(57)【要約】  本発明は、新規の核酸及びタンパク質分子、並びに癌の治療及び診断におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌治療用組成物の調製のための、配列番号１若しくは２又は配列番号１若しくは２の変異体の核酸断片の使用であって、前記核酸断片は、配列番号３又は４のＤＣＬ−タンパク質の量を有意に減少させることができる使用。
【請求項２】
癌が神経外肺葉起源である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、グリア芽腫、希突起膠腫、希突起星細胞腫、星状細胞腫、神経線維腫、上衣腫、ＭＰＮＳＴ（悪性末梢神経鞘腫）、神経節細胞腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、網膜芽腫、小細胞肺癌、副腎髄質褐色細胞腫、未分化ＰＮＥＴ（末梢性神経外肺葉性腫瘍）、ユーイング肉腫及び黒色腫の治療のための、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
核酸断片が、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は二本鎖低分子干渉ＲＮＡから選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
配列番号１若しくは２又は配列番号１若しくは２の変異体のセンス及び／又はアンチセンス核酸断片であって、前記核酸断片が、神経外肺葉起源の癌細胞に導入した場合に、配列番号３又は４のＤＣＬタンパク質の量を有意に減少させることができることを特徴とするセンス及び／又はアンチセンス核酸断片。
【請求項６】
１種又は複数の請求項４に記載の核酸断片と、生理学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項７】
１種又は複数の標的化合物をさらに含み、前記標的化合物がインビボ又はインビトロで神経外肺葉起源の癌細胞を標的にすることができる、請求項１〜６いずれかに記載の組成物。
【請求項８】
標的化合物が、免疫リポソーム又はモノクロナール抗体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
神経外肺葉起源の癌の治療に適している、請求項６〜８に記載の組成物。
【請求項１０】
配列番号３のマウスダブルコルチン様タンパク質及び配列番号４のヒトダブルコルチン様タンパク質。
【請求項１１】
ａ）対象の血清試料又は生検試料を、配列番号２のＲＮＡ又はＤＮＡの有無、及び／又は配列番号４のＤＣＬタンパク質の有無に関して分析するステップと、ｂ）試料中に存在する配列番号２及び／又は配列番号４の量を定量化してもよいステップとを含む、神経外肺葉起源の癌を診断する方法。
【請求項１２】
試料中の配列番号２及び／又は配列番号４の存在を検出できる、プライマー、プローブ及び／又は抗体、必要な追加の検出試薬、並びに使用説明書を含む、診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なダブルコルチン様（ＤＣＬ，doublecortin like）タンパク質及び該タンパク質をコードする新規なｍＲＮＡスプライシング変異体に関する。新規なＤＣＬタンパク質をコードするマウス及びヒトの核酸配列（ＲＮＡ及びＤＮＡ）、並びにマウス及びヒトのタンパク質それ自体、並びに治療及び診断用途に適切な様々な核酸の断片及び変異体を提供する。本発明はさらに、癌治療、特に神経芽細胞腫治療におけるＤＣＬタンパク質レベルの調節方法、診断方法及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
小児における最も一般的な固形腫瘍として、神経芽細胞腫が全ての小児の癌の８〜１０％を占める（Lee et al., 2003, Urol. Clin. N. Am. 30, 881-890再検討されたれたし）。年間発生率は、カナダ、ドイツ及び日本において実施したスクリーニングに基づく数によれば、小児１０００００人に１０〜１５人程度である。神経芽細胞腫は異質な疾患であり、４０％が予後の非常に順調な１歳未満の小児、残りは先進的な医療及び外科処置にもかかわらず予後の不良な、１歳より年長の小児及び若年層に診断される。中程度からハイリスクな患者に共通な治療は、化学療法及びその後の外科的切除である。しかし、神経芽細胞腫細胞の完全な根絶は殆ど達成されない。したがって、これらの患者の多くは再発を起こし、再発した多くの場合に従来の治療に耐性があり、急速に重篤になる。したがって、一次治療によって一見回復した後に、少数の生存細胞を完全に根絶し、再発を防ぐための新規な治療戦略が必要である（Lee et al., 2003, 上記）。
【０００３】
脳の発達には、神経芽細胞の細胞分裂、移動及び分化の組織的で正確なパターンが必要である（Noctor et al., 2001, Nature 409, 714-720; Noctor et al., 2004, Nat. Neuroscience 7, 136-144）。これらの過程の両方においてカギとなる事象は、微小管と微小管結合タンパク質（ＭＡＰ, microtubule-associated proteins）とを含む細胞骨格の（再）構成及び（不）安定化である。神経細胞の移動が可能になる前に、微小管といくつかのＭＡＰとの、慎重に組織化された相互作用が必要である（Feng and Walsh, 2001, Nat. Rev. Neurosci. 2, 408-416において再検討された）。しかし、神経細胞の移動に関与する因子は十分確立されているが、有糸分裂及び神経芽細胞増殖などの、早期過程を調節する遺伝子については比較的知られていない。このような因子は、微小管及び細胞骨格の要素の動的制御にもまた深く関与すると思われる（Haydar et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 2890-2895; Kaltschmidt et al., 2000, Nat. Cell Biol. 2, 7-12; Knoblich, 2001, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 11-20）。
【０００４】
近年、細胞骨格の再構成に関与するいくつかの遺伝子が特定され、該遺伝子は、分裂又は変異した場合に神経細胞の移動の障害を起こす（Feng and Walsh, 2001, 上記において再検討された）。これらの遺伝子の１つはダブルコルチン（ＤＣＸ，doublecortin）であり、ダブルコルチンは新生皮質神経細胞の移動に重要な３６５ＡＡタンパク質をコードする（国際公開番号ＷＯ９９／２７０８９号を参照されたし）。ヒト及びげっ歯類のゲノムにおいて、ダブルコルチン様キナーゼ（ＤＣＬＫ，doublecortin-like kinase）と呼ばれる、ＤＣＸ遺伝子との実質的配列同一性を有する関連遺伝子が存在する。ヒトのＤＣＬＫ遺伝子は、２５０ｋｂより多く、広範囲に及ぶ選択的スプライシングに供され、異なるタンパク質をコードする多数の転写産物を産生する（Matsumoto et al., 1999, Genomics 56, 179-183）。主要な転写産物の１つであるＤＣＬＸ−ロングは、Ｃａ＋＋/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ＣａＭＫ，Ｃａ＋＋/Calmodulin dependent protein kinase）ファミリーのメンバーとのアミノ酸相同性を有するキナーゼ様ドメインに融合された、ＤＣＸドメインをコードする。別の転写産物であるＤＣＬＫ−ショートは、主に成人の脳で発現し、ＤＣＸドメインを欠いており、ＣａＭＫ様特性を有するキナーゼをコードする（Engels et al., 1999, Brain Res. 835, 365-368; Engels et al., 2004, Brain Res. 120, 103-114; Omori et al., 1998, J. Hum. Genet. 43, 169-177; Vreugdenhil et al., 2001, Brain Res. Mol. Brain Res. 94, 67-74）。最近の研究では、カルシウム依存性の神経可塑性及び神経変性においてＤＣＬＫ遺伝子が果たす重要な役割が提唱された（Burgess and Reiner, 2001, J. Biol. Chem. 276, 36397-36403; Kruidering et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 38417-38425）。ＤＣＬＫ−ロングは早期発達において発現し（Omori et al, 1998, 上記）、DCXのように微小管を重合できる（Lin et al., 2000, J. Neurosci. 20, 9152-9161）。しかし、神経系の発達におけるＤＣＬＫ遺伝子の正確な役割は未知である。
【０００５】
様々な代替のＤＣＬＫのスプライシング変異体が記載され、これらのうちの２種は異なった形で発現し、異なるキナーゼ活性を有することが発見されている（Burgess and Reiner 2002, J Biol. Chem. 277, 17696-17705）。本発明者らは本明細書中で、ダブルコルチン様（ＤＣＬ）と称するＤＣＬＫの遺伝子の新規なスプライシング変異体をクローン化し、機能的に特徴付け、ＤＣＬが、神経芽細胞分裂の紡錘体に関与する細胞骨格遺伝子であることを示した。さらに、本発明者らは癌の治療及び診断、特に神経芽細胞腫の治療及び診断の新規な方法を発明した。
【０００６】
近年、神経芽細胞腫の治療に関する、２種の異なる癌遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を含む新規な研究が公表されている（Pagnan et al., 2000, J. Natl. Cancer Inst. Vol 92, 253-261; Brignole et al. 2003, Cancer Lett. 197, 231-235; Burkhart et al., 2003, J. Natl. Cancer Inst. 95, 1394-1403）。第一の研究は、ｃ−Ｍｙｂ癌遺伝子を対象とした（Pagnan et al., 2000, 上記）。ｃ−Ｍｙｂ遺伝子の発現は、細胞の増殖及び分化と関連があるいくつかの異なる胚起源の固形腫瘍（神経芽細胞腫を含む）において報告されている。ヒトｃ−Ｍｙｂ  ｍＲＮＡのコドン２〜９に相補的な、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドが、インビトロで神経芽細胞腫細胞の成長を阻害したことが示された。神経外肺葉抗原のジシアロガングリオシドＧＤ２に特異的なモノクロナール抗体（ｍＡｂ，monoclonal antibody）により被覆された、立体的に安定化されたリポソーム内の細胞に送達された場合に、その阻害効果は最大であった（Pagnan et al., 2000, 上記）。しかし、抗ＧＤ２標的リポソームの静脈注射後の薬物動態学的研究及び生体内分布研究が実施されたが（Brignole et al., 2003, 上記）、今のところインビボ神経芽細胞腫モデルにおける効果は示されていない。ｃ−Ｍｙｂタンパク質は正常細胞の増殖において基本的な役割を果たし、ｃ−Ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチドが、インビトロでヒトの正常な血液生成を阻害することがすでに示されている（Gewirtz and Calabretta, 1988, Science 242, 1303-1306）ので、ｃ−Ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチドの中毒性副作用の可能性もまた考慮しなければならない。
【０００７】
別のアンチセンス研究は、ＭＹＣＮ（Ｎ−ｍｙｃ）癌遺伝子を対象としていた（Burkhart et al., 2003, 上記）。ＭＹＣＮ遺伝子の増幅は神経芽細胞腫のわずか２５〜３０％において起こるが、疾患の進行期に随伴するもので、腫瘍の進行は早く、生存率は１５％未満である。ヒトＭＹＣＮ  ｍＲＮＡの最初の5個のコドンに相補的なホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの効果が、神経芽細胞腫のネズミモデルにおいてインビボで試験された。皮下に埋め込んだ微小浸透圧ポンプを介して、６週間オリゴヌクレオチドを連続的に送達することにより、埋め込みポンプの部位における腫瘍の発生及び腫瘍の質量を減少させられることが示された（Burkhart et al., 2003, 上記）。この研究は非常に局所的であるが、全身送達の後の正常細胞に対する中毒性副作用の可能性に加えて、離れた臓器部位への転移に関するオリゴヌクレオチドの全身効果が、確立されるべきままである。また、すでに確立された腫瘍についてのオリゴヌクレオチドの効果も示されていない。
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ９９／２７０８９号
【非特許文献１】Lee et al., 2003, Urol. Clin. N. Am. 30, 881-890
【非特許文献２】Noctor et al., 2001, Nature 409, 714-720;
【非特許文献３】Noctor et al., 2004, Nat. Neuroscience 7, 136-144
【非特許文献４】Feng and Walsh, 2001, Nat. Rev. Neurosci. 2, 408-416
【非特許文献５】Haydar et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 2890-2895
【非特許文献６】Kaltschmidt et al., 2000, Nat. Cell Biol. 2, 7-12
【非特許文献７】Knoblich, 2001, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 11-20
【非特許文献８】Matsumoto et al., 1999, Genomics 56, 179-183
【非特許文献９】Engels et al., 1999, Brain Res. 835, 365-368
【非特許文献１０】Engels et al., 2004, Brain Res. 120, 103-114
【非特許文献１１】Omori et al., 1998, J. Hum. Genet. 43, 169-177
【非特許文献１２】Vreugdenhil et al., 2001, Brain Res. Mol. Brain Res. 94, 67-74
【非特許文献１３】Burgess and Reiner, 2001, J. Biol. Chem. 276, 36397-36403
【非特許文献１４】Kruidering et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 38417-38425
【非特許文献１５】Lin et al., 2000, J. Neurosci. 20, 9152-9161
【非特許文献１６】Burgess and Reiner 2002, J Biol. Chem. 277, 17696-17705
【非特許文献１７】Pagnan et al., 2000, J. Natl. Cancer Inst. Vol 92, 253-261
【非特許文献１８】Brignole et al. 2003, Cancer Lett. 197, 231-235
【非特許文献１９】Burkhart et al., 2003, J. Natl. Cancer Inst. 95, 1394-1403
【非特許文献２０】Gewirtz and Calabretta, 1988, Science 242, 1303-1306
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
標的遺伝子の選択は、有効な神経芽細胞腫の治療及び診断の開発にとって重要である。上記のように、本発明者らは新規なＤＣＬタンパク質をコードするＤＣＬＫ遺伝子の新規なｍＲＮＡスプライシング変異体をクローン化し、このスプライシング変異体を機能的に特徴付けた。驚いたことに、このスプライシング変異体は神経芽細胞腫において排他的に発現し、健康な組織及び検査した細胞系では検出されなかったことが発見された。この発見を新規な治療法及び診断法の発明に使用した。
【０００９】
定義
本明細書中で「遺伝子サイレンシング」は、細胞内での標的タンパク質産生の減少（下方制御）又は完全な停止を指す。遺伝子サイレンシングは標的遺伝子の転写及び／又は翻訳の減少の結果と思われる。「標的遺伝子」は、サイレンシングされる遺伝子である。標的遺伝子は普通内在性遺伝子であるが、ある特定の状況では導入遺伝子であってもよい。方法は、遺伝子ファミリーの全て又はいくつかのメンバーのサイレンシングに使用できるので、「標的遺伝子」という用語はサイレンシングされる遺伝子ファミリーもまた指すことができる。
【００１０】
「遺伝子」という用語は、転写制御配列、エンハンサー、５’リーダー配列、コード領域及び３’非翻訳配列などの、転写に必要な様々な配列要素に、動作可能に連結されたｍＲＮＡ分子に転写される核酸配列（「転写領域」）を指す。内在性遺伝子は、細胞内に天然に見出される遺伝子である。
【００１１】
「センス」は、二本鎖ＤＮＡ分子又はｍＲＮＡ転写分子のコード鎖などの核酸分子のコード鎖を指す。「アンチセンス」は、センス鎖の逆相補鎖を指す。アンチセンス分子はアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ（即ちアンチセンスＤＮＡと同一核酸配列を有し、違いはＴ（チミン）がＵ（ウラシル）で置換されたことである）であってもよい。
【００１２】
「含む（comprising）」という用語は、提示した部分、ステップ又は要素の存在を明記するが、１種又は複数の追加の部分、ステップ又は要素の存在を排除するものではないと解釈するべきである。したがって、領域Ｘを含む核酸配列は、追加の領域を含み得る、即ち領域Ｘはより大きな核酸領域に組み込まれていてもよい。
【００１３】
「実質的に同一(substantially identical)」、「実質的同一性(substantial identity)」或いは「本質的に類似(essentially similar)」又は「本質的類似性(essential similarity)」という用語は、最適なアラインメントを行った場合、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列が、デフォルトパラメータを使用するＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴのプログラムなどにより、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５又は９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％の配列同一性又はそれを超える（例えば９９％の配列同一性）を共有することを意味する。ＧＡＰはNeedlemanとWunschのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用し、２つの配列を、その全長にわたってアラインメントし、マッチする数を最大化し、ギャップの数を最小化する。通常、ギャップ挿入ペナルティ（gap creation penalty ）＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty ）＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）で、GAPデフォルトパラメータを使用する。ヌクレオチドに関して使用したデフォルトスコア行列はｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質に関しては、デフォルトスコア行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Science 89, 915-919）。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と本質的に類似である、又はある程度の配列同一性を有すると言われる場合、ＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）がＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に相当すると考えられることは明らかである。「同一な」配列は、アラインメントを行った場合、核酸配列又はアミノ酸配列が１００％の同一性を有する。またこの場合、ＲＮＡ配列とＤＮＡ配列との違いが、ＲＮＡ配列が同じ位置のＴの代わりにＵを含んでいることだけであるならば、ＲＮＡ配列はＤＮＡ配列と１００％同一である。配列アラインメント及び配列同一性の割合のスコアは、Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA社製ＧＣＧ Wisconsin Package, Version 10.3などのコンピュータプログラムを使用して決定できる。或いは、類似性又は同一性のパーセントは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースを検索することによって決定できる。
【００１４】
本明細書中で「配列」又は「配列断片」を指す場合、ヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はアミノ酸のある配列を有する分子を指すと理解される。
【００１５】
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を特定するためにもまた使用できる。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、状況が異なると違ってくる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおいて特定の配列に関する融点温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度及びｐＨの下で）標的配列の５０％がハイブリッドを形成し、プローブと完全にマッチする温度である。通常は、ストリンジェントな条件は塩濃度がｐＨ７において約０．０２モル、温度は少なくとも６０℃に選択される。塩濃度の低下及び／又は温度の増加によりストリンジェントが増す。ＲＮＡ−ＤＮＡのハイブリッド形成に関するストリンジェントな条件（例えば、１００ｎｔのプローブを使用したノーザンブロット）は、例えば６３℃において２０分間、０．２×ＳＳＣで少なくとも１回洗浄することを含む条件、又は同等の条件である。ＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリッド形成に関するストリンジェントな条件（例えば、１００ｎｔのプローブを使用したサザンブロット）は、例えば少なくとも５０℃、通常約５５℃の温度において２０分間、０．２×ＳＳＣで少なくとも１回（通常は２回）洗浄することを含む条件、又は同等の条件である。
【００１６】
「対象」は、本明細書中では哺乳動物対象、特にヒト又は動物の対象を指す。
【００１７】
「標的細胞」は、本明細書中ではＤＣＬタンパク質レベルが修正される（特に減少される）細胞を指し、ＤＣＬタンパク質が正常に産生される任意の癌細胞、具体的には神経外肺葉起源の癌細胞、特に神経芽細胞腫細胞を含む。標的細胞におけるＤＣＬの存在は、本明細書の他の場所に記載したように決定できる。以下では神経芽細胞腫のみの治療及び診断を指しているが、神経芽細胞腫細胞に対して述べたいずれの事柄も、他の型の癌標的細胞、具体的には神経外肺葉起源の癌標的細胞に同じように適用でき、このような方法、使用及びキットは本明細書に包含されると理解される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、神経芽細胞腫の治療及び診断方法に使用するための新規な核酸及びタンパク質配列を提供する。ＤＣＬタンパク質は、今までのところ検査した全ての神経芽細胞腫細胞系（ヒト及びマウスの細胞系）において細胞特異的に発現することが発見された。ＤＣＬは、微小管を重合し安定化することが見出され、内因性ＤＣＬと分裂神経芽細胞腫細胞における紡錘体との共局在により、分裂細胞における紡錘体の正しい形成に関するＤＣＬの役割が示唆される。神経芽細胞腫細胞系におけるＤＣＬ遺伝子サイレンシングは、紡錘体の劇的な変形又はさらには不在、及び微小管の分解をもたらす。
【００１９】
神経芽細胞腫細胞は、神経外肺葉起源である。脊椎動物において、胚神経管（神経外肺葉）の多能性幹細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ，central nervous system）及び末梢神経系（ＰＮＳ，peripheral nervous system）の主要な細胞型を生み出す。このような細胞型は、神経外肺葉由来の細胞又は言い換えると神経外肺葉起源として規定される。神経外肺葉起源の腫瘍は、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、グリア芽腫、希突起膠腫、希突起星細胞腫、星状細胞腫、神経線維腫、上衣腫、ＭＰＮＳＴ（悪性末梢神経鞘腫，malignant peripheral nerve sheath tumors）、神経節細胞腫又は神経鞘腫などのＣＮＳ及びＰＮＳの全ての腫瘍を含む。さらに神経外肺葉起源の腫瘍は、横紋筋肉腫、網膜芽腫、小細胞肺癌、副腎髄質褐色細胞腫、未分化ＰＮＥＴ（末梢性神経外肺葉性腫瘍，peripheral neuroectodermal tumor）、ユーイング肉腫及び黒色腫である。これらの腫瘍は全て神経芽細胞腫細胞に共通の胚起源を共有するので、これらの場合にＤＣＬが治療及び診断の標的となるであろう。
【００２０】
本発明による核酸配列及びアミノ酸配列
本発明は、配列番号１（マウスｄｃｌ  ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ）及び配列番号２（ヒトｄｃｌ  ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ）の新規な核酸配列を提供し、これらは配列番号３（マウスＤＣＬ）及び配列番号４（ヒトＤＣＬ）のタンパク質をコードする。配列番号１及び２のｄｃｌ  ｍＲＮＡ配列は、マウス及びヒトのＤＣＬＫ遺伝子の新規なスプライシング変異体である。該スプライシング変異体は、エクソン１〜エクソン８（部分的には終止コドンまで）を含み、エクソン１は非コードである。両方の配列において、ＤＣＬＫ遺伝子のエクソン６は欠損している。マウスのｍＲＮＡ配列において、翻訳開始コドンがヌクレオチド１８９〜１９１に見出され、一方翻訳終止コドンはヌクレオチド１２７５〜１２７７に見出される。エクソン２はｎｔ１６９から始まり、エクソン３はｎｔ５６５から始まり、エクソン４はｎｔ９１２から始まり、エクソン５はｎｔ１０１２から始まり、エクソン７はｎｔ１１２９から始まり、エクソン８はｎｔ１２２４から始まる。ヒトｍＲＮＡ配列において、翻訳開始コドンはヌクレオチド２１３〜２１５に見出され、一方翻訳終止コドンはヌクレオチド１３０２〜１３０４に見出される。エクソン２はｎｔ１９４から始まり、エクソン３はｎｔ５８９から始まり、エクソン４はｎｔ９３６から始まり、エクソン５はｎｔ１０３６から始まり、エクソン７はｎｔ１１５３から始まり、エクソン８はｎｔ１２４８から始まる。マウス及びヒトのＤＣＬタンパク質は、アミノ酸配列が非常に類似しており、両方とも約４０ｋＤａの分子量を有する。マウスのＤＣＬタンパク質は３６２個のアミノ酸を含み、一方ヒトのＤＣＬタンパク質は３６３個のアミノ酸を含む。アミノ酸配列の同一性は約９８％であり、４個のアミノ酸だけが異なる。これらはアミノ酸１７２位（マウスの配列ではＧであり、ヒトの配列ではＳである）、２９０位（マウスの配列ではＡであるのに対してヒトの配列ではＳである）、２９４位（マウスの配列ではＧであるのに対してヒトの配列ではＳである）及びヒトの配列の３５９位のＶがマウスの配列では欠損している。ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡレベルにおいても配列は高度に類似しているため（コード領域では約９０％）、どちらの核酸配列（配列番号１又は２）又はこれらの断片若しくは変異体も、標的細胞、特にヒトの神経外肺葉起源の癌細胞の遺伝子サイレンシング研究に使用できる。配列表はＤＮＡ配列を表しているが、本明細書中でＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子について言及している場合、ＲＮＡ分子は、Ｔ（チミン）がＵ（ウラシル）に置き換わった点が異なるが、ＤＮＡ配列と同一であると解釈される。
【００２１】
ｄｃｌの完全核酸配列（配列番号１及び２）とは別に、標的遺伝子としてｄｃｌを有する、遺伝子サイレンシング法への使用に適切な配列番号１及び２のセンス及び／又はアンチセンス断片を提供する。したがって、以下に記載の遺伝子サイレンシング法のいずれか１つに使用する場合、断片は機能的でなければならず、具体的には神経外肺葉起源の癌細胞に存在する場合、配列番号３又は４のＤＣＬタンパク質の産生を有意に減少させる。「配列番号３及び４の産生を有意に減少させる」とは、配列番号１及び／又は２のセンス及び／又はアンチセンス断片を導入していない神経外肺葉起源の癌細胞において見出されるＤＣＬタンパク質レベルと比較して、配列番号１及び／又は２のセンス及び／又はアンチセンス断片を含む、神経外肺葉起源の癌細胞において少なくとも５０％、６０％、７０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％又は１００％のＤＣＬタンパク質を減少させることを指す。さらに、配列番号１及び／又は２のセンス及び／又はアンチセンス断片の導入により、細胞でのＤＣＬタンパク質の産生が有意に減少又は停止することによって、表現型の変化が細胞に起こる。具体的には、微小管の分解及び紡錘体の変形が起き、神経外肺葉起源の癌細胞、例えば神経芽細胞腫細胞の増殖が有意に減少する。「神経外肺葉起源の癌細胞の増殖、例えば神経芽細胞腫細胞の増殖の有意な減少」とは、例えば配列番号１及び／又は２のセンス及び／又はアンチセンス断片を含む神経芽細胞腫細胞の成長（細胞分裂）の減少又は完全な阻害を指す。当業者は、本明細書に記載の方法を使用して、配列番号１及び／又は２のセンス及び／又はアンチセンス断片が所望の効果を起こす能力を有するかどうかを容易に検査できる。このことを検査する最も容易な方法は、センス及び／又はアンチセンス断片を例えばインビトロで培養した神経芽細胞腫細胞系に導入し、対照細胞と比較して、それらの細胞におけるｄｃｌ  ｍＲＮＡ及び／又はＤＣＬタンパク質のレベル及び／又は表現型の変化及び／又は神経芽細胞腫細胞の増殖を分析することである。インビトロ効果は、センス及び／又はアンチセンス断片を、例えば神経芽細胞腫の治療用組成物の製造に使用することの適切性を反映する。
【００２２】
原則として、配列番号１及び／又は２の（センス及び／又はアンチセンス）断片は、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２５、３０、５０、１００、２００、５００、１０００又はそれを上回る、配列番号１又は２の連続したヌクレオチドを含む、配列番号１若しくは２の任意の部分、又はその相補体若しくはその逆相補体であってよい。センス及び／又はアンチセンス断片は、ＲＮＡ断片又はＤＮＡ断片であってよい。さらに、断片は一本鎖又は二本鎖（二重鎖）であってよい。核酸断片はまた、配列番号１又は２の非コード領域（例えば配列番号１のヌクレオチド１〜１８８又は配列番号２のヌクレオチド１〜２１２の領域）部分、又はコード領域（配列番号のヌクレオチド１８９〜１２７４又は配列番号２のヌクレオチド２１３〜１３０１）部分、又は１部分は非コードであり１部分はコードである領域（イントロン−エクソンの境界又はエクソン１など）と１００％同一であってもよい。核酸断片は、例えばApplied Biosystems Inc.（Fosters, CA, USA）社製のオリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して、化学合成により新たに作製してもよく、又はSambrook et al.（1989）及びSambrook and Russell（2001）に記載のように標準的な分子生物学的方法を使用してクローン化してもよい。本発明による核酸断片は、ＰＣＲのプライマーとして、核酸のハイブリッド形成用プローブとして、標的細胞に送達されるべきＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴヌクレオチドとして、或いは標的細胞に送達されるべき又は標的細胞で発現されるべきｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ，small interfering RNAs）としてなどの様々な目的に使用できる。異なる遺伝子サイレンシング方法は、異なるセンス及び／又はアンチセンス核酸断片を使用するので、これらは、本発明の範囲を限定するものではないが、以下に詳細に記載する。
【００２３】
さらに、上記の配列番号１及び２の変異体、それらの相補体又は逆相補体を提供する。「変異体」は、核酸配列が配列番号１又は２（又はそれらの相補体若しくは逆相補体）と１００％同一ではないが、それらの核酸配列は「本質的に類似」である。「配列番号１又は２の変異体」は、遺伝コードの縮重により、さらに配列番号３若しくは４のアミノ酸をコードする核酸配列又はこれらの断片を含む。配列番号１又は２の変異体は、それらの相補体、逆相補体は、１個又は複数個のヌクレオチドの置換（substitution）、欠失及び／又は置き換え（replacement）を介して、配列番号１又は２とは異なる配列番号１又は２もまた包含する。配列番号１及び２の変異体はさらに、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid，ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid，ロックされた核酸）などのヌクレオチドの模倣体を含む又はからなる配列、又はモルホリノ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ若しくは２’−Ｏ−アリルＲＮＡを含む配列を含む。
【００２４】
変異体核酸配列は、例えば化学合成により新たに作製しても、突然変異生成又は遺伝子シャッフリング法によって発生させても、或いは、例えばＰＣＲ技術又は核酸のハイブリッド形成を使用して天然供給源から単離してもよい。配列番号１又は２の変異体は、さらに配列番号１又は２に「本質的に類似」（上に規定）している核酸配列、それらの相補体又は逆相補体として規定できる。特に、配列の全長にわたって配列番号１又は２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の配列同一性を有する変異体は、本発明に包含される。本発明の一実施形態において、配列番号１又は２と本質的に類似な核酸配列のセンス及び／又はアンチセンス断片を提供する。配列番号１又は２の断片に関して記載したように、神経外肺葉起源の癌細胞、例えば神経芽細胞腫細胞に、適切な量で導入した場合、配列番号１又は２の変異体の断片はＤＣＬタンパク質の細胞レベルを有意に減少させる能力を有する。したがって、これらの変異体断片は、記載したセンス及び／又はアンチセンス断片と機能的に同等でなければならず、当業者はこのような断片の機能性を記載と同じ方法で検査できる。
【００２５】
配列番号３及び配列番号４の単離タンパク質並びにそれらの断片及び変異体をさらに提供する。本発明によるＤＣＬタンパク質（或いはそれらの断片又は変異体）は、例えばモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体などの抗体を産生するために使用でき、該抗体はその時様々なＤＣＬ検出方法、診断若しくは治療方法又はキットに使用できる。或いは、免疫応答を誘発するエピトープをタンパク質内に特定できる。ＤＣＬタンパク質、それらの断片又は変異体は、合成的に作製でき、天然の供給源から精製でき、組み換えの細胞又は細胞培養物内に発現できる。ＤＣＬタンパク質断片は、２０、５０、１００又は２００以上の連続したアミノ酸を含む、配列番号３又は４の相当する部分と同一又は本質的に類似の、配列番号３又は配列番号４の任意の断片であってよい。ＤＣＬタンパク質変異体は、配列番号３又は４との実質的配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば１、２、３、４又は５個以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により、配列番号３又は４と異なるアミノ酸配列を含む。変異体は、ペプチド骨格の修飾又は非タンパク質アミノ酸（例えば、β−、γ−、σ−アミノ酸、β−、γ−、σ−イミノ酸）又はＬ−α−アミノ酸の誘導体などのアミノ酸の模倣体を含むタンパク質を含む。多くの適切なアミノ酸模倣体が当業者には公知であり、シクロヘキシルアラニン、３−シクロヘキシルプロピオン酸、Ｌ−アダマンチルアラニン、アダマンチル酢酸などが挙げられる。本発明のペプチドに適切なペプチド模倣体は、Morgan and Gainor,（1989）Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252により論じられている。
【００２６】
本発明による方法
一実施形態において本発明は、標的細胞又は標的組織、具体的には神経外肺葉起源の癌細胞、特に神経芽細胞腫細胞においてｄｃｌ遺伝子をサイレンシングする方法を提供する。これらの方法では共通して、１種又は複数の、配列番号１若しくは２のセンス及び／若しくはアンチセンス核酸断片又は配列番号１若しくは２の変異体の断片（上記）が標的細胞（神経芽細胞腫細胞）に送達され、標的細胞に導入され、その結果標的細胞への導入により内在性ｄｃｌ遺伝子（標的遺伝子）のサイレンシングが起こり、具体的にはＤＣＬタンパク質及び神経外肺葉起源の癌細胞の増殖、例えば神経芽細胞腫細胞の増殖が有意に減少する。
【００２７】
当分野では、様々な遺伝子サイレンシングの方法が公知である。一般的には、内在性標的遺伝子に相同なＲＮＡ又はＤＮＡ配列を、内在性標的遺伝子の転写及び／又は翻訳に干渉を目的として細胞に導入する。標的タンパク質の産生は、その結果有意に減少又は好ましくは完全に停止される。公知の遺伝子サイレンシング法には、アンチセンスＲＮＡの発現（例えば欧州特許第１４０３０８Ｂ１号を参照のこと）、共抑制（センスＲＮＡの発現、例えば欧州特許第０４６５５７２Ｂ１号を参照されたし）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の細胞への送達又は細胞での発現（国際公開番号ＷＯ０３／０７０９６９号、Fire et al. 1998, Nature 391, 806-811、国際公開番号ＷＯ０３／０９９２９８号、欧州特許第１０６８３１１号、Zamore et al. 2000, Cell 101: 25-33、Elbashir et al. 2001, Genes and Development 15:188-200、Sioud 2004, Trends Pharmacol. Sci. 25:22-28を参照されたし）及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への送達（例えば、国際公開番号ＷＯ０３／００８５４３号、Pagnan et al. 2000 上記、Burkhard et al. 2003, 上記）が挙げられる。さらに遺伝子サイレンシング研究の再検討に関して、Yen and Gerwitz（2000, Stem Cells 18:307-319）もまた参照されたし。
【００２８】
さらに、（陽イオン性）リポソーム送達（Pagnan et al. 2000, 上記）、陽イオン性ポルフィリン、融合ペプチド（Gait, 2003, Cell. Mol. Life Sci. 60: 844-853）、又は人工ビロソーム（再検討のためにはLysik and Wu-Pong, 2003, J. Pharm. Sci. 92:1559-1573; Seksek and Bolard, 2004, Methods Mol. Biol. 252: 545-568を参照されたし）などの、標的細胞に核酸分子を送達する様々な方法があり、本発明において使用できる。
【００２９】
マウス及びヒトのＤＣＬスプライシング変異体のクローン化及び特徴付けにより、インビトロ（培養細胞又は培養組織において）又はインビボで、マウス又はヒトの神経外肺葉起源の癌細胞において、ＤＣＬタンパク質のレベルを有意に減少させる（又はＤＣＬタンパク質の産生を完全に停止させる）、公知の遺伝子サイレンシング法のいずれかの使用が可能になる。特に、ＤＣＬサイレンシングの表現型効果が、分裂する神経外肺葉起源の癌細胞、例えば神経芽細胞腫細胞における紡錘体の変形、及び／又は神経外肺葉起源の癌細胞、例えば神経芽細胞腫細胞の増殖の有意な減少又は完全な阻害として、インビボ又はインビトロで、観察される。
【００３０】
一実施形態において、神経外肺葉起源の癌細胞におけるＤＣＬタンパク質レベルを有意に減少させ、及び神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、グリア芽腫、希突起膠腫、希突起星細胞腫、星状細胞腫、神経線維腫、上衣腫、ＭＰＮＳＴ（悪性末梢神経鞘腫）、神経節細胞腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、網膜芽腫、小細胞肺癌、副腎髄質褐色細胞腫、未分化ＰＮＥＴ（末梢性神経外肺葉性腫瘍）、ユーイング肉腫及び黒色腫を治療するための組成物の調製のための、１種又は複数の、配列番号１又は２のセンス及び／又はアンチセンス核酸断片或いは配列番号１又は２の変異体断片の使用を提供する。具体的には、適切な量で、適切な頻度で該組成物を投与することにより、神経外肺葉起源の癌細胞の増殖を減少又は完全に阻害する。
【００３１】
別の実施形態において、神経外肺葉起源の癌細胞のインビトロの治療方法を提供する。この方法は、核酸断片及びこれらを含む組成物の機能性を検査するために使用できる。該方法は、ａ）神経外肺葉起源の癌細胞系の細胞培養物の確立、ｂ）本発明による核酸断片又は核酸断片を含む組成物を用いた細胞の処理、ｃ）対照細胞と比較した、神経外肺葉起源の癌細胞の表現型の変化（視覚的評価、顕微鏡などを使用する細胞増殖、微小管の変形など）の分析及び／又は細胞の分子分析（例えばＰＣＲ、ハイブリッド形成、化学発光法検出方法などを使用する、ｄｃｌ転写レベル、ＤＣＬタンパク質レベルなどの分析）を含む。
【００３２】
ｄｃｌ遺伝子サイレンシングに適切な、配列番号１及び／又は２に配列同一性又は本質的配列類似性を有するセンス及び／又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子の限定されない例は、以下の通りである。
【００３３】
１．低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
低分子干渉ＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを上回る、配列番号１又は２の連続したヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなる。このようなｄｓＲＮＡ分子は、所望の配列の短い一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、その後これらをアニーリングすることによって、容易に合成的に作製できる（実施例を参照されたし）。好ましくは、追加の１、２、又は３個のヌクレオチド、最も好ましくは２個のチミンヌクレオチド又はチミジンデオキシヌクレオチドが３’突出末端（３’末端ＴＴ）として存在する。これらのｄｓＲＮＡは、センス及びアンチセンスＲＮＡの両方を含む。限定されない例は以下である：
（ｓｉＤＣＬ−２）
5'-   CAAGAAGACGGCUCACUCCTT -3'（配列番号５）
3'- TTGUUCUUCUGCCGAGUGAGG   -5'（配列番号６）
（ｈｕ−ｓｉＤＣＬ−２）
5'-   CAAGAAAACGGCUCAUUCCTT -3'（配列番号７）
3'- TTGUUCUUUUGCCGAGUAAGG   -5'（配列番号８）
（ｓｉＤＣＬ−３）
5'-   GAAAGCCAAGAAGGUUCGATT -3'（配列番号９）
3'- TTCUUUCGGUUCUUCCAAGCT   -5'（配列番号１０）
（ｈｕ−ｓｉＤＣＬ−３）
5'-   GAAGGCCAAGAAAGUUCGUTT -3'（配列番号１１）
3'- TTCUUCCGGUUCUUUCAAGCA   -5'（配列番号１２）
【００３４】
上記のように、配列番号１又は２の任意の他の断片、或いは配列番号１又は２の変異体の任意の断片は、ｓｉＲＮＡを構築するために適切に使用できる。ｓｉＲＮＡ分子は、さらに蛍光標識又は放射性標識などの標識を、観察及び検出のために含むことができる。
【００３５】
都合の良いことに、ｓｉＲＮＡはＤＮＡベクターからもまた発現できる。このようなＤＮＡベクターは、センス断片とアンチセンス断片の間に追加のヌクレオチドを含むことができ、ＲＮＡ転写産物のフォールディングに続いてステムループ構造をもたらす。ｓｉＲＮＡを神経芽細胞腫細胞に送達及び導入する代わりに、ｓｉＲＮＡを標的細胞内に転写できるように、このようなＤＮＡベクターを標的細胞に一時的に又は安定して導入できる。例えば、遺伝子送達のためのベクター、例えば遺伝子治療用に開発されたベクターは、神経芽細胞腫細胞にＤＮＡを送達するために使用でき、そこから配列番号１若しくは２のセンス及び／若しくはアンチセンス断片又は配列番号１若しくは２の変異体のセンス及び／若しくはアンチセンス断片が転写される。例としては、Hirata et al., 2000（J. of Virology 74:4612-4620）, Pan et al.（J. of Virology 1999, Vol 73, 4: 3410-3417）, Ghivizanni et al.（2000, Drug Discov. Today 6:259-267）又は国際公開番号ＷＯ９９／６１６０１号に記載のように、組み換えアデノ随伴ウィルスベクター（adeno-associated viral vector，ＡＡＶ）がある。
【００３６】
当業者は、ｓｉＲＮＡ分子がｄｃｌ遺伝子サイレンシングに適切であるか、及び有効であるかどうかを、例えば該分子を神経芽細胞腫細胞系に送達し、その後ｓｉＲＮＡ分子を含む細胞によって産生されたｄｃｌ  ｍＲＮＡ  及び／又はＤＣＬ  タンパク質のレベルをＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ検査などの公知の方法を使用して評価することによって、容易に検査できる。適切な神経芽細胞腫細胞系は、例えばヒトＳＨＳＹ５、マウスＮ１Ｅ−１１５、マウスＮＳ２０Ｙ又はマウス神経芽細胞腫／ラット神経膠腫ハイブリッドＮＧ１０８系などである。或いは、紡錘体の変形などのｄｃｌ遺伝子サイレンシングの表現型効果は実施例に記載したように、例えば免疫細胞化学的染色又は免疫蛍光法を使用して評価できる。抗ＤＣＬ抗体は、当業者によって例えば実施例に記載したように生成でき、又は本発明においてＤＣＬに対して高度な特異性を有することが発見された既存の抗体（Kruidering et al. 2001, 上記）も使用できる。
【００３７】
ＤＣＬタンパク質のレベルは、ｓｉＲＮＡ分子を神経芽細胞腫細胞に導入した後で、ｓｉＲＮＡ分子を有さない細胞と比較して、又は実施例において記載したｓｉＤＣＬ−１などの陰性対照ｓｉＲＮＡ分子を含む細胞と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少することが好ましい。
【００３８】
２）アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２の逆相補体配列の約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２５、３０個又はそれを上回る連続したヌクレオチドからなる。このようなＲＮＡオリゴヌクレオチドは、合成的に容易に作製又はＤＮＡベクターから容易に転写できる。
【００３９】
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの使用のような骨格の修飾は、オリゴヌクレオチドの安定性を増すために使用できる。２’糖部位の、例えばＯ−メチル、フルオロ、Ｏ−プロピル、Ｏ−アリル又は他の基による他の修飾もまた安定性を改善する。
【００４０】
適切なアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの限定されない例は、以下である：
（ＤＣＬｅｘ２Ｃ）（２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホロチオエート）
5'- GCUGGGCAGGCCAUUCACAC -3'（配列番号１３）
（hu-DCLex2C）（２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホロチオエート）
5'- GCUCGGCAGGCCGUUCACCC -3'（配列番号１４）
（ＤＣＬｅｘ２Ｄ）（２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホロチオエート）
5'- CUUCUCGGAGCUGAGUGUCU -3'（配列番号１５）
（hu-DCLex2D）（２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホロチオエート）
5'- CUUCUCGGAGCUGAGCGUCU -3'（配列番号１６）
【００４１】
ｓｉＲＮＡ分子に関して、当業者は他の適切なアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを容易に作製でき、それらのｄｃｌ遺伝子サイレンシングの有効性を上記のように検査できる。配列番号１又は２の逆相補体に１００％マッチする連続する区間を使用する代わりに、配列番号１又は２の逆相補体に本質的に類似する配列を、例えば１、２又は３個のヌクレオチドを、追加、置き換え又は欠失することで使用できる。
【００４２】
ＤＮＡ分子、具体的にはＲＮＡ転写産物又は転写産物の一部としてのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを産生することができるＤＮＡベクターもまた包含する。このようなベクターは、ベクターが適切な細胞系内に存在する場合に、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの産生のために使用できる。さらに、ＤＮＡベクター（例えば、ＡＡＶベクター、上記を参照されたし）を、内在性ｄｃｌ遺伝子発現をサイレンシングするために、インビボで神経芽細胞腫細胞に送達できる。したがって、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達する代わりに、ＤＮＡベクターを神経芽細胞腫細胞に送達し、神経芽細胞腫細胞の増殖を防止する、又は減少させることができる。
【００４３】
ＤＣＬタンパク質のレベルは、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを神経芽細胞腫細胞に導入した後で、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを有さない細胞と比較して、又は陰性対照アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（即ち、ＤＣＬタンパク質のレベルに効果がない）を含む細胞と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少することが好ましい。
【００４４】
３）アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド
アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２の逆相補体配列の約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２５、３０個又はそれを上回る連続したヌクレオチドからなる。このようなＤＮＡオリゴヌクレオチドは、容易に合成的に作製できる。
【００４５】
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの使用のような骨格の修飾は、オリゴヌクレオチドの安定性を増すために使用できる。２’糖部位の、例えばＯ−メチル、フルオロ、Ｏ−プロピル、Ｏ−アリル又は他の基による他の修飾もまた安定性を改善する。
【００４６】
適切なアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの限定されない例は、以下である：
（ＤＣＬｅｘ２Ａ）（ＤＮＡホスホロチオエート）
5'- GCTGGGCAGGCCATTCACAC -3'（配列番号１７）
（ｈｕ−ＤＣＬｅｘ２Ａ）（ＤＮＡホスホロチオエート）
5'- GCTCGGCAGGCCGTTCACCC -3'（配列番号１８）
（ＤＣＬｅｘ２Ｂ）（ＤＮＡホスホロチオエート）
5'- CTTCTCGGAGCTGAGTGTCT -3'（配列番号１９）
（ｈｕ−ＤＣＬｅｘ２Ｂ）（ＤＮＡホスホロチオエート）
5'- CTTCTCGGAGCTGAGCGTCT -3'（配列番号２０）
【００４７】
ｓｉＲＮＡ分子及びアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドに関して、当業者は他の適切なアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを容易に作製でき、それらのｄｃｌ遺伝子サイレンシングの有効性を上記のように検査できる。
【００４８】
配列番号１又は２の逆相補体に１００％マッチする、連続する区間を使用する代わりに、配列番号１又は２の逆相補体に本質的に類似する配列を、例えば１、２、３個又はそれを上回るヌクレオチドを、追加、置き換え又は欠失することで使用できる。
【００４９】
ＤＣＬタンパク質のレベルは、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを神経芽細胞腫細胞に導入した後で、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを有さない細胞と比較して、又は陰性対照アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド（即ち、ＤＣＬタンパク質のレベルに効果がない）を含む細胞と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少することが好ましい。
【００５０】
ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド及び／又はアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの混合物の送達を、ｄｃｌ特異的サイレンシングにもまた使用できると理解される。
【００５１】
したがって、本発明による組成物は、配列番号１若しくは２のセンス及び／若しくはアンチセンス断片又は配列番号１若しくは２に本質的に類似のセンス及び／若しくはアンチセンス断片の適当量と、生理学的に許容される担体とを含む。該組成物をインビトロで神経芽細胞腫細胞の培養物に導入するために使用する場合、組成物は標的化合物をさらに含み得るが、標的化合物は必ずしも必要ではなく、例えば市販の形質移入キット（例えばスーパーフェクト（Superfect）、Qiagen社製, Velancia, CA）、エレクトロポレーション、リポソーム仲介形質移入などを使用する形質移入によって、分子を容易に導入できる。「標的化合物（targeting compound）」は、インビボで核酸断片を標的神経芽細胞腫細胞に運搬できる、即ち細胞標的化能を有する、化合物又は分子を指す。
【００５２】
「適当量」又は「治療的有効量」は、神経芽細胞腫細胞に存在する場合、ＤＣＬタンパク質のレベルを有意に減少させる又は停止させる、及び神経芽細胞腫細胞の増殖を有意に減少させる又は完全に阻害することができる量を指す。適当量は、過度の実験をしなくても上記のように、当業者により容易に決定できる。センス及び／又はアンチセンス分子（ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチド）の適当量は、例えば０．０５〜５μｍｏｌ／ｍｌの範囲で、１〜１００ｍｌ／ｋｇ体重を注入する。
【００５３】
神経芽細胞腫細胞培養物ではなく、対象に投与する組成物は、治療的有効量の本発明の核酸分子と、さらに１種又は複数の標的化化合物を含む。このような標的化化合物は、例えばPagnan et al.（2000, 上記）又はPatorino et al.（Clin Cancer Res. 2003, 9（12）:4595-605）により記載されたような免疫リポソームであってもよい。免疫リポソームは、それらの外部に細胞表面指向性抗体を含む。例えば、ジシアロガングリオシドＧＤ２抗原などの、神経芽細胞腫細胞の抗原に対して産生されるモノクロナール抗体を使用して、神経芽細胞腫細胞を標的としてリポソームをそれに送り込むことができる。明らかに、他の神経芽細胞腫細胞抗原は、細胞特異的抗体を産生させるために使用できる。核酸分子を、公知の方法を使用して免疫リポソーム内にカプセル化し、モノクロナール抗体をリポソームの外部に共有結合させる（例えば、p254 of Pagnan et al. 2000, 上記を参照のこと）。リポソームの神経芽細胞腫細胞への結合、及び神経芽細胞腫細胞による核酸分子の摂取は、Pagnan et al.（2000）に記載のように公知の方法を使用してインビトロで評価できる。同様に、核酸が細胞内に存在することによる表現型効果及び／又は分子効果も評価できる。
【００５４】
他の標的化化合物は、例えば核酸分子に結合した神経芽細胞腫細胞表面抗原に対して産生されたモノクロナール抗体などの抗体であってよい。例えば、マウスにおいて神経芽細胞腫腫瘍細胞を標的としてサイトカインをそれに送り込むことが示された、キメララット／マウスモノクロナール抗体ｃｈ１７２１７などの、抗トランスフェリン受容体抗体が使用できる（Dreier et al., 1998, Bioconj. Chem. 9: 482-489）。このような方法は当分野において周知であり、例えばGuillemard and Saragovi（Oncogene, Advanced online publication, published 22 March 2004, Prodrug chemotherapeutics bypass p-glycoprotein resistance and kill tumors in vivo with high efficacy and target-dependent selectivity）を参照されたい。
【００５５】
同様に、本発明による核酸分子は、天然又は合成のリガンド或いはリガンド模倣体に結合でき、これらは標的細胞表面受容体（例えば、神経芽細胞腫細胞表面受容体）に結合し、核酸分子のエンドサイトーシスをもたらす。このようなリガンドの例は、例えばトランスフェリンである。トランスフェリン−ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の静脈注射は、マウスにおいて皮下のＮｅｕｒｏ２ａ神経芽細胞腫腫瘍への遺伝子導入をもたらすことが示されている（Ogris et al., 2003, J. Controlled Release 91: 173-181）。
【００５６】
治療用組成物は、限定するものではないが水、生理食塩水、グリセロール又はエタノールなどの様々な他の成分を、さらに含んでもよい。追加の薬学的に許容される補助剤、例えば乳化剤、湿潤剤、バッファー、等張調整剤、安定化剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート及びオレイン酸トリエタノールアミンが存在してもよい。他の生物学的有効分子、例えば他の遺伝子標的をサイレンシングするヌクレオチド分子（例えばｃ−Ｍｙｂ）、マーカー又はマーカー遺伝子（例えばルシフェラーゼ）、リガンド、抗体、薬剤などが存在してもよい。
【００５７】
治療用組成物は、局所的、例えば注射、好ましくは標的組織に、又は全身的、例えば輸液の点滴又は皮下持続放出装置によって投与できる。
【００５８】
注入送達系は、溶液、懸濁液、ゲル、ミクロスフェア、及びポリマー注入物質を含み、溶解性改変剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール及びショ糖）及びポリマー（例えば、ポリカプリラクトン及びＰＬＧＡ）などの賦形剤を含み得る。投与の様々な型に適切な製剤に関する更なる手引きは、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed.（1985）に見出すことができる。
【００５９】
一実施形態において、本発明による組成物は、他の神経芽細胞腫治療、例えば化学療法、放射線治療、外科手術及び／又は骨髄移植を補完するために使用する。したがって、１種又は複数の従来の治療の事前、同時、及び／又は直後のいずれかに、組成物を対象に、好ましくは毎週、より好ましくは毎月、有効量で投与する。他の治療で効果的に除去又は根絶されない任意の神経芽細胞腫細胞は、それ故ｄｃｌサイレンシングによって増殖を防止される。この治療は、神経芽細胞腫細胞が体の他の部分に広がる（転移の形成）危険性を減少させ、再発、即ち（一次）神経芽細胞腫の再帰を防止又は少なくとも遅らせる。ＤＣＬサイレンシングは、正常な組織に対して毒性が低く、神経芽細胞腫細胞に高度の特異性を有するという、化学療法又は外科手術を上回る利点を有する。したがって望ましくない副作用は存在しない、又は最小限であると思われる。
【００６０】
別の実施形態において対象の治療方法を提供し、それによってその他の神経芽細胞腫治療（例えば化学療法、外科手術など）を実施しない。該方法は、ａ）神経芽細胞腫の診断の確立と、ｂ）本発明による組成物の適当量の投与と、ｃ）様々な間隔での観察（フォローアップ治療）とを含む。
【００６１】
ステップａ）の診断は、例えば下記の診断方法及び診断キットを使用して確立できる。或いは、神経芽細胞腫の診断は従来の方法、例えばＣＴ又はＣＡＴスキャン、ＭＲＩスキャン、ｍＩＢＧスキャン（メタヨードベンジルグアニジン）、Ｘ線、カテコールアミン或いは尿又は血清試料中のそれらの代謝産物（例えば、ドーパミン、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸）の生検又は分析などを使用して確立できる。ステップｂ）は、本明細書中の他の場所に記載する。ステップｃ）は、以下の診断検査、血液又は尿検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩスキャンなどの様々なフォローアップ検査を含み得る。フォローアップ観察の目的は、腫瘍細胞が完全に根絶され、再発しないことを確実に観察するためである。そうでない場合、新たな治療を開始する必要がある。 
【００６２】
更なる実施形態において、診断方法及び診断キットを提供し、これらは対象における神経芽細胞腫発生の初期段階を選択的にスクリーニングするために有用である。対象は、１種又は複数の他の神経芽細胞腫検査においてすでに陽性と判定されていてもよく、この場合本検査により初期診断を確認できる。或いは、対象はまだ神経芽細胞腫の診断をされていなくてもよいが、神経芽細胞腫によって起こり得る症状を示してよい。腫瘍の位置によって症状は、食欲の減退、疲労、呼吸又は嚥下の困難、腹部膨満、便秘、下肢の衰弱／不安定など大きく変わり得る。或いは、未だどのような症状も示さないハイリスクの対象を、本発明による診断方法を使用して、通常の間隔で予防的検査をして、初期診断を確認してもよく、それにより神経芽細胞腫細胞を根絶する機会が大幅に増加する。エクスビボの診断方法は、対象から採血し、血清中の遊離の神経芽細胞腫細胞の有無を検出することを含む。或いは、エクスビボの診断方法は、（推定）腫瘍組織の生検試料に関して実施してもよい。ＤＣＬタンパク質及びｄｃｌ  ｍＲＮＡは、神経芽細胞腫細胞に特異的なので、試料中のｄｃｌ  ｍＲＮＡ及び／又はＤＣＬタンパク質の存在を分析することによって、細胞の存在を検出でき、定量化してもよい。これは当分野で公知の方法、ｄｃｌ特異的又は縮重プライマーを使用する（定量的）ＲＴ−ＰＣＲ、例えばｄｃｌ遺伝子領域の特異的増幅のような他のＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ、ハイブリッド形成のためのＤＮＡプローブ又はＤＣＬタンパク質を検出する方法、例えばＤＣＬ特異的抗体（例えば、モノクロナール又はポリクロナール抗体）を使用する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はウェスタンブロットを使用して実行できる。一実施形態において、本発明による診断方法及びキットは、モノクロナール抗体の抗ＤＣＬＫ（Kruidering et al. 2001, 上記では抗ＣａＭＬＫとも称される）を含み、これは、本発明によるヒト及び／又はマウスのＤＣＬタンパク質（約４０ｋＤａの分子量を有するとして検出可能）を認識し、結合する。抗ＤＣＬＫは、ＤＣＬＫ−ショート（即ちｃｐｇ１６）及びＣＡＲＰなどの他のスプライシング変異体をさらに認識するが、ｃｐｇ１６及びＣＡＲＰの発現からＤＣＬの時空間分離及び分子量の違いを使用して、偽陽性を容易に最小化／回避できる。明らかに他のＤＣＬ特異的モノクロナール抗体を産生し使用できる。
【００６３】
さらに、エクソン８ＲＮＡに特異的なプライマー又はプローブ（ＤＣＬ  ＲＮＡに存在するが、ＤＣＬＫ−ショートＲＮＡには存在しない）をＲＮＡの検出法に使用できる。対照として、例えばＤＣＬ  ＲＮＡには存在しない、ＤＣＬＫ−ショート（即ちｃｐｇ１６）及びＣＡＲＰのエクソン６ＲＮＡ、又はＤＣＬＫのエクソン９〜２０に結合する（ハイブリッドを形成する）プライマー又はプローブを使用できる。
【００６４】
以下の標準的テキストブックを参照すると見出されるように、配列番号２のＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は配列番号４のタンパク質を、特異的に検出する（例えば、配列特異的増幅、配列特異的ハイブリッド形成又は特異的結合によって）プライマー対、プローブ及び抗体は、当業者によって標準的分子生物学的方法を使用して作製できる。プライマー対及びプローブは配列番号２に基づいて作製できる。ＤＣＬタンパク質に特異的なモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体は、当分野で公知のように産生できる。
【００６５】
診断方法は、ａ）対象の血液試料を、配列番号２のＲＮＡ又はＤＮＡの有無、及び／又は配列番号４のＤＣＬタンパク質の有無に関して分析するステップと、ｂ）存在する配列番号２及び／又は配列番号４の量を定量化してもよいステップと、を含む。定量化は、存在する神経芽細胞腫細胞の数に直接相関させることができ、それらは順に神経芽細胞腫の進行及び拡大の重篤性を示すことができる。
【００６６】
上記の方法を実施するためのエクスビボの診断キットをさらに提供する。したがって、診断キットは、ｄｃｌ遺伝子、ｄｃｌ  ｍＲＮＡ及び／又はＤＣＬタンパク質の検出、及び定量化をしてもよい、適切な、プライマー、プローブ及び／又は抗体、並びに他の試薬（バッファー、標識など）を含む。さらにキットは、試薬（例えば、免疫検出試薬）の使用法の取扱説明書及び手順書及び対照試料、例えば単離したＤＣＬタンパク質又はｄｃｌＤＮＡを含む。
【００６７】
以下の限定されない例は、新規なＤＣＬスプライシング変異体の特定、単離及び特徴付けを例示する。特に明記しない限り、本発明の実践は、分子生物学、ウィルス学、微生物学又は生化学の標準的な従来の方法を用いるつもりである。このような技術は、Sambrook and Russell（2001）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al.（1994）Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA and in Volumes I and II of Brown（1998）Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press（UK）, Oligonucleotide Synthesis（N. Gait editor）, Nucleic Acid Hybridization（Hames and Higgins, eds.）, "Enzyme immunohistochemistry" in Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P. Tijssen（Elsevier 1985）に記載されている。ＰＣＲに関する標準的材料及び方法は、Dieffenbach and Dveksler（1995）PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labroatory Press, 及びMcPherson et al（2000）PCR Basics: From Background to Bench, first edition, Springer Verlag Germanyに見出すことができる。モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体の作製方法は、例えばHarlow and Lane, Using Antibodies: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998, and in Leddell and Cryer “A Practical Guide to Monoclonal Antibodies”, Wiley and Sons 1991に記載されている。上記の参考文献は全て参照により本明細書に組み込まれている。
【００６８】
説明及び実施例を介して、以下の配列に関して述べる。
配列番号１：マウスｄｃｌのｃＤＮＡ配列
配列番号２：ヒトｄｃｌのｃＤＮＡ配列
配列番号３：マウスＤＣＬのアミノ酸配列
配列番号４：ヒトＤＣＬのアミノ酸配列
配列番号５：ｓｉＤＣＬ−２センスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ鎖）
配列番号６：ｓｉＤＣＬ−２アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ鎖）
配列番号７：ｈｕ−ｓｉＤＣＬ−２センスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ鎖）
配列番号８：ｈｕ−ｓｉＤＣＬ−２アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ鎖）
配列番号９：ｓｉＤＣＬ−３センスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ鎖）
配列番号１０：ｓｉＤＣＬ−３アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ鎖）
配列番号１１：ｈｕ−ｓｉＤＣＬ−３センスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ鎖）
配列番号１２：ｈｕ−ｓｉＤＣＬ−３アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ鎖）
配列番号１３：ＤＣＬｅｘ２ＣアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１４：ｈｕ−ＤＣＬｅｘ２ＣアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１５：ＤＣＬｅｘ２ＤアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１６：ｈｕ−ＤＣＬｅｘ２ＤアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１７：ＤＣＬｅｘ２ＡアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１８：ｈｕ−ＤＣＬｅｘ２ＡアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１９：ＤＣＬｅｘ２ＢアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２０：ｈｕ−ＤＣＬｅｘ２ＢアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド
［実施例］
【実施例１】
【００６９】
マウス及びヒト由来のＤＣＬのクローン化
マウス由来のＤＣＬ  ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列（配列番号１）の分析により、予測分子量が４０ｋＤａ（図１Ｂ）で両方のタンパク質の全長にわたって、マウスのＤＣＸとアミノ酸同一性が７３％（類似性が８１％）である３６２アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号３）が明らかになった。２つの予測ＤＣＸ反復とマウスのＤＣＸとのアラインメント（Taylor et al., 2000, 上記）により、ＤＣＸのドメインＩに関して８１％のより高いアミノ酸同一性（類似性が８９％）、及びＤＣＸのドメインIIに関して９０％のアミノ酸同一性（類似性が９９％）が明らかになり、この後者のドメインは両方のタンパク質において類似の機能を有することを強く示唆している。ＣＡＲＰと大きく一致するセリン／プロリン（ＳＰ）に富むＣ末端（Vreugdenhil et al., 1999, Neurobiology 39, 41-50）は、６３％の低いアミノ酸同一性（類似性７８％）を示す。このＳＰに富むドメインはＤＣＸ及びＤＣＬの両方に存在する。このようなＳＰに富むドメインは有力なＭＡＰキナーゼモチーフであり（Sturgill et al., 1988, Nature 334, 715-718）、Ｃ末端がＭＡＰキナーゼの基質であることを示唆している。興味深いことに、ＤＣＸのこの領域におけるＹＬＰＬモチーフは、ＡＰ−１及びＡＰ−２と相互に作用することが示されており、タンパク質の選別及び小胞の輸送に関与している（Friocourt et al., 2001, Mol. Cell Neurosc. 18, 307-319）。しかし、ＤＣＬにおいて一致するモチーフは、疎水性ロイシンが塩基性アルギニン残基に置き換えられたＹＲＰＬであり、ＤＣＬがＡＰ−１及びＡＰ−２と相互に作用しているとは思えないことを示唆している。
【００７０】
ヒトｄｃｌ  ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ（配列番号２）及びタンパク質（配列番号４）の配列は、ヒト神経芽細胞腫細胞系（ＳＨＳＹ５）から、マウスの配列を使用して得られ、本明細書中の他の場所に記載したように、ネズミの配列に非常によく似ていることを見出した。
【実施例２】
【００７１】
ＤＣＬはＭＡＰ（微小管結合タンパク質）であり、細胞骨格を安定化する。
ＤＣＸ及びＤＣＬＫロングの２つのＤＣＸドメインは相互に作用し、微小管構造を安定化することが示されている（Francis et al., 1999, 上記; Gleeson et al., 1999 上記; Kim et al., 2003, Struct. Biol. 10, 324-333; Lin et al., 2000, 上記）。ＤＣＬは、ＤＣＬＫロングと同一であるＤＣＸドメインを含むので、微小管に関する同様の安定化及び重合化効果がＤＣＬに関して期待された。このことを確認するために、３種の実験を実施した：第１にＣＯＳ−１細胞におけるＤＣＬの過剰発現が、α−チューブリン抗体との共局在によって示されるように（図２．Ｉ  Ｂ及びＣ）、微小管の分布と重複する体細胞における線維状染色パターンをもたらした（図２．Ｉ  Ａ）。第２に、検査のためにＤＣＬ含有微小管束がＤＣＸ及び他のＭＡＰに関して公知であるように、解重合に対して同様の耐性を示す場合、ＤＣＬ形質移入細胞を１０μｇのコルヒチン、解重合した化合物、崩壊したチューブリン微小管に曝した。未処理細胞は、微小管細胞骨格の明らかな解重合を示したが、一方ＤＣＬを形質移入した全ての細胞の微小管細胞骨格は、特に濃縮した微小管／ＤＣＬ束において、コルヒチン処理に１時間耐えた（図２．Ｉ  Ｄ〜Ｆ）。これにより、ＤＣＬＫロング及びＤＣＸに類似のＤＣＬが微小管を安定化できることが示された。第三に、インビトロの重合試験においてＤＣＬの微小管重合特性を、異なる濃度の、組み換え、タグなしのＤＣＬを精製チューブリンと共にインキュベートすることによって検査した。タクソールを、陽性対照として使用し、これは微小管重合化合物として周知である。微小管重合の分光光度観察により、ＤＣＬが微小管を用量依存性手段において重合化することが明らかになった（図２．II）。それと共に、これらのデータは、ＤＣＬＫロング及びＤＣＸなどのＤＣＬが微小管を直接重合化及び安定化できることを示す。
【実施例３】
【００７２】
ＤＣＬ認識抗体の特徴付け
近年、抗ＣａＭＫＬＫと呼ばれるＣＡＲＰに対する抗体の産生が記載され（Kruidering et al., 2001, 上記）、この抗体はＤＣＬＫショート（ｃｐｇ１６（Silverman et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 2631-2636）又はＣａＭＬＫとしても公知である）を含む、ＤＣＬＫ遺伝子の他のスプライシング変異体もまた認識する。ＣＡＲＰは、５５アミノ酸（そのうち４３がＤＣＬのＣ末端と同一である）の低分子タンパク質であり、ヒトＤＣＸと７０％のアミノ酸相同性を共有する（Vreugdenhil et al., 1999）。抗ＣａＭＬＫの特異性を扱うために、ＤＣＸ及びＤＣＬをＣＯＳ−１細胞において過剰発現させ、ウェスタンブロット分析により交差反応性の可能性を分析した。抗ＣａＭＬＫは、ＤＣＬを強く認識し（図３Ａ、レーン４〜６）、一方ＤＣＸには交差反応性は多少観察されるだけである（図３Ａ、レーン２及び３）。他方では、本明細書中で使用する、ＤＣＸのＣ末端の１７アミノ酸に対して産生されるＤＣＸ抗体は、ＤＣＸを強く認識するが（図３Ａ、レーン２及び３）、ＤＣＬは認識しない（図３Ａ、レーン４〜６）。したがって抗ＣａＭＬＫは、ＤＣＬＫショート及びＤＣＬを含むＤＣＬＫ遺伝子の多くのスプライシング変異体を強く認識し、それ故抗ＣａＭＬＫは本明細書中では「抗ＤＣＬＫ」と称する。さらに、抗ＤＣＬＫとＤＣＸのいくらかの交差反応性が起こり得る一方で、ＤＣＸ抗体はＤＣＸ単体に関して特異的であるがＤＣＬに関しては特異的でない。
【実施例４】
【００７３】
ＤＣＬは、脳の発達の初期段階において高度に発現する。
胚脳ホモジネートのウェスタンブロット分析により、抗ＤＣＬＫに関して免疫陽性である４０ｋＤａのタンパク質の存在が明らかになった。タンパク質の大きさは、ＣＯＳ−１細胞において過剰発現した組み換えＤＣＬタンパク質の大きさに相当する（図３Ｂ）。他の免疫反応性のバンドが観察されなかったので、抗ＤＣＬＫは発達中のマウスの脳においてＤＣＬのみを認識する（図３Ｂ、レーン８〜１８）。ＥＤ１０においてシグナルはすでに存在したが、最も高いレベルの免疫反応性ＤＣＬタンパク質はＥＤ１２及びＥＤ１４において見出された。ＥＤ１４の後、ＤＣＬタンパク質のレベルは下降し、成熟脳においても弱いが明確な４０ｋＤａのバンドがなお存在した。ここで、５３ｋＤａの追加のバンドが非常に顕著であった（図３Ｂ）。５３ｋＤａの分子量が一致することから、このバンドはＤＣＬＫショートを表すと思われ、これは成熟脳においてのみ豊富に発現し、発達脳においては発現しない（Vreugdenhil et al, 2001; Omori et al., 1998）。成熟脳内では、ＤＣＬタンパク質は嗅球において最も高いレベルで、海馬及び大脳皮質においては低レベル、及び小脳、脳幹及び視床下部において非常に低いレベルで発見された（図３Ｃ）。
【００７４】
ＤＣＸは、選択された領域において非常に少量で発現し続けるにもかかわらず（Nacher et al., 2001, Eur J Neurosci 14, 629-644）、ＤＣＸは、発達期に特異的に発現し、成熟脳においては検出レベルより下に落ちることが報告された（Francis et al., 1999 上記; Gleeson et al., 1999 上記）。ＤＣＬの発見と比較するために、タンパク質溶解物を、Ｃ末端を認識するＤＣＸ特異的抗体を用いてさらに分析した。他の研究（Francis et al., 1999; Gleeson et al., 1999）と一致して、ＤＣＸの最も高い濃度はＥＤ１２において見出され、その後下降した（図３Ｂ）。
【００７５】
ＤＣＬに反して、さらに長期曝露した後でもＤＣＸタンパク質の発現はＥＤ８及びＥＤ１０の胚の頭部又は成熟脳において全く検出できなかった。しかし、神経細胞の移動におけるＤＣＸの役割と一致して、ＤＣＸの免疫反応性が成熟嗅球において観察された（図３Ｃ、レーン７）が、他の脳構造においては観察されず（図３Ｃ、レーン２〜６）、全脳溶解物においてＤＣＸが検出レベルより希薄であることを示唆している。
【００７６】
ＤＣＸ及びＤＣＬの発現の領域的違いをより詳細に分析するために、初期胚発生におけるＤＣＬの時空的発現をインサイツのハイブリッド形成を使用して研究した。ＥＤ８において神経上皮（後期発達段階において、中枢神経系及び層をなす皮質を生じる運命にある）の長さに沿って、低レベルのＤＣＬ  ｍＲＮＡの発現が観察された（図４．Ｉ  Ａ）。ＥＤ１０において、大規模な分裂が開始され顕著になった場合、実質的な発現が、特に初期の間脳、終脳及び中脳において見出された（図４．Ｉ  Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット実験に一致して、ＥＤ１２におけるＤＣＬの発現の強度は、ＥＤ８及び１０と比較して増殖脳室帯において高レベルで著しく増加した（図４．Ｉ  Ｃ）。
【００７７】
ＤＣＬタンパク質の時空的分布を研究するために、免疫組織化学を８、９、１０及び１１日齢のマウスの胚由来の切片について、これらの日齢において限定的にＤＣＬを認識するＤＣＬＫ抗体（抗ＤＣＬＫ）を使用して、実施した（上記及び図３Ｂを参照されたし）。ＥＤ８においてＤＣＬの染色は全く観察されなかった（データ非掲載）。しかし、ＥＤ９において、ＤＣＸタンパク質の発現がない時期が見出され（図４．II  Ｂ）、ＤＣＬシグナルは脳室壁及び大規模な有糸分裂及び神経発生の特定の範囲である、主要な神経上皮において顕著である（図４．II  Ｃ及びＪ）。ＥＤ１０及び１１において、ＤＣＬタンパク質は一般的にインサイツのハイブリッド形成パターンに続き、終脳、間脳、側部神経節隆起、神経管の神経上皮、並びに例えば後根及び交感神経節を含む中枢神経系及び末梢神経系の増殖領域において高レベルであったが、一方、例えば骨又は腸などの非神経組織は、どのようなシグナルも欠いていた（図４．II  Ａ及びＤ）。初期新皮質の高度拡大により、ＤＣＬが皮質板の上層だけでなく内部脳室帯においても発現し、中間帯においては明らかに低レベルで発現することが明らかになった（図４．II  Ｆ及びＨ）。
【００７８】
特に顕著な観察は、有糸分裂細胞、例えば脳室帯及び上皮壁におけるＤＣＬの免疫反応性（図４．II  Ｃ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｎの例）であり、一方ＤＣＬ陽性の有糸分裂細胞が神経管の神経上皮（図４．II  Ｄ）及び皮質神経上皮の中間体（図４．II  Ｆ）において発見され、全体としてより孤立して発生し、頻度は低かった。同じ切片の上皮のＤＣＬ染色パターンに加えて、明らかな免疫陽性ダブレットが観察された（図４．II  Ｄ及びＦ）。さらに、細胞周期の特定の段階における有糸分裂細胞が認識でき（図４．II  Ｊ〜Ｎ）、染色体及び免疫陽性の中心体様構造の間の激しい免疫反応性（図４．II  Ｌ）を明らかに見ることができる。
【００７９】
統合すれば、データは、ＥＤ８からすでに始まるＤＣＸの発現及びＥＤ９以降に始まるＤＣＬタンパク質の発現に先行して、ＤＣＬ  ｍＲＮＡの発現が存在することを明らかに示した。ＤＣＬ  ｍＲＮＡ及びＤＣＬタンパク質の発現は、それぞれＥＤ１２及びＥＤ１４に最も高いことが見出されたが、ＤＣＸに反して、さらにＤＣＬの転写産物及びタンパク質発現体が成熟脳からウェスタンブロットで発見された。初期発生におけるタンパク質の分布は、同じ時のＤＣＸの分布と異なるだけでなく、位置も異なる、即ちＤＣＬは皮質板単独だけでなく、脳室帯及び皮質板において発見された（図４．II  Ｃ、Ｆ〜Ｈ）。最も目立ったことには、ＤＣＬの免疫反応性が神経上皮の有糸分裂細胞に、時として中間帯に定期的に見出された。
【実施例５】
【００８０】
ＤＣＬは神経芽細胞腫細胞において内因性の発現をする。
神経増殖におけるＤＣＬの役割の可能性を調査するために、いくつかの神経細胞系における内因性ＤＣＬの発現を分析した。およそ４０ｋＤａのＤＣＬ免疫反応性バンドが、４種の異なる神経芽細胞腫細胞系において観察され、このバンドは研究した非神経芽細胞腫細胞系のいずれにおいても不在であり（図５．Ｉ  Ａ）、神経線維様表現型の細胞におけるＤＣＬの発現に特異的であることを示唆している。ＰＣ１２細胞を含む、他の非神経芽細胞腫細胞系のスクリーニングでは、いずれのＤＣＬ陽性細胞系も特定できなかった（データ非掲載）。神経芽細胞腫細胞系Ｎ１Ｅ−１１５において、４０ｋＤａの免疫反応性ダブレットは、過剰発現ＤＣＬからもたらされたダブレットと共移動した（図５．Ｉ  Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲ実験及びウェスタンブロット分析の両方とも、ＤＣＸ特異的プライマー及びＤＣＸ特異的抗体を使用してＤＣＸシグナルを検出できなかった（データ非掲載）ので、この４０ｋＤａのバンドは、Ｎ１１５細胞におけるＤＣＸの存在によっては説明できない。したがって、４０ｋＤａのＤＣＬダブレットの上のバンドはＤＣＬのホスホイソ型を表すと思われ、細胞溶解物をホスファターゼと共にインキュベートした場合に、この考えは内因性ＤＣＬ並びに過剰発現ＤＣＬの両方の上のバンドが消失することによって確認された。これはＤＣＸに類似したＤＣＬが、少なくとも神経細胞系においてリンタンパク質であることをさらに実証する。
【実施例６】
【００８１】
ＤＣＬは、Ｎ１Ｅ−１１５細胞において微小管の構造及び構成に影響を与える。
ＤＣＬの機能及び細胞内局在性を研究するために、中間期のＮ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫細胞における低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ技術を使用したＤＣＬ発現操作の後で、免疫細胞化学実験を、共焦点顕微鏡法を使用して、実施した。Ｎ１１５細胞により取り込まれたｓｉＲＮＡを定着させるために、抗ＤＣＬ合成ｓｉＲＮＡ分子をＣｙ−５を用いて標識し、Ｎ１１５細胞中のそれらの有無を蛍光顕微鏡により観察した。これらの研究は、全Ｎ１１５細胞のおよそ９５％に抗ＤＣＬ  ｓｉＲＮＡが存在することを示唆した（データ非掲載）。ＤＣＬに対する３種の異なるｓｉＲＮＡ分子：ｓｉＤＣＬ−１、２及び３を構築した。ウェスタンブロット分析により、ｓｉＤＣＬ−１がＤＣＬタンパク質をノックダウンできなかったことが示され（図５．II、レーン１）、この発見は、このアンチセンス鎖の３’末端においてＴＴの２つのヌクレオチドが欠けていることによって説明できた。ｓｉＤＣＬ−１を、それ以降ｓｉＲＮＡ手順の効果に関する陰性対照として使用した。未処理細胞及びｓｉＤＣＬ−１と比較して、ｓｉＤＣＬ−２及びｓｉＤＣＬ−３分子の形質移入は、ウェスタンブロット分析により決定したように、それぞれ８０％及び９０％のノックダウンを引き起こす（図５．II、レーン２及び３）。次の、抗−ＤＣＬＫ及びα−チューブリン又はγ−チューブリン抗体を使用した、ｓｉＲＮＡ処理Ｎ１１５細胞の免疫細胞化学分析により、中間期の細胞の微小管細胞骨格の構造に関する著しい効果を明らかにした。未処理細胞において、抗ＤＣＬ染色は通常点状であり、体細胞の残余の至る所に存在する（図５．III  Ａ）。体細胞の辺縁及びさらに神経突起の先端に選択的に位置して出現する（Friocourt et al., 2003; Schaar et al., 2004）ＤＣＸに反して、ＤＣＬの免疫反応性は体細胞の辺縁で緩和され（図５．III  Ａ及びＣ）、多くの場合核の片面又は両面近くで強度が増すことを示し（図５．III  Ａ、Ｃ、Ｄ及びＦ）、ＤＣＬが特に中心体を囲む細胞骨格に沿って集中することを示唆する。この細胞内局在性は、中心体マーカーγチューブリンを用いた共染色によって確認した（図５．IV  Ａ〜Ｃを参照されたし）。
【００８２】
ウェスタンブロット分析に一致して、ｓｉＤＣＬ−１の形質移入により内因性ＤＣＬの免疫細胞化学染色パターンは変化しなかった。ＤＣＬのノックダウンはｓｉＤＣＬ−３により誘導されたが、抗ＤＣＬＫ染色のほぼ完全な消失を誘導し（図５．III  Ｇを参照されたし）、抗ＤＣＬＫ抗体が高度に特異的な方法でＮ１１５細胞内のＤＣＬを認識することを強く示している。目立ったことには、ｓｉＤＣＬ−２を形質移入した細胞の４０％及びｓｉＤＣＬ−３を形質移入した細胞の８０％において、細胞骨格が崩壊し、そのことは、変化し、より分散したα−チューブリン染色パターン及び不規則な構成から明らかであった。ｓｉＤＣＬ−２及びｓｉＤＣＬ−３を形質移入したが、正常な細胞骨格を有するＮ１１５細胞は、異常な細胞骨格を有する細胞より、抗ＤＣＬＫによりよく染色されたこともさらに示した。このことは、有効なＤＣＬのノックダウンとそれに続く微小管の安定性の異常との間の因果関係をさらに裏付ける。未処理細胞における正常な微小管細胞骨格と比較して、ＤＣＬのノックダウンの後の異常なパターンは、より集中し、分散構造が少なくなり、明らかに分岐の少なくなった微小管束により特徴付けられる（図５．III  Ｈ及びＩ）。これは、微小管細胞骨格の分岐及び安定化におけるＤＣＬの役割を示した。
【００８３】
ＤＣＬタンパク質の分布は中心体の周りで高度に集中して見出されたので、ＤＣＬのノックダウンは中心体タンパク質複合体、続く核の位置づけ、細胞骨格の連結性及び（再）構成に影響を与えることができる。この問題を扱うために、ＤＣＬのノックダウンを、γチューブリン染色と併用して実施した（図５．IV  Ｄ〜Ｉを参照されたし）。Ｎ１１５細胞の正倍数性特性と一致して、細胞当たり複数の中心体が観察された。しかし、ＤＣＬの効果的なノックダウンにもかかわらず、中心体の数又は構造に明らかな変化は見られず、ＤＣＬが中心体の構造的構成のカギとなる因子ではないことが示されている。
【実施例７】
【００８４】
ＤＣＬは、神経芽細胞腫細胞において紡錘体形成に必須である。
脳室帯におけるＤＣＬの存在（図４）は、神経増殖及び前駆分裂におけるＤＣＬの役割に一致する。したがって、分裂Ｎ１Ｅ−１１５細胞をｓｉＲＮＡによるＤＣＬのノックダウンの後で、共焦点顕微鏡を使用して分析した。強いＤＣＬの免疫反応性が、中期又は後期の始まりの、全ての分裂Ｎ１Ｅ−１１５細胞において観察された（図６Ａ及びＤ参照）。ＤＣＬの免疫反応性はα−チューブリンと大いに共局在し、紡錘体との関連を示している。しかし、免疫反応性勾配は分析した全ての細胞内のＤＣＬに関して明らかであり、中心体の近くでは低レベルであり、紡錘体において及び動原体の近くでは高レベルであり、紡錘体の形成におけるＤＣＬの役割を示唆している。この一致は、ｓｉＤＣＬ−２及びｓｉＤＣＬ−３によるＤＣＬのノックダウンの劇的な効果であり、これは紡錘体の完全な変形及び時として欠如に関連する。（図６Ｇ〜Ｌ）。この紡錘体に関する効果は全分裂細胞（ｓｉＤＣＬ−２）の４０％及びｓｉＤＣＬ−３を形質移入した全分裂細胞において観察された。ｓｉＤＣＬ−１による、無効なノックダウンは、ＤＣＬの紡錘体との共局在化を未変化のままにし、一方紡錘体の表現型の出現は未処理細胞の紡錘体の表現型の出現と類似している（図６Ｄ〜Ｆ）。したがって、明らかに、ＤＣＬは分裂神経芽細胞又は神経前駆細胞の紡錘体の正しい形成に必要である。
【実施例８】
【００８５】
ＤＣＬの過剰発現が紡錘体の伸長を引き起こす。
普通はＤＣＬタンパク質を発現しないＣＯＳ−１細胞におけるＤＣＬの過剰発現により、機能獲得について研究した。分裂Ｎ１１５細胞における内因性ＤＣＬ発現についての上記の発見に一致して、ＤＣＬの免疫反応性は分裂ＣＯＳ−１細胞において紡錘体と共局在する（図７を参照されたし）。２つの異なる表現型が観察された：第１に、分析した分裂ＣＯＳ−１細胞の２０％（ｎ＝１２６）において、ＤＣＬの過剰発現はα−チューブリンと共局在し、分裂Ｎ１Ｅ−１１５細胞における内因性ＤＣＬ発現パターンに類似し（図７  Ｄ〜Ｆ）、ＤＣＬは動原体及び紡錘体に局在する。しかし、Ｎ１Ｅ−１１５と違って、ＤＣＬもまた中心体及び星状糸に随伴して見出される。第２に、分裂ＣＯＳ−１細胞の大部分（８０％）において、ＤＣＬの発現の正確な有糸分裂期とベクター形質移入細胞との比較が、ＤＣＬを発現した分裂細胞の全てが、紡錘体が伸長した異常な表現型を示すという事実によって妨げられた。
【００８６】
最も目立ったことには、半分の紡錘体が観察され、ＤＣＬの過剰発現は中心体の分離及び紡錘体の配向性に影響を与えることを示している（図７Ａ〜Ｃ、Ｇ〜Ｉ）。さらに、紡錘体は対照細胞の紡錘体よりだいぶ長く、多くの場合厚くなって出現した（例えば形質移入していない細胞の紡錘体の長さであるｒｅｆ挿入の図７Ｂと、図７Ｃとを比較されたし）。これらのＤＣＬ効果は異常なＤＮＡの染色及び分布パターンと著しく関連があり、この場合染色体は完全に押しのけられ、体細胞に分散し、正常な配向パターンとは顕著に異なり、双極中心体位置に関して垂直である（ｒｅｆ挿入図７Ｂ）（図７Ｃと比較した参考の長さを参照されたし）。したがって、ＣＯＳ−１細胞におけるＤＣＬの過剰発現は紡錘体の伸長及び半紡錘体の形成を引き起こし、ＤＣＬが紡錘体の形態及び長さに関して重要な役割を担うことを示唆している。
【実施例９】
【００８７】
材料及び方法
９．１ネズミＤＣＬのクローン化
本発明者らは、ＣＡＲＰ特異的エクソンの終止コドン領域に相当する、アンチセンスプライマー１Ａ：CTGGA ATTCT TACAC TGAGT CTCCT GAG（EcoR1部位に下線を引いた）、及びネズミのＤＣＬＫ遺伝子のエクソン３に相当するセンスプライマー２Ｓ：GCAGG TTCTC ACTGA CATTA CCGを開発した。ＰＣＲの３０周期で、４５７ｂｐ断片を、鋳型としてマウスの胚ｃＤＮＡ及びポリメラーゼPfuI（Stratagene社製）を使用して、増幅した。ＤＮＡ配列分析により、ＤＣＬＫ特異的であるＤＮＡ配列を確認した。その後、完全なＤＣＬタンパク質をコードするＤＣＬ  ｃＤＮＡを、CCAGGATCCACCATGTCGTTCGGCAGAGATATG（BamH1部位に下線を引いた）をセンスとして、アンチセンスプライマーとして１Ａを使用して増幅し、BamH1及びEcoR1を用いて切断し、発現プラスミドｐｃＤＮＡ  ３．１（InVitrogen社製, Groningen, The Netherlands）においてサブクローン化した。ＤＣＬ−ＥＧＦＰの構築体を、pEGFP-C1（Clontech社製;図１も参照されたし）のSmaI/KpnI部位において、ｐｃＤＮＡ３．１．ＤＣＬからKpnI/EcoRV ＤＣＬ断片をサブクローン化することによって産生した。
【００８８】
９．２インサイツのハイブリッド形成
ＤＣＬ  ｍＲＮＡは、ＣＡＲＰを除く他の大部分のＤＣＬＫ転写産物には存在しないエクソン８（図１）を含む。ＣＡＲＰは、胚発生期には非常に低レベルで発現するため、エクソン８特異的配列に相補的な、４０ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発した（5' -TTTGC TGTTA GATGC TTGCT TAGGA AATGG GAAAC CTTGA-3'）。陰性対照として６つのミスマッチ（下線を引いた）を含む、オリゴヌクレオチド5'-TTTGA TGTTA TATGC TTGAT TAGGA CATGG GACAC CTGGA-3'を使用した。両方のオリゴヌクレオチドをα−３３Ｐ  ｄＡＴＰ（NEN Life Science Products社製, Hoofddorp, The Netherlands, 2000Ci/mmol, 10 mCi/ml）を用いて、製造業者の指示に従ってターミナルトランスフェラーゼ（Roche Molecular Biochemicals社製, Almere, The Netherlands）を使用して、末端を標識した。インサイツのハイブリッド形成及びシグナルの視覚化を前記のように実施した（Meijer et al., 2000, Endocrinology 141, 2192-2199）。
【００８９】
９．３抗体
抗ＤＣＬ抗体の産生を先に記載した（Kruidering et al., 2001, 上記）。マウスモノクロナール抗α−チューブリンをSigma 社より入手した。ヤギポリクロナール抗ダブルコルチン（Ｃ−１８）抗体、ローダミン結合二次抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体はSanta Cruz Biotechnology, Inc社製であった。
【００９０】
９．４細胞の培養及び処理
細胞培養用の全試薬は、特に明記しない限りLife Science Technologies, Inc社から入手した。全細胞は３７℃、５％ＣＯ２で保存した。ＣＯＳ−１細胞を、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎児血清を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Dulbecco's modified Eagles medium）で培養した。ＮＧ１０８−１５及びＮ１１５細胞を、ピルビン酸ナトリウムを除き、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ハイブリドーマ（ＨＡＴ）混合物及び１０％ウシ胎児血清を添加した、ＤＭＥＭで培養した。一過性形質移入実験のために、細胞を、ポリ−Ｌ−リジンで被覆したプレート又はカバースリップ上で培養した。新生マウス由来の一次解離神経細胞を、Ｌグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎児血清を添加した、Ｆ−１２  Ｈａｍ、Kaighnの改変培地（Sigma社製）で培養した。一次神経細胞を１日齢のマウスの海馬領域から単離し、それをトリプシン溶液中で３７℃において２５分インキュベートした。その後、細胞を培養培地で２回洗浄し、ポリ−Ｌ−リジンで被覆したカバースリップ上に播種した。２４時間後、培養培地を交換し、７．５μＭシトシン―β−Ｄ−アラビノシド（Sigma社製）を添加し、グリア細胞の量を減らした。一過性形質移入実験を、スーパーフェクト（Superfect（Qiagen社, Valencia, CA））を用いて、製造業者の指示に従って、実施した。一次神経細胞を単離4日後に形質移入した。
【００９１】
９．５  ｓｉＲＮＡ実験
ｓｉＲＮＡ実験のために、マウスの神経芽細胞腫細胞系Ｎ１Ｅ−１１５（ＡＴＣＣ  番号ＣＲＬ−２２６３）を使用した。合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド5'-CAAGA AGACG GCUCA CUCC-3'及び5'-GGAGU GAGCC GUCUU CUUG-3'（ｓｉＤＣＬ−１をアニーリング）、5'- CAAGA AGACG GCUCA CUCCT T- 3'（配列番号５）及び5'-GGAGU GAGCC GUCUU CUUGT T-3'（配列番号６）（ｓｉＤＣＬ−２をアニーリング）並びに5'-GAAAG CCAAG AAGGU UCGAT T-3'（配列番号９）及び5'-TCGAA CCUUC UUGGC UUUCT T-3'（配列番号１０）（ｓｉＤＣＬ−３をアニーリング）（３’のチミジンがデオキシヌクレオチドである）を、Eurogentec社より入手し、アニーリングバッファー（１００ｍＭ  ＫＡｃ、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＭｇＡｃ）に溶解し、最終濃度を１００μＭにした。二本鎖ｓｉＲＮＡの形成のために、等モル量のセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを混合し、９４℃において１分間加熱し、続いて３７℃で１時間インキュベートした。ウェル当たり、最終濃度１００ｎＭの二本鎖ｓｉＲＮＡを使用した。遺伝子サイレンシングのために、６０ｐｍｏｌの二本鎖ｓｉＲＮＡを５０μｌのオプティメム（ｏｐｔｉ−ＭＥＭ，Life Technologies社製）に溶解し、３μｌのオリゴフェクタミン試薬（Invitrogen社製）を分注することによって混合し、１２μｌのオプティメムに溶解した。室温で２０分間インキュベートした後で、３２μｌのオプティメムで容量を増し、全混合物（１００μｌ）を細胞（５００μｌ）に加えた。４８時間後、遺伝子サイレンシングをウェスタンブロット分析及び免疫蛍光法により検査した。
【００９２】
９．６免疫細胞化学
細胞を、上記のように培養し、一過性形質移入した。表示の時間に、カバースリップ上の細胞を、８０％のアセトン水溶液を用いて室温において５分間で固定した。細胞をその後リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，phosphate-buffered saline）、０．０５％トゥイーン２０で２回すすぎ、ブロッキングバッファー：ＰＢＳ、０．０５％トゥイーン２０、５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ，Normal Goat Serum， Sigma社製）で少なくとも１時間ブロッキングした。１次抗体を添加し、ブロッキングバッファー中で室温で１時間置き、０．０５％トゥイーン２０のＰＢＳを用いて３回洗浄し、ブロッキングバッファー中でローダミン結合二次抗体と共に室温において３０分間インキュベートした。もう１度洗浄した後で、核を０．２μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８を用いて、５分間染色し、４回洗浄し、分析した。画像を、Sonyの３CCDカラービデオカメラにつないだOlympus AX70蛍光顕微鏡を用いて、Analysis（登録商標）ソフトウェア（Soft Imaging System, Corp.社製）により動作させて得た。ＤＣＬタンパク質分布をマッピングするために、ＥＤ９、１０及び１１の胚ＣＤ１マウス胚をＰＢＳで簡単に洗浄し、その後メタノール／アセトン／水（４０：４０：２０）（MAW, Franco et al, 2001）で室温において４時間固定し、その後パラプラストプラス（Paraplast Plus）（Kendall, Tyco Healthcare社, Mansfield, MA 02048, USA）に埋め込む前に７０％のエタノール中で２週間保存し、その後６μｍの厚さの切片をスーパーフロストプラススライド（Superfrost Plus slide）（Menzel-Glaser社製）に取り付けた。ＴＢＳを以下の全てのステップにおいて洗浄バッファーとして使用した。キシレン及び等級の付いたエタノールできれいにした後、切片をブアンの固定液（Bouin's fixative）で、洗浄前に後固定し、０．１％の過酸化水素処理を15分間行うことによって内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。特異的結合を減らすために、１％のミルクパウダーＰＢＳ溶液（Campina社製、The Netherlands）を３０分間用いた。一次ＤＣＬ抗体を、０．２５％ゼラチン／０．５％トリトンＸ−１００のＴＢＳ溶液（Supermix）に１：５０で、室温において１時間、その後４℃において一晩用いた。二次抗体（ビオチン化、抗ウサギ、Amersham Life Sciences社製、１：２００）のインキュベーションを、Supermix中で室温において１時間３０分行い、アビジン―ビオチン（ＡＢＣ）Elite（Vector Laboratories社製, Burlingame）、ビオチン化チラミド（１：５００）０．０１％過酸化物液を用いて３０分間増幅させその後さらに４５分間ＡＢＣを用いてインキュベートした。最後に０．０５Ｍ  トリス  ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．６）で２回洗浄し、０．０５Ｍ  トリス  ＨＣｌバッファーをジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（０．０５Ｍ）の溶解にもさらに使用した。切片を、クレシルバイオレットを用いて対比染色し、エンテラン（Entellan）（Merck社製）にカバースリップをのせた。
【００９３】
比較のために、ＤＣＸタンパク質の分布もまた、隣接する切片で、Ｃ−１８ダブルコルチン特異性抗体（Santa Cruz Biotechnology社, South Cruz CA, USA）を１：７５の希釈で使用してマッピングした。ミルクパウダー溶液中でのブロッキングステップを省略し、ビオチン化抗ヤギ抗体を二次抗体としたことを除いて、上記と同じプロトコルを使用した。
【００９４】
９．７タンパク質の抽出及びウェスタンブロット
マウスの組織及び細胞を、コンプリート（Complete（商標））ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤混合物（ Roche Molecular Biochemicals社製）を添加した溶解バッファー（２０ｍＭトリエタノールアミンｐＨ７．５、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％デオキシコール酸塩、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０５％トリトンＸ１００）を用いて可溶化し、１６０００ｇで３０分間遠心分離機にかけた。上清を回収し、ピアス法（Pierce method）を使用してタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、イモビロン（immobilon）−Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Millipore社製）に転写した。ブロットを、ブロッキングバッファー（トリス−緩衝生理食塩水、０．２％トゥイーン２０（ＴＢＳＴ）、５％ミルク）を用いて1時間ブロッキングし、一次抗体と共にブロッキングバッファー中で1時間インキュベートし、ＴＢＳＴを用いて３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と共に、ブロッキングバッファー中で３０分間インキュベートし、ＴＢＳＴを用いて３回洗浄した。抗体の結合をＥＣＬ（Amersham Pharmacia Biotech社製）により検出した。
【００９５】
９．８ホスファターゼ処理
ＤＣＬを形質移入した、及び形質移入しないＮ１Ｅ−１１５細胞を、コンプリート（Complete（商標））ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤混合物（Roche Molecular Biochemicals社製）を添加した溶解バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ９．３、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、１ｍＭスペルミジン）を用いて可溶化し、１６０００ｇで３０分間遠心分離機にかけた。上清を回収し、ピアス法（Pierce method）を使用してタンパク質濃度を測定した。各上清を５０μｇのタンパク質を含む３つの試料に分割した。第１の試料を未処理、第２の試料を、酵素を加えずに３７℃において３０分間インキュベートし、第３の試料を、１０単位の仔牛小腸アルカリホスファターゼ（Calf Intestinal Alkaline Phophatase）（Promega Bioscience, Inc.社製）と共にインキュベートした。試料を上記のようにウェスタンブロットにより分析した。
【００９６】
９．９チューブリン重合試験
ｃＤＮＡをコードするＤＣＬを、ｐｃＤＮＡ３．１発現コンストラクト及びｐＥＴ２８への再連結体から、BamH1及びEcoR1を使用して切り離した。得られたＤＣＬの発現コンストラクトを、ＢＬ２１細胞に形質移入した。単一コロニーを５００ｍｌのLB中でＯＤ０．７まで成長させ、その時点でＩＰＴＧを添加し、最終濃度を０．４ｍＭにした。導入の３時間後、細菌を回収し、ＰＢＳを用いて洗浄し、ペレットにした。組み換えＤＣＬタンパク質を、ペレットを再懸濁し、それをフレンチプレス（French press）に通すことによって単離し、その後製造業者の指示に従ってプロボンド（Probond）（Invitrogen社製）Ｎｉ２＋親和性樹脂を使用して精製した。精製ＤＣＬを、Centricon 30濃縮装置を使用して、０．８ｍｇ／ｍｌに濃縮した。チューブリン重合試験を、Gleesonら（Gleeson et al., 1999, 上記）に従って、Cytoskeleton社のチューブリン重合試験キット（カタログ番号ＢＫ００６）を使用して実施した。手短に言うと、１ｍｇのチューブリンを、製造業者の指示に従って１．１ｍｌの氷冷重合バッファーに溶解し、このうち１００μｌを、１０μｌの様々な濃度のＤＣＬタンパク質に、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて加えた。その後、３４０ｎｍにおける吸収を、HTS2000（Biorad/Perkin Elmer社製）を使用して、３０分間、３０秒おきに測定した。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
[図１]ＤＣＬのゲノム構成及びＤＣＸとのアラインメントの図である。
【図１ａ】（Ａ）：ＤＣＬＫ遺伝子のゲノム構成及びＤＣＬ  ｃＤＮＡのクローン化戦略。最近特定された、ＣＡＲＰ及びＤＣＬに共通の３’末端をコードするエクソン８（Vreugdenhil et al., 2001, 上記）を含む、ＤＣＬ部のエクソン−イントロン構造のみを示す。エクソンは、長方形で表し、アラビア数字で示し、イントロンは実線である。ＤＣＬ転写産物は、（ＤＣＬ）のゲノム構造の下に示す。ＯＲＦは、長方形で、非翻訳配列は線で表す。ＤＣＬのクローン化に使用するプライマーの位置は矢印で示す。
【図１ｂ】（Ｂ）：ＤＣＬタンパク質とＤＣＸとのアラインメント。同一残基は、暗い灰色、保存された置換は明るい灰色である。２つのＤＣＸドメイン及びＳＰに富むドメインを矢印で示す。
【図２】ＤＣＬがＭ．Ａ．Ｐであり、微小管を安定化させる図である。
【００９８】
パネルＩ
（Ａ〜Ｃ）ＣＯＳ−１細胞におけるＤＣＬの過剰発現。
（Ｄ〜Ｆ）コルヒチンを用いて処理したＣＯＳ−１細胞におけるＤＣＬの過剰発現。
緑はＤＣＬを表す。赤はα−チューブリンを表し、黄色はＤＣＬとα−チューブリンとの共局在を示す。青はＤＮＡ（核）を表す。矢印は、コルヒチン処理に耐性のある微小管束に随伴するＤＣＬを表す。Ａ及びＢにおいて、中心体の明らかな随伴にも留意されたし。スケールバーは、１０μｍである。
【００９９】
パネルII
ＤＣＬによるインビトロの微小管の重合。異なる濃度の組み換えＤＣＬタンパク質を、精製チューブリンと共にインキュベートし、ＤＣＬ／チューブリン混合物の濁度を３４０ｎｍで３０分観察した。タクソールを陽性対照として、水を陰性対照として使用した。グラフは、結果が同様であった複数の実験（Ｎ＝４）からの典型的な例を示す。
【図３】ＤＣＬの発現が発展的に制御される図である。
【０１００】
（Ａ）：抗体を認識するＤＣＸとＤＣＬＫとの交差反応性。抗ＤＣＸ（上方パネル）又は抗ＤＣＬＫ（下方パネル）によりＤＣＬ（レーン４〜６）又は２つの異なるＤＣＸ変異体（レーン２及び３）を過剰発現するＣＯＳ−１細胞の溶解物のウェスタンブロット分析。
【０１０１】
（Ｂ）：胚形成期におけるＤＣＬ及びＤＣＸタンパク質の発現。日齢ＥＤ８〜ＥＤ１８の胚脳画分及び成熟脳の免疫ブロットを、抗ＤＣＬＫ及び抗ＤＣＸを用いて染色した。ＣＡＲＰ／ＤＣＬ抗体のための陽性対象として、ＤＣＬを過剰発現するＣＯＳ−１細胞の抽出物を使用した。
【０１０２】
（Ｃ）：様々な成熟脳領域におけるＤＣＬ及びＤＣＸのウェスタンブロット分析。１：ＥＤ１２の頭（陽性対照）、Ｍ：分子量マーカー、２：小脳、３：脳幹、４：視床下部、５：大脳皮質、６：海馬、７：嗅球。
【０１０３】
[図４]胚脳においてＤＣＬ発現が局在及び発生する図である。
【図４（Ｉ）】Ｉ：胚期（ＥＤ）８日目（パネルＡ）の脳の横断面のインサイツのハイブリッド形成及びＥＤ１０及びＥＤ１２における矢状断面（それぞれパネルＢ及びＣ）。ＥＤ８及びＥＤ１０について、シグナルは低いが、ＥＤ１２において大幅に増加した。略称：ｄｉ-間脳（diencephalon）、ｌｖ−側脳室（lateral ventricle）、ｍｅ−中脳（mesencephalon）；ｍｏ−延髄（medulla oblongata)、ｍｔ−小脳（metencephalon）、ｍｖ−中脳胞（mesenchephalic vesicle）、ｎｃ−新皮質（neopallial cortex）、ｎｅ−神経上皮（neuroepithelium）、ｒｈ−菱脳（rhombencephalon）、ｔｅ−終脳（telencephalon）、ｔｖ−終脳胞（telencephalic vesicle）、IV  ｖ−第４脳室（4th ventricle）。スケールバー：１ｍｍ；曝露時間：１４日）。
【図４（ＩＩ）】II：初期マウス神経上皮におけるＤＣＬタンパク質の分布。
【０１０４】
Ａ：ＥＤ１１におけるＤＣＬタンパク質の分布（矢状断面）。染色は増殖領域に限定され（左側及び右側がそれぞれ終脳及び間脳）、軟膜（pia）に近接する外層並びに内部脳室域に染色が見出される（矢頭：下の高度な拡大図をさらに参照されたし）、一方第一鰓弓の下顎の要素（Ｍ）などの非神経組織は、どのようなシグナルもない。IV：第４脳室、バーは１５０μｍを表す。
【０１０５】
Ｂ＋Ｃ：ＤＣＸ（Ｂ）及びＤＣＬ（Ｃ）に関して免疫染色した、ＥＤ９における初期神経上皮からの隣接する横（冠状）断面。ＤＣＸの染色は観察されないが（Ｂにおける矢頭）、ＤＣＬは内部上衣（上の２つの矢印）と外部辺縁部（下の矢印）の両方においてすでに発現している。バーは２５μｍを表す。
【０１０６】
Ｄ：ＥＤ１１における神経管の神経上皮の矢状断面であり、内腔の境（矢頭）で豊富な発現を示し、一方発達中の神経組織、単離分裂細胞は同様に免疫陽性である（矢印）。Ｌは神経管の神経内腔を示す。バーは７０μｍを表す。
【０１０７】
Ｅ：神経上皮におけるＤＣＬ免疫陽性有糸分裂細胞の詳細。正中開裂面に向かう染色体（矢頭）が明らかである。バーは３μｍを表す。
【０１０８】
Ｆ：ＥＤ１０における終脳の神経上皮の概観であり、脳室（上衣）層（左側の矢頭）及び辺縁／皮質板帯（右側の矢頭）上においてＤＣＬの発現を示す。中間帯における分裂細胞の２つの免疫陽性ダブレット（矢印）を見ることができる。バーは、１５μｍを表す。
【０１０９】
Ｇ＋Ｈ：皮質神経上皮の横断面であり、分化した、まだ部分的に重複した、ＤＣＸ及びＤＣＬの分布を例示している。ＤＣＸは、ＥＤ１１まで発現せず（Ｇ）、主に皮質神経上皮の皮質板及び辺縁／皮質板領域（矢印）の最上部において発現する。対照的に、ＤＣＬはＥＤ９においてすでに発現し（Ｈ）、特に脳室（上衣）層において高レベルであり（左側の矢頭）、中間帯及び辺縁帯において低レベルである（右側の矢頭）。脳室層（Ｇにおける星印）がＤＣＸのシグナルを欠いていることに留意されたし。バーは５μｍを表す。
【０１１０】
Ｉ：ＥＤ９における脳室帯の上衣層の詳細であり、神経上皮から中間帯へ伸長した繊維におけるＤＣＬの発現を示している（矢印）。バーは１２μｍを表す。
【０１１１】
Ｊ：上衣層の詳細であり、内腔に隣接する、終期（左）、後期（中間）の分裂神経上皮細胞において明らかな免疫活性を示し、一方前期半ばのＤＣＬ陽性細胞が、内腔（右）から離れて移動しながら垂直に分裂して出現するのを（矢頭）見ることができる。バーは８μｍを表す。
【０１１２】
Ｋ：ＥＤ１１における上衣層、前期及び終期の細胞（矢頭）、並びに中期／後期の芽球様細胞（矢印）におけるＤＣＬ免疫反応性。バーは、１０μｍを表す。
【０１１３】
Ｌ：上衣層における２個のＤＣＬ免疫陽性有糸分裂細胞であり、中心体様構造（下の矢印）においてもさらに激しい免疫反応性を示している。バーは１．５μｍを表す。
【０１１４】
Ｍ＋Ｎ：後期II／終期II（Ｍ）及び中期／後期Ｉにある、２個のＤＣＬ免疫陽性の分裂細胞の例であり、染色体がはっきり見ることができ（矢印）、同時にいくつかの微小管染色が観察される（矢頭）。バーは１μｍを表す。
【０１１５】
[図５]神経芽細胞腫細胞におけるＤＣＬ発現の図である。
【図５】パネルＩ：Ａ：ＤＣＬは、いくつかの神経芽細胞腫細胞系において内因性の発現をする。ＤＣＬ陽性細胞系に関する、ウェスタンブロット分析によるスクリーニング。レーン１：ＣＯＳ−１細胞、レーン２：Ｈｅｌａ細胞、レーン３：ＮＧ１０８−１５細胞、レーン４：ＮＳ２０Ｙ細胞、レーン５：Ｎ１Ｅ−１１５細胞、レーン６：分子量マーカー、レーン７：ＳＨＳＹ５細胞。ＤＣＬが神経芽細胞腫細胞系において発現する（レーン３、４、５及び７）が、非神経起源由来の細胞系においては発現しない（レーン１及び２）ことに留意されたし。
【０１１６】
Ｂ：ＤＣＬはリンタンパク質である。抗ＤＣＬを用いて染色したＮＧ１０８−１５の溶解物。レーン１：未処理溶解物、レーン２：ホスファターゼなしで３７℃においてインキュベートした溶解物、レーン３：ホスファターゼと共に３７℃においてインキュベートした溶解物。レーン４〜６は１〜３と同様であるが、ＤＣＬは過剰発現である。レーン４〜６において内在性ＤＣＬが、過剰発現したＤＣＬと一緒に共移動することに留意されたし。
【０１１７】
パネルII：
２連で実施した、ｓｉＲＮＡ処理を施したＮ１Ｅ−１１５細胞（１〜３）及び施さなかった細胞（４）において発現したＤＣＬのウェスタンブロット分析。ＤＣＬを標的とする３種の異なるｓｉＲＮＡ分子：ｓｉＤＣＬ−１（レーン１）、ｓｉＤＣＬ−２（レーン２）及びｓｉＤＣＬ−３（レーン３）を使用した。ｓｉＤＣＬ−２及びｓｉＤＣＬ−３が効果的にノックダウンを引き起こす一方、ｓｉＤＣＬ−１は同様にはできかったことに留意されたし。対照として、同じ膜をα−チューブリンを用いて再染色した。
【０１１８】
パネルIII：
ＤＣＬのノックダウンにより、中間期に微小管細胞骨格の弛緩を引き起こす。抗ＤＣＬＫ（緑）染色は、斑紋型を含み、これらは未処理細胞（Ａ〜Ｃ）において核の近くで最も顕著である（Ａ）。このパターンは、ｓｉＤＣＬ−１（Ｄ）には影響されないが、抗ＤＣＬＫはｓｉＤＣＬ−３によりノックダウンされた有効なＤＣＬによっては、殆ど染色されない（Ｇ）。α−チューブリン染色（Ｂ、Ｅ及びＨ）により示されるように、細胞骨格は未処理細胞（Ｂ）及びｓｉＤＣＬ−１を用いて処理した細胞（Ｅ）において、良好な迷路構造を有するが、ｓｉＤＣＬ−３により非常に弛緩している。ＤＣＬ及びα−チューブリン染色を統合した図により、未処理細胞（Ｃ）、ｓｉＤＣＬ−１を形質移入した細胞（Ｆ）及びｓｉＤＣＬ−３を形質移入した細胞（Ｉ）を示す。緑＝ＤＣＬ、赤＝α−チューブリン、黄色＝ＤＣＬ及びα−チューブリンの共局在。スケールバーは１０μｍである。
【図５（ＩＶ）】パネルIV：  ＤＣＬノックダウンは中心体の構造に影響を与えない。抗γチューブリン染色（Ｂ、Ｅ及びＨ）により示されるように、斑紋型抗ＤＣＬＫ染色（Ａ、Ｄ、Ｇ）は、中心体の周りに非常に集中しており（Ａ、Ｄ）、ＤＣＬの効果的ノックダウン（Ｇ）は、中心体の構造又は形態に明らかな変化を引き起こさない（Ｉ）。未処理細胞（Ｃ）、ｓｉＤＣＬ−１を形質移入した細胞（Ｆ）及びｓｉＤＣＬ−３を形質移入した細胞（Ｉ）の、ＤＣＬ及びα−チューブリン染色を統合した図を示す。緑＝ＤＣＬ、赤＝γ−チューブリン、黄色＝ＤＣＬ及びγ−チューブリンの共局在。スケールバーは１０μｍである。
【図６】ＤＣＬのノックアウトが紡錘体の変形を引き起こす図である。未処理細胞（Ａ〜Ｃ）において、ＤＣＬ（Ａ）はα−チューブリン（Ｂ）と大いに共局在する。統合図（Ｃ）は、ＤＣＬが動原体に存在することを示す（矢印）。ｓｉＤＣＬ−１を形質移入する（Ｄ〜Ｆ）ことにより、ＤＣＬのノックダウンは引き起こされず（Ｄ）、α−チューブリン染色によって示されるように紡錘体の形態もまた変化しなかった（Ｅ）。ｓｉＤＣＬ−２による効果的なＤＣＬのノックダウン（Ｇ〜Ｉ）又はｓｉＤＣＬ−３による効果的なＤＣＬのノックダウン（Ｊ〜Ｌ）は、α−チューブリン染色により示されるように、ＤＣＬの消失（Ｇ、Ｊ）及び紡錘体の消失（Ｈ）及び変形（Ｋ）を引き起こす。緑＝ＤＣＬ、赤＝α−チューブリン、黄色＝ＤＣＬ及びα−チューブリンの共局在。スケールバーは１０μｍである。
【図７】分裂ＣＯＳ−１細胞におけるＤＣＬの過剰発現の図である。
【０１１９】
Ａ〜Ｃ：ＤＣＬの過剰発現の免疫細胞化学的分析。α−チューブリンを用いて染色した正常な分裂ＣＯＳ−１細胞を対照（ｒｅｆ）として示す。ＤＣＬの過剰発現（緑、Ａ）は、α−チューブリンを用いた共染色により示されるように紡錘体の伸長を引き起こす（Ｂ）。矢印で示すように、形質移入された細胞と形質移入しなかった細胞の紡錘体の長さの違いに留意されたし。ＤＮＡはＤＡＰＩ（青）を用いて染色する（青）。
【０１２０】
Ｄ〜Ｉ：細胞分裂期のＣＯＳ−１細胞におけるＤＣＬの過剰発現の共焦点顕微鏡検査。１つの表現型が、ＤＣＬ（Ｄ）がα−チューブリンと大いに共局在する（Ｅ）野生型ＣＯＳ−１細胞に似ている（Ｄ〜Ｆ）。分裂Ｎ１Ｅ−１１５細胞におけるＤＣＬの内因性局在と同様に、ＤＣＬは動原体にもまた局在化する。ＤＣＬの局在は緑で示し、これはα−チューブリン染色（赤）により示されるように紡錘体と重複する。観察された他の表現型は、紡錘体の伸長及び配向性の変化を引き起こす（Ｇ〜Ｉ）。緑＝ＤＣＬ（Ａ、Ｄ、Ｇ）、赤＝α−チューブリン（Ｂ、Ｅ、Ｈ）、黄色＝ＤＣＬ及びα−チューブリンの共局在（Ｃ、Ｆ、Ｉ）。スケールバーは１０μｍである。
【０１２１】
[配列表]
Dcl 及び DCL配列
［配列番号１］
ccacgcgtcc gcggagaacc gcatttcaat gaggaccagc tccagcgcat cagtgcacta    
gcggtcgcag cttccagacg ctcgtgctcc gcagccccag ccgcgcccag cccggcgagg    
acagctccag cagccggcca cagacaaccc agcctccacc cgcgaccggt tccataagca    
agccagccat gtcgttcggc agagatatgg agttggagca ttttgatgag cgggacaagg    
cgcagaggta cagcaggggg tcccgtgtga atggcctgcc cagccccaca cacagcgccc    
actgcagctt ctaccgcacc cgcaccctgc agacactcag ctccgagaag aaagccaaga    
aggttcgatt ctacagaaat ggtgaccgct acttcaaagg aattgtgtat gccatctccc    
cagaccgctt cagatctttc gaggccctgc tggctgattt gacccgaact ctctcggata    
atgtgaattt gccccagggg gtgagaacca tctacaccat cgatggactc aagaagatct    
ccagcctgga ccagctggtg gaaggtgaaa gctatgtctg cggctccatc gagcccttta    
agaagctgga gtacaccaag aatgtgaacc ccaactggtc agtgaacgtc aagaccacct    
cagcctcccg cgcagtgtct tctttggcca ctgccaaggg tgggccttcg gaggttcggg    
agaataagga tttcattcga cccaagctgg tcaccatcat cagaagtggg gtgaagccac    
ggaaggctgt cagaatcctg ctgaacaaga agacggctca ctccttcgag caggttctca    
ctgacattac cgacgctatc aagctggact ccggtgtggt gaagcgcctg tacactctgg    
atgggaagca ggtgatgtgc cttcaggact tttttggtga cgatgacatt tttattgcat    
gtggaccaga gaagttccgt taccaggatg atttcttgct agatgaaagt gaatgtcgag   
tggtgaaatc aacttcttac accaaaatag catcagcgtc ccgcagaggc acaaccaaga   
gcccaggacc ttcccggaga agcaagtccc cagcctccac cagctcagtt aatggaaccc   
ctggtagtca gctctctact ccacgctcgg gcaagtcacc aagtccatca cccaccagcc   
caggaagcct gcggaagcag agggacctgt accgccccct ctcgtcggat gatttggact   
caggagactc agtgtaagaa ttc                                           
［配列番号２］
gcacatccct gcactagtgg ccgcaaccga gacgccgcgc tccagcagct gctgccgccc     
agcccggccc cgccgccgcc ccccagccct gcagccccgc agccccggcc gcgcccagcc    
cggcgaggac agcaccagga ggcggccccc agcgcggcca caaagacccc cggcggcgtc    
tctccgcgga ccggtcctac ttgaagtcca tcatgtcctt cggcagagac atggagctgg    
agcacttcga cgagcgggat aaggcgcaga gatacagccg agggtcgcgg gtgaacggcc    
tgccgagccc gacgcacagc gcccactgca gcttctaccg cacccgcacg ctgcagacgc    
tcagctccga gaagaaggcc aagaaagttc gtttctatcg aaacggagat cgatacttca    
aagggattgt gtatgccatc tccccagacc ggttccgatc ttttgaggcc ctgctggctg    
atttgacccg aactctgtcg gataacgtga atttgcccca gggagtgaga acaatctaca    
ccattgatgg gctcaagaag atttccagcc tggaccaact ggtggaagga gagagttatg    
tatgtggctc catagagccc ttcaagaaac tggagtacac caagaatgtg aaccccaact    
ggtcggtgaa cgtcaagacc acctcggctt ctcgggcagt gtcttcactg gccactgcca    
aaggaagccc ttcagaggtg cgagagaata aggatttcat tcggcccaag ctggtcacca    
tcatcagaag tggcgtgaag ccacggaaag ctgtcaggat tctgctgaac aagaaaacgg    
ctcattcctt tgagcaggtc ctcaccgata tcaccgatgc catcaagctg gactcgggag    
tggtgaaacg cctgtacacg ttggatggga aacaggtgat gtgccttcag gacttttttg    
gtgatgatga catttttatt gcatgtggac cggagaagtt ccgttaccag gatgatttct   
tgctagatga aagtgaatgt cgagtggtaa agtccacttc ttacaccaaa atagcttcat   
catcccgcag gagcaccacc aagagcccag gaccgtccag gcgtagcaag tcccctgcct   
ccaccagctc agttaatgga acccctggta gtcagctctc tactccgcgc tcaggcaagt   
cgccaagccc atcacccacc agcccaggaa gcctgcggaa gcagagggac ctgtaccgcc   
ccctctcttc ggatgacttg gattcagtag gagactcagt gtaaaagaaa              
［配列番号３］
Met Ser Phe Gly Arg Asp Met Glu Leu Glu His Phe Asp Glu Arg Asp 
1               5                   10                  15      
Lys Ala Gln Arg Tyr Ser Arg Gly Ser Arg Val Asn Gly Leu Pro Ser 
20                  25                  30          
Pro Thr His Ser AlaHis Cys Ser Phe Tyr Arg Thr Arg Thr Leu Gln 
35                  40                  45              
Thr Leu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Lys Lys Val Arg Phe Tyr Arg Asn 
50                  55                  60                  
Gly Asp Arg Tyr Phe Lys Gly Ile Val Tyr Ala Ile Ser Pro Asp Arg 
65                  70                  75                  80  
Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu Ala Asp Leu Thr Arg Thr Leu Ser 
85                  90                  95      
Asp Asn Val Asn Leu Pro Gln Gly Val Arg Thr Ile Tyr Thr Ile Asp 
100                 105                 110         
Gly Leu Lys Lys Ile Ser Ser Leu Asp Gln Leu Val Glu Gly Glu Ser 
115                 120                 125             
Tyr Val Cys Gly Ser Ile Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr Thr Lys 
130                 135                 140                 
Asn Val Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser Ala Ser 
145                 150                 155                 160 
Arg Ala Val Ser Ser Leu Ala Thr AlaLys Gly Gly Pro Ser Glu Val 
165                 170                 175     
Arg Glu Asn Lys Asp Phe Ile Arg Pro LysLeu Val Thr Ile Ile Arg 
180                 185                 190         
Ser Gly Val Lys Pro Arg Lys Ala Val Arg Ile Leu Leu Asn Lys Lys 
195                 200                 205             
Thr Ala His Ser Phe Glu Gln Val Leu Thr Asp Ile Thr Asp Ala Ile 
210                 215                 220                 
Lys Leu Asp Ser Gly Val Val Lys Arg Leu Tyr Thr Leu Asp Gly Lys 
225                 230                 235                 240 
Gln Val Met Cys Leu Gln Asp Phe Phe Gly Asp Asp Asp Ile Phe Ile 
245                 250                 255     
Ala Cys Gly Pro Glu Lys Phe Arg Tyr Gln Asp Asp Phe Leu Leu Asp 
260                 265                 270         
Glu Ser Glu Cys Arg Val Val Lys Ser Thr Ser Tyr Thr Lys Ile Ala 
275                 280                 285             
Ser Ala Ser Arg Arg Gly Thr Thr Lys Ser Pro Gly Pro Ser Arg Arg 
290                 295                 300                 
Ser Lys Ser Pro AlaSer Thr Ser Ser Val Asn Gly Thr Pro Gly Ser 
305                 310                 315                 320 
Gln Leu Ser Thr Pro Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr 
325                 330                 335     
Ser Pro Gly Ser Leu Arg Lys Gln Arg Asp Leu Tyr Arg Pro Leu Ser 
340                 345                 350         
Ser Asp Asp Leu Asp Ser Gly Asp Ser Val 
355                 360         
［配列番号４］
Met Ser Phe Gly Arg Asp Met Glu Leu Glu His Phe Asp Glu Arg Asp 
1               5                   10                  15      
Lys Ala Gln Arg Tyr Ser Arg Gly Ser Arg Val Asn Gly Leu Pro Ser 
20                  25                  30          
Pro Thr His Ser AlaHis Cys Ser Phe Tyr Arg Thr Arg Thr Leu Gln 
35                  40                  45              
Thr Leu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Lys Lys Val Arg Phe Tyr Arg Asn 
50                  55                  60                  
Gly Asp Arg Tyr Phe Lys Gly Ile Val Tyr Ala Ile Ser Pro Asp Arg 
65                  70                  75                  80  
Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu Ala Asp Leu Thr Arg Thr Leu Ser 
85                  90                  95      
Asp Asn Val Asn Leu Pro Gln Gly Val Arg Thr Ile Tyr Thr Ile Asp 
100                 105                 110         
Gly Leu Lys Lys Ile Ser Ser Leu Asp Gln Leu Val Glu Gly Glu Ser 
115                 120                 125             
Tyr Val Cys Gly Ser Ile Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr Thr Lys 
130                 135                 140                 
Asn Val Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser Ala Ser 
145                 150                 155                 160 
Arg Ala Val Ser Ser Leu Ala Thr AlaLys Gly Ser Pro Ser Glu Val 
165                 170                 175     
Arg Glu Asn Lys Asp Phe Ile Arg Pro LysLeu Val Thr Ile Ile Arg 
180                 185                 190         
Ser Gly Val Lys Pro Arg Lys Ala Val Arg Ile Leu Leu Asn Lys Lys 
195                 200                 205             
Thr Ala His Ser Phe Glu Gln Val Leu Thr Asp Ile Thr Asp Ala Ile 
210                 215                 220                 
Lys Leu Asp Ser Gly Val Val Lys Arg Leu Tyr Thr Leu Asp Gly Lys 
225                 230                 235                 240 
Gln Val Met Cys Leu Gln Asp Phe Phe Gly Asp Asp Asp Ile Phe Ile 
245                 250                 255     
Ala Cys Gly Pro Glu Lys Phe Arg Tyr Gln Asp Asp Phe Leu Leu Asp 
260                 265                 270         
Glu Ser Glu Cys Arg Val Val Lys Ser Thr Ser Tyr Thr Lys Ile Ala 
275                 280                 285             
Ser Ser Ser Arg Arg Ser Thr Thr Lys Ser Pro Gly Pro Ser Arg Arg 
290                 295                 300                 
Ser Lys Ser Pro AlaSer Thr Ser Ser Val Asn Gly Thr Pro Gly Ser 
305                 310                 315                 320 
Gln Leu Ser Thr Pro Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr 
325                 330                 335     
Ser Pro Gly Ser Leu Arg Lys Gln Arg Asp Leu Tyr Arg Pro Leu Ser 
340                 345                 350         
Ser Asp Asp Leu Asp Ser Val Gly Asp Ser Val 
355                 360           
【図１ａ】
2009524426.tif 000002
【図１ｂ】
2009524426.tif 000003
【図２】
2009524426.tif 000004
【図３】
2009524426.tif 000005
【図４（Ｉ）】
2009524426.tif 000006
【図４（ＩＩ）】
2009524426.tif 000007
【図５】
2009524426.tif 000008
【図５（ＩＶ）】
2009524426.tif 000009
【図６】
2009524426.tif 000010
【図７】
2009524426.tif 000011
【配列表】
2009524426000001.app
【国際調査報告】
2009524426.tif 000012
2009524426.tif 000013
2009524426.tif 000014
2009524426.tif 000015