(57)【要約】  本発明は、ｄＡＴＰαＳのような、ＤＮＡポリメラーゼに対して反応性が低く高価な試薬を用いることなく、ｄＡＴＰを用いた安価で高精度かつ高感度な核酸分析のためのホタルルシフェラーゼ、それを用いる核酸分析方法及び核酸分析キットを提供する。  ｄＡＴＰに対する反応性がＡＴＰに対する反応性の１／４００以下であるルシフェラーゼを含む、核酸分析用組成物、上記の組成物を用いることを特徴とする、核酸分析方法、及び上記の組成物を含む、核酸分析用キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｄＡＴＰに対する反応性がＡＴＰに対する反応性の１／４００以下であるルシフェラーゼを含む、核酸分析用組成物。
【請求項２】
ルシフェラーゼの４２５位のアミノ酸がロイシンであるか、４３８位のアミノ酸がグリシンであるか、５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、４２５位のアミノ酸がロイシンでありかつ４３８位のアミノ酸がグリシンであるか、４２５位のアミノ酸がロイシンでありかつ５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、４３８位のアミノ酸がグリシンでありかつ５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、４２５位のアミノ酸がロイシンであり、４３８位のアミノ酸がグリシンでありかつ５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、３４４位のアミノ酸がアラニンであるか、３４４位のアミノ酸がバリンであるか、３４４位のアミノ酸がイソロイシンであるか、又は３４４位のアミノ酸がアラニンであり、４２５位のアミノ酸がロイシンでありかつ４３８位のアミノ酸がグリシンである、請求項１に記載の核酸分析用組成物。
【請求項３】
ルシフェラーゼがヘイケボタルに由来する、請求項１又は２に記載の核酸分析用組成物。
【請求項４】
ルシフェラーゼがＮ末側にゲンジホタルの１〜４４８位のアミノ酸配列を有し、２１７位、２１９位、２３９位がそれぞれイソロイシン（Ｉ）に改変され、Ｃ末側に北米産ホタルルシフェラーゼの４４７〜５５０位のアミノ酸配列を有するキメラ型ルシフェラーゼである、請求項１に記載の核酸分析用組成物。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の組成物を用いることを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項６】
請求項１〜４に記載の組成物を含む、核酸分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異体ホタルルシフェラーゼを含む核酸分析用組成物、それを用いる核酸分析方法及び核酸分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｄ−ルシフェリン及び酸素を、ＡＭＰ、オキシルシフェリン及び二酸化炭素に変換し、光を生成する酵素である。【０００３】
ホタルルシフェラーゼを利用した発光検出による核酸分析法として、現在、パイロシーケンシング法（例えば、非特許文献１参照）、ＢＡＭＰＥＲ法を用いた遺伝子多形（ＳＮＰｓ）解析法（例えば、非特許文献２参照）、ハイブリダイゼーション法を用いた遺伝子検出法（例えば、非特許文献３参照）等が知られている。【０００４】
これらの核酸分析法は、相補鎖合成によりヌクレオチドが取り込まれたときに放出されるピロリン酸を、ＡＴＰスルフリラーゼやピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）等の酵素を用いてＡＴＰに変換し、生成したＡＴＰを、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により発光測定するという原理に基づいている。【０００５】
例えば、パイロシーケンシング法では、鋳型となる一本鎖ＤＮＡ（試料核酸）にプライマーをハイブリダイゼーションさせ、４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を１種類ずつ順番に反応液中に加え、相補鎖を合成させる。相補鎖が合成されると、反応生成物としてピロリン酸が生じる。このピロリン酸をＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変換し、生成したＡＴＰをルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により発光測定する。次いで、未反応のヌクレオチドを、アピラーゼ等を用いて分解する液相法により、又は鋳型ＤＮＡを固相に結合させておき、反応液を洗い流して洗浄する固相法等により、除去する。この一連の工程を、ヌクレオチドを変えながら繰り返し行うことで、試料核酸の配列を決定していく。【０００６】
パイロシーケンシング法により決定できる塩基配列の長さは一度に１００塩基程度にすぎないが、１プレートあたり数百万のウェルを有するピコタイタープレートを用いて並列して解析する等により、低コストで大規模な核酸分析を行える方法として注目を集めている。【０００７】
しかし、上述のような原理に基づく各種核酸分析法においては、多くの場合、反応液中に相補鎖合成反応の基質であるｄＡＴＰを試薬として加える必要がある。さらに、多くの場合、試料核酸中にもｄＡＴＰを含んでいる。ｄＡＴＰはＡＴＰと構造が類似しているために、ＡＴＰに比べると極めて弱いものの、ルシフェラーゼの基質として作用し、発光を生じる。したがって、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用して、このようなｄＡＴＰを含む反応液中で核酸を分析する際には、混入するｄＡＴＰによって、バックグラウンド発光量が高くなり、結果として分析感度が低下するという問題を有していた。【０００８】
ｄＡＴＰに起因するバックグラウンド発光を防ぐ方法として、ｄＡＴＰの代わりに、ｄＡＴＰの誘導体であるデオキシアデノシンα−チオトリホスフェート（ｄＡＴＰαＳ）を使用する方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、ｄＡＴＰαＳはｄＡＴＰと比べ非常に高価であり、また、ＤＮＡポリメラーゼ反応への取り込み効率が悪く、相補鎖合成反応が正常に行われない等の問題を有している。【０００９】
また、パイロシーケンシング法においては、ｄＡＴＰの含有比率を低下させることによりｄＡＴＰによるバックグラウンド発光を抑える方法も報告されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、ｄＡＴＰの含有比率を低下させると、鋳型ＤＮＡの配列においてチミン（Ｔ）が連続している場合、必要とされるｄＡＴＰが不足することにより完全に相補鎖合成を完了することができない。したがって、チミンの数に対応したシグナル発光量が得られず、また、未反応のチミンが残存することにより、次の配列へと反応を進めることもできず、結果として、正確に塩基配列を決定することができないという問題を有している。
【特許文献１】国際特許出願第９８／１３５２３号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−６８４５０号公報
【非特許文献１】Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７年  １６７巻、ｐ２３５−２３８
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１年  ２９巻（１９）、ｐ９３
【非特許文献３】Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４年  ３３３巻、ｐ２９６−３０２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ｄＡＴＰαＳのような、ＤＮＡポリメラーゼに対して反応性が低く高価な試薬を用いることなく、ｄＡＴＰを用いた安価で高精度かつ高感度な核酸分析のためのホタルルシフェラーゼ、それを用いる核酸分析方法及び核酸分析キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
出願人は、このような課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ｄＡＴＰに対して反応性の低いホタルルシフェラーゼを用いることにより、ｄＡＴＰによるバックグラウンド発光が抑制された安価で高精度かつ高感度な核酸分析法が実現できることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に関する。【００１２】
１．ｄＡＴＰに対する反応性がＡＴＰに対する反応性の１／４００以下であるルシフェラーゼを含む、核酸分析用組成物、
２．ルシフェラーゼの４２５位のアミノ酸がロイシンであるか、４３８位のアミノ酸がグリシンであるか、５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、４２５位のアミノ酸がロイシンでありかつ４３８位のアミノ酸がグリシンであるか、４２５位のアミノ酸がロイシンでありかつ５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、４３８位のアミノ酸がグリシンでありかつ５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、４２５位のアミノ酸がロイシンであり、４３８位のアミノ酸がグリシンでありかつ５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、３４４位のアミノ酸がアラニンであるか、３４４位のアミノ酸がバリンであるか、３４４位のアミノ酸がイソロイシンであるか、又は３４４位のアミノ酸がアラニンであり、４２５位のアミノ酸がロイシンでありかつ４３８位のアミノ酸がグリシンである、上記１に記載の核酸分析用組成物、
３．ルシフェラーゼがヘイケボタルに由来する、上記１又は２に記載の核酸分析用組成物、
４．ルシフェラーゼがＮ末側にゲンジホタルの１〜４４８位のアミノ酸配列を有し、２１７位、２１９位、２３９位がそれぞれイソロイシン（Ｉ）に改変され、Ｃ末側に北米産ホタルルシフェラーゼの４４７〜５５０位のアミノ酸配列を有するキメラ型ルシフェラーゼである、上記１に記載の核酸分析用組成物、
５．上記１〜４に記載の組成物を用いることを特徴とする、核酸分析方法、
６．上記１〜４に記載の組成物を含む、核酸分析用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ｄＡＴＰによるバックグラウンド発光の影響が抑えられ、高感度な核酸分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｄＡＴＰ／ＡＴＰ比と相補鎖合成試験におけるｄＡＴＰ添加時発光量との関係である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（ルシフェラーゼ）
本発明で使用するルシフェラーゼ（ＥＣ  １．１３．１２．７）の由来としては、甲虫、例えばゲンジボタル、ヘイケボタル、北米産ホタル等が挙げられるが、ＡＴＰを基質として発光反応を示し、かつｄＡＴＰに対して低反応性のルシフェラーゼであれば、その他の起源のものであってもよい。また、天然の配列を有するものであってもよく、さらに、各種の公知の変異を有するものでもよい。耐熱性、薬剤耐性、発光強度、発光持続性、発光の色調等、ｄＡＴＰへの反応性以外の目的で導入された変異を含むルシフェラーゼも利用することができる。また、耐熱性や薬剤耐性等、ほかの目的で入れられた変異を含むものも利用することができる。【００１６】
本発明で使用するルシフェラーゼは、好ましくは、ゲンジボタルルシフェラーゼ、ヘイケボタルルシフェラーゼ又は北米産ホタルルシフェラーゼであり、より好ましくは、ヘイケボタルルシフェラーゼである。【００１７】
（ｄＡＴＰに対する反応性）
本発明において、発光反応に使用するルシフェラーゼがｄＡＴＰに対して低反応性であることは極めて重要である。「ｄＡＴＰに対して低反応性である」とは、同一条件下で反応を行った時に、ＡＴＰに対する反応性に対してｄＡＴＰに対する反応性が相対的に低く、その程度が一定値以下であることをいう。そのような特性を有するルシフェラーゼを本発明の方法に使用する場合には、ｄＡＴＰによるバックグラウンド発光が抑制され、高精度かつ高感度な測定値を得ることができる。【００１８】
（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比測定方法）
本発明における、ｄＡＴＰに対するルシフェラーゼの反応性を表すために、例えば、ＡＴＰに対する反応性とｄＡＴＰに対する反応性の比（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比）を利用することができる。この比率を指標に、本発明で使用するのに好適なルシフェラーゼを特定することが可能である。ただし、このＡＴＰ／ｄＡＴＰ比は、測定時に用いたＡＴＰやｄＡＴＰの濃度、ｐＨ、反応温度、試薬組成、測定装置等の反応条件によって変動する。また、これらの条件は複合的にも変動する。例えば、ｐＨ、反応温度、試薬組成等のいずれか又は複数を変化させることにより、生じる発光の最大波長が変化する場合がある。一方、発光を測定する装置側の感度も波長ごとに異なるため、そのような場合には、測定装置によっても、異なる結果が得られる場合がある。こうした状況を考慮し、本発明に用いる酵素を特定するためのＡＴＰ／ｄＡＴＰ比は、一定条件下で測定する必要がある。【００１９】
例えば、本発明に用いる酵素を特定するためのＡＴＰ／ｄＡＴＰ比は、以下の条件下で測定することができる。
ｄＡＴＰとＡＴＰに対する反応性を調べるため発光試薬として、ルシフェラーゼを含むＡＴＰ／ｄＡＴＰ比測定用試薬（ｐＨ７．５±０．１、６０ｍＭ  トリシン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．４ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、０．１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を調製する。ルシフェラーゼ濃度は、測定対象となるルシフェラーゼの比活性によって異なり、ルミテスターＣ−１００Ｎ（キッコーマン社製）等の検出器で安定して測定できる濃度に調整するが望ましい。０．０１μｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬが望ましい。【００２０】
ＡＴＰ測定では、０．１ｍＬ  ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比測定試薬（ルシフェラーゼを含む）に、０．１ｍＬの１×１０−７Ｍ  ＡＴＰを添加し、添加直後の発光量をルミテスターＣ−１００Ｎにて測定する。
ｄＡＴＰ測定では、０．１ｍＬ  ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比測定用試薬に０．１ｍＬの１×１０−５Ｍ  ｄＡＴＰを添加し、添加直後の発光量をルミテスターＣ−１００Ｎにて測定する。【００２１】
ＡＴＰ濃度とｄＡＴＰ濃度を補正するために、ＡＴＰ添加時の発光量を１００倍し、その値をｄＡＴＰ添加時の発光量で割った値を「ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比」とすることができる。測定は２５±１℃において行うことが好ましい。【００２２】
測定器には、光電子増倍管（ホトマルチプライヤー）を検出部とするルミテスターＣ−１００Ｎ、又は、それと同等の性能を有する測定器を使用する。【００２３】
上記の測定条件下で得られたＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が４００以上、好ましくは、８００以上、より好ましくは２，０００以上、さらに好ましくは４，０００以上であるルシフェラーゼを使用する場合には、ｄＡＴＰによるバックグラウンド発光が抑制され、高精度かつ高感度な測定値を得ることができる。一方、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が４００未満のルシフェラーゼを使用する場合には、ｄＡＴＰによるバックグラウンド発光が悪影響を及ぼし、精度及び感度が十分な測定を行うことができない。【００２４】
（ｄＡＴＰに対して低反応性であるルシフェラーゼの選抜）
上述の指標を用いて、公知の各種ルシフェラーゼや公知の各種ルシフェラーゼの配列を元に新たに作製したルシフェラーゼから、ｄＡＴＰに対して低反応性であるルシフェラーゼを選抜することができる。そのように選抜された本発明で好適に使用できるルシフェラーゼとしては、例えば、ルシフェラーゼの４２５位のアミノ酸がロイシンであるか、４３８位のアミノ酸がグリシンであるか、５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、４２５位のアミノ酸がロイシンでありかつ４３８位のアミノ酸がグリシンであるか、４２５位のアミノ酸がロイシンでありかつ５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、４３８位のアミノ酸がグリシンでありかつ５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、４２５位のアミノ酸がロイシンであり、４３８位のアミノ酸がグリシンでありかつ５３２位のアミノ酸がアルギニンであるか、３４４位のアミノ酸がアラニンであるか、３４４位のアミノ酸がバリンであるか、３４４位のアミノ酸がイソロイシンであるか、又は３４４位のアミノ酸がアラニンであり、４２５位のアミノ酸がロイシンでありかつ４３８位のアミノ酸がグリシンであり、４４０位のアミノ酸がアラニンであるルシフェラーゼを挙げることができる。なお、上記のアミノ酸位置は、ヘイケボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）による。
また、ルシフェラーゼがＮ末側にゲンジホタルの１〜４４８位のアミノ酸配列を有し、２１７位、２１９位、２３９位がそれぞれイソロイシン（Ｉ）に改変され、Ｃ末側に北米産ホタルルシフェラーゼの４４７〜５５０位のアミノ酸配列を有するキメラ型ルシフェラーゼ（ＬＵＣ−Ｃ）も挙げることができる。【００２５】
（ｄＡＴＰに対して低反応性である変異ルシフェラーゼの作製）
公知の各種の変異酵素の作製方法を用いて、ｄＡＴＰに対して低反応性であるルシフェラーゼを新たに作製することもできる。変異導入方法としては、例えば、通常的に用いられる方法として、変異プライマーを用いたＰＣＲによりベクターごと増幅する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、ランダムミューテーションにより得られた変異ルシフェラーゼから、目的のものを探索することもできる。甲虫類ルシフェラーゼにおいては、アミノ酸配列の相同性が全長にわたって高いことが知られており、あるルシフェラーゼ遺伝子における変異について、異なる由来のルシフェラーゼの相応するアミノ酸残基に変異を導入することで同様の性質改良効果得られる場合も多く知られているため、各種甲虫における情報を参考に変異を導入することが好ましい。ｄＡＴＰに対する低反応性に加えて、さらなる性質改良効果を奏する変異を併せ持つルシフェラーゼを作製することも可能であり、それらの変異酵素は実用上有用性が高いものとなる。
次に、得られた変異ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドで宿主細胞を形質転換する。得られた形質転換体を培養して得られる菌体から、変異ルシフェラーゼを精製する。宿主としては、大腸菌Ｋ−１２株が挙げられるが、これに限定するものではない。【００２６】
（核酸分析方法）
上述の試薬、酵素、各工程を組み合わせて、核酸の分析を行う。具体的には、分析は、以下の工程の組み合わせを含むことができる。
（１）試料核酸を含む反応液に、塩基ＡＧＴＣに対応する４種のｄＮＴＰ又はその誘導体の少なくとも１種を添加して前記試料核酸を鋳型とする相補鎖合成を行う工程
（２）前記相補鎖合成により生成するピロリン酸からＡＴＰを生成させる工程
（３）前記ＡＴＰを反応基質とするルシフェラーゼ反応により生じる発光の検出により前記相補鎖合成の有無の判定や合成量の定量を行う工程。
上記工程はそれぞれ個別に行うことも可能であるが、（１）と（２）、（２）と（３）、又は（１）から（３）を１液中で同時に行うことも可能である。【００２７】
各工程における各成分の濃度範囲は、公知の各種の方法で知られたものを使用できる。
ｄＮＴＰ濃度に関しては、パイロシーケンシング法等のような段階的相補鎖合成反応による核酸分析を行う場合、ｄＮＴＰの不足は、不完全な合成を引き起こし、配列の誤解読の原因となるため、十分な濃度を加える必要がある。特に、ゲノム配列の解析において、同じ塩基配列が１０連続する配列がＤＮＡ配列上にしばしば存在する。このような塩基配列を正確に決定するためには、ｄＮＴＰを少なくとも鋳型ＤＮＡの３０倍以上、望ましくは６０倍以上、さらに望ましくは１００倍以上添加する必要がある。この値は１０塩基分合成するのに必要なｄＮＴＰ量（鋳型ＤＮＡの１０倍量）の３倍、６倍、１０倍の量である。【００２８】
ルシフェラーゼ反応により生じた発光は、公知の測定装置を用いて測定すればよい。例えば、ルミテスターＣ−１００Ｎ等の光電子増倍管（ホトマルチプライヤー）を検出部とする測定装置や、そのほか、フォトダイオード、ＣＣＤ、Ｃ−ＭＯＳ、インスタントカメラ、イメージングインテンシファイヤ等の検出部とする測定装置を使用することができる。【００２９】
（試料核酸）
本発明で使用する試料核酸としては、各種核酸分析法で用いられる各種の核酸、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。試料核酸の由来は、ヒト、その他の真核、原核生物、ウイルス等の生体由来のものや、ＰＣＲ等で増幅したもの、ＤＮＡシンセサイザー等で人工的に合成されたものも使用できる。特に、ヒトや微生物のゲノム配列を含む試料核酸等が好ましい。【００３０】
（ｄＮＴＰ）
本発明で使用するｄＮＴＰとは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸ｄＣＴＰ等であるが、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）であるｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰやその他のｄＮＴＰの誘導体を使用してもよく、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、相補鎖合成を行い、ピロリン酸を生成し得るものであればよい。また、他のｄＮＴＰやバックグラウンド発光の原因となるＡＴＰやピロリン酸を含まない高純度品を使用することが望ましい。ＰＣＲ、シーケンシング、突然変異導入、ｃＤＮＡ合成等用として市販されているので、それらを使用することができる。【００３１】
ピロホスファターゼやアピラーゼ等の酵素を加えて、夾雑するピロリン酸やＡＴＰを事前に分解することもできる。加えた酵素は、限外ろ過膜で取り除いたり、薬剤等を加えて活性を停止させたりし、相補鎖合成により生成したピロリン酸やＡＴＰが分解されるのを低減することもできる。【００３２】
（相補鎖合成）
本発明で使用する相補鎖合成工程としては、公知の各種の方法を用いることができる。例えば、ＳＮＰｓ解析のように、１種類のｄＮＴＰを加えて、１塩基分の相補鎖合成を行う方法を用いれば、相補鎖合成の有無により、標的部分の塩基を解析することができる。また、パイロシーケンシング法等のように、１種類ずつｄＮＴＰを添加し、段階的に相補鎖合成する方法を用いれば、標的部分の塩基配列を解析することができる。核酸配列の同定では、４種類すべてのｄＮＴＰと既知のプライマーを加え、相補鎖合成の有無によって、特定の配列を持つ核酸の有無を検査することができる。【００３３】
本発明で使用する相補鎖合成には、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法等のようなＤＮＡ増幅法を用いてこともできる。これらの相補鎖合成を行う過程で、相補鎖合成量に相当するピロリン酸が生成する。【００３４】
（ＤＮＡポリメラーゼ）
本発明における相補鎖合成工程で使用するＤＮＡポリメラーゼには、核酸を鋳型として、それに相補的な塩基配列を持つＤＮＡ鎖を合成する酵素を意味し、ＤＮＡを鋳型としＤＮＡを複製するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡを鋳型としＤＮＡを複製するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）等が含まれる。本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドを基質とし、ピロリン酸を生成する活性を有している酵素であれば、特に限定されない。【００３５】
（ピロリン酸量に相当するＡＴＰの生成）
上述の相補鎖合成工程により生成したピロリン酸を、相当するＡＴＰへと変換する方法としては、各種の公知の方法を用いることができるが、酵素を用いる方法が特に好ましい。使用する酵素としては、例えばＡＴＰスルフリラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．４）（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５年  １５１巻（２）、ｐ５０４−５０９）、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．１）（特表２００３−５０９６０１号公報）、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）（ＵＳ５８９１６５９、非特許文献３）等が挙げられるが、これらに特に限定されるものではない。【００３６】
（核酸分析用キット）
上述の試薬、酵素等を組み合わせて、本発明の核酸分析方法に使用するためのキットを作製することができる。キットは、例えば、以下の成分を含むことができる。
１）塩基ＡＧＴＣに対応する４種のｄＮＴＰ又はその誘導体
２）ＤＮＡポリメラーゼ
３）Ｄ−ルシフェリン及び請求項１〜４記載のｄＡＴＰに対して低反応性のルシフェラーゼ
４）ＡＭＰとホスホエノールピルビン酸とピルビン酸リン酸ジキナーゼ、及び／又は、アデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）とＡＴＰスルフリラーゼ。【００３７】
上記のキットにおける各試薬、酵素の配合量は、使用する酵素の特性や測定条件によって変化し得るが、例えば反応時において、ｄＮＴＰ又はその誘導体の濃度が０．００１〜１μＭ、ＤＮＡポリメラーゼが1〜５０００Ｕ／ｍＬ、Ｄ−ルシフェリンが０．００１〜１０ｍＭ、ルシフェラーゼが１〜５０００ＧＬＵ／ｍＬ、ＡＭＰが０．００１〜１０ｍＭ、ホスホエノールピルビン酸が０．００１〜１０ｍＭ、ピルビン酸リン酸ジキナーゼが０．１〜１０００Ｕ／ｍＬ、ＡＰＳが０．１〜１００μＭ、ＡＴＰスルフリラーゼが０．０２〜２Ｕ／ｍＬとなるよう調製することができる。【００３８】
キット使用時のｐＨは、使用する酵素の特性等によって変化し得るが、例えば、ｐＨ６．０〜８．５となるよう調整することができる。
マグネシウム塩やその他の金属塩等、ＢＳＡ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の酵素類の活性化因子や安定化剤を加えてもよい。【００３９】
また、バックグラウンドとなるＡＴＰやピロリン酸を分解するため酵素として、アピラーゼやピロホスファターゼを加えることも可能である。【００４０】
以下、実験例及び実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
１．ルシフェラーゼ変異体
北米産ホタルルシフェラーゼ（野生型）はシグマ社製のものを使用した。また、ＬＵＣ−Ｈ（キッコーマン社製、製品コード：６１３１４）は、ヘイケボタルの２１７位がロイシン（Ｌ）、４９０位がリジン（Ｋ）に改変させ、安定性を向上させたルシフェラーゼであり、ＬＵＣ−Ｔ（キッコーマン社製、製品コード：６１３１５）は、ゲンジボタルの２１７位をイソロイシン（Ｉ）に改変させ、安定性を向上させたルシフェラーゼである。さらに、ＬＵＣ−Ｃ（キッコーマン社製、製品コード：６１３１３）は、Ｎ末側にゲンジホタルの１〜４４８位のアミノ酸配列を有し、２１７位、２１９位、２３９位がそれぞれイソロイシン（Ｉ）に改変され、Ｃ末側に北米産ホタルルシフェラーゼの４４７〜５５０位のアミノ酸配列を有するキメラ型ルシフェラーゼである。【００４２】
ｐＥＴ１６ｂ−ＢＬＵ−Ｙの作製
ビオチン化ルシフェラーゼ構造遺伝子を増幅するために全長用プライマー（配列番号２）を合成した。特許第３４６６７６５号記載のプラスミドｐＨＬｆ２４８（尚、大腸菌ＪＭ１０１［ｐＨＬｆ２４８］は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−５０８１として寄託されている。）を鋳型として上記プライマーと市販Ｍ１３−Ｍ４プライマー（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで消化した後、アガロースゲルを用いて精製した。一方、プラスミドベクターｐＥＴ１６ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩ、ＨｉｎｄIII消化した後、精製し、上記ＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＥＴ１６ｂ−ＢＬＵ−Ｙを作製した。作製したプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミドを精製し、ＤＮＡ配列を確認した。【００４３】
ｐＥＴ３２−ＬＵＣ−Ｈの作製
ルシフェラーゼ構造遺伝子を増幅するために全長用プライマー（配列番号３、４）を合成した。特許第３７４９６２８号記載のプラスミドｐＨＬｆＬＫ（尚、大腸菌ＪＭ１０９［ｐＨＬｆＬＫ］は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−６１４７として寄託されている。）を鋳型として上記プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を、ＳｍａＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入した。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、アガロースゲルを用いてルシフェラーゼ構造遺伝子を精製した。一方、ＤＮＡ断片を挿入するプラスミドベクターは、ｐＥＴ３２ｃ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、精製し、アニーリングした合成オリゴヌクレオチド（配列番号５、６）を挿入して作製した。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、形質転換した後、プラスミドを抽出した。このプラスミドのＤＮＡ配列を確認し、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで消化した後、アガロースゲルを用いて精製し、上記のルシフェラーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＥＴ３２−ＬＵＣ−Ｈを作製した。作製したプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミドを精製し、ＤＮＡ配列を確認した。【００４４】
変異ルシフェラーゼ３４４Ａ、３４４Ｖおよび３４４Ｉの作製
ヘイケルシフェラーゼのアミノ酸配列において、３４４番目のアミノ酸残基ロイシンをアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）およびイソロイシン（Ｉ）に変換するよう設計したＰＣＲプライマーを合成した。配列Ｆ−３４４Ｖ、Ｉ共通（配列番号７）には候補株の選択を容易にするためにサイレント変異を導入することにより、ネイティブにはないＡａｔＩＩサイトが出来上がるよう設計している。ｐＥＴ１６ｂ−ＢＬＵ−Ｙを鋳型として、ＰＣＲにより全長を増幅した。プライマーの組み合わせは以下となる。
ｐＨＬｆ３４４Ａ   Ｆ−３４４Ａ（配列番号８）、Ｒ−３４４Ａ（配列番号９）
ｐＨＬｆ３４４Ｖ   Ｆ−３４４Ｖ、Ｉ共通、Ｒ−３４４Ｖ（配列番号１０）
ｐＨＬｆ３４４Ｉ   Ｆ−３４４Ｖ、Ｉ共通、Ｒ−３４４Ｉ（配列番号１１）
ＰＣＲ反応液を用いて、ＤｐｎＩ消化により鋳型プラスミドを分解し、キナーゼ処理によりＰＣＲ産物末端をリン酸化した。処理後のＰＣＲ反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。得られた形質転換体ＪＭ１０９株よりプラスミドを精製し、ＤＮＡ配列を確認した。【００４５】
変異ルシフェラーゼ４２５Ｌ、４３８Ｇおよび５３２Ｒの作製
ヘイケルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２５位のアミノ酸がロイシン（Ｌ）、４３８位のアミノ酸がグリシン（Ｇ）および５３２位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）となるよう、上記と同様にプライマーを設計し、アミノ酸置換を行った。使用したプライマーの組み合わせは以下となる。
ｐＨＬｆ４２５Ｌ  Ｆ−４２５Ｌ（配列番号１２）、Ｒ−４２５Ｌ（配列番号１５）
ｐＨＬｆ４３８Ｇ  Ｆ−４３８Ｇ（配列番号１３）、Ｒ−４３８Ｇ（配列番号１６）
ｐＨＬｆ５３２Ｒ  Ｆ−５３２Ｒ（配列番号１４）、Ｒ−５３２Ｒ（配列番号１７）
また、これらの変異の組み合わせたものをそれぞれ作製した。ｐＨＬｆ４２５Ｌを鋳型として上記と同様にして４３８Ｇ変異をＰＣＲにより導入した（ｐＨＬｆ４２５Ｌ＋４３８Ｇ）。さらに、ｐＨＬｆ４２５Ｌ、ｐＨＬｆ４３８Ｇ、ｐＨＬｆ４２５Ｌ＋４３８Ｇを鋳型として上記と同様にして５３２Ｒ変異を導入し、それぞれｐＨＬｆ４２５Ｌ＋５３２Ｒ、ｐＨＬｆ４３８Ｇ＋５３２Ｒ、ｐＨＬｆ４２５Ｌ＋４３８Ｇ＋５３２Ｒを作製した。【００４６】
変異ルシフェラーゼ３４４Ａ＋４２５Ｌ＋４３８Ｇの作製
ｐＨＬｆ４２５Ｌ＋４３８ＧをＡｐａＩで消化して得られたＤＮＡ断片を、アガロースゲルを用いて精製した。一方、ｐＨＬｆ３４４ＡをＡｐａＩで消化して得られたＤＮＡを鋳型として同様に精製し、上記断片を挿入したプラスミドｐＨＬｆ３４４Ａ＋４２５Ｌ＋４３８Ｇを作製した。得られたプラスミドＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドを精製し、配列を決定した。【００４７】
変異ルシフェラーゼ４４０Ａの作製
ヘイケルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４４０番目のアミノ酸残基ロイシンをアラニン（Ａ）に変換するよう設計したＰＣＲプライマーを合成した。ｐＥＴ３２−ＬＵＣ−Ｈを鋳型として、ＰＣＲにより全長を増幅した。プライマーの組み合わせは以下となる。
ｐＨＬｆ４４０Ａ  Ｆ−４４０Ａ（配列番号１８）、Ｒ−４４０Ａ（配列番号１９）
ＰＣＲ反応液を用いて、ＤｐｎＩ消化により鋳型プラスミドを分解し、８０℃で２０分間インキュベーションし、ＤｐｎＩを失活させた後のＰＣＲ反応液を用いて大腸菌ＫＲＸ株に導入し、形質転換した。得られた形質転換体ＫＲＸ株よりプラスミドを精製し、ＤＮＡ配列を確認した。【００４８】
変異ルシフェラーゼの精製
上記で作製したプラスミドｐＥＴ３２−ＬＵＣ−Ｈ、ｐＨＬｆ３４４Ａ、ｐＨＬｆ３４４Ｖ、ｐＨＬｆ３４４Ｉ、ｐＨＬｆ４２５Ｌ、ｐＨＬｆ４３８Ｇ、ｐＨＬｆ５３２Ｒ、ｐＨＬｆ４２５Ｌ＋４３８Ｇ、ｐＨＬｆ４２５Ｌ＋５３２Ｒ、ｐＨＬｆ４３８Ｇ＋５３２Ｒ、ｐＨＬｆ４２５Ｌ＋４３８Ｇ＋５３２Ｒ、ｐＨＬｆ３４４Ａ＋４２５Ｌ＋４３８Ｇ、ｐＨＬｆ４４０Ａを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）または、大腸菌ＫＲＸ株に導入した形質転換体を用いて、変異ルシフェラーゼＨｉｓ−ＬＵＣ−Ｈ、３４４Ａ、３４４Ｖ、３４４Ｉ、４２５Ｌ、４３８Ｇ、５３２Ｒ、４２５Ｌ＋４３８Ｇ、４２５Ｌ＋５３２Ｒ、４３８Ｇ＋５３２Ｒ、４２５Ｌ＋４３８Ｇ＋５３２Ｒ、３４４Ａ＋４２５Ｌ＋４３８Ｇ、４４０Ａを作製した。それぞれ変異ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを導入した形質転換体を５０ μｇ／ｍＬ アンピシリンを含むＬＢ培地中２ｍＬに植菌し、３７℃で好気培養を行った。培養条件は回転数１２０ｒｐｍ、３７℃で３時間培養し、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、その後は３０℃で４時間誘導発現を行った。
集菌した菌体は、生理食塩水によって洗浄を行い、得られた菌体を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波により破砕し、遠心分離によって細胞残渣を取り除いた。
得られた遠心上清について、ヒスタグ精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ −Ｈｉｓ−ｔａｇ−、東洋紡社製）を用い、プロトコールに従って精製し、以下の実験に用いた。【００４９】
２．試薬
以下の物質を各濃度になるように添加溶解して調製し、実験に使用した。
（１）ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比測定用試薬（ｐＨ７．５）
６０ｍＭ  トリシン
２ｍＭ  ＥＤＴＡ
２０ｍＭ  酢酸マグネシウム
０．２ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
０．４ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン
０．１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
１μｇ／ｍＬ  ルシフェラーゼ
（２）相補鎖合成確認用発光試薬（ｐＨ７．５）
６０ｍＭ  トリシン（同仁化学社製）
２ｍＭ  ＥＤＴＡ（同仁化学社製）
２０ｍＭ  酢酸マグネシウム（和光純薬工業社製）
０．２ｍＭ  ＤＴＴ（和光純薬工業社製）
３３．８Ｕ／ｍＬ  ＰＰＤＫ（キッコーマン社製）
６５８．８ＧＬＵ／ｍＬ  ルシフェラーゼ
１．８Ｕ／ｍＬ  アピラーゼ（シグマ社製）
０．４ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン（ＹＭＣ社製）
０．０８ｍＭ  ホスホ（エノール）ピルベート・３Ｎａ（シグマ社製）
０．４ｍＭ  ＡＭＰ（オリエンタル酵母社製）
０．１％  ＢＳＡ（シグマ社製）
（３）ＡＴＰ溶液
１×１０−７Ｍ  ＡＴＰ（オリエンタル酵母社製）
（４）ｄＡＴＰ溶液
１×１０−５Ｍ  ｄＡＴＰ溶液（ＧＥライフサイエンス社製）【００５０】
３．ＡＴＰ、ｄＡＴＰに対する反応性の測定
各種ルシフェラーゼを含むＡＴＰ／ｄＡＴＰ比測定用試薬を作製した。ＡＴＰ測定では、０．１ｍＬ  ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比測定試薬に０．１ｍＬの１×１０−７Ｍ  ＡＴＰを添加し、添加直後の発光量をルミテスターＣ−１００Ｎにて測定した。ｄＡＴＰ測定では、０．１ｍＬ  ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比測定用試薬に０．１ｍＬの１×１０−５Ｍ  ｄＡＴＰを添加し、添加直後の発光量をルミテスターＣ−１００Ｎにて測定した。ＡＴＰ添加時の発光量を１００倍した値を、ｄＡＴＰ添加時の発光量で割った値を「ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比」として示した。測定は２５℃において行った。
その結果を下記に示した。
2009066673.tif 000002
【００５１】
北米産ホタルルシフェラーゼ（野生型）ではＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が１００、ＬＵＣ−Ｔでは、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が２５０、ＬＵＣ−Ｈでは、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が１６０であった。また、ＬＵＣ−Ｈにヒスチジンタグを挿入したＨｉｓ−ＬＵＣ−Ｈでは、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比は、ＬＵＣ−Ｈとほぼ同等の１７０であり、ヒスチジンタグの挿入は、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比に影響しないことが明らかになった。【００５２】
それに対して、ＬＵＣ−Ｃ、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が４３０、４２５Ｌで５００、５３２Ｒでは４００であった。４３８Ｇでは５２０、４２５Ｌ＋５３２Ｇでは５９０、４２５Ｌ＋４３８Ｇでは６９０、さらには、４３８Ｇ＋５３２Ｒでは６４０、４２５Ｌ＋４３８Ｇ＋５３２Ｒでは１，３００であった。さらに３４４Ａでは、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が７，２００、３４４Ｖは４６０、３４４Ｉは７２０、３４４Ａ＋４２５Ｌ＋４３８Ｇは、１６，０００、４４０Ａは２４０であった。【００５３】
ＬＵＣ−Ｃは、耐熱性等の安定性に優れ、しかも触媒効率の高いルシフェラーゼとして知られている（特許文献：特願平１０−５４８５９４）が、ｄＡＴＰに対する反応性について調べられた報告はなく、今回、本酵素がｄＡＴＰに対して反応性が低い酵素であることをはじめて見出した。【００５４】
３４４Ａは、ヘイケボタルの３４４位（北米産ホタルでは３４２位に相当）のロイシンをアラニンに変更したルシフェラーゼである。本酵素に類似する酵素として、ブランチーニらの報告には、北米産ホタルの３４２位のロイシンをアラニンに変更することにより、発光ピークは下がるが、半減期が長い発光パターンとなることが明らかにされている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第４２巻、ｐ．１０４２９）が、ｄＡＴＰに対する反応性について調べられた報告はなく、今回、本酵素がｄＡＴＰに対して反応性が低い酵素であることをはじめて見出した。【００５５】
４２５Ｌ、４３８Ｇ、５３２Ｒ、４４０Ａまたはそれらの組み合わせを含む変異ルシフェラーゼに関しては、発光強度が増強される変異として報告されている（特許文献：特開２００７−９７５７７号公報）が、これらに関してもｄＡＴＰに対する反応性について調べられたものではなく、今回、これらの酵素がｄＡＴＰに対して反応性が低いことをはじめて明らかにした。【００５６】
４２５Ｌ（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比  ５００）と４３８Ｇ（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比  ５２０）の変異を組み合わせた４２５Ｌ＋４３８Ｇでは、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が６９０となり、４２５Ｌと５３２Ｒ（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比  ４００）を組み合わせた４２５Ｌ＋５３２Ｒでは、５９０となり、４３８Ｇと５３２Ｒを組み合わせた４３８Ｇ＋５３２Ｒでは、６４０となる。また、これら３つの変異を組み合わせた４２５Ｌ＋４３８Ｇ＋５３２Ｒでは１，３００となる。さらに３４４Ａ（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比  ７，２００）に、４２５Ｌと４３８Ｇを組み合わせた３４４Ａ＋４２５Ｌ＋４３８Ｇでは、１６，０００となっていることから、ｄＡＴＰに対して反応性が低くする効果がある変異を組み合わせることにより、ｄＡＴＰに対する反応性がより低い変異体を得ることができることも明らかにした。【００５７】
すなわち、４４０Ａ（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比  ２４０）のように、変異前と比較するとｄＡＴＰに対する反応性は低くなっているが、単独ではその効果が小さいと思われる変異体であっても、他の同様の効果があるルシフェラーゼと組み合わせることにより、効果が大きくなると考えられる。【００５８】
（本発明のルシフェラーゼを用いた核酸分析）
ＰＰＤＫを用いたピロリン酸測定法を用いたパイロシーケンシング法により核酸分析法において実施した。実施例により本発明を詳細に説明するが、実施例は本発明を何ら限定するものではない。【００５９】
ＬＵＣ−Ｈ、ＬＵＣ−Ｔ、ＬＵＣ−Ｃ、４２５Ｌ＋４３８Ｇ変異体、３４４Ａ変異体、及び３４４Ａ＋４２５Ｌ＋４３８Ｇ変異体を用いて、相補鎖合成確認用発光試薬を作製した。０．１００ｍＬの相補鎖合成確認用発光試薬に、０．００２ｍＬの５×１０−６Ｍの分析用テンプレートＤＮＡ（配列番号２０）（終濃度５×１０−８Ｍ）、０．００２ｍＬの５×１０−６Ｍの分析用プライマーＤＮＡ（配列番号２１）（終濃度５×１０−８Ｍ）を添加し、さらに、０．００２ｍＬの５０００Ｕ／ｍＬ  Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｃｌｏｎｅｄ）（Ａｍｂｉｏｎ社製、終濃度５０Ｕ／ｍＬ）を加え、超純水を加え、０．２ｍＬとし、３７℃で加温した。測定は、０．０３ｍＬの１×１０−５Ｍ  ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰ（０．１Ｕ／ｍＬ  ピロホスファターゼを含む）を添加し、そのときの発光量の経時変化をＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０７（ベルトールド社製）にて、１秒間隔で６０秒間測定した。【００６０】
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰは、分析用テンプレートＤＮＡ、分析用プライマーＤＮＡの３０倍量になるように添加した。【００６１】
分析用テンプレートＤＮＡと分析用プライマーＤＮＡは、ｄＣＴＰを添加すると１塩基分相補鎖合成して、発光を示し、他のヌクレオチドでは、相補鎖合成しない配列になっている。【００６２】
各種のルシフェラーゼを用いて１塩基の相補鎖合成を行ったときの発光量の経時変化を測定した。ＬＵＣ−Ｈ（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比  １６０）では、鋳型ＤＮＡの３０倍量のｄＡＴＰを加えた場合、ｄＣＴＰの場合の最大値を示す添加６秒後の発光量は、約１２０％であった。同様に、ＬＵＣ−Ｔ（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比  ２５０）では８９％であり、ｄＡＴＰに起因するバックグラウンド発光と相補鎖合成に由来する発光が容易に区別できるとは言えない。【００６３】
しかしながら、ＬＵＣ−Ｃ（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比  ４３０）ではｄＡＴＰ添加時の発光量が４３％、４２５Ｌ＋４３８Ｇ（ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比  ６９０）では３８％となり、５０％以下となることから、ｄＡＴＰに起因するバックグラウンド発光と相補鎖合成に由来する発光が容易に区別できるようになる。【００６４】
使用するルシフェラーゼのＡＴＰ／ｄＡＴＰ比がさらに大きくなるにつれて、ｄＡＴＰ添加時の発光量は低くなり、３４４Ａ（ｄＡＴＰ／ＡＴＰ比  ７，２００）、３４４Ａ＋４２５Ｌ＋４３８Ｇ（ｄＡＴＰ／ＡＴＰ比  １６，０００）では、ほとんど発光は見られなかった。【００６５】
各種ルシフェラーゼのＡＴＰ／ｄＡＴＰ比の逆数、すなわち、ｄＡＴＰ／ＡＴＰ比と相補鎖合成試験におけるｄＡＴＰ添加時発光量との関係を図１に示した。図１を見ると、ｄＡＴＰ／ＡＴＰ比とｄＡＴＰ添加時の発光量は比例関係にあり、近似直線の傾きは２０，０００であった。【００６６】
相補鎖合成に起因する発光量とｄＡＴＰに起因する発光量を明確に区別するためには、相補鎖合成時の発光量に対するｄＡＴＰによる発光量の割合が、ピーク発光量で約５０％以下、好ましくはピーク発光量で約１０％以下である必要がある。【００６７】
また、ゲノム配列においては、同じ塩基配列が１０塩基程度連続する配列がしばしば存在することから考えて、ｄＮＴＰが不足することなく、正確に塩基配列を解読するには、その鋳型ＤＮＡの３０倍、望ましくは６０倍、さらに望ましくは１００倍のｄＮＴＰを添加する必要がある。【００６８】
図１の結果から、ｄＡＴＰの添加量を鋳型核酸の３０倍とした場合、ｄＡＴＰに起因するバックグラウンド発光を５０％以下にするには、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が４００以上、１０％以下にするには、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が２，０００以上のルシフェラーゼを使用する必要があることがわかる。【００６９】
また、ｄＡＴＰの添加量とそれに起因するバックグラウンド発光量は比例関係にあるので、ｄＡＴＰの添加量を鋳型ＤＮＡの６０倍とした場合、５０％以下、１０％以下にするには、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が、それぞれ、８００以上、４，０００以上、１００倍の場合、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が１，３００、６，７００以上のルシフェラーゼを使用する必要がある。【００７０】
これまで、北米産ホタルルシフェラーゼやＬＵＣ−ＨのようにＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が４００以下のルシフェラーゼを使用した例は報告されているが、ＡＴＰ／ｄＡＴＰ比が４００以上のルシフェラーゼを用いて塩基配列解析を実施した報告はない。【００７１】
発明者らは、ｄＡＴＰに対して反応性が低いルシフェラーゼを使用することにより、ｄＡＴＰに起因するバックグラウンド発光を低く抑えることが可能であることを見出し、安価で、安定した相補鎖合成が可能なｄＡＴＰを使用しながらも、高精度な核酸分析を可能にした。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によれば、ｄＡＴＰによるバックグラウンド発光の影響が抑えられることから、ｄＡＴＰαＳのような高価な試薬を用いる必要がなく、安価で高精度かつ高感度な核酸分析を行うことができる。
【図１】
2009066673.tif 000003
【配列表】
2009066673000001.app
【国際調査報告】
2009066673.tif 000004
2009066673.tif 000005
2009066673.tif 000006
2009066673.tif 000007