何れかの作物、作物の部分、雑草又はそれらの耕作区域に対して、有効量の目的除草剤を適用することを含む。除草剤は耕作区域に作物を植栽する前又は後に適用できると認識される。そのような除草剤の適用はグリホセート、ＡＬＳ阻害剤化学物質又はそれらの他の組合せの適用を包含できる。特定の実施形態においては、グリホセートと組み合わせたＡＬＳ阻害剤化学物質の混合物をグリホセートＡＬＳ阻害剤耐性植物に適用し、その場合、ＡＬＳ阻害剤化学物質の少なくとも２種の有効濃度は該当対照植物を有意に損傷する。１つの非限定的な実施形態において、除草剤はスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン；トリアゾロピリミジン；ピリミジニル（チオ）ベンゾエート；イミダゾリノン；トリアジン；及び／又はホスフィン酸の少なくとも１つを含む。
【０１３９】
別の非限定的な実施形態において、除草剤の組合せはグリホセート、イマザピル、クロリムロン−エチル、キザロホップ及びフォメサフェンを含み、ここで該有効量は作物及び対照雑草により許容される。本明細書に別途開示する通り、これ等の除草剤の何れかの有効量を適用できる。特定の実施形態においては、この除草剤組合せは、約１１１０〜約１１３０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含むグリホセートの有効量；約７．５〜約２７．５ｇ  ａｉ／ヘクタールを含むイマザピルの有効量；約７．５〜約２７．５ｇ  ａｉ／ヘクタールを含むクロリムロン−エチルの有効量；約５０〜約７０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含むキザロホップの有効量；そして約２４０〜約２６０ｇ  ａｉ／ヘクタールを含むホメサフェンの有効量を含む。
【０１４０】
１つの実施形態において、２種の除草剤の少なくとも組合せを適用し、その場合、組合せはグリホセートを包含しない。別の実施形態においては、少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤及びグリホセートを植物に適用する。本発明の方法において使用できる種々の除草剤組合せに関しては本明細書において別途、更に詳細に考察する。
【０１４１】
１つの実施形態においては、雑草を制御する方法は、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性作物種子又は植物を区域に植栽すること、及び作物、作物の部分、該作物の種子又は栽培中の区域に除草剤有効量を適用することを含み、ここで該有効量は：
ｉ）第１の対照作物、作物の部分、種子又は耕作区域に適用した場合に第１の対照作物により許容されない量、ここで該第１の対照作物はグリホセートに対する耐性を付与する第１のポリヌクレオチドを発現し、そしてＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを発現しないもの；
ｉｉ）第２の作物、作物の部分、種子又は耕作区域に適用した場合に第２の対照作物により許容されない量、ここで該第２の対照作物は第２のポリヌクレオチドを発現し、そして第１のポリヌクレオチドを発現しないもの；および、
ｉｉｉ）グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性の作物、作物の部分、種子又はその耕作区域に適用した場合に許容される量；を含む。除草剤はグリホセートを包含するか包含しない除草剤の組合せを含むことができる。特定の実施形態においては、除草剤の組合せは後述において更に詳細に考察する通り、ＡＬＳ阻害剤化学物質を含む。
【０１４２】
別の実施形態においては、雑草を制御する方法はグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性の作物の種子又は植物を区域に植栽すること、及び、作物、作物の部分、該作物の種子、又は栽培中の区域に対して除草剤有効量を適用することを含み、ここで、該有効量は作物に対する推奨標示使用比率より高値のレベルを含み、そしてここで該有効量はグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性の作物、作物の部分、種子、又は耕作区域に適用した場合に許容される。適用される除草剤はグリホセートを包含するか包含しない除草剤の組合せを含むことができる。特定の実施形態においては、除草剤の組合せは後述において更に詳細に考察する通り、ＡＬＳ阻害剤化学物質少なくとも１つを含む。本発明の種々の方法において使用できる別の除草剤及びその組合せは後述において更に詳細に考察する。
【０１４３】
別の非限定的な実施形態において、本明細書に開示した何れかの方法において適用される除草剤はグリホセート、クロリムロン−メチル、リムスルフロン、トリベヌロン−メチル又はチフェンスフロン−メチルを含まない。
【０１４４】
ａ．除草剤の型
何れかの除草剤をグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性の作物、作物の部分又は該作物植物を含有する耕作区域に適用できる。除草剤の分類（即ち除草剤のクラス及びサブクラスへのグループ分け）は当該分野で良く知られており、ＨＲＡＣ（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及びＷＳＳＡ（ｔｈｅ  Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）による分類を包含する（更に又Ｒｅｔｚｉｎｇｅｒ及びＭａｌｌｏｒｙ−Ｓｍｉｔｈ（１９９７）Ｗｅｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：３８４−３９３を参照できる）。ＨＲＡＣ分類の簡約版（対応するＷＳＳＡグループに関する注記付）を後に示す表１に記載する。
【０１４５】
除草剤はその作用様式及び／又は作用部位により分類でき、そして、更にそれらが適用される時期（例えば発芽前又は発芽後）により、適用方法（例えば葉面適用又は土壌適用）により、又は、それらがどのようにして植物に取り込まれるか、又は影響するかにより、分類することもできる。例えば、チフェンスルフロン−メチル及びトリベヌロン−メチルは作物（例えばトウモロコシ）の葉面に適用され、そして一般的にそこで代謝されるが、リムスルフロン及びクロリムロン−エチルは一般的に植物の根及び葉の両方から取り込まれる。「作用様式」とは一般的に除草剤が阻害するか、又は別の態様で障害を与える植物内の代謝的又は生理学的なプロセスを指すのに対し、「作用部位」とは一般的に除草剤が作用するか直接相互作用する植物内部の生理学的な位置又は生化学的な部位を指す。除草剤は種々の方法で、例えば作用様式及び／又は作用部位により、分類することができる（例えば表１参照）。
【０１４６】
頻繁には、特定の除草剤又は他の化学物質に対する耐性を付与する除草剤耐性遺伝子は、それを発現している植物上では、更に、同じクラス又はサブクラス、例えば表１に示すクラス又はサブクラスの他の除草剤又は化学物質に対しても耐性を付与することになる。即ち、本発明の一部の実施形態においては、本発明のトランスジェニック植物は１種より多い同じクラス又はサブクラスの除草剤又は化学物質、例えばＰＰＯの阻害剤、スルホニル尿素又は合成オーキシンに対して耐性である。
【０１４７】
典型的には本発明の植物は異なる種々の型の除草剤（即ち異なる種々の作用様式及び／又は異なる作用部位を有する除草剤）による、並びに、以前より知られている植物の場合よりも大量の除草剤による処理を許容することができ、これにより、除草剤耐性雑草の発生及び蔓延を低減するために推奨される改良した雑草管理方策を可能にする。特定の除草剤の組合せを使用することにより効果的に雑草を制御できる。
【０１４８】
従って本発明はトランスジェニック作物を生育させるべき区域における除草剤耐性雑草種の蔓延に基づいた、作物生産における使用の為に選択できるトランスジェニック作物植物を提供する。種々の雑草種の除草剤耐性を試験するための方法は当該分野で知られている。雑草管理手法も当該分野で知られており、例えば地域的雑草種が耐性ではない除草剤に対して耐性である作物を用いた作物ローテーションが挙げられる。多くの機関、例えばＨｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＲＡＣ）、ｔｈｅ  Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ及び色々な州当局が除草剤耐性雑草の発生及び特性をモニタリングして発表（例えば２００４  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋの種々の広葉樹雑草に関する除草剤耐性資料参照）しており、当業者はこの情報を使用することにより特定の地域においてどの作物及び除草剤の組合せを使用すべきか決定することができる。
【０１４９】
これ等の機関はまた除草剤耐性雑草の発達及び／又は出現を防止し、そして拡大を制御するための助言と指針を発表している（例えばＯｗｅｎ及びＨａｒｔｚｌｅｒ（２００４）、２００５  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ、Ｐｕｂ．ＷＣ  ９２  Ｒｅｖｉｓｅｄ（Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉバルｓｉｔｙ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ及びＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｓ、Ｉｏｗａ）；Ｗｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ、Ｓｏｙｂｅａｎｓ、及びＳｏｒｇｈｕｍ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ｏｆ  ２００４  Ｉｌリンｏｉｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌリンｏｉｓ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌリンｏｉｓ  ａｔ  Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））；Ｗｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｅｌｄ  Ｃｒｏｐｓ、ＭＳＵ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｅ４３４（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｅａｓｔ  Ｌａｎｓｉｎｇ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）参照）。
【０１５０】
表１．ＨＲＡＣ除草剤分類の簡約版
Ｉ．ＡＬＳ阻害剤（ＷＳＳＡグループ２）
Ａ．スルホニル尿素
１．アジムスルフロン
２．クロリムロン−エチル
３．メトスルフロン−メチル
４．ニコスルフロン
５．リムスルフロン
６．スルホメツロン−メチル
７．チフェンスルフロン−メチル
８．トリベヌロン−メチル
９．アミドスルフロン
１０．ベンスルフロン−メチル
１１．クロルスルフロン
１２．シノスルフロン
１３．シクロスルファムロン
１４．エタメトスルフロン−メチル
１５．エトキシスルフロン
１６．フラザスルフロン
１７．フルピルスルフロン−メチル
１８．ホラムスルフロン
１９．イマゾスルフロン
２０．ヨードスルフロン−メチル
２１．メソスルフロン−メチル
２２．オキサスルフロン
２３．プリミスルフロン−メチル
２４．プロスルフロン
２５．ピラゾスルフロン−エチル
２６．スルホスルフロン
２７．トリアスルフロン
２８．トリフロキシスルフロン
２９．トリフルスルフロン−メチル
３０．トリトスルフロン（ｔｒｉｔｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）
３１．ハロスルフロン−メチル
３２．フルセトスルフロン
Ｂ．スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン
１．フルカルバゾン
２．プロカルバゾン
Ｃ．トリアゾロピリミジン
１．クロランスラン−メチル
２．フルメツラム
３．ジクロスラム
４．フロラスラム
５．メトスラム
６．ペノクスラム
７．ピロクスラム
Ｄ．ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート
１．ビスピリバク
２．ピリフタリド
３．ピリベンゾキシム
４．ピリチオバク
５．ピリミノバク−メチル
Ｅ．イミダゾリノン
１．イマザピル
２．イマゼタピル
３．イマザキン
４．イマザピク
５．イマザメタベンズ−メチル
６．イマザモックス。
【０１５１】
ＩＩ．他の除草剤活性成分／別の作用機序
Ａ．アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤（ＷＳＳＡグループ１）
１．アリールオキシフェノキシプロピオネート（‘ＦＯＰｓ’）
ａ．キザロホップ−Ｐ−エチル
ｂ．ジクロホップ−メチル
ｃ．クロジナホップ−プロパルギル
ｄ．フェノキサプロプ−Ｐ−エチル
ｅ．フルアジホップ−Ｐ−ブチル  
ｆ．プロパキザホップ
ｇ．ハロキシホップ−Ｐ−メチル  
ｈ．シハロホップ−ブチル  
ｉ．キザロホップ−Ｐ−エチル  
２．シクロヘキサンジオン（‘ＤＩＭｓ’）
ａ．アロキシジム
ｂ．ブトロキシジム
ｃ．クレソジム
ｄ．シクロキシジム
ｅ．セトキシジム
ｆ．テプラロキシジム
ｇ．トラルコキシジム
Ｂ．光化学系ＩＩの阻害剤-ＨＲＡＣグループＣｌ／ＷＳＳＡグループ５
１．トリアジン
ａ．アメトリン
ｂ．アトラジン
ｃ．シアナジン
ｄ．デスメトリン
ｅ．ジメタメトリン
ｆ．プロメトン
ｇ．プロメトリン
ｈ．プロパジン
ｉ．シマジン
ｊ．シメトリン
ｋ．テルブメトン
１．テルブチラジン
ｍ．テルブトリン
ｎ．トリエタジン
２．トリアジノン
ａ．ヘキサジノン
ｂ．メトリブジン
ｃ．メトラミトロン
３．トリアゾリノン
ａ．アミカルバゾン
４．ウラシル
ａ．ブロマシル
ｂ．レナシル
ｃ．テルバシル
５．ピリダジノン
ａ．ピラゾン
６．フェニルカーバメート
ａ．デスメジファム
ｂ．フェンメジファム
Ｃ．光化学系ＩＩの阻害剤−ＨＲＡＣグループＣ２／ＷＳＳＡグループ７  
１．尿素
ａ．フルオメツロン
ｂ．リヌロン
ｃ．クロロブロムロン
ｄ．クロロトルロン
ｅ．クロロクスロン
ｆ．ジメフロン
ｇ．ジウロン
ｈ．エチジムロン
ｉ．フェヌロン
ｊ．イソプロツロン
ｋ．イソウロン
１．メタベンズチアズロン
ｍ．メトブロムロン
ｎ．メトクスロン
ｏ．モノリヌロン
ｐ．ネブロン
ｑ．シズロン
ｒ．テブチウロン
２．アミド
ａ．プロパニル
ｂ．ペンタノクロル
Ｄ．光化学系ＩＩの阻害剤−ＨＲＡＣグループＣ３／ＷＳＳＡグループ６
１．ニトリル
ａ．ブロモフェノキシム
ｂ．ブロモキシニル
ｃ．イオキシニル
２．ベンゾチアジアジノン（ベンタゾン）
ａ．ベンタゾン
３．フェニルピリダジン
ａ．ピリデート
ｂ．ピリダフォル
Ｅ．光化学系−Ｉ−電子ダイバージョン（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）（ビピリジリウム）（ＷＳＳＡグループ２２）
１．ダイコート
２．パラコート
Ｆ．ＰＰＯ阻害剤（プロトポリフィリノーゲンオキシダーゼ）（ＷＳＳＡグループ１４）
１．ジフェニルエーテル
ａ．アシフルオルフェン−Ｎａ
ｂ．ビフェノックス
ｃ．クロメトキシフェン
ｄ．フルオログリコフェン−エチル
ｅ．フォマサフェン
ｆ．ハロサフェン
ｇ．ラクトフェン
ｈ．オキシフルオルフェン
２．フェニルピラゾール
ａ．フルアゾレート
ｂ．ピラフフェン−エチル
３．Ｎ−フェニルフタルイミド
ａ．シニドン−エチル
ｂ．フルミオキサジン
ｃ．フルミクロラク−ペンチル
４．チアジアゾール
ａ．フルチアセト−メチル
ｂ．チジアジミン
５．オキサジアゾール
ａ．オキサジアゾン
ｂ．オキサジアルギル
６．トリアゾリノン
ａ．カルフェントラゾン−エチル  
ｂ．スルフェントラゾン
７．オキサゾリジンジオン  
ａ．ペントキサゾン
８．ピリミジンジオン  
ａ．ベンズフェンジゾン
ｂ．ブタフェニシル
９．その他
ａ．ピラゾギル
ｂ．プロフルアゾール
Ｇ．退色（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）：フィトエンデサチュラーゼ工程におけるカロテノイド生合成の抑制（ＰＤＳ）（ＷＳＳＡグループ１２）
１．ピリダジノン
ａ．ノルフラゾン
２．ピリジンカルボキサミド
ａ．ジフルフェニカン
ｂ．ピコリナフェン
３．その他
ａ．ベフルブタミド
ｂ．フルリドン
ｃ．フルロクロリドン
ｄ．フルルタモン
Ｈ．退色：４−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（４−ＨＰＰＤ）の阻害（ＷＳＳＡグループ２８）
１．トリケトン
ａ．メソトリオン
ｂ．スルコトリオン
２．イソキサゾール
ａ．イソキサクロルトール
ｂ．イソキサフルトール
３．ピラゾール
ａ．ベンゾフェナップ
ｂ．ピラゾキシフェン
ｃ．ピラゾリネート
４．その他
ａ．ベンゾビシクロン
Ｉ．退色：カロテノイド生合成の阻害（未知標的）（ＷＳＳＡグループ１１及び１３）
１．トリアゾール（ＷＳＳＡグループ１１）
ａ．アミトロール
２．イソキサゾリジノン（ＷＳＳＡグループ１３）
ａ．クロマゾン
３．尿素
ａ．フルオメツロン
３．ジフェニルエーテル
ａ．アクロニフェン
Ｊ．ＥＰＳＰシンターゼの阻害
１．グリシン（ＷＳＳＡグループ９）
ａ．グリホセート
ｂ．スルホセート
Ｋ．グルタミン合成酵素の阻害
１．ホスフィン酸
ａ．グルホシネート−アンモニウム
ｂ．ビアラホス
Ｌ．ＤＨＰ（ジヒドロプテロエート）シンターゼの阻害（ＷＳＳＡグループ１８）
１  カーバメート
ａ．アズラム
Ｍ．微小管組立阻害（ＷＳＳＡグループ３）
１．ジニトロアニリン
ａ．ベンフルラリン
ｂ．ブトラリン
ｃ．ジニトラミン
ｄ．エラルフラリン
ｅ．オリザリン
ｆ．ペンジメタリン
ｇ．トリフラリン
２．ホスホロアミデート
ａ．アミプロホス−メチル
ｂ．ブタミホス
３．ピリジン
ａ．ジチオピル
ｂ．チアゾピル
４．ベンズアミド
ａ．プロナミド
ｂ．テブタム
５．ベンゼンジカルボン酸
ａ．クロルタール−ジメチル
Ｎ．有糸分裂／微小管組織化の阻害（ＷＳＳＡグループ２３）
１．カーバメート  
ａ．クロロフラム
ｂ．プロフラム
ｃ．カルベタミド
Ｏ．細胞分裂の阻害（提案される機序としての超長鎖脂肪酸の阻害；ＷＳＳＡグループ１５）
１．クロロアセトアミド
ａ．アセトクロル
ｂ．ラクロル
ｃ．ブタクロル
ｄ．ジメタクロル
ｅ．ジメタナミド
ｆ．メタザクロル
ｇ．メトラクロル
ｈ．ペトキサミド
ｉ．プレチラクロル
ｊ．プロパクロル
ｋ．プロピソクロル
ｌ．テニルクロル
２．アセトアミド
ａ．ジフェナミド
ｂ．ナプロパミド
ｃ．ナプロアニリド
３．オキシアセトアミド
ａ．フルフェナセト
ｂ．メフェナセト
４．テトラゾリノン
ａ．フェントラザミド
５．その他
ａ．アニロフォス
ｂ．カフェンストロール
ｃ．インダノファン
ｄ．ピペロホス
Ｐ．細胞壁（セルロース）合成阻害
１．ニトリル（ＷＳＳＡグループ２０）
ａ．ジクロベニル
ｂ．クロルチアミド
２．ベンザミド（イソキサベン（ＷＳＳＡグループ２１））
ａ．イソキサベン
３．トリアゾロカルボキサミド（フルポキサム）
ａ．フルポキサム
Ｑ．未カップリング（膜破壊）：（ＷＳＳＡグループ２４）
１．ジニトロフェノール
ａ．ＤＮＯＣ
ｂ．ジノセブ
ｃ．ジノターブ
Ｒ．ＡＣＣ阻害以外による脂質合成の阻害
１．チオカーバメート（ＷＳＳＡグループ８）
ａ．ブチレート
ｂ．シクロエート
ｃ．ジメピペレート
ｄ．ＥＰＴＣ
ｅ．エスプロカーブ
ｆ．モリネート
ｇ．オルベンカーブ
ｈ．ペブレート
ｉ．プロスルホカーブ
ｊ．ベンチオカーブ
ｋ．トリカルバジル
ｌ．トリアレート
ｍ．ベルノレート
２．ホスホロジチオエート
ａ．ベンスリド
３．ベンゾフラン
ａ．ベンフレセート
ｂ．エトフメセート
４．ハロゲン化アルカン酸（ＷＳＳＡグループ２６）
ａ．ＴＣＡ
ｂ．ダラポン
ｃ．フルプロパネート
Ｓ．合成オーキシン（ＩＡＡ様）（ＷＳＳＡグループ４）
１．フェノキシカルボン酸
ａ．クロメプロプ
ｂ．２，４−Ｄ
ｃ．メコプロプ
２．安息香酸
ａ．ジカンバ
ｂ．クロラムベン
ｃ．ＴＢＡ
３．ピリジンカルボン酸
ａ．クロピラリド
ｂ．フルロキシピル
ｃ．ピクロラム
ｄ．トリシクロピル
４．キノリンカルボン酸
ａ．クンクロラック
ｂ．キンメラック
５．その他（ベナゾリン−エチル）
ａ．ベナゾリン−エチル
Ｔ．オーキシン輸送の阻害
１．フタラメート；セミカルバゾン（ＷＳＳＡグループ１９）
ａ．ナプタラム
ｂ．ジフルフェンゾピル−Ｎａ
Ｕ．その他の作用機序
１．アリールアミノプロピオン酸
ａ．フラムプロプ−Ｍ−メチル／−イソプロピル
２．ピラゾリウム
ａ．ジフェンゾコート
３．有機砒素
ａ．ＤＳＭＡ
ｂ．ＭＳＭＡ
４．その他
ａ．ブロモブチド
ｂ．シンメスリン
ｃ．クミルロン
ｄ．ダゾメット
ｅ．ダイムロン−メチル
ｆ．ジムロン
ｇ．エトベンザニド
ｈ．フォサミン
ｉ．メタム（ｍｅｔａｍ）
ｊ．オキサジクロメフォン（ｏｘａｚｉｃｌｏｍｅｆｏｎｅ）
ｋ．オレイン酸
１．ペラルゴン酸
ｍ．ピリブチカルブ（ｐｙｒｉｂｕｔｉｃａｒｂ）。
【０１５２】
１つの実施形態において、１つのＡＬＳ阻害剤又は少なくとも２つのＡＬＳ阻害剤をグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性の作物又は耕作区域に適用する。１つの非限定的な実施形態において、ＡＬＳ除草剤の組合せはグリホセートを包含しない。ＡＬＳ除草剤は雑草を選択的に制御し、そして作物を有意に損傷させることのない何れかの有効な速度で適用できる。特定の実施形態においては、少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤を、該当対照植物を有意に損傷させるレベルにおいて適用する。別の実施形態においては少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤を作物に対する推奨標示使用比率より高値において適用する。更に別の実施形態においてはＡＬＳ阻害剤混合物を推奨使用比率より低値において適用し、雑草を選択的に制御し続ける。従ってアセトラクテートシンターゼ（アセトヒドロキシ酸シンターゼとしても知られている）を阻害し、そしてそのため本発明の方法において有用である除草剤は表１に列挙するスルホニル尿素、及び農業上適しているその塩（例えばナトリウム塩）；表１に列挙するスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、及び農業上適しているその塩（例えばナトリウム塩）；表１に列挙するトリアゾロピリミジン、及び農業上適しているその塩（例えばナトリウム塩）；表１に列挙するピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート、及び農業上適しているその塩（例えばナトリウム塩）；及び表１に列挙するイミダゾリノン、及び農業上適しているその塩（例えばナトリウム塩）を包含する。一部の実施形態においては、本発明の方法はクロリムロン−メチル、クロロスルフロン、リムスルフロン、トリフェンスルフロン−メチル又はトリベヌロン−メチルではないスルホニル尿素の使用を含む。
【０１５３】
更に別の方法においては、グリホセートは目的の他の除草剤と組合せて、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物又はその耕作区域に適用できる。グリホセート製剤の非限定的な例を表２に示す。特定の実施形態においては、グリホセートはアンモニウム、イソプロピルアンモニウム、カリウム、ナトリウム（セスキナトリウムを包含する）又はトリメシウム（別名スルホセート）との塩の形態となる。更に別の実施形態においてはグリホセート及びＡＬＳ阻害剤（例えばスルホニル尿素）の組合せの相乗作用有効量の混合物をグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物又はその耕作区域に適用する。
【０１５４】
【化１】
2009505654.tif 000003
即ち、一部の実施形態においては、本発明のトランスジェニック植物は、植物が耐性を示す除草剤の適用による、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性作物の生育の方法において使用する。この態様において、１つ以上の除草剤、例えば限定しないが、アセトクロル、アシフルオフェン及びそのナトリウム塩、アクロニフェン、アクロレイン（２−プロペナール）、アラクロル、アロキシジム、アメトリン、アミカルバゾン、アミドスルフロン、アミノピラリド、アミトロール、アンモニウムスルファメート、アニロホス、アスラム、アトラジン、アジムスルフロン、ベフルブタミド、ベナゾリン、ベナゾリン−エチル、ベンカルバゾン、ベンフルラリン、ベンフレセート、ベンスルフロン−メチル、ベンスリド、ベンタゾン、ベンゾビサイクロン、ベンゾフェナップ、ビフェノックス、ビラナホス、ビスピリバク及びそのナトリウム塩、ブロマシル、ブロモブチド、ブロモフェノキシム、ブロモキシニル、ブロモキシニルオクタノエート、ブタクロル、ブタフェナシル、ブタミホス、ブトラリン、ブトキシジム、ブチレート、カフェンストロール、カルベタミド、カルフェントラゾン−エチル、カテシン、クロメトキシフェン、クロラムベン、クロルブロムロン、クロルフルレノール−メチル、クロリダゾン、クロリムロン−エチル、クロロトルロン、クロルプロファム、クロルスルフロン、クロルタール−ジメチル、クロルチアミド、シニドン−エチル、シメチリン、シノスルフロン、クレトジム、クロジナホップ−プロパルギル、クロマゾン、クロメプロプ、クロピラリド、クピラリド−オラミン、クロランスラム−メチル、ＣＵＨ−３５（２−メトキシエチル２−［［［４−クロロ−２−フルオロ−５−［（１−メチル−２−プロピニル）オキシ］フェニル］（３−フルオロベンゾイル）アミノ］カルボニル］−１−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、クミルロン、シアナジン、シクロエート、シクロスルファムロン、シクロキシジム、シハロホップ−ブチル、２，４−Ｄ及びそのブトチル、ブチル、イソクチル及びイソプロピルエステル及びそのジメチルアンモニウム、ジオラミン及びトロラミン塩、ダイムロン、ダラポン、ダラポン−ナトリウム、ダゾメット、２，４−ＤＢ及びそのジメチルアンモニウム、カリウム及びナトリウム塩、デスメジファム、デスメトリン、ジカンバ及びそのジグリコールアンモニウム、ジメチルアンモニウム、カリウム及びナトリウム塩、ジクロベニル、ジクロプロプ、ジクロホップ−メチル、ジクロスラム、ジフェンゾコートメチルスルフェート、ジフルフェニカン、ジフルフェンゾピル、ジメフロン、ジメピペレート、ジメタクロル、ジメタメトリン、ジメテナミド、ジメテナミド−Ｐ、ジメチピン、ジメチルヒ酸及びそのナトリウム塩、ジニトラミン、ジノテルブ、ジフェナミド、ダイコートジブロミド、ジチオピル、ジウロン、ＤＮＯＣ、エンドタール、ＥＰＴＣ、エスプロカルブ、エタルフルラリン、エタメトスルフロン−メチル、エトフメセート、エトキシフェン、エトキシスルフロン、エトベンザニド、フェノキサプロプ−エチル、フェノキサプロプ−Ｐ−エチル、フェントラザミド、フェヌロン、フェヌロン−ＴＣＡ、フラムプロプ−メチル、フラムプロプ−Ｍ−イソプロピル、フラムプロプ−Ｍ−メチル、フラザスルフロン、フロラスラム、フルアジホップ−ブチル、フルアジホップ−Ｐ−ブチル、フルカルバゾン、フルセトスルフロン、フルクロラリン、フルフェナセット、フルフェンピル、フルフェンピル−エチル、フルメトスラム、フルミクロラック−ペンチル、フルミオキサジン、フルメツロン、フルオログリコフェン−エチル、フルピルスルフロン−メチル及びそのナトリウム塩、フルレノール、フルレノール−ブチル、フリドン、フルロクロリドン、フルオキシピル、フルルタモン、フルチアセト−メチル、フォメサフェン、ホラムスルフロン、フォサミン−アンモニウム、グルホシネート、グルホシネート−アンモニウム、グリホセート及びその塩、例えばアンモニウム、イソプロピルアンモニウム、カリウム、ナトリウム（セスキナトリウムを包含）及びトリメシウム（別名スルホセート）、ハロスルフロン−メチル、ハロキシホップ−エトチル、ハロキシホップ−メチル、ヘキサジノン、ＨＯＫ−２０１（Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）−１，５−ジヒドロ−Ｎ−（ｌ−メチルエチル）−５−オキソ−１−［（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチル］−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−４−カルボキサミド）、イマザメタベンズ−メチル、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマザキン−アンモニウム、イマザタピル、イマザタピル−アンモニウム、イマゾスルフロン、インダノファン、インドスルフロン−メチル、イオキシニル、イオキシニルオクタノエート、イオキシニル−ナトリウム、イソプロツロン、イソウロン、イソキサベン、イソキサフルトール、イソキサクロルトール、ラクトフェン、レナシル、リヌロン、マレイン酸ヒドラジド、ＭＣＰＡ及びその塩（例えばＭＣＰＡ−ジメチルアンモニウム、ＭＣＰＡ−カリウム及びＭＣＰＡ−ナトリウム、エステル（例えばＭＣＰＡ−２−エチルヘキシル、ＭＣＰＡ−ブトチル）及びチオエステル（例えばＭＣＰＡ−チオエチル）、ＭＣＰＢ及びその塩（例えばＭＣＰＢ−ナトリウム）及びエステル（例えばＭＣＰＢ−エチル）、メコプロプ、メコプロプ−Ｐ、メフェナセット、メフルイジド、メソスルフロン−メチル、メソトリオン、メタム−ナトリウム、メタミホップ、メタミトロン、メタザクロリ、メタベンズチアズロン、メチルアルソン酸及びそのカルシウム、モノアンモニウム、モノナトリウム及びジナトリウム塩、メチルジムロン、メトベンズロン、メトブロムロン、メトラクロリ、Ｓ−メトラクロル、メトスラム、メトキスロン、メトリブジン、メトスルフロン−メチル、モリネート、モノリヌロン、ナプロアニリド、ナプロパミド、ナプタラム、ネブロン、ニコスルフロン、ノルフラゾン、オルベンカルブ、オリザリン、オキサジアルギル、オキサジアゾン、オキサスルフロン、オキサジクロメホン、オキシフルオルフェン、パラコートジクロリド、ペブレート、ペラルゴン酸、ペンジメタリン、ペノクスラム、ペンタノクロル、ペントキサゾン、ペルフルイドン、ペトキシアミド、フェンメジファム、ピクロラム、ピクロラム−カリウム、ピコリナフェン、ピノキサデン、ピペロホス、プレチラクロル、プリミスルフロン−メチル、プロジアミン、プロホキシジム、プロメトン、プロメトリン、プロパクロル、プロパニル、プロパキザホップ、プロパジン、プロファム、プロピソクロル、プロポキシカルバゾン、プロピズアミド、プロスルホカルブ、プロスルフロン、ピラクロニル、ピラフルフェン−エチル、ピラスルホトール、ピラゾジル、ピラゾリネート、ピラゾキシフェン、ピラゾスルフロン−エチル、ピリベンゾキシム、ピリブチカルブ、ピリデート、ピリフタリド、ピリミノバク−メチル、ピリミスルファン、ピリチオバク、ピリチオバク−ナトリウム、ピロクスラム、キンクロラック、キンメラック、キノクラミン、キザロホップ−エチル、キザロホップ−Ｐ−エチル、キザロホップ−Ｐ−テフリル、リムスルフロン、セトキシジム、シズロン、シマジン、シメトリン、スルコトリオン、スルフェントラゾン、スルホメツロン−メチル、スルホスルフロン、２，３，６−ＴＢＡ、ＴＣＡ、ＴＣＡ−ナトリウム、テブタム、テブチウロン、テフリルトリオン、テムボトリオン、テプラロキシジム、テルバシル、テルブメトン、テルブチラジン、テルブトリン、テニルクロル、チアゾピル、チエンカルバゾン、チフェンスルフロン−メチル、チオベンカルブ、チオカルバジル、トプラメゾン、トラルコキシジム、トリアレート、トリアスルフロン、トリアジフラム、トリベヌロン−メチル、トリクロピル（ｔｒｉｃｌｏｐｙｒ）、トリクロピル−ブトチル、トリクロピル−トリエチルアンモニウム、トリジファン、トリエタジン、トリホキシスルフロン、トリフルラリン、トリフルスルフロン−メチル、トリトスルフロン及びベノレートの組合せによる処理を行う。
【０１５５】
他の適当な除草剤及び農薬は当該分野で知られており、例えばＷＯ２００５／０４１６５４に記載されているものが挙げられる。他の除草剤は又、バイオ除草剤、例えばＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ  Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ（Ｐｅｎｚ．）Ｐｅｎｚ．＆  Ｓａｃｃ，Ｄｒｅｃｈｓｉｅｒａ  ｍｏｎｏｃｅｒａｓ（ＭＴＢ−９５１），Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ  ＆  Ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚ）Ｄｉｔｍａｒ：Ｆｒｉｅｓ，Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｌｍｉｖｏｒａ（Ｂｕｔｌ．）Ｂｕｔｌ．及びＰｕｃｃｉｎｉａ  ｔｈｌａｓｐｅｏｓ  Ｓｃｈｕｂを包含する。種々の除草剤の組合せが雑草に対する相加分超の（即ち相乗的な）作用、及び／又は、作物又は他の所要植物に対する相加分未満の作用（即ち毒性緩和）をもたらすことができる。特定の場合において、グリホセートと同様の制御スペクトルを有するが作用様式の異なる別の除草剤との組合せが抵抗性雑草の発生を防止するために特に有効となる。何れかの特定の除草剤の除草剤有効量は単純な実験を介して当業者が容易に決定できる。
【０１５６】
除草剤はその作用様式を参照しながら上記したグループ及び／又はサブグループに分類してよく、或いは、それらはその化学構造に従ってグループ及び／又はサブグループに分類してよい。
【０１５７】
スルホンアミド除草剤は本質的な分子構造としてスルホンアミド部分（−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−）を有する。本明細書においては、スルホンアミド除草剤は特にスルホニル尿素除草剤、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤及びトリアゾロピリミジン除草剤を含む。スルホニル尿素除草剤において、スルホンアミド部分はスルホニル尿素架橋（−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｒ）−）における成分である。スルホニル尿素除草剤において、スルホニル架橋のスルホニル末端は直接、又は、酸素原子又は場合により置換されたアミノ又はメチレン基を経由することにより、典型的に置換された環状又は非環状の基に連結される。スルホニル尿素架橋の逆の末端において、水素原子の変わりにメチル（ＲがＣＨ３）のような置換基を有してよいアミノ基が、メチル、エチル、トリフルオロメチル、メトキシ、エトキシ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ及びハロゲンのような置換基１又は２個を有する複素環基、典型的には対称のピリミジン又はトリアジン環に連結される。スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤においては、スルホンアミド部分がスルホニルアミノカルボニル架橋（−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＣ（Ｏ）−）の成分である。スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤においては、スルホニルアミノカルボニル架橋のスルホニル末端は典型的には置換されたフェニル環に連結される。スルホニルアミノカルボニル架橋の逆の末端においては、カルボニルは、トリアゾリノン環の１位に連結し、これは典型的にはアルキル及びアルコキシのような基で置換されている。トリアゾロピリミジン除草剤においては、スルホンアミド部分のスルホニル末端は置換された［１，２，４］トリアゾロピリミジン環系の２位に連結し、そしスルホンアミド部分のアミノ末端は置換されたアリール、典型的にはフェニル基に連結されるか、或いは、スルホンアミド部分のアミノ末端は置換された［１，２，４］トリアゾロピリミジン環系の２位に連結され、そしてスルホンアミド部分のスルホニル末端は置換されたアリール、典型的にはフェニル基に連結される。
【０１５８】
本発明において有用なスルホニル尿素除草剤の代表例は下記式：
【０１５９】
【化２】
2009505654.tif 000004
［式中、
Ｊは下記：
【０１６０】
【化３】
2009505654.tif 000005
【０１６１】
【化４】
2009505654.tif 000006
よりなる群から選択されるか；又は、
ＪはＲ１３ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）−；
ＲはＨ又はＣＨ３であり；
Ｒ１はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ３−Ｃ４シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ４ハロアルケニル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、Ｃ２−Ｃ４アルコキシアルコキシ、ＣＯ２Ｒ１４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＳＯ２ＮＲ１７Ｒ１８、Ｓ（Ｏ）ｎＲ１９、Ｃ（Ｏ）Ｒ２０、ＣＨ２ＣＮ又はＬであり；
Ｒ２はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＳＣＨ３、ＣＦ３又はＯＣＦ２Ｈであり；
Ｒ３はＣｌ、ＮＯ２、ＣＯ２ＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）−シクロプロピル、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＳＯ２ＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ３であり；
Ｒ４はＣ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、Ｃ２−Ｃ４ハロアルケニル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＣＯ２Ｒ１４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＳＯ２ＮＲ１７Ｒ１８、Ｓ（Ｏ）ｎＲ１９、Ｃ（Ｏ）Ｒ２０又はＬであり；
Ｒ５はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ３であり；
Ｒ６はＣ１−Ｃ３アルキルただし場合により０−３Ｆ、０−１Ｃｌ及び０−１Ｃ３−Ｃ４アルコキシアセチルオキシで置換されたもの，又はＲ６はＣ１−Ｃ２アルコキシ、Ｃ２−Ｃ４ハロアルケニル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｒ１４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＳＯ２ＮＲ１７Ｒ１８、Ｓ（Ｏ）ｎＲ１９、Ｃ（Ｏ）Ｒ２０又はＬであり；
Ｒ７はＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ３又はＣＦ３であり；
Ｒ８はＨ、Ｃ１−Ｃ３アルキル又はピリジニルであり；
Ｒ９はＣ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＣＯ２Ｒ１４、ＳＯ２ＮＲ１７Ｒ１８、Ｓ（Ｏ）ｎＲ１９、ＯＣＦ２Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ２０、Ｃ２−Ｃ４ハロアルケニル又はＬであり；
Ｒ１０はＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃ１−Ｃ３アルキル又はＣ１−Ｃ２アルコキシであり；
Ｒ１１はＨ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、Ｃ２−Ｃ４ハロアルケニル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｒ１４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＳＯ２ＮＲ１７Ｒ１８、Ｓ（Ｏ）ｎＲ１９、Ｃ（Ｏ）Ｒ２０又はＬであり；
Ｒ１２はハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル又はＣ１−Ｃ３アルキルスルホニルであり；
Ｒ１３はＣ１−Ｃ４アルキルであり；
Ｒ１４はアリル、プロパルギル又はオキセタン−３−イルであるか；又はＲ１４はＣ１−Ｃ３アルキルただし場合によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ及びＣＮよりなる群から独立して選択される少なくとも１つのメンバーで置換されているものであり；
Ｒ１５はＨ、Ｃ１−Ｃ３アルキル又はＣ１−Ｃ２アルコキシであり；
Ｒ１６はＣ１−Ｃ２アルキルであり；
Ｒ１７はＨ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、アリル又はシクロプロピルであり；
Ｒ１８はＨ又はＣ１−Ｃ３アルキルであり；
Ｒ１９はＣ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、アリル又はプロパルギルであり；
Ｒ２０はＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル又はＣ３−Ｃ５シクロアルキルただし場合によりハロゲンで置換されているものであり；
ｎは０、１又は２であり；
Ｌは下記：
【０１６２】
【化５】
2009505654.tif 000007
であり；
Ｌ１はＣＨ２、ＮＨ又はＯであり；
Ｒ２１はＨ又はＣ１−Ｃ３アルキル；
ＸはＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ５アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ５アルコキシアルコキシ、アミノ、Ｃ１−Ｃ３アルキルアミノ又は（ジ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）アミノであり；
ＹはＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキルチオ、Ｃ２−Ｃ５アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ５アルコキシアルコキシ、アミノ、Ｃ１−Ｃ３アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）アミノ、Ｃ３−Ｃ４アルケニルオキシ、Ｃ３−Ｃ４アルキニルオキシ、Ｃ２−Ｃ５アルキルチオアルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキルスルフィニルアルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキルスルホニルアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ４アルキニル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、アジド又はシアノであり；そして、
ＺはＣＨ又はＮであるが；ただし（ｉ）１つ又は両方のＸ及びＹはＣ１ハロアルコキシである場合は、ＺはＣＨであり；そして（ｉｉ）Ｘがハロゲンである場合は、ＺはＣＨ及びＹはＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｎ（ＯＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２又はＯＣＦ２Ｈである］のものである。特記すべきは、Ｒ６がアルキルであり、該アルキルが未置換である式Ｉのスルホニル尿素１つ以上を含む本発明の単一の液体除草剤組成物である。
【０１６３】
本発明における使用の為に意図されるチアゾロピリミジン除草剤の代表例は、下記式：
【０１６４】
【化６】
2009505654.tif 000008
［式中、
Ｒ２２及びＲ２３は各々独立してハロゲン、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ又はＣ２−Ｃ３アルコキシカルボニルであり；
Ｒ２４はＨ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ２アルキル又はＣ１−Ｃ２アルコキシであり；
Ｗは−ＮＨＳ（Ｏ）２−又は−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−であり；
Ｙ１はＨ、Ｃ１−Ｃ２アルキル又はＣ１−Ｃ２アルコキシであり；
Ｙ２はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｃ１−Ｃ２アルキル又はＣ１−Ｃ２アルコキシであり；
Ｙ３はＨ、Ｆ又はメトキシであり；
Ｚ１はＣＨ又はＮであり；そして、
Ｚ２はＣＨ又はＮであるが；
ただしＹ１及びＹ２の少なくとも１つはＨではない］のものである。
【０１６５】
上記した代表的トリアゾロピリミジン除草剤のＭａｒｋｕｓｈ記載において、Ｗが−ＮＨＳ（Ｏ）２−である場合、スルホニル部分のスルホニル末端は［１，２，４］トリアゾロピリミジン環系に連結しており、そしてＷが−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−である場合、スルホンアミド部分のアミノ末端が［１，２，４］トリアゾロピリミジン環系に連結している。
【０１６６】
上記説明において、「アルキル」という用語は、単独又は複合語、例えば「アルキルチオ」又は「ハロアルキル」において用いる場合、直鎖又は分枝鎖アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル，又は異なるブチル異性体を包含する。「シクロアルキル」とは例えば、シクロプロピル，シクロブチル及びシクロペンチルを包含する。「アルケニル」とは直鎖又は分枝鎖アルケン例えばエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル，及び異なるブテニル異性体を包含する。「アルケニル」はまたポリエン、例えば１，２−プロパジエニル及び２，４−ブタジエニルを包含する。「アルキニル」とは直鎖又は分枝鎖アルキン  例えばエチニル、１−プロピニル、２−プロピニル及び異なるブチニル異性体を包含する。「アルキニル」とは又多数の三重結合を含む部分、例えば２，５−ヘキサジイニルを包含できる。「アルコキシ」とは例えば、  メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ及び異なるブトキシ異性体を包含する。「アルコキシアルキル」とはアルキル上のアルコキシ置換を意味する。「アルコキシアルキル」の例はＣＨ３ＯＣＨ２、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２及び  ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２を包含する。「アルコキシアルコキシ」とはアルコキシ上のアルコキシ置換を意味する。「アルケニルオキシ」とは直鎖又は分枝鎖アルケニルオキシ部分を包含する。「アルケニルオキシ」の例はＨ２Ｃ＝ＣＨＣＨ２Ｏ、（ＣＨ３）ＣＨ＝ＣＨＣＨ２Ｏ及び  ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｏを包含する。「アルキニルオキシ」とは直鎖又は分枝鎖アルキニルオキシ部分を包含する。「アルキニルオキシ」の例はＨＣ＝ＣＣＨ２Ｏ及び  ＣＨ３Ｃ＝ＣＣＨ２Ｏを包含する。「アルキルチオ」とは分枝鎖又は直鎖アルキルチオ部分、例えばメチルチオ、エチルチオ，及び異なるプロピルチオ異性体を包含する。「アルキルチオアルキル」とはアルキル上のアルキルチオ置換を意味する。「アルキルチオアルキル」の例はＣＨ３ＳＣＨ２、ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＳＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２及びＣＨ３ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２を包含し；「アルキルスルフィニルアルキル」及び「アルキルスルホニルアルキル」とは対応するスルホキシド及びスルホンをそれぞれ包含する。他の置換基、例えば「アルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」も同様に定義される。
【０１６７】
置換基内の炭素原子の総数は「Ｃｉ−Ｃｊ」接頭語で示し、ここでｉ及びｊは１〜５の数である。例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキルメチルからブチル、例えば種々の異性体を指す。別の例として、Ｃ２アルコキシアルキルはＣＨ３ＯＣＨ２を指し；Ｃ３アルコキシアルキルは例えばＣＨ３ＣＨ（ＯＣＨ３）、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２又はＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２を指し；そしてＣ４アルコキシアルキルは合計４炭素原子を含有するアルコキシ基で置換されたアルキル基の種々の異性体を指し、例えばＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２及びＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２を包含する。
【０１６８】
「ハロゲン」という用語は、単独で又は「ハロアルキル」のような複合語において、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を包含する。更に又、複合語、例えば「ハロアルキル」において使用する場合は、該アルキルは部分的又は完全に同じか又は異なるハロゲン原子で置換されていてもよい。「ハロアルキル」の例はＦ３Ｃ、ＣｌＣＨ２、ＣＦ３ＣＨ２及びＣＦ３ＣＣｌ２を包含する。「ハロアルコキシ」、「ハロアルキルチオ」などの用語は、「ハロアルキル」という用語と同様に定義される。「ハロアルコキシ」の例はＣＦ３Ｏ、ＣＣｌ３ＣＨ２Ｏ、ＨＣＦ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ及びＣＦ３ＣＨ２Ｏを包含する。「ハロアルキルチオ」の例はＣＣｌ３Ｓ、ＣＦ３Ｓ、ＣＣｌ３ＣＨ２Ｓ及びＣｌＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓを包含する。
【０１６９】
以下のスルホニル尿素除草剤は本発明において有用なスルホニル尿素を示しており、それらはアミドスルフロン（Ｎ−［［［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］−スルホニル］−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド）、アミズスルフロン（Ｎ−［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）−アミノ］カルボニル］−１−メチル−４−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−スルホンアミド）、ベンスルフロン−メチル（メチル２−［［［［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］−スルホニル］メチル］ベンゾエート）、クロリムロン−エチル（エチル２−［［［［（４−クロロ−６−メトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］ベンゾエート）、クロルスルフロン（２−クロロ−Ｎ−［［（４−メトキシ−６−メチル−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ］カルボニル］ベンゼンスルホンアミド）、シノスルフロン（Ｎ−［［（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ］カルボニル］−２−（２−メトキシエトキシ）−ベンゼンスルホンアミド），シクロスルファムロン（Ｎ−［［［２−（シクロプロピルカルボニル）フェニル］アミノ］−スルホニル］−Ｎ１−（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イル）尿素）、エタメトスルフロン−メチル（メチル２−［［［［［４−エトキシ−６−（メチルアミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］−ベンゾエート）、エトキシスルフロン（２−エトキシフェニル［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］−カルボニル］スルファメート）、フラザスルフロン（Ｎ−［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］−３−（トリフルオロメチル）−２−ピリジンスルホンアミド）、フルセトスルフロン（ｌ−［３−［［［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］−２−ピリジニル］−２−フルオロプロピルメトキシアセテート）、フルピルスルフロン−メチル（メチル２−［［［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］−アミノ］スルホニル］−６−（トリフルオロメチル）−３−ピリジンカルボキシレート）、ホラムスルフロン（２−［［［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］−４−（ホルミルアミノ）−Ｎ、Ｎ−ジメチルベンズアミド）、ハロスルフロン−メチル（メチル３−クロロ−５−［［［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］−ｌ−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート）、イマゾスルフロン（２−クロロ−Ｎ−［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］イミダゾ［１，２−α］ピリジン−３−スルホンアミド）、ヨードスルフロン−メチル（メチル４−ヨード−２−［［［［（４−メトキシ−６−メチル−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］ベンゾエート）、メソスルフロン−メチル（メチル２−［［［［（４，６−ジメ���キシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］−４−［［（メチルスルホニル）アミノ］メチル］ベンゾエート）、メトスルフロン−メチル（メチル２−［［［［（４−メトキシ−６−メチル−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］ベンゾエート）、ニコスルフロン（２−［［［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ピリジンカルボキサミド）、オキサスルフロン（３−オキセタニル２−［［［［（４，６−ジメチル−２−ピリミジニル）アミノ］−カルボニル］アミノ］スルホニル］ベンゾエート）、ピリミスルフロン−メチル（メチル２−［［［［［４，６−ビス（トリフルオロメトキシ）−２−ピリミジニル］アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］ベンゾエート）、プロスルフロン（Ｎ−［［（４−メトキシ−６−メチル−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ］カルボニル］−２−（３，３，３−トリフルオロ−プロピル）ベンゼンスルホンアミド）、ピラゾスルフロン−エチル（エチル５−［［［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］−ｌ−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート）、リムスルフロン（Ｎ−［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］−３−（エチルスルホニル）−２−ピリジンスルホンアミド）、スルホメツロン−メチル（メチル２−［［［［（４，６−ジメチル−２−ピリミジニル）−アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］ベンゾエート）、スルホスルフロン（Ｎ−［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］−２−（エチルスルホニル）イミダゾ［１，２−α］ピリジン−３−スルホンアミド）、チフェンスルフロン−メチル（メチル３−［［［［（４−メトキシ−６−メチル−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ］−カルボニル］アミノ］スルホニル］−２−チオフェンカルボキシレート）、トリアスルフロン（２−（２−クロロエトキシ）−Ｎ−［［（４−メトキシ−６−メチル−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ］カルボニル］ベンゼンスルホンアミド）、トリベヌロン−メチル（メチル２−［［［［Ｎ−（４−メトキシ−６−メチル−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｎ−メチルアミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］ベンゾエート）、トリフロキシスルフロン（Ｎ−［［（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジニル）アミノ］カルボニル］−３−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−２−ピリジンスルホンアミド）、トリフルスルフロン−メチル（メチル２−［［［［［４−ジメチルアミノ）−６−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−１，３，５−トリアジン−２−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］−３−メチルベンゾエート）及びトリトスルフロン（Ｎ−［［［４−メトキシ−６−（トリフルオロメチル）−１，３，５−トリアジン−２−イル］アミノ］カルボニル］−２−（トリフルオロメチル）ベンゼン−スルホンアミド）である。
【０１７０】
以下のトリアゾロピリミジン除草剤は本発明の為に有用なトリアゾロピリミジンを示しており、それらはクロランスラム−メチル（メチル３−クロロ−２−［［（５−エトキシ−７−フルオロ［１，２，４］−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン−２−イル）スルホニル］アミノ］ベンゾエート、ジクロスラム（Ｎ−（２，６−ジクロロフェニル）−５−エトキシ−７−フルオロ［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン−２−スルホンアミド、フロラスラム（Ｎ−（２，６−ジフルオロフェニル）−８−フルオロ−５−メトキシ［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン−２−スルホンアミド）、フルメツラム（Ｎ−（２，６−ジフルオロフェニル）−５−メチル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−スルホンアミド）、メトスラム（Ｎ−（２，６−ジクロロ−３−メチルフェニル）−５，７−ジメトキシ［１，２，４］トリアゾロ−［１，５−α］ピリミジン−２−スルホンアミド）、ペノクスラム（２−（２，２−ジフルオロエトキシ）−Ｎ’−（５，８−ジメトキシ−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン−２−イル）−６−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホンアミド）及びピロクスラム（Ｎ−（５，７−ジメトキシ［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル）−２−メトキシ−４−（トリフルオロ−メチル）−３−ピリジンスルホンアミド）である。
【０１７１】
以下のスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤は本発明の為に有用なスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンを示しており、それらはフルカルバゾン（４，５−ジヒドロ−３−メトキシ−４−メチル−５−オキソ−Ｎ−［［２−（トリフルオロメトキシ）フェニル］スルホニル］−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−カルボキサミド）及びプロカルバゾン（メチル２−［［［（４，５−ジヒドロ−４−メチル−５−オキソ−３−プロポキシ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−ｌ−イル）カルボニル］アミノ］スルホニル］ベンゾエート）である。
【０１７２】
別の除草剤はフェンメジファム、トリアゾリノン及び参照により全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／０１２９８１に開示されている除草剤を包含する。
【０１７３】
本方法は更に、作物植物を有意に損傷することなく雑草を制御するための、例えばグリホセート、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ阻害剤（例えばメソトリオン又はスルコトリオン）、フィトエンデサチュラーゼ阻害剤（例えばジフルフェニカン）、色素合成阻害剤、スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラホス、ホスフィノトリシン、アザフェニジン、ブタフェナシル、スルホセート、グルホシネート、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート、又はスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤、例えばキザロホップ−Ｐ−エチル、合成オーキシン、例えばキンクロラック、又は、プロトックス阻害剤のような、作物の種子又は植物が耐性を示す除草剤少なくとも１つの十分な量を、圃場における作物及び雑草に適用することを含む。
【０１７４】
ｂ．除草剤の有効量
一般的に圃場に適用する除草剤の有効量は作物に有意な影響を与えることなく雑草を選択的に制御するために十分である。「雑草」とは本明細書においては特定の区域において望ましくない植物を指す。逆に、「作物植物」とは本明細書においては特定の区域において望ましい植物、例えば大豆植物を指す。即ち、一部の実施形態においては、雑草は非作物植物又は非作物種であり、他の実施形態においては、雑草は特定の区域から排除したい作物種、例えばトランスジェニックのトウモロコシを植栽した圃場における劣等及び／又は非トランスジェニックのトウモロコシ植物、又は、コーンを植栽した圃場における大豆植物である。雑草は２つの主要な群、即ち単子葉植物及び双子葉植物の何れかに分類できる。
【０１７５】
多くの植物種を本明細書に記載した除草剤により制御（即ち殺傷又は損傷）することができる。従って、本発明の方法はこれ等の植物種をそれらが望まれないところ（即ち、それらが雑草であるところ）で制御する場合に有用である。これ等の植物種は作物植物、並びに一般的に雑草と見なされている種、例えば限定しないが、以下のような種：スズメノテッポウ（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ  ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ）、ジャイアント・フォックステイル（Ｓｅｔａｒｉａｆａｂｅｒｉ）、メヒシバ（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ  ｓａｎｇｕｉｎａｌｉｓ）、スリナム・グラス（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）、野生カラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｆａｔｕｄ）、オナモミ（Ｘａｎｔｈｉｕｍ  ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｍ）、シロザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）、アサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｃｏｃｃｉｎｅａ）、アカザ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）、イチビ（Ａｂｕｔｉｌｉｏｎ  ｔｈｅｏｐｈｒａｓｔｉ）、イヌビエ（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ  ｃｒｕｓ−ｇａｌｌｉ）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）、ヤセチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ  ｔｅｃｔｏｒｕｍ）、オヒシバ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｉｎｄｉｃａ）、エノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、ネズミムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、ヒメカナリークサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ｍｉｎｏｒ）、ウィンドグラス（Ａｐｅｒｏ  ｓｐｉｃａ−ｖｅｎｔｉ）、ナルコビエ（Ｅｒｉｃｈｌｏａ  ｖｉｌｌｏｓａ）、カヤツリグサ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、ハコベ（Ｓｔｅｌｌａｒｉａ  ｍｅｄｉａ）、ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）、Ｋｏｃｈｉａ  ｓｃｏｐａｒｉａ、ヒメムカシヨモギ（Ｃｏｎｙｚａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ボウムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｒｉｇｉｄｕｍ）、オヒシバ（Ｅｌｅｕｃｉｎｅ  ｉｎｄｉｃａ）、アレチノギク（Ｃｏｎｙｚａ  ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、ヘラオオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）、マルバツユクサ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）、セイヨウヒルガオ（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）、ハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄａｓ）、レッドバイン（Ｂｒｕｎｎｉｃｈｉａ  ｏｖａｔａ）、アメリカツノクサネム（Ｓｅｓｂａｎｉａ  ｅｘａｌｔａｔａ）、エビスグサ（Ｓｅｎｎａ  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）、テキサスブルーウィード（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｃｉｌｉａｒｉｓ）及びデビルズクロウ（Ｐｒｏｂｏｓｃｉｄｅａ  ｌｏｕｉｓｉａｎｉｃａ）を包含する。他の実施形態においては、雑草は除草剤抵抗性のライグラス、例えばグリホセート抵抗性のライグラス、パラコート抵抗性のライグラス、ＡＣＣａｓｅ抵抗性のライグラス、及び非選択的除草剤抵抗性のライグラスを含む。一部の実施形態においては、望ましくない植物は作物植物の近傍にある。
【０１７６】
本明細書においては、「選択的に制御される」とは耕作区域の雑草の大部分が有意に損傷を受けるか殺傷されるが、作物植物も圃場に存在する場合は、作物植物の大部分は有意に損傷を受けない。即ち、方法は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の雑草が有意に損傷を受けるか殺傷された場合に雑草を選択的に制御したと見なされるが、作物植物も圃場に存在する場合は作物植物の４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％又は１％未満しか有意に損傷を受けるか殺傷されない。
【０１７７】
一部の実施形態においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は、エーカー当たり、又はヘクタール当たり、活性成分又は市販品又は除草剤製剤の少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１５０、１７０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、８００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００グラム又はオンス以上（１オンス＝２９．５７ｍｌ）の比率と等価の用量においてその植物に適用される特定の除草剤による処理により有意に損傷を受けないのに対し、該当対照植物は同じ処理により有意に損傷を受ける。
【０１７８】
特定の実施形態においては、ＡＬＳ阻害剤除草剤の有効量はヘクタール当たり活性成分少なくとも約０．１、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００グラム又はオンス（１オンス＝２９．５７ｍｌ）以上を含む。別の実施形態においては、ＡＬＳ阻害剤の有効量はヘクタール当たり活性成分少なくとも約０．１〜５０、約２５〜７５、約５０〜１００、約１００〜１１０、約１１０〜１２０、約１２０〜１３０、約１３０〜１４０、約１４０〜１５０、約１５０〜２００、約２００〜５００、約５００〜６００、約６００〜８００、約８００〜１０００グラム又はオンス（１オンス＝２９．５７ｍｌ）以上を含む。何れかのＡＬＳ阻害剤、例えば表１に列挙するものをこれ等のレベルで適用できる。
【０１７９】
別の実施形態においては、スルホニル尿素の有効量はヘクタール当たり活性成分少なくとも０．１、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、５０００グラム又はオンス（１オンス＝２９．５７ｍｌ）以上を含む。別の実施形態においては、スルホニル尿素の有効量はヘクタール当たり活性成分少なくとも約０．１〜５０、約２５〜７５、約５０〜１００、約１００〜１１０、約１１０〜１２０、約１２０〜１３０、約１３０〜１４０、約１４０〜１５０、約１５０〜１６０、約１６０〜１７０、約１７０〜１８０、約１９０〜２００、約２００〜２５０、約２５０〜３００、約３００〜３５０、約３５０〜４００、約４００〜４５０、約４５０〜５００、約５００〜５５０、約５５０〜６００、約６００〜６５０、約６５０〜７００、約７００〜８００、約８００〜９００、約９００〜１０００、約１０００〜２０００グラム又はオンス（１オンス＝２９．５７ｍｌ）以上を含む。このレベルで適用できる代表的なスルホニル尿素を表１に示す。
【０１８０】
他の実施形態においては、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート及びイミダゾリノンの有効量はヘクタール当たり活性成分少なくとも０．１、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２５００、３５００、４０００、４５００、５０００グラム又はオンス（１オンス＝２９．５７ｍｌ）以上を含む。他の実施形態においては、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート又はイミダゾリノンの有効量はヘクタール当たり活性成分少なくとも約０．１〜５０、約２５〜７５、約５０〜１００、約１００〜１１０、約１１０〜１２０、約１２０〜１３０、約１３０〜１４０、約１４０〜１５０、約１５０〜１６０、約１６０〜１７０、約１７０〜１８０、約１９０〜２００、約２００〜２５０、約２５０〜３００、約３００〜３５０、約３５０〜４００、約４００〜４５０、約４５０〜５００、約５００〜５５０、約５５０〜６００、約６００〜６５０、約６５０〜７００、約７００〜８００、約８００〜９００、約９００〜１０００、約１０００〜２０００グラム又はオンス（１オンス＝２９．５７ｍｌ）以上を含む。
【０１８１】
除草剤の有効量の別の範囲は例えばＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎサービスの種々の出版物に記載されている。例えば参考として本明細書に援用されるＢｅｒｎａｒｄｓら、（２００６）Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｗｅｅｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｎｅｂｒａｓｋａ（ｗｗｗ．ｉａｎｒｐｕｂｓ．ｕｒｌ．ｅｄｕ／ｓｅｎｄｌｔ／ｅｃｌ３０）；Ｒｅｇｈｅｒら、（２００５）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｗｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｏｒ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｃｒｏｐｓ、Ｐａｓｔｕｒｅｓ、Ｒａｎｇｅｌａｎｄ、及びＮｏｎｃｒｏｐｌａｎｄ、Ｋａｎｓａｓ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ及びＣｏｒｐｏｒａｔｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ；Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒら、（２００６）Ｎｏｒｔｈ  Ｄａｋｏｔａ  Ｗｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｇｕｉｄｅ、Ｎｏｒｔｈ  Ｄａｋｏｔａ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ及びＩｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎのｗｗｗ．ｗｅｅｄｓ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕを参照できる。
【０１８２】
本発明の一部の実施形態においては、グリホセートはエーカー当たり酸換算量８〜３２オンスの比率において、又は、適用範囲下限においてエーカー当たり酸換算量１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８及び３０オンスの比率において、そして、適用範囲上限においてエーカー当たり酸換算量１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２オンスの比率において、耕作区域に対し、及び／又は耕作区域の植物少なくとも１つに対して、適用される（１オンス＝２９．５７ｍｌ）。他の実施形態においては、グリホセートはヘクタール当たり活性成分少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０オンス以上で適用される（１オンス＝２９．５７ｍｌ）。本発明の一部の実施形態においては、スルホニル尿素除草剤はエーカー当たり活性成分０．０４及び１．０オンスの比率において、又は、適用範囲下限においてエーカー当たり活性成分０．１、０．２、０．４、０．６及び０．８オンスの比率において、そして、適用範囲上限においてエーカー当たり活性成分０．２、０．４、０．６、０．８及び１．０オンスの比率において、耕作区域に対し、及び／又は耕作区域の植物少なくとも１つに対して、適用される（１オンス＝２９．５７ｍｌ）。
【０１８３】
当該分野で知られる通り、１つのクラスとしてのグリホセート除草剤は同活性成分を含有するが、活性成分は多くの異なる塩及び／又は製剤の１つとして存在する。しかしながら、ＡＬＳを阻害することがわかっている除草剤はその活性成分並びにその化学製剤において変動する。除草剤調製物の特定の容量及び／又は重量中に存在する活性成分の量及び／又は酸換算量の測定は当業者の知る通りである。
【０１８４】
一部の実施形態においては、ＡＬＳ阻害剤除草剤を使用する。作物、作物の部分、種子又は耕作区域に適用するＡＬＳ阻害剤除草剤の比率は本明細書に開示する比率のいずれかであることができる。一部の実施形態においては、ＡＬＳ阻害剤除草剤の比率は約０．１〜約５０００ｇ  ａｉ／ヘクタール、約０．５〜約３００ｇ  ａｉ／ヘクタール又は約１〜約１５０ｇ  ａｉ／ヘクタールである。
【０１８５】
一般的に、特定の除草剤は特定の圃場（及びそこで生育している何れかの植物）に対して、一年に１、２、３、４、５、６、７又は８回以下、又は、生育季節当たり１、２、３、４、５回以下、適用される。
【０１８６】
作物、耕作区域又は圃場への除草剤の「組合せで処理された」又は「組合せを適用すること」とは、所望の作用が達成されるように、即ち、雑草は選択的に制御されるが作物は有意に損傷を受けないように、特定の圃場、作物又は雑草が除草剤の各々及び／又は組合せの部分であることが示されている化学物質により処理されることを意図している。一部の実施形態においては、除草剤の各々に対して感受性である雑草は相加的又は相乗的である除草剤各々に起因する損傷を示す。各除草剤及び／又は化学物質の適用は同時であってよく、又は、所望の作用が達成される限り、適用は異なる時間でもよい。更に又、適用は作物の植栽の前に行うこともできる。
【０１８７】
除草剤組成物中の別の除草活性成分と共に本発明の方法において使用される除草剤の割合は一般的に重量で５０００：１〜１：５０００、１０００：１〜１：１０００、１００：１〜１：１００、１０：１〜１：１０又は５：１〜１：５の比である。最適な比は所望の雑草制御スペクトルに基づいて当業者が容易に決定できる。更に又、表３に開示する種々の除草剤の範囲の何れかの組合せも本発明の方法において適用できる。
【０１８８】
即ち、一部の実施形態においては、本発明は圃場における雑草を選択的に制御するための向上した方法を提供し、ここで総除草剤適用は他の方法において用いられるものの９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％又は１％未満であってよい。同様に、一部の実施形態においては、圃場における雑草を選択的に制御するために使用される特定の除草剤の量は、他の方法、即ち本発明の植物を利用しない方法において使用される特定のその特定の除草剤の量の９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％又は１％未満であってよい。
【０１８９】
一部の実施形態においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は相乗作用に由来する利点を被り、この場合グリホセートに対する抵抗性を付与するポリペプチド（即ちＧＡＴ）及び少なくともＡＬＳ阻害剤耐性のポリペプチドにより付与される除草剤耐性は、それらを個々に含有するトランスジェニック植物に対して別個に各遺伝子により付与される除草剤耐性を単に合わせることから予測されるよりも高値となる。例えばＭｃＣｕｔｃｈｅｎら、（１９９７）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．９０：１１７０−１１８０；Ｐｒｉｅｓｌｅｒら、（１９９９）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．９２：５９８−６０３を参照できる。本明細書においては、「相乗性」、「相乗的」、「相乗的に」という用語及びその派生語、例えば「相乗作用」又は「相乗作用除草剤組合せ」又は「相乗作用除草剤組成物」とは、少なくとも第１の除草剤及び第２の除草剤のような除草剤の組合せの生物学的活性が個々の除草剤の生物学的活性の合計より高値となる状況を指す。「相乗性指数（ＳＩ）」の項で表示される相乗性は一般的にＦ．Ｃ．ＫｕＩｌｌら、，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９，５３８（１９６１）の記載した方法により求めることができる。更に又，Ｃｏｌｂｙ，Ｓ．Ｒ．，“Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，”Ｗｅｅｄｓ  １５，２０−２２（１９６７）も参照できる。
【０１９０】
他の例においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物に対して付与される除草剤耐性は相加的であり；即ち、除草剤耐性遺伝子により付与される除草剤耐性プロファイルはそれらを個々に含有するトランスジェニック植物に対して別個に各遺伝子により付与される除草剤耐性を単に合わせることから予測されるものとなる。重要な雑草種に対する２種以上の除草剤の相加的及び／又は相乗的な活性は全体的有効性を増大させ、及び／又は、該雑草を制御するために必要な活性成分の実際の量を低減することになる。このような相乗作用が観察される場合、本発明の植物は除草剤のより高い用量又は比率に対して耐性を示すか、及び／又は、植物は耐性を示すことが予測される程度を超えて追加的除草剤又は他の化学物質に対して耐性を示す。例えばＧＡＴ遺伝子及びＨＲＡ遺伝子を含有する植物は殺虫剤のような有機ホスフェート化合物及び／又は４−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼの阻害剤に対しても耐性を示す場合がある。
【０１９１】
即ち、例えば、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は種々の除草剤、例えばグリホセート、ＡＬＳ阻害剤化学物質及びスルホニル尿素除草剤に対して予測されるより高値の耐性を示すことができる。本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は、特定の除草剤又は除草剤の組合せに対して、同除草剤又は除草剤の組合せに対して耐性を付与する単一の除草剤耐性遺伝子のみを含有する該当対照植物の耐性よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２２％、２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％又は５００％以上高値の耐性を示してよい。即ち、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は該当対照植物と比較して除草剤の同じ用量に由来する損傷が低減されてよく、或いは、それらは、対照植物よりも遥かに高用量の除草剤に応答して同程度の損傷を示してよい。従って、特定の実施形態においては、圃場において雑草を選択的に含有するために使用される特定の除草剤は、他の方法、即ち本発明の植物を利用しない方法において使用されるその特定の除草剤の量よりも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％超又はそれ以上となる。
【０１９２】
同様の態様において、一部の実施形態においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は該当対照植物と比較して除草活性成分の特定の製剤に対して改良した耐性を示す。除草剤は、典型的には他の成分を除草活性成分に加えて包含する製剤として市販されており；それらの成分は活性成分の効果を増強する意図を有する場合が多い。そのような他の成分は例えば、毒性緩和剤及びアジュバントを包含できる（例えばＧｒｅｅｎ及びＦｏｙ（２００３）“Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，”Ｗｅｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ及びＭａｎａｇｅｍｅｎｔ，ｅｄ．Ｉｎｄｅｒｊｉｔ（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）参照）。即ち，本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は除草剤の特定の製剤（例えば特定の市販の除草剤製品）に対して、同じ除草剤製剤に対して耐性を付与する単一の除草剤耐性遺伝子のみを含有する該当対照植物の耐性よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２２％、２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１１００％、１２００％、１３００％、１４００％、１５００％、１６００％、１７００％、１８００％、１９００％又は２０００％以上高値の耐性を示すことができる。
【０１９３】
一部の実施形態においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は、少なくとも１つの他の除草剤耐性遺伝子が耐性を付与する相手である除草剤又は除草剤のクラスに対する改良した耐性、並びに、グリホセート又は該少なくとも１つの他の除草剤耐性遺伝子に対応する除草剤とは異なる作用の機序又は根拠を有する少なくとも１つの他の除草剤又は化学物質に対する改良した耐性を示す。本発明のこの意外な利点は、例えば作物を生育させるために使用される他の化学物質を包含する種々の化学物質の組合せを用いた処理を含む作物の生育方法において使用できる。即ち、例えば、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性トウモロコシ植物（即ちＧＡＴ／ＨＲＡ植物）はまた、チトクロームＰ４５０遺伝子の妨害を介して除草剤を代謝するトウモロコシの能力を妨害する全身性有機ホスフェート殺虫剤であるクロルピリホスに対する改良した耐性を示してよい。即ち、本発明はまた、チトクロームＰ４５０に影響する化学物質への改良した耐性を示す、グリホセートに対する耐性を付与する配列（即ちＧＡＴ遺伝子）及びスルホニル尿素除草剤耐性遺伝子を含むトランスジェニック植物、及びその使用方法を提供する。一部の実施形態においては、例えばＧＡＴ遺伝子及びスルホニル尿素除草剤耐性遺伝子を含む本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物はまた、ジカンバに対する改良した耐性を示す。これ等の実施形態において、ジカンバに対する改良した耐性はグリホセート及びスルホニル尿素除草剤の存在下において顕在化してよい。
【０１９４】
他の方法において、除草剤の組合せは本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物上に適用され、その場合、除草剤の組合せは雑草の制御に関して相加的又は相乗的な作用の何れかをもたらす。除草剤のこのような組合せは適用比率を低減し、望ましくない繁茂のより広範なスペクトルを制御し、より少ない適用による望ましくない繁茂の改良した制御、除草剤活性のより迅速な発生、又はより長時間の除草剤活性を可能にすることができる。
【０１９５】
「相加的除草剤組成物」は個々の成分の観察される活性と概ね等しい除草剤活性を有する。「相乗的除草剤組成物」は単独で使用される場合の個々の成分の観察される活性に基づいて予測することができるものよりも高値の除草剤活性を有する。従って、本明細書に開示する要件は相乗作用的な除草剤の組合せを提供し、その場合、混合物の雑草制御の程度は個々の除草剤の制御の合算を超過する。一部の実施形態においては、混合物の雑草制御の程度は、個々の除草剤の制御の合算を、何れかの統計学的に有意な量の分だけ、例えば
約１％〜５％、約５％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約１００％〜１２０％以上超過する。更に又、除草剤の「相乗作用的有効量」とは除草剤組成物中に存在する別の除草剤において相乗作用的効果を示すために必要なある除草剤の量を指す。即ち、「相乗剤」及びその派生語は活性成分（ａｉ）の活性を増強する物質、即ち生物学的作用が得られる製剤中の物質、例えば除草剤を指す。
【０１９６】
従って、一部の実施形態においては、本明細書に開示する要件は耕作区域における雑草を制御するための方法を提供する。一部の実施形態においては、本方法は、（ａ）作物種子又は作物苗木を区域に植栽すること、ここで作物種子又は作物苗木は以下の成分、即ち（ｉ）作物種子又は作物苗木において活性なプロモーターに作動可能に連結したグリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）作物種子又は作物苗木において活性なプロモーターに作動可能に連結したＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド；を含むものであること；及び、（ｂ）雑草、作物植物、作物の部分、耕作区域又はこれ等の組み合わせに対し、相乗作用的有効量のグリホセート及び相乗作用的有効量のＡＬＳ阻害剤（例えば限定しないがスルホニル尿素除草剤）又はこれ等の農業上適する塩の少なくとも１つを含む除草剤組成物の有効量を適用すること、ここで以下の通り、即ち（ｉ）グリホセートの相乗作用的有効量はスルホニル尿素除草剤の非存在下で雑草を制御するために必要なグリホセートの量より低値であること；（ｉｉ）スルホニル尿素除草剤の相乗作用的有効量はグリホセートの非存在下で雑草を制御するために必要なＡＬＳ阻害剤の量より低値であること；及び、（ｉｉｉ）これ等の組合せの少なくとも１つであり；そして、ここで除草剤組成物の有効量は作物種子又は作物苗木により許容され、そして耕作区域の雑草を制御するものであること；を含む。
【０１９７】
上記において詳述した通り、一部の実施形態においては、第１のポリヌクレオチドはグリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする。より詳細には、一部の実施形態においては、第１のポリヌクレオチドはグリホセート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ又はグリホセート耐性グリホセートオキシドレダクターゼをコードする。更に又、上記において詳述した通り、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドは突然変異したアセトラクテートシンターゼポリペプチドを含む。一部の実施形態においては、突然変異したアセトラクテートシンターゼポリペプチドはＨＲＡを含む。
【０１９８】
一部の実施形態においては、雑草を制御するための本明細書に開示した方法において使用する除草剤組成物はグリホセート及びスルホニル尿素除草剤の相乗作用的有効量を含む。更に別の実施形態においては、本明細書に開示した相乗作用除草剤組成物はグリホセート及びメトスルフロン、クロルスルフロン及びトリアスルフロンよりなる群から選択されるスルホニル尿素を含む。
【０１９９】
特定の実施形態において、相乗作用的な除草剤の組合せは更に、アジュバント、例えば硫酸アンモニウム系アジュバント、例えばＡＤＤ−ＵＰ（登録商標）（Ｗｅｎｋｅｍ  Ｓ．Ａ．，Ｈａｌｆｗａｙ  Ｈｏｕｓｅ，Ｍｉｄｒａｎｄ，Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）を含む。別の実施形態においては、本明細書に開示した相乗作用的な除草剤の組合せは追加的除草剤、例えば有効量のピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート除草剤を含む。一部の実施形態においては、ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート除草剤はビスピリバク、例えば（ＶＥＬＯＣＩＴＹ（登録商標），Ｖａｌｅｎｔ  Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）又は農薬上適当なその塩を含む。
【０２００】
望ましくない植物を制御するための本明細書に開示した方法の一部の実施形態において、グリホセートは望ましくない植物又は植物作物に対し、発芽前、発芽後又は発芽前及び後に適用し；そしてＡＬＳ阻害剤除草剤（即ちスルホニル尿素除草剤）は望ましくない植物又は植物作物に対し、発芽前、発芽後又は発芽前及び後に適用する。他の実施形態においては、グリホセート及びＡＬＳ阻害剤除草剤（例えばスルホニル尿素除草剤）は共に適用するか、又は、別個に適用する。更に他の実施形態においては、相乗作用的な除草剤の組合せの適用、例えば上記工程（ｂ）は、目的作物の植栽、例えば上記工程（ａ）よりも前に少なくとも１回、行う。
【０２０１】
本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は多くの除草剤に対して耐性であるが、それらは数種の除草剤、例えばジニトロアニリン、ＡＣＣａｓｅ及びクロルアセトアミド除草剤に対しては耐性ではない。即ち、雑草の制御を含む本発明の方法はまたグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物、例えば異なる作物を植栽又は再植栽されている圃場において発生している「自生」グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物作物を制御するためにこれ等の処理を使用してよい。
【０２０２】
作物が生育している（例えば大豆作物）圃場においてグリホセート単独に夜制御することが困難である可能性のある雑草は、限定しないがヒメムカシヨモギ（例えば  Ｃｏｎｙｚａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ボウムギ（例えば  Ｌｏｌｉｕｍ  ｒｉｇｉｄｕｍ）；オヒシバ（例えばＥｌｅｕｓｉｎｅ  ｉｎｄｉｃａ）；ネズミムギ（例えばＬｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；アレチノギク（例えばＣｏｎｙｚａ  ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ）；ヘラオオバコ（例えばＰｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）；ブタクサ（例えばＡｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｆｏｌｉａ）；アサガオ（例えばＩｐｏｍｏｅａ  ｓｐｐ．）；アカザ（例えばＡｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）；セイヨウヒルガオ（例えばＣｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）；カヤツリグサ（例えばＣｙｐｅｒｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）；シロザ（例えばＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）；ソバカズラ（例えばＰｏｌｙｇｏｎｉｕｍ  ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ）；イチビ（例えばＡｂｕｔｉｌｏｎ  ｔｈｅｏｐｈｒａｓｔｉ）；ホウサギ（例えばＫｏｃｈｉａ  ｓｃｏｐａｒｉａ）；及びツユクサ（例えばＣｏｍｍｅｌｉｎａ  ｓｐｐ．）を包含する。このような雑草が発見される区域においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（ＧＡＴ−ＨＲＡ植物）は、これ等のポリヌクレオチドの両方を含有しない作物植物に対して許容できない損傷を誘発する除草剤の組合せで圃場を（そして、従って本発明場内に生育する如何なる作物をも）処理可能とする場合において、特に有用となる。異なる作用様式又は作用部位を有する他の除草剤少なくとも１つに対して耐性であることに加えて、グリホセート及び他の除草剤、例えばスルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニル（チオ）ベンゾエート及び／又はスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤に対して耐性である本発明の植物は、植物が耐性である同じ除草剤の少なくとも２つに対して雑草が耐性である状況において、特に有用である。この態様において、本発明の植物は１つより多い除草剤に対して耐性である雑草の向上した制御を可能にする。
【０２０３】
例えば、現在商業用作物（例えば大豆）を生育している圃場における雑草制御のために一部共通して使用されている処理は、グリホセート及び場合により２，４−Ｄを包含するが；この組合せは幾分難点を有する。特に、それらが良好に機能しない雑草種が存在し、そして、それらはまた寒冷気候における雑草制御のためには良好に機能しない。大豆圃場における雑草制御のための別の共通して使用されている処理はスルホニル尿素はクロリムロン−エチルであり、これは土壌中に顕著な残留活性を有し、このため、全ての後続発芽雑草種に対して選択的圧力を保持し、スルホニル尿素抵抗性雑草の生育及び拡大に対して好ましい環境を創生する。しかしながら、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ち本発明のＧＡＴ−ＨＲＡ植物）、例えばグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性大豆植物（即ちＧＡＴ−ＨＲＡ大豆植物）は標準的な植物品種に対して許容できない損傷をもたらし得る除草剤（例えばクロリムロン−エチル）及び除草剤の組合せにより処理できる。即ち、例えば、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性大豆植物（即ちＧＡＴ−ＨＲＡ大豆植物）を含有する圃場はスルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニル（チオ）ベンゾエート及び／又はスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、例えばスルホニル尿素クロリムロン−エチルを単独で、又は他の除草剤と組み合わせて使用しながら処理することができる。例えば、本発明の大豆植物を含有する圃場はグリホセート及びトリベヌロン−メチル（Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）として市販）の組合せにより処理できる。この組合せは一部の状況下、例えば異なる作用様式を有する除草剤の使用、及び、土壌中の残存活性が比較的短期間である除草剤の使用において、雑草制御のための幾つかの利点を有している。残存活性の比較的短い期間を有する除草剤は、例えば除草剤耐性雑草の生育に好都合な選択圧力を低減することが重要である状況において、望ましいものである。当然ながら、雑草制御が必要な何れかの特定の状況において、他の懸案事項、例えば比較的長期の残存活性を有する除草剤を用いることにより作物の植栽の前に圃場における雑草の発達及び／又は出現を防止する必要性がより重要となる場合がある。グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性大豆は又、ニコスルフロン、メトスルフロン−メチル、トリベヌロン−メチル、トリフェンスルフロン−メチル及び／又はリムスルフロンの少なくとも１つを包含する除草剤の組合せを用いて処理することもできる。トリベヌロン−メチル及びトリフェンスルフロン−メチルの両方を包含する処理が特に有用である場合がある。
【０２０４】
現在の商業的品種の作物（例えば大豆）を生育している圃場における雑草制御の為の他の共通して使用されている処理はスルホニル尿素除草剤チフェンスルフロン−メチル（Ｈａｒｍｏｎｙ  ＧＴ（登録商標）として市販）を包含する。しかしながら、チフェンスルフロン−メチルの１つの難点は持続的雑草制御の為に必要とされるより高値の適用比率は、同じ圃場において生育している作物に対して傷害を誘発する場合が多い。大豆植物を包含する本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は、グリホセート及びチフェンスルフロン−メチルの組合せで処理することができ、これは異なる作用様式を有する除草剤を用いることの利点を有している。即ち、何れかの除草剤単独に対して抵抗性である雑草は、２つの除草剤の組合せにより制御され、そして本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は処理により有意に損傷を受けない。
【０２０５】
現在の商業的品種の作物（例えば大豆）を生育している圃場における雑草制御の為に使用されている他の除草剤はトリアゾピリミジン除草剤クロラスラム−メチル（ＦｉｒｓｔＲａｔｅ（登録商標）として市販）及びイミダゾリノン除草剤イマザキン（Ｓｃｅｐｔｏｒ（登録商標）として市販）である。これ等の除草剤を個々に使用した場合、それらは僅かに境界的な雑草制御を示すのみである。しかしながら、大豆植物を包含する本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物を含有する圃場は例えばグリホセート（例えばＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）（グリホセートイソプロピルアミン塩））、イマザピル（現在Ａｒｓｅｎａｌ（登録商標）として市販）、クロリムロン−エチル（現在Ｃｌａｓｓｉｃ（登録商標）として市販）、キザロホップ−Ｐ−エチル（現在Ａｓｓｕｒｅ  ＩＩ（登録商標）として市販）及びホメサフェン（現在Ｆｌｅｘｓｔａｒ（登録商標）として市販）の組合せにより処理できる。この組合せは異なる作用様式を有する除草剤の使用の利点を有する。即ち、これ等の除草剤の１種又は数種のみに対して耐性である雑草が、５種の除草剤の組合せにより制御され、そして、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物はこの除草剤の組合せにより有意な損傷を受けない。この組合せは現在の雑草制御の実際において発生及び拡大すると推定される除草剤耐性雑草の型に対抗した極めて広範な保護スペクトルを与える。
【０２０６】
大豆植物を包含する本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ちＧＡＴ／ＨＲＡ植物）を含有する圃場はまた、例えばグリホセート、リムスルフロン及びジカンバ又はメソトリオンを包含する除草剤の組合せで処理してもよい。この組合せはＡＬＳを抑制する除草剤に対するある程度の耐性を発生させている雑草を制御する場合に特に有用とされる。雑草制御の為に特に有用とされる他の除草剤の組合せはグリホセート及び、エトスルフロン−メチル（Ａｌｌｙ（登録商標）として市販）、イマザピル（Ａｒｓｅｎａｌ（登録商標）として市販）、イマゼタピル、イマザキン及びスルフェントラゾンの少なくとも１つを包含する。上記又は本明細書中別途考察する何れかの組合せはまた何れかの他の除草剤又は農薬との組合せて区域を処理するために使用してよい。
【０２０７】
現在の商業用作物（例えばトウモロコシ）を生育している圃場における雑草制御の為の一部共通して使用されている処理は、グリホセート（現在Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）として市販）、リムスルフロン（現在Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）又はＭａｔｒｉｘ（登録商標）として市販）、ジカンバ（Ｃｌａｒｉｔｙ（登録商標）として市販）、アトラジン及びメソトリオン（Ｃａｌｌｉｓｔｏ（登録商標）として市販）を包含する。これ等の除草剤は場合によっては多数の除草剤に対する乏しい作物耐性の為に個々に使用される。残念なことに、個々に使用した場合、これ等の除草剤の各々は顕著な難点を有する。特に、個々の除草剤に対して耐性である雑草の発生率が増大し、グリホセートは一部の状況において望まれるよりも低効果となる。リムスルフロンは作物に傷害を誘発する可能性のある高濃度において良好な雑草制御をもたらし、ジカンバのような代替物は他の商業的に使用されている除草剤より高価である場合が多い。しかしながら、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ちＧＡＴ−ＨＲＡ植物）、例えばグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性トウモロコシ植物は、リムスルフロン及び／又はジカンバを含む除草剤の組合せを包含する標準的な植物品種に対して許容できない損傷を誘発する場合のある除草剤及び除草剤の組合せで処理することができる。本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物と共に使用するための除草剤の他の適当な組合せは、例えば、メトスルフロン−メチル、トリベヌロン−メチル、クロリムロン−エチル、イマゼタピル、イマザピル及びイマザキンの少なくとも１つを包含する、グリホセート、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシ（チオ）ベンゾエート及び／又はスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤を包含する。
【０２０８】
例えば、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ちＧＡＴ／ＨＲＡ植物）はグリホセートとリムスルフロンの組合せ、又はリムスルフロンと少なくとも１つの別の除草剤の組合せにより処理できる。グリホセート／ＡＬＳ阻害剤植物（即ちＧＡＴ−ＨＲＡ植物）は又、グリホセート、リムスルフロン及びジカンバの組合せ、又はグリホセート、リムスルフロン及び少なくとも１つの他の除草剤の組合せにより処理できる。一部の実施形態においては、少なくとも１つの他の除草剤はグリホセート及びリムスルフロンの両方と異なる作用様式を有する。グリホセート、リムスルフロン及びジカンバの組合せは、除草剤耐性雑草の発生率及び拡大の危険性を低減する異なる作用様式及び短い残留活性をこれ等の除草剤が有しているという利点を有する。
【０２０９】
現在の商業用作物（例えばワタ）を生育している圃場における雑草制御の為の一部共通して使用されている処理は、グリホセート（現在Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）として市販）、クロリムロン−エチル、トリベヌロン−メチル、リムスルフロン（現在Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）又はＭａｔｒｉｘ（登録商標）として市販）、イマゼタピル、イマザピル及びイマザキンを包含する。残念なことに、個々に使用した場合、これ等の除草剤の各々は顕著な難点を有する。特に、個々の除草剤に対して耐性である雑草の発生率は上昇し続け、各々個々の除草剤は一部の状況において望まれるよりも低効果となる。しかしながら本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物、例えばワタ植物は、上記したものの少なくとも１つを包含する除草剤の組合せを含む、標準的な植物品種に対して許容できない損傷を誘発する場合のある除草剤の組合せにより処理できる。
【０２１０】
ｃ．除草剤適用の方法
本発明の方法においては、除草剤は、何れかの適当な態様において製剤し、そして目的の区域、例えば圃場又は耕作区域に適用してよい。除草剤は何れかの形態において、例えば液体スプレー中で、又は固体粉末又は顆粒として、圃場に適用してよい。特定の実施形態においては、方法において使用される除草剤又は除草剤の組合せはタンクミックス又はプレミックスを含む。除草剤は又、例えばブレンド技術を用いながら製造される「均質な顆粒ブレンド」として製剤してよい（例えばＵｎｉｆｏｒｍ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｇｒａｎｕｌｅｓと題された米国特許６，０２２，５５２参照）。米国特許６，０２２，５５２のブレンド技術は特定の問題点を解決するように設計されたカスタマイズされた混合物の送達を可能にする乾燥顆粒形態における製剤された作物保護化学物質の非分離性のブレンド（すなわち「均質な顆粒ブレンド」）を製造している。均質な顆粒ブレンドは、多数の活性成分が同じ顆粒中に製剤されている伝統的なプレミックス製品と同様の態様で出荷、取り扱い、サブサンプル化（ｓｕｂｓａｍｐｌｅ）及び適用が可能である。
【０２１１】
慨すれば、「均質な顆粒ブレンド」は少なくとも２種の押出成型製剤された顆粒製品を共に混合することにより製造する。一部の実施形態においては、各顆粒製品は例えば除草剤、殺真菌剤及び／又は殺虫剤である単一の活性成分を含有する登録された製剤を含む。「均質な顆粒ブレンド」の均一性（均質性）はブレンド中に使用する顆粒の相対的粒径及び粒径分布を制御することにより最適化することができる。押出成型された顆粒の直径は押出機のダイスの孔部の大きさにより制御され、そして遠心シフティングプロセス（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｓｉｆｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を用いることにより所望の長さの分布を有する押出成型された顆粒の集団を得てよい（例えば米国特許６，２７０，０２５参照）。
【０２１２】
均質な顆粒ブレンドは、それを適切なサイズのアリコートにサブサンプル化することができ、そして各アリコートの組成物が必要な試験使用を満足する場合に「均質」と見なされる。均質性を明らかにするためには、均質な顆粒ブレンドの大量サンプルを製造し、次に最小限の統計学的サンプルサイズよりも大きいアリコートとなるようにサブサンプル化する（実施例４参照）。
【０２１３】
非限定的な実施形態においては、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物（即ちＧＡＴ−ＨＲＡ植物）、例えば大豆植物は、除草剤（例えばクロリムロン−エチル、及び、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物の非存在下ではグリホセート／ＡＬＳ阻害剤の遺伝子的特徴を有さない植物品種に対して許容されない作物応答を誘発する別の除草剤の組合せ）で処理することができる。即ち、例えばグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性の大豆、コーン又はワタの品種（即ちＧＡＴ／ＨＲＡ植物）を植栽し、それらを含有している圃場は、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニル（チオ）ベンゾエート及び／又はスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤を単独で、又は他の除草剤と組み合わせて使用しながら処理することができる。ＡＬＳ阻害剤化学物質は異なる除草剤属性を有しているため、ＡＬＳ＋他の化学物質のブレンドは、優れた雑草管理方策、例えば多様で増強された雑草スペクトル、特定の残留活性を与える能力をもたらすことになる（残留活性を有するＳＵ／ＡＬＳ阻害剤化学物質は向上した葉面活性をもたらし、これがグリホセート適用間隔のより広い時間枠並びに天候条件により好機適用が不可能な場合にさらなる制御期間をもたらす）。
【０２１４】
ブレンドは又、通常の標示された使用比率における別の農薬、例えば追加的な除草剤（第３／第４の作用機序）、殺真菌剤、殺虫剤、植物生育調節剤等の追加を可能とし、これにより追加的適用に係る経費を節約できる。
【０２１５】
グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物に対して適用する何れかの除草剤製剤は「タンクミックス」組成物として製造できる。そのような実施形態において、各成分又は成分の組合せは相互に分離して貯蔵できる。その後、成分を適用前に相互に混合できる。典型的には、そのような混合は適用直前に行う。タンクミックスのプロセスにおいては、各成分は混合前においては、典型的には水又は適当な有機溶媒中に存在する。製剤の技術に関して更に説明が必要であれば、Ｔ．Ｓ．Ｗｏｏｄｓ，“Ｔｈｅ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ’ｓ  Ｔｏｏｌｂｏｘ−−Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｆｏｒｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ”Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏ  ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ，Ｔ．Ｂｒｏｏｋｓ及びＴ．Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９９９，ｐｐ．１２０−１３３を参照できる。更に又、米国特許第３，２３５，３６１号、第６欄１６行〜第７欄の１９行、及び実施例１０−４１；米国特許第３，３０９，１９２号、第５欄４３行〜第７欄６２行、及び実施例８，１２，１５，３９，４１，５２，５３，５８，１３２，１３８−１４０，１６２−１６４，１６６，１６７及び１６９−１８２；米国特許第２，８９１，８５５号、第３欄６６行〜第５欄１７行、及び実施例１−４；Ｋｌｉｎｇｍａｎ，Ｗｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｓ  ａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６１，ｐｐ８１−９６；及びＨａｎｃｅら、，Ｗｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９も参照でき、これ等は各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
本発明の方法は更にグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物と共に使用するべき除草剤の組合せの開発を可能にする。このような方法において、耕作区域における環境条件を評価する。評価することができる環境条件は、限定しないが、地中水及び表面水の汚染の問題、作物の使用意図、作物の耐性、土壌残留性、耕作区域に存在する雑草、土壌の材質、土壌のｐＨ、土壌中の有機物の量、適用装置及び耕作慣行を包含する。環境条件の評価の後、除草剤の組合せの有効量を作物、作物の部分、作物の種子又は耕作区域に適用することができる。
【０２１７】
ｄ．除草剤適用の好機
一部の実施形態においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物に適用する除草剤は感受性の雑草の生育開始を防止する働き、及び／又は、耕作区域に生育している雑草に対する損傷を誘発する働きを有する。一部の実施形態においては、除草剤又は除草剤混合物は目的の区域に後に植栽される作物に影響する雑草に対してこれ等の作用を発揮する。本発明の方法においては、除草剤の組合せの適用は同時に生じる必要はない。作物を植栽する圃場が検出可能な量の第１の除草剤を含有しており、そして作物が耕作区域内に存在する期間中の何らかの時期において第２の除草剤が適用される限り、作物は本発明による除草剤の混合物により処理されていると見なされる。即ち、本発明の方法は「発芽前」、「発芽後」、「植栽前配合」である、及び／又は、植栽前の種子処理を包含する除草剤の適用を包含する。
【０２１８】
１つの実施形態において、種子をコーティングするための方法が提供される。方法は種子を有効量の除草剤又は除草剤の組合せ（本明細書に記載）でコーティングすることを含む。次に種子を耕作区域に植栽する。更に又、除草剤又は除草剤の組合せの有効量を含むコーティングを有する種子が提供される（本明細書で別途考察）。
【０２１９】
「発芽前」とは植物が土壌から目視可能に発芽する前に目的の区域（例えば圃場又は耕作区域）に適用される除草剤を指す。「発芽後」とは植物が土壌から目視可能に発芽した後に区域に適用される除草剤を指す。一部の場合においては、「発芽前」及び「発芽後」という用語は目的の区域の雑草に言及しながら使用され、そして一部の場合はこれ等は目的の区域の作物植物に言及しながら使用される。雑草に言及しながら使用される場合は、これ等の用語は目的の区域に存在するか、存在すると考えられる雑草又は雑草種の特定の型のみに適用してよい。如何なる除草剤も発芽前及び／又は発芽後の処理において適用してよいが、一部の除草剤は発芽前又は発芽後の何れかに適用した場合に雑草の制御においてより効果的であることがわかっている。例えば、リムスルフロンは発芽前及び発芽後の活性の両方を有するが、他の除草剤は主に発芽前（メトラクロル）又は発芽後（グリホセート）の活性を有する。特定の除草剤のこのような特性は当該分野で知られており、そして当業者により容易に測定できる。更にまた、本発明のトランスジェニック植物及び／又は本発明のトランスジェニック植物を植栽すべき区域と共に使用するための適切な除草剤及び適用回数は当業者が容易に選択できる。「植栽前配合」とは植栽前に土壌に化合物を配合することを包含する。
【０２２０】
即ち、本発明は作物の生育及び／又は雑草の制御の向上した方法、例えば「植栽前バーンダウン（ｂｕｒｎ  ｄｏｗｎ）」を提供し、この場合、区域は目的の作物の植栽の前に除草剤で処理し、これにより、より良好に雑草を制御する。本発明は又、「無耕作」又は「低耕作」（「低減された耕転（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｉｌｌａｇｅ）」とも称する）である作物の生育及び／又は雑草の制御の方法を提供する。そのような方法において、土壌は伝統的な方法と比較して生育サイクルの間は耕作しないか、低頻度に耕作され；これ等の方法は、それを行わない場合には追加的耕作の為に生じる経費、例えば労賃及び燃料費を節約することができる。
【０２２１】
本発明の方法は除草剤の多数のクラスの同時及び／又は逐次的適用の使用を包含する。一部の実施形態においては、本発明の方法は本の植物及び／又は目的の区域（例えば圃場又は耕作区域）及び／又は雑草を、単一の除草剤のみ又は他の化学物質、例えばスルホニル尿素除草剤で処理することを包含する。
【０２２２】
目的の区域（及びそこの何れかの植物）に除草剤を適用する時期は雑草制御を最適化する場合に重要である場合がある。除草剤を適用する時期は植物の大きさ及び／又は生育段階及び／又は目的区域における植物、例えば区域に生育している作物植物又は雑草の発達を参照しながら決定してよい。生育段階及び／又は植物の発達は当該分野で知られている。例えば、大豆植物は通常はＶＥ（発芽）、ＶＣ（子葉）、Ｖ１（単葉）及びＶ２からＶＮにいたるものとして知られている植物生育段階を経由して成長する。次に大豆は光周期の合図に応答して繁殖生育期に切り替わり；繁殖段階はＲ１（開花開始）、Ｒ２（完全開花）、Ｒ３（結莢（ｐｏｄ）開始）、Ｒ４（完全結莢）、Ｒ５（結実開始）、Ｒ６（完全結実）、Ｒ７（成熟開始）及びＲ８（完全成熟）を包含する。コーン植物は通常は以下の植物段階、即ちＶＥ（発芽）；Ｖ１（第１葉）；Ｖ２（第２葉）；Ｖ３（第３葉）；Ｖ（ｎ）（第ｎ葉）；及びＶＴ（タッセリング）を経由して成長する。繁殖期を経由するトウモロコシの生長は以下の通り、即ち、Ｒ１（シルキング）；Ｒ２（ブリスタリング）；Ｒ３（ミルク）；Ｒ４（ドウ）；Ｒ５（デント）；及びＲ６（生理学的成熟）である。ワタ植物は通常はＶＥ（発芽）、ＶＣ（子葉）、Ｖ１（第１葉）及びＶ２からＶＮを経由して成長する。次に、Ｖ１４近傍で開始する繁殖段階は、Ｒ１（開花開始）、Ｒ２（完全開花）、Ｒ３（結鞘（ｂｏｌｌ）開始）、Ｒ４（カットアウト、鞘の発達）、Ｒ５（成熟開始、第１開花鞘）、Ｒ６（成熟、５０％開花鞘）及びＲ７（完全成熟、８０〜９０％開放鞘）を包含する。即ち、例えば、植物が生育している目的の区域に除草剤又は他の化学物質を適用する時期は、特定の区域の植物の一部又は全てが少なくとも特定の大きさ及び／又は生育及び／又は発達の段階に到達した時点、又は、特定の区域の植物の一部又は全てが特定の大きさ及び／又は生育及び／又は発達の段階に到達していない時点であってよい。
【０２２３】
一部の実施形態においては、穂のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は発芽後の除草剤処理に対して向上した耐性を示す。例えば、本発明の植物はより高用量の除草剤に対して耐性であり、より広範な範囲の除草剤に対して耐性（即ちより多くのＡＬＳ阻害剤化学物質に対して耐性）であってよく、そして／又は、該当対照植物と比較して発達のより早期又は後期において適用される除草剤の用量に対して耐性であってよい。例えば、一部の実施形態においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は発達の特定の段階における処理に起因することがわかっている形態学的欠陥に対して増大した抵抗性を示す。例えば、一部の実施形態においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は発達の特定の段階における処理に起因することがわかっている形態学的欠陥に対する増大した抵抗性を示す。即ち、例えば「イアピンチ（ｅａｒ  ｐｉｎｃｈ）」として知られている現象は、トウモロコシ植物がＶ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｖ１１、Ｖ１２、Ｖ１３よりも後の段階、又はより後の段階において除草剤で処理された場合に生じるが、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は同じ段階で処理されても「イアピンチ」の発生率は低値である。即ち、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は以前に可能であったよりも後の発達段階における除草剤処理を行う方法において使用できる。即ち、本発明の植物は発達の同じ段階において処理された対照植物において形態学的欠陥を誘発する特定の除草剤により処理してよいが、本発明のグリホセート植物は同じ処理により有意に損傷されない。
【０２２４】
異なる化学物質、例えば除草剤の「残留」作用は異なっており、即ち、化学物質又は除草剤の処理が処理区域に生育する植物に対して作用を有し続ける時間量が異なっている。このような作用は、処理区域（例えば圃場又は耕作区域）の所望の将来目的に応じて、望ましい場合と望ましくない場合がある。即ち、作物ローテーションスキームは、各作物に対して使用されることになる処理から得られる残留作用及び同じ区域に後に生育させることになる作物に対するそれらの作用に基づいて選択してよい。除草剤の残留作用を評価するために使用できる手法は当業者の知る通りであり；例えば一般的に、グリホセートは土壌残留活性が殆ど、又は全くないが、ＡＬＳを阻害する作用を有する除草剤はその残留活性のレベルにおいて多様である。種々の除草剤に関する残留活性は知られており、種々の環境要因、例えば土壌水分量、温度、ｐＨ及び土壌組成（材質及び有機物）に応じて変動することがわかっている。本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は除草剤の残留活性に対する向上した耐性が有益である作物の生育方法において特定の用途を有する。
【０２２５】
例えば、一部の実施形態においては、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性植物は個々に適用した場合のグリホセート並びにＡＬＳ阻害剤化学物質（例えばスルホニル尿素除草剤）に対して向上した耐性を有し、そして更に、グリホセート及び／又はＡＬＳ阻害剤化学物質のような除草剤の組合せに対しても改良した耐性をもたらす。更に又、本発明のトランスジェニック植物は除草剤処理と連携して一般的に使用されている追加的化学物質、例えば毒性緩和剤、アジュバント、例えば、スルホン酸アンモニウム及び作物油濃縮物（ｃｒｏｐ  ｏｉｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）等による処理に対しても向上した耐性をもたらす。
【０２２６】
ｅ．毒性緩和剤及びアジュバント
「毒性緩和剤」という用語は、除草剤製剤に添加した場合に特定の作物に対する除草剤の植物毒性作用を排除又は低減する物質を指す。当業者の知る通り、毒性緩和剤の選択は部分的には目的の作物植物及び相乗作用除草剤組成物中に含まれる特定の除草剤又は除草剤の組合せにより変動する。本明細書に開示した除草剤組成物と共に使用するのに適する例示される毒性緩和剤は、限定しないが、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許４，８０８，２０８；５，５０２，０２５；６，１２４，２４０及び米国特許出願公開２００６／０１４８６４７；２００６／００３０４８５；２００５／０２３３９０４；２００５／００４９１４５；２００４／０２２４８４９；２００４／０２２４８４８；２００４／０２２４８４４；２００４／０１５７７３７；２００４／００１８９４０；２００３／０１７１２２０；２００３／０１３０１２０；２００３／００７８１６７に開示されるものを包含する。本発明の方法では作物の安全性を上昇させるために、ベノキサコール、ＢＣＳ（ｌ−ブロモ−４−［（クロロメチル）スルホニル］ベンゼン）、クロキントセット−メキシルシオメトリニル、ジクロルミド、２−（ジクロロメチル）−２−メチル−ｌ，３−ジオキソラン（ＭＧ１９１）、フェンクロラゾール−エチル、フェンクロリム、フルラゾール、フルクソフェニム、フリラゾール、イソキサジフェン−エチル、メフェンピル−ジエチル、メトキシフェノン（（４−メトキシ−３−メチルフェニル）（３−メチルフェニル）−メタノン）、無水ナフタル酸（無水１，８−ナフタル酸）及びオキサベトリニルのような除草剤毒性緩和剤と組み合わせて除草剤を使用する。除草剤毒性緩和剤の解毒有効量を本発明の化合物と同時に適用することができ、又は、種子処理として適用できる。従って、本発明の特徴はグリホセート、他の除草剤少なくとも１つ及び除草剤毒性緩和剤の解毒有効量を含む混合物の使用に関する。
【０２２７】
種子処理は作物植物に対する解毒性を物理的に制限するため、選択的雑草制御のためには特に有用である。従って、本発明の特に有用な実施形態は、毒性緩和剤の解毒有効量で作物を生育させる原料の種子を処理すること、及び、雑草を制御するために除草剤の有効量で圃場を処理することを含む、圃場における雑草の生育を選択的に制御するための方法である。毒性緩和剤の解毒有効量は単純な実験を通して当業者が用意に決定できる。毒性緩和剤の解毒有効量は、植物に対する除草剤の作用が毒性緩和剤で処理されていない植物に対する除草剤の作用と比較して低減されるように毒性緩和剤で所望の植物を処理する場合に存在し；一般的に毒性緩和剤の解毒有効量は毒性緩和剤で処理した植物に対する損傷又は重度の損傷を防止する。毒性緩和剤の使用が適切であるかどうか決定すること、及び、作物に投与するべき毒性緩和剤の用量を決定することは、当業者であれば可能である。
【０２２８】
特定の実施形態においては、本発明の植物に適用する除草剤又は除草剤組成物は毒性緩和剤として作用する。この実施形態において、第１の除草剤又は除草剤混合物は植物に対し解毒有効量で適用する。従って、耕作区域における雑草を制御するための方法が提供される。方法は、植物において活性なプロモーターに作動可能に連結したグリホセートに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；及び、植物において活性なプロモーターに作動可能に連結したＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む作物の種子又は植物を区域に植栽とすることを含む。第１及び第２の除草剤の少なくとも有効量を含む除草剤の組合せを作物、作物の部分、雑草又はそれらの耕作区域に適用する。除草剤の組合せの有効量が雑草を制御し；そして第１の除草剤の有効量は単独で適用した場合に第１の除草剤に曝露されていない対照作物と比較して作物により許容されず；そして第２の除草剤の有効量は毒性緩和作用をもたらすために十分であり、ここで、毒性緩和作用は第１の除草剤を単独で適用した場合の作物耐性と比較して第１及び第２の除草剤の適用時に作物耐性の増大をもたらす。
【０２２９】
特定の実施形態においては、毒性緩和除草剤の組合せは第１のＡＬＳ阻害剤及び第２のＡＬＳ阻害剤を含む。他の実施形態においては、毒性緩和作用はグリホセート及び少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤化学物質の組合せの有効量を適用することにより達成される。更に別の実施形態においては、毒性緩和作用は、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性作物、作物の部分、作物の種子、雑草又は耕作区域を、化学物質のＡＬＳファミリーの除草剤少なくとも１つ（例えばイミダゾリノン）と組み合わせて化学物質のスルホニル尿素ファミリーの除草剤少なくとも１つで処理した場合に達成される。
【０２３０】
このような混合物は増強された作物耐性（即ち除草剤傷害の低減）をもたらす。この方法は処理の前後における化学物質の増大した適用比率を可能にする。そのような方法は所用又は所望ではない繁茂の増強された制御の為に使用できる。更に別の実施形態においては、毒性緩和作用は、グリホセート／ＡＬＳ阻害剤耐性作物、作物の部分、作物の種子、雑草又は耕作区域を、イミダゾリノンファミリーの除草剤少なくとも１つと組み合わせて化学物質のスルホニル尿素ファミリーの除草剤少なくとも１つで処理する場合に、達成される。この方法は増強された作物耐性（即ち除草剤傷害の低減）をもたらす。特定の実施形態においては、スルホニル尿素はリムスルフロンを含み、そしてイミダゾリノンはイマゼタピルを含む。他の実施形態においては、グリホセートはやはり作物、作物の部分、又は耕作区域に適用する。
【０２３１】
本明細書においては、「アジュバント」は農薬の作用又はスプレー溶液の物理的特性を改質するためにスプレー溶液又は製剤に添加される何れかの物質である。例えばＧｒｅｅｎ及びＦｏｙ（２００３）“Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，”Ｗｅｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ｅｄ．Ｉｎｄｅｒｊｉｔ（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照できる。アジュバントは活性化剤、酸性化剤、緩衝剤、添加剤、接着剤、凝集防止剤、泡沫形成防止剤、消泡剤、凍結防止剤、誘引剤、基材ブレンド、キレート形成剤、浄化剤、着色料又は染料、適合性付与剤、共溶媒、カップリング剤、作物油濃縮物、付着剤、洗剤、分散剤、浮遊性制御剤、乳化剤、蒸発低減剤、膨張剤、肥料、泡沫形成剤、製剤化補助剤、不活性剤、湿潤剤、メチル化種子油脂、高負荷ＣＯＣ、重合体、変性植物油、浸透剤、忌避剤、石油濃縮物、保存料、レインファースト剤、保持増強剤、可溶化剤、界面活性剤、展着剤、粘着剤、展着粘着剤、相乗剤質、濃厚化剤、転座補助剤、紫外線補助剤、植物油、水調節剤及び水和剤に範疇化又は下位分類することができる。
【０２３２】
ｆ．追加の農薬
更に又、本発明の方法は、農業状の保護の更に広範なスペクトルをもたらす多成分混合物を形成するための、除草剤又は除草剤の混合物、並びに、１つ以上の他の殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺菌剤、殺ダニ剤、生育調節剤、化学不妊化剤、信号化学物質、忌避剤、誘引剤、フェロモン、摂餌促進剤又は他の生物学的に活性な化合物又は昆虫病原性の細菌、ウィルス又はカビの使用を含むことができる。本発明の方法において使用できるそのような農業保護剤の例は、以下のもの、即ち：殺虫剤、例えば、アバメクチン、アセフェート、アセトアミプリド、アミドフルメト（Ｓ−１９５５）、アベルメクチン、アザジラクチン、アジンホス−メチル、ビフェンスリン、ビフェナゼート、ブプロフェジン、カルボフラン、カータップ、クロルフェナピル、クロルフルアズロン、クロピリホス、クロルピリホス−メチル、クロマフェノジド、クロチアニジン、シフルメトフェン、シフルスリン、ベータ−シフルスリン、シハロスリン、ラムダ−シハロスリン、シペルメスリン、シロマジン、デルタメスリン、ジアフェンチウロン、ジアジノン、ジエルドリン、ジフルベンズロン、ジメフルスリン、ジメトエート、ジノテフル及びイオフェノラン、エマメクチン、エンドスルファン、エスフェンバレレート、エチプロール、フェノチオカルブ、フェノキシカルブ、フェンプロパスリン、フェンバレレート、フィプロニル、フロニカミド、フルベンジアミド、フルシスリネート、タウ−フルバリネート、フルフェネリム（ＵＲ−５０７０１）、フルフェノクスロン、ホノホス、ハロフェノジド、ヘキサフルムロン、ヒドラメチルノン、イミダクロプリド、インドキサカルブ、イソフェンホス、ルフェヌロン、マラチオン、メタフルミゾン、メタルデヒド、メタミドホス、メチダチオン、メトミル、メトプレン、メトキシクロル、メトフルスリン、モノクトロホス、メトキシフェノジド、ニテンピラム、ニチアジン、ノバルロン、ノビフルムロン（ＸＤＥ−００７）、オキサミル、パラチオン、パラチオン−メチル、ペルメスリン、ホレート、ホサロン、ホスメット、ホスファミドン、ピリミカルブ、プロフェノホス、プロフルスリン、ピメトロジン、ピラフルプロール、ピレスリン、ピリダリル、ピリプロール、ピリプロキシフェン、ロテノン、リラノジン、スピノサド、スピロジクロフェン、スピロメシフェン（ＢＳＮ２０６０）、スピロテトラマト、スルプロホス、テブフェノジド、テフルベンズロン、テフルスリン、テルブホス、テトラクロルビンホス、チアクロプリド、チアメトキサム、チオジカルブ、チオスルタップ−ナトリウム、トラロメスリン、トリアザメート、トリクロルホン及びトリフルムロン；殺真菌剤、例えば、アシベンゾラル、アルジモルフ、アミスルブロム、アザコナゾール、アゾキシストロビン、ベナラキシル、ベノミル、ベンチアバリカルブ、ベンチアバリカルブ−イソプロピル、ビノミアル、ビフェニル、ビテルタノール、ブラスチシジン−Ｓ、Ｂｏｒｄｅａｕｘ混合物（３塩基性（ｔｒｉｂａｓｉｃ）硫酸銅）、ボスカリド／ニコビフェン、ブロムコナゾール、ブピリメート、ブチオベート、カルボキシン、カルプロパミド、カプタホル、カプタン、カルベンダジム、クロロネブ、クロロハロニル、クロゾリネート、クロトリマゾール、銅オキシクロリド、銅塩、例えば硫酸銅及び水酸化銅、シアゾファミド、シフルナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、ジクロフラニド、ジクロシメト、ジクロメジン、ジクロル及びイエトフェンカルブ、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジモキシストロビン、ジニコナゾール、ジニコナゾール−Ｍ、ジノカップ、ジスコストロビン、ジチアノン、ドデモルフ、ドジン、エコナゾール、エタコナゾール、エジフェンホス、エポキシコナゾール、エタボキサム、エチリモール、エトリジアゾール、ファムオキサドン、フェンアミドン、フェナリモール、フェンブコナゾール、フェンカラミド、フェンフラム、フェンヘキサミド、フェノキサニル、フェンピクロニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、酢酸フェンチン、水酸化フェンチン、フェルバム、フェルフラゾエート、フェリムゾン、フラジナム、フルジオキソニル、フルメトバル、フロピコリド、フロキサストロビン、フルキンコナゾール、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルスルファミド、フルトラニル、フルトリアホル、ホルペト、ホスエチル−アルミニウム、フベリダゾール、フララキシル、フラメタピル、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、グアザチン、イマザリル、イミベンコナゾール、イミノクラジン、ヨージカルブ、イプコナゾール、イプロベンホス、イプロジオン、イプロバリカルブ、イソコナゾール、イソプロチオラン、カスガマイシン、クレソキシム−メチル、マンコゼブ、マンジプロパミド、マネブ、マパニピリン、メフェノキサム、メプロニル、メタラキシル、メトコナゾール、メタスルホカルブ、メチラム、メトミノストロビン／フェノミノストロビン、メパニピリム、メトラフェノン、ミコナゾール、ミクロブタニル、ネオ−アソジン（鉄メタンアルソン酸塩）、ムヌアリモール、オクチリノン、オフラス、オリサストロビン、オキサジキシル、オキソリン酸、オキシポコナゾール、オキシカルボキシン、パクロブトラゾール、ペンコナゾール、ペンシクロン、ペンチオピラド、ペルフラゾエート、ホスホン酸、フタリド、ピコベンザミド、ピコキシストロビン、ポリオキシン、プロベナゾール、プロクロラズ、プロシミドン、プロパモカルブ、プロパモカルブ−ヒドロクロリド、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、ピラゾホス、ピリフェノクス、ピリメタニル、ピリフェノクス、ピロルニトリン、ピロキロン、キンコナゾール、キノキシフェン、キントゼン、シルチオファム、シメコナゾール、スピロキサミン、ストレプトマイシン、スルフル、テブコナゾール、テクラゼン、テクロフタラム、テクナゼン、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チフルザミド、チオファネート、チオファネート−メチル、チラム、チアジニル、トルクロホス−メチル、トリフラニド、トリアジメホン、トリアジメノール、トリアリモール、トリアゾックシド、トリデモルフ、トリモルファミドトリサイクラゾール、トリフロキシストロビン、トリホリン、トリチコナゾール、ユニコナゾール、バリダマイシン、ビンクロゾリン、ジンブ、ジラム、及びゾキサミド；殺ダニ剤例えばアルジカルブ、オキサミル及びフェナミホス；殺菌剤例えばストレプトマイシン；殺ダニ剤例えばアミトラズ、チノメチオナト、クロロベンジレート、シヘキサチン、ジコホル、ジエノクロル、エトキサゾール、フェナザキン、フェンブタチンオキシド、フェンプロパスリン、フェンピロキシメート、ヘキシチアゾックス、プロパルガイト、ピリダベン及びテブフェンピラド；及び生物学的物質、例えば昆虫病原性細菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ａｉｚａｗａｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｋｕｒｓｔａｋｉ、及びカプセル化されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのデルタ−内毒素（例えばＣｅｌｌｃａｐ、ＭＰＶ、ＭＰＶＩＩ）；昆虫病原性カビ、例えば黒きょう病カビ；及び昆虫病原性ウィルス、例えばバキュロウィルス、核多面体ウィルス（ＮＰＶ）例えばＨｚＮＰＶ、ＡｆＮＰＶ；及び顆粒症ウィルス（ＧＶ）例えばＣｐＧＶを包含する。これ等の種々の混合相手の本発明の方法で使用される他の組成物（例えば除草剤）に対する比は、典型的には、１００：１〜１：１００、又は３０：１〜１：３０、１０：１〜１：１０、又は４：１〜１：４である。
【０２３３】
本発明は又目的の除草剤又は除草剤の混合物の生物学的有効量、及び、少なくとも１つの追加的な生物学的に活性な化合物又は物質の有効量を含む組成物に関し、そして更に少なくとも１つの界面活性剤、固体希釈剤又は液体希釈剤を含むことができる。そのような生物学的に活性な化合物又は物質は、以下のもの、即ち：殺虫剤、例えば、アバメクチン、アセフェート、アセトアミプリド、アミドフルメト（Ｓ−１９５５）、アベルメクチン、アザジラクチン、アジンホス−メチル、ビフェンスリン、ビフェナゼート、ブプロフェジン、カルボフラン、クロルフェナピル、クロルフルアズロン、クロルピリホス、クロルピリホス−メチル、クロマフェノジド、クロチアニジン、シフルスリン、ベータ−シフルスリン、シハロスリン、ラムダ−シハロスリン、シペルメスリン、シロマジン、デルタメスリン、ジアフェンチウロン、ジアジノン、ジフルベンズロン、ジメトエート、ジオフェノラン、エマメクチン、エンドスルファン、エスフェンバレレート、エチプロール、フェノチカルブ、フェノキシカルブ、フェンプロパスリン、フェンバレレート、フィプロニル、フロニカミド、フルシスリネート、タウ−フルバリネート、フルフェネリム（ＵＲ−５０７０１）、フルフェノクスロン、ホノホス、ハロフェノジド、ヘキサフルムロン、イミダクロプリド、インドキサカルブ、イソフェンホス、ルフェヌロン、マラチオン、メタルデヒド、メタミドホス、メチダチオン、メトミル、メトプレン、メトキシクロル、モノクトロホス、メトキシフェノジド、ニチアジン、ノバルロン、ノビフルムロン（ＸＤＥ−００７）、オキサミル、パラチオン、パラチオン−メチル、ペルメスリン、ホレート、ホサロン、ホスメット、ホスファミドン、ピリミカルブ、プロフェノホス、ピメトロジン、ピリダリル、ピリプロキシフェン、ロテノン、スピノサド、スピロメシフム（ＢＳＮ２０６０）、スルプロホス、テブフェノジド、テフルベンズロン、テフルスリン、テルブホス、テトラクロルビンホス、チアクロプリド、チアメトキサム、チオジカルブ、チオスルタップ−ナトリウム、トラロメスリン、トリクロルホン及びトリフルムロン；殺真菌剤例えばアシベンゾラル、アゾキシストロビン、ベノミル、ブラスチシジン−Ｓ、Ｂｏｒｄｅａｕｘ混合物（３塩基性硫酸銅）、ブロムコナゾール、カルプロパミド、カプタホル、カプタン、カルベンダジム、クロロネブ、クロロトハロニル、銅オキシクロリド、銅塩、シフルフェナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、（５）−３，５−ジクロロ−Ｎ−（３−クロロ−ｌ−エチル−ｌ−メチル−２−オキソプロピル）−４−メチルベンザミド（ＲＨ７２８１）、ジクロシメト（Ｓ−２９００）、ジクロメジン、ジクロル及びイフェノコナゾール、（Ｓ）−３，５−ジヒドロ−５−メチル−２−（メチルチオ）−５−フェニル−３−（フェニル−アミノ）−４Ｈ−イミダゾール−４−オン（ＲＰ４０７２１３）、ジメトモルフ、ジモキシストロビン、ジニコナゾール、ジニコナゾール−Ｍ、ドジン、エジフェンホス、エポキシコナゾール、ファムオキサドン、フェンアミドン、フェナリモール、フェンブコナゾール、フェンカラミド（ＳＺＸ０７２２）、フェンピクロニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、酢酸フェンチン、水酸化フェンチン、フラジナム、フルジオキソニル、フルメトバル（ＲＰＡ４０３３９７）、フルモルフ／フルモルリン（ＳＹＰ−Ｌ１９０）、フロキサストロビン（ＨＥＣ５７２５）、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルトラニル、フルトリアホル、ホルペト、ホスエチル−アルミニウム、フララキシル、フラメタピル（Ｓ−８２６５８）、ヘキサコナゾール、イプコナゾール、イプロベンホス、イプロジオン、イソプロチオラン、カスガマイシン、クレソキシム−メチル、マンコゼブ、マネブ、メフェノキサム、メプロニル、メタラキシル、メトコナゾール、メトミノ−ストロビン／フェノミノストロビン（ＳＳＦ−１２６）、メトラフェノン（ＡＣ３７５８３９）、ミクロブタニル、ネオ−アソジン（鉄メタン−アルソン酸塩）、ニコビフェン（ＢＡＳ５１０）、オリサストロビン、オキサジキシル、ペンコナゾール、ペンシクロン、プロベナゾール、プロクロラズ、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロキナジド（ＤＰＸ−ＫＱ９２６）、プロチオコナゾール（ＪＡＵ６４７６）、ピリフェノクス、ピラクロストロビン、ピリメタニル、ピロキロン、キノキシフェン、スピロキサミン、スルフル、テブコナゾール、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チフルザミド、チオファネート−メチル、チラム、チアジニル、トリアジメホン、トリアジメノール、トリサイクラゾール、トリフロキシストロビン、トリチコナゾール、バリダマイシン及びビンクロゾリン；殺ダニ剤例えばアルジカルブ、オキサミル及びフェナミホス；殺菌剤例えばストレプトマイシン；殺ダニ剤例えばアミトラズ、チノメチオナト、クロロベンジレート、シヘキサチン、ジコホル、ジエノクロル、エトキサゾール、フェナザキン、フェンブタチンオキシド、フェンプロパスリン、フェンピロキシメート、ヘキシチアゾックス、プロパルガイト、ピリダベン及びテブフェンピラド；及び生物学的物質、例えば昆虫病原性細菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ａｉｚａｗａｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｋｕｒｓｔａｋｉ、及びカプセル化されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのデルタ−内毒素（例えばＣｅｌｌｃａｐ、ＭＰＶ、ＭＰＶＩＩ）；昆虫病原性カビ、例えば黒きょう病カビ；及び昆虫病原性ウィルス、例えばバキュロウィルス、核多面体ウィルス（ＮＰＶ）例えばＨｚＮＰＶ、ＡｆＮＰＶ；及び顆粒症ウィルス（ＧＶ）例えばＣｐＧＶである。本発明の方法は又、無脊椎動物の害虫に対して毒性である蛋白（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのデルタ−内毒素）を発現するように遺伝子的に形質転換された植物の使用を含んでよい。そのような実施形態において、内因性に適用された無脊椎動物害虫制御化合物の作用は発現された毒素蛋白と相乗作用的であってよい。
【０２３４】
これ等の農業保護剤の一般的参考文献はＴｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ，１３ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ｄ．Ｓ．Ｔｏｍｌｉｎ，Ｅｄ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｆａｒｎｈａｍ，Ｓｕｒｒｅｙ，Ｕ．Ｋ．，２００３及びＴｈｅ  Ｂｉｏ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｌ．Ｇ．Ｃｏｐｐｉｎｇ，Ｅｄ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｆａｒｎｈａｍ，Ｓｕｒｒｅｙ，Ｕ．Ｋ．，２００１を包含する。
【０２３５】
特定の例においては、同様の制御スペクトルを有するが異なる作用様式を有する他の無脊椎動物害虫制御化合物又は物質との組合せが抵抗性管理の為に特に好都合となる。即ち、本発明の組成物は更に、同様の制御スペクトルを有するが異なる作用様式を有する追加的な無脊椎動物害虫制御化合物又は物質の少なくとも１つの生物学的有効量を含むことができる。植物保護化合物（例えば蛋白）を発現するように遺伝子的に改質された植物又は植物の場所を本発明の化合物の生物学的有効量に接触させることも、植物保護のより広範なスペクトルをもたらすことができ、そして、抵抗性管理の為に好都合である。
【０２３６】
即ち、本発明の方法は、除草剤又は除草剤の組合せを使用し、そして、殺虫剤及び／又は殺真菌剤及び／又は他の農薬、例えば肥料の使用を更に含んでよい。本発明のそのような組合せによる処理の使用は、追加的雑草種に対抗した活性のスペクトルをより広範なものとし、そして、何れかの抵抗性の生物型の増殖を抑制することができる。
【０２３７】
本発明の方法は更に、植物成長調節剤、例えばアビグリシン、Ｎ−（フェニルメチル）−１Ｈ−プリン−６−アミン、エテホン、エポコレオン、ジベレリン酸、ジベレリンＡ４及びＡ７、ｈａｒｐｉｎ蛋白、メピカットクロリド、プロヘキサジオンカルシウム、プロヒドロジャスモン、ナトリウムニトロフェノレート及びトリネキサパック−メチル及び植物生育改質性の生物、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ株ＢＰ０１の使用を含むことができる。
【０２３８】
ＶＩ．選択可能なマーカーとしての使用及び形質転換の方法
一部の実施形態においては、ＧＡＴポリヌクレオチド及びＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドを含む本発明のコンストラクトは例えば植物、細菌、放線菌類、酵母、藻類又は他のカビにおける選択可能なマーカーとして機能する。例えば、ＧＡＴポリヌクレオチドを含むベクターを用いて形質転換されている生物を、グリホセートの存在下に生育するその能力に基づいて選択できる。或いは、ＡＬＳ阻害剤耐性ポリヌクレオチドを含むベクターを用いて形質転換されている生物を、ＡＬＳ阻害剤の存在下に生育するその能力に基づいて選択できる。本発明の一部の実施形態においては、ＧＡＴポリヌクレオチド及び他の除草剤耐性ポリヌクレオチド（即ちＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＨＲＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等）を含む本発明のコンストラクトは、例えば植物、細菌、放線菌類、酵母、藻類又は他のカビにおける選択可能なマーカーとして機能する。例えばＧＡＴポリヌクレオチド及び他の除草剤耐性ポリヌクレオチドを含むベクターを用いて形質転換されている生物を、グリホセート及び該当する他の除草剤の存在下に生育するその能力に基づいて選択できる。実施例１０及び図７に示す通り、そのような選択方法は、例えば、発現に関わる潜在的問題点を発見するために形質転換過程における早期の段階において目的の何れかのポリヌクレオチドの発現を評価できるようにする。目的の何れかのポリヌクレオチドを使用することができるが、特定の実施形態においては、殺虫剤遺伝子を使用する。
【０２３９】
ＧＡＴポリヌクレオチド及び／又はＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本発明のコンストラクトは極めて高値の形質転換効率、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％以上の効率を示す場合がある。この態様において、形質転換の向上した方法が提供される。更に又、本発明のコンストラクトがＧＡＴポリヌクレオチド及び／又はＡＬＳ阻害剤耐性ポリヌクレオチドを含む場合、得られる形質転換体は、例えば形質転換体の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％がグリホセート及び／又はＡＬＳ阻害剤に対して耐性であるように、グリホセート又はＡＬＳ阻害剤に対する耐性を極めて高頻度で示す場合がある。本明細書においては、「形質転換効率」という用語はグリホセート及び／又はＡＬＳ阻害剤の化学的特徴のような、選択物質の特定の濃度に抵抗性であるＴ０事象のパーセントとして定義される。本発明のコンストラクトが例えば３５Ｓエンハンサーのようなエンハンサーに作動可能に連結したＧＡＴポリヌクレオチド及び／又はＡＬＳ阻害剤耐性ポリヌクレオチドを含む場合、得られる形質転換体は、例えば形質転換体の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％がグリホセート又はＡＬＳ阻害剤に対して耐性であるように、グリホセート及び／又はＡＬＳ阻害剤に対する耐性を極めて高頻度で示す場合がある。更に又、本発明のコンストラクトがＧＡＴポリヌクレオチド及び／又はＡＬＳ阻害剤耐性ポリヌクレオチドを含む場合、コンストラクトの僅か単一コピーのみがゲノム内に挿入される形質転換事象の頻度は少なくとも３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上もの高値となる場合がある。本発明のコンストラクトが例えば３５Ｓエンハンサーのようなエンハンサーに作動可能に連結したＧＡＴポリヌクレオチド及び／又はＡＬＳ阻害剤耐性ポリヌクレオチドを含む場合、コンストラクトの僅か単一コピーのみがゲノム内に挿入される形質転換事象の頻度は少なくとも３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上もの高値となる場合がある。このような態様において、本発明は又形質転換の改良した方法を提供する。エンハンサーをコンストラクトにおいて使用するばあい（例えばＳ３５エンハンサー）、例えば１、２、３、４、５、６以上の複数のコピーを使用することができる。そのような場合において、形質転換体はグリホセート及び／又はＡＬＳ阻害剤を用いて選択してよく、又は、それらは別の化合物、例えば形質転換したコンストラクトが耐性形質を含有している相手となる別の除草剤を用いて選択してよい。
【０２４０】
ＶＩＩ．キット
本発明は更に、本発明のグリホセート／ＡＬＳ阻害剤植物を創生する場合に使用するための、グリホセート耐性を付与できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び／又はＡＬＳ阻害剤耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト少なくとも１つを含むキットを提供する。特定の実施形態においては、キットはＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、又は、キットはＧＡＴをコードするポリヌクレオチド及びＡＬＳ阻害剤耐性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド（即ちＨＲＡ）を含むことができる。一部の特徴において、本発明のコンストラクトはＴ−ＤＮＡ配列を含むことになる。コンストラクトは場合によりグリホセート抵抗性を付与するポリヌクレオチドに作動可能に連結した調節配列（例えばプロモーター）を包含することができ、その場合、プロモーターはそのポリヌクレオチドに対して異種であり、そして、核酸コンストラクトで形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を増強するために十分なコードされたポリペプチドの発現を誘発するために有効である。
【０２４１】
本明細書において冠詞「ａ」および「ａｎ」は、「１つ」又は「１つより多い」（即ち少なくとも１つの）その冠詞の文法上の目的語を指す。例示すれば、「ある要素」は１つ以上の要素を意味する。
【０２４２】
本明細書において記載した全ての刊行物及び特許出願は本明細書が関連する技術における当業者のレベルを示すものである。全ての刊行物及び特許出願は各々の刊行物及び特許出願が特定的及び個々に参照により組み込まれることを示すが如く参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４３】
上記した本発明は理解を明確化する目的のための説明及び例示により一部詳細に記載してあるが、特定の変化及び変更を添付請求項の範囲内で実施できることは明白である。
【実施例】
【０２４４】
実験
実施例１−ＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシ植物は種々の除草剤及び農薬に耐性である。
【０２４５】
構成的プロモーターに作動可能に連結したＧＡＴポリヌクレオチド（配列番号４）及びＨＲＡポリヌクレオチド（配列番号６６）を含有する発現カセットを用いたトウモロコシのアグロバクテリウム媒介形質転換の為に、Ｚｈａｏの方法を用いる（米国特許第５，９８１，８４０号及びＰＣＴ特許公開ＷＯ９８／３２３２６；内容は参考として本明細書に援用される）。ＧＡＴポリヌクレオチド及びＨＲＡポリヌクレオチドを含む発現カセットを作製した。一部の発現カセットにおいては、ＧＡＴ及びＨＲＡポリヌクレオチドは３５Ｓエンハンサー（配列番号７２）の少なくとも１コピーに作動可能に連結させた。一部の発現カセットにおいては、ＧＡＴ及びＨＲＡポリヌクレオチドは配列番号１の３５Ｓエンハンサーの２又は３コピーに作動可能に連結させた。一部の発現カセットにおいては、ＧＡＴポリヌクレオチドはユビキチンプロモーターに作動可能に連結させ、そしてＨＲＡポリヌクレオチドはネイティブのトウモロコシアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）に作動可能に連結させた。
【０２４６】
慨すれば、未成熟の胚をトウモロコシから単離し、そして胚をアグロバクテリウムの懸濁液と接触させ、ここで、細菌は、未成熟胚少なくとも１つの細胞少なくとも１つにＧＡＴ及びＨＲＡ配列を移入させることができるものである（工程１：感染工程）。この工程において、未成熟胚は接種開始の為にアグロバクテリウム懸濁液中に浸漬する。胚をアグロバクテリウムと共に一定期間同時培養する（工程２：同時培養工程）。未成熟胚を感染工程後に固体培地上で培養する。この同時培養期間の後、任意の「休止」工程を意図する。この休止工程において、植物形質転換体のための選択物質を添加することなく、アグロバクテリウムの生育を阻害することがわかっている抗生物質少なくとも１つの存在下に胚をインキュベートする（工程３：休止工程）。未成熟胚は、固体培地上、抗生物質と共に、ただし選択物質非存在下で培養することにより、アグロバクテリウムを除去し、そして感染細胞の休止期を確保する。次にインキュベートされた胚を選択物質を含有する培地上で培養し、そして生育中の形質転換されたカルスを回収する（工程４：選択工程）。未成熟の胚を選択物質と共に固体培地上で培養することにより形質転換した細胞を選択的に生育させる。次にカルスを植物にまで再生（工程５：再生工程）し、選択培地上に生育したカルスを固体培地上で培養して植物を再生する。
【０２４７】
除草剤耐性の評価
ＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシ植物のグリホセート及び他の除草剤に対する耐性について評価した。この評価において使用した１つのプロトコルは以下の通りである。Ｖ２段階（Ｒｉｔｃｈｉｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｗａｙ（１９８２），“Ｈｏｗ  ａ  ｃｏｒｎ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｓ”Ｓｐｅｃ．Ｒｅｐ．４８．（Ｃｏｏｐ．Ｅｘｔ．Ｓｅｒ．，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖ．，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ））において、植物の草丈を測定し、除草剤を噴霧適用により適用した。噴霧適用後１０〜１４日、トランスジェニック植物を傷害症状について評価し、そして、再度草丈を測定することにより植物生育速度を測定した。試験の１つのシリーズにおいては、ＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシ及び対照植物を以下の除草剤の１つ、即ち：トリベヌロン（Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、適用比率０及び２００グラム活性成分／ヘクタール（ｇ  ａｉ／ｈａ））；クロリムロン（Ｃｌａｓｓｉｃ（登録商標）、０及び２００ｇ  ａｉ／ｈａ）；イマザピル（Ａｒｓｅｎａｌ（登録商標）、２００ｇ  ａｉ／ｈａ）；メトスルフロン−メチル（Ａｌｌｙ（登録商標）、０．５ｏｚａｉ／ａｃ（３６．９ｍｌａｉ／ｈａ）または３５ｇ  ａｉ／ｈａ）で処理（発芽後）した。各処理に付き、ＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシは処理による有意な損傷を示さなかったが、対照トウモロコシは重度の損傷を受けるか、殺傷された。
【０２４８】
ＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシ植物はまた種々の他の除草剤及び除草剤の組合せ並びに他の農薬、例えばグリホセート（ＷｅａｔｈｅｒＭａｘ（登録商標），適用比率６４．４ｏｚａｉ／ａｃ（４．７Ｌａｉ／ｈａ））；リムスルフロン（Ｍａｔｒｉｘ（登録商標），適用比率１．９ｏｚａｉ／ａｃ（１４０ｍｌａｉ／ｈａ））；スルホメツロン−メチル（Ｏｕｓｔ（登録商標），適用比率４．５ｏｚａｉ／ａｃ（３３２ｍｌａｉ／ｈａ））；Ｂａｓｉｓ（登録商標）（リムスルフロンとチフェンスルフロン−メチルの組合せ、適用比率１．４ｏｚａｉ／ａｃ（１０３ｍｌａｉ／ｈａ））；及びクロルピリホス（Ｌｏｒｓｂａｎ（登録商標），適用比率１４．４ｏｚａｉ／ａｃ（１．０６Ｌａｉ／ｈａ））で処理した。次に植物を処理後種々の時点、例えば処理後１０又は１４日において評価した。耐性植物は除草剤又は除草剤の組合せによる処理後に殆ど、又は全く損傷を示さなかったものであった。この評価により多数のスルホニル尿素及びグリホセート化学物質に対して耐性であるＧＡＴ−ＨＲＡ植物が発見された。ＧＡＴ−ＨＲＡ植物は対照植物と比較して生育又は種子結実（即ち収量）における如何なる有意差も示さなかった。葉のサンプルはＧＡＴ−ＨＲＡ植物から採取し、定量的ＰＣＲ及び他の分析において使用することにより、植物ゲノム内に組み込まれたＧＡＴ及びＨＲＡポリヌクレオチドのコピーの数及び配置を調べた。
【０２４９】
評価のための他のプロトコルはイミダゾリノン除草剤、例えば市販除草剤Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（登録商標）（イマザピルとイマゼタピルの組合せ）による処理を包含し、これは圃場標示比率（ｆｉｅｌｄ  ｌａｂｅｌ  ｒａｔｅ）（２５０ｇ  ａｉ／ｈａ）の４倍でＶ２葉の段階においてＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシに適用した。植物は除草剤適用後１４日に評価し、試験した６つのトランスジェニック事象のうち４つが除草剤由来の傷害の症状を示していなかった。評価のための他のプロトコルはイミダゾリノン除草剤並びにスルホニル尿素及びグリホセート除草剤による処理を包含していた。これ等の試験においては、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（登録商標）（イマザピルとイマゼタピル）、Ｂａｓｉｓ（登録商標）（リムスルフロンとチフェンスルフロン）及びＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）（グリホセートカリウム塩）の種々の組合せでＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシを処理した。これ等の除草剤はＶ２段階において以下の通り、即ちＬｉｇｈｔｎｉｎｇ（登録商標）は圃場標示比率の２倍（１．８ｏｚａｉ／ａｃ（１３３ｍｌａｉ／ｈａ））、Ｂａｓｉｓ（登録商標）は圃場標示比率の２倍（０．５ｏｚａｉ／ａｃ（３６．９ｍｌａｉ／ｈａ））そしてＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）は圃場標示比率の４倍（４３ｏｚａｉ／ａｃ）において適用した。適用の１４日後、植物を評価した。１２トランスジェニック事象のうち１１が除草剤傷害症状を示していなかった。「圃場標示比率」とは、製品の標示部に明記されている適用比率を指す。特定の状況に対する適用比率が比率の範囲である場合は、本明細書においては「圃場標示比率」という用語はその範囲の上限を示す。農薬に関する製品標示情報は合衆国環境保護局から入手でき、そしてｏａｓｐｕｂ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｐｅｓｔｌａｂｌ／ｐｐｌｓ．ｏｗｎのＵＲＬでオンラインにより更新されており；製品標示情報はｗｗｗ．ｃｄｍｓ．ｎｅｔのＵＲＬでオンライン入手することもできる。
【０２５０】
別の試験によりこれ等のＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシ植物の多数の除草剤に対する耐性が安定に継承されることが確認された。温室評価において優秀な除草剤耐性を示した２０体のトランスジェニックＴ０植物からＴ１種子を収穫した。当業者の知る通り、除草剤に対する植物の耐性は環境により変動する場合があり、そして温室環境における除草剤処理は圃場における除草剤処理よりも大きい処理植物に対する影響を有する場合がある。従って、Ｔ１種子を圃場条件下において更に評価した。Ｔ１植物には、スルホニル尿素及びグリホセート除草剤を包含する４種の異なる除草剤処理組合せによりＶ４葉段階において噴霧した。一部の試験においては、グリホセートには耐性であるが他の除草剤には感受性であることがわかっているトランスジェニック対照系統を使用した。試験したＴ１植物もまた、圃場条件下において優秀な除草剤耐性を示し、除草剤耐性の安定な継承が確認された。
【０２５１】
除草剤の範囲に対する耐性の評価
次にＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシ植物が他の除草剤に対しても耐性であるかどうか調べるためにこれ等を評価した。発芽前及び発芽後の除草剤適用の両方の試験を実施した。詳細には、評価すべき各系統７点のコーン種子をＴａｍａシルトローム土壌の５．５インチの正方形のプラスチックコンテナ中１ｃｍの深さに植栽した。表３及び４に記載する処理を適用後に全ての散水を行った。発芽後１週間に、苗木を間引きして各コンテナが２体の均一な植物を有するようにした。迅速な成長のためにコーン苗木には散水施肥し、そして１６時間の照明時間で生育させた。天然光度が５００μＥ／ｍ２／ｓ未満に低下した場合は、１６０μＥ／ｍ２／ｓの光合成活性照射を有するハロゲン化金属ライトにより補充した。温度は日中は２８±２℃、そして夜間は２２±２℃に維持した。相対湿度は一般的に５０〜９０％の範囲であった。
【０２５２】
発芽前除草剤適用の検討では市販の除草剤製剤を使用した。噴霧混合物は室温で脱イオン水を用いて製造し、そして少なくとも１５分間攪拌した。製造後１〜２時間に噴霧処理した。可溶化を確実にするために高ｐＨ塩基性ブレンドアジュバントを用いながら１３８ｋＰａに設定した噴霧圧力で５１ｃｍのフラットファンノズルで３７４Ｌ／ｈａの噴霧容量において全て適用処理した。植物は傷害について目視評価し、そして新芽は処理後４週間に計量した（結果は表１）。作物傷害もまた、０％を無傷害、１００％を植物死とする０％〜１００％範囲の尺度上で目視により推定した。結果は表３に示す通りであり、４連の平均として表示した。
【０２５３】
【化７】
2009505654.tif 000009
【０２５４】
【化８】
2009505654.tif 000010
発芽後除草剤適用の検討でも市販の除草剤製剤を使用した。詳細には、評価すべき各系統４点のコーン種子を合成生育培地の５．５インチの正方形のプラスチックコンテナ中１ｃｍの深さに植栽した。極めて幼若なトランスジェニック苗木をグリホセートで前処理することによりグリホセートに感受性である分離株を排除した。グリホセート処理により傷害を受けた植物は除去し、コンテナを間引きすることにより各々２つの均一な植物とした。余分なコンテナにも植栽することにより、２つの均一で未傷害の植物を有するコンテナのみを実験で使用した。迅速な成長のためにコーン苗木には散水施肥し、そして１６時間の照明時間で生育させた。天然光度が５００μＥ／ｍ２／ｓ未満に低下した場合は、１６０μＥ／ｍ２／ｓの光合成活性照射を有するハロゲン化金属ライトにより補充した。温度は日中は２８±２℃、そして夜間は２２±２℃に維持した。相対湿度は一般的に５０〜９０％の範囲であった。
【０２５５】
発芽後の検討では市販の除草剤製剤を使用し、植栽の２週間後に適用した。除草剤の噴霧混合物は室温で脱イオン水を用いて製造し、そして少なくとも１５分間攪拌した。製造後１〜２時間に噴霧処理した。全ＡＬＳ除草剤処理は１３８ｋＰａに設定した噴霧圧力で５１ｃｍのフラットファンノズルで３７４Ｌ／ｈａの噴霧容量において適用し、そして可溶化及び葉面浸透を確実にするために高ｐＨ塩基性ブレンドアジュバントを含有させた。グリホセート及びグルホシネートの除草剤調製物は高い葉面活性を確保するためにその市販製剤中にアジュバント系を含有している。生新芽を処理２週間後に計量（データは表５）し、そして、０％を無傷害、１００％を植物死とする０％〜１００％の尺度上で目視により植物を傷害について評価した（データは表６）。結果は４連の平均として表５及び６に表示した。
【０２５６】
【化９】
2009505654.tif 000011
【０２５７】
【化１０】
2009505654.tif 000012
他の農薬を包含する追加的試験
他のプロトコルを用いて、ＧＡＴ−ＨＲＡ植物が対照植物よりも種々の除草剤に対してより耐性であることの外に、更に他の農薬に対しても対照植物より耐性であるかどうかを評価した。例えば１つのプロトコルは有機リン酸系殺虫剤クロルピリホス（Ｌｏｒｓｂａｎ（登録商標））による処理に加えてスルホニル尿素除草剤リムスルフロン及びチフェンスルフロン−メチルによるＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシの処理を包含している。この試験においては、植物は処理後１４日に評価し、そして全て２０体のＧＡＴ−ＨＲＡトランスジェニック植物がこれ等の化学物質に対して良好〜優秀な耐性を示したのに対し、対照植物は処理の結果として有意な損傷を示していた（表８参照）。除草剤傷害スコア（耐性スコアとも称する）は、等級９が植物が傷害兆候を示さなかったことを表し、そして等級１が完全な植物死を表す１〜９の尺度上に区画ごとに割り付けた。等級５は中程度の葉面傷害を指す。本明細書において使用した尺度は更に以下の表７においても説明する。
【０２５８】
【化１１】
2009505654.tif 000013
【０２５９】
【化１２】
2009505654.tif 000014
噴霧適用後１４日に２０体のトランスジェニック植物を更に草丈に関して区画ごとに評価した。同じ４種の最も耐性のＧＡＴ−ＨＲＡ事象の草丈を非ＧＡＴ−ＨＲＡ対照と共に採取した。４種のトランスジェニック事象は全ての除草剤処理に対して均一な植物の生育を示した。非ＧＡＴ−ＨＲＡ対照はスルホニル尿素処理により植物生育の減少を示した。これ等の測定により得られた平均の区画草丈の結果を表９に示す。
【０２６０】
【化１３】
2009505654.tif 000015
除草剤用量範囲に対するＧＡＴ−ＨＲＡ植物の応答の比較
ＧＡＴ−ＨＲＡトウモロコシ植物を種々の発現カセットを用いて製造し、グリホセートと組み合わせた多数のスルホニル尿素化学物質に対する耐性について上記した通り試験した（表１０参照）。
【０２６１】
【化１４】
2009505654.tif 000016
【０２６２】
【化１５】
2009505654.tif 000017
実施例２−ＧＡＴ−ＨＲＡダイズ植物は種々の除草剤及び農薬に対して耐性である。
トランスジェニック植物の形質転換及び再生
以下の通り、構成的プロモーターに作動可能に連結したＧＡＴ（配列番号６８）及びＨＲＡポリヌクレオチド（配列番号６５）を含有する発現カセットをダイズ胚に衝突させた。ＧＡＴ配列の為に使用したプロモーターはＳＣＰ１プロモーターであり、そしてＨＲＡ配列の為に使用したプロモーターはＳＡＭＳプロモーターであった。２プロモーター／遺伝子組合せをＧＡＴプロモーター／遺伝子の下流にＨＲＡプロモーター／遺伝子と直列の方向で配置させる。体性胚を誘導するために、ダイズ品種Ｊａｃｋの表面殺菌未成熟種子から切り出した長さ４ｍｍの子葉を６〜１０週間適切な寒天培地上２６℃において照明又は消灯下に培養した。次に二次胚を生成している体性胚を切開し、適当な液体培地に植栽した。早期の球状段階の胚として増殖している体性胚のクラスターについての反復選択の後、懸濁液を以下に記載する通り維持した。ここでは、形質転換された植物により保有されるべき除草剤耐性形質を選択可能なマーカーとして使用した。
【０２６３】
ダイズ胚形成性懸濁培養物を１６：８時間の照明／消灯スケジュールにおいて蛍光灯下に２６℃において、１５０ｒｐｍの回転振とう器上の３５ｍｌの液体培地中に維持した。液体培地３５ｍｌ中に組織約３５ｍｇを接種することにより２日毎に培養物を継代した。
【０２６４】
ダイズ胚形成性懸濁液培養物は次に、粒子ガン衝突法により形質転換した（Ｋｌｅｉｎら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３，米国特許４，９４５，０５０）。
【０２６５】
６０ｍｇ／ｍＬの１μｍ金粒子の懸濁液５０μｌに対し、（順次）５μｌのＤＮＡ（１μｇ／μｌ）、２０μｌのスペルミジン（０．１Ｍ）及び５０μｌのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）を添加した。次に粒子調製物を３分間振とうし、１０秒間マイクロ遠心分離器中で回転させ、そして上澄みを除去した。次にＤＮＡコーティング粒子を４００μｌの７０％エタノール中で一回洗浄し、そして無水エタノール４０μｌに再懸濁した。ＤＮＡ／粒子懸濁液を各々１秒ずつ３回超音波処理した。ＤＮＡコーティング金粒子５マイクロリットルを次に各マクロキャリアディスク上にロードした。
【０２６６】
２週齢の懸濁培養物約１５０〜２００ｍｇを６０×１５ｍｍのペトリ皿にいれ、残存液はピペットで組織から除去した。各形質転換実験につき、約５〜１０プレートの組織を通常通り衝突させた。膜破壊圧力は１１００ｐｓｉ（７７．３５６ｋｇ／ｃｍ）とし、チャンバーを２８インチ水銀の真空度まで吸引した。組織を保持スクリーンから約８．８９ｃｍ離しておき、そして３回衝突させた。衝突の後、組織を半分に分割し、液体内に戻し、上記した通り培養した。
【０２６７】
衝突後５〜７日に、液体培地を新しい培地と、そして衝突後１１〜１２日に３０〜５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含有する新しい培地と交換し、そして１００ｎｇ／ｍｌのクロルスルフロンを選択物質として使用した。この選択培地は週ごとに新しくした。衝突後７〜８週間に、形質転換されていない壊死性胚形成性クラスターから緑色の形質転換した組織が生育しているのが観察された。単離した緑色の組織を取り出し、個々のフラスコに接種することにより新規にクローン的に増殖された、形質転換された胚形成性懸濁培養物を生成した。形質転換された組織の別個の区域から誘導された各々の新しい培養物を独立した形質転換事象として取り扱い；個々の培養物並びに形質転換された単一区域から誘導された初期（Ｔ０）植物並びにその子孫は一般的に単一の「事象」を示すべきものとされた。これ等の懸濁液を次に継代し、未成熟胚のクラスターとして維持するか、又は、個々の体性胚の成熟化及び発芽により完全な植物まで再生した。
【０２６８】
除草剤処理
幼若な再生トランスジェニック植物に１×グリホセート（グリホセートの１×比率は１１２０ｇ／ｈａのグリホセートイソプロピルアミンである）を噴霧することにより分離株を間引いた。各処理に付き４連で実施した。次に植物をグリホセート及びＡＬＳ阻害剤除草剤を包含する種々の除草剤で処理した。トリベヌロン−メチル除草剤で処理した場合、０及び３５ｇ／ｈａで処理したＧＡＴ−及びＨＲＡ−含有トランスジェニックダイズは有意な損傷を示さなかったのに対し、除草剤処理非トランスジェニック対照ダイズは処理により殺傷された。次に植物を８×グリホセート及び３５ｇ／ｈａのトリベヌロン−メチル並びに３５ｇ／ｈａのリムスルフロンで処理し、同様の結果が得られた。
【０２６９】
試験すべき各品種から６体のダイズ種子を合成生育培地の５．５インチ（１３．９７ｃｍ）の正方形のプラスチックコンテナ中１ｃｍの深さに植栽した。極めて幼若なトランスジェニック苗木をグリホセートで前処理することによりグリホセートに耐性でない分離株を排除し；この処理により傷害を受けた植物を除去した。可能な場合は、コンテナを間引きして２体の均一な植物を有するようにした。非トランスジェニック系統は間引きしてコンテナ当たり２体の均一な植物を有するようにした。迅速な成長のためにダイズ苗木には散水施肥した。植物は１６時間の照明時間で生育させ、天然光度が５００μＥ／ｍ２／ｓ未満に低下した場合は、１６０μＥ／ｍ２／ｓの光合成活性照射を有するハロゲン化金属ライトにより補充した。温度は日中は２８±２℃、そして夜間は２２±２℃に維持した。相対湿度は一般的に５０〜９０％の範囲であった。
【０２７０】
これ等の発芽後の検討では市販の除草剤製剤を使用し、植栽の約２週間後に適用した。噴霧混合物は室温で脱イオン水を用いて製造し、そして少なくとも１５分間攪拌した。製造後１〜２時間に噴霧処理した。３５ｇ／ｈａリムスルフロン及びトリベヌロン−メチル除草剤処理は１３８ｋＰａに設定した噴霧圧力で５１ｃｍのフラットファンノズルで３７４Ｌ／ｈａの噴霧容量において適用し、そして可溶化及び葉面浸透を確実にするために高ｐＨ塩基性ブレンドアジュバントを含有させた。グリホセート処理の市販製剤も１３８ｋＰａに設定した噴霧圧力で５１ｃｍのフラットファンノズルで３７４Ｌ／ｈａの噴霧容量において適用した。植物は０％を無傷害、１００％を植物死とする尺度上で傷害について目視により評価した。結果は４連の平均として表１１に表示した。
【０２７１】
【化１６】
2009505654.tif 000018
実施例３−トランスジェニックＧＡＴ−ＨＲＡワタは数種の除草剤に耐性である。
【０２７２】
ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）Ｃｏｋｅｒ  ３１２を強力な構成的植物ウィルスプロモーターに共に作動可能に連結したＧＡＴポリヌクレオチド（ｇａｔ４６２１）及びＨｒａポリペプチド（配列番号８６）で形質転換した。ｇａｔ４６２１に連結したプロモーターはイチゴベインバンディングウィルス（Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  Ｖｅｉｎ  Ｂａｎｄｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ）転写物プロモーターの重複部分を含有している（Ｗａｎｇら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２０：１１−１７，２０００；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ９７３０４）。Ｈｒａ遺伝子はミラビリスモザイクカウリモウィルス完全長転写物プロモーターの重複部分を含有している（米国特許第６，４２０，５４７号；Ｄｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｉｔｉ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ  ３：６１−７０，１９９９）。形質転換操作法では移入すべき遺伝子と共に発現カセットを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び胚形成を起こす一部の能力を有する子葉外移植誘導カルスを使用した。カルスは４８〜７２時間Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに曝露した。次にカルスを固体培地中５０〜２００μｇ／ｌのクロロスルフロン及び／又は５０〜４５０μＭのグリホセート上で形質転換細胞選択に曝露した。グリホセートは又約５〜約４５０μＭの濃度範囲でも使用できる。体性胚が形成されるまで選択を適用し、そして胚発芽工程において、そして場合により小植物の根形成の間に選択を再度適用した。４５０超のＧＡＴ−ＨＲＡ形質転換事象がクロルスルフロン及びグリホセートの両方による選択を用いながらもたらされた。
【０２７３】
形質転換したワタ植物に根形成させ、次にその後の生育の為に土壌に移した。次に植物を温室中で除草剤噴霧処理に付した。１処理において、グリホセートをエーカー当たり１．５ｌｂ酸換算量（ヘクタール当たり２．５８Ｋｇ酸換算量）の適用比率で発達の４〜６葉段階において植物上面に噴霧した。形質転換されていないＣｏｋｅｒ３１２対照植物はグリホセート適用後２週間で死滅した。これとは対照的に、ＧＡＴ−ＨＲＡトランスジェニック植物（各々別個の形質転換事象に相当）の約５０％は適用後１４日においてグリホセート処理による有害兆候は示していなかった。ＧＡＴ及びＨＲＡの両方で形質転換された植物は更に、１６ｇ活性成分／ヘクタールの比率でスルホニル尿素除草剤リムスルフロンの「オーバーザトップ（ｏｖｅｒ  ｔｈｅ  ｔｏｐ）」適用に付した。ここでも又、トランスジェニック植物の約３５がリムスルフロン適用１４日後、及び、グリホセート適用２８日後に、二重除草剤適用による有害兆候は示していなかった。形質転換されていないＣｏｋｅｒ３１２対照植物は如何なるグリホセート適用も行わなかった場合でさえ、リムスルフロン適用による重度の損傷を示していた。別の実験において、３２ｇ  ａｉ／ｈａリムスルフロンをワタに適用した。
【０２７４】
ＧＡＴ及びＨＲＡポリヌクレオチドの各々の存在は更に、発現されたＧＡＴ及びＨＲＡポリペプチドを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験及びウェスタンブロット分析を用いながら除草剤抵抗性トランスジェニック植物において確認した。
【０２７５】
実施例４−均質顆粒ブレンドの製剤
本発明において有用な除草剤組成物は何れかの適当な態様において、例えば「均質顆粒ブレンド」として製剤してよい（例えば「Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｇｒａｎｕｌｅｓ」と題された米国特許６，０２２，５５２参照）。米国特許第６，０２２，５５２号に従って均質顆粒ブレンドとして製剤された除草剤組成物は押出又はペレット化により典型的には作製される実質的に円筒形の顆粒の２群以上を振とう又は他の態様で混合することにより製造することができ、ここで１つの群は除草剤少なくとも１つを含む活性成分含有量を有し、そして１つ以上の他の群は異なる活性成分含有量又は不活性物質含有量を有し、各群内の顆粒は実質的に均一の直径及び直径の１〜８倍の長手方向の長さを有し、顆粒の平均の長さは直径の１．５〜４倍であり、そして各群の平均の直径は相互に３０％を超えて異ならない。一部の実施形態においては、各顆粒群は例えば除草剤、殺真菌剤及び／又は殺虫剤である単一の活性成分を含有する登録された製剤製品を含む。「実質的に円筒形」とは棒状又は管状であり、ここで横断面の形状は環状、８角形、長方形又は何れかの他の認知可能な形状であってよく、そして、長手方向の形状は螺旋状、曲線又は直線であってよい。平均直径の差はより大きい直径を有する群の顆粒の平均直径からより小さい直径を有する群の顆粒の平均直径を差し引き、そして次に、計算された差をより小さい直径を有する群の顆粒の平均直径で割り、そして最後に、計算された商に１００％を掛けることにより計算される。
【０２７６】
「均質顆粒ブレンド」の均一性はブレンド中に使用される顆粒の相対的粒径及び粒径分布を制御することにより最適化することができる。密度の相違は比較的重要ではない（例えばＲｈｏｄｅｓ（１９９０）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．７１−７６（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）参照）。押出成型された顆粒の直径は押出機のダイスの孔部の大きさにより制御され、そして遠心シフティングプロセスを用いることにより所望の長さの分布を有する押出成型された顆粒の集団を得てよい（例えば米国特許第６，２７０，０２５号参照）。好ましくは、各顆粒群の平均直径は相互に２０％を超えて、より好ましくは１０％を超えて異なることはない。更に好ましくは各群の長手方向の長さは顆粒の直径の１．５〜４倍である。
【０２７７】
各製剤の活性成分は表１２に示す通り、国連の食糧農業機構（ＦＡＯ）のガイドラインに基づいた変動性に関する耐性を有する。
【０２７８】
【化１７】
2009505654.tif 000019
均質顆粒ブレンド中の活性成分含有量は、成分顆粒の活性成分含有量及び成分顆粒が混合される比率に基づいて決定される。均質顆粒ブレンドはブレンド成分の活性成分の名目の値が正確であると推定しながら製造される。活性成分の試験に関連する現実上の変動性並びに混合及びサンプル採取における変動性の為に、以下の通り、均質顆粒ブレンド中の活性成分含有量に関する範囲を計算するための操作法が開発されている。
１．ブレンド成分の各々に関する登録されたＦＡＯ仕様を定義する（「成分中の％ＡＩ」）。
２．ブレンド中の各成分の量に関する製造限度を確立するためにＦＡＯ耐性を適用する（「ブレンド中の％成分」）。
３．「成分中の％ＡＩ」に関する最大限度を「ブレンド中の％成分」に関する最大限度と掛け合わせることによりブレンド中の活性成分（「ブレンド中の％ＡＩ」）の最大限度を計算する。最大及び名目の計算は同様に行う。
【０２７９】
数種の均質顆粒ブレンド製品に関する計算の例を以下に記載する。各々の例の表中の最終欄は例における均質顆粒ブレンドと同じ活性成分含有量を含有する伝統的プレミックス製品に適用される標準的なＦＡＯ試験範囲を示す。均質顆粒ブレンド製品に関するより広い範囲（「ブレンド中の％ＡＩ」）は、製品中の成分としての活性成分含有量の関連する範囲を有する登録された製品を用いることにより導入される変動性を考慮している。
【０２８０】
【化１８】
2009505654.tif 000020
【０２８１】
【化１９】
2009505654.tif 000021
【０２８２】
【化２０】
2009505654.tif 000022
特定の均質顆粒ブレンドが所望の範囲に入るかどうかを調べるための操作法も開発した。均質顆粒ブレンドは顆粒のランダムな混合物であり；従って、組成物を正確に代表するためには、特定数の顆粒を評価しなければならない。サンプルのための顆粒の最小数は下記：
ｓ２＝Ｐ（１００−Ｐ）／ｎ
［式中、ｓ＝ブレンド中の成分の割合の標準偏差、Ｐ＝成分の重量パーセント、そしてｎ＝サンプル中の顆粒の数（約４００個の１ｍｍ直径顆粒＝１グラム）］の統計学的な式を用いて推定できる（Ｒｈｏｄｅｓ（１９９０），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ），ｐｐ．７１−７６参照）。変動性の特定の選択されたレベルに対してブレンド組成物を代表するために必要なサンプルサイズは、ｎの解を求め、そしてこの値のグラムへの変換のために１グラムサンプル中の１ｍｍペースト押出成型顆粒の平均数（例えば４００）で「ｎ」を割ることにより求めることができる。
【０２８３】
この計算の標準偏差が特定の顆粒ブレンドにおける成分の量に関するＦＡＯ耐性に基づいている場合、その顆粒ブレンドに関する最小サンプルサイズを計算できる。９５％信頼区間については、「ブレンド中の％成分」近傍の耐性を２標準偏差に設定する。これは理論的な統計学的推定であると理解される。
【０２８４】
顆粒ブレンドが実用可能な市販製品であるためには、統計学的サンプルサイズは農業経営者又は散布者により計量可能な最小量、典型的にはヘクタール当たりの用量以下でなければならない。上記した顆粒ブレンドに関するサンプルサイズ計算の例を以下に示す。
【０２８５】
【化２１】
2009505654.tif 000023
ＤＰＸ−ＣＤＱ７３  ３９．１  ＷＧブレンドに関する最小サンプルサイズの詳細な計算
少量のブレンド成分（Ｑｕａｎｔｕｍ７５ＰＸ）に関しては±５％相対（ｒｅｌａｔｉｖｅ）のＦＡＯ耐性は５％×３４．８＝１．７の範囲を示している。９５％信頼区間については、２標準偏差を＝１．７に設定し、以下の計算のための標準偏差＝０．８５とする。
【０２８６】
ｓ２＝Ｐ（ｌ−Ｐ）／ｎ＝（０．８５）２＝（６５．２×３４．８）／ｎ
ｎ＝３１４０顆粒＝７．８グラム（４００顆粒／グラムに基づく）
計算された最小の統計学的サンプルサイズである約８グラムは３８ｇ／ｈａの製品使用比率より低値である。
【０２８７】
均質顆粒ブレンドはそれが適切なサイズのアリコートにサブサンプル化でき、そして各アリコートの組成が必要な試験仕様を満足する場合に「均質」と見なされる。均質性を明らかにするためには、均質顆粒ブレンドの大量サンプルを製造し、次にそれを最小統計学的サンプルサイズより大きいアリコートまでサブサンプル化する。ブレンドの第２のサンプルを製造し、シミュレーション輸送試験（ＡＳＴＭＤ４７２８−８７，Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｖｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｈｉｐｐｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）に付し、そして次にサブサンプル化してアリコートとした。アリコートの活性成分を液体クロマトグラフィーを用いて分析する。シミュレーション輸送試験では標準時間量に渡って特定の振動数でビンを振とうし、顆粒に動く機会を与える。顆粒ブレンド成分が適切なサイズでない場合、分離が生じ、そしてアリコートの組成は許容できないほど変動する。
【０２８８】
ＤＰＸ−ＣＤＱ７３  ３９．１ＷＧブレンドに関する均質性試験のアリコート分析データを以下の表１７に示す。顆粒ブレンドアリコートにおいて試験した全データポイントはその該当する計算された仕様の範囲内となり、ブレンドが均質であることを示していた。
【０２８９】
【化２２】
2009505654.tif 000024
均質顆粒ブレンドはロールタイプミキサーを用いたバッチプロセスにより製造されてきた。混合後、顆粒ブレンドを市販用の適切なコンテナ（ビン、袋等）に充填する。製造された均質顆粒ブレンドＤＰＸ−ＣＤＱ７３ＷＧの試験では、ブレンドの異なるバッチに関する全てのデータは、活性成分に関する該当する提案された試験範囲内であることを示していた。
【０２９０】
実施例５−異なるＧＡＴ及びＨＲＡ配列を担持するダイズ植物の間のグリホセート及びＡＬＳ阻害剤除草剤の効果のレベルの評価
ダイズにおける３種のＧＡＴ７事象を４種の選択されたＧＡＴ１１ダイズ事象と比較することにより、高比率のグリホセート＋スルホニル尿素処理に対する耐性に関して差を検出できるかどうか調べた。処理組合せに渡って、ＧＡＴ７コンストラクトは７、１４及び２８ＤＡＳにおいてＧＡＴ１１と比較して有意に低値の噴霧応答を有していた。８×Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ（登録商標）＋１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋２×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）処理及び８×Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ（登録商標）＋２×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋４×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）処理内において、ＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５６０．４．３は７、１４、及び２８ＤＡＳにおいて、全ての事象と比較して最低の噴霧応答スコアを有していた。
【０２９１】
材料及び方法
各処理につき、３種の選択されたＧＡＴ７事象及び４種の選択されたＧＡＴ１１事象の２つの１２フィートの区画３連をハワイの２地区においてＲＣＢ設計（処理によってブロックした（ｂｌｏｃｋｅｄ））で生育させた。試験した個々の系統、事象及びコンストラクトは以下の表１８に示す通りである。
【０２９２】
【化２３】
2009505654.tif 000025
Ｖ３生育段階において適用した３種の異なる処理は、
１．８×Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ（登録商標）Ｈｉ−Ｔｅｃｈ（８６３０．５５ｇ／ｈａａ．ｉ．グリホセート）＋１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）（３５．０ｇ／ｈａａ．ｉ．リムスルフロン）＋２×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（１７．５ｇ／ｈａトリベヌロン）、
２．８×Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ（登録商標）Ｈｉ−Ｔｅｃｈ（８６３０．５５ｇ／ｈａａ．ｉ．グリホセート）＋２×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）（７０．０ｇ／ｈａａ．ｉ．リムスルフロン）＋４×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（３５．０ｇ／ｈａトリベヌロン）及び
３．未噴霧対照であった。全噴霧処理は又、１×の非イオン性界面活性剤及び硫酸アンモニウムを含有していた。噴霧後７、１４及び２８日において、観察された退緑、壊死及び／又は植物の発育停止に基づいて目視による噴霧損傷の格付けを区画に対して行った（０％＝観察される影響なし〜１００％＝全区画死滅）。目視による格付けデータはＡＮＯＶＡ及びＳＡＳを用いた平均値分離に付した。
【０２９３】
結果及び考察
３種の処理に渡って、ＧＡＴのラウンド（７ｖｓ１１）、ＤＮＡコンストラクト、事象、処理、ＧＡＴ＊処理、コンストラクト＊処理及び事象＊処理は７ＤＡＳと１４ＤＡＳにおいて有意に異なっていた（データ示さず）。２８ＤＡＳにおいて、ＧＡＴラウンド、コンストラクト、事象、処理、ＧＡＴ＊処理及び事象＊処理の作用は有意に異なっていた（データ示さず）。ＧＡＴ７系統は７、１４及び２８日において、３種の処理に渡って観察された有意に低値の応答を有していた（データ示さず）。
【０２９４】
８×Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ（登録商標）＋１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋２×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）処理内において、ＧＡＴ７コンストラクトＰＨＰ２０１６３Ａは７、１４及び２８ＤＡＳにおいてＧＡＴｌ１コンストラクトＰＨＰ２２０２１Ａと比較して有意に低値の噴霧応答格付けを有していた（データ示さず）。ＰＨＰ２０１６３Ａは２８ＤＡＳのみにおいてＰＨＰ２２１１７Ａと比較してこの処理に対して有意に高値の耐性を有していた（データ示さず）。比較した事象のうち、ＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５６０．４．３は７及び１４ＤＡＳにおいて観察された最も初期の耐性を有しており、そして２８ＤＡＳにおいて最良の回復スコアを有していた（データ示さず）。最小自乗平均（ＬＳＭｅａｎｓ）の間の差を検討した場合、３種のＧＡＴ７事象の各々はＧＡＴｌ１ＥＡＦＳ３８６１．２．３及びＧＡＴｌ１ＥＡＦＳ３８６２．２．５と比較して７ＤＡＳにおいて有意に低値の噴霧応答を有しており、そして統計学的にはＧＡＴ１１ＥＡＦＳ３８６２．２．５及びＧＡＴｌ１ＥＡＦＳ３８７６．８．１と同様に格付けされた（データ示さず）。１４ＤＡＳにおいて、３種のＧＡＴ７事象はＧＡＴｌ１ＥＡＦＳ３８６２．４．２と比較して有意に低値の応答スコアを有していたが、僅かにＧＡＴ７ＥＡＦＳ３５６０．４．３のみがＥＡＦＳ３８６１．２．３及びＥＡＦＳ３８６２．２．５と比較して有意に低値の応答を有していた（データ示さず」）。２８ＤＡＳにおいて、全三種のＧＡＴ７事象はＧＡＴｌ１事象ＥＡＦＳ３８６１．２．３，ＥＡＦＳ３８６２．４．２，及びＥＡＦＳ３８７６．８．１と比較して有意に良好な回復を有していた（データ示さず）。更に又、ＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５６０．４．３は２８ＤＡＳにおいてＧＡＴｌ１事象ＥＡＦＳ３８６２．２．５と比較して有意に低値の噴霧応答を有していた（データ示さず）。
【０２９５】
８×Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ（登録商標）＋２×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋４×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）処理を検討した場合、ＧＡＴ７ＰＨＰ２０１６３Ａは７、１４及び２８ＤＡＳにおいてＧＡＴｌ１ＰＨＰ２２０２１と比較して有意に低値の応答を有しており、そして、ＰＨＰ２０１６３Ａは２８ＤＡＳにおいてＧＡＴｌ１ＰＨＰ２２１１７Ａと比較して有意に低値の応答を有していた（データ示さず）。事象のうち、ＧＡＴ７ＥＡＦＳ３５６０．４．３は７及び１４ＤＡＳにおいて全ての他の事象と比較して有意に良好な耐性を有しており、そして、ＧＡＴ７ＥＡＦＳ３５５９．２．１及びＥＡＦＳ３５６０．４．３は２８ＤＡＳにおいて全ての他の事象と比較して有意に低値の噴霧応答を有していた（データ示さず）。ＬＳＭｅａｎｓにおける差を比較すれば、７ＤＡＳ及び１４ＤＡＳにおいて、ＧＡＴ７ＥＡＦＳ３５６０．４．３は全ての他のＧＡＴ１１事象と比較して有意に低値の応答を有していた（データ示さず）。他の２種のＧＡＴ７事象は７及び１４ＤＡＳにおいてＧＡＴ１１事象ＥＡＦＳ３８６２．４．２と比較して応答において有意に低値であった（データ示さず）。２８ＤＡＳにおいて、ＧＡＴ７事象ｓＥＡＦＳ３５５９．２．１及びＥＡＦＳ３５６０．４．３は全てのＧＡＴＩｌ事象と比較して有意に良好な回復を有していた（データ示さず）。ＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５６１．１．１はＧＡＴｌ１事象ＥＡＦＳ３８６２．４．２よりも有意に良好であるのみであった（データ示さず）。
【０２９６】
実施例６−ダイズにおける頑健性試行データ分析
圃場試行条件下におけるスルホニル尿素とイミダゾリノンの間の相互作用を検討している。スルホニル尿素とイミダゾリノン化学物質の間の拮抗性は市販のＳＴＳ（登録商標）ダイズ品種において以前に観察されている。チフェンスルフロンのようなＳＵはＳＴＳ（登録商標）ダイズに対しては通常は安全である。イマゼタピル（Ｐｕｒｓｕｉｔ）のようなＩＭＩを付加すると混合物の安全性は低下する（作物の安全性に拮抗する）。ＧＡＴＲｄ７の場合、リムスルフロンは作物ｐｈｙｔｏを誘発する。ＰｕｒｓｕｉｔのようなＩＭＩを付加すると混合物はより安全になる（作物傷害に拮抗する）。以下に記載する提出された試行は例えばリムスルフロンの通常は傷害性の量を例えば通常は「安全な」イミダゾリノン除草剤であるイマゼタピルと混合した場合、作物安全性は増大することを示している。実施例６Ａはこの作用を明らかにしている圃場試行を含む。実施例６Ｂは圃場試行データを確認する温室データを示す。
【０２９７】
実施例６Ａ
ＨＲＡ（配列番号６５）も有する上位（ｌｅａｄ）ＧＡＴ７事象（配列番号６８）のダイズのＴ６世代［ＳＣＰ：ＧＡＴ７：：ＳＡＮＳ：ＡＬＳ］を９２Ｂ２５と比較することにより、スルホニル尿素、クロルピリホス及び／又はイマゼタピル化学物質の異なる組合せ及び比率で噴霧した場合の頑健性のレベルを調べた。１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）（有意差検出されず）を除く全ての処理の組合せに渡って、ＧＡＴ７は第７、１４及び２８噴霧後日（ＤＡＳ）においてＳＴＳ（登録商標）と比較して有意に低値の噴霧応答を有していた。Ｌｏｒｓｂａｎ（登録商標）の存在下及び非存在下の１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）の適用は７ＤＡＳにおいてＧＡＴ７及びＳＴＳ（登録商標）からの大きい応答をもたらした。ＧＡＴ７はまた１４及び２８ＤＡＳにおいてこれ等の処理から有意に回復することができたのに対し、ＳＴＳ（登録商標）系統は重度の損傷を受けたままであった。ＧＡＴ７系統は７ＤＡＳにおいてＳＴＳ（登録商標）系統と比較して４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）に対して有意に低値の噴霧応答を有していたが、両方の系統とも１４及び２８ＤＡＳにおいては統計学的差はなかった。１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）を適用した場合、ＧＡＴ７系統は７、１４及び２８ＤＡＳにおいてＳＴＳ（登録商標）系統と比較して有意に高値の耐性を有していた。７、１４及び２８ＤＡＳの１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）においては、ＧＡＴ７又はＳＴＳ（登録商標）系統の何れからも大きい応答は観察されなかった。１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）を４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）と、又は１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）を４×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）と組み合わせた処理により得られたデータは、７、１４及び２８ＤＡＳにおいてＳＴＳ（登録商標）系統と比較してＧＡＴ７が有意に低値の噴霧応答を有していたことを示している。更に又、０．２５×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋１．５×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）処理から得られた７、１４及び２８ＤＡＳのデータは、ＧＡＴ７がＳＴＳ（登録商標）と比較して有意に高値の耐性を有していたことを示している。一般的に、本試験から得られたデータはＧＡＴ７が多数の除草剤及び殺虫剤化学物質に渡ってＳＴＳ（登録商標）と比較して有意に高値の耐性を与えることを示している。
【０２９８】
材料及び方法
各処理につき、上位ＧＡＴ７事象（ＥＡＦＳ  ３５６０．４．３；ＧＥＩＤ＝ＪＨ１２８６２５２８）及び９２Ｂ２５（ＳＴＳ（登録商標））の２つの１２フィートの区画３連をハワイの２地区においてＲＣＢ設計（処理によってブロックした）で生育させた。Ｖ３生育段階において適用した９種の異なる処理は、
１．１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）（２ｏｚ）（３５．０ｇ／ｈａａ．ｉ．リムスルフロン）、
２．１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）（３５．０ｇ／ｈａａ．ｉ．リムスルフロン）＋１×Ｌｏｒｓｂａｎ（登録商標）４Ｅ（５６０．０ｇ／ｈａａ．ｉ．クロルピリホス）、
３．４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）（２１１．８ｇ／ｈａａ．ｉ．イマゼタピル）、
４．１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）（３５．０ｇ／ｈａａ．ｉ．リムスルフロン）＋４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）（２１１．８ｇ／ｈａａ．ｉ．イマゼタピル）、
５．１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）ＧＴ（７０．０ｇｍｓ／ｈａａ．ｉ．チフェンスルフロン）、
６．１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）（７０．０ｇｍｓ／ｈａａ．ｉ．チフェンスルフロン）＋４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）（２１１．８ｇ／ｈａａ．ｉ．イマゼタピル）、
７．１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）（７０．０ｇｍｓ／ｈａａ．ｉ．チフェンスルフロン）＋４×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（３５．０ｇ／ｈａａ．ｉ．トリベヌロン）、
８．０．２５×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）（２，１５７ｇ／ｈａａ．ｉ．グリホセート）＋１．５×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（１３．１ｇ／ｈａａ．ｉ．トリベヌロン）、
９．未噴霧対照であった。全噴霧処理は又、１×の非イオン性界面活性剤及び硫化アンモニウムを含有していた。噴霧後７、１４及び２８日において、観察された退緑、壊死及び／又は植物の発育停止に基づいて目視による噴霧損傷の格付けを区画に対して行った（０％＝観察される影響なし〜１００％＝全区画死滅）。目視による格付けデータはＡＮＯＶＡ及びＳＡＳを用いた平均値分離（ｍｅａｎ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）に付した。
【０２９９】
結果及び考察
７及び１４ＤＡＳにおいて全ての処理に渡って、位置、ＧＥＩＤ、処理及びＧＥＩＤ＊処理の作用は有意に異なっていた（データ示さず）。ＧＡＴ７系統は７及び１４ＤＡＳにおいて全処理に渡りＳＴＳ（登録商標）より有意に低値にスコア付けされた（データ示さず）。２８ＤＡＳにおいて、ＧＥＩＤ、ｌｏｃ＊ＧＥＩＤ、処理及びＧＥＩＤ＊処理の作用は有意に異なっていた（データ示さず）。全処理に渡り、ＧＡＴ７系統は２８ＤＡＳにおいてＳＴＳ（登録商標）と比較して有意に低値の噴霧損傷であるとスコア付けされた（データ示さず）。
【０３００】
１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）（リムスルフロン）処理は７ＤＡＳにおいてＧＡＴ７（７０％）及びＳＴＳ（登録商標）（８３％）の両方から大きい応答をもたらしている。１４ＤＡＳにおいて、ＧＡＴ７系統（７４％）はＳＴＳ（登録商標）（９３％）と比較して有意に低値の応答を有していた（データ示さず）。２８ＤＡＳまでにＧＡＴ７は回復でき、そしてＳＴＳ（登録商標）系統と比較して有意に低値の損傷であるとスコア付けされた（３２％ｖｓ９３％）（データ示さず）。
【０３０１】
Ｌｏｒｓｂａｎ（登録商標）（クロルピリホス）＋１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）の処理から得られたデータを検討したところ、ＧＡＴ７系統は１４及び２８ＤＡＳまでＳＴＳ（登録商標）系統への応答と比較して有意に低値の応答を有していなかった（データ示さず）。２８ＤＡＳにおいて、Ｌｏｒｓｂａｎ（登録商標）及びＲｅｓｏｌｖｅ（登録商標）で噴霧したＧＡＴ７系統（５６％）はＧＡＴ７系統に対する１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）（３２％）と比較した場合のみ同様に迅速に回復しなかった（データ示さず）。
【０３０２】
４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）（イマゼタピル）の適用は７ＤＡＳにおいてＳＴＳ（登録商標）系統（７２％）からの大きい応答をもたらしたが、ＧＡＴ７系統（２９％）は有意に低値の応答を有していた（データ示さず）。１４ＤＡＳ及び２８ＤＡＳにおいて、ＧＡＴ７とＳＴＳ（登録商標）の間の差は有意ではなかった（データ示さず）。
【０３０３】
１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）のタンクミックスは７、１４及び２８ＤＡＳにおいてＳＴＳ（登録商標）系統と比較してＧＡＴ７系統に対して有意に低値の噴霧応答をもたらした（データ示さず）。ＧＡＴ７に対する１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）処理は１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）のみ及び１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋Ｌｏｒｓｂａｎ（登録商標）処理と比較して７、１４及び２８ＤＡＳにおいて全体的に低値の損傷であるとスコア付けされた（データ示さず）。ＧＡＴ７系統のみに対するこれ等の処理の対にした比較（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｃｏｐａｒｉｓｏｎ）を用いれば、１４及び２８ＤＡＳにおいて、１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）処理は１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋Ｌｏｒｓｂａｎ（登録商標）処理よりも有意に低値にスコア付けされた。更に又、ＧＡＴ７に対する１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）処理と比較した場合の１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）処理の対にした比較は、１４ＤＡＳにおいて有意に低値であるのみであった。
【０３０４】
１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）の適用は格付けした３日間においてＧＡＴ７及びＳＴＳ（登録商標）系統からの大きい応答をもたらさなかった（データ示さず）。ＧＡＴ７は全ての１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）スコアに対して、ＳＴＳ（登録商標）と有意に異ならなかった（データ示さず）。１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）と混合した４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）を適用した処理は７、１４及び２８ＤＡＳにおいてＳＴＳ（登録商標）系統と比較してＧＡＴ７系統について有意に低値の応答スコアをもたらさなかった（データ示さず）。１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）との４×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）の混合物は７、１４及び２８ＤＡＳにおいてＳＴＳ（登録商標）系統と比較してＧＡＴ７系統について有意に低値にスコア付けされた（データ示さず）。一般的に、ＧＡＴ７系統は全スコア付け日において１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）、１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）＋４×Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）、及び、１６×Ｈａｒｍｏｎｙ（登録商標）＋４×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）処理に対する優秀な全体的耐性をもたらした。
【０３０５】
０．２５×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋１．５×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）の混合物は７ＤＡＳ（５３％）及び１４ＤＡＳ（４７％）においてＧＡＴ７系統からの作物応答をもたらしたが、これは２８ＤＡＳでは顕著ではなかった（１２％）（データ示さず）。ＳＴＳ（登録商標）系統は７ＤＡＳ（７９％）及び１４ＤＡＳ（９０％）においてＧＡＴ７と比較して有意に高値の応答を有していた（データ示さず）。ＳＴＳ（登録商標）系統は２８ＤＡＳにおいて回復せず（８７％）、そしてＧＡＴ７系統と比較して有意に高値の応答を有していた（データ示さず）。ＧＡＴ７系統のみを検討した場合、０．２５×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）＋１．５×Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）処理の対にした比較では、７、１４及び２８ＤＡＳにおいて１×Ｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）処理と比較して有意に低値の応答が観察された。
【０３０６】
【化２４】
2009505654.tif 000026
【０３０７】
【化２５】
2009505654.tif 000027
実施例６Ｂ
実施例６Ｂは実施例６Ａにおいて上記した圃場試行データを確認する温室データを示している。上位ＧＡＴ７事象及びＨＲＡも含むダイズを検討において使用した。
【０３０８】
【化２６】
2009505654.tif 000028
【０３０９】
【化２７】
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実施例７−トウモロコシにおけるＧＡＴ配列を用いた形質転換の方法
Ｉ．アグロバクテリウムマスタープレートの製造
１．ＧＡＴ成分（配列番号７０又は配列番号５５）を有する操作されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株を入手し、５０％グリセロール保存液中−８０℃の冷凍庫中に保管する。使用した転写調節領域はＺｍＵｂｉＰＲＯ−５ＵＴＲ−ＺｍＵｂｉイントロン１プロモーター（配列番号７８）に作動可能に連結した３×３５ＳＥＮＨ（−）とした。この転写制御領域（配列番号７８）は以下に示す通りであり、これは調節領域の種々の領域の位置を示しており、即ち、ａ）逆方向の３５Ｓエンハンサー（３×）には一重下線を付し、ｂ）ＵＢＩプロモーターには二重下線を付し、そしてｃ）ＵＢＩイントロンはイタリックで表記した。
【０３１０】
【化２８】
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【０３１１】
【化２９】
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２．グリセロール保存液から細菌を線状に植菌することによりマスタープレートを作製し、＃８００培地上に単コロニーを形成させ、細菌を３〜４日間暗所で２８℃においてインキュベートする。
３．＃８１０培地を横断するようにマスタープレートから１コロニーを線状に植菌することによりワーキングプレートを作製する。細菌を１〜２日間暗所で２８℃においてインキュベートする。
【０３１２】
ＩＩ．胚感染のための細菌の製造
１．胚単離の１日前にアグロバクテリウムの液体培養物を製造する。５５７Ａ培地３０ｍｌｓ、２％アセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）３０μｌ及び５％スペクチノマイシン３０μｌでフラスコをセットアップする。
２．８１０培地からアグロバクテリウム１白金耳を植菌し、一夜２８℃暗所において振とう器（２００ｒｐｍ）上におく。
３．感染日の午前、アグロバクテリウムの液体培養物からサンプルを採取し、５５７Ａで１／４に希釈する。希釈された液体培養物を用いて５５０ｎｍの可視光でＯＤ値を読み取る。
４．胚単離の間０．２〜０．８のＯＤ値が維持されるようにＯＤ値に応じて適宜アグロバクテリウム培養物を希釈する。
５．感染用のアグロバクテリウムの製造時には、液体培養物のＯＤ値読み取りを反復する。ＯＤ値を用いながら、標準曲線から誘導されたものとしての式ＥＸＰＯＮＥＮＴ（１．７５５＊（ｌｎＯＤ）＋２１．７７）を使用することにより、５Ｅ１０ｃｆｕ／ｍｌ（ｃｆｕ＝コロニー形成単位）を得るために必要なｍｌｓ数を計算する。計算された量のアグロバクテリウム液体培養物を１４ｍｌの試験管にピペットで添加し、１０分間４〜２０℃において４５００ｒｐｍで遠心分離する。上澄みを除去し、５６１Ｑ中の１００ｕＭアセトシリンゴン溶液の適切な量中にアグロバクテリウムを再懸濁する。
【０３１３】
ＩＩＩ．未成熟胚単離
１．長さ１〜２ｍｍの大きさの胚を有する受粉後９〜１１日のＧＳ３穂（ｅａｒ）を収穫する。
２．５０％ブリーチ及び１滴のＴｗｅｅｎ中において２０〜３０分間、穂を滅菌する。滅菌水で３〜５回漱ぐ。
３．胚を仁から単離し、２ｍｌｓの５６１Ｑを含有するマイクロ試験管に入れる。
【０３１４】
ＶＩ．胚のアグロバクテリウム感染
１．単離胚を有するマイクロ試験管からピペットを用いて５６１Ｑを除去し、そして上記したＯＤのアグロバクテリウム懸濁液１ｍｌを添加する。
２．約３０秒間回転混合する。
３．室温で５分間感染させる。
【０３１５】
Ｖ．同時培養
１．液体培地を除去した後、胚を移し、５６２Ｐ同時培養培地の表面上で胚軸が下になるように胚を方向付ける。
２．３日間２０℃のインキュベーター中に胚を入れる。２８℃に移して更に３日間保持する。
【０３１６】
ＶＩ．トランスジェニック推定カルス事象の選択
１．同時培養後、１ｍＭグリホセートを含有する５６３Ｉ選択培地に胚を移す。暗所２８℃で胚を培養する。
２．１４〜２１日毎に胚を新しい５６３Ｉ培地に移す。選択プロセスは活発に生育する推定カルス事象が発見できるまで約２ヶ月継続してよい。５６３Ｉ培地中に推定カルス事象を維持し、カルスを採取してＰＣＲに付す。
【０３１７】
ＶＩＩ．Ｔ０植物の再生
１．体性胚が成熟するまで０．１ｍＭグリホセートを含有する２８７Ｉ培地にカルス事象を移す。暗所２８℃においてカルスを培養する。
２．プレート中の０．１ｍＭグリホセート含有２７３Ｉ胚発芽培地に成熟胚を移す。照明下２８℃でプレートを培養する。
３．新芽及び根が発生した時点で、個々の植物を試験管中の０．１ｍＭグリホセート含有２７３Ｉに移す。照明下２８℃で試験管を培養する。
４．確立した新芽及び根を有する小植物を温室に移し、更に生育させてＴ１種子を生産させる。
【０３１８】
実施例８−形質転換効率に対する３５Ｓエンハンサーの作用及びトウモロコシにおけるＧＡＴ及びＡＬＳの効果
材料及び方法
４種の３５Ｓエンハンサーコンストラクト（ＰＨＰ２０１１８、ＰＨＰ２０１２０、ＰＨＰ２０１２２、ＰＨＰ２０１２４）及び１種の非３５Ｓコンストラクト（ＰＨＰ１９２８８）を使用して事象を生じさせることにより形質転換効率に対する３５Ｓエンハンサーの作用及びＧＡＴ（配列番号７０）の効果を評価した（図１）。４種の３５Ｓエンハンサーコンストラクトの間の差は３５Ｓエンハンサーのコピー数及びコンストラクト中の３５Ｓエンハンサーの方向である。各３５Ｓエンハンサーコンストラクトの概要を以下に示す。
【０３１９】
ＰＨＰ２０１１８は３５ＳＥＮＨ（＋）：ＺｍＵＢＩＰＲＯ−５ＵＴＲ−ＵＢＩＩＮＴＲＯＮｌ（＋は３５Ｓエンハンサーの正方向を示す）を含む。この転写制御領域（配列番号８０）は以下に示す通りであり、これは調節領域の種々の領域の位置を示しており、即ち、ａ）正方向の３５Ｓエンハンサーには一重下線を付し、ｂ）ＵＢＩプロモーターには二重下線を付し、そしてｃ）ＵＢＩイントロンはイタリックで表記した。
【０３２０】
【化３０】
2009505654.tif 000032
ＰＨＰ２０１２２は３×３５ＳＥＮＨ（＋）：ＺｍＵＢＩＰＲＯ−５ＵＴＲ−ＵＢＩＩＮＴＲＯＮｌ（＋は３５Ｓエンハンサーの正方向を示す）を含む。この転写制御領域（配列番号８１）は以下に示す通りであり、これは調節領域の種々の領域の位置を示しており、即ち、ａ）正方向の３５Ｓエンハンサーには一重下線を付し、ｂ）ＵＢＩプロモーターには二重下線を付し、そしてｃ）ＵＢＩイントロンはイタリックで表記した。
【０３２１】
【化３１】
2009505654.tif 000033
【０３２２】
【化３２】
2009505654.tif 000034
ＰＨＰ２０１２０は３５ＳＥＮＨ（−）：ＺｍＵＢＩＰＲＯ−５ＵＴＲ−ＵＢＩＩＮＴＲＯＮｌ（−は３５Ｓエンハンサーの逆方向を示す）を含む。この転写制御領域（配列番号８２）は以下に示す通りであり、これは調節領域の種々の領域の位置を示しており、即ち、ａ）逆方向の３５Ｓエンハンサーには一重下線を付し、ｂ）ＵＢＩプロモーターには二重下線を付し、そしてｃ）ＵＢＩイントロンはイタリックで表記した。
【０３２３】
【化３３】
2009505654.tif 000035
【０３２４】
【化３４】
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ＰＨＰ２０１２４は３×３５ＳＥＮＨ（−）：ＺｍＵＢＩＰＲＯ−５ＵＴＲ−ＵＢＩＩＮＴＲＯＮｌ（−は３５Ｓエンハンサーの逆方向を示す）を含む。この転写制御領域（配列番号８３）は以下に示す通りであり、これは調節領域の種々の領域の位置を示しており、即ち、ａ）逆方向の３５Ｓエンハンサーには一重下線を付し、ｂ）ＵＢＩプロモーターには二重下線を付し、そしてｃ）ＵＢＩイントロンはイタリックで表記した。
【０３２５】
【化３５】
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【０３２６】
【化３６】
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形質転換実験は同じ穂に由来する同じ胚を用いて並置（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）により実施した。ＧＳ３系統の未成熟胚を無菌的に各穂から採取し、５部分に分割した。次に胚の各部分をそれぞれ５コンストラクトの各々に由来する発現カセットを含有するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４に感染させた。６日間の同時培養の後、グリホセートを含有する新しい選択培地に胚を移した。グリホセート選択を克服して生存している形質転換された細胞は増殖し、そして体性の胚形成性のカルスを生成する。約２ヶ月の継代の後、カルスは次にグリホセート存在下に完全なトランスジェニック植物を再生するように操作し、そして温室に移した。次にＴ０植物を温室中Ｖ３又はＶ４段階において、６×（１５６ｏｚ／ａｃ）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ＵｌｔｒａＭａｘＴＭにおいてグリホセート噴霧に付した。コピー数に関する定量的ＰＣＲ及び発現に関するウェスタンブロットの為に陽性の植物をサンプリングした。次にＴ０植物を近親系統と交配することにより追加的評価のための種子を得た。
【０３２７】
結果
形質転換効率は選択の後に抵抗性のカルスを生成した感染胚のパーセントとして測定した。ＰＨＰ１９２８８、ＰＨＰ２０１１８、ＰＨＰ２０１２０、ＰＨＰ２０１２２及びＰＨＰ２０１２４に関する平均形質転換効率はそれぞれ５８％、６３％、５９％、５７％及び５１％であった。データは、ＰＨＰ２０１１８は僅かな増大を示していたが、全てのコンストラクトが極めて高値の同様の形質転換効率を有していたことを示していた（図３）。
【０３２８】
Ｔ０植物効果は６×グリホセート噴霧に対して完全に抵抗性であったＴ０事象のパーセントとして定義した。非３５Ｓコンストラクト（ＰＨＰ１９２８８）の効果は４８．１％であった。これとは対照的に、３５Ｓエンハンサーコンストラクト（ＰＨＰ２０１１８、ＰＨＰ２０１２０、ＰＨＰ２０１２２及びＰＨＰ２０１２４）の効果はそれぞれ９６．６％、９３．５％、８９．１％及び９１．１％であった（図４）。データは全ての３５Ｓエンハンサーコンストラクトがグリホセートに対する植物効果を有意に増大させた。
【０３２９】
３５Ｓエンハンサーを使用することの別の有意な向上点はトランスジーンの組み込みパターンにある。非３５Ｓエンハンサーコンストラクトに関する単コピーであった試験事象のパーセントは僅か３８％であるが、４種の３５Ｓエンハンサーコンストラクト（ＰＨＰ２０１１８、ＰＨＰ２０１２０、ＰＨＰ２０１２２及びＰＨＰ２０１２４）については単コピー事象はそれぞれ事象の６５％、６３％、７１％及び８８％を示した（図４）。
【０３３０】
５種全てのコンストラクトによる事象のサブセットをウエスタン分析によりサンプリングすることにより、非３５Ｓと３５Ｓ事象の間のＧＡＴ発現に何らかの比較上の相違があるかどうか調べた。この分析によれば、非３５Ｓエンハンサーコンストラクトに由来する事象はＧＡＴ発現の極めて低値のレベルを有していたのに対し、３５Ｓエンハンサーコンストラクトに由来する事象の大部分はＧＡＴ発現の極めて高値のレベルを有していたことを示している（図５）。
【０３３１】
実施例９−新規カルス系遺伝子／コンストラクト評価システムの開発における３５ＳエンハンサーＧＡＴの使用
材料及び方法
この試験は発現に関する潜在的問題を発見するために形質転換プロセスにおける極めて早期の段階おける殺虫性遺伝子の発現の評価を向上させるために開発された。この試験の基本は選択可能なマーカーとしてのグリホセートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子（配列番号５５）の使用である。ＧＡＴ及び殺虫性被験遺伝子の両方とも強力な構成的プロモーターにより駆動され、そして同じコンストラクトに連結されることになる。使用したプロモーターは実施例７に記載した３×３５Ｓエンハンサーと共にＺｍＵＢＩＰＲＯ−５ＵＴＲ−ＵＢＩＩＮＴＲＯＮｌを含む。結果として、グリホセートの高レベルに対する選択は高殺虫性被験遺伝子発現体を発見することになると予測される。これ等の推定高発現体由来のカルス組織を次に昆虫バイオアッセイにおいて使用することにより遺伝子産物が機能性であるかどうか調べる。効果を示したコンストラクトを形質転換にまで進めることができる。コンストラクトが効果を示さなかった場合は、フォローアップの生化学及び分子分析を実施することにより問題点を発見することができ、そして、遺伝子を再度設計し、系において再試験することになる（図６）。
【０３３２】
結果
試験は現在開発中である。予備的なデータによれば、有効な昆虫制御遺伝子の活性をカルス段階において検出できることがわかった。カルス活性と植物効果の間の相関は現在評価中である。
【０３３３】
実施例１０−選択可能なマーカーとしてのＧＡＴ
材料及び方法
アグロバクテリウム媒介形質転換を用いてコーンゲノム内にＧＡＴ（配列番号５５）発現カセットを導入した。ＧＡＴ発現カセットはｇａｔ遺伝子に作動可能に連結した３×３５Ｓエンハンサー（実施例１において前述）と共にＺｍＵＢＩＰＲＯ−５ＵＴＲ−ＵＢＩＩＮＴＲＯＮｌを含むプロモーター、及び、ｐｉｎＩＩターミネーターを含んでいる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４はそのネイティブのＴ−ＤＮＡを除去することにより病原性上無力化した。大体として、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ部位にはＧＡＴ発現カセットを含有させた。
【０３３４】
トウモロコシの未成熟胚を発達中の穎果から無菌的に採取し、ＧＡＴ発現カセットを含有するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４で処理した。グリホセート非存在下における固体培地上の胚とアグロバクテリウムの同時培養の期間の後、抗生物質及びグリホセートを含有する新しい選択培地に胚を移した。抗生物質は残存するアグロバクテリウムがあれば全て殺傷する。選択培地はトウモロコシ体性胚形成を刺激し、組み込まれたｇａｔ遺伝子を含有する細胞に対して選択的である。従って、グリホセートを克服して生存し、胚形成性組織を生成しているカルスは遺伝子的に形質転換されたと推定される。分子分析用にカルスサンプルを採取し、ＰＣＲによりトランスジーンの存在を確認した。次に胚組織を操作してグリホセートの存在下トランスジェニック植物を再生し、次にこれを温室に移した。Ｔ０植物に種々のの雑草のグリホセートを噴霧した。トランスジーンコピー数の分子分析の為に陽性の植物をサンプリングし、近親系統と交配することにより初回形質転換植物からの種子を得た。
【０３３５】
グリホセートの種々の異なるレベルを有する培地上で非形質転換胚応答を試験することによりグリホセート殺傷曲線を作製した。ＧＳ３胚を未成熟穂から単離し、０．０、０．５、１．０及び２．０ｍＭでグリホセートを含有する培地上に置いた。約４０日の培養の後、胚の応答を観察し、記録した。同様にＧＡＴコンストラクトを有する感染ＧＳ３胚を０．０、０．５、１．０及び２．０ｍＭでグリホセートを含有する培地上に置いた。約４０日の培養の後、感染胚の応答を観察し、記録した（図７）。
【０３３６】
並置実験を実施することによりＧＡＴ、ｂａｒ及びｍｏｐａｔの形質転換効率を比較した。ＧＳ３系統の未成熟胚を無菌的に各穂から採取し、３部分に分割した。次に胚の各部分をそれぞれＧＡＴ、ｂａｒ及びｍｏｐａｔの発現カセットを含有するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４に感染させた。同時培養の後、ＧＡＴコンストラクトに感染した胚を通常のグリホセート培地上で選択肢、ｂａｒ又はｍｏｐａｔコンストラクトに感染した胚を通常のグルホシネート培地上で選択した。継代は２週毎に実施した。約５０日の選択において、胚の応答を観察し、記録した。
【０３３７】
結果
グリホセート殺傷曲線実験により、０．０ｍＭグリホセートを有する培地上の全胚は健康なカルスを発生したのに対し、０．５ｍＭグリホセートを有する培地上の胚の約半数がカルス発生を示した。１．０及び２．０ｍｍグリホセートを有する培地上の胚ではカルス生育は極めて低値であった。これは０．５ｍＭは全胚の生育を阻害するために十分ではないが、１ｍＭ又は２ｍＭは非形質転換胚を殺傷するために十分強力であることを示している。感染胚実験において、０．０及び０．５ｍＭグリホセートを有する培地上出はより多くのカルスが生育したが、一部の胚は１．０ｍＭ又は２．０ｍＭグリホセートを有する培地上で抵抗性のカルスを発生させた。ウエスタン又はＰＣＲ分析はこれ等の抵抗性か留守が形質転換されたことを確認するものであった。現在ＧＡＴはＧＳ３及びｉｎｔｒｏＥＦ０９Ｂ遺伝子型の両方において優秀な形質転換効率を有する効果的な選択可能なマーカーとして一貫して機能している（図１０及び表４５）。
【０３３８】
【化３７】
2009505654.tif 000039
ＧＡＴ、ｂａｒ及びｍｏｐａｔを比較するための並置実験において、ＧＡＴは約６４％の最大形質転換効率を示し、ｂａｒは３４％、ｍｏｐａｔは３０％であった。ＧＡＴ選択のカルスがグルホシネート上で選択されたものより迅速に生育するように観察された（図８）。
【０３３９】
実施例１１−ライグラスの制御に対するグリホセート、メトスルフロン−メチル及び２種の添加剤の間の相互作用
非グリホセート抵抗性ライグラスに対して実験を行った。表２３に示す通り、グリホセート［１８０ｇａ．ｉ．Ｌｈａ−１（０．５Ｌグリホセート（ＳＣＡＴ（登録商標）））］＋メトスルフロン−メチル（ＢＲＵＳＨ−ＯＦＦ（登録商標））（５及び１０ｇｈａ−１）を包含する全ての処理はライグラスの１００％制御をもたらした。メトスルフロン−メチル（ＢＲＵＳＨ−ＯＦＦ（登録商標））は単独では作用を示さなかったが、ライグラス植物を僅かに成長停止させた。０．５Ｌｈａ−１グリホセート（ＳＣＡＴ（登録商標））処理において１６植物中１５体（１２％）は最終的には死滅したが、それらが死滅するまでの時間は遥かに長かった。これ等の結果はグリホセート（ＳＣＡＴ（登録商標））とメトスルフロン−メチル（ＢＲＵＳＨ−ＯＦＦ（登録商標））の間には相乗作用が存在する可能性があることを示している。２種の添加剤、ＡＤＤ−ＵＰ及びＶＥＬＯＣＩＴＹは処理の何れによる制御の程度においても差を示さなかった。
【０３４０】
【化３８】
2009505654.tif 000040
【０３４１】
【化３９】
2009505654.tif 000041
生物型：非グリホセート抵抗性ライグラス（７０−０４）
集団プロファイル：Ｒｕｐ０．２５対照（％）６．２５
Ｒｕｐ０．５対照（％）８１．２５
Ｒｕｐ１．０対照（％）９３．７５
生育段階：５〜６葉段階
条件：高温晴天
容量比率：２００Ｌｈａ−１。
【０３４２】
実施例１２−アレチノギク（Ｃｏｎｙｚａ  ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ）の制御に対するグリホセート、メトスルフロン−メチル及び２種の添加剤の間の相互作用
この実験はＫｌｅｉｎｓｋｒａａｌｈａｎｓ（Ｃｏｎｙｚａ  ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ）のグリホセート感受性生物型に対して処理を行った以外は実施例１１において使用したものと同じ処理を行った。グリホセートは単独では不良な制御しかもたらさず、１６植物中僅か１体（１２％）を殺傷したのみであった。しかしながらこの実験では、硫酸アンモニウム系アジュバント（ＡＤＤ−ＵＰ（登録商標））がビスピリバク−ナトリウム（ＶＥＬＯＣＩＴＹ（登録商標））よりも混合物として良好に機能した。
【０３４３】
【化４０】
2009505654.tif 000042
【０３４４】
【化４１】
2009505654.tif 000043
生物型：非グリホセート抵抗性Ｃｏｎｙｚａ（Ｗｅｌｇｅｖａｌｌｅｎ−パラコート抵抗性）対照
生育段階：１０〜１５葉段階
条件：冷涼晴天
容量比率：２００Ｌｈａ−１
グリホセート（ＲＯＵＮＤＵＰ）：３６０ｇ．ａ．ｉ．Ｌ−１。
【０３４５】
実施例１３−グリホセート、パラコート及びＡＣＣａｓｅ阻害剤に抵抗性のライグラスの制御に対するグリホセート、メトスルフロン−メチル及び２種の添加剤の間の相互作用
この実験は、グリホセート、パラコート及びＡＣＣａｓｅ阻害剤に対して抵抗性である、世界で最も抵抗性のライグラスの型（非選択的除草剤に対して抵抗性のライグラス、例えばＦａｉｒｖｉｅｗ（Ｔｕｌｂａｇｈ））に対して実施した。この実施例においては、メトスルフロン−メチル（ＢＲＵＳＨ−ＯＦＦ（登録商標））５及び１０ｇｈａ−１を１％硫酸アンモニウム系アジュバント（ＡＤＤ−ＵＰ（登録商標））と共に０．５ＬのＲｏｕｎｄｕｐに添加したところ、制御が４４％向上した（例えば５０％から９４％）。更に又、硫酸アンモニウム系アジュバント（ＡＤＤ−ＵＰ（登録商標））は添加剤としてビスピリバク−ナトリウム（ＶＥＬＯＣＩＴＹ（登録商標））よりも優秀であった。
【０３４６】
【化４２】
2009505654.tif 000044
生物型：グリホセート、パラコート及びＡＣＣａｓｅ阻害剤に対して抵抗性であるＦａｉｒｖｉｅｗ（Ｔｕｌｂａｇｈ）
生育段階：１０〜１５葉段階
条件：冷涼晴天
容量比率：２００Ｌｈａ−１
グリホセート（ＲＯＵＮＤＵＰ）：３６０ｇ．ａ．ｉ．Ｌ−１。
【０３４７】
実施例１４−グリホセート、パラコート及びＡＣＣａｓｅ阻害剤に抵抗性のライグラスの制御に対するグリホセート及び代表的ＳＵの間の相互作用
この実施例においては、４種の異なるＳＵを抵抗性ライグラスに対してグリホセート（ＳＣＡＴ（登録商標））と共に適用した。グリホセートに対する最良のＳＵパートナーとしての結果は決定的なものではなかったが、除草剤抵抗性ライグラスに対してグリホセートとともにＳＵを適用することの平均的利益は３９％（例えばグリホセート（ＳＣＡＴ（登録商標））単独で３４％制御、そしてグリホセート（ＳＣＡＴ（登録商標））＋メトスルフロン−メチル（ＢＲＵＳＨ−ＯＦＦ（登録商標））、クロルスルフロン（ＧＬＥＡＮ（登録商標））又はトリアスルフロン（ＬＯＧＲＡＮ（登録商標））では５７〜８３％制御）であった。
【０３４８】
【化４３】
2009505654.tif 000045
生物型：グリホセート、パラコート及びＡＣＣａｓｅ阻害剤に対して抵抗性であるＦａｉｒｖｉｅｗ（Ｔｕｌｂａｇｈ）
生育段階：４葉段階
条件：冷涼晴天
容量比率：２００Ｌｈａ−１
全処理１％ＡＤＤ−ＵＰとともに噴霧。
【０３４９】
実施例１５−ダイズ単離株（ｉｓｏｌｉｎｅ）に対してＧＡＴは収量に対する影響を有さない。
【０３５０】
要約
１２種の選択されたＳＣＰ：ＧＡＴ７：：ＳＡＭＳ：ＡＬＳ事象を２００４年の３つのアイオワ環境及び２００５年の６つの中西部環境において収量試験に付した。これ等の環境に関する収量データを総合した場合、ＧＡＴ７陽性系統とＧＡＴ７陰性系統の間には、コンストラクトに渡って、及び特定の事象内において、有意な収量の差は観察されていない。３つの上位事象（ＥＡＦＳ３５５９．２．１、ＥＡＦＳ３５６０．４．３、ＥＡＦＳ３５６１．１．１）に関して、ＧＡＴ７陽性系統をＧＡＴ７陰性姉妹系統と比較した場合、統計学的な収量の差はなかった。全体として、試験した系統に関するデータはＧＡＴ７トランスジーンの存在が最終収量に影響するとは考えられないことを示している。
【０３５１】
材料及び方法
２００４Ｄ試験の材料及び方法
品種Ｊａｃｋを選択可能なマーカーインサートＳＡＭＳ：ＡＬＳに連結したグリホセートアセチルトランスフェラーゼラウンド７（ＧＡＴ７）の発現を駆動する構成的プロモーター（ＳＣＰ１）で形質転換した。ＳＣＰ：ＧＡＴ７：：ＳＡＭＳ：ＡＬＳの４０の初期事象をＴ２世代まで進行させた。進行したＴ２世代の接合性は先ず、ＧＡＴインサートのＰＣＲ増幅の為に系統当たり１２種ランダム植物をスクリーニングすることにより調べた。４５４系統を仮にＧＡＴに関してホモ接合陽性又はホモ接合陰性の何れかとして選択した。選択された系統は事象によりブロック化し、そして２００４年の間、Ｃｅｄａｒ  Ｆａｌｌｓ（植栽日６／５／０４）、Ｄａｌｌａｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（植栽日６／４／０４）及びＪｏｈｎｓｔｏｎ、ＩＡ（植栽日６／９／０４）においてＤレベル収量試験（１０フィート２列の１連）において生育させた。各系統の１２個の残存Ｔ３種子をＶ３生育段階におけるグリホセート噴霧又はスルホニル尿素溶液に残存種子を浸漬させることによりスクリーニングした。グリホセート処理又はＳＵ種子浸漬に基づいて、３０事象による３４２ＳＣＰ：ＧＡＴ７：：ＡＬＳ系統がホモ接合陽性又はホモ接合陰性であることが確認された。成熟度スコアはＤａｌｌａｓ  Ｃｅｎｔｅｒ及びＪｏｈｎｓｔｏｎの地区において全エントリーに関して収集した。収量のデータを収集し、多重回帰、ＡＮＯＶＡ及びＳＡＳを用いた平均値分離に付した。
【０３５２】
２００５Ｃ試験の材料及び方法
２００４年の収量性能及び除草剤効果スコアに基づき、１２ＧＡＴ７事象を２００５年におけるＣレベル収量試験に進行させた。これ等の選択された１２事象から、２８陽性及び２３陰性単離株を選択した。２００５Ｃ試験はランダム完全ブロック（事象による）として設計し、Ｃｅｄａｒ  Ｆａｌｌｓ、ＩＡ；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、ＩＡ；Ｓｔｕａｒｔ、ＩＡ；Ｍｏｎｍｏｕｔｈ、ＩＬ；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＩＬ；及びＮａｐｏｌｅｏｎ、ＯＨにおいて生育させた。成熟度スコア及び収量のデータを収集し、多重回帰、ＡＮＯＶＡ及びＰＲＩＳＭ及び／又はＳＡＳを用いた平均値分離に付した。
【０３５３】
結果及び考察
試験した選択系統に関する２００４年の収量データをＡＮＯＶＡに付した場合、地区、事象、地区＊事象及びＧＡＴ（陽性又は陰性）の変数は有意に異なっていた（データ示さず）。全ての陽性系統の平均は２００４年に試験した全ての陰性系統の平均と比較した場合収量に関して有意に低値ではなかった。２００５年において、地区、事象、地区＊事象、ＧＡＴ又はＧＡＴ＊地区の変数は有意に異なっていた（データ示さず）。試験した全陽性系統の平均は２００５年に試験した全ての陰性系統の平均と有意に異なっていなかった（データ示さず）。２００４年及び２００５年のデータを合わせれば、年、地区、事象、年＊事象、地区＊事象、年＊ＧＡＴ及び地区＊ＧＡＴの変数は有意に異なっていた（データ示さず）。全ＧＡＴ陽性系統の平均は９種の中西部環境に渡り試験した全てのＧＡＴ陰性系統の平均と有意に異なっていなかった（データ示さず）。
【０３５４】
２００４年の収量、除草剤効果及び分子分析に基づけば、３つの上位ＧＡＴ７事象を潜在的な規制用及び製品開発の実験に関して選択した。２００５年の単離株の収量データを２００４年のデータと組み合わせた場合、地区はＥＡＦＳ３３５９．２．１内で有意に異なっていた（データ示さず）。ＥＡＦＳ３３５９．２．１内の陽性ＧＡＴ系統は陰性姉妹単離株と比較した場合に収率に関して有意に異なっていなかった（データ示さず）。ＥＡＦＳ３５６０．４．３内では、９地区及び地区＊ＧＡＴの相互作用が有意に異なっていた。しかしながら、ＧＡＴ陽性単離株は同じ事象内ではＧＡＴ陰性単離株と比較した場合に収量に関しては有意に異なっていなかった（データ示さず）。事象ＥＡＦＳ３５６１．１．１内では、地区は有意に異なっていたが、ＧＡＴスコア及び地区＊ＧＡＴの相互作用は有意に異なっていなかった（データ示さず）。ＥＡＦＳ３５６１．１．１内では、ＧＡＴ陽性系統はＧＡＴ陰性姉妹系統と比較して収量に関しては有意に異なっていなかった（データ示さず）。
【０３５５】
２００５年に試験した６つの環境に関する収量×成熟度の多重回帰を３つの上位事象に対して実施することにより全体的な収量の潜在性を調べた。一般的に、３つの上位事象の各々内においてＧＡＴ陽性及びＧＡＴ陰性系統はランダムであると考えられる（データ示さず）。このことは、ＧＡＴ７トランスジーンが存在する場合に収量は有意に改変されないと考えられることを示唆している。
【０３５６】
改変したｔ検定を終了することにより各試験地区における各特定の事象内でＧＡＴ７陽性系統をＧＡＴ７陰性系統と比較した（データ示さず）。試験した９地区に渡り、同じ事象内でＧＡＴ７陰性姉妹系統と比較してＧＡＴ７陽性系統に関して明らかな収量の不良点は観察されなかった。３つの上位事象に関し、ＧＡＴ陽性系統は陰性の平均の２．６％内にあり、全体的な収量の同格性が試験した全環境において存在することを示していた（データ示さず）。個々の系統に対して実施したＡＮＯＶＡ及びＬＳＤ分析はＥＡＦＳ３５６０．３．２を除いて各事象において試験した系統の間で区別可能な相違点を示していない（データ示さず）。全体として、ＧＡＴ７陽性系統とＧＡＴ７陰性系統の間には収量の差は無いと考えられた。
【０３５７】
実施例１６−ＧＡＴダイズはグリホセート及びグリホセート＋ＳＵ処理に対して耐性を有する。
【０３５８】
この実験の目的は上位ＧＡＴ７事象のスルホニル尿素（ＳＵ）除草剤耐性をＳＴＳの耐性との直接の比較において評価すること、及び、種々のグリホセート（Ｇｌｙ）、Ｇｌｙ＋ＳＵおよびＳＵ処理に渡って上位ＧＡＴ７事象内で耐性の差が検出できるかどうかを調べることであった。全ての処理に渡って、４つの上位ＧＡＴ７事象は噴霧後７日及び噴霧後１４日においても形質転換されていないＪａｃｋ及びＳＴＳと比較して有意に低値の作物損傷応答と格付けされた。４つの上位ＧＡＴ７事象のうち、一部応答の差が検出され、ＥＡＦＳ３５６０．４．３は全処理に渡って最良の性能を示し、そしてＥＡＦＳ３５６０．３．２は最大の除草剤応答を示した。一般的に、ＳＴＳと比較してＳＡＭＳ：ＡＬＳコンストラクトに関しては数種のＳＵ化学物質に対する有意に良好な耐性が存在すると考えられた。更に又、試験したＧＡＴ７事象は変動比率のグリホセート、スルホニル尿素及びグリホセート＋スルホニル尿素化学物質による処理に対して良好な耐性を有していた。
【０３５９】
材料及び方法
コンストラクトＰＨＰ２０１６３Ａ由来のＧＡＴラウンド７（ＧＡＴ７）トランスジェニック事象を除草剤効果（ＪＨＭ４６４ＴＧＡＴＥＦＦ）及び収量潜在性（ＪＨＤ４＿ＧＡＴ７  ｔｅｓｔｓ）に関して２００４年に評価した。これ等の予備的結果及び市場化の潜在性に基づいて、４つの上位事象を２００５年の実験ＪＨＭ５Ｇ０３０における追加的効能試験の為に選択した。９２Ｍ９０はＧＡＴ７事象においてＳＡＭＳ：ＡＬＳコンストラクトと直接比較するためにＳＴＳ品種として選択した。
【０３６０】
選択された系統を対になった１２フィートの列２連で実験ＪＨＭ５Ｇ０３０において生育させ１１種の異なる処理を適用した。系統は事象及び処理によりブロック化することにより１１種の異なる噴霧処理の並置比較を可能とし、各処理の間には２列の境界を設けることにより噴霧飛散物が捕獲されるようにした。噴霧処理（特段の記載が無い限りＶ３）は０Ｘ（対照）、３５．０３ｇ／ｈａ  ａｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ、１４０．１１ｇ／ｈａ  ａｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ、８．７５ｇ／ｈａ  ａｉ  トリベヌロン、３５．０ｇ／ｈａ  ａｉ  トリベヌロン、８．７５ｇ／ｈａ  ａｉ  リムスルフロン、３５．０ｇ／ｈａ  ａｉ  リムスルフロン、３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセート、３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセートをＶ３において、次いで３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセートをＲｌにおいて、３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセート＋３５．０ｇ／ｈａ  ａｉ  トリベヌロン（タンクミックス）及び３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセート＋７０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  リムスルフロン（タンクミックス）とした。系統には１００（完全感受性、１００％損傷）〜０（完全耐性、０％損傷）の目視による格付けを処理後７日及び処理後１４日に行った。目視による格付けは該当する未噴霧対照列と比較した場合の処理列における退緑、壊死及び植物の発育停止の全体的程度に基づいた。噴霧後７及び１４日の格付けデータをＡＮＯＶＡ及びＳＡＳを用いた平均値分離に付した。
【０３６１】
結果及び考察
適用後７及び１４日における種々の処理に関する全ての噴霧格付けデータをＡＮＯＶＡに付した場合、事象及び処理は有意に異なっていたが、反復（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）においては有意に異なっていなかった（データ示さず）。Ｊａｃｋは、第７および１４噴霧後日（ＤＡＳ）においてＳＴＳ及びＧＡＴ事象と比較して有意に高値の噴霧応答を有していた（データ示さず）。４つのＧＡＴ系統は噴霧適用から７日後及び１４日後の両方において、全処理に関してＪａｃｋ及びＳＴＳよりも有意に低値の損傷であるとスコア付けされた（データ示さず）。
【０３６２】
個々の処理を検討した場合、Ｊａｃｋ区画とＳＴＳ区画は７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）において４つのＧＡＴ事象と比較して有意に高値の噴霧損傷スコアで格付けされたため、対照区画はある程度の噴霧飛散物の証拠を有しているように観察された。噴霧飛散物は潜在的には他の区画の結果を混乱させるが、処理間に２列の境界を使用することにより幾分低減されると期待される。
【０３６３】
８．７５ｇ／ｈａ  ａｉ  リムスルフロン処理内では、４つのＧＡＴ事象は７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）の両方においてＪａｃｋ及びＳＴＳと比較して有意に低値の噴霧損傷とスコア付けされた。４つのＧＡＴ事象内において、両方の格付け時点において統計学的差は観察されなかった（データ示さず）。３５．０ｇ／ｈａ  ａｉ  リムスルフロン処理を検討したところ、４つのＧＡＴ事象は７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）の両方においてＪａｃｋ及びＳＴＳと比較して有意に低値の噴霧損傷とスコア付けされた。ＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５６０．４．３は７ＤＡＳ（ｖ）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）の両方においてＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５５９．２．１及びＥＡＦＳ３５６１．１．１と比較して低値の損傷を有するとスコア付けされた。
【０３６４】
３５．０３ｇ／ｈａ  ａｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ処理の後、４つのＧＡＴ事象は７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）の両方においてＪａｃｋ及びＳＴＳと比較して有意に低値の噴霧損傷とスコア付けされた。４つのＧＡＴ事象内において、７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）の両方において統計学的な差は観察されなかった。１４０．１１ｇ／ｈａ  ａｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ処理を検討したところ、４つのＧＡＴ事象は７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）の両方においてＪａｃｋ及びＳＴＳと比較して有意に低値の噴霧損傷とスコア付けされた。ＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５６０．４．３及びＥＡＦＳ３５６１．１．１は７ＤＡＳ（データ示さず）においてＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５５９．２．１及びＥＡＦＳ３５６０．３．２と比較して低値の損傷とスコア付けされた。１４ＤＡＳにおいて、１４０．１１ｇ／ｈａ  ａｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ処理、ＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５６０．４．２、ＥＡＦＳ３５５９．２．１及びＥＡＦＳ３５６１．１．１は無損傷と格付けされたが、ＥＡＦＳ３５６０．３．２はＳＴＳと同様にスコア付けされた（データ示さず）。
【０３６５】
８．７５ｇ／ｈａ  ａｉ  トリベヌロン処理を検討したところ、４つのＧＡＴ事象は７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）の両方においてＳＴＳ及びＪａｃｋと比較して有意に低値の目視損傷を有していた。ＧＡＴ７事象は７ＤＡＳ（データ示さず）において有意に異なっていなかったが、事象ＥＡＦＳ３５６０．４．３及びＥＡＦＳ３５５９．２．１は１４ＤＡＳ（データ示さず）においてＥＡＦＳ３５６０．３．２と比較して有意に低値の損傷を有していた。３５．０ｇ／ｈａ  ａｉ  トリベヌロン処理に関しては、４ＧＡＴ７事象は７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）の両方においてＪａｃｋ及びＳＴＳと比較して有意に低値の噴霧応答と格付けされた。４つのＧＡＴ事象は７ＤＡＳ（データ示さず）においては相互に有意に異なっていなかったが、ＥＡＦＳ３５６０．３．２は１４ＤＡＳ（データ示さず）において他の３ＧＡＴ７事象よりも有意に大きい噴霧損傷と格付けされた。
【０３６６】
３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセート及びＶ３における３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセートとその後のＲ１処理における３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセートに関しては、予測された通り、７日後にはＪａｃｋ及びＳＴＳ品種は破壊された（データ示さず）。４ＧＡＴ７事象は７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）において３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセート処理に関して如何なる観察される噴霧損傷も有していなかった。最小限の噴霧損傷が処理に関して７ＤＡＳにおいて４ＧＡＴ７事象に関して記録され（データ示さず）、そして事象ＥＡＦＳ３５６０．４．３及びＥＡＦＳ３５５９．２．１は１４ＤＡＳにおいてＥＡＦＳ３５６０．３．２よりも有意に良好であると格付けされた（データ示さず）。
【０３６７】
グリホセートとスルホニル尿素除草剤の２種のタンクミックスは７ＤＡＳ及び１４ＤＡＳにおいて同様の結果をもたらした。３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセート＋７０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  リムスルフロンの処理については、４つのＧＡＴ事象は７ＤＡＳにおいて約４０％損傷（データ示さず）及び１４ＤＡＳにおいて約３５％損傷（データ示さず）の同様の除草剤応答を有していた。全体的作物応答の低値が３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセート＋３５．０ｇ／ｈａ  ａｉ  トリベヌロン処理について観察され、そして４つのＧＡＴ事象は７ＤＡＳ（データ示さず）及び１４ＤＡＳ（データ示さず）において有意に異なっていなかった。
【０３６８】
７ＤＡＳ及び１４ＤＡＳにおける目視による格付けの平均を４上位ＧＡＴ事象、Ｊａｃｋ及びＳＴＳ系統に関してグラフ化することによりデータの目視的解釈を可能にした（データ示さず）。リムスルフロン処理に関しては、４上位ＧＡＴ事象では作物応答は観察されず、ＥＡＦＳ３５６０．４．３が最大の耐性を示していた（データ示さず）。ＧＡＴ７事象の応答は７ＤＡＳ及び１４ＤＡＳの両方のリムスルフロン処理に関してＳＴＳ及びＪａｃｋ対照よりも有意に低値であった（データ示さず）。
【０３６９】
１×及び１４０．１１ｇ／ｈａ  ａｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ処理への平均応答スコアを検討したところ、ＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５６０．４．３及びＥＡＦＳ３５６１．１．１に関する明らかな損傷は観察されず、そしてＧＡＴ７事象ＥＡＦＳ３５５９．２．１及びＥＡＦＳ３５６０．３．２の最小限の応答が観察された（データ示さず）。全てのＧＡＴ事象はＪａｃｋ及びＳＴＳ系統と比較して有意に低値の作物応答を有していた（データ示さず）。
【０３７０】
４つのＧＡＴ７事象はＪａｃｋ及びＳＴＳと比較して７ＤＡＳ及び１４ＤＡＳにおいて１×及び３５．０ｇ／ｈａ  ａｉ  トリベヌロン適用への有意に低値の作物応答を有していた（データ示さず）。ＧＡＴ７事象内において、ＥＡＦＳ３５６０．４．３が最良の性能を示し、ＥＡＦＳ３５６０．３．２は全体的に最大の応答を示していると考えられた（データ示さず）。
【０３７１】
３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセート適用については、７ＤＡＳ及び１４ＤＡＳにおいて４ＧＡＴ７事象全てについて明らかな作物応答は観察されなかった（データ示さず）。Ｖ３における３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセートとその後のＲ１における３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセートに関しては、７ＤＡＳにおいて４種のＧＡＴ７事象の間に統計学的差は無かったが、ＥＡＦＳ３５６０．４．３及びＥＡＦＳ３５５９．２．１は１４ＤＡＳにおいてＥＡＦＳ３５６１．１．１及びＥＡＦＳ３５６０．３．２と比較して低値の応答を有していたと考えられた（データ示さず）。
【０３７２】
２種のタンクミックス処理のうち、７０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  リムスルフロン＋３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセートは３５．０ｇ／ｈａ  ａｉ  トリベヌロン＋３３６０．０ｇ／ｈａ  ａｉ  グリホセート処理と比較して高値のレベルの作物損傷を誘発した（データ示さず）。４種の上位ＧＡＴ７事象内で、７ＤＡＳ及び１４ＤＡＳにおいて目視による格付けに関して統計学的な差を観察したものは無かった（データ示さず）。
【０３７３】
本明細書内において言及した全ての刊行物及び特許出願は本発明の当業者のレベルを示している。全ての刊行物及び特許出願は、各々個々刊行物又は特許出願が特定的個別的に参考として本明細書に援用される場合と同程度まで参考として本明細書に援用される。
【０３７４】
上記した発明は理解の明確化の目的の為に説明及び例示によりある程度詳述したが、特定の変化及び変更は添付請求項の範囲内で実施してよいことは明白である。
【図面の簡単な説明】
【０３７５】
【図１】図１は３５Ｓエンハンサーエレメントを有するコンストラクトの例を示す。
【図２】図２はＴＸ効率に対する３５Ｓエンハンサーの作用を示す模式図である。
【図３】図３はＴ０効率に対する３５Ｓエンハンサーの作用を示す模式図である。
【図４】図４は事象コピー数に対する３５Ｓエンハンサーの作用を示す模式図である。
【図５】図５はＴ２効率に対する３５Ｓエンハンサーの作用を示す表である。
【図６】図６は殺虫性遺伝子評価試験を示す。
【図７】図７はＧＡＴ選択スキームの開発を示す模式図である。
【図８】図８は選択可能なマーカーとしてＧＡＴを使用できることを示している。
【図９】図９はＧＡＴ形質転換効率を示す模式図である。
【図１】
2009505654.tif 000046
【図２】
2009505654.tif 000047
【図３】
2009505654.tif 000048
【図４】
2009505654.tif 000049
【図５】
2009505654.tif 000050
【図６】
2009505654.tif 000051
【図７】
2009505654.tif 000052
【図８】
2009505654.tif 000053
【図９】
2009505654.tif 000054
【配列表】
2009505654000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月17日(2008.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009505654000001.app
【国際調査報告】
2009505654.tif 000055
2009505654.tif 000056
2009505654.tif 000057
2009505654.tif 000058