(57)【要約】ミトコンドリアに非ミトコンドリアタンパク質を送達する方法が提供される。また、ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）、核外移行シグナル（ＮＥＳ）およびコードされたタンパク質に融合されたＤＮＡ結合性ポリペプチドをコードするコード配列を含む核酸構築物も提供される。前記構築物は、ミトコンドリアにＤＮＡ結合性タンパク質を正常に送達する。上記の構築物に基づくキメラのメチラーゼはミトコンドリアに正常に送達され、それによってｍｔＤＮＡの改変がもたらされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）及び核外移行シグナル（ＮＥＳ）に融合されたＤＮＡ結合性ポリペプチドをコードするコード配列を含む核酸構築物。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合性ポリペプチドがミトコンドリアに対して異種である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ結合性ポリペプチドがジンクフィンガーポリペプチド（ＺＦＰ）である、請求項１又は請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記ＺＦＰが２個、３個又はそれ以上のジンクフィンガーを含む、請求項３に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合性ポリペプチドがミトコンドリアゲノムにおける標的配列と結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記標的配列が疾患と関連するＤＮＡ領域内に存在する、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記疾患が、ＬＨＯＮ（レーベル遺伝性視神経症）；ＭＭ（ミトコンドリアミオパシー）；ＡＤ（アルツハイマー病）；ＬＩＭＭ（致死性小児性ミトコンドリアミオパシー（Ｌｅｔｈａｌ  Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｍｙｏｐａｔｈｙ））；ＡＤＰＤ（アルツハイマー病及びパーキンソン病）；ＭＭＣ（母性ミオパシー及び心筋症（Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ））；ＮＡＲＰ（神経原性筋力低下、失調及び色素性網膜炎；この遺伝子座の別の表現型はリー病として報告される）、ＦＩＣＰ（致死性小児性心筋症プラス（Ｆａｔａｌ  Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  Ｐｌｕｓ）、ＭＥＬＡＳ関連心筋症）、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作）、ＬＤＹＴ（レーベル遺伝性視神経症及びジストニー）、ＭＥＲＲＦ（ミオクローヌス癲癇及び赤色ぼろ筋線維）、ＭＨＣＭ（母性遺伝性肥大性心筋症）、ＣＰＥＯ（慢性進行性外眼筋麻痺）、ＫＳＳ（キーンズ・セイアー症候群）、ＤＭ（糖尿病）、ＤＭＤＦ（糖尿病＋難聴）、ＣＩＰＯ（ミオパシー及び眼筋麻痺を伴う慢性的腸偽閉塞（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｐｌｅｇｉａ））、ＤＥＡＦ（母性遺伝性難聴又はアミノグリコシド誘導性難聴）、ＰＥＭ（進行性脳症）、ＳＮＨＬ（感音難聴）、老化、脳筋症、ＦＢＳＮ（家族性両側性線条体壊死）、ＰＥＯ及びＳＮＥ（亜急性壊死性脳症）からなる群から選択される、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記ＤＮＡ結合性ポリペプチドがＤＮＡ結合性ポリペプチドのライブラリーから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記ＤＮＡ結合性ポリペプチドが、ファージディスプレイ、ツーハイブリッド選択及び細菌ディスプレイからなる群から選択される１つ以上の方法によって、ランダム化された変異体ポリペプチドのライブラリーから選択される、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ結合性タンパク質の調製において合理的な設計が用いられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ結合性ポリペプチドが機能的ドメインに融合される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記機能的ドメインが転写活性化ドメイン又は転写抑制ドメインである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記機能的ドメインがＤＮＡ修飾酵素から得られる、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ修飾酵素が、ＤＮＡメチラーゼ及びＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインからなる群から選択される、請求項１３に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記ＭＴＳがミトコンドリアタンパク質のシグナルペプチドである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記ＭＴＳが、ヒトチトクロームｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩＩ、ヒトＡＴＰシンターゼのサブユニットｃのＰ１アイソフォーム、ヒトＡＴＰシンターゼのＦ１βサブユニット、アルデヒドデヒドロゲナーゼターゲティング配列及びＢＣＳ１タンパク質からなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記ＮＥＳが、ＭＭＶの非構造タンパク質２、プロテインキナーゼ阻害剤、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ及びＭＡＰキナーゼキナーゼ、ＭＶＭ  ＮＳ２、ＮＭＤ３、Ａｎ３、ＩκＢα、サイクリンＢ１及びＴＦＩＩＩＡからなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記ＮＥＳが、ＬＡＬＫＬＡＧＬＤＩＮ（プロテインキナーゼ阻害剤）、ＬＱＬＰＰＬＥＲＬＴＬＤ（ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ）及びＬＧＬＫＬＥＥＬＥＬＥ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）、ＭＴＫＫＦＧＴＬＴＩ（ＭＶＭ  ＮＳ２）、ＬＡＥＭＬＥＤＬＨＩ（ＮＭＤ３）、ＬＤＱＱＦ−ＡＧＬＤＬ（Ａｎ３）、ＭＶＫＥＬＱＥＩＲＬ（ＩκＢα）、ＬＣＱＡＦＳＤＶＩＬ（サイクリンＢ１）及びＬＰＶＬＥＮＬＴＬ（サイクリンＢ１）からなる群から選択される、請求項１７に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）において目的配列を改変するための融合タンパク質であって、
（ａ）ｍｔＤＮＡ内の標的配列と結合するＤＮＡ結合性ポリペプチドであって、該標的配列は、該目的配列の中又は近くに存在する、ＤＮＡ結合性ポリペプチド；
（ｂ）ｍｔＤＮＡを修飾する機能的ドメイン；
（ｃ）ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）；及び
（ｄ）核外移行配列（ＮＥＳ）、
を含む、融合タンパク質。
【請求項２０】
前記機能的ドメインが、メチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記機能的ドメインがエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインである、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記エンドヌクレアーゼがＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項２０又は請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ結合性ポリペプチドがジンクフィンガーポリペプチド（ＺＦＰ）である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む細胞。
【請求項２６】
請求項１８〜２４のいずれか１項に記載のタンパク質を含む細胞。
【請求項２７】
（ａ）請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物を調製するステップ；及び
（ｂ）前記核酸構築物を真核細胞内に導入するステップ、を含むミトコンドリアにポリペプチドを送達する方法であって、該構築物が前記ポリペプチドを産生するように発現され、そして該ポリペプチドがミトコンドリアに入る、方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項１３又は請求項１４に記載の核酸構築物を調製するステップ；及び
（ｂ）前記核酸構築物を真核細胞内に導入するステップ、を含むミトコンドリアＤＮＡ内の配列を改変する方法であって、該構築物が前記ポリペプチドを産生するように発現され、そして該ポリペプチドがミトコンドリアに入る、方法。
【請求項２９】
請求項１３又は請求項１４に記載の核酸構築物内に含まれる前記ＭＴＳがミトコンドリアタンパク質のシグナルペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＴＳが、ヒトチトクロームｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩＩ、ヒトＡＴＰシンターゼのサブユニットｃのＰ１アイソフォーム、ヒトＡＴＰシンターゼのＦ１βサブユニット及びアルデヒドデヒドロゲナーゼターゲティング配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＮＥＳが、ＭＭＶの非構造タンパク質２、プロテインキナーゼ阻害剤、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ及びＭＡＰキナーゼキナーゼ、ＭＶＭ  ＮＳ２、ＮＭＤ３、Ａｎ３、ＩκＢα、サイクリンＢ１及びＴＦＩＩＩＡからなる群から選択されるタンパク質から得られる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ミトコンドリアにおける遺伝子発現の調節のための、ミトコンドリアに対して異種のＤＮＡ結合性ポリペプチドの使用。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ結合性ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記ＤＮＡ結合性ポリペプチドがジンクフィンガーポリペプチドである、請求項３２又は請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項３６】
ミトコンドリア病の治療のための医薬組成物の調製における請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアに対するポリペプチドのターゲティングに関する。特に、本発明は、ミトコンドリアへの送達に抵抗性がある非常に強い核局在化を有するポリペプチド等のミトコンドリアに対して異種のポリペプチドのミトコンドリアターゲティングに関する。更に本発明は、ミトコンドリアに送達されるポリペプチドを使用してミトコンドリアＤＮＡを修飾する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ミトコンドリアは、エネルギー代謝、アポトーシス及び老化に中心的な役割を果たす真核細胞において見られる細胞器官である。ミトコンドリアは特異なミトコンドリアゲノムを含み、ヒトミトコンドリアは、酸化的リン酸化機構の必須成分をコードするそれ自身の１６，５６９ｂｐのＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の２〜１０個のコピーを含む。これによって、ミトコンドリアは、タンパク質がミトコンドリア中で直接合成されるという点で核とはほとんど無関係なものとなる。ミトコンドリアＤＮＡは、イントロンを有さない遺伝子を含む環状の２本鎖分子であるという点で、原核生物のＤＮＡに似ており；更にその遺伝暗号は、「正常」な普遍的遺伝暗号とは異なる。
【０００３】
核ＤＮＡの単一コピーとは対照的に、各細胞においてｍｔＤＮＡの多数のコピーが存在する結果として、ミトコンドリアは突然変異誘発に高い感受性がある。更に、ヌクレオチド除去修復機構等の、ミトコンドリアにおける特定の修復機構が欠けている。
【０００４】
ヒトｍｔＤＮＡにおける点変異、欠失又は再配列は、酸化的リン酸化を阻害し、現在治療法がない一連の遺伝病を引き起こす。例えば、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）は、ｍｔＤＮＡにおける複合体ＩのＮＤ４サブユニットをコードする遺伝子中のＧ１１７７８Ａ点変異によって引き起こされる。ニューロパシー、失調及び色素性網膜炎（ＮＡＲＰ）並びに母性遺伝性リー症候群（ＭＩＬＳ）は、更に通常、ｍｔＤＮＡにおけるＡＴＰシンターゼ６遺伝子中のＴ８９９３Ｇ点変異に起因する。ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳筋症；乳酸アシドーシス；脳卒中）は、ＭＥＬＡＳ症候群の８０％の原因となるＡ３２４３Ｇ突然変異を含む種々のミトコンドリア遺伝子（通常はｔＲＮＡＬｅｕ）における突然変異によって引き起こされる。ＭＥＲＲＦ（ミオクローヌスてんかん；赤色ぼろ線維）は、ミトコンドリアのｔＲＮＡＬｙｓにおける突然変異に一般に関連しており；心筋症は、ｔＲＮＡＩｌｅにおける突然変異と多くの場合関連しており；ミオパシー、難聴及び糖尿病もまた、全てミトコンドリアと関連がある。
【０００５】
ｍｔＤＮＡの自己複製、維持及び発現の方法については、更に相当な不確実性がある。細胞内のミトコンドリアにおける特定のｍｔＤＮＡ配列を操作又は修飾する能力があれば、正常なｍｔＤＮＡのプロセスの考察が容易になり、ミトコンドリアＤＮＡ配列の変化に起因する疾患の治療の開発も可能になる。しかし、この目的を達成することは、遺伝的方法においてミトコンドリア内にＤＮＡの外来性のコピーを送達する等の標準的な遺伝子治療の方法が問題を含んだままであるので、困難であることが分かっている。
【０００６】
ミトコンドリアは、それ自身のゲノムを含むが、細胞質のリボソームで産生して核遺伝子中でコードされた多数のタンパク質（約１０００個と評価される）を取り込む。ミトコンドリア内に取り込むための核タンパク質は、関連の細胞器官へポリペプチドを再配置するシグナル配列を有し；これらは、ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）として知られている。
【０００７】
Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  ９：５３４−５４１では、ＳｍａＩエンドヌクレアーゼが、チトクロームｃ酸化酵素のサブユニットＩＶ  ＭＴＳに融合されることによってミトコンドリアに送達されることを報告された。ＳｍａＩは、例えばＮＡＲＰ又はＭＩＬＳにおいてＴ８９９３Ｇの突然変異の結果としてｍｔＤＮＡで発現する配列ＣＣＣ／／ＧＧＧを切断する。突然変異体のミトコンドリアＤＮＡは制限酵素によって切断された。突然変異体のミトコンドリアＤＮＡは通常、野生型ｍｔＤＮＡと共存するので（異形成として知られている現象（卵子における複数のミトコンドリアの母性遺伝に起因する））、突然変異体ＤＮＡの破壊によって野生型ＤＮＡを含むミトコンドリアが細胞中で優位になることが可能になり、疾患症状を治療することができる。しかし、天然由来の制限酵素の特異性は数に限りがあるため、この方法は、修正可能な突然変異に対する適用としては限られている。
【０００８】
ミトコンドリアの外部のこのような課題を解決するために、制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間の融合が行われた。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをキメラ制限エンドヌクレアーゼに変換する方法は、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１５６−１１６０、に記載されている。
【０００９】
ＭＴＳは、当該技術分野で知られており、例えば、Ｐｆａｎｎｅｒ＆Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：３３９−４９、で概説され、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【００１０】
米国特許出願第ＵＳ２００４／００７２７７４号には、細胞質中で合成されたポリペプチドをミトコンドリアに移すためのＭＴＳの使用が記載される。ＵＳ２００４／００７２７７４において提供されるＭＴＳの例としては、ヒトチトクロームｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩＩのＮ末端領域、ヒトＡＴＰシンターゼのサブユニットｃのＰ１アイソフォームのＮ末端領域、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼターゲティング配列のＮ末端領域が挙げられる。
【００１１】
しかし、ＵＳ２００４／００７２７７４は、ＤＮＡ結合性ポリペプチド以外のポリペプチドの送達に関する。例えば、ＵＳ２００４／００７２７７４は、野生型配列を有する天然のミトコンドリアポリペプチドを導入することによってミトコンドリア病が補正され得ることを示唆する。
【００１２】
ＤＮＡ結合性タンパク質は、細胞の核における遺伝子発現を調節するために用いられてきた。組換えＺＦＰは、培養細胞（例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３−９６（１９９５）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：５５２５−５５３０（１９９７）；及びＢｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９５：１４６２８−１４６３３  （１９９８）参照）及び外来染色体配列（Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：６４２−６４５（１９９４））において一時的に発現したリポーター遺伝子の遺伝子発現を調節する能力を有することが報告された。
【００１３】
より最近の研究によって、培養細胞［Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ  ９７：１４９５−１５００；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７５：３３８５０−３３８６０；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６：１１３２３−１１３３４］及び動物全身［Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：１４２７−１４３２；Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０：２４６７−２４７５］における天然状態の内在性の染色体遺伝子の発現を調節するために転写活性化ドメイン及び転写抑制ドメインへのＺＦＰ融合の使用が示される。
【００１４】
特に、Ｂｅｅｒｌｉらは、合理的な設計によって産生されたジンクフィンガーポリペプチドを使用して内在性のｅｒｂＢ−２及びｅｒｂＢ−３遺伝子を標的とした。Ｂｅｅｒｌｉらは、ＺＦＰに融合された、ＫＲＡＢ及びＶＰ６４の抑制ドメイン及び活性化ドメインを使用して、内在性のｅｒｂＢ−２及びｅｒｂＢ−３遺伝子の発現のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを認めることができた。Ｚｈａｎｇらは、ＶＰ１６トランス活性化ドメインに結合されたＺＦＰを使用して内在性のエリトロポイエチン遺伝子を活性化した。ＺＦＰは合理的な設計によって得られ、それをテストして内在性及びトランスフェクトＥＰＯ遺伝子をトランス活性化するその能力を判定した。１０ｎＭ未満の解離定数を有するＺＦＰはトランスフェクトＥＰＯ鋳型を活性化することに効果的であることが判明し；これらのサブセットは内在性遺伝子をトランス活性化することに効果的であった。Ｌｉｕらは、内在性ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を調節するために、ＤＮアーゼＩの過敏性の分析によってマップされたＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内のクロマチン領域を開放するために標的としたＺＦＰを使用した。Ｒｅｂａｒら及びＤａｉらは、それぞれマウスモデル及びウサギにおける血管形成を誘導するために内在性ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を標的とした。
【００１５】
ＦｏｋＩからのＩＩＳ型制限酵素切断ドメインに対するＺＦＰ融合を用いて所定部位で染色体ＤＮＡの切断に触媒作用を起こし、それによって標的突然変異誘発［非特許文献１；非特許文献２］及び標的相同組換え［非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５］の両方が促進された。
【００１６】
Ｌｌｏｙｄらは、ＺＦＰを用いて植物遺伝子において標的突然変異誘発を誘導した。この手順において、ＺＦＮを用いて特異的なゲノム部位で２本鎖切断を引き起こした。非相同末端再結合（ＮＨＥＪ）による後の修復は、植物においてエラーを起こしやすいことが知られており、切断部位で突然変異を生じる。熱ショックプロモーターにより駆動されたＺＦＮ遺伝子及びその標的の両方を担持する構築物がシロイヌナズナ・ゲノムに導入された。苗発育中の熱ショックによるＺＦＮ発現の誘導によって、１つの標的につき０．２回の突然変異の頻度でＺＦＮ認識配列において突然変異が生じた。特徴を記述された１０６個のＺＦＮ誘導突然変異の内、８３個（７８％）が１〜５２ｂｐの単純な欠失であり（４ｂｐの中央値）、１４個（１３％）が１〜４ｂｐの単純な挿入であり、そして９個（８％）が挿入を伴う欠失であった。
【００１７】
Ｐｏｒｔｅｕｓ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅは、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合を用いてヒト細胞内の外来性の統合染色体ＧＦＰ遺伝子内の遺伝子欠損の修正を示すことができた。Ｂｉｂｉｋｏｖａらは、ショウジョウバエ胚内のｙｅｌｌｏｗ遺伝子座においてＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合が介在する標的組換えを示した。Ｕｒｎｏｖらはは、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合タンパク質を使用して、ヒト細胞内において、内在ＩＬ−２Ｒγ遺伝子座で標的組換えを２０％に近い頻度で得た。ＺＦＰ融合なしで、標的組換えは、約５０万個の内で約１〜２個の細胞の頻度で発現する。
【００１８】
しかしながら、上記の構築物のいずれもミトコンドリアにおいて使用されてこなかった。それ故、ＺＥＰ等のＤＮＡ結合性タンパク質をミトコンドリアにおいて使用することができるのか、そしてその場合においてかかるタンパク質がどのようにミトコンドリアに対して標的とされ得るのかについて確認する必要がある。
【非特許文献１】Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１１６９−１１７５
【非特許文献２】Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ  １０２：２２３２−２２３７
【非特許文献３】Ｐｏｒｔｅｕｓ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：７６３
【非特許文献４】Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：７６４
【非特許文献５】Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−６５１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
本発明者らは、ミトコンドリアに対してあらゆる所望のポリペプチドを標的とすることが、単にそれにミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）を融合することによってでは可能ではないことを発見した。転写因子等のＤＮＡ結合性ポリペプチドが包含される多くのポリペプチドは、細胞過程におけるそれらの正常な役割に適するように、核局在化の方へ強く偏ると思われる。ＭＴＳの使用は、ミトコンドリアの環境に異種のＤＮＡ結合性ポリペプチドの送達に十分でないと思われる。
【００２０】
本発明は、ミトコンドリアへＤＮＡ結合性ポリペプチドを送達するための方法及び組成物を提供する。更に、本発明は、ミトコンドリア基質内のミトコンドリアに対して異種のＤＮＡ結合性タンパク質の使用を提供する。
【００２１】
それ故、第１の態様においては、ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）及び核外移行シグナル（ＮＥＳ）に融合させた、ＤＮＡ結合性ポリペプチドをコードするコード配列を含む核酸構築物が提供される。
【００２２】
好ましくは、ミトコンドリアのゲノムを修飾するために用いられ得る、転写活性化ドメイン又は転写抑制ドメイン、制限酵素或いは他のＤＮＡ修飾酵素等のエフェクター分子（即ち、機能的ドメイン）が、ＤＮＡ結合性タンパク質に融合される。
【００２３】
好ましくは、機能的ドメインは、制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインである。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼは、通常は分離可能なＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインを有する。それ故、任意の所望位置でｍｔＤＮＡを切断し得、そして任意の標的配列に合わせて調整され得る特異性を有する人工制限酵素を産生するために、切断ドメインを代替的なＤＮＡ結合タンパク質に付けることができる。それ故、好ましくは、制限エンドヌクレアーゼはＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼである。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの例としては、ＦｏｋＩ，ＢｐｍＩ，ＢｓｇＩ  ａｎｄ  ＭｂｏＩＩが挙げられる。
【００２４】
転写活性化ドメインや転写抑制ドメイン等の、代替的なエフェクター分子及び機能的ドメインを用いて、ｍｔＤＮＡ遺伝子の転写を修飾することができる。
【００２５】
好都合にも、ＤＮＡ結合性タンパク質が結合する配列（「標的配列」）は、ミトコンドリアゲノム内の固有の部位である。この部位は好ましくはミトコンドリア病又は遺伝病と関連しており、このことは、それが、ミトコンドリア病又は遺伝病において発現する突然変異の部位か、若しくはその近くにあることを意味する。このような方法において、疾患と関連した突然変異が起こるミトコンドリアゲノムだけが、本発明のポリペプチドによって影響される。例えば、上記のように、前記部位は、疾患と関連する点変異の部位であってよい。
【００２６】
エフェクター分子が制限酵素である場合、前記固有の部位は、好ましくは野生型ミトコンドリアで発現しない。このように、突然変異を有するミトコンドリアゲノムは、選択的に不活性化され得る。
【００２７】
しかしながら、前記機能的ドメインが転写調節ドメインである場合、前記部位は、野生型ミトコンドリアゲノム内、しかし好ましくは融合ポリペプチドの結合が遺伝子発現に影響を及ぼさない場所に発現し得る。
【００２８】
ミトコンドリア病又は遺伝病に「関連すること」によって、核酸結合タンパク質の結合の部位も通常突然変異の結果としてミトコンドリア病又は遺伝病の原因となるミトコンドリアゲノム内でのみ発現するということが示されることが意図されるか、若しくは、前記部位がミトコンドリア病又は遺伝病と関連する遺伝子の調節の原因となる場所であることが示されることが意図される。
【００２９】
本発明に記載の核酸は、真核細胞において発現することが可能で、且つ核酸の転写及び翻訳を確保するために必要な調節配列を含むベクター内に存在することができる。前記ベクターは、真核細胞において一時的に発現することができるか、若しくは安定して発現することができる。ＭＶＡ、レンチウイルスベクター及びアデノ関連ウィルスベクター等の突然変異体が包含される、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、サイトメガロウィルスベクター、ワクシニア及び他のポックスウイルス等のウィルスベクターの使用は、当該技術分野で知られており、そしてｉｎ  ｖｉｖｏにおける真核細胞の形質転換の有効な手段である。
【００３０】
有利な点としては、ＤＮＡ結合性ポリペプチドはミトコンドリアに対して異種である。ミトコンドリアの環境に固有ではないタンパク質は、ミトコンドリアに送達することがより困難であると考えられ、本発明の方法は、そのようなポリペプチドの送達に特に有利である。
【００３１】
好ましくは、本発明において有用なＤＮＡ結合性タンパク質は、転写因子、特に転写因子のＤＮＡ結合ドメインに由来する。特に好ましいＤＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーポリペプチドである。
【００３２】
ＤＮＡ結合性タンパク質は天然のタンパク質であり得るか、若しくはライブラリー、必要に応じて、更に本明細書において記載されるような、ランダム化されたか或いは部分的にランダム化されたポリペプチドのライブラリーから選択され得る。更に、ＤＮＡ結合性タンパク質及び特にＺＦＰは、確立された原理を用いて合理的に設計され得る。
【００３３】
本発明に記載のベクターは、ミトコンドリアの基質にＤＮＡ結合性ポリペプチドを送達するために使用することができる。そのようなポリペプチドは、ミトコンドリアＤＮＡの修飾、ミトコンドリアの遺伝子発現の調節、又は他の所望の目的のために使用することができる。
【００３４】
更なる一態様において、本発明の第１の態様による核酸構築物によって形質転換された真核細胞が提供される。また、本発明の核酸構築物によってコードされたタンパク質を含む細胞も提供される。
【００３５】
本発明の更なる一態様において、
（ａ）ｍｔＤＮＡ中の特異的部位（即ち、標的配列）と結合するＤＮＡ結合性ポリペプチド；
（ｂ）機能的ドメインのエフェクター分子；
（ｃ）ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）；及び
（ｄ）核外移行配列（ＮＥＳ）、を含む融合タンパク質が提供される。
【００３６】
好ましくは、本発明に記載の融合タンパク質は、上記態様において説明されたような属性及び特徴を有する。好都合にも、融合タンパク質は、部位特異的方法でｍｔＤＮＡに結合して、それを修飾する。特に好ましい一実施形態において、前記融合タンパク質は、特定のｍｔＤＮＡ分子を認識及び破壊することができる。
【００３７】
本発明は、本発明の上記態様による核酸ベクターを含む医薬組成物を更に提供するものである。前記医薬組成物は、注射或いは別の方法による生物への投与に適切な形態の核酸構築物を含む。ウィルスベクターは、多細胞生物における細胞の伝達に使用することができる。本発明に記載の医薬組成物は、ミトコンドリア異常を伴う疾患を治療する方法に有用であり、その方法は、それを必要とする被験体に本発明に記載の核酸構築物を含む組成物を投与することを含む。
【００３８】
また、ミトコンドリア病の治療のための医薬組成物の調製における本明細書に記載されるような核酸構築物の使用も提供される。
【００３９】
なお更なる一態様において、ミトコンドリアにポリペプチドを送達する方法であって、次のステップ：
（ａ）本発明の第１の態様による核酸構築物を調製すること；及び
（ｂ）核酸構築物を真核細胞内に導入すること、を含み、前記構築物が発現して前記ポリペプチドを産生し、そして前記ポリペプチドがミトコンドリアに入るような方法が提供される。
【００４０】
更なる一態様において、本発明は、ミトコンドリア基質内のミトコンドリアに対して異種のＤＮＡ結合性タンパク質の使用を提供するものである。本発明者らは、ＺＦＰ等の核に由来するＤＮＡ結合性タンパク質がそのＤＮＡ結合活性をミトコンドリア内に有することを見出した。従って、ミトコンドリアの遺伝子発現を調節する方法であって、ミトコンドリアに対して異種のＤＮＡ結合性タンパク質を該ミトコンドリアに送達することを含む方法が提供される。好ましくは、前記ＤＮＡ結合性タンパク質はＺＦＰである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（発明の詳細な説明）
特に定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法及び生化学における）によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子的、遺伝子的及び生化学的な方法（本明細書に参照により組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ  Ｅｄ（ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を一般に参照されたい）、化学法、医薬製剤及び患者への送達及び患者の治療のために標準的技法が用いられる。
【００４２】
Ａ．ＤＮＡ結合性ポリペプチド
「ＤＮＡ結合性ポリペプチド」という用語には、核酸と結合又は会合し得る任意のポリペプチドが包含される。この結合又は会合は、任意の種類の可逆的又は不可逆的な会合を介することができる。「ＤＮＡ結合性ポリペプチド」という用語は、本明細書において広範囲に使用される。しかしながら、ＤＮＡ以外の他のタイプの核酸が関連していてもよい。従って、一般に上記の用語は「核酸結合分子」という用語と置き換えることができるということが意図される。核酸は、一般にＲＮＡ又はＤＮＡであり、２本鎖又は１本鎖である。しかしながら、本発明の好ましい一態様において、「ＤＮＡ」に対する参照は、文字通りの意味のデオキシリボ核酸を意味し、特に本発明に記載のＤＮＡ結合性タンパク質についての標的であるミトコンドリア（ｍｔ）ＤＮＡを指す。ポリペプチドは、更にミトコンドリアＲＮＡを標的とすることができる。
【００４３】
本発明のＤＮＡ結合性ポリペプチドは、好ましくはミトコンドリアに非相同である。このことは、それらが、核内でコードされ且つ細胞質からミトコンドリアに送り出されるか、或いは野生型の形態でミトコンドリアゲノム内でコードされるかのいずれのミトコンドリアタンパク質でもないことを意味する。
【００４４】
本発明に記載のポリペプチドとしては、バクテリオファージ粒子の表面にディスプレイされるポリペプチドを挙げることができる。また、本発明によるポリペプチドとしては、バクテリオファージ粒子の外面上のエンベロープタンパク質の不可欠の部分として示されるポリペプチドのライブラリーも挙げることができる。ランダム化されたポリペプチドをコードするライブラリーの産生方法は、当該技術分野で知られており、本発明において適用することができる。例えば、国際公開第９６／０６１６６号；同第９８／５３０５７号；同第００／４２２１９号及び同第０１／４０７９８号参照されたい。ランダム化は全体又は部分であってよく；部分的ランダム化の場合、選択されたコドンは、好ましくはアミノ酸についての任意のものをコードし、終止コドンについてはコードしない。
【００４５】
ポリペプチドをライブラリーから選択する別の方法としては、ツーハイブリッド選択や細菌ディスプレイが挙げられる。ジンクフィンガーのツーハイブリッド選択は、Ｊｏｕｎｇｅｔ  ａｌ．９７（１３）：７３８２（２０００）、に記載されている。このシステムは、Ｈｕ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ，Ｍ．Ｇ．＆Ｈｏｃｈｓｃｈｉｌｄ，Ａ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０，８０−９４；Ｄｏｖｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．＆Ｈｏｃｈｓｃｈｉｌｄ，Ａ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３８６，６２７−６３０；並びにＤｏｖｅ，Ｓ．Ｌ．＆Ｈｏｃｈｓｃｈｉｌｄ，Ａ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２，７４５−７５４、に記載されるスクリーンの改変である。そのスクリーンにおいて、イーストツーハイブリッドシステムのように、ｌａｃＺリポーター遺伝子の転写活性化につながる方法で相互作用する２種の融合タンパク質がある。１つのタンパク質は、別のドメイン（Ｘ）に融合されるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から構成される。もう１つのタンパク質は、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットに融合される更なるドメイン（Ｙ）を含む。このアレンジメントにおいて、ｌａｃＺ発現の活性化には、適切なタンパク質−ＤＮＡ及びタンパク質−タンパク質の相互作用が必要とされる。即ち、ＤＢＤは、プロモーターの近くに配置されるＤＮＡ結合部位（ＤＢＳ）と結合しなければならず、そしてドメインＸは、同時にドメインＹと相互作用してプロモーターにＲＮＡポリメラーゼを補充しなければならず、これによって転写を活性化する。このシステムの主な長所は、ほとんど全てのタンパク質−ＤＮＡ（ＤＢＤ−ＤＢＳ）又はタンパク質−タンパク質（Ｘ−Ｙ）の相互作用が転写活性化を媒介しなければならないということである。しかしながら、ｌａｃＺはこのシステムにおけるリポーター遺伝子として使用されるので、候補を視覚的表現型によって同定しなければならない（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルｂ−Ｄ−ガラクトシドプレートには青色）。従って、１０５〜１０６より大きなサイズのライブラリーをスクリーンニングするために前記システム（この形態における）を容易に用いることはできない。それを使用して大きさが１０８より大きいライブラリーを解析することができるようにこの上述のシステムを改善するために、Ｊｏｕｎｇｅｔ  ａｌ．では、前記ｌａｃＺ遺伝子を選択可能なイーストＨＩＳ３遺伝子と置き換えられた。
【００４６】
ＤＮＡ結合性ポリペプチドは、ＤＮＡ結合性タンパク質（例えば、ＤＮＡ修復酵素、ポリメラーゼ、レコンビナーゼ、メチラーゼ、制限酵素、複製因子、ヒストン又はＤＮＡ結合構造タンパク質（例えば染色体骨格タンパク質））であるか、若しくはそれに由来するものであり；好ましくは、該ポリペプチドは転写因子に由来する。「由来する」は、ＤＮＡ結合性ポリペプチドが、転写因子、転写因子のフラグメント、転写因子に相同の配列、或いは転写因子、転写因子のフラグメント又は転写因子に相同の開始配列から完全に又は部分的にランダム化されたポリペプチドの内の好ましくは１つ以上を含むことを意味する。最も好ましくは、ＤＮＡ結合性ポリペプチドは、下記に定義される相同性算出アルゴリズムの内の１つを使用して、１つ以上の転写因子に対して少なくとも４０％相同的、より好ましくは少なくとも６０％相同的、更により好ましくは少なくとも７５％相同的、又は更に、例えばより８５％又は９０％又は更に９５％超相同的なポリペプチドを含む。
【００４７】
ＤＮＡ結合性ポリペプチドは、とりわけ、任意のタンパク質のＤＮＡ結合部分、例えばジンクフィンガー転写因子、Ｚｉｆ２６８、ＡＴＦファミリー転写因子、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ｂＺＩＰタンパク質、ＣＨＯＰ、ＮＦ−κＢ、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、ＭＤＭ、ｃ−ｊｕｎ、ｅｌｋ、血清反応因子（ＳＲＦ）、三重複合体因子（ＴＣＰ）；ＫＲＵＰＰＥＬ、奇数番目の体節を欠いた、偶数番目の体節を欠いた、及び他のキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子；イースト転写因子（例えばＧＣＮ４、ガラクトース誘導性転写因子のＧＡＬファミリー）；細菌性転写因子又はリプレッサー（例えばｌａｃＩｑ）或いはそのフラグメント又は誘導体を含み得る。当業者によって、誘導体は、例えば少なくとも４０％又はそれ以上の整数値の配列相同性であれば、それが由来する分子に機能的及び／又は構造的に関連があると判断されるであろう。
【００４８】
ＤＮＡ結合性ポリペプチドは、ランダム化されないポリペプチド、例えば天然由来のポリペプチドの「野生型」又は対立遺伝子変異体であり得、或いは相互に共有結合する天然由来のポリペプチドの非天然由来の組み合わせであり得、或いは特異的な突然変異体であり得、或いは完全又は部分的にランダム化されたポリペプチドであり得、好ましくは本明細書において記載されるようなＤＮＡ結合性タンパク質に構造的に関連し得る。
【００４９】
これらのＤＮＡ結合性ポリペプチドは、バクテリオファージ粒子の表面にディスプレイされ得、そして特定の実施形態においては、部分的にランダム化されたジンクフィンガータイプの転写因子であり、好ましくはジンクフィンガータイプの転写因子に少なくとも４０％の相同性（本明細書において記載されるように）を有する。
【００５０】
場合によっては、配列相同性は、構造的に重要な残基、或いは進化的に保存されることが知られているか若しくは疑われる残基に関して判断され得る。かかる例においては、特定の構造的配座について変異性であるか必須ではないことが知られている残基を相同性算出からあらかじめ計算に入れることができる。例えば、本明細書において説明されるように、ジンクフィンガーは、立体的なジンクフィンガー構造の形成に重要な特定の残基を有することで知られる。これらの場合、相同性は、フィンガー構造全体を含み得る約３０の残基の中の該重要なアミノ酸残基の内の約７個について認めることができる。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、相同性という用語は構造的相同性を指す。構造的相同性は、２個以上の分子の炭素原子の主鎖の主要部の構造的ＲＭＳ偏差を比較して推定することができる。前記偏差が５Å以下、好ましくは３Å以下、より好ましくは１．５Å以下である場合、好ましくは、分子は構造的に相同であると考えることができる。必ずしも構造的に相同的な分子が有意な配列相同性を示すというわけではない。
【００５２】
上記に記載の通り、ＤＮＡ結合性ポリペプチドは、ＤＮＡを結合しない分子を除去するように核酸に対する分子の結合を判定するための当該技術分野で知られているルーチンアッセイを使用して、本発明の方法でテストされる前に事前にスクリーニングすることができる。例えば、ＤＮＡ結合性ポリペプチド又はＤＮＡ結合性ポリペプチドのライブラリーを核酸に接触させ、そして結合を判定する。洗浄ステップ後に例えば蛍光を調べることによって結合を容易に判定することができるように、例えば蛍光団／蛍光色素等の検出可能な標識で核酸を標識付けすることができる。
【００５３】
結合性ポリペプチドが接触する核酸は、ランダムなオリゴヌクレオチドライブラリー又は超音波破砕されたゲノムＤＮＡ等の非特異的核酸であり得る。或いは、特異的な配列又は配列の部分的にランダム化されたライブラリーを使用することができる。
【００５４】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ結合性ポリペプチド及び核酸配列を提供する。上記のように、本発明の核酸及びポリペプチドのフラグメント、突然変異体、対立遺伝子及び他の誘導体は、好ましくは該配列との実質的な相同性を有する。本明細書で用いられる場合、「相同性」は、当業者によって類似であると判定されるに十分な特徴が２つの構成要素によって共有されることを意味する。好ましくは、相同性を用いて配列同一性を指す。従って、本発明の該ＤＮＡ結合性ポリペプチドの誘導体は、好ましくは該分子との実質的な配列同一性を有する。
【００５５】
本発明の文脈において、相同配列は、例えば本明細書における配列表に示すように、少なくとも５、好ましくは８、１０、１５、２０、３０、４０又は更にそれより多い残基または塩基について、本発明の分子（即ちその配列）と少なくとも６０、７０、８０又は９０％同一（或いはその間の任意の整数値）、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一である任意の配列を含むものとする。特に、通常は、必須ではない隣接した配列よりむしろ機能的に重要であると考えることができる分子の領域を基準にして相同性を判断しなければならない。本発明の文脈において、相同性は、類似性（即ち、類似の化学的性質／官能性を有するアミノ酸残基）に関しても判断され得るが、配列同一性に関して相同性を発現することが好ましい。
【００５６】
相同性比較は、目で、又はより普通には配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性の割合を算出することができる。
【００５７】
相同性の割合は、連続した配列について算出され得、即ちある配列は別の配列と配置され、ある配列内の各アミノ酸は一度に他の配列、即ち１つの残基内の対応するアミノ酸と直接比較される。これは、「ギャップのない」アラインメントと呼称される。通常、かかるギャップのないアラインメントは、比較的少ない数の残基（例えば５０未満の連続したアミノ酸）についてのみ実施される。
【００５８】
これは非常に単純且つ整合的な方法であるにもかかわらず、例えば、その他の場合の１対の同一の配列において１つの挿入又は欠失によって以下のアミノ酸残基のアライメントがずれることを考慮することができず、従ってグローバルアラインメントを実施する際に相同性の割合が大きく低下する可能性が出てくる。従って、大部分の配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度にペナルティを科すことなく可能な挿入及び欠失が考慮される最適なアラインメントを生じるように設計される。これは、局所的な相同性を最大にしようとするために「ギャップ」を配列アラインメント内に挿入することによって達成される。
【００５９】
しかしながら、同じ数の同一のアミノ酸について、できるだけ少ない数のギャップを有する配列アラインメント（２つの比較された配列間のより高い関連性を反映する）が多くのギャップを有するものより高いスコアを達成するように、これらのより複雑な方法は、アラインメント内で生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てるものである。ギャップの存在について比較的高いコストを課し、ギャップ中の各配列残基についてより小さいペナルティを科する「アフィンギャップコスト（ａｆｆｉｎｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔ）」が通常は使用される。これは、最も普通に使用されるギャップスコアリングシステム（ｇａｐ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）である。もちろん、高いギャップペナルティは、より少ないギャップを有する最適化されたアライメントを生じる。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティが修飾されるのを可能にする。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用するときには、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔ  ｐａｃｋａｇｅ）（以下参照）を用いる際には、アミノ酸配列についてのデフォルトギャップペナルティはギャップについて−１２、かつ各伸長について−４である。
【００６０】
それ故、最大の相同性の割合の計算は、まず、ギャップペナルティを考慮して、最適アライメントの生成を必要とする。そのようなアライメントを行うための適当なコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ総合ソフトウェア（ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ  ｓｕｉｔｅ）が挙げられるが、それらに限定されることはない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方が、オフライン及びオンラインサーチのために入手可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ，７−５８〜７−６０参照）。しかしながら、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用することが好ましい。
【００６１】
最終的な相同性の割合は、同一性によって測定することができるが、アライメントプロセスはそれ自体、通常は、全か無かの対比較に基づかない。その代わり、化学的類似性又は進化による距離に基づく各対の比較にスコアを割り当てる、見積られた類似性スコアマトリックス（ｓｃａｌｅｄ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ）を一般に使用する。一般に使用されるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスであり、これは、プログラムのＢＬＡＳＴ総合ソフトウェアのためのデフォルトマトリックスである。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値（ｐｕｂｌｉｃ  ｄｅｆａｕｌｔ  ｖａｌｕｅ）又は、与えられるならば、カスタムシンボル比較表（ｃｕｓｔｏｍ  ｓｙｍｂｏｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔａｂｌｅ）（更なる詳細についてはユーザーマニュアル参照）を使用する。ＧＣＧパッケージについてはパブリックデフォルト値を使用することが好ましく、或いは他のソフトウェアの場合には、デフォルトマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。
【００６２】
ソフトウェアが最適アライメントを生じたならば、相同性の割合、好ましくは配列同一性の割合を計算することが可能である。ソフトウェアは、通常は配列比較の一部としてこれを行い、数で表した結果を生じる。
【００６３】
本発明によるＤＮＡ結合性ポリペプチドとしては、任意の原子、イオン、分子、巨大分子（例えばポリペプチド）又は核酸（例えばＤＮＡ）に結合することが可能なかかる構成要素の組み合わせを挙げることができる。好都合にも、本発明に記載される分子としては、核酸結合モチーフが判明している又は疑われるポリペプチドのファミリーを挙げることができる。これらには、例えば、ジンクフィンガータンパク質（下記参照）が包含され得る。また、本発明に記載の分子としては、当業者に知られているヘリックス・ターン・ヘリックスタンパク質、ホメオドメイン、ロイシンジッパータンパク質、ヘリックス・ループ・ヘリックスタンパク質又はβシートモチーフも挙げることができる。
【００６４】
本発明によれば、核酸結合分子のライブラリーを提供するために、１つ以上の既知であるか疑わしい核酸結合ポリペプチドのＤＮＡ結合モチーフを有利にランダム化することができる。
【００６５】
結晶構造は、当該技術分野で知られている方法によって、核酸結合タンパク質の関連ＤＮＡ結合領域を選択又は予測する際に有利に用いられ得る。
【００６６】
同じ構造的ファミリーの内のタンパク質のＤＮＡ結合領域は、多くの場合保存されるか、若しくは相互に、例えばジンクフィンガーαヘリックス、ロイシンジッパー塩基性領域、ホメオドメインヘリックス３に相同である。
【００６７】
例えばヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）ファミリー及び／又はプローブ・ヘリックス（ＰＨ）ファミリーに由来する転写因子の他のファミリー、Ｃ４亜鉛結合ファミリー（ホルモン受容体（ＨＲ）ファミリーを含む）、Ｇａｌ４ファミリー、ｃ−ｍｙｂファミリー、他のジンクフィンガーファミリー、又は当業者に知られているＤＮＡ結合性タンパク質の任意の他のファミリーが、本発明の文脈において使用され得る。
【００６８】
これらのファミリーの１つ以上に由来する１つ以上のポリペプチドを都合よくランダム化して本発明に用いるための分子のライブラリーを提供することができる。好ましくは、核酸結合に重要であることが知られているアミノ酸残基をランダム化することができる。しかし、ＤＮＡに接触するアミノ酸が存在する２次構造の要素の外側のアミノ酸配列に対する改変によって分子のＤＮＡ結着性に影響を及ぼし得る配座変化が引き起こされる可能性があることから、ＤＮＡ結合性ポリペプチドの他の領域をランダム化することは望ましい可能性がある。
【００６９】
例えば、ランダム化はジンクフィンガーポリペプチドの改変を伴うことができ、該改変はＤＮＡ又はタンパク質のレベルにおいて達成される。ジンクフィンガーポリペプチドの突然変異誘発及びスクリーニングは、任意の適切な手段によって達成され得る。好ましくは、突然変異誘発は、例えば突然変異体ポリペプチドコードしこれらを発現して種々の異なるタンパク質を得る新規な遺伝子を合成することによって、核酸レベルで実施される。或いは、所望の突然変異遺伝子を得るために、例えば部位特異的又はランダムな突然変異誘発によって既存の遺伝子自体を変異させることができる。更なる選択肢は、単一のポリペプチドにおいて、個々のジンクフィンガー等の天然由来のＤＮＡ結合ドメインのランダムなアレンジメントを生成することである。
【００７０】
突然変異は、当業者に知られている任意の方法によって実施され得る。しかしながら、対象のタンパク質をコードする核酸配列の部位特異的変異誘発が好ましい。Ｍ１３等の１本鎖ファージを使用する方法からＰＣＲに基づく技法（”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＭＡ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｔ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ（ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９０）参照）まで、部位特異的変異誘発のための多くの方法が当該技術分野で知られている。好ましくは、商業的に入手可能なＡｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅ  ＩＩ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書に従って使用することができる。
【００７１】
本明細書において提供されるコードによって残基の選択が得られる場合、ジンクフィンガー結合のモチーフのランダム化は、好ましくはアミノ酸残基に関する（下記参照）。例えば、好ましくは疎水性アミノ酸を回避しつつ＋１位、＋５位及び＋８位が都合よくランダム化され；また、核酸への結合に関与する位置、特に−１位、＋２位、＋３位及び＋６位は、好ましくは下記に関する基準によって得られる選択内でランダム化され得る。
【００７２】
突然変異遺伝子によって産生されるタンパク質のスクリーニングは、遺伝子を発現させ、次いでタンパク質産物の結合能力をアッセイすることによって好ましくは実施される。これが達成され得る単純且つ都合のよい迅速な方法はファージディスプレイによるものであって、突然変異体ポリペプチドは、糸状バクテリオファージのコートタンパク質を有する融合タンパク質（例えば、バクテリオファージｍ１３の、又はバクテリオファージＦｄの遺伝子ＩＩＩの微量コートタンパク質ｐＩＩ）として発現し、そして突然変異遺伝子で形質転換されるバクテリオファージのキャプシドにディスプレイされる。親和性精製によって、標的核酸配列をプローブとして使用して直接ファージ面のタンパク質と結合させ、そして有利な突然変異体を有するファージを選択する。次いで、所望のファージのための突然変異体プールを濃縮して最終的に好ましいクローンを単離するために、細菌性宿主における継代によってファージを増幅し、選択及び増幅の更なるラウンドに供する。ファージディスプレイのための詳細な方法は当該技術分野で知られており、例えば米国特許第５，２２３，４０９号；Ｃｈｏｏ  ａｎｄ  Ｋｌｕｇ，（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４３１−４３６；Ｓｍｉｔｈ，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、に記載され、全ては参照により本明細書に組み込まれる。ファージディスプレイ用のベクターシステム及びキットは、例えばＰｈａｒｍａｃｉａから商業的に入手できる。
【００７３】
ジンクフィンガーポリペプチド等の特異的なペプチドリガンドは、ｌａｃリプレッサーＬａｃｌのＣ末端に結合するペプチドの大きなライブラリーを使用して、親和性選択によって標的に対する結合について更に選択され得る（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９，１８６５−９）。大腸菌において発現する場合、リプレッサーのタンパク質は、プラスミド上のｌａｃオペレータ配列に結合することによってコードプラスミドに物理的にリガンドを結合する。
【００７４】
完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏのポリソームディスプレーシステムもまた報告されており（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９１，９０２２−６）、新生ペプチドは、それをコードするＲＮＡにリボソームを介して物理的に結合される。米国特許第６，７３３，９７０号も参照されたい。
【００７５】
更なるｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択方法については、国際公開第９８／３７１８６号、同第２００４／２２７４６号及び英国特許第２，３３８，２３７号に記載される。
【００７６】
ツーハイブリッド選択法は、国際公開第０１／８８１９７号に開示される。
【００７７】
更にまた、ポリペプチドは、物理的コンパートメント、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏの皿のウェル又は細胞下コンパートメントに分割することができ、或いは小さな流体粒子又は液滴（例えば乳剤）に分割することができ；この主題における更なる教示は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（国際公開第９９／０２６７１号参照）及びＣｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（国際公開第０２／１８６４８号）に見出すことができる。
【００７８】
本発明に用いられるライブラリーは、選択が下記で参照される基準において得られる位置でランダム化することができる。これらの基準によって、所定の位置における所望のコドン利用に関するインフォームドチョイスを当業者が行うことが可能になる。
【００７９】
ＰＨファミリーポリペプチドの認識ヘリックスは、核酸におけるリン酸塩の結合に関与する重要な構造要素である保存されたＡｒｇ／Ｌｙｓ残基を含む。塩基特異性は、ヘリックスのアミノ酸１、４、５及び８に起因する。これらの残基は好都合にも変化し得るものであって、アミノ酸１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅから選択されてＡ、Ｃ、Ｇ又はＴに結合する可能性をもたらす。同様に、アミノ酸４は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＬｅｕから選択されてＡ，Ｃ，Ｇ又はＴに結合する可能性をもたらす。好ましくは、（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４：ＰＮＡＳ  ｖｏｌ  ９１  ｐｐ１２３５７−６１）で説明される基準は、塩基特異的な方法であるにせよ、或いはリン酸塩主鎖に対する結合を介してであるにせよ、核酸を有する分子の相互作用に影響を及ぼすそれらのアミノ酸をランダム化するために使用され、それによって本発明の方法に用いるための核酸結合分子のライブラリーが得られる。
【００８０】
同様に、ヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）ファミリーのポリペプチド分子をランダム化して分子のライブラリーを得ることができ、少なくともその幾つかは、本発明の方法で使用される際に好ましくは核酸を結合し得る。特に、アミノ酸１、２、５及び６は、ＨＴＨモチーフにおける塩基特異的な核酸結合において保存され、機能することが知られている。その結果、少なくともアミノ酸１、２、５又は６は、本発明による使用のための分子を産生するようにランダム化されることが好ましい。例えば、アミノ酸１、５及び６は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ又はＬｅｕから選択することができ、そしてアミノ酸２は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｌａから選択することができる。
【００８１】
本発明の方法において好都合に使用され得る転写因子の別のファミリーは、ホルモン受容体型転写因子が包含されるＣ４ファミリーである。このファミリーのポリペプチドを用いて、核酸との会合がリガンドによって調節可能である核酸結合分子の選択に使用される分子を提供することができる。Ｃ４のモチーフのアミノ酸１、４、５及び９は、ＤＮＡの接触に関与することが知られており、従って好ましくはこれらの残基を改変してリガンド依存した方法でＤＮＡを結合する複数の異なる分子が得られる。例えば、アミノ酸１及び５はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ又はＬｅｕから選択され、そしてアミノ酸４及び９はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔから選択される。
【００８２】
ＤＮＡ結合性ポリペプチドの特に好ましい例としては、当該技術分野でよく知られているように、ジンクフィンガーとして知られる結合モチーフを介して標的核酸配列と結合するＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガー結合タンパク質がある。ジンクフィンガー核酸結合タンパク質における各ジンクフィンガーには、核酸結合配列において核酸の三つ組又は重なる四つ組への結合を決定する役割がある。好ましくは、各結合タンパク質には、２つ以上のジンクフィンガー、例えば２、３、４、５、６又はそれより多くのジンクフィンガーがある。
【００８３】
ジンクフィンガーの一般的な構造はαヘリックスに結合するβターンを含むものであって、前記βターンは前記ヘリックスに対するアミノ末端基である。ジンクフィンガー内の４つのアミノ酸残基は、前記フィンガーの構造を安定させる亜鉛イオンを配位する。最初の２つの亜鉛配位残基（多くの場合、システイン残基）は、βターン内に位置する。その他の２つの亜鉛配位残基（多くの場合、ヒスチジン残基）は、ジンクフィンガーのαヘリックス部分内に位置する。標準的な亜鉛配位残基の内の１つが異なるアミノ酸（例えばＣｙｓ３−Ｈｉｓジンクフィンガー）で置換された修飾ジンクフィンガーは、国際公開第０２／５７２９３号に記載されており、本明細書に記載されるポリペプチドにおいて使用され得る。
【００８４】
ジンクフィンガー結合モチーフは、当業者によく知られた構造であり、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１６０９−１６１４；Ｂｅｒｇ（１９８８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：９９−１０２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：６３５−６３７に記載され、ＵＳＳＮ第０８／４２２１０７号に対応する国際特許出願ＷＯ９６／０６１６６号及びＷＯ９６／３２４７５号を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８５】
本明細書で使用される「核酸」とは、天然の核酸塩基又は合成の塩基又はそれらの混合物から構成されるＲＮＡ及びＤＮＡの両方を指す。しかしながら、好ましくは、本発明の結合タンパク質はＤＮＡ結合性タンパク質である。
【００８６】
一般に、好ましいジンクフィンガーのフレームワークは、以下の構造を有する。
【００８７】
【数１】
2009520488.tif 000002
ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、下付き添字の数はＸで表される残基の可能な数を示す。
【００８８】
好ましい本発明の態様において、ジンクフィンガーの核酸結合モチーフは、以下の１次構造を有するモチーフとして表される。
【００８９】
【数２】
2009520488.tif 000003
ここで、Ｘ（Ｘａ、Ｘｂ及びＸｃを含む）は任意のアミノ酸である。Ｘ２−４及びＸ２−３は、それぞれ２又は４或いは２又は３のアミノ酸の存在を指す。共に亜鉛金属原子を配位するＣｙｓ残基及びＨｉｓ残基は、αヘリックスの＋４位のＬｅｕ残基のように、太字のテキストにおいてマークされ、通常は不変である。
【００９０】
この表現に対する改変は、アミノ酸の挿入、変異又は欠失によって、必ずしもジンクフィンガーの機能を無効にすることなく生じるか若しくは生じさせることができる。例えば、第２のＨｉｓ残基はＣｙｓで置換することができることが知られており（Ｋｒｉｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４５１８−４５２３）、そして幾つかの状況では＋４のＬｅｕがＡｒｇと置換され得ることが知られている。Ｘｃの前のＰｈｅ残基は、Ｔｒｐ以外の任意の芳香族で置換することができる。更に、実験によって、好ましい構造からの逸脱及びジンクフィンガーに対する残基の割当が許容され、特定の核酸配列に対する結合に有益であることが更に証明され得る。しかしながら、このことを考慮に入れる場合でさえ、４つのＣｙｓ残基又はＨｉｓ残基と接触する亜鉛原子によって配位されるαヘリックスを含む一般的な構造は変化しない。本明細書で使用される上記の構造（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２タイプの全てのジンクフィンガー構造を表す例示的な構造として取り上げられる。
【００９１】
好ましくは、ＸａはＦ／γ−Ｘ又はＰ−Ｆ／γ−Ｘである。この文脈において、Ｘは任意のアミノ酸である。好ましくは、この文脈において、ＸはＥ、Ｋ、Ｔ又はＳである。Ｑ、Ｖ、Ａ及びＰは、あまり好ましくないが想定される。残留するアミノ酸は可能なままである。
【００９２】
好ましくは、Ｘ２−４は、４つではなく２つのアミノ酸からなる。これらのアミノ酸で第１のものは、任意のアミノ酸であってよいが、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ｔ、Ｐ及びＲが好ましい。好都合には、それはＰ又はＲである。任意のアミノ酸を用いることができるが、これらのアミノ酸の第２のものは好ましくはＥである。
【００９３】
好ましくは、ＸｂはＴ又はＩである。
【００９４】
好ましくは、ＸＣはＳ又はＴである。
【００９５】
好ましくは、Ｘ２−３は、Ｇ−Ｋ−Ａ、Ｇ−Ｋ−Ｃ、Ｇ−Ｋ−Ｓ又はＧ−Ｋ−Ｇである。しかしながら、例えばＭ−Ｒ−Ｎ又はＭ−Ｒの形態においては、好ましい残基からの逸脱が可能である。
【００９６】
好ましくは、リンカーはＴ−Ｇ−Ｅ−Ｋ又はＴ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｐである。
【００９７】
上記で述べたように、主要な結合−相互作用は、アミノ酸−１、＋２、＋３及び＋６において生じる。アミノ酸＋４及び＋７は、ほとんど不変である。残留するアミノ酸は、基本的には任意のアミノ酸でもあってよい。好ましくは、＋９位は、Ａｒｇ又はＬｙｓが占める。好都合には、＋１位、＋５位及び＋８位は疎水性アミノ酸でない、即ち、ＰｈｅやＴｒｐやＴｙｒではない。
【００９８】
従って、上記をまとめると、最も好ましい態様においては、所定の核酸の四つ組と特に結合するジンクフィンガー核酸結合モチーフにおけるあらゆる残基を定義することが可能である。
【００９９】
本明細書において提供されるコードは全く厳密なものであるというわけではなく、ある種の選択が提供される。例えば、＋１位、＋５位及び＋８位は、任意のアミノ酸割当を有することができるが、一方で他の位置は、ある種の選択肢を有することができ、例えば、この基準によって、中心的なＴ残基に対する結合のために、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＶａｌのいずれか１つを＋３位で使用することができる。最も広義には、あらゆる定義された標的核酸の四つ組に結合し得る極めて大きい数のタンパク質が記載される。
【０１００】
しかしながら、好ましくは、可能性の数は著しく減少してよい。例えば、重要でない残基＋１、＋５及び＋８には、デフォルトオプションとしてそれぞれ残基Ｌｙｓ、Ｔｈｒ及びＧｌｎが占めることができる。他の選択の場合、例えば、最初に与えられたオプションは、デフォルトとして使用され得る。従って、上記のコードによって、標的の四つ組と結合する単一の定義されたポリペプチド（「デフォルト」ポリペプチド）の設計が可能になる。
【０１０１】
ジンクフィンガー結合タンパク質のαヘリックスは、ジンクフィンガーのＮ末端からＣ末端の配列に対応するために１次核酸配列が３’側から５’側にかけて配置されるように核酸鎖に逆平行に並ぶ。核酸配列は、従来は５’側から３’側にかけて並びにアミノ酸配列Ｎ末端からＣ末端にかけて記されるため、核酸配列及びジンクフィンガータンパク質を慣行に従って並べる場合、核酸の鎖が３’側から５’側にかけて並ぶことからジンクフィンガーの１次相互反応は核酸の鎖に対して起こるという結果となる。これらの慣行は、本明細書において用いられる命名法において採用される。しかしながら、自然界においては、タンパク質ＧＬＩのフィンガー４等の特定のフィンガーは核酸の＋鎖と結合するということに留意しなければならない（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）ＮＡＲ  ２２：３３９７−３４０５並びにＰａｖｌｅｔｉｃｈ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１７０１−１７０７参照）。本発明に記載のＤＮＡ結合性ポリペプチドへのかかるフィンガーの組込みが想定される。
【０１０２】
本発明には、以下の出版番号を有するＰＣＴ特許出願におけるジンクフィンガーポリペプチドについて記載される基準を取り込むことができる：国際公開第９８／５３０５７号、同第９８／５３０６０号、同第９８／５３０５８号及び同第９８／５３０５９号。これらの文書においては、合理的な設計によって所望の核酸配列を結合し得るジンクフィンガーポリペプチドを設計するための改良された技法が記載される。例えば国際公開第９６／０６１６６号に記載されるファージディスプレイ等の選択手順と組み合わせて、これらの技法は、実際に任意の所望の配列を確認し得るジンクフィンガーポリペプチドの産生を可能にする。
【０１０３】
合理的な設計によって部分的に産生されるＺＦＰは、上記のもの等の設計基準による残基の選択によって１つ以上のアミノ酸位を決定することによって変異を低下させたライブラリーから選択されるＺＦＰであってよい。合理的な設計で完全に産生されるＺＦＰは、ライブラリーから選択なしに設計基準から設計される。
【０１０４】
上記教示に従って設計及び／又は選択されるジンクフィンガー結合モチーフは、多数のジンクフィンガーを有する核酸結合ポリペプチド分子に結合され得る。好ましくは、タンパク質は少なくとも２個のジンクフィンガーを有する。自然界において、Ｔｒａｍｔｒａｃｋ等の２個のジンクフィンガーのタンパク質が知られているが、ジンクフィンガー結合タンパク質は、一般に少なくとも３個のジンクフィンガーを有する。少なくとも３個のジンクフィンガーの存在が好ましい。核酸結合タンパク質は、必要なフィンガーの端を端に、Ｎ末端をＣ末端に結合することによって構成される。好ましくは、これは、全ての結合タンパク質をコードする複合核酸コード配列を産生するためにジンクフィンガーをコードする関連の核酸配列を共に結合することによって生じさせる。
【０１０５】
「リーダー」ペプチドをＮ末端フィンガーに付加することができる。好ましくは、リーダーペプチドは、ＭＡＥＥＫＰである。
【０１０６】
更に、リンカーを用いてジンクフィンガーモチーフを共に結合してＤＮＡ結合性ポリペプチドを作製することができ、かかるリンカーは、ＷＯ２００１５３４８０号に記載されており、そして通常はＧＥＫＰ、ＧＥＲＰ、ＧＱＫＰ及びＧＱＲＰから選択される標準的なリンカー配列の構造を有する。より好ましくは、リンカー配列は、ＧＧＥＫＰ、ＧＧＱＫＰ、ＧＧＳＧＥＫＰ、ＧＧＳＧＱＫＦ、ＧＧＳＧＧＳＧＥＫＰ及びＧＧＳＧＧＳＧＱＫＰから選択される配列を含む。また、インターフィンガー（ｉｎｔｅｒ−ｆｉｎｇｅｒ）リンカーに関する更なる開示については、米国特許第６，４７９，６２６号及び第６，９０３，１８５号を参照されたい。
【０１０７】
Ｂ．エフェクター分子及び機能的ドメイン
本発明によれば、ミトコンドリアの効果を媒介するために、エフェクター分子又は機能的ドメインが好ましくはＤＮＡ結合性タンパク質に融合される。本発明のＤＮＡ結合性タンパク質は、遺伝子発現の調節のための転写調節ドメインと任意に会合し得る。ＤＮＡ結合性タンパク質は、１つ以上の調節ドメイン、或いは２つ以上の調節ドメイン、即ち同じドメイン又は２つの異なるドメインの２つのコピーである２つ以上のドメインと共有結合又は非共有結合で会合し得る。調節ドメインは、例えば融合タンパク質の一部としてアミノ酸リンカーを介してＤＮＡ結合性タンパク質に共有結合することができる。ＤＮＡ結合性タンパク質はまた、例えばロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン又はＦＫ５０６結合タンパク質等、非共有の二量体化ドメインを介して調節ドメインと会合することができる（例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：５３９（１９９１），Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｋｌｅｎｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：８２２−８２６（１９９６）；及びＰｏｍｅｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：９６５（１９９８）参照）。調節ドメインは、ＤＮＡ結合性タンパク質のＣ末端又はＮ末端を含む任意の適切な位置でＤＮＡ結合性タンパク質と会合することができる。
【０１０８】
ＤＮＡ結合性タンパク質に付加するための一般的な調節ドメインとしては、例えば、転写因子（アクティベーター、リプレッサー、コアクティベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、核ホルモン受容体、腫瘍遺伝子転写因子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）；ＤＮＡ修復酵素並びにその関連因子及び修飾子；ＤＮＡ再構成酵素並びにその関連因子及び修飾因子；クロマチン関連タンパク質及びその修飾因子（例えばキナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ）；及びＤＮＡ修飾酵素（例えばメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）並びにその関連因子及び修飾因子に由来するエフェクタードメインが挙げられる。
【０１０９】
調節ドメインを得ることができる転写因子ポリペプチドとしては、調節転写及び基底転写に関与するものが挙げられる。かかるポリペプチドとしては、転写因子、そのエフェクタードメイン、コアクティベーター、サイレンサー、核ホルモン受容体（例えば、転写に関与するタンパク質及び核酸要素の概要については、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８４：８２５−３０（１９９６）；一般の転写因子についての概要は、Ｂａｒｎｅｓ＆Ａｄｃｏｃｋ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２５  Ｓｕｐｐｌ．２：４６−９（１９９５）並びにＲｏｅｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７３：１６５−７１（１９９６）を参照）。転写因子を専門とするデータベースが知られている（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：６３０（１９９５）参照）。核ホルモン受容体の転写因子は、例えばＲｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．３８：４８５５−７４（１９９５）に記載される。転写因子のＣ／ＥＢＰファミリーの概要は、Ｗｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９３：１７１−８５（１９９５）に示される。核ホルモン受容体によって転写調節を媒介するコアクティベーター及びコリプレッサーは、例えばＭｅｉｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３４（２）：１５８−９（１９９６）；Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３４２−５（１９９６）；及びＵｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：４９８−５０２（１９９８）で概説される。血液生成の調節に関与するＧＡＴＡ転写因子は、例えばＳｉｍｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：９−１１（１９９５）；Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：９９−１０７に記載される。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）及びその関連のＴＡＦポリペプチド（ＴＡＰ３０、ＴＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１１０、ＴＡＦ１５０及びＴＡＦ２５０が包含される）は、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ及びＴｊｉａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：４０３−９（１９９４）及びＨｕｒｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６９−７５（１９９６）に記載される。例えば、転写因子のＳＴＡＴファミリーは、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−８（１９９６）で概説される。疾患に関与する転写因子は、Ａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５６１−９（１９９６）で概説される。
【０１１０】
一実施形態において、ヒトＫＯＸ−１タンパク質に由来するＫＲＡＢ抑制ドメインは、転写リプレッサーとして使用される（Ｔｈｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２：３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：４５１４−４５１８（１９９４）；また実施例ＩＩＩも参照）。別の一実施形態において、ＫＡＰ−１（ＫＲＡＢコリプレッサー）は、ＫＲＡＢと共に使用される（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２０６７−２０７８（１９９６））。或いは、ＫＡＰ−１を単独でＤＮＡ結合性タンパク質と使用することができる。転写リプレッサーとして働く他の好ましい転写因子及び転写因子ドメインとしては、ＭＡＤ（例えば、Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６６３２−６６４２（１９９８）；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：１１４９−１１５９（１９９８）；Ｑｕｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：９６７−９７７（１９９８）；Ｌａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：７３７−７４８（１９９７）；Ｌａｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ：，Ｃｅｌｌ  ８９：３４９−３５６（１９９７）；及びＣｕｌｔｒａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２３５３−２３５９（１９９７）参照）；ＦＫＨＲ（横紋筋肉腫遺伝子内のフォークヘッド；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：３５４２−３５４６（１９９８）；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４１１８−４１３０（１９９８））；ＥＧＲ−１（初期成長反応遺伝子産物−１；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９５：８２９８−８３０３（１９９８）；及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））；ｅｔｓ２リプレッサー因子リプレッサードメイン（ＥＲＤ；Ｓｇｏｕｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４７８１−４７９３（１９９５））；及びＭＡＤ  ｓｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ；Ａｙｓｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５７７２−５７８１（１９９６））、が挙げられる。
【０１１１】
一実施形態において、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメインが転写アクティベーターとして使用される（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５９５２−５９６２（１９９７）参照）。活性化ドメインを与え得る他の好ましい転写因子としては、ＶＰ６４活性化ドメイン（Ｓｅｉｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｌ１：４９６１４９６８（１９９６））；核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ：Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８））；核因子κＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ＆Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）並びにＤｏｙｌｅ＆Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２９３７−２９４２（１９９７））；及びＥＧＲ−１（初期成長反応遺伝子産物−１；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９５：８２９８−８３０３（１９９８）；及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））が挙げられる。
【０１１２】
また、遺伝子調節に関与するポリペプチドを修飾するキナーゼ、ホスファターゼ及び他のタンパク質は、ＤＮＡ結合性タンパク質のための調節ドメインとして有用である。かかる修飾因子は、例えばホルモン類によって媒介される転写のオン／オフの切換に多くの場合関与する。転写調節に関与するキナーゼは、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４２：４５９−６７（１９９５），Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２８：２７９−８６（１９９３）及びＢｏｕｌｉｋａｓ，Ｇｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｙｏｔ．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．５：１−７７（１９９５）に概説されるが、一方でホスファターゼは、例えばＳｃｈｏｎｔｈａｌ＆Ｓｅｍｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．６：２３９−４８（１９９５）に概説される。核チロシンキナーゼは、Ｗａｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３７３−６（１９９４）に記載される。
【０１１３】
前述のように、有用なドメインはまた、腫瘍遺伝子の遺伝子産物（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー）並びにその関連因子及び修飾因子から得られることができる。腫瘍遺伝子は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ−Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５、に記載される。ｅｔｓ転写因子は、Ｗａｓｌｙｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：７−１８（１９９３）及びＣｒｅｐｉｅｕｘｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．５：６１５−３８（１９９４）に概説される。Ｍｙｃ腫瘍遺伝子は、例えば、Ｒｙａｎｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：７１３−２１（１９９６）に概説される。ｊｕｎ及びｆｏｓ転写因子は、Ｔｈｅ  Ｆｏｓ  ａｎｄ  Ｊｕｎ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｎｇｅｌ＆Ｈｅｒｒｌｉｃｈ，ｅｄｓ．（１９９４）に記載される。ｍａｘ腫瘍遺伝子は、Ｈｕｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５９：１０９−１６に概説される。ｍｙｂ遺伝子ファミリーは、Ｋａｎｅｉ−Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：８９−９８（１９９６）に概説される。ｍｏｓファミリーは、Ｙｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１９−２５（１９９３）に概説される。
【０１１４】
エフェクタードメインとしては、ＤＮＡ修復酵素並びにその関連因子及び修飾因子から得られる調節ドメインが挙げられる。ＤＮＡ修復系は、例えば、Ｖｏｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：３８５−９５（１９９２）；Ｓａｎｃａｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ  ２９：６９−１０５（１９９５）；Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ．１７：１−１９（１９９５）；及びＷｏｏｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１３５−６７（１９９６）で概説される。また、ＤＮＡ再構成酵素並びにその関連因子及び修飾因子は、調節ドメインとして使用され得る（例えば、Ｇａｎｇｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ５０：２６１−９（１９９４）；Ｓａｄｏｗｓｋｉ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：７６０−７（１９９３）参照）。
【０１１５】
同様に、調節ドメインは、ＤＮＡ修飾酵素（例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ）並びにその関連因子及び修飾因子に由来し得る。ヘリカーゼは、Ｍａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１６：１３−２２（１９９４）に概説され、メチルトランスフェラーゼは、Ｃｈｅｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：４−１０（１９９５）に記載される。また、ヒストンデアセチラーゼ等のクロマチン関連タンパク質及びその修飾因子（例えばキナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ）（Ｗｏｌｆｆｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：３７１−２  （１９９６））は、選択のＤＮＡ結合性タンパク質に対する付加のためのドメインとして有用である。一実施形態において、調節ドメインは、転写リプレッサーとして働くＤＮＡメチル基転移酵素である（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｙｎｇａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２６：２８３−２８９（１９９８）；Ｆｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９：１０１−１１６（１９９８）；Ｏｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２５３６−２５４０（１９９８）；並びにＺａｒｄｏ＆Ｃａｉａｆａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５１７−１６５２０（１９９８）参照）。
【０１１６】
別の一実施形態においては、Ｆｏｋ１等のＩＩｓ型エンドヌクレアーゼを機能的ドメインとして使用してＤＮＡ切断を引き起こす（例えば、国際公開第９５／０９２３３号及びＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２０１号参照）。かかる切断は、標的とされた突然変異誘発及び／又は標的とされた組換えを促進するために有用であり得る。例えば、国際公開第０３／８０８０９号、同第０３／８７３４１号、同第２００４／３７９７７号及び同第２００５／１４７９１号を参照されたい。該突然変異誘発又は標的とされた組換えが、遺伝子内で、その遺伝子を不活性化するように生じる場合、その結果は前記遺伝子の発現の抑制であり得る。
【０１１７】
クロマチン及びＤＮＡの構造、運動及び局所化を制御する因子並びにその関連因子及び修飾因子；微生物（例えば、原核生物、真核生物及びウイルス）に由来する因子、及びそれらに会合又はそれらを修飾する因子はまた、キメラタンパク質を得るために用いることができる。一実施形態において、リコンビナーゼ及びインテグラーゼは、調節ドメインとして使用される。一実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、転写アクティベーターとして使用される（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：３７１−３７２（１９９６）；Ｔａｕｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：４０８−４１１（１９９６）；及びＨａｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９５：３５１９−３５２４（１９９８）参照）。別の一実施形態においては、ヒストンデアセチラーゼが転写性リプレッサーとして使用される（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉ＆Ｔｈｉｒｅｏｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４４１４−２４４１９（１９９８）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）；及びＭａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２３７８１−２３７８５（１９９８）参照）。
【０１１８】
特定の実施形態において、エフェクター分子又は機能的ドメインは、制限エンドヌクレアーゼである。好都合には、それはＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインであり、最も好都合には、それはＦｏｋＩである。ジンクフィンガー―ヌクレアーゼ融合の概要については、Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５  ３３（１８）：５９７８−５９９０；また、Ｃｈａｄｒａｓｅｇａｒａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３８０（７−８）：８４１−８を参照されたい。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼは当該技術分野で知られており、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１９９１  Ａｐｒ；１００：１３−２６．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｇｅｎｅ  １９９１  Ｄｅｃ  ２０；１０９（ｌ）：１６９に概説される。
【０１１９】
Ｃ．ミトコンドリアのターゲティングシグナル及び核外移行シグナル
ミトコンドリアターゲティングシグナル（ＭＴＳ）は、当該技術分野で知られており、ミトコンドリア膜全体のパッセンジャーポリペプチドの輸送を行い、ミトコンドリア膜内のそれらの固定を促進する。通常は、ＭＴＳは、荷電性の疎水性且つヒドロキシル化されたアミノ酸残基である。ＭＴＳの例としては、ヒトチトクロームｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩＩのＮ末端領域、ヒトＡＴＰシンターゼのサブユニットｃのＰ１アイソフォームのＮ末端領域、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ標的配列のＮ末端領域が挙げられる。ミトコンドリア輸送メカニズム及びＭＴＳは、Ｐｆａｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：３３９−３４９に概説される。ミトコンドリアにポリペプチドを送達するＭＴＳの具体的な使用については、米国特許第２００４／００７２７７４号及びＴａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  ９：５３４−５４１に記載される。
【０１２０】
核外移行シグナル（ＮＥＳ）は当該技術分野で知られている。代表的なＮＥＳは、ロイシン及びイソロイシンを含む疎水性アミノ酸が豊富である。１つのエクスポートのメカニズムにおいて、ロイシンの豊富なＮＥＳは、核からのエクスポートを媒介するＣＲＭ１／ｅｘｐｏｒｔｉｎ１と相互作用する。ＮＥＳとしては、プロテインキナーゼ阻害剤（ＬＡＬＫＬＡＧＬＤＩＮ）、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ（ＬＱＬＰＰＬＥＲＬＴＬＤ）及びＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＬＧＬＫＬＥＥＬＥＬＥ）、ＭＶＭ  ＮＳ２（ＭＴＫＫＦ−ＧＴＬＴＩ）、ＮＭＤ３（ＬＡＥＭＬ−ＥＤＬＨＩ）、Ａｎ３（ＬＤＱＱＦ−ＡＧＬＤＬ）、ＩκＢα（ＭＶＫＥＬ−ＱＥＩＲＬ）、サイクリンＢ１（ＬＣＱＡＦ−ＳＤＶＩＬ）及びＴＦＩＩＩＡ（Ｌ−ＰＶＬ−ＥＮＬＴＬ）に由来するものが知られている。新規なＮＥＳの設計についての概要並びに教示については、Ｋｕｔａｙ  ａｎｄ  Ｇｕｅｔｔｉｎｇｅｒ，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５  Ｎｏ．３  Ｍａｒｃｈ  ２００５を参照されたい。
【０１２１】
ＭＴＳ及びＮＥＳは、当該技術分野で知られている手順によってＤＮＡ結合性タンパク質と融合させることが可能であり、米国特許第２００４／００７２７７４号、Ｔａｎａｋａｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  ９：５３４−５４１並びにＫｕｔａｙ  ａｎｄ  Ｇｕｅｔｔｉｎｇｅｒ，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５  Ｎｏ．３  Ｍａｒｃｈ  ２００５に記載される。
【０１２２】
Ｄ．ＤＮＡ結合性タンパク質をコードする核酸ベクター
本発明によるＤＮＡ結合性タンパク質をコードする核酸は、操作及び発現用のベクター内に組み込むことができる。この文脈において、ＤＮＡ結合性タンパク質は、本発明の方法に必要なＮＥＳ及びＭＴＳを含むものと理解される。ベクターを両方のクローニング目的で使用して必要な構築物を作製し、そしてミトコンドリアに対する核酸結合タンパク質の送達のために真核細胞内で構築物を発現する。
【０１２３】
本明細書で使用されるベクター（又はプラスミド）とは、発現又は複製のために非相同の核酸を細胞に導入するために用いられる個別の要素を指す。そのようなビヒクルの選択及び使用は十分に当業者の技術の範囲内である。多くのベクターが入手可能であり、適切なベクターの選択は、ベクターの用途、即ちそれはＤＮＡ増幅に用いられるものなのか若しくは核酸発現に用いられるものなのかかどうか、ベクターに挿入されるＤＮＡのサイズ並びにベクターで形質転換される宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅又はＤＮＡの発現）及びそれが適合する宿主細胞に依存する各種の成分を含む。前記ベクター成分としては、以下の：複製開始点、１個以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、転写終結配列及びシグナル配列の内の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
発現ベクター及びクローニングベクターの両方は、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において自己複製するのを可能にする核酸配列を一般に含む。通常は、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは無関係に自己複製するのを可能にするものであり、且つ複製開始点又は自己複製配列を含む。かかる配列は、種々の細菌、イースト及びウィルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製開始点は大部分のグラム陰性菌に適切であり、２μプラスミド開始点はイーストに適切であり、そして各種のウィルス開始点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は哺乳類細胞のクローニングベクターに有用である。一般に、哺乳動物発現ベクターが高レベルのＤＮＡ複製にコンピテントな哺乳類細胞（例えばＣＯＳ細胞）に使用されない限り、成分の複製開始点は哺乳動物発現ベクターのために必要とされない。
【０１２５】
大部分の発現ベクターはシャトルベクターである。即ちそれらは、生物の少なくとも１つの類において複製が可能であるが、発現のために生物の別の類にトランスフェクトすることができる。例えば、ベクターは、宿主細胞染色体とは無関係に自己複製することができない場合であっても、大腸菌内でクローン化され、次いで同じベクターがイースト、哺乳動物又は植物細胞内にトランスフェクトされる。ＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅され得、そしていかなる複製成分も有さない宿主細胞内に直接トランスフェクトされ得る。
【０１２６】
好都合には、発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、選択培養培地中で増殖する形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、培養培地中において生存しない。代表的な選択遺伝子は、抗生物質及び他の毒素（例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリン）に対する耐性を与えるタンパク質をコードし、栄養要求性欠乏を補完し、そして複合培地から入手不可能な重要な栄養物質を供給する。
【０１２７】
ベクターの複製は大腸菌内で都合よく行われることから、大腸菌の遺伝標識及び大腸菌の複製開始点が好都合に含まれる。これらは、抗生物質（例えばアンピシリン）に対する耐性を与える大腸菌複製開始点及び大腸菌遺伝標識を含むｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター又はｐＵＣプラスミド（例えばｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９）等の大腸菌プラスミドから得ることができる。
【０１２８】
哺乳類細胞のための適切な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ或いはＧ４１８又はハイグロマイシンに対する抵抗性を与える遺伝子等のＤＮＡ結合性タンパク質の核酸を取り上げるのにコンピテントな細胞の同定を可能にする。哺乳類の細胞形質転換体は、マーカーを取り上げて発現した形質転換体だけが生存するのに独自に適する選択圧の下で配置される。ＤＨＥＲ又はグルタミン合成酵素（ＧＳ）マーカーの場合、選択圧は、圧力が次第に増加し、それによって選択遺伝子と、ＤＮＡ結合性タンパク質をコードする結合されたＤＮＡとの両方の増幅（その染色体組込み部位で）が引き起こされる条件下で形質転換体を培養することによってかけることができる。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生をより必要とする遺伝子が、所望のタンパク質をコードし得る密接に関連した遺伝子と共に組換え細胞の染色体内で一列に反復されるプロセスである。所望のタンパク質の増加量は、通常増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１２９】
発現ベクター及びクローニングベクターは、宿主生物によって認識され、そしてＤＮＡ結合性タンパク質をコードする核酸に操作可能な状態で結合されるプロモーターを通常含む。かかるプロモーターは誘導性又は構成的であってよい。プロモーターは、制限酵素での消化によって原料ＤＮＡからプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＤＮＡ結合性タンパク質をコードするＤＮＡに操作可能な状態で結合される。天然のＤＮＡ結合性タンパク質のプロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を使用してＤＮＡをコードするＤＮＡ結合性タンパク質の発現を引き起こすことができる。
【０１３０】
哺乳類宿主のベクターからのＤＮＡ結合性タンパク質遺伝子転写は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス及びシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスのゲノムに由来する、アクチンプロモーター又は非常に強いプロモーター（例えばリボソームタンパク質プロモーター）等の異種の哺乳類のプロモーターに由来する、及び通常ＤＮＡ結合性タンパク質配列に会合するプロモーターに由来するプロモーターによって制御されるが、それはかかるプロモーターが宿主細胞系と適合している場合においてである。
【０１３１】
高等真核生物によるＤＮＡ結合性タンパク質をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大させることができる。エンハンサーは、向き及び位置について比較的独立している。多くのエンハンサー配列は、哺乳類の遺伝子（例えばエラスターゼ及びグロビン）から知られている。しかしながら、通常は、真核細胞ウィルスからエンハンサーを使用する。例としては、複製開始点（ｂｐ１００〜２７０）の後半側上ＳＶ４０エンハンサー、及びＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ＤＮＡ結合性タンパク質ＤＮＡの５’側又は３’側の位置でベクター中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０１３２】
好都合には、本発明によるＤＮＡ結合性タンパク質をコードする真核生物発現ベクターは、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含むことができる。ＬＣＲは宿主細胞クロマチンに組込んだ導入遺伝子の高レベルの組込み部位非依存性発現を導くことができ、それは、ベクターの染色体組込みが生じる永続的に形質転換した真核生物細胞株の文脈において、或いはトランスジェニック動物においてＤＮＡ結合性タンパク質遺伝子が発現する場合に特に重要である。
【０１３３】
また、真核生物ベクターは、転写の終了及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含むことができる。かかる配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’側及び３’側の非翻訳領域から一般に入手できる。
【０１３４】
発現ベクターは、そのようなＤＮＡの発現が可能なプロモーター領域等の調節配列と有効に結合する核酸を発現することが可能な任意のベクターを含む。従って、発現ベクターとは、適切な宿主細胞内への導入の際にクローン化ＤＮＡの発現をもたらす組換えＤＮＡ又はＲＮＡ構築物（例えばプラスミド、ファージ、組換えウィルス又は他のベクター）を指す。適切な発現ベクターは、当業者によく知られており、そして真核細胞及び／又は原核細胞において複製可能であるものを含み、且つエピソームのままであるか若しくは宿主細胞ゲノム内に組込まれるものを含む。例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質をコードするＤＮＡは、例えばＣＭＶエンハンサーに基づくベクター（例えばｐＥＶＲＦ等）の哺乳類細胞のｃＤＮＡの発現に適切なベクター内に挿入され得る（Ｍａｔｔｈｉａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＮＡＲ  １７，６４１８）。
【０１３５】
本発明によるベクターの構造は、従来のライゲーション法を使用する。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片は、必要なプラスミドを作製するために望まれる形態で切断、調整及び再ライゲーションされる。所望により、構成されたプラスミドの正しい配列を確認するための分析を既知の方法で実施する。発現ベクターを構成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写物を調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、そしてＤＮＡ結合性タンパク質の発現及び機能を評価するための分析を実施する適切な方法は、当業者に知られている。遺伝子の存在、増幅及び／又は発現は、例えば、本明細書において提供される配列に基づき得る適切に標識されたプローブを使用して、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を数量化するためのノーザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼイションによって、直接試料において測定することができる。当業者は、所望によりこれらの方法がどのように修正され得るのかについて容易に想定するであろう。
【０１３６】
本発明の別の一実施形態によって、上記の核酸を含む細胞が提供される。原核生物、イースト及び高等真核細胞等のかかる宿主細胞は、ＤＮＡを複製し、そしてＤＮＡ結合性タンパク質を産生するために使用することができる。本発明のベクターを含む真核生物によって、本発明によるＤＮＡ結合性タンパク質が産生され、そしてそれがミトコンドリアに運ばれる。適切な原核生物としては、真正細菌（例えば、大腸菌（例えば大腸菌Ｋ−１２株、ＤＨ５α及びＨＢ１０１）又は桿菌等のグラム陰性菌又はグラム陽性菌）が挙げられる。ベクターをコードするＤＮＡ結合性タンパク質に適切な更なる宿主としては、糸状菌又はイースト（例えばサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））等の真核微生物が挙げられる。高等真核細胞としては、植物細胞及び動物細胞（例えば昆虫や脊椎動物の細胞、特にヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞又は他の多細胞生物に由来する有核細胞等の哺乳類細胞）が挙げられる。近年、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖はルーチンの手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例としては、上皮細胞株又は線維芽細胞株（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞又は２９３Ｔの細胞）が挙げられる。この開示に関する宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養における細胞並びに多細胞の宿主生物内の細胞を含む。
【０１３７】
ＤＮＡは、当該技術分野で知られている方法を用いて、細胞に安定して組み込むことができ、若しくは一時的に発現させることができる。安定トランスフェクト細胞は、選択可能なマーカー遺伝子を有する発現ベクターに細胞を接触させ、そしてマーカー遺伝子を発現する細胞について選択的な条件下でトランスフェクト細胞を増殖させることによって調製することができる。一時的なトランスフェクタントを調製するために、細胞をリポーター遺伝子でトランスフェクトしてトランスフェクション効率を調べることができる。
【０１３８】
かかる安定的又は一時的にトランスフェクトされる細胞を産生するために、ＤＮＡ結合性タンパク質をコードする十分な量の核酸で前記細胞をトランスフェクトしてＤＮＡ結合性タンパク質の発現を可能にする。ＤＮＡ結合性タンパク質をコードするＤＮＡの正確な量は、実験に基づいて決定することができ、そして特定の細胞及びアッセイのために最適化することができる。
【０１３９】
宿主細胞は、本発明の上述の発現又はクローニングベクターでトランスフェクトされるか若しくは好ましくは形質転換され、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように修飾された従来の栄養培地中で培養される。異種ＤＮＡは、当該技術分野で知られている任意の方法（例えば、リン酸カルシウム共沈法又はエレクトロポレーションによる異種ＤＮＡをコードするベクターでのトランスフェクション）によって宿主細胞に導入されることができる。トランスフェクションの数多くの方法は当業者に知られている。異種ＤＮＡの作用の任意の徴候が宿主細胞内で生じる場合、成功したトランスフェクションが一般に認められる。形質転換は、使用される特定の宿主細胞に適切な標準的技法を使用して達成される。
【０１４０】
適切な発現ベクター内へのクローン化ＤＮＡの組込み、プラスミドベクター或いは１つ以上の異なる遺伝子をそれぞれコードするか又は直鎖状ＤＮＡとのプラスミドベクターの併用での真核細胞のトランスフェクション、並びにトランスフェクト細胞の選択は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１４１】
トランスフェクト又は形質転換された細胞は、当該技術分野で知られている培地及び培養方法を用いて好ましくは条件下で培養され、それによって、ＤＮＡによってコードされたＤＮＡ結合性タンパク質が発現される。適切な培地の組成物は当業者に知られており、そのためそれは容易に調製され得る。また、適切な培養培地は商業的に入手可能である。
【０１４２】
Ｅ．真核細胞
本発明の核酸構築物は、構築物内の、構築物によってコードされるＤＮＡ結合ペプチドを発現するために、真核細胞内に導入される。真核細胞は、例えば、動物細胞、菌類の細胞又は植物細胞であってよい。本発明の一実施形態において、真核細胞は、骨髄細胞、生殖系列細胞、分裂終了細胞（例えば中枢神経系の細胞）、前駆細胞及び幹細胞が包含される哺乳類の細胞である。特定の実施形態において、前記細胞は、ヒト細胞株に由来する細胞（例えばＨｅＬａ細胞）又は１次細胞が包含されるヒト細胞である。
【０１４３】
本発明の核酸構築物は、当該技術分野で知られているトランスフェクション又は形質転換の標準的方法によって真核細胞内に導入され得る。構築物が細胞内に導入され得る方法の例としては、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、カチオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、ｉｎ  ｖｉｖｏの電場の作成、ＤＮＡコーティング微粒子銃、組換え複製−欠損ウィルスの注射、相同組換え、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療、ウィルスベクター及び裸のＤＮＡ転移又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。遺伝子治療に適した組換えウィルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、ＨＳＶ、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、セムリキ森林熱ウィルス、サイトメガロウィルス並びにワクシニアウイルス及びその誘導体（例えばＭＶＡ）等のウィルスのゲノムに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
従来の手順を用いて核酸構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで真核細胞内に導入して本発明のペプチドの細胞の発現を達成することができる。次いで、ペプチドを発現する真核細胞を哺乳類に導入して、機能性ペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏでミトコンドリア内に発現するような細胞を有する哺乳類を提供することができる。そのようなｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療法において、真核細胞は、哺乳類から好ましくは除去され、核酸構築物を組込むための技法に供され、次いで哺乳類に再導入される。しかしながら、真核細胞はまた、同じ種又は異なる種のいずれかの哺乳類以外の生物に由来し得る。
【０１４５】
Ｆ．使用
本発明は、真核細胞内のミトコンドリアに送達されるＤＮＡ結合性タンパク質を提供するものである。ＤＮＡ結合性タンパク質は、一旦ミトコンドリア内に入ると、多くの活性を媒介することができる。
【０１４６】
従って、本発明によるＤＮＡ結合性タンパク質は、診断法や調査ツールが包含される広い種類の用途に用いられ得る。本発明によるＤＮＡ結合性ポリペプチドは、好ましくは異なる標的ｍｔＤＮＡ分子間を分化させることができる。
【０１４７】
更なる一実施形態において、ｍｔＤＮＡ標的配列についての結合アフィニティーは、Ｗ０２０００７３４３４号に記載されるように、ＤＮＡ結合性リガンドによって任意に調節される。本発明によるＤＮＡ結合性ポリペプチドは、ミトコンドリアの遺伝子発現の切換又は調節、並びにｍｔＤＮＡの切断によるミトコンドリアの遺伝子欠損の修正に有用である。
【０１４８】
例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインを含む融合ポリペプチドを使用するミトコンドリア核酸配列の特異的な切断によって、或いはジンクフィンガーに対する転写調節ドメインの融合によって、ミトコンドリア遺伝子転写の調節において本発明による標的とされるｍｔＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばジンクフィンガー）を更に用いて、ジンクフィンガー結合配列を有する遺伝子からの転写を活性化又は抑制することができる。
【０１４９】
ミトコンドリア病の補正
本発明は、とりわけ、ミトコンドリアゲノムの修飾又はミトコンドリア遺伝子発現の調節によるミトコンドリア病の補正のための手段を提供するものである。
【０１５０】
「ミトコンドリア病」は、ミトコンドリアの活性又は機能の欠陥、特にｍｔＤＮＡの突然変異に起因又は関連するミトコンドリアの活性又は機能の欠陥を特徴とする症状、疾患又は障害である。ミトコンドリア病の例としては、老化；ＡＤ（アルツハイマー病）；ＡＤＰＤ（アルツハイマー病及びパーキンソン病）；アミノグリコシド誘導性難聴；心筋症；ＣＰＥＯ（慢性進行性外眼筋麻痺）；脳筋症；ＦＢＳＮ（家族性両側性線条体壊死）；ＦＩＣＰ（致死性小児性心筋症プラス（Ｆａｔａｌ  Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  Ｐｌｕｓ）、ＭＥＬＡＳ関連心筋症）；ＬＤＹＴ（レーベル遺伝性視神経症及びジストニー）；ＬＨＯＮ（レーベル遺伝性視神経症）；ＬＩＭＭ（致死性小児性ミトコンドリアミオパシー（Ｌｅｔｈａｌ  Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｍｙｏｐａｔｈｙ））；ＭＭ（ミトコンドリアミオパシー）；ＭＭＣ（母性ミオパシー及び心筋症（Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ））；ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリアミオパシー、脳症、乳酸アシドーシス、及び脳卒中様発作）；ＭＥＲＲＦ（脳卒中様発作を伴うミオクローヌス癲癇）；ＭＥＲＲＦ（ミオクローヌス癲癇及び赤色ぼろ筋線維）；ＭＩＬＳ（母性遺伝性リー症候群）；ミトコンドリアミオパシー；ＮＡＲＰ（神経性筋力低下、失調及び色素性網膜炎；この遺伝子座の別の表現型はリー病として報告される）；ＰＥＯ；ＳＮＥ（亜急性壊死性脳症）；ＭＨＣＭ（母性遺伝性肥大性心筋症）；ＣＰＥＯ（慢性進行性外眼筋麻痺）；ＫＳＳ（キーンズ・セイアー症候群）；ＤＭ（糖尿病）；ＤＭＤＦ（糖尿病＋難聴）；ＣＩＰＯ（ミオパシー及び眼筋麻痺を伴う慢性的腸偽閉塞（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｐｌｅｇｉａ））；ＤＥＡＦ（母性遺伝性難聴又はアミノグリコシド誘導性難聴）；ＰＥＭ（進行性脳症）及びＳＮＨＬ（感音難聴）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５１】
本発明の一実施形態において、ミトコンドリア病はｍｔＤＮＡにおいて突然変異（例えば点変異）と関連する。本明細書で用いられる「突然変異」は、遺伝物質における永続的な伝播性（ｔｒａｎｓｍａｓｓｉｂｌｅ）の変異である。本明細書において更に用いられる「野生型」という用語は、天然の原料（例えば、自然集団において）において最もよく認められるような特定の遺伝子（又はその遺伝子産物）についての特徴的な遺伝子型（又は表現型）を意味する。
【０１５２】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子発現の調節
本発明の特定の実施形態において、ＤＮＡ結合性ポリペプチドは、ｍｔＤＮＡ内の標的配列に結合し得るものであり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのミトコンドリア遺伝子からの発現を調節するために用いられる。
【０１５３】
標的ミトコンドリア遺伝子は、突然変異ミトコンドリア遺伝子であって、その配列が野生型遺伝子とは異なるものである。そのような場合、ミトコンドリアＤＮＡを、例えば切断によって破壊して、異形成の結果としての遺伝子欠損を補正することができる。ＤＮＡ結合性ポリペプチドは、標的ｍｔＤＮＡ配列を含む宿主細胞に存在する核酸構築物から通常は発現する。核酸構築物は、宿主細胞のゲノム内に任意に安定して組込まれる。
【０１５４】
本発明による細胞は、標的ｍｔＤＮＡ配列、及び細胞内のＤＮＡ結合性ポリペプチドの発現を導き得る構築物を含む。
【０１５５】
ＤＮＡ結合性ポリペプチドを発現するための適切な構築物は、当該技術分野で知られており、上記のセクションＤに記載される。コード配列が構成的に発現され得るか、若しくはその発現が調節され得る。発現は、遍在性又は組織特異的であり得る。適切な調節配列は当該技術分野で知られており、それはまた上記のセクションＤに記載される。従って、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞内でＤＮＡ結合性ポリペプチドの発現を導き得る調節配列に操作可能な状態で結合されるＤＮＡ結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【０１５６】
核酸構築物を細胞内に導入するための技法は、原核生物細胞及び真核生物細胞の両方について当該技術分野で知られている。これらの技法の多くは、下記においてトランスジェニック生物の産生に関するセクション中で示される。
【０１５７】
ここで「多細胞生物」という用語は、ミトコンドリアを含むヒト以外のすべての多細胞植物及び動物を意味し、即ち具体的には原核生物は除外される。また、前記用語は、胚形成期及び胎児期を包含する全ての発育段階の生物個体も包含する。「トランスジェニック」多細胞生物は、組換えウィルスの微量注入又は感染による等、細胞下レベルでの意図的な遺伝子操作によって直接的又は間接的に受け取られた遺伝情報を有する細胞を含む任意の多細胞生物である。好ましくは、前記生物は、本明細書において定義されるようなＤＮＡ結合性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含むことにより、トランスジェニックである。
【０１５８】
本文脈における「トランスジェニック」は、古典的な異種交配又は体外受精を包含せず、１個以上の細胞に組換えＤＮＡ分子が投与される生物をむしろ意味する。１つ以上のトランスジェニック生物の後続の古典的な異種交配又は体外受精によって得られるトランスジェニック生物は、「トランスジェニック」という用語の範囲内に含まれる。
【０１５９】
「生殖細胞系トランスジェニック生物」という用語は、遺伝情報を取り出して生殖細胞系細胞内に組み込み、その結果前記情報を後代に伝える能力を与えたトランスジェニック生物を意味する。かかる後代が、実際、その情報の一部又は全てを有する場合、それらもまた本発明の範囲内のトランスジェニック多細胞生物である。
【０１６０】
前記生物に導入される情報は、レシピエントが帰属する（即ち「異種の」）動物の種に対して異種であり得る、或いは特定の個体のレシピエントに対してのみ異種であり得る、或いはレシピエントによってすでに所有される遺伝情報であり得る。最後のケースにおいて、導入された遺伝子は、天然の遺伝子よりも異なって発現し得る。
【０１６１】
「操作可能な状態で結合された」とは、ポリヌクレオチド配列が共有結合するコード配列及び非コード配列の発現をもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。かかる制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物においては、かかる制御配列としては、一般にプロモーター、リボゾーム結合部位及び転写終結配列が挙げられ、真核生物においては、制御配列としては、エンハンサー、プロモーター、リボソーム結合部位、スプライス部位、転写終結配列、ポリアデニル化配列、絶縁体要素及び基質付着部位が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「制御配列」という用語は、その存在が発現に影響し得る構成要素を少なくとも包含することが意図され、そしてまたその存在が有利な更なる構成要素、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を包含し得る。本発明の文脈において、必須の制御配列としてはＭＴＳ及びＮＥＳが挙げられ、他の配列が必要とされ得る。エフェクター分子を含む融合パートナーは、一般的に「ＤＮＡ結合性ポリペプチド」という用語に包含される。
【０１６２】
核酸構成要素が宿主ゲノムに取り込まれる場合、特定のゲノムの文脈におけるポリペプチドの発現を可能にする配列を含むことが重要である。１つの可能なアプローチは、相同組換えを使用して、その発現を同等の配列と調整することが望ましい内在性遺伝子の全部又は一部を置換することであり、ここで調節領域は本発明のＤＮＡ結合性タンパク質についての結合部位を含む。このことによって、前記遺伝子は、本発明のＤＮＡ結合性タンパク質による調節以外の内在性遺伝子と同じ転写調節メカニズムの影響下にあることが保証される。或いは、相同組換えが同様の方法で用いられ得るが、また、前記遺伝子が調節の種々の形態の影響下にあるように調節配列で置換される。
【０１６３】
しかしながら、ＤＮＡ結合性ポリペプチド又は標的ＤＮＡのいずれかをコードする構築物がゲノム内にランダムに配置される場合、その領域内のクロマチンは転写を起こさず、濃縮型形態にある可能性がある。このことが生じる場合、ポリペプチドは発現することができず、これらは位置依存性効果と称される。この課題を解決するために、転写的にコンピテントな開放的な配座において介在性のクロマチンを維持する遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含むことが望ましい可能性がある。ＬＣＲ（スカフォールド結合領域（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  （ＳＡＲｓ））又はマトリックス結合領域（ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  （ＭＡＲｓ））としても知られている）は当該技術分野でよく知られており、例としてはニワトリリゾチームＡ要素があり（Ｓｔｉｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：３４３）、それは関連する表現可能な遺伝子周辺に位置して遺伝子の全体的な発現の増大をもたらし、そして生物のゲノム内への組込みの際に位置依存性効果を低下させ得る（Ｓｔｉｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）前掲）。別の例としては、Ｌａｎｇｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９：５８５１−５８５６に記載されるＣＤ２遺伝子ＬＣＲがある。
【０１６４】
従って、多細胞生物のゲノム内にＤＮＡ結合性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入するための本発明に用いられるポリヌクレオチド構築物は、コード配列の発現を導き得る調節配列に操作可能な状態で結合したＤＮＡ結合性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を通常は含む。更に、ポリヌクレオチド構築物は、組込みを促進するために宿主細胞ゲノムに相同なフランキング配列を含むことができる。別のアプローチは、宿主ゲノム（例えばレトロウイルス）に組込むことができるウィルスベクターを使用することである。
【０１６５】
任意には、本発明で用いられるヌクレオチド構築物は、更にフランキングＬＣＲを含む。
【０１６６】
ＤＮＡ結合性ポリペプチドを発現するトランスジェニック生物の作製
本発明のトランスジェニック生物は、好ましくは多細胞の真核生物、例えば動物、植物又は菌類である。動物としては、刺胞動物門、有櫛動物門、扁形動物門、線形動物門、環形動物門、軟体動物門、鋏角亜門、単枝亜門、甲殻亜門及び脊索動物門の系統の動物が挙げられる。単枝亜門としては、昆虫（例えば有翼昆虫）を包含する六脚上綱の亜門が挙げられる。脊索動物門としては、脊椎動物の群（例えば哺乳類、鳥、爬虫類及び両生類）が挙げられる。哺乳類の特定例としては、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、有蹄類（例えばウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ及びウマ）及び齧歯類（例えばマウス、ラット、スナネズミ及びハムスター）が挙げられる。
【０１６７】
植物としては、種子を有する植物である被子植物及び球果植物が挙げられる。被子植物としては、双子葉植物及び単子葉植物が挙げられる。双子葉植物の例としては、タバコ（ニコチアナプルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）及びニコチアナタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、アラビドプシス（シロイヌナズナ）、セイヨウアブラナ、クロガラシ、毛朝鮮朝顔、ウィキア・ナルボネンシ（Ｖｉｃｉａ  ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ）、ソラマメ、エンドウ（エンドウマメ）、カリフラワー、カーネーション及びレンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）が挙げられる。単子葉植物の例としては、穀類（例えば小麦、オオムギ、オート麦及びトウモロコシ）が挙げられる。
【０１６８】
トランスジェニック動物の作製
トランスジェニック動物を作製するための技法は、当該技術分野でよく知られている。この主題に関する有用な一般的テキストは、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，１９９７）であり、魚からマウスやウシまでのトランスジェニック動物を作製するために用いられる技法の広範囲にわたる概要である。
【０１６９】
現在、胚顕微操作の技術の進歩は、例えば哺乳類の受精卵内に非相同のＤＮＡを導入することを可能にする。例えば、全能性幹細胞又は多能性幹細胞は、微量注入、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染又は他の手段によって形質転換され得、次いで前記形質転換細胞は胚に導入され、次いで前記胚はトランスジェニック動物に発育する。一方法において、発育する胚は所望のＤＮＡを含むレトロウイルスで感染させ、前記感染胚からトランスジェニック動物が作製される。別の一実施形態において、適切なＤＮＡは、好ましくは単細胞期に胚の前核又は細胞質に同時注入され、そして成熟したトランスジェニック動物に前記胚を発育させることができる。それらの技法はよく知られている。Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６）；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：８４４（１９９１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：３４３（１９８５）；Ｋｒａｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）；Ｈａｍｍｅｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：６８０（１９８５）；Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１７５，３８５号；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１７５，３８４号が包含される哺乳類の受精卵内への非相同のＤＮＡの微量注入のための標準的実験法の概要を参照されたい。それらの各内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
トランスジェニック動物を作製するために用いられる別の一方法は、標準的方法によって前核期の卵子内に核酸を微量注入することを含む。次いで、注入された卵子を培養し、その後偽妊娠レシピエントの卵管内に移植する。
【０１７１】
また、トランスジェニック動物は、Ｓｃｈｎｉｅｋｅ，Ａ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：２１３０及びＣｉｂｅｌｌｉ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１２５６に記載されるような核移植技術によって作製することもできる。この方法を使用して、ドナー動物からの繊維芽細胞は、関連する核酸配列を組み込むプラスミドで安定してトランスフェクトされる。次いで安定したトランスフェクタントが除核卵母細胞に融合され、培養され、そして雌性のレシピエントに移植される。例えば、ミトコンドリアの遺伝子発現を調節する本発明によるＤＮＡ結合性タンパク質を発現するトランスジェニック動物を作製することができる。
【０１７２】
トランスジェニック配列の存在についての動物の分析は、通常は標準的方法の後にＰＣＲかサザンブロット分析のいずれかを行うことによって実施される。
【０１７３】
ウシ等のトランスジェニック哺乳類の作製の具体例によって、ＤＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド構築物は、例えば米国特許第４，８７３，１９１号に記載される技法を用いて、哺乳類から新しく摘出された卵巣から得られる卵母細胞内に微量注入される。卵母細胞は卵胞から吸引され、次いで沈殿させ、その後、ヘパリンで受精能を獲得し、そして可動性分画を単離するためにパーコール勾配で前分別した解凍された凍結精子で受精を行う。
【０１７４】
前記受精卵母細胞は、注入用前核を視覚化するために、例えば８分間、１５，０００ｇで遠心分離され、次いで卵管組織調整培地中で接合糸期から桑実期又は胚盤胞期まで培養される。この培地は、卵管からこすり落される管腔組織を用いて調製され、培養培地中で希釈される。接合子は、微量注入後２時間以内に培養培地中に配置される。
【０１７５】
次いで、ウシ等の予定レシピエント哺乳類においては、例えばコプロスタノールを投与することによって発情を同期化する。発情は２日以内に生じ、発情して５〜７日後に前記胚を前記レシピエントに移植する。成功した移植は、サザンブロットによって後代において評価され得る。
【０１７６】
或いは、所望の構築物は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）内に導入することが可能であり、そして前記細胞は、導入遺伝子による修飾を確実にするために培養される。次いで、修飾された細胞を胞胚期に注入し、そして胞胚を偽妊娠宿主に置換する。その結果生じる後代は、ＥＳ細胞及び宿主細胞に関するキメラであり、ＥＳ後代を含むだけの非キメラ株は、従来の交雑育種を使用して得ることが可能である。この技法は、例えば国際公開第９１／１０７４１号に記載される。
【０１７７】
トランスジェニック植物の作製
トランスジェニック植物を作製する技法は、当該技術分野でよく知られている。通常は、全植物、細胞又はプロトプラストのいずれも、ＤＮＡ結合性ポリペプチド又は標的ＤＮＡをコードする適切な核酸構築物で形質転換することが可能である（核酸構築物の例については上記を参照）。形質転換ＤＮＡ構築物を細胞内に導入する方法は多くあるが、全てが植物細胞へのＤＮＡの送達に適切というわけではない。適切な方法としては、アグロバクテリウム感染（とりわけ、Ｔｕｒｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４２：２２７−２３９）或いは例えばＰＥＧ介在形質転換、エレクトロポレーション又はＤＮＡ被覆粒子の加速によるＤＮＡの直接的な送達が挙げられる。加速方法が一般に好ましく、例えば微粒子銃が挙げられる。米国特許第５，８７４，２６５号から得られる、トランスジェニック植物（特に単子葉植物）を作製するための代表的なプロトコールは、以下に記載される。
【０１７８】
植物細胞に形質転換ＤＮＡ部分を送達する方法の一例は、微粒子銃である。この方法では、非生物学的粒子が核酸でコーティングされ得、推進力によって細胞内に送達される。典型的な粒子としては、タングステン、金、プラチナ等を含むものが挙げられる。
【０１７９】
双子葉植物及び単子葉植物の両方を再現的に安定して形質転換する有効な手段であることに加えて、微粒子銃の特定の長所は、プロトプラストの単離もアグロバクテリウム感染に対する感受性も必要ないということである。加速によって植物細胞にＤＮＡを送達する方法の例示の実施形態は、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍであって、それを用いて、ＤＮＡでコーティングされた粒子を、懸濁液中で培養される植物細胞でカバーされるフィルタ面上に、ステンレス鋼やＮｙｔｅｘスクリーン等のスクリーンで推進することができる。スクリーンは、タングステン−ＤＮＡ粒子が大きな凝集体中のレシピエント細胞に送達されないようにタングステン−ＤＮＡ粒子を分散させる。発射装置と衝突される細胞との間にスクリーンが介在しない場合、発射体は凝集し、高頻度の形質転換を達成するには大き過ぎる可能性があると考えられる。これは、大き過ぎる発射体によってレシピエント細胞に加えられる損傷に起因し得る。
【０１８０】
衝撃のために、懸濁液中の細胞は、好ましくはフィルター上に濃縮される。衝突される細胞を含むフィルターは、巨大粒子発射阻止プレート（ｍａｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ｐｌａｔｅ）より短い適切な距離で配置される。所望により、一つ以上のスクリーンはまた、銃と衝突される細胞との間に位置する。本明細書において記載される技法を用いることにより、衝突されたフィルター上にマーカー遺伝子（「病巣」）を一時的に発現する細胞の最高１０００以上のクラスターを得ることができる。衝撃の４８時間後の外来性の遺伝子産物を発現する病巣内の細胞の数は、多くの場合１から１０個の範囲であり、平均は２〜３個である。
【０１８１】
上記で考察される方法のいずれかによってレシピエント細胞への外来性ＤＮＡの送達を行った後、好ましいステップは、更なる培養及び植物再生のための形質転換細胞の同定である。このステップは、直接スクリーン可能な形質について、或いは衝突された培養物を選択剤又は剤に曝露することによって培養物をアッセイすることを含む。
【０１８２】
スクリーン可能なマーカー形質の一例としては、トウモロコシにおけるＲ遺伝子座の制御下で産生される赤い色素がある。この色素は、このステージで増殖を補助することが可能な栄養培地を含む固体支持体上の細胞を培養すること、例えば１８℃及び１８０μＥｍ−２ｓ−１超で細胞をインキュベーションすること、及び着色されたコロニー（細胞の可視凝集体）から細胞を選択することによって検出することが可能である。これらの細胞は、懸濁液中又は固体培地中のいずれかで更に培養することが可能である。
【０１８３】
形質転換細胞を同定する方法の例示的な一実施形態は、選択剤（例えば代謝阻害剤、抗生物質、除草剤等）に衝突された培養物を曝露することを含む。形質転換され、且つ使用する選択剤に対する耐性を付与するマーカー遺伝子を安定して組込んだ細胞は、培養において成長及び分裂するであろう。感受性細胞は、更なる培養に適さないであろう。
【０１８４】
ｂａｒ−ビアラホス選択的系を使用するために、フィルター上の衝突された細胞は、非選択的液体培地中で再懸濁され、培養され（例えば１〜２週間）、そして１〜３ｍｇ／Ｌのビアラホスを含む固形培地を覆うフィルターへ移される。１〜３ｍｇ／Ｌの範囲が通常は好ましいが、０．１〜５０ｍｇ／Ｌの範囲で本発明の実施における有用性が認められることが提唱される。衝撃に用いられるフィルターの種類は、特に重要であるとは考えられないが、固体、多孔質、不活性の任意の支持体を含むことができる。
【０１８５】
選択剤に対する曝露を耐え抜く細胞は、植物の再生を補助する培地中で培養することが可能である。組織は、約２〜４週間ホルモン類と共に塩基性培地に維持され、次いでホルモン類なしで培地へ移される。２〜４週後、シュート生長によって、別の培地に移す時が示される。
【０１８６】
再生は、形質転換されたカルスからより成熟した植物への逐次的な発育段階の間にその組成物が修飾されて適切な栄養物質及びホルモンのシグナルを提供する培地の進行を通常は必要とする。発育する苗木は、例えば約８５％の相対湿度、６００ｐｐｍのＣＯ２及び２５０μＥｍ−２ｓ−１の光で環境的に制御されたチャンバーにおいて土壌に移されて硬化する。植物は、グロースチャンバー内又は温室内のいずれかで好ましくは成熟する。再生には、通常は約３〜１２週間かかる。再生中、細胞は、組織培養容器内の固体培地で成長する。かかる容器の例示の実施形態はペトリ皿である。再生する植物は、好ましくは約１９℃〜２８℃で成長する。再生する植物がシュート生長及び根生長のステージに達した後、それらは更なる成長及びテストのために温室に移され得る。
【０１８７】
ゲノムＤＮＡをカルス細胞株及び植物から単離して、ＰＣＲ及び／又はサザンブロット法等の当業者によく知られた技法を用いることにより外来性の遺伝子の存在を判定することができる。
【０１８８】
遺伝情報を挿入する技法が幾つか存在するが、２つの主要な原理は、遺伝情報の直接的な導入及びベクター系を用いた遺伝情報の導入である。一般的な技法の概要は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ［１９９１］４２：２０５−２２５）及びＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９４  １７−２７）による論文において見出すことができる。
【０１８９】
従って、一態様において、本発明は、本発明によるＤＮＡ結合性ポリペプチド又は標的ＤＮＡをコードする構築物を担持し、且つ生物（例えば植物）のゲノム内に構築物を導入することが可能なベクター系に関する。
【０１９０】
ベクター系は１つのベクターを含むことができるが、それは、少なくとも２つのベクターを含むことができる。２つのベクターの場合、そのベクトル系はバイナリーベクター系と通常呼ばれる。バイナリーベクター系は、Ｇｙｎｈｅｕｎｇ  Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０），Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ３，１−１９において更に詳細に記載される。
【０１９１】
所定のプロモーター又はヌクレオチド配列又は構築物を有する植物細胞の形質転換のための広範囲に使用される１つの系は、アグロバクテリウムツメファシエンスに由来するＴｉプラスミドの使用、又はアグロバクテリウムリゾゲネスに由来するＲｉプラスミドの使用に基づく（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１，３０１−３０５及びＢｕｔｃｈｅｒ  Ｄ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８０），Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ，ｅｄｓ．：Ｄ．Ｓ．Ｉｎｇｒａｍｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｐ．Ｈｅｌｇｅｓｏｎ，２０３−２０８）。
【０１９２】
幾つかの異なるＴｉプラスミド及びＲｉプラスミドについては、上記に記載の植物又は植物細胞構築物の作製に適切なものが作製されてきた。
【０１９３】
ここで、例証を示すだけで非限定的な以下の実施例によって本発明を説明する。
【実施例】
【０１９４】
実験手順
ｍｔＤＮＡ標的を結合するためのジンクフィンガータンパク質のエンジニアリング及び設計
ｍｔＤＮＡに特異的なＺＦＰのエンジニアリング
結合ジンクフィンガーに適切な多くの可能な標的部位は、ｍｔＤＮＡにおいて同定されてきた。これらは、ｗｔ  ｍｔＤＮＡのＤループ領域内の部位、並びに遺伝的障害に関与する点変異（例えばＮＡＲＰ  Ｔ８９９３Ｇ）を含む配列を含む。可能な結合剤は、Ｓａｎｇａｍｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．によって作製された、予め選択された２フィンガーモジュールのアーカイブから集められ、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｓａｌａｎ，Ｍ．，Ｋｌｕｇ，Ａ．＆Ｃｈｏｏ，Ｙ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９，６５６−６０（２００１））に記載のＺｉｆ２６８ランダム化ライブラリーに基づいた。ＤＮＡ結合ドメインは、２×２設計の３フィンガー又は４フィンガーのタンパク質として設計され、選択的にそれらの標的配列を結合する能力についてテストされた。更に、非結合３フィンガータンパク質ＺＦＰ−ｃｏｎｔ及び非ミトコンドリア特異性を有する６フィンガータンパク質（Ｐａｐｗｏｒｔｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，１６２１−６（２００３））を対照として使用した。
【０１９５】
ＭＴＳ−ＺＦＰのための発現ベクターの作製
ＭＴＳ−ジンクフィンガー融合タンパク質（ＭＴＳ−ＺＦＰ）を作製するため、設計されたジンクフィンガーをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによって修飾されてｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）又はＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）エピトープ標識をＺＦＰのＣ末端に導入し、そして固有のＸｈｏＩ（５’）及びＥｃｏＲＩ（３’）制限部位でフランクされた。これらは、以下のＮ末端ＭＴＳ配列の内の１つをコードする固有のＸｂａＩ（５’）及びＸｈｏＩ（３’）制限部位でフランクされたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片で結合された：（ｉ）ヒトチトクロームｃ酸化酵素（Ｃ８）のサブユニットＶＩＩＩに由来する３３アミノ酸（ａａ）プレ配列、（ｉｉ）ヒトＡＴＰシンターゼＦ１βサブユニット（Ｆ）に由来する５１ａａプレ配列、（ｉｉｉ）コナミドリムシＡＴＰシンターゼサブユニット６（Ｒ）に由来する１０９ａａプレ配列、（ｉｖ）トリパノソーマブルース（Ｔ１）に由来するタンパク質ＭＰ４２の５４ａａプレ配列、（ｖ）トリパノソーマブルース（Ｔ２）に由来するタンパク質ＭＰ６３の５９ａａプレ配列、及び（ｖｉ）Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ（Ｔ３）に由来するタンパク質７ｂの６４ａａプレ配列（これはＭＴＳ及び更なるＮ末端配列を含む）。全てのＭＴＳ−ＺＦＰ構築物は、ＸｂａＩ（５’）−ＥｃｏＲＩ（３’）フラグメントとしてｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に挿入され、そしてそれらの配列を確認した。
【０１９６】
更にクローン３０について、ＢａｍＨＩ部位が配置されたＡＴＰシンターゼのＦ１βサブユニットに対するヒトｍＲＮＡに由来する３’側ＵＴＲに対応するＰＣＲ増幅フラグメントをＦ−ＺＮＦ３０のＢａｍＨＩ部位内に挿入することによって、プラスミドＦ−ＺＦＰ３０−３’ＵＴＲを作製した。
【０１９７】
更なるＣ末端のドメインを有するＭＴＳ−ＺＦＰの作製
プラスミドのＣ８−ＺＦＰ−ＧＦＰ系列を作製するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢｇｌＩ及びＥｃｏＲＩ部位内にフランクで付加され且つＣ末端ＧＦＰタンパク質を有するフレーム内でクローン化される固有のＢｇｌＩＩ（５’側）及びＥｃｏＲＩ（３’側）部位を有するＣ８−ＺＦＰ鋳型から、Ｃ８ＭＴＳ−ジンクフィンガー及びエピトープ標識融合物をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。
【０１９８】
ＸｂａＩ制限部位を含む５’側Ｆ特異的プライマーと、末端の３’側で付加されたＭＶＭ（ＶＤＥＭＴＫＫＦＧＴＬＴＩＨＤＴＥＫ）及びＢａｍＨＩ部位のＮＳ２タンパク質に由来するＮＥＳ配列を更に含む３’エピトープ標識特異的プライマーとを使用して、Ｆ−ＺＦＰ鋳型からＦ  ＭＴＳジンクフィンガータンパク質及びエピトープ標識をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅することによって、プラスミドのＦ−ＺＦＰ−ＮＥＳ系列を作製した。その結果生じるＦ−ＺＦＰ−ＮＥＳ  ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ部位内にクローン化し、そしてそれらの配列を確認した。
【０１９９】
その後、トランスフェクトされたクローンのピューロマイシン選択を可能にするｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｆ−ＺＦＰ−ＮＥＳ−ｐｕｒｏ）において、選択されたＦ−ＺＦＰ−ＮＥＳクローンも発現させた。鋳型としてのｐｍａｘＧＦＰ（Ａｍａｘａ，ＧｍｂＨ）及びＸｈｏＩフランク特異的プライマーを使用し、そしてその結果生じる産物をｐｃＤＮＡ３．１（−）主鎖内のＦ−ＺＦＰ−ＮＥＳのＸｈｏＩ部位内に挿入して、Ｐｏｔｅｌｌｉｎａ種に由来するＧＦＰをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅することによって、前記Ｆ−ＧＦＰ−ＺＦＰ−ＮＥＳを作製した。構築物のこの系列を更に使用して、Ｆ−ＧＦＰ−ＺＦＰ−ＮＥＳ内のＮＥＳから上流のＥｃｏＲＩ部位内に、１７ａａの長い可撓性リンカー（［ＳＧＧＧＧ］３ＳＳ）をコードするＥｃｏＲＩフランクＰＣＲフラグメント及びｈＤＮＭＴ３ａ触媒ドメイン（残基５９２〜９０９）を挿入することによって、Ｆ−ＧＦＰ−ＺＦＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを設計した。
【０２００】
より長期間キメラメチラーゼの発現を促進し、トランスフェクトされた集団においてメチラーゼ陽性細胞を富化するために、Ｆ−ＺＥＰ−ＮＥＳ−ｐｕｒｏ（図３Ａ）のＥｃｏＲＩ部位内に、リンカー（上記参照）及びＥｃｏＲＩ部位によってフランクされたｈＤＮＭＴ３ａの触媒ドメインについてコードするＰＣＲ増幅領域を挿入することによって、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３においてＦ−ＺＦＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ発現カセットを作製した。ＺＦＰドメイン（Ｆ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ）が欠けている類似の構築物を対照として設計した（図３Ａ）。
【０２０１】
ゲルリターデイションアッセイ
３−フィンガーペプチドＺＦＰＮＡＲＰ及びＺＦＰｃｏｎｔ並びにそれらの誘導体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し、既に述べた方法を用いてゲルリターデイションアッセイに供した（Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．，Ｋｌｕｇ，Ａ．＆Ｃｈｏｏ，Ｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１４３７−４１（２００１））。ＺＦＰＮＡＲＰは、３７ｂｐプローブに組み込まれたＮＡＲＰ変異（Ｔ８９９３Ｇ）を含むその完全長標的部位に対して、並びにＮＡＲＰ−Ｃ変異（Ｔ８９９３Ｃ）及びｗｔ配列を含んだ結合部位において１ｂｐ置換を有する密接に関連した部位に対してテストされた。また、適切なＤＮＡ配列に対するジンクフィンガータンパク質の結合も、更なるドメイン（例えばＮ末端ＭＴＳ  ＦやＣ末端メチラーゼドメイン）及びＮＥＳの存在下でテストされた。
【０２０２】
また、ミトコンドリアに標的化されたＦ−ＺＦＰＮＡＲＰを一時的に発現する細胞からのミトコンドリア抽出物についても、ゲルリターデイションアッセイを実施した。この場合、トランスフェクションの２４時間後、細胞を収集し、そして無損傷のミトコンドリアを下記のように単離した（「細胞分画」参照）。その後、音波処理によってミトコンドリアタンパク質を可溶化し、ミトコンドリア抽出物（約２〜２．５μｇのタンパク質）が、上記のような特異的ＤＮＡ標的についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのゲルリターデイションアッセイに用いられた。
【０２０３】
哺乳類の細胞株のトランスフェクション
哺乳類細胞のトランスフェクションの全ては、Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ａｍａｘａ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、バッファーキットＶ（Ａｍａｘａ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＱｉａｆｉｌｔｅｒ  ＭｉｄｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製されたプラスミドＤＮＡを用いて実施された。ＣＯＳ−７細胞については、プログラムＡ−２４が製造業者によって推奨されるように用いられ、一方で細胞株１４３Ｂ（ＴＫ−）及び１４３Ｂについては、ＮＡＲＰサイブリッドプログラムＩ−１３が実験的に最適になるように決定された。免疫検出研究のために、ジンクフィンガー構築物を一時的な系において２４〜３６時間発現させた。一方でメチル化の研究については、トランスフェクションの１２時間後に培養培地に添加された０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを有するｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ｈＤＮＭＴ３ａの触媒ドメインを含むタンパク質を６０時間発現させた。
【０２０４】
一時的に発現させたジンクフィンガータンパク質の免疫検出
一時的に発現されたジンクフィンガータンパク質は、免疫蛍光法又は免疫ブロット法のいずれかによって解析された。免疫蛍光法のために意図された付着細胞をカバーグラス上で成長させ、そして必要であれば、ミトコンドリアを視覚化するために、培養培地に添加されたＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ＣＭＸＲｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で３０分間染色した。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、そして４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで直接カバーガラス上に固定した。１％ＴｒｉｒｏｎＸ−１００での透過化処理及びＰＢＳにおける洗浄の後、１：１００の希釈度で使用されるエピトープ標識に対する抗体（ＨＡ標識（Ｒｏｃｈｅ）に対するマウスモノクローナル抗体１２ＣＡ５又はｃ−ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対するマウス９Ｅ１０モノクローナル抗体）を用いて、ジンクフィンガータンパク質を視覚化した。その後、１：１００の希釈度で使用されるＦＩＴＣ（ベクター）に結合する２次抗体抗マウスＩｇＧでインキュベーションを行った。ＴＦＡＭ及びｍｔＳＳＢを有するＺＦＰ構築物の共局在研究については、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色ステップを省略した。固定細胞をＴＦＡＭ又はｍｔＳＳＢ抗血清でインキュベートし、その後テキサスＲｅｄと結合した二次抗体で行った。次いでＢｉｏＲａｄコンフォーカル顕微鏡を使用して免疫蛍光法について検討した。免疫ブロット分析について、ニトロセルロース膜へ移され、特異的抗体でブロットされるＳＤＳ−ＰＡＧＥに、全体の細胞溶解液又はタンパク質分画（下記参照）に対応する等量のタンパク質が供される。ブロットは、ＨＲＰ結合２次抗体で更にインキュベートされ、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して視覚化された。
【０２０５】
ｍｔＤＮＡの標識化
ＢｒｄＵを使用する１４３Ｂ（ＴＫ−）ｗｔ又はＴ８９９３Ｇサイブリッド細胞におけるｍｔＤＮＡの代謝標識化は、Ｇａｒｒｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇａｒｒｉｄｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４，１５８３−９６（２００３））に従って、以下の改変を行って実施された。１５μＭの終濃度でのトランスフェクションの１２時間後にＢｒｄＵを添加し、細胞を１８〜２４時間インキュベートした。固定化、透過化処理（上記参照）及び脱水／再水和ステップの後、ＤＮＡは、２ＭのＨＣｌで１０分間変性され、次いでＰＢＳ及びｄｄＨ２Ｏで大量に洗浄された。ｍＡｂ抗ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ）及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄに結合した２次抗マウス抗体を使用して、組み込まれたＢｒｄＵを検出した。
【０２０６】
細胞分画
Ｍｉｎｃｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｉｎｃｚｕｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃｒ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０，５０７４−８６（２００２））に記載されるように、１４３Ｂ  ｗｔ又はＴ８９９３Ｇサイブリッド細胞に由来するミトコンドリアを単離した。次いで、図３Ｂに示す濃度でプロテイナーゼＫで補充された１×ＩＢ緩衝液（４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２）中でミトコンドリアの分画をインキュベートした。ＺＦＰタンパク質構築物を検出するために、タンパク含有量について正規化される細胞成分分画を抗ＨＡ−ｍＡｂで解析した。また、前記分画を確認するために、マーカータンパク質（抗ＴＦＡＭ血清及び抗ＧＡＰＤＨ  ｍＡｂ（Ａｂｃａｍ））に対する抗体を使用するブロット法を実施した。
【０２０７】
シトシンのメチル化の検出
シトシンのメチル化の研究のための全体の細胞ＤＮＡサンプルは、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離され、そしてＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して製造業者の説明書に従って重亜硫酸塩変換に供された。その結果生じるＤＮＡは、重亜硫酸塩変換ｍｔＤＮＡのＨ鎖に特異的なプライマーを使用するｍｔＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のための鋳型として用いられた。その結果生じるＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ−ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローン化され、そしてそれらの配列が解析された。
【０２０８】
実施例１
ミトコンドリアにＺＦＰを送達するための戦略
ジンクフィンガーは、大部分が核内で働くために進化的に適応したＤＮＡ結合性タンパク質である。核局在化シグナル（ＮＬＳ）が存在しない場合でさえ、それらは多くの場合核内に局在する（Ｐａｐｗｏｒｔｈ，Ｍ．，Ｋｏｌａｓｉｎｓｋａ，Ｐ．＆Ｍｉｎｃｚｕｋ，Ｍ．Ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００５））。ｍｔＤＮＡを操作するデザイナーＺＦＰを使用するために、それらは、ミトコンドリアに効果的に標的とされなければならないと同時に、毒性であり得る核ＤＮＡへの結合を回避するために核に不在でなければならない（具体例は、Ｐａｐｗｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，１６２１−６（２００３）に考察される）。大部分のミトコンドリアのタンパク質は、核内遺伝子によってコードされ、切断可能なＮ末端ミトコンドリアのターゲティング配列（ＭＴＳ）によって細胞質から取り込まれる。ＭＴＳは、長さ及び組成が大きく異なり、種々のタンパク質に合わせて個別に調整されると思われる（Ｐｆａｎｎｅｒ，Ｎ．＆Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ａ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２，３３９−４９（２００１））。Ｎ末端にＭＴＳを融合することによって、ミトコンドリアに各種の外来性のタンパク質を送達することが可能になる。
【０２０９】
ミトコンドリアへのＺＦＰ送達を発現及び最適化させるために、２フィンガーユニットの対を融合することによって設計された４フィンガーＺＦＰのライブラリー（Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．，Ｋｌｕｇ，Ａ．＆Ｃｈｏｏ，Ｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９８，１４３７−４１（２００１））を、天然のミトコンドリアタンパク質に由来するＭＴＳによってミトコンドリアに入るその能力についてテストした（表１）。使用されたジンクフィンガーペプチドは、ＤＮＡ接触ヘリックス中に含まれるアミノ酸において大部分が互いに密接に関連及び相違する（表１）（完全な配列については、図５を参照）。種々のＭＴＳとのジンクフィンガー融合及び更なるＣ末端のＧＦＰの有無における細胞内局在化の研究によって、核のみ、各種の比率でのミトコンドリア及び核、及びミトコンドリアのみを含むＺＦＰ（表１）について可能な細胞内の送達先の範囲が明らかにされた。多様な局在化において同一のパターンが、３フィンガータンパク質のファミリーについて認められた（データは示されない）。ＭＴＳ−ＺＦＰ融合へのＣ末端ＧＦＰの付加によってミトコンドリアの取り込みが抑制され、ＭＴＳに結合した６フィンガーＺＦＰが全く取り込まれなかった（データは示されない）。これによって、ＺＦＰのミトコンドリアの取り込みにおいてサイズの制限がある可能性が示唆された。取り込みに関する非常に密接に関連したＺＦＰとサイズ制限との間の局在化パターンの多様性は、ミトコンドリアにＺＦＰ及びその誘導体を導くという我々の目的にとって予期しない最初の妨げであった。それ故、我々の第１の課題は、ミトコンドリアにＺＦＰを輸送するための一般的なシステムを開発することであった。
【０２１０】
このことを検討するために、我々は、ＺＦＰクローン３０（ＺＦＰ３０）を、ミトコンドリアへの取り込みが最も困難であるという理由でケーススタディとして選択した（表１参照）。我々は、ミトコンドリアの取り込みを促進することが知られているＡＴＰシンターゼのＦ１βサブユニットについて、ジンクフィンガーモチーフを含む内在性ミトコンドリアタンパク質に由来するＭＴＳ並びにヒトｍＲＮＡに由来する３’ＵＴＲを含むＺＦＰ３０との融合において幾つかのＭＴＳをテストした（Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ｊ．Ｍ．＆Ｃｕｅｚｖａ，Ｊ．Ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３４６  Ｐｔ  ３，８４９−５５（２０００））（図１Ａ）。全てのこれらの融合タンパク質は核内に局所化した。ヒトミトコンドリアＡＴＰシンターゼ（Ｆで示される）のＦ１βサブユニットに由来するＭＴＳを使用した際、ミトコンドリアの局在化が稀に認められた（図１Ａ、矢印７）。
【０２１１】
大部分は、核局在化及び細胞質に由来する全てのＭＴＳ−ＺＦＰ３０融合の欠如によって（図１Ａ）、フィンガー２及びフィンガー４のＤＮＡ認識ヘリックス内の塩基性アミノ酸の１群が介在する可能性のある非常に効率的な核ターゲティングが示唆される（表１及び図５参照）。ＺＦＰの核内移行を防止するために、我々は、核外移行シグナル（ＮＥＳ）が、核内の新生ポリペプチドの隔離を阻止すること、又は再び外部へルート変更することのいずれかによってミトコンドリアの取り込みを促進し、従ってそれによってミトコンドリアによる取り込みの時間が与えられる可能性があると仮定した。このことをテストするために、我々は、ヒトミトコンドリアのＡＴＰシンターゼ（Ｆ）のＦ１βサブユニットに由来するＭＴＳ及びマウスの微小ウィルスの非構造タンパク質２に由来するＮＥＳにＺＦＰ３０を融合させ（Ｅｉｃｈｗａｌｄ，Ｖ．，Ｄａｅｆｆｌｅｒ，Ｌ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｍ．，Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ，Ｊ．＆Ｓａｌｏｍｅ，Ｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６，１０３０７−１９（２００２））、Ｆ−ＺＦＰ３０−ＮＥＳタンパク質を産生した。
【０２１２】
Ｆ−ＺＦＰ３０−ＮＥＳ融合の免疫蛍光検査研究によって、それはミトコンドリアに効率的に標的化され、そして核に存在しないことが示された（図１Ｂ）。対照実験において、ＺＦＰ３０及びＮＥＳを含んでなるがＭＴＳを含まない融合タンパク質が核内に更に認められたが、このことは、単独ではミトコンドリアの取り込みシグナルとして機能し得ないＮＥＳを示す（データは示されない）。更なるドメインを融合することでＦ−ＺＦＰＮＥＳタンパク質のサイズを更に増大させることは、効果的なミトコンドリアの取り込みにつながった（図１Ｂ）。それ故、Ｎ末端Ｆ  ＭＴＳと共にＮＥＳを使用することによって、ＺＦＰ融合タンパク質の範囲の効果的なミトコンドリア取り込みが促進された。このアプローチは、他のＺＦＰ及びその誘導体によって機能し（表２）、３及び６フィンガーＺＦＰについて効果的であった（データは示されない）。ＺＦＰに融合された大きな外来性のドメインから構成されるミトコンドリアタンパク質に送達するこの能力は、特異的ｍｔＤＮＡ配列に標的化されるキメラ酵素を作製する可能性をもたらした。
【０２１３】
【表１】
2009520488.tif 000004
表１  ミトコンドリアに標的化されたＺＦＰの多様な局在化パターン
Ｚｉｆ２６８の主鎖に作製された４フィンガー（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ４）を含むジンクフィンガーペプチド（ＺＦＰ）のファミリーを選択してｍｔＤＮＡの配列を結合させた。連続した１２ｂｐ結合部位（リンカーなしでクローンによって結合）、又は１２ｂｐ結合部位の中に１ｂｐギャップを含む非連続の部位（Ｆ２とＦ３との間にＧＧＧリンカーを含むクローンによって結合）のいずれかがある。連続したフィンガーのＤＮＡ接触ヘリックスのアミノ酸配列（αヘリックスの先頭に対してアミノ酸位が−１〜６）は、ボールド体（ＺＦＰ配列）で、直接ＤＮＡと接触するアミノ酸と共に各クローンについて示される。ヒトＡＴＰアーゼ（Ｆで示される）のＦ１βサブユニット又はヒトチトクロームｃ酸化酵素（Ｃ８）のサブユニットＶＩＩＩのＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列をＺＦＰに融合し、免疫蛍光法によって更なるＣ末端ＧＦＰ（必要な場合、Ｃ８−ＺＦＰ−ＧＦＰ）の有無についてそれらの細胞内局在化を解析した。クローンは、核（Ｎ）のみ、ミトコンドリアのみ（Ｍ）並びに大部分はミトコンドリア（Ｍ／Ｎ）又は大部分は核（Ｎ／Ｍ）のいずれかの同一の細胞内のミトコンドリアと核との混合を含む細胞内局在化の各種のパターンを示した。
【０２１４】
バックグランドの細胞質内局在化は、ほとんど認められず、それ故にこれらの研究において省略された。同一のライブラリーに由来し、ＤＮＡ接触ヘリックスの外側の同一のアミノ酸配列を含むＺＦＰは、共に表の上下の部分にグループ分けされる。更なる研究のために使用するクローン３０は網掛けされる。ＺＦＰの多様な細胞内局在化の類似パターンが、ＣＯＳ−７又は１４３Ｂのいずれかにおいて認められた。
【０２１５】
【表２】
2009520488.tif 000005
表２  核外移行シグナル及び外来性ドメインに融合されたミトコンドリアに標的化されたＺＦＰの局在化
ＭＴＳ  Ｆ（表１に示されるＺＦＰクローン番号及び配列）を含む多くのＺＦＰタンパク質は、Ｃ末端ＮＥＳに融合され、そして更なるドメイン（ＧＦＰ（Ｆ−ＧＦＰ−ＺＦＰ−ＮＥＳ）、ｈＤＮＭＴ３ａメチラーゼ（Ｆ−ＺＦＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ）の触媒ドメイン或いはＧＦＰ及びｈＤＮＭＴ３ａ（Ｆ−ＧＦＰ−ＺＦＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ）の触媒ドメインの両方が包含される）に結合する際にミトコンドリアに入るその能力についてテストされた。個々のクローンの細胞内局在化は、免疫蛍光法を用いて評価され、タンパク質がミトコンドリア内にのみ位置する場合はミトコンドリア（Ｍ）と記載され、ミトコンドリアに選好性を有する両コンパートメント内にタンパク質が認められる場合はミトコンドリア−核（Ｍ／Ｎ）と記載された。ＣＯＳ−７と１４３Ｂのいずれにおいても同じ結果が得られた。
【０２１６】
実施例２
特定のｍｔＤＮＡ配列を結合するミトコンドリア標的化ＺＦＰの作製
次のステップは、特定のｍｔＤＮＡ配列に選択的に結合するＺＦＰを作製することであった。このために、我々は、ｍｔＤＮＡ内の９ｂｐ配列ＧＣＣＣＧＧＧＣＣを結合するように設計された、ミトコンドリアに標的化された３フィンガータンパク質Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰを作製した（図２Ａ）。太字のＧは、ｍｔＤＮＡ内の８９９３位にあり、ミトコンドリア病（神経原性筋力低下、失調及び色素性網膜炎（ＮＡＲＰ）並びに母性遺伝性リー症候群（ＭＩＬＳ））の原因となる突然変異を示す。野生型（ｗｔ）配列は、この位置にＴを有する。ゲルリターデイションアッセイ（図２Ｂ）によって評価されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＦＺＦＰＮＡＲＰは、具体的にはＧＣＣＣＧＧＧＣＣを含むオリゴヌクレオチドを結合した。それに対して、ＧＣＣＣＴＧＧＣＣ（ｗｔ）かＧＣＣＣＣＧＧＣＣのいずれかを含むオリゴヌクレオチドは、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰによって結合されなかった（図２Ｂ）。更に、ＺＦＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結合の研究によって、ＮＥＳの付加はＤＮＡ結合に影響を及ぼさなかったことが示された（データは示されない）。ＦＺＦＰＮＡＲＰとしての同一サイズの対照（Ｆ−ＺＦＰｃｏｎｔ）は、テストされた３つのＤＮＡ配列のいずれとも結合せず（図２Ｂ）、それ故にミトコンドリアに対してＺＦＰを標的とする任意の非配列特異的効果についての対照として更に使用することが可能であった。それ故、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰは、Ｔ８９９３Ｇ変異を含む配列と非常に特異的に結合するが、単一のｂｐによって異なるｗｔ  ｍｔＤＮＡには結合しない。
【０２１７】
外来性のＺＦＰがミトコンドリア内に亜鉛を組み込み、正確に折りたたまれるのかどうかについては不明であった。これは、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰを発現する細胞に由来するミトコンドリアの抽出物を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合の研究において扱われた（図２０）。これらの実験によって、これらの細胞に由来するミトコンドリアが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現されたＦ−ＺＦＰＮＡＲＰと同じようにしてＧＣＣＣＧＧＧＣＣを結合したＤＮＡ結合活性を含んだことが示された。これは非特異的ＤＮＡ結合に起因したものではなかったが、それは、Ｆ−ＺＦＰｃｏｎｔを発現する細胞に由来するミトコンドリアの抽出物がこれらのＤＮＡオリゴマーを阻害しなかったためであった（データは示されない）。それ故、ＺＦＰは、標的ＤＮＡ配列の選択的な結合が可能な活性化状態のままの細胞内でミトコンドリアに送達することが可能である。
【０２１８】
実施例３
特定のｍｔＤＮＡ配列に対するキメラＺＦＰ−メチラーゼの標的化
次のステップは、Ｆ−ＺＦＰＮＡＫＰが、選択的に突然変異体ＧＣＣＣＧＧＧＣＣ  ｍｔＤＮＡ配列に活性を修飾するＤＮＡを導くことができるかどうかについて検討することであった。ＤＮＡ修飾活性として、我々は、ヒトＤＮＭＴ３ａ  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインを選択した。この酵素は、基質としてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を使用して５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）に対するＣｐＧ部位において主にシトシンをメチル化する。Ｚｉｆ２６８に由来するＺＦＰ及び触媒ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含むキメラタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｘｕ，Ｇ．Ｌ．＆Ｂｅｓｔｏｒ，Ｔ．Ｈ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １７，３７６−８（１９９７）；ＭｃＮａｍａｒａ，Ａ．Ｒ．，Ｈｕｒｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．＆Ｆｏｒｄ，Ｋ．Ｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０，３８１８−３０（２００２））及びｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｃａｒｖｉｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｐａｒｒ，Ｒ．Ｄ．＆Ｋｌａｄｄｅ，Ｍ．Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，６４９３−５０１（２００３））において配列特異的ＤＮＡメチル化に触媒作用を及ぼすことが既に示されている。ヒトｍｔＤＮＡにおける内在性のシトシンのメチル化は極めて限定的であるが（Ｓｈｍｏｏｋｌｅｒ  Ｒｅｉｓ，Ｒ．Ｊ．＆Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５８，９０７８−８５（１９８３）；Ｍａｅｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５０，１４８０−１（２００４））、ＳＡＭはミトコンドリアの中に存在する（Ａｇｒｉｍｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７９，１８３−９０（２００４））。メチラーゼを使用することの主要な長所は、その活性が配列特異的な５Ｃメチル化の程度によって容易に評価され得るということにある（Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９，１８２７−３１（１９９２））。
【０２１９】
可撓性リンカー及びＣ末端ＮＥＳを使用してヒトＤＮＭＴ３ａ（ｍｅｔｈ）のメチラーゼドメインにＦ−ＺＦＰＮＡＫＰ構築物を融合してＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを得た（図３Ａ）。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳがヒト細胞において発現される場合、ＭＴＳ  Ｆは、従来のミトコンドリアの取り込み経路による取り込みと一致する成熟タンパク質から切断されることが明らかになった。単離されたミトコンドリアがプロテイナーゼＫでインキュベートされた場合、ＦＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳの成熟形態は、ミトコンドリアの基質タンパク質ｍｔＴＦＡＭと同程度にタンパク質分解が保護され（Ｋａｎｇ，Ｄ．＆Ｈａｍａｓａｋｉ，Ｎ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０４２，１０１−８（２００５））、一方でＧＡＰＤＨ（ミトコンドリア外膜に結合したタンパク質）（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｈ．＆Ｃｈｒｉｓｔｅｎ，Ｐ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１８，９０５−１０（１９９３）；Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１，２８１−６（２００３））が分解された（図３Ｂ）。更なる免疫蛍光法実験によって、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳは、ミトコンドリアのヌクレオイドに認められた常在性のタンパク質に特有の点状のパターン（図３Ｃ、１〜３）におけるミトコンドリアの中でＭｉｔｏＴｒａｃｅｒ  Ｒｅｄと共局在したことが示された（Ｇａｒｒｉｄｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４，１５８３−９６（２００３））。ヌクレオイドにおけるその局在化は、その分布を、ヌクレオイドの一部であることが知られているミトコンドリアの転写因子、ｍｔＴＦＡＭ（図３Ｃ、４〜６）及び更にミトコンドリアの単鎖ＤＮＡ結合性タンパク質ｍｔＳＳＢ（図示せず）と比較することによって確認された（Ｇａｒｒｉｄｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４，１５８３−９６（２００３））。最終的な確認は、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳが、ＢｒｄＵ（図３０、７〜９）又はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（図６参照）に標識されたｍｔＤＮＡ自体と共局在したことを示すことから得られた。それ故、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳは、細胞の中でミトコンドリアによって取り上げられ、基質内のｍｔＤＮＡに局所化する。
【０２２０】
実施例４
キメラＺＦＰメチラーゼによるｍｔＤＮＡの配列特異的ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化
最終の目的は、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳが、標的とされたＧＣＣＣＧＧＧＣＣ配列に隣接したＣｐＧ部位においてシトシンの５Ｃメチル化を選択的に増加させたかどうかを判定することである。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ構築物は、ｍｔＤＮＡにおいて８９９３位でＧを含むＮＡＲＰ細胞において発現され、そして更にこの位置でＴを有するｗｔ細胞で発現された。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳによるｍｔＤＮＡメチル化の配列特異性を評価するために、我々は重亜硫酸塩法を使用した（Ｆｒｏｍｍｅｒ，  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９，１８２７−３１（１９９２））。この技法は、ｍ５Ｃを変化させずに残しつつＤＮＡを重亜硫酸塩で処理して全てのシトシンをウラシルに変換することからなる。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ又は対照構築物（図４）でトランスフェクトされたｗｔ又はＮＡＲＰ細胞のいずれかに由来する全体のＤＮＡが抽出され、次いで目的のＧＣＣＣＧＧＧＣＣ配列を含む重亜硫酸塩変換ｍｔＤＮＡ  Ｈ鎖の１２０ｂｐフラグメントがＰＣＲによって増幅され、クローン化された。２つの独立した実験からの統計学的に有意な数のクローンが構築物ごとにランダムに選択され、シーケンスされ、そして対照配列と比較して、どのシトシンがメチル化されたのかを示した（図７及び８参照）。ＧＣＣＣＧＧＧＣＣ配列を囲むＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを発現するＮＡＲＰ細胞に由来するクローンの２３％に認められた（図４、右）。それに対して、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを発現するｗｔ細胞において、類似の領域におけるＣｐＧメチル化の程度は約６倍低く、ＣｐＧメチル化の背景レベルと区別がつかなかった。同様に、Ｆ−ＺＦＰｃｏｎｔ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳがＮＡＲＰ細胞において発現された場合、解析された領域においてＣｐＧメチル化の約６倍低かった。ＺＦＰのないミトコンドリアに標的化されたメチラーゼドメイン、Ｆ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ（図３Ａ参照）は、ＮＡＲＰ細胞において発現され、更にＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳよりもＣｐＧメチル化レベルのはるかな低下（２．６倍）を引き起こした。更に、Ｆ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ対照は、全ての解析された領域の全体にわたって広がったメチル化されたＧｐＧ部位を示した（図４、左）。Ｆ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳと比較した、ｗｔ細胞において発現したＦ−ＺＦＰｃｏｎｔｍｅｔｈ−ＮＥＳ又はＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳについて認められたメチル化レベルの低下は、既に報告されたようにＺＦＰに対する融合によるメチルトランスフェラーゼＤＮＡの親和性の低下に起因する可能性があった（Ｘｕ，Ｇ．Ｌ．＆Ｂｅｓｔｏｒ，Ｔ．Ｈ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １７，３７６−８（１９９７））。これらの対照によって、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳの発現におけるＧＣＣＣＧＧＧＣＣ配列の周辺のＣｐＧメチル化の増加は、ミトコンドリアにおけるメチラーゼの存在の単純な結果ではなかったことが示される。更にまた、ＣｐＧメチル化の増加は、ＧＣＣＣＧＧＧＣＣ配列へのＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳの配列特異的結合の結果であるが、それ���、この部位（領域３８０〜５７０及び１３５００〜１３６５０）から非常に離れたｍｔＤＮＡの他の領域におけるＣｐＧメチル化の増加が認められなかったためであった。
【０２２１】
ＧＣＣＣＧＧＧＣＣから下流に３ｂｐのＣｐＧ部位についてＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ介在メチル化（クローンの約１８％）の高い選好が認められた（図４、左のＣｐＧ−ｃで示される）。それに対して、ＧＣＣＣＧＧＧＣＣから下流に１１ｂｐ位置したＣｐＧ部位のメチル化は認められなかった（図４、左のＣｐＧ−ｂ）。高度にメチル化されたＣｐＧ−ｃ部位は、ｈＤＮＭＴ３ａメチラーゼ（ＡＣＧＣ）について最も好ましい配列関係にあるが、一方でメチル化されていないＣｐＧ−ｂは最も好ましくないヌクレオチドがフランクされる（ＣＣＧＣ）（Ｈａｎｄａ，Ｖ．＆Ｊｅｌｔｓｃｈ，Ａ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４８，１１０３−１２（２００５））。更に、ｈＤＮＭＴ３ａによって触媒作用を及ぼされるメチル化は、非対称であり、強い鎖選好選択を示す（Ｌｉｎ，Ｉ．  Ｇ．，Ｈａｎ，  Ｌ．，Ｔａｇｈｖａ，Ａ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｌ．Ｅ．＆Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２２，７０４−２３（２００２））。それ故、ＣｐＧ−ｂのメチル化は、主にＬ鎖に生じ、従って、高いピリミジン含有量のためにＬ鎖に適用することが困難なこの部分の重亜硫酸塩配列決定によっては検出されなかった可能性がある。２つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳが結合するＧＣＣＣＧＧＧＣＣ配列（図４のｄ及びｅで示される）に認められなかった。しかしながら、これらのＣｐＧ部位のメチル化は、擬及びＦ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳトランスフェクト細胞において検出された。このことは、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ結合によってこれらのＣｐＧ部位のメチル化から保護されることと一致している。上記の知見は、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳがＧＣＣＣＧＧＧＣＣ配列に結合し、可撓性リンカーによってメチラーゼが選択的にＣｐＧ−ｃに接近することが可能になることを示唆する（図４）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｚｉｆ２６８−Ｍ．ＳｓｓＩ融合は、好ましくは結合部位から上流に１６〜２２ｂｐに位置するＣｐＧ部位でシトシンをメチル化したが（Ｘｕ，Ｇ．Ｌ．＆Ｂｅｓｔｏｒ，Ｔ．Ｈ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １７，３７６−８（１９９７））、一方でイーストにおいては、Ｚｉｆ２６８−Ｍ．ＳｓｓＩは、強い部位選好を有する結合部位の両側の５〜５２ｂｐに位置するＣｐＧｓをメチル化した（Ｃａｒｖｉｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｐａｒｒ，Ｒ．Ｄ．＆Ｋｌａｄｄｅ，Ｍ．Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，６４９３−５０１（２００３））。それ故、我々の結果は、ＺＦＰｓに結合したメチラーゼの以前のｉｎ  ｖｉｖｏ研究に一致している。内在性タンパク質との相互作用、メチラーゼドメイン及びＺＦＰを分離するリンカーの柔軟性、並びにＤＮＡに結合した標的化メチラーゼに対する特定のＣｐＧのヘリックス面の関係は、幾つかの部位の選択的なｉｎ  ｖｉｖｏでのメチル化に寄与することができた。
【０２２２】
Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを発現するＮＡＲＰ細胞において、シトシンのメチル化には、ＧＣＣＣＧＧＧＣＣ配列の近くの塩基置換が多くの場合付随した（データは示されない）。これらの突然変異は、ＮＡＲＰとｗｔ細胞のいずれの非メチル化クローンにおいても検出されなかった。その標的部位に対するＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳの結合及び／又はｍｔＤＮＡのメチル化のいずれも、この領域のｍｔＤＮＡ複製の適合度に影響を及ぼす可能性がある。この問題は現在検討されている。
【０２２３】
我々の研究はまた、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを発現する細胞におけるＧＣＣＣＧＧＧＣＣの近くで、クローンのそれぞれ約４％、２．５％及び１％において、ＣｐＡ、ＣｐＴ及びＣｐＣジヌクレオチドにおいてメチル化が高まったことを示した（図４）。それに対して、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを発現するｗｔ細胞のこの領域において、或いはＦ−ＺＦＰｃｏｎｔｍｅｔｈ−ＮＥＳ又はＦ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを発現するＮＡＲＰ細胞において、非ＣｐＧメチル化のレベルの大きな低下が認められた（図４）。この結果は、ＤＮＭＴ３ａメチラーゼが、あまり効果的でないにせよ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで非ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンをメチル化することもできるという報告と一致する（Ｇｏｗｈｅｒ，Ｈ．＆Ｊｅｌｔｓｃｈ，Ａ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９，１２０１−８（２００１）；Ａｏｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９，３５０６−１２（２００１）；Ｍｕｎｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７８，７６３−８（２００４）；Ｒａｍｓａｈｏｙｅ，Ｂ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  ＮａｔＩ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，５２３７−４２（２０００））。更に、ジヌクレオチドＣｐＧ、ＣｐＡ、ＣｐＴ、ＣｐＣにおいて認められたメチル化の全体的な相対的比率は、これらの部位についてのＤＮＭＴ３ａメチラーゼの既知の傾向に非常に一致する。標的とされたＧＣＣＣＧＧＧＣＣ配列を囲む領域の非ＣｐＧメチル化の上昇は、それ故、ＺＦＰによってそこで導かれる酵素の高濃度の結果である可能性があった。要約すると、我々は、標的とされたメチラーゼによるｍｔＤＮＡの部位の配列特異的メチル化を示した。
【０２２４】
考察
我々は、ミトコンドリアに対して酵素的に活性なキメラＺＦＰを標的とすることが可能であることを示した。従来のＭＴＳは、信頼性が高いミトコンドリアの局在化を確実にするには十分でなかった。そして我々は、ＭＴＳと共にＮＥＳを融合タンパク質のＣ末端に組み込む必要があった。この再ルーチング戦略は、ＺＦＰｓがミトコンドリアのみに向けられたことを確実にすることに効果的であったことを立証した。核局在化が問題を含む場合、Ｃ末端ＮＥＳを組み込むこの戦略は、ミトコンドリアを標的としたＺＦＰｓの使用に必須であるだけでなく、ミトコンドリア及び他の細胞器官に対してタンパク質を標的とすることに一般的に用いることが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究におけるように、ミトコンドリアの中で、ＺＦＰは正確に折りたたまれ、そして適当なＤＮＡ配列を同じ配列識別に結合した。重要なことに、このＺＦＰは、ミトコンドリアにおいて発現された場合、既に報告された核ＺＦＰｓと同様に、確認された９個の塩基対の内の単一の点変異によって異なる突然変異体とｗｔ  ｍｔＤＮＡとの間を区別することができた（Ｃｈｏｏ，Ｙ．，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｃｉａ，Ｉ．＆Ｋｌｕｇ，Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７２，６４２−５（１９９４））。前記ＺＦＰは、ＤＮＡ修飾酵素活性をｍｔＤＮＡの特定の位置に標的化した。原理の証明としてここで選択された活性はメチラーゼドメインであった。その理由は、配列特異的なメチル化は、活性が真に配列依存的であるかどうかを確認するために容易に評価され得るからである。これによって、ＺＦＰに対するメチラーゼの結合がｍｔＤＮＡの配列特異的な修飾につながったことが確認された。各種の配列特異性を有する広範囲にわたるＺＦＰを設計することが可能であるため、ここで報告されるアプローチは、ミトコンドリア内のＤＮＡ配列のかなりの範囲に対する選択的な標的化に有用であり得た。このことは、ＺＦＰが特定のエフェクタードメインに結合し、次いでミトコンドリア内の所定のＤＮＡ配列と結合することに向けられることを可能にする。例えば、ヌクレアーゼドメインに結合したＺＦＰは、ｗｔ  ｍｔＤＮＡを無損傷のままにして変異を選択的に分解するために使用することが可能である。これは、異種形成（ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｍｉｃ）ミトコンドリア病に対する可能な治療として使用することが可能である。
【０２２５】
これらの疾患に対する１つの可能な治療戦略は、変異したｍｔＤＮＡの複製の選択的阻害に基づき得る。変異したｍｔＤＮＡのコピー数を減少させることによって、細胞はｗｔ  ｍｔＤＮＡによって再び増殖することが可能になり、従ってそれによりミトコンドリアの機能が回復し、そして疾患表現型が消失した。別の応用は、ｍｔＤＮＡの複製及び転写のための調節領域を検討することであった。要約すると、我々は、配列特異的なＺＦＰに対する結合によって、ｍｔＤＮＡの特定の配列に各種の活性を標的化するための方法を開発した。
【０２２６】
上記の明細書で言及された全ての刊行物は、本明細書に参照により組み込まれている。
【０２２７】
本発明の記載された方法及びシステムの各種の改変及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態と関連して記載されたが、請求される本発明をかかる具体的な実施形態に過度に限定してはならないと理解されなければならない。実際、分子生物学又は関連分野の当業者に直ちに明らかである本発明を実施するための記載された形態の各種の改変は、以下の請求項の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】ＺＦＰの細胞内局在化に対する種々のミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）及び更なる配列の作用。一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞における免疫蛍光法によって、ＺＦＰクローン３０（ＺＦＰ３０）に由来する構築物の細胞内局在化を解析し、その際にミトコンドリアは、エピトープ標識に対する抗体によって検出されるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ＣＭＸ  Ｒｅｄ及びＺＦＰで、その後ＦＩＴＣに結合する２次抗体で染色された。（Ａ）は、種々のＭＴＳの状況下並びにＣ末端のＧＦＰ（２）又は３’ＵＴＲ（８）等の更なる配列の有無において最初にテストされたＺＦＰ３０に由来する赤（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ由来）及び緑の蛍光の結合した局在化画像を示す。内在性のミトコンドリアタンパク質に由来する以下のＮ末端ＭＴＳをテストした。Ｃ８：ヒトチトクロームｃ酸化酵素のサブユニットＶＩＩＩに由来（１及び２）、Ｔ１：トリパノソーマブルセイ（Ｔｒｙｐｈａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）に由来するジンクフィンガータンパク質ＭＰ４２に由来（３）、Ｔ２：トリパノソーマブルセイ（Ｔ．  ｂｒｕｃｅｉ）に由来するジンクフィンガータンパク質ＭＰ６３に由来（４）、Ｔ３：Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅに由来するジンクフィンガー７ｂタンパク質に由来（５）、Ｒ：コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に由来するＡＴＰシンターゼのサブユニット６に由来（６）、及びＦ：ＡＴＰシンターゼのヒトＦ１βサブユニットに由来（７及び８）。Ｆ−ＺＦＰ３０（７）は部分的なミトコンドリアの局在（７の矢印）を示す唯一の構築物であり、それ故、それを用いてＮＥＳを含む構築物のファミリーを設計した（パネルＢ）。（Ｂ）は、更なるドメインの有無においてＮＥＳ（１）を含むＦ−ＺＦＰ３０に由来する赤（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ由来）及び緑の蛍光の結合した局在化画像を示す。テストされた融合タンパク質としては、４８ｋＤａのサイズの産物を形成するＧＦＰを組み込んだＦ−ＧＦＰ−ＺＦＰ３０−ＮＥＳ（２）、６１ｋＤａの産物を生じるｈＤＮＭＴ３ａメチラーゼの触媒ドメインを組み込んだＦ−ＺＦＰ３０−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ（３）、及び８６ｋＤａの融合タンパク質を生じるＧＦＰとｈＤＮＭＴ３ａの触媒メチラーゼドメインとの両方を組み込んだＦ−ＧＦＰ−ＺＦＰ３０−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ（４）が挙げられる。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒを含むＺＦＰ３０の共局在は、デジタル的に結合された画像で黄色に見える。
【図２】ＮＡＲＰに特異的なミトコンドリアＦ−ＺＦＰＮＡＲＰの設計及びＤＮＡ結合。（Ａ）３−フィンガータンパク質Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰによるＤＮＡ認識。Ｚｉｆ２６８系Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰを選択してｍｔＤＮＡのＬ鎖のＴ８９９３Ｇ変異を含む配列を結合した（８９９３Ｇは標的部位内のブラックボックスとしてマークした）。ジンクフィンガーＦ１、Ｆ２及びＦ３のαヘリックスのアミノ酸配列は、単一の文字コードを使用して下記で一覧が示される。フィンガーＦ１、Ｆ２及びＦ３は、灰色の球体として示される亜鉛イオンによって安定するαヘリックス及び２つのβ鎖によって表される。ｍｔＤＮＡのＬ鎖に対する−１位、３位及び６位の残基の予測される接触は、実線の黒い矢印として示される。曲線の灰色の矢印は、２位のアミノ酸と各フィンガーに対する隣接する３ｂｐの結合部位間の界面の相補的Ｈ鎖との間の交差鎖相互作用の可能性を示す。（Ｂ）Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰによる配列識別。突然変異体Ｔ８９９３Ｇ（ＮＡＲＰ−Ｇ）又はＴ８９９３Ｃ（ＮＡＲＰ−Ｃ）又はｗｔ配列８９９３Ｔ（ｗｔ）のいずれかを含む標的ＤＮＡに対する結合についてのゲルリターデイションアッセイで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ及び対照のジンクフィンガーペプチドＦ−ＺＦＰｃｏｎｔをテストした。全てのペプチドを連続した５倍の希釈（勾配の記号で示される）で使用し、そしてＤＮＡプローブを０．３ｎＭの濃度で使用した。文字「ｆ」は遊離ＤＮＡを意味し、一方で文字「ｂ」はタンパク質が結合した複合体を意味する。タンパク質が結合した複合体「ｂ」の２つの移動性の形態は、交差鎖相互作用の有無で発現するＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ＤＮＡの２つの異なる圧縮の程度に起因する可能性がある。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰがこれらの相互作用について最適化されなかったことには注意しなければならない。（Ｃ）Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰは、ミトコンドリアへの取り込みにおける結合能力を有する。ミトコンドリアに標的化されたＦ−ＺＦＰＮＡＲＰを一時的に発現する細胞からのミトコンドリア抽出物に関して、Ｔ８９９３Ｇ変異（ＮＡＲＰ−Ｇ）を含むＤＮＡ標的におけるゲルリターデイションアッセイを実施した。細胞質ゾル分画を対照として使用した。タンパク質の一連の希釈及びプローブの濃度は、（Ｂ）と同様であった。
【図３】ミトコンドリアに標的化されたジンクフィンガーメチラーゼＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳの構造及びミトコンドリア内局在化。（Ａ）ミトコンドリアに標的化されたメチラーゼの概略的構造。ＮＡＲＰに特異的な（Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ）又は対照の（Ｆ−ＺＦＰｃｏｎｔ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ）を作製するために、ヒトＤＮＭＴ３ａ  ＤＮＡメチラーゼ（ｈＤＮＭＴ３ａ  ＣＤ）の触媒ドメイン（残基５９２〜９０９）への（ＳＧＧＧＧ）３ＳＳの１７アミノ酸の長い可撓性リンカーを使用してキメラのメチラーゼＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ又はＦ−ＺＦＰｃｏｎｔを結合した。核外移行シグナル（ＮＥＳ）をＣ末端に付加した。更なる対照として、ＤＮＡ結合ドメインが欠けている、ミトコンドリアに標的化されたメチラーゼを、Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ構築物からＺＦＰを欠失させることによって作製した（Ｆ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ）。更なる検出を容易にするために、両方の構築物にはＨＡエピトープ標識を用いた。（Ｂ）ミトコンドリア内のＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳジンクフィンガーメチラーゼの局在化。一時的にＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを過剰発現させたＮＡＲＰ細胞を分画し、そして抗ＨＡ  ｍＡｂを使用してウエスタンブロット法によってタンパク質分画を解析した。示された通りの各種条件下で全細胞可溶化物（「Ｔ」）、細胞質ゾル（「Ｃ」）及びプロテイナーゼＫで処理されたミトコンドリア分画におけるＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳ前駆体（「ｐ」）及びその成熟した（「ｍ」）形態の局在化が、マーカータンパク質の局在化と比較された。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳの前駆体は、ミトコンドリア分画において認められたが、プロテアーゼ消化に到達可能であったことから、明確にミトコンドリアの外側に位置していた。反対に、キメラのメチラーゼの成熟形態は、ミトコンドリアがＴｒｉｒｏｎＸ−１００と共に溶解された後のみ、保護され、そしてタンパク質分解に到達可能となった。以下の内在性タンパク質を分画マーカーとして使用した。（ｉ）ミトコンドリア外膜２５、２６に静電的に関連すると以前に報告されたＧＡＰＤＨ。（ｉｉ）ｍｔＴＦＡＭ：ミトコンドリア基質２７において局所化される転写因子。（Ｃ）ミトコンドリアヌクレオイドとのＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳジンクフィンガーメチラーゼの共局在。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳの細胞内局在化を、一時的にトランスフェクトされたＮＡＲＰ細胞における免疫蛍光法によって解析した。ミトコンドリアは、ＨＡエピトープ標識に対する抗体によって検出されるＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  ＣＭＸ  Ｒｅｄ（赤）及びＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳで、その後ＦＩＴＣ（緑）に結合する２次抗体で染色された。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳは、点状のミトコンドリア内染色パターン（１〜３）を示す。更に、大部分の一時的に発現したＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳは、ｍｔＴＦＡＭ、即ちヒトミトコンドリアヌクレオイドの周知のタンパク質と共局在化し、それはポリクローナル抗体で染色され、そしてＴｅｘａｓＲｅｄ（４〜６）で視覚化された。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳに対して陽性のミトコンドリア内の病巣は、ＢｒｄＵ（７〜９）で標識されたｍｔＤＮＡと共局在化した。
【図４】ＺＦＰＮＡＲＰ結合部位に隣接したｍｔＤＮＡ領域のｉｎ  ｖｉｖｏでのメチル化の結果。示された各構築物のＮＡＲＰ突然変異部位を囲むｍｔＤＮＡのＨ鎖におけるシトシン残基のメチル化状態を判定するために、細胞ＤＮＡの全体を重亜硫酸塩の変換に供した。次いで、対象の領域（示された通り、８９５０〜９０７０位）をＰＣＲによって増幅し、そして大腸菌内にクローン化した。どのシトシンがメチル化されたのかを同定するために、各構築物について、統計学的に有意の数の独立したクローン（「Ｎ＝」によって示される）をランダムに選択し、配列決定し、そして解析した。図は、ｍｔＤＮＡフラグメントがＮＡＲＰ細胞か対照ｗｔ細胞のいずれかから生じたことを示し、ここで、メチル化されていないＣｐＮジヌクレオチドは無記入の四角として表され、メチル化されたＣｐＮ部位（ｍＣｐＮ）は記入された四角として示され、説明文によって色づけられる。記入された四角内の数は、各構築物について検出されたｍＣｐＮの頻度を表す。解析された領域において認められるＣｐＧ部位は、本文の参照のために更に「ａ」から「ｆ」までアルファベット順に示される。各構築物について、少なくとも１つのｍＣｐＮ、ｍＣｐＧ又はメチル化された非ＣｐＧを含むクローンの割合をグラフに示す。Ｆ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳを発現するＮＡＲＰ細胞及び対照から生じるＤＮＡのメチル化における統計的な差は、対応のあるスチューデントｔ検定によって判定した場合、非常に有意（Ｐ＞０．００１）であることが認められた。
【図５】ミトコンドリアの取り込みについてテストされるジンクフィンガータンパク質の配列。２フィンガーユニット（２Ｆ×２Ｆ）の２倍として設計される密接に関連した４フィンガータンパク質のライブラリーのタンパク質配列が並べられる。前記タンパク質は、各種のＭＴＳを用いてミトコンドリア内に取り込まれるその能力についてテストされた。αヘリックスにおいて予測されたＤＮＡ接触残基は、黄色でマークされる。ジンクフィンガーＦ１〜Ｆ４に対する認識αヘリックスの位置は、その並びの上に示される。２つのフィンガーの第１及び第２のセット間に存在するリンカー（配列ＧＧＧ）は、該当する場合、青で示す。認識αヘリックスの外部の置換は、黒でマークされる。ＮＬＳとして働く可能性があるフィンガーＦ２及びＦ４の認識αヘリックス内の塩基性アミノ酸のセットが構成される。群１及び群２のタンパク質は、異なるライブラリーから形成された。
【図６】ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ染料で染色されるｍｔＤＮＡとのＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳの共局在。一時的にトランスフェクトされたＮＡＲＰ細胞における免疫蛍光法によって、ｍｔＤＮＡとのＦ−ＺＦＰＮＡＲＰ−ｍｅｔｈ−ＮＥＳの共局在を解析した。実験手順で説明されるように、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎで染色された細胞を固定し、透過化処理し、そして免疫染色に供した。キメラのメチラーゼは、ＨＡエピトープ標識に対する抗体で、その後Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（赤）に結合する２次抗体で検出された。共局在は、デジタル的重ねた画像上の黄色として現れる。
【図７−１】５Ｃメチル化を解析するために用いられる重亜硫酸塩方法の説明。ＮＡＲＰ細胞（８９５０ｂｐ〜９０３０ｂｐ）のｍｔＤＮＡにおけるＺＦＰＮＡＲＰ結合部位に隣接した領域のミトコンドリアのＨ鎖のＤＮＡ配列は、前記方法を例証するために示される。ＺＦＰＮＡＲＰ結合部位の配列がハイライトされる。（Ａ）重亜硫酸塩の変換前のメチル化ＤＮＡ鋳型。（Ｂ）重亜硫酸塩の投与後のメチル化されていないＤＮＡ鋳型。全てのシトシンがチミンに変わることに注意が必要である。（Ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣｐＧメチラーゼＭ．ＳｓｓＩが投与され、そして更に重亜硫酸塩の変換に供されるＤＮＡ鋳型。（Ｄ）及び（Ｅ）異なるクローンの重亜硫酸塩の変換後のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるメチル化ＤＮＡ鋳型の２つ例。ＣｐＧの場合におけるＤＮＡのメチル化から生じる無変化のシトシンは、下線を引かれる。
【図７−２】５Ｃメチル化を解析するために用いられる重亜硫酸塩方法の説明。ＮＡＲＰ細胞（８９５０ｂｐ〜９０３０ｂｐ）のｍｔＤＮＡにおけるＺＦＰＮＡＲＰ結合部位に隣接した領域のミトコンドリアのＨ鎖のＤＮＡ配列は、前記方法を例証するために示される。ＺＦＰＮＡＲＰ結合部位の配列がハイライトされる。（Ａ）重亜硫酸塩の変換前のメチル化ＤＮＡ鋳型。（Ｂ）重亜硫酸塩の投与後のメチル化されていないＤＮＡ鋳型。全てのシトシンがチミンに変わることに注意が必要である。（Ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣｐＧメチラーゼＭ．ＳｓｓＩが投与され、そして更に重亜硫酸塩の変換に供されるＤＮＡ鋳型。（Ｄ）及び（Ｅ）異なるクローンの重亜硫酸塩の変換後のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるメチル化ＤＮＡ鋳型の２つ例。ＣｐＧの場合におけるＤＮＡのメチル化から生じる無変化のシトシンは、下線を引かれる。
【図８】ＺＦＰＮＡＲＰ結合部位から離れているｍｔＤＮＡ領域のメチル化の結果。示された構築物についてのＮＡＲＰ突然変異部位から離れているｍｔＤＮＡのＨ鎖におけるシトシン残基のメチル化状態を判定するために、細胞のＤＮＡの全体が重亜硫酸塩の変換に供された。次いで、ｍｔＤＮＡ（３８０位〜５７０位及び１３５００位〜１３６５０位）の対照の領域をＰＣＲによって増幅し、そして大腸菌内にクローン化した。どのシトシンがメチル化されたのかを同定するために、各構築物について、統計学的に有意の数の独立したクローン（「Ｎ＝」によって示される）をランダムに採集し、配列決定し、そして解析した。図は、ｍｔＤＮＡフラグメントがＮＡＲＰ細胞から生じたことを示し、ここで、メチル化されていないＣｐＮジヌクレオチドは無記入の四角として表され、メチル化されたＣｐＮ部位（ｍＣｐＮ）は記入された四角として示され、説明文によって色づけられる。記入された四角内の数は、各構築物について検出されたｍＣｐＮの頻度を表す。各構築物について、少なくとも１つのｍＣｐＮ、ｍＣｐＧ又はメチル化された非ＣｐＧを含むクローンの割合をグラフに示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月6日(2008.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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