(57)【要約】  本発明によって提供される真核細胞の外部から該細胞の核内に目的とするペプチドモチーフを移送する方法は、アミノ酸配列：ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）により規定される細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側又はＣ末端側に目的のペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列を備えるペプチド鎖を合成すること、前記合成ペプチドを真核細胞又は該細胞を有する組織を含有する培地に添加すること、および、前記合成ペプチドが添加された真核細胞又は該細胞を含む組織を培養すること、を包含する。
2009093692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞の外部から該細胞の核内に目的とするペプチドモチーフを移送する方法であって、
以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
により規定される細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側又はＣ末端側に前記目的のペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列を備えるペプチド鎖を合成すること、
前記合成ペプチドを、対象である真核細胞又は該細胞を有する組織を含有する培地に添加すること、および、
前記合成ペプチドが添加された真核細胞又は該細胞を含む組織を培養すること、
を包含する方法。
【請求項２】
前記合成ペプチドを構成する総アミノ酸残基数が５００以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的のペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列は、配列番号２〜８０のうちの何れかのアミノ酸配列から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記合成ペプチドを構成する総アミノ酸残基数が５０以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞である、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
真核細胞の外部から該細胞の核内に目的とするペプチドモチーフを移送するために人為的に合成された人工ペプチドであって、
以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
により規定される細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側又はＣ末端側に、天然においては前記配列に隣接して存在しない前記目的のペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列を備えるように合成されたペプチド鎖から構成されている、人工ペプチド。
【請求項７】
総アミノ酸残基数が５００以下である、請求項６に記載の人工ペプチド。
【請求項８】
前記目的のペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列は、配列番号２〜８０のうちから選択される何れかである、請求項６又は７に記載の人工ペプチド。
【請求項９】
前記合成ペプチド鎖を構成する総アミノ酸残基数が５０以下である、請求項８に記載の人工ペプチド。
【請求項１０】
真核細胞の外部から該細胞の核内に目的とするペプチドモチーフを移送するための人工ペプチドを製造する方法であって、
前記ペプチドモチーフおよび該モチーフを構成するアミノ酸配列を選択すること、
以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
により規定される細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側又はＣ末端側に、前記選択されたペプチドモチーフのアミノ酸配列を備えるペプチド鎖を設計すること、および、
前記設計したペプチド鎖を合成すること、
を包含する製造方法。
【請求項１１】
全アミノ酸残基数が５００以下となるように前記ペプチド鎖を設計する、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記目的のペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列は、配列番号２〜８０のうちの何れかのアミノ酸配列から選択される、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記合成ペプチドを構成する総アミノ酸残基数が５０以下である、請求項１２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞の外部から該細胞の核内（典型的には核小体）に所望する目的のペプチドモチーフを移送（導入）する方法ならびに該方法に用いられる人工ペプチドに関する。
本願は２００８年１月２５日に出願された日本国特許出願第２００８−０１４９６６号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
ヒトやそれ以外の哺乳動物等の細胞（真核細胞）内にポリペプチド等の生理活性物質を導入し、当該細胞（さらには該細胞から成る組織や器官）の形質を転換したり或いは当該細胞の機能を改善・向上させることが行われている。
例えば、特許文献１には、ポリペプチド、ＤＮＡ等を細胞内に導入するための細胞透過性キャリアペプチドが記載されている。この特許文献には、細胞透過性キャリアペプチドと異種ポリペプチド、ＤＮＡ等を連結したキャリアペプチドコンジュゲートを用いることによって、ポリペプチド、ＤＮＡ等の生理活性物質を高効率に細胞内に導入することができると記載されている。【０００３】
導入したい生理活性物質として比較的分子量の大きいポリペプチド全体を目的の細胞内に導入して当該細胞の形質を転換したり機能を改善（若しくは向上）させたりする手法に代えて、当該ポリペプチドの有するある特定の機能に着目し、その機能を発現させ得る最小単位であるアミノ酸配列部分、即ちペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列を細胞内に導入する方法が挙げられる。【０００４】
例えば、特許文献２には、ＳＯＣＳタンパク質及びそれらのファミリータンパク質（以下総称して「ＳＯＣＳ系タンパク質」という。）を構成するペプチド鎖（アミノ酸配列）の一部であって、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣコンプレックスに結合すると考えられている特定領域「ＢＣ−ボックス」の全部又は一部を構成するアミノ酸配列が体性幹細胞に対する高い神経分化誘導活性を有するモチーフであることが開示されており、該モチーフを哺乳動物の体性幹細胞に導入することにより該導入細胞を神経細胞に分化誘導し得ることが開示されている。
【特許文献１】日本国特許第３８５４９９５号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００７／０１０９８９号パンフレット
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(JOURNALOF BIOLOGICAL CHEMISTRY)、２８１巻３５号、２００６年、ｐｐ．２５２２３−２５２３０
【非特許文献２】ＰＮＡＳ、９５巻、１９９８年、ｐｐ．１１４−１１９
【非特許文献３】ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES &DEVELOPMENT)、１２巻、１９９８年、ｐｐ．３８７２−３８８１
【非特許文献４】ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES &DEVELOPMENT)、１８巻、２００４年、ｐｐ．２８６７−２８７２
【非特許文献５】ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES &DEVELOPMENT)、１８巻、２００４年、ｐｐ．３０５５−３０６５
【発明の開示】
【０００５】
ところで、上記のようなある種の機能を有するペプチドモチーフを細胞内に導入するにあたって、細胞内のどの部位（或いはオルガネラ）に目的のモチーフ（及び当該モチーフを有するペプチド）を移送するかは重大な問題である。移送される部位によって当該導入細胞に与える効果の度合いが著しく異なることが考えられるからである。例えば、上記の神経分化誘導のような、細胞の分化や形質転換に関わる機能を有するモチーフを導入する場合、当該モチーフを細胞質内よりも核内に移送することが望ましく、更にはリボソームＲＮＡ合成の場である核小体にまで移送することが望ましい場合もあり得る。
しかしながら、特許文献１及び２に記載されるような従来の細胞透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のタンパク質導入ドメイン：ＴＡＴ）は、細胞外部から細胞膜を透過して細胞質に目的のペプチドモチーフを導入するツールとしては有用であるものの、核内への移送能力は著しく低く、さらには核小体に目的のペプチドモチーフ（ペプチド断片）を移送することは望めなかった。
【０００６】
そこで本発明は、上記従来の問題点を解決すべく創出されたものであり、本発明の一つの目的は、所望する目的のペプチドモチーフを真核細胞の外部（即ち細胞膜の外）から当該細胞内に導入し、更に核内（好ましくはさらに核小体）に高効率に移送し得る方法を提供することである。また、本発明の一つの目的は、そのような方法を実現する手段としての人工ペプチドとその製造方法を提供することである。また、本発明によって提供される方法及び人工ペプチドによって所望する機能や形質を獲得した細胞や組織を提供することを他の目的とする。
【０００７】
本発明によって提供される方法の一つは、ヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される真核細胞の外部（即ち細胞膜の外）から該細胞の核内（好ましくは核小体）に目的とするペプチドモチーフを移送する方法である。ここで開示される方法は、アミノ酸配列：ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）により規定される「細胞膜透過性核小体局在シグナル配列」のＮ末端側又はＣ末端側に、上記目的のペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列を備えるペプチド鎖を合成すること、および、該合成ペプチドを対象である真核細胞又は該細胞を有する組織を含有する培地又は生体に添加することを包含する。典型的には、さらに上記合成ペプチドが添加された真核細胞又は該細胞を含む組織を培養すること、を包含する。
ここで「ペプチドモチーフ（配列モチーフ）」とは、当該分野において通常使用されるのと同様の意味で本明細書において用いられる用語であり、ポリペプチド（タンパク質）の機能的な最小単位となる部分構造を指す用語である。即ち、ペプチドモチーフとは、何らかの機能や構造と関連付けられる比較的短いアミノ酸配列をいう。かかる意味において配列番号１に示す上記アミノ酸配列もまた、細胞外から核内（典型的には核小体）へのペプチド移行に関与するペプチドモチーフとして認識され得る。
【０００８】
本発明者は、上記非特許文献１に記載されるように核小体局在シグナル（Nucleolar
localization signal：ＮｏＬＳ）として知られる上記配列番号１に示すアミノ酸配列と、目的とする他のペプチドモチーフ（具体例は後述する実施例参照）を構成するアミノ酸配列とを含むペプチドを合成し、培養中の真核細胞に添加したところ、当該ペプチドが高効率に対象細胞の細胞膜を通過し得ること、さらには高効率に核膜を通過し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、上記構成の本発明の方法によると、目的とするペプチドモチーフ（即ち、対象とする細胞に導入しようとする機能を有するモチーフ）を構成するアミノ酸配列を上記配列番号１により規定される「細胞膜透過性核小体局在シグナル配列」と組み合わせて得られた人工ペプチドを構築（合成) し、対象とする真核細胞に添加することによって、当該目的のペプチドモチーフ（即ち該モチーフを含む人工ペプチド）を真核細胞の外部（細胞膜の外側）から核内（好ましくは核小体）に高効率に移送することができる。
【０００９】
ここで開示されるペプチドモチーフ移送方法の好ましい一態様では、上記合成ペプチドを構成する総アミノ酸残基数が５００以下である。
このような比較的鎖長の短いペプチド（典型的にはリニア（直線）形状のペプチド）は化学合成が容易であり、対象とする真核細胞内に容易に導入され得るため好ましい。
【００１０】
ここで開示されるペプチドモチーフ移送方法の好ましい他の一態様では、モチーフを導入する対象の真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の幹細胞である。
本発明によると、ヒトその他哺乳類の幹細胞（例えば体性幹細胞）に所定の機能を有する目的のモチーフを核内（好ましくはさらに核小体）に移送することにより、当該幹細胞の形質転換、例えば特定の細胞（神経細胞、骨細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、等）への分化を実現することができる。
【００１１】
また、本発明は、上記目的を実現するべく、真核細胞の外部から該細胞の核内（好ましくは核小体）に目的とするペプチドモチーフを移送するために人為的に合成された細胞膜透過性を備える人工ペプチドを提供する。
このペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
により規定される細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側又はＣ末端側に、天然においてはかかる配列に隣接して存在しないペプチドモチーフを構成するアミノ酸配列を備えるように合成されたペプチド鎖から構成されている。
上記「細胞膜透過及び核小体移行配列」と目的のペプチドモチーフ（配列モチーフ）とを近接させて構築した単純な配列構成のペプチドを用いることによって、真核細胞の細胞膜の外側から細胞質内、さらには核内（好ましくは核小体）に目的とするモチーフ（機能を有するアミノ酸配列）を高効率に移送することができる。総アミノ酸残基数が５００以下である人工ペプチド（典型的にはリニア形状のペプチド）は、化学合成が容易であり、真核細胞内へ高効率に導入可能であることから好ましい。
【００１２】
また、本発明は、上記目的を実現するべく、真核細胞の外部から該細胞の核内（好ましくは核小体）に目的とするペプチドモチーフを移送するための人工ペプチドを製造する方法を提供する。即ち本製造方法は、
目的のペプチドモチーフおよび該モチーフを構成するアミノ酸配列を選択すること、
以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
により規定される細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側又はＣ末端側に、前記選択されたペプチドモチーフのアミノ酸配列を備えるペプチド鎖を設計すること、および、上記設計したペプチド鎖を合成すること、を包含する。
好ましい一態様では、全アミノ酸残基数が５００以下となるように上記ペプチド鎖を設計する。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１〜配列番号８５  合成ペプチド
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ラット神経幹細胞の培養液にサンプル２のペプチドを培養液中の濃度が１μＭとなるように添加して２４時間培養した後、培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。図１の写真を４等分して左端から第１番目のエリアはＤＡＰＩによる核染色で生じたプロットを示し、左端から第２番目のエリアは蛍光色素標識抗ＧＦＡＰ抗体の存在による蛍光発色状況を示し、左端から第３番目のエリアは蛍光色素標識抗チューブリン抗体の存在による蛍光発色状況を示し、左端から第４番目（右端）のエリアはＤＡＰＩによる核染色で生じたプロットと蛍光色素標識抗チューブリン抗体の存在による蛍光発色状況を重ねて示している。
【図２】図２は、ラット神経幹細胞の培養液に比較サンプル１のペプチドを培養液中の濃度が１μＭとなるように添加して２４時間培養した後、培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。図２の写真を４等分して左端から第１番目のエリアはＤＡＰＩによる核染色で生じたプロットを示し、左端から第２番目のエリアは蛍光色素標識抗ＧＦＡＰ抗体の存在による蛍光発色状況を示し、左端から第３番目のエリアは蛍光色素標識抗チューブリン抗体の存在による蛍光発色状況を示し、左端から第４番目（右端）のエリアはＤＡＰＩによる核染色で生じたプロットと蛍光色素標識抗チューブリン抗体の存在による蛍光発色状況を重ねて示している。
【図３】図３は、ＦＩＴＣラベルした一実施例に係る本発明の人工ペプチドを添加した細胞懸濁液を０．５時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。
【図４】図４は、ＦＩＴＣラベルした一実施例に係る本発明の人工ペプチドを添加した細胞懸濁液を１時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。
【図５】図５は、ＦＩＴＣラベルした一実施例に係る本発明の人工ペプチドを添加した細胞懸濁液を２時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。
【図６】図６は、ＦＩＴＣラベルした一実施例に係る本発明の人工ペプチドを添加した細胞懸濁液を６時間培養した後にメタノール固定した試料（細胞）を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えば構築された人工ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成、ポリヌクレオチド合成、細胞培養に関するような一般的事項）は、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。
また、本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。【００１５】
本明細書において「人為的に合成された人工ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみで独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造された合成ペプチドをいう。
本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。従ってアミノ酸残基数が１０程度までのオリゴペプチド或いはそれ以上のアミノ酸残基から成るポリペプチドも本明細書における人工ペプチドに包含される。
本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。【００１６】
また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのＤＮＡフラグメント及びＲＮＡフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。【００１７】
ここで開示される「細胞膜透過性核小体局在シグナル配列」は、上記配列番号１のアミノ酸配列により規定（把握）される配列であって、細胞膜透過性及び核移行性（核膜透過性）を発揮させるアミノ酸配列（シグナル配列）であることにより特徴付けられる配列である。
ここで配列番号１に記載される具体的なアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2：上記非特許文献１参照）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成る配列部分（即ちモチーフ）に相当する核小体局在シグナルであることに加え、本発明者によって新たに優れた細胞膜透過性を示すことが見出された配列である。
従って、ここで開示される「上記配列番号１のアミノ酸配列により規定（把握）される「細胞膜透過性核小体局在シグナル配列」とは、典型的には配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一の配列であるが、当該同一配列の他に、細胞膜透過性及び核移行性を損なうことなく１個または数個（例えば５個以下典型的には２，３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列を包含する。即ち、そのような軽微な改変配列は、ここで開示される情報に基づいて当業者にとって容易に利用されるものであり、ここで開示される技術的思想としての「細胞膜透過性核小体局在シグナル配列」に包含されるからである。典型例として、配列番号１のアミノ酸配列のうち１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列が挙げられる。【００１８】
ここで開示されるペプチドモチーフの移送方法に用いられる人工ペプチドは、上述の細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側に、所望するペプチドモチーフ（本明細書においてドメインを包含する。）を構成するアミノ酸配列を連結することによって設計・構築され得るペプチドである。一つの人工ペプチドを構築するのに使用されるモチーフは一つに限られず、例えば一種類のペプチドモチーフ（アミノ酸配列）が２単位以上存在する（例えばタンデムに２単位以上が連続して配置される）ようにペプチド鎖を設計してもよいし、或いは、種類の異なる（即ち機能の異なる）ペプチドモチーフ又は機能は同様であるが相互に配列の異なるペプチドモチーフを複数使用してペプチド鎖を設計してもよい。
また、細胞膜透過性核小体局在シグナル配列についても同様であり、一つのペプチド鎖に少なくとも１単位の細胞膜透過性核小体局在シグナル配列が存在すればよいが、これに限定されず、同一配列又は相互に配列の異なる複数の細胞膜透過性核小体局在シグナル配列が一つのペプチド鎖の複数箇所に存在していてもよい。【００１９】
人工ペプチド構築に利用されるモチーフ（ドメイン）としては特に限定されず、従来知られた種々の配列モチーフを利用することができる。例えば、導入対象の真核細胞がヒトその他哺乳動物の幹細胞（体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞を包含する。）である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々のモチーフの利用が好ましい。また、導入対象の真核細胞が癌細胞（腫瘍細胞）である場合、当該癌細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のモチーフの利用が好ましい。【００２０】
本発明の実施に特に好ましく使用され得るペプチドモチーフの好適例として、上述の特許文献２に記載される、神経分化誘導性を発揮し得る種々のアミノ酸配列（モチーフ）が挙げられる。
即ち、特許文献２には、エロンジンＡ（ＥｌｏｎｇｉｎＡ）と複合体を形成して転写調節因子として働くことが知られているエロンジンＢＣ（ＥｌｏｎｇｉｎＢＣ）コンプレックス（具体的にはＥｌｏｎｇｉｎＣの一部）に結合し得る領域（アミノ酸配列）であるＳＯＣＳ−ボックスを有する種々のＳＯＣＳタンパク質（サイトカイン情報伝達のサプレッサー）及びそれらのファミリータンパク質（以下総称して「ＳＯＣＳ系タンパク質」という。）を構成するアミノ酸配列の一部であって、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣコンプレックスに結合すると考えられている特定領域「ＢＣ−ボックス」に包含されるアミノ酸配列が、体性幹細胞に対して高い神経分化誘導活性を有することが記載されている。【００２１】
その典型例である配列番号２〜１９は、ＳＯＣＳ系タンパク質として同定された各種タンパク質のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である（非特許文献２〜５参照）。
具体的には、ｍＳＯＣＳ−１（配列番号２），ｍＳＯＣＳ−２（配列番号３），ｍＳＯＣＳ−３（配列番号４），ｍＳＯＣＳ−４（配列番号５），ｍＳＯＣＳ−５（配列番号６），ｈＳＯＣＳ−６（配列番号７），ｈＳＯＣＳ−７（配列番号８），ｈＲＡＲ−１（配列番号９），ｈＲＡＲ−ｌｉｋｅ（配列番号１０），ｍＷＳＢ−１（配列番号１１），ｍＷＳＢ−２（配列番号１２），ｍＡＳＢ−１（配列番号１３），ｍＡＳＢ−２（配列番号１４），ｈＡＳＢ−３（配列番号１５），ＬＲＲ−１（配列番号１６），ｈＡＳＢ−７（配列番号１７），ｍＡＳＢ−１０（配列番号１８），ｈＡＳＢ−１４（配列番号１９），に含まれるＢＣ−ボックスのＮ末端から１５個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を示している（非特許文献２〜５参照）。
また、特に詳細な説明は省略するが、配列番号２０〜８０は、ウイルス（ＨＩＶ、ＡｄＶ、ＳＩＶ等）や哺乳動物から同定された種々のＳＯＣＳ系タンパク質のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列及び該配列から成るペプチドを示している。例えば、配列番号７５および配列番号７９は、ヒトから同定されたＳＯＣＳ系タンパク質（ＭＵＦ１）のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である。また、配列番号８０は、マウスから同定されたＳＯＣＳ系タンパク質ｍＣＩＳ（cytokine-inducible SH2-containing protein）のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である。
これらは例示であり、ＢＣ−ボックスの構成アミノ酸配列（モチーフ）をこれらに限定することを意図したものではない。ここに例示するまでもなく、様々なＢＣ−ボックスの構成アミノ酸配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それらアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。【００２２】
本発明の好適な一実施形態では、上述したいずれかのＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（典型的には配列番号２〜８０のうちの何れかのアミノ酸配列）を神経分化誘導に関与するペプチドモチーフ（配列モチーフ）として使用し、標的とする真核細胞（例えばヒトや哺乳動物由来の体性幹細胞）に導入する人工ペプチドを構築することができる。従って、上記説明から明らかなように、本発明によって、少なくとも一種の真核細胞を神経細胞に分化誘導する方法が提供される。即ち、本方法は、本発明に係る上記細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側又はＣ末端側に、神経分化誘導に関するペプチドモチーフとしていずれかのＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（典型的には配列番号２〜８０のうちのいずれかに示すアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個（例えばＮ末端から少なくとも１０個）の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列）を備えるペプチド鎖を合成すること、および、該合成ペプチド（人工ペプチド）を対象である真核細胞又は該細胞を有する組織を含有する培地又は生体に添加すること、を包含する。典型的には、さらに該合成ペプチドが添加された真核細胞又は該細胞を含む組織を培養すること、を包含する。【００２３】
また、上記説明から明らかなように、本発明によって、そのような神経細胞への分化誘導方法に利用する人工ペプチドとその製法が提供される。
即ち、かかる構成の人工ペプチド（神経分化誘導ペプチド）は、上記細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側又はＣ末端側に、神経分化誘導に関するペプチドモチーフとしていずれかのＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（以下「ＢＣ−ボックス関連配列」ともいう。典型的には配列番号２〜８０のうちのいずれかに示すアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個（例えばＮ末端から少なくとも１０個）の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列）を備えるように合成される。好ましくは、総アミノ酸残基数が５０以下である。
なお、上述した細胞膜透過性核小体局在シグナル配列の場合と同様、神経分化誘導に関するペプチドモチーフとしての機能を保持する限りにおいて、１個または数個（例えば５個以下典型的には２，３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成される改変アミノ酸配列もまた、上記「ＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列（ＢＣ−ボックス関連配列）」に包含される。【００２４】
上記構成の神経分化誘導ペプチドは少なくとも一種の細胞（典型的には幹細胞）に対して高い神経分化誘導活性を有する。このため、神経分化誘導剤の有効成分として好適に使用し得る。なお、神経分化誘導剤に含有される神経分化誘導ペプチドは、神経分化誘導活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、神経分化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。【００２５】
神経分化誘導剤は、有効成分である上記構成の神経分化誘導ペプチドの他、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。神経分化誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、神経分化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
神経分化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、神経分化誘導ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。【００２６】
本発明によって提供される神経分化誘導剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、ここで開示されるＢＣ−ボックス関連配列を含む神経分化誘導ペプチド(即ち該ペプチドを含む神経分化誘導剤）は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。これにより、生体内で、典型的には患部又はその周辺に存在する体性幹細胞から、神経細胞を発生(生産)させることができる。このため、神経再生が有力な治療法となる種々の神経疾患を効果的に治療することが可能となる。例えば、パーキンソン病、脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患を再生医療的アプローチによって治療することが実現される。【００２７】
或いはまた、生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料、即ち生組織や細胞塊(例えば体性幹細胞の培養物)に、適当量の神経分化誘導剤（神経分化誘導ペプチド）を付与することによって、効率よく目的のペプチドモチーフ（ＢＣ−ボックス関連配列）を核内（好ましくは核小体）に移送することができ、神経細胞を効率よく発生させることができる。このことは当該細胞材料中に所望する神経細胞を大量に生産し得ることを意味する。
而して、大量に生産された神経細胞、或いは該生産された神経細胞を含む細胞材料（生組織や細胞塊）を再び生体内(典型的には神経再生が要求されている患部）に戻すことによっても、生体に直接神経分化誘導剤（神経分化誘導ペプチド）を投与する場合と同様の治療効果が得られ得る。
以上の説明から明らかなように、本発明はまた、ここで開示される上記構成の神経分化誘導ペプチドのいずれかを利用することによって、神経疾患治療に有用な、神経細胞に分化誘導された細胞、細胞塊又は生組織を提供することができる。【００２８】
また、本発明の神経分化誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、神経分化誘導ペプチドをコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント、或いはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする部位に導入することにより、常時、生体（細胞）内で本発明に係る神経分化誘導ペプチドを発現させることが可能である。従って、本発明の神経分化誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント等）は、上述した患者等に対し、神経疾患を治療し又は予防する薬剤として有用である。【００２９】
典型例として説明した上記神経分化誘導ペプチドのような、本発明によって提供されるペプチドモチーフ移送のための人工ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されていてもよい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、当該ペプチドの細胞質内及び核内における構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させ得る。
人工ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が５００以下（好適には３００以下、特に好ましくは１００以下、例えば５０以下）であるものが望ましい。このような短鎖長のペプチドは化学合成手法によって容易に構築することができる。
なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。
なお、本発明の人工ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、内在する細胞膜透過性核小体局在シグナル配列ならびにペプチドモチーフの所望する機能を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
また、内在する細胞膜透過性核小体局在シグナル配列ならびにペプチドモチーフの所望する機能を失わない限りにおいて、これら配列に含まれ得ない付加的な配列を部分的に含み得る。【００３０】
使用する人工ペプチドのうちペプチド鎖の比較的短いものは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。即ち、市販のペプチド合成機（例えば、PerSeptive Biosystems社、Applied Biosystems社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。【００３１】
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて人工ペプチドを生合成してもよい。このアプローチは、ペプチド鎖の比較的長いポリペプチドを製造する場合に好適である。すなわち、所望する人工ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のＤＮＡを合成する。そして、このＤＮＡと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、動物（哺乳類）細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的のアミノ酸配列から成るペプチドを得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的のペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。【００３２】
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計した人工ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、目的のペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち目的とする人工ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
従って、核内（好ましくは核小体）への導入対象であるペプチドモチーフに対応するアミノ酸配列（例えば上述したＢＣ−ボックス関連配列）を決定し、上記細胞膜透過性核小体局在シグナル配列と合わせてペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的のペプチドを容易に合成・生産することができる。例えば、日本の（株）ポストゲノム研究所のピュアシステム（登録商標）に基づいてペプチドを容易に生産することができる。【００３３】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。【００３４】
＜実施例１：ペプチド合成＞
計６種類のペプチド（サンプル１〜５、比較サンプル１）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列を列挙している。【００３５】
【表１】
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【００３６】
表１に示すように、サンプル１〜５は、いずれもＮ末端側又はＣ末端側に配列番号１として記載されるアミノ酸配列（１３アミノ酸残基）から成る「細胞膜透過性核小体局在シグナル配列」を有する。また、サンプル１〜５は、当該細胞膜透過性核小体局在シグナル配列に隣接してペプチドモチーフとして神経分化誘導に関与するいずれかの「ＢＣ−ボックス関連配列」を有するように構築されている。即ち、
サンプル１は、細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＣ末端側にｈＳＯＣＳ−６（配列番号７）のアミノ酸配列を有する総アミノ酸残基数が２８である合成ペプチドである（配列番号８１）。
サンプル２は、細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側にｈＳＯＣＳ−６（配列番号７）のアミノ酸配列を有する総アミノ酸残基数が２８である合成ペプチドである（配列番号８２）。
サンプル３は、細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側にｈＡＳＢ−７（配列番号１７）のアミノ酸配列を有する総アミノ酸残基数が２８である合成ペプチドである（配列番号８３）。
サンプル４は、細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側にｍＡＳＢ−１０（配列番号１８）のアミノ酸配列を有する総アミノ酸残基数が２８である合成ペプチドである（配列番号８４）。
サンプル５は、細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のＮ末端側にｈＡＳＢ−１４（配列番号１９）のアミノ酸配列を有する総アミノ酸残基数が２８である合成ペプチドである（配列番号８５）。
比較サンプル１は、細胞膜透過性核小体局在シグナル配列のみから成る総アミノ酸残基数が１３である合成ペプチドである（配列番号１）。
なお、いずれのサンプルも、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）はアミド化（−ＣＯＮＨ２）されている。【００３７】
上述した各ペプチドは、市販のペプチド合成機（アプライドバイオシステム社製品  ４３３Ａ）を用いて固相合成法（Ｆｍｏｃ法）により合成した。なお、縮合剤としてＨＡＴＵ（Applied Biosystems社製品）を使用し、固相合成法に用いた樹脂及びアミノ酸はNOVA biochem社から購入した。アミノ酸配列のＣ末端をアミド化する場合には、固相担体として「Rink Amide resin (100〜200 mesh)」 を使用した。
而して、上記ペプチド合成機の合成プログラムに準じて脱保護基反応及び縮合反応を反復して樹脂に結合するFmoc−アミノ酸からペプチド鎖を伸長していき、目的の鎖長の合成ペプチドを得た。具体的には、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド(DMF)（ペプチド合成用グレード、関東化学（株）製品）によって、アミノ酸のアミノ保護基であるFmocを切断除去し、ＤＭＦで洗浄し、Fmoc−アミノ酸(-OH)各４ｅｑを反応させ、ＤＭＦで洗浄する操作を反復した。そして、ペプチド鎖の伸長反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦによりFmoc基を切断し、ＤＭＦ、メタノールの順で上記反応物を洗浄した。【００３８】
固相合成後、合成したペプチド鎖を樹脂と共に遠沈管に移し、エタンジオール１．８ｍＬ、m-クレゾール０．６ｍＬ、チオアニソール３．６ｍＬ及びトリフルオロ酢酸２４ｍＬを加え、室温で２時間撹拌した。その後、ペプチド鎖に結合していた樹脂を濾過して除去した。
次いで、濾液に冷却エタノールを加え、氷冷水で冷却してペプチド沈澱物を得た。その後、遠心分離（2500rpmで５分間）によって上澄みを廃棄した。沈殿物に冷ジエチルエーテルを新たに加えて十分に撹拌した後、上記と同じ条件で遠心分離を行った。この撹拌と遠心分離の処理を計３回反復して行った。【００３９】
得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、高速液体クロマトグラフ（Waters 600：Waters社製品）を用いて精製を行った。
具体的には、プレカラム（日本ウォーターズ（株）製品、Guard-Pak Delta-pak C18 A300）及びＣ１８逆相カラム（日本ウォーターズ（株）製品、XTerra（登録商標）カラム、MS C18、5μm、4.6×150mm）を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。即ち、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で１０％から８０％への濃度勾配を設ける）、１．５ｍＬ／分の流速で上記カラムを用いて３０〜４０分間の分離精製を行った。なお、逆相カラムから溶離したペプチドは紫外線検出器（490E Detector：Waters社製品）を用いて波長：２２０ｎｍで検出され、記録チャート上にピークとして示される。
また、溶離した各ペプチドの分子量をPerSeptive Biosystems社製のVoyager DE RP（商標）を用いてMALDI-TOF/MS（Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析)に基づいて決定した。その結果、目的のペプチドが合成・精製されていることが確認された。【００４０】
＜実施例２：合成人工ペプチドの神経分化誘導活性評価＞
上記実施例１で得られた６種の人工ペプチドについて、神経分化誘導活性を調べた。
即ち、これらサンプルペプチドを、ラットから採取した神経幹細胞の培養液中に添加し、インキュベーションした。ペプチド添加量は、何れのペプチドについても培養液中のペプチド濃度が１μＭとなるように調整した。【００４１】
ペプチドを添加して２４時間経過後、各サンプルについて、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。
また、同じサンプルに対して神経分化誘導マーカーによる評価を行った。即ち、ニューロン（神経細胞）を識別するマーカーとしてチューブリンを採用し、当該チューブリンを識別する蛍光色素標識抗チューブリン抗体を用いた蛍光抗体法によって培養液中のチューブリンの存在（即ちニューロンの存在）の有無を確認した。また、グリア細胞を識別するマーカーとしてグリア細胞の細胞骨格タンパク質であるグリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を採用し、当該ＧＦＡＰを識別する蛍光色素標識抗ＧＦＡＰ抗体を用いた蛍光抗体法によって培養液中のＧＦＡＰの存在（即ちグリア細胞の存在）の有無を確認した。【００４２】
上記評価試験の結果、サンプル１〜５の人工ペプチド（神経分化誘導ペプチド）を添加した場合、顕著な神経分化が認められた。即ち、サンプル２のペプチドを添加した細胞培養物についての蛍光顕微鏡写真（画像）である図１に示すように、ＤＡＰＩによる核染色で生じたプロット（図１を４等分して左端から第１番目のエリア参照）、即ち核（細胞）の存在する位置の９０％以上で蛍光色素標識抗チューブリン抗体の存在による蛍光発色が認められた（図１を４等分して左端から第３番目及び第４番目（右端）のエリア参照）。このことは、細胞培養物中の生存細胞の９０％以上が神経幹細胞からニューロンに分化したことを示している。また、蛍光色素標識抗ＧＦＡＰ抗体の存在による蛍光発色は認められなかった（図１を４等分して左端から第２番目のエリア参照）。従って、グリア細胞への分化は認められなかった。
他方、図２に示すように、比較サンプル１のペプチドを添加した細胞培養物については、蛍光色素標識抗チューブリン抗体の存在による蛍光発色も蛍光色素標識抗ＧＦＡＰ抗体の存在による蛍光発色も認められず、神経幹細胞からニューロン（及びグリア細胞）への分化は認められなかった。【００４３】
＜実施例３：合成人工ペプチドの細胞膜透過性能評価＞
上記実施例１で得られた５種の神経分化誘導活性（上記実施例２参照）を有する人工ペプチドについて、細胞膜透過性能を調べた。
具体的には、マウス胎児（Ｅ１４．５）から採取した大脳線条体をマウス神経幹細胞用増殖培地（Cell Applications社製品）に懸濁し、セルストレーナーを通して組織片を除去することによりマウス神経幹細胞（ｍＮＳＣ）を含む細胞懸濁液を作製した。次いで、細胞密度が２×１０５cells／ｍＬとなるように上記増殖培地で調整した細胞懸濁液を超低接着表面フラスコにて３７℃、５％ＣＯ２条件下で１週間培養し、ニューロスフェア（未分化状態の神経幹細胞を含む細胞塊）を作製した。そして、かかる作製したニューロスフェアをピペッティングにより分散させて、以下に記す膜透過試験に用いた。【００４４】
膜透過試験は以下の条件で行った。
（１）培養容器：Poly-D-Lysine coated chamber slide（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社(BD)のBioCoat製品）を用いた。
（２）方法：上記ニューロスフェア由来のマウス神経幹細胞（ｍＮＳＣ）を含む細胞懸濁液を上記増殖培地にて５×１０４cells／ｍＬに調整した。次いで、該細胞懸濁液中に、予めＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）でラベルされた上記人工ペプチド（上記サンプル１〜５の何れか）を該ペプチド濃度が１μＭとなるように添加した。そして、上記培養容器の各ウェルに該ＦＩＴＣラベル化ペプチド（上記サンプル１〜５の何れか）を含む細胞懸濁液を１ｍＬずつ添加した。かかる添加から３７℃、５％ＣＯ２条件下で０．５時間培養した試料（即ちウェル中の細胞培養物）、１時間培養した試料、２時間培養した試料、及び６時間培養した試料をそれぞれサンプリングし、メタノールで固定した。次いで、Prolong（登録商標）Gold Antifade Reagent（Invitrogen社製品）を使用して該メタノール固定された試料（細胞）を封入した。そして、各試料（メタノール固定後に上記封入した試料）について、共焦点レーザー顕微鏡を用いてＦＩＴＣラベル化ペプチドの局在を確認した。
図３〜６は、ＦＩＴＣラベルした上記サンプル１のペプチドを添加した細胞懸濁液についての結果を示す顕微鏡写真であり、図３，４，５および６は、それぞれ、０．５時間培養後、１時間培養後、２時間培養後、及び６時間培養後の試料についての結果である。
これら顕微鏡写真から明らかなように、上記添加されたペプチドは、添加後迅速に細胞外から細胞膜を透過して細胞内に移行し更に核内に移行すること（即ち核内に局在すること）が確認された。即ち、上記実施例１で得られた計５種（サンプル１〜５）の神経分化誘導活性を有する人工ペプチドは、優れた細胞膜透過性を示すことが確認された。【００４５】
なお、詳しいデータは示していないが、サンプル１〜５の各ペプチドに含まれる計１５アミノ酸残基から成るＢＣ−ボックス関連配列（ｈＳＯＣＳ−６，ｈＡＳＢ−７，ｍＡＳＢ−１０，ｈＡＳＢ−１４）を、それぞれ、該ＢＣ−ボックス関連配列のＮ末端から１０アミノ酸残基のみの短い配列に変更した場合も、同様の良好な神経分化誘導活性が認められた。【００４６】
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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