(57)【要約】多発性硬化症、インスリン依存性（Ｉ型）糖尿病、慢性関節リウマチ、末梢神経炎、および肺高血圧症のような、炎症過程の治療のために、カリウム流入の新規阻害剤の使用が開示される。その化合物はまた、脳卒中を治療および予防するのに有用である。これらの阻害剤は、ＩＫ１チャネルに高い特異性を有し、そして非フッ素置換ホモログと比較してより高い安定性を有する。疾患によって影響される細胞の、細胞イオン流入を変化させることによって、炎症過程（例えば多発性硬化症）をコントロールすることは、強力な治療的アプローチである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症過程の治療または予防のための方法であって、該方法は、該炎症過程に罹患している被験体に、治療的に有効な量の式Ｉ：
【化１】
2009520826.tif 000019
の化合物を投与することを含み、ここで、
ｍ、ｎ、およびｐは、独立して、０および１から選択され、かつｍ、ｎ、およびｐのうちの少なくとも１つは１であり；
ｍ、ｎ、およびｐが全て１である場合、環１および環２におけるフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから独立して選択される位置に配置され、環３における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置にあり；そして
ｐが０、かつｍが１、かつｎが１である場合、環１におけるフルオロ置換基はアセトアミド置換基に対してパラであり、環２における置換基はアセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置に配置される、方法。
【請求項２】
前記化合物が、式ＩＩ：
【化２】
2009520826.tif 000020
に従う構造を有し、ここで、
ｍ、ｎ、およびｐは、独立して、０および１から選択され、かつｍ、ｎ、およびｐのうちの少なくとも１つが１である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、式ＩＩＩ：
【化３】
2009520826.tif 000021
に従う構造を有し、ここで、
ｎは０および１から選択される整数である、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物は、以下：
【化４】
2009520826.tif 000022
から選択される構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記炎症過程が、多発性硬化症、インスリン依存性（Ｉ型）糖尿病、慢性関節リウマチ、末梢神経炎、および肺高血圧症から選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記炎症過程が多発性硬化症である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記炎症過程が肺高血圧症である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記炎症過程がカリウムチャネルによって媒介される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記カリウムチャネルがＩＫ１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
多発性硬化症を治療または予防する方法であって、該方法は、多発性硬化症に罹患している被験体に、治療的に有効な量の式Ｉ：
【化５】
2009520826.tif 000023
の化合物を投与することを含み、ここで、
ｍ、ｎ、およびｐは、独立して、０および１から選択され、かつｍ、ｎ、およびｐのうちの少なくとも１つは１であり；
ｍ、ｎ、およびｐが全て１である場合、環１および環２におけるフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから独立して選択される位置に配置され、環３における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置にあり；そして
ｐが０、かつｍが１、かつｎが１である場合、環１におけるフルオロ置換基はアセトアミド置換基に対してパラであり、環２における置換基はアセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置に配置される、方法。
【請求項１１】
肺高血圧症を治療または予防する方法であって、該方法は、肺高血圧症に罹患している被験体に、治療的に有効な量の式Ｉ：
【化６】
2009520826.tif 000024
の化合物を投与することを含み、ここで、
ｍ、ｎ、およびｐは、独立して、０および１から選択され、かつｍ、ｎ、およびｐのうちの少なくとも１つは１であり；
ｍ、ｎ、およびｐが全て１である場合、環１および環２におけるフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから独立して選択される位置に配置され、環３における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置にあり；そして
ｐが０、かつｍが１、かつｎが１である場合、環１におけるフルオロ置換基はアセトアミド置換基に対してパラであり、環２における置換基はアセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置に配置される、方法。
【請求項１２】
脳卒中を治療または予防する方法であって、該方法は、脳卒中に罹患しているかまたは脳卒中を有するリスクのある被験体に、治療的に有効な量の式Ｉ：
【化７】
2009520826.tif 000025
の化合物を投与することを含み、ここで、
ｍ、ｎ、およびｐは、独立して、０および１から選択され、かつｍ、ｎ、およびｐのうちの少なくとも１つは１であり；
ｍ、ｎ、およびｐが全て１である場合、環１および環２におけるフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから独立して選択される位置に配置され、環３における置換基は、アセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置にあり；そして
ｐが０、かつｍが１、かつｎが１である場合、環１におけるフルオロ置換基はアセトアミド置換基に対してパラであり、環２における置換基はアセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置に配置される、方法。
【請求項１３】
前記化合物が、式ＩＩ：
【化８】
2009520826.tif 000026
に従う構造を有し、ここで、
ｍ、ｎ、およびｐは、独立して、０および１から選択され、かつｍ、ｎ、およびｐのうちの少なくとも１つが１である、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、式ＩＩＩ：
【化９】
2009520826.tif 000027
に従う構造を有し、ここで、
ｎは０および１から選択される整数である、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物は、以下：
【化１０】
2009520826.tif 000028
から選択される構造を有する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年１２月２０日に出願された先の米国仮特許出願第６０／７５２，９３５号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／７５２，９３５号の開示は、その全体が、全ての目的のために本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の背景）
１つの局面において、本発明は、炎症過程を治療または予防する方法に向けられ、それは特に多発性硬化症および肺高血圧症を含む。
【背景技術】
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系の慢性炎症性疾患である。ＭＳに罹患した個人は、視力の喪失、運動能の低下、感覚の障害、失調症、および中枢神経系における異常に関連した他の問題を含む、神経障害を示す；しかし、ＭＳは、認知機能は損なわない。ＭＳ疾患の進行は、個人によって高度に可変性の過程であり、急性症状に続いて寛解の期間があり、そして次いで後に慢性および変性状態に進行する。ＭＳの正確な原因は不明であるが、自己免疫、遺伝、環境因子および／またはウイルス感染の組み合わせであり得ることが推測される。証拠は、ＭＳの初期の段階は、自己免疫反応によって引き起こされ得、一方後の慢性の段階は、ミエリン鞘および下の軸索の変性に起因し得ることを示唆する。非特許文献１。この理論と一致して、マウスモデルにおける最近の研究は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞が、中枢神経系を攻撃することによって、ＭＳの病因に寄与することを示唆する。従って、自己反応性Ｔ細胞の抑制は、潜在的な治療手段を示す。非特許文献２；非特許文献３。
【０００４】
Ｔ細胞は、Ｃａ２＋遊離−活性化Ｃａ２＋（ＣＲＡＣ）チャネルによるＣａ２＋イオンの流入によって活性化される。陽イオンの流入を相殺するために、２つのＫ＋チャネル、Ｋｖ１．３およびＩＫ１が作動してＫ＋を細胞から押し出す。これらのＫ＋チャネルは、２つの別々のメカニズムによって作動する。Ｋｖ１．３は、膜脱分極に反応して開口する電位開口型チャネルであり、そして静止膜電位を維持するよう作動する。非特許文献２。ＩＫ１は、細胞質Ｃａ２＋の増加に反応し、そして膜電位を過分極させるように作動する。両方のチャネルは、一緒になって、Ｔ細胞の活性化、接着、および移動に重要な役割を果たす。Ｔ細胞において、ＩＫ１およびＫｖ１．３チャネルのｍＲＮＡおよびタンパク質発現の両方が、抗原性および分裂促進的刺激に反応してアップレギュレートされる。
【０００５】
これらのカリウムチャネルは、その制限された発現のために、薬剤候補のよい標的である。それらは主に血液および上皮細胞に発現する。これらのチャネルの特異的発現パターンは、特異的Ｋ＋チャネル阻害剤は副作用がより少なくあり得ることを示唆する。
【０００６】
実験的に、いくつかの公知の阻害剤が、他のＫ＋チャネルよりもＫｖ１．３およびＩＫ１チャネルを選択的に阻害する。Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ由来のペプチド毒素（ＳｈＫ）は、Ｋｖ１．３およびＩＫ１チャネルの両方を阻害する。インビトロ研究は、ＳｈＫ−Ｄａｐ２２、マーガトキシン、およびコレオライド（ｃｏｒｒｅｏｌｉｄｅ）が、Ｋｖ１．３チャネルを特異的に阻害し、一方クロトリマゾールおよびＴＲＡＭ−４（クロトリマゾールの合成アナログ）はＩＫ１を特異的に阻害することを示す。非特許文献４。インビトロ研究を用いて、Ｂｅｅｔｏｎらは、選択的Ｋｖ１．３遮断薬は、慢性的に活性化されたＴ細胞の増殖を阻害し、一方選択的ＩＫ１遮断薬は、急性に活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することを示した。非特許文献２。
【０００７】
実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスは、ＭＳの多くの病理学的特徴を模倣し、そして標準的な動物モデルとして広く研究されている。Ｔ細胞を枯渇した実験動物は、ＥＡＥを発症する能力の喪失を示し、Ｔ細胞がヒトにおけるＭＳの発症に必要であることを示唆する。養子移植ＥＡＥ動物モデルにおいて、Ｂｅｅｔｏｎらは、より一般的なカリウムチャネル遮断薬、ＳｈＫが、致死的なＥＡＥ養子移植を予防し、そして疾患の進行を改善するために最も強力な治療を提供したことを同定した。Ｋｖ１．３特異的遮断薬Ｓｈｋ−Ｄａｐ２２は、２番目に高い保護を提供し、一方ＩＫ１特異的遮断薬ＴＲＡＭ−３４は、最も効果の低い治療を提供した。Ｓｈｋ−Ｄａｐ２２およびＴＲＡＭ−３４の組み合わせは、Ｓｈｋ−Ｄａｐ２２単独よりも高い保護を提供したことに注意する。この結果は、もしかして、慢性的に活性化されたＴ細胞における、ＩＫ１チャネルと比較して高いＫｖ１．３チャネルの比によって説明し得る。実際、ＭＳ被験体から取られたミエリン反応性Ｔ細胞も、ＩＫ１比と比較して高いＫｖ１．３を含み、これらの細胞は、疾患の進行の間に複数回の抗原刺激を受けることを示唆する。
【０００８】
上記で記載した養子移植マウスモデルと対照的に、ＴＲＡＭ−３４は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質のペプチド断片で免疫したマウスにおいて、ＥＡＥの発症を抑制することが発見された。非特許文献５；非特許文献６。興味深いことに、この研究は、ＴＲＡＭ−３４はＴ細胞のクローン増殖には影響を及ぼさないが、サイトカインの発現レベルは強力に抑制することを示した。これらのインビボ研究は、Ｋｖ１．３およびＩＫ１チャネルは、重複する特徴を有さないことを示唆する。従って、新規Ｋ＋チャネル遮断薬の開発および試験は、分子メカニズムの理解および疾患の治療のために、さらなる情報を提供し得る。
【０００９】
ある現在公知のＩＫ１阻害剤は、いくつかの問題を有する。クロトリマゾール、およびミコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、およびスルコナゾールを含む他の関連する抗真菌薬は、ＩＫ１を阻害し、そしてＫ＋の喪失を予防することが示されたが、それらは潜在的および観察された肝毒性のために、理想的な臨床医薬品ではない。それらはまた、短いインビボでの半減期、低い生物学的利用能、およびＩＫ１との相互作用における比較的低い効力しか有さない。いくつかの阻害剤は、非ＩＫ１カルシウム活性化カリウムチャネルと非特異的な相互作用を有する。従って、ＩＫ１チャネル阻害剤の必要性が依然として存在する。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす、選択されたＩＫ１チャネル阻害剤のグループを記載する。
【００１０】
本発明は、肺高血圧症の治療または予防において特に有用である。従って、本発明は、肺高血圧症の治療または予防の方法を提供する。その方法は、肺高血圧症を患う被験体に、式（Ｉ）による構造を有する、治療的に有効な量の化合物を投与することを含む。この方法は、それに加えて鎌状赤血球症を患う被験体において特に有用である。
【００１１】
本明細書中で使用される肺高血圧症（またはＰＨ）は、肺における血管、肺動脈における圧の異常な上昇を指す。時間につれて、増加した圧は大きいおよび小さい肺動脈を両方損傷する。最も小さい血管の壁は肥厚し、そして血液および肺の間で、もはや正常に酸素および二酸化炭素を交換できない。従って、血液中の酸素レベルは低下し得る。低い酸素レベルは、肺動脈の狭小化（狭窄）を引き起こし得る。これらの変化はさらに、肺循環の圧の増加に寄与する。
【００１２】
肺高血圧症になると、心臓の右側は、肺動脈を通じて肺まで血液を押し出すためにより強く働かなければならない。時間につれて、右心室は肥厚および肥大し、肺性心と呼ばれる状態になる。
【００１３】
特定の人々においては、血液中の低い酸素を代償するために、骨髄がより多くの赤血球を産生し、赤血球増加症と呼ばれる状態になる。過剰の赤血球は、血液をより濃く、そして粘着性にし、さらに心臓に対する負荷を増加させる。これらの変化はまた、濃縮された血液は凝集し、そして主に脚の静脈において血塊を形成するので、肺性心の人の、肺塞栓症のリスクを増加させる。これらの血塊が取れて、そして肺に移動し得る。
【００１４】
２つの型の肺高血圧症：原発性および続発性が存在する。両方の型の肺高血圧症が、本明細書中で使用されるこの用語に含まれる。原発性肺高血圧症は、続発性肺高血圧症よりまれである。原発性肺高血圧症において、原因は不明であるが、おそらく肺動脈の筋肉層の痙攣（収縮）から始まる。女性は、男性の２倍、原発性肺高血圧症にかかり、そして半分の人々は、診断時に３５歳以上である。続発性肺高血圧症は、その状態が、肺の構造または機能に影響を与える別の異常のために起こったことを意味する。
【００１５】
続発性肺高血圧症は、肺を通じた血液の流れを妨害する、または持続する期間、血液中の低酸素を引き起こすあらゆる疾患によって起こり得る。最もよくある原因の１つは、慢性閉塞性肺疾患である。肺が疾患によって損傷された場合、それらを通じて血液をポンプで送るために、より多くの努力を必要とする。時間につれて、慢性閉塞性肺疾患は、肺において小さい空気嚢（肺胞）を、その小さい血管（毛細血管）と共に破壊する。慢性閉塞性肺疾患における、肺高血圧症の単一の最も重要な原因は、低い血液酸素レベルの結果として起こる、肺動脈の狭小化である。
【００１６】
肺高血圧症を引き起こし得る別の疾患は、肺線維症であり、それは肺に広範な瘢痕組織の形成を引き起こす。瘢痕組織は、肺循環を破壊し、そして血液の流れをより困難にする。肺高血圧症を引き起こし得る、他の肺疾患は、嚢胞性線維症、および石綿肺および珪肺症のような、ある職業的肺疾患を含む。
【００１７】
より少ないが、肺高血圧症は、手術または外傷による、肺組織の広範な喪失によって、または心不全、強皮症、呼吸能力の低下した肥満（ピックウィック症候群）、呼吸筋を含む神経疾患、慢性肝臓疾患、ＨＩＶ感染、およびダイエット薬によって、引き起こされる。肺高血圧症の急な原因は、肺塞栓症、血塊が肺の動脈につかえて、重大な問題を引き起こす状態である。
【００１８】
肺高血圧症を有する人々のいくらかは、結合組織異常、特に強皮症を有する。人々が両方の状態を有する場合、肺高血圧症の症状が現れる前に、多くの場合レイノー現象が発現する。
【００１９】
Ｋｖ１．３および／またはＩＫ１チャネルの遮断によってＴ細胞の活性化を抑制することは、炎症過程の治療および／または予防に向けてのアプローチである。従って、炎症を抑制する手段として、Ｋｖ１．３および／またはＩＫ１チャネルを阻害し得る化合物が望ましい。明白な有効性にもかかわらず、現在までに調査された、イミダゾールに基づくＫｖ１．３および／またはＩＫ１チャネル阻害剤は、文書により十分に立証された肝毒性の可能性を含むいくつかの欠点が障害となる。この毒性は、それぞれがその阻害剤のより高いおよびより頻繁な投与量の投与の動機付けとなる、阻害剤の低い効力、Ｋｖ１．３および／またはＩＫ１チャネルの他の、カルシウム活性化カリウムチャネルとの非特異的相互作用、および低い生物学的利用能によって増悪される。
【非特許文献１】Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２：７６２−７６４（２００１）
【非特許文献２】Ｂｅｅｔｏｎ，Ｃ．ら、ＰＮＡＳ、９８：１３９４２−１３９４７（２００１）
【非特許文献３】Ｗｕｌｆｆら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：１７０３−１７１３（２００３）
【非特許文献４】Ｇｈａｎｓｈａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３７１３７−３７１４９（２０００）
【非特許文献５】Ｍａｄｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１０（２００５）
【非特許文献６】Ｒｅｉｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１（２００５）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の概要）
トリフェニルアセトアミドに基づくＫ＋チャネル遮断薬は、本明細書中で参考文献に組み込まれる、米国特許第６，２８８，１２２号において議論されたように、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の治療のための有望な候補である。それに加えて、研究は、トリフェニルアセトアミドに基づく阻害剤は、ＭＳまたはＰＨのような、炎症状態の治療のための、可能性のある候補薬剤であることを示す。インビトロの研究は、トリフェニルアセトアミドに基づく阻害剤、表１の化合物３は長い半減期を有し、ＩＫ１チャネルに対する高い選択性でＫ＋チャネルを阻害することを示す。
【００２１】
従って、第一の局面において、本発明は、炎症過程を治療または予防する方法を提供し、当該方法は、当該炎症過程を患う被験体に、治療的に有効な量の、式Ｉによる構造を有する化合物を投与することを含む：
【００２２】
【化１１】
2009520826.tif 000002
ここで、ｍ、ｎおよびｐは、０および１から独立に選択され、そしてｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１である。
【００２３】
代表的な実施態様において、ｍ、ｎおよびｐが全て１である場合、環１および環２のフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから独立に選択される位置にあり、そして環３の置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置である。別の代表的な実施態様において、ｐが０であり、そしてｍが１およびｎが１である場合、環１のフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してパラであり、そして環２の置換基は、アセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置にある。
【００２４】
疾患によって影響される細胞の、細胞イオン流入を変化させることによって、炎症過程（例えば多発性硬化症）をコントロールすることは、強力な治療的アプローチである。さらに、疾患過程および正常生理機能の両方における、細胞イオン流入の役割の基礎的な理解は、新しい治療様式、レジメおよび薬剤を提供することを約束する。細胞イオン流入を変化させる化合物、特にカリウム流入を阻害するものは、薬剤として、およびこれらのイオン流入の基礎にある基本的なメカニズムを明らかにするためのプローブとして、非常に望ましい。同様に、基礎研究および治療的適用においてこれらの化合物を利用する方法は、研究者および臨床医の両方の集積において、価値あるツールである。従って、そのような化合物および方法も、本発明の目的である。
【００２５】
従って、別の局面において、本発明は、細胞のカリウム流入を阻害する方法を提供する。その方法は、細胞を、カリウム流入を阻害するのに有効な量の、式（Ｉ）による化合物と接触させることを含む。
【００２６】
多発性硬化症のような、炎症過程の治療のために重要な治療経路は、自己反応性Ｔ細胞の増殖を予防または遅らせることである。この増殖遅延を、Ｔ細胞の細胞イオン流入を操作することによって達成し得る。従って、別の局面において、本発明は、自己反応性Ｔ細胞の増殖を予防または遅らせる方法を提供する。その方法は、Ｔ細胞を、自己反応性Ｔ細胞の増殖を予防または遅らせるのに有効な量の、式（Ｉ）による化合物と接触させることを含む。
【００２７】
従って、別の局面において、本発明は、多発性硬化症を治療または予防する方法を提供する。その方法は、多発性硬化症を患う被験体に、治療的に有効な量の、式（Ｉ）による構造を有する化合物を投与することを含む。別の代表的な実施態様において、その方法は、本発明の化合物を、他の点では本発明の化合物による以外には治療の必要がない哺乳類に投与することによって、多発性硬化症を治療することを含む。
【００２８】
別の局面において、本発明は、肺高血圧症を治療または予防する方法を提供する。その方法は、肺高血圧症を患う被験体に、治療的に有効な量の、式（Ｉ）による構造を有する化合物を投与することを含む。別の代表的な実施態様において、その方法は、本発明の化合物を、他の点では本発明の化合物による治療の必要がない哺乳類に投与することによって、肺高血圧症を治療することを含む。
【００２９】
またさらなる局面において、本発明は、脳卒中を治療または予防する方法を提供する。その方法は、脳卒中を患う被験体、または脳卒中を起こすリスクのある被験体に、治療的に有効な量の、式（Ｉ）による構造を有する化合物を投与することを含む。促進薬（ｏｐｅｎｅｒ）または遮断薬のどちらでも、イオンチャネル修飾物質で神経および循環器疾患を治療することの、優れた実績が存在する。一般的なクラスとしてのイオンチャネル遮断薬は、脳卒中、てんかん、および不整脈の治療のための主要な治療薬である。別の代表的な実施態様において、その方法は、本発明の化合物を、他の点では本発明の化合物による治療の必要がない哺乳類に投与することによって、脳卒中を治療または予防することを含む。
【００３０】
本発明のこれらおよび他の目的および利点が、以下の詳細な説明および実施例から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
（略語および定義）
本明細書中で使用される「生物学的媒体」は、インビトロおよびインビボ両方の生物学的環境を指す。代表的なインビトロの「生物学的媒体」は、細胞培養、組織培養、ホモジネート、血漿および血液を含むがこれに限らない。インビボの適用は、一般的に哺乳類、好ましくはヒトにおいて行う。
【００３２】
「フルオロアルキル」は、部分的にフッ素化された、または全フッ素置換された、アルキルまたは置換アルキル基を含む、「置換アルキル」のサブクラスを指す。フッ素置換は、アルキル部分の唯一の置換であり得る、またはそれはあらゆる他の置換基または置換基のグループとの実質的にあらゆる組み合わせであり得る。
【００３３】
化合物
第一の局面において、本発明は式（Ｉ）による構造を有する化合物を利用する：
【００３４】
【化１２】
2009520826.tif 000003
ここでｍ、ｎおよびｐは、０および１から独立に選択され、そしてｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１である。
【００３５】
代表的な実施態様において、ｍ、ｎおよびｐが全て１である場合、環１および環２のフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから独立に選択される位置にあり、そして環３の置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置である。別の代表的な実施態様において、ｐが０であり、そしてｍが１およびｎが１である場合、環１のフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してパラであり、そして環２の置換基は、アセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置にある。
【００３６】
代表的な実施態様において、本発明において利用される化合物は、式（ＩＩ）による構造を有する：
【００３７】
【化１３】
2009520826.tif 000004
ここでｍ、ｎおよびｐは、０および１から独立に選択され、そしてｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１である。
【００３８】
この構造による化合物を、表１に示す。
【００３９】
別の代表的な実施態様において、本発明の化合物は、式ＩＩＩによる構造を有する：
【００４０】
【化１４】
2009520826.tif 000005
ここでｎは０または１のいずれかである。
【００４１】
本発明の化合物と構造的に近い関係の化合物も表１に示す。本発明の化合物と構造的に関連する化合物は、本発明のフッ素化化合物の利点および予期しない性質および利点を評価するための「ベースライン」として作用する。
【００４２】
表１
【００４３】
【化１５】
2009520826.tif 000006
【００４４】
【化１６】
2009520826.tif 000007
【００４５】
【化１７】
2009520826.tif 000008
化合物合成
本発明の化合物を、有機合成の分野において標準的な技術によって調製し得る。適当な開始材料および試薬を、市販で入手し得る、またはそれらを標準的な有機化学技術によって調製し得る。代表的な過程を、特定の実施例によって説明する。代表的な合成経路を、スキーム１において提供する。
スキーム１
【００４６】
【化１８】
2009520826.tif 000009
スキーム１において、フッ素置換トリフェニルアセトアミドの合成は、フッ素置換ベンゾフェノン、およびフェニルまたはフッ素置換フェニル部分をベンゾフェノンケトンに付加する試薬から調製される、対応するフッ素置換トリフェニルメタノールから進行する。フッ素置換トリフェニルメタノールを次に、そのアルコールを塩化アセチル、続いてシアン化銅に接触させることによって、対応するフッ素置換トリフェニルアセトニトリルに変換する。中間体ニトリルを、硫酸および氷酢酸の混合物と反応させることによって、アセトアミドを形成し得る。フッ素置換トリフェニルメタン種、特にアセトアミドに至る他の合成経路が、当業者の能力の範囲内である。
【００４７】
化合物の安定性
化合物が薬学的に有用なＩＫ１チャネル阻害剤として作用するために、候補化合物は、許容可能な生物学的利用能およびインビボにおける安定性の両方を示さなければならない。治療を受ける被験体は、本発明の化合物を定期的に投与されなければならない。増加したインビボ滞留時間および増加した生物学的利用能を有する化合物は、単純な投与レジメン（すなわちより少ない投与／日および／またはより少ない薬物）を可能にする。さらに、投与する化合物の量を抑制することは、薬物および／またはその代謝物によって起こる副作用を抑制する見込みがある。従って、高い生物学的利用能および増強されたインビボ安定性を示すＩＫ１チャネル阻害剤を提供することが、非常に望ましい。
【００４８】
化合物の活性
薬学的に有用なＩＫ１チャネル阻害剤を開発するために、候補化合物は、標的チャネルに対する許容可能な活性を示さなければならない。化合物は、もしそれらが１００−５００ｎＭ以下のＩＫ１チャネルに対するＩＣ５０を有するなら、十分強力であると判断される。
【００４９】
イオンチャネルに対する本発明の化合物の活性を、当該分野で公知の方法を利用してアッセイし得る。例えば、Ｂｒｕｇｎａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１２）：８７６０−８７６８（１９９３）を参照のこと。この参考文献において記載された方法を利用して、Ｇａｒｄｏｓチャネルの阻害パーセントおよび本発明の化合物のＩＣ５０の両方をアッセイし得る。
【００５０】
イオンチャネルの活性およびイオンチャネルに影響を与える３０の薬剤の活性をアッセイする他の方法が、当該分野で公知である。適当なアッセイ方法の選択は、当業者の能力の十分範囲内である。例えば、Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．、Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  Ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｓｉｎａｎｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９２）を参照のこと。
【００５１】
化合物の選択性
化合物が、薬学的に有用なＩＫ１チャネル阻害剤として作用するために、候補化合物は、標的チャネルに対する許容可能な選択性を示さなければならない。Ｇａｒｄｏｓチャネルに対して少なくとも３０倍の選択性を有する化合物が、十分選択的であると判断される。
【００５２】
別のカリウムイオンチャネルと比較した、ＩＫ１チャネルに関する特定の化合物の選択性を、２つの化合物の結合−関連量（例えばＩＣ５０）の比として、簡便に決定する。代表的な実施態様において、上記で議論されたように決定した活性を用いて選択性を決定するが、イオンチャネルの活性およびイオンチャネルに影響を与える薬剤の活性をアッセイするための他の方法が、当該分野で公知である。適当なアッセイ方法の選択は、当業者の能力の十分範囲内である。例えば、Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．、Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  Ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｓｉｎａｎｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９２）を参照のこと。
【００５３】
１つの実施態様において、本発明の化合物は、ＩＫ１チャネルによって媒介されるもののような、カリウム流入の強力、選択的、および安定な阻害剤である。
【００５４】
いかなる特定の作用理論に拘束されることを望まないが、現在、本発明の化合物のある構造的特徴（すなわち、水素のフッ素による置換）が、これらの化合物の安定性、選択性および効力に関係すると考えられている。従って、代表的な実施態様において、本発明の阻害剤は、アリール部分を含み、ここでアリール部分の少なくとも１つの水素原子が、フッ素原子を含むラジカルによって置換されている。この実施態様において、本発明は、カリウムイオン流入を阻害する化合物のフッ素化誘導体、特にＩＫ１チャネル阻害活性を有するものを含む（例えば抗真菌薬、例えばミコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、およびスルコナゾール）。カリウムイオンチャネル阻害活性、および特にＩＫ１チャネル阻害活性を有し、そして少なくとも１つのフッ素原子を有する少なくとも１つのアリール部分を有する他の薬剤が、本発明の範囲内である。
【００５５】
代表的な実施態様において、そのアリール部分はフェニル基である。別の代表的な実施態様において、そのアリール部分は、トリフェニルメチル基の成分である。
【００５６】
本発明の化合物を、それ自体で、または活性化合物が１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤との混合物である医薬品組成物の形式で投与し得る。従って、細胞イオンの流入に影響を与える化合物（例えばＩＫ１チャネル阻害活性）に加えて、本発明はまた、本発明の化合物を含む医薬品処方を提供する。
【００５７】
薬学的処方
第二の局面において、本発明は、薬学的に許容可能な賦形剤と混合した、式（Ｉ）による本発明の化合物を含む医薬品処方を提供する。代表的な実施態様において、その化合物は式（ＩＩ）による、およびより好ましくは式（ＩＩＩ）によるものである。
【００５８】
本明細書中で記載された化合物、またはその薬学的に許容可能な付加塩または水和物を、広く様々な投与経路または方式を用いて被験体に伝達するために処方し得る。適当な投与経路は、吸入、経皮、経口、眼内、直腸内、経粘膜、腸管および筋肉内、皮下、および静脈内注射を含む非経口投与を含むがこれに限らない。
【００５９】
本明細書中で記載された化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／または水和物を、単一で、本発明の他の化合物と組み合わせて、および／または他の治療薬と組み合わせたカクテルで投与し得る。本発明の化合物と同時投与し得る治療薬の選択は、部分的には、治療する状態に依存する。
【００６０】
例えば、多発性硬化症のような炎症過程を患う被験体に投与する場合、本発明の化合物を、疼痛、感染、および炎症過程に通常関連する他の症状および副作用を治療するために使用される薬剤を含むカクテルで投与し得る。そのような薬剤は、例えば鎮痛薬、抗生物質等を含む。その化合物をまた、酪酸および酪酸誘導体（Ｐｅｒｒｉｎｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８（２）：８１−８６（１９９３））；ヒドロキシウレア（Ｃｈａｒａｃｈｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３（２０）：１３１７−１３２２（１９９５））；エリスロポエチン（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３（６）：３６６−３７２（１９９０））；およびマグネシウムのような食用塩（Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉら、Ｂｌｏｏｄ  ８８（６４８ａ）：２５８０（１９９６））を含む、炎症過程を治療するのに通常使用される他の薬剤を含むカクテルで投与し得る。
【００６１】
本発明によって使用するための医薬品組成物を、活性化合物を薬剤的に使用し得る調製物へ処理することを促進する賦形剤および補助剤を含む、１つまたはそれ以上の生理学的に許容可能な担体を用いて、従来の方式で処方し得る。適当な処方は、選択された投与経路に依存する。
【００６２】
注射に関して、本発明の薬剤を、水性溶液中で、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液のような、生理学的に適合性の緩衝液中で処方し得る。代表的な実施態様において、その処方は、水およびアルコールおよび／またはグリコールを含む。この処方の他の有用な成分は、例えば界面活性剤、乳化剤およびエトキシ化オイルのような物質を含む。代表的な処方は、本発明の化合物、ポリ（エチレングリコール）４００、エタノールおよび水を１：１：１の比で含む。別の代表的な処方は、本発明の化合物、水、ポリ（エチレングリコール）４００およびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ−ＥＬを含む。
【００６３】
経粘膜投与（例えば頬側、直腸内、鼻腔内、眼内等）に関して、浸透するバリアーに適当な浸透剤を処方において使用する。そのような浸透剤は、一般的に当該分野で公知である。
【００６４】
経口投与に関して、活性化合物を、当該分野で周知の薬学的に許容可能な担体と組み合わせることによって、その化合物を容易に処方し得る。そのような担体は、治療される被験体による経口摂取のために、本発明の化合物を錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することを可能にする。経口使用のための医薬品調製物を、固体賦形剤と組み合わせ得、任意でできた混合物を粉砕し、そして顆粒の混合物を、もし望ましいなら適当な補助剤を加えた後に、錠剤または糖衣丸のコアを得るために処理する。適当な賦形剤は、特にラクトース、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールを含む糖のような充填剤；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような、セルロース調製物である。もし望ましいなら、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を加え得る。
【００６５】
糖衣丸のコアを、適当なコーティングと共に提供する。この目的のために、濃縮糖溶液を使用し得、それは任意でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。同定のために、または活性化合物投与量の異なる組み合わせを特徴付けるために、色素（ｄｙｅｓｔｕｆｆｓ）または色素（ｐｉｇｍｅｎｔｓ）を、錠剤または糖衣丸のコーティングに加え得る。
【００６６】
経口的に使用し得る医薬品調製物は、ゼラチンでできた押し込みばめ（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、およびゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤でできた軟らかい、密封カプセルを含む。押し込みばめカプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および任意で安定剤との混合物中に活性成分を含み得る。軟カプセルにおいて、活性化合物を、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような、適当な液体に溶解または懸濁し得る。それに加えて、安定剤を加え得る。経口投与のための全ての処方は、そのような投与に適当な投与量であるべきである。
【００６７】
頬側投与に関して、組成物は、従来の方式で処方された錠剤またはロゼンジの形式をとり得る。
【００６８】
吸入による投与に関して、本発明によって使用するための化合物を、適当な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当な気体を使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形式で、簡便に伝達する。加圧エアロゾルの場合、投与量単位を、計測した量を伝達するためのバルブを提供することによって決定し得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを、化合物およびラクトースまたはデンプンのような適当な粉末基剤の粉末混合物を含んで処方し得る。
【００６９】
注射、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与のために化合物を処方し得る。注射のための処方を、単位投与量形式、例えば保存剤を加えたアンプルまたは複数回投与容器で提示し得る。その組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルションの形式をとり得、そして架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤を加え得る。
【００７０】
非経口投与のための医薬品処方は、上記で静脈内投与に関して記載されたもののような、水溶性形式の活性化合物の水性溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液を、適当な油性注射懸濁液として調製し得る。適当な親油性溶媒または媒体は、ごま油のような脂肪酸、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘性を増加させる物質を含み得る。任意で、その懸濁液はまた、適当な安定剤または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の可溶性を高める薬剤を含み得る。
【００７１】
あるいは、活性成分は、使用の前に適当な媒体、例えば滅菌した発熱物質を含まない水で構築するための粉末形式であり得る。
【００７２】
その化合物をまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含む、坐剤または保持浣腸のような直腸内組成物に処方し得る。
【００７３】
以前に記載された処方に加えて、その化合物をまたデポ調製物に処方し得る。そのような長期作用処方を、埋め込み、または経皮伝達（例えば皮下または筋肉内）、筋肉内注射または経皮パッチによって投与し得る。従って、例えばその化合物を、適当なポリマー性または疎水性物質と（例えば許容可能な油中のエマルションとして）、またはイオン交換樹脂と、または難溶性の誘導体、例えば難溶性の塩として処方し得る。
【００７４】
その医薬品組成物はまた、適当な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含み得る。そのような担体または賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーを含むがこれに限らない。
【００７５】
有効な投与量
本発明で使用するために適当な医薬品組成物は、活性成分を治療的に有効な量で、すなわち意図する目的を達成するために有効な量で含む組成物を含む。特定の適用のために有効な実際の量は、とりわけ治療する状態に依存する。例えば、多発性硬化症の発生を抑制する、および／または自己反応性Ｔ細胞の形成を障害するための方法において投与する場合、そのような組成物は、この結果を達成するために有効な量の活性成分を含む。有効な量の決定は、特に本明細書中における詳細な開示を考えて、当業者の能力の十分範囲内である。
【００７６】
本明細書中で記載されたあらゆる化合物に関して、治療的に有効な量を、最初に細胞培養アッセイから決定し得る。標的血漿濃度は、ＩＫ１チャネルの阻害を誘導し得る活性化合物の濃度である。代表的な実施態様において、ＩＫ１チャネル活性を、少なくとも２５％阻害する。少なくとも約５０％、７５％、または９０％までも、またはそれ以上のＩＫ１チャネルカリウム流入の阻害を誘導し得る活性化合物の標的血漿濃度が、現在好ましい。被験体におけるＩＫ１チャネルの阻害パーセンテージをモニターして、達成した血漿薬物濃度の適切さを評価し得、そして望ましい阻害パーセンテージを達成するために、投与量を上方または下方に調整し得る。
【００７７】
当該分野で周知であるように、ヒトで使用するために治療的に有効な量を、動物モデルからも決定し得る。例えば、ヒトのための投与量を、動物において有効であることが見出された循環濃度を達成するために処方し得る。多発性硬化症に関して特に有用な動物モデルは、ＥＭＥマウスモデルである（Ｂｅｅｔｏｎら、ＰＮＡＳ、９８：１３９４２−１３９４７（２００１）；Ｒｅｉｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１（２００５）；Ｌａｒｓ  Ｍａｄｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１０（２００５））。上記で記載したように、ＩＫ１チャネル阻害をモニターし、そして投与量を上向きまたは下向きに調整することによって、ヒトにおける投与量を調整し得る。
【００７８】
当該分野で周知であるように、上記で記載した方法および他の方法に基づいて、ヒトにおいて最大の有効性を達成するために投与量を調整することは、当業者の能力の十分範囲内である。局所投与の場合には、投与された化合物の全身循環濃度は特に重要ではない。そのような場合には、意図する結果を達成するために有効な局所領域での濃度を達成するように化合物を投与する。
【００７９】
炎症過程の発症の予防および治療のために好ましい投与方式である、本明細書中で記載された化合物の経口投与のための被験体投与量は、典型的には約１ｍｇ／日から約１０，０００ｍｇ／日、より典型的には約１０ｍｇ／日から約１，０００ｍｇ／日、そして最も典型的には約５０ｍｇ／日から約５００ｍｇ／日の範囲である。被験体の体重の式で示された、典型的な投与量は、約０．０１から約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約０．１から約１５ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も典型的には約１から約１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【００８０】
他の投与方式に関して、投与量および間隔を個々に調整して、治療する特定の臨床適応症に有効な、投与した化合物の血漿レベルを提供する。例えば、もし急性炎症過程が最も主要な臨床症状であるなら、１つの実施態様において、本発明による化合物を、比較的高い濃度で、１日当たり複数回投与し得る。あるいは、もし被験体がまれに、定期的に、または不規則に、定期的な炎症性急性発症を示すだけなら、１つの実施態様において、本発明の化合物を、最低有効濃度で投与する、およびより頻繁でない投与レジメを使用することがより望ましくあり得る。これは、個人の炎症性疾患の重症度に釣り合った治療レジメを提供する。
【００８１】
本明細書中で提供された教示を利用して、有効な予防的または治療的治療レジメを計画し得、それは実質的な毒性を引き起こさず、そして特定の被験体が示す臨床症状を治療するために完全に有効である。この計画は、化合物の効力、相対的な生物学的利用能、被験体の体重、副作用の存在および重症度、好ましい投与方式、および選択した薬剤の毒性プロファイルのような因子を考慮することによる、活性化合物の注意深い選択を含むべきである。
【００８２】
化合物の毒性
特定の化合物に関する毒性と治療効果との間の比がその治療係数であり、そしてＬＤ５０（集団の５０％において致死的な化合物の量）とＥＤ５０（集団の５０％において有効な化合物の量）との間の比として表し得る。高い治療係数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび／または動物研究から得られた治療係数データを、ヒトにおいて使用するためにある範囲の投与量を処方することにおいて使用し得る。そのような化合物の投与量は、好ましくは毒性がほとんど無い、または全く無い、ＥＤ５０を含む血漿濃度の範囲内にある。投与量は、採用された投与形式、および利用する投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。例えば、Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｈ．１、ｐ．１、１９７５を参照のこと。正確な処方、投与経路および投与量は、被験体の状態および化合物を使用する特定の方法の観点から、個々の医師によって選択され得る。
【００８３】
方法
上記で詳細に議論した化合物および医薬品処方に加えて、本発明は、本発明の化合物が有用である多くの方法を提供する。その方法は、実験室の設定で、例えば薬物動態学、薬物の活性、疾患の起源および進行等の基礎的なメカニズムを探索するために使用し得るものに及ぶ。
【００８４】
本発明は、炎症性疾患を治療または予防するのに特に有用である。本明細書中で使用される「炎症過程」は、リンパ球増殖が疾患を引き起こす組織または臓器の損傷に寄与する疾患である。例えば、組織または臓器の部位での過剰なＴ細胞の増殖は、組織または臓器に損傷を引き起こす。炎症過程は、当該分野で周知であり、そして医学教科書において広範囲に記載されている（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１３版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【００８５】
代表的な実施態様において、本発明は、炎症過程を患う被験体に、式Ｉによる構造を有する、治療的に有効な量の化合物を投与することを含む、炎症過程を治療または予防する方法を提供する。
【００８６】
炎症過程の異常に関連する疾患は、増殖性糸球体腎炎；エリテマトーデス；強皮症；側頭動脈炎；閉塞性血栓血管炎；皮膚粘膜リンパ節症候群；喘息；宿主対移植片症候群、炎症性腸疾患；癌；多発性硬化症；慢性関節リウマチ；甲状腺炎；グレーブス病；抗原誘発気道活動亢進；肺好酸球増多症；ギランバレー症候群、アレルギー性鼻炎；重症筋無力症；ヒトＴリンパ増殖性ウイルス１型関連脊髄症；単純ヘルペス脳炎；炎症性筋疾患；動脈硬化症；グッドパスチャー症候群、インスリン依存性（１型）糖尿病；末梢神経炎；実験的自己免疫心筋炎および肺高血圧症を含むがこれに限らない。炎症過程のいくつかの例、および化合物を試験および開発するための動物モデルを、下記の表２で述べる。
【００８７】
上記で列挙した特定の過程に加えて、本発明はまた、ケロイド、肥厚性瘢痕、脂漏性皮膚疾患、パピローマウイルス感染（例えば尋常性疣贅、足底の疣贅、扁平疣贅、コンジローマ等を生じる）、湿疹、カポジ肉腫および日光角化症のような上皮の前癌病変を含む皮膚疾患の治療または予防に有用である。
【００８８】
表２
【００８９】
【化１９】
2009520826.tif 000010
【００９０】
【化２０】
2009520826.tif 000011
従って、最初の局面において、本発明は、炎症過程を治療または予防するための方法を提供し、当該方法は、当該炎症過程を患う被験体に、治療的に有効な量の、上記で述べたような式（Ｉ）による化合物を投与することを含む。
【００９１】
従って、別の局面において、本発明は、多発性硬化症を治療または予防する方法を提供する。その方法は、多発性硬化症を患う被験体に、治療的に有効な量の、式（Ｉ）による構造を有する化合物を投与することを含む。別の代表的な実施態様において、その方法は、他の点では本発明の化合物による治療を必要としない哺乳類に、本発明の化合物を投与することによって、多発性硬化症を治療することを含む。
【００９２】
別の局面において、本発明は、肺高血圧症を治療または予防する方法を提供する。その方法は、肺高血圧症を患う被験体に、治療的に有効な量の、式（Ｉ）による構造を有する化合物を投与することを含む。別の代表的な実施態様において、その方法は、他の点では本発明の化合物による治療を必要としない哺乳類に、本発明の化合物を投与することによって、肺高血圧症を治療することを含む。
【００９３】
促進薬または遮断薬のどちらでも、イオンチャネル修飾因子による神経および循環器異常の治療の、優れた実績が存在する。一般的なクラスとしてのイオンチャネル遮断薬は、脳卒中、てんかんおよび不整脈の主要な治療薬である。またさらなる局面において、本発明は、脳卒中を治療または予防する方法を提供する。その方法は、脳卒中を患う、または脳卒中を有する危険性のある被験体に、治療的に有効な量の、式（Ｉ）による構造を有する化合物を投与することを含む。代表的な実施態様において、その方法は、他の点では本発明の化合物による治療を必要としない哺乳類に、本発明の化合物を投与することによって、脳卒中を治療または予防することを含む。
【００９４】
本発明の方法の代表的な実施態様において、その方法を用いて治療した被験体は、鎌状赤血球症を有さない。
【００９５】
まとめると、本発明は様々な疾患状態を治療または予防する方法を提供する、よって、１つの局面において、本発明は、炎症過程を治療または予防する方法を提供する。その方法は、炎症過程を患う被験体、または炎症過程を患う危険性のある被験体に、治療的に有効な量の、式Ｉによる化合物を投与することを含む：
【００９６】
【化２１】
2009520826.tif 000012
式Ｉにおいて、ｍ、ｎおよびｐは、０および１から独立に選択され、そしてｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１である。ｍ、ｎおよびｐが全て１である場合、環１および環２のフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、アセトアミド置換基に対してメタ、およびアセトアミド置換基に対してパラから独立に選択される位置にあり、そして環３の置換基は、アセトアミド置換基に対してオルト、およびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置である。ｐが０、そしてｍが１およびｎが１である場合、環１のフルオロ置換基は、アセトアミド置換基に対してパラであり、そして環２の置換基は、アセトアミド置換基に対してオルトおよびアセトアミド置換基に対してパラから選択される位置にある。
【００９７】
本発明はまた、上記の段落による方法を提供し、ここでその疾患状態は、多発性硬化症、インスリン依存性（Ｉ型）糖尿病、慢性関節リウマチ、末梢神経炎および肺高血圧症から選択される。
【００９８】
本発明はまた、多発性硬化症を治療または予防する方法を提供する。その方法は、多発性硬化症を患う、または多発性硬化症を発症する危険性のある被験体に、治療的に有効な量の、式Ｉによる化合物を投与することを含む。
【００９９】
肺高血圧症を治療または予防する方法も提供される。その方法は、肺高血圧症を患う被験体に、治療的に有効な量の、式Ｉによる化合物を投与することを含む。
【０１００】
本発明はさらに、脳卒中を治療または予防する方法を提供する。その方法は、脳卒中を患う、または脳卒中を有する危険性のある被験体に、治療的に有効な量の、式Ｉによる化合物を投与することを含む。
【０１０１】
上記の段落のいずれかによる方法も提供され、ここでその化合物は、式ＩＩによる構造を有する：
【０１０２】
【化２２】
2009520826.tif 000013
式ＩＩにおいて、ｍ、ｎおよびｐは、０および１から独立に選択され、そしてｍ、ｎおよびｐの少なくとも１つは１である。
【０１０３】
別の実施態様は、上記の段落のいずれかによる方法を提供し、ここでその化合物は、式ＩＩＩによる構造を有する：
【０１０４】
【化２３】
2009520826.tif 000014
式ＩＩＩにおいて、ｎは０および１から選択される整数である。
【０１０５】
上記の段落のいずれかによる方法も提供され、ここでその化合物は、以下のものから選択される構造を有する：
【０１０６】
【化２４】
2009520826.tif 000015
【０１０７】
【化２５】
2009520826.tif 000016
本発明はまた、上記の段落のいずれかの方法を提供し、ここでその疾患状態は、カリウムチャネルによって媒介される。
【０１０８】
上記の段落のいずれかによる代表的な方法において、そのカリウムチャネルはＩＫ１である。
【０１０９】
上記の段落のいずれかによる代表的な実施態様において、上記の段落のいずれかで述べた方法を用いて治療された被験体は、鎌状赤血球症を有さない。
【０１１０】
本発明の化合物、組成物および方法はさらに、以下の実施例によって説明される。これらの実施例は説明するために提供されるが、請求される発明を制限しない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１は、本発明の化合物の合成および特徴づけに関する方法を説明する。本発明の化合物を、この実施例において詳述する方法を用いて、実質的に純粋な形式で、そして高い収率で単離した。他の合成方法が、米国特許第６，２８８，１２２号および米国特許第６，０２８，１０３号において開示される。
【０１１２】
実施例２は、本発明の化合物による、カリウムチャネルの阻害を測定するバイオアッセイを記載する。
【０１１３】
（実施例１）
この実施例は、本発明の化合物の合成および特徴づけに関する方法を説明する。本発明の化合物を、下記で詳述する方法を用いて、実質的に純粋な形式で、そして高い収率で単離した。その実施例は、明確に例示されたもの以外に、本発明の化合物を合成するために使用し得る、一般的な範囲の方法を提供する。
【０１１４】
１．１  材料および方法
他に述べなければ、試薬は受け取ったままで使用した。Ｆｒａｎｃｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎｓ  Ｔｒａｎｓ．ＩＩ、４４３（１９８８）の方法を使用して、市販されていないフルオロフェニルリチウム試薬およびフルオロベンゾフェノンを調製した。全ての湿度感受性反応は、乾燥機で乾燥させたガラス製品を用いて、窒素雰囲気下で行った。反応を、Ｈａｎｃｓｓｉａｎ染色で焦がすことによって検出して、シリカゲル６０  Ｆ２５４上のＴＬＣによってモニターした（Ｋｈａｄｅｍら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、３０：１９５８（１９６５））。Ｓｅｌｅｃｔｏシリカゲル（３２−６３ΓＭ）を用いて、カラムクロマトグラフィーを行った。融点は、Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ＩＡ９０００ユニットで決定し、補正はしていない。１Ｈ（３００ＭＨｚ）および１９Ｆ（２８２ＭＨｚ）スペクトルを、ＣＤＣｌ３中、室温で、Ｖａｒｉａｎ（Ｇｅｍｉｎｉ２０００）ＮＭＲ機で記録した。テトラメチルシランを、内部参照として用いた。化合物１のキラル分離を、ＣＨＬＩＲＡＣＥＬ１  ｔｏｒｅｑ．ＯＤ−Ｒカラムおよび溶出剤としてアセトニトリル／水を用いて、Ｃｈｉｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって行った。
【０１１５】
１．２  化合物１の調製
化合物１を、市販で入手可能な前駆体から、４つの工程で、２８％の収率で調製した。
【０１１６】
１．２ａ  （２−フルオロフェニル）−（４−フルオロフェニル）フェニルメタノールの合成
臭化フェニルマグネシウム（１．８３ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）を、室温（「ｒｔ」、約２５℃）で、ｔ−ブチルメチルエーテル（１２ｍＬ）中の２，４’−ジフルオロベンゾフェノン（１．０９ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、１滴ずつ加えた。添加が終わった後、反応を還流で３時間加熱した。溶液を室温に冷却し、そして氷冷１．０ＭのＨＣｌ（ａｑ）（２０ｍｌ）に注いだ。有機物をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出し、そして乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。減圧下で濃縮して、望ましい産物（２−フルオロフェニル）−（４−フルオロフェニル）フェニルメタノールを、淡褐色の油として得て、それをさらなる精製無しに次の反応に使用した。
【０１１７】
１．２ｂ  （２−フルオロフェニル）−（４−フルオロフェニル）フェニルアセトニトリルの合成
（２−フルオロフェニル）−（４−フルオロフェニル）フェニルメタノール（１．４７ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を、室温で、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の塩化アセチルの２０％溶液に加えた。できた溶液を１２時間攪拌し、その後溶媒を蒸発によって除去した。トルエン（２×２０ｍＬ）を残渣に加え、そして蒸発させて未精製の２−フルオロフェニル−（４−フルオロフェニル）フェニルクロロメタンを得て、それを精製無しに次の工程で使用した。
【０１１８】
シアン化銅（０．５０ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を残渣に加え、そしてできた混合物を１３０℃で２．５時間加熱した。いったん反応を約１１０℃まで冷却し、トルエン（３０ｍＬ）を加え、そして混合物を１０分間激しく攪拌した。混合物をろ過し、そして溶媒を減圧下で除去した。熱いヘキサン（３０ｍＬ）を未精製の物質に加え、そして混合物を３０分間激しく攪拌した。ろ過し、そしてさらにヘキサンで洗浄して、望ましいシアノ産物を白色固体として得、それをさらなる精製無しに使用した。
【０１１９】
１．２ｃ  （２−フルオロフェニル）−（４−フルオロフェニル）フェニルアセトアミド（１）の合成
濃硫酸（１０ｍＬ）および氷酢酸（１０ｍＬ）の溶液を、未精製の（２−フルオロフェニル）−（４−フルオロフェニル）フェニルアセトニトリル（１．４８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に室温で加えた。できた橙色の溶液を、１３０℃で３時間攪拌および加熱した。反応物を０℃に冷却し、そして水酸化アンモニウムを１滴ずつ加えることによって中和した。水を加え（３０ｍＬ）、そして有機物をクロロホルムで抽出した（３×３０ｍＬ）。有機画分をあわせて、そして水（２×１０ｍＬ）および鹹水（２０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下で濃縮した。できた淡褐色の油にヘキサン（３０ｍＬ）を加え、沈殿を開始した。沈殿物をすり砕き、そして熱いヘキサン（３０ｍＬ）で連続的に洗浄した。ヘキサン／ジクロロメタンからの結晶化によって、望ましい産物（２−フルオロフェニル）−（４−フルオロフェニル）フェニルアセトアミドを、白色結晶固体として得た（０．４５ｇ、１．４ｍｍｏｌ、２８％、４工程）。
【０１２０】
１．３  化合物３の調製
化合物３を、市販で入手可能な前駆体から、５８％の収率で、３工程で調製した。
【０１２１】
１．３ａ  ビス（４−フルオロフェニル）フェニルメタノールの合成
臭化フェニルマグネシウム（１００ｍＬ、０．１ｍｏｌ）を、室温で、ｔ−ブチルメチルエーテル（１５０ｍＬ）中の４，４’−ジフルオロベンゾフェノン（２０ｇ、０．０９２ｍｏｌ）の攪拌溶液に、１滴ずつ加えた。加え終わったあと、反応を還流で３時間加熱した。溶液を室温に冷却し、そして氷冷水性１．０Ｍ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）に注いだ。有機物を、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出し、そして乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。減圧下で濃縮して、ビス（４−フルオロフェニル）フェニルメタノールを、淡褐色の油として得た。真空中で２時間乾燥した後、未精製の物質を、さらなる精製無しに次の反応で使用した。
【０１２２】
１．３ｂ  ビス（４−フルオロフェニル）フェニルアセトニトリルの合成
ビス（４−フルオロフェニル）フェニルメタノール（０．０９２ｍｏｌ）を、室温で、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の塩化アセチルの２０％溶液に加えた。できた紫色の溶液を１２時間攪拌し、その後溶媒を蒸発によって除去した。トルエン（１００ｍＬ）を残渣に加え、そして次いで蒸発させ、未精製のビス（４−フルオロフェニル）フェニルクロロメタンを得て、それを精製無しに次の工程で使用した。
【０１２３】
シアン化銅（８．２４ｇ、０．１１ｍｏｌ）を、未精製の残渣に加え、そしてその混合物を１４０℃で３時間加熱した。反応を１００℃まで冷却し、そしてトルエン（１００ｍＬ）を加えた。できた混合物を１０分間激しく攪拌し、室温まで冷却し、シリカの短いパッドでろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して、褐色の固体を得た。熱いヘキサン（１００ｍＬ）を、粉末化した未精製の物質に加え、そして混合物を４時間激しく攪拌した。ろ過し、そしてさらなるヘキサンで洗浄して、望ましいビス（４−フルオロフェニル）フェニルアセトニトリルを、白色固体として得た（１８．９ｇ、６７％）。
【０１２４】
１．３ｃ  ビス（４−フルオロフェニル）フェニルアセトアミド（３）の合成
濃硫酸（５０ｍＬ）および氷酢酸（５０ｍＬ）の溶液を、ビス（４−フルオロフェニル）フェニルアセトニトリル（１８．９ｇ、０．０６ｍｏｌ）に室温で加えた。できた橙色の溶液を、１３０℃で３時間攪拌および加熱した。反応物を０℃に冷却し、氷水（１５０ｍＬ）に注いで、そして水酸化アンモニウムで中和した。有機物をクロロホルム（３×１００ｍＬ）で抽出し、あわせて、そして鹹水（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下で濃縮して、黄−橙色の固体を得た。その固体を熱いヘキサン（１００ｍＬ）と３０分間攪拌し、そしてろ過した。ジクロロメタン／ヘキサンから結晶化して、ビス（４−フルオロフェニル）フェニルアセトアミド（３）を、白色の結晶性固体として得た（１６．９ｇ、０．０５２ｍｏｌ、８７％）。
【０１２５】
１．４  化合物５の調製
化合物５を、市販で入手可能な前駆体から、４工程で、６６％の収率で調製した。
【０１２６】
１．４ａ  ビス（４−フルオロフェニル）−２−フルオロフェニルメタノールの合成
臭化ｐ−フルオロフェニルマグネシウム（１２４ｍＬ、０．１２ｍｏｌ）を、ｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍＬ）中の２，４’−ジフルオロベンゾフェノン（２４．５ｇ、０．１１ｍｏｌ）の攪拌溶液に、室温で１滴ずつ加えた。加え終わった後、反応物を還流で３時間加熱した。次いで溶液を室温に冷却し、そして氷冷１．０Ｍ  ＨＣｌ（ａｑ）（１００ｍＬ）に注いだ。有機物をＥｔＯＡｃ（３×７０ｍＬ）で抽出し、そして乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。減圧下で濃縮して、望ましい産物ビス（４−フルオロフェニル）−２−フルオロフェニルメタノールを、淡黄色の油として得て、それをさらなる精製無しに次の反応で使用した。
【０１２７】
１．４ｂ  ビス（４−フルオロフェニル）−２−フルオロフェニルアセトニトリルの合成
ジクロロメタン（６０ｍＬ）中２０％の塩化アセチル溶液を、未精製のビス（４−フルオロフェニル）−２−フルオロフェニルメタノールに室温で加えた。できた溶液を１２時間攪拌し、その後溶媒を蒸発によって除去した。トルエン（１００ｍＬ）を残渣に加え、そして次いで蒸発させて未精製のビス（４−フルオロフェニル）−２−フルオロフェニルクロロメタンを得て、それを精製無しに次の工程で使用した。
【０１２８】
未精製の物質にシアン化銅（１２ｇ、０．１３ｍｏｌ）を加え、そしてできた混合物を１６０℃で３時間加熱した。反応物を約１１０℃に冷却し、トルエン（１００ｍＬ）を加え、そして混合物を１０分間激しく攪拌した。混合物を冷却し、短いシリカの栓でろ過し、そして減圧下で濃縮した。熱いヘキサン（１００ｍＬ）を未精製の物質に加え、そして混合物を３０分間激しく攪拌した。ろ過し、そしてさらなるヘキサンで洗浄して、望ましいビス（４−フルオロフェニル）−２−フルオロフェニルアセトニトリルを、白色固体として得た（２５．３ｇ、７０％）。
【０１２９】
１．４ｃ  ビス（４−フルオロフェニル）−２−フルオロフェニルアセトアミド（５）の合成
濃硫酸（１０ｍＬ）および氷酢酸（１０ｍＬ）の溶液を、ビス（４−フルオロフェニル）−２−フルオロフェニルアセトニトリル（５．０ｇ、０．０１５ｍｏｌ）に室温で加えた。できた橙色の溶液を、１３０℃で２時間攪拌および加熱した。反応物を０℃に冷却し、そして氷（５０ｇ）に注いだ。できた混合物を、水酸化アンモニウムを１滴ずつ加えることによって中和した。塩化メチレン（１００ｍＬ）を加え、そして有機物をさらなる塩化メチレン（３×３０ｍＬ）で抽出した。あわせた有機画分を、水（２×１０ｍＬ）および鹹水（２０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下で濃縮して、黄色／橙色の固体を得た。その固体を粉末化し、そしてろ液が着色しなくなるまで、熱いヘキサン（５０ｍＬ）で繰り返し洗浄した。ヘキサン／ジクロロメタンから結晶化して、望ましい産物ビス（４−フルオロフェニル）−２−フルオロフェニルアセトアミド５を、白色の結晶性固体として得た（４．９８ｇ、０．０１４５ｍｏｌ、９４％）。
【０１３０】
１．５  化合物１６の調製
化合物１６を、市販で入手可能な前駆体から、４工程で、１１％の収率で調製した。
【０１３１】
１．５ａ  ビス（４−フルオロフェニル）−３−フルオロフェニルメタノールの合成
ｎ−ブチルリチウム（４ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を、−７８℃で、ＴＨＦ（２５ｍＬ）中のブロモ−３−フルオロベンゼン（１．７５ｇ、１０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に１滴ずつ加えた。２０分後、４，４’−ベンゾフェノン（１．９６ｇ、９ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を０℃まで３０分以上温めた。飽和塩化アンモニウム（ａｑ）（３０ｍＬ）を加え、そして３０分間攪拌を続けた。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を加え、有機物を分離し、鹹水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１００％ヘキサンから１００％塩化メチレンまで）によって精製して、ビス（４−フルオロフェニル）−３−フルオロフェニルメタノール（２．８１ｇ、９２％）を得た。
【０１３２】
１．５ｂ  ビス（４−フルオロフェニル）−３−フルオロフェニルアセトニトリルの合成
ビス（４−フルオロフェニル）−３−フルオロフェニルメタノール（９９９ｍｇ、３．１８ｍｍｏｌ）を、室温で、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の塩化アセチルの２０％溶液に加えた。できた紫色の溶液を１２時間攪拌し、その後溶媒を蒸発によって除去した。トルエン（２０ｍＬ）を残渣に加え、そして次いで蒸発させて、未精製のビス（４−フルオロフェニル）−３−フルオロフェニルクロロメタンを得て、それを精製無しに次の工程で使用した。
【０１３３】
シアン化銅（３４４ｍｇ、３．８２ｍｍｏｌ）を、未精製の物質に加え、そしてできた混合物を１４０℃で３時間加熱した。反応物を約１１０℃まで冷却し、トルエン（５０ｍＬ）を加え、そして混合物を１０分間激しく攪拌した。混合物を室温まで冷却し、シリカの短いパッドでろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して、ベージュ色の固体を得た。熱いヘキサン（１００ｍＬ）を粉末化した未精製の物質に加え、そして混合物を１時間激しく攪拌した。ろ過し、そしてさらなるヘキサンで洗浄して、ビス（４−フルオロフェニル）−３−フルオロフェニルアセトニトリルを、白色固体として得て、それをさらなる精製無しに使用した。
【０１３４】
１．５ｃ  ビス（４−フルオロフェニル）−３−フルオロフェニルアセトアミド（１６）の合成
濃硫酸（１０ｍＬ）および氷酢酸（１０ｍＬ）の溶液を、室温で、ビス（４−フルオロフェニル）−３−フルオロフェニルアセトニトリル（３．１８ｍｍｏｌ）に加えた。できた橙色の溶液を、１３０℃で３時間攪拌および加熱した。反応物を０℃に冷却し、氷水（５０ｍＬ）に注ぎ、そして水酸化アンモニウムで中和した。有機物をクロロホルム（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機画分をあわせ、鹹水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下で濃縮して黄色−橙色の固体を得た。その固体を熱いヘキサン（５０ｍＬ）と３０分間攪拌し、そしてろ過した。ジクロロメタン／ヘキサンから結晶化して、望ましい産物ビス（４−フルオロフェニル）−３−フルオロフェニルアセトアミド１６を、白色の結晶性固体として得た（１４７ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、１１％、４工程）。
【０１３５】
１．６  １Ｈおよび１９Ｆ  ＮＭＲ分光測定法および融点による化合物の特徴付け
本発明の化合物を、１Ｈおよび１９Ｆ  ＮＭＲ分光測定法の組み合わせによって特徴付け、そして化合物の融点を決定した。
【０１３６】
【化２６】
2009520826.tif 000017
【０１３７】
【化２７】
2009520826.tif 000018
（実施例２）
ＭＳの治療に関する研究
多発性硬化症に対するＩＫ１遮断薬の効果は、マウスにおいて試験することができる。典型的な有用なマウスは、メスＣ５７ＢＬ／６マウスである。まずマウスにおいてＥＡＥを誘発し、そして次いでＩＫ１遮断薬で治療する。ＥＡＥの誘発に関して、１５０μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドおよび３００μｇの死滅Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓをＣＦＡ中で混合し、そして１日目にマウスの側腹部に５０μｌを２回皮下注射し得る。また、２００ｎｇの百日咳毒素を、０および２日目に静脈内注射し得る。動物をイソフルランの吸入によって麻酔する。
【０１３８】
本発明のＩＫ１遮断薬を、処方中に導入し、そしてマウスへの腹腔内注射によって、１００μｌの容量で１日２回投与し得る。処方の例としては、生理食塩水および０．４％メチルセルロース中のＩＫ１遮断薬が挙げられる。ＩＫ１の投与を、ＭＯＧ３５−５５免疫（１日目）の２４時間前、０日目に開始する。次いでマウスを毎日モニターし、そして盲検方式で疾患の臨床的徴候に関して評価する。多発性硬化症の症状を決定するために、以下の基準を使用し得る：０、疾患の徴候なし；１、尾の麻痺；２、尾をひきずる、および後肢の脱力；３、後肢の麻痺；４、後肢プラス前肢の麻痺；および５、瀕死または死亡。累積臨床スコアを、免疫日から実験の終了までの毎日のスコアを加算することによって計算し得る。別々の日の平均臨床スコアおよび平均最大スコアは、個々のマウスのスコアを加算し、そしてＥＡＥの徴候を発症しなかったマウスを含む各グループのマウスの数で除算することによって計算し得る。
【０１３９】
マウスの免疫組織化学的分析に関して、以下の抗体を使用し得る：抗ＣＤ４、抗ＣＤ１５２、抗ＩＣＯＳ、抗マウスＩＦＮγ、および抗マウスＴＮＦα。ビオチン化ウサギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）およびビオチン化抗ハムスターＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）も使用し得る。
【０１４０】
実験の終了時に、心臓の左心室を通じてマウスを灌流する。次いで脳および脊髄を解剖し得、ついで脊髄部分をＯＣＴ媒体に埋め込んで、そして凍結し得る。次いでＨ＆Ｅ染色を行って、脊髄の細胞浸潤を調査し得る。脊髄の損傷部位における様々な細胞型を決定するために、ペルオキシダーゼに基づく免疫組織化学的染色も行い得る。これを達成するために、脊髄切片を、マウスＣＤ４およびＩＣＯＳに対する一次抗体、またはアイソタイプコントロールｍＡｂの１つと、続いてビオチン結合二次抗体およびストレプトアビジン−ＨＲＰとインキュベートし得る。サイトカイン検出に関して、標本を、マウスＩＦＮ−γまたはマウスＴＮＦ−αに特異的な一次抗体で染色し得る。最後に、ＤＡＢを使用して、陽性に染色された細胞において褐色を発生させ得、そして組織をヘマトキシリンで対比染色し得る。
【０１４１】
次いで、抗原特異的Ｔ細胞増殖アッセイを、以下の過程によって行い得る。終了時にマウスから単離した脾臓細胞を、生理食塩水で洗浄し得、続いてＭＯＧペプチドを加えた物質と培養する。非特異的刺激コントロールのために、細胞をＣｏｎＡとインキュベートし得る。細胞を９６穴マイクロタイタープレートで、１ｍｌあたり１×１０６細胞の密度で培養する。インキュベーション後、細胞を、ウェルあたり１μＣｉの３［Ｈ］チミジンで２４時間パルスラベルし、次いで回収および計測し得る。
【０１４２】
ＲＮＡを、各マウスの脊髄組織から、ＴＲＩ試薬を用いて単離し得る。ＲＮＡの完全性および濃度を、ＲＮＡ６０００Ｎａｎｏ  ＬａｐＣｈｉｐキットによって決定し得る。次いでＲＴ−ＰＣＲキットを用いて、逆転写を行い、ＲＮＡのｃＤＮＡコピーを産生し得る。逆転写を、ＲＴ−ＰＣＲキットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ第１鎖合成システムを用いて以下のように行い得る。全ＲＮＡを、１２μｌの全容量で、０．５μｇのオリゴ（ｄＴ）および５０ｎｇのランダムヘキサマーと、７０℃で１０分間アニーリングし、そして氷上で冷却し得る。次いで２．５×ＲＴ緩衝液、６．２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２５ｍＭのＤＴＴおよび２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を含む８μｌのカクテルを加え得る。その混合物を、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、および７０℃で１５分間インキュベートし、そして氷上で冷却し得る。その試料を、２ＵのＲＮＡ分解酵素Ｈで、３７℃で２０分間処理し得る。
【０１４３】
次いでマウスにおけるｍＲＮＡレベルを計算するために必要な量でｃＤＮＡを得るために、リアルタイムＰＣＲをｃＤＮＡに対して行い得る。リアルタイムＰＣＲを、ＧｅｎｅＡｍｐ、５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを利用して、下記で記載するように行い得る。オリゴヌクレオチドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し得る。ＰＣＲ反応は、３０μｌの全容量中、２５ｎｇのｃＤＮＡ、４００ｎＭの各標的プライマー、および１×最終濃度のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘから成る。以下の増幅パラメーターを使用し得る：５０℃で２分間、続いて９５℃で１０分間、および９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクル。反応を６０℃でさらに２０分間進め、プライマーの特異性および潜在的なプライマーダイマーを決定する。サンプルを２組で実施し得る。次いで比較サイクル閾値（ＣＴ）法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ’  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．２）の修正を用いることによって、２（−Δ℃ｔ）×１００００の式によって、ｍＲＮＡレベルを計算する。その値を次いで、対応するユビキチンハウスキーピング遺伝子のレベルに対して標準化する。次いで結果を、ＩＫ１遮断薬で治療した、および治療していない、ＥＡＥを有するマウスに関して示す。
【０１４４】
２番目のグループの治療動物もまた、血液採取のために使用して、血漿中のＩＫ１遮断薬の濃度を決定し得る。最後の治療後１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、および２４時間に、麻酔後、後眼窩洞穿刺によって血液を採取した。次いで血液をヘパリン処理したチューブに採取し、そして氷上で維持した。遠心によって血漿を得て、そして分析まで−８０℃で保存し得る。血漿中のＩＫ１遮断薬濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて決定する。実験で有用な質量分析機の例は、Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｍｉｃｒｏ三連四重極である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳへのサンプルの導入を、四方向Ｈａｒｎｅｙバルブおよびランダムサンプリング能力を有するＣＴＣ  ＨＴＳ−ＰＡＬオートサンプラーを用いて行い得る。ＨＰＬＣシステムはまた、２つのＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０ＡＤｖｐポンプおよびＬｕｎａ  Ｃ１８（２）２．０×５０．０ｍｍ、５μＭカラムを含み得る。
【０１４５】
０．２５ｍｌ／分の流速で、溶媒混合物Ａ（ＳＭＡ）およびＢ（ＳＭＢ）を用いた勾配溶出を採用し得る。ＳＭＡは９５％水性メタノール中０．１％のギ酸であり、そしてＳＭＢは５％水性メタノール中０．１％のギ酸である。勾配条件は、注入後最初の１．５分間、１００％Ａ；１．５から２．５分、７０％Ａ；２．５から３．５分、５０％Ａ；３．５から４．５分、０％Ａおよび４．５分で最初の条件（１００％ＳＭＡ）にスイッチバックする。血漿サンプルを、２容量のアセトニトリルで処理し、ボルテックスし、そして遠心してタンパク質を沈殿させる。上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入し得る。陽イオンモードで、複数反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）（ＭＲＭ）を用いて、分析を行い得る。モニターする転移は、ｍ／ｚ３４５から２７７である。ＩＫ１遮断薬の血漿濃度を、投与していないマウスの血漿において調製した５点検量線で計算する。
【０１４６】
マウスにおける多発性硬化症の進行に対するこれらＩＫ１遮断薬のインビボ効果をまた、Ｅｌｌｏｓｏら、米国特許公開第２００４／０１６７１１２（公開日：２００４年８月２６日）（“Ｅｌｌｏｓｏ”）の実施例１において記載されたモデルを用いることによって試験し得る。サイトカイン産生の阻害に対するこれらＩＫ１遮断薬のインビトロ効果を、Ｅｌｌｏｓｏの実施例２において記載されたモデルを用いることによって試験し得る。
【０１４７】
本明細書中で記載された実施例および実施態様は、説明目的のためのみであり、そしてそれを考えて様々な修飾または変更が当業者に示唆され、そして本申請の意図および範囲内に含まれると考えられ、そして添付の請求の範囲内であると考えられることが理解される。本明細書中で引用された全ての出版物、特許、および特許申請は、これによって、全ての目的のために、その全体として参考文献に組み込まれる。
【国際調査報告】
2009520826.tif 000029