(57)【要約】一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質及び核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）を含む融合タンパク質。正確性が高いこれらのタンパク質は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む核酸増幅法での使用に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離又は精製された一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）−核酸ポリメラーゼ融合タンパク質。
【請求項２】
前記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記核酸ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記核酸ポリメラーゼが熱安定ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記熱安定ＤＮＡポリメラーゼが、サーモコッカス ジリギ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉ）（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＳＳＢが熱安定ＳＳＢである、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＳＳＢが、スルホロブス ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓｏ）ＳＳＢである、請求項６記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＳＳＢ−核酸ポリメラーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項９】
前記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項８記載の核酸分子。
【請求項１０】
核酸ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項８記載の核酸分子。
【請求項１１】
ＤＮＡポリメラーゼが熱安定ＤＮＡポリメラーゼである、請求項９記載の核酸分子。
【請求項１２】
熱安定ＤＮＡポリメラーゼが、サーモコッカス ジリギ（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１１記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記ＳＳＢが熱安定ＳＳＢである、請求項８記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ＳＳＢが、スルホロブス ソルファタリカス（Ｓｓｏ）ＳＳＢである、請求項１３記載の核酸分子。
【請求項１５】
異種プロモーターと制御可能な状態で連結される請求項８記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
スルホロブス ソルファタリカス（Ｓｓｏ）ＳＳＢ−サーモコッカス ジリギ（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１８】
標的核酸上でのポリメラーゼ反応の収率を向上させる方法であって、
（ａ）標的核酸分子を、それに対して特異的にハイブリダイズするプライマー、及び単離又は精製された一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）−核酸ポリメラーゼ融合タンパク質であって、一本鎖ＤＮＡと結合し、かつＳＳＢが融合していない当該ポリメラーゼと比較して当該核酸ポリメラーゼの活性が向上されている当該タンパク質と接触させる工程、並びに
（ｂ）得られる混合物を、当該プライマーが当該ポリメラーゼにより伸長する条件下でインキュベートする工程
を含む方法。
【請求項１９】
前記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡポリメラーゼがサーモコッカス ジリギＤＮＡポリメラーゼである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ＳＳＢが熱安定ＳＳＢである、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記熱安定ＳＳＢがスルホロブス ソルファタリカス（Ｓｕｌｆａｌｏｂｕｓ  ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＳＳＢである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
単離又は精製されたスルホロブス ソルファタリカス（Ｓｓｏ）ＳＳＢ−サーモコッカス ジリギ（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）及び核酸ポリメラーゼを含む融合タンパク質、並びに核酸合成反応においてかかる融合タンパク質の使用法の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鋳型（通常はＤＮＡ鋳型）の全て又は一部と相補的なＤＮＡ分子を合成する。ＤＮＡ鋳型にプライマーがハイブリダイゼーションしてプライマー鋳型が形成された後、ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型に誘導される態様で（すなわち鋳型のヌクレオチドのシークエンスに依存して）、プライマー中のヌクレオチド配列の３’ヒドロキシ末端にヌクレオチドを添加できる。すなわち、デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄＮＴＰｓ）及びプライマーの存在下で、１つ以上の核酸鋳型の全て又は一部と相補的な、新規なＤＮＡ分子を、合成できる。
【発明の開示】
【０００３】
ゆえに、高い合成効率及び／又は正確性（すなわち鋳型に誘導される重合が正確であること）が向上したＤＮＡポリメラーゼは、核酸合成、増幅及びシークエンス反応において有用である。本願明細書に記載されている組成物及び方法は、かかるＤＮＡポリメラーゼの提供に基づくものである。
【０００４】
発明の概要
本発明は、単離又は精製された一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）−核酸ポリメラーゼ融合タンパク質の提供に関する。一実施態様では、当該核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。他の実施態様では、当該核酸ポリメラーゼは逆転写酵素である。当該核酸ポリメラーゼは熱安定性を有してもよい。一実施態様では、当該熱安定ＤＮＡポリメラーゼはサーモコッカス ジリギ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉ）（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼである。他の実施態様では、ＳＳＢは熱安定性を有する。この実施態様の一局面では、当該ＳＳＢはスルホロブス ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓｏ）のＳＳＢである。
【０００５】
本発明はまた、ＳＳＢ−核酸ポリメラーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子の提供に関する。一実施態様では、当該核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。他の実施態様では、当該核酸ポリメラーゼは逆転写酵素である。当該核酸ポリメラーゼは熱安定性を有してもよい。一実施態様では、当該熱安定ＤＮＡポリメラーゼはサーモコッカス ジリギ（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼである。他の実施態様では、ＳＳＢは熱安定性を有する。この実施態様の一局面では、当該ＳＳＢはスルホロブス ソルファタリカス（Ｓｓｏ）のＳＳＢである。
【０００６】
また異種プロモーターに制御可能な状態で連結された状態で、上記の核酸分子を含む発現ベクターの提供に関する。本発明はまた、かかる発現ベクターを含む宿主細胞の提供に関する。
【０００７】
本発明はまた、スルホロブス ソルファタリカス（Ｓｓｏ）ＳＳＢ−サーモコッカス ジリギ（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質をコードする核酸分子の提供に関する。
【０００８】
本発明の他の実施態様は、標的核酸上のポリメラーゼ反応の合成効率を向上させる方法に関し、当該方法は、標的核酸を、それに対して特異的にハイブリダイズするプライマー、及び単離又は精製されたＳＳＢ−核酸ポリメラーゼ融合タンパク質と接触させる工程、並びに得られる混合物を、当該プライマーが当該ポリメラーゼにより伸長する条件下でインキュベートする工程を含む。一実施態様では、当該核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。他の実施態様では、当該核酸ポリメラーゼは逆転写酵素である。当該核酸ポリメラーゼは熱安定性を有してもよい。一実施態様では、当該熱安定ＤＮＡポリメラーゼはサーモコッカス ジリギ（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼである。他の実施態様では、ＳＳＢは熱安定性を有する。この実施態様の一局面では、当該ＳＳＢはスルホロブス ソルファタリカス（Ｓｓｏ）のＳＳＢである。
【０００９】
本発明はまた、単離又は精製されたスルホロブス ソルファタリカス（Ｓｓｏ）ＳＳＢ−サーモコッカス ジリギ（Ｔｚｉ）ポリメラーゼ融合タンパク質の提供に関する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼと一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）との融合により、ＤＮＡＰの合成効率及び／又は正確性が改良されるという予想外の発見に、少なくとも部分的に基づくものである。本願明細書には、かかるＳＳＢ−ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質、並びにかかるＳＳＢ−ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質を使用した核酸の塩基配列決定方法、増幅方法（例えばＰＣＲ）及び合成方法が記載されている。
【００１１】
定義
以下の用語は、分子生物学の分野における当業者が通常用いるものである。
【００１２】
核酸
一般に、核酸はリン酸ジエステル結合により結合した一連のヌクレオチド（例えば「鎖」及び「配列」）を含んで構成される。核酸は一本鎖又は二重鎖であってもよく、２つの鎖は補完的なヌクレオチド塩基間の非共有結合相互作用により結合する。核酸には天然のヌクレオチド及び／又は非天然の塩基部分が包含される。核酸は、リボ核酸（ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び合成ＤＮＡなどのＤＮＡ）であってもよい。核酸は、染色体又はｃＤＮＡ分子などの独立した分子そのものを指してもよい。あるいは、核酸は独立した分子の一部（すなわちホスホジエステル結合した一連のヌクレオチド部分）であってもよい。
【００１３】
鋳型
鋳型とは、プライマー−鋳型複合体を構成したときに、ＤＮＡポリメラーゼの基質として機能しうる一本鎖核酸である。鋳型は、ＤＮＡ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの場合）又はＲＮＡ（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの場合）であってもよい。核酸合成混合物は、単一の鋳型を含んでもよく、又は異なるヌクレオチド配列を有する複数の鋳型を含んでもよい。特定の鋳型に特異的な複数のプライマーを用いれば、核酸合成混合物中の複数の鋳型に対応するプライマー伸長生成物を調製することができる。複数の鋳型は、別個の核酸分子内に存在してもよく、又は同一核酸内に存在してもよい。
【００１４】
鋳型は、供給源となる生物体内に存在する核酸から取得又は調製できる（例えば細胞、組織、体液、器官及び生物体）。すなわち、鋳型は以下の供給源に存在する核酸から取得又は調製できる：細菌（例えばエシェリキア属、バチルス属、セラチア属、サルモネラ属、ブドウ球菌、連鎖球菌、クロストリジウム属、クラミジア、ナイセリア属、トレポネマ属、マイコプラズマ属、ボレリア属、レジオネラ、シュードモナス、マイコバクテリウム、ヘリコバクター属、エルビニア属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、及びストレプトマイセス属）；真菌（例えばイースト）；ウイルス（例えば、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科(Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ)、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ））、原生動物、動植物（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などの昆虫、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）などの線虫、魚、鳥、齧歯動物、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、及び霊長類（ヒトを含む））。環境中のサンプル（例えば土壌、水、及び空気サンプル）に存在する核酸から、鋳型を取得又は調製してもよい。当業者に公知のルーチンの手法を使用して、かかる生物学的及び環境中の供給源から核酸を調製できる。
【００１５】
幾つかの実施態様では、生物学的供給源又は環境中の供給源から直接に当該鋳型を得る。他の実施態様では、生物学的又は環境中の供給源から得られる二本鎖核酸を完全に又は部分的に変性させることにより、当該鋳型を調製する。幾つかの実施態様では、当該鋳型は組換え型又は合成ＤＮＡ分子である。組換え型又は合成ＤＮＡは一本鎖でもよく、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、その鋳型を完全に又は部分的に変性して一本鎖鋳型を調製してもよい。幾つかの実施態様では、当該鋳型は１つのｍＲＮＡ分子、又はｍＲＮＡ分子の混合物である。他の実施態様では、当該鋳型はｃＤＮＡ分子の混合物中に存在する１つのｃＤＮＡ分子である。ｃＤＮＡ鋳型は、逆転写酵素活性を有する酵素を用いて核酸合成反応において合成してもよく、又は外部の供給源（例えばｃＤＮＡライブラリ）から得てもよい。
【００１６】
プライマー
プライマーとは、鋳型より短い一本鎖核酸であって、鋳型の部分と相補的な配列を有するものを指す。プライマーが鋳型にハイブリダイズし、プライマー−鋳型複合体（すなわちプライム鋳型(ｐｒｉｍｅｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅ)）を形成することにより、ＤＮＡＰが全て又は一部の鋳型と相補的な核酸分子（すなわちプライマー伸長生成物）を合成する。
【００１７】
プライマーは通常は１２〜６０のヌクレオチド長（例えば１８〜４５のヌクレオチド長）であるが、それより短くてもよく、また長くてもよい。プライマーをその鋳型と実質的に相補的となるように設計し、それによりプライマーは特異的に鋳型とハイブリダイズし、プライマー−鋳型複合体を形成し、更にそれらはプライマー伸長生成物を得るためのＤＮＡＰの基質として機能しうる。若干のプライマー−鋳型複合体においては、プライマーと鋳型は完全に相補的であり、すなわちプライマー中の各ヌクレオチドが、鋳型ヌクレオチドのそれと相補的であり、かつ相互作用する。プライマーは公知の方法によって調製してもよく（例えばＡＢＩ  ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、又はＢｉｏｓｅａｒｃｈ８６００若しくは８８００シリーズの合成装置（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．社製）を使用）、又は多くの供給業者から購入してもよい。
【００１８】
ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）
ＤＮＡポリメラーゼとは、プライマー−鋳型複合体のプライマー中の３’ヒドロキシ末端に、デオキシヌクレオシド１リン酸分子を付加できる酵素であり、それにより、ＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型に基づき連続的にプライマー伸長生成物中の３’ヒドロキシ末端に付加させ、結果的にポリヌクレオチドの合成をもたらす。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、３’に対する５’方向のプライマーを延長することによって、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型と相補的なＤＮＡ分子の形成を合成できる。ＤＮＡＰには、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが包含される。ＤＮＡＰの中には、複数のポリメラーゼ活性を有するものも存在する。例えば、若干のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ）では、ＲＮＡ依存性ＤＮＡＰ活性をも有する。ＤＮＡＰは通常、使用する鋳型と相補的であるヌクレオチドを付加するが、ＤＮＡＰは重合又は合成反応に、非相補的なヌクレオチド（ミスマッチ）を付加することもある。すなわち、合成された核酸鎖は鋳型と完全に相補的ではない場合もある。ＤＮＡＰは、使用する鋳型より長さの短い核酸分子を合成することもある。ＤＮＡＰは好ましくは２つの基質を用いる。１つはプライマー−鋳型複合体（プライマーの末端にはフリーの３’ヒドロキシル基が存在する）であり、もう１つはデオキシヌクレオチド５’−３リン酸（ｄＮＴＰ）である。ホスホジエステル結合は、プライマー末端中の３’−ＯＨの、ｄＮＴＰ中のα−リン酸基に対する求核攻撃と、末端ピロリン酸の除去により形成される。ＤＮＡＰは、当業者に公知の方法により生物体から単離してもよく、また多くの供給業者から市販品を購入してもよい。
【００１９】
幾つかのＤＮＡＰは熱安定性を有し、ＰＣＲに基づく核酸合成で通常採用される温度で実質的に失活しない。かかる温度は、ｐＨ、鋳型及びプライマー−ヌクレオチド組成、プライマー長及び塩濃度などの反応条件によって変化する。熱安定ＤＮＡＰとしては、サーマス サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）のＤＮＡＰ、サーマス アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）のＤＮＡＰ、サーモトガ ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ）（Ｔｎｅ）のＤＮＡＰ、サーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）のＤＮＡＰ、サーモトガ菌株ＦＪＳＳ３−Ｂ．１のＤＮＡＰ、サーモコッカス リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ又はＶＥＮＴ（商標））のＤＮＡＰ、パイロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）のＤＮＡＰ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）  ＤＮＡＰ、パイロコッカス ウーシー（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ）（Ｐｗｏ）のＤＮＡＰ、パイロコッカス種  ＫＯＤ２（ＫＯＤ）のＤＮＡＰ、バチルス ステロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）のＤＮＡＰ、バチルス カルドフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）のＤＮＡＰ、スルホロブス アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（Ｓａｃ）のＤＮＡＰ、サーモプラズマ アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｔａｃ）のＤＮＡＰ、サーマス フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）のＤＮＡＰ、サーマス ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（Ｔｒｕ）のＤＮＡＰ、サーマス ブロッキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（商標））のＤＮＡＰ、サーモシフォ アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）のＤＮＡＰ、サーモコッカス ジリギ（Ｔｚｉ）、並びにその変異体、変形物及び誘導体などが挙げられる（例えば、米国特許第６０７７６６４号、米国特許第５４３６１４９号、米国特許第４８８９８１８号、米国特許第５５３２６００号、米国特許第４９６５１８８号、米国特許第５０７９３５２号、米国特許第５６１４３６５号、米国特許第５３７４５５３号、米国特許第５２７０１７９号、米国特許第５０４７３４２号、米国特許第５５１２４６２号、国際公開第９４／２６７６６号、国際公開第９２／０６１８８号、国際公開第９２／０３５５６号、国際公開第８９／０６６９１号、国際公開第９１／０９９５０号、国際公開第９１／０９９４４号、国際公開第９２／０６２００号、国際公開第９６／１０６４０号、国際公開第９７／０９４５１号、国際公開第０３／０２５１３２号、米国特許仮出願第６０／６４７４０８号（２００５年１月２８日出願）、Ｂａｒｎｅｓ、Ｗ．Ｇｅｎｅ１１２：２９−３５（１９９２）、Ｌａｗｙｅｒ、Ｆ．ら、（１９９３）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７、及びＦｌａｍａｎ、Ｊ．ら、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３２５９−３２６０）を参照）。他のＤＮＡＰは中温性であり、ｐｏｌ  ＩファミリーのＤＮＡＰ（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｄ．ラディオデュランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、Ｈ．ピロリ(Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、Ｃ．アウランチアカス（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒ．Ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、Ｔ．パリダム（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｉｓ)種、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、Ｍ．スメグマティス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、バクテリオファージＬ５、ｐｈｉ−Ｃ３１、１７、Ｔ３、Ｔ５、ＳＰＯｌ、ＳＰ０２、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びキイロショウジョウバエ(Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のＤＮＡＰ）、ｐｏｌ  ＩＩＩタイプのＤＮＡＰ、並びにその変異体変形物及び誘導体が挙げられる。
【００２０】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）とは、逆転写酵素活性を有する（すなわち一本鎖ＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成する触媒作用を有する）酵素である。かかる酵素としては、レトロウイルスの逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌の逆転写酵素、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ、Ｒ．Ｋ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１、米国特許第４８８９８１８号及び第４９６５１８８号）、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９６／１０６４０号、及び国際公開第９７／０９４５１号）、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５３７４５５３号）、並びにその変異体、変形物又は誘導体（例えば国際公開第９７／０９４５１号、及び国際公開第９８／４７９１２号を参照）が挙げられるが、これに限定されない。ＲＴの中には、ＲＮａｓｅＨ活性が減少、実質的に減少又は当該活性を有さないものも存在する。「ＲＮａｓｅＨ活性が実質的に減少した」酵素とは、対応する野生型（例えば野生型のモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の逆転写酵素）のＲＮａｓｅＨ＋酵素のＲＮａｓｅＨ活性に対して、約２０％未満、好ましくは約１５％、１０％又は５％未満、最も好ましくは約２％未満の活性を有する酵素のことを指す。いかなる酵素のＲＮａｓｅＨ活性も、例えば米国特許第５２４４７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ、Ｍ．Ｌ．，ら、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５及びＧｅｒａｒｄ、Ｇ．Ｆ．，ら、（１９９２）ＦＯＣＵＳ  １４：９１などに記載の様々なアッセイで測定できる。本発明に使用する特に好ましいポリペプチドとしては、限定されないが、Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＳＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＡＭＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＡＶ（ラウス関連ウイルス）Ｈ−逆転写酵素、ＭＡＶ（骨髄芽球症関連ウイルス）Ｈ−逆転写酵素及びＨＩＶ  Ｈ−逆転写酵素（米国特許５２４４７９７号、国際公開第９８／４７９１２号）が例示される。ＤＮＡ分子をリボ核酸分子から合成できる（すなわち逆転写酵素活性を有する）いかなる酵素も本発明の組成物、方法及びキットに等しく使用できることは、当業者にとり自明である。
【００２１】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、リン酸基、リン酸エステル結合でそれに結合するペントース（ＲＮＡではリボース、及びＤＮＡではデオキシリボース）、並びにそれに結合する有機塩基から構成される。核酸のモノマー単位はヌクレオチドである。天然のＤＮＡ及びＲＮＡは、各々４つの異なるヌクレオチドを含み、天然のＤＮＡではアデニン、グアニン、シトシン、及びチミン塩基がヌクレオチド中に存在し、天然のＲＮＡではアデニン、グアニン、シトシン、及びウラシル塩基がヌクレオチド中に存在する。アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル塩基は、それぞれＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、及びＵと略記される。
【００２２】
ヌクレオチドには、フリーのモノ−、ジ−、及びトリリン酸塩の形態が包含される（すなわちそれぞれリン酸基は１個、２個、又は３個のリン酸塩部分を有する）。すなわち、ヌクレオチドにはリボヌクレオシド三リン酸（例えばＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、及びＧＴＰ）、及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）、並びにその誘導体が包含される。ヌクレオチドにはまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、及びｄｄＴＴＰなどのｄｄＮＴＰｓ）及びその誘導体が包含される。
【００２３】
ヌクレオチド誘導体には、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、７−ｄｅａｚａ−ｄＡＴＰ、及び核酸分解に対する抵抗性を付与したヌクレオチド誘導体が包含される。ヌクレオチド誘導体はまた、例えば検出可能な放射性同位元素（例えば３２Ｐ又は３５Ｓ）、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分、又は酵素で標識したヌクレオチドが包含される。
【００２４】
プライマー伸長生成物
プライマー伸長生成物は、プライマーを含み、そこにＤＮＡＰが１つ以上のヌクレオチドを添加した核酸のことを指す。プライマー伸長生成物は、プライマー−鋳型複合体中の鋳型と同じ長さであってもよく、短くてもよい。
【００２５】
増幅
増幅とは、ＤＮＡＰを用いてインビトロで核酸のコピー数を増加させる方法のことを指す。核酸増幅により、プライマー又は伸長中のプライマー伸長生成物にヌクレオチドが付加され、鋳型と相補的な新規な分子が形成される。核酸増幅において、プライマー伸長生成物とその鋳型を変性させ、それらを更なる核酸分子合成用の鋳型として用いることができる。多くの増幅サイクルで増幅反応を行ってもよく、例えば１回のＰＣＲにおいては変性及びプライマー伸長のサイクルが５〜１００回行われうる。核酸を増幅する一般的な方法は当業者に公知である（例えば米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号及び第４８００１５９号、Ｉｎｎｉｓ、Ｍ．Ａ．，ら、ｅｄｓ．、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９０）、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．及びＡ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）を参照）。本発明に適用可能な増幅方法としては、ＰＣＲ法（米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号）、Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＳＤＡ法、米国特許第５４５５１６６号、欧州特許第０６８４３１５号）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＮＡＳＢＡ法、米国特許５４０９８１８号、欧州特許第０３２９８２２号）が挙げられる。
【００２６】
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とは、ヌクレオチド配列とは無関係に、二本鎖ＤＮＡよりも一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と選択的に結合するタンパク質のことを指す。ＳＳＢは実質的に全て公知の生物体において確認されており、ＤＮＡ代謝、複製、組換え、及び修復などにとって重要であると考えられている。天然のＳＳＢは通常は２、３、又は４つのサブユニットから構成され、それは同場合もあり、また異なる場合もある。通常、天然のＳＳＢサブユニットには少なくとも１つの保存されたＤＮＡ結合領域又は「ＯＢフォールド」（例えばＰｈｉｌｉｐｏｖａ、Ｄ．ら、（１９９６）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２２２２−２２３３及びＭｕｒｚｉｎ、Ａ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８６１−８６７）を含み、ゆえに天然のＳＳＢは４つ以上のＯＢフォールドを有する。
【００２７】
熱安定ＳＳＢは７０℃において、３７℃でのｓｓＤＮＡとの結合に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、及び少なくとも９５％）の結合性を示し、中温性ＳＳＢよりもＰＣＲ用途に適する。熱安定ＳＳＢは古細菌から調製できる。古細菌は、１６ＳのｒＤＮＡ配列分析により、真正細菌とは区別される微生物群である。古細菌は更に、クレンアーキオータ(ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ)、ユリアーキオータ(ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ)、及びコルアーキオータ(ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ)の３つの群に分割できる（例えばＷｏｅｓｅ、Ｃ．及びＧ．Ｆｏｘ（１９７７）ＰＮＡＳ  ７４：５０８８−５０９０、Ｗｏｅｓｅ、Ｃ．ら、（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：４５７６−４５７９及びＢａｒｎｓ、Ｓ．ら、（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３：９１８８−９１９３を参照）。近年では、ユリアーキオータ（メタノコッカス ジャンナキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｃｈｉｉ）ＳＳＢ、メタノバクテリウム サーモアウトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＳＳＢ、及びアーケオグロブス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）ＳＳＢなど）、並びにクレンアーキオータ（ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）ＳＳＢ（スルホロブス スルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＳＳＢ及びアエロピルム ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）ＳＳＢなど）のＳＳＢ同定及び機能解析に関する報告がなされている（例えばＣｈｅｄｉｎ、Ｆ．ら、（１９９８）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：２７３−２７７、Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ  Ｃ．ら、（２００２）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５０５−１５１５、Ｋｅｌｌｙ、Ｔ．ら、（１９９８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４６３４−１４６３９、Ｋｌｅｎｋ、Ｈ．ら、（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：３６４−３７０、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．ら、（１９９７）  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７１３５−５５、Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ、Ｒ．及びＭ．Ｗｈｉｔｅ（２００１）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：９１４−９２０、及び米国特許仮出願第６０／１４７，６８０。
【００２８】
当業者であれば、ＳＳＢ（古細菌ＳＳＢを含む）を精製し、組換え体を作製し、ルーチン方法（例えばＨａｓｅｌｔｉｎｅ  Ｃ．ら、（２００２）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５０５−１５１５で開示される方法）を使用してＳＳＢ活性を測定できる。公知のＳＳＢの一部を示すリスト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号による）を表１に示す。本発明にはこれらのＳＳＢの任意のホモログ及び変異型が包含され、使用できる。
【００２９】
（表１）
2009520461.tif 000002
2009520461.tif 000003
2009520461.tif 000004
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2009520461.tif 000010
【００３０】
単離
ポリペプチドに関して、「単離された」とは、当該ポリペプチドが、成分の混合物中において、例えば重量で３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上を占める主要成分であることを指す。単離されたポリペプチドは通常、当該ポリペプチドを含有する生物（例えばポリペプチドを発現するトランスジェニック生物）から精製して得られるが、化学合成により調製してもよい。ポリペプチドの精製方法としては、例えば硫酸アンモニウム沈殿、クロマトグラフィ、及び免疫アフィニティ精製法が挙げられる。
【００３１】
本発明のポリペプチドは公知のいかなる手段によっても検出することができ、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、その後にクーマシーブルー染色、又は検出対象のポリペプチドとの結合親和性を有するモノクローナル若しくはポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析によって検出できる。
【００３２】
熱安定
「熱安定」とは、酵素又はタンパク質（例えばＤＮＡＰ、ＲＴ及びＳＳＢ）が熱による失活に対して抵抗性を有することを指す。一般に、熱安定酵素は中温性酵素より熱失活に対する抵抗性が高い。すなわち、熱安定酵素又はタンパク質の核酸合成活性又は一本鎖結合活性は、熱処理によってある程度低下しうるが、中温性酵素又はタンパク質ほど顕著ではない。
【００３３】
熱安定ＤＮＡＰでは、９０℃で３０秒間の核酸合成混合物を加熱された後での、その核酸合成活性が、少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、及び少なくとも９５％）維持される。対照的に、中温性ＤＮＡＰでは、かかる熱処理の後、大部分のそれらの核酸合成活性が失われる。熱安定ＤＮＡＰはまた、典型的に、最適核酸合成温度が中温性Ｔ５  ＤＮＡＰより高い。
【００３４】
熱安定ＳＳＢは、３７℃の場合と比較して、７０℃で少なくとも７０％（例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、及び少なくとも９５％）の結合性でｓｓＤＮＡと結合する。かかる温度でＳＳＢがｓｓＤＮＡと結合する程度は、固有のＳＳＢ蛍光を測定することにより測定できる。固有のＳＳＢ蛍光は、保存されたＯＢフォールドアミノ酸に固有のものであり、ｓｓＤＮＡとの結合によりクエンチする（例えばＡｌａｎｉ、Ｅ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：５４−７１を参照）。ＳＳＢ−ｓｓＤＮＡ結合を測定するためのルーチンなプロトコルは、Ｋｅｌｌｙ、Ｔ．ら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４６３４−１４６３９に記載されている。要約すると、２ｍｌのバッファー（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５％のイノシトール及び１ｍＭのＤＴＴを含有）中でＳＳＢ−ｓｓＤＮＡ結合反応を実施し、固定されたＳＳＢの量を、幾つかの量のポリ（ｄＴ）と共にインキュベートし、蛍光は約２９５ｎｍの励起波長及び約３４８ｎｍの放出波長を使用して測定する。
【００３５】
正確性
正確性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）とは核酸重合反応における精度のことを指し、すなわち鋳型と相補的な核酸分子を合成するとき、正確な基質（例えばヌクレオチド）と誤った基質とを識別するＤＮＡＰの能力のことを指す。正確性がより高いほど、当該酵素は核酸合成の間、伸長するヌクレオチド鎖にヌクレオチドを誤って取り込みする頻度が少なくなる。すなわち、正確性の増加又は向上により、ＤＮＡＰ又はＲＴによる、誤った取り込みの少ない、正確な核酸合成がもたらされる。
【００３６】
増加した／向上した／高い正確性とは、正確性が、好ましくは約１．２〜約１０，０００倍、約１．５〜約１０，０００倍、約２〜約５，０００倍又は約２〜約２０００倍（好ましくは約５倍超、より好ましくは約１０倍超、より好ましくは約５０倍超、より好ましくは約１００倍超、更に好ましくは約５００倍超、最も好ましくは約１０００倍超）高まり、核酸合成の間における、コントロールＤＮＡＰ（例えばＳＳＢの非存在下）の正確性と比較した、所定の長さの核酸の合成において誤って取り込みされたヌクレオチド数が減少していることを意味する。
【００３７】
誤った取り込みの減少とは、核酸重合の間における誤った取り込みが、コントロールＤＮＡＰ（例えばＳＳＢの非存在下）の場合に対して９０％未満、８５％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、又は好ましくは５０％未満、好ましくは２５％未満、好ましくは１０％未満、最も好ましくは１％未満であることを意味する。
【００３８】
ホモログ及び変異体
本発明の組成物及び方法に適するホモログ及び変異体は、相応するヌクレオチド及びポリペプチドの配列解析により同定できる。１種類の生物の公知のポリペプチドを用いて、他の生物の相応するポリペプチドを同定できる。例えば、ヌクレオチド又はポリペプチド配列のデータベースのクエリーを実行することにより、公知のポリペプチドのホモログを同定できる。相応する配列分析は、公知のポリペプチドのアミノ酸配列を使用した、データベース上におけるＢＬＡＳＴ又はＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ解析により行ってもよい。データベース中の、３５％を超える配列同一性を有するタンパク質を候補として選抜し、本発明の組成物及び方法に適合するか否かを更に評価する。必要に応じて、かかる候補の手作業による評価を行い、更に評価しようとする候補の数を減少させて絞り込んでもよい。当該手作業による評価は、公知のポリペプチド間で保全されているドメインを有するように見える候補を選抜することにより実施する。
【００３９】
ベクター
ベクターとは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、又はファージミドなどの核酸であって、宿主細胞中で独立に複製できる核酸のことを指す。ベクターは、１つ又は少数の切断可能部位を有し、その部位において一定の様式にて制限エンドヌクレアーゼによって切断され、またＤＮＡをその部位に挿入することができる。ベクターはまた、当該ベクターを含む宿主を同定する用途に適するマーカーを含んでもよい。マーカーは、かかるマーカーを発現する宿主細胞に対して識別可能な表現型を付与する。一般的に用いられるマーカーとしては、テトラサイクリン抵抗又はアンピシリン抵抗などを付与する、抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。ベクターはまた、宿主へのベクター導入を容易にするポリペプチドをコードする配列を含んでもよい。かかるポリペプチドはまた、宿主におけるベクターの保持を補助することができる。「発現ベクター」は、宿主への導入後、挿入されたＤＮＡの発現を強化及び／又は制御できる核酸配列を含んでもよい。発現ベクターは、制御可能な状態でＤＮＡ挿入物と連結された、１つ以上の調節エレメントを含む。かかる調節エレメントとしては、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、又は核酸の発現を調節する誘導可能エレメントが挙げられる。本発明では、「制御可能な状態で連結される」とは、ＤＮＡ挿入物に対するベクター上の調節エレメントのポジショニングであって、挿入物の転写、及び／又は得られるＲＮＡ転写物の翻訳を可能にし、容易にできるポジショニングのことを指す。発現ベクターに含有させるエレメントの選択は、幾つかの因子（例えば複製効率、選抜可能性、誘導可能性、所望の発現レベル、及び細胞若しくは組織特異性）に依存する。
【００４０】
宿主
「宿主」という用語には、原核生物（例えば大腸菌）、並びに真核生物（例えば真菌、昆虫、植物、及び動物細胞）が包含される。動物細胞としては、例えばＣＯＳ細胞、及びＨｅＬａ細胞が挙げられる。真菌の細胞としては、酵母細胞（例えばサッカロマイセス セレビジエの細胞）が挙げられる。宿主細胞は、当業者に公知の技術（例えばリン酸カルシウム又は酢酸リチウム沈殿、エレクトロポーレーション、リポフェクション、及びパーティクルガン）を用い、ベクターにより形質転換又はトランスフェクションすることができる。ベクター又はその部分を含む宿主細胞（「組換え宿主」）を用いて、ベクターの伝播、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の調製、又はポリペプチド発現を行うことができる。場合によっては、当該組換え宿主は、宿主ゲノム上にベクターの全部又は一部（例えばＤＮＡ挿入物）を含む。
【００４１】
ＳＳＢ−ＤＮＡＰ融合タンパク質
ＳＳＢ−ＤＮＡＰ融合タンパク質は、Ｎ末端にＳＳＢ部分を配置し、Ｃ末端にポリメラーゼ部分を配置して設計してもよく、又はその逆であってもよい。すなわち、当該融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、ポリメラーゼ部分の上流（５’）側にＳＳＢ部分を配置してもよく、又はその逆であってもよい。分子生物学の公知の方法を使用して、ＳＳＢ遺伝子をＤＮＡＰ遺伝子の上流（又は下流）に、読み枠を合わせた状態でクローニングしてもよい。一実施態様では、ＤＮＡＰはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。他の実施態様では、ＤＮＡＰはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。これらの２つの部分は、各々が直接に隣接していてもよく、又はアミノ酸リンカーにより分離していてもよい。当該アミノ酸リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００、又はそれ以上のアミノ酸長であってもよい。一実施態様では、当該ＳＳＢは熱安定である。幾つかの実施態様では、本発明の核酸合成組成物は、２つ以上の融合タンパク質を含む。一実施態様では、当該ＳＳＢは熱安定ＳＳＢである。
【００４２】
ＳＳＢ−ＤＮＡＰ融合タンパク質としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む（若しくはそれのみからなる）ポリペプチド、及び／又はその変異体、断片若しくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。かかる断片としては、実質的なポリメラーゼ活性、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性及び／又は５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を保持（配列番号２に示される融合タンパク質の活性の例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を保持）するものが挙げられる。配列番号２に示す融合タンパク質のＳｓｏ  ＳＳＢ及びポリメラーゼ部分は、アミノ酸リンカーで２つの部分に分離されてはいるものの、当該２つの部分はかかるアミノ酸リンカーを介さずに結合されていてもよい。本発明はまた、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号１）、並びにその変異体（挿入、欠失及び点変異を有する）を包含する。
【００４３】
融合タンパク質の発現及び精製
本願明細書に記載の融合タンパク質の発現を最適化するために、公知技術の誘導性又は構成的プロモーターを用いて、組換え宿主における組換え融合タンパク質遺伝子の発現制御を行ってもよい。同様に、高コピー数又は低コピー数のベクター（公知のベクター）を用いて、発現を適正レベルに維持してもよい。誘導性高コピー数のベクターは、組換え宿主における融合タンパク質の発現の向上に有用であると考えられる。
【００４４】
プラスミドライブラリを構築するための原核生物ベクターは、限定されないが例えばｐＢＲ３２２、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９の）などの、大腸菌において複製可能なプラスミドが挙げられる。バチルス属プラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２１７などが挙げられる（Ｇｌｙｃｚａｎ、ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ  ３０７−３２９．１９８２）。適切なストレプトマイセス属プラスミドとしては、ｐＩＪ１０１などが挙げられる（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３、１９８７）。シュードモナス属プラスミドとしては、Ｊｏｈｎら（Ｒａｄ．Ｉｎｓｅｃ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４、１９８６）及びＩｇａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２、１９７８）らの文献に記載のものが挙げられる。広宿主域プラスミド又はコスミド（例えばｐＣＰ１３）（Ｄａｒｚｉｎｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：９−１８、１９８４）を使用してもよい。
【００４５】
融合タンパク質は、原核宿主（例えば限定されないが、エシェリキア属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属、及びプロテウス属などの大腸菌又は他の細菌）にクローニングしてもよい。真核生物宿主を用いて、野生型又は変異型のポリメラーゼのクローニング及び発現を行ってもよい。かかる宿主としては、酵母、真菌、昆虫、及び哺乳動物細胞が挙げられる。かかる真核生物細胞において所望のＤＮＡポリメラーゼを発現させる際に、真核生物プロモーターなどの真核生物調節領域を用いてもよい。真核生物細胞における融合タンパク質のクローニング及び発現は、公知の真核生物ベクター系を使用して公知の技術により実施できる。
【００４６】
ルーチンな公知技術を用いて宿主を形質転換することができる。一実施態様では、形質転換されたコロニーをプレーティングし、ニトロセルロース膜に転写することによって、形質転換された大腸菌のコロニーにおける融合タンパク質の発現をスクリーニングすることができる。形質転換された細胞をニトロセルロース膜上で増殖させた後、標準的な技術を用いて細胞を溶解させ、次に膜を９５℃で５分間処理し、内在性の大腸菌由来の酵素を失活させる。使用する宿主、及びクローニングした融合タンパク質の温度安定性に応じて、宿主ポリメラーゼを失活させるための温度を適宜変化させてもよい。更に公知技術を使用して融合タンパク質活性をアッセイし、ＤＮＡポリメラーゼ活性の存在を検出する（Ｓａｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ  ９７：１１９−１２３、１９９１）。
【００４７】
また、本発明には、これらの核酸分子を含有する宿主細胞、並びにこれらの核酸分子を含むベクターが包含される。更に、ポリペプチドの調製方法（例えばこれらの核酸分子及び宿主細胞を使用してポリペプチドを調製する方法）が包含される。具体的態様では、ポリペプチドは、（１）単離された形態、（２）実質的に純粋な形態、及び／又は（３）基本的に純粋な形態、で提供される。他の局面として、本願明細書に記載の１つ以上のポリペプチド及び／又は１つ以上のポリヌクレオチドを含むか、若しくは構成する組成物及び混合物（例えば反応混合物）が包含される。
【００４８】
融合タンパク質の発現を最適化するために、誘導性の又は構成的な公知のプロモーターを用いて、組換え宿主において融合タンパク質を高発現させてもよい。同様に、高コピー数ベクター（公知技術）を用いて、組換え宿主における融合タンパク質の発現を実施するか、又は向上させてもよい。
【００４９】
原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌、シュードモナスなど）における所望の融合タンパク質発現のために、融合タンパク質をコードする遺伝子を、機能的な原核生物プロモーターに制御可能な状態で連結してもよい。しかしながら、天然のプロモーターを機能させて原核宿主において融合タンパク質を発現させてもよい。すなわち、天然のプロモーター又はその他のプロモーターを用いて融合タンパク質を発現させてもよい。他のプロモーターを用いて、発現レベルを向上させてもよく、それらは構成的なプロモーターであってもよいか、又は制御可能な（すなわち誘導性か若しくは抑制されない）プロモーターであってもよい。構成的プロモーターの例としては、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター及びｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターが挙げられる。誘導性原核生物プロモーターの例としては、バクテリオファージλの左右プロモーター（ＰＲ及びＰＬ）、並びに大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ｔｅｔ、ｇａｌ、ｔｒｃ及びｔａｃプロモーターが挙げられる。枯草菌プロモーターとしては、α−アミラーゼプロモーター（Ｕｌｍａｎｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６２：１７６−１８２（１９８５））、及びバチルス属バクテリオファージプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ（Ｔ．）上記。）が挙げられる。ストレプトマイセス属プロモーターに関しては、Ｗａｒｄらの文献に記載されている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８、１９８６）。また原核プロモーター生物に関しては、Ｇｌｉｃｋ、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２、１９８７、Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｔｏ、Ｙ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６８：５０５−５１６、１９８６、及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（１９８４）に記載されている。原核細胞の発現においては、遺伝子のコード配列の上流におけるリボソーム結合部位の存在が必要となる。かかるリボソーム結合部位に関しては、例えば、Ｇｏｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５−４０４（１９８１）に記載されている。
【００５０】
一実施態様では、本願明細書に記載の融合タンパク質は、クローニングされた融合タンパク質遺伝子を有し、それを発現する組換え宿主を培養して生産する。目的の好熱性生物又はクローニングされた融合タンパク質遺伝子を含む宿主により同化される、いかなる栄養分を培地に添加してもよい。最適な培養組織条件は、使用する菌株及び培地の組成に従ってケースバイケースで選択する必要がある。抗生物質を培地に添加して、発現される所望の遺伝子を含むベクターＤＮＡの維持を確保してもよい。
【００５１】
本発明の融合タンパク質を産生する組換え宿主細胞を、例えば遠心分離によって液体培養組織から分離してもよい。一般に、微生物細胞を回収し、適切なバッファー中に分散させ、超音波処理又は他の公知の方法で破砕し、更にバッファー中に酵素を抽出する。超遠心分離又は遠心分離による細胞残渣の除去後、標準的なタンパク質精製技術（例えば抽出、沈殿、クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動等）により融合タンパク質を精製できる。精製の間に融合タンパク質の存在を検出するアッセイ方法は公知であり、従来技術の生化学な精製方法の間にこれを用い、これらの酵素の存在を測定できる。
【００５２】
融合タンパク質の使用
本願明細書に記載されている融合タンパク質を用いて、公知のＤＮＡ塩基配列決定、ＤＮＡのラベリング、ＤＮＡ増幅又はｃＤＮＡ合成反応を行ってもよい。当該融合タンパク質を用いて、多形ＤＮＡ断片の分析及び／又はタイピングを行ってもよい。
【００５３】
核酸合成
ＳＳＢ−ＤＮＡＰ融合タンパク質を用いて、以下の手順で核酸合成反応を行ってもよい。（ａ）１つ以上の鋳型と１つ以上の融合タンパク質を混合して混合物を調製し、（ｂ）鋳型の全部又は一部と相補的な核酸（すなわちプライマー伸長生成物）を調製するのに適する条件下で当該混合物をインキュベートする。核酸合成に適する反応条件（例えばｐＨ、温度、イオン強度及びインキュベート時間）はルーチンな公知の方法に従って最適化でき、１つ以上のプライマー、１つ以上のヌクレオチド、及び／若しくは１つ以上のバッファー若しくはバッファー塩類、又はそのいかなる組合せの使用を含めてもよい。
【００５４】
ＳＳＢ−ＤＮＡＰ融合タンパク質を用いて、以下の手順で増幅を行ってもよい。（ａ）１つ以上の鋳型と１つ以上の融合タンパク質を混合して混合物を調製し、（ｂ）鋳型の全部又は一部と相補的な核酸を増幅するのに適する条件下で当該混合物をインキュベートする。かかる条件には、１つ以上のプライマー、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のバッファー、及び／若しくは１つ以上の緩衝塩類、又はそのいかなる組合せの使用を含めてもよい。当業者であれば、ｐＨ、イオン強度、温度、及びインキュベート時間などの、核酸合成を可能にする条件を通常の手法を用いて決定できる。
【００５５】
核酸合成後、核酸を単離して更なる使用又は機能解析に使用してもよい。公知のいかなる手段（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィ（例えば分子篩、アフィニティ及び免疫クロマトグラフィ）、密度勾配遠心分離及び免疫吸着）を用いて、核酸合成反応系中に存在する他の核酸及び他の成分から合成された核酸を分離してもよい。ゲル電気泳動で核酸を分離することにより、迅速かつ再現性のある核酸分離方法が提供でき、同じ又は異なるサンプルに存在する核酸を、直接、同時に比較することができる。上記の方法によって調製された核酸を、ルーチンな方法を用い単離できる。例えば電子溶出又は物理的な切除によって核酸を電気泳動ゲルから除去できる。単離された核酸は、ベクター（原核若しくは真核生物の細胞のトランスフェクション又は形質転換に適する発現ベクターを含む）に挿入できる。
【００５６】
ＤＮＡ塩基配列決定
シークエンシング反応（等温処理によるＤＮＡ塩基配列決定、及び温度サイクル処理によるＤＮＡ塩基配列決定）においてＳＳＢ−ＤＮＡＰ融合タンパク質を使用できる。例えば、融合タンパク質を用いてＳＳＢ−ＤＮＡＰは、鎖伸長のターミネーションを採用するジデオキシ法による塩基配列決定を行うことができる。その場合、特異的なポリマー及び塩基特異的な鎖ターミネーターを用いてＤＮＡポリメラーゼによる伸長に供し、更にポリアクリルアミドゲルを用いて、新しく合成され、鎖が終結されたＤＮＡ分子を、サイズごとに分離することにより、元のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できる。具体的には、ＤＮＡ分子は４つの別々のＤＮＡシークエンス反応を用いて配列決定され、それぞれは異なる塩基特異的なターミネーターを含有する。例えば、第１の反応はＧ特異的なターミネーターを含み、第２の反応はＴ特異的なターミネーターを含み、第３の反応はＡ特異的なターミネーターを含み、更に第４の反応はＣ特異的なターミネーターを含む。好ましいターミネーターヌクレオチドとしては、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄｄＮＴＰｓ）（例えばｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＣＴＰ）が挙げられる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩のアナログを用いてもよく、またそれは公知技術でもある。通常は検出可能なラベルで標識したヌクレオチドをシークエンシング反応に含有させる。限定されないが、放射性同位元素、蛍光ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル及び酵素ラベルなどの様々な標識ヌクレオチドを用いて、シークエンシング（又はラベリング）反応を実施できる。
【００５７】
融合タンパク質を用いてサイクルシークエンシング反応を実施してもよい。サイクルシークエンシングは通常蛍光色素の使用を伴う。幾つかのサイクルシークエンシングのプロトコルでは、シークエンシング・プライマーは蛍光色素で標識されている（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＭｅｇａＢＡＣＥ  ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｐｒｉｍｅｒｓ、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）  ＢｉｇＤｙｅ（商標）ｐｒｉｍｅｒサイクルシークエンシングキット、及びＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＷｅｌｌＲＥＤ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｙｅ）。蛍光プライマーを使用したシークエンシング反応は、精度が向上することや解析可能な配列長が得られるなどの利点をもたらす。しかしながら、配列上の位置を決定しようとするヌクレオチドの塩基ごとに別々の反応サンプルを調製する必要がある。他のサイクルシークエンシングのプロトコルでは、蛍光色素をｄｄＮＴＰに結合させてダイターミネーターとして調製する（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＭｅｇａＢＡＣＥ  ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシークエンシングキット、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）  ＢｉｇＤｙｅ（商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシークエンシングキット、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）  ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシークエンシングキット、ＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅ（商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｍｉｘ、及びＣＥＱ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシークエンシングキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＷｅＩｌＲＥＤ  ｄｙｅｓを使用）を用いる）。ダイターミネーターは塩基ごとにユニークな蛍光ダイで標識されているため、単一の反応サンプルにおいてシークエンシングを実施できる。
【００５８】
すなわち、核酸のシークエンシングは以下の手順で実施する。（ａ）配列決定された１つ以上の鋳型を１つ以上の融合タンパク質（また任意に１つ以上の核酸合成停止剤（例えばｄｄＮＴＰｓ））と混合し、混合物を調製し、（ｂ）当該混合物を、鋳型の全部又は一部と相補的な分子集団の合成に適する条件下でインキュベートしてシークエンス反応を行わせ、（ｃ）当該集団を分離し、配列決定しようとする鋳型の全部又は一部のヌクレオチド配列を決定する。
【００５９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（公知のＤＮＡ増幅法）とは、ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて標的ＤＮＡ鋳型を増幅する方法である。かかるＰＣＲ反応では、２つのプライマー（１つは増幅しようとするＤＮＡ分子の第１鎖の３’末端（又は３’末端の付近）と相補的な鎖であり、もう１つは、増幅しようとするＤＮＡ分子の第２の鎖の３’末端（又は３’末端付近）と相補的な第２プライマー）をそれぞれＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼにより、デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、第１の鎖と相補的な第３のＤＮＡ分子及びＤＮＡ分子の第２の要素と相補的な第４のＤＮＡ分子の合成が増幅される。この合成により２つの二本鎖ＤＮＡ分子が得られる。更にこれらの二本鎖ＤＮＡ分子を用いて、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を提供することにより、更なるＤＮＡ分子の合成のためのＤＮＡ鋳型とすることができる。公知のように、更なる合成反応は、変性及び合成処理を複数回行わせることを可能にする当初の反応（過剰なプライマー及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を使用）の「繰り返し」により実施する。通常、高温で二本鎖ＤＮＡ分子を変性させ、一本鎖ＤＮＡ鋳型を形成させる。本願明細書に記載の融合タンパク質は熱安定性であるものが包含されるため、ＤＮＡ増幅反応の間のかかる熱サイクルでも活性を失わない。すなわち、これらの融合タンパク質はＰＣＲ反応（特に増幅の間、ＤＮＡ分子を変性させるのに高温を用いる場合）に非常に適している。融合タンパク質は、当業者にとり従来公知の全てのＰＣＲ方法で使用することができる（例えば、エンドポイントＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲ（米国特許第６５６９６２７号、第５９９４０５６号、第５２１００１５号、第５４８７９７２号、第５８０４３７５号、第５９９４０７６号（それらの全開示内容を本発明に援用する）、対立遺伝子特異的増幅、リニアＰＣＲ、１ステップ逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、２ステップＲＴ−ＰＣＲ、突然変異誘導ＰＣＲ、マルチＰＣＲ、並びに出願係属中の米国特許出願第０９／５９９５９４号に記載のＰＣＲ法（その全開示内容を本発明に援用する））。
【００６０】
ｃＤＮＡの調製
本願明細書に記載の融合タンパク質（ＳＳＢ−逆転写酵素酵素）を用いて、ｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを調製してもよい。米国特許第５４０５７７６号及び第５２４４７９７号（それらの全開示内容を本発明に援用する）を参照。すなわち、本発明はまた、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法にも関し、当該方法は、（ａ）オリゴ（ｄＴ）プライマー又は他の相補的プライマーとｍＲＮＡとを接触させ、ハイブリッドを形成させる工程と、（ｂ）処理（ａ）で形成させたハイブリッドを、本発明の融合タンパク質及び４つのｄＮＴＰｓと接触させ、ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを得る工程を含む。処理（ｂ）の反応混合物が、産生されるｃＤＮＡと相補的な適当なオリゴヌクレオチドを更に含むとき、第１の鎖合成後にｄｓＤＮＡを得ることができる。すなわち本発明はまた、本願明細書に記載の融合タンパク質を用いてｄｓＤＮＡを調製する方法に関する。
【００６１】
他の実施態様は、核酸の合成、塩基配列決定又は増幅のための、本発明の融合タンパク質を含む組成物及び反応系に関する。これらの混合液中に、１つ以上の融合タンパク質、１つ以上のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、核酸鋳型、オリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウム及びバッファー塩、並びに任意に他の成分（例えば非イオン系界面活性剤）を含有させてもよい。シークエンシング反応を実施する場合、反応系に１つ以上のｄｄＮＴＰｓを含有させてもよい。ｄＮＴＰｓ又はｄｄＮＴＰｓは非標識であってもよく、又は蛍光、化学発光、生物発光、酵素、放射性ラベルなどによって標識してもよい。幾つかの実施態様では、１つ以上の融合タンパク質を含む組成物は国際公開第９８／０６７３６号にて説明したよう調製される（その全開示内容を本願明細書に援用する）。
【００６２】
幾つかの実施態様は、例えば本願明細書に記載の方法を実施するためのキットの提供に関する。かかるキットは、１つ以上の融合タンパク質以外に、１つ以上の宿主細胞（好ましくは核酸分子を取り込む能力がある）、１つ以上の核酸（例えば核酸鋳型）、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の核酸プライマー、１つ以上のベクター、１つ以上のリガーゼ、１つ以上のトポイソメラーゼ、並びに１つ以上のバッファー又はバッファー塩からなる群から選択される１つ以上のコンポーネントを含んでもよい。
【００６３】
多形ＤＮＡ断片の解析及びタイピング
一実施態様では、第１の個体と第２の個体の関係を、特定の多形ＤＮＡ断片（例えばミニサテライトＤＮＡ又はマイクロサテライトＤＮＡ配列）を解析し、タイピングすることにより決定できる。かかる方法では、各個体ごとに増幅した断片同士を比較し、異同を決定する。例えば、かかる解析は、各個体ごとに増幅した断片のサイズを比較することによって、又は、各個体ごとに増幅した断片の配列を比較することによって実施する。他の局面では、本発明により遺伝子の同一性を決定できる。かかる同一性試験は、例えば親子鑑定、法医学分析などにおいて重要である。本発明の本局面では、ＤＮＡを含むサンプルを１つ以上の個体からのサンプルと比較して解析する。そのような本発明の局面では、ある１つのＤＮＡサンプルは第１の個体から調製して、他のサンプルは、第１の個体との関係が不明な第２の個体から調製してもよく、本発明の方法を用いた、第１及び第２の個体から調製したこれらのサンプルの比較を行うことにより、第１及び第２の個体の遺伝子の同一性又は関係の決定が可能となる。その特に好ましい局面では、第１のＤＮＡサンプルは公知の個体に由来する公知の試料であってもよく、第２のＤＮＡサンプルは例えば犯行現場から採取した未知のサンプルであってもよい。本発明の更なる局面では、１つのＤＮＡサンプルを第１の個体から調製し、他のサンプルを当該第１の個体に関連する第２の個体から調製してもよく、本発明の方法を用いた、第１及び第２の個体から調製したこれらのサンプルの比較により、第１及び第２の個体の遺伝子の親類関係の決定（例えばメンデル性遺伝の検査（多形、ミニサテライト、マイクロサテライト又はＳＴＲ  ＤＮＡ断片など））を実施できる。
【００６４】
本発明の他の局面では、目的の遺伝子をコードすることを示す遺伝子マーカーとして重要なＤＮＡ断片を同定、単離することができる。例えば、異なる供給源から調製したサンプルと比較することによって、伝染病（細菌、真菌、寄生虫若しくはウイルスに起因する）、癌又は遺伝病などの疾患を引き起こす際に重要と考えられるＤＮＡ断片を同定及び機能解析することが可能となる。本発明の本局面では、健常者の細胞又は組織から調製したＤＮＡサンプルを、罹患者の細胞又は組織から調製したＤＮＡサンプルと比較する。本発明における比較を行った後、１つのＤＮＡサンプルに存在し、その他のＤＮＡサンプルには存在しない１つ以上の独特の多形フラグメントを同定、単離する。かかる独特な多形フラグメント同定により、疾病の状態と関連する、関与する又は原因となる配列の同定が可能となる。
【００６５】
ゲル電気泳動は通常、アガロース又はポリアクリルアミドシークエンシングゲルにおいて実施され、典型的には３〜１２％（例えば８％）の濃度のポリアクリルアミドと、約４〜１２Ｍ（例えば８Ｍ）の濃度の尿素を含むゲルを使用し、標準的なプロトコルに従って実施する。サンプルをゲル上へロードし、通常は異なるゲノムＤＮＡの供給源から調製した増幅されたＤＮＡ断片を含有するサンプルを、ゲル上のその隣接するレーンにロードし、次の比較操作を容易にする。サイズが公知の参照マーカーを用いて、サンプルの比較を容易にしてもよい。電気泳動による分離後、ＤＮＡ断片を、当業者にとりルーチンな様々な方法（例えばオートラジオグラフィ）によって視覚化し、同定してもよい。次にオートラジオグラフィに供したフィルムを解析し、多形断片パターンの違い（「タイピング」）、又は１つのゲルレーン中の１つ以上のユニークなバンドの存在（「同定」）を検出することができ、１つのレーン（単一のサンプル、細胞、又は組織タイプに対応する）中のバンドであって、他のレーンにおいて観察されないバンドの存在は、その独特なバンドを含むＤＮＡ断片が供給源特異的であり、すなわち有用な多形ＤＮＡ断片であることを示す。
【００６６】
核酸合成組成物
核酸合成組成物中に、１つ以上のＳＳＢ−ＤＮＡポリメラーゼ、又はＳＳＢ−逆転写酵素融合タンパク質、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のプライマー、１つ以上のバッファー及び／又は１つ以上の鋳型を含有させてもよい。幾つかの実施態様では、核酸合成反応において、ｍＲＮＡと、逆転写酵素活性を有する融合タンパク質とを含有させてもよい。これらの組成物を用いることにより、核酸合成（例えばｃＤＮＡ合成、増幅及びｃＤＮＡ合成／増幅反応の組み合わせ）により産生されるプライマー伸長生成物の収率及び／又は均質性を改善させることが可能となる。
【００６７】
キット
本願明細書に記載の融合タンパク質は、キットの作製に適している。これらの融合タンパク質を含むキットは、キットの構成物の違いに応じて、公知の技術によるＤＮＡ分子の標識、ＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡ分子の増幅又はｃＤＮＡ合成などのために使用できる。米国特許第４９６２０２０号、第５１７３４１１号、第４７９５６９９号、第５４９８５２３号、第５４０５７７６号、及び第５２４４７９７号を参照（いずれも本願明細書に援用される）。かかるキットは、１つ以上の容器（例えばバイアル、試験管など）を近接した状態で封入するための、区分された収納手段を含んでもよい。かかる容器の各々には、ＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡ標識、ＤＮＡ増幅又はｃＤＮＡ合成の実施に必要な成分又は成分の混合物が含まれている。
【００６８】
かかるキットは、１つ以上の融合タンパク質以外に、１つ以上の宿主細胞（好ましくは核酸分子を取り込む能力を有する）、１つ以上の核酸（例えば核酸鋳型）１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の核酸プライマー、１つ以上のベクター、１つ以上のリガーゼ、１つ以上のトポイソメラーゼ、及び１つ以上のバッファー若しくはバッファー塩からなる群から選択される１つ以上のコンポーネントを含んでもよい。
【００６９】
キットのコンポーネントは通常、個々の容器（例えばバイアル、管、アンプル及び瓶）ごとに提供してもよく、又はそれらをまとめた形で提供してもよい。キットには通常、核酸の合成、増幅、配列決定の際の当該キットの使用方法を記載した使用説明書が同封される。例えば、第１容器中に実質的に精製された各融合タンパク質のサンプルを含有させてもよい。第２容器中に、ＤＮＡ鋳型と相補的なＤＮＡ分子を合成するのに必要な、１つ以上のタイプのヌクレオチドを含有させてもよい。第３容器中に、１つ又はそれ以上の異なるタイプのジデオキシヌクレオシド三リン酸を含有させてもよい。第４容器中に、ピロホスファターゼを含有させてもよい。上記の容器に加えて、１つ以上のＤＮＡプライマーを含有する更なる容器をキットに含めてもよい。ＤＮＡの増幅に使用するキットには、例えば、本願明細書に記載の実質的に純粋な融合タンパク質を含有する第一容器、並びに単一タイプのヌクレオチド又はヌクレオチドの混合物を含有する１つ以上の更なる容器が含まれる。ＤＮＡを増幅するためのキットに様々なプライマーを含めてもよく、又は含めなくともよい。様々なキットのコンポーネントを、必ずしも別々の容器に梱包する必要はなく、同じ容器内に様々に組み合せて梱包してもよい。例えば、融合タンパク質とヌクレオチドは同じ容器内に梱包してもよく、又は、当該融合タンパク質とヌクレオチドを別々の容器に梱包して提供してもよい。
【００７０】
ｃＤＮＡ合成用のキットは、融合タンパク質を含有する第１容器、４つのｄＮＴＰｓを含有する第２容器及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを含有する第３容器を含む。米国特許第５４０５７７６号及び第５２４４７９７号（いずれも本発明に援用される）を参照。また、本発明の融合タンパク質はｄｓＤＮＡを調製できるため、第４容器に第１のｃＤＮＡ鎖と相補的な適当なプライマーを含有させてもよい。当然ながら、単一の試験管中にこれらの試薬の１つ以上を組み合わせて含有させてもよい。必要に応じて、本発明のキットに、ＤＮＡ分子の合成又はシークエンシングにおいて使用可能な検出可能なラベルで標識されたヌクレオチドを含有する容器を含めてもよい。様々なラベルのうちの１つを用い、かかるヌクレオチドを検出してもよい。当該ラベルの例としては、限定されないが、放射性同位元素、蛍光ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル及び酵素ラベルなどが挙げられる。
【００７１】
以上で一般的な実施態様を記載したが、それは以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。但し以下の実施例はあくまで例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７２】
実施例
本発明を以下の実施例で更に詳細に記載するが、それらは請求項に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
＜実施例１＞Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質のクローニング
【００７３】
Ｓｓｏ  ＳＳＢ遺伝子を、ｐＥＴ２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）上で、Ｔ．ジリギ（Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ）（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流に、読み枠を合わせた状態でクローニングした。６量体リンカー（ＧＳＳＧＶＤ）を、Ｓｓｏ  ＳＳＢ領域とＴｚｉポリメラーゼ領域の間に介在させた。Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を配列番号１で示し、対応するアミノ酸配列を配列番号２で示す。融合タンパク質は、Ｓｓｏ部分（アミノ酸１〜１５０）６量体アミノ酸リンカー（アミノ酸１５１〜１５６）及びＴｚｉ部分（アミノ酸１５７〜９４１）からなる。
配列番号１：
2009520461.tif 000011
配列番号２：
2009520461.tif 000012
【００７４】
＜実施例２＞Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質の精製
２つの更なるｔＲＮＡ（ＡｒｇＵ（アルギニン）及びＩｌｅＹ（イソロイシン））を発現するプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３細胞において、ｐＴＴＱ−ＳｓｏＴｚｉ融合タンパク質を発現させた。これらの培養細胞を、３０℃で一晩、０．１８％のデキストロース、４０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢ培地１５０ｍＬ中で増殖させた。この培養液を更に６リットルのＬＢ培地で希釈し、細胞を〜０．８〜１．０のＯＤ６００となるまで３７℃で培養し、更に１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導後３時間、細胞を増殖させ、その後２０分間、６，０００×ｇで遠心分離して集菌した。
【００７５】
遠心分離後、細胞ペレットを、湿菌体（ペースト）１ｇ当たり３ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、８％のグリセロール、１０ｍＭのＫＣ１．５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍｌのフェニルメチルスルホニルフルオライド）中に再懸濁し、超音波処理（ＯＤ６００において７０〜８０％の溶解）を行い溶解させた。次に細胞溶解液を８５℃で３０分間熱処置し、その直後に氷冷し、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液を添加して２５０ｍＭの最終濃度とした。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２％（ｖ／ｖ））を、０．１５％（ｖ／ｖ）の最終濃度となるように４℃で滴下して溶解液に添加し、４℃で３０分間混合した。溶解液を１７，５００回転／分でＳＳ−３４ローターで１時間遠心分離し、上澄みを保存した。上記上澄みを４℃で撹拌しながら約５５％飽和による硫酸アンモニウム沈殿を行った。溶解物を１３，０００回転／分でＳＳ−３４ローターで３０分間遠心分離し、ペレットを低濃度の塩を含むバッファー（３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し、低塩バッファーで一晩透析した。
【００７６】
５ｍｌのＥＭＤ−ＳＯ４カラム（１．６×５ｃｍ）（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に溶液をアプライし、低塩バッファーで平衡化した。カラムを４カラム体積（ｃＶ）の低塩バッファーで洗浄し、１５ｃＶのバッファー（３０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％のグリセロール、１，０００ｍＭのＮａＣｌ）による、低塩から７０％の高塩までの濃度勾配、更には７０％の高塩バッファー３ｃＶで洗浄し、タンパク質を溶出させた。２ｍｌのフラクションを回収し、４〜２０％のトリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）によるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、製造業者の指示に従ってＮｏｖｅｘ  ＳｉｍｐｌｙＳａｆｅ染色液で染色した。所望のタンパク質バンドを含むフラクションを、以下の通りにポリメラーゼ活性単位アッセイを行い、更に解析した。
【００７７】
Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質のＤＮＡポリメラーゼ活性を、ニックを入れられたサケ精巣ＤＮＡ鋳型に対する、放射性同位元素識別したヌクレオチドの取り込み率により評価した。このアッセイでは、１つのポリメラーゼ単位は、標準的なバッファー条件下における、７４℃、３０分の酸沈殿材料へのデオキシヌクレオチド１０ｎｍｏｌの取り込みに対応する。酸沈殿断片へのヌクレオチド取り込みは、ＧＦ／Ｃフィルター上に反応液アリコートをスポッティングし、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液でフィルターを洗浄し、シンチレーションカウンターを使用してフィルター上の放射線量を測定することにより解析した。
【００７８】
標準単位アッセイにおいて、Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質の希釈液５μＬを、５０μＬの反応混合液に添加した。各反応液中には、５０μＬの最終ボリューム中、０．５μｇ／μＬのニック入りサケ精巣ＤＮＡ、１×単位アッセイバッファー（２５ｍＭのＴＡＰＳ（ｐＨ９．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣ１２、１ｍＭのＤＴＴ及び１〜２μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）中の０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）が含まれる。
【００７９】
融合タンパク質を添加して反応を開始させ、７４℃に調整したヒートブロックへ移動させた。反応を１０分間継続させ、氷上で、５０μＬの各々の反応液に０．５ＭのＥＤＴＡを１０μＬ添加して反応を終了させた。各々の混合物４０μＬを、ＴＣＡ沈殿のためにＧＦ／Ｃフィルター上へスポッティングした。反応液中に、飽和しない量（すなわち活性が希釈濃度に対して直線的に相関する濃度範囲）のポリメラーゼを含有させた。
【００８０】
ＴＣＡ沈殿を以下の通りに実施した。フィルターを、１％のピロリン酸ナトリウムを含有する１０％のＴＣＡ溶液で１５分間洗浄し、５％のＴＣＡ溶液で１０分間、３回洗浄し、更に９５％エタノールで１０分間洗浄した。フィルターを加熱ランプの下で５〜１０分間乾燥させ、放射能の減衰速度をＢｅｃｋｍａｎシンチレーションカウンター（モデル＃ＬＳ３８０１）を使用して、ＳｃｉｎｔｉＳａｆｅ  Ｅｃｏｎｏ  １シンチレーションカクテル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、パート＃ＳＸ２０−５）中で測定した。
【００８１】
ポリメラーゼ活性が最も強いフラクションをプールし、２ＬのＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ低塩バッファー（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％のグリセロール、５０ｍＭのＮａＣｌ）で透析した。
【００８２】
ＳｏｕｒｃｅＱ低塩バッファー（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール）で平衡化した８ｍｌのＳｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アマシャム社製）にサンプルをアプライした。カラムを５カラム体積（ｃＶ）の低塩バッファーで洗浄し、２０ｃＶのバッファー（２５ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％のグリセロール、１，０００ｍＭのＮａＣｌ）による、低塩から５０％の高塩までの濃度勾配、更には５０％の高塩バッファー３ｃＶで洗浄し、タンパク質を溶出させた。２ｍｌのフラクションを回収し、４〜２０％のトリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）によるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、製造業者の指示に従ってＮｏｖｅｘ  ＳｉｍｐｌｙＳａｆｅ染色液で染色した。所望のタンパク質バンドを含むフラクションを、ポリメラーゼ活性単位アッセイを行い、更に解析した。ポリメラーゼ活性が最も強いフラクションをプールし、２Ｌの保存バッファー（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％のグリセロール）で透析した。ＢｉｇＣｈａｐ及びＣｈａｐｓｏの添加の前に、後述するＵＶ吸光度でタンパク質濃度を測定した。なぜならこれらの界面活性剤はＵＶによる吸光度測定を妨害するからである。ＢｉｇＣｈａｐ及びＣｈａｐｓｏを、１．２％及び０．１２％の最終濃度でそれぞれ添加した。得られるＳｓｏ−Ｔｚｉ融合タンパク質は９５％超の純度であった。
【００８３】
＜実施例３＞Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質の、ＵＶ吸光度による測定
Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質のタンパク質濃度を、２７８ｎｍによるＵＶ吸光度測定により測定した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｍｏｄｅｌ  ＤＵ−６４０分光光度計を使用して、２２０〜３２０ｎｍのＢｅｃｋｍａｎミクロクォーツセル（８ｍｍ）によりＵＶスペクトルを測定した。ＢｉｇＣｈａｐ及びＣｈａｐｓｏは測定（上記参照）を妨害するため、ＵＶ測定はこれらの界面活性剤を含有しない条件で行った。３２０、３１５、２７８及び２６０ｎｍの吸光度スペクトルを解析した。３２０及び３１５ｎｍの吸光度を用いてベースラインの傾斜を算出し、一方で２７８及び２６０ｎｍの吸光度を用いて核酸コンタミネーションの範囲を推定した。２７８ｎｍの吸光度からベースライン値を減算して補正し、以下の方程式を用いてベースラインの傾斜から算出した。
Ａｂｓ（２７８）ｃａｌ＝Ａｂｓ（２７８）ｏｂｓ−８．４×（Ａｂｓ（３１５）ｏｂｓ−Ａｂｓ（３２０）ｏｂｓ）
（式中、Ａｂｓ（２７８）ｃａｌは補正後の２７８ｎｍの吸光度であり、及びＡｂｓ（２７８）ｏｂｓ、Ａｂｓ（３１０）ｏｂｓ及びＡｂｓ（３２０）ｏｂｓはそれぞれ２７８、３１０及び３２０ｎｍにおける吸光度測定値である）。いずれかの値が２ＯＤより高い場合、全ての値が２ＯＤ以下となるまでタンパク質溶液を保存バッファーで希釈した。１ｍｇ／ｍｌ溶液は１．２７（減衰係数）のＡｂｓ（２７８）ｃａｌを有する。従って、調製液中のタンパク質濃度は以下の通りに決定できる。
酵素濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａｂｓ（２７８）ｃａｌ／１．２７
【００８４】
ＤＮＡのコンタミネーションを、同様にＵＶ吸光度により検出できる。ＤＮＡ（特に一本鎖ＤＮＡ）は高い減衰係数を有し、すなわちＤＮＡの非常に少ない量で高いＯＤを示すことを意味する。タンパク質の測定と同様に、２６０ｎｍの吸光度を以下の通りに算出した。
Ａｂｓ（２６０）ｃａｌ＝Ａｂｓ（２６０）ｏｂｓ−１２×（Ａｂｓ（３１５）ｏｂｓ−Ａｂｓ（３２０）ｏｂｓ
（式中、Ａｂｓ（２６０）ｃａｌは補正後の２６０ｎｍの吸光度であり、Ａｂｓ（２６０）ｏｂｓ、Ａｂｓ（３１０）ｏｂｓ及びＡｂｓ（３２０）ｏｂｓはそれぞれ２６０、３１０及び３２０ｎｍにおける吸光度測定値である）。Ａｂｓ（２７８）ｃａｌに対するＡｂｓ（２６０）ｃａｌの比率がより高いほど、ＤＮＡのコンタミネーション量が大きい。酵素溶液中のＤＮＡコンタミネーションの許容範囲は、Ａｂｓ（２７８）ｃａｌ／Ａｂｓ（２６０）ｃａｌ比率において約２±１０％偏差（１．８〜２．２）である。上記の方法によって調製されるＳｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質は、上記の許容範囲のＡｂｓ（２７８）ｃａｌ／Ａｂｓ（２６０）ｃａｌ比率を有していた。精製されたＳｓｏ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質調製液はまた、ヌクレアーゼのコンタミネーションに関しても評価した。Ｓｓｏ−Ｔｚｉポリメラーゼの調製液ではエンドヌクレアーゼ活性を検出することができず、また極微量の５’−エキソヌクレアーゼのコンタミネーションが検出された。５’−エキソヌクレアーゼ活性は、キナーゼで５’末端を放射性同位元素識別したＤＮＡ基質を使用して測定した。放射性同位元素標識の放出を、７４℃で１時間のインキュベートの後、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を行うことによってモニターした。
【００８５】
二本鎖エンドヌクレアーゼアッセイは、スーパーコイル状のｄｓφＸ１７４  ＤＮＡに対して、マグネシウム濃度を増加させた１×Ｔｚｉバッファー（４５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中のＳｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質を、濃度を様々に変化させて添加することにより行った。スーパーコイル状の円形φＸ１７４  ＤＮＡ：リラックス型の円形ＤＮＡの比率を、１．２％のアガロースゲル電気泳動で測定した。高いエンドヌクレアーゼ活性は、スーパーコイル状ＤＮＡからリラックス型の円形ＤＮＡへの高い転換率となって表れる。リラックス型の円形ＤＮＡは、スーパーコイル状の円形ＤＮＡと比較してゲル上の移動速度が減少する。
【００８６】
＜実施例４＞ＰＣＲ条件及びＳｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質のための最適化
特に明記しない限り、ＰＣＲ反応は５０μＬの反応ボリュームとして調製した。典型的な反応溶液５０μＬ中には、５単位のＴｚｉ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、１×Ｔｚｉバッファー（４５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）、各プライマー０．３μＭ、０．３ｍＭのｄＮＴＰミックス、及び１０〜１００ｐｇの鋳型濃度（プラスミド）、１０ｎｇ〜１μｇのｃＤＮＡ、及び５０〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡを含有させた。ＰＣＲ反応液を室温で調製し、特に明記しない限り、標準的なプロトコルに従い実施した。加熱サイクルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００かＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００を使用して実施した。
2009520461.tif 000013
【００８７】
サーマルサイクルの終了後、ＰＣＲ増幅生成物を５μＬの１０×ＢｌｕｅＪｕｉｃｅと混合し、アリコート（各レーン当たり１０μＬの総反応ボリューム）を０．５μｇ／ｍｌの濃度で、臭化エチジウムを含む０．８％アガロースゲル（／０．５×ＴＢＥ）電気泳動で解析した。得られるゲルを用い、様々なサンプルに関して特異性及び収率に関して視覚的に解析した。
【００８８】
＜実施例５＞ＤＮＡポリメラーゼ正確性アッセイ
ストレプトマイシン抵抗性に基づくＤＮＡポリメラーゼ正確性アッセイを実施した（Ｌａｃｋｏｖｉｃｈら、Ｆｏｃｕｓ  ２３：６−７（２００１）、Ｆｕｊｉｉら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２８９：５９６−６０１（１９９９））。簡潔には、アンピシリン（Ａｐｒ）及び（ｒｐｓＬ）遺伝子を含むｐＭＯＬ  ２１プラスミドＤＮＡ（４ｋｂ）をＳｅａＩで直鎖状にし、それを鋳型とし、ビオチン化プライマーを使用して標準的なＰＣＲ反応を行った。Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質５単位を使用して増幅させた。鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ）を３５サイクルの増幅反応に供した。ＰＣＲのサイクルにおけるパラメータを、９４℃で５分間の後、９４℃で１５秒間、５８℃で１０秒間及び７２℃で５分間のサイクルを３５サイクル、更に７２℃で１０分間、最終的な伸長反応とした。ＰＣＲ生成物をストレプトアビジン磁気ビーズで精製し、アガロースゲル電気泳動にかけ、ＤＮＡ濃度及び鋳型の増幅を解析した。精製ＤＮＡをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、ＭＦ１０１コンピテントセルを形質転換した。細胞をアンピシリンプレートにプレーティングし、形質転換細胞の総数を測定した。細胞を、アンピシリン及びストレプトマイシンを含有する培地にプレーティングし、ｒｐｓＬ変異体（すなわちストレプトマイシン変異体の数）の総数を測定した。ｒｐｓＬ変異体の総数を、形質転換細胞の総数で割り、突然変異頻度を測定した。
【００８９】
Ｔａｑ、Ｔｚｉ（野生型）、ＳｓｏＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ（Ｃ末端にＨｉｓ６タグを有する若しくは有さないＳｓｏＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ）の正確性（相対値）を表２に示す。１つの比較的正確性は３４．１３±９．５６×１０−６であり、これはエラー比率である。表２に示されるデータは、少なくとも３回の測定による平均値を表す。
【００９０】
（表２）ＳｓｏＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質及び野生型Ｔｚｉポリメラーゼの正確性
2009520461.tif 000014
【００９１】
＜実施例６＞ＳｓｏＳＳＢ−ＴｚｉポリメラーゼによるＰＣＲ増幅
所定範囲の標的ゲノムを使用して、ＳｓｏＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼを試験した。試験した標的は、
Ａ）Ｒｈｏｄ：４６２ｂｐ、
Ｂ）ｐ５３：１４９４ｂｐ、
Ｃ）Ｒｈｏｄ：２４９７ｂｐ、
Ｄ）Ｒｈｏｄ：３１２３ｂｐ及び
Ｅ）Ｒｈｏｄ：３８７１ｂｐ
とした。鋳型として１００ｎｇのＫ５６２細胞のＤＮＡを用い、標準的なＰＣＲを実施した（実施例４）。結果を図１に示す。Ｐｈｕｓｉｏｎ及びｉＰｒｏｏｆでは最も小さい標的の増幅が弱く、一方Ｐｈｕｓｉｏｎでは長い３８７１ｂｐ断片の増幅ができなかった。Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質は全体を通して最も大きな収率を示し、一方ｉＰｒｏｏｆでは５つの標的のうちの３つに関して、Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質よりも僅かに低いレベルで増幅されていた。
【００９２】
本願明細書に記載の方法及び用途に対する適切な修飾及び最適化を、本発明又はそのいかなる実施態様の範囲内において実施できることは、当分野の当業者にとり自明である。本発明を詳細な説明により記載したが、上記の説明はあくまで例示を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを目的とするものではなく、それはむしろ添付の特許請求の範囲により定義されることを理解すべきである。他の局面、効果及び修飾は当該特許請求の範囲内である。本発明を詳細に記載したが、それは以下の実施例を参照することにより明確に理解されると考えられる。但しそれらはあくまで例示を目的とするものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ社製）及びｉＰｒｏｏｆ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）と比較した、本発明のＳｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質のＰＣＲによる標的配列の増幅を示すアガロースゲル電気泳動の写真。１００ｎｇのＫ５６２細胞のＤＮＡ鋳型を用いてＰＣＲを実施した。試験した標的は、  Ａ）Ｒｈｏｄ：４６２ｂｐ、  Ｂ）ｐ５３：１４９４ｂｐ、  Ｃ）Ｒｈｏｄ：２４９７ｂｐ、  Ｄ）Ｒｈｏｄ：３１２３ｂｐ及び  Ｅ）Ｒｈｏｄ：３８７１ｂｐである。Ｓｓｏ  ＳＳＢ−Ｔｚｉポリメラーゼ融合タンパク質は、全ての標的配列を最も大きな収率で増幅した。
【図１】
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【配列表】
2009520461000001.app