(57)【要約】  本発明は、サンプルが炎症性関節炎を患っている個体由来であるか又は炎症性関節炎を患う危険のある個体由来であるかを判定する方法であって、前記サンプルについて、表A、表B又は表4の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを測定する工程及び前記発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法を提供する。さらに基準の非ヒト動物に比べて表A、表B又は表4の遺伝子の発現が変化している非ヒト動物モデル、並びにこのモデルの、関節炎モデルとしての使用又は関節炎モデルにおける使用を提供する。さらに滑膜線維芽細胞の表現型に効果を及ぼす化合物をスクリーニングするためのin vitroアッセイを提供する。滑膜線維芽細胞は、好ましくは炎症性関節炎を患っているヒト又は非ヒト動物由来である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物、(ポリ)ペプチド又は核酸分子若しくはその機能等価物が、炎症性関節炎を患っているか又はそれを患う危険のある個体又は非ヒト動物の滑膜線維芽細胞の表現型に影響を及ぼすかを判定する方法であって、前記個体又は非ヒト動物由来の発症した関節又は発症する危険のある関節から得たサンプル由来の滑膜線維芽細胞を前記化合物の存在下でin vitro培養する工程及び/又は前記滑膜線維芽細胞に前記核酸若しくは前記その機能等価物を供給する工程及び前記培養滑膜線維芽細胞の表現型が変化しているかを判定する工程を含む方法。
【請求項２】
前記滑膜線維芽細胞が、Tg197マウス、請求項44〜56のいずれか1項に記載の非ヒト動物及び/又は表5に示される遺伝モデルの遺伝子変化を含むマウスの関節から得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物、核酸又はその機能等価物が、細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための化合物である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が癌治療に有効である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が以下の化合物：サイトカラシンD、ファロイジン、ジャスプラキノリド、コンドラミド、ドロスタチン11、ラトランクリンA、スウィンホリドA、ミサキノリドA、ミカロリドB、シンクソリドC、スキトフィシン、ゴニオドミンA、プソイドプテロリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジル酸；の1つである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸がアンチセンス配列、好ましくはRNAi、siRNA、又はshRNAを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸又はその機能等価物がモルフォリノ、固定化核酸(LNA)又はペプチド核酸(PNA)を含む、請求項1〜3又は6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記アンチセンス配列が、表A、B、C、又は表4に列挙される遺伝子のアンチセンス配列であり、このとき前記遺伝子は、前記表のどれかで発現SF Up若しくはWJ Upによって同定されるか又は前記遺伝子がVASPである、請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
前記表現型が、前記滑膜線維芽細胞の接着、移住、増殖、創傷治癒及び/又はアポトーシスを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記表現型が、ストレスファイバー形成を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
高処理能力セッティングにおける、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸が表A、B、C、3又は4の遺伝子によって産生されるタンパク質をコードし、このとき前記遺伝子は前記表のどれかでSF down又はWJ downによって同定されるか又は前記遺伝子はゲルソリン若しくはADF/コフィリンである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
表A、B又はCのSF down及び/又はWJ downによって同定される遺伝子、表4の遺伝子、ゲルソリン又はADF/コフィリンのコード領域を含んでなる遺伝子送達ビヒクルの、関節の細胞に前記遺伝子を送達するための使用。
【請求項１４】
前記遺伝子を滑膜線維芽細胞、又は全関節の細胞に送達するための請求項13に記載の遺伝子送達ビヒクルの使用。
【請求項１５】
表A、B又はCのSF down又はWJ downによって同定される遺伝子、ゲルソリン又はコフィリンのコード領域を含んでなる遺伝子送達ビヒクルの、前記遺伝子を滑膜線維芽細胞(SF UP)及び/又は関節細胞(WJ UP)に送達するための組成物の調製のための使用。
【請求項１６】
炎症性関節炎の治療のための請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
前記遺伝子がゲルソリン、ADF/コフィリンである、請求項67〜70のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１８】
表A、B又はCのSF UP若しくはWJ UPよって同定される遺伝子又はVASPのアンチセンス配列を含むか、又はそのための発現カセットを含む核酸若しくはその機能等価物を含んでなる遺伝子送達ビヒクルの、前記核酸若しくはその機能等価物を滑膜線維芽細胞(SF UP)又は関節細胞(WJ UP)に送達するための使用。
【請求項１９】
前記アンチセンス配列がshRNA、RNAi及び/又はsiRNAを含む、請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
前記遺伝子送達ビヒクルがリポソーム、又はウイルスベクターを含む、請求項13〜19のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２１】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
前記遺伝子送達ビヒクルが全身投与される、請求項19〜21のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２３】
前記遺伝子送達ビヒクルが関節内投与される、請求項19〜21のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２４】
前記発現カセットがpol IIプロモーター又はpol IIIプロモーターによって推進される、請求項13〜23のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２５】
サンプルが炎症性関節炎を患っている個体由来であるか又は炎症性関節炎を患う危険のある個体由来であるかを判定する方法であって、前記サンプルについて、表A、表B、又は表4の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを測定する工程及び前記発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法。
【請求項２６】
前記遺伝子産物がRNAを含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルが前記個体の関節由来である、請求項25又は26に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプルが滑膜又は滑液の細胞を含む、請求項25〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記測定工程が前記サンプルの細胞内である、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも2つの遺伝子産物を測定する、請求項25〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも1つの遺伝子産物が表A、及び/又は表4の遺伝子の遺伝子産物である、請求項25〜30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも1つの遺伝子産物が表A、表B、及び/又は表4の遺伝子の遺伝子産物であり、かつ少なくとも1つの他の遺伝子産物が表Cの遺伝子の遺伝子産物である、請求項25〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも1つの遺伝子産物が表A、又は表4の遺伝子の遺伝子産物であり、かつ少なくとも1つの他の遺伝子産物が表B又はCの遺伝子の遺伝子産物である、請求項25〜32のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
サンプルが炎症性関節炎を患っている個体由来であるか又はそれを患う危険のある個体由来であるかを判定する方法であって、前記サンプル由来の細胞中の、細胞骨格の配置に関与する遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを測定する工程及び前記発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法。
【請求項３５】
前記遺伝子が滑膜線維芽細胞内の細胞骨格の配置に関与する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記遺伝子が前記細胞骨格への細胞外又は細胞内シグナル伝達に関与する、請求項34又は35に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子がアクチン細胞骨格の結合及び/又は再編成に関与する、請求項34〜36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
前記遺伝子が以下の遺伝子：チューブリンα1、RAB14、ゲルソリン、膜関連ホスファチジルイノシトール、マトリックスメタロプロテイナーゼ3、マトリックスメタロプロテイナーゼ13、マトリックスメタロプロテイナーゼ13の組織インヒビター、カテプシンS、マトリックスγ-カルボキシルグルタメート、インテグリンαX、ミオシン軽鎖、トロポニンT1骨格スロー、トロポニンI骨格ファースト2、VASP、ADF/コフィリン；のいずれか1つの遺伝子及び/又は表4の遺伝子である、請求項34〜37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
前記炎症性関節炎がリウマチ性関節炎である、請求項25〜38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための化合物の、個体の炎症性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減するための薬物製造のための使用。
【請求項４１】
細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための化合物の、滑膜細胞内のストレスファイバーを減らすための使用。
【請求項４２】
前記化合物が癌の治療用薬物である、請求項40又は41に記載の使用。
【請求項４３】
前記化合物が以下の化合物：サイトカラシンD、ファロイジン、ジャスプラキノリド、コンドラミド、ドロスタチン11、ラトランクリンA、スウィンホリドA、ミサキノリドA、ミカロリドB、シンクソリドC、スキトフィシン、ゴニオドミンA、プソイドプテロリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジル酸；の1つである、請求項40〜42のいずれか1項に記載の使用。
【請求項４４】
表A、表B、又は表4に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物。
【請求項４５】
表A、又は表4に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物。
【請求項４６】
表A、表B、又は表4に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現され、かつ表C又は表6に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物。
【請求項４７】
表A、又は表4に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現され、かつ表B、表C又は表6に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物。
【請求項４８】
細胞骨格の再編成に関与することが分かっている少なくとも1つの遺伝子がノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物。
【請求項４９】
前記細胞骨格の再編成が滑膜線維芽細胞内においてである、請求項48に記載の非ヒト動物。
【請求項５０】
前記遺伝子が前記細胞骨格への細胞外又は細胞内シグナル伝達に関与する、請求項48又は49に記載の非ヒト動物。
【請求項５１】
前記遺伝子がアクチン細胞骨格の結合及び/又は再編成に関与する、請求項48〜50のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
【請求項５２】
前記遺伝子が以下の遺伝子：チューブリンα1、RAB14、ゲルソリン、膜関連ホスファチジルイノシトール、マトリックスメタロプロテイナーゼ3、マトリックスメタロプロテイナーゼ13、マトリックスメタロプロテイナーゼ13の組織インヒビター、カテプシンS、マトリックスγ-カルボキシルグルタメート、インテグリンαX、ミオシン軽鎖、トロポニンT1骨格スロー、トロポニンI骨格ファースト2、VASP、ADF/コフィリン；のいずれか1つであり、及び/又は表4の遺伝子である、請求項48〜51のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
【請求項５３】
前記動物が、過剰発現又は不十分発現している前記遺伝子又はその相同体のトランスジェニック動物である、請求項44〜52のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
【請求項５４】
前記動物がマウス又はラットである、請求項44〜53のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
【請求項５５】
前記表A、表B、表3、表4又は表6に列挙される遺伝子の少なくとも1つが、関節炎の遺伝モデルにおいて、ノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている、請求項44〜54のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
【請求項５６】
前記遺伝モデルが、Tg197マウス又は表5に示される遺伝モデルの特異的な遺伝子修飾を含む、請求項55に記載の非ヒト動物。
【請求項５７】
請求項44〜56のいずれか1項に記載の非ヒト動物の、疾患モデルとしての使用。
【請求項５８】
前記疾患が炎症性関節炎、好ましくはリウマチ性関節炎である、請求項57に記載の使用。
【請求項５９】
前記炎症性関節炎及び/又はリウマチ性関節炎が誘発される、請求項58に記載の使用。
【請求項６０】
前記誘発が表5に示される誘発因子によって達成される、請求項59に記載の使用。
【請求項６１】
化合物が炎症性関節炎の症状の軽減に有効であるかを判定する方法であって、前記症状のモデルシステムで前記化合物を試験する工程を含み、前記化合物が細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための化合物であることを特徴とする方法。
【請求項６２】
前記化合物が癌治療に有効である、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物が以下の化合物：サイトカラシンD、ファロイジン、ジャスプラキノリド、コンドラミド、ドロスタチン11、ラトランクリンA、スウィンホリドA、ミサキノリドA、ミカロリドB、シンクソリドC、スキトフィシン、ゴニオドミンA、プソイドプテロリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジル酸；の1つである、請求項61又は62に記載の方法。
【請求項６４】
化合物が表A、表B、又は表4に列挙される1つ以上の遺伝子の発現に効果を及ぼすかを判定する方法であって、前記遺伝子が発現される環境内で前記化合物を試験する工程及び結果の発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法。
【請求項６５】
化合物が表A、又は表4に列挙される1つ以上の遺伝子の発現に効果を及ぼすかを判定する方法であって、前記遺伝子が発現される環境内で前記化合物を試験する工程及び結果の発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法。
【請求項６６】
化合物が表A、表B、又は表4に列挙される1つ以上の遺伝子の発現及び表Cに列挙される1つ以上の遺伝子の発現に効果を及ぼすかを判定する方法であって、前記遺伝子が発現される環境内で前記化合物を試験する工程及び結果の発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法。
【請求項６７】
化合物が表A、又は表4に列挙される1つ以上の遺伝子の発現及び表B又は表Cに列挙される1つ以上の遺伝子の発現に効果を及ぼすかを判定する方法であって、前記遺伝子が発現される環境内で前記化合物を試験する工程及び結果の発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法。
【請求項６８】
個体の炎症性及び/又はリウマチ性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減する方法であって、前記個体の細胞内における表A、表B、又は表4に列挙される遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程を含み、このとき前記遺伝子産物がタンパク質を含む、前記方法。
【請求項７０】
個体の炎症性及び/又はリウマチ性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減するための薬物製造のための化合物の使用であって、前記化合物が表A、表B、又は表4に列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列を含んでなる、前記使用。
【請求項７１】
前記遺伝子が前記表のどれかで発現SF Up若しくはWJ Upによって同定されるか又は前記遺伝子がVASPである、請求項70に記載の使用。
【請求項７２】
前記化合物が表A、又は表4に列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列を含む、請求項70又は71に記載の使用。
【請求項７３】
前記化合物が表A又は表Bに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列及び表Cに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列を含む、請求項70〜72のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７４】
前記化合物が表Aに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列及び表B又は表Cに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列を含む、請求項70〜73のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７５】
表A、表B、又は表4の遺伝子によってコードされるタンパク質の、炎症性及び/又はリウマチ性関節炎の治療のための候補薬物を選択するための薬物標的としての使用。
【請求項７６】
前記タンパク質が表Aの遺伝子によってコードされる、請求項75に記載の使用。
【請求項７７】
表A又は表Bの遺伝子によってコードされる第1のタンパク質を第1の薬物標的として使用し、かつ表Cの遺伝子によってコードされる第2のタンパク質を第2の薬物標的として使用する、請求項75又は76に記載の使用。
【請求項７８】
表Aの遺伝子によってコードされる第1のタンパク質を第1の薬物標的として使用し、かつ表B又は表Cの遺伝子によってコードされる第2のタンパク質を第2の薬物標的として使用する、請求項75〜77のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７９】
前記遺伝子が前記表のどれかで発現SF Up若しくはWJ Upによって同定されるか又は前記遺伝子がVASPである、請求項75〜78のいずれか1項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、分子診断学及び/又は医学の分野に関する。本発明は、特に関節炎における遺伝子及び/又はプロセスの調節解除に関する。本発明は、この調節解除をいくつかの手段で利用する。
本発明はリウマチ性関節炎(RA)によって例示されるが、本発明はこの疾患に限定されるものではなく、すべての炎症性関節炎疾患に適用可能である。RAは全人口の1〜3%に発症する慢性破壊的関節障害である。RAは人的、社会的及び経済的損失を与える。RAは関節の持続性炎症によって特徴づけられ、最終的に軟骨及び骨の破壊につながる。炎症は初めに、可動関節を裏打ちする滑膜細胞の単層である滑膜表層内に局在化する。RAでは、滑膜細胞の増殖及び炎症性細胞による炎症のため、滑膜表層が顕著に厚くなる。この増殖性腫瘤、パンヌスが関節の軟骨及び骨に侵入して破壊し、関節の構造と機能の不可逆的な破壊をもたらす[1]。RAの現在の療法は、主に非ステロイド性抗炎症薬及び/又は疾患改変抗リウマチ薬による対症療法に依存している。しかし、利用可能な最良の治療(ターゲティングTNF及びTNFシグナリングのような)でさえ該疾患を治癒せず、大多数の患者の進行を遅延させることさえ不十分であり、さらに前記治療は有害な副作用を示すことが多い[2]。
【０００２】
極度の努力にもかかわらず、RAの病因及び病原は十分に理解されていない。RAに対する伝統的なパラダイムによれば、滑膜炎症の惹起及び永続化に寄与する種々の機序が関係すると見なされてきた。例えば、自己抗体及び免疫複合体、T-細胞媒介抗原特異性反応、サイトカインネットワーク及び他の炎症誘発性分子の持続性、遺伝的偏り及び性的素因、並びに関節滑膜の増殖性挙動が挙げられる[3]。RAの動物モデルはヒト疾患と多くの臨床的特徴を共有するので、疾患の活性化と永続化を支配する病原機序の解読に有用な手段を構成する[4]。そのうち、TNF-Tgマウス[5]は、この疾患の発症におけるTNFの役割の実証に役に立ち、かつ該疾患の効率的な管理を変える抗-TNF療法の導入と成功の徴候を示した[6]。このモデルでは、慢性のヒトTNFの過剰発現が慢性侵食性対称性多発関節炎をもたらし、100%の表現型浸透度、好機を失わない発症及び進行性の組織学的症状を有し、ヒトRAと密接に似ている[5〜7]。
【０００３】
ヒトゲノムプロジェクトの完成及び機能ゲノミクスと高処理能力技術の出現がRAの病因学への研究の新しい可能性を提供する。その中で、発現プロファイリングは、数千の遺伝子の発現レベルの同時定量化によって疾患状態の分子フィンガープリントを作成する。同様に、逆遺伝学(特定遺伝子の機能の検索における該遺伝子の遺伝的修飾)は、病原機序のin vivo精査に有用な手段である疾患の動物モデルの作成を斟酌する。
発現プロファイリング、すなわち同時の数千の遺伝子の発現レベルの相対的定量化は、分化、発生及び疾患の機序を理解するためのアプローチである。しかし、使用するサンプルが少ないと有意に統計解析を制限し、かつRAのような多遺伝子性疾患に妥当であろう偽発見率方法論及び多変量技術の使用を不可能にする。現状では、発現プロファイリングの結果は独立した生物学的方法で確認する必要があり、いずれの所定アプローチの高処理能力特性及び発見率も大いに低減する。
【０００４】
これらの問題を克服するため、一局面の本発明は、サブトラクティブcDNAライブラリー及びオリゴヌクレオチドDNAマイクロアレイハイブリダイゼーションで構成される新規な双高処理能力アプローチを提供する。両方法論は、実験装備のため、異なる束縛：ライブラリーのためのランダムな機会、マイクロアレイのためのロボット工学のクローン選択とチップデザイン；によって支配される。結果として、両方法論は異なる独立した統計解析を採用し、エラーの伝搬に対して完全に無相関であり、かつ概念的に完全に異なった偽発見率を有する。この結果として、両方法論の統計的に有意な調節が解除された遺伝子リストの共通部分は非常に低い偽発見率（発見誤認率）を有する。このことを実証するため及び双高処理能力アプローチの有効性を示すため、共通に選択されたリストからのいくつかの代表的な遺伝子をいくつかの異なる方法、例えば自動文献検索、マウスとヒトの両サンプルでの半定量的及び定量的RT-PCRで確認した。このようにして2つの異なる高処理能力アプローチの結合について独立した確認を行うことは不要であることが実証されたが、併せて行ってもよいことは当然である。結果として、調節が解除されたと思われる遺伝子の数は増える。従って、一実施形態では、本発明は障害に関与する遺伝子の同定方法であって、個体のサンプルについてサブトラクティブcDNAライブラリー方法論とオリゴヌクレオチドDNAマイクロアレイハイブリダイゼーション方法論を別々に行ってから（任意に、別の高処理能力発現プロファイリング方法論を行ってもよい）、前記方法論の結果の共通部分を解釈することを含む方法を提供する。
【０００５】
生成された調節が解除された遺伝子リストをなおさらに確証するため、並びにRAの2つの異なる動物モデルを橋わたしするため、本発明の発現プロファイリングを遺伝的連鎖解析と併用した。すべての差次的に発現した遺伝子が、関節炎の誘発動物モデル、コラーゲン誘発関節炎(Collagen Induced Arthritis(CIA))で既知のQTLと共に染色体にマッピングされた[14]。CIA QTL(図1；WJ：Ctss、Pitpnm、Ncf1、Psmb8、Siat8e、SF：Rab14、Aqp1、及びGsn)に8個の調節が解除された遺伝子が認められ、これらの遺伝子が、誘発性刺激(自己免疫又は炎症性)に無関係な関節炎のプロセスにおける主要な影響を有するという結論をもたらす。興味深いことに、染色体(4、7、10、11及び13)の隣接領域に該遺伝子のいくつかが一緒に集団を形成している。これらの遺伝子座は新しいQTLを定義し、或いはクロマチンレベルでの共通の調整制御を示すことができるだろう。
【０００６】
調節が解除された遺伝子は、健康な個体由来の「正常な細胞」と比べた場合、より低レベル又はより高レベルでその1つ以上の遺伝子産物(又はその酵素活性)を発現する。この変化した発現を用いてサンプルを綿密に検査し、サンプルが炎症性関節炎(IA)を患っている個体由来であるか又はIAを患う危険のある個体由来であるかを判定することができる。従って、本発明は、サンプルが炎症性関節炎を患っている個体由来であるか又は炎症性関節炎を患う危険のある個体由来であるかを判定する方法であって、前記サンプルについて、表A、表B、又は表4の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベル又は酵素活性を測定する工程及び前記発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法を提供する。言及した表は、IAにおいて、前記遺伝子産物の発現又は酵素活性が「正常」より高いか又は「正常」より低いかどうかを示す。従って、少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベル又は酵素活性を測定し、かつそれを基準値と比較することによって、該サンプルがIAを患っているか又はIAを患う危険のある個体由来であるか、或いはIAを患っていないか又はIAを患う危険がない個体由来であると同定することができる。このやり方で、前記遺伝子の1つの遺伝子産物の発現又はその酵素活性を解析することによってサンプルを同定することができる。この場合、発現レベル又は酵素活性が表A、B、3、4及び/又はCで与えられている指示方向に少なくとも1.5の係数で変化しているとき、サンプルがIAを患っているか又は患う危険のある個体由来であると同定される。本発明の文脈では、前記遺伝子の遺伝子産物の発現レベル又は酵素活性が表A、B、3、4及び/又はCで与えられている指示方向に少なくとも1.5の係数で変化しているとき、遺伝子は「調節が解除された」と言われる。表A、表B、表3又は表4の1つより多くの遺伝子の遺伝子産物の発現レベル又は酵素活性を判定すると、該サンプルの発現レベルのパターンを基準のパターンと比較できるので診断方法の精度が増す。この場合、発現レベル又は酵素活性のパターンが、IAを患っているか又は患う危険のある個体由来の基準のパターンとマッチするとき、サンプルがIAを患っているか又は患う危険のある個体由来であると同定される。或いはこれとは別に、パターンが基準のパターンとマッチするとき、正常と同定される。本発明で使用する場合、基準は好ましくは関節炎サンプル由来であるが、正常サンプルを使用することもできる。好ましくは、基準は少なくとも関節炎サンプル由来であり、また正常サンプル由来の基準である。発現レベルのパターンを解析するための統計法は技術上利用可能である。本発明で有利に利用できる、発現プロファイルの類似性を判定するための非限定的な統計法は、Rosetta Error Model (Hughes TR, Marton MJ, Jones AR et al. Functional discovery via a compendium of expression profiles. Cell. 2000;102:109-126)を参考にする。実用的事例は、WO 02/103320Aの6ページの3行目〜7ページの19行目に記載されている。
【０００７】
当然、遺伝子産物の発現レベル又は酵素活性を判定する遺伝子セットを拡大することができる。好ましい実施形態では、表A、表B、又は表4の少なくとも2つ、さらに好ましくは少なくとも5つの遺伝子の遺伝子産物の発現レベルを解析する。前記5つの遺伝子の解析は、IAの非存在又は存在との良い相関関係を提供する。表A又は表Bの遺伝子の解析数を増やすと、さらに前記相関関係を高める。従って、特に好ましい実施形態では、表A、B、又は4の少なくとも10個の遺伝子の遺伝子産物又は酵素活性を解析する。好ましい実施形態では、少なくとも1つの遺伝子産物又は酵素活性は表Aの遺伝子のものであり、かつ少なくとも1つの他の遺伝子産物又は酵素活性は表B若しくはCの遺伝子のものである。特に好ましい実施形態では、前記1つ以上、前記少なくとも2つ、前記少なくとも5つ又は前記少なくとも10個の遺伝子は表Aの遺伝子であり、任意に表B又は表Cの1つ以上の遺伝子の遺伝子産物又は酵素活性で補充してよい。述べたように、解析する遺伝子セットを他の遺伝子、好ましくはIAで調節が解除されるとして知られている遺伝子に拡張してよい。従って、好ましい実施形態では、前記解析は表Cの少なくとも1つの遺伝子の遺伝子産物の解析を含む。関節炎サンプルにおいて発現が影響を受ける方向は、表A、B及びCに示されている(SF UP、SF down、WJ up、WJ down、ここで、SFは発現が滑膜線維芽細胞について示されることを意味し、WJは発現が全関節細胞について示されることを意味する)。
【０００８】
遺伝子はいくつかの異なる遺伝子産物を有しうる。典型的に、必ずではないが、遺伝子はmRNA内で転写され、順次タンパク質に翻訳される。遺伝子はいくつかのmRNA内で転写されることがあり、順次いくつかのタンパク質に翻訳されうる。本明細書では、用語「遺伝子産物」は、RNA及びタンパク質産物の両者を包含する。好ましい実施形態では、本発明の方法の遺伝子産物はRNAを含む。RNAの発現レベルは典型的に、前記RNAと特異的にハイブリダイズするプローブ(ノーザンブロット)及び/又は前記RNAに特異的にアニールする1セットのプライマー(リアルタイムRT-PCR)で判定される。タンパク質の発現レベルは典型的に該遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体で直接判定され、或いは関心のあるタンパク質の酵素的/触媒的活性によって間接的に判定される。現在、多くの異なる種類のプローブが技術的に知られている。多くの場合、プローブは核酸である。しかし、当業者は、本質的に(必ずしも総計でないが)同じ結合特異性を有する代替物を利用でき、このような代替物として、限定するものではないが、ペプチド核酸(PNA)が挙げられる。同様に、多くの異なる特異性結合体が利用できる。古くから、抗体が使用されている。しかし、現在は、抗体の多くの異なる部分、誘導体及び/又は類似体が使われている。このような部分、誘導体及び/又は類似体の非限定例は、単鎖Fv-フラグメント、モノボディ、VHH、Fab-フラグメント等である。このような特異性結合体の共通因子は、アフィニティー領域(結合ペプチド)の存在である。この領域は、該結合ペプチドを提示するために適切な構造を与える構造体上に存在する。結合ペプチドは典型的に抗体のCDR配列(典型的にCDR3配列)由来であるか又は該CDR配列に類似するが、その構造供給体は典型的に抗体のフレームワーク領域由来であるか又は該フレームワーク領域に類似する。適切なプローブ及び特異性結合体の精査のため、以下のいずれかの参考文献を参照されたい：
Diagnosing early-onset rheumatoid arthritis: the role of anti-CCP antibodies, Vasishta A, Am Clin Lab. 2002 Aug-Sep;21(7):34-6; Keys to unlocking the mysteries of rheumatic autoimmune disease, Moser KL, Gaffney P, Peterson E, Behrens T, Minn Med. 2004 May;87(5):46-51; A new tool for rheumatology: large-scale analysis of gene expression Lequerre T, Coulouarn C, Derambure C, Lefebvre G, Vittecoq O, Daveau M, Salier JP, Le Loet X, Joint Bone Spine, 2003 Aug;70(4):248-56
【０００９】
種々の機序の結果として遺伝子産物の発現レベルは変化しうる。これには、限定するものではないが、転写/翻訳レベルの変化、安定性の変化、タンパク質及び/又はRNAの分解の変化が挙げられる。細胞内プロセスの組合せの結果としても発現レベルは変化しうる。解析すべきサンプルは典型的にIAを患っていると疑われる個体又はIAを患う危険があると疑われる個体由来である。サンプルは、関節鏡検査中に単離した滑膜若しくは滑液、及び/又は前記個体の血液から単離した血清でよい。
【００１０】
個体は典型的にヒトであるが、関心のある遺伝子の発現レベル又は酵素活性を動物モデルで判定して薬効を判定することができる。従って、個体は好ましくは哺乳動物、好ましくはげっ歯類又は霊長類である。さらに好ましくはヒトである。
本発明の特定分類の調節が解除された遺伝子は、細胞骨格の配置と関係がある。従って、一局面の本発明は、サンプルが炎症性関節炎、好ましくはリウマチ性関節炎を患っている個体又はそれを患う危険のある個体由来であるかを判定する方法であって、前記サンプル中の、細胞骨格の配置に関与する遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを測定する工程及び前記発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
細胞内の細胞骨格の配置は、細胞骨格の構築及び組織化と関係がある構造プロセスと、該構造プロセスを指揮する細胞内のシグナル伝達機構との両者を含む。構築は、細胞骨格の増加と損失の両方を含む。組織化は典型的に細胞の明白な三次元の出現を含む。細胞骨格の組織化に関与するシグナル伝達機構は細胞外成分と細胞内成分を有するので、好ましい実施形態では、前記遺伝子は、細胞骨格への上流/下流の細胞外又は細胞内のシグナル伝達に関与する。本発明の好ましい実施形態では、特にアクチン細胞骨格の構築に関与する遺伝子の調節解除に関連する。従って、好ましい実施形態では、前記遺伝子はアクチン細胞骨格の結合及び/又は再編成に関与する。好ましい実施形態では、前記遺伝子は滑膜線維芽細胞内の細胞骨格の配置に関与する。特に好ましい実施形態では、前記遺伝子は以下のいずれかの遺伝子である：チューブリンα1、RAB14、ゲルソリン、膜関連ホスファチジルイノシトール、マトリックスメタロプロテイナーゼ3、マトリックスメタロプロテイナーゼ13、マトリックスメタロプロテイナーゼ13の組織インヒビター、カテプシンS、マトリックスγ-カルボキシルグルタメート、インテグリンαX、ミオシン軽鎖、トロポニンT1骨格スロー、トロポニンI骨格ファースト2、VASP、ゲソリン(Gesolin)及び/又は表4。少なくとも前記サンプルの細胞骨格の配置に関与する遺伝子の前記遺伝子産物の発現レベルに前記基準値と少なくとも1.5の差異があるとき、個体は炎症性関節炎を患っている。好ましくは、前記方法は、前記サンプル中の、細胞骨格の配置に関与する少なくとも2つの前記遺伝子の遺伝子産物の発現レベルを測定する工程及び前記発現レベルを基準値と比較する工程を含む。特に好ましい実施形態では、細胞骨格の配置に関与する少なくとも5つの前記遺伝子の遺伝子産物の発現レベルを測定して基準値と比較する。
【００１２】
本発明の方法により、少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベル又は酵素活性を測定してそれを基準値と比較すると同時に、前記発現レベルと前記基準レベルとの間の差異の大きさを判定することができる。一実施形態では、前記発現レベルと前記基準値との差異の大きさが、前記炎症性関節炎が存在する場合の程度として規範的である、本発明の方法が提供される。本明細書では、差異の大きさは測定値と基準値との少なくとも有意な差異を含む。例えば、蛍光強度を測定することによって差異の大きさを決定することができる。前記発現レベルと前記基準値との差異は、炎症性関節炎が存在する程度を確認するという点で規範的である。炎症性関節炎が存在する程度は、個体においてIAが達したIAの段階でよく、及び/又は前記程度は個体においてIAの重症度の測定でよい。
【００１３】
遺伝子の調節解除は多くの種々の疾患で起こるプロセスである。当該各疾患は、前記疾患において調節が解除される特徴的な遺伝子又は複数の遺伝子を有する。IAはこのような疾患である。IAは特有の型の関節炎を包含する一般用語である。特有の型の関節炎は典型的に調節が解除される種々の特徴的な遺伝子と関連する。遺伝子の調節解除は遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの変化、ひいては遺伝子産物の量の変化又は遺伝子産物の組成の変化をもたらすだろう。一実施形態では、本発明は、個体の炎症性関節炎の型を決めるため、表A、表B、又は表4の遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの使用を提供する。好ましい実施形態では、表A、表B、又は表4の少なくとも2つ、さらに好ましくは少なくとも5つの遺伝子の遺伝子産物の発現レベルを解析する。解析する表A、表B、又は表4の遺伝子数を増やすと、関連するIAの型につての確実性がさらに増す。従って、特に好ましい実施形態では、表A、表B、又は表4の少なくとも10個の遺伝子の遺伝子産物を解析する。別の好ましい実施形態では、表Aの遺伝子の遺伝子産物を解析する。さらに好ましい実施形態では、表Aの少なくとも2つ、さらに好ましくは少なくとも5つの遺伝子の遺伝子産物を解析する。特に好ましい実施形態では、表Aの少なくとも10個の遺伝子の遺伝子産物を解析する。試験遺伝子の発現レベルが表A、B又はCに示される方向に変化する場合、サンプルはIAを患っているか又は患う危険がある個体又は非ヒト動物由来であると型決定される(IAの滑膜線維芽細胞で過剰発現される遺伝子についてはSF UP、IAの前記細胞で不十分に発現される遺伝子についてはSF-down、IAの全関節細胞で過剰発現される遺伝子についてはWJ UP、IAの全関節細胞で不十分に発現される遺伝子についてはWJ down)。
【００１４】
炎症性関節炎にはいくつかの特有の関節炎状態が含まれ、限定するものではないが、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、若年性リウマチ性関節炎、再発性多発性軟骨炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、結晶沈着症、痛風軟骨石灰化、カルシウムヒドロキシアパタイト結晶沈着症が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明はリウマチ性関節炎(RA)に関する。従って、本発明が一般的に炎症性関節炎に言及する場合、好ましい適用はリウマチ性関節炎においてである。
【００１５】
本発明のIAの型決定は、測定値のパターンが個体の測定値より特異的であるとき、遺伝子産物の発現レベルのパターン(すなわち、表A、B及びCにおいて正常なSF UP、WJ upより高いか又は正常なSF down、WJ downより低い)を決定することを含む。従って、本発明は、前記型決定は、サンプル中の少なくとも2つの遺伝子の遺伝子産物の発現レベルのパターンを決定することを含み、かつ前記遺伝子の少なくとも1つが表A、表B、又は表4の遺伝子である、本発明の使用を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも1つの遺伝子産物が表Aの遺伝子の遺伝子産物であり、少なくとも1つの他の遺伝子産物が表B又はCの遺伝子の遺伝子産物である。特に好ましい実施形態では、前記1つ以上、前記少なくとも2つ、前記少なくとも5つ又は前記少なくとも10個の遺伝子が表Aの遺伝子であり、任意に表B又は表Cの1つ以上の遺伝子の遺伝子産物で補充されていてよい。述べたように、解析する遺伝子セットを他の遺伝子、好ましくはIAで調節が解除されることが分かっている遺伝子に拡張することができる。従って、好ましい実施形態では、前記解析は表Cの少なくとも1つの遺伝子の遺伝子産物の解析を含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、前記型決定が以下の型：リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、若年性リウマチ性関節炎、再発性多発性軟骨炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、結晶沈着症、痛風軟骨石灰化、カルシウムヒドロキシアパタイト結晶沈着症；の1つを指し示すことを含む、本発明の使用を提供する。本発明の特に好ましい実施形態では、前記型決定はリウマチ性関節炎を指し示すことを含む。本明細書では、一般用語「炎症性関節炎」に前記型の関節炎がすべて包含される。
【００１７】
本発明の一実施形態では、遺伝子及び/又は該遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現レベルが検出される。遺伝子産物の発現レベル又は遺伝子の酵素活性は、プローブ若しくはプローブセット又は適切な酵素アッセイによって判定される。従って、本発明はプローブ若しくは1セットのプローブ又は酵素アッセイを含んでなる部品のキットを提供する。ここで、前記プローブの少なくとも1つは表A、表B、又は表4に列挙される遺伝子の1つに特異的なプローブである。好ましくは1セットのプローブは表A、表B、又は表4に列挙される遺伝子の1つに特異的な2つ以上のプローブを含む。別の実施形態では、本発明は、プローブ又は1セットのプローブを含んでなり、前記プローブの少なくとも1つが表Aに列挙される遺伝子の1つに特異的なプローブである、本発明の部品のキットを提供する。本発明は、さらに、少なくとも2つのプローブを含んでなり、前記プローブの少なくとも1つが表A、表B、又は表4に列挙される遺伝子の1つに特異的なプローブであり、かつ前記プローブの少なくとも1つが表Cに列挙される遺伝子の1つに特異的ある、本発明の部品のキットを提供する。本発明により、少なくとも2つのプローブを含んでなり、前記プローブの少なくとも1つが表Aに列挙される遺伝子の1つに特異的なプローブであり、かつ前記プローブの少なくとも1つが表B又は表Cに列挙される遺伝子の1つに特異的ある、本発明の部品のキットも提供される。本発明のいずれのプローブセットも表A、B又はCに列挙されていない遺伝子に特異的なプローブを含んでよい。このようなプローブは、好ましくは炎症性関節炎に関与することが分かっている遺伝子、さらに好ましくはリウマチ性関節炎に関与することが分かっている遺伝子に特異的である。別の好ましい実施形態では、このようなプローブは細胞骨格の配置に関与することが分かっている遺伝子に特異的である。
【００１８】
本発明は、驚くべきことに、細胞骨格の配置と関係がある特定の遺伝子がIAにおいて調節が解除されることを見出した。その結果、本発明は療法の新規手段を提供する。ここに、一実施形態において、本発明は、細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための化合物の、個体の炎症性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減するための薬物製造のための使用を提供する。IAの個体は1つの症状又は複数の症状を呈しうる。少なくとも1つの症状を軽減すると、IAの個体の状態を良くし、それによって患者の生活の質が向上するだろう。疾患の症状を軽減すると言及する場合、これは症状の重症度を少なくとも減らすことを意味する。
【００１９】
リウマチ性関節炎は多遺伝子疾患である。従って、複数の遺伝子の研究は、1つの遺伝子に集中するよりもRAについて、より有益な情報を提供する。従って、本発明では、関連する遺伝子機能と細胞プロセスを研究して、RAの治療処置のために有益な手がかりを集め、その標的に優先順位をつけた。この文脈では、ジーンオントロジー協会(Gene Ontology Consortium)の制御された用語によって形式化されている通りに、調節が解除されたプロセスを判定した[17]。選択した遺伝子リストにおいてGO用語頻度を計算し、その統計的有意性を評価した。結果の表(補充表3)は、該疾患の病原(例えばコラーゲン異化、補体活性化、免疫応答及びストレス応答)についての蓄積された知識を包含するいくつかの作用を含む。さらに重要なことに、26の予測された調節が解除されたGO作用のうちの5つがアクチン細胞骨格に関連した(直接又は間接的)。実験的証拠を増やすため、F-アクチンストレスファイバー(stress fiber)を関節炎のみならずwtのSF(初生及び不死化の両方)についてin vitroで可視化した。図3aで明らかなように、関節炎のSFと正常なSFの間には著しい差異があり、関節炎のSFは顕著なストレスファイバーを示した。ストレスファイバーは、分化した線維芽細胞内で現われることが分かっている。これらの分化した線維芽細胞は筋線維芽細胞(myofibroblast)と呼ばれる。この筋線維芽細胞は固有収縮性線維芽細胞であり、創傷治癒及び病的拘縮中の張力の確立に重要な役割がある[21,22]。その結果、本発明は、関節炎の滑膜内の筋線維芽細胞の存在についての第1の直接的な指標を提供する。この概念と一致して、関節炎のSFはさらに顕著なFAKポジティブ島を有することが観察された(図示せず)。FAKポジティブ島は筋線維芽細胞の顕著な特徴である[22]。アクチン細胞骨格は、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン及び他のECM成分の細胞外結合部位を有する受容体(主にインテグリン)を介して二方向的にECMと相互作用する。細胞とECMとの密接した広範囲の接着的接触の形成は、接着系とアクチン細胞骨格との間の協力及び該細胞の領域を横切る力の生成に起因する[24]。この文脈では、筋線維芽細胞はその高い接着能によって該基体に高い張力を及ぼし、より平坦で伸長した細胞形状をもたらすと考えられる[22]。従って、我々は、in vitroで関節炎のSFが高いアフィニティーで種々のECM成分に接着し(図3b)、in vivoにおけるより伸長した形状をもたらすこと(図3c)を観察し、さらに関節炎の滑膜内における筋線維芽細胞の存在を確証した。
【００２０】
従って、本発明は、驚くべきことに、細胞内における細胞骨格の配置に関与する遺伝子の調節解除が関節炎のSFの顕著な特徴であることを見出した。その結果、新しい治療及び診断の入口が確立される。一実施形態では、本発明は滑膜細胞内のストレスファイバーを減らすため、細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための化合物の使用を提供する。
【００２１】
最近の実験は、細胞骨格が腫瘍形成で重要な役割を果たすことを示した[31]。癌における細胞骨格の役割は確立されているので、細胞骨格に向けられる化合物は癌の治療のために開発されている。一実施形態では、本発明は、細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための癌の治療用薬物の、個体の炎症性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減するための薬物製造のための使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための癌の治療用薬物の、滑膜細胞内におけるストレスファイバーを減らすためか又は炎症性関節炎の治療のための使用を提供する。細胞骨格に向けられる薬物の非限定例は以下の通りである：サイトカラシンD、ファロイジン、ジャスプラキノリド、コンドラミド(Chondramides)、ドロスタチン(Dolostatin)11、ラトランクリンA、スウィンホリド(Swinholide)A、ミサキノリド(Misakinolide)A、ミカロリド(Mycalolide)B、シンクソリド(Shinxolide)C、スキトフィシン(Scytophycins)、ゴニオドミン(Goniodomin)A、プソイドプテロリド(Pseudopterolide)、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジル酸。一実施形態では、本発明は、本発明の化合物の使用であって、前記化合物が以下の化合物の1つである使用を提供する：サイトカラシンD、ファロイジン、ジャスプラキノリド、コンドラミド、ドロスタチン11、ラトランクリンA、スウィンホリドA、ミサキノリドA、ミカロリドB、シンクソリドC、スキトフィシン、ゴニオドミンA、プソイドプテロリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジル酸。
【００２２】
RAの研究では多くの異なった動物モデルが使用される。動物モデルは典型的にRAの患者を表す。動物にRAを患っている個体を代表させるため、種々の戦略的経路を適用できる。例えば、免疫原性物質の注入によって病気を誘発することができる。或いは、変化した遺伝子発現を有して動物が生まれてもよい。このような動物の遺伝子はノックアウト、過剰発現又は不十分発現されうる。本発明は、遺伝子発現が変化した動物を提供する。一実施形態では、本発明は、表A、表B、表3又は表4に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物を提供する。別の実施形態では、本発明は、表Aに列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物を提供する。本発明は、さらに、表A、表B、表3又は表4に列挙される遺伝子の少なくとも1つ及び表C又は表6に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物を提供する。さらに、本発明は、表Aに列挙される遺伝子の少なくとも1つ及び表B、表C、表3、表4又は表6に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物を提供する。もちろん、本発明は、表A、B、3、4、6又はCに列挙される遺伝子に加え、別の遺伝子がノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている動物をも提供する。前記別の遺伝子は、好ましくはRAに関与することが分かっている遺伝子である。この文脈の別の好ましい遺伝子は、細胞骨格の再編成に関与することが分かっている遺伝子である。一実施形態の本発明は、細胞骨格の再編成に関与することが分かっている少なくとも1つの遺伝子がノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている非ヒト動物を提供する。
【００２３】
RAにおいて該疾患プロセスで非常に重要な役割を果たす細胞型の1つは滑膜線維芽細胞である。従って、好ましい実施形態では、本発明は、前記細胞骨格の配置が滑膜線維芽細胞内である、本発明の非ヒト動物を提供する。細胞骨格の組織化は、典型的に多様なシグナルによって影響を及ぼされる。従って、一実施形態の本発明は、前記遺伝子が細胞骨格への細胞外又は細胞内シグナル伝達に関与する、本発明の非ヒト動物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、前記遺伝子がアクチン細胞骨格の結合及び/又は再編成に関与する、本発明の非ヒト動物を提供する。本発明は、細胞骨格の再編成に関与する遺伝子を提供する。従って、本発明は、好ましい実施形態において、前記遺伝子が以下の遺伝子：チューブリンα1、RAB14、ゲルソリン、膜関連ホスファチジルイノシトール、マトリックスメタロプロテイナーゼ3、マトリックスメタロプロテイナーゼ13、マトリックスメタロプロテイナーゼ13の組織インヒビター、カテプシンS、マトリックスγ-カルボキシルグルタメート、インテグリンαX、ミオシン軽鎖、トロポニンT1骨格スロー、トロポニンI骨格ファースト2、VASP、ADF/コフィリンのいずれか1つであり、及び/又は表4の遺伝子である、本発明の非ヒト動物を提供する。好ましくは、前記遺伝子はゲルソリン、VASP及び/又はADF/コフィリンである。これらの遺伝子については、実施例、表及び図面でさらに検討する。
【００２４】
遺伝子が過剰発現又は不十分発現される動物を作成するための代替手段は、前記動物のゲノムに外来遺伝子を導入することである。このような動物はトランスジェニック動物である。一実施形態の本発明は、本発明の非ヒト動物であって、前記動物が、過剰発現又は不十分発現される前記遺伝子又はその相同体のトランスジェニック動物である非ヒト動物を提供する。組換えDNA方法論を用いて外来遺伝子を構築することができる。本発明によって提供される好ましい非ヒト動物はげっ歯類又は非ヒト霊長類である。好ましくは、前記非ヒト動物はマウスである。この動物の特徴は周知であり、この動物は研究室環境に実用的である。RAの疾患モデルではマウス及びラットが使用されることが多い。好ましい実施形態では、本発明は、疾患モデルとしての本発明の非ヒト動物の使用を提供する。好ましくは、前記モデルで表現される前記疾患はリウマチ性関節炎である。或いは前記疾患は本発明で判定される調節が解除された遺伝子が関与する疾患である。動物の炎症性及び/又はリウマチ性関節炎は既知若しくは未知の内的原因によって自発的に発生し、或いは誘発されてもよい。好ましい実施形態では、本発明は、リウマチ性関節炎の疾患モデルとしての非ヒト動物の使用であって、前記リウマチ性関節炎が誘発される、前記使用を提供する。誘発は直接又は間接的に進行しうる。例えば、直接誘発は関節炎を引き起こす免疫原性組成物を注入すると起こる。このような免疫原性組成物の例として、限定するものではないが、コラーゲンが挙げられる。間接誘発は、例えば、動物がその生涯のある段階で関節炎を発症するための遺伝子の欠陥による。該誘発の好ましい例は表5に示されている。
【００２５】
さらに好ましくは、関節炎モデルにおいて、前記表A、表B、表C、表3、表4又は表6に列挙される遺伝子の少なくとも1つがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されている、本発明の非ヒト動物である。好ましくは遺伝的関節炎モデル、好ましくは表5及び/又はTg197マウスで示される遺伝モデルである。好ましくはゲルソリン、VASP及び/又はADF/コフィリンがノックアウト、過剰発現又は不十分発現されているTg197マウスが提供される。好ましくは、特に骨髄系列である。好ましくは、ゲルソリン及び/又はADF/コフィリンはノックアウト又は不十分発現されている。VASPは好ましくは過剰発現されている。
本発明は、さらに本発明の非ヒト動物の炎症性関節炎モデルとしての使用を提供する。好ましくは、前記非ヒト動物は炎症性関節炎を患っている。これは典型的に前記炎症性関節炎を誘発する組成物を本発明の非ヒト動物に与えることによって達成される。このような組成物は技術上周知であり、限定するものではないが、コラーゲンが挙げられる(他の周知例がある)。
【００２６】
炎症性関節炎は確実な治癒が見出されていない重度な疾患なので、RAの多様な型と段階に有効な薬物が継続して要望されている。有効な薬物の検索プロセスでは、この薬物に含まれる化合物の信頼できる試験が必須である。本発明は、化合物がIAの症状の軽減に有効であるかを判定するための方法であって、前記症状のモデルシステムで前記化合物を試験する工程を含み、前記化合物が細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための化合物であることを特徴とする方法を提供する。癌治療の開発において化合物が細胞骨格の配置に関与することが分かっているので、前記化合物を本発明で使用する。従って、一実施形態では、本発明は化合物がIAの症状の軽減に有効であるかを判定するための方法であって、前記症状のモデルシステムで前記化合物を試験する工程を含み、前記化合物が細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための化合物であり、前記化合物が癌治療に有効であることを特徴とする方法を提供する。前記化合物は好ましくは以下の化合物の1つである：サイトカラシンD、ファロイジン、ジャスプラキノリド、コンドラミド、ドロスタチン11、ラトランクリンA、スウィンホリドA、ミサキノリドA、ミカロリドB、シンクソリドC、スキトフィシン、ゴニオドミンA、プソイドプテロリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジル酸。
【００２７】
本発明では、IAにおいて特有の遺伝子について調節が解除されることが分かった。IAの治療に治療的価値のある化合物の検索プロセスでは、これらの遺伝子の発現が有用なパラメーターである。本発明で見出された調節解除遺伝子の調節が解除される他の疾患のためにも同様に前記パラメーターを使用できる。例えば、これらの疾患と同様に作用する同様の原因機序のため同様の調節解除が起こる。本発明は、化合物が表A、表B、又は表4に列挙される1つ以上の遺伝子の発現に効果を及ぼすかを判定する方法であって、前記遺伝子が発現される環境内で前記化合物を試験する工程及び結果の発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法を提供する。好ましくは、基準値は表A、B又はCに列挙される遺伝子の正常な発現レベルよりSF UP及び/又はWJ upだけ高いことを示し、或いは表A、B又はCに示される正常な発現レベルよりSF down、及び/又はWJ downだけ低いことを指し示す。本発明は、さらに、化合物が表Aに列挙される1つ以上の遺伝子の発現に効果を及ぼすかを判定する方法であって、前記遺伝子が発現される環境内で前記化合物を試験する工程及び結果の発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、化合物が表A、表B、又は表4に列挙される1つ以上の遺伝子の発現並びに表Cに列挙される1つ以上の遺伝子の発現に効果を及ぼすかを判定する方法であって、前記遺伝子が発現される環境内で前記化合物を試験する工程及び結果の発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、化合物が表Aに列挙される1つ以上の遺伝子の発現並びに表B又は表Cに列挙される1つ以上の遺伝子の発現に効果を及ぼすかを判定する方法であって、前記遺伝子が発現される環境内で前記化合物を試験する工程及び結果の発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法を提供する。好ましくは、表A、B又はCに列挙される複数の遺伝子に及ぼす効果を判定する。
【００２８】
本発明の一実施形態では、本発明で調節が解除されることが分かった遺伝子がIAの疾患モデルで使用される。該実施形態では、前記遺伝子は意図的に調節が解除される。対照的に、IAの個体では、前記遺伝子は常に調節が解除されている。この文脈では、前記意図は、前記個体の状態を改善するために前記遺伝子を調節することである。従って、一実施形態では、本発明は、個体のリウマチ性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減する方法であって、細胞骨格の配置に関与する遺伝子の前記個体における発現を改変する工程を含む方法を提供する。本明細書では、発現を改変する工程は、前記個体の状態が改善されるように前記個体における前記調節が解除された遺伝子の発現を変える。患者のIAの症状を軽減することは、通常、前記遺伝子の発現が正常、すなわち健康な状態の基準値と近いか又は等しくなるように、下方制御された遺伝子を上方制御するか又は上方制御された遺伝子を下方制御することを意味する(それぞれ、表A、B又はCのSF若しくはWJ down及びSF若しくはWJ UP参照)。好ましい実施形態では、本発明は、個体のリウマチ性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減する方法であって、細胞骨格の配置に関与する遺伝子の前記個体における発現を改変する工程を含み、前記遺伝子の発現が滑膜線維芽細胞内で改変される、方法を提供する。本発明の一実施形態では、前記遺伝子は細胞骨格への細胞外又は細胞内シグナル伝達に関与する。別の実施形態では、前記遺伝子はアクチン細胞骨格の結合及び/又は再編成に関与する。本発明は、細胞骨格の配置に関与し、かつIAで調節が解除される遺伝子を開示する。従って、一実施形態では、本発明は、前記遺伝子が以下の遺伝子：チューブリンα1、RAB14、ゲルソリン、膜関連ホスファチジルイノシトール、マトリックスメタロプロテイナーゼ3、マトリックスメタロプロテイナーゼ13、マトリックスメタロプロテイナーゼ13の組織インヒビター、カテプシンS、マトリックスγ-カルボキシルグルタメート、インテグリンαX、ミオシン軽鎖、トロポニンT1骨格スロー、トロポニンI骨格ファースト2、VASP、ADF/コフィリンのいずれか1つであり、及び/又は表4の遺伝子である、本発明の方法を提供する。上記遺伝子のような細胞骨格の配置に関与する遺伝子の調節が解除される、IA以外の別の障害でも本発明の方法を適用できる。好ましい実施形態では、本発明の方法における前記遺伝子は、ゲルソリン、VASP又はADF/コフィリンをコードする。好ましくはゲルソリンをコードする。
【００２９】
ゲルソリンは、とりわけ、細胞骨格構築の動的再編成へのシグナルの伝達に関係があるとされているアクチン結合タンパク質[33]である。カルシウムの存在下で、ゲルソリンは
先在するアクチンフィラメントを切断してそれらをキャップすることによって、その急成長端へのモノマー付加を阻止する。この反矢じり端キャップは、カルシウムの非存在下でさえ、ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート(PIP-2)等の制御リン脂質との相互作用によって置換されなければ非常に安定である。プロフィリン(別のアクチン結合タンパク質)の大プールの存在下、又は解重合条件下では、これらのゲルソリンキャップド端が、この尖形端からのサブユニット損失によってアクチンフィラメント集団の分解を許す[34]。Gsn-/-線維芽細胞は、関節炎のSFで観察されるものに非常に似ている過剰のストレスファイバーを有することがin vitroで分かり[18]、ゲルソリンが種々の方法で下方制御されることが分った。関節炎マウスからのgsn発現をノックアウトすると該疾患の悪化をもたらすことから(図4)、該疾患の病態生理学におけるアクチン細胞骨格の再編成の関与が証明される。ゲルソリンはRasによる線維芽細胞の悪性形質転換に対して最も著しく下方制御されるマーカーの1つであることが分かり[35]、ゲルソリン突然変異体の過剰発現がRas-誘導形質転換を抑制することが分った[36]。その発現は、ヒトの胃癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌及び乳癌の大多数では検出できないか又は減少することが分った[37〜39]。
【００３０】
細胞骨格の配置に関与する遺伝子は、本発明では、IAで調節が解除されることが分っている1群の遺伝子だけである。他の遺伝子は、とりわけ、表A、表B、表3、表4又は表Cに列挙されている。一実施形態の本発明は、個体の炎症性及び/又はリウマチ性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減する方法であって、前記個体の細胞内における表A、表B、表3、表4又は表Cの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程を含む方法を提供する。別の実施形態では、前記方法は、前記個体の細胞内における表Aの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程を含む方法を提供する。さらなる実施形態では、前記方法は、前記個体の細胞内における表A、表B、又は表4の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物及び表Cの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程を含む方法を提供する。さらに、本発明は、前記方法が、前記個体の細胞内における表Aの少なくとも1つの遺伝子産物及び表B又は表Cの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程を含む、本発明の方法を提供する。好ましい状況では、本発明の方法は2つ以上の症状を軽減する。好ましくは表A、B、C、又は4の遺伝子の2、3又はそれより多くの遺伝子の発現レベルが改変される。発現レベルが改変される方向は、遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの調節が解除される方向によって決まる(表A、B又はC参照)。適用する改変の範囲は、前記遺伝子の前記遺伝子産物の前記発現レベルの調節が解除される程度によって決まる。遺伝子の遺伝子産物の発現レベルは、好ましくは、健康状態を表す基準値、例えば正常レベルにマッチするか又は近づくように改変される。或いは、遺伝子の遺伝子産物の発現レベルは、個体の生理学的に許容しうるレベルにマッチするように改変される。生理学的に許容しうるレベルは、多くの場合、ほぼ正常レベルであるレベルだろう。正常レベルは、同一の年齢と気質の健康な個体で見出されうるレベルである。生理学的に許容しうるレベルは正常範囲から外れてよいが、それでも該レベルは個体に十分な機能を与える。
【００３１】
本発明の方法における遺伝子産物はRNA産物とタンパク質産物の両方を包含する。一実施形態では、本発明は個体の炎症性及び/又はリウマチ性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減する本発明の方法であって、前記遺伝子産物がタンパク質を含む、方法を提供する。本発明の方法で遺伝子の遺伝子産物の発現レベルが改変される細胞は、個体の炎症性及び/又はリウマチ性関節炎の疾患プロセスで影響を受ける細胞である。好ましくは前記細胞は前記個体の関節と連絡がとれる細胞である。本発明の好ましい実施形態では、前記細胞が関節細胞又はその前駆細胞である、本発明の方法が提供される。この細胞は関節のいずれの成分の部分でもよい。前駆細胞は前記関節内又はその周囲に既に存在していてよく、或いは例えば血液から誘導されうる。好ましい実施形態では、前記細胞は滑膜細胞又は滑液の細胞を含む。好ましくは本発明の方法において、少なくとも2つの遺伝子産物の発現レベルが改変される。好ましい実施形態では、本発明の方法は、前記個体の細胞内において、表A、表B、又は表4の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程及びIAで調節が解除されることが分っている表A、B又はCに列挙される遺伝子以外の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程を含む。さらに、前記方法が、前記個体の細胞内において、表Aの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程及びIAで調節が解除されることが分っている表A、B又はCに列挙される遺伝子以外の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程を含む、本発明の方法が提供される。さらなる実施形態では、前記方法は、前記個体の細胞内において、表A又は表Bの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物及び表Cの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程並びにIAで調節が解除されることが分っている表A、B又はCに列挙される遺伝子以外の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程を含む。さらに、本発明は、前記方法が前記個体の細胞内において、表Aの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物及び表B又は表Cの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物並びにIAで調節が解除されることが分っている表A、B又はCに列挙される遺伝子以外の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを改変する工程を含む。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明は、個体の炎症性及び/又はリウマチ性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減する本発明の方法であって、前記発現レベルを改変する工程が、比較できる健康な個体に比べて前記個体で過剰発現されている遺伝子の発現を下げるか、又は比較できる健康な個体に比べて前記個体で不十分発現されている遺伝子の発現を上げる工程を含む方法を提供する。
【００３３】
不十分発現されている遺伝子の発現を上げる工程は、例えば転写因子の添加により、及び/又はエンハンサー配列を活性化することによって達成される。過剰発現されている遺伝子の発現を下げる工程は、例えばアンチセンス療法を適用することによって、又は前記異常発現遺伝子のプロモーターに結合するリプレッサータンパク質を投与することによって実現される。好ましい実施形態では、本発明は、前記発現を下げる前記工程がアンチセンス配列を利用することを含む、本発明の方法を提供する。遺伝子産物の下方制御生産に対する多くの異なったアンチセンスアプローチが当業者に利用可能である。アンチセンス技術は、オリゴヌクレオチド類似体を利用してワトソン-クリックハイブリダイゼーションによって標的RNAに結合する。結合後、該アンチセンス薬は標的RNAの分解を無力にするか又は誘導する。アンチセンス薬はスプライシングを変えることもできる。アンチセンス技術の基本的機序は最近の10年で広範囲に探査された。多くは、アンチセンス分子の医化学及び薬理学、薬物動態学、並びに毒物学的な特性について確認された。アンチセンス技術は遺伝子の機能化及び標的の確証に有益であることが判った。
【００３４】
アンチセンスアプローチの非限定例はRNA干渉(RNAi)、マイクロRNA及びスプライス干渉法、例えばエクソンスキッピングである。アンチセンス配列を単鎖分子として又はヘアピン構築分子の一部として投与することができる。アンチセンス配列を直接投与でき、或いは発現カセットを用いて細胞内で産生させうる。今日、RNA干渉(RNAi)は、既知のmRNAに相補的な外因性の二本鎖RNA(dsRNA)を細胞内に導入して当該特定のmRNAを特異的に破壊することによって遺伝子発現を減少又は廃止させる技術である。この技術はドロソフィラ、エレガンス線虫、植物、及び最近、哺乳動物の細胞培養内で有効であることが判った。哺乳動物の培養細胞における研究目的では、低分子干渉RNA(siRNA)を細胞中に送達する。siRNAは約21〜25ヌクレオチドのdsRNAである。この送達はトランスフェクション試薬、すなわち培養細胞がDNA及びRNAを吸収できるように最適化した溶液を用いて行われる。好ましい実施形態では、本発明は、前記発現を下げる工程がRNAiを利用する工程を含む、本発明の方法を提供する。好ましくは、RNAiの誘導のためsiRNAを使用する。古典的なアンチセンス配列は、それが特異的なmRNAの少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%に相補的でありうる。siRNA、miRNA、RNAi及びエクソンスキッピングアンチセンス配列は、本分野で典型的に使用される正常オーバーラップを有する。それらは典型的に15〜40、好ましくは15〜30の塩基のオーバーラップを有する。siRNAは典型的に21〜25のヌクレオチドを有する。技術上周知なようにその効率によって、アンチセンスを単鎖又は二本鎖分子として供給することができる。アンチセンス配列は核酸又はその機能等価物で構成されうる。
【００３５】
例えば遺伝子の遺伝子産物の発現レベルを改変するために適用される化合物でアンチセンス配列を使用できる。好ましい実施形態では、本発明は、個体の炎症性及び/又はリウマチ性関節炎の少なくとも1つの症状を軽減するための薬物製造のための化合物の使用であって、前記化合物が表A又は表Bに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列を含む、前記使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記化合物が表Aに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列を含む、本発明の使用を提供する。さらに、前記化合物が表A又は表Bに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列及び表Cに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列を含む、本発明の使用を提供する。本発明の別の使用では、前記化合物が表Aに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列及び表B又は表Cに列挙される1つの遺伝子のアンチセンス配列を含む。好ましくは、表A、B又はCに列挙される2つ以上の遺伝子のアンチセンス配列が本発明の使用に含まれる。上述した遺伝子のアンチセンス配列に加え、IAに関与することが分かっている他の遺伝子のアンチセンス配列が前記化合物に含まれてよい。好ましい実施形態では、アンチセンスは表A、B又はCでSF UP又はWJ upによって同定されている遺伝子由来のmRNAに対する特異性を備える。
【００３６】
適切な薬物が開発される前に、薬物標的を同定かつ確証しなければならない。薬物標的は主にタンパク質、DNA又はRNAである。本発明は、本発明がIAで調節が解除される遺伝子及び遺伝子産物を同定したような薬物標的を提供する。従って、一実施形態では、本発明は、表A、表B、又は表4の遺伝子によってコードされるタンパク質の、炎症性関節炎の治療用の候補薬物を選択するための薬物標的としての使用を提供する。さらに前記タンパク質が表Aの遺伝子によってコードされる、本発明の使用を提供される。一実施形態では、表A又は表Bの遺伝子によってコードされる第1のタンパク質を第1の薬物標的として使用し、かつ表Cの遺伝子によってコードされる第2のタンパク質を第2の薬物標的として使用する。別の実施形態では、表Aの遺伝子によってコードされる第1のタンパク質を第1の薬物標的として使用し、かつ表B又は表Cの遺伝子によってコードされる第2のタンパク質を第2の薬物標的として使用する。こうして本発明の使用によって前記薬物標的が確証される。確証後、薬物をさらに、まず前臨床セッティングで試験してから臨床環境で試験する。
【００３７】
既に述べたように、本発明はIAで調節が解除される遺伝子に特異的なプローブを提供する。こうして提供されるプローブは、前記遺伝子が調節解除されるIA以外の障害でも適用できる。遺伝子のアドレッシングをさらに特異的にするため、1つより多くのプローブが優先的に使用される。本明細書では、好ましくは1つより多くのプローブがアレイに含まれる。アレイを用いて1つ以上の遺伝子又は遺伝子産物について同時に1つ以上のサンプルを解析する。アレイは全ゲノムに特異的でありうるが、本発明では、優先的にゲノムの一部、すなわちサブゲノムに特異的である。本発明の別の優先は、トランスクリプトーム(transcriptome)又はトランスクリプトームの一部、すなわちサブトランスクリプトームに特異的なアレイである。本明細書では、生体のトランスクリプトームは、ある点で産生されるすべてのDNA転写物、大部分はmRNAである。ある点は、その位置及び/又は時間で特定される。従って、本発明の好ましい実施形態では、アレイはサブゲノムアレイ又はサブトランスクリプトームアレイである。好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも2つのプローブを含んでなるアレイであって、少なくとも1つのプローブが表A、表B、又は表4に列挙される少なくとも1つの遺伝子に特異的である、前記アレイを提供する。本発明は、さらに、少なくとも1つのプローブが表Aに列挙される少なくとも1つの遺伝子に特異的である、本発明のアレイを提供する。本発明によって、少なくとも1つのプローブが表A又は表Bに列挙される少なくとも1つの遺伝子に特異的であり、かつ少なくとも1つのプローブが表Cに列挙される少なくとも1つの遺伝子のプローブである、本発明のアレイも提供される。別の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのプローブが表Aに列挙される少なくとも1つの遺伝子に特異的であり、かつ少なくとも1つのプローブが表B又は表Cに列挙される少なくとも1つの遺伝子に特異的である、本発明のアレイを提供する。好ましい実施形態では本発明のアレイはマイクロアレイである。従って、前記遺伝子に特異的な前記プローブは、好ましくはマイクロアレイに含まれる。前記マイクロアレイは、好ましくはオリゴヌクレオチド又はその機能等価物を含む。プローブ又はオリゴヌクレオチドは好ましくは15〜80、さらに好ましくは15〜40のヌクレオチド又はその機能等価物の長さである。
一実施形態では、本発明の方法で本発明で提供されるアレイを使用する。サンプルが炎症性及び/又はリウマチ性関節炎を患っている個体由来であるか又はそれを患う危険のある個体由来であるかを判定するための本発明の方法であって、前記方法が前記サンプルにおいて、表A又は表Bの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを測定する工程及び前記発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法における本発明のアレイの使用が提供される。さらに、個体がIAを患っているか又はIAを患う危険があるかを判定するための本発明のアレイの使用が提供される。
【００３８】
ELISA、ウェスタンブロット又はタンパク質の比色若しくは蛍光定量に基づいた抗体の別の選別のような種々の方法でタンパク質の発現レベルを測定できる。好ましい実施形態では、本発明は少なくとも2つの結合体を含んでなるアレイであって、少なくとも1つの結合体が表A、表B、又は表4の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物に特異的である、前記アレイを提供する。一実施形態では、前記結合体は抗体である。前記遺伝子産物はRNA又はタンパク質である。一実施形態では、本発明は前記遺伝子産物がタンパク質である、本発明のアレイを提供する。好ましい実施形態では、本発明のアレイは、表Aの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物に特異的な少なくとも1つの結合体を含む。さらに、少なくとも1つの結合体が表Aの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物に特異的である、本発明のアレイが提供される。一実施形態では、本発明は、少なくとも1つの結合体が表A、表B、又は表4の遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物に特異的であり、かつ少なくとも1つの結合体が表Cの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物に特異的である、本発明のアレイを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも1つの結合体が表Aの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物に特異的であり、かつ少なくとも1つの結合体が表B又は表Cの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物に特異的である、本発明のアレイを提供する。本発明の前記アレイは好ましくはマイクロアレイである。一実施形態では、本発明の方法で前記アレイが使用される。サンプルが炎症性及び/又はリウマチ性関節炎を患っている個体由来であるか又はそれを患う危険のある個体由来であるかを判定するための本発明の方法であって、前記方法が前記サンプルにおいて、表A又は表Bの遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを測定する工程及び前記発現レベルを基準値と比較する工程を含む方法における本発明のアレイの使用が提供される。さらに、個体がIAを患っているか又はIAを患う危険があるかを判定するための本発明のアレイの使用が提供される。
この関連において表A又は表Bを参照する場合、この参照は表3及び表4の参照をも包含する。この場合、好ましくは表A、B又は表3について示される。好ましくは表A又は表Bであり、好ましくは少なくとも表Aである。
【００３９】
本発明は、さらに、化合物、(ポリ)ペプチド又は核酸分子若しくはその機能等価物が炎症性関節炎を患っているか又はそれを患う危険のある個体又は非ヒト動物の滑膜線維芽細胞の表現型に影響を及ぼすかを判定する方法であって、前記個体又は非ヒト動物由来の発症した関節又は発症する危険のある関節から得たサンプル由来の滑膜線維芽細胞を前記化合物の存在下でin vitro培養する工程及び/又は前記滑膜線維芽細胞に前記核酸若しくは前記その機能等価物を供給する工程及び前記培養滑膜線維芽細胞の表現型が変化しているかを判定する工程を含む方法を提供する。好ましくは、前記滑膜線維芽細胞がTg197マウス、本発明の非ヒト動物及び/又は表5に示される遺伝モデルの遺伝子変化を含むマウスの関節から得られる。好ましい実施形態では、前記化合物、核酸若しくはその機能等価物は細胞内の細胞骨格又はその組織化を変えるための化合物である。好ましくは、上述したように前記化合物は癌治療に有効である。好ましくは前記化合物は以下の化合物の1つである：サイトカラシンD、ファロイジン、ジャスプラキノリド、コンドラミド、ドロスタチン11、ラトランクリンA、スウィンホリドA、ミサキノリドA、ミカロリドB、シンクソリドC、スキトフィシン、ゴニオドミンA、プソイドプテロリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジル酸。
【００４０】
好ましい実施形態では、前記核酸は、アンチセンス配列、好ましくはRNAi、siRNA、又はshRNAである。前記アンチセンス配列は核酸又はその機能等価物で供給される。前記核酸又はその機能等価物は、好ましくはモルフォリノ、固定化(locked)核酸(LNA)又はペプチド核酸(PNA)を含む。特に好ましい実施形態では、前記アンチセンス配列は表A、B、C、又は表4に列挙される遺伝子のアンチセンス配列であり、このとき前記遺伝子は、前記表のどれかで発現SF Up若しくはWJ Upによって同定されるか又は前記遺伝子はVASPである。特に好ましい実施形態では、前記アンチセンス配列は表Aに発現SF UP若しくはWJ upによって示される表Aの遺伝子に特異的である。ストレスファイバーの形成、存在が影響を受けるかを判定することが好ましい。別の好ましい実施形態では、前記表現型は、前記滑膜線維芽細胞の接着、移住、増殖、創傷治癒及び/又はアポトーシスを含む。本in vitroアッセイは、特に高処理能力スクリーニングのため、特にIAにおける治療効果の可能性のため本発明の候補薬物及び/又は核酸をスクリーニングするために適する。好ましい実施形態では、前記核酸は表A、B、C、又は4の遺伝子によって産生されるタンパク質をコードし、このとき前記遺伝子は表A、B又はCでSF down及び/又はWJ downによって同定され、或いはゲルソリン又はADF/コフィリンである。アンチセンス配列は、好ましくは表A、B又はCでSF UP若しくはWJ UPよって同定される遺伝子、又はVASPに特異的である。前記(ポリ)ペプチドは好ましくは抗体又はその機能等価物、例えば限定するものではないが、単鎖抗体、モノボディ、FAB断片などである。ペプチドはペプチド連鎖内に好ましくは少なくと6、好ましくは少なくとも8個のアミノ酸を含む。ペプチドは、好ましくは40個のアミノ酸より長くない。ポリペプチドはペプチド連鎖内に41個以上のアミノ酸を含む。本発明の(ポリ)ペプチドは、例えばタンパク質に化学修飾及び/又は翻訳後修飾などの修飾を含んでよい。(ポリ)ペプチドは線形又は環状でよい。
【００４１】
本発明は、さらに、表A、B又はCのSF及び/又はWJ downよって同定される遺伝子、ゲルソリン又はADF/コフィリンのコード領域を含んでなる遺伝子送達ビヒクルの、関節の細胞に前記遺伝子を送達するための使用を提供する。好ましくは、前記遺伝子は滑膜線維芽細胞に送達される。別の局面では、本発明は、表A、B又はCのSF又はWJ downによって同定される遺伝子、ゲルソリン又はコフィリンのコード領域を含んでなる遺伝子送達ビヒクルの、前記遺伝子を関節の細胞(WJ down)及び/又は滑膜線維芽細胞(SF down)に送達するための組成物の調製のための使用を提供する。好ましくは前記遺伝子送達ビヒクルを炎症性関節炎の治療のために使用する。特に好ましい実施形態では前記遺伝子はゲルソリン、ADF/コフィリンである。従って本発明はさらに、ゲルソリン及び/又はADF/コフィリンのコード領域を含んでなる遺伝子送達ビヒクルを提供する。さらに、表A、B又はCのSF及び/又はWJ UPによって同定される遺伝子又はVASPのアンチセンス配列を含むか又はそのための発現カセットを含む核酸若しくはその機能等価物を含んでなる遺伝子送達ビヒクルの、前記核酸若しくはその機能等価物を関節の細胞又は滑膜線維芽細胞に送達するための使用が提供される。好ましくは前記アンチセンス配列はshRNA、RNAi及び/又はsiRNAを含む。好ましくは前記遺伝子送達ビヒクルはリポソーム、又はウイルスベクターを含む。好ましくはアデノウイルス、アデノ関連ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。遺伝子送達ビヒクルは全身送達/投与される。特に好ましい実施形態では、前記遺伝子送達ビヒクルは局所投与、好ましくは関節内投与される。前記発現カセットは好ましくはコード領域及び/又はアンチセンス配列の発現を推進するプロモーターを含む。好ましくは前記プロモーターはpol IIプロモーター又はpol IIIプロモーターである。
【実施例１】
【００４２】
〔材料と方法〕
動物：混合型CBAxC57BL/6遺伝的バックグラウンドに基づいてすべてのトランスジェニックマウスを育種かつ維持し、ヘルシンキ原則の宣言に応じて特有の病原フリー条件下でB.S.R.C.“Al. Fleming”の動物施設で管理した。(温度20〜22℃、湿度55±5%、12時間の明/暗サイクル、水は自由)。“関節炎”トランスジェニックマウス(Tg197, hTNF+/-)はヒトTNF遺伝子(3' UTRがb-グロビンからの対応するもので置換されている)を保有した[5]。“関節炎”ノックインマウス(129/C57BL6に対してTNFΔARE/+)は内因性mTNF遺伝子(3' UTRでTNF ARE(AU-リッチ要素)を包含する69bpが欠失している)を発現した結果、高いメッセージ安定性と翻訳効率をもたらす[8]。この研究で示される実験のため適切な場合明瞭に列挙したように、全部で86匹のマウスを用いた(いくつかの実験は単に代表実験なので)。
【００４３】
細胞の単離と培養：基本的に以前に記載されている通りに6〜8週齢マウスから滑膜線維芽細胞(VCAM+)を単離した[7,40]。少なくとも21日及び最低4継代の連続培養で線維芽細胞を選択した。FACS解析ではマクロファージを検出できなかった。10%のFBS及び100単位/mlのペニシリン/ストレプトマイシで補充した完全DMEM培地(Gibco/BRL)内で37℃、5%のCO2にて細胞を増殖させた。条件的に不死化した滑膜線維芽細胞系統の生成及び培養条件(33℃、10単位/mlのマウスIFN-γ)は以前に記載されている[7]。
RNA抽出：RNAwiz試薬(Ambion Inc.)と共に培養したサブコンフルエントな(70〜80%)滑膜線維芽細胞(初生又は条件的に不死化)から全RNAを抽出後、製造業者の使用説明書に従ってRNeasyカラム(AIAGEN, Hilden, Germany)に1回通した。イソチオシアン酸グアニジニウム/酸フェノールプロトコルを用いて全関節から全RNAを抽出後[41]、RNeasyカラムに1回通した。変性1.2%アガロース/ホルムアルデヒドゲル上の電気泳動によってRNAの完全性を評価した。260/280nmにおけるOD解読に基づいてRNAの量/質を計算した。
【００４４】
全長cDNAライブラリーの生成：トレハロエース及びソルビトールの存在下で56℃にてSUPERSCRIPT II(Life technologies/Invitrogen)を用いて第1鎖cDNA合成を行った。mRNAの5’末端のキャップ構造をビオチン化し、RNアーゼI処理後、ストレプトアビジン被覆ビーズを用いて全長cDNAを選択した[42]。二重鎖DNAリンカー(ランダムな6-bpのdN6又はdGN5、3’オーバーハングを有する)を単鎖cDNAに結合する単鎖リンカー連結法(SSLLM)で第2鎖合成を開始した[43]。第2鎖は、広範囲の耐熱性ポリメラーゼの混合物を用いてプライマー伸長後、制限消化(BamHI nd XhoI)及びλ-FLCIファージミドベクターへの連結によって作られる[43、43]。パッケージング後、以前に記載されている通りに、固相上でcDNAライブラリーを増幅した[45]。
【００４５】
cDNAライブラリーの規準化及びサブトラクション(概要を補充図1aに示した)：増幅したファージミドλ-FLCI cDNAライブラリーを用いてCre-発現細菌株化細胞(BNN-132)を感染させ、切除プラスミドを単離した[44]。二重鎖プラスミドDNAに部位特異性(f1開始点)エンドヌクレアーゼGeneIIで切れ目を入れ、エクソヌクレアーゼIIIによる消化で環状の単鎖に変換した[45]。この環状の単鎖プラスミドcDNAライブラリー(テスターライブラリー)を、これらライブラリーから生成されたPCR-誘導単鎖アンチセンスDNAドライバーと共に単工程規準化-サブトラクション工程に供した[45]。規準化は「自己」ライブラリーから生成されたドライバーとの低CoTハイブリダイゼーション(CoT=2)を意味し、高度に発現したmRNAの提示の低減を目的とする。サブトラクションは異なるライブラリーから生成されたドライバーとの高CoTハイブリダイゼーション(CoT=100〜200)を意味する。ハイブリッド形成した二重鎖cDNAをヒドロキシアパタイト(HAP)カラムに2回通して除去した。ハイブリッド形成していない単鎖cDNAを二重鎖に変換し、引き続き、テスターcDNAだけが増殖できる(複製開始点の存在及び抗生物質耐性のため)DH10b細菌細胞中にエレクトロポレーションで導入した[45]。
【００４６】
高処理能力配列決定及び配列解析：コロニー選抜、cDNA配列決定及び配列解析を基本的に以前に記載されている通りに行った[46〜48]。プライマー及びベクター配列について配列を選別し[48]、げっ歯類特異性かつ哺乳類の広いリピートをリピートマスカー（RepeatMasker）でマスキングした(http://www.phrap.org)。ESTクラスター化をスタックPACK及びd2_クラスター(ワードサイズ6、類似カットオフ0.98、最小配列サイズ50、ウィンドウサイズ200)で行った[49、50]。Unigene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)、FANTOM2(http://fantom2.gsc.riken.go.jp)[53]及びSWISSPROT(http://www.ebi.ac.uk/ swissprot/)データベースにて、BLAST[51、52]を用いて既知遺伝子によるホモロジー検索を行った。BLAST結果をhttp://source.stanford.edu/cgi-bin/sourceSearch(Unigeneのため)、ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/GO/goa/SPTR/gene_association.goa_sptr.gz(SWISSPROTのため)及びhttp:// fantom2.gsc.riken.go.jp(FANTOM2のため)における遺伝子概念体系(Gene Ontology)(GO)用語(http://www.geneontology.org)と関連づけた。詳細な結果(クローン数、クラスター/遺伝子、ブラスト結果及びE値、受入番号及びGO割当を含む)は、対応する作者のウェブサイト、http://www.fleming.gr/en/investigators/Aidinis/data.htmlで見つけられる。進行中のFANTOM(マウスの機能予測(Functional annotation of the mouse))プロジェクト[48]の状況において、ほとんどの配列決定データが既に公共データベース[47]に提示されている。
【００４７】
サブトラクティブなライブラリーの差次的遺伝子発現統計解析：異なるサブトラクテッドcDNAライブラリー間の差次的な遺伝子発現/存在量をこの目的のため特に設計された単統計検定で計算した[55]。基本的に、使用した式はcDNAライブラリー間の遺伝子の区画化のエントロピーであり、漸近的なX2分布に従う(2Rj)対数公算比統計値であるR値によって記述される[55]。j番目の遺伝子について統計的なRjの式は下記表現で与えられる。
【００４８】
【数１】
2009512429.tif 000002
【００４９】
式中、mはcDNAライブラリーの数、Niは第1ライブラリーで配列決定されたクローンの総数、χi,jはi番目のライブラリー中のj番目の遺伝子の数(転写物コピー)であり、fiは全ライブラリー中のj番目の遺伝子の遺伝子転写物コピーの頻度である。
観測数に基づいてシミュレートしたライブラリーデータベースを用いて「最適な」カットオフ値を確証することを試す再サンプリング法を用いてR統計値の有意性を確証した。この方法は以下のように進む：1)各及びあらゆる遺伝子について、上式の助けを借りて共通の遺伝子転写物の頻度fjを計算する。この数は、全ライブラリー中で遺伝子jの存在量に差がないという帰無仮説下で予測される遺伝子転写物の頻度に相当する。2)各遺伝子及びライブラリーについてクローン存在量のサンプリング分布を与えるポアソン分布のパラメーターを前記帰無仮説下で計算する。このパラメーターは、ライブラリーi中の遺伝子jのNifj(Niはライブラリーi中で配列決定されたクローンの総数(すべての遺伝子を考慮して)であり、fjは工程1で計算された)に等しい。この値は前記帰無仮説下で予測されるi番目のライブラリー中のj番目の遺伝子のクローンの絶対数に等しい。3)次に、比較される各ライブラリー及び各遺伝子について、工程2のポアソン分布からランダム数を生成する。この数は、前記帰無仮説、すなわち全ライブラリー中で特定遺伝子の遺伝子頻度は同一であるという仮設と適合しうるシミュレート数である。この工程はコンピューターのランダム生成機能を用いて、ライブラリー作成の実際の実験及び前記帰無仮説下で比較される各ライブラリーの解析を行うことに対応する人工データセットを作成する。4)工程3の人工データセット中の遺伝子jについて、χi,jの代わりに工程3で生成されたランダム数を用い、fjの代わりに工程1で計算された頻度を用い、かつNiの代わりに配列決定されたクローンの総数を用いることによって試験統計値Rを計算した。5)工程4で計算されたR値を降順にソートし、一連の値の特異性(すなわち真の陰性率)について対応するR統計値を見出す。これらは前記帰無仮説下でライブラリーから得られたので、定義「真の陰性」による。6)工程3〜5を1000回繰り返して補充図2aに示される棒グラフを作成した。この棒グラフは必要な真の陰性率カットオフの関数としてR値の分布を表す。この(実験)分布の平均を実験データセットの解析用のR値カットオフとして使用する。7)観測クローン数を用いてすべての比較できるライブラリーについて実験データセットR値を計算する。以前に確証されたカットオフより大きいR値を有する遺伝子はライブラリー間で差次的に制御されるとみなされる。Computer Algebra Sysytem Mathematica 4.2(www.wri.com)(MathStaticaを含む)[56]にて、要求して入手可能なノートを用いて計算を行った。
【００５０】
高密度オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーション：5μgの全RNAからcDNAプローブを生成し、製造業者の使用説明書に従い(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)、かつ以前に記載されている通りに[7]、Mu11K(サブユニットA及びB)チップセットにハイブリダイズした。チップセットは13179の個々のマウス転写物を集団で認識するように設計されている(ここで、いずれの与えられた遺伝子の発現レベルも40個のオリゴヌクレオチドで問合せが行われ、20個は完全マッチ配列(PM)、20個は単一のミスマッチ(MM)を有する)。ハイブリッド形成したチップを標準プロトコルに従って洗浄してFluidics Station(Affymetrix)で染色し；引き続きAffymetrixスキャナーで蛍光強度を解読した。すべてのMIAME-用のマイクロアレイデータをArrayExpressデータベース(受入番号：E-MEXP-255)及び作者の対応ウェブサイト(http://www.fleming.gr/en/investigators/Aidinis/data.html)からダウンロードすることができる。
【００５１】
マイクロアレイデータの前処理及び規準化(概要を補充図3に示した)：結果の走査画像の低レベル解析(個々プローブの細胞強度のバックグラウンドサブトラクション及び計算のような)をMicroArray Suite 5.0(MAS5)ソフトウェア(Affymetrix)で自動的に行った。 要するに、いずれの与えられた遺伝子の発現の定量レベル(シグナル値)、及び発現の定性測定(検出要求)も所有者のAffymetrixアルゴリズムによって、20個のPMオリゴヌクレオチドと20個のMMオリゴヌクレオチド(プローブセット)を組み合わせたバックグラウンド調整ハイブリダイゼーション強度から計算される。この実験の全チップの全シグナル値を500又は2500の目標強度(TGT)に達するように、使用する個々のチップセットについてのAffymetrix推奨に従ってスケーリングした。スケーリングした値を規準化工程に供した。この規準化工程は、各チップサブユニットのシグナル分布が同サブユニットのチップじゅうで同一の全体形状を持つようにすることを目的とする。遺伝子発現値を2つ、各チップサブユニット(A,B)(行及び列はそれぞれ遺伝子及びチップを表す)について1つの個別データマトリックスに再編成した。BioConductorを用いてデータマトリックスの列を規準化して同変位値を有するようにした[57]。各列の各変位値をアレイじゅうの当該変位値の平均に設定した(補充図4a)。次に、2つのデータマトリックスの行をマージし、結果のデータマトリックスの列を、リウマチ性関節炎の対応動物モデル(Tg197, TNFΔARE)及びサンプル(SF又はWJ)の型に従って分割することによって合計4つの個別データマトリックスを得た。最後に、存在要求(検出要求)されないか又は少なくとも1つのサンプル中でTGTの1/5未満しか規準化シグナルを持たない遺伝子についてはさらに考慮しなかった。従って、その後の解析は残りの8021個のプローブセットについて行った。
【００５２】
マイクロアレイデータ解析：Affymetrixチップハイブリダイゼーションの比較及びリアルタイムPCRは、チップ解析が正確で信頼性があり、かつ遺伝子発現の差異を過小評価することを示した[58]。それにもかかわらず、システムの性能を評価するため、規準化シグナルのピアソン相関係数、及び検出一致(両チップで「存在」又は「非存在」要求によって一貫して検出されたプローブセットのパーセンテージとして表される)の点から、(技術的)複製サンプルの再現性を調べた。補充図4bで分かるように、Affymetrixデータは非常に再現性及び信頼性があった。
【００５３】
以前に報告されているように[59、60]、倍率変化(差次的発現の尺度として常用される)の有意性は対応する遺伝子の発現レベルに非常に依存する。従って、有意に差次的に発現される遺伝子を同定するため、固定した倍率変化閾値ではなく、以前に記載されているアプローチ[61]の変形を用いて複製チップ間のモデル強度依存性倍率変化を使用することを決めた。要するに、まず、同一実験条件下で測定した同一サンプル型(SF又はWJ)のトランスクリプトームを表す複製チップの対での比較において下記定義：
FC＝|x1−x2|／min(x1,x2)
（式中、xiはi番目のチップにおける所定遺伝子の規準化発現レベルである）を用いて倍率変化を計算した。次に、遺伝子をその2個の発現値の小さい順(すなわちmin(x1,x2))に分類し、全発現範囲を、それぞれ同数のプローブセットを含有する10間隔に分割した。各区画において、すべてのmin(x1,x2)のメジアン並びに90パーセンタイル及び95パーセンタイルの倍率変化を判定することによって、各サンプル型(SF又はWJ)及び2つの各有意性レベル(90%又は95%)について10の個別モデリング点を得た。高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイの測定可変性は、べき法則に従ってシグナル強度に依存するという観測に基づいて、対数-対数プロットで最小二乗線形フィットを用いて10のモデリング点から連続的な倍率変化モデル(FCM)を導いた。2つのFCMについて以下のモデリングパラメーターを得た(補充図4c)：SF FCMについては-0.327の勾配及び2.356の切片、WJ FCMについては-0.346の勾配及び2.678の切片。これは、WJが本質的にSFより可変性である(予想通り)であることを意味する。結果の回帰曲線の勾配(a90%又はa95%)及び切片(b90%又はb95%)を用い、各所定サンプル型(SF又はWJ)について及びいずれの所定の最小発現レベルについても90%及び95%の有意性閾値を得ることができた：
FC90%＝min(x1,x2)a90%*eb90%
FC95%＝min(x1,x2)a95%*eb95%
【００５４】
4つの各データマトリックス(すなわち、Tg197/SF、TNFΔARE/SF、Tg197/WJ、TNFΔARE/WJ)について、実験条件(病的又は正常)の観測平均倍率変化を各遺伝子について下記様式で計算した：
FCobs＝|μ1−μ2|／min(μ1,μ2)
（式中、μiはi番目の実験条件における所定遺伝子の平均発現レベルである）。複製物が利用できない場合、平均の代わりに、所定遺伝子の単一の発現レベルを使用した。次に、各遺伝子についてこの観測倍率変化を、以下の当該遺伝子のμiの観測値を与えて、対応する「サンプル型」に特異性のFCMを用いて90%(又は95%)の有意性レベルで予測される倍率変化と比較した：
FC90%＝min(μ1,μ2)a90%*eb90%
FC95%＝min(μ1,μ2)a950%*eb95%
【００５５】
最後に、FVobs>FC90%(又は>FC95%)の遺伝子を90%(又は95%、それぞれ)の有意性レベルにおいて差次的に発現されるとして選択。
量的形質遺伝子座(QTL)及び遺伝子発現データの可視化をhttp://ensembl.pzr.uni-rostock.de/Mus_musculus/expressionviewのExpression viewにおけるExpression view[62]で行った。Serrano-Fernadezら[63]からQTLデータを誘導した。
【００５６】
機能的クラスター化及び統計上の有意性の決定：遺伝子概念体系(GO)の形態の生物学的アノテーション「生物学的プロセス」用語[17]は、表2中の各遺伝子(プローブセット)について、NetAffxポータル(http://www.affymetrix.com)から得た。次に、調節が解除された機能を発見するための手段として、観測されたGO用語頻度を計算した(補充表3)。GO用語頻度の統計的有意性を基本的に以前に記載されている通りに判定した[64]。要するに、超幾何分布を用いて、NetAffxにおいて特定のGO用語で注釈されている所定数の遺伝子を観測することによって適切なp値を計算する機会の確率を得た。さらに詳細には、選択したプローブセットのリストサイズ(n)で特定のGO用語で注釈されている少なくとも(k)個のプローブセットを観測する確率を以下のように計算した[64]: 
【００５７】
【数２】
2009512429.tif 000003
【００５８】
式中、(f)は機能カテゴリー内の遺伝子の総数であり、(g)は該チップセットについてのプローブセットの総数である(13,179)。
接着アッセイ：製造業者の使用説明書に従い、ヒトフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン及びコラーゲンIで被覆したCytometrix接着ストリップ(Chemicon)で行った。
【００５９】
免疫蛍光：4%のパラホルムアルデヒド/PBSを用いて細胞を固定化し、標準的方法で染色した。F-アクチンを可視化するため、Alexa594-ファロイジン(Molecular Probes)で染色した。4G10抗体(Upstate Biotechnology)を用いてP-チロシンを検出し、モノクロナール抗体(クローン77, Transduction Laboratory)を用いてFAKを検出した。組換えマウスゲルソリンでウサギを免疫化してゲルソリンに対する抗体を産生させ、免疫血清を1:500希釈で使用した。ウェスタンブロット解析のため、10μgの全細胞タンパク質をSDS/PAGEで分離し、Immobilion-Pに転移させ、ゲルソリンについて探査し、かつ内部負荷コントロールとしてアクチンについて再探査した。
RT-PCR：TRIzol試薬(Life Technologies, Rockville, MD)を用い、製造業者の使用説明書に従って滑膜線維芽細胞及び全関節組織から全RNAを抽出した。RNAの収率と純度を分光光度的に260/280nmにて決定した。MMLV逆転写酵素及びオリゴ-dT15(Promega)を用いて第1鎖cDNA合成を行った。
【００６０】
半定量的PCRを、95℃で30秒間の変性、57〜62℃(各個々のプライマーセットのTmによって決まる)で30秒間のアニーリング及び72℃で1分間の伸長の20〜25サイクル(20μlの最終体積で)によって行った。産物を1.5%のアガロースゲル上の電気泳動で分離して臭化エチジウムで染色した。GelWorcs 1D Advanced(v.4.01)で産物強度を定量化し、B2m及び/又はL32の強度に規準化した。プライマーを選択して2つのエクソンを架橋し、Primer Bankデータベース(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)から2つのコントロールプライマーを選択した。プライマー配列(5'→3'、s:センス；as:アンチセンス)及び産物サイズ(bpで)は以下の通りだった：
【００６１】
Aqp1 (s:TCACCCGCAACTTCTCAAAC as:AGCTCTGAGACCAGGAAACA, 400), 
Bsg (s:ATGAGAAGAGGCGGAAGCCA as:CCACTCCACAGGGCTGTAGT, 426), 
CD14 (s:CAATCCTGAATTGGGCGAGA as:CGAGTGGGATTCAGAGTCCA, 400), 
CDC42 (s:AAGTGGCCCAGATCCTGGAA as:AGCACTGCACTTTTGGGGTT, 380), 
Gsn  (s:TGCAGGAAGACCTGGCTACT as:ATGGCTTGGTCCTTACTCAG, 300), 
Hp (s:GAAGCAATGGGTGAACACAG as:GGGGTGGAGAACGACCTTCT, 331), 
Marco (s:CACAGGAATTCAAGGACAGA as:ATTGTCCAGCCAGATGTTCC, 397), 
Mglap (s:CAGTCCCTTCATCAACAGGA as:CTGCAGGAGATATAAAACGA, 274)
Mb (s:TCACACGCCACCAAGCACAA as:TGGGCTCCAGGGTAACACTG, 354), 
Ptgis (s:TCACAGATGACCACACTCCC as:GCAGTAGGACGACAAATTGT, 403), 
B2M (s:TTCTGGTGCTTGTCTCACTGA as:CAGTATGTTCGGCTTCCCATTC, 104)及び
L32 (s:TTAAGCGAAACTGGCGGAAAC as:TTGTTGCTCCCATAACCGATG, 100)。
【００６２】
iCycler iQ Real-Time検出システム及びIQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad Laboratories)を用い、製造業者の使用説明書に従って、94℃で4分間及び40サイクルの変性/アニーリング(95℃で50秒；57〜62℃で50秒)で定量的リアルタイムPCRを行った。大イントロンで分離されるエクソンからプライマーを選択し、融解曲線解析及びゲル電気泳動によってPCRの質と特異性を検証した。値をB2m及び/又はL32に規準化した(半定量的PCR用と同じプライマーを用いて)。マウス(m)及びヒト(h)プライマー配列及び予測長さは以下の通りだった：
mAqp 1 (s:TCACCCGCAACTTCTCAAAC as:TCATGCGGTCTGTGAAGTCG, 123), 
mGsn (s:TGCAGGAAGACCTGGCTACT as:TCGATGTACCGCTTAGCAGA, 130). 
hAqp 1 (s:CTCCCTGACTGGGAACTCG as:GGGCTACAGAGAGGCCGAT, 182), 
hBsg  (s:TTCCTGGGCATCGTGGCTGA as:GCGGACGTTCTTGCCTTTGT, 159), 
hCd14 (s:CGGCGGTCTCAACCTAGAG as:GCCTACCAGTAGCTGAGCAG, 142),
hcdc42 (s:AATTGATCTCAGAGATGACC as:TTTAGGCCTTTCTGTGTAAG, 150) 
hGsn (s:GGTGTGGCATCAGGATTCAAG as:TTTCATACCGATTGCTGTTGGA,199),
hMarco (s:TGGGACGAGATGGAGCAAC as:CCCTTAGTTCCAGTTTCCCCTT, 193),
hMb (s:TTGGTGCTGAACGTCTGGG as:CTGTGCCAGGGGCTTAATCTC, 249), 
hB2M (s:CTGAAAAAGATGAGTATGCC as:ACCCTACATTTTGTGCATAA, 202)及び
hL32 (s:TTAAGCGTAACTGGCGGAAAC as:GAGCGATCTCGGCACAGTAA, 210)
【００６３】
関心のある遺伝子(gene of interest)(GOI)及びコントロール構成遺伝子(HKG；L32及び/又はb2m)のそれぞれについてiCycler iQソフロウェアから増幅効率(η；80〜120%)と共にサイクル閾値(Ct；増幅が検出されうる最初のサイクル)を得た。マウスサンプルについては、下記式：相対的発現＝2-(S ΔCt-R ΔCt)(式中ΔCt=GOI Ct- HKG Ct)を利用する遺伝子発現-相対的数量化Microsoft(登録商標)Excel(マクロ含む)(Bio-Rad Laboratories)を用いてサンプル(S)のwtコントロールに対する相対的発現を基準サンプル(R)として計算した。ヒトサンプルでは、基準サンプルの段階希釈(二倍で)によって作成した標準曲線を利用してCt値を濃度値(ng/ml)に変換した。値を対応する基準(構成)遺伝子の値に規準化し、発現指標として提示した(可視化目的のため対数目盛で)。
【００６４】
関節炎のスコア及び組織病理学：パラフィン埋込み関節組織サンプルを切断してヘマトキシリン及びエオシンで染色した。以前に記載された通りに、半定量的(0〜5)スコアリングを用いて、滑膜肥厚化、炎症部位の存在、軟骨破壊及び骨侵食について別々に関節炎の組織病理学を評価した(盲検法で)[65]。
透過型電子顕微鏡：足首関節(各マウス(3匹のTg197と3匹のwt)の右後肢から切開した)を脛骨と距骨の間の正中線を通って縦に裂き開き、PBS(pH 7.4) O/N中2.5%のグルタルアルデヒドで前固定化した。PBS中1%の四酸化オスミウムで2時間後固定化後、段階系列のエタノールで脱水してアラルダイト中で処理した。半薄切片(1.0μ)をカットし、メチレンブルーで染色して光学顕微鏡で配向を観察した。次に、超薄切片(80〜90nm)を超ミクロトーム(Riechert-Jung Ultracut E)でカットし、銅グリッド上で標本にし、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で対比染色し、電子顕微鏡(CM120 Biotwin, FEI Company)で評価した。
【００６５】
〔結果〕
RAの病原に関与する遺伝子及び細胞経路を大規模で発見するため、異なる拘束によって支配され、かつ異なる統計学で解析される2つの全く異なる方法論を含んでなるツイン高処理能力アプローチを行った。6週齢の関節炎(RA；疾患重症度指標3、図4参照)マウス(Tg197、hTNF+/-)[5]及びその正常な(wt)同腹の子から単離した全関節(WJ)と滑膜線維芽細胞(SF)のex vivo培養から全RNAサンプルを抽出した。各サンプル(4種から：RA SF、wt SF、RA WJ、wt WJ)は、4匹(2匹のオスと2匹のメス)のマウス(合わせて16匹のマウス)からプールした等量のRNAから成り、(ある程度)生物学的多様性を等しくした。同様のサンプル(生物学的複製物：異なる抽出、同じ貯蔵戦略)をサブトラクティブcDNAライブラリーの作成、並びにオリゴヌクレオチドマイクロアレイのハイブリダイゼーションの両方のために使用した。
【００６６】
サブトラクティブcDNAライブラリー及び大量配列決定：「材料と方法」で述べたように、λ-FLCIベクターでクローン化することによって、全長cDNAライブラリーをキャップ-トラッパー(cap-trapper)法で構築した。補充図1aに概要が示されるように、固相増殖及びプラスミド切取り後、4つの異なるcDNAライブラリー(RA SF、wt SF、RA WJ、wt WJ)を相互規準化かつサブトラクトした。規準化は「自己」ライブラリーから生成されたドライバーとの該テスターライブラリーの低CoTハイブリダイゼーションを意味し、高度に発現したmRNAの提示の低減を目的とする。サブトラクションは異なるライブラリーから生成されたドライバーとの高CoTハイブリダイゼーションを意味し、両集団共通のmRNAの除去を目的とする。実験デザインのため、結果のサブトラクテッドライブラリー(L0、L1、L2及びL7)はテスターcDNAライブラリー由来のcDNAを含むので、対応するテスターライブラリー中の上方制御された遺伝子の(又はドライバーライブラリー中の下方制御された遺伝子の)ライブラリーを構成する。「材料と方法」に記載され、かつ補充図1bに要約されているように、前記サブトラクテッドライブラリーの27511 cDNA/クローンを配列決定し、9176のクラスター/遺伝子にクラスター化した。次に、「材料と方法」で述べたように、Unigene、FANTOM及びSWISSPROTデータベースでBLASTホモロジー検索を通じて各遺伝子に注釈をつけた。要するに、見つかった9176個の遺伝子のうち、7977個が既知遺伝子に対応し、1199個の遺伝子は以前に報告されていない配列を有した。ほとんどすべてのライブラリー内において、サブトラクション効率と転写物の存在量に正比例する種々の数のクローンで各遺伝子を表した。各ライブラリー内の各遺伝子の相対分布は、クローンを選択するとき偶然に生じるサンプリングエラーによって不鮮明になりうる差次的発現の真の尺度である。従って、かつ真に差次的発現される遺伝子を同定するため、対での相対ライブラリー(SF/L0L1、WJ/L2L7)の比較から各遺伝子に公算値(R)を割り当てた。次に「材料と方法」に記載され、かつ補充図2に提示されるように統計的有意性の閾値を計算した。2つの有意性レベルを選択した(表1aで要約)：独立して結果を報告するための非常に高いレベル(99.99%；p≦0.0001)及びDNAマイクロアレイハイブリダイゼーションの対応する結果と比較するためのより低いレベル(99%；p≦0.01)。既知(UnigeneクラスターIDで)の99.99%の有意性レベルで差次的に発現される遺伝子を補充表1に提示する。
【００６７】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイハイブリダイゼーション：全RNA(RA SF、wt SF、RA WJ、wt WJ)の同様の(生物学的複製物、上記参照)サンプルから調製した標識化cRNAプローブを利用してAffymetrix Mu11KオリゴヌクレオチドDNAチップセット(8チップセット、全部で16チップ)にハイブルダイズした(二通りで)。さらに、関節炎の別の動物モデル(自発性ノックイン,TNFΔARE+/-)[8]由来の全RNA(SF及びWJから)の同様のサンプル(4匹−2匹のオスと2匹のメス−の6週齢の関節炎マウス；重症度指標3からプールした等量のRNA)をさらなるチップハイブリダイゼーション(4チップセット、全部で8チップ)のために使用した。補充図3に概要を示し、「材料と方法」及び補充図4で詳述したように、MIAME-対応の[9]マイクロアレイデータ(ArrayExpressデータベース[10]で見つかる、受入番号：E-MEXP-255)を規準化及び解析した。「材料と方法」で述べたように、異なる有意性レベル(90%/p≦0.1及び95%/p≦0.05)でサンプル特異性の倍率変化モデル(FCM)[11]を利用して、差次的発現遺伝子(DEG)を選択した。ここで、選択されるDEGは常に、予測される倍率変化より高い観測倍率変化を有する。両動物モデルの結果を表1bに要約する。両動物モデル(有意性：95%,p≦0.05)で共通のサンプル特異性の差次的発現遺伝子を補充表2に提示する。
【００６８】
クロスプラットフォームの比較及び確証：上述した両差次的発現解析法は高い統計的有意性の調節が解除された遺伝子のリストを作成した。この結果を独立に確証するため、かつ非常に多くのRT-PCRの実施を回避するため、同一の動物モデル(Tg197、hTNF+/-)及びサンプル型(WJ、SF)、並びに同方向(上方又は下方)の調節が解除された発現について、両プラットフォームの解析による差次的発現結果を相互に比較した。ライブラリーでは99%及びマイクロアレイでは90%の有意性レベルでの比較(同様の出力遺伝子数に基づいて選択)をNetAffxデータベース(www.affymetrix.com)を通じて行った。顕著に(発現プロファイリングクロス-プラットフォームオーバーラップの例がほとんどなかったので[12,13])、46((SFで15；WJで31)個の遺伝子が両方法で共通して上方/下方制御されると予測された(表2)(0.001の組合せp値)。
【００６９】
ツイン高処理能力アプローチの妥当性を確証するため、かつ報告遺伝子リストが精度保証されることを立証するため、いくつかの調節が解除される予測遺伝子を種々の方法で確認した。ノックイン疾患モデル(TNFΔARE+/-、表2)で40個の遺伝子も調節が解除されると予測さた。20個の遺伝子はBiolab Experiment AssistantTMテキストマイニングソフトウェア(BEA, BIOVISTA, Greece)を通じて同定されたので、文献で以前にRAと関連すると報告された(補充図5；表2に要約)。11個の代表遺伝子(SF：Gsn、Aqp1、mglap、cdc42 hom.、Hp；WJ：Marco、Hp、CD14、Mb、Bsg、Ptgis)をさらに半定量的(SQ)RT-PCR(補充図6a、6b、6c、表2に要約)で確認した。サブトラクティブライブラリー及びマイクロアレイハイブリダイゼーションの両方で使用するためのサンプルの生物学的反復実験(同じ貯蔵戦略)における反応の線形範囲で(構成遺伝子に対して規準化された3つの異なる濃度で)すべてのSQ-RT-PCRを行った。i)異なるサンプル源：WJから6個及びSFから5個、ii)調節が解除される発現の異なる方向と程度：6個の上方制御と5個の下方制御及びiii)生物学的関心と潜在的追跡に基づいて代表遺伝子を選択した。さらに、そのうちの2個(SF：Gsn、Aqp1)はリアルタイムRT-PCRでも確認した(補充図6e、表2に要約)。
【００７０】
遺伝子発現解析を遺伝子連鎖解析と併用する試みでは、関節炎の誘発動物モデルであるコラーゲン誘発関節炎(CIA)[14]について、既知の量的形質遺伝子座(QTL、量的形質による染色体領域/遺伝子分離)と共にすべての差次的発現遺伝子を染色体にマッピングした。図1でグラフ的に示し(かつ表2に要約し)たように、8個の遺伝子をCIA QTLにマッピングし(WJ：Ctss、Pitpnm、Ncf1、Psmb8、Siat8e、SF：Rab14、Aqp1、及びGsn)、選択した遺伝子リストの妥当性をさらに示した。関節炎マウス内で調節が解除されることが分かり、かつマウスサンプルのRT-PCRで確認した7つの遺伝子の発現レベルは、リアルタイムRT-PCR解析にてヒト患者のRNAサンプルでも調べた。正常な(wt)ヒト滑膜サンプルを欠いているため、19個のRAサンプルの発現をコントロールとして8個の骨関節炎(OA)サンプルの発現と比較した(関節炎の差次的発現解析のコンセンサス戦略[15,16])。図2に示され、かつ表2に要約されるように、高い統計的有意性(Gsn、Aqp1、Bsg、Mb)の4個を含め、6個(解析した7個のうち)の遺伝子の調節が解除された発現がヒトでも同様に確認されので、マウスモデル作成調節解除遺伝子リストの妥当性と有用性をヒト疾患に拡張した。
【００７１】
関節炎の滑膜線維芽細胞は再編成された細胞骨格を有する：上述したツイン高処理能力発現プロファイリングアプローチは、高い統計的有意性の、大くの疾患に関係する調節が解除された遺伝子をもたらした。さらに、かつi)該発現データ解析の妥当性を立証し、かつ有用性をさらに拡張するため、ii)該遺伝子発現データから調節が解除された生体機能を推測するため及びiii)さらなる遺伝子選択のための機能的基準を定義するため、選択された遺伝子に遺伝子概念体系(GO)[17]用語「生物学的プロセス」の形態で注釈をつけた。次に、「材料と方法」で述べたように、選択された遺伝子リスト中のGO用語頻度を計算してその統計的有意性を評価した。補充表3に示されるように、SF中の予測された調節が解除された機能は、予想通りに、コラーゲン代謝、補体活性化、免疫応答及びストレス応答を包含する。興味深いことに、26のうち5という統計的に有意な(p<0.01)調節解除GO機能がアクチン細胞骨格に(直接又は間接的に)関係していたことから、関節炎SFは再編成されたアクチン細胞骨格を有することを示唆している。この予測を確証するため、関節炎のSF及びwt SF(両方初生及び不死化)上in vitroでF-アクチンを可視化した。図3aから明らかなように、関節炎SFは顕著なストレスファイバーを示すので、in silico発現ベース仮説を確証している。線維芽細胞内のストレスファイバーは、創傷治癒の必須プロセスである、その周囲の細胞外マトリックス(Extra Cellular Matrix)(ECM)に緊張を及ぼさせる。アクチン細胞骨格の差異はECM付着特性の変化を反映し、及び/又は逆も同様であることが十分予想される。実際、関節炎SFは、異なる特性のECM(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン及びコラーゲン)に高いアフィニティーで付着することがin vitroで示された(図3b)。
【００７２】
主に膜貫通インテグリン分子の関与とクラスター化によって媒介されるECMへの付着(及び関連する細胞骨格の変化)は、細胞の形状と形態及びその挙動と運命を大雑把に定義する。ECMへの高い接着力は、より伸長した形状をもたらすと予想される。関節炎線維芽細胞の高い接着力をin vivoで確認するため、関節炎又はwtの同腹のマウス由来の足首関節を透過型電子顕微鏡で超構造レベルについて調べた(図3c)。wtマウスでは、SFは顕著な核、大量の自然のままの小胞体(r-ER)及び種々の形状と大きさのミトコンドリアを含んだ。対照的に、関節炎マウスの関節ではSFの顕著な変化が見られ、ランダムに扁平な細胞(そのほとんど)が、r-ERの膨張及び歪んだクリステで腫れたミトコンドリアによって特徴づけられる伸長した形状を有した。
【００７３】
このようにして我々はRAの新しい病原機序を見出した：アクチン重合の促進及びアクチン細胞骨格の再編成。ゲルソリン(Gsn)はCIA QTLの1つに位置する遺伝子であり(図1)、その発現は関節炎SFで下方制御されることがサブトラクティブライブラリー及びマイクロアレイハイブリダイゼーションの両方で分かった。その調節が解除された発現は、マウス(補充図5b、5c及び5e)とヒト(図2)の両サンプルについてリアルタイムRT-PCRで、並びに不死化SFにおけるウェスタンブロット(補充図5d)で確認された。この遺伝子はフィラメント切断特性を有するアクチン結合タンパク質をコードし[18]、かつGsn-/-線維芽細胞は過剰なアクチンストレスファイバーを有し[18]、関節炎SFで観察される特性に非常によく似ている(図3a)。RAの病原における細胞骨格の組織化の関与を立証するため、及びその中でのゲルソリンの役割を強調するため、関節炎マウス(Tg197、hTNF+/-)をgsnノックアウトマウス(gsn-/-)と番わせた[18]。予想通りに、SFからgsn発現をノックアウトすると、gsnの切断活性を阻害することによってRA病原を促すだろう。図4に示されるように、gsn発現の廃止は滑膜の肥厚化及び関節炎の悪化をもたらした。
【実施例２】
【００７４】
〔材料と方法〕
実施例2では特に断らない限り、実施例1の材料と方法を用いた。
マウスのコフィリン1及びVASPのSQ及びQ-RT-PCR解析：
細胞培養、全関節組織とex-vivo滑膜線維芽細胞の両細胞培養からのRNA抽出及びRT-PCR条件に関する詳細はAidinisら(2005)に記載されている。mコフィリン1に特異的なプライマーは、s:TGGGTGAAACTCTGGGAGAT as: CCATAGTGGAAGCCTGATGC, 399bp、及びmVASPではs: CTTGCCAAGGATGAAGTCG as: GCTTCACCCTCTCCAAGT, 98bpだった。
創傷治癒アッセイ：
コンフルエント(3×105/ウェル)で培養した細胞を6-ウェルプレート(10%のFCSと100単位/mlのペニシリン/ストレプトマイシンで補充したDMEM中、37℃、5%のCO2)に接種して24時間付着させた。次の日、細胞を培地中10μg/mlのマイトマイシンC(Sigma)で37℃にて2時間処理して細胞増殖を遮断した。ピペット先端のエッジで細胞の単層を擦って傷をつけて直線を形成することによって創傷治癒アッセイを行った。次に、細胞を成長させ、擦過後0、24及び48時間に写真を撮った。
アポトーシスアッセイ：
コンフルエントなマウス滑膜線維芽細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄し、血清の無いDMEN内に24時間置いた。次の日、1.5×104個の細胞を96-ウェル丸底プレート(Costar, Corning Inc.)の各ウェル中、100μlの培地プラス血清内に蒔いた。24時間後、細胞を12.5〜100ng/mlのTNFαプラス0.5〜3μg/mlのシクロヘキサミド(CHX)、30〜300μMのエトポシド及び0.01〜1μMのスタウロスポリンで24時間37℃にて一晩処理した。クリスタルバイオレットアッセイを用いて細胞の生存率を決定した。以前に記載されているように、マイクロプレートリーダー(SPECTRAmax PLUS384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)で570nmでの存在量を決定した(Aidinis et al, 2003)。結果は、三通り行った代表実験の平均±S.E.で表される。スチューデントt検定を用いてp<0.05の有意性レベルで統計解析を行った。
薬物処理−in vitroアッセイ：
以前に記載されているように、37℃で2時間4μg/mlのラトランクリンA(Sigma)でアクチン細胞骨格の破壊を誘発した(Spector et al, 1989)。アクチン-細胞骨格組織化におけるTNFα関与のコントロールとして、同じ時間、細胞上に1μg/mlの抗-TNF(Infliximab)を添加した。
【００７５】
〔結果〕
SQ-RT-PCRを用いてTg197マウスモデルにてマイクロアッセイで同定した調節が解除された遺伝子(DEG)の確証：
全RNAを5〜8匹のTg197マウスから(全関節組織とex-vivo滑膜線維芽細胞の両細胞培養から)抽出してプールした。比較群のため、全RNAを野生型の同腹の子から(全関節組織とex-vivo滑膜線維芽細胞の両細胞培養から)抽出してプールした。結果を表3に示す。
細胞骨格の配置に影響を及ぼす好ましいタンパク質として、アクチンフィラメントの核形成、構築、分解、架橋及び/又は重合しないアクチンの大きさ、局在化及び動態を制御するアクチン結合タンパク質が挙げられる。本発明では表4のタンパク質が好ましい。特に好ましいタンパク質として、ゲルソリン遺伝子、VASP及び/又はコフィリンによって発現されるタンパク質が挙げられる(Galler et al, 2006; Hotulainer et al, 2005; Paavilainen et al, 2004)。その他、Autotaxin及びSHIP2等(Song et al, 2005; von Wichert et al, 2003)。これらの遺伝子は、アクチン細胞骨格の再編成をもたらすシグナル伝達経路で主要な約割を果たす。
コフィリン1(非筋コフィリン)は、ゲルソリンと同様にアクチンフィラメントを解重合して切断することによって、アクチンの動態を促進する(Hotulainer et al, 2005)。図5が示すように、コフィリン1はTg197の全関節と滑膜線維芽細胞の両方で野生型のものより下方制御された。
【００７６】
Tg SFにおけるVASPの遺伝子発現状態を評価するため、全関節サンプルとex-vivo滑膜線維芽細胞の両細胞培養(SQ-RT-PCR用の材料と同一材料)でQ-RT-PCRを行った。驚くべきことに、VASPは、野生型の同腹の子に比べてTgマウスの全関節で過剰発現されるが、SFでは不十分発現されることが分かる(図6)。この知見は予想外であるが、おそらくVASP発現とリンクしうる関節炎関節内の別の細胞型の存在を示唆しているであろう。興味深いことに、関節炎の滑膜内における筋線維芽細胞の存在の可能性のいくつかの示唆がある(Aidinis et al, 2005)。筋線維芽細胞は、創傷治癒及び病的収縮中の張力を証明するするのに非常に重要な役割のある分化型線維芽細胞である(Tomasek et al, 2002)。
細胞骨格に関与することが分かっている遺伝子のKOマウスを(i)該疾患を悪化させる目的、(ii)該疾患を軽減する目的及び(iii)滑膜線維芽細胞に特異的な疾患を生じさせる目的でTg197及び/又はコラーゲンVI-Creノックアウトと交雑した。
in vitroで示されるように、VASPはアクチン細胞骨格内においてF-アクチン形成を促すための重要なプレーヤーであり、in vivoでアクチン重合を調節かつ促進する(Hauser et al, 1999)。本発明では、VASP KOとTg197の交雑は該疾患の寛解をもたらすと予想する。
コフィリンはゲルソリンと同様にアクチンフィラメントを解重合して切断するので、本発明では、コフィリンKOとTg197の交雑は該疾患の悪化をもたらすと予想する(Gurniak et al, 2005)。
LST-1はTg197由来の全関節内で過剰発現されることが分かったが(Aidinis et al, 2005)、in vitro研究では、この遺伝子を長い糸状仮足の生成、ひいてはF-アクチンの蓄積によって細胞骨格の機能と関係づけている(Raghunathan et al, 2001)。この遺伝子のKOの生成とTg197との交雑は、さらに細胞骨格関連リウマチ性関節炎におけるこの遺伝子の関与の証拠を提供する。
RhoA、Rac及びCdc42は、アクチン重合を誘発することが分かっているGTP-結合タンパク質のRhoファミリーに属する(Lamarche et al, 1996)。これらの遺伝子の条件付アブレーション(Chrostek et al, 2006)並びにColVI-Cre及びTg-197との交雑は滑膜線維芽細胞に特異的な疾患を寛解させるだろう。同様の結果が、いくつかのアクチン-細胞骨格遺伝子(RhoA、Vinculin、Actin)の発現を調節する転写因子であり、かつそのアブレーションは低F-アクチンレベルと低い接着及び移住能力をもたらすことが分かっている(Wiebel et al, 2002)血清応答因子(SRF) KOとの交雑から予測される。
オートタキシン(Aautotaxin)(ATX)の条件付KOモデルは、RAにおける細胞骨格の再構築の役割を支持するためにも利用される。活性化した肥厚性のRA滑膜線維芽細胞(SF)は、そのアクチン細胞骨格の再編成及び調節が解除されたECM接着力を示し、関節炎の滑膜の腫瘍様の挙動を説明することができる。種々の腫瘍で高度に発現される、オートタキシン(ATX)-リゾホスホリパーゼDの酵素産物であるリゾホスファチジン酸(LPA)は、多くの細胞型で細胞骨格の再編成、増殖及び移住を誘発することが分かっている重要な脂質媒介物である。予備研究はATXの発現がTg197由来のSFで上方制御され、かつex vivo培養RA SFはその野生型対応物より有意に多くのATXタンパク質を分泌することを示した。
【００７７】
ex-vivo初生滑膜線維芽細胞の特性(移住、接着、増殖及びアポトーシス)を試験するためのin vitroアッセイの開発：
ここで、Tg SFが野生型マウスの表現型に比べて異なる表現型を示すことを提案する。Tg SFはアクチン細胞骨格を再編成し、かつ顕著なストレスファイバーを示すことが分かった。我々は、Tg SFがin vitroで高いアフィニティーでECMのタンパク質に接着し、野生型マウスに比べて大きい運動性を有することも示した。この高い接着力はSFのより伸長した形状をもたらす。この理由のため、接着、移住、増殖、創傷治癒及びアポトーシスといったいくつかのin vitroアッセイを開発/標準化した(図7)。
これらのin vitroアッセイは、Wt SFに比べて高い接着、移住及びアポトーシス耐性といった異なるTg SFの特性を実証し、さらに増殖は増える。発現を標的にすると、細胞骨格関連遺伝子(例えば好ましくはゲルソリン、VASP、コフィリン1及び/又はアクアポリン1)は細胞骨格配置に影響する。該遺伝子の発現をノックダウンすると、SFのアクチン細胞骨格機構に影響を及ぼし、これは上記アッセイで明らかになる。
F-アクチン重合のインヒビターであるラトランクリンA(Lat-A)の効果に関するin vitroアッセイは(Giganti and Friederich, 2003)、Tg197滑膜線維芽細胞の細胞骨格特性を変える際のアクチン-薬物の可能性を示した。詳細には、Lat-Aによる処理がTgSFの接着力を減少させながら、移住はWtに比べて増えたようである(図8)。これは、Lat-A処理と筋原線維の以前の知見(Wang et al, 2005)と調和している。同時に、抗-TNFで処理したTg SFが接着/移住特性の変化を示さず、この効果がTNFで作動されないことを示唆している。さらに、Lat-Aによる処理はTgSFの増殖レベルに劇的な効果を及ぼし、WtSFの増殖レベルよりさらに減少するようであるが、DMSO及びTNFαはTgSFラットの増殖に作用しない(図9)。最も重要なことに、細胞死の誘発因子としてスタウロスポリンを利用するアポトーシスアッセイは、細胞骨格のLat-A分布はWt SFレベルでのアポトーシスに対する耐性を減少させることを明らかにした(図10)。この結果は、サイトカラシンD(急速なアクチン重合のインヒビター)による処理がHeLa細胞内でアポトーシスを促すが、ファロイジン(アクチン重合の誘発因子)はアポトーシスに影響を及ぼさないことを示す以前の知見(Kulms et al, 2002)に従っている。
【００７８】
ヒトRA及びOAサンプルについて、選択した調節が解除された遺伝子(DEG)のQ-RT-PCRによる確証：
本特許は、「表A、B及びCから選択したDEGを定量的RT-PCR(Q-RT-PCR)によって解析すると、炎症性関節炎(IA)の非存在又は存在との良い相関関係を提供しうる」と述べる。この目的のため以下の基準に基づいていくつかの遺伝子を選択した(すなわち、C3、CstB、Dusp1、LSP1、PITPNM、RAB14、SHIP2、TGFB1I4、TIMP1、TIMP3、TUBA1、C1QA、SHIP、LST1)：a)Tg197マウスモデルでSQ-RT-PCR解析による確証後、差次的発現の最高レベルを示したDEG；b)Tg197マウスマイクロアレイデータで同定され、かつアクチン細胞骨格の制御で重要なプレーヤーであるDEG；及びc)マイクロアレイ実験(SHIP及びSHIP2)で同定されなかったが、アクチン細胞骨格の機序に関与することが分かっている、興味のある候補遺伝子。
上記課題を果たすため、Wilson博士の研究室(University of Sheffield, UK)との共同研究を樹立した。Wilson博士は我々にRA及びOA患者のバイオプシー由来の十分な量のcDNAを提供することに同意した(Ethics no: SSREC 01/333；プロジェクトタイトル「RAにおけるサイトカイン遺伝子の制御」)。詳細には、米国リウマチ学会(American College of Rheumatology)(以前は、米国リウマチ協会(American Rheumatism Association))の1987年の改訂基準に準拠して定義されるRAの患者(n=21)から関節交換手術の際に滑膜線維芽細胞を得た。膝関節交換手術を受けている骨関節炎(OA)の患者(n=12)からも滑膜線維芽細胞を得た。国家倫理規定に従い、対応する地方倫理委員会で実施されるように、患者のインフォームドコンセントを得た。
以前に記載されているように定量的リアルタイムPCRを行った(Aidinis et al, 2005)。大イントロンによって分離されるエクソンか又はエクソン境界からプライマーを選択し、融解曲線解析及びゲル電気泳動法によってPCRの質と特異性を検証した。値をB2M及びL32の両方に規準化した。ヒトプライマー配列及び予測長は以下の通りだった(5'→3'方向かつs;センス及びas;アンチセンスと表す)：hC3 (s, GGCCTTTGTTCTCATCTCGCT; as, ATAGGATGTGGCCTCCACGTT, 274bp), hCSTB (s, CCTGTGTTTAAGGCCGTGTCAT; as, GGAGAGATTGGAACACTCGCAG, 115bp), hDUSP1 (s, ACAAGGCAGACATCAGCTCCTG; as, TAAGCAAGGCAGATGGTGGCT, 130bp), hLSP1 (s, CAACAATTAAGAGCACCCCATC; as, TGGCAACAGGAAGCAACTTCT, 223bp), hRAB14 (s, GCTTATTGTTCCTCGAAGCGAG; as, ATCCAAGCTTCCATCCTGAATG, 107bp), hSHIP2 (s, GGCTCGGAGGAACCAAAACTAC; as, TGAGGTCCCCAAACCAGAAGA, 119bp), hTGFB1I4 (s, TAGCTCCTCTGGTGCAAGTGTG; as, TCCACTTCTTCTCTGACCGCA, 102bp), hLST1 (s, CGTGATGAGGAACTTGAGG; as, GCGATAACATTAGGTCAGGG, 114bp)。
研究した8個の細胞骨格関連DEGのうち、5個はヒトサンプルで同一パターンの調節が解除された発現を示したので、さらなる調査に値する(図11)。また、別の重要な結論は別の集団において、RA患者のゲルソリンの遺伝子産物の下方制御という有意な関連性である。これはRA患者の病原におけるゲルソリンとアクチン-細胞骨格の再編成との関連性を強化する。
【００７９】
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【００８０】
表１. サブトラクティブライブラリー及びマイクロアレイハイブリダイゼーションの要約結果
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a.サブトラクティブライブラリーの要約結果。全遺伝子：統計的に有意な調節が解除されたクラスター/遺伝子の数；Unigene：UnigeneクラスターIDを有する全遺伝子の数；FANTOM：FANTOM受入番号を有する全遺伝子の数。b.オリゴヌクレオチドマイクロアレイハイブリダイゼーションの要約結果。数はAffymetrixプローブセットに相当する。a及びb. SF：滑膜線維芽細胞、WJ：全関節；パーセンテージは統計的有意性を示す。*表2に示されるクロス-プラットフォーム比較で使用される遺伝子；**補充表1に示される遺伝子；***補充表2に示される遺伝子に対応するプローブセット；
【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
表４ アクチン-細胞骨格の動態及び組織化の重要な制御因子
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【００８５】
表５.リウマチ性関節炎のマウスモデル
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【００８６】
表６.Tg197との交雑によるリウマチ性関節炎の新規マウスモデル及びRAの病原における細胞骨格の組織化の関与(KO,ノックアウト；GT,遺伝子トラップ)。
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】RA動物モデルで同定された調節が解除された遺伝子の染色体の局在化を、コラーゲン誘発関節炎(Collagen Induced Arthritis)(CIA)の量的形質遺伝子座(Quantitative Trait Loci)(QTL)と共に示す。赤/緑矢印はそれぞれ上方/下方制御遺伝子を示す。黒/青文字はそれぞれ全関節/滑膜線維芽細胞内の調節が解除された遺伝子を表す。
【図２】ヒト患者サンプルにおける調節が解除された発現の確証を示す。19個のRAサンプルと8個のOAサンプルの指示遺伝子について定量的RT-PCRを示す。値をB2mの発現に規準化し、発現指標として表した。同様の結果をL32に対する規準化について得た。ノンパラメトリックなマンホイットニー(Mann-Whitney)の統計検定に準拠してp値を得た。
【図３】関節炎のSFは再編成された細胞骨格と高いECM接着力を有する。aはF-アクチンについて関節炎(RA)又は正常(wt)の初生及び不死化滑膜線維芽細胞(それぞれpSF及びiSF)の免疫蛍光を示す。bは精製ECM成分に関する関節炎又は正常の初生及び不死化SFの接着アッセイを示す。cはwtマウス及び関節炎マウスから単離した足首関節由来の滑膜線維芽細胞(SF)の透過型電子顕微鏡(TEM、倍率5000倍)写真を示す。Nは核；r-ERはラフな小胞体；矢じりはr-ERの拡大を示し；矢印は歪曲したクリスタで腫れたミトコンドリアを指す。
【図４】ゲルソリン発現のノックアウトは疾患(RA)の悪化をもたらす。aは組織病理学的スコアを示す(*p=0.025、n=8〜11)。bは関節炎の関節の代表的な組織病理学解析(H/E)を示す。示される画像は複数の重なり断面から構築された。矢印は滑膜を示す。
【図５】Tg197動物モデルにおける非筋コフィリンのSQ-RT-PCR解析を示す。
【図６】野生型の全関節及び滑膜線維芽細胞に対するTg197モデルにおけるmVASPのQ-RT-PCR解析を示す。
【図７Ａ】Tg SF対Wt SFの特性を研究するin vitroアッセイで、TG SFはフィブロネクチンへの高い接着力を示す(平均バックグラウンド(BSAへの接着)値を減算した三通りの平均値。3つのうち代表的実験(t-検定；p<0.05))。
【図７Ｂ】Tg SF対Wt SFの特性を研究するin vitroアッセイで、TG SFはフィブロネクチンへの高い移住を示す(平均バックグラウンド(BSAへの接着)値を減算した三通りの平均値。3つのうち代表的実験(t-検定；p<0.05))。
【図７Ｃ】10%FBSの存在下又は非存在下における処理48時間後のDNA合成/増殖アッセイを示す。値は[3H]チミジン取込みを表す(×103)。三通りの平均(t-検定；p<0.05))。
【図７Ｄ】マイトマイシンCで2時間処理した創傷治癒のアッセイを示す。創傷後0時間と24時間に写真を撮った(0時間は示さず)。
【図７Ｅ】シクロヘキサミドによるTNF細胞毒性アッセイを示す。24時間後にクリスタルバイオレットアッセイを用いて生存率を決定した。
【図７Ｆ】30〜300μMのエトポシドを用いたアポトーシスアッセイを示す。
【図７Ｇ】0.01〜1μMのスタウロスポリンを用いたアポトーシスアッセイを示す。この図は、Tg-SFの特性の1つはTg-SFがWt-SFに比べて高い増殖を示すことを示す(高い接着力、移住及びアポトーシスに対する耐性に加えて)。
【図８Ａ】Tg197アクチン-細胞骨格特性に及ぼすLat-Aの効果を示す接着アッセイを示す。
【図８Ｂ】Tg197アクチン-細胞骨格特性に及ぼすLat-Aの効果を示す移住アッセイを示す。
【図９】Tg197滑膜線維芽細胞のアポトーシスに及ぼすLat-Aの効果を明らかにする増殖アッセイを示す(p<0.05、スチューデントのt-検定)。
【図１０】Tg197滑膜線維芽細胞のアポトーシスに及ぼすLat-Aの効果を明らかにするアポトーシスアッセイを示す(p<0.05、スチューデントのt-検定)。
【図１１】ヒト患者サンプルに関する発現のDEG確証を示す。12のOA(骨関節炎)サンプルと21のRAサンプルについての指示遺伝子のQ-RT-PCR解析を示す。値を(a)B2M、(b)L32の発現に基準化して発現指標として表した。ノンパラメトリックなマンホイットニーの統計検定を用いてp値を導いた。
【図１２】固相増殖及びプラスミド切取り後、4つの異なるcDNAライブラリー(RA SF、wt SF、RA WJ、wt WJ)を相互規準化かつサブトラクトした（補充図1a）。前記サブトラクテッドライブラリーの27511 cDNA/クローンを配列決定し、9176のクラスター/遺伝子にクラスター化した（補充図1b）。
【図１３】指示有意性レベルに対する異なるカットオフ及び対でのシミュレート比較についてのR統計値の分布(すなわち、比較毎の擬陽性要求の予測率)を示す(補充図2a)。行われた対での各ライブラリー比較について、ある(100-特異性)%の擬陽性ヒットに達するのに必要なR値のカットオフ値を示す(補充図2b)。
【図１４】マイクロアレイデータの規準化及び解析の概要を示す。
【図１５】個別オリゴヌクレオチドチップサブユニットに関する変位値の規準化を示す(補充図4a)。Affymetrixハイブリダイゼーションにおける技術的複製サンプルの再現性を示す(補充図4b)。複製チップから誘導される「サンプル型」特異性倍率変化モデルを示す(補充図4c)。
【図１６】対応刊行物のPubmed ID；WJ：全関節；SF：滑膜線維芽細胞を示す(補充図5a)。テキストマイニング結果の概要表示。赤色及び緑色はそれぞれ上方制御及び下方制御される遺伝子を示し；黒色及び青色はそれぞれWJ及びSFを示す(補充図4b)。
【図１７】関節炎/wtの全関節組織(WJ)、初生滑膜線維芽細胞(pSF)及び不死化滑膜線維芽細胞(iSF)の種々のcDNA量由来の表示遺伝子の半定量的RT-PCR。臭化エチジウム染色PCR産物をGelWorks 1D Advanced(v4.01)ソフトウェアで定量化し、B2Mの発現に対して規準化した(補充図6-a、b、c)。SDS/PAGEにおける関節炎及びwtの不死化SF由来の全細胞抽出物のゲルソリン及びアクチン抗体とのウェスタンブロット及びニトロセルロースへの転移を示す(補充図6d)。表示サンプル由来の表示遺伝子のリアルタイムRT-PCRを示す(補充図6e)。
【図１８】99.99%の特異性におけるサブトラクティブライブラリーからの差次的発現結果を示す（補充表1）。
【図１９】95%の特異性におけるオリゴヌクレオチドDNAマイクロアレイハイブリダイゼーションからのリウマチ性関節炎の2匹の動物モデルに共通の差次的発現遺伝子を示す（補充表2）
【図２０】サブトラクティブライブラリーとマイクロアレイの両方から選択された、関節炎の滑膜線維芽細胞(SF)及び全関節(WJ)において差次的に発現された遺伝子のジーンオントロジー(GO)用語頻度を示す（補充表3）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【国際調査報告】
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