(57)【要約】  老化に伴い、頻繁に貧血が見られることから、老人性の貧血防止に有効な治療剤を開発することを第１の課題とする。  更に、今後は老齢化が進むことから、副作用が低く安価で効果的なアンチエイジング剤を提供することを第２の課題とする。  また、骨髄機能抑制を原因とする貧血、具体的には抗癌剤投与の副作用としての貧血に有効な治療剤を提供することを第３の課題とする。  本願発明者は、メチオニン（Met）の単体や、メチオニン（Met）と、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）から選ばれる１以上からなるアミノ酸組成物など、更に、（１）Ile、Trp、Thr、Val、His、Phe、Lys及びLeu、（２）Ile、Thr、Val、His、Lys及びLeu、（３）Trp、Thr、His、Phe、及びLys、（４）Ile、Trp、Thr、Val、Phe、及びLeuから選択されるアミノ酸混合物を有効成分として含む剤に、老人性貧血を改善回復する能力などがあることを初めて見出し、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、及び細胞老化防止剤を提供できた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Metを有効成分として含有する赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤。
【請求項２】
更に、Glu及びGlyを含む請求項１記載の赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤。
【請求項３】
更に、以下の（１）〜（３）から選択されるアミノ酸混合物を含む請求項１記載の赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤。
（１）Ile、Thr、Val、His、Lys、及びLeu
（２）Trp、Thr、His、Phe、及びLys
（３）Ile、Trp、Thr、Val、Phe、及びLeu
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項記載の赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤を含有する飲食品。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項記載の赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤を含有する貧血防止剤又は貧血治療剤。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項記載の赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤を含有する老人性貧血防止剤又は老人性貧血治療剤。
【請求項７】
Metを有効成分として含有する細胞老化防止剤。
【請求項８】
更に、Glu及びGlyを含む請求項７記載の細胞老化防止剤。
【請求項９】
更に、以下の（１）〜（３）から選択されるアミノ酸混合物を含む請求項７記載の細胞老化防止剤。
（１）Ile、Thr、Val、His、Lys、及びLeu
（２）Trp、Thr、His、Phe、及びLys
（３）Ile、Trp、Thr、Val、Phe、及びLeu
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか１項記載の細胞老化防止剤を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤及び老化防止の技術分野に関する。本願発明は、特に赤血球の増殖における、造血幹細胞等赤血球系幹細胞の機能低下の抑制及び老化防止の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化、加齢により、皮膚のしわ、頭髪の減少・白髪などの身体の表面に現れる変化だけでなく、身体の機能は徐々に低下し、様々な症状が現れる。例えば、高血圧、心筋梗塞、狭心症などの疾患、インスリン生産の低下による糖尿病リスクの増大、骨粗しょう症、老人性白内障、老人性貧血などが挙げられる。【０００３】
これら老化対策として、民間療法も含め、種々の健康食品、治療薬が開発されてきた。【０００４】
例えば、メラトニンは老化に伴い減少することから、老化により生じる神経変性疾患へのメラトニン投与が検討され、近年ではメラトニン又はその類縁物質（米国特許第５４０３８５１号）に老化防止作用があるといわれている。更に、このメラトニンの作用はHGHを介するものとして、成長ホルモンを老化防止剤として用いることもなされている（Annu Rev Med. 2003;54:513-33. Epub 2001 Dec 3）。【０００５】
また、体内で生じる活性酸素は細胞やDNAの損傷、脂質の過酸化などを引き起こし、多くの疾患に関与することによる種々の影響があるとして、活性酸素を封じ込めるための抗酸化剤の利用が検討され、例えば、ビタミンC、ビタミンEなどが利用され、αトコフェロールの利用及びその類縁体の利用など（特開平８−２７７２８２号）、更には、ラジカルスカベンジャーが開発されてきた（特開平９−２４１６３７号）。【０００６】
また更に、老化に伴う諸症状のうち、貧血との関係では、体内で発生する「活性酸素」が貧血や免疫不全を誘発するとの報告もある（Nature 431，997-1002）。【０００７】
老人性貧血用については、漢方薬として、例えば、人参（ニンジン）、蒼朮（ソウジュツ）又は白朮（ビャクジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、甘草（カンゾウ）、生姜（ショウキョウ）、大棗（タイソウ）、酸棗仁（サンソウニン）、竜眼（リュウガン）、遠志（オンジ）、当帰（トウキ）、黄耆（オウギ）、木香（モッコウ）、柴胡（サイコ）及び梔子（シシ）からなる加味帰脾湯が知られている。
【特許文献１】米国特許第５４０３８５１号
【特許文献２】特開平８−２７７２８２号
【特許文献３】特開平９−２４１６３７号
【非特許文献１】Annu Rev Med．2003，54 ，513-33．Epub 2001 Dec 3
【非特許文献２】Nature 431，997-1002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
老化に伴い、頻繁に貧血が見られることから、老人性の貧血防止に有効な治療剤を開発することを第１の課題とする。【０００９】
そして、今後は更に老齢化が進むことから、副作用が低く安価で効果的なアンチエイジング剤を提供することを第２の課題とする。【００１０】
また、老人に限らず、広く適用できる貧血防止に有効な治療剤を開発することを第３の課題とする。【００１１】
更に、人工血液製造などのために、効率的に赤血球を細胞培養により調製することを第4の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者は、偶然にも、メチオニン（Met）及びメチオニン含有アミノ酸組成物が赤血球の造血機能を維持や促進する効果を有し、老人性貧血の改善に効果的であることを見出した。メチオニン含有アミノ酸組成物として具体的には、メチオニンに加えて、グリシン（Gly）及びグルタミン酸（Glu）を有効成分として含むアミノ酸組成物に、老人性貧血を改善回復する能力があることを初めて見出したものである。【００１３】
又本願発明は、in vitroでの効率的な赤血球の増殖及び／又は分化方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本願発明のメチオニンを有効成分とする老人性貧血防止剤又は老人性貧血治療剤により、今後も増大すると予想される老人性貧血に対し、安全で安価な処置が可能となる。更に、本願発明の赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤により、強度の運動者の貧血、抗癌剤の副作用や腎臓の疾患による貧血などの造血を必要とする幅広い範囲の貧血を治療・改善できる。更に、本願発明により、老化に伴う細胞の機能低下を防止でき、老化現象を全般的に防止できる。又、本願発明により、細胞培養による赤血球への効率的な増殖、分化が可能となる。【００１５】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2007-300814号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】アミノ酸混合物投与開始直前の各群マウス末梢血のヘモグロビン量。平均±標準偏差を示す。＊：P<0.0001(若齢マウスに対するstudent’s t-test）
【図２】アミノ酸混合物投与後の各群マウス末梢血のヘモグロビン量。平均±標準偏差を示す。＊：P<0.01  (老齢マウス（カゼイン）に対するstudent’s t-test）
【図３】アミノ酸混合物が707fl.細胞の増殖に与える効果。平均±標準偏差を示す。＊：P<0.05(アミノ酸混合物を添加していない条件に対するstudent’s t-test)
【図４】必須アミノ酸混合物から特定のアミノ酸を除いた場合に707fl.細胞の増殖促進効果に与える影響。平均±標準偏差を示す。＊：P<0.005(アミノ酸混合物を添加していない条件に対するstudent’s t-test)
【図５】メチオニンとスレオニンが707fl.細胞の増殖に与える影響。平均±標準偏差を示す。＊：P<0.05(アミノ酸混合物を添加していない条件に対するstudent’s t-test)
【図６】アミノ酸混合物のヒト由来K562細胞に対する増殖促進効果。平均±標準偏差を示す。＊：P<0.05(アミノ酸混合物を添加していない条件に対するstudent’s t-test)
【図７】アミノ酸混合物のヒト由来HEL92.1.7細胞に対する増殖促進効果。平均±標準偏差を示す。＊：P<0.05(アミノ酸混合物を添加していない条件に対するstudent’s t-test)
【図８】メチオニンの濃度が707fl.細胞の増殖に与える影響。平均値±標準偏差を示す。
【図９】高濃度メチオニンによる707fl.細胞の増殖阻害活性に対するアミノ酸[スレオニン（Thr）、又はグリシン（Gly）及びグルタミン酸（Glu）の混合物]の緩和効果。平均±標準偏差を示す。＊：P<0.05(コントロールに対するstudent t-test)
【図１０】抗癌剤アクチノマイシンD誘導貧血モデルにおけるメチオニンの有効性・試験期間中の末梢血ヘモグロビン量の推移。平均±標準誤差を示す。
【図１１】抗癌剤アクチノマイシンD誘導貧血モデルにおけるメチオニンの有効性・アクチノマイシンD投与開始から17日後の抹消血ヘモグロビン量。平均±標準誤差を示す。異なる文字間に有意差あり、P<0.05(one-way ANOVA with Newman-Keuls's post hoc analysis)
【図１２】メチオニンの濃度と707fl.細胞の増殖量。平均±標準偏差を示す。統計解析はstudent’s t-testによる。
【図１３】メチオニンの濃度の違いによる、赤血球関連遺伝子の発現量の変化。平均±標準偏差を示す。統計解析はstudent’s t-testによる。
【図１４】メチオニンの経時的な濃度の変化が、赤血球分化関連遺伝子の発現量に及ぼす効果−１。はじめの3日間、次の24時間、及びその後の24時間の培養に用いられた培地は、それぞれ次の濃度のメチオニン等を含む培地である。図中左から：１：30μM→30μM→30μM２：30μM→150μM→150μM３：30μM→150μM→30μM４：30μM→150μM→＞3μM５：30μM→150μM＋1%DMSO→150μM＋1%DMSO平均±標準偏差を示す。＊：P<0.05(２に対するstudent’s t-test)
【図１５】メチオニンの経時的な濃度の変化が、赤血球分化関連遺伝子の発現量に及ぼす効果−２。はじめの3日間、次の24時間、及びその後の24時間の培養に用いられた培地は、それぞれ次の濃度のメチオニン等を含む培地である。図中左から：１：30μM→30μM→30μM２：30μM→150μM→150μM３：30μM→150μM→30μM４：30μM→150μM→＞3μM５：30μM→150μM＋1%DMSO→150μM＋1%DMSO平均±標準偏差を示す。＊：P<0.05(２に対するstudent’s t-test)
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
１．はじめに
貧血は単に症状を示すもので、直接的には、赤血球の産生低下、ヘモグロビンの合成低下、赤血球の破壊の亢進などにより生じ、原因はそれぞれ異なっている。【００１８】
例えば、赤血球の産生低下では、（イ）腎不全などによるエリスロポエチンの産生低下、（ロ）再生不良性貧血などに見られる造血幹細胞の異常、（ハ）白血病や癌の骨髄などが原因として挙げられている。また、ヘモグロビンの合成低下では、鉄の不足が原因として挙げられており、それぞれの原因に応じた処置が必要となっている。【００１９】
２．老人性貧血並びに赤血球系幹細胞の増殖促進及び赤血球系幹細胞から赤血球への分化促進（赤血球系幹細胞の分化増殖促進）
若年性の貧血では、鉄の欠乏が原因であることが多い。老化による貧血の発生原因は完全には解明されていないが、若年性貧血とは対照的に、骨髄の老化に伴う造血幹細胞の減少、産生される赤血球の寿命の短縮、胃の粘膜の萎縮に伴う栄養の吸収量の減少などが原因として挙げられている。現段階で内臓出血や栄養不足など以外の原因では、加齢による血液幹細胞の機能低下、特に自己再生能の低下と、赤血球への分化誘導が阻害や低下した状態と考えられている。【００２０】
なお、赤血球は造血幹細胞から、赤芽球バースト形成細胞（BFU−E：burst-forming-unit-erythroid）、赤芽球コロニー形成細胞（CFU-E：colony-forming-unit-erythroid)、前赤芽球、赤芽球、網状赤血球、赤血球と分化して生産されると考えられている。【００２１】
本願発明でいう赤血球系幹細胞には、造血幹細胞、赤芽球バースト形成細胞（BFU−E：burst-forming-unit-erythroid）、赤芽球コロニー形成細胞（CFU-E：colony-forming-unit-erythroid)、前赤芽球、及び赤芽球などの赤血球前駆細胞が包含される。【００２２】
３．メチオニン（Met）と老人性貧血の予防又は治療、細胞老化抑制、赤血球系幹細胞の分化及び/又は増殖の促進、老化に伴う赤血球系幹細胞の分化及び/又は増殖機能の低下や、抗癌剤の副作用による骨髄機能の抑制に起因する貧血の予防や改善（以下、アミノ酸は３文字コードで示すことがある。）
３−１．本願発明者は、Met及びMetを含むアミノ酸組成物が、赤血球の造血機能を維持や促進する効果を有し、老人性貧血の改善に効果的であることを実験的に見出した。【００２３】
また、Met及びMetを含むアミノ酸組成物の投与により、老化に伴い発現量の低下、あるいは亢進が認められる遺伝子の発現量が回復することから、本特定組成のアミノ酸組成物を老化に伴う細胞機能の低下や不調を抑制するための剤、言い換えれば、細胞老化防止剤として用いることが可能であることを見出した。【００２４】
３−２．更に、Met及びMetを含むアミノ酸組成物が、マウスの脾臓に由来する赤芽球様細胞である707fl.細胞の増殖を促進させることを見出した。同時にMetで増殖が促進された赤芽球様細胞である707fl.細胞の遺伝子発現を解析した結果、老齢マウスの場合と同様に、ヘム合成酵素や赤血球の構造タンパク質の遺伝子の発現は増加し、主に白血球で発現するインターロイキン（IL）などの遺伝子の発現は減少したため、赤血球への分化の促進が推定された。またこのとき、DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 遺伝子（Dnmt1）やHistone deacetylase (Hdac)などのエピジェネティクな変化に関連する遺伝子の発現が変動したことで、Metによる707fl.細胞の増殖促進には、細胞におけるエピジェネティックな変化を伴うことが予想された。実際にDNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 (DNMT1)の阻害剤であるゼブラリンを作用させたところ、707fl.細胞に対するMetの増殖促進活性は阻害された。【００２５】
３−３．赤血球系幹細胞の増殖促進及び/又は分化促進、老化に伴う赤血球系幹細胞の増殖及び/又は分化機能の低下や、抗癌剤の副作用による骨髄機能の抑制に起因する貧血の予防や改善
Metが赤血球系幹細胞の増殖を促進すること、及び赤血球系幹細胞から赤血球への分化を促進することが明らかになった。【００２６】
つまり、Metの赤血球系幹細胞の分化及び/又は増殖促進作用を通じて、老人を含む健常者の貧血、強度の運動者の貧血、抗癌剤の副作用や腎臓の疾患による貧血などの造血を必要とする幅広い範囲の人に、Met又はMet含むアミノ酸組成物を与えることにより、貧血などの造血機能の低下を予防や改善することができる。【００２７】
また、副作用として貧血を起こす抗癌剤としては、副作用として貧血を生じるいずれの抗癌剤も対象となるが、特に骨髄機能の抑制に起因する貧血を生じる抗癌剤が挙げられる。例えば、シスプラチンやカルボプラチンなどのプラチナ系、ドキソルビシンやエピルビシンなどのアントラサイクリン系、タキソールやタキソテールなどのタキサン系の抗癌剤を挙げることができる。【００２８】
本発明者等は、培養細胞を用いた系で、上記のようにMetが赤芽球様細胞の増殖及び分化に効果を示すことを見出した後、Metの有効な濃度範囲及び濃度があたえる影響について検討した。まず、赤芽球様細胞の増殖促進に有効なMetの濃度範囲としては、25μM〜50000μM、好適には30μM〜5000μM、より好適には、50μM〜3500μM、さらに好適には、50μM〜200μMの範囲を挙げることができる。なお、Metの濃度がある一定範囲、約200μM付近より高濃度で2mM以下の範囲では、細胞増殖への効果を弱める何らかのメカニズムが存在するかも知れない。或いは、メチオニンの濃度により、細胞増殖のメカニズムが異なる増殖作用が存在する可能性もある。【００２９】
また、Met濃度が25μM未満では、赤芽球様細胞への増殖作用は弱いが、赤芽球様細胞に対する分化促進作用が優勢となることを見出した。【００３０】
また、一過性にMetの濃度を上昇させた後、さらに再びMetの濃度を減少さることにより、Metが低濃度の状態で優勢となる分化促進作用が、より一層増強できることを見出した。つまり、Metの急激な濃度変化を与えることにより、赤血球系幹細胞の増殖と分化をより効率よく制御できることとなる。人や動物がMetを摂取したときには、一過性に造血組織中でのMet濃度が上昇すると予想され、赤血球系幹細胞の増殖は促進されると考えられる。さらに再びMetの濃度が減少した場合に分化が進行するので、元の赤血球系幹細胞が増殖した分だけ赤血球が多く産生されることになり、その結果として、赤血球数が増加すると考えられる。以前から、過剰なMetの摂取による溶血性貧血が生じることが知られていたが、これは、過剰なMetの摂取は、赤血球先駆細胞の増殖を継続的に促進すると同時に分化を阻害し、その結果として、未分化の赤血球が大量に産生されるために溶血性貧血を誘導するためと考えることができる。【００３１】
４．Metを含むアミノ酸組成物（アミノ酸製剤）
本願発明で用いるアミノ酸組成物として、Metを含むアミノ酸組成物を有効成分として含有する赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤、貧血防止剤、貧血治療剤、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、又は細胞老化防止剤を包含する。【００３２】
本願発明は、好適には、Metに加えて、Gly及びGluが添加されたアミノ酸組成物を有効成分として含有する、赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤、老人性貧血防止剤、貧血治療剤、又は細胞老化防止剤を包含する。【００３３】
本願発明には、前記アミノ酸組成物に任意の添加成分として、イソロイシン（IIe）、トリプトファン（Trp）、バリン（Val）、ヒスチジン（His）、フェニルアラニン（Phe）、リジン（Lys）及び/又はロイシン（Leu）を更に含むアミノ酸組成物を有効成分として含有する赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤、貧血防止剤、貧血治療剤、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、又は細胞老化防止剤を包含する。【００３４】
具体的には、アミノ酸組成物がMet、Gly、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、Ile、Trp、Val、His、Phe、Lys及び／又はLeuからなるアミノ酸組成物を有効成分として含有する赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤、貧血防止剤、貧血治療剤、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、又は細胞老化防止剤を包含する。【００３５】
本願発明のアミノ酸組成物を構成する各アミノ酸は、D-体、L-体のどちらでもよく、好ましくはL-体である。また、遊離のアミノ酸でもよく、また、薬学上又は食品上、許容される塩でもよい。例えば、各アミノ酸は、塩酸塩、乳酸塩などであってもよい。【００３６】
本願アミノ酸組成物としては、次のものを挙げることができる。【００３７】
４−１．Metに加えて、Gly、Glu、Ser及びThrからなる群から選ばれる１以上のアミノ酸が添加されたアミノ酸組成物を有効成分として含有する赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤、貧血防止剤、貧血治療剤、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、又は細胞老化防止剤。【００３８】
本願発明には、Metに Gly、Glu、Ser及びThrからなる群から選ばれる１以上のアミノ酸が添加されたアミノ酸組成物からなる赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤、貧血防止剤、貧血治療剤、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、又は細胞老化防止剤が包含される。Gly、及びGluを併用することでは、Metを過剰に摂取した場合の溶血性貧血に対する抑制効果を示す。【００３９】
更に、本願発明には、Metに Gly及びGluが添加されたアミノ酸組成物からなる赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤、貧血防止剤、貧血治療剤、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、又は細胞老化防止剤が包含される。GlyとGluを併用してMetに添加すると、Glyを単独で添加するよりも、高濃度のMetに対する細胞障害作用を緩和することができる。【００４０】
４−２．Metに加えて、Ile、Trp、Thr、Val、His、Phe、Lys及びLeuからなる群から選択される１以上のアミノ酸が添加されたアミノ酸組成物を有効成分とする赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、又は細胞老化防止剤。【００４１】
好適には、（１）Ile、Thr、Val、His、Met、Lys及びLeuからなるアミノ酸混合物、（２）Trp、Thr、His、Phe、Met、及びLysからなるアミノ酸混合物、（３）Ile、Trp、Thr、Val、Phe、Met及びLeuからからなるアミノ酸混合物から選択されるアミノ酸混合物からなる赤血球系幹細胞の分化促進剤及び／又は増殖促進剤、貧血防止剤、貧血治療剤、老人性貧血防止剤、老人性貧血治療剤、又は細胞老化防止剤が挙げられる。【００４２】
５．本願発明の組成物の使用の形態  
本願発明のアミノ酸組成物の使用形態は特に限定されないが、飲食用、栄養補助飲食用としても、医療用としても用いることができる。食用とする場合には、本願アミノ酸組成物は、そのまま食用できるが、各種食品への添加物とすることもできる。また、本願発明の組成物は水に溶解して飲料とすることもでき、その場合には、他の栄養成分、例えば、水溶性ビタミン類、タウリンなどを更に添加することもできる。また、嗜好性の改善のために、塩化ナトリウムなどの塩類、クエン酸等の酸類及び／又は他の適当な風味を加えて飲料とすることもできる。安定性のために、pH調整剤、キレート剤を更に添加することもできる。【００４３】
医療用とする場合にも、経口投与、経管投与、直腸投与、注射，輸液による投与などの一般的投与径路により使用することができる。経口投与としては、上記組成物自体あるいは薬学上、許容される担体、賦形剤、希釈剤などとともに混合し、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤などとすることもできる。また、注射剤としては、適当な緩衝剤、等張剤などを添加し、滅菌蒸留水に溶解したものを用いればよい。好適には、経口投与することができる。【００４４】
本願発明のMet及びMet含有アミノ酸組成物は極めて安全であるので、その投与量は非常に広範に設定でき、更に、投与方法、使用目的により異なる。例えば、Met含量0.1%〜1%の溶液で1日1ml〜600mlくらいの範囲で経口投与できる。また、例えば、MetにGly及びGluを添加した組成物として使用する場合には、例えば、Met:Gly:Gluの比率は10：1〜10：1〜10で使用することができる。そして、本願発明の組成物は、鉄、葉酸、ビタミンB12などと併用して、その効果を更に高めることを期待できる。【００４５】
また、具体的には、例えば、10mg / 50kg body / day〜100g / 50kg body / day程度の範囲、好適には、100mg / 50kg body / day〜10g / 50kg body / day程度の範囲、より好適には、130mg / 50kg body / day程度の投与量が挙げられる。赤血球系幹細胞の増殖促進に有効なMetの濃度範囲としては、25μM〜50000μM、好適には30μM〜5000μM、より好適には、50μM〜3500μM、さらに好適には、50μM〜200μMの範囲を挙げることができる。赤芽球などから赤血球への分化を主とする場合に有効なMetの濃度範囲としては、25μM未満、好適には0.01μM〜20μM、より好適には0.1μM〜10μM さらに好適には0.1μM〜5μMの範囲を挙げることができる。【００４６】
６．赤血球系幹細胞の培養
６−１．細胞培養添加剤
本願発明は、更に、Metを有効成分として含有する、赤血球系幹細胞の増殖促進又は／及び分化促進するための細胞培養培地添加剤を包含する。【００４７】
本願発明のMetを有効成分とする赤血球系幹細胞の増殖促進剤及び/または分化促進剤は、赤血球系幹細胞、つまり造血幹細胞、赤芽球バースト形成細胞（BFU−E：burst-forming-unit-erythroid）、赤芽球コロニー形成細胞（CFU-E：colony-forming-unit-erythroid)、前赤芽球、及び赤芽球などの赤血球前駆細胞の細胞培養培地に添加して用いることができる。これら赤血球系幹細胞用の細胞培養培地としては、いずれの培地でも良いが、例えば、商業上入手できる単分化能赤血球前駆細胞用培地などを挙げることができる。【００４８】
前記の培地への添加濃度としては、まず、赤血球系幹細胞の増殖促進に有効なMetの濃度範囲としては、25μM〜50000μM、好適には30μM〜5000μM、より好適には、50μM〜3500μM、さらに好適には、50μM〜200μMの範囲を挙げることができる。また、赤血球系幹細胞の分化促進に有効なMet濃度範囲としては、25μM未満、好適には0.01μM〜20μM、より好適には0.1μM〜10μM さらに好適には0.1μM〜5μMの範囲を挙げることができる
６−２．赤血球系幹細胞の培養方法
本願発明は、赤血球系幹細胞を（１）Metを高濃度で含有する培地を用いて増殖させる工程、（２）Metを低濃度で含有する培地を用いて分化させる工程を包含する、赤血球系幹細胞の培養方法を含む。更に、本願発明には、（１）Metを高濃度で含有する培地を用いて赤血球系幹細胞を増殖させる工程、及び（２）前記(1)工程で増殖した赤血球系幹細胞を再びMetを低濃度で含有する培地を用いて分化させる工程により、分化促進作用をより一層増強する工程を包含する、赤血球系幹細胞の培養方法を含む。又本願発明には、低濃度と高濃度でMetを含有する培地を組み合わせて用いることにより、赤血球系幹細胞の増殖と分化を効率よく制御する工程を含む、赤血球系幹細胞の培養方法を含む。【００４９】
前記の赤血球系幹細胞としては、前述のように、造血幹細胞、赤芽球バースト形成細胞（BFU−E：burst-forming-unit-erythroid）、赤芽球コロニー形成細胞（CFU-E：colony-forming-unit-erythroid)、前赤芽球、及び赤芽球などの赤血球前駆細胞が包含される。【００５０】
前記（1）工程で含有させる高濃度のMetの濃度としては、25μM〜50000μM、好適には、30μM〜5000μM、より好適には、50μM〜3500μM、さらに好適には、50μM〜200μMの範囲を挙げることができる。また、前記（２）工程で含有させる低濃度のMetの濃度としては、25μM未満、好適には、0.01μM〜20μM、より好適には、0.1μM〜10μM、 さらに好適には、0.1μM〜5μMの範囲を挙げることができる
【実施例１】
【００５１】
アミノ酸の摂取による老齢マウスの抹消血ヘモグロビン量の増加
ICR雄性マウスを、20ヶ月齢まで自由飲水、MF飼料（オリエンタル酵母）の自由摂取条件で飼育し、体重により3群に群分けした（老齢マウス）。また、対照として、５週齢のICR雄性マウスを用いた（若齢マウス）。試験飼料には、表１に示すように、AIN-93M精製飼料（カゼイン含量14%）を基本飼料とし、この基本飼料に14%で含まれるカゼインの2%相当分をアミノ酸組成物に置換した飼料を用いた。試験期間中、飼料は自由摂取とした。【００５２】
アミノ酸を与える群では、表２に示すように、16種類のアミノ酸を混合したアミノ酸混合１（AAM1）を投与した群(老齢マウス（AAM1）)と、必須アミノ酸を中心としたアミノ酸混合２（AAM2）を投与した群(老齢マウス（AAM2）)の2群を設けた。対照としてAIN-93M精製飼料を与える群（カゼイン投与群）は、若齢マウス、老齢マウス（カゼイン）の各１群を設けた。
【表１】
2009066562.tif 000002
【表２】
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【００５３】
老齢マウス及び若齢マウスの各群の尾静脈より採血して、末梢血のヘモグロビン量を、ヘモグロビンB-テスト・ワコー（和光純薬）にて測定した。このとき、若齢マウスは5週齢、老齢マウスは各群とも20ヶ月齢であった。そして、若齢マウスはn=9、老齢マウスは各群ともn=15である。統計解析は、student's t-testを用い、若齢マウスに対する有意差検定を行った。【００５４】
結果を図１に示す。老齢マウスのカッコ内のAAM1は17種類のアミノ酸からなる混合物を投与する予定の群、AAM2は12種類のアミノ酸混合物を投与する予定の群を示す（アミノ酸の種類などは表１参照）。この投与前では、若齢マウスに比べて有意に、老齢マウスでヘモグロビン量の低下が認められ、造血機能の低下が示された。【００５５】
この後、それぞれの群の老齢マウスに、表１に示したアミノ酸混合AAM1又はAAM2を、2ヶ月間摂取させた。その後に、尾静脈より採血して、末梢血中のヘモグロビン量を同様に測定した。このとき、上記と同様に、若齢マウスはn=9、老齢マウスは各群ともn=15である。統計解析では、student's t-testを用い、カゼイン投与群の老齢マウスに対する有意差検定を行った。【００５６】
結果を図２に示す。アミノ酸を摂取しなかった老齢マウスでは、ヘモグロビン量の回復は認められなかったが、アミノ酸を摂取させた老齢マウスの末梢血ヘモグロビン量は、若齢マウスと同レベルにまで回復した。これにより、アミノ酸混合物の経口摂取は赤血球造血機能を促進し、老化に伴い低下した抹消血ヘモグロビン量を効果的に上昇させることが示された。
【実施例２】
【００５７】
アミノ酸混合物によるマウス赤芽球様細胞（707fl.細胞）の細胞増殖の促進効果
実施例１において、加齢により低下する抹消血ヘモグロビン量を増加させたアミノ酸の本体を同定するため、707fl.細胞（ECACC（European Collection of Cell Cultures）標準株の細胞を購入した。）を用いて検討した。707fl.細胞は赤血球に分化可能なマウス脾臓由来の赤芽球様細胞である。この707fl.細胞を、RPMI1640培地（SIGMA）に最終濃度が5%の濃度となるように牛胎児血清を添加した培地（5%牛胎児血清含RPMI1640培地）で培養した。アッセイ開始時に、約1×104 cell/wellで、96穴マイクロプレートに細胞を播種し、そこにアミノ酸混合物を種々の濃度（0.5％〜0.001％程度）で添加した。その際に、アミノ酸混合物のpHを中性付近に調整して添加した。この状態で細胞を3日間、培養した後に、WST-1アッセイ法により細胞の増殖を測定した。すなわち、10μlのPremix WST-1試薬（タカラバイオ）を各ウェル（well）に加え、炭酸ガスインキュベーター内で1〜4時間、インキュベーションし、生きている細胞中のミトコンドリア内脱水素酵素によるWST-1の開裂により生成されるホルマザンの量を、A450nm（リファレンスA655nm）で測定した。【００５８】
まず、必須アミノ酸を中心とした12種類のアミノ酸混合物であるAAM2、および9種類の必須アミノ酸混合物であるAAM3について検討した（アミノ酸の種類などは表２参照）。【００５９】
結果を図３に示す。AAM2およびAAM3の両者に707fl.細胞の増殖を促進する効果が認められた。上記の結果は、実施例１における老齢マウスを用いた結果と一致しており、この707fl.細胞を用いた評価系が、赤血球系幹細胞に対するアミノ酸の増殖促進効果を推定するのに有効であることが示された。
【実施例３】
【００６０】
赤血球系幹細胞に対する増殖促進活性の本体となるアミノ酸の特定
実施例２において、赤芽球様細胞に対する増殖促進活性が認められた必須アミノ酸混合物のAAM3から、2ないし3種のアミノ酸を除いた混合物を細胞培養用培地である5%牛胎児血清含RPMI1640培地に溶解した。ここでアミノ酸を除く際の組合せは、分枝鎖アミノ酸（Val、Leu、Ile）、塩基性アミノ酸（His、Lys）、芳香族アミノ酸（Trp、Phe）、その他のアミノ酸（Met、Thr）とした。また、このとき、個々のアミノ酸濃度は、基本となるAAM3の1%溶液に含まれる濃度と等しくなるようにした。各アミノ酸溶液の2倍希釈の系列を50μlで、96穴マイクロプレートに分注した。そこに適当に希釈した細胞（約1×104cell）を50μlで加え、炭酸ガスインキュベーター内で3日間、培養した。この後に、10μlのWST-1試薬を各ウェル（well）に加え、炭酸ガスインキュベーター内で1〜4時間、インキュベーションし、A450nm（リファレンスA655nm）を測定し、細胞増殖を確認した。【００６１】
結果を図４に示す。707fl.細胞に対する増殖促進活性は、AAM3およびAAM3より各アミノ酸を除いた混合物の大半において、濃度が0.004%〜0.008%の範囲において確認された。しかしながら、MetとThrを除いた際に、細胞の増殖促進活性が認められず、赤芽球様細胞に対する増殖促進活性の本体はMetあるいはThrである可能性が強く示された。【００６２】
そこで、更に、上記と同様な方法で、MetとThrの赤芽球様細胞に対する増殖促進活性を検討した。【００６３】
結果を図５に示す。Metには赤芽球様細胞に対する増殖促進活性が認められたが、Thrには増殖促進活性は認められず、増殖促進活性の大部分がMetに依存していることが示された。また、Metの赤芽球様細胞に対する増殖促進活性の至適濃度は、約1〜5μg/mlと推定された。一方、AAM3の赤芽球様細胞に対する増殖促進活性は、0.005％(W/V)付近で認められており、このときに含まれるMet量は全体の3.3%(W/V)＝1.65μg/mlとなり、今回の結果とほぼ一致した。【００６４】
ここで、Metを過剰に摂取すると、副作用で溶血性貧血が惹起されることが報告されている。また、この現象が、Gly、Ser、Thrなどのアミノ酸によって抑制されることも報告されている。上記の現象とMetの赤芽球様細胞に対する細胞増殖促進効果とから、Metを過剰に摂取した場合には、造血組織での赤血球系幹細胞の増殖が過度に促進され、不完全な赤血球が生産されることで溶血が促進し、貧血が誘導されることが推定される。【００６５】
またGlyなどのアミノ酸により、Met過剰摂取で誘導される溶血性貧血が抑制される理由は、生体成分の材料として必要とされるアミノ酸の追加は、造血における補助要件として有効であるからと考えられる。つまり、Metの細胞増殖促進の誘導において、赤血球に必要なグルタチオン、赤血球中のヘムの材料となる生体成分であるGly及びサクシニルCoA、さらには、サクシニルCoAの材料となる生体成分である分岐鎖アミノ酸（BCAA）やMet、Glyの合成の材料になるSer、また、サクシニルCoAはクエン酸サイクルからも供給されるので、クエン酸サイクルに関わる生体成分の材料となるアミノ酸が追加されることは、造血における補助用件と考えられる。アミノ酸の関与は、赤血球合成のための生体成分の材料となるだけでなく、例えばGlyが、サクシニルCoAとの量的バランスを取ることによる効果もあると考えられる。またGlyは、細胞分裂に必要な核酸の合成、グルタチオンやクレアチンの生合成の材料でもあるためと考えられる。
【実施例４】
【００６６】
ヒト由来血球系細胞に対するアミノ酸の増殖促進効果
ヒト細胞でも同様に、Metの細胞増殖の促進効果を検討した。ヒト細胞には、慢性骨髄性白血病（赤白血病）由来のK562細胞と赤芽球性白血病由来のHEL92.1.7細胞（いずれも、ECACC（European Collection of Cell Cultures）標準株の細胞を購入した。）を用いた。いずれの細胞ともに、赤血球に分化させられることが報告されている。アッセイ開始時に、約1×104 cell/wellで、96穴マイクロプレートに細胞を播種し、そこに、アミノ酸混合物を種々の濃度（0.5％〜0.008％程度）で添加した。また、その際に、アミノ酸混合物のpHを中性付近に調整して添加した。この状態で3〜4日、培養した後に、WST-1アッセイ法により細胞の増殖を確認した。【００６７】
結果を図６と図７に示す。K562細胞およびHEL92.1.7細胞に対しても、707fl.細胞と同様に、アミノ酸混合物による増殖促進効果が認められた。更に、AAM2よりも必須アミノ酸混合物であるAAM3の方に、より高い細胞増殖に対する促進効果が認められた。以上の検討から、必須アミノ酸は、ヒトでもマウスと同様に、赤血球造血に対する促進効果のあることが示唆された。
【実施例５】
【００６８】
707fl.細胞の増殖に必要なMet量
707fl.細胞の増殖に必要なメチオニンの濃度の影響を検討した。【００６９】
基本培地であるRPMI1640よりメチオニンを除いた培地（Met不含RPMI1640培地）（フナコシ）に5%終濃度で牛胎児血清を添加した（5%牛胎血清含Met不含RPMI1640培地）。また5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地で100mM Met溶液を調製した。5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地で、上記Met溶液の2倍希釈系列を作製し、50μl/wellで96穴マイクロプレートに分注した。さらに2×105 cell/mlになるように707fl.細胞を5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地に懸濁し、50μl/wellでMet希釈系列の入ったウェルに加えた。炭酸ガスインキュベーター中で3日間、培養した後に、WST-1アッセイ法により細胞増殖の程度を確認した。【００７０】
結果を図８に示す。Metの濃度が25μM〜50000μMで、707fl.細胞の 細胞増殖の促進効果が認められ、50μM〜200μMの濃度において最も高い細胞増殖促進効果が認められた。
【実施例６】
【００７１】
高濃度Metによる細胞増殖阻害を緩和するアミノ酸の検討
実施例３に示されるように、高濃度のMetは細胞の増殖に最適なMetの濃度のときと比べて707fl.細胞の増殖を阻害する。そこで、これを緩和することを指標として、高濃度Metによる増殖阻害活性を緩和するアミノ酸の検討を行った。試験に供する各アミノ酸としては、（イ）Thr、又は（ロ）Gly及びGluを用い、それぞれMetと同重量混合したものを作製した。各アミノ酸混合物を細胞培養用培地である5%牛胎児血清含RPMI1640培地に溶解し、その希釈系列50μlを96穴マイクロプレートに分注した。そこに適当に希釈した細胞（およそ5×104 cell/50μl）50μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で3日間培養した。この後、10μlのWST-1試薬を各ウェルに加え、さらに２〜４時間インキュベーションし、A450nm（リファレンスA655nm）を測定し、細胞増殖を比較した。【００７２】
結果を図９に示す。Met、12.5μg/mlの濃度以上において、細胞増殖阻害が検出された。ThrをMetと同濃度共存させた場合には、12.5μg/ml 以上25μg/ml未満の範囲まで阻害活性を遅延させることが可能であった。これに対してGlyとGluをそれぞれMetと同濃度共存させた場合、50μg/ml以上のMetが及ぼす増殖阻害効果の抑制が認められ、Thrよりも高い効果があることが示された。
【実施例７】
【００７３】
抗癌剤アクチノマイシンD誘導貧血モデルにおけるMetの有効性の検討
［方法］
導入したマウスは10日間馴化した。馴化7日目に尾静脈より血液を10μl採取し、ヘモグロビン（Hｂ）量を測定した。また体重も測定し、Hb量と体重により群分けを行った。群分け後、マウスに対して、5日間連続でアクチノマイシンDの腹腔内投与を2日間のインターバルを入れて2回行った。投与量はマウス腹腔内5日間連続投与時のLD50の半分量である0.07mg/kg body mass/dayとした。またアクチノマイシンDは、生理食塩水に溶解した後、100μl/bodyで投与を行った。また、アクチノマイシンDではなく生理食塩水を100μl/bodyの投与量で腹空内投与し、陰性対照群とした。【００７４】
アクチノマイシンD投与開始時より試験終了時まで、アミノ酸水溶液又は滅菌水の強制経口投与を行った。Met水溶液の濃度は0.2%、1%、5%水溶液とした。陰性対照として滅菌水を用いた。また、造血効果に関するアミノ酸水溶液の陰性対照として1%Thr水溶液を用いた。投与量はいずれのアミノ酸水溶液又は滅菌水とも、200μl/body/dayとした。【００７５】
試験期間中は、適当な頻度で尾静脈より10μlの血液を採取し、Hb量を測定した。【００７６】
上記試験終了後、マウスは麻酔下で全採血して殺処分し、脾臓および骨髄組織を採取して遺伝子解析を行った。【００７７】
なお群構成（各群10匹）は次のとおりである。【００７８】
第1群：生理食塩水腹腔内投与、滅菌水経口投与群
第2群：アクチノマイシンD（0.07mg/kg body mass/ day）腹腔内投与、滅菌水経口投与群
第3群：アクチノマイシンD（0.07mg/kg body mass/ day）腹腔内投与、1%Thr水溶液経口投与群
第4群：アクチノマイシンD（0.07mg/kg body mass/ day）腹腔内投与、0.2%Met水溶液経口投与群
第5群：アクチノマイシンD（0.07mg/kg body mass/ day）腹腔内投与、1.0%Met水溶液経口投与群
第6群：アクチノマイシンD（0.07mg/kg body mass/ day）腹腔内投与、5.0%Met水溶液経口投与群
［結果］
試験期間中の末梢血Hb量の変動を測定した結果を図10に示す。投与開始17日後にHb量の低下が最大となった。投与開始から17日後の抹消血Hb量を図11に示す。このとき、1%Thr水溶液投与群は滅菌水投与群と統計的有意差が認められなかった。これに対して0.2%Met水溶液投与群では、Hb量の上昇傾向が認められ、さらに1%と5%Met水溶液投与群では有意差を持って上昇が認められた。【００７９】
本試験により、Metに骨髄機能抑制に伴う貧血を抑制あるいは改善する効果のあることが再度確認できた。骨髄機能抑制に伴う貧血を抑制あるいは改善するためには、Met濃度1%の経口摂取で十分効果があることが判明したが、Met濃度0.2%でも効果が期待できる。1%Metの投与量をヒトに換算した場合、体表面積換算でおよそ130mg / 50kg body / dayとなる。これはヒトに対して十分投与可能な量である。Metの赤血球造血促進効果は、老齢マウスにおいて低下する末梢血Hb量を回復するだけでなく、抗癌剤の副作用に起因する貧血に対しても効果があることが確認された。
【実施例８】
【００８０】
Met投与アクチノマイシンD誘導貧血マウスの脾臓および骨髄の遺伝子発現量解析
〔方法〕
実施例７に供されたマウスから脾臓と骨髄組織を採取し、組織の約10倍容のAmbion社製RNAレイター試薬に浸け4℃一晩静置した。処理後の組織はRNAを抽出するまで-80℃で保存した。保存組織からのRNA抽出および精製はキアゲン社のRNeasyキットを用い、添付の手順書にしたがって行った。精製後のRNAの品質は、Agilent社のバイオアナライザーを用いて確認した。さらに精製したRNAを用いDNAマイクロアレイ解析を、Affymetrix社のGeneChip、マウス430_2.0アレイを用いて行った。アクチノマイシンD投与で貧血を誘導したマウスへの1%Met投与の効果（実施例７第５群に供されたマウス）を、アクチノマイシンDで貧血を誘導し滅菌水を投与したアミノ酸投与群の対照となるマウス（実施例７第２群に供されたマウス）との遺伝子発現量の比較により検討した。【００８１】
〔結果〕
1%Met投与により発現が上昇した赤血球関連遺伝子を表３に示した。なお、アクチノマイシンDにより貧血を誘導し、かつ滅菌水を投与したマウスの各遺伝子の発現量に対する相対発現量が数値で表３に示されている。【００８２】
マウスの赤血球造血組織である脾臓および骨髄の両者において、赤血球に関連する遺伝子の多くは滅菌水を投与したマウスに比べて上昇した。この結果、Metの投与により赤血球の分化が促進していることが示された。また発現上昇している遺伝子は、骨髄幹細胞からCFU-Eにまで発現しているc-kit（別名CD117膜貫通型チロシンキナーゼで、コロニー形成細胞など造血前駆細胞に発現しているがB細胞系の前駆細胞には発現していない。CD117とリガンドとの相互作用は造血に重要である。）およびそのリガンド（幹細胞因子：SCFとも言われる。）から、CFU-E以降の分化段階で発現量が増すトランスフェリン受容体（CD71）、ヘム合成酵素や赤血球膜タンパク質にまで及んでいる。したがって、Metの効果は、赤血球に分化が決まった単能性幹細胞から赤芽球までの広い範囲に及んでいると言える。
【表３】
2009066562.tif 000004
【実施例９】
【００８３】
Metの濃度と赤芽球様細胞の分化と増殖促進効果との関係
マウスあるいはヒトの血漿中のMetの濃度は、およそ30μM前後である。更に主要な造血組織である骨髄となると、その組織液中のMet濃度は検出限界以下（＜3μM）となる。したがって、通常生体の造血組織における細胞外Met濃度は、In vitroにおける細胞培養条件に比べてかなり低いと考えられる。また前出の図８から、赤芽球様細胞に対して、Metは25μM〜50000μMで増殖促進効果を示すことが分かる。【００８４】
そこで、赤芽球様細胞に対して増殖促進効果を示す150μMの濃度でMetが存在する場合と、骨髄液同様にMetがほぼ存在しない場合の707fl.細胞の遺伝子発現を比較検討した。【００８５】
〔方法〕
Met不含RPMI1640培地に、最終濃度5%の濃度となるように牛胎児血清を添加した培地（5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地）を調製した。さらに上記培地に各々の濃度となるようMet添加した培地（各濃度Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地）を調製した。【００８６】
707fl.細胞を30μM Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地で3日間培養した。培養後の細胞は2分して集め、一方はおよそ5×105  cell/mlの濃度で5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地に再懸濁した。ここで5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地は、5%のウシ胎児血清を添加してあるため、およそ1〜3μM 程度の血清由来のMetが含まれている。もう一方は、およそ5×105  Cell/mlの濃度で150μM Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地に再懸濁した。さらに各条件の細胞は3分割して、それぞれ24時間培養した後、細胞培養液の一部を取ってWST-1アッセイ法により細胞増殖の程度を確認した。【００８７】
〔結果〕
150μM Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地で培養した細胞（150μM Met）は、5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地で培養した細胞(>3μM Met)と比べて有意に細胞数の増加が認められた（図12）。さらにこれらの細胞からRNAを抽出し、リアルタイムPCRにより赤血球関連マーカー遺伝子の発現量を比較検討した。赤血球分化マーカーとしては、赤血球の細胞膜状に豊富かつ特異的に存在するタンパク質であるグリコフォリンAと、ヘム生合成系の酵素で律速酵素のひとつであるフェロケラターゼの遺伝子の発現量を測定した。またこのとき、リファレンス遺伝子としては、ベータ・アクチンを用いた。その結果、5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地で培養した細胞(>3μM Met)では、150μM Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地で培養した細胞（150μM Met）と比べて両遺伝子の発現は有意に高くなっていた（図13）。したがって、通常よりも高い濃度でMetが存在した場合には、赤血球系幹細胞は分化よりも増殖が促進され、逆にMetが低い濃度に変化した場合には増殖よりも分化がより促進されることが示された。上記の結果より、赤血球系幹細胞にはMet濃度を感じ取るセンサー機能が備わっており、細胞外のMetの濃度により巧妙に増殖と分化がコントロールされると考えられた。
【実施例１０】
【００８８】
Met濃度の変化に伴う赤芽球様細胞の分化と増殖促進効果との関係
〔方法〕
5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地に、さらに150μMの濃度となるようMetを添加し、さらにそこに1%の終濃度となるようにdimethyl sulfoxide(DMSO)を添加した培地（150μMMet含5%牛胎児血清含１％DMSO含RPMI1640培地）を調製した。【００８９】
30μM Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地（30μM）にて707fl.細胞を第１〜５までの５つのグループに分けて、3日間培養した。その後、第１のグループは、再度30μM Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地（30μM）に、第２−４グループは、150μM Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地（150μM）に、第５グループは、50μM Met含5%牛胎児血清含１％DMSO含RPMI1640培地（150μM＋１％DMSO）にそれぞれ交換し、24時間培養した。【００９０】
さらに第１及び３のグループは、30μM Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地（30μM）に、第２のグループは150μM Met含5%牛胎児血清含RPMI1640培地（150μM）に、第4のグループは、5%牛胎児血清含Met不含RPMI1640培地(>3μM )に、第５のグループは、150μM Met含5%牛胎児血清含１％DMSO含RPMI1640培地（150μM＋１％DMSO）に、それぞれ交換し、24時間培養した。ここで1%DMSOは、分化に関する陽性対照として加えた。培養終了後、各々の細胞からRNAを抽出し、リアルタイムPCRにより赤血球関連マーカー遺伝子であるグリコフォリンA及びフェロケラターゼの遺伝子発現量を比較検討した。またこのときのリファレンス遺伝子としては、ベータ・アクチンを用いた。【００９１】
〔結果〕
Met濃度30μMで継続して培養した細胞と比較して、Met濃度150μMで培養した細胞では、赤血球分化関連遺伝子の発現は減少しており、分化より増殖が促進されていると言える。これに対して、Met濃度を3μM未満に低下させると分化関連遺伝子の発現は、Met濃度30μMで継続して培養した場合や150μM Met含有培地から30μM Met含有培地に交換して培養した場合よりも上昇し、1%DMSO存在下で培養した場合とほぼ同じレベルに達した（図14、図15）。これらの結果は、Metの急激な濃度変化により、赤芽球様細胞である707fl.細胞において、細胞増殖から分化に効率よく誘導が行われたことを示した。したがって、Metは赤血球系幹細胞の増殖と分化を効率よく制御できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本願発明は、老人性貧血防止剤及び老人性貧血治療剤を提供するものであり、医薬品製造業又は食品製造業で利用可能である。【００９３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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