(57)【要約】夫々に複合体となり活性型の酵素を形成するβ‐ガラクトシダーゼ断片を有するタンパク質の細胞内における移動を特定する方法及び化合物を提供する。一方の断片が関心対象のタンパク質に結合し、他方の断片がコンパートメント局在シグナルに結合している２つの融合コンストラクトを有する細胞を使用する。かかる細胞は、高イオン強度の溶液を用いて酵素複合体を検出して、移動に影響する化合物をスクリーニングするために使用される。
2009512460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え細胞を使用し、刺激物に対する応答によりタンパク質が移動することを検出する方法であって、
前記遺伝子組換え細胞は、細胞内コンパートメントが細胞質である場合を除き、前記刺激物により該細胞内コンパートメントに移動する関心対象のタンパク質に融合した、第一のβ‐ガラクトシダーゼ断片をコードする第一の発現コンストラクト、及び、第二のβ‐ガラクトシダーゼ断片を該細胞内コンパートメントに導くシグナル配列に融合した、第二のβ‐ガラクトシダーゼ断片をコードする第二の発現コンストラクトを有し、
該第一及び第二の断片は夫々複合体となり、活性型の酵素を形成し、該第一のβ‐ガラクトシダーゼ断片が該細胞内コンパートメントに存在しないときには、該活性型の酵素を形成する第一及び第二のβ‐ガラクトシダーゼ断片について、該コンパートメントが物理的な障壁となり、
また、前記方法が、
該細胞を、候補刺激物を含む少量の培地に、任意の移動が起こるのに充分な時間接触させるステップと、
酵素基質組成物を含む高イオン強度の試薬を添加して、シグナル：ノイズ比が少なくとも約５：１となる期間内にて、発光生成物から発光シグナルを作り出すステップと
を含み、
前記候補刺激物が細胞を刺激して、前記関心対象のタンパク質を移動させたことを、正の発光シグナルが示すことを特徴とするタンパク質の移動検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記関心対象のタンパク質が核に移動する表面膜タンパク質であり、前記第二の断片が該核内に位置している、タンパク質の移動検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記試薬溶液が、前記少量且つ高強度の試薬の約１：２以下の希釈液となる、タンパク質の移動検出方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記第一の断片がβ‐ガラクトシダーゼの小さな断片である、タンパク質の移動検出方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記試薬が約１００〜３００ｍＭのＮａＣｌを含む水溶液である、タンパク質の移動検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記試薬溶液のモル濃度が約１００〜３５０の範囲内にある、タンパク質の移動検出方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、１〜３％の両性イオン界面活性剤を含む、タンパク質の移動検出方法。
【請求項８】
遺伝子組換え細胞を使用し、リガンドとの結合に対する応答により表面膜タンパク質の受容体が核へと移動することを検出する方法において、
前記遺伝子組換えされた細胞は、前記受容体に融合した第一のβ‐ガラクトシダーゼの小断片をコードする第一の発現コンストラクト、及び前記第二のβ‐ガラクトシダーゼを前記核に導くシグナル配列と融合した第二のβ‐ガラクトシダーゼの大断片をコードする第二の発現コンストラクトを有し、
該第一及び第二の断片は夫々に複合体となり、活性型の酵素を形成し、該第一のβ‐ガラクトシダーゼ断片が該核に存在しないときには、活性型の酵素を形成する第一及び第二のβ‐ガラクトシダーゼ断片について、該核が物理的な障壁となり、
また、前記方法が、
該細胞を、候補刺激物を含む少量の培地に、任意の移動が起こるのに充分な時間接触させるステップと、
酵素基質組成物を含む高イオン強度の試薬溶液を添加して、シグナル：ノイズ比が少なくとも約５：１となる期間内にて、発光生成物から発光シグナルを作り出すステップと
を含み、
前記候補刺激物が細胞を刺激して、前記受容体を移動させたことを、正の発光シグナルが示すことを特徴とするタンパク質の移動検出方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記試薬溶液が、約１：２以下の前記培地及び試薬溶液の希釈液となる、タンパク質の移動検出方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法において、前記第一の断片がβ‐ガラクトシダーゼの小さな断片である、タンパク質の移動検出方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法において、前記試薬溶液が約１００〜３００ｍＭのＮａＣｌを含む、タンパク質の移動検出方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記試薬溶液のモル濃度が約１００〜３５０の範囲内にある、タンパク質の移動検出方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、１〜３％の両性イオン界面活性剤を含む、タンパク質の移動検出方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記界面活性剤がＣＨＡＰＳである、タンパク質の移動検出方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記受容体が糖質コルチコイド受容体である、タンパク質の移動検出方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において使用される試薬溶液であって、該方法を実施する指示と組み合わせて使用され、約１００〜３００ｍＭのＮａＣｌ、リン酸緩衝液、マグネシウム塩及び両性イオン界面活性剤を含む高いイオン強度を有する試薬溶液。
【請求項１７】
請求項１６に記載の試薬溶液において、前記両性イオン界面活性剤が約１〜３％の量のＣＨＡＰＳである、試薬溶液。
【請求項１８】
請求項１６に記載の試薬溶液において、前記指示が電子的に読み込み可能な形態にある、試薬溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００５年１０月２４日付けで提出された米国仮特許出願第６０／７３０，０８９号の利益を主張し、その全体をここに援用するものである。
【０００２】
出願人は、配列リストの紙コピーが、添付のコンピュータディスク内のコンピュータで読み込み可能な形態の配列リストと同一であることを主張する。また、出願人は、配列リストの内容の全体をここに援用する。
【０００３】
この発明の分野は、細胞内の事象のハイスループットスクリーニングアッセイである。
【背景技術】
【０００４】
細胞内の事象を特定することは、細胞経路及び事象の特定の研究において、また、生物活性により化合物をスクリーニングすることにおいて、重要性が増してきている。細胞内の事象を検出することに関する文献において、これまで多くの技術が説明されてきた。細胞経路の理解及び治療薬となり得る化合物の同定に重要だと考えられている事象は移動である。移動の際には、外部からの事象により細胞が刺激されることで、一つ以上の細胞内の構成要素がある細胞内コンパートメント又は部位から、その他のコンパートメント又は部位へと動く。かかる移動の結果、経路が誘導又は抑制され、翻訳が開始又は抑制され、細胞内の構成要素が分解又は修飾され、その他の事象が発生し、或いはそれらの組み合わせが起こる。
【０００５】
治療薬となり得る薬剤のスクリーニング法としては、マルチウェルプレートを使用したハイスループットスクリーニング法に関心が持たれている。これらプレートをロボット操作により取り扱うことにより、ウェルを同時に充填し、多くの枚数のプレートを積み重ね、そして、移動させ、夫々のプレートの読み込みを同時に行うことができるので、同一条件にて多様なステージを実施することが実質的に補償される。この方法では、プレートが培養されている間に、その他のプレートは、操作、読み込み、充填、あるいは管理されるので、装置が有効に使用されることとなる。アッセイプロトコール及び試薬はしっかりとしており、信頼性が高く、かつ、低濃度の試薬及び候補化合物であっても強いシグナルを提供するものでなければならない。
【０００６】
実質的な程度において、移動分析は、蛍光タンパク質タグの使用に頼ってきた。かかるアプローチ法は、蛍光タンパク質が大きいことから関心対象の事象に干渉したり、発光強度が小さいことから、検出には相当量のラベルが必要となったり、かかる検出が、バックグランド干渉に曝され、誤った解釈がなされる虞のある、相当の困難を伴う細胞内の部位にてシグナルを観察することを必要とすることなどの多くの欠点を有する。そのため、汎用性が高く、正確であり、そして自動化可能なハイスループットスクリーニング法のニーズがある。
【０００７】
β‐ガラクトシダーゼ断片の使用に関する記載は、特許及び科学文献にて広範に見つけるとこができ、例えば、国際公開第００／０３９３４８号には、上記したように、マーカーが、特異的なプロテアーゼ切断部位を有するタンパク質と融合したβ‐ガラクトシダーゼ断片であるプロテアーゼアッセイ法が記載されている。また、アッセイシステムにおいて、β‐ガラクトシダーゼ断片を使用することに関するその他の多数の参考文献がある。以下のものは、代表的なものである。Douglas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3983-7, (1984)は、ＡＴＰ‐２とｌaｃZとの融合タンパク質を説明するものであり、国際公開第９２／０３５５９号は、プロテナーゼを測定するために、β‐ガラクトシダーゼをα相補する融合タンパク質を説明するものである。相互作用するタンパク質に融合した酵素断片の相補に基づくアッセイ法では、Rossi et al, Trends in Cell Biol., 10: 119-22, (2000)にて概説されているように、相互作用するタンパク質が複合体となり、活性型の酵素が提供される。また、Fung et al, "A Homogeneous Cell-Based Assay to Measure Nuclear Translocation Using [beta]‐Galactosidase Enzyme Fragment Complementation," Assay and Drug Dev. Tech., 4(3): 263-272, (2006)は、酵素断片の相補に関する、いくつかの試薬及び手順を更に説明するものである。
【０００８】
【特許文献１】国際公開第００／０３９３４８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９２／０３５５９号パンフレット
【非特許文献１】Douglas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3983-7, (1984)
【非特許文献２】Rossi et al, Trends in Cell Biol., 10: 119-22, (2000)
【非特許文献３】Fung et al, "A Homogeneous Cell-Based Assay to Measure Nuclear Translocation Using [beta]‐Galactosidase Enzyme Fragment Complementation," Assay and Drug Dev. Tech., 4(3): 263-272, (2006)
【発明の開示】
【０００９】
細胞内アッセイ法は、その夫々が複合体となり、活性型の酵素を形成し、１つの断片が関心対象のタンパク質に融合しているβ‐ガラクトシダーゼ断片を使用して実施される。アッセイに供される細胞は、融合断片及び非融合断片を発現し、一方の断片は、例えば、コンパートメントや部位などの所定の位置に配置され、そして、他方の断片はそれとは異なる位置に配置される。刺激を受けると、異なる位置にある断片が所定の位置に動き、活性型の酵素複合体を形成する。透過性の高イオン強度緩衝液及び発光生成物となる基質が、細胞を含む溶液に対し大量に添加され、溶液の発光が読み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
細胞の状態、特には移動事象を検出する細胞内アッセイを実施するための方法及び試薬を提供する。かかるアッセイにおける主要な構成要素は、特定の細胞内における事象についてのシグナルを得るために、遺伝子的に組換えられた細胞及び試薬組成物である。遺伝的に組換えられた細胞は、β‐ガラクトシダーゼ断片が関心対象のタンパク質に融合した融合タンパク質を発現する発現コンストラクト、及び、コンパートメントが細胞質以外の場合に局在シグナル配列に融合している、他方のβ‐ガラクトシダーゼ断片を発現する発現コンストラクトの２つの発現コンストラクトを有する。試薬組成物は、複数の無機塩、有機緩衝液、酵素用のマグネシウム塩、及び発光生成物を提供するβ‐ガラクトシダーゼ基質を含む高イオン強度水溶液である。
【００１１】
β‐ガラクトシダーゼ断片は、α又はＥＤ、並びにω又はＥＡと称されている。ＥＤは概して、小さい方の断片であり、酵素のＮ末端部分の少なくとも５〜４０アミノ酸を含む、慣用的には約３５〜９０の、より慣用的には４０〜６０のアミノ酸からなり、一方、ＥＡは、概して酵素のＮ末端近傍の大部分が欠如しているが、残りの酵素部分を含むものである。ＥＤが存在しないＥＡは、相当に不活性となり、その活性は、ＥＤと複合体を形成したＥＡの活性の約５％未満となる。β‐ガラクトシダーゼ酵素断片及びアッセイにおけるその使用についての更なる記載は、例えば、米国特許第４，３７８，４２８号、米国特許第４，７０８，９２９号、米国特許第５，０３７，７３５号、米国特許第５，１０６，９５０号、米国特許第５，３６２，６２５号、米国特許第５，４６４，７４７号、米国特許第５，６０４，０９１号、米国特許第５，６４３，７３４号、国際公開第９６／１９７３２号及び国際公開第９８／０６６４８号に記載されている。
【００１２】
ＥＤ及びＥＡは、その夫々が融合しているその他の結合タンパク質を用いることなく、夫々に複合体となり活性型の酵素を形成する。このように、付加的な結合能を具えない細胞において、断片が活性型の酵素を形成する。このことは、異なる断片に融合した二つのポリペプチドが結合せずに、ＥＤ及びＥＡが有効量の活性型酵素を形成しないような、いわゆる弱いアフィニティーとは対照的である。
【００１３】
一般に、小さな断片は、ターゲットタンパク質と融合する。ＥＤは、移動を含むターゲットタンパク質の機能に干渉することなく、ＥＡと複合体となり得るよう、ターゲットタンパク質の任意の適当な部位と融合させることができる。
【００１４】
関心対象のタンパク質は、刺激物により、あるコンパートメントからその他のコンパートメントに移動する細胞内のタンパク質である。関心対象の表面膜タンパク質としては、糖質コルチコイド受容体、グルコーストランスポーター、ステロイド受容体などが挙げられる。移動が生じる部位は、核、ゴルジ装置、細胞質膜又はその他の細胞コンパートメントである。
【００１５】
ＥＡは、一つ以上の制御シグナル配列をＥＡに融合することで改変することができる。例えば、ＥＡを核内に局在させたいときには、ＥＡにＮＬＳを融合し、また、任意選択的にＮＲＳを融合する。かかるＮＲＳは、Mol. Cell Biol., 22(19): 6871-6882, October (2002)に記載の核保持シグナルである。その他の局在については、その他の適当な制御シグナル配列を採用することができる。
【００１６】
当該発明の主要な役割は、移動を刺激する又は刺激を阻害する化合物を検出することにある。そのことから、化合物は、アロステリック効果も評価され得るが、一般に受容体結合部位であるターゲットに結合する。或いは、かかる化合物は、その阻害能を測定するために、例えば天然リガンドである公知の結合化合物を阻害することができる。この方法により、所望の生物活性を有する候補化合物を見出し、各種表示のためにその化合物を薬として更に調査することができる。
【００１７】
この方法では、アッセイ試料の準備のために、細胞を適当な培地にて少量の所望される細胞数の条件で生育させ、次いで、候補化合物などの所望される刺激物を添加する。その容量は、概して約２５０μｌを超えず、慣用的には約２００μｌ以下であり、また、一般には少なくとも約２５μｌであり、添加される試薬の容量は、概して細胞の培地を約１：１未満に希釈し、慣用的には０．５：１未満に希釈する。試薬が乾燥している場合には希釈しない。関心対象の事象が起こるのに充分な時間、一般には約１時間から約一日までの時間分析試料を培養した後、アッセイ試料に試薬溶液を添加し、基質からの生成物の一つ以上の読み込みが行われる。希釈の比率は１：２以下であり、慣用的には約１：０．２５〜１：２であり、より慣用的には１：１であり、そして、１：０．２５まで小さくする又はそれ以下とする。かかる希釈因子は、読み込み時における複合体の形成を減少させ、読み込み時におけるシグナルのバックグラウンドに対する比が少なくとも５倍の、慣用的には少なくとも１０倍の強いシグナルを得ることを可能とする。１５０分以内に一つ以上の読み込みが行われ、それは、より慣用的には１２０分以内であり、好ましくは約６０分以内であり、また、慣用的には約１０分以後であり、より慣用的には約１５分以後である。
【００１８】
多様な細胞内の事象が関心対象となるが、その主たる関心対象は移動である。このアッセイ法では、形成されたとしても少しであるが、融合タンパク質が移動することなく活性型酵素が形成される。かかる形成に対する障壁は、融合していない断片が細胞内コンパートメントに保持される物理的な障壁である。融合タンパク質のコンパートメントへの移動によってのみ、充分量の活性型酵素の複合体が形成される。特に関心が高いのは、活性化されることで細胞内コンパートメントに輸送される表面膜タンパク質である。細胞内コンパートメントとしては、ミトコンドリア、クロロプラスト、細胞核、ゴルジ装置、小胞、微小管及び細胞質そのものが挙げられる。
【００１９】
任意の真核細胞を使用することができ、その大部分は細胞株が使用される。細胞株は慣用的に哺乳類のものであるが、目的に応じて単細胞生物や非脊椎動物の細胞を使用することもできる。哺乳類の細胞株としては、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＭＴＶ及びその類似株がある。かかる細胞は、一過的に又は永久的に、慣用的には永久的に、遺伝子が組換えられている。市販されている多様なベクターを使用して、真核細胞内に２つの発現コンストラクトを有効に導入することができる。細胞株、ベクター、遺伝子組換え方法、発現コンストラクトについての広範な記載は、２００３年５月１５日公開のＺｈａｏらによる米国特許出願公開第２００３／００９２０７０号の段落０００４６〜０００６６に記載されており、ここに特に援用する。
【００２０】
２つの断片のプロモーターの相対強度について、いくつかの選択をすることができる。融合していない断片のプロモーターが、融合している断片のプロモーターよりも強過ぎないことが好ましく、概して、それら２つのタンパク質の発現間における発現比が、約２０未満であり、慣用的には約１０未満である。プロモーターの発現レベルを特定することは従来技術として周知であり、従来技術のアッセイ法によって、ラベルされた抗体を２つのタンパク質に使用することが適当である。
【００２１】
試薬溶液は、酵素の基質と細胞膜を介して細胞内にて形成された酵素とを相互作用させ得る、高イオン強度溶液である。この方法では、細胞の刺激及び移動により形成される任意の活性型酵素の複合体を、生成物から得られるシグナルとして検出することができる。かかるアッセイ法は、具体的には塩化ナトリウムと少量のその他の塩類による高塩濃度の使用に依存している。概して、高イオン強度の試薬溶液のモル濃度は、１００ｍＭを超え、また、約３５０ｍＭ以下であり、慣用的には約１５０〜２５０ｍＭの範囲内にある。塩化ナトリウムは全塩類の少なくとも５０％であり、より慣用的には少なくとも約６０％であり、また、慣用的には約９０未満であり、慣用的には約１００〜３００ｍＭの範囲内にある。補助塩類は、イオン強度を適正に増強すること以外の多様な目的にて役立つ。これら塩類は、一般に、夫々の塩類が、全塩類の約１〜５％の範囲内の分量を有する。これらの塩類濃度では、酵素は活性化しており、酵素生成物は直ちに検出することが可能である。これら塩類としては、カリウム塩、特には試薬溶液及び分析溶液のｐＨにおいて１塩基性リン酸塩と２塩基性リン酸塩との混合物であるリン酸塩、並びにマグネシウム塩、特には酵素活性を補助する酢酸マグネシウムが挙げられる。また、リン酸塩は緩衝剤としても役立ち、全体として約５〜２０ｍＭで存在する。かかる分量は、ｐＨがアッセイ条件内にて維持されている限りは、致命的とはならない。かかるｐＨは、概して約６．５〜８．０の範囲内にあり、より慣用的には、６．７〜７．５の範囲内にあり、好ましくは約６．９である。
【００２２】
また、塩類に加え、有機界面活性剤が使用される。特に興味深いのは、中性の、例えば両性イオンの界面活性剤である。ＣＨＡＰＳ（３‐[(３‐コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]‐１‐プロパンスルホナート）などの多様な界面活性剤を使用することができ、ＣＨＡＰＳを使用することが好ましい。界面活性剤の濃度は、概して試薬溶液の約１〜５％であり、より慣用的には１〜３％であり、特には２％である。
【００２３】
また、発光試薬は、β‐ガラクトシダーゼ基質及び任意選択的にシグナルエンハンサーを含んでいる。発光試薬は、形成され得るβ‐ガラクトシダーゼの最大量に対し、大きく超過した量となる。市販のＡＢＩ社製のエメラルドＩＩエンハンサーとともに使用されるガラクトンスターを発光基質として使用することが好ましい。また、任意の同等の発光基質組成物を使用することも可能である。かかる基質は、試薬溶液の、約１〜１０重量％であり、エンハンサーは、約１０〜３０重量％である。これらの分量は、使用される具体的な基質の組成によって異なる。
【００２４】
試薬溶液は、販売されている５〜２０倍又はそれ以上の濃度のもの、或いは、粉末状の固形体にて提供され、それを適当な割合で水に溶解して調製することができる。
【００２５】
アッセイにて使用される細胞は、細胞の特性に従い生育させる。ほとんどの場合、細胞はマイクロタイタープレートのウェル内にて培養され、かかるウェル数は概して約９６〜１５３６の範囲にあり、概して９６〜３８４のウェル数である。その底は概して透明なので、読み込みはウェルの底から行われる。ウェル内にプレーティングされる細胞数は、概して約１０２〜１０４個の細胞である。培地の分量は、少量であり、慣用的には約５０〜２００μｌの範囲にあることから、試薬溶液を添加された場合、培地は全体量に対しより小さな分量となる。次いで、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、オーバーナイトにて接着させる。
【００２６】
かかる接着細胞に対し、細胞を刺激してタンパク質の移動を開始させる、或いは細胞を刺激する化合物を阻害する能力にてスクリーニングされた、通常は有機化合物である、関心対象の化合物を添加する。関心対象の化合物の濃度は、ターゲットの性質、関心対象の活性範囲、水性培地への溶解度などに応じて大きく異なる。概して、添加される薬剤の容量は、約５〜５０μｌの範囲内にある。それらの混合液が再度、実施された具体的な解析に基づき適当な時間培養される。培養時間は、概して少なくとも約０.５時間であり、慣用的には２４時間を超えず、一般には約１〜６時間の範囲内にある。
【００２７】
効力を生じ、ターゲットタンパク質が移動するのに充分な時間、細胞を刺激した後、細胞の培地に対し、一般には少なくとも約２倍、より慣用的には少なくとも約３倍であり、また、約１０倍以下、慣用的には約５倍以下の大量の試薬を添加する。概して、試薬溶液の量は、約２００〜６００μｌの範囲内にあり、より慣用的には約３００〜５００μｌの範囲内にある。形成された酵素複合体が保持され、細胞の透過に起因して新たな複合体となることが阻害されるので、移動により形成される複合体以外のバックグラウンドが最小となることが見出された。この方法により、刺激の活性に対する強い応答が達成される。更なる添加物は必要とされない。概して５〜６０分の、酵素反応が安定化するのに充分な時間が経過した後に、一つ以上の読み込みが行われる。従来市販されている発光プレートリーダーを効果的に使用することが可能である。
【００２８】
慣用的にはスタンダードを使用し、それによって、候補の化合物と同一の条件下で行った公知刺激物の濃度にシグナルを関連付ける。スタンダード化合物の濃度の変化によるシグナルの変化を示すグラフを作成することができる。
【００２９】
試薬溶液又は適当な比率の構成要素の粉末を含むキットを準備でき、通常は約１０％過剰以下の成分を準備する。細胞をキットに含めることもできるが、受け取った者が試薬を使い切ってもその細胞の集団を継続して拡大することができるよう、それらを個別に提供することもできる。また、アッセイを実施するための説明書とともに、グラフ、或いは比較に使用される化合物として、スタンダードを提供することができる。説明書は、書面（ハードコピー）、又は、例えばＣＤなどの電子的なもの（ソフトコピー）とすることができる。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例は、例証であり、この発明を制限するものではない。
【００３１】
以下の記載は、試薬溶液の組成、及びＥＤに融合した糖質コルチコイド受容体に使用されたプロトコールである。
【００３２】
ＧＲ移動アッセイのための試薬溶液緩衝液の調合
５ｍＭ  （２塩基性）リン酸カリウム
５ｍＭ  （１塩基性）リン酸カリウム
１５０ｍＭ  塩化ナトリウム
１０ｍＭ  酢酸マグネシウム
２％ＣＨＡＰＳ
ｐＨ６．９
アッセイにて使用された試薬緩衝液／基質の調合物／混合物
１部  ガラクトンスター（ＡＢＩ社製）
５部  エメラルドＩＩエンハンサ（ＡＢＩ社製）
１９部  ２％ＣＨＡＰＳを含む溶解緩衝液（ＤＸ）
アッセイプロトコール（９６ウェルのアッセイフォーマット）
１．  コスターの９６ウェル、白色、透明底板に、１００μｌの体積にて、１ウェル当たり１０,０００個のＣＨＯ−ＥＡ＋ＧＲ−ＰＬ細胞をプレーティングし、培養器内にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて一晩接着させる。
２．  翌日、かかる細胞に対し、所望の濃度の（Ｆ１２培地に希釈された試薬濃度５％のエタノール溶液として作製され、反応物中の最終濃度が１％エタノールとなる）デキサメタゾン（シグマ社製、カタログ番号:Ｄ８８９３）を２０μｌ添加する。
３．  反応物を、３７℃、５％ＣＯ２の培養器内にて３〜４時間培養する。
４．  反応物に対し、その同量を５０ｍｌの試薬溶液からウェルに添加する。
５．  ３０分及び６０分後に、発光強度の測定が可能な（ワラックビクターＩＩ（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩ）又はパッカードルミカウント（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｌｕｍｉｃｏｕｎｔ）などの）標準的なマルチウェルプレートリーダによりプレートを読み取る。
【００３３】
以下の記載は、ＣＨＯ−ＥＡ＋ＧＲ−ＰＬ細胞の準備、コンストラクトの準備、ベクターへの組込み、かかるベクターのＣＨＯ細胞への導入についての記載である。また、適当な活性を有する細胞のスクリーニングについての記載である。
【００３４】
ＥＡ‐ＮＬＳ／ＮＲＳコンストラクト
β‐ガラクトシダーゼの初めのω又はＥＲ断片を、スタンフォード大にて作製されたＥＡ−ＮＬＳ／ＮＲＳコンストラクトをＰＣＲのテンプレートに使用することで作り出した（Wehrman, T.S., Casipit, C.L., Gewertz, N.M., Blau, H.M., Nature methods, 2, 521-527, (2005)）。ＰＣＲ反応により、ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩの制限酵素部位が夫々５´端及び３´端に設計されている。かかるＥＡ断片を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクター、ｐｃＤＮＡ３．１ｈｙｇｒｏ（カタログ番号：Ｖ８７０−２０）にサブクローニングした。かかるプラスミドコンストラクトを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、核内に局在するＥＡを発現するハイグロマイシン耐性のクローン細胞を最終的に選抜した。
【００３５】
クローン選抜は、ＦｕＧｅｎｅ６試薬（ロシュ社製）を用いて細胞を４８時間にわたり形質転換し、ハイグロマイシン（１００、２５０、４００μｇ／ｍｌ）を増量させつつ付与し、ＥＡ−ＮＬＳ／ＮＲＳプラスミドを取り込んだ細胞を選抜圧下に曝すことにより行われた。２週間の選抜後、相同組換え事象によりＥＡ−ＮＬＳ／ＮＲＳのｃＤＮＡがＣＨＯ−Ｋ１のゲノムに組み込まれ、ＥＡ−ＮＬＳ／ＮＲＳを発現するハイグロマイシン耐性の細胞のプール集団が作り出される。段階的に希釈した選抜プール細胞を９６ウェルのプレートにプレーティングし、単一細胞由来と推定されるクローンを同定し、特徴付けた。クローンの特徴付けは、クローン細胞からライセートの産生、並びに（１、１０、１００ｎＭ濃度の）外性ＥＤ試薬及び基質のターンオーバーの総量を測定するための化学発光基質の添加を伴った。これらの結果から、ＥＡ発現クローンが段階的に選抜され、その他のＥＤタグが付された遺伝子（市販のＥＤは、ＰＬ又はＰｒｏＬａｂｅｌと呼ばれている）との相互作用能について更なる特徴付けを行った。
【００３６】
β−ガラクトシダーゼの第二のω又はＥＡ断片を、Ｐａｎｏｍｉｃｓ社にて作製されたＤｉｓｃｏｖｅＲｘ ｐＣＭＶ−ＥＡコンストラクトをＰＣＲのテンプレートに使用することで、作り出した。ＰＣＲ反応により、ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩの制限酵素部位が夫々５´端及び３´端に設計されている。かかるＥＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクター、ｐｃＤＮＡ３．１ｈｙｇｒｏ（カタログ番号：Ｖ８７０−２０）にサブクローニングした。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプラスミドであり、カタログ番号がＶ８２１−２０のｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｎｕｃをＰＣＲテンプレートとして用いて作り出された）ＳＶ４０を３回繰り返した配列の核局在配列（ＮＬＳ）を、ＥＡの３´端であって、ＥＡプラスミドのＮｏｔＩとＸｈｏＩ部位間にサブクローニングした。最終的に、このコンストラクトに対し、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社のｃＤＮＡクローン（ＩＭＡＧＥｃｌｏｎｅ番号：３４５２０２４）をＰＣＲテンプレートに使用することによりＳＣ３５由来の核保持シグナル（ＮＲＳ）を作り出し、次いで、それをＥＡ−ＮＬＳプラスミドコンストラクトのＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位間にサブクローニングした。このコンストラクトの最後のバリエーションとしては、ＥＡ−ＮＬＳ／ＮＲＳコンストラクトにサブクローニングされる配列として、ｃ−ｍｙｃ配列（（ＤＬＫＶＲＫＡＡ）核にタンパク質を局在させることが実証されている配列ＩＤ番号：１の配列（Saphire, A.C.S., Bark, S.J., Gerace, L., JBC, 273, 29764-29769, (1998)）を追加することにある。このプラスミドを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に形質転換するために使用し、次いで、上述した段落にて記載したように、抗生物質処理を行い、段階的に単一細胞クローンを選抜して、ＤＸ ＥＡ−Ｎｕｃ親細胞株を作製した。
【００３７】
ＧＲ‐ＰＬ‐ｍｙｃコンストラクト
糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）を、Ｐａｎｏｍｉｃｓ社にて作製されたｐＣＭＶ−ＧＲ−ＰＬコンストラクトをＰＣＲテンプレートとして使用して、Ｂｇｌ２及びＫｐｎＩ部位を夫々の５´端及び３´端に追加して、サブクローニングした。かかるＧＲ配列は、人間のＧＲについての参照配列、ＮＭ＿０００１７６に基づくものであり、それとの相同性が確認されている。該ＧＲのｃＤＮＡを、β−ガラクトシダーゼのα又はＥＤ／ＰｒｏＬａｂｅｌ断片であって、ＰｒｏＬａｂｅｌの３´端にｍｙｃエピトープタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）配列ＩＤ番号：２を有する断片を予め含む、ｐＣＭＶに基づくプラスミドのマルチクローニング部位中にサブクローニングした。このプラスミドは、安定したＣＨＯ−Ｋ１＋ＥＡ−ＮＬＳ／ＮＲＳ発現細胞株に一過的に形質転換された。ＥＡ−ＮＬＳ／ＮＲＳとＧＲ−ＰＬの両方を発現する細胞のクローン選抜を、細胞に２種の抗生物質選抜（ハイグロマイシン及びジェエネティシン／Ｇ４１８）を施すことを除き、上述したようにして実施した。かかるクローンを、ＥＦＣ（酵素断片相補）測定、Ｅａｓｔｅｒｎ法（登録商標）、ウェスタン法、α‐ｍｙｃ、α‐β‐ガラクトシダーゼ及びα‐ＧＲ抗体を使用した免疫蛍光イメージング法、並びにデキサメタゾン処理への細胞の応答による機能性薬物試験により確かめた。
【００３８】
白色のＣｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェルプレートに、１ウェル当たり１０,０００個の細胞をプレーティングし、一晩接着させた。細胞を一晩接着させた後、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞にＧＲアゴニスト、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン及びトリアムシノロンを３時間添加し、そのＥＦＣ活性を測定した。図１参照。細胞をデキサメタゾン又はその他のアゴニストとともに３７℃、５％ＣＯ２にて３時間培養した。かかる反応物に対し、５０μｌの細胞溶解／基質溶液を添加して、６０分後に、ＷａｌｌａｃｅＶｉｃｔｏｒ２プレートリーダーによりプレートを読み込んだ。デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン及びトリアムシノロンのＥＣ５０（半数影響濃度）は、夫々、３．５、３３．１、２９．７及び６２．９ｎＭであった。化合物のシグナルのノイズに対する比は、〜８．５であった。（ＥＣ８０濃度の）アゴニストを３時間処理する前に、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞とともに１時間事前に培養したゲルデナマイシン（１〜１０００ｎＭ）を滴定量用いて、拮抗剤の研究を行い、ＥＦＣ活性を測定した。ゲルダナマイシンの１１．６ｎＭのＩＣ５０を、図２に示すように、デキサメタゾン処理により得た。上記した手順により、１ｍＭの異なるアゴニストであるプレドニゾロン及びヒドロコルチゾンを使用して、夫々のＩＣ５０が２２．３及び２２．８ｎＭのものを得た。
【００３９】
次なる調査では、デキサメタゾン処理について上述した手順を用いて、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒＧＲ細胞アッセイの化学発光（ＣＬ）及び蛍光（ＦＬ）の検出を比較した。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒＧＲ細胞アッセイは、実施が単純であり、ＣＬ及びＦＬ検出に適している。化学発光モードでは、デキサメタゾンのＥＣ５０は２．１ｎＭであり、シグナルのノイズに対する比は１２．３であった。一方、蛍光発光モードでは、デキサメタゾンのＥＣ５０は１１ｎＭであり、シグナルのノイズに対する比は１６．２であった。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒＧＲ細胞アッセイは、強いシグナル生産量にて、アッセイ処理能力を減ずることなく、ＣＬ及びＦＬモードの両方にて測定することが可能である。その結果を、図３Ａ及び３Ｂに示す。
【００４０】
上記した結果から明らかなように、当該発明は、細胞内の事象、特には、細胞障壁によりβ‐ガラクトシダーゼの二つの断片が活性型の酵素複合体を形成することが抑制されるところの移動を、高い感度で、正確に測定する方法を提供する。かかる方法は、細胞内における核への移動についての特定の用途に使用される。そのプロトコールは単純、簡単、そして正確に実行することができ、試薬が豊富にあれば、低濃度の候補化合物から強いシグナルが得られる。
【００４１】
この明細書に引用されている全ての出版物及び特許出願は、夫々個別の出版物又は特許出願として特定的かつ個別に援用されるよう、ここに援用するものである。
【００４２】
前述した発明は、その理解を明確化するため、図面及び実施例を幾分詳細に説明しているが、当業者であれば、この発明の教示を考慮して、添付の請求項の精神又は範囲を逸脱しない限りは、これにある程度の変更及び修正を施し得ることは容易に想到し得ることである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）に融合したＥＤ及び核局在シグナル（ＮＬＳ）に融合したＥＡ用の発現コンストラクトにより組換えられた細胞に対する、糖質コルチコイドのアゴニスト及び阻害剤の応答曲線を示した図である。
【図２】図１に示す細胞の、デキサメタゾンによる活性化後の、ゲルダナマイシンへの応答を示すグラフである。
【図３Ａ】ＧＲアゴニストであるデキサメタゾンに対し、基質を生成する化学発光生成物の応答を示すグラフである。
【図３Ｂ】ＧＲアゴニストであるデキサメタゾンに対し、基質を生成する蛍光発光生成物の応答を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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