(57)【要約】【課題】本発明は金−酸化鉄複合ナノ粒子を用いたペプチドの合成方法に関し、特に、磁力でスクリーニング可能な複合ナノ粒子−ペプチド複合体および該複合ナノ粒子−ペプチド複合体から構成されるペプチドライブラリーの有利な合成方法に関する。【解決手段】本発明のペプチドの合成方法は、金−酸化鉄複合ナノ粒子における金の表面にリンカー分子を吸着させる工程とペプチド固層合成を用いてリンカー分子にペプチドを合成する工程とを有するものである。また、本発明のペプチドライブラリーの合成方法は、金−酸化鉄複合ナノ粒子における金の表面にリンカー分子を吸着させる工程とスプリット合成を用いてリンカー分子にペプチドを合成する工程とを有するものである。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金−酸化鉄複合ナノ粒子を固体支持体としたペプチドの合成方法であって、
前記金−酸化鉄複合ナノ粒子における金の表面にリンカー分子を吸着させる工程と、
ペプチド固層合成を用いて前記リンカー分子にペプチドを合成する工程と、
を有するペプチドの合成方法。
【請求項２】
前記金−酸化鉄複合ナノ粒子が磁性酸化鉄からなる核粒子と前記磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなり、
前記核粒子の平均粒子径が１０
〜 ３００ ｎｍであり、
前記金粒子の平均粒子径が１ 〜 ２０ ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のペプチドの合成方法。
【請求項３】
前記リンカー分子が硫黄とアミノ基とを有する分子であることを特徴とする請求項１〜２いずれか１項に記載のペプチドの合成方法。
【請求項４】
前記リンカー分子がチオール基とアミノ基とを有する分子であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項に記載のペプチドの合成方法。
【請求項５】
前記リンカー分子がシステインであることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項に記載のペプチドの合成方法。
【請求項６】
金−酸化鉄複合ナノ粒子の金の表面にリンカー分子が吸着し、
前記リンカー分子にペプチドが結合していることを特徴とする複合ナノ粒子−ペプチド複合体。
【請求項７】
前記金−酸化鉄複合ナノ粒子が磁性酸化鉄からなる核粒子と前記磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなり、
前記核粒子の平均粒子径が１０
〜 ３００ ｎｍであり、
前記金粒子の平均粒子径が１ 〜 ２０ ｎｍであることを特徴とする請求項６に記載の複合ナノ粒子−ペプチド複合体。
【請求項８】
前記リンカー分子が硫黄とアミノ基とを有する分子であることを特徴とする請求項６〜７いずれか１項に記載の複合ナノ粒子−ペプチド複合体。
【請求項９】
前記リンカー分子がチオール基とアミノ基とを有する分子であることを特徴とする請求項６〜８いずれか１項に記載の複合ナノ粒子−ペプチド複合体。
【請求項１０】
前記リンカー分子がシステインであることを特徴とする請求項６〜９いずれか１項に記載の複合ナノ粒子−ペプチド複合体。
【請求項１１】
金−酸化鉄複合ナノ粒子を固体支持体としたペプチドライブラリーの合成方法であって、
前記金−酸化鉄複合ナノ粒子における金の表面にリンカー分子を吸着させる工程と、
スプリット合成を用いて前記リンカー分子にペプチドを合成する工程と、
を有するペプチドライブラリーの合成方法。
【請求項１２】
前記金−酸化鉄複合ナノ粒子が磁性酸化鉄からなる核粒子と前記磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなり、
前記核粒子の平均粒子径が１０
〜 ３００ ｎｍであり、
前記金粒子の平均粒子径が１ 〜 ２０ ｎｍであることを特徴とする請求項１１に記載のペプチドライブラリーの合成方法。
【請求項１３】
磁力によるペプチドのスクリーニングが可能なペプチドライブラリーであって、
金−酸化鉄複合ナノ粒子とリンカー分子とペプチドとからなる複合ナノ粒子−ペプチド複合体から構成され、
前記金−酸化鉄複合ナノ粒子が磁性酸化鉄からなる核粒子と前記磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなり、
前記核粒子の平均粒子径が１０
〜 ３００ ｎｍであり、
前記金粒子の平均粒子径が１ 〜 ２０ ｎｍであることを特徴とするペプチドライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は金−酸化鉄複合ナノ粒子を用いたペプチドの合成方法に関し、特に、磁力でスクリーニング可能な複合ナノ粒子−ペプチド複合体および該複合ナノ粒子−ペプチド複合体から構成されるペプチドライブラリーの有利な合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新しい機能性化合物を効率的に創生するための革新的な方法としてコンビナトリアルケミストリー（化合物誘導体群の合成技術と方法論に関する有機化学の一分野）が注目され、盛んに研究されている。この様な背景の下、ペプチドを固体支持体上に合成し、スクリーニングする方法が公知の技術として利用されている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
これまでに、粒径が８０〜１００μｍのビーズ上に１００
ｐｍｏｌ程度の同一種類のペプチドを合成した“ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｌｉｂｒａｒｙ”を合成し、癌細胞表層レセプターに特異的に結合するペプチドのスクリーニングに成功した例がある。しかしながら、ビーズの粒径が大きいため、効率的にペプチドをスクリーニングすることは困難である。加えて、ライブラリーサイズも十分とは言えない（非特許文献１および２参照）。【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２０１６４８号公報
【非特許文献１】Ｏｌｕｌａｎｕ  Ｈ．  Ａｉｎａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ２００７，  ４（５），  ６３１−６５１．
【非特許文献２】Ｌｉ  Ｐｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ａｇａｉｎｓｔ  α４β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２００６，  ２，  ３８１−３８９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の技術で合成されたペプチドライブラリーはサイズが十分でなく、効果的にペプチドをスクリーニングすることも困難である。機能性化合物の選択の可能性を広げるためには、ライブラリーサイズの増大および効率的なスクリーニング手法の確立が必要不可欠である。【０００６】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、スクリーニング可能なペプチドおよびその有利な合成方法、大規模かつ容易にスクリーニング可能なペプチドライブラリーおよびその有利な合成方法、およびペプチドの効果的なスクリーニング方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のペプチドの合成方法は、金−酸化鉄複合ナノ粒子における金の表面にリンカー分子を吸着させる工程とペプチド固層合成を用いてリンカー分子にペプチドを合成する工程とを有するものである。金−酸化鉄複合ナノ粒子は磁性酸化鉄からなる核粒子と磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなり、核粒子の平均粒子径は１０
〜 ３００ ｎｍ、金粒子の平均粒子径は１ 〜 ２０ ｎｍであることが好ましい。リンカー分子は硫黄とアミノ基とを有する分子であることが好ましく、チオール基とアミノ基とを有する分子であることがより好ましく、特にシステインであることが好ましい。【０００８】
本発明のスクリーニング可能なペプチドは、複合ナノ粒子−ペプチド複合体であり、該複合ナノ粒子−ペプチド複合体は金−酸化鉄複合ナノ粒子の金の表面にリンカー分子が吸着し、該リンカー分子にペプチドが結合しているものである。金−酸化鉄複合ナノ粒子は磁性酸化鉄からなる核粒子と磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなり、核粒子の平均粒子径は１０
〜 ３００ ｎｍ、金粒子の平均粒子径は１ 〜 ２０ ｎｍであることが好ましい。リンカー分子は硫黄とアミノ基とを有する分子であることが好ましく、チオール基とアミノ基とを有する分子であることがより好ましく、特にシステインであることが好ましい。【０００９】
本発明のペプチドライブラリーの合成方法は、金−酸化鉄複合ナノ粒子における金の表面にリンカー分子を吸着させる工程とスプリット合成を用いてリンカー分子にペプチドを合成する工程とを有するものである。金−酸化鉄複合ナノ粒子は磁性酸化鉄からなる核粒子と磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなり、核粒子の平均粒子径は１０
〜 ３００ ｎｍ、金粒子の平均粒子径は１ 〜 ２０ ｎｍであることが好ましい。リンカー分子は硫黄とアミノ基とを有する分子であることが好ましく、チオール基とアミノ基とを有する分子であることがより好ましく、特にシステインであることが好ましい。【００１０】
本発明のスクリーニングが可能なペプチドライブラリーは、磁力によってペプチドをスクリーニングし得るものであり、金−酸化鉄複合ナノ粒子とリンカー分子とペプチドとからなる複合ナノ粒子−ペプチド複合体から構成される。金−酸化鉄複合ナノ粒子は磁性酸化鉄からなる核粒子と磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなり、核粒子の平均粒子径は１０
〜 ３００ ｎｍ、金粒子の平均粒子径は１ 〜 ２０ ｎｍであることが好ましい。リンカー分子は硫黄とアミノ基とを有する分子であることが好ましく、チオール基とアミノ基とを有する分子であることがより好ましく、特にシステインであることが好ましい。【００１１】
本発明のペプチドライブラリーのスクリーニング方法は、磁力の印加によって複合ナノ粒子−ペプチド複合体に含まれる磁性酸化鉄を移動させることで、複合ナノ粒子−ペプチド複合体を移動させるものである。複合ナノ粒子−ペプチド複合体からペプチドを分離させる工程を有することが好ましく、複合ナノ粒子−ペプチド複合体に特異的に結合するターゲットを複合ナノ粒子−ペプチド複合体に結合させる工程を有することがより好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のペプチドの合成方法は、固体支持体に金−酸化鉄複合ナノ粒子を使用しているため、スクリーニング可能な多種のペプチドをペプチド固層合成によって容易に合成することができる。また、本発明のペプチドは、複合ナノ粒子−ペプチド複合体からなり、磁力の印加によって複合ナノ粒子に含まれる磁性酸化鉄を移動させることでペプチドを容易にスクリーニングすることができる。【００１３】
本発明のペプチドライブラリーの合成方法は、固体支持体に金−酸化鉄複合ナノ粒子を使用しているため、スクリーニング可能な多種のペプチドから構成されるペプチドライブラリーをスプリット合成によって容易に合成することができる。また、本発明のペプチドライブラリーは、多種の複合ナノ粒子−ペプチド複合体からなり、磁力の印加によって複合ナノ粒子に含まれる磁性酸化鉄を移動させることで目的とするペプチドを容易にスクリーニングすることができる。【００１４】
本発明のペプチドライブラリーのスクリーニング方法は、磁力によってペプチドを容易にスクリーニングし得るものである。また、複合ナノ粒子−ペプチド複合体からペプチドを分離させる工程を有しているため、分離後のペプチドの配列を簡便に解析することができる。さらに、複合ナノ粒子−ペプチド複合体に特異的に結合するターゲットを複合ナノ粒子−ペプチド複合体に結合させる工程を有しているため、創薬リード化合物等のスクリーニングを効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明で用いる金−酸化鉄複合ナノ粒子の模式図である。
【図２】本発明のペプチドの合成方法の概念図である。
【図３】本発明のペプチドの模式図である。
【図４】本発明のペプチドライブラリーの合成方法の概念図である。
【図５】本発明のペプチドライブラリーの模式図である。
【図６】金−酸化鉄複合ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。
【図７】実施例１におけるシステイン吸着量測定の結果である。
【図８】実施例１におけるＤＭＦ水溶液洗浄後のシステイン吸着量測定の結果である。
【図９】実施例１におけるピペリジン処理後のシステイン吸着量測定の結果である。
【図１０】実施例３におけるアミノ酸の種類と吸着量の関係である。
【図１１】実施例４における金−酸化鉄複合ナノ粒子上で合成されたアラニンの量である。
【図１２】実施例４における濃縮前のペプチドのＴＯＦ  ＭＳ解析結果である。
【図１３】実施例４における濃縮後のペプチドのＴＯＦ  ＭＳ解析結果である。
【図１４】実施例４における縮合回数３回のサンプルのＴＯＦ  ＭＳ解析結果である。
【図１５】実施例５におけるペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析結果である。
【図１６】実施例６におけるペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析結果である。
【図１７】金−酸化鉄複合ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。
【図１８】実施例２において(i) 金/酸化鉄複合ナノ粒子、(ii) 酸化鉄ナノ粒子にPEG-SH(5000Da) 修飾を施したもの、(iii) (i)の粒子にPEG(20000Da) 修飾を施したもの、(iv) (i)の粒子にPEG-SH(5000Da) 修飾を施したものについての熱重量分析結果である。
【図１９】実施例２において吸着させるPEG-SHの濃度を変化させて、リンカー分子としてのPEG-SHのAu/Nano Tek複合ナノ粒子に対する吸着特性の評価結果である。
【符号の説明】
【００１６】
１０…金−酸化鉄複合ナノ粒子
１２…磁性酸化鉄からなる核粒子
１４…金粒子
２０…リンカー分子
２２…ペプチド
３０…複合ナノ粒子−ペプチド複合体
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
図１は本発明で用いる金−酸化鉄複合ナノ粒子の模式図である。金−酸化鉄複合ナノ粒子１０は磁性酸化鉄からなる核粒子１２と磁性酸化鉄からなる核粒子１２の表面に結合した金粒子１４とからなる。磁性酸化鉄からなる核粒子１２の平均粒子径は１０
〜 ３００ ｎｍ、金粒子１４の平均粒子径は１ 〜 ２０ ｎｍであることが好ましい。磁性酸化鉄としては特に限定されず、例えば、磁鉱、マグヘマイト、フェライト等のＦｅ２Ｏ３を主成分とする磁性酸化鉄や、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４等の磁性酸化鉄等が挙げられる。【００１８】
金−酸化鉄複合ナノ粒子の製造方法としては特に限定されず、例えば、金イオンまたは金錯体を含有する溶液に磁性酸化鉄からなる核粒子を分散させ、次いで超音波または電離放射線を照射する方法や、金イオンまたは金錯体を含有する溶液に磁性酸化鉄を与える金属イオンを添加し、次いで超音波または電離放射線を照射する方法等が挙げられる。上記照射によって、磁性酸化鉄の表面に、還元された金のナノ粒子が析出する。金−酸化鉄複合ナノ粒子およびその製造方法は発明者らが以前に発明したものであり、詳しくは特開２００７−２０５９１１等に開示されている。【００１９】
図２は本発明のペプチドの合成方法の概念図である。本発明のペプチドの合成方法は、金−酸化鉄複合ナノ粒子１０における金粒子１４の表面にリンカー分子２０を吸着させる工程とペプチド固層合成を用いてリンカー分子２０にペプチド２２を合成する工程とを有している。リンカー分子２０は硫黄とアミノ基とを有する分子であることが好ましく、チオール基とアミノ基とを有する分子であることがより好ましく、特にシステインであることが好ましい。【００２０】
ペプチド固層合成とは、ペプチドを化学的に合成する際に一般的に用いられる方法の１つである。表面をリンカー分子で修飾したビーズ等を固体支持体として用い、脱水反応によってリンカー分子に１つずつアミノ酸鎖を伸長していく。目的とするペプチドの配列が出来上がったら固体支持体からペプチドを切り出し、目的のペプチドを得る方法である。ここで、無保護アミノ酸を使ってペプチド合成をすることはできない。無保護アミノ酸が自己縮合してジケトピペラジン体になったり、オリゴマーが生成してからペプチドと反応したりするためである。ペプチド固層合成においては、アミノ基の保護基としてＦｍｏｃ基等が使用される。【００２１】
固体支持体とアミノ酸との反応が終了した後、固体支持体を溶媒でよく洗浄し、残ったアミノ酸などを除去する。この後、固体支持体に結合しているアミノ酸の保護基を除去（脱保護）すると、次の反応点となるアミノ基が再び固体支持体に出現する。使用するアミノ酸を順次変更しながらこの手順を繰り返すことで、目的とする配列を有するペプチドを精度よく合成することができる。【００２２】
図３は本発明のペプチドの模式図である。本発明のペプチドは、複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０であり、該複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０は金−酸化鉄複合ナノ粒子１０の金粒子１４の表面にリンカー分子２０が吸着し、リンカー分子２０にペプチド２２が結合しているものである。金−酸化鉄複合ナノ粒子１０は磁性酸化鉄からなる核粒子１２と磁性酸化鉄からなる核粒子１２の表面に結合した金粒子１４とからなり、磁性酸化鉄からなる核粒子１２の平均粒子径は１０
〜 ３００ ｎｍ、金粒子１４の平均粒子径は１ 〜 ２０ ｎｍであることが好ましい。リンカー分子２０は硫黄とアミノ基とを有する分子であることが好ましく、チオール基とアミノ基とを有する分子であることがより好ましく、特にシステインであることが好ましい。【００２３】
図４は本発明のペプチドライブラリーの合成方法の概念図である。本発明のペプチドライブラリーの合成方法は、金−酸化鉄複合ナノ粒子１０における金粒子１４の表面にリンカー分子２０を吸着させる工程とスプリット合成を用いてリンカー分子２０にペプチド２２を合成する工程とを有している。リンカー分子２０は硫黄とアミノ基とを有する分子であることが好ましく、チオール基とアミノ基とを有する分子であることがより好ましく、特にシステインであることが好ましい。【００２４】
スプリット合成はペプチド固層合成を用いて、種々のペプチドから構成されるペプチドライブラリーを合成する手法である。具体的には、多数の固体支持体を各々単一のアミノ酸が含まれる別々の反応器に分配し、固体支持体にアミノ酸を付加させる。これらの固体支持体を１つに混合した後に分割し、次のアミノ酸を付加する。これを繰り返すことで多様なペプチドを固体支持体上に合成することができる。スプリット合成によって合成されたライブラリーの特徴として、１個の固体支持体には１種類のペプチドのみが結合している点が挙げられる（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）。各ペプチドは等モル分布とはならず、統計的な分布となるため、スプリット合成では全く同じライブラリーを厳密に再構築することはできない。また、ペプチド１種類あたりに十分な数の固体支持体を用いないと、ライブラリー要素が欠落することもある。そこで、実際には理想的な等モル分布に近づけるために、合成するペプチド１種類に対するビーズの数を増やすことが必要である。これらの理由により、必要な固体支持体の数は合成段階数が増えるに従って飛躍的に増大する。【００２５】
スプリット合成によってペプチドを合成する場合、固体支持体として用いる粒子の粒径が合成されるペプチドの多様性と大きく関係する。例えば、ビーズの粒径が９０μｍの場合、粒子１個の体積は３.６×１０−１ ｎｌとなり、２０種類の天然アミノ酸で構成されるアミノ酸１０ 残基の長さのペプチドの完全にランダムな組合せライブラリーを粒子上に合成するためには、粒子１０１２個（２０１０種類のペプチドの数に相当）の粒子が理論上必要でその体積は３６０
ｌとなる。一方、粒子の粒径が５０ ｎｍの場合、ビーズ１個の体積は６.３×１０−１１ ｎｌとなり、粒子１０１２個の体積は６３
ｎｌとなる。つまり、粒径が９０μｍの粒子を使用した場合に比べ、粒径が５０ ｎｍの粒子を使用した場合の約６０億分の１の体積で取扱いが可能である。【００２６】
また、現実的な実験スケールである１
ｍｌでｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙの合成を想定した場合、粒径が９０μｍの粒子では１ ｍｌ中に３×１０５個しか粒子が存在せず、最長でもアミノ酸５残基分の長さののランダムペプチドライブラリーしか合成できない。一方、粒径が５０
ｎｍの粒子では１ ｍｌ中に１．５×１０１６個の粒子が存在し、最大１２残基の長さのランダムペプチドライブラリーを網羅できる粒子数が確保される事になる。本発明で固体支持体として用いる金−酸化鉄複合ナノ粒子の粒径は約５０
ｎｍ程度であり、小スケールの合成で大規模なペプチドライブラリーを合成することができる。【００２７】
また、これまで固体支持体として用いられてきた粒径がマイクロメートルオーダーのビーズと比較して、本発明で固体支持体として用いる金−酸化鉄複合ナノ粒子の比表面積は大幅に増加している。これは標的とする分子との接触面積が増加していることを意味しており、標的とする分子が粒子表面のペプチドとの結合が平衡に達するまでの時間が大幅に短縮される。粒子ペプチド複合体と標的分子の結合効率が飛躍的に改善することができる。【００２８】
図５は本発明のペプチドライブラリーの模式図である。本発明のペプチドライブラリーは、金−酸化鉄複合ナノ粒子１０とリンカー分子２０とペプチド２２とからなる複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０から構成される。金−酸化鉄複合ナノ粒子１０は磁性酸化鉄からなる核粒子１２と磁性酸化鉄からなる核粒子１２の表面に結合した金粒子１４とからなり、磁性酸化鉄からなる核粒子１２の平均粒子径は１０
〜 ３００ ｎｍ、金粒子１４の平均粒子径は１ 〜 ２０ ｎｍであることが好ましい。リンカー分子２０は硫黄とアミノ基とを有する分子であることが好ましく、チオール基とアミノ基とを有する分子であることがより好ましく、特にシステインであることが好ましい。また、単一の金−酸化鉄複合ナノ粒子１０に結合しているペプチド２２は１種類となっている。【００２９】
本発明のペプチドライブラリーのスクリーニング方法は、磁力によってペプチドを容易にスクリーニングし得るものである。外部からの磁力の印加によって複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０に含まれる磁性酸化鉄からなる核粒子１２を移動させ、ペプチド２２のスクリーニングを達成する。磁力の印加方法としては、例えば、永久磁石等を用いることができる。【００３０】
また、スクリーニングの後に複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０からペプチド２２を分離することで、分離後のペプチド２２の配列をＴＯＦ  ＭＳ等を用いて解析することができる。ペプチドの分離は、複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０をジチオトレイトールやβメルカプトエタノール溶液等で洗浄することで達成される。また、複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０においては、単一の複合ナノ粒子に１種類のペプチド２２が多分子結合しているため、ペプチド２２の配列を容易に解析することができ、ペプチド２２の量が微量であっても解析が可能である。【００３１】
また、複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０に特異的に結合するターゲットを複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０に含まれるペプチド２２に結合させ、磁力を印加して目的の複合ナノ粒子−ペプチド複合体３０を移動させることで、創薬リード化合物等のスクリーニングを効率的に行うことができる。
【実施例】
【００３２】
以下に本発明の実施例及び比較例を図面を参照して説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
フェライト粒子の表面に金粒子が結合した金−酸化鉄複合ナノ粒子を用い、下記の手順で該金粒子にリンカー分子としてのシステインを吸着させた。(1) ０．０１ ｍｍｏｌ〜１ ｍｍｏｌのシステイン水溶液１ ｍｌと金−酸化鉄複合ナノ粒子１ ｍｇとを室温で１時間攪拌した後、遠心分離と磁気捕集によって金−酸化鉄複合ナノ粒子と上澄み液とを分離した。(2) 分離した金−酸化鉄複合ナノ粒子に純水を加え、超音波洗浄を行った後、遠心分離と磁気捕集によって再び金−酸化鉄複合ナノ粒子と上澄み液とを分離した。(2)の操作を３回繰り返した後、ジメチルホルムアミドに金−酸化鉄複合ナノ粒子を懸濁した。なお、システインは放射能標識されたものを含み、放射線濃度を測定することで金−酸化鉄複合ナノ粒子１
ｍｇに吸着できるシステインの量を見積もることができる。【００３３】
実際に用いた金−酸化鉄複合ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を図６、図１７に示す。粒径５０
ｎｍ程度のフェライト粒子の表面に粒径が数ｎｍの金粒子が結合しているのが確認できる。なお、以下の全ての実施例において、使用した金−酸化鉄複合ナノ粒子は図６、図１７に示したものと同様である。【００３４】
図７にシステイン吸着量測定の結果を示す。システイン吸着量は、回収した金−酸化鉄複合ナノ粒子に吸着したシステインの放射線濃度を測定することで評価した。図７より、金−酸化鉄複合ナノ粒子１
ｍｇあたりに３５ ｎｍｏｌのシステインが吸着されることが確認された。【００３５】
金−酸化鉄複合ナノ粒子に放射能標識されたシステインを約８nmol吸着させた後、Ｆｍｏｃ固層合成反応の場合と同様に、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）またはピペリジン溶液に分散させ、超音波洗浄を行い、金−酸化鉄複合ナノ粒子を遠心分離、磁気捕集によって回収する洗浄作業を３回行った。ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）による洗浄後の金−酸化鉄複合ナノ粒子上のシステイン残存量を図８に、ピペリジン溶液洗浄後の金−酸化鉄複合ナノ粒子上のシステイン残存量を図９にそれぞれ示す。ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）による洗浄またはピペリジン溶液洗浄によってシステインの吸着量はほとんど変化しておらず、これらの処理によるシステインの剥離は認められない。この結果から、金−酸化鉄複合ナノ粒子に吸着したシステイン分子はＦｍｏｃ固層合成反応中にも安定に金−酸化鉄複合ナノ粒子上に保持される事が確認できた。【００３６】
実施例２
ここでリンカー分子として分子量の大きいＰＥＧ−ＳＨを用いてリンカー分子の吸着量を定量分析した。実際には、合成した金−酸化鉄複合ナノ粒子にPEG-SH修飾を施した際、実際にAu-S結合を介して金/酸化鉄複合ナノ粒子をPEG-SH修飾できているかどうかを確認するため、また、結合したPEG-SHの定量を行うため熱重量分析を行った。【００３７】
本試験には核粒子としての担体酸化鉄粒子にNanoTek（登録商標）を、保護剤高分子にPVA用いて電子線合成し、その後得られた金-酸化鉄複合ナノ粒子を濃縮・精製し、各々の濃度のPEG-SH（リンカー分子）と混合し金-酸化鉄複合ナノ粒子を修飾した後、濃縮・精製を行った。【００３８】
（PEG-SHによる修飾）
修飾に用いるPEG-SH(日油株式会社製)には分子量5,000Daのものを用いた。 複合ナノ粒子の分散液を、酸化鉄濃度5 g/Lに調整した後、その分散液5mlとPEG-SH水溶液15mlを混合し、ミックスローターを用いて12時間攪拌した。その際、複合ナノ粒子中の金に対してPEG-SHの量が大過剰( 金：PEG-SH の重量比が 1：100 )になるようPEG-SH水溶液の濃度を調整した。攪拌後、修飾されなかった余剰PEG-SHを除去するために、磁気分離または遠心分離によって磁性成分を沈殿させて上澄み液を廃棄し、超純水に再分散させた。その後、熱重量分析によるPEG-SH結合量の定量分析の前処理として、凍結乾燥を行った。【００３９】
（熱重量分析）
修飾済み複合ナノ粒子のPEG-SH結合量を調べる為に熱重量分析を行った。
ここで、熱重量分析とは測定試料を天秤の上に載せ加熱した時、試料によって熱分解・気化により重量減少をする現象を利用する。試料を熱しながら変化する温度に対応する重量を測定する。金や酸化鉄ナノ粒子は熱分解・気化することはないので、PEG-SHが熱分解・気化する温度以上に加熱する事で、重量減少からAu-S結合を介して結合しているPEG-SHの量を評価した。この測定には装置は島津製作所のTGA50/50Hを使用した。【００４０】
また、試料の前処理として物理吸着によって吸着しているPEG-SHを除く為、PEG-SH修飾した複合ナノ粒子を分離し純水中に再分散する操作3回繰り返した後、再度分離し5 mlの純水中に再分散させ凍結乾燥を行った。【００４１】
（熱重量分析によるPEG-SHの定量評価）
図１８は、(i) 金/酸化鉄複合ナノ粒子(図１８の丸１を(i)と称する。以下同様)、(ii) 酸化鉄ナノ粒子にPEG-SH (5000Da) 修飾を施したもの、(iii)
(i)の粒子にPEG (20000Da) 修飾を施したもの、(iv) (i)の粒子にPEG-SH
(5000Da) 修飾を施したものについてそれぞれ熱重量分析を行った。
(i)  をコントロールとして、
(ii)  Auが存在しないのでAu-S結合は起こらない
(iii)  チオール基が存在しないのでAu-S結合は起こらない
(iv)  Auとチオール基が存在するのでAu-S結合が起こりうる【００４２】
よって、(i)と(ii)とは、重量残存率にほとんど変化がなく、(iii)は重量残存率に変化が小さく、(iv)のみ重量残存率が大きく変化する事で、金/酸化鉄複合ナノ粒子をPEG-SHで修飾した際、Au-S結合により修飾されている可能性が示唆される。さらに、(i)と(iv)の比較から、PEG-SHで修飾した際に金化鉄複合ナノ粒子に結合しているPEG-SHの定量が可能であると考えられる。【００４３】
また、図１８を参照すれば、まず始めに(i)と(ii)を比較したところ重量残存率にほとんど変化がない。これは酸化鉄粒子のみをPEG-SHで修飾を試みても物理吸着なので吸着が弱く、その後の精製段階でPEGが脱着してしまうためだと考えられる。同様に、(i)と(iii)を比較したところ、金/酸化鉄複合ナノ粒子1mgに対して(i)は0.08mg、(iii)は0.14mgと若干変化した。これは保護剤として使用したPVAが精製を経ても粒子表面に残存しており、その後PEGと架橋結合したためと考えられる。PVAとPEGを水溶液中で混合すると架橋結合する事は過去に報告されている。【００４４】
それに対して(iv)は、精製を経てもAu-S結合は非常に強い結合なので、PEG-SHが脱離せずに結合状態を保ち、その重量が金/酸化鉄複合ナノ粒子1mgに対して0.23mg減少した。この重量差と金ナノ粒子の幾何平均粒子径および金と酸化鉄の質量比から金粒子一個当たりに結合しているPEG-SHの数を推算した。金ナノ粒子一個当たりに44個のPEG-SHが結合しており、PEG-SH鎖一本当たりは13.5個の金ナノ粒子の面積を占有している。【００４５】
次に、吸着させるPEG-SHの濃度を変化させて、リンカー分子としてのPEG-SHのAu/Nano
Tek複合ナノ粒子に対する吸着特性を評価した。図１９を参照すれば、Au/Nano Tek複合ナノ粒子へPEG-SHを吸着させた結果を上段の丸プロット（１０点）とし、Au/Nano Tek複合ナノ粒子へPEGをを吸着させた結果を下段の丸プロット（２点）として示されている。
この結果、SH-PEGは粒子1mg当たり最大30nmol程度吸着することがわかった。一方、PEGは吸着性が非常に悪いことがわかった。【００４６】
実施例３
フェライト粒子の表面に金粒子が結合した金−酸化鉄複合ナノ粒子を用い、下記の手順で該金粒子に種々のリンカー分子を吸着させた。リンカー分子を含む水溶液と金−酸化鉄複合ナノ粒子１
ｍｇとを室温で１時間攪拌した後、遠心分離と磁気捕集によって金−酸化鉄複合ナノ粒子と上澄み液とを分離した。リンカー分子としては、種々のアミノ酸（アスパラギン酸（Ａｓｐ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、シスチン（Ｃｙｓ2）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、リシン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、プロリン（Ｐｒｏ））の混合液を用いて上記の操作を行った。上澄み液に残留する各アミノ酸の量を、アミノ酸分析装置で定量することで、金粒子に吸着したアミノ酸の種類と量を見積もる事ができる。【００４７】
図１０にアミノ酸の種類と吸着量の関係を示す。側鎖に硫黄を含むシスチン（Ｃｙｓ２）とメチオニン（Ｍｅｔ）の吸着量が多く、特に、側鎖にチオール基を有するシスチン（Ｃｙｓ２）の吸着量が多いことが確認された。【００４８】
実施例４
固体支持体としてフェライト粒子の表面に金粒子が結合した金−酸化鉄複合ナノ粒子を用い、ペプチドの合成を試みた。１
ｍｌの溶液（ＤＭＦ：ＤＩＥＡ＝１：２）に１ ｍｇの金−酸化鉄複合ナノ粒子（リンカー分子としてシステインを吸着させたもの）と放射能標識したＦｍｏｃ−アラニン、ＨＰＢｔ、ＨＢＴＵを添加し、１５分間攪拌して縮合反応を進行させた。添加したＦｍｏｃ−アラニン、ＨＰＢｔ、ＨＢＴＵの量は、金−酸化鉄複合ナノ粒子１
ｍｇに吸着するシステインのモル数を１として、Ｆｍｏｃ−アラニン：ＨＰＢｔ：ＨＢＴＵ＝４：４：３．６とした。縮合反応の後、金−酸化鉄複合ナノ粒子を１ ｍｌの２５％ピペリジン／ＤＭＦ
溶液で２分間洗浄し、該洗浄を２回繰り返した。洗浄後、上述の方法と同じ条件で２回目の縮合反応および洗浄を行い、縮合回数１回〜２回のサンプルおよび、１回目の縮合反応後の洗浄後サンプルを得た。【００４９】
図１１に金−酸化鉄複合ナノ粒子上で合成されたアラニンの量を示す。アラニンの量は放射線量で定量した。縮合反応１回に比べ、２回目では約２倍のアラニンが金−酸化鉄複合ナノ粒子上に結合していることが確認された。【００５０】
金−酸化鉄複合ナノ粒子上に合成されたペプチドをＤＴＴで洗浄した後、金−酸化鉄複合ナノ粒子と上澄み液を遠心分離と磁気捕集により分離し、金−酸化鉄複合ナノ粒子から遊離したペプチドを含む上澄み液を回収した。さらに本上澄み液を逆走カラムクロマトグラムにより濃縮した。濃縮前および濃縮後のペプチドをＴＯＦ  ＭＳで検出した結果を図１２および１３にそれぞれ示す。ペプチドを金−酸化鉄複合ナノ粒子から遊離させ、濃縮することで、ＴＯＦ  ＭＳ検出が容易になることが確認された。【００５１】
図１４にアラニンを用いた縮合回数３回のサンプルのＴＯＦ  ＭＳ解析結果を示す。金−酸化鉄複合ナノ粒子上でアラニン３残基からなるトリペプチドが合成できていることが確認された。【００５２】
実施例５
固体支持体としてフェライト粒子の表面に金粒子が結合した金−酸化鉄複合ナノ粒子を用い、ペプチドの合成を試みた。１
ｍｌの溶液（ＤＭＦ：ＤＩＥＡ＝１：２）に１ ｍｇの金−酸化鉄複合ナノ粒子（リンカー分子としてシステインを吸着させたもの）と放射線標識したＦｍｏｃ−アラニン、ＨＰＢｔ、ＨＢＴＵを添加し、１５分間攪拌して縮合反応を進行させた。添加したＦｍｏｃ−アラニン、ＨＰＢｔ、ＨＢＴＵの量は、金−酸化鉄複合ナノ粒子１
ｍｇに吸着するシステインのモル数を１として、Ｆｍｏｃ−アラニン：ＨＰＢｔ：ＨＢＴＵ＝４：４：３．６とした。縮合反応の後、金−酸化鉄複合ナノ粒子を１ ｍｌの２５％ピペリジン／ＤＭＦ
溶液で２分間洗浄し、該洗浄を３回繰り返した。洗浄後、上述の方法と同じ条件で縮合反応および洗浄を繰り返し、縮合回数８回のサンプルを得た。【００５３】
ペプチドを合成した後、ＤＴＴ添加によって金−酸化鉄複合ナノ粒子とペプチドとを解離させ、磁気分離でペプチド画分を分取し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで質量分析した。図１５に得られたサンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析結果を示す。金−酸化鉄複合ナノ粒子に吸着したシステインに、２〜８残基のアラニンが伸長したペプチドが合成されていることが確認できた。【００５４】
実施例６
固体支持体としてフェライト粒子の表面に金粒子が結合した金−酸化鉄複合ナノ粒子（リンカー分子としてシステインを吸着させたもの）を用い、ペプチドライブラリーの合成を試みた。アラニン、アスパラギン酸、イソロイシンの３種類のアミノ酸を用いたスプリット合成により、３残基のペプチドライブラリーを得た。なお、スプリット合成はバッチ法により、１５
ｍｇの金−酸化鉄複合ナノ粒子を用いて行った。【００５５】
ペプチドライブラリーを合成した後、ＤＴＴ添加によって金−酸化鉄複合ナノ粒子とペプチドとを解離させ、磁気分離でペプチド画分を分取し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで質量分析した。図１６に得られたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析結果を示す。ライブラリーを構成するペプチドの混合物が合成されていることが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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