(57)【要約】  本発明は、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を迅速・簡便に判定し、被検者の出身地を推定するための手段を提供する。本発明は、オリゴヌクレオチドプローブ(a-1)、(a-2)、(a-3)及び(a-4)；オリゴヌクレオチドプローブ(b-1)、(b-2)、(b-3)及び(b-4)；オリゴヌクレオチドプローブ(c-1)、(c-2)及び(c-3)；オリゴヌクレオチドプローブ(d-1)、(d-2)及び(d-3)；並びにオリゴヌクレオチドプローブ(e-1)、(e-2)及び(e-3)を含む、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定するためのオリゴヌクレオチドプローブのセットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のオリゴヌクレオチドプローブを含む、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定するためのオリゴヌクレオチドプローブのセット：
(a-1)配列番号１、２又は３の223〜241番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(a-2)配列番号４の223〜241番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(a-3)配列番号５又は６の223〜241番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(a-4)配列番号７の223〜241番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(b-1)配列番号１、２又は４の271〜290番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(b-2)配列番号３の271〜290番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(b-3)配列番号５又は６の271〜290番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(b-4)配列番号７の271〜290番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(c-1)配列番号１、４、５、６又は７の285〜304番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(c-2)配列番号２又は３の285〜304番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(c-3)配列番号７の285〜304番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(d-1)配列番号１の53〜72番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(d-2)配列番号２、４、５、６又は７の53〜72番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(d-3)配列番号３の53〜72番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(e-1)配列番号１、２、３又は４の81〜100番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(e-2)配列番号５又は６の81〜100番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(e-3)配列番号７の81〜100番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブのセットが担体上に固定化されてなる、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定するためのマイクロアレイ。
【請求項３】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブのセットが担体上に固定化されてなる、被検者の出身地を推定するためのマイクロアレイ。
【請求項４】
担体が、表面にカーボン層と化学修飾基とを有するものである、請求項２又は３記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定する方法であって、
被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、
抽出したDNAを鋳型とし、BKウイルスゲノムのVP1領域をコードする核酸を増幅する工程と、
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット又は請求項２〜４のいずれか１項記載のマイクロアレイを用いて増幅された核酸を検出する工程と
を含む、前記方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法によって判定されたBKウイルスのゲノム型に基づいて被検者の出身地を推定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定するためのオリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイ、並びにこれらを用いた被検者に感染したBKウイルスのゲノム型の判定方法及び被検者の出身地の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界各地で行われた血清学的な調査によって、パポーバウイルスの一種であるJCウイルス（JCV）がヒト集団に蔓延していること、大部分のヒトは子供の時にJCVに無症候性感染することが明らかにされた。体内に入ったJCVは免疫反応によって完全に排除されず、一部のウイルスは腎組織、末梢血リンパ球、リンパ組織に行き、そこに生涯、持続感染する。JCVの起源を解明する目的で、世界各地の人種からクローニングされたJCVゲノムDNAの解析が実施され、その過程でJCVのゲノム型が人種と関係があることが明かとなった。それ以来世界各地で収集された尿からJCVゲノムDNAのIG領域（610塩基対）の塩基配列が決定され、得られた塩基配列から近隣結合法（Neighbor-Joining法、NJ法）により分子系統樹が作成された。その系統樹からJCVゲノム型はヒト集団の新規な指標として注目されるに至った。そして、身元不明死体の出身地域の推定法としてヒトの尿や腎臓から検出されるJCVのゲノム型を用いることが報告されている（例えば、非特許文献１）。【０００３】
しかし、JCVのゲノム型を用いる上記方法でも、出身地域を推定できない場合があることも明らかとなった。そのため、別のマーカーとしてJCVと同じパポーバウイルスの一種であるBKウイルス（BKV）を用いた出身地域の推定方法が検討された。BKウイルスは最初に腎臓移植患者から検出され、その後、血清学的な調査によって、JCウイルスと同様にヒト集団に蔓延していること、大部分のヒトは子供の時にBKウイルスに感染することが明らかにされた。そして、BKウイルスのVP1遺伝子の配列解析から、BKウイルス株が血清学的調査に基づく群分けと十分に対応する４つのサブタイプ（I〜IV）に分類できることが報告された。【０００４】
これまでBKVゲノム型を正確に判定するためには、そのVP1遺伝子の全塩基配列を明らかにし、分子系統解析する方法が採用されていた（例えば、非特許文献２）。しかし、このような従来の方法は、解析に専門的な技術が必要であるとともに時間がかかるという問題があった。また、試料が非常に少ない場合などには対応できない場合もあった。
【非特許文献１】JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 1995, p.1448-1451
【非特許文献２】FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL, 2007, p.41-46
【発明の概要】
【０００５】
本発明の課題は、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を迅速・簡便に判定し、被検者の出身地を推定するための手段を提供することである。
【０００６】
本発明者らは、BKウイルスのゲノムDNAの塩基配列から、BKウイルスのゲノム型を判定するために有用なオリゴヌクレオチドプローブのセットを設計することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下のオリゴヌクレオチドプローブを含む、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定するためのオリゴヌクレオチドプローブのセット：
(a-1)配列番号１、２又は３の223〜241番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(a-2)配列番号４の223〜241番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(a-3)配列番号５又は６の223〜241番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(a-4)配列番号７の223〜241番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(b-1)配列番号１、２又は４の271〜290番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(b-2)配列番号３の271〜290番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(b-3)配列番号５又は６の271〜290番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(b-4)配列番号７の271〜290番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(c-1)配列番号１、４、５、６又は７の285〜304番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(c-2)配列番号２又は３の285〜304番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(c-3)配列番号７の285〜304番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(d-1)配列番号１の53〜72番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(d-2)配列番号２、４、５、６又は７の53〜72番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(d-3)配列番号３の53〜72番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(e-1)配列番号１、２、３又は４の81〜100番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(e-2)配列番号５又は６の81〜100番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ
(e-3)配列番号７の81〜100番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ。
（２）（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブのセットが担体上に固定化されてなる、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定するためのマイクロアレイ。
（３）（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブのセットが担体上に固定化されてなる、被検者の出身地を推定するためのマイクロアレイ。
（４）担体が、表面にカーボン層と化学修飾基とを有するものである、（２）又は（３）記載のマイクロアレイ。
（５）被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定する方法であって、
被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、
抽出したDNAを鋳型とし、BKウイルスゲノムのVP1領域をコードする核酸を増幅する工程と、
（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット又は（２）〜（４）のいずれかに記載のマイクロアレイを用いて増幅された核酸を検出する工程と
を含む、前記方法。
（６）（５）記載の方法によって判定されたBKウイルスのゲノム型に基づいて被検者の出身地を推定する方法。
【０００８】
本発明により、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を、少量の試料を用いて、迅速・簡便に判定することが可能になる。また、本発明により、高度な専門的な知識を持たない人でもBKウイルスのゲノム型を判定できる手段が提供される。さらに、BKウイルスのゲノム型に基づいて、被検者の出身地を推定することもできる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００８−１０８２０９号の明細書および特許請求の範囲に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
BKウイルスは、ポリオーマウイルス科に属するウイルスのうちヒトを宿主とするウイルスである。本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、被検者に感染したBKウイルスのゲノムのVP1遺伝子をコードする領域（VP1領域）を検出するものである。VP1領域は、BKウイルスのゲノムのうち変異が多い、327塩基対の領域であり（J. Med. Virol. 41 (1993) 11-17）、VP1領域におけるゲノム型は、Ia型、Ib-1型、Ib-2型、Ic型、II型、III型、IV型に分類される（J. Gen. VIrol. 85 (2004) 2821-2827）、7つのタイプのゲノム型として分類できる領域として報告されている。
【００１０】
本発明において、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定することには、被検試料の起源となる被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定することが含まれ、被検者の出身地を推定することには、被検試料の起源となる被検者の出身地を推定することが含まれる。
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、オリゴヌクレオチドプローブ群(a)〜(e)を少なくとも含む。
【００１２】
オリゴヌクレオチドプローブ群(a)はオリゴヌクレオチドプローブ(a-1)、(a-2)、(a-3)及び(a-4)からなり；オリゴヌクレオチドプローブ群(b)はオリゴヌクレオチドプローブ(b-1)、(b-2)、(b-3)及び(b-4)からなり；オリゴヌクレオチドプローブ群(c)はオリゴヌクレオチドプローブ(c-1)、(c-2)及び(c-3)からなり；オリゴヌクレオチドプローブ群(d)はオリゴヌクレオチドプローブ(d-1)、(d-2)及び(d-3)からなり；オリゴヌクレオチドプローブ群(e)はオリゴヌクレオチドプローブ(e-1)、(e-2)及び(e-3)からなる。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットにおいては、オリゴヌクレオチドプローブ群(a)などの各オリゴヌクレオチドプローブ群として、１種類のオリゴヌクレオチドプローブ群が含まれていてもよいし、条件を満たす限り複数種のオリゴヌクレオチドプローブ群が含まれていてもよい。同様に、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットにおいて、各オリゴヌクレオチドプローブ群には、オリゴヌクレオチドプローブ(a-1)などの各オリゴヌクレオチドプローブとして、１種類のオリゴヌクレオチドプローブが含まれていてもよいし、条件を満たす限り複数種のオリゴヌクレオチドプローブが含まれていてもよい。
【００１４】
以下、各オリゴヌクレオチドプローブ群に含まれる各オリゴヌクレオチドプローブについて説明する。
【００１５】
オリゴヌクレオチドプローブ群(a)：
オリゴヌクレオチドプローブ(a-1)は、配列番号１、２又は３の223〜241番目の塩基（共通配列：配列番号8の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号１、２及び３は、241番目の塩基の下流37塩基も共通しており、従って、オリゴヌクレオチドプローブ(a-1)は、好ましくは、配列番号１、２又は３の223〜252番目の塩基から選択される30塩基以下の連続した塩基配列であって、配列番号１、２又は３の223〜241番目の塩基を含むもの、またはそれに相補的な塩基配列である。好ましくは配列番号8の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(a-2)は、配列番号４の223〜241番目の塩基（配列番号9の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは配列番号9の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(a-3)は、配列番号５又は６の223〜241番目の塩基（共通配列：配列番号10の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号５及び６は、223〜241番目の塩基の上流18塩基と下流85塩基も共通しており、従って、オリゴヌクレオチドプローブ(a-3)は、好ましくは、配列番号５又は６の213〜252番目の塩基から選択される30塩基以下の連続した塩基配列であって、配列番号５又は６の223〜241番目の塩基を含むもの、またはそれに相補的な塩基配列である。好ましくは配列番号10の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(a-4)は、配列番号７の223〜241番目の塩基（配列番号11の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは配列番号11の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。
【００１６】
オリゴヌクレオチドプローブ群(b)：
オリゴヌクレオチドプローブ(b-1)は、配列番号１、２又は４の271〜290番目の塩基（共通配列：配列番号12の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号１、２及び４は、271〜290番目の塩基の上流9塩基と下流3塩基も共通しており、従って、オリゴヌクレオチドプローブ(b-1)は、好ましくは、配列番号１、２又は４の262〜293番目の塩基から選択される30塩基以下の連続した塩基配列であって、配列番号１、２又は４の271〜290番目の塩基を含むもの、またはそれに相補的な塩基配列である。好ましくは配列番号12の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(b-2)は、配列番号３の271〜290番目の塩基（配列番号13の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは配列番号13の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(b-3)は、配列番号５又は６の271〜290番目の塩基（共通配列：配列番号14の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号５及び６は、271〜290番目の塩基の上流65塩基と下流37塩基も共通しており、従って、オリゴヌクレオチドプローブ(b-3)は、好ましくは、配列番号５又は６の261〜300番目の塩基から選択される30塩基以下の連続した塩基配列であって、配列番号５又は６の271〜290番目の塩基を含むもの、またはそれに相補的な塩基配列である。好ましくは配列番号14の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(b-4)は、配列番号７の271〜290番目の塩基（配列番号15の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは配列番号15の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。
【００１７】
オリゴヌクレオチドプローブ群(c)：
オリゴヌクレオチドプローブ(c-1)は、配列番号１、４、５、６又は７の285〜304番目の塩基（共通配列：配列番号16の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号１、４、５、６及び７は、285〜304番の塩基の上流1塩基と下流23塩基も共通しており、従って、オリゴヌクレオチドプローブ(c-1)は、好ましくは、配列番号１、４、５、６又は７の284〜314番目の塩基から選択される30塩基以下の連続した塩基配列であって、配列番号１、４、５、６又は７の285〜304番目の塩基を含むもの、またはそれに相補的な塩基配列である。好ましくは配列番号16の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(c-2)は、配列番号２又は３の285〜304番目の塩基（共通配列：配列番号17の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号２及び３は、285〜304番の塩基の上流5塩基と下流23塩基も共通しており、従って、オリゴヌクレオチドプローブ(c-2)は、好ましくは、配列番号２又は３の280〜314番目の塩基から選択される30塩基以下の連続した塩基配列であって、配列番号２又は３の285〜304番目の塩基を含むもの、またはそれに相補的な塩基配列である。好ましくは配列番号17の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(c-3)は、配列番号７の285〜304番目の塩基（配列番号18の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは配列番号18の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。
【００１８】
オリゴヌクレオチドプローブ群(d)：
オリゴヌクレオチドプローブ(d-1)は、配列番号１の53〜72番目の塩基（配列番号19の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは配列番号19の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(d-2)は、配列番号２、４、５、６又は７の53〜72番目の塩基（共通配列：配列番号20の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号２、４、５、６及び７は、53〜72番目の塩基の上流52塩基と下流2塩基も共通しており、従って、オリゴヌクレオチドプローブ(d-2)は、好ましくは、配列番号２、４、５、６又は７の43〜74番目の塩基から選択される30塩基以下の連続した塩基配列であって、配列番号２、４、５、６又は７の53〜72番目の塩基を含むもの、またはそれに相補的な塩基配列である。好ましくは配列番号20の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(d-3)は、配列番号３の53〜72番目の塩基（配列番号21の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは配列番号21の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。
【００１９】
オリゴヌクレオチドプローブ群(e)：
オリゴヌクレオチドプローブ(e-1)は、配列番号１、２、３又は４の81〜100番目の塩基（共通配列：配列番号22の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号１、２、３及び４は、81〜100番目の塩基の上流11塩基と下流1塩基も共通しており、従って、オリゴヌクレオチドプローブ(e-1)は、好ましくは、配列番号１、２、３又は４の71〜101番目の塩基から選択される30塩基以下の連続した塩基配列であって、配列番号１、２、３又は４の81〜100番目の塩基を含むもの、またはそれに相補的な塩基配列である。好ましくは配列番号22の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(e-2)は、配列番号５又は６の81〜100番目の塩基（共通配列：配列番号23の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号５及び６は、81〜100番目の塩基の上流80塩基と下流17塩基も共通しており、従って、オリゴヌクレオチドプローブ(e-2)は、好ましくは、配列番号５又は６の71〜110番目の塩基から選択される30塩基以下の連続した塩基配列であって、配列番号５又は６の81〜100番目の塩基を含むもの、またはそれに相補的な塩基配列である。好ましくは配列番号23の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブ(e-3)は、配列番号７の81〜100番目の塩基（配列番号24の塩基配列）を含む連続した30塩基以下の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは配列番号24の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。
【００２０】
上記記載において、配列番号XのY〜Z番目の塩基を含む連続した30塩基以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブとは、換言すれば、配列番号Xで表される塩基配列における連続した30塩基以下の部分配列であって、該配列番号のY〜Z番目の塩基を含むオリゴヌクレオチドプローブをさす。
【００２１】
上記本発明のオリゴヌクレオチドプローブの長さは、通常30塩基以下であり、好ましくは25塩基以下、より好ましくは23塩基以下である。
【００２２】
オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは核酸であり、より好ましくはDNAである。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは好ましくは一本鎖DNAである。
【００２３】
配列番号１はIa型のVP1領域の塩基配列を表し、配列番号2はIb-1型のVP1領域の塩基配列を表し、配列番号3はIb-2型のVP1領域の塩基配列を表し、配列番号4はIc型のVP1領域の塩基配列を表し、配列番号5はII型のVP1領域の塩基配列を表し、配列番号6はIII型のVP1領域の塩基配列を表し、配列番号7はIV型のVP1領域の塩基配列を表す。なお、VP1領域の各ゲノム型の塩基配列は、例えば、NCBI（National Center for Biotechnology Information）の遺伝子データベースGenBankからも取得できる。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、担体上に固定化することにより、マイクロアレイの形態で用いるのが好ましい。担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン及びそれらの化合物などの貴金属、及びグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
【００２６】
本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、及びカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
【００２７】
本発明のマイクロアレイにおいては、微細な平板状の構造を有する担体が好適に用いられる。形状は、長方形、正方形及び丸形など限定されないが、通常、1〜75mm四方のもの、好ましくは1〜10mm四方のもの、より好ましくは3〜5mm四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層及び化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
【００２８】
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収がないため検出系UVに対して透明性である点、及びエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。
【００２９】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマCVD(Chemical vapor deposit）法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit）法、ICP(Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００３０】
高周波プラズマCVD法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にカーボン層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1〜99体積％と残りメタンガス99〜1体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成してもよい。
【００３１】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００３２】
レーザ蒸着法では、例えばNd:YAGレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００３３】
基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜100μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm〜1μm、より好ましくは5nm〜500nmである。
【００３４】
カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、オリゴヌクレオチドプローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基及び活性エステル基が挙げられる。
【００３５】
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することにより又はプラズマ処理することにより実施できる。又は、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。又は、メチレンジアミン、エチレンジアミン等の多価アミン類ガス中で、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
【００３６】
カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：X-R1-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリル酸、4-クロロ安息香酸；式：HOOC-R2-COOH（式中、R2は単結合又は炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：R3-CO-R4-COOH（式中、R3は水素原子又は炭素数1〜12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：X-OC-R5-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R5は単結合又は炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００３７】
エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
【００３８】
ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
【００３９】
ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
【００４０】
活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。
【００４１】
活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特開2001-139532）。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、オリゴヌクレオチドプローブが担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。又は、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
【００４３】
スポッティング後、オリゴヌクレオチドプローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常−20〜100℃、好ましくは0〜90℃の温度で、通常0.5〜16時間、好ましくは1〜2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50〜90％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/0.05% Tween20、2×SSC/0.2% SDS溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、同一の担体に固定化されていてもよいし、異なる担体に固定化されていてもよいが、少なくとも同じオリゴヌクレオチドプローブ群に含まれるオリゴヌクレオチドプローブは、同一の担体に固定化されていることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、それぞれの条件を満たす限り、複数種のものが担体上に固定化されていてもよい。
【００４５】
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドプローブのセット又はマイクロアレイを用いて被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定する方法に関する。本発明の判定方法は、
被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、
抽出したDNAを鋳型とし、BKウイルスゲノムのVP1領域をコードする核酸を増幅する工程と、
本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセット又はマイクロアレイを用いて、増幅された核酸を検出する工程と
を含む。
【００４６】
被検者は通常ヒトであり、被検者由来の試料は、BKウイルスが含まれうる試料であれば特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清及び血漿など）、リンパ液、汗、涙、唾液、尿、糞便、腹水及び髄液等の体液、並びに細胞、組織又は臓器（例えば、心臓、膵臓、肝臓、卵巣、肺、脳、骨髄、リンパ節及び腎臓など）の破砕物及び抽出液などが挙げられる。好ましくは、腎臓の破砕物及び抽出液が用いられる。被検者由来の試料は、人体から直接採取したものでなくてもよく、例えば、尿斑や血痕から採取した試料でもよい。
【００４７】
まず、被検者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。
【００４８】
次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、BKウイルスのVP1領域をコードする核酸、好ましくはDNAを増幅させる。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
【００４９】
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、BKウイルスのVP1領域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸及び塩化マグネシウム等を含む反応系である。
【００５０】
増幅反応に用いるプライマーは、BKウイルスゲノムにおけるVP1領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜設計できる。例えば、BKウイルスゲノムのVP1領域の1〜20番目の塩基からなるプライマーと327〜308番目の塩基からなるプライマーからなるプライマーセットが挙げられる。具体的には、
プライマー１：5'-CAAGTGCCAAAACTACTAAT-3'（配列番号２５）及び
プライマー２：5'-TGCATGAAGGTTAAGCATGC-3'（配列番号２６）
からなるプライマーのセットが挙げられる。
【００５１】
上記のようにして得られた増幅核酸と本発明のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、各オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。また、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のDNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することもできる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分及び2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。
【００５２】
上記ハイブリダイゼーション反応においては、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットが担体上に固定化されたマイクロアレイを用い、該マイクロアレイに増幅核酸を適用することが好ましい。
【００５３】
本発明のBKウイルスのゲノム型の判定方法は、各オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした上記増幅核酸の量を、各オリゴヌクレオチドプローブ群内で比較することにより実施する。具体的には、オリゴヌクレオチドプローブ群内で、各オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした増幅核酸の量（例えば標識由来のシグナル強度に対応する）の順位づけを行う。各オリゴヌクレオチドプローブ群におけるその順位が、特定のゲノム型に特徴的なものである場合とそうでない場合があるので、被検者由来の試料について、どのゲノム型に特徴的なシグナルを有するかを判定することにより、その被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定することができる。
【００５４】
現在明らかとなっているBKウイルスのゲノム型について、VP1領域を増幅し、増幅核酸を本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットにハイブリダイズさせた場合、各オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする増幅核酸の量は、プローブ群ごとに以下のような特徴を示す。すなわち、各オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする増幅核酸の量の比がシグナル強度比として検出される。
【００５５】
【表１】
2009128399.tif 000002
【００５６】
例えば、被検者に感染したBKウイルスがIa型である場合、オリゴヌクレオチドプローブ群(a)について見たときに、オリゴヌクレオチドプローブ（a-1）にハイブリダイズした増幅核酸の量は、オリゴヌクレオチドプローブ（a-2）、（a-3）及び（a-4）のそれぞれにハイブリダイズした増幅核酸の量より多く検出される。
【００５７】
また、被検者に感染したBKウイルスがIV型である場合は、オリゴヌクレオチドプローブ群(c)について見たときに、オリゴヌクレオチドプローブ（c-1）にハイブリダイズした増幅核酸の量がオリゴヌクレオチドプローブ（c-2）及び（c-3）のそれぞれにハイブリダイズした増幅核酸の量より多く検出される場合と、オリゴヌクレオチドプローブ（c-3）にハイブリダイズした増幅核酸の量がオリゴヌクレオチドプローブ（c-1）及び（c-2）のそれぞれにハイブリダイズした増幅核酸の量より多く検出される場合がある。
【００５８】
上記表１に示されるシグナル強度比の中には、異なる遺伝子型に重複して見られるものもあるので、オリゴヌクレオチドプローブ群(a)〜(e)におけるシグナル強度比を組み合わせて遺伝子型を判定することが好ましい。しかし、上記シグナル強度比の中には、特定の遺伝子型にしか見られないものもあるので、そのシグナル強度比が検出されれば他のシグナル強度比を見なくても遺伝子型を特定できる。従って、表１に示されるシグナル強度比のうち、遺伝子型の判定に有効なシグナル強度比を下記表２に示す。
【００５９】
【表２】
2009128399.tif 000003
【００６０】
例えば、以下のように遺伝子型を特定することができる。
オリゴヌクレオチドプローブ群(d)について見たときに、オリゴヌクレオチドプローブ（d-1）にハイブリダイズした増幅核酸の量が、オリゴヌクレオチドプローブ（d-2）及び（d-3）にハイブリダイズした増幅核酸の量より多かった場合は、他のオリゴヌクレオチドプローブ群を検討することなく、その被検者に感染したBKウイルスはIa型であると判定できる。
【００６１】
また、オリゴヌクレオチドプローブ群(b)について見たときに、オリゴヌクレオチドプローブ(b-1)にハイブリダイズした増幅核酸の量がオリゴヌクレオチドプローブ（b-2）、(b-3)及び(b-4)にハイブリダイズした増幅核酸の量より多く、かつ、オリゴヌクレオチドプローブ群(c)について見たときに、オリゴヌクレオチドプローブ(c-2)にハイブリダイズした増幅核酸の量がオリゴヌクレオチドプローブ（c-1）及び(c-3)にハイブリダイズした増幅核酸の量より多かった場合は、他のオリゴヌクレオチドプローブ群を検討することなく、その被検者に感染したBKウイルスはIb-1型であると判定できる。
【００６２】
オリゴヌクレオチドプローブ群(b)について見たときに、オリゴヌクレオチドプローブ(b-2)にハイブリダイズした増幅核酸の量がオリゴヌクレオチドプローブ（b-1）、(b-3)及び(b-4)にハイブリダイズした増幅核酸の量より多い場合は、他のオリゴヌクレオチドプローブ群を検討することなく、その被検者に感染したBKウイルスはIb-2型であると判定できる。また、オリゴヌクレオチドプローブ群(d)について見たときに、オリゴヌクレオチドプローブ(d-3)にハイブリダイズした増幅核酸の量がオリゴヌクレオチドプローブ（d-1）及び(d-2)にハイブリダイズした増幅核酸の量より多い場合も、他のオリゴヌクレオチドプローブ群を検討することなく、その被検者に感染したBKウイルスはIb-2型であると判定できる。
【００６３】
オリゴヌクレオチドプローブ群(b)について見たときに、オリゴヌクレオチドプローブ(b-3)にハイブリダイズした増幅核酸の量がオリゴヌクレオチドプローブ（b-1）、(b-2)及び(b-4)にハイブリダイズした増幅核酸の量より多い場合は、他のオリゴヌクレオチドプローブ群を検討することなく、その被検者に感染したBKウイルスはII型又はIII型であると判定できる。また、オリゴヌクレオチドプローブ群(e)について見たときに、オリゴヌクレオチドプローブ(e-2)にハイブリダイズした増幅核酸の量がオリゴヌクレオチドプローブ（e-1）及び(e-3)にハイブリダイズした増幅核酸の量より多い場合も、他のオリゴヌクレオチドプローブ群を検討することなく、その被検者に感染したBKウイルスはII型又はIII型であると判定できる。
【００６４】
BKウイルスは、ヒト集団に蔓延しており、世界中において各ゲノム型がそれぞれ特有の分布域を持つことから、被検者に感染したBKウイルスのゲノム型を判定することにより、被検者の出身地を推定することができる。従って、本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセット又はマイクロアレイを用いる上記方法によって判定されたBKウイルスのゲノム型に基づいて被検者の出身地を推定する方法に関する。
【００６５】
各ゲノム型の分布域については、Microbes Infect. 9(2) (2007) 204-13に詳細に記載されている。7つの主なゲノム型の具体的な分布は、Ia型は、アフリカに分布しており、Ib-1型は、東南アジアに分布しており、Ib-2型は、ヨーロッパに分布しており、Ic型は、日本を中心とする極東アジアに分布しており、II型、III型は、地域差はないが、IV型のサブグループは、大陸アジアに分布している（J Mol Evol. 65(1) 2007   103-11.）。
【実施例】
【００６６】
実施例１  担体の作製
3mm角のシリコン基板にイオン化蒸着法を用いて、下記の条件で2層のDLC層の製膜を行った。【００６７】
【表３】
2009128399.tif 000004
【００６８】
得られた表面にDLC層を有するシリコン基板上に、下記の条件でアンモニアプラズマを用いて、アミノ基を導入した。【００６９】
【表４】
2009128399.tif 000005
【００７０】
140mM 無水コハク酸及び0.1M ホウ酸ナトリウムを含む1-メチル-2-ピロリドン溶液に30分間浸漬し、カルボキシル基を導入した。0.1M リン酸カリウムバッファー、0.1M 1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド、20mM N-ヒドロキシスクシイミドを含む溶液に30分間浸漬し、活性化を行い、シリコン基板表面にDLC層及び化学修飾基としてのN-ヒドロキシスクシイミド基を有する担体を得た。【００７１】
実施例２  マイクロアレイの作製
BKウイルスの7種類のゲノム型の塩基配列（配列番号１〜７）に基づき、19又は20塩基の塩基配列からなり5'末端をアミノ基で修飾した17種のオリゴヌクレオチドプローブを合成した。各オリゴヌクレオチドプローブ（以下プローブと記載する）の配列を下記表5に示す。表5に記載したプローブについて、対応する本発明のオリゴヌクレオチドプローブ群及び各オリゴヌクレオチドプローブをプローブと記載した列に記載した。【００７２】
【表５】
2009128399.tif 000006
【００７３】
表5に示した17種のプローブを10 pmol/μlとなるようにスポットソリューション（Sol．6）に溶解し、スポッターSPBIO（日立ソフト社製）を用いて実施例１で作製した担体上にスポットした。80℃で1時間ベーキング後、2×SSC/0.2% SDS溶液（室温）で15分間洗浄し、さらに2×SSC/0.2% SDS溶液（95℃）で5分間洗浄した。超純水で3回リンスし、遠心機で水分を飛ばし乾燥させることにより17種のプローブが担体上に固定化されたマイクロアレイを得た。【００７４】
実施例３  BKウイルスのゲノム型に特徴的シグナルの解析
その被検者が有するBKウイルスのゲノム型（Ia型、Ib-1型、Ib-2型、Ic型、II型、III型、IV型）が、従来法（増幅したVP1領域の塩基配列を決定し、系統解析によりゲノム型を判定する方法、Forensic Sci. Int. 173(1) (2007) 54-60）ですでに特定されている被検者由来の試料（試料1〜11）について、実施例２で作製したマイクロアレイを用いて増幅したVP1領域の検出を行った。【００７５】
試料（腎臓組織の破砕物）を採取し、QiaAmp DNA（QIAGEN社製）を用いてDNAの抽出を行った。このDNAを鋳型DNAとし、BKウイルスのVP1領域（327bp）を増幅するよう、表6に示した組成でPCR反応液を作製した。【００７６】
【表６】
2009128399.tif 000007
【００７７】
用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
プライマー１：5'-CAAGTGCCAAAACTACTAAT-3'（配列番号２５）
プライマー２：5'-TGCATGAAGGTTAAGCATGC-3'（配列番号２６）
調製したPCR反応液に対し、GeneAmp PCR system 9700 (ABI)を用い、下記温度サイクルでPCR反応を行い、それぞれの試料についてBKウイルスゲノムのVP1領域を増幅した。【００７８】
【表７】
2009128399.tif 000008
【００７９】
このときCy5-dCTPをPCR産物中に取り込ませることにより蛍光標識を行った。
2μL PCR産物と1μL 3×SSC／0.3% SDSを混合し、実施例２で作製したマイクロアレイに滴下し、カバーを被せた。水を張ったタッパーに入れ、45℃で1時間インキュベートした。室温で2×SSC／0.2% SDSで2回、2×SSCで2回、洗浄を行った。【００８０】
洗浄後のマイクロアレイを1000rpmで遠心し、乾燥した。続いてFLA 8000（フジフイルム社製）でスキャンを行い、蛍光画像からArray Gauge（フジフイルム社製）を用いて各スポットの蛍光強度を数値化した。【００８１】
各試料について得られたシグナル強度の値を下記表8に示す。各プローブ群において一番強いシグナルが得られたプローブにおけるシグナルに対応する数値に網掛けを付し、上記表２に基づいて遺伝子型を判定した。判定結果を最下行に記載した。【００８２】
【表８】
2009128399.tif 000009
【００８３】
試料1、2、5及び7の結果を見ると、プローブ群(e)においてシグナル強度がe-3>e-1、e-2であることからIV型と判定できる。また、プローブ群(b)においてシグナル強度がb-4>b-1、b-2、b-3であることからもIV型と判定できる。試料3及び6の結果を見るとプローブ群(b)においてシグナル強度がb-2>b-1、b-3、b-4であることからIb-2型と判定でき、また、プローブ群(d)においてシグナル強度がd-3>d-1、d-2であることからもIb-2型と判定できる。試料4及び10の結果を見ると、プローブ群(b)においてシグナル強度がb-1>b-2、b-3、b-4であり、かつ、プローブ群(c)においてシグナル強度がc-2>c-1、c-3であることからIb-1型と判定できる。試料8の結果を見ると、プローブ群(a)においてシグナル強度がa-2>a-1、a-3、a-4であることからIc型と判定できる。試料9の結果を見るとプローブ群(b)においてシグナル強度がb-3>b-1、b-2、b-4であることからII型又はIII型と判定でき、また、プローブ群(e)においてシグナル強度がe-2>e-1、e-3であることからもII型又はIII型と判定できる。試料11の結果を見ると、プローブ群(d)においてシグナル強度がd-1>d-2、d-3であることからIa型と判定できる。【００８４】
マイクロアレイを用いて判定された遺伝子型の結果は、従来法（増幅したVP1領域の塩基配列を決定し、系統解析によりゲノム型を判定する方法）で判定された遺伝子型の結果と一致していた。【００８５】
以上から、本発明の方法により、被検者由来の試料から被検者が有するBKウイルスのゲノム型を簡便かつ正確に判定することができ、当該被検者の出身地を推定できることが示された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【配列表】
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【国際調査報告】
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