(57)【要約】  本発明は、本明細書に規定した親水性残基と疎水性残基とのバランスを有する追加のペプチドに親ペプチドを結合させて、親分子単独よりも高い経口生物学的利用能を有するコンジュゲートを形成する工程を含む、親ペプチドの経口送達の改善方法を提供する。前記コンジュゲートを含む医薬組成物として、本発明の方法で使用するコンジュゲートも提供し、前記コンジュゲート又は医薬組成物を用いる治療方法も提供する。
2009502976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ペプチドを追加のペプチドに結合させて、親分子単独よりも高い経口生物学的利用能を有するコンジュゲートを形成する工程を含む、前記親ペプチドの経口送達を改善する方法であって、
前記追加のペプチドが、式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む、方法。
【請求項２】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドに結合させた親ペプチドを含む、ペプチドコンジュゲート。
【請求項３】
前記コンジュゲートが１２以下のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４】
Ａ及び／又はＣが疎水性アミノ酸残基である、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５】
Ａ及び／又はＣが、２又は３のアミノ酸残基の実質的に疎水性のペプチドである、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項６】
Ｂが１から５の親水性アミノ酸残基である、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項７】
Ｂが１又は２の親水性アミノ酸残基である、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項８】
１つ又は複数あるいは全ての親水性アミノ酸残基が、電荷を有するアミノ酸残基である、請求項６又は７に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項９】
前記追加のペプチドが１２以下のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１０】
前記追加のペプチドが６以下のアミノ酸を有する、請求項９に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１１】
前記追加のペプチドが配列番号１から９から選択される、請求項１０に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１２】
前記親ペプチドが、ジスルフィド結合したペプチドである、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
前記親ペプチドが２０以下のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１４】
前記親ペプチドが２１から４０アミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１５】
前記親ペプチドが４１から６０のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１６】
前記親ペプチドが６１から８０のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１７】
前記親ペプチドが８１以上のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１８】
配列番号１２、１３、又は１４の１つとして与えられるペプチドを含むか又は前記ペプチドから本質的に構成される、ペプチドコンジュゲート。
【請求項１９】
前記ペプチドコンジュゲートが請求項２から１８のいずれか一項に記載のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
製薬学的に許容される担体と共に、請求項２から１８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、経口投与のための医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２から１８のいずれか一項に記載のペプチドコンジュゲート又は請求項２０に記載の医薬組成物の有効量を動物に経口投与することによる、通常は実質的に経口生物学的利用能を有さない親ペプチドで治療する必要がある動物において病理疾患を治療する方法。
【請求項２２】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドを含む、経口送達システムであって、
前記追加のペプチドが、親ペプチドに結合して、前記親ペプチドの経口生物学的利用能を改善するためのものである、経口送達システム。
【請求項２３】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含むペプチドの使用であって、親ペプチドに結合させて前記親ペプチドの経口生物学的利用能を改善するための使用。
【請求項２４】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドの使用であって、親ペプチドで治療する必要がある患者に経口投与するための、前記親ペプチドを含む医薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質又はペプチドの経口送達を改善するための方法、特に経口投与された際に改善された生物学的利用能を有するタンパク質又はペプチド、及び改善された経口生物学的利用能を有するタンパク質及びペプチドを設計する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療の投与計画を患者が最良に遵守し、投与計画のより大きな柔軟性を可能にし、並びに注射による投与に関連するリスク、不都合、及び費用を避けるため、治療剤の経口送達は望ましい。しかしながら、経口経路が利用可能であるかは、
（ａ）口腔、食道、又は消化管における粘膜層を介して吸収される、
（ｂ）消化管における酸分解及び酵素分解に耐え得る、並びに
（ｃ）上皮細胞層を越えて全身循環へと通過する
という薬剤の機能によって制限される。
【０００３】
ほぼ全ての薬理学的なペプチドが、有用な程度では経口的に利用することができない。特に、インスリン、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン、又はカルシトニンのようなホルモン、並びにインターフェロン又はインターロイキンのようなサイトカインは、特別な製剤を使用しなければ、２％をはるかに下回る経口利用能を有することが知られている。その様なレベルでは、時間的及び個人間での利用能の変化が典型的に高く、経口投与を非実用的、非経済的、又は危険なものとする。
【０００４】
ペプチドは、医療における重要性を増している。しかしながら、それらの使用は、大半のペプチドが注射によって投与されることを必要とするという事実によって制限されている。肺、鼻、又は経皮的な経路のような全身投与の代替的な経路が提案されているが、これまでは、限られた範囲の薬剤についてのみ開発されており、単回用量において送達され得る化合物の量及び許容性における制限に悩まされている。
【０００５】
医薬品の生物学的利用能を改善するため各種の試みが為されている。これらは、サリチレート、脂質−胆汁塩混合物、ミセル、グリセリド、及びアシルカルニチンのような浸透促進剤を含ませることを含むが、これらは、大半の場合において毒性の問題を生じさせることが認められている。
【０００６】
医薬品がタンパク質又はペプチドである場合は、経口生物学的利用能を改善する試みとして、アプロチニン、ダイズトリプシンインヒビター、及びアマスタチンのようなプロテアーゼインヒビターと、タンパク質又はペプチドとを混合して投与される治療剤の分解を制限することが含まれる。残念なことに、これらのプロテアーゼインヒビターは選択的なものではなく、内因性のプロテアーゼも阻害して望ましくない効果を生じさせる。
【０００７】
ペプチドの経口製剤を提供しようとする他の試みは、例えば親水性ポリエチレングリコール部分と親油性アルキル部分とを含む両親媒性オリゴマー又はポリマーへのタンパク質又はペプチドのカップリングによるペプチドの化学的修飾と共に又は単独で、腸溶コーティングのような保護コーティングを利用している。これらの技術は、非常に限定された成功を与えている。他の手法は、胃腸管におけるタイトジャンクションをゆるめる賦形剤の添加であるが、機能が低下した障壁によってバクテリアを含む全ての分子が近接に存在することを許容され得るため、この手法は許容性の問題を生じさせる。カルシウムアルギネート被覆リポソーム製剤もペプチドの結腸投与に使用されている。しかしながら、その様な手法は、限られた用途にのみ認められている。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＡＵ９８／００７２４
【特許文献２】ＰＣＴ／ＡＵ０１／００３５４
【特許文献３】ＰＣＴ／ＡＵ００／０１３６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、当該技術分野には、分子、特にタンパク質又はペプチドの経口送達を改善する新規方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第一の態様では、本発明は、親ペプチドを追加のペプチドに結合させて、親ペプチド単独よりも高い経口生物学的利用能を有するコンジュゲートを形成する工程を含む、親ペプチドの経口投与尾を改善する方法であって、前記追加のペプチドが式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣは、各々、疎水性アミノ酸残基、又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなく良い、並びに
Ｂは、１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む方法を提供する。
【００１０】
本出願人の先の出願であるＰＣＴ／ＡＵ９８／００７２４、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００３５４、及びＰＣＴ／ＡＵ００／０１３６２は、ヒトの成長ホルモンのＣ末端配列、特にアミノ酸配列１７７−１９９の配列及び当該配列のアナログに由来するペプチドファミリーを開示している。ＡＯＤペプチドと称されるこのファミリーのペプチドは、任意の用量において見られる毒性は有さないことが認められており、数日に一度から連続的な範囲の頻度で有効に投与され得る。これらの出願に開示されているようなＡＯＤ９６０４及びＡＯＤ９４０１を含むＡＯＤペプチドの幾つかは、実質的に、経口で生物学的に利用可能であることが認められている。ここで、本発明者は、経口で生物学的に利用可能ではない（又は制限された経口生物学的利用能を有するのみである）ペプチドにＡＯＤペプチドの小領域を結合することが、そのペプチドに対して実質的な経口生物学的利用能を与え得ることを見出した。ＡＯＤペプチドの小領域の更なる分析によって、本発明者は、追加のペプチドに結合する親ペプチドの経口送達を改善するために必要とされる追加ペプチドの必須の構成要素を決定することができた。
【００１１】
第二の態様では、本発明は、追加のペプチドを含む経口送達システムであって、前記追加のペプチドが、式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣは、各々、疎水性アミノ酸残基、又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなく良い、並びに
Ｂは、１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含み、前記追加のペプチドは、親ペプチドの経口生物学的利用能を改善するために親ペプチドに結合するためのものである、経口送達システムを提供する。
【００１２】
第三の態様では、本発明は、追加のペプチドに結合した親ペプチドを含むペプチドコンジュゲートであって、前記追加のペプチドが、式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣは、各々、疎水性アミノ酸残基、又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなく良い、並びに
Ｂは、１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む、ペプチドコンジュゲートを提供する。
【００１３】
第四の実施態様では、本発明は、製薬学的に許容される担体と共に、本発明の第三の態様に係るコンジュゲートを含む、経口投与のための医薬組成物を提供する。
【００１４】
第五の態様では、本発明は、式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣは、各々、疎水性アミノ酸残基、又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなく良い、並びに
Ｂは、１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含むペプチドの使用であって、親ペプチドの経口生物学的利用能を改善するために親ペプチドに結合させるための使用を提供する。
【００１５】
第六の態様では、本発明は、本発明の第三の態様に係るコンジュゲート又は第四の態様に係る医薬組成物の有効量を動物に経口投与することによる、通常では経口で生物学的に利用可能ではない親ペプチドを用いた治療を必要とする動物における病理疾患を予防又は治療するための方法も提供する。
【００１６】
第七の態様では、式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣは、各々、疎水性アミノ酸残基、又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなく良い、並びに
Ｂは、１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドの使用であって、親ペプチドを用いた治療を必要とする患者に経口投与するための、親ペプチドを含む医薬の製造における使用を提供する。
【００１７】
前記追加のペプチドは、病理疾患の進行に対する更なる治療剤の効果又は病理疾患の進行の診断又はモニタリングにおける使用のための親ペプチドの経口送達に使用されて良い。
【００１８】
認められる有益な効果に関して任意の提案されている機構に限定されることを望まないが、前記追加のペプチドは、特定の膜結合特性、並びに前記コンジュゲートが胃腸（ＧＩ）管における粘膜層を透過し、上皮細胞膜に接近し、結合し、及び透過することを促進する親油性及び親水性バランスを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明者は、追加のペプチドによって提供される疎水性残基と親水性残基とのバランスが、追加のペプチドによる、消化管の酸分解及び酵素分解からの親ペプチドの保護を可能にし、且つ、親ペプチドの治療活性を除外すること無く、口腔、食道、又は消化管の粘膜層を通って親ペプチドが吸収され、上皮細胞層から全身循環へと通過することを可能にする。
【００２０】
本明細書における用語「ペプチド」の使用は、特に制限しない限り、タンパク質を含む、任意のアミノ酸長のポリペプチドを含む。
【００２１】
したがって、本明細書で規定したように、親ペプチドは、親ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を包含する。
【００２２】
本明細書で称する「経口送達」及び「経口投与」は、ＧＩ管への任意の投与又は送達を包含し、口腔咽頭への直接投与、並びに胃、小腸、又は大腸を含む消化管でペプチド又はポリペプチドの実際の吸収が生じる口を介する投与を包含する。本明細書で使用する経口投与は、舌下投与（口腔咽頭を介する投与の一態様である、受容者の舌の下への適用による投与）及び頬投与（需要者の歯と頬の間への剤形の投与）を包含する。
【００２３】
経口送達及び経口投与は、本明細書では互換的に使用されて良い。
【００２４】
本明細書で使用する生物学的利用能は、血流における親ペプチドの利用能を示す。
【００２５】
追加のペプチド
式Ｉの追加のペプチドにおいて、Ａ及びＣは同じものであるか又は異なるものであって良く、Ａ又はＣのいずれか１つが存在しなくても良い。Ａ及び／又はＣは、疎水性アミノ酸であるか、又は２−９アミノ酸残基の実質的に疎水性のペプチドのいずれかである。
【００２６】
本明細書で規定する疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、トリプトファン、及びメチオニンから選択される天然のアミノ酸残基であるか、又は以下に規定するそれらのアナログである。
【００２７】
本明細書で規定する実質的に疎水性のペプチドは、少なくとも１つの疎水性アミノ酸を含み、任意の親水性又は電荷を有するアミノ酸を含まない配列を有するペプチドである。好ましくは、疎水性ペプチド配列を構成するアミノ酸の少なくとも５０％が、疎水性アミノ酸である。より好ましくは、疎水性ペプチド配列を構成する全アミノ酸の少なくとも８０％が、疎水性アミノ酸である。さらに好ましくは、疎水性ペプチド配列を構成する膳アミノ酸の少なくとも９０％又は９５％が、疎水性アミノ酸である。好ましくは、前記疎水性残基の残部は、中性アミノ酸を含む。
【００２８】
本明細書で規定する親水性アミノ酸残基は、セリン又はスレオニンから選択される天然のアミノ酸残基であるか、又は以下に規定するそれらのアナログである。
【００２９】
本明細書に規定する電荷を有するアミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジン（全て正電荷を有するか又は酸性である）並びにアスパラギン酸及びグルタミン酸（双方が不電荷を有するか又は酸性である）から選択される天然のアミノ酸残基であるか、又は以下に規定するそれらのアナログである。
【００３０】
本明細書に規定する中性のアミノ酸は、グリシン、アスパラギン、又はグルタミンから選択される天然のアミノ酸残基であるか、又は以下に規定するそれらのアナログである。
【００３１】
天然のアミノ酸残基は、Ｌ−アミノ酸残基である。これらは、一般的に「一般アミノ酸（ｃｏｍｍｏｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」と称され、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、メチオニン、アルギニン、リジン、プロリン、セリン、スレオニン、及びヒスチジンからなる群から選択される。これらは、従来使用されている三文字表記又は一文字表記によって示される。
【００３２】
追加のペプチドの配列中の１つ又は複数の個々のアミノ酸残基が、追加のペプチドのコンフォメーション、構造、及び電荷を実質的に維持して、追加のペプチドが結合した親ペプチドの経口送達における改善を与えることを可能にするという条件で、非通常アミノ酸（すなわち、アナログ又は非一般アミノ酸）に置換されて良い。
【００３３】
本明細書で使用する天然アミノ酸のアナログは、非通常アミノ酸又は化学的なアミノ酸アナログを含む。かくして、ロイシンはノルロイシンによって置換されてよく、バリンはノルバリンによって置換されて良く、システインはホモシステインによって置換されて良く、セリンはホモセリンによって置換されて良く、リジンは５−ヒドロキシリジンによって置換されて良く、プロリンは４−ヒドロキシプロリンによって置換されて良く、アルギニンはホモアルギニン、オルニチン、若しくはシトリルリンによって置換されて良く、アラニンはα−メチルアラニン又はβ−アラニンによって置換されて良く、Ｄ−アミノ酸は対応するＬ−アミノ酸に代わって使用されて良く、任意のアミノ酸がＮ−メチル化されて良く、あるいはＮ−末端がアセチル化されて良い。非通常アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸、ホモアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、デヒドロアミノ酸、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン以外のもの）、オルト−、メタ−、若しくはパラ−アミノ安息香酸、オルニチン、シトルリン、ノルロイシン、γ−グルタミン酸、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、及びα，α−二置換アミノ酸からなる群から選択されるものを更に含む。
【００３４】
非通常アミノ酸は、１，３又はより大きな置換パターンで分離したアミン官能基及びカルボキシル官能基を有する化合物、例えば、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒラクタム、二環式ジペプチド（ＢＴＤ）、アミノ−メチル安息香酸、及び当該技術分野において良く知られた他のものも含む。スタチン様アイソスター、ヒドロキシエチレンアイソスター、還元アミド結合アイソスター、チオアミドアイソスター、尿素アイソスター、カルバメートアイソスター、チオエーテルアイソスター、ビニルアイソスター、及び当該技術分野において既知の他のアミド結合アイソスターが使用されても良い。
【００３５】
アナログ又は非通常アミノ酸の使用は、整理条件下における分解に対してより耐性を有するため、追加のペプチドの安定性及び生物学的半減期を改善し得る。当業者は、作製されて良い同様のタイプの置換に気付くであろう。
【００３６】
天然のアミノ酸についての適切な置換として使用されて良い非通常アミノ酸の非制限的なリスト及びそれらの標準的な表記を表１に挙げる。
【００３７】
【表１Ａ】
2009502976.tif 000003
【表１Ｂ】
2009502976.tif 000004
【表１Ｃ】
2009502976.tif 000005
【表１Ｄ】
2009502976.tif 000006
【００３８】
本発明は、以下：
１．１つ又は複数のアミノ酸が対応するＤ−アミノ酸によって置換されているペプチド。当業者は、実質的に全てのアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、その配列が逆であるレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）アミノ酸配列を含む、その様な配列が、標準的な方法（例えば、Ｃｈｏｒｅｖ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ，（１９９３）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６，２６６−２７３）によって合成され得ることに気付くであろう；
２．ペプチド結合が代謝分解に対してより耐性を有する構造構造によって置換されている、ペプチド摸倣化合物（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６  ３０３９−３０４９）；並びに
３．個々のアミノ酸がアナログ構造、例えば、ｇｅｍ−ジアミノアルキル基又はアルキルマロニル基によって置換されており、電荷を変化させるために修飾末端又はアルキル、アシル、若しくはアミン置換を有するか又は有さないペプチド、
を含むが、それらに限らない追加のペプチドのアナログも包含することが明確に理解されるべきである。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様では、Ａ及び／又はＣは疎水性アミノ酸残基である。代替的に、Ａ及び／又はＣは、２、３、４、５、６、７、８、又は９アミノ酸を含む実質的に疎水性のペプチドである。
【００４０】
好ましくは、Ｂは、５以下の親水性アミノ酸であり、より好ましくは４、３、又は２以下の親水性アミノ酸である。好ましい実施態様では、Ｂは、１から５の間の、電荷を有するアミノ酸残基であり、より好ましくは１から５の塩基性アミノ酸残基である。好ましくは、Ｂは、Ｌ又はＤ−Ａｒｇ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓである。
【００４１】
１つの実施態様では、Ａ又はｃは、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃという配列［Ｘａ−Ｘｃの各々は任意の非親水性アミノ酸である］を有する。
【００４２】
好ましくは、追加のペプチドは、１２以下のアミノ酸残基。更に好ましくは１０以下のアミノ酸残基、最も好ましくは５、６、７、８、又は９以下のアミノ酸残基を有する。
【００４３】
好ましい追加のペプチドは、
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １）
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２）、
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３）、
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４）、
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ５）、
Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ６）、
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ７）、
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ８）、
の配列又はそれらのアナログの１つを含む。好ましくは、グリシンを除く全てのアミノ酸がＬ絶対配置のものである。
【００４４】
親ペプチド
本明細書で使用する親ペプチドは、経口生物学的利用能が制限されているか又はこれを有さない、治療用ペプチド（又はポリペプチド若しくはタンパク質）である。
【００４５】
好ましくは、前記親ペプチドはＧＩ管では十分に安定であるが、血流に入るのに困難性を有する。
【００４６】
本明細書で使用する「十分に安定」とは、少なくとも２０％の投与したペプチドがＧＩ管への曝露の３０分後に残存していることを示す。その様なペプチドの例はコノトキシンであるＡＣＶ１であり、以下に詳述する。
【００４７】
親ペプチドは、酵素、ホルモン、抗体及び抗体断片、並びにコノトキシンを含む。
【００４８】
親ペプチドは、ジスルフィド結合したペプチド、例えば、実施例に記載しているもののようなコノトキシンであって良い。その様なジスルフィド結合したペプチドは、ジスルフィド結合が、典型的に、ある程度親ペプチドを胃腸管による分解から保護するという点において特に利点を有して良い。
【００４９】
親ペプチドのサイズが大きくなると、本発明によって与えられる経口の利用能が低減することが予想されるべきである。
【００５０】
親ペプチドは、２０又はそれよりも少ないアミノ酸のペプチドであって良く、本発明の経口送達システムを使用して投与される際に実質的な経口活性を強力に提供する。その様な親ペプチドの例は、α−メラノサイト刺激ホルモン、バソプレッシン、オキシトシン、エンケファリン、ソマトスタチン、及びＡＣＶ１を含むコノトキシンを含む。
【００５１】
親ペプチドは、２１から４０アミノ酸の間であって良く、例えば、本発明の送達システムによって与えられる経口の利用能は少ないが使用可能である、実施例に記載のパラチロイドホルモン（ＰＴＨ１−３４）であって良い。その様な親ペプチドの他の例は、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、カルシトニン、ＰＹＹ３−３６、オキシントモジュリン、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、エンドルフィン、及びスーパーファミリーの関連するメンバーを含む。
【００５２】
親ペプチドは、本発明の送達システムによって与えられる経口の利用能が更に低い可能性がある４１から６０のアミノ酸の間であって良い。その様な親ペプチドの例は、インスリン及びインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）である。
【００５３】
親ペプチドは、本発明の送達システムによって与えられる経口の利用能が更に低い可能性がある６１から８０のアミノ酸の間であって良い。
【００５４】
親ペプチドは、本発明の送達システムによって与えられる経口の利用能が２％未満で比較的低いことが予想され、且つ、数例でのみ有用である可能性がある、８０アミノ酸より大きいものであって良い。その様な親ペプチドの可能性がある例は、成長ホルモン、インターロイキン、又は他の大きな増殖因子である。
【００５５】
親ペプチドの任意のアミノ酸が、追加のペプチドについて上述したアナログ又は非通常アミノ酸によって置換されて良い。
【００５６】
結合
親ペプチドの経口生物学的利用能を改善するために、追加のペプチドを親ペプチドに結合させなければならない。その結合は、共有結合であるか又は非共有結合であって良い。
【００５７】
実施例で示すように、本発明の第一の態様に係る追加のペプチドの親ペプチドへの結合は、親ペプチドの経口生物学的利用能を改善する。追加のペプチドは、本明細書で規定する任意の親ペプチドの経口送達のための送達システムにおいて使用されて良い。
【００５８】
好ましくは、追加のペプチドは、親ペプチドのＮ末端に結合する。追加のペプチドが親ペプチド又はヌクレオチドにＣ末端において結合しても良いことが更に予期される。この実施態様では、追加のペプチドのアミノ酸配列が好ましくは逆になっており、Ｃ末端が好ましくはアミド化される。例えば、上記の実施態様では、追加のペプチドは、
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２）
である。
【００５９】
このペプチドを親ペプチドのＣ末端に結合させることが好ましい場合には、
Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９）
が好ましい。
【００６０】
親ペプチド及び追加のペプチドは、生物学的活性を与える任意の簡便な方法と組み合わせて良い。例えば、親ペプチドと追加のペプチドの双方が、Ｆｍｏｃ又はＢｏｃ化学のような従来の固相方法によって簡便に合成するのに十分短い場合には、これが非常に簡便な合成方法であり、結合は従来のペプチド結合である。代替的に、親ペプチドは組換え方法を使用して合成して良く、続いて単離し、酵素を用いた方法を使用して追加のペプチドに結合させるか、又はコンジュゲート全体を組換え方法を使用して合成して良い。適切な方法は当業者によく知られており、任意の所定の状況のための最も好都合な方法が容易に選択されて良い。
【００６１】
好ましい結合部位は、親ペプチドの性質に依存して変化するであろう。１つの特定の実施態様では、コンジュゲートにおいて、親ペプチドのＮ末端が追加のペプチドのＣ末端に結合しているが、これは付加した部位が生物学的活性を維持していることに主に依存するであろう。
【００６２】
１つの実施態様では、追加のペプチドは、
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２）
の配列を含み、親ペプチドは、
Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １０）
のＡＣＶ１配列を含む。Ｎ末端は任意にアセチル化されて良い。
【００６３】
他の実施態様では、追加のペプチドは、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３）の配列を含み、親ペプチドは、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １１）のＰＴＨ１−３４配列を含む。
【００６４】
コンジュゲートペプチド
本明細書で規定するコンジュゲートペプチドは、本明細書で規定するような親ペプチドに結合した、本明細書で規定するような追加のペプチドを任意の順序で含む。
【００６５】
好ましいコンジュゲートペプチドは、配列番号１２、１３、又は１４を含むか又は本質的に構成されるものである。
【００６６】
本発明は、以下に記載するような、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加によって修飾された配列を有するコンジュゲートペプチドを包含することが明確に理解されるであろう。
【００６７】
置換は、各種の天然又は非天然のアミノ酸残基によってアミノ酸が置換される、アミノ酸の変更を包含する。その様な置換は、ペプチドに存在するアミノ酸残基が類似の特性を有する他の天然のアミノ酸で置換される「保存的」として分類されて良く、例えば、ＧｌｙからＡｌａ、ＡｓｐからＧｌｕ、ＡｓｎからＧｌｎ、又はＴｒｐからＴｙｒである。可能性がある代替的なアミノ酸は、セリン又はスレオニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸又はγ−カルボキシグルタメート、プロリン又はヒドロキシプロリン、アルギニン又はリジン、アスパラギン又はヒスチジン、ヒスチジン又はアスパラギン、チロシン又はフェニルアラニン又はトリプトファン、アスパルテート又はグルタメート、イソロイシン又はロイシン又はバリンを含む。
【００６８】
その様な保存的置換は、好ましい置換という表題で表２に示す。その様な置換が機能的活性における変化を生じさせない場合には、更なる実質的な変化、表２に記載の例示的な置換、又はアミノ酸の種類に関連して以下に更に記載するようなものが導入されて良く、結果として生じる変異体を機能活性について分析する。
【００６９】
本発明に包含される置換は、ポリペプチドに存在するアミノ酸残基が異なる特性を有するアミノ酸、例えば、異なる群の天然アミノ酸によって置換される（例えば、電荷を有するアミノ酸又は親水性アミノ酸又は疎水性アミノ酸をアラニンで置換する）か、あるいは天然のアミノ酸が非通常アミノ酸で置換される「非保存的」であっても良い。付加は、１つ以上の天然又は非通常アミノ酸の付加を包含する。欠失は、１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失を含む。
【００７０】
【表２】
2009502976.tif 000007
【００７１】
本発明の範囲を制限することを望まないが、親ペプチドにおけるジスルフィド結合に関与する任意の残基、特にＡＣＶ１のようなコノトキシンのシステイン残基が分子の生物学的活性に必須ものであるようであり、そのため、この部位における置換の範囲が制限されて良い。
【００７２】
ペプチドアナログのコンビナトリアル合成のための方法、及び活性を保持しているか測定するためのペプチド及びペプチドアナログのスクリーニングのための方法は、当該技術分野において良く知られている（Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３−１２５１；Ｈｏｇａｎ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５  ３２８−３３０）。
【００７３】
コンジュゲートは、糖鎖付加、アセチル化、リン酸化、アミド化などを含むが、それらに限らない方法によって合成の間又は後のいずれかに修飾されて良い。
【００７４】
本発明で使用する用語「ＡＯＤペプチド」は、上述のヒト成長ホルモンのＣ末端配列由来、本質的にはヒト成長ホルモンのアミノ酸残基１７７−１９９に由来するペプチド種のメンバーを示す。
【００７５】
用語「ＡＣＶ１ペプチド」は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０２／００４１１で配列番号１０の配列を有するＶｃ１．１として開示されているα−コノトキシンを意味する。
【００７６】
医薬組成物
本発明の１つの態様は、病的状態の予防又は治療に有用な各種の医薬組成物を提供する。本発明の１つの実施態様に係る医薬組成物は、本発明の第三の態様に係るペプチドコンジュゲート、又はそのアナログ、誘導体、若しくは塩を、担体、賦形剤、及び添加剤若しくは補助剤を用いて対象への投与に適切な形態にすることによって調製される。
【００７７】
頻繁に使用される担体又は補助剤は、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及び他の糖、タルク、ミルクプロテイン、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロース及びその誘導体、動物油及び植物油、ポリエチレングリコール及び溶媒、例えば、滅菌水、アルコール、グリセロール、及び多価アルコールを含む。他の製薬学的に許容される担体は、非毒性賦形剤であって、参照によって本明細書にその内容を取り込むＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｅｉｎｓ（２０００）及びＴｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ４３ｒｄ  ｅｄ．（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｙａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ，  ２００２；http://bnf.rhn.net）に記載の塩、保存剤、及び緩衝剤などを含む。
【００７８】
保存剤は、抗菌剤、抗酸化剤、及びキレート剤を含む。製薬組成物の各種の成分のｐＨ及び正確な濃度は、当該技術分野における日常的な技術に従って調整される。Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （７ｔｈ  ｅｄ．，１９８５）を参照する。
【００７９】
医薬組成物は、投与単位において好ましく調製及び投与される。固体の投与単位は、錠剤、カプセル剤、及び坐剤を含む。対象の治療に関しては、化合物の活性、投与の様式、疾患の性質及び重度、対象の年齢及び体重に依存して、各種の一日の用量が使用されて良い。しかしながら、ある環境下では、より多い又は少ない用量が適当であって良い。１日の用量の投与は、個々の投与単位の形態又はより小さい複数の投与単位における単独の投与によって、及び特定の間隔で細分化した用量の多数の投与によっても実施されて良い。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、腸溶コーティングからの利益を受けて、ＧＩ管における分解が低減して良い。好ましい親ペプチドはＧＩ管において実質的に安定であるため、腸溶コーティングは全ての状況において必要ではないであろう。
【００８１】
本発明に係る医薬組成物は、治療上の有効量で投与されて良い。この使用についての有効量は、言うまでも無く、疾患の重度に依存し、対象の体重及び一般的な状態に依存する。典型的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用する用量は、医薬組成物のｉｎ  ｓｉｔｕ投与に有用な量における有用な指標を提供する可能性があり、動物モデルを使用して細胞毒性の副作用の治療のための有効用量を決定して良い。各種の考察が、例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７，（１９９０）に記載されている。
【００８２】
経口の使用のための製剤は、活性剤が不活性の固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又はカオリンと混合されている硬質ゼラチンカプセルの形態であって良い。それらは軟質ゼラチンカプセルの形態であっても良く、活性剤が水又は油の媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、又はオリーブ油と混合されて良い。
【００８３】
水性懸濁物も経口の使用のために適切であり、通常、水性懸濁物の調製に適切な賦形剤、例えば、生理食塩水との混合物中に活性物質を含有する。その様な賦形剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムアルギネート、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、及びアカシアガムのような懸濁剤；
（ａ）天然のフォスファチド、例えば、レシチン；
（ｂ）アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート；
（ｃ）エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール；
（ｄ）エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート；あるいは
（ｅ）エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、
であって良い分散剤若しくは湿潤剤、であって良い。
【００８４】
本発明のコンジュゲートの投与レベルは、前記コンジュゲートの効力に依存して広範に変化し、通常は体重１ｋｇあたり約１μｇから約５ｍｇ、一日あたり患者ごとに約１００μｇから約５００ｍｇであろう。担体物質と組み合わせて単回用量を製造して良い活性剤の量は、治療しようとする対象及び特に投与の態様に依存して変化するであろう。例えば、ヒトに経口投与するために意図される製剤は、約１００μｇから５００ｍｇの活性化合物を、適当且つ好都合な量の担体物質と共に含有して良く、組成物全体の約５から９５％で変化して良い。投与単位の形態は、通常、約５ｍｇから５００ｍｇの活性成分を含有するであろう。
【００８５】
しかしながら、任意の特定の患者について特異的な投与レベルは、使用する特定の化合物、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬剤併用、及び治療する特定の疾患の重度を含む各種の因子に依存するであろうことが理解されるであろう。
【００８６】
本発明の化合物は、有効な併用を提供する他の化合物と更に組み合わせて良い。組み合わせることによって本発明のコンジュゲートの活性が排除されない限りにおいて、任意の化学的に適合する医薬活性剤の組み合わせを含む事も意図される。
【００８７】
治療方法
本発明のコンジュゲート又は医薬組成物は、経口投与される親ペプチドによって治療され得る任意の病理疾患の治療方法において使用されて良い。
【００８８】
本明細書で言及する治療は、病理疾患の予防又は病理疾患の緩和を包含することを意図する。
【００８９】
本発明によって治療しようとする病理疾患は、ペプチドによって治療される任意の疾患であって良い。例えば、ペプチド薬は、糖尿病（例えば、インスリン）、成長ホルモン欠乏症（例えば、成長ホルモン）、及び疼痛（例えば、コノトキシン）などを治療することが知られている。
【００９０】
本発明の明細書及び添付の特許請求の範囲では、記載又は示唆されていることにより文脈から必要とされない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又はその変形「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は包括的な意味において使用され、すなわち、言及する特徴の存在を特定するが、本発明の各種の実施態様における更なる特徴の存在又は付加を除外しない。
【００９１】
本明細書で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに違うことが明らかにされていない限り、対応する複数の参照を含む。かくして、例えば、「ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ」は、複数のその様なペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）を含み、「ａｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ」は、１つ又は複数のアミノ酸である。
【００９２】
値の範囲を表わす場合には、この範囲が、範囲の上限及び下限、並びにそれらの間の全ての値を包含することが明確に理解されるであろう。
【００９３】
他に示さない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明の属する分野の通常の知識を有するものによって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載したものと類似又は同等の任意の物質及び方法が本発明を実施又は試験するために使用されて良いが、好ましい物質及び方法は記載している。
【００９４】
本発明は、変化し得る本明細書に記載の特定の物質及び方法に限定されないことが明確に理解されるべきである。本明細書で使用する専門用語は、特定の実施態様のみを記載するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【００９５】
他に示さない限り、本発明は、当業者の能力の範囲内において従来の化学、タンパク質化学、分子生物学、及び酵素学的技術を利用する。その様な技術は、熟練技術者には良く知られており、文献において十分に説明されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｄｕｎｎ，Ｐｌｏｅｇｈ，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，及びＷｉｎｇｆｉｅｌｄ：「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９９９）Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（２００１）；Ｓｈｕｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．：Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｂａｓｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９１）；Ｇｌａｚｅｒ，Ａ．Ｎ，ＤｅＬａｎｇｅ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｅｒｄａｍ，１９７５）；Ｇｒａｂｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｗａｎｇ，  Ｊ．Ｈ，：Ｃｏ−  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ（１９９４）；Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．（１９９５）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆ１．ＵＳＡ；及びＧｏｄｉｎｇ，  Ｊ．Ｗ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：３ｒｄ  ｅｄ．１９９６）を参照のこと。
【００９６】
本発明は、以下の非制限的な実施例及び図面のみを参照することによって詳細に開示されるであろう。
【実施例】
【００９７】
（実施例１）
ペプチドの合成
Ａｕｓｐｅｐ  Ｐｔｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によるＭｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ又はＧｌｏｂａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ）と契約して、固相ペプチド合成法及びＦｍｏｃ化学（Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ａｌｖｅｒｉｃｃｉｏ（１９９１）Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  １９９９０ｓ  Ｉｎ  Ｂｏｎｄ，Ｓ（ｅｄ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １９９０／１９９１．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｅｎｔｕｒｙ  ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  １５５−１６３）を使用し、ペプチドを合成した。
【００９８】
各ペプチド産物の分子量は、マススペクトル分析によって確認し、ペプチドの純度を高速液体クロマトグラフィーによって、例えば、Ａｕｓｐｅｐ  Ｐｔｙ  ＬｔｄでＭｅｒｃｋ  ＳｕｐｅｒｓｐｅｒＲ  ２５０−４ＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ  １００  ＲＰ−１８  ｃｏｌｕｍｎ上で、以下の溶媒：溶媒Ａ−水中の０．１％トリフルオロ酢酸；溶媒Ｂ−０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中の９０％アセトニトリルを使用して評価した。３０分間に亘る１００％Ａ：０％Ｂから３０％Ａ：７０％Ｂへの直線勾配を使用して、１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。溶出は２１８分にモニターされ、均一な単独のピークを得た。全てのペプチドは、酢酸塩の形態で提供した。生産物の純度は少なくとも９５％であった。
【００９９】
以下のペプチドを合成した：
ＡＣＶ１: Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０）、
ＡＣＶ３: Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１２）、
ＡＣＶ３．２: Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １３）、及び
ＥＰ−ＰＴＨ: Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＯＨ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １４）。
【０１００】
ＡＣＶ３はＡＣＶ１のアナログであり、ＡＣＶ１のＮ末端に、そのＣ末端によって結合したＡＯＤ９６０４のＮ末端のアセチル化断片からなる。全てのＡＣＶ１ペプチドにおけるシステイン残基は、空気酸化によって同時に形成する１−３、２−４コンフォメーションにある。ＡＣＶ３．２は、アセチル化されていないことを除いてＡＣＶ３と同一である。
【０１０１】
ＥＰ−ＰＴＨは、ＰＴＨ１−３４のアナログであり、ＰＴＨ１−３４のＮ末端に配列番号１の追加のペプチドを有する。
【０１０２】
（実施例２）
クロム親和性細胞からのカテコールアミンのニコチン誘発放出に対するＡＣＶペプチドの効果
国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０２／００４１１は、本明細書では「ＡＣＶペプチド」と総称するα−コノトキシンのファミリーを、予測されない強力な鎮痛活性とともに開示しており、少なくとも１つのケース（ＰＣＴ／ＡＵ０２／００４４１において設計されたＶｃ１．１）において神経損傷からの回復を促進する機能を開示している。このペプチドの翻訳後修飾は鎮痛活性を欠失させるが、神経損傷からの回復を促進する親ペプチドの機能を保持する。
【０１０３】
これまでは、注射によってコトノキシンを投与する必要があり、少なくとも幾つかのケースでは、例えば、ジコニチドでは、髄腔内注射が必要とされる。本実施例では、ＰＣＴ／ＡＵ０２／００４１１に開示されたα−コノトキシンのファミリーのメンバーをＡＯＤ９６０４に結合させることによって、経口生物学的利用能が達成されることを示す。
【０１０４】
ＡＣＶペプチドは、神経のニコチン性アセチルコリン受容体アンタゴニストである。ニコチンによって刺激されるノルアドレナリン及びアドレナリン放出に対するＡＣＶペプチドの効果は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０２／００４１１に開示されている方法に軽微な変更をして評価した。副腎クロム親和性細胞は、Ｌｅｖｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｉｎ Ｐｏｉｓｎｅｒ ＡＭ， Ｔｒｉｆａｒｏ ＪＭ （ｅｄｓ） Ｔｈｅ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｓｓ， Ｖｏｌ ３．  Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， １７１−１７５ ａｎｄ １７７−２０４に開示されているように、成体のウシ副腎から単離した。単離した細胞は、２．８×１０５細胞／ｃｍ２の密度でコラーゲン被覆２４穴プレートに播種した。
【０１０５】
カテコールアミンは、逆相高速液体クロマトグラフィーに続いて、電気化学的な検出（６５０ｍＶ  ＢＡＳ  ｍｏｄｅｌ  ＬＣ−３Ａ）によって測定した
【０１０６】
３から４日培養したクロム親和性細胞を１０分間室温に平衡させた。インキュベーション媒体を、ＨＥＰＥＳ緩衝液［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．６ｍＭ  ＫＣｌ、１．１８ｍＭ  ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ，１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ遊離酸、２．２ｍＭ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ，０．５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４］で１０分間、２回の連続した洗浄によって除去した。次いで、１μＭ、５μＭ、又は１０μＭのＡＣＶ１又はＡＣＶ３と共に、１０分間に亘って細胞をインキュベートし、１−４μＭのニコチンで刺激する前に更に１０分間に亘ってインキュベートした。インキュベートした混合物は細胞から分離して、２Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）を用いて酸性化し、０．４Ｍ  ＰＣＡの最終的な濃度を与えた。クロム親和性細胞に残存するカテコールアミンを、０．４ＭのＰＣＡで細胞を溶解することによって放出させた。沈殿したタンパク質を、１０分間に亘って２５００ｒｐｍの遠心分離することで除去した。カテコールアミンの基礎的な放出は、ニコチンの非存在下でＡＣＶペプチドの存在下において測定した。カテコールアミンの最大の放出を測定するために、ＡＣＶペプチドの非存在下において、第二の対照を１−４μＭのニコチンで刺激した。
【０１０７】
各サンプルに存在するカテコールアミンを、Ｃ１８カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ粒径）及び移動相（７０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ、０．２％  ヘプタンスルホン酸）において１０％メタノールを使用する等張溶出を使用して逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分離した。カラムから溶出したカテコールアミンは、それらの保持時間によって同定し、電気化学的検出（６５０ｍＶ  ＢＡＳ  ｍｏｄｅｌ  ＬＣ−３Ａ）によって定量した。既知のアドレナリン及びノルアドレナリンの基準を使用して、各サンプルのカテコールアミンの量を計算し、これらを細胞内容物全体の割合として表わした。
【０１０８】
ペプチドＡＣＶ１及びＡＣＶ３を、このアッセイで試験して、結果を図１にまとめた。双方のペプチドがニコチンに応答するカテコールアミン放出を低減することが認められ、このアッセイにおける親のコノトキシンＡＣＶ１の活性が、少なくとも部分的にＡＣＶ３によって保持されたことを確認した。
【０１０９】
（実施例３）
ＡＣＶ１は経口投与されると有効でない
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける慢性神経障害のモデルにおいて、経口投与又は舌下に投与されたＡＣＶ１の鎮痛効果を、皮下投与の効果と比較した。慢性神経障害は、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｘｉｅ（１９８８）Ｐａｉｎ  ３３，８７−１０７の慢性狭窄損傷（ＣＣＩ）モデルの変種を使用して誘導した。
【０１１０】
麻酔条件下で無菌状態において、前記ラットの中央大腿領域の右坐骨神経を鈍的切開によって大腿二頭筋から露出させ、周囲の結合組織から分離した。ＣＣＩ群に関しては、坐骨神経周囲に４箇所軽く結紮し（４−０ｃｈｒｏｍｉｃ ｇｕｔ）、触れることはできるが、僅かにのみ神経が収縮した。全てのラットにおいて、対側は障害を与えなかった。動物の振る舞いを、手術して麻酔からの回復を確認した後に観察した。
【０１１１】
機械的な痛みの閾値に対するＡＣＶ１の鎮痛効果は、Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ  Ａｎａｌｇｅｓｙｍｅｔｅｒ（Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙ）と共に、Ｒａｎｄａｌｌ−Ｓｅｌｉｔｔｏ法（Ｒａｎｄａｌｌ  ａｎｄ  Ｓｅｌｉｔｔｏ（１９５７）  Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．１１１  ４０９−４１９）の僅かに修飾した方法を用いて、意識のあるラットにおいて機械的な肢引込み閾値の測定によって評価した。この機器は、一定速度で増大する力を及ぼす。均等目盛に沿って動くポインタが連続して、この力をモニターする。丸い先端（直径１．５ｍｍ）の円錐状の押出機上の小さい台に置かれる、ラットの後肢に前記力を適用する。前記ラットを、自由に試験するために頭と肢で直立させて固定したが、身体の残りの部分の大半は実験実施者の手で支えた。次いで、肢をラットが後ろ肢を引くか又は均等目盛の３００ｇを経過するまで押出機の下においた。
【０１１２】
ＡＣＶ１の単回用量を、経口、舌下、又は皮下注射によって、表３に挙げたラットの群に投与し、次いで痛覚過敏を投与の１時間及び３時間後に試験した。経口投与を生理食塩水のビヒクル中において、１ｍｌの強制経口投与容量で実施した。
【０１１３】
【表３】
2009502976.tif 000008
【０１１４】
経口投与に関しては、ラットは後ろに傾けて固定して首を伸ばし、鼻から剣状突起までの距離を測定して、使用する強制経口投与チューブの丸い末端の長さを推定した。投与する物質の粘度によって針のゲージを測定した。
【０１１５】
舌下投与に関しては、動物は投与前に、例えば、ケタミン（Ｐｆｉｚｅｒ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ）／Ｄｏｍｉｔｏｒ又はＣＯ２の混合物を使用して麻酔を打たれた。試験薬剤を、上述の容量で舌の両側に適用した。試験薬剤の投与後又は８分でＡｎｔｉｓｅｄｅｎを使用して麻酔をといた。
【０１１６】
結果を図２に挙げる。皮下投与する際にＡＣＶ１は痛みを緩和するのに有効であった（図２ａ）。しかしながら、経口投与（図２ｃ）又は舌下（図２ｂ）では、効果的ではなかった。したがってＡＣＶ１は、経口又は舌下に利用可能な物ではないようである。
【０１１７】
経口経路によるＡＣＶ１の予測された低い経口利用能が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを使用して投与した動物中の血漿濃度を測定することによっても確認され、皮下と比較して１−２％の結果であった。
【０１１８】
（実施例４）
ＡＣＶ３は舌下投与する際に有効である
ＣＣＩを使用して、ＡＣＶ３をラットに舌下投与した。実施例３に記載のように、潜在的に誘導され得る鎮痛効果を測定した。
【０１１９】
０．９６ｍｇ／１００μｌ（２ｍｇ／ｋｇ）の用量でＡＣＶ３を、各動物の舌の両側に適用した。ビヒクルは生理食塩水であった。この容量は各側で０．４８ｍｇ／５０μｌと等しい。薬剤の舌下投与を適用するために使用する方法は、ラットを麻酔する必要がない。この実験で使用する全てのラットは意識を有していた。ラットの意識状態は、口に残るのではなく、おそらく吸収される腸への経路を作る薬剤の一部、もしかすると大部分によるものである可能性があろう。
【０１２０】
図３に示すように、舌下のＡＣＶ３とビヒクル群とは有意な差があり、これはＡＣＶ３が、舌下に与えられた際に鎮痛効果を有する事を示す。一時間後、ＡＣＶ３で処理した全ての動物が、引込み閾値の増大を示し、この増大は３時間後にも継続していたが、一匹の動物は１時間よりも３時間のほうが高い閾値を示していた。
【０１２１】
（実施例５）
ＡＣＶは糖尿病神経因性疼痛のモデルにおいて経口で有効である
１３０−１７０ｇの重量の非近交系の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（６−７週齢）に、一晩絶食させた後にストレプトゾトシン（ＳＴＺ；０．１Ｍクエン酸ナトリウムに溶解し、ｐＨ４に緩衝化した７５ｍｇ／ｋｇ（体重））を注射した。それらに４８時間に亘って５％スクロース溶液を与え、次いで任意に標準的な食餌（Ｂａｒｒｏｓｔｏｃｋ  ＧＲ２）及び水を与えた。尿グルコースアッセイ（例えば、ＤｉａｓｔｉｘＴＭ、Ｂａｙｅｒ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｌｔｄ）をラットの糖尿病状態の指標としての食餌の変化の２−３日後に実施した。次いで、ラットを血中グルコースアッセイ（例えば、Ｒｅｆｌｏｌｕｘ  ＳＴＭ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ）によって高血糖レベルについて評価した；血液は、尾の動脈又は静脈から取り出した。２７ｍｍｏｌ／ｌ以上の血中グルコース値を有するラットを本試験において使用した。ＳＴＺ注射の6週後に、動物にＡＣＶ３（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、及び１ｍｇ／ｋｇ）を、経口強制投与又は首の後ろへの皮下注射のいずれかによって投与し、潜在的に誘導され得る鎮痛効果を実施例３に記載のように測定した。
【０１２２】
図４ａ及び４ｂにおいて認められるように、いずれの経路についても、最大の活性に関しては、ほぼ同一の最小用量、０．３ｍｇ／ｋｇであった。経口及び皮下に与えられるＡＣＶ３の用量反応曲線からのＥＤ５０値の推定に基づくと、ＡＣＶ３は３０−７０％の相対的な経口利用能を有する。効果の時間プロフィールに基づくと、ＡＣＶ３の経口吸収は速く、皮下送達と同様の時間内に標的組織に到達する様である。経口と比較して皮下において与えられるＡＣＶ３の僅かに高い最大活性は、２つの経路による代謝の異なるパターンに関連する可能性がある。
【０１２３】
（実施例６）
ＡＣＶ３．２は糖尿病神経因性疼痛のモデルにおいて経口で有効である
ＡＣＶ３のアセチル化していない変種（ＡＣＶ３．２と称する）を、神経因性疼痛を有する糖尿病ラット（上述のようにストレプトゾシンで誘導した）に経口投与し、潜在的に誘導され得る抗アロディニア効果を実施例５に記載したように測定した。
【０１２４】
１ｍｇ／ｋｇの用量でＡＣＶ３．２を実施例３に記載のように4週間に亘って毎日、経口投与した。実施例５に示したように、ＡＣＶ３．２とビヒクルの群との間には有意な差が存在しており、これにより、ＡＣＶ３．２が経口投与された際に鎮痛効果を有することが示された。実際に、経口投与したＡＣＶ３．２の効果は、皮下注射によって投与したＡＣＶ１の効果と類似していた。したがって、ＡＣＶ３．２も、ＡＣＶ３とおそらく同様に実質的に経口利用能を有する。
【０１２５】
（実施例７）
ＥＰ−ＰＴＨは、経口投与された際の血中カルシウム濃度の増大において有効である
ＥＰ−ＰＴＨ（配列番号１４）はパラチロイドホルモンのアナログであり、パラチロイドホルモンのＮ末端に、そのＣ末端によって結合したＡＯＤ９６０４のＮ末端からなる。
【０１２６】
パラチロイドホルモンは、血中カルシウムを調節することが既知である。しかしながら、約０．３％と報告されているパラチロイドホルモンの低い経口生物学的利用能は、骨粗鬆症における使用を制限する。本実施例においては、薬物動態測定に基づいて、ＥＰ−ＰＴＨが約１０％の経口生物学的利用能を有することを示す。
【０１２７】
ＥＰ−ＰＴＨを正常なマウスに経口投与し、血中カルシウム濃度に対するタンパク同化作用を測定した。更に具体的には、０時点における最初の血液のサンプル回収後に、正常なＣＤ−１マウスの群にＥＰ−ＰＴＨを経口強制投与（４０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、又は４００μｇ／ｋｇ）又は皮下注射（４０μｇ／ｋｇ）によって実施例３に記載のように投与した。ＥＰ−ＰＴＨ投与の一時間後に、第二の血液サンプル回収を実施した。次いで、血液サンプルの血清カルシウムレベルを酵素的方法により評価した。
【０１２８】
経口投与したＥＰ−ＰＴＨは、ビヒクルの対照と比較して、血中カルシウムレベルに対する用量依存的な効果を示した。図６に示すように、４００μｇ／ｋｇのＥＰ−ＰＴＨを経口投与した動物は、皮下注射により４０μｇ／ｋｇのＥＰ−ＰＴＨを投与した動物と同様の血中カルシウムレベルに対する効果を示した。これにより、ＥＰ−ＰＴＨが約１０％の生物学的利用能を有することが示された。
【０１２９】
当業者は、薬物動態についての動物実験における経口用量反応曲線を特定することによって経口利用能を推定し、非経口投与の用量反応曲線と比較する方法が、他の親ペプチドに対する本発明の適用の評価に使用し得ることを理解するであろう。
【０１３０】
本発明は明確性及び理解のために、ある程度詳細に記載しているが、本明細書に記載した実施態様及び方法に対する各種の修飾又は変更が、本明細書に開示した本発明の概念の範囲から逸脱することなく為されて良いことは当業者には明らかであろう。
【０１３１】
多数の従来技術の文献を本明細書において参照しているが、参照によって組み込まれるものであり、この参照は、オーストラリア又は任意の他の国において従来技術における一般的な通常の知識の一部を形成すること了解するものではないことが明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるウシクロム親和性細胞から放出されるカテコールアミン刺激に対するＡＣＶ１及びＡＣＶ３の効果のアッセイの結果を示す。（ａ）ＡＣＶ１（２つの測定の平均）（ｂ）ＡＣＶ３（２つの測定の平均）
【図２ａｂ】図２は、ラットの神経因性疼痛のモデルにおけるＡＣＶ１の効果の比較を示す。（ａ）皮下注射、２０μｇ／ｋｇ（体重）（ｂ）舌下投与、１００μｇ／ｋｇ（体重）
【図２ｃ】図２は、ラットの神経因性疼痛のモデルにおけるＡＣＶ１の効果の比較を示す。（ｃ）経口投与、１００μｇ／ｋｇ（体重）
【図３】図３は、ラットの神経因性疼痛のモデルにおけるＡＣＶ３の舌下投与の効果を示す。
【図４】図４は、神経因性疼痛の他のモデルであるＳＴＺラットにおけるＡＣＶ３の経口及び皮下投与の比較効果を示す。（ａ）ＡＣＶ３の皮下注射（ｂ）ＡＣＶ３の経口投与
【図５】図５は、ＳＴＺラットにおけるＡＣＶ３．２の経口投与の効果を示す。
【図６】図６は、マウスにおける血中カルシウムレベルに対するＥＰ−ＰＴＨの経口投与の効果を示す。
【図１】
2009502976.tif 000009
【図２ａｂ】
2009502976.tif 000010
【図２ｃ】
2009502976.tif 000011
【図３】
2009502976.tif 000012
【図４】
2009502976.tif 000013
【図５】
2009502976.tif 000014
【図６】
2009502976.tif 000015
【配列表】
2009502976000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
好ましい追加のペプチドは、
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １）
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２）、
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３）、
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ５）、
Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ６）、
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ７）、
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ８）、
の配列又はそれらのアナログの１つを含む。好ましくは、グリシンを除く全てのアミノ酸がＬ絶対配置のものである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
以下のペプチドを合成した：
ＡＣＶ１: Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０）、
ＡＣＶ３: Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１２）、
ＡＣＶ３．２: Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １３）、及び
ＥＰ−ＰＴＨ: Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＯＨ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １４）。
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月22日(2007.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ペプチドを追加のペプチドに結合させて、親分子単独よりも高い経口生物学的利用能を有するコンジュゲートを形成する工程を含む、前記親ペプチドの経口送達を改善する方法であって、
前記追加のペプチドが、式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む、方法。
【請求項２】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドに結合させた親ペプチドを含む、ペプチドコンジュゲート。
【請求項３】
前記追加のペプチドが１２以下のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４】
Ａ及び／又はＣが疎水性アミノ酸残基である、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５】
Ａ及び／又はＣが、２又は３のアミノ酸残基の実質的に疎水性のペプチドである、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項６】
Ｂが１から５の親水性アミノ酸残基である、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項７】
Ｂが１又は２の親水性アミノ酸残基である、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項８】
１つ又は複数あるいは全ての親水性アミノ酸残基が、電荷を有するアミノ酸残基である、請求項６又は７に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項９】
前記追加のペプチドが１２以下のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１０】
前記追加のペプチドが６以下のアミノ酸を有する、請求項９に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１１】
前記追加のペプチドが配列番号１から９から選択される、請求項１０に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１２】
前記親ペプチドが、ジスルフィド結合したペプチドである、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
前記親ペプチドが２０以下のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１４】
前記親ペプチドが２１から４０アミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１５】
前記親ペプチドが４１から６０のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１６】
前記親ペプチドが６１から８０のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１７】
前記親ペプチドが８１以上のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１８】
配列番号１２、１３、又は１４の１つとして与えられるペプチドを含むか又は前記ペプチドから本質的に構成される、ペプチドコンジュゲート。
【請求項１９】
前記ペプチドコンジュゲートが請求項２から１８のいずれか一項に記載のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
製薬学的に許容される担体と共に、請求項２から１８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、経口投与のための医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２から１８のいずれか一項に記載のペプチドコンジュゲート又は請求項２０に記載の医薬組成物の有効量を動物に経口投与することによる、通常は実質的に経口生物学的利用能を有さない親ペプチドで治療する必要がある動物において病理疾患を治療する方法。
【請求項２２】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドを含む、経口送達システムであって、
前記追加のペプチドが、親ペプチドに結合して、前記親ペプチドの経口生物学的利用能を改善するためのものである、経口送達システム。
【請求項２３】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含むペプチドの使用であって、親ペプチドに結合させて前記親ペプチドの経口生物学的利用能を改善するための使用。
【請求項２４】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドの使用であって、親ペプチドで治療する必要がある患者に経口投与するための、前記親ペプチドを含む医薬の製造における使用。
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月2日(2008.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ペプチドを追加のペプチドに結合させて、親分子単独よりも高い経口生物学的利用能を有するコンジュゲートを形成する工程を含む、前記親ペプチドの経口送達を改善する方法であって、
前記追加のペプチドが、式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む、方法。
【請求項２】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドに結合させた親ペプチドを含む、ペプチドコンジュゲート。
【請求項３】
Ａ及び／又はＣが疎水性アミノ酸残基である、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項４】
Ａ及び／又はＣが、２又は３のアミノ酸残基の実質的に疎水性のペプチドである、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項５】
Ｂが１から５の親水性アミノ酸残基である、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項６】
Ｂが１又は２の親水性アミノ酸残基である、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項７】
１つ又は複数あるいは全ての親水性アミノ酸残基が、電荷を有するアミノ酸残基である、請求項５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項８】
前記追加のペプチドが１２以下のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項９】
前記追加のペプチドが６以下のアミノ酸を有する、請求項８に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１０】
前記追加のペプチドが配列番号１から９から選択される、請求項９に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１１】
前記親ペプチドが、ジスルフィド結合したペプチドである、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１２】
前記親ペプチドが２０以下のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
前記親ペプチドが２１から４０アミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１４】
前記親ペプチドが４１から６０のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１５】
前記親ペプチドが６１から８０のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１６】
前記親ペプチドが８１以上のアミノ酸を有する、請求項２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項１７】
配列番号１２、１３、又は１４の１つとして与えられるペプチドを含むか又は前記ペプチドから本質的に構成される、ペプチドコンジュゲート。
【請求項１８】
前記ペプチドコンジュゲートが請求項２から１７のいずれか一項に記載のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
製薬学的に許容される担体と共に、請求項２から１７のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、経口投与のための医薬組成物。
【請求項２０】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドを含む、経口送達システムであって、
前記追加のペプチドが、親ペプチドに結合して、前記親ペプチドの経口生物学的利用能を改善するためのものである、経口送達システム。
【請求項２１】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含むペプチドの使用であって、親ペプチドに結合させて前記親ペプチドの経口生物学的利用能を改善するための使用。
【請求項２２】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ    （Ｉ）
［式中、Ａ及びＣの各々は、疎水性アミノ酸残基であるか又は２から９アミノ酸残基の間の実質的に疎水性のペプチドであり、Ａ及びＣは異なるものであって良く、Ａ又はＣの１つは存在しなくて良い；Ｂは１つ又は複数の親水性アミノ酸残基である］
のペプチドを含む追加のペプチドの使用であって、親ペプチドで治療する必要がある患者に経口投与するための、前記親ペプチドを含む医薬の製造における使用。
【請求項２３】
病理疾患を治療するために経口投与するための医薬の製造における、請求項２から１７のいずれか一項に記載のペプチドコンジュゲートの使用。
【請求項２４】
請求項２から１７のいずれか一項に記載のペプチドコンジュゲートを含み、親分子単独よりも高い経口生物学的利用能を有する、病理疾患の治療剤。
【国際調査報告】
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