(57)【要約】【課題】【解決手段】生物学的サンプルの散乱測定用の方法と装置を開示する。一個以上のサンプル容器を設けた基板を整える。各サンプル容器は夫々光散乱特性で特徴付けられる物体を保持する。一種以上のサンプル溶液がサンプル容器に配合される。鏡面反射減少素子がサンプル容器内のサンプル溶液の中少なくも幾らかに入れられ、サンプル溶液の凹凸面の曲率を減少させ、従って一個以上の検出器への反射光が減少する。光源からの光線がサンプル容器内の物体に導かれ、サンプル容器内の物体からの散乱光が集光されて一個以上の検出器に転送される。検出器からの信号が解析され一個以上のサンプルの一個以上の特性が検出される。【選択図】図４
2009524061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
夫々が光散乱特性によって特徴付けられるサンプル溶液を保持するように構成された一個以上のサンプル容器を、内部に備えた基板を用意する工程と、
一個以上のサンプル溶液を複数のサンプル容器へ分配する工程と、
一個或いはそれ以上の検出器へ反射する光を減少させるべく鏡面反射減少素子を複数のサンプル容器の中の少なくとも幾つかのサンプル溶液に適用する工程と、
光源からの光線をサンプル容器中の物体へ導く工程と、
サンプル容器中の物体で散乱された光を集め、集められた光を一個或いはそれ以上の検出器へ伝送する工程と、
検出器からの信号を解析して一個以上のサンプルの一個以上の特性を検出する工程と
を備え、一個以上のサンプルの一個以上の特性に関する光学的情報を収集する方法。
【請求項２】
前記鏡面反射減少素子が、ゲル、油、固体、プラスティク、ガラス、可撓性固体、硬質固体、蝋状物から選ばれる一個である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記鏡面反射減少素子がサンプル溶液の凹凸面の曲率を減少するように構成された請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記鏡面反射減少素子が、光源の波長範囲に対応する波長範囲の光を吸収し、
反射を更に減少するように構成された請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記鏡面反射減少素子が、サンプル溶液に近い或いは同じ屈折率を有する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記鏡面反射減少素子を少なくとも幾らかのサンプル溶液に適用する前に、鏡面反射減少素子を殺菌する工程を、更に備えた請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記鏡面反射減少素子を適用する工程が、気泡が鏡面反射減少素子の下に閉じ込められないように、サンプル溶液の表面に対して角度を成すように鏡面反射減少素子を適用する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記鏡面反射減少素子が直接サンプル溶液の表面の上に留まる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記鏡面反射減少素子が液体或いは固体からなる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
散乱測定技術を使用して一個以上のサンプルの一個以上の特性に関する光学的情報を収集するための装置であって、
光源と、
夫々が光散乱特性によって特徴付けられるサンプル溶液を保持するように構成された複数のサンプル容器を内部に備えた基板であって、複数のサンプル容器の中の少なくとも幾つかのサンプル容器が一個或いはそれ以上の検出器への鏡面反射をする光を減少させる機能の鏡面反射減少素子を含む基板と、
光源からの光線をサンプル容器の中の物体に導くための一個以上の照明用光学素子と、
サンプル容器の中の物体からの散乱光を集め、集められた光を一個以上の検出器へと伝送する一個以上の集光用光学素子と
を備えた装置。
【請求項１１】
前記鏡面反射減少素子が、ゲル、油、固体、プラスティク、ガラス、可撓性固体、硬質固体、蝋状物から選ばれる一個である請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記鏡面反射減少素子がサンプル溶液の凹凸面の曲率を減少するように構成された請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記鏡面反射減少素子が、光源の波長範囲に対応する波長範囲の光を吸収し、
反射を更に減少するように構成された請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
前記鏡面反射減少素子が、サンプル溶液に近い或いは同じ屈折率を有する請求項１０に記載の装置。
【請求項１５】
前記鏡面反射減少素子がサンプル容器の中に入れられる前に殺菌される請求項１０に記載の装置。
【請求項１６】
前記鏡面反射減少素子が直接サンプル溶液の表面の上にある請求項１０に記載の装置。
【請求項１７】
前記鏡面反射減少素子が液体或いは固体から成る請求項１０に記載の装置。
【請求項１８】
散乱測定技術を使用して一個以上のサンプルの一個以上の特性に関する光学的情報を収集するための複数の容器を有する板カバーであって、
複数の鏡面反射減少素子から成り、各鏡面反射減少素子は複数の容器を有する板の上のサンプル容器の中に適合するように機能し、サンプル溶液に均一な圧力を加えてサンプル溶液の凹凸面の曲率を減少するようにサンプル容器の中のサンプル溶液と接触し、サンプル容器が散乱測定システムを使用して対象とされた場合に一個以上の検出器への不要な反射光を減少する複数の容器を有する板カバー。
【請求項１９】
前記鏡面反射減少素子が、ゲル、油、固体、プラスティク、ガラス、可撓性固体、硬質固体、蝋状物から選ばれる一個である請求項１８に記載の複数の容器を有する板カバー。
【請求項２０】
前記鏡面反射減少素子が、複数の容器を有する板中のサンプル容器を対象とする動作する散乱測定システムで使用される光源の波長範囲に対応する波長範囲の光を吸収する請求項１８に記載の複数の容器を有する板カバー。
【請求項２１】
前記各鏡面反射減少素子が、対応するサンプル容器中のサンプル溶液に近い或いは同じ屈折率を有する請求項１８に記載の複数の容器を有する板カバー。
【請求項２２】
前記鏡面反射減少素子は鏡面反射減少素子がサンプル溶液に適用される以前に殺菌されている請求項１８に記載の複数の容器を有する板カバー。
【請求項２３】
前記鏡面反射減少素子は、複数の容器を有する板カバーがサンプル容器の上へと位置された時に気泡が鏡面反射減少素子の下に閉じ込められないように、サンプル溶液の表面に対して角度を成すように構成される請求項１８に記載の複数の容器を有する板カバー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は散乱測定技術を使用した生物学的サンプルの測定特性に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトメトリーとは細胞の測定に関するものであり、細胞の物理的特性(形体、体積など)或いは細胞の生理学的特性（蛋白質含有量、脂質含有量など）を指す。サイトメトリー測定の普遍的な一種類として光散乱測定があり、これは散乱測定メトロロジーとも呼ばれている。散乱測定技術は懸濁液の中のバクテリア濃度の推定から単独細胞の精密構成の解像に至る生物学的応用範囲に於いて使用可能である。例えば生きている細胞群を研究するのに蛍光色素が有毒である場合のように蛍光測定（即ち細胞を蛍光色素で染色し、励起して、散乱光を調べること）が不適な場合、散乱測定は往々好適な単独細胞の研究方法である。また、散乱測定によって、蛍光測定の場合のように、蛍光蛋白質を現す細胞のみか、あらゆる種類の細胞や粒子の測定が可能になる。
【０００３】
単独の細胞が光線、典型的にはレーザ線を横切ると、光線の一部が散乱される。散乱される光の量は、細胞の大きさ、形状、屈折率の複雑な関数である。これらの各要素の測定精度は、散乱光が収集される角度の範囲に依存する。例えば小角度で散乱された光（即ち前方散乱光）は散乱粒子の大きさに最も依存する。
【０００４】
通常散乱測定で問題になるのは、検出器で受信される不要な反射、散乱などの信号の存在である。そのような問題の一例として、如何に光がサンプル容器内の溶液の凹凸面で反射され、検出器に入射するものかを図１に示す。図２と３はサンプルの画像にこのような凹凸面での反射が現れる様子を示す。図２や３の左側に於いて、これら凹凸面での反射は各種の大きな半月形に現れている。これらの反射はサンプル液と空気との凹凸面での境面に於ける屈折率の相違によるものであり、その形状はレーザ光の凹凸面への入射点での凹凸面の角度とか容器の壁の角度に起因する。容器の種類によってはその壁自身からの反射も存在する。
【０００５】
当業者には理解されるように、このような反射はサンプルからの貴重な散乱データを曖昧にするので、非常に好ましからぬものである。従って、例えば凹凸面からの鏡面反射を減少させ、レーザ散乱測定技術によってサンプル溶液中の細胞を観察する能力を改良する方法や装置が必要である。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は種々の面に於いて上記のチャレンジの一部乃至全部に応じる。一般論として、本発明はその一面に於いて、一個以上の生物学的サンプル一個以上の特性に関する散乱測定の技術を実施使用する為の、コンピュタプログラム製品をも含め、方法と装置を提供する。この装置とは光源、平坦な基板、一個以上の照明用光学素子、及び一個以上の集光用光学素子を有する。基板には各々サンプルを保持するように構成された一個以上のサンプル容器があり、各サンプル容器は鏡面反射減少素子で覆われている。 照明用光学素子は光源からの光線をサンプル容器の上へ導き、集光用光学素子はサンプル容器内からの光を集光し、それを一個以上の検出器へと導く。
【０００７】
好適な実施例としては、以下の特性の中の一つ以上を含む。鏡面反射減少素子はゲル、油、固体、プラスティク、ガラス、可撓性固体、硬質固体、蝋状物から選ばれる一個でよい。鏡面反射減少素子はサンプル溶液の凹凸面の曲率を減少するように構成されたものでよい。鏡面反射減少素子は、光源の波長範囲に対応する波長範囲の光を吸収し、反射を更に減少するように構成されたものであってよい。鏡面反射減少素子は、サンプル溶液に近い或いは同じ屈折率を有するものであってよい。鏡面反射減少素子を少なくとも幾らかのサンプル溶液に適用する前に、鏡面反射減少素子を殺菌する工程から更に成るものであってよい。鏡面反射減少素子を適用する工程は、気泡が鏡面反射減少素子の下に閉じ込められないように、サンプル溶液の表面に対して角度を成すように鏡面反射減少素子を適用するものであってよい。鏡面反射減少素子は直接サンプル溶液の表面の上に留まっているものであってよい。鏡面反射減少素子は液体或いは固体から成るものであってよい。
【０００８】
一般論として、本発明はその一面に於いて、一個以上の生物学的サンプル一個以上の特性に関する散乱測定の技術を実施使用する為の、コンピュタプログラム製品をも含め、方法と装置を提供する。この装置とは光源、基板、一個以上の照明用光学素子、及び一個以上の集光用光学素子を有する。基板には数個のサンプル容器が形成されている。各サンプル容器は光散乱特性によって特徴づけられた物体を含むサンプル溶液を保持するように構成されている。サンプル容器の中少なくとも数個は一個以上の検出器への鏡面反射光を減少するための鏡面反射減少素子を含んでいる。 照明用光学素子は光源からの光線をサンプル容器の中の物体へ導き、集光用光学素子はサンプル容器内の物体で反射された光を集光し、それを一個以上の検出器へと導く。
【０００９】
一般論として、本発明はその一面に於いて、散乱測定技術を使用して一個以上のサンプルの一個以上の特性に関する光学的情報を収集するための複数の容器を有する板カバーを提供する。この複数の容器を有する板カバーは複数の鏡面反射減少素子を有する。各鏡面反射減少素子は複数の容器を有する板の上のサンプル容器の中に適合するように機能し、サンプル溶液に均一な圧力を加えてサンプル溶液の凹凸面の曲率を減少するようにサンプル容器の中のサンプル溶液と接触し、サンプル容器が散乱測定システムを使用して対象とされた場合に一個以上の検出器への不要な反射光を減少する。
【００１０】
一つ以上の下記の特徴が有利な実施例として含まれる。本発明の一個以上の実施例の詳細は同伴の図面と以下の記述によって提示される。本発明のその他の特徴や利点は記述や図面、更に請求項から自明であろう。 鏡面反射減少素子はゲル、油、固体、プラスティク、ガラス、可撓性固体、硬質固体、蝋状物から選ばれる一個でよい。鏡面反射減少素子は、複数の容器を有する板中のサンプル容器を対象とするのに散乱測定システムで使用される光源の波長範囲に対応する波長範囲の光を吸収するものでよい。各鏡面反射減少素子は対応するサンプル容器中のサンプル溶液に近い或いは同じ屈折率を有するものでよい。鏡面反射減少素子は鏡面反射減少素子がサンプル溶液に適用される以前に殺菌されているものでよい。鏡面反射減少素子は、複数の容器を有する板カバーがサンプル容器の上へと位置された時に気泡が鏡面反射減少素子の下に閉じ込められないように、サンプル溶液の表面に対して角度を成すように構成されるものでよい。
【００１１】
本発明の一個以上の実施例の詳細は同伴の図面と以下の記述によって提示される。本発明のその他の特徴や利点は記述や図面、更に請求項から自明であろう。なお、各図に於いて同様な素子は同様なシンボルで表示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、本発明を実施するために 発明者が最適と思考する形態を含め、本発明の特別な実施例を詳細に参照する。これら実施例はここに同伴する図に示されている。本発明はこれらの特別の実施例によって記述されるものの、これが記述された実施例によって限定されるとの意図でないことは理解されよう。それに反し、ここに付記される請求項で定義される発明の精神や範囲に含まれるこれらの代替、変更、均等例などは網羅されることが意図されている。以下の記述に於いて、本発明が完全に理解されるべく、特別な実施例が開示される。本発明を実施するに当たって、これらの総てが必要とは限らない。本発明の内容を不必要な程度までに曖昧にしないために、周知の事項については記述が省かれてある。
【００１３】
本発明は例えば凹凸面からの不要な光反射を減少し、サンプル溶液中の細胞を観察する能力を改良する方法と装置を提供する。典型的実施例が以下記述されるが、付記される請求項で定義される発明の精神と範囲の中に於いて、多くの変化例が実施可能であることは当業者には明らかであるべきことである。
【００１４】
図４に示される第一実施例に於いて、サンプルの凹凸面の曲率は散乱測定実施の前にサンプルの上に液体を用いることによって減少される。図１に於いては凹凸面の曲率が大きいためサンプル容器の中央に近く入射する光でさえ検出器へと反射されているのに、図４に例示したように、凹凸面の曲率が減少されると、サンプル容器の壁に近く入射する光のみ検出器へと反射される。図２に示された容器と同じながら、その上に液体がコーティングされたものの像である図５に於いて凹凸面での反射の改良が見られる。
【００１５】
液体の適当は例には鉱物油、グリセリン、過フッ素化されたポリエーテルなどがある。一般に、サンプル溶液と液体の境界面での反射を減少するため、出来るだけ屈折率がサンプル溶液の屈折率に近い（例えば約１０％以内）液体を選ぶことが望ましい。この液体はサンプルに手動或は自動的に、自動ピペットとか液体注入器のような既知の手法で加えることが出来る。サンプル上の液層の厚さは典型的には１００マイクロメートルから１０，０００マイクロメートルの範囲である。実施例によっては鉱物油をサンプルに適用する前に液体を染めておいてもよい。染料の色は、散乱測定に使用される光源の波長の領域の光を吸収するように選択することが出来、これで他の表面から検出器へ反射で戻って来る光が減少される。
【００１６】
図６に示される第二実施例に於いて、サンプルの凹凸面は散乱測定の実施前にサンプルの頂上に光学的に平坦なカバースリップを適用して完全に、或は殆ど完全にしておく。図５に例示したように、液体とカバースリップの境界面から検出器へとは殆ど光が反射されない。カバースリップが適用されている以外図３と同じサンプル容器の画像を示している図７に於いて、この第二実施例による凹凸面の反射にかかる改良が見られる。図３と図７を比較するに当たり、カバースリップ適用前（即ち図３）と適用後（即ち図７）の両方に於いて、細胞（画像では明るい点として現れる）は同じ位置にあることが見えることに留意される。これは即ちカバースリップの適用で細胞が乱されなかったことを示す。
【００１７】
適宜なカバースリップ材料の例としては、プレキシグラス、ポリカーボネイト、ガラス、アクリルなどがある。第一実施例の場合と同様、サンプル溶液とカバースリップの境界面での反射を減少するため、出来るだけ屈折率がサンプル溶液の屈折率に近いカバースリップを選ぶことが望ましい。実施例によっては、散乱測定に使用される光源の波長の領域の光を吸収するような色のカバースリップが使用出来、これで検出器へ反射で戻って来る光が減少される。着色カバースリップの吸収特性によっては、カバースリップの表面が光学的に平坦であることという規制は緩和されてもよい。即ち、カバースリップが十分に多量の光を吸収するならば、カバースリップの表面が光学的に平坦であることはさして重要ではないことになる。
【００１８】
実施例によっては、サンプル上に設置される前に、カバースリップは殺菌される。例えば細胞がコロニとして生育されて抗体として使用される場合、サンプルを乱すことなく細胞を生きたまま殺菌することが重要である。このような場合には、不要な反射を減少させるために殺菌されたカバースリップの使用が重要となる。
【００１９】
留意すべきことながら、どの程度に不要な反射が減少されるかと言うことは、カバースリップが如何に溶液に適用されるかによって往々決定される。例えばカバースリップが適用される際に、カバースリップ下の溶液に気泡が閉じ込められないことが重要である。これを回避する一方法として、カバースリップはサンプル溶液の表面に対して角度を成して適用することがある。これは当業者には既知の方法が幾らもあるが、典型的にはカバースリップを壁ごとに適用して行くことになり、これは９６個の容器を持つ板の場合のように容器が多数の場合には時間の浪費ともなり、誤差も生じやすい。このような場合、多数の容器をつけた唯一枚のカバーであって、その上に個々の容器用のカバースリップが搭載され、例えばカバーが容器に適用されている時にはカバースリップが第一位置に在り、カバーが容器の上に適応し終わった時には第二位置に在るようにさせる「木馬」の上に個々のカバースリップが設置されたものを使用するのが望ましい。このようにすれば、すべての容器に同時に角度を持ってカバースリップを適用されることが出来、カバースリップが適用された後、容器は木馬のように揺れることによって位置づけられ、上記のように各容器のサンプル面の上に留まることが出来る。別法として、水を分配する用具を使用する各種の吸盤を使用してカバースリップを壁に設置することも出来る。どのような方法によっても、カバースリップを適用するに当たって、気泡がカバースリップの下に捉え込まれない事に注意すべきことには留意すべきである。さもないと、適用工程に於いてカバースリップに擦り傷やマークが生じることとなり、不要な反射が生じてしまう。
【００２０】
不要な反射を減少するのにカバースリップを使用するか液体を使用するかの選択は、反射の程度のみならず、実施されている実験の種類、使用されているサンプルの種類などの関する種々の要因によって決定される。例えば散乱測定の完了後にサンプルが破棄されるのであれば、鉱物油が好適である。これに反してサンプルが数日に亘って繰り返し調査されなくてはならず、調査の合間に異なる剤質が添加されるかも知れない場合には、カバースリップが選択されよう。
【００２１】
実施例によっては、カバースリップと液体の組み合わせが使用される。例えば、９６個の容器を持つ板のすべての容器に個々のカバースリップを適用するのは困難であり時間の浪費となる場合がある。このような場合には図８に示す実施例が適当となる。図８に示されるように、個々のサンプル容器は先ず適当な液体で過度に満たされ、次いで過度に満たされたサンプル容器の上にカバースリップが載せられる。この方法の利点の一つは、サンプル板の上のすべてのサンプル容器を唯一枚のカバースリップ或は蓋によって覆うことが出来ることである。もっとも、これら容器を覆うのに複数個のカバースリップを使用することも可能である。溶液は、中で細胞のコロニが生育されている媒体と同じが近似した屈折率をもつものが選択され得る。一実施例によれば、細胞を生育するのと、サンプル容器を過度に満たすのとに、同種の媒体が使用される。叉或る実施例によれば、過度に満たすための液体或は／及びカバースリップが不要な反射による光を吸収すべく着色されている。
【００２２】
上記の実施例は単に凹凸面の曲率を減少或は解消し、叉別法でサンプル液の上に何か入れて不要な反射をなくす一般的な技術の例に過ぎない。ゲル、油、固体、プラスティク、ガラス、可撓性固体、硬質固体、蝋状物のような、温度によって特性の変わるその他の物質も使用可能である。上記のように、液体と固体の種々な組み合わせも使用出来る。このような物質はいずれもサンプル液の凹凸面を平坦化する。これらの物質の中の多くは、サンプル液と屈折率が近似するように選択出来る。多くの物質は内在的に光を吸収するか、サンプルに適用された場合に既定の波長領域に於いて光を吸収するように処理され得る。
【００２３】
上記の技術は種々の分析・評価（assays)に対して使用可能である。例えば従来、所望の薬品を発見使用とする研究員は、特別な薬品候補品についてその効力を確定しようとする。効力は典型的には細胞を殺す能力、抑制能力、その他で現される。こうした効力を表現する指標としては、ＥＣ４０値とかＩＣ５０値のようなものがある。かような情報の収集のために、種々の分析・評価が使用される。
【００２４】
「クロノジェニク評価」(clonogenic assay)と呼ばれている古典的手法では治療後の細胞成長を評価する。ここでは、既定の期間に亘って生育された細胞が問題の組成物に露出される。往々異なる培養細胞が複数の異なる濃度で異なる期間に亘って組成物に露出される。所用の露出時間の後、培養細胞は洗浄されて組成物を除去し、各条件下にある既定数の細胞が再度低濃度で準備される。更に或る時間がたった後、生き残った細胞は小さいコロニに生育し、数えられ、元の細胞の数と比較される。組成物によって強く刺激を受けた細胞は生残細胞として使用されてもよく育つことはない。コロニの数えられた数を使用して、生残物の健康状態や成長の可能性が推定される。その結果得られるのは生残対薬品濃度のグラフ表示であり、細胞生残曲線と呼ばれる。組成物の濃度依存からＩＣ５０値も得られる。
【００２５】
従来の分析・評価は手動で作られたものであり、洗浄の後生残細胞は除去されて寒天皿中再使用される。典型的には、細胞は蛋白質分解酵素トリプシンで処理され、生残細胞は再使用のために選択される。一例によれば、約１００個の生残細胞が収穫されて再使用される。収穫された細胞は典型的に１週間から１０日の期間成長させられる。そして染色され、撮像され、それらによって形成されるコロニが数えられる。上記のように、組成物の効力は相対数で推定される。
【００２６】
従来、腫瘍細胞を殺す為に使用もされる照射線をも含めて各種の刺激の評価にクロノジェニク評価が使用されているが、当業者が認識するように、散乱測定技術で発見され得る殆どどの細胞用刺激も本発明を使用して研究することが出来る。これには細胞成長に否定的のみならず肯定的効果を持つ刺激も含まれる。換言すれば、研究対象の刺激は細胞成長を阻止するものでなく、助長するもの、例えば骨細胞やニューロンの成長を促進する要素でもよい。
【００２７】
上記サンプル容器の散乱測定実施に適宜な装置が「TIME DEPENDENT FLOYRESCENCE MEASUREMENTS」 と題する２００４年８月２６日を出願日とする米国特許出願１０／９２７，７４８や、「MEASURING TIME DEPENDENT FLUORESCENCE」と題する２００４年８月２６日を出願日とする米国特許出願１０／９２８，４８４に記載されて居り、これら両者の開示内容はあらゆる目的に於いて本願において参照されるものとする。これら二件の特許出願に記載された装置や方法は蛍光に焦点を絞ったが、当業者には理解されるように、これらの装置や方法は以下詳細に説明する些細な変更を加えることにより、散乱測定の実施にも同様に応用が可能な。一般論として、サンプルとか物体の列に焦点を当てられる散乱光源を使用し、背景にあるノイズや信号を区別出来る装置は、画像コントラストの機構を有する。本発明の装置は、集められるべき散乱測定のデータの種類によって異なるモード或はその組み合わせで機能する。数種の典型的モードの高級的記述を先ず行い、それから装置の散乱測定への応用に重要な特殊な特性などについて、詳細な議論へと続ける。
【００２８】
第一モードでは、装置からの出力信号が、細胞或は散乱光のもととなるその他の物体内の分離した位置とか、散乱源の物体の相対的位置のような情報を含む。照明光学のデザインの結果、サンプルの容積内の領域に収まる相対的に大きい照明領域が作成され、それにより複数のサンプル或はサンプルの列を連続的に実時間で照明する焦点の調節を必要とするような装置が不必要となる。集光光学のデザインは、検出領域をサンプルが含まれてデータが集められる焦点容積に限定する。一実施例によれば、複数の集光用配置が使用され、それには伴った利点がある。これらについて、以下二個のレンズを使用する機構に関して記述する。
【００２９】
第二モードでは平面偏光されたレーザ光線が光学システムを通ってサンプル上へと伝播され得るので、偏光によって生物学的物体を調査することが出来る。このモードでは、散乱光は二つの直交する成分に分離可能であり、光電変調機のようなスイッチ可能な変調機を使用して平行成分と垂直成分とを時間的に順繰りに、或は特殊な平行及び垂直偏光フィルタ使用する複合集光光学によって同時に解析することが出来る。光を散乱する物体が特別な方向を有する場合散乱効率は入射光線の偏光の関数であるから、偏光は重要なものである。実施例によっては、細胞のコロニ（方向はないか或は殆どない）からの散乱光をそのままにする一方、サンプル容器の擦り傷とか、カバースリップ（非常に方向づけられている）とかからの散乱光が最小になるような方向に偏光させる。偏光が影響する別の例として、点散乱、即ち表面の擦り傷のように唯一の散乱イヴェントで高度の偏光や非等方性の偏光が起こることである。これに対し、容積散乱、即ち複数の散乱イヴェントが光が散乱容積から出るまでに起こる場合、偏光の度が少ない偏光が起こる。鏡面反射は常に偏光の度が高い。従って、三次元的な細胞コロニからの散乱光を調査する場合、散乱光は偏光度を失っているが、鏡面反射光とか、擦り傷からの散乱は高い偏光度であり、偏光フィルタを使用して取り除くことが出来る。
【００３０】
第三モードでは数本のレーザ光線が光学システムを通してサンプルに伝播され、異なる波長の光或は同じ波長で異なる時点で生物学的物体を対象とすることが出来る。このモードでのレーザは同時のパルスでもよく、パルス間に一定或は可変の遅延があってもよい。周知のように、散乱効率は光の周波数の四乗に比例するので、照明光の周波数とは重要なものである。それ故、或る実施例に於いては青色に対して消衰係数の高いカバースリップ材料とか液体染料と共に、青色のレーザが光源として使用される。
【００３１】
第四モードでは一個の集光光学配置と共に数個の検出器が使用されるので、 複数の解析用制限領域が作成される。この利点については以降に於いて詳細に記述する。
【００３２】
第五モードでは、特別の構成と唯一の集光光学に比して改良された制限を提供すべく数個の集光光学構成が使用可能であり、或は各集光光学に特別に指定された数個の特徴を持つ制限領域からの散乱を集光するのに使用可能である。この利点については以降に於いて詳細に記述する。
【００３３】
次に図８ないし図１０を参照し、実施例によって装置を更に詳細に説明する。図９に例示されるように、一実施例によれば、光源（１）からの光（４）が調査の対象としてマイクロアレイ板に保持されたサンプル（２）に投射される。典型的に光源（１）はレーザであり、例えば、波長が夫々４８８、５１４、５６８及び６４７nmのＡｒ 或は Ａｒ／Ｋｒ混合ガスレーザである。一実施例に於いては、Picarro Inc. of Sunnyvale, California製のPicarro Cyan レーザのような連続周波（CW）レーザが光源として使用される。レーザ（１）及び装置で使用される所定の光学によって、光源の波長は可視範囲（即ち４００〜７００nm）であってもそれ以外であってもよい。例えば可視範囲以外の場合、近赤外線光は組織透過に優れているため散乱測定技術によって組織サンプルが研究される。これに反し、紫外光線は効率の高い散乱を示す．しかし、可視範囲以外の波長を使用すると使用されるサンプル容器や複数の容器を持つ板などに対し、どの波長領域で発信出来るかなどの要求が多くなることに留意されるべきである。
【００３４】
照明光はレーザでも狭いバンドの光源でもなくてよいと留意されるべきである。しかし、レーザは光子フルエンスが高く、非常に小さい物体からの散乱光をも測定可能なので使用するのが有利である。白色やＬＥＤの光も偏光されるけれど、上記のようにレーザの偏光をも利用可能である。本明細書に記載される特別の実施例の場合、面上の走査が可能な焦点を合わせた光が必要なので、レーザが好適な光源である。ここで、光を吸収する着色カバースリップや液体を使用することが望ましいことに留意されたい。レーザの波長は典型的に非常によく定義されたものであり、カバースリップや液体の吸収波長に容易に合致させることが出来るため、これが光源としてレーザを使用する更なる理由である。しかし、検出器の感度によっては、白色光での照明も面上の擦り傷や損傷を検査する場合など典型的に使用されて居り、可能である。
【００３５】
レーザ（１）から出た後、照明光（４）はサンプル（２）へと一個以上の照明用光学素子を通過する。照明用光学素子に含まれるものには、光電変調機（８）、光線形成用レンズのセット（３）、走査用具（５）、複合レンズ（９）などがある。サンプル（２）に行われる研究に於いて必要な場合には、光電変調機（８）が照明光を偏光させるのに使用出来る。光線形成用レンズのセット（３）は走査レンズの入射開口に適合し、サンプル（２）の上の望まれる照明領域を供給するようにレーザ光線を拡大する。走査用具（５）は拡大されたレーザ光線が複合レンズ（９）によって焦点付けられた後、サンプル（２）の上を移動させる。以下詳細に説明される走査用具（５）は検流計で駆動される鏡のような光学素子と組み合わされた電子機械的装置であってもよい。以下詳細に説明される実施例によれば、走査用具（５）は複数の反射面を持つ多面体であって、サンプル（２）をレーザ光で走査する。複合レンズ（９）はレーザ光をレーザ（１）の作用波長に於いて焦点に合わせるように設計される。 複合レンズ（９）は例えば作用波長に於ける顕微鏡の対物レンズやテレセントリクレンズのような特殊な走査用レンズであってもよく、テレセントリクレンズは平坦な焦点面を達成するような適当なパラメタであり、作用距離が長く、第一次第二次収差が低く、広範囲の位置（例えば走査線）に於いて同じ点の大きさや形状を得る。テレセントリクレンズは広い視野の場合殊に有用である。
【００３６】
複合レンズ（９）を通過した後、光線（１０）はサンプル（２）の撮像されるべき領域に焦点が合わされる。焦点領域は例えばマイクロアレイ板の基の上方に位置づける。サンプル（２）とは上記のように、サンプル容器に含まれた細胞のような散乱測定で研究される物体であり得る。
【００３７】
サンプル（２）からの散乱光は一個以上の集光用光学素子（１９）で集光される。下記に於いて説明するように、マイクロアレイ板のような大きなアレイの走査用の集光用光学素子の構成には種々の方法がある。一実施例に於いて、集光用光学素子（１９）は棒レンズであり、サンプルアレイの基台（１１）の一方向の長さを光線（１０）で走査するように設計されている。 集光用光学素子（１９）は更にその他の種類のレンズ或はレンズ群など、放射についての所定の情報で決定されるものを含んでもよい。或る実施例に於いては、集光効率を改良するために複数の光学素子（１９）の組み立てを使用してもよい。
【００３８】
集光用光学素子（１９）で集光された光は集光用光学素子（１９）から適宜な距離に位置される検出器（２１）に送られる。散乱光の転送には例えば光ファイバや光ファイバ束（２０）が使用され得る。一実施例によれば、検出器（２１）は電気出力信号を発生する光増幅管のような高ゲインのものである。電気出力信号は、信号促進、平均化、或は積分検出システムなどを利用してゲインや信号対ノイズ比（S／N）の最適化のような処理を実行するデータ収集システム（１４）によって処理される。
【００３９】
レーザ光（４）を受ける複合レンズ（９）は、レーザ光をレーザ（１）の作用波長に於いて焦点付けるように設計されている。複合レンズ（９）は典型的には５〜２０ミクロンであり１〜２００ミクロンのように大きくも小さくもあり得る複合レンズ（９）の回折限度に近くレーザ光を焦点付ける。サンプルやサンプルアレイ（２）はサンプル（２）の基台（１１）或はそのすぐ上に於いて焦点を合わせた光線を受けるように構成されている。サンプルアレイを横切る走査線の長さは変更可能であり、典型的には５mmから１００mmの領域にある。
【００４０】
図１０はサンプル（２）の拡大図であり、如何に入射光（１０）がサンプル（２）や散乱光が図９の一個の検出器での実施例装置で集光される光源領域（１７）を照射するかを示す。サンプル（２）は基台（１１）の上に、アレイに含まれたサンプルへレーザ光（１０）を通過させる一列の光学素子（１６）と共に位置付けられる。このアレイは例えば溶液やサンプルが底に粘着した容器を含むマイクロアレイ板であり得る。焦点面の位置は光学素子（１６）の内側に近く、光束が最高の領域即ち放射光源の最も高い領域を定義する。この領域の容積サイズは 複合レンズ（９）構成と、基台（１１）の上方に位置する研究対象のサンプル（２）の深さとに依存する。光源領域（１７）の定義された容積は事実散乱信号のもととなるものであり、ここで説明するように、集光用光学素子（１９）の構成にも依存する。
【００４１】
図１０に例示したように、 集光用光学素子（１９）のデザインは、集光領域が検出器（２１）の視野に含まれるようにしたものである。散乱信号強度は、図９に例示したように、光源の焦点領域とこの領域内の検出器（２１）の像との交点で形成される光源領域（１７）に限られている。光源領域はサンプルの限られた鉛直方向の深さに限られ、即ち、サンプル（２）がその上に残留する基台（１１）の上で限られた距離の範囲内に位置されている。集光路（１８）を入射光（１０）と角を成すように集光用光学素子（１８）は配置することで多くの利点が得られる。例えば、容器（２）の表面開口（１６）の位置の移動のない光学的に平坦なサンプル容器が不必要になる。集光領域は一定か、或はシステムの焦点面から外れないように集光用光学素子（１９）構成で限定される。別の利点として、サンプル容器の中で、背後の散乱から高度の信号識別が達成出来る。
【００４２】
光源領域（１７）からの散乱光は集光路（１８）に沿って集光用光学素子（１９）へ転送される。図１０に例示するように、集光路（１８）はサンプル容器の基台（１１）の中の光学素子（１６）を通って伸びることが出来る。別の実施例によれば、集光路（１８）は例えば図９に例示したように、サンプルアレイの中の容器を通って伸びることが出来る。両方の実施例に於いて、集光用光学素子（１９）は上記のように、光源領域からの散乱光を集光して焦点付けるように構成されている。
【００４３】
集光用光学素子（１９）の種々の詳細及び構成方法については上記の二件の特許に開示されてあるので、ここでの説明は省略する。しかし、図１１に示される一実施例は殊に有用である。図１１に示されるところでは、二個以上の集光用光学構成（１９a,１９ｂ）がある。図１１での集光レンズ（１９a,１９ｂ）のステレオ構成によって、一個のレンズで生成される一個の視野や、図１０に関して説明された焦点源に比較して、二個のレンズの焦点視野の制限は改良されたものであり得る。この改良は図１１に於いて、レンズ（１９a,１９ｂ）の主対物面に対応する集光光学構成（１９a,１９ｂ）の焦点面の交点（２２）によって概略的に示されている。
【００４４】
二組の集光用光学素子（１９a,１９ｂ）による図１１の構成は、偏光源からの放射の直交成分の同時集光にも使用され得る。第一偏光フィルタ（２３a）が第一偏光のみ第一検出器（２１a）を通過させ、第二偏光フィルタ（２３ｂ）が直交する第二偏光のみ第二検出器（２１ｂ）を通過させる。この構成によって得られる信号間の相関、検出システム内での検出、記録された信号のその後の取り扱いなどによって、それに付随する信号への改良と共に、一個の検出器のみからでは得られない情報が得られることになる。
【００４５】
一般的に留意されるべきこととして、散乱光を受信する上、検出器の設置は非常に重要である。物体と照明システムには二方向散乱分布関数（Bidirectional Scatter Distribution Function (ＢＳＤＦ))なるものがあり、これが或る角方向への散乱光の強度を表す。或る物体は小角度への散乱を増加し、別の物体は大角度への散乱を増加させる。散乱測定の上記の実施例では、検出器光学の高い数値的開口により、非常に大きな角度の範囲が記録可能であり、それによって非常に能率的な散乱測定システムとなる。欠点となり得るものとしては、大角度と小角度とを区別する能力があり、これによってこの解析システムの応用可能な範囲が制限されることになるが、当業者には容易に理解されるように、この欠点とは解析システムそのものに関するものであって、本明細書に記載する凹凸面での散乱を減少する本発明の方法と装置に関するものではない。
【００４６】
本発明の数々の実施例が説明されたが、種々な変更が発明の精神や範囲から逸脱せずに可能であることは自明であろう。例えば、各サンプルを対象とする連続的に操作するモードを記述したが、並列照明とかステッピングなど、その他の技術を使用してもよい。上記の記述は生物学的応用と個別の細胞からの散乱に焦点を置いたものであったが、同じ原則が細胞のコロニのようなより大きな物体、或いは細胞より小さいものにも該当することに留意されるべきである。上記の方法や装置は空中或いは液体内の有機物以外のものの検出にも使用可能であり、従って、他の実施例も本発明の請求項の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】従来例の散乱測定に於いて如何に反射が起こるかを示す模式図である。
【図２】従来例の応用に於ける生物学的サンプルを含むサンプル容器の画像に現れる反射の様子を示す説明図である。
【図３】従来例の応用に於ける生物学的サンプルを含むサンプル容器の画像に現れる反射の様子を示す説明図である。
【図４】本発明の第一実施例によって如何に反射が減少されるかを示す模式図である。
【図５】本発明の第一実施例によって鏡面反射減少素子を適用した結果、図２のサンプル容器の反射の減少の様子を示す説明図である。
【図６】本発明の第二実施例によって如何に反射が減少されるかを示す模式図である。
【図７】本発明の第二実施例によって鏡面反射減少素子を適用した結果、図３のサンプル容器の反射の減少の様子を示す説明図である。
【図８】本発明の第三実施例において、反射が減少されるか様子を示す説明図である。
【図９】サンプル容器から本発明に従って光学散乱測定データを集める装置の概略構成図である。
【図１０】図９の装置の一検出器の構成の限られた視野を示す説明図である。
【図１１】複数の検出器を示す図９の装置のステレオ構成の限られた視野を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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