(57)【要約】  本発明は、その５'側に第一配列を、３'側に第二配列を含み、該第一配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、該第二配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の配列において前記第一領域よりも３'側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能である、ＣＫ７のｍＲＮＡ検出用プライマに関する。
2009119331.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一プライマ、第二プライマ、第三プライマおよび第四プライマを含み；
１）前記第一プライマが、５'側に第一配列を、３'側に第二配列を含み、
前記第一配列が、
（ａ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ）配列番号１の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
前記第二配列が、
（ｃ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ）配列番号１の配列において前記第一領域よりも３'側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第二領域が、
i.配列番号１の７２４および７２５位のヌクレオチド、
ii.配列番号１の９８５および９８６位のヌクレオチド、
iii.配列番号１の１１１１および１１１２位のヌクレオチド、
iv.配列番号１の１３３２および１３３３位のヌクレオチド、または
v.配列番号１の１３６７および１３６８位のヌクレオチド
を含み、
２）前記第二プライマが、５’側に第三配列を、３’側に第四配列を含み、
前記第三配列が、
（ｅ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｆ）配列番号１の配列において前記第一領域よりも５’側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第四配列が、
（ｇ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｈ）配列番号１の配列において前記第三領域よりも５’側に位置する第四領域にハイブリダイズ可能であり、
３）前記第三プライマが、配列番号１の配列において前記第四領域よりも５’側に位置する第五領域にハイブリダイズ可能であり、
４）前記第四プライマが、配列番号１の配列において前記第二領域よりも３’側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である、サイトケラチン７のｍＲＮＡの検出用プライマを含む試薬。
【請求項２】
５'側に第一配列を、３'側に第二配列を含み；
前記第一配列が、
（ａ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ）配列番号１の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
前記第二配列が、
（ｃ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ）配列番号１の配列において前記第一領域よりも３'側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第二領域が、
i．  配列番号１の７２４および７２５位のヌクレオチド、
ii． 配列番号１の９８５および９８６位のヌクレオチド、
iii．配列番号１の１１１１および１１１２位のヌクレオチド、
iv． 配列番号１の１３３２および１３３３位のヌクレオチド、または
v．  配列番号１の１３６７および１３６８位のヌクレオチド
を含む、サイトケラチン７のｍＲＮＡ検出用プライマ。
【請求項３】
以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号３３〜４５および１０９〜１１５の何れかに記載のポリヌクレオチド、
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項２に記載のプライマ。
【請求項４】
配列番号１の７２１〜７３９位の領域、
配列番号１の９７４〜９９９位の領域、
配列番号１の９７６〜９９５位の領域、
配列番号１の９７８〜９９３位の領域、
配列番号１の９７８〜９９７位の領域、
配列番号１の９８１〜１０００位の領域、
配列番号１の１０９５〜１１１５位の領域、
配列番号１の１１００〜１１１７位の領域、
配列番号１の１１０１〜１１１７位の領域、
配列番号１の１３５３〜１３７６位の領域、
配列番号１の１３５３〜１３７９位の領域、および
配列番号１の１３５４〜１３７６位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項２または請求項３に記載のプライマ。
【請求項５】
前記第二配列の３’末端の３ヌクレオチドが、前記第二領域の配列と完全に相補的である、請求項２に記載のプライマ。
【請求項６】
第一プライマ、第二プライマ、第三プライマおよび第四プライマを含む；
１）前記第一プライマが、請求項２に記載のプライマであり、
２）前記第二プライマが、５’側に第三配列を、３’側に第四配列を含み、
前記第三配列が、
i.１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
ii.配列番号１の配列において前記第一領域よりも５’側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第四配列が、
iii.１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
iv.配列番号１の配列において前記第三領域よりも５’側に位置する第四領域にハイブリダイズ可能であり、
３）前記第三プライマが、配列番号１の配列において前記第四領域よりも５’側に位置する第五領域にハイブリダイズ可能であり、
４）前記第四プライマが、配列番号１の配列において前記第二領域よりも３’側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である、サイトケラチン７のｍＲＮＡ検出用プライマセット。
【請求項７】
前記第二プライマが、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号１４〜３２および１０６〜１０８の何れかに記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択され、
前記第三プライマが、以下の（ｃ）および（ｄ）：
（ｃ）配列番号２〜１３および１０５のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項８】
前記第二プライマが、
配列番号１の５７４〜５９０位の領域、
配列番号１の８１３〜８３４位の領域、
配列番号１の８１３〜８８２位の領域、
配列番号１の８１６〜８３４位の領域、
配列番号１の８３７〜８５６位の領域、
配列番号１の８４０〜８５７位の領域、
配列番号１の８５１〜８６９位の領域、
配列番号１の８５１〜８７１位の領域、
配列番号１の８６１〜８８２位の領域、
配列番号１の８６３〜８８３位の領域、
配列番号１の９６３〜９８２位の領域、
配列番号１の９６４〜９８２位の領域、
配列番号１の１１６５〜１１８２位の領域、
配列番号１の１２３５〜１２５２位の領域、および
配列番号１の１２３６〜１２５２位の領域
からなる群より選択される領域の相補領域にハイブリダイズする、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項９】
前記第三プライマが、
配列番号１の５３８〜５５６位の領域、
配列番号１の５４２〜５６１位の領域、
配列番号１の５４６〜５６４位の領域、
配列番号１の７７５〜７９４位の領域、
配列番号１の７９６〜８１５位の領域、
配列番号１の８１６〜８３４位の領域、
配列番号１の８２７〜８４３位の領域、
配列番号１の８２８〜８４５位の領域、
配列番号１の８４０〜８５９位の領域、
配列番号１の９３２〜９５０位の領域、
配列番号１の１１３４〜１１４９位の領域、および
配列番号１の１２１３〜１２２８位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１０】
前記第四プライマが、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号４６〜６０および１１６〜１２０のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１１】
前記第四プライマが、
配列番号１の７４１〜７５９位の領域、
配列番号１の７４２〜７６０位の領域、
配列番号１の１００７〜１０２３位の領域、
配列番号１の１００９〜１０２５位の領域、
配列番号１の１０１１〜１０２８位の領域、
配列番号１の１０１２〜１０２８位の領域、
配列番号１の１０１２〜１０２９位の領域、
配列番号１の１０１２〜１０３０位の領域、
配列番号１の１１１７〜１１３２位の領域、
配列番号１の１１１７〜１１３３位の領域、
配列番号１の１１１８〜１１３３位の領域、
配列番号１の１１１８〜１１３４位の領域、
配列番号１の１１１８〜１１３５位の領域、
配列番号１の１１３１〜１１４７位の領域、
配列番号１の１１３２〜１１４８位の領域、
配列番号１の１３５６〜１３３９位の領域、
配列番号１の１３８３〜１４００位の領域、
配列番号１の１３８４〜１４０１位の領域、および
配列番号１の１３９０〜１４０６位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１２】
前記配列番号１の配列に含まれる前記第三領域と前記第四領域との間に位置する第七領域にハイブリダイズする第五プライマをさらに含む、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１３】
前記第五プライマが、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号６１〜８４のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド。
からなる群より選択される、請求項１２に記載のプライマセット。
【請求項１４】
前記第五プライマが、
配列番号１の９８３〜１００２位の領域、
配列番号１の９８３〜１００３位の領域、
配列番号１の９８４〜１００２位の領域、
配列番号１の９８４〜１００３位の領域、
配列番号１の９８４〜１００４位の領域、
配列番号１の９８５〜１００４位の領域、
配列番号１の９８６〜１００４位の領域、
配列番号１の９８６〜１００５位の領域、
配列番号１の９８７〜１００５位の領域、
配列番号１の９８７〜１００６位の領域、
配列番号１の１２５１〜１２７１位の領域、
配列番号１の１２５１〜１２７３位の領域、
配列番号１の１２５１〜１２７４位の領域、
配列番号１の１２５２〜１２７３位の領域、
配列番号１の１２５２〜１２７４位の領域、
配列番号１の１２５３〜１２７４位の領域、
配列番号１の１２５６〜１２７７位の領域、
配列番号１の１２５６〜１２７８位の領域、
配列番号１の１２５７〜１２７８位の領域、
配列番号１の１２５８〜１２７８位の領域、
配列番号１の１２５９〜１２７８位の領域、
配列番号１の１２５９〜１２７９位の領域、および
配列番号１の１２６０〜１２７９位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項１２に記載のプライマセット。
【請求項１５】
前記配列番号１の配列に含まれる前記第一領域と第二領域との間に位置する第八領域の相補領域にハイブリダイズする第六プライマをさらに含む、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１６】
前記第六プライマが、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号８５〜１０４のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項１５に記載のプライマセット。
【請求項１７】
前記第六プライマが、
配列番号１の１０７３〜１０８９位の領域、
配列番号１の１０７３〜１０９１位の領域、
配列番号１の１０７３〜１０９３位の領域、
配列番号１の１０７４〜１０９３位の領域、
配列番号１の１０７５〜１０９４位の領域、
配列番号１の１０７６〜１０９３位の領域、
配列番号１の１０７６〜１０９４位の領域、
配列番号１の１０７７〜１０９６位の領域、
配列番号１の１０７８〜１０９７位の領域、
配列番号１の１０７８〜１０９８位の領域、
配列番号１の１０７８〜１０９９位の領域、
配列番号１の１０８１〜１１００位の領域、
配列番号１の１３２８〜１３４５位の領域、
配列番号１の１３３０〜１３４８位の領域、
配列番号１の１３３０〜１３４９位の領域、
配列番号１の１３３０〜１３５１位の領域、
配列番号１の１３３１〜１３５０位の領域、
配列番号１の１３３１〜１３５１位の領域、
配列番号１の１３３１〜１３５２位の領域、および
配列番号１の１３３２〜１３５２位の領域
からなる群より選択される領域の相補領域にハイブリダイズする、請求項１５に記載のプライマセット。
【請求項１８】
配列番号２５の配列を含む、サイトケラチン７のｍＲＮＡ検出用プライマ。
【請求項１９】
請求項６に記載のプライマセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰｓとを含む、サイトケラチン７のｍＲＮＡ検出用キット。
【請求項２０】
１）生体から採取した試料、請求項６に記載のプライマセットおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、前記試料中のサイトケラチン７のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と、
２）前記プライマセット、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび前記工程で合成されたｃＤＮＡを反応させて、ｃＤＮＡを増幅する工程と、
３）増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のサイトケラチン７のｍＲＮＡを検出する工程と
を含む、サイトケラチン７のｍＲＮＡ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のサイトケラチン７（以下、「ＣＫ７」とする）のｍＲＮＡを検出するために用いられるプライマ及びプライマセット、並びにそれらを含む試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＫ７は、上皮細胞に見られる中間径フィラメント構成タンパク質であるサイトケラチン類の一種であり、最近では肺がんや食道がん等のリンパ節転移を検出するための分子マーカーとして有用であることが報告されている。例えば、非特許文献１によると、生体から採取したリンパ節から測定試料を調製し、該測定試料中のＣＫ７のｍＲＮＡを核酸増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）法によって検出し、非小細胞性肺がんのリンパ節転移を高い特異性で判定できることが開示されている。
【非特許文献１】Pulteら, CANCER 2005, vol.104, No.7, 145３〜61.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記の通り、ＣＫ７のｍＲＮＡは、がん検出のための分子マーカーとして有用である。そして、従来の技術においては、ＣＫ７のｍＲＮＡの検出に、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いている。該ＲＴ−ＰＣＲ法は、非常に高感度で、例えばがん細胞のリンパ節への微小転移をも検出できる核酸増幅法であるが、その検出には非常に時間（２〜４時間程度）がかかっていた。【０００４】
それゆえ、本発明は、従来の技術よりも短時間でＣＫ７のｍＲＮＡを検出することができるプライマおよびプライマセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＣＫ７のｍＲＮＡを検出するためのプライマを提供する。このプライマは、その５’側に第一配列を、その３’側に第二配列を含む。該第一配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さであり、配列番号１の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能である。該第二配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さであり、配列番号１の配列において、前記第一領域よりも３’側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によると、従来の技術よりも短時間で、ＣＫ７のｍＲＮＡを検出することができるプライマおよびプライマセットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＣＫ７のｍＲＮＡ検出用プライマおよびプライマがハイブリダイズする核酸領域を示した模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書において、「検出する」とは、本発明の標的物質であるＣＫ７のｍＲＮＡが試料中に存在するか否かを判定することだけでなく、試料中のＣＫ７のｍＲＮＡを定量することも含む。
「プライマ」とは、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法（米国特許第６４１０２７８号公報および米国特許第６９７４６７０号公報参照）などの核酸増幅技術において、増幅対象である核酸の特定の領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる増幅反応の起点となることのできる機能（以下、「プライマ機能」とする）を有するポリヌクレオチドである。検出対象である核酸は、ＣＫ７のｍＲＮＡであるため、これを、逆転写反応を含む核酸増幅反応（例えば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法など）により検出することができる。
「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で、ポリヌクレオチドの塩基の相補性に基づいて、あるポリヌクレオチドの一部または全部の配列が、別のポリヌクレオチドの一部または全部の配列と、水素結合を介して結合することをいう。
「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う際に、当業者が一般的に用いる条件であって、本実施形態のプライマが、ＣＫ７のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる条件であれば、特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマの長さ、プライマのＧＣ含量およびハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J.ら, 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第２編), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。より具体的には、「５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの核酸を含む溶液中、ハイブリダイゼーション温度４２℃」を例示することができるが、これに限定されない。【０００９】
本実施形態のプライマは、特にＲＴ−ＬＡＭＰ法を利用したＣＫ７のｍＲＮＡの検出に好適に用いられる。ＣＫ７のｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。ｍＲＮＡには、チミンではなくウラシルが含まれるが、配列番号１では便宜上、ウラシルをチミン（ｔ）として表記してある。この配列は、GenBankデータベースにアクセッション番号NM_005556として登録されている。【００１０】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法においては、まずは逆転写反応（ＲＴ反応）によってｍＲＮＡからそのｃＤＮＡが合成され、続いて合成されたｃＤＮＡがＬＡＭＰ反応により増幅される。ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いてＣＫ７のｍＲＮＡを検出する場合、プライマとして、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列に含まれる領域Ｒ１ｃに対し相補的な領域Ｒ１にハイブリダイズ可能な第一配列をその５’末端側に有し、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列において領域Ｒ１ｃよりも下流（3’側）に位置する領域Ｒ２ｃにハイブリダイズ可能な第二配列をその3’末端側に有するポリヌクレオチドを用いることができる。【００１１】
上記第一配列は、上記第二配列と直接連結されてもよいし、介在配列を介して連結されてもよい。該介在配列としては、ＣＫ７のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと相同性の低い配列であることが好ましい。例えば、5'-tttt-3'などを挙げることができる。該介在配列の長さは、好ましくは１〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１〜４０ヌクレオチドである。【００１２】
上記プライマは、上記ＲＴ−ＬＡＭＰ法で用いられるプライマのうち、リバースインナープライマ（以下、「ＲＩＰ」とする）として機能することができる。上記ＲＴ―ＬＡＭＰ法では、このＲＩＰに加えて、フォワードインナープライマ（以下、「ＦＩＰ」とする）およびＦ３プライマを含むプライマセットが用いられる。以下、このＦＩＰおよびＦ３プライマについて、図１に基づいて説明する。【００１３】
図１は、各プライマおよび、各プライマがハイブリダイズする核酸領域を示した模式図である。なお、図１中、Ｆ１、Ｆ２、Ｌ、Ｆ１、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、およびＲ３ｃの各領域は、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列に含まれる領域であり、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｒ１、Ｍ、Ｒ２、およびＲ３の各領域は、ＣＫ７のｍＲＮＡの相補鎖であるＣＫ７のｃＤＮＡ配列に含まれる領域である。また、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれＦ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃおよびＲ３ｃと相補的である。これらの領域は、ＣＫ７のｍＲＮＡの検出効率、検出の再現性等を考慮して選択される。【００１４】
上記ＦＩＰは、領域Ｆ１（領域Ｆ１ｃの相補領域）にハイブリダイズ可能な第三配列をその５’側に有し、かつ領域Ｆ２ｃにハイブリダイズ可能な第四配列をその３’側に有するポリヌクレオチドである。該第三配列は、該第四配列と直接連結されてもよいし、上記介在配列を介して連結されてもよい。
上記Ｆ３プライマは、ＣＫ７のｃＤＮＡ配列において領域Ｆ２ｃよりも下流（３’側）に位置する領域Ｆ３ｃにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。【００１５】
さらに、上記プライマセットは、ＦＩＰ、ＲＩＰおよびＦ３プライマに加えて、Ｒ３プライマを含んでもよい。このＲ３プライマは、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列において領域Ｒ２ｃよりも下流（３’側）に位置する領域Ｒ３ｃにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。【００１６】
さらに、上記プライマセットは、ループプライマを含んでもよい。該ループプライマとして、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列に含まれる領域Ｆ２とＦ１との間に位置する領域Ｌにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであるループプライマＦ、およびＣＫ７のｃＤＮＡ配列に含まれる領域Ｒ１とＲ２との間に位置する領域Ｍにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであるループプライマＲがあげられる。これらループプライマの片方または両方を用いることにより、ＬＡＭＰ反応によるｃＤＮＡの増幅を、より迅速に行うことが可能となる。【００１７】
第一配列、第二配列、第三配列、第四配列、Ｆ３プライマ、Ｒ３プライマ、ループプライマＦおよびループプライマＲの長さとしては、プライマ機能を有する長さであれば、特に限定されない。核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマの長さは、５ヌクレオチド前後であることから、プライマの長さは、好ましくは５〜１００ヌクレオチドである。また、該プライマの長さは、プライマのヌクレオチド配列とプライマがハイブリダイズする領域との間の特異性を考慮すると、１０ヌクレオチド以上が好ましく、また、プライマのハイブリダイゼーション温度を考慮すると、３０ヌクレオチド以下であることがより好ましい。すなわち、ＦＩＰおよびＲＩＰの長さは、好ましくは１０〜２００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドである。【００１８】
上記プライマのうち、少なくとも一つが、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列に含まれるエキソンジャンクションを含む領域に、ハイブリダイズすることが好ましい。ＣＫ７遺伝子は９個のエキソンからなり、エキソンとエキソンとの間にはイントロンが介在している。細胞内でＣＫ７遺伝子からそのｍＲＮＡが合成される際は、スプライシングによってイントロンが除去されて、エキソン同士が直接連結される。このエキソンとエキソンとが連結されたつなぎ目の部分を、エキソンジャンクションという。例えば、ゲノム中ではエキソン１とエキソン２とは、イントロンによって隔離されているが、ｍＲＮＡ合成においてイントロンは除去されるため、該ｍＲＮＡではエキソン１の３’末端とエキソン２の５’末端とは隣接している。配列番号１の配列は９個のエキソンからなるため、以下の８個のエキソンジャンクション（エキソンジャンクション１〜８）がある。
エキソン１と２とのエキソンジャンクション１：４５１位と４５２位の結合部分
エキソン２と３とのエキソンジャンクション２：６６３位と６６４位の結合部分
エキソン３と４とのエキソンジャンクション３：７２４位と７２５位の結合部分
エキソン４と５とのエキソンジャンクション４：８２０位と８２１位の結合部分
エキソン５と６とのエキソンジャンクション５：９８５位と９８６位の結合部分
エキソン６と７とのエキソンジャンクション６：１１１１位と１１１２位の結合部分
エキソン７と８とのエキソンジャンクション７：１３３２位と１３３３位の結合部分
エキソン８と９とのエキソンジャンクション８：１３６７位と１３６８位の結合部分【００１９】
上記エキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズ可能なプライマは、ｍＲＮＡにハイブリダイズするが、ゲノム中のＣＫ７遺伝子にハイブリダイズする可能性は極めて低い。このようなプライマを用いることによって、上記ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によるｍＲＮＡ検出の際に、非特異的にＣＫ７遺伝子が増幅されることを防止することが可能となる。【００２０】
また、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の反応機序（米国特許第６４１０２７８号公報および米国特許第６９７４６７０号公報参照）によると、ＲＩＰの第二配列が、試料中のＣＫ７のｍＲＮＡと最初にハイブリダイズする。従って、上記プライマのうち、ＲＩＰの第二配列が、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列中のエキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズすることが好ましい（すなわち、領域Ｒ２ｃがエキソンジャンクションを含むことが好ましい）。これにより、反応の初期の段階で非特異的にＣＫ７遺伝子が増幅されることを避けることができる。【００２１】
他のサイトケラチン類（例えば、サイトケラチン６やサイトケラチン８など）のｍＲＮＡとの相同性、検出速度、検出の再現性等の観点から、上記のエキソンジャンクションのうち、エキソンジャンクション３，５，６および８の何れかを含む領域にハイブリダイズするプライマを用いることが好ましい。また、エキソンジャンクション１，２，４，および７の何れかを含む領域にハイブリダイズするプライマも、他のサイトケラチン類（サイトケラチン５、サイトケラチン６、サイトケラチン８等）のｍＲＮＡとの相同性、検出速度、検出の再現性等を考慮して作成し得る。【００２２】
本実施形態のプライマと、該プライマがハイブリダイズするＣＫ７ｍＲＮＡの特定の領域とは、完全に相補的である必要はなく、ハイブリダイズできる程度の相補性を有していればよい（このことは、米国特許第４８００１５９号公報に記載される）。すなわち、プライマ機能を有するポリヌクレオチドであれば、上記プライマは、上記特定の領域と完全な相補性を有する配列に、置換、欠失、挿入、付加などのような変異が１個または複数個導入されたポリヌクレオチドであってもよい。このヌクレオチドの変異は、好ましくは４個以内である。この変異が導入されたポリヌクレオチドは、変異導入前のポリヌクレオチドに対して、好ましくは８０％以上の相同性を有し、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。【００２３】
上記プライマが、目的の核酸であるＣＫ７のｍＲＮＡにハイブリダイズした後、ポリメラーゼの作用によって、プライマの３’末端を起点として核酸合成が行われる。このため、プライマの３’末端部分とＣＫ７のｍＲＮＡとの相補性が低い場合は、核酸合成反応が進行しにくくなることが考えられる。従って、好ましくはプライマの３’末端の３塩基が、プライマのハイブリダイズする領域と完全に相補的であり、より好ましくはプライマの３’末端の５塩基が完全に相補的である。【００２４】
Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、ＬおよびＭの各領域は、配列番号１に示されるＣＫ７のｍＲＮＡの配列中に設定できる。以下に、これらの領域の例を挙げる。【００２５】
（Ｆ１）
６１９〜６３６位の領域
６３１〜６５２位の領域
８５８〜８７９位の領域
８７３〜８９２位の領域
８７８〜８９８位の領域
８７９〜８９８位の領域
８９３〜９１３位の領域
９０９〜９２８位の領域
９１０〜９２８位の領域
１００６〜１０２５位の領域
１００７〜１０２５位の領域
１００７〜１０２６位の領域
１２１９〜１２４０位の領域
１２７５〜１２９５位の領域
１２７６〜１２９６位の領域
１２８０〜１３００位の領域【００２６】
（Ｆ２）
５７４〜５９０位の領域
８１３〜８３４位の領域
８１３〜８８２位の領域
８１６〜８３４位の領域
８３７〜８５６位の領域
８４０〜８５７位の領域
８５１〜８６９位の領域
８５１〜８７１位の領域
８６１〜８８２位の領域
８６３〜８８３位の領域
９６３〜９８２位の領域
９６４〜９８２位の領域
１１６５〜１１８２位の領域
１２３５〜１２５２位の領域
１２３６〜１２５２位の領域【００２７】
（Ｆ３）
５３８〜５５６位の領域
５４２〜５６１位の領域
５４６〜５６４位の領域
７７５〜７９４位の領域
７９６〜８１５位の領域
８１６〜８３４位の領域
８２７〜８４３位の領域
８２８〜８４５位の領域
８４０〜８５９位の領域
９３２〜９５０位の領域
１１３４〜１１４９位の領域
１２１３〜１２２８位の領域【００２８】
（Ｒ１ｃ）
６８０〜６９７位の領域
６８０〜６９９位の領域
８９８〜９１７位の領域
９１６〜９３７位の領域
９２３〜９４３位の領域
９２４〜９４５位の領域
９４１〜９５８位の領域
１０５１〜１０７２位の領域
１０５２〜１０７３位の領域
１０５８〜１０７８位の領域
１２６８〜１２８６位の領域
１２９７〜１３１６位の領域
１２９７〜１３１７位の領域
１３０３〜１３２０位の領域【００２９】
（Ｒ２ｃ）
７２１〜７３９位の領域
９７４〜９９９位の領域
９７６〜９９５位の領域
９７８〜９９３位の領域
９７８〜９９７位の領域
９８１〜１０００位の領域
１０９５〜１１１５位の領域
１１００〜１１１７位の領域
１１０１〜１１１７位の領域
１３５３〜１３７６位の領域
１３５３〜１３７９位の領域
１３５４〜１３７６位の領域【００３０】
（Ｒ３ｃ）
７４１〜７５９位の領域
７４２〜７６０位の領域
１００７〜１０２３位の領域
１００９〜１０２５位の領域
１０１１〜１０２８位の領域
１０１２〜１０２８位の領域
１０１２〜１０２９位の領域
１０１２〜１０３０位の領域
１１１７〜１１３２位の領域
１１１７〜１１３３位の領域
１１１８〜１１３３位の領域
１１１８〜１１３４位の領域
１１１８〜１１３５位の領域
１１３１〜１１４７位の領域
１１３２〜１１４８位の領域
１３５６〜１３３９位の領域
１３８３〜１４００位の領域
１３８４〜１４０１位の領域
１３９０〜１４０６位の領域【００３１】
（Ｌ）
９８３〜１００２位の領域
９８３〜１００３位の領域
９８４〜１００２位の領域
９８４〜１００３位の領域
９８４〜１００４位の領域
９８５〜１００４位の領域
９８６〜１００４位の領域
９８６〜１００５位の領域
９８７〜１００５位の領域
９８７〜１００６位の領域
１２５１〜１２７１位の領域
１２５１〜１２７３位の領域
１２５１〜１２７４位の領域
１２５２〜１２７３位の領域
１２５２〜１２７４位の領域
１２５３〜１２７４位の領域
１２５６〜１２７７位の領域
１２５６〜１２７８位の領域
１２５７〜１２７８位の領域
１２５８〜１２７８位の領域
１２５９〜１２７８位の領域
１２５９〜１２７９位の領域
１２６０〜１２７９位の領域【００３２】
（Ｍ）
１０７３〜１０８９位の領域
１０７３〜１０９１位の領域
１０７３〜１０９３位の領域
１０７４〜１０９３位の領域
１０７５〜１０９４位の領域
１０７６〜１０９３位の領域
１０７６〜１０９４位の領域
１０７７〜１０９６位の領域
１０７８〜１０９７位の領域
１０７８〜１０９８位の領域
１０７８〜１０９９位の領域
１０８１〜１１００位の領域
１３２８〜１３４５位の領域
１３３０〜１３４８位の領域
１３３０〜１３４９位の領域
１３３０〜１３５１位の領域
１３３１〜１３５０位の領域
１３３１〜１３５１位の領域
１３３１〜１３５２位の領域
１３３２〜１３５２位の領域【００３３】
上記の各領域に基づき、本発明のプライマを設計することができる。以下に、各プライマの例を挙げる。なお、配列の表示に続く括弧内の記載は、各プライマがＣＫ７のｍＲＮＡ配列（配列番号１）の何れの領域と同一であるか、または相補的であるかを示したものである。【００３４】
（Ｆ３プライマ）
配列番号２：5'-GACATCTTTGAGGCCCAGAT-3'  （５４２〜５６１位の領域と同じ配列）
配列番号３：5'-TCTTTGAGGCCCAGATTGC-3'  （５４６〜５６４位の領域と同じ配列）
配列番号４：5'-CCCAGACATCTTTGAGGCC-3'  （５３８〜５５６位の領域と同じ配列）
配列番号５：5'-AGACGGAGTTGACAGAGCT-3'  （８１６〜８３４位の領域と同じ配列）
配列番号６：5'-CAGAGCTGCAGTCCCAGA-3'  （８２８〜８４５位の領域と同じ配列）
配列番号７：5'-CTTCCTCAGGACCCTCAATG-3'  （７９６〜８１５位の領域と同じ配列）
配列番号８：5'-GCGGGGCAAGCAGGAT-3'  （１２１３〜１２２８位の領域と同じ配列）
配列番号９：5'-CCCAGATCTCCGACACATCT-3' （８４０〜８５９位の領域と同じ配列）
配列番号１０：5'-ACAGAGCTGCAGTCCCA-3' （８２７〜８４３位の領域と同じ配列）
配列番号１１：5'-TGCCCTGAATGATGAGATCA-3' （７７５〜７９４位の領域と同じ配列）
配列番号１２：5'-GAGGAGATGGCCAAATGCA-3'  （９３２‐９５０位の領域と同じ配列）
配列番号１３：5'-GCGGGGCAAGCAGGAT-3'  （１２１３〜１２２８位の領域と同じ配列）【００３５】
（ＦＩＰ）
配列番号１４：5'-TGCATGCTCCGCAGCTCCGGGTCAGCTTGAGGCAC-3' 
（６１９〜６３６位の領域の相補配列と、５７４〜５９０位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１５：5'-GTCCTCCACCACATCCTGCATGGGGTCAGCTTGAGGCAC-3' 
（６３１〜６５２位の領域の相補配列と、５７４〜５９０位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１６：5'-CAGGTCCAGGGAGCGACTGTTCCCAGATCTCCGACACAT-3' 
（８７８〜８９８位の領域の相補配列と、８４０〜８５７位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１７：5'-AGCGATGATGCCGTCCAGGTCGACACATCTGTGGTGCTGT-3'
（８９３〜９１３位の領域の相補配列と、８５１〜８６９位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１８：5'-TTGTCCATGGACAGCACCACAGAGACGGAGTTGACAGAGCT-3' 
（８５８〜８７９位の領域の相補配列と、８１６〜８３４位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１９：5'-GCGATCTCGATGTCCAGGGCCCGGCAGCTGCGTGAGTAC-3' 
（１２７６〜１２９６位の領域の相補配列と、１２３５〜１２５２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２０：5'-CAGGTCCAGGGAGCGACTGTAGTCCCAGATCTCCGACACA-3'
（８７９〜８９８位の領域の相補配列と、８３７〜８５６位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２１：5'-CTGCGCCTTGACCTCAGCGATGGTGCTGTCCATGGACAACAG-3'
（９０９〜９２８位の領域の相補配列と、８６１〜８８２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２２：5'-CTGCGCCTTGACCTCAGCGGTGCTGTCCATGGACAACAGT-3'
（９１０〜９２８位の領域の相補配列と、８６３〜８８３位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２３：5'-CTGCGCCTTGACCTCAGCGAGACACATCTGTGGTGCTGTCC-3'
（９０９〜９２８位の領域の相補配列と、８５１〜８７１位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２４：5'-CAGGGAGCGACTGTTGTCCAATGAGACGGAGTTGACAGAGCT-3'
（８７３〜８９２位の領域の相補配列と、８１３〜８３４位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２５：5'-CGTCCCCATGCTTCCCAGCCCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
（１００６〜１０２５位の領域の相補配列と、９６３〜９８２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２６：5'-TCGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
（１００７〜１０２６位の領域の相補配列と、９６４〜９８２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２７：5'-CGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
（１００７〜１０２５位の領域の相補配列と、９６３〜９８２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２８：5'-TCGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
（１００７〜１０２６位の領域の相補配列と、９６２〜９８２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号２９：5'-CGATCTCGATGTCCAGGGCCACGGCAGCTGCGTGAGT-3'
（１２７５〜１２９５位の領域の相補配列と、１２３５〜１２５０位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号３０：5'-CGATCTCGATGTCCAGGGCCAGGCAGCTGCGTGAGTAC-3'
（１２７５〜１２９５位の領域の相補配列と、１２３６〜１２５２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号３１：5'-GGTGGCGATCTCGATGTCCAGCGGCAGCTGCGTGAGTAC-3'
（１２８０〜１３００位の領域の相補配列と、１２３５〜１２５２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号３２：5'-GGTGGCGATCTCGATGTCCAGCGGCAGCTGCGTGAGT-3'
（１２８０〜１３００位の領域の相補配列と、１２３５〜１２５０位の領域と同じ配列とを連結した配列）【００３６】
（ＲＩＰ）
配列番号３３：5'-AACCACCGCACAGCTGCTGAGGCAGCATCCACATCCTTC-3'
（６８０〜６９９位の領域と同じ配列と、７２１〜７３９位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号３４：5'-AACCACCGCACAGCTGCTGGCAGCATCCACATCCTTC-3'
（６８０〜６９７位の領域と同じ配列と、７２１〜７３９位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号３５：5'-GCGCAGTATGAGGAGATGGCCCTGGAGGGTCTCAAACTTGG-3'
（９２３〜９４３位の領域と同じ配列と、９８１〜１０００位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号３６：5'-GCGCAGTATGAGGAGATGGCCAGAGGGTCTCAAACTTGGTCT-3'
（９２３〜９４３位の領域と同じ配列と、９７８〜９９７位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号３７：5'-GGTCAAGGCGCAGTATGAGGAGGGGTCTCAAACTTGGTCTGG-3'
（９１６〜９３７位の領域と同じ配列と、９７６〜９９５位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号３８：5'-CACCTACCGCAAGCTGCTGGTCACAGAGATATTCACGGCT-3'
（１２９７〜１３１６位の領域と同じ配列と、１３５４〜１３７６位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号３９：5'-GCCAAATGCAGCCGGGCTTGGAGGGTCTCAAACTTGGTCTGGTA-3'
（９４１〜９５８位の領域と同じ配列と、９７４〜９９９位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号４０：5'-GGACGGCATCATCGCTGAGGGTCTCAAACTTGGTCTGGTA-3'
（８９８〜９１７位の領域と同じ配列と、９７８〜９９３位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号４１：5'-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3'
（１０５１〜１０７２位の領域と同じ配列と、１０９５〜１１１５位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号４２：5'-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCGGCACGCTGGTTCTTGA-3'
（１０５１〜１０７２位の領域と同じ配列と、１１０１〜１１１７位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号４３：5'-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCGGCACGCTGGTTCTTGAT-3'
（１０５１〜１０７２位の領域と同じ配列と、１１００〜１１１７位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号４４：5'-CACCTACCGCAAGCTGCTGGATCATCACAGAGATATTCACGGCTC-3'
（１２９７〜１３１７位の領域と同じ配列と、１３５３〜１３７６位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号４５：5'-CCGCAAGCTGCTGGAGGGAATTCATCACAGAGATATTCACGGCTC-3'
（１３０３〜１３２０位の領域と同じ配列と、１３５３〜１３７９位の領域の相補配列とを連結した配列）【００３７】
（Ｒ３プライマ）
配列番号４６：5'-CAGCTCCACCTTGCTCATG-3' （７４２〜７６０位の領域の相補配列）
配列番号４７：5'-AGCTCCACCTTGCTCATGT-3' （７４１〜７５９位の領域の相補配列）
配列番号４８：5'-AGGTCGTCCCCATGCTTC-3' （１０１２〜１０２９位の領域の相補配列）
配列番号４９：5'-CGTCCCCATGCTTCCCA-3' （１００９〜１０２５位の領域の相補配列）
配列番号５０：5'-TCCCCATGCTTCCCAGC-3' （１００７〜１０２３位の領域の相補配列）
配列番号５１：5'-CACCGCCACTGCTACTG-3' （１３９０〜１４０６位の領域の相補配列）
配列番号５２：5'-CGTCCCCATGCTTCCCA-3'（１００９〜１０２５位の領域の相補配列）
配列番号５３：5'-GGTCGTCCCCATGCTTCC-3' （１０１１〜１０２８位の領域の相補配列）
配列番号５４：5'-GGTCGTCCCCATGCTTC-3' （１０１２〜１０２８位の領域の相補配列）
配列番号５５：5'-GGCGGCCTCCAACTTG-3'（１１１７〜１１３２位の領域の相補配列）
配列番号５６：5'-TGGCGGCCTCCAACTT-3'（１１１８〜１１３３位の領域の相補配列）
配列番号５７：5'-AATGGCGGCCTCCAACTT-3'（１１１８〜１１３５位の領域の相補配列）
配列番号５８：5'-CCACTGCTACTGCCACCA-3'（１３８４〜１４０１位の領域の相補配列）
配列番号５９：5'-ATGGCGGCCTCCAACTT-3'（１１１８〜１１３４位の領域の相補配列）
配列番号６０：5'-CACTGCTACTGCCACCAG-3'（１３８３〜１４００位の領域の相補配列）【００３８】
（ループプライマＦ）
配列番号６１：5'-GGGCCTGGAGGGTCTCAAA-3'  （９８６〜１００４位の領域の相補配列）
配列番号６２：5'-TGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3'  （９８７〜１００５位の領域の相補配列）
配列番号６３：5'-GGGCCTGGAGGGTCTCAAACT-3'  （９８４〜１００４位の領域の相補配列）
配列番号６４：5'-GGGCCTGGAGGGTCTCAAAC-3'  （９８５〜１００４位の領域の相補配列）
配列番号６５：5'-GGCCTGGAGGGTCTCAAACT-3'  （９８４〜１００３位の領域の相補配列）
配列番号６６：5'-GGCCTGGAGGGTCTCAAACTT-3'  （９８３〜１００３位の領域の相補配列）
配列番号６７：5'-CTGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3'  （９８７〜１００６位の領域の相補配列）
配列番号６８：5'-TGGGCCTGGAGGGTCTCAAA-3'  （９８６〜１００５位の領域の相補配列）
配列番号６９：5'-GCCTGGAGGGTCTCAAACT-3'  （９８４〜１００２位の領域の相補配列）
配列番号７０：5'-TGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3'  （９８７〜１００５位の領域の相補配列）
配列番号７１：5'-GCCTGGAGGGTCTCAAACTT-3'  （９８３〜１００２位の領域の相補配列）
配列番号７２：5'-TCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3'  （１２５１〜１２７１位の領域の相補配列）
配列番号７３：5'-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTG-3'  （１２５３〜１２７４位の領域の相補配列）
配列番号７４：5'-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3'  （１２５１〜１２７４位の領域の相補配列）
配列番号７５：5'-CTTCACGCTCATGAGTTCCTGG-3'  （１２５２〜１２７３位の領域の相補配列）
配列番号７６：5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAG-3'  （１２５９〜１２７８位の領域の相補配列）
配列番号７７：5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAGTTC-3'（１２５６〜１２７８位の領域の相補配列）
配列番号７８：5'-CTTCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3'  （１２５１〜１２７３位の領域の相補配列）
配列番号７９：5'-GGCCAGCTTCACGCTCATGA-3'  （１２６０〜１２７９位の領域の相補配列）
配列番号８０：5'-CCAGCTTCACGCTCATGAGTTC-3'  （１２５６〜１２７７位の領域の相補配列）
配列番号８１：5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAGTT-3'  （１２５７〜１２７８位の領域の相補配列）
配列番号８２：5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAGT-3'  （１２５８〜１２７８位の領域の相補配列）
配列番号８３：5'-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTGG-3'  （１２５２〜１２７４位の領域の相補配列）
配列番号８４：5'-GGCCAGCTTCACGCTCATGAG-3'  （１２５９〜１２７９位の領域の相補配列）【００３９】
（ループプライマＲ）
配列番号８５：5'-AGGCTGCAGGCTGAGATCG-3' （１０７６〜１０９４位の領域と同じ配列）
配列番号８６：5'-GAGGCTGCAGGCTGAGATCG-3' （１０７６〜１０９３位の領域と同じ配列）
配列番号８７：5'-AGAGGCTGCAGGCTGAGATC-3' （１０７４〜１０９３位の領域と同じ配列）
配列番号８８：5'-GAGGCTGCAGGCTGAGATCG-3' （１０７５〜１０９４位の領域と同じ配列）
配列番号８９：5'-CAGAGGCTGCAGGCTGA-3' （１０７３〜１０８９位の領域と同じ配列）
配列番号９０：5'-CAGAGGCTGCAGGCTGAGA-3' （１０７３〜１０９１位の領域と同じ配列）
配列番号９１：5'-CAGAGGCTGCAGGCTGAGATC-3' （１０７３〜１０９３位の領域と同じ配列）
配列番号９２：5'-GCTGCAGGCTGAGATCGACAAC-3' （１０７８〜１０９９位の領域と同じ配列）
配列番号９３：5'-GCAGGCTGAGATCGACAACA-3' （１０８１〜１１００位の領域と同じ配列）
配列番号９４：5'-GCTGCAGGCTGAGATCGACA-3' （１０７８〜１０９７位の領域と同じ配列）
配列番号９５：5'-GCTGCAGGCTGAGATCGACAA-3' （１０７８〜１０９８位の領域と同じ配列）
配列番号９６：5'-GGCTGCAGGCTGAGATCGAC-3' （１０７７〜１０９６位の領域と同じ配列）
配列番号９７：5'-CCGGTTGGCTGGAGATGGAGTG-3' （１３３０〜１３５１位の領域と同じ配列）
配列番号９８：5'-AGCCGGTTGGCTGGAGAT-3' （１３２８〜１３４５位の領域と同じ配列）
配列番号９９：5'-CGGTTGGCTGGAGATGGAGTGG-3' （１３３１〜１３５２位の領域と同じ配列）
配列番号１００：5'-CCGGTTGGCTGGAGATGGAG-3' （１３３０〜１３４９位の領域と同じ配列）
配列番号１０１：5'-CGGTTGGCTGGAGATGGAGT-3' （１３３１〜１３５０位の領域と同じ配列）
配列番号１０２：5'-CGGTTGGCTGGAGATGGAGTG-3' （１３３１〜１３５１位の領域と同じ配列）
配列番号１０３：5'-GGTTGGCTGGAGATGGAGTGG-3' （１３３２〜１３５２位の領域と同じ配列）
配列番号１０４：5'-CCGGTTGGCTGGAGATGGA-3'（１３３０〜１３４８位の領域と同じ配列）【００４０】
また、上記以外にも、以下に例示するプライマを用いることができる。
（Ｆ３プライマ）
配列番号１０５：5'-TTGCCGAGGCTGAGGA-3'  （１１３４〜１１４９位の領域と同じ配列）【００４１】
（ＦＩＰ）
配列番号１０６：5'- CGTCCCCATGCTTCCCAGCCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
（１００６〜１０２５位の領域の相補配列と、９６４〜９８２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１０７：5'- CGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
（１００７〜１０２５位の領域の相補配列と、９６４〜９８２位の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１０８：5'- CTGCCGTGCCATATCCTGCTTGGCTCAAGGATGCTCGTGC-3'
（１２１９〜１２４０位の領域の相補配列と、１１６５〜１１８２位の領域と同じ配列とを連結した配列）【００４２】
（ＲＩＰ）
配列番号１０９：5'-CGCAGTATGAGGAGATGGCCAACTGGAGGGTCTCAAACTTGG-3'
（９２４〜９４５位の領域と同じ配列と、９８１〜１０００位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１１０：5'- ATGAACCGGGCCATCCAGAGGCTTGGCACGCTGGTTCTTG-3'
（１０５８〜１０７８位の領域と同じ配列と、１１０２〜１１２０位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１１１：5'- TTCAGAGATGAACCGGGCCATCACTTGGCACGCTGGTTCTTG-3'
（１０５１〜１０７２位の領域と同じ配列と、１１０２〜１１２１位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１１２：5'- TCAGAGATGAACCGGGCCATCCACTTGGCACGCTGGTTCTTG-3'
（１０５２〜１０７３位の領域と同じ配列と、１１０２〜１１２１位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１１３：5'- TTCAGAGATGAACCGGGCCATCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3'
（１０５１〜１０７２位の領域と同じ配列と、１０９５〜１１１５位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１１４：5'- TCAGAGATGAACCGGGCCATCCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3'
（１０５２〜１０７３位の領域と同じ配列と、１０９５〜１１１５位の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１１５：5'- GTGAAGCTGGCCCTGGACACCAACCGGCTCTCCTC-3'
（１２６８〜１２８６位の領域と同じ配列と、１３２２〜１３３７位の領域の相補配列とを連結した配列）【００４３】
（Ｒ３プライマ）
配列番号１１６：5'-GAGGTCGTCCCCATGCTTC-3'（１０１２〜１０３０位の領域の相補配列）
配列番号１１７：5'- CTCAGCCTCGGCAATGG-3'（１１３１〜１１４７位の領域の相補配列）
配列番号１１８：5'- CCTCAGCCTCGGCAATG-3'（１１３２〜１１４８位の領域の相補配列）
配列番号１１９：5'- TGGCGGCCTCCAACTTG-3'（１１１７〜１１３３位の領域の相補配列）
配列番号１２０：5'- GCTCCCACTCCATCTCCA-3'（１３３９〜１３５６位の領域の相補配列）【００４４】
上記のＲＩＰプライマのうち、配列番号３３および３４のプライマは、上記エキソンジャンクション３を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号３５〜３７，３９、４０および１０９のプライマは、上記エキソンジャンクション５を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号４１〜４３および１１０〜１１４のプライマは、上記エキソンジャンクション６を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号１１５のプライマは、上記エキソンジャンクション７を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号３８，４４および４５に示されるプライマは、上記エキソンジャンクション８を含む領域にハイブリダイズ可能である。【００４５】
上記のプライマは、目的の増幅領域に応じて適宜組み合わされるプライマセットとして用いられる。Ｆ３プライマ、ＦＩＰ、ＲＩＰおよびＲ３プライマの４種類を含むプライマセットの具体例を、表１に示す。なお、表中の各プライマの列に記載された数字は配列番号を示す。【００４６】
【表１】
2009119331.tif 000003
【００４７】
また、Ｆ３プライマ、ＦＩＰ、ＲＩＰおよびＲ３プライマに加えて、ループプライマＦおよびループプライマＲをさらに含むプライマセットの具体例を下記表２に示す。なお、表中の各プライマの列に記載された数字は配列番号を示す。【００４８】
【表２】
2009119331.tif 000004
【００４９】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いる場合、試料を、本実施形態のプライマセット、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「逆転写酵素」とする）、鎖置換活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ」とする）ならびにｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰを含む）と混合し、反応させることにより、試料中のＣＫ７のｍＲＮＡを検出することができる。【００５０】
逆転写酵素および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、どちらも、当該分野において公知のものを用いることができる。また、逆転写酵素および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用および鎖置換を行いながらＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用を備える、一種類の酵素を用いてもよい。【００５１】
さらに、好ましくは上記酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤を用いる。
本実施形態のプライマセットは、凍結乾燥した状態または溶液状態で試薬として提供され得る。異なる種類のプライマを同一の容器に収容してもよいし、各種プライマをそれぞれ別の容器に収容してもよい。
ＲＴ−ＬＡＭＰ法で用いられる各試薬は、それぞれ別々の容器に収容することができるが、逆転写酵素および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを同一の容器に収容してもよい。また、ｄＮＴＰｓ、緩衝剤、および各種プライマのうち少なくとも二種類の物質を同一の容器に収容してもよい。これらの試薬をユーザに提供する際は、上記の試薬の一部または全部を含む試薬キットとして提供してもよい。
ＣＫ７のｍＲＮＡ検出に供される試料としては、生体から採取した組織（リンパ節、リンパ液、血液等）または便などが例示される。【００５２】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いた検出は、増幅工程および検出工程を経て行われる。まず、生体から採取したＣＫ７のｍＲＮＡを含む試料を、上記プライマセット、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓおよび鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと混合する。これらの混合液を一定の温度（例えば、６５℃）まで加温してＲＴ反応およびＬＡＭＰ反応を行い、ＣＫ７のｃＤＮＡを増幅する。【００５３】
ＲＴ反応およびＬＡＭＰ反応の機序は、以下の通りである。
まず、反応液において、ＲＩＰの第二配列が、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列に含まれる領域Ｒ２ｃにハイブリダイズする。そして、逆転写酵素によって該ＲＩＰの３’末端から、ＣＫ７のｍＲＮＡを鋳型として、ＣＫ７のｃＤＮＡが合成される。これにより、ＣＫ７のｍＲＮＡと、該ＲＩＰから伸長したＣＫ７のｃＤＮＡ（ＲＩＰ伸長鎖）との二本鎖核酸が合成される。
次に、Ｒ３プライマが、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列に含まれる領域Ｒ３ｃにハイブリダイズする。そして、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって該Ｒ３プライマの３’末端から、ＣＫ７のｍＲＮＡを鋳型として、既にＣＫ７のｍＲＮＡと結合している上記ＲＩＰ伸長鎖を剥がしながら（置換しながら）、ＣＫ７のｃＤＮＡが合成される。
上記ＲＩＰ伸長鎖は、ＣＫ７のｍＲＮＡ配列と相補的な配列を有するので、該ＲＩＰ伸長鎖には領域Ｆ２ｃが含まれている。また、該ＲＩＰ伸長鎖は、上記反応により一本鎖の状態になっており、ここにＦＩＰの第四配列がハイブリダイズする。
そして、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによってＦＩＰの３’末端から、上記ＲＩＰ伸長鎖を鋳型として、ＤＮＡ合成を行う。この合成されたＤＮＡは、その５’末端に第三配列（領域Ｆ１にハイブリダイズする配列）を有するので、該第三配列は、前記の合成されたＤＮＡの配列に含まれる領域Ｆ１にハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。また、前記の合成されたＤＮＡは、その３’末端に第一配列の相補配列（領域Ｒ１ｃにハイブリダイズする配列）を有するので、該第一配列の相補配列は、前記の合成されたＤＮＡの配列に含まれる領域Ｒ１ｃにハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。従って、前記の合成されたＤＮＡは、その５’末端および３’末端の両方にステムループ構造を有するダンベル構造を形成する。
このダンベル構造のＤＮＡ（ダンベルＤＮＡ）は、その３’末端から、自己の配列を鋳型として、５’末端側のステムループ構造を解きながら、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。この伸長鎖は、その５’末端、３’末端およびこれらの中央に、それぞれ互いに相補的な配列を有するので、該伸長鎖内で３つのステムループ構造が形成される。さらに、該伸長鎖は、その３’末端から、自己の配列を鋳型として、前記ステムループ構造を解きながら、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。この反応が実質的に等温下で繰り返されることにより、分子内に特定の配列を複数有するＤＮＡが合成される（該反応の詳細は、米国特許第６４１０２７８号公報および米国特許第６９７４６７０号公報を参照されたい）。【００５４】
上記のようにして増幅された核酸の大部分は、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ：double strand DNA）であるため、この増幅産物をエチジウムブロマイド、SYBR GREEN I、Pico Greenなどのような蛍光インターカレーターで蛍光染色した後、紫外線を照射することによって蛍光を検出することができる。該蛍光染色は、増幅反応後の反応液に蛍光色素を添加することによって行ってもよい。あるいは、あらかじめ上記反応液に蛍光色素を添加し、蛍光色素の存在下で核酸増幅を行ってもよい。蛍光が検出されるか否かにより、試料中にＣＫ７のｍＲＮＡが存在しているか否かを判定することができる。また、反応後の反応液の蛍光強度を測定することによって、増幅産物の定量を行うことができる。また、この定量結果に基づいて、試料に含まれるＣＫ７のｍＲＮＡを定量することも可能である。特に、蛍光色素の存在下で核酸増幅を行う場合は、反応液の蛍光強度の増大をリアルタイムに測定し、一定の蛍光強度に達するまでの時間を測定することによって、試料中のＣＫ７のｍＲＮＡの量に換算することもできる（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＬＡＭＰ法など）。【００５５】
また、ＬＡＭＰ反応では、副産物として水に不溶なピロリン酸マグネシウムが生成する。ピロリン酸マグネシウムは核酸増幅が進むにつれて増加し、この増加に伴って反応液が白濁する。そこで、反応液の濁りを目視により確認する、あるいは反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を測定する、または反応液を有色のフィルターで濾過し、フィルター上の残渣を確認することにより標的核酸を検出することができる（国際公開WO 第01/83817号）。反応液の吸光度または散乱光強度を測定して濁度測定を行う場合、前記蛍光色素を用いた場合と同様に、濁度変化をリアルタイムでモニターすることによって、閉鎖系でＤＮＡの増幅および濁度の増加を追跡可能である。反応液が白濁するか否かにより、試料中にＣＫ７のｍＲＮＡが存在しているか否かを判定することができる。また、増幅産物の濁度を測定することによって、該増幅産物を定量することができる。さらに、該定量結果に基づいて、試料に含まれるＣＫ７のｍＲＮＡを定量することも可能である。該濁度の増加をリアルタイムに測定する場合は、一定の濁度に達するまでの時間（以下、「増幅立ち上がり時間」とする）を測定し、この時間を試料中のＣＫ７のｍＲＮＡ量に換算することも可能である。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
表１に示されるプライマセット１〜２１を用いるＲＴ−ＬＡＭＰ法により、ＣＫ７のｍＲＮＡを検出できるか否かを、以下の通り検証した。【００５７】
（１）試料調製
５×１０10copy/μＬのＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリーのＹｅａｓｔ  ＲＮＡ溶液（５０ｎｇ／μＬのＹｅａｓｔ  ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を含む）にて段階希釈し、５×１０3copy/μＬのＲＮＡ（以下、「ＲＮＡ試料Ａ」とする）を調製した。【００５８】
（２）反応液の調製
Ｆ３プライマ、ＦＩＰ、ＲＩＰおよびＲ３プライマを、下記の通り緩衝液に添加し、プライマーミックスを調製した。
３２μＭ  ＦＩＰ
３２μＭ  ＲＩＰ
２μＭ  Ｆ３プライマ
２μＭ  Ｒ３プライマ
１０ｍＭ  トリスＨＣｌ  （ｐＨ８．０）【００５９】
まず下記の試薬類を混合し、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応用緩衝液を調製した。
５３ｍＭ  トリスＨＣｌ  （ｐＨ８．８）
１．８×  Thermopol buffer (New England Biolabs)
１．４３ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  （Invitrogen）
５．３６ｍＭ  ＭｇＳＯ4  （ナカライテスク）
８．９３ｍＭ  ＤＴＴ  （和光純薬）
２％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  （Ｓｉｇｍａ）【００６０】
次に下記の試薬類を混合し、酵素液を調製した。
１０Ｕ／μＬ  ＡＭＶ逆転写酵素  （Ｐｒｏｍｅｇａ）
８Ｕ／μＬ  ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ  （New England Biolabs）
ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）【００６１】
下記の試薬を混合し、２５μＬの反応液を調製した。
ＲＴ−ＬＡＭＰ反応用緩衝液  １４．０μＬ
酵素液  ３．０μＬ
プライマーミックス  ２．５μＬ
１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）  ３．５μＬ
ＲＮＡ試料Ａ  ２．０μＬ【００６２】
また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、２．０μＬのＲＮＡ試料Ａの代わりに、Ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ溶液（５０ｎｇ／μＬのＹｅａｓｔ  ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を含む）２．０μＬを添加した反応液も調製した。【００６３】
（３）検出および検出結果
２１種類のプライマセットの何れかを含む反応液を収容したチューブを、あらかじめ６５℃に加温しておいたリアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス社）にセットし、さらに６５℃で反応液をインキュベートした。反応開始から反応液の濁度が０．１に達するまでの時間を測定した。ネガティブコントロールの測定を１回行い、ＲＮＡ試料Ａの測定を３回行った（ｎ＝３）。ネガティブコントロールの結果およびＲＮＡ試料Ａの測定結果の平均値を、表３に示す。【００６４】
【表３】
2009119331.tif 000005
【００６５】
表中、−（ハイフン）は６０分以内に濁度が０．１に達しなかったことを示す。表３に示されるとおり、ネガティブコントロールでは、６０分以内に濁りの検出が確認されなかった（非特異的な増幅が起こらなかった）が、ＲＮＡ試料Ａを用いた３回の測定では、いずれも６０分以内に核酸増幅が確認された（表中では平均値のみ示す）。以上より、プライマセット１〜２１の何れを用いても、６０分以内にＣＫ７のｍＲＮＡを検出できることがわかった。【００６６】
（実施例２）
表２に示されるプライマセット２２〜６１を用いるＲＴ−ＬＡＭＰ法により、ＣＫ７のｍＲＮＡを検出できるか否かを、以下の通り検証した。【００６７】
（１）試料調製
５×１０10copy/μＬのＲＮＡをＲＮａｓｅフリーのＹｅａｓｔ  ＲＮＡ溶液（５０ｎｇ／μＬのＹｅａｓｔ  ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を含む）にて段階希釈し、２．５×１０3copy/μＬのＲＮＡ（以下、「ＲＮＡ試料Ｂ」とする）を調製した。【００６８】
（２）反応液の調製
Ｆ３プライマ、ＦＩＰ、ＲＩＰ、Ｒ３プライマ、ループプライマＦおよびループプライマＲを、下記の通り緩衝液に添加し、プライマーミックスを調製した。
１６μＭ  ＦＩＰ
１６μＭ  ＲＩＰ
１μＭ  Ｆ３プライマ
１μＭ  Ｒ３プライマ
１２μＭ  ループプライマＦ
１２μＭ  ループプライマＲ
１０ｍＭ  トリスＨＣｌ  （ｐＨ８．０）【００６９】
下記の試薬を混合し、２５μＬの反応液を調製した。
実施例１で調製したＲＴ−ＬＡＭＰ反応用緩衝液  １４．０μＬ
実施例１で調製した酵素液  ３．０μＬ
プライマーミックス  ５μＬ
１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １．０μＬ
ＲＮＡ試料Ｂ  ２．０μＬ【００７０】
（３）検出および検出結果
４０種類のプライマセットの何れかを含む反応液を収容したチューブを、あらかじめ６５℃に加温しておいたリアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス社）にセットし、さらに６５℃で反応液をインキュベートした。反応開始から反応液の濁度が０．１に達するまでの時間を測定した。ネガティブコントロールの測定を１回行い、ＲＮＡ試料Ｂの測定を３回行った（ｎ＝３）。ネガティブコントロールの結果およびＲＮＡ試料Ｂの測定結果の平均値を、表４に示す。【００７１】
【表４】
2009119331.tif 000006
【００７２】
表中、−（ハイフン）は６０分以内に濁度が０．１に達しなかったことを示す。表３に示されるとおり、ネガティブコントロールでは、６０分以内に濁りの検出が確認されなかった（非特異的な増幅が起こらなかった）が、ＲＮＡ試料Ｂを用いた３回の測定では、いずれも４０分以内に核酸増幅が確認された（表中では平均値のみ示す）。以上より、プライマセット２２〜６１の何れを用いても、４０分以内にＣＫ７のｍＲＮＡを検出できることがわかった。【００７３】
本出願は、２００８年３月２８日に出願された日本国特許出願特願２００８−０８８１８８号に関し、この特許請求の範囲、明細書、図面、表、配列表及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
2009119331.tif 000007
【配列表】
2009119331000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月20日(2009.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一プライマ、第二プライマ、第三プライマおよび第四プライマを含み；
１）前記第一プライマが、５’側に第一配列を、３’側に第二配列を含み、
前記第一配列が、
（ａ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ）配列番号１の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
前記第二配列が、
（ｃ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ）配列番号１の配列において前記第一領域よりも３’側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第二領域が、
ｉ．配列番号１の７２４および７２５位のヌクレオチド、
ｉｉ．配列番号１の９８５および９８６位のヌクレオチド、
ｉｉｉ．配列番号１の１１１１および１１１２位のヌクレオチド、
ｉｖ．配列番号１の１３３２および１３３３位のヌクレオチド、または
ｖ．配列番号１の１３６７および１３６８位のヌクレオチド
を含み、
２）前記第二プライマが、５’側に第三配列を、３’側に第四配列を含み、
前記第三配列が、
（ｅ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｆ）配列番号１の配列において前記第一領域よりも５’側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第四配列が、
（ｇ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｈ）配列番号１の配列において前記第三領域よりも５’側に位置する第四領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
３）前記第三プライマが、配列番号１の配列において前記第四領域よりも５’側に位置する第五領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
４）前記第四プライマが、配列番号１の配列において前記第二領域よりも３’側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である、サイトケラチン７のｍＲＮＡの検出用プライマを含む試薬。
【請求項２】
５’側に第一配列を、３’側に第二配列を含み；
前記第一配列が、
（ａ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ）配列番号１の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
前記第二配列が、
（ｃ）１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ）配列番号１の配列において前記第一領域よりも３’側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第二領域が、
ｉ．配列番号１の７２４および７２５位のヌクレオチド、
ｉｉ．配列番号１の９８５および９８６位のヌクレオチド、
ｉｉｉ．配列番号１の１１１１および１１１２位のヌクレオチド、
ｉｖ．配列番号１の１３３２および１３３３位のヌクレオチド、または
ｖ．配列番号１の１３６７および１３６８位のヌクレオチド
を含む、サイトケラチン７のｍＲＮＡ検出用プライマ。
【請求項３】
以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号３３〜４５および１０９〜１１５の何れかに記載のポリヌクレオチド、
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項２に記載のプライマ。
【請求項４】
配列番号１の７２１〜７３９位の領域、
配列番号１の９７４〜９９９位の領域、
配列番号１の９７６〜９９５位の領域、
配列番号１の９７８〜９９３位の領域、
配列番号１の９７８〜９９７位の領域、
配列番号１の９８１〜１０００位の領域、
配列番号１の１０９５〜１１１５位の領域、
配列番号１の１１００〜１１１７位の領域、
配列番号１の１１０１〜１１１７位の領域、
配列番号１の１３５３〜１３７６位の領域、
配列番号１の１３５３〜１３７９位の領域、および
配列番号１の１３５４〜１３７６位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項２または請求項３に記載のプライマ。
【請求項５】
前記第二配列の３’末端の３ヌクレオチドが、前記第二領域の配列と完全に相補的である、請求項２に記載のプライマ。
【請求項６】
第一プライマ、第二プライマ、第三プライマおよび第四プライマを含む；
１）前記第一プライマが、請求項２に記載のプライマであり、
２）前記第二プライマが、５’側に第三配列を、３’側に第四配列を含み、
前記第三配列が、
ｉ．１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
ｉｉ．配列番号１の配列において前記第一領域よりも５’側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第四配列が、
ｉｉｉ．１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
ｉｖ．配列番号１の配列において前記第三領域よりも５’側に位置する第四領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
３）前記第三プライマが、配列番号１の配列において前記第四領域よりも５’側に位置する第五領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
４）前記第四プライマが、配列番号１の配列において前記第二領域よりも３’側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である、サイトケラチン７のｍＲＮＡ検出用プライマセット。
【請求項７】
前記第二プライマが、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号１４〜３２および１０６〜１０８の何れかに記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択され、
前記第三プライマが、以下の（ｃ）および（ｄ）：
（ｃ）配列番号２〜１３および１０５のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項８】
前記第二プライマが、
配列番号１の５７４〜５９０位の領域、
配列番号１の８１３〜８３４位の領域、
配列番号１の８１３〜８８２位の領域、
配列番号１の８１６〜８３４位の領域、
配列番号１の８３７〜８５６位の領域、
配列番号１の８４０〜８５７位の領域、
配列番号１の８５１〜８６９位の領域、
配列番号１の８５１〜８７１位の領域、
配列番号１の８６１〜８８２位の領域、
配列番号１の８６３〜８８３位の領域、
配列番号１の９６３〜９８２位の領域、
配列番号１の９６４〜９８２位の領域、
配列番号１の１１６５〜１１８２位の領域、
配列番号１の１２３５〜１２５２位の領域、および
配列番号１の１２３６〜１２５２位の領域
からなる群より選択される領域の相補領域にハイブリダイズする、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項９】
前記第三プライマが、
配列番号１の５３８〜５５６位の領域、
配列番号１の５４２〜５６１位の領域、
配列番号１の５４６〜５６４位の領域、
配列番号１の７７５〜７９４位の領域、
配列番号１の７９６〜８１５位の領域、
配列番号１の８１６〜８３４位の領域、
配列番号１の８２７〜８４３位の領域、
配列番号１の８２８〜８４５位の領域、
配列番号１の８４０〜８５９位の領域、
配列番号１の９３２〜９５０位の領域、
配列番号１の１１３４〜１１４９位の領域、および
配列番号１の１２１３〜１２２８位の領域
からなる群より選択される領域に対する相補鎖にハイブリダイズする、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１０】
前記第四プライマが、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号４６〜６０および１１６〜１２０のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１１】
前記第四プライマが、
配列番号１の７４１〜７５９位の領域、
配列番号１の７４２〜７６０位の領域、
配列番号１の１００７〜１０２３位の領域、
配列番号１の１００９〜１０２５位の領域、
配列番号１の１０１１〜１０２８位の領域、
配列番号１の１０１２〜１０２８位の領域、
配列番号１の１０１２〜１０２９位の領域、
配列番号１の１０１２〜１０３０位の領域、
配列番号１の１１１７〜１１３２位の領域、
配列番号１の１１１７〜１１３３位の領域、
配列番号１の１１１８〜１１３３位の領域、
配列番号１の１１１８〜１１３４位の領域、
配列番号１の１１１８〜１１３５位の領域、
配列番号１の１１３１〜１１４７位の領域、
配列番号１の１１３２〜１１４８位の領域、
配列番号１の１３５６〜１３３９位の領域、
配列番号１の１３８３〜１４００位の領域、
配列番号１の１３８４〜１４０１位の領域、および
配列番号１の１３９０〜１４０６位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１２】
前記配列番号１の配列に含まれる前記第三領域と前記第四領域との間に位置する第七領域にハイブリダイズする第五プライマをさらに含む、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１３】
前記第五プライマが、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号６１〜８４のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド。
からなる群より選択される、請求項１２に記載のプライマセット。
【請求項１４】
前記第五プライマが、
配列番号１の９８３〜１００２位の領域、
配列番号１の９８３〜１００３位の領域、
配列番号１の９８４〜１００２位の領域、
配列番号１の９８４〜１００３位の領域、
配列番号１の９８４〜１００４位の領域、
配列番号１の９８５〜１００４位の領域、
配列番号１の９８６〜１００４位の領域、
配列番号１の９８６〜１００５位の領域、
配列番号１の９８７〜１００５位の領域、
配列番号１の９８７〜１００６位の領域、
配列番号１の１２５１〜１２７１位の領域、
配列番号１の１２５１〜１２７３位の領域、
配列番号１の１２５１〜１２７４位の領域、
配列番号１の１２５２〜１２７３位の領域、
配列番号１の１２５２〜１２７４位の領域、
配列番号１の１２５３〜１２７４位の領域、
配列番号１の１２５６〜１２７７位の領域、
配列番号１の１２５６〜１２７８位の領域、
配列番号１の１２５７〜１２７８位の領域、
配列番号１の１２５８〜１２７８位の領域、
配列番号１の１２５９〜１２７８位の領域、
配列番号１の１２５９〜１２７９位の領域、および
配列番号１の１２６０〜１２７９位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項１２に記載のプライマセット。
【請求項１５】
前記配列番号１の配列に含まれる前記第一領域と第二領域との間に位置する第八領域の相補領域にハイブリダイズする第六プライマをさらに含む、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１６】
前記第六プライマが、以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）配列番号８５〜１０４のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項１５に記載のプライマセット。
【請求項１７】
前記第六プライマが、
配列番号１の１０７３〜１０８９位の領域、
配列番号１の１０７３〜１０９１位の領域、
配列番号１の１０７３〜１０９３位の領域、
配列番号１の１０７４〜１０９３位の領域、
配列番号１の１０７５〜１０９４位の領域、
配列番号１の１０７６〜１０９３位の領域、
配列番号１の１０７６〜１０９４位の領域、
配列番号１の１０７７〜１０９６位の領域、
配列番号１の１０７８〜１０９７位の領域、
配列番号１の１０７８〜１０９８位の領域、
配列番号１の１０７８〜１０９９位の領域、
配列番号１の１０８１〜１１００位の領域、
配列番号１の１３２８〜１３４５位の領域、
配列番号１の１３３０〜１３４８位の領域、
配列番号１の１３３０〜１３４９位の領域、
配列番号１の１３３０〜１３５１位の領域、
配列番号１の１３３１〜１３５０位の領域、
配列番号１の１３３１〜１３５１位の領域、
配列番号１の１３３１〜１３５２位の領域、および
配列番号１の１３３２〜１３５２位の領域
からなる群より選択される領域の相補領域にハイブリダイズする、請求項１５に記載のプライマセット。
【請求項１８】
第二プライマが配列番号２５の配列を含む、請求項６に記載のプライマセット。
【請求項１９】
請求項６に記載のプライマセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰｓとを含む、サイトケラチン７のｍＲＮＡ検出用キット。
【請求項２０】
１）生体から採取した試料、請求項６に記載のプライマセットおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、前記試料中のサイトケラチン７のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と、
２）前記プライマセット、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび前記工程で合成されたｃＤＮＡを反応させて、ｃＤＮＡを増幅する工程と、
３）増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のサイトケラチン７のｍＲＮＡを検出する工程と
を含む、サイトケラチン７のｍＲＮＡ検出方法。
【国際調査報告】
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