(57)【要約】  細胞及び／又は核移植ユニット及び／又は幹細胞を、培養においてそのような化合物を個々に若しくは組合せで用いて処理する方法が記述されている。その方法により、ゲノムは包括的に低メチル化され、細胞の分化及び／又は発生能若しくは可能性は回復される。さらに、ゲノムを脱メチル化することにより回復された分化能（全能性、多能性、又は多分化能性）を得た再プログラムされた細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製する方法が記述されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞を再プログラムする方法であって：
（ａ）前記真核細胞におけるＳ−アデノシルメチオニン対Ｓ−アデノシルホモシステイン比（ＳＡＭ対ＳＡＨ比）を減少させるステップを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって：
（ｂ）前記真核細胞内のＤＮＡにおける５−メチルシトシンのレベルを減少させるステップをさらに含む方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）及び（ｂ）を同時に行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、前記真核細胞内のＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性を特異的に抑制することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）が、前記細胞をＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害物質に接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）が、抑制に効果的な量の、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するために必要な大きさで形成された低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）に前記細胞を接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）が、ＳＥＱＩＤ番号：１乃至４１からなる群から選択されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）が、前記真核細胞内のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）が、前記細胞内のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的なある量のレチノイン酸に前記細胞を接触させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＡＭ対ＳＡＨ比を０．１以下まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＡＭ対ＳＡＨ比を０．５以下まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＡＭ対ＳＡＨ比を１．００以下まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
真核細胞を再プログラムする方法であって：
（ａ）真核細胞内のＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性を特異的に抑制するステップ；並びに、同時に、
（ｂ）前記真核細胞内のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性を増加させるステップ；
を含む方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）が、抑制に効果的な量の、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）が、抑制に効果的な量の、細胞内のＤＮＡにおける５−メチル化シトシンを少なくとも約５％だけ減少するよう抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡにその前記細胞を接触させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）が、前記細胞内のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的なある量のレチノイン酸に前記細胞を接触させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）が、オールトランスレチノイン酸に前記細胞を接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）が、レチノイン酸受容体に結合する化合物に前記細胞を接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）及び（ｂ）と同時に、（ｃ）５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ並びにシスタチオン（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータシンターゼからなる群から選択された前記細胞内の酵素の発現、活性、又は発現及び活性を特異的に抑制するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
ＳＥＱＩＤ番号：１乃至４１からなる群から選択されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
真核細胞における分化能を変更する方法であって、当該方法は、ある量のｓｉＲＮＡに前記真核細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含み、前記ｓｉＲＮＡは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するために必要な大きさで形成されるが、ただし、前記ｓｉＲＮＡはグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現を抑制せず、さらに、前記量は、ゲノム全域にわたるＤＮＡ脱メチル化を誘導するのに効果的であり、細胞の分化能が増加する方法。
【請求項２２】
前記真核細胞が、幹細胞、前駆細胞、体細胞、及び体細胞核移植に提起された細胞（ＮＴ細胞）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（Ｄｎｍｔ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（Ｄｎｍｔ３ａ）、及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（Ｄｎｍｔ３ｂ）からなる群から選択されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的なある量の化合物に前記細胞を接触させることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
レチノイン酸に前記細胞を接触させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
オールトランスレチノイン酸に前記細胞を接触させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ｓｉＲＮＡ及びオールトランスレチノイン酸を組合せで含む組成物に前記細胞を接触させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
分化細胞における分化能を増加させる方法であって、当該方法が、組成物に分化細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含み、前記組成物は：
（ｉ）ノックダウンに効果的な量の低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）であって、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡ；
（ｉｉ）ノックダウンに効果的な量の、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ及びシスタチオン（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータシンターゼからなる群から選択された酵素の発現を抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡ；並びに、
（ｉｉｉ）グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的な化合物；
の組合せを含み、
前記細胞内のゲノム全域にわたるＤＮＡ脱メチル化を誘導するのに効果的な時間の間、前記組成物に前記細胞を接触させ、それによって細胞の分化能が増加する、方法。
【請求項２９】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（Ｄｎｍｔ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（Ｄｎｍｔ３ａ）、及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（Ｄｎｍｔ３ｂ）からなる群から選択されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡを含む組成物に前記細胞を接触させることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的な前記化合物がレチノイン酸である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的な前記化合物がオールトランスレチノイン酸である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ＳＥＱＩＤ番号：１乃至４１からなる群から選択されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
細胞の発生能を決定する方法であって、当該方法が、前記細胞におけるＳＡＭ対ＳＡＨ比を決定することを含み、約１．０未満のＳＡＭ対ＳＡＨ比は、前記細胞の発生能が増加されたことを示す、方法。
【請求項３４】
前記細胞のＤＮＡに存在するシトシン残基のメチル化を測定することをさらに含み、約１０％未満のメチル化は、前記細胞の発生能が増加されたことを示す、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞における分化能を調節する方法であって：
（ａ）前記細胞におけるＳＡＭ対ＳＡＨ比を約１．０未満に維持するステップ；及び、
（ｂ）前記細胞のＤＮＡにおけるシトシン残基のメチル化を約４０％未満に維持するステップ；
を含む方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって：
（ａ）前記細胞における前記ＳＡＭ対ＳＡＨ比を約０．５未満に維持するステップ；及び、（ｂ）前記細胞のＤＮＡにおけるシトシン残基のメチル化を約２０％未満に維持するステップ；
を含む方法。
【請求項３７】
分化細胞における分化能を増加させるための細胞培地であって、前記分化細胞は当該培地内に配置され、前記細胞の生存率を維持するのに十分な基本培地を、当該細胞培地に存在するメチル供与体の活性を減少させる因子と組み合わせて含む細胞培地。
【請求項３８】
前記因子が、ホモシステイン及びオールトランスレチノイン酸からなる群から選択される、請求項３７に記載の細胞培地。
【請求項３９】
前記因子が、抑制に効果的な量の、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡである、請求項３７に記載の細胞培地。
【請求項４０】
細胞分化に影響を及ぼす化合物を同定する方法であって：
（ａ）細胞のＤＮＡにおいてメチル化されたシトシンの割合を少なくとも約５％だけ減少させるステップであり、前記細胞が前記減少の前に第一の表現型を有する、ステップ；
（ｂ）前記細胞におけるＳＡＭ対ＳＡＨ比を約１．０未満に減少させるステップ；次に、
（ｃ）細胞の分化に影響を及ぼすのではないかと思われる化合物に前記細胞を接触させるステップ；及び、
（ｄ）前記細胞の第一の表現型を、ステップ（ｃ）後の前記細胞の表現型と比較するステップであって、第一の表現型とは異なる表現型のステップ（ｃ）後の出現は、前記化合物が細胞分化に影響を及ぼすことを示す、ステップ；
を含む方法。
【請求項４１】
ステップ（ａ）が、前記細胞の前記ＤＮＡにおけるメチル化されたシトシンの割合を少なくとも約５％だけ減少させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ａ）が、前記細胞の前記ＤＮＡにおけるメチル化されたシトシンの割合を約１０％だけ減少させることも含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、転写における変化をモニターするためにレポーターシステムを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記レポーターシステムが、ルシフェラーゼ活性、ベータラクタマーゼ活性、及びベータガラクトシダーゼ活性からなる群から選択された酵素活性の存在を測定する、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、細胞生物学、幹細胞、細胞分化、体細胞核移植、及び細胞を基にした薬物療法学の分野に関する。より明確には、本発明は、細胞再プログラミング及び細胞を基にした薬物療法学のための方法並びに生成物に向けられている。単離及び培養の方法、並びに、単離された細胞の治療用途も提供されている。
【背景技術】
【０００２】
最近の食餌研究により、メチル基供与体の状態、一炭素代謝、及びＤＮＡメチル化の間における相互作用が説明されてきた[１〜１２]。ＤＮＡメチル化は、発生の状態及び分化能に関与している[１３〜１９]。さらに、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）により誘導された再プログラミング及び通常の受精と関連した再プログラミングのための明確な必要条件は、ＤＮＡ脱メチル化である[２０]。これに関しては、以下の背景技術により検討されている。
【０００３】
多細胞生物の発生の間、細胞及び組織によって、得られる遺伝子発現のプログラムは異なる。これらの異なる遺伝子発現パターンは、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及び種々のクロマチン結合蛋白質等のエピジェネティックな修飾により実質的に調節されているように思われる[２１、２２]。このように、多細胞生物内の各細胞型は、細胞が分化する又は細胞周期を抜けると「確定」になると考えられている特有のエピジェネティックな特徴を有している。
【０００４】
しかし、一部の細胞は、正常な発生又はある種の疾患状態中に、主要のエピジェネティックな「再プログラミング」を行う。再プログラミングは、核におけるエピジェネティックマークの除去を必要とし、その後、異なるマークの確立が起こる[２３〜２５]。例えば、受精時に、配偶子のエピジェネティックマークが消去され、分化全能性及び胚発生に必要とされる胚のマークと置き換えられる。再プログラミングは、親由来のインプリントが消去され、分化全能性を回復する始原生殖細胞においても起こる。癌細胞及び分化転換する細胞も、再プログラミングを行うと考えられている。最後に、劇的な再プログラミングは、生殖クローニング及び幹細胞治療の目的のために、ＳＣＮＴに続いて必要とされる[２６〜３３]。
【０００５】
最近では、正常発生及びＳＣＮＴにおけるエピジェネティックな再プログラミングに対する新たな見識が得られてきた。再プログラミングの機構及び必要とされる因子に対する見識は未だに基本的であるが、基礎知識は、今や、より詳細な概念を発展することができ、新規の商業的機会を提供するであろう機械論的な態様を調査するために新規の実験的アプローチを考案できる段階に達している。ｉｎ  ｖｉｖｏ（受精及び胚形成）及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにより誘導されたＳＣＮＴ再プログラミングの簡潔な要約は以下に続く。
【０００６】
エピジェネティックな再プログラミング及び発生
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ再プログラミング−受精：
ＤＮＡメチル化：マウスでは、受精時に、親ゲノムは、独特なエピジェネティックマーク及びクロマチン組織を有する種々の細胞周期の段階にある。成熟した精子により伝えられた父系ゲノムは、単一のコピーであり、プロタミンと共に密に凝縮されている。母系のゲノムは、中期ＩＩで止められ、その２つのコピーゲノムがヒストンと共に凝縮されている。受精の際、プロタミンはヒストンに置き換えられ、母系ゲノムは減数分裂を完了する。ヒストン獲得後、親ゲノムは、間接的な免疫蛍光検査[３４]及び重亜硫酸塩のシークエンシング[３５]により検出されるように、ゲノム全体にわたるＤＮＡメチル化の喪失を受ける。ＤＮＡ複製が親の前核で始まる前に、脱メチル化は完了する。しかし、ゲノムの全領域がこの段階で脱メチル化されるわけではないことに注目すべきである。卵母細胞の細胞質は、精子のクロマチンにおける特定の配列種類を特異的に標的にする又は除外する脱メチル化因子を含むと信じられている。
【０００７】
ヒストン修飾：母系クロマチンは組織化され、ＤＮＡメチル化及びクロマチン修飾は受精時に豊富になる。これらは、活性及び抑圧的な状態に関連する核ヒストン修飾もクロマチン蛋白質も含む。例えば、主としてアセチル化リジン及びＨ３Ｋ４ｍｅ等の活性な状態に関連するヒストン修飾は、女性の前核に存在している[３４、３６、３７]。Ｈ３Ｋ９ｍｅ２／３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、及びＨ４Ｋ２０ｍｅ３等の、主として抑圧的なクロマチン状態に関連する異質染色質の修飾も存在する。
【０００８】
男性の前核に関連するヒストンは、非常にアセチル化されている[３４、３６]。しかし、ヒストンの取込み後すぐに、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ９ｍｅ１、及びＨ３Ｋ２７ｍｅ１は検出可能である[３７〜３９]。これは、ＤＮＡメチル化が男性の前核内になお存在している場合に起こる。親ゲノムに起こっている進行性のヒストン修飾は、母系ゲノムと同等のクロマチン状態をおそらく生じている。
【０００９】
着床前発生
受動的な脱メチル化：マウスでは、１つの細胞から胚盤胞期まで、包括的なＤＮＡメチル化においてさらなる変化がある。ＤＮＡメチル化は卵割毎に次第に減少し、この喪失はＤＮＡ複製に依拠している[４０、４１]。卵母細胞から受け継いだＤＮＭＴ１蛋白質であるＤｎｍｔ１ｏは、始めの３つの卵割中に除外され[４２、４３]、受動機構によるメチル化の喪失の原因となる。
【００１０】
ヒストン修飾：ヒストン修飾が受動ＤＮＡ脱メチル化中に再プログラミングされる程度は、現在は明らかではない。
【００１１】
エピジェネティックな非対称及び細胞系譜へのコミットメント
メチル化：哺乳動物の胚形成における最初の細胞系譜分配の事象は、桑実期で起こり、胚盤胞において内部細胞塊（ＩＣＭ）及び栄養外胚葉（ＴＥ）を形成する。細胞運命決定の機構は、知られていない。興味深いことに、２細胞割球はまだ全能性であるが、第４細胞期までに（マウスにおいて）、細胞系譜バイアスは減少する全能性に基づいて存在する[４４]。胚外細胞系譜と胚の細胞系譜のＤＮＡメチル化における包括的な違いが検知され、その違いは、早くも、能動及び受動な脱メチル化の組合せがＴＥにおいてメチル化の低状態を生じる胚盤胞期で検知可能である。これとは対照的に、ＩＣＭでは、ＤＮＭＴ３ｂによりおそらく引き起こされる新規のメチル化のために、包括的なメチル化のレベルが増加される。そのＤＮＭＴ３ｂは、新規のＤＮＡメチルトランスフェラーゼであり、ＴＥではなく胚盤胞ＩＣＭで検知可能である[３４]。
【００１２】
ヒストン修飾：マウスでは、ヒストンＨ３Ｋ９ｍｅ３はＩＣＭ内で異質染色質の病巣を標識し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、ｍｅ２、及びｍｅ３はＴＥよりもＩＣＭ内でより豊富である[３８]。不活性なＸ染色体及び特定のインプリントされた領域は、Ｈ３２７ｍｅ及びＨ３Ｋ９ｍｅによりＴＥ内で標識される。通常、ＤＮＡメチル化のように、ＴＥと比べてより高いレベルの特異的で抑圧的なヒストンメチル化マークがＩＣＭ内でも発見される。このようにして、エピジェネティックな非対称は発生のために必要とされる。
【００１３】
体細胞核移植：実験的にエピジェネティックマークを改変する１つの方法は、ＳＣＮＴ又はクローニングによるものである。ＳＣＮＴでは、核ＤＮＡ材料が除去されている（「除核」と呼ばれることが多い）卵母細胞環境において、分化した体細胞核が全能性の状態へと再プログラムされることが必要とされる。多様な種由来のクローン化された胚及び成体において調べられた全てのエピジェネティックマークは異常を示し、大部分のＳＣＮＴ胚も所有する明確なエピジェネティック特性において互いに異なることから、ＳＣＮＴにより誘導されたエピジェネティックな再プログラミングは、偶然で確率的な過程であると示されている[３０〜３３，４５]。
【００１４】
さらに、ＳＣＮＴ胚の発生は非常に変わりやすく、大多数が発生の全ての段階で死滅し、生き残っても種々の異常を有してしまう。後の妊娠の段階または期間まで発達したものの多くが、胎盤異常を有し、子宮外の生活に対する乏しい順応力から、相当な割合が周産期に死滅する。クローン化された動物の子孫は正常であると思われるため、大部分のクローンにおける発生上の問題は、おそらく、エピジェネティックな欠陥により引き起こされる。ＳＣＮＴ胚の発生の異常もエピジェネティックな異常も、調査されるのが早いほどより深刻な傾向があり、異常の少ないものが後の段階まで生き残る[４６]。
【００１５】
クローン化された子孫及びＳＣＮＴ胚において記述されたエピジェネティックな欠陥には、Ｘ不活化[４７、４８]、インプリンティング[４９〜５１]、ＤＮＡメチル化（包括的な遺伝子座も特定の遺伝子座も）[３６、４７、５２、５３]、ヒストンアセチル化[４３]、メチル化[４３]、並びに、鍵となり多能性及び発生的に重要な遺伝子であるＯｃｔ４の再活性化の失敗[５５〜５７]などを含む遺伝子発現の変化[５４]における誤りが挙げられる。
【００１６】
従って、ＳＣＮＴにより誘導される再プログラミングは、少なくとも２つの重要な必要条件を有していると思われる。その条件とは、核蛋白質の除去及び体細胞ＤＮＡの脱メチル化であり、後者が最も重要であることは明らかである。例えば、ソモンソン（Ｓｏｍｏｎｓｓｏｎ）＆ガードン（Ｇｕｒｄｏｎ）は、メチル化された体細胞核がマウス胸腺細胞からツメガエル卵母細胞に注入された場合、Ｏｃｔ４発現のかなりの遅れを観察した[２０]。その遅れは、核が核移植に先だって除蛋白された場合に減少した。しかし、例えばバクテリアプラズミド等のメチル化されていないＤＮＡが注入された場合、検知可能な遅れはなかった。これは、全ての抑圧的蛋白質が核から除去された場合に、実質的な遅れはなお起こり、ＤＮＡは、転写が続いて起きる前に、脱メチル化されなければならないことを示している。さらに、Ｄｎｍｔ１の低形質の対立遺伝子を使用して、ブレロッヒ（Ｂｌｅｌｌｏｃｈ）等は、ドナー体細胞の脱メチル化が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのクローニングの能率を良くし、胚性幹細胞の作製を改善したことを実証した。それにより、分化された細胞の分化及び発生能の回復は、減少されたＤＮＡメチル化により可能になることが示されている[１３６]。
【００１７】
ＤＮＡからメチル化を除去する機構は理解されていない：ＤＮＡからのメチル化（又は、そのためにヒストン）の除去は、機械論的に理解されていない。接合体における親ゲノムのＤＮＡメチル化の喪失は、おそらく、酵素により触媒された活性な脱メチル化になることである。卵母細胞も、移入された体細胞核を積極的に脱メチル化でき、活性が存在していると示唆している。直接シチジン環のＣ５位置にあるメチル基を除去する（直接脱メチル化）、又は、シチジン基から除去する（間接脱メチル化）いくつかの候補生化学経路が提案されてきた。現在まで、メチル基を除去する明白な方法は、記載されておらず、確証されてもいない。
【００１８】
脱メチル化への間接的な経路は、ＤＮＡ修復を必要とする：例えば、チミジンＤＮＡグリコシラーゼ等のＤＮＡグリコシラーゼ及びメチル結合ドメイン蛋白質４は、通常、５ｍｅＣの自発性脱アミノ化から生じると考えられているＴ：Ｇ不適正塩基対を修復する。より最近では、活性化により誘導されたシチジンデアミナーゼ及びシチジンデアミナーゼであるＡｐｏｂｅｃ１が５ｍｅＣをＴに脱アミノ化し、これらの酵素が卵母細胞及び生殖細胞において発現されていることが示されてきた。塩基除去修復と連結されたシチジンデアミナーゼのこの活動により、理論上は、ＤＮＡ複製は無くても脱メチル化できるが、それでも、初期の接合体において大規模な塩基除去修復が必要とされる。
【００１９】
環境因子：拡大する根拠の主体から、食餌等の変更可能な環境因子がＤＮＡメチル化に影響を及ぼすことができると示唆されている。例えば、メチルが補われた食餌を出生前に摂食することにより、子孫におけるＤＮＡメチル化及び遺伝子の表現型発現のレベルを増加することができる。マウスにおける毛色は、アグーチ遺伝子発現により決定される。これは、毛包におけるアグーチ遺伝子の末端反復配列のＤＮＡメチル化状態により決定される。この領域が過剰メチル化されている場合、マウスは野ネズミ色であり、マウスが低メチル化である場合、マウスは黄色である。妊娠中の雌マウスが、亜鉛、メチオニン、ベタイン、コリン、葉酸、及びビタミンＢ１２が豊富のメチルが補われた食餌を与えられた場合、アグーチ末端反復配列のメチル化状態に変更があり、黄色の毛を持つ子はできなかった[５８]。このように、子宮内での栄養分への曝露により、子孫におけるゲノムのエピジェネティックな修飾は生じうる。
【００２０】
ＤＮＡメチル化における葉酸の役割：水溶性のＢ−ビタミンである葉酸は、ＤＮＡメチル化状態において重要で調節的な役割を果たしている。葉酸の唯一の生化学的機能は、一炭素部分の移動の媒介となることであり[５９〜６１]、従って、一炭素代謝において中心的役割を担っていることである。葉酸の欠乏がネズミの肝臓にゲノム及び遺伝子特異的低メチル化を引き起こし、その程度は葉酸の減少の激しさ及び期間に依拠しているように思われることが、動物試験によりさらに示されてきた[６２、６３]。ＤＮＡ低メチル化は、低葉酸食餌のヒトのリンパ球においても確認され、葉酸過多により逆になることもできる[６４]。しかし、ＤＮＡメチル化に関する葉酸の欠乏の効果は、非常に複雑でもある。例えば、葉酸の欠乏は、ＤＮＭＴ１の減少の有無を問わず、正常若しくは腫瘍性組織において、全体のゲノムＤＮＡメチル化レベル、又は、２種類の候補遺伝子、Ｅ−カドヘリン及びｐ５３のメチル化レベルに影響を及ぼさなかった。
【００２１】
一炭素代謝
ＤＮＡメチル化の調節におけるＳＡＭ：ＳＡＨ比の重要性及び栄養分の役割：栄養分の入手可能性は、ＤＮＡメチル化の調節において重要な役割を果たすことができる。さらに、一炭素代謝に関与する因子も、メチル基の供給、従って、メチル化の過程の生化学経路に影響を及ぼすことから、メチル化状態においておそらく重要な役割を果たす。食餌から供給された、コリン及びメチオニン形状のメチル基、又は、葉酸依存性一炭素プールから供給されたメチル基は、メチル基転移反応において基質として働くために、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に活性化されなければならない。Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）はメチル基転移反応の生成物及びＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼの強力な阻害物質であるため、ＳＡＭ：ＳＡＨの比は、メチル基転移能力の重要な指標である[６５、６６]。割合が高い場合、メチル化の可能性は高い。割合が低い場合、メチル化の可能性は低い。葉酸の欠乏のみで、ＳＡＭプールを減少させるために十分な摂動力であることは周知である。このことにより、ＳＡＨ−ホモシステイン相互変換の平衡は実際にＳＡＨ合成を好むために、ＳＡＨの細胞レベルは増加する。従って、ホモシステイン代謝が阻害された場合に、葉酸欠乏のように、細胞ＳＡＨレベルは増加する。増加したＳＡＨは、メチルトランスフェラーゼの活性を阻害し、その結果、ＤＮＡメチル化反応を阻害する。
【００２２】
グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）がメチル基転移反応を最適化する：細胞質酵素ＧＮＭＴは、ＳＡＭ：ＳＡＨ比の調節によりメチル基転移反応を最適化するために機能する。メチル基が豊富で、ＳＡＭレベルが上げられた場合、ＧＮＭＴは、グリシンからサルコシンを形成することにより、過剰のメチル基を処分する。ＳＡＭも、５−メチルテトラヒドロ葉酸（５−メチル−ＴＨＦ）の合成を司る酵素である５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）を阻害することにより、一炭素プールから生じたメチル基の供給を減少させる[６７、６８]。５−メチル−ＴＨＦは、そのメチル基をホモシステインに供与してメチオニンを形成する葉酸補酵素である。５−メチル−ＴＨＦはＧＮＭＴにも結合してその活性を阻害するため[６９、７０]、ＳＡＭによるＭＴＨＦＲの阻害のために生じる５−メチル−ＴＨＦレベルの減少により、ＧＮＭＴの活性は増加する。ＧＮＭＴを活性化する因子は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含むメチルトランスフェラーゼを下方調節する。
【００２３】
現在まで、培養における細胞のＧＮＭＴの活性化がＤＮＡメチル化を減少するという仮説を検証したという報告はない。しかし、いくつかの報告には、齧歯類におけるＧＮＭＴの食餌操作が記載されている[７１〜７３]。例えば、ビタミンＡ及びビタミンＡ誘導体、例えばオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）が補足された食餌は、ネズミの肝細胞におけるＧＮＭＴ活性及び低メチル化のＤＮＡを増加し、食餌性葉酸、コリン、ベタイン、及びビタミンＢ６＆１２における減少も、特定の組織においてＤＮＡメチル化を減少させた。このように、メチオニンの操作により成分は循環され、メチル供与体の栄養分入手可能性を調整することにより、ＤＮＡを脱メチル化する及び能力を回復するために可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法が表されている。現在までに、一炭素代謝に関与する成分を改変すること、栄養分の入手可能性を変更すること、及び／又は、ＧＮＭＴを変更することにより、再プログラムする又は再プログラミングの能力を変更する先の試みは報告されていない。
【００２４】
細胞の再プログラミングを誘導する最新の方法：哺乳動物における細胞の再プログラミングを誘導する最新の方法は、核再プログラミング、細胞抽出物に対するより少ない程度の曝露、細胞型の融合、及び核蛋白質の除去を含むＳＣＮＴに主として依拠している。しかし、これらの方法のうち、能率のよい再プログラミングに必要とされるＤＮＡメチル化レベルの減少における主要な律速段階を克服したものはない。
【００２５】
核再プログラミング非能率：一般的に能率が悪い又は遅い核再プログラミングは、クロマチンの状態及び特にＤＮＡの脱メチル化に依拠している。例として、ＳＣＮＴクローニングには、ドナー細胞遺伝子発現を停止させ、胚パターンの遺伝子発現を活性化させるために、遺伝子発現の能率のよい再プログラミングが必要とされる。再プログラミングは、ＳＣＮＴの直後に起こる早期の事象によって開始される可能性があるが、発生が卵割及びおそらく原腸形成を介して進むに従い次に続いていくということが最近の観測により示されている。再プログラミングは遅い進行性であるため、ＮＴユニットは受精した胚に比べて特徴を劇的に変更する。
【００２６】
上記の核移植の方法は、業界では一般的に既知であり、幹細胞の分化を導くために適用されてきた、又は、適用されている。しかし、ほぼ全ての適用が、核移植技術に依拠している。ゲロン（Ｇｅｒｏｎ）（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）は、胚性幹細胞を使用して神経細胞及び心筋細胞を作製し、幹細胞を操作して他種の組織を作製することに前進を遂げてきた。Ｉｎｆｉｇｅｎ．Ｉｎｃ．社（ＤｅＦｏｒｅｓｔ  ＷＩ）も、家畜クローニング応用に初めて導いたいくつかの核移植特許を受けた。
【００２７】
核移植の能率を増進するための他の試みにおいて、ＭＩＴ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのラドルフ  ヤニッシュ博士（Ｄｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ）は、ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して、特に核移植における核再プログラミングの分子分類基準を確立した。ヤニッシュ博士の第一焦点は、癌等のヒト疾患に対して、癌を再プログラミングすること、及び、エピジェネティックな再プログラミングを改良するための戦略を計画することである。彼の主要な活動は、ＤＮＡメチル化及びメチル化されたゲノムの再プログラミングを確立する機構を理解することに焦点をあわせられた。ヤニッシュ博士は、ドナー細胞株のＤＮＭＴ１をノックアウトし、その株を用いてＮＴユニットを作製することによりメチル化が欠けている、核移植により生じたユニットを発達させることを試みている[１３６]。
【００２８】
Ｔｅｍｐｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのキース  レイサム博士（Ｄｒ．Ｋｅｉｔｈ  Ｌａｔｈａｍ）は、どのように非能率な再プログラミングはクローン化された胚に影響を及ぼすか調査している。レイサム博士の研究は、第一に、クローニング後の表現型における変化を調査するなど、生理学的なデータに焦点を合わせている[１３７、１３９]。
【００２９】
Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのケビン  エガン博士（Ｄｒ．Ｋｅｖｉｎ  Ｅｇｇａｎ）は、核移植をモデルとして用いて、どのようにして成体細胞の発生の運命は回復（再プログラム）できるのかを評価し、２００５年には、ヒト皮膚細胞を胚性幹細胞と融合させてハイブリッドを作製することにより大きく取りあげられた。そのハイブリッドは、幹細胞に類似し、幹細胞のように働き、患者に合わせた遺伝子的に匹敵する幹細胞を作製するための基板を潜在的に築いている[１３８]。
【００３０】
調査中である、幹細胞又は幹細胞様の細胞を作製するための他の方法には、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬ）のウリ  ベルリンスキー（Ｕｒｉ  Ｖｅｒｌｉｎｓｋｙ）の策略がある。ベルリンスキーは、体細胞の分子が体細胞と同じ種類の細胞へ幹細胞の分化を導くという理論のもと、体細胞を幹細胞と融合させるために細胞融合工程を用いた方法を使用している。ベルリンスキーは、伝えられるところによると、彼の新しいＳｔｅｍＢｒｉｄ（ｓｔｅｍ／ｈｙｂｒｉｄ）技術を用いて１０個の胚性幹細胞株を作製した。胚は使用されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明の目的は、細胞の包括的なＤＮＡメチル化を減少させることにより細胞分化能を回復する方法に向けられている。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、包括的に低メチル化されたゲノム並びに分化のための細胞の回復能（例えば、多能性、多分化能性、及び／又は全能性）を生じるために、培養における細胞、及び／又は核移植（ＮＴ）ユニット、及び／又は幹細胞の処置に向けられ、新しい細胞型へと分化する細胞の能力として定義されている。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明は、真核細胞を再プログラムする方法に向けられ、当該方法は、ステップ（ａ）として、真核細胞におけるＳ−アデノシルメチオニン対Ｓ−アデノシルホモシステイン比（ＳＡＭ対ＳＡＨ比）を減少させるステップを含む。ＳＡＭ対ＳＡＨ比を、０．１以下、好ましくは０．５以下、及び最も好ましくは１．００以下まで減少させることができる。ステップ（ａ）は、ＳＥＱＩＤ番号：１〜４１からなる群から選択されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることを含むことができる。さらに、ステップ（ａ）は、真核細胞内のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させることを含むことができる。ステップ（ａ）は、細胞内のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的なある量のレチノイン酸に前記細胞を接触させることも含むことができる。さらに、当該方法は、ステップ（ｂ）として、真核細胞内のＤＮＡにおける５−メチルシトシンのレベルを減少させるステップを含む。ステップ（ａ）及び（ｂ）を同時に行うことは本発明の範囲内である。ステップ（ｂ）は、真核細胞内のＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性を特異的に抑制することも含んでいる。ステップ（ｂ）は、前記細胞をＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害物質に接触させることも含むことができる。さらに、ステップ（ｂ）は、抑制に効果的な量の、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するために必要な大きさで形成された低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）に前記細胞を接触させることを含むことができる。
【００３４】
本発明は、真核細胞を再プログラムする方法にも向けられ、当該方法は、ステップ（ａ）として、真核細胞内のＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性を特異的に抑制するステップ；並びに、同時に、ステップ（ｂ）として、真核細胞内のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性を増加させるステップを含む。ステップ（ａ）は、抑制に効果的な量の、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることを含むことができる。ステップ（ａ）は、抑制に効果的な量の、細胞内のＤＮＡにおける５−メチル化シトシンを少なくとも約５％だけ減少させるよう抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることも含むことができる。ステップ（ｂ）は、細胞内のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的なある量のレチノイン酸に前記細胞を接触させることを含むことができる。ステップ（ｂ）は、オールトランスレチノイン酸に前記細胞を接触させることも含むことができる。さらに、ステップ（ｂ）は、レチノイン酸受容体に結合する化合物に前記細胞を接触させることを含むことができる。ステップ（ａ）及び（ｂ）に加えて、当該方法は、ステップ（ｃ）として、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ並びにシスタチオン（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータシンターゼからなる群から選択された細胞内の酵素の発現、活性、又は発現及び活性を特異的に抑制するステップを含むことができる。ＳＥＱＩＤ番号：１〜４１からなる群から選択されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることは、本発明の範囲内である。
【００３５】
本発明は、さらに、真核細胞における分化能を変更する方法に向けられている。当該方法は、ある量のｓｉＲＮＡに前記真核細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含む。そこで、前記ｓｉＲＮＡは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するために必要な大きさで形成されるが、ただし、ｓｉＲＮＡはグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現を抑制しない。さらに、その量は、ゲノム全域にわたるＤＮＡ脱メチル化を誘導するのに効果的であり、細胞の分化能は増加する。その真核細胞は、幹細胞、前駆細胞、体細胞、及び体細胞核移植に提起された細胞（ＮＴ細胞）からなる群から選択される。この方法は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（Ｄｎｍｔ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（Ｄｎｍｔ３ａ）、及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（Ｄｎｍｔ３ｂ）からなる群から選択されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む。当該方法は、さらに、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的なある量の化合物、レチノイン酸又はオールトランスレチノイン酸等に前記細胞を接触させることを含む。前記細胞を、ｓｉＲＮＡ及びオールトランスレチノイン酸を組合せで含む組成物に接触させることもできる。
【００３６】
本発明は、さらに、分化細胞における分化能を増加させる方法に向けられている。当該方法は、組成物に分化細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含む。前記組成物は、（ｉ）ノックダウンに効果的な量の、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するために必要な大きさで形成された低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）；（ｉｉ）ノックダウンに効果的な量の、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ及びシスタチオン（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータシンターゼからなる群から選択された酵素の発現を抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡ；並びに、（ｉｉｉ）グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、又は発現及び活性両方を増加させるのに効果的な化合物、の組合せを含む。そこで、前記細胞は、該細胞内のゲノム全域にわたるＤＮＡ脱メチル化を誘導するのに効果的な時間の間、前記組成物に接触し、それによって細胞の分化能は増加する。当該方法は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（Ｄｎｍｔ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（Ｄｎｍｔ３ａ）、及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（Ｄｎｍｔ３ｂ）からなる群から選択されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡを含む組成物に前記細胞を接触させることを含む。グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現、活性、若しくは発現及び活性両方を増加させるのに効果的なその化合物は、レチノイン酸又はオールトランスレチノイン酸である。前記細胞は、ＳＥＱＩＤ番号：１〜４１からなる群から選択されたｓｉＲＮＡに接触させられる。
【００３７】
本発明は、さらに、細胞の発生能を決定する方法に向けられている。当該方法は、細胞におけるＳＡＭ対ＳＡＨ比を決定することを含み、約１．０未満のＳＡＭ対ＳＡＨ比は、細胞の発生能が増加されたことを示している。当該方法は、細胞のＤＮＡに存在するシトシン残基のメチル化を測定することを含み、約１０％未満のメチル化は、細胞の発生能が増加されたことを示している。
【００３８】
本発明は、さらに、細胞における分化能を調節する方法を含む。当該方法は、ステップ（ａ）として、細胞におけるＳＡＭ対ＳＡＨ比を約１．０未満に維持するステップ；及び、（ｂ）細胞のＤＮＡにおけるシトシン残基のメチル化を約４０％未満に維持するステップを含む。請求項３４に記載の方法は、ステップ（ａ）として、細胞におけるＳＡＭ対ＳＡＨ比を約０．５未満に維持するステップ；及び、ステップ（ｂ）として、細胞のＤＮＡにおけるシトシン残基のメチル化を約２０％未満に維持するステップを含む。
【００３９】
本発明は、さらに、分化細胞における分化能を増加させるための細胞培地に向けられている。前記分化細胞は当該培地内に配置され、当該培地は、細胞の生存率を維持するのに十分な基本培地を、当該細胞培地に存在するメチル供与体の活性を減少させる因子と組み合わせて含んでいる。前記因子は、ホモシステイン及びオールトランスレチノイン酸からなる群から選択される。あるいは、前記因子は、抑制に効果的な量の、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するために必要な大きさで形成されたｓｉＲＮＡである。
【００４０】
本発明は、細胞分化に影響を及ぼす化合物を同定する方法にも向けられている。当該方法は、ステップ（ａ）として、細胞のＤＮＡにおいてメチル化されたシトシンの割合を少なくとも約５％だけ減少させるステップであり、前記細胞が前記減少の前に第一の表現型を有する、ステップ；及び、ステップ（ｂ）として、細胞におけるＳＡＭ対ＳＡＨ比を約１．０未満に減少させるステップ；及び、ステップ（ｃ）として、細胞の分化に影響を及ぼすのではないかと思われる化合物に前記細胞を接触させるステップ；及び、ステップ（ｄ）として、細胞の第一の表現型を、ステップ（ｃ）後の細胞の表現型と比較するステップを含み、第一の表現型とは異なる表現型のステップ（ｃ）後の出現は、前記化合物が細胞分化に影響を及ぼすことを示している。ステップ（ａ）は、細胞のＤＮＡにおけるメチル化されたシトシンの割合を少なくとも約５％だけ減少させることを含むことができる。ステップ（ａ）は、細胞のＤＮＡにおけるメチル化されたシトシンの割合を約１０％だけ減少させることも含むことができる。前記細胞は、転写における変化をモニターするためにレポーターシステムを含むことができる。前記レポーターシステムは、ルシフェラーゼ活性、ベータラクタマーゼ活性、及びベータガラクトシダーゼ活性からなる群から選択された酵素活性の存在を測定する。
【００４１】
本発明は、細胞分化能を回復する方法に向けられ、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメチル供与体を減少させることにより、体細胞核、細胞、及び／又は細胞のうち特定の部分におけるＤＮＡメチル化を減少させるステップ；
（ｂ）ＳＡＭ：ＳＡＨ比並びにＤＮＡメチル化のレベルを減少させるＧＮＭＴ遺伝子の発現及び／又は酵素活性を増加させるステップ；
（ｃ）ＭＴＨＦＲ及び／又はシスタチオン（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータシンターゼ（Ｃｂｓ）等の特定の酵素の発現及び／又は活性を減少させることによりＳＡＭ：ＳＡＨ比を減少させるステップ；
（ｄ）Ｄｎｍｔ１、３ａ、及び／又は３ｂを含むＤＮＡメチルトランスフェラーゼの活性を減少させるステップ；
（ｅ）ＳＡＭ：ＳＡＨ比を下げるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでホモシステイン及び／若しくはＳＡＨレベルを、グルカゴン、又は関連する因子を増加させるステップ（減少されたＳＡＭ：ＳＡＨ比はメチル化を減らすことになる）；
（ｆ）ＳＡＭ：ＳＡＨ比を減少させるためにグルタチオンレベルを激減させるステップ；
（ｇ）メチル化を減少させるために、上記因子を１又は複数取り込む制限された培地を開発するステップ（メチル供与体が欠乏している培地、ホモシステインが添加された培地等）；
（ｈ）ベータラクタマーゼレポーター遺伝子及び／若しくは他の生存可能なレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、ベータグルコシダーゼ、若しくはその他）の使用に基づいて新たなアッセイを開発し、ＧＮＭＴ遺伝子の転写を誘導する因子又はＧＮＭＴ活性を促進する他の因子若しくは活性を同定する因子を同定するステップ；並びに
（ｉ）ベータラクタマーゼレポーター遺伝子及び／若しくは他の生存可能なレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、ベータグルコシダーゼ、若しくはその他）の使用に基づいて新たなアッセイを開発し、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子の転写を減少させる因子又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼの活性を減少させる他の因子若しくは活性を同定する因子を同定するステップ；
を含んでいる。
【００４２】
本発明は以下を含むが、それに限定されない：
（ａ）ゲノムを脱メチル化することにより、回復された分化能（全能性、多能性、多分化能性）を有する再プログラムされた細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの作製を可能にする特殊化された培地及び細胞培養を含む新たな研究の手段；
（ｂ）これらの培地及び培養物により作製され、研究又は治療上の応用に使用することができる新たな幹細胞類似の細胞；
（ｃ）細胞の回復分化能に対するＧＮＭＴ発現若しくは他の活性の影響力を評価するための、ベータラクタマーゼレポーター遺伝子、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、及び／又は他の関連するレポーター遺伝子を用いたＧＮＭＴ発現をモニターするための新たなアッセイ系；
（ｄ）細胞の回復分化能に対するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ発現若しくは他の活性の影響力を評価するための、ベータラクタマーゼレポーター遺伝子、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、及び／又は他の関連するレポーター遺伝子を用いたＤＮＡメチルトランスフェラーゼ発現をモニターするための新たなアッセイ系；
（ｅ）体細胞核移植の能率を増進すること；並びに
（ｆ）ＳＣＮＴ再構成胚（又はユニット）からの胚性幹細胞の誘導を増進すること
実施形態は以下を含む：
（ａ）ＧＮＭＴ転写及び活性を増加させ、ＳＡＭ：ＳＡＨ比及び細胞のメチル化能力を減少させ、分化及び／若しくは発生能を回復させるＡＴＲＡを用いて、現存する市販の培地又は他の培地を処理する；
（ｂ）ＤＮＡメチル化のレベルを減少させるＲＮＡ干渉技術を用いてＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１、３ａ、及び／若しくは３ｂのノックダウンを可能にするために、現存する市販の培地又は他の培地を改変する；
（ｃ）ＳＡＭ：ＳＡＨ比及びＤＮＡメチル化を減少させるＲＮＡ干渉技術、アンチセンス、又は他のノックダウン技術を用いて、ＭＴＨＦＲ及び／若しくはＣｂｓのノックダウンを可能にするために、現存する市販の培地又は他の培地を改変する；
（ｄ）ＳＡＭ：ＳＡＨ比及びＤＮＡメチル化を減少させるＧＮＭＴの転写、蛋白質発現、並びに活性を増加させるために、現存する市販の培地又は他の培地を改変する；
（ｅ）メチル供与体及び／若しくはホモシステイン及び／若しくはＳＡＨのレベルを変更することによりＳＡＭ：ＳＡＨ比を減少させるために、現存する市販の培地又は他の培地を改変する
本発明の背後にある理論的根拠のための１つの説明に固守されることを望むことなく、食餌、培地、又は葉酸依存性一炭素プールから供給されるメチル基は、正常な機能にとって不可欠であることが信じられている。メチル基欠乏により、メチル基転移反応は下方調節される。食餌（又は培地）から供給されるコリン及びメチオニンの形状のメチル基、又は、葉酸依存性一炭素プールから供給されるメチル基は、数多くのメチル基転移反応において基質として働くために、ＳＡＭに活性化されなければならない。ＳＡＨはメチル基転移反応の生成物であり、大部分のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼの強力な阻害物質であるため、ＳＡＭ／ＳＡＨの比は、メチル基転移能力の重要な指標である。従って、ＳＡＭの細胞内の供給は、メチル基転移において重大であるが、この比の調節も重要である。
【００４３】
細胞質酵素ＧＮＭＴは、ＳＡＭ／ＳＡＨ比の調節によりメチル基転移反応を最適化するために機能する。メチル基が豊富で、ＳＡＭレベルが上げられた場合、ＧＮＭＴは、グリシンから本質的に不活性の代謝産物サルコシンを形成することにより、過剰のメチル基を処分する。ＳＡＭも、５−メチル−ＴＨＦの合成を司る酵素であるＭＴＨＦＲを阻害することにより、一炭素プールから生じたメチル基の供給を減少させる。５−メチル−ＴＨＦは、そのメチル基をホモシステインに供与してメチオニンを形成する葉酸補酵素である。５−メチル−ＴＨＦはＧＮＭＴにも結合してその活性を阻害するため、ＳＡＭによるＭＴＨＦＲの阻害のために生じる５−メチル−ＴＨＦ量の減少により、ＧＮＭＴの活性は増加する。逆に、メチル基及びＳＡＭが減少した状況下では、ＭＴＨＦＲの阻害は除去され、５−メチル−ＴＨＦ濃度並びに後のＧＮＭＴの阻害は増加される。このことは、メチル基入手可能性に障害が生じた場合に、重要なメチル基転移反応のためにメチル基が保存されることを確実にしている。従って、不適切にＧＮＭＴを活性化する因子は、数多くの、適切なメチル化状態の維持において重要であるメチルトランスフェラーゼを下方調節する可能性がある。
【００４４】
本発明は、新しく、より効果的で、能率的な細胞再プログラミングの方法の開発を促進する必要性により推進された。そのような方法は、幹細胞を含む治療上役に立つ細胞の発見及び開発、幹細胞及び他の細胞を基にした治療研究を促進するための新たな研究手段、貴重な動物又は絶滅の危機に瀕した動物の繁殖、並びに、高価な遺伝子改変された動物の作製に強い影響を与える。
【００４５】
本発明は、現用の方法を用いた、細胞を脱分化してその細胞を新たな細胞に再分化する問題を解決する方へ向けられている。特に、主としてＳＣＮＴに基づいた現用の方法は、非常に能率が悪く、その結果は信頼できないものである。新たな発明は、核移植の利用及びそれに伴う制限を避けている。ＳＣＮＴユニットは、能率の悪い細胞再プログラミングの一因となる包括的な脱メチル化の欠乏を含むＤＮＡメチル化調節の欠点を示している。本発明は、この特定の問題を克服している。
【００４６】
本発明は、再構築後必要とされる脱分化（包括的な脱メチル化）プロセスを改良することにより、絶滅の危機に瀕した動物、付加価値を持つ家畜、及びＥＳ細胞の誘導体の作製のためのＳＣＮＴを可能にし、その能率も増進する。
【００４７】
本発明は、免疫拒絶及び胚性幹細胞の利用に伴う物質の限られた起源という重大な問題を克服する新たな細胞を基にした薬物療法学の開発も可能にする。脱分化及び新たな細胞型への再分化のために患者自身の体細胞の利用を可能にすることにより、本発明は、多種の開始細胞型から細胞の免疫と適合性のある起源を提供する。
【００４８】
さらに、幹細胞研究の分野は、脱分化状態で細胞を維持する又は細胞を特異的な系譜に沿って分化させるための細胞培養物及び培地が不適切であることにより、現時点では非常に制限されている。本発明と関連する経路、蛋白質、及び関係のある分子は、これらの制限を克服する新たな培養物及び培地の開発を可能にする。同様に、本発明は、分化及び再分化の新たなマーカー、並びに、再生医療薬物候補をスクリーニングするための新たな方法を提供および高めることにより創薬を早める新たな分化細胞株を作製する能力を提供する。
【００４９】
細胞を基にした薬物療法学の分野は、出発物質の起源が限られ、並びに、ＧＭＰ／ＧＭＬガイドラインに基づいた単離及び拡大の方法は高価であるため、現時点では非常に制限されている。例えば、糖尿病患者においてインシュリンを産生するために島細胞の移植を必要とする新たな細胞治療を適用する場合に、現用の方法では、たった１人の患者に十分な細胞を提供するために少なくとも２人の死体提供者が必要とされた。本発明は、使用される出発物質及び所望の生成物の量を著しく改善することにより、これらの欠点を克服することに当てられている。さらに、そのような細胞は、移植患者に有害な免疫拒絶を誘導するという固有のリスクを保有している。本発明は、出発物質の起源として患者自身の細胞を使用する機会を提供することにより、この問題を克服することに当てられている。
【００５０】
本発明は、ＤＮＡメチル化を調節することにより、再プログラミングの進行を促進できる方法の方へ向けられている。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現及び／又は活性を変更するように意図された方法は、ＳＡＭ：ＳＡＨ比を変更することにより再プログラミングの能率を増進する重大な効果を有しうる。１つの方法は、鍵となる酵素の発現をレチノイン酸（ＲＡ）及びレチノイド等の化合物を用いて特異的に変更することにより、メチル基代謝の調節を変更することである。ＡＴＲＡ及び他のレチノイド化合物の施用は、ＧＮＭＴを誘導並びに活性化し、ＤＮＡのメチル化を含めたＳＡＭ依存性メチル基転移反応に欠陥を生じさせ、結果としてゲノムＤＮＡを低メチル化させる。他の研究者は、５−アザシチジン及び５−アザ−２’−デオキシチジン等のメチル化阻害物質を使用して、ＤＮＡメチル化レベルを減少並びに抗腫瘍効果を提供してきた[８２]。
【００５１】
別の方法は、培養において体細胞内でデメチラーゼを過剰発現させることである。現在までに、活性なデメチラーゼは確証されていない。
【００５２】
従来の方法よりも有利となる本発明の鍵となる利点には以下が挙げられる：
本発明は、核移植の利用を必要とせず、従って、核再プログラミング及び実際の細胞発生における非能率を避けている。
【００５３】
本発明は、細胞分化のための出発物質として胚性幹細胞の利用に依拠しない。従って、出発物質の入手可能性における重大な制限障害を克服している。
【００５４】
本発明は、胚及び成体幹細胞培養系を改良するために使用し、自然分化を最小化することができる。
【００５５】
本発明は、新たな再生細胞治療の開発のために胚性幹細胞又は他の異物に依拠せず、従って、患者による免疫拒絶の可能性を最小化する。
【００５６】
本発明は、単純な栄養上の方法により自然な代謝プロセスを利用する。従って、５’−アザシチジン及びアザシタジン（ａｚａｃｉｔａｄｉｎｅ）（ＡｚａＣとして、及び、商標ＶＩＤＡＺＡのもとＰｈａｒｍｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｕｌｄｅｒ社により製造されるとしても既知である）等の化合物により誘導される細胞毒性の影響、又は、遺伝子導入系を用いて活性なデメチラーゼを過剰発現させる等、遺伝子の変化を必要としているといった失敗の一因となりうる複雑因子の数を減少させる。
【００５７】
本発明は、ＳＣＮＴを改良するために使用することができる。
【００５８】
本発明を使用して、ＳＣＮＴにより生じた胚（ユニット）からのＥＳ細胞の誘導体をより能率的に改良することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
以下の、添付の図面と共に記述された本発明の好ましい実施形態の詳細説明から、本発明の目的及び利点はより完全に見えてくる。
略語及び定義
本明細書においてそうでないと記述しない限り、以下の定義及び略語はこの開示中適用される：
ＡＴＲＡは、オールトランスレチノイン酸を意味する。
【００６０】
Ｃｂｓは、シスタチオン（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータシンターゼを意味する。
【００６１】
細胞再プログラミングは、末期的に分化した細胞を、その細胞が新たな細胞型に分化する可能性を有する状態に回復させるプロセスを意味する。
【００６２】
培地又は増殖培地は、細胞の増殖を支持する能力がある適切な培地を意味する。
【００６３】
脱メチル化培地又は脱メチル化増殖培地は、ＤＮＡの脱メチル化を誘導するように細胞の増殖を支持する能力がある適切な培地を意味する。
【００６４】
分化は、胚発生中に細胞を構造的及び機能的に特殊化させるプロセスを意味する。
【００６５】
ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを意味する。
【００６６】
ＤＮＡは、デオキシリボ核酸を意味する。
【００６７】
ＤＮＡメチル化は、真核生物のＤＮＡにおけるシトシン（ＤＮＡに存在する４種類の窒素性の塩基の１つ）へのメチル基（ＣＨ３基）の結合を意味する。これは、外来性のＤＮＡを破壊するために産生された酵素及び化学物質から自己のＤＮＡを保護する方法として、並びに、ＤＮＡにおける遺伝子の転写を調節する方法として日常的に行われる。
【００６８】
ＤＮＭＴは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを意味する。
【００６９】
エピジェネティックは、ヌクレオチド配列を変更することなく、機能を遺伝的に変更するＤＮＡの状態を意味する。エピジェネティックな変化は、ＤＮＡのヌクレオチド配列を変えることなく、メチル化及び脱メチル化等、ＤＮＡの修飾により引き起こすことができる。
【００７０】
ＦＲＥＴは、蛍光共鳴エネルギー転移を意味する。
【００７１】
ＧＡＰＤＨは、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素を意味する。
【００７２】
ＧＮＭＴは、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼを意味する。
【００７３】
Ｈ３Ｋ４ｍｅは、Ｌｙｓ４でのヒストンＨ３のメチル化を意味する。
【００７４】
Ｈ３Ｋ９ｍｅ２／３は、ヒストンＨ３上のリジン９等の特定のリジン残基のジ／トリメチル化を意味する。
【００７５】
ヒストンは、染色体に存在する蛋白質分子の種類を意味し、核内に収まるようにＤＮＡを凝縮することに司る。原核生物は、ヒストンを有していない。しかし、サーモプラズマ属（古細菌ドメインのうち細胞壁を欠いたメンバー）のＤＮＡは、真核生物のヒストンに非常に似た、大変基本的なＤＮＡ結合蛋白質により包囲されている。
【００７６】
ＩＢＭＸは、イソブチルメチルキサンチンを意味する。
【００７７】
ＩＣＭは、内部細胞塊を意味する。
【００７８】
「ノックダウン」は、遺伝子の特異的な方法で遺伝子の発現を抑制することを意味する。１または複数の「ノックダウンされた」遺伝子を有する細胞は、ノックダウン生物又は単に「ノックダウン」と呼ばれる。
【００７９】
ＭＤＳは、骨髄異形成症候群を意味する。
【００８０】
ＭＴＨＦＲは、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを意味する。
【００８１】
卵母細胞は、減数分裂により４個の一倍体細胞へ分裂し、発生する女性の生殖細胞を意味する。その一倍体細胞は、精細胞により受精することができる１個の卵細胞を形成する。
【００８２】
多能性は、３種類の胚葉の細胞型又は一次組織型に分化する能力があることを意味する。
【００８３】
ＲＡは、レチノイン酸を意味する。
【００８４】
再プログラミングは、核におけるエピジェネティックマークの除去に続き、異なるエピジェネティックマークを確立することを意味する。多細胞生物における発生の間、細胞及び組織によって、得られる遺伝子発現のプログラムは異なる。これらの異なる遺伝子発現パターンは、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及び他のクロマチン結合蛋白質等のエピジェネティックな修飾により実質的に調節されているように思われる[２２、２３]。このように、多細胞生物内の各細胞型は、細胞が分化する又は細胞周期を抜けると「確定」になり不変になると慣例的に考えられている特有のエピジェネティックな特徴を有している。しかし、一部の細胞は、正常な発生又はある種の疾患状態中に、主要のエピジェネティックな「再プログラミング」を行う。
【００８５】
ＲＮＡは、リボ核酸を意味する。
【００８６】
ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写のポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００８７】
ＳＡＨは、Ｓ−アデノシルホモシステインを意味する。
【００８８】
ＳＡＭは、Ｓ−アデノシルメチオニンを意味する。
【００８９】
ＳＣＮＴは、体細胞核移植を意味する。
【００９０】
ｓｉＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡを意味し、短鎖干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても既知である。
【００９１】
体細胞は、（特に卵細胞又は精細胞等、新たな生物が発生することができる種々の細胞全てである生殖細胞に対立するものとして）体の組織、器官等に分化された生物の細胞全てを意味する。
【００９２】
ＴＥは、栄養外胚葉を意味する。
【００９３】
全能性は、完全な胚又は器官に発達する能力があることを意味する。
【００９４】
ＴＺＤは、チアゾリジンジオンを意味する。
【００９５】
本発明は、分化能を回復し、治療用細胞の自己起源として使用することができるように、患者の成体幹細胞若しくは完全に分化した体細胞の脱メチル化を誘導する；又は、脱メチル化された細胞を使用して、ＳＣＮＴの能率を増進し、治療の目的で使用されることになる患者特異的ＥＳ細胞をより能率的に作製する。
【００９６】
本発明は、特に、特殊化された細胞株及び特殊化された細胞培養に向けられている。両方を得る方法は、本発明にとって重大である。基本的な感覚からでも、その方法は、再プログラムされた細胞株を生じる脱メチル化ステップを含んでいることがわかる。脱メチル化を可能にする因子は、細胞培地内に含ませる。その細胞培地は、新たな細胞型に分化することができる細胞を作製するために使用される。
【００９７】
本発明は、分化及び／若しくは発生能を回復する程度までＤＮＡメチル化レベルを減少させるように、ＡＴＲＡ及び／若しくはｓｉＲＮＡを添加することができる細胞培地、又は、十分に調整された成分に向けられている。その分化及び／若しくは発生能は、それだけに限定されないが、サイトカイン等の特定の分化因子、増殖因子、転写因子で誘導する、並びに／又は、ＳＣＮＴのために脱メチル化された細胞を使用することにより回復される。
【００９８】
本発明は、ゲノムを脱メチル化することにより回復された分化能（全能性、多能性、多分化能性）を有した再プログラムされた細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの作製に向けられている。実施形態は以下を含む：
（ａ）ＡＴＲＡ、ｓｉＲＮＡ、及び／又は類似の若しくは関連する分子で処理するステップ；
（ｂ）阻害のために干渉ＲＮＡ技術、アンチセンス、若しくは他の機構を用いて、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１、３ａ、及び／又は３ｂをノックダウンするステップ；
（ｃ）干渉ＲＮＡ技術を用いて、ＭＴＨＦＲ及び／又はＣｂｓをノックダウンするステップ；
（ｄ）ＧＮＭＴの転写、蛋白質発現、及び活性を増加させるステップ；
（ｅ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでホモシステインのレベルを上げるステップ；
（ｆ）ＳＡＨのレベルを上げるステップ；
（ｇ）ＳＡＭのレベルを下げるステップ；
（ｈ）それだけには限定されないが、葉酸塩、メチオニン、コリン、ベタイン、ビタミンＢ６及びＢ１２等のメチル供与体のレベルを下げるステップ；
（ｉ）ＳＣＮＴを改良するために細胞を使用するステップ；並びに
（ｊ）ＳＣＮＴ再構築ユニット（胚）からＥＳ細胞をより能率的に誘導するために細胞を使用するステップ
細胞：本発明の目的において、単数又は複数の「細胞」という用語は、特に反対に限定されない限り、いかなる体細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、核移植（ＮＴ）ユニット、及び幹細胞様の細胞も含む。器官及び組織の移植のための有望な起源は、幹細胞技術の発展に見いだされている。理論上、幹細胞は、自己複製する細胞分裂を行って無限に表現型及び遺伝子型の同一な娘細胞を生じることができ、さらに、最終的には、少なくとも１つの最終細胞型に分化できる。患者自身の細胞から組織又は器官を作製することにより、移植組織を作製し、感染又は組織拒絶という付随するリスクなしに異種移植に関連する利点を提供することができる。
【００９９】
幹細胞は、遺伝子治療の結果を改善する期待も提供している。患者自身の幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子改変することができ、次に、所望の遺伝子産物を産生するためにｉｎ  ｖｉｖｏに再導入できる。これらの遺伝子改変幹細胞は、体内の特定部位での移植用又は全身投与用に、分化して多数の細胞型を形成するために誘導される可能性を有している。あるいは、異種幹細胞は、移植患者の主要組織適合抗原遺伝子複合体（ＭＨＣ）を発現させる又は全く発現させないために遺伝子改変でき、不随する拒絶のリスクなしにドナーから移植患者へのそれらの細胞の移植を可能にする。
【０１００】
幹細胞は、広範囲で不明瞭な増殖能力を有し、いくつかの細胞系譜に分化し、移植の後で組織を再配置することができる細胞として定義される。無制限の自己複製及び多能性分化能を有することから、典型的な幹細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である。これらの細胞は、胚盤胞の内部細胞塊由来、又は、移植後の胚の始原生殖細胞（胚性生殖細胞又はＥＧ細胞）から得ることができる。ＥＳ及びＥＧ細胞は、マウスから、より最近ではヒト以外の霊長類及びヒトからも得られた。ＥＳ細胞がマウスの胚盤胞又は他の動物の胚盤胞に導入された場合、ＥＳ細胞はマウス（動物）の全組織の一因となることができる。ＥＳ及びＥＧ細胞が出生後の動物に移植された場合、それらの細胞は奇形腫を生じ、その多能性をここでも実証している。ＥＳ及びＥＧ細胞は、抗体であるＳＳＥＡ１及びＳＳＥＡ４を用いて陽性染色により同定することができる。
【０１０１】
分子レベルで、ＥＳ及びＥＧ細胞は、これらの未分化細胞に対して非常に特異的であるいくつかの転写因子を発現する。これらの転写因子には、Ｏｃｔ−４及びＲｅｘ−１が挙げられる。ＬＩＦ−Ｒ並びに転写因子Ｓｏｘ−２及びＲｏｘ−１も存在するが、後者２つの転写因子はＥＳ細胞以外でも発現する。Ｏｃｔ−４は、原腸未形成胚、卵割初期胚、胚盤胞の内部細胞塊の細胞、及び胚性癌（ＥＣ）細胞で発現する転写因子である。細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化するよう誘導された場合にＯｃｔ−４は下方調節され、さらに、成長した動物において、ｏｃｔ−４は生殖細胞内のみに存在する。いくつかの研究により、Ｏｃｔ−４はＥＳ細胞の未分化の表現型の維持に必要とされ、胚形成及び分化における初期段階の決定において主要な役割を果たしていることが示されてきた。Ｏｃｔ−４は、Ｒｏｘ−１と組み合わせて、Ｚｎフィンガー蛋白質Ｒｅｘ−１の転写活性化を引き起こし、未分化状態でＥＳを維持するためにも必要とされている。さらに、Ｓｏｘ−２は、ＥＳ／ＥＣ細胞の未分化状態を保つため、及び、マウス（ヒトではない）ＥＳ細胞を維持するためにＯｃｔ−４と共に必要である。ヒト又はマウスの始原生殖細胞は、ＬＩＦの存在を必要とする。ＥＳ細胞の別の特徴は、これらの細胞に無限の自己複製能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで提供するテロメラーゼの存在である。
【０１０２】
幹細胞は、いくつかの器官組織において確認されてきた。最も特徴づけられているのは、造血幹細胞である。これは、中胚葉由来の細胞であり、細胞表面マーカー及び機能的特徴に基づいて精製されてきた。骨髄、血液、臍帯血、胎児の肝臓及び卵黄嚢から単離されるこの造血幹細胞は、移植患者の命のために造血を再度開始し、複数の造血性系譜を生じる始原細胞である[９３〜１００]。造血幹細胞が致死量の放射線にさらされた動物又はヒトに移植された場合、その造血幹細胞は、赤血球、好中球マクロファージ、巨核球、及びリンパ球の造血細胞プールを再配置することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、造血幹細胞を少なくとも数度自己複製する細胞分裂を行うために誘導し、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られるのと同じ系譜に分化すために誘導することができる。従って、この細胞は、幹細胞の基準を満たしている。しかし、造血系譜の細胞を形成するためだけに分化する幹細胞は、例えば、高用量の化学療法薬物により損傷を受けた心臓又は肺組織等、他の損傷を受けた組織の修復のための細胞の起源を提供することはできない。
【０１０３】
広く研究されてきた第二の幹細胞は、神経幹細胞である[１０１〜１０３]。神経幹細胞は、胎児の脳の脳室下帯及び嗅球内で初めて確認された。最近まで、成体脳は幹細胞の能力を有する細胞をすでに含んでいないと信じられていた。しかし、齧歯類、より最近ではヒト以外の霊長類及びヒトにおけるいくつかの研究により、幹細胞は成体脳に存在し続けることが示されてきた。これらの幹細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで増殖でき、少なくとも一部の神経細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に再生することができる。神経幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで培養した場合、その神経幹細胞を増殖するよう誘導でき、並びに、異なる種類のニューロン及びグリア細胞に分化するよう誘導することができる。脳に移植された場合は、神経幹細胞を植え付けることができ、神経細胞及びグリア細胞を生じることができる。従って、この細胞も、幹細胞の定義を満たすことができる。
【０１０４】
幹細胞と命名されている第三の組織特異的細胞は、フリデンシュタイン（Ｆｒｉｄｅｎｓｈｔｅｉｎ）により初めて記載された間葉性幹細胞（ＭＳＣ）である[１０４]。本来、胚性中胚葉由来で成体骨髄から単離される間葉性幹細胞は、筋肉、骨、軟骨、脂肪、ストロマ、及び腱を形成するよう分化できる。胚形成の間、中胚葉は、肢芽中胚葉、骨、軟骨、脂肪、骨格筋、及びおそらく内皮を生じる組織に発達する。中胚葉は、心筋、平滑筋、又は、内皮及び造血始原細胞からなる血島を生じることができる内臓中胚葉にも分化する。従って、原始中胚葉又は間葉性幹細胞は、いくつかの細胞及び組織型の起源を提供できる。いくつかの間葉性幹細胞が単離されてきた[１０５〜１１７]。記載されてきた多くの間葉性幹細胞のうち、全てが、間葉系起源のものであると一般的に考えられている分化細胞のみを形成する制限された分化を実証した。現在までで、報告された最も多分化能な間葉性幹細胞は、ピッテンガー（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ）等により単離された細胞であり、その細胞は、ＳＨ２＋ＳＨ４＋ＣＤ２９＋ＣＤ４４＋ＣＤ７１＋ＣＤ９０＋ＣＤ１０６＋ＣＤ１２０ａ＋ＣＤ１２４＋ＣＤ１４−ＣＤ３４−ＣＤ４５−表現型を発現する。この細胞は、間葉起源のいくつかの細胞型を形成するよう分化する能力があるが、その細胞を単離したチームが、造血細胞は拡大された培養物において確認されなかったと留意したように、明らかに間葉系譜の細胞に分化する能力に限定されている。
【０１０５】
消化管幹細胞、上皮幹細胞、及び卵円形細胞とも呼ばれている肝幹細胞を含む他の幹細胞が同定されてきた[１１９〜１２１]。これらの細胞のうち大部分が他に比べよく特徴づけられていない。
【０１０６】
ＥＳ細胞と比較すると、組織特異的幹細胞は自己複製能力が低い。これらの細胞は複数の系譜に分化するが、多能性ではない。組織特異的細胞が上記のＥＳ細胞のマーカーを発現するかどうかを扱った研究はない。さらに、これらの細胞が非常に豊富な集団を多数得ることは幾分困難であるため、組織特異的幹細胞におけるテロメラーゼ活性の程度は十分に調査されていない。
【０１０７】
最近まで、器官特異的幹細胞は、同じ組織の細胞のみに分化することができると考えられていた。いくつかの最近の文献によると、成体器官特異的幹細胞には異なる組織の細胞に分化する能力がありうると示唆されている。いくつかの研究によると、骨髄移植時に移植された細胞は、骨格筋に分化することができると示されている[１２２〜１２３]。このことは、骨髄に存在する間葉細胞にありうる分化能の範囲内であると考えることができる。ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）は、筋衛生細胞は、ここでも臓側中胚葉内の表現型におけるスイッチである造血細胞に分化できると発表した[１２４]。他の研究によると、ある胚葉（例えば、臓側中胚葉）由来の幹細胞は、胚形成中に異なる胚葉から得られたと考えられる組織に分化することができると示されている。例えば、骨髄移植を受けたヒト又は動物で検出される内皮細胞又はそれらの前駆体は、少なくとも一部は骨髄提供者由来である[１２５〜１２６]。このように、臓側中胚葉ではなくＭＳＣ等の内臓中胚葉に由来する子孫は、注入される骨髄と共に移植される。さらに驚くべきことに、肝上皮細胞及び胆管上皮細胞はドナー骨髄由来であると齧歯類でもヒトでも実証した報告がある[１２７〜１２９]。同様に、３つのグループが、神経幹細胞は造血細胞に分化することができると示してきた。最後に、クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）等は、胚盤胞に注入された神経幹細胞はキメラマウスの全組織の一因になりうると報告した[１３０]。
【０１０８】
異種の胚性幹細胞から作製された組織及び器官の移植には、細胞をさらに遺伝子改変して特定の細胞表面マーカーの発現を阻害する、又は、化学療法の免疫抑制因子の使用を続けて移植による拒絶から保護することが必要とされている。このように、胚性幹細胞の研究は移植用器官の起源が限られているという問題に対する有望な新解決手段を提供しているが、異種細胞又は組織の移植に耐えるための免疫抑制の必要性に不随する問題及びリスクは残る。大多数の人口を対照とする治療に備えて免疫と適合性がある細胞を提供するために、推定２０個の免疫学的に異なる系統の胚性幹細胞が確立される必要がある[１３２]。
【０１０９】
胚からではなく成長した個体から細胞を自己又は同種幹細胞の起源として使用することは、移植胚性幹細胞の使用に付随する組織の不適合性という問題を克服し、並びに、胚性幹細胞研究に付随する倫理上のジレンマも解決する。組織移植のために同種幹細胞を使用することに不随する最大の欠点は、これまでのところその制限された分化能にある。いくつかの幹細胞が十分に成長した生物、特にヒトから単離されているが、これらの細胞は、多分化能性であると報告されているにもかかわらず、複数の細胞型に分化する能力は限られていると実証されている。
【０１１０】
複数の分化能を有する幹細胞が以前に他の研究者等により単離されてきたが、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、内皮、ストロマ、平滑筋、心筋、神経細胞、及び造血細胞を含む種々の系譜の幅広い細胞型に分化する能力を有する脱メチル化された細胞は記載されていない。細胞及び組織移植並びに遺伝子治療が期待される治療上の進歩を提供することであった場合、患者特異的治療用細胞のための起源、又はより能率的なＳＣＮＴ用ドナー細胞、又は特定の系譜に沿った分化の誘導に寄与するために使用される可能性がある分化因子若しくは化合物のスクリーニング用物体として、回復された又は拡大された分化及び／若しくは発生能を有する脱メチル化された細胞が必要とされる。
【０１１１】
細胞培地：本発明は、細胞培地と、増殖因子と、細胞のＤＮＡ脱メチル化を誘導する方法並びに脱メチル化された細胞の培養物を増殖及び維持する方法とを利用する。培地は細胞の増殖及び維持を提供し、添加の因子及び有用な組合せの因子をスクリーニングするために使用することができる。本明細書で提供されている細胞培地、増殖因子、及び方法を用いて細胞を実質的に未分化の状態で増殖させる能力は、複数の遺伝子改変を有する細胞株を作製する能力を含む重要な利益を（遺伝子治療の応用と同様に）重要な治療上の応用と共に提供する。
【０１１２】
細胞培地は、脱メチル化された細胞の増殖を支持するのに効果的な増殖培地；脱メチル化された細胞の増殖を支持するのに効果的な栄養素血清；非必須及び必須のアミノ酸、並びにピルビル酸塩を含むことができる。随意に、細胞培地は還元剤も含むことができる。
【０１１３】
本発明の実施において役に立つ適切な培地の制限しない別の例は、ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）の主成分で調製された種々の増殖培地を含む。ＤＭＥＭは、ウシ胎児血清、グルタミン、及び／又はピルビン酸ナトリウムを含む種々の栄養補助剤で補うことができる。ＤＭＥＭは、１５％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むことが好ましい。
【０１１４】
適切な培地の別の例は、グルコース及びリン酸を含まない改変されたヒト卵管液培地（ＨＴＦ）であり、１５％胎児血清、０．２ｍＭグルタミン、０．５ｍＭタウリン、及び０．０１ｍＭの以下のアミノ酸：アスパラギン、グリシン、グルタミン酸、システイン、リジン、プロリン、セリン、ヒスチジン、及びアスパラギン酸で補われている。
【０１１５】
増殖因子：増殖培地は、脱メチル化された細胞の増殖及び生存能力を維持するのに効果的な栄養分を供給するいかなる血清又は血清を基にした溶液も含むことができる。そのような血清の例として、限定することなく、ウシ胎児血清（ＦＢＳ及びＦＣＳ）が挙げられる。例えば、ＦＢＳは、約１％から約２５％までの間の濃度で提供できる。特に、ＦＢＳは、約２．５％から約２０％までの間の濃度で提供できる。１つの実施形態では、脱メチル化された細胞は１０％ＦＢＳで増殖する。
【０１１６】
増殖因子は、脱メチル化された細胞の培養物の実質的に未分化の状態での誘導及び維持に寄与するために提供されることもできる。そのような増殖因子の主体性及び効果的な濃度は、本明細書に記載の方法又は細胞培養分野の技術者には既知の技術を用いて決定することができる。例えば、１または複数の以下の因子：１０μＭのホルスコリン（［３Ｒ−（３α，４αβ，５Ｂ，６Ｂ，６ａα．，１０α．，１０αβ，１０α）］−５−（アセチルオキシ）−３−エテニルドデカヒドロ−６，１０，１０ｂ−トリヒドロキシ−３，４ａ，７，７，１０ａ−ペンタメチル−１Ｈ−ナフト［２，１−ｂ］ピラン−１−オン）、１０μＭのコレラトキシン、０．１ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１ｍＭのジブチリルアデノシンサイクリック一リン酸（ｄｂｃＡＭＰ）を規定された終濃度で使用することができる。別の実施形態では、増殖因子は、約１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲における塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）であり、より明確には、ヒト組換え型塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）である。
【０１１７】
別の因子は、ヒト胎児性癌（ＥＣ）細胞の培養物から得られた増殖培地である。特定の例では、ヒトＮＴＥＲＡ−２ＥＣ細胞（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ１９７３）は、１０％ウシ胎児血清で補われたＤＭＥＭにおいてコンフルエンスまで増殖される、又は、マウスＥＳ細胞は、１５％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１０００Ｕ／ｍｌＬＩＦで補われたＤＭＥＭにおいてコンフルエンスまで増殖される。増殖培地は、何日もの間毎日収穫され、０．２２ミクロンの濾過器にかけられ、−８０℃で凍結される。このヒトＥＣ又はマウスＥＳで「条件づけられた」培地は、脱メチル化された細胞の増殖及び生存能力に対する効果により判断されたように、経験的に決定された量で脱メチル化増殖培地に添加される。
【０１１８】
別の実施形態では、増殖培地は、シグナル伝達ｇｐ１３０と結合する受容体に結合することにより、又は、直接ｇｐ１３０に結合することにより、ｇｐ１３０を活性化するリガンドを含む。例えば、約１０００Ｕ／ｍｌから２０００Ｕ／ｍｌのヒト組換え型白血病抑制因子（ＬＩＦ）又は１０Ｕ／ｍｌのオンコスタチン−Ｍを使用することができる。
【０１１９】
組織培養抗生物質：一般的に、胚性生殖（ＥＧ）培地は、ペニシリン及びストレプトマイシン等、一般的に使用される組織培養抗生物質も含有する。従って、効果的な量の因子がこれらの基礎液のうちいずれかに毎日追加され、本発明のヒトＥＧ増殖培地が調製される。「効果的な量」という用語は、細胞培養分野の技術者に共通の判断を用いて、又は、本明細書において提供されている技術により、ヒトＥＧ細胞におけるヒトＥＧ増殖及び生存能力に対する有益な効果を可能にするような記述された因子の量を意味する。
【０１２０】
一般的に、脱メチル化培地も、ペニシリン及びストレプトマイシン等、一般的に使用される組織培養抗生物質を含有する。従って、効果的な量のこれらの因子がこれらの基礎液のうちいずれかに毎日追加され、本発明の脱メチル化増殖培地が調製される。本明細書において使用される「効果的な量」という用語は、細胞培養分野の技術者に共通の判断を用いて、又は、本明細書において提供されている技術により、細胞の脱メチル化及び生存能力に対する有益な効果を可能にするような記述された因子の量である。
【０１２１】
範囲：表１は、本発明の細胞培地において有用な成分の範囲を提供している。
【０１２２】
表１
【０１２３】
【表１】
2009502201.tif 000002
2009502201.tif 000003
以下の表２に記述されているように、本発明で使用することができる細胞培地の例は、アルファ−ＭＥＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）である。
【０１２４】
表２
【０１２５】
【表２】
2009502201.tif 000004
2009502201.tif 000005
2009502201.tif 000006
培養のための一般的な技術
分子遺伝学及び遺伝子工学における一般的な方法は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｒｏｋ）等の最新版[８４]、ミラー＆カロス（Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ）[８５]、並びにＦ．Ｍ．オースベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）等[８６]に記載されている。細胞生物学、蛋白質化学、及び抗体法は、Ｊ．Ｅ．コリガン（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎ）等[８７]、Ｊ．Ｓ．ボニファシノ（Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ）等[８８]、及びＪ．Ｅ．コリガン（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎ）等[８９]で見つけることができる。本開示において言及されている遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、及び道具は、ＢｉｏＲａｄ社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、ＣｌｏｎＴｅｃｈ社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）等の販売業者から入手可能である。
【０１２６】
細胞培養方法は、一般的に、フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）[９０]、Ｍ．Ａ．ハリソン＆Ｉ．Ｆ．ラエ（Ｍ．Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ＆Ｉ．Ｆ．Ｒａｅ）[９１]、及びＫ．タルクセン（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ）[９２]に記載されている。細胞培養の備品及び試薬は、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＮａｌｇｅｎｅＮｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｈｙｃｌｏｎｅ社（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、及びＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社（Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）等の販売業者から入手可能である。
【０１２７】
脱メチル化された細胞は、支持細胞に加えてプレート上で増殖することができる。あるいは、支持細胞を、初めにコンフルエンスまで増殖し、次にさらなる増殖を防ぐために（例えば、照射により）有糸分裂的に不活化することができる。あるいは、脱メチル化された細胞を、支持細胞層なしで増殖することができる。そのような方法は、一組の細胞、すなわち、脱メチル化された細胞による増殖のみのモニターを必要とするため、細胞培養の管理を単純化するという利点を有している。
【０１２８】
確立された脱メチル化された細胞の培養：脱メチル化された細胞は、確立されると、種々の技術を用いて上記の条件づけられた培地のもとで培養することができる。１つの例では、容器は無条件の培地において支持細胞を保持している。溶解された支持細胞のマトリックスは、標準法を用いて調製される。次に、培養されることになる脱メチル化された細胞は、条件付けられた培地と共にマトリックスの上に添加される。あるいは、脱メチル化された細胞を、当分野では既知の方法を用いて、生支持細胞上で増殖することができる。次に、脱メチル化された細胞の増殖はモニターされ、培養された細胞が分化した程度が決定される。アルカリホスファターゼのマーカーを使用して、どの細胞が分化したかを確かめることができる。十分な数の細胞が分化した場合、又は、培養物がコンフルエンスまで増殖した場合、少なくとも一部の未分化細胞を継代培養させることができる。細胞を継代培養させるための決定及びそのような継代培養を実現するための技術は、当分野では周知の標準技法を用いて行うことができる。
【０１２９】
培養における体細胞の脱分化：細胞は、１若しくは複数のメチル供与体又は補酵素（葉酸塩、ベタイン、コリン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２及びメチオニン）が欠乏した、又は、増加した量のホモシステイン若しくはＳＡＨを含有する注文設計された増殖培地において増殖する。製法は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ社（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）推薦の培地に基づく。
【０１３０】
欠乏又は補充の式は以下の表３に示されている。
【０１３１】
表３
【０１３２】
【表３】
2009502201.tif 000007
例として、培地を１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、及び０．１％ファンギゾンで補うことができる。調製ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を葉酸塩欠乏培地に添加し、血清中の葉酸を除去する。細胞は、３７℃、湿度９５％、及び５％ＣＯ２の状態で維持される。培地は３〜４日毎に変えられ、細胞は９０％までの培養密度で繰返し６週間まで継代培養される。終点として、減少したシトシンメチル化レベル、減少したＳＡＭ：ＳＡＨ比、並びに、増加したＧＮＭＴ発現、活性、及び蛋白質存在量が挙げられる。
【０１３３】
Ｄｎｍｔ活性及びシトシンメチル化を阻害するために、細胞を以下の培地で増殖する：
（ａ）Ｄｎｍｔ１、２、３ａ、及び／又は３ｂｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ社）で処理された培地；
（ｂ）ＲＧ１０８（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＬＳＵ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で処理された培地；
（ｃ）５−ＡｚａｄＣｙｄ（Ｓｉｇｍａ社）で処理された培地
製造者の手順に従ったｓｉＲＮＡ形質移入の簡単な説明が以下に提供される。
【０１３４】
ＧＮＭＴ合成及び活性を促進するために、細胞をＡＴＲＡ（Ｓｉｇｍａ社）で処理された培地で増殖する。露光からＡＴＲＡを保護するために、弱められた照明でこの手法を行い、さらに、処理フラスコを箔で包む。
【０１３５】
ヒストン脱アセチル化を阻害し、脱メチル化を誘導するために、細胞をＴＳＡ及び／又はＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ社）で処理された培地で増殖する。以下の表４において、それだけに限定されないが、処理濃度が列挙され、条件が示されている。
【０１３６】
表４
【０１３７】
【表４】
2009502201.tif 000008
細胞は、３７℃、湿度９５％、及び５％ＣＯ２の状態で維持される。培地は３〜４日毎に新たな処理で変えられ、細胞は９０％までの培養密度で繰返し６週間まで継代培養される；例外には以下のＤｎｍｔｓｉＲＮＡ形質移入法を参照。細胞の生存能力／細胞毒性及び増殖率は、相対的な細胞数により決定される。終点として、減少したシトシンメチル化レベル、減少したＳＡＭ：ＳＡＨ比、増加したＧＮＭＴ発現、活性、及び蛋白質存在量、並びに、減少したＤｎｍｔ発現が挙げられる。
【０１３８】
ＤｎｍｔｓｉＲＮＡ形質移入：ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ社）形質移入試薬、Ｄｎｍｔ１、２、３ａ、及び／又は３ｂｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ社）、シクロフィリンｂｓｉＲＮＡ（陽性対照ｓｉＲＮＡ）、又はショウジョウバエ標的外ｓｉＲＮＡ（陰性対照ｓｉＲＮＡ）を含有する増殖培地内で、約７０〜８０％の培養密度で、細胞は形質移入される。Ｄｎｍｔ２は、機能しうると決定されてなく、追加の対照として作用する可能性もある。形質移入は、製造者の手順に従って実行される。細胞を形質移入培地内で４８時間培養する。製造者の推奨値に従って、細胞毒性を２４時間後に観察する場合、形質移入培地は増殖培地と取り替えられ、培養は２４時間追加で続けられる。４８時間の培養の後８０％の生存能力を示す穴は、分化に使用される。
【０１３９】
別の実施形態
本発明は、ベータガラクタマーゼ（Ｇａｌａｃｔａｍａｓｅ）、ルシフェラーゼ、ベータグルコシダーゼ、又はその他のレポーター遺伝子の使用に基づいた新たなアッセイの開発にも向けられている。そのアッセイは、細胞分化能の脱メチル化及び回復に対するＧＮＭＴ発現及び／又は活性の影響をモニターする能力を提供する。
【０１４０】
本発明は、さらに、脱分化されたドナー細胞を用いたＳＣＮＴにおける新規の方法の開発に向けられている。
【０１４１】
本発明は、ＳＣＮＴ再構築ユニット（胚）から胚性幹細胞を誘導する新規の方法の開発にも向けられている。
【０１４２】
実施例
以下の実施例は、単に、本発明のより完全な理解に寄与するために含まれている。実施例は、本明細書に記述された発明の範囲をいかなる方法でも制限することはない。
【０１４３】
実施例１−ウシの体細胞メチル化に対するＲＡの作用：   
ウシ連続核移植ドナー体細胞（生きた動物の作製に成功しておらず、低い胚盤胞発生率（＜１０％、Ｐ＜０．００１）及び低い妊娠開始率（＜１％、Ｐ＜０．０５）により特徴づけられた細胞株）を、増殖培地（ＣＯＮ）、又は、ＤＭＳＯ若しくはＡＴＲＡ（ＤＭＳＯ媒体）で処理された増殖培地においてコンフルエントになるまでＴ−７５フラスコ内で培養した。濃度１０ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭのＡＴＲＡを使用した。ＡＴＲＡの処理に続いて、細胞を収集し、その細胞からＤＮＡを単離した。次に、そのＤＮＡを、逆相ＨＰＬＣのために、一つのヌクレオチドまで完全に消化した。セザー（Ｃｅｚａｒ）等により記載されているように逆相ＨＰＬＣを行い[７６]、メチル化されたシトシン残基の相対レベルを測定した。
【０１４４】
図１に示されているように、ＨＰＬＣにより、１００ｎＭのＡＴＲＡで処理された培地で培養した細胞におけるメチル化されたシトシンは、対照に比べて相対的に２５％減少したことが明らかになった。ＤＭＳＯ又は１０〜５０ｎＭのＡＴＲＡで処理された培地で培養した細胞は、メチル化されたシトシンが対照に比べて８〜１０％減少したことを示した。これらの結果により、ＡＴＲＡが、連続核移植を介して得られた細胞等、再プログラミングに抵抗する細胞においてでもメチル化の状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少できることが示された。
【０１４５】
図２で示されているように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＳＡＭ：ＳＡＨ比及び細胞のメチル化能力を調節する鍵となる酵素、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）をコードする遺伝子の上方調節が実証された。（結果は、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水酵素（ＧＡＰＤ）に対するＧＮＭＴの比として描写されている。ＧＡＰＤ発現レベルは、ＧＮＭＴの発現を既知のマーカーに正常化するために使用される。）図２に示されているようなＧＮＭＴの上方調節は、図１に示されているＤＮＡメチル化の減少と同時に起こることに注目されたい。さらに、ＲＴ−ＰＣＲにより、最も診断に役立つ哺乳動物幹細胞／多能性マーカーであるＯｃｔ４、並びに、Ｓｏｘ２及びｎａｎｏｇ（データは示されていない）の上方調節と目立った発現が確証された。ＲＴ−ＰＣＲ実験を商業的に入手可能な道具を用いて製造者の指示（ＴＡＱＭＡＮ−ｂｒａｎｄ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従い行った。他の研究者等は、Ｏｃｔ４の脱メチル化はマウス体細胞核の能率的な再プログラミングの必要条件であると実証した[２０]。
【０１４６】
これらのデータは、ＡＴＲＡへの曝露によりＧＮＭＴの発現、並びに、おそらくＧＮＭＴ酵素の活性は増加し、包括的な脱メチル化（Ｏｃｔ４プロモーターの脱メチル化及び後の発現を含む）を生じると示している。減少したＤＮＡメチル化は脱分化と一致し、増加したＯｃｔ４の発現は分化能の回復と一致する。本発明者の知る限りでは、本発明は、一炭素代謝を改変することにより、幹細胞マーカーを哺乳動物体細胞において誘導した最初の実証である。その結果は、哺乳動物細胞を誘導して通常未分化幹細胞にだけ存在するマーカーを発現することができ、従って、細胞は再プログラムして異なる細胞型に分化できると示したため重要である。
【０１４７】
実施例２−ウシの体細胞に対するＲＡ及び脂肪生成誘導カクテルの作用：
分化能が回復されたかを決定するために、ウシ体細胞をＣＯＮ、ＤＭＳＯ、又はＡＴＲＡ培地（実施例１と同じＲＡ）においてコンフルエントになるまでＴ−７５フラスコ内で培養した。ＡＴＲＡ処理に続いて、細胞をＲＮＡ単離のために収集し又は６穴プレートに移送して、ＤＭＥＭ、ＦＢＳ、インシュリン、ＩＢＭＸ、及びデキサメタゾンを含んだ脂肪生成誘導カクテルにおいて培養した。ＩＢＭＸ除去し、４８時間後にＴＺＤを添加した。細胞を１１〜１２日間誘導培地に残し、次に、脂肪滴の存在を確かめるためにオイルレッドＯ（Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）で染色し、又は、ＲＮＡ単離のために収集した。幹細胞マーカー（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＡＰ）及び脂肪生成マーカー（ＰＰＡＲγ、ＬＰＬ、ＦＡＳ）のＲＴ−ＰＣＲのためにｃＤＮＡにＲＮＡを逆転写し、又は、ＧＮＭＴのワンステップ定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて直接使用した。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水酵素（ＧＡＰＤＨ）をノーマライズ／ハウスキーピング遺伝子として使用した。
【０１４８】
図３（ａ）に示されているように、ＡＴＲＡへの曝露中、胚様体に著しく類似した構造の発生を含む重大な形態変化が観察された。図３（ｂ）において矢印により示されているように、陽性オイルレッドＯ染色も誘導後に観察され、脂質の存在を示している。ＰＣＲによる遺伝子発現分析によって、脂肪細胞分化において既知のマーカーであるＰＰＡＲγの誘導が明らかになった（データは示されていない）。これらの結果は、体細胞を誘導して他の細胞型に再分化できることを示唆しているため重要である。
【０１４９】
実施例３−初代培養肝細胞に対するＲＡ及び脂肪生成誘導カクテルの作用：
初代培養ネズミ肝細胞を、５０〜２００ｎＭＡＴＲＡで処理した培地において増殖した。処理に続いて、脂肪生成誘導カクテル（実施例２に記述されている）をＴ−７５フラスコに添加することを除いて、上記のウシ体細胞と同じ比較条件のもと細胞を培養した。ＡＴＲＡ処理中に形態変化が観察され、誘導培地への最初の曝露の後４８時間以内に、これらの変化は明白になった。脂肪生成誘導培地への曝露後４日目までに、これらの形態変化は球状体発生の開始、及び、対照細胞では達成しない状態である培養密度により証明された明瞭な細胞の増殖により併発された。これらの観察により、終末に分化するこれらの初代培養肝細胞は、培養におけるＡＴＲＡ処理及び脂肪生成誘導培地への曝露に続いて細胞周期に再び入り、処理に続いて著しく増殖したことが示唆されている。
【０１５０】
実施例４−マウス体細胞に対するＲＡ及び骨形成誘導カクテルの作用：
３Ｔ３Ｌ１細胞を、５０〜２００ｎＭＡＴＲＡで処理した培地において増殖した。ＡＴＲＡ処理に続いて、細胞を６穴プレートに移送して、ＤＭＥＭ、ＦＢＳ、アスコルビン酸２−リン酸、デキサメタゾン、ベータグリセロリン酸、及びビタミンＤを含有した骨形成誘導培地に２１日間曝露した。図４（ａ）及び図４（ｂ）に示されているように、骨形成誘導に続いて、骨芽細胞様の細胞に対する陽性染色（図４（ａ））及びリン酸カルシウムミネラル化（図４（ｂ））が、それぞれアルカリホスファターゼ及びアリザリン染色を用いて観察された。図５に示されているように、ＲＴ−ＰＣＲにより、骨芽細胞特異的な分化のマーカーとして既知のオステオカルシン及びｃｂｆａ１の誘導が明らかになった。
【０１５１】
実施例５−干渉ＲＮＡ技術を用いてＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１，３Ａ、及び／又は３Ｂをノックダウンすることにより回復された分化能を有する細胞を生成する細胞培養物の作製、並びに、細胞株の作製：
干渉ＲＮＡ技術を用いてＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１，３ａ、及び／又は３ｂをノックダウンすることで、ＤＮＡメチル化のレベルを減少した。培地を改変してｓｉＲＮＡ技術を組み入れることにより、選択的な遺伝子発現抑制を実現できる。基礎培地、その培地に対する特定の処理及び改変、並びに、ノックダウン能力を確かめるための方法を含むこの影響を得るための方法論は、以下に記述される。
【０１５２】
一炭素代謝を改変する、及び／又は、ＤＮＭＴ活性を阻害することにより、分化能を回復することができる包括的なＤＮＡ脱メチル化が誘導される。複数の系譜に再分化する能力を有する脱分化された細胞株を、包括的なエピジェネティックな再プログラミングにより作製することができる。どのようにしてこれが実現されるかは、予備調査により実証される。その予備調査は、ｓｉＲＮＡ技術を用いたＤＮＭＴ遺伝子ノックダウンが、ＳＣＮＴのためのウシドナー細胞株及びマウス線維芽細胞株における包括的なＤＮＡ脱メチル化に対して与える影響を分析するよう計画された。
【０１５３】
実施例５．１−ウシドナー体細胞メチル化及び発生能に対するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１ｓｉＲＮＡ形質移入の作用：
屠殺場の卵巣から吸引されたウシ卵母細胞を、黄体ホルモン（１０ＩＵ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）、エストラジオール（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）、及びＦＢＳ（１０％；Ｈｙｃｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）で補われた成熟培地（培地１９９；Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社）において、３８．５℃の加湿された５％ＣＯ２培養器内で一晩成熟させた。ファースバーグ（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ）等により記載されているように[１３１]、ウシ核移植を行った。ロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）等により使用されたＤｎｍｔ１に対するヒトｓｉＲＮＡは[１４０]、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）に注文した。その配列は、ＡＡＧＣＡＵＧＡＧＣＡＣＣＧＵＵＣＵＣＣ．ｄＴ．ｄＴ（ＳＥＱＩＤ番号：１）であった。これを、製造者の指示に従って、二重にし、さらに脱塩した。ｓｉＲＮＡの形質移入が、リポフェクチン製造者手順に従い起こった。手短に、１Ｘユニバーサル緩衝液内の２μＭｓｉＲＮＡを、血清を含まない増殖培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を有するリポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）形質移入試薬と混ぜ合わせた。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）等[１４０]。形質移入に先立ち、４０〜６０％までコンフルエントになった細胞から培地を除去し、最終的な形質移入濃度が２００ｎＭｓｉＲＮＡ及び０．６％リポフェクチン形質移入試薬になるように、３ｍｌの形質移入試薬液を添加した。
【０１５４】
細胞を３７℃で２４時間培養し、血清を含有するＡｍｉｎｏＭＡＸブランドの培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で洗浄した。分析に先立ち、細胞を二度形質移入した。同時に生成した対照試料及び試験試料は、以下を含む：
１．       
培地のみで処理した細胞
２．       
形質移入試薬（リポフェクチン）のみで処理した細胞
３．       
対照ｓｉＲＮＡ（ＬａｍｉｎＡ／Ｃ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）で処理した細胞
４．       
試験ｓｉＲＮＡ（Ｄｎｍｔ１；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）で処理した細胞
以下の図及びレジェンドは、これらの研究を要約している。図６（ａ）及び図６（ｂ）は、ｓｉＲＮＡによるＤｎｍｔ１のノックダウンを示している。ＳＣＮＴ用ウシドナー細胞におけるｓｉＲＮＡ処理の後、Ｄｎｍｔ１は能率的にノックダウンし（図６（ａ）、レーンＤ）、一方で、アクチン発現は影響を受けなかった（図６（ａ）、レーンＧ〜Ｉ）。これとは対照的に、ラミンｓｉＲＮＡへの曝露により、ラミン発現はノックダウンされたが（図６（ｂ）、レーンＣ）、Ｄｎｍｔ１はノックダウンされなかった（図６（ａ）、レーンＣ）。ＨＰＬＣ分析により、約４０％の包括的なメチル化レベルの減少が、Ｄｎｍｔ１ｓｉＲＮＡで処理された細胞において確証され、その後その細胞をＳＣＮＴに使用した。図６（ｃ）は、対照（レーンＡ＆Ｂ）と比較した場合の、少なくとも２細胞期まで持続したＤｎｍｔ１のノックダウンを示し（レーンＣ〜Ｆ）、さらに、対照に比べ、胚盤胞発生率は有意に高かった（５０％対２１％、ｐ＜０．０５）。
【０１５５】
実施例５．２−マウス体細胞メチル化に対するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂｓｉＲＮＡ形質移入の作用：
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を２００ｎＭマウスＤｎｍｔ３ｂｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）で形質移入した。プールされたｓｉＲＮＡ配列は：ＧＣＡＡＵＧＡＵＣＵＣＵＣＵＡＡＣＧＵ（ＳＥＱＩＤ番号：２）；ＧＧＡＡＵＧＣＧＣＵＧＧＧＵＡＣＡＧＵ（ＳＥＱＩＤ番号：３）；ＵＡＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＣＵＵＣＡＡＵ（ＳＥＱＩＤ番号：４）；ＧＣＡＡＡＧＧＵＵＵＡＵＡＵＧＡＧＧＧ（ＳＥＱＩＤ番号：５）である。形質移入手順を、本質的には製造者により記載されているように、本発明において最適化した。手短に、１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液内の２μＭｓｉＲＮＡを、血清を含まない増殖培地（ＤＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を有するＤｈａｒｍａＦＥＣＴ形質移入試薬と混ぜ合わせた。形質移入に先立ち、７０〜８０％までコンフルエントになった細胞から培地を除去し、表面を覆うように形質移入試薬液を添加した。最終的な形質移入濃度は、６穴プレートの１つの穴あたり全容積が２ｍｌで、２００ｎＭｓｉＲＮＡ及び０．６％ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ形質移入試薬であった。
【０１５６】
細胞を３７℃の５％ＣＯ２で２４〜４８時間培養した。全ての実験は、以下の対照及び試験試料を三組含んだ：
１．       
未処理の細胞（培地のみ）
２．       
モック形質移入（ｓｉＲＮＡは無し；ＤｈａｒｍａＦＥＣＴのみ）
３．       
陽性対照ｓｉＲＮＡ（サイクロフィリン）
４．       
陰性対照ｓｉＲＮＡ（ショウジョウバエ標的外）
５．       
試験ｓｉＲＮＡ（Ｄｎｍｔ３ｂ）
Ｄｎｍｔ３ｂｍＲＮＡ発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより（ＴＡＱＭＡＮ−ｂｒａｎｄ  ＲＴ−ＰＣＲキット及び以下の製造者の指示を用いて）決定した。結果は図７（ａ）；ｎ＝２に示されている。メチル化レベルをＨＰＬＣにより決定した。結果は図７（ｂ）；ｎ＝３に示されている。
【０１５７】
図７（ａ）に示されているように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、対照の細胞に比べ、Ｄｎｍｔ３ｂｓｉＲＮＡで形質移入された細胞におけるサイクロフィリンｂに関連するＤｎｍｔ３ｂｍＲＮＡレベルが７９％減少したことが明らかになった。図７（ｂ）に示されているように、ＨＰＬＣにより、対照の細胞に比べ、Ｄｎｍｔ３ｂｓｉＲＮＡで形質移入された細胞におけるメチル化されたシトシンが５２％減少したことが明らかになった。これらのデータは、Ｄｎｍｔ３ｂ遺伝子ノックダウンがメチル化状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少できると示している。
【０１５８】
実施例６−ヒト及びマウス体細胞におけるＤＮＡメチルトランスフェラーゼｓｉＲＮＡ形質移入のための新たな培地：
追加のヒト及びマウスＤｎｍｔｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入した。プールされたｓｉＲＮＡ配列は：
１．ヒトＤｎｍｔ１：ＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＵＵＡＣＵＡＵＡＡ（ＳＥＱＩＤ番号：６）；
ＧＡＧＣＧＧＡＧＧＵＧＵＣＣＣＡＡＵＡ（ＳＥＱＩＤ番号：７）；
ＧＧＡＣＧＡＣＣＣＵＧＡＣＣＵＣＡＡＡ（ＳＥＱＩＤ番号：８）；
ＧＡＡＣＧＧＵＧＣＵＣＡＵＧＣＵＵＡＣ（ＳＥＱＩＤ番号：９）；
２．ヒトＤｎｍｔ３ａ：ＧＣＡＣＡＡＧＧＧＵＡＣＣＵＡＣＧＧＧ（ＳＥＱＩＤ番号：１０）；
ＣＡＡＧＡＧＡＧＣＧＧＣＵＧＧＵＧＵＡ（ＳＥＱＩＤ番号：１１）；
ＧＣＡＣＵＧＡＡＡＵＧＧＡＡＡＧＧＧＵ（ＳＥＱＩＤ番号：１２）；
ＧＡＡＣＵＧＣＵＵＵＣＵＧＧＡＧＵＧＵ（ＳＥＱＩＤ番号：１３）；
３．ヒトＤｎｍｔ３ｂ：ＧＡＡＡＧＵＡＣＧＵＣＧＣＵＵＣＵＧＡ（ＳＥＱＩＤ番号：１４）；
ＡＣＡＡＡＵＧＧＣＵＵＣＡＧＡＵＧＵＵ（ＳＥＱＩＤ番号：１５）；
ＧＣＵＣＵＵＡＣＣＵＵＡＣＣＡＵＣＧＡ（ＳＥＱＩＤ番号：１６）；
ＵＵＵＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＧＡＡＵＵＡ（ＳＥＱＩＤ番号：１７）；
４．マウスＤｎｍｔ１：１−ＧＧＡＡＡＧＡＧＡＵＧＧＣＵＵＡＡＣＡ（ＳＥＱＩＤ番号：１８）；
ＧＣＵＧＧＧＡＧＡＵＧＧＣＧＵＣＡＵＡ（ＳＥＱＩＤ番号：１９）；
ＧＡＵＡＡＧＡＡＡＣＧＣＡＧＡＧＵＵＧ（ＳＥＱＩＤ番号：２０）；
ＧＧＵＡＧＡＧＡＧＵＵＡＣＧＡＣＧＡＡ（ＳＥＱＩＤ番号：２１）；
５．マウスＤｎｍｔ３ａ：ＣＧＣＧＡＵＵＵＣＵＵＧＡＧＵＣＵＡＡ（ＳＥＱＩＤ番号：２２）；
ＣＧＡＡＵＵＧＵＧＵＣＵＵＧＧＵＧＧＡ（ＳＥＱＩＤ番号：２３）；
ＡＡＡＣＡＵＣＧＡＧＧＡＣＡＵＵＵＧＵ（ＳＥＱＩＤ番号：２４）；
ＣＡＡＧＧＧＡＣＵＵＵＡＵＧＡＧＧＧＵ（ＳＥＱＩＤ番号：２５）；
である。
【０１５９】
全ての手順を、本質的には製造者により記載されているように、本発明において最適化する。手短に、１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液内の２μＭｓｉＲＮＡを、血清を含まない増殖培地（ＤＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を有するＤｈａｒｍａＦＥＣＴ形質移入試薬と混ぜ合わせる。形質移入に先立ち、７０〜８０％までコンフルエントになる細胞から培地を除去し、表面を覆うように形質移入試薬液を添加する。最終的な形質移入濃度は、６穴プレートの１つの穴あたり全容積が２ｍｌで、２００ｎＭｓｉＲＮＡ及び０．６％ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ形質移入試薬である。
【０１６０】
細胞を３７℃の５％ＣＯ２で２４〜４８時間培養する。全ての実験は、以下の試料を三組含む：未処理の細胞、モック形質移入（ｓｉＲＮＡ無し、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴのみ）、陽性対照ｓｉＲＮＡ（サイクロフィリンｂ）、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ショウジョウバエ標的外）、及び試験ｓｉＲＮＡ。
【０１６１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲが遺伝子ノックダウンを確かめるために使用される。ＨＰＬＣが相対的なシトシンメチル化レベルを測定するために使用される。
【０１６２】
実施例７−干渉ＲＮＡ技術を用いてＭＴＨＦＲ及び／又はＣｂｓをノックダウンする新たな培地：
干渉ＲＮＡ技術を用いてＭＴＨＦＲ及び／又はＣｂｓをノックダウンすることにより、ＳＡＭ：ＳＡＨ比並びにＤＮＡメチル化を減少する。適切なｓｉＲＮＡは商業的に購入し（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、製造者の指示に従って、二重にし、さらに脱塩される。プールされたヒト及びマウスｓｉＲＮＡ配列は：
ヒトＭＴＨＦＲ：ＡＧＵＧＡＧＡＧＣＵＣＣＡＡＡＧＡＵＡ（ＳＥＱＩＤ番号：２６）；
ＧＡＡＧＵＧＡＧＵＵＵＧＧＵＧＡＣＵＡ（ＳＥＱＩＤ番号：２７）；
ＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＵＡＣＡＵＣＵＡ（ＳＥＱＩＤ番号：２８）；
ＧＣＡＡＧＵＧＵＣＵＵＵＧＡＡＧＵＣＵ（ＳＥＱＩＤ番号：２９）；
ヒトＣｂｓ：ＡＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＣＣＵＡ（ＳＥＱＩＤ番号：３０）；
ＣＡＣＣＡＣＣＧＣＵＧＡＵＧＡＧＡＵＣ（ＳＥＱＩＤ番号：３１）；
ＧＧＡＣＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＡＡＧＵＧ（ＳＥＱＩＤ番号：３２）；
ＧＧＡＡＧＡＡＧＵＵＣＧＧＣＣＵＧＡＡ（ＳＥＱＩＤ番号：３３）；
マウスＭＴＨＦＲ：ＣＧＣＣＡＵＧＧＣＵＡＣＡＧＡＧＵＡＡ（ＳＥＱＩＤ番号：３４）；
ＧＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＵＧＡＵＧＡ（ＳＥＱＩＤ番号：３５）；
ＣＡＧＡＡＧＧＣＣＵＡＣＣＵＣＧＡＡＵ（ＳＥＱＩＤ番号：３６）；
ＣＡＵＡＣＧＡＧＣＵＧＣＧＧＧＵＣＡＡ（ＳＥＱＩＤ番号：３７）；
マウスＣｂｓ：ＧＣＡＡＡＣＡＧＣＣＵＡＵＧＡＧＧＵＧ（ＳＥＱＩＤ番号：３８）；
ＧＣＡＡＡＧＵＣＣＵＣＵＡＣＡＡＧＣＡ（ＳＥＱＩＤ番号：３９）；
ＧＡＵＣＧＡＡＧＡＵＧＣＵＧＡＧＣＧＡ（ＳＥＱＩＤ番号：４０）；
ＣＡＡＣＣＣＵＵＵＧＧＣＡＣＡＣＵＡ（ＳＥＱＩＤ番号：４１）；
である。
【０１６３】
陽性及び陰性ｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から購入し、直接形質移入に使用する。
【０１６４】
全ての手順を、本質的には製造者により記載されているように最適化する。手短に、１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液内の２μＭｓｉＲＮＡを、血清を含まない増殖培地（ＤＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を有するＤｈａｒｍａＦＥＣＴ形質移入試薬と混ぜ合わせる。形質移入に先立ち、７０〜８０％までコンフルエントになる細胞から培地を除去し、表面を覆うように形質移入試薬液を添加する。最終的な形質移入濃度は、６穴プレートの１つの穴あたり全容積が２ｍｌで、２００ｎＭｓｉＲＮＡ及び０．６％ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ形質移入試薬である。
【０１６５】
細胞を３７℃の５％ＣＯ２で２４〜４８時間培養する。全ての実験は、以下の試料を三組含む：未処理の細胞、モック形質移入（ｓｉＲＮＡ無し、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴのみ）、陽性対照ｓｉＲＮＡ（サイクロフィリンｂ）、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ショウジョウバエ標的外）、及び試験ｓｉＲＮＡ。
【０１６６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲが遺伝子ノックダウンを確かめるために使用される。ＨＰＬＣが相対的なシトシンメチル化レベルを測定するために使用される。
【０１６７】
実施例８−ＧＮＭＴの転写、蛋白質発現、及び活性を増加する新たな培地：
ＧＮＭＴの転写、蛋白質発現、及び活性を増加することにより、ＳＡＭ：ＳＡＨ比並びにＤＮＡメチル化は減少する。このことは、ＧＮＭＴ活性を増加する、及び／又は、ＳＡＭ：ＳＡＨ比を減少する等、ＡＴＲＡと類似した作用を有する化合物、抽出物、分子の同定を必要とする。
【０１６８】
メチル供与体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで激減させることにより、ＳＡＭ：ＳＡＨ比及びＤＮＡメチル化は減少する。培地は注文設計され、１若しくは複数のメチル供与体又は補酵素（葉酸塩、ベタイン、コリン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、及びメチオニン、及び／若しくはその他）が欠如する；又は、増加した量のホモシステインを有する；又は、欠如したメチル供与体／補酵素及び／若しくは増加した量のホモシステインの組合せを有する。配合は、表５に示されているように、改変を有してＨｙｃｌｏｎｅ社の１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）に基づいている。
【０１６９】
表５
【０１７０】
【表５】
2009502201.tif 000009
実施例９−ホモシステインのレベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増加する培地：
ホモシステインのレベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増加することにより、ＳＡＭ：ＳＡＨ比及びＤＮＡメチル化は減少する。培地は注文設計され、増加した量のホモシステイン；又は、欠如したメチル供与体／補酵素及び／若しくは増加した量のホモシステインの組合せを含む。配合は、表６に示されているように、改変を有してＨｙｃｌｏｎｅ社の１６４０培地に基づいている。
【０１７１】
表６
【０１７２】
【表６】
2009502201.tif 000010
減少若しくは激減されたレベルの特定のメチル供与体若しくは複数のメチル供与体を有する、又は、増加したレベルのホモシステイン又は減少若しくは激減されたレベルの特定のメチル供与体若しくは複数のメチル供与体と組み合わせた増加したレベルのホモシステインを含有する規定された培地において細胞を培養することにより、ＳＡＭ：ＳＡＨ比及びＤＮＡメチル化は減少する。
【０１７３】
実施例１０−ＧＮＭＴプロモーターを用いたハイスループットアッセイ：
ＧＮＭＴの発現を増加し、及び／又は、ＧＮＭＴを活性化する因子は、おそらく、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを下方調節し、包括的なメチル化レベルを減少するものである。βラクタマーゼを基にしたアッセイ（及び／又は以下に記述された他のアッセイ）は、ＧＮＭＴ転写の誘導により、ＧＮＭＴ発現のインデューサー（並びにサプレッサー）を同定するために開発されている。
【０１７４】
βラクタマーゼアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、細胞を基にしたアッセイを開発する。その細胞を基にしたアッセイを使用して、一炭素代謝経路を介してＤＮＡ脱メチル化を誘導する薬物、分子、及び抽出物、並びに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで回復された多能性及び多分化能性の細胞株の再分化を誘導する薬物、分子、及び抽出物を同定することができる。最初の目的は、ＧＮＭＴの発現を誘導する薬物、分子、及び抽出物をスクリーンするために使用することができる細胞を基にしたアッセイを開発することである。
【０１７５】
このアッセイの基礎は、ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）である。そのＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ技術は、ハイスループットスクリーニングのために生細胞染色、蛍光活性化セルソーティングとの適合性、レシオメトリック読み出し、及び最適化されたプラットフォームを提供する膜浸透性の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を基にした基質（ＣＣＦ２−ＡＭ）に基づいた遺伝子レポーターシステムである。４０５ｎｍでのＣＣＦ２の励起により、それぞれ、ＣＣＦ２基質分子におけるＦＲＥＴの欠如のため、青／緑色の放出物が生じる。細胞浸透性のＣＣＦ２−ＡＭは、セファロスポリン核により連結された２個のフルオロフォア、７−ヒドロキシクマリン、及びフルオレセインからなっている。
【０１７６】
４０５ｎｍでのクマリンの励起は、５３０ｎｍで緑色の蛍光光線を放射するフルオレセイン部分にＦＲＥＴを生じる。βラクタマーゼにより、ＣＣＦ２−ＡＭ基質分子のセファロスポリン核内にあるβラクタム部分は２個の独立したフルオロフォアに切断され、ＦＲＥＴは崩壊する。
【０１７７】
４０５ｎｍでの細胞の励起は、４６０ｎｍで検知されるクマリンによる青色の蛍光放出を生じる。細胞にβラクタマーゼが存在することにより、緑色の蛍光細胞は青色の蛍光細胞へと変化する。このように、異なる放出特徴を有する細胞をＦＡＣＳ分析中に収集することができる。
【０１７８】
ヒトＧＮＭＴの５’上流領域を含む１．８ｋｂのＤＮＡ断片を、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅する。使用されるプライマーは：
Ｐｒ４５４６：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴ−３’（ＳＥＱＩＤ番号：４２）及び
Ｐｒ６３９１：５’−ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＴ−３’（ＳＥＱＩＤ番号：４３）である。
【０１７９】
ＰＣＲの条件は、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、２００ｎｍプライマー、６０℃での１分間のアニーリングステップを３５サイクル、７２℃での２分間の延長、及び３５サイクルである。
【０１８０】
増幅後、ＳＤＳ及びＥＤＴＡをそれぞれ０．１％及び５ｍＭまで添加する。ＤＮＡを、２．５Ｍ酢酸アンモニウム及び７０％エタノールで沈殿させる。断片をＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ゲル電気泳動後にアガロースから溶出により単離する。その断片を、βラクタマーゼＭコード配列（ｂｌａＭ）遺伝子を担時するベクターｐ７−ｂｌａＭに結合する。リポフェクタミン２０００ブランドの試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質移入試薬として用いて、そのコンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１細胞に形質移入する。挿入断片無しのベクターを陰性の対照として形質移入する。ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）への耐性により安定した細胞を選択する。１０％炭処理血清、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、及び１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液を有するフェノールレッドを含まないＭＥＭ−α培地において細胞を増殖する。
【０１８１】
βラクタマーゼ低発現を有するクローンを、ＦＡＣＳ分析により選択する。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液［リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、５％炭処理ＦＢＳ］で２回トリプシン処理及び洗浄し、さらに細胞浸透性のＦＲＥＴを基にした基質（ＣＣＦｓ−ＡＭ）に適切なＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ技術を用いて１×１０６細胞／ｍｌの濃度で載せ、暗い場所で１時間穏やかに振盪する。
【０１８２】
細胞を遠心分離により回収し、同じ細胞濃度のＦＡＣＳ緩衝液において再懸濁する。細胞をベクトン−ディッキンソンＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓセルソーター（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて分別する。アルゴンＵＶレーザーを用いて基質に載せられた細胞を励起させる。反応している緑色の蛍光を有するクローンを、２００ｇ／ｍｌゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）を有する増殖培地を含んでいる９６穴プレートに収集し、最終的な細胞集団が６×１０６になるまで増殖する。安定した細胞株をＡＴＲＡで処理することにより、誘導能を調べる。
【０１８３】
先の実験により、ＧＮＭＴ転写のＡＴＲＡに対する容量反応が実証されている。この反応を、アッセイが成功しているかどうかの判断基準として使用する。特に、３倍の誘導が１００ｎＭＡＴＲＡでの処理により検出され、リアルタイムＰＣＲにより確かめられた場合に、アッセイは成功していると考えられる。ＡＴＲＡ誘導性のβラクタマーゼ発現を有するクローンを同定し、さらなる開発のために使用する。
【０１８４】
ルセリフェラーゼ（Ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、ベータガラクトシダーゼ、又はその他のレポーター遺伝子を使用した類似の処理を用いたアッセイを利用することも本発明の範囲内である。
【０１８５】
本発明は、本明細書において例示され記述された部分の特定の構成及び配置に制限されないが、請求項の範囲内でそのような改変された形状を含むことが理解されたい。
【０１８６】
本国際出願は、２００５年８月１日に出願した米国仮出願番号第６０／７０４，４６５号に基づく優先権を主張するものであり、６０／７０４，４６５号の全内容を本国際出願に援用する。
【参考文献】
【０１８７】
1.  Balaghi  M,  Wagner  C.  DNA  methylation  in  folate  deficiency:  use  of  CpG  methylase.  Biochm  Biophys  Res  Commun.  1993;193:  1184-1190.
2.  Alonso-Aperte  E,  Varela-Moreiras  G.  Brain  folate  and  DNA  methylation  in  rats  fed  a  choline  deficient  diet  or  treated  with  low  doses  of  methotrexate.  Int  J  Vitamin  Nutr  Res.  1996;66_232-236.
3.  Jacob  RA,  Gretz  DM,  Taylor  PC,  et  al.  Moderate  folate  depletion  increases  plasma  homocysteine  and  decreases  lymphocyte  DNA  methylation  in  postmenopausal  women.  J  Nutr.  1998;128:1204~1212.
4.  Rampersaud  GC,  Kauwell  GP,  Hustson  AD,  Cerda  JJ,  Bailey  LB.  Genomic  DNA  methylation  decreases  in  response  to  moderate  folate  depletion  in  elderly  women.  Am  J  Clin  Nutr.  2000;72:998-1003.
5.  Pufulete  M,  AI-Ghaniem  R,  Leather  AJ,  et  al.  Folate  status,  genomic  DNA  hypomethylation,  a  risk  of  colorectal  adenoma  and  cancer:  a  case  control  study.  Gastroenterology.  2003;124:1240-1248.
6.  Fowler  BM,  Giulano  AR,  Piyathilake  C5  Nour  M,  Hatch  K.  Hypomethylation  in  cervical  tissue:  is  there  a  correlation  with  folate  status?  Cancer  Epidemiol  Biomarkers  Prev.  1998;7:901-906.
7.  Fang  JY,  Xiao  SD,  Zhu  SS5  Yuan  JM  Qiu  DK,  Jiang  SJ.  Relationship  of  plasma  folic  acid  and  status  of  DNA  methylation  in  human  gastric  cancer.  J  Gastroenterol.  1997;32:  171-175.
8.  Friso  S,  Choi  SW,  Girelli  D,  et  al.  A  common  mutation  in  the  5,10-methylenetetrahydrofolate  reductase  gene  affects  genomic  DNA  methylation  through  and  interaction  with  folate  status.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  2002,99:5606-5611.
9.  Cravo  M,  Fidalgo  P,  Pereira  AD  et  al.  DNA  methylation  as  an  intermediate  in  colorectal  cancer:  modulation  by  folic  acid  supplementation.
10.  Kim  YI,  Baik  HW,  Fawaz  K,  et  al.  Effects  of  folate  supplementation  on  two  provisional  molecular  markers  of  colon  cancer:  a  prospective,  randomized  trial.  Am  J  Gastroneterol.  2001;96:184-195.
11.  Ingrosso  D,  Cimmino  A,  Perna  AF,  et  al.  Folate  treatment  and  unbalanced  methylation  and  changes  of  allelic  expression  induced  by  hyperhomocysteinaemia  in  patients  with  uraemia.  Lancet.  2003;361:  1693-1699.
12.  Duthie  SJ,  Narayanan  S,  Slum  S,  Pirie  L,  Brand  GM.  Folate  deficiency  in  vitro  induces  uracil  misincorporation  and  DNA  hypomethylation  and  inhibits  DNA  excision  repair  in  immortalized  normal  human  colon  epithelial  cells.  Nutr  Cancder.  2000;37:245-251.
13.  Carlson  LL,  Page  AW,  Bestor  TH.  Properties  and  localization  of  DNA  methyltransferase  in  pre-implantation  mouse  embryos:  implications  for  genomic  imprinting.  Genes  Dev.  1992;6:2536-2541.
14.  Chen  T,  Ueda  Y,  Dodge  JE,  Wang  J,  Li  E.  Establishment  and  maintenance  of  genomic  methylation  patterns  in  mouse  embryonic  stem  cells  by  Dnmt3a  and  Dnmt3b.  MoI  Cell  Biol.  2003;23:5594-5604.
15.  Lei  H,  Oh  SP,  Okano  M,  Jutterman  R,  Goss  KA,  Jaensisch  R,  Li  E.  De  novo  DNA  cystosine  methyltransferase  activities  in  mouse  embryonic  stem  cells.  Development.  1996;122:3195-  3205.
16.  Mayer  W,  Niveleau  A,  Walter  R,  Funele  R,  Haaf  T.  Demethylation  of  the  zygotic  paternal  genome.  Nature.  2000;403:501-502.
17.  Okano  M,  Bell  DW,  Haber  DA,  Li  E.  DNA  methyltransferases  Dnmt3a  and  Dnmt3b  are  essential  for  de  novo  methylation  and  mammalian  development.  Cell.  1991;99:247-257.
18.  Panning  B,  Jaenisch  R.  DNA  hypomethylation  can  activate  Xist  expression  and  silence  X-  linked  genes.  Genes  Dev.  1996;10:1991-2002.
19.  Jackson  M,  Krassowska  A,  Gilbert  N  et  al.  Severe  global  DNA  hypomethylation  blocks  differentiation  and  induces  histone  hypereacetylation  in  embryonic  stem  cells.  MoI  Cell  Biol.  2004;25:8862-8871.
20.  Somonsson  S,  Gurdon  J.  DNA  methylation  is  necessary  for  the  epigenetic  reprogramming  of  somatic  cell  nuclei.  Nat  Cell  Bio.  2004;6:984-990.
21.  Bird  A.  DNA  methylation  patterns  and  epigenetic  memory.  Genes  Dev.  2002;16:6-21.
22.  Li,  E.  Chromatin  modification  and  epigenetic  programming  in  mammalian  development.  Nat  Rev  Genet.  2002;3:662-673.  
23.  Reik  W,  Dean  W,  Walter  J.  Epigenetic  reprogramming  in  mammalian  development.  Science.  2001  ;293:  1089-1093.
24.  Rideout  WM,  Eggan  K5  Jaenisch  R.  Nuclear  cloning  and  epigenetic  reprogramming  of  the  genome.  Science.  2001;293:1093-1098.
25.  Surani  MA.  Reprogramming  of  genome  function  through  epigenetic  inheritance.  Nature.  2001;414:122-128.
26.  Feinberg  AP,  Tycko  B.  The  history  of  cancer  epigenetics.  Nat  Rev  Cancer.  2004;4:  143-153.
27.  Goodell  MA.  Stem  cell  plasticity:  befuddled  by  the  muddle.  Curr  Opin  Hematol.  2003;10:208-213.
28.  Pomerantz  J,  Blau  HM.  Nuclear  reprogramming:  a  key  to  stem  cell  function  in  regenerative  medicine.  Nat  Cell  Biol.  2004;6:810-816.
29.  Hsieh  J,  Gage  FH.  Epigenetic  control  of  neural  stem  cell  fate.  Curr  Opin  Genet  Dev.  2004;14:461-469.
30.  Dean  W,  Santos  F,  Reik  W.  Epigenetic  programming  in  early  mammalian  development  and  following  SCNT.  Semin  Cell  Dev  Biol.  2003;14:93-100.
31.  Jouneau  A,  Renard  JP.  Reprogramming  in  nuclear  transfer.  Curr  Opin  Genet  Dev.  2003;13:486-491.
32.  Kang  YK,  Lee  KK,  Han  YM.  Reprogramming  DNA  methylation  in  the  preimplantation  stage:  peeping  with  Dolly's  eyes.  Curr  Opin  Cell  Biol.  2003;15:290-295.
33.  Hochedlinger  K,  Rideout  WM,  Kyba  M  et  al.,  Nuclear  transplantation,  embryonic  stem  cells  and  the  potential  for  cell  therapy.  Hematol  J.  S3.  2004;Sl  14-Sl  17.
34.  Santos  F,  Hendrich  B,  Reik  W,  Dean  W.  Dynamic  reprogramming  of  DNA  methylation  in  the  early  mouse  embryo.  Dev  Biol.  2002;241:  172-182.
35.  Lane  N,  Dean  W,  Erhardt  S,  Hajkova  P,  Surani  A,  Walter  J,  Reik  W.  Resistance  of  IAP  to  methylation  reprogramming  may  provide  a  mechanism  for  epigenetic  inheritance  in  the  mouse.  Genesis.  2003;35:88-93.
36.  Adenot,  PG,  Mercier  Y,  Renard  JP,  Thompson  EM.  Differential  H4  acetylation  of  paternal  and  maternal  chromatin  precedes  DNA  replication  and  differential  transcriptional  activity  in  pronuclei  of  1-cell  mouse  embryos.  Development.  1997;124:4625-4625.
37.  Lepikhov  K,  Walter  J.  Differential  dynamics  of  histone  H3  methylation  at  positions  K4  and  K9  in  the  mouse  zygote.  BMC  Dev  Biol.  2004;4:12-16.
38.  Erhardt  S,  Su  IH,  Schnieder  R,  Barton  S,  et  al,  Consequences  of  the  depletion  of  zygotic  and  embryonic  enhancer  of  zeste  2  during  preimplantation  mouse  development.  Development.  2003;130:4235-4248.
39.  Santos  F,  Peters  AH,  Otte  AP,  Reik  W,  Dean  D.  Dynamic  chromatin  modifications  characterize  the  first  cell  cycle  in  mouse  embryos.  Dev  Biol.  2005;280:225-236.
40.  Monk  M,  Boubelik  M,  Lehnert  S.  Temproal  and  regional  changes  in  DNA  methylation  in  the  embryonic,  extraembryonic  and  germ  cell  lineages  during  mouse  embryo  development.  Development.  1987;99:371-382.
41.  Howlett  SK,  Reik  W.  Methylation  levels  of  maternal  and  paternal  geneomes  during  preimplantation  development.  Development.  1991  ;113:119-127.
42.  Bestor  TH.  The  DNA  methyltransferases  of  mammals.  Hum  MoI  Genet.  2000;9:2395-2402.
43.  Howell  CY,  Bestor  TH,  Ding  F,  Latham  KE,  et  al.  Genomic  imprinting  disrupted  by  a  maternal  effect  mutation  in  the  Dnmtl  gene.  Cell.  2001;  104:829-838
44.  Fujimori  T,  Kurotaki  Y,  Miyazald  J,  Nabeshima  Y.  Analysis  of  cell  lineage  in  two-  and  four-  cell  mouse  embryos.  Development.  2003;130:5113-5122.
45.  Santos  F,  Zakhartchenko  V,  Stojkovic  M  et  al.,  Epigenetic  marking  correlates  with  developmental  potential  in  cloned  bovine  preimplantation  embryos.  Curr  Biol.  2003;13:1116-2111.
46.  Zhang  S,  Kubot  C,  Yang  L  et  al.  Genomic  imprinting  of  Hl  9  in  naturally  reproduced  and  cloned  cattle.  Biol  Reprod.  2004;71:1540-1544.
47.  Eggan  K,  Akutsu  H  Hochedlinger  K  et  al.  X-chromosome  inactivation  in  cloned  mouse  embryos.  Science.  2000;290:  1578-1581.
48.  Xue  F,  Tian  XC,  Du  F,  et  al.  Aberrant  patterns  of  X  chromosome  inactivation  in  bovine  clones.  Nat  Genet.  2002;31:216-220.
49.  Humphreys  D,  Eggan  K,  Akutsu  H  et  al.  Epigenetic  instability  in  ES  cells  and  cloned  mice.  Science.  2001  ;293  :95-97.
50.  Inoue  K,  Kohda  T,  Lee  J,  et  al.  Faithful  expression  of  imprinted  genes  in  cloned  mice.  Science.  2002;295:297-297.
51.  Mann  MR5  Chung  YG,  Nolen  LD,  et  al.  Disruption  o  f  imprinted  gene  methylation  and  expression  in  cloned  preimplantation  stage  mouse  embryos.  Biol  Reprod.  2003;69:902-914.
52.  Bourc'his  D,  Le  Bourhis  D,  Patin  D,  et  al.  Delayed  and  incomplete  reprogramming  of  chromosome  methylation  patterns  in  bovine  cloned  embryos.  Curr  Biol.  2001  ;11  :  1542-1546.
53.  Kang  YK,  Koo  DB,  Park  JS,  et  al.  Aberrant  methylation  of  donor  genome  in  cloned  bovine  embryos.  Nat  Genet.  2001;28:173-177.
54.  Humphreys  D,  Eggan  K,  Akutsu  H.  et  al.  Abnormal  gene  expression  in  cloned  mice  derived  from  embryonic  stem  cell  and  cumulus  cell  nuclei.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  2002;99:  12889-  12894.
55.  Boiani  M,  Eckardt  S,  Scholer  HR,  Mclaughlin  KJ.  Oct4  distribution  and  level  in  mouse  clones:  consequences  for  pluripotency.  Genes  Dev.  2002;16:1209-1219.
56.  Bortvin,  A.,  Egan  K,  Skaletsky  H,  et  al.  Incomplete  reactivation  of  Oct4-realted  genes  in  mouse  embryos  cloned  from  somatic  nuclei.  Development.  2003;130:1673-1680.
57.  Boiani  M,  Echardt  S,  Leu  NA,  et  al.  Pluripotency  deficit  in  clones  overcome  by  clone-clone  aggregation:  epigenetic  complementation?  EMBO  J.  2003;22:5304-5312.
58.  Cooney  CA,  Dave  AA,  Wolff  GL.  Maternal  methyl  supplements  in  mice  affect  epigenetic  variation  and  DNA  methylation  of  offspring.  J  Nutr.  2002;132:2393S-2400S.
59.  Choi  SW,  Mason  JB.  Folate  Status:  effects  on  pathways  of  colorectal  carcinogenesis.  J  Nutr.  2002;132:2413S-2418S.
60.  Kim  YI.  Folate  and  carcinogenesis:  evidence,  mechanisms,  and  implications.  JNutr  Biochem.  1999;;  10:66-88.
61.  Lamprecht  SA,  Lipkin  M.  Chemoprevention  of  colon  cancer  by  calcium,  vitamin  D  and  folate:  molecular  mechanisms.  Nature  Rev  Cance.  2003;3:601-614.
62.  Kim  YI,  Pgribny  IP,  Basnakian  AG,  et  al.  Folate  deficiency  in  rats  induces  DNA  strand  breaks  and  hyponiethylation  within  the  p53  tumor  suppressor  gene.  Am  J  Clin  Nutr.  1997;65:46-62.
63.  Balaghi  M,  Warner  C.  DNA  methylation  in  folate  deficiency:  use  of  CpG  methylase.  Bioch  Biophys  Res  Commun.  1993;  193:  1184-  1190.
64.  Ingrosso  D,  Cimmno  A5  Perna  AF,  et  al.  Folate  treatment  and  unbalanced  methylation  and  changes  in  allelic  expression  induced  by  hyperhomocysteinaemia  in  patients  with  uranemia.  Lancet.  2003;361  :  1693-1699.
65.  Cantoni  GL,  Chiang  PK.  The  role  of  S-adenosylhomocysteine  and  S-adenosylhomocysteine  hydrolase  in  the  control  of  biological  methylations.  In:  Natural  Sulfur  Compounds,  pp67-80,  Plenum  Press,  New  York,  NY.  1980.
66.  Kerr  SJ.  Competing  methyltransferase  systems.  J  Biol  Chem.  1972,247:4248-4252.
67.  Wagner  C,  Briggs  WT,  Cook  RJ.  Inhibition  of  glycine  N-methy  transferase  by  folate  derivatives:  implications  for  regulation  of  methyl  group  metabolism.  Bioch  Biophys  Res  Comm.  1985;127:746-752.
68.  Wagner  C,  Decha-Umphai  W,  Corbin  J.  Phosphorylation  modulates  the  activity  of  glycine  N-methyltransferase,  a  folate  binding  protein.  J  Biol  Chem.  1989;264:9638-9642.
69.  Kutabach  C,  Stokstad  ELR.  Feedback  inhibition  of  methylenetetrahydrofolate  reductase.  Biochem  Biophys  Acta.  1967;250:459-477.
70.  Jencks  DA,  Matthews  RG.  Allosteric  inhibition  of  methylenetetrahydrofolate  reductase  by  adenosylmethionine.  J  Biol  Chem.  1987;262:2485-2493.
71.  Rowling  MJ,  Schalinske  KL.  Reinoid  compounds  activate  and  induce  hepatic  glycine  N-  methyltransferase  in  rats.  J  Nut.  2001  ;  131  :  1914-  1917.
72.  McMullen  MH,  Rowling  MJ,  Ozias  MK,  Schalinske  KL.  Activation  and  induction  of  glycine  N-methyltransferase  by  retinoids  are  tissue-  and  gender  specific.  Arch  Biochem  Biphys.  2002;401:73-80.
73.  Rowling  MJ,  McMullen  MH,  Schalinske  KL.  Vitamin  A  and  its  derivatives  induce  hepatic  glycine  N-methyltransferase  and  hypomethylation  of  DNA  in  rats.  J  Nutr.  2002;132:365-369.
74.  RESERVED
75.  RESERVED
76.  Cezar  GG,  Bartolomei  MS,  Forsberg  EJ,  First  NL,  Bishop  MD,  Eilertsen  KJ.  Genome-wide  epigenetic  alterations  in  cloned  bovine  fetuses.  Biol  Reprod.  2003;68:1009-1014.
77.  RESERVED
78.  RESERVED
79.  RESERVED
80.  RESERVED
81.  RESERVED
82.  J.  Goffm  and  E.  Eisenhauer  Annals  of  Oncology  13:1699-1716,  2002
83.  McKieman  et  al.,  Molecular  Reproduction  and  Development  42:188-199,  1995
84.  Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor,  2001
85.  Miller  &  Calos,  eds,  Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells,  Cold  Spring  Harbor,  1987
86.  F.  M.  Ausubel  et  al.  eds.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley  &  Sons,
87.  J.  E.  Colligan  et  al.  eds.,  Current  Protocols  in  Protein  Science,  Wiley  &  Sons,
88.  J.  S.  Bonifacino  et  al.,  Current  Protocols  in  Cell  Biology,  Wiley  &  Sons,
89.  J.  E.  Colligan  et  al.  eds.,  Current  protocols  in  Immunology,  Wiley  &  Sons
90.  R.  I.  Freshney  ed.,  Culture  of  Animal  Cells:  A  Manual  of  Basic  Technique,  Wiley  &  Sons,  2005
91.  M.  A.  Harrison  &  I.  F.  Rae,  General  Techniques  of  Cell  Culture,  Cambridge  Univ.  Press
92.  K.  Turksen  ed.,  Embryonic  Stem  Cells:  Methods  and  Protocols,  Humana  Press,  2002
93.  U.S.  Pat.  No.  5,635,387  to  Fei,  R.,  et  al.
94.  U.S.  Pat.  No.  5,460,964  to  McGlave,  et  al.
95.  U.S.  Pat.  No.  5,677,136  to  Simmons,  P.,  et  al.
96.  U.S.  Pat.  No.  5,750,397  to  Tsukamoto,  et  al.
97.  U.S.  Pat.  No.  759,793  to  Schwartz,  et  al.
98.  U.S.  Pat.  No.  5,681,599  to  DiGuisto,  et  al.
99.  U.S.  Pat.  No.  5,716,827  to  Tsukamoto,  et  al.
100.  Hill,  B.,  et  al.,  Exp.  Hematol.  (1996)  24  (8):  936  943).
101.  Gage  F  H:  Science  287:1433  1438,  2000
102.  Svendsen  C  N  et  al,  Brain  Path  9:499  513,  1999
103.  Okabe  S  et  al,  Mech  Dev  59:89  102,  1996)
104.  Fridenshtein,  Arkh.  PatoL,  44:3  11,  1982
105.  U.S.  Pat.  No.  5,486,359  to  Caplan,  A.,  et  al.
106.  U.S.  Pat.  No.  5,827,735  to  Young,  H.,  et  al.
107.  U.S.  Pat.  No.  5,811,094  to  Caplan,  A.,  et  al.
108.  U.S.  Pat.  No.  5,736,396  to  Bruder,  S.,  et  al.
109.  U.S.  Pat.  No.  5,837,539  to  Caplan,  A.,  et  al.
110.  U.S.  Pat  No.  5,837,670  to  Masinovsky,  B.
111.  U.S.  Pat.  No.  5,827,740  to  Pittenger,  M.
112.  Jaiswal,  N.,  et  al.,  J.  Cell  Biochem.  (1997)  64(2):  295  312
113.  Cassiede  P.,  et  al.,  J.  Bone  Miner.  Res.  (1996)  11(9):  1264  1273;
114.  Johnstone,  B.,  et  al.,  Exp.  Cell  Res.  (1998)  238(1):  265  272
115.  Yoo,  et  al.,  I  Bone  Joint  Sure.  Am.  (1998)  80(12):  1745  1757
116.  Gronthos,  S.,  Blood  (1994)  84(12):  41644173
117.  Makino,  S.,  et  al.,  J.  Clin.  Invest.  (1999)  103(5):  697  705).
118.  Pittenger,  et  al.,  Science  (1999)  284:  143  147
119.  Potten  C,  Philos  Trans  R  Soc  Lond  B  Biol  Sci  353:821  30,  1998
120.  Watt  F,  Philos.  Trans  R  Soc  Lond  B  Biol  Sci  353:831,  1997
121.  Alison  M  et  al,  Hepatol  29:678  83,  1998)
122.  Ferrari,  Science  279:528  30,  1998
123.  Gussoni  Nature  401  :390  4,  1999
124.  Jackson  PNAS  USA  96:14482  6,  1999
125.  Takahashi,  Nat  Med  5  :434  8,  1999
126.  Lin,  Clin  Invest  105:71  7,  2000
127.  Petersen,  Science  284:1168  1170,  1999
128.  Theise,  Hepatology  31:235  40,  2000
129.  Theise,  Hepatology  32:  11  6,  2000
130.  Clarke,  Science  288:1660  3,  2000
131.  Forsberg,  et  al.  Biol.  Reprod.  2002  67:327-333
132.  Wadman,  M.,  Nature  (1999)  398:  551
133.  Leu  et  al.,  Cancer  Res.  (2003)  63:6110-6115
134.  Stresemann  et  al.,  Cancer  Res.  (2006)  66:2794-2800
135.  Detich  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  (2003)  278:27586-27592
136.  Blelloch,  R,  et  al.,  Stem  Cells,  2006  in  press,  Epub  ahead  of  print  May  18
137.  Chung  YG,  et  al,  Biol  Reprod,  2002  Apr;  66(4):  1178-84
138.  Cowan  CA,  et  al.,  Science,  2005  Sep  9;122(5):653-4.  139.  Gao  S,  et  al.,  Biol  Reprod,  2003  Jul;69(l):48-56.
140.  Robert  et  al.  (Nat.  Genet.  2003  33:61-65)
［配列表］
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【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】増殖培地のみ（ＣＯＮ）、ＤＭＳＯで処理された増殖培地（ＤＭＳＯ）、及び、オールトランスレチノイン酸で処理された増殖培地（ＡＴＲＡ）においてコンフルエンスまで成長した後のウシ連続核移植ドナー体細胞におけるシトシンメチル化の相対レベルを描写するグラフである。実施例１を参照。
【図２】増殖培地のみ（ＣＯＮ）、ＤＭＳＯで処理された増殖培地（ＤＭＳＯ）、及び、オールトランスレチノイン酸で処理された増殖培地（ＡＴＲＡ）においてコンフルエンスまで成長した後のウシ連続核移植ドナー体細胞におけるＧＮＭＴ遺伝子発現のレベル（リアルタイムＰＣＲにより測定）を示すグラフである。実施例１を参照。
【図３】実施例２に記述されているように処理されたウシの細胞を示す写真である。図３（ａ）はＡＴＲＡで処理された後の細胞を示している。図３（ｂ）はＡＴＲＡ処理に続くオイルレッドＯ（脂質用の一般的な染色）を用いた陽性染色後の細胞を示している。実施例２を参照。
【図４】実施例４に記述されているように、ＡＴＲＡに続いて骨形成誘導培地で処理されたマウスの３Ｔ３Ｌ１細胞を示す写真である。図４（ａ）は、アルカリホスファターゼ染色を用いた骨芽細胞様の細胞検査で陽性と出た細胞を描写している。図４（ｂ）は、アリザリン染色を用いてリン酸カルシウムミネラル化を示す細胞を描写している。
【図５】ＡＴＲＡに続いて骨形成誘導培地で処理されたマウスの３Ｔ３Ｌ１細胞におけるオステオカルシン及び骨芽細胞特異的マーカーであるｃｂｆａ１の遺伝子発現を示す（ＲＴ−ＰＣＲによる）ゲルの写真である。実施例４を参照。
【図６】実施例５に記述されているように、ｓｉＲＮＡによるＤｎｍｔ１遺伝子のノックダウンを示すゲルの写真である。図６（ａ）は、Ｄｎｍｔ１ｓｉＲＮＡを用いたＤｎｍｔ１の特異的ノックダウンを描写している。図６（ｂ）は、ラミンｓｉＲＮＡを用いたラミンの特異的ノックダウンを描写している。図６（ｃ）は、図６（ａ）に示されているＤｎｍｔ１のノックダウンを示すゲルで、Ｄｎｍｔ１が少なくとも２細胞期まで持続した写真である。実施例５を参照。
【図７】実施例５．１に記述されているように、マウスＮＩＨ３Ｔ３体細胞のメチル化に対するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂｓｉＲＮＡ形質移入の効果を示すグラフである。図７（ａ）は、対照と比較してＤｎｍｔ３ｂｍＲＮＡレベルが７９％減少したことを示すリアルタイムＰＣＲの結果を描写している。図７（ｂ）は、細胞内のメチル化されたシトシンが５２％相対的に減少したことを示すＨＰＬＣの結果を描写している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図６（ｃ）】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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