(57)【要約】  全血もしくは多血小板血漿またはそれらの薬剤処理液から選択される第１の液体を流入させる第１の流路と、第１の流路に接続されて、前記第１の液体と反応しうる薬剤を含む第２の液体を流入させる第２の流路と、第１の流路と第２の流路の接続部から延設された合流流路とを内部に備えるマイクロチップであって、前記合流流路に、前記第１の液体と前記第２の液体を混合する攪拌子を有する撹拌部が設置されたことを特徴とする、マイクロチップおよびそれを用いた血液観測装置。
2009069656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血もしくは多血小板血漿またはそれらの薬剤処理液から選択される第１の液体を流入させる第１の流路と、第１の流路に接続されて、前記第１の液体と反応しうる薬剤を含む第２の液体を流入させる第２の流路と、第１の流路と第２の流路の接続部から延設された合流流路とを内部に備えるマイクロチップであって、前記合流流路に、前記第１の液体と前記第２の液体を混合する攪拌子を有する撹拌部が設置されたことを特徴とする、マイクロチップ。
【請求項２】
前記攪拌子の表面が凝固抑制処理されたことを特徴とする、請求項１記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記凝固抑制処理がヘパリン、ポリビニルラクトンアミドまたはポリ２−メトキシエチルアクリレートで少なくとも前記攪拌子の表面を形成する処理である、請求項２記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記撹拌部の幅が前記合流流路より広い、請求項１ないし３のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項５】
前記撹拌部の幅が下流に向かって次第に狭まる、請求項１ないし４のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項６】
前記撹拌部の深さが前記合流流路より深い、請求項１ないし５のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項７】
前記撹拌部の深さが下流に向かって次第に浅くなる、請求項１ないし６のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項８】
前記合流流路の深さが５０μｍ〜２００μｍである、請求項１ないし７のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項９】
前記第１の流路、第２の流路および合流流路を構成する溝が表面に掘られた第１の基板と、前記撹拌部となる穴が表面に掘られた第２の基板を、該溝および穴の開口部を内側にして積層させてなる、請求項１ないし８のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項１０】
前記第１の基板と第２の基板の貼り合わせ強度が0.5〜50kgfである、請求項９に記載のマイクロチップ。
【請求項１１】
前記マイクロチップは、前記撹拌部の下流に、その内部の少なくとも一部に血栓の生成を誘発する血栓生成誘発材が設けられた血栓生成室を有する、請求項１ないし１０のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項１２】
前記血栓生成誘発材がコラーゲンまたはコラーゲンと組織因子の混合物である、請求項１１記載のマイクロチップ。
【請求項１３】
請求項１ないし１１のいずれかに記載のマイクロチップを用いる血栓形成の測定方法であって、前記第一の流路より抗凝固処理された血液を、前記第２の流路より抗凝固処理を解除させる試薬を、それぞれ撹拌部に流入させ、該攪拌部で混合した後、血栓生成室において血栓形成を測定することを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記抗凝固処理された血液がクエン酸によって抗凝固処理された血液であり、前記抗凝固処理を解除させる試薬がカルシウムを含む溶液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１１いずれかに記載のマイクロチップを用いる血栓形成及び血栓溶解能の測定方法であって、前記第１の流路より抗凝固処理された血液を、前記第２の流路より抗凝固処理を解除させる試薬を、それぞれ撹拌部に流入させ、該攪拌部で混合した後、血栓生成室において血栓形成を測定し、さらに、前記第２の流路より血栓溶解物質を流入させて生成した血栓を溶解させることを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記血栓溶解物質がプラスミン、ウロキナーゼ、および組織プラスミノゲンアクチベータからなる群より選ばれる１種類以上である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１１いずれかに記載のマイクロチップを用いる血小板機能の測定方法であって、前記第１の流路より抗凝固処理された血液を、前記第２の流路より血小板を活性化させる試薬を、それぞれ撹拌部に流入させ、該攪拌部で混合した後、血栓生成室を通過させて血小板機能を測定することを特徴とする、方法。
【請求項１８】
前記抗凝固処理された血液がクエン酸又はヘパリンによって抗凝固処理された血液であり、前記抗凝固処理を解除させる試薬がADP、コラーゲン、リストセチン、またはアラキドン酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第１の流路から流入させる抗凝固処理された血液と第２の流路から流入させる試薬の容量比が１０対２〜１００対１であることを特徴とする、請求項１３ないし１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記攪拌部において、第１の流路から流入した血液と第２の流路から流入した試薬の混合液が５秒〜３分間攪拌されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記攪拌子の旋回速度が30〜300回転/分であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１ないし１１のいずれかに記載のマイクロチップを用いたことを特徴とする、血液観測装置。
【請求項２３】
前記第１の流路と前記第２の流路が下方、および、前記合流流路が上方となるようにマイクロチップが設置された、請求項２２記載の血液観測装置。
【請求項２４】
前記第１の流路、前記第２の流路および前記合流流路の少なくとも一つの流路にかかる圧力を測定するための圧力センサーを備えた、請求項２２または２３記載の血液観測装置。
【請求項２５】
前記合流流路内を観察するためのカメラを備えた、請求項２２ないし２４のいずれかに記載の血液観測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量血液と薬剤を効率よく混合して血液の反応性や性状を調べるためのチップに関し、より詳しくは血液凝固能や血小板機能などの血液観測を行うためのマイクロチップおよびそれを用いた血液観測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞等のアテローム血栓症は、動脈硬化部位にてアテロームプラークが壊れ、血流に暴露された組織因子を含むコラーゲン上に、血小板が粘着し、さらに血小板凝集、血液凝固系の活性化が複合的に起こり、閉塞性の重篤な血栓を生じる。心筋梗塞等の心疾患による死亡は日本においても全死因の２位を占める重篤な疾患である。
しかしながら、心筋梗塞等においては動脈硬化領域においてのみ血栓生成が進み、全身における血栓傾向が極端に進む事はない。このような血栓症における血栓傾向の評価、抗血栓療法における抗血栓効果のモニタリングには試験管内の試験は不向きであり、血流の存在下、凝固および血小板（粘着、凝集）の総合的な評価が重要である。【０００３】
従来、血液凝固能の評価は、血漿を用いた部分活性化トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンボプラスチン時間（ＰＴ）、によって観測されている。ＡＰＴＴは主に内因系凝固、ＰＴは外因系凝固を反映する。血小板の観測としては多血小板血漿を用い、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、コラーゲン等の血小板活性化物質を加え透過度の変化等によって血小板の凝集能を評価する事もできる。また、全血凝固時間、カルシウム再添加全血凝固時間等によって全血の凝固時間の測定もなされる。
さらに、全血を用いた観測系としてはトロンボエラストグラムが用いられ、凝固成分の活性化および血小板の凝集等がモニタリングされる。
しかしながら、生体内では血流下で血栓が成長するのに対し、上記の観測方法等は閉鎖された試験管内での測定であるため、血栓が生体内で成長する状態を観察することはできない。【０００４】
この問題点を解決する提案として、特許文献１、非特許文献１、２には、評価すべき抗血栓薬が投入された血液をコラーゲンセル上を通過させ、血小板を蛍光標識する事で血小板の粘着、凝集を共焦点顕微鏡装置によりモニタリングする方法が開示されている。
しかし、この文献に記載の発明は、抗凝固薬の存在下で観測を行うために、凝固系によって起こる血小板の粘着、凝集による血栓が生成されないこと、ないしは、血栓の生成能の低下を、血小板の形態変化を観測することで評価するものであり、凝固系と連動した血小板活性化が反映されない。したがって、抗血小板薬の薬効を評価するには好ましい発明ではあるが、血栓そのものや血栓生成過程全体をモニターする事はできない。【０００５】
また、特許文献２には、血管を模した流路に抗凝固処理された血液を、抗凝固処理を解除または血液凝固を促進しつつ流して血栓の生成を観測する血栓観測装置であって、その内部の少なくとも一部に血栓生成を誘発する血栓誘発材が設けられた血栓生成室と、該血栓生成室に接続されて前記血栓生成室に血液を流入させる流入管と、該流入管に接続されて前記流入管に抗凝固処理を解除する薬剤または血液凝固を促進する薬剤を投入する薬剤管と、を有することを特徴とする血栓観測装置が開示されている。この装置によれば微量の血液サンプルを試用して血液観測を行うことができるが、血液と抗凝固解除剤や凝固促進剤が混ざりにくい場合があり、改善の余地があった。
また、特許文献１、非特許文献１、２の手法によって血小板をキナクリンで染色した場合には、同時に白血球も染色され、血小板の機能のみを選択的に評価することは出来なかった。また、蛍光色素の退色や装置が高額であるなど観測に向かない点が多かった。
また、従来の線溶能の評価は、フィブリンの溶解のみを測定するもので、実際の動脈において生成される白色血栓の溶解効果を測定しうる手法は存在しなかった。【０００６】
基板に所望の流路の溝を彫り、蓋板と貼り合わせることで形成されるマイクロ流体チップがキャピラリー電気泳動、ＰＣＲ、その他、種々の観測など様々な用途に用いられている。マイクロチップ内の液体はレイノルズ数が非常に大きくなることにより層流が形成され、マイクロチップ内の液体を自然に混合することは困難である。この問題を解決するために、種々のアプローチがなされている。
例えば、特許文献３には柱状の突起物からなる攪拌子、特許文献４にはピエゾ効果で振動する攪拌子、特許文献５には光の圧力で回転する攪拌子が提案されている。しかし、提案されたこれらの攪拌子を用いて全血、多血小板血漿、それらの薬剤処理液などを含む液体をマイクロチップ内で攪拌すると活性化が起きて血液凝固等が発生することがあり、例えば、血液凝固や血小板機能などを観測する場合には、正確に観測することは非常に困難である。また、流路を長くすることでマイクロチップ内の液体を自然に混合することも考えられるが、マイクロチップが大きくなるという問題がある。そして、これを防ぐために流路をつづら折り状に複数回屈曲させると液体が滞留する領域などで活性化が起きて血液凝固等が発生し、観測を正確に行うことは出来ない。
【特許文献１】特開２００４−２５１６３０号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０４６４５０号パンフレット
【特許文献３】特開２００７−２４５２２号公報
【特許文献４】特開２００６−２０５０８０号公報
【特許文献５】特開２００１−２５２８９７号公報
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ．  １９９０；７５：３９０−３９８
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ．  １９９９  Ａｕｇ  １；９４（３）：９６８−７５．
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、全血または多血小板血漿（本明細書においては、これらをまとめて「血液」という場合がある。）を用いて血流と同等環境下における血液凝固および血小板による血栓生成を微量の血液を用いて効率よく正確に評価することのできる装置および方法を提供することを課題とする。
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明は、全血もしくは多血小板血漿またはそれらの薬剤処理液から選択される第１の液体を流入させる第１の流路と、第１の流路に接続されて、前記第１の液体と反応しうる薬剤を含む第２の液体を流入させる第２の流路と、第１の流路と第２の流路の接続部から延設された合流流路とを内部に備えるマイクロチップであって、前記合流流路に、前記第１の液体と前記第２の液体を混合する攪拌子を有する撹拌部が設置されたことを特徴とする、マイクロチップを提供する。
前記攪拌子の表面は凝固抑制処理されていることが好ましい。ここで、前記凝固抑制処理は凝固系の接触層を活性化させない処理であれば特に限定されないが、ヘパリン、ポリビニルラクトンアミドまたはポリ２−メトキシエチルアクリレートで少なくとも前記攪拌子の表面を形成する処理であることが好ましい。
本発明のマイクロチップにおいては、前記撹拌部の幅は、前記合流流路より広いことが好ましく、また、下流に向かって次第に狭まることが好ましい。
また、前記撹拌部の深さは、前記合流流路より深いことが好ましく、また、下流に向かって次第に浅くなることが好ましい。
本発明のマイクロチップにおいては、前記合流流路の深さが５０μｍ〜２００μｍであることが好ましい。
本発明のマイクロチップは、前記第１の流路、第２の流路および合流流路を構成する溝が表面に掘られた第１の基板と、前記撹拌部となる穴が表面に掘られた第２の基板を、該溝および穴の開口部を内側にして積層させてなるマイクロチップであることが好ましい。ここで、前記第１の基板と第２の基板の貼り合わせ強度が0.5〜50kgfで且つ内部に血液を流した際の耐圧性が100kＰａであることが好ましい。
本発明のマイクロチップは、前記撹拌部の下流に、その内部の少なくとも一部に血栓の生成を誘発する血栓生成誘発材が設けられた血栓生成室を有するものが好ましい。ここで、血栓生成誘発材はコラーゲンまたはコラーゲンと組織因子の混合物であることが好ましい。
【０００９】
本発明はまた、前記いずれかに記載のマイクロチップを用いる血栓形成の測定方法であって、前記第１の流路より抗凝固処理された血液を、前記第２の流路より抗凝固処理を解除させる試薬を、それぞれ撹拌部に流入させ、該攪拌部で混合した後、血栓生成室において血栓形成を測定することを特徴とする方法を提供する。ここで、前記抗凝固処理された血液がクエン酸によって抗凝固処理された血液であり、前記抗凝固処理を解除させる試薬がカルシウムを含む溶液であることが好ましい。
本発明はまた、前記いずれかに記載のマイクロチップを用いる血栓形成及び血栓溶解能の測定方法であって、前記第１の流路より抗凝固処理された血液を、前記第２の流路より抗凝固処理を解除させる試薬を、それぞれ撹拌部に流入させ、該攪拌部で混合した後、血栓生成室において血栓形成を測定し、さらに、前記第２の流路より血栓溶解物質を流入させて生成した血栓を溶解させることを特徴とする方法を提供する。ここで、前記血栓溶解物質がプラスミン、ウロキナーゼ、および組織プラスミノゲンアクチベータからなる群より選ばれる１種類以上であることが好ましい。
本発明はまた、前記いずれかに記載のマイクロチップを用いる血小板機能の測定方法であって、前記第１の流路より抗凝固処理された血液を、前記第２の流路より血小板を活性化させる試薬を、それぞれ撹拌部に流入させ、該攪拌部で混合した後、血栓生成室を通過させて血小板機能を測定することを特徴とする方法を提供する。ここで、前記抗凝固処理された血液がクエン酸又はヘパリンによって抗凝固処理された血液であり、前記血小板を活性化する試薬がADP、コラーゲン、リストセチン、またはアラキドン酸であることが好ましい。
前記各方法においては、第一の流路から流入させる抗凝固処理された血液と第２の流路から流入させる試薬の容量比が１０対２〜１００対１であることが好ましい。また、前記攪拌部において、第一の流路から流入した血液と第二の流路から流入した試薬の混合液が５秒〜３分間攪拌されることが好ましい。また、前記攪拌子の旋回速度が30〜300回転/分であることが好ましい。
【００１０】
本発明はまた、前記いずれかのマイクロチップを用いてなる血液観測装置を提供する。本発明の血液観測装置においては、前記第１の流路と前記第２の流路が下方、および、前記合流流路が上方となるように本発明のマイクロチップが設置されたものが好ましい。
また、本発明の血液観測装置は前記第１の流路、前記第２の流路および前記合流流路の少なくとも一つの流路にかかる圧力を測定するための圧力センサーを備えたものであることが好ましい。
また、本発明の血液観測装置は前記合流流路内を観察するためのカメラを備えたものであることが好ましい。
カメラは流路内を一定時間ごとに静止画または動画として自動で撮影する機能を有していることが好ましい。より好ましくは、流路全体をパノラマ写真又は静止画の連続として静止画で一定時間間隔で撮影できると、測定後の流路の閉塞状況を視覚的にも確認できて好ましい。
【００１１】
本発明はまた、本発明のマイクロチップを用いて観測する血液の観測方法であって、抗凝固処理をされた全血または多血小板血漿を、抗凝固処理を解除する薬剤、血小板を活性化する薬剤または血栓溶解剤と流路内で撹拌して混合し、流路内を流動させつつ観測することを特徴とする、血液観測方法を提供する。ここで、血栓溶解剤がウロキナーゼ、プラスミンおよび組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）から選択される１種以上であることが好ましい。血液観測方法としては、血液凝固または血小板機能の測定方法であることが好ましい。また、血小板を活性化する薬剤がアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、コラーゲン、トロンビンおよびリストセチンから選択される１種以上であることが好ましい。そして、本発明の血液観測方法は、血液凝固や血小板機能の観測に用いることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の第１の態様に係るマイクロチップ１の要部を示す概念図である。（Ａ）はマイクロチップ１の第１の基板、（Ｂ）はマイクロチップ１の第２の基板、（Ｃ）は完成したマイクロチップ１の平面図、（Ｄ）は完成したマイクロチップ１の正面図（撹拌子省略）を示す。
【図２】本発明の第２の態様に係るマイクロチップ２の要部を示す概念図である。（Ａ）はマイクロチップ２の第１の基板、（Ｂ）はマイクロチップ２の第２の基板２、（Ｃ）はマイクロチップ２の第３の基板、（Ｄ）は完成したマイクロチップ２の平面図、（Ｅ）は完成したマイクロチップ２の正面図（撹拌子省略）を示す。
【図３】本発明の第３の態様に係るマイクロチップ３の要部を示す概念図である。（Ａ）はマイクロチップ３の第１の基板、（Ｂ）はマイクロチップ３の第２の基板、（Ｃ）は完成したマイクロチップ３の平面図、（Ｄ）は完成したマイクロチップ３の正面図（撹拌子省略）を示す。
【図４】本発明の第１の態様に係る血液観測装置Ａを示す概念図である。
【図５】本発明の第２の態様に係る血液観測装置Ｂを示す概念図である。
【図６】本発明の第２の態様に係る血液観測装置Ｂを垂直に立てて設置した状態を示す概念図である。
【図７】本発明の血液観測装置Ａを使用したときの流量−圧力グラフである。（Ａ）は第１のポンプより３．２％クエン酸ナトリウムを１０分の１量加えた２５μｇ／ｍｌのコーン由来トリプシンインヒビターを添加した全血を、第２のポンプより０．２Ｍ  ＣａＣｌ2を、ポンプ３より、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ１０  を流入させたときの結果を示す。（Ｂ）は第１のポンプより３．２％クエン酸ナトリウムを１０分の１量添加した全血を、第２のポンプより０．１μＭ  ＡＤＰ溶液を流入させたときの結果を示す。
【図８】本発明の血液観測装置Ｂを使用して観察された血栓の様子を示す図（写真）。
【図９】図８の結果を数値化したグラフ。
【図１０】本発明の第４の態様に係るマイクロチップ４の要部を示す概念図である。（Ａ）はマイクロチップ４の第１の基板、（Ｂ）はマイクロチップ４の第２の基板、（Ｃ）は完成したマイクロチップ４の側面図を示す。
【図１１】本発明の血栓観測装置Ｃのステージを示す概念図。
【図１２】本発明の血栓観測装置Ｃの概念図。
【図１３】本発明の血液観測装置Ｃを使用したときの流量−圧力グラフである。（a）はcontrol（実施例７）, （b）は8000単位/ml tPA製剤（実施例１０）, （c）は0.5単位/ml 低分子ヘパリン（実施例９）を示す。
【図１４】本発明の血栓観測装置ＣのCCDカメラにより、各位置で経時的に静止画を撮影し、再合成した図（中間調画像）である。
【図１５】血栓の走査型電子顕微鏡写真。Ａは本発明の血栓観測装置Ｃのマイクロチップを剥がして、白色血栓を観察した図。Ｂは対象の静置環境で形成される血餅である。
【００１３】
[符号の説明]
１、２、３、４…マイクロチップ、
４０…ステージ
１００、２００、３００、４００…第１の基板、
１１０、２１０、３１０、４１０…第２の基板、
２２０…第３の基板、
１０１、２０１、３０１、４０１…第１の流路、
１０２、２０２、３０２、４０２…第２の流路、
１０３、２０３、３０３、４０３…合流流路、
１０４、３０４…廃液貯留部、
１０５、２０５、３０５…狭窄部、
１１１、２１１、３１１、４１１…第１の流入口、
１１２、２１２、３１２、４１２…第２の流入口、
１１３、２１３、３１３、４１３…撹拌部、
１１４、２１４、３１４、４１４…排出口、
１１５、２１５、３１５、４１５…誘発材設置部（血栓生成室）、
１１７、２１７、３１７、４１７…撹拌子、
３０６、４０６…第３の流路、３１８、４１８…第３の流入口、
３２０、４２０…第１のポンプ（ポンプ１）、
３２１、４２１…第２のポンプ（ポンプ２）、
３２２、４２２…第３のポンプ（ポンプ３）、
３２３…固定用穴、
３２４、４２４…カメラ、
３２５、４２５…画像解析装置、
３２６…マイクロチップ固定用ピン、
３２７、４２７…ヒーター、
３２８…観測用隙間、
３２９、４２９…スターラー、
３３０…マイクロチップ設置用ステージ、
３３１、４３１…照明、
４３２…圧力センサー、
４３３…血液リザーバー、４３４…廃液タンク
４３５…第１の接続ノズル、４３６…第２の接続ノズル、４３７…廃液チューブＡ…血液観測装置、Ｂ…血液観測装置、Ｃ…血液観測装置。【００１４】
[発明の効果]
請求項１にかかる本発明のマイクロチップによれば、該合流流路に第１の液体と第２の液体を混合する為の攪拌子を有することにより、第１の液体と第２の液体をマイクロチップ混合部にて、血液凝固の活性化が起きて血液凝固塊等が発生することを抑制して攪拌し均一に混合することができるので、全血、多血小板血漿、それらの薬剤処理液などを含む液体をマイクロチップ内で、例えば、血液凝固や血小板機能などを観測する場合に適している。【００１５】
請求項２および３にかかる本発明のマイクロチップによれば、第１の液体と第２の液体が合流した液体の凝固を抑制する凝固抑制処理がヘパリン、ポリビニルラクトンアミドまたはポリ２−メトキシエチルアクリレートで少なくとも攪拌子の表面を形成する処理であると攪拌子を溶融樹脂への浸漬による被覆や射出成型等の樹脂加工で作製できるため、マイクロチップを効率よく作製することができる。【００１６】
請求項４にかかる本発明のマイクロチップによれば、撹拌部の幅は、前記合流流路より広いため、第１の液体と第２の液体が合流した液体の撹拌部における滞留時間を長くすることができ、十分に撹拌することができる。
請求項５にかかる本発明のマイクロチップによれば、撹拌部の幅は下流に向かって次第に狭まるため、撹拌後の混合液が下流の合流流路にスムーズに流れ、攪拌部の出口で液体の活性化が起きて血液凝固等が発生することがない。また、攪拌部の空気が流出しやすく、攪拌部に空気が残ることがない。
請求項６にかかる本発明のマイクロチップによれば、前記撹拌部の深さは前記合流流路より深いため、第１の液体と第２の液体が合流した液体の撹拌部における滞留時間を長くすることができ、十分に撹拌することができる。
請求項７にかかる本発明のマイクロチップによれば、前記撹拌部の深さは下流に向かって次第に浅くなるため、撹拌後の血液混合液が下流の合流流路にスムーズに流れ、攪拌部の出口で液体の活性化が起きて血液凝固等が発生することがない。また、攪拌部の空気が流出しやすく、攪拌部に空気が残ることがない。
請求項８にかかる本発明のマイクロチップによれば、前記合流流路の深さが５０μｍ〜２００μｍであるため、少量の試料および試薬で解析を行うことができ、好ましい。
請求項９にかかる本発明のマイクロチップによれば、マイクロチップを、前記第１の流路、第２の流路および合流流路を構成する溝が表面に掘られた第１の基板と、前記撹拌部となる穴が表面に掘られた第２の基板を、該溝および穴の開口部を内側にして積層させて得ることができるため、簡便にマイクロチップを作製できる。
請求項１０にかかる本発明のマイクロチップによれば、前記第１の基板と第２の基板の貼り合わせ強度が0.5〜50kgfであるため、血栓形成を測定した後に、両基板を剥がして解析することができ、好ましい。【００１７】
また、請求項１１にかかる本発明のマイクロチップによれば、前記撹拌部の下流に、その内部の少なくとも一部に血栓の生成を誘発する血栓生成誘発材が設けられた血栓生成室を有するため、撹拌後の混合液が血栓生成室を通過するときに血栓生成が誘発されるので、血液凝固能や血小板による血栓を生成することができる。
請求項１２にかかる本発明のマイクロチップによれば、血栓生成誘発材がコラーゲンまたはコラーゲンと組織因子の混合物であるため、効率よく血栓が生成する。【００１８】
請求項１３にかかる本発明の測定方法によれば、前記第１の流路より抗凝固処理された血液を、前記第２の流路より抗凝固処理を解除させる試薬を、それぞれ撹拌部に流入させ、該攪拌部で混合した後、血栓生成室において血栓形成を測定することにより、血液と試薬が効率よく混合されて血栓生成室に達するので、効率よく血栓形成を測定することができる。
請求項１４にかかる本発明の測定方法によれば、前記抗凝固処理された血液がクエン酸によって抗凝固処理された血液であり、前記抗凝固処理を解除させる試薬がカルシウムを含む溶液であるため、安価に抗凝固処理を行うことができ、好ましい。【００１９】
請求項１５にかかる本発明の測定方法によれば、前記第１の流路より抗凝固処理された血液を、前記第２の流路より抗凝固処理を解除させる試薬を、それぞれ撹拌部に流入させ、該攪拌部で混合した後、血栓生成室において血栓形成を測定し、さらに、前記第２の流路より血栓溶解物質を流入させて生成した血栓を溶解させることにより、血栓形成及び血栓溶解能の両方を測定することができる。
請求項１６にかかる本発明の測定方法によれば、前記血栓溶解物質がプラスミン、ウロキナーゼ、および組織プラスミノゲンアクチベータからなる群より選ばれる１種類以上であるため、効率よく血栓を溶解させることができる。【００２０】
本発明のマイクロチップを用いた請求項１７にかかる測定方法によれば、前記第１の流路より抗凝固処理された血液を、前記第２の流路より血小板を活性化させる試薬を、それぞれ撹拌部に流入させ、該攪拌部で混合した後、血栓生成室を通過させることにより、血小板機能を測定することができる。
請求項１８にかかる本発明の測定方法によれば、前記抗凝固処理された血液がクエン酸又はヘパリンによって抗凝固処理された血液であり、前記血小板を活性化する試薬がADP、コラーゲン、リストセチン、またはアラキドン酸であるため、効率よく血小板を活性化させることができる。【００２１】
請求項１９にかかる本発明の測定方法によれば、第１の流路から流入させる抗凝固処理された血液と第２の流路から流入させる試薬の容量比が１０対２〜１００対１であるため、少量の試薬で効率よく、血栓生成、血栓溶解、または血小板活性化を引き起こすことができる。
請求項２０にかかる本発明の測定方法によれば、前記攪拌部において、第１の流路から流入した血液と第二の流路から流入した試薬の混合液が５秒〜３分間攪拌されるため、血液と試薬を均一に混合することができる。
請求項２１にかかる本発明の測定方法によれば、前記攪拌子の旋回速度が30〜300回転/分であるため、緩やかな条件で攪拌を行うことができる。【００２２】
本発明の血液観測装置は本発明のマイクロチップを含むものであるため、微量の血液サンプルで効率よく血液観測を行うことができるので、被検者の負担が小さくて済む。
また、本発明の血液観測装置において、前記第１の流路と前記第２の流路が下方、および、前記合流流路が上方となるようにマイクロチップが設置されたものであると、流路や撹拌部に気泡が生じた場合に、気泡は自然に上方に追い出され、気泡が邪魔することなく安定して均一に撹拌・混合することができ、血液観測をより正確に行うことができる。
また、第１の流路、第２の流路及び合流流路が上部に設置され、攪拌子を含んだ攪拌の溝が下部に設置されると気泡が攪拌部に溜まることなく均一に攪拌・混合でき、血栓観測をより正確に行うことが出来る。
また、本発明の血液観測装置が前記第１の流路、前記第２の流路および前記合流流路の少なくとも一つの流路にかかる圧力を測定するための圧力センサーを備えたものであると、血栓生成や血栓溶解の程度を数値化でき、定量的な評価が可能である。
また、本発明の血液観測装置が前記合流流路内を観察するためのカメラを有することで血栓生成や血栓溶解の様子を映像として観察することも可能である。
設置されるカメラは動画、静止画を撮影可能であることが望ましい。一定時間間隔で自動的に内部の動画及び静止画を撮影し保存すると、測定後に血栓形成状態を経時的に視覚的に評価でき好ましい。流路内をパノラマ写真又は静止画の連続として全体を撮影できると保存および客観的比較が容易でありより望ましい。静止画、動画を撮影するにあたり、透過型の光源、即ちカメラと反対側に光源を設置して撮影するとより鮮明な画像の撮影が可能である。
マイクロチップ内に出来た生成された血栓は、測定後取り出し、さらに電子顕微鏡や蛍光染色による顕微鏡の観察、電気泳動など目的に応じて詳細に形状、組成などを調べることで、さらに詳細な検査を行うことが可能である。血栓誘発材をコートした領域のチップが容易に手で剥がす事ができると、測定後に内部より血栓を取り出すことが出来て望ましい。【００２３】
本発明の血液観測方法は、本発明のマイクロチップを用いて、抗凝固処理された全血または多血小板血漿を、抗凝固処理を解除する薬剤、血小板を活性化する薬剤または血栓溶解剤と流路内で撹拌して混合し、流路内を流動させつつ観測することを特徴とするため、抗血栓薬等の効能を人体内に近い環境で観測することや、血小板の粘着、凝集などの血小板機能を測定すること、血栓の大きさの変動を確認する血栓溶解観測を行うこと、などが可能である。
前記血栓溶解剤がウロキナーゼ、プラスミンおよびｔＰＡから選択される１種以上であると、生理状態に近い環境状態で形成された血栓の血栓溶解を効率よく観測することができる。また、前記血小板を活性化する薬剤がＡＤＰ、コラーゲン、トロンビンおよびリストセチンから選択される１種以上であると、血小板を効率よく活性化できる。
そして、前記方法が血液凝固能または血小板機能を調べるものであると、抗血栓薬の効能や血液中の血小板の機能を調べることができるので好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
まず、図面を参照して本発明のマイクロチップを説明する。
図１は、本発明のマイクロチップの第１の形態例を示す概念図である。以下、図１に基づいて第１の形態例を説明する。
図１Ａは、マイクロチップの流路となる溝が表面に掘られた第１の基板１００の平面図である。図１Ｂは、マイクロチップの撹拌子の収納部となる穴が裏面に掘られた第２の基板１１０の平面図である。図１ＣおよびＤは、これらの溝や穴の開口部を内側にして第１の基板１００と第２の第２の基板１１０が積層された第1の形態例のマイクロチップ１の平面図および正面図である。波線は、溝や穴等がマイクロチップ１の内部に存在することを示す。【００２５】
図１Ａにおいて、第１の基板１００には、第１の流路１０１と合流流路１０３として、連続した１本の溝が設けられる。この溝は中間に幅が狭くなる狭窄部１０５があり、狭窄部１０５の上流で溝の幅が広い部分に接続される第２の流路１０２となる溝が設けられている。これらの溝の断面形状は、凹字状、Ｕ字状、Ｖ字状等任意である。また、合流流路１０３の下流の終端には廃液貯留部１０４となる穴が設けられている。穴の開口形状は、円形、四角形等任意であり、穴の底面は、平面でも曲面でもよい。なお、本明細書の図面の説明においては、「上流」という場合は図の左方、「下流」という場合は図の右方を意味する。
図１Ｂにおいて、第２の基板１１０上には、第１の基板１００と積層されたときに、それぞれ、第１の流路１０１の上流の始端に相当する位置に第１の流入口１１１となる貫通孔が、第１の基板１００上の第２の流路１０２の上流の始端に相当する位置に第２の流入口１１２となる貫通孔が、第１の基板１００上の廃液貯留部１０４に相当する位置に排出口１１４となる貫通孔が、そして、第１の基板１００上の第１の流路１０１と第２の流路１０２の接続部に相当する位置に撹拌部１１３となる円筒形の穴が掘られている。穴の底面は、平面でも曲面でもよい。また、第１の基板１００上の狭窄部１０５から下流の合流流路１０３に被せられる第２の基板１１０の裏面にコラーゲン等の血栓生成誘発材が塗布される。具体的には、図Ｃに示す様に、誘発材設置部１１５に、安全を見て広幅に塗布される。そして、誘発材設置部１１５内を通る合流流路１０３が血栓生成室となる。【００２６】
血栓生成誘発材としては、コラーゲンやｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）、予め作られた血栓、絹糸やコットン等の繊維基材などを挙げることができる。これらは一種単独で、または、複数を組み合わせて使用することができる。これらのうち、入手が容易で、取り扱いやすく、実際の血管に近いモデルとなることからコラーゲンが特に好ましく、コラーゲンと組織トロンボプラスチンを含むものでも良い。血栓生成誘発材が血流によって流出しないようコラーゲンやｖＷＦなどの血栓生成誘発材は、誘発材設置部１１５に高い接着強度でコーティングされている。コラーゲンのコーティングは、例えば、特開平０５−２６０９５０号公報やＢｌｏｏｄ．１９９５  Ａｐｒ  １；８５（７）：１８２６−３５．に記載されているように、コラーゲンを酸性溶液に溶解し、これに親水性が付与されたガラスやポリスチレンの基板を浸漬し、洗浄、乾燥するなどの方法にて簡便に高い接着強度でコーティングが可能である。
疎水性の樹脂等にコートする場合には、樹脂表面をプラズマ処理等で親水化した後、所望の領域にコラーゲン溶液を塗布し、自然乾燥ないしは減圧下にて乾燥することでコーティングすることが出来る。
また、繊維基材や予め作られた血栓などの血栓生成誘発材は、血栓生成室となる誘発材設置部１１５内の合流流路１０３内部に固定された状態が望ましい。そして、薄い吸湿性の繊維基材、例えば、コットン、不織布や織布等にコラーゲンを含浸し、乾燥させておく事で、より血栓生成誘発能の高い血栓生成誘発材が得られる。また、組織トロンボプラスチンを含むコラーゲン溶液にそれらの基材を浸漬させ乾燥させると、さらに血栓生成誘発能が高まる。
血栓生成誘発材としてコラーゲンをコーティングする場合、第２の基板１１０の少なくとも誘発材設置部１１５となる部位の基材は平滑なガラスまたはプラスチックとするとコラーゲンの密着性に優れ好ましい。基材としてプラスチックを用いた場合はプラズマ処理等で親水化し、所望の領域にコラーゲン溶液をピペットやシリンジ等のディスペンサーで塗布し、自然乾燥または減圧下で乾燥することでコラーゲンまたは組織トロンボプラスチンを含むコラーゲンを容易にコーティングすることが可能である。
なお、狭窄部１０５も血栓生成誘発材であり、狭窄部１０５のみを血栓生成誘発材として用いる場合もある。本形態例のように狭窄部位１０５を設けておくと、高ずり応力惹起血小板凝集も観測することができ、アテローム血栓症の血栓生成を再現することもできるので好ましい。【００２７】
図１ＣおよびＤに示す様に、第１の形態例のマイクロチップ１は、第１の基板１００の上に第２の基板１１０を、第２の基板１１０に設けられた誘発材設置部１１５を内側とし、各流路および撹拌部１１７が封止されるように密着させて積層することによって得られる。【００２８】
マイクロチップの材質は、金属、ガラスやプラスチック、シリコーン等が好ましい。また、血液観測（特に画像解析）に使用する観点からは透明な材質が好ましい。さらに、回路を形成する観点からはプラスチックが好ましく、透明なプラスチックが特に好ましい。材質をＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のシリコーン製とした場合には、基板同士の密着性に優れるため、第１の基板１００と第２の基板１１０を接着剤などで接着しなくても圧着することで積層することが出来るが、マイクロチップ１の内部に高い圧力がかかる場合は、接着剤を用いることが好ましい。ポリスチレン製の基板を用いた場合には流路内をポリビニルラクトンアミド（ＰＶＬＡ）で簡便に高い接着強度でコーティングすることができるので、抗凝固処理されていない血液を用いる場合に、意図しない部位での血液凝固を抑制することが可能である。また、ポリ２−メトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）によっても簡便かつ効果的に意図しない部位での血液凝固を抑制する事が可能である。なお、マイクロチップ１の基板に設けられる溝や穴は、刃物やレーザー光線で堀ることもできるが、マイクロチップ１の材質がプラスチックである場合は、射出成型で形成することもできる。射出成型で形成すると、一定した品質のマイクロチップ１が効率よく作成できるので好ましい。【００２９】
本形態例のマイクロチップ１を用いた血液観測の一例を図１ＣおよびＤに基づき説明する。第１の流入口１１１および第２の流入口１１２には図示しないチューブが接続され、チューブを介して図示しない送液ポンプ、真空採血管やシリンジが接続される。そして、接続されたポンプや真空採血管あるいはシリンジによってそれぞれ血液と薬剤がマイクロチップ１内の第１および第２の流路１０１、１０２に導入される。なお、抗凝固処理されていない血液を用いる場合は、マイクロチップに接続されるシリンジや真空採血管などの容器も、ヘパリンコーティングされた容器やポリビニルラクトンアミド（ＰＶＬＡ）、ポリ２−メトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）等の血液凝固抑制性を有する素材でコートされた容器を用いる事が望ましい。【００３０】
第１の流入口１１１から導入され、第１の流路１０１を通過した第１の液体である血液と、第２の流入口１１２から導入された血液と反応しうる薬剤を含む第２の液体は、第２の流路１０２を通過し、第１の流路１０１と第２の流路１０２の接続部分において合流し、撹拌部１１３に達する。撹拌部１１３では撹拌子１１７によって血液と薬剤が均一に混合され、撹拌混合された混合液は、両者が反応しつつ、合流流路１０３を流下する。撹拌混合された混合液は、合流流路１０３の狭窄部１０５や誘発材設置部１１５を通過することで血栓の生成が誘発される。なお、狭窄部１０５は、合流流路１０３を通過する混合液の流速や性状を観測することによって、血液との反応性など、目的とする観測を行うことができる。観測に供した血液は、合流流路１０３の終端に設けられた廃液貯留部１０４に貯留され、必要に応じて排出口１１４から排出される。なお、廃液貯留部１０４を設けることなく、直接、排出口１１４から排出してもよい。【００３１】
撹拌子１１７は、マイクロチップの外部から図示しないモーターの回転力が磁気で伝達されて回転できるものが好ましい。撹拌子１１７は、第１の液体と第２の液体が合流した液体の凝固を抑制する凝固抑制処理が施されている。凝固抑制処理としては、ヘパリン、ポリビニルラクトンアミド（ＰＶＬＡ）やポリ２−メトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）等を磁性体の表面に溶融樹脂への浸漬による被覆やインモールド射出成型等の樹脂加工を用いて攪拌子の表面を形成する処理とすることが可能である。【００３２】
図２は本発明のマイクロチップの第２の形態例を示す概念図である。以下、図２に基づいて第２の形態例を説明する。本形態例が第１の形態例と異なる点は、基板が３枚用いられてマイクロチップ２が構成されている点である。第１の形態例と共通する部分は、説明を省略する。
図２Ａは、マイクロチップの流路となる溝が裏面に掘られ、これらに接続して流入口や排出口となる貫通孔が掘られた第１の基板２００の平面図である。図２Ｂは、マイクロチップの撹拌子の収納部となる貫通孔が掘られた第２の基板２１０の平面図である。図２Ｃは、撹拌子の収納部の底となる第３の基板２２０の平面図である。図２ＤおよびＥは、これら３枚の基板が積層された第２の形態例のマイクロチップ２の平面図および正面図である。【００３３】
図２Ｂにおいて、第２の基板２１０上には、積層されたときに、撹拌部２１３となる貫通孔が掘られている。この貫通孔は幅が下流に向かって次第に狭まり、深さが下流に向かって次第に浅くなる形状を有している。本形態例においては、第２の基板２１０の表面に血栓生成誘発材が設けられる。
図２ＤおよびＥに示す様に、第２の形態例のマイクロチップ２は、第１の基板２００の下に第２の基板２１０を、各流路が封止されるように密着させて積層し、さらに、第２の基板２１０の下に第３の基板２２０を、第２の基板２１０上に設けられた撹拌部２１３の底となるように密着させて積層することによって得られる。【００３４】
図３は本発明のマイクロチップの第３の形態例を示す概念図である。以下、図３に基づいて第３の形態例を説明する。本形態例が第１の形態例と異なる点は、第３の流路が設けられてマイクロチップ３が構成されている点である。第１の形態例と共通する部分は、説明を省略する。
図３Ａは、マイクロチップの流路となる溝が表面に掘られた第１の基板３００の平面図である。図３Ｂは、マイクロチップの撹拌子の収納部となる穴が裏面に掘られた第２の基板３１０の平面図である。図３ＣおよびＤは、これらの溝や穴の開口部を内側にして基板３００と基板３１０が積層された第３の形態例のマイクロチップ３の平面図および正面図である。【００３５】
図３Ａにおいて、第１の基板３００は、狭窄部３０５の下流、かつ、廃液貯留部３０４の上流で、一端が合流流路３０３に接続されるように第３の流路３０６となる溝が表面に設けられている。
図３Ｂにおいて、第２の基板３１０は、第１の基板３００と積層されたときに、第１の基板３００上の第３の流路３０６の他端に相当する位置に第３の流入口３１８となる貫通孔が設けられている。撹拌部３１３は、第２の形態例に係るマイクロチップ２と同様である。
図３ＣおよびＤに示す第３の形態例に係る本発明のマイクロチップ３は、第１の形態例と同様に密着させて積層することによって得られる。【００３６】
なお、第３の形態例に係るマイクロチップ３は、第３の流入口３１８に図示しないチューブが接続され、チューブを介して図示しない送液ポンプやシリンジが接続されて混合液の凝固を抑制するための抗凝固処理剤が第３の流路３０６に導入される。この抗凝固処理剤が導入されることによって、観測に供した混合液が凝固してマイクロチップ内の流路が詰まることがないので、安定した観測が可能である。抗凝固処理剤としては、後述するが、例えば、ＥＤＴＡ溶液などが例示される。【００３７】
次に、本発明のマイクロチップを用いた本発明の血液観測装置について説明する。
図４は、第３の形態例に係るマイクロチップ３を透明な基板で構成して組み込んだ本発明の血液観測装置の第1の形態例である血液観測装置Ａの模式図である。以下、図４に基づいて第１の形態例を説明する。
マイクロチップ３の第１の流入口３１１にはチューブを介して抗凝固処理された血液を供給する第１の送液ポンプ３２０が接続されている。第１の送液ポンプ３２０には図示しない圧力センサーが接続されている。
第２の流入口３１２にはチューブを介して抗凝固解除剤を供給する第２の送液ポンプ３２１が接続されている。抗凝固解除剤は、抗凝固処理された血液の抗凝固処理を解除する薬剤である。
第３の流入口３１８にはチューブを介して血液凝固防止剤を供給する第３の送液ポンプ３２２が接続されている。
送液ポンプ３２０から押出された抗凝固処理された血液は、マイクロチップ３内で送液ポンプ３２１から注入された抗凝固解除剤と合流流路で合流し、撹拌部３１３で撹拌子３１７によって撹拌混合された後、合流流路を流下し、血栓生成誘発材がコートされた誘発材設置部３１５に到達する。
誘発材設置部３１５の合流流路である血栓生成室における血栓の生成を目視または図示しないカメラで観察することで血液観測を行うことができる。あるいは、流路内の圧力を送液ポンプ３２０に接続された圧力センサーによって測定することでより定量的な血液観測が可能となる。
血栓生成室を通過した血液混合液は、第３の流入口３１８にチューブを介して接続された第３のポンプ３２２から導入される血液凝固防止剤と混合され、排出口３１４から円滑に排出される。【００３８】
図５および図６は、第３の形態例に係るマイクロチップ３を透明な基板で構成して組み込んだ本発明の血液観測装置の第２の形態例である血液観測装置Ｂの模式図である。以下、図５に基づいて第２の形態例を説明する。本形態例が第１の形態例と異なる点は、装置がシステム化されている点である。第１の形態例と共通する部分は、説明を省略する。
血液観測装置Ｂに用いるマイクロチップ３は、第２の流入口３１２にチューブを介して血小板活性化剤を供給する第２の送液ポンプ３２１が接続されていること以外は、第１の形態例と同様に構成されている。血小板活性化剤は、血小板を活性化する薬剤である。血液観測装置Ｂは、血液観測装置Ａにさらに、血栓生成室を観察するためのＣＣＤカメラ３２４と画像解析装置３２５とヒーター３２９と照明３３１と図示しないコンピュータを付設したもので、血栓生成の様子を画像化したり、マイクロチップ内の圧力をモニターしたり制御したりすることのできるシステムである。
マイクロチップ３には固定用の穴３２３が２箇所設けられ、マイクロチップ３を設置するためのステージ３３０の上に設けられたチップ固定用ピン３２６にはめ込むことで、固定した状態で測定を行うことができる。ステージ３３０上のマイクロチップ直下となる位置にはヒーター３２７が設けられ、３７℃に加温することでより生体内に近い条件で測定を行うことができる。【００３９】
この血液観測装置Ｂを用いた本発明の血液観測方法について概略を説明する。
第1のポンプ３２０から流入した抗凝固処理された血液と、第２のポンプ３２１から流入した血小板を活性化する薬剤は撹拌部３１３で、磁力スターラー３２９によって回転される撹拌子により混合されて、流下しつつ誘発材設置部３１５の血栓生成室で血栓が生成される。ステージ３３０の血栓生成室に相当する部分には照明用の隙間３２８が設けられており、光源３３１によって血栓生成室が照明され、これをカメラ３２４で撮影し、画像解析装置３２５で解析する。【００４０】
この血液観測装置Ｂにおいては、画像解析により血栓生成の状況をより詳細に把握することが出来る。特にキナクリン等によって血小板、白血球を蛍光標識し、コラーゲンへの粘着および凝集を観測する場合は、蛍光発色による単位面積あたりの輝度を画像解析で観測することで観測結果を数値化し、データとして取得することが可能である。流血下で生成される血栓は、血小板、白血球を多く含む白色血栓であり、抗凝固状態で血小板を活性化して得られる血栓も血小板による白色血栓であるので、血液の赤が白に変化していく様子や紅白の割合、面積を、本装置を用いて観測することで容易に血栓の生成過程を解析することが可能である。そして、画像解析およびポンプ３２０にかかる圧力の変化の測定により総合的な血栓生成の状況を観測することができる。【００４１】
図６は、血液観測装置Ｂを、マイクロチップ３の第１の流路と第２の流路が下方、かつ、合流流路が上方となるように、すなわち、流入口３１１と流入口３１２が下方に、排出口３１４が上方になるように垂直に立てて設置したものである。マイクロチップ３は、図５の様に水平に寝かせて設置すると攪拌部３１３が上方に凸となる。すると、攪拌部３１３に血液が流入しても、空気が若干残る場合がある。このように垂直に立てて設置されていると、撹拌部で混合される際に、気泡が生じても、気泡は自然に上方に追い出され、気泡が邪魔することなく安定して均一に撹拌混合することができる。【００４２】
以下、本発明の第４の形態例に係るマイクロチップ４と、それを用いた血栓観測装置Ｃについて説明する。
図１０は、本発明の第４の形態例に係るマイクロチップ４を示す概念図である。図１０Ａは第1の基板４００、図１０Ｂは第2の基板４１０（B）、そして、図１０Ｃは完成図を示す。
マイクロチップ４は基板４００と基板４１０が貼り合わされてなる。基板４００には、第1の流入口４１１に相当する貫通孔が設けられ、さらに、第１の流路４０１、第２の流路４０２、合流流路４０３、及び第３の流路４０６に相当する溝が設けられている。
基板４１０には、第２の流入口４１２、第３の流入口４１８、および排出口４１４に相当する貫通孔が設けられ、さらに、攪拌部４１３に相当する穴が設けられ、血栓生成室４１５に相当する部分に血栓誘発材がコートされている。【００４３】
図１０の（Ｃ）は基板４００と基板４１０を貼りあわせマイクロチップ４としたときの図である。基板４１０を下にして置いたとき、第1の流入口４１１は上に向く開口、第２の流入口４１２、第３の流入口４１８及び排出口４１４は下に向く開口となる。基板４００と基板４１０は、基板４００の第１流路４０１、第２流路４０２及び混合流路４０３に相当する溝と、基板４１０の攪拌部４１３に相当する溝及び血栓誘発材コート部とが向かい合う形で、かつ、撹拌子を撹拌部に収容した状態で貼り合わされる。基板４１０の第２の流入口４１２及び第３の流入口４１８はそれぞれ基板４００の第２の流路４０２の左端部、第３の流路４０６の右端部に接続される。基板４１０の排出口４１４は基板４００の合流流路４０３の右端部に接続される。【００４４】
図１１はマイクロチップ４を乗せるステージ４０を示す。
ステージ４０には、マイクロチップ４の第２の流入口４１２、第３の流入口４１８にそれぞれ接続される、第１の接続ノズル４３５，第２の接続ノズル４３６が設置されている。これらのノズルはステンレスや硬質のプラスチックで出来ており、マイクロチップ４の各流入口に下から接続される。この様に接続されることで、これらのノズルが、マイクロチップ４をステージ４０の所定の位置に正確にガイドし、カメラ等の観測機器や攪拌子を駆動する磁力スターラーとの位置を最適なものとする機能も有する。そして第１及び第２の接続ノズルはそれぞれチューブを介して第２のポンプ４２１及び第３のポンプ４２２と接続されている。
第１の接続ノズル４３５より抗凝固処理を解除する薬剤（例えば塩化カルシウム）や血小板を活性化する試薬（例えばＡＤＰ）または線溶薬（例えばｔＰＡ）などが第２の流入口４１２を通じ第２の流路４０２に流れる。血液凝固が進行して血栓誘発材塗布領域４１５より下流の合流流路４０３及び排出チューブ４３７が詰まることを防止するために、第２の接続ノズル４３６から血液凝固防止剤が第３の流入口４１８を通じ第３の流路４０６に流れる。
第２の流入口４１２から流入される抗凝固処理を解除する薬剤の量は第３の流入口４１８より流入される血液凝固防止剤に比べて、より少量で且つ精密な流量の制御が要求される。したがって、第１の接続ノズル４３５の径は第２の接続ノズル４３６の径よりも小さく設計されることが望ましい。第１の接続ノズル４３５の径を小さめに設計すると、少量の液体を流入させる場合であってもノズル先端のデッドボリュームが小さいので精密で安定な送液が可能となる。【００４５】
第１の接続ノズル及び第２の接続ノズルの外径は第２の流入口４１２、第３の流入口４１８の穴と漏れの無い様に接続可能な形で設計される。例えば、第１の接続ノズルの外径が0.5〜１.5mm、第２の接続ノズルの外径が１〜３ｍｍ、第２の流入口の穴の径が０．５〜１.５ mm、第３の流入口の穴の径が１〜３ｍｍ程度であると望ましい。
第１、第２の接続ノズル４３５，４３６は攪拌部４１３に収納される攪拌部４１３に収納される攪拌子を駆動する磁力スターラー４２９への位置ガイドとしての機能も有し、第１の接続ノズル４３５および第２の接続ノズル４３６に接続されて位置が固定されたマイクロチップ４の攪拌部４１３の真下に磁力スターラー４２９が設置される。合流流路４０３の下は透明なヒーター４２７になっておりマイクロチップ４の温度を制御すると共に、合流流路４０３の下の照明４３１によって合流流路４０３の血栓誘発材設置部４１５上の血栓を照らす。ステージ４０にはマイクロチップ４の排出口４１４の位置に合わせて廃液排出の孔が開いており廃液タンク４３４に廃液チューブ４３７を介して接続される。廃液タンク４３４は陰圧になっており廃液が排出口４１４より吸引される。【００４６】
図１２は、本発明の血栓観測装置Ｃの模式図である。血栓観測装置Ｃは、ステージ４０にマイクロチップ４を設置し、上部に、第1のポンプ４２０および圧力センサー４３２が接続された血液リザーバー４３３、および画像解析装置４２５に接続されたCCDカメラ４２４を設置して構成される。
第1の流入口４１１には抗凝固処理された血液が流される。抗凝固処理された血液は血液リザーバー４３３に貯留され、血液リザーバー４３３は第１のポンプ４２０に接続される。第１のポンプ４２０からはミネラルオイルが血液リザーバー４３３に注入され、注入されたミネラルオイルに押されて血液がマイクロチップ４内に流入する。血液の流入圧力は圧力センサー４３２によって計測される。
合流流路４０３の血栓誘発剤を塗布した領域４１５の上部にはCCDカメラ４２４が設置される。CCDカメラ４２４は合流流路に沿って移動可能とされ、プログラムに従い定期的に合流流路４０３の静止画を撮影する。CCDカメラ４２４は一定距離ずつ移動しながら静止画を取り込み、合流流路４０３全体を静止画の連続として取り込むことが可能である。【００４７】
ところで、第１の形態例のマイクロチップ１を用いる場合においても、水平に寝かせて設置すると攪拌部が上方に凸となるので、血液観測装置Ｂの様に立てて設置することが好ましい。一方、第２の形態のマイクロチップ２を用いる場合は、水平に寝かせて設置しても攪拌部が下方に凸となるので、水平に寝かせても、立てても、いずれの設置方法も採用することができる。
なお、マイクロチップ１やマイクロチップ３をマイクロチップ２の様に構成しない理由は、マイクロチップを射出成型する場合、従来は、溝のみを成型し、必要に応じて、流入口や排出口を後から設けていたので、溝と孔を一度に成型する金型が存在しないためである。ちなみに、第２の形態のマイクロチップ２の第1の基板２００は、溝と孔が併存するが、これは、孔を後から開けたものである。したがって、溝と孔を一度に成型する金型を作成すれば、マイクロチップ１やマイクロチップ３の攪拌部を、下方に凸とすることができる。【００４８】
さらに、血液観測装置Ｂを用いた本発明の血液観測方法について詳細に説明する。
まず、図５に基づき、マイクロチップ３の細部は図３を参照して、本発明のマイクロチップ３を用いた本発明の血液観測方法の第１の形態例を説明する。
第１の流入口３１１には第１の送液ポンプ３２０とチューブの間に抗凝固処理された血液が収容された図示しないシリンジが倒立して接続されている。そして、第１の送液ポンプ３２０には、血液と混ざらず、血液より比重が小さい液体を充填し、その液体を血液が収容されたシリンジ内に圧入して血液の上に重層して、血液より比重が小さい液体を介して血液をマイクロチップ３内に押し出すように構成されている。
第１の送液ポンプ３２０の血液圧送用の血液より比重が小さい液体としては流動パラフィン、ミネラルオイルやシリコーンオイルなどの各種油脂、生理食塩水等が挙げられる。この様に、間接的に血液を押し出すことにより送液ポンプや圧力センサーが血液で汚染されることを防ぐことが可能となる。
なお、ポンプとしては、市販の一般的なポンプを用いてもよいが、エアーの一定圧で押し出したり、シリンジをプランジャーが上になるよう倒立させ、プランジャーに重りをのせたりしてシリンジポンプとしてもよい。【００４９】
血液の凝固を抑制する抗凝固処理に用いる抗凝固処理剤としては、クエン酸ナトリウムまたはカリウム、シュウ酸ナトリウムまたはカリウム、ＡＣＤ（Ａｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）塩などを挙げることができる。このような抗凝固処理剤は、粉末、凍結乾燥品、水溶液などの溶液として使用することができる。これらの抗凝固処理剤のうち、一般的な３．２％クエン酸ナトリウムが容易に入手できることから好ましい。この場合、血液９容に対してこの抗凝固処理剤１容とするのが好ましい。
その他の抗凝固処理剤としてはへパリン、ヒルジン、ヒルログ（ヒルジンＣ末端領域ペプチド）、アプロチニン、抗トロンビン抗体、トロンビンアプタマー、コーン由来トリプシンインヒビター（１９７７．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５２．８１０５）等の利用が可能である。なお、抗凝固処理剤は、複数用いられてもよい。【００５０】
測定用サンプルを採血する方法としては、シリンジまたは真空採血管に予め上記の抗凝固処理剤を入れて採血を行うか、または、採血直後の血液に抗凝固処理剤を速やかに加える等の方法で抗凝固処理した血液を得ることができる。
さらに、ヘパリンを含む真空採血管等で採血した後、へパリナーゼと観測目的に適した抗凝固処理剤を加え、ヘパリナーゼでヘパリンを分解させ、測定目的に適した抗凝固処理剤と置き換えることも可能である。また、同様にクエン酸を含む真空採血管で採血し、塩化カルシウムおよびコーン由来トリプシンインヒビターやトロンビンアプタマー等の観測目的に適した凝固因子阻害剤を加えることで、観測目的に合わせて抗凝固処理した血液を採血することが可能である。【００５１】
第２の流入口３１２には、抗凝固解除剤が充填された図示しない薬剤管が接続された第２のポンプ３２１が接続されている。
抗凝固解除剤としては、クエン酸のようなキレート剤による抗凝固処理を解除する場合は、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム等のハロゲン化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、重炭酸カルシウム等の無機酸カルシウム塩、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、アルギン酸、乳酸、グルコン酸、グリセリン酸、グリセロリン酸等の有機酸のカルシウム塩、などの遊離カルシウム供与体であるカルシウム化合物を挙げることができる。【００５２】
また、抗凝固解除剤として凝固因子阻害剤（抗凝固処理剤）による抗凝固処理を解除する場合は、凝固因子阻害剤に応じた抗凝固解除剤を適宜選択して使用することができる。例えば、ヘパリンを用いて抗凝固処理した場合の抗凝固解除剤としては、プロタミン、へパリナーゼまたは抗へパリン抗体等が利用可能であり、ヒルジン、ヒルログおよびアプロチニンを用いて抗凝固処理した場合の抗凝固解除剤としては、それぞれ抗ヒルジン抗体、抗ヒルログ抗体および抗アプロチニン抗体等の抗凝固解除剤が使用可能である。
さらに、抗トロンビン抗体を凝固因子阻害剤による抗凝固処理を解除する場合は、抗凝固解除剤として、ＰＰＡＣＫトロンビン等の完全に不活性化されたトロンビン、トロンビンの分解断片およびトロンビン中における抗体認識エピトープを含有する合成ポリペプチド等の抗凝固解除剤の使用が可能である。
なお、抗凝固処理、または抗凝固解除に使用される抗体は補体系への影響を最小限にする為に、パパイン等でＦｃドメインを取り除いたものを使用するか鶏卵抗体等のヒト補体系活性化能を有さない抗体を使用することが望ましい。【００５３】
そして、１本鎖オリゴＤＮＡであるトロンビンアプタマー（Ｂｌｏｏｄ．  １９９３  Ｊｕｎ  １５；８１（１２）：３２７１−６．やＪ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９７  Ｏｃｔ  １０；２７２（５）：６８８−９８．）を抗凝固処理剤として用いた場合にはトロンビンアプタマーに対するアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ等のトロンビンアプタマーに結合し機能を阻害する物質が抗凝固解除剤として使用可能である。トロンビンアプタマーはエクソサイトＩおよびＩＩを認識する２種を併用すると、単独の場合より飛躍的に高い抗凝固処理効果が得られる。この際用いられるアンチセンスＤＮＡは実質的にトロンビンアプタマーの抗トロンビン機能を無効化するものであれば、トロンビンアプタマーの一部に対するものであってもよい。【００５４】
第１の流入口３１１から導入され、第１の流路３０１を通過した抗凝固処理された血液と、第２の流入口３１２から導入され、第２の流路３０２を通過した抗凝固解除剤は、合流して撹拌部３１３に達し、撹拌子３１７によって均一に混合される。混合された血液は抗凝固処理が解除されながら合流流路３０３の狭窄部３０５や誘発材設置部３１５を通過することで血栓の生成が誘発される。血栓生成室を通過した血液は排出口３１４に接続された図示しない排出管から排出される。
このときの血液の流速を目視で観測したり、圧力を第１のポンプ３２０に接続された圧力センサーによって測定することによって血液が有する血液凝固能を評価することができる。また、血栓生成室を目視やカメラ３２４で観測することによって血液凝固の状態を調べることができる。【００５５】
そして、第１の流入口３１１に接続したシリンジ内に抗凝固処理、例えば、クエン酸ナトリウムで処理した全血および多血小板血漿（第１の液体）を充填する。第２の流入口３１２に接続した薬剤管内には、抗凝固解除剤、例えば、塩化カルシウム溶液（第２の液体）を充填する。第２の液体の濃度は第１の液体の凝固カスケードが開始される約５〜２０ミリモルに調整する。第１の液体と第２の液体の混合液は撹拌子３１７によって撹拌され、誘発材設置部３１５内の血栓生成室に流入する。この様な透視可能な誘発材設置部３１５を通過する血液を観測する装置によって簡便に血栓生成が観測される。【００５６】
また、血栓生成の観測は、一定時間血液を流した後、血栓生成室内から血液を除去する事によって、目視によって評価する事が出来る。第１の液体や第２の液体を送液するポンプがエアー駆動である場合は、一定圧で第１の液体や第２の液体を送液することで、排出管から排出される血流量の低下によって、コラーゲン上での血栓生成をモニターする事が出来る。多血小板血漿を用いた場合は、血栓は視認性が高いので観察が容易であり、肉眼による血栓生成の観察も可能である。さらには血小板をメパクリン等で蛍光ラベルし蛍光顕微鏡でモニターする事も可能である。【００５７】
次に、第１の形態例と同様に、図５および図３を参照して、本発明の血液観測方法の第２の形態例を説明する。
本形態例が第１の形態例と異なる点は、血液として抗凝固処理をされた全血または多血小板血漿を使用し、血液と反応させる薬剤として血小板を活性化する薬剤を使用する点である。第１の形態例と共通する部分は、説明を省略する。
以下、図６に基づいて説明する。
マイクロチップ３の第１の流入口３１１に接続されたシリンジ内の血液は抗凝固処理されている。抗凝固処理は上述したとおりであるが、これらの中ではクエン酸処理が好ましい。
第２の流入口３１２に接続された薬剤管には血小板を活性化する薬剤が充填されている。血小板を活性化する薬剤としては、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビンおよびリストセチンなどが挙げられる。
第１の流入口３１１から導入され、第１の流路３０１を通過した抗凝固処理された血液と、第２の流入口３１２から導入され、第２の流路３０２を通過した血小板を活性化する薬剤は、合流して撹拌部３１３に達し、撹拌子３１７によって均一に混合される。混合された血液は、血小板が活性化されながら合流流路３０３の狭窄部３０５や誘発材設置部３１５を通過することで、血小板の粘着・凝集が惹起され、血小板血栓を生成する。
このときの血液の流速や圧力を測定することによって血小板機能を評価することができる。また、血栓生成室を目視やカメラ３２４で観測することによって血小板による血栓生成の状態を調べることができる。これにより、血小板の粘着、凝集などの血小板機能を人体内に近い環境で具体的に観測することができる。【００５８】
次に、第１の形態例と同様に、図５および図３を参照して、本発明の血液観測方法の第３の形態例を説明する。
本形態例が第１の形態例と異なる点は、血液として全血または多血小板血漿を使用し、これをそのまま第１の流路３０１に流して血栓生成室において血栓を生成させ、ある程度血栓の生成が見られたら、血液と反応しうる薬剤として血栓溶解剤の溶液を第２の流路３０２に流す点である。第１の形態例と共通する部分は、説明を省略する。
以下、図５に基づいて説明する。
マイクロチップ３の第１の流入口３１１に接続されたシリンジ内の血液は特に抗凝固処理はされていない。
第２の流入口３１２に接続された薬剤管には血栓溶解剤が充填されている。血栓溶解剤としては、ウロキナーゼ、プラスミンおよびｔＰＡなどが挙げられる。
第１の流入口３１１から導入され、第１の流路３０１を通過した血液は撹拌部３１７を通過し、血栓生成室において血栓を生成する。なお、このとき、攪拌子３１７が凝固抑制処理されていても撹拌部３１３で血液凝固が起きることがある。これを防ぐためには、攪拌子３１７を回転させずに静止させておくことが好ましく、攪拌部３１３もＰＶＬＡ等で凝固抑制処理されていることがより好ましい。
ある程度血栓が観測されたら、第２の流路３０２から血栓溶解剤が導入され、第２の流路３０２を通過した血栓溶解剤は、撹拌部３１３に達し、撹拌子３１７によって均一に混合される。混合された血液は、血栓生成室に到達し、生成した血栓を溶解する。
このときの血液の流速や圧力を測定することによって血栓溶解能を評価することができる。また、血栓生成室を目視やカメラ３２４で観測することによって血栓溶解の様子を調べることができる。【００５９】
次に図１０〜１２を用い本発明の血栓観測方法を説明する。
マイクロチップ４はステージ４０に設置される。第１の接続ノズル４３５及び第２の接続ノズル４３６がそれぞれ第２の流入口４１２、第３の流入口４１８に差し込まれ、攪拌部４１３がステージ４０の磁力スターラー４２９上に、合流流路４０３の血栓誘発剤設置部４１５の上にＣＣＤカメラ４２４が下に照明４３１が設置される。ステージ４０はヒーター４２７が設置されておりマイクロチップ４を一定の温度に保つ。マイクロチップ４は３７℃付近に保たれることが望ましい。
用いる試薬や血液、血栓誘発材は、測定の目的によって適宜決定される。
例えば、血液凝固、血小板機能、線溶などを総合的に反映した血栓形成能を測定する場合には以下の様な測定方法が望ましい。
血液リザーバー４３３には、抗凝固処理された全血が入っている。抗凝固処理は特に限定されないが、クエン酸又はクエン酸とコーン由来トリプシンインヒビターによるものが好ましい。血液リザーバー４３３は第１のポンプ４２０及び第１の流入口４１１に接続される。第１のポンプ４２０よりミネラルオイルが血液リザーバー４３３に注入され、血液が第１の流入口４１１よりマイクロチップ４内に注入される。第１の接続ノズル４３５を通じて第２の流入口４１２からは塩化カルシウムが注入される。血液及び塩化カルシウムは第１の流路及び第２の流路を通じて攪拌部４１３で合流し、攪拌子によって混合される。
混合される塩化カルシウムと血液の容量比は、血液対塩化カルシウムが１０対２〜１００対１の容量比で混合されるのが望ましい。１０対２を超えると血液が塩化カルシウムで希釈されてしまい観測に好適な血栓形成が起こらず、１００対１を下回る場合には塩化カルシウム溶液の量が微量となり、低流速となり第２のポンプ４２１による精密な送液が困難になる場合がある。塩化カルシウム溶液の濃度は混合されたときにクエン酸の抗凝固処理を無効化（解除）する濃度に調整される。混合部４１３では５秒〜３分程度滞留させて攪拌される様に第１や第２のポンプを制御することが好ましい。攪拌が５秒以下であると十分な攪拌がされない可能性があり、３分を超えると攪拌部４１３で血液凝固が進んでしまう可能性がある。
混合された血液は合流流路４０３を通じて血栓生成室４１５を通過する。血栓生成室４１５に付着させる血栓誘発材は、コラーゲンと組織トロンボプラスチン混合物のコーティングが望ましい。
コラーゲンと組織因子を含むことでコラーゲン上で血小板の粘着及び凝集ならびに組織因子による凝固系の活性化など総合的に血栓形成に関与する現象が誘発される。合流流路４０３と血栓誘発材設置部４１５によって構成される血栓生成室４１５を通過した血液は、第２のノズル４３６から第３の流路を通じて注入される血液凝固防止剤と混合され排出口４１４から排出され排出チューブ４３７を通って廃液タンク４３４に貯められる。
血液凝固防止剤としては、排出口４１４から廃液タンク４３４への廃液の移動中の血液凝固によるつまりや圧力上昇を防止する目的で用いられるもので、EDTA、クエン酸等のキレート剤、酸、アルカリ溶液、アルコール類またはグアニジン、尿素、SDS等の変性剤を用いることが可能である。
合流流路にて血栓形成が進むと血液リザーバー４３３へミネラルオイル送液部分の圧力が上昇する。圧力センサー４３２により圧力上昇を見ることで流路内の閉塞状況を判定することが可能である。
白色LEDによる照明４３１により下部より照らされ、上部カメラ４２４よりマイクロチップ４内の血栓形成の様子が撮影される。カメラ４２４は指定された一定時間毎に一定の距離を移動して同じ位置を連続的に撮影することで経時的な合流流路４０３内全体の血栓形成を把握することが可能となる。
【実施例】
【００６０】
以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００６１】
実施例１
〔マイクロチップおよび血液観測装置の作成〕
図１Ａに示す第１の基板１００および図１Ｂに示す第２の基板１１０の２枚の透明な基板（株式会社リッチェル製射出成型品）を用意した。第１の基板１００の流路が開口する面と第２の基板１１０の撹拌部１１３となる穴が開口する面を対向させて接着剤を用いて積層し、図１Ｃおよび図１Ｄに示すマイクロチップ１とした。なお、各流路の深さは０．１２ｍｍ、第１の流路１０１の幅は１．２ｍｍ、合流流路１０３の狭窄部分の幅は０．３ｍｍとした。攪拌子１１７は、鉄製の円柱をＰＶＬＡで被覆した直径１ｍｍ、長さ２ｍｍの円柱形状のものを撹拌部１１３に収納した。攪拌部１１３となる穴は内径３ｍｍ深さ１．２ｍｍの断面円形の貫通孔とした。第２の基板１１０の誘発材設置部１１５にコラーゲンを塗布した。撹拌子１１７は、スターラーの磁力によって１００〜２００ｒｐｍで回転するようにした。
作成したマイクロチップ１の第１の注入口および第２の注入口にポンプを接続して血液観測装置を作成した。【００６２】
〔混合状態および残存空気の確認〕
マイクロチップ１の第１の流入口１１１から第１の液体として精製水を２０μＬ／ｍｉｎ、第２の流入口１１２から第２の液体として赤インクを１０μＬ／ｍｉｎの速度で注入し攪拌部１１３で攪拌し、排出口１１４から排出したところ、２液は均一に混合されていた。
第１の基板１００を下に、第２の基板１１０を上にした状態でマイクロチップ１を水平に寝かせて設置して血液観測装置とした場合には、第１の液体と第２の液体は、円滑に混合されたものの、攪拌部１１３に若干の空気が残ることがあった。
一方、マイクロチップ１の第１の流入口１１１を下に、排出口１１４を上にした状態でマイクロチップを垂直に立てて設置した場合は空気が残ることはなかった。【００６３】
実施例２
〔マイクロチップの作成〕
図２Ａに示す第１の基板２００および図２Ｂに示す第２の基板２１０の２枚の透明な基板（フルイドウェア社製射出成型品）および透明なアクリル板からなる図２Ｃに示す第３の基板２２０の基板を用意した。第１の基板２００の流路が開口する面と第２の基板２１０の撹拌部２１３となる穴が開口する面を対向させて接着剤を用いて積層した。第２の基板２００の撹拌部２１３の孔の開口を、接着剤を用いて第３の基板２２０で封鎖して図２Ｄおよび図２Ｅに示すマイクロチップ２とした。なお、第２の基板２１０の厚さは、攪拌部２１３となる孔の深さに合わせて、１．２ｍｍとした。第２の基板２１０の攪拌部２１３となる孔は、内径３ｍｍ円形の貫通孔に加え、三次元的に傾斜のついた三角錐状の流出路を有する図２Ｂおよび図２Ｅに示す形状とした。各流路の深さは０．２５ｍｍ、第１の流路２０１の幅は０．５ｍｍ、合流流路２０３の狭窄部分の幅は０．２ｍｍ、第２の流路２０２の幅は０．１５ｍｍとし、コラーゲンの塗布および攪拌子の収納は、実施例１と同様とした。【００６４】
〔血液観測装置の作成および混合状態の確認〕
第１の基板２００を上に、第３の基板２２０を下にした状態で水平に寝かせてマイクロチップ２を設置し、第１の注入口および第２の注入口にポンプを接続して血液観測装置を作成した。
マイクロチップ２の第１の流入口２１１から第１の液体として精製水を２０μＬ／ｍｉｎ  第２の流入口２１２から第２の液体として赤インクを１０μＬ／ｍｉｎの速度で注入し攪拌部を通過させ排出口２１４から排出したところ、２液は均一に混合されていた。また、攪拌部２１３に空気が残ることはなかった。【００６５】
実施例３
実施例２の第２の基板２１０の撹拌部２１３として、内径３ｍｍの単なる円形の貫通孔としたこと以外は、実施例２と同様にマイクロチップ２および血液観測装置を作成し、実施例２と同様に混合状態の確認実験を行った。その結果、２液は均一に混合されたが、攪拌部に空気が残ることがあった。【００６６】
実施例４〔マイクロチップおよび血液観測装置の作成〕
実施例１と同様にして図３に示すマイクロチップ３を作成した。ただし、第３の流路３０６は幅を０．２ｍｍとし、第２の基板３１０の誘発材設置部３１５にコラーゲンタイプＩ（新田ゼラチン社）とＰＴ試薬（シスメックス社）混合液約１０μＬを塗布した。コラーゲンタイプＩは、３ｍｇ／ｍｌのものを用いた。ＰＴ試薬は、シスメックス社のＰＴ試薬１バイアルを２ｍｌの精製水に溶解し精製水にて１晩透析したものを１対１の割合で混合したものを使用した。また、撹拌部３１３の形状は、実施例２と同様とした。
第２の基板３１０を上に、第１の基板３００を下にした状態で水平に寝かせてマイクロチップ２を設置し、第１の注入口ないし第３の注入口に第１ないし第３のポンプ３２０ないし３２２をそれぞれ接続して図５に示す血液観測装置Ｂを作成した。【００６７】
〔血液観測１〕
それぞれのポンプは、表１に示すプログラムのステップを上から順次、実行することで各ポンプを所定の流速となるように制御しつつ、マイクロチップ３の第１の流入口３１１より３．２％クエン酸ナトリウムを１０分の１量加えた２５μｇ／ｍｌのコーン由来トリプシンインヒビターを添加した全血、第２の流入口３１２より０．２Ｍ  ＣａＣｌ2、第３の流入口３１８より、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ１０  を流入させた。観測後の血液は、排出口３１４より排出した。
なお、マイクロチップ３は、最初の３２秒間（ステップ１と２）垂直に立ててＣａＣｌ2と全血を流し、攪拌部３１３から空気が完全に除去されたことを確認し、第２の基板３１０を上、第１の基板３００を下となる状態で水平にステージ３３０上に設置した。
血液は、第１の流入口３１１に直接差し込める先細の注入筒を先端に有する容器（リザーバータンク）に６００μＬ入れ、さらにリザーバータンクにミネラルオイルを入れた。このリザーバータンクの先端を第１の流入口３１１に直接差し込み、リザーバータンクを倒立させ、後端にチューブを介して第１のポンプ３２０に接続した。第１のポンプ３２０をプログラムに沿って作動させることで、ミネラルオイルを介して血液をマイクロチップ３内に押し入れた。第１のポンプ３２０の圧力センサーによって圧力変化を測定した。結果を図７Ａに示す。【００６８】
【表１】
2009069656.tif 000003
【００６９】
実施例５
〔血液観測２〕
実施例４と同様、図３に示すマイクロチップ３を用いた図５の血液観測装置Ｂを用いて以下の観測を行った。実施例４と同様な部分は省略し、異なる部分のみを説明する。
第１の流入口３１１（第１のポンプ３２０）より３．２％クエン酸ナトリウムを１０分の１量添加した全血を、第２の流入口３１２（第２のポンプ３２１）より０．１μＭ  ＡＤＰ溶液を流入させた。
マイクロチップ３の第３の流入口３１８は塞いで使用しなかった。
それぞれのポンプは、表２に示すプログラムで制御しつつ、第１の流入口３１１から全血、０．１μＭ、第２の流入口３１２からＡＤＰ溶液をマイクロチップ３内に押し入れた。なお、最初のステップ１と２は、攪拌部３１３から空気を除去するためポンプを作動させるためのものである。第１のポンプ３２０の圧力センサーによって圧力変化を測定した。結果を図７Ｂに示す。【００７０】
【表２】
2009069656.tif 000004
【００７１】
実施例６
血栓生成の画像解析
実施例５の血栓生成の過程は実際には図８のＡ〜Ｄの写真のように観察される。血液流入直後の流路内は、血液により赤いが、流路内に白色血栓が生成されるにつれ、白の領域が増加する。【００７２】
なお、画像処理方法は血液観測装置Ｂの画素成分を解析する下記の手法で行った。カラー画像（ＲＧＢ）のＢ成分（Ｂｌｕｅ）に関し、閾値（８０）より小さい画素をカウントして、画像処理の結果とした。
これは、Ｒ（Ｒｅｄ）が強調された部分を抽出していることに相当する。閾値は０〜２５５の間で、赤色部分が適度に抽出されるように試行錯誤で８０と決定した。
更に、チャネル範囲に相当する画素数（約８６０００ドット）に対する割合（チャネル割合）を算出し、ＲＧＢのＢ成分が閾値（８０）より小さい画素をカウントして、系列１として画像処理の結果をグラフ化した。結果を図９に示す。【００７３】
実施例７
図１２に示す血栓観測装置Ｃを用いた凝固及び血小板よりなる血栓形成の測定例を示す。
図１０Ａの基板４００の全ての流路は、深さが１２０μｍ、流路幅が第１の流路４０１、合流流路４０３は２５０μｍ、第２の流路４０２は50μｍ、第３の流路４０６は50μｍの溝である。各流入口及び排出口の形状及び大きさは、第１の流入口４１１が直径２ｍｍ、第２の流入口４１２が直径０．７ｍｍ、第３の流入口４１８が直径２ｍｍの円形とした。各接続ノズルの太さは、第１の接続ノズル４３５の外径が０．７ｍｍ、第２の接続ノズル４３６の外径が２ｍｍとした。排出口４１４は直径２mmの円形とした。図１０Ｂの様に攪拌部４１３は半径１．５ｍｍの円形で下流に行くに従い扇状に狭まる形状で、深さを１．２ｍｍとした。攪拌子４１７は長さ２ｍｍ直径１ｍｍの円柱形の磁性を有する攪拌子で表面をニッケルでコーティングした。
血栓誘発剤としてコラーゲンタイプＩ（新田ゼラチン社）とＰＴ試薬（シスメックス社）の混合液２４μＬを基板４１０の血栓誘発材設置部４１５に相当する位置に１辺が１ｃｍの正方形に塗布し、−０．０８メガパスカルで3時間減圧下に乾燥した。基板４００と基板４１０を貼り合わせたときに合流流路４０３が血栓誘発材を塗布した正方形の部分の中心を通らないように、即ち正方形の端から２．５mmの位置に合流流路４０３が通るように血栓誘発材をコーティングした。血栓誘発材を塗布した正方形の部分の中心を通らないようにしたのは、血栓誘発材が周囲から乾燥し、ここが最後に乾燥するので、表面が平滑でないことがあるためである。コラーゲンタイプＩは、３ｍｇ／ｍｌのものを用いた。ＰＴ試薬は、シスメックス社のＰＴ試薬１バイアルを２ｍｌの精製水に溶解し精製水にて１晩透析したものを１対１の割合で混合したものを使用した。【００７４】
血液リザーバー４３３に第１のポンプ４２０を接続し、第１の接続ノズル４３５を第２のポンプ４２１、第２の接続ノズル４３６を第３のポンプ４２２にそれぞれチューブを介して接続した。
第１のポンプ４２０にはミネラルオイルを、第２のポンプ４２１には０．２M塩化カルシウム溶液を、第３のポンプ４２２には０．５M EDTA（pH10）の溶液を充填した。
3.2％クエン酸ナトリウム溶液を採血直後の血液に、容量比が血液９に対してクエン酸ナトリウム溶液１になるように混和し、さらに終濃度25μｇ/mlになるようにコーン由来トリプシンインヒビターを加え抗凝固処理した血液を血液リザーバー４３３に充填した。【００７５】
第１のポンプ４２０、第２のポンプ４２１、第３のポンプ４２２のプログラムを下記表３に示す。プログラムに従って血液をマイクロチップ４に注入し、塩化カルシウムと混合しながら合流流路へ血液を流した。
血液を合流流路へ流したときの圧力センサー４３２で測定した圧力変化のデータを図１３に（a）として示す。【００７６】
【表３−１】
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【表３−２】
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【００７７】
図１４は本測定例で白色血栓を形成させ、図１２の駆動式CCDカメラ４２４で経時的に静止画を撮影し、再合成した例である。同一箇所を一定時間毎に撮影することで徐々に白色血栓が形成されマイクロチップ４の流路が閉塞していく様子が観察される。【００７８】
実施例８
実施例７のマイクロチップ４を血栓観測装置より取り出し、基板４００と基板４１０を剥がし、血栓誘発材設置部上に形成された血液凝固及び活性化血小板で構成される白色血栓を取り出し、１％グルタルアルデヒド及び四酸化オスミウムで固定化した後、臨界点乾燥法で乾燥し、走査型電子顕微鏡で観察を行った。また、カルシウム再添加により静置下に全血凝固させたものを同様に処理して走査型電子顕微鏡で観察し比較した。
図１５Aはマイクロチップ内に形成される白色血栓、図１５Bは静置環境で形成される血餅の電子顕微鏡写真である。
図１５Aは血小板が主成分で赤血球が殆ど観察されないのに対し、図１５Bは赤血球がフィブリン繊維に絡まって形成されている。図１５のAとBの違いより本血栓観測装置における血栓が、血流の無い環境で形成される従来の全血凝固させた血餅とはミクロの分析においても異なることが判る。また、マイクロチップ４を剥がし、さらに詳細に観察・分析することでより細かな情報を得ることができる。【００７９】
実施例９
血液にさらに0.5単位/mlになるように低分子ヘパリン（フラグミン）を添加した以外は、実施例７と同様の測定を行った。
圧力センサー４３２により測定された、血栓形成による圧力上昇を図１３（ｃ）に示す。【００８０】
実施例１０
０．２M塩化カルシウム溶液の代わりに、8000単位/ml tPA製剤（クリアクター  エーザイ）を含む0.2M 塩化カルシウム溶液を第２のポンプ４２１に充填した以外は実施例７同様の測定を行った。
圧力センサー４３２により測定された、血栓形成による圧力上昇を図１３（ｂ）に示す。【００８１】
実施例１１
図１２に示す血栓観測システムＣを用いた血小板機能の測定例を示す。
基板４００の全ての流路の深さは１２０μｍ、流路幅は第１の流路４０１、合流流路４０３は２５０μｍ、第２の流路４０２は50μｍ、第３の流路４０６は50μｍとした。第１の流入口４１１の直径を２ｍｍ、第２の流入口４１２の直径を０．７ｍｍ、第３の流入口４１８の直径を２ｍｍとした。第１の接続ノズル４３５の外径を０．７ｍｍ、第２の接続ノズル４３６の外径を２ｍｍ、排出口４１４の径を２ｍｍとした。攪拌部４１３は半径１．５ｍｍの円で下流に行くに従い扇状に狭まる形態で、深さを１．２ｍｍとした。攪拌子４１７は長さ２ｍｍ直径１ｍｍの円柱形の攪拌子で表面をニッケルでコーティングした。
血栓誘発剤としてコラーゲンタイプＩ（新田ゼラチン社）とＰＴ試薬（シスメックス社）混合液２４μＬを１ｃｍ x １ｃｍの正方形に塗布し、−０．０８メガパスカルで3時間減圧下に乾燥した。基板４００と基板４１０を貼り合わせたときに合流流路４０３が血栓誘発剤を塗布した正方形の中心を通らないように、すなわち、正方形の端から２．５ｍｍの位置に合流流路４０３が通るように血栓誘発剤をコーティングした。コラーゲンタイプＩは、３ｍｇ／ｍｌのものを用いた。ＰＴ試薬は、シスメックス社のＰＴ試薬１バイアルを２ｍｌの精製水に溶解し精製水にて１晩透析したものを１対１の割合で混合したものを使用した。【００８２】
血液リザーバー４３３に第１のポンプ４２０を接続し、第１の接続ノズル４３５を第２のポンプ４２１、第２の接続ノズル４３６を第３のポンプ４２２にそれぞれ接続した。
第１のポンプ４２０にはミネラルオイルを、第２のポンプ４２１には精製水及び１μM又は２μMのADP溶液を、第３のポンプ４２２には０．５MEDTA（pH10）の溶液をそれぞれ充填した。
3.2％クエン酸ナトリウム溶液を採血直後の血液に、容量比が血液９に対してクエン酸ナトリウム溶液１になるように混和した血液を血液リザーバー４３３に充填した。
第１のポンプ４２０、第２のポンプ４２１、第３のポンプ４２２のプログラムは実施例７同様のプログラム（表３）で実施した。【００８３】
第２のポンプ４２１が精製水の場合は測定開始後30分後も血小板塊は確認されなかった。第２のポンプ４２１が１μM  ADPの場合は約１５分後、２μMの場合は約１０分後より明らかな血小板凝集塊が血栓生成室４１５に形成された。しかしながら血小板凝集塊の強度が弱く圧力上昇は起きなかった。【００８４】
以上、本発明を最適な実施の形態例に基づいて説明したが、本発明はこれらの実施例や形態例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の改変が可能である。
例えば、攪拌子は、特許文献３に記載の柱状の突起物からなる攪拌子、特許文献４に記載のピエゾ効果で振動する攪拌子、あるいは、特許文献５に記載の光の圧力で回転する攪拌子などに凝固抑制処理を施して用いてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のマイクロチップ、血液観測装置および血液観測方法は、患者等に投与した抗血栓薬の効能を評価したり、微量の血液を用いて血流と同等環境下における血液凝固および血小板による血栓生成を総合的に観測することに好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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