(57)【要約】Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド由来のシトルリン化ペプチドに対して反応する自己抗体が、関節リウマチを有する患者において見出される。これらは、Ｉ型コラーゲンのα１鎖由来の配列−ＹＹＸＡもしくはα２鎖由来の配列−ＦＹＸＡ、またはＩＩ型コラーゲンのα１鎖由来の配列−ＹＭＸＡ（式中、Ｘはシトルリンである）を検出する。これらの抗体は、抗フィラグリン抗体とは異なる。本発明のペプチドは、関節リウマチの診断において使用できる。シトルリン化ペプチドの経口投与は、寛容を誘導し、関節リウマチの治療を導き得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチに関連して形成された自己抗体を検出するための方法であって、
１種または複数の免疫複合体の形成に適した条件下で１種または複数のペプチドを生体液試料と接触させるステップ、および
形成された自己抗体を検出し、その量を任意選択で測定するステップからなり、
前記ペプチドが、
Ｉ型コラーゲンのα１鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
Ｉ型コラーゲンのα２鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
ＩＩ型コラーゲンのα１鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
からなる群から選択され、ペプチド配列中の少なくとも最後のアルギニン残基がシトルリンに変換されている、方法。
【請求項２】
ペプチド（１種または複数）が、−ＹＹＸＡ、−ＦＹＸＡおよび−ＹＭＸＡからなる群から選択される配列で終わり、Ｘがシトルリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチド（１種または複数）が組織コラーゲンから単離され、アルギニン（１種または複数）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでシトルリン（１種または複数）に変換される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ペプチド（１種または複数）が、部分的または完全に合成ペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ペプチド（１種または複数）の長さが、１０〜５０アミノ酸、好ましくは１２〜３０アミノ酸である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ペプチド（１種または複数）が、ＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＸＡ（配列番号１）、ＹＤＦＧＹＤＧＤＦＹＸＡ（配列番号２）およびＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＸＡ（配列番号３）からなる群から選択される配列を含み、Ｘがシトルリンである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
生体液試料が、血清試料または滑液試料である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ペプチド（１種または複数）が、放射性標識、発光標識、蛍光標識、ランタニドおよび酵素からなる群から選択される標識を含む、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ペプチドと生体液試料との間の免疫反応が固相中で実施され、ペプチドが、試験管もしくはプレートまたは対応する固相に直接的または間接的に結合する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドと生体液試料との間の免疫反応が液相中で実施され、ペプチド配列が液体中で固体粒子に直接的または間接的に結合する、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＬＩＳＡアッセイにおける吸光度の強度として、自己抗体が検出されるかまたは自己抗体の量が測定される、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
化学発光アッセイにおける放射光として、自己抗体が検出されるかまたは自己抗体の量が測定される、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
結合したシトルリンペプチドが、結合したアルギニンペプチドと比較されるように、自己抗体が検出されるかまたは自己抗体の量が測定される、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
可溶性シトルリンペプチドからなるアッセイ溶液中で、自己抗体が検出されるかまたは自己抗体の量が測定される、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｉ型コラーゲンのα１鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列をからなるペプチド、
Ｉ型コラーゲンのα２鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
ＩＩ型コラーゲンのα１鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
からなる群から選択されるシトルリン化ペプチドであって、ペプチド配列中の少なくとも最後のアルギニン残基がシトルリンに変換されている、ペプチド。
【請求項１６】
−ＹＹＸＡ、−ＦＹＸＡおよび−ＹＭＸＡからなる群から選択される配列で終わり、Ｘがシトルリンである、請求項１５に記載のシトルリン化ペプチド。
【請求項１７】
ペプチド（１種または複数）の長さが、１０〜５０アミノ酸、好ましくは１２〜３０アミノ酸である、請求項１５または１６に記載のシトルリン化ペプチド。
【請求項１８】
ペプチド配列が、ＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＸＡ（配列番号１）、ＹＤＦＧＹＤＧＤＦＹＸＡ（配列番号２）およびＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＸＡ（配列番号３）からなる群から選択される配列からなる、請求項１５乃至１７のいずれか１項に記載のシトルリン化ペプチド。
【請求項１９】
請求項１５乃至１８のいずれか１項に記載の少なくとも１種のシトルリン化ペプチドを含む、キット。
【請求項２０】
請求項１５乃至１８のいずれか１項に記載のペプチドの少なくとも１種の有効量を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
経口投与または注射に適している、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
１〜５０μｇ／日、好ましくは１〜２５μｇ／日の量で患者に投与される、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
関節リウマチを治療するための方法であって、そのような治療を必要とする個体に請求項１５乃至１８のいずれか１項に記載のペプチドの少なくとも１種の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
Ｉ型および／またはＩＩ型コラーゲンに対する免疫寛容を誘導するための方法であって、そのような治療を必要とする個体に請求項１５乃至１８のいずれか１項に記載のペプチドの少なくとも１種の有効量を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者において見出される自己抗体を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチは、世界人口の約１％が罹患している一般的な自己免疫疾患である。この疾患は、早期段階で認識することが難しく、この疾患は次に、軟骨を破壊することおよび関節周囲の骨のびらんを導くことによって、関節における不可逆的な損傷へと進行する。
【０００３】
シトルリンは、酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって、ペプチドまたはタンパク質中のアルギニンから翻訳後に形成されるアミノ酸である。ＲＡ患者におけるいくつかの自己抗体はシトルリンを含むタンパク質に対するものであるので、この構造は、リウマチ学においてかなりの注意を引いてきた。最初のこのような自己抗体は、早くも１９６４年にはＮｅｉｎｈｕｉｓおよびＭａｎｄｅｍａによって記載された、抗核周囲因子（ＡＰＦ）であった（Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  １９６４；２３：３０２〜３０５頁）。この抗原は、ヒト頬粘膜細胞の核の周囲のケラトヒアリン顆粒中に存在する。１９７９年に、Ｙｏｕｎｇら（ＢＭＪ  １９７９；２：９７〜９９頁）は、ラット食道の切片を使用した間接的免疫蛍光によって、抗ケラチン抗体（ＡＫＡ）を発見した。Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９８；１０１：２７３〜２８１頁）およびＧｉｒｂａｌ−Ｎｅｕｈａｕｓｅｒら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１６２：５８５〜５９４頁）は後に、ＡＰＦおよびＡＫＡの両方が、シトルリン残基を含む（プロ）フィラグリンに特異的に結合することを、独立して示した。これらの自己抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙによって提唱された分類基準の１つを構成する特定の従来の自己抗体（例えば、リウマチ因子）よりも、ＲＡに対して特異的である（Ａｒｎｅｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９８８；３１：３１５〜３２４頁）。他方、それらの特異性に起因して、シトルリン化タンパク質に対する抗体は、ＲＡの病因および／または病原に関与し得ると推測されてきた（ｖａｎ  Ｂｏｅｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２００２；４：８７〜９３頁）。しかし、抗シトルリン化フィラグリン抗体の産生が疾患の発病に先立つという事実は、シトルリン化および／または抗シトルリン化フィラグリン抗体がそれ自体病原性であるという単純な仮説と矛盾している（Ｙａｍａｄａら、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ２００５；１０：５４〜６４頁）。例えば、関節周囲の組織における軟骨の深在性の破壊および骨びらんは、これらの自己抗体によっては誘導できない。
【０００４】
シトルリン化タンパク質に対する自己抗体の結合は、いくつかの方法によって検出され得る。最初に使用された免疫染色法は、臨床検査室において慣用的に使用するには適していなかったが、後に、環状シトルリン化ペプチドを抗原（抗ＣＣＰ）として用いた酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）の導入は、良好な再現性でこのような抗体の決定を大いに簡略化した（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２０００；４３：１５５〜１６３頁）。抗ＣＣＰ抗体の存在は、見た目には健康な個人におけるＲＡの発症（Ｒａｎｔａｐａａ−Ｄａｈｌｑｖｉｓｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００３；４８：２７４１〜２７４９頁およびＮｉｅｌｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０：３８０〜３８６頁）およびＲＡへの未分化関節炎の進行（ｖａｎ  Ｇａａｌｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０：７０９〜７１５頁）を予測することが報告されている。これらの抗体の病原の役割に関する可能な手がかりには、アポトーシスとシトルリン化との関連、臨床症状の発生前の抗ＣＣＰ抗体の出現およびＲＡに対するそれらの特異性、ならびにＲＡに関連するシトルリン化の増加を導く示唆された遺伝的リスク因子が含まれる（ｖａｎ  Ｇａａｌｅｎ  ＦＡら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０：７０９〜７１５頁を参照のこと）。
【０００５】
関節内には抗ＣＣＰ抗原は存在せず、このことは、これらの抗原と反応する自己抗体はいずれも、免疫交差反応を反映しているに過ぎない可能性が最も高いことを意味する（Ｙａｍａｄａら、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ２００５；１０：５４−６４頁）。本来の免疫原の可能な候補には、滑膜組織中のフィブリンのシトルリン化されたα鎖およびβ鎖（Ｍａｓｓｏｎ−Ｂｅｓｓｉｅｒｅら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；１６６：４１７７〜４１８４頁）ならびにシトルリン化ビメンチンとして同定されたＳａ抗原（Ｖｏｓｓｅｎａａｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２００４；６：Ｒ１４２〜Ｒ１５０）が含まれる。
【０００６】
コラーゲンに対する自己免疫は、ＲＡの病原に関与し得ると長く想定されていた。しかし、その証拠は、状況証拠に過ぎない。特定の動物種（例えば、ラット、マウス、ウサギおよびサル）において、ＩＩ型コラーゲンでの免疫は、ヒトＲＡに似た多発性関節炎の発症を生じる。ＩＩ型コラーゲンは翻訳後に修飾され、これらの修飾（例えば、２６４位でのリジンのグリコシル化）のなかには、Ｔ細胞により認識され得るものがある（Ｈｏｌｍｄａｈｌら、Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ２００２；１：１３５〜１４７頁）。抗コラーゲン抗体は、軟骨コラーゲンに対して形成されるだけではなく、骨（Ｉ型コラーゲン）および軟組織コラーゲン（例えば、ＩＩＩ型およびＶ型コラーゲン）に対しても形成される（Ｓｔｕａｒｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９８３；２６：８３２〜８４０頁）。変性コラーゲンに対する抗体は、ネイティブなコラーゲンに対する抗体よりも、ＲＡ血清においてより高頻度かつより高濃度で存在する（Ｎｉｊｅｎｈｕｉｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ａｃｔａ  ２００４；３５０：１７〜３４頁およびＮｏｍｕｒａ  Ｋ、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １９９２；２９３：３６２〜３６９頁）。これらの抗コラーゲン抗体は、決してＲＡに特異的なのではなく、それらの形成はこの疾患の原因ではなく、結合組織の破壊に対して二次的なものであり得る。
【０００７】
数年前、経口投与されたＩＩ型コラーゲンによる関節リウマチの治療を扱う多数の論文が刊行された（Ｔｒｅｎｔｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；２６２：１７２７〜１７３０頁）。しかし、これらの実験は何の利益も示さなかった（Ｃａｚｚｏｌａら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２０００；１８：５７１〜５７７頁）、あるいはごく僅かなＲＡの疾患の改善しか示さなかったため（Ｃｈｏｙら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００１；４４：１９９３〜１９９７頁）、この仮説における興味はそれ以来失われていた。
【０００８】
Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔら（Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５．３５：１６４３〜１６５２頁）は、コラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）が、この軟骨特異的自己抗原に対する自己寛容の破壊を生じ得る、ＰＡＤ酵素による構造的修飾の基質であり得るか否かという仮説を試験した。その結果は、ＰＡＤ２（ＰＡＤアイソタイプ２）が、自己抗体形成のための免疫優勢なＣＩＩ領域における、アルギニンのシトルリンへの変換を触媒するという証拠を与え、早期ＲＡ患者においてシトルリン化三重螺旋コラーゲンペプチドＣＩＩのアミノ酸残基３５９〜３６９に特異的に結合する循環自己抗体の存在を示した。Ｂｕｒｋｈａｒｄｔらによれば、彼らの結果は、シトルリン化コラーゲンの自己免疫認識が早期ＲＡにおいて頻繁な事象であることを示している。著者らはさらに、シトルリン化ＣＩＩに対するＩｇＧ抗体が、ＲＡの早期マーカーとして使用される抗ＣＣＰ自己抗体の存在と相関するということに、さらに注目している。
【０００９】
Ｓｕｚｕｋｉら（Ｂｉｏｃｈ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００５；３３：４１８〜４２６頁）は、免疫スクリーニングによるＲＡ滑膜細胞ｃＤＮＡライブラリーを使用して、ヒトＩ型コラーゲンがこの自己抗原の１つであり得ることを見出した。彼らは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンが、シトルリン化の基質として使用され得るか否かという仮説を試験した。以前の論文（Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｏｎｕｌ  ２００５；３５：１６４３〜１６５２頁）の知見とは対照的に、ＲＡにおいてシトルリン化ＩＩ型コラーゲンに対する特異的抗体は存在しなかったが、シトルリン化Ｉ型コラーゲンに対する抗体は見出された。
【００１０】
抗ＣＣＰ自己抗体は、関節リウマチに非常に特異的ではあるが、おそらく無害である。なぜなら、この自己抗体は、軟骨および関節周囲の骨の破壊を担い得ないからである。抗ＣＣＰに対する公開された第１のアッセイ（マーク１）は、−ＳＴＸＧ−（式中、Ｘはシトルリンである）の配列を有するシトルリン化フィラグリンを検出する（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２０００；４３：１５５〜１６３頁）。抗ＣＣＰに対する公開された第２のアッセイ（マーク２）は、ＲＡ血清とコントロール血清との間の識別に基づいてランダムに作成された合成ペプチドから選択された、いくつかのペプチド配列に基づく（Ｚｅｎｄｍａｎ  Ａら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００６、４５：２０−５およびＫｉｎｌｏｃｈ  ＡＪら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；２；３６５〜３７５頁）。これらの配列は公開されていないが、フィラグリンにもヒトの身体において見出される任意の他のタンパク質のいずれにも関係していない。
【００１１】
Ｌｕｎｄｂｅｒｇら（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２００５；７：Ｒ４５８〜Ｒ４６７）は、未修飾ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と比較して、ラットＴ細胞およびＢ細胞の、シトルリン化ラット血清アルブミン（Ｃｉｔ−ＲＳＡ）に対する応答を試験した。Ｃｉｔ−ＲＳＡ抗原およびＲＳＡ抗原の両方に対して抗体が産生されたことから、Ｃｉｔ−ＲＳＡが免疫寛容の破壊を導くことが見出された。しかし、ＲＳＡ単独では抗体をまったく誘導しなかった。シトルリン化ＩＩ型コラーゲン（Ｃｉｔ−ＣＩＩ）は、ネイティブの対応物よりも高い発生率およびより早期の発生で、関節炎を誘導した。シトルリン化タンパク質および酵素ＰＡＤ４の量は、Ｌｕｎｄｂｅｒｇらによれば、炎症の重篤度に相関し、健康な関節においては検出不能であった。
【００１２】
公知のコラーゲンのアミノ酸配列の例は、例えば、データベースＥＭＢＬ−ＥＢＩ、ＡＣ  Ｑ８Ｎ４７３、０１−ＯＣＴ−２００２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ、Ｉ型コラーゲンα１、前タンパク質、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ、ＡＣ  Ｑ７Ｚ５Ｓ６、０１−ＯＣＴ−２００３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ、Ｉ型コラーゲンα２、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ、ＡＣ  Ｑ９６ＩＴ５、０１−ＤＥＣ−２００１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ、ＣＯＬ２Ａ１タンパク質（ＩＩ型コラーゲンα１）において見出され得る。
【００１３】
Ｉ型コラーゲンの架橋されたカルボキシ末端テロペプチド（ＩＣＴＰ）についてのアッセイは、関節リウマチなどのいくつかの病理的状態においてＩ型コラーゲン分解の増加を反映していることが示された。ＩＣＴＰアッセイによって認識される抗原決定基は、ヒトＩ型コラーゲンの２つのα１鎖のカルボキシ末端テロペプチド（ヒトＩ型コラーゲン中のＡＧＦＤＦＳＦＬ）の疎水性フェニルアラニンリッチ領域内に存在することが、Ｓａｓｓｉ  Ｍ．−Ｌ．ら（Ｂｏｎｅ、Ａｐｒｉｌ  ２０００；２６（４）：３６７〜３７３頁によって示された。Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＣｒｏｓｓＬａｐｓ（登録商標）ＥＬＩＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ）アッセイは、骨吸収の評価に使用され得る。これは、破骨細胞の骨吸収の間に生成されるＩ型コラーゲンフラグメントを検出し、異性体化形態中のエピトープＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−β−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含むＩ型コラーゲンα１鎖のＣ−テロペプチドフラグメントを認識するモノクローナル抗体を使用する。
【００１４】
関節リウマチを診断する際の使用が示唆されるペプチドを開示する、いくつかの特許公報が存在する。国際特許公開ＷＯ９５／０８１１５号は、体液中のコラーゲンフラグメントを決定するための方法を記載している。この方法は、架橋のための潜在的な部位を含むコラーゲン由来の合成ペプチドを使用する。米国特許第６３５５４４２号においても、コラーゲンフラグメントを決定するための方法が開示されている。国際特許公開ＷＯ０３／０５０５４２号は、関節リウマチに罹患している患者から自己抗体を検出するための方法を記載している。この方法は、ＸＧモチーフおよびＸ非Ｇを含むペプチド単位の使用を含み、ここでＸは、シトルリン残基またはそのアナログであり、Ｇはアミノ酸グリシンであり、非Ｇはグリシン以外のアミノ酸である。国際特許公開ＷＯ２００４／０７８９８号は、エピトープを共有するＭＨＣクラスＩＩ分子に対する親和性が増加したシトルリン化ペプチドを開示している。このようなペプチドは、関節リウマチを診断する際に使用されることが示唆される。国際特許公開ＷＯ２００４／０８７７４７号は、線状シトルリン化合成ペプチドおよびそれらを含む複数の抗原ペプチドを開示している。これらのペプチドは、関節リウマチを診断する際に使用されることも示唆される。
【００１５】
【非特許文献１】ＮｅｉｎｈｕｉｓおよびＭａｎｄｅｍａ、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  １９６４；２３：３０２〜３０５頁
【非特許文献２】Ｙｏｕｎｇら、ＢＭＪ  １９７９；２：９７〜９９頁
【非特許文献３】Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９８；１０１：２７３〜２８１頁
【非特許文献４】Ｇｉｒｂａｌ〜Ｎｅｕｈａｕｓｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１６２：５８５〜５９４頁
【非特許文献５】Ａｒｎｅｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９８８；３１：３１５〜３２４頁
【非特許文献６】ｖａｎ  Ｂｏｅｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２００２；４：８７〜９３頁
【非特許文献７】Ｙａｍａｄａら、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ２００５；１０：５４〜６４頁
【非特許文献８】Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２０００；４３：１５５〜１６３頁
【非特許文献９】Ｒａｎｔａｐａａ−Ｄａｈｌｑｖｉｓｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００３；４８：２７４１〜２７４９頁
【非特許文献１０】Ｎｉｅｌｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０：３８０〜３８６頁
【非特許文献１１】ｖａｎ  Ｇａａｌｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０：７０９〜７１５頁
【非特許文献１２】Ｍａｓｓｏｎ−Ｂｅｓｓｉｅｒｅら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；１６６：４１７７〜４１８４頁
【非特許文献１３】Ｖｏｓｓｅｎａａｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２００４；６：Ｒ１４２〜Ｒ１５０
【非特許文献１４】Ｈｏｌｍｄａｈｌら、Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ２００２；１：１３５〜１４７頁
【非特許文献１５】Ｓｔｕａｒｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９８３；２６：８３２〜８４０頁
【非特許文献１６】Ｎｉｊｅｎｈｕｉｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ａｃｔａ  ２００４；３５０：１７〜３４頁
【非特許文献１７】Ｎｏｍｕｒａ  Ｋ、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １９９２；２９３：３６２〜３６９頁
【非特許文献１８】Ｔｒｅｎｔｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；２６２：１７２７〜１７３０頁
【非特許文献１９】Ｃａｚｚｏｌａら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２０００；１８：５７１〜５７７頁
【非特許文献２０】Ｃｈｏｙら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００１；４４：１９９３〜１９９７頁
【非特許文献２１】Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔら、Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５．３５：１６４３〜１６５２頁
【非特許文献２２】Ｓｕｚｕｋｉら、Ｂｉｏｃｈ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００５；３３：４１８〜４２６頁
【非特許文献２３】Ｚｅｎｄｍａｎ  Ａら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００６、４５：２０−５
【非特許文献２４】Ｋｉｎｌｏｃｈ  ＡＪら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；２；３６５〜３７５頁
【非特許文献２５】Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２００５；７：Ｒ４５８〜Ｒ４６７
【非特許文献２６】Ｓａｓｓｉ  Ｍ．−Ｌ．ら、Ｂｏｎｅ、Ａｐｒｉｌ  ２０００；２６（４）：３６７〜３７３頁
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ９５／０８１１５号
【特許文献２】米国特許第６３５５４４２号
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ０３／０５０５４２号
【特許文献４】国際特許公開ＷＯ２００４／０７８９８号
【特許文献５】国際特許公開ＷＯ２００４／０８７７４７号
【非特許文献２７】Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ、１９６４．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｓｏｃ．６５：２１４９
【非特許文献２８】Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）
【非特許文献２９】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５：１６１〜２１４頁（１９９０）
【非特許文献３０】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｅ．Ｗａｎｓｃｈ（Ｅｄ．Ｖｏｌ．１５ｐｔｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ．Ｔｈｉｅｍｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９８７））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、関節リウマチを診断するための改善された方法を提供することである。本発明の目的はまた、関節リウマチの治療のためおよびこのような治療をモニタリングするための新規方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の１つの目的は、関節リウマチに関連する自己抗体を検出するための方法である。この方法は、この疾患の診断において使用され得る。
【００１８】
この方法は、関節リウマチを有する患者において自己抗体がコラーゲンペプチドの部分に対して形成されたという知見に基づいている。特に、コラーゲンペプチドのこのような部分はテロペプチドであり、より具体的にはカルボキシ末端テロペプチドである。Ｃ−テロペプチドが、−ＹＹＸＡ、−ＦＹＸＡおよび−ＹＭＸＡ（式中、Ｘは、シトルリンに変換されたアルギニンを示す）の群から選択されるペプチド配列を含むことが見出された。−ＹＹＸＡは、Ｉ型コラーゲンのα１鎖中に見出され、−ＦＹＸＡは、Ｉ型コラーゲンのα２鎖中に見出され、−ＹＭＸＡは、ＩＩ型コラーゲンのα１鎖中に見出された。これらの自己抗体は、フィラグリンに基づく配列を用いて検出されたものとは異なっていた。従って、先行技術（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２０００；４３：１５５〜１６３頁）において示唆された抗ＣＣＰ法は、関節リウマチに関連する正確なペプチド配列を検出できなかった。
【００１９】
本発明のさらなる１つの目的は、ＲＡを治療するためのペプチドおよび医薬組成物である。シトルリン化コラーゲンの部分がコラーゲンの潜在的に有害なシトルリン化に対する免疫寛容を誘導し得ることが、本発明において見出された。従って、ＲＡ患者は、シトルリン化コラーゲンの部分を投与することによって治療され得る。特に、コラーゲンのこのような部分は、テロペプチド、より具体的にはカルボキシ末端テロペプチド由来であった。Ｃ−テロペプチドが−ＹＹＸＡ、−ＦＹＸＡおよび−ＹＭＸＡ（式中、Ｘは、シトルリンに変換されたアルギニンを示す）の群から選択されるペプチド配列を含むことが見出された。
【００２０】
先行技術の刊行物は、ＲＡを有する患者における自己抗体形成におけるコラーゲンテロペプチドの役割の研究を開示していない。その理由は、このような自己抗体が、ペプシン消化によって可溶性になったコラーゲン調製物を使用することによって主に試験されてきたからである。このプロテアーゼは、コラーゲンのカルボキシテロペプチドを除去し、従って、先行技術の刊行物の著者らは、テロペプチドの観察をまったくできていなかった。
【００２１】
さらに、本発明は、本発明のペプチドで治療されたＲＡを有する患者をモニタリングするために使用され得る。
【００２２】
この研究において開発されたアッセイは、自己抗体を検出して患者においてＲＡを診断するため、および本発明のペプチドで治療されたＲＡを有する患者をモニタリングするための両方に使用され得る。
【００２３】
抗ＣＣＰ法は、関節リウマチの診断において充分に機能する。しかし、この方法によって検出される自己抗体は、軟骨および骨の分解を担い得ない。従って、薬物による最も積極的な治療を必要とする患者を認識することが重要である。
【００２４】
関節リウマチを有するかまたは関節リウマチを有すると疑われる患者を治療するために使用される多数の薬物は、いくつかの副作用を引き起こす。従って、この薬物を全ての患者に与えることはできない。患者がシトルリン化コラーゲンに対する抗体を有することが示された場合、これは、最も積極的な様式で患者を治療する理由である。最も最近の薬物は非常に高価でもあり、それらの広範な使用を妨げている。本発明の方法を使用することによって、最も有効な治療を必要とする患者を認識でき、この治療を適正な患者群に向けることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
「関節リウマチ」（ＲＡ）は、滑膜炎症およびパンヌス形成によって特徴付けられる一般的な自己免疫疾患であり、軟骨および骨の分解を導き得る。
【００２６】
３つのクラスのヒトコラーゲンが記載されている。第１の群は、いくつかのコラーゲン型（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＶ型）を含む。これらのうち、Ｉ型コラーゲンは、有機骨基質の９０％より多くを占める。ＩＩ型コラーゲンは、関節の軟骨中に豊富な分子である。Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンは、コアコラーゲン分子に結合したＮ末端およびＣ末端のプロペプチド配列を含むプロコラーゲンとして合成される。プロペプチドが除去されると、コラーゲン分子の残りのコアは、非螺旋の短い末端テロペプチド配列を有する三重螺旋ドメインからなる。
【００２７】
用語「自己抗体」は、関節リウマチを有する患者において、アルギニン含有ペプチドまたはそのシトルリン化形態に対して形成された抗体を意味する。これらの自己抗体は、軟骨および骨の分解に関連して形成される。
【００２８】
本発明において、特に、カルボキシ末端テロペプチドが自己抗体の検出において使用され得る配列を含むことが見出された。このような配列は、Ｉ型コラーゲンのα１鎖、Ｉ型コラーゲンのα２鎖およびＩＩ型コラーゲンのα１鎖から特異的に見出された。さらに、ペプチド配列中の最後のアルギニン残基がシトルリンに変換されている場合、これらのカルボキシ末端部分由来の配列を含むペプチド配列が、自己抗体の検出において使用され得ることが見出された。
【００２９】
Ｉ型コラーゲンのα１鎖のカルボキシ末端テロペプチドの長さは、２６アミノ酸である。Ｉ型コラーゲンα２鎖のカルボキシ末端テロペプチドの長さは１７アミノ酸であり、ＩＩ型コラーゲンのα１鎖のカルボキシ末端テロペプチドの長さは２７アミノ酸である。
【００３０】
本発明は、カルボキシ末端テロペプチドのＣ末端部分のアミノ酸配列を含むペプチドを特に包含する。免疫複合体の形成に適した条件下で生体液試料と接触させた場合に、自己抗体複合体の形成を誘導し得るテロペプチド（１種または複数）の部分が、特に対象となる。
【００３１】
このペプチドは好ましくは、−ＹＹＸＡ、−ＦＹＸＡおよび−ＹＭＸＡ（式中、Ｘはシトルリンである）を含む群から選択される配列で終わる。
【００３２】
本発明の最も好ましい実施形態によれば、このペプチドは、ＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＸＡ（配列番号１）、ＹＤＦＧＹＤＧＤＦＹＸＡ（配列番号２）およびＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＸＡ（配列番号３）（式中、Ｘはシトルリンである）を含む群から選択された配列を含むかまたは有する。
【００３３】
表現「カルボキシ末端テロペプチド由来の配列を含むペプチド配列」とは、そのペプチド配列が、カルボキシ末端テロペプチドと同じ配列を含むか、またはそのペプチド配列が同じ様式でなお機能するようなアミノ酸変化を有していることを意味する。好ましくは、このペプチド配列は、カルボキシ末端テロペプチドと同じ配列を含む。
【００３４】
本発明のペプチド配列の長さは、好ましくは１０〜３０アミノ酸、より好ましくは１２〜２７アミノ酸である。好ましくは、それらの長さは少なくとも１２アミノ酸、より好ましくは少なくとも１７アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２６アミノ酸である。
【００３５】
ペプチド配列は、組織コラーゲンから単離され得、アルギニンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでシトルリンへと変換され得る。精製は、当業者に周知のタンパク質精製方法によって達成され得る。タンパク質精製方法は、例えば、クロマトグラフィー法（例えば、ゲル濾過、イオン交換および免疫親和性、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速等電点電気泳動法ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィー）、または沈降、特に免疫沈降である。
【００３６】
アルギニンは、脱イミノ化を介してシトルリンへと翻訳後修飾され得る。このプロセスは、酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって触媒される。この脱イミノ化プロセスはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る。
【００３７】
ペプチド配列は、当業者に周知の方法でも合成できる。このような方法は、例えば、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ、１９６４．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｓｏｃ．６５：２１４９；Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）およびＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５：１６１〜２１４頁（１９９０））などの化学合成法であるか、またはこの合成は、均質溶液中で実施され得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｅ．Ｗａｎｓｃｈ（Ｅｄ．Ｖｏｌ．１５ｐｔｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ．Ｔｈｉｅｍｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９８７））。
【００３８】
ペプチド配列は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術によっても調製できる。脱イミノ化プロセスは、酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）を使用することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る。
【００３９】
体液試料は、好ましくは、血清試料または別の生体液の試料、例えば、滑液試料である。
【００４０】
本発明のペプチド配列は、種々のアッセイにおけるそれらの検出を促進するために、標識で標識してもよい。このような標識の例は、例えば、放射性標識、蛍光標識、発光標識、ランタニドまたは酵素である。
【００４１】
ペプチド配列と生体液試料との間の免疫反応は、固相中で実施され得る。これらのペプチドは、金もしくはポリスチレンのミクロスフィア、スライド、チップまたはマイクロタイタープレートの壁などの固体担体に共有結合または非共有結合によりカップリングさせてもよい。ペプチド配列は、直接的に、または例えばストレプトアビジンを介して間接的に、試験管またはプレートに結合され得る。
【００４２】
あるいは、ペプチド配列と生体液試料との間の免疫反応は、液相中で実施してもよく、ペプチド配列は、直接的に、または例えばストレプトアビジンを介して間接的に、固体粒子（例えば、磁性粒子）に結合させてもよい。
【００４３】
本発明は、医薬組成物もまた包含する。この医薬組成物は、少なくとも１つの本発明のペプチド配列の有効量を含む。この医薬組成物は、患者へのｉｎ  ｖｉｖｏの投与に適した、生物学的に適合した形態である。このような組成物は、いずれの毒性効果も有するべきではない。医薬組成物は、有効量のペプチド配列および医薬として許容される添加物を含む。添加物とは、ゼラチン、デキストリン、ペクチン、寒天、油、生理食塩水、スクロース、ラクトース、リン酸カルシウムおよび水などの医薬として許容される担体、炭水化物（例えば、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストリン、グルコースおよびソルビトール）、タンパク質（例えば、カゼインおよびアルブミン）などの安定剤、ならびに緩衝剤を意味する。医薬組成物はまた、１種または複数のアジュバントを含み得る。
【００４４】
「有効量」とは、ヒトにおいて所望される結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量である。所望の結果は、ヒトにおける免疫応答であり、年齢、体重、健康状態、性別または疾患状態に依存し得る。この医薬組成物は、１〜５０μｇ／日の量で投与され得る。好ましくは、この量は、１〜２５μｇ／日である。投与量は、投与経路、投与時間に依存し得、個体の免疫応答に依存して変動し得る。
【００４５】
適切な投与経路は、皮下注射、筋内注射、静脈内注射または腹腔内注射、経口および鼻腔内投与である。最も適切な経路は、経口投与または注射である。
【００４６】
関節リウマチを治療するための方法は、そのような治療を必要とする個体に、少なくとも１つの本発明のペプチドの有効量を投与することを含む。投与は、医薬組成物の形態で与えられ得る。
【００４７】
Ｉ型コラーゲンおよび／またはＩＩ型コラーゲンに対する免疫寛容を誘導するための方法は、少なくとも１つの本発明のペプチドの有効量を個体に投与することを含む。
【００４８】
キットは、本発明による少なくとも１種のペプチドを含む。試験キットは、本発明による診断方法またはモニタリング方法で使用され得る。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態によれば、生物学的流体試料中の自己抗体は、本発明のシトルリン化ペプチドでコーティングした固体基板（例えば、マイクロタイタープレート）を使用することによって検出され得る。生体液の試料は、基板上に吸着したペプチドと接触するように配置され、これらと共にインキュベートされる。生物学的試料の非結合物質は、洗浄によって除去される。シトルリン化ペプチド／抗シトルリン化ペプチド抗体複合体中に存在する任意の抗体を結合し得るインジケータ抗体が、固体基板に添加される。このインジケータは、抗ヒトＩｇＧ免疫グロブリンであり得る。固体基板上のシトルリン化ペプチド／抗シトルリン化ペプチド抗体／インジケータ抗体複合体の存在が検出される。この検出は、例えば、ルミノメータによって検出される化学発光および放射光に基づき得る。
【００５０】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、このアッセイは、ＥＬＩＳＡ法によって実施され、このとき、インジケータ抗体は酵素にコンジュゲートしている。適切な酵素は、例えば、発色基質の使用によって検出できる酵素である。このような酵素は、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼである。発色基質は、酵素との反応の結果として着色産物を生じる。この着色産物は、分光分析法によって検出できる。
【００５１】
生体液試料中の自己抗体の存在は、例えばＥＬＩＳＡ法または化学発光イムノアッセイを使用することによって、本発明のペプチドとの免疫反応として検出され得る。生体液中の自己抗体の豊富さは、分光光度計による吸光度の強度またはルミノメータによって定量される化学発光反応の光として測定され得る。本発明のペプチドによるＲＡの治療は、治療前後で患者における自己抗体の量を比較することによってモニタリングできる。
【００５２】
関節リウマチには正常なＩ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンに対する抗体も存在するので、シトルリン化形態に対する特異的抗体を検出するために、Ｉ型コラーゲンまたはＩＩ型コラーゲンのカルボキシテロペプチドのアルギニン含有ペプチドおよびシトルリン含有ペプチドの両方を使用する２つのアッセイを実施すべきである。アルギニン含有ペプチドの吸光度がシトルリン含有ペプチドの吸光度から減算されるか、またはシトルリン含有ペプチドとアルギニン含有ペプチドとの結合比が計算される。あるいは、シトルリン化ペプチドを用いるアッセイバージョンのみを使用して、免疫学的結合の阻害剤としての可溶性形態の同じまたは類似のペプチドの添加ありおよびなしの両方で、それを実施することが可能である。
【００５３】
本発明をさらに詳細に説明するために以下に実施例を示すが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
ＥＬＩＳＡアッセイ
１２０人のＲＡを有する患者由来の血清試料を、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｏｕｌｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。コントロールは、年齢および性別が一致した健康な人由来の８１の血清からなった。６対のビオチン化ペプチドを、ＮｅｏＭＰＳ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）によって合成した。図１は、ヒトＩ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンの一次構造における選択されたペプチドの配列および位置を示す。図１Ａ〜Ｃは、ＩＩ型コラーゲン中のペプチドＣＣ１〜ＣＣ４の位置およびそれらの配列を示す。括弧内の数字はアルギニン残基を示す：ＣＣ１（１０５９）、ＣＣ２（１０４８）、ＣＣ３（７９９）およびＣＣ４（２８）。コラゲナーゼ切断部位は、図１Ａ中で矢印で示される−ＧＰＰＧＰＱＧ│ＬＡＧＱＲＧＥ−（配列番号９）。図１Ｂは、配列ＣＣ１  ＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＸＡ（配列番号３）、ＣＣ２  ＳＡＦＡＧＬＧＰＸＥＫＧＰＤ（配列番号６）、ＣＣ３  ＬＡＧＱＸＧＩＶＧＬＰ（配列番号７）およびＣＣ４  ＧＰＭＧＰＸＧＰＰＧＰＡ（配列番号８）を示す。Ｘはアルギニン／シトルリンである。図１Ｃは、ＩＩ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドの詳細な構造を示す（ＧＰＰは螺旋に属する）。ＩＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチドは、配列ＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＸＡを有する。配列ＧＰＰＧＰＧＩＤＭＳＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＸＡは、配列番号１０として配列表に示される。カルボキシ末端の１２アミノ酸は、ペプチドＣＣ１を示す。図１Ｄは、Ｉ型コラーゲンのα１鎖（ＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＸＡ；配列番号１）およびα２鎖（ＹＤＦＧＹＤＧＤＦＹＸＡ；配列番号２）のカルボキシ末端テロペプチドの配列を示す。各対の一方のメンバーは、それぞれの遺伝子によって予測されるアルギニンを含んだが、一方でその対の他方のメンバーでは、このアルギニンはシトルリンで置換されていた。
【００５５】
ビオチン化ペプチドを、１０μｇ／ウェルの濃度で、ストレプトアビジンでコーティングされた９６穴アッセイプレート（ＢｉｏＢｉｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ、Ｖａｎｔａａ、Ｆｉｎｌａｎｄ）にカップリングさせた。このカップリングは、室温でｐＨ７．５で２時間実施した。ストレプトアビジンでコーティングしたウェルは、非特異的結合を防止するために、製造者によってブロッキングされたものであった。
【００５６】
試験すべき血清を、１％ウサギ血清を補充したアッセイ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＢＳＡ、１％［体積／体積］Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％［重量／体積］デオキシコール酸Ｎａ、０．１％  ＳＤＳ；ｐＨ７．６）中に希釈し、室温で１時間インキュベートした。洗浄（ＰＢＳ／０．０５％［体積／体積］Ｔｗｅｅｎ−２０で３回）後、ＥＩＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）中に１：７５００希釈した、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ（Ｐｒｏｄｕｃｔ  ＃３１４１２、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を１００μｌ添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄した（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０で３回）。結合した抗体を、基質として３，３’−５，５’−テトラメチル−ベンジジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）（１００ｍＭ  酢酸ナトリウム３水和物、１．５ｍＭ  クエン酸１水和物、０．００１５％  Ｈ２Ｏ２中、１ウェル当たり０．０１ｍｇ／１００μｌ）を用いて検出した。３０分後、１００μｌの２Ｍ硫酸／ウェルを添加することによって反応を停止させた。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ２機器（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）中で４５０ｎｍの波長で読み取り、Ｍｕｌｔｉｃａｌｃ（Ｗａｌｌａｃ）によって計算した。全ての血清は２連で試験した。変動係数は一般に１０％未満であった。
【００５７】
単一のペプチドを直接分析したところ、ＲＡを有する患者のうち４２％〜５３％が、特にＩＩ型コラーゲン由来のペプチドの結合の増加を示した（表１）。
【００５８】
表１．ＥＬＩＳＡにおけるヒト血清に対するペプチドの結合
【表１】
2009505049.tif 000002
ｎｓ有意差なし、コントロールと比較して＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１
【００５９】
各ペプチド対を試験したとき、コントロール試料の差異の平均（シトルリン化ペプチドの吸光度値−アルギニンペプチドの吸光度値）および分散は、ＣＣ１について−０．０２６（ＳＤ  ０．０３２）、ＣＣ２について−０．０２７（０．０２９）、ＣＣ３について−０．００１（０．０２６）およびＣＣ４について＋０．００５（０．０２０）。ＲＡ血清のＣＣ３およびＣＣ４のシトルリン化形態への特異的結合は存在しなかった。しかし、ＲＡ患者中のペプチドＣＣ２および特にペプチドＣＣ１は差異を示した。なぜなら、ペプチドＣＣ２群中の２つの血清およびペプチドＣＣ１群中の１２の血清は、正常なペプチドよりもシトルリン化ペプチドと結合したからである。Ｉ型コラーゲンのα１鎖について、コントロール試料の差異の平均（シトルリン化ペプチドの吸光度値−アルギニンペプチドの吸光度値）および分散は、約＋０．０２６（０．０７４）であった。Ｉ型コラーゲン由来のα２鎖のＣ−テロペプチドを用いると、コントロール試料間の差異の平均および分散は、＋０．０７１（０．２５２）であった。２０のＲＡ血清は、それぞれのアルギニンペプチドよりも強力に、Ｉ型コラーゲンのα１鎖（α１（Ｉ）テロペプチド）由来のシトルリン化カルボキシテロペプチドと結合した。
【００６０】
本発明者らは、ペプチドＣＣ１およびより低い程度までペプチドＣＣ２が、シトルリン化タンパク質に対する自己抗体に特異的に結合することを見出した。これらの結果は、アルギニンが、ＰＡＤ酵素の作用に感受性のカルボキシ末端に近いことを示す。
【実施例２】
【００６１】
化学発光アッセイ
測定を、ヒトＩ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンのα１鎖の合成Ｃ−テロペプチド（それぞれ、ＮｅｏＭＰＳ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ製のＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＲＡ（配列番号４）およびＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ（配列番号５）、またはＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＸＡ（配列番号１）およびＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＸＡ（配列番号３）（式中、Ｘはシトルリンを示す））に対するＩｇＧ抗体を検出する２部位化学発光イムノアッセイで実施した。最初に、血清試料を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＢＳＡ、１％［体積／体積］Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％［重量／体積］デオキシコール酸Ｎａ、０．１％  ＳＤＳを含む緩衝液（ｐＨ７．６）中に１：１０希釈し、適切な濃度の上記ペプチドの１つ（ビオチン化形態）およびストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子と共に、３７℃で１０分間インキュベートした。未結合のビオチン化抗原および抗体を、反応混合物の吸引および引き続く洗浄によって、磁性粒子に結合した複合体から分離した。その後、アクリジニウム標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を反応混合物に添加し、その後もう１０分間インキュベートして、サンドイッチ複合体を生成した。未結合の標識を、反応混合物の吸引および引き続く洗浄によって分離した。洗浄した、複合体を伴う磁性粒子に、本発明者らは、化学発光反応を開始するトリガー１および２を注入した。トリガー１溶液は、希酸中に過酸化水素を含み、トリガー２溶液は希水酸化ナトリウムを含んだ。
【００６２】
早期ＲＡを有する１２０人の患者由来の血清試料を、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｏｕｌｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。コントロールは、年齢および性別が一致した健康な個人由来の８１の血清からなった。
【００６３】
１２０人中４４人のＲＡ患者において、血清は、Ｉ型コラーゲンのα１鎖由来のシトルリン化合成Ｃ−テロペプチドの結合の増加を示した（コントロールと比較してｐ＝０．００３）。ＩＩ型コラーゲンのα１鎖由来の対応するＣ−テロペプチド対について、３５人の患者の血清はアルギニンペプチドよりも強力にシトルリン化ペプチドに結合したが、コントロールと比較した差異は有意ではなかった（ｐ＝０．０７４）。２つのカルボキシテロペプチド間の相関は、ｒ＝０．４７３（ｐ＜０．００１）であった。
【実施例３】
【００６４】
関節リウマチ患者の血清における自己抗体の特異性
抗体特異性を検出するために、本発明者らは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンの両方のテロペプチドアッセイおよび抗ＣＣＰマーク２アッセイキットを試験した。患者の血清を、各アッセイにおける最初の結合がそれぞれのペプチドで著しく阻害できるように、アッセイ緩衝液中に希釈した。競合ペプチド（α１（Ｉ）およびα１（ＩＩ）のコラーゲンＣ−テロペプチドのアルギニン形態およびシトルリン形態）の段階希釈物を添加した（図２）。プレートにカップリングされたものと同じペプチドの可溶性形態による阻害は、両方のテロペプチドアッセイにおいて、特異性コントロールとして機能した。抗ＣＣＰアッセイについて、このようなペプチドは特異性試験には利用可能でなかった。％阻害を、可溶性ペプチドの濃度に対してプロットした。ヒト血清のみ（最初の結合）で得られたシグナル（４５０ｎｍの波長）を０％阻害として定義し、ブランク（血清試料なし）のシグナルを１００％阻害として定義した。本発明者らは、可溶性形態の正常抗原またはシトルリン化抗原のいずれかとの結合を阻害した。可溶性テロペプチド抗原は、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンの両方のテロペプチドアッセイにおいて結合を阻害した（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００６５】
図２．競合アッセイ。１つの血清試料を、３つの異なるＥＬＩＳＡにおいて試験した：Ｉ型コラーゲン（Ａ）およびＩＩ型コラーゲン（Ｂ）のα１鎖のシトルリン化カルボキシテロペプチドアッセイならびに抗ＣＣＰアッセイ（Ｃ）。阻害剤は、ＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＲＡ（配列番号４）（白三角）、ＥＫＡＨＤＧＧＲＹＹＸＡ（配列番号１）（黒三角、Ｉ型コラーゲンアッセイにおける固定化抗原に対応する）、ＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ（配列番号５）（白四角）およびＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＸＡ（配列番号３）（黒四角、ＩＩ型コラーゲンアッセイにおける固定化抗原に対応する）であった。
【００６６】
このように、同一または類似の抗体が結合に関与するようである。しかし、コラーゲンテロペプチドは、抗ＣＣＰアッセイとは異なる抗体種に結合する。なぜなら、抗ＣＣＰ結合は、これらのペプチドを阻害できないからである（図２Ｃ）。
【００６７】
コラーゲンに対する自己抗体は、抗ＣＣＰアッセイで検出されたものとは異なるが、両方の自己抗体が、関節リウマチを有する患者において増加する。表２中に示すように、これらの自己抗体間には有意な相関が存在した。
【００６８】
表２．Ｉ型コラーゲン（α１鎖およびα２鎖）およびＩＩ型コラーゲン（α１鎖）由来のシトルリン化Ｃ−テロペプチドに対する抗体結合と抗ＣＣＰアッセイ結果との間の一致係数（１２０人の関節リウマチ患者由来の血清に基づく）。＊＊＊ｐ＜０．００１
【表２】
2009505049.tif 000003
【実施例４】
【００６９】
阻害アッセイ
関節リウマチにおいて、正常なＩ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンに対する抗体もまた存在するので、シトルリン化形態に対する特異的抗体を検出するために、Ｉ型またはＩＩ型のカルボキシテロペプチドのアルギニン含有ペプチドおよびシトルリン含有ペプチドの両方を使用する２つのアッセイを実施すべきである。次いで、アルギニン含有ペプチドとの反応の吸光度を、それぞれのシトルリン含有ペプチドとの反応の吸光度から減算するか、またはシトルリン含有ペプチドとアルギニン含有ペプチドとの結合比を計算する。
【００７０】
優先的に、シトルリン化ペプチドアッセイバージョンのみを使用することも可能であり、このとき、このアッセイは標準条件で、アッセイ溶液中の同じまたは類似の可溶性ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）を添加して実施される。
【００７１】
ＲＡ患者（ｎ＝１２０）由来の血清およびコントロール（ｎ＝８１）由来の血清を、アッセイ緩衝液および／または阻害緩衝液（可溶性シトルリン含有ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）を含む）中に１：１００希釈した。阻害時間は３０分間であった。阻害反応後、血清を、ビオチン化したシトルリン含有ペプチドをカップリングさせておいた、ストレプトアビジンでコーティングした９６穴アッセイプレートのウェルに移した。洗浄（ＰＢＳ／０．０５％［体積／体積］Ｔｗｅｅｎ−２０で３回）後、ＥＩＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）中に１：７５００希釈した、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ（Ｐｒｏｄｕｃｔ＃３１４１２、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を１００μｌ添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄した（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０で３回）。結合した抗体を、基質として３，３’−５，５’−テトラメチル−ベンジジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）（１００ｍＭ  酢酸ナトリウム３水和物、１．５ｍＭ  クエン酸１水和物、０．００１５％  Ｈ２Ｏ２中、１ウェル当たり０．０１ｍｇ／１００μｌ）を用いて検出した。３０分後、１００μｌの２Ｍ硫酸／ウェルを添加することによって反応を停止させた。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ２機器（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）中で４５０ｎｍの波長で読み取った。全ての血清は２連で試験した。変動係数は一般に１０％未満であった。
【００７２】
ＥＬＩＳＡ実験においてＩＩ型コラーゲンカルボキシテロペプチドを用いたとき、コントロール中のそれぞれの可溶性抗原による阻害％は５．４％±３．８（平均±ＳＤ）であり、ＲＡ患者において、１２０人中３８人が阻害の増加を示した（１３．０％を上回る阻害）。
【００７３】
このように、これらの自己抗体が対応する可溶性抗原で阻害され得ることがさらに確認された場合、これは、テロペプチドのシトルリン化形態を用いたアッセイを行うのに充分である。１つのアッセイのみが使用されるので、この修飾は変動を減少させ、２つのＥＬＩＳＡアッセイを使用した試験よりも、驚くほど多くのポジティブが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ヒトＩ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンの一次構造における選択されたペプチドの配列および位置を示す図である。
【図２】血清試料を、３つの異なるＥＬＩＳＡ：Ｉ型コラーゲン（Ａ）およびＩＩ型コラーゲン（Ｂ）のα１鎖のシトルリン化カルボキシテロペプチドの結合ならびに抗ＣＣＰ２アッセイ（Ｃ）における反応で試験したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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