(57)【要約】本発明は、健常人ボランティアや被験者に負担をかけることなく、ＡＤＣＣアッセイ用の均質なエフェクタ細胞を大量に得ること、及びこれを利用したＡＤＣＣアッセイ系を構築することを目的とする。本発明によれば、細胞表面にＦｃ受容体を発現した、継代培養可能なエフェクタ細胞株が樹立される。より具体的には、組換えウイルスベクタによりＦｃ受容体遺伝子が細胞の染色体に組み込まれた、ＮＫ細胞由来の細胞株が樹立される。
2009041113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面にヒトＦｃ受容体を発現した、ＮＫ細胞由来細胞株。
【請求項２】
前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃ-γ受容体である、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
前記Ｆｃ-γ受容体が、Ｆｃ-γＩＩＩａ（ＣＤ１６）によりコードされるものであり、その１５８番目のアミノ酸残基がバリンであるか（１５８Ｖ）、又はフェニルアラニンであり（１５８Ｆ）、前記ＮＫ細胞由来細胞株が、ＫＨＹＧ−１である、請求項２に記載の細胞株。
【請求項４】
（ｉ）ヒトＦｃ受容体をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクタを調製する工程；
（ｉｉ）上記工程（ｉ）により調製した組換えベクタでＮＫ細胞由来細胞株を形質転換する工程；及び
（ｉｉｉ）形質転換済細胞株を培養し、細胞表面におけるＦｃ受容体の発現の有無に基づき、Ｆｃ受容体を発現した細胞株を選択・分離する工程；
を含む、Ｆｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株の作製方法。
【請求項５】
前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃ-γＩＩＩａ（ＣＤ１６）によりコードされるものであり、前記ベクタが、レトロウイルスベクタであり、前記ＮＫ細胞由来細胞株が、ＫＨＹＧ−１である、請求項４に記載のＦｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株の作製方法。
【請求項６】
（ａ）標的細胞に、これを認識するヒト抗体、ヒト化抗体、及びヒトキメラ抗体からなる群より選択される抗体を接触する工程；
（ｂ）請求項１乃至３の何れか一項に記載の細胞株を、前記抗体に接触する工程；
（ｃ）前記標的細胞に細胞障害が生じているか否かを検出する工程；
を含む、抗体依存性細胞障害のアッセイ方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）を、顕微鏡観察法、乳糖脱水素酵素（ＬＤＨ）法、フローサイトメトリー計測法、比色法、蛍光法、及びＣｒ法からなる群より選択される方法により行う、請求項６に記載のアッセイ方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）における前記標的細胞、及び前記抗体が、Ｂリンパ腫患者のリンパ腫組織由来の細胞及びリツキシマブ（ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体）；乳がん患者のＨｅｒ２陽性細胞及びトラスツマブ；又はＥＧＦＲ陽性細胞及びセツキシマブである、請求項６に記載のアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Fc受容体遺伝子を導入したＮＫ細胞、その作製方法、及びこれを用いた抗体依存性細胞障害のアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体には、高い結合活性、結合特異性、及び血中での安定性が備わっている。そのため、これらの特徴を生かしてヒトの各種疾患の診断・予防・治療へ応用することが可能である。中でも遺伝子組み替え技術を利用したキメラ抗体やヒト化抗体の中には、目覚しい治療効果があがっているものもあり、これらの抗体を利用する抗体医薬の研究・開発が近年注目されている。【０００３】
抗体医薬の作用機序としては、シグナリングによる増殖抑制やアポトーシス誘導、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）等が挙げられる。この中のＡＤＣＣとは、抗体が結合した標的細胞（癌細胞等）に対して、当該抗体を介してエフェクタ細胞（ＮＫ細胞、単球等）が作用し、標的細胞を貪食やパーフォリンやグランザイムＢなどで攻撃することによって、当該標的細胞を破壊する現象である。このＡＤＣＣを利用したアッセイにおいて使われるエフェクタ細胞は、通常、健常人ボランティア又は被験者から採取したものである（非特許文献１等）。
【非特許文献１】Clin. Cancer Res., 13(5) March 1, 2007
【非特許文献２】Exp. Hematol., 33(10), pp.1160-71, Oct. 2005
【非特許文献３】Blood, 90(3), pp.1109-14, Aug. 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のようにＡＤＣＣアッセイ用のエフェクタ細胞は、健常人ボランティア又は被験者からの末梢血採血により入手することができる。しかしながらこの場合、末梢血を採取した後に単核球フラクションを分離するために比重遠心を行い、更にそのフラクションからエフェクタ細胞のみを選別するために、エフェクタ細胞表面に発現している特定の表面抗原に対する抗体を固定した磁気ビーズを利用した分離を行う等の、煩雑で時間の要する精製工程を経る必要がある。【０００５】
このように入手に手間のかかるエフェクタ細胞はそもそも、その活性において提供者毎に大きく異なっており、たとえ同一人から採取したものであっても、採取時期によりその活性に差異が存在していることも多い。また、提供者からの採血量そのものに限界があるため、分離されるエフェクタ細胞の量も、当然に少量となるという本質的な問題が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
斯かる事情に鑑みて、本願発明は、ＡＤＣＣアッセイに用いることが可能な均質なエフェクタ細胞を大量に調製し、これを当該アッセイに使用することを目的とし、下記のような構成をとる。
即ち、本発明の細胞株は、
（１）細胞表面にヒトＦｃ受容体を発現した、ＮＫ細胞由来細胞株；
（２）前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃ-γ受容体である、上記（１）に記載の細胞株；及び
（３）前記Ｆｃ-γ受容体が、Ｆｃ-γＩＩＩａ（ＣＤ１６）によりコードされるものであり、その１５８番目のアミノ酸残基がバリンであるか（１５８Ｖ）、又はフェニルアラニンであり（１５８Ｆ）、前記ＮＫ細胞由来細胞株が、ＫＨＹＧ−１である、上記（２）に記載の細胞株；
である。【０００７】
本発明のＦｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株の作製方法は、
（４）  （ｉ）ヒトＦｃ受容体をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクタを調製する工程；
（ｉｉ）上記工程（ｉ）により調製した組換えベクタでＮＫ細胞由来細胞株を形質転換する工程；及び
（ｉｉｉ）形質転換済細胞株を培養し、細胞表面におけるＦｃ受容体の発現の有無に基づき、Ｆｃ受容体を発現した細胞株を選択・分離する工程；
を含む、Ｆｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株の作製方法；並びに
（５）前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃ-γＩＩＩａ（ＣＤ１６）によりコードされるものであり、前記ベクタが、レトロウイルスベクタであり、前記ＮＫ細胞由来細胞株が、ＫＨＹＧ−１である、上記（４）に記載のＦｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株の作製方法；
である。【０００８】
本発明の抗体依存性細胞障害のアッセイ方法は、
（６）（ａ）標的細胞に、これを認識するヒト抗体、ヒト化抗体、及びヒトキメラ抗体からなる群より選択される抗体を接触する工程；
（ｂ）上記（１）乃至（３）の何れか一つに記載の細胞株を、前記抗体に接触する工程；及び
（ｃ）前記標的細胞に細胞障害が生じているか否かを検出する工程；
を含む、抗体依存性細胞障害のアッセイ方法； 
（７）前記工程（ｃ）を、顕微鏡観察法、乳糖脱水素酵素（ＬＤＨ）法、フローサイトメトリー計測法、比色法、蛍光法、及びＣｒ法からなる群より選択される方法により行う、前記（６）に記載のアッセイ方法；並びに
（８）前記工程（ａ）における前記標的細胞、及び前記抗体が、Ｂリンパ腫患者のリンパ腫組織由来の細胞及びリツキシマブ（ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体）；乳がん患者のＨｅｒ２陽性細胞及びトラスツマブ；又はＥＧＦＲ陽性細胞及びセツキシマブである、前記（６）に記載のアッセイ方法；
である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は上記構成をとるため、下記の効果を発揮することができる。即ち、
・健常人ボランティアや被験者からの末梢血の採血に依存することなく、アッセイに用いることが可能なエフェクタ細胞を大量に調製することが可能である；
・細胞株の培養物を用いてアッセイを行うことができるため、煩雑で時間のかかるエフェクタ細胞精製工程を経る必要がない；
・株化した細胞を大量に調製することができるため、エフェクタ細胞の活性を均一とすることができ、アッセイを安定して行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】この図は、実施例１の結果を示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の細胞株は、細胞表面にヒトＦｃ受容体を発現した、ＮＫ細胞由来細胞株であるが、具体的には当該Ｆｃ受容体はＦｃ-γ受容体である。当該Ｆｃ-γ受容体は、具体的にはＦｃ-γＩＩＩａ（ＣＤ１６）によりコードされるものであり、その１５８番目のアミノ酸残基がバリンであるか（１５８Ｖ）、又はフェニルアラニンである（１５８Ｆ）。より具体的には当該細胞株は、本発明のＦｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株の作製方法により、ＫＨＹＧ-１を使って作製される細胞株である。
以下、本発明の、Ｆｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株の作製方法について説明する。【００１２】
本発明のＦｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株は、
（ｉ）ヒトＦｃ受容体をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクタを調製する工程；
（ｉｉ）上記工程（ｉ）により調製した組換えベクタでＮＫ細胞由来細胞株を形質転換する工程；及び
（ｉｉｉ）形質転換済細胞株を培養し、細胞表面におけるＦｃ受容体の発現の有無に基づき、Ｆｃ受容体を発現した細胞株を選択・分離する工程；
を含む方法により作製することができる。【００１３】
まず、工程（ｉ）においては、ヒトＦｃ受容体をコードする遺伝子を組換えベクタに組み込んだものを調製する。ここでヒトＦｃ受容体としてはそのｃＤＮＡ配列がデータベース（例：ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information））に報告されているものを用いることができ、具体的にはヒトＦｃ-γ受容体を挙げることができる。このヒトＦｃ-γ受容体には、異なるＡＤＣＣ活性と関連付けられた多型が存在しており（非特許文献３）、これらをそれぞれコードする遺伝子を利用することができる。この多型は、Ｆｃ-γ受容体の１５８番目のアミノ酸残基がバリンである１５８Ｖと、フェニルアラニンである１５８Ｆとからなる。
例えばヒト末梢血から分離した単球フラクションより抽出したｍＲＮＡをもとに、市販の逆転写酵素を利用してｃＤＮＡを調製しておき、Ｆｃ受容体についての既知のｃＤＮＡ配列情報に基づきプライマを設計し、これらをＰＣＲにかけて全長ヒトＦｃ受容体遺伝子をコードするＤＮＡの調製を行う。工程（ｉ）のこの部分については、市販のＲＴ-ＰＣＲキット等を使って行うことができる。尚、ヒトＦｃ-γ受容体の多型のそれぞれについてのＤＮＡを調製する方法については、下記の調製例に記載する。【００１４】
工程（ｉ）における組換えベクタとしては、当該技術分野において知られるものを使用することができる。当該ベクタはゲノムに確実にインジェクションでき、細胞内においてヒトＦｃ受容体遺伝子を安定して発現することができるよう、細胞のゲノムに組み込まれるタイプのものを使用することが好ましい。好ましくは組換えレトロウイルスベクタを挙げることができる。以下においては組換えレトロウイルスベクタを利用する場合に則して説明する。なお、本発明の実施にあたっては、組換え（ウイルス）ベクタの代わりに、エレクトロポレーションやリポフェクションなどの他の形質転換方法による遺伝子の直接的導入方法を採用することも可能である。【００１５】
上述のように調製したヒトＦｃ受容体遺伝子のＤＮＡを、組換えウイルスベクタに導入する。ウイルスベクタへの遺伝子導入に当たっては、まず、ウイルスベクタ作製用のプラスミドベクタ（例：Takara社製、pDON-AI）に当該遺伝子を導入したものを調製する。より具体的には、当該プラスミドベクタの導入部位と共通する制限酵素認識配列を、Ｆｃ受容体遺伝子のコード領域の上流と下流をそれぞれ認識するプライマに入れておき、当該制限酵素でそれぞれ消化したＦｃ受容体遺伝子とプラスミドベクタを連結してからこれを増幅させ、ついで、この増幅したプラスミドベクタを市販のレトロウイルスパッケージングキット等（例：Takara社製、Retrovirus Packaging Kit）とともに利用することにより、遺伝子が発現するよう構成された組換えレトロウイルスを調製することができる。【００１６】
次に、上記工程（ｉ）により調製したウイルスベクタをＮＫ細胞由来細胞株にインフェクションする、工程（ｉｉ）を行う。継代培養が可能な細胞株として樹立されているＮＫ細胞には種々のものがあるが、例えば細胞障害活性が高いことが非特許文献２に報告され、入手が可能であるＫＨＹＧ-１株を利用することができる。このＫＨＴＧ-１株は、ＮＫ細胞由来の細胞株であり、培養により大量に調製することが可能であるが、ＡＤＣＣに必要なヒトＦｃ受容体の発現が停止してしまっている。そこで本発明の方法により、ＡＤＣＣアッセイに利用可能な細胞株を作製する。本発明で使用するＮＫ細胞由来細胞株としては上記のＫＨＹＧ-１が好ましいが、これ以外のＮＫ細胞由来細胞株も使用することができる。具体的には、ＮＫ−９２、ＹＴ等を挙げることができる。
本発明においては、このような細胞株以外にも、ＡＤＣＣ能とＦｃ受容体とを持つ、ヒト由来のＮＫ細胞、単核球、マクロファージを人工的に不死化し、これを株化したものも用いることができる。また、これらの細胞について細胞腫が入手できる場合には、それを利用することも可能である。【００１７】
次に、インフェクション済細胞株を培養し、細胞表面におけるＦｃ受容体の発現の有無に基づき、Ｆｃ受容体を発現した細胞株を選択・分離する工程（ｉｉｉ）を行う。インフェクション済細胞株の培養は、選択したＮＫ細胞由来細胞株の増殖、維持に適した培養液で行う。また、Ｆｃ受容体の発現の有無に基づく細胞株の選択・分離は、例えば当該Ｆｃ受容体を認識する抗Ｆｃ受容体抗体を固定化した磁気ビーズを使った方法により行うことができる。
また、例えば、限界希釈法やメチルセルロースによる検鏡下で細胞株のクローニングを行なったものを更に培養して、これをエフェクタ細胞として用いることも可能である。【００１８】
上記のように調製した本発明のＦｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株は、抗体依存性細胞障害のアッセイに有効に利用することができる。即ち本発明の抗体依存性細胞障害のアッセイ方法は、
（ａ）標的細胞に、これを認識するヒト抗体、ヒト化抗体、及びヒトキメラ抗体からなる群より選択される抗体を接触する工程；
（ｂ）上記（１）乃至（３）の何れか一つに記載の細胞株を、前記抗体に接触する工程；
（ｃ）前記標的細胞に細胞障害が生じているか否かを検出する工程；
を含むものである。【００１９】
本アッセイ方法において使用する標的細胞としては、抗体医薬による治療を行おうとしている患者に由来する細胞、具体的には、患者の患部から外科的方法により採取したものや、白血化した細胞を対象とする場合には末梢血からの採血により採取したものを挙げることができる。これに併せて、適宜、陽性対照及び/又は陰性対照となる細胞を準備することが望ましい。【００２０】
本アッセイにおいて使用する標的細胞の具体例としては、ＣＤ２０陽性細胞、Ｂ細胞性リンパ腫、より具体的には前駆Ｂリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾片縁帯Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞腫瘍、節外製濾胞辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節製濾胞辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫などの疾患を有する患者より採取したリンパ腫組織由来の細胞を挙げることができる。【００２１】
本アッセイの工程（ａ）において使用することが可能な抗体は、標的細胞表面の抗原を認識することが可能な抗体であり、抗体医薬として患者に投与することを予定しているものが好ましい。具体例としては、Ｂ細胞性リンパ腫に対するリツキシマブや、イブリツモマブ、乳がんＨｅｒ２陽性細胞に対するトラスツマブ、ＥＧＦＲ陽性細胞に対するセツキシマブ等が挙げられる。【００２２】
工程（ａ）においては、標的細胞に上記抗体を接触して両者を結合させる。この段階で結合がうまく生じない場合には、接触する条件を変更することが考えられるが、それでも結合が生じない場合、当該抗体は当該標的細胞を採取した患者の治療に向かないことを示唆する。したがって、本発明のアッセイ方法は、抗体医薬の治療有効性評価に効果的に用いることが可能である。【００２３】
次に、本発明のＦｃ受容体発現-ＮＫ細胞由来細胞株の何れかを、上記工程（ａ）を終了した抗体-標的細胞の組み合わせに接触させる工程（ｂ）を行う。工程（ａ）において標的細胞と抗体との結合が生じている場合、当該細胞株はその表面に発現しているＦｃ受容体を介して当該抗体に結合する。そしてこの結合に依存して、ＡＤＣＣが生じて細胞障害が発生する。工程（ｂ）にかける時間は、ＡＤＣＣが十分に発生する時間とするため、通常は、１〜４８時間の範囲とすることができる。より好ましくは２〜１２時間である。【００２４】
工程（ｂ）において十分な時間培養した後、ＡＤＣＣが発生したか否かを検出する工程（ｃ）を行う。この工程において使用することができる手法としては、当該技術分野で知られるものであって、ＡＤＣＣアッセイに使用することが可能なものを挙げることができる。具体的には、顕微鏡観察法、乳糖脱水素酵素（ＬＤＨ）法、フローサイトメトリー法、比色法、蛍光法、Ｃｒ法等の、生細胞と死細胞とを有意に識別する手法である。【００２５】
顕微鏡観察法を採用する場合、死細胞が標的細胞であるかエフェクタ細胞であるかを区別するため、標的細胞若しくはエフェクタ細胞のいずれか、又は両方を標識してそれぞれを蛍光顕微鏡等を用いた観察において識別できるように処理しておくことが望ましい。具体的にはＮＫ細胞マーカとしてよく利用されている抗ＣＤ５６抗体を利用してエフェクタ細胞を標識し、標的細胞がＣＤ５６陰性であることを前提とすること等が望ましい。
他には、ＰＫＨ(シグマ社製)、ＤｉＯ Ｃ６(インビトロジェン社製)、Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl ester(CFDA)(インビトロジェン社製)など、細胞膜染色蛍光試薬によって標的細胞若しくはエフェクタ細胞、又はその両方を接触させる前に染色しておく方法も可能である。更には標的細胞に特有の表面抗原を染色するか、又は標的細胞に接触させる抗体そのものを蛍光標識しておいて使用する方法も可能である。
このように標識（染色）を行うことで、観察・カウントされる生細胞、死細胞の数から、エフェクタ細胞の数を差し引くことが容易になり、アッセイ結果の正確性を向上させることが可能である。【００２６】
工程（ｃ）においてフローサイトメトリー法を採用する場合、上記顕微鏡観察法の欄に記載したように、標的細胞若しくはエフェクタ細胞のいずれか、又は両方を標識しておき、これをフローサイトメータ（ＦＣＭ）にかけて測定することができる。また、工程（ｃ）においてＬＤＨ法を採用する場合、例えばＰｒｏｍｅｇａ社製のＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（登録商標）を用いて検出を行うことが可能である。【００２７】
本発明のアッセイ方法は、特に抗体医薬の投与を予定している疾患、例えば癌、腫瘍に当該医薬が十分に効果を発揮するか否かを確認することを目的とした場合などに有効に用いることができる。本方法において使用できる標的細胞と抗体との組合せは、このような目的に添ったものであれば特に限定されないが、標的細胞としてはＣＤ２０陽性細胞、Ｂ細胞性リンパ腫、より具体的には前駆Ｂリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾片縁帯Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞腫瘍、節外製濾胞辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節製濾胞辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫などの疾患を有する患者より採取したリンパ腫組織由来の細胞を挙げることができる。一方の抗体は、これらの腫瘍に特異的に発現している抗原を認識することができる抗体を挙げることができる。
組合せの具体例としては、Ｂ細胞性リンパ腫に対するリツキシマブや、イブリツモマブ、乳がんに対するトラスツマブ（抗Her2抗体医薬）、ＥＧＦＲ陽性細胞(適応は大腸がん)に対するセツキシマブ等が挙げられる。【００２８】
以下においては、Ｆｃ-γ受容体遺伝子を発現するウイルスベクタの作製、及びこれを利用したＦｃ-γ受容体遺伝子発現-ＮＫ細胞由来細胞株の調製について、具体的な調製例、実施例を挙げて説明する。【００２９】
（調製例）Ｆｃ-γ受容体多型遺伝子のクローニング
健常人ボランティアから末梢血を採血し、ヒストパックを用いて末梢血から単球を分離した。市販のＲＮＡ抽出キット（キアゲン社製RNAeasy micro等）を使用して単球からRNAを抽出した。市販の逆転写酵素（Takara社製M-MLV RTase）を使用して、前記抽出済みのRNAからｃDNAを合成した。逆転写反応の際のプライマとしては、ランダム６ｍｅｒを利用した。【００３０】
Ｆｃ-γ受容体の多型（１５８Ｖ及び１５８Ｆ）をそれぞれ独立にクローニングするため、当該受容体遺伝子の多型部分を挟んだ５’側領域と、３’側領域とをそれぞれ別個に第1のＰＣＲで増幅し、各増幅物の混合物を、当該多型部分でアニーリングしたものを鋳型として第２のＰＣＲ増幅を行った。第１のＰＣＲにおいては、配列番号１乃至６のプライマを使用した。第２のＰＣＲは、アニーリングした多型部分をプライマとして機能させた。配列番号１はＦｃ-γ受容体遺伝子のフォワードプライマであって、その５’末端側にＢａｍＨＩ認識配列を持つものである。配列番号２はＦｃ受容体遺伝子のリバースプライマであって、その５’末端にＮｏｔＩ認識配列を持つものである。配列番号３は１５８Ｆの多型部分をフォワードプライマである。配列番号４は１５８Ｆのリバースプライマである。配列番号５は１５８Ｖのフォワードプライマである。配列番号６は１５８Ｖのリバースプライマである。【００３１】
配列番号１と配列番号４のプライマの組合せ、及び配列番号２と配列番号３のプライマの組み合わせにより、１５８Ｆの５’領域と３’領域とを第１のＰＣＲで増幅した。配列番号１と配列番号６のプライマの組合せ、及び配列番号２と配列番号５のプライマの組合せにより１５８Ｖの５’領域と３’領域とを第１のＰＣＲで増幅した。増幅産物をそれぞれゲル電気泳動により分離し、ゲルの切り出しによりＤＮＡを抽出、精製した。【００３２】
ついで、１５８Ｆの５’領域の増幅産物と、３’領域の増幅産物とを混合してアニーリングし、第２のＰＣＲを行い、８７７ｂｐのＦｃ-γ（１５８Ｆ）を調製した。一方、１５８Ｖの５’領域の増幅産物と、３’領域の増幅産物とを混合してアニーリングし、第２のＰＣＲを行い、８７７ｂｐのＦｃ-γ（１５８Ｖ）も調製した。そしてこの調製物をゲル電気泳動により分離し、ゲルの切り出しによりＦｃ-γ受容体をコードする二つの多型ＤＮＡ片を調製した。【００３３】
調製した多型ＤＮＡ片のそれぞれを、ＢａｍＨＩで消化した。当該ＤＮＡ片の３’末端は、制限酵素消化を行うことなく、平滑末端とした。適宜制限酵素処理したこのＤＮＡ片のそれぞれを、ＢａｍＨＩ、及びＨｐｎＩで処理したベクタ、ｐＤＯＮ-ＡＩ（Takara社製）に連結した。このベクタをコンピテント大腸菌にトランスフェクションし、アンピシリンを含有したプレートでベクタを含有した大腸菌株を培養した。 【００３４】
この大腸菌から、Ｆｃ-γ受容体遺伝子を導入したｐＤＯＮ-ＡＩを、市販のレトロウイルスパッケージングキット（Takara社製 Retrovirus Packaging Kit）を使用して組換えレトロウイルス構築に用いた。具体的にはキット内に提供される、ｇａｇ及びｐｏｌをコードするプラスミド、並びにｅｎｖをコードするプラスミドと共に、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞へコ・トランスフェクションし、当該細胞を培養して組換えウイルス粒子を産生させた。
【実施例１】
【００３５】
（乳酸脱水素酵素法を利用したＡＤＣＣアッセイ）
方法：
標的細胞にはバーキットリンパ腫（ＣＤ２０陽性リンパ腫）細胞株であるＲａｊｉ細胞を、抗体にはリツキシマブ（抗ＣＤ２０マウス-ヒトキメラ抗体）を、エフェクタ細胞としてはＦｃ-γ受容体ＩＩＩａ遺伝子（１５８Ｖ及び１５８Ｆ）を導入したＫＨＹＧ-１細胞株を利用して実験を行った。
Ｒａｊｉ細胞は、１０％ＦＣＳ及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ-２を含有するＲＰＭＩ培地で培養し、１．２５×１０６細胞／ｍｌの濃度で９６穴プレートの１ウェル当たり４０μｌで使用した。エフェクタ細胞も同様の条件で培養及び使用を行った。リツキシマブ（中外製薬社製リツキサン、１０ｍｇ／ｍｌ）は、１０％ＦＣＳ及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ-２を含有するＲＰＭＩ培地で５×濃度で調製し（最終濃度は、０ｎｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ）、９６穴プレートの１ウェル当たり２０μｌで使用した。エフェクタ細胞：標的細胞の比率を０：１〜１：１の間で４段階とし、エフェクタ細胞の作用時間を４時間とし、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で静置した。測定は、Promega社製キット、CytoTox-ONE(登録商標)を使い、キットに付属の説明書に添って行った。測定結果を図１に示す。図１中Mockは、Fc-γ受容体を導入していないNK細胞腫由来細胞株KHYG-1を利用したときの結果を表す。FcγRIIIa（158V）及びFcγRIIIa（158F）は、それぞれFc−γ受容体の多型（158V及び158F）をそれぞれ発現させたKHYG-1細胞株を利用したときの結果を表す。
乳酸脱水素酵素法は細胞の生死に由来する物質の細胞膜透過性を利用した方法であるが、同様の方法としてヨウ化プロピディウム等核酸染色色素による蛍光測定、トリパンブルー等による比色方法などがある。両者とも生細胞の細胞膜は透過できないため染色されないが、細胞死が誘導された後には細胞膜の透過性が高くなり、色素が容易に細胞内に浸透する。前者では、核酸が赤く蛍光を発し、後者では細胞質が青色に染色されることによって定量的に死細胞を計測することができる。【００３６】
結果：
図１より明らかなとおり、１５８Ｖの方が、１５８ＦよりもＡＤＣＣ活性が高く、１５８Ｖを用いた場合のエフェクタ細胞：標的細胞  の比率は、０．１：１以上の場合にＡＤＣＣによる効果において有意な差異が生じた。
【実施例２】
【００３７】
方法及び結果：
標的細胞を１×１０５細胞／ｍｌの濃度で１２穴プレートを用いて培養し、ＡＤＣＣの測定方法をフローサイトメトリーにより行うこと以外は実施例１と同様にして実験を行った。フローサイトメトリーを使用する場合、標的細胞をカウントしているのか、エフェクタ細胞をカウントしているのかがそのままでは不明である。このため、標的細胞とエフェクタ細胞を分けてカウントできるように、エフェクタ細胞に対して、ＮＫ細胞表面に発現しているＣＤ５６を抗ＣＤ５６抗体で染色した。染色は、標的細胞とエフェクタ細胞との混合培養後に細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳにより適宜洗浄し、氷上でＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５６抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製  カタログ＃３４０４１０）に接触させ、５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピディウムを加えて１５分間、インキュベートして行った。その後フローサイトメトリーで、生きている標的細胞と、死んでいる標的細胞と、エフェクタ細胞をカウントし、死んでいる標的細胞の数を標的細胞の全カウント数（生細胞+死細胞）で割って、ＡＤＣＣ活性を示す数値を算出した。結果は、実施例１と同様の傾向を示すものであった（図示せず）。
【実施例３】
【００３８】
方法：
ＡＤＣＣの測定方法を顕微鏡観察法により行い、ＮＫ細胞の染色の代わりにリツキシマブをAlexa Fluor488で標識すること以外は実施例１及び２と同様にして実験を行った。
市販のリツキシマブは、濃度が薄く、また界面活性剤を含んでいるため、標識化前に、透析又は限外ろ過による濃縮精製を行った。透析には、Pierce社製製品番号66810のSlide-A-Lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength) 10,000 MWCO 3-12ml Capacityを使用した。限外ろ過を行う場合には、リツキシマブをMicrocon YM-30(Millipore社製 ＃42409)に分注し、キットに添付されているプロトコールに従い２５℃の条件下14,000gで12分間遠心し、リツキシマブを濃縮・精製して２ｍｇ／ｍｌ以上の濃度とした。
上記のように濃縮精製を行ったリツキシマブ１ｍｇを、Molecular Probes Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit (Invitrogen社製 ＃A10237)の添付プロトコールに従い、Alexa Fluor 488(A488)で標識した。
ＡＤＣＣの測定は、レーザー共焦点顕微鏡FV1000(オリンパス社製)にステージインキュベータ(オリンパス社製  MI-IBC)を設置し、当該ステージ上で３７℃、５％ＣＯ２で培養できる環境を作成して行った。ステージインキュベータ上にグラスボトムディッシュ(松浪硝子工業社製  D110300)など)設置し、必要に応じてシリコン製のマイクロウェルを設置して培養を行った。
結果は、実施例１及び２と同様の傾向を示すものであった（図示せず）。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば、表面にＦｃ受容体を発現し、継代培養が可能なＮＫ細胞由来の細胞株が得られるので、ＡＤＣＣアッセイにおいて用いることができるエフェクタ細胞を、ボランティアや被験者の負担を増大することなく行うことが可能である。 
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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