(57)【要約】  本発明は、動物罹患性病原体の混入のおそれがなく、大量生産が可能で、環境や人体に有害な有機溶媒の使用を必須としない、天然原料からのシアル酸含有化合物の抽出方法を提供することを目的とする。  本発明は、植物体もしくは植物体の加工品、特には穀類又は豆類の種子もしくはその加工品を、水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水を用いて水溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から、セロトニンアフィニティー担体を充填したカラムにより分離し回収する、水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体もしくは植物体の加工品を、水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水を用いて水溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から、セロトニンアフィニティー担体を充填したカラムにより分離し回収する、水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法。
【請求項２】
前記水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水を用いて水溶性成分を粗抽出する工程において、超音波処理を行うことを特徴とする請求項１に記載の水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法。
【請求項３】
前記水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水を用いて水溶性成分を粗抽出する工程の後、エタノールを注加し、夾雑物を沈殿除去することを特徴とする、請求項１又は２に記載の水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法。
【請求項４】
前記植物体が、穀類又は豆類の種子である、請求項１〜３のいずれかに記載の水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法から得られる水溶性シアル酸含有化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物からの水溶性のシアル酸含有化合物の抽出方法に関し、詳しくは穀類または豆類の種子からの水溶性のシアル酸含有化合物の抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸は、アミノ糖であるノイラミン酸のアシル誘導体の総称であり、２０種類以上の誘導体が存在するが、天然には、Ｎ-アセチルノイラミン酸およびＮ-グリコリルノイラミン酸として最も多量に存在しシアル酸含有スフィンゴ糖脂質である「ガングリオシド」やシアル酸含有糖鎖である「ポリシアル酸糖鎖」として、動物の脳、牛乳、鶏卵卵黄などに存在する。
ガングリオシドは、シアル酸を非還元末端側に有する糖脂質の総称であり、シアル酸の数と結合部位によって複数の種類がある。ポリシアル酸とは、シアル酸が数十個以上結合した糖鎖である。ポリシアル酸は、神経細胞の移動や神経突起の伸長、シナプス形成の場で機能している巨大な神経特異的糖蛋白質である神経接着因子（ＮＣＡＭ）の糖鎖部分を構成している。【０００３】
シアル酸を分子構造中に含む化合物は、１）レゾルシノール−塩酸試薬を反応させる事により赤紫色ないし青紫色に発色する（例えば、非特許文献１参照）、２）セロトニンアフィニティーカラムに親和性を有する（例えば、非特許文献２参照）、といった性質を持つ。逆に、これらの性質を示す物質はシアル酸を分子構造中に有する化合物である。【０００４】
シアル酸含有化合物は、脳を構成する神経の分化、成長、維持に必須の物質であり、経口摂取により学習能力向上作用も認められている、高い機能性を有する物質である（例えば、非特許文献３参照）。さらに、シアル酸含有化合物は、免疫活性化作用、抗癌作用を有することも知られている。従って、今後、シアル酸含有化合物は、高齢化社会の到来とともに、さらに増大する脳関連疾患や悪性腫瘍性疾患の治療に幅広く利用されることが予想される。【０００５】
これまでシアル酸含有化合物は主として牛脳や牛乳から調製されてきたが、牛海綿脳症（ＢＳＥ）問題の発生により牛脳や牛乳からの調製が困難となっている。また、鶏卵もシアル酸含有化合物の供給源であるが、鳥インフルエンザ問題の発生により鶏卵からのシアル酸含有化合物の製造もその安全性が疑問視されている。即ち、鳥インフルエンザウイルスは鶏卵には感染しないとされているが、消費者の安心を得ているとは言い難い。
なお、シアル酸含有化合物を人工的に化学合成することも行われているが、現時点ではその手法では収率やコストの面において実用可能なレベルに達しておらず、大量生産するには至っていない。
このような現状から、ウイルスやプリオンなどの動物罹患性病原体の混入の心配のない、新たな天然素材由来のシアル酸含有化合物の供給源が望まれている。
また、従来の天然物由来のシアル酸含有化合物の抽出方法においては、クロロホルム−メタノール混合溶媒、もしくは熱メタノールなどを用いて抽出されており（シアル酸含有化合物の化学合成法においても、クロロホルムをはじめとする様々な有機溶媒が使用されており）、環境問題及び人体への影響の観点から、有害な有機溶媒の使用を抑制しようとの動きもあり、これらに配慮したシアル酸含有化合物の抽出方法の開発が望まれている。【０００６】
これまで、植物にシアル酸が存在することを示唆する報告は、Sharらの論文（非特許文献４，５参照）及びRichard Bourbouzeらの論文（非特許文献６参照）にのみ記載されている。
しかしながら、Sharらの論文には、シロイヌナズナにシアル酸の存在を示唆する間接的な証拠の記載があるのみで、シアル酸含有化合物特有の性質の有無を直接調べた実験は行われておらず、さらに具体的な抽出方法も開示されていない。
また、Richard Bourbouzeらの論文には、コンカナバリンＡカラム（シアル酸との親和性を示す性質を有するが、α−Ｄ−マンノースやα−Ｄ−グルコースにより強く親和性を示す）と親和性を有する糖鎖が抽出できたことを示すのみで、該糖鎖中におけるシアル酸含有化合物の存在を直接調べた実験は行われていない。さらに、Richard Bourbouzeらの論文には、ソバから塩溶液可溶性の糖蛋白質を、緩衝液を用いて抽出した後、糖蛋白質を加水分解により切り出し、回収する方法を示すのみで、大量抽出が可能な方法は開示されていない。【０００７】
なお、特許文献１には、植物を含む生体由来原料からのガングリオシドを含む糖脂質を抽出できる旨が並列的に記載されているが、詳しくはマウスの脳からの抽出方法しか開示されておらず、植物を材料としたガングリオシドを含む糖脂質の具体的な抽出方法は記載されていない。また、クロロホルムを用いるため好ましくない。【０００８】
【非特許文献１】新生化学実験講座４  脂質III  糖脂質, (1990) p149
【非特許文献２】Carbohydrate Research, 103 (1982) p213-219
【非特許文献３】ガングリオシド研究法I, (1995), p7-25
【非特許文献４】Nature Biotechnology, 21 (2003) p1470-1471
【非特許文献５】Nature Biotechnology, 22 (2004) p1351-1352
【非特許文献６】Carbohydrate Research, 106, (1982) p21-30
【特許文献１】特開２００３−１２９０８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、動物罹患性病原体の混入の恐れがなく、大量生産が可能で、環境や人体に有害な有機溶媒の使用を必須としない、天然原料からのシアル酸含有化合物の抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記従来の課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、植物体、特に穀類及び豆類の種子、に水溶性のシアル酸化合物が存在することを見出し、前記植物体を、水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水を用いて水溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から、セロトニンアフィニティー担体を充填したカラムにより分離し回収することで、動物罹患性病原体の混入の恐れがない水溶性シアル酸含有化合物を抽出できることを見出した。
本発明は、係る知見に基づいて完成されたものである。【００１１】
即ち、請求項１に係る本発明は、植物体もしくは植物体の加工品を、水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水を用いて水溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から、セロトニンアフィニティー担体を充填したカラムにより分離し回収する、水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法を提供するものである。
請求項２に係る本発明は、前記水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水を用いて水溶性成分を粗抽出する工程において、超音波処理を行うことを特徴とする請求項１に記載の水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法を提供するものである。
請求項３に係る本発明は、前記水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水を用いて水溶性成分を粗抽出する工程の後、エタノールを注加し、夾雑物を沈殿除去することを特徴とする、請求項１又は２に記載の水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法を提供するものである。
請求項４に係る本発明は、前記植物体が、穀類又は豆類の種子である、請求項１〜３のいずれかに記載の水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法を提供するものである。
請求項５に係る本発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の方法から得られる水溶性シアル酸含有化合物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、動物罹患性病原体の混入の恐れがなく、有害な有機溶媒の使用を必須とせず、且つ大量生産が可能な、水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法が提供できる。
本発明によれば、摂取する上で安全な植物由来の水溶性シアル酸含有化合物が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】試験例１〜３において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、大豆種子全粒の粉、小麦粉、玄米全粒の粉、又は玄米糊粉層部分の粉、からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図２】試験例４において、抽出溶媒としてエチレングリコールを用いて抽出した、玄米糊粉層部分の粉又は米胚芽からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図３】図３の（ａ）は、試験例５において、抽出溶媒としてエチレングリコールもしくは水を用いて抽出した、玄米糊粉層部分の粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、ヨウ素蒸気雰囲気下で全有機化合物の存在を検出した図であり、図３の（ｂ）は、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図４】試験例６において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、玄米糊粉層部分の粉もしくは白米表層部分の粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図５】試験例７において、抽出溶媒として水、塩酸を含有する水もしくはエチレングリコールを用いて抽出した、小豆種子の粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図６】試験例８〜１０において、玄米最外層部分、玄米糊粉層部分、白米表層部分、黒大豆種子の子葉又はトウモロコシの粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図７】試験例１１において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、米胚芽又は玄米糊粉層部分の粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図８】実施例１において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、玄米糊粉層部分の粉からの粗抽出液を、セロトニンアフィニティー担体を用いたカラムクロマトグラフィーにより分画した図である。
【図９】実施例２において、抽出溶媒として水を用いて、米胚芽からの粗抽出液を、セロトニンアフィニティー担体を用いたカラムクロマトグラフィーにより分画した図である。
【図１０】実施例３において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、白米表層部分の粉からの粗抽出液を、セロトニンアフィニティー担体を用いたカラムクロマトグラフィーにより分画した図である。
【図１１】実施例３において、セロトニンアフィニティー担体を充填したカラムにより分画した画分を、薄層クロマトグラフィーで分離し、ヨウ素蒸気雰囲気下で全有機化合物の存在を検出した図（ａ）、および、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した結果を示した図（ｂ）である。
【図１２】試験例１２において、抽出溶媒としてエチレングリコールを用いて抽出した、胚芽からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レクチン結合反応によりシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図１３】試験例１３において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、玄米最外層部分を削り取った胚芽と糊粉層の残った米を炊飯したものからの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図１４】試験例１４において、抽出溶媒としてグリセロールを用いて抽出した、小麦全粒粉または大麦全粒粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図１５】試験例１５において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、小麦全粒粉、大麦全粒粉、小麦フスマ、大麦フスマ、米胚芽からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図１６】試験例１６において、抽出溶媒として水、もしくは１１．８３％酢酸、もしくは７．０６％塩酸を用いて抽出した、小麦小ブスマの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図１７】試験例１７において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、小麦小ブスマの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理で水溶性シアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【図１８】試験例１８において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、米糠、小麦フスマ、大麦フスマからの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レクチン結合反応によりシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、植物体もしくは植物体の加工品を、水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水を用いて水溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から、セロトニンアフィニティー担体を充填したカラムにより分離し回収する、水溶性シアル酸含有化合物の抽出方法である。【００１５】
本発明における「シアル酸含有化合物」とは、シアル酸を分子構造中に有する化合物を指す。シアル酸は、アミノ糖であるノイラミン酸のアシル誘導体の総称であり、２０種類以上の誘導体が存在するが、天然には、Ｎ-アセチルノイラミン酸およびＮ-グリコリルノイラミン酸として最も多量に存在する。下記の化学式（１）のＮ-アセチルノイラミン酸の構造が示すように、シアル酸は９個の炭素からなる骨格を有する九炭糖であり、官能基としてカルボキシル基やＮ-アシル基を有するという特徴がある。
なお、１９８６年に、５位のアミノアシル基が水酸基で置換された２−ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−ｎｏｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＫＤＮ）が発見されたため、現在ではシアル酸の定義として、９炭糖骨格のαケト酸を持つ糖（２−ケト−３−デオキシノノン酸）が採用されている。【００１６】
【化１】
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【００１７】
シアル酸含有化合物に該当する分子種としては、シアル酸含有糖鎖であるポリシアル酸糖鎖、前記糖鎖を含有するシアル酸含有糖タンパク質であるフェチュイン、α１−酸性糖蛋白質及びムチン、シアル酸含有スフィンゴ糖脂質であるガングリオシドなどが挙げられる。
ガングリオシドは、シアル酸を非還元末端側に有する糖脂質の総称であり、シアル酸の数と結合部位によって複数の種類がある。ポリシアル酸とは、シアル酸が数十個以上結合した糖鎖である。特にポリシアル酸は、神経細胞の移動や神経突起の伸長、シナプス形成の場で機能している巨大な神経特異的糖蛋白質である神経接着因子（ＮＣＡＭ）の糖鎖部分を構成している。
また、シアル酸は陰性荷電を有し、細胞接着、細胞分化などに関与し、特に神経細胞の分化、成長、維持に必須の物質である。
なお、本発明においては、シアル酸含有化合物とは、シアル酸単体も含む概念である。【００１８】
本発明におけるシアル酸含有化合物の抽出原料としては、植物体、すなわち植物の器官や組織であれば如何なるものでも用いることができるが、好ましくは、穀類又は豆類の種子を用いることが望ましい。
前記穀類又は豆類としては、稲（米）、小麦、大豆、小豆、トウモロコシ、大麦などを用いることが望ましい。
穀類又は豆類の種子に由来する組織であれば、胚、胚芽、胚乳、種皮、糠、糊粉層、澱粉貯蔵部、子葉などいかなる組織や部分でも用いることができる。また、種子全体（全粒）を用いることもできる。【００１９】
また、本発明におけるシアル酸含有化合物の抽出原料としては、前記植物体の加工品を用いることができる。具体的には、小麦粉、米粉、炊飯米、大豆粉、トウモロコシ粉、大麦粉、小豆粉、ココナッツパウダー、さらには、廃棄対象となる、米糠、小麦フスマ（小麦糠）、大麦フスマ、くず大豆、規格外小豆、トウモロコシから澱粉を抽出した残り粕（トウモロコシ胚芽など）、サトウキビ絞りかす、焼酎絞りかす等を挙げることができる。
これらのうち、特に、穀類又は豆類の加工品である、小麦粉、米粉、炊飯米、大豆粉、トウモロコシ粉、大麦粉、小豆粉、米糠、小麦フスマ、大麦フスマ、を好適に用いることができる。【００２０】
本発明の水溶性シアル酸含有化合物の抽出は、次の方法により行うことができる。
原料の植物体は、器官や組織の部位によってはそのまま水溶性成分の粗抽出に用いることができるが、粗抽出処理に用いることができる大きさに細断もしくは破砕した後、好ましくは、抽出効率の向上の点から原料の植物体を「粉砕もしくは粉状化」した後、水溶性成分の粗抽出に用いることが望ましい。
植物体原料の粉砕もしくは粉状化は、公知技術のどのような方法で行うことができるが、特に穀類を材料に用いる場合は、粉砕機（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ，ＭＲＫ−ＲＥＴＳＣＨ製、又はＣｙｃｌｏｎｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｍｉｌｌ、ＵＤＹ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）、ブラシ式精米機（ＨＲＧ−１２２、みのる産業製）あるいは研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）を用いて粉状化することができる。また、豆類を材料に用いる場合は、粉砕機（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ，ＭＲＫ−ＲＥＴＳＣＨ製）を用いることができる。
なお、精米過程で脱落する米胚芽や小麦粉、米粉、大豆粉、トウモロコシ粉、大麦粉、ココナッツパウダーのような粉状の加工品は、粉砕もしくは粉状化せずに、そのまま水溶性成分の粗抽出に用いることができる。【００２１】
まず、本発明の原材料として用いる植物体もしくはその加工品を、「水」、「ポリオール」、もしくは「酸，アルカリ又はポリオールを含む水」に浸漬し混合することで、水溶性成分の粗抽出を行う。
前記植物体もしくはその加工品１質量部に対して、１〜１０質量部、好ましくは３〜５質量部の水を注水し、よく混合することで、水溶性成分の粗抽出を行う。
本発明の抽出溶媒として用いる水としては、水道水、蒸留水、脱イオン水など如何なる水を用いることもできるが、前記したように、酸、アルカリ又はポリオールを含有する水を用いることもできる。
また、本発明の抽出溶媒として用いるポリオールとしては、「１００％のポリオール溶媒」として用いることができるものであれば、如何なるポリオールでも用いることができるが、好ましくはエチレングリコール、グリセロールを好適に用いることができる。【００２２】
本発明において、シアル酸含有化合物は、水溶性の性質を有するものであれば、如何なる分子種のものでも抽出することが可能である。また、水溶性の性質が弱いものやｐＨ変化で溶解性が変化するものであっても、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオール存在下の水を用いることで、溶解性が向上し抽出できるものもある。
なお、酸またはアルカリを含む水を用いた場合、特に２５〜４０℃の温度範囲での長時間の浸漬中の雑菌繁殖を抑制できる効果があり好ましい。また、ポリオール、もしくはポリオールを含む水を用いた場合、夾雑物を減少できる効果があり好ましい。【００２３】
本発明における抽出溶媒の水に含有できる酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸などを挙げることができ、好ましくは、塩酸、酢酸を好適に用いることができる。
本発明における抽出溶媒の水に含有できるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニアなどを挙げることができ、好ましくは、水酸化マグネシウム、アンモニアを好適に用いることができる。
本発明における抽出溶媒の水に含有できるポリオールとしては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール（グリセリン）、ポリグリセリン、ソルビトール、グルコース、ショ糖、トレハロース、キシリトールなどを挙げることができ、好ましくは、エチレングリコール、グリセロールを好適に用いることができる。【００２４】
本発明における「抽出溶媒の水に含有できる酸，アルカリ又はポリオール」の濃度は、用いる物質によって様々であるが、例えば、塩酸を用いた場合では、０．５〜１２％（ｖ／ｖ）、好ましくは１％（ｖ／ｖ）〜７％（ｖ／ｖ）程度（０．２８Ｎ〜２Ｎ程度）を含有させることが望ましい。酢酸を用いた場合では、０．５〜１２％（ｖ／ｖ）、好ましくは１．７％（ｖ／ｖ）〜１２％（ｖ／ｖ）程度（０．２８Ｎ〜２Ｎ程度）を含有させることが望ましい。
また、エチレングリコールを用いる場合では、２０％（ｖ／ｖ）以上〜１００％（ｖ／ｖ）未満、好ましくは５０％（ｖ／ｖ）以上〜１００％（ｖ／ｖ）未満を水に含有させることが望ましい。【００２５】
前記「水」、「ポリオール」もしくは「酸，アルカリ又はポリオールを含む水」に浸漬し混合された、植物体もしくはその加工品は、超音波処理を１〜３０分間、好ましくは１〜２分間施すことで、さらに微細な状態に破砕することができ、水溶性シアル酸含有化合物の溶出効率を向上することができる。
本発明における超音波処理としては、従来の行われている如何なる方法でも行うことができるが、例えば、Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ（ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用いることができる。【００２６】
その後、前記水、ポリオール、もしくは酸，アルカリ又はポリオールを含む水に浸漬し混合された、植物体もしくはその加工品は、１〜８０℃、好ましくは５〜４０℃、さらに好ましくは５〜１０℃の温度で、１分〜２４時間、好ましくは５分〜１２時間、静置もしくは振盪することで、水溶性シアル酸含有化合物の溶出効率を向上することができる。
なお、シアル酸化合物の酵素代謝による変化を防ぎたい場合は、５〜１０℃の温度で、もしくは５分〜１２時間（特には５分〜４時間）、静置もしくは振盪することが望ましい。
また、逆に、シアル酸含有化合物を低分子化、断片化させて（易溶性を向上させて）溶出効率を向上させるためには、室温（例えば２５℃程度）で４時間以上、好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上、静置もしくは振盪することで、原料である植物体に含まれる内在性酵素を働かせることが望ましい。
また、（特に、内在性酵素が失活した植物加工品を原料に用いる場合には）、濃度の高い酸（例えば、２Ｎ程度塩酸や酢酸）を含む水において、４０〜８０℃程度、好ましくは８０℃程度で、静置もしくは振盪することが望ましい。【００２７】
前記粗抽出工程の後、得られた水溶性シアル酸含有化合物を含有する粗抽出液は、残渣である沈殿と分離し回収する。固液分離の方法は、従来の如何なる方法でも行うことができ、ろ紙、布、ガーゼなどでろ過することで残渣を分離し、ろ液を回収することもできるが、遠心分離によって行うことが好適である。
遠心分離で行う場合、具体的には、５００〜１８０００ｒｐｍで１０〜６０分間、好ましくは、３０００ｒｐｍで１０分間程度行うことで、該粗抽出液を植物体残渣から分離し回収することができる。【００２８】
前記工程で得られた、固液分離した水溶性シアル酸含有化合物を含有する粗抽出液は、次の工程である「クロマトグラフィー処理」を行うことができるが、その前に該粗抽出液に含まれる夾雑物を、エタノール沈殿処理により除去することが望ましい。なお、該エタノール沈殿処理で夾雑物を取り除くことにより、次の工程でカラムクロマトグラフィーを行う際のカラムの目詰まりを大幅に減少させることができる。
粗抽出液に注加するエタノールの添加量は、粗抽出液の０．５〜５倍量、好ましくは等倍量程度注加することが望ましい。なお、当該エタノール沈殿処理におけるエタノールの注加とは、前記粗抽出液にエタノールを加える操作を指すものであるが、先に取り分けたエタノールに前記粗抽出液を加える操作をも含むものである。
当該エタノール注加により、前記粗抽出液に含まれていたエタノール不溶成分、例えば、核酸、蛋白質、多糖類などの一部のものは、夾雑物として沈殿を形成する。【００２９】
エタノール注加後、直ちに固液分離操作を行ってもよいが、好ましくは５〜４０℃で５〜２４時間、さらに好ましくは５〜１０℃で５〜１２時間静置し、十分に沈殿を形成させた後に、固液分離操作を行い、粗抽出液を回収することが望ましい。
固液分離の方法は、如何なる方法でも行うことができるが、遠心分離によって行うことが好適である。遠心分離で行う場合、具体的には、５００〜１８０００ｒｐｍで１０〜６０分間、好ましくは、３０００ｒｐｍで１０分間程度行うことで、該粗抽出液を夾雑物沈殿から分離し回収することができる。【００３０】
上記工程を経て得られた粗抽出液は、クロマトグラフィーにより前記粗抽出液に含まれるシアル酸含有化合物を分離することができる。
シアル酸含有化合物を含む画分の分離方法としては、平面上で展開を行う薄層クロマトグラフィーやカラムを用いて分離を行うカラムクロマトグラフィーを挙げることができる。しかし、薄層クロマトグラフィーでは、少量の試料を平面上に展開し、目的物質の存在を半定量的に検出することは可能であるが、液体試料から大量の目的物質を分離し回収するには「カラムクロマトグラフィー」により行うことが好適である。【００３１】
なお、薄層クロマトグラフィーによるシアル酸含有化合物を含む画分の分離および検出は、具体的には以下のように行うことができる。
〔レゾルシノール塩酸を用いた検出〕
シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝３〜５／３〜５／０〜２（Ｖ／Ｖ／Ｖ）、好ましくは４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで分離することができる。また、ＣＨ３Ｃｌ、ＣＨ３ＯＨ、ＣａＣｌ２に加えて、アセトン、酢酸、ピリジン等を含むものを用いて展開してもよい。
展開したシリカゲルプレートは、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９０〜１０５℃、好ましくは９５℃で加熱発色処理を行うことで、展開されたプレート上から、シアル酸含有化合物を含む画分を検出することができる。
〔レクチン結合反応を用いた検出〕
もしくは、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝３〜５／３〜５／１〜２（Ｖ／Ｖ／Ｖ）、好ましくは４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開及び分離し、または、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／水＝３〜５／３〜５／１〜２（Ｖ／Ｖ／Ｖ）、好ましくは４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開及び分離し、蛍光標識レクチンと特異的に結合する物質を検出することで、展開されたプレート上から、シアル酸含有化合物を含む画分を検出することができる。【００３２】
なお、前記薄層クロマトグラフィーでアプライできる試料の量は１〜１００μＬ程度であり（例えば、プレートサイズが２０ｃｍ×２０ｃｍの場合、アプライできる試料の量は１００μＬ程度となる）、発色反応により検出される画分に存在する、シアル酸含有化合物の量は極めて微量である。さらに、前記の分離された画分から、シアル酸含有化合物を回収する操作が必要になる。
従って、前記したように、液体試料から大量の目的物質を分離し回収する目的にはカラムクロマトグラフィーにより行うことが好適である。【００３３】
本発明において、シアル酸含有化合物の分離および回収を行うカラムクロマトグラフィーは、シアル酸含有化合物と強い特異的親和性を示すカラム担体を用い、シアル酸含有化合物を極めて特異的に解離できる溶出操作を行うカラムクロマトグラフィーを指し、シアル酸含有化合物を分離し回収することができる。【００３４】
本発明におけるシアル酸含有化合物と強い特異的親和性を示すカラム担体としては、セロトニンアフィニティー担体を用いることができる。具体的には、セロトニンアフィニティー担体（ＬＡＳ−Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ担体、Ｊ−オイルミルズ製）を用いることができる。もしくは、セロトニンをリガンドとして適当な市販の担体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製Ｓｅｐｈａｄｅｘなど）に化学的にリガンドカップリングさせたセロトニンアフィニティー担体を作成し用いることができる。
なお、シアル酸との結合性を有する担体として、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）担体を挙げることができるが、ＣｏｎＡ担体は、シアル酸よりも‘α−Ｄ−マンノースやα−Ｄ−グルコース’により強く親和性を示すため、本工程のカラム担体として用いることができない。【００３５】
本発明に用いるセロトニンアフィニティー担体を充填したカラムは、抽出液量に応じて任意のスケールのものを用いることができ、必要に応じてスケールアップすることができる。また、カラムを複数セット用意し同時に精製操作を行うこともできる。具体的には、０．１ｍＬの前記粗抽出液をアプライする場合、直径４ｍｍで長さ５ｃｍのカラムもしくは直径４．６ｍｍで長さ１５ｃｍのカラムを用いることができる。また、２ｍＬの前記粗抽出液をアプライする場合、直径２６ｍｍで長さ４．６ｃｍのカラムを用いることができる。【００３６】
本発明におけるカラムクロマトグラフィーは、まず、前記粗抽出液を、セロトニンアフィニティー担体を充填したカラムにアプライし、吸着させる。アプライされた粗抽出液に含まれる水溶性成分のうち、水溶性シアル酸含有化合物は、担体の吸着許容量の範囲でセロトニンアフィニティー担体に吸着される。
次に、水を送液し吸着カラムを洗浄することにより、吸着担体に吸着しなかった非吸着夾雑物を除去する。送液の条件としては、流速０．１〜０．５ｍＬ／分、好ましくは０．２ｍＬ／分、水の送液時間を９０〜６００分間、好ましくは９０〜３００分間、行うことが望ましい。
なお、ここで用いる水としては、蒸留水、水道水、脱イオン水、純水など、如何なる水を用いることもできるが、具体的には純水を用いることができる。【００３７】
また、シアル酸含有化合物とセロトニンアフィニティー担体との相互作用を確実にするため、水の送液が終了した後、５〜７２時間、好ましくは１２時間程度、静置することで、シアル酸含有化合物とセロトニンアフィニティー担体との相互作用を確実にすることができる。【００３８】
次に、酢酸アンモニウム溶液又は塩化ナトリウム溶液を送液することにより、水溶性シアル酸含有化合物をセロトニンアフィニティー担体から解離させ回収することができるが、具体的には酢酸アンモニウム溶液を用いることができる。送液の条件としては、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは４〜３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を用い、流速０．１〜０．５ｍＬ／分、好ましくは０．２ｍＬ／分、送液時間を１２０〜４２０分間、好ましくは１５０〜３００分間、行うことが望ましい。
また、０Ｍから２Ｍ、好ましくは０Ｍから１Ｍの酢酸アンモニウム溶液を直線勾配条件で送液してもよい。
上記工程により、酢酸アンモニウム溶液に溶出した水溶性シアル酸含有化合物の溶出画分を得ることができる。
なお、水溶性シアル酸含有化合物の溶出画分回収後、０〜１Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１〜１Ｍの酢酸アンモニウム溶液を６０〜３００分、それから純水を６０〜３００分間送液することでカラム洗浄を行うことができる。【００３９】
上記工程を経て回収した水溶性シアル酸含有化合物の溶出画分である希酢酸アンモニウム液は、アンモニア塩を揮発もしくは透析除去させた後の液体として、食品や医薬品などの原料に用いることもできるが、乾固物もしくは乾燥粉末にしたものを用いることもできる。
ここで、水溶性シアル酸含有化合物の溶出画分の乾固物もしくは乾燥粉末は、エバポレーター、凍結乾燥、窒素気流乾燥、減圧乾燥などの方法により得ることができるが、具体的には、Ｆｒｅｅｚｄｒｙｅｒ  ＦＤ−１（ＥＹＥＬＡ製）やＤｒｙ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂａｔｈ  ＭＧ−２１００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて完全に乾燥させることが望ましい。また、適量のエタノールを添加し、完全に溶媒を気化させてもよい。
なお、凍結乾燥、窒素気流乾燥などの手法により乾固物もしくは乾燥粉末にしておき、必要な時に水などの溶媒に溶解して用いることも可能である。【００４０】
上記工程を経て回収した水溶性シアル酸含有化合物の回収量は、原材料の植物、具体的には穀類又は豆類の種子を３ｇ用いた場合、水溶性シアル酸含有化合物２．５〜４．５ｍｇ程度が抽出できる。
また、上記工程を経て回収した水溶性シアル酸含有化合物の溶出画分に含まれる夾雑物の含有量は、ヨウ素蒸気雰囲気下で検出する全有機化合物量の検出限界以下であり、本発明からは、従来技術と比べて顕著に純度が高く、多量のシアル酸含有化合物が抽出できる。
【実施例】
【００４１】
以下に本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。【００４２】
試験例１（大豆種子の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
大豆種子（サチユタカ）全粒を粉砕器（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ，ＭＲＫ−ＲＥＴＳＣＨ製、どちらもメッシュ径は０．５ｍｍもしくは１ｍｍ）によって粉砕することで得た大豆粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１−１）。この混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１に示す。【００４３】
試験例２（玄米全粒および玄米糊粉層部分の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
玄米（コシヒカリ）全粒を粉砕器（Ｃｙｃｌｏｎｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｍｉｌｌ、ＵＤＹ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料２−２）。
また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｓａｔａｋｅ  Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、Ｓａｔａｋｅ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６〜９１質量％の範囲の部分（前記５質量％の範囲にあたる玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料２−５）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１に示す。【００４４】
試験例３（小麦粉の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
小麦粉（農林６１号）３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料３−３）。小麦粉（Western White）３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料３−４）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１に示す。【００４５】
なお、図１において、レーン１は大豆種子（サチユタカ）全粒の粉（試料１−１）、レーン２は玄米（コシヒカリ）全粒の粉（試料２−２）、レーン３は小麦粉（農林６１号）（試料３−３）、レーン４は小麦粉（Western White）（試料３−４）、レーン５は玄米（コシヒカリ）糊粉層部分の粉（試料２−５）から、抽出溶媒として水を用いて上記工程より得られた粗抽出液を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００４６】
図１が示すように、大豆種子全粒の粉（試料１−１）（レーン１）、玄米全粒の粉（試料２−２）（レーン２）、小麦粉（試料３−３，３−４）（レーン３，４）、玄米糊粉層部分の粉（試料２−５）（レーン５）を原料とし、上記工程より、抽出溶媒として水を用いて得られた粗抽出液には、水溶性のシアル酸含有化合物が含まれることが明らかになった。また、これらの中でも、大豆種子全粒の粉（試料１−１）（レーン１）と玄米糊粉層部分の粉（試料２−５）（レーン５）に、上記方法で抽出可能な水溶性シアル酸含有化合物が、特に多く含まれることが示された。
この結果から、大豆、米及び小麦の種子に由来する粉末から、有害な有機溶媒を使用することなく、抽出溶媒として水を用いることで、水溶性シアル酸含有化合物を含有する粗抽出液が得られることが明らかになった。【００４７】
試験例４（エチレングリコールを用いた粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６〜９１質量％の範囲の部分（前記５質量％の範囲にあたる玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料４−７）。また、米胚芽（コシヒカリ）３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料４−８）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図２に示す。【００４８】
なお、図２において、レーン１はＮ−アセチルノイラミン酸標品（シアル酸含有）（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ＴｙｐｅＩＶ−Ｓ、Ｓｉｇｍａ製）、レーン２はガングリオシドＧＤ１ａ標品（シアル酸含有）（Ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＤ１ａ、Ｓｉｇｍａ製）、レーン３はガングリオシドＧＴ１ｂ標品（シアル酸含有）（Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＴ１ｂ、Ｓｉｇｍａ製）、レーン４はホスファチジルセリン標品（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｂｅｅｆ  ｂｒａｉｎ、ＳＥＲＤＡＮＹ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、レーン５はホスファチジルエタノールアミン標品（Ｌ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔ、ＡＶＡＮＴＩ  Ｐｏｌａｒ−Ｌｉｐｉｄｓ製）、レーン６はリゾホスファチジルコリン標品（Ｌ−α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｓｏｙｂｅａｎ、Ｓｉｇｍａ製）をシリカゲルプレート上で展開したものである。
レーン７は玄米（コシヒカリ）糊粉層部分の粉（試料４−７）、レーン８は米胚芽（コシヒカリ）（試料４−８）から、抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（ポリオール）を用いて上記工程より得られた粗抽出液を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００４９】
図２が示すように、抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（ポリオール）を用い、玄米糊粉層部分の粉（試料４−７）（レーン７）又は米胚芽（試料４−８）（レーン８）を原料とし、上記工程より得られた粗抽出液にも、水溶性シアル酸含有化合物が含まれることが示された。
また、米胚芽部分（試料４−８）（レーン８）にも、玄米糊粉層部分（試料４−７）（レーン７）と同程度に多量の水溶性シアル酸含有化合物を含むことが示された。【００５０】
試験例５（エチレングリコールによる抽出への影響）
玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｓａｔａｋｅ  Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、Ｓａｔａｋｅ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６〜９１質量％の範囲の部分（前記５質量％の範囲にあたる玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料５−１）。また、前記玄米糊粉層部分の粉３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料５−２）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離した。
展開したシリカゲルプレートは、ヨウ素蒸気雰囲気下に室温にて７２時間静置することで、全有機化合物の検出を行った。続いて、ヨウ素蒸気雰囲気から取り出したシリカゲルプレートを２４時間静置し、充分にヨウ素を脱着させたのち、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図３に示す。なお、図３において、検出された全有機化合物を（ａ）に、検出されたシアル酸含有化合物を（ｂ）に示す。【００５１】
なお、図３において、レーン１は玄米糊粉層部分の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料５−１）、レーン２は玄米糊粉層部分の粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料５−２）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００５２】
図３の（ａ）と（ｂ）の比較の結果が示すように、抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用いて抽出する（試料５−２）（レーン２）ことで、玄米糊粉層部分の粉から、抽出溶媒として水を用いて抽出する（試料５−１）（レーン１）よりも、夾雑物混入の少ない水溶性シアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。【００５３】
試験例６（エタノール沈殿処理の抽出への影響）
玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６〜９１質量％の範囲の部分（前記５質量％の範囲にあたる玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料６−１〜６−３）。また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると白米表層部分に相当する９１〜８６質量％部分（白米表層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料６−４〜６−６）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。【００５４】
上記工程により、玄米糊粉層部分の粉又は白米表層部分の粉から得られた、「エタノール注加後の遠心上清」を試料６−１，６−４、「エタノール注加後の遠心沈殿の水再溶解液」を試料６−２，６−５、「最初の水粗抽出後の遠心沈殿の水再溶解液」を試料６−３，６−６とし、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図４に示す。【００５５】
なお、図４において、レーン１は玄米糊粉層部分の粉から得られたエタノール注加後の遠心上清（試料６−１）、レーン２は玄米糊粉層部分の粉から得られたエタノール注加後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６−２）、レーン３は玄米糊粉層部分の粉から得られた最初の水粗抽出後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６−３）、レーン４は白米表層部分の粉から得られたエタノール注加後の遠心上清（試料６−４）、レーン５は白米表層部分の粉から得られたエタノール注加後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６−５）、レーン６は白米表層部分の粉から得られた最初の水粗抽出後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６−６）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
また、レーン７はガングリオシドＧＤ１ａ標品（シアル酸含）（Ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＤ１ａ、Ｓｉｇｍａ製）、レーン８はガングリオシドＧＴ１ｂ標品（シアル酸含）（Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＴ１ｂ、Ｓｉｇｍａ製）、レーン９はＮ−アセチルノイラミン酸標品（シアル酸含）（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ＴｙｐｅＩＶ−Ｓ、Ｓｉｇｍａ製）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００５６】
図４が示すように、玄米糊粉層部分の粉又は白米表層部分から、上記の抽出方法により得られたエタノール注加後の遠心上清（粗抽出液）（試料６−１，６−４）（レーン１，４）には、水溶性シアル酸含有化合物が特に多量に含まれることが示された。
また、原料に玄米糊粉層部分の粉を用いた場合、エタノール注加後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６−２）（レーン２）にも、水溶性シアル酸含有化合物が多量に含まれることが示された。
なお、玄米糊粉層部分の粉又は白米表層部分から、最初の水粗抽出後の遠心沈殿（残渣）の水再溶解液（試料６−３，６−６）（レーン３，６）には、水溶性シアル酸含有化合物がほとんど存在しないことから、最初の水粗抽出において、水溶性シアル酸含有化合物のほとんどが粗抽出液中に抽出されていたことが示された。【００５７】
試験例７（各種溶媒を用いた粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
小豆種子を粉砕器（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ，ＭＲＫ−ＲＥＴＳＣＨ製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料７−１，７−４，７−７）。また、前記小豆種子の粉３ｇに、１％（ｖ／ｖ）塩酸１５ｍＬを加え、よく混合した（試料７−２，７−５，７−８）。また、前記小豆種子の粉３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料７−３，７−６，７−９）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃（試料７−７〜７−９）、２５℃（試料７−４〜７−６）もしくは３７℃（試料７−１〜７−３）で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図５に示す。【００５８】
なお、図５において、レーン１は小豆種子の粉から抽出溶媒として３７℃の水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７−１）、レーン２は小豆種子の粉から抽出溶媒として３７℃の１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７−２）、レーン３は小豆種子の粉から抽出溶媒として３７℃の１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７−３）、レーン４は小豆種子の粉から抽出溶媒として２５℃の水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７−４）、レーン５は小豆種子の粉から抽出溶媒として２５℃の１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７−５）、レーン６は小豆種子の粉から抽出溶媒として２５℃の１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７−６）、レーン７は小豆種子の粉から抽出溶媒として１０℃の水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７−７）、レーン８は小豆種子の粉から抽出溶媒として１０℃の１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７−８）、レーン９は小豆種子の粉から抽出溶媒として１０℃の１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７−９）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００５９】
図５が示すように、抽出溶媒として水、１％（ｖ／ｖ）塩酸、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用いて、１０，２５，３７℃の温度で抽出することで、小豆種子の粉からも水溶性シアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。【００６０】
試験例８（玄米各層の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると最外層部分に相当する１００〜９６質量％の範囲の部分（前記５質量％の範囲にあたる玄米最外層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料８−１）。また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６〜９１質量％部分（玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料８−２）。また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると白米表層部分に相当する９１〜８６質量％の範囲の部分（前記５質量％の範囲にあたる白米表層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料８−３）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図６に示す。【００６１】
試験例９（黒大豆脱皮種子子葉部分の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
黒大豆脱皮種子の子葉部分を粉砕器（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ，ＭＲＫ−ＲＥＴＳＣＨ製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料９−４）。また、前記黒大豆脱皮種子の子葉部分の粉３ｇに、１％（ｖ／ｖ）塩酸１５ｍＬを加え、よく混合した（試料９−５）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図６に示す。【００６２】
試験例１０（トウモロコシ種子の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
トウモロコシ種子（ポップコーン種子）を粉砕器（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ，ＭＲＫ−ＲＥＴＳＣＨ製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１０−６）。また、前記トウモロコシ種子（ポップコーン種子）の粉３ｇに、１％（ｖ／ｖ）塩酸１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１０−７）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図６に示す。【００６３】
なお、図６において、レーン１は玄米最外層部分の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料８−１）、レーン２は玄米糊粉層部分の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料８−２）、レーン３は白米表層部分の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料８−３）、レーン４は黒大豆種子の子葉の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料９−４）、レーン５は黒大豆種子の子葉の粉から抽出溶媒として１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料９−５）、レーン６はトウモロコシ種子から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１０−６）、レーン７はトウモロコシ種子から抽出溶媒として１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１０−７）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
また、レーン８はガングリオシドＧＤ１ａ標品（シアル酸含）（Ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＤ１ａ、Ｓｉｇｍａ製）、レーン９はガングリオシドＧＴ１ｂ標品（シアル酸含）（Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＴ１ｂ、Ｓｉｇｍａ製）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００６４】
図６が示すように、玄米最外層部分の粉から、抽出溶媒として水を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料８−１）（レーン１）にも、玄米糊粉層部分の粉もしくは白米表層部分の粉から、抽出溶媒として水を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料８−２，８−３）（レーン２，３）と同程度に多量の水溶性シアル酸含有化合物が含まれることが示された。
また、黒大豆子葉の粉から、抽出溶媒として水もしくは１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料９−４，９−５）（レーン４，５）にも、玄米糊粉層部分の粉もしくは白米表層部分の粉から、抽出溶媒として水を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料８−２，８−３）（レーン２，３）と同程度に多量の水溶性シアル酸含有化合物が含まれることが示された。
また、トウモロコシの粉から、抽出溶媒として水もしくは１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料１０−６，１０−７）（レーン６，７）においても、水溶性シアル酸含有化合物が含まれることが示された。【００６５】
試験例１１（抽出時間の抽出への影響）
米胚芽（コシヒカリ）３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１１−１，１１−２，１１−５，１１−６）。また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６〜９１質量％の範囲の部分（前記５質量％の範囲にあたる玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１１−３，１１−４，１１−７，１１−８）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で２．５時間（試料１１−１〜１１−４）もしくは１２時間（試料１１−５〜１１−８）静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。【００６６】
上記工程により、米胚芽又は玄米糊粉層部分の粉から得られた、「エタノール注加後の遠心上清」を試料１１−２，１１−４，１１−６，１１−８とし、最初の「水粗抽出後の遠心上清」を試料１１−１，１１−３，１１−５，１１−７として、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図７に示す。【００６７】
なお、図７において、レーン１は米胚芽から、２．５時間の水抽出を行った後の遠心上清（試料１１−１）、レーン２は米胚芽から、２．５時間の水抽出を行い、上記工程により得られたエタノール注加後の遠心上清（試料１１−２）、レーン３は玄米糊粉層部分の粉から、２．５時間の水抽出を行った後の遠心上清（試料１１−３）、レーン４は玄米糊粉層部分の粉から、２．５時間の水抽出を行い、上記工程により得られたエタノール注加後の遠心上清（試料１１−４）、レーン５は米胚芽から、１０時間の水抽出を行った後の遠心上清（試料１１−５）、レーン６は米胚芽から、１０時間の水抽出を行い、上記工程により得られたエタノール注加後の遠心上清（試料１１−６）、レーン７は玄米糊粉層部分の粉から、１０時間の水抽出を行った後の遠心上清（試料１１−７）、レーン８は玄米糊粉層部分の粉から、１０時間の水抽出を行い、上記工程により得られたエタノール注加後の遠心上清（試料１１−８）、を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００６８】
図７が示すように、米胚芽又は玄米糊粉層部分の粉から、１０℃で２．５〜１０時間の水抽出により得られた粗抽出液には、水溶性シアル酸含有化合物が多量に含まれることが示された。また、水抽出を１０時間行った場合（試料１１−５〜１１−８）（レーン５〜８）、２．５時間行った場合（試料１１−１〜１１−４）（レーン１〜４）よりも抽出できる水溶性シアル酸含有化合物の量が増えることが示された。
なお、水抽出後の遠心上清（試料１１−１，１１−３，１１−５，１１−７）（レーン１，３，５，７）とエタノール注加後の遠心上清（試料１１−２，１１−４，１１−６，１１−８）（レーン２，４，６，８）とでは、水溶性シアル酸含有化合物の抽出量に、大きな差は認められなかった。【００６９】
実施例１（玄米糊粉層部分からのシアル酸含有化合物の抽出回収）
試験例２と同様に、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６〜９１質量％の範囲の部分（前記５質量％の範囲にあたる玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。
この混合物に超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した抽出上清に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液１ｍＬを、セロトニンアフィニティー担体ＬＡＳ−Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ担体、Ｊ−オイルミルズ製）を充填した直径４ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム（ＬＡＳ−Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ、Ｊ−オイルミルズ製）にアプライし分画した。クロマトグラフィーの条件としては、流速０．２ｍＬ／分で、純水送液を９０分間行い（区間１）非吸着成分の除去を行った後、次いで４ｍＭから３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液の送液を直線勾配条件で１５０分間行い（区間２）担体から解離したシアル酸含有化合物を回収した。なお、最後に純水の送液を９０分間行いカラムの再生処理を行った（区間３）。
シアル酸含有化合物の検出は、セロトニンアフィニティー担体から溶出した化合物の量をＯＤ２８０ｎｍの吸光度で測定することにより行った。結果を図８に示す。【００７０】
また、このセロトニンアフィニティーカラムによる分画を２回行い（前記粗抽出液１ｍＬずつを２回）、２回分の水溶性シアル酸含有化合物が溶出した画分（区間２）を凍結乾燥機（Ｆｒｅｅｚｄｒｙｅｒ  ＦＤ−１、ＥＹＥＬＡ製）を用いて凍結乾燥し、重量を測定した。【００７１】
図８が示すように、純水のカラムへの送液によってカラムからセロトニンアフィニティー担体非吸着成分を排出した後（区間１）、４ｍＭから３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を直線勾配条件でカラムへ送液することで、セロトニンアフィニティー担体から解離した「水溶性シアル酸含有化合物」が溶出した画分（区間２）が回収できることが示された。また、区間２の中でも、溶出開始（区間１の最初）から１３０〜１６０分後付近の画分に、特に多量のシアル酸含有化合物が溶出されることが示された。
また、前記粗抽出液２ｍＬ（１ｍＬずつを２回）をセロトニンアフィニティーカラムで分画した画分（区間２）から０．５ｍｇの乾燥固形物が得られることから、原料の玄米糊粉層部分の粉３ｇ（上記工程を経ることで玄米糊粉層部分の粉３ｇから前記粗抽出液２０ｍＬが得られる）からは、５ｍｇの水溶性シアル酸含有化合物の乾燥固形物が得られことが示された。【００７２】
実施例２（米胚芽からのシアル酸含有化合物の抽出回収）
米胚芽（コシヒカリ）３ｇに水１５ｍＬを加え、よく混合した。
この混合物に超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液０．１ｍＬを、セロトニンアフィニティー担体（ＬＡＳ−Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ担体、Ｊ−オイルミルズ製）を充填した直径４ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム（ＬＡＳ−Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ、Ｊ−オイルミルズ製）にアプライし分画した。クロマトグラフィーの条件としては、流速０．２ｍＬ／分で、純水送液を２８５分間行い非吸着成分の除去を行った後、シアル酸含有化合物とセロトニンアフィニティー担体との相互作用を確実なものにするため１２時間送液を停止した。その後、３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液の送液を２８５分間行い担体から解離したシアル酸含有化合物を回収した。（なお、本実施例ではカラム再生処理は省略した。）
シアル酸含有化合物の検出は、セロトニンアフィニティー担体から溶出した化合物の量をＯＤ２８０ｎｍの吸光度で測定することにより行った。結果を図９に示す。
なお、図９において、純水送液時のＯＤ２８０ｎｍの吸光度の変化を（ａ）に、３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液の送液時のＯＤ２８０ｎｍの吸光度の変化を（ｂ）に示す。【００７３】
図９が示すように、純水のカラムへの送液（ａ）によってカラムからセロトニンアフィニティー担体非吸着成分を排出し１２時間送液を停止した後、３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液をカラムへ送液（ｂ）することで、セロトニンアフィニティー担体から解離した「水溶性シアル酸含有化合物」が溶出した画分が回収できることが示された。また、３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液のカラムへの送液開始から、３０〜８０分後付近の画分に、特に多量のシアル酸含有化合物が溶出されることが示された。【００７４】
実施例３（白米表層部分からのシアル酸含有化合物の抽出回収）
玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Ｇｒａｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｉｌｌ、ＳＡＴＡＫＥ製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると白米表層部分に相当する９１〜８６質量％の範囲の部分（前記５質量％の範囲にあたる白米表層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。
この混合物に超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液２ｍＬを、セロトニンアフィニティー担体（ＬＡＳ−Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ担体、Ｊ−オイルミルズ製）を充填し、担体の充填サイズが高さ４．６ｃｍになった直径２６ｍｍ、長さ２０ｃｍのカラム（ＸＫ２６／２０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｋ製）にアプライし分画した。クロマトグラフィーの条件としては、流速０．２ｍＬ／分で、純水送液を３００分間行い、非吸着成分の除去を行った（区間１）後、次いで０Ｍから１Ｍ酢酸アンモニウム溶液の送液を直線勾配条件で２４０分間行い、担体から解離したシアル酸含有化合物を回収した（区間２）。なお、その後、１Ｍ酢酸アンモニウム溶液の送液を１８０分間行うことでカラム洗浄（カラム吸着成分の除去）（区間３）を行い、最後に１Ｍ酢酸アンモニウム溶液から純水への直線逆勾配での送液を６０分、純水の送液を１８０分間行いカラムの再生処理（区間４）を行った。
シアル酸含有化合物の検出は、セロトニンアフィニティー担体から溶出した化合物の量をＯＤ２８０ｎｍの吸光度で測定することにより行った。結果を図１０に示す。
図１０はセロトニンアフィニティーカラムを通過した溶液のＯＤ２８０ｎｍの吸光度の経時変化を示したものである。【００７５】
上記工程を経てセロトニンアフィニティーカラムを通過した溶液は、１０分ごとに一つの画分（フラクション）として９６個に分画回収し、凍結乾燥した。
これらのうち、前記の区間１〜４の代表的な画分を再度純水に溶解し、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離した。
展開したシリカゲルプレートは、ヨウ素蒸気雰囲気下に室温にて７２時間静置することで、全有機化合物の検出を行った。続いて、ヨウ素蒸気雰囲気から取り出したシリカゲルプレートを２４時間静置し、充分にヨウ素を脱着させたのち、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１１に示す。
なお、図１１において、前記の区間１〜４の代表的な画分を薄層クロマトグラフィーで分離し、検出された全有機化合物を（ａ）に、検出されたシアル酸含有化合物を（ｂ）に示したものである。【００７６】
また、このセロトニンアフィニティーカラムによる分画は２回行い（前記粗抽出液２ｍＬずつを２回）、２回分の上記の０Ｍから１Ｍ酢酸アンモニウム溶液を直線勾配条件でカラムへ送液した部分（区間２）に相当する画分を集め、凍結乾燥機（Ｆｒｅｅｚｄｒｙｅｒ  ＦＤ−１、ＥＹＥＬＡ製）を用いて凍結乾燥し、重量を測定した。【００７７】
なお、図１１において、レーン１は１１０分から１２０分に溶出した画分１２（試料ア）、レーン２は４３０分から４４０分に溶出した画分４４（試料イ）、レーン３は４７０分から４８０分に溶出した画分４８（試料ウ）、レーン４は５３０分から５４０分に溶出した画分５４（試料エ）、レーン５は７９０分から８００分に溶出した画分８０（試料オ）、レーン６は８８０分から８９０分に溶出した画分８９（試料カ）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００７８】
図１０が示すように、純水のカラムへの送液によってカラムからセロトニンアフィニティー担体非吸着成分を排出した（区間１：０〜３００分）後、０Ｍから１Ｍ酢酸アンモニウム溶液を直線勾配条件でカラムへ送液すること（区間２：３００〜５４０分）により、セロトニンアフィニティー担体から解離した水溶性シアル酸含有化合物が溶出した画分が回収できることが示された。また、カラム洗浄のために１Ｍ酢酸アンモニウム溶液の送液した画分（区間３：５４０〜７２０分）においても、６６０分後付近までの画分には、セロトニンアフィニティー担体から解離した水溶性シアル酸含有化合物が溶出されることが示された。
また、区間２及び区間３の中でも、特に、４３０分後付近の画分（区間２での酢酸アンモニウム溶液のカラムへの送液開始から１３０分後付近の画分）をピークに、多量のシアル酸含有化合物が溶出されることが示された。
なお、区間２と区間３において、シアル酸含有化合物の溶出ピークがブロードになっているのは、本実施例で用いたカラムの体積（実施例１，２の４０倍の体積のものを使用）に対して、送液の流速が遅いために、溶出ピークが拡散しているものと考えられる。【００７９】
図１１の（ｂ）が示すように、４３０分から４４０分に溶出した画分４４（試料イ）（レーン２）、４７０分から４８０分に溶出した画分４８（試料ウ）（レーン３）、及び５３０分から５４０分に溶出した画分５４（試料エ）（レーン４）には、シアル酸含有化合物が含まれることが示された。
また、７９０分から８００分に溶出した画分８０（試料オ）（レーン５）、８８０分から８９０分に溶出した画分８９（試料カ）（レーン６）には、シアル酸含有化合物が含まれないことが示された。
この結果から、図１０で示した０Ｍから１Ｍ酢酸アンモニウム溶液を直線勾配条件でカラムへ送液した部分である区間２のピークを含む画分には、シアル酸含有化合物が含まれることが示され、カラムの再生過程である区間４に見られる低いピークには、シアル酸含有化合物が含まれないことが示された。
また、図１１の（ａ）と（ｂ）の比較の結果が示すように、４３０分から４４０分に溶出した画分４４（試料イ）（レーン２）、４７０分から４８０分に溶出した画分４８（試料ウ）（レーン３）、及び５３０分から５４０分に溶出した画分５４（試料エ）（レーン４）からは、‘夾雑物混入が極めて少ない（夾雑物の含有量が、ヨウ素蒸気雰囲気下で検出する全有機化合物量の検出限界以下である）’シアル酸含有化合物が回収できることが示された。【００８０】
これらの結果から、米に由来する粉末から、有害な有機溶媒を使用することなく、抽出溶媒として水を用い、セロトニンアフィニティーカラムから酢酸アンモニウムを用いた溶出によって、水溶性シアル酸含有化合物を含有する夾雑成分の極めて少ない画分が得られることが明らかになった。【００８１】
また、前記粗抽出液４ｍＬ（２ｍＬずつを２回）をセロトニンアフィニティーカラムで分画した画分（区間２）から０．５〜０．９ｍｇの乾燥固形物が得られることから、原料の白米表層部分の粉３ｇ（上記工程を経ることで白米表層部分の粉３ｇから前記粗抽出液２０ｍＬが得られる）からは、２．５〜４．５ｍｇの水溶性シアル酸含有化合物の乾燥固形物が得られことが示された。【００８２】
なお、純水のカラムへの送液によってカラムからセロトニンアフィニティー担体非吸着成分を排出した区間１のピークである、１１０分から１２０分に溶出した画分１２（試料ア）（レーン１）には、シアル酸含有化合物が多量に含まれることが示された。これは、使用したセロトニンアフィニティーカラムの担体が有するシアル酸含有化合物吸着能力を大幅に超える量のシアル酸含有化合物が、カラムにアプライした試料液に含まれているからと思われ、充分なシアル酸含有化合物吸着能力を有する、さらに大規模なカラム、例えばセロトニンアフィニティー担体の体積が１０リットル程度以上の工業用カラムを用いれば、さらに効率よく水溶性シアル酸含有化合物を、分離、回収することが出来る。【００８３】
試験例１２（レクチンブロットによるシアル酸含有化合物の検出確認）
米胚芽（コシヒカリ）３ｇに、エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した。
この混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した（試料１２）。
上記工程により得られた「米胚芽−エチレングリコール抽出液の遠心上清」（試料１２）を、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）、もしくは、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／水＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）によって展開することで成分ごとに分離したのち、冷風乾燥した。
このシリカゲルプレートをポリ（イソブチルメタクリレート）のｎ−ヘキサン／ＣＨ３Ｃｌ＝９／１（Ｖ／Ｖ）溶液（濃度２ｇ／５００ｍＬ）に３０秒間浸漬し、冷風乾燥した。【００８４】
次いで、このポリ（イソブチルメタクリレート）処理をしたシリカゲルプレートを、プラスチック容器中でＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＭＡＡレクチン（Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ製）の０．１５Ｍ塩化ナトリウム−１％ＢＳＡ入り０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２〜７．４）で１００倍希釈した溶液、もしくは、ＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＳＮＡ−Ｉレクチン（Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ製）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム−１％ＢＳＡ入り０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２〜７．４）で１００倍希釈した溶液に浸漬し、室温にて４８時間振盪して、レクチン結合反応を行った。
なお、‘ＭＡＡレクチン’は、「Ｎ−アセチルノイラミン酸α（２→３）Ｇａｌ」構造に特異的に結合するレクチンであり、‘ＳＮＡ−Ｉレクチン’は、「Ｎ−アセチルノイラミン酸α（２→６）Ｇａｌ」もしくは「Ｎ−アセチルノイラミン酸α（２→６）ＧａｌＮＡｃ」構造に特異的に結合するレクチンである。
レクチン結合反応終了後、ポリ（イソブチルメタクリレート）処理シリカゲルプレートに対し洗浄操作をおこない、目的物に結合していない蛍光レクチンを洗浄除去したのち、蛍光の観察される部分、すなわちシアル酸に特異的に結合するレクチンの存在部位を観察することで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を、検出条件の組合せの違いごとに、図１２（Ａ）〜（Ｄ）に示す。【００８５】
なお、図１２において、（Ａ）は、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＭＡＡレクチンを反応させた結果である。
（Ｂ）は、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／水＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＭＡＡレクチンを反応させた結果である。
（Ｃ）は、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＳＮＡ−Ｉレクチンを反応させた結果である。
（Ｄ）は、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／水＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＳＮＡ−Ｉレクチンを反応させた結果である。
また、（Ａ）〜（Ｄ）の各図において、左側の写真はレクチン結合反応を行う前のシリカゲルプレートの撮影画像であり、右はレクチン結合反応を行った後のシリカゲルプレートの撮影画像である。【００８６】
図１２（Ａ）〜（Ｄ）が示すように、蛍光レクチン結合反応前（各図の左側写真）において発光していない部分が、蛍光レクチン結合操作後（各図の右側写真）では発光していることが観察された（矢印の部分）。この各図の右側写真の発光部分とは、蛍光標識されたＭＡＡレクチンやＳＮＡ−Ｉレクチンが、上記Ｎ−アセチルノイラミン酸に特異的な構造を有する化合物と特異的に結合していることを示すものである。
詳しくは、図１２（Ａ）および（Ｂ）（ＭＡＡレクチンでの検出結果）から、シリカゲルプレート上で展開した矢印で示された部分の化合物のなかに、「Ｎ−アセチルノイラミン酸α（２→３）Ｇａｌ」構造を有する化合物が存在することが示された。
また、図１２（Ｃ）および（Ｄ）（ＳＮＡ−Ｉレクチンでの検出結果）から、シリカゲルプレート上で展開した矢印で示された部分の化合物のなかに、「Ｎ−アセチルノイラミン酸α（２→６）Ｇａｌ」構造もしくは「Ｎ−アセチルノイラミン酸α（２→６）ＧａｌＮＡｃ」構造を有する化合物が存在することが示された。
従って、本試験例の結果から、米胚芽のエチレングリコール抽出液中に、‘シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を含む化合物’が存在することが示された。【００８７】
試験例１３（炊飯米の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
玄米（コシヒカリ）をブラシ式精米機（ＨＲＧ−１２２  みのる産業製）で外側から研削し、玄米を１００質量％とすると「１００〜９６質量％の範囲の部分（玄米最外層部分）を削り取った胚芽と糊粉層の残った米」（換言すると、玄米最外層部分を削り取って、残った９６質量％の部分にあたる、胚芽と糊粉層の残った米）を、２０℃（試料１３−１、１３−２）もしくは２５℃（試料１３−３、１３−４）の水に６時間浸漬し静置した。そして、軽く３回研いでから、当該米２質量部に水２質量部を加え、家庭用炊飯器で炊飯し、これら炊飯米３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した上清は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／水＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１３に示す。【００８８】
なお、図１３において、レーン１は‘玄米最外層を削り取った胚芽と糊粉層の残った米’を炊飯前に２０℃の水に６時間浸漬し静置したものを炊飯したものから、抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液２μＬ（試料１３−１）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。また、レーン２はレーン１と同じもの４μＬ（試料１３−２）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
レーン３は‘玄米最外層を削り取った胚芽と糊粉層の残った米’を炊飯前に２５℃の水に６時間浸漬し静置したものを炊飯したものから、抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液２μＬ（試料１３−３）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。また、レーン４はレーン３と同じもの４μＬ（試料１３−４）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００８９】
図１３の結果が示すように、‘玄米最外層を削り取った胚芽と糊粉層の残った米’を炊飯処理しても、水抽出によって水溶性シアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。【００９０】
試験例１４（グリセロールを用いた粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
小麦（農林６１号）全粒および大麦（サチホゴールデン、Ｂｅｔｚｅｓ、ダイシモチ、イチバンボシ、烏金１号）全粒を粉砕器（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ，ＭＲＫ−ＲＥＴＳＣＨ製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）グリセロール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１４−１〜１４−６）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１４に示す。【００９１】
なお、図１４において、レーン１は小麦農林６１号全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４−１）を、レーン２は大麦サチホゴールデン全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４−２）を、レーン３は大麦Ｂｅｔｚｅｓ全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４−３）を、レーン４は大麦ダイシモチ全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４−４）を、レーン５は大麦イチバンボシ全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４−５）を、レーン６は大麦烏金１号全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４−６）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００９２】
図１４の結果が示すように、抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用いて抽出することで、小麦および大麦の全粒粉から水溶性シアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。【００９３】
試験例１５（各種穀類由来の粉および加工品の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
小麦（農林６１号）全粒および大麦（サチホゴールデン、Ｂｅｔｚｅｓ、ダイシモチ、イチバンボシ、烏金１号）全粒を粉砕器（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ，ＭＲＫ−ＲＥＴＳＣＨ製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１５−１〜１５−６）。また、小麦（農林６１号）、大麦（サチホゴールデン）の小ブスマ３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１５−７，１５−８）。また、米（ハツシモ）胚芽を粉砕器（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ，ＭＲＫ−ＲＥＴＳＣＨ製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１５−９）。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を直ちに、１０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１５に示す。【００９４】
なお、図１５において、レーン１は小麦農林６１号全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５−１）を、レーン２は大麦サチホゴールデン全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５−２）を、レーン３は大麦Ｂｅｔｚｅｓ全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５−３）を、レーン４は大麦ダイシモチ全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５−４）を、レーン５は大麦イチバンボシ全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５−５）を、レーン６は大麦烏金１号全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５−６）を、レーン７は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５−７）を、レーン８は大麦サチホゴールデン小ブスマから抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５−８）を、レーン９は米ハツシモ胚芽粉砕粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５−９）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００９５】
図１５の結果が示すように、抽出溶媒として水を用いて抽出することで、小麦および大麦の全粒粉や小ブスマ、米胚芽から水溶性シアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。
米胚芽からは、小麦や大麦の全粒や小ブスマと比べて、特定の一種類のシアル酸含有化合物が高濃度で抽出できることが示された。小麦や大麦からは、米胚芽には含まれないシアル酸含有化合物が複数種抽出できることが示された。小麦や大麦に関して、小ブスマを抽出原料とすれば全粒粉からよりも高濃度でシアル酸含有化合物を抽出できることが示された。【００９６】
試験例１６（酸の種類による抽出への影響）
小麦農林６１号の小ブスマ３ｇに、水、もしくは１１．８３％（２Ｎ）酢酸、もしくは７．０６％（２Ｎ）塩酸１５ｍＬを加え、よく混合した。これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を８０℃で３時間振盪したのち（試料１６−１〜１６−３）、１０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
また、小麦農林６１号の小ブスマ３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。この混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を直ちに（試料１６−４）、もしくは、１０℃で２８．５ｈ（約３時間）静置したのち（試料１６−８）、１０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１６に示す。【００９７】
なお、図１６において、レーン１は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後に８０℃で３時間振盪したのち遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６−１）を、レーン２は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として２Ｎ酢酸を用い、超音波処理後に８０℃で３時間振盪したのち遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６−２）を、レーン３は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として２Ｎ塩酸を用い、超音波処理後に８０℃で３時間振盪したのち遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６−３）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
また、レーン４は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後直ちに遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６−４）を、レーン８は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後１０℃で約３時間静置したのち遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６−８）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
そして、レーン５はシアル酸含有化合物標品ＧＤ１ａ（ＳＩＧＭＡ製）を、レーン６はシアル酸含有化合物標品ＧＴ１ｂ（ＳＩＧＭＡ製）を、レーン７はシアル酸含有化合物標品Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＳＩＧＭＡ製）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【００９８】
図１６の結果が示すように、８０℃、約３時間の酢酸処理、塩酸処理によって、水で抽出されるのとは異なるシリカゲルプレート上で高い位置に移動するシアル酸含有化合物が得られることが示された。この結果は、熱を加えた酸処理によって、シアル酸含有化合物の‘低分子化、断片化’が起こり、低極性化したためと考えられる。
すなわち、熱を加えた酸処理を行うことによって、低分子化、断片化させることが出来、易溶性を向上（溶出効率を向上）させることができることが示唆された。【００９９】
試験例１７（室温抽出における抽出時間の影響）
小麦（シラサギコムギ）の小ブスマ２ｇに、水１０ｍＬを加え、よく混合した。これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を直ちに（試料１７−１）、もしくは２５℃で１時間（試料１７−２）、４時間（試料１７−３）、１２時間（試料１７−４）、２４時間（試料１７−５）振盪したのち、１０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
分離した粗抽出液は、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／アセトン／ＣＨ３ＯＨ／酢酸／水／ピリジン＝７５／４５／３０／２５／５／２０（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１７に示す。【０１００】
なお、図１７において、レーン１は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後直ちに上記工程より得られた粗抽出液（試料１７−１）を、レーン２は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後２５℃で１時間振盪後、上記工程より得られた粗抽出液（試料１７−２）を、レーン３は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後２５℃で４時間振盪後、上記工程より得られた粗抽出液（試料１７−３）を、レーン４は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後２５℃で１２時間振盪後、上記工程より得られた粗抽出液（試料１７−４）を、レーン５は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後２５℃で２４時間振盪後、上記工程より得られた粗抽出液（試料１７−５）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【０１０１】
図１７の結果が示すように、小麦小ブスマを２５℃の水に（４時間以上、特には１２時間以上）浸漬することで、原点付近の発色バンドを、より上側に展開されるバンドに転化させることができることが示された。この結果は、内在性酵素の働きによって、シアル酸含有化合物の‘低分子化、断片化’が起こり、低極性化したためと考えられる。
すなわち、特別な酵素を添加することなく、小麦小ブスマ中のシアル酸含有化合物を低分子化、断片化させること（シアル酸含有化合物の組成を変化させること）が出来、易溶性を向上（溶出効率を向上）させることができることが示唆された。【０１０２】
試験例１８（各穀類糠の粗抽出液からのレクチンブロットによるシアル酸含有化合物の検出確認）
米（ひとめぼれ）糠、小麦（ニシノチカラ）フスマ、大麦（マンネンボシ）フスマ３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。
これら混合物に超音波処理装置（Ｂ−４２Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＢＲＡＮＳＯＮ製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を直ちに１０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した（試料１８−１〜１８−３）。
上記工程により得られた粗抽出液を、シリカゲルプレート上で、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）によって展開することで成分ごとに分離したのち、冷風乾燥した。
このシリカゲルプレートをポリ（イソブチルメタクリレート）のｎ−ヘキサン／ＣＨ３Ｃｌ＝９／１（Ｖ／Ｖ）溶液（濃度２ｇ／５００ｍＬ）に３０秒間浸漬し、冷風乾燥した。【０１０３】
次いで、このポリ（イソブチルメタクリレート）処理をしたシリカゲルプレートを、プラスチック容器中でＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＭＡＡレクチン（Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ製）の０．１５Ｍ塩化ナトリウム−１％ＢＳＡ入り０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２〜７．４）で１００倍希釈した溶液に浸漬し、室温にて２４時間振盪して、レクチン結合反応を行った。
なお、‘ＭＡＡレクチン’は、「Ｎ−アセチルノイラミン酸α（２→３）Ｇａｌ」構造に特異的に結合するレクチンである。
レクチン結合反応終了後、ポリ（イソブチルメタクリレート）処理シリカゲルプレートに対し洗浄操作をおこない、目的物に結合していない蛍光レクチンを洗浄除去したのち、蛍光の観察される部分、すなわちシアル酸に特異的に結合するレクチンの存在部位を観察することで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を、図１８に示す。【０１０４】
なお、図１８は、ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ／０．２％ＣａＣｌ２＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＭＡＡレクチンを反応させた結果である。すなわち、左側の写真はレクチン結合反応を行う前のシリカゲルプレートの撮影画像であり、右はレクチン結合反応を行った後のシリカゲルプレートの撮影画像である。
図１８において、レーン１は米（ひとめぼれ）糠から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１８−１）を、レーン２は小麦（ニシノチカラ）フスマから抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１８−２）を、レーン３は大麦（マンネンボシ）フスマから抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１８−３）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。【０１０５】
図１８が示すように、蛍光レクチン結合反応前（各図の左側写真）において発光していない部分が、蛍光レクチン結合操作後（各図の右側写真）では発光していることが観察された（矢印の部分）。この各図の右側写真の発光部分とは、蛍光標識されたＭＡＡレクチンが、上記Ｎ−アセチルノイラミン酸に特異的な構造を有する化合物と特異的に結合していることを示すものである。
詳しくは、「Ｎ−アセチルノイラミン酸α（２→３）Ｇａｌ」構造を有する化合物が存在することが示すものである。
従って、本試験例の結果から、米糠、小麦フスマ、大麦フスマの水抽出液中に、‘シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を含む化合物’が存在することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明によれば、動物罹患性病原体の混入のおそれがなく、摂取する上で安全な植物由来の原料、特に穀類又は豆類の種子およびその加工品、から、水溶性シアル酸含有化合物を提供することができる。
また、本発明によれば、植物由来廃棄物である米糠（赤糠、白糠）、小麦フスマ、大麦フスマ、くず大豆、規格外小豆、トウモロコシから澱粉を抽出した残り粕、から、水溶性シアル酸含有化合物を提供することができる。
さらに、本発明品である植物由来のシアル酸含有化合物は、シアル酸を含有する機能性食品、高付加価値化粧品および医薬品原料として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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