(57)【要約】  共培養による初代肝細胞のスフェロイド化技術に培養細胞の凍結技術を適用し、初代肝細胞のスフェロイド化技術を適用した検査、試験の作用性を向上させることができる細胞凍結物固定化基材、初代肝細胞培養ツール並びに初代肝細胞培養ツールの製造方法を提供する。パターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養基材上に動物由来の接着性細胞を培養し、これを凍結用培地と共に冷凍する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養基材上に動物由来の接着性細胞を培養し、これを凍結用培地と共に冷凍したことを特徴とする細胞凍結物固定化基材。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞凍結物固定化基材を解凍し、凍結用培地を通常培地と置換した後、初代肝細胞を播種したものであることを特徴とする初代肝細胞培養ツール。
【請求項３】
請求項２に記載の初代肝細胞評価用ツールにおいて、前記解凍を３０〜４８℃で行うことを特徴とする初代肝細胞培養ツール。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞凍結物固定化基材を解凍し、凍結用培地を通常培地と置換した後、初代肝細胞を播種する工程を具備することを特徴とする初代肝細胞培養ツールの製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の初代肝細胞培養ツールの製造方法において、前記解凍を３０〜４８℃で行うことを特徴とする初代肝細胞培養ツールの製造方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の初代肝細胞培養ツールの製造方法において、前記解凍後、２４時間以内に初代肝細胞を播種することを特徴とする初代肝細胞培養ツールの製造方法。
【請求項７】
請求項４又は５に記載の初代肝細胞培養ツールの製造方法において、前記解凍後、３時間以内に初代肝細胞を播種することを特徴とする初代肝細胞培養ツールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物由来の接着性細胞をパターン状に培養したまま凍結した細胞凍結物固定化基材に関する。また、この細胞凍結物固定化基材を解凍後、一定時間内に初代肝細胞を播種することで得られる、初代肝細胞培養ツールに関する。また、初代肝細胞培養ツールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、パターン状に細胞を培養する技術はいくつか提案されており、例えば水系の感光材を基材上に塗布し、フォトリソグラフフィーによりパターンを構築した上で細胞を培養することで、元の基材が露出した部分のみに細胞が接着することを利用した、パターン培養基材が開発されている（特許文献１参照）。このパターン培養基材上では、動物由来の接着性細胞を特定の領域、例えば１０μｍφ〜１ｍｍφの円状に効果的にパターンを形成することなどが可能である。しかしながら、細胞を接着させた状態で液体培地と共に輸送すること、あるいは長期間培養状態のまま維持することが共に難しかった。【０００３】
また、パターン状に細胞を接着させたものを用いる有力な用途として、共培養による初代肝細胞のスフェロイド化技術が提案されている（特許文献２参照）。この技術は、１００μｍφ程度の円形領域に動物由来の接着性細胞をフィーダー細胞として培養し、さらに初代肝細胞を播種することで肝スフェロイドを形成させ、これまで困難であった初代肝細胞を簡便に長期生存させることを可能とするものである。しかしながら、フィーダー細胞を播種後、２４時間以上プレ培養し、その後に肝細胞を播種するという操作を行わないと、安定な肝スフェロイド形成が起こらないので、フィーダー細胞を播種後２４時間以上プレ培養して肝細胞を播種することが必要であった。そのため、それを用いた検査、試験における作業の効率が悪いという問題があった。【０００４】
一方、足場依存性動物性細胞を培養基質上で培養したのち、培養培地を凍結用培地に交換し、培養基質上に付着している足場依存性動物性細胞を凍結用培地と共に培地基質ごと凍結するという技術が提案されている（特許文献３参照）。しかしながら、この技術は、足場依存性動物細胞を培養する課程で凍結して培養を停止させ、その後、解凍したのちに培養を継続するという単純なものであり、上述したような複雑な系への適用の示唆は全くない。【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２８００７６号公報（段落番号［００４９］、［００９４］等）
【特許文献２】ＷＯ２００３−１０３０２号公報（発明の開示等）
【特許文献３】特公平５−７７３８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はこのような事情に鑑み、上述した共培養による初代肝細胞のスフェロイド化技術に培養細胞の凍結技術を適用し、初代肝細胞のスフェロイド化技術を適用した検査、試験の作用性を向上させることができる細胞凍結物固定化基材及び初代肝細胞培養ツール並びに初代肝細胞培養ツールの製造方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決する本発明の第１の態様は、パターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養基材上に動物由来の接着性細胞を培養し、これを凍結用培地と共に冷凍したことを特徴とする細胞凍結物固定化基材にある。【０００８】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の細胞凍結物固定化基材を解凍し、凍結用培地を通常培地と置換した後、初代肝細胞を播種したものであることを特徴とする初代肝細胞培養ツール（＝器具）にある。【０００９】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の初代肝細胞培養ツールにおいて、前記解凍を３０〜４８℃で行うことを特徴とする初代肝細胞培養ツールにある。【００１０】
本発明の第４の態様は、第１の態様に記載の細胞凍結物固定化基材を解凍し、凍結用培地を通常培地と置換した後、初代肝細胞を播種する工程を具備することを特徴とする初代肝細胞培養ツールの製造方法にある。【００１１】
本発明の第５の態様は、第４の態様に記載の初代肝細胞培養ツールの製造方法において、前記解凍を３０〜４８℃で行うことを特徴とする初代肝細胞培養ツールの製造方法にある。【００１２】
本発明の第６の態様は、第４又は５の態様に記載の初代肝細胞培養ツールの製造方法において、前記解凍後、２４時間以内に初代肝細胞を播種することを特徴とする初代肝細胞培養ツールの製造方法にある。【００１３】
本発明の第７の態様は、第４又は５の態様に記載の初代肝細胞培養ツールの製造方法において、前記解凍後、３時間以内に初代肝細胞を播種することを特徴とする初代肝細胞培養ツールの製造方法にある。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、動物由来の接着性細胞をパターン状に培養した状態で、凍結用培地に置換した後、凍結保存することで、長期保存・輸送が可能となる細胞凍結物固定化基材を提供することができるという効果を奏する。かかる細胞凍結物固定化基材を用いると、動物由来の接着性細胞を、その性状等を変えることなくパターン状に凍結させておくことが可能となり、冷凍下で１年以上保存が可能となること、また凍結剤であるドライアイスと共に上記基材を梱包することで凍結状態のまま輸送が可能になること、さらには解凍後別途用意した初代肝細胞を速やかに播種でき、細胞の保存・輸送媒体、並びに薬物スクリーニングなどの作業に簡便で、好適に用いることができるという効果を奏する。【００１５】
また、この細胞凍結物固定化基材を用いた初代肝細胞培養ツールは、細胞凍結物固定化基材を解凍後速やかに肝細胞を播種したものであり、薬物候補になり得る化合物（薬物）スクリーニングなどの作業を高効率で行うことができるという効果を奏する。【００１６】
さらに、本発明の細胞凍結物固定化基材を用いた初代肝細胞培養ツールの製造方法によると、細胞凍結物固定化基材を解凍後速やかに肝細胞を播種することができ、薬物スクリーニングなどの作業を高効率で行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例２の結果を示す写真である。
【図２】実施例３の結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明で用いることが可能なパターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養基材は、細胞の接着領域をパターン状に規定したものであれば特に限定されないが、好ましくは親水性の高分子架橋体により細胞非接着領域が作成され、その細胞非接着領域の中に高分子架橋体が除去された部位である細胞接着領域が規定された基材であるのが望ましい。ここで、細胞非接着領域を規定する高分子架橋体は、好ましくは光架橋により架橋体とされたものである。【００１９】
このような細胞非接着領域を規定する親水性の高分子は、特に限定されないが、好ましくはポリ酢酸ビニル鹸化物、ポリエチレングリコール又はポリヒドロキシエチル（メタ）アクリレートが挙げられる。この中で、ポリ酢酸ビニル鹸化物又はポリエチレングリコールがさらに好ましい。【００２０】
このような高分子を架橋体とする光架橋は、感光基を活性化させる波長の紫外光等光を照射することで容易に進行する。その際、該光を遮蔽するパターン付きマスクなどを介することで、高分子架橋体のパターンを形成することが容易になるという利点を有する。光架橋を形成する反応は特に限定されないが、光重合開始剤を介した光重合系、スチルベンなどの光二量化反応又はアジド基の光開裂による架橋反応などが挙げられる。この中で、アジド基の光開裂反応を好適に用いることができる。【００２１】
細胞非接着領域を規定する親水性の高分子が架橋された部位と、これら高分子が除去された細胞接着領域のパターン形状は、使用目的に合致すること以外特に限定されない。例えば、初代肝細胞スフェロイドを形成するツールとして用いる場合、細胞接着領域は１００μｍφのホール形状を有することが好ましい。【００２２】
このような高分子架橋体のパターンを形成する基材は、所望の動物由来の接着性細胞が接着することが可能であれば、特に限定は無いが、ガラス、組織培養用ポリスチレン、ポリエチレン又はポリプロピレンなどを用いることができる。特にガラス又は組織培養用ポリスチレンが好適に用いることができる。【００２３】
これらの基材上に、細胞接着を促進する物質を固定してあってもよい。細胞接着を促進する物質としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ−Ｌ−リシンなどが挙げられる。【００２４】
基材の形状についても特に限定は無いが、平板、シャーレ又は細胞培養用マルチウェルプレートなどを用いることができる。【００２５】
このようにして調製したパターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養基材を用いて、動物由来の接着性細胞を播種する。播種する細胞は、動物由来の接着性細胞であれば特に限定は無いが、好ましくは血管内皮細胞又は線維芽細胞である。パターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養基材上に細胞を播種することで、その後特に操作をすることなく細胞のパターンが得られる。【００２６】
播種する細胞懸濁液の濃度は、接着する領域において細胞がコンフルエントになる濃度が好ましい。増殖性を有する細胞ではこれより１／８程度まで薄くしても特に支障は無い。またコンフルエント濃度より濃い場合であっても、接着できなかった細胞が培地交換時に除去される限り特に支障は無い。しかし、そのような高濃度は、細胞が無駄になる点で避けた方がよい。【００２７】
上記動物由来の接着性細胞を播種した後、安定に細胞が接着するまで、培地を用いて培養を行うことが必要となる。培養時間は、細胞が沈降し細胞接着領域に接着することができれば特に限定は無いが、例えば、３時間以上４８時間以内、好ましくは２４時間以上４８時間以内、さらに好ましくは２４時間である。【００２８】
培養する培地は、細胞種により通常用いられる培地を用いればよい。例えば、血管内皮細胞又は線維芽細胞では、１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地が好適に用いることができる。【００２９】
所定時間培養後、細胞が接着した状態でパターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養基材を凍結することで、細胞凍結物固定化基材が得られる。凍結する前に培地を凍結用培地に置換する必要がある。これは通常用いる培地のまま凍結すると、解凍時に細胞の生存率が著しく減少するからである。凍結用培地としては、１０％（Ｖ／Ｖ）のジメチルスルホキシド（＝ＤＭＳＯ）など凍結障害保護剤を含む培地が適当であり、例えばセルバンカー（十慈フィールド（株）製）、又はバンバンカー（（株）リンフォテック製）などの市販品を好適に用いることが可能である。さらに凍結障害を抑制するために、単糖、二糖、オリゴ糖又は多糖などを添加することも有効である。凍結保護のための糖として、グルコース、ラクトース、トレハロース、又はラフィノースなどが挙げられる。【００３０】
凍結用培地に置換した後、直ちに、例えば３０分以内の時点で、プログラムフリーザーなどを用いて凍結する。凍結温度は、解凍した際細胞が変質・大幅な生存率減少などが起きない限り特に限定は無いが、好ましくは−２０℃〜−８０℃、特に好ましくは−８０℃である。【００３１】
また、細胞が接着した状態でパターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養基材を凍結する際には、その基材を通常は作業性などを考慮して容器（気密性又は非気密性のもの）に入れて凍結する。【００３２】
凍結が完了した段階で、細胞凍結物固定化基材となる。例えば−８０℃下で保存してあれば、培地が固化しているため、常温では困難であった輸送が可能となる。輸送は、ドライアイス下、断熱できる容器に入れることが好ましい。また、直接基材がドライアイスに接していると破損する恐れがあるため、ポリエチレンなどの袋に入れて梱包することが好ましい。【００３３】
細胞凍結物固定化基材を用いる際には、３０℃〜４８℃で解凍を行うことが好ましく、例えば３７℃に設定したインキュベーターなどで解凍してから用いる。インキュベーター内に静置した後、１０分程度で凍結用培地が溶解するため、その後用いる通常培地に置換後、さらに培養する。本細胞凍結物固定化基材を用いることで、解凍後の細胞の剥離、あるいは生存率の低下が起きず、その後凍結を行っていない基材と同様に用いることができる。【００３４】
解凍後の基材を、初代肝細胞培養ツールとして用いるためには、通常培地に置換後所定時間培養してから、初代肝細胞を播種すればよい。一般的には、動物由来の接着性細胞を播種した後、初代肝細胞を播種できるようになるまでに、動物由来の接着性細胞が安定に接着する必要があり、通常２４時間以上の培養が必要になるが、本発明の細胞凍結物固定化基材は、凍結前に動物由来の接着性細胞が安定に接着しているので、凍結−解凍後、好ましくは２４時間以内に、さらに好ましくは３時間以内に肝細胞を播種することができ、これによっても好適に肝機能を維持したスフェロイドを形成することが可能となる。すなわち、本発明の細胞凍結物固定化基材を用いた初代肝細胞培養ツール又は初代肝細胞培養ツールの製造方法によると、細胞凍結物固定化基材を解凍後、２４時間以上と長時間に亘って動物細胞の培養を行うことなく、迅速に初代肝細胞の播種を行うことができるので、薬物スクリーニングなどの作業を効率的に行うことができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明について実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００３６】
（実施例１）細胞凍結用固定化基材の製造
（パターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養基材の調製）
特開２００５−２８００７６号公報実施例に従い、ポリ酢酸ビニル鹸化物をベースとする水溶性感光材を、特開２００６−３０７１８４号公報実施例に従い、ポリエチレングリコールをベースとする水溶性感光材を得た。これらを２１ｍｍφガラス薄板（松浪硝子工業（株）製）及び１２穴マルチウェルプレート（住友ベークライト（株）製）にそれぞれ塗布し、パターン付きマスクを介して露光・現像することで、１００μｍφホール（基材露出部）が多数（２５００個／ｃｍ2）構築された、パターン状に細胞接着領域を規定するパターン培養用ガラス薄板並びにパターン培養用１２穴マルチウェルプレートを得た。【００３７】
（細胞凍結物固定化基材調製）
上記のようにして得た基材のうち、パターン培養用ガラス薄板は１２穴マルチウェルプレート（住友ベークライト（株）製）の各ウェル底部に設置した後、それを紫外光下で滅菌した。一方、パターン培養用１２穴マルチウェルプレートも紫外光下で滅菌した。次いで、ウシ血管内皮細胞、又はマウス線維芽細胞を懸濁させた細胞懸濁液（培地：１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地、細胞濃度：２×１０5個／ｍｌ）を各ウェルにそれぞれ１ｍｌ添加し、３７℃に設定したＣＯ2インキュベーター（ＣＯ2濃度：５％）で、２４時間、又は４８時間培養した。【００３８】
上述したように培養した基材全てを、それぞれ各種凍結用培地に置換した。凍結用培地としては、以下の（１）〜（９）の９種を用い、それぞれ０．５ｍｌ添加した。【００３９】
置換後直ちに、各種の基材を、−２０℃、又は−８０℃のフリーザーに入れ凍結させることで、細胞凍結物固定化基材を得た。
（１）  １０％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキシド添加１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地
（２）  １５％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキシド添加１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地
（３）  （１）＋０．０５Ｍ（＝ｍｏｌ／Ｌ）  トレハロース
（４）  （１）＋０．１Ｍ  トレハロース
（５）  （１）＋０．２Ｍ  トレハロース
（６）  （１）＋０．０５Ｍ  ラフィノース
（７）  （１）＋０．１Ｍ  ラフィノース
（８）  （１）＋０．２Ｍ  ラフィノース
（９）  セルバンカー（市販品）【００４０】
（実施例２）細胞凍結物固定化基材の性能評価並びに初代肝細胞培養ツールの製造及び初代肝細胞培養ツール製造方法の実施
実施例１で調製した全ての細胞凍結物固定化基材の性能を評価するため、解凍後の細胞形状観察、細胞剥離後の生存率測定・増殖率評価を行った。凍結保存期間は２ヶ月、１ヶ月、１週間の３時点のものを用いた。保存期間終了後、通常培地を１ｍｌ加え、３７℃インキュベーターにて１０分間静置し、通常の１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地と置換した。そのまま培養しながら、３時間、２４時間の時点で細胞の形状を顕微鏡下で観察した。一例として、３時間の時点で観察した結果を図１に示す（その他の条件としては、水溶性感光材：ポリエチレングリコールをベースとするもの、基材：パターン培養用ガラス薄板、動物由来の接着性細胞：ウシ血管内皮細胞、プレ培養：２４時間、凍結用培地：セルバンカー、凍結保存期間：２ヶ月）。【００４１】
この結果、いずれの時点でも、−２０℃で保存した基材は、−８０℃で保存した基材に比べ若干細胞の剥離が見られたが、使用上問題の無い程度であった。その後リン酸緩衝液で洗浄後、トリプシン溶液を用いて細胞を基材から回収した後、一部をトリパンブルー染色することで生存率を評価した結果、全ての条件で生存率は９９％以上を維持していた。【００４２】
また、下記表１、表２の条件の凍結用培地を用いた細胞凍結物固定化基材（作成条件  水溶性感光材：ポリエチレングリコールをベースとするもの、基材：パターン培養用ガラス薄板、動物由来の接着性細胞：ウシ血管内皮細胞、プレ培養：２４時間、凍結保存期間：１ヶ月）から回収した細胞につき、培養フラスコでさらに培養することで増殖能の評価を行った。評価を行った全ての条件で細胞の増殖が確認でき、また倍化時間も大きくずれていないことが確認できた。【００４３】
【表１】
2009050965.tif 000002
【００４４】
【表２】
2009050965.tif 000003
【００４５】
（実施例３）細胞凍結物固定化基材の輸送試験並びにその後の初代肝細胞培養ツール及び初代肝細胞培養ツールの製造の実施
実施例１で調製した全ての細胞凍結物固定化基材のうち−８０℃で保存したものに関して、輸送試験を行った。凍結保存期間は、２ヶ月、１ヶ月、１週間の３時点のものを用いた。発泡スチロール製の容器にドライアイスを敷き詰め、基材をおき、さらに隙間に砕いたドライアイスを詰め蓋をし、全体を梱包した。冷凍宅配便で一昼夜輸送後、開梱し−８０℃で１週間保存した。保存期間終了後、通常培地を１ｍｌ加え、３７℃インキュベーターにて１０分間静置し、通常の１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地と置換した。そのまま２４時間培養した後、細胞の形状を顕微鏡下で観察した。この状態の例を図２に示す（その他条件  水溶性感光材：ポリエチレングリコールをベースとするもの、基材：パターン培養用ガラス薄板、動物由来の接着性細胞：ウシ血管内皮細胞、プレ培養：２４時間、凍結用培地：１０％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキシド添加１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地、凍結保存期間：１ヶ月）。【００４６】
この結果、細胞の剥離や形状変化など見られず、凍結前と同様の状態であった。またリン酸緩衝液で洗浄後、トリプシン溶液を用いて細胞を回収した後、トリパンブルー染色することで生存率を評価した結果、全ての条件で生存率は９９％以上を維持していた。【００４７】
（実施例４）初代肝細胞培養用ツールの製造及びその性能評価
実施例１で調製した細胞凍結物固定化基材のうち、水溶性感光材としてポリエチレングリコールをベースとしたもの、基材としてパターン培養用ガラス薄板、動物由来の接着性細胞として血管内皮細胞、プレ培養として２４時間、凍結用培地としてセルバンカー、凍結保存期間１週間の条件のものを用い、初代肝細胞培養ツールとしての性能評価を行った。実施例２と同様に解凍・培地置換操作を行い、そのまま培養を行った。培養時間２、４、６、２４時間の各時点で、これまで培養していた培地を取り出し、別途調製したラット初代肝細胞の懸濁液（培地：ウィリアムズＥ培地、細胞濃度：３．５×１０5個／ｍｌ）をそれぞれ各ウェルに１ｍｌ添加することで播種した。初代肝細胞培養開始後１日経過後又は３日経過後に１５０μＭ（＝μｍｏｌ／Ｌ）のテストステロンを系に添加し、１時間後の培地中に存在する６β―ヒドロキシテストステロン（テストステロンの代謝物）量を、ＨＰＬＣ（＝高速液体クロマトグラフィー）により定量した。コントロール実験として、調製直後の肝細胞懸濁液について上記同様に実験を行った。また血管内皮細胞を凍結せず肝細胞を播種したパターン基板についても同様に実験を行った。この結果を表３に示す。【００４８】
この結果、採取直後の肝細胞の代謝活性よりは若干下がるものの、凍結を経ていない基板と同等以上の代謝活性を維持することが明らかとなった。【００４９】
【表３】
2009050965.tif 000004
【図１】
2009050965.tif 000005
【図２】
2009050965.tif 000006
【国際調査報告】
2009050965.tif 000007
2009050965.tif 000008
2009050965.tif 000009
2009050965.tif 000010