(57)【要約】１または２以上のハロゲン化カルボン酸（好ましくはα−トリハロメチル基を有する）またはそれらの誘導体から誘導される単位を含む吸着剤により、ドウモイ酸を選択的に結合する。前記吸着剤は、ポリマー、またはカルボン酸、誘導体もしくはポリマーがその上にグラフトされた固体支持体であってよい。好ましい酸は、２−トリフルオロメチルアクリル酸である。アミノ酸のような潜在的妨害物の存在下の混合物（例えば、海産物抽出物、海水または尿）から、ドウモイ酸を選択的に結合することができ、有機酸を含む溶離剤を用いて回収することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドウモイ酸を含む混合物からドウモイ酸を抽出する方法であって、
（ａ）ドウモイ酸を選択的に結合する吸着剤を調製する工程と、
（ｂ）前記吸着剤を、前記混合物の溶液または前記混合物から誘導される溶液と、ドウモイ酸が吸着されるように接触させる工程と
を含んでなり、前記吸着剤が、１または２以上のハロゲン化カルボン酸またはその誘導体から誘導される単位を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記吸着剤が、塩、エステル、チオエステル、アミドおよびニトリルから選択される１または２以上のカルボン酸誘導体から誘導される単位を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カルボン酸または誘導体が、カルボン酸基のカルボニルに対してβ位の炭素原子においてハロゲン化されている請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記カルボン酸または誘導体が、α−トリハロメチル基を有する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カルボン酸または誘導体が、フッ素化されている前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記カルボン酸または誘導体が、α−トリフルオロメチル基を有する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記カルボン酸が、式ＡまたはＢで表される前記請求項のいずれかに記載の方法：
【化１】
2009524634.tif 000005
式中、Ｘはハロゲン原子であり、
Ｒ1は、水素、置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキル、置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール、置換されていてもよいアミン、−ＯＲまたは−ＳＲから選択され、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、置換されていてもよく；
Ｒ2は、置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキル、置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール、置換されていてもよいアミン、−ＯＲまたは−ＳＲから選択され、Ｒは、先に定義の通りであるか、または二重もしくは三重炭素−炭素結合を含む基であり；
Ｒ3は、置換されていてもよいアルキレンまたはシクロアルキレン、酸素および硫黄から選択され、
前記吸着剤は、前記カルボン酸またはその誘導体から誘導される単位を有している。
【請求項８】
Ｘが、ＦまたはＣｌである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カルボン酸が、２−トリフルオロメチルアクリル酸である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記吸着剤が、重合に用いられる炭素−炭素多重結合を有するカルボン酸またはその誘導体であるモノマーを重合することにより調製されるポリマーを含む前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
重合が、架橋剤も含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート、メチレンビスアクリルアミドまたはＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルピペラジンである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記重合工程において、フリーラジカル重合を用いる請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記重合工程において、リビング重合、イオン重合または懸濁もしくは乳化重合を用いる請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記吸着剤が、カルボン酸、その誘導体、またはカルボン酸もしくはその誘導体のポリマーを、固体支持体上にグラフトすることにより調製される請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体が、ビーズ、繊維、毛細管または薄膜の状態である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記吸着剤からドウモイ酸を溶離するその後の工程（ｃ）を含む前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）において、酸を含む溶離剤を用いる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶離剤が、有機酸を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
溶離されたドウモイ酸を定量するその後の工程（ｄ）を含む請求項１７、１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物が、生物または食物サンプルを含む前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記混合物が、海水、魚もしくは貝のホモジネートもしくは抽出物、または尿を含む前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記混合物が、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、γ−アミノ酪酸およびカイニン酸の１または２以上も含む前記請求項のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
広義には、本発明は、ドウモイ酸を結合することができる物質の調製に関し、また、例えば分析化学、または環境、臨床もしくは食物分析におけるその使用に関する。好ましい吸着剤は、ドウモイ酸に対する高い親和性を有し、この化合物の精製、種々のサンプルからの抽出および濃縮に用いることができる。
【０００２】
ドウモイ酸は、珪藻シュードニッチャ属（Ｐｓｅｕｄｏ−ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）により生成され、藻類ブルーム（ａｌｇａｌ  ｂｌｏｏｍ）中に貝や他の海産種により蓄積される非常に危険な神経毒である。ドウモイ酸に汚染された貝を摂取すると、記憶喪失性の貝中毒が生じ、動物とヒトの両方において死を引き起こす場合がある。この理由から、漁場またはその近辺の環境サンプル中、ヒト消費用の貝中の両方におけるドウモイ酸水準のモニタリングは、重要な食物安全性手段である。欧州委員会指令２００２／２２６／ＥＣは、ヒト消費を意図した場合、貝１ｋｇ当たり２０ｍｇのドウモイ酸当量の最大許容水準を導入した。大部分の他の食物安全当局で、同様の最大許容水準が採用されている。ドウモイ酸の検出には、海水、食物サンプルおよび複合的生物流体中に見られる妨害性の化合物、塩および他の物質から予備濃縮または精製するために、その毒素を特異的かつ強力に吸着することができる物質が必要とされる。本発明の好ましい態様は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびＨＰＬＣと、質量分析（ＭＳ）、ガスクロマトグラフィーおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）との組み合わせを含むクロマトグラフィーのような任意のさらなる検出および定量法に許容できる量で、ドウモイ酸を抽出、精製および予備濃縮するために用いることができる親和性マトリクスを提供する。
【０００３】
〔背景技術〕
＜参考文献＞
特許  ：５，３０６，４６６ＵＳＡ
国    ：米国
発行日：１９９４年４月２６日
名称  ：食物中の汚染物質の検出
＜他の参考文献＞
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４  (Kotoulas C, Kiparissides C. (2006). A generalized population balance model for the prediction of particle size distribution in suspension polymerization reactors. Chemical Engineering Science, 61, 332-346
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７  Larpent C, Bernard E., Richard J., Vaslin S. (1997). Polymerization in microemulsions with polymerizable cosurfactants: a route to highly functionalized nanoparticles. Macromolecules, 30, 354-362
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１１  Hu M-X., Yang Q., Xu Zh.-K. (2006). Enhancing the hydrophilicity of polypropylene microporous membranes by the grafting of 2-hydroxyethyl methacrylate via a synergistic effect of photoinitiators. Journal of Membrane Science, 285, 196-205
１２  Piletsky S. A., Matuschewski H., Schedler U., Wilpert A., Piletska E. V., Thiele T. A., Ulbricht M. (2000). Surface functionalization of porous polypropylene membranes with molecularly imprinted polymers by photo-graft copolymerization in water. Macromolecules, 33, 3092-3098.
幾つかの材料が、過去において、ドウモイ酸の固相抽出（ＳＰＥ）に用いられてきた。例えば、強アニオン交換（ＳＡＸ）カートリッジ［１］、親水性および親油性保持性の両方を示すポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）に基づくＯａｓｉｓ  ＨＬＢ抽出カートリッジ［２］、および芳香族スルホン酸に基づくＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ｓｐｅ（登録商標）のような強カチオン交換（ＣＡＸ）カートリッジ［３］が挙げられる。これらは、全て、操作方式に関する幾つかの不利益を有している。ＳＡＸカートリッジおよびＯａｓｉｓ  ＨＬＢ吸着剤は、低い（＜１ｎｇ／ｍｌ）および高い（＞５００μｇ／ｍｌ）濃度のドウモイ酸を結合するための充分に高い親和性を有することが示されていない。さらなる問題は、市販の吸着剤では、ドウモイ酸と、アスパラギン酸およびグルタミン酸のようなアミノ酸との間の識別ができないことである。米国特許第５，３０６，４６６号に記載の免疫吸着剤は、多くの例において、必要な親和性および選択性を有しているが、安定性い乏しく高コストである。芳香族スルホン酸を含む強カチオン交換（ＣＡＸ）カートリッジは、これらの物質により吸着されたドウモイ酸の複雑な回収から生じる他の不利益を有する。このように吸着剤からドウモイ酸を除去するために、硫酸または塩酸のような強鉱酸を用いることが必要とされる。このことは、ＭＳ検出またはＥＬＩＳＡのような多くの用途との適合性に劣る。
【０００４】
〔発明の開示〕
本発明は、ドウモイ酸を含む混合物からドウモイ酸を抽出する方法であって、（ａ）ドウモイ酸を選択的に結合する吸着剤を調製する工程と、（ｂ）前記吸着剤を、前記混合物の溶液または前記混合物から誘導される溶液と、ドウモイ酸が吸着されるように接触させる工程とを含んでなり、前記吸着剤が、１または２以上のハロゲン化カルボン酸またはその誘導体から誘導される単位を含むことを特徴とする方法を提供する。「誘導体」という用語は、塩、エステル、チオエステル、アミドおよびニトリルを包含する。カルボン酸部分は、好ましくは、少なくとも、カルボン酸基のカルボニル原子に対してβ位（または、誘導体中の対応する位置）の炭素原子においてハロゲン化されている。好ましくは、α−トリハロメチル基がある。より好ましくは、それはα−トリクロロメチルまたは（最も好ましくは）α−トリフルオロメチルである。
【０００５】
好ましいカルボン酸は、式（Ａ）または（Ｂ）で表されるものであり、好ましい誘導体はそれらの誘導体である。
【０００６】
【化１】
2009524634.tif 000002
【０００７】
式中、Ｘはハロゲン原子であり、
Ｒ1は、水素、置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキル、置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール、置換されていてもよいアミン、−ＯＲまたは−ＳＲから選択され、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、置換されていてもよく；
Ｒ2は、置換されていてもよいアルキルまたはシクロアルキル、置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール、置換されていてもよいアミン、−ＯＲまたは−ＳＲから選択され、Ｒは、先に定義の通りであるか、または二重もしくは三重炭素−炭素結合を含む基であり；
Ｒ3は、置換されていてもよいアルキレンまたはシクロアルキレン、酸素および硫黄から選択される。
【０００８】
アルキルおよびアルキレン基は、通常、１〜６個の炭素原子を有する。アリールおよびヘテロアリールは、通常、１２個までの炭素原子を有する。「置換されていてもよい」は、１または２以上の水素原子が、ハロゲン、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ2、−ＣＯ−Ｒ、アリールまたはヘテロアリール（Ｒは先に定義の通り）から好適に選択される置換基により置換される可能性を意味する。
【０００９】
カルボン酸が、炭素−炭素多重結合を含まない場合、通常、例えばビニルまたはアリルアルコールのエステルである誘導体が用いられる。
【００１０】
一部の態様において、−ＣＸ3がＨにより置換されている式（Ａ）の変異形であるカルボン酸または誘導体が用いられる。この場合、この化合物は、ハロゲン化されなくてよい。例えば、ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭ）でもよい。
【００１１】
本発明を具体化した方法は、とりわけ、分析化学において、ならびに環境、臨床および食物分析において、用いることができる。
【００１２】
ドウモイ酸を結合することができる好ましい材料は、２−トリフルオロメチルアクリル酸のようなトリフルオロメチルカルボン酸およびその誘導体から構成される。これらの誘導体から合成される吸着剤は、ドウモイ酸に対して高い親和性を有することができると共に、その化合物の抽出、濃縮および精製に用いることができる。提案された物質の実質的利点としては、例えば、アセトニトリルまたはメタノール中に蟻酸または酢酸を含む溶液のような酸性化有機溶媒での溶離によって、吸着剤からドウモイ酸を比較的容易に回収することが挙げられる。他の代替可能な有機酸および有機溶媒を、当業者は容易に思いつく。提案された吸着剤は、限定はされないが、グルタミン酸およびアスパラギン酸、グルタミン、プロリン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）およびカイニン酸のような他のアミノ酸、ならびに他のマトリックス成分を含む、構造類似体を含む混合物からドウモイ酸を選択的に抽出することができる。
【００１３】
主な態様として、以下が挙げられる：
（１）ハロゲン化された（より具体的にはフッ素化された）カルボン酸の重合性誘導体からの、重合による吸着剤の合成：場合により、その後の以下の工程を伴う：
（２）ハロゲン化された（好ましくはフッ素化された）カルボン酸を含む得られたポリマーを、ビーズ、薄膜または他の支持体の表面にグラフトする工程。
【００１４】
次いで、合成された吸着剤を、ドウモイ酸の抽出、濃縮もしくは精製、または検出に用いることができる。
【００１５】
〔発明を実施するための形態〕
吸着剤は、重合性カルボン酸またはその誘導体から製造することができる。カルボン酸誘導体としては、限定されないが、無機または有機酸の塩、エステル、チオエステル、アミドおよびニトリルが挙げられる。通常、重合性二重結合を含むカルボン酸（またはその誘導体）のモノマーが、適切な有機溶媒中または水中で架橋剤およびラジカル開始剤と混合される。重合は、加熱によりまたは好ましくはＵＶ照射により開始することができ、通常、種の反応性に依存して数分または数時間かかる。
【００１６】
ラジカル重合、リビング重合、イオン重合、懸濁または乳化重合を含む幾つかの異なる型の重合を用いることができる［例えば４〜９を参照］。好ましい重合の種類は、ラジカル重合である。吸着剤の調製に用いることができるモノマーとしては、カルボン酸の誘導体：ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレートが挙げられる。カルボン酸は、ハロゲン化されている。より好ましくは、カルボン酸は、カルボン酸基のカルボニルに対してβ位の炭素原子においてハロゲン化されている。一層より好ましくは、カルボン酸は、α−トリハロメチル基を有し、さらにより好ましくは、α−トリフルオロメチル基を有する。最も好ましいのは、２−トリフルオロメチルアクリル酸（ＴＦＭＡＡ）である。
【００１７】
合成に適した架橋剤の典型例としては、限定されないが、エチレングリコールジメタクリレート、メチレンビスアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルピペラジンが挙げられる。当業者は、特定のシステムに適したモノマーおよび架橋剤を選択することができる。
【００１８】
吸着剤は、カルボン酸もしくはその誘導体またはそれらのポリマーであって、好ましくはフッ素化されているものを、支持体の表面上にグラフトすることにより調製することもできる。好ましい支持体としては、予備成形されたビーズ、薄膜、毛細管または繊維のような調製物品が挙げられる。グラフトは、当業者に知られている種々の方法で達成することができる［例えば１０〜１２を参照］。すなわち、対応する無機またはポリマー材料の表面を、対応するカルボン酸、カルボン酸の誘導体、またはそれらのポリマーを共有結合することができる官能基で活性化することができる。これに用いられる化学反応の例としては、シッフ塩基、ジスルフィド結合、Ｓ−金属結合の形成、またはエステルの形成が挙げられる。別の型のグラフトとして、ビーズまたは薄膜の表面上に固定化されたラジカル開始剤を用いるラジカルグラフトが挙げられる。親和性吸着剤の生成に、プラズマグラフトを用いることもできる。
【００１９】
合成された吸着剤は、ドウモイ酸の精製、種々のサンプルからのその抽出もしくは濃縮、またはその検出および／もしくは定量に用いることができる。ドウモイ酸の検出または定量のための合成吸着剤の適用は、種々の方法により実施することができ、限定はされないが、当業者によく知られた分析技術による吸着剤からの溶離液のアッセイが挙げられる。または、吸着剤を化学的センサーデバイスにおける検出マトリクスとして用いることができる。この適用の典型例は、海水、生物または食物サンプルからのドウモイ酸の固相抽出であり得る。これらの吸着剤は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびＨＰＬＣと、質量分析（ＭＳ）、ガスクロマトグラフィーおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはセンサーとの組み合わせを含むクロマトグラフィーのような定量法と組み合わせて用いることができる。
【００２０】
以下の非限定的実施例を参照して、本発明をさらに具体的に説明する。
【００２１】
〔実施例１：架橋された２−トリフルオロメチルアクリル酸（ＴＦＭＡＡ）の合成〕
ＴＦＭＡＡ１００ｍｇ、ＤＭＦ２ｍｌ、架橋剤９００ｍｇ、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）および開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）１０ｍｇを混合することで、ポリマーを合成した。ポリマー混合物を、オイルバス中にて８０℃で１２時間熱重合した。合成後、ポリマーを研磨し、メタノールで湿式篩にかけることで、６３〜１０６μｍの粒子を得た。ポリマー（１００ｍｇ）を、１ｍｌＳＰＥカートリッジに充填し、ドウモイ酸の吸着に用いた。未反応モノマーを除去するために、ポリマーカートリッジを、１００ｍＭ  ＮａＯＨを含む５０％メタノール５ｍｌで洗浄し、続いて脱イオン水１０ｍｌで洗浄した。カートリッジの再生の際にも、同様のプロトコールを用いた。実験前のカートリッジの予備調整には、０．１Ｍ  ＨＣｌを用いた。
【００２２】
〔実施例２：架橋官能性モノマーの合成〕
ＤＭＦ（５ｇ）中で、官能性モノマー（ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）またはＴＦＭＡＡ（１ｇ）、架橋剤（ＥＧＤＭＡ）（４ｇ）および開始剤（５０ｍｇ）を混合することで、ポリマーを調製した。ポリマー混合物を、窒素で２分間脱気した。１２時間の熱重合（８０℃）によって、ポリマーを調製した。ポリマーを手で研磨し、メタノールで湿式篩にかけた。４５〜６５μｍのフラクションを集めた。ポリマー粒子を、炉内にて６０℃で３０分間乾燥した。１ｍｌＳＰＥカートリッジに、ポリマー５０ｍｇを充填した。ポリマーの結合特性を、ｐＨ４．６で試験した（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤）。カートリッジを実験前に緩衝剤１０ｍｌで調整した。濃度６５μｇ／ｍｌのドウモイ酸溶液５００μｌを、各カートリッジを通し、濾液を集め、ＨＰＬＣを用いて分析した。結果は、ｐＨ４．６におけるドウモイ酸の結合は、ジエチルアミノエチルメタクリレート系ポリマー（ＤＥＡＥＭ）では１００％、メタクリル酸系ポリマー（ＭＡＡ）では８０％、および２−トリフルオロメチルアクリル酸系ポリマー（ＴＦＭＡＡ）では１００％であったことを示している。海水（〜３．５％ＮａＣｌ）からのドウモイ酸の結合は、ＴＦＭＡＡでは実質的に同じであったが、ＤＥＡＥＭおよびＭＡＡ系ポリマーの場合は実質的に低下した（＜４０％）。
【００２３】
〔実施例３：海水からのドウモイ酸の選択的抽出へのＴＦＭＡＡ系吸着剤の適用〕
海塩（Ｓｉｇｍａ，Ｓ−９８８３）の３．５％溶液として人工海水を調製した。次いで、人工海水サンプルに、ドウモイ酸、またはグルタミン酸およびアスパラギン酸のようなドウモイ酸の構造類似体を加えた。ＴＦＭＡＡ系ポリマーからのその回収を評価するために、一連の実験を行った。０．１Ｍ  ＨＣｌの１ｍｌでカートリッジを調整した後、異なる濃度のドウモイ酸（１００〜５００ｎｇ／ｍｌ；０．３〜１．６μＭ）、グルタミン酸（２９〜１４７μｇ／ｍｌ；０．２５〜１ｍＭ）およびアスパラギン酸（２６〜１３３μｇ／ｍｌ；０．２５〜１ｍＭ）を加えた人工海水を、カートリッジに導入した。溶離液中の３種の分析体の全て−すなわちドウモイ酸、グルタミン酸およびアスパラギン酸−の定量を、ＨＰＬＣ−ＭＳを用いて同時に行った。全てのサンプルにおいて、ドウモイ酸の定量的な回収を示したが、グルタミン酸およびアスパラギン酸の回収は無視し得る程度（＜１％）しか示さなかった。
【００２４】
【表１】
2009524634.tif 000003
【００２５】
〔実施例４：尿からのドウモイ酸の選択的抽出へのＴＦＭＡＡ系吸着剤の適用〕
同様に、異なる濃度のドウモイ酸、グルタミン酸およびアスパラギン酸を加えた尿サンプルの抽出実験を行った。尿サンプルにおいても、ドウモイ酸の充分な回収レベルが達成された（表２）が、グルタミン酸およびアスパラギン酸の回収は低かった（＜１〜２％）ことが分かった。
【００２６】
【表２】
2009524634.tif 000004
【００２７】
〔実施例５：貝からのドウモイ酸の選択的抽出へのＴＦＭＡＡ系吸着剤の適用〕
貝肉（５０ｇ）を高速ブレンダー中で均質化し、そのホモジネートのサンプル（５ｇ）を、５０ｍｌ遠心分離管中で５０％メタノール／水抽出溶液（２０ｍｌ）と一緒に渦ミキサーで混合し、次いで、室温で３０００ｘｇの条件で１０分間遠心分離する。上澄みを除去し、前述のような１ｍｌＳＰＥカートリッジ（実験前に緩衝剤１０ｍｌで予備調整されたもの）を通す。ドウモイ酸を、０．１Ｍ蟻酸を含む８０％アセトニトリルを用いて溶離し、溶離液を集める。
【国際調査報告】
2009524634.tif 000006