(57)【要約】  タグペプチドを利用して所望のタンパク質を効率よく回収及び精製することを目的とする。  (A)少なくとも１つのメチオニン残基を含有するペプチドタグをコードする塩基配列、(B)プロモーター配列（ここで、該プロモーター配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び(C)所望のタンパク質をコードする塩基配列（ここで、該所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流または下流に接続されている）を含む、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター。
2009101737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(A)〜(C)を含む、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター、
(A)少なくとも１つのメチオニン残基を含有するペプチドタグをコードする塩基配列、
(B)プロモーター配列（ここで、該プロモーター配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び
(C)所望のタンパク質をコードする塩基配列（ここで、該所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流または下流に接続されている）。
【請求項２】
プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列（ここで、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記所望のタンパク質をコードする塩基配列との間に接続されている）を含む、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項３】
リンカーペプチドをコードする塩基配列（ここで、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記所望のタンパク質をコードする塩基配列の間に接続されている）を含む、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項４】
プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列（ここで、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、前記所望のタンパク質をコードする塩基配列と前記リンカーペプチドをコードする塩基配列との間に接続されている）を含む、請求項3に記載の発現ベクター。
【請求項５】
以下の(D)〜(F)を含む、メチオニン残基含有ペプチドタグベクター、
(D)少なくとも１つのメチオニン残基を含有するペプチドタグをコードする塩基配列、
(E)プロモーター配列（ここで、該プロモーター配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び
(F)所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入するためのクローニングサイト（ここで、該クローニングサイトは、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流及び／または下流に接続されている）。
【請求項６】
プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列（ここで、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記クローニングサイトとの間に接続されている）を含む、請求項5に記載のタグベクター。
【請求項７】
リンカーペプチドをコードする塩基配列（ここで、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記クローニングサイトの間に接続されている）を含む、請求項5に記載のタグベクター。
【請求項８】
プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列（ここで、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、前記クローニングサイトと前記リンカーペプチドをコードする塩基配列との間に接続されている）を含む、請求項7に記載のタグベクター。
【請求項９】
請求項5〜8のいずれかに記載のベクターに接続されたクローニングサイトに、所望のタンパク質をコードする塩基配列が導入された、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター。
【請求項１０】
請求項1〜4及び9のいずれかに記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
【請求項１１】
請求項10に記載の形質転換体から得られる、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質。
【請求項１２】
請求項10に記載の形質転換体からメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を発現させる工程を含有する、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項11で得られたメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を、金磁性粒子を用いて回収する工程を含有する、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター、メチオニン残基含有ペプチドタグベクター、前記タグベクターに所望のタンパク質をコードする塩基配列が導入された発現ベクター、ならびに前記発現ベクターが導入された形質転換体に関する。また、本発明は、該形質転換体を用いることにより得られるメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質、該タンパク質の製造方法、ならびに該タンパク質の回収及び精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを大腸菌、酵母、動物細胞等の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体においてタンパク質を発現させた後に、所望のタンパク質を分離、精製する方法が広く知られている。タンパク質を分離、精製する方法としては、特にイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが知られているが、いまだタンパク質をより純度高く、かつ効率良く回収する手段が求められている。【０００３】
また、タグペプチドを利用して所望のタンパク質を分離、精製する方法が知られており、タグペプチドとしてはヒスチジンタグやシステインタグが例示される。例えば、これまでに、ヒスチジンタグを付加したタンパク質を亜鉛またはコバルト付加固体支持体を用いて単離する方法が報告されている（特許文献１）。また、ヒスチジンタグが融合したタンパク質を、ニッケルアフィニティーカラムを利用して取得できることが報告されている（特許文献２）。
【特許文献１】特表2007-505134号公報
【特許文献２】特開平10-212298号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、タグペプチドを利用して所望のタンパク質を効率よく回収及び精製することを目的とする。また、本発明は、効率よく回収及び精製できるペプチドタグが付加されたタンパク質を取得することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題について検討を行い、メチオニン残基を含有するペプチドタグを所望のタンパク質に付加することにより、所望のタンパク質を効率よく回収及び精製できることを見出した。また、メチオニン残基を含有するペプチドタグをリンカーを介して所望のタンパク質に付加することにより、所望のタンパク質を一層効率よく回収及び精製できることを見出した。本発明は当該知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
項１．以下の(A)〜(C)を含む、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター、
(A)少なくとも１つのメチオニン残基を含有するペプチドタグをコードする塩基配列、
(B)プロモーター配列（ここで、該プロモーター配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び
(C)所望のタンパク質をコードする塩基配列（ここで、該所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流または下流に接続されている）。
項２．プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列（ここで、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記所望のタンパク質をコードする塩基配列との間に接続されている）を含む、項1に記載の発現ベクター。
項３．リンカーペプチドをコードする塩基配列（ここで、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記所望のタンパク質をコードする塩基配列の間に接続されている）を含む、項1に記載の発現ベクター。
項４．プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列（ここで、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、前記所望のタンパク質をコードする塩基配列と前記リンカーペプチドをコードする塩基配列との間に接続されている）を含む、項3に記載の発現ベクター。
項５．リンカーペプチドが、αへリックス構造を形成するものである、項3または4に記載の発現ベクター。
項６．ペプチドタグをコードする塩基配列が、グリシン残基をコードする塩基配列を含有するものである、項1〜5のいずれかに記載の発現ベクター。
項７．以下の(D)〜(F)を含む、メチオニン残基含有ペプチドタグベクター、
(D)少なくとも１つのメチオニン残基を含有するペプチドタグをコードする塩基配列、
(E)プロモーター配列（ここで、該プロモーター配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び
(F)所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入するためのクローニングサイト（ここで、該クローニングサイトは、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流及び／または下流に接続されている）。
項８．プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列（ここで、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記クローニングサイトとの間に接続されている）を含む、項7に記載のタグベクター。
項９．リンカーペプチドをコードする塩基配列（ここで、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記クローニングサイトの間に接続されている）を含む、項7に記載のタグベクター。
項１０．プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列（ここで、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、前記クローニングサイトと前記リンカーペプチドをコードする塩基配列との間に接続されている）を含む、項9に記載のタグベクター。
項１１．リンカーペプチドが、αへリックス構造を形成するものである、項9または10に記載のタグベクター。
項１２．ペプチドタグをコードする塩基配列が、グリシン残基をコードする塩基配列を含有するものである、項7〜11のいずれかに記載の発現ベクター。
項１３．項7〜12のいずれかに記載のベクターに接続されたクローニングサイトに、所望のタンパク質をコードする塩基配列が導入された、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター。
項１４．項1〜6及び13のいずれかに記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
項１５．項14に記載の形質転換体から得られる、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質。
項１６．項14に記載の形質転換体からメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を発現させる工程を含有する、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の製造方法。
項１７．項15で得られたメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を、金磁性粒子を用いて回収する工程を含有する、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の回収方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターによれば、これを宿主細胞に導入することにより得られた形質転換体において、メチオニン残基含有ペプチドタグが付加された所望のタンパク質を容易に発現させることができる。【０００７】
また、本発明のメチオニン残基含有ペプチドタグベクターによれば、該ベクターに所望のタンパク質をコードする塩基配列を挿入することにより、前記メチオニン残基含有ペプチドタグが付加された所望のタンパク質を発現させることのできるベクターを容易に作製することができる。【０００８】
また、前記ベクターを用いることにより得られる前記メチオニン残基含有ペプチドタグが付加された所望のタンパク質によれば、金、さらには金磁性粒子を使用することにより、該所望のタンパク質を効率よく回収及び精製することができる。さらに、前記ペプチドタグが付加された所望のタンパク質を、さらにリンカーペプチドを有するものとすることにより、一層効率よく所望のタンパク質を回収することができる。【０００９】
また、前記ペプチドタグが付加された所望のタンパク質をプロテアーゼ認識部位を有するものとした場合には、プロテアーゼを作用させることにより、ペプチドタグ及びリンカーを所望のタンパク質から容易に切断、除去することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について説明する。【００１１】
(1)メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター
本発明のメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター（以下、発現ベクターと称することもある）は、(A)少なくとも１つのメチオニン残基を含有するペプチドタグをコードする塩基配列、(B)プロモーター配列、及び(C)所望のタンパク質をコードする塩基配列を少なくとも有する。【００１２】
前記(A)に記載の塩基配列でコードされる少なくとも１つのメチオニン残基を含有するペプチドタグのアミノ酸残基数は、所望のタンパク質の発現を損なうことなく、発現された所望のタンパク質の活性等に影響を与えず、金との結合能力を有するものであれば限定されない。例えば、前記ペプチドタグは１〜２０のアミノ酸残基からなり、好ましくはアミノ酸残基２〜１５からなり、より好ましくはアミノ酸残基３〜９からなり、よりさらに好ましくはアミノ酸残基５〜９からなる。メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターに、後述するプロテアーゼ認識部位をコードする塩基配列やリンカーをコードする塩基配列が含まれる場合には、前記ペプチドタグはこれらの発現にも影響を与えない。【００１３】
前記ペプチドタグのアミノ酸配列は、少なくとも１つのメチオニン残基を有し、所望のタンパク質の発現を損なうことなく、発現された所望のタンパク質の活性等に影響を与えず、金との結合能力を有するものであれば、任意のアミノ酸残基から構成されていてよい。前記ペプチドタグのアミノ酸配列は、好ましくはメチオニン残基ならびにシステイン残基及び／またはグリシン残基からなり、メチオニン残基が有するスルフィド基の向きを一定方向に固定できる点から、より好ましくはメチオニン残基及びグリシン残基からなる。【００１４】
例えば、前記ペプチドタグのアミノ酸配列が、メチオニン残基及びシステイン残基からなる場合、そのアミノ酸配列は限定されない。例えば、ペプチドタグが３のアミノ酸残基からなる場合、好ましくはシステイン残基数はメチオニン残基数より少ない。【００１５】
また例えば、前記ペプチドタグのアミノ酸配列がメチオニン残基及びグリシン残基からなる場合、そのアミノ酸配列は限定されず、例えばメチオニン残基とグリシン残基はランダムであってもよく、メチオニン残基とグリシン残基とが規則正しく配置されていてもよい。例えば、前記ペプチドタグのアミノ酸配列は、１以上のメチオニン残基と１以上のグリシン残基とが同じ数ずつ交互に配置されていてもよく、１つのメチオニン残基と２つのグリシン残基とが交互に配置されていてもよく、１つのメチオニン残基と３つのグリシン残基とが交互に配置されていてもよく、またメチオニン残基とグリシン残基との配置関係が、この逆となっていてもよい。例えば、前記ペプチドタグのアミノ酸配列がメチオニン残基及びグリシン残基からなる場合、MGMGM（配列番号1：tag 1）、MGGMGGM（配列番号2：tag 2）、MGGGMGGGM（配列番号3：tag 3）、MMGGMMGGMM（配列番号4：tag 4）、MMMGGGMMMGGGMMM（配列番号5：tag 5）等の配列が挙げられる。【００１６】
前記ペプチドタグのアミノ酸配列は、該ペプチドタグと金との結合能力に応じて、当業者により適宜決定される。【００１７】
このため、前記(A)に記載の塩基配列は、前述のアミノ酸残基数及びアミノ酸配列を備えたアミノ酸をコードする塩基配列からなる。【００１８】
ただし、前記発現ベクターに後述するリンカーペプチドをコードする塩基配列が含まれない場合には、前記ペプチドタグは、前述のアミノ酸残基数及びアミノ酸配列のうち、連続する3〜5のメチオニン残基からなるもの以外に限定される。すなわち、前記発現ベクターにリンカーペプチドをコードする塩基配列が含まれない場合には、前記(A)に記載の塩基配列は、前述のアミノ酸残基数及びアミノ酸配列を有するペプチドタグをコードする塩基配列のうち、連続する3〜5のメチオニン残基をコードする塩基配列からなるものは含まない。【００１９】
前記ペプチドタグをコードする塩基配列が、前記発現ベクターを構築するために用いられるベクター（以下、基本ベクターと称することもある）にあらかじめ含まれている場合には、これを、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の一部または全部として利用することができる。該基本ベクターにあらかじめ含まれる前記ペプチドタグをコードする塩基配列には、開始メチオニンに相当する塩基配列も包含される。【００２０】
すなわち、前記発現ベクターに含まれるペプチドタグをコードする塩基配列は、(i)基本ベクターに、前記ペプチドタグをコードする塩基配列を導入することにより得られるものでもあってもよく、また(ii)基本ベクター中にあらかじめ含まれている前記ペプチドタグをコードする塩基配列であってもよく（開始メチオニンをコードする塩基配列を包含していてもよい）、また(iii)基本ベクターに導入された塩基配列と、基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列とをあわせることにより得られる前記ペプチドタグをコードする塩基配列であってもよい。【００２１】
このため、前記発現ベクターを利用することにより発現されるペプチドタグは、前記基本ベクターに導入される塩基配列のみから発現されるか、前記基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列のみから発現されるか、または前記基本ベクターに導入される塩基配列と基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列とをあわせた塩基配列から発現される。【００２２】
前記発現ベクターにおけるプロモーター配列の接続位置は、前記発現ベクターを導入することにより得られる形質転換体において、前記ペプチドタグが付加された所望のタンパク質が発現される限り限定されない。例えば、該プロモーター配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続される。前記発現ベクターにおいて、前記ペプチドタグをコードする塩基配列は該プロモーター配列の制御下にある。【００２３】
ここで使用されるプロモーターは、当該分野で従来公知のプロモーターであれば限定されない。例えば、プロモーターとしてT7lac、T7、araBADプロモーターなどが挙げられ、これは例えば大腸菌においてタンパク質を発現させる場合に使用される。また、SV40、CMV、RSV、TK、EF-1αプロモーターなどが挙げられ、これは例えば動物細胞においてタンパク質を発現させる場合に使用される。プロモーターとして、他に酵母用プロモーター、昆虫細胞用プロモーター、ウイルスプロモーターを使用することも可能である。【００２４】
前記発現ベクターにおける所望のタンパク質をコードする塩基配列の接続位置も、前記発現ベクターを導入することにより得られる形質転換体において、前記ペプチドタグが付加された所望のタンパク質が発現される限り限定されない。【００２５】
例えば、該所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列より下流に接続され、かつ前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流または下流に接続される。該所望のタンパク質をコードする塩基配列が、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続されるか下流に接続されるかについては、使用する所望のタンパク質の性質や宿主細胞の性質等に応じて適宜変更され、当該変更は当該分野において一般的に検討される範囲内で行われる。【００２６】
例えば、該所望のタンパク質をコードする塩基配列が前記ペプチドタグをコードする塩基配列の下流に接続された場合、その所望のタンパク質をコードする塩基配列のＮ末端部にシグナル配列等が存在する場合には、シグナルペプチダーゼ等の酵素の作用により切断を受ける可能性がある。このような場合には、所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列より下流に接続されており、かつ前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続することが好ましい。【００２７】
いずれの場合であっても、前記発現ベクターにおいて、所望のタンパク質をコードする塩基配列は前記プロモーターの制御下に接続されている。【００２８】
前記所望のタンパク質の種類は限定されず、任意のタンパク質を使用することができる。【００２９】
前記発現ベクターには、さらにプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列を接続させることができる。前記発現ベクターにおけるプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列の接続位置は、前記発現ベクターを導入することにより得られる形質転換体において、例えば前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記所望のタンパク質をコードする塩基配列との間に接続される。該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列も、前記プロモーターの制御下に接続される。【００３０】
該プロテアーゼ切断認識部位のアミノ酸配列としてはPreScission（登録商標）Protease（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）により認識されるLEVLFQGPG、エンテロキナーゼ（メルク株式会社）により認識されるDDDDL、Factor Xa (Promega、メルク株式会社他)により認識されるIEGR、トロンビン（メルク株式会社、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社他）により認識されるLVPRGS、Pro TEV Protease(Promega)により認識されるENLYFQG[EXXYQ(G/S)]が例示される。【００３１】
このため、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、前述のプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列からなる。【００３２】
また、前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列が、前記発現ベクターを構築するために用いられる基本ベクターにあらかじめ含まれている場合には、該塩基配列を、前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列の一部または全部として利用することができる。すなわち、前記発現ベクターに導入されるプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は、(i)基本ベクターに、前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列を導入することにより得られるものでもあってもよく、また(ii)基本ベクター中にあらかじめ含まれている前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列であってもよく、また(iii)基本ベクターに導入された塩基配列と、基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列とをあわせることにより得られる前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列でもよい。【００３３】
前記発現ベクターにプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列を導入した場合、その後に発現されるペプチドタグが付加された所望のタンパク質にプロテアーゼを作用させることにより、付加されたペプチドタグを所望のタンパク質から容易に切断、除去することができる。【００３４】
前記発現ベクターには、さらにリンカーペプチドをコードする塩基配列を導入することができる。該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流もしくは下流に配置される。例えば、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記所望のタンパク質をコードする塩基配列の間に接続される。さらに、前記発現ベクターが前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列を有する場合には、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、特に前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列の間に接続される。いずれの場合も、前記発現ベクターにおいて、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は前記プロモーターの制御下に接続されている。【００３５】
該リンカーペプチドのアミノ酸残基数も、前記ペプチドタグ及び所望のタンパク質の発現を損なうことなく、発現された所望のタンパク質の活性等の特性に影響を与えず、前記ペプチドタグと金との結合を妨げず、さらに前記発現ベクターに前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列が導入されている場合、該プロテアーゼ切断認識部位の発現を損なわない限り限定されない。例えば、該リンカーペプチドは１〜50のアミノ酸残基からなり、好ましくはアミノ酸残基1〜30からなり、より好ましくはアミノ酸残基12〜30からなる。【００３６】
また、該リンカーペプチドのアミノ酸配列は、前記ペプチドタグと金との結合を妨げない限り限定されない。例えば、リンカーペプチドは、棒状の構造をとるものが好ましく、より好ましくはαへリックス構造、又はポリプロリンへリックスを形成する。ポリプロリンへリックスとしては、例えばJ. AM. CHEM. SOC. 2007, 129, 873-880に記載のものが例示される。該リンカーペプチドは、さらにより好ましくはαへリックス構造を形成する。αへリックス構造を形成する該リンカーペプチドの例としては、一般式(EAAAK)n、(AAKAA)n，KAAAAKAAAAKAAAAK（配列番号６：linker 1）、YGG(KAAAA)nG、Y((AEAAKA)×8）F（配列番号７：linker 2）等で表されるものが例示される。【００３７】
ここで、(EAAAK)nはEAAAK配列がn回連続して繰り返されていることを意味し、nは任意の整数とするが、nは2〜5、好ましくは3〜5、さらに好ましくは4〜5、特に好ましくは5である。該(EAAAK)nは、例えばArai R. et al., Conformations of variably linked chimeric proteins evaluated by synchrotron X-ray small-angle scattering, PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics 57:829-838(2004)に開示されている。【００３８】
また、(AAKAA)nも同様に、AAKAA配列がn回連続して繰り返されていることを意味し、nは任意の整数とするが、nは2以上、好ましくは3以上、より好ましくは4以上、さらに好ましくは4〜10、特に好ましくは4〜7である。【００３９】
また、YGG(KAAAA)nGも同様に、KAAAA配列がn回連続して繰り返されていることを意味し、nは任意の整数とするが、nは2以上、好ましくは2〜10、より好ましくは2〜7以上、さらに好ましくは3〜7である。例えばn=3がよく用いられている。【００４０】
Y((AEAAKA)×8）Fは、AEAAKA配列が8回連続して繰り返されていることを意味する。【００４１】
このため、リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前述のリンカーペプチドをコードする塩基配列からなる。【００４２】
また、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と同様に、前記リンカーペプチドをコードする塩基配列が、前記発現ベクターを構築するために用いられる基本ベクターにあらかじめ含まれている場合には、これを前記リンカーペプチドをコードする塩基配列の一部または全部として利用することができる。すなわち、前記発現ベクターに導入されるリンカーペプチドをコードする塩基配列は、(i)基本ベクターに、前記リンカーペプチドをコードする塩基配列を導入することにより得られるものでもあってもよく、また(ii)基本ベクター中にあらかじめ含まれている前記リンカーペプチドをコードする塩基配列であってもよく、また(iii)基本ベクターに導入された塩基配列と、基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列とをあわせることにより得られる前記リンカーペプチドをコードする塩基配列でもよい。【００４３】
前記発現ベクターにリンカーペプチドをコードする塩基配列を導入した場合、前記ペプチドタグと金とが結合する割合を向上させることができ、従って所望のタンパク質を効率よく回収・精製することができる。【００４４】
このほか、前記発現ベクターには、複製起点やタンパク質の発現に一般に必要なリボソーム結合部位などをコードする塩基配列が接続されていてもよく、またGreen Fluorescent Protein(GFP)遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、薬剤耐性遺伝子等の塩基配列、また、β−ガラクトシダーゼをコードする塩基配列（LacZ遺伝子）等が接続されていてもよい。これらの塩基配列は、目的に応じて前記発現ベクターの任意の位置に配置される。【００４５】
前記発現ベクターの製造方法としては、当該分野で従来公知の方法を用いることができ、所望の発現ベクターが得られる限り限定されない。【００４６】
例えば、基本ベクターへの前記所望のタンパク質をコードする塩基配列の導入は、基本ベクター上に前記ペプチドタグをコードする塩基配列とともにクローニングサイトを配置し、該クローニングサイト部分に制限酵素等を用いて所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入することにより行ってもよい。【００４７】
また、例えば、基本ベクターへの前記ペプチドタグをコードする塩基配列の導入は、基本ベクター上に、所望のタンパク質をコードする塩基配列とともにクローニングサイトを配置し、該クローニングサイト部分に、制限酵素等を用いてペプチドタグをコードする塩基配列を導入することにより行ってもよい。【００４８】
また、例えば、基本ベクターへの、前記ペプチドタグをコードする塩基配列及び所望のタンパク質をコードする塩基配列の導入は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と、所望のタンパク質をコードする塩基配列とをあらかじめ接続し、これを基本ベクターに導入することにより行ってもよい。この場合、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列のベクターへの導入及びリンカーペプチドをコードする塩基配列のベクターへの導入も、上記と同様に当該分野で従来公知の方法に従い適宜行えばよい。例えば、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と、所望のタンパク質をコードする塩基配列と、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列とを、さらにはリンカーペプチドをコードする塩基配列とをあらかじめ接続し、これを基本ベクターに導入することにより行ってもよい。【００４９】
前記発現ベクターを構築するために用いられるベクター（基本ベクター）は、所望の発現用ベクターが得られる限り種々のものが利用でき限定されない。該基本ベクターとしては、例えば、pUC18/19、pBR322、pBluescript等のプロモーターを含まないベクターやpETvector、pCruz expression vector、pcDNA vectorなどあらかじめタンパク質発現用のプロモーターを含むベクターが挙げられる。これらのベクターは、当該分野において一般的に検討される範囲内で使用目的に応じて適宜選択すればよい。【００５０】
(2)メチオニン残基含有ペプチドタグベクター
本発明のメチオニン残基含有ペプチドタグベクター（以下、タグベクターと称することもある）は、(D)少なくとも１つのメチオニン残基を含有するペプチドタグをコードする塩基配列、(E)プロモーター配列、及び(F)所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入するためのクローニングサイトを少なくとも有する。【００５１】
前記(D)として記載される少なくとも１つのメチオニン残基を含有するペプチドタグをコードする塩基配列は、前述の(A)と同様のものが挙げられる。【００５２】
前記タグベクターにおける前記プロモーター配列の接続位置は、所望の効果を有するベクターが得られる限り限定されない。例えば、前記プロモーター配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続される。該タグベクターにおいて、前記ペプチドタグをコードする塩基配列は該プロモーターの制御下にある。ここで使用されるプロモーターは、当該分野で公知のプロモーターであれば限定されず、前述のものが例示される。【００５３】
また、前記タグベクターにおけるクローニングサイトの接続位置も、所望の効果を有するベクターが得られる限り限定されない。例えば、前記クローニングサイトは、前記プロモーター配列の下流に接続され、かつ前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流及び／または下流に接続される。【００５４】
前記クローニングサイトが、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続されるか、下流に接続されるかについては、その後、該クローニングサイトに導入され得るタンパク質や、該タグベクターに導入される後述のプロテアーゼ切断認識部位やリンカーペプチドの性質、更には宿主細胞の性質等に応じて適宜変更され、当該変更は当該分野において一般的に検討される範囲内で行われる。【００５５】
例えば、該クローニングサイトが前記ペプチドタグをコードする塩基配列の下流に接続され、かつ、該クローニングサイトにその後に導入され得るタンパク質をコードする塩基配列のＮ末端部にシグナル配列等がある場合、これは当該Ｎ末端部でメチオニンシグナルペプチダーゼ等の酵素の作用により切断を受ける可能性がある。このような場合には、好ましくは、前記クローニングサイトは前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続される。【００５６】
前記クローニングサイトが、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流及び下流に接続される場合には、その後に導入され得るタンパク質をコードする塩基配列は、上流部または下流部のいずれか、またはその両方のクローニングサイトに導入されればよい。この場合、タンパク質をコードする塩基配列を上流、下流または両方のうち、いずれのクローニングサイトに導入するかについては、前述のように該クローニングサイトに導入され得るタンパク質の性質や、更には宿主細胞の性質等に応じて適宜決定される。【００５７】
該クローニングサイトは、主に所望のタンパク質をコードする塩基配列を前記タグベクターに導入するために接続されており、これは限定されないが例えばマルチクローニングサイトが挙げられる。このため、該クローニングサイトに所望のタンパク質をコードする塩基配列が導入される場合、該所望のタンパク質をコードする塩基配列は前記プロモーター配列の制御下に接続されることになる。該クローニングサイトに導入される所望のタンパク質の種類は限定されず、任意のタンパク質を使用することができる。【００５８】
なお、同様にクローニングサイトを利用して、後述のプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列やリンカーペプチドをコードする塩基配列を前記タグベクターに導入することもできる。【００５９】
前記タグベクターには、さらにプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列を接続させることができる。前記発現ベクターにおける該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列の接続位置は、所望の効果を有するベクターが得られる限り限定されず、例えば、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記クローニングサイトをコードする塩基配列との間に接続される。この場合も前記タグベクターにおいて、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列は前記プロモーターの制御下に接続されており、この配列がコードするアミノ酸配列は前述のとおりである。このため、該プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列も前述の通りである。【００６０】
前記タグベクターには、さらにリンカーペプチドをコードする塩基配列を接続させることができる。前記発現ベクターにおける該リンカーペプチドをコードする塩基配列の接続位置も、所望の効果を有するベクターが得られる限り限定されない。例えば、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記クローニングサイトをコードする塩基配列の間に接続される。さらに、前記タグベクターが前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列を有する場合には、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、特に前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列の間に接続される。いずれの場合も、前記タグベクターにおいて、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は前記プロモーターの制御下にある。また、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前述のリンカーペプチドを構成するアミノ酸配列をコードする。【００６１】
このほか、前記タグベクターには、プラスミドの増幅やタンパク質の発現に一般に必要な塩基配列が接続されている。また、ＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、薬剤耐性遺伝子等の遺伝子をコードする塩基配列などが接続されていてもよく、その塩基配列及び導入場所は前述のものが例示される。これらの塩基配列は、ペプチドタグや導入され得る所望のタンパク質、さらにはプロテアーゼ切断認識部位やリンカーペプチドの好適な発現を妨げない限り、前記タグベクターの任意の位置に接続される。【００６２】
前記タグベクターの製造方法としては、当該分野で従来公知の方法を用いることができ、所望の発現ベクターが得られる限り限定されず、当該分野で従来公知の方法に従い製造することができる。【００６３】
また、前記のタグベクターを構築するために用いられるベクター（基本ベクター）としては、前述のものが例示される。【００６４】
(3)所望のタンパク質をコードする塩基配列のタグベクターへの導入
前記タグベクターには、所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入することができる。該所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーターの制御下に接続されれば導入箇所は限定されないが、好ましくは、タグベクターに接続された前記クローニングサイトに導入される。ここで、所望のタンパク質は限定されない。【００６５】
前記所望のタンパク質をコードする塩基配列のタグベクターへの導入は、当該分野で公知の方法に従い行われる。例えば、前記所望のタンパク質をコードする塩基配列がクローニングサイトに導入される場合、該クローニングサイトに含まれる制限酵素認識部位を利用することにより、目的とする位置に該塩基配列を導入することができる。【００６６】
このように所望のタンパク質をコードする塩基配列を前記タグベクターに導入することにより、該所望のタンパク質をコードする塩基配列のＮ末端側またはＣ末端側に、ペプチドタグをコードする塩基配列を付加することができる。また、前記タグベクターがさらにプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列及び／またはリンカーペプチドをコードする塩基配列を有する場合には、同様にして、該所望のタンパク質をコードする塩基配列に、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列及び／またはリンカーペプチドをコードする塩基配列を介して、ペプチドタグをコードする塩基配列を付加することができる。【００６７】
このように、前記タグベクターに所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入することによっても、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターを得ることができる。【００６８】
(4)形質転換体
本発明の形質転換体は、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、または前記タグベクターに所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入したのち、これを宿主細胞に導入することによりにより得ることができる。【００６９】
ここで、上記宿主細胞は限定されず、大腸菌をはじめとする細菌類、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞など種々の細胞が挙げられる。好ましくは、細菌類、動物細胞である。【００７０】
また、前記発現ベクターまたは所望のタンパク質をコードする塩基配列が導入されたタグベクターの宿主細胞への導入は、当該分野で従来公知の方法に従い行うことができる。【００７１】
例えば、これらのベクターの大腸菌への導入には、塩化カルシウム法や塩化ルビジウム法で作製したコンピテントセルにヒートショック法で導入する方法や、電気的に細胞膜に穴を開けて導入するエレクトロポレーション法などを用いることができる。また、例えば酵母細胞にはＬｉ法など、植物細胞にはアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法など、哺乳細胞には塩化カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ウイルス法などを用いることができる。【００７２】
このようにして得られた形質転換体を用いることにより、当該形質転換体において、Ｎ末端またはＣ末端に少なくともペプチドタグが付加されたタンパク質を発現させることができる。また、宿主細胞に導入される前記ベクターに、さらにプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列及び／またはリンカーペプチドをコードする塩基配列が含有されている場合には、当該形質転換体を用いることにより、プロテアーゼ切断認識部位及び／またはリンカーペプチドを介してペプチドタグが付加されたタンパク質を発現させることができる。【００７３】
(5)メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の製造方法
前述のようにして得られた形質転換体における所望のタンパク質の発現は、形質転換体においてメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を発現させる工程を経ることにより製造される。該形質転換体におけるメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の発現は、前述のようにして得られた形質転換体を、その形質転換体が増殖できる培地で培養し、その後、必要に応じて発現を誘導することにより実施される。例えば、宿主として真核細胞を用いた場合には、ベクタープラスミドを該真核細胞に導入するだけで、所望のタンパク質を発現させることができる。【００７４】
ここで使用される培地、また培養時間や培養温度等の条件は限定されず、当該分野で従来公知の手順に従い適宜決定される。例えば、前記ベクターに、薬剤体性遺伝子等が発現可能なように接続されている場合には、前記培地に抗生物質等が添加されていてもよい。また、発現誘導についても、使用される発現誘導剤、作用時間及び作用温度は、その形質転換体に応じて当該分野で従来公知の手順に従い適宜決定される。【００７５】
例えば以下の実施例に記載の方法により、前記ペプチドタグが付加されたタンパク質を発現、取得することができる。また、インテインを使ったプロテインスプライシング法（Chembiochem. 2008 Sep 22;9(14):2317-25、Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(27):5234-7）等によっても前記ペプチドタグが付加されたタンパク質を取得することができる。
(6)メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の回収・精製方法【００７６】
前記タグ付きタンパク質を発現させた形質転換体は、遠心分離などの手法を用いて回収され、発現させた該タグつきタンパク質を溶解できるバッファーを用いて抽出、溶解される。この溶解の効率を高めるため、超音波破砕などの方法が必要に応じて用いられる。【００７７】
このようにして得られた該タグ付きタンパク質を含む溶液から、ペプチドタグと親和性を有する物質を用いてペプチドタグが付加されたタンパク質を回収・精製することができる。【００７８】
例えば金を利用して以下のように回収・精製することができる。前述のようにして発現されたペプチドタグ付きタンパク質と金粒子とを溶液中で混合・撹拌することにより、前記タンパク質に付加されたペプチドタグと金粒子とを結合させることができる。ここで得られた、タンパク質に付加されたペプチドタグと金粒子との結合物は、例えば金粒子と親和性の高い物質を利用して分離・回収される。ここで、磁力を利用することにより得られた結合物を容易に分離・回収できる点から、金粒子はあらかじめ磁性金属との複合体（以下、金磁性粒子と称する場合もある）としておくことが好ましい。このように金粒子をあらかじめ磁性金属との複合体としておくことにより、前述のようにして発現されたペプチドタグ付きタンパク質は金磁性粒子との結合物となる。そして、結合物中の磁性金属が磁石等にひきつけられ、その結果、得られた複合物を磁力を利用して容易に分離・回収することができる。【００７９】
具体的には、例えば、前記タンパク質に付加されたペプチドタグと金磁性粒子との結合をチューブ中で行い、該チューブの外側に磁石等を近づけることにより、磁石周辺に金磁性粒子を集めることができる。すなわち、これにより磁石周辺に前記結合物を集めることができる。そしてその後、チューブから溶液を排除することにより、前記結合物を溶液中から容易に分離・回収することができる。【００８０】
ここで、ペプチドタグと金粒子とを結合させる際に使用される前記溶液としては、前記タンパク質に付加されたペプチドタグと金粒子とが結合し、所望のタンパク質が溶解する限り限定されず、例えば緩衝液が例示される。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が例示される。また、緩衝液のpHも前記ペプチドタグと金粒子とが結合する限り限定されず、好ましくはpH 7付近が例示される。また、撹拌温度も前記ペプチドタグと金粒子とが結合し、所望のタンパク質が分解されない限り限定されず、例えば4〜25℃が例示される。また、撹拌時間も同様に限定されず、例えば１分以上、好ましくは5〜60分が例示される。【００８１】
また、ここで使用される磁性金属としては、磁性を有し、前記金粒子と複合体を形成でき、かつ磁力により前記結合物が磁石等に捕集される効果を発揮できるものであれば限定されないが、例えば磁性金属酸化物微粒子が例示できる。磁性金属酸化物微粒子としては、酸化鉄（とりわけ磁鉱、マグヘマイト、フェライトなどのＦｅ２Ｏ３を主成分とする磁性酸化物など）の微粒子、コバルト、ニッケルなどの酸化物微粒子、これらの金属の金属間化合物またはこれらの金属と鉄との金属間化合物（例えばＣｏＰｔ、ＦｅＰｔなど）の酸化物微粒子、またはこれら各金属の合金（例えばＣｏ／Ｎｉ、Ｃｏ／Ｆｅ、Ｎｉ／Ｆｅなどの２元合金、Ｃｏ／Ｆｅ／Ｎｉなどの３元合金など）の酸化物微粒子等を例示できる。磁性金属酸化物微粒子として、好ましくはγ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４等が挙げられる。【００８２】
また、金粒子の平均粒子径は、金粒子と前記ペプチドタグとの結合が妨げられず、さらには前記磁力による捕集が妨げられない限り限定されないが、例えば平均粒子径が１−５００ｎｍ、好ましくは平均粒子径１−１００ｎｍ程度である。【００８３】
また、前記磁性金属の平均粒子径も、金粒子と前記ペプチドタグとの結合を妨げず、前記金粒子を接合ないし担持でき、さらには前記磁力により捕集できる限り限定されないが、平均粒子径１ｎｍ−１μｍ、好ましくは平均粒子径１−５００ｎｍ程度、より好ましくは１−２００ｎｍ程度、さらに好ましくは１−１００ｎｍ程度を挙げることができる。【００８４】
前記金粒子と磁性金属の大きさの関係は、前記所望の効果を発揮できる限り限定されないが、金粒子の平均粒子径をＡ、磁性金属の平均粒子径をＢとしたとき、０．０１＜Ａ／Ｂ＜１０００、好ましくは０．１＜Ａ／Ｂ＜１０の式を満たすことが望ましい。【００８５】
そのほか、前記金粒子及び磁性金属は、ＷＯ２００４／０８３１２４号公報に基づき入手することができ、また金粒子と磁性金属との複合体、すなわち金磁性粒子は前記公報に従い製造することができる。【００８６】
上述のように分離・回収された結合物における金磁性粒子の分離は、例えば緩衝液等の溶液を用いて行うことができる。例えば前記溶液が排除された上記チューブに緩衝液を添加し、前記結合物においてペプチドタグと金磁性粒子とを分離させる。その後、上述のように磁力を用いて金磁性粒子のみを磁石付近に集め、次いで溶液を回収する。これにより、ペプチドタグ付きタンパク質のみを容易に分離することができる。ここで使用される緩衝液等の溶液としては、前記タンパク質に付加されたペプチドタグと金粒子とを分離でき、所望のタンパク質を分解もしくは不溶化させない限り限定されない。例えば、該溶液として、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、メチオニンやシステインを含む緩衝液等が例示される。また、該溶液のpHも同様に限定されず、例えばpH7付近が例示される。また、結合物と緩衝液との混合温度も同様に限定されず、例えば4〜25℃、好ましくは4℃が例示される。また、混合時間も同様に限定されず、例えば5分以上、好ましくは15分以上が例示される。【００８７】
さらに、回収されたペプチドタグ付きタンパク質における、所望のタンパク質からの前記ペプチドタグの分離は、当該分野で従来公知の方法に従い行うことができるが、容易に分離できる点で、前記プロテアーゼ切断認識部位をあらかじめベクターに導入しておき、発現されたプロテアーゼ切断認識部位にプロテアーゼを作用させ、当該切断部位で切断することが好ましい。プロテアーゼ切断認識部位については、前述の通りである。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
試験例1
メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターの構築方法をタグ領域の種類毎に分けて説明する。【００８９】
(1)メチオニン残基からなるペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターの構築
本試験では、メチオニン残基からなるペプチドタグの例として、３つのメチオニン残基からなるペプチドタグ（MMM）、及び５つのメチオニン残基からなるペプチドタグ（MMMMM）を採用した。【００９０】
本試験で構築した発現ベクターはプロモーター配列を有する。本試験では基本ベクターとして、大腸菌でタンパク質発現が可能なベクターpET-15b(MERCK/Novagen)を用いたことから、プロモーター配列としては、基本ベクターpET-15bにあらかじめ備わっているプロモーターを用いた。【００９１】
また、本試験で構築した発現ベクターは、所望のタンパク質コードする塩基配列を有する。前記所望のタンパク質としては、Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)を用いた。【００９２】
本試験ではまず、EGFPをコードする塩基配列を含むpCruz GFP Expression vector C (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)を使用して、EGFPをコードする配列の３’末端部にメチオニンタグ導入用配列を付加し、これを基本ベクターpET-15bに導入した。【００９３】
具体的には、pCruz GFP Expression vector C ５μｇを制限酵素ScaI（東洋紡績株式会社） 25 Uを用い添付のバッファー条件を用いて100 μl中37℃で16時間処理した後、その処理液の一部を使い完全切断を電気泳動で確認した。さらに、得られた処理液に制限酵素BglII（東洋紡績株式会社製）25 Uを加え37℃で３時間処理した後、その処理液の一部を使い完全切断を電気泳動で確認した。確認後、得られた処理液をTEバッファー（10 mM Tris-HCl (pH7.5)，1 mM EDTAを含有する水溶液）で200 μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理（容量比が、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール=25：24：1の混合液を等量加えて、ボルテックスミキサーで混合）し酵素を失活させた。その後、遠心機M150-IV（株式会社佐久間製作所製）を用い15000 rpm、5分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。【００９４】
その上清に、10μg/μl グリコーゲン水溶液 1μlを加え、前記制限酵素処理済みのpCruz GFP Expression vector Cをエタノール沈殿後、回収（前記ベクタープラスミドに、3 M 酢酸ナトリウム水溶液 を20μl、エタノール（特級：ナカライテスク株式会社製）を500μl加えてよく混和後、15000 rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を除去した。得られた沈殿物に70％(v/v)エタノール水溶液を500μl加え、よく混和後、15000rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を除去した。）し、真空乾燥させた。これをTEバッファー 30μlに溶解後、その一部を用いて電気泳動を行ない、切断されたpCruz GFP Expression vector Cの回収量を、濃度既知の分子量マーカーを用いて推定した。【００９５】
一方、ペプチドタグ導入用配列を含むオリゴヌクレオチド（5’-CATGATGATGTA-3’と5’-GATCTACATCATCATG-3’）をアニール（相補鎖を持つ配列をあわせて二本鎖にすること）させた。なお、前者のプライマーをsequence 1とし、配列番号8で表す。また、後者のプライマーをsequence 2とし、配列番号9で表す。アニール反応は、それぞれの配列のオリゴヌクレオチドを100 pmol/μlになるようにTEバッファーで溶解し、これを各5μlと5 M NaCl水溶液25μlとをTEバッファーで500μlにメスアップし95℃で5分間熱処理した後、1時間半ほどかけて徐冷して行った（アニール反応後の溶液濃度は10 pmol/μl）。これを150 fmolまたは300 fmol用いて、先に制限酵素処理を行なったpCruz GFP Expression vector C 50 fmolにライゲーションキット（タカラバイオ株式会社製）を用いて16℃、30 分間で導入した。【００９６】
導入後、得られた溶液をTEバッファーで200μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。さらに、15000 rpm、5 分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。その上清に、10μg/μl グリコーゲン水溶液1μlを加え、ライゲーション反応済みプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させた。これをTEバッファー 5μlで溶解後、制限酵素ScaI 5 Uを用いて添付のバッファー条件で50μL中37℃、30分間処理した。さらにTEバッファーで200μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。次いで、15000 rpm、5 分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。その上清のプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥後、TEバッファー 5μlで溶解した。【００９７】
この溶液全量にコンピテントセルDH5α 50μlを加え氷上で30分間静置後、42℃で60 秒、氷上で3 分間静置後、SOC medium（2％(w/v)トリプトン、0.5％(w/v) yeast extract、10 mM 塩化ナトリウム、10 mM硫酸マグネシウム、20 mM グルコースを含む水溶液をオートクレーブで121℃ 20分の滅菌処理を施し-80℃で分注保存してあるもの）を 450μl加え、37℃で１時間インキュベートし、50 μg/mlアンピシリン含有LBプレート（1.5%(w/v) Agar, powder (Wako)を含むLB培地（1%(w/v) Tripton, 0.5%(w/v) Yeast extract, 1%(w/v) NaClを含む水溶液）をオートクレーブで121℃ 20分の滅菌処理を施した後、寒天が固まる前に滅菌済み10 cmプラスチックシャーレに無菌的に20ml入れて固まらせたもの）に塗布した。37℃、16時間後、得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認した。これにより、導入したペプチドタグをコードする塩基配列が含まれているプラスミドを得た。【００９８】
得られたプラスミドを鋳型にプライマー（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’、5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’）を用いてPCRを行なった。なお、前者のプライマーをsequence 3とし、配列番号10で表す。また、後者のプライマーをsequence 4とし、配列番号11で表す。増幅したペプチドタグを含むEGFP部分を制限酵素NcoIとBglIIで処理し、得られた断片（EGFPのC末端側にペプチドタグをコードする塩基配列を導入した配列）をpET-15bのNcoI、BamHI部位に挿入し、大腸菌用のペプチドタグ付きEGFP発現ベクターを作製した。具体的には、得られたプラスミドを1/100希釈したもの0.5μlを鋳型に、上記配列番号10及び11で表されるプライマーを各2.5 fmolを用いてEX Taq (タカラバイオ株式会社)の添付プロトコール通りにPCR反応を行なった。なお、PCRのサイクルは95℃ 30秒、(95℃ 10秒、55℃ 20秒、72℃ 60秒)×30サイクル、72℃ 4分、15℃ 保持で行なった。反応後、得られたPCR産物をWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)を用いて添付プロトコールに従って精製した。その後、得られた溶液全量を制限酵素NcoI (NEB)、BclII (NEB)各20 Uを用いて100μl中で添付バッファー条件を用いて37℃、2時間処理した。全量を7％(w/v) SEAKEM（登録商標）GTG（登録商標）Agarose (CAMBREX)ゲルを用いてTABバッファー中で100 V定圧条件で30分間電気泳動を行なった。確認された所定の位置の泳動バンドを切り出し、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)を用いて添付プロトコールに従ってゲルからの精製を行なった。得られた断片溶液を一部電気泳動し、サイズマーカーから濃度を推定した。【００９９】
このようにして得られた断片が導入されるプラスミドpET-15b 5μgを制限酵素NcoI (タカラバイオ株式会社)、BamHI (タカラバイオ株式会社) 各25 Uを用いて100 μl中で添付バッファー条件を用いて37℃、16時間処理した。一部を使い7%(w/v)アガロース（タカラバイオ株式会社）ゲル電気泳動で確認後、TEバッファーで200μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。15000 rpm、5 分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。その上清に、10μg/μl グリコーゲン水溶液を1μl加え、制限酵素処理済みプラスミドpET-15bをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させた。これをTEバッファー 20μlに溶解後、アルカリフォスファターゼ (BAPC75、タカラバイオ株式会社)を用いて添付プロトコールにしたがって65℃、30分処理後（BAP処理）、さらに酵素を1μl追加し65℃、30分処理した。反応後TEバッファーで200μlにメスアップ後、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。得られた溶液について15000 rpm、5 分間、室温で遠心分離を行ない、さらに下層のフェノールを分取したのち、再度、フェノール・クロロホルム処理し酵素を完全に失活させた。この上清を分取し制限酵素処理済みおよびBAP処理済みプラスミドpET-15bをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥後、TEバッファー 30μlで溶解した。一部をとって電気泳動を行ない、分子量マーカーを用いて濃度を推定した。【０１００】
このように処理されたプラスミドpET-15b 50 fmolと先に回収した断片溶液50 fmolをライゲーションキット（タカラバイオ株式会社）の添付プロトコール通りに16℃、30分反応し、その一部とコンピテントセルDH5α 30μlを用いトランスフォーメーション反応した後、50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに全量塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、pET-15bにおいてEGFPをコードする塩基配列のC末端側にペプチドタグをコードする塩基配列がついたプラスミドを得た。EGFPをコードする塩基配列のC末端側にMMMからなるメチオニンタグをコードする塩基配列が存在するかどうかを確かめるために、導入した配列の全塩基配列を確認した。【０１０１】
同様にして先に示したメチオニンタグ導入用プライマーにメチオニンを5個コードする配列を含む以下の配列（5’- CATGATGATGATGATGTA -3’と5’- GATCTACATCATCATCATCATG -3’）を使用することによって５つのメチオニン残基からなるペプチドタグ付きEGFP発現ベクターを得た。なお、前者のプライマーをsequence 5とし、配列番号12で表す。また、後者のプライマーをsequence 6とし、配列番号13で表す。【０１０２】
ここで得られたベクターを鋳型として、制限酵素認識配列を付加したオリゴヌクレオチドを用いてPCRすることにより、該ベクターに、(iii)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、または(iv)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列及びリンカーペプチドをコードする塩基配列を導入するための制限酵素部位を付加導入した。得られたPCR産物はTAクローニング法を用いてpGEM-T vectorに導入し、前記付加した制限酵素部位に、(iii)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、または(iv)プロテアーゼ切断認識部位およびリンカーペプチドをコードする塩基配列を導入した。【０１０３】
図１に示すように、プロテアーゼ切断認識部位を導入することでペプチドタグ領域と所望タンパク質とを、プロテアーゼにより容易に切り離すことが可能となる。リンカーペプチドは長さの異なる２種類（（EAAAK）×２（すなわちｎ＝２）および（EAAAK）×５（すなわちｎ＝５））を作製した。 (iii)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、または(iv)プロテアーゼ切断認識部位およびリンカーペプチドをコードする塩基配列をコードする塩基配列を導入することにより得られたプラスミドから、EGFP及びプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、またはEGFP、プロテアーゼ切断認識部位及びリンカーペプチドをコードする塩基配列を各々切り出し、これをpET-15b発現ベクターに戻した後、各々の塩基配列を確認し、MMMまたはMMMMMからなるペプチドタグ付きEGFP発現ベクターとした。【０１０４】
具体的には、前述のようにして作製したペプチドタグ付きEGFP発現ベクター 0.5 ngを鋳型として用い、5’側のプライマー（5’- TAATACGACTCACTATAGGG -3’（配列番号14：sequence 7））および3’側のプライマー[制限酵素SnaBI認識配列を含むオリゴヌクレオチド：5’- GAAGATCTACATCATCATTACGTAGAATTCCTT -3’(メチオニン残基３個(MMM)からなるペプチドタグ付きEGFP発現ベクター用（配列番号15：sequence 8）)、5’- GAAGATCTACATCATC ATCATCATTACGTAGAATT -3’ (メチオニン残基５個(MMMMM)からなるペプチドタグ付きEGFP発現ベクター用（配列番号16：sequence 9）)]各々50 pmol用いて50μlの系でTaKaRa Ex Taq（登録商標）Hot Start Version（タカラバイオ株式会社）0.5 μlを用いて添付バッファー条件で全量50 μlとしプロトコールに従ってPCR cycler TGRADIENT (Biometra（登録商標）)を用いて95℃ 30秒、94℃ 20秒、40℃ 30秒、72℃ 60秒、(94℃ 10秒、55℃ 20秒、72℃ 60秒)×30cycle、72℃ 4分間、15℃ 保持で増幅した。得られたPCR産物はWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)を用いて添付プロトコールに従って精製した。なお、後述するペプチドタグをコードする塩基配列を有さない発現ベクターの製造においては、3’側のプライマーとして 5’- CAGCCAGATCTATACGTAGAATTCCTT -3’（配列番号17：sequence 10）を使用した。【０１０５】
得られた精製液1 μlをpGEM（登録商標）-T Vector System (Promega)の添付プロトコールに従ってライゲーション反応を行ない、そのライゲーション溶液3 μlをコンピテントセルDH5α 30 μlに加えトランスファーメーション反応（ここで、トランスファーメーション反応として、コンピテントセルDH5αを氷上で30分静置後、42℃、30 秒のヒートショックを行ない、速やかに氷上に戻して２分間静置し、その後、あらかじめ37℃にあたためておいたSOC培地（2％(w/v)トリプトン、0.5％(w/v) yeast extract、10 mM 塩化ナトリウム、10 mM硫酸マグネシウム、20 mM グルコースを含む水溶液をオートクレーブで121℃ 20分の滅菌処理を施し-80℃で分注保存してあるもの）を0.3 ml加え１時間37℃でインキュベートした。）した後、50 μg/mlアンピシリン含有LBプレート（1.5%(w/v) Agar, powder (Wako)を含むLB培地（1%(w/v) Tripton, 0.5%(w/v) Yeast extract, 1%(w/v) NaClを含む水溶液）をオートクレーブで121℃ 20分の滅菌処理を施した後、寒天が固まる前に滅菌済み10 cmプラスチックシャーレに無菌的に20ml入れて固まらせたもの）に事前に100 mM IPTG水溶液を100 μlと50 mg/ml X-Gal (50 mg の5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidaseを1mlのN,N’-dimethyl formamideで溶解したもの)20 μlを塗布して無菌的に乾燥したものに全量塗布した。得られた白色コロニーから、プラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、制限酵素配列が付加されたPCR産物の導入を、塩基配列を解読することで確認した。【０１０６】
また、後述の比較例１及び２に示す、ペプチドタグをコードする塩基配列を有さない発現ベクターを作製するにあたり、ペプチドタグを導入しない以外は前述と同様の操作を行い、PCR産物が導入されていることを確認した。【０１０７】
確認したプラスミド約5 μgを、制限酵素SnaBI(NEB)5 Uを用い添付バッファー条件で37℃、16時間処理した。その一部を用い、完全切断を電気泳動することで確認した後、残りの溶液に制限酵素EcoRIを20 U追加し37℃、1時間処理した。その後、溶液の一部を用い制限酵素による完全切断を、7%(w/v)アガロース（タカラバイオ株式会社）ゲルを用いた電気泳動（以下、電気泳動とする）で確認した。確認後、残った処理液をTEバッファーで200μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。その後、遠心機を用い15000 rpm、5 分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。【０１０８】
その上清に、10μg/μl グリコーゲン溶液1μlを加えた後、制限酵素処理済みプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させた。これを滅菌精製水 43.5μlに溶解し、アルカリホスファターゼ(BAPC75、タカラバイオ株式会社)を1.5μl、10X BAP buffer 5 μl加え65℃、30分処理（BAP処理）した。処理後TEバッファーで200μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。得られた溶液について15000 rpm、5分間、室温で遠心分離を行ない、さらに下層のフェノールを除去したのち、再度フェノール・クロロホルム処理し完全に酵素を失活させた。【０１０９】
この上清を分取し、制限酵素処理およびBAP処理済みプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥し、TEバッファー10μlで溶解した。一部をとってアガロース電気泳動を行ない、分子量マーカーを用いて濃度を推定（約20 fmol/μl）し、(iii)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、または(iv)プロテアーゼ切断認識部位およびリンカーペプチドをコードする塩基配列導入用のベクターとした。【０１１０】
一方、導入する前記塩基配列は、T4 PNK (NEB)の添付プロトコールに従って各オリゴヌクレオチド50 pmolを用いT4 PNK 1μl（添付試薬）、10X PNK buffer 10μl（添付試薬）、100 mM ATP 1μl（Roche）、滅菌精製水を用いて全量を100μlにし、37℃、30分間反応することで、5’側をリン酸化させた後、得られた溶液50μlを用いて等量の相補鎖とアニール反応（95℃3分間熱処理後、2時間ほどかけて室温まで徐冷）を行なった。【０１１１】
用いた前記オリゴヌクレオチドは、以下の通りである。
(iii)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列：5’- AATTTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC -3’（配列番号18：sequence 11）および5’- GGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGA -3’（配列番号19：sequence 12）、
(iv)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列およびリンカーペプチド[(EAAAK)×２]をコードする塩基配列:(I) 5’- AATTTCTGGAAGTTCTGTT CCAGGGGCCCGGGG -3（配列番号20：sequence 13）’および5’- CTGAAGCTGCTGCAAAAGAGGCGGCCGCTAAGGCC -3’（配列番号21：sequence 14）と(II) 5’- GG CCTTAGCGGCCGCCTCTTTTGCAGCAGC -（配列番号22：sequence 15）’および5’- TTCAGCCCCGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGA -3’（配列番号23：sequence 16）【０１１２】
先に作製した (iii)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、または(iv)プロテアーゼ切断認識部位およびリンカーペプチドをコードする塩基配列導入用のベクター50fmolに、 (iii)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列のアニール済み配列0.5μl、または、 (iv)プロテアーゼ切断認識部位およびリンカーペプチドをコードする塩基配列のアニール済み配列２種 (I及びII)各々0.5μlを加え、ライゲーションキット（タカラバイオ株式会社）を用いて16℃、30 分間で導入した(この処理により制限酵素SnaBIとEcoRI認識部位が欠失)。この反応溶液にEcoRI 10 U,およびSnaBI 2.5 Uを用いて添付バッファー系を用いて全量50 μlにし、37℃、30分間反応した。この溶液をTEバッファーで200 μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。その後、15000 rpm、5 分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。【０１１３】
その上清から、ライゲーションしたプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させた。これをTEバッファー 2μlで溶解し、その全量とコンピテントセルDH5α 30μlを用いトランスフォーメーション反応した後、50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに全量塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、 (iii)プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、または(iv)プロテアーゼ切断認識部位およびリンカーペプチドをコードする塩基配列が導入されているか塩基配列を解読し確認した。【０１１４】
得られたプラスミド2μgを制限酵素NcoI (NEB)、BclII (NEB)各20 Uを用いて50μl中で添付バッファー条件を用いて37℃、2時間処理した。全量を7％(w/v) SEAKEM（登録商標）GTG（登録商標）Agarose(CAMBREX)ゲルを用いてTABバッファー中で100 V定圧条件で30分間電気泳動を行なった。確認された所定の位置の泳動バンドを切り出し、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)を用いて添付プロトコールに従ってゲルからの精製を行なった(アガロースゲル精製)。得られたプラスミド断片精製液を一部電気泳動し、サイズマーカーから濃度を推定した(27 fmol/μl)。【０１１５】
これを導入するベクターpET-15b 5μgを制限酵素NcoI (タカラバイオ株式会社)、BamHI (タカラバイオ株式会社) 各25 Uを用いて全量100 μl中で添付バッファー条件を用いて37℃、16時間処理した。一部を使い電気泳動で確認後、TEバッファーで200μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。15000 rpm、5分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。その上清に、10μg/μl グリコーゲン溶液を1 μl加え、制限酵素処理したpET-15bをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させた。これを滅菌精製水に溶解後、BAP処理を行なった。反応後TEバッファーで200μlにメスアップ後、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。得られた溶液について15000 rpm、5分間、室温で遠心分離を行ない、さらに下層のフェノールを除去したのち、再度フェノール・クロロホルム処理し酵素を完全に失活させた。この上清を分取し、BAP処理・制限酵素処理済pET-15bをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥し、TEバッファー 30μlで溶解した。一部をとって電気泳動を行ない、分子量マーカーを用いて濃度を推定した（20 fmol/μl）。【０１１６】
このBAP処理・制限酵素処理済pET-15b 40 fmolと先に回収したプラスミド断片溶液40 fmolをライゲーションキット（タカラバイオ株式会社）の添付プロトコール通りに16℃、30分反応し（これにより制限酵素BamHI認識配列が欠失）、この反応溶液にBamHI 10 U用いて添付バッファー系を用いて全量50μlで37℃、30分間反応した。この溶液をTEバッファーで200μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。その後、15000 rpm、5 分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。その上清から、ライゲーションしたプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させた。これをTEバッファー 2μlで溶解し、その全量とコンピテントセルDH5α 30μlを用いトランスフォーメーション反応した後、50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに全量塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、挿入配列の塩基配列を確認した。【０１１７】
これにより、pET-15bベクター上の大腸菌発現プロモーターが制御する領域かつEGFPのC末端側にプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、またはプロテアーゼ切断認識部位およびリンカーペプチド［（EAAAK）×2]をコードする塩基配列ならびにメチオニン残基からなるペプチドタグMMM、またはMMMMMをコードする塩基配列が導入されたプラスミド、すなわちメチオニン残基からなるペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターを得た。また、ペプチドタグをコードする塩基配列を有さない発現ベクターを得た。具体的には、以下の発現ベクターを得た。【０１１８】
実施例１：３つのメチオニン残基MMMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、及びプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１１９】
実施例２：MMMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK）×2]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１２０】
実施例３：５つのメチオニン残基MMMMMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、及びプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１２１】
実施例４：MMMMMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK)×2]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１２２】
比較例１：プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、及びプロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列を含む発現ベクター。ただし、ペプチドタグをコードする塩基配列は有さない。【０１２３】
比較例２：プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド[(EAAAK)×2]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。ただし、ペプチドタグをコードする塩基配列は有さない。【０１２４】
そしてさらに、前記実施例２及び４ならびに比較例２に記載のベクタープラスミドを各々用いて、リンカーペプチド [(EAAAK)×5]コードする塩基配列を含む発現ベクターの構築を試みた。前記リンカーペプチド [(EAAAK）×5]をコードする塩基配列は、後述のインサートを用いて導入した。【０１２５】
具体的には、前記実施例２及び４ならびに比較例２に記載の各々のベクタープラスミド5μgを制限酵素SfiI (NEB) 20 Uを用いて添付のバッファー条件で全量50μlにして50℃、3時間処理した。これに、BAPC75を1μl加え50℃、30分反応後、TEバッファーで200μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。得られた溶液について15000 rpm、5 分間、室温で遠心分離を行ない、さらに下層のフェノールを除去したのち、再度フェノール・クロロホルム処理し酵素を完全に失活させた。この上清を分取し、制限酵素処理およびBAP処理したプラスミドをエタノール沈澱後、回収し、真空乾燥後、TEバッファー30μlで溶解した。一部をとって電気泳動を行ない所望の塩基配列が回収できているかを確認し、分子量マーカーを用いて濃度を推定した（20 fmol/μl）。【０１２６】
一方、前記インサートはオリゴヌクレオチド  5’- AAGAGGCGGCCGCTAAGGAAGCGGCTGCAAAAGAGGCCGCTGCTA -3（配列番号24：sequence 17）’と 5’- CAGCGGCCTCTTTTGCAGCCGCTTCCTTAGCGGCCGCCTCTTTAG -3’（配列番号25：sequence 18）を用い、先に記述した方法と同様に各々50 pmolをリン酸化した後、アニールし作成した。【０１２７】
このインサート150 fmolと先に作製した実施例２に記載のプラスミド50 fmolをライゲーションキット（タカラバイオ株式会社）の添付プロトコール通りに16℃、30分反応し（これにより制限酵素SfiI認識配列が欠失）、制限酵素SfiI 10 Uを用いて添付バッファー条件で50℃、30分間処理した。この反応液をTEバッファーで200 μlにメスアップし、フェノール・クロロホルム処理し酵素を失活させた。その後、15000 rpm、5 分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。その上清に、エタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させた。これをTEバッファー 2 μlで溶解し、全量とコンピテントセルDH5α 30 μlを用いてトランスフォーメーション反応し、50 μg/ml カルベニシリンを含むLBプレートに全量塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、導入部分の塩基配列を確認した。【０１２８】
これにより、前述の実施例２に記載のベクタープラスミドを用いた場合には、pET-15bベクター上の大腸菌発現プロモーターが制御する領域かつEGFPのC末端側に、プロテアーゼ切断認識部位、リンカーペプチド [(EAAAK)×5]をコードする塩基配列、及び３つのメチオニン残基からなるペプチドタグMMMをコードする塩基配列が導入されたプラスミド、すなわち３つのメチオニン残基からなるペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターを得た。【０１２９】
また、前述の実施例４に記載のベクタープラスミドを用いた場合には、pET-15bベクター上の大腸菌発現プロモーターが制御する領域かつEGFPのC末端側に、プロテアーゼ切断認識部位、リンカーペプチド [(EAAAK)×5]をコードする塩基配列、及び５つのメチオニン残基からなるペプチドタグMMMMMをコードする塩基配列が導入されたプラスミド、すなわち５つのメチオニン残基からなるペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターを得た。【０１３０】
また、前述の比較例２に記載のベクタープラスミドを用いた場合には、pET-15bベクター上の大腸菌発現プロモーターが制御する領域かつEGFPのC末端側に、プロテアーゼ切断認識部位、リンカーペプチド [(EAAAK)×5]をコードする塩基配列をコードする塩基配列が導入されているものの、ペプチドタグをコードする塩基配列をコードする塩基配列は導入されていないプラスミドベクターを得た。
具体的には、以下の発現ベクターを得た。【０１３１】
実施例５：３つのメチオニン残基MMMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK)×5]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１３２】
実施例６：５つのメチオニン残基MMMMMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK)×5]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１３３】
比較例３：プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK)×5]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。ただし、ペプチドタグをコードする塩基配列は有さない。【０１３４】
一方、メチオニンを４つ (MMMM)をコードする塩基配列は次のようにして得た。【０１３５】
先に得た実施例５に記載の発現ベクターを鋳型に、ペプチドタグ領域MMM直後の停止コドン部より3’末端側80 bpをPCR増幅し（制限酵素BglII認識配列を持たせるようにする）、精製する。得られた精製DNA断片をTAクローニング法でpCR（登録商標）4-TOPO（登録商標）ベクターに導入した。これにより、タグ領域部位変異用のプラスミドを得た。【０１３６】
得られたプラスミドを制限酵素NotIとBglIIで処理し、ペプチドタグがメチオニンの間にグリシンが挟まれたアミノ酸配列になるように、好適な塩基配列を導入した。これにより得られたプラスミドを鋳型にして、PCRで増幅した産物を制限酵素NotIとBpu1102Iで処理し、アガロースゲル精製後、これを制限酵素NotIとBpu1102Iで処理した実施例５に記載の発現ベクターに導入し、メチオニン残基及びグリシン残基からなるペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターを作製した。【０１３７】
具体的には、実施例５に記載の発現ベクター0.5 ngを鋳型にして、プライマー 5’- GTAGATCTGGCTGCTAACAAAGCCCG -3’（配列番号26：sequence 19）(下線部：制限酵素BglII認識配列)と5’- AGGGTTATGCTACTTATTGCTCAGCGGT -3’（配列番号27：sequence 20）各1 mM溶液0.25 μlを用いて50μlの系でTaKaRa Ex Taq(登録商標) Hot Start Version（タカラバイオ株式会社）0.25μlを用いて添付バッファー条件でPCR反応（95℃ 30秒、（95℃ 10秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒）×30cycle、72℃ 4分間、15℃ 保持）を行なった。得られたPCR産物はWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)を用いて添付プロトコールに従って精製した。【０１３８】
この精製物1μlをTOPO TA Cloning(登録商標) Kit（Invitrogen）を用いて添付プロトコールに従い付属のpCR(登録商標)4-TOPO(登録商標)ベクターにライゲーション反応を行なった。この反応液2μlとコンピテントセルTOP10 50μlを用いてトランスフォーメーション反応を行なった後、全量を50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認し、pCR(登録商標)4-TOPO(登録商標)ベクターの制限酵素NotI認識配列側に導入断片の制限酵素BglII認識配列側が結合したプラスミドを得た。このプラスミドをタグ領域部位変異用プラスミドとした。【０１３９】
その変異用プラスミド3μgを制限酵素NotI (タカラバイオ株式会社)とBglII (タカラバイオ株式会社)を用いて添付バッファー条件で37℃、2時間処理した。処理した溶液をフェノール・クロロホルム処理し酵素を失活した後、得られた上清から、制限酵素処理したプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させ、TEバッファー 15μlに溶解した。一部をとって電気泳動を行ない、所望の断片が回収できているかを確認し、分子量マーカーを用いて濃度を推定した（10 fmol/μl）。【０１４０】
そして以下の5本のオリゴヌクレオチドを用いて、メチオニンを４つ（MMMM）コードする塩基配列を導入した。
(a) 5’- GGCCGCTAAAGAGGCGGCAGCTAAGGAAGCGGCTGCAAA -3’ （配列番号28：sequence 21）、
(b) 5’- CTTAGCTGCCGCCTCTTTAGC -3’（配列番号29：sequence 22）、
(c) 5’- CCTTAGCCGCGGCCTCTTTTGCAGCCGCTTC -3’ （配列番号30：sequence 23）、
(d) 5’- AGAGGCCGCGGCTAAGGCCGTAATGATGATGATGTA -3’ （配列番号31：sequence 24）、
(e) 5’- GATCTACATCATCATCATTACGG -3’ （配列番号32：sequence 25）
各々のオリゴヌクレオチド50 pmolを先に示した方法でリン酸化し、リン酸化済みの5本のオリゴヌクレオチド各々20μlをあわせてアニール反応を行なった（全量100μl）。【０１４１】
アニール済みサンプル 90 fmolを先に作製した制限酵素処理済み変異用プラスミド30 fmolに加え、ライゲーションキットを用いて16℃、30分間反応を行なった。その全量とコンピテントセルTop10 50 μlを用いてトランスフォーメーション反応を行ない50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認した。これにより、メチオニン４つからなるペプチドタグMMMMが導入されているプラスミドを得た。【０１４２】
このプラスミド10 μgを鋳型にプライマーM13 Forward(-20): 5’- GTAAAACGACGGCCAG -3’（配列番号33：sequence 26）と、M13 Reverse: 5’- CAGGAAACAGCTATGAC -3’ （配列番号34：sequence 27）（各1 mM溶液）をそれぞれ0.1 μl加え、50 μlの系でKOD-Plus-（東洋紡績株式会社）を用いて添付プロトコール通りにPCR反応を行った。なお、PCRのサイクルは95℃ 30秒、（95℃ 20秒、45℃20秒、72℃ 30秒）×30サイクル、72℃ 4分、15℃保持で行った。反応後得られたPCR産物はWizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)を用いて添付のプロトコールに従って精製した。得られた精製DNA断片は、反応制限酵素NotI (タカラバイオ株式会社)20 Uを用いて添付バッファー条件で37℃、4時間処理し、電気泳動を用いて完全に切断されていることを確認した。その反応液はTEバッファーを用いて全量を200μlにし、フェノール・クロロホルム処理することにより酵素を失活させ、得られた上清から、制限酵素処理したプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させ、TEバッファー 20μlに溶解した。その溶液全量を制限酵素Bpu1102I（タカラバイオ株式会社）10 Uを用いて添付バッファー条件で37℃、16時間処理し、全量を使用してアガロースゲル精製し、導入断片とした。【０１４３】
その導入断片を導入するプラスミドとして、前記実施例５に記載の発現ベクターを用いた。そのプラスミド5μgを制限酵素NotI 20 UとBpu1102I 10 Uを用いて上記導入断片と同様の処理を行なった。【０１４４】
導入断片とそれを導入するプラスミドは、各々一部をとり電気泳動を行ない、回収できているかを確認し、分子量マーカーを用いて濃度を推定した（断片：181.8 fmol/μl、ベクター：30 fmol/μl）。【０１４５】
そのプラスミド30 fmolと導入断片90 fmolをあわせてライゲーションキットを用いて反応を行ない、全量とコンピテントセルDH5α 100μlを用いてトランスフォーメーション反応後、50 μg/mlカルベニシリン含有LBプレートに塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認した。これにより、メチオニン４つからなるペプチドタグMMMMタグ付きEGFP発現ベクターを得ることができた。具体的には、以下の発現ベクターを得た。【０１４６】
実施例７：4つのメチオニン残基MMMMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK）×5]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１４７】
(2)メチオニン残基及びグリシン残基からなるペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターの構築
本試験では、メチオニン残基及びグリシン残基からなるペプチドタグの例として、3種類のペプチドタグ（MGMGM、MGGMGGM、MGGGMGGGM）を採用した。【０１４８】
先の(1)で得た実施例５に記載の発現ベクターを鋳型として用い、ペプチドタグ領域MMM直後の停止コドン部より3’末端側80 bpをPCR増幅し（制限酵素BglII認識配列を持たせるようにする）、精製した。得られた精製DNA断片をTAクローニング法でpCR（登録商標）4-TOPO（登録商標）ベクター（Invitrogen）に導入した。これにより、タグ領域部位変異用のプラスミドを得た。【０１４９】
得られたプラスミドを制限酵素NotIとBglIIで処理し、ペプチドタグがメチオニンの間にグリシンが挟まれたアミノ酸配列になるように、好適な塩基配列を導入した。これにより得られたプラスミドを鋳型にして、PCRで増幅した産物を制限酵素NotIとBpu1102Iで処理し、アガロースゲル精製後、これを制限酵素NotIとBpu1102Iで処理した実施例５に記載の発現ベクターに導入し、メチオニン残基及びグリシン残基からなるペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターを作製した。【０１５０】
具体的には、実施例５に記載の発現ベクター0.5 ngを鋳型にして、プライマー 5’- GTAGATCTGGCTGCTAACAAAGCCCG -3’（配列番号26：sequence 19）(下線部：制限酵素BglII認識配列)と5’- AGGGTTATGCTACTTATTGCTCAGCGGT -3’（配列番号27：sequence 20）各1 mM溶液0.25 μlを用いて50μlの系でTaKaRa Ex Taq(登録商標) Hot Start Version（タカラバイオ株式会社）0.25μlを用いて添付バッファー条件でPCR反応（95℃ 30秒、（95℃ 10秒、58℃ 20秒、72℃30秒）×30cycle、72℃ 4分間、15℃ 保持）を行なった。得られたPCR産物はWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)を用いて添付プロトコールに従って精製した。【０１５１】
この精製物1μlをTOPO TA Cloning(登録商標) Kit（Invitrogen）を用いて添付プロトコールに従い付属のpCR(登録商標)4-TOPO(登録商標)ベクターにライゲーション反応を行なった。この反応液2μlとコンピテントセルTOP10 50μlを用いてトランスフォーメーション反応を行なった後、全量を50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認し、pCR(登録商標)4-TOPO(登録商標)の制限酵素NotI認識配列側に導入断片の制限酵素BglII認識配列側が結合したプラスミドを得た。このプラスミドをタグ領域部位変異用プラスミドとした。【０１５２】
その変異用プラスミド3μgを制限酵素NotI(タカラバイオ株式会社)とBglII(タカラバイオ株式会社)を用いて添付バッファー条件で37℃、2時間処理した。処理した溶液をフェノール・クロロホルム処理し酵素を失活した後、得られた上清から、制限酵素処理したプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させ、TEバッファー 15μlに溶解した。一部をとって電気泳動を行ない、所望の断片が回収できているかを確認し、分子量マーカーを用いて濃度を推定した（10 fmol/μl）。【０１５３】
一方、前記3種類のペプチドタグ (MGMGM、MGGMGGM、MGGGMGGGM)をコードする塩基配列は、以下の表１に記載の(a)、(b)、(c)、(d)、（e）、(f)に示す６本のオリゴヌクレオチドを用いて導入した。【０１５４】
【表１】
2009101737.tif 000003
【０１５５】
各々のオリゴヌクレオチド50 pmolを先に示した方法でリン酸化し、リン酸化済みの６本のオリゴヌクレオチド各々20μlをあわせて（全量120μl）アニール反応を行なった。アニール済みサンプル 150 fmolを先に作製した制限酵素処理済み変異用プラスミド50 fmolに加え、ライゲーションキットを用いて16℃、30分間反応を行なった。その全量とコンピテントセルDH5α 50 μlを用いてトランスフォーメーション反応を行ない50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認した。これにより、メチオニン残基及びグリシン残基からなるペプチドタグMGMGM、MGGMGGMまたはMGGGMGGGMが導入されているプラスミドを得た。【０１５６】
このプラスミド25μgを制限酵素NotI (タカラバイオ株式会社)10 Uを用いて添付バッファー条件で37℃、2時間処理し、電気泳動を用いて完全に切断されていることを確認した。その反応液はTEバッファーを用いて全量を250μlにし、フェノール・クロロホルム処理することにより酵素を失活させ、得られた上清から、制限酵素処理したプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させ、TEバッファー 50μlに溶解した。その溶液全量を制限酵素Bpu1102I（タカラバイオ株式会社）10 Uを用いて添付バッファー条件で37℃、16時間処理し、全量を使用してアガロースゲル精製し、導入断片とした。【０１５７】
その導入断片を導入するプラスミドとして、前記実施例５に記載の発現ベクターを用いた。そのプラスミド5μgを制限酵素NotI 10 UとBpu1102I 10 Uを用いて上記導入断片と同様の処理を行なった。導入断片とそれを導入するプラスミドは、各々一部をとり電気泳動を行ない、回収できているかを確認し、分子量マーカーを用いて濃度を推定した（断片：70 fmol/μl、ベクター：7.5 fmol/μl）。そのプラスミド50 fmolと導入断片150 fmolをあわせてライゲーションキットを用いて反応を行ない、全量とコンピテントセルDH5α 100μlを用いてトランスフォーメーション反応後、50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認した。これにより、メチオニン残基及びグリシン残基からなるペプチドタグMGMGM、MGGMGGMまたはMGGGMGGGMタグ付きEGFP発現ベクターを得ることができた。具体的には、以下の発現ベクターを得た。【０１５８】
実施例８：MGMGMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK）×5]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１５９】
実施例９：MGGMGGMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK）×5]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１６０】
実施例１０：MGGGMGGGMからなるペプチドタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK）×5]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１６１】
(3)メチオニン残基及びシステイン残基からなるペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターの構築
本試験では、メチオニン残基及びシステイン残基からなるペプチドタグの例として、2種類のペプチドタグ（CMM、MMC）を採用した。【０１６２】
先に得た実施例５に記載の発現ベクターを鋳型にして、ペプチドタグ領域MMM直後の停止コドン部より3’末端側80 bpをPCR増幅し（制限酵素BglII認識配列を持たせるようにする）、精製した。得られた精製DNA断片をTAクローニング法でpCR（登録商標）4-TOPO（登録商標）ベクター (Invitrogen)に導入した。これにより、タグ領域部位変異用のプラスミドを得た。【０１６３】
得られたプラスミドを制限酵素NotIとBglIIで処理し、ペプチドタグがメチオニンの間にグリシンが挟まれたアミノ酸配列になるように、好適な塩基配列を導入した。これにより得られたプラスミドを鋳型にして、PCRで増幅した産物を制限酵素NotIとBpu1102Iで処理し、アガロースゲル精製後、これを制限酵素NotIとBpu1102Iで処理した実施例５に記載の発現ベクターに導入し、メチオニン残基及びグリシン残基からなるペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターを作製した。【０１６４】
具体的には、実施例５に記載の発現ベクター0.5 ngを鋳型にして、プライマー 5’- GTAGATCTGGCTGCTAACAAAGCCCG -3’（配列番号26：sequence 19）(下線部：制限酵素BglII認識配列)と5’- AGGGTTATGCTACTTATTGCTCAGCGGT -3’（配列番号27：sequence 20）各1 mM溶液0.25 μlを用いて50μlの系でTaKaRa Ex Taq(登録商標) Hot Start Version（タカラバイオ株式会社）0.25μlを用いて添付バッファー条件でPCR反応（95℃ 30秒、（95℃ 10秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒）×30cycle、72℃ 4分間、15℃ 保持）を行なった。得られたPCR産物はWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)を用いて添付プロトコールに従って精製した。【０１６５】
この精製物1μlをTOPO TA Cloning(登録商標) Kit（Invitrogen）を用いて添付プロトコールに従い付属のpCR(登録商標)4-TOPO(登録商標)ベクターにライゲーション反応を行なった。この反応液2μlとコンピテントセルTOP10 50μlを用いてトランスフォーメーション反応を行なった後、全量を50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認し、pCR(登録商標)4-TOPO(登録商標)の制限酵素NotI認識配列側に導入断片の制限酵素BglII認識配列側が結合したプラスミドを得た。このプラスミドをタグ領域部位変異用プラスミドとした。【０１６６】
その変異用プラスミド3μgを制限酵素NotI (タカラバイオ株式会社)とBglII(タカラバイオ株式会社)を用いて添付バッファー条件で37℃、2時間処理した。処理した溶液をフェノール・クロロホルム処理し酵素を失活した後、得られた上清から、制限酵素処理したプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させ、TEバッファー 15μlに溶解した。一部をとって電気泳動を行ない、所望の断片が回収できているかを確認し、分子量マーカーを用いて濃度を推定した（10 fmol/μl）。【０１６７】
一方、前記2種類のペプチドタグ (CMM、MMC)をコードする塩基配列は、以下の表２に記載の (a)、(b)、(c)、(d)、(e)に示す５本のオリゴヌクレオチドを用いて導入した。【０１６８】
【表２】
2009101737.tif 000004
【０１６９】
各々のオリゴヌクレオチド50 pmolを先に示した方法でリン酸化し、リン酸化済みの5本のオリゴヌクレオチド各々20μlをあわせてアニール反応を行なった（全量100μl）。【０１７０】
アニール済みサンプル 90 fmolを先に作製した制限酵素処理済み変異用プラスミド30 fmolに加え、ライゲーションキットを用いて16℃、30分間反応を行なった。その全量とコンピテントセルTop10 50 μlを用いトランスフォーメーション反応を行ない50 μg/ml アンピシリン含有LBプレートに塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認した。これにより、ペプチドタグCMM及びMMCがそれぞれ導入されているプラスミドをそれぞれ得た。【０１７１】
このプラスミド10 μgを鋳型にプライマーM13 Forward(-20): 5’- GTAAAACGACGGCCAG -3’と、M13 Reverse: 5’- CAGGAAACAGCTATGAC -3’（各1 mM溶液）をそれぞれ0.1 μl加え、50 μlの系でKOD-Plus-（東洋紡績株式会社）を用いて添付プロトコール通りにPCR反応を行った。なお、PCRのサイクルは95℃ 30秒、（95℃ 20秒、45℃20秒、72℃ 30秒）×30サイクル、72℃ 4分、15℃保持で行った。反応後得られたPCR産物はWizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)を用いて添付のプロトコールに従って精製した。得られた精製DNA断片は、反応制限酵素NotI (タカラバイオ株式会社) 20 Uを用いて添付バッファー条件で37℃、4時間処理し、電気泳動を用いて完全に切断されていることを確認した。その反応液はTEバッファーを用いて全量を200μlにし、フェノール・クロロホルム処理することにより酵素を失活させ、得られた上清から、制限酵素処理したプラスミドをエタノール沈殿後、回収し、真空乾燥させ、TEバッファー 20μlに溶解した。その溶液全量を制限酵素Bpu1102I（タカラバイオ株式会社）10 Uを用いて添付バッファー条件で37℃、16時間処理し、全量を使用してアガロースゲル精製し、導入断片とした。【０１７２】
その導入断片を導入するプラスミドとして、前記実施例５に記載の発現ベクターを用いた。そのプラスミド5μgを制限酵素NotI 20 UとBpu1102I 10 Uを用いて上記導入断片と同様の処理を行なった。導入断片とそれを導入するプラスミドは、各々一部をとり電気泳動を行ない、回収できているかを確認し、分子量マーカーを用いて濃度を推定した（断片：180 fmol/μl、ベクター：30 fmol/μl）。そのプラスミド30 fmolと導入断片90 fmolをあわせてライゲーションキットを用いて反応を行ない、全量とコンピテントセルDH5α 100μlを用いてトランスフォーメーション反応後、50 μg/ml カルベニシリン含有LBプレートに塗布した。得られたコロニーからプラスミドをQuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて調製し、塩基配列を確認した。これにより、ペプチドタグCMMタグ付きEGFP発現ベクター及びペプチドタグMMCタグ付きEGFP発現ベクターを得ることができた。具体的には、以下の発現ベクターを得た。【０１７３】
実施例１１：ペプチドタグCMMをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK）×5]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１７４】
実施例１２：ペプチドタグMMCをコードする塩基配列、プロモーター配列、EGFPをコードする塩基配列、プロテアーゼ切断認識部位をコードする塩基配列、及びリンカーペプチド [(EAAAK）×5]をコードする塩基配列を含む発現ベクター。【０１７５】
試験例2
メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質は公知の方法で発現させ、回収することが可能である。試験例2では、前記試験例1で作製したメチオニン残基含有ペプチドタグ付きEGFP発現ベクターを大腸菌に形質転換して得られた組み換え大腸菌を用いて実験を行った。なお、以下の操作は、試験例１に示したすべてのタグ付きEGFP発現用ベクターについて各々行った。【０１７６】
具体的には、前記形質転換は次のように行った。試験例1で作製したメチオニン残基含有ペプチドタグ付きEGFP発現ベクタープラスミド約10 ngをコンピテントセルBL21(DE3) 100μl に加え、氷上で30分静置後、42℃、60秒間熱処理し、すばやく氷上に戻し3分間静置する。その後SOC培地を1 ml加え、37℃でインキュベート後、50 μg/ml カルベニシリン含有LBプレートに塗布し、37℃、16時間インキュベートして得たコロニーを形質転換体とした。【０１７７】
得られた形質転換体を、50μg/mlカルベニシリンを含むLB液体培地を用いて30℃で培養し、対数増殖期（OD600=0.6付近）にIPTGを終濃度1mMになるように加えて発現誘導をかけ、3時間後に大腸菌を回収した。これより以下の操作をすべて4℃で行なった。【０１７８】
回収した大腸菌を1 mM DTT含有トリスバッファー（20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、50 mM NaClを含む水溶液）で2回洗浄後、1 mM DTT およびprotease inhibitor含有トリスバッファー(100×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク株式会社）水溶液をトリスバッファーに1×になるように添加したもの)で懸濁し、氷上で超音波破砕（BRANSON SONIFIER 250で20〜30 sec、duty cycle 10%、output 40〜60%）した。得られた懸濁液を遠心分離し、その上清を0.45μmのフィルターで濾過した後、Econo gradient pump system（Bio-Rad）とEcono packイオン交換カートリッジ High Q (Bio-Rad)を用いて精製した。この際に、1 mM DTT含有トリスバッファーを用いてEGFPをカラムへ結合させ、NaCl濃度を80 mMに上げることによりEGFP以外のタンパク質を除去した。その後、塩濃度を80 mMから110 mMまで濃度勾配をかけ110 mM付近でEGFPを含む画分を回収、濃縮することにより、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の精製を行なった。【０１７９】
試験例3
メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を、金のついた磁性金属酸化物粒子（大阪大学工学部  山本孝夫教授の研究室から提供。以下金磁性粒子と称する）を用いた方法で特異的にかつ効率よく分離、精製することを試みた。【０１８０】
ここで、磁性金属酸化物粒子としては、γ−Fe3O4を使用し、前記金磁性粒子はＷＯ２００４／０８３１２４号公報に記載の方法に従い製造した。また、本試験は、前記試験例２において得られた、すべてのメチオニン残基含有ペプチドタグ付きEGFPタンパク質について各々行なった。【０１８１】
試験例２で作製した各々のメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質またはタグなしタンパク質を各々限外ろ過システムで濃縮し、ペプチドタグ付きタンパク質溶液、及びタグなしタンパク質溶液を得た。また、金磁性粒子をトリスバッファーであらかじめ洗浄した。各々のEGFPタンパク質の量は蛍光強度(単位なし)を測定した後、500（蛍光強度）/μlになるようにトリスバッファーを用いて希釈した。【０１８２】
金磁性粒子100μl (Fe 5 mg/ml)に、先に準備したペプチドタグ付きタンパク質溶液またはタグなしタンパク質溶液各々300μlを加えロータリーシェイカーで混合しながら、４℃、30分間、金磁性粒子とタンパク質とを結合させた。その後、金磁性粒子とタンパク質との結合体をマグネット存在下で約５分間静置することで磁気分離し、上清を分取した。この上清の蛍光量を測定し、得られた値から結合前の溶液の蛍光量を差し引き、EGFPタンパク質が金磁性粒子に結合した量を求めた。【０１８３】
さらに、前記磁気分離により回収された金磁性粒子とタンパク質との結合物を含む残渣をバッファーで懸濁し、磁気分離後、上清を除くという操作を２回行なうことで、金磁性粒子への非特異的な吸着物等を除去し、その後、24 mM メルカプトエタノールを含むバッファー 400μlで懸濁後、ロータリーシェイカーで混合しながら４℃、30分間、タンパク質を溶出させた。そして、磁気分離後の蛍光量を測定し、これを上記結合物からのEGFPタンパク質溶出量を求めることが可能である。【０１８４】
蛍光量は96穴プレートに測定サンプル250μlとり、蛍光プレートリーダーGemini XPS（Molecular Devices）を用いて測定し、バックグラウンドを差し引いた後、実際の液量に換算して結合量を求めた。【０１８５】
まず、前記実施例１または５に記載の発現ベクターを使用することにより得られたペプチドタグ付タンパク質における結果を図２に示した。実施例１に記載のベクターを使用した場合より、実施例５に記載のベクターを使用した場合のほうが、すなわちリンカーペプチドをベクターに導入した方が金磁性粒子への結合量が有意に多くなることが明らかとなった。（ｐ＜０．０５）。溶出量についても同様に、実施例５に記載のベクターを使用した場合のほうが高くなることが明らかとなった。【０１８６】
次に、前記実施例５または７に記載の発現ベクターを使用することにより得られたペプチドタグ付タンパク質における結果を図３に示した。実施例７に記載のベクターを使用した場合、金磁性粒子への結合量が実施例５に記載のベクターを使用した場合と同等またはそれ以上となることが明らかとなった。すなわち4つのメチオニン残基MMMMからなるペプチドタグを付加した場合、金磁性粒子への結合量が３つのメチオニン残基MMMからなるペプチドタグを付加した場合と同等またはそれ以上となることが明らかとなった。実施例７に記載のベクターを使用した場合、溶出量についても同様に、実施例５に記載のベクターを使用した場合と同等またはそれ以上となることが明らかとなった。【０１８７】
また、タグ領域がメチオニン残基とグリシン残基からなるリンカーペプチド付きタンパク質においても同様に金磁性粒子への結合実験を行った。結果を図４に示した。メチオニン残基間にグリシン残基を多く挿入する方が結合量が多くなった。溶出量についても同様に、メチオニン残基間にグリシン残基を多く挿入する方が高くなることが明らかとなった。なお、図４は、前記実施例５及び７〜９に記載の発現ベクターを使用することにより得られたペプチドタグ付タンパク質における結果を示す。【０１８８】
さらに、図５に示した通り、タグ領域がメチオニン残基とシステイン残基からなるリンカーペプチド付きタンパク質においても同様に金磁性粒子への結合実験を行ったところ、金磁性粒子への結合がみられた。なお、図５は、前記実施例５及び１１〜１２に記載の発現ベクターを使用することにより得られたペプチドタグ付タンパク質における結果を示す。【０１８９】
試験例4
試験例２で作製した各々のメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質溶液またはタグなしタンパク質溶液に対して以下の通り別途作製した大腸菌抽出液をそれぞれ添加することであえてタンパク質溶液中の夾雑物を増やしておき、かかる状況下で金磁性粒子を用いて試験例３と同様にタグ付きタンパク質を特異的にかつ効率よく分離、精製することを試みた。【０１９０】
大腸菌抽出液は、以下のとおり調製した。まず、何もプラスミドを導入していない大腸菌を、LB液体培地を用いて30℃で培養し、対数増殖期（OD600=0.6付近）に1M IPTG水溶液を終濃度1mMになるように加えて発現誘導をかけ、3時間後に大腸菌を回収した。これより以下の操作をすべて4℃で行なった。回収した大腸菌は、1 mM トリスバッファー（20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、50 mM NaClを含む水溶液）で2回洗浄後、protease inhibitor含有トリスバッファー(100×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク株式会社）水溶液をトリスバッファーに1×になるように添加したもの)で懸濁し、氷上で超音波破砕（BRANSON SONIFIER 250で20〜30 sec、duty cycle 10%、output 40〜60%）した。得られた懸濁液を遠心分離し、その上清を0.45 μmのフィルターでろ過し、タンパク質重量をBCA Protein assay kit（Thermo SCIENTIFIC）を用いて測定した上で、それぞれのタンパク質溶液と次の通り混合した。【０１９１】
それぞれのタンパク質溶液と大腸菌抽出液との混合条件は、タンパク質の精製度に応じて次の通り決定した。【０１９２】
まず、蛍光強度(単位なし)がちょうど500 (蛍光強度)/μlとなる、MMMタグ付きEGFPタンパク質のタンパク質重量を算出した。次にこれと等重量の大腸菌抽出液をMMMタグ付きEGFPタンパク質溶液に加え、さらにこの溶液中の総タンパク質重量を算出した。他のタグ付きEGFPタンパク質については、蛍光強度とタンパク質重量を測定した後、蛍光強度、総タンパク質重量、及び溶液量のいずれもが先に調製しておいたMMMタグ付きEGFPタンパク質溶液のものと一致するように適宜大腸菌抽出液とトリスバッファーを用いて調整した。【０１９３】
これらのタンパク質溶液を用いて、試験例３と同様に実験を行なった。この結果を図６に示した。タグなし（リンカー付き）ベクターの場合よりメチオニン残基含有ペプチドタグ（リンカー付き）がついたベクターを使用した場合の方が金磁性粒子への結合量が有意に多くなることが明らかとなった。溶出量についても同様に、タグなしベクターを使用した場合は全く溶出せず、タグ付きベクターを使用した場合だけ溶出することができることが明らかとなった。【０１９４】
試験例５
大腸菌で発現させたメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を、大腸菌抽出液から直接精製した。【０１９５】
まず、実施例７〜１０、及び比較例３に記載の発現ベクタープラスミドを導入した形質転換体を、50 μg/mlカルベニシリンを含むLB液体培地を用いて30℃で培養し、対数増殖期（OD600=0.6付近）にIPTGを終濃度1mMになるように加えて発現誘導をかけ、3時間後に大腸菌を回収した。これより以下の操作はすべて4℃で行なった。【０１９６】
上の通り回収した大腸菌を1 mM DTT含有トリスバッファーで2回洗浄後、1 mM DTT およびprotease inhibitor含有トリスバッファー(100×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク株式会社）水溶液をトリスバッファーに1×になるように添加したもの)で懸濁し、氷上で超音波破砕（BRANSON SONIFIER 250で20〜30 sec、duty cycle 10%、output 40〜60%）した。得られた懸濁液を遠心分離し、その上清を0.45 μmのフィルターで濾過した。【０１９７】
結合実験に用いる金磁性粒子をトリスバッファーであらかじめ洗浄した。各々のEGFPタンパク質の量は蛍光強度(単位なし)を測定した後、500（蛍光強度）/ μlになるようにトリスバッファーを用いて希釈した。【０１９８】
金磁性粒子100 μl (Fe 5 mg/ml)に、先に準備したペプチドタグ付きタンパク質を含む大腸菌破砕液またはタグなしタンパク質を含む大腸菌破砕液各々300 μlを加えロータリーシェイカーで混合しながら、４℃、30分間、金磁性粒子とタンパク質とを結合させた。その後、金磁性粒子とタンパク質との結合体をマグネット存在下で約５分間静置することで磁気分離し、上清を除いた。さらに、前記磁気分離により回収された金磁性粒子とタンパク質との結合物を含む残渣をバッファーで懸濁し、磁気分離後、上清を除くという操作を２回行なうことで、金磁性粒子への非特異的な吸着物等を除去した。その後、24 mM メルカプトエタノールを含むバッファー 300 μlで懸濁後、ロータリーシェイカーで混合しながら４℃、30分間、タンパク質を溶出させた。そして、磁気分離後の蛍光量を測定した。蛍光量は96穴プレートに測定サンプル250 μlとり、蛍光プレートリーダーGemini XPS（Molecular Devices）を用いて測定し、バックグラウンドを差し引いた後、実際の液量に換算した。【０１９９】
金磁性粒子と結合させる前の大腸菌抽出液（精製前）と、金磁性粒子から溶出したサンプル溶液（精製後）から、EGFPタンパク質の蛍光強度が1000（単位なし）となる分量をそれぞれ分取し、トリスバッファーで20 μlに調製した。この溶液に5×SDS sample loding buffer (250 mM Tris-HCl (pH 6.8)、20％(v/v) 2-Mercaptoethanol、10％(w/v) SDS、0.1 mg/ml BPB、50%(v/v) Glycerol)を5 μl加えた混合液を95℃で３分間熱処理した後、氷上で急冷した。これらの試料及び分子量マーカーを12％ SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いて20 mAの一定電流で電気泳動を行った。泳動後、クーマシーブリリアントブルーで染色した結果を図7に示した。【０２００】
泳動写真（図7）から、タグなしのEGFPタンパク質（比較例３）が全く溶出できていないことが分かった。一方、実施例７〜１０に記載の発現ベクターを導入した大腸菌の抽出液からは、単一のバンドとなって泳動されるタンパク質が回収されていることが確認できた。すなわち、MMMM、MGMGM、MGGMGGM、及びMGGGMGGGMのそれぞれからなるペプチドタグをそれぞれ付加したタンパク質は高純度に精製できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】本発明のメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクターを用いて発現させたタンパク質のモデル図を示した。この図はN末端側に所望のタンパク質であるEGFPタンパク質を持ち、C末端側にメチオニン残基含有タグを持つ（例としてMMMを示す）。間には所望のタンパク質とタグの間の距離をとるために導入されたαへリックス構造をとる（EAAAK)ｎ配列（例としてn=5を示す）のリンカーペプチド配列が挿入されている。そして、そのリンカーペプチド配列及びタグ配列を所望のタンパク質からとり除くためにペプチダーゼ認識配列（例としてPreScission Protease認識配列を示す）を導入してある。
【図２】リンカーペプチドを導入したペプチドタグ付きタンパク質の金磁性粒子への結合量を求めた結果を示した。横軸は金磁性粒子へのEGFPタンパク質結合量をEGFPタンパク質の蛍光強度で示した。
【図３】メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の金磁性粒子への結合量を求めた結果を示した。横軸は金磁性粒子へのタンパク質結合量をEGFPタンパク質の蛍光強度で示した。
【図４】グリシンを導入したメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の金磁性粒子への結合量を求めた結果を示した。横軸は金磁性粒子へのタンパク質結合量をEGFPタンパク質の蛍光強度で示した。
【図５】システインを導入したメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の金磁性粒子への結合量を求めた結果を示した。横軸は金磁性粒子へのタンパク質結合量をEGFPタンパク質の蛍光強度で示した。
【図６】グリシンを導入したメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の、大腸菌抽出液存在下における金磁性粒子への結合量を求めた結果を示した。横軸は金磁性粒子へのタンパク質結合量をEGFPタンパク質の蛍光強度で示した。
【図７】グリシンを導入したメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を含む大腸菌抽出液をまず金磁性粒子と結合させ、その後に溶出させたサンプル溶液（精製後）の電気泳動写真を示した、図面に代わる写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０２０２】
配列番号１は、tag 1のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、tag 2のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、tag 3のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、tag 4のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、tag 5のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、linker 1のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、linker 2のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、sequence 1の塩基配列を示す。
配列番号９は、sequence 2の塩基配列を示す。
配列番号１０は、sequence 3の塩基配列を示す。
配列番号１１は、sequence 4の塩基配列を示す。
配列番号１２は、sequence 5の塩基配列を示す。
配列番号１３は、sequence 6の塩基配列を示す。
配列番号１４は、sequence 7の塩基配列を示す。
配列番号１５は、sequence 8の塩基配列を示す。
配列番号１６は、sequence 9の塩基配列を示す。
配列番号１７は、sequence 10の塩基配列を示す。
配列番号１８は、sequence 11の塩基配列を示す。
配列番号１９は、sequence 12の塩基配列を示す。
配列番号２０は、sequence 13の塩基配列を示す。
配列番号２１は、sequence 14の塩基配列を示す。
配列番号２２は、sequence 15の塩基配列を示す。
配列番号２３は、sequence 16の塩基配列を示す。
配列番号２４は、sequence 17の塩基配列を示す。
配列番号２５は、sequence 18の塩基配列を示す。
配列番号２６は、sequence 19の塩基配列を示す。
配列番号２７は、sequence 20の塩基配列を示す。
配列番号２８は、sequence 21の塩基配列を示す。
配列番号２９は、sequence 22の塩基配列を示す。
配列番号３０は、sequence 23の塩基配列を示す。
配列番号３１は、sequence 24の塩基配列を示す。
配列番号３２は、sequence 25の塩基配列を示す。
配列番号３３は、sequence 26の塩基配列を示す。
配列番号３４は、sequence 27の塩基配列を示す。
配列番号３５は、sequence 28の塩基配列を示す。
配列番号３６は、sequence 29の塩基配列を示す。
配列番号３７は、sequence 30の塩基配列を示す。
配列番号３８は、sequence 31の塩基配列を示す。
配列番号３９は、sequence 32の塩基配列を示す。
配列番号４０は、sequence 33の塩基配列を示す。
配列番号４１は、sequence 34の塩基配列を示す。
配列番号４２は、sequence 35の塩基配列を示す。
配列番号４３は、sequence 36の塩基配列を示す。
配列番号４４は、sequence 37の塩基配列を示す。
配列番号４５は、sequence 38の塩基配列を示す。
【図１】
2009101737.tif 000005
【図２】
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【図３】
2009101737.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月20日(2009.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）を含む、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター、
（Ａ）メチオニン残基からなるか、またはグリシン残基及び少なくとも３つのメチオニン残基からなる、アミノ酸残基数が３〜１０のペプチドタグをコードする塩基配列、
（Ｂ）プロモーター配列（ここで、該プロモーター配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び
（Ｃ）所望のタンパク質をコードする塩基配列（ここで、該所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流または下流に接続されている）。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
リンカーペプチドをコードする塩基配列（ここで、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記所望のタンパク質をコードする塩基配列の間に接続されている）を含む、請求項１、１４、及び１５のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
以下の（Ｄ）〜（Ｆ）を含む、メチオニン残基含有ペプチドタグベクター、
（Ｄ）メチオニン残基からなるか、またはグリシン残基及び少なくとも３つのメチオニン残基からなる、アミノ酸残基数が３〜１０のペプチドタグをコードする塩基配列、
（Ｅ）プロモーター配列（ここで、該プロモーター配列は、、前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び
（Ｆ）所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入するためのクローニングサイト（ここで、該クローニングサイトは、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記ペプチドタグをコードする塩基配列の上流及び／または下流に接続されている）。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
リンカーペプチドをコードする塩基配列（ここで、該リンカーペプチドをコードする塩基配列は、前記ペプチドタグをコードする塩基配列と前記クローニングサイトの間に接続されている）を含む、請求項５、１６、及び１７のいずれかに記載のタグベクター。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
請求項５、７、１６、及び１７のいずれかに記載のベクターに接続されたクローニングサイトに、所望のタンパク質をコードする塩基配列が導入された、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１、３、１４、及び１５、並びに９のいずれかに記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体から得られる、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質。
【請求項１２】
請求項１０に記載の形質転換体からメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を発現させる工程を含有する、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１で得られたメチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質を、金磁性粒子を用いて回収する工程を含有する、メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質の回収方法。
【請求項１４】
前記（Ａ）の塩基配列が、
メチオニン残基からなるか；または
少なくとも３つのメチオニン残基、及びメチオニン残基よりも多いグリシン残基からなる、
アミノ酸残基数が７〜１０のペプチドタグをコードする塩基配列である、
請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記（Ａ）の塩基配列が、少なくとも３つのメチオニン残基、及びメチオニン残基よりも多いグリシン残基からなる、アミノ酸残基数が７〜１０のペプチドタグをコードする塩基配列である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記（Ｄ）の塩基配列が、
メチオニン残基からなるか；または
少なくとも３つのメチオニン残基、及びメチオニン残基よりも多いグリシン残基からなる、
アミノ酸残基数が７〜１０のペプチドタグをコードする塩基配列である、請求項５に記載のタグベクター。
【請求項１７】
前記（Ｄ）の塩基配列が、少なくとも３つのメチオニン残基、及びメチオニン残基よりも多いグリシン残基からなる、アミノ酸残基数が７〜１０のペプチドタグをコードする塩基配列である、請求項５に記載のタグベクター。
【国際調査報告】
2009101737.tif 000012
2009101737.tif 000013
2009101737.tif 000014