(57)【要約】  本発明は、第VII因子に対する新規の抗体、試料中の正しく折り畳まれたインタクトな第VII因子の量を決定するための使用、並びに精製のための使用及び方法の最適化のための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体。 
【請求項２】
前記エピトープが、配列番号：１のアミノ酸残基Ｐｈｅ４、Ｌｅｕ５、Ｇｌａ６、Ｇｌａ７、Ｌｅｕ８、Ｐｒｏ１０、Ｇｌｙ１１、Ｇｌａ１４、Ａｒｇ１５、Ｇｌａ１６、Ｃｙｓ１７、Ｇｌａ１９、Ｇｌａ２０、Ｃｙｓ２２、Ｇｌａ２５、Ｇｌａ２６、Ａｌａ２７、Ｇｌａ２９、Ｐｈｅ３１、Ｌｙｓ３２、Ｇｌａ３５の一又は複数を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 
【請求項３】
モノクローナル抗体が、 
(a) 配列番号：３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
(b) 配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
(c) 配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含んでなる抗体と競合する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体が、 
(a) 配列番号：３のアミノ酸配列の残基２４−３４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：３のアミノ酸配列の残基５０−５６に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：３のアミノ酸配列の残基８９−９５に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３可変領域、及び配列番号：５のアミノ酸配列の残基３３−３５に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：５のアミノ酸配列の残基５０−６４に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：５のアミノ酸配列の残基９９−１１２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３可変領域；
(b) 配列番号：７のアミノ酸配列の残基２４−３４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：７のアミノ酸配列の残基５０−５６に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：７のアミノ酸配列の残基８９−９５に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３可変領域、及び配列番号：９のアミノ酸配列の残基３３−３５に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：９のアミノ酸配列の残基５０−６４に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：９のアミノ酸配列の残基９９−１１２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３可変領域；又は
(c) 配列番号：１１のアミノ酸配列の残基２４−３４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：１１のアミノ酸配列の残基５０−５６に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：１１のアミノ酸配列の残基８９−９５に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３可変領域、及び配列番号：１３のアミノ酸配列の残基３３−３５に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：１３のアミノ酸配列の残基５０−６４に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：１３のアミノ酸配列の残基９９−１１２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３可変領域
を含んでなる、請求項１から３のいずれか一に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、
(a) 配列番号：３に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：５に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
(b) 配列番号：７に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：９に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
(c) 配列番号：１１に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：１３に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含んでなる、請求項１から４のいずれか一に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、
(a) 配列番号：３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
(b) 配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号：９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
(c) 配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含んでなる、請求項１から５のいずれか一に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である、請求項１から５のいずれか一に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体がＩｇＧ４抗体である、請求項１から５のいずれか一に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含んでなる細胞。
【請求項１２】
試料中のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸ドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定する方法であって、
(a) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下において請求項１から８のいずれか一に記載の一次モノクローナル抗体と試料を接触させ；
(b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該一次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ；
(c) 該一次モノクローナル抗体のエピトープと異なり、該第VII因子ポリペプチドに存在する第二のエピトープに特異的な検出可能な二次モノクローナル抗体と該一次抗体複合体を接触させ；
(d) 該一次抗体複合体を該検出可能な二次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ；そして、
(e) 二次抗体複合体に存在する二次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなる方法。
【請求項１３】
試料中のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸ドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定する方法であって、
(a) 請求項１から８のいずれか一に記載のモノクローナル抗体によって同定されるエピトープと異なる、第VII因子ポリペプチドに存在するエピトープに特異的な二次モノクローナル抗体と試料を接触させ；
(b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該二次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ；
(c) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下において請求項１から８のいずれか一に係る検出可能な一次モノクローナル抗体と該一次抗体複合体を接触させ；
(d) 該一次抗体複合体を該検出可能な一次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ；そして、
(e) 二次抗体複合体に存在する該一次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなる方法。
【請求項１４】
第二エピトープが前記第VII因子ポリペプチドのＥＧＦ-様ドメイン１又はＥＧＦ-様ドメイン２に存在する、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記二価の陽イオンが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｓｍ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｓｍ２＋及びＵｏ２＋からなる群から選択される、請求項１２から１４のいずれか一に記載の方法。
【請求項１６】
前記二価の陽イオンがＣａ２＋である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記二価の陽イオンが、０．０５ｍＭより多く、例として０．１ｍＭより多く、例として０．６ｍＭより多く、例として１ｍＭより多く、例として５ｍＭより多く存在する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記二価の陽イオンが、およそ０．０５ｍＭからおよそ５０ｍＭ、例としておよそ０．１ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ０．６ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ１ｍＭからおよそ２０ｍＭ、例としておよそ５ｍＭからおよそ１０ｍＭの範囲の量で存在する、請求項１５から１７のいずれか一に記載の方法。
【請求項１９】
前記の検出可能な抗体の検出が、ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴及び圧電気バイオセンサーから選択される方法によって実行される、請求項１２から１８のいずれか一に記載の方法。 
【請求項２０】
試料中の第VII因子ポリペプチドの総量に対するインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸ドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの比率を決定する方法であって、
(a) 請求項１２から１９のいずれか一に記載の方法を用いてインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸ドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定し；そして、
(b) 試料中に存在する第VII因子ポリペプチドの総量を決定する
工程を含んでなる方法。
【請求項２１】
産生の間に機能的な第VII因子ポリペプチドの収率を最適化するための、請求項１２から２０のいずれか一に記載の方法の使用。 
【請求項２２】
試料からのインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸ドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの精製方法であって、
(a) 請求項１から８のいずれか一に記載の抗体を免疫親和性精製カラムにカップリングさせ；
(b) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオン存在下において、該カラムに該試料をアプライし；そして、
(c) カラムからの二価の陽イオンの除去によって、インタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸ドメインを含んでなる該第VII因子ポリペプチドをカラムから溶出する
工程を含んでなる方法。
【請求項２３】
前記二価の陽イオンが、およそ０．０５ｍＭからおよそ５０ｍＭ、例としておよそ０．１ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ０．６ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ１ｍＭからおよそ２０ｍＭ、例としておよそ５ｍＭからおよそ１０ｍＭの範囲の量で存在するＣａ２＋である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、第VII因子に対する新規の抗体、試料中の正しく折り畳まれたインタクトな第VII因子の量を決定するための使用、並びに精製のための使用及び方法の最適化のための使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質の工業生産のために、便利で簡単なアッセイにおける試料中の第VII因子ポリペプチドの濃度を決定することができることが望ましい。このための１つの方法は、第VII因子ポリペプチドと結合し、その後コンジュゲートされた酵素の酵素反応によって定量化されうる特異的な抗体によるものである。この酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)は、試料中の特定のタンパク質の検出のために当分野で公知である。試料中の抗原の絶対的な量が決定されなければならず、抗原標準物質が有用である場合、より正確な抗原濃度の決定のために、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡが非常に有用である。
このアッセイを利用するために、ある抗体(「捕獲」抗体)が精製され、固相に結合される。次いで、抗原を加え、結合した抗体と複合体化させる。次いで、結合していない生成物を洗浄により除去し、標識した二次抗体(「検出」抗体)を抗原と結合させ、このようにして「サンドイッチ」を完了する。次いで、このアッセイは、比色基質の使用によって、基質に結合した標識二次抗体の量を計量することにより定量化される。この技術の主な利点は、抗原を使用前に精製する必要がないということ、またこれらのアッセイが非常に特異的であるということである。しかしながら、すべての抗体が用いられうるわけではない。モノクローナル抗体の組み合わせは、抗原上の異なるエピトープを認識することができることを意味する「マッチドペア(matched pairs)」で適格性を確認しなければならない。
【０００３】
サンドイッチＥＬＩＳＡの感度は、固相に結合する一次抗体の分子数；抗原の一次抗体の親和性；抗原の二次抗体の親和性；二次抗体の特異的な活性の４つの因子に依存している。
特に、抗原に対する抗体の親和性は、他の抗体との置換によって変更のみされうる。したがって、特定の第VII因子ポリペプチドに対して強力な親和性を有する抗体が望ましい。
多くのタンパク質は活性化されるために、翻訳後修飾を必要とする。これらの修飾には、プロペプチドの切断と、成熟ポリペプチドの適切な折畳みとが含まれる。
特定のファミリーのタンパク質は、特徴的なモジュラー編成によって認識され、それらの生合成のためにビタミンＫを必要とする。アミノ末端膜結合ドメインは、γ-カルボキシル化されたグルタミン酸(ＧＬＡ)残基を含有し、ビタミンＫ依存的な反応においてカルボキシラーゼによって翻訳後に修飾される。これらのタンパク質のγ-カルボキシル化は、それらの適当な折畳み、及びこれによる活性にも影響する。
【０００４】
このファミリーに属するタンパク質の産生の間、免疫親和性カラムを応用することによって非常に効率的な方法で培養物液体を精製することが望ましい場合がある。また、培養物中の活性な第VII因子ポリペプチドの収率を最適化するために、培養方法を良好にコントロールすることが望ましいであろう。この目的は、効率の良いモノクローナル抗体の同定と、及び培養物中の第VII因子ポリペプチドの総量に対する対象の活性なタンパク質(正しくプロセシングされた：構造的エピトープの形成を引き起こすγ-カルボキシル化)の割合を決定するための簡便で迅速なアッセイによって達成されうるであろう。このことにより、本方法をモニタリングし、培養中の最適なときに培養物を回収するなどの、最適な条件に調整してもよい。
【０００５】
（発明の概要）
現在、第VII因子のＧＬＡドメインに対するカルシウムのような二価の陽イオンの存在下において、高親和性を有する特定のモノクローナル抗体が同定されている。
これらの抗体は、第VII因子ポリペプチドの良好で絶対的な濃度測定のための方法に利用されてもよく、さらにこれらの高親和性抗体が第VII因子ポリペプチド上に露出する異なるエピトープを認識する抗体と組み合わされる場合に、試料中の第VII因子ポリペプチドの総量に対する正しくプロセシングされた第VII因子ポリペプチドの比率を決定することができる方法が開発されている。この方法は、産生の間の活性な第VII因子ポリペプチドの収率を最適化するために用いられてもよい。 
さらに、ＧＬＡドメインに対するカルシウムの存在下において、高親和性を有するこれらの新規な特異的抗体は、精製のための非常に効率的で簡便な方法に用いられてもよい。
したがって、広義の態様では、本発明は、野生型ヒト第VII因子に対する効率の良いモノクローナル抗体の同定に関する。
【０００６】
本発明の第一の態様は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体に関する。 
本発明の第二の態様は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体をコードする核酸分子に関する。
更なる態様では、本発明は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体をコードする核酸分子を含んでなるベクターに関する。
更なる態様では、本発明は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含んでなる細胞に関する。
【０００７】
更なる態様では、本発明は、試料中のインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定するための方法であって、
a) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ-カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープに結合する一次モノクローナル抗体と試料を接触させ、
b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該一次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ、
c) 該一次モノクローナル抗体のエピトープと異なり、該第VII因子ポリペプチドに存在する第二のエピトープに特異的な検出可能な二次モノクローナル抗体と該一次抗体複合体を接触させ、
d) 該一次抗体複合体を該検出可能な二次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ、そして、
e) 二次抗体複合体に存在する二次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなる方法に関する。
【０００８】
更なる態様では、本発明は、試料中のインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定するための方法であって、
a) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ-カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体に同定されるエピトープと異なり、該第VII因子ポリペプチドに存在するエピトープに特異的な二次モノクローナル抗体と試料を接触させ、
b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該二次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ、
c) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ-カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープに結合する検出可能な一次モノクローナル抗体と少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下の一次抗体複合体を接触させ、
d) 該一次抗体複合体を該検出可能な一次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ、そして、
e) 二次抗体複合体に存在する該一次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなる方法に関する。
【０００９】
更なる態様では、本発明は、試料中の第VII因子ポリペプチドの総量に対するインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの比率を決定するための方法であって、
a) 本発明に係る方法を用いてインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定し；そして、
b) 試料中に存在する第VII因子ポリペプチドの総量を決定する
工程を含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、産生の間に機能的な第VII因子ポリペプチドの収率を最適化するための本発明に係る方法の使用に関する。
【００１０】
更なる態様では、本発明は、試料からのインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの精製方法であって、
(a) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオン存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ-カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体を免疫親和性精製カラムにカップリングさせ、
(b) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオン存在下において、該カラムに該試料をアプライし、
(c) カラムからの二価の陽イオンの除去によって、インタクトなＧＬＡドメインを含んでなる該第VII因子ポリペプチドをカラムから溶出する
工程を含んでなる方法に関する。
【００１１】
（図面の説明）
本発明は、図面(一又は複数)により以下に詳細に説明される。
図１は、天然のヒトの第VII凝固因子の完全なアミノ酸配列(配列番号：１)を示す。
図２は、本発明に係る例示的な抗体の成熟した可変軽鎖(ＶＬ)領域及び可変重鎖(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
図３は、記載したＥＬＩＳＡアッセイの代表的な標準曲線を示す。
図４は、記載したＥＬＩＳＡアッセイの代表的なｌｎ／ｌｎ標準曲線を示す。
図５は、異なる培養についての時間(日数)に応じたＣＤＩを示す。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、広義の態様では、第VII因子のＧＬＡドメインに対する、新規な特異的抗体の同定に関する。
これらの特異的なモノクローナル抗体は、カルシウムなどの二価の陽イオンの存在下において、第VII因子のＧＬＡドメインに対して高い親和性を有する。
この抗体は、インタクトなＧＬＡドメインを有する第VII因子ポリペプチドの良好で絶対的な濃度測定のための方法に利用されてもよく、さらにこれらの高親和性抗体が第VII因子ポリペプチド上に露出する異なるエピトープを認識する抗体と組み合わされる場合に、試料中の第VII因子ポリペプチドの総量に対する正しくプロセシングされた第VII因子ポリペプチドの比率を決定することができる方法が開発されている。この方法は、産生の間の活性な第VII因子ポリペプチドの収率を最適化するために用いられてもよい。 
さらに、ＧＬＡドメインに対するカルシウムなどの二価の陽イオンの存在下において、高親和性を有するこれらの新規な特異的抗体は、精製のための非常に効率的で簡便な方法に用いられてもよい。
【００１３】
本発明の一態様では、本発明に係る抗体は、インタクトなＧＬＡドメインを有する第VII因子ポリペプチドの量の測定に用いられる。これは一般的に、一次抗体である捕獲抗体が固体支持体に付着された後に、所定の適切な条件下で第VII因子ポリペプチドに抗体を結合させるアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイにより達成される。洗浄工程の後に第VII因子ポリペプチドを固体支持体上に維持させるであろう。結合していない生成物は洗浄によって除去し、標識した二次抗体(「検出」抗体)を第VII因子ポリペプチドに結合させ、こうして「サンドイッチ」を完了する。次いで、抗原の量は、基質に結合した標識二次抗体の量を測定することによって定量化される。酵素に結合される検出用抗体の場合には、比色アッセイが行われ、色の変化が測定される。既知濃度の第VII因子ポリペプチドの適切な標準物質から、試料中に存在する第VII因子ポリペプチドの絶対的な量が決定されうる。
本発明の一実施態様では、検出用抗体が酵素結合性である場合、本発明の方法はサンドイッチＥＬＩＳＡ法に関する。
【００１４】
本発明において「捕捉抗体」なる用語は、バッファで希釈されたサンドイッチＥＬＩＳＡの一次抗体を意味し、インキュベートの際に固相に受動的に付着されるものである。また、例えばストレプトアビジンコートの固相に加えられるビオチン化された抗体を用いることによって、有効な付着が用いられうる。
本発明において「検出用抗体」なる用語は、バッファで希釈され、抗原の後に加えられるサンドイッチＥＬＩＳＡの二次抗体を意味する。二次抗体は、直接ＥＬＩＳＡ又は標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡに記載の抗種コンジュゲートにおいて、活用してもよい。抗種コンジュゲートは、二次抗体が調製された血清の種と結合する。
【００１５】
ヒト血漿第VII因子には、アミノ末端(Ｎ末端)γ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメイン(アミノ酸１−３８)、２つの上皮細胞増殖因子(ＥＦＧ)-様ドメイン、及びセリンプロテアーゼドメインの４つの別々のドメインが含まれる。活性な２鎖の酵素は、Ａｒｇ１５２の後で特異的に切断されて生成される(Hagen等, Proc Natl Acad Sci USA, 1986; 83:2412-2416)。
Ｎ末端ＧＬＡドメインはリン脂質表面と結合する；Ｃ末端セリンプロテアーゼドメインは酵素活性を与える；２つのＥＧＦ-様ドメインはそれらの間のスペーサーである；４つすべてのドメインは組織因子(ＴＦ)との相互作用に関与する。
カルシウムイオンは第VII因子の３つのドメインと結合する(Banner等, Nature 1996; 380:41-46)。カルシウムイオンがなければ第VII因子は実質的に生物活性を持たない。７つのカルシウム部位はＧＬＡドメインに位置し、それらは第VII因子が細胞膜に結合するため(Person and Petersen, Eur J Biochem 1995; 234:293-300)、更にＴＦとの適切な相互作用のために必要である。
【００１６】
感度、及び、それによる培養試料中のインタクトなＧＬＡドメインの有無にかかわらない第VII因子分子の絶対的な内容物及び濃度の良好な測定は、とりわけ、それらの標的抗原に対して高い親和性を有する良好な抗体に依存する。具体的な実施態様では、インタクトなＧＬＡドメインを有する第VII因子分子の量を決定するのに用いられる本発明の抗体は、Ｃａ２＋などの二価の陽イオンの存在下において、ポリペプチドに対して非常に高い親和性を有する抗体として選択される。
また、ＧＬＡドメインより第VII因子ポリペプチド上の異なるエピトープに対する高親和性抗体が、これらの方法で用いられてもよい。
好ましくは、インタクトなＧＬＡドメインの有無にかかわらずすべての第VII因子分子の絶対的な内容物及び濃度の良好な測定に用いられる抗体は、抗原が適切に折り畳まれるか活性化されるかにかかわらず、抗原に常に存在するエピトープを認識するであろう。第VIIa因子では、ＥＧＦ-様ドメイン内に見られるエピトープが特にこの目的に適している。
【００１７】
本明細書中で用いられる「第VII因子ポリペプチド」又は「ＦVIIポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第VIIa因子(すなわち米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸配列１−４０６を含んでなる任意のタンパク質、その変異体、並びに第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートを意味する。これには、野生型ヒト第VIIa因子と相対的に同じか改善された生物学的活性を実質的に示す第VII因子コンジュゲート、第VII因子誘導体及び第VII因子変異体が含まれる。第VII因子のこのような変異体は、安定性、リン脂質結合、変更された特定の活性などを含め、ヒトの第VII因子と比べて異なる性質を表してもよい。
「第VII因子」又は「ＦVII」なる用語は、それらの非切断(チモーゲン)型の第VII因子ポリペプチドを意味する。一般的に、第VII因子は、残基１５２と１５３の間で切断されて第VIIa因子となる。「野生型ヒト第VII因子」は、その機能的生理活性型の野生型ヒト第VIIa因子の非切断の酵素前駆体型である。
【００１８】
「第VIIa因子」又は「ＦVIIa」なる用語は、、それぞれ機能的な生理活性型となるようにタンパク質加水分解されている第VII因子ポリペプチドを意味する。
本明細書中で用いられる「野生型ヒト第VIIa因子」は、その機能的な生理活性型で米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
本明細書中で用いられる「第VII因子誘導体」なる用語は、野生型第VII因子に対して相対的に同じか又は改善された生物学的活性を実質的に示すＦVIIポリペプチドを表すことを意図し、このＦVIIポリペプチドにおいて、親ペプチドの一又は複数のアミノ酸が、例えばアルキル化、グリコシル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって遺伝的に及び／又は化学的に及び／又は酵素的に修飾されている。これには、ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子、システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子及びその変異体を含むが、これらに限定されるものではない。第VII因子誘導体の非限定的な例には、国際公開第０３／３１４６４号及び米国公開特許第２００４００４３４４６号、同第２００４００６３９１１号、同第２００４０１４２８５６号、同第２００４０１３７５５７号及び同第２００４０１３２６４０号(Neose Technologies, Inc.)に開示されるグリコＰＥＧ化ＦVII誘導体；国際公開第０１／０４２８７号、米国公開特許第２００３０１６５９９６号、国際公開第０１／５８９３５号、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)及び国際公開第０２／０２７６４号、米国公開特許第２００３０２１１０９４号(University of Minnesota)に開示されるＦVIIコンジュゲートが含まれる。
【００１９】
「改善された生物学的活性」なる用語は、i) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を有するＦVIIポリペプチド、又はii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したＴＦ結合活性を有するＦVIIポリペプチド、又はiii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加した血漿中の半減期を有するＦVIIポリペプチドを指す。「ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子ポリペプチドにコンジュゲートされたＰＥＧ分子を有するヒト第VIIa因子を意味する。ＰＥＧ分子が第VIIa因子ポリペプチドのいずれかのアミノ酸残基又は糖鎖を含む第VIIa因子ポリペプチドのいずれかの部分に付着しうることは理解される。「システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子に導入されるシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートされるＰＥＧ分子を有する第VIIa因子を意味する。
【００２０】
組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を有する第VII因子変異体の非限定的な例には、Ｓ５２Ａ-ＦVIIa、Ｓ６０Ａ-ＦVIIa( Lino等, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第５５８０５６０号に開示される、増加したタンパク質分解性安定性を表すＦVIIa変異体；残基２９０と２９１又は残基３１５と３１６の間でタンパク質分解的に切断されている第VIIa因子(Mollerup等, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第VIIa因子の酸化型(Kornfelt等, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９(国際公開第０２／０７７２１８号に対応する)に開示されるＦVII変異体；及び、国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示される、増加したタンパク質分解性安定性を表すＦVII変異体；国際公開第９９／２０７６７号、米国特許第６０１７８８２号及び同第６７４７００３号、米国公開特許第２００３０１００５０６号(University of Minnesota)及び国際公開第００／６６７５３号、米国公開特許第２００１００１８４１４号、同第２００４２２０１０６号、及び同第２００１３１００５号、米国特許第６７６２２８６号及び同第６６９３０７５号(University of Minnesota)に開示される、変性Ｇｌａ-ドメインを有し、亢進した膜結合を示すＦVII変異体；及び、国際公開第０１／５８９３５号、米国特許第６８０６０６３号、米国公開特許第２００３００９６３３８号(Maxygen ApS)、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０２９０９１号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０８３３６１号(Maxygen ApS)及び国際公開第０４／１１１２４２号(Maxygen ApS)、並びに国際公開第０４／１０８７６３号(Canadian Blood Services)に開示される、ＦVII変異体が含まれる。
【００２１】
野生型ＦVIIaと比較して増加した生物学的活性を有するＦVII変異体の非限定的な例には、国際公開第０１／８３７２５号、国際公開第０２／２２７７６号、国際公開第０２／０７７２１８号、ＰＣＴ／ＤＫ０２／００６３５(国際公開第０３／０２７１４７号に対応)、デンマーク特許出願第ＰＡ２００２０１４２３号(国際公開第０４／０２９０９０号、デンマーク特許第ＰＡ２００１０１６２７号(国際公開第０３／０２７１４７号；国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示されるＦVII変異体；及び、特願２００１０６１４７９(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示される、亢進された活性を有するＦVIIa変異体が含まれる。第VII因子の変異体の例には、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、及びS336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-第VII因子、S60A-第VII因子；R152E-第VII因子、S344A-第VII因子、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；及び、２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII；３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII；及び、１５３Ｉｌｅから２２３Ａｒｇまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVIIが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００２２】
インタクトなＧＬＡドメインを有する第VII因子分子の濃度の測定のために使用する抗体は、ＧＬＡドメインのエピトープを認識する。ＧＬＡドメインのある好適なエピトープは、配列番号：１のアミノ酸残基Ｐｈｅ４、Ｌｅｕ５、Ｇｌａ６、Ｇｌａ７、Ｌｅｕ８、Ｐｒｏ１０、Ｇｌｙ１１、Ｇｌａ１４、Ａｒｇ１５、Ｇｌａ１６、Ｃｙｓ１７、Ｇｌａ１９、Ｇｌａ２０、Ｃｙｓ２２、Ｇｌａ２５、Ｇｌａ２６、Ａｌａ２７、Ｇｌａ２９、Ｐｈｅ３１、Ｌｙｓ３２、Ｇｌａ３５の一又は複数を含むエピトープである。
本明細書中で用いる「インタクトなＧＬＡドメイン」なる句は、ＧＬＡドメインがヒト第VII因子のｃｙｓ１７とｃｙｓ２２との間のジスルフィド結合に対応するジスルフィド結合を有することを意味することを意図する。
本明細書中で用いる「インタクトなＧＬＡドメインを含む第VII因子ポリペプチド」なる句は、インタクトなＧＬＡドメインが第VII因子分子の残りの部分に共有結合により付着している第VII因子ポリペプチドを意味することを意図する。
【００２３】
本発明の関係において、抗体が決定基を「結合する」なる用語は、抗体が特異性及び／又は親和性を有して決定基を結合することを表す。
「特異的な結合」又は「特異性」とは、他のタンパク質ないしは構造と相対的に僅かな検出可能な反応性を有しながらも、ＦVIIポリペプチドなどの抗原に提示されるエピトープを検出可能に結合する抗体ないし他の薬剤の能力を指す。本明細書中の他で記述されるように、特異性は例えばＢｉａｃｏｒｅ機具を用いた結合アッセイ又は競合的結合アッセイにより相対的に測定されうる。特異性は、特定の抗原への結合と他の無関係な分子への非特異的な結合における親和性／結合活性が例えばおよそ１０：１、およそ２０：１、およそ５０：１、およそ１００：１、およそ１００００：１又はそれ以上の比であるとして表されうる(この場合特異的な抗原はＦVIIポリペプチドである)。
【００２４】
「エピトープ」は、抗原結合性ペプチド(例えば抗体)が特異的に結合する抗原上の部位又は領域である。タンパク質のエピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基(エピトープの免疫優勢成分とも称する)、及び該結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば特異的な抗原結合性ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基(すなわち、該アミノ酸残基は特異的抗原結合性ペプチドの「フットプリント」 内にある)を含みうる。本明細書中のエピトープなる用語は、抗ＦVII抗体に特異的に結合するＦVIIポリペプチドのいずれかの特定の領域にある複数の種類のアミノ酸を含有する。ＦVIIポリペプチドは、限定するものではないが(１)直線状の抗原決定基、(２)成熟したＦVIIポリペプチド高次構造内で互いに近くに配位する一又は複数の近接していないアミノ酸からなる高次構造的な抗原決定基；及び(３)炭水化物基などの、ＦVIIポリペプチドに共有結合により付着される分子構造の全体ないしは一部からなる翻訳後抗原決定基を含みうる多くの異なるエピトープを含みうる。
【００２５】
一次抗体が二次抗体と「実質的に」又は「少なくとも部分的に」同じエピトープを結合するなる句は、一次抗体に対するエピトープ結合部位が、二次抗体のエピトープ結合部位を構成する抗原上のアミノ酸残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上を含むことを意味する。また、一次抗体が二次抗体と実質的に又は部分的に同じエピトープを結合することは、上記のように、一次抗体と二次抗体が抗原への結合において競合することを意味する。ゆえに、モノクローナル抗体ＦVII-３Ｆ３Ａ４と「実質的に同じエピトープ又は決定基に結合する」なる用語は、抗体がＦVII-３Ｆ３Ａ４と「競合する」ことを意味する。通常、対象のモノクローナル抗体(例えばＦVII-３Ｆ３Ａ４、ＦVII-３Ｆ２０Ａ１、ＦVII-３Ｆ１１Ａ３)「と実質的に同じエピトープ又は決定基に結合する」抗体は、抗体が一又は複数のＦVIIポリペプチドへの結合について対象の抗体と「競合する」ことを意味する。
【００２６】
「直線状ペプチド抗原決定基」なる用語は、アミノ酸の直鎖配列上で近接しているアミノ酸残基からなるエピトープとして定義される(一次構造)。
「高次構造的な抗原決定基」なる用語は、全く近接しておらず、それゆえに分子の折り畳み(フォールディング)により互いに近接したアミノ酸の直鎖配列の離れた部分を表すアミノ酸残基からなるエピトープとして定義される(二次、三次及び／又は四次構造)。高次構造的エピトープは三次元構造に依存する。したがって、「高次構造」なる用語は「構造的な」なる用語と互換性を持って用いられることが多い。
【００２７】
一実施態様では、本発明は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体であって、該エピトープが、配列番号：１のアミノ酸残基Ｐｈｅ４、Ｌｅｕ５、Ｇｌａ６、Ｇｌａ７、Ｌｅｕ８、Ｐｒｏ１０、Ｇｌｙ１１、Ｇｌａ１４、Ａｒｇ１５、Ｇｌａ１６、Ｃｙｓ１７、Ｇｌａ１９、Ｇｌａ２０、Ｃｙｓ２２、Ｇｌａ２５、Ｇｌａ２６、Ａｌａ２７、Ｇｌａ２９、Ｐｈｅ３１、Ｌｙｓ３２、Ｇｌａ３５の一又は複数を含むモノクローナル抗体に関する。
【００２８】
一実施態様では、本発明は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、  
(a) 配列番号：３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
(b) 配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
(c) 配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含んでなる抗体と競合する、モノクローナル抗体に関する。
【００２９】
一実施態様では、本発明は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体であって、  
(a) 配列番号：３のアミノ酸配列の残基２４−３４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：３のアミノ酸配列の残基５０−５６に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：３のアミノ酸配列の残基８９−９５に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３可変領域、及び配列番号：５のアミノ酸配列の残基３３−３５に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：５のアミノ酸配列の残基５０−６４に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：５のアミノ酸配列の残基９９−１１２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３可変領域；
(b) 配列番号：７のアミノ酸配列の残基２４−３４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：７のアミノ酸配列の残基５０−５６に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：７のアミノ酸配列の残基８９−９５に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３可変領域、及び配列番号：９のアミノ酸配列の残基３３−３５に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：９のアミノ酸配列の残基５０−６４に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：９のアミノ酸配列の残基９９−１１２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３可変領域；又は
(c) 配列番号：１１のアミノ酸配列の残基２４−３４に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：１１のアミノ酸配列の残基５０−５６に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：１１のアミノ酸配列の残基８９−９５に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３可変領域、及び配列番号：１３のアミノ酸配列の残基３３−３５に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１可変領域、配列番号：１３のアミノ酸配列の残基５０−６４に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２可変領域、配列番号：１３のアミノ酸配列の残基９９−１１２に対応するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３可変領域
を含んでなるモノクローナル抗体に関する。
【００３０】
一実施態様では、本発明は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体であって、
(a) 配列番号：３に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：５に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
(b) 配列番号：７に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：９に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
(c) 配列番号：１１に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号：１３に少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含んでなるモノクローナル抗体に関する。
【００３１】
一実施態様では、本発明は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体であって、
(a) 配列番号：３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
(b) 配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号：９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
(c) 配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含んでなるモノクローナル抗体に関する。
【００３２】
一実施態様では、本発明は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体であって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体であるモノクローナル抗体に関する。
一実施態様では、本発明は、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体であって、ＩｇＧ４抗体であるモノクローナル抗体に関する。
【００３３】
一実施態様では、本発明は、試料中のインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定するための方法であって、
a) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合する一次モノクローナル抗体に、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下で試料を接触させ、
b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該一次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ、
c) 第二のエピトープが該一次モノクローナル抗体のエピトープと異なり、該第VII因子ポリペプチドに存在する第二のエピトープに対して特異的な検出可能な二次モノクローナル抗体と該一次抗体複合体を接触させ、
d) 該一次抗体複合体を該検出可能な二次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ、そして、
e) 二次抗体複合体に存在する二次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなり、このとき第二のエピトープが第VII因子ポリペプチドのＥＧＦ-様ドメイン１又はＥＧＦ-様ドメイン２上に存在するものである方法に関する。
【００３４】
一実施態様では、本発明は、試料中のインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定する方法であって、
a) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合する一次モノクローナル抗体に、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下で試料を接触させ、
b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該一次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ、
c) 第二のエピトープが該一次モノクローナル抗体のエピトープと異なり、該第VII因子ポリペプチドに存在する第二のエピトープに対して特異的な検出可能な二次モノクローナル抗体と該一次抗体複合体を接触させ、
d) 該一次抗体複合体を該検出可能な二次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ、そして、
e) 二次抗体複合体に存在する二次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなり、このとき該二価の陽イオンが、およそ０．０５ｍＭからおよそ５０ｍＭ、例としておよそ０．１ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ１ｍＭからおよそ２０ｍＭ、例としておよそ５ｍＭからおよそ１０ｍＭの範囲の量で存在するＣａ２＋である方法に関する。
【００３５】
一実施態様では、本発明は、試料中のインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定する方法であって、
a) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合する一次モノクローナル抗体に、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下で試料を接触させ、
b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該一次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ、
c) 第二のエピトープが該一次モノクローナル抗体のエピトープと異なり、該第VII因子ポリペプチドに存在する第二のエピトープに対して特異的な検出可能な二次モノクローナル抗体と該一次抗体複合体を接触させ、
d) 該一次抗体複合体を該検出可能な二次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ、そして、
e) 二次抗体複合体に存在する二次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなり、このとき、検出可能な抗体の検出が、ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴及び圧電気バイオセンサーから選択される方法によって実行されるものである方法に関する。
【００３６】
一実施態様では、本発明は、試料中のインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定する方法であって、
a) エピトープが少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体によって同定されるエピトープと異なり、第VII因子ポリペプチドに存在するエピトープに対して特異的な二次モノクローナル抗体と試料を接触させ、
b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該二次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ、
c) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合する検出可能な一次モノクローナル抗体と、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下で一次抗体複合体を接触させ、
d) 該一次抗体複合体を該検出可能な一次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ、そして、
e) 二次抗体複合体に存在する一次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなり、このとき第二のエピトープが第VII因子ポリペプチドのＥＧＦ-様ドメイン１又はＥＧＦ-様ドメイン２上に存在するものである方法に関する。
【００３７】
一実施態様では、本発明は、試料中のインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定する方法であって、
a) エピトープが少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体によって同定されるエピトープと異なり、第VII因子ポリペプチドに存在するエピトープに対して特異的な二次モノクローナル抗体と試料を接触させ、
b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該二次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ、
c) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合する検出可能な一次モノクローナル抗体と、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下で一次抗体複合体を接触させ、
d) 該一次抗体複合体を該検出可能な一次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ、そして、
e) 二次抗体複合体に存在する一次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなり、このとき該二価の陽イオンが、およそ０．０５ｍＭからおよそ５０ｍＭ、例としておよそ０．１ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ１ｍＭからおよそ２０ｍＭ、例としておよそ５ｍＭからおよそ１０ｍＭの範囲の量で存在するＣａ２＋である方法に関する。
【００３８】
一実施態様では、本発明は、試料中のインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの量を決定する方法であって、
a) エピトープが少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体によって同定されるエピトープと異なり、第VII因子ポリペプチドに存在するエピトープに対して特異的な二次モノクローナル抗体と試料を接触させ、
b) 試料中に存在するいずれかの第VII因子ポリペプチドを該二次モノクローナル抗体に結合させて、一次抗体複合体を形成させ、
c) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合する検出可能な一次モノクローナル抗体と、少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下で一次抗体複合体を接触させ、
d) 該一次抗体複合体を該検出可能な一次モノクローナル抗体に結合させ、二次抗体複合体を形成させ、そして、
e) 二次抗体複合体に存在する一次モノクローナル抗体の量を検出することによって、該二次抗体複合体の量を検出する
工程を含んでなり、このとき検出可能な抗体の検出が、ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴及び圧電気バイオセンサーから選択される方法によって実行されるものである方法に関する。
【００３９】
一実施態様では、本発明は、試料からのインタクトなＧＬＡドメインを含んでなる第VII因子ポリペプチドの精製方法であって、
(a) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオンの存在下においてのみ、野生型ヒト第VII因子のインタクトなγ‐カルボキシグルタミン酸(ＧＬＡ)ドメインに存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体を免疫親和性精製カラムにカップリングさせ、
(b) 少なくとも０．０５ｍＭの二価の陽イオン存在下において、該カラムに該試料をアプライし、
(c) カラムからの二価の陽イオンの除去によって、インタクトなＧＬＡドメインを含んでなる該第VII因子ポリペプチドをカラムから溶出する、
工程を含んでなり、このとき該二価の陽イオンが、およそ０．０５ｍＭからおよそ５０ｍＭ、例としておよそ０．１ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ１ｍＭからおよそ２０ｍＭ、例としておよそ５ｍＭからおよそ１０ｍＭの範囲で存在するＣａ２＋である方法に関する。
【００４０】
本明細書中で用いる「ＥＧＦ-様ドメイン１」なる用語は、配列番号：１のアミノ酸配列４６−８２を意味する。本明細書中で用いる「ＥＧＦ-様ドメイン２」なる用語は、配列番号：１のアミノ酸配列８７−１２８を意味する。
第VII因子の適切な折畳み(フォールディング)及び活性はカルシウムの存在に依存しており、現在、第VII因子上の特定のエピトープがカルシウムイオンなどの二価の陽イオンの存在下で露出されているだけであることが明らかとなっている。金属イオンの存在は、本発明に係る抗体によって認識されるＧＬＡドメインのエピトープの形成及び露出に必須である。一実施態様では、二価の陽イオンは金属イオンである。一実施態様では、二価の陽イオンは、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｓｍ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｓｍ２＋及びＵｏ２＋からなる群から選択される。一実施態様では、二価の陽イオンはカルシウムである。一実施態様では、二価の陽イオンはＺｎ２＋である。一実施態様では、二価の陽イオンはＭｇ２＋である。
【００４１】
二価の陽イオンの正確な量は当業者により容易に測定されうるが、通常、陽イオン濃度は少なくとも０．０５ｍＭ、例として少なくとも０．１ｍＭ、例として少なくとも１ｍＭでなければならない。 
具体的な実施態様では、二価の陽イオンは、０．０５ｍＭより多い、例として０．１ｍＭより多い、例として０．６ｍＭより多い、例として１ｍＭより多い、例として５ｍＭより多い量で存在する。
具体的な実施態様では、二価の陽イオンは、およそ０．０５ｍＭからおよそ５０ｍＭ、例としておよそ０．１ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ０．６ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ１ｍＭからおよそ２０ｍＭ、例としておよそ５ｍＭからおよそ１０ｍＭの範囲の量で存在する。
具体的な実施態様では、Ｃａ２＋は、およそ０．０５ｍＭからおよそ５０ｍＭ、例としておよそ０．１ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ０．６ｍＭからおよそ３０ｍＭ、例としておよそ１ｍＭからおよそ２０ｍＭ、例としておよそ５ｍＭからおよそ１０ｍＭの範囲の量で存在する。
【００４２】
抗体
本発明は、適切な折畳みに関係のないドメイン内に存在するエピトープに対して高い親和性を有して抗原を結合する新規の抗体及びその断片ないしはその誘導体、及び正しくプロセシングされた抗原／ポリペプチド内の抗原に露出されたエピトープに結合する抗体を提供する。この後者の抗体は、カルシウムの存在下において露出されたエピトープを認識する。
本明細書中で用いられる「抗体」なる用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を指す。重鎖中の定常ドメインの種類に応じて、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの１つに割り当てられる。これらのうちのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのように、サブクラス又はアイソタイプにさらに分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」 、「γ」及び「μ」と称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。ＩｇＧ及び／又はＩｇＭは、生理的な状況において最も一般的な抗体であり、且つ実験室条件下で最も簡単に作製されるので、本発明で使用される抗体の好ましいクラスである。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。
【００４３】
本発明の抗体は当分野で公知の様々な技術によって生産されうる。典型的に、ＦVIIポリペプチドを含んでなる免疫原による非ヒト動物、好ましくはマウスの免疫化により産生される。
あるいは、特異的な抗体は組み換えタンパク質として発現されてもよい。本発明の特異的な抗体は適切な抗体の例を意味し、可変領域の特定の配列、特に相補性決定領域(ＣＤＲ)として知られている高頻度可変領域から生成されうる。実施例においても例示されるように、当業者は、ＣＤＲ-領域の配列から完全なモノクローナル抗体を組み換えて発現させることができるであろう。
第VII因子ポリペプチドは、完全長配列、又はその断片ないしはその誘導体、典型的には免疫原性断片、すなわち露出したエピトープを含む第VII因子ポリペプチドの一部を含んでなりうる。
【００４４】
ヒト以外の哺乳動物を抗原で免疫化する工程は、マウスでの抗体の産生を刺激するために、当分野で周知の任意の様式で実施することができうる(例としてE. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照)。次いで、必要に応じて、完全フロイントアジュバントなどのアジュバントとともに、バッファ中に免疫原を懸濁、又は溶解する。免疫原の量、バッファの種類及びアジュバントの量を決定する方法は当業者に周知であり、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。これらのパラメーターは、免疫原ごとに異なる場合がありうるが、容易に解明される。
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫化の位置及び頻度も、当分野において周知である。典型的な免疫化プロトコールでは、１日目に、ヒト以外の動物に抗原を腹腔内注射し、約１週後に再度抗原を腹腔内注射する。この後、必要に応じて、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントとともに、２０日目前後に、抗原のリコール注射(recall injections)を行う。リコール注射は、静脈内に行われ、連続する数日間繰り返してもよい。その後、典型的にはアジュバントなしに、静脈内又は腹腔内の何れかで、４０日目に追加免疫注射を行う。このプロトコールによって、約４０日後に、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞が産生される。免疫化に使用される抗原に対して誘導される抗体を発現するＢ細胞の産生をもたらす限り、他のプロトコールも使用することができる。
【００４５】
ポリクローナル抗体の調製の場合、免疫されたヒト以外の動物から血清を得て、その中に存在する抗体を周知の技術によって単離する。ＦVIIポリペプチド、特に第VIIa因子と反応する抗体を得るために、固形支持体に連結された上記免疫原の何れかを用いて、血清を親和性精製してもよい。
別の実施形態では、免疫化されていないヒト以外の哺乳動物からリンパ球を単離し、インビトロで増殖し、次いで、細胞培養において免疫原に曝露する。次いで、リンパ球を採集し、以下に記載する融合工程を実施する。
【００４６】
モノクローナル抗体の場合、次の工程は、免疫されたヒト以外の哺乳動物から脾細胞を単離した後、これらの脾細胞を不死化された細胞と融合して、抗体を産生するハイブリドーマを形成させる。ヒト以外の哺乳動物からの脾細胞の単離は当分野において周知であり、典型的には、麻酔されたヒト以外の哺乳動物から脾臓を取り出し、脾臓を小片に切断し、脾臓カプセル(splenic capsule)から細胞濾過器のナイロンメッシュを通して、脾細胞を適切なバッファ中に絞り取り、単一細胞の懸濁液を得る。細胞を洗浄し、遠心し、全ての赤血球を溶解するバッファ中に再懸濁する。この溶液を再び遠心し、最後に、ペレット中に残存するリンパ球を新鮮なバッファ中に再懸濁する。
【００４７】
一旦単離され、単一の細胞懸濁液中に存在した時点で、リンパ球は不死化細胞株に融合される。これは、典型的には、マウスのミエローマ細胞株であるが、ハイブリドーマの作製に有用な他の多くの不死化細胞株も、当分野において公知である。好適なマウスのミエローマ株には、ＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.Aから入手可能)、又はＸ６３  Ａｇ８６５３及びＳＰ-２細胞株(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.Aから入手可能)から由来するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。融合はポリエチレングリコールなどを用いて行われる。次いで、得られたハイブリドーマを、融合されていない親ミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含有する選択培地中で増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠如していれば、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を抑制する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むであろう(ＨＡＴ培地)。ハイブリドーマは、典型的には、マクロファージの支持細胞(フィーダー層)上で増殖される。マクロファージは、脾細胞を単離するために使用されるヒト以外の哺乳動物の同腹仔から得ることが好ましく、典型的には、ハイブリドーマを播種する数日前に、不完全フロイントアジュバントなどで刺激される。融合法は、Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986)に記述される。
【００４８】
細胞は、コロニー形成と抗体産生に十分な時間、選択培地中で増殖させる。これは通常７日から１４日の間である。次いで、ＦVIIポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生について、このハイブリドーマコロニーをアッセイする。このアッセイは典型的な比色定量的なＥＬＩＳＡタイプのアッセイであるが、ハイブリドーマが増殖しているウェルに適する任意のアッセイが実行されてもよい。他のアッセイには、免疫沈降法及びラジオイムノアッセイが含まれる。一又は複数の異なるコロニーが存在するかどうかを決定するために、所望の抗体産生について陽性であるウェルを調べる。１より多いコロニーが存在すれば、細胞を再度クローニングし、増殖させて、単一の細胞のみが、所望の抗体を産生するコロニーを生じるようにする。確実にモノクローナル抗体が唯一つ検出され、産生されるように、典型的には、単一の明白なコロニーを有する陽性細胞を再クローニングし、再アッセイする。
例えばWard等(Nature 341 (1989) 544)に開示されるように、抗体は、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選別によって生産されてもよい。
【００４９】
組み換え産生
また、抗体は、標準的な技術を用いて、酵母などの単一の細胞生物内での；又は、細菌細胞培養物(例として大腸菌)内での；又は、真核細胞培養物内での(例として哺乳動物細胞の培養物内での)組み換え発現によって調製されうる。
ゆえに、別の実施態様では、抗第VII因子抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを本発明のハイブリドーマから単離して、適当な宿主への形質移入のために適切な発現ベクター内に配置する。次いで、抗体ないしはその変異体、例えばヒト化された様式のモノクローナル抗体、抗体の活性断片、又は抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体などを組み換え産生するために、宿主を使用する。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を用いて(例えば、マウス又はヒトの抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)配列決定される。一旦単離されると、ＤＮＡは、免疫グロブリンタンパク質を他の方法で産生しない大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入される発現ベクター内に配置され、組み換え宿主細胞内でモノクローナル抗体を合成する。抗体のＤＮＡコード化断片の細菌内での組み換え発現は、当分野で公知である(例としてSkerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993)；及びPluckthun, Immunol. Revs. 130, pp. 151 (1992)を参照)。
【００５１】
加えて、公知の可変重鎖(ＶＨ)及び可変軽鎖(ＶＬ)鎖及びヒトの定常領域からの抗体の組み換え産生は、例として、ＣＨＯ細胞内でのヒトモノクローナル抗-ＨＩＶ-１抗体の発現を報告するRuker等(Annals of the New York Academy of Sciences. 1991;646:212-219)；トランス補完(trans-complementing)発現ベクターを用いた完全長抗体の高レベル発現を記載するBianchi等 (Biotechnology and Bioengineering. 2003;84:439-444)、ジヒドロ葉酸還元酵素媒介遺伝子の増幅の間のＣＨＯ細胞のヒト化抗体発現に生じるクローン変異の重要な決定因子を記載するNo Soo Kim等 (Biotechnol. Prog. 2001;17:69-75)；マウス-ヒトキメラ抗体及びキメラＦａｂ'断片の発現、精製及び特徴を記載するKing等 (Biochemical Journal. 1992;281:317-323)；ヒト重鎖及びヒト軽鎖の可変領域(ともにＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４配列を含む)を含む単離されたヒトモノクローナル抗体を記述する国際公開第２００３０６４６０６号；及び、ヒトＣＤ４０に特異的に結合して活性化するキメラ又はヒトのモノクローナル抗体及び抗原結合性部位を記述する国際公開第２００３０４０１７０に記載されている。
【００５２】
ヒトＩｇＧの定常領域をコードするｃＤＮＡ配列全体は、以下のＧｅｎＢａｎｋに見つけることができ、その各々はその全体が出典明記によって援用されるものであり、２００５年１月６日に受託されている： 
ヒトＩｇＧ１定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託＃：Ｊ００２２８
ヒトＩｇＧ２定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託＃：Ｊ００２３０
ヒトＩｇＧ３定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託＃：Ｘ０４６４６
ヒトＩｇＧ４定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託＃：Ｋ０１３１６
ヒトκ軽鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託＃：Ｊ００２４１。
【００５３】
上記のように、本発明に係る特定の方法への使用に適切な抗体は「一致した組み合わせ」で用いられなければならない。この「一致した組み合わせ」とは２つの抗体が第VII因子ポリペプチド上の異なるエピトープを認識して結合することを意味する。特定の抗体が異なるエピトープと結合するかどうかの決定は、抗体の競合が評価されうる様々な免疫学的スクリーニングアッセイのいずれかを用いて、容易に決定されうる。このすべてのアッセイは当分野で慣例となっている(例として１９９７年８月２６日発行の米国特許第５６６０８２７号を参照)。
上記の技術に従って、いくつかの特異的なモノクローナル抗体が単離され、試験されており(これらの抗体の発現に関する詳細は実施例及び配列リストを参照)、第VII因子-３Ｆ１１Ａ３、第VII因子-３Ｆ３Ａ４及び第VII因子-３Ｆ２０Ａ１の３つのモノクローナル抗体が、 第VII因子ポリペプチドのＧＬＡドメインである標的ドメインに対して非常に高い親和性を有することが示されている。これらの抗体は、カルシウムイオンに依存するポリペプチドに存在するエピトープを認識し、カルシウム依存的な結合と称される。
【００５４】
本発明の一実施態様では、インタクトなＧＬＡドメインを有する第VII因子ポリペプチドの量の測定のための方法は、ＧＬＡドメインに存在するエピトープに特異的なモノクローナル抗体として第VII因子-３Ｆ３Ａ４、第VII因子-３Ｆ１１Ａ３及び第VII因子-３Ｆ２０Ａ１のいずれかを用いて行われる。
抗体第VII因子-３Ｆ３Ａ４の可変軽鎖(ＶＬ)のアミノ酸配列は配列番号：３に示される。抗体第VII因子-３Ｆ３Ａ４の可変重鎖鎖(ＨＬ)のアミノ酸配列は配列番号：５に示される。
抗体第VII因子-３Ｆ２０Ａ１の可変軽鎖(ＶＬ)のアミノ酸配列は配列番号：７に示される。抗体第VII因子-３Ｆ２０Ａ１の可変重鎖(ＨＬ)のアミノ酸配列は配列番号：９に示される。
抗体第VII因子-３Ｆ１１Ａ３の可変軽鎖(ＶＬ)のアミノ酸配列は配列番号：１１に示される。抗体第VII因子-３Ｆ１１Ａ３の可変重鎖(ＨＬ)のアミノ酸配列は配列番号：１３に示される。
【００５５】
本発明の方法は、第VII因子ポリペプチドを産生する宿主細胞の培養の間に生成物である第VII因子ポリペプチドの質を迅速かつ正確に測定するために非常に簡便であることが明らかとなった。 
本発明の方法を応用することによって、機能的な第VII因子ポリペプチドの量、並びに培養溶液中に存在する第VII因子ポリペプチドの総量を決定することが可能である。この機能的な第VII因子ポリペプチドは、本明細書において、インタクトなγカルボキシル化ＧＬＡドメインを含む正しくプロセシングされた第VII因子ポリペプチドを意味する。
したがって、一実施態様では、本発明は、試料中の第VII因子ポリペプチドの総量に対する正しくプロセシングされた第VII因子ポリペプチドの比率を決定するための方法であって、
a) ｃｙｓ１７とｃｙｓ２２との間にジスルフィド結合を有するγ-カルボキシル化ＧＬＡドメインを含む第VII因子ポリペプチドの量を決定し；そして、
b) 試料中に存在する第VII因子ポリペプチドの総量を決定する
工程を含んでなる方法に関する。
【００５６】
したがって、試料中の第VII因子ポリペプチドの総量に対する正しくプロセシングされたポリペプチドの比率が算出され、その比率は本願ではカルシウム依存性指標(ＣＤＩ)と称される。 
γ-カルボキシ化ドメインであるＧＬＡドメインを含むポリペプチドの正しいプロセシングは、カルシウムに依存しており、おそらく適切な折り畳みのためのものであることが示されている。カルシウムの存在下において誘導されたこの構造的な変化により、ＦVIIポリペプチドのプロ-ペプチド型、無ＧＬＡドメイン型又は非γ-カルボキシル化型で存在しない折り畳まれたポリペプチド内のエピトープが露出されるであろう。
一実施態様では、異なる形態の第VII因子ポリペプチドの測定は、ポリペプチドの異なるドメインに特異的な抗体を結合させ、検出用抗体の量を検出することによって行われる。
標的抗原への抗体の結合を検出するための異なる検出システムは当分野で公知であり、例えばコンジュゲート酵素(ＥＬＩＳＡ)及び蛍光結合抗体が含まれる。
【００５７】
したがって、更なる実施態様では、本発明は、試料中の第VII因子ポリペプチドの総量に対する正しくプロセシングされた第VII因子ポリペプチドの比率を決定するための方法であって、試料中に存在する第VII因子ポリペプチドの総量と正しくプロセシングされたＧＬＡドメインを含む第VII因子ポリペプチドの量は、第VII因子ポリペプチドの正しくプロセシングされたＧＬＡドメイン上の、Ｃａ２＋の存在下で露出されたエピトープに対する特異的な検出用抗体の結合を検出し、第VII因子ポリペプチドの異なるドメインのいずれか他のエピトープのそれぞれに対する他の特異的な検出用抗体の結合を検出することによって決定される。
この場合、固形支持体に固定された一又は複数の捕捉抗体(catching antibody)が一又は複数の検出用抗体(detecting antibody)とともに用いられる「サンドイッチ」技術が行われる。抗体の組合せにはいくつか考えられうる。
【００５８】
一実施態様では、捕捉抗体は、抗原／ポリペプチドに対して高い親和性を有する任意の抗体であり、その抗体は第VII因子ポリペプチドのすべて又はほとんどの形態を結合するであろう。このような抗体は、例えば第VII因子ポリペプチドのＥＧＦ-様ドメインのエピトープと結合しうる。次いで、検出用抗体は、存在する異なる形態間で識別されうるべきであり、一つの検出用抗体はＣａ２＋の存在下でＧＬＡドメイン上に露出されるエピトープに特異的でなければならず、他方の検出用抗体はＧＬＡドメインでないドメイン上にあり、かつそのＧＬＡドメインでないドメイン上のエピトープが捕捉抗体が認識するエピトープと異なるエピトープに特異的でなければならない。
正しくプロセシングされた抗原又はすべての抗原を測定する検出用抗体の結合の検出は、サンドイッチＥＬＩＳＡ技術が用いられる場合であるので２つの別々の試料で都合よく実施されるが、検出用抗体上の蛍光分子が直接測定される場合には同じ試料で両方の検出用抗体を検出することも考えられる。また、２つの異なる励起波長を用いる必要があるであろう。
【００５９】
一方、２つの異なる捕捉抗体が本方法に用いられる場合、常に２つの異なる試料が用いられる。この場合、２つの捕捉抗体のうち、一つの捕捉抗体はＣａ２＋の存在下でＧＬＡドメイン上に露出されるエピトープに特異的であり、他方の捕捉抗体はＧＬＡドメインでないドメインの第一エピトープに特異的であり、検出用抗体はＧＬＡドメインでないドメインの第二エピトープに特異的な抗体であり、このときの第二エピトープは第一エピトープと異なる。
例えば、一実施多様では、捕捉抗体としてＦ１及びＦ９、検出用抗体としてＦ７としてもよい。
上記の通りに、検出用抗体の結合を検出する一つの方法は、酵素コンジュゲート抗体が用いられ、結合した抗体の量が比色アッセイによって測定されるＥＬＩＳＡによるものである。特にＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡである。しかしながら、検出用抗体結合のための他の手段も同様に用いられてもよい。
【００６０】
生体分子相互作用をモニターするための一つの公知技術は、表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ)によるものである。表面プラスモン共鳴は、光が薄い金属フィルムから反射されるときに発生する現象である。一定の角度での光エネルギーの発生の一部は、金属フィルム(プラスモン)の局在化していない電子と相互作用しうるため、反射光強度が減少しうる。これが生じるときの発生の正確な角度は多くの因子によって決定されるが、Pharmacia ＢＩＡｃｏｒｅ装置では、主要な決定因子は金属フィルムの後方の近くの屈折率であり、その金属フィルムには標的分子が固定されており、フローセルに沿って移動する移動相のリガンドによって誘導される。固定された標的に結合が起こると、局所の屈折率が変化し、ＳＰＲ角度の変化が生じ、この変化は、センサーグラムを生じる反射光の強度の変化を検出することによって、リアルタイムにモニターされうる。ＳＰＲシグナルの変化の割合を分析して、反応の結合相と解離相の見かけの速度係数を求めることができる。これらの値の比率は見かけの平衡定数(親和性)を与える。ＳＰＲシグナルの変化の大きさは固定されている質量に正比例しており、したがって相互作用の化学量論に関しておよその解釈ができる。シグナルは物質のマイクログラム未満の量から容易に得られる。ＳＰＲシグナルが固定されたテンプレートへの結合にのみ依存するので、抽出物中の分子から結合を調べることもできる。すなわち、高度に精製された成分を有する必要はない。
【００６１】
センサー表面で生じる生体分子の相互作用は、溶質濃度及びそれによる感知しにくい波動浸透率内の屈折率を変化させる。したがって、ＳＰＲ現象(ＳＰＲ角度)を引き起こすために必要とされる発生角度を変更し、測定されるこの変化を応答シグナルとする。したがって、ＳＰＲは、基本的に相互作用物の性質とは独立した質量検出器である。この技術は標識を必要としない。
抗体と抗原との間の相互作用を検出するために好適な他の考えられる手段は、測定されるパラメーターが耐性、電流又は電圧である圧電気バイオセンサーによるものである。標的である第VII因子ポリペプチドは内蔵圧抵抗器を有するカンチレバーに固定され、検出用抗体の結合により圧抵抗器を引っ張る屈曲が誘導され、それにより抵抗器の値が変化する。検出の他の考えられる手段は、例えばＳＡＷ(表面音波)-バイオセンサーなど、当業者が容易に考えつくものでよい。
【００６２】
したがって、一実施態様では、検出用抗体／抗体の結合の検出は、ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴、圧電気バイオセンサー又はＳＡＷ-バイオセンサーによって実施される。
本発明のＣＤＩはＧＬＡドメインを有する任意のタンパク質を測定してもよく、そのタンパク質の正しいプロセシングはタンパク質の活性と相関し、適切な折り畳みはカルシウムの存在に影響を受けるものである。このようなタンパク質には、第VII因子、第VIIa因子、第IX因子、第IXa因子、第X因子、第Xa因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、基質ＧＬＡ-タンパク質、プロリンリッチＧｌａタンパク質１及び２が含まれる。
ＣＤＩの算出方法は、ポリペプチドの望ましくない形態、例えば第VIIa因子、例としてＧＬＡドメインのないＦVII、プロ-ＦVII、非γ-カルボキシル化ＦVII、及び分解されたＧＬＡドメインを有するＦVIIの他の形態(通常のサンドイッチＥＬＩＳＡにて検出されうるもの)が識別され、それにより培養物の質的指標が得られるという利点がある。
驚くべきことに、第VII因子の産生の間のＣＤＩ指標が培養期間の間で非常に異なり、それゆえにＣＤＩの認識が最も良好な生成物の回収のために非常に重要であることが明らかとなった。
したがって、本発明の第二の態様は、産生の間に機能的な第VII因子ポリペプチドの収率を最適化するための本発明の方法の使用に関する。
【実施例】
【００６３】
実施例１  抗体の組み換え産生
例示的な実施態様では、第VII因子抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列から組み換えｍＡｂを生産するために、以下のプロトコールを応用することができる。工程１−３は、モノクローナル第VII因子抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細胞のＶＨ領域及びＶＬ領域の検索を示す。あるいは、工程４で用いられる第VII因子抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ断片を合成するために十分に確立された技術を用いて、図２に示す配列情報から調製することができる。また、所望の抗体のＶＨ断片及びＶＬ断片、又はその変異体ないし誘導体は、完全長抗体を発現するために、所望のＩｇサブクラスの定常領域を含む、科学文献に記載される多くの発現ベクター又は市販の発現ベクターのいずれかにクローニングされてもよい。さらに、所望の抗体のＶＨ断片及びＶＬ断片、又はその変異体ないし誘導体は、抗体断片(例えばＦａｂ断片)を発現するために切断された定常領域をコードするベクターにクローニングされてもよい。市販のベクターの一つの例は、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection, catalog number 87094)から入手可能な、ｐＡＳＫ８４である。
【００６４】
(1) ハイブリドーマ細胞からの総ＲＮＡの単離：
第VII因子に対する抗体を分泌する４×１０６個のハイブリドーマ細胞を、製造業者の指示に従って、QiagenのＲＮｅａｓｙミニキットを用いた総ＲＮＡの単離のために用いる。簡単にここで概説する：１０００回転数／分で５分間遠心して、細胞をペレット状にし、１０μｌ／ｍｌのβ-メルカプトエタノールを含有する３５０μｌのＲＬＴバッファを加えて破壊する。溶解物を、QiagenのＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムに移し、最大速度で２分間遠心分離する。流出物を等量の７０％エタノールと混合する。ＲＮｅａｓｙスピンカラム(Qiagen)に最高７００μｌの試料をアプライし、１４０００回転数／分で遠心分離して、流出物を破棄する。カラムに７００μｌのＲＷ１バッファをアプライし、１４０００回転数／分で１５秒間遠心分離してカラムを洗浄する。５００μｌのＲＰＥバッファにてカラムを２度洗浄し、１４０００回転数／分で１５秒間遠心分離する。カラムを乾燥させるために、さらに１４０００回転数／分で２分間遠心分離する。カラムを新規の収集管へ移し、５０μｌの無ヌクレアーゼ水にてＲＮＡを溶出し、１４０００回転数／分で１分間遠心分離する。ＯＤ＝２６０ｎｍの吸光度にてＲＮＡ濃度を測定する。必要になるまでＲＮＡを−８０℃に保存する。
【００６５】
(2) ｃＤＮＡ合成：
１μｇのＲＮＡを、ClontechのSMART RACE ｃＤＮＡ増幅キットを用いて一本鎖(first-strand)のｃＤＮＡ合成に用いる。5'-RACE-Ready ｃＤＮＡの調製のために、上記のように単離したＲＮＡ、リバースプライマー５'-ＣＤＳプライマーバック、及びSMART II Ａオリゴを含有する反応混合物を調製し、次いで、この混合物をおよそ２分間７２℃でインキュベートした後、およそ２分間氷上にて冷まし、１×First-Strandバッファ、ＤＴＴ(２０ｍＭ)、ｄＮＴＰ(１０ｍＭ)及びPowerScript逆転写酵素を加える。反応混合物を４２℃で１．５時間インキュベートし、トリシン-ＥＤＴＡバッファを加えて、７２℃で７分間インキュベートする。この時点で試料を−２０℃で保存することができる。
【００６６】
(3) ヒトの可変軽鎖(ＶＬ)及びヒトの可変重鎖(ＶＨ)のＰＣＲ増幅及びクローニング：
１×Advantage HF 2 ＰＣＲバッファ、ｄＮＴＰ(１０ｍＭ)及び１×Advantage HF 2ポリメラーゼ混合物を含有するＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)反応混合物は、上記のように作製されたｃＤＮＡのＶＬ及びＶＨ両方の可変領域それぞれの増幅のために作製する。
ＶＬの増幅には以下のプライマーを用いる： 
ＵＰＭ(ユニバーサルプライマー混合物)：
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (配列番号：１４)
5'-CTAATACGACTCACTATAGGG-3' (配列番号：１５)
ＶＫ  ＲＡＣＥ２：
5'-GCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC-3' (配列番号：１６)
ＶＨの増幅には以下のプライマーを用いる： 
ＵＰＭ(ユニバーサルプライマー混合物)：
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (配列番号：１７)
5'-CTAATACGACTCACTATAGGG-3' (配列番号：１８)
ＡＢ９０ＲＡＣＥ：
5'-GTGCCAGGGGGAAGACCGATGGG-3' (配列番号：１９)
【００６７】
ＰＣＲは３回行う。ラウンド１：９４℃で５秒間及び７２℃で３分間を５サイクルにてＰＣＲを行う。ラウンド２：９４℃で５秒間、７０℃で１０秒間、及び７２℃で１分間を５サイクルにてＰＣＲを行う。ラウンド３：９４℃で５秒間、６８℃で１０秒間、及び７２℃で１分間を２８サイクルにてＰＣＲを行う。
ＰＣＲ生成物は１％アガロースゲルの電気泳動にて分析し、QiagenのＱＩＡＥＸ１１アガロースゲル抽出キットを用いてＤＮＡをゲルから精製する。精製されたＰＣＲ生成物を、InvitrogenのTOPO TAクローニングキットを用いてＰＣＲ４-ＴＯＰＯベクターに導入して、ＴＯＰ１０コンピテント細胞の形質転換に用いる。
適切な量のコロニーを、Ｔａｑポリメラーゼ、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファ、ｄＮＴＰ(１０ｍＭ)及び以下のプライマーを用いたコロニーＰＣＲにより分析する。ＰＣＲプログラムは以下の通りである：
Ｍ１３フォワードプライマー：5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' (配列番号：２０)
Ｍ１３リバースプライマー：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' (配列番号：２１)
ＰＣＲプログラム：
９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で１分間で２５サイクル行う。
ＶＬ及びＶＨのインサートをそれぞれ含むクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、上記に挙げたプライマーＭ１３フォワード及びＭ１３リバースを用いて配列決定する。第VII因子ｍＡｂの場合の、重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする配列を図２に示す。
【００６８】
(4) 哺乳動物発現ベクターへの抗体遺伝子のサブクローニング
ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡの配列データに基づいて、可変軽鎖(ＶＬ)及び可変重鎖(ＶＨ)のそれぞれの遺伝子の増幅のためにプライマーを設定する。可変領域はＰＣＲによりフォーマット化し、コザック配列、リーダー配列及び固有の制限酵素部位を包含させる。これは、ＶＬでは、ＨｉｎｄIII部位とコザック配列を導入し、かつ可変軽鎖領域のリーダー配列の５'末端に相同になるように５'ＰＣＲプライマーを設定することによって達成される。３'プライマーは、可変領域の３'末端に相同であり、可変領域の３'境界域にＢｓｉＷI部位を導入する。ＶＨ領域は、５'末端及び３'末端にＨｉｎｄIII及びＢｓｉＷIでなくそれぞれＮｏｔＩ部位及びＮｈｅI部位が導入される点を除き、同様に生成される。
標準的な技術を用いて、増幅遺伝子生成物は、軽鎖及び重鎖の定常領域を含有する真核生物発現ベクターにそれぞれクローニングする。ＶＬ ＤＮＡ断片はＨｉｎｄIII及びＢｓｉＷIにて消化して、アンピシリンに対する耐性物質をコードするβ-ラクタマーゼ遺伝子及び大腸菌複製起点(ｐＵＣ)を含有する真核生物発現ベクターにライゲートする；結果として生じるプラスミドは設定したＶＬＣＬである。ＶＨ ＤＮＡ断片をＮｏｔI及びＮｈｅIにて消化し、上記のＶＬ断片の導入によって生じるＶＬＣＬベクターに導入する。結果として生じるプラスミドは、同じプラスミドに抗体の重鎖及び軽鎖の両方をコードする機能的な発現カセットを含有する。ライゲートしたプラスミドを用いて大腸菌を形質転換する。プラスミドＤＮＡは、これらのアンピシリン耐性の微生物集団から調製し、チャイニーズハムスター卵巣細胞又は他の哺乳類の細胞株に形質移入するために用いる。"Molecular Cloning", Sambrook等の実施例に記述されるように、形質移入及び細胞培養を標準的な方法によって行う。結果は、第VII因子ｍＡｂ又は第VII因子ＡｂのＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｍＡｂなど、対象の抗体分を安定して発現し、分泌する形質移入細胞株である。
抗体の変異体は容易に生成されうる。例えば、第VII因子-３Ｆ１１Ａ３、第VII因子-３Ｆ３Ａ４及び第VII因子-３Ｆ２０Ａ１などと全く同じ特異性を有するがＩｇＧ４と異なるアイソタイプの抗体は、κ軽鎖定常領域及びＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ３の定常領域をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドに、対象のＡｂのＶＬ及びＶＨをコードするｃＤＮＡをサブクローニングすることによって得ることができる。したがって、生成された抗体は任意のアイソタイプを有し得、次いで抗体は当分野で従来の技術を用いて転換されるアイソタイプでもよい。このような技術には、直接組み換え技術(例として米国特許第４８１６３９７号参照)、細胞-細胞融合技術(例として米国特許第５９１６７７１号参照)、及び当分野で公知の他の好適な技術の使用が含まれる。したがって、本発明によって提供される抗体のエフェクター機能は、治療目的を含め様々な使用のために、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体へのアイソタイプの転換によって、親抗体のアイソタイプに関して「変化して」もよい。
【００６９】
実施例２  サンドイッチＥＬＩＳＡによる試料中の総第VIIa因子濃度の測定。
試料中の総第VII因子濃度の測定は、抗ＥＧＦドメイン抗体などの２つの異なるエピトープに対する任意の２つのモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで測定することができる：
９６ウェルマイクロプレート(Nalgene Nunc InternationalのC96 maxisorp Nunc-Immunoプレート)を、１μｇのモノクローナルＦ９抗ＦVII(一次)を含む１００μｌのコーティングバッファ(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．８)にて４℃で終夜をかけてコートした。インキュベートの後、プレートを、３５０μｌの洗浄バッファ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４)にて４回洗浄した。洗浄後、ウェルを、３５０μｌのブロッキングバッファ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０)にて２．５時間かけてブロックした。ブロッキングは、室温で振とうしながら行った。
１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼにコンジュゲートしたモノクローナルＦ７抗ＦVII(二次)１００μｌを各々のウェルに加えた。
試料を希釈バッファ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０)にておよそ２０ｎｇのＦVII／ｍｌに希釈し、２０μｌを各々のウェルに流し込んだ。また、０、５、１０、２０、３０及び５０ｎｇ／ｍｌの二重の連続した標準物質と多くのコントロール物質を加えた。流し込んだ後、プレートを振とうテーブル上で室温で２時間インキュベートした。
【００７０】
プレートの配置は以下の通りである：
表１  ＥＬＩＳＡプレート配置。Ｓｔｄ ｘｘ＝標準物質ｘｘｎｇ／ｍｌ、Ｃ＝コントロール、Ｕ＝試料。
表１
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【００７１】
インキュベートの後、プレートを、３５０μｌの洗浄バッファ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４)を用いて５回洗浄した。１００μｌの基質(１００ｍＭ ＯＰＤ(オルト-フェニレンジアミン)、５０ｍＭ ＮａＡｃの１ｍＭ Ｈ２Ｏ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ５．２)を各ウェルに加え、プレートを振とうテーブル上で室温で反応させ、高コントロールのＯＤがおよそ１．２に達したときに１．２５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を止めた。プレートは、４９２ｎｍのフィルターを用いたＥＬＩＳＡプレート読み取り機にて読み取った。 
図３に示される標準曲線を用いて各ウェルの第VII因子濃度を決定した。
【００７２】
実施例３  活性な第VIIa因子の産生のための産生パラメーターの調節
実施例２に記載の標準的なＦVII ＥＬＩＳＡを用いてＦVIIの全体の産生についてバッチ又は連続的な細胞培養をモニタリングできる。インタクトなＧＬＡドメインを包含する特定の内容物及びそれによるＦVIIの産生は、ＧＬＡドメインに対する抗体及びＦVIIの他のエピトープに対する抗体をベースとした、以下のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定されうる。
９６ウェルマイクロプレート(Nalgene Nunc InternationalのC96 maxisorp Nunc-Immunoプレート)を、１ウェル当たり５μｇのモノクローナルＦ１抗ＦVII(一次)を含む１００μｌのコーティングバッファ(５０μｇ／ｍｌ Ｆ１Ａ２ｉ ２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４)にて４℃で終夜をかけてコートした。インキュベートの後、プレートを、３５０μｌの洗浄バッファ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０)にて４回洗浄した。洗浄後、ウェルを、３５０μｌのブロッキングバッファ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０)にて２．５時間かけてブロックした。２．５時間かけて、室温で振とうしながらブロッキングを行った。
１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼにコンジュゲートしたモノクローナルＦ７抗ＦVII(二次)１００μｌを各々のウェルに加えた。
試料を希釈バッファ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０)にておよそ７５ｎｇのＦVII／ｍｌに希釈し、２０μｌを各々のウェルに流し込んだ。また、０、２０、３０、５０、８０、１００及び１３０ｎｇ／ｍｌの二重の連続した標準物質と多くのコントロール物質を加えた。流し込んだ後、プレートを振とうテーブル上で室温で２時間インキュベートした。
【００７３】
プレートの配置は以下の通りである：
表２  ＥＬＩＳＡプレート配置。Ｓｔｄ ｘｘ＝標準物質ｘｘｎｇ／ｍｌ、Ｃ＝コントロール、Ｕ＝試料。
表２
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【００７４】
インキュベートの後、プレートを、３５０μｌの洗浄バッファ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０)を用いて５回洗浄した。１００μｌの基質(１００ｍＭ ＯＰＤ(オルト-フェニレンジアミン)、５０ｍＭ ＮａＡｃの１ｍＭ Ｈ２Ｏ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ５．２)を各ウェルに加え、プレートを振とうテーブル上で室温で反応させ、高コントロールのＯＤがおよそ１．２に達したときに１．２５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を止めた。プレートは、４９２ｎｍのフィルターを用いたＥＬＩＳＡプレート読み取り機にて読み取った。 
図４に示される標準曲線を用いて各ウェルの第VII因子濃度を決定した。
【００７５】
実施例４  ＦVII培養をモニターするためのＣＤＩの使用
カルシウム依存性指標(Calcium Dependent Index, ＣＤＩ)は、少なくとも一のＧＬＡドメイン特異的抗体(例えばＦVII-３Ｆ１１Ａ３、ＦVII-３Ｆ３Ａ４又はＦVII-３Ｆ２０Ａ１)を用いたＥＬＩＳＡにおいて応答するＦVIIと抗ＥＧＦ(例えばＦ７又はＦ９)などの任意の他の抗体を用いたＥＬＩＳＡにおいて応答する総ＦVIIとの間の比率として定められる。
【００７６】
実施例５  免疫親和性精製のための抗体の使用
２０ｍＭ Ｃａ２＋の存在下における免疫親和性精製の実施
１０ｍＭ Ｃａ２＋の濃度にカルシウムを加え、１０ｍＭの濃度にトリスバッファを加えて、その後ＨＣｌにてｐＨ８に調製することによって安定化した、１０００ｍｌのＢＨＫ-２１培養物上清部分を０．４５μのdead-endフィルターにて濾過する。安定化した培養物上清を、Pharmaciaセファロース４Ｂ上に固定した、Ｃａ２＋-依存性モノクローナル抗体ＦVII-３Ｆ３Ａ４を充填したカラム(１．６ｃｍ内径×１０ｃｍの長さ＝２０ｍｌ ＣＶ)に流し込む。流し込む前に、カラムを、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ トリス、ｐＨ８の５ＣＶにて平衡化する。流し込みの後で、カラムを、１０ＣＶのために２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ トリス、ｐＨ８にて洗浄する。結合したＦVIIは３０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ トリス、ｐＨ８の１０ＣＶにて溶出する。精製の間、１２ＣＶ／ｈの流速及びCelsius５℃の温度を用いる。溶出物はすぐに、塩化カルシウムを加えて５０ｍＭの終濃度に安定させる。 
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】天然のヒトの第VII凝固因子の完全なアミノ酸配列(配列番号：１)を示す。
【図１Ｂ】天然のヒトの第VII凝固因子の完全なアミノ酸配列(配列番号：１)を示す。
【図２Ａ】本発明に係る例示的な抗体の成熟した可変軽鎖(ＶＬ)領域及び可変重鎖(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】本発明に係る例示的な抗体の成熟した可変軽鎖(ＶＬ)領域及び可変重鎖(ＶＨ)領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図３】記載したＥＬＩＳＡアッセイの代表的な標準曲線を示す。
【図４】記載したＥＬＩＳＡアッセイの代表的なｌｎ／ｌｎ標準曲線を示す。
【図５】異なる培養についての時間(日数)に応じたＣＤＩを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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