(57)【要約】本発明は、免疫調節活性を有するが、タンパクフォールディング活性を欠いているか又は実質的に欠いている単離されたシャペロニン１０ポリペプチドに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節活性を有するが、タンパクフォールディング活性を欠いているか又は実質的に欠いている、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項２】
免疫調節活性を有する単離されたシャペロニン１０ポリペプチドであって、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較して可動ループ領域に１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは少なくとも対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドのレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項２に記載の単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項４】
前記可動ループ領域は配列番号１２に示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項２又は請求項３に記載の単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項５】
前記可動ループ領域のＩＭＬトリペプチドの又は複数の残基は荷電した残基で置換される、請求項２から請求項４のいずれかに記載の単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＩＭＬトリペプチドはＥＥＥ、ＩＩＩ又はＩＦＩ残基をコードするトリペプチドで置換され、対応するシャペロニン１０アミノ酸配列は配列番号３９、３７及び３５で示される、請求項５に記載の単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドは対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの可動ループ領域を実質的に欠いている、免疫調節活性を有する、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項８】
前記可動ループ領域は配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記シャペロニン１０ポリペプチドは、配列番号３又は２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる可動ループ領域を実質的に欠いている、請求項７又は請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記シャペロニン１０ポリペプチドは、配列番号４又は５又は２５で示されるヌクレオチド配列でコードされる可動ループ領域を実質的に欠損している、請求項７又は請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記シャペロニン１０ポリペプチドは、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項７から請求項１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
免疫調節活性を有する単離されたシャペロニン１０ポリペプチドであって、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較してルーフβ−ヘアピン領域に又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ルーフβ−ヘアピン領域は配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１２又は請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドのルーフβ−ヘアピン領域を実質的に欠いている、免疫調節活性を有する単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ルーフβ−ヘアピン領域は配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記シャペロニン１０ポリペプチドは、配列番号６又は２６で示されるアミノ酸配列を含んでなるルーフβ−ヘアピン領域を実質的に欠いている、請求項１５又は請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記シャペロニン１０ポリペプチドは、核酸配列番号７又は８又は２７で示されるヌクレオチド配列でコードされるルーフβ−ヘアピン領域を実質的に欠いている、請求項１５又は請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記シャペロニン１０ポリペプチドは少なくとも対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項１５から請求項１８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
単離されたシャペロニン１０ポリペプチドであって、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較してルーフβ−ヘアピン領域に又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでなる、免疫調節活性を有する、ポリペプチド。
【請求項２１】
単離されたシャペロニン１０ポリペプチドであって、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較して、可動ループ領域及びルーフβ−ヘアピン領域を両方とも実質的に欠いている、ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号９又は２８で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１０又は２９で示されるヌクレオチド配列でコードされる、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
少なくとも対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項２１又は請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドは、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較して追加的なＮ末端アラニン残基の欠失を含んでなる、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２３で示されるアミノ酸を含んでなる、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号４４で示されるヌクレオチド配列でコードされる、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと比較して減少したレベルの免疫調節活性を示す、請求項２５又は請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドのＮ終端は実質的にバックテリア性シャペロニン１０Ｎ終端で置換される、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号１４で示されるアミノ酸を含んでなる、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号４３で示されるヌクレオチド配列でコードされる、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと比較して減少したレベルの免疫調節活性を示す、請求項２９又は請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較して、グリシン残基が前記ポリペプチドの追加的なＮ末端アラニン残基を置換する、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号３１で示されるヌクレオチド配列でコードされる、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
少なくとも対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項３３又は請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
請求項１から請求項３６のいずれかに係るシャペロニン１０ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項３８】
適宜、又は複数の調節配列に操作可能にリンクした請求項３７に係る核酸を含んでなる、発現コンストラクト。
【請求項３９】
請求項１から請求項３６のいずれかのポリペプチドを発現するか、又は請求項３７の核酸又は請求項３８の発現コンストラクトを含んでなる、ホスト細胞。
【請求項４０】
請求項１から請求項３６のいずれかのポリペプチドと選択的に結合する抗体。
【請求項４１】
請求項１から請求項３６のいずれかのポリペプチド、請求項３７の核酸、請求項３８の発現コンストラクト又は請求項４０の抗体を含んでなる、医薬品組成物。
【請求項４２】
又は複数の追加薬剤を含んでなる、請求項４１に記載の医薬品組成物。
【請求項４３】
請求項１から請求項３６のいずれかのシャペロニン１０ポリペプチド又は請求項３７の核酸の有効量を被検者に投与するステップを含んでなる、被検者の治療方法。
【請求項４４】
前記治療は前記被検者の免疫応答を調節する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫応答はトール様受容体シグナリングの調節により調節される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法は、請求項１から請求項３６のいずれかのシャペロニン１０ポリペプチド又は請求項３７に記載の核酸の有効量を被検者に投与することを含んでなる、被検者の疾患又は症状の治療又は予防方法。
【請求項４７】
前記疾患、障害又は症状は、急性又は慢性炎症性疾患、喘息、アレルギー、多発性硬化症、ＧＶＨＤ、他の自己免疫疾患又は感染症から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記感染症は細菌又はウィルス感染である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細菌感染症はグラム陰性細菌により生じる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
患者又は少なくとも１つの細胞、組織又はこれらの臓器内でＴＬＲ４シグナリングを調節する方法であって、請求項１から請求項３６のいずれかのシャペロニン１０ポリペプチド又は請求項３７に記載の核酸の有効量を被検者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項５１】
前記シャペロニン１０ポリペプチドはアゴニスト誘導ＴＬＲシグナリングを調節する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
患者又は少なくとも１つの細胞、組織又はこれらの臓器内で又は複数の免疫調節剤の生産及び／又は分泌を調節する方法であって、請求項１から請求項３６のいずれかのシャペロニン１０ポリペプチド又は請求項３７に記載の核酸の有効量を被検者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項５３】
前記ポリペプチドはＴＬＲ４シグナリングを調節する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
免疫調節剤は炎症誘発性サイトカイン又はケモカイン、若しくは抗炎症性サイトカイン又はケモカインである、請求項５２又は請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ケモカイン又はサイトカインがＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−β又は１型インターフェロンから選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１から請求項３６のいずれかのポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）候補化合物を前記ポリペプチドに接触させるステップ、及び
（ｂ）前記候補化合物及び前記ポリペプチドの錯体生成を試験するステップ、を含んでなる方法。
【請求項５７】
前記錯体生成を試験するステップが、競争結合試験又はツーハイブリッド試験である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１から請求項３６のいずれかのポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記候補化合物の前記ポリペプチドに対する好適な相互作用を可能にする条件下において、前記ポリペプチドを候補化合物に接触させるステップ、及び
（ｂ）前記ポリペプチドの活性を試験するステップ、を含んでなる方法。
【請求項５９】
前記ポリペプチドの活性を試験するステップが、標識した基質を添加するステップ及び前記標識した基質における変化を計測するステップを含んでなる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリペプチドがヒトシャペロニン１０ポリペプチドであり、並びに配列番号１又は２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１から請求項５９のいずれかに記載の、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが配列番号２又は２２で示されるヌクレオチド配列でコードされる、請求項６０に記載の、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シャペロニン１０ポリペプチド、及びそれをコードする核酸に関する。本発明は、さらに、免疫調節活性を呈するシャペロニン１０ポリペプチド、それを使用する方法、及びかかるポリペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質１０（Ｈｓｐ１０）や妊娠早期因子（ＥＰＦ）としても知られる哺乳類のシャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）は典型的には、シャペロニン６０（Ｃｐｎ６０；Ｈｓｐ６０）と共にタンパク質のフォールディングに関与するミトコンドリア内の「分子シャペロン」タンパク質として特徴付けられる。Ｃｐｎ１０及びＣｐｎ６０は各々、細菌のタンパク質ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬのホモログである。ＧｒｏＥＳとＣｐｎ１０は各々７員環にオリゴマー化し、各々、１４個のＧｒｏＥＬ又は７個のＣｐｎ６０分子から構成されるバレル状構造の上に蓋として結合し、変性タンパク質を複合体に繋留する（非特許文献１及び２）。
【０００３】
Ｃｐｎ１０タンパク質は種間で高度に保存され、ヒトＣｐｎ１０はウシＣｐｎ１０と１００％同一であり、ラットＣｐｎ１０とは１つの位置のアミノ酸のみが相違する。ヒトＣｐｎ１０は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来ＧｒｏＥＳと３０％の配列同一性（６０％の相同性）を有する。大腸菌ＧｒｏＥＳの７量体結晶構造が過去に報告されている（非特許文献３の図１Ａ参照）。Ｃｐｎ１０／ＧｒｏＥＳタンパク質は基本的に３つの異なる構造の領域、すなわち逆平行β−バレル領域、並びにそれに隣接する「ルーフβ−ヘアピンループ」領域及び「可動ループ」領域からなる。可動ループ領域はＣｐｎ６０／ＧｒｏＥＬとの相互作用を仲介し、ゆえにＣｐｎ６０／ＧｒｏＥＬとの複合体の形成、及び「分子シャペロン」、すなわちタンパク質フォールディング活性にとり重要である。
【０００４】
しかしながら、Ｃｐｎ１０は分子シャペロンとしてのその細胞内の役割に加え、細胞表面（非特許文献４参照）及び細胞外流体中（非特許文献５参照）にも存在することが解明され、免疫反応の制御因子としての役割が次第に認識されつつある。例えばＣｐｎ１０は、自己免疫性脳脊髄炎、遅延型過敏症、及び同種移植片拒絶のモデル実験において、免疫抑制活性を有することが実証されている（非特許文献５及び６）。
【０００５】
また、本発明者らは最近、多数のヒト及びマウスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系及びマウス疾患モデルにおいて、Ｃｐｎ１０がＮＦ−ｋＢのＬＰＳ誘発活性を阻害し、ＬＰＳ誘発によるＴＮＦα及びＲＡＮＴＥＳ分泌を減少させ、ＩＬ−１０産生を亢進し得ることを実証しており（非特許文献７及び特許文献１、これらの開示事項は本願明細書でも参照により援用する）、Ｃｐｎ１０が自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療のための免疫治療薬としての有用性を発揮しうることを示唆している。
【非特許文献１】Ｂｕｋａｕ及びＨｏｒｗｉｃｈ、１９９８年、Ｃｅｌｌ、９２巻、３５１−３６６ページ
【非特許文献２】Ｈａｒｔｉ及びＨａｙｅｒ−Ｈａｒｔｌ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５巻、１８５２−１８５８ページ
【非特許文献３】Ｘｕら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ、３８８巻、７４１−７５０ページ
【非特許文献４】Ｂｅｌｌｅｓら、１９９９年、Ｉｎｆｅｃｔ．ｌｍｍｕｎ．、６７巻、４１９１−４２００ページ
【非特許文献５】Ｓｈｉｎら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８巻、７６０６−７６１６ページ
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇら、２００３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｓｃｉ．、２１２巻、３７４６ページ
【非特許文献６】Ｍｏｒｔｏｎら、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７８巻、６０３−６０７
【非特許文献７】Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０巻、４０３７−４０４７ページ
【特許文献１】国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００００４１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、この免疫調節活性の仲介に関与するＣｐｎ１０分子内の部位は未だ同定されていない。
【０００７】
本発明は、Ｃｐｎ１０分子の修飾、及び免疫調節活性に及ぼすこれらの組換えの効果に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明は、野生型Ｃｐｎ１０と比較して１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を含んでなるＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、これらのポリペプチドは免疫調節活性を呈することを特徴とする。
【０００９】
本発明の第１の態様は、免疫調節活性を有するが、タンパク質フォールディング活性を欠くか又は実質的に欠く、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関する。
【００１０】
本発明の第２の態様は、免疫調節活性を有する単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、当該ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較し可動ループ領域において１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を含むことを特徴とする。
【００１１】
当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと少なくとも同等の免疫調節活性を示しうる。
【００１２】
一実施形態において、Ｃｐｎ１０ポリペプチドの可動ループ領域におけるＩＭＬトリペプチドの１つ以上の残基は、荷電残基で置換されてもよい。
【００１３】
別の実施形態において、ＩＭＬトリペプチドを含むＣｐｎ１０ポリペプチドは、トリペプチドＥＥＥで置換されてもよい。ＥＥＥトリペプチドを含む当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号３９に記載のものであってもよい。当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号４０に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００１４】
さらに別の実施形態において、ＩＭＬトリペプチドを含むＣｐｎ１０ポリペプチドは、トリペプチドＩＩＩで置換されてもよい。ＩＩＩトリペプチドを含む当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号３７に記載のものであってもよい。当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号３８に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００１５】
さらなる別の実施形態において、ＩＭＬトリペプチドを含むＣｐｎ１０ポリペプチドは、トリペプチドＩＦＩで置換されてもよい。ＩＦＩトリペプチドを含む当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号３５に記載のものであってもよい。当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号３６に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００１６】
本発明の第３の態様は、免疫調節活性を有する単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、当該ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの可動ループ領域を実質的に欠くことを特徴とする。
【００１７】
一実施形態において、可動ループ領域を実質的に欠く当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号３又は２４に示すアミノ酸配列を含む。この可動ループ領域を実質的に欠く当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号４、５又は２５に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００１８】
当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと少なくとも同等の免疫調節活性を示しうる。
【００１９】
本発明の第４の態様は、免疫調節活性を有する単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、前記ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較しルーフβ−ヘアピン領域において１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を含むことを特徴とする。
【００２０】
当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと少なくとも同等の免疫調節活性を示しうる。
【００２１】
本発明の第５の態様は、免疫調節活性を有する単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、前記ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドのルーフβ−ヘアピン領域を実質的に欠くことを特徴とする。
【００２２】
一実施形態において、ルーフβ−ヘアピン領域（配列番号１３）を実質的に欠く当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号６又は２６に示すアミノ酸配列を含む。このルーフβ−ヘアピン領域を実質的に欠く当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号７、８又は２７に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００２３】
当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと少なくとも同等の免疫調節活性を示し得る。
【００２４】
本発明の第６の態様は、免疫調節活性を有する単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、前記ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較し可動ループ領域とルーフβ−ヘアピン領域において１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を含むことを特徴とする。
【００２５】
本発明の第７の態様は、単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、前記ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの可動ループ領域とルーフβ−ヘアピン領域の双方を実質的に欠くことを特徴とする。
【００２６】
この単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと少なくとも同等の免疫調節活性を示しうる。
【００２７】
一実施形態において、当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号９又は２８に示すアミノ酸配列を含む。当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号１０又は２９に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００２８】
本発明の第８の態様は、免疫調節活性を有する単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、前記ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較し追加的なＮ末端アラニン残基が欠失していることを特徴とする。
【００２９】
当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較し、Ｎ末端のアセチル基を欠いてもよい。このＣｐｎ１０ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと比較し低減した免疫調節活性のレベルを示しうる。
【００３０】
一実施形態において、追加的なＮ末端アラニン残基が欠失しているＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号２３に示すアミノ酸配列を含んでもよい。この追加的なＮ末端アラニン残基が欠失しているＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号４４に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００３１】
本発明の第９の態様は、免疫調節活性を有する単離されたＣｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドのＮ末端は、細菌のＣｐｎ１０のＮ末端で実質的に置換されていることを特徴とする。
【００３２】
当該細菌のＣｐｎ１０はＧｒｏＥＳであってもよい。
【００３３】
当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと比較し低減した免疫調節活性のレベルを示しうる。
【００３４】
一実施形態において、当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含んでもよい。当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号４３に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００３５】
本発明の第１０の態様は、免疫調節活性を有する単離Ｃｐｎ１０ポリペプチドの提供に関し、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較し、グリシン残基により、Ｃｐｎ１０ポリペプチドの追加的なＮ末端アラニン残基が置換されていることを特徴とする。
【００３６】
当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと比較し低減した免疫調節活性のレベルを示しうる。
【００３７】
一実施形態において、当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号３０に示すアミノ酸配列を含んでもよい。当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号３１に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００３８】
本発明の第１１の態様は、上記第１から第１０の態様のいずれかに係るＣｐｎ１０ポリペプチドをコードする単離された核酸の提供に関する。
【００３９】
本発明の第１２の態様は、１つ以上の調節配列に制御可能に連結した状態で第１１の態様に係る核酸を含んでなる発現コンストラクトの提供に関する。
【００４０】
本発明の第１３の態様は、上記第１から第１０の態様のうちのいずれかのポリペプチドを発現する、又は第１１の態様の核酸若しくは第９の態様を発現する発現コンストラクトを含んでなる宿主細胞の提供に関する。
【００４１】
本発明の第１４の態様は、第１から第１０の態様のうちのいずれかのポリペプチドと選択的に結合する抗体の提供に関する。
【００４２】
本発明の第１５の態様は、第１から第１０の態様のうちのいずれかのポリペプチド、第１１の態様の核酸、第１２の態様の発現コンストラクト、又は第１４の態様の抗体を含んでなる医薬組成物の提供に関する。
【００４３】
当該医薬組成物は、さらに１つ以上の薬剤を含んでもよい。例えば、複数の硬化症の治療のため、当該組成物は有効量のＩＦＮβをさらに含んでもよい。
【００４４】
本発明の第１６の態様は、被験者に有効量の第１から第１０の態様のうちのいずれかのＣｐｎ１０ポリペプチド又は有効量の第１１の態様の核酸を投与するステップを含む、被検者の治療方法の提供に関する。
【００４５】
この治療により、被験者の免疫反応が調節されうる。免疫反応は、Ｔｏｌｌ様受容体のシグナリングの調節を介して調節されうる。
【００４６】
本発明の第１７の態様は、被験者の疾患又は症状を治療又は予防する方法の提供に関し、当該方法は、有効量の上記第１から第１０の態様のうちのいずれかのＣｐｎ１０ポリペプチド又は第１１の態様の核酸を被験者に投与することを含んでなる。
【００４７】
当該疾患、障害又は症状は、急性若しくは慢性の炎症性疾患、喘息、アレルギー、多発性硬化症、ＧＶＨＤ、又は感染症から選択されてもよい。当該感染症は細菌感染又はウィルス感染から生じるものでもよい。当該細菌はグラム陰性菌でもよい。
【００４８】
本発明の第１８の態様は、被験者における、又はその少なくとも１つの細胞、組織若しくは器官におけるＴＬＲ４シグナリングを調節する方法の提供に関し、当該方法は、有効量の上記第１から第１０の態様のうちのいずれかのＣｐｎ１０ポリペプチド又は第１１の態様の核酸を投与することを含んでなる。
【００４９】
典型的には、Ｃｐｎ１０はアゴニストの誘発によるＴＬＲ４シグナリングを制御する。
【００５０】
本発明の第１９の態様は、被験者における、又はその少なくとも１つの細胞、組織、若しくは器官における１つ以上の免疫調節物質の産生及び／又は分泌を調節する方法の提供に関し、当該方法は、有効量の上記第１から第１０の態様のうちのいずれかのＣｐｎ１０ポリペプチド又は第１１の態様の核酸を投与することを含んでなる。
【００５１】
当該Ｃｐｎ１０は、ＴＬＲ４からのシグナリングを調節してもよい。
【００５２】
免疫調節物質は、炎症促進性のサイトカイン若しくはケモカイン、又は抗炎症性のサイトカイン若しくはケモカインであってもよい。当該サイトカイン又はケモカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、又は１型インターフェロンから選択されてもよい。当該１型インターフェロンは、ＩＦＮα又はＩＦＮβであってもよい。
【００５３】
本発明の第２０の態様は、上記第１から第１０の態様のうちのいずれかのポリペプチドに結合する化合物を同定する方法の提供に関し、当該方法は以下のステップを含んでなる。（ａ）候補化合物を前記ポリペプチドと接触させるステップ、及び（ｂ）候補化合物と前記ポリペプチドとの複合体の形成をアッセイするステップ。
【００５４】
複合体形成のアッセイは、競合的結合アッセイ又はツーハイブリッドアッセイであってもよい。
【００５５】
本発明の第２１の態様は、第１から第１０の態様のうちのいずれかのポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法の提供に関し、当該方法は、次のステップを含んでなる。
（ａ）前記ポリペプチド、及びヌクレオチド、又はそれらの混合物に対する候補化合物の相互作用を可能にするのに適切な条件下で、前記ポリペプチドを前記候補化合物と接触させるステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドの活性をアッセイするステップ。
【００５６】
当該ポリペプチドの活性のアッセイは、標識した基質を添加し、その標識した基質の変化を測定することを含んでもよい。
【００５７】
また、本発明には、上記の態様及び実施形態に係る修飾Ｃｐｎ１０ポリペプチド及びポリヌクレオチドの変異体、誘導体、相同体、類似体、及び断片が包含される。
【００５８】
上記の態様及び実施形態では、Ｃｐｎ１０ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、任意の動物から調製してもよく、組換ＤＮＡ技術を用いて調製してもよく、又は合成してもよい。典型的には、当該Ｃｐｎ１０は真核生物由来のＣｐｎ１０である。
【００５９】
上記の態様では、当該野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号１又は２１に示すアミノ酸配列を含むヒトＣｐｎ１０ポリペプチドであってもよい。
【００６０】
上記の態様では、当該野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号２又は２２に示すヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００６１】
上記の態様及び実施形態では、当該Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性は、ポリペプチドの７量体の産生を伴ってもよい。
【００６２】
（定義）
本願明細書の文脈において、用語「含む」は、「主として含むが、必ずしも単独ではない」ことを意味する。さらに、「含有する」や「含んでなる」のような「含む」の変形は、相応に変化した意味を有する。
【００６３】
Ｃｐｎ１０ポリペプチドに関する本願明細書における用語「野生型」には、それらの天然又は非天然の形態におけるポリペプチドが包含される。例えば、天然のヒトＣｐｎ１０は、そのＮ末端がアセチル化されているが、本発明において用語「野生型」を用いる場合、アセチル化された形態又はアセチル化されていない形態のポリペプチドが包含される。さらに野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、Ｎ末端に更なるアラニン（Ａ）残基を含んでもよい（国際公開第２００４／０４１３００号、この開示事項は本願明細書でも参照により援用される）。
【００６４】
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって相互に結合したアミノ酸から構成されるポリマーを意味する。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本願明細書において相互に交換可能に用いられるが、本発明における「ポリペプチド」の用語は、全長のタンパク質の一部を構成するという意味において用いられうる。
【００６５】
本願明細書における用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド塩基、又は公知の天然ヌクレオチドの類似体からなる一本鎖又は二重鎖のポリマーのことを指し、この用語は、他に明記がなければ、特定の配列に加え、それに対して相補的な配列をも包含する。用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本願明細書において相互に交換可能に用いられる。
【００６６】
用語「単離」は、対象の分子がその自然環境又は宿主から取り出され、付随の不純物が低減又は除去され、問題の分子が存在する支配的な分子種となっている（すなわち分子ベースで組成物／サンプル中の他の個々の種よりも豊富である）状態のことを意味する。典型的には、実質的に純粋な画分とは、対象の種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約３０％（分子ベース）を占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０超〜９０％を含んでなる。最も好ましくは、対象の分子種は、実質的に同質になる（不純物が通常の検出方法では組成物中に検出できない程度）まで精製され、その組成物は実質的に単一の高い分子種からなる。
【００６７】
本願明細書における用語「実質的」とは、大部分ではあるが必ずしも全てではないことを意味し、従って、対応する野生型ポリペプチドの構成領域を「実質的」に欠く組換ポリペプチドというときは、その組換ポリペプチドはその構成領域の一部を保持している場合もある。例えば、対応する野生型ポリペプチドの構成領域を「実質的」に欠く組換ポリペプチドは約５０％以下の構成領域の配列を保持してもよいが、典型的には除かれる配列領域に比例して、当該構成領域は構造的及び／又は機能的に不活性となる。
【００６８】
本願明細書における用語「保存的アミノ酸置換」とは、ポリペプチド鎖（タンパク質の一次配列）の中で１つのアミノ酸を同様な特性を有する別のアミノ酸と置換又は交換することを指す。例えば、荷電アミノ酸のグルタミン酸（Ｇｌｕ）を類似の荷電アミノ酸のアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換することがその保存的アミノ酸置換である。
【００６９】
本願明細書における用語「治療」、「治療する」及びこれらの変形は、疾患状態又は症候を治療する、疾患の確立を防止する、あるいは、形はどうあれ何らかの方法により疾患又は他の不都合な症状の進行を防止、後退、遅延又は好転させるための全ての任意の方法を指す。
【００７０】
本願明細書における用語「有効量」には、その意味中に、所望の治療又は予防効果を提供するための薬剤又は化合物の、毒性はないが十分な量という意味が包含される。必要とされる正確な量は、治療される種類、被験者の年齢及び健康状態、治療される症状の重症度、投与される具体的な薬剤、及び投与方法等の因子に依存して、被験者ごとに異なる。このため、正確な「有効量」を特定することはできない。しかしながら、ある特定の場合には、適切な「有効量」は所定の実験のみを用いて当業者が定めてもよい。
【００７１】
本願明細書における用語「調節する」、「調節」、及びこれらの変形は、本発明の特定の分子又は薬剤の存在下での分子の活性、生成、分泌、又は機能のレベルが、その分子又は薬剤が存在しない場合のその活性、生成、分泌、又は他の機能と比較して増加又は減少することを指す。これらの用語は、増加若しくは減少のいずれの定量化も暗示するものではない。当該調節は、所望の結果を生じるのに十分な程度であってもよく、また直接又は間接的な調節であってもよい。
【００７２】
（配列の参照）
表１．下記の参照用の表中に、本願明細書の全体を通して用いるＣｐｎ１０ポリペプチドに付した名称を示す。この表は、本願明細書に開示のＣｐｎ１０ポリペプチドの特徴及びそれらの対応するアミノ酸及び核酸の配列番号の記載を含む。
【表１】
2009505667.tif 000002
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
Ｃｐｎ１０は、１０ｋＤａの同一サブユニット７個のドーム形状である。ドーム内は多くの電荷を有して親水性である。各々のＣｐｎ１０サブユニットは、２つの大きな伸展部分が突出した不規則なβ−バレル形状を形成する。第１の伸展部分は、７量体の中心部に延び、ドーム様の構造を形成するβ−ヘアピンループである。興味深いことに、ＧｒｏＥＳ（大腸菌Ｃｐｎ１０）のルーフ部分は生理条件下で陰性荷電であるが、哺乳類Ｃｐｎ１０は陽性荷電しており、一方、ルーフの大部分はバクテリオファージＣｐｎ１０（Ｇｐ３１）から完全に失われている。この分子は、ドーム基部から延長しＣｐｎ６０との相互作用を仲介する、フレキシブルな１８アミノ酸可動ループである別の伸展部分も有する。部位特異的変異により、Ｃｐｎ６０との相互作用にとって決定的な、可動ループ内の種々の残基、すなわち、実際のＣｐｎ６０結合サイトを構成する可動ループ基部の３つの疎水性残基（３０−ＩＭＬ−３２）、及び可動ループの柔軟性を制限する２つの残基（２６−Ｔ及び３３−Ｐ）が同定されてきた（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、４９８１−４９８７ページ、２００１年）。この結果、Ｃｐｎ６０とのＣｐｎ１０の会合は、Ｃｐｎ１０の１８アミノ酸可動ループにより仲介される（図１Ｄ参照）。大腸菌ＧｒｏＥＳにおいては、Ｃｐｎ６０／ＧｒｏＥＬ−結合サイトのトリペプチドの疎水性はより低く（２５−ＩＶＬ−２７）、可動ループは哺乳類Ｃｐｎ１０よりも柔軟である。このような変化により、ＧｒｏＥＳのＣｐｎ６０／ＧｒｏＥＬに対する親和性は減少しており、Ｃｐｎ１０及びＧｒｅＥＳがＧｒｏＥＬに対して機能する一方で、ＧｒｏＥＳはＣｐｎ６０との相互作用を生成することはできない。
【００７４】
細胞外Ｃｐｎ１０が免疫調節効果を発生するメカニズムはＣｐｎ６０を含むという仮説から出発し、本発明者らは可動ループ領域を目標としてＣｐｎ１０の部位特異的変異体を作製し、本願明細書において、Ｃｐｎ６０との相互作用を損なわせる変異によっても免疫調節活性が保持されることを証明する。
【００７５】
従って、本発明の一態様においては、免疫調節活性を示すが、実質的にタンパクフォールディング活性を欠いている、単離Ｃｐｎ１０ポリペプチドを提供する。
【００７６】
本願明細書においてはまた、Ｃｐｎ１０の可動ループ領域の本質的な部分及び／又はＣｐｎ１０のルーフβ−ヘアピン領域を欠失しても、Ｃｐｎ１０がＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ４からのシグナリングを調節する能力が消滅しないことを証明する。
【００７７】
従って、本願発明は、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較して、可動ループ領域とルーフβ−ヘアピン領域の１つ又は両方において、１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでなる、免疫調節活性を有する単離Ｃｐｎ１０ポリペプチドも提供する。Ｃｐｎ１０の可動ループ及びルーフループの欠失は、本願明細書において開示のように、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレルポリペプチドと呼ぶ。
【００７８】
本発明はまた、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペチドと比較して、可動ループ領域とルーフβ−ヘアピン領域の１つ又は両方を実質的に欠いている、単離Ｃｐｎ１０ポリペプチドを提供する。
【００７９】
本願明細書に記載のように、本発明者らは、ＴＬＲシグナリングの調節として決定しうるヒトＣｐｎ１０に起因する免疫調節効果を、大腸菌ＧｒｏＥＳに導入できないことも証明した。さらに、ヒトＣｐｎ１０のＮ末端残基が、それに対応する大腸菌ＧｒｏＥＳ由来Ｎ末端残基で置換されているＣｐｎ１０ポリペプチドが活性を有さないことは、Ｃｐｎ１０のＮ末端が免疫調節活性に必須であることを証明している。
【００８０】
本願明細書において後述するように、本発明者らはまた、Ｃｐｎ１０のＮ末端にグリシン残基を付加すると免疫調節活性が増大することを証明した。アラニン残基又はグリシン残基等、アセチル基と構造上の相同性が得られるアセチル基又はアミノ酸が存在すると、Ｃｐｎ１０の免疫調節活性が増大すると考えられる。
【００８１】
（ポリペプチド）
本願明細書に記載のように、本発明には典型的には、対応する野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸欠失、付加又は置換を含んでなり、免疫調節活性を有するＣｐｎ１０ポリペプチドが包含される。典型的には前記野生型Ｃｐｎ１０は真核生物由来の任意のＣｐｎ１０ポリペプチドである。例えば、Ｃｐｎ１０は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ等）、カエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ等）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ等）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｔｅｒｉｏ等）、ハエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ等のコバエ等）、植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ等）又は哺乳類由来であってもよい。哺乳類Ｃｐｎ１０は霊長類、ネズミ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ブタ又はウマの由来であってもよい。あるいは、Ｃｐｎ１０は古細菌由来であってもよい。特定の実施形態において、当該Ｃｐｎ１０はヒトＣｐｎ１０である。野生型のヒトＣｐｎ１０は配列番号１又は２１で示されうる。野生型ヒトＣｐｎ１０をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２又は２２で示されるか、又は配列番号２又は２２とハイブリダイズするための十分な同一性を示すものでもよい。
【００８２】
本発明は、本願明細書に記載される野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの修飾体に関するが、それ以外にもＮ末端又はＣ末端において１つ以上のアミノ酸残基を付加、欠失、又は置換して修飾した野生型分子も包含される。例えば、アミノ酸付加は、Ｃｐｎ１０ポリペプチド又はその断片と第２のポリペプチド又はペプチド（例えばポリヒスチジンタグ）との融合、マルトース結合タンパクとの融合、グルタチオンＳ転移酵素との融合、緑色蛍光タンパク質との融合、あるいは、ＦＬＡＧ又はｃ−ｍｙｃ等との融合により得られる。例えば、野生型ヒトＣｐｎ１０ポリペプチドは更なるグリシン（Ｇ）残基の付加を含んでなってもよい。前記Ｃｐｎ１０ポリペプチドはＮ末端にメチオニンイニシエータを有してもよく、有さなくてもよい。
【００８３】
ヒトＣｐｎ１０に基づくか又は本質的に由来する、本発明の免疫調節Ｃｐｎ１０ポリペプチドにおいては、当該ポリペプチドは典型的には、Ｎ末端配列ＭＡＧＱＡＦＲＫＦＬ、任意に１つ以上の上述の修飾を含んでなる。
【００８４】
本願明細書に開示のように、本発明のポリペプチドは、可動ループ領域及びルーフβ−ヘアピン領域のいずれか又は両方に、又は複数のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含んでなる。一実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換は、例えばＣｐｎ６０との相互作用の原因となるトリペプチド領域内の可動ループ領域で起こり、改変ポリペプチドは、免疫調節活性は維持されるがタンパクフォールディング活性は有さなくなる。別の実施形態において、Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、例えば、配列番号３又は２４で表すように可動ループ領域を、あるいは、例えば、配列番号６又は２６で表すようにルーフβ−ヘアピン領域を、あるいは配列番号９又は２８で表すように可動ループ領域及びルーフβ−ヘアピン領域の両方を、本質的に欠く。
【００８５】
本願明細書に定義のように、可動ループ又はルーフβ−ヘアピンを構成するアミノ酸は、配列に基づいて定義され、大腸菌Ｃｐｎ１０すなわちＧｒｏＥＳの結晶構造が知られている。真核生物Ｃｐｎ１０ポリペプチドの可動ループ及びルーフβ−ヘアピン領域は、進化においてＣｐｎ１０配列が保存され予想される３次元タンパク構造が保存される見地から、同等であると予想された。しかしながら、真核生物Ｃｐｎ１０ポリペプチドの可動ループ及びルーフβ−ヘアピン領域の正確な境界は、ＧｒｏＥＳとはやや異なるようである。
【００８６】
本願明細書に使用の用語「変異体」は、実質的に類似の配列を指す。通常、ポリペプチド配列変異体は、一般に同等の生物活性を有する。さらに、これらのポリペプチド配列変異体は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を共有してもよい。同様に、用語「変異体」の意味には、本発明のポリペプチドのホモログも含まれる。ホモログは、典型的には異種由来のポリペプチドであるが、本質的に同一の生物学的機能、又は本発明に開示の対応するポリペプチドとしての活性を共有している。
【００８７】
さらに、用語「変異体」には本発明のポリペプチドのアナログも包含され、用語「アナログ」は本発明のポリペプチド誘導体であり、当該誘導体は、実質的に同一の機能を有するように、又は複数のアミノ酸残基の付加、欠失、置換を含んでなるポリペプチドのことを意味する。用語「保存的アミノ酸置換」は、ポリペプチド鎖（タンパク質の一次配列）の中の１つのアミノ酸を、同様な特性を有する別のアミノ酸と置換又は交換することを指す。
【００８８】
本発明には、本願明細書に開示のポリペプチドの断片も包含される。用語「断片」は、本発明のポリペプチド又はそれらの変異体の構成物をコードするか又は構成物である、ポリペプチド分子を指す。典型的には、当該断片は、構成物であるポリペプチドに共通の定性的な生物活性を有する。当該ペプチド断片は、約５〜約１５０アミノ酸長、約５〜約１００アミノ酸長、約５〜約５０アミノ酸長、又は約５〜約２５アミノ酸長であってもよい。あるいは、当該ペプチド断片は約５〜約１５アミノ酸長であってもよい。
【００８９】
上述の、又は複数のアミノ酸残基の付加、欠失、置換によりＮ−及び／又はＣ末端が修飾されたＣｐｎ１０ポリペプチドも本発明の範囲に包含される。
【００９０】
（Ｃｐｎ１０の調製）
本発明によれば、Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、当技術分野に周知の組み換えＤＮＡ及び分子生物学における標準的な技術を用いて調製してもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年、及び、Ａｕｓｕｂｅｌら、”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９２年、等の標準テキストからガイダンスを入手してもよい。Ｍｏｒｔｏｎら、２０００年（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７８巻、６０３−６０７ページ）、Ｒｙａｎら、１９９５年（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０巻、２２０３７−２２０４３ページ）、及びＪｏｈｎｓｏｎら、２００５年（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０巻、４０３７−４０４７ページ）に記載の方法はＣｐｎ１０ポリペプチド精製の適切な例であるが、当業者であれば、本発明は用いた精製法若しくは調製法、あるいは本発明の方法及び組成物に係るＣｐｎ１０調製に利用しうる他のいかなる方法であってもよく、限定されないことを理解するであろう。Ｃｐｎ１０ペプチドは、ｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ−Ｃ、及びｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ｖ８−ｐｒｏｔｅａｓｅ等の１つ以上のプロテイナーゼによるタンパク分解により調製してもよい。消化されたペプチド断片は、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により精製してもよい。
【００９１】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド精製は、大量生産用にスケールアップしてもよい。例えば、本発明者らは本願明細書に記載のように、大腸菌のバッチ発酵により高純度の臨床グレードＣｐｎ１０ポリペプチドを大量（グラム単位で）生産するバイオプロセスを開発した。
【００９２】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド、並びにその断片及び変異体は、当技術分野において公知の標準的な液相又は固相化学的方法により合成してもよい。例えば、Ｓｔｅｗａｒｄ及びＹｏｕｎｇ（Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｄ及びＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、”Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版）”、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、米国イリノイ州、１９８４年、に記載の固相化学的手法に従い、当該分子を合成してもよい。
【００９３】
一般的に、このような合成法は、又は複数のアミノ酸又は適切に保護されたアミノ酸を順次付加してペプチド鎖を伸長させることを含んでなる。典型的には、最初のアミノ基又はカルボキシ基を適切な保護基により保護する。次いで、保護されたアミノ酸を、非反応性の固体支持体に結合させるか、又はアミド結合生成に適した条件下において、相補的（アミノ又はカルボキシ）基を適切に保護された、配列における次のアミノ酸を付加することにより溶液中で反応させる。次いで、この新たに付加したアミノ酸残基から保護基を除去し、次の（保護された）アミノ酸を添加し、同様の反応を以降続ける。所望のアミノ酸を全て結合させた後、全ての残りの保護基、必要であれば全ての固体支持体を、逐次又は平行して除去し、最終的なポリペプチドを得る。
【００９４】
関連技術分野における当業者に周知の技術を用いてＣｐｎ１０のアミノ酸変異を行ってもよい。適切な読み枠が維持される限り、ヌクレオチドの付加、欠失又は置換（保存的及び／又は非保存的）等の任意のヌクレオチド変異導入を行い、その結果としてアミノ酸を変異させてもよい。例示される当該技術としては、ランダム変異導入、部位特異的変異導入、オリゴヌクレオチド媒介又はポリヌクレオチド媒介による変異導入、現存の又は人為的に設けた制限酵素部位を用いた特定の領域の欠失、並びにポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。
【００９５】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドを用いて免疫調節活性を生じさせる際、Ｃｐｎ１０の７量体を形成させてもよい。本発明の実施に際して免疫調節活性を試験する場合、当業者に公知の多数の技術のうちのいずれか１つを用いてもよい。本願明細書に例示のように、Ｃｐｎ１０の免疫調節活性は、当該ポリペプチドがＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ４からのシグナル伝達を調節する能力を、例えばルシフェラーゼ・バイオアッセイを用いて、典型的にはリポポリサッカライド等のＴＬＲ４アゴニストの存在下において測定することにより解析できる。その代替法として、又はその方法に加えて、例えば末梢血単核細胞等の細胞中でのＮＦ−ｋＢ産生又はサイトカイン産生等をインビトロ、エクスビボ若しくはインビボアッセイ等の他のアッセイを行って免疫調節活性を解析してもよい。
【００９６】
（ポリヌクレオチド）
本発明の実施形態は、上述のＣｐｎ１０をコードする単離ポリヌクレオチド並びに当該ポリヌクレオチドの変異体及び断片を提供する。野生型Ｃｐｎ１０をコードするヌクレオチド配列は配列番号２又は２２で示されるか、又は配列番号２又は２２の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【００９７】
とりわけ、本発明のＣｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４３として示されるか、又は配列番号４３の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【００９８】
本発明のＡｌａ−Ｃｐｎ１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２として示されるか、又は配列番号２２の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【００９９】
本発明のＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５として示されるか、又は配列番号２５の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１００】
本発明のＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２７として示されるか、又は配列番号２７の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１０１】
本発明のＣｐｎ１０β−バレルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０として示されるか、又は配列番号１０の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。本発明のＡｌａ−Ｃｐｎ１０β−バレルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２９として示されるか、又は配列番号２９の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１０２】
本発明のＧｌｙ−Ｃｐｎ１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３１として示されるか、又は配列番号３１の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１０３】
本発明のＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＦＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３６として示されるか、又は配列番号３６の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１０４】
本発明のＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８として示されるか、又は配列番号３８の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１０５】
本発明のＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０として示されるか、又は配列番号４０の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１０６】
本発明のＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４２として示されるか、又は配列番号４２の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１０７】
Ｃｐｎ１０−Δｍｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は本発明の中で考慮され、配列番号４又は５として示されるか、又は配列番号４又は５の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１０８】
Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は本発明の中で考慮され、配列番号７又は８として示されるか、又は配列番号７又は８の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１０９】
Ｃｐｎ１０β−バレルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は本発明の中で考慮され、配列番号１０として示されるか、又は配列番号１０の配列とハイブリダイズするための十分な配列同一性を有する。
【０１１０】
上記のポリペプチドに関して、本願明細書で使用する用語「変異体」とは、実質的に類似する配列のことを指す。一般的に、ポリヌクレオチド配列変異体は、定性的な生物活性を共有するポリペプチドをコードする。さらに、これらのポリヌクレオチド配列変異体は少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を共有してもよい。同様に、用語「変異体」の意味には、本発明のポリヌクレオチドのホモログも包含される。ホモログとは典型的には、異種由来のポリヌクレオチドであるが、本質的に同一の生物学的機能を共有するポリヌクレオチドである。
【０１１１】
本発明のポリヌクレオチドの断片もまた本発明に包含される。用語「断片」は、本発明のポリヌクレオチドの構成物をコードするか又は本発明のポリヌクレオチドの構成物である、核酸分子を指す。ポリヌクレオチドの断片は、必ずしも生物活性を保持するポリペプチドをコードしない。例えば、当該断片はむしろハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして有用である。当該断片は本発明のポリヌクレオチドに由来してもよく、あるいは、例えば化学合成等の他の手段により合成してもよい。本発明のポリヌクレオチド及びその断片を用いて、当業者に公知の技術に使用されるアンチセンス分子を調製してもよい。
【０１１２】
従って、本発明には、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づく、プライマー又はプローブとして用いられるオリゴヌクレオチド及び断片が包含される。オリゴヌクレオチドとは、ＰＣＲ等の核酸増幅での使用に適切な短い核酸残基の配列であり、典型的には少なくとも約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド長、より典型的には約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド長である。当該プローブは様々な長さのヌクレオチド配列であり、例えば約１０ヌクレオチド〜数千ヌクレオチド長を有し、典型的にはハイブリダイゼーションによるホモログ配列の検出に用いられる。配列間の相同性（配列の同一性）は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーにより主に決定される。とりわけ、プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、低いストリンジェンシー、中度のストリンジェンシー、又は高いストリンジェンシー下で、本願明細書に開示のポリヌクレオチドのホモログ又は他の変異体に対してハイブリダイズしてもよい。ストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件は、５０℃、２×ＳＳＣ中でなされるハイブリダイゼーションに対応してもよい。当技術分野に公知の条件及び反応は多数存在し、それらを用いてハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを変化させてもよい。例えば、特定の核酸に対してハイブリダイズさせる核酸の長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、塩又は他の成分（ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコール等）の濃度、並びにハイブリダイゼーション及び／又は洗浄ステップ時の温度変化等が挙げられる。例えば、ハイブリダイゼーションフィルターを、少なくとも５５℃（低ストリンジェンシー）、少なくとも６０℃（中度のストリンジェンシー）、少なくとも６５℃（中度／高いストリンジェンシー）、少なくとも７０℃（高いストリンジェンシー）又は少なくとも７５℃（非常に高いストリンジェンシー）の温度で、２×ＳＳＣ中で３０分間、２回洗浄してもよい。
【０１１３】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドをベクター中にクローニングしてもよい。当該ベクターは、プラスミドベクター、ウィルスベクター、又は外来配列の挿入、真核生物細胞への導入及び導入された配列の発現に好適な任意の他の担体であってもよい。典型的には当該ベクターは真核生物で発現するベクターであり、プロモータ、エンハンサ、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列等の発現制御配列及びプロセシング配列を含んでもよい。
【０１１４】
（抗体）
本発明は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに選択的に結合する抗体、並びにその断片及びアナログを提供する。好適な抗体としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリが挙げられるが、限定されない。本発明の抗体は、Ｃｐｎ１０ポリペプチド、その断片若しくはアナログのアゴニスト若しくはアンタゴニストとして作用してもよい。
【０１１５】
好適な抗体は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの別々の領域又は断片、とりわけ免疫調節活性の供与、及び／又はパートナー又は基質との結合に関与するそれらから調製される。抗原性Ｃｐｎ１０ポリペプチドは少なくとも５個の、好適には少なくとも１０個のアミノ酸を含んでなる。
【０１１６】
適切な抗原を産生させる方法は、当業者にとり自明である。例えば、抗Ｃｐｎ１０モノクローナル抗体（典型的にはＦａｂ部分を含む）は”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国ニューヨーク、１９８８年に記載のハイブリドーマ技術を用いて調製してもよい。
【０１１７】
本質的に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド、その断片又はアナログに対するモノクローナル抗体の調製は、培養液中の連続培養細胞を用いる任意の抗体分子の産生方法を用いてもよい。これらの方法としては、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５−４９７ページ、１９７５年）が開発した最初のハイブリドーマ技術、並びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻、７２ページ、１９８３年）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”、７７−９６ページ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、１９８５年）等が挙げられる。不死化した抗体生産細胞株は、細胞融合以外の技術（例えば発ガン性ＤＮＡによるＢ細胞の直接転換、又はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスの形質移入等）により作製することもできる例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、”Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、１９８０年；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”、１９８１年；Ｋｅｎｎｅｔｔら、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、１９８０年、を参照。
【０１１８】
要約すると、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマの生成手段であり、骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）又は他の不死化細胞株を、その認識因子結合部分、又は認識因子、又は起源特異的なＤＮＡ結合部分を免疫された、哺乳類の脾臓由来のリンパ球と融合する。本発明の実施に有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、存在する認識因子と免疫反応する能力、及び標的細胞において特異的な転写活性を抑制する能力を基に同定される。
【０１１９】
本発明の実施に有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性を有する抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する培地を含んでなるモノクローナルハイブリドーマ培養液を培養することにより調製できる。当該培養液は、ハイブリドーマが抗体分子を培養液中に分泌するのに適する条件下で十分な期間維持する。次いで抗体含有培養液を回収する。さらに抗体分子を公知の技術により単離することができる。
【０１２０】
同様に、本発明のＣｐｎ１０、あるいはその断片又はアナログに対するポリクローナル抗体の調製に用いられる公知の種々の手順が存在する。Ｃｐｎ１０ポリクローナル抗体を調製する場合、限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ他の種々の宿主動物を、Ｃｐｎ１０ポリペプチドあるいはその断片又はアナログの注射により免疫してもよい。さらに、Ｃｐｎ１０ポリペプチドあるいはその断片又はアナログを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の免疫キャリアとコンジュゲートしてもよい。同様に、免疫応答を増強させるために、フロイント（完全及び不完全）のアジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにヒト用の有用なアジュバントとしてＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ等の種々のアジュバントを用いてもよいが、これらに限定されない。
【０１２１】
また、所望の抗体のスクリーニングは当業者に公知の種々の方法により実施できる。抗体の免疫学的な特異的結合に関するアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集反応アッセイ、補体結合反応アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ及び免疫電気泳動アッセイ等（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９９４年、”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体結合は、抗Ｃｐｎ１０一次抗体上の検出可能な標識によって検出してもよい。あるいは、抗Ｃｐｎ１０抗体は、適切に標識した二次抗体又は試薬との結合によって検出してもよい。イムノアッセイにおいて結合を検出するための種々の方法が当業者に公知であり、本発明の範囲内に包含される。
【０１２２】
本発明の抗体を、当業者に周知の診断方法及びキットに用いて体液又は組織中のＣｐｎ１０を定性的に検出若しくは定量することができ、あるいは当該抗体を、種々の疾病、障害又は症状の治療のための方法及び組成物に使用してもよい。
【０１２３】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドあるいはその断片又はアナログを免疫源として産生させた抗体（又はその断片）は、Ｃｐｎ１０との結合親和性を有する。好適には、当該抗体（又はその断片）は、約１０５Ｍ−１以上、好適には約１０６Ｍ−１以上、より好適には約１０７Ｍ−１以上、最も好適には約１０８Ｍ−１以上の結合親和性又は結合活性を有する。
【０１２４】
本発明に係る抗体を十分な量で調製するために、血清フリー培地を用いたバッチ培養により抗体を生産してもよい。培養後、クロマトグラフィー及びウィルス不活性化／除去工程を組み合わせた多段階工程を経て抗体を精製してもよい。例えば、まず抗体をプロテインＡアフィニティカラムにより分離し、次いで溶媒／界面活性剤で処理し、あらゆる脂質エンベロープを有するウィルスを不活性化する。さらなる精製を行う場合、典型的にはアニオン及びカチオン交換クロマトグラフィーを用いて残余タンパク、溶媒／界面活性剤及び核酸を除去してもよい。精製した抗体を、ゲル濾過カラムを用いてさらに精製し、０．９％生理食塩水中懸濁液としてもよい。次いで、処方したバルク調製液を滅菌し、ウィルスをフィルタ除去して懸濁液を調製してもよい。
【０１２５】
（アゴニスト及びアンタゴニスト）
抗Ｃｐｎ１０抗体そのもの以外にも、本発明のポリペプチド並びにその断片及び変異体は、Ｃｐｎ１０と相互作用する化合物又は薬剤のスクリーニング及び同定に特に有用である。とりわけ、望ましい化合物はＣｐｎ１０の免疫調節活性を調節する化合物である。かかる化合物は、Ｃｐｎ１０の免疫調節活性を、活性化、増加、阻害又は抑制することを通じて調節する。適切な化合物は、Ｃｐｎ１０と直接的（例えば結合）又は間接的に相互作用することによって影響を及ぼす。
【０１２６】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドと結合若しくは相互作用する化合物、具体的にはＣｐｎ１０の活性を調節する化合物は、種々の適切な方法により同定してもよい。相互作用及び／又は結合は、競合結合アッセイ又はツーハイブリッドアッセイを用いて測定してもよい。
【０１２７】
例えば、ツーハイブリッドアッセイは、タンパク−タンパク相互作用の検出に典型的に用いられる、酵母ベースの遺伝子アッセイ系（Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｏｎｇ、１９８９年）である。要約すると、このアッセイは転写活性化因子のマルチドメイン性を利用するアッセイである。例えば、公知の転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインが本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドあるいはその断片又は変異体と融合し、転写活性化因子の活性化ドメインが候補タンパクと融合する。候補タンパクとＣｐｎ１０ポリペプチドあるいはその断片又は変異体との相互作用により、転写活性因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインが近接する。それにより転写活性因子によって活性化された特定のレポーター遺伝子の転写により、その相互作用を検出することが可能となる。
【０１２８】
あるいは、アフィニティクロマトグラフィを用いてＣｐｎ１０の結合パートナーを同定してもよい。例えば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドあるいはその断片又は変異体を支持体（セファロース等）に固定化し、細胞可溶化液をカラムに通過させる。次いで、固定化したＣｐｎ１０ポリペプチドあるいはその断片又は変異体に結合するタンパク質をカラムから溶出して同定してもよい。最初に、かかるタンパクを例えばＮ末端アミノ酸シーケンシングにより同定してもよい。
【０１２９】
あるいは、上述の技法の変形例として、Ｃｐｎ１０ポリペプチドあるいはその断片又は変異体を、アルカリホスファターゼ等の検出可能なタグと融合させることにより融合タンパクを調製し、Ｆｌａｎａｇａｎ及びＬｅｄｅｒ、１９９０年、に記載の免疫沈降法の変形法を実施してもよい。
【０１３０】
Ｃｐｎ１０活性を調節する化合物を検出する方法は、Ｃｐｎ１０ポリペプチドを候補化合物及び適切な標識基質と結合させる操作と、当該基質の変化を基にしてＣｐｎ１０に対する当該化合物の効果（時間の関数として計測してもよい）をモニターする操作を含んでなる。適切な標識物質としては、例えば比色測定、放射測定、蛍光測定、又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの方法のために標識された物質を含んでなる。
【０１３１】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド並びに適切な断片及び変異体を用いて、候補化合物のＣｐｎ１０との結合能若しくは相互作用能をハイスループットスクリーニングで試験してもよい。かかる候補化合物をさらに、機能性Ｃｐｎ１０に対してスクリーニングし、Ｃｐｎ１０活性への当該化合物の効果を測定してもよい。
【０１３２】
なお、上述の方法は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド並びにその断片及び変異体と相互作用するか、又はその活性を調節しうる化合物を同定するために用いる方法の若干例に過ぎない。他の適切な方法も当業者に公知であり、また本発明の範囲内に包含される。
【０１３３】
上述の方法により、化合物がＣｐｎ１０活性を活性化する（アゴニスト）か、又は抑制する（アンタゴニスト）かのいずれであるかを同定することができる。例えば、当該化合物は抗体、低分子量ペプチド、核酸、又は非タンパク性有機分子でもよい。
【０１３４】
上述の方法によるスクリーニングのための有望なＣｐｎ１０活性調節剤は、当業に公知の無数の技法により生成されうる。例えば、種々の形態のコンビナトリアルケミストリーを用いて、推定上の非タンパク性調節剤を調製してもよい。さらに、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）及びＸ線結晶解析等の技術を用いてＣｐｎ１０ポリペプチド、その断片及び変異体の構造をモデリングし、コンピュータを用いて可能な調節剤を予測してもよい。
【０１３５】
（組成物及び投与経路）
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、治療薬としても有用である。例えば、これらの分子の用途としては、被検者に対して治療的有効量の当該分子を投与して被検者の疾病又は症状の治療又は予防を行うことが挙げられる。典型的には、当該疾病及び症状は、被検者の免疫応答を調節することにより治療できるものである。当該疾病及び症状の例としては、急性又は慢性的炎症疾患、喘息、過敏症、多発性硬化症、ＧＶＨＤ及び感染症が挙げられるがこれらに限定されない。当該感染症は細菌又はウィルス感染により生じうる。従って、Ｃｐｎ１０ポリペプチド及びポリヌクレオチドを含んでなる、疾病又は症状の治療又は予防用の薬理学的に有用な化合物が考慮される。
【０１３６】
また、抗Ｃｐｎ１０抗体等の、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストは、治療薬としても有用である。従って、本発明には、当該アゴニスト及びアンタゴニスト並びにそれを含んでなる薬理学的組成物を用いる治療法も包含される。
【０１３７】
一般的に、本発明に係る方法への使用に適切な組成物は、当業者に公知の方法及び手順に従って調製してもよく、従って薬理学的に許容できる担体、希釈剤及び／又はアジュバントを含んでもよい。
【０１３８】
組成物は標準的な経路で投与されてもよい。一般的に、当該組成物は非経口的（例えば、静脈内、脊髄内、皮下、又は筋肉内）、経口的、又は局所的な投与経路により投与される。投与は全身投与又は局所投与であってもよい。任意の所与の状況において採用される投与経路は、治療しようとする症状の性質、症状の重篤さの程度、供給される特定の化合物の必要量、及び当該化合物による副作用等の数多くの要因に依存する。
【０１３９】
通常、当業者に公知の方法に従って適切な化合物は調製されてもよく、薬理学的に許容できる希釈剤、アジュバント及び／又は賦形剤を含んでもよい。希釈剤、アジュバント及び／又は賦形剤は、当該組成物の他の成分と適合性を有するという意味で「許容できる」ものでなくてはならず、その受容者に有害であってはならない。
【０１４０】
薬理学的に許容できる担体又は希釈剤としては、脱塩水又は蒸留水；生理食塩水；ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、とうもろこし油、ゴマ油、落花生種（ａｒａｃｈｉｓ）油又はココナツ油等の植物油；シリコーン油（メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリシロキサン等のポリシロキサン類を含む）；揮発性シリコーン類；液状パラフィン、ソフトパラフィン又はスクアラン等の鉱物油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体；エタノール又はイソプロパノール等の低級アルカノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はグリセリン）；パルミチン酸イソプロピル、ミスチリン酸イソプロピル又はオレイン酸エチル等の脂肪酸エステル；ポリビニルピリドン；寒天；カラギーナン；トランガカントゴム又はアラビアゴム及びワセリンが挙げられる。典型的には、１つ以上の担体は組成物の１０重量％〜９９．９重量％を構成する。
【０１４１】
本発明の組成物は、注射投与に適切な形態、経口投与に適切な剤形（例えばカプセル、錠剤、カプレット、エリキシル剤等）、局所投与に適切な軟膏、クリーム又はローションの形態、点眼に適した形態、鼻腔内又は経口吸引等の吸引投与に適したエアロゾル形態、非経口投与（すなわち皮下、筋肉内又は静脈注射）に適した形態であってもよい。
【０１４２】
注射可能な溶液又は懸濁液、毒性を有さず非経口投与に許容できる希釈剤又は担体としては、リンガー液、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール及び１，２プロピレングリコール等が挙げられる。
【０１４３】
経口使用のための適切な担体、賦形剤及びアジュバントの例としては、ピーナッツ油、液状パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン及びレシチンが挙げられる。これらに加えて、経口投与用の製剤には適切な香料及び着色剤を含有させてもよい。カプセルの形態で用いる場合は、カプセルは崩壊を遅延するモノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリン等の化合物でコーティングしてもよい。
【０１４４】
アジュバントは、典型的には軟化剤、乳化剤、濃化剤、保存料、殺菌剤及び緩衝剤を含んでなる。
【０１４５】
経口投与用の固形剤には、ヒトへの投与及び獣医学的に薬理学的に許容できる結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香料、コーティング剤、保存料、潤滑剤及び／又は時間遅延剤を含有させてもよい。適切な結合剤としては、アラビアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース又はポリエチレングリコールが挙げられる。適切な甘味料としてはショ糖、乳糖、ブドウ糖、アスパルテーム又はサッカリンが挙げられる。適切な崩壊剤としてはコーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸又は寒天が挙げられる。適切な希釈剤としては乳糖、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム又はリン酸二カルシウムが挙げられる。好適な香料としては、ハッカ油、冬緑油、サクランボ、オレンジ又はラズベリー香料が挙げられる。好適なコーティング剤としては、アクリル酸及び／又はメタクリル酸及び／又はそれらのエステルの重合体又は共重合体、ロウ、脂肪アルコール、ゼイン、シェラック又はグルテンが挙げられる。好適な保存料としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン又は亜硫酸水素ナトリウムが挙げられる。好適な潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム又はタルクが挙げられる。好適な時間遅延剤としては、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンが挙げられる。
【０１４６】
経口投与用の液体製剤は、上述の薬剤に加えて液体担体を含有してもよい。好適な液体担体としては、水、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、サフラワー油、落花生種（ａｒａｃｈｉｓ）油、ヤシ油等の油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリド又はそれらの混合物が挙げられる。
【０１４７】
経口投与用の懸濁液は、分散剤及び／又は懸濁化剤をさらに含有してもよい。好適な懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム又はアセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤としては、レシチン、ステアリン酸等の脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノ又はジオレアート、ステアラート又はラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノ又はジオレアート、ステアラート又はラウラート等が挙げられる。
【０１４８】
経口投与用のエマルジョンは、さらに又は複数の乳化剤を含有してもよい。好適な乳化剤としては、上記に例示した分散剤、又はアラビアゴム又はトラガカントゴム等の天然ゴムが挙げられる。
【０１４９】
非経口投与可能な組成物の調製方法は当業者に公知であり、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、米国ペンシルバニア州により多くの詳細が記載され、本願明細書において参照することにより援用する。
【０１５０】
本発明に係る局所投与用製剤は、有効成分、並びに１つ以上の許容できる担体及び任意の他の治療用薬効成分を含んでなる。局所投与に適した製剤としては、例えば眼、耳又は鼻への投与用のリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏剤又はペースト剤、並びに液滴等の、皮膚を通過して治療を要する部位への輸送に適する液体又は半流動体の製剤が挙げられる。
【０１５１】
本発明に係る液滴は、滅菌された水溶液若しくは油性溶液、又は懸濁液を含有してもよい。これらは、抗菌剤及び／又は抗真菌剤及び／又は他の任意の適切な保存料を含有する水溶液に有効成分を溶解させ、適宜界面活性剤を添加して調製してもよい。次いで得られた溶液をろ過して浄化し、適切な容器に移して滅菌してもよい。滅菌は、オートクレーブ又は９０〜１００℃に半時間維持することにより、又はろ過後により達成してもよく、次いで無菌技術による容器への移動に続く。液滴への添加に適切な抗菌剤又は抗真菌剤の例としては、フェニル水銀の硝酸塩又は酢酸塩（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）及び酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）が挙げられる。油性溶液の製剤にとり好適な溶媒としては、グリセロール、希釈アルコール及びプロピレングリコールが挙げられる。
【０１５２】
本発明に係るローションとしては、皮膚又は眼への滴下に適しているものが挙げられる。点眼剤には適宜殺菌剤を含有する滅菌水溶液を含有させてもよく、上記の液滴の製剤化に関する方法と同様に調製してもよい。皮膚への塗布用のローション又はリニメント剤はまた、アルコール又はアセトン等の皮膚の乾燥を促進し、冷却する物質、及び／又はグリセロール又はヒマシ油若しくは落花生種油（ａｒａｃｈｉｓ）等のオイル等の保湿剤を含有してもよい。
【０１５３】
本発明に係るクリーム、軟膏剤又はペースト剤は、外用有効成分を含有する半固体製剤である。これらは、微細に粉体化された形態の有効成分を、単独で、又は当該有効成分を含有する水性若しくは非水性溶媒中の溶液若しくは懸濁液の状態で、グリス状又は非グリス状の基材と混合して調製してもよい。当該基材は、硬質・軟質・液状パラフィン等の炭化水素、グリセロール、ビーズワックス、金属石鹸；粘性物質；アーモンド油、トウモロコシ油、落花生種（ａｒａｃｈｉｓ）油、ヒマ油又はオリーブ油等の天然起源の油；羊毛脂又はその誘導体、又はステアリン酸又はオレイン酸等の脂肪酸、並びにプロピレングリコール又はマクロゴール等のアルコールが挙げられる。
【０１５４】
当該組成物には、ソルビタンエステル又はそのポリオキシエチレン誘導体、アニオン性、カチオン性又は非イオン性界面活性剤等の任意の適切な界面活性剤を添加してもよい。天然ガム、セルロース誘導体、又はケイ質シリカ等の無機物質の懸濁剤、及びラノリン等の他の成分を含有させてもよい。
【０１５５】
当該組成物はリポソームの形態で投与してもよい。リポソームは、一般的にリン脂質又は他の脂質に由来し、水溶性溶媒中に分散した単層又は多層の水和液晶により形成される。毒性がなく、生理学的に許容でき、代謝され、リポソームを形成できる脂質が使用できるリポソームの形態の組成物は、安定剤、保存料、賦形剤等を含有してもよい。好適な脂質は、リン脂質及びホスファチヂルコリン（レシチン）であり、それらは天然由来でも合成物でもよい。リポソーム調製法は当業に公知であり、特に本件に関しては、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ編集、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、１４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９７６年、３３ページ以下（本願明細書に援用する）を参照されたい。
【０１５６】
当該組成物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体のアレーとコンジュゲートさせてもよい。タンパクへのＰＥＧ付加（ＰＥＧ化）は、血漿クリアランス速度を低下させるための確立された方法であり、これによりタンパクの効力は増加する（Ｎｕｃｃｉら、１９９１年、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．、Ｒｅｖ．６、１３３ページ）。さらなるＰＥＧ化の利点としては、タンパクがより安定化し、免疫原性が低下し、溶解度が上昇し、タンパク分解に対する感受性が低下すること等が挙げられる。ＰＥＧ分子は（ＯＣＨ３ＣＨ２）ｎ−ＯＨの基本繰り返し構造を有し、分子量に従って分類される。ＰＥＧ誘導体はタンパク質とコンジュゲートすることにより水力学的な半径を増大させ、半減期の増加は通常、付加したＰＥＧ鎖のサイズと直接に相関する（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｗ．、２００１年、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．、１巻、１−２２ページ）。
【０１５７】
当該組成物はマイクロパーティクルの形態で投与してもよい。従来、ポリアクチド（ＰＬＡ）、ポリアクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、及びエプシロン−カプロラクタム（ε−カプロラクトン）から調製される生分解性のマイクロパーティクルが、血漿中の半減期を長期化して有効性を持続させるための薬剤担体として広範に用いられている（Ｒ．Ｋｕｍａｒ，  Ｍ．、２０００年、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．、３巻、２号、２３４−２５８ページ）。マイクロパーティクルは従来、ワクチン、抗体、及びＤＮＡ等の種々の薬剤候補物の輸送用に調製されている。さらにこれらの調製物は、種々の非経口的な輸送経路（皮下注射、静脈内注射及び吸引等）用に開発・改良がなされている。
【０１５８】
当該組成物は、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル（ＳＡＩＢ）、並びに有機溶媒若しくは混合有機溶媒を含んでなる制御放出マトリクスと組み合わせてもよい。また、ポリマー添加物を放出制御剤として担体に添加して、さらに粘度を高めて放出速度を低下させてもよい。ＳＡＩＢは周知の食品添加物である。これは非常に高い親水性を有し、名目上６個のイソブチル酸エステルと２個の酢酸エステルの比率で完全にエステル化したショ糖誘導体である。混合エステルとしてのＳＡＩＢは結晶化しないが、透明で粘性の液体として存在する。ＳＡＩＢを、エタノール又はベンジルアルコール等の薬理学的に許容できる有機溶媒と混合すると、混合物の粘性が、注射可能な程度まで低下する。薬理活性成分をＳＡＩＢ輸送用の担体に添加し、ＳＡＩＢ溶液又は懸濁液の処方を調製してもよい。この製剤を皮下注射すると、溶媒がマトリクスから拡散し、ＳＡＩＢ−薬剤又はＳＡＩＢ−薬剤−ポリマー混合物が、ｉｎ  ｓｉｔｕでデポーが形成される。
【０１５９】
本発明においては、被検者への分子及び薬剤の投与は治療的であってもよく、又は予防的であってもよい。治療用途では、すでに疾病に罹患している患者に対し、少なくとも疾病及び合併症を治癒する又は部分的に抑止するのに十分量な量の組成物を投与する。当該組成物は、患者を効果的に治療するための十分な量の分子又は薬剤を提供しなければならない。
【０１６０】
特定の患者に対する治療上有効な投与レベルは、治療しようとする障害及びその障害の重篤度；使用する分子又は薬剤の活性；使用する組成物；年齢、体重、健康状態、患者の性別及び食事；投与時間；投与経路；分子又は薬剤の排出速度；治療期間；治療と組み合わせて又は治療と同時に使用する薬剤、並びに医学分野で周知の他の関連する要因等に依存する。
【０１６１】
当業者であれば、ルーチン実験により疾病又は症状の治療に要する薬剤又は組成物の、有効かつ毒性を生じさせない量を決定することができる。
【０１６２】
一般的に、有効な投与量は、２４時間あたり体重ｋｇあたり約０．０００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、典型的には２４時間あたり体重ｋｇあたり約０．００１ｍｇ〜約７５０ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約１．０ｍｇ〜約２５０ｍｇの範囲と考えられる。より典型的には、有効な服用量は、２４時間あたり体重ｋｇあたり約１．０ｍｇ〜約２００ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約１．０ｍｇ〜約１００ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約１．０ｍｇ〜約２５ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約５．０ｍｇ〜約５０ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約５．０ｍｇ〜約２０ｍｇ、２４時間あたり体重ｋｇあたり約５．０ｍｇ〜約１５ｍｇの範囲と考えられる。
【０１６３】
あるいは、有効な投与量は、５００ｍｇ／ｍ２以下である。一般的に、有効な投与量は、約２５〜約５００ｍｇ／ｍ２、好適には約２５〜約３５０ｍｇ／ｍ２、より好適には約２５〜約３００ｍｇ／ｍ２、より好適には約２５〜約２５０ｍｇ／ｍ２、より好適には約５０〜約２５０ｍｇ／ｍ２、より好適には約７５〜約１７０ｍｇ／ｍ２の範囲と考えられる。
【０１６４】
典型的には、治療用途において、当該治療は疾病状態である期間全体にわたり行われる。
【０１６５】
さらに、当業者であれば、各々の投与における最適な量及び間隔が、治療しようとする疾病状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、並びに治療しようとする個人の状態により決定されることは自明であろう。同様に、かかる最適条件は通常の技法によっても決定できる。
【０１６６】
当業者であれば、所定の日数の間における１日あたりの当該組成物の投与回数等、最適な治療計画を、治療計画を決定するための通常の試験を用いて当業者が決定できることを認識するであろう。
【０１６７】
本発明の実施形態には、Ｃｐｎ１０をコードするポリヌクレオチドの投与も包含される。その場合、当該ポリヌクレオチドは典型的にはプロモータに制御可能に連結し、それにより適切なポリペプチド配列が産生され、結果的に被検者に対して当該ポリヌクレオチドが投与される。当該ポリヌクレオチドは、ベクター中に存在する形で被検者に投与されてもよい当該ベクターは、プラスミドベクター、ウィルスベクター、又は外来配列の挿入、真核生物細胞への導入及び導入された配列の発現に好適な任意の他の担体であってもよい。典型的には当該ベクターは真核生物用の発現ベクターであり、プロモータ、エンハンサ、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列等、発現制御配列及びプロセシング配列を含んでもよい。投与される核酸コンストラクトは、裸のＤＮＡから構成されてもよく、又は１つ以上の薬理学的に許容できる担体と共に組成物の形態であってもよい。
【０１６８】
当業者であれば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、本発明の方法に従ってそれ単独で、又は１つ以上の追加的な薬剤と組み合わせて投与してもよいことを理解するであろう。例えば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ＴＬＲ受容体（ＴＬＲ４等）を刺激しうる又は複数のアゴニストと共に投与してもよい。さらに本発明には、疾病及び障害に対する他の治療的アプローチとの組み合わせで本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドを用いる複合療法が包含される。例えば、Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、ＩＦＮβ又はＩＦＮα等の１型インターフェロンを伴う治療法に感受性のウィルス性疾患の治療に有用であり、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、多発性硬化症等の自己免疫疾患の治療においてＩＦＮβとの組み合わせで使用できる。
【０１６９】
かかる複合療法においては、用いられる各成分は、同時に、任意の順序で連続的に、又は別々のタイミングで投与し、所望の効果を得ることができる。あるいは、これらの成分を単一のユニットドーズ中に組み合わせて製剤化してもよい。別々に投与する場合には、同一の投与経路により各成分を投与することが好適であるが、必ずしもそうである必要はない。
【０１７０】
以下、具体的な実施例を参照して本発明を記載するが、如何なる意味においても、これらにより本発明の範囲が限定されると解釈すべきでない。
【実施例】
【０１７１】
（実施例１：Ｃｐｎ１０ポリペプチドの生成に用いられる遺伝子的パラメータ）
表２に、遺伝子的パラメータ、具体的には下記のＣｐｎ１０ポリペプチドの調製に使用される発現系（すなわちプラスミドの名称、抗生物質による選抜、及び宿主細胞）を記載する。
【０１７２】
表２：Ｃｐｎ１０ポリペプチドの調製に用いる遺伝子的パラメータ
【表２】
2009505667.tif 000003
【０１７３】
（実施例２：Ｃｐｎ１０ポリペプチドの調製プロセス）
Ｃｐｎ１０の調製プロセスをさらに詳細に説明するため、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の調製プロセスを例示する。
【０１７４】
まず、Ｎ末端に付加的なアラニン残基（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０＿ｐＰＬ５５０）を有するヒトＣｐｎ１０をコードする熱誘導による発現プラスミドを、Ｓｏｍｏｄｅｖｉｌｌａ−Ｔｏｒｒｅｓら（２００３、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．、３２巻、２７６−２８７ページ）から入手した。次いで、プラスミドベクターを大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入して形質転換し、１つのクローンを選択し、マスターセルバンクとして確立した。
【０１７５】
次いで、基本的にＲｙａｎら（１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０巻、２２０３７−２２０４３ページ）に記載の方法に従い、大腸菌中でＡｌａ−Ｃｐｎ１０を産生させた。また、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ（ＢｉｏＲａｄ）に結合しなかった物質を、Ｓ−セファロース、次いでゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってさらに精製した。５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中の精製Ｃｐｎ１０を、メーカーの使用説明書（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、米国ミシガン州、Ｃａｔ  Ｎｏ．ＭＳＴＧ５Ｅ３）に従って、０．２ｍｍ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｅ膜を備えたＡｃｒｏｄｉｓｃを用いて濾過して残留するエンドトキシンを除去し、−７０℃で保存した。Ｃｐｎ１０の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９９％超と測定された。アリコートを使用前に一度解凍した。
【０１７６】
大部分のヒトＣｐｎ１０ポリペプチドは、ＧｒｏＥＬ媒介によるロダネーゼのリフォールディングアッセイにおいて大腸菌ＧｒｏＥＳ（Ｂｒｉｎｋｅｒら、２００１年、Ｃｅｌｌ、１０７巻、２２３−２３３ページ）（データ示さず）と同様のモル活性を示した。Ｃｐｎ１０のＬＰＳ汚染は、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅアッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、米国ミズリー州）により、精製Ｃｐｎ１０タンパク質１ｍｇあたり０．０３ＥＵ／ｍｇ未満と測定された。
【０１７７】
上記のような調製プロセスから得られたＣｐｎ１０ポリペプチドの純度は、バッチごとに質量分析によって評価した。下記の表３に示すように、予測質量と計算出質量は一致した。
【０１７８】
表３．Ｃｐｎ１０ポリペプチドの質量スペクトルデータと理論ｐＩ
【表３】
2009505667.tif 000004
【０１７９】
（実施例３：免疫調節活性Ｃｐｎ１０ポリペプチドを測定するためのＲＡＷ２６４−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣバイオアッセイ）
Ｃｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節活性を、基本的に国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００００４１号に記載の方法に従い、ＨＡＷ２６４−ＨＩＶ−ＬＴＲルシフェラーゼバイオアッセイを用いて試験した。
【０１８０】
このアッセイでは、リポ多糖（ＬＰＳ）の存在下における、Ｃｐｎ１０又はその変異体、ミュータント、若しくは誘導体による、Ｔｏｌｌ様受容体のＴＬＲ４からのシグナリング調節活性を測定する。
【０１８１】
ＲＡＷ２６４−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ細胞を液体窒素ストックから融解して再培養した後、Ｇ４１８（２００ｍｇ／ｍｌ）の存在中で５日間培養し、７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）中で懸濁培養した。ＲＡＷ２６４−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ細胞を繰り返しピペッティングして分散させ、２４ウェルのプレートに２．５×１０５細胞／ウェルで蒔き、一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。大腸菌由来の粗ＬＰＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ−６５２９、Ｓｔｒａｉｎ  ０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ）及び大腸菌由来の超高純度ＬＰＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｔｌｒｌ−ｐｅｌｐｓ、Ｓｔｒａｉｎ  ０１１１：Ｂ４、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を滅菌蒸留水に溶解させ、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌに調製し、ガラスバイアル中において４℃で保存した。使用直前に溶液を激しくボルテックスし、アリコートを採取した。所定の濃度でＬＰＳを添加する前に、Ｃｐｎ１０を細胞と共に２時間プレインキュベートした。さらに２時間インキュベートした後、接着細胞をルシフェラーゼアッセイ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国ウィスコンシン州）用に処理した。ルシフェラーゼ活性は、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ  ＴＤ  ２０／２０（ＲＬＵ）又はＰｅｒｋｉｎ−Ｂｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃｅ  Ｖｉｃｔｏｒ  ２  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＣＰＳ）のいずれかを用いて測定した。
【０１８２】
（実施例４：インビトロでのＧｒｏＥＬ媒介によるロダネーゼリフォールディングアッセイを用いた、Ｃｐｎ１０ポリペプチドのコシャペロン活性の分析）
分子シャペロンとして作用し、ＧｒｏＥＬと共にタンパク質をフォールディングするＣｐｎ１０ポリペプチドの能力を、Ｗｅｂｅｒ  Ｆ．及びＨａｙｅｒ−Ｈａｒｔｌ  Ｍ．Ｋ．（Ｃｈａｐｅｒｏｎ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｅｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｃ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、２０００年、１１７−１２６ページ）に記載の適切な方法を用い、インビトロでのロダネーゼのリフォールディングをアッセイすることによって測定した。未変性のウシのロダネーゼ（３０μＭ、ＳＩＧＭＡ）を、５Ｍ  塩酸グアニジン及び８ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、及び２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液（バッファＡ）中で変性させ、次いでロダネーゼの最終濃度が４００ｎＭとなるように、変性剤からＧｒｏＥＬ（４００ｎＭ）を含むバッファＡ中に希釈した（７５倍）。ＧｒｏＥＬは、迅速かつ安定に変性ロダネーゼ（Ｄ−Ｒｈｏ）と結合し、一方、バッファのみではＤ−Ｒｈｏはミスフォールディングし、凝集した（すなわち非効率的な自発的リフォールディング）。予め形成させた安定ＧｒｏＥＬ結合ロダネーゼ複合体に、Ｃｐｎ１０（下記参照）及びＡＴＰ（２０．６ｍＭ）を添加することにより、効率的にリフォールディングが進行した。Ｃｐｎ１０の非存在下でＡＴＰを添加すると、Ｄ−Ｒｈｏはフォールディング能力が喪失された状態でＧｒｏＥＬへの着脱サイクルを生じさせ、結局はミスフォールディング及び凝集を生じさせた（この反応は適切なアッセイブランクとして有用である）。各々のフォールディング反応液は全体で２９０μＬであり、所定の時点（すなわち０、１５、３０、４５、６０、７５、９０分）でアリコートを３０μＬ採取し、７０μＬのロダネーゼ活性のアッセイ混合物（５７．１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、７１．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、７１．４ｍＭ  チオ硫酸ナトリウム、及び７１．４ｍＭ  ＫＣＮ）と６分間混合した。ＡＴＰを用いたリフォールディング反応の開始前に採取したアリコート３０μＬを、Ｔ＝０分のリフォールディング時点とした。ロダネーゼ活性アッセイ混合物中のＥＤＴＡはＭｇ２＋イオンをキレートするため、ＧｒｏＥＬのＡＴＰ結合を妨げ、結果としてフォールディング反応が直ちに停止した。次いで、１５体積％のホルムアルデヒドを５０μＬ添加し（最終濃度５体積％）、６分後にロダネーゼ活性を停止させた。
【０１８３】
ロダネーゼは、チオ硫酸塩とシアン化物からのチオシアニド（Ｒｈｏｄａｎｉｄ）の形成を触媒する。チオシアニドは、硝酸第二鉄の存在時に赤い鉄錯体を形成し、比色分析（吸光度４５０ｎｍ）で容易に検出される。ロダネーゼ活性の測定（１５０μＬ）では、硝酸第二鉄試薬１５０μＬ（６４．５ｍＭ硝酸第二鉄及び９．２体積％の硝酸）の添加により発色させる。ロダネーゼ活性の測定は、９６ウェルのマイクロプレート中、Ａ４５０ｎｍの測定により行う。
【０１８４】
典型的なロダネーゼのフォールディング反応は、フォールディングされたロダネーゼの収量が最大となるまでの間、時間経過に対するロダネーゼ活性（すなわち、フォールディングされたロダネーゼ）の指数関数的傾斜として示される。一定量のＧｒｏＥＬ（４００ｎＭ）及びロダネーゼ（４００ｎＭ）においては、ＧｒｏＥＬ（１４量体）に対するＣｐｎ１０（７量体）モル濃度が同等（すなわち、４００ｎＭ）に達するまで、Ｃｐｎ１０増加に伴う直線的な関係（ロダネーゼ活性と時間の間の関係）が観察された。Ｃｐｎ１０濃度が４００ｎＭを上回ると、ロダネーゼ活性の増加は迅速に最大に達した。アッセイは、５つのスタンダード（二重）及び試験サンプル（二重）で構成した。Ｃｐｎ１０スタンダードの濃度は、０ｎＭ、１４０ｎＭ、２５０ｎＭ、２８０ｎＭ、及び３５０ｎＭとした。３０、４５、６０、７５、及び９０分の時点でのロダネーゼ活性（すなわち、Ｃｐｎ１０活性）の測定値の平均値を算出した。０ｎＭのＣｐｎ１０スタンダードはアッセイのバックグラウンド活性の適切な測定値として役立つため、０ｎＭのＣｐｎ１０スタンダードについての吸光度の測定値を、全ての他の測定された吸光度（又は活性値）から差し引いた。バックグラウンド補正後、２８０ｎＭのＣｐｎ１０スタンダードの吸光度の測定値を１００％活性とし、全ての他の吸光度測定値を、１００％スタンダードに対する相対的活性％として変換した。異常値のデータ点は、追加試験における測定値との比較によって除外し、二重の測定値間の３０％を超える偏差は許容範囲外と見なした。許容範囲内のデータを用い、５つのスタンダードの濃度、すなわち０ｎＭのＣｐｎ１０（０％活性）、１４０ｎＭのＣｐｎ１０（５０％活性）、２５０ｎＭのＣｐｎ１０（８９．３％活性）、２８０ｎＭのＣｐｎ１０（１００％活性）、及び３５０ｎＭのＣｐｎ１０（１２５％活性）を用いて、較正曲線（直線）を作成した。ロダネーゼ活性（すなわちＣｐｎ１０活性）をＣｐｎ１０濃度に対してプロットした。アッセイバイアスの補正のため、試験サンプルによる活性％の値を、線形の較正曲線から得られた式を用いて再計算した。
【０１８５】
シャペロニンの濃度を、オリゴマータンパク質の分子量（ＭＷ）から計算し、一方、ロダネーゼではモノマーのＭＷから計算した。すなわち、大腸菌ＧｒｏＥＬ  １４量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０６１３９）＝８００，７６６．４ｇ／ｍｏｌ、ヒトＣｐｎ１０  ７量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｑ０４９８４）＝７６，１００．５ｇ／ｍｏｌ、及びウシロダネーゼ単量体（ＳｗｉｓＰｒｏｔ  Ｐ００５８６）＝３３，１６４．６ｇ／ｍｏｌである。
【０１８６】
表４に、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０活性に対するパーセンテージとしてバッチごとに計算したＣｐｎ１０ポリペプチドのリフォールディング活性を示す。
【０１８７】
表４．Ｃｐｎ１０ポリペプチドのリフォールディング活性
【表４】
2009505667.tif 000005
【０１８８】
（実施例５：大腸菌ＧｒｏＥＳはＬＰＳ媒介によるＨＩＶ−ＬＴＲ活性を阻害しない）
組換え型大腸菌ＧｒｏＥＳを精製し、実質的にエンドトキシン汚染を含まない（０．１４ＥＵ／ｍｇ）ことが示された（図３Ｋ参照）。精製ＧｒｏＥＳを、上記のように、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０との比較で、ＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイにおいて試験した。図２に示すように、試験した濃度（２５−１００μｇ／ｍｌ）のいずれにおいても、ＧｒｏＥＳは、ＨＩＶ−ＬＴＲのＬＰＳ誘発活性を阻害しなかった。これらの結果は、Ｃｐｎ１０について観察された免疫調節活性が、実際の有意な生物学的効果であることを裏付ける。
【０１８９】
（実施例６：ヒトＣｐｎ１０変異体の構築）
（ＩＭＵ２３−２５の部位特異的変異体）
可動ループ領域の疎水性ＩＭＬ部分（残基２３−２５）を変異導入し、Ｃｐｎ１０とＣｐｎ６０との間の相互作用の強度（表１参照）を変化させた。ＩＭＬを、Ｃｐｎ６０との相互作用を撹乱させると予測される荷電トリペプチドＥＥＥで置換し、また、ＩＭＬを、疎水性を高めることによってＣｐｎ１０のＣｐｎ６０との相互作用を潜在的に強化するものと予想されるＩＩＩ又はＩＦＩ部分として変異させた。図３Ｃ、Ｅ、及びＦに、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＦＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＩＩの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１９０】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＩＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＦＩ、及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓを、表１において説明した相補的プライマーペアを用い、メーカーの使用説明書に従って、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により作製した。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＩＩとＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＦＩについては、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０＿ｐＰＬ５５０プラスミドをＤＮＡ鋳型として使用した。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓについては、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓ＿ｐＥＴ２３プラスミドをＤＮＡ鋳型として使用した（下記参照）。
【０１９１】
（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０）
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０を構成すると予測されるアミノ酸配列を、配列番号２１に示す。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０をコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号２２）を、ｐＰＬ５５０プラスミドのＮｃｏＩ及びＥｃｏＲｌ部位に挿入した（Ｓｏｍｏｄｅｖｉｌｌａ−Ｔｏｒｒｅｓら、２００３年、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．、３２巻、２７６−２８７ページ）。バッチＣＨ００１とＣＨ００３におけるＡｌａ−Ｃｐｎ１０の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図３のＡとＢにそれぞれ示す。
【０１９２】
（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓ）
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓを構成すると予測されるアミノ酸配列を、配列番号４１に示す。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓをコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号４２）を、終止コドン以外のＡｌａ−Ｃｐｎ１０のＤＮＡ配列（配列番号２２）を、ｐＥＴ２３ａプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ及びＸｈｏｌ部位に挿入して調製した。当該クローニングにより、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０のＣ末端にヘキサヒスチジンのタグが付与される。図３Ｄに、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１９３】
（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌ）
Ｃｐｎ１０の可動ループ領域（配列番号１２）から１６のアミノ酸を除去し、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌ（配列番号２４）と称する８６アミノ酸の変異体を作製した。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌをコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号２５）を、ｐＰＬ５５０プラスミドのＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位に挿入した（Ｓｏｍｏｄｅｖｉｌｌａ−Ｔｏｒｒｅｓら、２００３、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３２巻、２７６−２８７ページ）。可動ループはＣｐｎ１０ポリペプチド鎖の中央に位置するため、可動ループの２つの残基（両端の１つの残基）を残してＮ末端フラグメントとＣ末端フラグメントを連結させた状態にすることで、適切なフォールディングと７量体の形成がなされた。
【０１９４】
図３Ｇに、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌの部分的なグルタルアルデヒド架橋（図３Ｈ、レーン２）により、銀染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で７つの明瞭なバンドが検出され、分子が７量体構造を有することが示された。全量で３００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、５８０μｇの量のＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌを、２５℃で３０分間にわたり、０．０１重量％のグルタルアルデヒド（ＡＰＳ）と共にインキュベートした。１５μｌの２Ｍ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）の添加によって反応をクエンチした。反応混合物の１００μｌのアリコートを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）限外濾過カラムを用い、０．５ｍｌ／分の流速でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で分離させた。非架橋Ｃｐｎ１０オリゴマーと同じ滞留時間で溶出されたピークを、０．５ｍｌずつ２つのフラクションに回収し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって解析した。
【０１９５】
（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆ）
β−ヘアピン領域（配列番号１３）から７アミノ酸を欠失させ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆと称する９５アミノ酸の変異体を作製した。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆをコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号２７）を、ｐＰＬ５５０プラスミドのＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位に挿入した（Ｓｏｍｏｄｅｖｉｌｌａ−Ｔｏｒｒｅｓら、２００３年、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．、３２巻、２７６−２８７ページ）。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。さらに、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを配列番号２７に示す。図３Ｊに、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレル）Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレルを構成すると予測されるアミノ酸配列を、配列番号２８に示す。図３Ｄに、Ｃｐｎ１０−β−ｂａｒｒｅｌの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレルをコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号２９）を、ｐＰＬ５５０プラスミドのＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位に挿入した（Ｓｏｍｏｄｅｖｉｌｌａ−Ｔｏｒｒｅｓら、２００３年、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．、３２巻、２７６−２８７ページ）。図３Ｊに、Ｃｐｎ１０−β−バレルの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１９６】
（Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０）
Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０を構成すると予測されるアミノ酸配列を、配列番号３０に示す。Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０をコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号３１）をｐＥＴ３０ａプラスミドに挿入した。図３Ｎに、Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１９７】
（Ｘ−Ｃｐｎ１０）
Ｘ−Ｃｐｎ１０を構成すると予測されるアミノ酸配列を配列番号２３に示す。Ｘ−Ｃｐｎ１０をコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号４４）を、ｐＰＬ５５０プラスミドのＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位に挿入した（Ｓｏｍｏｄｅｖｉｌｌａ−Ｔｏｒｒｅｓら、２００３年、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．、３２巻、２７６−２８７ページ）。図３Ｍに、Ｘ−Ｃｐｎ１０の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１９８】
（ＧｒｏＥＳ）
大腸菌ＧｒｏＥＳ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０５３８０）を構成すると予測されるアミノ酸配列を、配列番号１１に示す。ＧｒｏＥＳをコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号３４）を、ｐＥＴ１１ａプラスミドに挿入した。図３Ｋに、ＧｒｏＥＳの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１９９】
（Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳ）
Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳを構成すると予測されるアミノ酸配列を、配列番号１４に示す。ヒトＸ−Ｃｐｎ１０の残基１−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬ−９（配列番号２３）を、大腸菌ＧｒｏＥＳの残基１−ＭＮＩＲ４（配列番号１１）で置換し、Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳタンパク質を作製した。Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳをコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号４３）を、ｐＥＴ２３ａプラスミドに挿入した。図３Ｌに、Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０２００】
（実施例７：Ｃｐｎ１０のＩＭＬトリペプチドの変異体の活性）
可動ループのＩＭＬトリペプチド（Ｃｐｎ６０との相互作用、さらにはタンパク質のフォールディングに極めて重要）の変異体を作製し、可動ループのＣｐｎ６０との相互作用を撹乱又は強化した（実施例６参照）。
【０２０１】
ＥＥＥ可動ループを有するＡｌａ−Ｃｐｎ１０タンパク質変異体（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓ）では、インビトロにおけるロダネーゼリフォールディングのプロセスの際、Ｃｐｎ１０のＧｒｏＥＬ（大腸菌Ｃｐｎ６０）と共に機能する活性が損なわれたが、ＩＩＩとＩＦＩ変異体では活性が維持された（表３参照）。
【０２０２】
以上の結果から、ＧｒｏＥＬへのＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓの親和性が顕著に低下することが示された。タンパク質のフォールディングアッセイとは対照的に、ＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイでは、全てのトリペプチド変異体（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓを含む）が、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０と同様な活性を示してＴＬＲ４シグナリングを調節できることが示され、すなわちＣｐｎ１０のこの免疫調節活性にとり、可動ループ（すなわちＣｐｎ６０）が重要ではないことが示唆された（図４Ｂ、Ｄ、Ｆ、及びＨ参照）。
【０２０３】
（実施例８：Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌは、ロダネーゼのリフォールディングにおいてＧｒｏＥＬと協働しない。）
可動ループ領域（及び従ってＣｐｎ６０）が免疫調節活性に必要でないことを確認するため、１６アミノ酸を可動ループ領域（配列番号１２）から欠失させ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌと称する８６アミノ酸の変異体を作製した（実施例６参照）。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌのアミノ酸配列を、配列番号２４に示す。
【０２０４】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌが、ロダネーゼ再フォールディングのプロセスにおいてＧｒｏＥＬ（大腸菌Ｃｐｎ６０）と共に生産的に機能する性能について試験した。ポジティブコントロールとして、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０を同じアッセイ系に添加すると、約１００％の活性を示した（表３参照）。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌの活性は約０％の活性と測定され、すなわちＧｒｏＥＬとは相互作用せず、従ってタンパク質のフォールディングのプロセスの際にコシャペロンとして機能しないことが示された。なお、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０とＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌのポリペプチドの双方を同じモル濃度として試験を行った。
【０２０５】
（実施例９：Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌは、ＨＩＶ  ＬＴＲのＬＰＳ誘発活性を阻害する）
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌを、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０との比較において、ＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイにおいて試験した。このアッセイにおいて、ルシフェラーゼレポーターはＮＦＫＢシグナル伝達と間接的に連結しており、ＮＦＫＢはＬＰＳによって誘導される一次転写因子である。ルシフェラーゼ活性は、使用した測定方法に応じて、相対光単位（ＲＬＵ）又はカウント／秒（ＣＰＳ）として測定した。図５Ａ及び５Ｂに示すように、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌは、１−１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で、ＬＰＳ誘発によるＨＩＶ−ＬＴＲの活性化を阻害した。これは単独のアッセイであるが、２つの反復した実験を別なマイクロタイタープレートで行い、やはり同様の活性が示された。このデータセットにおいて、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０と比較して一貫して大きい阻害活性を有することが観察された。
【０２０６】
上記の実施例８に記載のように、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌは、ロダネーゼのリフォールディングのプロセスにおいて、ＧｒｏＥＬのコシャペロンとして機能できなかった。しかしながら、ＬＰＳの存在下でのＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイに使用した場合、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌによる活性は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０と同等のレベルとして観察された。すなわち、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌは用量依存的にＨＩＶ−ＬＴＲレポーターのＬＰＳ誘発による活性化を阻害した。これらの結果は、ＴＬＲ４シグナリングを調節するＣｐｎ１０の機能においては、Ｃｐｎ６０は全く関与しないことを示すものであった。
【０２０７】
（実施例１０：Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆは、ＨＩＶ  ＬＴＲのＬＰＳ誘発による活性化を阻害する。）
Ｃｐｎ１０のβ−ヘアピンルーフループ領域（図１参照）は、哺乳類において正味の正電荷を有するが、多くの細菌においては正味の負電荷を有する（大腸菌ＧｒｏＥＳが代表例）。興味深いことに、バクテリオファージＴ４もまた、大腸菌ＧｒｏＥＬと共にＴ４主要カプシドタンパク質Ｇｐ２３をフォールディングする機能を有する固有のＣｐｎ１０（Ｇｐ３１）を持つ。なお、ＧｒｏＥＳ及びＣｐｎ１０はいずれもこの機能を有さない。Ｇｐ３１とＣｐｎ１０／ＧｒｏＥＳの間の主な相違点は、Ｇｐ３１がルーフβ−ヘアピンループを完全に欠くことであり、Ｇｐ３１の異常な機能及び性能の理由ともなりうる（Ｈｕｎｔら、１９９７年、Ｃｅｌｌ、９０巻、３６１−３７１ページ）。
【０２０８】
Ｃｐｎ１０免疫調節活性に対するルーフβ−ヘアピン領域の関与を解析するため、７つのアミノ酸をβ−ヘアピン領域（配列番号１３）から除去し、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆと称する９５アミノ酸の変異体を作製した（実施例６参照）。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆのアミノ酸配列を、配列番号２６に示す。
【０２０９】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆを、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０及び大腸菌ＧｒｏＥＳとの比較において、ＬＰＳの存在下、ＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイにおいて試験した。図６に示すように、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆは、５０−１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で、ＨＩＶ−ＬＴＲのＬＰＳ誘発活性を阻害した。これは単独のアッセイであるが、２つの反復した実験を別なマイクロタイタープレート上で実施し、同様の活性が示された。このデータセットにおいて、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の約８０％の活性を一貫して有することが観察された。これらの結果は、Ｃｐｎ１０によるＴＬＲ４シグナリングの調節が、分子の機能的ルーフβ−ヘアピン領域が存在しない場合でも生じうることを示すものである。
【０２１０】
（実施例１１：Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレル変異体は、免疫調節活性を示す）
上記実施例９及び１０に記載のデータの裏付けとして、本発明者らは、可動ループとβ−ヘアピンルーフループの双方を欠くヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０変異体を作製した（「Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレル」、配列番号２８、実施例６参照）。興味深いことに、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレル変異体は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０とＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌ変異体に比較し、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて若干大きい分子として溶出された。このことから、当該ルーフがサブユニットを強固に結合した高次構造中に保持することを助長すると示唆される。一方、可動ループは７量体を不安定にしてその分解を促進するが、それにもかかわらず当該７量体は分解された個々のモノマーよりもエネルギー的に安定である。
【０２１１】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレルのポリペプチドを、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０及び大腸菌ＧｒｏＥＳとの比較において、ＬＰＳの存在下で、ＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイにおいて試験した。図７に示すように、この変異体は、ＴＬＲ４シグナリングの調節において、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の活性に対して約５０％の活性を示し、すなわち当該免疫調節活性は、β−ヘアピンルーフループに部分的に寄与するか、又は７量体の安定性に起因することが示唆された。なお、得られた結果は２つの独立した実験結果に基づくものである。
【０２１２】
（実施例１２：Ｎ末端Ｃｐｎ１０変異体の免疫調節活性）
Ｃｐｎ１０のＮ末端は、（サイトゾル中での合成後の）ミトコンドリアマトリクスのターゲティングを補助することが知られている。しかしながら、殆どのミトコンドリアマトリクスのタンパク質は、切断可能なＮ末端のターゲティング配列を有するものの、Ｃｐｎ１０のＮ末端は切断されず、さらなる機能を有することを示唆する。
【０２１３】
本発明者らは、インビトロにおける免疫反応を調節するヒトＣｐｎ１０のＮ末端変異体の性能を検討した。試験した変異体（本願明細書において「Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳ」と称する）は、ヒトＮ末端配列「ＭＡＧＱＡＦＲＫＦＬ」の位置において、大腸菌ＧｒｏＥＳからのＮ末端配列「ＭＮＩＲ」を有する。Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
【０２１４】
Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳは、シャペロン媒介によるロダネーゼのリフォールディングにおいて、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の活性に対してわずか約１２％の活性を示した（ＧｒｏＥＬと協働、表３参照）。しかしながら、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果、ＧｒｏＥＬ（Ｃｐｎ６０）との結合時には、Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳは可動ループを備えた無傷の７量体であることが確認された（データ示さず）。
【０２１５】
図８Ａ及び８Ｂに示すように、Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳ変異体は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０で観察される活性と対照的に、ＨＩＶ−ＴＬＲのＬＰＳ誘発による活性を免疫学的に調節する機能を喪失していた。このことは、ＴＬＲ４を伴うＣｐｎ１０の免疫調節活性にとり、Ｃｐｎ１０のＮ末端が必要であることを示唆する。従って、大腸菌（ＧｒｏＥＳ）のように、ＥＳ−Ｎｔｅｒｍ−Ｃｐｎ１０は、ＬＰＳによって誘発されるＮＦ−ｋＢ（すなわちＴＬＲ４調節）を抑制できなかった（図８Ｂ参照）。
【０２１６】
（実施例１３：Ｘ−Ｃｐｎ１０における、ＨＩＶ  ＬＴＲのＬＰＳ誘発による活性化阻害能の低下）
Ｘ−Ｃｐｎ１０を、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０との比較において、ＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイを用いて試験した。実施例６で議論したように、Ｘ−Ｃｐｎ１０は、追加的なＮ末端アラニン残基及び天然ヒトＣｐｎ１０に存在するアセチル基を欠く。このアッセイにおいて、ルシフェラーゼレポーターを、ＮＦｋＢシグナル伝達と間接的にリンクさせた。ＮＦｋＢは、ＬＰＳによって誘発される一次転写因子である。ルシフェラーゼ活性は、使用した測定方法に応じて、相対光単位（ＲＬＵ）又はカウント／秒（ＣＰＳ）として測定した。図９Ａ及び９Ｂに示すように、Ｘ−Ｃｐｎ１０は、ＨＩＶ−ＬＴＲのＬＰＳ誘発活性を部分的に阻害した（Ａｌａ−又はＧｌｙ−Ｃｐｎ１０活性の約５０％）。このデータセットにおいて、アラニン等のＣｐｎ１０のＮ末端上の付加的な残基は、ＴＬＲ４シグナリングの免疫調節活性に関与しうることが観察された。
【０２１７】
（実施例１４：Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０はＨＩＶ  ＬＴＲのＬＰＳ誘発による活性化を阻害する）
Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０を、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０との比較において、ＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイを用いて試験した。実施例６で議論したように、Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の追加的なＮ末端アラニン残基をグリシン残基で置換している。このアッセイにおいて、ルシフェラーゼレポーターを、ＮＦｋＢシグナル伝達と間接的にリンクさせた。ＮＦｋＢは、ＬＰＳによって誘発される一次転写因子である。ルシフェラーゼ活性は、使用した測定方法に応じて、相対光単位（ＲＬＵ）又はカウント／秒（ＣＰＳ）として測定した。図１０Ａ及び１０Ｂに示すように、Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０は、ＨＩＶ−ＬＴＲのＬＰＳ誘発による活性化を、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０よりも大きい規模で阻害した。
【０２１８】
図１６に示すように、アセチル基は構造的にアラニン残基よりもグリシン残基と類似する。従って、アセチルＣｐｎ１０ポリペプチド（すなわち、天然のＣｐｎ１０）の活性はＧｌｙ−Ｃｐｎ１０の活性と同程度であると考察される。
【０２１９】
（実施例１５：ＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイにおける超高純度ＬＰＳの使用）
図５−７及び１０に示すデータは、上記のＲＡＷ２６４．７−ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＬＵＣ阻害アッセイにおいて、粗ＬＰＳを用いることによって得た。図１１−１４では、ＴＬＲ４に特異的な超高純度ＬＰＳを使用した結果を示す。図１１（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０Δｍｌ）、図１２（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０Δｒｏｏｆ）、図１３（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレル）、及び図１４（Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０）の結果は、図５−７、及び１０において示した対応するデータと非常に類似するものである。このことは、Ｃｐｎ１０による免疫調節活性を解析するために本願明細書において使用され開示されたアッセイデータが、ＴＬＲ４に特異的に由来するデータであることを示す。
【０２２０】
（実施例１６：マウス内毒血症の試験）
種々のＣｐｎ１０ポリペプチド（すなわち、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆ、及びＸ−Ｃｐｎ１０）のインビトロ免疫調節活性が、インビボ活性を反映するか否かを解析するため、敗血症モデルマウスを用い、内毒血症の試験を行った。
【０２２１】
Ｃｐｎ１０分子の仮定された活性領域を系統的に変異又は欠失させることにより、かつ多数の生物から得たＣｐｎ１０のホモログを試験することにより、最適な活性にとり必要となる最小限の構造領域及び／又は配列モチーフを解明することができ、最終的に、治療用途により有力な分子の設計が可能となる。これまで、免疫調節活性についてのこれらの領域の重要性を調査するため、Ｃｐｎ１０におけるいくつかのバリエーション又は変異体を作製した（図１参照）。
【０２２２】
上記のインビトロの試験から、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に対して、Ｃｐｎ１０の可動ループ又はルーフループ領域に欠失のあるコンストラクト（すなわちそれぞれＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ΔｍｌとＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆ）は、ＴＬＲ４とＬＰＳとの結合に応答したＮＦｋＢ活性の低下に関して、同程度の活性を示すことが観察されている。他方で、非アセチル化Ｃｐｎ１０（Ｘ−Ｃｐｎ１０）では、このインビトロ活性評価を用いた場合、ＮＦｋＢ活性を下方調節する性能が顕著に低下していた。
【０２２３】
本試験において、多数のＣｐｎ１０変異体が、炎症（すなわち内毒血症）のインビボモデルにおいて、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に対して同様な活性を有することが見出された。マウスの内毒血症モデルを用いて、ＬＰＳ誘発による炎症性サイトカインの産生を低下させるＣｐｎ１０の能力を測定した。
【０２２４】
（実施例１６ａ：マウス内毒血症試験に用いた材料及び方法）
以下のマウス内毒血症の試験に使用した材料及び方法を、下記の実施例１７ａ（１）〜１７（ａ）２に記載する。
【０２２５】
（実施例１６ａ（１）：内毒血症の試験に使用したマウス）
本試験は、８４匹のメスＢａｌｂ／ｃマウスを用いて行った。いずれも成体であり（＞９週齢、平均体重約２０ｇ（０．０２ｋｇ））、１つの群あたり７匹のマウスとして、１２群に分けた（表５参照）。マウスを１２／１２の明／暗サイクル条件下において収容し、標準的な実験動物用飼料（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ、Ｇｌｅｎ  Ｆｏｒｒｅｓｔ、オーストラリア）及び水を自由に摂取させた。各マウスの体重を注射の前に測定した。下記に示す要領（表５参照）で、尾静脈からの静脈（ＩＶ）ルートを経て注射を行った。
【０２２６】
（実施例１６ａ（２）  マウス内毒血症の試験に用いて薬剤／溶液）
実施例１６ａ（１）マウス内毒血症の試験に使用した薬剤／溶液を以下（（Ａ）から（Ｈ）に掲げる）に示す。（Ａ）タンパク質製剤バッファ（ＦＢ）：このバッファは、本試験のネガティブコントロールであり、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）と１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む（＜０．０２ＥＵ／ｍｌ）。このバッファは、試験物質として、またポジティブコントロール及び試験サンプルの希釈用液として使用する。（Ｂ）Ａｌａ−Ｃｐｎ１０：このＣｐｎ１０ポリペプチドは、本試験のポジティブコントロールであり、５ｍｇ／ｍｌのストック濃度を有する（＜０．０１ＥＵ／ｍｇ）。４００μｌのタンパク質溶液を１．６ｍｌの製剤バッファ中に希釈することによって、１ｍｇ／ｍｌの試験用溶液を調製した。（Ｃ）Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌ：このＣｐｎ１０ポリペプチドは、３．５ｍｇ／ｍｌ（＜０．０３ＥＵ／ｍｇ）のストック濃度を有する。５７１μｌのタンパク質溶液を１．４２９ｍｌの製剤バッファ中に希釈することによって、１ｍｇ／ｍｌの試験用溶液を調製した。（Ｄ）Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆ：このＣｐｎ１０ポリペプチドは、４．２ｍｇ／ｍｌのストック濃度を有する（＜０．１ＥＵ／ｍｇ）。タンパク質溶液４７７μｌを１．５２３ｍｌの製剤バッファ中に希釈することによって、１ｍｇ／ｍｌの試験用溶液を調製した。（Ｆ）Ｘ−Ｃｐｎ１０：このＣｐｎ１０ポリペプチドのストック濃度は５ｍｇ／ｍｌである（＜０．０４ＥＵ／ｍｇ）。４００μｌのタンパク質溶液を１．６ｍｌの製剤バッファ中に希釈することにより、１ｍｇ／ｍｌの試験用溶液を調製した。（Ｇ）エンドトキシン：リポ多糖（ＬＰＳ）をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ６５２９）から入手した。使用の直前に、バイアルの内容物（１ｍｇ）を１ｍｌの無菌の生理食塩水中で再調製した。各群への注射の前に、当該内容物を無菌の生理食塩水中に１００μｇ／ｍｌまでさらに希釈（１／１０）した。（Ｈ）エンドトキシンコントロール：注射用の無菌生理食塩水を、９００ｍｇ／ｍｌ（０．９％）の濃度で、Ｐｆｉｚｅｒ、オーストラリア（Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＤＷ−ＳＣ００１０）から入手した（＜０．０１ＥＵ／ｍｌ）。
【０２２７】
（実施例１６ｂ：マウス内毒血症の試験において行った薬剤投与及び採血）
マウスの異なる群における薬剤投与の手順は、表５に示す通りである（下記参照）。投与はいずれも、ある拘束したマウスに対する意識下での１００μｌの尾静脈注射により行った。ＬＰＳ用量はいずれも１０μｇ／マウスとした。Ｃｐｎ１０変異体はいずれも１００μｇ／マウス（体積１００μＬ）で注射した。
【０２２８】
下記表５に採血の手順を概説する。血液サンプルは、ハロタン麻酔（Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｔｄ．、Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ、イギリス）（ＳＯＰ  ＥＴ−０１１）下における心臓穿刺又は死後の心臓切開による出血から採取した。抗凝固剤（血塊活性剤）を含まない小児科用血清チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃  ４５０４０１）中に血液を採取した。サンプルを室温に約５分間放置して凝集させ、室温にて５分間、１２０００ｒｐｍの遠心分離（Ｂｉｏｆｕｇｅ  １３、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を行った。血清を新しいチューブに移し、−２０℃に置き、ドライアイス上へ移した。
【０２２９】
全ての薬剤投与と採血の時間を臨床記録シート（Ｆｏｒｍ  ＩＭＶＳ  ２０６１／Ａ）に記録した。同じ記録シートを使用し、実験の全体を通した一般的条件をモニターした。
【０２３０】
表５．Ｃｐｎ１０内毒血症の試験手順
【表５】
2009505667.tif 000006
【０２３１】
（実施例１６ｃ：サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）分析）
炎症関連のサイトカインのレベルにおける変化を評価するため、血清サンプルについてマウスの炎症ＣＢＡ分析（Ｃａｔ＃５５２３６４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｄｅｎｃｅｓ）を行った。すなわち、ＬＰＳ投与マウス（表５、群１、３、５、７、９、及び１１）又は生理食塩水対照マウス（表５、群２、４、６、８、１０、及び１２）から調製したＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ血清を、必要により、分析前にアッセイ希釈剤に希釈した（ＬＰＳ処理群について５倍、生理食塩水対照について２倍）。各サンプルを、ＣＢＡソフトウェアを備えたＢＤ  ＦＡＣＳ−Ａｒｒａｙ装置を用い、メーカーの使用説明書に従って、２回試験した。
【０２３２】
（実施例１６ｄ：サイトカインレベルの低下率の測定）
下記の式を使用し、ＬＰＳ感作マウスに及ぼすＣｐｎ１０処理の効果を測定した。Ｃｐｎ１０変異体で予備処理したマウス（すなわち試験群）の予備処理していないマウス（すなわち対照群）に対するＬＰＳ誘発サイトカインの低下率を、次の式に従って計算した。
低下％＝１００−［（試験群の平均サイトカインレベル／対照群の平均サイトカインレベル）×１００］
【０２３３】
（実施例１６ｅ：ＥＬＩＳＡ分析）
ＣＢＡ分析を裏付けるため、メーカーの使用説明書に従ってＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ＃ＤＹ４１０）を用い、マウスＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡを行った。希釈剤としてＰＢＳ＋１０％ＦＣＳを用い、サンプルとスタンダードを希釈（３倍希釈）した。サンプルを２回試験した。
【０２３４】
（実施例１６ｆ：臨床的観察）
表５に記載の種々の群のマウスの挙動を、ＬＰＳ又は生理食塩水の注射後９０分間以内又は心臓穿刺による出血の前に解析した。表６に全ての観察を記録してまとめた。観察は、ＬＰＳ／生理食塩水の注射の直後と心臓穿刺（Ｃ．Ｐ．）によるマウスの出血の前に行った。臨床的観察の比較は、群１、２、又は３に関して行った。通常、ＬＰＳのみで処理したマウス（群１）は、注射後１５分間以内にＬＰＳ誘発による敗血症を示した。ＬＰＳ処理のマウスでは移動性の低下を示し、刺激（例えば騒音又は接触）に対する応答が少なかった。下痢や毛の乱れのようなＬＰＳ感作によるいくつかの典型的な悪影響は、本試験においてはいずれのマウスにも観察されなかった。このことは、この試験に使用したＬＰＳのロットが相対的に高い効果を有することを反映していると考えられる。生理食塩水処理の対照マウス（群２）は、刺激に対する応答が大きく、通常の応答性と移動性を示した。
【０２３５】
Ｃｐｎ１０と種々のＣｐｎ１０変異体で予備処理したマウスは、未処理のＬＰＳ対照群と比較し、ＬＰＳ感作に応答して、若干異なる挙動を示した。Ａｌａ−Ｃｐｎ１０とＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆで予備処理したマウス（群３と７）は落ち着きが少なく、刺激に対して若干敏感に反応するが、観察した期間全体にわたり群がり続けた。興味深いことに、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌで予備処理したマウス（群５）は、若干活発であり、観察期間の全体を通してそれ程群がらなかった。また、Ａｃｅｔｙｌ−Ｃｐｎ１０で予備処理したマウス（群９）のＬＰＳ感作の効果は、他の群で観察されたものと異なるように見受けられた。これらのマウスを観察したところ、ＬＰＳ注射後の最初の３０〜４５分間に、群３と類似の挙動を示したが、これらのマウスは、観察期間の終わりに向かうにつれて回復し、移動性と俊敏さが向上した。これに対し、Ｘ−Ｃｐｎ１０で予備処理したマウスは、群１と非常に似た挙動を示した。これらのマウスは極度に不活発であり、刺激に対する応答が少なく、殆どの観察期間において群れをなした。Ｃｐｎ１０変異体の生理食塩水による各対照群（すなわち、群４、６、８、１０、及び１２）では、未処理の生理食塩水群（群２）における対照動物に類似の有害な臨床症状が存在しないことが示された。
【０２３６】
ＬＰＳで感作されたマウスでは、一般に血圧が降下する（敗血症に関連する症状）典型的な症状を示すため、出血が困難となる。これらのマウスでは、心臓穿刺による出血は遅く、ＬＰＳを投与されなかったマウスと比較して血液の回収量が少なくなる。直接の心臓穿刺によって出血させることができなかったマウスについては、死後の心臓切開による出血を行った。ＬＰＳ投与マウスに対してＣｐｎ１０処理を行った場合、Ｃｐｎ１０処理マウスにおける血液回収への影響や改良が見られなかったが、ＬＰＳ対照動物と比較し、Ｃｐｎ１０処理マウスからの血液は、一般に、心臓切開による出血を行うことなく、直接の心臓穿刺によって回収することができると認められた。本試験において、各マウスから少なくとも血液４００μＬを回収した。通常の出血と回収からの逸脱はいずれも、該当する臨床的記録シートに記録した。
【０２３７】
表６．種々のＣｐｎ１０で予備処理した後にＬＰＳ／生理食塩水の注射をしたマウスの臨床的観察
【表６】
2009505667.tif 000007
【０２３８】
（実施例１６ｇ：マウスにおけるサイトカインの減少）
ＬＰＳ感作マウス（図１５参照）におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０サイトカインの平均レベルを示す。Ｃｐｎ１０で処理しなかった動物に対して炎症促進性サイトカインの低下において統計的有意性を示すＣｐｎ１０処理群を星印で表示する。予備処理しなかったマウス（表５に示す）と比較した、種々のＣｐｎ１０で予備処理したマウスにおいて分析した種々のサイトカインの低下率を括弧内に表示する。
【０２３９】
表７．種々のＣｐｎ１０変異体で処理したＬＰＳ感作マウスにおけるＬＰＳ誘発による炎症促進性サイトカインレベルの平均と低下率
【表７】
2009505667.tif 000008
【０２４０】
（血清のサイトカインレベルについてのＣＢＡ分析）
各マウスからの血清サンプルを、循環炎症促進性サイトカインの検出用のＢＤ  Ｍｏｕｓｅ炎症ＣＢＡアッセイを用いて分析した。このアッセイは、試験サンプル中のＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＭＣＰ−１、及びＩＦＮ−γサイトカインを検出する。分析は、アッセイの限界内での最適な検出のために、連続的に希釈したサンプル（実施例１６ａ参照）について行った。全てのサンプルを２回試験した。
【０２４１】
サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０の相対的発現をこのマウスの敗血症モデルにおける炎症の指標とし、対照郡に対するＣｐｎ１０処理群のそれらのレベルを解析した。この内毒血症の試験の時間枠（９０分間のＬＰＳ投与）において、ＩＦＮγ、ＭＣＰ−１、及びＩＬ−１２ｐ７０サイトカインのレベルは、一般にこのアッセイの検出限界外にあるため、データをここには示さない。ゆえにこれらのサイトカインは、本試験において検討しなかった。ＣＢＡの結果を解析する前に、本発明者らは、反復の間の一貫性に基づくデータの有意性が、標準曲線の線形範囲のどの部分に該当するかを評価した。極端な異常値は、分析から除外した。
【０２４２】
本試験における種々の群のマウスでの循環ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０の絶対値と平均を図１５に示す。予想通り、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０サイトカインの平均レベルは、それらの生理食塩水の対照と比較し、ＬＰＳで感作されたマウス血清中で誘発された数値よりも高かった（それぞれ図１５Ａ、Ｃ、Ｅ対Ｂ、Ｅ、Ｆ）。このことは、本試験において使用した量のＬＰＳが、炎症反応を誘発し、これらのサイトカインのバックグラウンドレベルが、これらのマウスにおいて十分に低かったことを示す。いくつかの生理食塩水の対照サンプル（図１５Ｆ、「Ｘ−Ｃｐｎ１０＋生理食塩水」）において検出されたＩＬ−１０のレベルは、ＬＰＳ感作の対照（すなわち、群１の「ＦＢ＋ＬＰＳ」）と同等に高かった。これらのサンプルでは、より濃縮した形態で分析を行ったため、内在性の血清因子がアッセイの読み取りを妨害し、ゆえにこのデータの不正確の原因となったことが考えられる。データはまた、ＬＰＳで感作されたマウスをＣｐｎ１０タンパク質で処理したとき、Ｃｐｎ１０で予備処理されていないマウスに比較して、血清ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０サイトカインのレベルを低下させることを示した（それぞれ図１５Ａ、Ｃ、及びＥ）。各サイトカインプロフィールについて、一方向のＡＮＯＶＡ分析（Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験）を行った。この分析により、種々の群におけるＩＬ−１０サイトカインレベルではないＴＮＦ−α及びＩＬ−６レベルの平均のいくつかが、統計的に異なることを見出した（図１５Ａ、Ｃ、及びＥ）。プロット上に示された平均サイトカインレベルの明らかな低下にもかかわらず、ＩＬ−１０サイトカインレベルにおいて、統計的差異がないことは、対照群のみにおけるＩＬ−１０サイトカインの大きな変動によるものと考えられる（図１５Ｅ、「ＦＢ＋ＬＰＳ」）。サンプリング集団を増やして試験結果の統計的有意性を改良するのが今後の課題である。
【０２４３】
Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆ又はＸ−Ｃｐｎ１０のいずれかで予備処理した群（すなわち、群７と１１）における平均のＴＮＦ−α及びＩＬ−６サイトカインのレベルが、未処理群（すなわち、群１）に対して統計的に低いことを示した（表７）。しかしながら、いくつかの群において、炎症促進性サイトカインにおける統計的に有意な低下（未処理群に対する）は、１つのサイトカインのプロフィールにおいてのみ観察された。例えば、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌ予備処理群では平均ＴＮＦ−αが低下したが、未処理群に対するＩＬ−６サイトカインレベルの低下は観察されず、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０予備処理群（表７）についてその逆であった。さらに、統計分析では、Ｃｐｎ１０変異体の予備処理した群の平均サイトカインレベルが相互に異なることは見出されなかった。
【０２４４】
いくつかのＣｐｎ１０変異体による予備処理群でのみ、統計的に有意な低下を示したが、全体的な傾向としては、全てのＣｐｎ１０変異体において、ＬＰＳ感作マウスにおける炎症関連のサイトカインのレベルが低下したことを示した。これらのマウスにおいて、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０サイトカインのレベルが全体として約３０〜５０％低下した（表７）。
【０２４５】
（議論及び結論）
本試験は、種々のＣｐｎ１０ポリペプチド（すなわち、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆ、及びＸ−Ｃｐｎ１０）によるマウスの予備処理が、ＬＰＳ誘発による内毒血症の臨床的効果を低下することを示した。ＬＰＳのみを投与されたマウスでは、内毒血症の典型的な症状（すなわち活動、応答、及び俊敏さの低下）を示した。他方で、いずれかのＣｐｎ１０タンパク質で予備処理したマウスではＬＰＳ感作による影響が少ない（すなわち刺激に対する高い応答性、及び機動性）ことが観察された（表６）。
【０２４６】
炎症関連のサイトカインについてのＣＢＡ分析は、ＬＰＳ注射前の全てのＣｐｎ１０変異体予備処理マウスの血清中においては、ＬＰＳのみを投与されたマウスの血清と比較し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０サイトカインレベルが低いことを示した。予想通り、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０で予備処理したマウスは、本発明者らの先の結果（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００５）と一致し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６サイトカインのレベル低下を示した。本はつめいの結果は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０により、全てのＴＬＲアゴニストに応答したＩＬ−１０産生が低下することを示唆する。本発明者らはさらに、多数のＣｐｎ１０変異体（表７）で予備処理したマウスにおけるこれらの炎症関連のサイトカインのレベルが、同様に低下することを確認した。統計分析は、未処理群と比較し、ＴＮＦ−αとＩＬ−６サイトカインのレベルの低下が、いくつかのＣｐｎ１０変異体予備処理群においてのみ有意であることを示したが（図１５Ａ及びＣ、表７）、全体の傾向としては、本試験において使用した全てのＣｐｎ１０タンパク質が、ＬＰＳ炎症反応を下方調節することを示した。
【０２４７】
インビボの内毒血症の結果は、検討した全てのＣｐｎ１０ポリペプチド（すなわち、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆ、及びＸ−Ｃｐｎ１０）がＡｌａ−Ｃｐｎ１０に対して同様な活性を示した。このことは、Ｃｐｎ１０の可動ループ又はルーフループ領域が、ＴＬＲ４−ＬＰＳの結合に応答する調節にとって必要ではないことを裏付けるものである。Ｘ−Ｃｐｎ１０のインビトロ活性において観察される変動は、Ｃｐｎ１０変異体で予備処理した群の間の平均サイトカインレベルが統計的に有意差を示さなかったため、内毒血症の試験において評価できなかった。
【０２４８】
（実施例１７：大腸菌バッチ培養液からのＣｐｎ１０の精製）
Ｃｐｎ１０ポリペプチド調製用のバイオプロセスを開発した。下記に示すように、このプロセスを用いて、１００Ｌの大腸菌培養液から約２０ｇの組換え型ヒトＣｐｎ１０（＞９９％純度、≦０．０３ＥＵ／ｍｇのエンドトキシン、及び≦１５５．３ｐｇ／ｍｇのＤＮＡ）を調製した。このプロセスを以下に概説する。
【０２４９】
（発酵）
ＡｌａＣｐｎ１０＿ｐＰＬ５５０プラスミドを有する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を含むバイアルを、マスターセルバンク（上記の「一般的方法」参照）から取り出し、３０℃にて抗生物質を添加せずにＳｏｙａ  Ｂｒｏｔｈで一晩「前培養」した。次に、上記の培地と成長温度のパラメータに設定した１００Ｌのバイオリアクター用の種培養液を調製した。この種アリコートを、動物由来の生成物を含まず、かつ抗生物質を添加しない、大豆ベースのペプトンリッチな最少培地（ＢｒｅｓａＧｅｎ、ＳＡ、オーストラリア）１００Ｌを仕込んだバイオリアクター中に添加した。バイオリアクターの培養ではバッチのフィードを必要とせず、培養温度を増殖期全体にわたり３０±１℃に維持した。アンモニアを添加してｐＨを７．０±０．２に維持した。Ｃｐｎ１０の誘導は、温度を４２℃にシフトさせてＯＤ６００値＝１０の時点で行い、４２±０．１℃でさらに３時間インキュベートし、ＯＤ６００値が２０〜２５に到達した時に終了させた。
【０２５０】
（細胞の溶解及び可溶化液の調製）
培養終了後３時間以内に、細菌細胞（約３．５ｋｇの湿重量）を遠心分離（５，０００×ｇ）してペレットを調製し、２５ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁し、ＡＰＶ  Ｇａｕｌｉｎ  Ｍｏｄｅｌ  ３０ＣＤ圧力ホモジナイザー（ＡＰＶ、ＵＳＡ）を４８．２ＭＰａ（７０００ｐｓｉ）で３回通すことによって溶解させた。細胞残渣を沈殿させた後、細菌可溶化液に含まれる可溶性Ｃｐｎ１０を、フロースルーＷｅｓｔｆａｌｉａ  ＭＳＢ−７遠心分離機を用いて回収した。約２０Ｌの透明な可溶化液を４℃で一晩保存した。
【０２５１】
（Ｃｐｎ１０の精製）
Ｂｉｇ  Ｂｅａｄ  Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＢＢＳＰ）カチオン交換、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＱＦＦ）アニオン交換、及びＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＳＰ（ＨＰＳＰ）カチオン交換クロマトグラフィーを含んでなる３つの後続プロセスを行い、Ｃｐｎ１０を精製した。Ｋ−ｐｒｉｍｅ  ４０−ＩＩ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｕｎｉｔ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、クロマトグラフィーを行った。
【０２５２】
（クロマトグラフィーカラム、容器、及びバッファの脱パイロジェン化）
全てのイオン交換クロマトグラフィーのカラムを１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄して脱パイロジェンし、溶出液が所定のバッファのｐＨと伝導率となるまでバッファで平衡化した。バッファの保存、及び種々の精製工程におけるカラム溶出液の貯留に使用した全ての容器はパイロジェンを含有しなかった。精製に使用した全てのバッファは、注射用蒸留水（ＷＦＩ）を用いて調製した。
【０２５３】
（Ｂｉｇ  Ｂｅａｄ  Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー）
２５ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）（バッファＡ）を用い、毎時７５ｃｍの一定流速、樹脂１Ｌあたり１０ｇ以下のＣｐｎ１０のローディング速度で、予め平衡化したＢＢＳＰカチオン交換カラム（ＢＰＧ３００／５００、８．６ＬＢＢＳＰ  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ、ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に２０〜４０分間かけて可溶化液を添加した。バッファＡで洗浄した後、捕捉されたＣｐｎ１０を１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファＡを用いて溶出し、１Ｌの画分を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＢＢＳＰプールが９５％超の純度であることを示した。
【０２５４】
（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー）
ＢＢＳＰ溶出液を、室温にて１５倍容のバッファＡで２回バッファ交換して脱塩した。第１の透析工程を２〜３時間実施した後、新たなバッファＡのタンクに移し、一晩透析を行った。透析バッグからタンクバッファへのＮａＣｌの再分配は、較正済のスタンダードに対する透析液の導電率を測定することによってモニターした（Ｃｙｂｅｒｓｃａｎ  １００、Ｅｕｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、シンガポール）。透析したＢＢＳＰプールは、毎時７５ｃｍの線流速、１Ｌの樹脂あたり１５ｇ以下のＣｐｎ１０の負荷割合で、バッファＡの中で予め平衡化した４．７ＬのＱＦＦアニオン交換樹脂（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＢＰＧ  ２００／５００カラムに添加した。Ｃｐｎ１０を含有するＱＦＦアニオン交換のフロースルー画分を回収した。ローディング条件下では、大腸菌細胞タンパク質、核酸、及びエンドトキシンの大部分はマトリクスに依然結合していた。
【０２５５】
（Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能クロマトグラフィー）
ＱＦＦフロースルーを、１．６７ＬのＳＰＨＰ樹脂（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＢＰＧ１００／５００カラム（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）（バッファＢ）で予め平衡化）を用い、樹脂１Ｌあたり１５〜２０ｇのＣｐｎ１０を添加した。結合したＣｐｎ１０を、１５Ｌの０〜１２０ｍＭのＮａＣｌ（直線勾配）で溶出し、０．５Ｌの画分を回収した。この画分を、限外濾過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＨＰＬＣ、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従ってプールした。Ｃｐｎ１０タンパク質とＮａＣｌイオンの濃度を、それぞれ、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度とイオン選択電極法（ＩＤＥＸＸ、オーストラリア）によって測定した。
【０２５６】
（調製）
プールしたＳＰＨＰ画分の伝導率測定とＮａ＋及びＣｌ−イオン測定の組み合わせに基づいて、バッファを１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）となるように最終調整した。調製したＣｐｎ１０を、無菌条件下で０．２μｍのフィルタを通して濾過した。濾過した溶液を、パイロジェンを含まない５００ｍｌプラスチックボトル中に、各ボトルあたり５００ｍｌずつ、合計２．５ｇのＣｐｎ１０となるように分配した。
【０２５７】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
大腸菌細胞の可溶化液とクロマトグラフィーの画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を、メーカーの手順書に従いＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州）を用いて行った。ゲルをクーマシーブリリアントブルー染色し、各ゲル中にＣｐｎ１０タンパク質と分子量マーカーが含まれるようにした。
【０２５８】
（分光測定による精製Ｃｐｎ１０の定量化）
精製Ｃｐｎ１０の濃度を、０．３５３ｍｇ−１ｍＬ−１ｃｍ−１の吸光係数を用い、２８０ｎｍにおいてＵＶ吸光度（ＢｉｏＲａｄ  ＳｍａｒｔＳｐｅｃ−３０００分光光度計）により測定した。ＢｉｏＲａｄ  ＳｍａｒｔＳｐｅｃ−３０００は通常、ウシ血清アルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ）に基づいた場合に０．５９のＡ２８０ｎｍ値を示すが、文献値は０．６７である（Ｐｉｅｒｃｅ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｎｏ．ＴＲ０００６．０）ことに留意すべきである。
【０２５９】
表８に、上記精製プロセス全体を通じてのＣｐｎ１０純度及び収率を示す。（Ａ）において、全体のタンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ）によって測定し、Ｃｐｎ１０純度は、各精製工程後の細胞可溶化液とＣｐｎ１０含有画分の濃度測定によって測定した。（Ｂ）３つのＣｐｎ１０精製からの最終的な純度及び収率の比較を示す。各精製物は、大腸菌バッチ培養液１００Ｌから調製した。全ての調製物をクーマシー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果、９９％超の最終的なＣｐｎ１０純度であった。エンドトキシン単位（ＥＵ）は、１ｍｇのＣｐｎ１０あたりのＥＵとして表し、ＤＮＡ濃度は１ｍｇのＣｐｎ１０あたりのｐｇとして表す。
【０２６０】
【表８】
2009505667.tif 000009
【０２６１】
【表９】
2009505667.tif 000010
【０２６２】
（実施例１８：組成物）
本発明に係る分子及び薬剤、並びに本発明の方法により同定される物質を用いて、種々の疾病の状態及び症状の治療又は予防を行ってもよい。かかる分子及び薬剤は、単独で投与してもよいが、典型的にはそれらは医薬組成物として投与する。
【０２６３】
本願明細書に記載の本発明を実施する最良の態様に従い具体的な好ましい組成物を以下に記載する。以下は、組成物の単なる説明に役立つ例示的多様であると解釈すべきであって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０２６４】
（実施例１８（ａ）：非経口投与用の組成物）
無菌緩衝水１ｍＬ及び適切な薬剤又は分子１ｍｇを含む態様で筋肉内注射用の組成物を調製した。
【０２６５】
同様に、点滴用の組成物の場合は、無菌リンガー溶液２５０ｍｌ及び適切な薬剤又は分子５ｍｇを含有してもよい。
【０２６６】
（実施例１８（ｂ）：注射可能な非経口組成物）
１０体積％のポリエチレングリコール及び水に、１重量％の適切な薬剤又は分子を混合することにより、注射投与に適する組成物を調製した。この溶液は、濾過滅菌することができる。
【０２６７】
（実施例１８（ｃ）：カプセル組成物）
カプセル形態に適切な薬剤又は分子の組成物を、標準的な２片の硬ゼラチンカプセル内に、粉末の形態の薬剤又は分子５０ｍｇ、ラクトース１００ｍｇ、タルク３５ｍｇ、及びステアリン酸マグネシウム１０ｍｇを充填して調製した。
【０２６８】
（実施例１８（ｄ）：点眼用組成物）
点眼薬として輸送される典型的な組成物を下記に概説する。
適切な薬剤又は組成物        ０．３ｇ
ヒドロキシ安息香酸メチル    ０．００５ｇ
ヒドロキシ安息香酸プロピル  ０．０６ｇ
純水                        約１００．００ｍｌまで
【０２６９】
ヒドロキシ安息香酸メチル及びヒドロキシ安息香酸プロピルを７５℃で７０ｍｌの純水に溶解し、得られた溶液を冷却した。次いで、適切な薬剤又は分子を添加し、膜フィルター（０．２２μｍの気孔サイズ）で濾過して溶液を滅菌し、無菌容器中に無菌でパックした。
【０２７０】
（実施例１８（ｅ）：吸入投与用の組成物）
容積２０〜３０ｍｌのエアロゾル容器に、適切な薬剤又は化合物１０ｍｇ及びポリソルベート８５又はオレイン酸等、０．５〜０．８重量％の潤滑剤との混合物を、フレオン等の噴霧剤中に分散させ、鼻腔内又は経口吸入のいずれかの投与に適切なエアロゾル容器に注入した。
【０２７１】
（実施例１８（ｆ）：軟膏組成物）
軟膏として輸送するための典型的な組成物を、適切な薬剤又は分子１．０ｇを白色軟パラフィン１００．０ｇ中に添加して調製し、分散され、滑らかで、かつ均一な生成物を得た。
【０２７２】
（実施例１８（ｇ）：局所用クリーム組成物）
局所用クリームとしての輸送用の典型的な組成物を以下に概説する。
適切な薬剤又は分子              １．０ｇ
Ｐｏｌａｗａｘ  ＧＰ  ２００    ２５．０ｇ
無水ラノリン                    ３．０ｇ
白ロウ                          ４．５ｇ
ヒドロキシ安息香酸メチル        ０．１ｇ
脱イオン水又は無菌水を添加して  １００．０ｇ
【０２７３】
ポーラワックス、ビーズワックス、及びラノリンを共に６０℃に加熱し、ヒドロキシ安息香酸メチルの溶液を添加し、高速で撹拌してホモジナイズした。次いで温度を５０℃まで低下させた。次いで薬剤又は分子を添加して全体的に分散させ、遅い速度で撹拌しながら組成物を冷却した。
【０２７４】
（実施例１８（ｈ）：局所用ローション組成物）
局所ローションとしての輸送用の典型的な組成物を以下に概説する。
適切な薬剤又は分子        １．２ｇ
ソルビタンモノラウレート  ０．８ｇ
ポリソルベート２０        ０．７ｇ
セトステアリルアルコール  １．５ｇ
グリセリン                ７．０ｇ
ヒドロキシ安息香酸メチル  ０．４ｇ
無菌水を添加して          約１００．００ｍｌ
【０２７５】
ヒドロキシ安息香酸メチル及びグリセリンを、７５℃の７０ｍｌの水に溶解させた。ソルビタンモノラウレート、ポリソルベート２０、及びセトステアリルアルコールを共に７５℃で溶解し、水溶液に添加した。得られたエマルジョンをホモジナイズし、連続的に撹拌しながら冷却し、残りの水の中に薬剤と分子を添加し、懸濁液とした。全ての懸濁液を撹拌してホモジナイズした。
【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】Ａ．逆平行β−バレル、「ルーフ」β−ヘアピンループ、及び可動ループ領域を示す大腸菌Ｃｐｎ１０（ＧｒｏＥＳ）の結晶構造。Ｃｐｎ１０は、７つの同じ１０ｋＤａサブユニットからなる。Ｂ．野生型ヒトＣｐｎ１０モノマーのアミノ酸配列。予測された１８アミノ酸の可動ループを太字イタリックで示す。予測された１４アミノ酸のルーフβ−ヘアピンを太字アンダーラインで示す。
【図２】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０及び大腸菌ＧｒｏＥＳの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００１）によるＬＰＳ−誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性の阻害（ＮＦｋＢ活性の間接的な測定）。大腸菌ＧｒｏＥＳではかかる阻害が見られなかった。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生されたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは４つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＲＬＵ＝相対光単位。ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。ゲルＡからＯまで（Ｈを除く）についてのレーン構成：レーン１は分子量マーカー（ｋＤａ）；レーン２−６はそれぞれ６０μｇ、６μｇ、３μｇ、１．２μｇ、及び０．３μｇのＣｐｎ１０。Ａ．精製Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（ＣＨ００１）をクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｂ．精製Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（ＣＨ００３）をクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｃ．精製Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓをクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｄ．精製Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓをクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｅ．精製Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＦＩをクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｆ．精製Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＩＩをクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｇ．精製Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌをクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｈ．Ｃｐｎ１０−Δｍｌ（レーン２）の部分的グルタルアルデヒド架橋により、銀染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に７つの明確なバンドが示され、分子が７量体であることを示す。レーン１は分子量マーカー（ｋＤａ）。Ｉ．精製Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆのクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｊ．精製Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレルのクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｋ．精製大腸菌ＧｒｏＥＳのクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｌ．精製Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳのクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｍ．精製大腸菌ＧｒｏＥＳのクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｎ．精製Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０のクーマシーブリリアントブルー染色した４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。
【図４−１】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＩＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＦＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓ、及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００１）、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０のＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓ）、及び多くの可動ループ変異体によるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈは、パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生されたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは４つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＲＬＵ＝相対光単位ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図４−２】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＩＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＦＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓ、及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００１）、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０のＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓ）、及び多くの可動ループ変異体によるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈは、パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生されたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは４つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＲＬＵ＝相対光単位ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図４−３】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＩＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＦＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓ、及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００１）、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０のＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓ）、及び多くの可動ループ変異体によるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈは、パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生されたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは４つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＲＬＵ＝相対光単位ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図４−４】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＩＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＩＦＩ、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ＥＥＥ−ｃＨｉｓ、及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００１）、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０のＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ｃＨｉｓ）、及び多くの可動ループ変異体によるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈは、パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生されたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは４つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＲＬＵ＝相対光単位ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図５】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０Δｍｌの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００１）及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ΔｍｌによるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生させたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは４つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＲＬＵ＝相対光単位。ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図６】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０とＡｌａ−Ｃｐｎ１０Δｒｏｏｆと大腸菌ＧｒｏＥＳの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００１）及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ΔｒｏｏｆによるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生させたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは６つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＣＰＳ＝毎秒の相対カウント。ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図７】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレルの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００１）及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレルによるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生させたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは６つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＣＰＳ＝毎秒の相対カウント。ＮＦｋＢ活性は、５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図８】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０及びＣｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳの効果。ヒト野生型Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００１）によるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。Ｃｐｎ１０−ＮｔｅｒｍＥＳではかかる阻害が見られなかった。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生させたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは６つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＣＰＳ＝毎秒の相対カウント。ＳＤ＝標準偏差。ＮＦｋＢ活性は６ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図９】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０とＸ−Ｃｐｎ１０の効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００３）及びＸ−Ｃｐｎ１０によるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生させたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは６つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＣＰＳ＝毎秒の相対的カウント。ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図１０】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０及びＧｌｙ−Ｃｐｎ１０の効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００３）及びＧｌｙ−Ｃｐｎ１０によるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生させたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは６つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＣＰＳ＝毎秒の相対カウント。ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図１１】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｍｌの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００３）及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ΔｍｌによるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生させたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の抑制率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは６つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＣＰＳ＝毎秒の相対カウント。ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌの超高純度リポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図１２】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０とＡｌａ−Ｃｐｎ１０−Δｒｏｏｆの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００３）及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ΔｒｏｏｆによるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生させたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の抑制率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは６つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＣＰＳ＝毎秒の相対カウント。ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌの超高純度リポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図１３】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレルの効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００３）及びＡｌａ−Ｃｐｎ１０−β−バレルによるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで生成したルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは６つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＣＰＳ＝毎秒の相対カウントＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌの超高純度リポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図１４】ＴＬＲ４シグナリングに及ぼすＡｌａ−Ｃｐｎ１０及びＧｌｙ−Ｃｐｎ１０の効果。ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０（バッチＣＨ００３）及びＧｌｙ−Ｃｐｎ１０によるＬＰＳ誘発ＨＩＶ−ＬＴＲ活性の用量応答性阻害。パネルＢは、パネルＡの結果から算出した、ＬＰＳのみで産生させたルシフェラーゼのレベルに対するルシフェラーゼ活性（ＮＦｋＢ活性）の阻害率を示す。ＬＰＳのみのサンプルは６つの反復試験の平均であり、他のサンプルはいずれも２つの反復試験の平均である。ＣＰＳ＝毎秒の相対カウント。ＮＦｋＢ活性は５ｎｇ／ｍｌの超高純度リポ多糖（ＬＰＳ）で誘発した。
【図１５−１】内毒血症の炎症モデルマウスにおけるＣｐｎ１０活性。Ｃｐｎ１０及びＣｐｎ１０変異体は、ＬＰＳ誘発による血清中へのＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、及びＩＬ−６の産生を低下させた。「ＩＰＳ攻撃」（表１、グループ１、３、５、７、９、及び１１参照）又は「生理食塩水コントロール」（表１、グループ２、４、６、８、１０、及び１２参照）のマウスからの血清を、ＣＢＡ（「方法」を参照）を用いて炎症関連のサイトカインについて分析した。Ａ、Ｂ）ＴＮＦ−α、Ｃ、Ｄ）ＩＬ−６、及びＥ、Ｆ）ＩＬ−１０サイトカインのレベルを、表示した各グループの平均（水平バー）と共にプロットした。テューキーのｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験を用いた一方向ＡＮＯＶＡ分析を各々のデータセットに関して行った。このデータの統計的有意性を括弧内に示す（ｐ＜０．０５）（詳しくは本文を参照）。
【図１５−２】内毒血症の炎症モデルマウスにおけるＣｐｎ１０活性。Ｃｐｎ１０及びＣｐｎ１０変異体は、ＬＰＳ誘発による血清中へのＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、及びＩＬ−６の産生を低下させた。「ＩＰＳ攻撃」（表１、グループ１、３、５、７、９、及び１１参照）又は「生理食塩水コントロール」（表１、グループ２、４、６、８、１０、及び１２参照）のマウスからの血清を、ＣＢＡ（「方法」を参照）を用いて炎症関連のサイトカインについて分析した。Ａ、Ｂ）ＴＮＦ−α、Ｃ、Ｄ）ＩＬ−６、及びＥ、Ｆ）ＩＬ−１０サイトカインのレベルを、表示した各グループの平均（水平バー）と共にプロットした。テューキーのｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験を用いた一方向ＡＮＯＶＡ分析を各々のデータセットに関して行った。このデータの統計的有意性を括弧内に示す（ｐ＜０．０５）（詳しくは本文を参照）。
【図１５−３】内毒血症の炎症モデルマウスにおけるＣｐｎ１０活性。Ｃｐｎ１０及びＣｐｎ１０変異体は、ＬＰＳ誘発による血清中へのＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、及びＩＬ−６の産生を低下させた。「ＩＰＳ攻撃」（表１、グループ１、３、５、７、９、及び１１参照）又は「生理食塩水コントロール」（表１、グループ２、４、６、８、１０、及び１２参照）のマウスからの血清を、ＣＢＡ（「方法」を参照）を用いて炎症関連のサイトカインについて分析した。Ａ、Ｂ）ＴＮＦ−α、Ｃ、Ｄ）ＩＬ−６、及びＥ、Ｆ）ＩＬ−１０サイトカインのレベルを、表示した各グループの平均（水平バー）と共にプロットした。テューキーのｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験を用いた一方向ＡＮＯＶＡ分析を各々のデータセットに関して行った。このデータの統計的有意性を括弧内に示す（ｐ＜０．０５）（詳しくは本文を参照）。
【図１６】アセチル−Ｃｐｎ１０、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０、及びＧｌｙ−Ｃｐｎ１０のＮ末端の図。
【図１】
2009505667.tif 000011
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月2日(2007.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節活性を有するが、タンパク折り畳み活性を欠いているか又は実質的に欠いている、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項２】
免疫調節活性を有するが、タンパク折り畳み活性を欠いているか又は実質的に欠いている単離されたシャペロニン１０ポリペプチドであって、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較して可動ループ領域に１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが少なくとも対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドのレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項２に記載の単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項４】
前記可動ループ領域が配列番号１２に示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項２又は請求項３に記載の単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項５】
前記可動ループ領域のＩＭＬトリペプチドの１つ以上の残基が荷電した残基で置換されている、請求項２から請求項４のいずれかに記載の単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＩＭＬトリペプチドがＥＥＥ、ＩＩＩ又はＩＦＩ残基をコード化するトリペプチドで置換され、対応するシャペロニン１０アミノ酸配列が配列番号３９、３７及び３５で示される、請求項５に記載の単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの可動ループ領域を実質的に欠き、免疫調節活性を有する、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項８】
前記可動ループ領域が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記シャペロニン１０ポリペプチドが、配列番号３又は２４で示されるアミノ酸配列を含んでなる可動ループ領域を実質的に欠いている、請求項７又は請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記シャペロニン１０ポリペプチドが、配列番号４又は５又は２５で示されるヌクレオチド配列でコードされる可動ループ領域を実質的に欠損している、請求項７又は請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記シャペロニン１０ポリペプチドが、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項７から請求項１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
免疫調節活性を有する単離されたシャペロニン１０ポリペプチドであって、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較してルーフβ−ヘアピン領域に１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ルーフβ−ヘアピン領域が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１２又は請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドのルーフβ−ヘアピン領域を実質的に欠き、免疫調節活性を有する、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ルーフβ−ヘアピン領域が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記シャペロニン１０ポリペプチドが、配列番号６又は２６で示されるアミノ酸配列を含んでなるルーフβ−ヘアピン領域を実質的に欠いている、請求項１５又は請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記シャペロニン１０ポリペプチドが、核酸配列番号７又は８又は２７で示されるヌクレオチド配列でコードされるルーフβ−ヘアピン領域を実質的に欠いている、請求項１５又は請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記シャペロニン１０ポリペプチドが少なくとも対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと同等の免疫調節活性を示す、請求項１５から請求項１８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
単離されたシャペロニン１０ポリペプチドであって、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較してルーフβ−ヘアピン領域に又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでなる、免疫調節活性を有する、ポリペプチド。
【請求項２１】
単離されたシャペロニン１０ポリペプチドであって、対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較して、可動ループ領域及びルーフβ−ヘアピン領域を両方とも実質的に欠いている、ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号９又は２８で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１０又は２９で示されるヌクレオチド配列でコードされる、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと少なくとも同等の免疫調節活性を示す、請求項２１又は請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドのＮ末端が実質的にバックテリアのシャペロニン１０Ｎ末端で置換される、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号１４で示されるアミノ酸を含んでなる、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号４３で示されるヌクレオチド配列でコードされる、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと比較して減少したレベルの免疫調節活性を示す、請求項２５又は請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドと比較して、グリシン残基が前記ポリペプチドの追加的なＮ末端アラニン残基を置換する、単離されたシャペロニン１０ポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号３１で示されるヌクレオチド配列でコードされる、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
対応する野生型シャペロニン１０ポリペプチドの免疫調節活性のレベルと少なくとも同等の免疫調節活性を示す、請求項２９又は請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１から請求項３２のいずれか１項記載のシャペロニン１０ポリペプチドをコード化する、単離された核酸。
【請求項３４】
適宜、１つ以上の調節配列に制御可能に連結させた請求項３３に係る核酸を含んでなる発現コンストラクト。
【請求項３５】
請求項１から請求項３２のいずれか１項記載のポリペプチドを発現するか、又は請求項３７の核酸又は請求項３４の発現コンストラクトを含んでなる宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１から請求項３２のいずれかのポリペプチドと選択的に結合する抗体。
【請求項３７】
請求項１から請求項３２のいずれかのポリペプチド、請求項３３の核酸、請求項３４の発現コンストラクト又は請求項３６の抗体を含んでなる、医薬組成物。
【請求項３８】
１つ以上の追加的な薬剤を含んでなる、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１から請求項３２のいずれかのシャペロニン１０ポリペプチド又は請求項３９の核酸を有効量で被検者に投与するステップを含んでなる、被検者の治療方法。
【請求項４０】
前記治療により前記被検者の免疫応答が調節される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記免疫応答がＴｏｌｌ様受容体シグナル伝達の調節により調節される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、請求項１から請求項３２のいずれかのシャペロニン１０ポリペプチド又は請求項３３に記載の核酸の有効量を被検者に投与することを含んでなる、被検者の疾患又は症状の治療又は予防方法。
【請求項４３】
前記疾患、障害又は症状が、急性又は慢性炎症性疾患、喘息、アレルギー、多発性硬化症、ＧＶＨＤ、他の自己免疫疾患又は感染症から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記感染症が細菌又はウィルス性の感染症である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細菌感染症がグラム陰性細菌により生じる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
患者、又はその少なくとも１つの細胞、組織若しくは臓器内でＴＬＲ４シグナル伝達を調節する方法であって、請求項１から請求項３２のいずれかのシャペロニン１０ポリペプチド又は請求項３３に記載の核酸を有効量で被検者に投与することを含んでなる方法。
【請求項４７】
前記シャペロニン１０ポリペプチドはアゴニスト誘導ＴＬＲシグナル伝達を調節する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
患者、又はその少なくとも１つの細胞、組織若しくは臓器内で、１つ以上の免疫調節物質の生産及び／又は分泌を調節する方法であって、請求項１から請求項３２のいずれかのシャペロニン１０ポリペプチド又は請求項３３に記載の核酸を有効量で被検者に投与することを含んでなる方法。
【請求項４９】
前記ポリペプチドによりＴＬＲ４シグナル伝達が調節される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫調節物質が炎症誘発性サイトカイン又はケモカイン、若しくは抗炎症性サイトカイン又はケモカインである、請求項４８又は請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ケモカイン又はサイトカインがＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−β又は１型インターフェロンから選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１から請求項３２のいずれかのポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）候補化合物を前記ポリペプチドに接触させるステップ、及び
（ｂ）前記候補化合物及び前記ポリペプチドの複合体形成を試験するステップ、を含んでなる方法。
【請求項５３】
前記複合体形成を試験するステップが、競合結合試験又はツーハイブリッド試験である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１から請求項３２のいずれかのポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記候補化合物の前記ポリペプチドに対する好適な相互作用を可能にする条件下において、前記ポリペプチドを候補化合物に接触させるステップ、及び
（ｂ）前記ポリペプチドの活性を試験するステップ、を含んでなる方法。
【請求項５５】
前記ポリペプチドの活性を試験するステップが、標識した基質を添加するステップと前記標識した基質の変化を測定するステップを含んでなる、請求項５４に記載の方法。
【国際調査報告】
2009505667.tif 000034
2009505667.tif 000035
2009505667.tif 000036