(57)【要約】核酸等を用いた肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法を提供する。これらは肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断または治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（h）のいずれかの核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（a）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（b）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、１７〜２８塩基の核酸
（c）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（d）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（e）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列の２〜８番目の塩基配列を含む核酸
（f）配列番号１５４４〜３３７１および３７４２〜４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（g）配列番号１５４４〜３３７１および３７４２〜４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（h）配列番号１５４４〜３３７１のおよび３７４２〜４１４７いずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
【請求項２】
核酸がマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体である、請求項１に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸または請求項４に記載の二本鎖核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸の発現または機能を制御する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
【請求項７】
核酸の発現または機能を制御する物質がsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
【請求項９】
核酸の標的配列の発現を抑制する物質がsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項８に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４に記載の二本鎖核酸、請求項５に記載のベクター、または請求項６〜９のいずれか１項に記載の物質を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸の発現量、該核酸の変異または該核酸をコードするゲノムの変異を検出する試薬を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬。
【請求項１２】
肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、請求項１０または１１に記載の診断薬または治療薬。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の脱顆粒抑制剤の有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満細胞の異常に起因する疾患の治療方法。
【請求項１４】
肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、請求項１３に記載の治療方法。
【請求項１５】
肥満細胞の異常に起因する疾患の治療薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脱顆粒抑制剤の使用。
【請求項１６】
肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４に記載の二本鎖核酸、請求項５に記載のベクター、または請求項６〜９のいずれか１項に記載の物質を用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒制御方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸の発現または機能を促進または抑制させることを指標とする、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の一種であるマイクロＲＮＡ(miRNA)は、蛋白質に翻訳されない約２２ヌクレオチドからなる小さな非コード一本鎖ＲＮＡであり、ヒトを含む生物に多数存在することが知られている（非特許文献１、２）。マイクロＲＮＡは、単一またはクラスター化されたマイクロＲＮＡ前駆体に転写される遺伝子から生成される。すなわち、まず遺伝子から一次転写産物であるprimary-microRNA (pri-miRNA)が転写され、次いでpri-miRNAから成熟型マイクロＲＮＡへの段階的プロセシングにおいて、特徴的なヘアピン構造を有する約70塩基のprecursor-microRNA (pre-miRNA)がpri-miRNAから生成される。さらに、Dicer介在によるプロセシングによりpre-miRNAから成熟型マイクロＲＮＡが生成される（非特許文献３）。【０００３】
成熟型マイクロＲＮＡは、標的となるmRNAに相補的に結合してmRNAの翻訳を抑制するか、あるいはmRNAを分解することにより、遺伝子発現の転写後制御に関与していると考えられている。
マイクロＲＮＡが標的mRNAの発現を抑制するメカニズムについては完全には明らかになっていないが、近年の研究により概要が解明されつつある。マイクロＲＮＡは標的となるmRNAの3’末端側非翻訳領域(3’UTR)中の部分的に相補的な配列に結合し、その翻訳を抑制し、または標的mRNAを分解することで発現を抑制する。上記の相補性は完全でなくても良いが、特にマイクロＲＮＡの5’- 末端側から２番目から８番目までの塩基の相補性が重要であることが示されており、この領域をマイクロＲＮＡの「シード配列(seed sequence)」と呼ぶこともある（非特許文献４）。シード配列が共通するマイクロＲＮＡは他の配列が異なっていても、共通の標的mRNAの発現を抑制することが示されている。従って、任意のmRNAの3’-末端に存在する配列と相補的な配列をシード配列となるようにすることで、マイクロＲＮＡ様の活性を有するＲＮＡを設計することができる。マイクロＲＮＡはsiRNAとは異なり、通常は細胞内に天然に存在するＲＮＡのみを指すことが多いため、このようにして設計したマイクロＲＮＡ様配列を特に人工マイクロＲＮＡと呼ぶ場合がある。【０００４】
2007年8月現在、マイクロＲＮＡのデータベースmiRBase（http://microrna.sanger.ac.uk/）には、ヒトで533種、全生物種で5,071種のマイクロＲＮＡが登録されている。ヒトを含む哺乳類で発現するマイクロＲＮＡの中で、その生理的機能に関して知られているものは、血球系分化に関与するmiR-181（非特許文献５）やインシュリン分泌に関与するmiR-375（非特許文献６）などごく一部のみであり、多くはその生理的活性が未解明である。ただし、線虫やショウジョウバエを用いた研究からマイクロＲＮＡが生物の発生、分化に様々な重要な役割を果たしていることが明らかとなってきており、ヒト疾患との関係においても、特に癌との深い関係を示唆する報告がされている(非特許文献７)。【０００５】
肥満細胞は各種刺激により活性化され、脱顆粒を起こし、数多くの炎症性メディエーターを遊離、産生することが知られている（非特許文献８〜１０）。メディエーターはアミン類、アラキドン酸代謝産物、プロテアーゼ、サイトカイン、ケモカインなど多種多様である。例えば、肥満細胞に抗原が認識されると、脱顆粒によりヒスタミンやトリプターゼが速やかに放出されると共に、プロスタグランジンD2（PGD2）、ロイコトリエン（LT）、血小板活性化因子（PAF）などのケミカルメディエーター、およびマクロファージ炎症性蛋白質（MIP）-1α等の各種のケモカインや顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）等の各種サイトカインが新たに合成され、放出されることが知られている。また、これまで好酸球が作ると考えられていた細胞障害性蛋白質である主要塩基性蛋白質（major basic protein）に関しても、ヒトの場合は肥満細胞が多量につくることが最近明らかになっている（非特許文献１１）。【０００６】
このように、肥満細胞は種々のアレルギー疾患の病態形成において主要な役割を演じていると考えられることから、肥満細胞の機能を制御することにより、アレルギー疾患の治療が可能であると考えられる。
肥満細胞からの炎症性メディエーター遊離を抑制する作用を有する種々の既存のアレルギー治療薬が知られているが、従来はげっ歯類の肥満細胞を用いた研究が主体であり、ヒト肥満細胞に対して実際に効果があるかについては充分検討されていなかった。しかし、最近、ヒト肥満細胞の調製法が確立され、既存薬のヒト肥満細胞に対する作用を解析することが可能になり、げっ歯類肥満細胞に対する作用と比較することが可能になった。その結果、げっ歯類肥満細胞とヒト肥満細胞では、薬剤への反応性が異なることが明らかになっている（非特許文献９）。例えば、炎症性メディエーター遊離抑制薬として使用されているクロモグリク酸ナトリウムは、ラット腹腔肥満細胞においてはIgE依存性の炎症性メディエーター遊離を顕著に抑制するが、ヒト肥満細胞に対する作用は強いものではなかった（非特許文献１２）。塩酸アゼラスチンは、高濃度においてはヒト培養肥満細胞からのヒスタミン、PGD2、LTの遊離、GM-CSFおよびMIP-1αの産生を抑制するが、いずれの活性も強いものではなかった。また、抗サイトカイン薬として使用されているトシル酸スプラタストは、ラット肥満細胞に対して炎症性メディエーター遊離抑制作用を示したが、ヒト肥満細胞に対する作用はなかった（非特許文献１２）。【０００７】
肥満細胞で発現する遺伝子は、種々のアレルギー疾患の治療薬のターゲットとなり得る点で重要であり、例えば、肥満細胞に発現しているGPCRに作用する薬剤が、ヒト培養肥満細胞からの炎症性メディエーターの産生を顕著に抑制することが知られている。具体的には、β2アドレナリン受容体刺激薬イソプロテレノールは10 nmol/lの低濃度で、ヒト培養肥満細胞からのヒスタミン、LT、PGD2、GM-CSFおよびMIP-1αの遊離を80％以上抑制する（非特許文献１３）。
また、各種刺激により活性化されたヒト肥満細胞とマウス肥満細胞で発現が誘導される遺伝子について比較された結果、ヒトとマウスでは発現する遺伝子が必ずしも一致しないことが明らかになった（非特許文献１４）。しかも上述したようにヒトとマウスでは、薬剤の反応性にも種差がある。
マイクロRNAが遺伝子発現制御に関わっていることを踏まえると、肥満細胞で発現するマイクロRNAも種々のアレルギー疾患の治療薬の候補となり得ると考えられる。現時点ではマウス骨髄由来肥満細胞で発現するマイクロRNAに関しての解析（非特許文献１５）があるだけであり、ヒト肥満細胞で発現するマイクロRNAについては報告されていない。ヒトとマウスの種差を考慮すると、マウス肥満細胞のマイクロRNAの発現情報をもとに、ヒト肥満細胞のマイクロRNAの発現情報を予測することは困難である。また、マイクロRNAの、肥満細胞の多用な機能に対する関与も知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
非特許文献１−Science, 294, 853-858 (2001)
非特許文献２−Cell，113, 673-676 (2003)
非特許文献３−Nature Reviews Genetics, 5, 522-531 (2004)
非特許文献４−Current Biology, 15, R458-R460 (2005)
非特許文献５−Science, 303, 83-86 (2004)
非特許文献６−Nature, 432, 226-230 (2004)
非特許文献７−Nature Reviews Cancer, 6, 259-269 (2006)
非特許文献８−黒沢元博編，「肥満細胞の臨床」，先端医学社，p142 (2001)
非特許文献９−黒沢元博編，「肥満細胞の臨床」，先端医学社，p559 (2001)
非特許文献１０−Crit. Rev. Immunol., 22, 115-140 (2002)
非特許文献１１−Blood, 98, 1127-1134 (2001)
非特許文献１２−Clin. Exp. Allergy, 28, 1228-1236 (1998)
非特許文献１３−J. Allergy Clin. Immunol., 103, 421-426 (1999)
非特許文献１４−Blood, 100, 3861-3868 (2002)
非特許文献１５−Genome Biology, 6, R71 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒトの種々の臓器で発現しているマイクロＲＮＡやその前駆体などの核酸を同定し、その機能を解析し、疾患との関係を解明することにより、新しい治療薬および診断薬が開発されることが期待される。
特に、肥満細胞で作用しているマイクロＲＮＡやその前駆体などの核酸を見出すことは、肥満細胞における分化や脱顆粒、サイトカイン産生肥満細胞の分化や脱顆粒、炎症性メディエーター産生、サイトカイン産生、ケモカイン産生等の機能解明につながり、肥満細胞の単離・培養・分化制御・脱顆粒制御・炎症性メディエーター産生制御・サイトカイン産生制御・ケモカイン産生制御法の開発およびそれらを利用した新しいアレルギー疾患等の治療法につながると期待できる。【００１０】
本発明の目的は、核酸等を用いた肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の（１）〜（１８）に関する。
（１）以下の（a）〜（h）のいずれかの核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（a）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（b）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含有する、１７〜２８塩基の核酸
（c）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（d）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（e）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列の２〜８番目の塩基配列を含む核酸
（f）配列番号１５４４〜３３７１および３７４２〜４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（g）配列番号１５４４〜３３７１および３７４２〜４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（h）配列番号１５４４〜３３７１および３７４２〜４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（２）核酸がマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体である、（１）に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（３）（１）に記載の核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（４）（１）に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（５）（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸または（４）に記載の二本鎖核酸を発現するベクターを有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（６）（１）に記載の核酸の発現または機能を制御する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（７）核酸の発現または機能を制御する物質がsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（６）に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（８）（１）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（９）核酸の標的配列の発現を抑制する物質がsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（８）に記載の肥満細胞の脱顆粒制御剤。
（１０）（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸、（４）に記載の二本鎖核酸、（５）に記載のベクター、または（６）〜（９）のいずれかに記載の物質を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（１１）（１）に記載の核酸の発現量、該核酸の変異または該核酸をコードするゲノムの変異を検出する試薬を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬。
（１２）肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、（１０）または（１１）に記載の診断薬または治療薬。
（１３）（１）〜（９）のいずれかに記載の脱顆粒抑制剤の有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満細胞の異常に起因する疾患の治療方法。
（１４）肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、（１３）に記載の治療方法。
（１５）肥満細胞の異常に起因する疾患の治療薬の製造のための、（１）〜（９）のいずれかに記載の脱顆粒抑制剤の使用。
（１６）肥満細胞の異常に起因する疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびアレルギー疾患からなる群から選ばれる疾患である、（１５）に記載の使用。
（１７）（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸、（４）に記載の二本鎖核酸、（５）に記載のベクター、または（６）〜（９）のいずれかに記載の物質を用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒制御方法。
（１８）（１）に記載の核酸の発現または機能を促進または抑制させることを指標とする、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、核酸等を用いた肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明で用いる核酸としては、ヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡが混合した重合体、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体をあげることができ、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。該核酸は、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。また二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。
【００１４】
ヌクレオチド類似体としては、ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、あるいは細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子であれば、いかなる分子であってもよい。例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等があげられる。
【００１５】
糖部修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、2’−O−メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−［2−（グアニジウム）エチル］リボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’−O−フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）(ＢＮＡ)、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）、およびエチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid）（ＥＮＡ）（Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)）があげられ、さらにペプチド核酸（PNA）（Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）（J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)）、およびペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）（J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)）等をあげることができる。
【００１６】
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、N3'-P5'ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等をあげることができる（細胞工学, 16, 1463-1473 (1997)）（RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)）。
【００１７】
核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子があげられる。例えば、5’−ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Cy5付加誘導体、Cy3付加誘導体、6−FAM付加誘導体、およびビオチン付加誘導体等をあげることができる。
【００１８】
本発明で用いる核酸としては、例えば以下の(a)〜(k)で示される核酸をあげることができる。
（a）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（b）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含む含有する、１７〜２８塩基の核酸
（c）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（d）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（e）配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列の２〜８番目の塩基配列を含む核酸
（f）（a）〜（e）の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸、または該二本鎖核酸を含有する核酸
（g）（a）〜（e）の核酸と、該核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸とからなる二本鎖核酸、または該二本鎖核酸を含有する核酸
（h）（f）または（g）の二本鎖核酸が８〜２８塩基からなるスペーサーオリゴヌクレオチドで連結されたヘアピン構造を有する一本鎖核酸、または該一本鎖核酸を含有する核酸
（i）配列番号１５４４〜３３７１および３７４２〜４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（j）配列番号１５４４〜３３７１および３７４２〜４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（k）配列番号１５４４〜３３７１および３７４２〜４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
【００１９】
上記の核酸としては、マイクロＲＮＡが好ましく用いられる。マイクロＲＮＡとは、１７〜２８塩基長からなる一本鎖ＲＮＡをいう。マイクロＲＮＡの該配列を含む周辺ゲノム配列はヘアピン構造を形成し得る配列を有しており、マイクロＲＮＡは該ヘアピンのいずれか片鎖から切り出され得る。マイクロＲＮＡは、その標的となるmRNAに相補的に結合してmRNAの翻訳を抑制し、あるいはmRNAの分解を促進することで遺伝子発現の転写後制御を行う。
【００２０】
本発明で用いるマイクロＲＮＡとしては、例えば、配列番号１〜１５０および３３７２〜３４０６のいずれかで表される塩基配列からなるヒトマイクロＲＮＡをあげることができる。さらに配列番号１〜１５０および３３７２〜３４０６のいずれかで表される塩基配列からなるヒトマイクロＲＮＡと同一の機能を有するマイクロＲＮＡとして、該ヒトマイクロＲＮＡのオーソログである、配列番号１５１〜１２３７および３４０７〜３６８４のいずれかで表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。具体的な例として、配列番号１のヒトマイクロＲＮＡのオーソログは配列番号１５１〜１７３および３４０７で表される塩基配列からなるものがあげられる。配列番号１〜１５０および３３７２〜３４０６のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡとそのオーソログの対応表を表１−１〜表１−８に示す。なお、表１−１〜表１−８の最上段において示される生物種はそれぞれ以下の通りである。hsa、Homo sapiens、ヒト；mmu、Mus musculus、マウス；rno、Rattus norvegicus、ラット；xla、Xenopus laevis、アフリカツメガエル；xtr、Xenopus tropicalis、ニシツメガエル；gga、Gallus gallus、ニワトリ；cfa、Canis familiaris、イヌ；mdo、Monodelphis domestica、ハイイロジネズミオポッサム；age、Ateles geoffroyi、アカクモザル；lla、Lagothrix lagotricha、フンボルトウーリーモンキー；sla、Saguinus labiatus、ムネアカタマリン；mml、Macaca mulatta、アカゲザル；mne、Macaca nemestrina、ブタオザル；pbi、Pygathrix bieti、クロキンシコウ；ggo、Gorilla gorilla、ゴリラ；ppa、Pan paniscus、ボノボ；ptr、Pan troglodytes、チンパンジー；ppy、Pongo pygmaeus、オランウータン；ssy、Symphalangus syndactylus、フクロテナガザル；lca、Lemur catta、ワオキツネザル；cgr、Cricetulus griseus、チャイニーズハムスター；bta、Bos taurus、ウシ；oar、Ovis aries、ヒツジ；ssc、Sus scrofa、ブタ；dre、Danio rerio、ゼブラフィッシュ；fru、Fugu rubripes、トラフグ；tni、Tetraodon nigroviridis、ミドリフグ。ヒト由来マイクロＲＮＡとそのオーソログは、その配列の同一性が高いことから、同様の機能を有していると考えられる。また、マイクロＲＮＡ名末尾に付加されたアルファベットによりサブグループ化されているマイクロＲＮＡ同士もまた、その配列の同一性が高いことから、同様の機能を有していると考えられる。
【００２１】
［表１−１］
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【００２２】
［表１−２］
2009148137.tif 000003
【００２３】
［表１−３］
2009148137.tif 000004
【００２４】
［表１−４］
2009148137.tif 000005
【００２５】
［表１−５］
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【００２６】
［表１−６］
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【００２７】
［表１−７］
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【００２８】
［表１−８］
2009148137.tif 000009
【００２９】
マイクロＲＮＡがその標的遺伝子のmRNAの翻訳を抑制するメカニズムとして、マイクロＲＮＡの5’末端側2〜8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するmRNAは、マイクロＲＮＡ標的遺伝子として認識されることが知られている（Current Biology, 15, R458-R460 (2005)）。このメカニズムにより、該mRNAの発現がマイクロＲＮＡによって抑制される。従って、５’末端側2〜8番目が同じ塩基配列を有するマイクロＲＮＡは、同じ標的遺伝子のmRNAの発現を抑制して同様の機能を有する。配列番号１〜１５０および３３７２〜３４０６のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡと５’末端側2〜8番目が同じ塩基配列を有するマイクロＲＮＡとして、配列番号１２３８〜１５４３および３６８５〜３７４１で表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。該マイクロＲＮＡの具体的な例としては、配列番号１のマイクロＲＮＡに対しては、配列番号１２３８〜１２８６のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡをあげることができる。配列番号１〜１５０および３３７２〜３４０６で表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡとその５’末端側2〜8番目が同じ塩基配列を有するマイクロＲＮＡの対応表を表２−１〜表２−８に示す。共通のシード配列を有するマイクロＲＮＡは、その標的塩基配列が同一と考えられることから、同様の機能を有していると考えられる。
【００３０】
［表２−１］
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【００３１】
［表２−２］
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【００３２】
［表２−３］
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【００３３】
［表２−４］
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【００３４】
［表２−５］
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【００３５】
［表２−６］
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【００３６】
［表２−７］
2009148137.tif 000016
【００３７】
［表２−８］
2009148137.tif 000017
【００３８】
上記の核酸としては、マイクロＲＮＡ前駆体もまた好ましく用いられる。マイクロＲＮＡ前駆体とは、上記本発明で用いる核酸を含む約５０〜約２００塩基長、より好ましくは約７０〜約１００塩基長の核酸であり、ヘアピン構造を形成し得る核酸である。マイクロＲＮＡは、Dicerと呼ばれる蛋白質によるプロセシングを経て、マイクロＲＮＡ前駆体から生成される。
【００３９】
本発明で用いるマイクロＲＮＡ前駆体として、例えば、配列番号１のヒトマイクロＲＮＡに対しては配列番号１５４４〜１５４５で表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。また、配列番号２〜１５４３および３３７２〜３７４１で表されるマイクロＲＮＡに対しては、配列番号１５４６〜３３７１および３７４２〜４１４７で表される塩基配列からなる核酸をあげることができる。本発明で用いるマイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡ前駆体の対応表を表３−１〜表３−３９に示す。
【００４０】
［表３−１］
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【００４１】
［表３−２］
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【００４２】
［表３−３］
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【００４３】
［表３−４］
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【００４４】
［表３−５］
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【００４５】
［表３−６］
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【００４６】
［表３−７］
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【００４７】
［表３−８］
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【００４８】
［表３−９］
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【００４９】
［表３−１０］
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【００５０】
［表３−１１］
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【００５１】
［表３−１２］
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【００５２】
［表３−１３］
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【００５３】
［表３−１４］
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【００５４】
［表３−１５］
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【００５５】
［表３−１６］
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【００５６】
［表３−１７］
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【００５７】
［表３−１８］
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【００５８】
［表３−１９］
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【００５９】
［表３−２０］
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【００６０】
［表３−２１］
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【００６１】
［表３−２２］
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【００６２】
［表３−２３］
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【００６３】
［表３−２４］
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【００６４】
［表３−２５］
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【００６５】
［表３−２６］
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【００６６】
［表３−２７］
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【００６７】
［表３−２８］
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【００６８】
［表３−２９］
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【００６９】
［表３−３０］
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【００７０】
［表３−３１］
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【００７１】
［表３−３２］
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【００７２】
［表３−３３］
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【００７３】
［表３−３４］
2009148137.tif 000051
【００７４】
［表３−３５］
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【００７５】
［表３−３６］
2009148137.tif 000053
【００７６】
［表３−３７］
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【００７７】
［表３−３８］
2009148137.tif 000055
【００７８】
［表３−３９］
2009148137.tif 000056
【００７９】
本発明において、配列番号１〜４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する核酸とは、ＢＬＡＳＴ（J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)）やＦＡＳＴＡ（Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)）等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号１〜３３７１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸と少なくとも９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上である核酸であることを意味する。
【００８０】
また、上記においてストリンジェントな条件とは、一方の鎖をブロットしたメンブレンに対し、7.5 mL、1M Na2HPO4(pH7.2) 0.6 mL、10% SDS 21 mL、50xDenhardt's solution 0.6 mL、10 mg/mL sonicated salmon sperm DNA 0.3 mLからなるHybridization bufferに、32P-ATPで標識した他方の鎖を加え、50 ℃で一晩反応させた後、50 ℃で10分間、5xSSC/5%SDS液で洗浄し、更に50℃で10分間、1xSSC/1%SDS液で洗浄し、その後メンブレンを取り出し、Ｘ線フィルムに感光させることによりシグナルを検出できる条件である。
【００８１】
本発明で用いる核酸を用いてマイクロＲＮＡなどの核酸の発現を検出する方法としては、検体中のマイクロＲＮＡあるいはマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の存在が検出できる方法であれば、いかなる方法でもよく、例えば、（１）ノーザンハイブリダイゼーション、（２）ドットブロットハイブリダイゼーション、（３）in situハイブリダイゼーション、（４）定量的ＰＣＲ、（５）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、（６）マイクロアレイ、（７）リボヌクレアーゼ保護アッセイ等があげられる。
【００８２】
本発明で用いる核酸を用いてマイクロＲＮＡなどの核酸の発現量、該核酸の変異、該核酸をコードするゲノムの変異を検出する方法としては、検体中のマイクロＲＮＡあるいはマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の塩基配列の変異が検出できる方法であればいかなる方法でもよく、例えば、非変異型塩基配列を有する核酸と変異型塩基配列を有する核酸とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法や、あるいは、検体由来の塩基配列を直接配列決定して、変異の有無を検出する方法等をあげることができる。
【００８３】
本発明で用いる核酸を発現するベクターとしては、細胞内に導入して転写されることにより本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸が生合成されるように設計されたベクターであればいかなるものであってもよい。細胞内で本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸を発現することができるベクターとしては、具体的には、pCDNA6.2-GW/miR（Invitrogen社製）、pSilencer 4.1-CMV（Ambion社製）、pSINsi-hH1 DNA（タカラバイオ社製）、pSINsi-hU6 DNA（タカラバイオ社製）、pENTR/U6（Invitrogen社製）等をあげることができる。
【００８４】
本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の標的塩基配列を有する遺伝子（以下、標的遺伝子ともいう）の発現を抑制する方法としては、該標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する方法であれば、いかなる方法でもよい。なお、発現を抑制するとは、mRNAの翻訳を抑制させる場合、およびmRNAを切断あるいは分解することによって、結果としてmRNAから翻訳される蛋白質の量を減少させる場合も含まれる。該標的塩基配列を有するmRNAの発現を抑制する物質としては、具体的にはsiRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸があげられる。該siRNAは、該mRNAの連続した配列情報を基に作製することができる（Genes Dev., 13, 3191 (1999)）。siRNAの一方の鎖を構成する塩基の残基数は、好ましくは１７〜３０残基、より好ましくは１８〜２５残基、さらに好ましくは１９〜２３残基である。
【００８５】
本発明で用いられるマイクロＲＮＡとしては、配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表されるマイクロＲＮＡの標的塩基配列を有する遺伝子（標的遺伝子）に存在する連続する７塩基の配列と相補する配列を２〜８番目の塩基配列として含む、１７〜２８塩基長からなる一本鎖ＲＮＡである人工マイクロＲＮＡも含まれる。人工マイクロＲＮＡ配列を含みそれを前後に延長させた配列がヘアピン構造を形成し、該マイクロＲＮＡ配列が細胞内でそのヘアピン構造のいずれか片鎖からマイクロＲＮＡの生合成経路によって切り出され得るＲＮＡである場合、その延長された配列を人工マイクロＲＮＡ前駆体という。発現を抑制したい遺伝子を標的遺伝子として、上記のような方法を用いて人工マイクロＲＮＡおよび人工マイクロＲＮＡ前駆体を設計することができる。
【００８６】
マイクロＲＮＡの標的塩基配列とは、本発明で用いるマイクロＲＮＡによって認識される数塩基からなる核酸の塩基配列で、かつ、該塩基配列を有するmRNAの発現が該マイクロＲＮＡにより抑制される塩基配列をいう。マイクロＲＮＡの5’末端側2〜8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列は、該塩基配列を有するmRNAが該マイクロＲＮＡによって翻訳が抑制されるので（Current Biology, 15, R458-R460 (2005)）、本発明で用いるマイクロＲＮＡの5’末端側2〜8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列が、該マイクロＲＮＡの標的塩基配列としてあげることができる。例えば、マイクロＲＮＡの5’末端側2-8番目の塩基配列に対して相補的な標的配列を用意し、ヒトmRNAの3'UTR塩基配列群に対して、文字列探索などの方法で選抜することで、完全一致配列を含有するmRNAを決定することができる。ヒトmRNAの3'UTR塩基配列群は、「UCSC Human Genome Browser Gateway（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）」より取得できるゲノム配列および遺伝子位置情報を用いて作製することができる。
【００８７】
配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表されるマイクロＲＮＡの標的塩基配列を有する遺伝子の具体的な例としては、米国国立バイオテクノロジー情報センターNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のEntreGeneデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/）で使われている名前（Official SymbolとGene ID）で表記された表４−１〜表４〜１４８に記載の遺伝子をあげることができる。
【００８８】
［表４−１］
2009148137.tif 000057
【００８９】
［表４−２］
2009148137.tif 000058
【００９０】
［表４−３］
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【００９１】
［表４−４］
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【００９２】
［表４−５］
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【００９３】
［表４−６］
2009148137.tif 000062
【００９４】
［表４−７］
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【００９５】
［表４−８］
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【００９６】
［表４−９］
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【００９７】
［表４−１０］
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【００９８】
［表４−１１］
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【００９９】
［表４−１２］
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【０１００】
［表４−１３］
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【０１０１】
［表４−１４］
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【０１０２】
［表４−１５］
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【０１０３】
［表４−１６］
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【０１０４】
［表４−１７］
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【０１０５】
［表４−１８］
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【０１０６】
［表４−１９］
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【０１０７】
［表４−２０］
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【０１０８】
［表４−２１］
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【０１０９】
［表４−２２］
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【０１１０】
［表４−２３］
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【０１１１】
［表４−２４］
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【０１１２】
［表４−２５］
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【０１１３】
［表４−２６］
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【０１１４】
［表４−２７］
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【０１１５】
［表４−２８］
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【０１１６】
［表４−２９］
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【０１１７】
［表４−３０］
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【０１１８】
［表４−３１］
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【０１１９】
［表４−３２］
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【０１２０】
［表４−３３］
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【０１２１】
［表４−３４］
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【０１２２】
［表４−３５］
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【０１２３】
［表４−３６］
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【０１２４】
［表４−３７］
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【０１２５】
［表４−３８］
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【０１２６】
［表４−３９］
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【０１２７】
［表４−４０］
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【０１２８】
［表４−４１］
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【０１２９】
［表４−４２］
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【０１３０】
［表４−４３］
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【０１３１】
［表４−４４］
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【０１３２】
［表４−４５］
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【０１３３】
［表４−４６］
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【０１３４】
［表４−４７］
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【０１３５】
［表４−４８］
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【０１３６】
［表４−４９］
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【０１３７】
［表４−５０］
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【０１３８】
［表４−５１］
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【０１３９】
［表４−５２］
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【０１４０】
［表４−５３］
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【０１４１】
［表４−５４］
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【０１４２】
［表４−５５］
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【０１４８】
［表４−６１］
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【０１４９】
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【０１５０】
［表４−６３］
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【０１５１】
［表４−６４］
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【０１５２】
［表４−６５］
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【０１５３】
［表４−６６］
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【０１５４】
［表４−６７］
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【０１５５】
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【０１５６】
［表４−６９］
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【０１５７】
［表４−７０］
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【０１５８】
［表４−７１］
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【０１５９】
［表４−７２］
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【０１６０】
［表４−７３］
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【０１６１】
［表４−７４］
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［表４−７５］
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【０１６３】
［表４−７６］
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【０１６４】
［表４−７７］
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【０１６５】
［表４−７８］
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【０１６６】
［表４−７９］
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【０１６７】
［表４−８０］
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【０１６８】
［表４−８１］
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【０１６９】
［表４−８２］
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【０１７０】
［表４−８３］
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【０１７１】
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【０１７２】
［表４−８５］
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【０１７６】
［表４−８９］
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【０２１０】
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【０２３０】
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【０２３１】
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【０２３３】
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【０２３４】
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【０２３５】
［表４−１４８］
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【０２３６】
本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の発現または機能を制御する物質としては、該核酸の発現または機能を阻害する物質であれば、低分子化合物、抗体、siRNAなどいかなる物質でも良いが、特にsiRNAが好ましい。本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の発現を抑制する物質としては、マイクロＲＮＡの生合成に必須な因子の機能を阻害する物質を用いることもできる。マイクロＲＮＡの生合成に必須な因子としては、例えば、Dicer、TRBP、Exportin5、Drosha、DGCR8などがあげられる。
【０２３７】
本発明において、マイクロＲＮＡなどの核酸を細胞で発現させる方法としては、例えば、マイクロＲＮＡをコードする遺伝子の他、細胞内に導入された際にマイクロＲＮＡなどを発現する核酸を用いる方法があげられる。該核酸としては、DNA、RNAまたはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、Pre-miRTMmiRNA Precursor Molecules（Ambion社製）やmiRIDIAN microRNA Mimics（GEヘルスケア社製）と同様に該核酸を設計し、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸を細胞内で発現させることができる。マイクロＲＮＡを発現させる場合は、細胞内で最終的にマイクロＲＮＡができる状態になればいかなる方法でもよく、例えば、（１）マイクロＲＮＡ前駆体である一本鎖ＲＮＡ、（２）マイクロＲＮＡおよび該マイクロＲＮＡの相補鎖からなり、かつ両者が完全に相補する２本鎖からなるＲＮＡ、（３）マイクロＲＮＡがDicerに切断された後の状態を想定した２本鎖ＲＮＡを、それぞれ導入させる方法があげられる。こうした方法を使用した製品としては、それぞれ例えば、miCENTURY OX Precursor（B-Bridge社製）、miCENTURY OX siMature（B-Bridge社製）、miCENTURY OX miNatural（B-Bridge社製）をあげることができる。
【０２３８】
本発明で用いる核酸を製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型として典型的なファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6 RNAポリメラーゼを用いた転写をあげることができる。
【０２３９】
本発明で用いる核酸を用いて、該核酸の発現または機能を制御する物質をスクリーニングする方法としては、例えば、該核酸を発現するベクターを細胞に導入し、それらの標的塩基配列を有するmRNAの発現または機能を促進または抑制する物質をスクリーニングする方法があげられる。
本発明で用いる核酸を有効成分とする医薬は、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断または治療に用いることができる。
【０２４０】
肥満細胞の異常に起因する疾患としては、具体的には、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、およびアレルギー疾患等をあげることができる。
肥満細胞の異常としては、脱顆粒の異常があげられるため、本発明で用いる核酸は、肥満細胞の脱顆粒制御剤、すなわち脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤として用いることができる。
【０２４１】
肥満細胞の脱顆粒抑制剤は、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、およびアレルギー疾患等の予防剤、治療剤として、好適に用いられる。
肥満細胞の脱顆粒促進剤は、免疫付活化剤として、好適に用いられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の発現を検出する方法
（１−１）肥満細胞の取得、培養
ヒト肥満細胞は、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば、ヒトの肺、皮膚、胎児肝臓などから公知の方法（J. Immunol. Methods, 169, 153 (1994); J. Immunol., 138, 861 (1987); J. Allergy Clin. Immunol., 107, 322 (2001); J. Immunol. Methods., 240, 101 (2000)）により調製することができる。また、公知の方法（J. Immunol., 157, 343, (1996); Blood, 91, 187 (1998); J. Allergy Clin. Immunol., 106, 141 (2000); Blood, 97, 1016 (2001); Blood, 98, 1127 (2001); Blood, 100, 3861 (2002); Blood, 97, 2045 (2001)）に従って、ヒトの臍帯血、末梢血、骨髄、肺あるいは皮膚から調製した単核球を、幹細胞因子（Stem Cell Factor, 以下、SCFと略す）の存在下で培養し、肥満細胞に分化させることにより、調製することができる。
【０２４２】
また、ヒト肥満細胞から樹立した細胞株を用いることもできる。ヒト肥満細胞株としては、ヒト肥満細胞の性質をよく保持していることが知られているLAD2（Leuk. Res., 27, 671 (2003); Leuk. Res., 27, 677 (2003)）等があげられる。
（１−２）RNAの取得
上記の各種方法で取得した肥満細胞から全RNAを抽出する方法は、マイクロＲＮＡなどの低分子RNAが含まれる方法であれば特に限定されないが、例えば、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行うことができる。あるいは、Trizol（Invitrogen社製）、ISOGEN（ニッポンジーン社製）、mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Ambion社製）、miRNeasy Mini Kit（キアゲン社製）などを用いて抽出することもできる。
【０２４３】
また、低分子RNAを含む全RNAから低分子RNAをクローニングすることもできる。低分子RNAのクローニング法としては、具体的には、ジーンズ  アンド  デベロップメント（Genes & Development）, 15, 188-200 (2000)に記載の方法に準じて、15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子RNAを分離する方法があげられる。これより5’末端脱リン酸化、3’−アダプターライゲーション、リン酸化、5’−アダプターライゲーション、逆転写、PCR増幅、コンカテマー化、ベクターへのライゲーションを順次経て、低分子RNAをクローニングし、そのクローンの塩基配列を決定する方法等があげられる。あるいは、例えば、サイエンス（Science）, 294, 858-862 (2001)に記載の方法に準じて、15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子RNAの分離および切り出し、5’−アデニル化3’−アダプターライゲーション、5’−アダプターライゲーション、逆転写、PCR増幅、コンカテマー化、ベクターへのライゲーションを順次経て、低分子RNAをクローニングし、そのクローンの塩基配列を決定することもできる。
【０２４４】
また、Nucleic Acids Research, 34, 1765-1771 (2006)に記載の方法により、15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子RNAの分離および切り出し、5’末端脱リン酸化、3’−アダプターライゲーション、リン酸化、5’−アダプターライゲーション、逆転写、PCR増幅、マイクロビーズベクターへのライゲーションを順次経て、低分子RNAをクローニングし、そのマイクロビーズの塩基配列を読み取ることで塩基配列を決定することにより低分子RNAを取得することもできる。
【０２４５】
低分子RNAを取得する他の方法として、small RNA Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いる方法があげられる。
（１−３）マイクロＲＮＡの同定
低分子RNA配列がマイクロＲＮＡであるかは、アール  エヌ  エイ（RNA）, 9, 277-279 (2003)に記載の基準に従うか否かで判定できる。例えば、新たに取得して塩基配列を決定した低分子RNAの場合、以下のようにして判定することができる。
【０２４６】
取得した低分子RNA塩基配列に対応するDNA配列を5’末端側および3’末端側にそれぞれ50 塩基程度伸ばした周辺ゲノム配列を取得し、そのゲノム配列から転写されることが予測されるRNAの2次構造を予測する。その結果、ヘアピン構造を有し、且つ該低分子RNAの塩基配列がヘアピンの片鎖に位置する場合、該低分子RNAはマイクロＲＮＡであると判定できる。ゲノム配列は一般に公開されており、例えば、UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu/) から入手可能である。また、2次構造予測も様々なプログラムが公開されており、例えば、RNAfold （Nucleic Acids Research, 31, 3429-3431 (2003)）やMfold （Nucleic Acids Research, 31, 3406-3415 (2003)） 等を用いることができる。また、既存のマイクロＲＮＡ配列はmiRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/) というデータベースに登録されており、ここに記載の配列と同一か否かで、既存のマイクロＲＮＡと同一か否かを判定することができる。
（１−４）マイクロＲＮＡなどの核酸の発現量の検出法
マイクロＲＮＡおよびその前駆体などの核酸の発現量を検出する方法としては、例えば、（１）ノーザンハイブリダイゼーション、（２）ドットブロットハイブリダイゼーション、（３）in situハイブリダイゼーション、（４）定量的PCR、（５）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、（６）マイクロアレイ、（７）リボヌクレアーゼ保護アッセイ等による方法があげられる。
【０２４７】
ノーザンハイブリダイゼーションは、検体由来RNAをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持体に転写し、該核酸の塩基配列をもとに適宜標識をしたプローブを作製し、ハイブリダイゼーションおよび洗浄をおこなうことで、本発明の核酸に特異的に結合したバンドを検出する方法であり、具体的には、例えば、Science, 294, 853-858 (2001)に記載の方法等に従って行うことができる。
【０２４８】
標識プローブは、例えば、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたは5'末端のリン酸化等の方法により放射性同位体、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基、化学発光基等を、該核酸の塩基配列と相補的な配列を有するDNAやRNA、あるいはLNAに取り込ませることで調製できる。標識プローブの結合量は該核酸の発現量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することで該核酸の発現量を定量することができる。電気泳動、メンブレンへの移行、プローブの調製、ハイブリダイゼーション、核酸の検出については、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行うことができる。
【０２４９】
ドットブロットハイブリダイゼーションは、組織や細胞から抽出したRNAをメンブラン上に点状にスポットして固定し、プローブとなる標識したポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを行い、プローブと特異的にハイブリダイズするRNAを検出する方法である。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものを用いることができる。RNAの調製、RNAのスポット、ハイブリダイゼーション、RNAの検出については、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行なうことができる。
【０２５０】
in situハイブリダイゼーションは、生体から取得した組織のパラフィンまたはクリオスタット切片、あるいは固定化した細胞を検体として用い、標識したプローブとハイブリダイゼーションならびに洗浄の工程を行い、顕微鏡観察により、核酸の組織や細胞内での分布や局在を調べる方法である（Methods in Enzymology, 254, 419 (1995)）。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものを用いることができる。具体的には、Nature Method, 3, 27 (2006)に記載の方法に従って、マイクロＲＮＡなどの核酸を検出することができる。
【０２５１】
定量的PCRでは、検体由来RNAから、逆転写用プライマーと逆転写酵素を用いて合成したcDNA（以下、該cDNAを検体由来cDNAともいう）を測定に用いる。cDNA合成に供する逆転写用プライマーとして、ランダムプライマーあるいは特異的RTプライマー等を用いることができる。特異的RTプライマーとは、核酸およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列に相補する配列を有するプライマーをいう。
【０２５２】
例えば、検体由来cDNAを合成後、これを鋳型とし、本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列、あるいは逆転写用プライマーに対応する塩基配列から設計した鋳型特異的なプライマーを用いてPCRを行い、本発明で用いる核酸を含むcDNAの断片を増幅させ、ある一定量に達するまでのサイクル数から検体由来RNAに含まれる本発明の核酸の量を検出する。鋳型特異的なプライマーとしては、該核酸およびその周辺ゲノム配列に対応する適当な領域を選択し、その領域の塩基配列の5'端20〜40塩基の配列からなるDNAまたはLNA、および3'端20〜40塩基と相補的な配列からなるDNAまたはLNAの組を用いることができる。具体的には、Nucleic Acids Research, 32, e43 (2004)に記載の方法等に準じて行うことができる。
【０２５３】
または、cDNA合成に供する逆転写用プライマーとして、ステム・ループ構造を有した特異的RTプライマーを用いることもできる。具体的には、Nucleic Acid Research, 33, e179 (2005)に記載の方法により、あるいは、TaqMan MicroRNA Assays（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行うことができる。
更に、本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を少なくとも1つ以上含む塩基配列に対応するDNAあるいはLNAを、固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基盤に対して、検体由来cDNAをハイブリダイゼーションし、洗浄を行うことにより、該核酸の量の変動を検出することができる。このようなハイブリダイゼーションに基づく方法としては、ディファレンシャルハイブリダイゼーション（Trends Genet., 7, 314 (1991)）やマイクロアレイ（Genome Res., 6, 639 (1996)）を用いる方法があげられる。いずれの方法もフィルターあるいは基盤上にU6RNAに対応する塩基配列などの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間での該核酸の量の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来のRNAをもとにそれぞれ異なる標識のdNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合物）を用いて標識cDNA合成を行い、１枚のフィルターあるいは１枚の基盤に２つの標識cDNAを同時にハイブリダイズさせることで正確に該核酸の定量を行うことができる。例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 9740-9744 (2004)やNucleic Acid Research, 32, e188 (2004)等に記載のマイクロアレイを用いてマイクロＲＮＡなどの核酸を検出することができる。具体的には、mirVana miRNA Bioarray（Ambion社製）を用いて検出または定量することができる。
【０２５４】
リボヌクレアーゼ保護アッセイでは、まず本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸あるいはその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列の3'端にT7プロモーター、SP6プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、標識したNTP（ATP、GTP、CTP、UTPの混合物）およびRNAポリメラーゼを用いたイン・ビトロの転写系により、標識したアンチセンスRNAを合成する。該標識アンチセンスRNAを、検体由来RNAと結合させて、RNA-RNAハイブリッドを形成させた後、１本鎖RNAのみを分解するリボヌクレアーゼAで消化する。該消化物をゲル電気泳動し、RNA-RNAハイブリッドを形成することにより消化から保護されたRNA断片を、該核酸として検出または定量する。具体的には、mirVana miRNA Detection Kit（Ambion社製）を用いて検出または定量することができる。
２．核酸の合成
本発明で用いるマイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸は、塩基配列に基づいてリボヌクレオチドの重合体であるRNAの他、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNAも合成することができる。例えば、上記１で同定したマイクロＲＮＡの塩基配列をもとに、DNAの塩基配列を決定することができる。RNAの塩基配列に対応するDNAの塩基配列は、RNAの配列に含まれるU（ウラシル）をT（チミン）に読み替えることで一義的に決定できる。また、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体や、ヌクレオチド類似体を含む重合体も同様にして合成することができる。
【０２５５】
本発明で用いる核酸を合成する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等を用いることができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型として典型的なファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法をあげることができる。
３．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の機能を検出する方法
マイクロＲＮＡなどの核酸の機能を検出する方法としては、標的塩基配列を有するmRNAの翻訳を抑制するか否かで機能を測定する方法をあげることができる。
【０２５６】
マイクロＲＮＡは、その標的塩基配列を3’UTRに含むmRNAの翻訳を抑制することが知られている（Current Biology, 15, R458-R460 (2005)）。そこで、測定しようとする一本鎖RNAに対する標的塩基配列を、適当なレポーター遺伝子発現ベクターの3’UTRに挿入したDNAを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に一本鎖RNAを発現させた時に、レポーター遺伝子の発現を測定することで、マイクロＲＮＡの機能を有しているか否かを検出することができる。
【０２５７】
レポーター遺伝子発現ベクターは、レポーター遺伝子の上流にプロモーターを有しており、宿主細胞においてレポーター遺伝子が発現できるものであればいかなるものでもよい。レポーター遺伝子としては、例えば、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子、DsRed蛍光遺伝子等を用いることできる。こうした性質を有するレポーター遺伝子発現ベクターとして、例えば、psiCHECK-1（Promega社製）、psiCHECK-2（Promega社製）、pGL3-Control（Promega社製）、pGL4（Promega社製）、pRNAi-GL（タカラバイオ社製）、pCMV-DsRed-Express（CLONTECH社製）等をあげることができる。また、一本鎖RNAは、後述の５に記載した方法で発現させることができる。
【０２５８】
一本鎖ＲＮＡのマイクロＲＮＡとしての機能は、以下のようにして検出することができる。まず宿主細胞をマルチウェルプレート等に培養し、標的配列を有したレポーター遺伝子発現ベクターと一本鎖RNAを発現させる。その後、レポーター活性を測定し、一本鎖RNAを発現させない場合に比べて、一本鎖RNAを発現させた場合のレポーター活性を測定することで、マイクロRNAの機能を検出することができる。
４．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の変異を検出する方法
マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の変異を検出する方法として、正常型と変異型の核酸のハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。
【０２５９】
ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法 （Trends genet., 7, 5 (1991)）、（２）一本鎖コンフォメーション多型解析法 （Genomics, 16, 325-332 (1993)）、（３）ミスマッチの化学的切断法 (CCM, chemical cleavage of mismatches) （Human Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers Limited）、（４）ミスマッチの酵素的切断法 （Nature Genetics, 9, 103-104 (1996)）、（５）変性ゲル電気泳動法 （Mutat. Res., 288, 103-112 (1993)）等の方法があげられる。
【０２６０】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるヘテロ二本鎖検出法は、例えば、以下のようにして行う。まず、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートに対し、本発明で用いる核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列を基に設計したプライマーにより、200 塩基対よりも小さい断片として増幅する。ヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりも移動度が遅く、それらは余分なバンドとして検出することができる。200 塩基対よりも小さい断片であれば、１塩基以上のほとんどの挿入、欠失、置換を検出することができる。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォメーション解析と組み合わせた１枚のゲルで行うことが望ましい。
【０２６１】
一本鎖コンフォメーション多型解析（SSCP解析；single strand conformation polymorphism analysis）では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートにして、本発明の核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて、200bpよりも小さい断片として増幅したDNAを変性後に、未変性ポリアクリルアミドゲル中で泳動する。DNA増幅を行う際にプライマーを同位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標識の増幅産物を銀染色することにより、増幅したDNAをバンドとして検出することができる。野生型のパターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に泳動すると、移動度の違いから変異を持った断片を検出できる。
【０２６２】
ミスマッチ化学的切断法（CCM法）では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートに、本発明の核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したDNA断片を、本発明の核酸に同位体あるいは蛍光標識をとり込ませた標識核酸とハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマッチしている場所のDNAの一方の鎖を切断させ変異を検出することができる。CCMは最も感度の高い検出法の１つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。
【０２６３】
上記の四酸化オスミウムの代わりに、T4ファージリゾルベースとエンドヌクレアーゼVIIのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とRNaseAと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。
変性ゲル電気泳動法（denaturing gradient gel electrophoresis：DGGE法）では、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAをテンプレートに、本発明の核酸の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したDNA断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する。増幅したDNA断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。変異がある場合とない場合では増幅したDNAのゲル内での移動が異なることから、変異の存在を検出できる。検出感度を上げるにはそれぞれのプライマーにポリ（G:C）端末をつけるとよい。
【０２６４】
また、検体由来DNAあるいは検体由来cDNAの塩基配列を直接的に決定し、解析することにより、本発明で用いる核酸の変異を検出することもできる。
５．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を発現させる方法
本発明で用いる核酸は、細胞内に導入して転写されることにより生合成されるようなベクターを用いることにより発現させることができる。具体的には、上記の核酸あるいは、その塩基配列を含むゲノムの塩基配列をもとに、ヘアピン部分を含むＤＮＡ断片を調製し、発現ベクターのプロモーター下流に挿入して発現プラスミドを造成し、次に該発現プラスミドを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、上記の核酸を発現させることができる。
【０２６５】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能または染色体中への組込みが可能で、本発明の核酸の塩基配列を含む遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであれば、いかなるものでもよく、例えば、RNA polymerase II(pol II)系プロモーターやU6RNAやH1RNAの転写系であるRNA polymerase III(pol III)系プロモーター等をあげることができる。pol II系プロモーターとしては例えば、サイトメガロウィルス（ヒトCMV）のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター等をあげることができる。それらを用いた発現ベクターとして、例えば、pCDNA6.2-GW/miR（Invitrogen社製）、pSilencer 4.1-CMV（Ambion社製）等を例示することができる。pol III系プロモーターとしてはU6 RNAやH1 RNAあるいはtRNAのプロモーターをあげることができる。それらを用いた発現ベクターとして、例えば、pSINsi-hH1 DNA（タカラバイオ社製）、pSINsi-hU6 DNA（タカラバイオ社製）、pENTR/U6（Invitrogen社製）等をあげることができる。
【０２６６】
または、本発明で用いる核酸の塩基配列を含む遺伝子をウィルスベクター内のプロモーター下流に挿入して組換えウィルスベクターを造成し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して組換えウィルスを生産して、該核酸の塩基配列を含む遺伝子を発現させることもできる。
パッケージング細胞はウィルスのパッケジ−ングに必要な蛋白質をコードする遺伝子のいずれかを欠損している組換えウィルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいずれの細胞もよく、例えばヒト腎臓由来のHEK293細胞、マウス繊維芽細胞NIH3T3などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウィルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のgag, pol, envなどの蛋白質、レンチウィルスベクターの場合はHIVウィルス由来のgag, pol, env, vpr, vpu, vif, tat, rev, nefなどの蛋白質、アデノウィルスベクターの場合はアデノウィルス由来のE1A,E1Bなどの蛋白質、また、アデノ随伴ウィルスベクターの場合はRep(p5, p19, p40), Vp(Cap)などの蛋白質を用いることができる。
【０２６７】
発現ベクターを用いる以外にも、本発明で用いる核酸を、ベクターを用いずに直接細胞に導入することもできる。本方法で用いられる該核酸としては、DNA、RNAまたはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules（Ambion社製）やmiRIDIAN microRNA Mimics（GEヘルスケア社製）と同様にして、本発明で用いる核酸を発現させることができる。マイクロＲＮＡを発現させる場合は、細胞内で最終的にマイクロＲＮＡができる状態になればいかなる方法でもよく、例えば、（１）マイクロＲＮＡ前駆体である一本鎖ＲＮＡ、（２）マイクロＲＮＡ、および該マイクロＲＮＡの相補鎖からなり、かつ両者が完全に相補する二本鎖からなるＲＮＡ、（３）マイクロＲＮＡがDicerに切断された後の状態を想定した二本鎖ＲＮＡを、それぞれ導入させる方法があげられる。こうした方法を使用した製品としては、miCENTURY OX Precursor（B-Bridge社製）、miCENTURY OX siMature（B-Bridge社製）、miCENTURY OX miNatural（B-Bridge社製）をあげることができる。
６．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の活性を抑制する方法
本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸は、アンチセンス技術（バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology, 9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)）、トリプル・ヘリックス技術（Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)）、リボザイム技術（Current Opinion in Chemical Biology, 3, 274 (1999)、FEMS Microbiology Reviews, 23, 257 (1999)、Frontiers in Bioscience, 4, D497 (1999)、Chemistry & Biology, 6, R33 (1999)、Nucleic Acids Research, 26, 5237 (1998)、Trends In Biotechnology, 16, 438 (1998)）、デコイDNA法（Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 56, 563 (1998)、Circulation Research, 82, 1023 (1998)、Experimental Nephrology, 5, 429 (1997)、Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 54, 2583 (1996)）、あるいはsiRNA（short interfering RNA）を用いて、その活性を抑制することができる。
【０２６８】
アンチセンスとは、ある標的核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸を塩基配列特異的にハイブリダイゼーションさせ、該標的核酸の発現を抑制できるものをいう。アンチセンスに用いる核酸はＤＮＡやＲＮＡまたはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、Nature, 432, 226 (2004)等に記載の方法に従うことでアンチセンスを作製し、発現を抑制することができる。具体的には、Anti-miRTM miRNA Inhibitors（Ambion社製）やmiRIDIAN microRNA Inhibitors（GEヘルスケア社製）と同様にして、本発明で用いる核酸の発現を抑制することができる。
【０２６９】
siRNAとは、ある標的核酸の塩基配列を含む短い二本鎖RNAであり、ＲＮＡ干渉（RNAi）により、該標的核酸の発現を抑制できるものをいう。siRNAの配列は、標的とする塩基配列から文献（Genes Dev., 13, 3191 (1999)）の条件に基づいて適宜設計することができる。選択した19塩基の配列および相補的な配列それぞれの3'端にTTを付加した配列を有する2本のＲＮＡを核酸合成機により合成し、アニーリングすることによりsiRNAを作製できる。また、pSilencer 1.0-U6 （Ambion社製）、pSUPER（OligoEngine社）等のsiRNA発現用ベクターに上記の選択した19塩基の配列に相当するDNAを挿入することにより、該遺伝子の発現を抑制できるsiRNAを発現するベクターを作製することができる。本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の機能を抑制できるsiRNAとしては、該核酸の機能を抑制できるものであればいかなるものでもよいが、配列番号１〜３３７１の配列情報から設計されたsiRNAが好ましい。siRNAの一方の鎖を構成する塩基の残基数は、好ましくは１７〜３０残基、より好ましくは１８〜２５残基、さらに好ましくは１９〜２３残基である。
【０２７０】
肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸に特異的なアンチセンスまたはsiRNAを用いて、肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの発現の抑制を行うことができる。例えば、該マイクロＲＮＡまたは該マイクロＲＮＡ前駆体に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを投与することにより該マイクロＲＮＡの活性を抑制し、肥満細胞におけるマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体の作用を制御することができる。
【０２７１】
また、肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡまたはその前駆体の発現異常による患者の場合、該マイクロＲＮＡやその前駆体に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを患者に投与することにより、肥満細胞の機能を制御し、上記発現異常により発症する疾患の治療をすることができる。すなわち、該マイクロＲＮＡまたはその前駆体に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、肥満細胞の異常に起因する疾患の治療薬として有用である。
【０２７２】
マイクロＲＮＡやその前駆体などの核酸に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを上記の治療薬として使用する場合は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを単独、あるいはこれらをコードする核酸をレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、下記９に記載した常法に従って医薬製剤とし、投与することができる。
７．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を用いて標的遺伝子の機能または発現を抑制する方法
本発明で用いる核酸の標的遺伝子の機能または発現を抑制する方法としては、標的塩基配列を有するmRNAの発現をマイクロＲＮＡなどの核酸が抑制する活性を利用する方法であればいかなる方法を用いてもよい。例えば、本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸を発現させ、細胞内の該核酸の量を増加させることにより、標的配列を有するmRNAの翻訳を抑制し、遺伝子の発現を抑制する方法をあげることができる。なお、本発明の核酸を発現させるには、上記５で記載した方法により行なうことができる。配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の標的塩基配列を有するmRNAとしては、例えば、それぞれ前述の表４で示される遺伝子群を例示することができる。
【０２７３】
また、表４で示される標的遺伝子に対するsiRNAを用いて、該標的遺伝子の機能を抑制することができる。
８．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を用いて該核酸の発現または機能を制御する物質をスクリーニングする方法
本発明で用いる核酸を用いて、マイクロＲＮＡまたはその前駆体などの核酸の発現または機能を制御する、すなわち促進または抑制する物質をスクリーニングすることができる。例えば、本発明で用いるマイクロＲＮＡまたはその前駆体の塩基配列から、スクリーニングの標的とする塩基配列を選択して、該塩基配列を有する核酸を発現する細胞を利用して、選択したマイクロＲＮＡまたはその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすることができる。
【０２７４】
スクリーニングに用いる、マイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体の塩基配列を有する核酸を発現する細胞としては、肥満細胞のほか、上記５で記載したように、該塩基配列を有する核酸を発現するベクターを動物細胞や酵母などの宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞や、該塩基配列を有する核酸をベクターを用いずに直接導入した細胞等を用いることもできる。
【０２７５】
具体的なスクリーニング方法としては、スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡまたはその前駆体などの核酸の発現量の変化を指標にする方法の他、マイクロＲＮＡなどの核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標にする方法をあげることができる。
（ａ）スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡまたはその前駆体の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
該核酸を発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の発現量の変化を指標に、マイクロＲＮＡおよびその前駆体などの核酸の発現を促進または抑制させる物質を得ることができる。核酸の発現量は、上記３で記載した方法により検出することができる。
（ｂ）スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡなどの核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
該mRNAを発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の標的配列を有するmRNAやそれにコードされる遺伝子産物の発現量の変化を指標に、マイクロＲＮＡおよびその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質を得ることができる。または、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸の標的配列を適当なレポーター遺伝子発現ベクターの3’UTRに挿入したDNAを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に試験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量の変化を指標に、マイクロＲＮＡおよびその前駆体などの核酸の発現または機能を促進または抑制させる物質を得ることができる。
【０２７６】
標的配列の選択は、上記７で記載した方法により行なうことができ、配列番号１〜１５４３および３３７２〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡなどの核酸の標的配列を有するmRNAとしては、例えば、それぞれ前述の表４で示される遺伝子群をあげることができる。
９．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を用いた肥満細胞の脱顆粒制御剤
本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸、およびその塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸は、標的配列を有する遺伝子の発現を制御することにより、肥満細胞の脱顆粒制御剤、すなわち脱顆粒抑制剤または脱顆粒促進剤として用いることができる。
【０２７７】
肥満細胞の脱顆粒抑制剤の有効成分としては、下記（a）〜（h）の核酸があげられる。
（a）配列番号１〜７０、１５１〜５８１、１２３８〜１４６１、３４０７〜３４５２のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（b）配列番号１〜７０、１５１〜５８１、１２３８〜１４６１、３４０７〜３４５２のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含む含有する、１７〜２８塩基の核酸
（c）配列番号１〜７０、１５１〜５８１、１２３８〜１４６１、３４０７〜３４５２のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（d）配列番号１〜７０、１５１〜５８１、１２３８〜１４６１、３４０７〜３４５２のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（e）配列番号１〜７０、１５１〜５８１、１２３８〜１４６１、３４０７〜３４５２のいずれかで表される塩基配列の２〜８番目の塩基配列を含む核酸
（f）配列番号１５４４〜１６２１、１６３４、１６６５〜１６６８、１６８８、１７０９〜２１９６、２８６２〜２８６４、２９７８〜３２８７、３３６５、３７８０〜３８２８のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（g）配列番号１５４４〜１６２１、１６３４、１６６５〜１６６８、１６８８、１７０９〜２１９６、２８６２〜２８６４、２９７８〜３２８７、３３６５、３７８０〜３８２８のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（h）配列番号１５４４〜１６２１、１６３４、１６６５〜１６６８、１６８８、１７０９〜２１９６、２８６２〜２８６４、２９７８〜３２８７、３３６５、３７８０〜３８２８のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
上記核酸としては、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ前駆体が好適に用いられる。
【０２７８】
上記（a）〜（h）の核酸の機能または発現を促進する物質を、肥満細胞の脱顆粒抑制剤として用いることもできる。
また、上記（a）〜（h）の核酸の標的遺伝子の機能または発現を抑制する物質を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として用いることもできる。標的遺伝子の発現を抑制する物質としては、該標的遺伝子のmRNAに対するsiRNAや該標的遺伝子に対するアンチセンス等をあげることができる。
【０２７９】
一方、下記（i）〜（p）の核酸の機能または発現を抑制する物質を、肥満細胞の脱顆粒抑制剤として用いることもできる。該核酸の機能または発現を抑制する物質としては、該核酸に対するsiRNAやアンチセンス等をあげることができる。
肥満細胞の脱顆粒促進剤の有効成分としては、下記（i）〜（p）の核酸があげられる。
（i）配列番号７１〜１５０、５８２〜１２３７、１４６２〜１５４３、３３７２〜３４０６、３４５３〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（j）配列番号７１〜１５０、５８２〜１２３７、１４６２〜１５４３、３３７２〜３４０６、３４５３〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸を含む含有する、１７〜２８塩基の核酸
（k）配列番号７１〜１５０、５８２〜１２３７、１４６２〜１５４３、３３７２〜３４０６、３４５３〜３７４１のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（l）配列番号７１〜１５０、５８２〜１２３７、１４６２〜１５４３、３３７２〜３４０６、３４５３〜３７４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
（m）配列番号７１〜１５０、５８２〜１２３７、１４６２〜１５４３、３３７２〜３４０６、３４５３〜３７４１のいずれかで表される塩基配列の２〜８番目の塩基配列を含む核酸
（n）配列番号１５５７、１５７５、１５９０、１５９２〜１５９３、１６２２〜１７０８、１９１９〜１９２５、１９２７〜１９２９、２１１２、２１９７〜２９７７、３０９２〜３０９３、３１６２〜３１６３、３１６９、３１７７、３２８１、３２８８〜３３７１、３７４２〜３７７９、３７９０〜３７９２、３８０７、３８２９〜４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸
（o）配列番号１５５７、１５７５、１５９０、１５９２〜１５９３、１６２２〜１７０８、１９１９〜１９２５、１９２７〜１９２９、２１１２、２１９７〜２９７７、３０９２〜３０９３、３１６２〜３１６３、３１６９、３１７７、３２８１、３２８８〜３３７１、３７４２〜３７７９、３７９０〜３７９２、３８０７、３８２９〜４１４７のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
（p）配列番号１５５７、１５７５、１５９０、１５９２〜１５９３、１６２２〜１７０８、１９１９〜１９２５、１９２７〜１９２９、２１１２、２１９７〜２９７７、３０９２〜３０９３、３１６２〜３１６３、３１６９、３１７７、３２８１、３２８８〜３３７１、３７４２〜３７７９、３７９０〜３７９２、３８０７、３８２９〜４１４７のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
上記核酸としては、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ前駆体が好適に用いられる。
【０２８０】
上記（i）〜（p）の核酸の機能または発現を促進する物質を、肥満細胞の脱顆粒促進剤として用いることもできる。
また、上記（i）〜（p）の核酸の標的遺伝子の機能または発現を抑制する物質を肥満細胞の脱顆粒促進剤として用いることもできる。標的遺伝子の発現を抑制する物質としては、該標的遺伝子のmRNAに対するsiRNAや該標的遺伝子に対するアンチセンス等をあげることができる。
【０２８１】
一方、上記（a）〜（h）の核酸の機能または発現を抑制する物質を、肥満細胞の脱顆粒促進剤として用いることもできる。該核酸の機能または発現を抑制する物質としては、該核酸に対するsiRNAやアンチセンス等をあげることができる。
本発明の肥満細胞の脱顆粒制御剤としては、上記(a)〜(h)および（i）〜（p）の核酸を発現するベクターを用いることもできる。
【０２８２】
本発明の肥満細胞の脱顆粒制御剤の製剤形態や、投与方法などについては、１０で後述するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を含有する診断薬および治療薬と同様である。
１０．マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を含有する診断薬および治療薬
本発明で用いるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸は、標的配列を有する遺伝子の発現を制御したり、本発明で用いるマイクロＲＮＡなどの核酸の発現を制御することにより、肥満細胞の異常等に起因する疾患の治療薬として用いることができる。また、該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAは、当該遺伝子の発現を制御することにより、肥満細胞の異常等に起因する疾患の治療薬として用いることができる。肥満細胞の異常としては、肥満細胞の分化や脱顆粒、炎症性メディエーター産生、サイトカイン産生、ケモカイン産生等の異常があげられ、それに起因する疾患としては、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性疾患等をあげることができる。
【０２８３】
また、本発明の核酸の定量または変異の検出により、肥満細胞の異常等に起因する疾患の診断をすることができる。
本発明の核酸を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、本発明で用いる核酸の定量あるいは変異の検出を行うために必要な試薬、例えば緩衝剤、塩、反応用酵素、本発明の核酸と結合する標識された蛋白、および検出用発色剤等を含んでもよい。
【０２８４】
本発明で用いる核酸を有効成分として含有する治療薬は、単独で投与することもできるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【０２８５】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
【０２８６】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
【０２８７】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
【０２８８】
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。本発明で用いる核酸、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり10 μg/kg〜20 mg/kgである。
【０２８９】
また、本発明で用いる核酸を有効成分として含有する治療薬は、本発明で用いる核酸を発現するベクターと核酸治療薬に用いる基剤とを調合することにより製造することもできる（Nature Genet., 8, 42(1994)）。
本発明の治療薬に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液または塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、pH調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油またはレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の治療剤は、治療の直前に液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して治療に使用することができる。
【０２９０】
本発明で用いる核酸を発現するベクターは、上記５の方法で作製した組換えウィルスベクターウィルスベクターをあげることができ、より具体的には、レトロウィルスベクターおよびレンチウィルスベクター等をあげることができる。
また、本発明で用いる核酸を、アデノウィルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウィルスベクターに結合させることにより、ウィルスベクターを調製することができる。該ウィルスベクターは安定に目的の細胞に到達し、エンドソームによる細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され核酸を効率的に発現させることができる。
【０２９１】
また、(-)鎖RNAウィルスであるセンダイウィルスをベースにしたウィルスベクターも開発されており（WO97/16538、WO97/16539）、当該センダイウィルスを用いて、本発明で用いる核酸を発現するセンダイウィルスベクターを作製することができる。
本発明で用いる核酸は、非ウィルス核酸移入法によっても移入することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈法（Virology, 52, 456-467 (1973)；Science, 209, 1414-1422 (1980)）、マイクロインジェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 5399-5403 (1980)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 7380-7384 (1980)；Cell, 27, 223-231 (1981)；Nature, 294, 92-94 (1981)）、リポソームを介した膜融合-介在移入法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987)；Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989)；J. Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989)；Hum. Gene Ther., 3, 267-275, (1992)；Science, 249, 1285-1288 (1990)；Circulation, 83, 2007-2011 (1992)）あるいは直接DNA取り込みおよび受容体-媒介DNA移入法（Science, 247, 1465-1468 (1990)；J. Biol. Chem., 266, 14338-14342 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 87, 3655-3659 (1991)；J. Biol. Chem., 264, 16985-16987 (1989)；BioTechniques, 11, 474-485 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3410-3414 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 4255-4259 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 87, 4033-4037 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 88, 8850-8854 (1991)；Hum. Gene Ther., 3, 147-154 (1991)）等により移入することができる。
【０２９２】
リポソームを介した膜融合−介在移入法は、リポソーム調製物を目的とする組織に直接投与することにより、本発明で用いる核酸を当該組織の局所に取り込み、および発現させることができる（Hum. Gene Ther., 3, 399 (1992)）。核酸を病巣に直接ターゲッティングするには、核酸を直接取り込む技術を用いることが好ましい。
受容体−媒介核酸移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドに核酸を結合することによって行う方法をあげることができる。リガンドは、目的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−核酸コンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合および核酸−蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。核酸の細胞内破壊を防止するために、アデノウィルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
１１．肥満細胞の活性化の程度を測定する方法
マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸が肥満細胞に対し、活性化抑制、脱顆粒抑制、炎症性メディエーター産生抑制、サイトカイン産生抑制およびケモカイン産生抑制のうちの少なくとも１つの作用を有していることは、例えば、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを肥満細胞に導入した後、肥満細胞を刺激し、放出された(i)脱顆粒の指標となるヒスタミンやβ−ヘキソサミニダーゼ、(ii)LTC4、LTD4、LTE4、PGD2等の炎症性メディエーター、(iii)TNF-αやGM-CSF等のサイトカイン、(iv)IL-8、I-309、MIP-1α等のケモカイン等を測定し、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを導入しなかった場合と比較することにより確認できる。
【０２９３】
また肥満細胞に、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを導入し、アポトーシスが誘導されることを、クロマチンDNAの断片化の測定やTUNEL法等によって検出することより、アポトーシス誘導作用を有していることを確認できる。
さらに、肥満細胞の活性化を抑制させる物質を添加させた状態で、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを肥満細胞に導入した後、肥満細胞を刺激し、本発明で用いる核酸や該核酸の標的遺伝子に対するsiRNAを導入しなかった場合と比較することにより確認できる。
【０２９４】
肥満細胞を刺激する方法としては、例えばIgEを添加して培養した後に抗IgE抗体を添加する方法や、コンパウンド48/80を添加する方法、ポリミキシンBを添加する方法、デキストランを添加する方法、カルシウムイオノフォアを添加する方法、アセチルコリンを添加する方法、カルバコールを添加する方法、トロンビンを添加する方法、コンカナバリンAを添加する方法、カルシウムイオノフォアを添加する方法、ATPを添加する方法、ドキソルビシンを添加する方法、等を挙げることができる。肥満細胞の活性化を抑制させる物質としては、例えば、マイクロＲＮＡ前駆体からマイクロＲＮＡが生合成される過程を阻害する物質があげられる。
【０２９５】
肥満細胞の活性化は、脱顆粒の代わりに、TNF-αやGM-CSF等のサイトカイン産生、IL-8、I-309、MIP-1α等のケモカイン産生、LTC4、LTD4、LTE4、PGD2等の炎症メディエーター産生等を測定することによっても調べることができる（Blood, 100, 3861（2002））。
以下に実施例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０２９６】
マイクロＲＮＡ前駆体の強制発現が、ヒト肥満細胞における脱顆粒に及ぼす作用
ヒトマイクロＲＮＡの前駆体をヒト肥満細胞株であるLAD2に導入し、該マイクロＲＮＡ前駆体が脱顆粒に及ぼす影響を調べた。
LAD2は近年樹立されたヒト肥満細胞株で、ヒト肥満細胞の性質をよく保持していることが知られている（Leuk. Res., 27, 671 (2003); Leuk. Res., 27, 677 (2003)）。National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health (Bethesda, MD 20892-1881, USA)よりLAD2を入手し、100 ng/mLのSCFを含むStem Pro-34培地（Invitrogen社製）で培養した。【０２９７】
LAD2を96穴プレートに1穴あたり4×103個になるように播種し、マイクロRNA前駆体をリポフェクション法、具体的には、TransIT-TKO (Mirus社製)を用いて、終濃度が25 nMとなるよう導入した。マイクロRNAの前駆体はAmbion社で合成されたヒトmiRNAライブラリーVer.1およびVer.2を用いた。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。【０２９８】
リポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した2日後に、終濃度が0.3 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養した。翌日、終濃度が10 μg/mLとなるようウサギ抗ヒトIgE抗体（ダコ社製）を加え、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で30分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。脱顆粒の程度は、培地中に放出された顆粒内酵素のβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定することにより評価した。β-ヘキソサミニダーゼ活性の測定は、培地中にタイロード緩衝液（126.1 mmol/L NaCl、4.0 mmol/L KCl、1.0 mmol/L CaCl2、0.6 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L KH2PO4、10 mM HEPES 、5.6 mmol/L D-グルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.4）に溶解した20 mmol/L 4-メチルアンベリフェリル-N-アセチル-β-D-グルコサミニド（シグマ社製）を40 μL加え、37℃で3時間インキュベートした後、450 nmにおける吸光度をプレートリーダーEnVision（パーキンエルマー社製）で測定することで行った。測定後、終濃度が1％となるようトリトンX-100を培地に添加して同様の実験を行うことにより、LAD2に含まれる全β-ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。抗IgE抗体によって誘導された脱顆粒の割合は、1% トリトンX-100によって放出させた全β-ヘキソサミニダーゼ活性に対する割合（％）で算出した。脱顆粒の相対活性は中央値からの偏差で評価し、脱顆粒効率よりその中央値を差し引き、平均偏差で割って算出した。脱顆粒促進活性はプラスで、脱顆粒抑制活性はマイナスで表した。
独立した実験を２回実施し、その結果を表５−１〜表５−２に示した。【０２９９】
［表５−１］
2009148137.tif 000205
【０３００】
［表５−２］
2009148137.tif 000206
【０３０１】
また、該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した7日後にも、終濃度が0.3 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養し、翌日、ウサギ抗ヒトIgE抗体添加により脱顆粒を誘導して脱顆粒の割合を測定した。その結果を表６−１〜表６−２に示した。【０３０２】
［表６−１］
2009148137.tif 000207
【０３０３】
［表６−２］
2009148137.tif 000208
【０３０４】
これらの結果から、hsa-miR-16, 195, 17-3p, 18a, 18b, 20b, 21, 24, 25, 32, 26b, 30a-3p, 34a, 449, 449b, 107, 140, 148b, 190, 199a, 199b, 202*, 208, 210, 211, 214, 218, 299-5p, 325, 328, 329, 338, 345, 425-5p, 484, 485-5p, 486, 488, 510, 515-3p, 515-5p, 517*, 520d, 520f, 520h, 522, 525*, 573, 587, 593, 595, 604, 612, 625, 634, 635, 637, 647, 650, 654, 658, 660, 668, 675, 765, 766（以上、それぞれ配列番号１〜６６で表される塩基配列からなる核酸）に対応するマイクロＲＮＡ前駆体の導入により脱顆粒の割合が減少し、逆にhsa-let-7e, hsa-miR-1, 206, 613, 9, 23b, 27b, 28, 31, 33b, 96, 100, 106a, 126*, 127, 128b, 129, 133a, 133b, 135b, 136, 142-5p, 146a, 181a, 182*, 183, 187, 192, 215, 200a*,  216, 217, 220, 222, 223, 224, 296, 302b*, 302c*, 362, 373*, 374, 376a, 378, 409-3p, 409-5p, 429, 432*, 448, 450, 451, 452, 487b, 489, 514, 517c, 518c, 524*, 542-3p, 544, 545, 550, 552, 596, 601, 608, 609, 617, 627, 632, 644, 659, 769-5p, 801（以上、それぞれ配列番号７１〜１１８および１２０〜１４６で表される塩基配列からなる核酸）に対応するマイクロＲＮＡ前駆体の導入により脱顆粒の割合が増加することが認められた。【０３０５】
また、6穴プレートを用いての脱顆粒活性測定も実施した。LAD2を6穴プレートに１穴あたり5x105個になるように播種し、マイクロＲＮＡ前駆体をリポフェクション法、具体的には、Gene Silencer（Genlantis社製）を用いて、終濃度が25 nMとなるよう導入した。マイクロＲＮＡの前駆体は、Pre-miRTMmiRNA Precursor MoleculesとしてAmbion社で合成されたものを用いた。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。【０３０６】
リポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した2日後に、1.0 μg/mLのヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加して37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養した。翌日、遠心分離により培地を除き、タイロード緩衝液（126.1 mmol/L NaCl、4.0 mmol/L KCl、1.0 mmol/L CaCl2、0.6 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L KH2PO4、10 mM HEPES 、5.6 mmol/L D-グルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.4）で洗浄した後、タイロード緩衝液を1.5 mL添加して細胞を懸濁し、96ウェル・プレートに1ウェルあたり100 μLずつ分注した。次いで、終濃度10 μg/mLとなるようウサギ抗ヒトIgE抗体（ダコ社製）を加え、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で20分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。遠心により上清を回収し、上清中のβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定することにより、脱顆粒の程度を測定した。【０３０７】
β-ヘキソサミニダーゼ活性は、回収した上清50 μLに、40 mmol/Lクエン酸緩衝液（pH 4.5）に溶解した4 mmol/L p-ニトロフェニルN-アセチル-β-グルコサミニド（シグマ社製）を50 μLを加え、37℃で1時間インキュベート後、0.2 mol/Lグリシン（pH 10.7）を100 μL加えたサンプルの405 nmにおける吸光度をプレートリーダー1420 ARVOsx（パーキンエルマー社製）を用いて測定することにより評価した。また、ウサギ抗ヒトIgE抗体の代わりに最終濃度1％のトリトンX-100を添加して同様の実験を行うことにより、LAD2中の全β-ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。脱顆粒の割合を、全β-ヘキソサミニダーゼ活性に対する上清中のβ-ヘキソサミニダーゼ活性の割合（％）で算出し、それぞれについて陰性対照区（Gene Silencerのみ）の脱顆粒の割合を1.0とした時の脱顆粒相対活性を計算した。【０３０８】
また、マイクロＲＮＡ前駆体を導入した7日後にも、終濃度が1.0 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養し、翌日、ウサギ抗ヒトIgE抗体添加により脱顆粒を誘導して脱顆粒の割合を測定し、それぞれについて陰性対照区（Gene Silencerのみ）の脱顆粒の割合を1.0とした時の脱顆粒相対活性を計算した。
それぞれ該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した3日後および8日後における脱顆粒相対活性の結果を表７に示す。【０３０９】
［表７］
2009148137.tif 000209
【０３１０】
表７に示した通り、hsa-miR-200c, 142-3p, 200a, 361（以上、それぞれ配列番号１１９および１４８〜１５０で表される塩基配列からなる核酸）に対応するマイクロＲＮＡ前駆体の導入により脱顆粒の割合が増加し、逆にhsa-miR-197, 221（以上、それぞれ配列番号６９および７０で表される塩基配列からなる核酸）の導入により脱顆粒の割合が減少することが認められた。
【実施例２】
【０３１１】
マイクロＲＮＡのアンチセンスを導入したヒト肥満細胞における脱顆粒活性
hsa-miR-194、hsa-miR-500およびhsa-miR-365（以上、それぞれ配列番号６７、６８および１４７で表される塩基配列からなる核酸）のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、リポフェクション法を用いて終濃度が25 nMとなるようLAD2に導入した。マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Anti-miRTMmiRNA Inhibitors (Ambion社製)を用いた。リポフェクションは製品に添付された説明書に記載された方法に従った。【０３１２】
リポフェクション法により該マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した2日後に、終濃度が0.3 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養した。翌日、終濃度が10 μg/mLとなるようウサギ抗ヒトIgE抗体（ダコ社製）を加え、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で30分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。脱顆粒の程度は、培地中に放出された顆粒内酵素のβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定することにより評価した。β-ヘキソサミニダーゼ活性の測定は、培地中にタイロード緩衝液（126.1 mmol/L NaCl、4.0 mmol/L KCl、1.0 mmol/L CaCl、0.6 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L KH2PO4、10 mM HEPES 、5.6 mmol/L D-グルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.4）に溶解した20 mmol/L 4-メチルアンベリフェリル-N-アセチル-β-D-グルコサミニド（シグマ社製）を40 μL加え、37℃で3時間インキュベートした後、450 nmにおける吸光度をプレートリーダーEnVision（パーキンエルマー社製）を用いることにより行った。【０３１３】
測定後、さらに培地に終濃度が1％となるようトリトンX-100を添加して同様の実験を行うことにより、LAD2に含まれる全β-ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。細胞を播種していないウェルの平均値を算出し、バックグランドとして各測定値から差し引いた。抗IgE抗体によって誘導された脱顆粒の割合は、1% トリトンX-100によって放出させた全β-ヘキソサミニダーゼ活性に対するβ-ヘキソサミニダーゼ活性の割合（％）で算出した。脱顆粒の相対活性は中央値からの偏差で評価し、脱顆粒効率よりその中央値を差し引き、平均偏差で割って算出した。脱顆粒促進活性はプラスで、脱顆粒抑制活性はマイナスで表した。独立した実験を２回実施し、その結果を表８に示す。【０３１４】
［表８］
2009148137.tif 000210
【０３１５】
また、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した7日後にも、終濃度が0.3 μg/mLとなるようヒトミエローマIgE（コスモバイオ社製）を添加し、37℃の5％CO2濃度のインキュベーター中で一晩培養し、翌日、ウサギ抗ヒトIgE抗体添加により脱顆粒を誘導して脱顆粒の割合を測定した。その結果を表９に示す。【０３１６】
［表９］
2009148137.tif 000211
【０３１７】
表８、９に示した通り、hsa-miR-194、hsa-miR-500に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド導入により脱顆粒の割合が増加し、逆にhsa-miR-365に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド導入により脱顆粒の割合が減少することが認められた。
【実施例３】
【０３１８】
マイクロＲＮＡ前駆体の強制発現が、脱顆粒が抑制された状態の肥満細胞における脱顆粒に及ぼす作用
Dicer1遺伝子のsiRNA(以下、Dicer1-siRNA)とヒトマイクロＲＮＡの前駆体をLAD2に共導入し、該マイクロRNA前駆体がコンパウンド48/80によって刺激される脱顆粒に及ぼす影響を調べた。【０３１９】
LAD2を96穴プレートに1穴あたり2×104個になるように播種し、Dicer1-siRNAとマイクロＲＮＡ前駆体をリポフェクション法、具体的には、GeneSilencer(Genlantis社製)を用いて、それぞれ終濃度が25 nMとなるよう共導入した。ヒトDicer1遺伝子に対するsiRNAの配列は配列番号４１４８を標的配列とするDicer1-siRNA（キアゲン社製）を用いた。マイクロＲＮＡの前駆体はAmbion社で合成されたヒトmiRNAライブラリーを用いた。siRNAとマイクロＲＮＡ前駆体の陰性対照にはそれぞれAll Stars Negative Control siRNA（以下、siRNA allstars）（キアゲン社製）とPre-miRTMmiRNA Precursor Negative Control #1（以下、miR-negacon#1）（Ambion社製）を用意し、同様にLAD2に導入した。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。【０３２０】
リポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した3日後に、培養培地をタイロード緩衝液（126.1 mmol/L NaCl、4.0 mmol/L KCl、1.0 mmol/L CaCl2、0.6 mmol/L MgCl2、0.6 mmol/L KH2PO4、10 mM HEPES 、5.6 mmol/L D-グルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.4）に置換し、細胞を懸濁させた。次に、細胞懸濁液を等量ずつ96穴プレートの異なる2箇所に播種し、終濃度1.0 μg/mLのCompound 48/80（Sigma-Aldrich社製）と終濃度1%のトリトンX-100をそれぞれ添加した。37℃で20分間インキュベートして脱顆粒を誘導した後、遠心分離にて培養上清を回収した。【０３２１】
脱顆粒の程度は、培養上清中に放出された顆粒内酵素のβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定することにより評価した。β-ヘキソサミニダーゼ活性は、回収した培養上清に40 mmol/Lクエン酸緩衝液（pH 4.5）に溶解した4 mmol/L 4-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニド（Sigma-Aldrich社製）を50 mLを加え、37℃で1時間インキュベート後、0.2 mol/Lグリシン（pH 10.7）を100 mL加えたサンプルの405 nmにおける吸光度をプレートリーダー1420 ARVOsx（パーキンエルマー社製）を用いて測定することにより評価した。【０３２２】
Compound48/80によって誘導された脱顆粒の割合は、1% トリトンX-100添加区のβ-ヘキソサミニダーゼ活性に対する割合（％）で算出した。Dicer1-siRNA導入による脱顆粒抑制を解除するmiRNAの活性は、Dicer1-siRNAとmiR-negacon#1共導入区における脱顆粒の割合を0%とし、siRNA allstarsとmiRNA-negacon#1共導入区における脱顆粒の割合を100%として相対活性を算出した。その結果を表１０に示す。【０３２３】
［表１０］
2009148137.tif 000212
【実施例４】
【０３２４】
miR-142-3p前駆体およびmiR-24前駆体を過剰発現させたLAD2のmRNA発現解析
ヒトマイクロＲＮＡのmiR-142-3pとmiR-24の前駆体をそれぞれLAD2に導入し、該マイクロＲＮＡ前駆体の導入によって発現量が変動する遺伝子群をmRNAアレイにて網羅的に探索した。
LAD2を6穴プレートに1穴あたり5×105個になるように播種し、マイクロRNA前駆体をリポフェクション法、具体的にはGeneSilencer(Genlantis社製)を用いて、終濃度が30 nMとなるよう導入した。マイクロRNA前駆体はPre-miRTM miRNA Precursor MoleculesとしてAmbion社で合成されたものを用いた。陰性対照にはAmbion社製のPre-miRTMmiRNA Precursor Negative Control#2(以下、miR-negacon#2)を用いた。リポフェクションは、製品に添付された説明書に記載された方法に従った。【０３２５】
リポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した2日後に細胞を回収し、miRNeasy（キアゲン社製）を用いて細胞よりtotal RNAを精製した。
精製したtotal RNAをAgilent Technologies社製のWhole Human Genome Oligo Microarrayを用いてmRNA発現解析をおこなった。解析方法はAgilent Technologies社のプロトコルに従った。具体的には、total RNAをCy3ラベルしたcRNAをマイクロアレイに対して65℃で約17時間のハイブリダイゼーションをおこない、洗浄した後、Agilent technologies Microarray Scannerを用いて5μmの解像度でスキャンし、シグナル値を取得した。【０３２６】
miR-142-3pまたはmiR-24の前駆体導入区において発現変動する遺伝子群をそれぞれ調べるため、miR-negacon#2導入区において検出された各遺伝子のシグナル値を1.0として発現量の相対活性を算出した。miR-142-3pの前駆体およびmiR-24の前駆体の導入区において、相対活性が0.8以下に発現が抑制された遺伝子群を、それぞれ表１１および表１２−１〜表１２−３に示す。【０３２７】
［表１１］
2009148137.tif 000213
【０３２８】
［表１２−１］
2009148137.tif 000214
【０３２９】
［表１２−２］
2009148137.tif 000215
【０３３０】
［表１２−３］
2009148137.tif 000216
【産業上の利用可能性】
【０３３１】
本発明により、肥満細胞の脱顆粒制御剤、肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断薬または治療薬、肥満細胞の脱顆粒制御方法、肥満細胞の脱顆粒制御剤のスクリーニング方法を提供することができる。これらは肥満細胞の脱顆粒制御に起因する疾患の診断または治療に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０３３２】
配列番号３９１６−ｎはａ、ｃ、ｇ又はｕ
配列番号４１４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
2009148137000001.app
【国際調査報告】
2009148137.tif 000217
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