(57)【要約】タンパク質試料をｐＩに基づいて１次分離するキャピラリー等電点電気泳動装置（２）、および前記キャピラリー等電点電気泳動装置（２）の一側に連結設置され、１次分離されたタンパク質を２次分離する中空糸フローフィールドフロー分画部（４）を含むタンパク質分離装置を開示する。本装置は、タンパク質をｐＩと分子量の大きさに基づいて分離することができ、タンパク質分離の際にタンパク質が変性されないうえ、タンパク質を分離回収した後、回収されたタンパク質を酵素加水分解処理する場合、ペプチドの分析にナノ流速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法を適用してタンパク質の識別を直接利用することができるという効果がある。
2009524818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質試料をｐＩに基づいて１次分離するキャピラリー等電点電気泳動装置、および前記キャピラリー等電点電気泳動装置の一側に連結設置され、１次分離されたタンパク質を２次分離する中空糸フローフィールドフロー分画部を含むことを特徴とする、タンパク質分離装置。
【請求項２】
前記キャピラリー等電点電気泳動装置は、等電点電気泳動用キャピラリーと、前記等電点電気泳動用キャピラリーの終端の一側に連結設置された第１連結部材と、前記第１連結部材の一側に連結設置され、タンパク質試料および両性電解質混合物を注入する第１注入ポンプと、前記第１連結部材の一側に連結設置された第２連結部材と、前記第２連結部材の一側に連結設置され、陽電解質溶液を注入する第２注入ポンプと、前記第２連結部材の一側に連結設置された陽極と、前記第１連結部材が連結設置された等電点電気泳動用キャピラリーの一側の終端に対向する他側の終端に連結設置された第３連結部材と、前記第３連結部材の一側に連結設置された第４連結部材と、前記第４連結部材の一側に連結設置された陰極電解質蓄積部材と、前記陰極電解質蓄積部材が連結設置された第４連結部材の一側に対向する他側に連結設置された陰極とを含むことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質分離装置。
【請求項３】
前記等電点電気泳動用キャピラリーがテフロン（登録商標）キャピラリーであることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質分離装置。
【請求項４】
前記第３連結部材および前記第４連結部材は、分子量透過限界約１０ｋＤａの半透膜が備えられたキャピラリーによって連結設置されることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質分離装置。
【請求項５】
前記中空糸フローフィールドフロー分画部は、キャピラリー等電点電気泳動装置の第３連結部材の一側に連結設置され、キャピラリー等電点電気泳動装置で分離されたタンパク質試料が流入される第１バルブと、前記第１バルブの一側に連結設置された中空糸膜と、前記第１バルブが連結設置された中空糸膜の一側に対向する他側に連結設置された検出器と、前記第１バルブおよび前記第１バルブに連結設置された中空糸膜の一側の終端に対向する他側の終端に連結設置され、内部に緩衝溶液を貯留する緩衝溶液貯留部材と、前記緩衝溶液貯留部材に連結設置され、貯留された緩衝溶液を前記第１バルブおよび前記中空糸膜に供給する供給ポンプとを含むことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質分離装置。
【請求項６】
前記中空糸フローフィールドフロー分画部は、緩衝溶液貯留部材から排出される緩衝溶液の移動回路を２つの流れ経路に分離した後、それぞれの流れ経路に第２バルブおよび第３バルブをそれぞれ連結させ、前記第２バルブの一側に第１圧力バルブおよび第１バルブを順次連結させ、前記第３バルブの一側を第１バルブが連結設置された中空糸膜の一側に対向する他側の終端に連結設置したことを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質分離装置。
【請求項７】
前記第１バルブと前記中空糸膜との間に備えられ、第１バルブから流入されるタンパク質および試料を中空糸膜に移動させる経路を提供すると同時に、その一側が放射流れに連結設置された第５連結部材をさらに含むことを特徴とする、請求項５または６に記載のタンパク質分離装置。
【請求項８】
前記中空糸膜がポリスチレンスルホン酸、ポリ塩化ビニール、ポリアクリロニトリルまたはこれらの混合物からなることを特徴とする、請求項５または６に記載のタンパク質分離装置。
【請求項９】
前記第１バルブに試料ループがさらに備えられたことを特徴とする、請求項５または６に記載のタンパク質分離装置。
【請求項１０】
前記第１バルブが６ポートバルブであることを特徴とする、請求項５または６に記載のタンパク質分離装置。
【請求項１１】
Ｉ）分離分析しようとするタンパク質試料と両性電解質溶液の混合物を第１注入ポンプに満たした後、等電点電気泳動用キャピラリーに前記混合物を供給する段階と、
ＩＩ）前記等電点電気泳動用キャピラリーに約１０〜５０分間２００〜７００Ｖ／ｃｍの電場をかけて等電点電気泳動させた後、全ての分離が終了するまで２００〜７００Ｖ／ｃｍの電場を維持する段階と、
ＩＩＩ）第２注入ポンプに陽電解質溶液を満たした後、これを等電点電気泳動用キャピラリーに注入し、等電点電気泳動されたタンパク質分取液を第１バルブに移動させて試料ループに満たす段階と、
ＩＶ）緩衝溶液貯留部材の一側に連結設置された供給ポンプを作動させ、緩衝溶液貯留部材に貯留された緩衝溶液を第１バルブに供給して、前記試料ループに満たされたタンパク質分取液を中空糸膜に供給すると同時に、前記第１バルブに連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側の終端へ緩衝供給を供給して平衡を維持する段階と、
Ｖ）前記段階ＩＶ）の平衡が終了した後、第３バルブを閉鎖し、その後緩衝溶液貯留部材の緩衝溶液を第１バルブを介して中空糸膜に流入されるようにして、フローフィールドフロー分画法で分子量の小さいタンパク質から分子量の大きいタンパク質の順でタンパク質を分離して検出器に流入させる段階とを含むことを特徴とする、タンパク質分離方法。
【請求項１２】
前記段階Ｖ）の後、エレクトロスプレーイオン化質量分析器を直接連結して分析する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載のタンパク質分離方法。
【請求項１３】
前記段階Ｖ）の後、分離されたタンパク質試料を回収してプロテオームを分析する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載のタンパク質分離方法。
【請求項１４】
前記段階ＩＩＩ）の試料ループに満たされる等電点電気泳動されたタンパク質の体積は、１〜１０μＬに調節するが、所望のｐＩ領域の大きさだけ調節することを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質分離方法。
【請求項１５】
前記段階ＩＶ）において、前記第１バルブおよび前記第１バルブに連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側の終端に流れる緩衝溶液の流速比率が１：９〜５：５に調節され、中空糸膜の両側の終端に流入される緩衝溶液は中空糸膜の入口から全長の約１０〜５０％となる位置で集中し、前記タンパク質分取液試料は中空糸膜の入口から全長の約１０〜５０％となる位置で平衡を成すことを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画 (capillary isoelectric focusing-hollow fiber flow field flow fractionation) 法を用いたタンパク質分離装置および方法に係り、さらに詳しくは、タンパク体(proteome)などの生体巨大分子タンパク質を等電点と分子量の差異を用いてタンパク質が変性しない状態で分離することが可能なタンパク質分離装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、生命科学および医薬分野において、疾病の治療および予防に関連して疾病関連タンパク質についての体系的な分析が要求されている。
分子生物学およびゲノミクス（ゲノム科学）を含んだ薬物発見のための基礎研究の発展に伴い、最近、薬物発見の領域が急速に変化している。特に、ゲノミック薬物発見で代表される、薬物発見のための新規方法が開発されている。
このため、前述した生命科学および新規医薬品開発などの医薬分野では、特定の疾患または特定の環境で生理学的活性を持つ物質を確認しなければならない。このような生物学的活性を持つ物質は大部分タンパク質からなっており、このようなタンパク質の構造および機能の解明は前記生命科学および医薬分野における本質的な問題に該当する。
【０００３】
ヒト遺伝子の種類は約３５，０００程度と確認されたが、ゲノム(genome)が生産するタンパク質の数は数十万〜数百万に達すると推定されている。細胞器官内で必要な全ての反応を行うことがタンパク質の役割なので、遺伝子の機能をタンパク質の水準で体系的に研究することが求められている実情である。
【０００４】
一方、前述したタンパク質は、分子量、等電点(isoelectric point、ｐＩ)、親水性または疎水性基質などの様々な特性によって非常に複雑である。よって、タンパク質を分析するためには、１次的にタンパク質を分離した後、これを質量分析法と生物情報学などに連係させてタンパク質を識別する過程が必要である。このような過程において、疾病関連タンパク質の場合、他の一般なタンパク質に比べて相対的存在比が低いタンパク質なので、高性能のタンパク質分離技術によってこれを分析することが必要となる。
【０００５】
タンパク質は、生命現象に非常に重要であり、タンパク質分子、ＤＮＡ分子、合成化合物または光子などが含まれる他の分子との相互作用においてその機能を示す。よって、特定のタンパク質を理解するためには、このような分子の物理的および／または化学的性質を詳述することに止まらず、互いに影響を及ぼす分子を同定し、相互作用（生理学的作用）現象の様式を解明することにより、どんな相互作用がどの分子と共に発生するかを確認することが必要である。
【０００６】
タンパク質を分離および分析する代表的な方法としては、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法がある。これは、ポリアクリルアミドゲル板に電場をかけて選択性の差異を用いてタンパク質を分離する方法である。この方法は、タンパク質を分子量の順で分離して確認する分野、および単純なタンパク質の分離・確認過程に広く用いられる１次元分離方法である。このような分離方法は、タンパク質の３次構造がＳＤＳ溶液状態で変性され、或いはタンパク質がゲルの内部に閉じ込められるという問題点がある。
【０００７】
一方、ゲノムによって生成されるタンパク質集合体（タンパク体）と定義されるもので、細胞内における位置、或いは細胞または組織の生理的な状態によってタンパク質の生成および相対的存在比などが決定されるプロテオームなどの多数のタンパク質混合物を分離し、その特性を同定する場合には、前述した１次元分離技術のみでは識別自体が不可能である。
【０００８】
したがって、前記タンパク質集合体を分離するためには、タンパク質の特性に応じて１次分離処理されたタンパク質を、タンパク質の別の特性である分子量の差異によって２次分離処理する２次元分離方法、すなわち２次元−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動法（２Ｄ−ＰＡＧＥ）が使用される[Zhou, F.; Johnston, M. V.  Anal. Chem. 2004, 76, 2734-2740; Klose, J.; Kobalz, U.  Electrophoresis, 1995, 16, 1034-1059; Righetti, P. G.l Castagna, A.; Herbert, B. Prefractionation Techniques in Proteome Analysis, Anal. Chem. 2001, 73, 320A-326A.]。
【０００９】
このような２Ｄ−ＰＡＧＥは、両性電解質(ampholyte)担体でｐＨ勾配が固定形成されている狭いゲルストリップにおいてタンパク質等電電荷（ｐＩ）に応じて等電点電気泳動（isoelectric focusing、ＩＥＦ）させる。この段階は約１２時間かかる。
また、前記タンパク質がｐＩの順序に基づいて分離された後、ポリアクリルアミドゲル板の上端の横方向にゲルストリップを固定させた後、縦方向に電気泳動を行うと、タンパク質は分子量の大きさの順で縦方向に分離されるが、この際、タンパク質分子量の小さいものがゲル板の下端に多く移動する。前述した２Ｄ−ＰＡＧＥ分離にかかる総時間は約３６時間程度である。
【００１０】
一方、２次元分離が終わると、ゲル板上に現れたタンパク質スポットを染色してタンパク質の数を確認し、必要に応じて各スポットのタンパク質を回収して酵素分解処理した後、質量分析法を用いてタンパク質を識別する。
【００１１】
このような２Ｄ−ＰＡＧＥ方法は、高い解像度を持っているためタンパク質の大略的なパターンの確認に非常に有用であり、準回収(semi-preparative)規模への分離が可能であって非常に複雑なタンパク質混合物形態を持つヒト血漿タンパク質だけでなく、小便、各種生体組織などから抽出したタンパク質の分析、疾病の検出および診断のために臨床的に使用できる[(Giddings, J. C., Unified Separation Science, John Wiley & Sons, New York 1991, pp. 126-128.)]。
【００１２】
ところが、前記２Ｄ−ＰＡＧＥは、労働集約的方法であり、自動化が難しいうえ、検出感度および力動的な範囲における制限による問題点などがあり、タンパク質分離の際にＳＤＳ溶液を使用するので、分離のためのタンパク質を変性されない状態で分離し難いから、タンパク質が変性された状態で分離される。また、前記２Ｄ−ＰＡＧＥは、分離されたタンパク質もゲルマトリックス内に閉じ込められていて試料の回収が容易ではないため、ゲル内でタンパク質を酵素分解処理した後、ペプチド形態で回収してから分析しなければならないという問題点などがある。
【００１３】
一方、キャピラリー内で等電点電気泳動を行うキャピラリー等電点電気泳動（capillary isoelectric focusing、ＣＩＥＦ）方法は、シリカキャピラリー内に両性電解質担体をタンパク質と共に満たした後、電場をかけてタンパク質のｐＩに応じて分離する方法である[Conti, M.; Gelfi, C.; Righetti, P.G. Electrophoresis 1996, 17, 1485-1491.]。
ここで、前記等電点電気泳動は、前述した２Ｄ−ＰＡＧＥの等電点電気泳動（ＩＥＦ）と同一の原理を持つが、ゲルストリップではなく、シリカキャピラリー内で行われる点で差異を示している。前記キャピラリー等電点電気泳動は、キャピラリー内で分離が行われるため、少量のタンパク質試料を処理することができ、高い感度を持つ場合にはｐＩ値が０．００３の小さい差異を持つタンパク質の分離も可能である[Quigley, W.C.;  Dovichi, N. J. Anal. Chem. 2000, 76, 4645-4658]。
【００１４】
また、前記キャピラリー等電点電気泳動は、キャピラリー内で分離が行われるため、少量のタンパク質試料を処理することができ、高い感度を持つ反面、プロテオームなどの複雑なタンパク質混合物を処理するには分離能力に限界があるから、分離効率を増大させるために単一分析技術として使用するよりは、クロマトグラフィーなどの２次分離方法とオンライン連結して使用しようとする努力が最近試みられている。
【００１５】
前述したキャピラリー等電点電気泳動とオンラインで連結して２次元分離を行う技術として代表的な一例は、キャピラリー等電点電気泳動をキャピラリー逆相液体クロマトグラフィー（reversed phase liquid chromatography、ＲＰＬＣ）とオンライン連結したキャピラリー等電点電気泳動−逆相液体クロマトグラフィー（ＣＩＥＦ−ＲＰＬＣ）法である。これは、キャピラリー等電点電気泳動でｐＩ領域に基づいて分離されたタンパク質、またはペプチドバンドをクロマトグラフィーカラムでペプチドの疎水性の差異によって２次的に分離する方法である[Chen, J.; Lee, C. S.; Shen, Y.; Smith, R. D.; Baehrecke, E. H. Electrophoresis 2002, 23, 3143-3148.]。このような方法を用いる場合、ショウジョウバエタンパク体から加水分解により得られたペプチド混合物に対して実験した結果、８時間程度の分離作業によってピーク容量１８００以上の効率を得ることができる。
【００１６】
また、キャピラリー等電点電気泳動とキャピラリーゲル電気泳動（capillary gel electrophoresis、ＣＧＥ）法をオンラインで連結するキャピラリー等電点電気泳動−キャピラリーゲル電気泳動（ＣＩＥＦ−ＣＧＥ）法は、前述したポリアクリルアミドゲル板の代わりにポリアクリルアミドゲルが満たされたキャピラリー内でタンパク質分子量の順序による分離を行うことができ、ヘモグロビンなどの簡単なタンパク質の分離に試みられた[Yang, C.l Liu, H.; Yang, Q.; Zhang, L.; Zhang, W.; Zhang Y. Anal. Chem. 2003, 75, 215-218.]。
【００１７】
ここで、前記キャピラリー等電点電気泳動−逆相液体クロマトグラフィー法は、タンパク質次元における分離よりは、タンパク質酵素で加水分解した後で得られたペプチドの混合物を分離する場合に有用であるが、タンパク質がクロマトグラフィーカラムを通過するときに誘発されるタンパク質鎖の破壊、カラム内におけるタンパク質損失などによりタンパク質への適用が困難である。キャピラリー等電点電気泳動−逆相液体クロマトグラフィーを質量分析器にエレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）方法でオンライン連結することは可能であるが[Tnag, Q.; Harrata, A. K.; Lee, C. S. Anal. Chem. 1996, 68, 2482-2487;  Yang, L.; Lee, C. S.; Hofstadler, S. A.; Pasa-Tolic, L.; Smith, R. D.  Anal. Chem. 1998, 70, 3235-3241; Martinovic, S.; Berger, S. J.; Pasa-Tolic, L.; Smith, R. D.  Anal. Chem. 2000, 72, 5356-5360]、キャピラリー等電点電気泳動の分離に用いられる両性電解質が除去されないため、分離が終了した後、両性電解質を除去するために別途の精製過程を経なければならない。
【００１８】
したがって、前記方法は、両性電解質の除去が先行されなければ、溶液中のイオンの妨害により試料分析が困難になるところ、これを解決するために、マイクロ透析可能な陰極セルなどのメンブレンを用いて両性電解質を相当量除去しなければならない[Zhou, F.; Johnston, M. V. Anal. Chem. 2004, 76, 2734-2740]。ところが、前述した方法を用いてタンパク質を分離するとしても、逆相液体クロマトグラフィー分離の際に有機溶媒が使用されるので、タンパク質の変性を回避することができず、分子量の大きいタンパク質の分離に適用することができないという問題点がある。
【００１９】
一方、タンパク質を分離量の大きさの順序に基づいて分離する方法としては、フローフィールドフロー分画（flow field flow fractionation、ＦＩＦＦＦ）法がある。これは、フィールドフロー分画（field flow fractionation、ＦＦＦ）法の一つであって、タンパク質、細胞、水溶性高分子およびナノ粒子の大きさ別分離、および拡散係数、粒子サイズ、分子量などの特性分析に用いられる分離分析法である[J. C. Giddings, F.J.F. Yang, M. N. Myers, Science 1976, 193, 1976, 1244; M. H. Moon, P.S. Williams, H. Kwon, Anal. Chem. 1999, 71(14), 1999, 2657.]。
【００２０】
ここで、前記フィールドフロー分画法による分離において、使用するチャネルは断面正方体であり、中空のチャネルであって、静止相が満たされていない。試料の分離は、チャネル軸に沿って試料を移動させる流体の流れ方向に垂直方向にかける外部場の強度に応じて行われる。よって、前記フローフィールドフロー 分画法 は、外部場として流体の交差流れを用い、前記交差流れの速度を調節してタンパク質などの巨大分子の滞留を制御する。
【００２１】
前記フローフィールドフロー分画チャネル内における試料の滞留は、チャネルの底を抜け出す交差流れの速度と試料のブラウン拡散運動の均衡によって行われる。試料がチャネル内で移動する平均高さは、タンパク質の場合、分子量またはストークの直径によって異なるブラウン拡散の度合いによって決定される。したがって、分子量が小さいほど大きい拡散運動を行うことになり、チャネルの底から高い位置で交差流れの強度と平衡をなす。この際、チャネルの軸に沿って流れる分離流れは放物線型であり、タンパク質または巨大分子試料はその大きさによる分離順序を持つ。このため、分子量の小さい試料がまずチャネルから排出されることにより、タンパク質分子量の大きさの順序による分離が行われる。
【００２２】
一方、タンパク質を分離および分析する別の一例は、中空糸膜を分離チャネルとして用いる分離法[W.J. Lee, B.-R.Min, M.H.Moon, Anal. Chem. 1999, 71(16), 3446; M.H.Moon, K.H. Lee, B.-R.Min, J. Microcolumn Sep., 1999, 11(9), 676; P. Reschiglian, A. Zattoni, D. Parisi, L. Cinque, B. Roda, F. D. Piaz, A. Roda, M. H. Moon, B.-R. Min, Anal. Chem. 2005, 77, 47]であって、外部場の役割は中空糸膜の外壁に排出される交差流れまたは放射流れの速度によって決定され、チャネル内の試料は、外部場と平衡を維持する場合、図１に示すように、円形の試料帯を成しながら進行し、この際、チャネルの縦軸に沿って進行する分離流れとの比率を調節して分離速度を調節する。
【００２３】
ここで、図１はタンパク質の分離に適用される中空糸フローフィールドフロー分画（ＨＦ ＦＩＦＦＦ）法の装置構成を示すものであって、流体はＨＰＬＣポンプ１４０から伝達され、チャネルから分離されて溶離されるタンパク質試料は紫外線／可視光線検出器１３０を用いて検出される。
【００２４】
前述した中空糸フローフィールドフロー分画法を用いてタンパク質を分離する場合、分子量が小さいタンパク質から分子量の大きいタンパク質の順で分離することができ、分離溶液として緩衝溶液を使用するので、タンパク質を変性されていない状態で分離すると共に、チャネル内に充填物が満たされていないため、タンパク質試料の破壊または詰まり等を最小化することができるうえ、中空糸膜の内径を減少させる場合、マイクロ流れ速度でタンパク質分離を実現することができて微量のタンパク質分離に適する[I. Park, K.-J. Paeng, D. Kang, M.H.Moon, J. Separation Sci., 2005, 28, 2043; D. Kang, M. H. Moon, Anal. Chem.,  2005, 77, 4207]。
【００２５】
ところが、前記中空糸フローフィールドフロー分画法を用いた分離法は、分子量が小さいタンパク質のから分子量の大きいタンパク質の順で分離することができ、タンパク質試料の破壊または中空糸膜のチャネル詰まり等を最小化することができ、比較的低価の中空糸膜を使用するので、費用的な側面で利点を持っているが、分離能が所望するほど良くなく、タンパク質の多様な特性による分離を行うことが難しいという問題点などがある。
【発明の開示】
【００２６】
そこで、本発明は、前述した問題点を解決するためのもので、その目的は、ポリアクリルアミドゲルを使用することにより、タンパク質の変性およびゲル内へのタンパク質の閉じ込めといった問題点などを伴う２Ｄ−ＰＡＧＥ、および有機溶媒を使用し、両性電解質を除去するために別途の精製処理を必要とするなどの問題点を伴うキャピラリー等電点電気泳動−逆相液体クロマトグラフィー分離方法の欠点を克服するために、ゲルを使用しない非ゲル方式のタンパク質分離過程中に両性電解質が自動的に除去されるとともに、水溶液上でタンパク質のｐＩと分子量の差異によってタンパク質分離が行われ得るようにした非ゲル方式の液相２次元タンパク質分離方法を提供することにある。
【００２７】
この発明の前記および他の目的、特徴およびその他の利点は、添付図面を参照する次の詳細な説明によって明確に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
一つの観点において、本発明は、タンパク質試料をｐＩに基づいて１次分離するキャピラリー等電点電気泳動装置と、前記キャピラリー等電点電気泳動装置の一側に連結設置され、１次分離されたタンパク質を２次分離する中空糸フローフィールドフロー分画部とを含むタンパク質分離装置を提供する。
【００２９】
他の観点において、本発明は、Ｉ）分離分析しようとするタンパク質試料と両性電解質溶液の混合物を第１注入ポンプに満たした後、等電点電気泳動用キャピラリーに前記混合物を供給する段階と、ＩＩ）前記等電点電気泳動用キャピラリーに約１０〜５０分間２００〜７００Ｖ／ｃｍの電場をかけて等電点電気泳動させた後、全ての分離が終了するまで２００〜７００Ｖ／ｃｍの電場を維持する段階と、ＩＩＩ）第２注入ポンプに陽電解質溶液を満たした後、これを等電点電気泳動用キャピラリーに注入し、等電点電気泳動されたタンパク質分取液を第１バルブへ移動させて試料ループに満たす段階と、ＩＶ）緩衝溶液貯留部材の一側に連結設置された供給ポンプを作動させ、緩衝溶液貯留部材に貯留された緩衝溶液を第１バルブに供給して、前記試料ループに満たされたタンパク質分取液を中空糸膜に供給すると同時に、前記第１バルブと連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側終端へ緩衝溶液を供給して平衡を維持する段階と、Ｖ）前記段階ＩＶ）の平衡が終了した後、第３バルブを閉鎖し、その後緩衝溶液貯留部材の緩衝溶液を第１バルブを介して中空糸膜に流入されるようにして、フローフィールドフロー分画法で分子量の小さいタンパク質から分子量の大きいタンパク質の順でタンパク質を分離して検出器に流入させる段階とを含む、タンパク質分離方法を提供する。
【００３０】
本発明に係るタンパク質分離装置は、タンパク質を分離分析するためのものであって、タンパク質をｐＩに基づいて分離することが可能なキャピラリー等電点電気泳動装置に、タンパク質を分子量の大きさの順序に従って分離することが可能な中空糸フローフィールドフロー分画部を互いに連結設置して、タンパク質を２次元分離技術で分離分析するように構成される。したがって、本発明に係るタンパク質分離装置は、前記キャピラリー等電点電気泳動および中空糸フローフィールドフロー分画を全て含むので、キャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画装置とも指称される。
ここで、本発明に係るキャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）装置は、キャピラリー内で等電点電気泳動を行う装置を意味するものであって、等電点電気泳動用キャピラリー、好ましくはテフロン（登録商標）キャピラリー内に両性電解質担体をタンパク質試料と共に満たした後、電場をかけてタンパク質をタンパク質のｐＩに基づいて分離する装置を意味する。前記中空糸フローフィールドフロー分画部は、中空糸膜を用いて、中空糸膜に流入されるタンパク質試料混合物からタンパク質を分子量の大きさによって分離する装置を意味する。
【００３１】
特に、前記キャピラリー等電点電気泳動のみを単独で用いてタンパク質試料を分離するキャピラリー等電点電気泳動方法は、分離に使用された両性電解質がタンパク質試料と共に収得されることにより、前記両性電解質の除去が必須的に要求される。このような理由により、前記キャピラリー等電点電気泳動方法は、一般にタンパク質試料を分取した後、半透過膜を用いた再分析(dialysis)方法が別途に要求される。ところが、前述した再分析方法を行わない場合、タンパク質を最終的に質量分析する段階において、前記両性電解質が分析を妨害する要因として作用するので、本発明は、前記キャピラリー等電点電気泳動法で分取されたタンパク質試料を中空糸膜に注入させてフィールドフロー分画法で分離することにより、前記両性電解質を自然に除去することができるようにする。
【００３２】
しかも、前記キャピラリー等電点電気泳動法は、キャピラリー内で電場による分離が終了すると、タンパク質試料をキャピラリーの外に移送しなければならないので、労働集約的であり、自動化が困難である。よって、本発明は、キャピラリーの両側にそれぞれ２つのティー(Tee)を用いて電極およびシリンジポンプを連結設置してキャピラリー等電点電気泳動法によるタンパク質試料の分析を自動化する。
【００３３】
ひいては、本発明に係るタンパク質分離装置は、キャピラリー等電点電気泳動装置と中空糸フローフィールドフロー分画部を互いに連結設置して構成することにより、有機溶媒を全く使用しない。よって、タンパク質試料の分離の際にタンパク質の変性を伴わず、分析しようとするタンパク質試料をｐＩおよび分子量領域に基づいて分離するが、ゲル相ではなく液相でｐＩ−分子量の方法によってタンパク質試料を分離することができ、所望のｐＩ−分子量領域のタンパク質分取液(fraction)を分取することができる。また、本発明に係るタンパク質分離装置は、分析に必要なタンパク質試料の最小限の量も従来のタンパク質分離装置に比べて１０倍程度少ない量である。
【００３４】
このような本発明に係るタンパク質分離装置をより具体的に考察すると、本発明に係るキャピラリー等電点電気泳動装置は、等電点電気泳動用キャピラリーと、前記等電点電気泳動用キャピラリーの終端の一側に連結設置された第１連結部材と、前記第１連結部材の一側に連結設置され、タンパク質試料および両性電解質の混合物を注入する第１注入ポンプと、前記第１連結部材の一側に連結設置された第２連結部材と、前記第２連結部材の一側に連結設置され、陽電解質溶液を注入する第２注入ポンプと、前記第２連結部材の一側に連結設置された陽極と、前記第１連結部が連結設置されたキャピラリーの一側の終端に対向する他側の終端に連結設置された第３連結部材と、前記第３連結部材の一側に連結設置された第４連結部材と、前記第４連結部材の一側に連結設置された陰極電解質蓄積部材と、前記陰極電解質蓄積部材が連結設置された第４連結部材の一側に対向する他側に連結設置された陰極とから構成される。
【００３５】
ここで、前記等電点電気泳動用キャピラリーは、タンパク質試料を等電点電気泳動してタンパク質をｐＩに基づいて分離するためのものであって、このような目的のために使用される通常の等電点電気泳動用キャピラリーであればいずれでも構わないが、好ましくは電気浸透流れ(Electricosmotic Flow)を除去するためにポリビニルアルコールのコートされたシリカキャピラリーなどを使用することがよく、より好ましくはテフロン（登録商標）キャピラリーがよく、推薦するには内径約７５〜４０５μｍ、外径約３６０〜７９３μｍのテフロン（登録商標）キャピラリーを使用することがよい。
【００３６】
また、本発明に係る等電点電気泳動用キャピラリーは、その長さ方向に対して両側の終端に陰極および陽極を持つ電極と、両性電解質溶液および陽電解質溶液などを供給することが可能な手段が連結設置されなければならないところ、前記陽極が備えられる等電点電気泳動用キャピラリーの一側終端には第１連結部材および第２連結部材が順次連結され、前記第１連結部材の一側には分離しようとするタンパク質試料および両性電解質を流入させるための第１注入ポンプが備えられ、第２連結部材の一側には陽極および陽電解質溶液を注入するための第２注入ポンプが連結設置される。
【００３７】
この際、前記第１連結部材は、前述した等電点電気泳動キャピラリー、第１注入ポンプおよび第２連結部材が互いに連結設置され、第２連結部材は、第１連結部材、第２注入ポンプおよび陽極が互いに連結設置されるように備えられるべきなので、好ましくは３方向に互いに連結できる「Ｔ」字型連結部材、より好ましくはマイクロ−ティー(Micro-Tee)を使用することが良い。
【００３８】
一方、前記第１連結部材、第２連結部材および陽極が順次連結設置される等電点電気泳動用キャピラリー一側の対向する他側には陰極が連結設置されなければならない。よって、前記陰極は、第１連結部材が連結設置されたキャピラリーの一側終端に対向する他側終端に連結設置される第３連結部材、および前記第３連結部材の一側に連結設置される第４電極部材に連結設置されるように構成される。この際、前記第４連結部材の一側には、電極の表面に発生する気泡を捕集するための陰極電解質溶液が満たされている電解質蓄積部材が連結設置されている。前記第４連結部材に連結設置される第３連結部材は、キャピラリーでｐＩに基づいて分離されるタンパク質試料を中空糸フローフィールドフロー分画部へ移動させるための経路が別途に備えられている。
【００３９】
したがって、本発明に係る第３連結部材および第４連結部材は、前述した第１連結部材および第２連結部材と同様に、３方向に互いに連結できる「Ｔ」字型連結部材、より好ましくはマイクロ−ティーを使用することが良い。
【００４０】
本発明に係る中空糸フローフィールドフロー分画（ＨＦ ＦＩＦＦＦ）部は、キャピラリー等電点電気泳動装置の第３連結部材の一側に連結設置され、キャピラリー等電点電気泳動装置で分離されたタンパク質試料が流入される第１バルブと、前記第１バルブの一側に連結設置された中空糸膜と、前記第１バルブが連結設置された中空糸膜の一側に対向する他側に連結設置された検出器と、前記第１バルブおよび前記第１バルブに連結設置された中空糸膜の一側の終端に対向する他側の終端に連結設置され、内部に緩衝溶液を貯留する緩衝溶液貯留部材と、前記緩衝溶液貯留部材に連結設置され、貯留された緩衝溶液を前記第１バルブおよび前記中空糸膜に供給する供給ポンプ部とから構成される。
【００４１】
ここで、本発明に係る第１バルブに連結設置される中空糸膜の終端の一側には必要に応じて、第５連結部材を連結設置した後、前記第５連結部材の一側に第１バルブを連結設置し、前記第５連結部材の他の一側に放射流れを可能にする放射流れの移動経路を提供するための経路が備えられてもよい。
【００４２】
本発明に係る中空糸膜は、タンパク質を分子量に基づいて分離するためのものであって、このような目的のために使用される通常の中空糸膜であればいずれでも構わないが、好ましくは透過限界１０〜１００ｋＤａ程度の中空糸膜がよく、より好ましくは透過限界３０ｋＤａ、内径３００〜１０００μｍ、外径５００〜１２００μｍおよび長さ１０〜４０ｃｍの中空糸膜がよく、その材質はポリスチレンスルホン酸、ポリ塩化ビニール、ポリアクリロニトリルまたはこれらの混合物などからなることが良い。
【００４３】
特定的に、本発明に係る中空糸膜は、中空糸膜が内部に挿入できる中空を有する円筒型管、例えばガラス管に挿入されて構成されるところ、前記ガラス管は、中空糸膜が安定的に挿入できるものであればいずれでも構わないが、少なくとも、前記中空糸膜の挿入されたガラス管は、中空糸膜を通じて流れるタンパク質試料および緩衝溶液などがガラス管の外部に排出されないように完全に密封されなければならない。
【００４４】
本発明に係る第１バルブは、キャピラリー等電点電気泳動装置で分離されたタンパク質試料が流入された後、これを中空糸膜に供給するためのものであって、好ましくはキャピラリー等電点電気泳動装置の第３連結部材の一側および中空糸膜の一側の終端に連結設置され、別の一側には緩衝溶液貯留部材から提供される緩衝溶液が流入される経路が連結設置されている。
また、本発明に係る第１バルブは、その内部のキャピラリー等電点電気泳動装置でｐＩに基づいて分離されたタンパク質試料の一側に試料ループが備えられ、キャピラリー等電点電気泳動装置でｐＩに基づいて分離されたタンパク質試料が満たされる。
【００４５】
ここで、前記第１バルブは、前記第３連結部材、中空糸膜および緩衝溶液の流入経路が互いに連結設置されるところ、前述したタンパク質試料および緩衝溶液などの容易な流れのために、前記第１バルブは６ポートバルブを使用することがよい。
【００４６】
一方、前記第１バルブに供給される緩衝溶液は緩衝溶液貯留部材に満たされており、前記緩衝溶液貯留部材の一側には、緩衝溶液を外部に供給するために駆動力を提供することが可能な供給ポンプが備えられる。
【００４７】
特定的に、本発明に係る緩衝溶液の移動経路に圧力バルブを備えることにより、緩衝溶液の流速および流量などを調節することができる。このような場合、前記緩衝溶液貯留部材から排出される緩衝溶液の移動経路を２つの流れ経路に分離した後、それぞれの流れ経路に第２バルブおよび第３バルブをそれぞれ連結設置し、前記第２バルブの一側には第１圧力バルブおよび第１バルブを連結設置して構成し、前記第３バルブの一側には第１バルブが連結設置された中空糸膜の一側に対向する他側、すなわち中空糸膜の出口を連結設置する。
【００４８】
特定的に、前記第３バルブを介して中空糸膜の出口に流入される緩衝溶液は、前記第３バルブおよび検出器を順次通過した後、中空糸膜の出口に流入されるように構成することもできる。
【００４９】
ここで、前記中空糸膜から分離されて排出されるタンパク質が検出器に流入される過程で発生する試料の帯状拡散を最小化させるために、前記第３バルブは検出器の排出口に連結設置することが良い。
【００５０】
一方、緩衝溶液を第３バルブから検出器を通過させて中空糸膜の出口に流入させることは中空糸膜におけるフローフィールドフロー分画による分離に必須的な手続きである。中空糸膜内におけるタンパク質分離が始まる前にタンパク質の拡散運動と放射流れで伝達される外部場が平衡を成さなければならないが、これを、通常、試料弛緩過程(sample relaxation)とも指称する。
【００５１】
ここで、前記試料弛緩過程のために、中空糸膜の入口と出口を介してそれぞれ流体を流入させるが、中空糸膜の全長の１０分の１位置で試料を集積させることが一般な方法である。このために、中空糸膜の入口と出口を介して流入される流体の速度を１：９〜５：５に調節する場合、全長の１０〜５０％となる位置、好ましくは１０分の１位置で、試料は平衡状態を得ながら集積される。この際、前記試料の弛緩過程が完了すると、さらに緩衝溶液の流れを中空糸膜の入口にのみ伝達して分離を行い始める。
【００５２】
一方、本発明に係る前記第２バルブおよび第３バルブは、緩衝溶液貯留部材から排出される緩衝溶液の流れを２つの流れ方向に分けられて流れるようにし、或いは緩衝溶液を第１バルブにのみ流れるようにするなどのように緩衝溶液の流れを容易に調節するために、少なくとも２つ以上の流れ方向を持つバルブを使用することが好ましいところ、推薦するには四方弁を使用することが良い。
【００５３】
これと共に、中空糸膜の放射流れによって移動しているタンパク質試料の溶離時間および分離能などは、第２圧力バルブの操作によってタンパク質試料の移動方向と垂直的な方向の放射流れを調節することにより調節できる。
【００５４】
特定的に、前記第３バルブを、少なくとも２つ以上の流れ方向を持つバルブ、好ましくは四方弁から構成する場合、前記四方弁の一側は緩衝溶液貯留部材に連結設置し、前記四方弁の他側は緩衝溶液が外部に排出できる経路として使用することができ、残り流体の移動経路を提供する一側はプラグなどで密封する。
【００５５】
一方、本発明に係る第１バルブが連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側、すなわち中空糸膜の出口には、中空糸膜を通過しながら分子量の大きさによって分離されたタンパク質が流入され、分離されたタンパク質を分析する検出器が連結設置されるところ、前記検出器は、分離されたタンパク質の分析に使用される当業界の通常の検出器であれば特に限定されないが、推薦するには紫外線検出器を使用することがよい。
【００５６】
また、本発明に係る各装置の構成要素において、タンパク質試料、電解質溶液および緩衝溶液などが流れる移動経路は、前述した物質と反応しない、当業界で通常使用される材質の管を使用すれば特に限定されないが、好ましくはキャピラリー、より好ましくはシリコンキャピラリーを使用することがよい。
【００５７】
また、本発明に係るタンパク質分離装置を構成する注入ポンプ、供給ポンプ、バルブおよび圧力バルブなどをコンピュータに連結させて制御し得るように構成した後、最終的にタンパク質が分離されて通過する中空糸膜分離モジュールを自動分取器に連結させる場合、タンパク質をｐＩおよび分子量によって自動分離することができ、中空糸膜の出口をキャピラリー、好ましくはシリカキャピラリーを用いてエレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）質量分析器(mass spectrometry、ＭＳ)とオンラインで連結することが可能である。
【００５８】
ここで、前記エレクトロスプレーイオン化−質量分析器（ＥＳＩ−ＭＳ）は、タンパク質の質量分析と共にタンデム質量分析法を使用する場合、タンパク質鎖に対する構造分析が可能であってタンパク質の識別に応用することができ、タンパク質試料が中空糸膜で分離される過程中に、等電点電気泳動用キャピラリーから流入した両性電解質は中空糸膜の放射流れと共に排出されるので、両性電解質の自動的な除去が可能になる。
【００５９】
一方、前述した構成を持つ本発明に係るタンパク質分離装置は、次の段階によってタンパク質を分離する：
Ｉ）分離分析しようとするタンパク質試料と両性電解質溶液の混合物を第１注入ポンプに満たした後、等電点電気泳動用キャピラリーに前記混合物を供給する段階と、
ＩＩ）前記等電点電気泳動用キャピラリーに１０〜５０分間２００〜７００Ｖ／ｃｍ、好ましくは約５００Ｖ／ｃｍの電場をかけて等電点電気泳動させた後、全ての分離が終了するまで２００〜７００Ｖ／ｃｍ、好ましくは３００Ｖ／ｃｍの電場を維持する段階と、
ＩＩＩ）第２注入ポンプに陽電解質溶液を満たした後、これを等電点電気泳動用キャピラリーに注入し、等電点電気泳動されたタンパク質分取液を第１バルブに移動させて試料ループに充填させる段階と、
【００６０】
ＩＶ）緩衝溶液貯留部材の一側に連結設置された供給ポンプを作動させ、緩衝溶液貯留部材に貯留された緩衝溶液を第１バルブに供給して、前記試料ループに満たされたタンパク質分取液を中空糸膜に供給すると同時に、前記第１バルブに連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側の終端に緩衝溶液を供給して平衡を維持する段階と、
【００６１】
Ｖ）前記段階ＩＶ）の平衡が終了した後、第３バルブを閉鎖し、その後緩衝溶液貯留部材の緩衝溶液を前記第１バルブを介して中空糸膜に流入されるようにして、フローフィールドフロー分画法で分子量の小さいタンパク質から分子量の大きいタンパク質の順でタンパク質を分離して検出器に流入させる段階。
ここで、前記段階ＩＩＩ）の試料ループに満たされる等電点電気泳動されたタンパク質の体積は１〜１０μＬ、好ましくは約２μＬに調節するが、所望のｐＩ領域の大きさだけ調節する。この際、使用された両性電解質のｐＨ領域が３〜１０の場合、１μＬの体積は約ｐＩ１間隔だけに該当するところ、例えば一番目の試料注入過程で１μＬを試料ループに充填すると、タンパク質のｐＩ領域は約９〜１０領域に該当する。
【００６２】
また、前記段階ＩＶ）において、前記第１バルブ、および前記第１バルブに連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側の終端に流れる緩衝溶液の流速比率は約１：９〜５：５に調節され、中空糸膜の両側終端、すなわち第１バルブに連結設置された一側（中空糸膜の入口）および第１バルブに連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側の終端（中空糸膜の出口）に流入される緩衝溶液は中空糸膜の入口から全長の１０〜５０％となる位置で集中し、前記中空糸膜に流入された緩衝溶液は中空糸膜壁の空隙に沿って中空糸膜の外部に排出されるが、前記タンパク質分取液試料も中空糸膜の入口から全長の１０〜５０％となる位置で平衡に到達する。
【００６３】
必要に応じて、本発明に係るタンパク質分離装置は、検出器の後方に分取液分取器を連結設置して使用することができるところ、前記分取液分取器を検出器に連結設置する場合、タンパク質を分子量領域に基づいて分取することができる。分取したタンパク質分取液は、酵素分解処理してペプチド化した後、ナノ流速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法（ｎａｎｏｆｌｏｗ ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ、nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry）を用いてペプチドを分離し、質量スペクトルをタンパク質データベースと比較してタンパク質を識別することができる。
【００６４】
以下、本発明について添付図面を参照して詳細に説明する。ところが、下記の説明は本発明を具体的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６５】
図２は本発明に係るタンパク質分離装置を示す構成図、図３は本発明に係るキャピラリー等電点電気泳動装置の連結部材の連結様態を示す構成図、図４は本発明に係る中空糸フローフィールドフロー分画部の連結部材の連結様態を示す構成図である。
【００６６】
図２〜図４に示すように、本発明に係るタンパク質分離装置は、巨視的な観点で、タンパク質試料をｐＩに基づいて１次分離するキャピラリー等電点電気泳動装置２と、前記キャピラリー等電点電気泳動装置２の一側に連結設置され、１次分離されたタンパク質を２次分離する中空糸フローフィールドフロー分画部４とから構成される。
【００６７】
ここで、前記キャピラリー等電点電気泳動装置２は、等電点電気泳動用キャピラリー１２と、前記等電点電気泳動用キャピラリー１２の終端の一側に連結設置された第１連結部材６と、前記第１連結部材６の一側に連結設置され、タンパク質試料および両性電解質の混合物を注入する第１注入ポンプ１０と、前記第１連結部材６の一側に連結設置された第２連結部材８と、前記第２連結部材８の一側に連結設置され、陽電解質溶液を注入する第２注入ポンプ２４と、前記第２連結部材８の一側に連結設置された陽極２０と、前記第１連結部材６が連結設置された等電点電気泳動用キャピラリー１２の一側の終端に対向する他側の終端に連結設置された第３連結部材１４と、前記第３連結部材１４の一側に連結設置された第４連結部材１６と、前記第４連結部材１６の一側に連結設置された陰極電解質蓄積部材１８と、前記陰極電解質蓄積部材１８が連結設置された第４連結部材１６の一側に対向する他側に連結設置された陰極２２とから構成される。
【００６８】
この際、前記等電点電気泳動用キャピラリー１２は、タンパク質試料を等電点電気泳動してタンパク質をｐＩに基づいて分離するためのものであって、このような目的のために使用される通常の等電点電気泳動用キャピラリー１２であればいずれでも構わないが、好ましくは電気浸透流れを除去するために、ポリビニルアルコールのコートされたシリカキャピラリーなどを使用することがよく、より好ましくはテフロン（登録商標）キャピラリー、シリカキャピラリーなどがよく、推薦するには内径７５〜４０５μｍ、特定的に約３１０μｍ、外径３６０〜７９３μｍ、特定的に約６１０μｍのテフロン（登録商標）キャピラリーを使用することがよい。
【００６９】
また、本発明に係る等電点電気泳動用キャピラリー１２は、その長さ方向に対して両側の終端に陽極２０および陰極２２を持つ電極と、両性電解質および陽電解質溶液などを供給することが可能な手段が連結設置されるところ、前記陽極２０が備えられる等電点電気泳動用キャピラリー１２の一側の終端には第１連結部材６および第２連結部材８が順次連結され、前記第１連結部材６の一側には分離しようとするタンパク質試料および両性電解質を流入させるための第１注入ポンプ１０が備えられ、前記第２連結部材８の一側には陽極２０および陽電解質溶液を注入するための第２注入ポンプ２４が連結設置される。
【００７０】
この際、前記両性電解質溶液は、等電点電気泳動のために、当業界で通常用いられる両性電解質溶液であればいずれでも構わないが、好ましくはｐＨ３〜１０の両性電解質溶液、より好ましくはｐＨ３〜１０および濃度２〜５％の両性電解質溶液を使用することがよく、前記陽電解質溶液は、当業界で通常用いられる陽電解質溶液であれもいずれでも構わないが、最も好ましくは２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４を使用することがよい。
【００７１】
また、前記第１連結部材６は前述した等電点電気泳動用キャピラリー１２、第１注入ポンプ１０および第２連結部材８が互いに連結設置され、第２連結部材８は第１連結部材６、第２注入ポンプ２４および陽極２０が互いに連結設置されるように備えられなければならないので、好ましくは３方向に互いに連結できる「Ｔ」字型連結部材、より好ましくはマイクロ−ティーを使用することがよい。
【００７２】
特に、本発明に係る連結部材６、８、１４、１６、３６としてマイクロ−ティーを使用することは、それぞれの連結部材の隙間体積を最小化させ、分離されたタンパク質試料の通過の際に帯状拡散現象を防止する。
【００７３】
一方、本発明に係る第１注入ポンプ１０および第２注入ポンプ２４は、前記第１注入ポンプ１０に満たされるタンパク質試料と、両性電解質および第２注入ポンプ２４に満たされる陽電解質溶液を等電点電気泳動用キャピラリー１２に注入することが可能な当業界の通常の注入ポンプであればいずれでも構わないが、好ましくはシリンジポンプを使用することがよい。
【００７４】
ここで、前記第１注入ポンプ１０としてシリンジポンプを使用し、第１連結部材６としてマイクロ−ティーを使用する場合、前記シリンジポンプのチュービング(tubing)がマイクロ−ティーに容易に締結できないので、これを解決するために、前記シリンジポンプである第１注入ポンプ１０とマイクロ−ティーである第１連結部材６との間にユニオン５４を備えて前記第１注入ポンプ１０と第１連結部材６とを互いに連結設置することができる。
【００７５】
一方、前記第１連結部材６、第２連結部材８および陽極２０が順次連結設置される等電点電気泳動用キャピラリー１２の一側の対向する他側には陰極２２が連結設置されなければならないところ、前記陰極２２は、第１連結部材６が連結設置された等電点電気泳動用キャピラリー１２の一側の終端に対向する他側の終端に連結設置される第３連結部材１４、および前記第３連結部材１４の一側に連結設置される第４連結部材１６に連結設置されるように構成される。この際、前記第４連結部材１６の一側には電極、特定的に陰極２２の表面に発生する気泡を捕集するための用途で陰極電解質溶液が充填されている電解質蓄積部材１８が連結設置、好ましくは垂直に連結設置される。前記第４連結部材１６に連結設置される第３連結部材１４は、等電点電気泳動用キャピラリー１２でｐＩに基づいて分離されるタンパク質試料を中空糸フローフィールドフロー分画部４に移動させるための別途の経路が備えられている。この際、前記陰極電解質溶液は、当業界で通常用いられる陰極電解質溶液であればいずれでも構わないが、最も好ましくは２０ｍＭのＮａＯＨを使用することがよい。
【００７６】
また、本発明に係る第３連結部材１４および第４連結部材１６は、前述した第１連結部材６および第２連結部材８と同様に、３方向に互いに連結できる「Ｔ」字型連結部材、より好ましくはマイクロ−ティーを使用することがよい。
一方、本発明に係る第３連結部材１４および第４連結部材１６を互いに連結設置するにおいて、前記第３連結部材１４の一側に連結設置された等電点電気泳動用キャピラリー１２でｐＩに基づいて分離されたタンパク質試料が第４連結部材１６へ移動しないようにタンパク質試料が通過し得ない別途の分離膜６４、好ましくは分子量透過限界３０ｋＤａ以下、より好ましくは約１０ｋＤａの半透膜が備えられたキャピラリー、特定的にシリカキャピラリー３８を用いて前記第３連結部材１４および第４連結部材１６を連結設置する。
【００７７】
特定的に、本発明に係る第３連結部材１４と第４連結部材１６の連結様態は、図３に示すように、第３連結部材１４であるマイクロ−ティーの一側はグラファイト材質のマイクロフェルール６０、好ましくは約０．０２５インチのマイクロフェルール６０を用いて等電点電気泳動用キャピラリー１２に連結設置し、前記等電点電気泳動用キャピラリー１２が連結されたマイクロ−ティーの一側に対向する他側にはマイクロタイトスリーブ、好ましくは約０．０１５５インチのマイクロタイトスリーブ６６を用いてキャピラリー、好ましくはシリカキャピラリー３０と連結設置してｐＩに基づいて分離されたタンパク質が中空糸フローフィールドフロー分画部４に移動する経路を提供し、前記マイクロ−ティーの他の一側は電圧伝達のために電極連結用Ｄｅｒｌｉｎ−Ｔｅｅとしての第４連結部材１６と連結設置するが、前記マイクロ−ティーとＤｅｒｌｉｎ−Ｔｅｅとの間に、タンパク質試料が電極方向に移動しないように分離膜６４として分子量透過限界３０ｋＤａ未満の半透過膜、好ましくは約１０ｋＤａの半透過膜を挿入したシリカキャピラリー３８を連結し、前記第４連結部材１６であるＤｅｒｌｉｎ−Ｔｅｅの一側に陰極電解質蓄積部材１８を備えて、陰極２２の表面に発生する気泡を捕集するように構成される。
【００７８】
しかも、本発明に係る陽極２０および陰極２２は、当業界で通常用いられる電極であれば特に限定されないが、好ましくは白金を使用することが良い。
本発明に係る中空糸フローフィールドフロー分画部４は、キャピラリー等電点電気泳動部２の第３連結部材１４の一側に連結設置され、キャピラリー等電点電気泳動装置２で分離されたタンパク質試料が流入される第１バルブ２６と、前記第１バルブ２６の一側に連結設置された中空糸膜３２と、前記第１バルブ２６が連結設置された中空糸膜３２の一側に対向する他側に連結設置された検出器５２と、前記第１バルブ２６および前記第１バルブ２６に連結設置された中空糸膜３２の一側の終端に対向する他側の終端に連結設置され、内部に緩衝溶液を貯留する緩衝溶液貯留部材４８と、前記緩衝溶液貯留部材４８に連結設置され、貯留された緩衝溶液を前記第１バルブ２６および前記中空糸膜３２に供給する供給ポンプ５０とから構成される。
【００７９】
ここで、本発明に係る第１バルブ２６に連結設置される中空糸膜３２の終端の一側には、必要に応じて、第５連結部材３６を連結設置した後、前記第５連結部材３６の一側に第１バルブ２６を連結設置し、前記第５連結部材３６の他の一側に放射流れ５６を可能にする放射流れ５６の移動経路を提供するための経路が備えられてもよい。
【００８０】
特定的に、本発明に係る第５連結部材３６は、図４に示すように、テフロン（登録商標）−ティー(Tee)を使用することができるところ、前記テフロン（登録商標）−ティーを第５連結部材３６として使用する場合、第１バルブ２６の一側に連結設置され、その内部にタンパク質試料および緩衝溶液が移動するシリカキャピラリー３０をマイクロタイトスリーブ６６と雄ナット６２でテフロン（登録商標）−ティーの一側に連結設置し、これに対向する他側は中空糸膜３２の一側の終端にマイクロタイトスリーブ６６およびスリーブの内側に位置するシリカキャピラリー３０が挿入された順序でテフロン（登録商標）フェルール６０、好ましくは１／１６インチのテフロン（登録商標）フェルール６０を通過する方法で締結され、中空糸膜３２とテフロン（登録商標）−ティーの内部には中空糸膜３２のみが通過できるようにし、前記中空糸膜３２の外壁から排出される緩衝溶液（放射流れ）はテフロン（登録商標）フェルール６０、好ましくは１／１６インチテフロン（登録商標）フェルール６０のチュービングを介して外部に排出されるように構成される。
【００８１】
また、本発明に係る中空糸フローフィールドフロー分画部４は、さらに、緩衝溶液貯留部材４８から排出される緩衝溶液の移動経路を２つの流れ経路に分離した後、それぞれの流れ経路に第２バルブ４０および第３バルブ４２をそれぞれ連結させ、前記第２バルブ４０の一側には第１圧力バルブ４４および第１バルブ２６を順次連結させ、前記第３バルブ４２の一側には第１バルブ２６が連結設置された中空糸膜３２の一側に対向する他側を連結設置させるように構成することができる。
【００８２】
本発明に係る中空糸膜３２は、タンパク質試料を分子量に基づいて分離するためのものであって、このような目的のために使用される通常の中空糸膜３２であればいずれでも構わないが、好ましくは透過限界１０〜１００ｋＤａの中空糸膜がよく、より好ましくは透過限界約３０ｋＤａ、内径３００〜１０００μｍ、特定的に約４５０μｍ、外径５００〜１２００μｍ、特定的に約７２０μｍおよび長さ１０〜４０ｃｍ、特定的に約２５ｃｍの中空糸膜がよく、その材質はポリスチレンスルホン酸、ポリ塩化ビニール、ポリアクリロニトリルまたはこれらの混合物などからなることが良い。
【００８３】
特定的に、本発明に係る中空糸膜３２は、中空糸膜が内部に挿入できる中空を持つ円筒型管、例えばガラス管３４に挿入されて使用できるところ、前記ガラス管３４は、中空糸膜３２が安定的に挿入できるものであればいずれでも構わないが、少なくとも、前記中空糸膜３２の挿入されたガラス管３４は、中空糸膜３２を通じて流れるタンパク質試料および緩衝溶液などがガラス管３４の外部に排出されないように完全に密封しなければならない。  
【００８４】
本発明に係る第１バルブ２６は、キャピラリー等電点電気泳動装置２で分離されたタンパク質試料が流入された後、これを中空糸膜３２に供給するためのものであって、好ましくはキャピラリー等電点電気泳動装置２の第３連結部材１４の一側および中空糸膜３２の一側の終端に連結設置され、他の一側には緩衝溶液貯留部材４８から提供される緩衝溶液が流入される経路が連結設置されている。
【００８５】
必要に応じて、本発明に係る第１バルブ２６は、その一側に廃棄物蓄積部材２８がさらに連結設置できるところ、前記廃棄物蓄積部材は、陽極２０が設置された高さより少なくとも１０ｃｍ以上高いところに設置し、等電点電気泳動過程で陽極２０の終端のキャピラリーに発生し得る電気浸透流れを、重力によって発生する流体力学的力によって最小化させるために設置することができる。
【００８６】
また、本発明に係る第１バルブ２６は、その内部のキャピラリー等電点電気泳動装置２でｐＩに基づいて分離されたタンパク質試料の一側に試料ループ５８が備えられ、キャピラリー等電点電気泳動装置２でｐＩに基づいて分離されたタンパク質試料が満たされる。
【００８７】
ここで、前記第１バルブ２６は、前記第３連結部材１４、中空糸膜３２および緩衝溶液の流入経路が互いに連結設置されるところ、前記タンパク質および緩衝溶液などの容易な流れのために６ポートバルブを使用することが良い。
【００８８】
特定的に、本発明に係る第１バルブ２６として６ポートバルブを使用する場合、前記６ポートバルブに備えられた６つのポートのうち、キャピラリー等電点電気泳動装置２から排出されるタンパク質試料の移動経路として備えられたキャピラリーに連結設置されたポートを任意に第１ポート７０と指称する場合、前記第１ポート７０の左側または右側に隣り合って第２ポート７２、第３ポート７４、第４ポート７６、第５ポート７８および第６ポート８０が順次備えられ、前記第１ポート７0と第４ポート７６との間に試料ループ５８が連結設置されるように構成される。
【００８９】
この際、前記６ポートの流路連結は、最初、第１ポート７０と第６ポート８０、第２ポート７２と第３ポート７４、および第４ポート７６と第５ポート７８の排出口が互いに連結された状態で前記第６ポート８０の排出口を介して、キャピラリー等電点電気泳動装置２で分離されたタンパク質試料が第２注入ポンプ２４によって第１ポート７０および第４ポート７６の排出口に連結された試料ループ５８に流入された後、前記６ポートバルブを操作して前記６ポートバルブの第１ポート７０と第２ポート７２、および第３ポート７４と第４ポート７６の排出口を互いに連結されるようにして、緩衝溶液の流れによって試料ループ５８に満たされているタンパク質試料が中空糸膜３２に供給されるように構成できる。
【００９０】
一方、前記第１バルブ２６に供給される緩衝溶液は、緩衝溶液貯留部材４８に満たされている。前記緩衝溶液貯留部材４８の一側には、緩衝溶液を外部に供給し得るように駆動力を提供する供給ポンプ５０が備えられる。この際、前記供給ポンプ５０は、前記緩衝溶液貯留部材４８に満たされている緩衝溶液を外部に供給することができるものであればいずれでも構わないが、好ましくはＨＰＬＣを使用することがよい。
【００９１】
特定的に、本発明に係る緩衝溶液の移動経路には、圧力バルブ４４、４６を備えて緩衝溶液の流速および流量などを調節することができるところ、このような場合、前記緩衝溶液貯留部材４８から排出される緩衝溶液の移動経路を２つの流れ経路に分離した後、それぞれの流れ経路に第２バルブ４０および第３バルブ４２をそれぞれ連結させ、前記第２バルブ４０の一側には第１圧力バルブ４４および第１バルブ２６を連結させて構成し、前記第３バルブ４２の一側には第１バルブ２６が連結設置された中空糸膜３２の一側に対向する他側、すなわちタンパク質試料が排出される中空糸膜３２の出口を連結設置し、このような構成を介して前記第１圧力バルブ４４を調節することにより、第１バルブ２６に流入される緩衝溶液の流速および中空糸膜３２の一側、好ましくは中空糸膜３２の出口に流入される緩衝溶液の流速比を１：９となるように調節することができる。
【００９２】
特定的に、前記第３バルブ４２を介して中空糸膜３２の出口に流入される緩衝溶液は、前記第３バルブ４２および検出器５２を順次通過した後、中空糸膜３２の出口に流入されるように構成することもできる。
【００９３】
この際、前記第２バルブ４０および第３バルブ４２は、緩衝溶液貯留部材４８から排出される緩衝溶液の流れを２つの流れ方向に分けられて流れるようにするか、或いは緩衝溶液を第１バルブ２６にのみ流れるようにするなどのように緩衝溶液の流れを容易に調節するために、少なくとも２つ以上の流れ方向を持つバルブを使用することが好ましいところ、推薦するには四方弁を使用することがよい。
【００９４】
特定的に、前記第３バルブ４２を少なくとも２つ以上の流れ方向を持つバルブ、好ましくは四方弁から構成する場合、前記四方弁の一側は緩衝溶液貯留部材４８から排出される緩衝溶液の移動経路に連結設置され、他の一側は緩衝溶液をタンパク質分離装置の外部に排出できる経路として使用することができ、残り流体の移動経路を提供する一側などはプラグ６８などで密封する。
【００９５】
一方、本発明に係る第１バルブ２６が連結設置された中空糸膜３２の終端の一側に対向する他側、すなわち中空糸膜３２の出口には、中空糸膜３２を通過しながら分子量の大きさによって分離されたタンパク質が流入され、分離されたタンパク質を分析する検出器５２が連結設置されるところ、前記検出器５２は、分離されたタンパク質の分析に使用される当業界の通常の検出器５２であれば特に限定されないが、推薦するには紫外線検出器５２を使用することが良い。
【００９６】
また、本発明に係る各装置の構成要素において、タンパク質試料、電解質溶液および緩衝溶液などが流れる移動経路は、前述した物質と反応しない、当業界で通常用いられる材質の管を使用すれば特に限定されないが、好ましくはキャピラリー３０、３８、より好ましくはシリコンキャピラリーを使用することがよい。
【００９７】
また、本発明に係るタンパク質分離装置は、これを構成する注入ポンプ１０、２４、供給ポンプ５０、バルブ２６、４０、４２、および圧力バルブ４４、４６などをコンピュータと連結させて制御し得るように構成した後、最終的にタンパク質が分離されて通過する中空糸膜３２の分離モジュールを自動分取器（図示せず）に連結させる場合、タンパク質をｐＩおよび分子量によって自動分離することができ、中空糸膜３２の出口をキャピラリー、好ましくはシリカキャピラリーを用いてエレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）質量分析器（mass spectrometry、ＭＳ）とオンライン連結することが可能である。
【００９８】
ここで、前記エレクトロスプレーイオン化−質量分析器（ＥＳＩ−ＭＳ）の場合、タンパク質の質量分析と共にタンデム質量分析法を使用する場合、タンパク質鎖に対する構造分析が可能であってタンパク質の識別に応用することができ、タンパク質試料が中空糸膜３２で分離される過程中に、等電点電気泳動用キャピラリー１２から流入された両性電解質は中空糸膜３２の放射流れと共に排出されるので、両性電解質の自動的な除去が可能になる。
【００９９】
次に、前述した構成を持つ本発明に係るタンパク質分離装置の作用方法について説明する。
まず、分離分析しようとするタンパク質試料と両性電解質溶液、好ましくはｐＨ３〜１０、濃度２〜５％の両性電解質溶液混合物を第１注入ポンプ１０に満たした後、等電点電気泳動用キャピラリー１２、好ましくはテフロン（登録商標）キャピラリーに前記混合物を供給する。
【０１００】
その後、前記等電点電気泳動用キャピラリー１２に１０〜５０分間２００〜７００Ｖ／ｃｍ、好ましくは約５００Ｖ／ｃｍの電場をかけて等電点電気泳動させた後、全ての分離が終了するまで２００〜７００Ｖ／ｃｍ、好ましくは３００Ｖ／ｃｍの電場を維持する。
【０１０１】
その後、第２注入ポンプ２４に陽電解質溶液、好ましくは２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４溶液を満たした後、これを等電点電気泳動用キャピラリー１２に注入し、等電点電気泳動されて分取されたタンパク質を第１バルブ１２に移動させて試料ループ５８に満たされるようにする。
【０１０２】
この際、前記試料ループ５８に満たされる等電点電気泳動されたタンパク質の体積は、１〜１０２μＬ、好ましくは最大２μＬに調節するが、所望のｐＩ領域の大きさだけ調節する。ここで、使用された両性電解質のｐＨ領域が３〜１０の場合、１μＬの体積は約ｐＩ１間隔だけに該当するところ、例えば一番目のタンパク質試料注入過程で１μＬを試料ループ５８に充填すると、タンパク質のｐＩ領域は約９〜１０領域に該当する。
【０１０３】
その後、緩衝溶液貯留部材４８の一側に連結設置された供給ポンプ５０を作動させ、緩衝溶液貯留部材４８に貯留された緩衝溶液を第１バルブ２６に供給し、前記試料ループ５８に満たされたタンパク質分取液を中空糸膜３２に供給する。
【０１０４】
ここで、前記緩衝溶液は、緩衝溶液貯留部材４８の一側に連結設置された第２バルブ４０および第３バルブ４２に同時に供給されて２つの流れに分けられるところ、前記第２バルブ４０に供給された緩衝溶液は、第２バルブ４０を経て第１バルブ２６に供給され、前記第３バルブ４２に供給された緩衝溶液は、第１バルブに連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側の終端、すなわち中空糸膜３２の出口に、好ましくは検出器５２を通過して中空糸膜３２の出口に供給される。この際、前記２つの流れに分けられた緩衝溶液の流速比率は第１圧力バルブ４４によって約１：９に調節され、中空糸膜３２の両側の終端に流入される緩衝溶液は第１バルブ２６に連結設置される中空糸膜３２の入口から全長の１０〜５０％となる位置で集中し、前記タンパク質試料も中空糸膜３２の入口から全長の１０〜５０％となる位置で平衡に到達する。
【０１０５】
また、前記中空糸膜３２の両側の終端に流入される緩衝溶液は、中空糸膜３２の壁の空隙に沿って中空糸膜の外部に排出されるが（放射流れ）、この過程は、試料の弛緩過程である試料弛緩過程(sample relaxation)といい、タンパク質試料は、前記放射流れ５６の強度によって中空糸膜の内壁方向に移動し、同時にタンパク質試料の拡散運動によって試料が中空糸膜３２の内方に移動する両方向の力が伝達される。この際、拡散の速い小さい分子量のタンパク質は、拡散の遅い大きい分子量のタンパク質より中空糸膜の内壁から相対的に遠く離れた位置で力の平衡を得る。
【０１０６】
その後、平衡が終了した後、第３バルブ４２を閉鎖し、第２バルブ４０を第１バルブ２６と直接連結されるようにして、緩衝溶液貯留部材４８の緩衝溶液が第１バルブ２６を介して中空糸膜３２に流入されるようにすることにより、フローフィールドフロー分画法によって分子量の小さいタンパク質から分子量の大きいタンパク質の順でタンパク質を分離して検出器５２に流入させる。
【０１０７】
必要に応じて、本発明に係るタンパク質分離装置は、検出器５２の後方に分取液分取器（図示せず）を連結設置して使用することができるところ、前記分取液分取器を検出器５２に連結設置する場合、タンパク質を分子量領域に基づいて分取することができる。分取したタンパク質分取液は、酵素分解処理してペプチド化した後、ナノ流速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法を用いてペプチドを分離し、質量スペクトルをタンパク質データベースと比較してタンパク質を識別することができる。
【０１０８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。ところが、下記の実施例は本発明を具体的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０９】
<実施例１>
タンパク質分離装置の製造
図２に示すように、等電点電気泳動用キャピラリーとして、９．５ｃｍ×３１０μｍ（内径）のテフロン（登録商標）キャピラリー（Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ社、米国）の一側終端に外径３６０μｍ、内径５０μｍのシリカキャピラリー（Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を連結管として２つのマイクロ−ティーを順次連結設置した。
【０１１０】
その後、前記一番目のマイクロ−ティーの一側にユニオン（Ｄｅｌｒｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｕｉｏｎ、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）およびシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ２２、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国）を順次連結設置し、２番目のマイクロ−ティー（ＭｉｃｒｏＴｅｅ、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の一側にシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ２２、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国）を連結設置し、他の一側に陽極としての白金を連結設置し、一番目のマイクロ−ティーに連結設置されたシリンジポンプにタンパク質試料［ミオグロビン（１５ｋＤａ、ｐＩ６．８）、トリプシノゲン（２４ｋＤａ、ｐＩ９．３）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ、ｐＩ５．８５）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６６ｋＤａ、ｐＩ４．８）、酵母アルコール脱水素酵素（ＹＡＤＨ、１５０ｋＤａ、ｐＩ６．２３）］およびｐＨ３〜１０の両性電解質溶液（Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｆｌｕｋａ、スイス）を満たし、２番目のマイクロ−ティーに連結設置されたポンプには陽電解質溶液として、０．１０μｍの分離膜フィルターで濾過した超純水（＞１８ＭΩ）で製造された２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４溶液を満たした。
【０１１１】
その後、前記一番目のマイクロ−ティーが連結されたテフロン（登録商標）キャピラリーの一側に対向する他側に連結部材として別の２つのマイクロ−ティーを順次連結設置した後、前記後端に連結設置されるマイクロ−ティーの一側に陰電極としての白金を連結設置し、これに対向する他側には陰電解質溶液として、０．１０μｍの分離膜フィルターで濾過した超純水（＞１８ＭΩ）で製造された２０ｍＭ ＮａＯＨ溶液が満たされた電解質蓄積部材（Ｃｒｏｓｓ、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を連結設置した。
【０１１２】
この際、前記２つのマイクロ−ティーは、分子量透過限界１０ｋＤａの半透過膜（ＰＬＣＧＣ、Ｍｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を挿入したシリカキャピラリー（Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を用いて互いに連結設置した。
【０１１３】
その後、テフロン（登録商標）キャピラリーに連結設置されるマイクロ−ティーの一側を試料ループ（２０ｍＬのサンプルループ、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ、米国）が備えられた６ポート試料注入バルブ（Ｃｏｔａｔｉ、ＣＡ、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ社、米国）に連結設置した後、前記６ポート試料注入バルブにマイクロ−ティーおよび内径４５０μｍ、外径７２０μｍ、長さ２５ｃｍ、透過限界３０ｋＤａの中空糸膜［コオロン中央研究所、韓国］を順次連結設置した。
【０１１４】
その後、前記中空糸膜の一側を検出器（ＵＶ７３０Ｄ、ヨンリン機器、韓国）および四方弁（４−４ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｖａｌｖｅ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、米国）に順次連結させ、６ポート試料注入バルブを圧力バルブおよび別の四方弁（ＬａｂＰｒｏ、Ｒｈｅｐｄｙｎｅ、米国）に連結させた。
【０１１５】
その後、前記２つの四方弁を緩衝溶液に満たされている緩衝溶液貯留部材（５Ｌの三角フラスコ、Ｓｃｈｏｔｔ Ｄｕｒａｎ、ドイツ）の一側に連結させてタンパク質分離装置を製造した。
【０１１６】
<実施例２>
タンパク質標準物に対するキャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画装置の分離
実施例１によって製造されたタンパク質分離装置（キャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画装置）の分離能を評価するために、５つのタンパク質標準物を混合してタンパク質混合物試料を準備した。ここで、前記タンパク質標準物の混合物の組成は表１の通りであった。
【０１１７】
【表１】
2009524818.tif 000003
【０１１８】
前記表１による組成を持つタンパク質混合物と両性電解質（５％ｖ／ｖ）の混合溶液を、実施例１によって製造されたタンパク質分離装置の１番目のシリンジポンプに装着した後、そのシリンジポンプを作動させてテフロン（登録商標）キャピラリーに前記混合溶液を供給した後、約２０分間５００Ｖ／ｃｍの電場をかけて等電点電気泳動させた後、全ての分離が終了するまで３００ｖ／ｃｍの電場を維持した。
【０１１９】
その後、陽電解質溶液である２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４溶液が満たされているシリンジポンプを作動させ、テフロン（登録商標）キャピラリー内の等電点電気泳動されたタンパク質が６ポートバルブに移動して試料ループに充填されるように伝達体積を調節した。この際、シリンジポンプが伝達する体積を正確に調節して、６ポートバルブに伝達される等電点電気泳動されたタンパク質のｐＩ領域を正確に調節するところ、タンパク質標準物の場合、４つの分取液、すなわちｐＩ区間３〜５、５〜６、６〜８および８から１０に分けて中空糸フローフィールドフロー分画による分離に使用したので、一番目の試料注入はｐＩ８〜１０領域のタンパク質分取液であり、これは約２μＬの体積に該当した。
【０１２０】
その後、試料ループに満たされたタンパク質分取液は、中空糸膜における分離のために６ポートバルブを開放して緩衝溶液貯留部材から緩衝溶液を試料ループを経て中空糸膜に伝達されるようにするところ、この際、図２に示すように、２つの四方弁の位置が点線連結されるようにして、緩衝溶液貯留タンクから排出される緩衝溶液が２つの流れに分離され、一つの流れは圧力バルブを経て中空糸膜の入口に伝達され、同時にもう一つの流れは他の四方弁および検出器を逆に経て中空糸膜の出口に伝達されるようにした。
【０１２１】
この際、前記２つの流れ流速比率は６ポートバルブに連結設置された圧力バルブによって１：９に調節され、中空糸膜の入口および出口に注入される緩衝溶液は中空糸膜の入口から全長の１０％となる位置、すなわち２．５ｃｍで集中され、タンパク質分取液の試料も前記１０％となる位置で平衡を持つようにした。
【０１２２】
その結果は図５に示した。ここで、番号１はミオグロビン、番号２はトリプシノゲン、番号３は炭酸脱水酵素、番号４はウシ血清アルブミン、番号５は酵母アルコール脱水素酵素である。
【０１２３】
図５に示すように、５つのタンパク質混合物の分離の際にキャピラリー等電点電気泳動から一番目に注入されたタンパク質分取液のｐＩは８〜１０であり、これに対する中空糸膜フローフィールドフロー分画による分離は図５の分離ピークの一番目のピークに現れている。
【０１２４】
流速条件６００μＬ／ｍｉｎ、放射流れ速度５４０μＬ／ｍｉｎ、中空糸膜出口流速６０μＬ／ｍｉｎにおける該当ピークは、タンパク質２番トリプシノゲン（ｐＩ９．３）試料であり、２番試料の分離が終了する頃に６ポートバルブの試料ループに注入されていた次のｐＩ領域（ｐＩ６〜８）のタンパク質分取液に対する中空糸膜フローフィールドフロー分画による分離が行われたところ、１番と５番のタンパク質が分離された。
【０１２５】
それぞれのｐＩ値は６．８、６．２３なので、当該ｐＩ領域のタンパク質がキャピラリー等電点電気泳動によって成功的に分離されて中空糸膜フローフィールドフロー分画で分子量別分離が行われることを確認することができた。
【０１２６】
また、１番ピークはミオグロビンであって、２量体によるピークが１番ピークの直後に分離されたと推定することができた。
また、タンパク質試料の５番ピークは、分離された時間が、分子量領域からみるとき１５０ｋＤａｒが検出される時間帯に現れたことからみて、タンパク質試料の変性を回避することができるものと確認された。
【０１２７】
<比較実施例１>
実施例２に使用されたタンパク質試料（タンパク質標準物の混合物）を２Ｄ−ＰＡＧＥ方法によって分離した。
【０１２８】
まず、タンパク質をｐＩに基づいて分離するために、ｐＨ３〜１０の範囲を持つ固定されたｐＨ勾配ゲル(immobilized pH gradient gel)を使用し、ｐＩに基づいて分離されたタンパク質をさらに１２％ポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質の大きさに基づいて分離した。
【０１２９】
しかも、前記タンパク質の分離のために使用された実験過程は、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ．Ｓｉｍｐｓｏｎ執筆の「Proteins and Proteomics: a laboratory manual, CSHL PRESS, New York, 2003」に詳細に説明されている。
その結果を図６に示した。
【０１３０】
図６に示すように、５番タンパク質試料である酵母アルコール脱水素酵素（ＹＡＤＨ）は、分子量が１５０ｋＤａと知られているが、実際分離されて示された位置は３６．５ｄＤａと５５ｋＤａとの間に位置しているところ、これはＹＡＤＨが４つのサブユニットから構成されているので、電気泳動過程でＳＤＳ(sodium dodecylasulfate)を使用する特性上、サブユニットが分離された状態（それぞれのサブユニットの分子量は３７．５ｋＤａ程度である）であると推定される。したがって、前記２Ｄ−ＰＡＧＥはタンパク質試料の変性を回避することができないものと確認された。
【０１３１】
<実施例３>
キャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画装置を用いたヒト尿タンパク体の分離
実施例１によって製造されたタンパク質分離装置（キャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画装置）を用いてヒトの尿から抽出したタンパク体試料の分離に適用しようとした。
収去した小便は、分子量透過限界３０ｋＤａを有する分離膜を用いてろ過することにより、分子量透過限界３０ｋＤａ以上のタンパク体試料のみを使用した。
まず、実施例２と同様の方法で行うが、実施例２のタンパク質標準物の混合物の代わりに濾過された尿タンパク体試料４０μｇを使用し、中空糸膜における分子量分離の際には等電点電気泳動されたタンパク質試料バンドを６つのｐＨ領域に分けて注入した。ｐＨ９〜１０、８〜９、７〜８、７〜７、５〜６、および３〜５の６段階に分けられて注入されたタンパク質体試料バンドは、中空糸フローフィールドフロー分画でそれぞれ分離された。
【０１３２】
これについての結果を図７に示した。ここで、タンパク質の識別はナノ流速ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析方法を使用した。
図７に示すように、キャピラリー等電点電気泳動による分取液のｐＨが減少するにつれて、分離時間５分帯で現れるピークの強度は大きく増加するものと確認された。また、５分以後には２番目のピークがｐＨ６〜７で新しく現れ始めた。
【０１３３】
これは分子量の大きさ約１００ｋＤａ以上のものであって、ｐＩ７より小さい値を持つ巨大分子に関することを意味する。
反面、キャピラリー等電点電気泳動による分取液Ｆはいずれのピークも示していないものと思われるところ、これは、キャピラリー等電点電気泳動チュービング内でフィールドフロー分画分離して待機しているタンパク質のうち、ｐＨ３〜５の分取液は最後の分離段階まで待機しなければならず、この際、電気浸透流れによる影響で一部のタンパク質が陰極方向に移動し、その結果ｐＩ３〜５に該当するタンパク質が前側の分取液に移動したものと推定される。
【０１３４】
実際に低いｐＩ値を持つタンパク質の存在は、図８に示した、同一の試料４００μｇを注入して分離した２Ｄ−ＰＡＧＥの結果より、ｐＨ領域３に大きいスポットがあるものと確認することができる。
【０１３５】
<比較実施例２>
実施例３に使用された尿タンパク体試料４００μｇを２Ｄ−ＰＡＧＥ方法によって分離した。
【０１３６】
ここで、前記尿タンパク質をｐＩと大きさによって分離するための実験過程は、タンパク質標準試料に使用された方法と同一であるが、広い領域におけるタンパク質大きさ別分離のために８〜１２％勾配ポリアクリルアミドゲルを使用したという点が比較実施例１の実験方法と異なる。
その結果を図８に示した。
【０１３７】
図８に示すように、ｐＨ領域３に大きいスポットがあるものと確認することができる。
【０１３８】
<実施例４>
ナノ流速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法を用いた尿タンパク質分取液に対するタンパク質分析
実施例３によって分離されるタンパク質を５分間隔で収去したタンパク質分取液の総２４個をそれぞれトリプシン酵素を用いて加水分解した後、ペプチド混合物に転換してそれぞれの２４個の試料に対してナノ流速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法で分離分析してタンパク質識別過程を行った。
その結果を図９に示した。
【０１３９】
図９は、中空糸フローフィールドフロー分画によって分取した分取液Ｅ１〜Ｅ４をペプチド化した後、ナノ流速ＬＣでそれぞれ分離し、分離の際にカラム溶離液を質量分析器でＥＳＩ方法によって直接イオン化して質量分析を行う過程で得られたベースピーククロマトグラム（base peak chromatogram、ＢＰＣ）である。
【０１４０】
図９ａは分取液Ｅ１（図７の分取液Ｅ（ｐＨ５〜６領域）に対する中空糸フローフィールドフロー分画による分離の際に０〜５分の間に分離されて出たタンパク質分取液を酵素加水分解処理して得られたペプチド混合物）に対するＬＣピークである。
【０１４１】
ナノ流速ＬＣ分離に使用された分離条件によれば、勾配溶離法(gradient elution)を使用し、溶媒条件によれば、溶媒Ａは３／９７％水／アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）／水溶液であり、溶媒Ｂは３／９７％水／アセトニトリル溶液であって、それぞれ０．１％のギ酸（ＨＣＯＯＨ）を添加した。
【０１４２】
勾配溶離条件によれば、溶媒Ｂが５％の条件で始めて５分後に全体溶媒の組成でＢが１２％となるように２５分間上昇させ、さらに６０分間Ｂの組成が６０％となるように増加させた。
【０１４３】
その後、３分間にわたって溶媒Ｂが８０％となるように上昇させた後、１０分間維持し、さらに５％に２分間にわたって減少させて最小２５分間カラムの再平衡過程を行った。
流速は勾配溶離全区間にわたって２００ｎＬ／ｍｉｎを維持した。
【０１４４】
図９に示したそれぞれのクロマトグラムは、ＬＣで溶離されたペプチドがエレクトロスプレーイオン化過程を経て質量分析器に注入されるとき、前駆体スキャンを行いながら測定されたイオンのうち毎回スキャン過程でピーク強度が大きいイオンの強度のみで描かれたクロマトグラムであり、分取液Ｅ１とＥ２は相当大きいペプチドイオンが分離されて出たものと確認される反面、分取液Ｅ３とＥ４は相対的にペプチドのピーク数が少ない。
【０１４５】
検出されたペプチドは、２次質量分析器で衝突誘起解離（collision induced dissociation、ＣＩＤ）によってタンデム質量分析を行い、断片化した分子のスペクトルからペプチドのアミノ酸配列を確認するが、この際、データ従属ＭＳ−ＭＳ分析法を使用し、詳細な説明は次の通りである。
【０１４６】
図９ａと図９ｂにそれぞれ「＊」と「＊＊」で表示された位置で測定された質量分析スペクトルは、次の通りである。
【０１４７】
図９ａに表示された「＊」位置は７０．９分に該当し、この時間で測定された前駆体スキャン質量スペクトルは図１０ａに示し、非常に多くのペプチドが同時に分離されて出ることを確認することができる。これはタンパク質分取液をペプチドで分解したときに生成されたペプチドの数が非常に多く、ＬＣ分離中に７０．９分に該当する時間帯に溶離されたペプチドのみを測定したにも拘らず、多くのペプチドが同時に分離されて出ることが分かる。図１０ａから確認されたいろいろのピークのうち、ｍ／ｚ ５８５．００（＋３がイオン）に該当するイオンを選択してデータ従属ＭＳ−ＭＳ分析を行った後、得られたタンデム質量スペクトルは図１０ｂに示したが、ペプチドが断片化したときに生成されるイオンのうちｙタイプのイオンを表示し、このスペクトルの情報と図１０ａから確認されたｍ／ｚ値を用いてタンパク質データベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）の情報から、タンパク質識別確認プログラムを用いてペプチドの識別および該当ペプチドの属したタンパク質に対する情報を得ることができる。
【０１４８】
タンパク質の識別に使用したプログラムは、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、この過程を経て確認された図１０ａのｍ／ｚ ５８５．００イオンはペプチドの構造式がＹＶＧＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲであり、タンパク質はＯｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ１であることが確認された。図１０ｂは、ペプチド構造式の両側にはペプチドがタンパク質から酵素分解される前段階に隣接したアミノ酸配列を共に示すことにより、トリプシンにより酵素分解されたものであることを共に示した。
【０１４９】
また、図９ｂの９５．４分（＊＊）に記録された前駆体スキャン質量スペクトルは図１１ａに示し、ペプチドｍ／ｚ ９８７．０６（＋２）イオンに該当する開裂スペクトルは図１１ｂに示した。タンパク質データベースの確認結果、ペプチドのアミノ酸配列はＳＦＰＡＬＴＳＬＤＬＳＤＮＰＧＬＧＥＲであり、タンパク質は単球細胞分化抗原(monocyte differentiation antigen)ＣＤ１４であると確認された。
【０１５０】
図１０および図１１に示した２つのタンパク質は、ヒトの肝炎症の際に現れる標識物質であることが文献上に知られている[J.X. Panf, N. Gianni, A.R.Dongre, S.A. Hefta, G.J.Opteck, J. Proteome Research, 2002, , 161-169]。
【０１５１】
また、全体２４個の分取液（Ａ１−Ｆ４）試料に対する分析から確認されたタンパク質を表２に示し、それぞれのタンパク質に対するｐＩおよび分子量値を共に表記した。それぞれのＣＩＥＦ分取液から識別されたタンパク質のｐＩ値は幾つかのタンパク質を除いては当該ＣＩＥＦ分取液が持つｐＨ範囲の値とよく一致しており、一部のタンパク質は当該ｐＨ範囲よりやや高い或いは低い場合であり、一部のタンパク質は隣接したキャピラリー等電点電気泳動分取液で同時に確認されるものが分取液毎に５〜７個程度に該当する。
【０１５２】
各分取液で確認されたタンパク質のｐＩ値（タンパク質データベース）と分子量を図１２に示したところ、各キャピラリー等電点電気泳動分取液に基づいて確認されたタンパク質のｐＩ平均値は実線で表示し、数値を各図面内に表記した。各ＣＩＥＦ分取液に基づいて確認されたタンパク質のｐＩ平均値は、当該分取液が持つｐＨ範囲内にあるものと確認される。また、各分取液に基づいて確認されたペプチドとタンパク質の数を表３に示し、確認された全体タンパク質の数は総１１４個である。
【０１５３】
この個数は、同一の尿タンパク試料をキャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画で前もって分離していない状態で直酵素分解処理した後、ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳのみで分析したとき、２１個のタンパク質のみが確認された場合と比較すれば、約５．５倍多いタンパク質が確認された結果と解釈することができる。
【０１５４】
これは、２次元タンパク質分離方法を使用したとき、相対的に存在比の低いタンパク質から得られたぺプチドが相対的存在比の高いペプチドと同時に分離分析されるときに現れるイオン抑制効果を相対的に減らすことができるためである。
【０１５５】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０１５６】
【表５】
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【０１５７】
本発明の好適な実施形態は説明の目的で記載されたものに過ぎず、当業者であれば、特許請求の範囲に開示された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、各種変更、追加および置換が可能であることを理解するであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明は、タンパク質をｐＩと分子量の順序に基づいて分離することができ、タンパク質分離の際にタンパク質が変性されないうえ、タンパク質を分離回収した後、回収されたタンパク質を酵素加水分解処理する場合、ペプチドの分析にナノ流速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法を適用してタンパク質の識別を直接利用することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】従来のタンパク質分離装置を示す構成図である。
【図２】本発明に係るタンパク質分離装置を示す構成図である。
【図３】本発明に係るキャピラリー等電点電気泳動装置の連結部材の連結様態を示す構成図である。
【図４】本発明に係る中空糸フローフィールドフロー分画部の連結部材の連結様態を示す構成図である。
【図５】本発明に係るタンパク質分離装置を用いて標準タンパク質試料の分離結果を示す図である。
【図６】標準タンパク質試料に対する２Ｄ−ＰＡＧＥを用いた試料の分離結果を示す図である。
【図７】本発明に係るタンパク質分離装置を用いた尿タンパク体試料の分離結果を示す図である。
【図８】尿タンパク体試料に対する２Ｄ−ＰＡＧＥを用いた試料の分離結果を示す図である。
【図９】本発明に係るタンパク質分離装置を用いて分離された４つの分取液に対するＬＣ−ＭＳ−ＭＳクロマトグラムを示す図である。
【図１０Ａ】図９ａの７０．９分に記録された質量スペクトルを示す図である。
【図１０Ｂ】図９ａの７０．９分に記録されたｍ／ｚ＝５８５．００イオンに対するタンデム質量スペクトルを示す図である。
【図１１Ａ】図９ｂの９５．４分に記録された質量スペクトルを示す図である。
【図１１Ｂ】図９ｂの９５．４分に記録されたｍ／ｚ＝９８７．０６イオンに対するタンデム質量スペクトルを示す図である。
【図１２】本発明に係る尿タンパク体試料に対する分子量値とｐＩ値に対する図式を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図６】
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【図８】
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【国際調査報告】
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