(57)【要約】  抗体結合能を有するリポソームおよびその調製方法、抗体修飾リポソームおよびその調製方法を提供する。本発明の抗体結合性リポソームは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその機能的同等物で表面が修飾されてなることを特徴とする。また本発明の抗体修飾リポソームは、上記の抗体結合性リポソームに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその機能的同等物を介して抗体が結合してなることを特徴とする。
2009060710.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるリポソーム結合性ペプチド：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）上記（ａ）に記載する記載のアミノ酸配列において、少なくとも１１〜５８および７０〜７３のアミノ酸領域を保有することを条件に、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなり、且つリポソーム結合性とリポソーム膜への移行性を有するペプチドをコードするアミノ酸配列。
【請求項２】
下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる抗体結合性ペプチド：
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
（ｄ）上記（ｃ）に記載する記載のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなり、且つ抗体結合能を有するペプチドをコードするアミノ酸配列。
【請求項３】
下記（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列からなるリンカーペプチド：
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｆ）上記（ｅ）記載のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなり、且つリポソーム結合性および抗体結合性を有するペプチドをコードするアミノ酸配列。
【請求項４】
請求項２に記載する抗体結合性ペプチドのＣ末端に、請求項１に記載するリポソーム結合性ペプチドが結合してなる、請求項３に記載するリンカーペプチド。
【請求項５】
請求項３または４に記載するリンカーペプチドで修飾されてなる抗体結合性リポソーム。
【請求項６】
請求項３または４に記載するリンカーペプチドとリポソームとを混合することによって、リポソームに上記リンカーペプチドを結合させる工程を有する、請求項５記載の抗体結合性リポソームを調製する方法。
【請求項７】
請求項５に記載する抗体結合性リポソームに、請求項３または４に記載するリンカーペプチドを介して抗体が結合してなる、抗体修飾リポソーム。
【請求項８】
上記抗体がＩｇＧである請求項７に記載する抗体修飾リポソーム。
【請求項９】
請求項５に記載する抗体結合性リポソームと抗体とを混合することによって、当該リポソームに、請求項３または４に記載するリンカーペプチドを介して、抗体を結合させる工程を有する、請求項７または８に記載する抗体修飾リポソームを調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体結合能を有するリポソームに関する。より詳細には、本発明は、抗体結合能を有するペプチドで修飾されたリポソーム（以下、「抗体結合性リポソーム」という）、およびその調製方法に関する。また本発明は、当該抗体結合性リポソームを用いて、抗体を結合してなるリポソーム（以下、「抗体修飾リポソーム」ともいう）、ならびにその調製方法に関する。【０００２】
さらに、本発明は、リポソームの修飾に使用される、抗体とリポソームの両方に対して結合する能力を備えたペプチド（以下、「リンカーペプチド」ともいう）、ならびにその調製に使用されるリポソーム結合性ペプチド（リポソームへの結合能を備えたペプチド）に関する。
【背景技術】
【０００３】
人工的な脂質２分子膜からなる小胞であるリポソームは、細胞のモデルとして基礎研究に用いられるほか、生体内において特定の組織や細胞に内包物を送達させるための薬物運搬担体（ドラッグデリバリーのツール）としての利用が注目を集めている。抗がん剤などの薬物を内封させたリポソームを生体に投与し、これをがん細胞などの特定の細胞や組織に選択的に送達させることができれば、特定の細胞や組織にのみ目的とする薬物を取り込ませることが可能であり、薬物の選択毒性の向上に大きく貢献することが可能と期待されるためである。【０００４】
リポソームを特定の細胞や組織に選択的に送達させる目的で、リポソーム表面を抗体で修飾することがしばしば行われている。従来、リポソーム表面を抗体で修飾させるためには、リポソームを調製する際に、あらかじめ抗体と反応性のある特殊なリン脂質を混ぜておき、斯くして調製されたリポソームに抗体を結合させる方法が採用されている（例えば、図１参照）。しかし、かかる方法には、一般に(1)特殊なリン脂質の使用と、(2)精製された抗体の準備が不可欠であり、また(3)抗体分子のどこにリン脂質が結合するのかは制御不能であるという問題がある。【０００５】
また、Protein Aをリポソームに共有結合させることによって、リポソームに抗体結合能を付与する方法も提案されている（例えば、非特許文献１および図２参照）。この方法では抗体を予め精製しておかなければならないという上記(2)の問題は克服できるものの、あらかじめ、リポソームを構成するリン脂質に対して、Protein Aとの反応性をもたせる処理を施す必要があるため、依然として(1)の問題は解決されていない。またProtein Aは、分子量がおよそ57kDaと比較的大きい分子であるため、取り扱いが難しいという問題もある。
【非特許文献１】Lee D. Leserman, Patrick Machy & Jacques Barbet、「Cell-specific drug transfer from liposomes bearing monoclonal antibodies」Nature 288 (1980) 602
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、リポソーム表面を抗体で修飾した「抗体修飾リポソーム」の調製にあたり、前述する(1)〜(3)の問題を解消することを目的とする。具体的には、(1)特殊なリン脂質を使用することなく、また(2)精製された抗体を使用することなく、(3)抗体の結合部位を所定部位に制御した状態で、「抗体修飾リポソーム」を調製する方法、ならびに当該「抗体修飾リポソーム」の調製に好適に使用される「抗体結合性リポソーム」を提供することを目的とする。さらに本発明は、かかる「抗体結合性リポソーム」の調製に使用されるペプチド（リンカーペプチドおよびリポソーム結合性ペプチド）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記問題を解消するために、バクテリアファージのコートタンパク質の1つであるPf3ペプチドのアミノ酸配列をもとに種々改良を重ねていたところ、リポソームを構成する脂質２分子膜に特定の方向性をもって突き刺さる特性（移行性と結合性）を有するペプチドを構築することに成功し（実験例１参照）、かかるペプチド（本発明では「リポソーム結合性ペプチド」という）が、リポソーム表面を修飾するリガンドとして有効に利用できると考えた。【０００８】
一方、Staphylococcus aureusが産生するタンパク質であって、多くの動物種の抗体分子に高い親和性を有するProtein Aは、60程度のアミノ酸からなる５つの抗体結合ドメインからなる。そこで、このうちの１つの抗体結合ユニット（ドメインＢ）を選択し、これに上記のリポソーム結合性ペプチドを融合させたところ、かかる融合ペプチドは、当該リポソーム結合性ペプチドの特性（移行性と結合性）に基づいてリポソームに自発的に移行し、しかも上記抗体結合ユニット（ドメインＢ）を表面に露出させた状態で、その脂質２分子膜に結合し、その結果、リポソームに抗体結合能を付与することができることが確認された。【０００９】
これらの知見から、本発明者らは、上記の融合ペプチドを結合させたリポソームは抗体結合能を有し、これをリンカーペプチドとして用いることにより、容易に抗体修飾リポソームが調製できると考え、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記の態様を備えるものである。【００１０】
（Ｉ）リポソーム結合性ペプチド
(I-1)下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるリポソーム結合性ペプチド：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）上記（ａ）に記載する記載のアミノ酸配列において、少なくとも１１〜５８および７０〜７３のアミノ酸領域を保有することを条件に、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなり、且つリポソーム結合性とリポソーム膜への移行性を有するペプチドをコードするアミノ酸配列。【００１１】
（II）抗体結合性ペプチド
(II-1)下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる抗体結合性ペプチド：
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
（ｄ）上記（ｃ）に記載する記載のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなり、且つ抗体結合能を有するペプチドをコードするアミノ酸配列。【００１２】
（III）リンカーペプチド
（III-１）下記（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列からなるリンカーペプチド：
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｆ）上記（ｅ）記載のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなり、且つリポソーム結合性および抗体結合性を有するペプチドをコードするアミノ酸配列。
（III-2）（II-1）に記載する抗体結合性ペプチドのＣ末端に、(I-1)に記載するリポソーム結合性ペプチドが結合してなる、(III-1)に記載するリンカーペプチド。
（III-3）（II-1）の（ｅ）に記載する抗体結合性ペプチドのＣ末端に、(I-1)の（ｃ）または（ｄ）に記載するリポソーム結合性ペプチドが結合してなる、(III-1)に記載するリンカーペプチド。
（III-4）（II-1）の（ｄ）に記載する抗体結合性ペプチドのＣ末端に、(I-1)の（ｃ）または（ｄ）に記載するリポソーム結合性ペプチドが結合してなる、(III-1)に記載するリンカーペプチド。【００１３】
（IV）抗体結合性リポソームとその調製方法
(IV-1) (III-1)または(III-2)に記載するリンカーペプチドで修飾されてなる抗体結合性リポソーム。
(IV-2) (III-1)または(III-2)に記載するリンカーペプチドとリポソームとを混合することによって、リポソームに上記リンカーペプチドを結合させる工程を有する、(IV-1)に記載する抗体結合性リポソームを調製する方法。【００１４】
（V）抗体修飾リポソームとその調製方法
(V-1)（IV-1）に記載する抗体結合性リポソームに、(III-1)または(III-2)に記載するリンカーペプチドを介して抗体が結合してなる、抗体修飾リポソーム。
(V-2) 上記抗体がＩｇＧである(V-1)に記載する抗体修飾リポソーム。
(V-3) (IV-1)に記載する抗体結合性リポソームと抗体とを混合することによって、当該リポソームに、(III-1)または(III-2)に記載するリンカーペプチドを介して、抗体を結合させる工程を有する、(V-1)または(V-2)に記載する抗体修飾リポソームを調製する方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明が提供するリンカーペプチドによれば、任意に調製されたリポソームに簡単に抗体結合能を付与することができる。特に、従来法のように、あらかじめタンパク質との反応性を持たせたリン脂質などをリポソームに組み込むまでもなく、リポソームに当該リンカーペプチドを混合するだけで容易にリポソームに抗体結合能を付与することができる。【００１６】
また従来、リポソームに抗体を結合させる場合には、抗体はあらかじめ精製してリポソームに添加する必要があったが、本発明が提供する抗体結合性リポソームは、抗体、特にＩｇＧに対して特異的結合性を示すため、抗血清などの抗体を直接当該リポソームに添加するだけで、リポソームを抗体（ＩｇＧ）で簡単に修飾することが可能である。【００１７】
従来法では、架橋剤などを用いた化学反応により、抗体をリポソームに非特異的に結合させるため、抗体の失活が問題になることがあった。本発明の方法は、架橋剤を用いないため、こうした問題も回避することができる。【００１８】
さらに、本発明のリンカーペプチドにおいて、その抗体結合領域として使用するProtein Aの抗体結合ユニット（ドメインＢ）は、抗体分子のＦｃ領域のＣＨ２とＣＨ３の間のヒンジ領域に結合することが知られている（Current Opinion in Structural Biology 1995, 5:471-481）。このため、かかるリンカーペプチドを結合してなる本発明の抗体結合性リポソームは、抗体分子と上記所定部位を介して結合するため、抗体分子のどこにリポソームが結合するか制御不能であった従来方法の問題点を解消することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（１）抗体結合性リポソームおよびその調製方法
本発明が対象とする「抗体結合性リポソーム」は、抗体に対して結合能を有するリポソームである。【００２０】
ここで「抗体」としては、抗血清を挙げることができるが、より好ましくはＩｇＧである。なお、かかる抗体の由来は特に制限されず、本発明の抗体結合性リポソームは、任意の動物種に由来する抗体、特にＩｇＧに対して結合能を有している。【００２１】
本発明の抗体結合性リポソームは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「リンカーペプチド」という）で、表面が修飾されてなることを特徴とする。【００２２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるリンカーペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる抗体結合性ペプチドのＣ末端側に、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるリポソーム結合性ペプチドの２〜７５のアミノ酸領域が結合してなる融合ペプチドである。【００２３】
ここで配列番号２に示すリポソーム結合性ペプチドは、後述する実験例１に示すように、リポソームを形成する脂質２分子膜に自発的に移行する性質（移行性）を有するとともに、当該脂質２分子膜に所定の方向性をもって、突き刺さった状態で結合するという性質（結合性）を有することを特徴とする。【００２４】
なお、当該リポソーム結合性ペプチドは、配列番号２に記載する特定のアミノ酸配列を有するペプチドに限定されず、その機能的同等物であってもよい。ここで機能的同等物としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加してなるアミノ酸配列を有し、且つ上記のリポソーム（脂質２分子膜）への移行性と結合性を有するペプチドを挙げることができる。【００２５】
かかる機能的同等物として、より好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも１１〜５８および７０〜７３のアミノ酸領域を有するペプチドである。この理由として、配列番号２に示すアミノ酸配列の１番目のアミノ酸残基（Met）を除去して、ここに配列番号３に示すアミノ酸配列を結合しても、上記脂質２分子膜への移行性と結合性が損なわれないこと（実験例２参照）、また、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１〜１０のアミノ酸領域および５９〜６９のアミノ酸領域は、それぞれ上記機能とは無関係なMycタグ領域およびT7タグ領域に相当することを挙げることができる。【００２６】
また、後述する実験例１に示すように、リポソーム結合性ペプチド（配列番号２）は、Ｎ側領域を脂質２分子膜の表面に露出させた状態で、Ｃ側領域を脂質２分子膜に突き刺したかたちで結合する。このことから、配列番号２に示すアミノ酸配列のＣ末端のHisタグ領域がリポソーム（脂質２分子膜）への移行性と結合性に関与していることが示唆される。【００２７】
すなわち、本発明が対象とする、配列番号２に示すペプチドの機能的同等物には、前述するように、配列番号２中少なくとも１１〜５８および７０〜７３のアミノ酸領域を有するペプチドであって、リポソームへの移行性と結合性を有する限りにおいて、Ｎ末端側、１〜１０の領域または５９〜６９の領域に、任意のアミノ酸残基またはアミノ酸配列を有しているペプチド、ならびにこれらの領域の１乃至複数のアミノ酸が、欠失しているか、または他のアミノ酸で置換されてなるペプチドを含むことができる。【００２８】
なお、かかるペプチドのリポソーム結合性は、実験例１および２に記載する方法に従って測定し、評価することができる。【００２９】
当該リポソーム結合性ペプチドは、特異的に脂質２分子膜に移行し、かつ結合する特性を有することから、これ自体、例えば脂質２分子膜の鋭敏な検出ツールとして有用である。また抗体結合能を有するペプチドと融合させることで、リポソーム結合性と抗体結合性を兼ね備えたリンカーペプチドが容易に調製できるため、リンカーペプチドの調製ツール（調製材料）として有効に利用することができる。【００３０】
また配列番号３に示す抗体結合性ペプチドは、前述する抗体、好ましくはＩｇＧに対して結合能力を有することを特徴とする。【００３１】
当該配列番号３に示す抗体結合性ペプチドは、Protein Aの１つの抗体結合ユニット（ドメインＢ）に由来するものである。なお、当該抗体結合性ペプチドは、配列番号３に記載する特定のアミノ酸配列を有するペプチドに限定されず、その機能的同等物であってもよい。ここで機能的同等物としては、配列番号３に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加してなるアミノ酸配列を有し、且つ上記の抗体結合能を有するペプチドを挙げることができる。【００３２】
かかる機能的同等物として、より好ましくは、配列番号３に示すアミノ酸配列を有し、そのＣ末端に１乃至複数のアミノ酸配列を付加してなるペプチドを挙げることができる。その理由として、配列番号３に示すアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号２に示すリポソーム結合性ペプチドのアミノ酸配列のうち、２〜７３のアミノ酸領域を結合しても、抗体結合能が損なわれないこと（実験例３参照）を挙げることができる。すなわち、本発明が対象とする、配列番号３に示すペプチドの機能的同等物には、配列番号３で示すアミノ酸配列を有するペプチドであって、抗体結合能を有する限りにおいて、そのＣ末端に任意のアミノ酸残基またはアミノ酸配列が付加されてなるペプチドを含むことができる。【００３３】
また機能的同等物には、配列番号３に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失または置換してなるアミノ酸配列を有するペプチドも含まれる。この場合の機能的同等物として、好ましくは、配列番号３に示すアミノ酸配列と、アミノ酸配列において８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、上記の抗体結合性を有するペプチドを挙げることができる。【００３４】
なお、かかるペプチドの抗体結合性は、実験例３に記載する方法に従って測定し、評価することができる。【００３５】
こうしたことから、前述するリンカーペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに限定されることなく、前述するリポソーム結合性ペプチドおよび抗体結合性ペプチドのそれぞれに由来して、リポソーム結合性および抗体結合性を備えた機能的同等物も含まれる。【００３６】
かかる配列番号１に示すリンカーペプチドの機能的同等物には、前述する配列番号３に示す抗体結合性ペプチドのＣ末端領域に、前述する配列番号２に示すリポソーム結合性ペプチドの機能的同等物が融合してなるペプチド、ならびに前述する配列番号３に示す抗体結合性ペプチドの機能的同等物のＣ末端領域に、前述する配列番号２に示すリポソーム結合性ペプチドまたはその機能的同等物が融合してなるペプチドが含まれる。当該機能的同等物として好ましくは、上記「抗体結合性ペプチド」のアミノ酸配列として、配列番号３に示すアミノ酸配列を少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ「リポソーム結合性ペプチド」のアミノ酸配列として配列番号２中の少なくとも１１〜５８および７０〜７３のアミノ酸領域の配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列と、アミノ酸配列において、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上の同一性を有し、リポソーム結合性と抗体結合性を兼ね備えたペプチドを挙げることができる。【００３７】
かかるペプチドは、本発明で開示するアミノ酸配列に基づいて、慣用に従って科学的または遺伝子工学的手法によって製造することができる。またアミノ酸配列における改変は、当業界において既に公知な方法、例えば部位特異的変異導入法（Current Protocols I molecular Biology edit. Ausubel et al.,(1987) Publish, John Wily & Sons Section 8.1-8.5)等を用いて、改変しようとするアミノ酸配列に、適宜、置換、欠失、挿入、付加などの変異を導入することによって行うことができる。【００３８】
斯くして調製されるペプチドのリポソーム結合性は実験例１および２に記載する方法、および抗体結合性は実験例３に記載する方法に従って測定し、評価することができる。【００３９】
リポソームは、リン脂質２分子膜からなり、脂質の疎水性基と親水性基との極性に基づいて生ずる膜により外界から隔てられた空間を形成する構造を有する閉鎖小胞である。膜を隔てて閉鎖小胞内外の水相は、それぞれ内水相、外水相と称される。【００４０】
リポソームの膜基材であるリン脂質は、生体膜の主要構成成分であり、分子内に長鎖アルキル基から構成される疎水性基とリン酸基より構成される親水性基のグループを持つ両親媒性物質である。リン脂質は、上記構造のリポソームを形成しうるものであれば、天然または合成のいずれのものでも使用可能であり、たとえば、フォスファチジルコリン（レシチンと称することもある）、フォスファチジルエタノールアミン（略称ＰＥ）、フォスファチジン酸、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルグリセロール、さらにスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質、カルジオリピンなどの天然あるいは合成のリン脂質もしくはこれらの誘導体、糖類を結合させた誘導体（糖脂質）およびこれらの水素添加物（飽和リン脂質）などを挙げることができる。【００４１】
ここで飽和リン脂質の具体例として、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジン酸、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどの水素添加物が挙げられる。飽和リン脂質としては、特に、卵黄あるいは大豆に由来する飽和リン脂質であって、水素添加率が５０％以上のものが好ましい。【００４２】
膜基材のリン脂質として、上記の単一種を用いてもよく、複数種を用いてもよい。たとえば、フォスファチジルコリンとフォスファチジルグリセロールとの組み合わせ、または飽和リン脂質に、荷電性のフォスファチジン酸、フォスファチジルグリセロール、ジセチルフォスフェートなどを組み合わせて用いてもよい。【００４３】
リポソームは、そこに封入された薬物が、保存時にあるいは血液などの生体中で容易に漏出しないようにするため、相転移点が生体内温度（３５〜３７℃）より高い主膜材を用いることが好適である。さらに、このようなリポソームを製造する場合には、生体温度より高い温度に晒される場合がある。すなわち、５０℃〜７０℃程度、例えば６０℃前後の温度条件下で製造されることがあり、熱によるリポソーム形成に対する影響が大きくなるので、これらの温度より高い相転移点を持つ主膜材を用いることが特に好ましい。具体的には、主膜材の相転移点は５０℃以上であることが好ましい。【００４４】
また上記膜基材のリン脂質とともに、上記膜構造を保持しうるものであって、リポソームに含むことができる他の膜成分を、本発明の目的を損なわない範囲で適宜に併用することができる。他の膜成分としては、リン酸基を分子内に含まない脂質、たとえばグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロールおよびコレスタノール類などのステロール類、これらの水素添加誘導体、脂肪酸などを挙げることができる。【００４５】
リン脂質と他の脂質との混合脂質をリポソームの膜成分とすることも好ましく、たとえばリン脂質、コレステロールおよび脂肪酸の混合脂質を好ましく挙げることができる。混合比は、リポソームカプセル形態を損なわない範囲で適宜に選択することができる。これらをリン脂質と混合することで、上記リン脂質の相転移温度を下げることが可能であり、６０℃以下でもリポソームを形成することが可能となる。【００４６】
上記のようなリン脂質を含む脂質からリポソームを作製するには、これに限定されるものではないが、たとえばフラスコ内で、リン脂質等の膜構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後に真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に、当該フラスコ内に内水相溶液を加え、激しく撹拌することにより、リポソームの懸濁液を得る。【００４７】
リポソームの内水相のｐＨは、添加する内水相溶液を必要に応じｐＨ調整剤などで所望のｐＨに調整できる。次いで、得られたリポソーム分散液を遠心分離し、上清をデカンテーションし精製することにより、リポソームの懸濁液を得ることができる。【００４８】
またリポソームは、上記方法以外にも、上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる。この方法は、「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田、吉村ら；シュプリンガー・フェアラーク東京（1992））に具体的に記載されている。またリポソームを所望のサイズにサイジングするために、いくつかの技術が利用可能である（G.Gregoriadis編「Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques」2nd edition,Vol.Ｉ-III、CRC Press）。なお、これらの記載は、本明細書の一部として引用される。【００４９】
リポソームの大きさは特に限定されないが、球状またはそれに近い形態をとる場合の平均粒子外径の直径として１００〜３００ｎｍ、好ましくは２００ｎｍ程度を挙げることができる。この直径は、動的光散乱法などにより測定することができる。【００５０】
かかるリポソームは、内水相に薬物を含むものであってよい。リポソームに薬物を担持するには、薬物に応じた方法を採択すればよく、たとえば薬物を含む水溶液でリポソームを構成する脂質２分子膜を水和させることにより薬物をリポソームに担持させるPassive loading法、あるいはリポソーム膜の内側／外側に形成したイオン勾配に従いリポソーム膜を透過させて薬物を担持させるRemote loading法などがある。【００５１】
リポソームは、投与経路次第で医薬的に許容される安定化剤、酸化防止剤、他の添加物をさらに含むことができる。安定化剤としては、特に限定されないが膜流動性を低下させる物質が挙げられ、グリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。また、膜構成成分の他の脂質として上述したコレステロール（Cholesterol）などのステロールはこの安定化剤として作用する。酸化防止剤としては、特に限定されないがアスコルビン酸、尿酸あるいはα、β、γ、δトコフェロール同族体、たとえばビタミンＥなどが挙げられる。添加物として、水、生理食塩水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される界面活性剤、生体内で許容し得る生理的ｐＨの緩衝液などが挙げられる。上記の各成分は、適宜選択され、あるいはそれらを組合せて使用されるが、これらに限定されるものではない。【００５２】
本発明では、リポソーム内には、種々の薬物を担持させることができ、たとえば、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメデイエーターの遊離阻害剤、血管内皮細胞の増殖促進または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成阻害剤、ＡＧＥｓ（Advanced glycation endproducts）阻害剤、ラジカルスカベンチャー、タンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖および多糖およびそれらの誘導体等の治療薬、Ｘ線造影剤、超音波診断剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬などの体内診断薬が挙げられる。【００５３】
本発明の抗体結合性リポソームは、上記のように準備されたリポソームの懸濁液を、前述するリンカーペプチドと混合することによって調製することができる。すなわち、両者を混合することによって、上記リポソームに本発明のリンカーペプチドが結合し、本発明の抗体結合性リポソームを取得することができる。混合条件は特に制限されないが、好ましくは室温で３０分〜数時間程度、好ましくは１時間程度、混合状態で保持する方法を挙げることができる。より好ましくは２２℃程度で１時間〜数時間保持する方法である。【００５４】
リポソームに対するリンカーペプチドの混合割合は、特に制限されないが、リン脂質濃度として１.５重量％の割合でリポソームを含有するリポソーム懸濁液に対するリンカーペプチド濃度として、０．０１〜０．０５重量％、好ましくは０.０２５〜０.０５重量％を例示することができる。【００５５】
斯くして、リンカーペプチドは、少なくともその抗体結合性ペプチド領域をリポソームの外側に露出し、リポソーム結合性ペプチド領域をリポソームの脂質２分子膜に突き刺した状態（または貫通させた状態）でリポソームに結合し、斯くして本発明の抗体結合能を有するリポソーム（抗体結合性リポソーム）を得ることができる。【００５６】
（２）抗体修飾リポソームおよびその調製方法
本発明が対象とする「抗体修飾リポソーム」は、上記抗体結合性リポソームに抗体を付加してなるリポソームである。【００５７】
ここで「抗体」は、抗血清を挙げることができるが、より好ましくはIｇＧである。【００５８】
当該抗体修飾リポソームは、上記の抗体を、前述する抗体結合性リポソームと混合することによって調製することができる。すなわち、両者を混合することによって、上記抗体結合性リポソームに、リンカーペプチドを介して、上記の抗体が結合してなる本発明の抗体修飾リポソームを取得することができる。混合条件は特に制限されないが、好ましくは室温で３０分〜数時間程度、好ましくは１時間程度、混合状態で保持する方法を挙げることができる。より好ましくは２２℃程度で１時間〜数時間保持する方法である。なお、混合は塩濃度が１５０ｍＭ以下の条件で行うことが好ましい。【００５９】
抗体結合性リポソームに対する抗体の混合割合は、特に制限されないが、リン脂質濃度として１.５重量％の割合で抗体結合性リポソームを含有するリポソーム懸濁液に対する抗血清の濃度として、０．０１〜０．１重量％、好ましくは０.０５〜０.１重量％を例示することができる。【００６０】
斯くして、抗体、特にＩｇＧで標識された本発明の抗体修飾リポソームを調製することができる。【００６１】
当該抗体修飾リポソームは、抗体として目的組織や細胞へのターゲッティング機能を有する抗体を用いることで、ドラッグデリバリーシステム製剤（DDS製剤）として有用なアクティブターゲティング型リポソームとして調製され、ＤＤＳ製剤として提供することができる。当該アクティブターゲティング型リポソームを用いることによって、がん細胞への特異的な薬物送達、ならびに目的細胞への特的な所望抗原の送達が可能となる。また本発明の抗体修飾リポソームは、任意の抗体を用いて容易に調製することができるので、上記ＤＤＳ製剤（アクティブターゲティング型リポソーム）の構築などに際して、スクリーニングツールとして有効に利用することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例等に限定されるものではない。【００６３】
実験例１  リポソーム膜への移行性と結合性
本発明のリポソーム結合性ペプチドに相当する、配列番号２に示すペプチド（3L-DRペプチド）をリポソームと混合した後、タンパク質分解酵素を用いて消化実験を行った。なお、当該3L-DRペプチドは、１〜１０のアミノ酸領域にMycタグ領域を、５９〜６９のアミノ酸領域にT7タグ領域を有している。【００６４】
ここで、リポソームは、フォスファチジルコリン（PC）とフォスファチジルグリセロール（PG）を１:３（モル比）の割合で混ぜて、定法に従って、100 mMの硫酸ナトリウムを含むpH8.5の10 mM HEPES緩衝液中で調製した粒径200nm程度のものを使用した。なお、粒径は、0.4μmのポアサイズのポリカーボネートフィルターに通してサイジングを行うことで調整した。【００６５】
具体的には、リポソーム懸濁液に配列番号２に示すペプチド（3L-DRペプチド）を添加して、これを室温で１時間混合した。次いで、これにトリプシンを0.5 mg/mlになるように添加し、３７℃で３０分間保温した。一方、比較試験として、上記リポソームと3L-DRペプチドの混合液に、上記トリプシン0.5 mg/mlに加えて、界面活性剤であるTriton X-100を最終濃度が1％になるように添加し、同様に３７℃で３０分間保温した。【００６６】
斯くして得られた反応液を、トリプシン処理前の液（Trypsin(−)）とともに、電気泳動（10〜15％のアクリルアミドゲルを使用。移動相：25mM Tris, 250mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3）に供した結果を、図４Ｂに示す。なお、電気泳動には、試料に2 x loading buffer（100 mM Tris-Cl, pH6.8, 200 mM dithiothreitol, 4 % SDS, 0.2 % bromophenolblue, 20 % glycerol）を等量加えて調整したサンプルを供した。【００６７】
この結果からわかるように、トリプシン処理前の液（Trypsin(−)、TritonX-100(−)）では、Mycタグ領域を有する3L-DRペプチドが検出されたが、トリプシン処理後の液（Trypsin(＋)、TritonX-100(−)）では、3L-DRペプチドのMycタグは検出されず、T7タグ領域を有する幾分短いペプチドが観察された。これから、トリプシン処理によって3L-DRペプチドのMycタグ領域を含むＮ末端領域が消化されたことがわかる。このことは、3L-DRペプチドが、リポソームの脂質２分子膜の表面に単に吸着しているのではなく、Mycタグ領域をリポソーム表面に露出した状態で、リポソームの脂質２分子膜に貫通結合していることを示唆する。また、比較試験として、界面活性剤（Triton X-100）の存在下でトリプシン処理した場合は（Trypsin(＋)、TritonX-100(＋)）、3L-DRペプチドのMycタグおよびT7タグはいずれも検出されなかった。これは、界面活性剤（Triton X-100）存在下ではリポソームが破壊されてペプチドがむき出しになるため、トリプシン処理によって3L-DRペプチドが消化されたものと考えられる。【００６８】
以上のことから、3L-DRペプチド（配列番号２）は、図４Ａに示すように、Mycタグ領域（図中、「MycK」と示す。）含むＮ側領域をリポソーム表面に露出した状態で、リポソームの脂質２分子膜に貫通結合していると考えられる。【００６９】
実験例２    リポソームへの結合性
（１）被験ペプチドの調製
被験ペプチドとして、（a）Protein Aの１つの抗体結合ユニット（ドメインＢ）に由来する配列番号３に記載するアミノ酸配列のＣ末端にHisタグ（ASHHHHHH：配列番号４）を付加したペプチド（以下、「SPAペプチド」と称する。配列番号５）、ならびに（b）当該SPAペプチドからHisタグ領域を除いたペプチドのＣ末端に、3L-DRペプチド（配列番号２）の２〜７５領域を付加したペプチド（以下、「SPA-DRペプチド」という。配列番号６。分子量16kDa程度）を用いた。【００７０】
これらのペプチドは、それぞれの発現ベクターをpETベクターもしくはpColdベクターで調製したものを、大腸菌株BL21(DE3)に導入し、当該大腸菌をLB培地で培養して、IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid）を最終濃度が0.4mMになるように添加して発現誘導をかけることによって、調製取得した。【００７１】
（２）リポソームの調製
リポソームはフォスファチジルコリン（PC）とフォスファチジルグリセロール（PG）を１:３（モル比）の割合で混ぜて、定法に従って、100 mMの硫酸ナトリウムを含むpH8.5の10 mM HEPES緩衝液中で調製した。これを、0.4μmのポアサイズのポリカーボネートフィルターに通してサイジングを行い、粒径が200nm程度になるように調整した。【００７２】
（３）リポソームへの結合試験
上記で調製した0.2μmol相当のリポソームに、10〜20μgの各ペプチドを添加し、37℃で1時間保温した後、105,000ｘg、４℃で1時間遠心分離した。次いで、上澄（S）とリポソームを含む沈殿（P）とを分離し、それぞれの画分に含まれるペプチドを、抗Hisタグ抗体もしくは抗Mycタグ抗体を用いて、Western blottingによって検出した。【００７３】
（４）結果
Western blottingの結果を図５に示す。図５に示すように、リポソームを含む沈殿（P）画分には、SPA-DRペプチドだけが検出され、SPAペプチドは検出されなかった。このことから、Protein Aの１つの抗体結合ユニットに相当するSPAペプチドはリポソームに結合せず、これに3L-DRペプチドを融合させたSPA-DRペプチドのみがリポソームに結合することが判明した。この結果から、SPA-DRペプチドの3L-DR領域がリポソームに対する結合性を有しており、当該SPA-DRペプチドは、その3L-DR領域を介してリポソームと結合すると考えられた。【００７４】
実験例３  抗体との結合性
SPA-DRペプチドのSPA領域はProtein Aの抗体結合ユニットであり、抗体結合能を有している。このため、上記で調製されたSPA-DRペプチドを結合したリポソーム（SPA-DR結合リポソーム）に抗体結合能が確認できれば、SPA-DRペプチドは、3L-DR領域がリポソーム膜に挿入され、しかも抗体結合ユニットであるSPA領域がリポソーム表面に露出された状態で、リポソームと結合していると考えられる。【００７５】
これを確認するために、下記に説明するように、上記で調製したSPA-DR結合リポソームに、抗血清を添加し、IgGの結合がみられるかどうか実験を行った。【００７６】
（１）実験方法
具体的には、実験例２で調製した、SPA-DRペプチドの結合が認められたリポソームを含む沈殿（P）画分（図５のSPA-DRのPに相当）に、10μg相当の抗血清を添加し、25℃で1時間保温した後、105,000ｘg、4℃で1時間遠心分離した。また、対照試験として、実験例２で調製した、SPAを加えた後に遠心して得られたリポソームを含む沈殿（P）画分（図５のSPAのPに相当）に、上記と同様に10μg相当の抗血清を添加し、25℃で1時間保温した後、105,000ｘg、4℃で1時間遠心分離した。なお、抗血清として、ヒトの転写因子PGC1αの部分ペプチドで免疫したウサギの粗血清を用いた。次いで、遠心分離によって分離した各上澄（S）と沈殿（P）の画分に含まれるIgGとアルブミン（Alb）を、Western blottingにより検出した。【００７７】
（２）実験結果
結果を図６に示す。なお、図６中、左欄（SPA-DR bound）は、SPA-DRペプチドの結合が認められたリポソームを含む沈殿（P）画分に抗血清を添加したときの結果（上澄（S）と沈殿（P））を、右欄（control）は、SPAを加えた後に遠心して得られたリポソーム画分に抗血清を添加したときの結果（上澄（S）と沈殿（P））を、それぞれ示す。【００７８】
その結果、図６の左欄に示す通り、リポソームを含む沈殿（P）画分に添加した抗血清（IgG）は、上澄(S)画分に検出されなかったことから、すべてのIgGが沈殿(P)画分のリポソーム（SPA-DR結合リポソーム）に結合していることが判明した。また、当該沈殿(P)画分には、血清中のアルブミンはほとんど結合していないことから、観察されたIgGのSPA-DR結合リポソームへの結合は非特異的な結合ではないことが確認された。【００７９】
以上のことから、SPA-DRペプチドは、図３の模式図で示すように、リポソーム結合性ペプチドに相当する3L-DRペプチド領域がリポソーム膜に挿入され、一方、抗体結合性ペプチドに相当するSPAペプチド領域がリポソーム表面に露出した状態で、リポソームと結合することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】従来公知のリポソーム表面の抗体修飾の態様を示す模式図である。このリポソームは、架橋試薬の存在下、反応性をもったリン脂質と抗体分子を混ぜることにより調製される。図中、符号１は「反応性をもったリン脂質」、符号２は「抗体」、符号３は「架橋試薬」を意味する。
【図２】従来公知のProtein Aを用いたリポソーム表面の抗体修飾態様を示す模式図である。抗体結合能を有するProtein A（符号４）がリン脂質（符号１）に架橋された態様を有する。図の右下欄は、５つの抗体結合ドメイン（符号５）を有するProtein A（符号４）の模式図を示す。符号２は「抗体」を意味する。
【図３】本発明によるリポソーム表面の抗体修飾の態様を示す模式図である。図の右下欄は、本発明のリンカーペプチド（符号６）の模式図を示す。符号２は「抗体」を意味する。
【図４】実験例１で行った電気泳動の結果をＢに、この結果から予測されるリポソーム結合性ペプチドのリポソームへの結合態様を示す模式図をＡに示す。
【図５】実験例２で行ったWestern blottingの結果を示す。図中、「SPA」はproteinAの１つの抗体結合ユニットであるペプチド、「SPA-DR」は当該SPAのC末端に膜移行性ペプチドである3L-DRペプチドを結合させた融合ペプチドを意味する。「Ｓ」は上澄画分、「Ｐ」は沈殿画分を意味する。この結果は、SPAペプチドはリポソームに結合しないが、これに3L-DRペプチドを結合させた融合ペプチドはリポソームと結合することを示している。
【図６】実験例３で行ったWestern blottingの結果を示す。左欄（SPA-DR bound）は、リポソームを含む沈殿（P）画分に抗血清を添加した場合の結果（上澄（S）と沈殿（P））を、右欄（control）は、リポソームを含まない上澄（S）画分に抗血清を添加した場合の結果（上澄（S）と沈殿（P））を、それぞれ示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１は、リンカーペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、リポソーム結合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、抗体結合性ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、Hisタグ領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、実験例２で被験ペプチドとして使用したSPAペプチド（Protein Aの１つの抗体結合ユニット（ドメインＢ）に由来する配列番号３に記載するアミノ酸配列のＣ末端にHisタグ（配列番号４）を付加したペプチド）のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、実験例２で被験ペプチドとして使用したSPA-DRペプチド（SPAペプチドからHisタグ領域を除いたペプチドのＣ末端に、3L-DRペプチド（配列番号２）の２〜７３領域を付加したペプチド）のアミノ酸配列を示す。
【図１】
2009060710.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月25日(2009.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるリポソーム結合性ペプチド：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）上記（ａ）に記載する記載のアミノ酸配列において、少なくとも１１〜５８および７０〜７３のアミノ酸領域を保有することを条件に、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなり、且つリポソーム結合性とリポソーム膜への移行性を有するペプチドをコードするアミノ酸配列。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
下記（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列からなるリンカーペプチド：
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｆ）上記（ｅ）記載のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなり、且つリポソーム結合性および抗体結合性を有するペプチドをコードするアミノ酸配列。
【請求項４】
下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる抗体結合性ペプチドのＣ末端に、請求項１に記載するリポソーム結合性ペプチドが結合してなる、請求項３に記載するリンカーペプチド：
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
（ｄ）上記（ｃ）に記載する記載のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなり、且つ抗体結合能を有するペプチドをコードするアミノ酸配列。
【請求項５】
請求項３または４に記載するリンカーペプチドで修飾されてなる抗体結合性リポソーム。
【請求項６】
請求項３または４に記載するリンカーペプチドとリポソームとを混合することによって、リポソームに上記リンカーペプチドを結合させる工程を有する、請求項５記載の抗体結合性リポソームを調製する方法。
【請求項７】
請求項５に記載する抗体結合性リポソームに、請求項３または４に記載するリンカーペプチドを介して抗体が結合してなる、抗体修飾リポソーム。
【請求項８】
上記抗体がＩｇＧである請求項７に記載する抗体修飾リポソーム。
【請求項９】
請求項５に記載する抗体結合性リポソームと抗体とを混合することによって、当該リポソームに、請求項３または４に記載するリンカーペプチドを介して、抗体を結合させる工程を有する、請求項７または８に記載する抗体修飾リポソームを調製する方法。
【国際調査報告】
2009060710.tif 000009
2009060710.tif 000010
2009060710.tif 000011
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