(57)【要約】  本発明は、ヒアルロン酸と治療活性剤とからなる薬物送達システムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸と、治療活性剤とからなる薬物送達システムであって、
該活性剤は、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基のＣ−６位において、共有結合されており、該活性剤は、下記式（Ｉ）の化合物を除き、
【化１】
2009524624.tif 000003
ここで：
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立に、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、Ｃ１−Ｃ５のアルキル、＝Ｏを示し；Ｘ及びＹは、−Ｃ（Ｒ５）＝、−ＣＨ（Ｒ５）−、−ＮＨ−、−Ｎ＝を示し、ここで、Ｒ５は、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ５のアルキルを示し、Ｚは、−ＣＨ（Ｒ１０）−、−Ｎ（Ｒ１０）−、−Ｏ−を示し、Ｒ１０は、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ５のアルキル、Ｃ１−Ｃ５のアルケニル、Ｃ１−Ｃ５のアルキニル、窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択された１〜３個のヘテロ原子を有する５員又は６員の複素環を示し、Ａｒは、１，４−フェニル基、１つ以上の５員又は６員の芳香族環と縮合した１，４−フェニル基、１つ以上の５員又は６員の複素環と縮合した１，４−フェニル基を示し、このＡｒは、Ｒ２で可能に置換され、環Ａ及びｂは、互いに独立に、芳香族環又は非芳香族環であってもよいことを特徴とする薬物送達システム。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸と前記の活性剤との間の結合は、エステル、アミノ、エーテル、チオエーテル、アミド、好ましくはエステルであることを特徴とする請求項１に記載のＤＤＳ。
【請求項３】
前記治療活性剤は、鎮痛剤、降圧剤、麻酔剤、利尿剤、気管支拡張剤、カルシウムチャネルブロッカー、コリン作動剤、ＣＮＳ剤、エストロゲン、免疫刺激剤、免疫抑制剤、脂肪親和剤、抗不安剤、抗潰瘍剤、抗不整脈剤、抗狭心剤、抗生物質、抗炎症剤、抗ウィルス剤、抗塞栓剤、血管拡張剤、解熱剤、抗うつ剤、抗精神病剤、抗腫瘍剤、粘液溶解剤、麻薬拮抗剤、ホルモン、鎮痙剤、抗ヒスタミン剤、抗真菌剤、乾癬治療薬（好ましくは、抗炎症剤、抗生物質、抗腫瘍剤）の複数の異なる治療分野に属する薬物から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＤＳ。
【請求項４】
前記の活性剤は、ＤＤＳの全重量に対して、０．１〜６０％ｗ／ｗ（好ましくは１〜５０％）の量を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸の第二水酸基は、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ２Ｈ、−ＯＰＯ３Ｈ２、−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯＲからなる基であって、ｎが１〜４であり、ＲがＣ１〜Ｃ１０のアルキル、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３である基を形成するように誘導体化されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項６】
酸の形態、又はアルカリ金属、アルカリ土類金属若しくは遷移金属で塩化されていることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項７】
医薬の調製のための請求項１乃至６のいずれか一項に記載の薬物送達システムの使用。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の薬物送達システムを含有し、医薬的に許容し得る賦形剤及び／又は希釈剤の混合物であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
注入可能な形態であることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の薬物送達システムの調製方法であって：
（ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位に離脱基を導入して、ＨＡ−６−活性体を得るステップと；
（ｂ）（ＨＡのＣ６位の）離脱基を、治療活性剤に存在する求核基と置き換えることにより、ＨＡ−６−活性体のＣ６位と、治療活性剤との間の化学結合を形成して、ＨＡ−６−活性剤を得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得たＨＡ−６−活性剤から、種々の未置換の離脱基を可能に置き換えるステップと；
（ｄ）ＨＡ−６−活性剤を回収するステップと；
を有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）から得たＨＡ−６−活性体は、反応混合物から単離され、その後、ステップ（ｂ）に従って、治療活性剤と反応されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｂ）は、ＨＡ−６−活性体を含有するステップ（ａ）の反応混合物に対して直接実行されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ−６位に導入された離脱基は、スルフォネート基、ホスホネート基（トリフェニルホスホネート基）、シアン化物（ＣＮ−）、窒化物（ＮＯ２−）、ハロゲン（好ましくは、塩素）、サルフェート基、ハロゲンサルフェート基、硝酸塩、ハロゲンサルファイト（クロロサルファイト）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の薬物送達システムの調製方法であって：
（ａ）塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位にスルフォネート基を導入して、ＨＡ−６−硫化物を得るステップと；
（ｂ）ＨＡのＣ６位のスルホン酸基を、治療活性剤に存在する求核基と置き換えることにより、ＨＡ−６−硫化物のＣ６位と、治療活性剤との間の化学結合を形成して、ＨＡ−６−活性剤を得るステップと；
（ｃ）ＨＡ−６−活性剤を回収するステップと；
を有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記ヒアルロン酸と前記の活性剤との間の結合は、エステル、アミノ、エーテル、チオエーテル、アミドであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒアルロン酸と前記の活性剤との間の結合は、エステルであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
スルフォネート基を導入するのに用いる試薬は、有機塩基又は無機塩基、好ましくは有機塩基の存在下でのアルキル又はアリールスルフォニルハライド、好ましくは塩化物であることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬は、メチルスルフォニルクロライド又はトルエン−ｐ−スルフォニルクロライドであり、
前記有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヒアルロン酸と式（Ｉ）の化合物とからなる薬物送達システムであって、
【化２】
2009524624.tif 000004
式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基は、エステル結合により、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ−６位に共有結合され、
当該ＤＤＳは：
（ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位に、スルフォネート基、ホスホネート基（トリフェニルホスホネート基）、シアン化物（ＣＮ−）、窒化物（ＮＯ２−）、サルフェート基、ハロゲンサルフェート基（好ましくはクロロサルフェート基）、硝酸塩、ハロゲンサルファイト（クロロサルファイト）からなる群から選択される離脱基を導入して、ＨＡ−６−活性体を得るステップと；
（ｂ）（ＨＡのＣ６位の）離脱基を、式（Ｉ）の化合物に存在するカルボキシル基と置き換えることにより、ＨＡ−６−活性体のＣ６位と、式（Ｉ）の化合物との間のエステル結合を形成して、ＨＡ−６−式（Ｉ）の化合物を得るステップと；
（ｃ）ＨＡ−６−式（Ｉ）の化合物を回収するステップと；
を有する方法により得られることを特徴とする薬物送達システム。
【請求項２０】
１〜５０％、好ましくは５〜４０％のＣ６−ＤＳｗを有することを特徴とする請求項１９に記載のＤＤＳ。
【請求項２１】
式（Ｉ）の化合物は、メトトレキサートであることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のＤＤＳ。
【請求項２２】
ステップ（ａ）から得たＨＡ−６−活性体は、反応混合物から単離され、その後、ステップ（ｂ）に従って、治療活性剤と反応されることを特徴とする請求項１９乃至２１のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項２３】
前記ステップ（ｂ）は、ＨＡ−６−活性体を含有するステップ（ａ）の反応混合物に対して直接実行されることを特徴とする請求項１９乃至２２のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項２４】
スルフォネート基を導入するのに用いる試薬は、有機塩基又は無機塩基、好ましくは有機塩基の存在下でのアルキル又はアリールスルフォニルハライド、好ましくは塩化物であることを特徴とする請求項１９乃至２３のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項２５】
前記試薬は、メチルスルフォニルクロライド又はトルエン−ｐ−スルフォニルクロライドであり、
前記有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンであることを特徴とする請求項２４に記載のＤＤＳ。
【請求項２６】
医薬の製造への、請求項１９乃至２５のいずれか一項に記載のＤＤＳの使用。
【請求項２７】
請求項１９乃至２５のいずれか一項に記載の薬物送達システムを含有し、医薬的に許容し得る賦形剤及び／又は希釈剤の混合物であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２８】
注入可能な形態であることを特徴とする請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位に、スルフォネート基、ホスホネート基（トリフェニルホスホネート基）、シアン化物（ＣＮ−）、窒化物（ＮＯ２−）、サルフェート基、ハロゲンサルフェート基（好ましくはクロロサルフェート基）、硝酸塩、ハロゲンサルファイト（クロロサルファイト）からなる群から選択される離脱基を導入して得られることを特徴とするＨＡ−６−活性体。
【請求項３０】
前記離脱基は、スルフォネート基であることを特徴とする請求項２９に記載のＨＡ−６−活性体。
【請求項３１】
１０〜９１％のＣ６−ＤＳｍｏｌを有することを特徴とする請求項２９又は３０に記載のＨＡ−６−活性体。
【請求項３２】
２０〜９０％のＣ６−ＤＳｍｏｌを有することを特徴とする請求項２９又は３０に記載のＨＡ−６−活性体。
【請求項３３】
４０〜８０％のＣ６−ＤＳｍｏｌを有することを特徴とする請求項２９又は３０に記載のＨＡ−６−活性体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の薬物送達システム：異なるクラスの治療活性剤用のキャリア分子としてのヒアルロン酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
疎水性の特徴を有し、従って水に対して低い溶解度を示す多くの薬物は、水への溶解性を増加させ生物学的利用能を向上させるため、親水性のポリマーにコンジュゲートされてきた。この目的のため、生体適合性及び生物分解性の特性を示す多くのポリマー材料が使用され、そのいくつかは、生物学的に活性であり、十分な薬物の負荷能を有し、且つ薬物標的化の能力を有する。その例としては、ポリグルタミン酸、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルデキストラン及びヒアルロン酸がある。しかしながら、ＰＬＧ、ＰＥＧ及びＣＭＤは、生物活性及び標的化能を欠落する一方で、ＨＡは、生物活性を有し且つ薬物を病変部位へと標的化する能力を有することから、他のものに対して利点を有する。多くの腫瘍は、ＣＤ４４受容体を過剰発現しており；ＨＡは、薬物を病変部位へと送達する標的化のため、抗癌剤をコンジュゲートするのに用い得る。ＣＤ４４ＨＡ受容体を発現する細胞株では、誘導体化したＨＡのエンドサイトーシスが見られる。蛍光標識したＨＡ−タキソールコンジュゲートは、ＨＡ受容体を過剰発現すると知られているヒトガン細胞株に対して選択的な毒性を示してきた。ＨＡに対する肝臓の受容体（ＨＡＲＬＥＣ）の存在が示唆するのは、薬物を肝組織に標的化するのにキャリア分子として使用され得ることである。ＨＡは、マウスにおいて、結腸腺癌からの肝転移を示す。
【特許文献１】国際公開第０１／６８１０５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／１８１３３号パンフレット
【非特許文献１】Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．、２００５年、３４０巻、ｐ．２２２９−２２３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＨＡのＣ−６の第一水酸基をジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤（ＤＨＦＲ）で置換したＨＡの調製は、特許文献１に述べられている。このコンジュゲートは、ＨＡの選択的ハロゲン化反応により、ＨＡ−６−ハロゲンを調製した後、ハロゲンをＤＨＦＲで置換することで得られる。このコンジュゲートは、抗増殖活性を未だ有しているが、ハロゲン基が残存するという問題を未だ示す。
【０００４】
多糖への離脱基の選択的な導入は、非特許文献１に述べられており、ここでは、アセトアミド及び塩化リチウムの混合物中でのセルロースのトシル化について報告されている；選択された条件により、この位置でのブロッキングとフリーな位置でのその他の化学基の導入を目的として、全ての第一水酸基を完全にスルフォニル化することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様では、ヒアルロン酸（ＨＡ）及び治療活性剤とからなる薬物送達システム（ＤＤＳ）が提供され、この活性剤は、式（Ｉ）の活性剤を除いて、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ−６位に共有結合される。
【０００６】
【化３】
2009524624.tif 000002
【０００７】
ここで：
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立に、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、Ｃ１−Ｃ５のアルキル、＝Ｏを示し；Ｘ及びＹは、−Ｃ（Ｒ５）＝、−ＣＨ（Ｒ５）−、−ＮＨ−、−Ｎ＝を示し、ここで、Ｒ５は、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ５のアルキルを示し、Ｚは、−ＣＨ（Ｒ１０）−、−Ｎ（Ｒ１０）−、−Ｏ−を示し、Ｒ１０は、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ５のアルキル、Ｃ１−Ｃ５のアルケニル、Ｃ１−Ｃ５のアルキニル、窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択された１〜３個のヘテロ原子を有する５員又は６員の複素環を示し、Ａｒは、１，４−フェニル基、１つ以上の５員又は６員の芳香族環と縮合した１，４−フェニル基、１つ以上の５員又は６員の複素環と縮合した１，４−フェニル基を示し、このＡｒは、Ｒ２で可能に置換され、環Ａ及びｂは、互いに独立に、芳香族環又は非芳香族環であってもよい。
【０００８】
式（Ｉ）の化合物は、特許文献１に記載のジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤である。
【０００９】
ヒアルロン酸（ＨＡとも称する。）は、二糖の繰り返し単位からなり、Ｄ−グルクロン酸と、２−アセタミド−２−デオキシ−３−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）とからなり、β（１→３）のグリコシド結合で結合されたものである；このＤ−グルクロン酸残基は、酸型であってもよく、また塩型であってもよい。各繰り返し単位は、β（１→４）のグリコシド結合により次の残基に結合し、直鎖のポリマーを形成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において使用する用語ヒアルロン酸は、酸型も塩型も両方包含する。
【００１１】
用語ヒアルロン酸は、種々の分子量を有するＨＡの分子画分、又はこの化合物の加水分解画分の一般的な群を言及するのに一般的に用いられる。本発明の目的のため、ヒアルロン酸は、１００００〜１００万の平均分子量を好ましく有し、さらに好ましくは、２００００〜５０００００である。
【００１２】
治療活性剤は、種々の異なる治療分野に属する薬物から選択され、鎮痛剤、降圧剤、麻酔剤、利尿剤、気管支拡張剤、カルシウムチャネルブロッカー、コリン作動剤、ＣＮＳ剤、エストロゲン、免疫刺激剤、免疫抑制剤、脂肪親和剤、抗不安剤、抗潰瘍剤、抗不整脈剤、抗狭心剤、抗生物質、抗炎症剤、抗ウィルス剤、抗塞栓剤、血管拡張剤、解熱剤、抗うつ剤、抗精神病剤、抗腫瘍剤、粘液溶解剤、麻薬拮抗剤、ホルモン、鎮痙剤、抗ヒスタミン剤、抗真菌剤、乾癬治療薬が挙げられる。
【００１３】
これらの治療活性剤は、求核基を有する。求核基は、電子対供与基であって、カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、水酸基、チオール、アミド基が挙げられ、カルボキシル基が好ましい。
【００１４】
このＤＤＳにおいて、ヒアルロン酸と治療活性剤との結合は、エステル、アミノ、エーテル、チオエーテル、アミドである。エステル結合が好ましい。
【００１５】
このＤＤＳsは、酸型又は塩型のいずれであってもよい。塩型である場合、アルカリ金属（好ましくは、Ｎａ又はＫ）、アルカリ土類金属（好ましくは、Ｃａ又はＭｇ）、遷移金属（好ましくは、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｏ、Ａｇ）で塩化（ｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。塩化は、当業者公知の方法で達成される。
【００１６】
任意で、ＤＤＳsの第二水酸基（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を誘導体化して、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ２Ｈ、−ＯＰＯ３Ｈ２、−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯＲから選択される基を形成してもよく、ここで、ｎは、１〜４であり、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３である。これらの置換は、当業者公知の方法により簡単に達成可能であり、ＤＤＳの親水特性を調節するように選択されてもよい。
【００１７】
ＤＤＳｓにおける治療活性剤の全量は、置換の度合い（Ｃ６−ＤＳ）で決定される；後者は、ＤＤＳの全量に対する治療活性剤の重量％（Ｃ６−ＤＳｗ）で示されるか、改変されたＨＡの繰り返し単位のモルに対する治療活性剤のモル％（Ｃ６−ＤＳｍｏｌ）で示されてもよい。
【００１８】
本発明のＤＤＳにおいて、Ｃ６−ＤＳｗは、好ましくは０．１〜６０％であり、さらに好ましくは１〜５０％であり、よりさらに好ましくは５〜４０％である。
【００１９】
実験部で示すように、本発明のＤＤＳｓは、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの繰り返し単位の第一水酸基に直接結合された治療活性剤の存在を特徴とする。ＨＡの他の水酸基は、薬物の化学結合に関与しない。さらに、ＤＤＳｓは、安定であり、実用的な医薬用途に有害であり得る所望しない反応の副産物及び不純物を含まない。
【００２０】
これらは、治療剤の医薬効果を保持する。従って、ＤＤＳにおいて特定の治療活性剤に適切な全ての病態の処置に首尾よく使用され得る。
【００２１】
従って、本発明のさらなる態様は、各治療剤に適切な病態の処置用の医薬の製造への、上記ＤＤＳｓの使用である。この病態は、腫瘍、皮膚疾患、乾癬、炎症病態、関節リューマチ及び感染病態からなる群から選択される。
【００２２】
また、本発明の態様は、医薬的に許容し得る賦形剤及び／又は希釈剤と組み合わせたＤＤＳsを含有する医薬組成物である。この医薬組成物は、液体又は固形のいずれであってもよい；この組成物は、経口、非経口、局所のいずれを介して投与されてもよい。特に興味のあるのは、本発明によるＤＤＳｓを含有する注入可能な医薬組成物である。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、上記の特徴を有する式（Ｉ）の化合物を除く、ＨＡと治療活性剤との薬物送達システムを調製する技術である。驚くべきことに見出されたように、この反応は、２つのカルボキシル基及び複素環を有する式（Ｉ）の構造を有する化合物で起こるのみならず、異なる治療分野に属する多くの数の異なる活性剤に広く適用可能である。
【００２４】
この技術は、下記の反応ステップを有する：
（ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位に離脱基を導入して、ＨＡ−６−活性体（ＨＡ−６−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）を得るステップと；
（ｂ）（ＨＡのＣ６位の）離脱基を、治療活性剤に存在する求核基と置き換えることにより、ＨＡ−６−活性体のＣ６位と、治療活性剤との間の化学結合を形成して、ＨＡ−６−活性剤（ＨＡ−６−ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）を得るステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得たＨＡ−６−活性剤から、種々の未置換の離脱基を可能に置き換えるステップと；
（ｄ）ＨＡ−６−活性剤を回収するステップ。
【００２５】
この目的を考慮して、好ましくは、０．１〜６０％、より好ましくは、１〜５０％、さらにより好ましくは５〜４０％のＣ６−ＤＳｗを有するＤＤＳｓを得ることが可能である。
【００２６】
本発明の目的を実行するのに２つの異なる方法がある。第一の方法は、ステップ（ａ）から得られるＨＡ−６−活性体を、反応混合物から単離し、その後、ステップ（ｂ）に従って、治療活性剤と反応させ、最終産物であるＨＡ−６−活性剤を得て、その後任意でステップ（ｃ）を行う方法である。
【００２７】
第二の方法は、ＨＡ−６−活性体を含有するステップ（ａ）で得た反応混合物に対して、直接ステップ（ｂ）を行う方法である。上記の反応を実行するこの第二の方法の利点は、ＨＡ−６−活性体を単離するステップを回避するという事実からなる。
【００２８】
出発物質であるＨＡは、フリーの形態であっても、塩の形態であってもよく、その対イオンは、アルカリ金属又はアルカリ土類金属であることが好ましく、又は窒素を含有する対イオンであることが好ましい。後者の場合、この対イオンは、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール及びテトラゾール並びに１以上のＣ１〜Ｃ６のアルキル基で可能に置換されたものからなる群から選択される複素環を有してもよい。窒素を含有する対イオンの好適な例は、アンモニウム、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）、ピリジニウム又はｓｙｍ−コリジニウムイオンである。
【００２９】
ステップ（ａ）は、適当な試薬を、非プロトン性有機溶媒中で完全に攪拌したＨＡ（フリーの形態又は塩の形態）の懸濁液又は溶液に添加することで行われる選択的反応である。
【００３０】
ＨＡのグルコサミン単位のＣ−６位に導入される離脱基は、求核基による置換の間に離脱する種々の電子対受容基である。これは、スルフォネート基、ホスホネート基（トリフェニルホスホネート基）、シアン化物（ＣＮ−）、窒化物（ＮＯ２−）、ハロゲン（好ましくは、塩素）、サルフェート基、ハロゲンサルフェート基、硝酸塩、ハロゲンサルファイト（クロロサルファイト）からなる群から選択されてもよい。
【００３１】
離脱基がハロゲンである場合、特許文献１及び２に記載の通り、ハロゲン化が行われる。ハロゲン基のうち、塩素基は、好適なものであって、ハロゲン化を行う好適な試薬は、メタンスルフォニルクロライドを有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
【００３２】
このステップにより、ＨＡ−６−活性体の形成が可能となる。
【００３３】
ステップ（ｂ）は、ＨＡ−６−活性体、又はステップ（ａ）から得た塩の形態のものを、治療活性剤と反応することにより、行われる。これは、治療活性剤に含まれる求核基により、離脱基を置換することからなり、ＨＡのＣ−６位と治療活性剤との間に共有結合を形成させる。この結合の化学的性質は、求核基の化学的性質に依存する。これは、求核基がカルボキシル基である場合に形成されるエステル結合であってもよい。ＨＡと治療活性剤との間に形成されるその他の結合としては、アミノ、エーテル、チオエーテル、アミドである。
【００３４】
ステップ（ｃ）は、可能なステップであって、種々の可能な未置換の離脱基の置き換えを可能とする種々の適当な反応であってもよい。斯かる置き換えは、例えば、還元による光分解により行われてもよい。いくつかの場合、種々の未置換の離脱基が反応条件又は試験（ｗｏｒｋ−ｕｐ）のためステップ（ｂ）において破壊される可能性があるので、ステップ（ｃ）は、必要ではない。ステップ（ｄ）において、得られるＨＡ−６−活性剤（ＤＤＳ）は、標準的な技術により、回収される。
【００３５】
本発明の方法の好適な実施例において、離脱基は、スルフォニル基であり、従って、得られる活性化されたＨＡは、ＨＡ−６−硫化物（ＨＡ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅｄ）である。この好適な反応は、下記の反応ステップを有する。
【００３６】
（ａ）塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位にスルフォネート基を導入して、ＨＡ−６−硫化物（ＨＡ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅｄ）を得るステップと；
（ｂ）（ＨＡのＣ６位の）スルホン酸基を、治療活性剤に存在する求核基と置き換えることにより、ＨＡ−６−硫化物のＣ６位と、治療活性剤との間の化学結合を形成して、ＨＡ−６−活性剤を得るステップと；
（ｄ）ＨＡ−６−活性剤を回収するステップ。
【００３７】
この実施例において、ステップ（ａ）の選択的なスルホン化は、スルホン化試薬としてアルキル又はアリールスルフォニルハライド、好ましくは塩化物を用いて、有機塩基又は無機塩基、好ましくは有機塩基の存在下で行われる。このアルキル又はアリールスルフォニルハライドは、メチルスルフォニル（メシル）、トルエン−ｐ−スルフォニル（トシル）、トリフィル、トリムシル（ｔｒｉｍｓｙｌ）、トリプシル（ｔｒｉｐｓｙｌ）、１，１−スルフォニル−イミダゾールから選択されてもよく、好ましくは、メチルスルフォニル（メシル）である。
【００３８】
上記の有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンなどの異なる有機アミンから好ましく選択される。
【００３９】
上記の溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルフォキシド、ホルムアミドからなる群から選択される。
【００４０】
一般的なスルホン化の手法は、下記の通りである。上記の塩基、好ましくは有機塩基を、窒素還流下で攪拌しながら、塩の形態、好ましくは有機塩基の形態のＨＡの懸濁液又は溶液に添加する。その後、適当な溶媒、好ましくは上記と同じ溶媒中のアルキル又はアリールスルフォニルクロライドを、滴下で添加する。２〜９０分（好ましくは、４５〜７５分）の所定の時間の後、ＮａＨＣＯ３を添加して反応を停止し、ＨＡの第二水酸基との反応中に形成されたギ酸エステルを除去する。その後、約１０〜２０時間、好ましくは１８時間、この反応を継続する。反応生成物（ＨＡ−６−硫化物）は、沈殿や乾燥などの公知の方法により溶液から直接回収され、又は回収後、適当な塩の形態のＨＡ−６−硫化物、例えば、ＨＡ−６−硫化物：ＴＢＡの形態で得られるような方法で、溶液を処理する。
【００４１】
この反応の条件は、穏やかであって、事実、反応は、室温又はより低い温度で首尾よく実行可能であり、冷却加熱サイクルは必要なく、ｐＨの条件も穏やかである。
【００４２】
上記の試薬は、限定的な量で使用され、適当な量は、スルフォニルハライド（例えば、メシルクロライド）のＨＡの繰り返し単位（好ましくは、２〜６モル当量）に対して、１〜１０モル当量を、有機アミン（例えば、ＤＩＥＡ）のＨＡの繰り返し単位（好ましくは４〜１２モル当量）に対して２〜２０モル当量の存在下に有するものである。
【００４３】
上記の反応条件において、得られるヒアルロン酸−６−硫化物は、１０〜９１％（モル／モル）、好ましくは、２０〜９０％、さらに好ましくは４０〜８０％の範囲の置換度（ＤＳｍｏｌ）を有する。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の第一位置（Ｃ−６）のメシル化反応の選択性は、５０〜１００％（Ｃ６−ＤＳｍｏｌ）である。いくつかのメシル化反応が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ−４位、Ｄ−グルクロン酸残基のＣ−２、Ｃ−３位などの第二位置（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）でも起きる。このポリマーにおける構造及びメシル基の置換の度合いは、ＮＭＲ分光法で確認される。
【００４４】
スルフォニル化反応の好適実施例において、ステップ（ｂ）により、ＨＡと、治療活性剤に存在するカルボキシル基との間のエステル結合が形成される。
【００４５】
この実施例において、ステップ（ａ）は、上述の通り実行され、ステップ（ｂ）は、下記の方法に従って通常実行される。
【００４６】
カルボキシル基を有する活性剤の溶液を、炭酸セシウムなどのアルカリ又はアルカリ土類金属の存在下、ＴＢＡ又はナトリウム塩、好ましくはＴＢＡ中のＨＡ−６−硫酸物の溶液に添加する。この反応は、４０〜９０℃、好ましくは８０℃で、一定の攪拌下、好ましくは窒素還流しながら、５〜４２時間、好ましくは８〜２０時間（１８時間）、行われる。この反応混合物は、公知の方法により用意される。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、ヒアルロン酸と、式（Ｉ）とからなる薬物送達システムであって、式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基が、エステル結合によりヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位のＣ−６位に共有結合され、このＤＤＳは、上記の特別の方法により得られる。これらの新規のＤＤＳｓは、ＨＡのＣ−６位に直接結合された式（Ｉ）の化合物を含有し、ＨＡの繰り返し単位のその他の水酸基は、薬物又はその他の化学基のいずれとも化学結合に関与していないことを特徴とする。特に、これらのＤＤＳｓは、ＨＡ単位の第一及び第二の両方とも、離脱基（例えば、スルフォネート基）を有さない。用語「有さない（ｄｅｖｏｉｄ）」は、残る離脱基が、ＮＭＲにより同定された量で０．５％ｗ／ｗ未満存在することを意味する。これらの特徴により、元のＨＡの化学構造の規則性及び炭素原子の配置を保持することが可能であり、これらの特性／態様は、有効性及び特定の受容体との相互作用を確実にする点で非常に重要である。
【００４８】
異なって、特許文献１に記載のＨＡとメトトレキサートとのコンジュゲートは、ハロゲン化のステップで多糖に導入された残りの塩素原子を含有する。
【００４９】
式（Ｉ）の異なる化合物のうち、好適なものは、メトトレキサートである。メトトレキサート（ＭＴＸ）は、式（Ｉ）で示され、Ｒ２及びＲ４は、−ＮＨ２であり；環Ａは、芳香族であり；環Ｂは、芳香族であり；Ｘ及びＹは、−Ｎ＝であり；Ｚは、−Ｎ（ＣＨ３）−であり；Ａｒは、１，４−フェニル基である。ＤＤＳｓのＣ６−ＤＳｗは、好ましくは０．１〜６０％であり、より好ましくは１〜５０％であり、さらに好ましくは、５〜４０％である。ＭＷは、１０，０００〜５００，０００である。
【００５０】
このＤＤＳの調製技術は、下記の反応ステップを有する。
【００５１】
（ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位に、スルフォネート基、ホスホネート基（トリフェニルホスホネート）、シアン化物（ＣＮ−）、窒化物（ＮＯ２−）、サルフェート基、ハロゲンサルフェート基、硝酸塩、ハロゲンサルファイト（クロロサルファイト）からなる群から選択された離脱基を導入して、ＨＡ−６−活性体を得るステップと；
（ｂ）（ＨＡのＣ６位の）離脱基を、式（Ｉ）の化合物に存在するカルボキシル基と置き換えることにより、ＨＡ−６−活性体のＣ６位と、式（Ｉ）の化合物との間のエステル結合を形成して、ＨＡ−６−式（Ｉ）の化合物を得るステップと；
（ｄ）ＨＡ−６−式（Ｉ）の化合物を回収するステップ。
【００５２】
好適実施例において、ステップ（ａ）は、スルフォニル化反応であり、スルホン基を導入するのに用いられる試薬は、有機塩基又は無機塩基の存在下の、アルキル又はアリールスルホネートハライド、好ましくはクロライドである。好適な試薬は、メチルスルフォニルクロライド、又はトルエン−ｐ−スルフォニルクロライドであり、有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンである。
【００５３】
ＤＤＳは、２つの異なる方法に従って上記の方法で取得され得る。第一の方法において、ステップ（ａ）から得たＨＡ−６−硫化物は、反応混合物から単離され、その後、ステップ（ｂ）に従って、式（Ｉ）の化合物と反応して、最終産物であるＨＡ−６−式（Ｉ）の化合物を得る。
【００５４】
上記の方法を実行する第二の方法において、ステップ（ｂ）は、ＨＡ−６−硫化物を含有するステップ（ａ）から得た反応混合物に直接行われる。上記の反応を実行するこの第二の方法の利点は、ＨＡ−６−硫化物を単離するステップを回避するという事実である。
【００５５】
実験部
例１：構造の同定
ＨＡ−６−メシレート（ＨＡ−Ｍｓ）中のメシル酸の含量のＮＭＲによる同定は、１．９５ｐｐｍ（ＨＡ鎖の３Ｈ）におけるピークに対する３．１０÷３．３２ｐｐｍ（ＨＡ鎖の１Ｈ及びメシル酸の３Ｈ）の領域のピークの積分により、行った。
【００５６】
例２：構造の同定
ＨＡ−６−トシレート（ＨＡ−Ｔｓ）中のトシル酸の含量のＮＭＲによる同定は、１．９５ｐｐｍ（ＨＡ鎖の３Ｈ）におけるピークに対する７．８ｐｐｍ（２Ｈ）、７．５ｐｐｍ（２Ｈ）及び２．４５ｐｐｍ（３Ｈ）の領域のトシル酸のピークの積分により、行った。
【００５７】
例３：構造の同定
ＨＡ−６−ＭＴＸ中のメトトレキサートの含量のＮＭＲによる同定は、１．８５÷２．５８ｐｐｍ（ＨＡ鎖の３Ｈ及びＭＴＸの４Ｈ）の領域におけるピークに対する６．０÷８．６ｐｐｍ（ＭＴＸの５Ｈ）の領域のピークの積分により、行った。
【００５８】
例４：構造の同定
ＨＡ−６−イブプロフェン中のイブプロフェンの含量のＮＭＲによる同定は、１．９５ｐｐｍにおけるＨＡ鎖におけるピーク（３Ｈ）に対する７．０２÷７．２４ｐｐｍ（４Ｈ）、２．３８ｐｐｍ（２Ｈ）、１．４０ｐｐｍ（３Ｈ）及び０．７８ｐｐｍ（６Ｈ）の領域のイブプロフェンのピークの積分により、行った。
【００５９】
例５：構造の同定
ＨＡ−６−ペニシリンＧ中のペニシリンＧの含量のＮＭＲによる同定は、１．９５ｐｐｍにおけるＨＡ鎖におけるピーク（３Ｈ）に対する７．０５÷７．２０ｐｐｍ（５Ｈ）、５．５５ｐｐｍ（１Ｈ）、５．４０ｐｐｍ（１Ｈ）の領域のペニシリンＧのピークの積分により、行った。
【００６０】
例６
ＨＰＬＣによるメトトレキサートの含量は、メトトレキサートの公定モノグラフ（ＵＳＰ  ２３−ｐ  ９８４）に従って、アルカリ加水分解の前後のサンプルを分析することにより、同定した。分析条件は、以下の通り：クロマトグラフ：Ｄｉｏｎｅｘ社製ＤＸ−６００；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ社製４μ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ８０、カラムサイズ：１５０×４６０ｍｍ；カラム粒子径：４μｍ；温度：４０℃；溶出液：９０％の０．２Ｍ第二リン酸ナトリウム／０．１Ｍクエン酸（６３０：２７０）、１０％ＣＨ３ＣＮ；等張条件（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）:０．５ｍＬ／分；検出器：ダイオードアレイ（範囲２００〜７８０ｎｍ）；定量用選択波長：３０２ｎｍ；注入量：２５μＬ；実施時間：３０分。フリーのメトトレキサートの同定用の溶液は、ＨＡ−ＭＴＸを適当な濃度で直接ミリＱ水に溶解することにより、調製した。メトトレキサートの全含量は、０．１ＭのＮａＯＨ中、２時間室温で実行するアルカリ加水分解の後に同定した。１Ｍの塩酸で中和した後、ＨＰＬＣシステムに注入する前に、その溶液を、０．４５μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｍｉｎｉｓａｒｔ社製ＲＣ２５  １７７９５Ｑ）で濾過した。較正曲線は、既知の濃度のメトトレキサートの標準溶液を用いて、同定した。この方法により、サンプル濃度で標準化された、サンプル溶液中のＭＴＸの濃度ＤＳｗｅｉｇｈｔ％ｗ／ｗを与える。
【００６１】
例７：重量平均分子量（Ｍｗ）の同定
ＨＡＤＤＳの分子量は、ＨＰ−ＳＥＣ（高速サイズ排除クロマトグラフィー；Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により測定した。分析条件は、下記の通り：クロマトグラフ：Ｒｈｅｏｄｙｎｅ社製９１２５ｉｎｊｅｃｔｏｒを有するＨＰＬＣポンプ９８０−ＰＵ（Ｊａｓｃｏ社製番号Ｂ３９０１３２５）；カラム：ＴＳＫ  ＰＷ×ｌ（ＴｏｓｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）Ｇ６０００＋Ｇ５０００＋Ｇ３０００；粒子径：６、１０、１３μｍ；温度：４０℃；移動相：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％ＮａＮ３；流速：０．８ｍＬ／分；検出器：ＭＡＬＳ（ＷＹＡＴＴ社製ＤＡＷＮ  ＥＯＳ、米国）；λ＝６９０ｎｍ、（ｄｎ／ｄｃ＝０．１６７ｍＬ／ｇ）；ＵＶ分光光度検出器：８７０−ＵＶ（Ｊａｓｃｏ社製番号Ｄ３６９３９１６）、λ＝３０５ｎｍ、干渉反射インデックスＯＰＴＩＬＡＢ  ＲＥＸ（ＷＹＡＴＴ社製、米国）；λ＝６９０ｎｍ；感度：１２８倍；温度：３５℃；注入量：１００μＬ；実施時間：６０分。
【００６２】
異なる薬物にコンジュゲートした分析対象であるサンプルＨＡ−Ｃｌ、ＨＡ−ＯＭｓ、ＨＡ−ＭＴＸを、約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．９％ＮａＣｌに溶解し、１２時間、攪拌下で保持した。その後、この溶液を、０．４５μｍの多孔性フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｍｉｎｉｓａｒｔ社製ＲＣ２５  １７７９５Ｑ）で濾過し、最終的にカラムクロマトグラフに注入した。この分析により、Ｍｗ（重量平均分子量）、Ｍｎ（数平均分子量）、ＰＩ（多分散性；ｐｏｌｙｄｉｐｅｒｓｉｔｙ）の測定が可能となる。Ｍｗ及びＭｎの値は、ｇ／モルとして表現する。ポリマーサンプル溶液の濃度は、屈折率の積分により、調節した。
【００６３】
例８：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−６−Ｍｓ又はＨＡ−Ｍｓ）の調製
５００ｍｇ（０．８０６ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２０ｍＬのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の溶液に、１．１１ｍＬ（６．４８ミリモル）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を窒素下で攪拌しながら添加した。その後、メタンスルフォニルクロライド（ＭｓＣｌ）（３１４μＬ；４．０３ミリモル）を室温で滴下で添加したところ、橙色の溶液が形成された。室温で１時間攪拌した後、反応混合物の１／３を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（５０ｍＬ）に添加してｐＨ９で一昼夜攪拌することで、急冷した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して、４０ｍｇの灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物を得た（全ＤＳ８３％モル／モル（ＮＭＲによる））。
【００６４】
残りの反応混合物を一昼夜攪拌し、その後、上述と同様に行い、９０ｍｇの灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物を得た（全ＤＳ８６％モル／モル（ＮＭＲによる））。
【００６５】
全収量：１３０ｍｇのＨＡ−Ｍｓナトリウム塩（４０％）
【００６６】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）ｐｐｍ：１．９５（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ３），３．２３（ｓ，２．５８Ｈ，ＭｓＯ），３．２÷４．２（ｍ，７．４２Ｈ，ＨＡ鎖），４．３÷４．７（ｍ，２Ｈ，アノマー炭素＋１．７２Ｈ，ＣＨ−ＯＭｓ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）ｐｐｍ：２３（ＮＨＣＯＣＨ３），３７（ＭｓＯ），５５，６１（ＣＨ２ＯＨ），６８，６９．５（ＣＨ２ＯＭｓ），７２，７４，７５，７６，８０，８３，１０１，１０３，１７４，１７５
【００６７】
例９：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
５．００ｇ（８．０６ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２００ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、１３．９ｍＬ（８１ミリモル）のＤＩＥＡを窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（３．２ｍＬ；４１ミリモル）を室温で滴下で添加したところ、橙色の溶液が形成された。室温で１時間攪拌した後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（４００ｍＬ）に添加し、水で全量を１Ｌとし（ｐＨ９．５）、一昼夜攪拌下で保持して、急冷した。得た溶液をドラフト中で限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に、ロータリーエバポレーターで蒸留して乾燥した（１００ｍｇ）：全メシル酸ＤＳ９１％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）５８％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性６４％。
【００６８】
残りの溶液を、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理し、凍結乾燥して、４．６２ｇの灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物を得た（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩）。
【００６９】
例１０：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
２．５０ｇ（４．０３ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する１００ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、５．６ｍＬ（３２．７ミリモル）のＤＩＥＡを窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１．３ｍＬ；１６．７ミリモル）を室温で滴下で添加したところ、橙色の溶液が形成された。室温で１時間攪拌した後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（２００ｍＬ）に添加し、水で全量を６００ｍＬとし（ｐＨ９．２）、一昼夜攪拌下で保持して、急冷した。得た溶液をドラフト中で限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（１３６ｍｇ）：全メシル酸ＤＳ７９％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸６４％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性８１％。
【００７０】
残りの溶液を、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理し、凍結乾燥して、２．１０ｇの灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物を得た（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩）。
【００７１】
例１１：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
３．００ｇ（４．８４ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する１００ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、８．４ｍＬ（４８．４ミリモル）のＤＩＥＡを窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１．９２ｍＬ；２４．２ミリモル）を室温で滴下で添加したところ、橙色の溶液が形成された。室温で１５分間攪拌した後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（２００ｍＬ）に添加し、水で全量を６００ｍＬとし（ｐＨ９．５）、一昼夜攪拌下で保持して、急冷した。得た溶液をドラフト中で限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（１８７ｍｇ）：全メシル酸ＤＳ７６％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸５８％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性７６％。
【００７２】
残りの溶液を、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理し、凍結乾燥して、２．５６１ｇの灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物を得た（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩）。
【００７３】
例１２：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
３．００ｇ（４．８４ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する１００ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、４．９６ｍＬ（２９．０ミリモル）のＤＩＥＡを窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１．１３ｍＬ；１４．５ミリモル）を室温で滴下で添加したところ、橙色の溶液が形成された。室温で１５分間攪拌した後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（２００ｍＬ）に添加し、水で全量を６００ｍＬとし（ｐＨ９．５）、一昼夜攪拌下で保持して、急冷した。得た溶液をドラフト中で限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（２４８ｍｇ）：全メシル酸ＤＳ５５％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸４１％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性７５％。
【００７４】
残りの溶液を、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理し、凍結乾燥して、２．４１ｇの灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物を得た（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩）。
【００７５】
例１３：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
３．００ｇ（４．８４ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する１００ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、ＤＩＥＡ（４．９６ｍＬ；２９．０ミリモル）を窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１．１３ｍＬ；１４．５ミリモル）を有するジクロロメタン（２０ｍＬ）を室温で２０分かけて滴下で添加したところ、橙色の溶液が形成された。その後、この反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（２００ｍＬ）に添加し、水で全量を６００ｍＬとし（ｐＨ９．５）、一昼夜攪拌下で保持して、急冷した。得た溶液をドラフト中で限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（１７２ｍｇ）：全メシル酸ＤＳ８５％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸５０％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性５９％。
【００７６】
残りの溶液を、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理し、凍結乾燥して、２．７８ｇの灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物を得た（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩）。
【００７７】
例１４：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
３．００ｇ（７．４８ミリモル）のＨＡのナトリウム塩（Ｍｗ２０，０００）を有する１００ｍＬのＤＭＳＯの懸濁液に、ＤＩＥＡ（１２．８ｍＬ；７４．８ミリモル）及びＭｓＣｌ（２．９０ｍＬ；３７．４ミリモル）を添加して、１分以内に濃橙色が形成されるのを観察した。１時間１５分の間室温で攪拌した後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（２００ｍＬ）に添加し、水で全量を８００ｍＬとし（ｐＨ９．５）、一昼夜攪拌下で保持して、急冷した。得た溶液をドラフト中で限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（０．１５ｇ）：全メシル酸ＤＳ５％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）。
【００７８】
例１５：６−Ｏ−ｐ−トルエンスルフォニルヒアルロン酸の調製
ＨＡのＴＢＡ塩（１．０１８ｇ；１．６４ミリモル）（Ｍｗ２０，０００）を有する３０ｍＬの乾燥ＤＭＦの溶液を、Ｅｔ３Ｎ（３．２ｍＬ；２３．０ミリモル）及びＴｓＣｌ（２．２４ｇ；１１．７ミリモル）を用いて室温で処理した；この反応混合物は、橙赤色となり、溶液は粘張となった。１時間後、６ｍＬの反応混合物をロータリーエバポレーターで半分の容量にまで濃縮し、アセトンを用いてサンプルを沈殿させた。若干量の固形物をＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、１Ｈ  ＮＭＲ及びＤＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルを得た。その結果、ＤＳのトシル基は、１６％モル／モルであった；ホルミル化されたサンプル９５ｍｇが回収された。
【００７９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）ｐｐｍ：１．９５（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ３），２．４５（ｓ，０．４９Ｈ，トシル酸のＣＨ３），３．０÷５．４（ｍ，１２．３Ｈ，ＨＡ鎖及びアノマー炭素），７．５（ｄ，０．３４Ｈ，トシル酸芳香族），７．８５（ｄ，０．３０Ｈ，トシル酸芳香族），８．０÷８．５（ｍ，２．１４Ｈ，Ｏ−ＣＨＯホルミルエステル基）
【００８０】
残りの溶液を、さらに１時間５０℃に加熱し、ｐＨ９の飽和ＮａＨＣＯ３の溶液中で急冷し、２４時間攪拌し、中和し、濾過して、固形物を除去した。その後、得た溶液を限外濾過し、凍結乾燥した。ＤＭＳＯ−ｄ６中での１Ｈ  ＮＭＲ及びＤＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルを得た。その結果、ＤＳのトシル基は、１２％モル／モルであった。５５ｍｇのサンプルを回収した。
【００８１】
例１６：６−Ｏ−ｐ−トルエンスルフォニルヒアルロン酸の調製
ＨＡのＴＢＡ塩（１．０５３ｇ；１．７０ミリモル）（Ｍｗ２０，０００）を有する３０ｍＬの乾燥ＤＭＦの溶液を、Ｅｔ３Ｎ（３．２ｍＬ；２３．０ミリモル）及びＴｓＣｌ（２．２４ｇ；１１．７ミリモル）を用いて０℃で処理した；この反応混合物は、橙赤色となり、溶液は粘張となった。３０分後、室温とし、さらに１時間後、反応混合物をロータリーエバポレーターで半分の容量にまで濃縮し、アセトンを用いてサンプルを沈殿させた。若干量の固形物をＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、１Ｈ  ＮＭＲ及びＤＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルを得た。その結果、ＤＳのトシル基は、４５％モル／モルであった；ホルミル化されたサンプル７００ｍｇを回収した。
【００８２】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）ｐｐｍ：１．９５（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ３），２．４５（ｓ，１．３６Ｈ，トシル酸のＣＨ３），３．０÷５．４（ｍ，１３．０Ｈ，ＨＡ鎖及びアノマー炭素），７．５（ｄ，０．９７Ｈ，トシル酸芳香族），７．８５（ｄ，０．９０Ｈ，トシル酸芳香族），８．０÷８．５（ｍ，２．３３Ｈ，Ｏ−ＣＨＯホルミルエステル基）
【００８３】
例１７：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
５００ｍｇ（０．８０６ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２０ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、８２９μＬ（４．８４ミリモル）のＤＩＥＡを窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１８８μＬ；２．４２ミリモル）を室温で滴下で添加したところ、橙色の溶液が形成された。室温で１時間攪拌した後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（４０ｍＬ）に添加し、水で全量を１００ｍＬとし（ｐＨ９．５）、一昼夜攪拌下で保持して、急冷した。得た溶液をドラフト中で限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥して、３２９ｍｇの白色の固体を得た。全メシル酸ＤＳ７７％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）５９％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性７７％。
【００８４】
例１８：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
５００ｍｇ（０．８０６ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２０ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、４１４μＬ（２．４２ミリモル）のＤＩＥＡを窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（９４μＬ；１．２１ミリモル）を室温で滴下で添加したところ、橙色の溶液が形成された。室温で１時間攪拌した後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（４０ｍＬ）に添加し、水で全量を１００ｍＬとし（ｐＨ９．５）、一昼夜攪拌下で保持して、急冷した。得た溶液をドラフト中で限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥して、３１０ｍｇの白色の固体を得た。全メシル酸ＤＳ３４％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）２２％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性６５％。
【００８５】
例１９：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
５００ｍｇ（０．８０６ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２０ｍＬのＤＭＦの溶液に、８２９μＬ（４．８４ミリモル）のＤＩＥＡを窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１８８μＬ；２．４２ミリモル）を室温で滴下で添加したところ、黄色の溶液が形成された。室温で１時間攪拌した後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（４０ｍＬ）に添加し、水で全量を１００ｍＬとし（ｐＨ９．５）、一昼夜攪拌下で保持して、急冷した。ｐＨを１０に上昇させ、その懸濁液を３日間攪拌したところ、固形物のほとんどが溶解した。その後、これを濾過し、得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥して、２７７ｍｇの白色の固体を得た。全メシル酸ＤＳ４２％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）４０％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性９５％。
【００８６】
例２０：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
５００ｍｇ（０．８０６ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２０ｍＬのＤＭＦの溶液に、８２９μＬ（４．８４ミリモル）のＤＩＥＡを−１０℃の窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１８８μＬ；２．４２ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を、−１０℃で１時間攪拌した。この反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（４０ｍＬ）に添加し、水で全量を１００ｍＬとして（ｐＨ９．５）、急冷した；一昼夜攪拌した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥して、２０７ｍｇの白色の固体を得た。全メシル酸ＤＳ３７％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）３７％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性１００％。
【００８７】
例２１：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
５００ｍｇ（０．８０６ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２０ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリドンの溶液に、８２９μＬ（４．８４ミリモル）のＤＩＥＡを窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１８８μＬ；２．４２ミリモル）を室温で滴下で添加したところ、黄色の溶液が形成された。室温で１時間攪拌した後、この反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（４０ｍＬ）に添加し、水で全量を１００ｍＬとして（ｐＨ９．５）、急冷した；一昼夜攪拌した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥して、３１０ｍｇの白色の固体を得た。全メシル酸ＤＳ５０％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）３１％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性６２％。
【００８８】
例２２：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
５００ｍｇ（０．８０６ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２０ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリドンの溶液に、８２９μＬ（４．８４ミリモル）のＤＩＥＡを−１０℃の窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１８８μＬ；２．４２ミリモル）を室温で滴下で添加し、得た混合物を−１０℃で１時間攪拌した。この反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（４０ｍＬ）に添加し、水で全量を１００ｍＬとして（ｐＨ９．５）、急冷した；一昼夜攪拌した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥して、２５０ｍｇの白色の固体を得た。全メシル酸ＤＳ４１％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）３９％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性９５％。ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトルで選択性を確認した。
【００８９】
例２３：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸（ＨＡ−Ｍｓ）の調製
５００ｍｇ（０．８０６ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２０ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリドンの溶液に、８２９μＬ（４．８４ミリモル）のＤＩＥＡを０℃の窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１８８μＬ；２．４２ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を０℃で１時間攪拌した。この反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３の溶液（４０ｍＬ）に添加し、水で全量を１００ｍＬとして（ｐＨ９．５）、急冷した；一昼夜攪拌した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥して、２７５ｍｇの白色の固体を得た。全メシル酸ＤＳ４４％モル／モル（プロトンＮＭＲによる）、第一メシル酸（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）４０％モル／モル（炭素ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性９０％。
【００９０】
例２４：６−Ｏ−メトトレキシルヒアルロン酸の調製
例１０のＨＡ−ＯＭｓ：ＴＢＡ塩（５００ｍｇ；０．７３ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１５ｍＬ）の溶液を、固形の炭酸セシウム（５９６ｍｇ；１．８３ミリモル）の存在下、メトトレキサート（８３３ｍｇ；１．８３ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１０ｍＬ）の溶液で処理した。この混合物を、窒素下、８０℃で１８時間攪拌したところ、固形物を形成しながら暗色を呈した。その後、周囲温度に冷却し、１００ｍＬの水に投入し（ｐＨ６．５）、１５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で処理し、１．５時間攪拌した。その後、固形物を濾取し、溶液を限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、１３１ｍｇの黄色がかった茶色の固形物を得た。ＮＭＲによるＭＴＸのＤＳ：４０％モル／モル；１３Ｃ  ＮＭＲは、Ｃ６の４０％が改変されていたことを示した。ＨＰＬＣ分析により、３２％ｗ／ｗが得られ、これは、４０％モル／モルに相当する。また、ＮＭＲ分析により、残存する第二のメシル酸基がないことが明らかとなり、且つＨＡの塩基構造が、ＭＴＸによる置換に由来する種々のＣ−６位を除き、変更されていないことが明らかとなった。このことが示すように、メシル化反応で第二の位置（Ｃ−４、Ｃ−２’、Ｃ−３’）に導入された種々の可能な離脱基（メシル酸）は、塩基条件下での置換反応中で加水分解されるか、これらの位置での配置を保持した加水分解の後に２’，３’−無水物の形成を経由して加水分解される。ＮＭＲスペクトルは、室温で３ヶ月保存した後に同様のサンプルで繰り返したところ、新規に調製した製品で得られるものと同様のピーク及び強度を提供し、従って、置換度は保持され、副産物は形成されない。
【００９１】
例２５：ＨＡ−Ｃｌ：ＴＢＡ塩の調製
５０ｇのヒアルロナンナトリウム塩を、窒素下、２０℃で攪拌しながら、９００ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドに懸濁した。その後、この懸濁液を、−１０℃に冷却し、９７ｍＬのメタンスルフォニルクロライドを、３０分間かけて添加した。さらに−１０℃で３０分後、温度を２０℃に昇温した。１時間後、温度を１時間かけて６０℃に徐々に上昇させ、１８時間攪拌を続けた。その後、この反応混合物を、氷及び炭酸ナトリウム溶液（４Ｌ、初期のｐＨ１１）の混合物に、激しく攪拌しながら投入し、必要な場合、１．５ＭのＮａＯＨを添加してｐＨを約９に保持した。得た茶色の懸濁液（最終容量６Ｌ）を、室温で、ｐＨ９．５で約４８時間攪拌したところ、澄明な溶液を形成した。これを濾過して、固形物を除去し、その後、限外濾過した（１０ｋＤａのカットオフメンブレン）。得た溶液を、ロータリーエバポレーターで最終容量が約１Ｌとなるまで濃縮し、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物として４６．７ｇのＨＡ−６−Ｃｌを得た（ＤＳ６４％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定）。
【００９２】
例２６：ＨＡ−イブプロフェンの調製
例１２で調製したＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩（４００ｍｇ；０．６４ミリモル）及びイブプロフェン（３３３ｍｇ；１．６１ミリモル）を、窒素下、室温で攪拌しながら、ＤＭＳＯ（１６ｍＬ）に溶解した。固形の炭酸セシウム（２６４ｍｇ；０．８１ミリモル）を添加し、その懸濁液を、攪拌しながら、７０℃で２０時間加熱した。得た黄色がかった橙色の溶液を、１５０ｍＬの水に投入し（ｐＨは６．５であった）、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。３０分間攪拌した後、その溶液を限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、０．１５ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：２７％モル／モル。
【００９３】
例２７：ＨＡ−イブプロフェンの調製
例２５で調製したＨＡ−Ｃｌ：ＴＢＡ塩（１ｇ；１．６ミリモル）及びイブプロフェン（６７０ｍｇ；３．２ミリモル）を、窒素下、室温で攪拌しながら、ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解した。固形の炭酸セシウム（２６４ｍｇ；０．８１ミリモル）を添加し、その懸濁液を、攪拌しながら、８０℃で４０時間加熱した。得た暗黄色の溶液を、１００ｍＬの水に投入し（ｐＨは８であった）、その後、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、淡褐色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：２０％モル／モル。
【００９４】
例２８：ＨＡ−ペニシリンＧの調製
例１２で調製したＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩（４００ｍｇ；０．６４ミリモル）、１８−クラウン−６（３３８ｍｇ；１．２８ミリモル）及びペニシリンＧナトリウム塩（５７４ｍｇ；１．６１ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１６ｍＬ）の溶液を、攪拌しながら、７０℃で２０時間加熱した。
【００９５】
得た黄色の溶液を、１５０ｍＬの水に投入し（ｐＨは、６．５であった）、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。３０分間攪拌した後、溶液を、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、０．２９ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：２６％モル／モル。
【００９６】
例２９：ＨＡ−ペニシリンＧの調製
例２５で調製したＨＡ−Ｃｌ：ＴＢＡ塩（１ｇ；１．６ミリモル）、１８−クラウン−６（８４０ｍｇ；３．２ミリモル）及びペニシリンＧナトリウム塩（１．１３ｇ；３．２ミリモル）を、室温で攪拌しながら、ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解した。この溶液を、攪拌しながら、８０℃で４０時間加熱し、その後、これを、１００ｍＬの水に投入し（ｐＨは、７．４であった）、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、１ｇ（収率６４％）の薄黄色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：６％モル／モル。
【００９７】
例３０：ＨＡ−アルブミンの調製
例２５で調製したＨＡ−Ｃｌ：ＴＢＡ塩（１ｇ；１．６ミリモル）及びヒト血清アルブミン（３００ｍｇ）を、窒素下、室温で攪拌しながら、ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解した。固形の炭酸セシウム（２６４ｍｇ；０．８１ミリモル）を添加し、その懸濁液を、攪拌しながら、８０℃で４０時間加熱した。得た溶液を、１００ｍＬの水に投入し（ｐＨは、９．５であった）、その後、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、０．９ｇの薄茶色の固形物を得た。ＨＰＬＣによるＤＳ：５％モル／モル。
【００９８】
例３１：６−Ｏ−メトトレキシルヒアルロン酸の調製
ＨＡ：ＴＢＡ塩（２５０ｍｇ；０．４０３ミリモル；Ｍｗ２０，０００）を、攪拌しながら、ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解し、窒素下で緩徐に加熱した；その後、トリエチルアミン（４５２μＬ；３．２２ミリモル）を室温で添加し、ＭｓＣｌ（１５７μＬ；２．０２ミリモル）を滴下で添加したところ、黄色の溶液を形成した。室温で１時間攪拌した後、さらに０．５０ｍＬのトリエチルアミンを添加し、反応フラスコに、真空装置を接続して、ガスの発生がおさまるまで、５０℃（浴の温度）まで緩徐に加熱した。その後、１．１０ｇ（２．４３ミリモル）のメトトレキサート及び７９２ｍｇ（２．４３ミリモル）の炭酸セシウムを添加し、その混合物を、一昼夜８０℃で攪拌した。反応混合物の半分を、水（２０ｍＬ）に投入した；ｐＨ６．３。飽和ＮａＨＣＯ３を用いてｐＨを６．８に調節し、その後、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。１０分間攪拌した後、溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して、６０ｍｇの黄色の固形物を得た。ＭＴＸのＤＳは、ＨＰＬＣにより、１１．６％ｗ／ｗであると分かり、ＮＭＲの分析により、確認した（１２％モル／モル）。また、低い割合でポリマーにメシル酸が残存していることも示された。
【００９９】
残りの反応混合物を、さらに２４時間（全体で４０時間）、８０℃で上記の通り作用させて、１０３ｍｇの黄色の固形物を得た。ＭＴＸ中のＤＳ１４．４％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣにより）。ＮＭＲ分析により確認した（１５％モル／モル）。ポリマーに残存するメシル酸はなかった。Ｍｗ２６９，６１０、ＰＩ１０．５。架橋エステル結合を、１０ｍＬの炭酸緩衝液（ｐＨ１０）中で凍結乾燥品を８時間加水分解することにより、分解した。中和し透析した後、凍結乾燥して、９６ｍｇの黄色の固形物を得た。この産物におけるＭＴＸのＤＳは、ＨＰＬＣにより１２．６％ｗ／ｗであり、ＮＭＲ分析により確認した（１３％モル／モル）；Ｍｗ２７，１２０、ＰＩ１．９。
【０１００】
例３２：６−Ｏ−メトトレキシルヒアルロン酸の調製
ＨＡ：ＴＢＡ塩（５０ｇ；Ｍｗ７０，０００）を有する１０００ｍＬの乾燥ＤＭＦの溶液に、攪拌しながら、塩化メシル（１０当量）を、窒素流入下、−１０℃で１時間かけて滴下で添加した。その混合物を、室温で１時間保持し、その後、６０℃で１６時間加熱した。これにより、４．２％ｗ／ｗ（１３Ｃ−ＮＭＲ）の塩素含量を有する４６．９ｇのＨＡ−ＣＬを得た。
【０１０１】
ＨＡ−ＣｌのＴＢＡ塩（２０ｇ）を有するＤＭＳＯ（１．２５Ｌ）の溶液を、ＭＴＸ（２９．３ｇ）及び炭酸セシウム（２１ｇ）を用いて、８０℃で４０時間処理して、５．６ｇの黄色の固形物を得た。
【０１０２】
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの６位に結合が生じていることを確認した：６４ｐｐｍにおけるピークは、ＣＨ２Ｏ−ＭＴＸであると指定し、その強度は、親の塩素誘導体と比較して、４４ｐｐｍにおけるピーク（ＣＨ２Ｃｌ）の低下と対応した。ＭＴＸの含量は、１８．８％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であった；フリーのＭＴＸは、０．１％ｗ／ｗであった；水の含量：８．２％ｗ／ｗ；Ｍｗ：１１，０００；ＰＩ：１．４。また、ＮＭＲにより、１．７６％ｗ／ｗの塩素が残存することが分かった。
【０１０３】
例３３：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ）の調製
５．０ｇ（８．１ミリモル）のＨＡ：ＴＢＡ（Ｍｗ５，０００）を有する１００ｍＬの乾燥ＤＭＦの溶液に、３．１ｍＬ（５．６２ｍＬ、３３．９ミリモル）のＤＩＥＡを窒素流入下、−１０℃で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１．２５ｍＬ；１６．１ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を、−１０℃で１時間攪拌した。この反応混合物を、飽和Ｎａ２ＣＯ３の溶液（２００ｍＬ）を添加し、水で全量を１Ｌとして、急冷した；ｐＨを、希ＨＣｌ溶液で１０．５に調節し、一昼夜攪拌した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（１００ｍｇ）：第一メシル酸３０％モル／モル（ＮＭＲによる）；Ｃ６位に対する選択性１００％。（３．２ｇ；Ｍｗ：６，９２５；Ｐ．Ｉ．１．８７）
【０１０４】
例３４：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ）の調製
１０．０ｇ（１６．１ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ２０，０００）を有する２５０ｍＬのＤＭＦの溶液に、７．５８ｍＬ（４４．３ミリモル）のＤＩＥＡを窒素下、−１０℃で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１．５６ｍＬ；２０．１ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を、−１０℃で１時間攪拌した。この反応混合物を、飽和Ｎａ２ＣＯ３の溶液（４００ｍＬ）を添加し、水で全量を２Ｌとして、急冷した；ｐＨを、希ＨＣｌ溶液で１０．５に調節し、一昼夜攪拌した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（１００ｍｇ）：第一メシル酸２４％モル／モル（ＮＭＲによる）；Ｃ６位に対する選択性１００％。
【０１０５】
残りの反応混合物を、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理し、凍結乾燥して、９．９２ｇの白色の固形物を得た（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩）。
【０１０６】
例３５：ＨＡ−Ｃｌ：ナトリウム塩の調製
５ｇのヒアルロナンナトリウム塩（Ｍｗ２００，０００）を、窒素下、２０℃で攪拌しながら、９０ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドに懸濁した。その後、この懸濁液を、−１０℃に冷却し、９．７ｍＬのメタンスルフォニルクロライドを、３０分間かけて添加した。さらに−１０℃で３０分後、温度を２０℃に昇温した。１時間後、温度を１時間かけて６０℃に徐々に上昇させ、１８時間攪拌を続けた。その後、この反応混合物を、氷及び炭酸ナトリウム溶液（４００ｍＬ、初期のｐＨ１１）の混合物に、激しく攪拌しながら投入し、必要な場合、１．５ＭのＮａＯＨを添加してｐＨを約９に保持した。得た茶色の懸濁液（最終容量５００ｍＬ）を、室温で、ｐＨ９．５で約４８時間攪拌したところ、澄明な溶液を形成した。これを濾過して、固形物を除去し、その後、限外濾過した（１０ｋＤａのカットオフメンブレン）。得た溶液を、濃縮し、凍結乾燥して、灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物として４．０５ｇのＨＡ−６−Ｃｌを得た（ＤＳ１７％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定）。Ｍｗ７９，５６０、Ｐ．Ｉ．３．５。
【０１０７】
例３６：ＨＡ−Ｃｌ：ナトリウム塩の調製
５ｇのヒアルロナンナトリウム塩（Ｍｗ５００，０００）を、窒素下、２０℃で攪拌しながら、９０ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドに懸濁した。その後、この懸濁液を、−１０℃に冷却し、９．７ｍＬのメタンスルフォニルクロライドを、３０分間かけて添加した。さらに−１０℃で３０分後、温度を２０℃に昇温した。１時間後、温度を１時間かけて７０℃に徐々に上昇させ、２１時間攪拌を続けた。その後、この反応混合物を、氷及び炭酸ナトリウム溶液（４００ｍＬ、初期のｐＨ１１）の混合物に、激しく攪拌しながら投入し、必要な場合、１．５ＭのＮａＯＨを添加してｐＨを約９に保持した。得た茶色の懸濁液（最終容量５００ｍＬ）を、室温で、ｐＨ９．５で約４８時間攪拌したところ、澄明な溶液を形成した。これを濾過して、固形物を除去し、その後、限外濾過した（１０ｋＤａのカットオフメンブレン）。得た溶液を、濃縮し、凍結乾燥して、灰色がかった白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）の固形物として３．５６ｇのＨＡ−６−Ｃｌを得た（ＤＳ１０％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定）。Ｍｗ５３，８３０、Ｐ．Ｉ．４．０２。
【０１０８】
例３７：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ）の調製
１０．０ｇ（１６．１ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ１８０，０００）を有する５００ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、９．１６ｍＬ（５３．４ミリモル）のＤＩＥＡを−１０℃の窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（１．８７ｍＬ；２４．２ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を、−１０℃で１時間攪拌した。この反応混合物を、飽和Ｎａ２ＣＯ３の溶液（４００ｍＬ）に添加し、水で全量を２Ｌとして、急冷した。ｐＨを、希ＨＣｌを用いて１０．５に調節し、一昼夜攪拌した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（１５０ｍｇ）：第一メシル酸３０％モル／モル（ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性１００％。
【０１０９】
残りの溶液を、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理し、凍結乾燥して、９．８０ｇの白色の固形物を得た（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩）。
【０１１０】
例３８：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ）の調製
２０．０ｇ（３２．２ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ１８０，０００）を有する１０００ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、３６．７ｍＬ（２１４ミリモル）のＤＩＥＡを−１０℃の窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（７．４８ｍＬ；９７ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を、−１０℃で１時間攪拌した。この反応混合物を、飽和Ｎａ２ＣＯ３の溶液（８００ｍＬ）に添加し、水で全量を４Ｌとして、急冷した。ｐＨを、希ＨＣｌを用いて１０．５に調節し、一昼夜攪拌した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（１２０ｍｇ）：第一メシル酸５５％モル／モル（ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性１００％。
【０１１１】
残りの溶液を、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理し、凍結乾燥して、１９．９５ｇの白色の固形物を得た（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩）。
【０１１２】
例３９：６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ）の調製
２．００ｇ（３．２２ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩（Ｍｗ５００，０００）を有する１５０ｍＬのＤＭＦの溶液に、３．６７ｍＬ（２１．４ミリモル）のＤＩＥＡを−１０℃の窒素下で攪拌しながら添加した。その後、ＭｓＣｌ（７５０μＬ；９．７ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を、−１０℃で１時間攪拌した。この反応混合物を、飽和Ｎａ２ＣＯ３の溶液（８０ｍＬ）に添加し、水で全量を１Ｌとして、急冷した；ｐＨを、希ＨＣｌを用いて１０．５に調節し、一昼夜攪拌した。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。少量を、ＮＭＲの分析用に凍結乾燥した（９０ｍｇ）：第一メシル酸７０％モル／モル（ＮＭＲによる）、Ｃ６位に対する選択性１００％。
【０１１３】
残りの溶液を、ＴＢＡを負荷したアンバーライトＩＲＡ−１２０で処理し、凍結乾燥して、１．９４ｇの白色の固形物を得た（ＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩）。
【０１１４】
例４０：６−Ｏ−メトトレキシルヒアルロン酸の調製
例３４のＨＡ−ＯＭｓ：ＴＢＡ塩（８．０ｇ；１２．９ミリモル）を有するＤＭＳＯ（２５０ｍＬ）の溶液を、固形の炭酸セシウム（１０．５ｇ；３２．２ミリモル）の存在下、メトトレキサート（１４．６６ｇ；３２．３ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１５０ｍＬ）の溶液で処理した。この混合物を、窒素下、８０℃で２０時間攪拌した。その後、周囲温度に冷却し、炭酸緩衝液に投入し、ｐＨを９．７に調節し、容量を２Ｌとした。１８時間攪拌した後、溶液を中和し、濾過し、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、４．７０ｇの黄色の固形物を得た。ＮＭＲによるＭＴＸのＤＳ：７．５％モル／モル；Ｍｗ２７，９６０、Ｐ．Ｉ．１．９２。
【０１１５】
例４１：６−Ｏ−メトトレキシルヒアルロン酸の調製
例３７のＨＡ−ＯＭｓ：ＴＢＡ塩（７．０ｇ；１１．３ミリモル）を有するＤＭＳＯ（６７０ｍＬ）の溶液を、固形の炭酸セシウム（９．１５ｇ；２８．１ミリモル）の存在下、メトトレキサート（１２．７９ｇ；２８．１ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１２０ｍＬ）の溶液で処理した。この混合物を、窒素下、７５℃で１８時間攪拌した。その後、周囲温度に冷却し、炭酸緩衝液に投入し、ｐＨを８．８に調節し、容量を２．５Ｌとした。２４時間攪拌した後、溶液を中和し、濾過し、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、４．３０ｇの黄色の固形物を得た。ＮＭＲによるＭＴＸのＤＳ：１３％モル／モル；Ｍｗ２０８，４００、Ｐ．Ｉ．２．１８。
【０１１６】
例４２：６−Ｏ−メトトレキシルヒアルロン酸の調製
例３８のＨＡ−ＯＭｓ：ＴＢＡ塩（１３．２ｇ；２１．３ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１２７０ｍＬ）の溶液を、固形の炭酸セシウム（１７．２６ｇ；５３．１ミリモル）の存在下、メトトレキサート（２４．１３ｇ；５３．１ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１２０ｍＬ）の溶液で処理した。この混合物を、窒素下、７５℃で１８時間攪拌した。その後、周囲温度に冷却し、炭酸緩衝液に投入し、ｐＨを１０．０に調節し、容量を５Ｌとした。１８時間攪拌した後、溶液を中和し、濾過し、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、６．５２ｇの黄色の固形物を得た。ＮＭＲによるＭＴＸのＤＳ：２０％モル／モル；Ｍｗ２１７，３００、Ｐ．Ｉ．２．０２。
【０１１７】
例４３：６−Ｏ−メトトレキシルヒアルロン酸の調製
例３９のＨＡ−ＯＭｓ：ＴＢＡ塩（５００ｍｇ；０．７４ミリモル）を有するＤＭＳＯ（８０ｍＬ）の溶液を、固形の炭酸セシウム（７２６ｍｇ；２．２３ミリモル）の存在下、メトトレキサート（１．０１ｇ；２．２３ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１０ｍＬ）の溶液で処理した。この混合物を、窒素下、８０℃で２２時間攪拌した。その後、周囲温度に冷却し、炭酸緩衝液に投入し、ｐＨを１０．０に調節し、容量を４００ｍＬとした。１８時間攪拌した後、溶液を中和し、濾過し、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、２６０ｍｇの黄色の固形物を得た。ＮＭＲによるＭＴＸのＤＳ：１１％モル／モル；Ｍｗ４６０，１００、Ｐ．Ｉ．２．２１。
【０１１８】
例４４：６−Ｏ−メトトレキシルヒアルロン酸の調製
例３３のＨＡ−ＯＭｓナトリウム塩（１．０ｇ；２．０ミリモル）を有するＤＭＳＯ（４０ｍＬ）の溶液を、固形の炭酸セシウム（１．３０ｇ；２ミリモル）の存在下、メトトレキサート（１．８３ｇ；４ミリモル）を有するＤＭＳＯ（４０ｍＬ）の溶液で処理した。この混合物を、窒素下、８０℃で２０時間攪拌した。この溶液を、Ｎａ２ＣＯ３飽和溶液を用いて中和して、最終容量５００ｍＬとし、濾過し、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、５００ｍｇの黄色の固形物を得た。ＨＰＬＣによるＭＴＸのＤＳ：７．８％モル／モル；Ｍｗ１６，０００、Ｐ．Ｉ．２．４。
【０１１９】
例４５：ＨＡ−イブプロフェンの調製
例２０で調製したＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩（５００ｍｇ；０．８０ミリモル）及びイブプロフェン（４１６ｍｇ；２．０１ミリモル）を、窒素下、室温で攪拌しながら、ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）に溶解した。固形の炭酸セシウム（３３０ｍｇ；１．０１ミリモル）を添加し、その懸濁液を、攪拌しながら、７０℃で２０時間加熱した。得た溶液を、２００ｍＬの水に投入し（ｐＨは６．５であった）、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。３０分間攪拌した後、その溶液を限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、０．２２ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：３０％モル／モル。
【０１２０】
例４６：ＨＡ−ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｘｅｎ）の調製
例２０で調製したＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩（５００ｍｇ；０．８０ミリモル）及びナプロキセン（４６３ｍｇ；２．０１ミリモル）を、窒素下、室温で攪拌しながら、ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）に溶解した。固形の炭酸セシウム（３３０ｍｇ；１．０１ミリモル）を添加し、その懸濁液を、攪拌しながら、７０℃で２０時間加熱した。得た溶液を、２００ｍＬの水に投入し（ｐＨは６．６であった）、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。３０分間攪拌した後、その溶液を限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、０．２７ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：２８％モル／モル。
【０１２１】
例４７：ＨＡ−リシノプリル（Ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ）の調製
例２０で調製したＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩（５００ｍｇ；０．８０ミリモル）及びリシノプリル（８８７ｍｇ；２．０１ミリモル）を、窒素下、室温で攪拌しながら、ＤＭＳＯ（２５ｍＬ）に溶解した。固形の炭酸セシウム（６５５ｍｇ；２．０１ミリモル）を添加し、その懸濁液を、攪拌しながら、７０℃で２０時間加熱した。得た溶液を、２００ｍＬの水に投入し（ｐＨは６．５であった）、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。３０分間攪拌した後、その混合物を濾過し、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、０．２０ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：２６％モル／モル。
【０１２２】
例４８：ＨＡ−ナリジキセート（Ｎａｌｉｄｉｘａｔｅ）の調製
例２０で調製したＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩（５００ｍｇ；０．８０ミリモル）及びナリジクス酸（４６７ｍｇ；２．０１ミリモル）を、窒素下、室温で攪拌しながら、ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）に溶解した。固形の炭酸セシウム（３３０ｍｇ；１．０１ミリモル）を添加し、その懸濁液を、攪拌しながら、７０℃で２０時間加熱した。得た溶液を、２００ｍＬの水に投入し（ｐＨは６．６であった）、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。３０分間攪拌した後、溶液を限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、０．２６ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：３０％モル／モル。
【０１２３】
例４９：ＨＡ−ペニシリンＧの調製
例２０で調製したＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩（４００ｍｇ；０．６４ミリモル）、１８−クラウン−６（３３８ｍｇ；１．２８ミリモル）及びペニシリンＧナトリウム塩（５７４ｍｇ；１．６１ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１６ｍＬ）の溶液を、攪拌しながら、７０℃で２０時間加熱した。
【０１２４】
得た黄色の溶液を、１５０ｍＬの水に投入し（ｐＨは６．５であった）、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。３０分間攪拌した後、溶液を限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、０．２７ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：３１％モル／モル。
【０１２５】
例５０：ＨＡ−セファゾリンの調製
例２０で調製したＨＡ−Ｍｓ：ＴＢＡ塩（４００ｍｇ；０．６４ミリモル）、１８−クラウン−６（３３８ｍｇ；１．２８ミリモル）及びセファゾリンナトリウム塩（７６７ｍｇ；１．６１ミリモル）を有するＤＭＳＯ（１８ｍＬ）の溶液を、攪拌しながら、７０℃で２０時間加熱した。
【０１２６】
得た黄色の溶液を、１８０ｍＬの水に投入し（ｐＨは６．７であった）、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。３０分間攪拌した後、溶液を限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、０．２５ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるＤＳ：２９％モル／モル。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１ａ】ＤＤＳｓの式を示し：ＨＡ−６−メトトレキサート、ＨＡ−６−イブプロフェン、又はＨＡ−６−ＰｅｎＧを示す。
【図１ｂ】ＤＤＳｓの式を示し：ＨＡ−６−メトトレキサート、ＨＡ−６−イブプロフェン、又はＨＡ−６−ＰｅｎＧを示す。
【図１ｃ】ＤＤＳｓの式を示し：ＨＡ−６−メトトレキサート、ＨＡ−６−イブプロフェン、又はＨＡ−６−ＰｅｎＧを示す。
【図２】例９で得たＨＡ−６−ＯＭｓのＤＯＳＹ  ＮＭＲのスペクトルを示し、ＤＯＳＹにおいて、加算した単次元のＮＭＲスペクトルでは、剛体巨大分子（ｒｉｇｉｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）のみが存在しており、このことは、ポリマーの化学修飾が行われたことを示す事実である）。
【図３】ＨＡ−６−ＯＭｓの１３Ｃ  ＮＭＲを示し、そのピークは、塩化したＤＩＥＡが存在する。
【図４】例２４で得たＨＡ−６−ＭＴＸのＤＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】例２４で得たＨＡ−６−ＭＴＸの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】例２６で得たＨＡ−イブプロフェンのＤＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】例２６で得たＨＡ−イブプロフェンの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図８】例２９で得たＨＡ−ペニシリンＧのＤＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１ａ】
2009524624.tif 000005
【図１ｂ】
2009524624.tif 000006
【図１ｃ】
2009524624.tif 000007
【図２】
2009524624.tif 000008
【図３】
2009524624.tif 000009
【図４】
2009524624.tif 000010
【図５】
2009524624.tif 000011
【図６】
2009524624.tif 000012
【図７】
2009524624.tif 000013
【図８】
2009524624.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月24日(2008.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸と、治療活性剤とからなる薬物送達システムであって、
該活性剤は、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基のＣ−６位において、共有結合されており、該活性剤は、下記式（Ｉ）の化合物を除き、
【化１】
2009524624.tif 000015
ここで：
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立に、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、Ｃ１−Ｃ５のアルキル、＝Ｏを示し；Ｘ及びＹは、−Ｃ（Ｒ５）＝、−ＣＨ（Ｒ５）−、−ＮＨ−、−Ｎ＝を示し、ここで、Ｒ５は、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ５のアルキルを示し、Ｚは、−ＣＨ（Ｒ１０）−、−Ｎ（Ｒ１０）−、−Ｏ−を示し、Ｒ１０は、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ５のアルキル、Ｃ１−Ｃ５のアルケニル、Ｃ１−Ｃ５のアルキニル、窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択された１〜３個のヘテロ原子を有する５員又は６員の複素環を示し、Ａｒは、１，４−フェニル基、１つ以上の５員又は６員の芳香族環と縮合した１，４−フェニル基、１つ以上の５員又は６員の複素環と縮合した１，４−フェニル基を示し、このＡｒは、Ｒ２で可能に置換され、環Ａ及びｂは、互いに独立に、芳香族環又は非芳香族環であってもよく、
当該薬物送達システムにおいて、ヒアルロン酸のいずれの水酸基も、薬物との化学結合に関与していないことを特徴とする薬物送達システム。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸と前記の活性剤との間の結合は、エステル、アミノ、エーテル、チオエーテル、アミド、好ましくはエステルであることを特徴とする請求項１に記載のＤＤＳ。
【請求項３】
前記治療活性剤は、鎮痛剤、降圧剤、麻酔剤、利尿剤、気管支拡張剤、カルシウムチャネルブロッカー、コリン作動剤、エストロゲン、免疫刺激剤、免疫抑制剤、脂肪親和剤、抗不安剤、抗潰瘍剤、抗不整脈剤、抗狭心剤、抗生物質、抗炎症剤、抗ウィルス剤、抗塞栓剤、血管拡張剤、解熱剤、抗うつ剤、抗精神病剤、抗腫瘍剤、粘液溶解剤、麻薬拮抗剤、鎮痙剤、抗ヒスタミン剤、抗真菌剤、乾癬治療薬（好ましくは、抗炎症剤、抗生物質、抗腫瘍剤）の複数の異なる治療分野に属する薬物から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＤＳ。
【請求項４】
前記の活性剤は、ＤＤＳの全重量に対して、０．１〜６０％ｗ／ｗ（好ましくは１〜５０％）の量を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸の第二水酸基は、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ２Ｈ、−ＯＰＯ３Ｈ２、−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯＲからなる基であって、ｎが１〜４であり、ＲがＣ１〜Ｃ１０のアルキル、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３である基を形成するように誘導体化されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項６】
酸の形態、又はアルカリ金属、アルカリ土類金属若しくは遷移金属で塩化されていることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項７】
医薬の調製のための請求項１乃至６のいずれか一項に記載の薬物送達システムの使用。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の薬物送達システムを含有し、医薬的に許容し得る賦形剤及び／又は希釈剤の混合物であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
注入可能な形態であることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の薬物送達システムの調製方法であって：
（ａ）塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位にスルフォネート基を導入して、ＨＡ−６−硫化物を得るステップと；
（ｂ）ＨＡのＣ６位のスルフォネート基を、治療活性剤に存在する求核基と置き換えることにより、ＨＡ−６−硫化物のＣ６位と、治療活性剤との間の化学結合を形成して、ＨＡ−６−活性剤を得るステップと；
（ｃ）ＨＡ−６−活性剤を回収するステップと；
を有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記ヒアルロン酸と前記の活性剤との間の結合は、エステル、アミノ、エーテル、チオエーテル、アミドであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒアルロン酸と前記の活性剤との間の結合は、エステルであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
スルフォネート基を導入するのに用いる試薬は、有機塩基又は無機塩基、好ましくは有機塩基の存在下でのアルキル又はアリールスルフォニルハライド、好ましくは塩化物であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬は、メチルスルフォニルクロライド又はトルエン−ｐ−スルフォニルクロライドであり、
前記有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒアルロン酸と式（Ｉ）の化合物とからなる薬物送達システムであって、
【化２】
2009524624.tif 000016
式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基は、エステル結合により、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ−６位に共有結合され、
当該ＤＤＳは、ヒアルロン酸単位の第一及び第二位置のいずれにも残存する離脱基を有さず、
当該ＤＤＳは：
（ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位に、スルフォネート基、ホスホネート基（トリフェニルホスホネート基）、シアン化物（ＣＮ−）、窒化物（ＮＯ２−）、サルフェート基、ハロゲンサルフェート基（好ましくはクロロサルフェート基）、硝酸塩、ハロゲンサルファイト（クロロサルファイト）からなる群から選択される離脱基を導入して、ＨＡ−６−活性体を得るステップと；
（ｂ）（ＨＡのＣ６位の）離脱基を、式（Ｉ）の化合物に存在するカルボキシル基と置き換えることにより、ＨＡ−６−活性体のＣ６位と、式（Ｉ）の化合物との間のエステル結合を形成して、ＨＡ−６−式（Ｉ）の化合物を得るステップと；
（ｃ）ＨＡ−６−式（Ｉ）の化合物を回収するステップと；
を有する方法により得られることを特徴とする薬物送達システム。
【請求項１６】
１〜５０％、好ましくは５〜４０％のＣ６−ＤＳｗを有することを特徴とする請求項１５に記載のＤＤＳ。
【請求項１７】
式（Ｉ）の化合物は、メトトレキサートであることを特徴とする請求項１５又は１６に記載のＤＤＳ。
【請求項１８】
ステップ（ａ）から得たＨＡ−６−活性体は、反応混合物から単離され、その後、ステップ（ｂ）に従って、治療活性剤と反応されることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項１９】
前記ステップ（ｂ）は、ＨＡ−６−活性体を含有するステップ（ａ）の反応混合物に対して直接実行されることを特徴とする請求項１５乃至１８のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項２０】
スルフォネート基を導入するのに用いる試薬は、有機塩基又は無機塩基、好ましくは有機塩基の存在下でのアルキル又はアリールスルフォニルハライド、好ましくは塩化物であることを特徴とする請求項１５乃至１９のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項２１】
前記試薬は、メチルスルフォニルクロライド又はトルエン−ｐ−スルフォニルクロライドであり、
前記有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンであることを特徴とする請求項２０に記載のＤＤＳ。
【請求項２２】
医薬の製造への、請求項１５乃至２１のいずれか一項に記載のＤＤＳの使用。
【請求項２３】
請求項１５乃至２１のいずれか一項に記載の薬物送達システムを含有し、医薬的に許容し得る賦形剤及び／又は希釈剤の混合物であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２４】
注入可能な形態であることを特徴とする請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単位のＣ−６位に、スルフォネート基、ホスホネート基（トリフェニルホスホネート基）、シアン化物（ＣＮ−）、窒化物（ＮＯ２−）、サルフェート基、ハロゲンサルフェート基（好ましくはクロロサルフェート基）、硝酸塩、ハロゲンサルファイト（クロロサルファイト）からなる群から選択される離脱基を導入して得られることを特徴とするＨＡ−６−活性体。
【請求項２６】
前記離脱基は、スルフォネート基であることを特徴とする請求項２５に記載のＨＡ−６−活性体。
【請求項２７】
１０〜９１％のＣ６−ＤＳｍｏｌを有することを特徴とする請求項２５又は２６に記載のＨＡ−６−活性体。
【請求項２８】
２０〜９０％のＣ６−ＤＳｍｏｌを有することを特徴とする請求項２５又は２６に記載のＨＡ−６−活性体。
【請求項２９】
４０〜８０％のＣ６−ＤＳｍｏｌを有することを特徴とする請求項２５又は２６に記載のＨＡ−６−活性体。
【国際調査報告】
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