(57)【要約】  非天然アミノ酸および非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドを検出する方法が、本明細書に開示される。非天然アミノ酸自身、またはポリペプチドの一部である非天然アミノ酸は、多種多様な官能基（オキシム基、カルボニル基、および／またはヒドロキシルアミン基など）を含み得る。また、翻訳後修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、および該ポリペプチドの検出方法が本明細書に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドにおける非天然にコードされたアミノ酸の側鎖を、検出する工程を含んでいる、ポリペプチドの検出方法。
【請求項２】
上記ポリペプチドが、免疫アッセイ、マイクロアレイ、顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、電気泳動、分光法、発色反応、放射能検出、放射能伝達、素粒子検出、金属結合、キレート、構造または立体構造の変化、酵素活性、特異的結合、写真撮影、磁場測定、センサー、電磁エネルギーの検出、遺伝子発現、可視光線または不可視光線の検出、温度検出、および化学検出から成る群から選ばれる技術を用いて検出される、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
上記免疫アッセイが、放射免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、酵素多重免疫アッセイ、微小粒子酵素免疫アッセイ、発光免疫アッセイ、および蛍光免疫アッセイから成る群から選ばれる、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
上記分光法が、ＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、蛍光分光法、ＮＭＲ、ＵＳ−Ｖｉｓ、およびＸ線結晶学から成る群から選ばれる、請求項２に記載の検出方法。
【請求項５】
上記電気泳動が、ゲル電気泳動、ゾーン電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、およびキャピラリー電気クロマトグラフィーから成る群から選ばれる、請求項２に記載の検出方法。
【請求項６】
上記ポリペプチドがリボソームにおいて合成される、請求項１に記載の検出方法。
【請求項７】
上記非天然アミノ酸ポリペプチドが、翻訳後修飾される、請求項１に記載の検出方法。
【請求項８】
翻訳後修飾されたポリペプチドにおける非天然にコードされたアミノ酸の側鎖を検出する工程を含んでいる、ポリペプチドの検出方法。
【請求項９】
上記ポリペプチドが、免疫アッセイ、マイクロアレイ、顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、電気泳動、分光法、発色反応、放射能検出、放射能伝達、素粒子検出、金属結合、キレート、構造または立体構造の変化、酵素活性、特異的結合、写真撮影、磁場測定、センサー、電磁エネルギーの検出、遺伝子発現、可視光線または不可視光線の検出、温度検出、および化学検出から成る群から選ばれる技術を用いて検出される、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
上記免疫アッセイが、放射免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、酵素多重免疫アッセイ、微小粒子酵素免疫アッセイ、発光免疫アッセイ、および蛍光免疫アッセイから成る群から選ばれる、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
上記分光法が、ＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、蛍光分光法、ＮＭＲ、ＵＳ−Ｖｉｓ、およびＸ線結晶学から成る群から選ばれる、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１２】
上記電気泳動が、ゲル電気泳動、ゾーン電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、およびキャピラリー電気クロマトグラフィーから成る群から選ばれる、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１３】
上記ポリペプチドがリボソームにおいて合成される、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１４】
非天然にコードされたアミノ酸の側鎖と、該非天然にコードされたアミノ酸の側鎖と特異的に相互作用する官能基を含んでいる分子とを接触させる工程を含んでいる、上記ポリペプチドにおける非天然にコードされたアミノ酸の側鎖の検出方法。
【請求項１５】
分子ライブラリーをスクリーニングする方法であって、
ａ）非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドとライブラリー分子とが相互作用することができる条件下において、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドとライブラリー分子とを組み合わせる工程、および
ｂ）非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドと相互作用するライブラリー分子を同定する工程、を含んでいる方法。
【請求項１６】
上記非天然アミノ酸アミノ酸ポリペプチドがリボソームにおいて合成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記非天然にコードされたアミノ酸の側鎖が、翻訳後修飾される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
上記非天然アミノ酸ポリペプチドが、リボソームにおいて合成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記ライブラリーが、化学的ライブラリーまたは生物学的ライブラリーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
上記化学的ライブラリーが、有機ライブラリーまたは無機ライブラリーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記生物学的ライブラリーの分子が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウィルス、リボソーム、翻訳複合体、バクテリオファージ、細菌、および酵母から成る群から選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
上記ライブラリー分子とポリペプチドとの相互作用が、該ライブラリー分子のポリペプチドに対する特異的な結合である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
上記ライブラリー分子とポリペプチドとの相互作用が、ライブラリー分子とポリペプチドとの間における共有結合の形成、またはライブラリー分子とポリペプチドとの複合体の形成である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
ｃ）非天然アミノ酸ポリペプチドと相互作用するライブラリー分子を回収する工程、および、
ｄ）非天然アミノ酸ポリペプチドをライブラリー分子から分離して、単離されたライブラリー分子を得る工程を含んでいる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
異なるアミノ酸配列を有する複数のポリペプチドを含んでいる、リボソームにおいて作製されたポリペプチドのライブラリーであって、各ポリペプチドが非天然アミノ酸を含んでいるライブラリー。
【請求項２６】
各ポリペプチドが同じ非天然アミノ酸を含んでいる、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項２７】
各ポリペプチドが異なる非天然アミノ酸を含んでいる、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項２８】
上記ポリペプチドの少なくとも１つが翻訳後修飾される、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項２９】
上記ポリペプチドが、非天然にコードされたアミノ酸について以外は同一である、請求項２７に記載のライブラリー。
【請求項３０】
各ポリペプチドが、天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドに相同である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項３１】
各ポリペプチドが、非天然アミノ酸の位置以外は同一である、請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項３２】
非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有するポリペプチドの精製方法であって、ポリペプチドにおける非天然にコードされたアミノ酸の側鎖と相互作用する物質と、該ポリペプチドとを接触させる工程を含んでいる精製方法。
【請求項３３】
上記物質が、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、および超臨界流体クロマトグラフィーから成る群から選ばれるクロマトグラフィーのマトリクスである、請求項３２に記載の精製方法。
【請求項３４】
上記液体クロマトグラフィーが、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーから成る群から選ばれる、請求項３３に記載の精製方法。
【請求項３５】
上記液体クロマトグラフィーが、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、およびバッチ処理から成る群から選ばれる、請求項３３に記載の精製方法。
【請求項３６】
上記ポリペプチドと上記物質との接触が、マイクロ流体装置において実施される、請求項３２に記載の精製方法。
【請求項３７】
上記ポリペプチドと上記物質との接触が、ナノ流体装置において実施される、請求項３２に記載の精製方法。
【請求項３８】
上記分配クロマトグラフィーが、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびイオン対クロマトグラフィーから成る群から選ばれる、請求項３４に記載の精製方法。
【請求項３９】
上記薄層クロマトグラフィーが、ろ紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび電気クロマトグラフィーから成る群から選ばれる、請求項３４に記載の精製方法。
【請求項４０】
上記アフィニティークロマトグラフィーが、リガンドクロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーから成る群から選ばれる、請求項３４に記載の精製方法。
【請求項４１】
非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有するポリペプチドの精製方法であって、ポリペプチドを沈殿させる工程を含んでおり、非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有しないポリペプチドの溶解性と比較した場合に、非天然にコードされたアミノ酸によってポリペプチドの溶解性が変わっている、精製方法。
【請求項４２】
上記沈殿が、塩、酸、塩基、およびポリマーから成る群から選ばれる化合物によって実施される、請求項４１に記載の精製方法。
【請求項４３】
上記精製が、免疫沈降によるものである、請求項４１に記載の精製方法。
【請求項４４】
上記物質が、磁性体である、請求項３２に記載の精製方法。
【請求項４５】
非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド側鎖に有する、リボソームにおいて作製されたポリペプチドの精製方法であって、ポリペプチドを電気泳動する工程を含んでおり、非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有しないポリペプチドの電気泳動の移動度と比較した場合に、非天然にコードされたアミノ酸によってポリペプチドの電気泳動の移動度が変わっている、精製方法。
【請求項４６】
上記電気泳動が、ゲル電気泳動およびキャピラリー電気泳動から成る群から選ばれる、請求項４５に記載の精製方法。
【請求項４７】
上記ゲル電気泳動が、ゾーン電気泳動および等電点電気泳動から成る群から選ばれる、請求項４６に記載の精製方法。
【請求項４８】
上記キャピラリー電気泳動が、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー電気クロマトグラフィー、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー、等速電気泳動、および一時的等速電気泳動から成る群から選ばれる、請求項４６に記載の精製方法。
【請求項４９】
非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド側鎖に有する、リボソームにおいて作製されたポリペプチドの精製方法であって、ポリペプチドを透析する工程を含んでおり、非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有しないポリペプチドの拡散率と比較した場合に、非天然にコードされたアミノ酸によってポリペプチドの拡散率が変わっている、精製方法。
【請求項５０】
上記透析が、電気透析である、請求項４９に記載の精製方法。
【請求項５１】
限外ろ過によってポリペプチドを精製する工程を含んでいる、非天然アミノ酸ポリペプチドの精製方法。
【請求項５２】
上記ポリペプチドが、微生物において発現される、請求項３２、４１、４５、または４９に記載の精製方法。
【請求項５３】
上記ポリペプチドが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、酵母、哺乳類細胞、および昆虫細胞から成る群から選ばれる微生物において作製される、請求項３２、４１、４５、または４９に記載の精製方法。
【請求項５４】
上記非天然アミノ酸ポリペプチドが、親和性タグを含んでいる複合ペプチドである、請求項５３に記載の精製方法。
【請求項５５】
上記非天然アミノ酸ポリペプチドが、翻訳後修飾される、請求項３２、４１、４５、または４９に記載の精製方法。
【請求項５６】
上記翻訳後修飾がオキシム交換反応によるものである、請求項５５に記載の精製方法。
【請求項５７】
上記非天然アミノ酸が、オキシム基を含むように翻訳後修飾される、請求項３２、４１、４５、または４９に記載の精製方法。
【請求項５８】
ａ）公知の生物活性を少なくとも１つ有する予め選択されたポリペプチドにおける、予め選択された１つの部位において、天然にコードされたアミノ酸を、非天然にコードされたアミノ酸に置換する工程、
ｂ）非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる、予め選択されたポリペプチドの生物活性を測定する工程、および、
ｃ）ｂ）工程の予め選択されたポリペプチドの生物活性と、（ｉ）予め選択されたポリペプチド鎖における異なる位置において天然にコードされたアミノ酸と置換された、非天然にコードされたアミノ酸を有する予め選択されたポリペプチドの生物活性、または（ｉｉ）ポリペプチド鎖において非天然にコードされたアミノ酸が置換されていない、予め選択されたポリペプチドの生物活性とを比較する工程、を含んでいる方法。
【請求項５９】
非天然にコードされたアミノ酸による置換のための、ポリペプチド鎖における予め選択された位置が連続している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
予め選択されたポリペプチド鎖における、１つの部位において、天然にコードされたアミノ酸を、非天然にコードされたアミノ酸に置換する工程が、該ポリペプチド鎖における各位置毎に繰り返される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
同じ非天然にコードされたアミノ酸が、置換される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
異なる非天然にコードされたアミノ酸が、置換される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
予め選択されたポリペプチド鎖の１以上の位置が、非天然にコードされたアミノ酸により置換される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
予め選択されたポリペプチドの翻訳後修飾のための位置を選択する方法であって、
ａ）公知の生物活性を少なくとも１つ有する予め選択されたポリペプチドにおける、予め選択された１つの部位において、天然にコードされたアミノ酸を、非天然にコードされたアミノ酸に置換する工程、
ｂ）非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる、予め選択されたポリペプチドの生物活性を測定する工程、および、
ｃ）ｂ）工程の予め選択されたポリペプチドの生物活性と、（ｉ）予め選択されたポリペプチド鎖における異なる位置において天然にコードされたアミノ酸と置換された、非天然にコードされたアミノ酸を有する予め選択されたポリペプチドの生物活性、または（ｉｉ）ポリペプチド鎖において非天然にコードされたアミノ酸が置換されていない、予め選択されたポリペプチドの生物活性とを比較する工程、を含んでいる方法。
【請求項６５】
上記翻訳後修飾が、水溶性ポリマーとの結合である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ポリペプチドの１以上の特定のアミノ酸において核酸分子と共有結合しているポリペプチドを含んでいる組成物であって、上記ポリペプチドと核酸分子とは、該ポリペプチドの１以上の非天然にコードされたアミノ酸のアミノ酸の側鎖において共有結合している組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、「Methods of Detecting Non-Natural Amino Acid Polypeptides in vivo and in vitro（インビボおよびインビトロにおける非天然アミノ酸ポリペプチドの検出方法）」と題された米国仮出願第60/737,855号明細書（２００５年１１月１６日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
〔発明の背景〕
非遺伝的にコードされた（遺伝的にコードされていないアミノ酸（すなわち「非天然アミノ酸」））を、タンパク質に組み込むことにより、天然に生じる官能基（リジンのイプシロン位のNH２、システインのスルフィドリル（SH）、ヒスチジンのイミノ基など）に代わる有益な化学官能基を導入することができる。特定の化学官能基は、２０の共通な遺伝的にコードされたアミノ酸において見られる官能基に挿入されるが、非天然アミノ酸に組み込まれ得る官能基と安定な結合を形成するために首尾よく効率的に反応することが知られている。
【０００３】
現在のところ、次の化学官能基を選択的に導入する方法が利用可能である。（ｉ）タンパク質において発見されず、（ｉｉ）２０の共通な遺伝的にコードされたアミノ酸に発見される官能基の全てに化学的に挿入され、（ｉｉｉ）安定な共有結合を形成するために特定の官能基を含んでいる試薬と、効率よく選択的に反応するために用いられ得る、化学官能基。
【０００４】
〔発明の要旨］
本明細書に記載し参照のために示すものは、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチドおよび修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを作製、精製、検出、特徴化ならびに使用するための方法、組成物、技術および戦略である。
【０００５】
本発明は、ポリペプチドにおける非天然にコードされたアミノ酸の側鎖を検出する工程を含んでいるポリペプチドの検出方法を提供する。いくつかの実施形態では、該ポリペプチドはリボソームにおいて合成される。また、本発明は、翻訳後修飾されたポリペプチドにおける非天然にコードされたアミノ酸の側鎖を検出する工程を含んでいる、ポリペプチドの検出方法を提供する。また、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖と、該非天然にコードされたアミノ酸の側鎖と特異的に相互作用する官能基を含んでいる分子とを接触させる工程を含んでいる、上記ポリペプチドにおける非天然にコードされたアミノ酸の側鎖の検出方法を提供する。また、非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有するポリペプチドの精製方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、ポリペプチドにおける非天然にコードされたアミノ酸の側鎖と相互作用する物質と、該ポリペプチドとを接触させる工程を含んでいる。他の実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有するポリペプチドの精製方法は、ポリペプチドを沈殿させる工程を含んでおり、非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有しないポリペプチドの溶解性と比較した場合に、非天然にコードされたアミノ酸によってポリペプチドの溶解性が変わっている方法である。非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド側鎖に有する、リボソームにおいて作製されたポリペプチドの精製方法は、ポリペプチドを電気泳動する工程を含んでおり、非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有しないポリペプチドの電気泳動の移動度と比較した場合に、非天然にコードされたアミノ酸によってポリペプチドの電気泳動の移動度が変わっている、方法である。他の実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド側鎖に有する、リボソームにおいて作製されたポリペプチドの精製方法は、ポリペプチドを透析する工程を含んでおり、非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチド鎖に有しないポリペプチドの拡散率と比較した場合に、非天然にコードされたアミノ酸によってポリペプチドの拡散率が変わっている、方法である。
【０００６】
また、本発明は、以下の工程を含む分子ライブラリーのスクリーニング方法を提供する：ａ）非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドとライブラリー分子とが相互作用することができる条件下において、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドとライブラリー分子とを組み合わせる工程、およびｂ）非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドと相互作用するライブラリー分子を同定する工程。いくつかの実施形態では、異なるアミノ酸配列を有する複数のポリペプチドを含んでいる、リボソームにおいて作製されたポリペプチドのライブラリーであって、各ポリペプチドが非天然アミノ酸を含んでいるライブラリーが、スクリーニングされる。
【０００７】
また、本発明は、以下の工程を含んでいる方法を提供する：a)公知の生物活性を少なくとも１つ有する予め選択されたポリペプチドにおける、予め選択された1つの部位において、天然にコードされたアミノ酸を、非天然にコードされたアミノ酸に置換する工程、ｂ)非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる、予め選択されたポリペプチドの生物活性を測定する工程、および、ｃ）ｂ）工程の予め選択されたポリペプチドの生物活性と、（i）予め選択されたポリペプチド鎖における異なる位置において天然にコードされたアミノ酸と置換された、非天然にコードされたアミノ酸を有する予め選択されたポリペプチドの生物活性、または（ii）ポリペプチド鎖において非天然にコードされたアミノ酸が置換されていない、予め選択されたポリペプチドの生物活性とを比較する工程。いくつかの実施形態では、予め選択したポリペプチドの翻訳後修飾のための位置を選択する方法は以下の工程を含んでいる。a)公知の生物活性を少なくとも１つ有する予め選択されたポリペプチドにおける、予め選択された1つの部位において、天然にコードされたアミノ酸を、非天然にコードされたアミノ酸に置換する工程、ｂ)非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる、予め選択されたポリペプチドの生物活性を測定する工程、および、ｃ）ｂ）工程の予め選択されたポリペプチドの生物活性と、（i）予め選択されたポリペプチド鎖における異なる位置において天然にコードされたアミノ酸と置換された、非天然にコードされたアミノ酸を有する予め選択されたポリペプチドの生物活性、または（ii）ポリペプチド鎖において非天然にコードされたアミノ酸が置換されていない、予め選択されたポリペプチドの生物活性とを比較する工程。
【０００８】
本明細書に記載の方法および組成物、ならびに参照によって組み込まれる方法および組成物は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、細胞株、コンストラクト、および試薬を限定するものではなく、それらは変更されてもよいことを理解されたい。また、本明細書で用いられている専門用語は、特定の実施形態のみを記載するために用いられているのであって、本明細書に記載の方法および組成物の限定を意図していないことを理解されたい。なお、本明細書に記載の方法および組成物は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０００９】
〔定義〕
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形の形態は、内容から明らかに分かるものを除いて、複数形の形態も含んでいる。
【００１０】
特に定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術用語および科学用語は、本明細書に記載の本発明が属する技術における当業者の一人によって、一般的に理解される意味と同じ意味を有している。本明細書に記載の方法、装置、および材料と、同等または類似の任意のものを、本明細書に記載の発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料が、本明細書に記載されている。
【００１１】
本明細書に述べられている全ての出版物および特許は、記述および開示を目的として参照のために引用される。例えば、出版物に記載された概念および方法論は、現に記載された発明と関連して用いられる。本明細書において検討された出版物は、単に本出願の出願日に先立つ開示のみに提供される。本明細書では、先行発明の長所または他の如何なる理由によって、本明細書に記載の本発明らが、上記開示よりも先行している資格を与えられないことを、承認していると解釈されることはない。
【００１２】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ（またはチオアルコキシ）」は、従来の意味において用いられ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子のそれぞれを介して、分子の残基に結合するアルキル基のことをいう。
【００１３】
用語「アルキル」は、それ自体または別の置換基の一部として、特に断りの無い限り、直鎖状、分岐鎖状、または環状の炭化水素の遊離基（ラジカル）、あるいはそれらの組み合わせを意味する。また、それらは、完全飽和、単不飽和、またはポリ不飽和であってもよい。また、それらは、炭素原子数が指定された２価の遊離基および多価の遊離基を含んでいてもよい。すなわち、Ｃ１−１０は、１から１０の炭素を意味する。飽和炭化水素の遊離基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、およびシクロプロピルメチル、ならびにｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどの同族体と異性体とが挙げられる。不飽和アルキル基は、１以上の２重または３重結合を有しているものである。不飽和アルキルとしては、例えば、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタンジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに、高級同族体および異性体などが挙げられる。また、用語「アルキル」は、特に断りの無い限り、下記においてより詳細に定義されるアルキルの誘導体（ヘテロアルキルなど）を含むことを意図している。炭化水素基に限定されないアルキル基のことを、「ホモアルキル」という。
【００１４】
用語「アルキレン」は、それ自体または別の置換基の一部として、アルカンから誘導された２価の遊離基を意味する。アルキレンとしては、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−という構造が挙げられる。また、アルキレンには、以下の「ヘテロアルキレン」として定義される基が含まれる。通常、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４までの炭素原子を有している。なお、本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態では、これらの基は、１０以下の炭素原子を有している。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、アルキル基またはアルキレン基における鎖がより短いもののことであり、一般的に、８以下の炭素原子を有している。
【００１５】
用語「アミノ酸」は、天然に生じるアミノ酸、および非天然アミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同様の様式において機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬体のことをいう。天然にコードされるアミノ酸は、２０の共通アミノ酸、ピロリジン、およびセレノシステインである。上記２０の共通アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と基本的な化学構造（すなわち、炭素が、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している構造）が同じである化合物のことをいい、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどが挙げられる。上記類似体では、Ｒ基が修飾されている（ノルロイシンなど）か、またはペプチド骨格が修飾されているが、基本的な化学構造が天然に生じるアミノ酸と同じである。
【００１６】
アミノ酸が本明細書に示されるときは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）から推薦されている公知の３文字表記、または１文字表記のどちらかが用いられてもよい。同様に、ヌクレオチドは、共通に受け入れられている１文字暗号により示されてもよい。
【００１７】
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に結合することができる任意の分子のことをいう。同様に、「カルボキシ末端修飾基」は、ポリペプチドのカルボキシ末端に結合することができる任意の分子のことをいう。末端修飾基としては、例えば、水溶性ポリマー、血清アルブミンなどのペプチドまたはタンパク質、あるいは、ペプチドの血中半減期を増加させる他の部分などが挙げられる。
【００１８】
用語「アリール」は、特に断りの無い限り、ポリ不飽和芳香族炭化水素の置換基を意味する。この置換基は、（ｉ）単環、または（ｉｉ）一緒に融合もしくは共有結合した複環であり、例えば、１から３までの環が挙げられる。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１から４までのヘテロ原子を含んでいるアリール基（環）のことである。上記ヘテロアリールでは、窒素原子および硫黄原子が、必要に応じて酸化されたり、窒素原子が必要に応じて４級化されたりしている。ヘテロアリール基を、ヘテロ原子を介して分子の残基に結合させることができる。アリール基およびヘテロアリール基としては、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル（ｐｕｒｉｎｙｌ）、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記の各アリール環系およびヘテロアリール環系のための置換基は、以下に記載の許容可能な置換基から選択される。
【００１９】
簡潔には、他の用語と一緒に用いたときの用語「アリール」（アリールオキシ、アリールチオキシ、アラルキルなど）は、上記において定義したようなアリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。したがって、用語「アラルキル」または「アルカリル」は、アリール基がアルキル基と結合している遊離基を含むことを意味し、例えば、ベンジル、フェネチル、およびピリジルメチルなどが挙げられる。また、上記アルキル基が、炭素原子が酸素原子により置換されているアルキル基である場合は、「アラルキル」または「アルカリル」としては、例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、および３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられる。
【００２０】
「２官能性ポリマー」は、他の部分（アミノ酸の側鎖など）と特異的に反応して、共有または非共有結合を形成することができる官能基を２つ別々に含んでいるポリマーのことをいう。２官能性リンカーでは、一方の官能基は、特定の生物活性を有する構成要素における基と反応し、もう一方の官能基は第２の生物活性を有する構成要素における基と反応する。この２官能性リンカーを用いて、第１の生物活性を有する構成要素、２官能性リンカーおよび第２の生物活性を有する構成要素を含んでいる接合体を形成してもよい。様々な化合物をペプチドに結合させるための多くの手法およびリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願公開第１８８，２５６号明細書、米国特許第４，６７１，９５８号明細書、米国特許第４，６５９，８３９号明細書、米国特許第４，４１４，１４８号明細書、米国特許第４，６９９，７８４号明細書、米国特許第４，６８０，３３８号明細書、および米国特許第４，５６９，７８９号明細書を参照のこと。これらは参照によって、本明細書に組み込まれる。「多官能性ポリマー」は、他の部分（アミノ酸の側鎖など）と特異的に反応して、共有または非共有結合を形成することができる官能基を２以上別々に含んでいるポリマーのことをいう。２官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、任意の所望の長さ、もしくは分子量であってもよいし、さらに、化合物に結合する１以上の分子と、該化合物もしくは該化合物に結合する分子との間に特定の間隔または立体構造を提供してもよい。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「生物活性分子（生物学的に活性な分子）」、「生物活性部分」、または「生物活性剤」は、生物に関する生物学的な系、経路、分子、または相互作用における任意の物理特性もしくは生物化学特性に影響を与えることができる任意の物質のことを意味する。上記生物としては、例えば、ウィルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトが挙げられる。特に、本明細書で用いられるような生物活性分子には、ヒトまたは他の動物における疾患の診断、回復、鎮静、治療、または予防を意図される任意の物質、あるいは、ヒトまたは動物の身体的もしくは精神的な健康状態を増強するための任意の物質が含まれるが、これらに限定されない。生物活性分子としては、例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子または分子、染料、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウィルス、リポソーム、微粒子、およびミセルなどが挙げられる。本明細書に記載の方法および組成物と一緒に使用するための生物活性剤の種類としては、薬物、プロドラッグ、核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、および細菌由来の毒素などが挙げられる。
【００２２】
本明細書で用いられるような「共フォールディング」は、具体的には、互いに相互作用する少なくとも２つのポリペプチドを用いて、折りたたまれていないか、不適切に折りたたまれたポリペプチドを、自然の適切に折りたたまれたポリペプチドへ変形させる、リフォールディング処理、反応または方法のことをいう。
【００２３】
本明細書で用いられるような「比較ウィンドウ」は、２０から６００までから成る群から選択される連続した位置の数のうちの何れか１つの部分を参照することを含んでいる。また、上記連続した数は、一般的には、約５０から約２００であり、より一般的には約１００から１５０である。２つの配列を最適に整列した後に、配列を参照配列と、連続した部位において同数で比較してもよい。比較のために配列を整列させる方法は、公知である。比較のための配列の最適な整列を、例えば、（ｉ）「Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c」の局所的相同性アルゴリズム（local homology algorithm）、（ｉｉ）「Needleman and Wunsch (1970) J. MoI. Biol. 48:443」の相同性整列アルゴリズム（homology alignment algorithm）、（ｉｉｉ）「Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444」の類似性に関する検索方法、（ｉｖ）これらアルゴリズムのコンピューターによる実施（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、あるいは（ｖ）手動による整列と目視検査と（例えば、「Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement) 」を参照のこと）によって、実施することができる。
【００２４】
配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために適したアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ２．０とが挙げられる。これらは、「Altschulら (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402」および「Altschulら (1990) J. MoI. Biol. 215:403-410」にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を介して、公的に利用することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーター、Ｗ、ＴおよびＸにより、整列（アライメント）の感度と速度とが決定される。ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期値として、１１のワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用している。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２得点集団（「Henikoff & Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915」を参照のこと）の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両方の鎖の比較を用いている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低い複雑性」のためのフィルタを使用することなく実施される。
【００２５】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、２つの配列間における類似性を統計解析（例えば、「Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 」を参照のこと）することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の測定の１つは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間における適合が偶然に生じる可能性の指標を与える最小総和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小総和確率が約０．２未満、約０．０１未満または約０．００１未満であるならば、核酸は、参照配列と類似していると考えられる。
【００２６】
用語「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列のことか、または核酸配列が、アミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列のことをいう。遺伝コードの縮重により、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのコドンは、全てアラニンのアミノ酸をコードしている。したがって、コドンによりアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、コドンを対応するコドンの何れかに変化させることができる。このような核酸の変種は「サイレント変種」であり、保存的に修飾された変種の１つである。また、ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸は、該核酸の全ての可能なサイレント変種も表している。当業者は、核酸における各コドンを修飾することにより、機能上同一の分子が得られることを認識する（なお、このときのコドンには、ＡＵＧ（メチオニンに対する通常唯一のコドン）およびＴＧＧ（トリプトファンに対する通常唯一のコドン）は除かれる）。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変種は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
【００２７】
アミノ酸配列に関して言えば、当業者は、コードされる配列において１アミノ酸または数％のアミノ酸を、変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、それら変更が、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、またはアミノ酸の置換（化学的に類似のアミノ酸との置換）になる場合において、「保存的に修飾されたバリアント」であると理解する。機能的に類似のアミノ酸を示す保存的な置換の一覧は、当業者にとって公知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本明細書に記載の方法および組成物における多形態バリアント、種間の同族体、および対立遺伝子に加えられるとともに、それらを排除するものではない。
【００２８】
以下の８群のそれぞれは、互いに保存的な置換となるアミノ酸を含んでいる（例えば、「Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition(December 1993))」を参照のこと）：
（１）アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびバリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）；ならびに、
（８）システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）。
【００２９】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自身または他の用語との組み合わせにおいて、特に断らない限りは、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環化型を表す。したがって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、飽和した環結合、部分的に不飽和した環結合、および完全に不飽和した環結合を含んでいる。さらに、ヘテロシクロアルキルについて言えば、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残基に結合する位置を占有することができる。シクロアルキルとしては、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルとしては、例えば、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、および２−ピペラジニルなどが挙げられる。さらに、上記用語は、２環構造、および３環構造も含んでいる。同様に、用語「ヘテロシクロアルキレン」は、それ自身、または他の置換基の一部として、ヘテロシクロアルキルに由来する２価の遊離基を意味し、用語「シクロアルキレン」は、それ自身、または他の置換基の一部として、シクロアルキルに由来する２価の遊離基を意味する。
【００３０】
本明細書で用いられるような「変性剤」は、タンパク質の可逆的なアンホールディングを引き起こす任意の化合物または材料として定義される。変性剤の強さは、特定の変性剤の特性と濃度との両方により決定される。適切な変性剤としては、例えば、カオトロピック性物質、界面活性剤、有機物質、水混和性溶媒、リン脂質、またはそれら作用物質の２以上の組み合わせが挙げられる。適切なカオトロピック性物質としては、例えば、尿素、グアニジン、およびチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。有用な界面活性剤としては、例えば、強界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンエステル（ＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎといった界面活性剤など）、サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）など）、非イオン性の弱い界面活性剤（ジギトニンなど）、陽イオン性の弱い界面活性剤（Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなど）、イオン性の弱い界面活性剤（コール酸ナトリウム、またはデオキシコール酸ナトリウムなど）、両性イオン性の弱い界面活性剤（スルホベタイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−ｌ−プロパンサルフェート（ＣＨＡＰＳ）、および３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−ｌ−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）など）が挙げられる。有機物質、水混和性溶媒（アセトニトリルなど）、低級アルカノール（特にＣ２−Ｃ４のアルカノール（エタノールまたはイソプロパノールなど））、または低級アルカンジオール（特に、Ｃ２−Ｃ４のアルカンジオール（エチレングリコールなど）を、変性剤として用いてもよい。本明細書に記載の方法、および組成物において有用なリン脂質は、例えば、天然に生じるリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトール）、または合成リン脂質誘導体もしくはバリアント（ジヘキサノイルホスファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジルコリンなど）が挙げられる。
【００３１】
本明細書で用いられるような用語「有効量」は、投与される（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの量であって、治療される疾患、病気、または疾患の１以上の症状をある程度軽減する量のことをいう。本明細書に記載の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物を、予防的治療、治療の増強、および／または、治療上の処置のために投与することができる。
【００３２】
用語「増強する」または「増強」は、所望の効果の効力、または持続期間のどちらかを、増加または引き延ばすことを意味する。つまり、治療剤の効果を増強する事に関して、用語「増強する」は、症状に対する他の治療剤の効果の効力または持続期間のどちらかを増加または引き延ばす能力のことをいう。本明細書で用いられるような「増強性有効量」は、所望の系における別の治療剤の効果を増強するのに十分な量のことをいう。患者に使用されたとき、この使用について有効な量は、疾病、病気、または疾患の重症度および治療単位（ｃｏｕｒｓｅ）、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。
【００３３】
本明細書で用いられるような用語「真核生物」は、系統発生領域（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）の真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物のことをいう。真核生物としては、例えば、動物（哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類など）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類など）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫目、原生生物などが挙げられる。
【００３４】
技術的に、および本明細書において用いられるような用語「官能基」、「活性部分」、「活性基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学反応基」、および「化学反応部分」は、識別可能で、定義可能な分子の一部またはユニットのことをいう。これらの用語は、ある機能または活性を行使するとともに、他の分子と反応する分子の一部を示すために、本明細書および化学技術においてある程度同義である。
【００３５】
用語「ハロゲン」には、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素が含まれる。
【００３６】
用語「ヘテロアルキル」は、それ自身または他の用語と組み合わせて、特に断りの無い限り、既定された数の炭素原子と、少なくとも１つのヘテロ原子から成る安定な直鎖状、分岐鎖状、または環状の炭化水素の遊離基、あるいはそれらの組み合わせを意味する。上記ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、ＳｉおよびＳから選択され、窒素原子および硫黄原子が、必要に応じて酸化されたり、窒素原子が必要に応じて４級化されたりしている。Ｏ、Ｎ、およびＳ、ならびにＳｉのヘテロ原子の位置は、ヘテロアルキル基の任意の内部、または、アルキル基が分子の残基と結合する位置であってもよい。例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。２以下のヘテロ原子は、隣接していてもよく、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３が挙げられる。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自身または他の置換基の一部として、ヘテロアルキルに由来する２価の遊離基を意味し、例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基では、同種または異種のヘテロ原子を、鎖の末端の一方または両方に配置することができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、およびアミノオキシアルキレンなどが挙げられる）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンの連結基では、連結基の配向性は、連結基の一般式が書かれた方向によって示されるわけではない。例えば、一般式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表している。
【００３７】
２以上の核酸またはポリペプチド配列に対する用語「同一」、または「同一性」の百分率は、同じである２以上の配列またはサブ配列のことをいう。（ｉ）配列を比較ウィンドウに対して最も対応するように比較および整列させたとき、あるいは、（ｉｉ）（ａ）配列を、以下の配列比較アルゴリズム（または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いるか、もしくは（ｂ）手動による整列と目視検査とによって測定されるような指定領域について比較および整列させたとき、それら配列が、ある百分率で同じであるアミノ酸残基または核酸を有する場合（すなわち特定の領域に対して約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性を有する場合）、配列は「実質的に同一」であるといえる。また、この定義は、試験配列の相補性のことでもある。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域を超えて、あるいは、７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域を超えて存在することができるし、あるいは、特に指定されない場合では、同一性は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長の配列に渡って、存在することができる。
【００３８】
配列比較では、通常、１つの配列を参照配列として、試験配列を比較するために用いる。配列比較アルゴリズムを用いたとき、試験配列および参照配列を、コンピューターに入力し、その後、配置を指定する。また、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムにおけるパラメーターを指定する。初期のプログラムパラメーターを用いてもよいし、別のパラメーターを指定してもよい。それから、配列比較アルゴリズムにより、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。
【００３９】
核酸またはタンパク質に適用されるときの用語「単離される」は、核酸またはタンパク質が、天然の状態では結合している細胞の構成要素のいくつかを少なくとも有しない、あるいは、核酸分子またはタンパク質が、インビボもしくはインビトロにおいて製造されたときの濃度よりも、濃縮されることを示す。それは、均質な状態であってもよい。単離される物質は、乾燥状態、半乾燥状態、または溶液（水溶液など）であってもよい。また、単離される物質は、追加の薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいる薬学的組成物の成分であってもよい。純度と均質性とは、通常、分析化学的手法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーなど）を用いて決定される。調製物の大部分を占めるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離される遺伝子は、興味のある遺伝子以外の遺伝子に隣接し、タンパク質をコードする翻訳領域から分離される。用語「精製される」は、拡散またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドで検出されることを示する。特に、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％の純度、少なくとも９０％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９９％の純度またはそれ以上であることを意味する。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「連結」または「リンカー」は、化学反応の結果、標準的に形成される基または結合のことであり、通常、共有連結または共有結合である。加水分解に安定な連結は、連結が実質的に水中において安定であり、（例えば、長期間、ことによると無期限の生理的条件下において）有用なｐＨの値において水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定または分解性の連結は、連結が水中または水溶液中（例えば、血液）において分解されることを意味する。酵素に不安定または分解性の連結は、連結が１以上の酵素により分解され得ることを意味する。当業者に理解されているように、ＰＥＧおよびそれに関連するポリマーは、分解性の連結を、ポリマーの骨格、またはポリマーの骨格と該ポリマー分子の末端にある１以上の官能基との間のリンカー基に含み得る。例えば、生物活性剤によりＰＥＧカルボン酸または活性型のＰＥＧカルボン酸とアルコール基との反応によって、形成されるエステル連結は、一般的に、生理条件下において加水分解され、生物活性剤を放出する。他の加水分解可能な連結としては、カーボネート連結、アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン連結、アルコールとリン酸基との反応により形成されるリン酸エステル連結、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン連結、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール連結、ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルソエステル連結、（例えば、ＰＥＧなどのポリマーの末端における）アミン基とペプチドのカルボキシル基とにより形成されるペプチド連結、および（例えばポリマーの末端における）ホスホラミジーテ（phosphoramidite）基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とにより形成されるオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。
【００４１】
本明細書で用いられるような用語「培養基」は、任意の宿主細胞を支持し得るまたは含み得る任意の培地、溶液、固体物、半固体物、または剛性の支持体を含んでいる。上記宿主細胞としては、例えば、細菌の宿主細胞、酵母の宿主細胞、昆虫の宿主細胞、植物の宿主細胞、真核生物の宿主細胞、哺乳類の宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物の細胞、E. coli，もしくはPseudomonasの宿主細胞、および細胞含有物が挙げられる。したがって、上記用語は、宿主細胞が成長した培養基（例えばポリペプチドが分泌された培養基）を包含し、そのような培養基は、増殖工程の前であってもよいし、後であってもよい。また、上記用語は、宿主細胞のライセートを含むバッファまたは試薬を包含してもよい。この場合、ポリペプチドが細胞内に製造されるので、ポリペプチドを放出させるために、宿主細胞は、溶解されるか、破壊される。
【００４２】
本明細書に開示の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの「代謝産物」は、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドが代謝されるときに形成される、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの誘導体のことである。用語「活性代謝産物」は、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドが代謝されるときに形成される（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの生物学的に活性な誘導体（生物活性誘導体）のことをいう。用語「代謝された」は、特定の物質が生物によって変化させられる処理の総体のことをいう。上記処理としては、例えば、加水分解反応、および酵素により促進剤される反応が挙げられる。また、代謝に対する情報を、「The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)」から得ることができる。（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを、宿主に投与して、宿主の組織試料を分析することにより、または（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを、肝細胞と一緒にインビトロにおいてインキュベーションして、生じる化合物を分析することにより、本明細書に開示の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの代謝産物を、同定することができる。
【００４３】
本明細書で用いられるような用語「修飾された」は、ポリペプチドにおいて翻訳後修飾が存在することをいう。「（修飾された）」の形態の用語は、検討されるポリペプチドが、必要に応じて修飾されることを意味する。すなわち、検討中のポリペプチドは、修飾され得るか、または修飾され得ない。
【００４４】
本明細書で用いられるような用語「調節された血中半減期」は、未修飾の形態と比べたときの修飾されたポリペプチドの循環半減期における正の変化または負の変化のことをいう。血中半減期は、ポリペプチドを投与した後の様々な時点の血液試料を採取して、各試料における該ポリペプチドの濃度を決定することにより測定される。血清中の濃度と時間との相互関係から、血中半減期を計算することができる。血中半減期が少なくとも約２倍に増加することが望ましいが、例えば、投与計画を満足するか、または毒性効果を避けることができる場合には、それよりも小さくてもよい。いくつかの実施形態では、増加は、少なくとも約３倍であるか、少なくとも約５倍であるか、または少なくとも約１０倍である。
【００４５】
本明細書で用いられるような用語「調節された治療半減期」は、未修飾の形態と比べたときの修飾されたポリペプチドの治療的有効量の半減期における正の変化または負の変化のことをいう。投与後の様々な時点における、ポリペプチドの薬物動態的または薬力学的性質を測定することにより治療半減期は測定される。治療半減期が増加すると、投与計画または総用量において特定の利益がもたらされることや、あるいは、望ましくない効果を避けることができる。いくつかの実施形態では、治療半減期が増加することにより、効力を増加させることや、修飾された分子の標的に対する結合を増加もしくは減少させることや、酵素（プロテアーゼなど）により分子の破壊を増加もしくは減少させることや、あるいは未修飾の分子における作用の別のパラメーターあるいは機構を増加もしくは減少させることができる。
【００４６】
本明細書で用いられるような用語「非真核生物」は、真核生物ではない生物のことをいう。例えば、非真核生物は、系統発生領域の真正細菌（Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putidaなどが挙げられるが、これらに限定されない）、または、系統発生領域の古細菌（例えば、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium(Haloferax volcaniiおよびHalobacterium種のNRC-1など), Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernixなど）に属している。
【００４７】
「非天然アミノ酸」は、２０の共通アミノ酸のうちの１つ、セレノシステイン、もしくはピロリジンではないアミノ酸のことをいう。用語「非天然アミノ酸」と同義として用いられてもよい別の用語は、「非天然にコードされるアミノ酸」、「天然ではないアミノ酸」、「非天然に生じるアミノ酸」、ならびに、それらの様々にハイフンで繋げられたもの、およびハイフンで繋げられていないものである。また、用語「非天然アミノ酸」としては、天然にコードされるアミノ酸（２０の共通アミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインなどが含まれるが、これらに限定されない）の修飾（例えば翻訳後修飾）によって天然に生じるが、翻訳複合体により成長中のポリペプチド鎖に組み込まれないアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。上記天然にコードされないが、天然に生じるアミノ酸としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそれらの一本鎖または２本鎖の形態のポリマーのことを表す。具体的に限定されない限り、上記用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を含む。ここで、上記類似体は、参照の核酸と同様の特性を有し、かつ天然に生じるヌクレオチドと同様の方法で代謝される。特に具体的に他のものに限定されない限り、上記用語は、オリゴヌクレオチドの類似体（ＰＮＡ（ペプチド核酸（peptidonucleic acid））、アンチセンス技術に用いられるＤＮＡの類似体（ホスホチオエート、およびホスホロアミデートなど）など）のこともいう。特に他に示さない限り、特定の核酸配列は、該核酸の保存的に修飾されたバリアント（縮重コドンの置換体など）、および相補的配列、ならびに明確に示された配列を当然に含む。具体的には、１以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を作製することにより、縮重コドンの置換体を得ることができる（「Batzerら Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)」、「Ohtsukaら J. Biol. Chem. 260:2605- 2608 (1985)」、および「Rossoliniら, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)」）。
【００４９】
タンパク質のリフォールディングに関して本明細書で用いられるような「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる、任意の化合物または材料として定義される。適切な酸化剤としては、酸化型グルタチオン、システイン、シスタミン、酸化型ジチオスレイトール、酸化型エリスリトール（oxidized erythreitol）、および酸素が挙げられる。多種多様な酸化剤は、本明細書に記載の方法および組成物における使用に適切である。
【００５０】
本明細書で用いられるような用語「ポリアルキレングリコール」は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの誘導体のことをいう。用語「ポリアルキレングリコール」は、直鎖状のポリマーおよび分岐鎖状のポリマー、ならびに１ｋＤａ〜１００ｋＤａの間の平均分子量を含む。他の典型的な実施形態では、ポリアルキレングリコールは、例えば、商業的な供給業者のカタログ（Shearwater Corporationのカタログ「Polyethylene and Derivatives for Biomedical Applications」(2001)など）に記載されたものである。
【００５１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーのことであり、本明細書では同義で用いられる。すなわち、ポリペプチドに関する記述は、ペプチドに関する記述およびタンパク質に関する記述に、等しく適用される。また同様に、逆のことも言える。上記用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマー、および１以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で用いられるような上記用語は、任意の長さ（全長のタンパク質など）のアミノ酸鎖を含んでおり、アミノ酸残基は共有のペプチド結合により連結されている。
【００５２】
用語「翻訳後修飾」は、天然または非天然アミノ酸の任意の修飾であって、上記アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後に、上記アミノ酸に生じる修飾のことをいう。この用語は、例えば、インビボの共翻訳修飾、インビトロの共翻訳修飾（無細胞翻訳系など）、インビボの翻訳後修飾、およびインビトロの翻訳後修飾などを含んでいる。
【００５３】
「プロドラッグ」は、インビボにおいて親薬物に変換される作用物質のことをいう。いくつかの状況において、プロドラッグは親薬物よりも簡便に投与されることがあるため、プロドラッグが有用である場合がある。プロドラッグは、例えば、経口投与により体内に吸収され利用され得るが、一方、親薬物はそうではない。また、プロドラッグは、薬学的組成物における可溶性を、親薬物よりも改善してもよい。
【００５４】
予防のための適用では、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物は、特定の疾病、疾患、または病気を発症しやすい患者、あるいは、特定の疾病、疾患、または病気の危険性のある患者に投与される。そのような量は、「予防的有効量」として定義される。この場合、正確な量は、患者の健康状態、および体重などに依存する。また、当業者は、一般的な実験（例えば、用量増加、臨床試験）により、上記予防的有効量を決定することが考慮される。
【００５５】
用語「保護された」は、ある反応条件下において化学的に反応性の官能基の反応を防止する部分、または「保護基」が存在することをいう。保護基は、保護される化学的に反応性の基の種類に応じて変えることができる。例えば、化学的に反応性の基が、アミンまたはヒドラジドである場合、保護基を、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から成る群から選ぶことができる。化学的に反応性の基が、チオールである場合、保護基は、オルソピリジルジスルフィドであってもよい。化学的に反応性の基が、カルボン酸（ブタン酸またはプロピオン酸など）またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル基またはアルキル基（メチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）であってもよい。また、公知の他の保護基（例えば、光解離性基（ＮｖｏｃおよびＭｅＮｖｏｃなど））も、本明細書に記載の方法および組成物と一緒に用いてもよいし、あるいは、本明細書に記載の方法および組成物に用いてもよい。
【００５６】
一例を挙げると、封鎖基／保護基は、以下の化合物から選択されてもよい。
【００５７】
【化１】
2009520949.tif 000002
【００５８】
他の保護基は、「Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999」に記載されている。なおこの文献の全ては、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５９】
「組み換え宿主細胞」、または「宿主細胞」は、挿入方法（例えば、直接の取込、形質導入、ｆ−交配、または組み換え宿主細胞を作製するための他の公知の方法）に関係無く、外因性のポリペプチドを含んでいる細胞のことをいう。外因性のポリペプチドを、非統合型のベクター（プラスミド）として維持してもよいし、あるいは、宿主のゲノムに統合してもよい。
【００６０】
タンパク質のリフォールディングに関して本明細書で用いられるような「還元剤」は、還元状態においてスルヒドリル基を維持し、かつ分子内または分子間のジスルフィド結合を減少させる任意の化合物もしくは材料として定義される。適切な還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元型グルタチオンが挙げられる。多種多様な還元剤は、本明細書に記載の方法および組成物における使用に適切である。
【００６１】
本明細書で用いられるような「リフォールディング」は、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを、ジスルフィド結合に関して、不適切に折りたたまれた状態、あるいは折りたたまれていない状態から、天然にもしくは適切に折りたたまれた立体構造に変形させる任意の処理、反応または方法のことである。
【００６２】
語句「〜に対する選択的な（または特異的な）ハイブリダイズ」は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下において、特定のヌクレオチド配列にのみ、分子が結合すること、２本鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることをいう。
【００６３】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件」は、技術的に公知である低イオン強度および高温度の条件をいう。通常、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）において標的のサブ配列にハイブリダイズするが、該複合混合物に存在する他の配列とはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列に依存する。また、環境が異なれば、ストリンジェントな条件も異なる。配列が長ければ、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。「Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)」には、核酸のハイブリダイゼーションが幅広く網羅されている。一般的に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度、ｐＨにおいて、特異的な配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低いように選択される。Ｔｍは、（既定のイオン強度、ｐＨ、および核酸の濃度において）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態において標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は、過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態において占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨが７．０−８．３において塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン濃度よりも低く、通常、約０．０１−１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ（１０〜５０ヌクレオチドなど）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（５０ヌクレオチドよりも長いものなど）については少なくとも約６０℃である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することにより達成されてもよい。選択的なまたは特異的なハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルが、バックグラウンドの少なくとも２倍であってもよいし、必要に応じて、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの１０倍であってもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の典型としては、以下の条件であり得る。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳにおいて、４２℃でインキュベーションするか、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおいて６５℃でインキュベーションし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにより、６５℃で洗浄する。上記洗浄は、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分またはそれ以上実施することができる。
【００６４】
本明細書で用いられるような用語「被検体」は、治療、観察または実験の対象である動物のことをいい、いくつかの実施形態では、哺乳類であり、他の実施形態では、ヒトである。
【００６５】
用語「実質的に精製された」は、天然に生じている環境（すなわち、組み換えにより製造されるポリペプチドの場合は、自然状態の細胞または宿主細胞）において発見されるようなタンパク質を伴う、または該タンパク質と相互作用する構成要素が、実質的にもしくは本質的に有し得ないポリペプチドに関する。細胞内の材料を実質的に有し得ないポリペプチドは、該ポリペプチドに含まれるタンパク質が乾燥重量で約３０％よりも少ない、約２５％よりも少ない、約２０％よりも少ない、約１５％よりも少ない、約１０％よりも少ない、約５％よりも少ない、約４％よりも少ない、約３％よりも少ない、約２％よりも少ない、または約１％よりも少ないものである。ポリペプチドまたはそのバリアントが、宿主細胞によって組み換えにより製造されるとき、該タンパク質は、細胞の乾燥重量に対して約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％あるいはそれ以下の重量で存在し得る。ポリペプチド、またはそのバリアントが、宿主細胞によって組み換えにより製造されるとき、該タンパク質は、細胞の乾燥重量に対して約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌあるいはそれ以下で培地に存在し得る。したがって、本明細書に記載の方法により製造されたときの「実質的に精製された」ポリペプチドは、適切な方法（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピクセルラリー電気泳動など）により決定されたときに、純度が少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％であり、具体的には、純度が少なくとも約７５％、８０％、８５％であり、より具体的には純度が少なくとも約９０％、純度が少なくとも約９５％、純度が少なくとも約９９％またはそれ以上である。
【００６６】
用語「置換基」は、特に限定されないが「不干渉性置換基」を含む。「不干渉性置換基」は、安定な化合物を産出する基である。適切な不干渉性置換基または遊離基としては、例えば、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル、Ｃ２−Ｃ１０のアルケニル、Ｃ２−Ｃ１０のアルキニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ、Ｃ５−Ｃ１２のアラルキル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２のシクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアルキル、Ｃ５−Ｃ１２のアルコキシアリール、Ｃ５−Ｃ１２のアリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２のオキシアリール、Ｃ１−Ｃ６のアルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルキルスルフォニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ここで、ｍは１から８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、ヘテロ環式の遊離基、置換ヘテロ環式の遊離基、ニトロアルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、Ｃ２−Ｃ１０のアルクチオアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−ＯＨ、−ＳＯ２、＝Ｓ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）−Ｓ−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ここで各ｍは１〜８である）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、およびそれらの塩などが挙げられる。上記に挙げた干渉性置換基または遊離基における各Ｒ基は独立して、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、またはアルカリルから成る群から選択される。置換基が、左から右に書くという従来の化学式により記載されている場合、それらは、化学的に同一の置換基（右から左に書かれた構造）を同じく含んでいる。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−と同じである。
【００６７】
アルキルおよびヘテロアルキルの遊離基（例えば、たいてい、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとして称される基）の置換基は、０から（２ｍ’＋１）の範囲の数を有する（ｍ’は上記遊離基における炭素原子の総数）−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮおよび、−ＮＯ２などから選択される様々な１以上の基であってもよい。上記に挙げた干渉性置換基または遊離基における各Ｒ基は独立して、Ｈ、置換もしくは置換されていないヘテロアルキル、置換もしくは置換されていないアリール（１−３のハロゲンで置換アリールなど）、置換もしくは置換されていないアルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、あるいはアラルキル基から成る群から選択される。２つのＲ基が同じ窒素原子に結合するとき、それらは、窒素原子と一緒に連結して５−，６−，７−員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ２は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルなどを含む。置換基に対する上記検討によれば、当業者の一人は、用語「アルキル」が、水素原子以外の基と結合した炭素原子を含む基（例えば、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３など）、およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など））を包含することを理解する。
【００６８】
アルキル遊離基について記載された置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基に関する置換基は、特に限定されないが、０から芳香環系の開放原子価の総数の範囲の数を有する−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルなどから選択される様々な１以上の基であってもよい。上記に挙げた置換基における各Ｒ基は独立して、Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから成る群から選択される。
【００６９】
治療への適用では、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物を、疾病、病気、または疾患の症状を回復するか、該症状の進行を少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、疾病、病気、または疾患を既に患っている患者に投与する。そのような量は、「治療的有効量」として定義され、疾病、病気、または疾患の重症度および治療単位、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。また、当業者は、一般的な実験（例えば、用量増加、臨床試験）により、上記治療的有効量を決定することが考慮される。
【００７０】
本明細書で用いられるような用語「試験リガンド」は、化合物、分子または複合体であり得る作用物質のことであって、非天然アミノ酸ポリペプチド（例えば、天然型が、生物（例えば、脊椎動物（具体的には哺乳類、さらに具体的にはヒト）における疾患または病気と関連しているか、または該疾患または病気の原因となることが知られているタンパク質またはタンパク質複合体など）に結合できるかどうかについて、試験された作用物質のことをいう。非天然アミノ酸ポリペプチドに対して直接影響を与えるリガンドによれば、該リガンドのその非天然アミノ酸ポリペプチドへの結合が必ず生じるので、本アッセイ方法により示される結合から、本明細書に記載されたように同定されたリガンドの治療可能性が強く示唆される。
【００７１】
本方法により評価することのできる試験リガンドは、事実上全ての作用物質、例えば、金属、ポリペプチド、タンパク質、脂質、多糖、ポリヌクレオチドおよび小さな有機分子を含む。非天然アミノ酸ポリペプチドに結合することが示された試験リガンドはリガンドといわれる。少なくとも１つの試験リガンドを含む、物質の複合混合物（例えば、天然生成物抽出物など）を試験することができ、もし肯定的な反応があれば（すなわち、非天然アミノ酸ポリペプチドとの結合が生じれば）、非天然アミノ酸ポリペプチドと結合したリガンドを、その治療可能性をさらに評価される前に混合物から精製することができる。
【００７２】
用語「治療」は予防および／または治療上の取り扱いをいう。
【００７３】
本明細書で用いられるような用語「水溶性ポリマー」は、水溶液に可溶である任意のポリマーのことをいう。水溶性ポリマーとポリペプチドとの結合により、例えば、以下のような変化が生じる。すなわち、非修飾の形態と比べた血中半減期の増加または調節、あるいは治療半減期の増加または調節、免疫原性の調節、物理的会合性質（凝集および多量体形成など）の調節、受容体結合性の変化、１以上の結合パートナーに対する結合性の変化、および、受容体の２量体化および多量体化の変化など。水溶性ポリマーは、それ自身生物活性を有していてもよいし、有していなくてもよい。適切なポリマーとしては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシ、またはそれらのアリールオキシ誘導体（これらは、米国特許第５，２５２，７１４号明細書に記載されている（この文献は参照により本明細書に組み込まれる））、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（デキストラン  サルフェートなど）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンの断片、多糖類（ポリサッカリド）、オリゴ糖（オリゴサッカリド）、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなど）、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテルエステル、およびアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）など、ならびに、それらの混合物が含まれる。上記水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる。
【００７４】
他に示されない限り、従来技術の範囲内における、質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生物化学、組み換えＤＮＡ技術、および薬理学に関する従来の方法が用いられる。
【００７５】
本明細書で示された化合物（上記化合物の何れかを製造するための試薬、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチド）には、同位体標識された化合物が含まれる。この同位体標識された化合物は、１以上の原子が、天然に通常発見される原子質量、または原子質量番号とは異なる原子質量、または原子質量番号を有する原子によって置換されていること以外は、本明細書で示された様々な一般式および構造によって表される化合物と同一である。示された化合物に組み込まれ得る同位体としては、例えば、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素および塩素の同位体が挙げられ、より具体的には、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６ＣＬなどである。本明細書に記載の同位体標識された特定の化合物（例えば、３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた化合物）を、薬物および／または基質の組織分布アッセイに用いることができる。さらに、同位体（重水素（すなわち２Ｈ）など）で置換することによって、代謝安定性がより良好になることに起因する治療上の利点（例えば、インビボにおける半減期が増加することや、必要な用量が減少すること）を得ることができる。
【００７６】
本明細書に記載の化合物（上記化合物の何れかを製造するための試薬、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチド）のいくつかは、不斉炭素を有しており、このため、鏡像異性体またはジアステレオマーとして存在することができる。ジアステレオマーの混合物を、公知の方法（例えば、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶）によって、それぞれの物理的、化学的違いに基づいて、各ジアステレオマーに分離することができる。鏡像異性体を、鏡像異性体の混合物を、以下のような方法により、より分離することができる。すなわち、鏡像異性体の混合物を、適切な光学活性化合物（アルコールなど）と反応させることによりジアステレオマーの混合物に変換し、該ジアステレオマーを分離し、そして、各ジアステレオマーを対応する純粋な鏡像異性体に変換する（加水分解など）ことにより分離することができる。上記の異性体（ジアステレオマー、鏡像異性体、およびそれらの混合物）の全ては、本明細書に記載の組成物の一部として考慮される。
【００７７】
さらに、または追加の実施形態では、本明細書に記載の化合物（上記化合物の何れかを製造するための試薬、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドなど）は、プロドラッグの形態で用いられる。さらに、または追加の実施形態では、本明細書に記載の化合物（上記化合物の何れかを製造するための試薬、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドなど）は、必要とする生物への投与により代謝されて、所望の効果（所望の治療効果など）を奏するのに用いられる代謝産物が製造される。さらに、または追加の実施形態では、本発明は、非天然アミノ酸および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの活性型代謝産物である。
【００７８】
本明細書に記載の方法および製剤には、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドのＮ酸化物、結晶性形状（多形態としても知られる）、または薬学的に許容可能な塩の使用が含まれる。いくつかの状況では、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドは、互変異性体として存在してもよい。全ての互変異性体は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの範囲に含まれる。また、本明細書に記載の非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドは、溶媒和していない形態であってもよいし、薬学的に許容可能な塩（水およびエタノールなど）と一緒に溶媒和した形態であってもよい。また、本明細書に記載の非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの溶媒した形態も、本明細書に開示されていると考えられる。
【００７９】
当業者は、本明細書の化合物（上記化合物の何れかを製造するための試薬、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドなど）のいくつかが、いくつかの互変異性体の形態で存在することができると、認識する。そのような互変異性体の形態は、本明細書に記載の組成物の一部であると考えられる。また、例えば、任意の化合物（上記化合物の何れかを製造するための試薬、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドなど）エノール−ケトの形態の全ては、本明細書に記載の組成物の一部であると考えられる。
【００８０】
本明細書の化合物（上記化合物の何れかを製造するための試薬、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドなど）のいくつかは、酸性であり、薬学的に許容可能な陽イオンとの塩を形成してもよい。本明細書の化合物（上記化合物の何れかを製造するための試薬、非天然アミノ酸、および（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドなど）のいくつかは、塩基性であり、このため、薬学的に許容可能な陰イオンと塩を形成してもよい。上記塩（２塩（ｄｉ−ｓａｌｔｓ）を含む）は、本明細書に記載の組成物の範囲に含まれる。また、上記塩を従来の方法により調製することができる。例えば、酸性の物質と塩基性の物質とを水性の反応媒質、非水性の反応媒質、または部分的に水性の反応媒質の何れかにおいて接触させることにより、塩を調製することができる。塩は、以下の技術のうちの少なくとも１つを用いて、回収される。すなわち、ろ過、ろ過に続く非溶媒との沈殿、溶媒の蒸発、または水溶液の場合は、凍結乾燥である。
【００８１】
塩としては、例えば、（１）無機酸または有機酸と一緒に形成された酸付加塩、（２）親化合物に存在する酸性のプロトンが、金属イオンによって置換されるか、または有機塩基に配位するときに形成される塩が挙げられる。上記無機酸としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。上記有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトニック酸（glucoheptonic acid）、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第３級ブチル酢酸（tertiary butylacetic acid）、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、およびムコン酸などが挙げられる。上記金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオンなどが挙げられる。許容可能な有機塩基としては、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、およびＮ−メチルグルカミンなどが挙げられる。許容可能な無機塩基としては、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、および水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
【００８２】
塩への参照は、塩の溶媒付加形態、または結晶形態（特に、溶媒和物、または多形態）が含まれることを理解されたい。溶媒和物は、化学量論的または非化学量論的な量の溶媒を含んでいる。また、溶媒和物は、結晶化の過程の間に形成されることが多い。水和物は、溶媒が水のときに形成され、アルコラートは、溶媒がアルコールのときに形成される。多形態には、化合物の基本的な組成は同じで、結晶の凝集配置が異なるものが含まれる。各多形態は、一般的に、異なるＸ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学および電気的特性、安定性、ならびに、可溶性を有している。様々な要因（再結晶溶媒、結晶化速度、および保存温度）により、単結晶を優先的に形成することができる。
【００８３】
〔参照による組み込み〕
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各刊行物、特許、または特許出願の１つ１つが、あらゆる目的のために参照によって組み込まれると具体的に示される場合と同じように、あらゆる目的のために参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００８４】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳しく記載されている。以下の詳細な説明では、本発明の原理を利用した実施形態が説明のために記載されており、詳細な説明と添付の図面とを参照することによって、上記特徴と本発明の利点は、さらに理解される。
【００８５】
図１は、本明細書に記載の方法、組成物、戦略、および技術の特定の態様の関係を表す概略図である。
【００８６】
図１ａは、様々なタンパク質検出方法を示す図である。
【００８７】
図２は、翻訳により（または別の方法により）ポリペプチドに組み込まれたアミノ酸の官能基（Ａ）、と反応物質（Ｂ）とを反応させて修飾されたポリペプチド（修飾ポリペプチド）を得る反応の、非限定的な具体例を示す図である。
【００８８】
図３は、カルボニル含有非天然アミノ酸要素と、ヒドロキシルアミン含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【００８９】
図４は、ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸要素と、カルボニル含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【００９０】
図５は、オキシム含有非天然アミノ酸要素とカルボニル含有試薬とによる、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【００９１】
図６は、ジカルボニル含有非天然アミノ酸要素とヒドロキシルアミン含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【００９２】
図７は、ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸要素とジカルボニル含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【００９３】
図８は、オキシム含有非天然アミノ酸要素と、カルボニルまたはジカルボニル含有試薬とのオキシム交換反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【００９４】
図９は、タンパク質に部位特異的に結合した分子の非限定的な具体例を示す図である。ここで、該分子は、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸のカルボニルと、分子のヒドロキシルアミンとの間に形成されたオキシムにより、タンパク質に部位特異的に結合している。
【００９５】
図１０は、非天然アミノ酸と反応する樹脂を利用した、非天然アミノ酸ポリペプチドの精製方法の一例を示す図である。
【００９６】
図１１は、非天然アミノ酸ポリペプチドの精製と、該ポリペプチドの接合とを「ワンポット」により実施する方法の一例を示す図である。
【００９７】
図１２は、樹脂の選択、および樹脂への官能基付与の一例を示す図である。
【００９８】
図１３は、ヒドロキシルアミン樹脂を用いた、非天然アミノ酸ポリペプチドの親和性精製の一例を示す図である。
【００９９】
図１４は、アルデヒド樹脂を用いた、非天然アミノ酸ポリペプチドの精製の一例を示す図である。
【０１００】
図１５は、切断によりチロシンに変換される非天然アミノ酸の前躯体から、未変性タンパク質を精製する一例を示す図である。
【０１０１】
図１６は、非天然アミノ酸の非限定的な例を示す図である。
【０１０２】
図１７は、ｈＧＨの一本鎖ＤＮＡの接合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果を示す図である。なお、１）は、接合反応の反応混合物を示し、２）は、ＨＩＣカラムにより精製されたｈＧＨの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の接合体を示す。
【０１０３】
図１８は、タンパク質とｓｓＤＮＡ接合体とのハイブリダイゼーションを示す図である。
【０１０４】
図１９は、ｈＧＨのｓｓＤＮＡ接合体のハイブリダイゼーションを、未変性の１４％グリシンゲルにより分析した結果を示す図である。該ハイブリダイゼーションは、ｈＧＨのｓｓＤＮＡ接合体（５μｌ）と、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３とのハイブリダイゼーションである。なお、１）、２）、３）、４）、および５）において、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３の濃度は１μＭであり、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３の量はそれぞれ０μｌ、２μｌ、４μｌ、６μｌ、８μｌ、および１０μｌである。また、７）、８）、および９）において、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３の濃度は１０μＭであり、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３の量はそれぞれ２μｌ、４μｌ、および８μｌである。
【０１０５】
図２０は、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３と混合された５μｌのｈＧＨのｓｓＤＮＡ、およびＦｔａｍ２８‐ｄ３と混合されたｈＧＨを、未変性ゲルにより分析した結果を示す図である。なお、１）、２）、および３）において、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３の濃度は１００μＭであり、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３の量はそれぞれ０μｌ、１μｌ、および４μｌである。また、４）、および５）において、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３の濃度は１００μＭであり、Ｆｔａｍ２８‐ｄ３の量はそれぞれ１μｌ、および０μｌである。
【０１０６】
図２１は、鋳型としてのＤＮＡを用いて、１次元（１−Ｄ）構造のｈＧＨを会合させた結果を示す図である。
【０１０７】
〔発明の詳細な説明〕
＜Ｉ．序文＞
近年、タンパク質科学において完全に新規の技術が報告されている。その技術はタンパク質の部位特異的修飾と結びついている多くの制限を打開することを期待させる。具体的には、原核生物であるＥｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）（例えば、L.Wangら（2001）,Science292:498-500）および真核生物であるＳａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、J.ChinらScience 301: 964-7(2003)）のタンパク質生合成機構に、新規の構成要素が加えられてきた。これにより、インビボでのタンパク質への非天然アミノ酸の組み込みが可能になった。これまでにない化学的、物理的または生物学的特性を有する多数の新たなアミノ酸が、この手法によって、アンバーコドン、ＴＡＧに反応して、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母においてタンパク質へ高い忠実性で効率的に組み込まれた。例えば、「J.W.Chinら, Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027(2002)」（その全体を参照のために示す）；「J.W.Chin,& P.G.Schultz, ChemBioChem 3(11):1135-1137(2002)（その全体を参照のために示す）；「J.W.Chinら, PNAS United States of America 99:11020-11024(2002)（その全体を参照のために示す）；および、「L. Wang,& P.G.Schultz, Chem. Comm.,1:1-11(2002)」（その全体を参照のために示す）を参照のこと。また、上記新たなアミノ酸としては、例えば、光親和性標識されたアミノ酸、光異性化性（photoisomerizable）アミノ酸ならびに光架橋性（photocrosslinking）アミノ酸、ケトアミノ酸、およびグリコシル化アミノ酸が挙げられる。これらの研究では、（１）タンパク質中に存在せず、（２）２０の共通の遺伝的にコードされたアミノ酸において存在する全ての官能基に対して化学的に不活性であり、（３）使用したときに、選択的かつ効率よく反応して安定な共有結合を形成し得る化学官能基を選択的且つ定期的に導入できることが証明された。
【０１０８】
＜ＩＩ．概観＞
図１は、本明細書に記載した組成物、方法および技術の概観である。参照のために示す米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書の全ては、少なくとも１つの非天然アミノ酸または修飾された非天然アミノ酸を含むポリペプチドを作成および使用するための手段（方法、組成物、技術）である。そのような非天然アミノ酸ポリペプチドはさらなる官能基を含んでもよい。例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋体；細胞毒性化合物；薬剤；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質（ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体；抗体または抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；単糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピンラベル；蛍光プローブ、金属含有部分（Moiety）；放射性部分；新規的な官能基；他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用している基；光ケージド部分（a photocaged moiety）；化学線により活性化されやすい部分；光異性体化可能部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチンの類似体；重原子を組み込まれた部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素結合した糖；酸化還元活性化薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識した部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光法による基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達薬剤；生物学的活性薬剤；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノトランスミッター；および上記の全ての組み合わせ。
【０１０９】
図１に示したように、ある態様において、方法、組成物および技術を用いて修飾されたポリペプチドの選択および設計のための方法である。その方法は、参照のために本明細書に示す米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書にさらに記載されている。新規ポリペプチドは、例えば、高速大量処理スクリーニング過程の一部として（その場合、大量のポリペプチドが設計、合成、同定および／または試験されてよい）新規に設計されてもよいし、または研究者の興味に基づいて設計されてもよい。新規のポリペプチドは既知または部分的に同定されたポリペプチドの構造に基づいて設計されてもよい。一例を示すと、成長ホルモンスーパーファミリー（下記に示す）は科学界による重要研究テーマである；新規ポリペプチドは本遺伝子ファミリーの構成員または複数の構成員の構造により設計されてよい。どのアミノ酸を置換および/または修飾するかという選択の原則は、本明細書において別々に記載した。どの修飾を用いるかについての選択も本明細書に記載し、実験者または消費者の需要に合致するように用いることができる。例を挙げれば、修飾はポリペプチドの治療上の有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロフィールの改良、ポリペプチドの薬物動態学の修正、ポリペプチドへの付加的な官能基の提供、タグ、標識または検出可能なシグナルのポリペプチドへの組み込み、ポリペプチドの分離特性の緩和、および前述修飾の全ての組み合わせを含む。
【０１１０】
したがって、少なくとも１つの非天然アミノ酸または修飾された非天然アミノ酸は、参照のために本明細書に示す米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書にさらに提供および記載されている。非常に多様な非天然にコードされたアミノ酸は本発明における使用に好適である。全ての非天然にコードされたアミノ酸はポリペプチドに導入することができる。一般的に、導入された非天然にコードされたアミノ酸は、２０の遺伝的にコードされたアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）に対して実質上化学的に不活性である。いくつかの実施形態において、側鎖に官能基を含む非天然にコードされたアミノ酸は、２０の共通アミノ酸に見られない官能基（限定されないがアジド、ケトン、アルデヒドおよびアミノオキシ基を含む）と安定な共有結合を形成し、効率的および選択的に反応する。本発明の非天然にコードされたアミノ酸は、概して、側鎖の構造においてのみ天然アミノ酸と異なっているため、非天然にコードされたアミノ酸は他のアミノ酸（天然または非天然にコードされるアミノ酸など）と、天然の生じるポリペプチドにおいて形成されるアミド結合と同様のアミド結合を形成する。しかし、非天然にコードされたアミノ酸は、それらと天然アミノ酸を区別する側鎖基を有する。例えば、側鎖（Ｒ基）は任意にアルキル、アリール、アクリル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エステル、チオール、セレノ、スルホニル、ホウ酸塩、ボロネート、リン、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基または類似体またはそれらの全ての組み合わせを含む。
【０１１１】
本発明における使用に好適であってよい他の非天然に生じる重要なアミノ酸は、光活性化可能な架橋剤、スピン標識されたアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属に結合したアミノ酸、金属を含むアミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基が付加したアミノ酸、共有結合または非共有結合で他の分子と相互作用しているアミノ酸、光ケージドおよび／または光異性体化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、セリン置換された糖のような糖化アミノ酸、他の炭化水素修飾されたアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能および／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して伸長した側鎖を有するアミノ酸、限定されないが、ポリエーテルまたは長い炭化水素鎖、限定されないが、約５または１０個以上の大きさの炭素、炭素結合した糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有のアミノ酸および１つ以上の毒性部分を含むアミノ酸を含む、アミノ酸を含む。
【０１１２】
ポリペプチドに組み込むための多くの非天然アミノ酸は、参照のために本明細書に引用する「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された国際公開第２００２/０８５９２３号パンフレットに見られる。非天然にコードされたアミノ酸のインビボでの組み込み方法および組成物は、ここで参照のために引用する米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアルナンバー１０／１２６，９２７）に記載されている。生物のインビボ翻訳系に用いられる直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を選択するための方法は、本明細書において参照のために引用する米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアルナンバー１０／１２６，９２７）、および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（シリアルナンバー１０／１２６，９３１）に記載されている。本明細書において参照のために引用する「Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins」と題されたＰＣＴ出願の国際公開第０４／０３５７４３号パンフレットは、ケトアミノ酸の組み込みのための直交するＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載している。本明細書において参照のために引用する「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題されたＰＣＴ出願の国際公開第０４／０９４５９３号パンフレットは、真核宿主細胞において非天然にアミノ酸をコードした組み込みのための直交するＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載している。非天然にコードされたアミノ酸は、非天然にコードされたアミノ酸を天然アミノ酸から区別する側鎖基を有している。側鎖は、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、ホウ酸塩、ボロネート、リン、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基または類似体またはそれらの全ての組み合わせを含む。
【０１１３】
ある実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸または修飾された非天然アミノ酸基を有するポリペプチドは、少なくとも１つの翻訳後修飾を、該ポリペプチドのいくつかの位置に含んでいる。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は細胞機構を介して起こる（例えば、糖鎖付加、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾など）。多くの場合、そのような細胞機構に基づく翻訳後修飾はポリペプチド上の天然に生じたアミノ酸部位で起こる。しかし、ある実施形態では、細胞機構に基づく翻訳後修飾はポリペプチド上の非天然アミノ酸部位において起こる。
【０１１４】
その他の実施形態において、翻訳後修飾は細胞機構を利用しない。しかしその代わりに、翻訳後修飾は、当業者の一人に公知の特定の反応基に好適な化学的手段を利用して、第１の反応基を含んでいる少なくとも１つの非天然アミノ酸と、第２の反応基を含んでいる分子とを結合させることにより得られる。上記第１の反応基を含んでいる少なくとも１つの非天然アミノ酸としては、限定されないが、例えば、ケトン、アルデヒド、アセタール、ヘミアセタール、オキシムまたはヒドロキシルアミン官能基を含んでいる非天然アミノ酸が挙げられる。また、上記第２の反応基を含んでいる分子としては、例えば、限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋体；細胞毒性化合物；薬剤；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質（ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体；抗体または抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；単糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光プローブ、金属含有部分；放射性部分；新規的な官能基；他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用している基；光ケージド部分；化学線により活性化されやすい部分；光異性体化可能部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチンの類似体；重原子を組み込まれた部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素に結合した糖；酸化還元活性化薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識した部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光法による基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達薬剤；生物学的活性薬剤；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノトランスミッター；および上記の全ての組み合わせを含む）が挙げられる。具体的な実施例において翻訳後修飾は真核細胞または非真核細胞においてインビボで生成される。特定の実施形態では、翻訳後修飾はインビトロで生成される。また、本態様には、少なくとも１つのそのような翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含むそのようなポリペプチドの製造、精製、同定および使用を含む。
【０１１５】
また、本明細書において参照のために引用する米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書の範囲内にさらに記載されている方法、組成物、戦略および技術の範囲内には、全ての前述の翻訳後修飾を生成するためにポリペプチドの部分である非天然アミノ酸と反応可能な試薬を含む。一般的に、翻訳後に修飾された非天然アミノ酸は、その後修飾反応を受ける少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。また、本態様においては、該非天然アミノ酸の全ての該翻訳後修飾を可能にする該試薬の製造、精製、同定および使用の方法を含む。
【０１１６】
特定の実施形態では、タンパク質は１つの宿主細胞によりインビボで作製される少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、その翻訳後修飾は通常、他の宿主細胞型により作製されない。特定の実施形態において、タンパク質は真核細胞によりインビボで作成される少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、その翻訳後修飾は通常、非真核細胞により作成されない。翻訳後修飾の例は、限定されないが、糖鎖付加、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾などを含む。１実施形態において、翻訳後修飾はＧｌｃＮａｃ−アスパラギン結合（例えば、オリゴ糖は（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含む）によるアスパラギンへのオリゴ糖の付加を含む。他の実施形態において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−ｓｅｒｉｎｅ、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリンまたはＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、セリンまたはスレオニンへのオリゴ糖の結合（例えば、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなど）を含む。特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドは、分泌または局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合タンパク質などを含む。分泌シグナル配列としては、例えば、原核生物分泌シグナル配列、真核生物分泌シグナル配列、細菌発現のために５’末端を最適化された分泌シグナル配列、新規の分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、ＯｍｐＡ分泌シグナル配列およびファージ分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列としては、例えば、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ  ＧＩＩＩおよびＭ１３（ファージ）、Ｂｇ１２（酵母）およびトランスポゾン由来のシグナル配列ｂｌａが挙げられる。また、本態様には、少なくとも１つの該翻訳後修飾を含む該ポリペプチドの製造、精製、同定および使用が含まれる。
【０１１７】
重要なタンパク質またはポリペプチドは少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは１０以上の非天然アミノ酸を含むことができる。非天然アミノ酸は同一または異なっていることができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のタンパク質の異なる部位であることができる。特定の実施形態において、天然発生型のタンパク質における特定のアミノ酸の少なくとも１つ（ただし、全てではない）が非天然アミノ酸で置換される。
【０１１８】
本明細書で提供および記載された方法および組成物は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを含有している。少なくとも１つの非天然アミノ酸のポリペプチドへの導入により、特異的な化学反応を含む共役化学を適用することができる。ここで、特異的な化学反応としては、例えば、１つ以上の非天然アミノ酸と反応するが、２０の共通アミノ酸とは反応しないという化学反応が挙げられる。一度組み込まれれば、天然にコードされたアミノ酸に存在する特定の官能基または置換基に好適な、当業者に公知の化学的手法を利用することにより、アミノ酸の側鎖を修飾することが可能である。
【０１１９】
本明細書において記載した非天然アミノ酸の方法および組成物により、多種多様な官能基、置換基または部分を有する物質と、以下の分子との接合体が得られる。すなわち、該分子としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋体；細胞毒性化合物；薬剤；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質（ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体；抗体または抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；単糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光プローブ、金属含有部分；放射性部分；新規的な官能基；他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用している基；光ケージド部分；化学線により活性化されやすい部分；光異性体化可能部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチンの類似体；重原子を組み込まれた部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素に結合した糖；酸化還元活性化薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識した部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光法による基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達薬剤；生物学的活性薬剤；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノトランスミッター；および上記の全ての組み合わせが挙げられる。分子（例えば、ビオチン）と非天然アミノ酸ポリペプチドとを接合させることにより、接合体の精製が可能になり得る。
【０１２０】
本明細書において参照のために引用する米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書にさらに記載されている方法、組成物、戦略および技術の別の態様は、全ての前述の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの研究または使用の方法である。本態様の範囲内には、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドまたはタンパク質を含むポリペプチドから利益を得る、例えば、治療上、診断上、分析に基づく、産業上、美容上、植物生物学、環境上、エネルギー生産上、および／または軍事上の使用を含む。
【０１２１】
本発明は上述の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドまたはその断片を検出する方法を提供する。そのような非天然アミノ酸ポリペプチドまたはその断片は、特異的相互作用を可能にするのに好適な条件下において、非天然アミノ酸ポリペプチドまたはその断片と分子ライブラリーとを組み合わせることにより得ることができる。また、本発明は前述の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドまたはその断片を検出するための方法も提供する。該方法では、特異的相互作用を可能にするのに好適な条件下において、非天然アミノ酸ポリペプチドまたはその断片を、タンパク質ライブラリーまたはその一部と組み合わせることにより、非天然アミノ酸ポリペプチドまたはその断片が得られる。そのような相互作用は、例えば、アセチル化、カルボキシル化、アシル化、リン酸化、脱リン酸、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾、ＡＤＰ−リボシル化、生体利用性および半減期を含む。そのようなライブラリーは、例えば、アルファ−１アンチトリプシン、アンギオステイン、抗溶血性因子、抗体、アポリポプロテイン、アポプロテイン、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球遊走因子−１、単球遊走因子−２、単球遊走因子−３、単球炎症性因子−１アルファ、単球炎症性因子−ｉベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣｌ、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体抑制因子、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、角質除去毒素（ｅｘｆｏｌｉａｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ）、血液凝固ＩＸ因子、血液凝固ＶＩＩ因子、血液凝固ＶＩＩＩ因子、血液凝固Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４へリックス束タンパク質（ｆｏｕｒ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｂｕｎｄｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長因子（ｈＧＦ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ランレオタイド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュートリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、上皮小体ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、小生合成タンパク質（ｓｍａｌｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、水溶性補体受容体Ｉ、水溶性Ｉ−ＣＡＭ、水溶性インターロイキン受容体、水溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロフィン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、トキシックショック症候群毒素、サイモシンアルファ１、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ウロテンシン−ＩＩ、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体およびコルチコステロンを含む。
【０１２２】
＜ＩＩＩ．ポリペプチドの非天然アミノ酸の局在＞
本明細書において開示した非天然アミノ酸ポリペプチドまたはそれらの断片は、ポリペプチドに組み込まれた１以上のアミノ酸を含んでいる。１以上の非天然アミノ酸はポリペプチドの活性を乱さずに、特別な位置に組み込まれてもよい。このことは、「保存的な」置換を行うことにより達成できる。この保存的な置換としては、限定されないが、例えば、疎水性のアミノ酸を疎水性のアミノ酸で置換する、大きなアミノ酸を大きなアミノ酸で置換する、親水性のアミノ酸を親水性のアミノ酸で置換する、および／または活性に不必要な部位に非天然アミノ酸を置換するというような置換が挙げられる。
【０１２３】
非天然アミノ酸で置換するためのポリペプチド内における所望の部位を選択するために多様な生化学的および構造的手段を採用することができる。ポリペプチド鎖の任意の部位は非天然アミノ酸を組み込むための選択に好適であり、選択は合理的設計に基づいていてもよいし、あるいは、任意もしくは非特定の所望の目的のための無作為的選択によるものであってもよい。所望の部位の選択は、以下の非天然アミノ酸ポリヌクレオチドを製造するためのものであってもよい：（１）任意の所望の特性または活性を有する非天然アミノ酸ポリペプチド（限定されないが、例えば、作動薬、超作用薬、逆作動薬、拮抗薬、受容体結合モジュレーター、受容体活性化モジュレーター、１つ以上の結合相手に結合するモジュレーター、結合相手活性化モジュレーター、結合相手構造変化モジュレーター、ダイマーまたはマルチマー形成など）、または（２）天然分子と比較して活性や特性が変化していない非天然アミノ酸ポリペプチド。あるいは、所望の部位の選択は、ポリペプチドの任意の物理的または化学的特性（溶解性、凝集性、または安定性など）を操作するためのものであってもよい。例えば、ポリペプチドの生物活性に要求されるポリペプチド内の位置を、技術的に知られたアラニン走査または同族体走査法といった点突然変異分析を用いて同定することができる。Cunningham, B.およびWells, J., Science, 244:1081-1085(1989)およびCunningham, Bら Science 243:1330-1336(1989)に記載のそれらと同様の方法は、生物学活性に決定的な残基を同定するために用いられてよく、および／または抗体および受容体の抗原決定基を同定するために用いてもよい。本明細書において参照のために引用する米国特許第５，５８０，７２３号明細書；米国特許第５，８３４，２５０号明細書；米国特許第６，０１３，４７８号明細書；米国特許第６，４２８，９５４号明細書；米国特許第６，４５１，５６１号明細書には、目的配列を有するポリペプチドの活性に影響する活性ドメインを同定することで、ポリペプチドの構造および機能の系統的に分析するための方法を記載している。アラニン走査または同族体走査法といった突然変異作製により生物学的活性に決定的として同定されたそれら以外の残基は、ポリペプチドに求められた所望の活性に依存して非天然アミノ酸と置換するための適した候補と考えられる。もう１つの方法として、生物活性に決定的に重要であると同定された部位も、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存して、非天然アミノ酸と置換するための適した候補と考えられる。その他の代替的方法は、単純に非天然アミノ酸とポリペプチド鎖上のそれぞれの部位において連続した置換を作成し、ポリペプチドの活性への影響を観察することである。全てのポリペプチドに非天然アミノ酸で置換するための部位を選択する全ての手段、技術または方法は通常の当業者に容易に理解され、本発明の使用に好適である。
【０１２４】
欠失を含むポリペプチドの天然に生じた変異の構造および活性を検査して、非天然アミノ酸による置換に耐性であり得るタンパク質の領域を決定することも可能である。一度、非天然アミノ酸による置換に耐えられそうでない残基が削除されれば、残存する各部位の計画した置換の効果は、該ポリペプチドおよび全ての結合したリガンドまたは結合しているタンパク質の３次元構造から検討できる。多くのポリペプチドのＸ線結晶解析およびＮＭＲ構造は、タンパク質および核酸の大きな分子の３次元立体構造データを含む中央データベースであるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ，ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）が利用可能である。従って、当業者は、非天然アミノ酸と置換可能なアミノ酸部位を容易に同定することが可能である。
【０１２５】
非天然アミノ酸の典型的な組み換え部位は、例えば、潜在的な受容体結合領域を除き、所望の完全な構造の柔軟性または剛性を変えることで、１つ以上の結合相手と結合する領域、完全にまたは部分的に溶媒に暴露されてよく、近くの残基と最小の水素結合相互作用を有するまたは全く近くの残基と水素結合相互作用を有しない、ポリペプチドの１つ以上の暴露面であってよく、３次元構造、ポリペプチドの二次、三次、四次構造、その関連する受容体、リガンドまたは結合しているタンパク質へ結合しているかまたは結合していないかにより柔軟性に富んだ領域または構造的に固い領域と予想されてよく、他のポリペプチドまたは他の生物学的活性分子に結合または結合していなくてもよく、ポリペプチドそれ自身または１つ以上のポリペプチドを含むダイマーもしくはマルチマーの構造を調節してもよい。
【０１２６】
多様な非天然アミノ酸は、ポリペプチドの与えられた部位に置換または組み換えることができる。一般的に、ポリペプチドタンパク質に導入することを所望された特定の非天然アミノ酸は、関連するリガンド、受容体および／または結合タンパク質、二次、三次または四次構造、保守的な置換基の存在（すなわち、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンまたはＯ−プロパジルチロシンのようなアリールに基づく非天然アミノ酸）および特別な共役化学を有するポリペプチドの三次元結晶構造の解析に基づき、組み換えを選択されてよい。
【０１２７】
さらにその方法は、第一反応基を含んでいる非天然アミノ酸をタンパク質へ組み込む工程；および第二反応基含んでいる下記の分子と上記タンパク質を接触させる工程を含んでいる。（ここで、該分子としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋体；細胞毒性化合物；薬剤；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質（ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体；抗体または抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；単糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光プローブ、金属含有部分；放射性部分；新規的な官能基；他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用している基；光ケージド部分；化学線により活性化されやすい部分；光異性体化可能部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチンの類似体；重原子を組み込まれた部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素に結合した糖；酸化還元活性化薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識した部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光法による基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達薬剤；生物学的活性薬剤；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノトランスミッター；および上記の全ての組み合わせが挙げられる）。
【０１２８】
一例では、非天然アミノ酸置換基または組み換えは、他の生物学的特性に影響を与えるポリペプチド内の他の添加物、置換基または欠失と組み合わされる。一例では、他の添加物、置換基または欠失はポリペプチドの安定性（例えば、タンパク質分解への抵抗性）を増加させてもよいし、あるいは、その好適な受容体、リガンドおよび／または結合タンパク質への親和性を増加させてよい。一例では、他の添加物、置換基または欠失がポリペプチドの水溶性（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞に発現された場合）を増加させてよい。一例では、天然にコードされたまたは非天然アミノ酸との置換のために部位が選択されるとともに、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ組み換え宿主細胞での発現後におけるポリペプチドの溶解性の増加を目的として、非天然アミノ酸の組み込みのためのもう1つ別の部位が選択される。一例では、該ポリペプチドは、リガンド、結合タンパク質および／または受容体と結合する親和性を調節する、受容体の二量体化を調節する（例えば、増加または減少）、受容体の二量体を安定化する、半減期の循環を調節する、放出または生物活性を調節する、精製を促進するあるいは特別な投与手段を促進または変更する他の添加物、置換基または欠失を含む。同様にポリペプチドは、検出（限定されないがＧＦＰ）、精製、組織または細胞膜を通した輸送、薬剤前駆体の放出または活性化、大きさの減少またはポリペプチドの他の特性を促進する化学的または酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリヒスチジン）または他の親和性に基づく配列（ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、ＧＳＴなど）または結合分子（限定されないがビオチン）を含んでいてもよい。
【０１２９】
＜ＩＶ．例としての成長ホルモンスーパーファミリー＞
本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術は、ポリペプチドまたはタンパク質の特定の種類、分類またはファミリーに限定されない。ほんの一例として、当該ポリペプチドは、以下の物質から成る群から選択された治療的なタンパク質に相同であり得る：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮性好中球活性ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４回螺旋状維管束タンパク質（four-helical bundle protein）、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン（neurturin）、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン（paracitonin）、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン（pleiotropin）、プロテインＡ（タンパク質Ａ）、プロテインＧ（タンパク質Ｇ）、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ��、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、サイモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロン。
【０１３０】
本明細書における抗体断片は、全長の抗体内に存在するより小さい構成要素である抗体、および操作された抗体を含む。抗体断片としては、例えば、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、２重特異性抗体、３重特異性抗体、４重特異性抗体、２官能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、各ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、および可変領域などが挙げられる。（「Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402」）。他の機能的な基礎構造は、ペプチドリンカーによって共有結合的に接続された免疫グロブリン重鎖、および免疫グロブリン軽鎖の可変領域から構成される、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である（「S-z Huら, 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061」）。これらの小さい（分子量２５，０００）タンパク質は、一般的に、１つのポリペプチドにおいて抗原に対する親和性と特異性とが保たれており、より大きい抗原特異的分子を構成する有用な基礎的要素となり得る。また、ポリペプチドは、他の抗原結合性のポリペプチドもしくは断片だけでなく、抗体の重鎖、軽鎖、可変領域、選択的な足場となる非抗体分子、および二重特異性抗体、ならびに他の抗原結合ポリペプチドまたはその断片を含む。
【０１３１】
従って、成長ホルモンスーパーファミリーについての以下の記述は、説明する目的のため、およびほんの一例として提供され、かつ本明細書に記載した方法、組成物、戦略および技術の範囲を制限するようなものではない。さらに、本出願におけるＧＨポリペプチドへの言及は、ＧＨスーパーファミリーにおけるあらゆる構成要素の例としての総称を使うことを意味する。従って、ＧＨポリペプチドまたはタンパク質に関する、本明細書に記載の修飾および化学反応が、本明細書に明確に記載された、または参照によって組み込まれるそれらを含む、ＧＨスーパーファミリーにおけるあらゆる構成要素に同等にされ得ることは、理解される。
【０１３２】
以下のタンパク質：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチン  Ｍ、繊毛状の神経栄養因子、白血病抑制因子、アルファ  インターフェロン、ベータ  インターフェロン、ガンマ  インターフェロン、オメガ  インターフェロン、タウ  インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、およびカージオトロフィン−１（cardiotrophin-1）（ＣＴ−１）（「前記ＧＨスーパーファミリー」）は、成長ホルモン（ＧＨ）スーパーファミリーの遺伝子によってコードされるタンパク質を含む（「Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan, J. F. Science 257: 410-413 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)」）。今後、遺伝子のクローニングおよび配列決定を経て、当該遺伝子ファミリーの更なる構成要素が同定されるであろうということが、予想される。ＧＨスーパーファミリーの各構成要素は、それらのアミノ酸またはＤＮＡ配列の同一性が通常、限られているにもかかわらず、類似した二次および三次構造を有する。共通の構造的特徴により、遺伝子ファミリーの新しい構成要素を、迅速に同定することができる。また、本明細書に記載されていたり、参照により組み込まれていたりする非天然アミノ酸に関する方法、および組成物に、同様の方法で、上記構成要素を適用することができる。
【０１３３】
Ｇ−ＣＳＦ（「Zinkら, FEBS Lett.314:435 (1992); Zinkら, Biochemistry 33:8453 (1994); Hillら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993)」）、ＧＭ−ＣＳＦ（「Diederichs, K.,ら Science 154: 1779-1782 (1991); Walterら, J. MoI. Biol. 224:1075-1085 (1992)」）、ＩＬ−２（「Bazan, J. F. and McKay, D. B. Science 257: 410-413 (1992)」）、ＩＬ−４（「Redfieldら, Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powersら, Science 256:1673-1677 (1992)」）、およびＩＬ−５（「Milburnら, Nature 363: 172-176 (1993)」）を含む多くのサイトカインの構造は、Ｘ線回折およびＮＭＲ調査によって決定されている。これによれば、上記サイトカインとＧＨとは、一次配列の相同性が著しく欠如しているにもかかわらず、サイトカインの構造は、ＧＨの構造を顕著に保存していることが示された。インターフェロンは、モデリングおよび他の研究（「Leeら, J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995); Murgoloら, Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnanら, Structure 4:1453 (1996); Klavsら, J. MoI. Biol. 274:661 (1997)」）に基づいて、当該ファミリーの構成要素であると考えられる。エリスロポエチンは、モデリングおよび突然変異生成の研究（「Boisselら, J. Biol. Chem. 268: 15983-15993 (1993); Wenら, J. Biol. Chem. 269: 22839-22846 (1994)」）に基づいて、当該ファミリーの構成要素であると考えられる。インターフェロン（ＩＮＦ）の例えばアルファ、ベータ、オメガ、タウ、イプシロン、およびガンマ  インターフェロンだけでなく、繊毛状の神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、オンコスタチン  Ｍ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含む、多数の更なるサイトカインおよび成長因子は、当該ファミリーに属する（「Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen and Ihle (1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS」において概説された）。現在、上記のサイトカインおよび成長因子のすべては、一つの大きい遺伝子ファミリーを構成すると考えられている。
【０１３４】
共有する類似した二次および三次構造に加えて、当該ファミリーの各構成要素は、細胞内シグナル伝達経路を活性化するために、細胞表面受容体をオリゴマー形成する必要があるという性質を共有する。ＧＨおよびＥＰＯなどが含まれるいくつかのＧＨファミリーの構成要素は、一種類の受容体に結合し、かつそれのホモ二量体を形成させる。ＩＬ−２、ＩＬ４、およびＩＬ−６などが含まれる他のファミリーの構成要素は、２種類以上の受容体に結合し、かつその受容体のヘテロダイマーまたはそれよりも高次の集合体を形成させる（「Davisら, (1993) Science 260: 1805-1808; Paonessaら, (1995) EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」）。突然変異生成の研究は、ＧＨのように、これらの他のサイトカインおよび成長因子が、複数、通常は２つの受容体結合部位を含み、かつそれらの同種の受容体に連続的に結合することを示している（「Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthewsら, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476」）。ＧＨのように、これらの他のファミリー構成要素にとっての主要な受容体結合部位は、主として４つのアルファヘリックスおよびＡ−Ｂ  ループに存在する。受容体結合に関与する螺旋状の束における特定のアミノ酸は、当該ファミリーの各構成要素の間で異なる。ＧＨスーパーファミリーの各構成要素と相互作用する細胞表面受容体のほとんどは、構造的に関連し、第二の大きな複数の遺伝子のファミリーを構成する。例えば、参照によって組み込まれる米国特許出願第６，６０８，１８３号明細書を参照のこと。
【０１３５】
ＧＨスーパーファミリーの多様な各構成要素の変異に関する研究から、通常、アルファヘリックスに結合したループが、受容体結合に関与していない傾向があるということであるという一般的な結論が得られた。特に、短いＢ−Ｃループは、全部ではないが多くのファミリーの各構成要素における受容体結合に関して不可欠ではないように見える。従って、ＧＨスーパーファミリーの各構成要素において、該Ｂ−Ｃループは、本明細書に記載の非天然アミノ酸で置換してもよい。また、Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ、（およびＧＨスーパーファミリーのインターフェロン／ＩＬ−１０のような構成要素のＤ−Ｅループ）は、非天然アミノ酸で置換してもよい。また、ヘリックスＡに近接した、および最後のヘリックスに遠位のアミノ酸は、受容体結合に関与していない傾向があるので、非天然アミノ酸を導入するための部位としてもよい。いくつかの実施形態において、ループ構造の中のあらゆる場所（例えば、上記Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸）で、非天然アミノ酸は置換される。いくつかの実施形態において、上記Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸において、非天然アミノ酸は置換される。
【０１３６】
ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびベータ  インターフェロンなどを含むＧＨファミリーの特定の構成要素は、Ｎ−結合および／またはＯ−結合の糖を含む。上記タンパク質における糖鎖形成部位は、ほぼ例外なくループ領域に生じ、かつアルファヘリックスの束には生じない。ループ部位は通常受容体結合に関与せず、かつ該部位は糖基による共有結合性の結合のための部位であるので、該部位は、非天然アミノ酸の置換を上記タンパク質に導入するための有用な部位となり得る。タンパク質においてＮ−およびＯ−結合の糖修飾部位を備えたアミノ酸は、これらのアミノ酸が表面に露出しているので、非天然アミノ酸置換のための部位となり得る。従って、天然のタンパク質は、これらの部位において該タンパク質に付着する嵩高い糖基を許容でき、かつ糖鎖形成部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向がある。
【０１３７】
今後、ＧＨ遺伝子ファミリーの更なる構成要素が、おそらく発見されるであろう。ＧＨスーパーファミリーの新しい構成要素は、予想されるタンパク質配列の、コンピューターを使った二次および三次構造解析を経て同定され得る。ＧＨスーパーファミリーの各構成要素は、通常非螺旋形のアミノ酸（ループ部位）によって結合される、４つか５つの両親媒性のヘリックスを持つ。該タンパク質は、細胞からの分泌を促進するために、該タンパク質のＮ末端に疎水性のシグナル配列を含んでいる。また上記のような後日発見されたＧＨスーパーファミリーの構成要素は、本明細書に記載の方法および組成物の中に含まれる。完全に参照によって組み込まれる「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際特許出願（国際公開第０５／０７４６５０号パンフレット、２００５年８月１８日）は、部位の選択およびポリペプチドの中への非天然アミノ酸の組み込みのための方法を提供する。
【０１３８】
＜Ｖ．非天然アミノ酸＞
非常に広範囲の非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸が以下の４つの性質のうち少なくとも１つを有する限りは、本明細書に記載の方法および組成物における使用に適しているといえる：
（１）（ａ）遺伝的にコードされる２０の共通アミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）の化学反応性に対して直交な、（ｉ）特徴、および／または（ｉｉ）活性、および／または（ｉｉｉ）反応性のうち少なくとも１つを有する、非天然アミノ酸の側鎖上の少なくとも１つの官能基、あるいは、（ｂ）非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドに存在する天然に生じるアミノ酸の化学反応性に対して少なくとも直交である、非天然アミノ酸の側鎖上の少なくとも１つの官能基；
（２）導入された非天然アミノ酸は、遺伝的にコードされた２０の共通アミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である；
（３）上記非天然アミノ酸が、ポリペプチドに安定に組み込まれ得る；上記の安定性は、天然に生じるアミノ酸と、または典型的な生理的条件下において相応であってもよく、かつ上記のような組み込みは、インビボの系によって生じてもよい；および、
（４）上記非天然アミノ酸は、オキシム官能基を含んでいる。あるいは、この非天然アミノ酸は、試薬と反応することによってオキシム基に変換されることができ、該非天然アミノ酸を含むポリペプチドの生物学的性質を破壊しない条件下（ただしもちろん、上記のような生物学的性質の破壊が修飾／変換の目的である場合を除く）において反応される官能基を含んでいる。ここで、上記変換はｐＨが約２と約１０との間、もしくはｐＨが約４と約８との間における水溶性条件下において起こり得、非天然アミノ酸における反応部位が、求電子性の部位であり得ることが好ましい。実例となる、組成物および方法と一緒に使われ得る非天然アミノ酸に関しての、これら４つの性質を満たすアミノ酸の限定されない例が、完全に参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書にさらに記載される。非天然アミノ酸は、いくつでもポリペプチドの中に取り込まれ得る。また非天然アミノ酸は、（ａ）保護されているかもしくは覆われたオキシム、あるいは、（ｂ）脱保護または脱マスキングの後で、オキシム基に変えられ得る、保護されているかもしくは覆われた基を、含んでいてもよい。
【０１３９】
本明細書に記載の方法および組成物における使用に適してよい非天然アミノ酸は、例えば光活性化可能な架橋剤、スピン標識されたアミノ酸、蛍光性のアミノ酸、金属結合したアミノ酸、金属を含むアミノ酸、放射性のアミノ酸、新規の官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸、光を閉じ込める（photocaged）および／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似物を含むアミノ酸、糖置換されたセリンなどの糖修飾されたアミノ酸、他の炭水化物に修飾されたアミノ酸、ケトを含むアミノ酸、ポリエチレン  グリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重元素に置換されたアミノ酸、化学的に切断できる、および／または光開裂できる（photocleavable）アミノ酸、例えばポリエーテル（polyethers）または長鎖炭化水素（例えば、約５個以上もしくは約１０個以上の炭素）などを含む、天然のアミノ酸と比べて細長い側鎖を有するアミノ酸、炭素が連結された糖を含むアミノ酸、酸化還元反応が活発なアミノ酸、アミノ  チオ酸（amino thioacid）を含むアミノ酸、および１つ以上の毒性を有する部分を含むアミノ酸などを含むアミノ酸を、包含する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、炭水化物の部分を備える。該アミノ酸の例は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンを含む。また、該アミノ酸の例は、上記アミノ酸と上記炭水化物との間の天然に生じるＮ−あるいはＯ−結合が、自然状態では通常見つからない共有結合によって置換されるところの例を含む―例えば、アルケン、オキシム、チオエーテル、およびアミドなど。また、該アミノ酸の例は、天然に生じるタンパク質においては通常見つからない、２−デオキシ−グルコースや２−デオキシガラクトースなどといった炭水化物を含む。
【０１４１】
タンパク質に組み込まれ得る非天然アミノ酸による化学的な部分は、上記タンパク質の種々の有利性および操作性を提供する。例えば、カルボニル基（ケト基を含む）の独特の反応性は、あらゆるヒドラジン−またはヒドロキシルアミン−を含む多くの試薬によって、インビトロおよびインビボにおいてタンパク質の選択的な修飾を可能にする。例えば、重元素を有する非天然アミノ酸は、位相調整の（phasing）Ｘ線構造データのために利用できる。また非天然アミノ酸を利用した重元素の部位特異的な導入は、重元素に対する場所の選択において選択性および柔軟性を提供する。例えば、光反応性の（photoreactive）非天然アミノ酸（例えば、ベンゾフェノンおよびアリールアジド（arylazides）（フェニルアジドなど）などの側鎖を含む）は、タンパク質の効率的なインビボおよびインビトロにおける光架橋（photocrosslinking）を可能にさせる。光反応性の非天然アミノ酸の例としては、ｐ−アジド−フェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンなどが挙げられる。その結果、光反応性の非天然アミノ酸を有するタンパク質は、光反応性の基が提供する時間的な制御における励起によって任意に架橋され得る。１例を挙げると、非天然アミノのメチル基は、例えば核磁気共鳴および振動分光法における利用などにおいて、局部の構造および動態の探り針として、同位体的に標識されたメチル基などと置き換えられ得る。
【０１４２】
多くの非天然にコードされたアミノ酸は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙの事業部）、またはＰｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。市販でないアミノ酸は、任意に合成される。有機合成技術に関して、例えば「Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon（1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.）」；「Advanced Organic Chemistry by March（Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York）」；および「Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg（Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York）」を参照のこと。多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、およびフェニルアラニンなどといった天然アミノ酸に基づいている。
【０１４３】
Ａ．非天然アミノ酸の細胞の取込
真核細胞による非天然アミノ酸の取込は、タンパク質に組み込むためなど、非天然アミノ酸を設計および選択するときに、通常に考慮される１つの問題である。例えば、αアミノ酸の高い荷電密度は、これらの化合物が細胞透過性に見込みがないことを示唆している。天然アミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の選択を介して真核細胞の中に取り込まれる。非天然アミノ酸が少しでも細胞によって取込まれることを評価することは、急速なふるいによってなされてもよい。例えば、参照によって組み込まれる「Protein Arrays」と題された米国特許出願公開第２００４／０１９８６３７号明細書；、および「Liu, D.R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785」における毒性の検定法を参照のこと。取込は種々の方法を用いて容易に分析されるので、細胞性の取込経路に影響され易い非天然アミノ酸を設計する代替案は、インビボにおいてアミノ酸を作り出す生合成経路を提供することである。
【０１４４】
Ｂ．非天然アミノ酸の生合成
多くの生合成経路が、アミノ酸および他の化合物を産生するために細胞にすでに存在している。特定の非天然アミノ酸に関する生合成方法は、真核細胞などの天然には存在していないが、本明細書に記載の方法および組成物は、そのような生合成方法を含んでいる。例えば、非天然アミノ酸に関する生合成経路は、新しい酵素を添加するか、または存在する宿主細胞経路を修飾することによって宿主細胞において任意に作製される。添加される新しい酵素は、任意に天然に生じる酵素または人工的に進化された酵素である。例えば、ｐ‐アミノフェニルアラニンの生合成（「Invivo incorporation of unnatural amino acids」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットに１例が示されているようなもの）は、他の生物に由来する公知の酵素を組み合わせたものの添加に頼っている。これらの酵素に関する遺伝子は、該遺伝子を備えるプラスミドを用いた細胞の形質転換によって真核細胞に導入され得る。該細胞において発現される該遺伝子は、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。任意に添加されるこの種の酵素の例は、以下の例に示される。添加される酵素の配列は、例えば、ジーンバンクに見られる。また、人工的に進化された酵素は、同様の方法において細胞に対して任意に添加される。この方法において、細胞の機序、および細胞の資源は、非天然アミノ酸を産生するために操作される。
【０１４５】
種々の方法が、生合成経路に使用する、または存在する経路を発展させるための新規な酵素の生成に利用可能である。例えば、反復的な組み換え（例えばMaxygen, Inc.（www.maxigen.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能な）によって開発されたような）は、新規の酵素および経路の開発に、必要に応じて使用される。例えば、「Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389- 391」；および、「Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751」を参照のこと。同様に、Genencor（genencor.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能な）によって開発されたDesignPath（登録商標）は、代謝経路設計（例えば細胞においてＯ‐メチル‐Ｌ‐チロシンを作り出す経路の設計など）に任意に使用される。この技術は、新しい遺伝子の組み合わせ（機能的なゲノミクスを介して同定された遺伝子などを含む）、ならびに分子進化および設計を用いて宿主生物に存在する経路を再構築する。また、Diversa Corporation（diversa.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能な）は、新しい経路を作り出すことなどを含む、遺伝子および遺伝子経路のライブラリーを急速にスクリーニングする技術を提供する。
【０１４６】
通常、設計された生合成経路を用いて生成された非天然アミノ酸は、タンパク質の効率のよい生合成に十分な濃度（例えば天然の細胞における量などであり、他のアミノ酸の濃度に影響するまたは細胞資源を使い果たすような程度ではない）に産生される。この方法においてインビボにおいて生成される通常の濃度は、約１０ｍＭから０．０５ｍＭである。細胞が、特定の経路に関して所望される酵素の生成に使用される遺伝子を備えるプラスミドを用いて形質転換され、かつ非天然アミノ酸が生成されると、インビボにおける選択は、リボソームのタンパク質合成および細胞増殖の両方に関して、非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために任意に使用される。
【０１４７】
＜ＶＩ．非天然アミノ酸を有するポリペプチド＞
完全に参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号、第６０／６３８，５２７号、第６０／６３９，１９５号、第６０／６９６，２１０号、第６０／６９６，３０２号、および第６０／６９６，０６８号明細書；米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（シリアル番号１０／１２６，９２７）号明細書および第２００３／０１０８８８５号（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書；「Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins」と題された国際公開第０４／０３５７４３号パンフレット、ならびに「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題されたＰＣＴ公開番号ＷＯ０４／０９４５９３において、さらに記載される組成物および方法は、ポリペプチドへの少なくとも１つの非天然アミノ酸の組み込みを提供する。非天然アミノ酸は、ポリペプチドのあらゆる末端位置またはあらゆる内部の位置を含む、ポリペプチドのあらゆる位置において存在し得る。当明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、生合成的にまたは非生合成的に生成され得る。生合成的にというのは、つまり、以下の構成要素：ポリヌクレオチド、コドン、ｔＲＮＡ、およびリボソームの少なくとも１つを使うことを含む、翻訳系（細胞性または非細胞性の）を利用したあらゆる方法を意味する。非生合成的にというのは、つまり、翻訳系を利用しないあらゆる方法を意味する：上記のやり方は、固体のペプチド合成法、固相のペプチド合成法、少なくとも１つの酵素を利用する方法、および少なくとも１つの酵素を利用しない方法を利用する方法に分けられる；もちろん、上記の細分化された方法は、重複してもよく、かつ多くの方法は、上記の細分化された方法の組み合わせを利用し得る。
【０１４８】
本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術は、ポリペプチドまたはタンパク質の特定の種類、分類またはファミリーに限定されない。実際、実質的にはあらゆるポリペプチドは、参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書、「Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins」と題された国際公開第０４／０３５７４３号パンフレット、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された国際公開第０４／０９４５９３号パンフレットならびに「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットにさらに記載された、少なくとも１つの非天然アミノ酸などを含んでよい。非天然アミノ酸ポリペプチドは、参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書、「Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins」と題された国際公開第０４／０３５７４３号パンフレット、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された国際公開第０４／０９４５９３号パンフレット、ならびに「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際公開第０５／０７４６５０パンフレットに記載されるように、さらに修飾してよく、かつ非天然アミノ酸ポリペプチドは、さらなる修飾をせずに使用してもよい。一形態において、組成物は、少なくとも１個（例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個あるいはそれ以上など）の非天然アミノ酸を有する、少なくとも１つのタンパク質を含んでいる。該ポリペプチドは、１以上の天然アミノ酸の置換を含んでいてもよい。
【０１４９】
参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書にさらに記載された非天然アミノ酸ポリペプチドの実施形態が、固相のペプチド合成法（たとえば、固体の樹脂）によるか、液相のペプチド合成法によるか、および／または酵素による補助なしかによって、化学的に合成され得るにもかかわらず、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドに関する他の実施形態は、細胞膜、細胞抽出物もしくは溶解物系によって、またはインビボの系、すなわち原核生物もしくは真核生物の細胞機構の使用によって、合成を可能にする。
【０１５０】
＜ＶＩＩ．核酸およびオリゴヌクレオチドを備える、組成物および方法＞
Ａ．使用のための一般的な組み換え核酸方法
参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；ならびに「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットは、当該ポリペプチド（一例としてＧＨポリペプチドを含む）をコードする核酸、ならびにそれがどうやって同定され、複製され、および多くの場合組み換え法を用いて改造され得るかを明確にする。上記実施形態は、例えばタンパク質の発現のために、または変異体、誘導体、発現カセット、もしくはポリペプチドに由来する他の配列の生成中などに使用される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする配列は、使用可能に異種プロモーターと接続される。
【０１５１】
非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドをコードする核酸配列は、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成され、次いで上記核酸配列が、当該アミノ酸残基の導入（すなわち組み込みもしくは置換）または除去（すなわち欠失もしくは置換）をもたらすために変化される。上記核酸配列は、従来の方法に従って部位特異的な突然変異生成によって都合良く修飾され得る。あるいは上記核酸配列は、オリゴヌクレオチドは所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成によって、作製され得る。また、この化学合成においては、組み換えポリペプチドが生成される宿主細胞において好まれるオリゴヌクレオチドのコドンが選択されることが好ましい。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ、連結反応または連結連鎖反応によって合成され、かつ集合され得る。例えば、参照によって組み込まれる、「Baranyら, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); U.S. 6,521,427」を参照のこと。
【０１５２】
Ｂ．セレクターコドン
米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；ならびに「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際公開０５／０７４６５０号明細書にさらに記載された方法および組成物の中に含まれるセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンの枠組みを拡張する。例えばセレクターコドンは、特異な３塩基コドン、終止コドン（アンバーコドン（ＵＡＧ）もしくはオパールコドン（ＵＧＡ）などを含む）などのナンセンスコドン、非天然コドン、４塩基以上のコドン、またはレアコドンなどを含む。所望の遺伝子に対して導入され得るセレクターコドンの数は、広範囲（当該のポリペプチドの少なくとも一部をコードする単一のポリヌクレオチドにおいて１つ以上、２つ以上、３つ以上、４、５、６、７、８、９、１０個以上などを含む）である。
【０１５３】
場合によっては、インビボにおける１つ以上の非天然アミノ酸の組み込みのために、ストップコドンであるセレクターコドンの使用を必要とする。インビボにおける非天然アミノ酸の組み込みは、真核の宿主細胞において著しい混乱なしにされ得る。またセレクターコドンは、４塩基以上のコドン（例えば４、５、または６塩基以上のコドンなど）を含む、幅のあるコドンを備える。また既知の系に関してセレクターコドンは、内在性の系が使用しない（またはほとんど使用しない）天然の塩基コドンであるところの、天然の３塩基コドンの１つを含み得る。セレクターコドンは、任意に非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は、既存の遺伝的なアルファベットをさらに拡張する。インビボにおける使用に関して、非天然ヌクレオシドは、膜透過可能でありかつ対応する三リン酸塩を形成するためにリン酸化される。さらに、増大した遺伝情報は、安定でありかつ細胞の酵素によって破壊されない。また翻訳上の迂回した系は、所望のポリペプチドにおいて非天然アミノ酸を組み込むために使用され得る。ある実施形態において、当該タンパク質またはポリペプチド（またはその一部分）は、核酸によってコードされる。通常、上記核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくとも２つのセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、または１０個以上のセレクターコドンを備える。
【０１５４】
＜ＶＩＩＩ．非天然アミノ酸を備えるポリペプチドのインビボにおける生成＞
ポリペプチドは、天然に生じる系においてコードされないアミノ酸を追加または置換するために修飾されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを使って、インビボにおいて生成され得る。非天然アミノ酸を備えるポリペプチドのインビボにおける生成に関して使用される、生成するためのすべての方法、スクリーニング方法および生物は、完全に参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された国際公開第０４／０９４５９３号パンフレット、ならびに「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットにおいてさらに記載される。
【０１５５】
天然に生じる系においてコードされないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを生成するための方法は、例えば参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（シリアル番号１０／１２６，９２７）明細書および第２００３／０１０８８８５号（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書において記載される。上記の方法は、翻訳の系に対して内在性の合成酵素とｔＲＮＡとに関係なく機能する翻訳の機構を生み出すことを含む（および従って時々「直交性」として言及される）。さらなる、または付加的な実施形態において、上記翻訳の系は、直交性のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を備える。広範囲の直交性ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、特定の人工のアミノ酸をポリペプチドの中に挿入するために技術的に記述されており、かつ通常、非天然アミノ酸ポリペプチドを産生する方法に適している。
【０１５６】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの使用は、非天然アミノ酸をコードする特異的なコドンの選択を含む。あらゆるコドンが使用され得るならば、上記Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが発現される細胞において、ほとんどまたは全く使用されないコドンを選択することは、通常好ましい。特異的なセレクターコドンは、ポリペプチドをコードする配列の適切な場所の中に、技術的に知られた突然変異誘発法（例えば部位特異的変異誘発、カセット式変異誘発、制限選択変異誘発など）を使って導入され得る。
【０１５７】
（Ａ．非真核生物および真核生物における発現）
クローン化されたポリヌクレオチドの高水準の発現を得るためには、一般的に所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を導く強いプロモーター、転写／翻訳のターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸の場合は翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターの中にサブクローニングする。適切な細菌性のプロモーターは、技術的によく知られており、かつ例えば「Sambrookら and Ausubelら」において記載される。完全に参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（シリアル番号１０／１２６，９２７）明細書および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された国際公開第０４／０９４５９３号パンフレット、ならびに「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットにおいてさらに記載される、細菌性の発現系および真核生物の宿主細胞もしくは非真核細胞の宿主細胞系は、非天然アミノ酸を備えるタンパク質を有用に大量に生合成するために使用され得る。
【０１５８】
（１．発現系、培地および分離）
所望のポリペプチドは、あらゆる適切な発現系（例えば酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、シュードモナス属細胞、および細菌を含む）において発現され得る。見本となる発現系の詳細は、完全に参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（シリアル番号１０／１２６，９２７）明細書および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された国際公開第０４／０９４５９３号明細書ならびに「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際公開第０５／０７４６５０号明細書にさらに記載される。
【０１５９】
（２．非天然アミノ酸ポリペプチドの精製）
（一般的な精製方法）種々の分離段階のうちいずれか１つは、細胞可溶化物、抽出物、培養液、封入体、宿主細胞の細胞膜周辺腔、宿主細胞の細胞質、または所望のポリペプチド、もしくはあらゆる分離段階（例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相−ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、展開基盤吸着、またはあらゆる組み合わせおよび／もしくはその繰り返しなどを含む）から生じる混合物を備える他の物質において、かつ任意の適切な順序で行われ得る。一般的な精製方法、装置、好ましい実施形態および他の精製技術は、完全に参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；ならびに「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットにおいてさらに記載される。
【０１６０】
Ｂ．インビボにおける翻訳後修飾
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するタンパク質またはポリペプチドを真核細胞において産生することにより、タンパク質またはポリペプチドは、真核生物の翻訳後修飾を含んでいる。ある実施形態においてタンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸、および真核細胞によってインビボにおいて作られた、少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでいる。ここで、この実施形態における翻訳後修飾は、原核細胞によっては作られないものである。例えば上記翻訳後修飾は、完全に参照によって組み込まれる米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；ならびに「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットにおいてさらに記載される。
【０１６１】
非天然アミノ酸の１つの利点は、上記アミノ酸が、さらなる分子を追加するために使われ得る付加的で化学的な部分を与えることである。上記の修飾は、真核もしくは非真核細胞においてインビボで、またはインビトロで作られ得る。従ってある実施形態において上記翻訳後修飾は、非天然アミノ酸を介したものである。
【０１６２】
＜ＩＸ．別の系における発現＞
非組み換え宿主細胞、突然変異誘発された宿主細胞または無細胞系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、種々の戦略が採用される。これらの系は、また、非天然アミノ酸ポリペプチドの作製に使用されることに適している。Ｌｙｓ、ＣｙｓおよびＴｙｒのような反応性の側鎖を有するアミノ酸の誘導体化により、リジンがＮ２‐アセチル‐リジンへ転換された。また、化学合成は、非天然アミノ酸を組み込むために複雑ではない方法を提供する。ペプチド断片の酵素的な連鎖結合、および本来の化学的な連鎖結合における近年の発展によって、より長いタンパク質を作製することが可能である。例えば、「P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000) 」を参照のこと。化学的なペプチド合成および本来の化学的な連鎖結合は、米国特許第６，１８４，３４４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３８４１２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２０８０４６号明細書、国際公開第０２／０９８９０２号パンフレットおよび国際公開第０３／０４２２３５号パンフレットに記載されている（なお、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。一般的な、インビトロの生合成方法では、所望の非天然アミノ酸により化学的にアシル化されるサプレッサーｔＲＮＡが、タンパク質の生合成を援助することができる抽出物に添加される。この方法を用いて、１００を越える非天然アミノ酸を、事実上任意の大きさの様々なタンパク質に組み込まれた。例えば、「V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995)」、「C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site- specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989)」、および「J. .D. Bain, C. G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013- 8014 (1989)」を参照のこと。広い範囲の官能基が、タンパク質の安定性、タンパク質の折りたたみ、酵素機序、およびシグナル伝達の研究用のタンパク質に導入される。
【０１６３】
選択圧力組み込み（selective pressure incorporation）と呼ばれるインビボにおける方法は、野生型シンテターゼの乱雑さを利用するために開発された。例えば、「N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J.. 13:41 (1999)」を参照のこと。細胞に特定の天然アミノ酸を供給する適切な代謝経路が断たれている栄養要求性株は、制限された濃度の天然アミノ酸を含む最少培地において培養されると同時に標的遺伝子の発現が抑制されている。安定した増殖期において、天然アミノ酸が使い果たされて、非天然アミノ酸類似体と置き換えられる。組み換えタンパク質の発現を誘導すると、非天然類似体を含むタンパク質が蓄積される。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍおよびｐ−フルオロフェニルアラニンが、タンパク質に組み込まれ、容易に同定され得るＵＶスペクトルにおける２つの特徴的な肩を示し（例えば、「C. Minks,R . Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000)」を参照のこと）、トリフルオロメチオニンが、１９Ｆ  ＮＭＲによってチトオリゴサッカライドリガンドとの相互作用を研究するためのバクテリオファージ  Ｔ４  リゾチームにおいて、メチオニン置換に使用され（例えば、「H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997)」を参照のこと）、トリフルオロロイシンがロイシンの代わりに組み込まれ、その結果として、ロイシンジッパータンパク質の熱安定性および化学安定性が向上する（例えば、「Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 40:1494 (2001)」を参照のこと）。さらに、セレノメチオニンおよびテルロメチオニンは、種々の組み換えタンパク質に組み込まれて、Ｘ線結晶学における相の溶解を容易にする。例えば、「W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990)、「J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol, 1:283 (1994)」、「N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995)」、および「N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol Biol, 270:616 (1997)」を参照のこと。また、アルケンまたはアルキン作用性を有するメチオニン類似体は、効率的に組み込まれて、化学的方法によるタンパク質の付加的な修飾を可能にする。例えば、「J. C. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998)」、「J. C.. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc, 122:1282 (2000)」、および、「K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000) 」、米国特許第６，５８６，２０７号明細書および米国特許出願公開第２００２／００４２０９７号明細書を参照のこと（なお、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６４】
この方法の成功は、通常、タンパク質翻訳の忠実度を保障するために高い感度を要求するアミノアシル‐ｔＲＮＡによる、非天然アミノ酸類似体の認識に依存している。この方法の範囲を拡張する１つの方法としては、アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を、緩和することであり、それは限られた数の場合において実現される。例えば、Escherichia coliのフェニルアラニル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）におけるＧｌｙによるＡｌａ２９４の置き換えは、基質結合ポケットの大きさを大きくし、かつｐ‐Ｃｌ‐フェニルアラニン（ｐ‐Ｃｌ‐Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡのアシル化を生じる。「M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994) 」を参照のこと。この突然変異体ＰｈｅＲＳを含んでいるEscherichia coli株では、フェニルアラニンの代わりにｐ‐Ｃｌ‐フェニルアラニンまたはｐ‐Ｂｒ‐フェニルアラニンが取り込まれることができる。例えば、「M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995)」、および「N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000)」を参照のこと。同様に、Escherichia coliチロシル‐ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位の近くにあるＰｈｅ１３０Ｓｅｒの点変異体により、アザチロシンがチロシンよりも高効率に組み込まれることを可能にすることが知られている。例えば、「F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000)」を参照のこと。
【０１６５】
インビボにおいてタンパク質に非天然アミノ酸を組み込むための他の戦略は、校正機構を有するシンテターゼを修飾することである。これらのシンテターゼは識別機能を有しないため、同種の天然アミノ酸と構造的に類似しているアミノ酸を活性化する。この誤りは、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡからミス導入されたアミノ酸を脱アシル化する別の部位において補正される。もしシンテターゼの校正活性が無効にされれば、ミス活性化される（misactivated）構造類似体は、校正機能を逃れて組み込まれるだろう。この提案は、バリル‐ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）を用いて最近、証明されている。例えば、「V. Doling, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001) 」を参照のこと。ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓ、Ｔｈｒまたはアミノブチレート（Ａｂｕ）を用いてｔＲＮＡＶａｌをミスアミノアシル化し得る；次いで、これらの非同種アミノ酸は、校正領域によって加水分解される。Escherichia coli染色体のランダム変異誘発の後に、ＶａｌＲＳの校正部位に突然変異を有するEscherichia coli突然変異株が選択される。この校正に欠損のあるＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡにＣｙｓを間違って入れる。Ａｂｕが構造的にＣｙｓ（Ｃｙｓの‐ＳＨ基は、Ａｂｕにおける‐ＣＨ３と置換される）と似ているので、ＶａｌＲＳ突然変異体はまた、このEscherichia coli突然変異株がＡｂｕ存在下において成長されるとき、タンパク質にＡｂｕを組み込む。質量分析解析は、天然タンパク質における各バリンの位置おいて、約２４％のバリンがＡｂｕによって置換されることを示す。
【０１６６】
また、固相合成法および固相半合成法は、新規アミノ酸を含む多くのタンパク質の合成を可能にしてきた。例えば、以下の公開文献および該刊行物において引用されている参考文献：「Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961)」、「Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem, 88(24): 5914-5919 (1966)」、「Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989)」、「Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987)」、「Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone- engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992)、「Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981)、「Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987)」、および「Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994)」を参照のこと。
【０１６７】
化学修飾は、補足因子、スピン標識、およびオリゴヌクレオチドを含む種々の非天然側鎖を、インビトロにおいてタンパク質に導入するために使用されてきた。例えば、「Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832): 1401-1403 (1987)」、「Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565- 595 (1985)」、「Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984)」、「Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol- subtilisin, J Biol. Chem, 243 (24): 6392-6401 (1968)」、「Polgar, L. et M. L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966)」、および「Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988)」を参照のこと。
【０１６８】
また、化学修飾されたアミノアシル‐ｔＲＮＡを用いる生物合成方法は、インビトロで合成されたタンパク質に、いくつかの生物物理的プローブを組み込むことに使用されてきた。以下の刊行物、および該刊行物において引用されている参考文献：「Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993)」、および「Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83(22):8604- 8608 (1986)」を参照のこと。
【０１６９】
以前から、非天然アミノ酸は、インビトロにおいてタンパク質に、部位特異的に組み込まれ得ることが示されている。これは、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、所望のアンバーナンセンス突然変異を含んでいる遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に加えることにより実施される。これらのアプローチを用いて、２０の共通アミノ酸の多くを、構造的に近縁な相同物に置換することができる（例えば、特定のアミノ酸について栄養要求性の株を用いて、フルオロフェニルアラニンをフェニルアラニンと置換することができる）。例えば、「Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989)」、「M.W. Nowakら, Science 268:439-42 (1995)」、「Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989)」、「N. Budisaら, FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992)」、および、「Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site- Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)」を参照のこと。
【０１７０】
例えば、終止コドン（ＵＡＧ）を認識するサプレッサーｔＲＮＡが調製されて、該サプレッサーｔＲＮＡが、非天然アミノ酸によって化学的にアミノアシル化された。従来の部位特異的突然変異誘発法は、終止コドン（ＴＡＧ）を、タンパク質の遺伝子における興味部位に導入するために使用された。例えば、「Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5’ -3’ Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791- 802 (1988)」を参照のこと。アシル化されたサプレッサーｔＲＮＡと突然変異遺伝子とが、インビトロの転写／翻訳系において組み合わされたとき、非天然アミノ酸が、特定位置でアミノ酸を含むタンパク質を与えるＵＡＧコドンに応じて組み込まれた。［３Ｈ］‐Ｐｈｅを用いた実験、およびα‐ヒドロキシ酸を用いた実験により、所望のアミノ酸だけが、ＵＡＧコドンにより特定された位置に組み込まれること、ならびに、このアミノ酸はタンパク質の他のいかなる部位にも組み込まれないことが実証された。例えば、「上記Norenらの文献」、「Kobayashiら, (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432」、および「Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)」を参照のこと。
【０１７１】
ｔＲＮＡは、任意の方法または手法によって、所望のアミノ酸を用いてアミノアシル化されてもよい。これは、化学的アミノアシル化または酵素的アミノアシル化を含むがこれに限定されるものではない。
【０１７２】
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって、または他の酵素分子（リボザイムなど）によって実施されてもよい。用語「リボザイム」は、「触媒ＲＮＡ」と同義である。Ｃｅｃｈおよびその同僚（「Cech, 1987, Science, 236:1532- 1539」、「McCorkleら, 1987, Concepts Biochem. 64:221-226」）は、天然に生じるＲＮＡが、触媒（リボザイム）として作用することを実証した。これらの天然ＲＮＡ触媒は、リボ核酸基質に対して切断およびスプライシングの作用をすることが示されただけであったが、リボザイムの人工進化に対する最近の発展によって、触媒のレパートリーが様々な化学反応にまで拡張されている。研究により、アミノアシル‐ＲＮＡ結合を、自身の（２’）３’‐末端上に触媒することができるＲＮＡ分子（Illangakekareら, 1995 Science 267:643-647）、および１つのＲＮＡ分子からもう１つ別のＲＮＡ分子にアミノ酸を転移することができるＲＮＡ分子が同定された（Lohseら, 1996, Nature 381:442-444）。
【０１７３】
米国特許出願公開２００３／０２２８５９３号明細書には、リボザイムをコンストラクトする方法、および、天然にコードされたアミノ酸または非天然にコードされるアミノ酸を用いたｔＲＮＡのアミノアシル化におけるその使用が開示されている（なお、上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。ｔＲＮＡをアミノアシル化することができる酵素分子（リボザイムなど）の基質固定化型は、アミノアシル化された産物を効率的に親和性精製することができる。適切な基質の例としては、アガロース、セファロース、および磁気ビーズが挙げられる。アミノアシル化に対するリボザイムの基質固定化型の製造および使用は、「Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084」、および米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されている（なお、これら文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７４】
化学的アミノアシル化の方法には、特に限定されないが、アミノアシル化においてシンターゼの使用を避けた、以下の方法：Hechtおよびその同僚により導入された方法（「Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545」、「Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C.; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254」、「Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517」）、ならびに、Schultz, Chamberlin, Dougherty、および他の研究者により導入された方法（「Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621」、「Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722」、「Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C.; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182」、「Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013」、「Bain, J. D.ら Nature 1992, 356, 537」、「Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740」、「Turcattiら, J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991」、「Nowak, M. W.ら Science, 1995, 268, 439」、「Saks, M. E.ら J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169」、「Hohsaka, T.ら J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34」）が含まれる。上記方法または他の化学的アミノアシル化方法を用いて、本発明のｔＲＮＡをアミノアシル化してもよい。
【０１７５】
触媒ＲＮＡを作製するための方法は、無作為化されたリボザイム配列の個々のプールを作製する工程、該プールに対して指向進化（directed evolution）を実施する工程、所望のアミノアシル化活性に対して該プールをスクリーニングする工程、および、所望のアミノアシル化活性を示すリボザイムの配列を選抜する工程を含んでいてもよい。
【０１７６】
リボザイムは、アシル化活性を促進するモチーフおよび／または領域（例えばＧＧＵモチーフおよびＵリッチ領域など）を含んでいてもよい。例えば、Ｕリッチ領域はアミノ酸基質の認識を促進できることや、ＧＧＵモチーフはｔＲＮＡの３’末端と塩基対を形成できることが報告されている。これらを組み合わせることにより、ＧＧＵモチーフおよびＵリッチ領域は、アミノ酸とｔＲＮＡとの両方を同時に認識することが、同時に促進される。これにより、ｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化が促進される。
【０１７７】
ｔＲＮＡＡｓｎＣＣＣＧと接合している、部分的に無作為化されたｒ２４ｍｉｎｉを用いたインビトロ選抜を行い、その後、活性クローンに見出されるコンセンサス配列を体系的に操作することによって、リボザイムを作製することができる。この方法により得られる典型的なリボザイムは、「Ｆｘ３リボザイム」と呼ばれ（米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されている（この文献の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる））、同種の非天然アミノ酸により作用を受ける様々なアミノアシル‐ｔＲＮＡを合成するための多目的酵素としてはたらく。
【０１７８】
アミノアシル化されたｔＲＮＡの効果的な親和性精製を可能にするために、アミノアシル化されたｔＲＮＡリボザイムは、基質上に固定化されることができる。適切な基質としては、例えば、アガロース、セファロース、および磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。リボザイムを、ＲＮＡの化学的構造を活用することによって、樹脂上に固定化することができる。例えば、ＲＮＡのリボースにおける３’‐シス‐ジオールを、過ヨウ素酸塩を用いて酸化して、対応するジアルデヒドを作製することにより、樹脂上へのＲＮＡの固定化が促進される。様々な種類の樹脂（安価なヒドラジド樹脂など）は、還元アミノ化が、樹脂とリボザイムとの間の相互作用を不可逆結合にすることにおいて、用いることができる。アミノアシル‐ｔＲＮＡの合成は、このカラム上アミノアシル化（on-column aminoacylation）によって、顕著に促進されることができる。Kourouklisら（Methods 2005; 36:239-4）は、カラムに基づくアミノアシル化の系を開示している。
【０１７９】
アミノアシル化ｔＲＮＡの単離は、様々な方法により実施することができる。適切な方法の１つは、緩衝液を用いてカラムからアミノアシル化ｔＲＮＡを溶出することである。該緩衝液としては、例えば、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む酢酸ナトリウム溶液、５０ｍＭ  Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐Ｎ’‐（３‐プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭ  ＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、あるいは、単純なＥＤＴＡ緩衝用水（ｐＨ７．０）などが挙げられる。
【０１８０】
アミノアシル化ｔＲＮＡを翻訳反応に添加することによって、ｔＲＮＡを上記翻訳反応により作られたポリペプチドにおける選択位置にてアミノアシル化する共に、アミノ酸を組み込むことができる。本発明に係るアミノアシル化ｔＲＮＡが用いられ得る翻訳系の例には、細胞ライセートが挙げられるが、これに限定されない。細胞ライセートには、投入ｍＲＮＡからポリペプチドをインビトロで翻訳するのに必要な反応要素が含まれている。上記反応要素としては、例えば、リボソームタンパク質、ｒＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、および翻訳に関わる他の因子が挙げられるが、これらに限定されない。また、翻訳系は、バッチ翻訳または区画化翻訳であってもよい。バッチ翻訳系では、１つの区画において反応要素が結合する。これに対し、区画化翻訳系では、翻訳効率を阻害し得る反応産物から翻訳反応要素が分離される。このような翻訳系は、市販により入手可能である。
【０１８１】
また、共役型転写／翻訳系を用いてもよい。共役型転写／翻訳系により、投入ＤＮＡから対応するｍＲＮＡへの転写と、反応要素によるその後の翻訳との両方を実施することができる。市販されている共役型転写／翻訳系としては、例えば、迅速翻訳系（Rapid Translation System (RTS, Roche Inc.)）が挙げられる。この系には、翻訳要素（リボソームおよび翻訳因子など）を提供するE. coliライセートを含有する混合物が含まれている。また、翻訳に用いられるｍＲＮＡの鋳型を、投入ＤＮＡから転写するためのＲＮＡポリメラーゼが含まれている。ＲＴＳでは、各反応区画（供給／消費区画、および転写／翻訳区画など）の間に膜を設ける方法によって、反応要素を区画化することができる。
【０１８２】
ｔＲＮＡのアミノアシル化を、他の作用物質（トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、触媒抗体、多機能タンパク質など）により実施してもよい。
【０１８３】
Ｓｔｅｐｈａｎは、「Scientist 2005 Oct 10:30-33」において、非天然にコードされたアミノ酸をタンパク質に組み込むための追加方法を記載した。Ｌｕらは、「MoI Cell. 2001 Oct;8(4):759-69」において、タンパク質と、非天然アミノ酸を含む合成ペプチドとを化学的にライゲーション（タンパク質のライゲーションと表現されている）する方法を記載した。
【０１８４】
マイクロインジェクション法もまた、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むことに使用されてきた。例えば、「M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268:439 (1995) 」、および「D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000) 」を参照のこと。アフリカツメガエルの卵母細胞に、インビトロで作製された２つのＲＮＡが、同時注入された。なお、この２つのＲＮＡとは、興味のあるアミノ酸の位置に終止コドン（ＵＡＧ）を有する標的タンパク質をコードしているｍＲＮＡ、および、所望の非天然アミノ酸を有する、アミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡである。その後、上記卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧによって指定された位置に、非天然アミノ酸を挿入する。この方法は、通常インビトロにおける発現系に影響を受けにくい膜内在性タンパクを、インビボで構造・機能研究することを可能にしている。例としては、蛍光共鳴エネルギー移動による距離測定のための、タキキニンニューロキニン‐２受容体内への蛍光アミノ酸の組み込み（例えば、「G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996) 」を参照のこと）、イオンチャンネルにおける立体構造変化のリアルタイム追跡のためのケージドチロシン類似体の使用（例えば「J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998) 」を参照のこと）、および、イオンチャンネル骨格の開閉機構をプローブするために、イオンチャンネル骨格を変化させるためのアルファヒドロキシアミノ酸の使用（例えば「P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999) 」および「T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001) 」を参照のこと）が挙げられる。
【０１８５】
インビボにおいてタンパク質に直接に非天然アミノ酸を組み込む能力は、突然変異タンパク質の高い収率、技術的な容易さ、細胞もしくは生きていると思われる組織における突然変異タンパク質を研究する将来性、ならびに治療的な処置におけるこれらの突然変異タンパク質の利用を含む、利点を提供する。タンパク質に、種々の大きさ、酸性度、求核性、疎水性、および他の性質を有する非天然アミノ酸を含ませる能力は、タンパク質の機能を調べることおよび新規な性質を有する新しいタンパク質もしくは有機体を作り出すことの両方のために、タンパク質の構造を合理的および体系的に操作するわれわれの能力を、大きく拡大することができる。しかしながら、タンパク質翻訳において高い忠実度を達成するために要求される、ｔＲＮＡシンテターゼの相互作用の複雑な性質が原因となり、上記プロセスは難しい。
【０１８６】
パラ‐Ｆ‐Ｐｈｅの部位特異的な組み込みを行う１つの試みにおいて、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル‐ｔＲＮＡシンテターゼ対は、ｐ‐Ｆ‐Ｐｈｅ耐性のあるＰｈｅ栄養要求性のEscherichia coli株において用いられた。例えば、「R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998) 」を参照のこと。無細胞（インビトロン）翻訳系を用いてポリヌクレオチドの発現を得ることもまた可能でありえる。翻訳系は、細胞翻訳系であってもよいし、無細胞翻訳系であってもよいし、原核細胞であってもよいし、真核細胞であってもよい。細胞翻訳系としては、所望の核酸配列を、ｍＲＮＡに転写し、該ｍＲＮＡを翻訳することができる全細胞調製物（透過化処理された細胞または細胞培養物）が挙げられるが、これに限定されない。また、無細胞翻訳系は、市販されているものを利用することができ、多くの異なる種類および系が公知である。無細胞翻訳系としては、原核生物のライセート（Escherichia coliのライセートなど）、および真核生物のライセート（小麦胚抽出物、昆虫細胞のライセート、ウサギの網状赤血球のライセート、ウサギの卵母細胞のライセート、およびヒト細胞のライセート）が挙げられるが、これらに限定されない。得られるタンパク質を、グリコシル化もしくはリン酸化するか、または他の修飾をするときは、真核細胞の抽出物あるいはライセートが好ましい。というのも、そのような修飾の多くは、真核細胞の系のみにおいて行うことが可能であるからである。上記抽出物およびライセートのいくつかは、市販されている（Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif; Amersham; Arlington Heights, I11.; GIBCO/BRL; Grand Island, N. Y）。また、分泌タンパク質を翻訳することに有用である膜抽出物（ミクロソーム膜を含んでいるイヌの膵臓抽出物）を利用することもできる。この系は、鋳型としてのｍＲＮＡ（インビトロでの翻訳）か、または鋳型としてのＤＮＡ（インビトロでの転写と翻訳との組み合わせ）のどちらかを含んでおり、インビトロでの合成は、リボソームにより誘導される。無細胞のタンパク質発現系を開発するために、相当な努力が費やされている。例えば、「Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001)」、「Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)」、「Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)」、「Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999)」、および「Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998)」、米国特許第６，３３７，１９１号明細書、米国特許出願公開第２００２／００８１６６０号明細書、国際公開第００／５５３５３号パンフレット、国際公開第９０／０５７８５号パンフレットを参照のこと。なお、これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。非天然アミノ酸ポリペプチドの発現に適用され得る他のアプローチには、ｍＲＮＡ‐ペプチド融合技術が含まれる。例えば、「R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997) 」、「A. Frankelら, Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003)」を参照のこと。このアプローチでは、ピューロマイシンに連結されたｍＲＮＡ鋳型が、リボソームにおいてペプチドに翻訳される。１以上のｔＲＮＡが修飾されている場合、非天然のアミノ酸を同様にペプチドに組み込むことができ��。ｍＲＮＡの最後のコドンが読まれた後、ピューロマイシンは、ペプチドのＣ末端を捕える。生じたｍＲＮＡ‐ペプチド接合体が、インビトロ試験において、興味深い特性を有していることを発見される場合、その同定は、ｍＲＮＡの配列から容易に明らかとされ得る。このような方法で、非天然アミノ酸ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングして、所望の特性を有するポリペプチドを同定することができる。さらに最近では、精製成分を用いたインビトロのリボソームによる翻訳により、非天然にコードされるアミノ酸で置換されたペプチドを合成できることが、報告された。例えば「A. Forsterら, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003) 」を参照のこと。
【０１８７】
また、再構成翻訳系を使用してもよい。ライセート、または精製された翻訳因子が添加されたライセートの組み合わせと同様に、精製された翻訳因子の混合物は、ｍＲＮＡをタンパク質に首尾よく翻訳するためにも用いられている。上記翻訳因子としては、開始因子‐１（ＩＦ‐１）、ＩＦ‐２、ＩＦ‐３（αまたはβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ‐Ｔｕ）、または終結因子などが挙げられる。また、無細胞系と、転写／翻訳系とを組み合わせてもよい。この転写／翻訳系では、「Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubelら editors, Wiley Interscience, 1993) 」に記載されているように、ＤＮＡが該系に導入されて、ｍＲＮＡに転写され、このｍＲＮＡが翻訳される。なお、これらは特に参照により本明細書に組み込まれる。真核生物の転写系において転写されたＲＮＡは、異核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）の形態であってもよいし、成熟ｍＲＮＡに５’末端のキャップ（７‐メチルグアノシン）および３’末端のポリＡを有する形態であってもよい。成熟ｍＲＮＡは、特定の翻訳系において有利になり得る。例えば、キャップされたｍＲＮＡは、網状赤血球ライセート系において高効率で翻訳される。
【０１８８】
‐ポリペプチドの非天然アミノ酸要素の翻訳後修飾‐
方法、組成物、技術、および戦略は、インビボでのタンパク質の翻訳の間における非天然アミノ酸の部位特異的な組み込みを発達させてきた。天然性アミノ酸の側鎖に対して直交する、側鎖の化学的性質を有する非天然アミノ酸を組み込むことによって、この技術は、組み替えタンパク質の部位特異的な誘導体化を可能にする。その結果、上記方法、組成物、技術、および戦略の主な利点は、現在、誘導体化されたタンパク質が、明確な同種の産物として作製され得ることである。
【０１８９】
上述された非天然アミノ酸ポリペプチドは、例えば、新規の治療法、診断法、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク、ならびにタンパク質の構造および機能の研究に対して有用である。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652」を参照のこと。上述された非天然アミノ酸ポリペプチドの他の使用には、ほんの一例として、基礎分析、化粧品、植物生物学、環境学、エネルギー生産、および／または軍事利用が挙げられる。しかしながら、上述された非天然アミノ酸ポリペプチドは、新規官能基または改良された官能基を組み込むために、さらに修飾されてもよい。上記修飾としては、上記ポリペプチドの治療有効性の操作、上記ポリペプチドの安全性プロフィールの改良、上記ポリペプチドの薬物動態学、薬理学、および／または薬力学的な調整（例えば、水溶性の向上、バイオアベイラビリティ、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原生の調節、生物活性の調節、または循環時間の延長）、上記ポリペプチドの追加的官能基の提供、上記ポリペプチドへのタグ、標識、または検出シグナルの組み込み、上記ポリペプチドの特性分離の緩和、ならびに上述された修飾の任意の組み合わせが挙げられる。
【０１９０】
上述された方法、組成、技術、および戦略には、ポリペプチドまたはタンパク質について特定のタイプ、クラス、ファミリーがあるが、これらに限定されない。組成物は、少なくとも１つの（例えば、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０この、またはそれ以上の）翻訳後修飾された非天然アミノ酸を有する、少なくとも１つのタンパク質を含んでいてもよい。上記翻訳後修飾された非天然アミノ酸は、同一であってもまたは異なっていてもよい。以下に限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上の異なった、翻訳後修飾された非天然アミノ酸を備える上記タンパク質において、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上の異なる部位があってもよい。組成物は、上記翻訳後修飾された非天然アミノ酸に置換された上記タンパク質において存在する特定のアミノ酸を、すべてではないが少なくとも１つ有するタンパク質を含んでもよい。１つ以上の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質について、上記翻訳後修飾された非天然アミノ酸は、同一であっても、異なっていてもよい（例えば、当該タンパク質は、２つ以上の異なる種類の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含んでいてもよく、または２つの同じ翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含んでいてもよい）。２つ以上の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質について、上記翻訳後修飾された非天然アミノ酸は、同一な、異なる、または組み合わせされた、少なくとも１つの異なる翻訳後修飾された非天然アミノ酸を有する、複数の同種である翻訳後修飾された非天然アミノ酸であってもよい。
【０１９１】
例えば、翻訳後修飾は、求核‐求電子反応を介してもよい。現在、タンパク質の選択的な修飾に使用されるほとんどの反応は、求核反応の相手と求電子反応の相手との間に、共有結合形成を含む。上記反応としては、例えば、ヒスチジン側鎖またはシステイン側鎖を有するα‐ハロケトンの反応が挙げられる。これらの場合における選択性は、タンパク質における求核性の残基の数および近づき易さによって決定される。本発明のタンパク質において、他のさらに選択的な反応は、インビボまたはインビトロにおいて、ヒドラジド化合物またはアミノオキシ化合物を有する非天然ケト‐アミノ酸の反応などに用いられてもよい。例えば、「Cornishら, (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151」、「Mahalら, (1997) Science, 276:1125-1128」、「Wangら, (2001) Science 292:498-500」、「Chinら, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027」、「Chinら., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci 99:11020-11024」、「Wangら, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci 100:56-61」、「Zhangら, (2003) Biochemistry. 42:6735-6746」、および「Chinら, (2003) Science, 301:964-7」を参照のこと。これによって、蛍光団、架橋剤、サッカリド誘導体、および細胞毒性分子を含む、多くの試薬を用いて実際に任意のタンパク質の選択的な標識が可能になる。また、「Glycoprotein synthesis」と題された米国特許第６，９２７，０４２号明細書を参照のこと（これは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１９２】
Ａ．非天然アミノ酸要素の修飾
非天然アミノ酸要素（ポリペプチドまたは他のポリマーにおける非天然アミノ酸部分と同様に、非天然アミノ酸も含まれる）の様々な修飾は、以下に限られないが、
（i）カルボニル含有非天然アミノ酸要素と、ヒドロキシルアミン含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成；
（ii）ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸要素と、カルボニル含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素を形成；
（iii）（i）および（ii）の場合におけるカルボニルおよびヒドロキシルアミンの反応により形成されたオキシム含有非天然アミノ酸要素と、異なるカルボニル含有試薬との反応による、オキシム交換反応を介した新たなオキシム含有非天然アミノ酸要素の形成；
（iv）ジカルボニル含有非天然アミノ酸要素と、ヒドロキシルアミン含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成；
（v）ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸要素と、ジカルボニル含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成；
（vi）（iv）および（v）の場合におけるジカルボニルおよびヒドロキシルアミンの反応によって形成されたオキシム含有非天然アミノ酸要素と、異なるジカルボニル含有試薬との反応による、オキシム交換反応を介した新たなオキシム含有非天然アミノ酸要素の形成；
を含む。
【０１９３】
このような反応は図２に示されている。図２では、ポリペプチド内に翻訳的に組み込まれた（または他の方法で組み込まれた）アミノ酸官能基（Ａ）は、修飾されたポリペプチドを産出するために反応剤（Ｂ）と反応する。このような反応はさらに、ポリマー（一例として、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、ポリサッカリド、またはこれらの複合体を含む）の上で、アミノ酸官能基（Ａ）とともに起こり、ここで、反応剤（Ｂ）との反応は修飾されたポリマーを産出する。便宜上、この項および本明細書の他の項において記載された修飾は、様々な修飾を説明するために、一例として、「ポリペプチド」または「複数のポリペプチド」を用いる。しかしながら、本明細書に記載された修飾は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、ポリサッカリド、合成高分子、またはこれらの複合体を含む他の分子内に、組み込まれた非天然アミノ酸に対して同様に適用される。
【０１９４】
本明細書で用いられる用語「要素」は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸を含有するポリマー、選択コドンを含有する核酸配列、ポリマーに結合した非天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸を含有するポリマーに結合した非天然アミノ酸ポリペプチド、核酸配列に結合した非天然アミノ酸ポリペプチド、核酸配列に結合した非天然アミノ酸ポリペプチド（各核酸配列は独立的に、ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、核酸配列、またはポリマーの、一部であってもよいし、またはそれらの内に組み込まれてもよい）のことをいう。
【０１９５】
これらの様々な反応の仕組みは、米国仮特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国仮特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国仮特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国仮特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国仮特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国仮特許出願第６０／６９６，０６８号明細書において記載されている（なお、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。上記仮特許出願それぞれに開示された記載は、本明細書で十分に提示されたのと同じ程度に、本明細書に記載された非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを製造、検出、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略に対して十分適用する。
【０１９６】
（カルボニル含有非天然アミノ酸要素と、ヒドロキシルアミン含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成）
求電子試薬含有側鎖（例えば、アルデヒド、エステル、チオエステル、およびケトンなどのカルボニル基が挙げられる）を有する非天然アミノ酸は、ポリペプチド内に組み込まれることができる。ポリペプチド内への上記求電子性側鎖を有する非天然アミノ酸の組み込みは、上記カルボニル基の求核攻撃を介して、該側鎖の部位特異的な誘導体化を可能にする。上記求核攻撃の相手がヒドロキシルアミンである場合には、オキシム誘導体化されたポリペプチドが発生する。誘導体化および／またはさらに修飾するための方法は、誘導体化工程の前または後で精製されたポリペプチドを用いて実施されてもよい。さらには、誘導体化工程は、弱酸性から弱塩基性条件の下で実施され行われ得る（一例として、ｐＨ約２から約１０の間、またはｐＨ約２から約８の間、またはまたはｐＨ約４から約８の間が含まれる）。
【０１９７】
ヒドロキシルアミン含有試薬または同様の化学活性を有する官能基によって、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸におけるカルボニル側鎖を修飾することにより、オキシム結合を含有する修飾されたポリペプチドが提供される。図３は、上記反応、およびその結果である上記修飾されたポリペプチドの構造を示す図である。
【０１９８】
本明細書に記載される一実施形態は、オキシム基を包含する側鎖を有する非天然アミノ酸を含有するポリペプチドである。他の実施形態では、上記オキシム基はさらに修飾されてもよく、例えば、ほんの一例として、マスクされたオキシム基（オキシム基に容易に転換され得る）、保護されたオキシム基（脱保護の結果として、他の化学反応に使用できるオキシム基に容易に転換され得る）、またはオキシム交換反応を介した新しいオキシム基の形成が挙げられる。
【０１９９】
上記修飾されたポリペプチドオキシム連鎖の一例は、これに限定されないが、下記に示される。
【０２００】
【化２】
2009520949.tif 000003
【０２０１】
（ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸要素と、カルボニル含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成）
ポリペプチド内へのヒドロキシル基含有非天然アミノ酸の組み込みは、様々な求電子基（例えば、ケトン、エステル、チオエステル、およびアルデヒドなどのカルボニル基が挙げられる）と反応することができる。ヒドロキシルアミン基の求核性は、弱酸性（弱塩基性）条件下の水溶液中で、カルボニル官能基または同様の化学活性を有する他の官能基を含む様々な分子と、機能的かつ選択的に反応し、対応するオキシム連鎖を形成することができる。上記カルボニル基の求核攻撃を介した上記側鎖の、この部位特異的な誘導体化および／またはさらなる修飾は、誘導体化工程の前または後で精製されたポリペプチドを用いて実施されてもよい。さらには、誘導体化工程は、弱酸性から弱塩基性条件の下で行われ得る。（一例として、ｐＨ約２から約１０の間、またはｐＨ約２から約８の間、またはまたはｐＨ約４から約８の間が含まれる）。
【０２０２】
カルボニル含有試薬によって、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸のヒドロキシルアミン基を修飾することにより、オキシム結合を含有する修飾されたポリペプチドが提供される。図４は、上記反応、およびその結果である上記修飾されたポリペプチドの構造を示す図である。
【０２０３】
本明細書に記載される一実施形態は、オキシム基を包含する側鎖を有する非天然アミノ酸を含有するポリペプチドである。他の実施形態では、上記オキシム基はさらに修飾されてもよく、例えば、ほんの一例として、マスクされたオキシム基（オキシム基に容易に転換され得る）、保護されたオキシム基（脱保護の結果として、他の化学反応に使用できるオキシム基に容易に転換され得る）、またはオキシム交換反応を介した新しいオキシム基の形成が挙げられる。
【０２０４】
上記修飾されたポリペプチドオキシム連鎖の一例は、これに限定されないが、下記に示される。
【０２０５】
【化３】
2009520949.tif 000004
【０２０６】
（カルボニルおよびヒドロキシルアミンの反応によって形成されたオキシム含有非天然アミノ酸要素と、異なるカルボニル含有試薬との反応による、オキシム交換反応を介した新たなオキシム含有非天然アミノ酸要素の形成）
オキシム基を含有する非天然アミノ酸は、特定の活性カルボニル基（例えば、アルデヒド、エステル、チオエステル、およびケトンが挙げられる）を含む様々な試薬と反応し、新たなオキシム基を包含する新たな非天然アミノ酸（ポリペプチド内に組み込まれ得る）を形成することができる。上記オキシム交換交換反応により、非天然アミノ酸ポリペプチドに官能基をさらに付与することができる。
【０２０７】
カルボニル含有試薬または同様のまたは同様の化学活性を有する官能基によって、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸におけるカルボニル側鎖を修飾することにより、新たなオキシム結合を含有する修飾されたポリペプチドが提供される。図５は、上記反応、およびその結果である上記修飾されたポリペプチドの構造を示す図である。
【０２０８】
本明細書に記載される一実施形態は、オキシム基を包含する側鎖を有する非天然アミノ酸を含有するポリペプチドである。他の実施形態では、上記オキシム基はさらに修飾されてもよく、例えば、ほんの一例として、マスクされたオキシム基（オキシム基に容易に転換され得る）、保護されたオキシム基（脱保護の結果として、他の化学反応に使用できるオキシム基に容易に転換され得る）、またはオキシム交換反応を介した新しいオキシム基の形成が挙げられる。
【０２０９】
（ジカルボニル含有非天然アミノ酸要素と、ヒドロキシルアミン含有試薬との反応による、オキシムの形成）
求電子試薬含有側鎖を有する非天然アミノ酸は、ポリペプチド内に組み込まれ得る。ここで、上記求電子試薬含有側鎖は、例えば、ジカルボニル基（例えばジケトン基、ケトアルデヒド基、ケト酸基、ケトエステル基、およびケトチオエステル基など）、ジカルボニル類似体基（ジカルボニル基と同様の反応性を有しており、かつカルボニル基と構造的に類似である）、マスクされたジカルボニル基（ジカルボニル基内に容易に転換され得る）、または保護されたジカルボニル基（脱保護により、ジカルボニル基と同様の反応性を有す）を含む。ポリペプチド内への上記求電子側鎖を有する上記非天然アミノ酸の組み込みは、カルボニル基の求核攻撃を介して、該側鎖の部位特異的な誘導体化を可能にする。上記求核攻撃の相手がヒドロキシルアミンである場合には、オキシム誘導体化されたポリペプチドが発生する。誘導体化および／またはさらに修飾するための方法は、誘導体化工程の前または後で精製されたポリペプチドを用いて実施されてもよい。さらには、誘導体化工程は、弱酸性から弱塩基性条件の下で行われ得る（一例として、ｐＨ約２から約１０の間、またはｐＨ約２から約８の間、またはまたはｐＨ約４から約８の間が含まれる）。
【０２１０】
ヒドロキシルアミン含有試薬または同様のまたは同様の化学活性を有する官能基によって、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸におけるジカルボニル側鎖を修飾することにより、オキシム結合を含有する修飾されたポリペプチドが提供される。図６は、上記反応、およびその結果である上記修飾されたポリペプチドの構造を示す図である。
【０２１１】
本明細書に記載される一実施形態は、オキシム基を包含する側鎖を有する非天然アミノ酸を含有するポリペプチドである。他の実施形態では、上記オキシム基はさらに修飾されてもよく、例えば、ほんの一例として、マスクされたオキシム基（オキシム基に容易に転換され得る）、保護されたオキシム基（脱保護の結果として、他の化学反応に使用できるオキシム基に容易に転換され得る）、またはオキシム交換反応を介した新しいオキシム基の形成が挙げられる。
【０２１２】
上記修飾されたポリペプチドオキシム連鎖の一例は、これに限定されないが、下記に示される。
【０２１３】
【化４】
2009520949.tif 000005
【０２１４】
（ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸要素と、ジカルボニル含有試薬との反応による、オキシムの形成）
ポリペプチド内へのヒドロキシルアミン基を含有する非天然アミノ酸の組み込みは、様々な求電子性基との反応を可能にさせる。ここで、上記求電子性基は、例えば、ジカルボニル基（例えばジケトン基、ケトアルデヒド基、ケト酸基、ケトエステル基、およびケトチオエステル基など）、ジカルボニル類似体基（ジカルボニル基と同様の反応性を有しており、かつカルボニル基と構造的に類似である）、マスクされたジカルボニル基（ジカルボニル基に容易に転換され得る）、または保護されたジカルボニル基（脱保護により、ジカルボニル基と同様の反応性を有す）を含む。ヒドロキシルアミン基の求核性は、弱酸性（弱塩基性）条件下の水溶液中で、上記ジカルボニル官能基、または同様の化学活性を有する他の官能基を含む様々な分子と、機能的かつ選択的に反応し、対応するオキシム連鎖を形成することができる。上記ジカルボニル基の求核攻撃を介した上記側鎖の、この部位特異的な誘導体化および／またはさらなる修飾は、誘導体化工程の前または後で精製されたポリペプチドを用いて実施されてもよい。さらには、誘導体化工程は、弱酸性から弱塩基性条件の下で行われ得る。（一例として、ｐＨ約２から約１０の間、またはｐＨ約２から約８の間、またはまたはｐＨ約４から約８の間が含まれる）。
【０２１５】
ジカルボニル含有試薬によって、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸におけるヒドロキシルアミン基を修飾することにより、オキシム結合を含有する修飾されたポリペプチドが提供される。図７は、上記反応、およびその結果である上記修飾されたポリペプチドの構造を示す図である。
【０２１６】
本明細書に記載される一実施形態は、オキシム基を包含する側鎖を有する非天然アミノ酸を含有するポリペプチドである。他の実施形態では、上記オキシム基はさらに修飾されてもよく、例えば、ほんの一例として、マスクされたオキシム基（オキシム基に容易に転換され得る）、保護されたオキシム基（脱保護の結果として、他の化学反応に使用できるオキシム基に容易に転換され得る）、またはオキシム交換反応を介した新しいオキシム基の形成が挙げられる。
【０２１７】
上記修飾されたポリペプチドオキシム連鎖の一例は、これに限定されないが、下記に示される。
【０２１８】
【化５】
2009520949.tif 000006
【０２１９】
（ジカルボニルおよびヒドロキシルアミンの反応によって形成されたオキシム含有非天然アミノ酸要素と、カルボニルまたは異なるジカルボニル含有試薬との反応による、オキシム交換反応を介した新たなオキシム含有非天然アミノ酸要素の形成）
オキシム基含有非天然アミノ酸は、特定の反応性ジカルボニル基を含有する様々な試薬と反応することができ、新しいオキシム基を包含する新しい非天然アミノ酸（ポリペプチドに組み込まれ得る）を形成する。ここで、上記反応性ジカルボニル基は、ジケトン基、ケトアルデヒド基、ケト酸基、ケトエステル基、およびケトチオエステル基、ジカルボニル類似体基（ジカルボニル基と同様の反応性を有しており、かつカルボニル基と構造的に類似である）、マスクされたジカルボニル基（ジカルボニル基に容易に転換され得る）、または保護されたジカルボニル基（脱保護により、ジカルボニル基と同様の反応性を有す）を含む。上記オキシム交換反応により、非天然アミノ酸ポリペプチドに官能基をさらに付与することができる。
【０２２０】
ジカルボニル含有試薬、または同様の化学活性を有する他の官能基によって、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸におけるオキシム側鎖を修飾することにより、新しいオキシム結合を含有する修飾されたポリペプチドが提供される。図８は、上記反応、およびその結果である上記修飾されたポリペプチドの構造を示す図である。
【０２２１】
本明細書に記載される一実施形態は、オキシム基を包含する側鎖を有する非天然アミノ酸を含有するポリペプチドである。他の実施形態では、上記オキシム基はさらに修飾されてもよく、例えば、ほんの一例として、マスクされたオキシム基（オキシム基に容易に転換され得る）、保護されたオキシム基（脱保護の結果として、他の化学反応に使用できるオキシム基に容易に転換され得る）、またはオキシム交換反応を介した新しいオキシム基の形成が挙げられる。
【０２２２】
Ｂ．血清アルブミンに対する増強された親和性
様々な分子は、血清中の半減期を調節するために、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドと融合されてもよい。ある場合には、分子は、動物における内因性血清アルブミンの親和性を増強するために、本明細書に記載の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドと連結または融合される。
【０２２３】
例えば、ある場合では、ポリペプチドとアルブミン結合配列との組み換え融合が行われる。他の場合では、本明細書に記載の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドは、脂肪酸とアシル化される。他の場合では、本明細書に記載の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドは、血清アルブミン（たとえばヒト血清アルブミン）と直接的に融合される。当業者であれば、血清アルブミンまたは他の血清要素との結合を調節するために、幅広い種類の他の分子を、本明細書に記載の修飾されたまたは非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドと連結することができる、と気づくだろう。さらに、血清アルブミンに対する親和性の増強に関する議論が米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；“Modified Four Helical Bundle Polypeptides And Their Uses”と名づけられた国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットに記載されている（なお、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２２４】
Ｃ．本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのグリコシル化
本明細書に記載の方法および組成物は、サッカリド残基を有する１つかそれ以上の非天然アミノ酸を組み込むポリペプチドを含む。サッカリド残基は、天然（たとえばＮ−アセチルグルコサミン）または非天然（たとえば３−フルロガラクトース）のどちらであってもよい。上記サッカリドは、Ｎ−またはＯ−連結グリコシド結合（たとえばＮ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリン）または非天然結合（たとえばオキシム、または対応するＣ−若しくはＳ−連結グリコシド）のいずれかによって、非天然アミノ酸と連結してもよい。
【０２２５】
上記サッカリド（たとえばグリコシル）部分は、インビボまたはインビトロのどちらかで、非天然アミノ酸ポリペプチドに添加されることができる。ある場合では、カルボニル含有非天然アミノ酸を包含するポリペプチドは、アミノオキシ基で誘導体化された上記サッカリドで修飾されて、オキシム結合を介して連結された対応するグリコシル化されたポリペプチドを生成する。一度非天然アミノ酸に接触されると、上記サッカリドは、グリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素での処理によって、さらに合成され、非天然アミノ酸ポリペプチドと結合したオリゴサッカロイドを生成する。例えば、「H. Liuら J. Am. Chem. Soc. 125:1702-1703(2003) 」を参照のこと。
【０２２６】
Ｄ．ポリペプチドニ量体およびポリペプチドマルチマーを含む、連結基の使用、ならびに利用
非天然アミノ酸ポリペプチドに対する直接的な官能基の追加に加えて、上記ポリペプチドの非天然アミノ酸部分は、まず、多官能性（例えばｂｉ−、ｔｒｉ、ｔｅｔｒａ−）リンカー分子を用いて修飾され、その後、さらに修飾される。すなわち、多官能性リンカー分子の少なくとも１つの末端は、ポリペプチドにおける少なくとも１つの非天然アミノ酸と反応し、また、多官能性リンカーの他の少なくとも１つの末端は、さらなる官能基付与に利用される。仮に多官能性リンカーの全ての末端が同一である場合、その結果、（化学量論的条件次第で）非天然アミノ酸ポリペプチドのホモマルチマーが形成されてもよい。仮に多官能性リンカーが特異的な化学活性を有する場合、その結果、多官能性リンカー基の少なくとも１つの末端は非天然アミノ酸ポリペプチドと結合され、次いで、他の末端は異なる官能基と反応し得る。ここで、上記異なる官能基は、ほんの一例として、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬剤；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；二次タンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補足因子；脂肪酸；炭化水素；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；単糖類；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；抑制性のリボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規な官能基；他の分子と共有的もしくは非共有的に反応する化学基；光を閉じ込める部分；光活性化励起部分；光異性化部分；ビオチン；ビオチン誘導体；重元素を取り込んでいる部分；化学的に開裂可能な化学基；光開裂可能な化学基；延長された側鎖；炭素連結された糖；酸化還元反応活性剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体的に標識された部分；生物物理的なプローブ；燐光性化学基；化学発光化学基；高電子密度の化学基；磁性のある化学基；挿入化学基；発色団；エネルギー転移剤；生物学的活性試薬；検出可能標識；小分子；量子小点；ナノ伝達物質；または上述の任意の組み合わせを含んでいる。
【０２２７】
ポリペプチドニ量体およびポリペプチドマルチマーを含む、連結基のさらなる使用、ならびにさらなる利用は、さらに、米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；“Modified Four Helical Bundle Polypeptides And Their Uses”と名づけられた国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットに記載されている（なお、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２２８】
Ｅ．官能基の追加の例：ポリペプチドの分離特性の緩和
天然発生のアミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドを試料から単離することは、多数の理由のために、難しい場合がある。この理由として、ポリペプチドの溶解性または結合特性などが挙げられる。例えば、治療的使用のためにポリペプチドの準備する場合において、上記ポリペプチドは、上記ポリペプチドを過剰に生産するように操作された組み換え系から単離されてもよい。しかしながら、ポリペプチドの溶解性または結合特性の理由で、所望する精製レベルを達成することが、しばしば困難である。上記方法、組成物、技術、および戦略は、米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許公開第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；“Modified Four Helical Bundle Polypeptides And Their Uses”と名づけられた国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットに、さらに記載されている（なお、これら全てはこの状況に対する解決法を提供しており、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２２９】
Ｆ．官能基の追加の例：ポリペプチドの存在の検出
天然に生じるアミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドを試料（インビボ試料およびインビトロ試料を含む）において検出することは、多数の理由のために、難しい場合がある。この理由としては、上記ポリペプチドに容易に結合し得る、試薬または標識の欠如などが挙げられる。上記方法、組成物、技術、および戦略は、米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；“Modified Four Helical Bundle Polypeptides And Their Uses”と名づけられた国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットに、さらに記載されている（なお、これら全てはこの状況に対する解決法を提供しており、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２３０】
Ｇ．官能基の追加の例：ポリペプチドの治療的特性の改善
天然に生じるアミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドは、特に疾患、疾病、または病気を有する患者に対して、特定の治療的な利点を提供することができる場合がある。上記治療的な利点は、多数の要因に基づく。上記要因には、ほんの一例として、上記ポリペプチドの安全性プロフィール、ならびに上記ポリペプチドの薬物動態学および／または薬力学（例えば水溶性、生体への利用性（バイオアベイラビリティ）、血中半減期、治療半減期、免疫原生、生物活性、または循環時間）が含まれる。加えて、上記ポリペプチドに対して、付着した細胞毒性化合物または薬剤などの官能基をさらに提供することは有利である。または、本明細書に記載の上記ホモマルチマーおよびヘテロマルチマーを形成するために、別のポリペプチドをさらに取り付けることが望ましい。上記修飾は、元のポリペプチドの活性および／または３次構造を破壊しないことが好ましい。上記方法、組成物、技術、および戦略は、米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書；“Modified Four Helical Bundle Polypeptides And Their Uses”と名づけられた国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットに、さらに記載されている（なお、これら全てはこの状況に対する解決法を提供しており、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２３１】
＜Ｘ．修飾ポリペプチドの治療的利用＞
本明細書に記載されている（修飾）非天然アミノ酸（該（修飾）非天然アミノ酸のホモ多量体およびヘテロ多量体を含む）は、例えば、治療的利用、診断的利用、アッセイの主成分としての利用、産業的利用、美容的利用、植物生物学的利用、環境利用、エネルギー生産への利用および／または軍事的利用を含む複数の利用が見出される。非限定的な説明として、（修飾）非天然アミノ酸の以下の治療的利用が与えられる。
【０２３２】
本明細書に記載されている（修飾）非天然アミノ酸は、広範囲の疾患に有用である。本明細書に記載されている（修飾）非天然アミノ酸ポリペプチド産物の投与は、ヒトにおける市販のポリペプチド調整物によって示されるあらゆる活性を生じる。（修飾）非天然アミノ酸の平均量は、変化してもよく、かつ特に、有資格医師の推薦および処方に基づくべきである。（修飾）非天然アミノ酸の正確な量は、処置される条件の正確な種類、処置される患者の条件、および組成物における他の成分といった要因に依存する選択の問題である。興味のある量は、（修飾）非天然アミノ酸を用いた治療に基づく当該分野における当業者によって用意に決定され得る。
【０２３３】
Ａ．投与および薬学的組成物
本明細書に記載されているような非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸（１つ以上の非天然アミノ酸を備えるシンテターゼ、タンパク質などを含むが、これらに限定されない）は、好適な薬学的担体と組み合わせなどを含む、治療的利用に対して任意に採用される。そのような組成物は、例えば、本明細書記載されているような、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸の治療的に有効な量、ならびに担体または賦形剤の薬学的に受容可能な量を備える。そのような担体または賦形剤としては、例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノールおよび／またはこれらの組み合わせが挙げられる。通常、タンパク質の投与方法は、当該分野において公知であり、かつ本明細書に記載されているような、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸の投与に対して適用され得る。
【０２３４】
本明細書に記載されているような、１つ以上の非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸を備える治療的組成物は、当該分野における当業者に公知の方法に従って、有効性、および組織代謝の確認、ならびに用量の評価のために、適切なインビトロおよび／または障害の動物モデルのインビボにおいて、任意に試験されてもよい。特に、用量は、天然アミノ酸相同物に対する非天然アミノ酸相同物の活性、安定性または他の好適な測定（以下に限定されないが、天然アミノ酸ポリペプチドに対する１つ以上の非天然アミノ酸を含む（修飾）ポリペプチドの比較）、例えば、関連性アッセイによって最初に決定されてもよい。
【０２３５】
投与は、血液または組織細胞と最終的に接触する分子の導入に通常に使用されるあらゆる経路による。本明細書に記載されているように、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸は、１つ以上の薬学的に受容可能な担体を任意に用いて、あらゆる好適な方法において投与される。本明細書に記載されているような、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸の患者に対する投与の好適な方法が利用可能であり、かつ２つ以上の経路が特定の組成物の投与に使用されてもよいが、特定の経路は、たいていの場合において、他の経路より即効性の、かつ効果的な作用または反応を提供し得る。
【０２３６】
薬学的に受容可能な担体は、投与される特定の組成物だけでなく、当該組成物の投与に使用される特定の方法によって部分的に決定される。従って、本明細書に記載されている薬学的組成物の種々の好適な調合物がある。
【０２３７】
非天然アミノ酸ポリペプチドは、タンパク質またはポリペプチドにとって好適な、以下に限定されないが、非経口的（例えば、以下に限定されないが、皮下、または静脈内、または注入もしくは点滴の他のあらゆる形態を含む注入）を含む従来のあらゆる経路によって投与され得る。ポリペプチド組成物（本明細書に記載されている種々のポリペプチドを含む）は、以下に限定されないが、経口的な、静脈内の、腹腔内の、筋肉内の、経皮的な、皮下的な、局所的な、舌下の、または直腸の手段を含む多くの経路によって投与され得る。また、本明細書に記載されているような、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸を備える組成物は、リポソームを介して投与されてもよい。そのような投与経路および適切な調合物は、単独に、または薬学的な担体といった他の好適な組み合わせて、使用されてもよい。
【０２３８】
また、本明細書に記載されているような、単独の、または他の好適な成分と組み合わせの、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸は、吸入を介して投与される噴霧調合物（例えば、それらは、噴霧化されてもよい）に作製されていてもよい。噴霧調合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、および窒素といった加圧された受容可能な噴霧剤に入れられていてもよい。
【０２３９】
例えば、関節内の（関節に）、静脈内の、筋肉内の、皮内の、腹腔内の、および皮下のといった非経口的な投与に好適な調合物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および意図される受容者の血液と等張性の調合物を提供する溶質を含み得る、水性および非水性の無菌等張性注入溶液、ならびに可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液を含む。パッケージされた拡散の調合物は、アンプルおよびバイアルといった、単位用量または多用量の密封された容器に存在していてもよい。
【０２４０】
経口投与および静脈投与は、投与の好ましい方法である。特に、現在利用されている調合物に従って、天然アミノ酸相同物治療物（以下に限定されないが、ＥＰＯ、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＩＦＮｓ、インターロイキン、抗体、および／またはあらゆる治療的に実現するタンパク質を含む）に対する使用における投与の経路は、本明細書に記載されているような、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドにとって、好ましい投与経路および調合物を提供する。
【０２４１】
本明細書に記載されている組成物および方法に即して、患者に投与される用量は、やがて患者に有益な治療的反応を有するために十分な量である。当該用量は、特定の調合物の有効性、および採用された修飾もしくは非修飾の非天然アミノ酸の活性、安定性、または血清半減期、および患者の状態だけでなく、処置される患者の体重または体表面積によって決定される。また、当該用量の大きさは、特定の調合物の投与に伴って生じるあらゆる有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
【０２４２】
疾患（以下に限定されないが、がん、遺伝性疾患、糖尿病、またはＡＩＤＳなどを含む）の処置または予防において投与される調合物の効果的な量の決定において、医師は、循環血漿レベル、調合物の毒性、疾患の進行および／または関連する場合には、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を調べる。
【０２４３】
例えば、７０キログラムの体重の患者に投与される用量は、通常、現在使用されている治療タンパク質の用量と等しい範囲において、該当する組成物の変化した活性または血清半減期に関して調整される。本明細書に記載されている薬学的組成物は、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性薬、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類縁物質、生体反応修飾因子の投与などを含む、あらゆる公知の従来の治療によって、処置条件を補うことができる。
【０２４４】
投与に関して、本明細書に記載されている薬学的組成物は、該当する調合物のＬＤ−５０もしくはＥＤ−５０、および／または非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドのあらゆる副作用の観察によって決定される割合において、以下に限定されないが、患者の大部分のおよび全般的な健康に適合されることを含むような、種々の濃度に投与される。投与は、単一用量または分割用量を介して達成されてもよい。
【０２４５】
調合物の注入を受けた患者が発熱、悪寒または筋肉痛を生じるのであれば、彼／彼女は、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたは他の痛み／熱制御薬を受ける。注入に対して、発熱、筋肉痛および悪寒といった反応を経験する患者は、後の注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、または以下に限定されないが、ジフェンヒドラミンを含む、いずれかを用いて前投与される。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミン剤にすぐに反応しないより深刻な悪寒および筋肉痛に使用される。細胞注入は、反応の深刻さに依存して、遅くされる、または中断される。
【０２４６】
本明細書に記載されるように、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、哺乳類の対象に対して直接に投与されてもよい。投与は、対象に対するポリペプチドの導入に通常に使用されるあらゆる経路による。本明細書に記載されているように、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入投与（以下に限定されないが、噴霧剤を介する投与を含む）、口腔投与（以下に限定されないが、舌下投与を含む）、膣投与、非経口投与（以下に限定されないが、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、関節内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、大脳内投与、動脈内投与、または静脈内投与を含む）、局所投与（例えば、肌の表面および気道の表面を含む粘膜の表面の両方）、経皮投与に好適なものを含むが、あらゆる任意の場合においてもっとも好適な経路は、処置される条件の性質および深刻さに依存する。投与は、局所または全身のいずれかであってもよい。調合物は、アンプルまたはバイアルといった単一用量または多用量を密閉した容器に存在していてもよい。本明細書に記載されているように、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、薬学的に受容可能な担体を用いた、単一用量の注入可能な形態（以下に限定されないが、溶液、懸濁液または乳剤を含む）における混合物に調整されてもよい。また、本明細書に記載されているように、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、連続的な注入（以下に限定されないが、浸透圧ポンプといったミニポンプを用いて）、単一の大量瞬時投与、ゆっくり放出する蓄積調合物によって投与されてもよい。
【０２４７】
投与に好適な調合物は、水性のおよび非水性の溶液、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および溶質を含有する等張性の無菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含有する、水性のおよび非水性の無菌懸濁液を含む。溶液および懸濁液は、上述した種類の無菌の粉剤、顆粒剤および錠剤から調整されてもよい。
【０２４８】
フリーズドライ（freeze-drying）は、興味のあるタンパク質調整物からの水の除去に役立つ、タンパク質を提供するために通常に採用される技術である。フリーズドライ、または凍結乾燥は、乾燥される材料がまず凍結され、かつそれから氷または凍結溶質が減圧環境において除去される過程である。賦形剤が、フリーズドライ過程の間に安定性を増強するために、および／または保存に関する凍結乾燥産物の安定性を向上するために前凍結乾燥された調合物に含まれてもよい。「Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990)」および「Arakawaら Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)」。
【０２４９】
また、調合薬の噴霧乾燥は、当該分野における通常の当業者に公知である。例えば、「Broadhead, J.ら, “The Spray Drying of Pharmaceuticals,” in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)」を参照すればよい。小分子調合薬に加えて、種々の生物学的な材料が噴霧乾燥され、かつこれらは、酵素、血清、血漿、微生物および酵母を含む。噴霧乾燥は、１段階過程において、純度の高い、ほこりのないまたは凝集された粉に液体の薬学的調整物に転換することができるので、有用な技術である。基本的な技術は、以下の４つの段階：（ａ）供給溶液を噴霧に霧化すること；（ｂ）噴霧−空気接触；（ｃ）噴霧の乾燥；および（ｄ）乾燥気体から乾燥された産物の分離を包含する。米国特許第６，２３５，７１０号明細書および米国特許第６，００１，８００号明細書は、噴霧乾燥による組み換えエリスロポエチンの調整について説明しており、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２５０】
本明細書に記載されている薬学的組成物は、薬学的に受容可能な担体を備えていてもよい。薬学的に受容可能な担体は、投与される特定の組成物と同様に、組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、本明細書に記載されている非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドにとって、薬学的組成物（任意の薬学的に受容可能な担体、賦形剤または安定剤）の好適な調合物は、広範囲である（例えば、「Remington 's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985」を参照すればよい）。好適な担体は、コハク酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、イミダゾール、酢酸塩、ジカルボン酸塩および他の有機酸を含有する緩衝液；以下に限定されないが、アスコルビン酸を含む酸化防止剤；以下に限定されないが、１０残基未満のポリペプチドを含む低分子量ポリペプチド；以下に限定されないが、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンを含むタンパク質；以下に限定されないが、ポリビニルピロリドンを含む親水性重合体；以下に限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジンもしくはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミンまたはリジンを含むアミノ酸；以下に限定されないが、トレハロース、スクロース、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、２糖または他の炭水化物；以下に限定されないが、ＥＤＴＡを含むキレート剤；以下に限定されないが、亜鉛、コバルトまたは銅を含む２価の金属イオン；以下に限定されないが、マンニトールまたはソルビトールを含む糖アルコール；以下に限定されないが、ナトリウムを含む塩形成対イオン；および／または、非イオン性の界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）およびＴｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）など）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）および他のプルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄｓ）（プルロン酸Ｆ６８（ポリキサマー１８８）など）、またはＰＥＧなど）を含む。好適な界面活性剤は、例えば、以下に限定されないが、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（例えば、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、またはポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）（例えば、ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）、またはこれらの組み合わせに基づくポリエーテルを含む。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯおよびＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、Ｒ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（登録商標）およびＲ−Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（登録商標）という商標名において市販されており、かつ参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２０，３５２号明細書にさらに記載されている。他のエチレン／ポリプロピレンブロック重合体は、好適な界面活性剤であり得る。界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、以下に限定されないが、攪拌の結果生じる負荷を含む負荷に対して、（修飾）非天然アミノ酸を安定化するために使用されてもよい。上述のいくつかは、「充填剤」と呼ばれてもよい。また、いくつかは、「張性修飾剤」���呼ばれてもよい。
【０２５１】
また、本明細書に記載されているような、ＰＥＧといった水溶性重合体と組み合わされたものを含む、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、持続型の系の一部によって、または持続型の系の一部として投与されてもよい。持続型組成物は、以下に限定されないが、成型品の形態（以下に限定されないが、薄膜または微小カプセルを含む）における半透過性の重合体基質を含む。持続型基質は、ポリ（２−ヒドロキシエチル  メタクリレート）（「Langerら, J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981)」および「Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)」）、エチレンビニル酢酸塩（上述の「Langerら」）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号明細書）、ポリラクタイド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書および欧州特許出願公開第ＥＰ５８，４８１号明細書）、ポリグリコリド（グリコール酸の重合体）、ポリラクタイドコグリコリド（酪酸およびグリコール酸の共重合体）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩（「Sidmanら, Biopolymers, 22, 547-556 (1983)」）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンといったアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンならびにシリコンといった生物学的適合性材料を含む。また、持続型の組成物は、リポソームに閉じ込められた組成物であってもよい。当該組成物を含有するリポソームは、独国特許出願公開第ＤＥ３，２１８，１２１号明細書；「Eppsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)」；「Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)」；欧州特許出願公開第ＥＰ５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第ＥＰ３６，６７６号明細書；米国特許第４，６１９，７９４号明細書；欧州特許出願公開第ＥＰ１４３，９４９号明細書；米国特許第５，０２１，２３４号明細書；日本国特許出願公開第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書；米国特許第４，５４４，５４５号明細書；および欧州特許出願公開第ＥＰ１０２，３２４号明細書によって公知の方法によって調製される。上述したすべての参考文献および特許文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２５２】
リポソームに閉じ込められたポリペプチドは、例えば、独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書；「Eppsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)」；「Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)」；欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書；米国特許第４，６１９，７９４号明細書；欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書；米国特許第５，０２１，２３４号明細書；日本国特許出願公開第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書；米国特許第４，５４４，５４５号明細書；および欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書に記載されている方法によって調製されてもよい。リポソームの組成および大きさは、当該分野の通常の当業者によって経験的に容易に決定され得ることは、公知である。例えば、「Park JW,ら, Proc. Natl. Acad. ScL USA 92:1327-1331 (1995)」；「Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998)」；「Drummond DC,ら, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002)」；「Park JW,ら, Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002)」；「Nielsen UB,ら, Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3): 109-1 18 (2002)」；および「Mamot C,ら, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)」に記載されているようなリポソームのいくつかの例。上述したすべての参考文献および特許文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２５３】
本明細書に記載されている組成物、調合物および方法に従って、患者に投与される用量は、ゆっくり時間をかけて対象に有益な反応を生じさせるために十分な量であるべきである。通常、本明細書に記載されているように、非天然アミノ酸、修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの、用量ごとに非経口的に投与される薬学的に効果的な量は、患者の体重に対して、約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇまたは約０．０５ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、これは、治療的な自由裁量に依存する。また、用量の頻度は、治療的な自由裁量に依存し、ヒトにおける使用にとってよいと認めた市販の産物よりも高い頻度、または低い頻度であってもよい。通常、本明細書に記載されているように、ほんの１例として、ＰＥＧ化した（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ポリペプチドを含む、重合体：ポリペプチド接合体は、上述したあらゆる投与の経路によって投与されてもよい。
【０２５４】
＜ＸＩ．単離および精製＞
Ａ．クロマトグラフィー
本明細書のあらゆる実施形態において、共同物または受容物をポリペプチドに結合している（修飾）非天然アミノ酸ポリペプチドである、ポリペプチドの単離は、クロマトグラフィーによって起こってもよい。クロマトグラフィーは、ポリペプチドの差別的な吸着および溶出に基づいている。試料は、気体、液体または超臨界流体であり得る移動相において溶解される。この移動相は、それからカラムに、または固体表面に固定されている非混和性の固定相を通って押し進められる。固定相の例としては、固体に吸収された液体、固体表面に固着された有機種、固体、イオン交換樹脂および重合体固体の隙間にある液体が挙げられる。異なるクロマトグラフィーまたは他の単離／精製法によって精製されるポリペプチドの能力は、任意に１つ以上の天然アミノ酸との組み合わせた非天然アミノ酸を用いて、１つ以上の非天然アミノ酸の付加または置換によって調節されてもよい。このようにして、ポリペプチドの特性は、公知の基質との相互作用を増強または低減できるアミノ酸組成物を変更することによって修飾されてもよい。アミノ酸組成物の変更は、以下に限定されないが、疎水性アミノ酸含有量、親水性アミノ酸含有量、ならびに電荷、ｐＩまたは他のポリペプチドの性質の変更を含む。そのような修飾は、天然に疎水性であり、かつ本来の高次構造を維持しているために単離が困難な、膜タンパク質の単離に有用であり得る。
【０２５５】
（ガスクロマトグラフィー）
１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって生じてもよい。試料は、気化され、かつクロマトグラフィーカラムの先端に注入される。気体の移動相の例として、以下に限定されないが、ヘリウム、アルゴン、窒素、２酸化炭素、および酸素が挙げられる。１つの実施形態において、試料は、固定相が固体である気固クロマトグラフィーによって単離される。他の実施形態において、ポリペプチドは、固定相が不活性固体の表面に不動化された液体である、気液クロマトグラフィーによって単離される。液体の固定相の例としては、ポリジメチルシロキサン、ポリ（フェニルメチルジメチル）シロキサン（１０％のフェニル）、ポリ（フェニルメチル）シロキサン（５０％のフェニル）、ポリ（トリフルオロプロピルジメチル）シロキサン、ポリエチレングリコールおよびポリ（ジシアノアリルジメチル）シロキサンが挙げられる。
【０２５６】
従来のＣＧカラムは、充填または中空の、管状またはキャピラリーのいずれかである。ＧＣクロマトグラフィーカラムは、２ｍ以下からから５０ｍ以上までの長さに変更される。これらの構築物に使う材料の例としては、ステンレス鋼、金属、ガラス、溶融石英およびテフロン（登録商標）が挙げられる。通常、ＧＣカラムは、おおよそ２から４ｍｍの内径を有している。マイクロＧＣは、おおよそ１ｍの内径を有している。キャピラリーＧＣは、おおよそ１００から７５０μｍの内径を有するキャピラリーを利用する。ナノＧＣは、５０μｍから１ｍｍの内径を利用可能である。
【０２５７】
（液体クロマトグラフィー）
１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）によって生じる。ＬＣは、固定相を覆う液体担体の使用を含む。ＬＣカラムの大部分は、１０から３０ｃｍの長さの範囲である。ＬＣカラムは、通常、滑腔ステンレス鋼配管から構築されるが、ときには厚ガラス配管に出くわす。従来のＬＣカラムは、おおよそ４．６ｍｍの内径およびおおよそ１ｍｌ／分の流速を有する。マイクロＬＣは、おおよそ１．０ｍｍの内径およびおおよそ４０μｌ／分の流速を有する。キャピラリーＬＣは、おおよそ３００μｍの内径およびおおよそ５μｌ／分の流速を有するキャピラリーを利用する。ナノＬＣは、おおよそ５０μｍ−１ｍｍの内径および２００ｎｌ／分の流速を利用可能である。ナノＬＣは、例えば、５、１５または２２５ｃｍの長さに変更可能である。また、ナノＬＣの固定相は、重合体モノリスまたはゾルゲルモノリスといったモノリス材料であってもよい。２つの基本的な種類の充填材料は、液体クロマトグラフィーにおいて、無孔性または多孔性の粒子が使用される。ビーズまたは粒子は、通常、粒径および孔径によって性質決定される。粒径は、通常、３から５０ミクロンの間の範囲にある。より大きな粒子は、系の圧力低下を生じ、かつより小さい粒子は、圧力の上昇を生じる。当該より小さい粒子は、通常、より高い分離効率を示す。粒子の孔径は、オングストロームにおいて計られ、かつ通常、１００−１００オングストロームの間の範囲にある。これらは、多孔質層、アルミナ、イオン交換樹脂、有機表面層、重合体、リガンド、炭水化物または特異的な共同因子を用いて覆われていてもよい。
【０２５８】
本発明の１つの実施形態において、ポリペプチドは、ＨＰＬＣ技術を用いて単離されてもよい。本発明の他の実施形態において、ポリペプチドは、カラムクロマトグラフィーを用いて単離されてもよい。カラムクロマトグラフィーにおいて、固体媒体が、クロマトグラフィーカラムに充填されており、かつポリペプチドを含有する最初の混合物が、結合可能なようにカラムを通される。それから、洗浄緩衝液がカラムを通され、かつ続いて、溶出緩衝液が試料回収のためにカラムに注がれる。これらの段階は、環境圧力において実施されてもよい。他の実施形態において、固定相に対するポリペプチドの結合は、容器における固定相に最初の混合物を加えること、２つをともに混合すること、（例えば、遠心分離によって）固定相を分離すること、液相を除去すること、洗浄すること、再遠心分離すること、溶出緩衝液を加えること、再遠心分離すること、および溶出液を除去することによって、バッチ（Ｂａｔｃｈ）処理を用いて達成されてもよい。本発明の他の実施形態において、結合がバッチ法によって行われ、それから標的分子結合を用いた固相がカラムに充填され、かつ洗浄および溶出がカラム上において実施される、混成方法が採用される。本発明のさらなる他の実施形態において、ポリペプチドの単離は、マイクロ流体装置において生じる。本発明の他の実施形態において、ポリペプチドの単離は、ナノ流体装置において生じる。
【０２５９】
（分配クロマトグラフィー）
１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、分配クロマトグラフィーによって生じる。１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、液液分配クロマトグラフィーによって生じる。液液分配クロマトグラフィーを用いて、液体固定相は、物理吸着によって充填材の表面に保持される。他の実施形態において、ポリペプチドの単離は、結合相（bonded phase）分配クロマトグラフィーを用いて、固定相は、支持表面に化学的に結合されている。
【０２６０】
他の実施形態において、順相クロマトグラフィーが、ポリペプチドの単離に使用される。順相クロマトグラフィーにおいて、極性固定相が、非極性溶媒とともに使用される。順相クロマトグラフィー用の固定相の例としては、以下に限定されないが、水、アルコールおよびトリエチレングリコールが挙げられる。順相クロマトグラフィー用の非極性溶媒の例としては、以下に限定されないが、エチル、エーテル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、フルオロアルカン、シクロヘキサン、１−クロロブタン、４塩化炭素、トルエン、ジエチルエーテル、ヘキサンおよびｉ−プロピルエーテルが挙げられる。１つの実施形態において、分配クロマトグラフィーは、逆相充填物を使用し、これは、逆相クロマトグラフィーと呼ばれる。逆相クロマトグラフィーにおいて、非極性固定相が、極性移動相とともに使用される。逆相クロマトグラフィー用の固定相の例としては、以下に限定されないが、炭化水素、エーテル、エステル、ケトン、アルデヒド、アミド、およびアミンが挙げられる。逆相クロマトグラフィー用の移動固定相の例としては、水、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジオキサン、ニトロメタン、エチレングリコール、テトラヒドロフランおよびアセトニトリルが挙げられる。
【０２６１】
１つの実施形態において、ポリペプチドの単離に使用され得る逆相クロマトグラフィーの種類は、イオン対クロマトグラフィーである。イオン対クロマトグラフィーにおける移動相は、メタノールまたはアセトニトリルといった有機溶媒を含む水性緩衝液、ならびに当該ポリペプチドに対して逆電荷の対イオンを含むイオン性化合物から構成される。それから、イオン対の溶出は、上述したものの１つのようなメタノールの水性溶液、または他の水溶性有機溶媒を用いて達成される。対イオンの例としては、ＣｌＯ４−、Ｃ１２Ｈ２５ＳＯ３−、（Ｃ４Ｈ９）４Ｎ＋、（Ｃ１６Ｈ３３）（ＣＨ３）３Ｎ＋、ビス−（２−エチルヘキシル）リン酸塩、および（Ｃ４Ｈ９）４Ｎ＋などが挙げられる。
【０２６２】
１つの実施形態において、ポリペプチドは、キラル固定相を有する分配クロマトグラフィーを用いて単離されてもよい。キラル固定相の種類の例としては、以下に限定されないが、小分子量のキラル、セルロースおよびアミロースの重合体、大環式の糖ペプチドならびにシクロデキストリンを基礎にした材料が挙げられる。
【０２６３】
（吸着クロマトグラフィー）
１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、吸着クロマトグラフィーによって生じる。吸着は、材料（移動相に含まれる）が、材料の単一の層（または複数の層）を固定相に付着させる物理力によって、固定相と相互作用する過程である。ほとんどの場合における固定相は、固体（例えば、シリカゲル、アルミナ、炭など）であろうし、また、ときに液体（例えば、水面上における界面活性剤）であろう。（複数の）表面層は、単一、２重または多重であってもよい。吸着クロマトグラフィーに使用され得る溶媒の例としては、水、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジオキサン、ニトロメタン、エチレングリコール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エチル、エーテル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、フルオロアルカン、シクロヘキサン、１−クロロブタン、４塩化炭素、トルエン、ジエチルエーテル、ヘキサンおよびｉ−プロピルエーテルが挙げられる。
【０２６４】
（イオン交換クロマトグラフィー）
１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、イオン交換クロマトグラフィーによって生じる。イオン交換クロマトグラフィーにおいて、ポリペプチドの単離は、イオン交換樹脂に基づいている。イオン交換樹脂は、陰イオン交換樹脂、または陽イオン交換樹脂であり得る。イオン交換樹脂は、クレイ（clay）およびゼオライトといった天然のイオン交換体、または合成イオン交換体によって作製され得る。陽イオン交換樹脂に関する通常の活性部位の例は、スルホン酸基−ＳＯ３−Ｈ＋、カルボン酸基−ＣＯＯ−Ｈ＋およびリン酸基ＰＯ３２＋Ｈ２である。陰イオン交換樹脂に関する通常の活性部位の例は、４級アミン基−Ｎ（ＣＨ３）＋ＯＨ−または１級アミン基−ＮＨ３＋ＯＨ−である。イオン交換クロマトグラフィーにおける移動相は、通常、適量のメタノールまたは他の水混和性ではない有機溶媒を含有する、水性溶液であり、また、これらの移動相は、緩衝液の形態としてイオン性種を含有する。
【０２６５】
１つの実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、塩濃度勾配を用いて溶出される。１つの例において、ポンプが緩、カラムを通過していくイオン濃度を連続的に一定に増加させるように衝液に対して次第に増加する量の塩を加える。それから、タンパク質は、緩衝液のイオン強度が電荷を中立化するときに、カラムの固定相から「溶出する」または離れる。最小に荷電された分子が最初に離れ、かつ最大に荷電された分子が最後に離れる。他の実施形態において、カラムは、所望のタンパク質が溶出するまで、次第に増強されるイオン強度の緩衝液を用いて、完全に洗浄処理され、この正確な同じ系列は、再現性の高い収量およびタンパク質の精製を得るために、同量の緩衝液を用いて毎回繰り返される。
【０２６６】
１つの実施形態において、試料は、イオン交換クロマトグラフィーによる所望のタンパク質の単離後に、高塩濃度の緩衝液の除去が実施される。１つの実施形態において、高塩濃度の除去は、透析によって実施されてもよい。透析は、半透膜を利用する。透析膜の主な特徴は、多孔質であることである。しかし、孔径は、小さな塩イオンが膜を自由に通過し、大きなタンパク質分子が通過できない（例えば、これらが保持される）ような大きさである。従って、透析膜は、保持するであろう最も小さい球状タンパク質の分子量によって特徴付けられる。高塩濃度の除去は、１回のまたは複数回の透析段階において達成されてもよい。他の実施形態において、高塩濃度の除去は、電気透析によって実施される。電気透析は、イオンが、電位勾配の影響下において、イオン透過膜を介して１つの溶液から他の溶液に輸送される、電気膜過程である。電気透析に使用される膜が、正または負の電荷を有し、かつ逆電荷のイオンを拒絶するので、電気透析は、電解質の濃縮、除去または分離に有用である。
【０２６７】
１つの実施形態において、塩の高濃度の除去は、重力流れゲルろ過における脱塩カラムを用いて実施される。重力流れゲルろ過は、好適な固定相に進入する相対的な能力に基づいて、異なる容積の分子のクロマトグラフィー分離に関する。脱塩カラムは、小さな多孔質のセルロースビーズを用いて充填される。これらのカラムは、特定の直径を有する湿性のビーズを有する。使用されるビーズの直径は、所望のペプチドの分子量に依存するだろう。分離の異なるレベルは、カラムに充填された媒体の孔径に基づいて実施されてもよい。当該媒体は、小さな溶質を含む限りにおいて、全体的に除去するタンパク質または大きな分子に対して選択されてもよい。大分子は、ゲルの内孔から締め出され、かつカラムから最初に現れる。小分子は、孔内に進入可能であり、かつそれから、より遅い速度においてカラムを進む。これらのより小さな分子は、その後に、付加的な容積の緩衝液を用いてカラムを通って勢い良く流される。
【０２６８】
（サイズ排除クロマトグラフィー）
１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、また、ゲル透過クロマトグラフィーまたはゲルろ過クロマトグラフィーとして知られる、サイズ排除クロマトグラフィーによって生じる。充填物の平均孔径よりも大きい分子は、排除されて、従って保持されない。サイズ排除クロマトグラフィー用の充填物の例としては、シリカ、セルロースビーズおよび重合体粒子が挙げられる。従来、多孔質のガラス、およびシリカ粒子は、４０オングストロームから２５００オングストロームの範囲にある平均孔径を有する。いくつかの実施形態において、１０２オングストロームの平均孔径を有する重合体充填物の分子量排除限界は、７００である。他の実施形態において、１０３オングストロームの平均孔径を有する重合体充填物の分子量排除限界は、（０．１−２０）×１０４である。他の実施形態において、１０４オングストロームの平均孔径を有する重合体充填物の分子量排除限界は、（１−２０）×１０４である。他の実施形態において、１０５オングストロームの平均孔径を有する重合体充填物の分子量排除限界は、（１−２０）×１０５である。さらなる他の実施形態において、１０５オングストロームの平均孔径を有する重合体充填物の分子量排除限界は、（５−１０）×１０６である。いくつかの実施形態において、１２５オングストロームの平均孔径を有する重合体充填物の分子量排除限界は、（０．２−５）×１０４である。他の実施形態において、３００オングストロームの平均孔径を有する重合体充填物の分子量排除限界は、（０．０３−１）×１０５である。他の実施形態において、５００オングストロームの平均孔径を有する重合体充填物の分子量排除限界は、（０．０５−５）×１０５である。さらなる他の実施形態において、１０００オングストロームの平均孔径を有する重合体充填物の分子量排除限界は、（５−２０）×１０５である。
【０２６９】
（薄層クロマトグラフィー）
他の実施形態において、ポリペプチドの単離は、薄層クロマトグラフィーによって生じることができる、薄層クロマトグラフィー法は、ろ紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび電気クロマトグラフィーに関する。いずれも、自己支持する、またはガラス表面、樹脂表面または金属表面の上に載せられている平らな薄層を利用する。移動相は、毛細管作用によって、ときには重力または電位に助けられて、固定相を通って移動する。１つの実施形態において、繊細に分割された粒子の薄い吸着層を用いて覆われた、平坦なガラス板または樹脂板上において、２次元分離が実施される。固定相および移動相は、吸着クロマトグラフィー、順相分配クロマトグラフィーおよび逆相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ならびにサイズ排除クロマトグラフィーにおいて述べられたものと同様である。１つの実施形態において、ポリペプチドは、有機化合物と反応して黒い産物を産生する溶液を板に噴霧することによって配置される。この種の溶液の例としては、ニンヒドリン、ヨード溶液および硫酸溶液が挙げられる。他の実施形態において、固定相に蛍光材料を組み込むことによって配置されてもよい。この板は、紫外光の下において調べられる。試料化合物は、板の全体が、非蛍光性試料化合物が位置している場所を除いて蛍光を放つように、蛍光材料を抑制する。
【０２７０】
（アフィニティークロマトグラフィー）
１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、アフィニティークロマトグラフィーによって生じることができる。アフィニティークロマトグラフィーは、分子の公知のサブセットと可逆的に結合する所望の固定相の能力に頼っている。親和性精製は、通常、以下の段階（１）標的分子の不動化されたリガンドとの結合を可能にする不動化されたリガンド支持材料と、未精製の試料をインキュベートする、（２）固体支持体から結合していない試料化合物を洗い流す、および（３）結合相互作用が生じなくなるような緩衝液条件に変えることによって、不動化されたリガンドから標的分子を溶出（分離および回収）する、を含む。アフィニティークロマトグラフィーに使用される溶出緩衝液の例としては、以下に限定されないが、１００ｍＭのグリシン  ＨＣＬ、１００ｍＭのクエン酸、５０−１００ｍＭのトリス、１０ｍＭのリン酸緩衝液における５Ｍの塩化リチウム、２．５Ｍヨウ化ナトリウム、０．２−３．０のナトリウムチオシアン酸塩、２−６Ｍのグアジニン  ＨＣｌ、２−８Ｍの尿素、１％のＳＤＳ、１０％のジオキサン、５０％のエチレングリコール、５０％のエチレングリコールを有する０．１Ｍのグリシン−ＮａＯＨ、３．０Ｍの塩化カリウム、２．０ＭのＮａＣｌを有する０．１Ｍのトリス−酢酸塩、５．０Ｍのヨウ化カリウム、１％ＳＤＳ、１％のナトリウムデオキシコール酸塩、２．０Ｍの尿素、６．０Ｍの尿素、２．０Ｍのグアジニン−ＨＣｌ、１．０Ｍのアンモニウムチオシアン酸塩、ならびに＞１．０Ｍの逆リガンドまたは類縁物質が挙げられる。
【０２７１】
１つの実施形態において、固定相は、以下に限定されないが、特異的な炭化水素または共同因子を含むリガンドを、含む。１つの実施形態において、それから、ポリペプチドは、高濃度の当該炭化水素または特異的な共同因子を用いて溶出される。結合部位の模倣物は、固定相としてときに使用されてもよい。固定相に使用される特異的な糖、阻害剤、または共同因子は、ポリペプチドの特性に従って、変更されるだろう。本発明の本実施形態は、当該分野において公知の、あらゆるリガンド、炭化水素または共同因子を包含する。
【０２７２】
他の実施形態において、不動化された固定相は、色素を含む。色素−リガンドクロマトグラフィーに通常に使用される色素の例としては、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  ２（Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  ３ＧＡ）、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  １２０（Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｒｅｄ  ＨＥ３Ｂ）、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  ４（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  ＭＲＢ）ＴＣ、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｅｅｎ  ５（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｅｅｎ  Ｈ４Ｇ）ＴＣ、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｅｅｎ  １９（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｅｅｎ  ＨＥ４ＢＤ）ＴＣ、Ｇｒｅｅｎ  １９Ａ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｅｅｎ  ＨＥ４ＢＤ）ＴＣ、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｙｅｌｌｏｗ  ８６（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｍ８Ｇ）ＴＣおよびＲｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｒｏｗｎ  １０（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｒｏｗｎ  Ｍ４Ｒ）ＴＣが挙げられる。
【０２７３】
他の実施形態において、固定相は、金属キレート樹脂を含む。金属キレートクロマトグラフィーにおいて、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋およびＮｉ２＋といった金属イオンは、ポリペプチドの表面に置かれた電子供与基との可逆的な相互作用に関与するキレート結合によってクロマトグラフィー固定相に不動化されている。電子基供与物が非プロトン化された形態において少なくとも存在するｐＨ値において、ポリペプチドは、固定相と結合され、かつ続いて、電子基がプロトン化されるより低いｐＨ値を有する緩衝液によって溶出される。キレート樹脂の例としては、８−ヒドロキシキノリン、サリチル酸、ジエチレントリアミン、ジエチレントリアミンテトラ酢酸、エチレントリアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）およびニトリロ−トリ酢酸が挙げられる。
【０２７４】
１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、免疫親和性クロマトグラフィーによって生じることができる。免疫親和性クロマトグラフィーまたは免疫吸着クロマトグラフィーの原理は、結合能力を保持する様式において固定相上に不動化されるリガンドとして、抗体または抗体断片を利用している。保持されたポリペプチドの溶出は、抗体−抗原相互作用を弱める移動相の条件に変更することによって、達成される。溶出条件は、抗原と抗体とをともに保持するイオン結合、疎水結合、水素結合を破壊することが意図される。上手く行く溶出条件は、生じている特異的な抗原−抗体相互作用に依存するだろう。
【０２７５】
ポリペプチドに存在する非天然アミノ酸を認識する抗体が、生成されてもよい。そのような抗体は、複雑な混合物、または樹脂といった支持体上の他の分子とのポリペプチドの接合から非天然アミノ酸を精製する、アフィニティークロマトグラフィー、非天然アミノ酸ポリペプチドの存在を検出する免疫アッセイ、ならびに抗体を使用する他のアッセイに使用されてもよい。ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、またはポリペプチドの他の部分に存在する１つ以上の非天然アミノ酸を認識する抗体が、使用されてもよい。
【０２７６】
非天然アミノ酸ポリペプチドが、抗体、抗体断片、または抗原結合ポリペプチドもしくはこれらの断片であってもよく、かつアフィニティークロマトグラフィーによる抗原の単離に使用されてもよい。
【０２７７】
１つの実施形態において、ポリペプチドは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって生じることができる。ポリペプチドは、親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸および疎水性非天然アミノ酸を含有していてもよい。ポリペプチドは、疎水性化合物と可逆的に結合する能力によって、それらの相対的な疎水性に従って、分離される。ポリペプチドは、緩衝液における塩濃度の減少を用いてカラムから溶出される。疎水性化合物の例としては、以下に限定されないが、疎水性脂肪酸鎖、ｎ−ブチル官能基を有する化合物、ｎ−オクチル官能基を有する化合物、およびフェニル官能基を有する化合物が挙げられる。
【０２７８】
（超臨界流体クロマトグラフィー）
１つの実施形態において、ポリヌクレオチドの単離は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）によって生じることができる。ＳＦＣにおいて、試料は、混合物が、カラムにおける分析物と固定相との間における相互作用の総計に基づく固有のバンドに分離される、分離カラムを通って、超臨界流体によって運ばれる。従来のＳＦＣカラムは、充填および中空の、管状またはキャピラリーのいずれかである。中空管カラムは、１０ｍから２０ｍ以上までの長さに変動する。代表的な中空管カラムは、おおよそ０．０５から４ｍｍの内径を有する。充填カラムは、０．５ｍｍ以下から４．６ｍｍまでの直径に変動し、３から１０μｍの範囲にある粒径を有する。充填カラムは、固定相が付着する小さな不活性化粒子を含有する。カラムは、従来、ステンレス鋼である。キャピラリーカラムは、当該カラムの壁と結合された固定相を有する、溶融石英から作製された狭い内径の蓋のない管状カラムである。被服物は、分配クロマトグラフィーに使用される被服物を同様である。ＳＦＣに使用される超臨界流体の例としては、以下に限定されないが、２酸化炭素、エタン、ペンタン、亜酸化窒素、ジクロロジフルオロメタン、ジエチルエーテル、ジエチルエーテル、アンモニアおよびテトラヒドラフランが挙げられる。いくつかの使用において、メタノールといった極性有機修飾物が低濃度（１−５％）において導入される。
【０２７９】
Ｂ．沈降
１つの実施形態において、ポリペプチドと共同物または受容体を結合している、（修飾）非天然アミノ酸ポリペプチドの単離は、沈降によって生じることができる。ポリペプチドの可溶性は、溶液のイオン強度およびｐＨの作用である。ポリペプチドは、アミノ酸の側鎖基の電荷が互いに釣り合う等電点を有する。溶液のイオン強度が非常に高いか、または非常に低いかのいずれかであるならば、タンパク質は、それらの等電点において沈降する傾向がある。１つの実施形態において、溶液のイオン強度は、塩の添加によって増強されるだろう。沈降法に使用される塩の例としては、以下に限定されないが、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウムが挙げられる。タンパク質沈降に関して当該分野において公知のあらゆる塩が本発明のあらゆる実施形態に使用されてもよい。他の実施形態において、ポリペプチドは、重合体を有する溶液から強制的に外に出される。通常に沈降に使用され得る重合体の一例は、ポリエチレングリコールである。タンパク質沈降に関して当該分野において公知のあらゆる重合体が本発明のあらゆる実施形態に使用されてもよい。１つの実施形態において、沈降されたポリペプチドは、遠心分離またはろ過によって取り出される。
【０２８０】
１つの実施形態において、溶液に塩を加えることによって所望のポリペプチドを沈降した後に、試料は、高塩濃度の除去に供される。脱塩法は、イオン交換クロマトグラフィーの項において説明されている。
【０２８１】
（免疫沈降）
本発明の１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、免疫沈降（ＩＰ）によって生じることができる。ＩＰは、特異抗体を用いた、抗原の小規模な親和性精製のことを言う。古典的な免疫沈降は、以下の段階：（１）特異抗体を、抗原を含む試料とともにインキュベートする、（２）不動化されたＰｒｏｔｅｉｎ  ＡアガロースゲルまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇアガロースゲル（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇは、抗原に結合されている抗体を結合する）を用いて抗体−抗原複合体を捕獲する（３）緩衝液を用いて当該ゲルを洗浄して非結合試料化合物を除去する、（４）抗原（および抗体）を溶出する、を含む。
【０２８２】
本発明の１つの実施形態において、古典的なＩＰは、不動化されたＰｒｏｔｅｉｎ  ＡアガロースゲルまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇアガロースゲルを用いてポリペプチド含有試料を有する遠心分離チューブにおいて実施される。当該ゲルは、各段階（洗浄および溶出）の後に、遠心分離によってペレットにされ、かつ上清が除去される。通常、溶出試料は、抗原および抗体の両方をいつも含んでおり、溶出された試料の還元ゲル電気泳動によって、抗原のバンドと、重鎖抗体断片および軽鎖抗体断片のバンドとの両方が生じる。電気泳動ゲルから分離されたポリペプチドを得る方法は、当該分野における通常の当業者にとって公知である。
【０２８３】
本発明の他の実施形態において、溶出された抗原の抗体汚染を回避するために、古典的なＩＰ法の改変が抗体が持続的に不動化され、かつ抗原とともに溶出しないように、なされてもよい。１つの例において、抗体は、プロテインＡゲルまたはプロテインＧゲルに最初に結合され、かつそれから抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧと共有的に架橋される。他の例において、抗体は、活性な親和性支持体対して直接に連結される。非天然アミノ酸ポリペプチドは、抗原結合ポリペプチドであり、かつ免疫沈降に使用されてもよい。
【０２８４】
１つの実施形態において、支持材料は、架橋された玉状のアガロース、または架橋されたビス−アクリルアミドとアズラクトンとの共重合体といった、多孔質のゲルである。本発明の１つの実施形態において、ポリペプチドは、磁気親和性分離によって単離されてもよい。所望の分子を含有する試料は、抗体または他の結合共同物を磁気ビーズとともにインキュベートされる。磁界は、溶液または表面から磁性ビーズを引き抜くために、使用される。あらゆる非結合分子を含有している緩衝液は、注意深く除去されてもよい。所望の分子の単離にとっての磁性ビーズを用いる手法は、当該分野において公知である。磁性ビーズは、以下に限定されないが、カルボン酸もしくは１級アミンである活性基、またはストレプトアビジン、ヤギ抗マウスＩｇＧ、ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧ、プロテインＡ、もしくはプロテインＧといった特異的な親和性分子を含有するために、誘導体化されてもよい。他の実施形態において支持体は、ミクロプレートである。
【０２８５】
Ｃ．電気泳動
本明細書におけるあらゆる実施形態において、ポリペプチドの単離は、電気泳動によって生じることができる。電気泳動は、電解において、分子の大きさおよびイオン電荷に基づいたゲルを介した差別的な移動パターンによる、ポリペプチドといったイオン性分子の分離である。電気泳動は、ゲルにおいて、キャピラリーにおいてまたはチップ上において実施されてもよい。電気泳動に使用されるゲルの例としては、スターチ、アクリルアミド、アガロースまたはこれらの組み合わせが挙げられる。ゲルは、架橋、界面活性剤の添加、酵素の不動化もしくは抗体の不動化（親和性電気泳動）もしくは基質の不動化（酵素電気泳動法）およびｐＨ勾配によって修飾されてもよい。電気泳動ゲルからポリペプチドを得る方法は、当該分野における通常の当業者に公知である。
【０２８６】
（キャピラリー電気泳動）
１つの実施形態において、共同物または受容体をポリペプチドと結合している（修飾）非天然アミノ酸ポリペプチドである、ポリペプチドの単離は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって生じることができる。ＣＥは、複雑な疎水性分子および高い電荷溶質の分離用に使用されてもよい。ＣＥは、小さな試料（０．００１から１０μＬの範囲にある大きさ）の利用、早い分離、容易な再現性、非常に高い効率、何百もの組成物が同時に分離され得るという価値、容易に自動化される、定量的に使用され得る、および試薬の限られた量の消費という利点を含む。通常、ＣＥ技術は、狭い内径の溶融石英キャピラリーを用いて、複雑な大量の大分子および小分子を分離する分離技術に関する。電荷、大きさおよび疎水性における差異に基づいて分子を分離するために、高い電圧が使用される。使用されるキャピラリーおよび緩衝液の種類に依存して、ＣＥは、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、およびキャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）といった分離技術に、さらに分かれる。
【０２８７】
また、自由溶液ＣＥ（ＦＳＣＥ）として知られるキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、ＣＥのもっとも簡単な形態である。ＣＺＥの分離機序は、分析物の質量に対する電荷の割合における差に基づいている。ＣＺＥにとっての原則は、キャピラリーの長さ全体に渡る、緩衝液の同質性、および一定の電界強度である。分離は、主に、溶質における酸性基のｐＨ制御された電離、または溶質における塩基性基のプロトン化に依存する。
【０２８８】
キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）は、ポリペプチドといった両性分子が、陰極と陽極との間のｐＨ勾配において、電気泳動によって分離されることを可能にする。溶質は、最終的な電荷が０になる点に移動する。この等電点（溶質のｐＩ）において、移動は停止し、かつ試料は、狭い帯域に集中される。ＣＩＥＦにおいて、溶質がそのｐＩに集中されると、その帯域は、圧力手段または化学手段のいずれかによって、検出器を通って移動される。
【０２８９】
ＣＥＣは、これまでの液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とＣＥとの混成技術である。基本的には、ＣＥキャピラリーは、ＨＰＬＣ充填物を用いて充填されており、かつ電気浸透流を生成する電圧が充填されたキャピラリーを通して印加される。ＥＯＦは、溶質を、検出器に向かってキャピラリーに沿って輸送する。溶質の差別的な区分けおよび電気泳動的な移動の両方が、それらの検出器に向かう、ＣＥＣ分離に導く輸送の間に生じる。従って、ＨＰＬＣおよびＣＥの両方に比べて、ＣＥＣを用いて固有の分離選択性を得ることが可能である。ＥＯＦの有効な流れ性質は、バンドのブロード化に関する流れを低減し、かつ１メートルごとに数十万のプレートの分離効率が、ＣＥＣにおいてしばしば得られる。また、ＣＥＣは、小さな径の充填材の使用を可能にし、かつ非常に高い効率を達成する。
【０２９０】
ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＣＣ）は、非荷電溶質の分離を可能にするキャピラリー電気泳動法である。この技術において、ドデシル硫酸ナトリウムといった界面活性剤は、ミセルを形成する臨界ミセル濃度を超える量を、動作緩衝液に加えられる。この種の非イオン性ミセルの表面は、それらに対して陽電極に向かう大きな電気泳動度を与える大きな負の電荷を有する。しかし、ほとんどの緩衝液は、非イオン性ミセルが陰電極に運ばれる高さの電気浸透性の割合（大きく低減された割合において）を示す。これは、水相の高速な移動、およびミセル相のより遅い移動を形成する。試料が、この系に導入されると、成分は、ミセルの内部において、水相と炭化水素相との間において自身を分配する。
【０２９１】
選択可能に、等速電気泳動（ＩＴＰ）は、不連続な緩衝液を用いた電気泳動分離によって試料の濃縮方法である。等速電気泳動において、２つの異なる緩衝液の系が、分析物を分離する帯域を作り出すために、使用される。等速電気泳動の実験中において、カチオンまたはアニオンの両方ではない、いずれかを分離することが可能である。ＩＴＰにおいて、大量の試料が、先行電解液と終末電解液との間に配置される。試料における分析物は、それらの移動度に従って次々と、狭いバンドに積み重なる。この技術は、キャピラリー電気泳動と併せて使用され、ここで、不連続な電解質の系がキャピラリーにおける試料注入部位に使用される。
【０２９２】
さらに、一時的等速電気泳動（ｔＩＴＰ）は、通常にキャピラリー電気泳動（ＣＥ）と併せて使用されるこの技術の変形である。「Foret, F.,らin "Trace Analysis of Proteins by Capillary Zone Electrophoresis with On-Column Transient Isotachophoretic Preconcentration". Electrophoresis 1993, 14, 417-428 (1993)」には、ｔＩＴＰの実施に関して、２つの電解質の配置について説明されている。
【０２９３】
１つの配置が、キャピラリーによって接続される２つのリザーバを採用している。キャピラリーおよび１つのリザーバは、先行電解質（ＬＥ）を用いて満たされると同時に、第２のリザーバは、終末電解質（ＴＥ）を用いて満たされている。分析用の試料はまず、ＬＥに満たされたキャピラリーに注入され、かつキャピラリーの注入端は、ＴＥを含むリザーバに挿入される。電位が印加されると、ＬＥおよびＴＥの移動度に対して中間の移動度を有する試料の成分が鮮明なＩＴＰ帯域に積み重なり、かつ定常状態濃縮を実現する。そのような帯域の濃縮は、ＴＥの濃度ではなく、ＬＥ共イオンの濃度に関係する。
定常状態に達すると、ＴＥを含むリザーバは、ＬＥを含むリザーバに置き換えられる。これは、個々の種をゾーン電気泳動様式に移すことができるＴＥの濃度ではなく、鮮明なＩＴＰ帯域の積み重ねの解除を生じる。
【０２９４】
Foret, F.,らによって明確にされた他の構成は、類似の研究方法を採用しているが、各リザーバに単一の背景電解質（ＢＧＥ）を使用する。ＢＧＥ共イオンの移動度は、終末イオンとしての役割を果たすことが可能なほどに低い。分析用の試料は、ｔＩＴＰ移動の間において、先行帯域としての役割を果たすが可能なほどに高い電気泳動度を有する付加的な共イオンを含んでいる。試料がキャピラリーに注入され、電圧が印加された後に、試料におけるより高い移動度の先行イオンは、対称な先行境界域および鮮明な後ろ境界域を形成する。後ろの境界域のすぐ後ろに、導電率の不連続が形を成し、かつこれが不均一な電解を生じて、このようにして試料イオンの積み重ねが生じる。移動が進行しているとき、先行帯域は、エレクトロマイグレーションの分散によって広がり、かつより移動度の高い塩の濃度が低下する。この結果は、移動帯域に沿って電解の差を低下させる。先行帯域のある濃度において、試料バンドは、積み重ねが解除され、かつゾーン電気泳動様式における速度とは独立に移動する。ポリペプチドの単離は、キャピラリー電気泳動（例えば、キャピラリーまたはチップ上において）またはクロマトグラフィー（例えば、キャピラリー、カラムまたはチップ上において）といった、当該分野において公知のあらゆる手法を含むことができる。
【０２９５】
Ｄ．汚染の除去方法
本発明のある実施形態において、所望のポリペプチドを得るための第１の精製手順に続いて、汚染物を除去する第２の精製段階が必要であってもよい。汚染物は、阻害剤、妨害物質または不適切な緩衝液であり得る。本発明の１つの実施形態において、汚染物の除去は、生物学的分子の複雑な混合物から所望のタンパク質を特異的に精製することによって、達成されるであろう。本発明の他の実施形態において、汚染物の除去は、所望のタンパク質を含む試料から汚染物を特異的に除去することによって達成されるであろう。例えば、不動化されたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａは、免疫グロブリンが汚染物であると考えられる場合において、試料から免疫グロブリンを選択的に除去するために使用されてもよい。さらに他の実施形態において、フィルターが試料から所望の成分を除去するために使用されてもよい。麗としては、以下に限定されないが、大きさおよび分子量を基準にして、分子を分離する、サイズ排除クロマトグラフィーおよび限外濾過膜が挙げられる。さらにたの実施形態において、試料から所望の成分を除去するために、超遠心分離が使用される。超遠心分離は、最適な系を用いて、粒子の沈降（またはこれらがないこと）を監視する試料の遠心分離を含むことができる。本発明の他の実施形態において、試料から所望の成分を除去するために、電気透析が使用される。電気透析は、電位勾配の影響下において、１つの溶液から他の溶液にイオン透過性膜を介して、イオンが輸送される電気膜過程である。当該膜が、正のまたは負の電荷を有するイオンを選択的に輸送する能力を有し、かつ逆の電荷のイオンを拒絶する、電気透析に使用されるので、電気透析は、電解質の濃縮、除去または分離に有用である。
【０２９６】
（エンドトキシンの除去）
本発明のある実施形態において、試料からエンドトキシンを除去する必要があり得る。エンドトキシンは、グラム陰性細菌の発熱性リポ多糖（ＬＰＳ）成分である。これらの細菌は、広範に分布しているので、エンドトキシンが生化学的な調整物の頻繁な汚染物であることは、意外なことでない。エンドトキシン汚染は、通常、エンドトキシンユニット（ＥＵ）として測定され、ここで、１ＥＵは、発熱反応の発生に十分な濃度のエンドトキシンと対応する。１つの実施形態において、エンドトキシンの除去は、超遠心分離によって実施される。他の実施形態において、エンドトキシンの除去は、不動化されたポリミキシン  Ｂを用いて実施される。エンドトキシンのレベルを低下させる方法は、当該分野における通常の当業者に公知であり、以下に限定されないが、シリカ支持体、ガラス粉末またはヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、相互作用クロマトグラフィーならびにこれらの技術の組み合わせなどを含む。エンドトキシンレベルを測定する方法は、当該分野における当業者に公知であり、以下に限定されないが、カブトガニ血球抽出液（ＬＡＬ）アッセイを含む。
【０２９７】
（界面活性剤の除去）
本明細書のある実施形態において、試料における界面活性剤のいくらかまたはすべてを除去する必要があり得る。例えば、おおくの水溶性ポリペプチドが、界面活性剤に可溶化した形態において、機能的であるが、他のポリペプチドは、界面活性剤への可溶化によって修飾または不活性化されるかもしれない。１つの実施形態において、界面活性剤の除去は、透析によって生じることができる。透析は、高いＣＭＣｓ（臨界ミセル濃度および／または小さい凝集数を有する、Ｎ−オクチルグルコシドといった界面活性剤の除去に有効である。他の実施形態において、試料からの界面活性剤の除去は、ショ糖密度購買分離によって生じることができる。さらなる他の実施形態において、界面活性剤は、サイズ排除クロマトグラフィーによって、試料から除去されてもよい。
【０２９８】
Ｅ．組み換えポリペプチド
本発明の１つの実施形態において、ポリペプチドの単離は、ハイブリッドタンパク質を合成する遺伝工学的技術を使用してもよい。興味のあるポリペプチドのコード配列を、リガンドに対する高い親和性を有するポリペプチドのコード配列と融合することによって、親和性タグを有するハイブリッドタンパク質は、微生物によって直接に生産されてもよい。発現系の例は、are Escherichia coli、Bacillus subtilis、Pseudomonas fluoresceins、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida、酵母、哺乳類細胞、および昆虫細胞におけるバキュロウィルス系である。従って、当該親和性タグは、培養液、細胞溶解液、抽出物（estract）封入体、宿主細胞の細胞膜周辺腔、またはアフィニティークロマトグラフィーによる他の材料に由来する産物を回収するために使用されてもよい。
【０２９９】
本発明の１つの実施形態において、培養液に分泌される非天然アミノ酸ポリペプチドは、遠心分離または濾過によって得られてもよい。これらの溶液は、クロマトグラフィーカラムに対する直接の使用に好適である。本発明の他の実施形態において、細胞内に蓄積されるポリペプチドは、精製の前にクロマトグラフィーによって抽出されてもよい。１つの実施形態において、ポリペプチドは、細胞崩壊によって抽出される。細胞崩壊技術の例としては、ガラスビーズ破砕器および高圧破砕器よいった機械的破砕器が挙げられる。本発明の他の実施形態において、細胞浸透化処理によって抽出されてもよい。浸透化剤の例としては、以下に限定されないが、グアニジン塩酸塩およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が挙げられる。化学的な浸透化に加えて、細胞は、酵素的溶解によって浸透化されてもよい。細胞の浸透化の後に得られた、組織粉末懸濁液または粗製抽出物の清澄化は、遠心分離、または精密濾過もしくは限外濾過といった異なる濾過方法によって行われてもよい。
【０３００】
精製タグは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、および金属キレートクロマトグラフィーに適用されるために作られている。ポリアルギニンタグを有する複合ポリペプチド（ハイブリッドポリペプチド）は、イオン交換クロマトグラフィーによって生成されてもよく、ポリフェニルアラニンタグを有する複合ペプチドは、親和性クロマトグラフィーによって生成されてもよく、β−ガラクトシダーゼタグを有する複合ペプチド（ハイブリッドペプチド）は、アフィニティークロマトグラフィーによって生成されてもよく、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａタグを有する複合ペプチドは、ＩｇＧ−親和性クロマトグラフィーによって生成されてもよく、抗原タグを有する複合ペプチドは、免疫親和性クロマトグラフィーによって生成されてもよく、かつポリヒスチジンを有する複合ペプチドは、金属キレートクロマトグラフィーによって生成されてもよい。タグは、分子間反応を介して除去される。リンカー分子は、放出されても、されなくてもよい。
【０３０１】
同様に、非天然アミノ酸は、精製タグ、およびクロマトグラフィーまたは他の技術を用いて生成され得るこれらのタグを有する、複合ポリペプチドを生成するために使用されてもよい。１つの実施形態において、複数の非天然アミノ酸が、ポリペプチドの末端に含まれている。複数のポリペプチドを有するこのポリペプチドの生成は、アフィニティークロマトグラフィーまたは非天然アミノ酸の特性に依存する他の方法によって精製されてもよい。ポリペプチドを、他の分子を有する複数の非天然アミノ酸タグと接合するために、以下の手法が実施されてもよい。非天然アミノ酸タグに結合する樹脂に対する、ポリペプチドの結合の後に、反応が、当該ポリペプチドを、ＰＥＧといった他の分子に対して接合するために実施されてもよい。接合された産物は、当該接合の結果として、または当該接合が完了した後に、樹脂から放出される。第２の分子は、当該ポリペプチドに存在する天然のアミノ酸または非天然アミノ酸において、ポリペプチドに対して接合されてもよい。第２の分子は、非天然アミノ酸に存在する天然のアミノ酸、または非天然アミノ酸において、当該ポリペプチドに対して接合されてもよい。
【０３０２】
他の実施形態において、ポリペプチドの末端に含まれる複数の非天然アミノ酸は、金属結合アミノ酸である。このポリペプチドの精製は、Ｈｉｓ−タグタンパク質に使用されるのと同様の方法を用いて実施されてもよい。他の実施形態において、ポリペプチドは、１つ以上の非天然アミノ酸が、ポリペプチドを樹脂に結合するために使用され、かつ第２の非天然アミノ酸が、以下に限定されないが、ＰＥＧを含むポリペプチドを、他の分子に対して接合するために使用されるように、２つ以上の非天然アミノ酸を備える。ある実施形態において、当該タグは、分子間反応を介して除去される。リンカーは、放出されても、されなくてもよい。
【０３０３】
他の実施形態において、複合ポリペプチドは、ポリペプチドとタグとの接合部に非天然アミノ酸を有していてもよい。非天然アミノ酸は、例えば、カラムに対するタグの結合の間または後に、タグからポリペプチドを化学的切断によって分離するために使用されてもよい。この非天然アミノ酸は、酵素的切断または分子間化学反応によって、タグからポリペプチドを分離するために使用されてもよい。
【０３０４】
１つの実施形態において、「プロドラッグ」の種類の手法が使用される。非天然アミノ酸ポリペプチドは、精製基質と結合されており、かつ一部またはすべてのポリペプチドは、以下に限定されないが、分子間反応、紫外光の露光（放出に関して分子を活性化される光）、化学的切断または酵素的切断を含む出来事の後に、放出される。
【０３０５】
他の実施形態において、ポリペプチドの一部の間における接合部における特異的な切断部位が導入されてもよい。これは、親和性タグのない興味のあるタンパク質を産生するための、例えば、ハイブリッド分子の切断を可能にする。融合配列の除去は、酵素的切断または化学的切断によって実施されてもよい。興味のあるポリペプチドから融合配列を分割するためには、特異的な化学的切断部位または酵素的切断部位が融合タンパク質に作り出されてもよい。融合配列の酵素的除去は、当該分野における通常の当業者に公知の方法を用いて実施されてもよい。融合配列の除去に対する酵素の選択は、融合の独自性によって決定され、かつ反応条件は、当該分野における通常の当業者にとって明らかであるような、控訴の選択によって、特定される。化学的切断は、以下に限定されないが、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ、および他の試薬を含む、当該分野における通常の当業者に公知の試薬を用いて実施されてもよい。切断試薬の例としては、蟻酸、ヒドロキシアミン、コラゲナーゼ、因子Ｘａ、エンテロキナーゼ、レニン、カルボキシペプチダーゼ  Ａおよびカルボキシペプチダーゼ  Ｂが挙げられる。切断されたｈＧＨ  ポリペプチドは、当該分野における通常の当業者に公知の方法によって、切断された融合配列および切断試薬から精製されてもよい。そのような方法は、当該分野における通常の当業者にとって明らかなような、融合配列およびポリペプチドの独自性および特性によって決定される。精製方法は、以下に限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、もしくは透析、またはあらゆるこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【０３０６】
開発中のタンパク質治療薬およびペプチド治療薬が次第に増加するにつれて、規模の拡大について高価、かつ困難ではない、効率的な、経済的なおよび大規模なタンパク質の精製方法が求められている。当該分野における当業者に公知の樹脂または他の材料が、ポリペプチドの単離に使用されてもよい。図１０は、非天然アミノ酸と反応する樹脂を利用した、非天然アミノ酸ポリペプチド用の精製方法の一例を示している。共有結合的な連結が、樹脂上における科学的に特異的な親和性タグと、タンパク質に存在する非天然アミノ酸との間に形成される。そのような連結は、広範囲のｐＨおよび精製条件において安定である。切断段階は、以下に限定されないが、大規模な精製を可能にする溶液様式を含む、代わりの様式において実施されてもよい。樹脂および親和性タグは、物理的および化学的に安定であり、従って、大規模化に関するタンパク質精製の費用を低減するために再利用され得る。分離は、以下に限定されないが、ＰＥＧを含む分子に対するポリペプチドの接合と連動して、実施されてもよい。この「ワンポット」法は、接合過程をさらに簡略化し、かつ以下に限定されないが、標的の治療的タンパク質を含むタンパク質の産生費用を低減する（図１１）。樹脂は、ポリペプチドに存在する非天然アミノ酸に従って選択および機能化されてもよい。図１２は、樹脂の選択および機能化の一例を示している。精製用の樹脂または他の混合物は、ポリペプチドに存在する非天然アミノ酸に依存して異なる官能基を用いて機能化されてもよい。例えば、図１３は、ヒドロキシアミンを用いた非天然アミノ酸ポリペプチドの親和性精製の一例を示している。図１４は、アルデヒド樹脂を用いた非天然アミノ酸ポリペプチドの精製の一例を示している。また、精製方法に使用される基質を再生する能力は、大規模精製にとって利点を提供する。
【０３０７】
ある実施形態において、精製過程は、ポリペプチドに存在する１つ以上の非天然アミノ酸を、１つ以上の天然アミノ酸に変化させる。図１５は、非天然アミノ酸前駆体から天然のタンパク質を精製する一例を示している。当該非天然アミノ酸は、精製過程に使用された樹脂から放出された後に、チロシンに転換される。図１６は、非天然アミノ酸の、非限定的な例を示している。
【０３０８】
２つ以上のタンパク質の集合に存在する非天然アミノ酸は、ポリペプチドの複合体の精製に使用されてもよい。非天然アミノ酸は、互いに結合されていても、またはポリペプチドの複合体の精製を可能にするために、リンカー、重合体、もしくは他の分子を介して接合されていてもよい。この様式において単離され得るポリペプチドは、以下に限定されないが、受容体または酵素の複数のサブユニットを含む。複合体の単離に使用される技術は、１つ以上のポリペプチドに存在する、１つ以上の付加的な非天然アミノ酸を利用してもよい。大きなタンパク質を単離する技術は、当該分野における当業者に公知である。ポリペプチド複合体の分離は、１つ以上のポリペプチドに存在する１つ以上の非天然アミノ酸を用いて実施されてもよい。１つ以上の非天然アミノ酸は、複合体に存在するポリペプチドの分離を生じる官能基を有する他の分子と、反応させられてもよい。
【０３０９】
ある実施形態において、当該ポリペプチドは、当該ポリペプチドに存在する１つ以上の非天然アミノ酸に関わる非共有結合的な相互作用に起因して、複合体を形成してもよい。
【０３１０】
ある実施形態において、電界または磁界といった電気的／化学的相互作用が、当該ポリペプチドに存在する１つ以上の非天然アミノ酸に起因するポリペプチドの精製に使用されてもよい。他の実施形態において、単一細胞精製または単一細胞単離が、非天然アミノ酸ポリペプチドを用いて実施されてもよい。
【０３１１】
＜ＸＩＩ．ライブラリースクリーニング＞
１．高速大量処理スクリーニング
本明細書に開示されている、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチドおよびそれらの断片に関する技術的手法は、以下に限定されないが、薬物成分が合成された固相に対する、マルチウェルプレートに基づくスクリーニング系、細胞に基づくスクリーニング系、微小流体工学に基づくスクリーニング系、および可溶性標的のスクリーニングを含む。自動化されたマルチウェル形式は、高速大量処理スクリーニング系を発展させる。
【０３１２】
自動化された９６ウェルプレートに基づくスクリーニング系は、広く使用されている。プレートに基づくスクリーニングウェルは、反応ウェルの容積をさらに減少させ得て、従ってプレートごとのウェルの密度を増加させ得る。また、小型化された細胞に基づくアッセイといった他の種類の高速大量処理アッセイは、本発明に使用されてもよい。小型化された細胞に基づくアッセイは、それらのインビボの性質に起因する、質の高いおよび正確なスクリーニングデータを生成する可能性を有している。インビトロ反応を測定する、微小流体工学に基づくスクリーニング系は、数百マイクロメートルの幅の通路を利用している。微小ポンプ、電気浸透流、統合された値および混合装置は、通路網を介して液体の移動を制御している。
【０３１３】
スクリーニング用のライブラリーは、ほんの一例として、通常の複素環式の格子を用いた集団（Groups）といった通常のスクリーニングまたはテンプレートに基いたもの（General Screening or Template-Based）：例えば、キナーゼ修飾因子（Kinase Modulators）、ＧＰＣＲリガンド（GPCR Ligands）、抗感染薬（Anti-infectives）、カリウムチャネル修飾因子（Potassium Channel Modulators）およびプロテアーゼ阻害剤（Protease Inhibitors）である機序（Mechanism）に基づく選択といった標的物（Targeted）；他の構造よりも高い生物学的活性とより頻度高く関連する、化学モチーフを含有する化合物（Compounds）といった特権構造（Privileged Structure）；最大の化学的多様性を有する利用可能なストックから前選択された化合物（Compounds）といった多様性（Diversity）；植物抽出物（Plant Extracts）；天然産物／誘導天然産物（Natural Products / Natural Product-Derived）など、として分類されてもよい。
【０３１４】
Ａ．化学的ライブラリー
組み合わせ化学的ライブラリーは、新しいリード化合物の生成を補助する手段である。組み合わせ化学的ライブラリーは、試薬といった多くの化学的「基礎単位（building blocks）」を組み合わせることによって、化学合成または生物合成のどちらかにより作製された、多様な化合物の集合体である。化学的基礎単位を、そのように組み合わせて混合することにより、無数の化合物を合成することができる。ＬｏｇＰ、分子量、Ｈ結合供与物の数およびＨ結合受容体の数は、薬物様特性に関する強力な候補者の決定を助ける。Ｌｉｐｉｎｓｋｉの「５つの規則」は、化合物に対してこれらの特性：５つ以下の水素結合供与物、５００Ｄａ以下の分子量、算出されたＬｏｇＰが５以下であること、および１０以下の水素結合受容体を有することを要求する。組み合わせの化学的性質を介して得られる化合物、および／または高速大量処理法と結び付けられた、高速大量処理スクリーニング技術は、本明細書に開示されているような、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片とってのリガンドの、速やかな同定および最適化に利用され得る。
【０３１５】
有機化合物の多様な化学的ライブラリーは、例えば、ベンゾジアゼピン、転換体（ヒンダントイン、ベンゾジアゼピン、および小化合物ライブラリーの有機合成類似体など）、（Ｎ−アルキルグリシン、ポリカルバミン酸塩とポリ尿素、および／またはペプチジルホスホン酸塩といった）オリゴマーライブラリー、炭化水素ライブラリー、キラル化合物ライブラリー、および小さな有機分子ライブラリーを含む。広範囲の複素環式化合物ライブラリーは、固相法によって合成される。これらは、ほんの一例として、ベンゾジアゼピン、ピロリジン、ヒタントイン、１，４−ジヒドロピロリジン、イソキノリノン、ケトピペラジン、ベンジルピペラジン、キノロン、ジヒドロ−イソキノリノンおよびテトラヒドロキノリノン、４−チアゾリドン、ｂ−ラクタム、ベンジソチアゾロン、ピロール、およびイミダゾールを含む。
【０３１６】
無機化合物の組み合わせライブラリーは、以下に限定されないが、（ａ）酸化ジルコニウム、二酸化チタン、マンガン酸塩酸化物といった遷移元素酸化物、およびセリウム酸化物、酸化ランタンといった希土類元素酸化物を含む金属酸化物ならびに主族元素の酸化物；２元、３元およびそれ以上の複合固体状態の酸化物およびセラミック相；アルミナ、シリカ、アルミノケイ酸塩およびアルミノリン酸塩の種々の形態；（ｂ）アルミノケイ酸塩、ならびにＺＳＭ−５、Ｂｅｔａ、ゼオライト  Ｙおよびフェリエリト（ferrierite）といったケイ酸塩ゼオライトの、天然および合成の形態、アルミノケイ酸塩およびチタンケイ酸塩といった分子シーブの種々の形態；天然もしくは合成のクレイ、およびカオリン、アタパルガイト、タルク、モンモリロナイトおよびＬａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）といった関連する鉱物；（ｃ）金属炭化物および金属窒化物といった非酸化セラミック；（ｄ）活性炭、炭素分子シーブ、グラファイト、フラーレン（fullerenes）、カーボンナノチューブ、およびカーボンブラックといった炭素の種々の形態；（ｅ）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアミド、ハロ炭化水素重合体、ポリエステルなどといった、有機物の重合体、低重合体または樹脂；（ｆ）上述の（ａ）〜（ｅ）に記載したあらゆる材料といったあらゆる支持体に堆積された、と混合された、またはに転換された、貴金属および／または遷移金属といった金属を含む。そのような相の例としては、Ｐｔ／アルミナ、Ｐｄ／アルミナおよびＣｕ−ＺＳＭ−５が挙げられる。
【０３１７】
Ｂ．生物学的ライブラリー
（微生物を用いることによるペプチドライブラリー）
免疫系の抗体および免疫細胞受容体は、代表的な生物学的ライブラリーである。免疫系において、ライブラリー設計、合成および最適化の過程は、生体自身によって制御される。胚性因子を形成するための抗原および遺伝情報の構造のみは、外的条件であるが、それ以外は、内部因子によって自発的に制御されている。免疫系が、タンパク質構造ライブラリーを使用するので、該タンパク質構造ライブラリーは、基礎的因子としてアミノ酸を使用するライブラリーである。アミノ酸からできたペプチドまたはタンパク質が遺伝情報を翻訳することによって合成される第１の産物であるので、遺伝工学的技術を介して、所望の配列のタンパク質は、細菌またはウィルスのような微生物に修飾された遺伝情報を挿入することによって、容易に得られる。微生物ライブラリー合成は、種々の利点をもたらす。微生物ごとに１種類のタンパク質のみを作製するための微生物をクローン化することができ、かつ１つの細胞のみが必要であるにもかかわらず、クローン数は、細胞増殖によって容易に増加させ得る。微生物を使用することの他の利点は、十分な補給があればいつでも、それらが自己増殖可能であるということである。所望のタンパク質配列を作製するＤＮＡ合成の後に、その相補鎖は、必要に応じて酵素によって、合成される。微生物において適切に複製および翻訳するために合成されたＤＮＡについて、ベクターを用いて積み込まれ、かつ微生物に挿入される必要がある。微生物の表面上に発現されるタンパク質および所望のタンパク質を見つけることは、次の段階である。
【０３１８】
ライブラリーを作製するためには、種々の遺伝情報が必要である。ラン抱くＤＮＡ合成、またはｃＤＮＡの切断または特定の生体の全ゲノムＤＮＡが使用されてもよい。特定のタンパク質を作製するＤＮＡ配列の部分は、変異タンパク質ライブラリーを作製するために使用されてもよい。微生物培養の容積の限界および発現率を考慮して、１０９（１０億）種類のライブラリーが作製されてもよい。１０６〜１０７種類の合成ライブラリーと比較すると、それは、莫大な数字ある。５ユニットのペプチドの数は、２０５（３２０万）であり、６ユニットのペプチドの数は、６４００万であり、かつ７ユニットのペプチドに関しては、１０億を超える。従って、７つ以上のアミノ酸が、含んでいない不完全なライブラリーを変更されているならば、考えられるすべての組み合わせが作製される。長いタンパク質に関しては、７つの異なるアミノ酸は、別々に選択され、かつ置き換えられてもよい。ＤＮＡが無作為に合成されるとき、ＤＮＡ暗号は、置き換えられて、同じアミノ酸を示してもよく、かつ発生頻度が変化する。従って、考えられるすべての組み合わせを作製するために、さらに多くのクローンが必要になる。
【０３１９】
ポリペプチドライブラリーといった、直線的な組み合わせの生物学的ライブラリーは、任意の化合物の長さ（例えば、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）にとってすべての考えられる様式において、アミノ酸と呼ばれる化学的な基礎単位の一揃えを組み合わせることによって、形成される。タンパク質は、受容体ファミリー（例：成長因子受容体、カタコールアミン受容体、アミノ酸誘導体受容体、サイトカイン受容体、レクチン）、リガンドファミリー（例：サイトカイン、セルピン（serpins））、酵素ファミリー（例：プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ｒａｓ様ＧＴＰａｓｅ、加水分解酵素）、転写因子（例：ステロイドホルモン受容体、熱ショックタンパク質、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ホメオドメイン）、ＨＩＶプロテアーゼもしくはＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）プロテアーゼ、および抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆａｂ）といったタンパク質ファミリーの１員であってもよい。他の例は、ペプトイド、コードされたペプチド、任意のバイオオリゴマー、ビニローグポリペプチド（vinylogous polypeptide）、ベータＤグルコース骨格を有する非ペプチド性のペプチド模倣物、抗体ライブラリー、およびペプチド核酸ライブラリーといったものである。
【０３２０】
（バクテリオファージライブラリー）
それは、多くのタンパク質ライブラリー法の１つである。バクテリオファージは、宿主細菌において生存しており、かつ遺伝材料およびカプシドを有するウィルスの１種である。Ｍ１３およびラムダウィルスが最も有名である。
【０３２１】
Ｍ１３は、細長いウィルスであり、かつその小さなゲノムサイズに起因して、多数のライブラリーが容易に作製され得る。他のウィルスとは異なり、宿主細胞を傷害すること、または宿主細胞の増殖を抑制することなしに、宿主細胞の外に出ることできる。Ｍ１３が、宿主細胞において遺伝情報を増幅し、かつ出現するときにカプシドをかぶることが知られている。Ｍ１３は、１０種のタンパク質を作り、かつｐＶＩＩＩカプシドおよびｐＩＩＩカプシドは、通常、それらの間においてライブラリー合成に使用される。ｐＶＩＩＩタンパク質は、全身を取り囲んでおり、かつ約５０アミノ酸を有している。通常、ウィルスごとに２７００が発現される。そのアミノ末端がカプシドの外に向かって突き出しているので、その上に異なるペプチドを発現するために修飾されてもよい。通常、長いペプチドは、発現され得ないが、６ユニットペプチドが可能である。大量の同じライブラリー分子が同時に発現されるので、比較的に短い大きさにもかかわらず、種々のリガンドとの反応に適している。ｐＩＩＩタンパク質は、ウィルスの端部に発現され、かつ４０６アミノ酸の３〜５のタンパク質が、通常、発現される。全体のタンパク質または抗体分子ライブラリーに使用されるような、非常に長いタンパク質を発現可能である。通常の抗体は、Ｆａｂ、抗原認識領域、またはＦｖｓ鎖を使用する。バクテリオファージライブラリーおよび雑種細胞は、抗体を作製する最も有名な方法である。Ｍ１３は、任意のペプチドライブラリーの作製に理想的であり、かつそのウィルスは、１〜１０μＬにおける１０９ライブラリーをスクリーニングことが可能なように沈降され、かつ濃縮されるには、十分に安定である。
【０３２２】
Ｍ１３とは異なり、ラムダウィルスは、細胞質においてカプシドを用いて自身を覆い、かつ出現するときにカプシドをかぶるのはなく、十分な数があるときに宿主細胞から出る。言い換えれば、異なるタンパク質が発現されると、それは、おそらく、適切な機能を有する、折りたたまれた形状において出現するだろう。ｐＶおよびＤタンパク質は、通常、ライブラリー合成に使用される。バクテリオファージ表面上に発現され得るタンパク質として、任意のペプチド、天然のタンパク質断片、変異された特定のタンパク質ライブラリー、および部分的な抗体断片があり、かつクロマトグラフィーの材料、タンパク質−
タンパク質相互反応、受容体結合部位検索、および薬剤開発に使用される。
【０３２３】
ファージディスプレイは、ペプチドライブラリーを作製するために広く利用される技術である。これらのペプチドライブラリーは、他のポリペプチド、または他の分子と結合することといった特定の所望の活性を有する、ペプチドを同定するためのスクリーニングに有用である。ファージディスプレイにおいて、ペプチドライブラリーは、ファージの表面に提示されている、典型的に外皮タンパク質であるバクテリオファージタンパク質を融合されている。ファージを担っているペプチドのライブラリーは、細胞表面タンパク質または精製タンパク質といった不動化された結合相手と接触されており、かつそれから特異的な結合体が単離される。ファージディスプレイ技術およびファージディスプレイライブラリーは、米国特許第５５８０７１７号明細書、米国特許第５７０２８９２号明細書、米国特許第５７５０３４４号明細書、米国特許第５８２１０４７号明細書、米国特許第５９６２２５５号明細書、米国特許第６１４０４７１号明細書、米国特許第６４７５８０６号明細書、米国特許第５４２７９０８号明細書、米国特許第５６６７９８８号明細書、米国特許第５７３３７４３号明細書、米国特許第５７５０３７３号明細書、米国特許第５８２４５２０号明細書、米国特許第６０９６５５１号明細書、米国特許第６２２５４４７号明細書、米国特許第６４９２１６０号明細書、に記載されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７５０，３７３号明細書は、それぞれの受容体分子に関する結合特性を変更されている成長ホルモンバリアント、および抗体断片バリアントといった、新規なタンパク質を選択する方法について説明している。当該方法は、興味のあるタンパク質をコードしている遺伝子を、繊状ファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩ外皮タンパク質のカルボキシル末端ドメインに融合することを包含する。
【０３２４】
（細菌ライブラリーおよび酵母ライブラリー）
カプシドを有するウィルスだけでなく、細胞壁および細胞膜を有する細菌が、同様にライブラリー発現に使用されてもよい。グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方は、細胞表面におけるタンパク質発現に使用されてもよく、かつグラム陰性細菌であるE. coliが通常、使用される。細菌ライブラリーは、ある抗体と強く結合すし、かつワクチンとして使用する抗原を見つることができる、または細菌ライブラリーは、特定の材料の解析について、診断的な抗体ライブラリーもしくは受容体ライブラリーを発現することができる。
【０３２５】
高等動物のタンパク質が、タンパク質合成の後に、リン酸化または糖付加によって修飾されることは、翻訳修飾と呼ばれている。しかし、原核生物である細菌は、そのような機能を有しておらず、かつタンパク質が合成されたときであっても、タンパク質が低いか要請によって沈降する、またはほとんどの場合において不活性化されるのいずれかである。従って、真核生物であるS. cerevisiaeが使用される。S. cerevisiaeは、単細胞であるにも関わらず、翻訳修飾機能を有し、かつ原物と非常に似たタンパク質が作製され得る。
【０３２６】
ウィルスとは異なり、ＦＡＣＳ（fluorescence- activated cell sorting）が使用され得るような、ミクロンの大きさを有している。蛍光標識された標的分子は、細胞表面に発現されたタンパク質のライブラリーに付加され、そしてＦＡＣＳ機械の細長い管に流される。ＦＡＣＳは、蛍光色および強度によって、生きたままで、各細胞を仕分ける。異なる色を有する、異なる標的分子を選別することがきでき、かつまた、異なる強度および感度の細胞を仕分けることができる。他の利点は、液相スクリーニングであることである。強くくっつき合っている分子を分離する必要がない。仕分けされた細胞は、ふたたび増殖され、かつそれらは再選別される。
【０３２７】
また、酵母表面ディスプレイ技術は、ペプチドライブラリーを産生および提示するために、広く利用される。酵母表面ディスプレイは、所望のペプチドを提示する細胞を選択するために、蛍光活性細胞仕分けと組み合わせて、利用されてもよい。酵母表面ディスプレイ技術および酵母表面ディスプレイライブラリーは、米国特許第６０８３６９３号明細書、米国特許第６４０６８６３号明細書、米国特許第６４１０２７１号明細書、米国特許第６２３２０７４号明細書、米国特許第６４１０２４６号明細書、米国特許第６６１０４７２号明細書に記載されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３２８】
細菌表面ディスプレイは、細胞表面または周辺質にペプチドを提示するための種々の形態において使用される。種々の細菌宿主は、細胞表面に提示されたペプチドを固定する、種々のポリペプチド固定ドメインとして、この系における使用に利用可能である。酵母表面ディスプレイ技術および酵母表面ディスプレイライブラリーは、米国特許第５３４８８６７号明細書、米国特許第５８６６３４４号明細書、米国特許第６２７７５８８号明細書、米国特許第５６３５１８２号明細書、米国特許第６１８０３４１号明細書に記載されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３２９】
他のインビボの系が、ポリペプチドライブラリーを作製し、かつアミノ酸配列の変化から生じた標的タンパク質の結合修飾といった、活性の変化を同定するために利用される。インビボの系の例としては、以下に限定されないが、酵母ツーハイブリッド（two hybrid）系（「Schneider, Sら, Nat. Biotechnol., 17, 170-175 (1990)」）およびジヒドロ葉酸還元酵素タンパク質断片相補性アッセイ（dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay）（「Pellitier, NJら, Nat. Biotechnol., 17, 683-690, (1990)」）が挙げら、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３３０】
（バイオパニング（Bio panning））
合成された微生物ライブラリーは、高い親和性を用いて特定の分子と結合するペプチドを見つけるために使用されてもよい。
【０３３１】
本明細書に開示されているように、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片といった標的分子は、試験プレート上に平らに配置されてもよい。調整された微生物ライブラリーは、当該プレートに加えられてもよい。当該標的分子と強く結合する微生物のみが、残り、かつのこりは、溶液中にあるだろう。しばらくしてから、未結合の微生物は、捨て去られ、かつそれから弱くまたは偶然に結合した微生物は、適切な溶液を用いて洗浄されてもよい。当該標的分子の結合親和性が、洗浄工程を決定する。まだ残っている微生物は、低いｐＨのまたは高濃縮された標的分子の添加によって分離され、かつその量は、再培養によって増幅される。ときには、当該親和性が強すぎて、微生物を殺すことなくそれらを分離することが困難であるかもしれない。バクテリオファージであれば、分離の代わりに、宿主細胞を直接に感染することができる。まだ、ある所望でない微生物が偶然に結合されているので、第１の増幅された微生物は、活性タンパク質を含むクローン数を増やすために、繰り返しのスクリーニング過程および繰り返しの増幅過程を受けてもよい。最後に、それらが低濃度において培養されたあとに、各クローンは、分離されてもよく、通常、１０クローンが選択され、かつＤＮＡ配列解析に使用されてもよい。ＤＮＡ情報からのペプチドが認識可能であり、かつほとんどのクローンが一致するペプチド配列を示せば、成功である。しかし、タンパク質は、クローンの種類次第で毒性を有し、かつＤＮＡ発現率が変化することあるので、所望のスクリーニング結果よりも、速く増殖するクローンおよびよく発現するクローンが選択される可能性があり得る。従って、確認段階は、ペプチド合成および結合親和性の測定によって必要である。
【０３３２】
微生物タンパク質ライブラリー技術は、基本的に、生きた組織の自己再生能を利用している。それは、得られた少量の候補分子を増幅する（養う）ことによるものであり、純度および量を向上可能である。
【０３３３】
（リボソームディスプレイ）
また、リボソームディスプレイ技術およびｍＲＮＡディスプレイ技術は、ペプチドライブラリーを作製するために、広く利用される。リボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイは、リボソームにおける、またはピューロマイシンによるのいずれかにおいて、ペプチドをコードするｍＲＮＡを、コードされるペプチドに結合させる、インビトロの技術である。リボソームディスプレイ技術およびｍＲＮＡディスプレイ技術ならびにライブラリーについて、米国特許第６４１６９５０号明細書、米国特許第６４３６６６５号明細書、米国特許第６６０２６８５号明細書、米国特許第６６６０４７３号明細書、米国特許第６４２９３００号明細書、米国特許第６４８９１１６号明細書、米国特許第６６２３９２６号明細書、米国特許第６５８９７４１号明細書、米国特許第６３４８３１５号明細書、米国特許第６２０７４４６号明細書、米国特許第６２５８５５８号明細書、米国特許第６４１６９５０号明細書、米国特許第６４４０６９５号明細書、米国特許第６２２８９９４号明細書、米国特許第６２８１３４４号明細書、米国特許第６４２９３００号明細書、米国特許第６６６０４７３号明細書、米国特許第５５８０７１７号明細書、米国特許第５６８８６７０号明細書、米国特許第６２３８８６５号明細書、米国特許第６２６１８０４号明細書、米国特許第６５１８０１８号明細書、米国特許第６２８１３４４号明細書、米国特許第６２５８５５８号明細書、米国特許第６２１４５５３号明細書に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３３４】
（ＤＮＡ、ＲＮＡライブラリー）
ＤＮＡ増幅技術であるＰＣＲの発展は、ライブラリーとして核酸を使用することを可能にしている。ＤＮＡおよびＲＮＡが４ユニットから構成されているので、１０の低重合体は４１０（約１０６＝１００万）種類を有し、かつ２０の低重合体は、約１０１２を有している。自動化された固相ＤＮＡ合成器を用いることによって、５’末端および３’末端は、配列に固定され、かつＡ、Ｔ、ＧおよびＣは、それぞれ配列の約２５％を占めるように、無作為に配置される。１つの鎖が作製されると、それは、酵素を用いることによって複製、またはＰＣＲによって増幅されてもよい。１０１４−１５の分子が作製され、かつ使用されるが、たまに無作為の取込に関して、ときにライブラリーの不完全な集合を用いて生じる約４０の位置（１０２４種類）がある。ＤＮＡライブラリーに関して、ＤＮＡ自身は簡単に使用されるが、ＲＮＡライブラリーに関して、Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼは、転写に必要である。
【０３３５】
調整されたライブラリーは、標的分子結合スクリーニングによって仕分けられる；ＤＮＡ用のＰＣＲおよびＲＮＡ用のＲＴ−ＰＣＲによって増幅される。本明細書に開示されているように、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびそれらの断片は、標的分子として使用されてもよい。増幅されたライブラリーのスクリーニングおよび増幅は、１０１４−１５の開始数が数百まで減少されるまで繰り返され、かつそれから、得られた候補分子配列が解析され、かつ各結合親和性が測定される。そのような得られたＤＮＡおよびＲＮＡは、アプタマーと呼ばれ、かつそれらは、標的分子に対する強い親和性を示す。アプタマーは、インビボにおいて標的分子の機能を阻害するが、それはインビボのヌクレアーゼによってすぐに破壊される。この問題を解決するために、ライブラリーのある部分は、ヌクレアーゼに対する体制を強めるために人口の核酸を用いて置換されている。
【０３３６】
生物学的ライブラリーの少数の例としては、以下に限定されないが、生物活性脂質ライブラリー（Bioactive Lipid Library）；種々の分類のリガンドを含むカナビノイド（ＣＢ）受容体、およびバニロイド（ＶＲ）受容体に活性を有している、エンドカンナビノイドライブラリー（Endocannabinoid Library）−化合物（例えば、アミド（Amides）、エタノールアミド（Ethanolamides）、リポ−アミノ酸（Lipo-amino acids）、アシル−ＧＡＢＡ（Acyl-GABAs）、アシル−ドーパミン（Acyl-dopamines）など）；ＧＰＣＲリガンド、第２の伝達子修飾因子、核内受容体リガンド、アクチン＆チュブリン修飾因子、キナーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、イオンチャネル遮断薬、遺伝子調節薬、脂質生合成阻害剤などといった、公知の生物活性物ライブラリー（Known Bioactives Library）；イオンチャネルリガンドライブラリー（Ion Channel Ligand Library）；キナーゼ／ポスファターゼ阻害剤ライブラリー（Kinase/Phosphatase Inhibitor Library）；化学的多様性の最高の源であり、かつ薬理的に活性な小分子用のあらゆるスクリーニング計画にとって、理想的な開始点である、天然産物ライブラリー（Natural Products Library）−天然産物（Natural products）；アドレナリン作用物（Adrenergics）、ドーパミン作用物（Dopaminergics）、セロトニン作用物（Serotonergics）、オピオイド性物（Opioids）（およびシグマリガンド（Sigma ligands））、コリン作用物（Cholinergics）、ヒスタミン作用物（Histaminergics）（およびメラトニンリガンド（Melatonin Ligands））、筋収縮性グルタミン酸作用物（Ionotropic Glutamatergics）、向代謝性グルタミン酸作用物（Metabotropic Glutamatergics）、ＧＡＢＡ作用物（GABAergics）、プリン作用物（Purinergics）（およびアデノシン（Adenosines））などといった、神経伝達物質ライブラリー−ＣＮＳ受容体リガンド；核内受容体を有する化合物を含む、核内受容体リガンドライブラリー−核内受容体リガンドライブラリー（Nuclear Receptor Ligand Library- Nuclear Receptor Ligand Library）が挙げられる。受容体作用物質、および受容体拮抗物質は、生物学的活性を有するが、タンパク質結合相手が同定されていない化合物を含む、孤立リガンドライブラリー−孤立リガンドライブラリー（Orphan Ligand Library-Orphan ligand library）を含んでいてもよい。例えば、微量のアミン（Amines）、神経伝達物質代謝産物、内在性βカルボリン、尿代謝物、ニコチン同種物、およびＤ−アミノ酸（D-Amino Acids）など。
【０３３７】
２．スクリーニング法
本発明は、タンパク質に結合する、または結合性質もしくはタンパク質の生物学的活性の修飾因子として作用する、候補作用物質を同定する方法を提供する。アッセイは、公知の分子を有する非天然アミノ酸ポリペプチドのライブラリーを、または逆も同様にスクリーニングすることを含む、種々の方法において実施されてもよい。１つの実施形態において、当該方法は、単一の試験チューブにおいて、または適度の規模において、実施される。他の実施形態において、当該方法は、複数を同時に実施される。例えば、当該方法は、マルチウェルのスクリーニング系において、複数のアッセイ混合物に関して同時に実施されてもよい。従って、１つの局面において、本発明は、高速大量処理スクリーニング系を提供する。１つの実施形態における相互作用についてのアッセイに関して、蛍光のまたは吸収の読み出しが、活性の決定に利用される。アッセイに対する他の生物学的活性物質は、ほんの一例として、アセチル化、カルボキシル化、アシル化、リン酸化、脱リン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾、ＡＤＰ−リボシル化、生体利用効率および半減期である。
【０３３８】
非天然アミノ酸ポリペプチドと、スクリーニングアッセイに含まれる他の分子との間における、相互作用の検出にまた使用され得る、当該分野における当業者に公知の多くの方法がある。これらの方法は、ほんの一例として、蛍光性結合物結合アッセイ、熱移動アッセイ、電気泳動度移動アッセイ、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ（例えば、免疫沈降）および細胞に基づくアッセイ（例えば、ツー−ハイブリッドスクリーニングもしくはスリー−ハイブリッドスクリーニング、ＧＳＴプルダウン、およびＴＡＰ−ＴＡＧ系）、発現アッセイ、タンパク質−ＤＮＡ結合アッセイ、ならびに機能的アッセイなどを含んでいてもよい。例えば、米国特許第６，４９５，３３７号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照すればよい。また、他の方法は、タンパク質−タンパク質相互作用の研究、リガンド結合の研究または免疫アッセイ（「MacBeath and Schreiber, Science 2000 289: 1760-1763」）の実施を補助する、酵素、受容体タンパク質、または抗体を選別可能なタンパク質チップ系を含んでいてもよい。他の実施形態は、非天然アミノ酸ポリペプチドと相互作用することが公知のＤＮＡおよび他のタンパク質について、蛍光染色を用いた細胞生理機能の精査によって、ならびに細胞の挙動の変化を測定することができるように写真を生成する蛍光顕微鏡を用いた、細胞生理機能の精査（「Mayer, T.U., Kapoor, T.M., Haggarty, SJ., King, R. W., Schreiber, S.L., Mitchison, TJ. (1999). Science.286, 971-4.」）によって、機能的な非天然アミノ酸ポリペプチドを用いて実施される、未処理の細胞に影響可能な薬物の性質決定を含んでいてもよい。
【０３３９】
特に、非天然アミノ酸ポリペプチドに対する試験リガンドの結合の検出による（そして、従って非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドの同定する）実行可能な多くの方法がある。有用な方法は、折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドが、折りたたまれていない非天然アミノ酸ポリペプチドから区別され得る、方法である。以下に記載されている方法は、これが実施され得るほんの一例である。それそれの場合において、検出方法は、非天然アミノ酸ポリペプチドのそのリガンドに対する結合、および対照組み合わせ物（試験リガンドが存在していないことを除いて、試験組み合わせ物と同じである）に関する結合のために、十分な時間が経過した後に、試験組み合わせ物（試験非天然アミノ酸ポリペプチドの組み合わせ物）について実行される。
【０３４０】
Ａ．折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドの存在判定方法
当該方法において、試験リガンドは、リガンド（非天然アミノ酸ポリペプチドを結合する作用物質）が同定されるべきである、非天然アミノ酸ポリペプチドと組み合わせてもよい。結果として生じる組み合わせ物は、試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチドの組み合わせ物、または試験組み合わせ物である。通常、試験リガンドは、非天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、過剰のモル量として存在している。当該方法は、溶液において実行されともよく、または当該方法のある実施形態において非天然アミノ酸ポリペプチド固相上に存在していてもよい（例えば、リンカーを介して、または他のやり方ではビーズに対して共有的に結合されている）。試験リガンドおよび非天然アミノ酸ポリペプチドは、非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドに対する結合に適した条件において（例えば、温度、ｐＨ、塩濃度、時間）、結合される。さらに、試験リガンドおよび非天然アミノ酸が組み合わせられる条件は、通常、可逆的にアンフォールディングする非天然アミノ酸ポリペプチドについて、非天然アミノ酸ポリペプチドの実質的な画分が、アンフォールディング形態において試験リガンドの非存在において存在するが、使用される検出方法に依存して当該画分が変化可能であるような条件である。非天然アミノ酸ポリペプチドが非可逆的にアンフォールディングする場合において、条件は、通常、非天然アミノ酸ポリペプチドが、リガンドの非存在において実質的な割合にアンフォールディングするような条件である。これらの条件は、非天然アミノ酸ポリペプチドが適度度な程度にアンフォールディングする；従って、観察されたシグナル（例えば、プロテアーゼによる消化、および抗体、シャペロニンもしくは表面に対する結合）が都合よく測定され得ることを、確実にするために選択される。アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドがあまりにほとんどないとき、観察されるシグナルが、都合よく測定されるには、レベルまたは割合が低くなりすぎる。評価される試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチドの組み合わせ物のそれぞれについて、当該方法が実行される条件は、公知の方法を用いて、実験的に決定されるだろう。そのような条件は、反応温度、および使用されるカオトロピック剤もしくは変性剤を含む。当該方法が実行される温度は、使用される非天然アミノ酸ポリペプチドによって決定され、かつ公知の方法を用いて実験的に決定され得る。アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドの画分を調整または最適化するために、変性条件は、ある非天然アミノ酸ポリペプチド用に要求されてもよい。そのような変性条件は、高められた温度の使用、インキュベーション組み合わせ物に対するタンパク質変性剤（例えば、尿素、グアニジン）の添加、または両方の使用を含んでいてもよい。さらに、ある非天然アミノ酸ポリペプチドの安定性は、非天然アミノ酸ポリペプチドにおける不安定化アミノ酸または安定化アミノ酸の置換という操作を介して調整されてもよい。試験リガンドおよび非天然アミノ酸ポリペプチドは、適切な条件および非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドに対する結合に十分な時間、組み合わせられ、維持される。非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドに対する結合に必要な時間は、使用される試験リガンド、非天然アミノ酸ポリペプチド、および他の条件に依存して、変化するだろう。ある場合において、結合は、瞬時に（例えば、試験リガンドおよび非天然アミノ酸ポリペプチドの組み合わせ物と本質的に同時に）生じ、一方において、結果として生じる試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチドの組み合わせ物は、結合が検出される前により長い時間に維持される。また、不可逆的にアンフォールディングする非天然アミノ酸ポリペプチドの場合において、アンフォールディングの割合は、試験リガンドの結合にとって適切な時間を決定することを考慮に入れる必要がある。非天然アミノ酸ポリペプチドの試験リガンドに対する結合は、種々の様式：折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドが、試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチド組み合わせ物に存在する程度を決定することによって；アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドが、試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチド組み合わせ物に存在する程度を決定することによって、または組み合わせ物におけるアンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドに対する、折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドの割合を決定することによって、のいずれか１つにおいて評価される。これは、折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドの量、アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドの量、またはアンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドに対する、折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドの割合の、決定される試験リガンドの存在下と非存在下との間に差があるためである。試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドを結合する（例えば、当該試験リガンドが、当該非天然アミノ酸ポリペプチドのとってのリガンドである）ならば、非天然アミノ酸ポリペプチドを結合する試験リガンドの非存在下において存在するよりも、折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドがより多く、かつアンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドがより少ない（そして従って、アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドに対する折りたたまれたもののより高い割合であり、かつ折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドに対するアンフォールディングもののより低い割合である）。折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチド、およびアンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドの量または画分を決定する必要はない。リガンドの存在および非存在において、またはアンフォールディング率の変化において、折りたたまれたタンパク質、またはアンフォールディングタンパク質の量に差があること（２つの形態の平衡に関する変化）のみを知ることが必要である。この差は、アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチド、および／または折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドが、試験組み合わせ物（試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチドの組み合わせ物）に存在する程度を、対照組み合わせ物（試験リガンドの非存在下における非非天然アミノ酸ポリペプチド）に存在するそれらの程度と、比較することによって、決定されてもよい。変更可能に、可逆的な折りたたみに関して、２つの形態が試験リガンドの非存在下において生じる程度の間における差は、それらの最初（例えば、非天然アミノ酸ポリペプチドの溶液、または試験タンパク質を結合された支持体に対して試験リガンドを加える前）における発生によって、およびそれから、試験リガンドが、非天然アミノ酸ポリペプチド−リガンド結合を生じる好適な条件において、非天然アミノ酸ポリペプチドと組み合わせられた後に、評価されてもよい。いずれかの場合において、非天然アミノ酸ポリペプチドの２つの形態の決定は、以下に記載されているような、公知の方法を用いて実行されてもよい。非天然アミノ酸ポリペプチドを結合するための当該方法によって示される試験リガンドは、当該非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドと呼ばれる。
【０３４１】
１．タンパク質分解を用いたリガンド結合決定
当該方法の１つの実施形態において、試験リガンドの非天然アミノ酸ポリペプチドに対する結合は、タンパク質分解の利用を介して検出される。この実施形態において、アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドに対して選択的に作用するプロテアーゼは、試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチド組み合わせ物（試験組み合わせ物）は、組み合わせられ、かつ結果として生じる試験組み合わせ物−プロテアーゼの混合物は、未処理のまたは分解された非天然アミノ酸ポリペプチドの内、試験リガンド存在下と非存在下にとの間における差を決定するために、以下に詳細に記載されている方法の１つを用いて、適切な期間のインキュベーションの後にアッセイされる。同一のアッセイが、試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチド組み合わせ物、および対照組み合わせ物について実施され、２つのアッセイの結果が比較される。対照組み合わせ物においてよりも、試験組み合わせ物において、より無傷のタンパク質、またはより少なく分解されたタンパク質は、試験リガンドが、非天然アミノ酸ポリペプチドと結合することを示し、かつ従って、試験リガンドが、非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドであることを表す。同様に、対照においてよりも、試験組み合わせ物において、分解されたタンパク質に対する未処理の非天然アミノ酸ポリペプチドの高い割合は、試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドであることを表す。
【０３４２】
トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８  プロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼ  Ｋ、サーモリシンおよびサブチリシンといった、広範囲のプロテアーゼが、本実施形態に使用されてもよい。当該プロテアーゼを直接に阻害する標的リガンドによる干渉を回避するために、１つ以上のプロテアーゼが、同時にまたは平行するアッセイに使用されてもよい。
【０３４３】
ペプチド結合を効率的に消化させるために、ペプチド基質−非天然アミノ酸ポリペプチド−は、選択されたプロテアーゼの酵素活性部位に接触可能である必要がある。折りたたまれたタンパク質における原子は、しっかりと密集しているので、感受性の強いペプチド結合の大部分は、タンパク質が折りたたまれた状態にあるとき、プロテアーゼ活性部位に入ることから立体的に阻止されている。アンフォールディング状態において、ペプチド結合は、より露出され、かつそのために、プロテアーゼの作用に対して比較的により強い感受性がある。
【０３４４】
従って、プロテアーゼ−抵抗物という形態において非天然アミノ酸ポリペプチドを安定化している、折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドと結合する試験リガンドの添加は、タンパク質分解の割合を変える。このようにして、非天然アミノ酸ポリペプチドとともに試験リガンドをインキュベートすること、選択的にアンフォールディングタンパク質を分解するためにプロテアーゼを添加すること、およびそれから、未処理のもしくは分解された非天然アミノ酸ポリペプチドを定量化するためにアッセイを使用することによって、試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドと結合し、かつ従って、潜在的に治療に有用であることを表す、試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドであるか否かを確認することが可能である。
【０３４５】
変更可能に、プロテアーゼは、非精製の、または部分的に精製された非天然アミノ酸ポリペプチドの試料に内在していてもよい。
【０３４６】
２．表面結合の検出を介したリガンド結合決定
当該方法の他の実施形態において、表面に付着するためにアンフォールディングタンパク質の性質が利用される。本実施形態は、折りたたまれたタンパク質が、特定の３次元配置に保持されており、かつ従って、表面に結合するためにそれらのアンフォールディングされた同等物とは、同様でないという事実に依存している。試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドと結合する（例えば、当該非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドである）ならば、試験リガンドは、非天然アミノ酸ポリペプチドの折りたたまれた形態を安定化する。従って、試験リガンドの非天然アミノ酸ポリペプチドに対する結合は、非天然アミノ酸ポリペプチドが試験リガンドの存在下、および非存在下において適切な立体表面と結合する程度を評価することによって、決定される。以下に詳細が説明されている方法は、この目的のために使用されてもよい。
【０３４７】
この実施形態において、非天然アミノ酸ポリペプチド、試験リガンド、およびアンフォールディングタンパク質と選択的に結合する表面は、非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドに対する結合、およびアンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドの当該表面に対する結合にとって適切な条件において、組み合わせられ、かつ維持される。この目的にとって好適な多くの表面があり、当該表面は、処理されたもしくは未処理のプラスチック、培養組織用にもしくは高度にタンパク質と結合するために処理されたプレート、ニトロセルロースおよびＰＶＤＦフィルターから構成されたマイクロタイタープレートを指す。
【０３４８】
試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドと結合するならば、比較する対照組み合わせ物よりも、より多い折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチド、およびより少ないアンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドが、試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチド組み合わせ物に存在する。すなわち、非天然アミノ酸ポリペプチドにとってのリガンドである試験リガンドの存在下において、非天然アミノ酸ポリペプチドにとってのリガンドである試験リガンドの非存在下においてよりも、より少ないアンフォールディングタンパク質が、選択的にアンフォールディングタンパク質と結合する表面との結合に有効である。溶液に残っている、表面結合非天然アミノ酸ポリペプチドの量、または非天然アミノ酸ポリペプチドの量の決定は、以下に記載された方法の１つを用いて実行されてもよい。試験リガンドの存在下においてよりも、試験リガンドの非存在下において、より多くの非天然アミノ酸ポリペプチドが結合された表面にない（例えば、より多くの非天然アミノ酸ポリペプチドが溶液中にある）ならば、試験リガンドは、当該非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドである。表面結合非天然アミノ酸ポリペプチドに対する溶液中の非天然アミノ酸ポリペプチドの割合は、試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドにとってのリガンドであるとき、そうではないときよりも大きい。逆に言えば、溶液中の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する表面結合非天然アミノ酸ポリペプチドの割合は、試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドにとってのリガンドであるとき、そうではないときよりも少ない。
【０３４９】
３．抗体結合を用いたリガンド結合決定
第３の実施形態において、折りたたまれていない（アンフォールディング）非天然アミノ酸ポリペプチドと折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドとが存在するときに、非天然アミノ酸ポリペプチドに対してリガンドが結合する程度は、アンフォールディング状態（折りたたまれていない状態）のみに対して作用する特異的な抗体（「変性特異的な抗体」または「ＤＳ抗体」）、または折りたたまれた状態のみに対して作用する特異的な抗体（「天然の状態に特異的な抗体」または「ＮＳ抗体」）の利用を介して評価される。非天然アミノ酸ポリペプチドが、折りたたまれた状態にあり、かつ非天然アミノ酸ポリペプチドにとってのリガンドである試験リガンドによってその状態に安定化されているとき、ＤＳ抗体の見かけの結合親和性は、低減され（「Breyer, (1989) "Production and Characterization of Mono-clonal Antibodies to the N-terminal Domain of the Lambda Repressor", J. Biol. Chem., 264(5):13348-13354」）、かつＮＳ抗体の見かけの結合親和性は、増強されるだろう。試験リガンドの存在下において、その非存在下においてよりも、非天然アミノ酸ポリペプチドに結合しているＤＳ抗体がより少ないとき、または非天然アミノ酸ポリペプチドに結合しているＤＳ抗体が、より多いとき、当該リガンドは、非天然アミノ酸ポリペプチドにとってのリガンドである。
【０３５０】
特定のタンパク質に結合する抗体を産生するための、当該分野において公知の多くの方法がある（「Harlow, E. & D. Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988」、参照によって本明細書に組み込まれる）。変性状態に対して特異的な抗体を調製するために、動物は、天然状態において覆い隠されているタンパク質の領域からのペプチドを用いて、免疫されてもよい。当該タンパク質の構造が未知であれば、抗体は、種々のペプチドに対して調製されてもよく、かつ当該抗体は、変性状態に対して選択的に結合するために選別されてもよい。抗体産生は、「Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, FIa. (1987)」（参照によって本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている単クローン性抗体を産生する技術といった、標準的な技術による。
【０３５１】
ＤＳ抗体またはＮＳ抗体が、折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドの存在、アンフォールディングタンパク質の存在、または一方の他方に対する割合における、リガンドに誘導された変化を検出するために使用され得る、基本的な方法が３つある。
【０３５２】
１つの方法において、アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドに方向付けられたＤＳ抗体、非天然アミノ酸ポリペプチド、および試験リガンドを含む試験溶液は、〜のうように、非天然アミノ酸ポリペプチドとそのリガンドとの結合、およびアンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドに対するＤＳ抗体の結合に適した条件において、例えば、変性非天然アミノ酸ポリペプチド、またはそのペプチド断片を用いて覆われたマイクロタイタープレートにおいて、インキュベートされる。試験リガンドを含まないことを除いて、試験溶液と同じである対照溶液は、試験溶液と同じように処理される。試験溶液と対照溶液との間において、プレートに結合された、または溶液に残っている抗体の量を比較することによって、非天然アミノ酸ポリペプチドの折りたたみにおける差異が検出される。プレートに結合されている、または溶液に残っている抗体の量は、以下に記載されているように、測定されてもよい。
【０３５３】
第２の方法において、ＤＳ抗体、試験リガンド、および非天然アミノ酸ポリペプチドを含む試験溶液は、固相抗体と呼ばれる、第２の抗体を用いて覆われたプレートにおいてインキュベートされる。該第２の抗体は、非天然アミノ酸ポリペプチドとＤＳ抗体とに対して同時に結合することができず、かつ非天然アミノ酸ポリペプチドに特異的である。しかし、該第２の抗体は、折りたたまれた状態に特異的であるか、または未変性状態と変性状態とを差別することができない（「非差別」または「ＮＤ抗体」）。結果として生じる試験組み合わせ物または試験溶液は、非天然アミノ酸ポリペプチドの、非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドに対する結合に、および抗体の、抗体が認識する（特異的である）タンパク質に対する結合に適した条件において、維持される。試験リガンドを含まないことを除いて、試験溶液と同じである対照溶液は、試験溶液と同じように処理される。両方の溶液において、変性（アンフォールディング）非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＤＳ抗体と結合し、かつ固相抗体との結合が阻害される。非天然アミノ酸ポリペプチドに対して結合する試験リガンドの能力は、折りたたまれた状態における非天然アミノ酸ポリペプチドの量を同様に反映する、試験溶液において固相抗体に結合する非天然アミノ酸ポリペプチドの量を決定すること、および非天然アミノ酸ポリペプチドが試験リガンドの非存在下において固相抗体に結合する程度とそれを比較することによって評価される。第２の抗体を介してプレートに結合されている、または溶液に残っている非天然アミノ酸ポリペプチドの量は、以下に記載の方法によって検出されてもよい。この方法は、溶液抗体としてのＮＳ抗体、および固相上におけるＤＳもしくはＮＤ抗体と、類所の方法において使用されてもよい。
【０３５４】
第３の方法において、非天然アミノ酸ポリペプチド、および試験リガンドを含む試験溶液は、ＤＳ抗体またはＮＳ抗体を用いて覆われたマイクロタイターウェルといった、容器においてインキュベートされ、かつ非天然アミノ酸ポリペプチドの、そのリガンドに対する結合に、および抗体の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する結合に適した条件において維持される。変更可能に、抗体は、ビーズの表面上に存在していてもよい。非天然アミノ酸ポリペプチドを結合するための試験リガンドの能力は、試験リガンドの存在下および非存在下において、非天然アミノ酸が溶液に残っている（抗体に対して結合していない）、もしくは固相表面に残っている（抗体に結合している）程度、または２つの合を決定するにことよって評価される。試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドと結合する（非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドである）ならば、対照溶液において抗体に結合されるよりも、ＤＳ抗体に結合する非天然アミノ酸ポリペプチドが少ない、またはＮＳ抗体に結合する非天然アミノ酸ポリペプチドが多い（例えば、ＤＳ抗体の場合において非天然アミノ酸ポリペプチドがより多い、またはＮＳ抗体について溶液に少ない）。さらなる実施形態において、抗体は、溶液に存在してもよく、かつ非天然アミノ酸ポリペプチドは、プレート表面またはビーズ表面といった固相に付着していてもよい。
【０３５５】
４．分子シャペロンを用いたリガンド結合決定
第４の実施形態において、分子シャペロンが、非天然アミノ酸ポリペプチドに対する試験リガンドの結合を決定するために使用される。シャペロンは、それらの通常の生理学的な機能の一部としてアンフォールディングタンパク質と結合する、種々のタンパク質である。それらは、通常、オリゴマータンパク質の集合、あるタンパク質の正しい折りたたみを確実にすること、および生理学的な負荷がある間にタンパク質性の凝集体の形成を防止することに関与している（「Hardy, (1991) "A Kinetic Partitioning Model of Selective Binding of Normative Proteins by the Bacterial Chaperone SecB", Science 251:439-443」）。これらのタンパク質は、限定された配列モチーフの特異的な認識なしで、多くのアンフォールディングタンパク質または部分的変性タンパク質と相互作用する能力を有している。
【０３５６】
E. coliに見られる１つの分子シャペロンは、ＳｅｃＢである。ＳｅｃＢは、他の点では関連のないタンパク質の一部の搬出に関連することが証明されている。競争実験は、ＳｅｃＢは、特定の搬出部分集合から外れたタンパク質を含むが、折りたたまれたタンパク質との相互作用が現れない、試験されたアンフォールディングタンパク質のすべてとしっかりと結合することを示している。
【０３５７】
この実施形態において試験リガンドおよび標的を含む試験溶液は、非天然アミノ酸ポリペプチドの、そのリガンドとの結合に、および使用された分子シャペロンの、アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドに対する結合に適した条件において、分子シャペロンを用いて覆われた、マイクロタイタープレートまたは他の好適な表面の上において、インキュベートされる。当該溶液におけるアンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドは、リガンド安定化折りたたみ非天然アミノ酸ポリペプチドに関連して、分子シャペロンに覆われた表面に対して結合する、強い傾向を有する。従って、非天然アミノ酸ポリペプチドに対して結合する試験リガンドの能力は、シャペロンに覆われた表面と、結合せずに残っている非天然アミノ酸ポリペプチドの量、または結合している量の、以下に詳述された方法を用いた、決定によって決定される。
【０３５８】
変更可能に、分子シャペロンに対する結合にとっての競合アッセイが利用されてもよい。精製された非天然アミノ酸ポリペプチド、試験リガンド、および分子シャペロンを含む試験溶液は、非天然アミノ酸ポリペプチドをそのリガンドとともに結合すること、および分子シャペロンのアンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドに対する結合に適した条件において、変性（アンフォールディング）非天然アミノ酸ポリペプチドを用いて覆われたマイクロタイターウェルといった容器において、インキュベートされてもよい。試験リガンドを含んでいないことを除いて、試験溶液と同じである対照溶液は、同じように処理される。溶液における変性非天然アミノ酸ポリペプチドは、シャペロンと結合し、かつ従って、容器表面（マイクロタイターウェルの表面）に対して結合された変性非天然アミノ酸ポリペプチドにシャペロンが結合することを阻害する。非天然アミノ酸ポリペプチドに対する試験リガンドの結合は、結果として、アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドの量をより少なくし、かつ従って、試験リガンドの結合の非存在においてよりも、多くのシャペロンが、固相変性非天然アミノ酸ポリペプチドに対する結合に有効である。従って、試験リガンドの結合は、試験溶液において、表面に結合された、もしくは溶液中のシャペロン、および対照溶液のｉＤの評価、ならびにこの結果の比較によって決定されてもよい。対照溶液においてよりも、試験溶液における大きな程度にまでの、固相変性非天然アミノ酸ポリペプチドに対するシャペロンの結合は、試験リガンド−非天然アミノ酸ポリペプチド結合を示している（例えば、非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドの同定を示している）。このアッセイにおいて、分子シャペロンは、通常、それらの結合に関する競合が測定され得るように、過剰に供給されない。
【０３５９】
変更可能に、非天然アミノ酸ポリペプチド、試験リガンド、および分子シャペロンを含む試験溶液は、表面が、折りたたまれた非天然アミノ酸ポリペプチドに対して特異的な血清または単クローン性抗体（ＮＳ抗体）を用いて覆われており、かつ分子シャペロンに対して非天然アミノ酸ポリペプチドを結合可能である、マイクロタイターウェルといった、容器においてインキュベートされてもよい。アンフォールディング非天然アミノ酸ポリペプチドは、溶液においてシャペロンに結合し、かつ従って、固相抗体との結合から阻害される。溶液中の、またはウェルの壁と結合されている、非天然アミノ酸ポリペプチドの検出、ならびに適切な対照（試験リガンドなしの同じ組み合わせ物）におけるいずれか一方または両方の比較によって、非天然アミノ酸ポリペプチドに対する試験リガンドの能力は、決定されてもよい。試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドであれば、対照溶液においてよりも、多くの非天然アミノ酸ポリペプチドは、試験溶液において、容器の表面に結合されている血清または単クローン性抗体と結合される。逆に言えば、対照溶液においてよりも、少ない非天然アミノ酸ポリペプチドは、試験溶液において、結合されない状態に（溶液中に）存在する。試験溶液と対照溶液とにおける、非天然アミノ酸ポリペプチド、非結合非天然アミノ酸ポリペプチド、または２つの割合の検出および比較は、試験リガンドが、非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドであるか否かを表している。
【０３６０】
５．タンパク質凝集の測定を介したリガンド結合決定
折りたたまれた形態におけるタンパク質の比率が高くればなるほど、折りたたまれた状態に対して排他的に結合するリガンドに対する結合に有効である、タンパク質の量が大きくなる。従って、タンパク質が公知のリガンドであれば、当該タンパク質上の他の部位に結合するリガンドを添加することによって、公知のリガンドに対する当該タンパク質の結合を増加することができる。この方法において、非天然アミノ酸ポリペプチドに対して結合する公知のリガンドは、固体の基質に不動化されている。それから、非天然アミノ酸ポリペプチドを含む溶液が、試験リガンドまたはリガンドとともに、加えられる。試験リガンド非存在下における同等のアッセイと比較した、不動化されたリガンドに対して結合する非天然アミノ酸ポリペプチドの量の増加は、試験リガンドが、非天然アミノ酸ポリペプチドと結合することを表す。固体の基質に結合された非天然アミノ酸ポリペプチドの量は、以下に概略が説明される検出方法を用いて、固体基質を試料採取することによって、または溶液を試料採取することによって、評価されてもよい。
【０３６１】
６．タンパク質凝集の測定を介したリガンド結合決定
不可逆的にアンフォールディングされるタンパク質について、アンフォールディングタンパク質は、しばしば、不溶性の凝集体を形成する。タンパク質凝集の程度は、光散乱、遠心分離およびろ過といった、以下に概要が説明される技術によって測定されてもよい。この方法において、非天然アミノ酸ポリペプチドおよび試験リガンドは、インキュベートされ、かつタンパク質凝集の量は、ゆっくり時間をかけて、または一定のインキュベーション時間の後に、測定される。試験混合物におけるタンパク質凝集の程度は、試験リガンドの非存在下における対照アッセイについての同じ測定と比較される。試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドと結合するならば、非天然アミノ酸ポリペプチドのアンフォールディングの割合は、試験リガンドの非存在下においてよりも、低いだろう。ゆっくり時間をかけた測定に関して、試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドであるならば、アンフォールディングタンパク質、およびそれゆえに凝集タンパク質の増加の割合は、試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドのリガンドではないときよりも低いだろう。一定の時間における測定について、試験リガンドが非天然アミノ酸ポリペプチドにとってのリガンドであれば、そうでないときよりも、少ないアンフォールディングタンパク質、および従って少ない凝集タンパク質であるだろう。従って、非天然アミノ酸ポリペプチドと結合する試験リガンドの能力は、試験リガンドの存在下、および非存在下におけるタンパク質凝集の程度を評価することによって決定されてもよい。
【０３６２】
＜ＸＩＶ．タンパク質検出技術＞
タンパク質の存在もしくは非存在、小ペプチド、または遊離アミノ酸を検出する、当該分野において公知の方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチドおよびそれらの断片を検出する当該方法に使用されてもよい。使用される方法は、検出されるべき産物（タンパク質、ペプチド、遊離アミノ酸）によって決定されてもよい。例えば、タンパク質の大きさを検出する方法は、非天然アミノ酸ポリペプチドのタンパク質分解の程度を決定するために使用されてもよい。放射線標識、蛍光標識、および酵素結合標識は、放射性、蛍光または酵素活性の測定によって、溶液中または基質上のいずれかにおける、存在または非存在を検出できる。免疫学的方法は、溶液中または基質上における、公知の非天然アミノ酸ポリペプチドの存在または非存在を、例えば、そのタンパク質に対して特異的な抗体の結合によって、検出できる。図１ａは、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびそれらの断片の検出に使用され得る、種々のタンパク質検出技術を表している。
【０３６３】
Ａ．蛍光顕微鏡
本明細書に開示されているタンパク質検出の方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびそれらの断片を検出するための蛍光顕微鏡法を含む。蛍光顕微鏡法は、観察される構造物の分子組成を、高い化学特異性の蛍光標識プローブの利用を介して同定可能な、広く使用される顕微鏡技術である。そのようなプローブは、非天然アミノ酸を備える、抗体、抗体断片、または抗原結合ポリペプチドであってもよい。蛍光顕微鏡法は、固定検体の研究に使用されてもよい。適度に十分な量に抽出および精製されたタンパク質に関して、蛍光団は、細胞に導入されるタンパク質および接合体に接合されてもよい。蛍光団は、ポリペプチドにおける非天然アミノ酸に接合されてもよい。蛍光類縁物質は、本来のタンパク質と同様に挙動し、かつそれゆえ細胞内における当該タンパク質の分布および挙動の解明に役立てることができると想定されている。ＮＭＲ、赤外分光法、円偏光二色性、および他の技術とともに、タンパク質本来の蛍光分解ならびに、それに共同された蛍光異方性の観察、酸素消光および共鳴エネルギー移動は、タンパク質検出に重要な技術である。
【０３６４】
蛍光分解の測定は、タンパク質における構造的変化の動態を直接に観察可能にする。さらに、アミノ酸であるチロシンおよびトリプトファンから放射するタンパク質本来の蛍光の励起は、外来性の蛍光プローブを用いたとき、局部環境の摂動の可能性を排除する。
【０３６５】
生物学的研究に対する蛍光プローブの利用の発展は、蛍光プローブとして、天然の蛍光タンパク質の利用である。蛍光タンパク質（ＧＦＲ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＴＯＰＡＳ、ＧＦＴ、ＲＦＰ）と呼ばれる天然に生じる色素は、１９９０年代の後半に発見された（Clonetech, USA）。これらの色素は、検体における還元作用によって区別される。従って、それらは、生きた調製物における標識細胞分野にとって特に好適である。
【０３６６】
クラゲのAequorea victoriaは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）として知られる、蛍光タンパク質を天然に産生する。これらの蛍光プローブの標的タンパク質に対する融合は、蛍光顕微鏡法による可視化、およびフローサトメトリーによる定量化を可能にする。これらが遺伝的にコードされ、かつ補助の共同因子を必要としないので、ＧＦＲタグは、生細胞および生体全体におけるタンパク質発現およびタンパク質局在の解析に使用され得る。このタンパク質にとっての遺伝子は、クローン化され、かつ他の生体にトランスフェクションされてもよい。ＧＦＰタグは、特定の遺伝子が、生体において発現される局在領域用に、または特定のタンパク質の位置を同定することに使用されてもよい。多くの場合において、キメラタンパク質は、それらの本来の機能を保持している。従って、例えば、タンパク質（以下に限定されないが、細胞骨格タンパク質を含む）の細胞内分布の可視化に、この技術をしばしば利用することができる。ＧＦＰを用いて、未染色または未固定の試料が観察されてもよい。現在、分光分解可能な発光色を提供する種々のＧＦＰがある。ＧＦＰの変異は、青色、シアン、および黄色の蛍光光を発光する異形を結果として生じる。現在の非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリペプチド、抗体、および抗体断片の標識に使用され得る蛍光タンパク質は、以下に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および増強ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）などを含む。ＧＦＰの新しい異形は、「ヒト化」ＧＦＰ  ＤＮＡ、哺乳類細胞における合成を増加させるタンパク質産物（「Cormackら, (1996) Gene 173, 33-38」、「Haasら, (1996) Current Biology 6, 315-324」、および「Yangら, (1996) Nucleic Acids Research 24, 4592-4593」を参照すればよい）を含む、変異を介して開発される。そのようなヒト化タンパク質の１つは、「増強緑色蛍光タンパク質」（ＥＧＦＰ）である。ＧＦＰ、ＧＦＰの異形、または他の天然に生じる色素は、非天然アミノ酸ポリペプチドに結合されてもよい。
【０３６７】
ＧＦＰは、特有の方法における蛍光によって、イオンレベルまたはｐＨの結果を伝える、バイオセンサーとして使用されてもよい。亜鉛イオンのレベルを感じ取るために使用され得る分子の１つは、ＰＤＢ（Protein Data Bank）の登録  1kysとして示される青色蛍光タンパク質である。当該タンパク質は、亜鉛が修飾した発色団と結合すると、容易に検出可能な可視シグナルを作り出して、２倍に明るい蛍光を発する。非天然アミノ酸を備える他のペプチドおよびタンパク質バイオセンサーは、それらの環境、オリゴマー状態、リガンド結合に関する高次構造、構造、または直接のリガンド結合における変化に応じて、変化した蛍光特性を示してもよい。適切に標識された蛍光生体分子は、生細胞内における生化学反応の、空間的および時間的な検出を可能にする。例えば、「Giuliano, K. A.ら, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995, 24:405-434」、「Day, R. N. MoI. Endocrinol. 1998, 12:1410-9」、「Adams, S. R.ら, Nature 1991, 349:694」、「Miyawaski, A.ら, Nature 1997, 388:882-7」、「Hahn, K.ら, Nature 1992, 359:736」、「Hahn, K. M.ら, J. Biol. Chem. 1990, 265:20335」、および「Richieri, G. V.ら, MoI. Cell. Biochem. 1999, 192:87-94」を参照すればよい。参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９５１，９４７号明細書には、検出環境が変化するバイオセンサーおよび蛍光団について論じられている。
【０３６８】
現在において、当該技術は、既存のプローブの新たな適用、ならびに新しい画期的な設計および合成によって、推進されている。本発明の範囲を制限することなく、当該プローブのいくつかは、以下のようなものである。
【０３６９】
（標識物）
蛍光の感度および安全性（放射線法と比較して）が、核酸、タンパク質および他の生体分子の特異的な標識に、ますます利用されている。フルオレセイン（Fluorescein）に加えて、４００から８２０ｎｍまでの全体の範囲を網羅する他の蛍光標識物がある。ほんの一例として、標識物のいくつかは、以下に限定されないが、フルオレセインおよびその誘導体、カルボキシフルオレセイン（Carboxyfluoresceins）、ローダミン（Rhodamines）およびその誘導体、アト（Atto）標識物、フルオレセントレッド（Fluorescent red）およびフルオレセントオレンジ（Fluorescent orange）（Ｃｙ３／Ｃｙ５（登録商標）代替物）、長い半減期を有するランタニド（Lanthanide）複合体、８００ｎｍまでの長波長標識物、ＤＹシアニン色素標識物、フィコビリンタンパク質を含む。１つの波長における吸収放射、およびより長波長における放出放射が可能である蛍光分子は、以下に限定されないが、Ａｌｅｘａ−５３２、ヒドロキシクマリン（Hydroxycou）、アミノクマリン（Aminocoumarin）、メトキシクマリン（Methoxycoumarin）、クマリン（Coumarin）、カスケードブルー（Cascade Blue）、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）、Ｐ−フィコエリトリン（P-Phycoerythrin）、Ｒ−フィコエリトリン（R-Phycoerythrin）、（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５接合体、ＰＥ−Ｃｙ７接合体、Ｒｅｄ  ６１３、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、Ｃｙ３、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン（X-Rhodamine）、リサミンローダミン（Lissamine Rhodamine B）、ＰｅｒＣＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、Ｃｙ５、Ｃｙ７、アロフィコシアン（Allophycocyanin）（ＡＰＣ）、ＴｒｕＲｅｄ、ＡＰＣ−Ｃｙ７接合体、オレゴングリーン（Oregon Green）、テトラメチルローダミン（Tetramethylrhodamine）、ダンシル（Dansyl）、ダンシルアジリジン（Dansyl aziridlne）、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｕｒａ−２、ＦＭ  １−４３、ＤｉＩＣ  １８（３）、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＳＮＡＲＦ−１、ＮＢＤ、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｌｕｏ−３、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＰ、モノクロロビマン（Monochlorobimane）、カルセイン（Calcein）、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミン（ＮＢＤ）、アナニリノナフタネレ（ananilinonapthanele）、デプロキシル（deproxyl）、フタルアミド（phthalamide）、アミノ  ｐＨ  フタルアミド、ジメチルアミノ−ナフタレンスルホンアミド、プロダン（Prodan）と同等のプローブ、ローダン（Lordan）もしくはアクリローダン（Acrylodan）、およびこれらの誘導体を含む。クマリン蛍光色素は、例えば、アミノメチルクマリン、７−ジエチルアミン−３−（４’−（１−マレイミジル）フェニル）−４−メチルクマリン（ＣＰＭ）、およびＮ−（２−（１−マレイミジル）エチル）７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボキシアミド（ＭＤＣＣ）を含む。他の有用な分子は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を示す分子を含む。そのような受容物の対の多くは、公知であり、フルオレセイン対ローダミン、クマリン対フルオレセインまたはローダミンなどを含む。有用な標識物の対のさらに他の組は、第２の群が、蛍光群の蛍光強度を低下させる消光剤である、蛍光団−消光剤の対を含む。主知の消光剤のいくつかは、アクリルアミド基、ヨウ化物または臭素酸塩といった重原子、��ＥＭＰＯといった窒素酸化物スピン標識物などを含む。これらのような標識物は、非天然アミノ酸ポリペプチドと接合されていてもよい。
【０３７０】
非天然アミノ酸ポリペプチドと接合される蛍光団は、いつでも、または当該ポリペプチドが標的に結合されているときだけ、蛍光を発し得る。蛍光団の他の種類は、接合体を含む。
【０３７１】
（接合体）
ほんの一例として、接合体のいくつかは、以下に限定されないが、イソチオシアネート接合体、ストレプトアビジン接合体、およびビオチン接合体を含む。抗体接合体は、生細胞および生体全体における追跡生体分子に広く使用されている。それらは、実質的にあらゆるエピトープに対しての特異性を用いて生成されてもよく、かつそれゆえ、広範囲の生体分子の画像化に、原則的に適用可能である。以下に限定されないが、抗体接合体を含む接合体は、非天然アミノ酸を備えていてもよい。
【０３７２】
（酵素基質）
酵素基質は、以下に限定されないが、蛍光発生的なおよび色素生産性の基質を含む。
【０３７３】
（微小ナノ粒子）
種々の技術は、大きさ、マトリクス化学的性質、蛍光団の種類、蛍光強度、および表面官能基の範囲に関して、広範囲の蛍光微粒子の調製を可能にする。ほんの一例として、使用される蛍光団は、ＦＩＴＣ（緑色蛍光、励起／放出＝５０６／５２９ｎｍ）、ローダミン  Ｂ（オレンジ蛍光、励起／放出＝５６０／５８４ｎｍ）、ナイルブルー  Ａ（赤色蛍光、励起／放出＝６３６／６８６ｎｍ）である。
【０３７４】
蛍光ナノ粒子は、例えば、生化学的領域、生物分析的領域、および医学的領域において、光学的なデータ蓄積および他の技術適用にとって有望なツールである。現在の医学的および生物学的な蛍光画像化法は、分子ごとの光放出と、同様に光安定性に限定される色素マーカーに主に基づく。ナノ粒子は、強く、かつ安定な蛍光を与えながら、これらの問題を克服する。蛍光ナノ粒子は、種々の免疫アッセイに首尾よく使用されている。蛍光ナノ粒子は、ポリアクリロニトリル、およびポリスチレンなどといった異なる材料に基づいている。
【０３７５】
（分子回転子）
蛍光分子回転子は、それらの回転が制限された場合に限って、蛍光を発するようになる微小環境の制限のセンサーである。蛍光強度の変化が、蛍光団の供与物−受容物結合について、分子内回転の緩和の制限に原因して生じる。分子制限の例としては、以下に限定されないが、増加した色素（凝集）、抗体との結合、またはアクチンの重合体化に捕捉されることが挙げられる。
【０３７６】
（ＩＥＦマーカー）
ＩＥＦ（等電点電気泳動）は、主にタンパク質である両性電解質の分離にとって、強力な分析ツールである。分析の高い性能を保証するために、ｐＩの標準物質（ｐＩマーカー）が必要である。蛍光ＩＦＥ−マーカーを用いた等電点ゲル電気泳動にとっての利点は、勾配の形成を直接に観察可能なことである。また、蛍光ＩＦＥ−マーカーは、２８０ｎｍ（２８℃）におけるＵＶ吸収によって検出されてもよい。
【０３７７】
あらゆるまたはすべてのこれらの蛍光プローブは、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片の検出に使用されてもよい。図９は、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸カルボニルと、分子のヒドロキシアミンとの間におけるオキシム形成を介して、タンパク質に対して部位特異的に付着される分子の限定されない例を表している。示されている当該分子は、蛍光団、ビオチンおよびキレート剤である。
【０３７８】
（バイオ直交化化学レポーター）
小分子は、細胞内区画および血管外区画に対して、より良好に接近する。画像化試として使用するこれらは、所望の生体分子に対する小さなプローブを選択的に標的する手段を必要とする。求核的な作用性は、大部分の種類の生体高分子に、ビオチン、蛍光団、および多くの他の小分子レポーターを用いた容易な誘導体化の許容を生じる。確立された生接合手順は、インビトロにおいて精製された生体重合体にとって、これらの操作を軽微にさせる。それは、抗体標識の特異性を有する遺伝的にコードされたタグの簡便性と、小分子プローブの汎用性とを一体にする、タグ付き生体分子にとって交換可能な方法である。この方法は、細胞自身の生合成機構を用いた、標的分子に対する固有の化学的機能性（バイオ直交化化学レポーター）の組み込みに関する。バイオ直交化化学レポーターは、外来の、外来的に供給されるプローブを用いた高い選択性の反応を介して、生体系において修飾される安定した手段である。この２段階標識過程は、プローブの性質に依存して検出または単離するための、標的生体分子の準備に使用されてもよい。
【０３７９】
バイオ直交化カップリング反応の例としては、以下に限定されないが、トリアリールホスフィンを用いたアジドのシュタウディンガーライゲーション（Staudinger ligation）、ケトン／アルデヒド−ヒドラジン反応、およびヒュイゲンの（Huisgen's）１，３−双極アジド−アルキン付加環化が挙げられる。立体的に目立たないアジド基を有する大きな蛍光タグの置き換えは、生細胞、組織または生体の内部において、偏りのない様式に分配可能なプローブを提供し得る。同様にまた、特異的タンパク質に対するプローブ結合親和性に関する、蛍光タグの可変性の、およびしばしば拮抗的な効果は、排除される。最後に、アジド−アルキン付加環化化学反応の利用は、化学的に多様な蛍光団タグ付の試薬を大量に生成および精製する必要を除くことによって、プローブ合成を簡素化する。非天然アミノ酸ポリペプチドを利用するカップリング反応は、蛍光的にタグ付けされたポリペプチドになる代替物である、プローブを提供し得る。ヒュイゲンの１，３−双極アジド−アルキン付加環化は、他の分子の付着に使用され、またはポリペプチドを精製もしくは検出する他の方法を提供し得る。
【０３８０】
ペプチドライブラリーは、固体支持体上において、および着色受容体によって合成されてもよく、染色された固体支持体は、１つずつ選択されてもよい。受容体が少しも色を示さないときには、それらの結合抗体が染色されてもよい。顕微鏡下、または拡大鏡下でさえ、ピンセットによって固体支持体を分離可能なので、当該方法は、タンパク質受容体に関してだけでなく、合成人工受容体の結合リガンドスクリーニング、およびその上に、新たな金属結合リガンドのスクリーニングに関してもまた、使用され得る。大量の化合物をスクリーニング可能なので、この方法は、新たな導出化合物の検索に有用である。
【０３８１】
しかし、蛍光強度に依存した活性の決定は、正確ではないかもしれず、大量の固体支持体は、必ずしも１つずつ処理されないかもしれない。従って、高速大量処理スクリーニング（ＨＴＳ）用の自動化された方法が要求されており、かつＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorter）が使用され得る。この機械は、そもそもキャピラリーチューブを通して細胞を流し、かつそれらの蛍光強度を検出することによって細胞を分ける。同様の方法は、細胞の代わりに固体支持体上において使用されてもよい。細胞を目指して設計されるので、細胞と同等の大きさの小さな樹脂が流されてもよいが、固体支持体の通常の大きさ（５０−２００ｐｍｏｌ）は、特に改変された機械を必要とする。また、化合物の部分的なまたは全体の単離が、行われてもよい。化合物の部分的な単離について、異なる条件における、時間制御された光分解、または切断される種々の官能基が、使用される。一方において、軟寒天上に固体支持体を拡散させ、かつある化合物を光分解によって単離することができる。それから、単離された化合物は、スクリーニングおよび固体支持体の分離が同時に行われ得るように、固体支持体の近くに広がる。
【０３８２】
Ｂ．免疫アッセイ
本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するための免疫アッセイを含む。免疫アッセイは、科学的試験（例えば、興味のある分析物（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片）の特異的な、および感度の高い検出のための、酵素免疫アッセイおよび免疫ブロット）を可能にする化学および免疫学の原理を兼ね備える。これらのアッセイの基本的な原理は、抗原抗体反応の特異性である。ウエスタンブロットも同様に、単一のタンパク質は、免疫ブロッティングを用いてその抗原によって検出され得る。競合的な結合免疫アッセイは、分析物が、抗原分子の制限されたプールに関して、標識された抗原と競合する（例えば、標識免疫アッセイ、ＥＭＩＴ）ように行われ得る。免疫アッセイは、抗体が過剰に存在し、かつ標識されているという点において、非競合的である。分析物である抗原が増加するに従って、標識された抗体−抗原複合体の量もまた、増加する（例えば、ＥＬＩＳＡ）。実験動物に抗原を注射することによって産生されるとき、抗体は、他クローン性であってもよく、または細胞融合および培養細胞技術によって産生されるとき、抗体は、単クローン性であってもよい。免疫アッセイにおいて、抗体は、分析物である抗原に対して特異的な試薬として役立つ。当該抗原は、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびそれらの断片であり得る。一方において、免疫アッセイに使用される当該抗体またはこれらの断片は、非天然アミノ酸ポリペプチドであってもよく、かつ非天然アミノ酸を父君いても、または含んでいなくてもよい抗原の検出に使用されてもよい。
【０３８３】
本発明の範囲および趣旨を制限することなく、ほんの一例として、免疫アッセイのある種類は、ＲＩＡｓ（放射免疫アッセイ）およびＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）のような酵素免疫アッセイ、ＥＭＩＴ（酵素多重免疫アッセイ技術）、微小粒子酵素免疫アッセイ（ＭＥＩＡ）、ＬＩＡ（発光免疫アッセイ）、ならびにＦＩＡ（蛍光免疫アッセイ）である。これらの技術は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するために使用されてもよい。１次抗体または２次抗体のいずれかとして使用される当該抗体は、放射性同位元素（例えば、１２５Ｉ）、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ）、または蛍光生成反応または発光反応を触媒する酵素（例えば、ＨＲＰまたはＡＰ）であってもよい。
【０３８４】
１．ＥＭＩＴ（酵素多重免疫アッセイ技術（Enzyme Multiplied Immunoassay Technique））
ＥＭＩＴは、分離段階を免れる競合的結合免疫アッセイである。タンパク質が酵素および酵素−タンパク質−抗原複合体を用いて標識されている免疫アッセイの種類は、非標識のタンパク質の定量化を可能にする酵素学的に不活性である。
【０３８５】
２．ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ法）
本明細書に開示されているタンパク質の検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するためのＥＬＩＳＡを含む。酵素結合免疫吸着アッセイ法は、低レベルのタンパク質の検出を可能にする系を生成する酵素反応を用いて組み合わせられた固体支持体に付着された選択的な抗体に基づいている。また、それは、酵素免疫アッセイまたはＥＩＡとして知られている。以下に限定されないが、タンパク質を含む当該抗原は、当該抗原に対して、すなわち、それを抗原として作製される抗体によって検出される。単クローン性抗体が、しばしば使用される。
【０３８６】
当該試験は、試験チューブといった固体支持体に固定された抗体、および酵素に結合された同じ抗体の調製を必要とする。当該酵素は、無色の基質から有色の産物を産生する酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）である。例えば、当該試験は、アッセイされるべき抗原溶液（例えば、タンパク質）を用いてチューブを充填することによって実施される。存在するあらゆる抗原分子が、不動化された抗体分子に結合し得る。抗体−酵素接合体は、反応混合物に加えられる。当該接合体の抗体部分は、あらかじめ結合されたあらゆる抗原分子と結合して、抗体−抗原−抗体の「サンドイッチ」を作り出す。あらゆる未結合の接合体を洗い流した後に、基質溶液が加えられる。ある指定の間隔の後に、反応が停止され（例えば、１規定のＮａＯＨの添加によって）、２次抗体に接合された分子と基質の反応によって形成される有色産物の濃度が、分光光度計において測定される。色の強度は、結合した抗原の濃度と比例する。
【０３８７】
また、ウェルが適切な抗原を用いて覆われている場合には、ＥＬＩＳＡが、抗体の濃度の測定に適応される。抗体を含む溶液（例えば、血清）が加えられる。不動化された抗原と結合する時間が経過した後に、試験されるべき抗体に対する抗体からなる、酵素接合抗免疫グロブリンが加えられる。未反応の試薬を洗い流した後に、基質が加えられる。生成される色の強度は、結合された酵素標識抗体の量（そして、従って、アッセイされるべき抗体の濃度）に比例する。
【０３８８】
３．放射免疫アッセイ
本明細書に開示されているタンパク質の検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するための放射免疫アッセイを含む。放射免疫アッセイは、非常に感度が高い。高い親和性（例えば、Ｋ０＝１０８−１０１１Ｍ−１）の抗体を用いて、チューブにおける数ピコグラム（１０−１２ｇ）の抗原を検出可能である。
【０３８９】
放射性同位元素は、少量の化合物のインビボにおける物質代謝、分布および結合に関する研究に使用され得る。１Ｈ、１２Ｃ、３１Ｐ、３２Ｓ、１２７Ｉの放射性同位元素として、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉが使用される。放射性同位元素は、それらが容易に転換され得るほどに、非放射性の同位元素と、ほとんど同じ化学的特性を有している。また、放射エネルギーが比較的に大きいので、少量しか必要ではない。
【０３９０】
（受容体固定法）
９６ウェルプレート形式に関して、受容体が、抗体用いること、または化学的方法によってウェルのそれぞれに固定され、かつ放射性標識リガンドが、結合を誘導するためにウェルのそれぞれに加えられる。未結合のリガンドは、洗い流され、そしてそれから、標準が、結合したリガンドの、または洗い流されたリガンドの放射性の定量的分析によって決定される。標的化合物が、標準の放射性リガンドよりも、受容体に対して高い親和性を示すとき、放射性リガンドのほとんどは、受容体と結合せず、かつ溶液に残される。従って、結合した放射性リガンド（または洗い流したリガンド）の量を分析することによって、標的化合物の親和性が容易に表され得る。
【０３９１】
ろ過膜法は、受容体が９６ウェルプレートに固定されない、またはリガンド結合が液相において実施されないときに使用されてもよい。この方法によれば、リガンド−受容体結合反応が溶液において起こった後に、反応溶液は、ニトロセルロースろ紙を介してろ過される。リガンドを含む小分子は、ろ紙を通って行き、かつタンパク質受容体のみは、当該紙に残される。受容体と強く結合されているリガンドのみが、ろ紙上に留まり続け、かつ加えられた化合物の相対的な親和性が、標準の放射性リガンドの定量分析によって同定され得る。また、この方法は、同様にタンパク質キナーゼ阻害剤の選別に使用され得る。この場合には、γ−３２Ｐ−ＡＴＰがリン酸基供給体として使用され、放射性標識タンパク質基質を確認することによって、酵素活性が分析され得る。反応しない放射性ＡＴＰは、ろ過され、かつ除去される。
【０３９２】
ほんの一例として、放射免疫アッセイは、放射性の抗原、およびその抗原に対する抗体の混合物を調製することによって、実施され得る。ヨウ素原子は、タンパク質におけるチロシン残基に導入され、放射性同位元素１２５Ｉまたは１３１Ｉがよく使用される。既知の量の非標識（「コールド」）抗原が混合物の試料に加えられてもよい。これらは、抗体の結合部位に関して競合する。非標識抗原の濃度が増加すると、抗体分子から置き換えられる放射性抗原の量が増加する。抗体−結合抗原は、上清の液体における遊離抗原から分離され、それぞれの放射性が測定される。これらのデータから、標準結合曲線が描かれてもよい。アッセイされるべき試料（「未知物質」）は、平行して実施される。未知物質のそれぞれにおいて遊離抗原と結合する割合を決定した後に、抗原濃度は、標準曲線から直接に読み取られ得る。
【０３９３】
非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出に使用される他の放射免疫アッセイは、ほんの一例として、１次抗体に対して方向付けられた「２次」抗体を加えることによる、抗原−抗体複合体の沈降である。例えば、ウサギＩｇＧが抗原との結合に使用されるとき、当該複合体は、抗ウサギＩｇＧ抗血清（例えば、ウサギＩｇＧを用いてヤギを免疫することによって生じる）を加えることによって沈降されてもよい。変更可能に、抗原特異的な抗体は、試験チューブの内壁と結合され得る。インキュベーションの後に、未結合の内容物が除去され；チューブが洗浄され；かつ未結合の材料および結合した材料の両方が、測定される。抗原−特異的な抗体は、セファデックス（Sephadex）のような粒子に結合されてもよい。反応混合物の遠心分子は、上清液体における遊離カウントから結合カウント（ペレットにおける）を分ける。
【０３９４】
４．蛍光免疫アッセイ
本明細書に記載されているタンパク質の検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するための蛍光免疫アッセイを含む。蛍光に基づく免疫学的方法は、非常に特異的な受容体部位に対して、非標識リガンドに対する標識リガンドの競合的結合に基づいている。それは、タンパク質の分析における臨床的および分析的生化学にとって、非常に重要なツールである。
【０３９５】
この技術は、分析物の濃度の変化に伴う、蛍光の半減期の変化に基づいた蛍光アッセイに使用され得る。この技術は、蛍光が、エオシン（受容物）へのエネルギー移動によって消失される、フルオレセインイソチオシアン酸塩（ＦＩＴＣ）（供与物）のような短い半減期を有する色素を用いて機能する。多くの分子種が、供与物分子から受容物分子にエネルギー移動を生じさせるために使用されてもよい。特に、サンドイッチ型の免疫複合体刑背は、この技術を用いて使用され得る。
【０３９６】
多くの光ルミネセンス化合物は、本発明の方法に使用されてもよく、かつ蛍光顕微鏡において上述した化合物と同様に、シアニン、オキサジン、チアジン、ポルフィリン、フタルシアニン、蛍光赤外発光多核芳香族炭化水素、フィコビリタンパク質、スクアライン（squaraines）および有機金属複合体、炭化水素ならびにアゾ色素といった群を含む。
【０３９７】
蛍光に基づく免疫学的方法は、例えば、異種または同種であり得る。同種の免疫アッセイは、遊離様式分析物からの結合の物理的な分離を包含する。分析物または抗体は、固体表面に付着されていてもよい。当該技術は、競合的（より高い選択性にとって）、または非競合的（より高い感受性にとって）であってもよい。検出は、直接的（使用される抗体が１種類のみ）または非直接的（２種類の抗体が使用される）であってもよい。同種の免疫アッセイは、物理的分離を包含しない。２重抗体蛍光標識抗原は、抗原および蛍光団の両方に対して方向付けられた抗体を用いた平衡反応に関する。標識抗体および非標識抗体は、制限された数の抗抗原抗体について競合する。
【０３９８】
（単純蛍光標識法）
受容体−リガンド結合に関して、適切な蛍光を用いることによる酵素活性に関して、ならびにｐＨ、イオン濃度、および電圧といったインビボにおける種々の生理学的変化の蛍光指標として、使用されてもよい。チロシンおよびトリプトファンといったアミノ酸の自己蛍光は、バックグラウンド放射を結果として生じ、かつよく使用されるシアニンといった５２０ｎｍよりも長いＵＶ長を吸収する弱い点蛍光物質に打ち勝つ。
【０３９９】
（ＦＲＥＴ：蛍光共鳴エネルギー移動）
ＦＲＥＴは、インビボにおける２つのタンパク質の相互作用を測定するために使用されてもよく、かつナノメーター規模の距離および距離（高次構造）の変化を測定することができる。従って、単純なタンパク質−タンパク質相互作用、ならびにタンパク質の折りたたみ、高次構造および安定性の変化に使用されている（「Philipps, B.; Hennecke, J.; Glockshuber R. MoI Biol. 2003, 327, 239-249」および「Riven, L; Kalmanzon, E.; Segev, L.; Reuveny E. Neuron. 2003, 38, 225-235」を参照すればよい）。２つの異なる蛍光分子（蛍光団）は、興味のある２つのタンパク質に接合される。蛍光団に接合された非天然アミノ酸ポリペプチドが、ＦＲＥＴに使用される。２つの蛍光化合物が、１つの蛍光団の代わりに使用されるとき、蛍光エネルギー移動を生じない。蛍光供与物の発光は小が受容物の吸収波長と類似しているとき、励起状態にある供与物は、蛍光を発する代わりに受容物にそのエネルギーを移動し、かつ続いて、放射が受容物の放射波長において生じる。多くの蛍光団の対が、興味のあるタンパク質に融合された、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、異種のＣＦＰ（シアン）およびＹＦＰ（黄色）を含む、ＦＲＥＴ分析に使用されている。
【０４００】
ＦＲＥＴ効果が５０％の距離Ｒ０は、供与物の放射範囲、受容物質の吸収範囲、ならびに受容物の量子産生および溶媒に依存している。２つの蛍光分子がＲ０より互いに短い距離にあるならば、供与物の吸収光が放射されるときに、理論的には、受容物の蛍光がより強くなる。当該距離がＲ０より長くなると、同じ光が放射されるとき、供与体の蛍光は、より強く検出される。従って、蛍光分子が、プロテアーゼといったキナーゼとして使用され得る、小さいペプチドの末端に結合されているとき、酵素活性は、容易に測定され得る。ＢＲＥＴ（生体発光共鳴エネルギー移動）は、Xuらによって開発された（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999, 96, 151-156）。それは、ＦＲＥＴと同様の原理において作用し、レニラ（Renilla）ルシフェラーゼの放射スペクトルが、ＣＦＰの放射スペクトルと類似しているという知見に基づいている。これらの技術は、蛍光タンパク質を標的化した細胞小器官を用いるとき、膜タンパク質−タンパク質相互作用を含む、特定の細胞内区画における相互作用の研究を可能にする。すべての転写後修飾の現象が、哺乳類細胞において研究され得る。
【０４０１】
（ＴＲＦ：時間分解蛍光）
蛍光のバックグラウンドを減少させるために、時間分解蛍光が開発された。一般的な蛍光分子の励起状態の半減期は、通常、数ミリ秒でしかないが、ランタニド系の元素は、ミリ秒の反撃を有している。ＴＲＦは、他の分子の放出が終わったあとに、ランタニド系の蛍光を選択的に測定する方法である。また、ＴＲＦは、ＦＲＥＴと一体になっていてもよく、かつランタニド系は、供与物または受容物になる。
【０４０２】
５．種々のアッセイ形態
「サンドイッチ」免疫アッセイおよびプローブアッセイを含む、種々のアッセイ形態を、本明細書に開示されている非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片の検出に使用してもよい。例えば、第１のアッセイの形態において、固相上に被覆した、他クローン性抗体、もしくは単クローン性抗体、もしくはそれらの断片、またはこれらの抗体の組み合わせを、第１の混合物を形成するために、試験試料を接触させる。この第１の混合物を、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件において、インキュベートする。それから、シグナル生成化合物が付着されている、他クローン性抗体、もしくは単クローン性抗体、もしくはそれらの断片、またはこれらの抗体の組み合わせを備える指標試薬を、第２の混合物を形成する抗原／抗体複合体と接触させる。それから、この第２の混合物を、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件においてインキュベートする。試験試料における、および固相上に捕獲されている抗原の存在は、いくらかでもあれば、シグナル生成化合物によって生成される測定可能なシグナルを検出することによって決定される。試験試料に存在する抗原の量は、生成されるシグナルに比例する。
【０４０３】
変更可能なアッセイ形態では、（１）抗原、または固体支持体に結合された抗体のような組み合わせと特異的に結合する、他クローン性抗体、単クローン性抗体、またはこれらの断片と、（２）試験試料と、（３）シグナル生成化合物に付着された、異なるエピトープ（またはこれらの抗体の組み合わせ）と特異的に結合する、他クローン性抗体、単クローン性抗体、またはこれらの断片を備える指標との接触によって、混合物を形成する。この混合物を、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件において、インキュベートする。試験試料における、および固相上に捕獲されている抗原の存在は、いくらかでもあれば、シグナル生成化合物によって生成される測定可能なシグナルを検出することによって決定される。試験化合物に存在する抗原の量は、生成されるシグナルと比例する。
【０４０４】
他のアッセイの形態において、本発明の少なくとも２つの単クローン性抗体の１つまたは組み合わせは、抗原に対する抗体の検出用の競合的なプローブとして、使用されてもよい。例えば、単独、または組み合わせのいずれかである、本明細書に開示されている非天然アミノ酸ポリペプチドは、固相上を覆っている。それから、抗原に対する抗体を含むと推測される試験試料は、シグナル生成化合物、および少なくとも１つの単クローン性抗体を備える指標試薬を用いて、固相に結合された試験試料および指標試薬か、固相に結合された指標試薬かのいずれかの抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件において、インキュベートされる。固相に対する単クローン性抗体の結合の低減は、定量的に測定されてもよい。
【０４０５】
さらに他の検出方法において、単クローン性抗体または他クローン性抗体を、免疫組織的分析によって、組織切片と同様に、細胞における抗原の検出に使用してもよい。組織切片を、組織の凍結固定試料または化学固定試料のいずれかから切ってもよい。抗原が細胞において検出されるときには、当該細胞を、血液、尿、胸部吸引液または他の体液から単離してもよい。当該細胞を、外科的な、または針によるのいずれかの生検によって得てもよい。抗体を用いた染色について細胞の特定の画分を富化するために、磁性粒子または第一鉄含有液体を用いた標識の後に、遠心分離または磁気誘引によって、当該細胞を単離してもよい。また、細胞化学的分析は、本発明の範囲内にある。これらの抗体が、（例えば、フルオレセイン、コロイド状の金、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼなど）直接に標識されている、または（本明細書に例示されているような種々の標識を用いて）２次の標識抗種抗体を用いることによって標識されている。
【０４０６】
また、単クローン性抗体（およびそれたの断片）の組み合わせは、本明細書に開示されている非天然アミノ酸ポリペプチドの他の領域と特異的に結合する抗体であり、かつそれぞれが異なる結合特異性を有する抗体を有する、混合物における構成要素として共に、または「カクテル」単独に使用されてもよい。当該アッセイに使用される他クローン性抗体は、他クローン性抗体の単独に、またはカクテルとしてのいずれかにおいて使用されてもよい。当該アッセイ形態において使用されるカクテルが、本明細書に開示されている非天然アミノ酸ポリペプチドに対する異なる結合特異性を有する単クローン性抗体、または他クローン性抗体を備えているので、それらは、種々の疾病および状態に対する、検出、診断、病期診断（staging）、監視、予後判定、インビボ画像化、予防もしくは処置、または素因の決定に有用である。
【０４０７】
本明細書に開示されている非天然アミノ酸が、組み換え抗体の利用と同様に、本明細書に開示されている非天然アミノ酸ポリペプチドのアミノ酸配列を備えるポリペプチドである合成ポリペプチド、または精製ポリペプチドの利用によるアッセイにおいて検出されてもよいことは、意図され、かつ本発明の範囲内に含まれる。また、本明細書に開示されている非天然アミノ酸ポリペプチドの異なるエピトープを同定する、異なる合成の、組み換えのまたは精製されたポリペプチドが、検出、診断、病期診断（staging）、監視、予後判定、インビボ画像化などに関するアッセイの組み合わせに使用されてもよいことは、本発明に範囲に含まれる。この場合において、これらのすべてのポリペプチドが、１つの固相上を覆っている、または別々のポリペプチドのそれぞれが、巨大粒子といった別々の固相上を覆っており、かつそれから、後のアッセイに使用され得るポリペプチド混合物を形成するために、組み合わせられてもよい。それから、固相を覆っている、または検出可能な標識を用いて標識されたポリペプチドは、制限された量の抗体に対して、試料に存在する抗体と競合することが可能である。抗体（または複数の抗体）に対する合成の、組み換えの、または精製されたポリペプチドは、本明細書に開示されている非天然アミノ酸ポリペプチドの存在の指標である。種々のアッセイ形態は、当該分野における通常の当業者に公知である。
【０４０８】
６．免疫アッセイ用の走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）
本明細書に開示されているタンパク質の検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するためのＳＰＭを含む。走査型プローブ顕微鏡において、捕捉相には、例えば、少なくとも１つの単クローン性抗体は、固相に付着され、かつ走査型プローブ顕微鏡は、当該固相の表面に存在する抗原／抗体複合体の検出に使用される。走査型トンネル顕微鏡の使用は、多くの免疫アッセイ系において抗原／抗体複合体の検出に必須に利用される、標識の必要性をなくす。
【０４０９】
特異的な結合反応を監視するためのＳＰＭの利用が、種々に起こり得る。１つの実施形態において、特異的な結合相手（単クローン性抗体である分析物の特異的な実質）の構成要素の１つは、走査に好適な表面に付着される。分析物の特異的な実質は、付着は、プラスチック表面または金属表面の固相を備える試験片に対する吸着によるものであり得る。誘導体化されたプラスチック、金属、ケイ素、またはガラスの固相を備える試験片に対する、特異的な結合相手（分析物の特異的な実質）の共有結合的付着は、利用され得る。共有結合的付着法は、当該分野における当業者に知られており、かつ試験片に対して特異的な結合相手を不可逆的に連結する一連の手段を含む。試験片がケイ素またはガラスであるとき、当該表面は、特異的な結合相手を付着する前に、必須に活性化される。また、多価電解質の相互作用は、技術および化学的性質を用いることによる、試験片に対する特異的な結合相手の不動化に使用され得る。付着の好ましい方法は、共結合的手段である。特異的な結合構成要素の付着に続いて、当該表面は、非特定的結合を最小化するために血清、タンパク質または他の遮断薬といった材料を用いて、さらに処理され得る。また、当該表面は、アッセイの目的にふさわしい安定性を確認するために、製品の部位または利用の段階において、走査されてもよい。走査過程は、試験片の特異的な結合特性の変質を見込まれない。
【０４１０】
Ｃ．分光法
１．核磁気共鳴（ＮＭＲ）
本明細書に開示されているタンパク質の検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するためのＮＭＲを含む。
【０４１１】
ＮＭＲ分光法は、原子の分解能において、タンパク質および核酸のような生物学的巨大分子の構造を決定することができる。さらに、巨大分子におけるの分子内動態、反応速度論、分子認識またはタンパク質の折りたたみといった時間依存的な現象を、ＮＭＲを用いて研究することが可能である。非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するためのＮＭＲを含む。
【０４１２】
ＮＭＲの理論的なおよび実施上の性能の発達は、ＮＭＲスペクトルの情報内容のますます増加する有効な利用を導いた。生化学的な方法（組み換えタンパク質発現）における平行した発展は、タンパク質試料の簡単な、および早い調製を可能にする。１５Ｎ、１３Ｃおよび２Ｈのような異核は、不均一に、または選択的な同位体標識によって、タンパク質に組み込まれ得る。これらの試料からのスペクトルは、大幅に単純化され得る。さらに、巨大分子の構造および動態に関する新たな情報のいくつかは、これらの方法を用いて決定され得る。これらの発展のすべてが、現在、３０ｋＤａまで、またはそれ以上の質量を有するタンパク質の構造決定を可能にしている。
【０４１３】
２．Ｘ線結晶学
本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するためのＸ線結晶解析を含む。
【０４１４】
Ｘ線結晶解析は、結晶における原子の密接配置格子を介したＸ線の回折によって生成されるパターンが、記録され、かつそれからその格子の性質を明らかにするために分析される、結晶解析に属する技術である。これは、通常、実体の物質的な、および分子の構造の理解を導く。結晶格子における空間配置は、ブラッグの法則を用いて決定され得る。原子核よりむしろ、原子を取り囲む電子が、入ってくるＸ線の格子と物理的に相互作用する実体である。この技術は、有機化合物、ＤＮＡおよびタンパク質を含む非常に多様な分子の構造を決定するために、化学および生化学において、広く使用されている。Ｘ線回折は、広く、物質の単一結晶を用いて実行されるが、もし利用可能でないときには、微晶質の粉末試料がまた使用されてもよいが、これは、異なる装置を必要とし、かつさらに簡単ではない。
【０４１５】
Ｘ線結晶解析に関して、分子は必須に結晶化されている。１つの電子によって回折された１つの光子は、確実に検出され得るわけではないが、規則正しい結晶構造のために、当該光子は、対象に配置された多くの分子において対応する電子によって回折される。ピークが一致する同じ周波数の波が、互いに強め合うので、シグナルが検出可能になる。構造を決定するために、興味のある分子の結晶は、ある結晶化法を用いて成長される。結晶は、回収され、かつ液体窒素を用いてしばしば凍結される。凍結結晶は、データ収集の間に被る放射線損傷を低減し、かつ結晶内における熱運動を低下させる。結晶は、Ｘ線の光線を放出する装置である回折計上に配置される。Ｘ線は結晶において回折し、かつ回折パターンは、フィルムに記録され、そしてコンピューターに読み取られる。これらの解析画像が、合成され、かつ最終的には、結晶化された分子の電子密度の地図を作成するために使用され、それから、原子が電子密度地図、および観察された回折データに最も適合させるために、精密化される位置といった種々の要因に適応させられる。
【０４１６】
３．蛍光分光法
本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するための蛍光分光法を含む。
【０４１７】
標準的な蛍光測定に加えて、種々の他の方法が開発されている。従来の蛍光光度法は、蛍光団のある放射最大量についての明確な波長における、放射光強度の測定に関する。総計蛍光光度法は、放射波長だけでなく、吸収の連続についてのデータの収集に関する。蛍光偏光において、偏光は、偏光の程度に影響する、蛍光色素標識抗体の特異的な抗体に対する励起および結合に使用される。狭帯域化分光法は、それが供給する狭大域放射スペクトルから、その選択性を誘導する低音固体状態の分光法に関する。
【０４１８】
時間依存蛍光分光法は、安定状態の値が時間分解決定の時間平均を表すので、安定状態の測定より多くの情報を含む時間分解測定を、備える。それは、励起光パルスと、試料によって放射される第１の光子との間の時間が測定される、単一光子の時間計測技術である。
【０４１９】
周波数領域蛍光分光法は、時間分解法と交換可能である。蛍光の時間遅延は、任意の周波数における正弦的に変調された強度を有する光源を用いて、励起光に関する蛍光シグナルの相遅延および相対的な変調によって、通常に測定される。
【０４２０】
４．マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ）
本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するためのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを含む。
【０４２１】
（直線型飛行時間質量解析）
質量分析は、複雑さが変わる大きな生体分子を分析および性質決定する重要なツールとなっている。１９８７年に開発されたマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）技術は、３００，００Ｄａを超える生体分子の質量分析的分析にとっての質量の上限を増大させており、かつ質量分析による大きな生体分子の分析を可能にして、より簡単にかつより感度よくしている。ＴＯＦ質量分析は、異なる質量／電荷（ｍ／ｚ）比のイオンが一時的かつ特別に規定された群が、同じ印加電界（Ｋ．Ｅ．＝［ｍｖ２］／２＝ｚｅＥｓ、ここで、Ｋ．Ｅ．＝反応速度学エネルギー；ｍ＝イオンの質量；ｖ＝イオンの速度；ｚ＝電荷の数；ｅ＝クーロン単位における電子の電荷；Ｅ＝電界勾配；およびｓ＝イオン供給領域の距離）にさらされ、かつ一定の電界領域に漂うことを可能にされるとき、それらが、ｍ／ｚ比に依存してある時間にこの領域を通過するという原理によって動作する。
【０４２２】
（リフレクトロンＴＯＦ−ＭＳ）
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳにおいて向上された質量分解能は、１段階または２段階のリフレクトロン（ＲＥＴＯＦ−ＭＳ）の利用によって得られている。飛行チューブの末端に配置されているリフレクトロンは、わずかに異なる反応速度論エネルギーのお暗示ｍ／ｚ比の飛行時間における差について、リフレクターによって補正するために、使用される。これは、検出器における空間および時間へのイオンパケットの収束を結果として生じる。リフレクトロン質量スペクトルにおいて、等方性多重線は、約３４００の半値全幅（ＦＷＨＭ）質量分解を生成してよく分解される。６０００までの質量分解能（ＦＷＨＭ）ＲＥＴＯＦ−ＭＳを用いて約３０００Ｄａまでのペプチドについて得られる。また、質量解析能を増強することは、イオンの質量を決定するときに、質量の正確さを向上することができる。
【０４２３】
従来、直線型ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびリフレクトロンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、タンパク質の構造的な情報に導く、分子イオンおよび酵素消化物の分子量決定に、主に利用されている。これらの消化物は、通常、分子量決定の前の精製を用いて、または用いずに質量分析される。種々の方法論が、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを利用して、タンパク質およびペプチドに関する一次配列情報を得るために開発されている。２つの異なる方法が取られ得る。第１の方法は、タンパク質ラダーシークエンシング（ladder sequencing）として知られており、かつＴＯＦ質量分析器に挿入すること、および続く分析の前に、分析物の構造的な情報を与える断片を得るために、採用される。第２の方法は、準安定なイオン分解の現象を利用し、かつＴＯＦ質量分析器の内部に配列情報の生成を生じる。
【０４２４】
（ＴＯＦ−ＭＳを用いたラダーシークエンシング）
タンパク質またはペプチドは、それぞれが１アミノ酸残基だけことなる断片内におけるタンパク質またはペプチドのＮ末端、またはＣ末端のいずれかからの、時間依存的な、または濃度依存的な化学分解のいずれかからなるラダーシークエンシング技術を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて、配列決定され得る。混合物は、特定のアミノ酸残基と一致する隣接する質量スペクトルのピーク間における質量差を用いた、単一のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ実験において質量分析される。この種類の分析は、単一のＭＡＬＤＩ試料に存在する一揃えのペプチド／タンパク質の質量を簡単に決定するものと考えられ得る。質量スペクトルに生じる整列は、もとのタンパク質またはペプチドにおけるアミノ酸の配列を明確にする。
【０４２５】
（ＲＥＴＯＦ−ＭＳ  ＭＡＬＤＩを用いたポストソース分解）
従来、ほぼ唯一に原型を保ってプロトン化された擬似分子（pseudomolecular）イオン種を生成する「穏やかな」イオン化技術と考えられている。準安定なイオン分解の有意な程度が、検出前のイオン加速の後に生じる。ペプチドおよびタンパク質の準安定なイオン分解からのイオン断片は、中性分子（例えば、水、アンモニアおよびアミノ酸の側鎖の一部）の消失およびペプチド結合における無作為の切断の両方を、典型的に含む。ＭＬＡＤＩ質量スペクトルにおけるこれらの準安定なイオン分解産物の観察は、ＴＯＦ器械の構成に依存している。
【０４２６】
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳは、正確な分子量決定および一次配列情報の両方を得るための、生命科学において有益なツールである。本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するためのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを含む。決して経験的に知られていなかった配列の質量スペクトルから得られた配列情報は、準安定なイオン分解質量スペクトルから未知のペプチド配列、またはタンパク質配列を推測する、直接な概要を意味する。これらのＭＡＬＤＩ技術は、タンパク質消化といった従来の生化学的技術と組み合わせて、最も有用であると想像される。それらは、このようにして、既知のタンパク質における遮断されたアミノ末端、転写後修飾および変異部位の同定に適用され得る。また、相対的に未知のものを用いて、有意な量の予備的な構造決定が、非常に少量（１０ｐｍｏｌ未満）の分析物に関して可能であろう。ラダーシークエンシングおよびインソースフラグメンテーションの研究において、潜在的なペプチド不純物を最小化するために重要である。
【０４２７】
（直線型ＴＯＦ−ＭＳを用いたインソース分解）
ＭＡＬＤＩ生成イオンの準安定なイオン分解の研究に関して、ＲＥＴＯＦに対して変更可能な方法は、直線型ＴＯＦ−ＭＳを用いたＤＥを利用するあことである。また、ＤＥ技術を採用することによって、ペプチドおよびタンパク質にとっての１次構造情報が、得られてもよい。また、脱離現象（すなわち、イオン形成）と同時に生成される即座のイオン断片化は、通常、ＭＡＬＤＩ生成ペプチドイオンまたはＭＡＬＤＩ生成タンパク質イオンが非存在である。イオン形成と抽出との間の時間遅延を組み込むことによって、ソースにおけるイオンは、比較的に短い期間（＜１００ｎｓ）における、抽出の前に、より小さいイオンおよび中性物への断片化を可能にされる。それから、引き出し電位が、断片化イオンの抽出に印加される。干渉性の質量スペクトルピークは、ペプチドおよびタンパク質に関する有意な構造的情報のもとになるこれらの準安定な分解イオンから、生成される。
【０４２８】
５．表面増強化レーザ脱離イオン化−飛行時間（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）
タンパク質混合物の定量的な分析に関する他のプロテオーム技術は、表面増強化レーザ脱離イオン化−飛行時間（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）として知られている。本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するための、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦを含む。
【０４２９】
この技術は、化学的な（親水性の、疎水性の、前活性化された、通常相の、不動化された金属親和性、ならびにアニオンまたはカチオンの）、または生物学的な（抗体、抗原結合断片（以下に限定されないがｓｃＦｖを含む）、ＤＮＡ、酵素、または受容体）直径１−２ｍｍのベイト表面を用いて作り出されたステンレス鋼、もしくはアルミニウムに基づく、支持体または小片を利用する。これらの多様な化学的または生物学的な表面は、タンパク質自身の本来の特性に基づいて、タンパク質の差別的な捕捉を可能にする。０．１μｌ程度の少なさの容積に可溶化された組織または体液は、ベイトの表面に親和性を有するタンパク質が結合しているであろう、これらの表面に直接に付けられる。非特異的に、または弱く結合されたタンパク質を除去する一連の洗浄に続いて、結合されたタンパク質は、ＭＳ分析用に、レーザ脱離およびレーザイオン化される。１０００Ｄａ未満の小さなペプチドから３００ｋＤａを超えるタンパク質までの範囲にあるタンパク質の質量が、飛行時間に基づいて算出される。タンパク質の混合物が異なる試料内において分析されるので、固有な試料のフィンガープリント（fingerprint）または特徴が、試験した各試料について、結果として生じる。続いて、実際のタンパク質同定よりむしろ、質量のパターンが、ＳＥＬＤＩ分析によって生成される。これらの質量パターンは、正常なものから病気のものといった、お互いから患者の試料を区別するために使用される。タンパク質のフィンガープリントは、差別的な生体マーカー発現に関して分析され得るが、この技術は、現在、ＭＳを用いた試料内のタンパク質を特異的に同定することができない。しかし、この状況は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ技術を直列質量分析器と連結して試験されている試作品のように、急速に発展されている。この種の機器の連結は、アミノ酸配列決定および続くタンパク質同定を可能にするだろう。
【０４３０】
６．紫外可視（ＵＶ−Ｖｉｓ）
本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するために、紫外可視を含む。
【０４３１】
光吸収分光法（ＵＶ／ＶＩＳ）は、濃縮物（タンパク質、ＤＮＡ、ヌクレオチドなど）の決定に重要な役割を果たしている。有機色素は、吸収の増強および可視範囲への移動（例えば、クーマシーブルー試薬）に使用され得る。巨大分子の集合、シャペロンに補助されたタンパク質の折りたたみ、およびタンパク質の転移といった過程の理解において、タンパク質の他の補助物との総合作用を制御する影響力を理解する。
【０４３２】
共鳴ラマン分光法（ＲＲＳ）は、分子構造および分子動態の研究に使用され得るツールである。共鳴ラマン散乱は、電子吸収帯内における励起を必要とし、散乱の大きな増大を結果として生じる。少数の分子は、可視吸収帯を有しているが、あらゆるものは、深い紫外において吸収する。ＵＶ光を用いることによって、広範囲の無色の発色団を研究することが可能であり、かつ蛍光からの干渉を回避するという付加的な利点を有している。さらに、異なる励起波長を有する、異なる官能基の電子が、選択的に励起され得る。この方法は、異なる励起波長を用いることによって、巨大分子の特定の部分を調査する助けになる。
【０４３３】
７．液体クロマトグラフィー（ＬＣ）
液体クロマトグラフィーは、複雑な混合物からタンパク質、ペプチドおよび他の分子を単離する有力なツールである。本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するために、ＬＣを含む。液体クロマトグラフィーは、親和性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ディアオード（diaode）アレイＬＣ、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であり得る。
【０４３４】
ゲルろ過クロマトグラフィーは、大きさに基づいて、タンパク質、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドを分離する。分子は、より大きなまたはより小さい程度のビーズを分散している、多孔性ビーズの土台を移動する。より小さい分子は、ビーズの孔にさらに分散され、かつ従って、よりゆっくりと土台を通って移動し、一方において、より大きな分子は、ほとんどまたはまったく進入せず、かつこのようにして素早く土台を通って移動する。ゲルろ過クロマトグラフィーは、混合物における成分の分離、または巨大分子の調整物からの塩の除去、もしくは緩衝液の交換に関して、分子の大きさの分析に使用され得る。
【０４３５】
アフィニティークロマトグラフィーは、生物選択的な（bioselective）吸着、よび続く不動化されたリガンドからの化合物の回収の過程である。この過程は、多くの多様なタンパク質および他の化合物の、高い特異性を有し、かつ効率的な精製を可能にする。当該過程は、同時に穏やかな条件における回収を許容する１０−４から１０−８の範囲にある解離定数を通常に有して、所望の化合物と結合する、適切な選択性を有するリガンドの利用を必要とする。リガンドは、充填カラムまたは単回処理方式の吸収媒体の形態であり得る、ビーズ状または多孔質のマトリクス上に、通常、不動化される。
【０４３６】
イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の総合的な電荷の間にある差に基づいて、分子を分離する。それは、通常、タンパク質精製に使用されるが、オリゴヌクレオチド、ペプチド、または他の電荷を有する分子の精製に使用され得る。興味のあるタンパク質は、結合するための樹脂に付着されている官能基とは、逆の電荷を必須に有している。例えば、総合的に正の電荷を有する免疫グロブリンは、負に帯電した官能基を含む陽イオン交換体と良好に結合する。溶出は、イオン性相互作用が破壊されるまでイオン強度を増加させることによって、またはタンパク質のｐＨを変化させることによって、達成される。
【０４３７】
ＨＰＬＣは、本明細書に開示されている非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片の、分離、精製および検出に使用され得る。ペプチド：逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の利用異は、合成ペプチド産生における通常のおよび重要な段階になっている。この過程には分析カラムが使用されるが、当該過程は、組織における少量の「活性」タンパク質に起因して、本質的に調整可能であり得る。他の利点のいくつかは、ＰＲＣにさらした後に、精製後の生物学的活性物の再生、および２次構造もしくは３次構造の再形成が、ペプチドの短い大きさのために有利に働くことである。粗製組織抽出物は、ＲＰＣ系に直接に入れられ、かつ勾配溶出によって動態化され得る。同一条件における再度のクロマトグラフィーは、さらなる精製が当然であるまたは必要なときに、１つの選択肢である。また、ＲＰＣは、タンパク質の構造決定の過程に利用され得る。この過程の通常の手法は、（１）タンパク質分解または化学切断による断片化；（２）精製；ならびに（３）配列決定である。有機溶媒が（１）ペプチドを可溶化し、（２）おおよそ２３０−２４０ｎｍにおいて検出可能であり、かつ（３）試料から蒸発可能であるので、ペプチドのＲＰＣに対する通常の移動相は、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液から０．１％ＴＦＡのアセトニトリルといった有機溶媒の溶液の勾配である。生物学的に活性なタンパク質：サイズ溶出クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、酵素、ホルモン、および抗体といった生物学的に活性なタンパク質（これらのタンパク質のそれぞれが、独自の構造を有し、かつ当該技術が生理学的条件において実施され得るので）を用いた利用によく適している。クロマトグラフィーにさらした後における活性の再生が実施されされてもよく、かつ現在、ＳＥＣカラムの有用性は、１０から１０００キロダルトンまでの分画を可能にするのに十分に多様化している。カラムがわずかに疎水性および陽イオンの特性を有する傾向にあるので、極めて基本的な、または疎水性のタンパク質は、本当のＳＣＥ特性を示す必要はない。ＩＥＣカラムを用いた勾配溶出の利用は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のような等価な分離という理由から、好ましい。液体アフィニティークロマトグラフィー（ＬＡＣ）において、相互作用は、基質、受容体などの模倣物に起因して、タンパク質の結合に基づいている。当該タンパク質は、解離を容易にする、競合的な試薬の導入、またはタンパク質の構成の変更によって、溶出される。膜タンパク質：膜タンパク質は、周辺性である（外表面に配置されている）、または必須である（一部に渡って、全体に渡って、または膜内に完全に位置して）かのいずれかである。２重膜の親油性は、膜内にあるタンパク質の親油的な特性（例えば、疎水性アミノ酸）を伝える。ＲＰＣは、これらのタンパク質の分析および生成における当然の選択であるだろうが、ＩＥＣがまた、採用される。膜タンパク質の分離に使用される他の手法は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００といった非イオン性の界面活性剤、またはＩＥＣを用いた有機溶媒によるタンパク質の可溶化���利用である。ＨＰＬＣは、ＭＳと連動させてもよい。
【０４３８】
ダイオードアレイ検出器液体クロマトグラフィー（ＤＡＤ−ＬＣ）は、比較によってピーク純度の指標を提供可能な、各ＨＰＬＣピークに関する完全な、複数のスペクトルを供給する。また、これらのデータは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅおよびありえる他のもの（Ｈｉｓ、Ｍｅｔ，Ｃｙｓ）の存在を決めることができ、かつ第２の誘導体または多成分性の分析によって、これらのアミノ酸を定量可能である。また、カラム後の誘導体化よって、ＤＡＤ−ＬＣは、個々のペプチドにおけるＣｙｓ、ＨｉｓおよびＡｒｇを、同定および定量できる。従って、１回のＬＣ工程において、各分離ペプチドの２０アミノ酸の内、６つに関する分析を可能にし、情報が、１回の段階において所定のペプチドにおけるこれらのアミノ酸の存在または非存在について得られる。これは、各ペプチドにおける残基の数を知ることによって、補助される。また、側鎖の発色団に関する２０５ｎｍの吸収における補正によって、この技術は、各ペプチドの相対的な量のずっと良好な評価を与えることができる。
【０４３９】
Ｄ．電気泳動
本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するために、電気泳動を含む。電気泳動は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動であってもよい。
【０４４０】
（ゲル電気泳動）
ゲル電気泳動は、タンパク質の分離に使用され得る技術である。大きな（巨大）分子の分離は、電荷および質量という２つの力に依存する。タンパク質といった生物学的試料が、緩衝液に混合され、かつゲルに入れられるとき、これらの２つの力が互いに作用する。１つの電極からの電流は、当該分子を押し返し、一方において、他方の電極は、同時に当該分子を引きつける。ゲル材料の摩擦力は、大きさによって当該分子を分離する「分子シーブ」として作用する。電気泳動に間において、電流が印加されているとき、巨大分子は、孔を通って移動させられる。電界を介したそれらの移動度は、電界の強度、分子の大きさおよび形状、試料の相対的な疎水性、ならびに分子が移動している緩衝液のイオン強度および温度に依存する。染色の後に、各列において分離された巨大分子は、ゲルの一端から多端にまで広がる一連のバンドとして見られ得る。この技術を用いて、単一のアミノ酸ほど少なく異なっているタンパク質分子を分離および同定することが可能である。その利点は、タンパク質が可視化されるだけでなく、分離されてもよく、研究者が混合物における多数のタンパク質、または特定のタンパク質調整物の純度を素早く評価することを可能にする。また、ゲル電気泳動は、等電点およびおおよその分子量といった、重大な特性の決定を可能にする。
【０４４１】
焦点電気泳動、または等電点電気泳動は、異なる分子をそれらの電荷（少しでもそれらが電荷を有していれば）によって分離する技術である。焦点電気泳動は、ほとんど通常に、タンパク質に対して使用される。焦点電気泳動は、分子の電荷が、環境のｐＨの変化につれて変化するという事実を利用するゾーン電気泳動の１種である。分子は、ｐＨ勾配（脂肪族の両電解質によって通常に作り出される）を有する媒体の全体に分配される。電流は、「正の」および「負の」末端を作り出す媒体を介して通される。負に帯電した粒子は、ｐＨ勾配を通って「正の」末端に向かって、泳動し、一方において、正に帯電した粒子は、「負の」末端に向かって移動する。粒子が、その電荷を中性にするｐＨに移動しながら、電流に従って停止するだろう。最初の電荷が同じ粒子は、ｐＨ勾配上の同じ位置の周辺に堆積（または集中）するだろう。
【０４４２】
（キャピラリー電気泳動）
キャピラリー電気泳動は、分離を達成するための緩衝液を充填したキャピラリーの中に高電圧を印加することに関する、分離技術の範囲の集団である。変形物は、分析物の間における大きさもしくは電荷に基づく分離（キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、または自由溶液ＣＥ（ＦＳＣＥ）と名付けられている）、界面活性剤ミセルを用いた中性化合物の分離（ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー、ＭＥＣＣ、またはときにＭＥＫＣとして呼ばれる）、ゲル網を通る溶質のふるい分析（キャピラリーゲル電気泳動（ＧＣＥ））、電気泳動移動度に基づく陽イオン（または陰イオン）の分離（キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ））、ｐＨ勾配内の双性イオン溶質のおよび分離（キャピラリー等電点電気泳動）を含む。キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）は、シリカゲル固定相を用いて充填されたキャピラリーの中に電圧を印加することえお含む、関連する動電分離である。ＣＥＣにおける分離選択性は、電気泳動過程およびクロマトグラフィー過程の両方の組み合わせである。ＣＥ分離の多くは、検出器に向かって溶液をくみ出すために、キャピラリー内における溶液の電気的に誘導された流動（電気浸透流（ＥＯＦ））の存在に依存している。ＧＣＥおよびＣＩＥＦは、タンパク質といった生体分子の分離に重要である。通常、ＣＥは、水溶性に基づく電解質を用いて実施されるが、ＣＥにおいて非水性の使用も増えている。
【０４４３】
ＣＥ系の動作は、狭い内径（２５−１００ｍｍ）のキャピラリーの中に高電圧（典型的に３０ｋＶ）を印加することを含む。キャピラリーは、キャピラリー内を通る電流を伝導する電解質溶液を用いて充填される。キャピラリーの端部は、電解質を用いて充填されたリザーバに漬けられている。また、プラチナといった不活性金属によってできた電極は、電気回路を完成するために電解質リザーバに挿入される。少量の試料が、キャピラリーの一端に注入される。キャピラリーは、通常、ＵＶ吸収検出器である検出器を介して、キャピラリーの反対の端部に渡っている。電圧の印加は、通常、検出器を通過して、適切な電極に向かう試料イオンの移動の原因である。電気泳動図（electropherogram）と名付けられた、時間と一緒に検出器の反応のプロットが、生成される。電気浸透流（ＥＯＦ）として知られる電解質の流動は、通常、検出器に向かうキャピラリーに沿った溶液の流動を、結果として生じる。この流動は、分析時間を有意に低減可能である、または電荷の符号によって引きつけられる電極に向かう泳動傾向を、イオンに乗り越えさせることが可能である。
【０４４４】
Ｅ．アレイ
本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するために、アレイを含む。
【０４４５】
アレイは、既知のタンパク質標的に対する複数の試料の平行した分析の実施を含む。種々のマイクロアレイ基本骨格の発展が、細胞または組織におけるタンパク質の存在量、局在、および相互作用の決定を、顕著に可能にし、かつ加速させている。マイクロアレイは、タンパク質、抗体またはペプチドの性質決定された集団に対する、タンパク質の相互作用または機能の同定を可能にする、基本骨格を提供する。
【０４４６】
タンパク質に基づくチップは、小表面上にタンパク質を整列させ、かつ蛍光に基づく画像化を用いて組織におけるタンパク質レベルを直接に測定することができる。タンパク質は、平らな固相またはキャピラリー系（微小流体アレイ）のいずれかに配列されてもよく、かつ種々の異なるタンパク質は、これらのアレイに適用され得る。現在、最もよく知られているアレイは、抗原−タンパク質相互作用も検出可能な、交代−抗原相互作用に依存している。現在、抗体アレイの可能性は、興味のある標的に対する、高い特異性（試料内の非特異的タンパク質との交差反応を排除するために）、および高い親和性（試料ないの少量の検出を可能にするために）の両方を有する抗体の利用に限られている。タンパク質アレイ技術の他の試みは、生物学的に活性な形状および形態にタンパク質を保存する能力である。アレイのプローブとしての抗体の利用に加えて、特異性がインビトロ溶出（アプタマー）によって最適化される、１本鎖オリゴヌクレオチドが、実行可能な代替物を提供する。アプタマーは、光架橋によって同種のタンパク質との共有結合的付着を可能にし、このようにしてバックグラウンドを低減する。それから、非特異的なタンパク質の染色は、結合されたタンパク質を検出するために使用される。参照によって本明細書に組み込まれる、「Protein Arrays」と名付けられた国際公開第０４／５８９４６号パンフレットには、固体支持体に対する非天然アミノ酸ポリペプチドの付着について記載されている。
【０４４７】
アレイは、以下に限定されないが、ビーズを基にしたアレイ、バイオアレイ（bioarrays）、生体電子工学アレイ、ｃＤＮＡアレイ、細胞アレイ、ＤＮＡアレイ、遺伝子アレイ、遺伝子発現アレイ、凍結細胞アレイ、ゲノムアレイ、高密度オリゴヌクレオチドアレイ、ハイブリダイゼーションアレイ、ミクロカンチレバー（microcantilever）アレイ、ミクロ電子工学アレイ、多重ＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ、ナノアレイ、オリゴヌクレオチドアレイ、オリゴ糖アレイ、プレーナーアレイ、タンパク質アレイ、溶液アレイ、点状（spotted）アレイ、組織アレイ、エクソンアレイ、フィルタアレイ、マクロアレイ、小分子マイクロアレイ、懸濁液アレイ、テーマ（theme）アレイ、タイリング（tiling）アレイおよび転写アレイを含む。
【０４４８】
Ｆ．センサー
本明細書に開示されているタンパク質検出方法は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を検出するために、センサーを含む。センサーは、インビボ検出およびインビトロ検出の両方に使用され得る。センサーは、非天然アミノ酸ポリペプチドの標的に対する結合、非天然アミノ酸ポリペプチドにおける高次構造変化といった現象の検出、および／または他の相互作用、修飾、もしくは非天然アミノ酸か、その周囲かのいずれかに対する変化の測定に、使用され得る。
【０４４９】
センサーは、化学センサー、光学センサーおよびバイオセンサーであり得る。化学センサーは、複雑な試料における特定の化合物またはイオンの存在に関する実時間情報、およびオンライン情報を伝える、最小化された分析装置である。光学センサーは、分析物の本来の光学特性、または固体支持体に付着された、指示色素もしくは標識生体分子の光学特性のいずれかの測定に基づく。バイオセンサーは、「基質」を産物に転換する酵素の能力に基づいた親和性バイオセンサー、または触媒バイオセンサーであり得る。
【０４５０】
標的（抗体、抗体断片、または抗原結合ポリペプチドもしくはこれらの断片など）に対する非天然アミノ酸ポリペプチドの結合が、測定され得る。非天然アミノ酸ポリペプチドは、ナノ伝達物質といった分子と接合される。インビボにおいて標的と結合されている間に、当該ナノ伝達物質は、医学用画像機器によってエクスビボ読み出されるシグナルを放出する。
【０４５１】
Ｇ．ライブラリースクリーニングからのタンパク質同定法
非天然アミノ酸ポリペプチドと相互作用する（複数の）タンパク質を同定するために、多くの方法が使用され得る。タンパク質分離は、個々のタンパク質が他の技術を用いてより容易に処理されるように、複雑な混合物の分離を補助する。タンパク質同定方法は、以下に限定されないが、エドマン分解、質量分析技術、ペプチド質量フィンガープリンティング、新規の配列決定、抗体に基づくアッセイ、および蛍光色素ゲル染色法、タグ付け法、もしくは化学修飾法（例えば、同位体コード化親和性タグ−ＩＣＴＳ、組み合わせ分別対角クロマトグラフィー−ＣＯＦＲＡＤＩＣ）といったタンパク質精製アッセイを介する低性能配列決定を含む。また、精製タンパク質は、分子内相互作用のモデリングに使用され得る、３次元結晶構造の決定に使用され得る。通常の３次元結晶構造の決定方法は、Ｘ線結晶学およびＮＭＲ分光法を含む。タンパク質同定法のいくつかについて、以下に詳細がある。
【０４５２】
（タンパク質配列決定）
Ｎ末端配列決定およびＣ末端配列決定。Ｎ末端配列決定は、未知のタンパク質の同定を補助する；組み替えタンパク質の同一性と忠実性と（読み枠、翻訳開始点など）を確認する；ＮＭＲデータと結晶学データとの解釈を補助する；タンパク質間における同一性の程度を証明する；または抗体生成に関する合成ペプチドの設計にとってのデータを提供するなどである。Ｎ末端配列決定は、十分に確立されたエドマン分解の化学的性質を利用しており、続いてタンパク質のＮ末端からアミノ酸残基を除去し、かつそれらを逆相ＨＰＬＣによって同定する。感度の高さは、１００ｓフェムトモルのレベルであり、かつ長い配列の読み込み（２０−４０残基）は、数１０ピコモルの開始材料から、しばしば得られ得る。精製タンパク質（＞９０％）は、解釈されたデータを容易に生成するが、また、不十分に精製されたタンパク質が、正確なデータ解釈を条件として、有用なデータを提供し得る。エドマンの化学性質を妨げる自由な１番目のアミノ基が存在しないような、Ｎ末端修飾（特にアセチル化）タンパク質は、直接に配列決定され得ない。しかし、遮断されたタンパク質のタンパク質分解の一部（例えば、臭化シアンを用いた）は、重要な配列情報を解釈するために、データベース解析を実施されてもよい、アミノ酸の混合物が機器の各サイクルにおいて生成されることを可能にし得る。
【０４５３】
Ｃ末端配列決定は、ときにタンパク質の構造および活性に重大な影響を与えている、重要な転写後修飾として見分けられる。種々の疾病状態は、障害性のタンパク質プロセシングと関連しており、かつＣ末端配列決定は、タンパク質の構造およびプロセシングの調査にとって付加的なツールを提供する。
【０４５４】
（プロテオーム解析）
プロテオミクスによれば、タンパク質が、興味のあるタンパク質についてエレクトロスプレー（ＥＳＩ）機器、マトリクス支援レーザ分離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）機器、飛行時間（ＴＯＦ）機器、または３次元四極子イオントラップから生成されたデータであって、一揃えの経験的に必要な質量／強度データに対する配列を指定するコンピューター検索演算手順によって、初期的に同定され得る。
【０４５５】
（他の検出方法）
付加的な検出方法は、ビピリジン、金属配位、ナノ技術（金）、ビオチン−ストレプトアビジン／アビジン、ＵＶ／Ｖｉｓ、標的に対する非天然アミノ酸の接近に起因する結合現象および共役現象を含む、２段階系に関する。標的に対する非天然アミノ酸の当該接近は、蛍光団、小分子、リポカリン（ベータバレル構造）、脂肪酸結合タンパク質、および暗から明もしくは明から暗になる蛍光団からの放射を結果として生じる。
【０４５６】
＜ＸＶ．画像処理および診断＞
非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を利用した画像化方法および診断方法は、本明細書に開示されている。
【０４５７】
分子画像化は、分子画像化標的を同定するための、分子生物学および細胞生物学、好適な画像化プローブお開発するための、放射線化学および生物接合化学、最適な標的効率および好ましいインビボにおける動態に対してプローブを最適化するための、薬理学、ならびにインビボにおける分子画像化プローブの最終結果を非浸襲的に監視するための、画像取込技術からの試みに関する、広い学問領域にわたる分野である。また、基礎的な診断適用を除いて、分子画像化は、治療効果の評価、薬剤開発、および生物系における分子機序の理解という役割を果たす。分子画像化プローブ（単クローン性抗体、ミニボディー、タンパク質、ペプチドおよびペプチド模倣物）は、分子標的の可視化および定量化に使用され得る。解剖学の技術（マイクロＭＲＩおよびマイクロＣＴ）と分子画像化技術（マイクロＰＥＴ、マイクロＳＰＥＣＴ、およびＮＩＲ蛍光画像化）との組み合わせは、分子情報および機能的情報の取得を可能にし、かつ特定の分子治療効率を監視することができる。バイオイメージング法は、空間的構成（例えば、分布）の検出、ならびに細胞および組織の天然成分、構造物、細胞器官、ならびに高い空間分解能およびスペクトル分解能を有するタグ付プローブ（例えば、蛍光プローブ）と、光透過方法、光反射方法、光散乱方法および蛍光放射方法を用いた薬物と、といった投与成分の定量に使用され得る。
【０４５８】
公知の薬学的な特性、および効率を有する試薬用の標識プローブを用いた、非標識化合物のインビボ競合アッセイは、薬物評価処理に使用され得る。薬物標的化、受容体占有率、受容体または酵素の効率的な阻害に必要な濃度などの非浸襲性の特性は、導出化合物の評価を促進できる。新たな薬物候補物が、薬力学的および薬物動態学的な研究を介して進められるとき、画像分析は、標的可触性、標的部位における保持および薬効との相関作用の持続時間、無関係な組織かの除去を、定量的および反復的に監視できる。
【０４５９】
臨床試験において、画像化アッセイは、それらの薬学的特性および患者における治療効果の両方について、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片の評価を容易にすることができる。画像化プローブを、構造的かつ機能的なデータを融合する多様性画像化機器と組み合わせることによって、医師は、解剖学的分析物を用いた複数の機能的画像化アッセイを同時に実施可能である。それから、構造的研究から、ならびに薬物分布および薬物濃度の、非浸襲性の反復的な監視から由来する情報は、シグナル伝達経路、標的酵素活性、抗原レベル、受容体活性化、細胞増殖、プロテアソーム活性などに関する生物学的効果と関連付けられてもよい。これらの非浸襲性アッセイは、実時間監視、ならびに標的された処置および治療戦略の改変を許容することができる。分子画像化技術は、臨床前の研究におけるマウスモデルの研究に使用されてもよい。例えば、癌および他の疾患に対する多くの薬物は、アポトーシスを誘導することによって、治療効果を発揮する。生きている動物におけるアポトーシス反応を反復的に画像化する能力は、これらの薬物の臨床前評価を容易にすることができる。遺伝子導入マウスの研究について、非浸襲的画像化による特有の空間パターンおよび一時パターンにおいて、導入遺伝子を発現可能な創始（founder）マウスの同定は、育種することなく創始体の同定を許容することができる。
【０４６０】
分子画像化は、遺伝子治療手法の最適化に対して、治療的遺伝子の位置、量、および発現持続時間を供給することができる。光学的な画像化は、標的された遺伝子導入と組み合わせられ得る。また、レポーター遺伝子の分子画像化は、細胞に基づく治療の生体分布および効力の監視に使用され得る。
【０４６１】
（画像処理プローブ）
画像化プローブは、放射性同位元素、または光放射分子、または近赤外線（ＮＩＲ）放射分子を用いて標識された分子であり得る。分子画像化プローブの濃度特性および／またはスペクトル特性は、調査条件において、特定の生物学的過程によって変更される。機能的な画像化研究に使用され得る２種類のプローブは、ほんの一例として、直接結合プローブおよび非直接プローブである。直接結合プローブおよび非直接プローブは、非天然アミノ酸ポリペプチドであり得る。直接結合プローブの例としては、以下に限定されないが、抗体、抗体断片、抗原結合ポリペプチドおよびそれらの断片、ならびに受容体リガンドが挙げられる。直接プローブは、それらの結合がストキオメトリック（stochiometric）なので、それらの標的の濃度を検出するために使用され得る。従って、直接プローブは、例えば、治療の前および後において、病理学的条件において過剰発現される標的の調査に有用である。非直接プローブは、触媒活性を含む、巨大分子の活性を監視するために使用される。そのようなプローブの例が、「Science 2003 302:605-608」においてHerschmanによって、記載されている。
【０４６２】
プローブは、内因性の標的分子および生物学的過程を監視するために開発されてもよい。そのようなプローブは、（修飾）非天然アミノ酸ポリペプチドであり得る。内因性過程の重要な媒介物および／または指示薬は、画像化プローブを用いて調査され得る。キナーゼまたはプロテアーゼといった酵素に対する基質は、リン酸化またはプロテアーゼ切断といった現象が分子画像化アッセイによって検出されるように、放射性核種または蛍光分子を介して標識され得る。プロテアーゼ分解の後にＮＩＲ蛍光光を放射する、そのような蛍光プローブは、「活性化可能な（activatable）」光学画像化プローブと呼ばれてもよい。
【０４６３】
直接プローブおよび非直接プローブは、化学的ライブラリーの高速処理スクリーニングによって発見され得る。また、直接プローブは、大きな組み換え抗体ライブラリーおよびファージライブラリーによって発見されてもよい。そのようなライブラリーは、（修飾）非天然アミノ酸ポリペプチドから構成され得る。
【０４６４】
（量子ドット）
本明細書に開示されている非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片を利用した、画像化方法および診断方法は、蛍光半導体ナノ結晶（また、量子ドットまたはｑｄｏｔとして知られている）を含む。ｑｄｏｔは、単一分子レベルにおける細胞内過程の研究、高分解能細胞画像化、細胞輸送の長期にわたるインビボ観察、腫瘍標的化、および診断に使用され得る。
【０４６５】
コロイド状の半導体量子ドットは、大きさおよび形状が、持続時間、温度および合成に使用されるリガンド分子によって正確に制御される、数ナノメートルの直径を有する単結晶である。この過程は、組成物およびサイズに依存する吸収および放射を有するｑｄｏｔを産生し得る。おおよそ半導体バンドギャップエネルギーのエネルギーを有する光子の吸収が、正孔対（または励起子）の産出を、結果として生じ得る。標準的な蛍光団とは明らかに対照的に、吸収は、より高いエネルギー（例えば、より短い波長）における増加された確率を有し、かつ広帯域の吸収スペクトルを結果として生じ得る。いわゆるボーア励起子半径（例えば、数ナノメートル）よりも小さいナノ結晶について、エネルギー準位は、ｑｄｏｔサイズと直接に関連する値を用いて量子化される（量子拘束と呼ばれる効果、よって「量子ドット」という名前がある）。励起子の放射性再結合（長い半減期（＞１０ｎｓ）によって特徴付けられる）は、狭い、対照的なエネルギー帯における光子の放射を導き得る。ｑｄｏｔの長い蛍光半減期は、より短い半減期の種のシグナル（例えば、細胞において接触したバックグラウンド自己蛍光）からそれらのシグナルを分離するためにタイムゲーテッド（time-gated）検出の利用を可能にし得る。
【０４６６】
単一のｑｄｏｔは、例えば、共焦点顕微鏡、全反射顕微鏡、または基礎的な広視野のエピ蛍光顕微鏡（epifluorescence microscopy）を用いて、連続した期間に渡って、観察および追跡記録され得る。蛍光相関分光法は、粒子ごとの輝度の決定を可能にしてもよく、かつまた、平均ｑｄｏｔサイズの測定を援助してもよい。また、それらは、非常に大きい吸収断面によって特徴付けられているので、ｑｄｏｔは、二光子共焦点顕微鏡用のプローブとして使用され得る。それらは、標準的な染色を同時に使用されてもよい。ｑｄｏｔは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対の特別注文可能な供与体として有用であり得る。
【０４６７】
非天然アミノ酸ポリペプチドといった標的分子のｑｄｏｔタグ付けといった適用に関して、単一の認識部分は、ｑｄｏｔにグラフトされてもよく、またはｑｄｏｔ可溶化リガンドとして使用されてもよい。アミン基またはカルボキシル基のいずれかを含むｑｄｏｔリガンドは、例えば、標準的な生接合反応を用いて、チオール基またはＮ−ヒドロキシコハク酸イミン（N-hydroxysuccinimyl）エステル部分を含む架橋分子の実現性を提供し得る。他の方法は、ｑｄｏｔと帯電アダプター分子との間の、またはｑｄｏｔと修飾して帯電ドメインを組み込んだタンパク質との間の静電的相互作用を利用することであり得る。これらの機能化段階は、機能性を付加する、または変えるために繰り返されてもよい。例えば、ストレプトアビジン被覆ｑｄｏｔは、ビオチン化タンパク質または抗体と組み合わせて使用され得る。（ｉ）特異標的に対する抗体、（ｉｉ）１次抗体に対するビオチン化２次抗体、および（ｉｉｉ）ストレプトアビジン被覆ｑｄｏｔを用いたような、３層法は、本明細書に開示されているように、ｑｄｏｔが非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片の標識することを可能にする。
【０４６８】
多くの潜在的な表面付着基が、結果として多能性プローブを生じる個々のｑｄｏｔに対して異なる機能性を「グラフト」するために使用され得る。例えば、認識部分に加えて、ｑｄｏｔは、膜通過能もしくは細胞内移行能、および／または酵素機能を備えさせられていてもよい。ペプチドは、特別に作製されてもよく、かつ配列の選択を用いて、１段階界面活性剤交換は、必要な機能：（ｉ）核／殻構造を保護し、かつ本来のｑｄｏｔ光物理学を維持する、（ｉｉ）ｑｄｏｔを可溶化する、（ｉｉｉ）生物学的作用領域を提供する、および（ｉｖ）多機能の組み込みを可能にする、をもたらし得る。結果の粒子は。コロイド状の性質、光物理学、および生物学的適合性を有してもよく、かつこの「ペプチドツールキット（toolkit）」は、付加的な機能性を提供するために調整され得る。そのような機能性は、分子進化によって向上され得る。
【０４６９】
全細胞標識、膜結合タンパク質の標識、および細胞質標的標識もしくは核標的標識といった生細胞実験は、細胞検出もしくは病原体検出、細胞追跡、細胞系統研究に使用され得る。これは、ｑｄｏｔのマイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは食作用を介したあらゆる機能性化なしで、達成され得る。異なる種類の機能性化は、細胞表面タンパク質に対してｑｄｏｔを標的化する方法のように、調査され得る。いくつかの例として、標的タンパク質の設計の後における。ストレプトアビジン、２次抗体もしくは１次抗体、上皮成長因子（ＥＧＦ）もしくはセロトニンといった受容体リガンド、認識ペプチド、親和性対が挙げられる。他の戦略は、ｑｄｏｔに対する１次抗体の架橋からなり得る。ペプチドがｑｄｏｔの機能性化に使用され得るので、タンパク質のいくつかは、ペプチドによって認識され得る。マイクロインジェクションは、適切な標的ペプチド配列を用いて機能性化されたｑｄｏｔを、ミトコンドリアまたは細胞核に輸送することを可能にすることができる。ｑｄｏｔの長期の安定性および輝度は、それらを生きた動物の標的化および画像化にとっての候補物にさせる。
【０４７０】
合成において、新しい組成物は、（ｉ）電界または磁界に対する感受性；（ｉｉ）（ランタニドドープｑｄｏｔ用いた）より狭い蛍光放射およびより長い半減期；（ｉｉｉ）三元合金によって示されるような、ＮＩＲスペクトルに対する、より小さいサイズおよび伸張；（ｉｖ）ナノロッドｑｄｏｔの末端特異的機能性化；（ｖ）明滅の抑制および量子産生の増強；ならびに（ｖｉ）内臓式オンオフスイッチまたは光電子生体変換といった、性質を有するｑｄｏｔを必然的に伴うことができる。
【０４７１】
生体変換体である光励起ｑｄｏｔは、電子受容物または正孔受容物として作用し、光活性化によって制御可能な酵素と結合するために、電荷を移動することができる。相互に、ｑｄｏｔは、化学発光を介して電子供与物または正孔供与物の酵素によって、光を発せられ得る。ナノ材料被覆ペプチドは、有機−無機作用領域に対する新規な機能を向上するためのツールである。（分子進化による）ペプチドの酸化還元反応電位を有する、（合理的な設計による）半導体バンドギャップの同時の設計は、結合、ならびに所望の光学特性、電子工学特性、磁気特性、および化学特性について、ｑｄｏｔ組成物およびペプチド配列を最適化するために使用され得る。要約すれば、異なる形状、特異性、組成は、細胞機序に対する光電子作用領域として開発され得るより複雑な生物無機構築物を、導くことができる。
【０４７２】
ｑｄｏｔは、ＭＲＩ、ＰＥＴ、コンピューター断層撮影、およびＩＲ蛍光画像化（上皮を介した直接画像化による、またはカテーテルに基づく共焦点繊維顕微鏡による後者）を組み合わせた機能的画像化にとっての対比試薬として、使用され得る。インビボ光学生検は、症状を確認可能であり、かつそれから治療は、標的化されたｑｄｏｔにエネルギーを預けることによって（ｋ殻吸収にとっての単色ｘ線またはレーザＩＲ放射）、選択的に、局所的に、および一時的に実施され得る。選択可能に、それは、ｑｄｏｔ表面に治療的酵素をグラフトし、かつ光によってそれらを活性化する、または光学的にｑｄｏｔを環化することによって遊離ラジカル（例えば、一重項酸素）を生成することを可能にしてもよい。
【０４７３】
（画像処理装置）
種々の装置が、本明細書に開示されているように、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、およびこれらの断片の画像化および診断に使用されてもよい。
【０４７４】
プローブの監視は、（１）測定系および（２）分析ソフトウエアからなっていてもよい。当該計測系は、光学、電子工学および試料が照明される態様（例えば、光源選択）、測定からの所望の結果を抽出するために最も適応された、測定の様式（例えば、蛍光または透過）と同様に、校正のすべてを含んでいてもよい。当該分析ソフトウエアは、意味のある方法において、重要な結果を分析および表示するために必要な、ソフトウエアおよび数学的演算手順のすべてを含んでいてもよい。測定は、例えば、直立顕微鏡または倒立顕微鏡、蛍光顕微鏡、マクロレンズ、内視鏡ならびに眼底カメラである、当該系に付随されるあらゆる光学系を実際に用いて実施されてもよい。さらに、光透過率（明視野および暗視野）、自己蛍光、および投与されたプローブの蛍光などを含む、あらゆる標準的な実験方法が使用される。蛍光測定は、（障壁フィルター、励起フィルター、および２色性ミラーからなる）あらゆる標準的なフィルターキューブ（filter cube）、または特別な適用に対して特別に作製されたフィルターキューブを用いて、系の感受性の範囲にある放射スペクトルを供給させてもよい。
【０４７５】
また、スペクトルバイオイメージングは、暗視野および位相差といった空間フィルタリング法、および偏光顕微鏡と組み合わせて、使用されてもよい。放射性核種標識プローブは、ＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴ（単一光放射暗断面撮影法）によって検出されてもよく、光放出プローブ（蛍光、生体発光、またはＮＩＲ放射）は、光学的画像化によって検出されてもよく、かつ電波放出は、ＭＲＩによって検出されてもよい。小さな動物素子は、放射性核種に基づく画像化（マイクロＳＰＥＴおよびマイクロＰＥＴ）、（感度の高い、冷却された荷電結合素子（ＣＣＤ）を）可視光の光学画像化、およびＮＩＲ放出に使用されてもよい。解剖学的画像化技術（マイクロＭＲＩおよびマイクロＣＴ）と分子画像化技術（マイクロＰＥＴ、マイクロＳＰＥＣＴおよびＮＩＲ蛍光画像化）との組み合わせは、分子情報および機能的情報の取得、ならびに特異的な分子治療効率の監視を補助することができる。
【０４７６】
非浸襲性のレポーター遺伝子アッセイは、生きている動物の分子画像化研究に使用され得る。放射線核種標識プローブは、生きているマウスにおける、直接結合ＦＥＳＰプローブを用いたレポーター遺伝子、または単純ヘルペスウィルス  １型−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）の発現の監視に使用され得る。ＨＳＶ−ＴＫは、陽電子標識チミジン類縁物質を用いて監視され得る。ＦＤＧのように、ＨＳＶ１−ＴＫにとっての陽電子標識基質であるヘキソキナーゼ用の非直接プローブは、リン酸化に依存する酵素の結果として、細胞に保持されてもよい。光学的画像化アッセイに関して、酵素によって基質から生成された光は、高感度のＣＣＤカメラを用いて監視されてもよい。蛍光体、生体発光体、または放射性核種プローブを用いて画像化される融合タンパク質をコードする、新たなレポーター遺伝子は、多くの異なる画像化プローブおよび機器を用いた単一の動物の研究に、別個の適用に対する使用を可能にすることができる。
【０４７７】
マイクロＰＥＴ装置は、機能アッセイ：例えば、器官内における腫瘍の位置の特定、より正確に細胞移動の位置を決定することなどのより良好な解剖学的識別を提供し得る。蛍光媒介断層撮影法は、光学的画像化手法の分解および定量化を向上できる。スペクトル画像化技術は、異なる光学的プローブの同時の分析、およびバックグラウンド自己蛍光の劇的な低下を可能にする複数の蛍光プローブからの放射を、区別可能である。
【０４７８】
（ポリペプチドおよびライブラリーの非天然アミノ酸スキャニング）
ポリペプチドの活性および特性を調節するために置換されるアミノ酸の同定は、特定部位の変異生成によってなされ得る。機能を調節する本発明のポリペプチドおよびポリペプチドライブラリーにおける、アミノ酸は、当該ポリペプチドのあらゆるまたはすべての位置における天然アミノ酸に代えて、非天然にコードされるアミノ酸に置換することよって、同定または調整されて得る。天然にコードされるアミノ酸は、特定部位の変異生成またはアラニン−スキャニング変異生成（Cunninghamら 1989を参照すればよく、この全体が参照によって本明細書に組み込まれる）といった、当該分野に公知の方法によって、ポリペプチドの選択された位置において置換されている。アラニン−スキャニング変異生成手法は、分子における選択された、またはあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入する。天然にコードされるアミノ酸であるアラニンを置換する代わりに、非天然アミノ酸が、ポリペプチド鎖における天然にコードされるアミノ酸と置換される。それから、非天然アミノ酸を備える結果物である変異体ポリペプチド分子は、特定のポリペプチドまたはタンパク質の機能測定に適したアッセイを用いて、生物学的活性について試験される。特別に興味のあるものは、帯電した天然にコードされるアミノ酸、および／または帯電しない天然にコードされるアミノ酸に対して、帯電した非天然にコードされるアミノ酸、または帯電しない非天然にコードされるアミノ酸の置換体であり得る。これらの置換体は、調整された受容体結合、調整された酵素活性、調整された抗原結合、または調整された凝集もしくは可溶性といった、非常に好ましく向上または調整された特性を有する、タンパク質を産生し得る。
【０４７９】
〔実施例〕
以下の実施例は、例証のために与えられるが、特許請求の範囲に記載されている発明を限定するものではない。
【０４８０】
〔実施例１〕
この実施例は、非天然アミノ酸ポリペプチドを用いて形成され得る接合体について説明する。分子はは、ポリペプチドにおける１つ以上の非天然アミノ酸ポリペプチドと直接に結合され得る、またはリンカー、重合体、水溶性重合体、または生物学的に活性な分子を介して付着され得る。
【０４８１】
図９は、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸と分子のヒドロキシアミンとの間の反応を介して、ポリペプチドに部位特異的に付着されている分子の非限定的な例を表す。以下に限定されないが、蛍光団、ビオチンおよびキレーターを含む分子は、非天然アミノ酸ポリペプチドに付着され得る。
【０４８２】
〔実施例２〕
当該分野において公知の樹脂または他の材料は、ポリペプチドの単離に使用され得る。図１０は、非天然アミノ酸ポリペプチドと反応する樹脂を利用して、非天然アミノ酸ポリペプチドの精製方法の一例を示す。共有結合的連結が、当該樹脂上の化学的に特異的なタグと、タンパク質に存在する非天然アミノ酸との間に形成される。そのような連結は、広範囲のｐＨおよび精製条件において安定である。分離段階は、以下に限定されないが、大規模な精製を可能にする槽様式を含む、変更可能な様式において実施され得る。樹脂および親和性タグは、物理的および化学的に安定であり、そして従って、大規模化したタンパク質精製の費用を低減するために再利用され得る。
【０４８３】
分離は、以下に限定されないが、ＰＥＧを含む分子に対するポリペプチドの接合と併せて、実施され得る。この「ワンポット」法は、接合過程をさらに簡略化し、かつ以下に限定されないが、標的治療タンパク質（図１１）を含む、タンパク質の産生費用を低減する。接合され得る他の分子は、以下に限定されないが、蛍光団を含む。
【０４８４】
精製用の樹脂または他の材料は、ポリペプチドに存在する非天然アミノ酸ポリペプチドに従って選択され、かつ機能性化され得る。図１２は、樹脂の選択および機能性化の一例を示す。
【０４８５】
精製用の樹脂または他の材料は、ポリペプチドにおける非天然アミノ酸とは、別に依存して機能性化され得る。例えば、図１３は、ヒドロキシルアミンを用いた非天然アミノ酸ポリペプチドの親和性精製の一例を示す。図１４は、アルデヒド樹脂を用いた非天然アミノ酸ポリペプチドの精製の一例を示す。ヒドロキシルアミンおよびアルデヒド樹脂の非限定的な例が示される。
【０４８６】
ある実施形態におおいて、精製過程の１つ以上の段階は、１つ以上の天然アミノ酸に対する、ポリペプチドに存在する１つ以上の非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾する。図１５は、非天然アミノ酸ポリペプチド前駆体から本来のタンパク質を精製する一例を示す。当該非天然アミノ酸は、精製過程に使用される樹脂から放出した後に、チロシンに転換される。図１６は、非天然アミノ酸の非限定的な例を示す。
【０４８７】
〔実施例３：非天然アミノ酸の突然変異スキャニング〕
この実施例は、E. coliにおける非天然にコードされるアミノ酸を含むｈＨＧポリペプチドのクローニング、および発現について詳述する。また、この実施例は、修飾ｈＨＧポリペプチドの生物学的活性を評価する１つの方法について説明する。
【０４８８】
ｈＨＧおよびこの断片をクローニングする方法は、米国特許第４，６０１，９８０号明細書、米国特許第４，６０４，３５９号明細書、米国特許第４，６３４，６７７号明細書、米国特許第４，６５８，０２１号明細書、米国特許第４，８９８，８３０号明細書、米国特許第５，４２４，１９９号明細書、および米国特許第５，７９５，７４５号明細書（これらは、参照によって本明細書に組み込まれる）に詳述されている。全長ｈＨＧ、またはＮ末端シグナル配列を欠損しているｈＧＨの成熟形態をコードするｃＤＮＡが、配列番号２１および配列番号２２それぞれ示されている。天然に生じるＧＨアミノ酸配列の完全な全長、成熟な天然に生じるＧＨアミノ酸配列、および天然に生じる変異体については、配列番号１、配列番号２および配列番号３を参照のこと。
【０４８９】
直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を備える、導入された翻訳系は、非天然にコードされるアミノ酸を含むｈＧＨの発現に使用される。当該Ｏ−ＲＳは、非天然にコードされるアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する。言い換えると、当該翻訳系は、コードされたセレクターコドンに応じて、ｈＧＨに非天然にコードされるアミノ酸を挿入する。
【０４９０】
【表１】
2009520949.tif 000007
【０４９１】
修飾ｈＧＨ遺伝子および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対（所望の非天然にコードされるアミノ酸に特異的な）を含むプラスミドを用いた、E. coliの形質転換は、当該ｈＧＨポリペプチドに対する、非天然にコードされるアミノ酸の部位特異的な組み込みを可能にする。０．０１−１００ｍＭの間において特定の非天然にコードされるアミノ酸を含有する培地において、３７℃で増殖された形質転換E. coliは、高い忠実性および効率を有する修飾ｈＧＨを発現する。非天然にコードされるアミノ酸を含有するＨｉｓタグつきｈＧＨは、E. coli宿主細胞によって、封入体および凝集体として産生される。当該凝集体は、可溶化され、かつ６ＭグアジニンＨＣｌにおける変性条件において親和性精製される。リフォールディングは、５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭのＣｕＳＯ４および２％のサルコシル（Sarkosyl）において、一昼夜４度において透析によって実施される。それから、材料は、２０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２に対して透析され、続いてＨｉｓタグの除去される。「Boisselら, (1993) 268:15983-93」を参照すればよい。ｈＨＧの精製方法は、当該分野において公知であり、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析、またはエレクトロスプレーイオン化質量分析などによって追認される。
【０４９２】
Ｈｉｓタグつき変異体ｈＧＨタンパク質は、標準的なＨｉｓタグつきタンパク質精製手法を介して、ProBond Nickel-Chelating Resin（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて精製され、続いてゲル上に入れる前の陰イオン交換カラムにかけられた。修飾ｈＧＨポリペプチドの生物学的活性をさらに評価するために、ｈＧＨの受容体との相互作用の下流マーカーを測定する圧制が、使用された。内在性に産生される受容体とのｈＧＨの相互作用は、ヒトＩＮ−９リンパ球細胞株における、シグナル伝達物質のチロシンリン酸化、および転写ファミリーメンバーの活性化物質であるＳＴＡＴ５を導く。ＳＴＡＴ５の２つの形態である、ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂは、ＩＭ−９  ｃＤＮＡライブラリーから同定された。「Silvaら, MoI. Endocrinol. (1996) 10(5):508-518」を参照すればよい。ＩＭ−９細胞におけるヒト成長ホルモン受容体は、検出可能なＳＴＡＴ５リン酸化の結果として生じるラット成長ホルモン、またはヒトプロラクチンのいずれにでもなく、ヒト成長因子に対して選択的である。重要なことは、ｈＧＨを担う、ラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）細胞外ドメイン、およびＧ１２０Ｒは、ｐＳＴＡＴ５リン酸化に刺激されるｈＧＨに対して効果的に競合する。
【０４９３】
ＩＭ−９細胞は、本発明のｈＧＨポリペプチドを用いて刺激された。ヒトＩＭ−９リンパ球は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入され、かつピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン（Invitrogen, Carlsbad, San Diego）、および１０％熱不活性化必須ウシ胎児血清（Hyclone, Logan, UT）を補った、ＲＰＭＩ１６４９において増殖された。ＩＭ−９細胞は、ｈＧＨポリペプチドの１２点の用量を用いて１０分間３７において刺激する前に、アッセイ培地（フェノールレッドなしのＲＰＭＩ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１％の熱不活性化チャコール／デキストラン処理したＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、およびストレプトマイシン）において、１晩中スターブされた（starved）。刺激された細胞は、氷上において１時間、９０％の氷冷メタノールを用いた透過化処理の前に、１％のホルムアルデヒドを用いて固定された。ＳＴＡＴ５リン酸化のレベルは、リン酸化ＳＴＡＴ５１次抗体（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）に続いてＰＥ接合２次抗体を用いて、室温において３０分間、細胞内染色によって検出された。試料収集は、Flowjo software（Tree Star Inc., Ashland, OR）において分析される必要なデータを用いて、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙについて実施された。ＥＣ５０値は、SigmaPlotを利用した平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いてプロットした、量反応曲線から導き出された。
【０４９４】
以下の表２は、変異体ｈＧＨポリペプチドを用いて生成されたＩＭ−９  データを要約する。異なる位置に非天然アミノ酸置換を有する種々のｈＧＨポリペプチドが、記載されているように試験された。示される置換は、表示されている位置においてｐ−アセチルフェニルアラニンを用いて作製された。ＰＥＧ付加される非天然アミノ酸を備えるｇＨＧポリペプチドの生物学的活性を評価するために、同じアッセイが使用された。表に示されるデータから、非天然にコードされるアミノ酸が、天然にコードされるアミノ酸に対して置換されている位置に依存して、受容体結合活性が異なることが、明らかである。
【０４９５】
【表２】
2009520949.tif 000008
【０４９６】
〔実施例４〕
この実施例は、E. collにおける修飾ｆＩＦＮポリペプチドのクローニングおよび発現について詳述する。
【０４９７】
この実施例では、非天然にコードされるアミノ酸を含むｈＩＦＮが、E. coliにおいてどのように発現され得るかが、証明される。「Nagataら, Nature, vol. 284, 316-320 (1980)」および米国特許４，３６４，８６３号明細書を参照のこと。全長ｈＩＦＮ、およびＮ末端シグナル配列を欠損しているｈＩＦＮの成熟形態をコードするｃＤＮＡは、配列番号２３および配列番号２４に、それぞれ示されている。全長ｈＩＦＮおよび成熟ｈＩＦＮをコードするｃＤＮＡは、アミノ酸配列を変えないでクローニングおよび発現のために配列を最適化した後に、発現ベクターであるｐＢＡＤ、ＨＩＳｃ、ｐＥＴ２０ｂ、およびｐＥＴ１９ｂに挿入される。
【０４９８】
直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および直交化アミノアシルｔＲＮＡ（Ｏ−ＲＳ）を備える導入された翻訳系は、非天然にコードされるアミノ酸を含有するｈＧＨを発現するために使用される。当該Ｏ−ＲＳは、非天然にコードされるアミノ酸を有する当該Ｏ−ｔＲＮＡを、好ましくアミノアシル化する。言い換えると、当該翻訳系は、コードされるセレクターコドンに応じて、ｈＧＨに非天然にコードされるアミノ酸を挿入する。
【０４９９】
インターフェロン発現を用いた使用に好適なＯ−ＲＳ、およびＯ−ｔＲＮＡ配列は、実施例３に示されるそれらを含む。修飾ｈＩＦＮ遺伝子、および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対（所望の非天然にコードされるアミノ酸）を含有するプラスミドを用いた、E. coliの形質転換は、ｈＩＦＮポリペプチドへの、非天然にコードされるアミノ酸の部位特異的な組み込みを可能にする。０．０１−１００ｍＭの間において特定の非天然にコードされるアミノ酸を含有する培地において、３７℃で増殖された形質転換E. coliは、高い忠実性および効率を有する修飾ｈＧＨを発現する。非天然にコードされるアミノ酸を含有するＨｉｓタグつきｈＩＦＮは、E. coli宿主細胞によって産生され、かつ親和性精製される。ｈＵＦＮの精製方法は、当該分野において公知であり、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析、またはエレクトロスプレーイオン化質量分析などによって追認される。
【０５００】
（結合アッセイ）
ｈＩＦＮ受容体は、米国特許第６，５６６，１３２号明細書、米国特許第５，８８９，１５１号明細書、米国特許第５，８６１，２５８号明細書、米国特許第５，７３１，１６９号明細書、米国特許第５，５７８，７０７号明細書（これらは、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているように、調整された。非天然アミノ酸を備える非ＰＥＧ付加ポリペプチドについて、ホルモンの受容体に対する親和性は、当該分野に知られた、BIAcore（登録商標）バイオセンサー(Pharmacia)技術を用いることによって、測定された。BIAcore（登録商標）バイオセンサーアッセイは、受容体結合データとともに、表３に示される位置において置換された非天然にコードされるアミノ酸を備える、ｈＩＦＮ分子の結合特性を測定するために使用された。表に示されるデータから、非天然にコードされるアミノ酸が、天然にコードされるアミノ酸に対して置換されている位置に依存して、受容体結合活性が異なることが、明らかである。
【０５０１】
【表３】
2009520949.tif 000009
【０５０２】
〔実施例５〕
タンパク質とオリゴヌクレオチドとの間の接合体および複合体は、免疫ＰＣＲ、遺伝子治療およびより最近のＲＮＡｉの標的化された送達といった、診断および治療に広く適用される。部位特異的接合により、新規な機能を有する、特別に設計された分子およびナノ構造の製造が可能になる。現在、部位特異的接合は、マレイミドの化学特性を介して、主に達成されている。これによれば、修飾されたタンパク質表面のシステインが、マレイミドと選択的に反応することにより、チオエーテルが形成される。ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的組み込みの発展は、タンパク質と分子との接合のための、大規模な化学アレイを可能にしている。３０を超える非天然にコードされたアミノ酸が、タンパク質に部位特異的に組み込まれる。１つの操作として以下に記載された非天然アミノ酸を用いたこの実施例では、オリゴヌクレオチドは、部位特異的にタンパク質に対して接合される。さらに鋳型としての１本鎖ＤＮＡを用いて、接合されたタンパク質が、規定の様式において１次元にて集められた。
【０５０３】
この実施例に使用されるタンパク質は、３５番目のチロシンが非天然にコードされるアミノ酸９．２（手順．１）によって置き換えられている、ヒト成長ホルモンＹ３５変異体であった。１本鎖ＤＮＡは、−８０℃において、２５ｍＭの水溶液として保存された。ｓｓＤＮＡ  ＦＴａｍ２７は、５’−ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＡＣＧ（配列番号２１）である。ＦＴａｍ２７の５’末端は、ヒドラジンを用いて修飾されている。鋳型用の配列は、ＦＴａｍ２８−ｄ１：５’−ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ（配列番号２１）；ＦＴａｍ−ｄ２：  ５’−ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  Ｔ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ（配列番号２２）；ＦＴａｍ２８−ｄ３：  ５’−ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＴＴ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ；ＦＴａｍ２８−ｔ１  （配列番号２３）；５’−ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  （配列番号２４）；ＦＴａｍ２８−ｔ２：  ５’−ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  Ｔ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  Ｔ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  （配列番号２５）；ＦＴａｍ２８−  ｔ３：  ５’−ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＴＴ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＴＴ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ（配列番号２６）である。
【０５０４】
（タンパク質−１本鎖ＤＮＡ接合）
タンパク質（１ｍｇ）は、ＰＤ１０  ゲルろ過カラムを用いて、反応緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａＯＡｃ、４００ｍＭのＡｒｇ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）に交換された緩衝液であった。タンパク質溶液は、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ  ＣＥＮＴＲＯＣＯＮ（Vivascience）を用いた９０μｌに濃縮された。ヒドラジンを用いた５’の修飾を有する２５ｍＭのｓｓＤＮＡ  ＦＴａｍ２７の水溶液の５μｌは、４０μｌの反応緩衝液に分散された。ｓｓＤＮＡ溶液は、タンパク質溶液にゆっくりと添加された。沈降が最初に現れたが、溶解した。２８℃におけるインキュベーションの後、２０時間において、５ｍＭのシアノホウ素水素化物ナトリウムが加えられた。反応混合物は、さらに２０時間インキュベートされ、かつ分析および精製が実施された。
【０５０５】
（接合体の精製）
１ｍｌのフェニルＨＩＣカラムが、接合体のＦＰＬＣ精製に採用された。緩衝液Ａ：２ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．０；緩衝液Ｂ：１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ  ７．０。精製に使用された勾配は、１０のカラム容積（ＣＶ）  ０％のＢ、５０％のＢに対する５のＣＶ、５のＣＶに対して５０％のＢに保持され、それから１００％のＢに対する３０のＣＶであった。精製された接合体は濃縮され、緩衝液が保存緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に交換され、かつＭＥＳ緩衝液において２００Ｖで４−１２％のＳＤＳゲルを用いてＰＡＧＥ分析が行われた。
【０５０６】
（ハイブリダイゼーション）
タンパク質−ｓｓＤＮＡの接合体の５μｌが、保存緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）における相補的ｓｓＤＮＡに加えられた。混合物は、２０μｌの最終容積にするために保存緩衝液を用いて補われ、かつ３０秒間４２℃に加熱され、それから、室温まで冷やされた。最終生成物は、３−５時間、１２５Ｖ、４℃において、本来のＴＲＩＳグリシンゲル電気泳動によって分析された。
【０５０７】
【化６】
2009520949.tif 000010
【０５０８】
手順．１  ヒドラジンを用いて５’末端に修飾された１本鎖ＤＮＡを用いた、ｈＧＨ変異体（Ｙ３５／非天然アミノ酸９．２）の接合手順。
【０５０９】
１，３ジケト部分を有する非天然にコードされるアミノ酸９．２が、３５番目のアミノ酸において、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に組み込まれ、かつ１５ｍｅｒの１本鎖ＤＮＡである、ヒドラジン官能基を用いて修飾されたＦＴａｍ２７（手順．１）を用いた接合用の操作物として使用された。この接合は、不可逆的な共有結合的連結を与えるシアノホウ素水素化ナトリウムを用いてさらに還元される、ヒドラゾンを最初に結果として生じた。ｓｓＤＮＡの５倍を超える、７０％の産物が得られた（図１７）。接合体は、ＨＩＣカラムを用いて約９０％の純度に精製され、かつハイブリダイゼーションが実施された。
【０５１０】
接合体は、スペーサーとしてそれらの間に０（１）、１（２）および２（３）つの塩基Ｔを用いて繰り返す、２（ｄ）または３（ｔ）の直列相補配列（ＦＴａｍ２８）を有するｓｓＤＮＡと、ハイブリダイズするように設計された（図１８）。ｈＨＧ−ＤＮＡ接合体相対的な濃度を決定するために、５μｌのｈＧＨ−ｓｓＤＮＡが、ＦＴａｍ２７、およびそれらの間のスペーサーとして２つのＴ塩基に対して相補的な２つの繰り返し配列を有する、ｓｓＤＮＡである、一連の濃度のＦＴａｍ２８−ｄ３を用いて混合された。その結果物が、本来のグリシンゲル電気泳動を用いて、１２５Ｖ、３時間、４℃において分析された（図１９）。最も完全なハイブリダイゼーションは、約１６μの接合体濃度を示す、１０μＭのＦＴａｍ２８−ｄ３を４μｌ用いて混合された５μｌのｈＨＧ−ｓｓＤＮＡを有するものであった。ゲルに従って、ｈＧＨ−ｓｓＤＮＡおよび、ＦＴａｍ２８−ｄ３を有するｈＧＨ−ｓｓＤＮＡモノマーは、おそらくＤＮＡ骨格にある非常に多くの負電荷に起因して、ｈＧＨ自身よりもより移動した。
【０５１１】
また、これらの現象は、対照実験において証明された（図２０）。ｈＧＨが、１００μＭのＦＴａｍ２８−ｄ３の１μｌを用いて混合されたとき、ハイブリダイゼーションが観察されなかった（列４）。一方において、１００μＭのＦＴａｍ２８−ｄ３の１μｌが、ｈＧＨ−ｓｓＤＮＡ接合体を用いて混合されたとき、ｈＧＨダイマーがハイブリダイゼーションを介して形成された。ｈＧＨとＤＮＡとの間に非特異的な相互作用はない。接合されたｈＧＨのダイマライゼーションは、特異的なＤＮＡハイブリダイゼーションの結果であった。過剰に多いＦＴａｍ２８−ｄ３が加えられたとき、より多くのハイブリッドモノマーおよびより少ないハイブリッドダイマーが形成された。８０ピコモルのｈＧＨ−ｓｓＤＮＡ接合体が、１０当量のＦＴａｍ２８−Ｄ３を用いて混合されたときに、存在するハイブリッドダイマーの実質的な量であった（列３）。これは、ハイブリッドダイマーが熱力学的にハイブリッドモノマーよりも安定であることを示した。
【０５１２】
十分に明確な手法においてタンパク質ｓｓＤＮＡの集合を証明するために（図２１）、鋳型として１本鎖ＤＮＡを用いてｈＧＨの６つの１次構造が、集合された。これらの構造は、各ｈＧＨ分子の間における、異なる価数およびスペーサーによって変化した。混合物は、５０℃において５分間、インキュベートされ、室温にまで冷やされ、かつ本来のグリシンゲル上において分析された。これらの１−Ｄ構造は、高い効率において集合された。列１から列３は、それぞれ０、１および２のスペーサー、ＤＮＡ配列の繰り返しにおけるＴ塩基を有するダイマー形成の結果を示している。列４から列６は、スペーサーとして、０、１および２つのスペーサーを有するトリマー形成の集合結果物を示している。
【０５１３】
化学操作物として、非天然にコードされるアミノ酸を用いて、１本鎖ＤＮＡは、タンパク質表面に対して部位特異的に接合された。この１本鎖ＤＮＡ−タンパク質接合体は、鋳型としてＤＮＡを用いた、タンパク質１−Ｄ構造を高い効率に集合するために使用され得る。また、部位特異的なオリゴヌクレオチド接合体は、新規な機能を有する新規なナノ構造を作り出す、よく知られた３−Ｄ構造を集合するために、使用され得る。さらに、タンパク質−オリゴヌクレオチド接合体技術は、タンパク質薬物の「プラグ＆プレイ」ライブラリーを作り出すために適用されてもよい。この場合において、オリゴヌクレオチドは、個々の小分子および／またはタンパク質をコードする、連結および「識別表」の両方として使用され得る。これらのタンパク質−オリゴヌクレオチド接合体は、診断適用に関する免疫ＰＣＲに使用され得る。また、この技術は、標的化ＲＮＡｉ治療に使用され得る、タンパク質ＲＮＡ接合体またはタンパク質ＰＮＡ接合体を作り出すために、使用され得る。
【０５１４】
本明細書に記載されている実施例および実施形態が、例証のみを目的としており、かつそれらの軽微な種々の修飾または変化が、当該分野における通常の当業者に示唆されており、かつ本出願および精神の、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが、理解される。本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、かつ記載されているが、そのような実施形態がほんの一例として与えられていることは、当該分野における当業者にとって明らかであろう。多くの変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当該分野における当業者にとって、直ちに生じるだろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する種々の変更可能物は、本発明の実施に採用され得る。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、かつこれらの特許請求の範囲に含まれる方法および構造、ならびにその等価物がこれによって網羅されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０５１５】
【図１】本明細書に記載の方法、組成物、戦略、および技術の特定の態様の関係を表す概略図である。
【図１ａ】様々なタンパク質検出方法を示す図である。
【図２】翻訳により（または別の方法により）ポリペプチドに組み込まれたアミノ酸の官能基（Ａ）、と反応物質（Ｂ）とを反応させて修飾されたポリペプチド（修飾ポリペプチド）を得る反応の、非限定的な具体例を示す図である。
【図３】カルボニル含有非天然アミノ酸要素と、ヒドロキシルアミン含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【図４】ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸要素と、カルボニル含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【図５】オキシム含有非天然アミノ酸要素とカルボニル含有試薬とによる、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【図６】ジカルボニル含有非天然アミノ酸要素とヒドロキシルアミン含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【図７】ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸要素とジカルボニル含有試薬との反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【図８】オキシム含有非天然アミノ酸要素と、カルボニルまたはジカルボニル含有試薬とのオキシム交換反応による、オキシム含有非天然アミノ酸要素の形成の、非限定的な具体例を示す図である。
【図９】タンパク質に部位特異的に結合した分子の非限定的な具体例を示す図である。
【図１０】非天然アミノ酸と反応する樹脂を利用した、非天然アミノ酸ポリペプチドの精製方法の一例を示す図である。
【図１１】非天然アミノ酸ポリペプチドの精製と、該ポリペプチドの接合とを「ワンポット」により実施する方法の一例を示す図である。
【図１２】樹脂の選択、および樹脂への官能基付与の一例を示す図である。
【図１３】ヒドロキシルアミン樹脂を用いた、非天然アミノ酸ポリペプチドの親和性精製の一例を示す図である。
【図１４】アルデヒド樹脂を用いた、非天然アミノ酸ポリペプチドの精製の一例を示す図である。
【図１５】切断によりチロシンに変換される非天然アミノ酸の前躯体から、未変性タンパク質を精製する一例を示す図である。
【図１６】非天然アミノ酸の非限定的な例を示す図である。
【図１７】ｈＧＨの一本鎖ＤＮＡの接合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果を示す図である。
【図１８】タンパク質とｓｓＤＮＡ接合体とのハイブリダイゼーションを示す図である。
【図１９】ｈＧＨのｓｓＤＮＡ接合体のハイブリダイゼーションを、未変性の１４％グリシンゲルにより分析した結果を示す図である。
【図２０】Ｆｔａｍ２８‐ｄ３と混合された５μｌのｈＧＨのｓｓＤＮＡ、およびＦｔａｍ２８‐ｄ３と混合されたｈＧＨを、未変性ゲルにより分析した結果を示す図である。
【図２１】鋳型としてのＤＮＡを用いて、１次元（１−Ｄ）構造のｈＧＨを会合させた結果を示す図である。
【図１】
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【図１ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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