(57)【要約】ホスホリパーゼA2（PLA2）フォリンは、その阻害が強力な抗痛覚過敏を誘導する脊髄内で発現される。炭化水素テールおよび4個の炭素テザーを有する2-オキソアミドからなる共通モチーフを含むPLA2阻害剤化合物が提供される。これらの化合物は、グループIVAカルシウム依存性PLA2（cPLA2）および／またはグループVIAカルシウム非依存性PLA2（iPLA2）および／またはグループV分泌型PLA2（sPLA2）を遮断する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（I）を有する化合物；およびその幾何異性体、エナンチオマー型、薬理学的もしくは免疫学的に許容される塩、またはプロドラッグ：
2009505990.tif 000034
式中、
R1は、直鎖状または分枝状である任意のC2-C8アルコキシ基であり；
R2は、任意の非存在、芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖、アルケニル鎖、もしくはアルキニル鎖であり、ここで該アルキル鎖、アルケニル鎖、もしくはアルキニル鎖は置換されてもよく；
R3は、芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル鎖であり；
n≧0、m≧0、k≧0である。
【請求項２】
k＞0であり、かつmおよびnの一方＞0である、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
kが2〜22である、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
R3がメチルである、請求項1〜3のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５】
mが0であり、かつnが1〜12である、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６】
mが0であり、nが2であり、かつR1が(-OCH2CH3)である、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７】
mが0であり、nが3であり、かつR1がt-ブトキシ(-OC(CH3)3)である、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８】
kが7であり、mが0であり、R1がメチルであり、R2が非存在であり、かつR3がアルケニル鎖である、請求項1記載の化合物。
【請求項９】
mが2であり、nが4であり、かつR1が(-OCH2CH3)である、請求項1記載の化合物。
【請求項１０】
mが0であり、nが4であり、かつR1が(-OCH2CH3)である、請求項1記載の化合物。
【請求項１１】
mが0であり、nが4であり、かつR1がt-ブトキシ(-OC(CH3)3)である、請求項1記載の化合物。
【請求項１２】
mが0であり、nが2であり、かつR1がt-ブトキシ(-OC(CH3)3)である、請求項1記載の化合物。
【請求項１３】
mが0であり、nが2であり、かつR1が(-OCH2CH3)である、請求項1記載の化合物。
【請求項１４】
mが0であり、nが1であり、かつR1がt-ブトキシ(-OC(CH3)3)である、請求項1記載の化合物。
【請求項１５】
kが13である、請求項9〜14のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６】
下記式I(a)を有する化合物；およびその幾何異性体、エナンチオマー型、薬理学的もしくは免疫学的に許容される塩、またはプロドラッグ：
2009505990.tif 000035
式中、
R1は、直鎖状または分枝状である任意のC1-C8アルコキシ基であり；
R2は、任意の非存在、芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖、アルケニル鎖、もしくはアルキニル鎖であり、ここで該アルキル鎖、アルケニル鎖、もしくはアルキニル鎖は置換されてもよく；
R3は、芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル鎖であり；
n≧0、m≧0、k≧0である。
【請求項１７】
R1がエトキシであり、R2が非存在であり、かつmが2である、請求項15記載の化合物。
【請求項１８】
kが13である、請求項16記載の化合物。
【請求項１９】
下記式（II）を有する化合物；およびその幾何異性体、エナンチオマー型、薬理学的もしくは免疫学的に許容される塩、またはプロドラッグ：
2009505990.tif 000036
式中、
Rは、直鎖状または分枝状、飽和または不飽和のC2-C8アルキル鎖、アルケニル鎖、またはアルキニル鎖であり；
R3は、置換されていてもよい任意の芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または置換されていてもよい直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖、アルケニル鎖、もしくはアルキニル鎖であり；
k≧0である。
【請求項２０】
R3がC10-C20アルケニルである、請求項19記載の化合物。
【請求項２１】
Rがエチルである、請求項19または20記載の化合物。
【請求項２２】
Rがt-ブチルである、請求項19または20記載の化合物。
【請求項２３】
Rがイソプロピルである、請求項19または20記載の化合物。
【請求項２４】
kが7である、請求項22記載の化合物。
【請求項２５】
kが12である、請求項22記載の化合物。
【請求項２６】
薬学的に許容される担体および請求項1〜15のいずれか一項記載の化学式（I）の化合物を含む、細胞または生物中のホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項２７】
阻害される酵素活性がホスホリパーゼcPLA2、iPLA2、およびsPLA2の酵素活性である、請求項26に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
化合物がAX048である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
化合物がAX057である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
化合物がAX113である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
化合物がAX111である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
化合物がAX114である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
化合物がAX110である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
化合物がAX105である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
薬学的に許容される担体および請求項16または17記載の化学式（Ia）の化合物を含む、細胞または生物中のホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項３６】
薬学的に許容される担体および請求項18〜25のいずれか一項記載の化学式（II）の化合物を含む、細胞または生物中のホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項３７】
薬学的に許容される担体および請求項24または25記載の化合物を含む、細胞または生物中の分泌型ホスホリパーゼA2（sPLA2）の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項３８】
薬学的に許容される担体および請求項2〜15のいずれか一項記載の化合物を含む、細胞または生物中の分泌型ホスホリパーゼA2（sPLA2）の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項３９】
薬学的に許容される担体および請求項17記載の化合物を含む、細胞または生物中の分泌型ホスホリパーゼA2（sPLA2）の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項４０】
薬学的に許容される担体および化合物AX015を含む、細胞または生物中の分泌型ホスホリパーゼA2（sPLA2）の酵素活性を特異的に阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項４１】
下記式（III）：
2009505990.tif 000037
の化合物、および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中のホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項４２】
下記式（IV）：
2009505990.tif 000038
の化合物、および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中のホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項４３】
下記式（V）：
2009505990.tif 000039
の化合物、および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中のホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項４４】
下記式（VI）：
2009505990.tif 000040
の化合物、および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中のグループIVAおよびグループVIAホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項４５】
下記式（VI）：
2009505990.tif 000041
の化合物、および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中のグループIVAおよびグループVIAホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【請求項４６】
請求項1〜34のいずれか一項記載の1つまたは複数の化合物の、グループIVAおよびグループVIAホスホリパーゼA2の阻害有効量を投与する工程を含む、哺乳動物における炎症プロセスの効果を調節するための方法。
【請求項４７】
化合物が、グループVホスホリパーゼA2阻害有効量でさらに投与される、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
グループVホスホリパーゼA2特異的阻害剤の有効量を投与する工程を含む、哺乳動物における炎症プロセスの効果を調節するための方法。
【請求項４９】
阻害剤が、グループIVAまたはグループVIAホスホリパーゼA2に対して統計学的に有意な阻害効果を発揮しない、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
阻害剤がAX015である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
阻害剤が、グループIVAホスホリパーゼA2に対して統計学的に有意な阻害効果を発揮しない、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
阻害剤がAX093またはAX081である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
調節される炎症プロセスの効果の1つが中枢神経系の炎症である、請求項46〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
調節される炎症プロセスが脊髄によって媒介される、請求項46〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
脊髄によって媒介される、調節される炎症プロセスの1つが痛覚過敏である、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
痛覚過敏が温熱性痛覚過敏である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
哺乳動物がヒトである、請求項46に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳動物がヒトである、請求項48に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府援助の言明
本発明は、米国国立衛生研究所（the United States National Institutes of Health）NIH補助金番号GM 20501およびGM 064611からの資金調達で、全体としてまたは部分的に援助された。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組織損傷および炎症は、適度な嫌悪刺激、例えば、痛覚過敏に対する感受性の明白な促進の発生に導く。この現象は、シクロオキシゲナーゼ（COX）活性を遮断する薬剤によって減少されることが長い間認識されてきた（Vane, Nat. New Biol, 231 :232-235, 1971）。初期の研究は、この作用が末梢効果から生じることを示唆したが（Ferreira, Nat. New Biol, 240:200-203, 1972）、続いて、脊髄COXの阻害もまた、促進された状態の逆転に導くことが見い出された（Yaksh, et al., 「Acetylsalicilic Acid: New Uses for an Old Drug」, pp.137-152 (Barnet, et al., editors) Raven Press, 1982; Taiwo and Levine, J. Neurosci., 8:1346-1349, 1988）。この作用と一致して、組織損傷から生じるような持続性の小さな救心性の入力が、脊髄送達されたCOX阻害剤によって遮断される様式で、インビボでプロスタノイドの有意な脊髄放出を誘発することが示された（Ramwell, et al., Am. J. Physiol, 211 :998-1004, 1966; Yaksh, 前出, 1982; Malmberg and Yaksh, Science, 257:1276-1279, 1992; Malmberg and Yaksh, J. Neurosci., 15:2768-2776, 1995; Ebersberger, et al., 1999, Samad et al., Nature, 410:471-475, 2001, and Yaksh,, et al., J. Neurosci., 21:5847-5853, 2001）。プロスタグランジン（PG）合成の重要な要素はホスホリパーゼA2（PLA2）である。なぜなら、これは、COX-媒介性プロスタノイド形成のための基質であるアラキドン酸を生成するために必要とされるからである。
【０００３】
ホスホリパーゼA2（PLA2）は、遊離の脂肪酸およびリゾリン脂質を産生する、膜リン脂質のsn-2位からの脂肪酸エステルの加水分解を触媒する酵素のスーパーファミリーを構成する。細胞内PLA2には、炎症促進性酵素と一般的に見なされている細胞質性グループIVA PLA2（GIVA PLA2、本明細書ではcPLA2とも呼ばれる）；カルシウム非依存性グループVIA PLA2（GVIA PLA2、本明細書ではiPLA2とも呼ばれる）；および分泌型グループV PLA2（sPLA2）がある。GVIA PLA2は、実際には、85〜88kDaの範囲の細胞質酵素の一群であり、同じ遺伝子のいくつかの別個のスプライシング変異体として発現され、これらの2つのみ（グループVIA-1およびVIA-2 PLA2）が触媒的に活性であることが示されてきた(Larsson, et al., J. Biol. Chem. 273: 207-214, 1998)。炎症プロセスにおけるGVIA PLA2の役割は明確でないが、しかし、この酵素は、細胞内の基礎的な代謝機能のための主要なPLA2と思われ、これらの機能としては、膜恒常性（Balsinde, et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 92:8527-8531, 1995; Balsinde, et al., J. Biol. Chem., 272: 29317-29321, 1997; Balsinde, et al., J. Biol. Chem., 272:16069-16072, 1997; Ramanadham, et al., J. Biol. Chem., 274:13915-13927, 1999; Birbes, et al.,. Eur. J. Biochem., 267:7118-7127, 2000; およびMa, et al., Lipids, 36:689-700, 2001.）、インスリン受容体シグナル伝達（Ramanadham, et al., J. Biol. Chem., 274: 13915-13927, 1999; Ma, et al., J. Biol. Chem., 276: 13198-13208, 2001）およびカルシウムチャネル調節（Guo, et al., J. Biol. Chem., 277: 32807-32814, 2002; Cummings, et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol, 283 : F492-498, 2002）を含む機能が報告されている。GVIA、GIVAおよびGV PLA2は、中枢神経系炎症プロセスにおいてすべて存在し、そこで活動的な役割を果たしている（例えば、Sun, et al., J.Lipid Res., 45 :205-213, 2004を参照されたい）。
【０００４】
GVIA PLA2酵素はすべて、部位特異的変異誘発によって確認された触媒性セリンを伴うコンセンサスリパーゼモチーフ、Gly-Thr-Ser*-Thr-Glyを含む（Larsson, et al., J. Biol. Chem., 273:207-14, 1998; Tang, et al., J. Biol. Chem., 272: 8567-8575, 2002）。触媒のために決定的に重要な他の残基はまだ確認されておらず、これがsn-2結合を切断するメカニズムは確立されていないものの、GVIA PLA2は、グループIVA PLA2と同様に、触媒性Ser/Asp二つ組を有するヒドロラーゼであるようである（Dessen, et al., Cell 1999, 97: 349-360, 1999; Dessen, Biochim. Biophys. Acta,1488:40-47, 2000; Phillips, et al., J. Biol. Chem., 278: 41326-41332, 2003）。グループIVAカルシウム依存性グループPLA2型（グループIVA cPLA2）およびグループVIAカルシウム非依存性グループiPLA2型（グループVIA iPLA2）および分泌型グループIIおよびV sPLA2型（Lucas, et al., Br. J. Pharmacol, 144:940-952, 2005, Svensson et al., Annu.Rev. Pharmacol. Toxicol, 42:553-555, 2005）の構成的mRNAおよびタンパク質は、脊髄で検出されている。
【０００５】
インビトロおよびインビボでグループIVA cPLA2を阻害する2-オキソアミドの新規な一連の構造の発見（Kokotos, et al., J. Med.Chem., 45:2891-2893, 2002; Kokotos, et al., J. Med.Chem., 47:3615-3628, 2004）が最近報告された。その初期の研究において、2-オキソアミドは、ラット足カラギーナン誘導性浮腫アッセイにおいて炎症を阻害することが観察された（Kokotos, et al., 前出、2004）。
【０００６】
基質の類似性、共通の阻害剤のクラス、触媒性セリンの領域中の非常に限定された配列相同性、ならびにGIVAおよびGVIA PLA2の活性部位の類似性に基づいて、GIVA PLA2は、GVIA PLA2との交差反応を示し得る。それゆえに、インビボで分子間を区別できるGIVAおよびGVIA PLA2選択性阻害剤を設計することは困難であった。さらに、GV PLA2のための選択性阻害剤は、設計することが困難であった。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、グループIVA cPLA2および／またはグループVIA iPLA2および／またはsPLA2に選択的であるものを含む、ホスホリパーゼA2（PLA2）の強力な2-オキソアミド阻害剤、ならびに阻害化合物の使用のための方法を提供する。これらの化合物は、痛覚過敏（刺激に対する過敏性を通して経験される痛み）などの状態をもたらす脊髄媒介性炎症プロセスに原因として関連する脊髄PLA2活性を阻害する際にとりわけ有用である。本発明の阻害化合物は、各々、炎症においてもまた関与するシクロオキシゲナーゼ酵素の排除に至るまで、PLA2に特異的に作用する。
【０００８】
本発明のPLA2阻害剤は、細胞質性（cPLA2）および／またはカルシウム非依存性（iPLA2）および／または分泌型（sPLA2）のPLA2の異性体に対する高度な特異性を示す2-オキソアミド化合物である。本発明の代表的な化合物は、5つの関連2-オキソアミド類縁体、AX006、AX010、AX048、AX057、およびAX015である（後者はsPLA2に弱く阻害性であるのみである）。これらの化合物のうちで、cPLA2活性を阻害する際の効力の順位付けの順番は、AX048>AX006>AX057>AX010であり；iPLA2活性を阻害する際のそれは、AX048>AX057>AX006>AX010であった。sPLA2については、AX048は、cPLA2およびiPLA2について示されたものと比較し得る阻害活性を実証したのに対して、AX015は、他の2つのPLA2異性体に対する有意な効果を伴わずに、sPLA2を阻害した。全体として、これらの5つの化合物の間のsPLA2阻害効力の範囲はAX057>AX048>AX015>AX010であった（AX006はsPLA2に対しては試験されなかった）。
【０００９】
より詳細には、本発明の1つの局面において、下記式（I）：
2009505990.tif 000002
を有する化合物；およびその任意の幾何異性体、エナンチオマー型、薬理学的もしくは免疫学的に許容される塩、またはプロドラッグが提供され、
式中、R1は、直鎖状または分枝状である任意のC2-C8アルコキシ基であり；R2は、任意の非存在、芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖、アルケニル鎖、もしくはアルキニル鎖であり、ここで該アルキル鎖、アルケニル鎖、またはアルキニル鎖は置換されてもよく；R3は、芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル鎖であり；n≧0、m≧0、k≧0（好ましくは13）である。1つの態様において、mは0であり、nは2であり、かつR1はエトキシである（例えば、AX048）。別の態様において、mは0であり、nは3であり、かつR1はt-ブトキシである（例えば、AX057）。別の態様において、mは2であり、nは4であり、かつR1はエトキシである（例えば、AX065）。さらなる態様において、mは0であり、nは4であり、かつR1はt-ブトキシである（例えば、AX105）。sPAL2に対して約95〜100%効力を有する態様において、mは0であり、nは1であり、かつR1はt-ブトキシであり（例えば、AX113）、またはmは0であり、nは0であり、かつR1はエトキシであり（AX114）、またはmは0であり、nは1であり、かつR1はt-ブトキシである（例えば、AX111）。
【００１０】
本発明の別の局面において、下記式(Ia)：
2009505990.tif 000003
の化合物；およびその任意の幾何異性体、エナンチオマー型、薬理学的もしくは免疫学的に許容される塩、またはプロドラッグが提供され、
式中、
R1は、直鎖状または分枝状である任意のC1-C8アルコキシ基であり；R2は、任意の非存在、芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖、アルケニル鎖、もしくはアルキニル鎖であり、ここで該アルキル鎖、アルケニル鎖、もしくはアルキニル鎖は置換されてもよく；R3は、芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル鎖であり；m≧0、k≧0である。1つの態様において、R1はメトキシであり、R2はメチルであり、かつmは2である。別の態様において、R1はC2-C4アルコキシであり、R2はメチルであり、かつmは2である。なお別の態様において、R1はエトキシであり、R2は非存在であり、かつmは2である（例えば、AX093）。
【００１１】
本発明の別の局面において、下記式（II）：
2009505990.tif 000004
の化合物；およびそのすべての幾何異性体、エナンチオマー型、薬理学的もしくは免疫学的に許容される塩、またはプロドラッグが提供され、
式中、
Rは、直鎖状または分枝状、飽和または不飽和のC2-C8アルキル鎖、アルケニル鎖、またはアルキニル鎖であり；R3は、置換されていてもよい任意の芳香族基、複素環基、もしくは炭素環基、または置換されていてもよい直鎖状もしくは分枝状、飽和もしくは不飽和のアルキル鎖、アルケニル鎖、もしくはアルキニル鎖であり；k≧0である。sPLA2に対して特異性を有する態様において、Rはt-ブトキシであり、かつkは7であり（例えば、AX055）、sPLA2に対して優先的な（たとえ弱くても）活性を有する1つの態様において、RはNH2である（例えば、AX015）。
【００１２】
本発明の他の局面に従って、薬学的に許容される担体を、化学式I、IaまたはIIのいずれかの化合物と合わせることによって、薬学的組成物が提供される。さらなる薬学的組成物は、以下のように同様に提供される。
【００１３】
例えば、下記式（III）
2009505990.tif 000005
の化合物および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中でホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【００１４】
さらなる例によって、下記式（IV）
2009505990.tif 000006
の化合物および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中でホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【００１５】
さらなる例によって、下記式（V）
2009505990.tif 000007
の化合物および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中でホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【００１６】
なおさらなる例において、下記式（VI）
2009505990.tif 000008
の化合物および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中でグループIVAおよびグループVIAホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【００１７】
およびさらなる例において、下記式（VII）
2009505990.tif 000009
の化合物および薬学的に許容される担体を含む、細胞または生物中でグループIVAおよびグループVIAホスホリパーゼA2の酵素活性を阻害する際の使用のための薬学的組成物。
【００１８】
本発明のさらなる局面において、グループIVAおよびグループVIAホスホリパーゼA2阻害有効量、ならびに／またはグループVホスホリパーゼA2阻害有効量の本発明の1種または複数の化合物を投与する工程を含む、哺乳動物における炎症プロセスの効果を調節するための方法が提供される。1つの態様において、調節される炎症プロセスの効果の1つは中枢神経系炎症である。別の態様において、調節される炎症プロセスは脊髄媒介性である。さらなる態様において、調節される脊髄媒介性炎症プロセスの1つは痛覚過敏であってもよい。特定の他の態様において、投与されるホスホリパーゼA2阻害剤はsPLA2に特異的であるか（すなわち、cPLA2もしくはiPLA2に対しては統計学的な効果を伴わない）、またはsPLA2およびiPLA2に特異的である（すなわち、cPLA2に対しては統計学的効果を伴わない）。
【００１９】
発明の詳細な説明
2003年3月7日に出願された同時係属中の共有に係る米国一般特許（Utility Patent）出願第10/506,059号の内容は、この参照により本明細書に組み入れられる。本発明はさらに、以下に詳細に説明される。
【００２０】
本明細書に引用されるすべての特許および他の参考文献は、本発明が属する当技術分野の当業者のレベルを示すものであって、これらは、あたかも各々の参考文献がその全体において個別に参照により組み入れられるのと同程度まで、任意の表および図面を含むそれらの実体において、参照により組み入れられる。
【００２１】
当業者は、言及された目的および利点、ならびにその中に固有である目的および利点を得るために、本発明が十分に適合されることを容易に認識する。現在、好ましい態様に代表的であると本明細書に記載される方法、変動（variances）および組成は例示的であり、本発明の範囲に対する限定として意図されない。その中および他の用途における変化は当業者であれば気付き、これらは本発明の技術思想の範囲内に含まれ、特許請求の範囲によって定義される。
【００２２】
本明細書で提供される定義は、他に示されない限り、当業者によって共通して理解される意味からの限定であることを意図しない。
【００２３】
A．本発明の化合物の構造の概観
本発明の化合物は、炭化水素テールおよび4個の炭素テザーを有する2-オキソアミドに基づいて構築される。これらの薬剤の機能性における重要な考慮は、6〜8の範囲である、これらの高いcLogP値である。5よりも大きなlogP値を有する薬剤は「薬物であり得る」ことがないかもしれないことが広く考慮されている（Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 46:3-26, 2001）。本発明の系において、薬物作用の標的が細胞質中にあることに注目することは重要である。このことは、PLA2と相互作用するために分子が細胞膜を容易に横切ることを可能にする親油性を分子が有することを必要とする。
【００２４】
これらの薬剤が示すインビトロ活性およびインビボ活性は、これらの分子が直面する分布の複雑な問題に十分に依存する可能性があり；AX048は、特に、プロドラッグとして作用している可能性がある。
【００２５】
カルボキシル基は、cPLA2を阻害するために必要であるように思われ、これは、おそらく、天然の基質リン脂質のリン酸頭基の模倣物として作用する。顕著には、天然の基質リン脂質中の切断されやすいsn-2エステル結合とリン酸頭基の間の間隔は、γ-アミノ酪酸ベースの2-オキソアミドまたはγ-ノルロイシンベースの2-オキソアミドと類似である。それゆえに、本発明の2-オキソアミド阻害剤のカルボキシル基は、cPLA2の活性部位において、ある程度の特異性で相互作用する可能性がある。sPLA2中にはセリン求核基は存在しないが、sPLA2に対する活性を有する本発明の2-オキソアミドPLA2阻害剤のリン脂質基質との類似性は、sPLA2活性部位にこれらをおそらく結合させる。従って、R2位における遊離のカルボキシル基は、本発明において必要であると推定されている。さらに、sPLA2に対する化合物AX015の特異性を他の異性体の排除に対して仮定すると（弱い阻害活性であるにも関わらず）、一級アミドの存在および分子中の低い疎水性は、その活性において役割を果たすことができ、それゆえに、sPLA2阻害剤の所望の特性である可能性がある。
【００２６】
B．PLA2阻害の多重効果
治療的には、体系的な生物的に利用可能なPLA2-選択性薬剤の開発を示す本研究は、痛み以外の治療標的に対して関連する可能性がある。従って、種々の神経炎症プロセスもまた、それらの神経軸索（neuraxial）PLA2異性体の活性化を通して媒介される可能性がある。
【００２７】
末梢性炎症および組織損傷の表面において侵害性刺激の誇張プロセスが続いて起こること、およびこの促進は脊髄レベルにおいて増強された侵害性プロセスに導く下流のカスケードの求心性誘発開始を部分的に反映することを説明することは明白である。現在の証拠は、このカスケードの重要な構成成分が脊髄関連プロスタノイドの作用と関連していることを示唆している。この主張の裏付けは、プロスタグランジンの脊髄送達が痛覚過敏を誘導すること、および組織損傷後にこれらの脂肪酸が脊髄の細胞外間隙に放出されるという観察から大部分が生じている。加えて、COX阻害剤の脊髄送達は、プロスタグランジンの放出、ならびに、末梢損傷によって、またはSPおよび／もしくはグルタミン酸などの小さな求心性神経伝達物質のIT注射によるこれらの回路の直接的活性化によって誘導される促進状態を減少する（Svensson and Yaksh、前出、2002を参照されたい）。このカスケードは、シクロオキシゲナーゼによって媒介されるものに先行する上流の連関；それゆえに、脊髄iPLA2、cPLA2、およびsPLA2への関心を追求することの妥当性を示唆するために十分であった。
【００２８】
PLA2活性の他の生成物が侵害性プロセスにおいて重要であるという以下のような実質的な証拠もまた存在している：i）PLA2によって生成されたアラキドン酸はNMDAイオノフォア機能を直接的に増強することができる（Richards, et al., Eur.J.Neurosci, 17:2323-2328, 2003）。NMDA受容体は、脊髄レベルでシナプス前およびシナプス後促進において重要な役割を果たすと考えられている（L'Hirondel, et al., Eur.J.Neurosci., 11:1292-1300, 1999; Richards, et al.、前出、2003）。ii）PLA2の作用によって形成されたアラキドン酸は、イソプロスタンのシクロオキシゲナーゼ非依存性合成のために必要である必須基質もまた提供する。脊髄イソプロスタンを用いた研究は、これらが伝達物質放出およびニューロン放電の促進を開始すること、およびこれらの脊髄送達は痛覚過敏をもたらすことを示してきた（Evans, et al., J.Pharmacol.Exp.Ther., 293:912-920, 2000）。iii）アルキルリン脂質である血小板活性化因子（PAF）はPLA2による膜脂質加水分解から生じる。PAFは脊髄送達後に顕著な異痛症を生じる（Morita, et al., Pain, 111:351-359, 2004）。この脂質メディエーターは脊髄中に存在し、興奮したミクログリア細胞から放出されることが報告されてきた（Jaranowska, et al., Mol.Chem.Neuropathol, 24:95-106, 1995）。これらの因子は、プラスタノイドのそれと類似した生理学的プロフィールを有する。iv）PLA2はリゾリン酸の形成をもたらす。これらの生成物はまた、最近、痛みのプロセスが促進された状態にも関連付けられてきた（Inoue, et al., Nat. Med., 10:712-718, 2004; Seung Lee, et al., Brain Res., 1035:100-104, 2005）。手短に言えば、上記の構成成分を考慮すると、脊髄侵害性プロセスに対してより顕著な効果は、PLA2によって表されるものなどの、COXに対しる上流の連関を遮断することによって生じる可能性があることを仮定することが合理的である。
【００２９】
PLA2の阻害は、中心的（IT-SP）と末梢的（足底内カラギーナン）の両方で開始される痛覚過敏に対して顕著な効果を発揮する。本発明の化合物は、グループIVA cPLA2および／またはグループVIA iPLA2および／またはグループV sPLA2を可逆的に遮断することによってこのような阻害を達成し、ならびに脊髄送達と全身送達の両方の後でそうする。例えば、AX010は弱い効果を発揮し、AX006はグループIVA PLA2優先的であるのに対して、AX048およびAX057はグループIVA cPLA2およびグループVIA iPLA2優先的であり、ならびにAX015はsPLA2優先的である（たとえ弱い阻害活性を有するとしても）。
【００３０】
加えて、全身的に投与された本発明の化合物は、任意の末梢性損傷の非存在下でIT-SPによって誘発された痛覚過敏を遮断する。このことは、全身的に送達された化合物の抗痛覚過敏活性が、中枢作用によって媒介されることを示唆する。
【００３１】
C．本発明のPla2阻害剤の合成および構造
本発明の化合物は、阻害剤が以下の2つの成分からなるはずであるという原理に基づいて構造的に設計される：（a）活性部位のセリン残基と反応可能である求電子基、および（b）酵素の基質結合間隙において特異的相互作用と適切な配向の両方のために必要な化学モチーフを含む親油性セグメント（Kokotos, J. Mol. Catal. B-Enzym. 2003, 22:255-269）。このストラテジーは、膵臓および胃のリパーゼの有効な阻害剤としての親油性2-オキソアミド（Chiou, et al., Lipids 2001, 36:535-542; Chiou, et. al., Org. Lett. 2000, 2:347-350）、2-オキソアミドおよびビス-2-オキソアミドトリグリセロール類縁体（Kotsovolou, et al., J. Org. Chem. 2001, 66:962-967; Kokotos, et al., Chemistry-A European Journal 2000, 6:4211-4217）、ならびに親油性アルデヒド（Kotsovolou, et al, Org. Lett. 2002, 4:2625-2628）およびトリフルオロメチルケトン（Kokotos, et al., ChemBioChem 2003, 4: 90-95）の開発において首尾よく応用されてきた。
【００３２】
従って、本発明は、GIVA PLA2を阻害する新規なクラスの2-オキソアミドを提供する（Kokotos, et al., J. Med. Chem. 2002, 45:2891-2893; Kokotos, et al., J. Med. Chem. 2004, 47:3615-3628）。この点において、GVIA PLA2が求核性残基としてセリンを使用することが決定されてきた（Tang, et al., J. Biol. Chem., 272:8567-8575, 1997）。本発明の2-オキソアミドは、以下のスキーム1に示される一般構造を共有する：
2009505990.tif 000010
【００３３】
オレイン酸またはフェニル基に基づく遊離のカルボキシル基またはカルボキシメチルエステル基のいずれかおよび2-オキソアシル残基を含む2-オキソアミド阻害剤の合成が図1に表現される。さらに、同じスキームにおいて、γ-アミノ-α,β-不飽和酸に基づく阻害剤の合成が示される。
【００３４】
これらの研究のために、AX006およびAX010は以前に記載されたように調製した（Kokotos, et al.、前出 2002; Kokotos et al.、前出、2004）。薬剤AX048およびAX057の合成および特徴付けは、本発明の化合物の合成を代表するものとして本明細書に記載され、図1は、以下にさらに詳述される合成スキームを要約する。
【００３５】
1．4-アミノ-ブタノエートのエステルとの2-ヒドロキシ-ヘキサデカン酸のカップリング
CH2Cl2（20 mL）中の2-ヒドロキシ-ヘキサデカン酸（2.0 mmol）および4-アミノ-ブタノエートのエステル（2.0 mmol）の攪拌溶液に、Et3N（6.2 ml、4.4 mmol）ならびに続いてWSCI（0.42 g, 2.2 mmol）およびHOBt（0.32 g、2.0 mmol）を0℃で加えた。この反応混液を、0℃で1時間および室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、EtOAc（20 mL）を加えた。有機層をブライン、1N HCl、ブライン、5% NaHCO3、およびブラインで連続して洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、ならびに減圧下で蒸発させた。残渣は、CHCl3-MeOH（95:5）を溶離液として使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００３６】
エチル4-[(2-ヒドロキシヘキサデカノイル)アミノ]ブタノエート
収率72%；
2009505990.tif 000011
【００３７】
tert-ブチル4-[(2-ヒドロキシヘキサデカノイル)アミノ]ブタノエート
収率64%；
2009505990.tif 000012
【００３８】
2．2-ヒドロキシ-アミドの酸化
トルエン-EtOAc（15 mL）の混液中の2-ヒドロキシ-アミド（1.00 mmol）の溶液に、水（1.3 mL）中のNaBr（0.11 g、1.05 mmol）の溶液、続いてAcNH-TEMPO（2 mg、0.01 mmol）を加えた。-5℃まで冷却した得られた二相系に、NaHCO3（0.25 g、3 mmol）を含む0.35 M NaOCl（3.1 mL、1.10 mmol）の水溶液を、1時間の時間にわたって-5℃で激しく攪拌しながら滴下して加えた。この混液をさらに15分間0℃にて攪拌した後、EtOAc（15 mL）およびH2O（5 mL）を加えた。水層を分離し、EtOAc（10 mL）で洗浄した。合わせた有機層を、KI（0.04 g）を含む5%クエン酸水溶液（15 mL）、10% Na2S2O3水溶液（6 mL）、およびブラインで連続して洗浄し、Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィー［EtOAc-石油エーテル 1:9（沸点40〜60℃）］によって精製した。
【００３９】
エチル4-[(2-オキソヘキサデカノイル)アミノ]ブタノエート（AX048）
収率86%；白色固形物；融点63〜64℃；
2009505990.tif 000013
【００４０】
tert-ブチル4-[(2-オキソヘキサデカノイル)アミノ]ブタノエート（AX057）
収率95%；白色固形物；融点61〜62℃；
2009505990.tif 000014
3．2-オキソアミド阻害剤の合成
a．アミノ成分との2-ヒドロキシ酸のカップリング
CH2Cl2（20 mL）中の2-ヒドロキシ酸（2.0 mmol）およびγ-アミノ酪酸メチル塩酸塩（hydrochloride methyl γ-aminobutyrate）（2.0 mmol）の攪拌溶液に、Et3N（6.2 mL、4.4 mmol）および引き続いて1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド（WSCI）（0.42 g、2.2 mmol）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）（0.32 g、2.0 mmol）を0℃で加えた。この反応混液を0℃で1時間、および室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、EtOAc（20 mL）を加えた。有機層をブライン、1N HCl、ブライン、5% NaHCO3、およびブラインで連続して洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、ならびに減圧下で蒸発させた。残渣は、CHCl3を溶離液として使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００４１】
4-(2-ヒドロキシ-5-フェニル-ペンタノイルアミノ)-酪酸メチルエステル（2a）
収率82%；白色固形物；融点34〜35℃；
2009505990.tif 000015
【００４２】
4-(2-ヒドロキシ-6-フェニル-ヘキサノイルアミノ)-酪酸メチルエステル（2b）
収率85%；白色固形物；融点50〜51℃；
2009505990.tif 000016
【００４３】
4-(2-ヒドロキシ-ノナデク-10-エノイルアミノ)-酪酸メチルエステル（2c）
収率82%；白色固形物；融点55〜57℃；
2009505990.tif 000017
【００４４】
b．メチルエステル基を含む2-ヒドロキシ-アミドの酸化（方法A）
トルエン-EtOAc 1:1の混液（30 mL）中の2-ヒドロキシ-アミド（5.00 mmol）の溶液に、水（2.5 mL）中のNaBr（0.54 g、5.25 mmol）の溶液、続いてTEMPO（11 mg、0.050 mmol）を加えた。-5℃まで冷却した得られた二相系に、NaHCO3（1.26 g、15 mmol）を含む0.35 M NaOCl（15.7 mL、5.50 mmol）の水溶液を、1時間の時間にわたって-5℃で激しい攪拌下で滴下して加えた。この混液をさらに15分間0℃にて攪拌した後、EtOAc（30 mL）およびH2O（10 mL）を加えた。水層を分離し、EtOAc（20 mL）で洗浄した。合わせた有機層を、KI（0.18 g）を含む5%クエン酸水溶液（30 mL）、10% Na2S2O3水溶液（30 mL）、およびブラインで連続して洗浄し、Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィー［EtOAc-石油エーテル（沸点40〜60℃）、1:9］によって精製した。
【００４５】
4-(2-オキソ-5-フェニル-ペンタノイルアミノ)-酪酸メチルエステル（AX037）
収率67%；白色固形物；融点30〜31℃；
2009505990.tif 000018
【００４６】
4-(2-オキソ-6-フェニル-ヘキサノイルアミノ)-酪酸メチルエステル（AX038）
収率75%；白色固形物；融点52〜54℃；
2009505990.tif 000019
【００４７】
c．メチルエステル基を含む2-ヒドロキシ-アミドの酸化（方法B）
乾燥CH2Cl2（20 mL）中の2-ヒドロキシ-アミド（1 mmol）の溶液に、Dess-Martinペリオジナン（0.64 gr, 1.5 mmol）を加え、この混液を室温で2時間攪拌した。有機溶液を10% NaHCO3水溶液で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、および有機溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を再結晶［EtOAc/石油エーテル（沸点40〜60℃）］により精製した。
【００４８】
4-(2-オキソ-ノナデク-10-エノイルアミノ)-酪酸メチルエステル（AX041）
収率82%；油状固形物；
2009505990.tif 000020
【００４９】
c．メチルエステルのけん化
ジオキサン-H2O（9:1、20 mL）の混液中の化合物2aまたは2b（2.00 mmol）の攪拌溶液に、1N NaOH（2.2 mL、2.2 mmol）を加え、この混液を室温で12時間攪拌した。有機溶媒を減圧下で蒸発させ、H2O（10 mL）を加えた。水層をEtOAcで洗浄し、1N HClで酸性化し、およびEtOAc（3×12 mL）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、および減圧下で蒸発させた。残渣を再結晶［EtOAc/石油エーテル（沸点40〜60℃）］後に精製した。
【００５０】
4-(2-ヒドロキシ-5-フェニル-ペンタノイルアミノ)-酪酸（3a）
収率79%；白色固形物；融点63〜65℃；
2009505990.tif 000021
【００５１】
4-(2-ヒドロキシ-6-フェニル-ヘキサノイルアミノ)-酪酸（3b）
収率86%；白色固形物；融点78〜80℃；
2009505990.tif 000022
【００５２】
d．遊離のカルボキシル基を含む2-ヒドロキシ-アミドの酸化（方法C）
この場合においては、混ぜる前に水層を酸化し、次いでEtOAcで抽出し、ならびに合わせた有機層を、KIを含む5%クエン酸水溶液および10% Na2S2O3水溶液（30 mL）で洗浄したという違いがある以外は、手順は上記の方法Aに従うものと同じである。残渣はカラムクロマトグラフィー［EtOAc-石油エーテル（沸点40〜60℃）］によって精製した。
【００５３】
4-(2-オキソ-5-フェニル-ペンタノイルアミノ)-酪酸（AX036）
収率48%；白色固形物；融点65〜67℃；
2009505990.tif 000023
【００５４】
4-(2-オキソ-6-フェニル-ヘキサノイルアミノ)-酪酸（AX035）
収率47%；白色固形物；融点60〜62℃；
2009505990.tif 000024
【００５５】
4-(2-オキソ-ノナデク-10-エノイルアミノ）-酪酸（AX040）
収率69%；白色固形物；融点57〜59℃；
2009505990.tif 000025
【００５６】
化合物5は以前に記載されたように調製した（Kokotos, G., Kotsovolou, S., Six, D.A., Constantinou-Kokotou, V., Beltzner, C.C., and Dennis, E.A., J. Med. Chem., 45: 2891-2893, 2002）。化合物AX073およびAX074は上記の手順に従って調製した。
【００５７】
4-(2-オキソ-ヘキサデカノイルアミノ)-オクト-2-エン酸メチルエステル（AX073）
白色固形物；融点48〜50℃；
2009505990.tif 000026
【００５８】
4-(2-オキソ-ヘキサデカノイルアミノ)-オクト-2-エン酸（AX074）
白色固形物；融点65〜67℃；[α]D-7.7 (c 0.84 CHCl3)；
2009505990.tif 000027
【００５９】
阻害剤AX001、AX002、AX006、AX009、AX010、およびAX015は、以前に記載されたように調製した（Kokotos, et al., (2002) J. Med. Chem. 45, 2891-2893.; Kokotos, et al., (2004) J. Med. Chem. 47, 3615-3628）。
【００６０】
エチルおよびtert-ブチル4-アミノ-ブタノエートは、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）の存在下で、縮合剤として1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド（WSCI）を使用して2-ヒドロキシ-ヘキサデカン酸とカップリングした。合成した2-ヒドロキシアミドは、触媒量の4-アセトアミド-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-イルオキシ遊離基（AcNH-TEMPO）の存在下でNaOClを用いて酸化して、化合物AX048およびAX057を産生した（図1A）。化合物AX035-AX041およびAX073-AX074は、図1Bに示されるスキームに従って合成した。
【００６１】
D．本発明の2-オキソアミド阻害剤によるGIVAおよびGVIA PLA2選択的阻害
多数の2-オキソアミドを、インビトロアッセイにおけるPLA2の阻害について試験した。表1a、1bおよび2に要約されるデータは、他に注記されない限り、XI(50)値として表される。XI(50)は、50%阻害を生じた阻害剤濃度として定義される。GIVAおよびGVIA PLA2は、三次元的な溶液中よりはむしろ二次元脂質界面において活性であるので、XI(50)が、より一般的なIC50とは対照的に使用される（Deems, Anal. Biochem., 287:1-16, 2000）。2-オキソアミド阻害剤は、おそらくミセル界面に分配し、それゆえに、バルク濃度（モル濃度単位）とは対照的に、表面濃度のパーセンテージ（モル画分）として表現されなければならない（Kokotos, et al., J. Med. Chem., 45:2891-2893, 2002）。
【００６２】
表1aにおいて列挙された14種の化合物の中で、5種が、試験した最大濃度でGVIA PLA2の少なくとも部分的阻害を示す。表1bにおいて示されるさらなる7種の化合物の中で、3種が、GVIA PLA2ならびにGIVA PLA2およびGV PLA2の少なくとも部分的な阻害を示す。
【００６３】
（表１ａ）2-オキソアミド阻害剤の構造ならびにそれらのGIVAおよびGVIA PLA2に対する効果
2009505990.tif 000028
2009505990.tif 000029
aND：最大用量において無視できる阻害（0〜25%）。bLD：最大用量において限定された阻害（25〜50%）。c参考文献22から取られたデータ。
【００６４】
（表１ｂ）2-オキソアミド阻害剤の構造ならびにそれらのGIVAおよびGVIA PLA2に対する効果
2009505990.tif 000030
N.D.は0.091モル画分における25%以下の阻害を示し、L.D.は0.091モル画分における25%と50%の間の阻害を示す。XI(50)は、酵素を50%阻害するために必要とされる全基質界面における阻害剤のモル画分である。XI(50)がより一般的なIC50またはKIの代わりに使用される理由は、PLA2が細胞膜、リン脂質ベシクル、またはリン脂質ミセルなどのリン脂質表面上でのみ活性であり、そこにその基質リン脂質が存在するからである。
【００６５】
最初の2-オキソアミドAX001およびAX015では、どちらもGIVAまたはGVIA PLA2の有意な阻害を示さない。R1位またはR2位のいずれかに長い炭素鎖を有する2番目の2-オキソアミド、AX002およびAX009は、GVIA PLA2の限定された阻害を示したが、GIVA PLA2の検出可能な阻害を示さなかった。R1位に置換フェニル鎖を含む4種の2-オキソアミド（AX035-AX038）はGVIA PLA2を阻害しなかった。このことは、フェニル含有フルオロケトンまたはフルオロホスフェートの選択性の以前の報告を考慮すると、予想外のことである。フェニル含有2-オキソアミドはいずれもGIVA PLA2を阻害しない。
【００６６】
遊離のカルボキシル基（AX006、AX040、AX074）を含む2-オキソアミドはGIVA PLA2を阻害するが、GVIA PLA2を阻害しない。実際に、すべての場合において、これらの化合物は酵素活性を増強する。増加したGIVA PLA2活性は、遊離のカルボキシル基を有する阻害剤の付加によるミセル表面における負電荷の増加に起因する可能性がある。GIVA PLA2の阻害剤とは異なり、GVIA PLA2の阻害剤（AX010、AX041、AX073）は電荷を有さない。AX006およびAX010を比較したときには電荷の効果が強調され、AX010は、AX006において見い出される遊離のカルボキシル基の代わりにカルボキシルメチルエステルを有する。AX010は限定されたGVIA PLA2の阻害を示すが、GIVA PLA2を有意に阻害しない。AX006は、0.091モル画分までの濃度ではGVIA PLA2を有意に阻害しないが、0.017モル画分のXI(50)値を有するGIVA PLA2の強力な阻害剤である（Kokotos, et al., J. Med. Chem., 45:2891-2893, 2002）。AX041は、0.067モル画分のXI(50)値を有するGVIA PLA2の阻害剤であり、興味深いことに、これは、0.012モル画分のXI(50)値でGIVA PLA2もまた阻害する。AX041の電荷を有する変種であるAX040はGVIA PLA2を阻害しないが、しかし、0.011モル画分のXI(50)値を有するGIVA PLA2の阻害剤である。一貫性のある結果は化合物AX073およびAX074を用いて見られた。これらの化合物もまた、カルボキシメチルエステル（AX073）または遊離のカルボキシル（AX074）のいずれかを含む変種である。
【００６７】
AX010、AX041、およびAX073による、GVIA PLA2の阻害の傾向を観察することによって、R1またはR2における不飽和鎖が飽和鎖よりも好ましく思われる。このことは、多くのリン脂質のsn-2位における不飽和脂肪酸の存在と一貫している。
【００６８】
以下の表2は、cPLA2、iPLA2、またはsPLA2異性体の1つまたは複数を阻害する分子の活性を実証する。
【００６９】
（表３）2-オキソアミド阻害剤の構造ならびにそれらのGIVAおよびGVIA PLA2およびGV PLA2に対する効果
2009505990.tif 000031
2009505990.tif 000032
2009505990.tif 000033
N.D.、いずれも以下のモル画分：a0.091、b0.08、c0.048、d0.04、e0.03、f0.02、g0.01において検出されなかった
【００７０】
PLA2のほとんどすべての阻害剤が、少なくともある程度まで、リン脂質表面に分配する。なぜなら、これらは、通常、PLA2の疎水性活性部位を補完する疎水性部分を有するからである。これらの阻害剤が表面に分配するとき、表面希釈と呼ばれる重要な物理的効果が作用し始める。この場合、阻害剤に対するPLA2の親和性は、モル濃度単位での阻害剤の三次元的（バルク）濃度には依存しないが、しかし、モル画分単位での阻害剤の二次元的（表面）濃度に依存する。示されるように（図2および3、ならびに表1bを参照されたい）、AX048およびAX057はグループIVA PLA2およびグループVIA PLA2に対して強力であり、AX006はグループIVA PLA2単独に対して強力であり、ならびにAX010は両方に対してより有効性が低かった。
【００７１】
興味深いことに、フェニル含有AX015は、0.091モル画分においてsPLA2に対して45.3%の効率で弱く阻害性であったが、しかし、cPLA2またはiPLA2に対しては有意な活性を有さなかった。対照的に、AX048およびAX057は、それぞれ61.5%および76.7%の効率で、関心対象の3種すべてのPLA2に対して活性であり、0.091モル画分においてsPLA2に対して活性であった（ClogPはそれぞれ7.6および8.3であった）。AX073もまた、sPLA2に対して75.3%効力を示し、8.95のClogPを有した。
【００７２】
他の化合物はcPLA2およびiPLA2に対して効力を示したが、しかしまた、AX105、AX110、AX111、AX113、およびAX114などのsPLA2に対して最も強力であり、AX113は0.091モル画分において約100%阻害を達成した。すべてが、iPLA2よりもcPLA2およびsPLA2に対してより強力であった。
【００７３】
E．2-オキソアミド阻害剤によるGVIA PLA2阻害の可逆性ならびにPGEおよびCox-2に対する効果
AX010およびAX073は、これらの阻害剤がGVIA PLA2の時間依存的または不可逆的のいずれかの阻害を示すか否かを決定するために試験した。GVIA PLA2（25 ng）は、0分、5分、15分、または30分の間、AX010またはAX0073（5μM）のいずれかとともにプレインキュベートし、次いで、5μM阻害剤を含む標準GVIA PLA2アッセイ混液中でアッセイした。アッセイ混液中の阻害剤の最終濃度は0.01モル画分であり、試料は40℃で30分間インキュベートした。AX010とAX073の両方が、インキュベーションの延長に伴う効力の増加を示さず、速い結合（図1C(A)）および可逆的様式の阻害（図1C(B)）を実証した。後者の局面において、25ngのGVIA PLA2は、10μM AX010またはAX073とともに10分間プレインキュベートし、その後、阻害剤を欠く標準GVIA PLA2アッセイ混液中に酵素を1:50希釈し、および40℃で30分間インキュベートした。これらのアッセイにおける最終阻害剤濃度は0.0004モル画分であり、AX010またはAX073のいずれかが酵素を阻害する表面濃度よりも十分に下であった。GVIA PLA2は、この系において完全な活性を示し、AX010とAX073の両方が自由に可逆的な阻害剤であることを実証した（図1C(B)）。
【００７４】
いくつかの2-オキソアミドは、マウスRAW 264.7マクロファージ様細胞株中で長期リポポリサッカリド（LPS）刺激経路において試験した（Raschke, et al., Cell, 1978, 15, 261-267）。この経路は、GIVA PLA2活性を必要とし、プロスタグランジンPGE2を含む多くのエイコサノイド化合物の細胞外放出を生じる（Gijon, et al., leukoc. Biol., 1999, 65, 330-336）。GIVA PLA2活性を有意に阻害しないAX010は、PGE2放出を阻害しなかった。低μM範囲において、AX041およびAX073は、およそ40%、PGE2放出を減少した（図1（D））。1μMおよび5μM濃度において、小さな活性化がしばしば見られた。選択的GVIA阻害剤であるAX010が細胞効果を有さなかったことを考えると、インビトロおよび細胞の結果はともに、GVIA PLA2の公知の役割と一貫している。GVIA PLA2-特異的2-オキソアミド阻害剤は、細胞系におけるGVIA PLA2の役割に対する研究を顕著に改善するはずである。GIVA PLA2に選択的な阻害剤または二重特異的阻害剤はPGE2レベルを減少し、これもまた、PGE2産生におけるGIVA PLA2の公知の役割と一貫している。
【００７５】
図4に示されるように、インドメタシンとのインキュベーションは、アッセイにおいてCOX活性のほぼ完全な阻害を生じた。対照的に、PLA2に対して有意な効果を有した濃度でのAX化合物とのインキュベーションは、COX活性に対して阻害効果を有さなかった。
【００７６】
実施例I
過形成のための動物モデルおよびアッセイ方法
動物
雄性Holtzman Sprague-Dawleyラット（300〜350 g; Harlan Industries）を個別に飼育し、食餌および水を自由に与えて12時間 明/暗サイクルで維持した。
【００７７】
髄腔内カテーテル移植
脊髄薬物注射のために、木材カテーテルを、Yaksh（Yaksh and Rudy、前出、1976）によって記載される手順の改変に従ってイソフルラン麻酔下でラットに移植した。ポリエチレンカテーテル（PE- 5; Spectranetics, 0.014のOD）を髄腔内腔に挿入し、
環椎後頭膜中の切開を通して、木材の拡張部の吻側端まで進めた。移植の5日後にラットを研究に参加させた。脊髄プロスタグランジン放出を評価するための別々の実験において、ラットは、以前に記載されたように、3つの管腔を有する木材ループ透析カテーテルを用いて調製した。（Yaksh, et al.、前出、2001）を参照されたい。
【００７８】
手短に述べると、外側の2つの管腔は、一定の長さの透析チューブ（10Kdaカットオフ）に接続した。次いで、このカテーテルは、髄腔内カテーテルのための上記と同じ技術を使用して髄腔内に移植した。研究に動物を含める前に、3日間の間隔を経過させた。すべての場合において、除外基準は、i）任意の神経学的後遺症の存在、ii）移植後の20%体重減少、またはiii）カテーテル閉塞であった。
【００７９】
行動解析
温熱性痛覚過敏。2つのアプローチを利用して痛覚過敏状態を開始した。炎症誘発性温熱性痛覚過敏は、左後足の足底面への2mgのカラギーナン（Sigma, St. Louis, MO、生理食塩種中20%溶液（w/v）の100μl）の皮下注射によって誘導した。熱誘発性の足を引っ込める応答を評価するために、Hargreavesおよび共同研究者によって記載されたもの（Hargreaves, Pain, 32:77-88, 1988）に続いてモデル化された市販のデバイスを使用した（Dirig and Yaksh, Neurosci. Lett., 220:93-96, 1996; Dirig, et al., J.Neurosci. Methods, 76:183-191, 1997を参照されたい）。
【００８０】
手短に述べると、このデバイスは、プレキシグラスキュービクル（9×22×25cm）上のラットを個々に配置しているガラス表面（25℃に維持）からなった。焦点を当てた映写用電球から生じた温熱性侵害刺激を、ガラス表面の下に配置した。この刺激は、この刺激の供給源上に取り付けられた角度付きミラーの補助で、各試験被験体のいずれかの後足に別々に送達した。
【００８１】
タイマーを光源とともに作動させ、タイマーを停止させかつ刺激を終了する光ダイオード動作センサーによって検出されるような、足が活発な引っ込めを示すために必要とされる時間として反応時間を定義した。足引っ込め反応時間（PWL）は、任意の処理前（対照）および処理後の間隔で評価した。左（損傷）および右（非損傷）の足引っ込め反応時間を評価し、時間に対してプロットした。加えて、反応時間差スコア（非損傷-損傷）を計算し、注射後観察間隔にわたる平均引っ込め反応時間を処理群間の比較のために計算した。
【００８２】
末梢性炎症の使用に加えて、温熱性痛覚過敏は、SP（20 nmol/10μL）の髄腔内注射によってもまた開始した。左足および右足の平均PWLは各時点で評価した。IT-SP前とIT-SP後の応答反応時間スコア間の差平均を分析のために計算した。
【００８３】
髄腔内透析およびPGE2アッセイ
PGE2の脊髄放出を規定する脊髄透析実験は、透析カテーテル移植の3日後に無麻酔ラットで実施した。シリンジポンプ（Harvard, Natick, MA）を接続し、透析チューブを、人工脳脊髄液（ACSF）で、10μl/分の速度で灌流した。ACSFは、151.1 Na+、2.6 K+、0.9 Mg2+、1.3 Ca2+、122.7 Cl-、21.0 HCO3、2.5 HPO4、および3.5 デキストロース（mM）を含み、各実験の前に95% O2/5% CO2でバブリングして、最終pHを7.2に調整した。流出物（画分あたり20分間）を自動フラクションコレクター（Eicom, Kyoto, Japan）で4℃にて収集した。2つのベースラインサンプルを30分間の洗い流し、およびNMDA（0.6μg）のIT注射後のさらなる3つの画分後に収集した。脊髄透析物中のPGE2の濃度は、市販のキット（Assay Designs 90001, Assay Designs, Ann Arbor, MI）を使用してELISAによって測定した。抗体はPGE2に選択的であり、PGF1、PGF2、6-ケトPGF1、PGA2、またはPGB2に対しては2.0 %未満の交差反応性であるが、PGE1およびPGE3と交差反応する。
【００８４】
薬物送達
薬物は、全身的に（IP）または脊髄に（IT）送達した。腹腔内薬物は、0.5 ml/kgの量で調製した用量で均一に送達した。IT注射した薬物は、10μlの総量で投与し、続いて媒体を使用する10μl洗い（flush）を行った。
【００８５】
酵素アッセイ
インビトログループIV cPLA2およびグループVI iPLA2アッセイを、以前に記載されたように行った（Kokotos, et al.、前出、2002）。手短に述べると、100μM脂質基質および100,000 cpm放射性標識類縁体をN2下で乾燥させ、400μM Triton X-100を含むアッセイ緩衝液中に溶解して、混合ミセル基質溶液を生じた。DMSO中に溶解した阻害剤を反応チューブに加え、40℃にて5分間、基質とともにインキュベートさせた。純粋な酵素を加えて500μlの最終容量を生じ、消化を40℃にて30分間実行した。反応は、Dole法を使用してクエンチおよび抽出し、生成物は液体シンチレーション計数によって定量した。阻害パーセントはXI(50)計算のために阻害剤モル画分濃度の範囲で決定した。
【００８６】
GV sPLA2活性は同様のアッセイにおいて測定した。最終アッセイ緩衝液は、50mM Tris-HCl（pH 8.0）および5 mM CaCl2から構成された。各アッセイは、100μLの5×基質溶液（20μLの10 mM Triton X-100および80μLアッセイ緩衝液）、390μLアッセイ緩衝液、10μL GV sPLA2溶液（1μLの40 ng/μL ストックおよび9μLアッセイ緩衝液）、ならびに5μLのDMSOまたはDMSO中の2-オキソアミドから構成された500μL総量で実施した。5×基質溶液はN2を用いてリン脂質（有機溶媒中）を乾燥させることによって調製した。適切な量の10 mM Triton X-100を加え、加熱し、および透明になるまでボルテックスした。次いで、アッセイ緩衝液を加えて、5×基質溶液を作製した。最終混合ミセルは、400μM Triton X-100および100μM DPPC（その中の100,000cpmの14C-DPPC）においてであった。
【００８７】
シクロオキシゲナーゼ1およびシクロオキシゲナーゼ2の阻害は、Cayman ChemicalからのCOX活性アッセイキット（カタログ760151）を使用してインビトロで試験した。アッセイは、COX-1およびCOX-2タンパク質を含んだ10μlの供給されたCOX標準（カタログ760152）を使用して96ウェルプレートで実施した。活性は、611 nmの吸収極大を有する、酸化型N, N, N', N'-テトラメチルフェニレンジアミン（TMPD）の出現によって、595 nmで比色定量的に検出した（Kulmacz and Lands, Prostaglandins, 25:531-540, 1983）。DMSO（研究化合物）またはエタノール（インドメタシン）中に溶解した阻害剤を50μM最終濃度まで加え、酵素を含むアッセイ混液とともに5分間インキュベートさせた。TMPDおよびアラキドン酸の付加後、試料を混合し、室温で5分間インキュベートさせ、その後595 nmの吸収を読み取って結果を決定した。結果を計算し、阻害パーセント値を導き出した。
【００８８】
薬物
これらの研究において使用したPLA2阻害剤は以下に記載されるように合成した。これらの薬剤は5% Tween 80の媒体中で調製した。これらの研究において使用した他の薬剤には、CB1アンタゴニストである、カンナビノイドアゴニスト、アナンドアミド（SR141716A）（Benjamin Cravatt, Scripps Institute, La Jolla, CAの好意により提供された）が含まれた。アナンドアミドは、100% DMSOならびにエタノール、エマルホア（Emulphor）および生理食塩水（1:1:18）中のSR141716Aの中で調製した。対照研究はそれぞれの媒体を用いて実行した。
【００８９】
実施例II
腹腔内送達後のカラギーナン誘導性温熱性痛覚過敏の治療
対照
痛覚過敏の誘導前に、ベースライン熱逃避反応時間は、すべての群において10〜12秒のオーダーであった。カラギーナンの足底内注射は、注射した後足の炎症ならびに対応する温熱性痛覚過敏を誘導し、これは、60分後に検出可能であり、研究全体を通して続いた。図5において示されるように、IPまたはIT媒体で処理した動物における熱逃避反応速度は、90〜120分以内に約3〜5秒まで顕著に減少した（図5と6の両方を参照されたい）。
【００９０】
腹腔内送達
カラギーナン注射前に3mg/kg（IP）の4種の薬剤を用いる前処理（30分間）は、さもなくば炎症を起こした足において観察される温熱性痛覚過敏をAX048が減少したが、AX006、AX010、またはAX 057が減少しなかったことを明らかにした。（図5）。重要なことに、媒体-処理動物または薬物-処理動物のいずれにおいても非損傷足の熱逃避反応時間の変化が存在せず、例えば、この薬剤は、抗痛覚過敏剤として機能的に挙動していた。非損傷足と損傷足の応答反応時間の間の平均群差の比較は、媒体処理群と比較して、AX048処理群における有意な減少を明らかにした。
【００９１】
用量依存性
IP AX048の効果は、0.2〜3 mg/kgの範囲にわたって、用量依存性であることを観察した（傾き；p<0.0004）（図6を参照されたい）。ED50は、媒体処理動物において観察された痛覚過敏を50%減少する用量として定義した。これを基礎として、IP AX048のIP ED50値の見積もりは1.2 mg/kg（95% CI：-0.5572〜0.7713）であった。
【００９２】
作用の時間経過
薬物作用の時間経過を決定するために、AX048（3 mg/kg）のIP送達は、-15分、-30分、および-180分に行った（図7）。示されるように、ピーク効果は30分において認められ、15分において最小効果を観察した。これらの効果は180分間持続したが、しかし360分間までには対照と違いがなかった。
【００９３】
実施例III
髄腔内送達後のカラギーナン誘導性温熱性痛覚過敏の治療
対照
媒体の髄腔内注射を受容した動物において、カラギーナンの足底内注射は、無注射足と比較して、顕著な片側温熱性痛覚過敏を生じた（図8）。
【００９４】
薬物効果
カラギーナンの送達15分前の30μg/10μLの4種の薬剤での前処理は、AX048が温熱性痛覚過敏を弱めたが、AX006、AX010、またはAX057は弱めなかったことを明らかにした（図8を参照されたい）。再度、髄腔内送達後、媒体処理動物または薬物処理動物のいずれにおいても、非損傷足の熱逃避反応時間の変化は存在しなかった。非損傷足と損傷足の応答反応時間の間の群差平均の比較もまた、媒体処理群との比較において、AX048-処理群における有意な減少を明らかにした。
【００９５】
実施例IV
髄腔内サブスタンスP-誘導性温熱性痛覚過敏の治療
対照
ベースライン熱逃避反応時間は10〜12秒のオーダーであった。全身性媒体処理動物においては、SPの髄腔内注射（20 nmol/10μl）は、注射後15分までの初期に、熱逃避反応時間の有意な減少を誘発し、これは、45分間の試験間隔を通して持続し、60分までにベースラインに戻った（図9を参照されたい）。
【００９６】
薬物効果
SPの髄腔内送達の30分前における3 mg/kg（IP）の4種の薬剤での前処理は、AX048が脊髄誘発性温熱性痛覚過敏を完全に予防するが、AX006、AX010、またはAX057は予防しないことを明らかにした（図9）。カラギーナン研究におけるのと同様に、AX048がベースラインよりも大きな値まで処理後反応時間を増加した、例えば、この薬剤が抗痛覚過敏剤として機能的に挙動したという証拠は存在しなかった。
【００９７】
実施例V
副作用プロフィール
任意の化合物の最高の全身用量（3 mg/kg）または髄腔内用量（20μg）の送達後に、瞬目、耳介、踏み直り、または歩行を含む、任意の評価された反射評価項目において変化は存在しなかった。動物は、立ち直り反応、全身性歩行運動、または自発的活動の変化を示さなかった。
【００９８】
実施例VI
プロスタグランジン放出の阻害
対照
最初の流出後かつ薬物処理前の全体のベースライン透析液濃度は555±75 pg/100μl灌流液であると決定された。SP（20μg）の髄腔内注射は、媒体処理対照と比較して、脊髄透析液中のPGE2濃度の統計学的に有意な増加を生じたが（図10）、しかし媒体はこれを生じなかった（生理食塩水、示さず）。
【００９９】
薬物効果
IT SP（20μg/10μL）の送達15分前での4種の薬物との前処理は、誘発されるPGE2の放出がAX048処理群においてのみ減少することを明らかにした。従って、4種の薬剤の中で、AX048のみが、PGE2の合成および放出に対して有意な阻害効果を発揮した（図10を参照されたい）。
【０１００】
本明細書に例証的に記載される発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の構成要素、限定の非存在下で適切に実施されてもよい。従って、例えば、「含む」、「包含する」、「含有する」などの用語は、拡張的にかつ限定なしで読まれるべきである。加えて、本明細書で利用される用語および表現は、説明の用語として、かつ限定の用語としてではなく使用されており、そこに示されかつ記載された特徴またはその一部の任意の等価物を排除するこのような用語および表現の使用を意図するものではないが、種々の改変が、特許請求された本明細書の範囲内で可能であることが認識される。従って、本発明は、その中で具体化される本発明の好ましい態様ならびに任意の特徴、改変、およびバリエーションによって具体的に開示されてきたが、本明細書に開示されたものは当業者によって用いられてもよいこと、ならびにこのような改変およびバリエーションは本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。
【０１０１】
本発明は、本明細書で広くかつ一般的に記載されてきた。一般的開示の範囲内にある、より狭い種および亜属の群類の各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、除外される材料が本明細書で具体的に列挙されるか否かに関わらず、この属からの任意の対象物を除去するネガティブ限定を条件として、本発明の一般的記載を含む。
【０１０２】
他の態様は添付の特許請求の範囲内にある。加えて、本発明の特徴および局面がマーカッシュグループで記載される場合、当業者は、本発明が、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはそのメンバーのサブグループの観点から、それによってもまた記載されることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明のAX化合物についての合成順序を示す図式からなる。
【図１Ａ】化合物AX048およびAX057の構造を示す。
【図１Ｂ】化合物AX035からAX041まで、およびAX073-AX074の構造を示す。
【図１Ｃ】（A）AX010（明るいバー）およびAX073（暗いバー）の時間依存性結合、（b）阻害の可逆性（対照＝阻害剤なし）を示すグラフである。ID．AX010（●）、AX041（○）およびAX073（▼）によるPLA2阻害についての用量応答曲線。
【図２】グループIVA cPLA2についてのAX006（丸○）、AX010（四角■）、AX048（上向き三角▲）、AX057（下向き三角▼）のインビトロ用量応答阻害曲線を示すグラフである。曲線は対数関数へのフィットを表す。
【図３】グループiVI iPLA2についてのAX010（四角■）、AX048（上向き三角▲）、AX057（下向き三角▼）のインビトロ用量応答阻害曲線を示すグラフである。曲線は対数関数へのフィットを表す。
【図４】阻害パーセントとして表現されるインビトロシクロオキシゲナーゼ活性に対する本発明の化合物の効果を示すグラフである。この図は、対照に対する薬物処理試料の平均±SDを提示する。示されるように、インドメタシン（インド（Indo）、50μM）は、利用した用量においてシクロオキシゲナーゼ活性を阻害するように働いたが、AX006（50μM）、AX010（50μM）、AX048（50μM）またはAX057（50μM）はそのように働かなかった。
【図５】カラギーナンの片側後足注射によって誘発された温熱性痛覚過敏に対するAX006、AX010、AX048、およびAX057（3mg/kg、IP）の効果を示すグラフである。薬物または媒体はカラギーナンの足底内注射の30分前に送達し、熱逃避反応時間を、直前およびその後180分まで間隔を置いて測定した。各グラフのセットは、薬物および媒体で処理した動物について、損傷足（注射あり（Inj））および非損傷足（注射なし（Uninj））の経時的な応答反応時間（秒）の平均±SEMを示す。対照処理群において、カラギーナン足は、ベースラインからの有意な反応時間の減少を示した（一元ANOVA）。この減少はAX048によって妨害された。挿入ヒストグラムは、試験の時間間隔（90〜180分）にわたる非損傷足と損傷足の間の応答反応時間の群累積差平均を示す。示されるように、この痛覚過敏の尺度はAX048によって有意に減少した（対応のないt-検定）。
【図６】カラギーナンの片側後足注射によって誘発された温熱性痛覚過敏に対するAX048の抗痛覚過敏効果の用量応答曲線を示すグラフである。各点は、損傷足と非損傷足の間の応答反応時間の違いの合計の平均およびSEM（N=5）を示す（＊傾き：p<0.0004）。水平方向の直線および破線は、媒体処理対照動物の平均±SEMを示す。これらの研究は図4に関連して記載したように実行した。このグラフは、用量の関数として、試験の時間間隔（90〜180分）にわたる非損傷足と損傷足の間の応答反応時間の群累積差の平均±SEMを示す。水平方向の直線および破線は、カラギーナン後の媒体処理ラットにおいて観察された温熱性痛覚過敏の平均±SEMを示す。AX048のED50用量は熱逃避反応時間の50%減少を表す。
【図７】カラギーナン誘発性温熱性痛覚過敏に対するAX048（3mg/kg、IP）の抗痛覚過敏効果に対する前処理時間間隔の効果を示すグラフである。薬物は足底カラギーナンの送達前15分、30分、180分または360分に送達され、熱逃避はカラギーナン直後およびその後3時間までの時間間隔に測定した。データは、損傷足と非損傷足の間の累積反応時間差として表現される。最大効果は30分で観察され、3時間まで持続した。一元ANOVA（p=0.0006）に続き、事後ボンフェローニ（Bonferroni）多重比較検定（n=4-12／処理群）を行った。＊＊対照に対して比較した場合にp<0.05。
【図８】カラギーナンの片側後足注射によって誘発された温熱性痛覚過敏に対するAX006、AX010、AX048、およびAX057（IT30μg/10μL）の効果を示すグラフである。薬物および媒体はカラギーナンの足底内注射15分前に送達し、熱逃避は直前およびその後180分まで間隔を置いて測定した。各グラフのセットは、薬物および媒体で処理した動物について、損傷足（注射あり（Inj））および非損傷足（注射なし（Uninj））の経時的な応答反応時間（秒）の平均±SEMを示す。示されるように、対照処理群において、カラギーナン足は、ベースラインからの反応時間の減少を示した（一元ANOVA）。この減少はAX048によって妨害された。挿入ヒストグラムは、試験の時間間隔（90〜180分）にわたる非損傷足と損傷足の間の応答反応時間の群累積差平均を示す。示されるように、この痛覚過敏の尺度はAX048によって有意に減少した（対応のないt-検定）。
【図９】髄腔内SPで誘発された温熱性痛覚過敏に対するAX006、AX010、AX048、およびAX057（3mg/kg、IP）の効果を示すグラフである。薬物または媒体はサブスタンスP（IT-SP；30nmol）の髄腔内送達の30分前に送達され、熱逃避はIT SP直前およびその後60分までの時間間隔で測定した。データは時間に対する応答反応時間（秒）として表現される。示されるように、一元ANOVAは、AX048について、媒体からの有意な温熱性痛覚過敏の逆転を示した。
【図１０】媒体またはAX006、AX010、AX048、およびAX057（3mg/kg、IP）のIP注射を受け、続いて20分後にサブスタンスPの髄腔内注射（IT-SP：20nmol）を行った、脊髄透析カテーテルで作製した無麻酔ラットの応答を示すグラフである。（上）PGE2放出の時間経過は、IP媒体またはIP AX048（3mg/kg）で前処理した動物において順次的な15分試料においてIT SPの45分後まで決定した。IT SPは、IP媒体後に時間依存的な放出の減少を誘発したが、IP AX048後には誘発しなかった（*p<05）。（下）媒体、AX006、AX010、AX048、またはAX057を受けたラットにおける0〜45分からのPGE2放出の時間効果曲線下面積。示されるように、IP AX006、AX010、またはAX057、IT SPは、媒体のみと比較して、有意な増加を誘発した（クラスカル・ワリス（Kruskall Wallace）p<0.008。＊p<0.05；＊＊p<0.01、対媒体ダンズ（Dunns）多重比較（VEH））。対照的に、IP AX048後では、IP媒体単独と比較した場合に、放出の間で差異が存在しなかった（p>0.05）。
【図１】
2009505990.tif 000042
【図１Ａ】
2009505990.tif 000043
【図１Ｃ（Ａ）】
2009505990.tif 000044
【図１Ｃ】
2009505990.tif 000045
【図１Ｃ（Ｂ）】
2009505990.tif 000046
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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