(57)【要約】proNeurotensin/Neuromedin N（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）タンパクに対する特異的モノクローナル抗体と、それを用いた高感度のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出／測定法を確立することにより、小細胞肺癌の早期診断法等を提供するものである。ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクのアミノ酸配列−１〜３８番、又は８〜８７番のペプチド断片を含む抗原を、マウスに免疫することにより７種類の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を作製し、さらにそれらの抗体を用いたｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ測定法を確立した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１。
【請求項２】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２。
【請求項３】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）及び配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号４〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３。
【請求項４】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４。
【請求項５】
配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５。
【請求項６】
配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６。
【請求項７】
配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法。
【請求項９】
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法が、サンドイッチＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体と、請求項５〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体とを、組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いて、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定することを特徴とする小細胞肺癌の診断方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を備え、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定しうることを特徴とする小細胞肺癌の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小細胞肺癌の腫瘍マーカーであるproNeurotensin/Neuromedin N（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）のモノクローナル抗体と、それを用いたｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出／測定法や、小細胞肺癌の診断方法・診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における診断・判定法として血中腫瘍マーカーの検出・計測を挙げることができる。腫瘍マーカーは腫瘍または腫瘍と反応した正常細胞が作る物質の中で、血中や尿中などに放出され腫瘍の体外診断を可能としているものである。【０００３】
上記腫瘍マーカーに関しては、乳癌患者と正常人の胸部組織に差異的に発現する遺伝子を使用した悪性腫瘍、特に乳癌を予想、診断 、予後判定、予防および処置するための新規な組成物、方法および使用（例えば、特許文献１参照）や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法（例えば、特許文献２参照）や、その遺伝子産物がＣＬＬ細胞および前立腺癌細胞の新生物性または腫瘍形成性増殖を抑制するｍｉＲ１５およびｍｉＲ１６のコピー数、変異状態または遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病または前立腺癌の診断方法（例えば、特許文献３参照）や、無症候性期または初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素ＩＩの活性化化合物、すなわち腫瘍マーカー、該癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法ならびに該癌の診断方法を行うためのキット（例えば、特許文献４参照）等が知られている。【０００４】
また、肺癌は小細胞癌と非小細胞癌の２つの型に大きく分類され、非小細胞癌はさらに腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌の３タイプに分類され、それぞれのタイプによって発生する部位がある程度決まっており、小細胞癌と扁平上皮癌は肺門部に、腺癌と大細胞癌は肺野部にできやすい肺癌といわれている。肺癌に関して、小細胞肺癌 (ＳＣＬＣ）を患う患者を治療し、またはＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための、比較的短いペプチド、詳細には、α−コノトキシンペプチドＭＩＩおよびＵ００２を使用して小細胞肺癌の存在または位置を決定することにより検出する方法（例えば、特許文献５参照）や、血清中の優れた肺癌マーカーとしての血管透過性因子を測定することにより、特に化学発光検出系酵素免疫測定法を用いて高感度で測定することにより、肺癌の早期診断、さらには治療効果の判定、経過観察を行う方法（例えば、特許文献６参照）等が知られている。【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１５９６４０号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０２９号公報
【特許文献３】特表２００６−５０６４６９号公報
【特許文献４】特表２００１−５２４８１５号公報
【特許文献５】特表平１１−５０６７３７号公報
【特許文献６】特開平９−３３５３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在日本において肺癌は男性の癌死亡率の第１位であり、女性では胃癌に次いで第２位であることから、肺癌特異的な腫瘍マーカーを開発することにより、肺癌の早期診断・治療成績の向上が期待されていた。本発明の課題は、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクに対する特異的モノクローナル抗体と、それを用いた高感度のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出／測定法を確立することにより、小細胞肺癌の早期診断法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、先にヒト肺癌由来培養細胞株の培養上清に放出されるたんぱく質・ペプチドのプロテオーム解析を行い、小細胞肺癌培養細胞株であるＳＢＣ３の培養上清にｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが放出されているが、小細胞肺癌以外の肺癌細胞株（腺癌・大細胞癌・扁平上皮癌）の培養上清にはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出されないとの知見を得て、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが有用な腫瘍マーカーであることを明らかにしている（特願２００７−０８６８３１号公報）。そこで、本発明者らは、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクのアミノ酸配列−１〜３８番（配列番号２）、又は８〜８７番（配列番号３）のペプチド断片を含む抗原を、マウスに免疫することにより７種類の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を作製し、さらに、それらの抗体を用いたｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ測定法を確立し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明は、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１や、（２）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２や、（３）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）及び配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号４〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３や、（４）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）と結合し、配列番号３〜８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４に関する。【０００９】
また本発明は、（５）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５や、（６）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６や、（７）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原の免疫により作製されたモノクローナル抗体であって、前記ペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、及び配列番号５〜７に示すアミノ酸配列からなるペプチド断片と結合し、配列番号２、４及び８に示すアミノ酸配列からなるいずれのペプチド断片とも結合しないことを特徴とするモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７に関する。【００１０】
また本発明は、（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法や、（９）ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法が、サンドイッチＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする上記（８）記載の方法や、（１０）上記（１）〜（４）のいずれか記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体と、上記（５）〜（７）のいずれかに記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体とを、組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする上記（９）記載の方法や、（１１）上記（１）〜（７）のいずれか記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株に関する。【００１１】
さらに本発明は、（１２）上記（１）〜（７）のいずれか記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いて、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定することを特徴とする小細胞肺癌の診断方法や、（１３）上記（１）〜（７）のいずれか記載のモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を備え、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定しうることを特徴とする小細胞肺癌の診断キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの構造と本発明で抗原として用いた領域を示す図である。
【図２】本発明で得られた８種の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ３細胞の無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの発現を検出した結果を示す図である。
【図３】本発明で得られた８種の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ３細胞の細胞抽出液中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの発現を検出した結果を示す図である。
【図４】本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４を用いたＥＬＩＳＡにより、ＳＢＣ３細胞の無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの濃度を測定した結果を示す図である。
【図５】本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４を用いたＥＬＩＳＡにより、培養液の影響を検討した結果を示す図である。
【図６】エピトープ解析に用いたペプチドを示す図である。
【図７】エピトープ解析の結果を示す図である。
【図８】エピトープ解析の結果を示す図である。
【図９】本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４を用いたＥＬＩＳＡによる標準曲線を示す図である。標準物質はそれぞれブロックで囲まれた中に記載されている。
【図１０】本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７を用いたＥＬＩＳＡによる標準曲線を示す図である。標準物質はそれぞれブロックで囲まれた中に記載されている。
【図１１】本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２及びＳＣＣ−ＭＧＤ−００５を用いて、ＳＢＣ３細胞の培養上清（希釈倍率１〜１０７）中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパク濃度を測定した結果を示す図である。
【図１２】本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２及びＳＣＣ−ＭＧＤ−００５を用いて、小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ１、ＳＢＣ２、ＳＢＣ３、ＳＢＣ５、ＮＣＩ−Ｈ６９、及び対照としての大細胞癌由来細胞株であるＮＣＩ−Ｈ６６１、Ｌｕ６５、Ｌｕ９９の無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ免疫活性を測定した結果を示す図である。
【図１３】本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２を用いたウエスタンブロッティングにより、各種肺癌細胞株の各無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの発現を検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原をマウスに免疫することにより作製されたモノクローナル抗体であり、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクに由来するペプチド断片である、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）：配列番号２、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜３８）：配列番号４、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）：配列番号３、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）：配列番号５、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）：配列番号６、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）：配列番号７、及びｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ６６〜８７）：配列番号８のうち、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１はｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２はｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３はｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）及びｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（８〜８７）を、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４はｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を、それぞれインビトロで認識する。これらＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４が認識するエピトープは、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクのアミノ酸配列−１〜７番にあると推定される。【００１４】
また、本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を含む抗原をマウスに免疫することにより作製されたモノクローナル抗体であり、これら３種の抗体は、上記ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクに由来する７種のペプチド断片のうちのｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）、及びｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）をインビトロで認識する。これらＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７が認識するエピトープは、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクのアミノ酸配列４７〜６６番にあると推定される。【００１５】
本発明のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを検出／測定する方法としては、上記本発明のモノクローナル抗体 、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントを用いる方法であれば特に制限されるものではなく、したがって、本発明のモノクローナル抗体には、これらモノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントも便宜上含まれる。これら本発明のモノクローナル抗体等を用いて、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の免疫学的測定方法を行うことによりｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを特異的かつ正確に測定することができる。例えば、固相化された本発明の第１のモノクローナル抗体と、これらモノクローナル抗体とは認識部位を異にする、標識化された第２のモノクローナル抗体とを用いる方法を挙げることができる。以下、かかるｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを認識する本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法について説明する。【００１６】
直接競合ＥＬＩＳＡ法では、抗マウスＩｇＧ抗体を担体に固相化（固相化二次抗体）する。これにヒト血液（血清）や尿等の検体、酵素標識抗原、及び抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体（一次抗体）を加え、抗体抗原反応により形成される一次抗体と検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ、又は酵素標識抗原の抗原抗体複合体と、固相化二次抗体を結合させる。抗体に結合しなかった酵素標識抗原を除去し、基質を加えて酵素反応を行う。検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮと標識抗原の一次抗体への結合は競合するため、検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ量と酵素活性は逆の相関関係を示し、既知量のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮと二次抗体に標識した酵素活性との関係を示す検量線から、検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ量を求めることができる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体を担体に固相化（固相化一次抗体）し、これにヒト血液（血清）や尿等の検体を加え、抗原抗体反応により検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを抗原抗体反応により固相化一次抗体に結合させる。次に酵素標識した認識部位を異にする抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体（酵素標識二次抗体）を反応させ、抗原抗体反応により酵素標識二次抗体を上記固相化一次抗体に結合している抗原に結合させる。その後、抗原に結合しなかった酵素標識二次抗体を除去し、基質を加えて酵素反応を行うことにより、既知量のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮと二次抗体に標識した酵素活性との関係を示す検量線から、検体中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ量を求めることができる。これらのＥＬＩＳＡ法を用いて測定されたｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパク測定値は、肺癌細胞の有無の指標として用いることができる。【００１７】
上記ＥＬＩＳＡ 法において、本発明のモノクローナル抗体に便宜上含まれるモノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントも使用することができる。モノクローナル抗体に代えて、例えば、Ｆ(ａｂ′)2、Ｆａｂなどの該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含むｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに結合する抗体フラグメントを使用することもできる。また、これらモノクローナル抗体や抗体フラグメントを標識する酵素としては、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等を例示することができ、これら酵素は「酵素標識法(生物化学実験法 27 ) 」 (第１版、石川栄治著、学会出版センター、１９９１年) などに記載されている方法で標識することができる。またこれら酵素に代えて、例えば、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ等のラジオアイソトープや、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることもできる。一方、固相としては、シリコン、ナイロン、プラスチック、ガラスからなるビーズ、マイクロプレート、試験管、フィルター、メンブレン等を用いることができる。【００１８】
本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、配列番号２に示されるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を含む抗原や配列番号３に示されるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば配列番号２に示されるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）や配列番号３に示されるペプチド断片ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）をそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、本件モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。【００１９】
本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７をそれぞれ産生する本件モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、静岡県立静岡がんセンター研究所遺伝子診療研究部（日本国静岡県駿東郡長泉町下長窪１００７番地）に保管されており、一定の条件下で分譲を受けることができる。【００２０】
本発明の小細胞肺癌の診断（判定）方法としては、上記本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を用いて、ヒト血清等の試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定する方法であれば特に制限されず、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出／測定方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッテイング、免疫染色、免疫拡散法等の免疫学的測定方法を挙げることができ、また、直接競合ＥＬＩＳＡ法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法を好適に例示することができる。【００２１】
本発明の小細胞肺癌の診断（判定）キットとしては、上記本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体から選択される１又は２以上のモノクローナル抗体を備え、試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出／測定しうるキットであれば特に制限されず、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体固相化ＥＬＩＳＡ用アッセイプレートや標識化抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体等の１又は２以上の本発明の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体の他、各種緩衝液、反応終了液、検出基質などを含んでいてもよい。【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
［抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体の作製］
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮは、１４７アミノ酸からなる分子量１７２３６のタンパク質である（配列番号１）。配列番号２及び３に示す２種類のペプチド、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）及びｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）を合成し、キャリアであるＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）と結合させ、抗原となるｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）−ＫＬＨおよびｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）−ＫＬＨを作製した。免疫方法として、初回は、免疫原とフロイント完全アジュバンドを用いてエマルジョンを作製し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌、７週齢）腹腔内に投与した（ペプチド換算約０．２ｍｇ／マウス）。２回目からは、同様に調製したエマルジョンをマウス腹腔内に投与し（ペプチド換算約０．１ｍｇ／マウス）、計６回の追加免疫を行った後、最終免疫より４週間後にブート免疫を行い、その３日後に細胞融合を行った。【００２４】
免疫マウスより脾臓細胞を調製し、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と細胞融合した。標準抗原としてｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）ペプチド、標識抗原としてビオチン標識ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）ペプチドを用い酵素免疫測定法による一次スクリーニングを行い、陽性ハイブリドーマを選出した後、さらに限界希釈法によるスクリーニングを行った。上記のスクリーニングにより選出されたハイブリドーマ細胞をヌードマウス腹腔内に投与し腹水を作製し、その腹水を回収した。脱脂後プロテインＡアフィニティーカラムにより、腹水よりモノクローナル抗体を精製し、Isotyping Test kit（大日本製薬製）を用いてIsotypeを調べた。その結果、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を抗原とする５種類の抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００８）と、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８−８７）を抗原とする３種類の抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７）を得た（図１）。
【実施例２】
【００２５】
［モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング］
上記の抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、培養上清中及び培養細胞抽出液中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの検出を行った。小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ３細胞を１×１０６となるよう１０ｃｍシャーレに播種し、一晩インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。培地は１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０を用いた。次にＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。ＲＰＭＩ１６４０培地で１時間インキュベートした後、培地を捨て、ＰＢＳでさらに２回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地を７ｍｌ加えた。４８時間インキュベートした後この培地を回収した。また、培養後の細胞を０．２５ｍｌのlysis buffer（７．５Ｍ  urea，２．５Ｍ  thiourea，１２．５％  glycerol，５０ｍＭ  Tris，２．５％  N-octylglucoside，６．２５ｍＭ  ＴＣＥＰ［Tris-carboxyethyl phosphine hydrocholine］，１．２５ｍＭ  protease inhibitor）で溶解し、細胞抽出液を調製した。【００２６】
調整した培養上清及び細胞抽出液におけるｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパク発現を、ウエスタンブロッティングにより検討した。対照として、すでに市販されている２種類の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ抗体（いずれもSanta Cruz Biotechnology社製）を用いた。図２に培養上清の、図３に細胞抽出液のウエスタンブロッティングの結果を示す。本発明の８種の抗体のうち、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００８以外の全ての抗体により２０ｋＤａのバンドが検出された。これはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの分子量と一致しており、さらに、対象の抗体で検出されたバンド位置と一致していることから、本発明のモノクローナル抗体はウエスタンブロッティングによりｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを検出することが可能あることが示された（図２及び３）。また、上清と細胞抽出液の両方に関して、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３により複数のバンドが検出されたことから、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３は非特異的に他のタンパクを認識する可能性が示された。以上の結果より、実施例１で得られたモノクローナル抗体のうち、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００８以外の７種の抗体が、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの測定系に使用できる可能性が示された。
【実施例３】
【００２７】
［直接競合ＥＬＩＳＡ法（化学発色）］
さらに、実施例１で作製した抗体を用いた酵素免疫測定を行い、培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクの測定を行った。酵素免疫測定の測定系は以下に示す通りである。０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Cosmo Bio社製）を９６ウェルプレートへ分注し４℃で一晩静置した。その後、ブロックエース（大日本製薬製）を用い４℃で一晩静置しブロッキングを行った。これを抗マウスＩｇＧ抗体固定化プレート（プレート）とし、以下のアッセイに用いた。プレートの各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−））で３回洗浄後、ビオチン標識した、又は標識していないｐｒｏＮＴ／ＮＭＮペプチドを緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−））で希釈し、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体とともにプレートに分注し、室温で３時間反応させた（シェーカー１００ｒｐｍ）。洗浄液で４回洗浄後、緩衝液で希釈したStreptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate（メルク社製）溶液を分注し室温で２時間反応させた（シェーカー１００ｒｐｍ）。洗浄液で４回洗浄後、ＯＰＤ基質溶液［基質溶解液（０．０６７Ｍリン酸水素二ナトリウム十二水和物、０．０３３Ｍクエン酸一水和物および０．０１５％Ｈ２Ｏ２）にＯＰＤ錠（Sigma社製）を使用直前に溶解］を分注し室温で２０分間反応させた（静置）。１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用い標識抗原の酵素活性をＯ．Ｄ．４９２ｎｍで測定した。【００２８】
実施例２でｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを認識することが確認された４種類のモノクローナル抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４）を用いて直接競合ＥＬＩＳＡ法を行い、ＳＢＣ３細胞の培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパク濃度を測定した。測定系には、標識抗原としてビオチン標識ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）ペプチドを用い、標準抗原としてｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）ペプチドを用いた。また、ＳＢＣ３無血清培養上清（５、１２、２５、３８および５０μｌ）を標識抗原としてビオチン標識ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）ペプチドと競合させ濃度を測定した。図４に示すように、全ての抗体において、培養上清の量にともなってＯ．Ｄ．値が低くなることが明らかとなった。また、このような阻害曲線は培養液のみを測定した結果では得られなかった（図５）。これらの結果から、本測定系により培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパクを特異的に測定できることが示された。
【実施例４】
【００２９】
［モノクローナル抗体のエピトープ解析］
続いて、実施例３の直接競合ＥＬＩＳＡ法を用い、７種のモノクローナル抗体のエピトープを解析した。解析には以下に示す７種のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮペプチドを用いた（図６）。
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）：配列番号２
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜３８）：配列番号４
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）  ：配列番号３
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）：配列番号５
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）：配列番号６
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）：配列番号７
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ６６〜８７）：配列番号８【００３０】
各測定では、一次抗体として０．５μｇ／ｍｌに希釈した各モノクローナル抗体、及び５−１０００ｎｇ／ｍｌの非標識ペプチドを用いた。また、ビオチン標識抗原として、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４の検討には２０ｎｇ／ｍｌのｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を（図７）、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７の検討には１０ｎｇ／ｍｌのｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）を用いた（図８）。【００３１】
図７に、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）の免疫により作製した４種類の抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４）の測定結果を、図８に、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）の免疫により作製した３種類の抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７）の測定結果を示す。図７に示すように、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）の免疫により作製した４種類の抗体は全て、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）を認識すること、その阻害濃度はほぼ同じであることが明らかとなった。また、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３のみがｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）にも結合を示したが、それ以外のペプチドに関しては、５種類すべての抗体が全く認識しないことが明らかとなった。一方、図８に示すように、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）の免疫により作製した３種類の抗体では、３種類全てがｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）を認識したが、それぞれのペプチドに対する各抗体の親和性は異なっており、
ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５とＳＣＣ−ＭＧＤ−００６では、
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）＝ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）、
ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７は、
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ８〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ４７〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ３９〜８７）＞ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ２６〜８７）であった。
以上の結果から、本発明において作製された抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体は、異なる性質を持つことが確認された。
【実施例５】
【００３２】
［直接競合ＥＬＩＺＡ法（化学発光）］
基質溶液として、ＯＰＤ基質溶液に代えてBM ChemiluminescenceELISA Substrate（ＰＯＤ）（Roche社製）を用い、マルチプレートリーダーで９６穴プレートの各ウェルの発光を測定する以外は、実施例３と同様に直接競合ＥＬＩＳＡ法を行い、標準物質による標準曲線を作成した。すなわち、ＥＬＩＺＡ反応後の９６穴プレートの各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−））で４回洗浄し、 Substrate reagent A : Starting reagent B ＝１００：１で混合後、各ウェルに１００ｍｌずつ分注し、３分間反応させてマルチプレートリーダーで９６穴プレートの各ウェルの発光を測定することにより、標準物質による標準曲線を作成した。抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００１、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００３、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００４はすべてｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（ａａ−１〜３８）ペプチドを標準物質とした。これらの標準曲線を図９に示す。また、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００５（標準物質；ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮａａ３９〜８７）、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００６（標準物質；ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮａａ８〜８７）、ＳＣＣ−ＭＧＤ−００７（標準物質；ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮａａ−１〜３８）の標準曲線を図１０に示す。【００３３】
次に、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２及びＳＣＣ−ＭＧＤ−００５を用いて、ＳＢＣ３細胞の培養上清（希釈倍率１〜１０７）中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパク濃度を測定した。結果を図１１に示す。図１１より、ＳＢＣ３細胞の無血清培養上清の測定値と標準曲線とが平行関係にあり、直接競合ＥＬＩＺＡ法（化学発光）により試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭタンパク濃度を測定できることがわかる。そこで、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２及びＳＣＣ−ＭＧＤ−００５を用いて、小細胞癌由来細胞株であるＳＢＣ１、ＳＢＣ２、ＳＢＣ３、ＳＢＣ５、ＮＣＩ−Ｈ６９、及び対照としての大細胞癌由来細胞株であるＮＣＩ−Ｈ６６１、Ｌｕ６５、Ｌｕ９９の無血清培養上清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ免疫活性を測定した。結果を図１２に示す。図１２より、ＳＢＣ１、ＳＢＣ２、ＳＢＣ３、特にＳＢＣ３の無血清培養上清中に高いｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ濃度が測定されることがわかる。【００３４】
また、実施例２に記載されている方法に準じて、各種肺癌細胞株の各無血清培養上清１ｍｌを濃縮し、電気泳動後、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図１３に示す。図１３より、ＳＢＣ１、ＳＢＣ２、ＳＢＣ３、特にＳＢＣ３の無血清培養上清中に高い濃度のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが発現していることがわかる。
【実施例６】
【００３５】
［小細胞肺癌の診断］
小細胞肺癌患者の血清５０μｌを、抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−００２を用いて、実施例５の直接競合ＥＬＩＺＡ法（化学発光）により患者血清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクを測定したところ、７ｐｍｏｌ／ｍｌのｐｒｏＮＴ／ＮＭＮタンパクが検出された。一方、対照となる健常人の血清中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮペプチドの測定値は有意に低かった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の７種類の抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体は、それぞれ異なる配列への結合能を有しており、これらの抗体を単独または組み合わせて使用することにより、高感度で確実なｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ検出・測定法を確立することができる。
【図１】
2009044561.tif 000002
【図２】
2009044561.tif 000003
【図３】
2009044561.tif 000004
【図４】
2009044561.tif 000005
【図５】
2009044561.tif 000006
【図６】
2009044561.tif 000007
【図７】
2009044561.tif 000008
【図８】
2009044561.tif 000009
【図９】
2009044561.tif 000010
【図１０】
2009044561.tif 000011
【図１１】
2009044561.tif 000012
【図１２】
2009044561.tif 000013
【図１３】
2009044561.tif 000014
【配列表】
2009044561000001.app
【国際調査報告】
2009044561.tif 000015
2009044561.tif 000016
2009044561.tif 000017
2009044561.tif 000018
2009044561.tif 000019
2009044561.tif 000020