(57)【要約】  本発明は、式(I)の光学活性アルコール（式中、nは0〜5の整数であり、Cycは場合により置換されていてもよい、単核もしくは多核の、飽和もしくは不飽和炭素環または複素環であり、R1はハロゲン、SH、OH、NO2、NR2R3、またはNR2R3R4+X-であり、ここでR2、R3、およびR4はそれぞれ独立して水素、低級アルキル基、または低級アルコキシ基であり、X-は対イオンである）の製造方法に関する。この方法によれば、(i)配列番号１のポリペプチド配列、または(ii)配列番号１に対して、25％までのアミノ酸残基が欠失、挿入、置換またはそれらの組合せにより改変されており、かつ配列番号１の酵素活性の少なくとも50％を保持しているポリペプチド配列、を有する酵素を、式(II)のアルカノン（式中、n、CycおよびR1は先に定義したとおり）を含む媒体中でインキュベートする。式(II)の化合物が酵素的に還元されて式(I)の化合物を生成し、このようにして得られた生成物を単離する。2009520483.tif 000018
2009520483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2009520483.tif 000014
［式中、
nは、0〜5の整数であり、
Cycは、場合により置換されていてもよい、単核もしくは多核の、飽和もしくは不飽和炭素環または複素環であり、
R1は、ハロゲン、SH、OH、NO2、NR2R3、またはNR2R3R4+X-であり、ここでR2、R3、およびR4は、それぞれ独立して、水素、低級アルキル基、または低級アルコキシ基であり、X-は対イオンである］
の光学活性アルカノールの製造方法であって、
式II：
【化２】
2009520483.tif 000015
［式中、n、Cyc、およびR1は先に定義したとおりである］
のアルカノンを含む媒体中で、
(i)配列番号１のポリペプチド配列、または
(ii)配列番号１に対して、25％までのアミノ酸残基が欠失、挿入、置換またはそれらの組合せにより改変されており、かつ配列番号１の酵素活性の少なくとも50％を保持しているポリペプチド配列、
を有する酵素をインキュベートして式IIの化合物を酵素的に還元し、生成された式Ｉの化合物を単離することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
式III：
【化３】
2009520483.tif 000016
［式中、R1はClまたはNHCH3である］
の1-(2-チエニル)-(S)-プロパノールの誘導体を製造するために、式IV：
【化４】
2009520483.tif 000017
の1-(2-チエニル)プロパノンの誘導体を含む媒体中で、この化合物を酵素的に還元して式IIIの化合物を得、生成された実質的に純粋なエナンチオマー生成物を単離する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素がラクトバチルス（Lactobacillus）属の微生物の酵素の中から選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
還元当量を添加して、または反応で消費される還元当量を再生させる条件下で、前記反応を実施する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
コファクターがC2-C10-アルカノールを用いて再生される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
式IIの化合物を、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科、シュードモナス（Pseudomonadaceae）科、リゾビウム（Rhizobiaceae）科、ストレプトマイセス（Streptomycetaceae）科、およびノカルジア（Nocardiaceae）科の細菌の中から選択される微生物の存在下で反応させる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が請求項1で定義した酵素をコードする核酸構築物により形質転換された組換え微生物である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
(i)配列番号１のポリペプチド配列、または
(ii)配列番号１に対して、25％までのアミノ酸残基が欠失、挿入、置換またはそれらの組合せにより改変されており、かつ配列番号１の酵素活性の少なくとも50％を保持しているポリペプチド配列、
を有する、デヒドロゲナーゼ活性を示す酵素。
【請求項９】
式ＩまたはIIIの化合物を製造するための、
(i)配列番号１のポリペプチド配列、または
(ii)配列番号１に対して、25％までのアミノ酸残基が欠失、挿入、置換またはそれらの組合せにより改変されており、かつ配列番号１の酵素活性の少なくとも50％を保持しているポリペプチド配列、
を有する、デヒドロゲナーゼ活性を示す酵素の使用。
【請求項１０】
デュロキセチンを製造するための方法における、請求項9に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性アルコールを、対応するケトンの酵素的還元により、製造する方法に関し、特に、(1S)-3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オールおよび(1S)-3-クロロ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
(1S)-3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オール（「デュロキセチンアルコール」）は、デュロキセチンを合成する際のビルディングブロックである。デュロキセチン（Duloxetine：登録商標）は現在、承認申請中の薬物であり、うつ病や尿失禁の適応分野での使用が意図されている。
【０００３】
EP-B-0273658は、デュロキセチンに対応する塩基の製造方法を記載しており、この方法は、2-アセチルチオフェンをホルムアルデヒドおよびジメチルアミンとマンニッヒ反応で反応させ、こうして得られたマンニッヒ塩基のケト基を還元してラセミ体の(S)-3-N,N-ジメチルアミノ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールを得、アルコール官能基をフッ化ナフチルでエーテル化し、最後にジメチルアミノ基をメチルアミノ官能基に変換することを含んでなる。目的のナフチルエーテルエナンチオマーを取得するには、キラルな出発物質を用いるか、または最終生成物の段階でラセミ体を、例えば光学活性酸を用いる塩形成、もしくはキラルな固定相でのクロマトグラフィーにより、分割する。
【０００４】
US-5,362,886は、ケト基の還元後に得られたラセミ体のプロパノールにS-マンデル酸を加えることを含んでなる類似の方法を記載している。この方法で得られるアルコールのSエナンチオマーが後続の反応段階で使用される。
【０００５】
EP-A-0457559も同様に、EP-B-0273658に記載の方法と類似した方法を記載している。ここでは、マンニッヒ塩基のケト基が、不斉還元系LAH-lcb（水素化アルミニウムリチウム[(2R,2S)-(-)-4-ジメチルアミノ-1,2-ジフェニル-3-メチル-2-ブタノール]）を用いることにより、当該アルコールのS-エナンチオマー体に還元される。この方法の欠点は、コストのほかに、たった数分間しか安定でないLAH-lcb還元系の感受性にある。
【０００６】
W. J. WheelerおよびF. Kuoは、Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, Volume XXXVI, No. 3, pp. 213-223にデュロキセチンの製造方法を記載している。そのために、塩化チオフェン-2-カルボニルを、Stilleカップリングで、DMPU (ジメチルプロピレンウレア)中の触媒量のベンジルクロロ-ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)の存在下で、ビニルトリ-n-ブチルスタンナンと反応させて式(V)：
【化１】
2009520483.tif 000003
【０００７】
の1-(チエン-2-イル)プロペノンを生成し、次いでこれを塩化水素で処理して式(VI)：
【化２】
2009520483.tif 000004
【０００８】
の3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンに変換している。その後、このようにして得られたクロロプロパンをキラルなオキサアザボリリジン（oxazaborylidine）とBH3で還元して式(VII)：
【化３】
2009520483.tif 000005
【０００９】
の(S)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールを得る。得られたアルコールを、ヨウ化ナトリウムと、続いてメチルアミンと順次反応させて、(S)-3-メチルアミノ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールに変換する。その後、水素化ナトリウム、1-フルオロナフタレンおよび塩化水素と連続的に反応させると、塩酸塩の形のデュロキセチンが得られる。
【化４】
2009520483.tif 000006
Hal＝ハロゲン
【００１０】
WO 05/108590は、光学活性アルカノールを、対応するアルカノンの還元により製造するための、特に3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパノンおよび3-クロロ-1-(2-チエニル)プロパノンを還元するための、デヒドロゲナーゼ類を記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパノンおよび3-クロロ-1-(2-チエニル)プロパノンのような置換アルカノンを立体特異的に還元する方法を見つけ出すことであった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、特にラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）種の微生物から得られる、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）活性を有する酵素が上記の反応を立体特異的に触媒することができる、という驚くべき知見により達成された。
【００１３】
本発明は、最初に、式Ｉ：
【化５】
2009520483.tif 000007
【００１４】
［式中、
nは、0〜5の整数、特に0、1または2であり、
Cycは、場合により置換されていてもよい、単核もしくは多核の、飽和もしくは不飽和炭素環または複素環、特に、場合により置換されていてもよい不飽和の単核複素環であり、
R1は、ハロゲン、SH、OH、NO2、NR2R3、またはNR2R3R4+X-、特にハロゲンまたはNR2R3であり、ここでR2、R3、およびR4は、それぞれ独立して、水素、低級アルキル基、または低級アルコキシ基であり、X-は対イオンである］
の光学活性アルカノールの製造方法に関し、この方法は、式II：
【化６】
2009520483.tif 000008
【００１５】
［式中、n、Cyc、およびR1は先に定義したとおりである］
のアルカノンを含む媒体中で、
(i)配列番号１のポリペプチド配列、または
(ii)配列番号１に対して、25％までのアミノ酸残基が欠失、挿入、置換またはそれらの組合せにより改変されており、かつ配列番号１の酵素活性の少なくとも50％を保持しているポリペプチド配列、
を有する酵素をインキュベートし、式IIの化合物を酵素的に還元して式Ｉの化合物を得、生成された実質的に純粋なエナンチオマー生成物を単離することを含んでなる。
【００１６】
特に好ましい実施形態では、前記方法は、式III：
【化７】
2009520483.tif 000009
【００１７】
［式中、R1はClまたはNHCH3である］
の1-(2-チエニル)-(S)-プロパノールの誘導体を製造するために使用され、この方法、式IV：
【化８】
2009520483.tif 000010
【００１８】
の1-(2-チエニル)プロパノンの誘導体を含む媒体中で、この化合物を酵素的に還元して式IIIの化合物を得、生成された実質的に純粋なエナンチオマー生成物を単離することを含んでなる。
【００１９】
この方法では、ラクトバチルス（Lactobacillus）属の微生物から調製しうる、デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を用いることが好ましい。
【００２０】
特に、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）のデヒドロゲナーゼを用いることが有利である。
【００２１】
前記方法の特に好ましい実施形態では、デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、配列番号１のアミノ酸配列、または、それから誘導された、25％まで、好ましくは20％まで、特に好ましくは15％まで、とりわけ10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％までのアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、または欠失、置換、挿入の組合せにより改変されている配列（ただし、配列番号１に対して改変されたポリペプチド配列は、配列番号１の酵素活性の少なくとも50％、好ましくは65％、特に好ましくは80％、とりわけ90％以上を保持している）を有する酵素の中から選択される。これに関連して、配列番号１の酵素活性とは、式(IV)のケトン（ここで、R1＝Cl）をエナンチオ選択的に還元して一般式(III)の(S)アルコールを生成する能力をさすものとする。
【００２２】
本発明の方法は、還元当量（NADHもしくはNADPH）を添加して、または反応で消費される還元当量を再生させる（生化学的もしくは電気化学的）条件下で実施することが好ましい。これらの好ましい実施形態については、一般的に応用できる再生系を説明している実施例2および3を参照されたい。
【００２３】
本発明の方法におけるコファクター再生の別の好適な実施形態は、水に非混和性の酸化性化合物、例えば高級アルコール、好ましくはヘキサノールを使用することであり、これは反応媒体中の第2の液相中に存在させることができる。
【００２４】
さらに、一般式II（例えば、式IV）の化合物を腸内細菌（Enterobacteriaceae）科、シュードモナス（Pseudomonadaceae）科、リゾビウム（Rhizobiaceae）科、ストレプトマイセス（Streptomycetaceae）科、およびノカルジア（Nocardiaceae）科の細菌の中から選択される微生物の存在下で反応させることが有利である。この微生物は、特に、先に定義したデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸構築物により形質転換された組換え微生物であり得る。
【００２５】
本発明は特に、
-    デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を産生する微生物を天然源から単離するか、または組換えにより作製すること、
-    該微生物を増殖させること、
-    該微生物からデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を、適切な場合に、単離するか、または該酵素を含むタンパク質画分を調製すること、
-    段階b)による微生物または段階c)による酵素を、式Ｉの化合物を含む媒体に移すこと、
に関する。
【００２６】
本発明は、
(i)配列番号１のポリペプチド配列、または
(ii)配列番号１に対して、25％までのアミノ酸残基が欠失、挿入、置換またはそれらの組合せにより改変されており、かつ配列番号１の酵素活性の少なくとも50％を保持しているポリペプチド配列、
を有する、デヒドロゲナーゼ活性を示す酵素に関する。
【００２７】
本発明はさらに、先に定義したポリペプチドをコードする配列を有するコード核酸配列に関する。
【００２８】
本発明はさらに、少なくとも1つの調節核酸配列に機能的に連結された、先に定義したコード核酸配列を含む発現カセットに関する。
【００２９】
本発明はさらに、少なくとも1つの前記発現カセットを含む組換えベクターに関する。
【００３０】
本発明はまた、少なくとも1つの本発明のベクターにより形質転換された原核または真核生物宿主に関する。
【００３１】
最後に、本発明は、先に定義したデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素、または該酵素を産生する微生物の、式ＩまたはIIIの化合物を製造するための使用、ならびに、例えばデュロキセチン（式VIII）を製造するための、そのさらなる処理に関する。
【化９】
2009520483.tif 000011
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
A.  一般用語および定義
特に指定のない限り、次の一般的な意味が当てはまる：
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードであり、特にフルオロまたはクロロである。
【００３３】
「低級アルキル」は、炭素原子数1〜6の直鎖または分枝鎖アルキル基、例えばメチル、エチル、イソプロピルまたはn-プロピル、n-、イソ-、sec-もしくはtert-ブチル、n-ペンチルまたは2-メチルブチル、n-ヘキシル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、2-エチルブチルである。
【００３４】
「低級アルケニル」は、炭素原子数2〜6の、上記アルキル基のモノまたはポリ、好ましくはモノまたはジ不飽和類似体であり、二重結合は炭素鎖のいずれの位置にも存在可能である。
【００３５】
「低級アルコキシ」は、上記アルキル基の、末端に酸素がある類似体である。
【００３６】
「アリール」は、単核または多核の、好ましくは単核または二核の、場合により置換されていてもよい芳香族基、特にフェニル、または任意の環位置で結合されるナフチル、例えば1-もしくは2-ナフチルである。これらのアリール基は、適切な場合、先に定義したハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、またはトリフルオロメチルの中から選択される1個または2個の同一のまたは異なる置換基を有していてもよい。
【００３７】
B.  置換アルカノン、(S)-アルカノール、およびそれらの誘導体
酵素触媒作用により本発明に従って得られるアルカノールは上記の式(I)の化合物であり、式(I)において、
nは、0〜5の整数であり、
Cycは、場合により置換されていてもよい、単核もしくは多核の、飽和もしくは不飽和炭素環または複素環であり、
R1は、ハロゲン、SH、OH、NO2、NR2R3、またはNR2R3R4+X-であり、ここでR2、R3、およびR4は、それぞれ独立して、水素、低級アルキル基、または低級アルコキシ基であり、X-は対イオンである。
【００３８】
酵素的合成に用いられる上記の式IIのアルカノンは、それ自体公知の化合物であり、また、周知の有機合成法（例えば、EP-A-0 273 658参照）により製造することができる。
【００３９】
上記の化合物において、nは好ましくは0、1または2であり、特に1である。
【００４０】
炭素環基および複素環基Cycの例を挙げると、特に、単核または二核の、好ましくは単核の、O、NおよびSから選択される最大4個までの、好ましくは1もしくは2個の、同一のまたは異なる環へテロ原子を有する基である。
【００４１】
これらの炭素環または複素環は、特に3〜12個、好ましくは4、5または6個の環炭素原子を含む。例を挙げると、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、これらのモノまたはポリ不飽和類似体、例えばシクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプタジエニル; さらに、5〜7員の飽和またはモノもしくはポリ不飽和の複素環基（O、NおよびSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有し、該複素環は適宜に別の複素環または炭素環に縮合していてもよい）がある。特に、ピロリジン、テトラヒドロフラン、ピペリジン、モルホリン、ピロール、フラン、チオフェン、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピリジン、ピラン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、クマロン、インドール、およびキノリンから誘導される複素環基を挙げる必要がある。
【００４２】
この場合、基Cycはどの環位置で結合されてもよく、好ましくは、環炭素原子を介してアルカノンまたはアルカノールに結合される。
【００４３】
適当なCyc基の例としては、次のものがある：2-チエニル、3-チエニル; 2-フラニル、3-フラニル; 2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル; 2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル; 4-メチル-2-チエニル、3-エチル-2-チエニル、2-メチル-3-チエニル、4-プロピル-3-チエニル、5-n-ブチル-2-チエニル、4-メチル-3-チエニル、3-メチル-2-チエニル; 3-クロロ-2-チエニル、4-ブロモ-3-チエニル、2-ヨード-3-チエニル、5-ヨード-3-チエニル、4-フルオロ-2-チエニル、2-ブロモ-3-チエニル、および4-クロロ-2-チエニル。
【００４４】
基Cycはさらに、モノまたはポリ置換、例えばモノまたはジ置換されていてもよい。置換基は環炭素原子上に位置することが好ましい。適当な置換基の例としては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、-OH、-SH、-NO2、またはNR2R3（ここで、R2およびR3は先に定義したとおりである）があり、好ましくはハロゲンもしくは低級アルキルである。
【００４５】
R1は、特に、ハロゲン、NR2R3、またはNR2R3R4+X-であり、ここでR2、R3およびR4は、それぞれ独立して、水素、低級アルキル基、または低級アルコキシ基であり、X-は対イオンである。基R2、R3およびR4の1つは水素であることが好ましい。適当な対イオンの例は、例えば、酸付加塩を調製するときに生じるような、酸アニオンである。その例は、例えば、EP-A-0 273 658に載っており、これを参照として本明細書に含めるものとする。基R1の好ましい例は、特にフルオロもしくはクロロ、またはNR2R3（ここで、R2およびR3は、同一でも異なっていてもよく、水素、またはメチル、エチルもしくはn-プロピルである）である。R1は特に好ましくはクロロまたは-NHメチルである。
【００４６】
C.  デヒドロゲナーゼ活性を有する好適な酵素
デヒドロゲナーゼ活性を有する好適な酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００４７】
本発明は同様に、具体的に開示した酵素の、デヒドロゲナーゼ活性を有する「機能的等価物」、ならびに本発明の方法におけるそれらの使用を含んでなる。
【００４８】
本発明において、具体的に開示した酵素の「機能的等価物」または類似体とは、これらの酵素と相違するが、例えば基質特異性のような所望の生物学的活性をまだ保持しているポリペプチドのことである。こうして、「機能的等価物」は、例えば、3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンを対応するSアルコールに還元し、かつ配列番号１に示したアミノ酸配列を有する酵素の活性の少なくとも50％、好ましくは60％、さらに好ましくは75％、さらに一層好ましくは90％を保持する酵素をさす。機能的等価物はまた、pH4〜10で安定していることが好ましく、至適pHはpH5〜8で、至適温度は20〜80℃の範囲であることが有利である。
【００４９】
本発明によれば、「機能的等価物」はまた、特に、上記のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置に、具体的に挙げたアミノ酸以外のアミノ酸を有するが、それにもかかわらず上記の生物学的活性の1つを保持している突然変異体をもさす。こうして、「機能的等価物」は、1個以上のアミノ酸の付加、置換、欠失、および/または逆位により得られる突然変異体を含む。かかる変異は、それらが本発明の特性プロファイルを有する突然変異体をもたらす限り、どのような配列位置にも存在可能である。機能的等価物はまた、特に、突然変異型と非変異型のポリペプチドの反応性パターンが質的に一致する（すなわち、同一の基質が、例えば、異なる速度で変換される）場合にも存在する。
【００５０】
適当なアミノ酸置換の例は下記の表に見出すことができる：
2009520483.tif 000012
【００５１】
本発明によれば、「機能的等価物」はまた、特に、上記のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置に、具体的に挙げたアミノ酸以外のアミノ酸を有するが、それにもかかわらず上記の生物学的活性の1つを保持している突然変異体をもさす。こうして、「機能的等価物」は、1個以上のアミノ酸の付加、置換、欠失、および/または逆位により得られる突然変異体を含む。かかる変異は、それらが本発明の特性プロファイルを有する突然変異体をもたらす限り、どのような配列位置にも存在可能である。機能的等価物はまた、特に、突然変異型と非変異型のポリペプチドの反応性パターンが質的に一致する（すなわち、同一の基質が、例えば、異なる速度で変換される）場合にも存在する。
【００５２】
上記の意味での「機能的等価物」はまた、記載したポリペプチドの「前駆体」でもあり、また、前記ポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
【００５３】
ここにおいて、「前駆体」は、所望の生物学的活性を有するまたは有しない、前記ポリペプチドの天然または合成前駆体である。
【００５４】
「塩」という語は、本発明のタンパク質分子のカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、それ自体公知の方法で調製することができ、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩のような無機塩だけでなく、アミン（例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジン）のような有機塩基との塩をも含む。本発明は同様に、酸付加塩、例えば塩酸や硫酸のような無機酸との塩、および酢酸やシュウ酸のような有機酸との塩にも関する。
【００５５】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」は同様に、公知方法を用いて、官能的なアミノ酸側鎖基またはそのN-末端もしくはC-末端において調製することができる。この種の誘導体には、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド（かかるアミドはアンモニアまたは一級もしくは二級アミンと反応させることにより得られる）、遊離アミノ基のN-アシル誘導体（かかる誘導体はアシル基と反応させることにより調製される）、または遊離ヒドロキシル基のO-アシル誘導体（かかる誘導体はアシル基と反応させることにより調製される）が含まれる。
【００５６】
「機能的等価物」はもちろん、他の生物から得られるポリペプチドおよび天然に存在する変異体をも包含する。例えば、相同配列の領域を配列比較によって決定し、本発明の具体的なガイドラインに沿って等価な酵素を確認することができる。
【００５７】
「機能的等価物」は同様に、本発明のポリペプチドの断片（好ましくは、それぞれのドメインまたは配列モチーフ）を包含し、かかる断片は例えば所望の生物学的機能を備えているものである。
【００５８】
「機能的等価物」はさらに、融合タンパク質を包含し、これは、上記のポリペプチド配列またはそれに由来する機能的等価物のいずれかと、それとは機能的に異なりかつN-末端またはC-末端で機能的に連結された（すなわち、融合タンパク質成分の実質的な相互の機能的損傷なしに連結された）少なくとも1つの他の異種配列とを含んでなる。そのような異種配列の非限定的な例は、シグナルペプチドまたは酵素である。
【００５９】
本発明に含まれる「機能的等価物」は、具体的に開示したタンパク質の相同体である。かかる相同体は、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448に記載のアルゴリズムを用いて計算して、具体的に開示したアミノ酸配列の1つに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも75％、特に少なくとも85％、例えば90％、95％または99％の相同性を保有する。本発明の相同ポリペプチドの相同性パーセントは、特に、アミノ酸残基の同一性パーセントであって、これは本明細書で具体的に開示したアミノ酸配列の全長に基づく。
【００６０】
タンパク質のグリコシル化が存在しうる場合、本発明の「機能的等価物」は、脱グリコシル化形態またはグリコシル化形態の、さらにはグリコシル化パターンを改変することにより得られる改変形態の、上記のタイプのタンパク質を包含する。
【００６１】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの相同体は、変異導入により、例えば該タンパク質の点変異もしくはトランケーション、により作製することができる。
【００６２】
本発明のタンパク質の相同体は、トランケーション変異体のような突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。例えば、タンパク質変異体の変化に富んだライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異導入により、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することによって、作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的相同体のライブラリーを作製するために使用できる方法が数多く存在している。縮重遺伝子配列をDNA合成機で化学的に合成し、次いでその合成遺伝子を適当な発現ベクターに連結させる。縮重遺伝子のセットを用いると、所望のセットの潜在的タンパク質配列をコードするあらゆる配列を混合物として作製することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に公知である (例えば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraら (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraら、(1984) Science 198:1056; Ikeら (1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
【００６３】
点変異またはトランケーションにより作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技法、ならびに所定の性質を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするための技法は、当技術分野でいくつか知られている。こうした技法は、本発明の相同体のコンビナトリアル変異導入により作製された遺伝子ライブラリーを迅速にスクリーニングするのに適している。ハイスループット解析に付される大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために汎用される技法は、その遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換し、そのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が当該遺伝子（その産物が検出される）をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、発現させることを含む。相同体を同定するために、ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める技法である帰納的集合変異誘発（recursive ensemble mutagenesis: REM）を、スクリーニング試験と組み合わせて使用してもよい (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgraveら (1993) Protein Engineering 6(3):327-331)。
【００６４】
D.  デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列
本発明は特に、デヒドロゲナーゼ活性を有する本発明の酵素をコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖のDNAおよびRNA配列、例えばcDNAおよびmRNA）に関する。好ましいものは、配列番号１に示すアミノ酸配列またはその特徴的な部分配列をコードする核酸配列である。対応する核酸は、遺伝子コードに従って配列番号１を逆翻訳することによって、容易に決定することができる。その核酸配列を、該核酸を発現させようとする宿主生物のコドン使用頻度に適合させることも好ましい。
【００６５】
本明細書に記載した全ての核酸配列は、それ自体公知の方法でヌクレオチド構成単位からの化学合成により、例えば二重らせんの、重複し、相補的な、個々の核酸構成単位の断片縮合によって、作製することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは公知の方法で、ホスホルアミダイト法(Voet, Voet, 第2版, Wiley Press New York, pp. 896-897)を用いて、化学的に合成しうる。合成オリゴヌクレオチドの組み立ておよびDNAポリメラーゼKlenow断片を用いたギャップのフィルイン、ならびにライゲーション反応、さらには一般的なクローニング法もまた、Sambrookら (1989)、Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００６６】
本発明はまた、上記のポリペプチドおよびそれらの機能的均等物（例えば人工ヌクレオチド類似体を用いることにより得られる）のいずれかをコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖のDNAおよびRNA配列、例えばcDNAおよびmRNA）に関する。
【００６７】
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする単離された核酸分子、ならびに、本発明のコード核酸を同定または増幅するための、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用しうる核酸断片に関する。
【００６８】
本発明の核酸分子は、コード遺伝子領域の3’および/または5’末端からの非翻訳領域をさらに含んでいてもよい。
【００６９】
本発明はさらに、具体的に開示したヌクレオチド配列に相補的な核酸分子またはその断片を包含する。
【００７０】
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞型および生物において相同配列を同定し、かつ/またはクローニングするために使用できるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。この種のプローブおよびプライマーは通常、「ストリンジェント」な条件（下記参照）下で、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約12個連続した、好ましくは少なくとも約25個、例えば約40、50もしくは75個連続したヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００７１】
「単離された」核酸分子は、その核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されており、さらに、それが組換え法によって調製される場合には他の細胞性材料や培地を実質的に含まず、また、それが化学合成される場合には化学前駆物質や他の化学薬品を含まない。
【００７２】
本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的手法および本発明によって提供される配列情報を用いて、単離することができる。例えば、cDNAは、適当なcDNAライブラリーから、具体的に開示した完全配列またはその部分配列の1つをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的なハイブリダイゼーション技法（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載される）により単離される。さらに、開示した配列またはその一部のいずれかを含む核酸分子は、その配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により単離される。このようにして増幅させた核酸は、適当なベクターにクローニングして、DNA配列分析により特性解析することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機を用いて、標準的な合成法により調製することもできる。
【００７３】
本発明の核酸配列は、基本的に、ラクトバチルス（Lactobacillus）属の任意の微生物から、特にLactobacillus brevisから同定し、単離することができる。本発明の核酸配列は、例えば、通常のハイブリダイゼーション法またはPCR法を用いることにより他の生物から、例えばゲノムまたはcDNAライブラリーを介して、単離することができる。こうしたDNA配列は標準条件下で本発明の配列とハイブリダイズする。有利には、保存領域（例えば活性部位に由来する）の短鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションに用いられるが、この保存領域は本発明のデヒドロゲナーゼと比較することで当業者に公知の方法により同定しうる。しかし、本発明の核酸のより長い断片または完全配列をハイブリダイゼーションに使用することも可能である。前記の標準条件は、用いる核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片、または完全配列）に応じて、あるいはハイブリダイゼーションに用いる核酸の種類（DNAまたはRNA）に応じて変化する。こうして、例えば、DNA：DNAハイブリッドの融解温度は、同じ長さのDNA：RNAハイブリッドの融解温度より約10℃低くなる。
【００７４】
核酸に応じて、標準条件は、例えば、0.1〜5 x SSC (1 X SSC = 0.15 M NaCl、15 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2)の濃度の水性バッファー溶液中で、またはさらに50％ホルムアミドの存在下で、42〜58℃の温度をさし、例えば5 x SSC、50％ホルムアミド中で42℃である。有利には、DNA：DNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、0.1 x SSCおよび約20〜45℃、好ましくは約30〜45℃の温度である。DNA：RNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、有利には、0.1 x SSCおよび約30〜55℃、好ましくは約45〜55℃である。示したハイブリダイゼーションの温度は、一例として、ホルムアミドの非存在下での、長さが100ヌクレオチドほどで、G＋C含量が50％である核酸について計算した融解温度の値である。DNAハイブリダイゼーションの実験条件は、例えばSambrookら、“Molecular Cloning”Cold Spring Harbor Laboratory, 1989のような遺伝学の専門書に記載されており、また、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの種類、またはG＋C含量の関数として、当業者に知られた式を用いて算出することができる。当業者はハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を次の文献から入手可能である：Ausubelら(編), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (編), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (編), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
【００７５】
本発明はまた、具体的に開示したまたは誘導可能な核酸配列の誘導体に関する。
【００７６】
本発明はさらに、「サイレント」変異を含む核酸配列、または、具体的に開示した配列と比較して、特定のソース生物または宿主生物のコドン使用頻度に従って改変されている核酸配列、ならびにその天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体をも包含する。
【００７７】
本発明はまた、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、あるアミノ酸が同じ電荷、大きさ、極性および/または溶解性の別のアミノ酸で置換される）によって得られる配列にも関する。
【００７８】
本発明はまた、具体的に開示した核酸から配列多型によって誘導される分子にも関する。こうした遺伝的多型は自然変異の結果として集団内の個体間に存在しうる。かかる自然変異は遺伝子のヌクレオチド配列に1〜5％の差異を生じさせる。
【００７９】
本発明の核酸配列の誘導体は、例えば、推定アミノ酸レベルで、全配列領域にわたって少なくとも40％、好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも80、85、90、93、95または98％相同である対立遺伝子変異体をさす（アミノ酸レベルでの相同性に関して、読者はポリペプチドについての上記説明を参照しうる）。有利には、相同性はその配列の部分領域でより高くなる。
【００８０】
さらに、誘導体はまた、本発明の核酸配列の相同体、例えば、真菌もしくは細菌の相同体、トランケート型の配列、コードおよび非コードDNA配列の一本鎖DNAまたはRNAをさす。こうして、例えばDNAレベルでは、示した全DNA領域に沿って少なくとも40％、好ましくは少なくとも60％、特に好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも80％相同である。
【００８１】
さらに、誘導体は例えばプロモーターとの融合体をさす。示したヌクレオチド配列の上流に位置するプロモーターは、1個以上のヌクレオチドの置換、挿入、逆位、および/または欠失により改変されていてもよいが、プロモーターの機能性および効力が損なわれないようにする。さらに、プロモーターの配列を改変することによってその効力を高めることができ、また、そのプロモーターをより活性の高いプロモーター（他の生物種に由来するもの）と完全に置き換えることもできる。
【００８２】
誘導体はまた、開始コドンの-1から-1000塩基上流の領域、または停止コドンの0から1000塩基下流の領域のヌクレオチド配列が、遺伝子発現および/またはタンパク質発現を変化させる（好ましくは増大させる）ように改変されている変異体をもさす。
【００８３】
本発明はさらに、上記のコード配列と「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズする核酸配列を包含する。これらのポリヌクレオチドは、ゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングすることで見出され、適宜に、適当なプライマーを用いてPCRにより増幅し、その後適当なプローブを用いて単離することができる。その上、本発明のポリヌクレオチドは化学合成することもできる。この特性は、ストリンジェントな条件下で実質的に相補的な配列と結合するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの能力をさし、これらの条件下では、非相補的パートナー間の非特異的結合は形成されない。そのために、配列同士は70〜100％、好ましくは90〜100％相補的である必要がある。互いと特異的に結合できる相補的配列の特性は、例えば、ノーザンまたはサザンブロット技術において、あるいはPCRやRT-PCRでのプライマー結合に利用されている。一般的には、そのために少なくとも30塩基対の長さのオリゴヌクレオチドが用いられる。ノーザンブロット法では、例えば、ストリンジェントな条件は、非特異的にハイブリダイズしたcDNAプローブまたはオリゴヌクレオチドを溶離するために、50〜70℃、好ましくは60〜65℃の洗浄溶液、例えば0.1％SDSを含む0.1 x SSCバッファー（20 x SSC: 3M NaCl、0.3M クエン酸ナトリウム、pH 7.0）を使用する。上述したように、ここで相互に結合した状態で存在する核酸だけが高度に相補的な核酸である。ストリンジェントな条件の設定は当業者に知られており、例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【００８４】
E.  本発明の構築物の実施形態
本発明はさらに、調節核酸配列の遺伝的制御下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物、ならびにそのような発現構築物の少なくとも1つを含むベクターに関する。
【００８５】
本発明の前記構築物は、好ましくは、特定のコード配列の5’上流にプロモーター、3’下流にターミネーター配列、適宜に、さらなる慣用の調節エレメントを含んでなり、それぞれがコード配列と機能的に連結される。
【００８６】
「機能的な連結」とは、調節エレメントのそれぞれが、コード配列の発現に必要とされるその機能を果たすことができるように、プロモーター、コード配列、ターミネーター、適宜に、さらなる調節エレメントが連続的に配置されることを意味する。機能的連結が可能な配列の例には、ターゲッティング配列があり、さらにエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどもそうである。他の調節エレメントには、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが含まれる。適当な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００８７】
本発明の核酸構築物は特に、本発明のデヒドロゲナーゼの遺伝子が該遺伝子の発現を調節する（例えば、高める）ための1以上の調節シグナルと機能的に連結されている構築物をさす。
【００８８】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然の調節シグナルが実際の構造遺伝子の上流にまだ存在してもよいが、適切な場合は、天然の調節シグナルがスイッチオフされて、該遺伝子の発現が高まるように天然の調節が遺伝的に改変されている。しかし、核酸構築物は単純な設計であってもよく、すなわち、追加の調節シグナルがコード配列の上流に一切挿入されておらず、天然のプロモーターがその調節シグナルと共に除かれていなくてもよい。その代わりに、該遺伝子の調節がもはや存在しないようにその天然の調節配列を変異させて、該遺伝子の発現を高める。
【００８９】
好適な核酸構築物はまた、有利には、先に述べた1以上のエンハンサー配列（プロモーターと機能的に連結され、核酸配列の発現を高めることができる）を含む。さらなる調節エレメントまたはターミネーターのような追加の有利な配列は、DNA配列の3’末端に挿入することも可能である。本発明の核酸は該構築物中に1以上のコピー数で存在しうる。構築物はまた、適宜に、該構築物を選択するための、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性補完遺伝子のような追加のマーカーを含んでいてもよい。
【００９０】
本発明の方法にとって有利な調節配列は、例えば、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、 T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP (rhaPBAD)SP6、λ-PRまたはλ-PLプロモーターのようなプロモーター中に存在し、これらのプロモーターは好ましくはグラム陰性菌において使用される。さらなる有利な調節配列は、例えば、グラム陽性プロモーター amyおよびSPO2、酵母もしくは真菌プロモーター ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中に存在する。これに関連して、例えばハンセヌラ（Hansenula）属由来の、ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびメタノールオキシダーゼプロモーターも有利である。調節のために人工プロモーターを使用することも可能である。
【００９１】
宿主生物内での発現のために、核酸構築物は、遺伝子を宿主内で最適に発現させることができる、例えばプラスミドやファージのようなベクターに挿入することが有利である。ベクターとは、プラスミドとファージのほかに、当業者に知られた他のベクター、例えばウイルス（SV40、CMV、バキュロウイルス、アデノウイルスなど）、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、および線状または環状DNAをさす。これらのベクターは宿主生物内で自律複製が可能であるか、または染色体上で複製可能である。こうしたベクターは本発明のさらなる実施形態を構成する。適当なプラスミドの例は次のものである：大腸菌では、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、lgt11、またはpBdCI、ストレプトマイセス属細菌では、pIJ101、pIJ364、pIJ702、またはpIJ361、バチルス属細菌では、pUB110、pC194、またはpBD214、コリネバクテリア属細菌では、pSA77またはpAJ667、真菌では、pALS1、pIL2、またはpBB116、酵母では、2αM、pAG-1、YEp6、YEp13、またはpEMBLYe23、植物では、pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、またはpDH51。上記のプラスミドは使用可能なプラスミドをわずかばかり選択したにすぎない。その他のプラスミドも当業者には公知であり、例えば、Cloning Vectors (Pouwels P. H.ら編 Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)に見出すことができる。
【００９２】
存在する他の遺伝子を発現させるために、核酸構築物は発現を高めるための3’末端および/または5’末端調節配列を含んでもよく、これらは選択した宿主生物および遺伝子に応じて最適な発現のために選択される。
【００９３】
これらの調節配列は、遺伝子およびタンパク質発現を特異的に発現させることを可能にするものである。宿主生物に応じて、これは、例えば、遺伝子が誘導後にだけ発現または過剰発現されること、あるいは遺伝子が直ちに発現または過剰発現されることを意味する。
【００９４】
これに関連して、調節配列または因子は好ましくは正の調節因子であり、それにより導入遺伝子の発現を高めることができる。こうして、調節エレメントは、有利には、プロモーターおよび/またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いることによって、転写レベルで増強される。しかし、これに加えて、例えばmRNAの安定性を改善することによって、翻訳を増強することも可能である。
【００９５】
ベクターのさらなる実施形態では、本発明の核酸構築物または本発明の核酸を含むベクターを線状DNAの形で微生物に導入して、非相同または相同組換えによって宿主生物のゲノムに組み込むことも有利である。この線状DNAはプラスミドのようなベクターを線状化したものであってもよいし、本発明の核酸構築物または核酸のみからなるものでもよい。
【００９６】
異種遺伝子を生物内で最適に発現させるためには、その生物における特定のコドン使用頻度に従ってヌクレオチド配列を変更することが有利である。コドン使用頻度は当該生物の他の既知遺伝子のコンピューター解析により容易に決定することができる。
【００９７】
本発明の発現カセットは、適当なプロモーターを、適当なコードヌクレオチド配列とターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルに融合することによって作製される。そのためには、以下の文献に記載されるような、一般的な組換えおよびクローニング技術が使用される：T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、さらにT.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)、ならびにAusubel, F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)。
【００９８】
適当な宿主生物内での発現を達成するためには、組換え核酸構築物または遺伝子構築物を、その宿主内での遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異的ベクターに挿入することが有利である。ベクターは当業者に公知であり、例えば“Cloning Vectors” (Pouwels P. H.ら編、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に見出すことができる。
【００９９】
F.  本発明による有用な宿主生物
本発明のベクターまたは構築物を用いて、例えば少なくとも1つの本発明のベクターで形質転換された、組換え微生物を作製することが可能であり、かかる微生物は本発明のポリペプチドを産生させるために使用することができる。有利には、上記の本発明の組換え構築物を適当な宿主系に導入して発現させる。これに関連して、前記核酸を特定の発現系において発現させるために、当業者によく知られたクローニングおよびトランスフェクション法、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いることが好ましい。適当な系は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubelら編、Wiley Interscience, New York 1997、またはSambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【０１００】
本発明によれば、相同組換えされた微生物を作製することも可能である。そのために、本発明の遺伝子の少なくとも一部、またはコード配列の少なくとも一部（本発明の配列を改変する（例えば、機能的に破壊する）ために、適宜、少なくとも1個のアミノ酸の欠失、付加、または置換が導入されている（ノックアウトベクター））を含むベクターを作製する。導入される配列は関連微生物由来のホモログであってもよいし、例えば哺乳動物、酵母または昆虫源に由来してもよい。あるいはまた、相同組換えに用いるベクターは、内在性遺伝子が相同組換えの場合に変異されるか、他の方法で改変されるが、依然として機能性タンパク質をコードするように、デザインすることができる（例えば、内在性タンパク質の発現が変更されるように、上流の調節領域が改変されている）。本発明の遺伝子の改変された部分は、相同組換えベクター中に含まれる。相同組換えに適したベクターの構築は、例えば、Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503に記載されている。
【０１０１】
本発明の核酸または核酸構築物に適する組換え宿主生物は、基本的に、どのような原核もしくは真核生物であってもよい。好ましくは、細菌、真菌、酵母などの微生物を宿主生物として用いる。グラム陽性またはグラム陰性細菌、好ましくは腸内細菌（Enterobacteriaceae）科、シュードモナス（Pseudomonadaceae）科、リゾビウム（Rhizobiaceae）科、ストレプトマイセス（Streptomycetaceae）科、またはノカルジア（Nocardiaceae）科の細菌、特に好ましくは、エシェリキア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ノカルジア（Nocardia）属、ブルクホルデリア（Burkholderia）属、サルモネラ（Salmonella）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、またはロドコッカス（Rhodococcus）属の細菌を用いるのが有利である。大腸菌属および種（Escherichia coli）が特に好ましいものである。加えて、さらなる有利な細菌はα-プロトバクテリア、β-プロトバクテリア、またはγ-プロトバクテリアの群に見出される。
【０１０２】
これに関連して、本発明の宿主生物は、好ましくは、デヒドロゲナーゼ活性を有する本発明の酵素をコードする本明細書に記載の核酸配列、核酸構築物、またはベクターを少なくとも1つ含むものである。
【０１０３】
本発明の方法で用いる生物は、宿主生物に応じて、当業者に公知の方法で増殖させるか、または培養する。通常は、炭素源（一般には糖類）、窒素源（一般には酵母エキスのような有機窒素源）、または塩類（例えば硫酸アンモニウム）、微量元素（例えば鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩）、適宜にビタミン類を含む液体培地中で0〜100℃、好ましくは10〜60℃の温度にて、酸素を通気しながら微生物を培養する。これに関連して、液体栄養培地のpHは一定の値に保持してもよく、すなわち、培養中に調節しても調節しなくてもよい。培養はバッチ方式、半バッチ方式、または連続方式で実施される。栄養素は発酵の開始時に導入してもよいし、半連続または連続方式ではその後に供給してもよい。ケトンは培養物に直接添加することができるが、有利には培養後に添加する。実施例に記載した方法を用いて生物から酵素を単離してもよいし、あるいは酵素を粗抽出物として反応に使用してもよい。
【０１０４】
G.  本発明のポリペプチドの組換え調製
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたはその機能的な生物活性断片を組換えにより調製するための方法に関する。この方法は、ポリペプチド産生微生物を培養し、適宜にポリペプチドの発現を誘導し、該ポリペプチドを培養物から単離することを含んでなる。ポリペプチドは、所望であれば工業規模でも、このようにして生産することができる。
【０１０５】
組換え微生物は公知の方法で培養し、発酵させることができる。例えば、細菌をTB培地またはLB培地で20〜40℃、pH 6〜9にて増殖させる。好適な培養条件は、例えばT. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に詳しく説明されている。
【０１０６】
ポリペプチドが培地に分泌されない場合には、細胞を破壊して、公知のタンパク質分離法により細胞溶解液から産物を取得する。細胞を破壊するには、例えば、高周波超音波、高圧（例えばフレンチプレスによる）、浸透圧、界面活性剤、溶解酵素もしくは有機溶媒の作用、ホモジナイザー、またはこれらの方法の2以上の組合せを用いることができる。
【０１０７】
ポリペプチドを精製するには、公知のクロマトグラフィー法、例えばモレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、例えばQ Sepharoseクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーを用いたり、さらには他の慣用方法、例えば限外濾過、結晶化、塩析、透析、および未変性ゲル電気泳動を用いることができる。好適な方法は、例えばCooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [もとの題名: The tools of biochemistry], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York、またはScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【０１０８】
組換えタンパク質は、cDNAを特定のヌクレオチド配列だけ延長して、例えば精製を単純化するために使用される改変型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを用いることにより、単離することが有利でありうる。この種の好適な修飾の例としては、ヘキサ-ヒスチジンアンカーとして知られる修飾のような、アンカーとして作用する「タグ」、または抗体によって抗原として認識されるエピトープがある（例えば、Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載される）。これらのアンカーは、固相支持体（例えば、クロマトグラフィーカラムに充填されるポリマーマトリックス）、マイクロタイタープレート、または別の支持体にタンパク質を固着させるために使用される。
【０１０９】
同時に、これらのアンカーはタンパク質の同定にも使用することができる。タンパク質はまた、該タンパク質を誘導体化するために、蛍光色素、酵素マーカー（基質との反応後、検出可能な反応産物を形成する）、または放射性マーカーのような慣用のマーカーを、単独でまたはアンカーとの組み合わせで用いることによって、同定することもできる。
【０１１０】
H.  (S)-アルカノールを製造するための本発明の方法の実施
本発明に従って用いられる、デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、本発明の方法においては遊離の酵素または固定化酵素として用いることができる。
【０１１１】
本発明の方法は、0〜95℃、好ましくは10〜85℃、特に好ましくは15〜75℃の温度で実施するのが有利である。
【０１１２】
本発明の方法では、pHをpH 4〜12、好ましくはpH 4.5〜9、特に好ましくはpH 5〜8に保つことが有利である。
【０１１３】
本発明の方法においては、エナンチオマーとして純粋なまたはキラルな生成物、つまり光学活性アルコールは、エナンチオマー富化を示すエナンチオマーをさす。少なくとも70％ee、好ましくは少なくとも80％ee、特に好ましくは少なくとも90％ee、最も好ましくは少なくとも98％eeのエナンチオマー純度を本方法で達成することが好ましい。
【０１１４】
本発明の核酸、核酸構築物、またはベクターを含む生存細胞を本発明の方法で使用することが可能である。また、休止細胞や破壊した細胞を使用することもできる。破壊細胞とは、例えば、溶媒で処理して透過性になった細胞、あるいは酵素処理、機械的処理（例えば、フレンチプレスまたは超音波処理）または他の方法によって破壊された細胞をさす。このようにして得られた粗抽出物は、都合がよいことに、本発明の方法に適している。精製または部分精製した酵素を本方法で使用することも可能である。固定化した微生物または酵素もこの反応での使用に同様に適している。
【０１１５】
遊離の生物または酵素は、本発明の方法で用いたとき、例えば濾過または遠心分離によって、抽出前に都合よく分離される。
【０１１６】
本発明の方法で製造された生成物、例えば(1S)-3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オールは、抽出または蒸留によって水性反応溶液から有利に得ることができる。収量を高めるために、抽出を数回繰り返してもよい。好適な抽出用溶剤の例としては、トルエン、塩化メチレン、酢酸ブチル、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、MTBE、または酢酸エチルといった溶剤があるが、これらに限定されない。
【０１１７】
有機相を濃縮した後、通常、生成物は良好な化学的純度で、すなわち80％を上回る化学的純度で得られる。しかし、抽出後に、生成物を含有する有機相を一部濃縮して、生成物を晶出させることもできる。そのためには、溶液を0〜10℃の温度に冷却することが有利である。結晶化は有機溶液または水溶液から直接行ってもよい。結晶化させた生成物は、再度の結晶化のために、再び同じまたは異なる溶剤に取り上げて、再結晶することができる。有利な結晶化を、必要に応じて、その後1回以上実施すると、生成物のエナンチオマー純度がさらに高まることがある。
【０１１８】
上記の後処理は、本発明の方法の生成物を、反応に使用した基質（例えば、3-メチルアミノ-1-(2-チエニル)プロパン-1-オン）に基づいて、60〜100％の収率で、好ましくは80〜100％、特に好ましくは90〜100％の収率で単離することを可能にする。単離された生成物は、＞90％、好ましくは＞95％、特に好ましくは＞98％の高い化学的純度により特徴づけられる。生成物は高いエナンチオマー純度をさらに有し、かかる純度は、必要なら、結晶化によってさらに高めることができる。
【０１１９】
本発明の方法は、バッチ方式、半バッチ方式、または連続方式で実施することができる。
【０１２０】
好都合なことに、本発明の方法は、例えばBiotechnology, 第3巻, 第2版, Rehmら編, (1993)、特に第II章に記載されるような、バイオリアクターで実施することができる。
【０１２１】
上記の説明および下記の実施例は本発明を例示するためのものである。本発明は、当業者にとって自明な、多くの可能な修飾を同様に含むものとする。
【実施例】
【０１２２】
実施例１
3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンおよび3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールの分析
3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オンと3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オールの濃度はHPLCを用いて測定することができる。固定相および移動相の選択によっては、濃度のほかにee値を決定することも可能である。
【０１２３】
a)  アキラル性の分析
この反応は次の系を用いて定量化した：
固定相：  Chromoltih SpeedROD RP18、50*4、6μm、Merck社 (Darmstadt、ドイツ)、
45℃に加熱
移動相：  溶離液A: 10 mM KH2PO4、pH 2.5
溶離液B: アセトニトリル
勾配：  0-0.5分、35％B; 0.5-1.0分、35％から80％B; 1.0-1.2分、80％B; 
1.2-1.3分、80％から35％B; 1.3-2.0分、35％B;
流速：    1.5 ml/分
検出：    230および260 nmでのUV検出
保持時間：3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オン：  約1.6分
3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オール：  約1.3分
標準物質を用いて、検量線を作成し、これに基づいて未知サンプルの濃度を決定することができる。
【０１２４】
b)  キラル性の分析
固定相：  Chiracel OD-H、250*4、6μm、Daicel社、40℃に加熱
移動相：  溶離液A: n-ヘキサン
溶離液B: イソプロパノール
2.5％Bによるアイソクラチック（無勾配）
流速：    1.0 ml/分
検出：    230および260 nmでのUV検出
保持時間：3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オン：  約9.5分
(1S)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オール：  約16.6分
(1R)-3-クロロ-1-(チエン-2-イル)プロパン-1-オール：  約18.3分
標準物質を用いて、検量線を作成し、これに基づいて未知サンプルの濃度を決定することができる。
【０１２５】
実施例２
コファクター再生のためのグルコースデヒドロゲナーゼの供給
グルコースデヒドロゲナーゼをコファクター再生のために使用することができる。この酵素は市販品（例えば、Juelich Fine Chemicals社、注文番号22.10または19.10）を入手するか、既知DNA配列に基づく調製が容易である。大腸菌XL10 Goldクローンを用いたが、これはpUC19プラスミド中に枯草菌（Bacillus subtilis）のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子(Genbank登録番号M12276)を含む。この構築物を大腸菌LU11293と呼ぶ。
【０１２６】
大腸菌LU11293の発酵のために次の培地を用意した：
2009520483.tif 000013
【０１２７】
2本の1Lエルレンマイヤーフラスコ内でそれぞれ150mlの培地を滅菌し、5mlの無菌塩溶液を加えて完成させた。LBアンピシリン寒天プレートから接種した後、前培養物を37℃、200rpmで12時間インキュベートし、発酵培地に加えた。発酵を37℃、内部圧0.1バール、pH 7.0（20％リン酸と25％NaOHにより調整）で、7.5 L/分および300rpmで通気しながら開始させた（10〜20 L/分の流入空気および500〜1500rpmによりpO2を20〜50％に調整）。2時間後、0.1mM IPTGを誘導のため添加し、合計13時間後に発酵を停止させた。細胞(1.3kg)を回収して洗浄した後、使用に供するまで細胞を−20℃で保存した（反応混合物中2〜20 g/l）。
【０１２８】
実施例３
コファクターの再生
コファクターは、アルカノン(II)のアルカノール(I)への変換を生じさせるデヒドロゲナーゼによっても再生することができる。この場合には、別の再生酵素を添加する必要がない。このデヒドロゲナーゼは還元剤としてさまざまな一価アルコールを受け入れる。それらは対応するカルボニル化合物へと酸化される。NADHをデヒドロゲナーゼで再生させるのに適した一価アルコールはイソプロパノールである。10％イソプロパノールを、グルコースデヒドロゲナーゼとグルコースの代わりに反応混合物中で使用する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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