(57)【要約】  配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるペプチド、またはその前駆体由来のペプチドを、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合させることを含むことを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるペプチド、またはその前駆体由来のペプチドを、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合させることを含むことを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記ペプチド、および前駆体由来のペプチドは、前記標的となる細胞表面のＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子に結合することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記ペプチド、および前駆体由来のペプチドは、前記標的となる細胞表面のＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記ペプチド、および前駆体由来のペプチドは、前記標的となる細胞表面のＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子に結合することを特徴とする方法。
【請求項５】
配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項６】
配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、特定の癌細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とする癌治療用の医薬組成物。
【請求項７】
配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、特定の癌細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とする癌の予防または治療に用いられるワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、およびそれを用いた医薬組成物およびワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内では、常時偶発的に癌細胞が発生すると考えられているが、通常は自然免疫による癌細胞由来の特異的な癌抗原の排除反応が起こり、次いで、特異的免疫応答が誘導され、癌細胞の排除反応が起こると想定されている。【０００３】
特異的免疫応答では、体液中の癌特異抗原が中和抗体により排除され、癌細胞自体が細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により排除される。すなわち、ＣＴＬは、癌細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子に提示された、８〜１１のアミノ酸からなる癌抗原（ＣＴＬエピトープ）を特異的に認識し、癌細胞を傷害することにより排除する。したがって、このような癌抗原に特異的なＣＴＬエピトープを同定することは、特異的免疫応答について調査する上で重要である。【０００４】
このＣＴＬエピトープの同定、および免疫誘導能の確認方法については、非特許文献１〜３に記載されている。
【非特許文献１】Ｙ．  Ｏｋａ，  Ｏ．Ａ．  Ｅｌｉｓｓｅｅｖａ，  Ａ．  Ｔｓｕｂｏｉ，  Ｈ．  Ｏｇａｗａ，  Ｈ．  Ｔａｍａｋｉ，  Ｈ．  Ｌｉ，  Ｙ．  Ｏｊｉ，  Ｅ．Ｈ．  Ｋｉｍ，  Ｔ．  Ｓｏｍａ，  Ｍ．  Ａｓａｄａ，  Ｋ．  Ｕｄａｋａ，  Ｅ．  Ｍａｒｕｙａ，  Ｈ．  Ｓａｊｉ，  Ｔ．  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｋ．  Ｕｅｄａ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓｕｇｉｙａｍａ  "Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ｗｉｌｍｓ'  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅ  （ＷＴ１）  ｐｒｏｄｕｃｔ．"  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５１，  ９９−１０７，  ２０００
【非特許文献２】Ｈ．  Ｏｈｍｉｎａｍｉ，  Ｍ．  Ｙａｓｕｋａｗａ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｆｕｊｉｔａ  "ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ＣＤ８＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｌｏｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ＷＴ１  ｐｅｐｔｉｄｅ．"  Ｂｌｏｏｄ，  ９５，  ２８６−２９３，  ２０００
【非特許文献３】Ｇａｏ，  Ｌ．，  Ｂｅｌｌａｎｔｕｏｎｏ，  Ｉ．，  Ｅｌｓａｓｓｅｒ，  Ａ．，  Ｍａｒｌｅｙ，  Ｓ．Ｂ．，  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｍ．Ｙ．，  Ｇｏｌｄｍａｎ，  Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｔａｕｓｓ，  Ｈ．Ｊ．  "Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ＣＤ３４＋  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ＷＴ１．"  Ｂｌｏｏｄ，  ９５，  ２１９８−２２０３，  ２０００
【非特許文献４】Ｎａｋａｔｓｕｋａ，  Ｓ．，  Ｏｊｉ，  Ｙ．，  Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＷＴ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．"  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９，  ８０４−８１４，  ２００６
【非特許文献５】Ｍｅｎｋｅ，  Ａ．Ｌ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ａ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｊｏｃｈｅｍｓｅｎ，  Ａ．Ｇ．  "Ｔｈｅ  Ｗｉｌｍｓ'  ｔｕｍｏｒ  １  ｇｅｎｅ：  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ？"  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，  １８１，  １５１−２１２，  １９９８
【発明の開示】
【０００５】
ところで、上記文献ではＨＬＡ結合性ペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するものが挙げられている。しかし、上記文献に記載された配列のみでは特異的癌抗原に依存した疾病の治療には対応できないことがある。
【０００６】
具体事例として、上記であげた非特許文献１，２（Ｏｋａら、Ｏｈｍｉｎａｍｉら）で同定されたペプチドＣＭＴＷＮＱＭＮＩは、水溶液に難溶性で、かつシステインを含むため、容易にジスルフィド結合による２量体を形成するため、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子結合活性が低下する上、さらに溶解が困難となる。このため、実効濃度の把握が容易でなく、また製剤化が困難である。加えて、このＣＭＴＷＮＱＭＮＩペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子以外への結合活性が確認されておらず、癌の免疫治療の対象がＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性の患者に限られる。非特許文献３（Ｇａｏら）で同定されたペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬについても同様に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子への結合活性しか示されておらず、対象がＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性の患者に限られる。
【０００７】
そこで、特定の癌の治療および予防のためには、使用できるアミノ酸配列のペプチド候補を増やして、より望ましい物性を持つペプチドに絞込み、さらに、それらについて細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド配列を同定することが望まれている。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、特定の癌の治療および予防を有効に行うことを可能にする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、およびこれを用いた医薬組成物およびワクチンを提供する。
【０００９】
本発明によれば、配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるペプチド、またはその前駆体由来のペプチドを、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合させることを含むことを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤が提供される。
【００１１】
また、本発明によれば、配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、特定の癌細胞表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とする癌治療用の医薬組成物が提供される。
【００１２】
また、本発明によれば、配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、特定の癌細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とする癌の予防または治療に用いられるワクチンが提供される。
【００１３】
本発明によれば、細胞傷害性Ｔ細胞を有効に誘導することができるため、特に癌の治療または予防に有用な医薬組成物およびワクチンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００１５】
【図１】実施例で用いた能動学習実験計画を説明する模式図である。
【図２】実施例にて、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を調べた結果を示すグラフである。
【図３】実施例にて、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を調べた結果を示すグラフである。
【図４】実施例にて、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を調べた結果を示すグラフである。
【図５】実施例にて、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を調べた結果を示すグラフである。
【図６】実施例にて、HLA-A*2402を有する担がん患者における、ペプチド免疫後のW10反応性INF-g産生細胞の増加を調べた結果を示すグラフである。
【図７】実施例にて、HLA-A*0201を有する担がん患者における、ペプチド免疫後のW10反応性INF-g産生細胞の増加を調べた結果を示すグラフである。
【図８】実施例にて、HLA-A*0206を有する担がん患者における、ペプチド免疫後のW10反応性INF-g産生細胞の増加を調べた結果を示すグラフである。
【図９】実施例にて、担がん患者の末梢血単核球をHLA結合性ペプチドで刺激して得られた、細胞傷害活性を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】実施例における、腺様嚢胞がん症例KB07-006のW10ペプチド免疫療法開始後の転移腫瘍径の変化を示すグラフである。
【図１１】実施例における、症例KB07-006の末梢血単核球に存在する、ペプチド特異的にIFN-γを産生する細胞の数を示すグラフである。
【図１２】実施例における、症例KB07-006の末梢血単核球中のHLA-24 tetramer結合性のCD8  T細胞の増加を示す図である。
【図１３】症例KB07-005でみられた、W10ペプチド免疫療法開始後の腫瘍抑制効果を示すグラフである。
【図１４】症例KB07-003でみられた、W10ペプチド免疫療法開始後の腫瘍抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。【００１７】
<実施形態１>
本実施形態にかかる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法では、配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるペプチド、またはその前駆体由来のペプチド（以下、「ＨＬＡ結合性ペプチド」という）を、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合させることを含むことを特徴としている。【００１８】
配列番号１（Ｗ１０ペプチド）、配列番号２（Ｗ３０２ペプチド）および配列番号３（Ｗ２９２ペプチド）に示されるアミノ酸配列は、いずれも配列番号４に示した癌抗原（Ｗｉｌｍｓ'  ｔｕｍｏｒ  １：ＷＴ１）の所定のゲノムタンパク質に含まれる９アミノ酸残基からなる配列である。【００１９】
ＷＴ１遺伝子は、ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒを持つ転写因子で、その機能の欠損が小児腎癌であるＷｉｌｍｓ腫瘍の発生と関連していることから、最初、腫瘍抑制遺伝子として同定された（非特許文献４）。しかし、その後、自然発症の悪性腫瘍細胞の約３０−８０％において、機能を保ったＷＴ１遺伝子産物が高発現され、そのことと細胞の悪性化に正の相関が観察されたため、多くの悪性腫瘍細胞においては、むしろ発癌遺伝子として働くことが示唆されている（非特許文献５）。【００２０】
また、これらアミノ酸配列は、能動学習実験法（特開平１１−３１６７５４号公報）を用いて得られる仮説により予測された、ＨＬＡ分子との結合性が、−ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上であるアミノ酸配列の中から、ＨＬＡ分子との結合実験により、実際にＨＬＡ結合性を示すことが確認され、かつ、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能が示されたものである。【００２１】
なお、候補の選定にあたり、ＨＬＡ分子との結合性が−ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上であるアミノ酸配列としたのは、生化学の分野では、−ｌｏｇＫｄ値に換算しておおよそ結合能の３前後が、実際にペプチドがＨＬＡをはじめとするＭＨＣに結合するかしないかのしきい値として取り扱うことができるという観点からである【００２２】
すなわち、配列番号１、２および３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、特定の癌細胞により表面のＨＬＡ分子に提示される、ＷＴ１遺伝子産物由来の抗原ペプチドのエピトープに相当する。【００２３】
配列番号１、２および３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子Aの対立遺伝子型のひとつであるＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子の産物（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子）、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子の産物（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子）、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子の産物（ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子）に結合することが確認されており、日本人を含む東洋人の７０〜８０％余り、また西洋人の５０％弱がこのいずれかの対立遺伝子型のＨＬＡ−Ａ分子を持つ。【００２４】
ここで、配列番号１、２および３の配列を、下記の表１、表２および表３に示す。【００２５】
【表１】
2009066462.tif 000002
【００２６】
【表２】
2009066462.tif 000003
【００２７】
【表３】
2009066462.tif 000004
【００２８】
表１では、配列番号１のＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子との結合性に関する予測スコアおよび結合実験データが、−ｌｏｇＫｄ値で示されている。
また表２では、配列番号２のＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子との結合性に関する予測スコアおよび結合実験データが、−ｌｏｇＫｄ値で示されている。
また表３では、配列番号３のＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子との結合性に関する予測スコアおよび結合実験データが、−ｌｏｇＫｄ値で示されている。【００２９】
従来は、このように実験計画法を活用してＨＬＡ結合性ペプチドを見出す手法は採られていなかったために、実験的にＨＬＡ結合性が確認された極少数のＨＬＡ結合性ペプチドが知られていたに過ぎなかった。そのため、従来の手法で全くランダムに９アミノ酸残基からなるペプチドを合成し、ＨＬＡ分子との結合実験を行っても、結合性が−ｌｏｇＫｄ値に換算して６を超えるものは、確率的には約１００個に１個しかなかった。【００３０】
しかし、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためには、能動学習実験法にてＨＬＡ結合性ペプチドの配列予測をするだけではなく、それらの予測された候補の中から、特定のアミノ酸配列を選択することは重要なファクターとなる。【００３１】
特に、表１の配列番号１および表２の配列番号２のペプチドは、３つの異なるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型分子のいずれにも高い結合能で結合する、きわめてまれなアミノ酸配列をもつペプチドである。ＨＬＡ分子は、脊椎動物の進化の過程で、それぞれの対立遺伝子産物が異なるレパートリーのペプチドを結合するよう、選ばれて分子進化してきたことが示唆されており、複数のＨＬＡ分子に結合するペプチドは、まれにしか存在しない（Evolution of the major histocompatibility
complex Jan Klein, Felipe Figueroa CRC critical reviews in Immunology volume 6
issue 4, 295-386, 1986）。このように複数のＨＬＡ−Ａ遺伝子型に結合するペプチドであれば、それらの遺伝子のいずれかを持つ患者はすべて、癌の免疫治療の対象とすることができるため、治療用ワクチンとして、きわめて有用である。能動学習実験法（特開平１１−３１６７５４号公報）による網羅的なＨＬＡ結合性ペプチドの検索技術は、このような複数のＨＬＡ対立遺伝子型分子に共通に結合するペプチドを探索するために、きわめて有効な方法である。【００３２】
本実施形態において、配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有するペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の標的となる細胞を含む系に導入されて、この細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子に結合し、抗原ペプチドとして細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞は、これを特異的に認識し、誘導される。また、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、前記抗原ペプチドを提示している細胞を傷害する。このようにして、配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有するペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための癌抗原（ＣＴＬエピトープ）として作用する。【００３３】
ここで、「誘導する」とは、ある活性もしくは作用をほとんど有さないものまたは状態から、活性もしくは作用を発生させることを意味する。特に、「細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する」とは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を、標的細胞を殺傷する能力を持つエフェクター細胞に分化させる、および／または増殖させることを意味する。【００３４】
したがって、別の観点によれば、配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことにより、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤を得ることができる。【００３５】
「細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤」とは、ある抗原を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在しないかあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、この抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用、および個々の細胞傷害性T細胞の標的殺傷能力を高める作用を示す薬剤を意味する。【００３６】
また、能動学習実験法にて予測され、結合実験により実際に結合することが確認されたアミノ酸配列を含むＨＬＡ結合性ペプチドのうち、一部のもののみに細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたということから、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためには、ペプチドが細胞表面のＨＬＡ分子に結合することが重要であることには変わりないが、個人ごとのＴ細胞レパートリーの違いなど、さらに別の要因が作用しているものと考えられる。【００３７】
なお、本実施形態にて用いるＨＬＡ結合性ペプチドには、配列番号１、２および３の配列を有するペプチドにおいて、ＨＬＡ分子への結合能に影響を及ぼさない配列または部位を、化学的な修飾、ＷＴ１のゲノムタンパク質で使用されるアミノ酸とは異なる立体異性体への置換など、修飾を入れたものも含まれる。また、このようなＨＬＡペプチドは、上述のようなアミノ酸残基のみからなるペプチドであってもよいが、特に限定するものではない。例えば、必要に応じて本発明の作用効果を阻害しない範囲で糖鎖または脂肪酸基などの修飾を受けているＨＬＡ結合性ペプチド前駆体であってもよい。このような前駆体が、人体の消化器官などのほ乳類の生体内において、消化酵素などにより消化されるなどの変化を受けて、ＨＬＡ結合性ペプチドとなることによっても、上記のＨＬＡ結合性ペプチドにおいて結合性ペプチドと同様の作用効果が得られる。【００３８】
本実施形態では、日本人種を含むアジア人種に多いＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子に対して結合するペプチドにより細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができるため、これを利用して日本人種を含むアジア人種に特に効果的な治療薬、予防薬などの開発に利用できる。また、欧米人種に多いＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に対して結合するペプチドにより細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができるため、これを利用して欧米人種に特に効果的な治療薬、予防薬などの開発に利用できる。【００３９】
また、本実施形態で使用されるＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、固相法または液相法により人工合成してもよい。また、これらのＨＬＡ結合性ペプチドをコードするＤＮＡ断片または組み換えベクターから発現することにより、これらのＨＬＡ結合性ペプチドを製造してもよい。また、こうして得られたＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて同定可能である。例えば、エドマン分解法や質量分析法などを用いて同定可能である。【００４０】
<実施形態２>
本実施形態にかかる医薬組成物は、実施形態１にて説明した細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤を含む。すなわち、この医薬組成物は、配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、特定の癌細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とする癌治療用の医薬組成物である。【００４１】
配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有するペプチドは、実施形態１で説明したように、ＨＬＡ結合性を有し、かつ、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。【００４２】
そこで、実施形態１の説明において、細胞傷害性Ｔ細胞の標的細胞として特定の癌細胞を用いることで、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができ、この誘導された細胞傷害性Ｔ細胞により、癌細胞が傷害される。【００４３】
すなわち、本実施形態の医薬組成物を特定の癌患者に投与することにより、組成物中に含まれるペプチドが、患者の体内で細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子に結合し、抗原ペプチドとして細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞は、これを特異的に認識し、活性化する。これにより、細胞傷害性Ｔ細胞が誘導される。また、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、前記抗原ペプチドを提示している癌細胞を傷害して、この働きにより癌の治療に寄与することができる。【００４４】
なお、本実施形態に含まれるＨＬＡ結合性ペプチドは、上述のようにアミノ酸残基のみからなるペプチドであってもよいが、特に限定するものではない。例えば、必要に応じて本発明の作用効果を阻害しない範囲で糖鎖または脂肪酸基などの修飾を受けているＨＬＡ結合性ペプチド前駆体であってもよい。このような前駆体が、人体の消化器官などのほ乳類の生体内において、消化酵素などにより消化されるなどの変化を受けて、ＨＬＡ結合性ペプチドとなることによっても、上記のＨＬＡ結合性ペプチドにおいて結合性ペプチドと同様の作用効果が得られる。また、このようなＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、固相法または液相法により人工合成してもよい。【００４５】
本実施形態の医薬組成物は、水溶性溶剤に溶かして、製薬上許容される塩の形態で製剤にして、患者に投与することができる。【００４６】
このような製薬上許容される塩の形態としては、生理的に受け入れられる水溶性の塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、などの塩の形で生理的なｐＨにて緩衝させた形態が挙げられる。また、水溶性溶剤の他に、非水溶性溶剤を用いることもでき、このような非水溶性溶剤としては、例えばアルコール、例えばエタノール、プロピレングリコールなどが挙げられる。【００４７】
また、本実施形態の医薬組成物を含む製剤には、様々な目的に対する薬剤を含めてもよく、このような薬剤としては、例えば保存剤、緩衝剤などが挙げられる。【００４８】
保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、アンモニア、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のｐＨを２〜９、好ましくは４〜８の間で維持することができる量で存在することができる。【００４９】
<実施形態３>
本実施形態にかかるワクチンは、実施形態２にて説明した医薬組成物を含む。すなわち、このワクチンは、配列番号１、２および３よりなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、かつ、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるとともに、特定の細胞の表面のＨＬＡ分子に結合するペプチド、またはその前駆体の少なくとも一つを含むことを特徴とする癌の予防または治療に用いられるワクチンである。【００５０】
前記医薬組成物に含まれる配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有するペプチドは、実施形態１で説明したように、ＨＬＡ結合性を有し、かつ、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。【００５１】
そこで、実施形態２と同様に、実施形態１の説明において、細胞傷害性Ｔ細胞の標的細胞として特定の癌細胞を用いることで、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができ、この誘導された細胞傷害性Ｔ細胞により、癌細胞が傷害される。【００５２】
すなわち、本実施形態のワクチンを特定の癌患者に投与することにより、組成物中に含まれるペプチドが、注射部位に常在する樹状細胞をはじめとする患者の組織細胞表面のＨＬＡ分子に結合する。これを、このペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が認識すると活性化し、増殖して全身循環に回る。ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が癌組織に侵入すると、癌細胞の表面にあるＨＬＡ分子に自然に結合している特異的癌抗原由来の同一ペプチドを認識して、その癌細胞を殺傷する。この働きにより癌の治療に寄与することができる。【００５３】
あるいは、本実施形態のワクチンを健康な人体に投与することにより、細胞傷害性Ｔ細胞が誘導され、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞が体内で留まるため、特定の癌細胞が発生したときに、この癌細胞を傷害することができる。この働きにより癌の予防に寄与することができる。【００５４】
なお、本実施形態に含まれるＨＬＡ結合性ペプチドは、上述のようにアミノ酸残基のみからなるペプチドであってもよいが、特に限定するものではない。例えば、必要に応じて本発明の作用効果を阻害しない範囲で糖鎖または脂肪酸基などの修飾を受けているＨＬＡ結合性ペプチド前駆体であってもよい。このような前駆体が、人体の消化器官などのほ乳類の生体内において、消化酵素などにより消化されるなどの変化を受けて、ＨＬＡ結合性ペプチドとなることによっても、上記のＨＬＡ結合性ペプチドと同様の作用効果が得られる。また、このようなＨＬＡ結合性ペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、固相法または液相法により人工合成してもよい。【００５５】
また、本実施形態のワクチンは、医薬組成物以外の成分であり、それ自身には活性がなく、医薬組成物のワクチンとしての効果をより一層高める効果のある成分を含んだ不活性成分含有ワクチンの剤型で使用することができる。不活性成分としては、アジュバント、トキソイドなどが挙げられる。【００５６】
実施形態２の医薬組成物、実施形態３のワクチンは、皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射または注入、または経皮、または鼻、咽などの粘膜からの吸入などにより、体内に投与される。
その一回投与量は、細胞傷害性Ｔ細胞を有意に誘導できる量から有意な数の非癌細胞が傷害を受けない量の間にて設定することができる。【００５７】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５９】
具体的に、本実施例における予測・実験・評価の手順は、国際公開２００６／００４１８２号パンフレットに記載された能動学習実験計画に基づいて行い、全体として次のステップを繰り返してルールを構築した。ここで用いた能動学習実験計画の模式図を図１に示す。【００６０】
（１）後述する下位学習アルゴリズムの試行１回分を行う。すなわち、蓄積データのランダムリサンプリングから複数の仮説を発現し、ランダムに発現された質問候補点（ペプチド）に対する予測値の分散が最も大きい点を、実験すべき質問点として選ぶ。【００６１】
（２）選ばれた質問点のペプチドを、後述する合成・精製法により製造し、実際の結合能を後述する実験により測定して蓄積データに加える。【００６２】
このような能動学習法を行うことにより、本来ならば、９アミノ酸残基からなるペプチドについて、ＨＬＡ結合性ペプチドの全候補物質５０００億（＝２０9）通り以上について行う必要のある結合実験の数を削減できた。【００６３】
以上説明したようなルールにより、配列番号１、２および３に示したアミノ酸配列を抽出した。【００６４】
<ペプチド合成と精製>
配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｆｍｏｃアミノ酸を用い、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法にて、マニュアル合成をした。脱保護の後、Ｃ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣ精製をし、９５％以上の純度にした。ペプチドの同定と純度の確認は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にて行った（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＲＰ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）。ペプチドの定量は、ＢＳＡを標準蛋白質としてＭｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）にて行った。【００６５】
<ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子への結合実験>
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子の産物であるＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子へのペプチドの結合能の測定は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を発現するＣ１Ｒ−Ａ２４細胞（熊本大学、滝口雅文教授作成のものを、許可を得て愛媛大学、安川正貴助教授から供与いただいた。）を用いて行った。【００６６】
まず、Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞をｐＨ３．３の酸性条件に３０秒曝し、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子に元来結合している内因性ペプチドと、ＨＬＡクラスＩ分子に共通して会合している軽鎖β２ｍを解離、除去した。中和後、Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞に精製β２ｍを添加し、ペプチドの希釈列に加えて、氷上４時間インキュベートした。この間に再会合したＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子、ペプチド、β２ｍの３者の会合体（ＭＨＣ−ｐｅｐ）を認識する蛍光標識モノクローナル抗体１７Ａ１２を用いて染色した。【００６７】
その後、個々のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞当たりのＭＨＣ−ｐｅｐ数（上記蛍光抗体の蛍光強度に比例する）を、蛍光細胞解析装置ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて定量測定した。１細胞当たりの平均蛍光強度から、論文（Ｕｄａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５１，  ８１６−８２８，  ２０００）に発表した方法にて、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子とペプチド間の結合解離定数Ｋｄ値を算出した。【００６８】
<ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子への結合実験>
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子の産物であるＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子へのペプチドの結合能の測定は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する細胞株ＪＹを用いて行った。【００６９】
まずＪＹ細胞をｐＨ３．８の酸性条件に３０秒曝し、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子にそれまで非共有結合的に会合していた内因性ペプチドと軽鎖β２ｍを解離、除去した。中和後、再会合実験を行った。
結合能を測定したいペプチドの段階希釈列に上記ＪＹ細胞と精製β２ｍを加えたのち、氷上で４時間インキュベートした。この時点までに再会合したＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を、会合型特異的な蛍光標識モノクローナル抗体ＢＢ７．２を用いて染色した。【００７０】
その後、１細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、論文 （Ｕｄａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５１，  ８１６−８２８，  ２０００）に発表した方法にて、解離定数Ｋｄ値を算出した。【００７１】
<ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子への結合実験>
ＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子の産物であるＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子へのペプチドの結合能の測定は、マウスのＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）欠損細胞株であるＲＭＡＳに、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子のｃＤＮＡを導入したＲＡ２．６細胞（高知大学にて新たに作成した細胞株）を用いて行った。【００７２】
まずＲＡ２．６細胞を２６℃で一晩培養し、細胞表面にペプチドを結合していないＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子が蓄積したところへペプチドの希釈列を加え、室温で30分結合させた。
その後３７℃で３．５時間培養することにより、ペプチドを結合していない空のＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子が変性し、立体構造が失われる。
そこへ、ペプチド結合型ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子を特異的に認識する蛍光標識モノクローナル抗体ＢＢ７．２を加え、氷上で２０分インキュベートし、細胞を染色した。【００７３】
その後、１細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、論文（Ｕｄａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５１，  ８１６−８２８，  ２０００）に発表した方法にて、解離定数Ｋｄ値を算出した。【００７４】
<結合実験の評価結果>
その結果、上記表１、表２および表３に示した予測結果および実験結果が得られた。【００７５】
配列番号１、２および３の配列は、ＧＥＮＢＡＮＫに登録されているＷＴ１のＭ８０２３２の所定のゲノムタンパク質の全長配列（配列番号４：MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL）に含まれる４４９アミノ酸残基からなる配列である。【００７６】
<細胞傷害性Ｔ細胞の誘導実験>
以下の実験を、ヒトの採取血液を用いて行った。
（１）細胞傷害性Ｔ細胞の活性化
あらかじめインフォームドコンセントを得たＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、あるいはＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性の癌患者または健常人から血液を採取した。
Ａｚｕｍａらの方法にしたがった（Ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＷＴ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０，  ７４０２−７４１２，  ２００４）。５ｘ１０５個／ｍｌにＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ）を懸濁し、下記の培養液に１μＭになるようにペプチドを加えたもので刺激した。
培養液は、１０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ‐２、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ‐７、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２を含む１０％ヒト血清を加えたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）を用いた。ＩＬ−２の１Ｕ（ユニット）は、ＩＬ−２依存性細胞株ＣＴＬＬ−２の最大増殖反応の半分を誘導するのに必要なＩＬ−２の量である（Ｇｅａｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｃ．Ｂ．Ｂｉｒｄ，  １９８７  Ｌｙｍｐｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｃｌｅｍｅｎｓ，  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．ｐ，２９６）。
１週間後に上記培養に、自家ＰＢＭＣに１μＭのペプチドを加えて当該PBMCの表面のＨＬＡ分子に結合させたものをマイトマイシン処理して加え、刺激した。さらに１週間後に同様の刺激をした。【００７７】
（２）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
第３回目のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原刺激の翌日に、１０ Ｕ／ｍｌのリコンビナント・ヒトＩＬ−２を加えて８−１４日置き、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイをしかけた。
上記で刺激を繰り返したｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞数を回収して数え、抗インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）モノクローナル抗体をコートしたＥＬＩＳＰＯＴ用９６穴プレートに、１穴あたり３．３ｘ１０3 〜 ２ｘ１０4個になるように加えた。刺激用の細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子結合性ＷＴ１ペプチドについてはＣ１Ｒ−Ａ２４細胞、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子結合性ＷＴ１ペプチドについてはＪＹ細胞に酸解離・再構成法（Ｍａｓｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５９，  １９７−２０９  ２００７）でペプチドを結合させたもの、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子結合性ＷＴ１ペプチドについてはＲＡ２．６細胞を用いて、マイトマイシン処理をした後に加えた。２０時間後に細胞を除き、抗ＩＦＮ−γ抗体を加え、さらにＨＲＰＯ酵素標識した２次抗体を反応させて、呈色反応により、ＩＦＮ−γ産生細胞の数を測定した。【００７８】
<誘導実験の結果>
あらかじめ遺伝子解析により確認した、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、あるいはＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性の担がん患者、あるいは健常人ボランティアの末梢血単核球ＰＢＭＣを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養系にて週１回ずつ３回ペプチドで刺激したのち、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った結果を図２、図３、および図４に示す。【００７９】
図２は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子をもつ担がん患者および健常人ボランティアの末梢血単核球から誘導した、ペプチド依存性にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を分泌する細胞の数を示す。値は、それぞれＨＥＲ２−６３（配列番号６），２３５Ｙ（配列番号５），Ｗ１０，またはＷ３０２ペプチドでｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激をして誘導したＰＢＭＣが、それぞれのペプチドを結合させたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対してＩＦＮ−γを産生した細胞数であり、１０４個の培養ＰＢＭＣあたりのＩＦＮ−γ産生細胞数を示している。ペプチドなしでｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激をしたそれぞれの人のＰＢＭＣが、ペプチドを結合させていないＣ１Ｒ−Ａ２４に対してＩＦＮ−γを産生した細胞数を差し引いたものである。ＨＥＲ２−６３は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子結合性だが、ＷＴ１と関係しない乳がんに特異的ながん抗原ペプチドで対照として使った。２３５Ｙは、現在、ＷＴ１ペプチド免疫療法に使われているペプチドである。（Ａ．  Ｔｓｕｂｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＷＴ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ９−ｍｅｒ  ＷＴ１  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｔ  ＨＬＡ−Ａ＊２４０２−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ"  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，  ５１，  ６１４−６２０，  ２００２）棒グラフは、それぞれの患者（図のａ，ｂ，ｃ，ｄ  各２２人）または健常人（図のｅ，ｆ，ｇ，ｈ  各５人）のＩＦＮ−γ産生細胞数を示している。担がん患者の末梢血には、ＷＴ１由来のペプチドに反応する細胞が多い傾向がみられる。ＮＤ：ｎｏｔ  ｄｏｎｅは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのデータが取れなかったものである。【００８０】
図３は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子をもつ担がん患者および健常人ボランティアの末梢血単核球から誘導した、ペプチド依存性にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を分泌する細胞の数を示す。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子結合性であるが、ＷＴ１と関係のないがん抗原ペプチドであるＩＰ３０−２７（配列番号７）をネガティブコントロールとして使った。ＩＰ３０−２７は、Ｈｕｎｔらが同定したＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子結合性ペプチドであり、Ｄｂ１２６（配列番号８）は、Ｓｔａｕｓｓらが同定したＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子結合性ＷＴ１ペプチドである。担がん患者の末梢血には、ＷＴ１由来のペプチドに反応する細胞が多い傾向がみられる。【００８１】
図４は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子をもつ担がん患者および健常人ボランティアの末梢血単核球から誘導した、ペプチド依存性にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を分泌する細胞の数を示す。ｐｈ２Ａ３８９（配列番号９）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子結合性が高くネガティブコントロールとして用いたペプチドである。担がん患者の末梢血には、ＷＴ１由来のペプチドに反応する細胞が多い傾向がみられる。【００８２】
図５は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子結合性ＷＴ１ペプチド特異的細胞株の、腫瘍細胞に対する反応性を示す。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性患者から樹立した、ペプチド依存性細胞株（ａ．  ２３５Ｙ，  ｂ．  Ｗ１０，  ｃ．  Ｗ３０２）に、自然にＷＴ１を発現するＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子陽性の細胞株４種（ＫＡＺＺ，  ＫＣＬ２２，  ＫＨ８８，  ＭＥＧ０１）と、ＷＴ１を発現しないネガティブコントロールのＣ１Ｒ−Ａ２４細胞を標的として加えたときのＩＦＮ−γ産生細胞の数を示した。異なる患者から樹立した細胞株の反応を棒グラフにして並べた。弱いながら、ＷＴ１を発現しないＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に比べて、ＷＴ１を発現する４つの細胞株に対する反応性が高い傾向が見られる。【００８３】
＜免疫療法を行った担がん患者におけるWT1ペプチド免疫後の細胞傷害性T細胞の活性の測定＞【００８４】
１．
標準免疫方法の決定
WT1ペプチドの、in vivoにおける細胞傷害性T細胞誘導能を調べるため、臨床第I／II相試験を組み、HLA-A*0201、HLA-A*0206、HLA-A*2402のいずれかを有する担がん患者に、W10ペプチド単独、あるいは百日咳全菌体ワクチンと共に毎週１回、合計３回皮内注射した。安全性試験では、W10ペプチド1mgを３名、次に、3mgを６名と段階的に増量して、CTCAE (Common Terminology Criteria for Adverse Events v3.0 by
JCOG/JSCO-Oct. 27, 2004)の有害事象の評価基準に従い、ペプチド投与後に有害事象が出現しないかどうか調べた。【００８５】
３回投与後１週間までに、Grade 2以上の有害事象は認められなかったため、次に、W10ペプチド1mgに百日咳全菌体ワクチンのO.D.600の値から推計した菌体数において、5x108個に相当する量を混ぜ、皮内注射を毎週１回、合計３回繰返し、その１週後までに出現した有害事象がないか調べた。６名に、Grade 2以上の有害事象は認められなかったため、次に、W10ペプチド3mgを、同数の百日咳菌全菌体ワクチンと混ぜて、６名に免疫した。合計３回注射後１週間までにgrade 2以上の有害事象は認められなかったため、それ以降、W10ペプチド3mgに5x108個の百日咳全菌体を混合して皮内注射する免疫方法を標準と決め、第I／II相試験を行った。【００８６】
２．WT1ペプチド免疫後の細胞傷害性T細胞の活性の測定
担がん患者に、W10ペプチド3mg、および5x108個の百日咳全菌体ワクチンを混合して皮内注射する免疫方法を毎週１回、合計３回皮内注射した。【００８７】
W10ペプチド3mgに5x108個の百日咳全菌体ワクチンの投与前と、３回投与後における末梢血単核球の細胞傷害活性を比較するため、末梢血単核球を、後述する条件で培養し、ELISPOT試験により、ペプチド依存性にIFN-gを産生する細胞の数を数えた。ELISPOT試験に使用した細胞も後述する。【００８８】
その結果を図６（HLA-A*2402を有する人のPBMCの反応）、図７（HLA-A*0201を有する人の反応）、図８（HLA-A*0206を有する人の反応）に示す。横軸は、抗原提示細胞（図中ではAPCｓ（antigen presenting cells）と表記）に結合させたペプチドの種類を、縦軸は、1x104個あたりのINF-g産生細胞の数を示す。３回免疫後１週間目の末梢血単核球の反応を黒で示し、当該免疫直前に採血した末梢血単核球の反応を白で示した。ペプチドなしで培養した末梢血単核球の、ペプチドを加えていない抗原提示細胞（図６；RA24、図７；Ｔ２、図８；RA2.6）に対してINF-gを産生する細胞の数を差し引いた数を、ペプチド特異的に反応した細胞の数として示した。KB07-xxxは、それぞれの患者の登録番号を示す。腫瘍の種類は、図にそれぞれ記載した。【００８９】
免疫後は、免疫に使ったW10ペプチドに反応してIFN-gを産生する細胞の数が増加している患者がしばしば観察された。興味深いことに、免疫後は、免疫に使ったW10ペプチドのみならず、他のWT1由来ペプチドに対する反応性も増している症例がみられた。
これは、W10ペプチド反応性T細胞が腫瘍を攻撃した結果、腫瘍局所あるいは、所属リンパ節において、腫瘍細胞が内因性に発現するWT1抗原ペプチドに対する細胞傷害性T細胞の活性も誘導された結果である可能性が考えられる。【００９０】
・ELISPOT試験に使用した細胞
C1R-A24は、上述のとおりヒトのHLAクラスI分子欠損株であるC1RにHLA-A*2402を発現させた細胞である。RA24は、マウスのTAP (transporter associated with antigen
processing)欠損株であるRMASに、レトロウイルスを基盤とした発現ベクターであるpLNCX2 (CLONETECH, BD Biosciences, Palo Alto, CA)に、HLA-A*2402遺伝子のcDNAを組み込んで発現させた（高知大・宇高恵子らが作成）。RA2.6は、上述のとおりRMAS細胞に、HLA-A*0206遺伝子のcDNAを発現vectorであるpMKITneoに組み込み、transfectして作製した（参天製薬・辻文雄氏と高知大・宇高が共同で作製）。T2は、ヒトのTAP欠損株であり、HLA-A*0201を発現する細胞である。T2はDr. Peter Cresswell（Yale University）より供与された。【００９１】
・ELISPOT法による、ヒト末梢血単核球のペプチド反応性試験の方法
末梢血単核球(PBMC)を、in
vitroで週１回、合計３回刺激しつつ培養し、その後、抗原ペプチドに対してIFN-gを産生する細胞数を数えた。In vitro刺激は、PBMCを、10U/mlのヒトIL-2、5ng/mlのヒトIL-7、100 pg/mlのヒトIL-12を含む10%ヒト血清DMEM(Dulbecco’s modified minimum essential
medium)に、1x106/mlになるように懸濁し、96穴U底プレートに、200 mlずつ入れて行った。ペプチドで刺激する細胞には、これに終濃度が1mM
になるようにHLA結合性ペプチドを加えた。【００９２】
刺激には、当出願で新規に記述するWT1ペプチド（W10, W302, W292,）のいずれかを使った。また、対照として、既報のHLA結合性のWT1由来ペプチドであるDb126（HLA-A*0201結合性; RMFPNAPYL）および、235Y（HLA-A*2402結合性; CYTWNQMNL）も、刺激に使った。２回目、３回目のin vitro刺激には、抗原提示細胞として、同じヒトのPBMCを20U/ml IL-2を含む10%ヒト血清入りのDMEMで培養したものをmitomycin C（MMC）処理をして増殖能を失わせ、これに終濃度が1mM
になるようにペプチドを加えて37℃、１時間インキュベートしたものを上記培養細胞に加えて刺激した。３回目の刺激の翌日に、20U/mlのIL-2を加え9日間インキュベートしたのち、ELISPOT試験を行った。【００９３】
まず、ELISPOT試験用にMultiscreen HTS, IPプレート（Millipore, Bedford, MA）を抗IFN-g抗体2G1 (ENDOGEN, Pierce Biotechnology,
Rockford IL)で被覆し、これに上記でin vitro刺激をしたPBMC5,000個あるいは、それを2倍、または4倍希釈したもの（それぞれPBMC2,500個、1,250個となる）と、反応性を調べたいHLA結合性ペプチドを結合させ、MMC処理した抗原提示細胞として加え、37℃で一晩培養した。それぞれのHLA分子を発現する抗原提示細胞として、RA24（HLA-A*2402）、T2（HLA-A*0201）、RA2.6(HLA-A*0206)を用いた。翌日細胞を除き、プレートに結合したIFN-gに、別のbiotin標識‐抗IFN-g抗体B133.5
(ENDOGEN)を結合させ、これにHRPO
(horseradish peroxidase)標識したstreptavidin（Mabtech, Cinncinati OH）を結合させて、酵素反応により、IFN-g産生細胞数を数えた。酵素の基質は、TMB（tetramethyl benzidine）を用いた。【００９４】
抗原提示細胞に結合させるHLA結合性の対照ペプチドは、次のものを使った。
HLA-A*0201結合性ペプチド：IP30-27;
LLDVPTAAV、Db126; RMFPNAPYL、HLA-A*2402結合性ペプチド：HER2-63; TYLPTNASLおよび235Y; CYTWNQMNL、HLA-A*0206結合性ペプチド：ph2A389; SLLPAIVEL, W292; GVFRGIQDV （W292は、WT1由来ペプチドであるので、試験ペプチドを兼ねる）。ここで、IP30-27、HER2-63、ph2A389を対照ペプチドとして使用する系では、培養の際に刺激を行っていない。【００９５】
＜51Cr（クロム51）試験によるペプチドを提示する標的細胞を殺傷する能力の測定＞
次に、担がん患者の末梢血単核球を、in vitroでペプチド刺激し、後述する51Cr試験方法に従い、ペプチドを提示する標的細胞を殺傷する能力がどの程度あるかを調べた。図９に示すように、担がん患者の末梢血には、ペプチドに反応して、細胞傷害を起こすような細胞種が含まれていることが明らかとなった。【００９６】
これらには、図９のａ．ｂ．に示すようなHLA-A*2402結合性のWT1由来のペプチドである、235Y、W10、W302ペプチドを認識する細胞傷害性細胞が含まれることが明らかとなった。また、ｃ．ｄ．に示すように、HLA-A*0201を有する担がん患者の末梢血単核球には、HLA-A*0201結合性のWT1由来のペプチドである、Db126、W10、W302ペプチドを認識する細胞傷害性細胞が含まれることがわかった。細胞傷害性試験によっても、in vitroの刺激に使ったW10のみならず、他のWT1由来ペプチドに対する反応性も増している症例がみられた。【００９７】
・51Cr遊離法による、細胞傷害性試験の方法
９６穴U底プレートに、51Crで標識し、必要に応じて調べたいHLA結合性ペプチドを結合させた標的細胞を5,000もしくは10,000個/well入れ、それに、ペプチドで２回in vitro刺激したPBMCをresponderとして加えて、３７℃でインキュベートし、この間に傷害された標的細胞から遊離された51Crの量を計測して、標的細胞の何％が殺されたかを計算した。標的細胞として、HLA-A*2402結合性ペプチドに対する反応を調べる場合にはC1R-A24、または、RA24細胞を標的として用い、responderを加えて５時間インキュベートした。HLA-A*0201結合性ペプチドに対する反応を調べる場合には標的細胞としてT2を用い、responderを加えて２時間インキュベートした。特異的細胞傷害活性は、次のように計算した。% specific lysis = (test release&#8211;spontaneous release)/(total release&#8211;spontaneous
release)x100【００９８】
＜患者に対する措置＞
18名の患者のうち、3名について症例報告の形態で例示する。上述に記載の安全性試験にて安全性を確認した後、いずれの患者にも原則７日に一度（１〜２日ずれた場合もある）W10ペプチドを１０mg/mlになるように５％ブドウ糖液に溶解したもの300μｌ（３mg当量）と、百日咳全菌体ワクチンを5X10９個/ｍｌになるように生理食塩水に懸濁したもの100μl（菌体数にして５Ｘ１０８個）とを投与直前に混合し、これを4箇所（腋窩のリンパ節に近い箇所2箇所、鼠径部に2箇所）、に１００μｌずつ皮内注射した。なお、安全性試験などでW10ペプチドを単独で加える場合も同様に、W10ペプチド溶液を4等分し4箇所に皮内注射した。また、腫瘍径の測定方法、HLA-A24 tetramerを用いたペプチド特異的T細胞のフローサイトメトリーによる解析方法は後述する方法を用いた。【００９９】
・症例報告１
KB07-006        ６６歳女性  腺様嚢胞がん stage 4C 肺転移  
原発腫瘍の免疫組織染色により、WT1蛋白質の発現あり。HLA-A*2402を有す。【０１００】
・W10ペプチド免疫療法の治療開始前の経過  
口底部の原発巣に対して、抗がん剤動注および放射線療法を併用し、中心部の壊死が観察されたが、腫瘍が残存し、かつ肺に１個、転移巣が出現したため、IFN‐γ、IL-2、LAK療法を施行するが、変化はみられず腫瘍の増大が続いた。このため、前治療を終了し、１ヵ月後に既知のWT1腫瘍抗原ペプチドである235Yペプチド（アミノ酸配列CYTWNQMNL）を用いた免疫療法を開始した。投与法は、235Yペプチド3mgを徐放性にするため、モンタナイド（成分は、Freund’s
incomplete adjuvant）に懸濁し、毎週１回、皮内注射した。免疫開始後４週目のMRIにより、原発腫瘍の著明な縮小が観察された。【０１０１】
その後も、毎週１回の免疫を繰返したところ、原発巣は消失し、治療後３年半となる現在も再発は見られていない。肺に単個ある遠隔転移は、235Yペプチド免疫を10ヶ月間続けた間は、大きさの変化はなく、抗がん剤評価のための後述するRECIST国際基準により、stable
disease (SD)と判定された。235Yペプチド免疫治療開始後10ヶ月間の時点で、患者の希望により、免疫療法は、いったん休止した。休止後、肺転移および腸骨への転移が進み、休止後１年7ヶ月の時点で、肺転移巣は合計18個に増加、そのうちの正確に測れる場所と大きさの腫瘍である標的腫瘍10個の長径の総和は16.3
cmに達していた。【０１０２】
RECIST国際基準とは、Theresse, P. et al., J Natl
Cancer Inst. 2000, 92, 205-216に記載の評価基準である。helical CTまたはMRIにより、すべての標的病変の消失が確認された場合はCR (complete
response)、標的病変の最長径の和が、30%以上減少した場合はPR (partial response)、標的病変の最長径の和が、20%以上増加した場合はPD (progressive disease)、PRにもPDにもかからぬ場合はSD (stable disease):とした。ただし、標的病変の変化の有無にかかわらず、新病変が1個でも出現した場合は、PDとした。【０１０３】
また、有害事象の判定基準はCTCAE (Common Terminology Criteria for Adverse Events v3.0)by  JCOG/JSCO-Oct. 27, 2004により、grade 2/3で休止、grade 4以上で、試験治療との因果関係に関係なく試験治療は中止とした。【０１０４】
・W10ペプチド免疫療法の治療開始後の経過
この時点で、W10（ALLPAVPSL）ペプチドを用いた免疫療法を開始した。最初の３週は、週に1回ずつW10ペプチド単独投与で1mg、次に、W10ペプチド1mgに、免疫賦活剤として5x108個の百日咳全菌体ワクチン(以下、「Wc」と記載する。投与量も同じ）を添加して３回免疫し、安全性を確かめた。【０１０５】
その後、W10ペプチド3mg＋Wcの投与法に固定し、毎週１回免疫を続けた。その結果、図１０に示すように、全標的腫瘍の長径和および、最初に出現した肺の転移巣１個の長径は、次第に成長速度が鈍化し、ほとんど変化しなくなった。新たな転移巣の出現は、W10ペプチド投与を開始して13ヶ月後の現在まで見られていない。現在も成長は緩徐であるが、治療前の値に比較して、標的腫瘍として選んだ１０個の転移巣の長径の総和は、32週まではSD、37週目のCTで、治療前に比べて20%以上の増大となり、progressive
disease (PD)と判定された。なお図１０ではRECIST国際基準に従い、標的腫瘍１０個の長径の総和（左図）、および、最初にあった肺の単個の転移腫瘍の長径（右図）の経時変化を示している。図に挿入した矢印は、それぞれの免疫治療の期間を示す。安全性試験のため、ペプチドの増量およびWcの併用を段階的に行う必要があった。【０１０６】
この症例の末梢血単核球のW10に対する反応性をELISPOT法にて調べたところ、図１１に示すように、W10ペプチド1mg投与前と、３週間後では、W10反応性にIFN-gを産生するT細胞の数が増加していた。さらに、末梢血単核球をW10ペプチドの存在下で培養すると、HLA-A24-W10テトラマー分子（ここでは、SA（streptavidin）にPE(phycoerythrin)で蛍光標識がなされたものを使って、HLA-A24-W10複合体に特異的なT細胞を蛍光染色し、フローサイトメトリーにより、抗原特異的T細胞を同定するために使用した）が結合する、W10特異的なCD8陽性T細胞（細胞傷害性T細胞）が増加していることが確認された（図１２）。【０１０７】
このことから、W10ペプチド免疫療法の結果、WT1を発現する腫瘍の成長抑制が起こることがわかった。一方、ペプチド免疫療法による有害事象は観察されておらず、免疫注射投与部位に投与後２日後をピークとする発赤と軽度の腫脹がみられるのみである。これらの結果より、W10ペプチドを用いた免疫療法の結果、W10反応性のCD8陽性の細胞傷害性T細胞が増加し、腫瘍の成長が抑制されていることが示唆された。【０１０８】
・症例報告２  
KB07-005  51歳男性  前立腺がん（ホルモン治療抵抗性未分化がん）
腫瘍組織の免疫組織染色にて、WT1蛋白質の発現あり。HLA-A*2402を有す。【０１０９】
・W10ペプチド免疫療法の治療開始前の経過
2005年10月、前立腺全摘術後、局所再発はないが、2006年10月に右大腿骨に転移腫瘍が出現した。疼痛緩和目的で、放射線療法（42Gy）を行った。2006月12月より、WT1ペプチド（235Y）免疫療法開始した。効果なく腫瘍は増大した。2007年3月、疼痛緩和のため、放射線療法を追加（36Gy）した。【０１１０】
・W10ペプチド免疫療法の治療開始後の経過
2007年10月より、新規WT1ペプチド（W10）免疫療法を開始（３回投与分ずつ、安全性を確認しながら、漸増した。W10ペプチド単独を1mgから3mgへ漸増後、W10ペプチド1mg+WcからW10ペプチド3mg+Wcへ漸増）。その後、W10ペプチドW10ペプチド3mg+Wcで継続投与した。図１３a.は前立腺腫瘍特異的マーカー、prostate specific antigen (PSA)の変化を示す。W10ペプチド単独、1mg投与開始時をday
0として提示した。3mgに増量してペプチド単独投与の安全性を確認した期間を、矢印で示す（W10）。百日咳全菌体ワクチン（Wc）をW10ペプチドに加えて投与し始めた期間も矢印で示した（W10+Wc）。免疫治療開始後より、PSAが急速に低下、0.04前後で安定化した（図１３a）。図１３b.は右大腿骨の転移腫瘍の長径の和(sum of the
longest diameters; SLD)を示す。この症例は、ホルモン治療抵抗性の未分化がんで、骨溶解性に病変が広がったものを計測した。骨転移腫瘍の増大もほぼ停止し（図１３b）、疼痛も消失した。2008年5月頃より、徐々にPSAが再上昇を始め、右大腿骨に疼痛も出現した。2008年７月末より、タキソテール＋プレドニン療法開始した。W10+Wc免疫療法は併用で継続した。W10ペプチドを用いた免疫治療を開始して以来、全期間を通じて、新規の遠隔転移は見られていない。【０１１１】
・症例報告３
KB07-003  ５８歳男性  前立腺がん（PSA陽性、ホルモン治療抵抗性）
前立腺腫瘍組織にWT1蛋白質の発現あり。HLA-A*0201およびHLA-A*2402を有する。【０１１２】
・W10ペプチド免疫療法の治療開始前の経過
2003年8月、前立腺全摘術を行った。術後PSAが上昇し骨転移したため、ホルモン治療を行った。一時奏功するも、次第に抵抗性となり、2005年3月以来、PSA上昇が続いた。2007年5-6月放射線治療およびホルモン治療により、PSA正常化した。8月末より、W10ペプチド免疫療法を開始した。【０１１３】
・W10ペプチド免疫療法の治療開始後の経過
最初は、W10ペプチド単独3mgで安全性を確認した後、W10ペプチド1mg+Wc、ついでW10ペプチド3mg+Wcと増量し、この投与量で毎週１回継続治療した。図１４a. はPSAの変化を示す。W10ペプチド単独、3mg投与開始時をday 0として提示した。白丸で示す値は、糖尿病性腎症による、grade 2のCre（クレアチニン：creatinine）上昇のため、PSAは測定したが、W10免疫治療は休止した週を示す。半年程度、PSAが0.1未満で安定した（図１４a）。ただし、糖尿病性腎症によるgrade 2のCreの上昇の出現のため、３回連続で免疫療法を中断すると、PSAの急激な上昇が起こった。W10＋Wc免疫療法を再開すると、PSAが低下した。その後、緩徐ながらPSAの上昇傾向があった。図１４b.は骨転移腫瘍の長径和(SLD)を示す。恥骨骨転移腫瘍の大きさも、これまでにRECIST基準で37週間SDが維持されている（図１４b）。W10ペプチド免疫療法開始以来、新規の遠隔転移はみられていない。鎮痛目的の放射線療法の期間を矢印で示した。【０１１４】
・腫瘍径の測定方法
上述した抗がん剤の評価に使われているRECIST国際基準に基づき、測定可能なすべての腫瘍を標的腫瘍として選択し、治療前後での腫瘍長径の総和の変化を追跡した。この他、腫瘍の大きさによらず、新規病変の出現がないか、画像診断の度にすべての転移腫瘍の個数を数えた。画像診断は、原則として毎月１回、helical CTあるいはMRIで行った。原発巣の変化のいかんに関わらず、新規転移が１個でも出現した場合は、PDとした。【０１１５】
・HLA-A24 tetramerを用いた、ペプチド特異的T細胞のフローサイトメトリーによる解析方法
HLA-A24 tetramerの作製は、Altmanらの方法（Altman, JD, Moss, PA., Goulder, PJ, Barouch, DH, McHeyzer-Williams,
MG, Bell, JI, McMichael, AJ, Davis, MM. Phenotypic analysis of antigen-specific
T lymphocytes. Science 1998 274, 94-96.）を改変して行った。【０１１６】
HLA-A24 tetramerはT細胞に抗原提示をするHLA-A*2402分子を大腸菌で発現させ、これにW10が結合した複合体を作製し、さらに、その複合体分子のC末端に部位特異的なビオチン化をしたのち、streptavidin (SA)に結合させ、１分子のSAに４分子のW10を会合したHLA-A*2402分子が結合した分子複合体である。
T細胞の抗原に対する結合親和性はきわめて低いため、単分子のHLA-A24-W10複合体が安定して結合し続けることは期待できないが、４分子を含むHLAテトラマーは、T細胞表面のT細胞レセプター（TCR）に多価結合するため、安定して結合する。
ここでは、SAにPE(phycoerythrin)で蛍光標識がなされたものを使って、HLA-A24-W10複合体に特異的なT細胞を蛍光染色し、flow
cytometryにより、抗原特異的T細胞を同定するために使用した。
HLA-A*2402分子を構成するH鎖である、HLA-A*2402および、軽鎖であるヒトβ2m （b2-microglobulin）のcDNAを、それぞれ、T7
promoter下に、挿入した遺伝子を発現するpET-21d+vector (Novagen, Merck)に組み込み、大腸菌BL21(DE3)pLysSに導入し、IPTG を用いて遺伝子発現を誘導した。封入体となったリコンビンナント蛋白質をprotease inhibitorsの存在下に8M Ureaで溶解し、同じく大腸菌で発現させたβ２ｍおよびW10ペプチドと、1:2:10の分子比で混合し、段階希釈法で分子のfoldingおよび３者の会合を起こさせた。正しく会合したHLA-A*2402-W10モノマーをDEAE-Sepharoseクロマトグラフィーにより精製し、部位特異的ビオチン化酵素であるBirAを使ってHLA-A*2402鎖のC末端にbiotinを１分子共有結合させた。【０１１７】
このHLA-A*2402-W10モノマーをPE標識したSAと４：１の分子比で結合させ、HLA tetramerを作製した。対照として、HLA-A*2402 tetramerは、HLA-A*2402結合性であるが、WT1とは関係のないHER2-63ペプチドをW10の代わりに会合させたものを使った。T細胞とHLA-A*2402-W10またはHLA-A*2402-HER2-63を氷上で１時間反応させたのち、フローサイトメトリーにて解析を行った。【０１１８】
＜治療効果の評価＞
W10ペプチドを用いた免疫療法を開始して以来、これまでに少なくとも、治療開始後３ヶ月＋１週間が経過している症例１８症例について、上述のRECIST国際基準により治療効果の評価を行ったところ、１８症例中８例がSD、１０例がPDと判定された。SD以上の症例の割合を腫瘍制御率として計算すると、４４％となった（表４）。これまでに報告されているペプチド免疫療法の報告では、SD以上の割合をまとめた腫瘍制御率は、世界的にも数％から、十数％にとどまる（参考文献１〜４）。それらの既報に比べると、良好な反応である。【０１１９】
【表４】
2009066462.tif 000005
【０１２０】
参考文献１〜４
1.      
Mosolits, S., Ullenhag, G., Mellstedt,
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review of Immunological and clinical results. Ann Oncol
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2.      
Nagorsen, D. and E. Thiel. Clinical and
immunologic responses to active specific cancer vaccines in human colorectal
cancer. Clin Cancer Res 12,
3064-3069, 2006
3.      
Rosenberg, S.A., Yang, J.C., Schwartzentruber, D.J., Hwu, P., Marincola, F.M., Topalian, S.L., Restifo, N.P., Dudley, M.E., Schwarz, S.L., Spiess, P.J., Wunderlich, J.R., Parkhurst, M.R., Kawakami, Y., Seipp,
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therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of
patients with metastatic melanoma. Nat Med 10, 909-915, 2004
4.      
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D.H., Hibbitts, S., Teates,
D., Neese, P.Y., Grosh,
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Engelhard, V.H. Clinical and immunologic results of a randomized phase II trial
of vaccination using four melanoma peptides either administered in
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in adjuvant or pulsed on dendritic cells. J Clin Oncol 21, 4016-4026, 2003【０１２１】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。【０１２２】
この出願は、２００７年１１月２０日に出願された日本出願特願２００７−３０１０００を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【図１】
2009066462.tif 000006
【図２】
2009066462.tif 000007
【図３】
2009066462.tif 000008
【図４】
2009066462.tif 000009
【図５】
2009066462.tif 000010
【図６】
2009066462.tif 000011
【図７】
2009066462.tif 000012
【図８】
2009066462.tif 000013
【図９】
2009066462.tif 000014
【図１０】
2009066462.tif 000015
【図１１】
2009066462.tif 000016
【図１２】
2009066462.tif 000017
【図１３】
2009066462.tif 000018
【図１４】
2009066462.tif 000019
【配列表】
2009066462000001.app
【国際調査報告】
2009066462.tif 000020
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2009066462.tif 000022
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