(57)【要約】  β−アミノ酸の製造方法は、アミノ酸アミノムターゼの存在下、α−アミノ酸からβ−アミノ酸を合成する工程を含み、反応液中でβ−アミノ酸を固体として析出させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸アミノムターゼの存在下、α−アミノ酸からβ−アミノ酸を合成する工程を含むβ−アミノ酸の製造方法であって、反応液中でβ−アミノ酸を固体として析出させることを特徴とするβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
前記アミノ酸アミノムターゼは、芳香族アミノ酸アミノムターゼであることを特徴とする請求項１に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項３】
前記芳香族アミノ酸アミノムターゼは、フェニルアラニンアミノムターゼであることを特徴とする請求項２に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項４】
前記フェニルアラニンアミノムターゼは、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼであることを特徴とする請求項３に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
前記フェニルアラニンアミノムターゼは、Ｒ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼであることを特徴とする請求項３に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項６】
前記α−アミノ酸は、芳香族Ｌ−アミノ酸であることを特徴とする請求項２に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】
前記芳香族Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項６に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項８】
前記β−アミノ酸は、芳香族β−アミノ酸であることを特徴とする請求項２に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項９】
前記芳香族β−アミノ酸は、β−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項８に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１０】
前記β−フェニルアラニンは、（Ｓ）−β−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項９に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１１】
前記β−フェニルアラニンは、（Ｒ）−β−フェニルアラニンであることを特徴とする請求項９に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１２】
前記芳香族アミノ酸アミノムターゼは、チロシンアミノムターゼであることを特徴とする請求項２に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１３】
前記芳香族Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−チロシンであることを特徴とする請求項６に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１４】
前記芳香族β−アミノ酸は、β−チロシンであることを特徴とする請求項８に記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１５】
前記反応液のｐＨが６以上１０以下であることを特徴とする請求項１乃至１４いずれかに記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１６】
前記反応液の温度が、４℃以上であって、前記アミノ酸アミノムターゼが失活する温度以下であることを特徴とする請求項１乃至１５いずれかに記載のβ−アミノ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸アミノムターゼの存在下、α−アミノ酸からβ−アミノ酸を合成する工程を含むβ−アミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−アミノ酸は医薬中間体として有用な化合物であることが知られている。従来、立体選択的にβ−アミノ酸を得るためには、ラセミ体のβ−アミノ酸を光学分割することによって目的の立体異性体を単離精製する手法がとられていた。しかしながら、この手法によれば、理論収率は５０％と低く、多工程で煩雑な製造方法となるため、得られるβ−アミノ酸も高価となってしまう。したがって、高効率化および低価格化を実現可能なβ−アミノ酸の製造方法の開発が期待される。【０００３】
近年、比較的安価に入手可能なＬ−アミノ酸を基質にβ−アミノ酸を合成する反応を触媒するアミノ酸アミノムターゼが存在することが報告されている。【０００４】
たとえば、非特許文献１には、Ｔａｘｕｓ  ｃａｓｐｉｄａｔａ由来のフェニルアラニンアミノムターゼを用いてＬ−フェニルアラニンから（Ｒ）−β−フェニルアラニンを合成する方法が報告されている。【０００５】
また、非特許文献２には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ由来のチロシンアミノムターゼを用いてＬ−チロシンからβ−チロシンを合成する方法が報告されている。【０００６】
また、非特許文献３には、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｅｈ３３５由来のＡｄｍＨを用いてＬ−フェニルアラニンからβ−フェニルアラニンが合成されることが報告されている。
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６（２００７）９７８５−９７９４
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（２００３）１２７０８−１２７１８
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ，４４８（２００７）８２４−８２７
【非特許文献４】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９（２００７）６９８８−６９８９
【発明の開示】
【０００７】
しかしながら、上記従来技術においては、いずれの場合も酵素の特徴付けを目的としてβ−アミノ酸を合成したものであり、反応収率および収量は低く、さらに単離精製には煩雑な操作が必要であると予想されるため、工業的に有利な方法とは言えない。β−アミノ酸は医薬品原料などとして有用な化合物であり、酵素反応そのものを効率よく行う製造方法の開発が望まれる。
【０００８】
本発明は、酵素反応によるβ−アミノ酸の製造方法において、効率よくβ−アミノ酸を製造することを目的とするものである。
【０００９】
本発明によれば、アミノ酸アミノムターゼの存在下、α−アミノ酸からβ−アミノ酸を合成する工程を含むβ−アミノ酸の製造方法であって、反応液中でβ−アミノ酸を固体として析出させることを特徴とするβ−アミノ酸の製造方法が提供される。
【００１０】
この発明によれば、β−アミノ酸を固体として析出させることにより、アミノ酸アミノムターゼによる酵素反応を効率よく行うことができ、さらに、反応液から固体を採取することで、生成物を容易に精製することができる。
【００１１】
本発明によれば、β−アミノ酸を効率よく製造する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に係る実施の形態は、芳香族β−アミノ酸の製造方法である。この製造方法は、芳香族アミノ酸アミノムターゼの存在下、芳香族α−アミノ酸から芳香族β−アミノ酸を合成する工程を含み、反応液中で芳香族β−アミノ酸を固体として析出させる。【００１３】
芳香族アミノ酸アミノムターゼとして、たとえば、フェニルアラニンアミノムターゼ、チロシンアミノムターゼが例示される。フェニルアラニンアミノムターゼには、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ、Ｒ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼが挙げられる。【００１４】
この明細書において、「Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ」とは、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質のことをいう。また、「Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性」とは、Ｓ体選択的にβ−フェニルアラニンを合成できることをいう。「Ｓ体選択的」とは、β−フェニルアラニン中に含まれる（Ｓ）−β−フェニルアラニンの光学純度が５０％ｅｅ以上であることをいうが、望ましくは８０％ｅｅ以上であり、さらに望ましくは９０％ｅｅ以上であり、９９％ｅｅ以上であると最も望ましい。【００１５】
また、この明細書において、「Ｒ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ」とは、Ｒ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質のことをいう。また、「Ｒ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性」とは、Ｒ体選択的にβ−フェニルアラニンを合成できることをいう。「Ｒ体選択的」とは、β−フェニルアラニン中に含まれる（Ｒ）−β−フェニルアラニンの光学純度が５０％ｅｅ以上であることをいうが、望ましくは８０％ｅｅ以上であり、さらに望ましくは９０％ｅｅ以上であり、９９％ｅｅ以上であると最も望ましい。【００１６】
芳香族α−アミノ酸として、たとえば、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンおよびこれらの類似体が例示される。【００１７】
芳香族β−アミノ酸として、たとえば、β−フェニルアラニン、β−チロシンおよびこれらの類似体が例示される。β−フェニルアラニンには、（Ｓ）−β−フェニルアラニン、（Ｒ）−β−フェニルアラニンが挙げられる。また、β−チロシンには、（Ｓ）−β−チロシン、（Ｒ）−β−チロシンが挙げられる。【００１８】
Ｒ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｒ）−β−フェニルアラニンを生成する反応を触媒する。また、Ｌ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｒ）−β−フェニルアラニン類似体を生成する反応を触媒することもできる（非特許文献４参照）。Ｌ−フェニルアラニン類似体には、Ｌ−４−フルオロフェニルアラニン、３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン、Ｌ−４−メトキシフェニルアラニン、Ｌ−２−フルオロフェニルアラニン、Ｌ−４−メチルフェニルアラニンなどが例示される。また、（Ｒ）−β−フェニルアラニン類似体には、（Ｒ）−β−４−フルオロフェニルアラニン、（Ｒ）−β−３−（２−チエニル）−アラニン、（Ｒ）−β−４−メトキシフェニルアラニン、（Ｒ）−β−２−フルオロフェニルアラニン、（Ｒ）−β−４−メチルフェニルアラニンなどが例示される。【００１９】
チロシンアミノムターゼは、Ｌ−チロシンからβ−チロシンを生成する反応を触媒する。また、Ｌ−チロシン類似体を基質とすることもできる（非特許文献２）。Ｌ−チロシン類似体には、Ｌ−３、４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−３−クロロチロシンなどが例示される。【００２０】
芳香族アミノ酸アミノムターゼが触媒する反応は、芳香族α−アミノ酸から芳香族β−アミノ酸の合成において可逆的であり、低収率であることが知られている。芳香族アミノ酸アミノムターゼが触媒する反応では、ｐＨおよび温度などの反応条件によるが、反応が平衡状態に達すると基質と生成物の濃度がほぼ同程度となり、その反応収率は最大でおおよそ６０％にとどまる。たとえば、非特許文献１には、フェニルアラニンアミノムターゼを用いた（Ｒ）−β−フェニルアラニン合成反応の収率が５３±１％と報告されている。また、非特許文献２には、チロシンアミノムターゼを用いたβ−チロシン合成反応の最大収率が〜６０％と報告されている。また、非特許文献３には、ＡｄｍＨを用いたβ−フェニルアラニン合成反応の平衡定数が１．２８であると報告されており、平衡定数からその収率は約５６％と求められる。【００２１】
本実施の形態において、「固体として析出させる」とは、芳香族β−アミノ酸を反応液中で飽和濃度または過飽和濃度を越えて生成させ、超過分を固体として発生させることをいう。芳香族アミノ酸アミノムターゼが触媒する反応において、生成する芳香族β−アミノ酸を固体として析出させながら反応を進めると、効率よく芳香族β−アミノ酸を製造することができる。フェニルアラニンアミノムターゼによるβ−フェニルアラニン合成反応で生成物の固体を析出させながら反応を進めると、反応が平衡状態に達したときには、反応液中に生成物の固体が析出している一方、溶解している基質と生成物の濃度が同程度になる。このとき、生成物の析出量が多いほど、反応収率および収量は高くなる。さらに、反応液から固体を採取することで、生成物の精製が容易になる。【００２２】
芳香族アミノ酸アミノムターゼ反応において、芳香族β−アミノ酸の生成量と溶解度の関係を最適化することにより、芳香族β−アミノ酸を固体として析出させながら反応を進めることができる。芳香族β−アミノ酸の生成量は、当然、用いる酵素の性質によるが、反応条件であるｐＨ、温度および基質添加量によっても変化する。また、芳香族β−アミノ酸の溶解度は反応液のｐＨおよび温度によって変化する。したがって、反応液のｐＨ、温度および基質添加量を最適化することにより、芳香族β−アミノ酸を固体として析出させながら反応を進めることができる。【００２３】
芳香族β−アミノ酸の析出量を増やし、反応収率および収量を高めるために、たとえば、芳香族β−アミノ酸の溶解度が低い条件で反応させることができる。【００２４】
また、芳香族β−アミノ酸の析出量を増やし、反応収率および収量を高めるために、基質の添加量を上げて反応させることができる。具体的には、反応系への芳香族α−アミノ酸の添加量を２．５重量％（ｗｔ％）以上とすることができ、より好ましくは７重量％（ｗｔ％）以上、さらに好ましくは１６重量％（ｗｔ％）以上とすることができる。反応系への芳香族α−アミノ酸の添加量の上限は特にないが、添加量が多すぎると反応系内の固体量が多くなり攪拌効率が下がるため、芳香族β−アミノ酸の生成速度が低下する。したがって、６０重量％（ｗｔ％）以下とすることが好ましく、より好ましくは５０重量％（ｗｔ％）以下、さらに好ましくは４０重量％（ｗｔ％）以下とする。反応液を適当に攪拌できる程度の添加量とすることにより、効率よく反応させることができる。【００２５】
基質の添加方法としては、反応開始時に一括添加してもよく、反応の進行に伴い分割してもしくは連続して添加してもよい。また、反応液中で基質は固体として存在していてもよい。【００２６】
たとえば、フェニルアラニンアミノムターゼを用いる場合、反応液のｐＨを６以上１０以下とするとよい。ｐＨ６未満とするとフェニルアラニンアミノムターゼの酵素活性が低くなるため、β−フェニルアラニンの生成速度が遅くなる。またｐＨを１０より大きくすると、β−フェニルアラニンの溶解度が高くなりすぎる。したがって、β−フェニルアラニンの固体としての析出量が少なくなり、反応収率および収量を高めることができない。【００２７】
また、反応液の温度は、４℃以上であって、芳香族アミノ酸アミノムターゼが失活する温度以下とするとよい。反応液の温度を４℃未満とした場合、芳香族アミノ酸アミノムターゼの酵素活性が低いため、芳香族β−アミノ酸の生成速度が遅くなる。【００２８】
失活する温度とは、反応液中で１０分間に５０％以上の芳香族アミノ酸アミノムターゼが失活する温度をいう。失活温度より高い温度とすると、有効に機能する芳香族アミノ酸アミノムターゼの量が少なくなるため、芳香族β−アミノ酸の生成速度が遅くなる。【００２９】
フェニルアラニンアミノムターゼを用いる場合、反応温度は、４℃以上とすることができる。これにより、フェニルアラニンアミノムターゼの酵素活性を高くし、β−フェニルアラニンの生成速度を高めることができる。より好ましくは反応温度を１５℃以上とする。これにより、さらに反応を効率よく行うことができる。【００３０】
また、フェニルアラニンアミノムターゼを用いる場合、反応液の温度は、６０℃以下とすることができる。これにより、フェニルアラニンアミノムターゼの酵素活性を安定に維持することができ、効率よく反応を行うことができる。【００３１】
芳香族アミノ酸アミノムターゼによる反応で芳香族β−アミノ酸の析出量を増やし、さらに反応を短時間で完結させるために、反応初期は酵素活性が高い条件下で、反応終期は生成物の溶解度が低い条件下で反応を行うことができる。たとえば、反応の初期と終期で反応液の温度を変化させる方法が挙げられる。具体的には、反応初期には下限値を２０℃とし上限値を芳香族アミノ酸アミノムターゼが失活する温度とするとよい。また、反応終期に４℃以上３０℃以下とするとよい。【００３２】
なお、Ｓ体選択性フェニラアラニンアミノムターゼおよびＲ体選択性フェニラアラニンアミノムターゼは、至適ｐＨおよび至適温度が近似している。また、（Ｓ）−β−フェニルアラニンと（Ｒ）−β−フェニルアラニンとは、溶解度が近似している。したがって、両酵素の性質および生成物の物性が類似していることからＳ体選択性フェニラアラニンアミノムターゼを用いた（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法の検討結果は、（Ｒ）−β−フェニルアラニンの製造方法にも適用可能である。【００３３】
芳香族アミノ酸アミノムターゼは、芳香族アミノ酸アミノムターゼ産生生物から取得することができる。芳香族アミノ酸アミノムターゼ産生生物として、タキサス属植物、パントエア属細菌、バチルス属細菌、ストレプトマイセス属細菌、コンドロマイセス属細菌が例示される。具体的には、Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ｔａｘｕｓ  ｃａｓｐｉｄａｔａ、Ｔａｘｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔａｘｕｓ  ×  ｍｅｄｉａ  ｃｖ  Ｈｉｃｋｓｉｉ、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｅｈ３３５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  Ｖｍ４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｒｏｃａｔｕｓ  Ｃｍ  ｃ５を例に挙げることができる。Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ｔａｘｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔａｘｕｓ  ×  ｍｅｄｉａ  ｃｖ  Ｈｉｃｋｓｉｉは、フェニルアラニンアミノムターゼ産生生物である。Ｔａｘｕｓ  ｃａｓｐｉｄａｔａは、Ｒ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ産生生物である。Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｅｈ３３５は、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ産生生物である。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  Ｖｍ４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｒｏｃａｔｕｓ  Ｃｍ  ｃ５はチロシンアミノムターゼ産生生物である。【００３４】
また、芳香族アミノ酸アミノムターゼをコードするＤＮＡにより宿主細胞を形質転換して、芳香族アミノ酸アミノムターゼを発現させ、単離してもよい。この方法によれば、芳香族アミノ酸アミノムターゼを簡便かつ効率的に取得することができる。【００３５】
反応に用いる芳香族アミノ酸アミノムターゼとしては、精製したものであってもよく、芳香族アミノ酸アミノムターゼ産生生物、芳香族アミノ酸アミノムターゼをコードするＤＮＡにより形質転換された形質転換体またはそれらの処理物であってもよい。【００３６】
処理物は、細胞の破壊を目的として、細胞を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、自己消化、界面活性剤処理、酵素処理したもの及びこれらの処理により得られる芳香族アミノ酸アミノムターゼを含む画分の固定化物、細胞の固定化物として得ることができる。【００３７】
芳香族アミノ酸アミノムターゼの使用量は、芳香族α−アミノ酸との反応が十分に進行すれば特に制限されない。芳香族アミノ酸アミノムターゼの添加方法は反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。【００３８】
反応液の媒体としては、水、水性媒体、有機溶媒又は水若しくは水性媒体と有機溶媒との混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよい。【００３９】
反応時間は、芳香族β−アミノ酸の固体を析出させることができれば、特に制限はされない。したがって、少なくとも、反応液中の芳香族β−アミノ酸の生成量が芳香族β−アミノ酸の溶解度を越えるまでに必要な反応時間を確保できればよい。反応時間は、用いる芳香族β−アミノ酸アミノムターゼの使用量に応じて適宜設定することができる。【００４０】
反応液からの芳香族β−アミノ酸の分離精製法は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。結晶化法では、反応液を濾過し、得られた固体を再結晶させることにより精製することができる。また、反応液中で析出した固体を一旦溶解し、菌体成分を除去した後、結晶を析出させることにより行うこともできる。【００４１】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるのもではない。
【実施例】
【００４２】
＜分析条件＞
（Ｓ）−β−フェニルアラニン、（Ｒ）−β−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニンは高速液体クロマトグラフィーにより定量した。これらの分析条件は次の通りである。【００４３】
（１）（Ｓ）−β−フェニルアラニン及び（Ｒ）−β−フェニルアラニンの分析条件
（１）の分析は主に、β−フェニルアラニンの光学純度の測定を目的とする。
カラム；ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＷＨ  ４．６×２５０（ダイセル化学工業株式会社）
カラム温度；５０℃
ポンプ流速；１．５ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液；２ｍｍｏｌ／ｌ  硫酸銅
検出；ＵＶ２５４ｎｍ
本分析条件において、（Ｓ）−β−フェニルアラニン及び（Ｒ）−β−フェニルアラニンの検出限界は、いずれもおおよそ１×１０−4重量％（ｗｔ％）であった。【００４４】
（２）β−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニンの分析条件
（２） の分析は主に、反応収率の測定を目的とする。
カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＴＭＳ−ＵＧ−５  ４．６×２５０（野村化学株式会社）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液；５ｍｍｏｌ／ｌ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）：メタノール＝８：２（ｖ／ｖ）
検出；ＵＶ２５４ｎｍ【００４５】
＜評価法＞
（Ｓ）−β−フェニルアラニンの光学純度は、上記（１）に示す分析条件下で得られたクロマトグラムのピーク面積値から算出した。また、（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率は、上記（２）に示す分析条件下で得られたクロマトグラムのピーク面積値から算出した。具体的には、反応液がβ−フェニルアラニンの固体もしくはＬ−フェニルアラニンの固体を含む場合は、それら固体を含む反応液を一部採取し、０．２ｍｏｌ／ｌ塩酸溶液と混合してそれら固体を溶解した溶液を分析した。（Ｓ）−β−フェニルアラニン標品の検量線を用いて（Ｓ）−β−フェニルアラニンの生成量（ｇ）をクロマトグラムのピーク面積値から算出し、（式１）から収率を求めた。
（式１）収率（％）＝（Ｓ）−β−フェニルアラニンの生成量（ｇ）／Ｌ−フェニルアラニン添加量（ｇ）×１００【００４６】
（実施例１）Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼを発現する形質転換体の作製
［（１）Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡの合成］
配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡをＤＮＡ２．０社に委託して合成した。該合成ＤＮＡは、５'末端及び３'末端付近に、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有するようにした。【００４７】
［（２）組換えＤＮＡの作製］
組換えＤＮＡとして組換えプラスミドを作製した。合成したＤＮＡ及びプラスミドｐＵＣ１８をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡績社製）を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（Ａｍ）１００μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性でかつ白色コロニーとなった形質転換体を得た。このようにして得られた形質転換体よりプラスミドを抽出した。
通常の塩基配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列が配列番号１に示す塩基配列であることを確認した。得られたＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡを持つプラスミドをｐＳＰＡＭと命名した。【００４８】
［（３）形質転換体の作製及び発現］
ｐＳＰＡＭを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＭＴ−１１０４６と命名した。該形質転換体を５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のＡｍ１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にてＯＤ（６６０ｎｍ）が０．５になるまで振盪培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピルーβーチオガラクトピラノシド）が１ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加し、さらに１６時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた菌体をそのまま−２０℃にて凍結保存するかまたは０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。【００４９】
（実施例２）Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼによる（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造
反応液（４．０ｇ）は、８重量％（ｗｔ％）Ｌ−フェニルアラニン、０．４ｇの１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、実施例１で調製したＭＴ−１１０４６の菌体懸濁液（適当量）および水を含み、２５℃で４８時間反応させた。反応液中の固体を一部採取し、上記に示す分析条件で分析することで、（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体の析出を確認した。（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率は８３％であった。光学純度については、（Ｒ）−β−フェニルアラニンが検出限界以下であり、９９．５％ｅｅ以上であることを確認した。【００５０】
（比較例１）Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼによる（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造（非特許文献３に記載の反応条件における（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造）
反応液（４．０ｇ）は、１．７×１０−２重量％（ｗｔ％）Ｌ−フェニルアラニン、０．８ｇの１００ｍｍｏｌ／ｌトリシン緩衝液（ｐＨ８．２５）、実施例１で調製したＭＴ−１１０４６の菌体懸濁液（適当量）および水を含み、３０℃で４時間反応させた。反応液中に（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体は析出せず、（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率は４８％であった。【００５１】
（実施例３）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造［ｐＨの検討１］
反応液（２５０ｇ）は、１２重量％（ｗｔ％）Ｌ−フェニルアラニン、実施例１で調製したＭＴ−１１０４６の菌体（適当量）および水を含み、２５℃で２４時間以上反応させた。反応中、反応液のｐＨを２５％アンモニア水にて表１に示す各ｐＨに調整した。検討した全ての条件下で（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各ｐＨにおける（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率を表１に示す。【００５２】
【表１】
2009044531.tif 000002
【００５３】
（比較例２）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造
反応液（２５０ｇ）は、１２重量％（ｗｔ％）Ｌ−フェニルアラニン、実施例１で調製したＭＴ−１１０４６の菌体（適当量）および水を含み、２５℃で２４時間以上反応させた。反応中、反応液のｐＨを６ｍｏｌ／ｌ塩酸溶液もしくは２５％アンモニア水にて表２に示す各ｐＨに調整した。検討した全ての条件下で（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体が析出しないことを確認した。各ｐＨにおける（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率を表２に示す。【００５４】
【表２】
2009044531.tif 000003
【００５５】
（実施例４）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造［ｐＨの検討２］
反応液（２５０ｇ）は、３６重量％（ｗｔ％）Ｌ−フェニルアラニン、実施例１で調製したＭＴ−１１０４６の菌体（適当量）および水を含み、２５℃で２４時間以上反応させた。反応中、反応液のｐＨを２５％アンモニア水にて表３に示す各ｐＨに調整した。検討した全ての条件下で（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各ｐＨにおける（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率を表３に示す。【００５６】
【表３】
2009044531.tif 000004
【００５７】
（実施例５）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造［ｐＨの検討３］
反応液（２５０ｇ）は、１２重量％（ｗｔ％）Ｌ−フェニルアラニン、実施例1で調製したＭＴ−１１０４６の菌体（適当量）および水を含み、２０℃で２４時間以上反応させた。反応中、反応液のｐＨを２５％アンモニア水にてｐＨ９．２に調整した。検討した条件下で、（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率は６２％であった。【００５８】
（比較例３）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造
反応液（２５０ｇ）は、３６重量％（ｗｔ％）Ｌ−フェニルアラニン、実施例１で調製したＭＴ−１１０４６の菌体（適当量）および水を含み、２５℃で２４時間以上反応させた。反応中、反応液のｐＨを６ｍｏｌ／ｌ塩酸溶液もしくは２５％アンモニア水にて表４に示す各ｐＨに調整した。検討した全ての条件下で（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体が析出しないことを確認した。各ｐＨにおける（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率を表４に示す。【００５９】
【表４】
2009044531.tif 000005
【００６０】
（実施例６）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造［温度の検討１］
反応液（４．０ｇ）は、１２重量％（ｗｔ％）Ｌ−フェニルアラニン、０．４ｇの１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、実施例1で調製したＭＴ−１１０４６の菌体懸濁液（適当量）および水を含み、表５に示す各温度で２４時間以上反応させた。検討した全ての条件下で（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各温度における（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率を表５に示す。【００６１】
【表５】
2009044531.tif 000006
【００６２】
（実施例７）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造［温度の検討２］
反応液（２５０ｇ）は、３６重量％（ｗｔ％）Ｌ−フェニルアラニン、実施例１で調製したＭＴ−１１０４６の菌体（適当量）および水を含み、表６に示す各温度で２４時間以上反応させた。反応中、反応液のｐＨを２５％アンモニア水にてｐＨ８．０に調整した。検討した全ての条件下で（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各温度における（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率を表６に示す。【００６３】
【表６】
2009044531.tif 000007
【００６４】
（実施例８）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造［基質添加量の検討１］
反応液（４．０ｇ）は、表７に示す各添加量のＬ−フェニルアラニン、０．４ｇの１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、実施例1で調製したＭＴ−１１０４６の菌体懸濁液（適当量）および水を含み、２５℃で２４時間以上反応させた。検討した全ての条件下で、（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各基質添加量における（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率を表７に示す。【００６５】
【表７】
2009044531.tif 000008
【００６６】
（実施例９）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造［基質添加量の検討２］
反応液（４．０ｇ）は、表８に示す各添加量のＬ−フェニルアラニン、０．４ｇの１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、実施例1で調製したＭＴ−１１０４６の菌体懸濁液（適当量）および水を含み、１０℃で２４時間以上反応させた。検討した全ての条件下で（Ｓ）−β−フェニルアラニンの固体が析出することを確認した。各基質添加量における（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率を表８に示す。【００６７】
【表８】
2009044531.tif 000009
【００６８】
（実施例１０）（Ｓ）−β−フェニルアラニンの精製
実施例３において、ｐＨ８．０に調製した反応液に６ｍｏｌ／ｌ塩酸を添加してｐＨ２．１に調製し、固体として析出した（Ｓ）−β−フェニルアラニンを溶解させた。その後、活性炭（５０％含水率）１６ｇを加え、２５℃で３０分間攪拌し、ろ過により活性炭と菌体成分を除去した。次いで、活性炭を水３２ｇで洗浄し、ろ液と洗浄液を合わせた後、１０℃で穏やかに攪拌しながら混合液を２０％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ５．６に調製し、（Ｓ）−β−フェニルアラニンを析出させた。晶析液をろ過し、結晶を冷水３０ｍｌで３回洗浄した。乾燥後、白色結晶の（Ｓ）−β−フェニルアラニン２１．６ｇを得た。結晶の水溶液をＨＰＬＣにて分析した結果、（Ｒ）−β−フェニルアラニンが検出限界以下であり、光学純度は９９．５％ｅｅ以上であることを確認した。  【００６９】
以上、本発明の実施形態および実施例について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。たとえば、実施の形態では、芳香族アミノ酸アミノムターゼによる芳香族β−アミノ酸の製造方法について例示したが、本発明は、芳香族アミノ酸以外のアミノ酸にも適応することができる。たとえば、リジン２，３−アミノムターゼを用いることによりβ−リジンを製造することができる。また、アルギニン２，３−アミノムターゼを用いることによりβ−アルギニンを、グルタミン酸２，３−アミノムターゼを用いることによりβ−グルタミン酸を、ロイシン２，３−アミノムターゼを用いることによりβ−ロイシンを製造することもできる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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