(57)【要約】本発明は、試料中の一つまたは複数の微生物ならびに／または一つまたは複数の抗生物質耐性マーカーを検出するための、明瞭な核酸領域の存在を識別することを含む方法に関する。そのような諸方法で使うのに好適なプライマーおよびプローブが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の一つまたは複数の微生物ならびに／または一つまたは複数の抗生物質耐性マーカーを検出するための、明瞭な核酸領域の存在を識別することを含む方法。
【請求項２】
微生物の前記明瞭な核酸領域が、23S  RNA遺伝子内にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記明瞭な核酸領域が、核酸増幅を使って識別される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
二つ以上の明瞭な核酸領域を検出するために多重PCRが使用される、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記明瞭な核酸領域がハイブリダイゼーションを使って識別される、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記微生物がEnterobacter  cloacaeであり、配列番号3および4または配列番号5および6によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
前記微生物がEnterobacter  cloacaeであり、配列番号3ないし6のうちいずれか一つによって表される配列に対応するハイブリダイゼーション・プローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記明瞭な核酸領域が配列番号1または2に対応し、微生物がEnterobacter  cloacaeである、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記微生物がEnterococcus  faecalisであり、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12または配列番号15および11によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物がEnterococcus  faecalisであり、配列番号9ないし15のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
前記明瞭な核酸領域が配列番号7または8に対応し、微生物がEnterococcus  faecalisである、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物がEnterococcus  faeciumであり、配列番号18および19、配列番号19および20または配列番号20および21によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物がEnterococcus  faeciumであり、配列番号19ないし21によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項１４】
前記明瞭な核酸領域が配列番号16または17に対応し、微生物がEnterococcus  faeciumである、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物がEscherichia  coliであり、配列番号24および25、配列番号24および26、配列番号27および29または配列番号28および29によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物がEscherichia  coliであり、配列番号24ないし29のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項１７】
前記明瞭な核酸領域が配列番号22または23に対応し、微生物がEscherichia  coliである、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物がKlebsiella  pneumoniaeであり、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36または配列番号37および33によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物がKlebsiella  pneumoniaeであり、配列番号32ないし37のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項２０】
前記明瞭な核酸領域が配列番号30または31に対応し、微生物がKlebsiella  pneumoniaeである、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記微生物がPseudomonas  aeruginosaであり、配列番号40および41または配列番号40および42によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項２２】
前記微生物がPseudomonas  aeruginosaであり、配列番号40ないし42のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項２３】
前記明瞭な核酸領域が配列番号38または39によって表される配列に対応し、微生物がPseudomonas  aeruginosaである、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
微生物がStaphylococcus  aureusであり、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物がStaphylococcus  aureusであり、配列番号45ないし51のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項２６】
前記明瞭な核酸領域が配列番号43または44によって表される配列に対応し、微生物がStaphylococcus  aureusである、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記微生物がStaphylococcus  epidermidisであり、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60または配列番号63および61によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項２８】
前記微生物がStaphylococcus  epidermidisであり、配列番号54ないし63のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項２９】
前記明瞭な核酸領域が配列番号52または53に対応し、微生物がStaphylococcus  epidermidisである、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記微生物がCandida  albicansであり、配列番号66および67、配列番号68および69または配列番号70および71によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項３１】
前記微生物がCandida  albicansであり、配列番号66ないし71のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項３２】
前記明瞭な核酸領域が配列番号64または65に対応し、微生物がCandida  albicansである、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記抗生物質耐性マーカーがblages-2であり、配列番号74および75または配列番号76および77によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項３４】
前記抗生物質耐性マーカーがblages-2であり、配列番号74ないし77のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項３５】
前記明瞭な核酸領域が配列番号72または73によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがblages-2である、請求項１、３、４、５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
前記抗生物質耐性マーカーがblashvであり、配列番号80および81または配列番号82および83によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項３７】
前記抗生物質耐性マーカーがblashvであり、配列番号80ないし83のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項３８】
前記明瞭な核酸領域が配列番号78または79によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがblashvである、請求項１、３、４、５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
前記抗生物質耐性マーカーがmecAであり、
配列番号86および87または配列番号88および89によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、
請求項３または４記載の方法。
【請求項４０】
前記抗生物質耐性マーカーがmecAであり、
配列番号86ないし89によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、
請求項５記載の方法。
【請求項４１】
前記明瞭な核酸領域が配列番号84または85によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがmecAである、請求項１、３、４、５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
前記抗生物質耐性マーカーがspAであり、配列番号92および93または配列番号94および95によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項４３】
前記抗生物質耐性マーカーがspAであり、配列番号92ないし95のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項４４】
前記明瞭な核酸領域が配列番号90または91によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがSpaである、請求項１、３、４、５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
前記抗生物質耐性マーカーがVanAであり、
配列番号98および99または配列番号100および101によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、
請求項３または４記載の方法。
【請求項４６】
前記抗生物質耐性マーカーがVanAであり、配列番号98ないし101によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項４７】
前記明瞭な核酸領域が配列番号96または97によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがVanAである、請求項１、３、４、５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
前記抗生物質耐性マーカーがVanBであり、配列番号104および105または配列番号106および107によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項４９】
前記抗生物質耐性マーカーがVanBであり、配列番号104ないし107のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項５０】
前記明瞭な核酸領域が配列番号102または103によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがVanBである、請求項１、３、４、５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
前記抗生物質耐性マーカーがVanCであり、配列番号110および111または配列番号112および113によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項５２】
前記抗生物質耐性マーカーがVanCであり、配列番号110ないし113のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項５３】
前記明瞭な核酸領域が配列番号108または109によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがVanCである、請求項１、３、４、５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
前記抗生物質耐性マーカーがMDR-1であり、配列番号116および117または配列番号118および119によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項５５】
前記抗生物質耐性マーカーがMDR-1であり、配列番号116ないし119のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項５６】
前記明瞭な核酸領域が配列番号114または115に対応し、抗生物質耐性マーカーがMDR-1である、請求項１、３、４、５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
前記抗生物質耐性マーカーがCDR-1であり、配列番号122および123または配列番号124および125によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、請求項３または４記載の方法。
【請求項５８】
前記抗生物質耐性マーカーがCDR-1であり、配列番号122ないし125のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、請求項５記載の方法。
【請求項５９】
前記明瞭な核酸領域が配列番号120または121に対応し、抗生物質耐性マーカーがCDR-1である、請求項１、３、４、５のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号9および10、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12、配列番号15および11、配列番号18および19、配列番号20および19、配列番号20および21、配列番号24および26、配列番号24および25、配列番号27および29、配列番号28および29、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36、配列番号37および33、配列番号40および41、配列番号40および42、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60、配列番号63および61、配列番号66および67、配列番号68および69、配列番号70および71、配列番号74および75、配列番号76および77、配列番号80および81、配列番号82および83、配列番号86および87、配列番号88および89、配列番号92および93、配列番号94および95、配列番号98および99、配列番号100および101、配列番号104および105、配列番号106および107、配列番号110および111、配列番号112および113、配列番号116および117、配列番号118および119、配列番号122および123ならびに配列番号124および125によって表される配列から選択される増幅プライマーの一つまたは複数の対をあらかじめロードされた容器。
【請求項６１】
配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125のうちいずれか一つによって表される配列から選択される一つまたは複数のプローブをあらかじめロードされた容器。
【請求項６２】
配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号9および10、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12、配列番号15および11、配列番号18および19、配列番号20および19、配列番号20および21、配列番号24および26、配列番号24および25、配列番号27および29、配列番号28および29、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36、配列番号37および33、配列番号40および41、配列番号40および42、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60、配列番号63および61、配列番号66および67、配列番号68および69、配列番号70および71、配列番号74および75、配列番号76および77、配列番号80および81、配列番号82および83、配列番号86および87、配列番号88および89、配列番号92および93、配列番号94および95、配列番号98および99、配列番号100および101、配列番号104および105、配列番号106および107、配列番号110および111、配列番号112および113、配列番号116および117、配列番号118および119、配列番号122および123、ならびに配列番号124および125によって表される配列から選択される増幅プライマーの一つまたは複数の対を有するキット。
【請求項６３】
配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択される一つまたは複数のプローブを有するキット。
【請求項６４】
請求項６０または６１記載の容器を一つまたは複数有するキット。
【請求項６５】
配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号9および10、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12、配列番号15および11、配列番号18および19、配列番号20および19、配列番号20および21、配列番号24および26、配列番号24および25、配列番号27および29、配列番号28および29、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36、配列番号37および33、配列番号40および41、配列番号40および42、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60、配列番号63および61、配列番号66および67、配列番号68および69、配列番号70および71、配列番号74および75、配列番号76および77、配列番号80および81、配列番号82および83、配列番号86および87、配列番号88および89、配列番号92および93、配列番号94および95、配列番号98および99、配列番号100および101、配列番号104および105、配列番号106および107、配列番号110および111、配列番号112および113、配列番号116および117、配列番号118および119、配列番号122および123、配列番号124および125によって表される配列から選択される増幅プライマーの一つまたは複数の対を有する装置。
【請求項６６】
配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択される一つまたは複数のプローブを有する装置。
【請求項６７】
試料中の一つまたは複数の微生物および／または一つまたは複数の抗生物質耐性マーカーを検出するための、請求項６０ないし６６記載のうちいずれか一項記載の容器、キットまたは装置の使用。
【請求項６８】
配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択されるプローブを有する組成物。
【請求項６９】
配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択される二つ以上のプローブを有する組成物。
【請求項７０】
配列番号3および4、配列番号7および8、配列番号11および12、配列番号15および16、配列番号19および20、配列番号23および24、配列番号27および28、配列番号31および32、配列番号35および36、配列番号39および40、配列番号43および44、配列番号47および48、配列番号51および52、配列番号55および56ならびに配列番号59および60によって表される配列から選択される増幅プライマーの対を有する組成物。
【請求項７１】
配列番号3および4、配列番号7および8、配列番号11および12、配列番号15および16、配列番号19および20、配列番号23および24、配列番号27および28、配列番号31および32、配列番号35および36、配列番号39および40、配列番号43および44、配列番号47および48、配列番号51および52、配列番号55および56ならびに配列番号59および60によって表される配列から選択される増幅プライマーの二つ以上の対を有する組成物。
【請求項７２】
配列番号131ないし157によって表される配列から選択される23S  RNA遺伝子の配列。
【請求項７３】
配列番号158ないし261によって表される配列から選択される抗生物質耐性マーカーの配列。
【請求項７４】
前記配列番号（単数または複数）によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、請求項６ないし５９のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
前記配列番号（単数または複数）によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列（homologous  sequence(s)）である、請求項６ないし５９および請求項７４のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
前記配列番号（単数または複数）によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、請求項６０ないし６７のうちいずれか一項記載の容器、キット、装置または使用。
【請求項７７】
前記配列番号（単数または複数）によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列（homologous  sequence(s)）である、請求項６０ないし６７および請求項７６のうちいずれか一項記載の容器、キット、装置または使用。
【請求項７８】
前記配列番号（単数または複数）によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、請求項６８ないし７１のうちいずれか一項記載の組成物。
【請求項７９】
配列番号によって表される配列が前記配列番号の類似配列である、請求項６８ないし７１および請求項７８のうちいずれか一項記載の組成物。
【請求項８０】
前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、請求項７２記載の23S  RNA遺伝子の配列。
【請求項８１】
前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列である、請求項７２または８０記載の23S  RNA遺伝子の配列。
【請求項８２】
前記配列番号（単数または複数）によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、請求項７３記載の抗生物質耐性マーカーの配列。
【請求項８３】
前記配列番号（単数または複数）によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列である、請求項７３または８２記載の抗生物質耐性マーカーの配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の23S  RNA遺伝子の配列および抗生物質耐性遺伝子に関係し、また、それらのハイブリダイゼーションおよび／または核酸増幅反応ならびに／または試料中での一つまたは複数の微生物および／または抗生物質耐性遺伝子の存在を検出するための他の識別方法のためのテンプレートとしての使用に関係する。本発明はさらに、前記配列の増幅および前記配列へのハイブリダイゼーションに好適な核酸増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸（NA:  nucleic  acid）の発見以来、試料中の特定のDNAまたはRNA配列の存在、不在または量の検出に関係する技術は学界および産業界において多大な関心を集めている。増幅技法、特にポリメラーゼ連鎖反応（PCR:  Polymerase  Chain  Reaction）およびハイブリダイゼーションの発明は、核酸配列の存在、不在または量の検出のためのあらゆる種類の検定の発展に大いに貢献した。現在、生物体から核酸含有試料を採取し、その中のある特定の核酸配列（標的配列）の存在、不在または量を決定することが可能である。複数の標的配列について同時にそのような解析、いわゆる標的配列の多重検出（multiplex  detection）を実行し、それによりスループットを上げるとともに診断上の有意性を改善する技術が利用可能である。
【０００３】
現在、核酸配列に基づく検出は、たとえば糖尿病の血糖濃度測定の場合がそうであるように、まだ日常的に実行されてはいない。一般には設備の整った実験室およびよく訓練されたスタッフが必要であり、信頼できる結果を与えるために入念な手順を使う必要がある。さらに、現在の解析方法は骨が折れるばかりでなく、時間もかかる。典型的には、DNAまたはRNA配列解析のための現在の手順は数日かかり、それはなかでも、試料採取、試料培養、試料からのDNAまたはRNAの単離、試料中の標的配列の存在、不在または量の解析のためのその後の検定、得られた結果の処理および該結果の対応する呈示のためのさまざまなシステムの要求のためである。
【０００４】
この時間のかかる解析は、高度に特異的なハイブリダイゼーションおよび増幅方法を標的配列の全体または部分に適用し、それによりある特定の核酸配列の存在、不在または量の決定を可能にすることによって劇的に改善できる。きわめて敏感で特異的なPCRおよび／またはハイブリダイゼーションが適用でき、それらは今度はある特定の核酸標的配列に対するきわめて特異的なプライマーを要求する。当技術分野ではいくつかの細菌株の核酸配列が知られている。たとえば、Staphylococcus  aureus核酸配列はJ  Clin  Microbiol.  (2000),  38(2),  781-8,  Journal  of  Microbiological  Methods  (2004),  58,  403-  411,  J  Clin  Microbiol.  (2004),  42(3),  1048-57,  US5,582,975,  WO  90/14444,  WO03/095677およびUS  5,958,679で開示され；Staphylococcus  epidermidis核酸配列はJournal  of  Microbiological  Methods  (2004),  58,  403-411およびWO  03/095677で開示され；Pseudomonas  aeruginosaの核酸配列はJournal  of  Microbiological  Methods  (2004),  58,  403-411,  J  Clin  Microbiol.  (2004),  42(3),  1048-57およびWO03/095677で開示され；Klebsiella  pneumoniae核酸配列はJournal  of  Microbiological  Methods  (2004),  58,  403-411およびWO  03/095677で開示され；Enterococcus  faecalis核酸配列はJournal  of  Microbiological  Methods  (2004),  58,  403-411で開示され；Enterococcus  faecium核酸配列はJournal  of  Microbiological  Methods  (2004),  58,  403-411およびWO  03/095677で開示され；Escherichia  coli核酸配列はJournal  of  Microbiological  Methods  (2004),  58,  403-411,  J  Clin  Microbiol.  (2004),  42(3),  1048-57およびWO  03/095677で開示され；Enterobacter  cloacae核酸配列はUS5,958,679で開示されている。当技術分野では、ある種の抗生物質耐性遺伝子の核酸配列が知られている。たとえば、βラクタマーゼSHV核酸はJ.  Clin  Microbiol  (2001)  39,  3193-3196,  J.  Clin  Microbiol  (1998)  36,  3105-3110,  J.  Clin  Microbiol  (1999)  37,  4020-4027,  US2004/0002080およびUS6,242,223から知られており；βラクタマーゼGES-2核酸はInternational  Journal  of  Antimicrobial  Agents  (2004)  24,  35-38およびJ.  Antimicrobial  Chemotherapy  (2002)  49,  561-565から知られており；メチシリン耐性MecA核酸はJ  Clin  Microbiol.  (2002),  40(5),  1821-3,  J  Clin  Microbiol.  (1995),  33(11),  2864-7,  J  Clin  Microbiol.  2000  Jun_38(6)_2429-33,  WO02082086A2およびUS5,437,978から知られており；spA核酸はJ.  Clin  Microbiol  (2003)  41,  5442-5448およびUS5,702,895から知られており；vanA核酸はJ.  Clin.  Microbiol.  (1997),  703-707およびJ.  Clin.  Microbiol.  (2000)  3092-3095から知られており；vanB核酸はJ.  Clin.  Microbiol.  (1997),  703-707およびJ.  Clin.  Microbiol.  (2000)  3092-3095から知られており;vanC核酸はJ.  Clin.  Microbiol.  (1997),  703-707およびJ.  Clin.  Microbiol.  (2000)  3092-3095から知られており；βラクタマーゼ耐性TEM-1H核酸はAntimicrobial  Agents  And  Chemotherapy  (2001),  2407-2413,  US2004/0002080およびUS6,242,223から知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、核酸検出の当技術分野における問題は、信頼性のあるプライマーまたはプローブを提供することである。特に多重検出が用いられる場合、交差反応および偽陽性もしくは偽陰性の結果が問題になる。本発明は、特異的で信頼できる単一モードおよび多重の核酸検出に好適な方法、配列およびプライマーを提供することによって、当技術分野の前記問題を克服することをねらいとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のある実施形態は、試料中の一つまたは複数の微生物および／または一つまたは複数の抗生物質耐性マーカーを検出する方法であって、明瞭な（distinct）核酸領域の存在を識別することを含む方法である。
【０００７】
本発明のもう一つの実施形態は、ある微生物についての前記明瞭な核酸領域が23S  RNA配列遺伝子中にある、上記のような方法である。
【０００８】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域の識別が核酸増幅を使って行われる、上記のような方法である。
【０００９】
本発明のもう一つの実施形態は、二つ以上の明瞭な核酸領域を検出するために多重PCRが使われる、上記のような方法である。
【００１０】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域がハイブリダイゼーションを使って識別される、上記のような方法である。
【００１１】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterobacter  cloacaeであり、配列番号3および4または配列番号5および6によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００１２】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterobacter  cloacaeであり、配列番号3ないし6のうちいずれか一つによって表される配列に対応するハイブリダイゼーション・プローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００１３】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号1または2に対応し、微生物がEnterobacter  cloacaeである、上記のような方法である。
【００１４】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterococcus  faecalisであり、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12または配列番号15および11によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００１５】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterococcus  faecalisであり、配列番号9ないし15のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００１６】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号7または8に対応し、微生物がEnterococcus  faecalisである、上記のような方法である。
【００１７】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterococcus  faeciumであり、配列番号18および19、配列番号19および20または配列番号20および21によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００１８】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterococcus  faeciumであり、配列番号19ないし21によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００１９】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号16または17に対応し、微生物がEnterococcus  faeciumである、上記のような方法である。
【００２０】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEscherichia  coliであり、配列番号24および25、配列番号24および26、配列番号27および29または配列番号28および29によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００２１】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEscherichia  coliであり、配列番号24ないし29のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００２２】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号22または23に対応し、微生物がEscherichia  coliである、上記のような方法である。
【００２３】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がKlebsiella  pneumoniaeであり、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36または配列番号37および33によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００２４】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がKlebsiella  pneumoniaeであり、配列番号32ないし37のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００２５】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号30または31に対応し、微生物がKlebsiella  pneumoniaeである、上記のような方法である。
【００２６】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がPseudomonas  aeruginosaであり、配列番号40および41または配列番号40および42によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００２７】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がPseudomonas  aeruginosaであり、配列番号40ないし42のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００２８】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号38または39によって表される配列に対応し、微生物がPseudomonas  aeruginosaである、上記のような方法である。
【００２９】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がStaphylococcus  aureusであり、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００３０】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がStaphylococcus  aureusであり、配列番号45ないし51のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００３１】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号43または44に対応し、微生物がStaphylococcus  aureusである、上記のような方法である。
【００３２】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がStaphylococcus  epidermidisであり、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60または配列番号63および61によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００３３】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がStaphylococcus  epidermidisであり、配列番号54ないし63のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００３４】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号52または53に対応し、微生物がStaphylococcus  epidermidisである、上記のような方法である。
【００３５】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がCandida  albicansであり、配列番号66および67、配列番号68および69または配列番号70および71によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００３６】
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がCandida  albicansであり、配列番号66ないし71のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００３７】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号64または65に対応し、微生物がCandida  albicansである、上記のような方法である。
【００３８】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがblages-2であり、配列番号74および75または配列番号76および77によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００３９】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがblages-2であり、配列番号74ないし77のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００４０】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号72または73によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがblages-2である、上記のような方法である。
【００４１】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがblashvであり、配列番号80および81または配列番号82および83によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００４２】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがblashvであり、配列番号80ないし83のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００４３】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号78または79によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがblashvである、上記のような方法である。
【００４４】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがmecAであり、配列番号86および87または配列番号88および89によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００４５】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがmecAであり、配列番号86ないし89によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００４６】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号84または85によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがmecAである、上記のような方法である。
【００４７】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがspAであり、配列番号92および93または配列番号94および95によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００４８】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがspAであり、配列番号92ないし95のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００４９】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号90または91によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがSpaである、上記のような方法である。
【００５０】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanAであり、配列番号98および99または配列番号100および101によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００５１】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanAであり、配列番号98ないし101によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００５２】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号96または97によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがVanAである、上記のような方法である。
【００５３】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanBであり、配列番号104および105または配列番号106および107によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００５４】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanBであり、配列番号104ないし107のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００５５】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号102または103によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがVanBである、上記のような方法である。
【００５６】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanCであり、配列番号110および111または配列番号112および113によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００５７】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanCであり、配列番号110ないし113のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００５８】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号108または109によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがVanCである、上記のような方法である。
【００５９】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがMDR-1であり、配列番号116および117または配列番号118および119によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００６０】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがMDR-1であり、配列番号116ないし119のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００６１】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号114または115に対応し、抗生物質耐性マーカーがMDR-1である、上記のような方法である。
【００６２】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがCDR-1であり、配列番号122および123または配列番号124および125によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
【００６３】
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがCDR-1であり、配列番号122ないし125のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。
【００６４】
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号120または121に対応し、抗生物質耐性マーカーがCDR-1である、上記のような方法である。
【００６５】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号9および10、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12、配列番号15および11、配列番号18および19、配列番号20および19、配列番号20および21、配列番号24および26、配列番号24および25、配列番号27および29、配列番号28および29、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36、配列番号37および33、配列番号40および41、配列番号40および42、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60、配列番号63および61、配列番号66および67、配列番号68および69、配列番号70および71、配列番号74および75、配列番号76および77、配列番号80および81、配列番号82および83、配列番号86および87、配列番号88および89、配列番号92および93、配列番号94および95、配列番号98および99、配列番号100および101、配列番号104および105、配列番号106および107、配列番号110および111、配列番号112および113、配列番号116および117、配列番号118および119、配列番号122および123ならびに配列番号124および125によって表される配列から選択される増幅プライマーの一つまたは複数の対をあらかじめロードされた容器である。
【００６６】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125のうちいずれか一つによって表される配列から選択される一つまたは複数のプローブをあらかじめロードされた容器である。
【００６７】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号9および10、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12、配列番号15および11、配列番号18および19、配列番号20および19、配列番号20および21、配列番号24および26、配列番号24および25、配列番号27および29、配列番号28および29、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36、配列番号37および33、配列番号40および41、配列番号40および42、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60、配列番号63および61、配列番号66および67、配列番号68および69、配列番号70および71、配列番号74および75、配列番号76および77、配列番号80および81、配列番号82および83、配列番号86および87、配列番号88および89、配列番号92および93、配列番号94および95、配列番号98および99、配列番号100および101、配列番号104および105、配列番号106および107、配列番号110および111、配列番号112および113、配列番号116および117、配列番号118および119、配列番号122および123、ならびに配列番号124および125によって表される配列から選択される増幅プライマーの一つまたは複数の対を有するキットである。
【００６８】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択される一つまたは複数のプローブを有するキットである。
【００６９】
本発明のもう一つの実施形態は、上記のような一つまたは複数の容器を有するキットである。
【００７０】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号9および10、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12、配列番号15および11、配列番号18および19、配列番号20および19、配列番号20および21、配列番号24および26、配列番号24および25、配列番号27および29、配列番号28および29、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36、配列番号37および33、配列番号40および41、配列番号40および42、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60、配列番号63および61、配列番号66および67、配列番号68および69、配列番号70および71、配列番号74および75、配列番号76および77、配列番号80および81、配列番号82および83、配列番号86および87、配列番号88および89、配列番号92および93、配列番号94および95、配列番号98および99、配列番号100および101、配列番号104および105、配列番号106および107、配列番号110および111、配列番号112および113、配列番号116および117、配列番号118および119、配列番号122および123、配列番号124および125によって表される配列から選択される増幅プライマーの一つまたは複数の対を有する装置である。
【００７１】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択される一つまたは複数のプローブを有する装置である。
【００７２】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の一つまたは複数の微生物および／または一つまたは複数の抗生物質耐性マーカーを検出するための、上記のような容器、キットまたは装置の使用である。
【００７３】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択されるプローブを有する組成物である。
【００７４】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択される二つ以上のプローブを有する組成物である。
【００７５】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号7および8、配列番号11および12、配列番号15および16、配列番号19および20、配列番号23および24、配列番号27および28、配列番号31および32、配列番号35および36、配列番号39および40、配列番号43および44、配列番号47および48、配列番号51および52、配列番号55および56ならびに配列番号59および60によって表される配列から選択される増幅プライマーの対を有する組成物である。
【００７６】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号7および8、配列番号11および12、配列番号15および16、配列番号19および20、配列番号23および24、配列番号27および28、配列番号31および32、配列番号35および36、配列番号39および40、配列番号43および44、配列番号47および48、配列番号51および52、配列番号55および56ならびに配列番号59および60によって表される配列から選択される増幅プライマーの二つ以上の対を有する組成物である。
【００７７】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号131ないし157によって表される配列から選択される23S  RNA遺伝子の配列である。
【００７８】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号158ないし261によって表される配列から選択される抗生物質耐性マーカーの配列である。
【００７９】
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような方法である。
【００８０】
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列（homologous  sequence(s)）である、上記のような方法である。
【００８１】
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような容器、キット、装置または使用である。
【００８２】
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列（homologous  sequence(s)）である、上記のような容器、キット、装置または使用である。
【００８３】
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような組成物である。
【００８４】
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号によって表される配列が前記配列番号の類似配列である、上記のような組成物である。
【００８５】
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような23S  RNA遺伝子の配列である。
【００８６】
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列である、上記のような23S  RNA遺伝子の配列である。
【００８７】
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような抗生物質耐性マーカーの配列である。
【００８８】
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列である、上記のような抗生物質耐性マーカーの配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
本発明は、微生物の23S  RNA遺伝子の配列および抗生物質耐性遺伝子に関係し、また、それらのハイブリダイゼーションおよび／または核酸増幅反応ならびに／または試料中での一つまたは複数の微生物および／または抗生物質耐性遺伝子の存在を検出するための他の識別方法のためのテンプレートとしての使用に関係する。本発明はさらに、前記配列の増幅および前記配列へのハイブリダイゼーションに好適な核酸増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブに関する。
【００９０】
前記試料は関心のあるいかなる試料でもよい。動物（たとえば、人間、農業用家畜、家畜、科学用家畜、動物学的家畜）に由来しても、非動物（たとえば、固体および液体の消費品、水システム、下水システム、土壌、加熱／冷却システム）に由来してもよい。試料が人間である場合は、たとえば、血液、唾液、尿、便、任意の体液または組織であってよい。試料は、調査を許し、テンプレート核酸を提供できるいかなるものでもよい。
【００９１】
本発明のある実施形態によれば、本発明に基づいて有用な微生物の種は、Staphylococcus  aureus,  Staphylococcus  epidermidis,  Enterobacter  cloacae,  Escherichia  coli,  Enterococcus  faecalis,  Pseudomonas  aeruginosa,  Enterococcus  faecium,  Klebsiella  pneumoniaeおよびCandida  albicansのうちの一つまたは複数である。
【００９２】
本発明のもう一つの実施形態によれば、本発明に基づいて有用な抗生物質耐性マーカーは、mecA（メチシリン耐性遺伝子；Bラクタムへの耐性を与える）、vanA（バンコマイシン耐性遺伝子A）、vanB（バンコマイシン耐性遺伝子B）、vanC（バンコマイシン耐性遺伝子C）、blashv（βラクタム耐性遺伝子）、blages-2（βラクタム耐性遺伝子）、spA（Staphylococcus-aureusタンパク質A）、MDR-1（菌類における多剤耐性［multi-drug  resistance］遺伝子1）およびCDR-1（菌類における多剤耐性遺伝子2）のうちの一つまたは複数である。
【００９３】
本発明によれば、23S  RNAまたは抗生物質耐性マーカーの核酸配列は、配列特異的な核酸検出法のためのテンプレートのはたらきをする。ある検出法は、一つまたは複数の明瞭な領域、すなわち23S  RNA遺伝子の領域（23S  RNA自身を含む）または抗生物質マーカーの領域であって、該領域の存在を検出することによってある種（species）または抗生物質耐性マーカーの識別を可能にするために十分はっきりしたものの存在を検出することに関わる。検出は、前記明瞭な領域のうち少なくともある部分の増幅によってもよい。代替的または追加的に、検出は、抗核酸抗体の使用または配列決定によってでもよい。検出は、他の種または分類群からの総核酸が試料中に存在するときに生じうる。前記明瞭な領域は、たとえば、
・複数の種の間で保存されない配列部分を有していても、
・複数の抗生物質耐性マーカーの間で保存されない配列部分を有していても、
・保存される配列部分の間にある保存されないいくつかの残基を有して、増幅反応の生成物の長さに基づく識別を可能にしても、
・ある種の条件のもとでプライマーまたはプローブの結合を許す、ある種に特有のある物理的な折り畳み属性または関連するタンパク質を有していてもよい。
【００９４】
明瞭な領域は、一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入されている類似配列を含む。ある類似配列において許される置換、削除および／または挿入の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000残基以下などである。あるいはまた、前記の数は、残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満である。類似配列は、変わっていない残基の一部または全部に基づいて、相変わらず、前記明瞭な領域の識別を許す。明瞭な領域は、該明瞭な領域の相補配列をも含む。
【００９５】
〈増幅〉
核酸増幅（たとえばPCR）が使われる場合、プライマー対とは、その種または耐性遺伝子の一つまたは複数の明瞭な領域が存在しているときにのみ増幅産物（アンプリコン）を提供するような配列および長さのものである。あるいはまた、プライマーは、関心のある種についての特定の長さまたはパターンをもち、他の配列の増幅から生じる増幅産物とは区別できる産物を与えてもよい。代替的または追加的に、増幅プライマーは、その種の識別を可能にする、産物の相対量を与えてもよい（たとえば、電気泳動ゲル上の一つまたは複数の強い帯）。増幅結果を関心のある核酸の存在に対応させる任意の方法が本発明の範囲内である。
【００９６】
PCRのような核酸増幅方法は当技術分野においてよく知られており（ここに参照によって組み込まれる米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照）、Roche、Invitrogen、Qiagen、Promegaといったさまざまな商業的な販売元がPCR試薬を販売し、PCRプロトコルを公表しているが、明確のため、若干の一般的なPCR情報を以下に与えておく。
【００９７】
PCRプロセスを開始するために、試料中の標的核酸が変性される（試料の核酸が二本鎖であるとして）。変性は典型的には試料を95°C程度まで加熱することによって達成される。
【００９８】
ひとたび鎖が分離されたら、PCRの次の段階は、試料の温度を融点TM以下まで下げることによって、分離された鎖をプライマーとハイブリダイゼーションすることを含む。プライマーは、標的領域または部分配列をはさむ。次いで、試料温度を最適延長温度（たとえば70ないし75°C）まで上げることによってプライマーが延長されて、標的鎖の相補的なコピーが作られる。変性、ハイブリダイゼーションおよび延長のサイクルは、所望の量の増幅された核酸を得るために必要なだけ繰り返される。
【００９９】
PCRにおけるプライマーのテンプレート依存延長は、反応媒体中の十分な量の４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）の存在において、重合剤によって触媒される。前記反応媒体は、適切な塩、金属カチオンおよびpH緩衝系からなる。好適な重合剤は、テンプレート依存DNA合成を触媒すると知られている酵素である。たとえば、テンプレートがRNAであれば、RNAを相補的なDNA（cDNA）配列に変換する好適な重合剤は、逆転写酵素（RT:  reverse  transcriptase）で、たとえば鳥骨髄芽球症（arian  myeloblastosis）ウイルスRTなどである。増幅のための標的がDNAとなると、好適なポリメラーゼにはたとえば、E.  coli  DNAポリメラーゼIまたはそのクレノウ（Klenow）断片、T4  DNAポリメラーゼおよびTaqポリメラーゼというThermus  aquaticusから単離された熱安定なDNAポリメラーゼが含まれる。この最後の酵素Taq  DNAポリメラーゼは、核酸の増幅および配列決定に広く使われている。DNAポリメラーゼを使うための反応条件は当技術分野において既知であり、たとえば、論文Methods  in  Enzymology、Maniatis  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manualに記載されている。
【０１００】
PCR工程の間、鎖の分離およびプライマーのアニーリングおよび延長が平衡状態で起こるよう、温度は注意深く制御される。温度の制御は典型的には、サーモサイクラーから生成される乾熱（dry  heat）を使って達成される。
【０１０１】
PCR工程の好ましい実施形態では、反応は、Taq  DNAポリメラーゼのような熱安定なDNAポリメラーゼ酵素によって触媒され、温度を上げて実行される。好ましい温度は、酵素が熱安定であり、かつ核酸が一本鎖および二本鎖の平衡状態にあるような温度である。それにより、十分なプライマーがテンプレート鎖にアニールし、そこそこの重合率が許容される。鎖分離は、二本鎖の変性を引き起こすために十分高い温度に十分な時間、だがポリメラーゼの不可逆的な変性を引き起こすほどではないように、反応を加熱することによって達成される。
【０１０２】
PCR法は、各段階後に新たな試薬が加えられる段階的な仕方で、あるいは所与の回数の段階後に試薬のすべてが加えられる仕方で、実行できる。たとえば、鎖分離が熱によって誘起され、ポリメラーゼが熱に敏感な場合、ポリメラーゼは鎖分離の毎ラウンド後に加えられる必要がある。しかしながら、たとえば変性にヘリカーゼが使われる場合、あるいは延長に熱安定なポリメラーゼが使われる場合、すべての試薬を最初に加えてもよい。あるいはまた、試薬のモル比が反応に重要な場合には、試薬は、合成反応によって消費されるにつれて定期的に補充されてもよい。
【０１０３】
PCR産物の存在、大きさおよび／または量を検出する方法は当技術分野において既知であり、電気泳動、クロマトグラフィー、毛細管ゾーン電気泳動、分析遠心法などの使用を含む。そのような方法は、標識（たとえば、蛍光、化学ルミネセンス、放射性同位体、酵素標識（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼまたはアルカリ・ホスファターゼのような）、染料、抗体など）の使用と組み合わされてもよい。検出はまた、溶液中で、あるいは検出されるべきDNAに向けられた固体支持体または抗体上に固定されて、ハイブリダイゼーション・プローブ（後述）の使用によって達成されてもよい。
【０１０４】
本発明のある実施形態によれば、増幅は容器上（on）または容器内（in）で実行される。容器は単一試料用でも複数試料用でもよい。単一試料用容器は、管、瓶、エッペンドルフ管などを含み、当業者には知られている。複数試料用容器は、これに限られないが、マルチウェル・プレート（multi-well  plate）、固相スライド、固相膜（たとえばナイロンまたはニトロセルロース）、ミクロスフィア、ガラス・スライド、マイクロアレイ、チップなどを含む。単一試料用容器は、上述の基板を単一試料モードで使ってもよい。複数試料用容器は、たとえば、単一の熱サイクル・ブロックを使って同時に進行する複数ないし多数のPCRを許す。容器は、高スループットのスクリーニングまたはマイクロアレイ・デバイスと適合性があってもよい。プライマーまたは試料の一つまたは複数の対は、固相に固定されてもよい。すでに一つまたは複数の対のプライマーを含む容器が提供されてもよい。そのようなあらかじめロードされた容器は、指定された微生物および／または耐性遺伝子の検出のためのプライマーの組み合わせを含んでいてもよい。あらかじめロードされた容器は、操作者にとって関心のある明瞭な領域の限られた組み合わせの検出（たとえば、単にE.  coliおよびvanAまたはvanBまたはvanCの検出）に好適なプライマーの組み合わせを含んでいてもよい。具体的な組み合わせの検出のためのいくつかの変形が利用可能にされてもよい。そのようなあらかじめロードされた容器は、キットの一部として利用可能であってもよいし、単独で利用可能であってもよい。
【０１０５】
本発明のある側面によれば、二対以上の増幅プライマーが、二つ以上の異なる種の存在または二つ以上の異なる抗生物質耐性マーカーの存在または少なくとも一つの種および少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーの存在を同時に検出するために使われる。それにより得られる増幅産物は、前記の種および／または抗生物質耐性マーカーの存在の識別を可能にするのに十分、属性が異なっている。同時増幅は、同じ温度サイクル条件のもとで実行されてもよいが、異なるウェルまたはスペースにおいて（たとえば、異なるプライマー対については別々のウェルをもつマイクロアレイ上で）実行されてもよい。任意的に、バッファは増幅プライマーの異なる対について同じであってもよい。異なるプライマー対は、温度および任意的にはバッファの条件が同一なもとで機能するために、ある配列および長さで設計されている。
【０１０６】
本発明のもう一つの側面では、増幅プライマーは同じウェルまたはスペースを占める。すなわち、すべてのプライマーは同じ反応中に存在する（多重化）。多重モードは、増幅プライマー対を二セット以上使った、異なる標的領域の同時増幅に関わる。したがって、温度および任意的にバッファのような条件は、多重PCRプライマーの対について同一である。よって、プライマーはさらに、プライマー対どうしの間の交差反応を起こさせず、似通った融点をもち、同一のバッファ条件で機能するよう設計される。
【０１０７】
多重化されたPCRのためのすべての対が互いに8°C以内のTmをもち、平均Tmが45°Cから約70°Cまでの間であることが好ましく、平均Tmは60°Cから66°Cまでの間であることがより好ましい。
【０１０８】
同時増幅は、ある範囲の細菌種および／または抗生物質耐性マーカーが単一のマイクロアレイ上で、あるいは単一の反応容器内で検出されることを可能にし、よって高速で、経済的で、精確なスクリーニングを許す。
【０１０９】
増幅プライマーは標的に対して完全に相補的であってもよい。すなわち、不一致がなくてもよい。また、プライマーが標的と完全に相補的ではないが、それでも標的の増幅を許容するというのも本発明の範囲内である。プライマーは、標的テンプレートに一つまたは複数の不一致、欠失および／または挿入があるところにも結合しうる。標的テンプレート中に許される不一致、欠失および／または挿入の数は、天然の相補的領域内で1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の残基であってもよく、それでも標的領域の増幅が許容される。あるいはまた、前記の数は天然の相補的領域内のテンプレート残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満であってもよい。当業者には既知であるように、そのような値は、プライマーの長さおよび組成に依存する。好ましくは、不一致、欠失および／または挿入は、相補的領域の中央からテンプレートの3′末端に向かう配列部分に制限される。
【０１１０】
プライマーは、一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。プライマーにおいて許される置換、欠失および／または挿入の数は、天然の相補的領域内で1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の残基であってもよい。あるいはまた、前記の数は天然の相補的領域の両末端の中のプライマー残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満である。当業者には既知であるように、そのような値は、プローブの長さおよび組成に依存する。好ましくは、不一致、欠失および／または挿入は、相補的領域の中央からプライマーの3′末端に向かう配列部分に制限される。さらに、増幅プライマーは、たとえば修飾された塩基または骨格（たとえば、チオリン酸、アルキルチオリン酸、ペプチド核酸；あるいは介入剤（intercalating  agents）を含んでいてもよい）により化学修飾されていてもよい。導入される変形または修飾は、要求される特異性および感度（sensitivity）を得るためにそのオリゴヌクレオチドが使われるべき条件に関して適応を必要とすることがありうるが、増幅反応の最終的な結果は本質的には同じになる。
【０１１１】
欠失、置換、挿入または修飾の導入は、アニーリングの速度論、アニーリングの可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性などといった特性にポジティブに影響するために有利となることがある。
【０１１２】
さらに、増幅プライマーは、5′方向に、一つまたは複数の追加的な塩基、修飾された塩基または化学基（たとえばタグ）で延長されてもよい。そのような修飾は当業者には既知であり、通常、増幅には影響しない。
【０１１３】
識別が二重増幅、すなわちネストされたPCRなどによる明瞭な領域を包含する領域の増幅およびそれに続く該明瞭な領域の増幅を含むことが、一つの側面である。第一の反応からの生成物（任意的に精製される）が第二の反応においてテンプレートとして適用されてもよい。あるいはまた、第一の反応が限られた数のサイクルにわたって進行することを許容されてから第二の反応に関係するプライマーが同じ反応容器に加えられてもよい。そのような変形は当業者には既知である。
【０１１４】
〈ハイブリダイゼーション〉
ハイブリダイゼーション・プローブが使われる場合、該プローブの配列および長さは、ある明瞭な領域の核酸が反応中に存在するときにのみハイブリダイゼーションが指示されるような配列および長さのものであってよい。ハイブリダイゼーション・プローブの選択的な結合を達成するための方法および手順は当業者には既知である。代替的または追加的に、プローブはバックグラウンドまたは他のハイブリダイゼーションに対して当該種（species）の識別を可能にするための特定の相対信号強度を提供してもよい。関心のある核酸の存在に対してハイブリダイゼーション反応の結果をマッチさせるいかなる方法も、本発明の範囲内である。
【０１１５】
ハイブリダイゼーション反応を実行する方法および条件は当技術分野において既知であり、たとえばMolecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (Third  Edition)  (Joseph  Sambrook,  Peter  MacCallum,  David  Russell,  Cold  Spring  Habor  Laboratory  Press)に見出すことができる。
【０１１６】
所望の特性をもつプローブを設計するために、当業者に既知の次の有用なガイドラインが適用できる。
【０１１７】
ここに記載されるようなハイブリダイゼーション反応の広がりおよび特異性はいくつかの因子によって影響されるため、それらの因子の一つまたは複数の操作が、特定のプローブの厳密な感度および特異性を、標的に対して完璧に相補的であるか否かにかかわりなく、決定する。さまざまな検定条件の重要性および効果はのちに説明する。
【０１１８】
［プローブ：標的］という核酸ハイブリッドの安定性は、検定条件と適合するよう選ばれるべきである。これは、たとえば、ATに富む長い配列を回避することによって、G:C塩基対でハイブリッドを終端することによって、および適切なTmをもつプローブを設計することによって達成されうる。プローブの開始点および終点の選択は、そのプローブの長さおよび%GCが、最終的な検定が実行される温度より約2ないし10°C高いTmにつながるようになされるべきである。プローブの塩基組成は重要である。というのも、G-C塩基対は追加的な水素結合のため、A-T塩基対に比べより大きな熱的安定性を示すからである。よって、C-C含有率の高い相補的核酸に関わるハイブリダイゼーションのほうがより高温でより安定である。
【０１１９】
プローブを設計するときには、プローブが使われるときのイオン強度およびインキュベーション温度といった条件も考慮に入れるべきである。ハイブリダイゼーションの度合いは、反応混合物のイオン強度が増すにつれて上昇することおよびハイブリッドの熱的安定性はイオン強度とともに上昇することが知られている。他方、ホルムアミド、尿素、DMSOおよびアルコールといった水素結合を破る化学試薬は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを上げる。そのような試薬による水素結合の不安定化は、Tmを大幅に下げることができる。一般に、約10ないし50塩基の長さのプローブの最適ハイブリダイゼーションは、所与の二本鎖の融点より約5°C下で起こる。最適より低い温度でのインキュベーションは、ハイブリダイズするためのミスマッチした塩基配列を許容することがあり、したがって特異性が下がる結果となりうる。
【０１２０】
高いストリンジェンシーの条件下でのみハイブリダイズするプローブをもつことが望ましい。高ストリンジェンシー条件下では、高度に相補的な核酸ハイブリッドのみが形成される。十分な相補性をもたないハイブリッドは形成されないか、弱めの信号として指示される。したがって、検定条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する二つの核酸鎖の間で必要とされる相補性の量を決める。ストリンジェンシーの度合いは、標的との間および非標的核酸との間に形成されるハイブリッドの安定性の差を最大にするように選ばれる。
【０１２１】
ハイブリダイゼーションに対して禁止的なほど強い内部構造を形成することが知られている標的DNAまたはRNA内の領域はそれほど好ましくない。同様に、広範な自己相補性をもつプローブも避けるべきである。ハイブリダイゼーションは、相補的な核酸の一本鎖が二つ結びついて水素結合した二本鎖を形成することである：二つの一本鎖の一方があるハイブリッドに完全または部分的に関わっている場合、それは新たなハイブリッドの形成に参加することはできにくくなることが含意される。十分な自己相補性があれば、一つの型のプローブの諸分子内で分子内または分子間ハイブリッドが形成されることもできる。そのような構造は、注意深いプローブ設計を通じて回避できる。関心のある配列のかなりの部分が一本鎖であるようなプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および広がりを大幅に増すことができる。この種の相互作用を検索するためのコンピュータ・プログラムが入手可能である。しかしながら、ある種の事例では、この種の相互作用を回避することができないこともありうる。
【０１２２】
配列の存在を検出する方法は、これに限られないが、サザンブロット、ノーザンブロット、親和性クロマトグラフィーおよび固相検定（solid-phase  assay）を含みうる。諸方法は、当業者には理解されるように、蛍光マーカー、放射性同位体マーカー、酵素リンクされたマーカー、染料、抗体、プローブにリンクされた酵素の使用を含んでいてもよい。
【０１２３】
本発明のある実施形態によれば、解析は容器上（on）または容器内（in）で実行される。容器は単一試料用でも複数試料用でもよい。単一試料用容器は、管、瓶、エッペンドルフ管などを含み、当業者には知られている。複数試料用容器は、これに限られないが、マルチウェル・プレート（multi-well  plate）、固相サポート、固相スライド、固相膜（たとえばナイロンまたはニトロセルロース）、多孔性構造、ミクロスフィア、ガラス・スライド、マイクロアレイ、チップなどを含む。単一試料用容器は、上述の基板を単一試料モードで使ってもよい。試料は、たとえばマルチプル・アプリケータ（multiple  applicator）、ソフト・リソグラフィーまたはマイクロ接触印刷（microcontact  printing）、インクジェット技術などを使って加えられてもよい。一つまたは複数のプローブまたは試料が、固相に（たとえば固相サポートに）固定されてもよい。複数試料固体サポートは、単一のハイブリダイゼーション・オーブンもしくはプラットフォームおよび／または単一セットの試薬を使って、たとえば数個または多数のハイブリダイゼーションが同時に進行することを許す。固体サポートは、高スループットのスクリーニングまたはマイクロアレイ・デバイスと適合性があってもよい。すでに一つまたは複数のプローブを含む容器が提供されてもよい。そのようなあらかじめロードされた容器は、指定された微生物および／または耐性遺伝子の検出のためのプローブの組み合わせを含んでいてもよい。あらかじめロードされた容器は、操作者にとって関心のある明瞭な領域の限られた組み合わせの検出（たとえば、単にE.coliおよびvanAまたはvanBまたはvanCの検出）に好適なプローブの組み合わせを含んでいてもよい。具体的な組み合わせの検出のためのいくつかの変形が利用可能にされてもよい。そのようなあらかじめロードされた容器は、キットの一部として利用可能であってもよいし、単独で利用可能であってもよい。
【０１２４】
本発明のある側面によれば、二つ以上のハイブリダイゼーション・プローブが、二つ以上の異なる種の存在または二つ以上の異なる抗生物質耐性マーカーの存在または少なくとも一つの種および少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーの存在を同時に検出するために使われる。それにより得られるハイブリダイゼーション産物は、前記の種および／または抗生物質耐性マーカーの存在の識別を可能にするのに十分、属性が異なっている。同時ハイブリダイゼーションは、同じ温度条件のもとで実行されてもよいが、異なるウェルまたはスペースにおいて（たとえば、異なるプライマー対については別々のウェルをもつマイクロアレイ上で）実行されてもよい。任意的に、バッファは異なるプローブについて同じであってもよい。こうして、異なるプローブは、温度および任意的にはバッファの条件が同一なもとで機能するために、ある配列および長さで設計されている。
【０１２５】
本発明のもう一つの側面では、ハイブリダイゼーション・プローブは同じウェルまたはスペースを占める。すなわち、すべてのプローブは同じ反応中に存在する。したがって、温度および任意的にバッファのような条件は、諸プローブについて同一である。よって、プローブはさらに、交差反応を起こさせず、二つ以上の種、DNA耐性遺伝子またはその両方の存在が信頼できる形で識別されることを許容する結果を与えるようよう設計される。
【０１２６】
そのような同時ハイブリダイゼーションは、交差結合からの誤った結果の起こりやすさを最小化して、ある範囲の細菌種および／または抗生物質耐性マーカーが単一のマイクロアレイ上で、あるいは単一の反応内で検出されることを可能にする。
【０１２７】
ハイブリダイゼーション・プローブは標的に対して完全に相補的であってもよい。すなわち、不一致がなくてもよい。また、プローブが標的と完全に相補的ではないが、それでも標的の識別および弁別を許容するというのも本発明の範囲内である。プローブは、標的テンプレートに一つまたは複数の不一致、欠失および／または挿入があるときでも結合しうる。標的テンプレート中に許される不一致、欠失および／または挿入の数は、天然の相補的領域の両末端の中で1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の残基であってもよい。あるいはまた、前記の数は天然の相補的領域の両末端の中のテンプレート残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満であってもよい。当業者には既知であるように、そのような値は、プローブの長さおよび組成に依存する。
【０１２８】
プローブ配列は、一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。プローブにおいて許される置換、欠失および／または挿入の数は、天然の相補的領域の両末端の中で1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の残基であってもよい。あるいはまた、前記の数は天然の相補的領域の両末端の中のプライマー残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満である。当業者には既知であるように、そのような値は、プローブの長さおよび組成に依存する。さらに、プローブは、たとえば修飾された塩基または骨格（たとえば、チオリン酸、アルキルチオリン酸、ペプチド核酸；あるいは介入剤（intercalating  agents）を含んでいてもよい）により化学修飾されていてもよい。導入される変形または修飾は、要求される特異性および感度（sensitivity）を得るためにそのオリゴヌクレオチドが使われるべき条件に関して適応を必要とすることがありうるが、ハイブリダイゼーションの最終的な結果は本質的には同じになる。これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション速度論、ハイブリダイゼーションの可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性などといった特性にポジティブに影響するために有利となることがある。
【０１２９】
本発明に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、明瞭な領域の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の塩基の配列またはその相補配列にアニーリングすることができる。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションのテンプレートが増幅産物であることが一つの側面である。すなわち、明瞭な領域を包含する核酸がまず増幅され、該増幅の産物を使ってハイブリダイゼーションが進行するということである。
【０１３１】
１．Enterobacter  cloacae
本発明のある側面によれば、Enterobacter  cloacaeの23S  RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１および表２に示されたヌクレオチド配列（配列番号1または2）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は前記明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０１３２】
【表１】
2009505651.tif 000002
表１：Enterobacter  cloacaeの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく置換の例は、T1502C（下線部）である。Wはアデニンまたはチミン塩基をもつヌクレオチドである。
【０１３３】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号1の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1251から2050までの間の任意の領域を増幅することができる。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1279から1998までの間（表２、配列番号2）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０１３４】
【表２】
2009505651.tif 000003
表２：Enterobacter  cloacaeの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく置換の例は、T1502C（下線部）である。Wはアデニンまたはチミン塩基をもつヌクレオチドである。
【０１３５】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1279から1998までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1279（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1998（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Enterobacter  cloacaeを検出するのに好適な増幅プライマーは、表３の配列を含む。順方向（F:  forwards）プライマーおよび逆方向（R:  reverse）プライマーの組み合わせは、表３に示されるように、配列番号3（F）と配列番号4（R）、配列番号5（F）と配列番号6（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０１３６】
【表３】
2009505651.tif 000004
表３：Enterobacter  cloacaeの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマーの配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０１３７】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号1またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０１３８】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1279から1998までの間の領域（配列番号2）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1279（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1998（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域にハイブリダイズすることができることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Enterobacter  cloacaeを検出するのに好適なプローブは、配列番号3ないし6によって表される配列およびその相補配列を含む。
【０１３９】
本発明のもう一つの側面は、表３のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Enterobacter  cloacaeを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号3ないし6のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０１４０】
本発明のもう一つの側面は、表３に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０１４１】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０１４２】
２．Enterococcus  faecalis
本発明のある側面によれば、Enterococcus  faecalisの23S  RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表４および表５に示されたヌクレオチド配列（配列番号7または8）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の類似配列である。
【０１４３】
【表４】
2009505651.tif 000005
表４：Enterococcus  faecalisの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく置換の例は、T1320Yおよび／またはY1337C（下線部）である。ここで、Yはピリミジン塩基をもつヌクレオチドである。
【０１４４】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号7の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1259から1978までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1268から1940までの間（表５、配列番号8）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０１４５】
【表５】
2009505651.tif 000006
表５：Enterococcus  faecalisの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく置換の例は、T1320Yおよび／またはY1337C（下線部）である。
【０１４６】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1268から1940までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1268（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1940（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Enterococcus  faecalisを検出するのに好適な増幅プライマーは、表６の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表６に示されるように、配列番号9（F）と11（R）、配列番号9（F）と12（R）、配列番号13（F）と14（R）、配列番号15（F）と12（R）、配列番号15（F）と11（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０１４７】
【表６】
2009505651.tif 000007
表６：Enterococcus  faecalisの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０１４８】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号7またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０１４９】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1279から1998までの間の領域（配列番号8）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1279（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1998（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Enterococcus  faecalisを検出するのに好適なプローブは、配列番号9ないし15によって表される配列およびその相補配列を含む。
【０１５０】
本発明のもう一つの側面は、表６のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Enterococcus  faecalisを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号9ないし15のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０１５１】
本発明のもう一つの側面は、表６に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０１５２】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０１５３】
３．Enterococcus  faecium
本発明のある側面によれば、Enterococcus    faeciumの23S  RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表７および表８に示されたヌクレオチド配列（配列番号16または17）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の類似配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０１５４】
【表７】
2009505651.tif 000008
表７：Enterococcus  faeciumの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。
【０１５５】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号16の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1381から1560までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1392から1547までの間（表８、配列番号17）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０１５６】
【表８】
2009505651.tif 000009
表８：Enterococcus  faeciumの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。
【０１５７】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1392から1547までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1392（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1547（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Enterococcus    faeciumを検出するのに好適な増幅プライマーは、表９の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表９に示されるように、配列番号18と19、配列番号19と20、配列番号20と21を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。
【０１５８】
【表９】
2009505651.tif 000010
表９：Enterococcus  faeciumの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０１５９】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号16またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０１６０】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1392から1547までの間の領域（配列番号17）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基1392（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1547（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Enterococcus  faeciumを検出するのに好適なプローブは、配列番号18ないし21のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０１６１】
本発明のもう一つの側面は、表９のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Enterococcus  faeciumを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号18ないし21のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０１６２】
本発明のもう一つの側面は、表９に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０１６３】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０１６４】
４．Escherichia  coli
本発明のある側面によれば、Escherichia  coliの23S  RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１０および表１１に示されたヌクレオチド配列（配列番号22または23）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０１６５】
【表１０】
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表１０：Escherichia  coliの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく削除の例は、G1294の削除（下線部）である。
【０１６６】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号22の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1201から1740までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1265から1667までの間（表１１、配列番号23）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０１６７】
【表１１】
2009505651.tif 000012
表１１：Escherichia  coliの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく削除の例は、G1294の削除（下線部）である。
【０１６８】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1265から1667までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1265（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1265（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Escherichia  coliを検出するのに好適な増幅プライマーは、表１２の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表１２に示されるように、配列番号24（F）と25（R）、配列番号24（F）と26（R）、配列番号27（F）と29（R）、配列番号28（F）と29（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０１６９】
【表１２】
2009505651.tif 000013
表１２：Escherichia  coliの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０１７０】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号22またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０１７１】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1265から1667までの間の領域（配列番号23）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1265（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1667（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Escherichia  coliを検出するのに好適なプローブは、配列番号24ないし29によって表される配列およびその相補配列を含む。
【０１７２】
本発明のもう一つの側面は、表１２のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Escherichia  coliを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号24ないし29のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０１７３】
本発明のもう一つの側面は、表１２に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０１７４】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０１７５】
５．Klebsiella  pneumoniae
本発明のある側面によれば、Klebsiella  pneumoniaeの23S  RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１３および表１４に示されたヌクレオチド配列（配列番号30または31）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な配列は、該明瞭な配列の類似配列またはその相補配列である。
【０１７６】
【表１３】
2009505651.tif 000014
表１３：Klebsiella  pneumoniaeの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。ここで、R（下線部）はGまたはAであり、Y（下線部）はCまたはTである。本発明に基づく置換の例は、C1354T（下線部）である。
【０１７７】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号30の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1251から1600までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1281から1560までの間（表１４、配列番号31）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０１７８】
【表１４】
2009505651.tif 000015
表１４：Klebsiella  pneumoniaeの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。ここで、R（下線部）は任意のプリン（GまたはA）であり、Y（下線部）は任意のピリミジン（CまたはT）である。本発明に基づく置換の例は、C1354T（下線部）である。
【０１７９】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1281から1560までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1281（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1560（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Klebsiella  pneumoniaeを検出するのに好適な増幅プライマーは、表１５の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表１２に示されるように、配列番号32（F）と34（R）、配列番号32（F）と33（R）、配列番号35（F）と36（R）、配列番号37（F）と33（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０１８０】
【表１５】
2009505651.tif 000016
表１５：Klebsiella  pneumoniaeの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび温度。R（下線部）は任意のプリン（GまたはA）であることを注意しておく。
【０１８１】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号30またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０１８２】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1281から1560までの間の領域（配列番号31）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基1281（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1560（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Klebsiella  pneumoniaeを検出するのに好適なプローブは、配列番号32ないし37によって表される配列およびその相補配列を含む。
【０１８３】
本発明のもう一つの側面は、表１５のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Klebsiella  pneumoniaeを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号32ないし37のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０１８４】
本発明のもう一つの側面は、表１５に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０１８５】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０１８６】
６．Pseudomonas  aeruginosa
本発明のある側面によれば、Pseudomonas  aeruginosaの23S  RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１６および表１７に示されたヌクレオチド配列（配列番号38または39）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０１８７】
【表１６】
2009505651.tif 000017
表１６：Pseudomonas  aeruginosaの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく置換の例は、T374C（下線部）である。
【０１８８】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号38の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基51から750までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基104から704までの間（表１７、配列番号39）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０１８９】
【表１７】
2009505651.tif 000018
表１７：Pseudomonas  aeruginosaの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく置換の例は、T374C（下線部）である。
【０１９０】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基104から704までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基104（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から704（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Pseudomonas  aeruginosaを検出するのに好適な増幅プライマーは、表１８の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表１８に示されるように、配列番号40（F）と41（R）、配列番号40（F）と42（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０１９１】
【表１８】
2009505651.tif 000019
表１８：Pseudomonas  aeruginosaの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０１９２】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号38またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０１９３】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基104から704までの間の領域（配列番号39）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基104（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から704（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Pseudomonas  aeruginosaを検出するのに好適なプローブは、配列番号40ないし42のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０１９４】
本発明のもう一つの側面は、表１８のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Pseudomonas  aeruginosaを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号40ないし42のうちのいずれか一つに対応する配列を有する。
【０１９５】
本発明のもう一つの側面は、表１８に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０１９６】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０１９７】
７．Staphylococcus  aureus
本発明のある側面によれば、Staphylococcus  aureusの23S  RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１９および表２０に示されたヌクレオチド配列（配列番号43または44）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０１９８】
【表１９】
2009505651.tif 000020
表１９：Staphylococcus  aureusの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。
【０１９９】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号43の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1021から1320までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1037から1263までの間（表２０、配列番号44）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０２００】
【表２０】
2009505651.tif 000021
表２０：Staphylococcus  aureusの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。
【０２０１】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1037から1263までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1037（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1263（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Staphylococcus  aureusを検出するのに好適な増幅プライマーは、表２１の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表２１に示されるように、配列番号45（F）と46（R）、配列番号48（F）と47（R）、配列番号48（F）と49（R）、配列番号48（F）と51（R）、配列番号50（F）と51（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０２０２】
【表２１】
2009505651.tif 000022
表２１：Staphylococcus  aureusの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０２０３】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号43またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０２０４】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1037から1263までの間の領域（配列番号44）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1037（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1263（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Staphylococcus  aureusを検出するのに好適なプローブは、配列番号45ないし51のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０２０５】
本発明のもう一つの側面は、表２１のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Staphylococcus  aureusを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号45ないし51のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０２０６】
本発明のもう一つの側面は、表２１に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０２０７】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０２０８】
８．Staphylococcus  epidermidis
本発明のある側面によれば、Staphylococcus  epidermidisの23S  RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表２２および表２３に示されたヌクレオチド配列（配列番号52または53）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０２０９】
【表２２】
2009505651.tif 000023
表２２：Staphylococcus  epidermidisの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく置換の例は、T859C（下線部）である。
【０２１０】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号52の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基501から1050までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1037から1263までの間（表２３、配列番号53）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０２１１】
【表２３】
2009505651.tif 000024
表２３：Staphylococcus  epidermidisの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。本発明に基づく置換の例は、T859C（下線部）である。
【０２１２】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1037から1263までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1037（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1263（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Staphylococcus  epidermidisを検出するのに好適な増幅プライマーは、表２４の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表２４に示されるように、配列番号54（F）と55（R）、配列番号54（F）と56（R）、配列番号54（F）と57（R）、配列番号58（F）と57（R）、配列番号58（F）と59（R）、配列番号58（F）と60（R）、配列番号58（F）と61（R）、配列番号58（F）と62（R）、配列番号63（F）と59（R）、配列番号63（F）と60（R）、配列番号63（F）と61（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０２１３】
【表２４】
2009505651.tif 000025
表２４：Staphylococcus  epidermidisの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０２１４】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号52またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０２１５】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1037から1263までの間の領域（配列番号53）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1037（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1263（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Staphylococcus  epidermidisを検出するのに好適なプローブは、配列番号54ないし63のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０２１６】
本発明のもう一つの側面は、表２４のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Staphylococcus  epidermidisを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号54ないし63のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０２１７】
本発明のもう一つの側面は、表２４に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０２１８】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０２１９】
９．Candida  albicans
本発明のある側面によれば、Candida  albicansの23S  RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表２５および表２６に示されたヌクレオチド配列（配列番号64または65）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０２２０】
【表２５】
2009505651.tif 000026
表２５：Candida  albicansの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。Yはピリミジン塩基をもつヌクレオチドである。ヌクレオチド「XX」は両方とも欠けていてもよく、「TT」であってもよく、あるいは単一のヌクレオチド「A」であってもよい。
【０２２１】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号64の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基181から778までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基214から739までの間（表２６、配列番号65）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０２２２】
【表２６】
2009505651.tif 000027
表２６：Candida  albicansの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域の配列。Yはピリミジン塩基をもつヌクレオチドである。ヌクレオチド「XX」は両方とも欠けていてもよく、「TT」であってもよく、あるいは単一のヌクレオチド「A」であってもよい。
【０２２３】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基214から739までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基214（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から739（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。
【０２２４】
本発明のある側面によれば、Candida  albicansを検出するのに好適な増幅プライマーは、表２７の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表２７に示されるように、配列番号66（F）と67（R）、配列番号68（F）と69（R）、配列番号70（F）と71（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０２２５】
【表２７】
2009505651.tif 000028
表２７：Candida  albicansの23S  RNA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０２２６】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号64またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０２２７】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基214から739までの間の領域（配列番号65）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基214（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から739（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Candida  albicansを検出するのに好適なプローブは、配列番号66ないし71のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０２２８】
本発明のもう一つの側面は、表２７のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Candida  albicansを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号66ないし71のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０２２９】
本発明のもう一つの側面は、表２７に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０２３０】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０２３１】
１０．blages-2（βラクタム耐性遺伝子）
本発明のある側面によれば、blages-2遺伝子のある明瞭な領域が、表２８および表２９に示されたヌクレオチド配列（配列番号72または73）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０２３２】
【表２８】
2009505651.tif 000029
表２８：blages-2遺伝子の明瞭な領域の配列。R（下線部）は任意のプリン（GまたはA）である。本発明に基づく削除の例は、R112および／またはR313のうち任意のものの削除を含む。
【０２３３】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号72の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から653までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基140から482までの間（表２６、配列番号73）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０２３４】
【表２９】
2009505651.tif 000030
表２９：blages-2遺伝子の明瞭な領域の配列。R（下線部）は任意のプリン（GまたはA）であることを注意しておく。本発明に基づく削除の例は、R112および／またはR313のうち任意のものの削除を含む。
【０２３５】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基140から482までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基140（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から482（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、blages-2遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表３０の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表３０に示されるように、配列番号74（F）と75（R）、配列番号76（F）と77（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０２３６】
【表３０】
2009505651.tif 000031
表３０：blages-2遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０２３７】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号72またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０２３８】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基140から482までの間の領域（配列番号73）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基140（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から482（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、blages-2遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号74ないし77のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０２３９】
本発明のもう一つの側面は、表３０のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、blages-2遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号74ないし77のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０２４０】
本発明のもう一つの側面は、表３０に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０２４１】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０２４２】
１１．blashv（βラクタム耐性遺伝子）
本発明のある側面によれば、blashv遺伝子のある明瞭な領域が、表３１および表３２に示されたヌクレオチド配列（配列番号78または79）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０２４３】
【表３１】
2009505651.tif 000032
表３１：blashv遺伝子の明瞭な領域の配列。Y（下線部）は任意のピリミジン（CまたはT）、R（下線部）は任意のプリン（GまたはA）、Sは（CまたはG）であることを注意しておく。本発明に基づく削除の例は、Y240、R583、R588およびS669のうち一つまたは複数の削除を含む。
【０２４４】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号78の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から693までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基149から350までの間（表３２、配列番号79）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０２４５】
【表３２】
2009505651.tif 000033
表３２：blashv遺伝子の明瞭な領域の配列。Y（下線部）は任意のピリミジン（CまたはT）であることを注意しておく。Y（下線部）は任意のピリミジン（CまたはT）、R（下線部）は任意のプリン（GまたはA）、Sは（CまたはG）であることを注意しておく。本発明に基づく削除の例は、Y240、R583、R588およびS669のうち一つまたは複数の削除を含む。
【０２４６】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基149から350までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基149（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から350（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、blashv遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表３３の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表３３に示されるように、配列番号80と81、配列番号82と83を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０２４７】
【表３３】
2009505651.tif 000034
表３３：blashv遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０２４８】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号78またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０２４９】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基149から350までの間の領域（配列番号79）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基149（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から350（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、blashv遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号80ないし83のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０２５０】
本発明のもう一つの側面は、表３３のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、blashv遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号80ないし83のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０２５１】
本発明のもう一つの側面は、表３３に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０２５２】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０２５３】
１２．mecA（メチシリン耐性遺伝子）
本発明のある側面によれば、mecA遺伝子のある明瞭な領域が、表３４および表３５に示されたヌクレオチド配列（配列番号84または85）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０２５４】
【表３４】
2009505651.tif 000035
表３４：mecA遺伝子の明瞭な領域の配列。
【０２５５】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号84の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から611までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基184から484までの間（表３５、配列番号85）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０２５６】
【表３５】
2009505651.tif 000036
表３５：mecA遺伝子の明瞭な領域の配列。
【０２５７】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基184から484までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基184（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から484（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、mecA遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表３６の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表３６に示されるように、配列番号86（F）と87（R）、配列番号88（F）と89（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０２５８】
【表３６】
2009505651.tif 000037
表３６：mecA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０２５９】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号84またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０２６０】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基149から349までの間の領域（配列番号85）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基184（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から484（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、mecA遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号86ないし89のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０２６１】
本発明のもう一つの側面は、表３６のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、mecA遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号86ないし89のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０２６２】
本発明のもう一つの側面は、表３６に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０２６３】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０２６４】
１３．spA（Staphylococcus  aureusタンパク質A）
本発明のある側面によれば、spA遺伝子のある明瞭な領域が、表３７および表３８に示されたヌクレオチド配列（配列番号90または91）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０２６５】
【表３７】
2009505651.tif 000038
表３７：spA遺伝子の明瞭な領域の配列。Sは（CまたはG）、Yはピリミジン（CまたはT）、Hは（A、CまたはT）であることを注意しておく。本発明に基づく削除の例は、S140、Y161、Y173、S287、H349、Y356、Y359、Y362、Y387および／またはY455の削除を含む。
【０２６６】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号90の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から501までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基292から409までの間（表３８、配列番号91）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０２６７】
【表３８】
2009505651.tif 000039
表３８：spA遺伝子の明瞭な領域の配列。Yはピリミジン（CまたはT）、Hは（A、CまたはT）であることを注意しておく。本発明に基づく削除の例は、H349、Y356、Y359、Y362および／またはY387の削除を含む。
【０２６８】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基292から409までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基292（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から409（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、spA遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表３９の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表３９に示されるように、配列番号92（F）と93（R）、配列番号94（F）と95（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０２６９】
【表３９】
2009505651.tif 000040
表３９：spA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０２７０】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号90またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０２７１】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基292から409までの間の領域（配列番号46）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基292（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から409（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、spA遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号92ないし95のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０２７２】
本発明のもう一つの側面は、表３９のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、spA遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号92ないし95のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０２７３】
本発明のもう一つの側面は、表３９に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０２７４】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０２７５】
１４．VanA（バンコマイシン耐性遺伝子A）
本発明のある側面によれば、VanA遺伝子のある明瞭な領域が、表４０および表４１に示されたヌクレオチド配列（配列番号96または97）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０２７６】
【表４０】
2009505651.tif 000041
表４０：VanA遺伝子の明瞭な領域の配列。Bは（T、CまたはG）であることを注意しておく。本発明に基づく削除の例は、B528の削除を含む。
【０２７７】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号96の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から944までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基138から641までの間（表４１、配列番号97）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０２７８】
【表４１】
2009505651.tif 000042
表４１：VanA遺伝子の明瞭な領域の配列。Bは（T、CまたはG）であることを注意しておく。本発明に基づく削除の例は、B528の削除を含む。
【０２７９】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基138から641までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基138（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から641（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、VanA遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表４２の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表４２に示されるように、配列番号98（F）と99（R）、配列番号100（F）と101（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０２８０】
【表４２】
2009505651.tif 000043
表４２：VanA遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０２８１】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号96またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０２８２】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基138から641までの間の領域（配列番号97）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基138（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から641（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、VanA遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号98ないし101のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０２８３】
本発明のもう一つの側面は、表４２のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、VanA遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号98ないし101のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０２８４】
本発明のもう一つの側面は、表４２に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０２８５】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０２８６】
１５．VanB（バンコマイシン耐性遺伝子B）
本発明のある側面によれば、VanB遺伝子のある明瞭な領域が、表４３および表４４に示されたヌクレオチド配列（配列番号102または103）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０２８７】
【表４３】
2009505651.tif 000044
表４３：VanB遺伝子の明瞭な領域の配列。Bは（T、CまたはG）であり、Rはプリン（GまたはA）であることを注意しておく。本発明に基づく削除の例は、B418、R540およびR696のうちの一つまたは複数を含む。
【０２８８】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号102の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から741までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基126から574までの間（表４４、配列番号103）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０２８９】
【表４４】
2009505651.tif 000045
表４４：VanB遺伝子の明瞭な領域の配列。Bは（T、CまたはG）であり、Rはプリン（GまたはA）であることを注意しておく。本発明に基づく削除の例は、B418およびR540のうちの一つまたは複数を含む。
【０２９０】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基126から574までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基126（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から574（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、VanB遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表４５の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表４５に示されるように、配列番号104（F）と105（R）、配列番号106（F）と107（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０２９１】
【表４５】
2009505651.tif 000046
表４５：VanB遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０２９２】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号102またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０２９３】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基126から574までの間の領域（配列番号103）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基126（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から574（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、VanB遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号102および103によって表される配列およびその相補配列を含む。
【０２９４】
本発明のもう一つの側面は、表４５のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、VanB遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号104ないし107のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０２９５】
本発明のもう一つの側面は、表４５に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０２９６】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０２９７】
１６．VanC（バンコマイシン耐性遺伝子C）
本発明のある側面によれば、VanC遺伝子のある明瞭な領域が、表４６および表４７に示されたヌクレオチド配列（配列番号108または109）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０２９８】
【表４６】
2009505651.tif 000047
表４６：VanC遺伝子の明瞭な領域の配列。
【０２９９】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号108の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から438までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基27から407までの間（表４７、配列番号109）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０３００】
【表４７】
2009505651.tif 000048
表４７：VanC遺伝子の明瞭な領域の配列。
【０３０１】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基27から407までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基27（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から407（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、VanC遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表４８の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表４８に示されるように、配列番号110（F）と111（R）、配列番号112（F）と113（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０３０２】
【表４８】
2009505651.tif 000049
表４８：VanC遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０３０３】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号108またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０３０４】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基27から407までの間の領域（配列番号109）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基27（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から407（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、VanC遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号110ないし113のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０３０５】
本発明のもう一つの側面は、表４８のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、VanC遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号110ないし113のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０３０６】
本発明のもう一つの側面は、表４８に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０３０７】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０３０８】
１７．MDR-1
本発明のある側面によれば、MDR-1遺伝子のある明瞭な領域が、表４９および表５０に示されたヌクレオチド配列（配列番号114または115）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０３０９】
【表４９】
2009505651.tif 000050
表４９：MDR-1遺伝子の明瞭な領域の配列。Yはピリミジン塩基をもつヌクレオチド、Rはプリン塩基をもつ任意のヌクレオチド、Wはアデニンまたはチミン塩基をもつ任意のヌクレオチドである。
【０３１０】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号108の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基201から850までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基275から834までの間（表５０、配列番号115）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０３１１】
【表５０】
2009505651.tif 000051
表５０：MDR-1遺伝子の明瞭な領域の配列。
【０３１２】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基275から834までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基275（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から834（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、MDR-1遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表５１の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表５１に示されるように、配列番号116（F）と117（R）、配列番号118（F）と119（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０３１３】
【表５１】
2009505651.tif 000052
表５１：MDR-1遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０３１４】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号114またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０３１５】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基275から834までの間の領域（配列番号115）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基275（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から834（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、MDR-1遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号116ないし119のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０３１６】
本発明のもう一つの側面は、表５１のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、MDR-1遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号116ないし119のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０３１７】
本発明のもう一つの側面は、表５１に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０３１８】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０３１９】
１８．CDR-1
本発明のある側面によれば、CDR-1遺伝子のある明瞭な領域が、表５２および表５３に示されたヌクレオチド配列（配列番号120または121）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０３２０】
【表５２】
2009505651.tif 000053
表５２：CDR-1遺伝子の明瞭な領域の配列。Yはピリミジン塩基をもつヌクレオチド、Rはプリン塩基をもつ任意のヌクレオチド、Kはチミンまたはグアニン塩基をもつ任意のヌクレオチド、Wはアデニンまたはチミン塩基をもつ任意のヌクレオチド、Mはシトシンまたはアデニン塩基をもつ任意のヌクレオチド、Sはシトシンまたはグアニン塩基をもつ任意のヌクレオチドである。
【０３２１】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号120の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から387までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基111から178までの間（表５３、配列番号121）の任意の領域を増幅することができる対である。
【０３２２】
【表５３】
2009505651.tif 000054
表５３：CDR-1遺伝子の明瞭な領域の配列。CDR-1遺伝子の明瞭な領域の配列。Yはピリミジン塩基をもつ任意のヌクレオチドである。
【０３２３】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基111から178までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基111（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から178（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、CDR-1遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表５４の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表５４に示されるように、配列番号122（F）と123（R）、配列番号124（F）と125（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
【０３２４】
【表５４】
2009505651.tif 000055
表５４：CDR-1遺伝子の明瞭な領域を増幅するための増幅プライマーの例、長さおよび融点。「型」は順方向（F）プライマーか逆方向（R）プライマーかの別、「対」は増幅のための対になるプライマー配列番号、「長さ」は増幅産物の長さである。
【０３２５】
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号120またはその相補配列へのアニーリングができる。
【０３２６】
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基111から178までの間の領域（配列番号121）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基111（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から178（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、MDR-1遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号122ないし125のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
【０３２７】
本発明のもう一つの側面は、表５４のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、CDR-1遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号122ないし125のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。
【０３２８】
本発明のもう一つの側面は、表５４に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。
【０３２９】
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０３３０】
〈図１〉
この図は、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  epidermidis、Enterobacter  cloacae、Escherichia  coli、Enterococcus  faecalis、Pseudomonas  aeruginosa、Enterococcus  faecium、Klebsiella  pneumoniaeおよびCandida  albicansのそれぞれの23S  RNAの配列を整列させ、同一性の指示（*で示す）を示している。
【０３３１】
本発明のある側面によれば、微生物の23S  RNA遺伝子の明瞭な領域は、図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号131ないし157）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は前記配列番号の相補配列である。本発明のある側面は、図１に示される配列番号131ないし157のいずれかによって表される配列またはその相補配列に対応する核酸である。
【０３３２】
本発明のある側面によれば、微生物の23S  RNA遺伝子の明瞭な領域は、該微生物に特異的な増幅プライマーの対を使って得られる、図１に示されるヌクレオチド配列を含む。該増幅プライマーは上述されており、その微生物に依存する：
Enterobacter  cloacae：配列番号3と4または配列番号5と6、
Enterococcus  faecalis：  配列番号9と10、配列番号9と11、配列番号9と12、配列番号13と14、配列番号15と12または配列番号15と11、
Enterococcus  faecium：配列番号18と19、配列番号20と19または配列番号20と21、
Escherichia  coli：配列番号24と26、配列番号24と25、配列番号27と29または配列番号28と29、
Klebsiella  pneumoniae：配列番号32と34、配列番号32と33、配列番号35と36または配列番号37と33、
Pseudomonas  aeruginosa：配列番号40と41または配列番号40と42、
Staphylococcus  aureus：配列番号45と46、配列番号48と47、配列番号48と49、配列番号48と51または配列番号50と51、
Staphylococcus  epidermidis：配列番号54と55、配列番号54と56、配列番号54と57、配列番号58と57、配列番号58と59、配列番号58と60、配列番号58と61、配列番号58と62、配列番号63と59、配列番号63と60または配列番号63と61、
Candida  albicans：配列番号66と67、配列番号68と69または配列番号70と71。
【０３３３】
本発明のもう一つの側面によれば、明確な領域は、該明確な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０３３４】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、図１の配列番号の少なくとも30塩基の任意の領域、その相補配列または該領域もしくは相補配列の類似配列を増幅することのできる対である。
【０３３５】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、明瞭な領域に対応する、図１に挙げられた配列の領域を増幅することのできる対である。該明瞭な領域は、配列番号1または2（Enterobacter  cloacae）、配列番号7または8（Enterococcus  faecalis）、配列番号16または17（Enterococcus  faecium）、配列番号22または23（Escherichia  coli）、配列番号30または31（Klebsiella  pneumoniae）、配列番号38または39（Pseudomonas  aeruginosa）、配列番号43または44（Staphylococcus  aureus）、配列番号52または53（Staphylococcus  epidermidis）、配列番号64および65（Candida  albicans）によって表されるものである。
【０３３６】
該プライマーが、上記の図１の対応する領域であって一端または両端から±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基の領域を増幅できることが、本発明の範囲内である。
【０３３７】
本発明に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、明瞭な領域またはその相補配列に対応する、図１に挙げられた配列の領域にハイブリダイズできる。該明瞭な領域は、配列番号1または2（Enterobacter  cloacae）、配列番号7または8（Enterococcus  faecalis）、配列番号16または17（Enterococcus  faecium）、配列番号22または23（Escherichia  coli）、配列番号30または31（Klebsiella  pneumoniae）、配列番号38または39（Pseudomonas  aeruginosa）、配列番号43または44（Staphylococcus  aureus）、配列番号52または53（Staphylococcus  epidermidis）、配列番号64および65（Candida  albicans）によって表されるものである。
【０３３８】
該プローブが、上記の図１の対応する配列であって一端または両端から±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基の配列に結合できることが、本発明の範囲内である。
【０３３９】
本発明のもう一つの側面は、明瞭な領域に対応する、図の配列の領域に向けられたプライマーの対を使った核酸の増幅によって、明瞭な領域を識別する方法である。該明瞭な領域は、配列番号1または2（Enterobacter  cloacae）、配列番号7または8（Enterococcus  faecalis）、配列番号16または17（Enterococcus  faecium）、配列番号22または23（Escherichia  coli）、配列番号30または31（Klebsiella  pneumoniae）、配列番号38または39（Pseudomonas  aeruginosa）、配列番号43または44（Staphylococcus  aureus）、配列番号52または53（Staphylococcus  epidermidis）、配列番号64および65（Candida  albicans）によって表されるものである。
【０３４０】
本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。
【０３４１】
明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブに対応する上述した領域の類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０３４２】
〈図２〉
この図は、mecA、vanA、vanB、vanC、blashv、blages-2、spA、MDR-1およびCDR-1のそれぞれの配列決定された遺伝子の整列を、コンセンサス（consensus）配列とともに示している。
【０３４３】
本発明のある側面によれば、抗生物質耐性遺伝子のある明瞭な領域が、図２に示されたヌクレオチド配列（配列番号158ないし261）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のある側面は、図２に示される配列番号158ないし261のうちのいずれかによって表される配列またはその相補配列に対応する核酸である。
【０３４４】
本発明のある側面によれば、抗生物質耐性遺伝子の明瞭な領域は、図２に示されたヌクレオチド配列を含む。該配列は、配列番号72または73（blages-2）、配列番号78または79（blashv）、配列番号84または85（mecA）、配列番号90または91（spA）、配列番号96または97（vanA）、配列番号102または103（vanB）、配列番号108または109（vanC）、配列番号114または115（MDR-1）、配列番号120または121（CDR-1）によって表される明瞭な領域に対応するものである。
【０３４５】
本発明のある実施形態によれば、抗生物質耐性遺伝子の明瞭な領域は、該微生物に特異的な増幅プライマーの対を使って得られる、図２に示されるヌクレオチド配列を含む。該増幅プライマーは上述されており、そのマーカーに依存する：
blages-2マーカー：配列番号74と75または配列番号76と77、
blashvマーカー：配列番号80と81または配列番号82と83、
mecAマーカー：配列番号86と87または配列番号88と89、
spAマーカー：配列番号92と93または配列番号94と95、
VanAマーカー：配列番号98と99または配列番号100と101、
VanBマーカー：配列番号104と105または配列番号106と107、
VanCマーカー：配列番号110と111または配列番号112と113、
MDR-1マーカー：配列番号116と117または配列番号118と119および
CDR-1マーカー：配列番号122と123または配列番号124と125。
【０３４６】
本発明のもう一つの側面によれば、明確な領域は、該明確な領域の類似配列またはその相補配列である。
【０３４７】
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、図２の配列番号の少なくとも30塩基の任意の領域、その相補配列または該領域もしくは相補配列の類似配列を増幅することのできる対である。
【０３４８】
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、図２に挙げられた配列の領域を増幅することのできる対である。該配列は、配列番号72または73（blages-2）、配列番号78または79（blashv）、配列番号84または85（mecA）、配列番号90または91（spA）、配列番号96または97（vanA）、配列番号102または103（vanB）、配列番号108または109（vanC）、配列番号114または115（MDR-1）、配列番号120または121（CDR-1）によって表される明瞭な領域に対応するものである。
【０３４９】
該プライマーが、上記の図２の対応する領域であって一端または両端から±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基の領域を増幅できることが、本発明の範囲内である。
【０３５０】
本発明に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、明瞭な領域またはその相補配列に対応する、図２に挙げられた配列の領域にハイブリダイズできる。該明瞭な領域は、配列番号72または73（blages-2）、配列番号78または79（blashv）、配列番号84または85（mecA）、配列番号90または91（spA）、配列番号96または97（vanA）、配列番号102または103（vanB）、配列番号108または109（vanC）、配列番号114または115（MDR-1）、配列番号120または121（CDR-1）によって表される明瞭な領域に対応するものである。
【０３５１】
該プローブが、上記の図２の対応する配列であって一端または両端から±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基の配列に結合できることが、本発明の範囲内である。
【０３５２】
本発明のもう一つの側面は、明瞭な領域またはその相補配列に対応する、図２の配列の領域のほうに向けられたプライマーの対を使った核酸の増幅によって、明瞭な領域を識別する方法である。該明瞭な領域は、配列番号72または73（blages-2）、配列番号78または79（blashv）、配列番号84または85（mecA）、配列番号90または91（spA）、配列番号96または97（vanA）、配列番号102または103（vanB）、配列番号108または109（vanC）、配列番号114または115（MDR-1）、配列番号120または121（CDR-1）によって表されるものである。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。
【０３５３】
明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブに対応する上述した領域の類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。
【０３５４】
〈組み合わせ〉
上述したように、本発明は、核酸の二つまたはそれ以上（たとえば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上）の明瞭な領域の同時検出にも関する。本発明のある実施形態は、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  epidermidis、Enterobacter  cloacae、Escherichia  coli、Enterococcus  faecalis、Pseudomonas  aeruginosa、Enterococcus  faecium、Klebsiella  pneumoniaeおよびCandida  albicansの二つまたはそれ以上（たとえば3、4、5、6、7、8、9またはそれ以上）の検出を、その中の23S  RNAの明瞭な領域に対応する核酸を検出することによって行う方法である。
【０３５５】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、
配列番号1または2（Enterobacter  cloacae）、
配列番号7または8（Enterococcus  faecalis）、
配列番号16または17（Enterococcus  faecium）、
配列番号22または23（Escherichia  coli）、
配列番号30または31（Klebsiella  pneumoniae）、
配列番号38または39（Pseudomonas  aeruginosa）、
配列番号43または44（Staphylococcus  aureus）、
配列番号52または53（Staphylococcus  epidermidis）および
配列番号64および65（Candida  albicans）
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9またはそれ以上）に対応する核酸を検出することによって行う方法である。
【０３５６】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、図１に挙げられている核酸の少なくとも二つ（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）の領域を検出することによって行う方法であって、各領域は、配列番号1または2（Enterobacter  cloacae）、配列番号7または8（Enterococcus  faecalis）、配列番号16または17（Enterococcus  faecium）、配列番号22または23（Escherichia  coli）、配列番号30または31（Klebsiella  pneumoniae）、配列番号38または39（Pseudomonas  aeruginosa）、配列番号43または44（Staphylococcus  aureus）、配列番号52または53（Staphylococcus  epidermidis）または配列番号64および65（Candida  albicans）の明瞭な領域に対応する領域である。
【０３５７】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、二つまたはそれ以上の（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）プライマー対を使って行う方法である。ここで、検出のための前記二つ以上の微生物および前記プライマー対は、以下から選択され、必須ではないが好ましくは、一つの微生物について一つのプライマー対が選択される：
Enterobacter  cloacae：配列番号3と4または配列番号5と6、
Enterococcus  faecalis：  配列番号9と10、配列番号9と11、配列番号9と12、配列番号13と14、配列番号15と12または配列番号15と11、
Enterococcus  faecium：配列番号18と19、配列番号20と19または配列番号20と21、
Escherichia  coli：配列番号24と26、配列番号24と25、配列番号27と29または配列番号28と29、
Klebsiella  pneumoniae：配列番号32と34、配列番号32と33、配列番号35と36または配列番号37と33、
Pseudomonas  aeruginosa：配列番号40と41または配列番号40と42、
Staphylococcus  aureus：配列番号45と46、配列番号48と47、配列番号48と49、配列番号48と51または配列番号50と51、
Staphylococcus  epidermidis：配列番号54と55、配列番号54と56、配列番号54と57、配列番号58と57、配列番号58と59、配列番号58と60、配列番号58と61、配列番号58と62、配列番号63と59、配列番号63と60または配列番号63と61、
Candida  albicans：配列番号66と67、配列番号68と69または配列番号70と71。
【０３５８】
本発明のもう一つの側面は、次のプライマー対、すなわち
Enterobacter  cloacae：配列番号3と4、
Enterococcus  faecalis：配列番号9と12、
Enterococcus  faecium：配列番号18と19、
Escherichia  coli：配列番号24と25、
Klebsiella  pneumoniae：配列番号32と33、
Pseudomonas  aeruginosa：配列番号40と42、
Staphylococcus  aureus：配列番号48と49、
Staphylococcus  epidermidis：配列番号54と55、
Candida  albicans：配列番号66と67、
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を有する組成物である。
【０３５９】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、検出対象の該二つ以上の生物に対応する下記の二つまたはそれ以上の（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）単一プローブ、すなわち
Enterobacter  cloacae：配列番号3ないし6のうちの任意のもの、
Enterococcus  faecalis：  配列番号9ないし15のうちの任意のもの、
Enterococcus  faecium：配列番号18ないし21のうちの任意のもの、
Escherichia  coli：配列番号24ないし29のうちの任意のもの、
Klebsiella  pneumoniae：配列番号32ないし37のうちの任意のもの、
Pseudomonas  aeruginosa：配列番号40ないし42のうちの任意のもの、
Staphylococcus  aureus：配列番号45ないし51のうちの任意のもの、
Staphylococcus  epidermidis：配列番号54ないし63のうちの任意のもの、
Candida  albicans：配列番号66ないし71のうちの任意のもの、
を使って行う方法であって、必須ではないが好ましくは、一つの微生物について一つのプローブが選択される。
【０３６０】
本発明のもう一つの側面は、次のプローブ、すなわち
Enterobacter  cloacae：配列番号3または4、
Enterococcus  faecalis：配列番号9または12、
Enterococcus  faecium：配列番号18または19、
Escherichia  coli：配列番号24または25、
Klebsiella  pneumoniae：配列番号32または33、
Pseudomonas  aeruginosa：配列番号40または42、
Staphylococcus  aureus：配列番号48または49、
Staphylococcus  epidermidis：配列番号54または55、
Candida  albicans：配列番号66または67、
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を有する組成物であって、必須ではないが好ましくは、一つの微生物について一つのプローブが選択される。
【０３６１】
本発明のもう一つの実施形態は、抗生物質耐性マーカーmecA、spA、vanA、vanB、vanC、blashv、blages-2、MDR-1、CDR-1の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10）の検出を、その中の明瞭な領域に対応する核酸を検出することによって行う方法である。
【０３６２】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの抗生物質耐性マーカーの識別を、
配列番号72または73（blages-2マーカー）、
配列番号78または79（blashvマーカー）、
配列番号84または85（mecAマーカー）、
配列番号90または91（spAマーカー）、
配列番号96または97（vanAマーカー）、
配列番号102または103（vanBマーカー）、
配列番号108または109（vanCマーカー）、
配列番号114または115（MDR-1マーカー）、
配列番号120または121（CDR-1マーカー）
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10）に対応する核酸を検出することによって行う方法である。
【０３６３】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、図２に挙げられている核酸配列の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を検出することによって行う方法であって、各配列は検出対象の微生物に対応する。
【０３６４】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、図１に挙げられている核酸の少なくとも二つ（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）の領域を検出することによって行う方法であって、各領域は配列番号72または73（blages-2マーカー）、配列番号78または79（blashvマーカー）、配列番号84または85（mecAマーカー）、配列番号90または91（spAマーカー）、配列番号96または97（vanAマーカー）、配列番号102または103（vanBマーカー）、配列番号108または109（vanCマーカー）、配列番号114または115（MDR-1マーカー）あるいは配列番号120または121（CDR-1マーカー）の明瞭な領域に対応する。
【０３６５】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの抗生物質耐性マーカーの識別を、二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10）のプライマー対を使って行う方法である。ここで、検出対象の抗生物質耐性マーカーとプライマー対とは、下記、すなわち：
blages-2マーカー：配列番号74と75または配列番号76と77、
blashvマーカー：配列番号80と81または配列番号82と83、
mecAマーカー：配列番号86と87または配列番号88と89、
spAマーカー：配列番号92と93または配列番号94と95、
VanAマーカー：配列番号98と99または配列番号100と101、
VanBマーカー：配列番号104と105または配列番号106と107、
VanCマーカー：配列番号110と111または配列番号112と113、
MDR-1マーカー：配列番号116と117または配列番号118と119および
CDR-1マーカー：配列番号122と123または配列番号124と125
から選択され、必須ではないが好ましくは一つのマーカーについて一つのプライマー対が選択される。
【０３６６】
本発明のもう一つの実施形態は、下記のプライマー対、すなわち：
blages-2マーカー：配列番号76と77、
blashvマーカー：配列番号80と81、
mecAマーカー：配列番号88と89、
spAマーカー：配列番号92と93、
VanAマーカー：配列番号100と101、
VanBマーカー：配列番号106と107、
VanCマーカー：配列番号112と113、
MDR-1マーカー：配列番号116と117、
CDR-1マーカー：配列番号124と125
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を含む組成物である。
【０３６７】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの抗生物質耐性マーカーの識別を、二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10）のプローブを使って行う方法である。ここで、検出対象の抗生物質耐性マーカーとプローブとは、下記、すなわち：
blages-2マーカー：配列番号74ないし77のうちの任意のもの、
blashvマーカー：配列番号80ないし83のうちの任意のもの、
mecAマーカー：配列番号86ないし89のうちの任意のもの、
spAマーカー：配列番号92ないし95のうちの任意のもの、
VanAマーカー：配列番号98ないし101のうちの任意のもの、
VanBマーカー：配列番号104ないし107のうちの任意のもの、
VanCマーカー：配列番号110ないし113のうちの任意のもの、
MDR-1マーカー：配列番号116ないし119のうちの任意のもの、
CDR-1マーカー：配列番号122ないし125のうちの任意のもの、
から選択され、必須ではないが好ましくは一つの微生物について一つのプローブが選択される。
【０３６８】
本発明のもう一つの実施形態は、下記のプローブ、すなわち：
blages-2マーカー：配列番号76または77、
blashvマーカー：配列番号80または81、
mecAマーカー：配列番号88または89、
spAマーカー：配列番号92または93、
VanAマーカー：配列番号100または101、
VanBマーカー：配列番号106または107、
VanCマーカー：配列番号112または113、
MDR-1マーカー：配列番号116または117、
CDR-1マーカー：配列番号124または125
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を含む組成物であって、必須ではないが好ましくは一つのマーカーについて一つのプローブが選択される。
【０３６９】
本発明のもう一つの実施形態は、抗生物質耐性マーカーmecA、spA、vanA、vanB、vanC、blashv、blages-2、MDR-1およびCDR-1の少なくとも一つ（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10またはそれ以上）と、微生物Enterobacter  cloacae、Enterococcus  faecalis、Enterococcus  faecium、Escherichia  coli、Klebsiella  pneumoniae、Pseudomonas  aeruginosa、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  epidermidisおよびCandida  albicansの少なくとも一つ（たとえば2、3、4、5、6、7、8もしくは9またはそれ以上）とを、その中の明瞭な領域に対応する核酸を検出することによって検出する方法である。
【０３７０】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも一つの微生物と少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーとを、上述した配列番号に対応する明瞭な領域を検出することによって識別する方法である。
【０３７１】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも一つの微生物と少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーとを、上述した配列番号に対応するプライマー対または単一プローブの二つ以上を使って識別する方法である。
【０３７２】
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の一つの微生物と少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーとを、23S  RNAに関係する上述した配列番号に対応するプライマー対または単一プローブの一つと、抗生物質耐性遺伝子に関係する上述した配列番号に対応する二つ以上（たとえば3、4、5、6、7、8、9もしくは10またはそれ以上）のプライマー対または単一プローブとを使って識別する方法である。
【０３７３】
本発明のもう一つの実施形態は、次のプライマー対、すなわち
Enterobacter  cloacae：配列番号3と4、
Enterococcus  faecalis：配列番号9と12、
Enterococcus  faecium：配列番号18と19、
Escherichia  coli：配列番号24と25、
Klebsiella  pneumoniae：配列番号32と33、
Pseudomonas  aeruginosa：配列番号40と42、
Staphylococcus  aureus：配列番号48と49、
Staphylococcus  epidermidis：配列番号54と55、
Candida  albicans：配列番号66と67
の一つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）と、次のプライマー対、すなわち
blages-2マーカー：配列番号76と77、
blashvマーカー：配列番号80と81、
mecAマーカー：配列番号88と89、
spAマーカー：配列番号92と93、
VanAマーカー：配列番号100と101、
VanBマーカー：配列番号106と107、
VanCマーカー：配列番号112と113、
MDR-1マーカー：配列番号116と117、
CDR-1マーカー：配列番号124と125
の一つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）とを含む組成物である。
【０３７４】
本発明のもう一つの実施形態は、次のプローブ、すなわち
Enterobacter  cloacae：配列番号3または4、
Enterococcus  faecalis：配列番号9または12、
Enterococcus  faecium：配列番号18または19、
Escherichia  coli：配列番号24または25、
Klebsiella  pneumoniae：配列番号32または33、
Pseudomonas  aeruginosa：配列番号40または42、
Staphylococcus  aureus：配列番号48または49、
Staphylococcus  epidermidis：配列番号54または55、
Candida  albicans：配列番号66または67
の、必須ではないが好ましくは一つの微生物について一つのプローブが選択された一つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）と、次のプローブ、すなわち
blages-2マーカー：配列番号76または77、
blashvマーカー：配列番号80または81、
mecAマーカー：配列番号88または89、
spAマーカー：配列番号92または93、
VanAマーカー：配列番号100または101、
VanBマーカー：配列番号106または107、
VanCマーカー：配列番号112または113、
MDR-1マーカー：配列番号116または117、
CDR-1マーカー：配列番号124または125
の、必須ではないが好ましくは一つのマーカーについて一つのプローブが選択された一つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）とを含む組成物である。
【０３７５】
本発明に基づく組成物（composition）は、溶液（solution）、混合物（mixture）、混成物（admixture）であってもよく、あるいは本発明の容器または装置の中（in）または上（on）の構成要素をなしていてもよい。
【０３７６】
本発明のもう一つの実施形態は、上記の方法および組成物実施形態において定義される二つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）のプライマー対を含む容器である。
【０３７７】
本発明のもう一つの実施形態は、上記の方法および組成物実施形態において定義される二つ以上のプローブ（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）を含む容器である。
【０３７８】
本発明のもう一つの実施形態は、上記の方法および組成物実施形態において定義される二つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）のプライマー対を含むキットである。
【０３７９】
本発明のもう一つの実施形態は、上記の方法および組成物実施形態において定義される二つ以上のプローブ（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）を含むキットである。
【０３８０】
本発明のある側面によれば、方法が一微生物当たり一つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子の存在を検出する。本発明のもう一つの側面によれば、方法が一微生物当たり一つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子およびまたその微生物の存在を検出する。
【０３８１】
プライマーは有利なことに、単一の反応において複数のテンプレート配列の同時または多重化されたPCRを、プライマー二量体の形成や交差反応なしに許す。さらに、生成物の長さは種または抗生物質耐性マーカーに固有である。これは、たとえば電気泳動によって増幅反応の生成物を分離することを、および一つまたは複数のバンドに帰される長さを評価することによっていくつかの遺伝子を識別することを許容する。
【０３８２】
標的配列の多重検出は、スループットを上げるという恩恵をもつばかりでなく、臨床応用における療法の、差分的な診断およびモニタリングをも許容する。たとえば、菌血症および敗血症の病気は、一つまたは複数の異なる病原によって引き起こされ、療法は、関わっている細菌および関わっている抗生物質耐性の細菌株の検出に強く依存し、それらが正しい抗生物質の適用をガイドすることになる。したがって、適正かつ効果的な療法のためには、一つまたは複数の病原およびその抗生物質耐性種――いわゆる病原および抗生物質耐性種のパネル（panel）――の特定の核酸配列の存在、不在または量を非常に特異的かつ敏感に検出することが本質的である。当業者には、菌血症および敗血症の治療がうまくいくのは、その病気の発生後、非常に狭い時間枠内のみであることはよく知られている。さらに、病気の検出が早いほど、療法はよりうまくいき、より速く効くことも当業者にはよく知られている。さらに、全体的な病原性の検出は、細菌および抗生物質耐性細菌株を含むパネルにのみ制約されることはなく、真菌株、ウイルス株、タンパク質および／またはハプテンのみを組み合わせたパネル、あるいはそれらを細菌および抗生物質耐性細菌株と一緒に組み合わせたパネルにもであることも当業者にはよく知られている。
【０３８３】
〈プロダクト〉
本発明は、本稿で述べた明瞭な領域の識別を可能にする装置内で使うのに好適な一つまたは複数のプライマーまたはプローブを含むプロダクトを含む。そのようなプロダクトは、たとえば次のものを含む。
・一つまたは複数の増幅プライマー対を事前ロードされた一つまたは複数の容器（たとえばマイクロアレイまたは多試料容器）。多試料容器は、複数の明瞭な領域の同時検出を、同じ反応において、あるいは別個の反応として許容する。
・一つまたは複数のプライマー対ならびに任意的にバッファ、試薬および容器を含む、増幅反応を実行するためのキット。
・一つまたは複数の容器ならびに任意的にバッファ、試薬を含む、増幅反応を実行するためのキット。
・増幅反応を実行するための一つまたは複数のプライマー対を含む装置。
・一つまたは複数のプローブを事前ロードされた一つまたは複数の容器（たとえばマイクロアレイまたは多試料容器）。多試料容器は、複数の明瞭な領域の同時検出を、同じ反応において、あるいは別個の反応として許容する。
・一つまたは複数のプローブならびに任意的にバッファ、試薬および容器を含む、ハイブリダイゼーションを実行するためのキット。
・一つまたは複数の容器ならびに任意的にバッファ、試薬および容器を含む、ハイブリダイゼーションを実行するためのキット。
・ハイブリダイゼーションを実行するための一つまたは複数のプローブを含む装置。
・本稿で述べた一つまたは複数のプライマー対を含む組成物。
・本稿で述べた一つまたは複数のプローブを含む組成物。
【０３８４】
〈例〉
以下の諸例は、本発明のさまざまな方法および複合物（compound）を例示することを意図したものである。
【０３８５】
例１：試料の調製
患者の血液200μlを、直径106μm以下で、酸洗いされたガラス・ビーズ（Sigma-Aldrich）を含む容器にピペットで移した。市販のIKA  MS2ミニシェイカー（Minishaker）で、懸濁物を環境温度で1ないし3分間攪拌した。
【０３８６】
例２：核酸抽出および精製
核酸の抽出および精製を修正された市販のバイオロボットEZ1（biorobot  EZ1）（Qiagen）上で実行した。攪拌した血液試料をリソスタフィンとともに37°Cで10分間インキュベートした。続く反応ステップで、核酸を磁気ビーズ上に固定した。外部磁場により種々の洗浄溶液（washing  and  rinsing  solutions）中の磁気ビーズを活性化することによって、固定された核酸は細胞破片およびその他の細胞タンパク質から自由になる。最終的な溶出ステップで、核酸は磁性粒子から分離され、次いで別個の容器で多重PCRマスターミックス（Mastermix）（Qiagen）と混合される。混合後、その溶液は、多重プライマー対および人間コントロールのプライマー対をもつストリップ容器に分配される。
【０３８７】
例３：多重PCR
多重PCRは、Qiagen  Multiplex  PCRキットを用い、市販のサーマルサイクラー、たとえばPerkin  Elmer  9700上で実行した。普遍的な多重サイクリング手順に続いて、最初の初期活性化ステップが95°Cで15分間実行された。94°Cでの30秒間の変性、61°Cでの90秒間のアニーリングおよび72°Cでの90秒間の延長を含む3ステップ・サイクリングが続いた。サイクル数は感度要件に応じて30から45の間であった。72°Cでの10分間にわたる最終的な延長が増幅を終了させた。
【０３８８】
例４：検出
増幅された核酸の検出は、DNA1000キット上で実行された。キットの一部であるチップは、2100バイオアナライザーを用いて読み出された。キットおよびアナライザーは、Agilent  Technologiesから購入したものである。
【０３８９】
メーカー推奨に従ってチップは調製され、基準をロードされ、核酸増幅され、次いで2100バイオアナライザーに挿入された。30分の解析実行時間ののち、パソコン上で走る独自ソフトウェアがバイオアナライザーからデータを読み出し、解析した。
【図面の簡単な説明】
【０３９０】
【図１−１】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−３】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−４】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−５】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−６】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−７】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−８】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−９】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１０】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１１】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１２】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１３】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１４】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１５】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１６】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１７】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１８】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１９】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２０】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２１】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２２】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２３】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２４】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２５】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２６】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２７】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２８】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−２９】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−３０】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−３１】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−３２】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−３３】微生物の23S  RNS配列の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−３】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−４】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−５】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−６】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−７】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−８】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−９】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１０】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１１】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１２】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１３】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１４】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１５】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１６】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１７】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１８】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−１９】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２０】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２１】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２２】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２３】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２４】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２５】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２６】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２７】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２８】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図２−２９】抗生物質耐性遺伝子の配列および整列を示す図の一部である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
2009505651.tif 000079
【図１−２５】
2009505651.tif 000080
【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図２−３０】
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【図２−３１】
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【図２−３２】
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【図２−３３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
2009505651.tif 000101
【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図２−１６】
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【図２−１７】
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【図２−１８】
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【図２−１９】
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【図２−２０】
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【図２−２１】
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【図２−２２】
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【図２−２３】
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【図２−２４】
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【図２−２５】
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【図２−２６】
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【図２−２７】
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【図２−２８】
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【図２−２９】
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【国際調査報告】
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