(57)【要約】  新たな疲労のバイオマーカーに基づく疲労度の評価方法及び疲労度を評価するためのキットを提供することを目的とする。不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの細胞外への分泌が細胞の酸化ストレス状態を反映するという知見に基づく疲労度の評価方法及び疲労度を評価するためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、
不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量に基づいて疲労度を決定する工程と、
を備える疲労度の評価方法。
【請求項２】
対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量とペルオキシレドキシンの存在量との比を測定する工程と、
不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量とペルオキシレドキシンの存在量との比に基づいて疲労度を決定する工程と、
を備える疲労度の評価方法。
【請求項３】
前記不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量の測定する工程が、以下の工程：
対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固相化する工程と、
固相化された不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと、標識された第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程であって、前記第１の抗体は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識し、標識された抗体である工程と、
前記免疫複合体中の第１の抗体の標識に由来するシグナル強度を検出し、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、
を備える、請求項１又は２に記載の疲労度の評価方法。
【請求項４】
前記不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量の測定する工程が、以下の工程：
対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固相化する工程と、
固相化された不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと、第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程であって、前記第１の抗体は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識する抗体である工程と、
前記免疫複合体と第２の分子との三者の免疫複合体を形成させる工程であって、前記第２の分子は、前記第１の抗体を特異的に認識し、標識された分子である工程と、
前記三者の免疫複合体中の第２の分子の標識に由来するシグナル強度を検出し、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、
を備える請求項１又は２に記載の疲労度の評価方法。
【請求項５】
前記不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量の測定する工程が、以下の工程：
標準不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固相化する工程と、
対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン存在下において、固相化された標準不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと、標識された第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程であって、前記第１の抗体は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識し、標識された抗体である工程と、
前記免疫複合体中の第１の抗体の標識に由来するシグナル強度を検出し、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、
を備える、請求項１又は２に記載の疲労度の評価方法。
【請求項６】
前記不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量の測定する工程が、以下の工程：
標準不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固相化する工程と、
対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン存在下において、固相化された標準不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと、標識された第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程であって、前記第１の抗体は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識し、標識された抗体である工程と、
前記免疫複合体と第２の分子との三者の免疫複合体を形成させる工程であって、前記第２の分子は、前記第１の抗体を特異的に認識し、標識された分子である工程と、
前記三者の免疫複合体中の第２の分子の標識に由来するシグナル強度を検出し、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、
を備える請求項１又は２に記載の疲労度の評価方法。
【請求項７】
請求項３又は５に記載の評価方法を行うための固相、第１の抗体及び使用説明書を含む、疲労度を評価するためのキット。
【請求項８】
請求項４又は６に記載の評価方法を行うための固相、第１の抗体、第２の分子及び使用説明書を含む、疲労度を評価するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疲労度の評価方法及び疲労度を評価するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
疲労は、痛み・熱と並んで生体の三大アラームの一つに挙げられ、身体の異常を知らせる生体シグナルである。疲労は身体的な又は精神的なストレスによって生じ、多くの場合、集中力の低下や意欲の喪失、不快感の増幅、眠気の誘発などの疲労感を伴う。さらに、疲労の蓄積や慢性疲労は、動脈硬化、心筋梗塞、糖尿病、癌などの生活習慣病をはじめとするさまざまな病気の発症に関与すると考えられている。【０００３】
厚生労働省の発表によると、過重労働による脳・心疾患の労災認定件数が年間３１０件以上にのぼり、年間３万４千人を超える自殺者のうち約９千人が労働者である（平成１５年度時点）。また、所定外労働時間が増加の傾向にあり、６割を超える労働者が仕事に強い不安やストレスを感じている。このような背景から、政策レベルでの過重労働・メンタルヘルス対策の強化が重要視されると共に、労働者をはじめとする個人レベルにおいても、自らの疲労の程度を把握・自覚し、積極的に自己の健康管理を行う必要性が高まっている。【０００４】
従来、ストレスや作業時における生体負担の評価方法としては、自覚症状に基づく心理的評価法、フリッカーなどのタスク評価法、脳波や心拍を測定する電気生理的計測法、体液中に含まれるストレス応答物質や免疫応答物質を測定する生化学測定法などがある。この中で、客観的及び定量的に優れた評価方法としては、生化学測定法を挙げることができる。これまでに例えば、体液中のクロモグラニンの濃度から、クロモグラニンの分泌量と相関関係のある生理状態を評価する方法（特許文献１）、体液中のアシルカルニチン濃度を指標として疲労度を評価する方法（特許文献２）などの生化学測定法が開示されている。【０００５】
【特許文献１】特開平１１−２３５７２号公報
【特許文献２】特開２００５−７００２４号公報
【非特許文献１】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７７，１９３９６−１９４０１(２００２)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の生化学的測定法では、主に、疲労の要因となる種々のストレスに応答する物質が指標として用いられていた。つまり、これらの指標は、主にストレスのシグナルの介在物質であるか出力物質であった。そこで、疲労の要因となるストレスそのものの様態を測定することができれば、新たな疲労のバイオマーカーを提供することが可能となると本発明者は考えた。【０００７】
疲労が生じるメカニズムは未だ解明されていないが、一つのモデルとして酸化ストレスが関与するメカニズムが提唱されている。活性酸素種は、タンパク質、脂質、核酸などの生体分子と非特異的に反応することによって、分子の機能異常や細胞・組織障害などの酸化ストレスを引き起こすとこが知られている。細胞・組織レベルの酸化還元状態を維持する酸化ストレス除去機構のバランスが崩れると、化学的に不安定な活性酸素種を除去しきれない酸化ストレス状態となる。身体的な又は精神的なストレス下では、このような生体内防御システムの機能が低下すると考えられる。【０００８】
これらの知見を踏まえ、本発明者は、酸化ストレスの様態を検出することによって、疲労が生じるメカニズム解明の手がかりとなると共に、従来の生化学的測定法と併せて、より客観的、総合的な疲労度の評価が可能になると考えた。しかしながら、従来、生体内で発生している活性酸素種や酸化ストレス除去機構を定量的に評価することは、その反応性の高さ及び可逆的反応系であるゆえに困難であった。本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、酸化ストレスの客観的指標を同定し、新たな疲労のバイオマーカーを提供すると共に、新たな疲労のバイオマーカーに基づく疲労度の評価方法及び疲労度を評価するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、過酸化水素による酸化ストレスが神経細胞に及ぼす影響を調べた結果、酸化ストレス負荷依存的に不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの分泌量が増加することを本発明者らは見出した。これらの知見は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの細胞外への分泌が細胞の酸化ストレス状態を反映することを示し、よって、疲労の程度を反映する指標として有効である可能性を示唆している。かかる知見に基づき、本発明者は、ペルオキシレドキシンを指標とする疲労度の評価方法及び疲労度を評価するためのキットを提供することを可能とし、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量に基づいて疲労度を決定する工程と、を備える疲労度の評価方法を提供する。本発明の評価方法は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの細胞外への分泌が細胞の酸化ストレス状態を反映するという知見を応用したものである。かかる分子機構は、本発明者が新たに発見したものであり、これによって、低侵襲的、簡便かつ定量的に疲労度を評価することが可能となる。【００１１】
本発明の評価方法は、また、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量とペルオキシレドキシンの存在量との比を測定する工程と、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量とペルオキシレドキシンの存在量との比に基づいて疲労度を決定する工程と、を備えることを特徴とする。このように、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量とペルオキシレドキシンの存在量との比に基づいて検討することにより、ペルオキシレドキシンの酸化還元状態のバランスをも考慮に入れた、より精度の高い評価を行うことができる。【００１２】
本発明の評価方法は、上記不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量の測定する工程が、以下の工程：対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固相化する工程と、固相化された不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと、標識された第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程であって、上記第１の抗体は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識し、標識された抗体である工程と、上記免疫複合体中の第１の抗体の標識に由来するシグナル強度を検出し、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、を備えることが好ましい。【００１３】
また、本発明の評価方法は、上記不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量の測定する工程が、以下の工程：対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固相化する工程と、固相化された不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと、第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程であって、上記第１の抗体は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識する抗体である工程と、上記免疫複合体と第２の分子との三者の免疫複合体を形成させる工程であって、上記第２の分子は、上記第１の抗体を特異的に認識し、標識された分子である工程と、上記三者の免疫複合体中の第２の分子の標識に由来するシグナル強度を検出し、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、を備えることが好ましい。【００１４】
本発明の工程を備えることによって、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を簡便かつ定量的に測定することができ、疲労度を評価することが可能となる。【００１５】
さらに、本発明の評価方法は、前記不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量の測定する工程が、以下の工程：標準不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固相化する工程と、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン存在下において、固相化された標準不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと、標識された第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程であって、前記第１の抗体は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識し、標識された抗体である工程と、前記免疫複合体中の第１の抗体の標識に由来するシグナル強度を検出し、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、を備えることが好ましい。【００１６】
また、本発明の評価方法は、前記不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量の測定する工程が、以下の工程：標準不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固相化する工程と、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン存在下において、固相化された標準不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと、標識された第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程であって、前記第１の抗体は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識し、標識された抗体である工程と、前記免疫複合体と第２の分子との三者の免疫複合体を形成させる工程であって、前記第２の分子は、前記第１の抗体を特異的に認識し、標識された分子である工程と、前記三者の免疫複合体中の第２の分子の標識に由来するシグナル強度を検出し、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、を備えることが好ましい。【００１７】
本発明の工程を備えることによって、夾雑タンパク等を多く含む試料を用いた場合においても、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を簡便かつ定量的に測定することができ、疲労度を評価することが可能となる。【００１８】
本発明は、上記評価方法を行うための固相、第１の抗体及び使用説明書を含む、疲労度を評価するためのキットを提供する。また、本発明は、上記評価方法を行うための固相、第１の抗体、第２の分子及び使用説明書を含む、疲労度を評価するためのキットを提供する。本発明のキットは、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの分泌量が細胞の酸化ストレス状態を反映するという本発明者が新たに発見した知見に基づくものである。これによって、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量に基づいて、簡便かつ定量的に疲労度を評価することが可能となる。なお、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量とペルオキシレドキシンの存在量との比の測定する場合、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量をこのキットを用いて測定し、ペルオキシレドキシンの存在量を公知の方法を用いて測定する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の疲労度の評価方法によれば、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの細胞外への分泌が細胞の酸化ストレス状態を反映するという知見に基づき、低侵襲的、簡便かつ定量的に疲労度を評価することが可能となる。また、本発明の疲労度を評価するためのキットによれば、簡便かつ定量的に疲労度を評価することが可能となる。酸化ストレス除去機構における酸化ストレス状態を定量的に測定することは、新たな疲労のバイオマーカーの提供につながると共に、これによって、特に慢性疲労の程度や自覚のない疲労に対して疲労度の客観的評価を与えることができ、予防医療に資するものと期待される。また、抗疲労食品・医薬品開発における指標としても期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】培養マウス神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏ−２ａ）の細胞活性に与える過酸化水素の影響を示すグラフである。前培養したＮｅｕｒｏ−２ａを種々の濃度で１時間の過酸化水素処理し、洗浄後ＭＴＴアッセイを行った。
【図２】培養マウス神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏ−２ａ）の酸化ストレス負荷における不可逆酸化型ペルオキシレドキシン分泌量を示すグラフである。０．０５ｍＭ過酸化水素処理を６０分間行い、培地上清中の不可逆酸化型ペルオキシレドキシン量を抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により定量した。
【図３】培養マウス神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏ−２ａ）の分泌タンパク質に対する過酸化水素の影響を示す二次元電気泳動のゲル染色像に相当する図である。上図は過酸化水素を加えていないコントロールの泳動像、下図は過酸化水素を加えた条件における泳動像である。
【図４】各種処理による体重変化を示すグラフである。
【図５】ラット血漿中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の好適な実施形態である疲労度の評価方法及び疲労度を評価するためのキットについて詳細に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。【００２２】
はじめに、疲労度を評価するための指標となる不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン及びペルオキシレドキシンについて説明する。【００２３】
（ペルオキシレドキシン）
酸化ストレス除去機構には、複数の酸化還元化酵素や電子供与体などが関与している。酸化還元化酵素として、従来、グルタチオンペルオキシターゼやカタラーゼが知られていたが、新たなメンバーとしてペルオキシレドキシンが同定された。ペルオキシレドキシンは、活性中心に存在するシステインが還元型（−ＳＨ）及び酸化型（二量体間でのジスルフィド結合形成）を可逆的に移行し、活性酸素除去反応を触媒している。ペルオキシレドキシンにはサブタイプ１〜６が存在し、酸化部位である活性中心のシステイン及びその近傍アミノ酸配列が多くのサブタイプで保存されている。このうち、マウス及びヒトのペルオキシレドキシン２（配列番号１及び２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＣ３５７４４及びＣＡＡ８０２６９）は、１９８アミノ酸残基からなる分子量およそ２２ｋＤａの分子で、その活性中心に存在するシステインは、５１残基目のシステイン（以下、５１Ｃｙｓという）に相当する。ペルオキシレドキシン２は、細胞内では、主に細胞質に局在することが知られている。【００２４】
（不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン）
過度な酸化ストレス下では、ペルオキシレドキシンの活性中心に存在するシステインが過剰に酸化され、スルフェン酸（−ＳＯＨ）、スルフィン酸（−ＳＯ２Ｈ）を経て、スルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）へと変遷する。このうち、スルフェン酸は可逆的であるが、スルフィン酸とスルホン酸はＤＴＴなどの還元剤では還元型にもどすことはできないので、スルフィン酸化ペルオキシレドキシン及びスルホン酸化ペルオキシレドキシンは、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと呼ぶことができる（非特許文献１）。【００２５】
（疲労度の評価方法）
次に、本実施形態である疲労度の評価方法を説明する。
本実施形態である疲労度の評価方法は、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程と、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量に基づいて疲労度を決定する工程と、を備える。【００２６】
別の実施形態では、疲労度の評価方法は、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量とペルオキシレドキシンの存在量との比を測定する工程と、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量とペルオキシレドキシンの存在量との比に基づいて疲労度を決定する工程と、を備える。【００２７】
対象はヒトであることが好ましい。また、対象は哺乳類動物であってもよく、この場合、牛、豚、馬、羊などの家畜又はマウス、ラット、ウサギなどであることが好ましい。対象から採取した体液は、血液・尿・唾液等であることが好ましい。これによって、低侵襲的、簡便かつ定量的に疲労度を評価することが可能となる。また、測定する工程で得られる測定値は、その測定系における相対値でもよく、又は標品をコントロールとして算出した絶対値でもよい。本実施形態における具体的な測定方法としては、後に説明する抗不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン抗体を用いた抗原固相化免疫測定法、間接競合法等が挙げられるが、これらに限定されず、直接競合法やサンドイッチ法による測定方法、及び、免疫沈降法と免疫測定法を組み合わせた測定方法、標識化抗体を用いたキャピラリ等電点電気泳動による測定方法等であっても良い。そして、疲労度を決定する工程では、健常群及び疲労群から得た値を統計的に処理し、いずれに該当するかに基づいて決定することが好ましい。また、定期的に測定を行い、対象の健常時の値と比較してもよい。【００２８】
（抗原固相化免疫測定法、間接競合免疫測定法、及び、キット）
本発明の実施形態にかかる抗原固相化免疫測定法は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識する抗体を用いて、適宜、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）等の公知の免疫学的測定法を適応することができる。【００２９】
ここで、抗不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン抗体とは、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に検出することが可能な抗体であり、ペルオキシレドキシンのサブタイプは区別せず、活性中心が不可逆性酸化されたもののみを識別する抗体を指す。抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体でも良く、モノクローナル抗体に由来するＦａｂ、モノクローナル抗体に由来する還元型ＩｇＧ及びＦａｂ’抗体等の抗体断片も利用可能である。また、抗体は免疫測定法に応用できるものであれば、公知の方法に基づき作製されたものでもよく、市販抗体を用いてもよい。例えば、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンサブタイプ１〜４を認識するモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ  Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ−ＳＯ３、ＬａｂＦｒｏｎｔｉｅｒ社、及び、Ａｎｔｉ  Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ−ＳＯ３、ＡｂＣａｍ社）が挙げられる。【００３０】
続いて、本実施形態にかかる抗原固相化免疫測定法を説明する。本実施形態の抗原固相化免疫測定法は、対象から採取した体液中の抗原、すなわち不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固定する工程（抗原固相化工程）と、固相に固定された不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程（１次反応工程）と、免疫複合体を検出し、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程（測定工程）を含む。【００３１】
抗原固相化工程は以下の通り行うことができる。固相には、例えば、ポリスチレン製の９６ウェルプレート等の固相を用い、対象から採取した体液又はその希釈液（例えば、ＰＢＳ又はブロッキング剤を含むＰＢＳで希釈したもの）を入れて４℃〜室温で一晩、または３７℃で１〜３時間静置して、ウェル底面に抗原を吸着させることにより、抗原を固定する。そして、試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ＢＳＡ等のブロッキング剤を含む溶液を用いて４℃〜３７℃にて１〜３時間ブロッキングを行う。次の１次反応工程は、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンが固相化されたウェル（固相）に、第１の抗体を希釈した溶液を添加して４℃〜室温で１〜３時間静置することにより行う。なお、反応温度、反応時間等の反応条件は、当業者が適宜最適化することができる。【００３２】
次に、本実施形態にかかる間接競合免疫測定法を説明する。本発明の実施形態にかかる間接競合免疫測定法は、標準抗原、すなわち濃度が一定の標準不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを固定する工程（標準抗原固相化工程）と、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン存在下において、固定化された不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンと第１の抗体との免疫複合体を形成させる工程（１次反応工程）と、免疫複合体を検出し、対象から採取した体液中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程（測定工程）を含む。【００３３】
間接競合免疫測定法は、固相化した標準抗原と試料中の抗原とが競合的に第１の抗体との免疫複合体を形成することを利用した方法であり、試料中の抗原と第１の抗体との免疫複合体を洗浄除去した後の、固相化した標準抗原と第１の抗体との免疫複合体に由来するシグナル強度に基づいて、試料中に存在する抗原の量を算出する方法である。本実施形態の間接競合免疫測定法に用いる固相、抗不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン抗体、ブロッキング溶液等としては、上述のものを用いることができる。【００３４】
本実施形態にかかるキットは、上記評価方法を行うための固相、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを特異的に認識する第１の抗体及び使用説明書を含むものであり、ある実施形態では、第１の抗体は標識されており、また、他の実施形態では、第１の抗体を特異的に認識する第２の分子をさらに含み、第２の分子は標識された分子である。したがって、抗原固相化免疫測定法の測定工程は、ある実施形態においては、免疫複合体中の第１の抗体の標識に由来するシグナル強度を検出し、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程（測定工程）を包含し、また他の実施形態においては、さらに免疫複合体と第２の分子との三者の免疫複合体を形成させる工程（２次反応工程）と、三者の免疫複合体中の第２の分子の標識に由来するシグナル強度を検出し、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定する工程（測定工程）とを包含する。常法に従い定量し、上述の疲労度の評価方法によって疲労度の評価を行う。【００３５】
なお、免疫複合体中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量を測定するための標識は、酵素、蛍光物質又は放射性物質であることが好ましい。酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファダーゼ（ＡＰ）等が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセイン及びその誘導体、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）等が挙げられる。他の実施形態における第１の抗体と第２の分子との組み合わせは、当業者であれば適宜選定することができるが、例えば、一次抗体と二次抗体の組み合わせ、ビオチン標識した一次抗体とアビジン（又はストレプトアビジン）の組み合わせ、アビジン（又はストレプトアビジン）標識した一次抗体とビオチンの組み合わせ等が挙げられる。また、糖鎖結合性タンパク質レクチンを利用した組み合わせでも良い。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限するものではない。【００３７】
本明細書及び本実施例において用いた略語とその名称を一覧にして記す。
ＢＰＢ：ブロモフェノールブルー
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＢＳＳ：アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＬＣ：液体クロマトグラフィー
ＭＥＭ：最小必須培地
ＭＳ：質量分析
ＭＴＴ：メチルチアゾールテトラゾリウム
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸【００３８】
（実施例１：神経細胞を用いた酸化ストレス負荷実験）
（実験材料及び培養条件）
マウス神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏ−２ａ）は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手した（ＩＦＯ５００８１）。培養関連の試薬及び培地などはすべてインビトロジェン（ギブコ）社製を用いた。細胞の維持及び継代に用いた培地は、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ−１及び抗生物質（１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン）を含有する１０％ＦＢＳ  ＭＥＭであり、以下これを維持培地という。【００３９】
−８０℃にて保存した神経芽細胞腫入りのアンプルを急速解凍した後、１０ｍｌの維持培地をあらかじめ入れた１５ｍｌチューブに移した。これを１０００ｒｐｍ、３ｍｉｎで遠心した後、上清を吸引し、５ｍｌの新鮮な維持培地を加えてピペッティングした。得られた細胞懸濁液を６ｃｍ  ｄｉｓｈ（ファルコン）に移し、直ちに５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータで培養した。培養を開始して４８時間後に、細胞を継代した。【００４０】
細胞を正常に維持するために、細胞がサブコンフルエントの状態から、希釈率１／６で継代した場合には２日程度で、希釈率１／２０で継代した場合には５日程度で、再びサブコンフルエント状態に増殖することを目安とした。また、実験の再現性のために、希釈率１／２０で継代した場合には次の継代までの培養日数を５日間までとし、継代を続ける期間は一ヶ月程度、継代数にして６〜７代を限度とした。本培養には７５ｃｍ２フラスコ（旭テクノグラス）用いた。継代方法は以下の通りである。維持培地を吸引しＰＢＳでリンスした後、２ｍｌの０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ４Ｎａを加え室温で５分放置し、５ｍｌの維持培地を加えピペッティングした。この細胞懸濁液を新鮮な維持培地で希釈して継代した。【００４１】
（酸化ストレス負荷条件の検討）
酸化ストレス負荷実験の前培養のために、サブコンフルエント状態の細胞をトリプシン処理し、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン）を含有する２％ＦＢＳ  ＭＥＭ（以下「２％血清培地」という）を加え、適切な細胞密度となるように希釈して培養皿に撒いた。ＭＴＴアッセイ（実施例２）には、ポリリジンコート済みの９６ウェルプレートを用い、ＥＬＩＳＡ解析（実施例３）及び二次元電気泳動解析（実施例４）には、１０ｃｍ  ｄｉｓｈ（旭テクノグラス）を用いた。細胞密度は９６ウェルプレートの場合、１．０ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌで１００μｌ／ウェルとし、１０ｃｍ  ｄｉｓｈの場合、２．５ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌで１０ｍｌ／ｄｉｓｈとした。【００４２】
前培養を４２時間行った後に酸化ストレス負荷実験を行った。手順は以下の通りである。２％血清培地を吸引して除き、細胞をＰＢＳで1回リンスした後に、種々の濃度となるように過酸化水素を添加したＥＢＳＳを加えて１時間培養した。その後、細胞をＰＢＳで２回リンスし、ＥＢＳＳを添加後、ＭＴＴアッセイ（実施例２）又は二次元電気泳動解析（実施例４）に用いるサンプル調整を開始した。【００４３】
（実施例２：ＭＴＴアッセイ）
各ウェルにＥＢＳＳを１００μｌ添加した直後に、ＥＢＳＳにＭＴＴ（シグマアルドリッチ社）を溶解して作製した５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液を１１μl添加し、ＣＯ２インキュベータで４時間培養した。上清を吸引した後、ＤＭＳＯを１００μl添加し、ピペッティングによりＭＴＴフォルマザンを充分溶解させた。得られた溶解液の５９５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定し、コントロールの吸光度に対する％で結果を表示した（図１）。【００４４】
本実験条件において、細胞活性を示すＭＴＴフォルマザン生成率（ＭＴＴ還元能）が約５０％となる過酸化水素濃度は９６ウェルプレートの場合、０．０２５ｍＭであり、１０ｃｍ  ｄｉｓｈの場合、０．０５ｍＭであった。【００４５】
（実施例３：神経細胞の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン分泌に対して酸化ストレス負荷が与える影響）
ポリリジンコート済みの１０ｃｍ  ｄｉｓｈ及び２％血清培地を用いて、Ｎｅｕｒｏ−２ａを４２時間培養した後、０．０５ｍＭ  過酸化水素を添加したＥＢＳＳに培地交換し、６０分間過酸化水素処理を行った。その後、細胞をＰＢＳでリンスした後にＥＢＳＳで３時間培養した。培地上清中の不可逆酸化型ペルオキシレドキシン量を、以下に示す抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により定量した。【００４６】
抗不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン抗体には、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンサブタイプ１〜４を認識するビオチン標識モノクローナル抗体（Ａｎｔｉ  Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ−ＳＯ３  ＡＢ［１０Ａ１］、製品番号：ａｂ１６９５１、ＡｂＣａｍ社）を用いた。【００４７】
まず、コーティングバッファー（０．０５Ｍ  炭酸バッファー）で希釈した試料（培地上清）を、９６ウェルプレートの１ウェルあたり１００μｌ添加し、４℃にて一晩静置した。その後、ブロッキング溶液（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１ウェルあたり２００μｌ添加し、室温にて２時間ブロッキングを行った。【００４８】
次に、ウェル内を０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した。続いて、ビオチン標識されている抗不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン抗体を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下「ＢＴ−ＰＢＳ」という）に４μｇ／ｍｌとなるように希釈し、１ウェルあたり１００μｌ添加し、室温にて２時間反応させた。反応後、ウェル内を洗浄液で洗浄し、ＢＴ−ＰＢＳで８０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ナカライテスク）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、室温にて２０分間反応させた。洗浄後、発色基質溶液を１ウェルあたり１００μｌ添加し、室温にて１時間反応させた。なお、発色基質溶液には、オルトフェニレンジアミン２５ｍｇを溶解させたクエン酸−リン酸バッファー１０ｍｌに、使用直前に過酸化水素水１０μｌを添加したものを使用した。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１ウェルあたり１００μｌ添加して発色反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。各ウェルの測定値からブランクの値を差し引き、標準品の濃度及び吸光度から標準曲線を求め、試料中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン量を定量した。【００４９】
図２に結果を示す。図２は、培養マウス神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏ−２ａ）の酸化ストレス負荷における不可逆酸化型ペルオキシレドキシン分泌量を示すグラフである。コントロール（過酸化水素なしのＥＢＳＳで培養したもの）の平均値を１として相対値で表わした（ｍｅａｎ±ＳＤ）。酸化ストレス負荷（０．０５ｍＭ過酸化水素処理、６０分間）を行った細胞培養では、コントロールと比較して、培地上清中に分泌された不可逆酸化型ペルオキシレドキシン量が４倍であった。すなわち、酸化ストレス負荷依存的に、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの分泌が有意に増加することが判明した。したがって、不可逆酸化型ペルオキシレドキシン量を測定することは、疲労を引き起こす要因である酸化ストレスの指標として有効であると考えられる。【００５０】
（実施例４：二次元電気泳動によるプロテオーム解析）
（サンプル調製）
サブコンフルエント状態の細胞が入った１０ｃｍ  ｄｉｓｈから上清を除き、各ｄｉｓｈにＥＢＳＳを１０ｍｌ添加した後、ＣＯ２インキュベータで３時間培養した。静かに採取した培養後のＥＢＳＳ培地を１０００ｒｐｍ、３ｍｉｎで遠心し、僅かに混入した細胞を除いた後、二次元電気泳動用サンプルの原液とした。この原液を、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように限外ろ過膜（ミリポア）を用いて濃縮し、以下に示す組成の溶液で脱塩し、二次元電気泳動用サンプルの溶液を得た。試薬は通常入手可能な市販品を用いた。
ｕｒｅａ                                    ２．５５ｇ
Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ３−１０              ０．１ｍｌ
ＤＴＴ                                      ０．０５ｇ
１０％  ＳＤＳ                              ０．１ｍｌ
１０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００              １．０ｍｌ
超純水                                      ｕｐ  ｔｏ  ５．０ｍｌ【００５１】
（一次元目電気泳動、等電点電気泳動）
乾燥ストリップゲルは、ｐＨ４−７、１８ｃｍ（アマシャム）を用いた。膨潤液の組成及びゲル１本当たりの量は以下の通りであり、これを用時調製して使用した。
ｕｒｅａ                                    １．８００ｇ
ｔｈｉｏｕｒｅａ                            ０．７６３ｇ
ＤＴＴ                                      ０．０１０ｇ
Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ３−１０              ０．０５０ｍｌ
０．１Ｍ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ            ０．１２５ｍｌ
０．１％（ｗ／ｖ）  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ        ０．１２５ｍｌ
２０％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．５００ｍｌ
超純水                                      ｕｐ  ｔｏ  ５．０ｍｌ【００５２】
乾燥ストリップゲルの膨潤は、次の手順で行った。ゲル1本当たり５ｍｌの膨潤液を容器（アクリル管にシリコンゴム栓をしたもの）に入れ、乾燥ストリップゲルの保護フィルムを剥がして、ゲル面を上にして膨潤液に浸した。マイルドミキサーを用いて、室温で終夜浸し、ゲルを膨潤させた。【００５３】
一次元目電気泳動（等電点電気泳動）は、アナテック社製の等電点電気泳動装置及びパワーサプライを用いて、下記のプログラムで通電を行った。
Ｓｔｅｐ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｔｉｍｅ
１      ５００Ｖ        ２ｈ
２      ７００Ｖ        １ｈ
３      １０００Ｖ      １ｈ
４      １５００Ｖ      １ｈ
５      ２０００Ｖ      １ｈ
６      ２５００Ｖ      １ｈ
７      ３０００Ｖ      １ｈ
８      ３５００Ｖ      １０ｈ
９      ５００Ｖ        ｋｅｅｐ【００５４】
（ＳＤＳ処理及び還元アルカリ化処理）
ＳＤＳ処理と還元アルカリ化処理に用いる溶液は、それぞれ以下の通り調整した。
ＳＤＳ処理液（用時調製、以下は1本当たりの量）
ｕｒｅａ                                    １．８１３ｇ
５０％（ｖ／ｖ）  ｇｌｙｃｅｒｏｌ          ２．５ｍｌ
０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８      ０．２５ｍｌ
ＤＴＴ                                      ０．０２５ｇ
０．１％（ｗ／ｖ）  ＢＰＢ                  ０．１２５ｍｌ
１０％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ                    １．０ｍｌ
還元アルキル化処理液（用時調製、以下は1本当たりの量）
０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８      ０．２５ｍｌ
１０％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ                    １．０ｍｌ
０．１％（ｗ／ｖ）  ＢＰＢ                  ０．１２５ｍｌ
５０％（ｖ／ｖ）  ｇｌｙｃｅｒｏｌ          ２．５ｍｌ
超純水                                      １．１２５ｍｌ
ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ                  ０．２２５ｇ【００５５】
ＳＤＳ処理は、次の手順で行った。まず、一次元目の電気泳動が終了したゲルストリップをピンセットで取り出し、超純水ですすいでシリコンオイルを流した。次いで、ＳＤＳ処理液を入れたアクリル管にゲルストリップを入れ、シリコンゴムで栓をした後に、マイルドミキサーを用いて４０分間インキュベートを行った。続く還元アルキル化処理の手順は以下の通りである。還元アルキル化処理液を入れたアクリル管にＳＤＳ処理済みのゲルストリップを入れ、マイルドミキサーを用いて２０分間インキュベートを行った。還元アルキル化処理後直ちに、次の操作であるＳＤＳ電気泳動を開始した。【００５６】
（二次元目電気泳動、ＳＤＳ電気泳動）
二次元目電気泳動（ＳＤＳ電気泳動）には、アナテック社製の二次元目電気泳動装置及び７．５％アクリルアミドゲルを用いた。ゲル一枚当たり４０ｍＡの定電流で約３．５時間通電し、ＳＤＳ電気泳動を行った。【００５７】
（銀染色）
銀染色ＭＳキット（和光純薬工業）に添付された説明書に従い、銀染色を行った。得られたゲル泳動像は、ＣＣＤカメラにより撮影し、そのデータをコンピュータに保存した。【００５８】
以上の操作を行い、酸化ストレス負荷が神経細胞に与える影響を二次元電気泳動によって解析した。結果として得られたゲル泳動像を図３に示す。ゲル泳動像を解析した結果、酸化ストレス負荷依存的に発現プロファイルが変化するスポットＮｏ．１及びＮｏ．２を見つけた。スポットＮｏ．１及びＮｏ．２は共に、分子量およそ２２ｋＤａを示し、等電点（ｐＩ）はそれぞれ５．５付近及び５．７付近であった。コントロールに対し、過酸化水素処理条件下では、スポットＮｏ．１に相当するタンパク質が出現し、スポットＮｏ．２に相当するタンパク質が減少することを見出した。【００５９】
（実施例５：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析による酸化ストレス負荷依存的なタンパク質同定）
（ゲル内消化処理）
実施例１〜３の解析の結果得られたスポットＮｏ．１及びＮｏ．２に相当するタンパク質を同定するために、以下に示す手順でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。まず、スポットＮｏ．１及びＮｏ．２に相当するタンパク質を含むゲル片をそれぞれ切り出した。これらのゲル片を脱銀した後、トリプシンを加えて３７℃、２０時間の処理を行い、それぞれの目的タンパク質のペプチド断片を含むサンプル溶液を得た。このサンプル溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に呈した。【００６０】
（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析における分析条件は以下の通りである。
ＨＰＬＣ装置は、Ｐａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ−４（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用い、ＨＰＬＣカラムは、ＭＡＧＩＣ  Ｃ１８  ３μ  ０．２ｘ５０ｍｍを使用した。ＨＰＬＣに用いる溶媒は、溶媒Ａ（２％  アセトニトリル／０．１％  ギ酸、２％  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ）及び溶媒Ｂ（９０％  アセトニトリル／０．１％  ギ酸、９０％  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ）であり、分離条件は、流速１．０  μｌ／ｍｉｎ及び以下のグラジエント条件を採用した。
グラジエント条件：    （ｍｉｎ）  溶媒Ｂ（％）
０．００        ５．０
５０．００      ６５．０
５１．００        ５．０
６０．００        ５．０【００６１】
質量分析装置は、ＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｉｇａｎ，ＵＳＡ）を用いた。イオン化方式はＮａｎｏｆｌｏｗ−ＬＣ  ＮＳＩ、イオン化モードはＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ、キャピラリ電圧２ｋＶにて分析を行った。【００６２】
（データベース検索による目的タンパク質の同定）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって得られたデータを、ＭＡＳＣＯＴ及びＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴの２種類のタンパク質データベースと照らし合わせ、目的タンパク質の同定を行った。その結果、スポットＮｏ．１及びＮｏ．２に相当するタンパク質は共に、ペルオキシレドキシン２（計算分子量は、約２２ｋＤａ）であることを発明者は見出した。実施例４の結果から明らかとなった両タンパク質の等電点と、これまでの知見（非特許文献１）と併せて、スポットＮｏ．２に相当するタンパク質は還元型ペルオキシレドキシン２であり、スポットＮｏ．１に相当するタンパク質はペルオキシレドキシン２の５１Ｃｙｓのチオール基がスルホン酸化又はスルフィン化されたペルオキシレドキシン２（不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン２）であることが判明した。【００６３】
以上の結果より、実施例３の結果と一貫して、酸化ストレス負荷依存的に不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの分泌量が有意に増加することが確認された。また、酸化ストレス負荷依存的に不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン量と還元型ペルオキシレドキシン量の比が変化することが判明した。したがって、不可逆酸化型ペルオキシレドキシン量を測定することに加えて、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンの存在量とペルオキシレドキシンの存在量との比を測定することは、疲労を引き起こす要因である酸化ストレスの指標として有効であると考えられる。【００６４】
（実施例６：間接競合ＥＬＩＳＡ法による血漿不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン定量方法の構築）
夾雑タンパク等が多く存在する血漿中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンを測定するにあたり、実施例３に示した抗原サンプル固相化ＥＬＩＳＡ法よりも高感度な測定方法として、新たに間接競合ＥＬＩＳＡ法による測定法を構築した。方法の詳細を以下に記す。【００６５】
抗不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン抗体には、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシンサブタイプ１〜４を認識するビオチン標識ポリクローナル抗体（Ａｎｔｉ  Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ−ＳＯ３  ＡＢ、製品番号：ａｂ１６８３０、ＡｂＣａｍ社）を用いた。【００６６】
まず、コーティングバッファー（０．０５Ｍ  炭酸バッファー）に希釈した一定濃度の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン標準品を調製し、ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートの１ウェルあたり１００μｌ添加し、４℃にて一晩静置した。洗浄液でウェル内を３回洗浄した後に、ブロッキング溶液（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１ウェルあたり３００μｌ添加し、室温にて２時間ブロッキングを行った。なお、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン標準品として、過酸化水素処理したＮｅｕｒｏ−２ａ培養上清の５倍希釈液を用いた。【００６７】
次に、ウェル内を洗浄液で３回洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した。続いて、ＢＴ−ＰＢＳ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で希釈した標準曲線作成用不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン（又は、ＢＴ−ＰＢＳで段階希釈した基準血漿サンプル）、又は、ＢＴ−ＰＢＳで希釈した測定用の血漿試料（５０μｌ／１ウェル）、及び、ＢＴ−ＰＢＳで希釈したビオチン標識抗Ｐｒｘ−ＳＯ３ポリクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／１ウェル）を添加し、室温にて２時間反応させた。反応後、ウェル内を洗浄液で洗浄し、ＢＴ−ＰＢＳで８０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ナカライテスク）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、室温にて２０分間反応させた。洗浄後、発色基質溶液を１ウェルあたり１００μｌ添加し、室温にて１時間反応させた。なお、発色基質溶液は、実施例３と同様に調製したものを使用した。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１ウェルあたり１００μｌ添加して発色反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。各ウェルの測定値からブランクの値を差し引き、標準品の濃度及び吸光度から標準曲線を求め、試料中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン量を定量した。【００６８】
（実施例７：疲労モデル動物における血漿中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン濃度測定）
疲労モデルラットは、Ｍ.  Ｔａｎａｋａらの方法（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．（２００３）ｖｏｌ．３５２，ｐ．５９−１６２）に従って作成した。これは熟眠を阻害するモデルであり、過労死モデルとも言われる。このモデルは７週齢のオスＳＤラットを５日間水浸飼育（水深１．５ｃｍ）することによって作成される。このモデルは体重の減少を伴うのでコントロールとして通常の飼育群に加え、食餌制限（７．５ｇ／日）により疲労群の体重変化に近くなるようにした群も設けた（図４）。水浸開始５日後に後大静脈よりヘパリンを用いて採血し、血漿を得た。【００６９】
上記ラット群について、間接競合ＥＬＩＳＡ法による血漿不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン濃度の測定結果を示す（図５）。コントロール群に比較し、水浸群で有意に血漿不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン濃度が高いことが分かった。なお、コントロール群及び食餌制限群間では有意差は見られなかった。【００７０】
以上より、疲労ラット血漿で有意に不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン濃度が増加することが分かった。また、疲労による血漿中の不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン濃度増加を測定できることが確認できた。したがって、不可逆性酸化型ペルオキシレドキシン濃度を測定することは、身体的な又は精神的な疲労を血漿等の体液から客観的に評価する方法として有効であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009069528.tif 000008
2009069528.tif 000009