(57)【要約】  本発明は、最上部表面に凹部形成された少なくとも１つ、好ましくは複数の細胞反発性区画を有するヒドロゲル基材を含む細胞凝集デバイスである。各区画は、開口最上部部分および底部部分を有する上部細胞懸濁播種チャンバー、ならびにポートによって上部細胞懸濁播種チャンバーの底部部分に連結された１つまたは１つより多くの下部細胞凝集凹部から構成される。ポートの直径はチャンバーの壁および凹部の壁と十分に連続し得るか、またはポートの直径はチャンバーの壁より狭いが凹部の壁と十分に連続するかあるいはチャンバーの壁および凹部の壁の両方よりも狭い。上部細胞懸濁播種チャンバーは、重力を介して下部細胞凝集凹部に細胞を集めるように形成および配置される。凝集凹部は、最小重力エネルギーの有限領域に細胞を一体化することによって細胞凝集を促進するように形成および配置され、細胞間接触を増大し、かつ基材への細胞結合を最小限にするかまたは妨げる。生細胞の凝集を封入するためのデバイスが提供される。デバイスは、（i）基材から広がる１つ以上の生体適合性で生体持続可能な、離間された細胞封入区画から構成された細胞封入面を有する生体適合性で生体持続可能な基材、ならびに（ii）基材および細胞封入区画を完全に取り囲む生体適合性で生体持続可能なポリマーから構成されるコーティング層を含む。デバイスを作製するための方法も提供される。
2009524414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上部表面および下部表面を有し、かつ該上部表面に少なくとも部分的に凹部形成された少なくとも1つの区画を有する生体適合性ポリマーヒドロゲル基材を含む細胞凝集デバイスであって、該区画は上部細胞懸濁播種チャンバー、少なくとも1つの下部細胞凝集凹部およびこれらの間に広がるポートから構成され、該上部細胞懸濁播種チャンバーは、重力を介して該下部細胞凝集凹部に細胞を集めるように形成および配置され、該下部細胞凝集凹部は、細胞反発性ヒドロゲルから構成され、かつ最小重力エネルギーの有限領域に該細胞を一体化するように形成および配置される、細胞凝集デバイス。
【請求項２】
該区画が実質的に十分に該ヒドロゲルに凹部形成される、請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
該上部細胞播種チャンバーは実質的に垂直に置かれる壁、該壁の最上部縁での実質的な開口によって規定され、該下部細胞凝集凹部は該播種チャンバー壁に依存し、該最小重力エネルギーの領域で終わる実質的に垂直に置かれる壁によって規定される、請求項２記載のデバイス。
【請求項４】
該上部細胞播種チャンバーが細胞反発性／非細胞接着性ヒドロゲルから構成される、請求項３記載のデバイス。
【請求項５】
該区画が複数の下部細胞凝集凹部および複数のポートから構成され、各ポートは該上部細胞播種チャンバーと該複数の下部細胞凝集凹部の単一凝集凹部との間に広がる、請求項４記載のデバイス。
【請求項６】
該ヒドロゲル基材は少なくとも部分的にその上部表面に凹部形成された複数の区画を有し、該区画のそれぞれは上部細胞懸濁播種チャンバー、少なくとも１つの下部細胞凝集凹部およびそれらの間に広がるポートから構成され、該上部細胞懸濁播種チャンバーは重力を介して該下部細胞凝集凹部に細胞を集めるように形成および配置され、該下部細胞凝集凹部は細胞反発性ヒドロゲルから構成され、かつ最小重力エネルギーの有限領域に該細胞を一体化するように形成および配置される、請求項１記載のデバイス。
【請求項７】
該区画のそれぞれが複数の下部細胞凝集凹部および複数のポートから構成され、各ポートは該上部細胞播種チャンバーと該複数の下部細胞凝集凹部の単一凝集凹部との間に広がる、請求項６記載のデバイス。
【請求項８】
該最小重力エネルギーの領域が、約2000ミクロン以下の最短軸の幅を有する小さく、平らな表面である、請求項４記載のデバイス。
【請求項９】
該最小重力エネルギーの領域が、凹表面、点で終わるテーパー表面または楔型テーパー表面からなる群より選択される、請求項４記載のデバイス。
【請求項１０】
該ヒドロゲル基材がポリアクリルアミドまたはアガロースから構成される、請求項９記載のデバイス。
【請求項１１】
該上部細胞播種チャンバーおよび該下部細胞凝集凹部のそれぞれが、少なくとも500ミクロンの深さを有し、該上部細胞播種チャンバーは最短寸法で少なくとも2mmの幅を有し、該下部細胞凝集凹部は20〜5000μｍの幅を有する、請求項１０記載のデバイス。
【請求項１２】
該上部細胞播種チャンバーの該深さが約1000〜約2000μｍであり、該下部細胞凝集凹部の該深さが約500〜約1000μｍであり、該下部細胞凝集凹部の該幅が約200〜600μｍである、請求項１０記載のデバイス。
【請求項１３】
請求項１〜１２いずれか記載の細胞凝集デバイスを作製するための鋳型。
【請求項１４】
請求項１〜１２いずれか記載の細胞凝集デバイスの上部細胞播種チャンバーに複数の細胞を堆積する工程、細胞が凝集できるように十分な時間該細胞をインキュベートする工程、および該デバイスから凝集細胞を除去する工程を含む、細胞を凝集する方法。
【請求項１５】
選択された凝集修飾剤を細胞に添加する工程を更に含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該細胞が、骨芽細胞、ケラチン生成細胞、メラニン形成細胞、肝細胞、グリア細胞、すい臓β細胞、すい臓外分泌細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、脊髄前駆細胞、神経細胞、乳腺細胞、唾液腺細胞、腎臓糸球体内皮細胞、管状内皮細胞、副腎皮質および副腎髄質細胞、心筋細胞、軟骨細胞、骨格筋および平滑筋細胞、脂肪および脂肪前駆細胞、角膜および水晶体細胞、胚性網膜細胞、血管細胞、内皮細胞、骨髄間質細胞、リンパ球、筋肉細胞（平滑、骨格、心臓）、結合組織細胞（線維芽細胞、単球、肥満細胞、顆粒細胞、形質細胞、破骨細胞、骨細胞、軟骨細胞）、上皮細胞（皮膚、胃腸管、尿管、もしくは生殖管由来、または肝臓、すい臓、もしくは脾臓由来の器官上皮細胞）、神経系細胞（グリア、神経、アストロサイト）ならびに胚性、非胚性および造血性哺乳動物幹細胞からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
請求項１４記載の方法によって凝集される細胞。
【請求項１８】
細胞凝集デバイスの寸法に対応する寸法を有する鋳型を提供する工程、該鋳型にヒドロゲルプレポリマーの溶液を注入する工程、該溶液を重合させる工程、および該鋳型から固体ヒドロゲル基材を除去する工程を含む、請求項１〜１２いずれか記載の細胞凝集デバイスを作製する方法。
【請求項１９】
ヒドロゲルプレポリマーの溶液がアガロースまたはアクリルアミド／ビスアクリルアミンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
（i）基材から広がる１つ以上の生体適合性で生体持続可能な、離間された細胞封入区画から構成された細胞封入面を有する生体適合性で生体持続可能な基材、ならびに
(ii)基材および細胞封入区画を完全に取り囲む生体適合性で生体持続可能なポリマーから構成される少なくとも1つのコーティング層
を含む、生細胞の凝集を封入するための封入デバイス。
【請求項２１】
基材は該1つ以上の離間された細胞封入区画を支持するのに十分な厚さを有する実質的に平らなシート物質を含み、該1つ以上の離間された細胞封入区画は、マイクロアレイにおいておよそ規則正しい間隔で実質的に平らなシートの１つの表面上に全体的に配置および堆積された複数の細胞封入区画を含む、請求項２０記載のデバイス。
【請求項２２】
該基材が請求項１〜１０いずれか記載の細胞凝集デバイスを含む、請求項２０記載のデバイス。
【請求項２３】
基材が約100〜約1000μｌの範囲の厚さを有する、請求項２１〜２２いずれか記載のデバイス。
【請求項２４】
基材および区画がマンヌロン酸に対するグルロン酸の実質的に等しい比を有する架橋アルギネートから構成される、請求項２１〜２２いずれか記載のデバイス。
【請求項２５】
コーティング層がポリ-L-リジン（PLL）から構成される、請求項２４記載のデバイス。
【請求項２６】
コーティング層が約1〜約50ミクロンの範囲の厚さを有する、請求項２５記載のデバイス。
【請求項２７】
(i)上部細胞播種チャンバーおよび下部細胞凝集凹部から構成される細胞凝集デバイスの上部細胞播種チャンバーに複数の細胞を堆積する工程、(ii)細胞が細胞凝集凹部で凝集できるように十分な時間該細胞をインキュベートする工程、(iii)上部細胞播種チャンバーに凝集封入基材物質を堆積する工程、（iv）一体化基材を形成するための基材物質および基材の１つの面から広がる1つ以上の細胞凝集封入区画を硬化させてマイクロアレイを形成する工程、（v）細胞凝集デバイスからマイクロアレイを形成する硬化された基材および一体化細胞凝集封入区画を除去する工程、(vi)生体適合性で生体持続可能なポリマー物質の溶液中にマイクロアレイを浸漬してコーティング層を形成する工程、ならびに(vii)コーティング層を形成させるために該溶液からマイクロアレイを除去する工程を含む、封入された凝集生細胞を作製する方法。
【請求項２８】
選択された凝集修飾剤を細胞に添加する工程を更に含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
請求項１記載のデバイスに封入された凝集生細胞。
【請求項３０】
凝集細胞が、骨芽細胞、ケラチン生成細胞、メラニン形成細胞、肝細胞、グリア細胞、すい臓β細胞、すい臓外分泌細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、脊髄前駆細胞、神経細胞、乳腺細胞、唾液腺細胞、腎臓糸球体内皮細胞、管状内皮細胞、副腎皮質および副腎髄質細胞、心筋細胞、軟骨細胞、骨格筋および平滑筋細胞、脂肪および脂肪前駆細胞、角膜および水晶体細胞、胚性網膜細胞、血管細胞、内皮細胞、骨髄間質細胞、リンパ球、筋肉細胞（平滑、骨格、心臓）、結合組織細胞（線維芽細胞、単球、肥満細胞、顆粒細胞、形質細胞、破骨細胞、骨細胞、軟骨細胞）、上皮細胞（皮膚、胃腸管、尿管、もしくは生殖管由来、または肝臓、すい臓、もしくは脾臓由来の器官上皮細胞）、神経系細胞（グリア、神経、アストロサイト）ならびに胚性、非胚性および造血性哺乳動物幹細胞ならびにこれらの細胞の任意の数および／または種類の凝集の混合物からなる群より選択される、請求項２９記載の細胞。
【請求項３１】
請求項２８記載の方法によって封入された凝集生細胞。
【請求項３２】
凝集細胞が、骨芽細胞、ケラチン生成細胞、メラニン形成細胞、肝細胞、グリア細胞、すい臓β細胞、すい臓外分泌細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、脊髄前駆細胞、神経細胞、乳腺細胞、唾液腺細胞、腎臓糸球体内皮細胞、管状内皮細胞、副腎皮質および副腎髄質細胞、心筋細胞、軟骨細胞、骨格筋および平滑筋細胞、脂肪および脂肪前駆細胞、角膜および水晶体細胞、胚性網膜細胞、血管細胞、内皮細胞、骨髄間質細胞、リンパ球、筋肉細胞（平滑、骨格、心臓）、結合組織細胞（線維芽細胞、単球、肥満細胞、顆粒細胞、形質細胞、破骨細胞、骨細胞、軟骨細胞）、上皮細胞（皮膚、胃腸管、尿管、もしくは生殖管由来、または肝臓、すい臓、もしくは脾臓由来の器官上皮細胞）、神経系細胞（グリア、神経、アストロサイト）、胚性、非胚性および造血性哺乳動物幹細胞、ならびにこれらの細胞の任意の数および／または種類の凝集の混合物からなる群より選択される、請求項３１記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞培養及び生体組織工学及び再構築技術に有用な細胞培養凝集及び封入デバイス及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細胞及び細胞集団の実験室研究は、ベンチトップで細胞のネイティブな環境を再現することができないことにより妨げられている。例えば、マイクロタイタープレート上に置かれた胚性幹細胞は、制御され、かつ再現性のある様式で均一な胚様体に凝集せず；これらはプレートの底部表面全体にわたって増殖する。単層で培養される細胞とは異なって、凝集した細胞は、インビボでの形態を保持し、結果として、より多くのシグナル伝達因子を生み出す傾向がある。これらの性質によって、凝集体は細胞-細胞結合を介して形成されるために、アノイキス(anoikis)の可能性が大いに減少し、凝集体が有意に長期にわたって生存可能のままであることを可能にする。凝集体は、細胞が互いに近接して密集されることを可能にする。従って、マイクロカプセル中の体積に対する細胞の比率は、より大きい。また、凝集細胞は、より多くのシグナル伝達因子及び標的タンパク質を生成するため、スケールアップが達成可能である。
【０００３】
現在、細胞を凝集させるために2つの主要技術が使用されている。懸滴技術において、細胞を含む細胞培養液体培地がスライドに適用され、次いで反転される。反転によって、細胞を含む培養培地の滴が固体表面と接触せずに下方に沈む。細胞は接着する固体表面を有さないために、これらは凝集し、幹細胞の場合には、まるでこれらがインビボで存在するように胚様体を形成し、滴の表面張力によって滴からの細胞の漏れを妨げる。技術の概説及び記載として、KelmおよびFussenegger,Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly, TRENDS in Biotechnology 22: 195-202(2004)を参照。懸滴技術の不都合は、スケールアップして、並行して（すなわち、アレイにおいて）多数の滴を吊るす困難性のために技術が不首尾であり、小体積が必要とされることである。別の不都合は、培養培地の組成を補充もしくは変更すること、またはこれらの懸滴中の凝集体に新しい細胞を添加することが困難であることである。規定された体積の液体を上から基部に適用し、次いで反転して滴を吊るすトップローディングはアレイ問題を解決しないが方法をいくらか改善する結果、さらに、該技術は非常に労働集約型である。
【０００４】
攪拌培養技術では、細胞が培養培地中に置かれ、スピンまたは活性的に混合される。凝集体の形成に導く適切な混合速度は、実験で決定されなければならない：非常に速い場合は、細胞が傷害を受け得るか、あるいは凝集体が過剰に大きくなり得る。さらに、得られた細胞凝集体の大きさは、制御できないが、生存可能であり、結果はまれに再現性がある。さらに、細胞が混合プロセス中に重大なせん断力に供される。せん断力は、細胞挙動および細胞応答に影響を及ぼすことが公知である。また、比較的弱い細胞間接着を有する細胞は、この高いせん断環境において、凝集体を容易に形成し得ない。
【０００５】
分裂し、次に凝集体を形成する細胞に限定される1つのさらなる公知の方法は、メチルセルロースまたは軟寒天における細胞培養である。細胞の懸濁液は、メチルセルロースまたは溶融した軟寒天中に懸濁され、細胞は、粘性メチルセルロースまたはゲル化軟寒天内の様々でランダムなｘ、ｙおよびｚ位置に捕捉される。細胞は、これらのマトリックス内で懸濁され、隣接する細胞と相互作用することができず、凝集体を形成する。これらの細胞のみ、特に増殖し得る癌性細胞または前癌性細胞は、これらが増殖するにつれて、これらが細胞の凝集体に増殖するという事実によって凝集体を形成する。細胞は粘性ゲル様メチルセルロースまたはゲル化軟寒天内にランダムに分散されるために、秩序立ったアレイの凝集体は作製され得ない。該方法は一般的に細胞凝集に適用可能でない；本質において、凝集としての細胞懸濁技術は、広範囲の細胞種類のためにはならず、これらの特定の環境下で活発に増殖する細胞に制限される。
【０００６】
該分野におけるより最近の研究は、米国特許出願公開公報第2003/0224510号によって明白であり、これは透過性膜上または中空繊維中の細胞懸濁液に圧力または遠心分離力を適用することによって細胞の凝集を形成する方法を開示する。また、Fukuda et al., Orderly Arrangement of Hepatocyte Spheroids on a Microfabricated Chip, Tissue Engineering 11: 1254-62(2005)は、回転力を適用してポリスチレンチップ穴中に球状多細胞肝細胞凝集体を調製する方法を開示する。そして、Fukuda et al., Novel hepatocyte culture system developed using microfabrication and collagen/polyethylene glycol microcontact printing, Biomaterials, in press, (2005)は、肝細胞が接着し、球状体を形成する規定コラーゲン-修飾領域を有する底面を有する円筒穴を有するポリメチルメタクリレート(PMMA）マイクロアレイを開示する。他の領域の穴は、ポリエチレングリコールで修飾され、非結合性領域を作り出した。
【０００７】
ヒドロゲルは、化学結合または物理結合を介して架橋された3次元網目状親水性ポリマー鎖から構成されるコロイドである。ポリマーは、外部相または分散相にあり、全重量（または全体積）の少なくとも10％で存在する水は、内部相または分散相にある（高吸収性ヒドロゲルは95％を超える水含有量を有する）。架橋の際、ポリマー鎖は、水または他の液体を保持し得る固体の、3次元開放格子型構造を形成する。
【０００８】
ヒドロゲルは、様々な適用において：コンタクトレンズにおいて、包帯として、静脈カテーテルのような医療用デバイスとして、軟骨移植として、および薬物送達において、有用性を提供する。表面上の水の存在による低表面間張力および低摩擦表面のために、ヒドロゲルは生体適合性生体材料の開発において広く使用されている。生体組織工学には、細胞増殖および分化のための骨格としてこれらが使用される。多くの種類のヒドロゲルがあり、ほとんどがいくつかの目的のために適切であり、他の目的のために適切ではない。ヒドロゲルは、アルギネート、ゼラチン、キトサン、プルロニック、コラーゲン、アガロース、多糖、タンパク質、ポリホスファゼン、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、エチレンジアミンのポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸のコポリマー、ポリビニル酢酸およびアルコールおよびスルホン化ポリマーから構成され得る。いくつかは、pHおよび温度感受性である。（Park et al., Synthesis and Characterization of pH- and/or temperature-sensitive hydrogels J. Applied polymer Sci. 46: 659-71(2003)を参照。）他のものは、光感受性、圧力応答性、電気感受性または特定の分子に対して応答性である。（Park et al., Environment-sensitive hydrogels for drug delivery, Advanced Drug Delivery Reviews 53: 321-39(2001)を参照。)  本発明者らが知っているところで、Boyan et al.の米国特許出願公開公報第2005/0196452号が組織修復のための移植として、ヒドロゲル、特にポリビニルアルコールヒドロゲルの使用を開示するが、細胞凝集のためのヒドロゲルの使用は、調査されていない。Boyan et alのヒドロゲルは表面改変され、孔または凹部から構成されるでこぼこの表面は、移植片の接着および受容を促進し、かつ細胞の物理的刺激を提供して、骨芽細胞の分化および増殖を増強するために所定の特徴を有する。ヒドロゲルのでこぼこ表面を含む孔の大きさは、1つの細胞型の接着を別のものに対して促進することを補助し得ることが述べられる。
【０００９】
（発明の説明）
驚くべきことに、成形ヒドロゲルによって、任意の力または領域改変の非存在下で、様々な細胞型の細胞凝集が細胞を一緒にさせるか、あるいは細胞を互いに接着させることを、発明者らは発見した。細胞はヒドロゲル基材に接着せずに凝集する。この調節された細胞凝集には、細胞を一箇所に集めるように形つくられ、少なくとも部分的に細胞反発性である表面を必要とする。表面特性およびジオメトリーの組み合わせは、細胞間相互作用および細胞対細胞接着を増大するように働く。重力が、デバイスの構造または機能に役割を果たし、細胞接着を補助し、移植を可能にするでこぼこ表面に依存するかどうかについて何も教示しないBoyan et al.,上掲の開示に比べて、本発明者らの発明の細胞凝集デバイスは重力依存的である。本発明者らはまた、細胞が、細胞型に依存する予測可能な特性および力学と共に凝集することを見出した。しかし、これらのプログラム化された凝集特性および力学は、凝集プロセスに使用される凝集構造の形状を改変することで、および／または凝集修飾剤の添加によって改変され得る。有利にも、本発明のデバイスで凝集した細胞は次に、凝集修飾剤の添加の有り無しのいずれかで、凝集に使用される同じデバイスを用いて容易に封入され得る。細胞のプログラム化された凝集特性および力学の知識ならびにこれらの特性および力学を改変する手段を強化して、本明細書の教示によって、組織培養および生体組織工学の分野における当業者は、良好に凝集プロセスを調節し、細胞および組織の移植および再構築に使用され得る構造、配置および形状をもたらすスケールアップを達成することができる。
【００１０】
1つの態様において、本発明は、最上部表面に凹部形成された少なくとも１つ、好ましくは複数の細胞反発性区画を有するヒドロゲル基材を含む細胞凝集デバイスである。各区画は開口最上部部分および底部部分を有する上部細胞懸濁播種チャンバー、およびポート(port)によって上部細胞懸濁播種チャンバーの底部に対して上部に結合される１つまたは１つより多くの下部細胞凝集凹部から構成される。ポートの直径は、チャンバーの壁および凹部の壁と十分に連続し得るか、あるいはポートの直径は凹部の壁と十分に連続するがチャンバーの壁よりも狭くあり得るか、チャンバーの壁および凹部の壁の両方よりも狭くあり得る。
【００１１】
上部細胞懸濁播種チャンバーは、重力を介して下部細胞凝集凹部に細胞を集めるように形成および配置される。該凝集凹部は、最小重力エネルギーの有限領域に細胞を一体化することによって細胞凝集を促進するように形成および配置され、細胞間接触を増大し、基材への細胞接着を最小化するか、または妨げる。
【００１２】
各区画の全てまたは一部は、ヒドロゲルに凹部形成され得るか、あるいはヒドロゲルを取り囲み、かつヒドロゲルの上部表面から上方に伸びる、実質的に垂直、すなわち直立壁と結合され得る。いずれの配置でも、細胞懸濁播種チャンバーは、実質的に直立壁によって、または上部から底部に内部に勾配するテーパー壁、壁の最上部縁での実質的に開口および凝集凹部に連結する遠位縁または下部縁の壁でのポートもしくは通路で規定される。上部細胞懸濁播種チャンバーに一度加えられた重力によってすばやく細胞が沈降するために、上部細胞懸濁播種チャンバーの壁は必ずしも細胞反発性ヒドロゲルから構成される必要はなく、他の物質、水平位置で正常に細胞接着するものも、細胞播種チャンバーの側壁に使用され得る。凝集凹部は、細胞懸濁播種チャンバーの壁に依存する壁と共に形成および配置される。播種チャンバーの壁は、凝集凹部の壁と垂直面で連続的であり得るか、あるいはこれらは、肩またはドッグがそれらの間で形成されるように、凝集凹部壁と垂直面で不連続であり得る。
【００１３】
凝集凹部は、凝集凹部の壁に依存する最小重力エネルギーの領域を含むようにさらに形成され、すなわち、凝集凹部の壁は最小重力エネルギーの領域で終了する。この領域は、約2000ミクロン以下の最短軸の幅を有する小さく、平らな表面であり得る。より好ましくは、この領域は凹表面、点で終わるテーパー表面または楔型テーパー表面であり得る。凝集凹部のテーパー表面の勾配は、垂直軸から約75度までの角度であり得る。凝集凹部はまた、垂直部分およびテーパー部分または局面部分の組み合わせを含み得る。例えば、凝集凹部は、試験管様凹部を形成する半球状下部領域と連続する垂直円筒状上部領域を有し得るか、あるいはこれは実質的に放射状凹部を形成する半球状下部領域と連続する内部に勾配する上部領域を有し得る。
【００１４】
播種チャンバーおよび凝集凹部は、様々な形状に形成され得る。平面図において、それぞれの形状は、円、楕円、トーラス、溝、または任意の複合形状または形状の組み合わせであり得る。それぞれのチャンバーまたは凹部の形状は、同じまたは異なり得る。播種チャンバーは、開口上部部分および底部表面を有し、全ての側面に壁を強いられた領域として規定可能である。底部表面において、デバイスの底部の方に垂直に延びる、凝集凹部が置かれ、配置される。デバイスは、細胞懸濁液が播種チャンバーに注入されることを許容し、重力フローによって凝集凹部に入るように形成される。重力によって、懸濁液中の細胞が播種チャンバーから凝集凹部の最上部部分に集められ、凹部の底部に沈むようにさせる。デバイスは、複数の凝集凹部を典型的におよび好ましくは含むために、播種チャンバーは、細胞懸濁液ができる限り多くの凝集凹部に入ることを確実にするように懸濁液中に十分な体積の細胞を保持することができるほど大きくあるべきである。結果として、凝集凹部の数が多くなるほど、細胞懸濁播種チャンバーの体積は大きくならなければならない。播種チャンバーあたり１つの凝集凹部が十分であるが、経済的規模の目的のために、播種チャンバーあたり１つより多くの凝集凹部が好ましい。各播種チャンバーあたりの凝集凹部の数は、デバイスを作製するために選択される特定のヒドロゲルの成形特性および能力に少なくとも部分的に依存する。硬いより硬質なヒドロゲルは、軟らかいより展性可能なヒドロゲルよりも容易に凝集凹部の形状を維持することができ、結果的に、これらから作製された細胞凝集デバイスは、多数の凝集凹部を含むことができる。それぞれの播種チャンバー内の細胞凝集凹部の配置は、凹部間に介入したヒドロゲル物質がその硬さを維持し、崩壊しないように、凹部が十分な距離で互いに分離している限り、重要ではない。1つの非常に好ましいパラメーターは、ヒドロゲルの透明性である。凝集が容易に見られ、プロセスが容易にモニターされ得るために、透明なヒドロゲルは、好ましい物質である。
【００１５】
別の可能性は、条件的に細胞反発性であるヒドロゲルである。例えば、ヒドロゲルに重合され得るポリ（N-イソプロピルアクリルアミド（PIPAAm）は、温度が上昇すると親水性（細胞反発性）（例えば、20℃）から疎水性（細胞接着性）（例えば、32℃）に変化する温度応答性ポリマーである。従って、低温で、細胞凝集体は、PIPAAmを含むヒドロゲル鋳型に形成され得る。一度凝集体が形成されると、温度が上昇され得、凝集体は自分自身およびヒドロゲルの壁と相互作用することができる。
【００１６】
デバイスの総深さ、幅および長さはまた、細胞型の種類、凝集の大きさ、および選択されるヒドロゲルに依存して変化し得る；選択されたヒドロゲルは、細胞反発性であり、安定で構造的に調節可能な形状に成形可能でなければならない。ポリアクリルアミドヒドロゲルについて、少なくとも500ミクロンの深さが播種チャンバーおよび凝集凹部の両方に望ましく、少なくとも1000ミクロンの総深さとなることを本発明者らは見出した。「細胞反発性」とは、硬化の際、ヒドロゲルが細胞に、固着、固定、結合、またはへばりつく能力を欠くことを意味する。
【００１７】
デバイスは、１つまたは１つより多くの培地交換ポートと共に構築され得る。培地交換ポートは、デバイスがインキュベートされるプレートまたはペトリ皿の壁とデバイスとの間にピペットチップを置く空間を提供するデバイスの外部垂直壁におけるくぼみまたは切り抜きである。ポートは、デバイス外部壁とデバイスを置くプレートまたはディッシュとの間にピペットチップの配置を可能にするように形成および配置される限り、任意の形状であり得る。アーチ型形状が、典型的である。これは、デバイスの凝集凹部内で凝集する細胞を阻害せずに、流体が実験中に交換されることを可能にする。
【００１８】
一般的に、本発明のデバイスの細胞播種チャンバーの幅は、長方形または卵断面形状について最短寸法長で測定され、壁から反対の壁までの少なくとも2mmであるか、あるいは円形または正方形断面形状について直径で少なくとも2mmである。細胞播種チャンバーの深さは、少なくとも500μm、好ましくは約1000〜約2000μｍである。最大深さは約5cmである。
【００１９】
細胞凝集凹部の寸法はまた、ヒドロゲルの特性に依存して変化し得る。ポリアクリルアミドヒドロゲルについて、水平断面最短長は、20〜5000μｍ、好ましくは約200〜600μｍであり、細胞凝集凹部の深さは、少なくとも500μｍ、好ましくは約500〜約1000μｍである。凹部の最大深さは、ポリアクリルアミドヒドロゲル基材の厚さおよび弾性によって与えられる。凹部はヒドロゲル基材内に十分に置かれ得るか、または凹部は基材の底部表面から突出し得る。
【００２０】
本発明は、ポリアクリルアミドを用いて例示され、これはその光学特性、検出可能な細胞表面との相互作用の欠如、その公知の生体適合性、ならびにアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの相対濃度を改変することによるその弾力性を調節する能力のために好ましい物質である。アクリルアミドおよび架橋剤ビスアクリルアミドの混合物の重合によって形成されるポリアクリルアミドヒドロゲルは5：1〜100：1のポリマー：架橋剤比、より好ましくは19：1〜29：1(W/W)のポリマー：架橋剤比を有し得る。しかし、他のヒドロゲルを含む他のポリマー物質は、本発明のデバイスを作り出すために使用され得る。このようなポリマー物質は、生体適合性でなければならず、すなわち、化合物または細胞に対して有害効果（例えば、毒性）なしに生物化合物およびまたは細胞と共に存在し得る。選ばれた物質はまた、「細胞反発性」でなければならず、すなわち、細胞に接着、結合、固定または固着することができない。生体適合性ポリマー物質は、天然細胞反発性であり得るか、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)の被覆または結合または固定によって細胞反発性であるように改変され得る。生体適合性ポリマー物質は、条件的に、細胞反発性状態で利用される細胞反発性ポリマーであり得る。条件的に細胞反発性ポリマーの例は、N-イソプロピルポリアクリルアミド（NIPAA）であり、32℃より上で細胞接着性であり、20℃以下で細胞反発性である。あるいは、細胞型に依存する細胞反発性ポリマー物質は、物質によって反発されることが公知の細胞凝集に使用され得る。例えば、I型コラーゲンはマクロファージ反発性であることが公知のポリマー物質である。結果として、これは、本発明のマクロファージ細胞凝集デバイスのポリマー物質として使用されるが、線維芽細胞のような他の細胞に接着性であるので、例えば線維芽細胞凝集デバイスのポリマー物質として不適切である。
【００２１】
ポリマー物質は、安定で構造的に制御可能な形状に成形可能でなければならない。本発明のデバイスの使用のためのポリマーヒドロゲル物質は、化学架橋、光重合、イオン性架橋、疎水性架橋、水素結合およびこれらの組み合わせによって形成され得る。ヒドロゲルを形成する方法は、当該分野で周知である。使用され得る典型的なイオン性架橋ヒドロゲルとしては、カルシウムアルギネート(alginate）、およびバリウムアルギネートが挙げられる。水素結合によって結合される典型的なヒドロゲルとしては、寒天およびアガロースが挙げられ、後者が好ましく、本明細書にも例示される。化学架橋によって形成される典型的なヒドロゲルとしては、ポリ（エチレングリコール）（PEG）、ポリビニルアルコールヒドロゲル（PVA）、2-ヒドロキシメチルメタクリレート（HEMA）、メチルメタクリレートと3-（t-ブトキシカルボニル）-N-ビニル-2-ピロリドンのコポリマー（MMA:TBNVP）、ヒアルロン酸（HA）、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEG-DA）、ポリ（エチルメタクリレート）とテトラヒドロフルフリルメタクリレート（PEMA/THFMA）、スルホン化PEGが挙げられる。ヒドロゲルは、1％〜500％W/W膨張する能力を有する。
【００２２】
別の態様において、ポリマー物質は、相互侵入網目構造高分子（IPN）から構成され得る。IPNは、並列して合成され、個々の成分のみと比較して改善された強度および機械特性を示す2つ以上の架橋ポリマーの組み合わせである。アクリルアミド、ポリエチレングリコール、およびアクリル酸のIPNは、本発明のデバイスに使用され得る典型的なポリマー物質である。
【００２３】
本発明の細胞凝集デバイスを作製するために使用される鋳型は、公知の製造技術を用いて作製され得る。自由形式製造技術を使用して、構造の形状を選択的に制御し、コンピューター援用設計（CAD）、続いてMEMS微細製造または3次元印刷を用いて微細構造を作り出し得る。微細製造プロセスは、市販されているエポキシ系フォトレジストと当該技術分野で公知の標準フォトリトグラフィー技術を用いて、特定の表面構造を生み出し得る。あるいは、ステレオリトグラフ技術、選択的レーザー焼結、融合沈着プロセス、3次元印刷、またはOBJプロセスが使用され得る。要約すると、任意の方法が、細胞凝集デバイスを作製するために使用される鋳型を製造するために使用され得る。細胞凝集デバイスを作製するために使用される鋳型を製造する好ましい方法は、デバイスを組み立てることができる、ｘ、ｙおよびｚ次元における解像力を有する。鋳型が本発明の細胞凝集デバイスを構築するために使用される場合、鋳型は、デバイスのネガティブ複製、すなわち、成型の際に所望の形状のデバイスおよび所望の寸法を有するデバイスが生ずるようなデバイスの正確なコピーであるネガティブレプリカまたはネガティブ3次元像である。
【００２４】
細胞凝集デバイスを作製するために使用される鋳型を作製することに加えて、他の方法が細胞凝集デバイスの作製に適用可能であり得る。成型プロセスよりむしろ、ヒドロゲル系細胞凝集デバイスは、凹部を作り出すスタンピング方法、または凹部を作り出すレーザー除去プロセス、または凹部を作製するための粒子リーチングプロセスによって製造され得る。
【００２５】
別の態様において、本発明は、本発明の細胞凝集デバイスの上部細胞播種チャンバーに複数の細胞を堆積する工程、細胞が凝集できるように十分な時間該細胞をインキュベートする工程、および該デバイスから凝集細胞を除去する工程を含む、細胞を凝集する方法を含む。任意に、該方法は、1以上の選択された凝集修飾剤を細胞に添加する工程を更に含み得る。好ましくは、選択された凝集修飾剤は、インキュベーション工程の前に細胞に添加され得る。凝集修飾剤の添加によって、細胞凝集の動力学および細胞凝集と関連する形態の正確な調節が提供され、これは生体組織工学適用の基本である。薬理学的介入を用いた凝集の改変は、十分であり、この調節を可能にする。以前に言及したように、全ての細胞型が複合形状に自己凝集することはない。細胞収縮、および細胞骨格活性（例えば、2,3-ブタンジオン一酸化物（monoxime）、ML-7、Y-27632、サイトコラジンD、コルヒチン、オカダ酸およびミカロリドBのようなインヒビターを用いる）、細胞接着（例えば、抗-E-カドヘリン、抗-zo-1、または抗-コネキシン32のような抗体を用いる）、細胞運動性（運動性インヒビターロコスタチンを用いた処理を介して）のようなプロセスを阻害することよって、または細胞収縮（例えば、リソフォスファチジン酸を用いる）を刺激することによって、複合形状が自己凝集中に維持され得る。
【００２６】
ホモ型細胞凝集において、これは、複合形状が、通常、球状に進行する細胞型（実施例に開示されるハニカム形状凹部においてY-27632で処理された線維芽細胞等）によって得られ得ることを意味する。これはまた、マトリックス生成、細胞代謝および他の特定化された細胞機能が活性のレベルおよび時期の両方で調節され得ることを意味する。ヘテロ型凝集において、このような細胞挙動の改変によって、球状凝集体または複合形状凝集体内の選別および最終細胞位置の調節がもたらされる。このことは、混合細胞型の任意の選別位置が凝集のために合わせる前の前処理された１つまたは複数の細胞型によって得られ得るので、生体組織工学適用に重要である。従って、へテロ型凝集体内の最終細胞位置は、細胞型間の差次接着性だけによらない。血管脳関門凝集モデルにこの原理を適用して、通常、RG2細胞（神経膠芽細胞腫脳癌細胞株）を用いて中央に選別される内皮細胞は、RG2を被覆させるための前記プロセスの1つのインヒビターで前処理され得る。これは、血液脳関門（BBB）に類似する微小環境をもたらし、大きなアレイのこれらの凝集体が、BBBを横断し、かつ神経膠芽細胞腫を処理するように設計された薬物の効能を試験するために使用され得る。
【００２７】
ホモ型およびヘテロ型凝集体について、薬理学的介入を介した異なる段階での細胞凝集の「停止」は、生体組織工学のいくつかの可能性を広げる。例えば、複合形状凝集は、表面細胞が形態を変更し、かつ可視可能な細胞間境界を失う前に「停止」され得る場合、この時点の内皮細胞型の添加で、凝集は、器官移植技術における重要な難題である、より効率的な「プレ血管形成」を可能にすることが可能である。
【００２８】
任意の凝集修飾剤が本発明で使用され得るために、任意の複合形状が任意の細胞型で達成され得ることがありえる。体の器官が異なる固有構造を有するので、これは、任意の構造および構造の組み合わせがより効率的な体内移植または移植に仕立てられるようにインビトロで設計され得ることを意味する。さらに、より多くのインビボ様微細組織が治療薬のスクリーニングのためにインビトロで使用され得る。インビトロで凝集修飾剤を用いた細胞選別および移動性の調節はまた、二分脊椎および口蓋裂のような選別および移動に関連する様々な胚障害を研究するためのモデルを提示し得る。
【００２９】
凝集細胞は、研究、細胞移植のような生体組織工学適用、幹細胞分化、および機能的微細組織形成において使用され得る。凝集細胞は、治療タンパク質、ワクチン用ウイルス、および他の細胞系産物の生成に使用され得る。凝集体は、薬物のスクリーニングに使用され得る。デバイスは、産物、例えば分泌タンパク質を回収し、生化学刺激を導入し、3次元生化学勾配を作り出すために使用され得る。
【００３０】
実際には、任意の種類の細胞が、本発明のデバイスおよび方法を用いて凝集され得る；細胞が凝集する能力を有する限り、使用され得る細胞に関して特別な制限はない（成熟赤血球および十分に成熟した精子のような細胞は凝集することができると知られていない）。細胞は原核生物または真核生物であり得る。任意の種類の哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、霊長類（特にヒト霊長類）、ニワトリ、ブタ、ウシ、ウマの細胞が使用され得る。初代培養細胞または樹立細胞株のいずれかが使用され得る。初代培養細胞は、任意の組織、例えば、軟骨、骨、皮膚、神経、口腔消化管、肝臓、すい臓、腎臓、腺、心臓、筋肉、腱、脂肪、結合組織、生殖器官組織、眼、血管、骨髄および血液に由来し得る。例示的な細胞種類としては、骨芽細胞、ケラチン生成細胞、メラニン形成細胞、肝細胞、グリア細胞、すい臓β細胞、すい臓外分泌細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、脊髄前駆細胞、神経細胞、乳腺細胞、唾液腺細胞、腎臓糸球体内皮細胞、管状内皮細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、心筋細胞、軟骨細胞、骨格筋および平滑筋細胞、脂肪および脂肪前駆細胞、角膜および水晶体細胞、胚性網膜細胞、血管細胞、内皮細胞、骨髄間質細胞、およびリンパ球が挙げられる。例えば、本発明のデバイスおよび方法は、筋肉細胞（平滑、骨格、心臓）、結合組織細胞（線維芽細胞、単球、肥満細胞、顆粒細胞、形質細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞）、上皮細胞（皮膚、胃腸管、尿管、もしくは生殖管由来、または肝臓、すい臓、もしくは脾臓由来の器官上皮細胞）、または神経系細胞（グリア、神経、アストロサイト）を凝集するために使用され得る。
【００３１】
さらに、哺乳動物幹細胞（胚性、非胚性、および造血性）の凝集は本発明のデバイスおよび方法を用いて作製され得る。凝集の際、幹細胞は、「胚体」を形成する。数日後に、凝集は、嚢胞性の胚体（本質的に中空球体）および内部構造、例えば、卵黄嚢または心臓筋肉を形成する。幹細胞凝集体は、分化した幹細胞、すなわち、凝集前の区別される細胞系譜を有するものに由来し得るか、あるいは幹細胞は凝集後または凝集中に細胞凝集において分化を起こし得る。分化によって、特定の機能を有する細胞がもたらされる。未分化細胞は多能性であり、すなわち、これらはそれらの特定の機能をまだ発現していない。例示はあらゆる種類の幹細胞である：外胚葉、中胚葉、内胚葉、間質、造血、神経、肝、筋肉、すい臓、皮膚、網膜および濾胞性幹細胞。
【００３２】
任意の非哺乳動物個体からの非哺乳動物細胞がまた、デバイスに使用され得る。多数の、植物細胞株、動物細胞株、昆虫細胞株、植物ウイルス細胞株および微生物の細胞株（古細菌、細菌、プラスミド、ファージ、酵母および真菌等が存在し、当業者に公知の寄託機関から入手可能である。（DSMZ、German National Resource Centre for Biological Materialが１つのものであり、ATCC、American Culture Collectionが別のものである。）任意の公知の寄託機関からの細胞が、本発明のデバイスおよび方法を用いて有利に凝集され得る。
【００３３】
本発明のデバイスおよび方法を用いて凝集される細胞は、ネイティブ細胞または遺伝子改変細胞またはその混合物であり得る。付加、欠失、または置換による細胞性RNAまたはDNAを改変する遺伝子改変は、当該技術分野で周知である。1種類の細胞が使用され得るか、あるいは細胞種類の組み合わせが使用され得る。正常細胞または異常細胞は、本発明のデバイスにおいて凝集され得る。正常細胞および異常細胞の混合物が使用され得る。例えば、骨芽細胞に分化するMC3T3-E1細胞および脂肪細胞に分化するMC3T3-G2/PA6細胞のような新生物形成または癌細胞が使用され得る。44PE、52PE、102PT、149PT、11315MO2、159PT、185PE、190PT、225CWN、229PEを含み、十分に特徴付けられ、かつ異なるサブタイプの乳癌を表す合計11個の乳癌細胞株、およびMDA-MB-435S、MDA-MB-231、MCF7、SK-OV-3、BJMC3879、MCF-7、MDAMB361、MFM223、BT549、MDAMB468、T-47D、BT474、SK-BR-3、HS578Tを含む他の乳癌細胞株のいずれかが使用され得る。OPCT-1、OPCT-2、OPCT-3、DU145、LNCaPおよびPC-3を含む前立腺腫瘍細胞株のいずれかが使用され得る。A549、NCI-H460、NCI-H1299を含む肺癌細胞株のいずれかが使用され得る。HCT116、HCT116p21-/-、HCT116p53-/-、HCT-15、HT-29、CaCo-2、CoLo205、SW48を含む結腸癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、SK-MEL-28、SK-MEL-5、SK-N-SH、HT1080、P815、SW872、UMSCC-14A、KS SA1N、UACC903およびA-431を含む皮膚癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、IMR-32、U-87  MG、A172、N1E115、SHSY5Y、A20、Neuro2A(N2a)、SKNSH、C6、PC12、およびU87を含む脳癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、786-OおよびACHNを含む腎臓癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、HepG2、COLO587、FaO、HTCおよびHuH7を含む肝臓癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、U-2  OSを含む骨癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、A2780、DOV13、OVCAR3、CoLo357、およびHeLaを含む卵巣癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、Capan1、Panc1、およびPanc89を含むすい臓癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、H295RおよびSW13を含む副腎癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、ECV304を含む膀胱癌細胞株のいずれかが使用され得る。例えば、SAOS2、SW1353およびU2OSを含む骨/軟骨細胞株のいずれかが使用され得る。
【００３４】
凝集後に、分化誘導因子が細胞に添加され得る。このような因子は当該技術分野で公知である；典型的な因子としては、例えば、幹細胞増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、エリトロポイエチン、およびトロンボポイエチン、インシュリン、インドメタシン、デキサメタゾンおよびトランスフェリンが挙げられる。キナーゼのインヒビター、レセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト、または干渉RNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのような他の薬剤、ペプチド、薬物、または分子が、特定の経路下で分化を促進またはガイドするために添加され得る。分化した細胞は次に、治療方法に使用され得る。あるいは、未分化細胞の凝集後に、凝集体は、動物への移植の際に分化するように誘導され得る。
【００３５】
得られた凝集体は、単独で、公知の組織移植骨格と組み合わせて、または後に記載される封入形態で使用され得る。任意の形態で、これらを使用して、損傷した組織および器官を置換または補い得る。例えば、本発明のデバイスを用いて作製された島様凝集体が糖尿病の処置に使用され得、真皮乳頭細胞凝集体が禿を処置するために使用され得、肝細胞凝集体が肝臓疾患の処置に使用され得、真皮細胞凝集体が化粧品および皮膚の再構築処置に使用され得、軟骨細胞または骨芽細胞凝集体が関節軟骨修復に使用され得る。
【００３６】
癌細胞または前癌細胞の凝集体は、腫瘍増殖、転移、および処置を研究するために実験動物に移植され得る。凝集体はまた、薬物効能または毒性を測定するための高処理量薬物スクリーニングおよび個人用医薬の領域で使用され得る。凝集体は、幹細胞の分化を調査または指向するために使用され得る。凝集体は、治療タンパク質または重要な他の代謝産物の生成に有用であり得る。凝集体は、重要な化合物または分子を生成する代謝可能性に有用であり得る。凝集体は、分子の除去、不活性化、または脱毒素化に有用であり得る。凝集体は、ワクチンとしての使用または遺伝子治療の適用と共に遺伝子導入剤としての使用のための、ウイルス、無力化されたウイルスまたは組み換えウイルスの生成に有用であり得る。凝集体は、特定の化合物または分子を検出するバイオセンサーまたは診断デバイスとして有用であり得る。凝集体は、食品として有用であり得る。凝集体は、分子またはナノ物質の毒素を測定する検出デバイスとして有用であり得る。
【００３７】
別の態様において、本発明は、本発明のデバイスのネガティブ複製鋳型を提供する工程、該鋳型に生体適合性で細胞反発性ポリマーヒドロゲルプレポリマーの溶液を注入する工程、該溶液を重合させる工程、および該鋳型から固体ヒドロゲル基材を除去する工程を含む、生体適合性で細胞反発性ポリマーヒドロゲル基材から構成される細胞凝集デバイスを作製する方法を含む。
【００３８】
なお別の態様において、本発明の細胞凝集デバイスおよび方法は、インビボまたはインビトロでの使用のための、生細胞の凝集体の封入マイクロアレイを構築するために使用され得る。二価カチオン溶液中のビーズ形成を介したアルギネートのゲル化を用いた現在の封入方法を使用する代わりに、封入凝集体のマイクロアレイを作り出すための新規技術が開発され、本明細書に開示される。細胞凝集デバイスを含む生体適合性で細胞反発性ポリマーヒドロゲル基材の上部でのインサイチュでの凝集体の封入によって、ウェル形態の保存、および封入され、かつ均一に離間されたマイクロアレイシートの作製が可能になる。封入凝集体のシートの作製は、現在の細胞封入方法に対していくつかの利点を提供する。封入マイクロアレイは個々のビーズよりも大きいために、シートはシグナル伝達因子の高用量の指向された送達を可能にし得る。腹膜腔へのビーズの注射の代わりに、マイクロアレイのより指向された挿入が生じ、薬物の局所送達を可能にし得る。封入マイクロアレイはまた、簡易移植、特にデバイスが除去される必要がある場合の移植を可能とする。
【００３９】
従って、本発明は、生細胞を封入するためのデバイスおよび方法をさらに含む。細胞封入デバイスは、実質的に平らな面、および最上部表面に凹部形成された少なくとも1つ、好ましくは複数の離間された細胞反発性区画を有する反対側の細胞封入面を有する生体適合性基材から構成される。各区画は、開口最上部部分および底部部分を有する上部細胞懸濁播種チャンバー、およびポートによって上部細胞懸濁播種チャンバーの底部に対して上部に連結された１つまたは１つより多くの下部細胞凝集凹部から構成される。本発明の細胞封入マイクロアレイは、本発明の細胞凝集デバイスから作製され得、ネガティブ鋳型として有利に使用される。凝集デバイスの下部細胞凝集凹部に凝集された細胞は、生体適合性の封入基材内に封入され、次に以下でより十分に記載される生体適合性コーティング層でコーティングされる。
【００４０】
封入基材は、凝集「鋳型」から形成される細胞封入区画を支持するほど少なくとも厚くなければならず、移植の際に機能が阻害されるほど厚くない。好ましくは、シートは100〜1000μｌの範囲の厚さを有する。シートの他の寸法（長さおよび幅）は、デバイスに意図される目的に依存して非常に変更可能であり得る。離間された細胞封入区画を有する長くて狭いシートは、軟骨欠損を処置または修復する軟骨細胞の凝集体の移植に望ましくあり得る。寸法で幾分正方形なシートは、やけどを処置するために上皮細胞の凝集体の移植に適切であり得る。
【００４１】
封入基材の表面の１つから広がる離間された細胞封入区画はまた、生体適合性および生体持続可能な物質から構成されなければならない。好ましくは、区画は、基材が単一封入物質から構成される一体型構造を形成するように、基材の一体化部分であり、同じ物質から形成される。区画のサイズは主に、基材の寸法に依存する：区画は任意の形状であり得るが、基材によって個々に支持されるほど小さく、所望の数の凝集細胞を含むほど大きくなければならない。他の物質は以下の基準を満たす限り使用され得るが、基材は好ましくは架橋アルギネートから構成される。
【００４２】
デバイスの機能性のための最も重要なパラメーターの１つは、デバイス内の凝集が生存し続ける能力である。従って、基材層は生体持続可能な物質から構成されなければならない。生体持続可能とは、所望の機能を発揮することを可能にする期間、凝集細胞の生存を支持することができることを意味する。物質、例えばアルギネート基材は、細胞機能を維持するために重要な栄養、増殖因子および他の分子の凝集細胞への拡散を可能にし、また、デバイスから老廃物が拡散することを可能にしなければならない。これはまた、デバイスが代謝能力に機能している場合に代謝または脱毒化される必要があり得る重要な分子の拡散を許容しなければならない。同様に、これは、デバイスが送達能力に機能する場合に細胞凝集によって合成される治療タンパク質のような重要な分子の拡散を許容しなければならない。アルギネートの構造の原因となり得、最終デバイスの強度および安定性に影響する多くの調節可能なパラメーターがある。１つのパラメーターは、物質の実組成である。好ましくは、アルギネートは基材層を作製するために使用され得る；マンヌロンサブユニットに対するグルロンの相対濃度および分子量は、変化する特性を有する基材層を作り出すために変更され得る。使用される二価カチオンの種類の変化はまた、基材の相対的な剛性および統一性に影響を与え得る。高濃度のグルロン酸は、基材層のケーシングにより大きな機械強度を与えるが、高濃度のマンヌロン酸はより安定な均一なコーティングを生み出すためにコーティング親和性の機械強度を犠牲にする。移植方法に関する考慮はまた、アルギネートの組成に影響を与え得る。より弾性のアルギネートは注射による移植に最適であり得るが、より機械的に安定なアルギネートが外科的移植に望ましい。
【００４３】
アルギネート中の高いグルロン酸またはマンヌロン酸濃度のいずれかを有することに明白な利点があるが、コーティング物質のための機械的安定性および親和性の両方の特性が、インビボでのマイクロカプセルの統合性に重要であり、結果として、両方のサブユニットの中間濃度が生体適合性および生体持続可能性に最適であることが経験的に決定される。
【００４４】
物質はまた、滅菌可能でなければならず、分解が所望される場合に生物学的条件に応答して調節された分解ができなければならない。このような場合に、滅菌可能で生物分解性ポリマーは、必須機械特性を有さなければならず、炎症または他の毒性応答を誘導する必要はなく、分解の際に代謝可能でなければならない。ポリマー物質が分解される場合、凝集生細胞は、例えば、創傷治癒のような隣接組織に取り込まれ、次に凝集体が創傷を修復する。従って、デバイスは部位に対して取り扱いすることおよびゆったり伸ばすことが非常に容易である細胞送達システムとして役立ち得、デバイスは凝集の所望されるレイアウトを有するので、細胞が特定の所望されるデザインまたは配置の部位に送達され得る。
【００４５】
これらの基準を満たし、かつ基材層に使用され得る代替的で例示的な生体持続可能な物質としては、コラーゲン、PEGおよびヒアルロン酸およびその誘導体、ならびにアガロースが挙げられる。ユードラジット等の架橋ポリアクリル酸がまた、使用され得る。化学架橋および光重合を含む架橋方法が使用され得る。例えば、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルピロリドンおよびポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）のヒドロゲル等の弱い親水性であるシリコーンまたはポリアクリルアミドヒドロゲルが使用され得る。生物医学目的の大半のヒドロゲルは合成ポリマーから作製されるが、架橋天然ポリマー、主に多糖から形成されるヒドロゲルが周知であり、使用され得る。さらなる例示的ポリマーが、Ka tz, 「Biomaterials: Developments in Medica; Polymers for Biomaterials Applications」,  Medical Device & Diagnostics Industry, 122 (2001) に概説され、Kalorama Information Industry Report: 「Advanced Polymers for Medical Applications: Materials, Product Development, and Market Opportunities」,第1章および第2章(2002)に議論されている。
【００４６】
封入デバイスは、基材にさらなる安定性を付与し、かつ凝集体の完全な封入を確実にするために、基材および細胞封入区画を完全に取り囲むか、または細胞封入区画のみを実質的に取り囲むかのいずれかである生体適合性ポリマーから構成されるコーティング層をさらに含む。コーティング層は好ましくはポリ-L-リジン(PLL)から構成され、1〜50ミクロンの範囲の厚さを有する。代替的なコーティング層物質としては、例えばPLGA(ポリ酪酸コ-グリコール酸)、ポリエチレンイミド、キトサン、および他の正電荷生体適合性ポリマーが挙げられる。本発明のデバイスの使用のための適切なコーティング物質の選択は当該分野の技術水準の範囲である。
【００４７】
コーティング層の厚さならびに基材の厚さおよび化学組成に応じて、封入デバイスは大きな分子および因子の出入り通過を制限し得、他のシグナル伝達因子の拡散を妨げ得る。結果として、基材層とコーティング層の両方の厚さの選択は、デバイスの使用される意図ならびに凝集細胞によって分泌されるタンパク質、因子等を考慮しなければならない。また、複数コーティングは、強度および均一薬物放出も付与する方法として可能である。複数のコーティングの例は、広く使用されるAPAシステム(アルギネート、PLL、アルギネート)である。第二コーティングは変更する必要はなく、これらが互いに結合する限り多くの化学物質を用いて行われ得る。第二コーティングは、増殖因子、薬物または細胞を含み得、非分解性物質または分解性物質から作製され得る。例えば、2段階デバイスは、第二コーティングの増殖因子が短期に放出され、続いて長期に細胞によって増殖因子が合成および放出される場合に作製され得る。
【００４８】
アルギネートの、PEG等のさらなるポリマーとの設計は、全体としてデバイスに対する安定性を提供するだけでなく、放出プロフィールを指向することにも役立ち得る。これらは標的組織に対する効果を得る前に体から迅速に除去されるために多くの薬物が過剰に与えられなければならない。健常組織に対する薬物の拡散はまた、これに対して有害事象を有し、有意な副作用を生じ得る。デバイスに多孔が少ない支持層を任意に導入して、所望因子の拡散がシートの１つの面で制限され得、標的組織により近い面のほうに濃度が移動し、より強い効果を可能にする。デバイスの奥の拡散は完全に調節することはできないが、これは、より均一でより強い放出が一面で優先的に観察されるように、調節および制限され得る。この極性はまた、インビトロ生物反応適用の使用のためのデバイスの優先的送達または代謝活性に有用であり得る。
【００４９】
別の態様において、デバイスは、細胞封入区画がマイクロアレイにおいておよそ規則正しい間隔で１つの面または側面から広がる実質的に平らなシートを含む基材、および基材と同じ物質から構成され、かつデバイスの細胞封入面上に実質的に平らな側面シートを形成するほど十分な厚さを有する細胞封入区画をコーティングするコーティング層から構成される。本態様において、デバイスは２つの実質的に平らな表面を有する。このような「二重フラット」デバイスが別々のコーティング層を必要としないことが予想される。しかし、コーティング層は、デバイスの機械的特性をさらに改善し、かつ因子、栄養物等の方向性拡散を生じるために、望まれ得る。さらに、コーティング層自体は、封入細胞の調節を補助し、細胞にさらなる栄養物を提供し、または薬物送達プロセスに影響を与えるために、１つ以上の生物学的物質、例えば、細胞調節因子(増殖因子、阻害因子等)を含み得る。
【００５０】
別の側面において、本発明は、ネガティブ鋳型として使用される細胞凝集デバイスの上部細胞播種チャンバーに複数の細胞を堆積する工程、細胞が凝集できるように十分な時間該細胞をインキュベートする工程、上部細胞播種チャンバーに凝集封入基材物質を堆積する工程、基材を硬化させて凝集封入基材層を形成する工程、鋳型から基材層を除去する工程、および生体適合性ポリマー物質の溶液に基材層を浸漬してコーティング層を形成する工程を含む、封入された凝集生細胞を作製する方法を含む。任意に、実施例１０に例示されるように、細胞凝集の力学がインキュベーション工程の前に選択される凝集修飾剤（上に議論される）の投与によって調節され得る。
【００５１】
別の態様において、細胞は、播種チャンバーに堆積され、同時に未硬化の封入基材物質に懸濁され得、細胞が凝集するまでインキュベートされ、次に基材が硬化される。少量の封入物質が播種チャンバー内に添加および架橋された後に、細胞がまた、デバイスの播種チャンバーに堆積され得る。細胞または細胞懸濁液および封入物質の添加後に、更なる封入物質が添加され、架橋工程が続く。
【００５２】
本発明のデバイスを作製する方法は、本アルギネートビーズのより均一で予測可能および規則正しいマイクロアレイをもたらす。凝集あたりの細胞の正確な位置および数が調節され、治療剤のより均一で予測可能な放出をもたらし得る。空間および配置が調節可能であるために、疾患組織が必要な場合に均一にまたは異なって処置され得る。シートの上部を横切る体液フローは、標的組織へのデバイスの直の近接から因子の迅速で有効的な除去を可能にする。移動しなければならない因子の距離が小さいために、因子をクエンチングすることによる除去または血流を介した損失の心配はより少ない。さらに、疾患組織上に直接的にマイクロアレイを置く可能性のために、治療因子の強い局所送達が達成され得る。細胞は、細胞ゲノムの遺伝子改変を介して連続的に、または治療因子の生成の速度および量を選択的に改変するように、与えられる環境キューに反応する応答パターンのいずれかで治療因子を生成し得る。封入凝集体のアレイを移植することによって、所望因子のより均一な分布および拡散が達成され、アルギネートマイクロカプセルに一貫して見られる高い因子濃度の節を排除する。
【００５３】
市販および科学等級アルギネートおよびPLLは様々な会社から様々な分子量で購入され得る。分子レベルで両方のポリマーの組成の影響を理解する目的のために、特徴付けが不可欠である。核磁気共鳴(NMR)および示差走査熱量計(DSC)を介して、アルギネートとPLLの両方の組成および両方の構成が決定され得る。DSCはアルギネートにおけるマンヌロン酸へのグルロン酸の比率を分析するために特に有用である。DSCを介したマイクロアレイ全体の分析によって、そのガラス転移温度の第三ピークに見られるPLLコーティングの存在が確認される。DSCは乾燥試料を使用するために、実際のデバイスに関して誤解に導き得る熱プロフィールを測定する潜在性がある。水和マイクロアレイが使用され得るが、得られたグラフに見られる水のプロフィールがポリマーの構成を決定することを困難にする。
【００５４】
封入アレイが破損なくインビボで維持される能力は、２つの相、インビトロおよびインビボでアッセイされ得る。インビトロ工程では、デバイスは、通常の培地中に長期間維持され、破損、デバイスに対する応力または汚染について毎日観察される。設定された時間経過のもと、これにより、血清を模倣する環境においてマイクロアレイのベースライン耐久性レベルが確立される。次に、動物モデルにデバイスを移植し、インビトロで設定された時点に対応する時点で外植を行ない、移植されたマイクロアレイを、破損および一般的な安定性について観察する。同じ組の実験を、異なるポリマーの混合物、例えば、アルギネートおよびPEGの組合せを用いて行なう。
【００５５】
トランスフェクトされた細胞は、凝集前にスクリーニングされ、選択される。所望の因子を分泌する能力は、凝集前後で、インビトロアッセイにより確認される。凝集体が封入されたら、治療因子を分泌する能力は、アルギネートマトリックスの多孔性によって複雑になる。因子は、有効であるためにアルギネートマトリックス中に拡散し得なければならず、凝集修飾剤は、マトリックス中に拡散し得なければならない。これは、デバイスを拡散チャンバー内に配置し、設定された時間経過の間にデバイス中に拡散された因子の濃度を測定することにより測定され得る。この効果をさらに確認するため、因子の除去を容易にするためにチャンバーに流れが適用され得、デバイスがインビボで遭遇し得る環境ストレスをより正確に模倣する。
【００５６】
マイクロアレイを特徴付けるため、インビトロ流体モデリングが使用され得る。コンピュータアルゴリズムを使用する放出パターンのモデリングにより、どのようにしてマイクロアレイがインビボで機能し得るかに関する洞察が提供され得る。アルギネートビーズ付近に高濃度の治療因子が存在し、遠ざかるにつれて量が減少し得る周期的な拡散の代わりに、本発明者らは、本発明のマイクロアレイデバイスは、因子濃度のむら(node)を平滑にすると予測する。２つの同様の放出パターンを並べることにより、より多くの治療因子がより均一に領域上に分散され、潜在的に、均一な投薬量を維持したまま、効果の範囲を増大させる。多数の凝集体のアレイ、およびシートが移植される疾患領域における放出プロフィールはほぼ均一であり、損傷器官または組織中における均一な分散および均一な効果を可能にする。
【００５７】
封入された凝集細胞は、研究、細胞移植などの生体組織工学適用、機能的微細組織形成、またはバイオリアクター適用において使用され得る。封入された凝集細胞は、治療タンパク質の作製に使用され得る。デバイスは、生成物、例えば分泌タンパク質を回収するため、生化学的刺激を導入するため、および３次元の生化学的勾配を作製するために使用され得る。
【００５８】
細胞の封入の最も重要な利益の１つは、宿主の免疫応答を心配することなく、細胞を宿主内に移植する能力である。アルギネートPLLまたはアルギネート単独の機械的保護バリアのため、マクロファージと他の免疫細胞との間の物理的接触は不可能である。さらに、アルギネート内の孔は、小さいタンパク質および分子のみを許容するが、免疫グロブリンなどのより大きくより複雑な分子の封入細胞へのアクセスを妨げる選択的透過性膜としての機能を果たす。Jones et al.、Transplantation 78：1454-62 (2004)およびZimmerman et al.、J. Mat. Sci. 16：491-501 (2005)を参照のこと。
【００５９】
免疫応答を特徴づけるため、デバイスの構造完全性を評価するために使用されるものと同様のインビボ移植物が時間経過中に追跡され得る。デバイスの周辺部での免疫細胞の過剰増殖の存在を測定するため、アルギネートデバイスの部分は固定(be and fixed)され、染色され得、動物の身体検査により、デバイスが移植された領域内の炎症のレベルに関する証拠が提供され得る。過剰増殖は、表面の不規則性によって促進されるが、典型的に、現在のビーズ技術では封入された細胞のおよそ5%にのみ見られる。De Groot et al.、J. Surgical Res. 115：235-41 (2003)およびDe Groot et al.、J. Surgical Res. 121：141-50 (2004)を参照のこと。本発明のマイクロアレイへの免疫応答を特徴付けるために、同様のインビトロ実験が行なわれ得る。
【００６０】
通常、封入細胞は、皮下注射または腹腔内への注射により送達される。その小さい大きさおよび分散する傾向のため、外植され得ない。さらに、マイクロカプセルに、あまり平滑でない(less than smooth)コーティングが形成されるか、またはその周囲にアルギネートマトリックスが形成されるリスクがあり、これは、マクロファージによるカプセルの過剰増殖を増大させ、引き起こし得る。本発明のマイクロアレイにより、より指向された移植手順が可能である。体内の特定の器官または組織位置に特異的な疾患を処置する場合、マイクロアレイシートは、問題の部分の上面に直接移植または配置され得、強力な局所薬物送達が可能になる。汚染、免疫拒絶または計画された除去の場合に、デバイスは外植され得る。
【００６１】
また別の局面において、本発明は、本発明の前述の方法によって作製される、封入された凝集生細胞を含む。事実上、任意の型の細胞が本発明のデバイスおよび方法を使用して凝集され、封入され得る。細胞が凝集する能力を有する限り、使用され得る細胞に関して特に制限はない(成熟赤血球および完全成熟精子などのいくつかの細胞は、凝集し得ないことが知られている)。細胞は、原核生物または真核生物であり得る。任意の型の哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、霊長類(特に、ヒト霊長類)、ニワトリ、ブタ、ウシ、ウマ細胞が使用され得る。初代培養細胞または樹立細胞株のいずれかが使用され得る。初代培養細胞は、任意の組織、例えば、軟骨、骨、皮膚、神経、口腔消化管、肝臓、膵臓、腎臓、腺、心臓、筋肉、腱、脂肪、結合組織、生殖器官組織、眼、血管、骨髄および血液に由来し得る。例示的な細胞型としては、骨芽細胞、ケラチン形成細胞、メラニン形成細胞、肝細胞、グリア細胞、膵ベータ細胞、膵臓外分泌細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、脊髄前駆細胞、神経細胞、乳腺細胞、唾液腺細胞、腎臓糸球体内皮細胞、管状上皮細胞、副腎皮質および副腎髄質細胞、心筋細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞および平滑筋細胞、脂肪および脂肪前駆細胞、角膜および水晶体細胞、胚性網膜細胞、血管細胞、内皮細胞、骨髄間質細胞ならびにリンパ球が挙げられる。例えば、本発明のデバイスおよび方法は、筋細胞(平滑、骨格、心臓)、結合組織細胞(線維芽細胞、単球、肥満細胞、顆粒球、形質細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞)、上皮細胞(皮膚、胃腸管、尿管もしくは生殖管由来、または肝臓、膵臓もしくは脾臓由来の器官上皮細胞)、または神経系細胞(グリア、ニューロン、アストロサイト)を凝集させるために使用され得る。
【００６２】
さらに、哺乳動物幹細胞(胚性、非胚性および造血性)の封入凝集体は、本発明のデバイスおよび方法を用いて作製され得る。凝集時、幹細胞は、「胚様体」を形成する。数日後、凝集体は、嚢胞性胚様体(本質的に中空の球)および内部構造、例えば、卵黄嚢または心筋細胞を形成する。幹細胞凝集体は、分化幹細胞、すなわち、凝集前に異なる細胞系統を有するものに由来するものであり得るか、または幹細胞は、凝集後もしくは凝集中に細胞凝集体において分化を行ない得る。分化により、特定の機能を有する細胞がもたらされる。未分化細胞は多能性である、すなわち、まだその特定の機能が発揮されていない。すべての型の幹細胞：外胚葉、中胚葉、内胚葉、間葉、造血系、神経、肝臓、筋肉、膵臓、皮膚、網膜および卵胞の幹細胞が例示される。
【００６３】
また、任意の非哺乳動物生物由来の非哺乳動物細胞がデバイスにおいて使用され得る。数多くの植物細胞株、動物細胞株、昆虫細胞株、植物ウイルス細胞株ならびに微生物(古細菌、細菌、プラスミド、ファージ、酵母および真菌などが存在する)の細胞株が、当業者に公知の寄託所(DSMZ、German National Resource Centre for Biological Materialはその１つである；ATCC、American Type Culture Collectionは別のものである)から入手可能である。任意の公知の寄託所からの細胞が本発明のデバイスおよび方法を用いて有利に凝集され得る。
【００６４】
本発明のデバイスおよび方法を用いて凝集され、任意に封入される細胞は、天然細胞または遺伝子修飾された細胞またはその混合物であり得る。付加、欠失または置換によって細胞のRNAまたはDNAを改変するための遺伝子修飾は、当該技術分野において周知の技術である。１つの型の細胞が使用され得るか、または細胞型の組合せが使用され得る。正常細胞または異常細胞が本発明のデバイスにおいて凝集され得る。正常細胞と異常細胞の混合物を使用してもよい。例えば、骨芽細胞に分化するMC3T3-E1細胞および脂肪細胞に分化するMC3T3-G2/PA6細胞などの新生物性細胞または癌性細胞が使用され得る。44PE、52PE、102PT、149PT、11315MO2、159PT、185PE、190PT、225CWN、229PEを含み、充分特徴づけされ、乳癌の異なるサブタイプを表す任意の計11種の乳癌細胞株、およびMDA-MB-435S、MDA-MB-231、MCF7、SK-OV-3、BJMC3879、MCF-7、MDAMB361、MFM223、BT549、MDAMB468、T-47D、BT474、SK-BR-3、HS578Tを含む他の乳癌細胞株が使用され得る。OPCT-1、OPCT-2、OPCT-3、DU145、LNCaPおよびPC-3を含む任意の前立腺腫瘍細胞株が使用され得る。A549、NCI-H460、NCI-H1299を含む任意の肺癌細胞株が使用され得る。HCT116、HCT116p21-/-、HCT116p53-/-、HCT-15、HT-29、CaCo-2、CoLo205、SW48を含む任意の結腸癌細胞株が使用され得る。例えば、SK-MEL-28、SK-MEL-5、SK-N-SH、HT1080、P815、SW872、UMSCC-14A、KS SAlN、UACC903およびA-431を含む任意の皮膚癌細胞株が使用され得る。例えば、IMR-32、U-87 MG、A172、N1E115、SHSY5Y、A20、Neuro2A (N2a)、SKNSH、C6、PC12およびU87を含む任意の脳の癌細胞株が使用され得る。例えば、786-OおよびACHNを含む任意の腎臓癌細胞株が使用され得る。例えば、HepG2、COLO 587、FaO、HTCおよびHuH7を含む任意の肝臓癌細胞株が使用され得る。例えば、U-2 OSを含む任意の骨の癌細胞株が使用され得る。例えば、A2780、DOV13、OVCAR3、CoLo357およびHeLaを含む任意の卵巣癌細胞株が使用され得る。例えば、Capan1、Panc1およびPanc89を含む任意の膵臓(pancrease)癌細胞株が使用され得る。例えば、H295RおよびSW13を含む任意の副腎の癌細胞株が使用され得る。例えば、ECV304を含む任意の膀胱癌細胞株が使用され得る。例えば、SAOS2、SW1353およびU2OSを含む任意の骨/軟骨細胞株が使用され得る。封入の前、後またはその一部として細胞に分化誘導因子が添加され得る。かかる因子は、当該技術分野で公知である；例示的な因子としては、例えば、幹細胞増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、エリトロポイエチンおよびトロンボポエチン、インスリン、インドメタシン、デキサメタゾンならびにトランスフェリンが挙げられる。下流の特定の経路で分化を促進または誘導するため、キナーゼのインヒビター、受容体アゴニストもしくはアンタゴニストまたは干渉RNAもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの他の薬剤、ペプチド、薬物または分子が添加され得る。次いで、分化細胞は、治療方法に使用され得る。代替的に、未分化細胞の凝集後、凝集体は、動物への移植時に分化するように誘導され得る。
【００６５】
異種型封入デバイスが作製され、使用され得る。例えば、所望の遺伝子でトランスフェクトされた１つの細胞型および免疫抑制物質を分泌することが知られた別の細胞型が、多区画凝集デバイスの異なる区画において凝集され得、記載される生体適合性の封入基材層およびコーティング層を伴って封入され得る。代替的に、デバイスの構成に応じて、両方の細胞型が同じ区画または異なる層に一緒にまたは逐次凝集され得る。デバイス付近の局所免疫抑制は、セルトリ細胞、除核赤血球を含有する異型の凝集体、または凝集体中の標的細胞をNOおよび他の小さい免疫原性因子の影響に耐性となるようにトランスフェクトすることのいずれかによって提供され得る。セルトリ細胞の首尾良い組込みにより、患者に危険な免疫抑制物質の終生計画を必要とすることなく、デバイスの完全性を保護しながら、所望の治療因子の動的送達を補助する局所領域の免疫抑制がもたらされ得る。免疫抑制物質であることが知られた細胞は、全身の免疫系を維持しながら、アレイ過剰増殖を妨げるための局所免疫抑制を提供する安定な同時封入細胞となり得る。セルトリ細胞および赤血球は例示である。Ramen et al.、Transplant International 18：1001-1009 (2005)およびWiegand et al.、Transplantation 56:1206-1212 (1993)を参照のこと。
【００６６】
封入された凝集細胞は、単独または損傷組織および器官を置き換えるか、もしくは増大させるための公知の組織移植骨格と組合せて使用され得る。例えば、本発明のデバイスを用いて作製された島様封入凝集体は、糖尿病の処置に使用され得、封入された真皮乳頭細胞凝集体は、禿頭症を処置するために使用され得、封入された肝細胞凝集体は、肝臓疾患の処置に使用され得、封入された皮膚細胞凝集体は、化粧用および皮膚の再構築処置に使用され得、封入された軟骨細胞および／または骨芽細胞凝集体は、関節の軟骨修復に使用され得る。
【００６７】
癌または前癌細胞の封入凝集体は、腫瘍増殖、転移および処置を研究するために実験動物に移植され得る。また、封入凝集体は、薬物の有効性または毒性を測定するためのハイスループット薬物スクリーニングおよび個人的医薬の領域において使用され得る。封入凝集体は、幹細胞の分化を調査または指向するために使用され得る。封入凝集体は、インビトロおよびインビボでの治療タンパク質または他の重要な代謝産物の作製に有用であり得る。封入凝集体は、貴重な化合物または分子を産生するためのその代謝能力に有用であり得る。封入凝集体は、分子の除去、不活性化もしくは解毒またはワクチンとしての使用のためのウイルス、不能ウイルスもしくは組換えウイルスの作製に有用であり得る。封入凝集体は、遺伝子療法で適用される遺伝子導入剤として使用され得る。封入凝集体は、ある種の化合物および分子を検出するためのバイオセンサーまたは診断デバイスとして有用であり得る。封入凝集体は、食品として有用であり得る。封入凝集体は、分子またはナノ材料の毒性を測定するための検出デバイスとして有用であり得る。封入凝集体は、バイオリアクターの作製に有用であり得る。
【００６８】
凝集体の封入マイクロアレイを用い、その短い半減期のために大きな使用濃度で身体に有害な薬物が送達され得る。IFN-γ、TNF-α、-βおよび-γならびにエンドスタチンなどの因子を用いる癌の処置に対する現在の障壁は、有益な効果をもたらすのに必要とされる濃度によるこれらの分子の毒性に起因する。しかしながら、細胞は、用量応答ベースでエンドスタチンを産生する遺伝子カセットでトランスフェクトされ得る。Joki et al.、Nature Biotechnology 19：35-39 (2001)；Read et al.、Nature Biotechnology 19：29-34 (2001)を参照のこと。次いで、かかる細胞は、腫瘍部位内または腫瘍部位上に凝集され、封入され、移植され得、癌細胞を殺傷することが公知の免疫原性因子の持続可能な濃縮された送達が可能になる。
【００６９】
本発明の他の特徴および詳細を、以下の実施例に具体的に記載する。実施例は、本発明の範囲を実施例に記載された詳細に限定することなく、本発明の特徴の例示が意図される。
【実施例】
【００７０】
実施例1：細胞凝集デバイスの作製および細胞培養物の調製
作製方法は、図1に本発明の一般的なデバイスについて示される。底面に多孔質ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜5を有する本質的に剛性プラスチックリング1である30ミリリットルMillicell(登録商標)CM細胞培養インサート10(Millipore)を成形鋳型として使用した。湿ると透明になるPTFE膜は、培養培地の拡散および倒立顕微鏡を介した細胞凝集体の可視化を可能にする。AutoCAD 2005(登録商標)ソフトウェアを用いて、種々の細胞凝集デバイスの形状および外形を設計し、ポリアクリルアミン基材をワックス鋳型からワックスの逐次層の高速プロトタイプ印刷によって作製し、所望の3D CAD設計トポグラフィーを作製した。鋳型トポグラフィーは、重力により細胞が凝集ウェルに集められるように設計した。ワックス鋳型は、鋳型の上面からの深さが1mmの平坦正方形の凹部が作製されるように設計した。作製されたソフトウェアファイルを鋳型製造用の3D Systems ThermoJet(登録商標)高速プロトタイプ機に供給した。
【００７１】
いったん鋳型を作製したら、多数のミニ垂直型ゲル成型チャンバーModel #Gcc-210  C.B.S. Scientific製を用いてヒドロゲル成型を行なった。生物学的安全キャビネットで、６つの30mm Millicell(登録商標)CM細胞培養インサート10を６つのワックス鋳型20にはめた。アセンブリを垂直型ゲル成型チャンバー25内に、複合体が2つのガラスプレート(図1の工程2)とゲル成型チャンバーの底面との間で垂直に向くように配置した。37.5mlのアクリルアミド/ビスアクリルアミン(29:1混合比、40%溶液；Sigma-Aldrich A-7802)を31.25mlのTrisバッファー、pH 6.8、および31.25 ml DMEM (1%ペニシリン/ストレプトマイシン)と、２つの50ml円錐型遠心チューブ中で混合することにより、100mlの15%プレポリマー溶液を調製した。プレポリマー溶液を30秒間真空への曝露によって脱泡し、キャップし、化学ヒュームフードに移した。フード内では、500μlの開始剤10%APS(脱イオン水中過硫酸アンモニウム溶液；Sigma-Aldrich A-9164)および100μlのTEMED (N,N,N’-テトラメチルエチレンジアミン(diame)99%；Sigma-Aldrich T-7024)触媒を100mlのプレポリマー溶液に添加し、逆さにすることによって混合し、ゲル化のために生物学的安全キャビネットに移した。
【００７２】
工程3において、約75mlの混合物を垂直型ゲル成型チャンバー25中にピペッティングし、鋳型20とインサート10との間の空間を満たした。重合を確認するためのテスターとして、キャップした遠心チューブ内に残りおよそ25mlを残した。PTFE膜5は多孔質であったため、溶液が孔内に流れ込んで重合され、それにより、膜5のヒドロゲルがインサート10に固定された。2時間後、重合が終了し、無菌的技術を用いて、フード内でのチャンバーの分解によってアセンブリを成型チャンバー25から除去した。インサート10周囲から過剰の重合ヒドロゲルを切り出し、ワックス鋳型20を除去し、次にポリアクリルアミンヒドロゲル細胞凝集デバイス30を支持するインサート10を、滅菌6ウェル組織培養プレートに移した。細胞凝集デバイス30は、図2に見られるように、細胞懸濁播種チャンバー31および複数の細胞凝集凹部32で構成され得る。凝集凹部32のすぐ上部の細胞懸濁播種チャンバー31の容積は約300μlであった。
【００７３】
前述のものは、凝集され、アルギネートに封入される細胞に好ましい方法である。その他、PTFE鋳型は使用されず、本発明のデバイスがワックスの代わりにポリジメチルシロキサン(PDMS)または機能的の等価なポリマーから成型される単純化された手順が好ましい。例えば、適切な寸法および構造を有するPDMS鋳型が成型され、溶融アガロース溶液(水中2〜4%w/v)が鋳型に添加され、冷却させる。冷却されると、アガロースが鋳型から除去され得、PDMS鋳型と正確に反対の凹凸をもつ(negative)複製物であるヒドロゲルが得られる。いくつかの標準的な大きさの組織培養プレートに適合する種々の大きさの鋳型が作製され得る。滅菌性を維持するため、プロトコルは、オートクレーブ滅菌アガロース溶液およびPDMS鋳型を用いて、生物学的安全キャビネット内で行なわれる。これは、凝集細胞がアルギネートに封入されない場合、本発明のデバイスの好ましい作製方法である。
【００７４】
実施例2：ヒト２倍体線維芽細胞の細胞播種および凝集
3mlの細胞培養培地(ウシ胎児血清ありおよびなしで、抗生物質として1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM)を添加し、プレートを細胞培養インキュベーターに移し、一晩平衡化して、未反応モノマーをいずれも洗い流し、pHを中和し、デバイス30の孔を培地で満たした。生物学的安全キャビネットで、過剰の培地を6ウェル組織培養プレートから吸引した。正常ヒト２倍体線維芽細胞をトリプシン処理し、計測し、167万細胞/mlの細胞密度まで再懸濁した。300μl(すなわち、約500,000細胞)を各播種チャンバー中にピペッティングした。図2は、凝集凹部32に入るプロセスの種々の段階の細胞33を播種チャンバーの１つにピペッティングされた直後の浸漬培地34に示されることを示す。
【００７５】
ヒドロゲル細胞凝集デバイスを、約1.5時間インキュベーターに移して、細胞を細胞凝集凹部内に置き、次いで、生物学的安全キャビネットに移し、任意の細胞を撹乱しないようにウェルの内壁上にゆっくりピペッティングすることにより6ウェル組織培養プレートの各ウェルに3mlのさらなる培地を添加した。次いで、デバイスをインキュベーターに戻し、放置した。24時間後、細胞凝集体が形成され、6ウェルプレート(まだ約3mlの培地を含んだ)のウェル内でデバイスを5〜10分間逆さにすることにより回収した。収率は80〜90%であった。反転後、穏やかな遠心分離(5分間、25℃、500rpm)によって、収率は100%に増加した。24時間のインキュベーション期間中、t=0、1、2、10および20の時間に光学顕微鏡画像を撮影した。結果を、250ミクロン直径凝集凹部内の線維芽細胞凝集体のアレイの上部から撮影した写真図(平面図)のコピーおよび単一の凹部内の１つの線維芽細胞凝集体の拡大図である図4に示す。2時間後、細胞凝集が明白に見られ(データ示さず)、図4に見られるように、20時間で細胞は完全に凝集している。
【００７６】
デバイス内の調節された凝集は、細胞を一緒に集める形状の細胞忌避表面を必要とする。この表面特性と幾何学的形状の組合せは、細胞間相互作用および細胞接着を増大させるように作用する。この実施例では、凝集に対する幾何学的形状の効果を評価した。細胞を種々のトポグラフィー特徴を有する細胞忌避ポリアクリルアミドゲル上に播種した。400μmの直径を有し、平坦または半球形状のいずれかの底を有する柱状凹部を含むデバイスを構成した。また、単一の大きな(17.6mm×17.6mm×1.8mm)平坦直方形凹部を有するデバイスを構成した。これらのヒドロゲルに正常ヒト線維芽細胞(2.5×105細胞／デバイス)を播種した。播種の24時間後に撮影した写真図は、凝集プロセスの調節は、重力を利用して細胞を一緒により密接に集める幾何学的形状によって改善されることを示した。図3Aに見られ得るように、単一の大きな平坦凹部は、不規則で非調節の細胞凝集をもたらし、不規則な形状の凝集体は、大きさが数十ミクロン〜数ミリメートルの範囲であった。半球形状の底を有する400μm直径の凹部の場合、図3Cに見られ得るように、細胞は、各凹部の中心に位置する単一の球形の凝集体を形成した。対照的に、平底の400μm直径の凹部内の細胞は、図3Bに見られ得るように、各凹部内に散在する多数の不規則な形状の細胞集団を形成した。半球形状の底を有する凹部の１つに形成された単一の球形の凝集体が図3Dに示される。
【００７７】
実施例3：HUVECおよび線維芽細胞の混合集団の凝集
ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)を単独で播種し、同時に正常ヒト２倍体線維芽細胞との共培養で播種し、また、後者は単独でも播種した。種々の細胞型を可視化するため、cell trackerTM 蛍光生細胞染色を使用した。新たにトリプシン処理したHUVECの懸濁液を5μM緑色蛍光cell trackerTM中(細胞培養培地中)でインキュベートし、線維芽細胞懸濁液を5μM赤色蛍光cell trackerTM中で45分間インキュベートした。細胞懸濁液を遠心分離し、cell trackerTMを吸引して除き、細胞を新鮮培地中に再懸濁し、30分間インキュベートした。
【００７８】
次いで、細胞懸濁液を、上記の実施例1に従って作製された凝集デバイスの播種チャンバー中に播種した。50万個のHUVEC単独(均一な集団)、50万個の線維芽細胞単独(均一な集団)ならびに共培養の25万個のHUVECおよび25万個の線維芽細胞(混合集団)を、播種チャンバーに添加した。細胞の３つの集団を2日間凝集させ、次いで、位相差ならびに蛍光顕微鏡検査を用いて可視化した。線維芽細胞またはHUVECの均一な集団は、凝集凹部内で凝集体を形成し、線維芽細胞およびHUVECの混合集団は、凝集凹部内で異型の凝集体を形成した。混合集団では、線維芽細胞は、自身を凝集体の中心に向かって整列するようであったが、HUVECは、線維芽細胞周囲の周縁部に局在した。
【００７９】
実施例4：マウス中皮細胞およびマクロファージの凝集
マウス悪性中皮腫細胞(40L)を単独で播種し、同時にeGFP-トランスジェニックマウスから単離された正常一次腹腔マクロファージ(MO)との共培養で播種し、また、後者は単独でも播種した。細胞を可視化するため、CDMEM培養培地に懸濁した細胞を、製造業者のプロトコルに従って、青色蛍光色素4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI - Vector Laboratories)で染色した。
【００８０】
染色後、３つの型の細胞懸濁液(均一な集団の中皮腫およびマクロファージ細胞、ならびに混合集団の中皮腫/マクロファージ細胞)を上記の実施例1に従って作製された凝集デバイスの播種チャンバー中に播種した。合計200細胞／凝集凹部を使用した。混合集団は、マクロファージ：中皮腫細胞が3:1比である。３つの細胞の集団を2日間インキュベートし、次いで、蛍光顕微鏡検査を用いて可視化した。中皮腫細胞の均一な集団は、凝集凹部内で長球形の凝集体を形成した。マクロファージの均一な集団は、凝集凹部内で非常にゆるい凝集体を形成した。これらは、細胞間接合部を形成しないため(互いに付着する中皮または上皮細胞とは対照的に)、密な凝集体を形成することが予測されなかった。しかしながら、播種チャンバー間でいくらかの変動があったが、共培養では、マクロファージは、インビボでの腫瘍と同様に、凝集凹部内で新生物性中皮細胞とともに凝集体を形成した。
【００８１】
実施例5：凝集された線維芽細胞の封入
正常ヒト２倍体線維芽細胞の凝集体を、上記の実施例1および2に従って作製した。細胞凝集デバイスは、典型的に、使用される前日に作製され、使用前に、培地中におよそ24時間浸漬させて平衡化させた。
【００８２】
簡単には、３次元ワックスプリンターを用いて、400および600μm直径の凝集ウェルをワックス鋳型上にプリントし、ゲルをこのワックス鋳型上に成型し、図1に示されるような、元の鋳型と反対の凹凸をもつものを作製した。各ウェルは柱状の形状であり、一端が半球状であった。従来の組織培養技術を用いて細胞を増殖させた。細胞がコンフルエンスまで増殖したら、合格(pass)とし、ゲルまたはデバイス１つあたり0.5×106細胞の細胞密度まで再懸濁した。図2に示されるように、150μl(約500,000細胞)を各凝集デバイスにゆっくりと滴下することにより、細胞を細胞凝集デバイス内に播種した。細胞を静置すると、典型的に、凝集体が播種24時間後に観察された。凝集後、培地を１日おきに凝集体が安定し、成熟する５日間まで交換した。５日後、細胞凝集体を、実施例6に記載のように正方形のシートとして細胞凝集デバイス内にインサイチュで封入した。
【００８３】
実施例6：封入のための凝集体のマイクロアレイの作製
図5に対する参照は、以下に詳細に示す手順を本明細書において例示する際に行なわれ得る。細胞培養アルギネートでさえ固有の不純物を有するため、最初に、滅菌フィールド内で1.8%アルギン酸ナトリウム(Sigma)を1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液中に混合し、次いで、4000rpmで45分間遠心分離し、不純物を除去した。次いで、0.42μmシリンジフィルターにより上清を濾過し、滅菌アルギネート溶液を得た。実施例5の細胞凝集デバイスを空の容器内に配置し、凝集細胞を浸した過剰の培地を、図5の工程1に示すようにして吸引し、細胞凝集デバイス内の上部の細胞懸濁チャンバーが保持し得る最大容量である300μlのアルギネートを、工程2で示されるチャンバー内にゆっくりとピペッティングした。次に、工程3では、CaCl2の0.15M溶液を添加し、インキュベーター内で１時間まで架橋させた。CaCl2の相対的に低い濃度のため、細胞の凝集体は、架橋期間中、死滅しない。
【００８４】
工程4では、ゲルが架橋されたら、残留するCaCl2を吸引し、ゲルを室温で2.5〜3時間乾燥させた。アルギネートとより遅いアクリルアミドとの脱水速度が異なるため、凝集細胞を含むアルギネートは凝集デバイスから容易に除去された。アルギネートを、マイクロアレイの一面上の隆起したドーム部あたり１つの凝集体を有する17.6×17.6mmのシートの形態でアクリルアミド凝集デバイスから剥がした。
【００８５】
次いで、アルギネートシートを倒立光学顕微鏡下で可視化すると、封入された細胞凝集体のマイクロアレイが見られた(図6)。MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)染色により、すべての細胞が生存しており、アポトーシス性でないことが確認された。MTT染色は、凝集体の壊死性のコアをマスクし得るため、凝集体コアの性質を識別するために生/死染色(Molecular Probes)が使用され得る。生/死染色は、２つの染料、カルセイン-AMおよびエチジウムホモダイマー(Eth-D)からなる。カルセイン-AMは、細胞質のエステラーゼがこれを切断して緑色蛍光を発することができる場合、生細胞によって取り込まれる。死細胞はカルセイン-AMを取り込まないが、代わりに、Eth-Dが死細胞の核内に侵入し得、赤色に染色する。生/死染色は、凝集体内のコア細胞が生存しているかどうかを示す。保存のため、シートを3mLの培養培地(ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen)、10%ウシ胎児血清(FBS、Invitrogen)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Penn-Strep、Invitrogen))中に浸漬し、培地を１日おきに交換した。
【００８６】
実施例7：封入生細胞凝集体へのコーティング層の適用
次いで、実施例6の凝集生線維芽細胞のマイクロアレイを完全な封入を確実にし、アルギネートの安定化を補助するため、ポリ-L-リジン層でコーティングした。滅菌水中のポリ-L-リジン(MW=23,400、Sigma)の5%ストック溶液を混合し、次いで、0.42μmシリンジフィルターにより濾過し、次いで、滅菌水の添加によって0.1%に希釈した。マイクロアレイを水で2〜3回洗浄し、保存培地から塩を排除し、次いで、図5の工程5に示されるように、0.1%PLL溶液を添加し、マイクロアレイをインキュベーター内に配置し、15〜20分間架橋させた。その後、PLL-水溶液を吸引し、マイクロアレイを滅菌水でもう１回洗浄し、過剰のPLLを排除した。
【００８７】
実施例6および7に記載の一般的なプロセスを図5に示す。工程1では、培地を凝集デバイスの細胞懸濁播種チャンバーから吸引した。工程2では、300μlのアルギネートを、チャンバー内およびその凝集凹部内の凝集細胞上に静かにピペッティングした。次に、工程3において、CaCl2溶液をデバイス内にピペッティングし、架橋させた。工程4では、過剰のCaCl2を吸引し、架橋アルギネートゲルを空気乾燥させ、次いで、アクリルアミド凝集デバイスから剥がした。次の工程では、さらなるコーティングのために、封入細胞のシートをポリ-L-リジンの溶液中に浸漬した。
【００８８】
実施例8：可視化研究
封入層およびコーティング層によって細胞凝集体が完全に封入されることを確実にするため、アルギネート基材およびPLLは、染色され、共焦点顕微鏡検査下で可視化され得る。4.5mMの濃度で混合したフルオレセインアミン(C20H13NO3、Sigma)を、1.8%アルギネート溶液とともにインキュベートし、室温で攪拌する。未反応色素を除去するため、溶液は、4℃の脱イオン水に対して透析され得る(26)。PLLは、Alexa 546などの蛍光色素へのタンパク質カップリングによって標識され得る。フルオレセインアミン-アルギネートの溶液およびAlexa 546-PLLでのコーティングからマイクロアレイを作製することにより、マイクロアレイは、共焦点顕微鏡検査を用いて可視化され得、その結果は、PLLコーティングが均一で規則正しいことを示した。
【００８９】
特徴付け研究のため、PLL(MW=23,400、Sigma)の代わりにFITC-PLLの0.1%溶液を用いて、同様のプロトコルに従い、作製されたマイクロアレイを標識PLLの光退色を防ぐためにホイルで覆って保存した。外側のコーティングを染色することにより、エピ(epi)-蛍光顕微鏡検査によって、マイクロアレイの最外コーティングに対する細胞の位置が確認され得る。細胞はまた、凝集体をPLLに関して同時局在させるために染色され得る(Cell Tracker、Molecular Probes)。
【００９０】
SEM可視化に必要とされる機械的応力にマイクロアレイが供されることを回避するため、試料は、環境走査電子顕微鏡(ESEM)により可視化され、凝集体の完全な封入が確認され得る。
【００９１】
実施例9：安定に自己集合する非長球形の細胞凝集体
異なる形状の本発明の凝集デバイスを用いて、本発明者らは、異なる細胞が異なる凝集能力および特徴を有し、異なる構造および形態に凝集することを決定した。例えば、正常ヒト線維芽細胞(NHF)およびラット肝細胞(H35細胞)は、凝集すると有意差を示す。溝形状の凹部では、H35細胞は、安定なロッド構造を容易に形成するが、NHF細胞は長球を形成する。ともに円環体を形成するが、H35円環体は、NHF円環体よりも安定である。これらの違いは、生体組織工学適用、例えば、生体適合性マトリックス内の連続する長球のマイクロインジェクションまたは所望のアレイ内への細胞の電気パターン形成（electropatterning）などの置換生体組織工学技術のための、凝集細胞の安定な非長球形構造を構築するのに有利に使用され得る。
【００９２】
A. 一部はロッドを形成し、一部は球形を形成する
各々が溝または円環体いずれかの形状で複数の細胞凝集凹部を有するマイクロ鋳型非接着性細胞凝集デバイスを、実施例1に記載の方法に従って作製した。ヒドロゲル材料としてアガロースを使用し、細胞凝集凹部外形(feature)は以下のとおりであった。溝は400μm幅であり、底は、200μmの半径で丸かった。溝は21列あり、ゲルあたりで長さが増加した。各列は11の溝を有し、その２つは400μm長であり、次いで、600μmから1800μmまで１つずつ長さが200μm増え、次いで、２つは2200μmの溝であった。2200μmの溝は、すべての溝長さのデータを表わす図9cのもの以外のすべての実験で使用された。円環体形状の凹部は800μm深さであり、環状トラックは400μmの広さであった。凹部底は、円縁を有し(filleted)、半径200μmであった。ペグ(peg)直径は600μmであり、その全外形のペグ直径は1400μmであった。ゲルあたり104の千鳥状に配列された円環体があり、各々は250μmずつ離れていた。
【００９３】
NHF細胞単独、H35細胞単独、およびNHF細胞およびH35細胞の50:50混合物を溝凝集デバイスおよび実施例2に記載の円環体凝集デバイスに播種し、凝集させた。簡単には、新生児包皮由来のNHF細胞およびH35 ラット肝癌細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を加えたDMEM中で拡大させた。NHF細胞を、10%CO2雰囲気中でインキュベートし、H35細胞を5%CO2中でインキュベートした。混合物の実験は、両方の細胞型の50:50混合であり、5%CO2雰囲気中に維持した。細胞を蛍光色素で染色し(NHF細胞は、Cell Tracker Red CMTPXで、およびH35細胞は、InvitrogenのCell Tracker Green CMFDAで)、その混合集団内での凝集が後に続くようにし、その凝集位置を可視化した。実験で使用された細胞は、3回継代〜9回継代の間のものであった。製造業者の指示書に従ってLIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit(Invitrogen)を使用し、細胞生存能力を測定した。
【００９４】
過剰の培地をウェルから吸引し、200μLの単一の細胞懸濁液を各ゲルの凝集凹部内にピペッティングした。細胞が凝集凹部内に沈降し、自己集合プロセスを開始した1.5時間のインキュベーション期間後、ウェルに培地を添加した。培地を１日おきに交換した。Nikon TE2000-S顕微鏡およびHamamatsu Orca-ERカメラを使用し、Openlab v4.0.2 (Improvision)に出力する低速度撮影顕微鏡検査により、凝集プロセスを観察した。特注設計Openlab 4.0.2オートメーションを使用し、各時点において、焦点面間10〜50μmを有する4倍対物レンズのz-スタック(stack)画像を収集し、Volocity 3.1 (Improvision)を用いて画像を分析した。AxioCam MRcデジタルカメラを備えたOlympus IX70顕微鏡を使用し、明視野および蛍光画像を得た。低速度撮影実験では、播種の20〜30分後、デバイスを低速度撮影顕微鏡に移す前に培地を注意深く添加した。ImageJデータ分析ソフトウェアを使用し、形態変化の測定を行なった。ロッドの長さは構造の端から端まで引いた線の長さであった(長軸長さ)。円環体のコア円周を、円環体(toroid)の垂直幅の推定中間点に位置する連続的な円周線として測定した。
【００９５】
播種の数分後、細胞は、いくつかの細胞層と共に湾曲した凹部底に沈降して被覆したが、凹部にいっぱいにはならなかった。自己集合は直ちに開始し、細胞は、合着し、密集して平滑な表面の3D構造を形成した。溝形状の凹部では、細胞は、端部が丸い柱状ロッドに自己集合し、その長軸に沿って長球形の形態に収縮した。NHF細胞および混合細胞は、まずロッド状に凝集し、次いで、15時間ほどの短時間で長球になったが、H35細胞は、ロッド形態に維持され、長球を形成しなかった。NHF細胞、H35細胞および混合細胞はすべて、円環体基材の中心ペグの周りに適合する安定な円環体を形成した。同一の播種密度および類似した平均細胞直径(H35=17±2μM、n=100；NHF=20±3μM、n=20)にもかかわらず、円環体には明白な形態の違いがあった。NHF円環体は、最も細く、H35のものは最も厚かった。混合細胞集団の厚さは、あまり規則的でなく、より高い細胞密度の細胞増殖巣は、より細い領域によって連結された。NHF細胞および混合細胞の両方は、2×106細胞/ゲルの初期播種密度で安定な円環体に凝集され得たが、H35細胞は、1×106/ゲルという低い播種密度でも安定な円環体に凝集され得た(データ示さず)。ロッドまたは円環体形状に凝集されたら、細胞は、基材から容易に除去され得た。除去された凝集体は、そのそれぞれの溝および環状基材において凝集中に形成した最終形状を維持した。
【００９６】
円環体およびロッド形成の動態を調べるため、安定性および形態の経時変化を測定した。NHF細胞、H35細胞およびその1:1混合物を、円環体または溝外形を有するマイクロ鋳型ゲル上に播種した。開放中心（patent center）を有する安定な円環体の数を経時的に測定し、n=728(H35)、511(NHF)、474(混合)であった。5日目、H35(88%)は、NHF(30%)または混合(60%)円環体よりもインタクトなものが有意に多かった。注目すべきことに、混合円環体の安定性は、H35とNHFのものの中間であった。円環体のコア円周は、細胞が凹部の底を覆う0時点で最大であった。自己集合が進行するにつれて、コア円周は、円環体がペグに適合するまで減少した。このプロセスは、H35細胞とNHF細胞および混合物の両方とで顕著に異なる速度で起こった。定常状態は、H35細胞では2日目までに達成されたが、NHF細胞および混合物の両方では１日未満であった。これらのデータは、安定な円環体が細胞型に応じて異なるコア円周を有することを示し、NHF細胞で最も短く、H35細胞で最も長く、混合物でほぼ両者の中間であった。混合物およびNHF細胞のコア円周の変化の速度は類似するが、混合物はNHF細胞よりも安定な円環体を形成することに注目することは興味深い。H35細胞のみがそのロッドおよび円環体の速度論の変化において異なり、コア円周は、ロッド長さより低い速度で進行した(データ示さず)。
【００９７】
溝形状の凹部では、凝集H35のロッド長さは、凝集NHFロッドおよび凝集混合ロッドのものより有意に低い速度で変化した。NHFおよび混合ロッドは、一晩で長球となるが、H35ロッドは、5日目までにその元の長さの41%の最終の安定性に達した。長さが増加する溝内に形成されたロッドに関するデータは、この割合が、最大長さとは無関係に一定に維持されることを示唆する。興味深いことに、NHF細胞および混合細胞が播種された円環体および溝は、一晩でその最終凝集形態に進行したが、H35細胞が播種された円環体は、2日でその最終円環形状の凝集形態に達し、H35細胞が播種された溝は、その最終ロッド形状の凝集形態に達するのに5日間必要であった。混合凝集体は、凝集NHF細胞単独と類似した速度論で自己集合した。
【００９８】
低速度撮影顕微鏡検査を使用し、ロッドおよび円環体の自己集合の初期速度論を調査した。1.6mmの溝内のロッドの写真を10分間隔で撮影し、長軸長さを測定し、時間の関数としてプロットした。NHFロッドが凝集体に自己集合し始めたとき、短軸に沿って中央にネッキング(necking)またはピンチング(pinching)がしばしば観察された。NHFロッドの初期長さは、20〜30分間ほぼ一定に維持された後、50分間にわたって急速に40%減少し、その後、1120分間にわたって、さらに小さくなる(15%)より低速な期間に移行した。ネッキングは10〜20分間以内に開始したが、30分間にわたって急速に50%減少し、1150分間にわたって、その開始状態よりも大きい値に増加しただけであった。最終の長さおよび幅はほぼ同一であり、これは、長球形の形成を示した。混合ロッドもまた、NHF細胞と類似した速度論で長球に進行した(混合物タウ(tau)=347分；NHFタウ=202分)。対照的に、H35ロッドにはラグ期間はなく、自己集合は、ずっと低い速度の線形速度論で進行した(タウ=1.21×108分)。
【００９９】
混合物円環体内の細胞選別を評価するため、H35細胞およびNHF細胞を、上記の蛍光色素で異なるように標識し、2日間自己集合させた。選別は、24時間以内に平行して起こり、コア円周が変化したが、最終の細胞型の位置は、1日目と2日目で変化しなかった。NHF細胞は、円環体基材に隣接する中央の環を形成し、H35細胞は、NHF細胞の周囲に隣接して凝集された構造で形成された。ある程度の混合は自明であったが、NHF細胞は、特に、円環体のより厚い領域において、中心ペグに向かって内部に明白に偏向された。NHF細胞の形態は、広がっており、より紡錘体様であり、最も顕著には高応力領域において境界があまり明確ではなかった。対照的に、H35細胞は、円環体内のその位置とは無関係により個別であり、円形で球形であった。円環体により均一に分布していたが、これらは、中心ペグから離れた最も外側の領域を占めた。2日後、これらの位置は、一貫しており、初日の後よりもやや明白であった。2日目までに、混合凝集体のいくつかは、一緒に中心ペグから離れて上側に移動し、開放中心はなお明白であった。
【０１００】
要約すると、2.2mmの長さまでの溝では、H35細胞は凝集されたロッド様構造に自己集合し、多くの先の研究によって予測されたように、長球を形成しなかった。NHF細胞および混合集団は、長球に凝集した。自己集合の速度論により、興味深い違いも明らかになった。わずかな遅滞後、NHFロッドの長さは、指数関数的速度論で急速に減少し、次いで、よりゆっくりと減少し、この間、1100分間で長球の形態に近づいた。対照的に、凝集H35ロッドの長さは、最初の24時間はほぼ線形速度論で、次の4日間の進行ではより遅い速度論で減少した。興味深いことに、NHF細胞とH35細胞の1:1混合物の速度論は、中間ではなかったが、凝集H35細胞よりもむしろ凝集NHF細胞の速度論により類似した。混合物は、同じわずかな遅滞を有した後、ロッド長さが指数関数的に減少し、およそ2時間遅延した以外は、凝集NHF細胞のものとほぼ同一の曲線であった。
【０１０１】
B.  指向された自己集合およびハニカム細胞凝集体の形成
この実験では、細胞凝集デバイスを、上記のようにしてアガロースゲルから形成したが、アガロースゲルは、溝または円環体の代わりに、ハニカム形状の凹部を有するマイクロ鋳型にした。ハニカム形状の凹部は、本質的に重複する円環体形状の凹部である。400uM幅および200μmの半径の丸くなった底を有する凹部の網目内に13のペグ(中央に1つ、中心ペグの周囲に同心円状に6つ、および0°、60°、120°、180°、240°、300°および360°に外側ペグの6つ)がある。再度、低速度撮影顕微鏡検査を使用し、上記のようにして、NHF細胞単独、H35細胞単独およびNHF細胞とH35細胞の50:50混合物の自己集合をモニターした。結果を図8に、時間0(上列)、播種10時間後(中列)および播種20時間後(下列)で、A欄に凝集NHF細胞、B欄に凝集H35細胞、およびC欄にNHFとH35細胞の凝集された1:1混合物を示す。凝集NHF細胞は急速に細くなり、トート(taught)になり、ハニカム形状の基材の外側ペグから消えた(pop off)。基材から解放されると、NHF細胞のハニカム形状の凝集体は、均一な様式で収縮したが、その形状を維持した。凝集H35細胞は、よりゆっくりと細くなり、外側ペグとの接触が維持され、鋳型内に留まった。混合細胞は、凝集NHF細胞単独と凝集H35細胞単独の中間の凝集挙動を示した。混合細胞は、凝集H35細胞単独よりも急速に細くなり、20時間後、ペグから一部のみが消えた。NHF凝集体と同様、得られた自由浮遊性の凝集NHF/H35混合ハニカムの構造完全性は、細胞が凝集され、構造が収縮したとき、保存された。この収縮プロセスの間に腔の開放性は失われたが、構造の一般的な形状は長球に進行しなかった。
【０１０２】
この複雑な分岐構造において自己分離をアッセイするため、標識H35細胞およびNHF細胞をハニカム鋳型に播種し、1日後および2日後に観察した。標識円環体の場合のように、選別は24時間以内に起こり、NHF細胞はペグに向かって中心に位置し、H35細胞は、全体の構造をコーティングする周縁部上に位置した。NHF細胞は、紡錘体様の拡張した平滑な細胞形態(これは、基材から離れると緩んで円形形態となった)を有したが、H35細胞は、より円形であり、明白な細胞境界を有した。自己分離は、ハニカム内の位置により異なった。6つの最も外側ペグの外縁に沿って、線維芽細胞は、円環体の場合のように、あまり中心ではなくペグ近くに位置した。
【０１０３】
また、本発明者らは、ペグから離れたハニカム形状の混合凝集体の細胞の位置および形態を評価した。これらの弛緩した構造において、腔の開放性は維持され、相対的な細胞の位置は未変化のままであったが、線維芽細胞形態において有意な変化があった。トート構造に見られる不明瞭な細胞の境界および細長い紡錘体様形態の代わりに、弛緩したハニカムにおけるNHF細胞は円形であり、細胞の境界は容易に識別可能であった。これは、円形のままであり、拡張したコンホメーションおよび弛緩したコンホメーションの両方において隣接部と識別されるH35細胞と対照的であった。
【０１０４】
この実験で作製された凝集細胞から構成される自己集合ハニカム構造は、張力が、骨格の必要性なく複雑な自己集合細胞構造全体に均衡され分布され得ることを示す。NHF細胞、H35細胞およびNHFとH35細胞の混合物のハニカムは、各々、6つの外側ペグの外縁との接触によって固定された。該構造は、内部の7つのペグとの接触は、あったとしてもほとんどなかった。低速度撮影実験は、全ハニカム構造が張力下にあること、およびNHF細胞の存在がこの張力を有意に増大させることを明白に示す。NHF細胞のハニカムおよびNHF/H35細胞混合物のハニカムは外側ペグから自然に消え、該構造は急速に収縮する。
【０１０５】
解放されたハニカム凝集細胞が収縮すると、その腔は狭くなった。収縮および狭さは、純粋なNHF細胞のハニカムで最大であり、純粋なH35細胞で最小であり、NHF/H35細胞混合物は中間であった。腔の開放性は、NHF細胞で2日間維持され、H35細胞では5日間も維持された。アガロースペグの直径の増大などの鋳型の幾何学的形状に対する変化は、開放性の増大および腔の大きさの調節を補助し得る。腔の開放性の維持は、細胞型間のその自己集合特性における別の有意差である。
【０１０６】
張力はまた、たぶん、複合体形状のNHF細胞とH35細胞の自己分離に役割を果たす。長球では、種々の細胞型が自己分離し、表面接着の差により互いを覆う。Foty, et al.、Development 122：1611-20 (1996)。これは、円環体およびハニカムのNHF細胞およびH35細胞について観察され、NHF細胞は中心に位置し、H35細胞は周縁をコーティングした。しかしながら、円環体では、NHF細胞の環は中央ではなく、アガロースペグ付近に位置した。ハニカムでは、張力が集中する領域である外側ペグの外縁上のNHF細胞のバンドもまた、アガロースペグの付近であったが、張力が均衡された場所であるハニカム内部のNHF細胞のバンドは、より等しく空間が開いていた。
【０１０７】
ロッド形状の凝集体、円環体形状の凝集体およびハニカム形状の凝集体は、実質細胞型であるNHF細胞よりもむしろ、間質細胞型であるH35細胞で作製され得たことは、微細規模生体組織工学に有望である。実際、本発明者らは、NHF細胞に対してH35細胞が1:1の比を調査したが、線維芽細胞に対する肝細胞の生理学的な比は、0.5:1に近い。Bhatia et al.、Biotechnology progress 14：378-87 (1998)。混合物が中間の安定性を有したという本発明者らの所見と合わせると、これは、より大きなインビボ様の比および組織構造を有する構築物は、より安定であり、したがって生体組織工学適用に用いるのにより良好であり得ることを示唆する。
【０１０８】
要するに、細胞の自己集合ロッド様凝集および細胞のハニカム凝集は、インビトロおよびインビボ適用のための３次元の微細組織の操作に対して興味深い新たな可能性を提供する。その最終的な大きさが拡散によってひどく制限される長球形とは異なり、ロッド構造の長さには理論的制限はないが、その半径は、細胞生存能力を維持するのに必要とされる臨界拡散制限内に維持されるものとする。Enmon et al.、Biotechnology and bioengineering 72、579-591 (2001)；Griffin et al.、Tissue Eng 11：257-66 (2005)；Ambrosi et al.、Journal of Mathematical Biology 48：477-99 (2004)。かかるロッド様構造は、バイオリアクターに適用し得る。本質的に構造的設計においてロッドと円環体の組合せであるハニカムは、効率的な幾何学的形状として周知であり、また、バイオリアクターおよび生体組織工学に適用し得る。開放腔を有する３次元分岐微細組織は、インビボ環境をより密接に近似し、腔構造は、移植のための自己集合微細組織の内皮形成(enothelialize)の可能性を提供する。
【０１０９】
実施例10：複雑な微細組織構造の薬物補助凝集
前述の実施例により、凝集細胞によって通常達成される最終凝集構造は、細胞型依存性であり、「予めプログラムされ」ているが、予めプログラムされた構造は、細胞を凝集体させるために使用される凝集デバイスの形状を変化させることにより変更され得ることが示された。この実施例をさらにすすめると、細胞の自己凝集の動力学は、凝集プロセス中での選択された凝集修飾剤の投与によって調節され得ることが示される。換言すると、凝集の速度および程度は、凝集が開始する前での細胞への選択された凝集修飾剤の添加によって調節可能である。以下に詳細に示す実験は、公知の細胞収縮インヒビターY-27632を用いたこの原理を示すが、凝集の動力学を変更する効果を有する任意の他の薬剤が使用され得る。
【０１１０】
実施例9に記載のようにして作製されたマイクロ鋳型アガロース円環体凝集デバイス(n=208)に、未処理NHFおよび100μMの細胞収縮インヒビターY-27632(Calbiochem (EMD Biosciences、Inc.)、San Diego、CA)で処理したNHFを播種し、開放中心を有する安定な円環体の数を経時的に測定した。1日目までに、すべての未処理NHF(n=104)が円環体から長球に進行したが、処理NHF(n=104)の90%がなお開放中心を有した。2日目までに、処理NHFの5%のみがなお開放中心を有した。これは、細胞凝集の自然な速度論が凝集インヒビターでの細胞の処置によって変更され得ることを示す。データを、図9のヒストグラムに示す。
【０１１１】
効果は、長球形の細胞凝集構造に限定されなかった。次に、溝特徴2.2mmの長さを有する凝集デバイスを、先の実施例に記載のようにして作製し、NHF細胞、無血清培地中のNHF細胞、50μMのY-27632で処理したNHF細胞、および200μMのY-27632で処理したNHF細胞を播種し、得られたロッド形状の凝集体の長さを測定した。結果を図10に示し、図中、NHFを黒三角(▲)で示し、無血清培地中のNHFを白三角(△)で示し、50μMのY-27632で処理したNHFを黒逆三角(▼) で示し、200μMのY-27632で処理したNHFを白逆三角(▽)で示す。Y-27632の劇的な増加は、ロッドの長さ変化速度論を遅くした。5日後、その溝長さの41%で維持されるH35ロッドは、参照に含まれ、黒丸(●)で示される。
【０１１２】
次いで、溝特徴2.2mmの長さを有するゲルにNHFまたは最初に100μMのY-27632で処理したNHFを播種し、10分毎に画像化した。1.5時間で、Y-27632溶液を除去し、通常培地と交換した。結果を図11に示し、図中、未処理NHFを黒逆三角で示し、処理NHFを白逆三角で示し、矢印は1.5時間での培地の交換を示す。結果は、凝集阻害薬物の除去時、NHF細胞がロッドに凝集し、未処理NHFのものと同様の速度論で進行することを示す。
【０１１３】
最後に、NHFを、実施例9Bに記載のようにして作製されたハニカム構造の細胞凝集デバイス上に播種し、Y-27632溶液中で維持した。未処理NHFは、1日以内にペグから離れて上側で収縮したが、処理NHFは、5日目でハニカム形状の凹部内で未変化のままであった。１つの処理NHFハニカムの一例を図12に示す。
生存能の染色により、ほとんどの細胞が5日目で生存していることが明らかにされた。
【０１１４】
これらの結果は、本発明の細胞凝集デバイス内での細胞凝集の自然な速度論は、凝集インヒビターでの細胞の処理によって変更され得ることを示す。したがって、凝集の速度論は、処置計画ならびに組織修復および／または再構築プロトコルによる必要性に応じて、凝集を加速または減速するいずれかの、凝集修飾剤での処理によって調節され得る。
【０１１５】
開示されたすべての組成物および方法ならびに本明細書に記載の特許請求の範囲は、本開示に鑑みて過度の実験なく作製および実行され得る。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記載したが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、該組成物および方法の変形が行なわれ得ることは、当業者に自明である。例えば、化学的に関連する特定の薬剤および組成物は、同じまたは同様の結果が達成され得る場合に、本明細書に記載の薬剤と置き換えられ得る。かかる同様の置換および修飾はすべて、当業者に自明であり、本発明の精神、範囲および概念に含まれるとみなされる。
【０１１６】
本明細書に挙げたすべての刊行物、特許出願、特許および他の文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書に支配される。また、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、限定は意図されない。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図1は、本発明の細胞凝集デバイスの４工程の作製方法を一般的に示す。
【図２】図2は、１つの細胞懸濁播種チャンバーおよび６つの細胞凝集凹部を示す本発明のデバイスの１つの態様を示す断面図である。
【図３】図3は、実施例1に記載のようにして作製された本発明のデバイスを用いて調節された細胞凝集の結果を示す写真の複製のコピーである。図3Aは、単一の大きな平坦凹部上の正常ヒト線維芽細胞の凝集を示す。図3Bは、平底の400μm直径の凹部内の凝集を示す。図3Cは、半球形状の400μm直径の凹部内の凝集を示す。図3Dは、図3Cの凹部の１つの細胞の単一の球形の凝集体の高倍率である。スケールバー= 300μm。
【図４】図4は、400ミクロン 直径凝集凹部内の線維芽細胞の凝集体のアレイの平面図および単一の凹部内の線維芽細胞の凝集体の１つの拡大図を示す、実施例2の結果の写真の複製のコピーである。
【図５】図5は、実施例6および7に詳細に記載された本発明の封入された凝集生細胞の作製方法を示す。
【図６】図6は、1.8%アルギネート溶液中の封入された凝集細胞のマイクロアレイの写真の複製のコピーである。乾燥後、マイクロアレイをアクリルアミド細胞凝集デバイスから剥がし、凝集体を特徴について観察した。スケールバー300μm。
【図７】図7AおよびBは、実施例9Aに記載の自己集合実験の結果のグラフ図である。
【図８】図8は、実施例9Bに詳細に記載の細胞凝集デバイスにおけるハニカム形状の凹部を用いた低速度撮影実験の結果の写真の複製である。
【図９】図9は、実施例10に記載の、未処理NHFまたは凝集修飾剤で処理されたNHFが播種されたマイクロ鋳型(micro-molded)アガロース円環凝集デバイスを用いて行なわれた凝集実験の結果を示すヒストグラムである。
【図１０】図10は、実施例10に記載の溝特徴を有する本発明の凝集デバイスを用いた薬物補助凝集実験の結果のグラフ図である。
【図１１】図11は、実施例10に記載の溝特徴を有する本発明の凝集デバイスを用いた薬物補助凝集実験の結果のグラフ図である。
【図１２】図12は、本発明のハニカム構造の細胞凝集デバイスを用いた薬物補助NHF細胞凝集実験の結果のいくつかの写真の複製である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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