(57)【要約】本発明は、生物学的に活性なＤＫＫ１タンパク質を、安定かつ高レベルで生産するための特定の組み換えセルラインに関する。本発明は、また、これらの組み換えセルラインに関し、ならびに、このような組み換えセルラインを実施し、生物学的に活性なＤＫＫ１タンパク質の安定かつ高レベルの生産方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリースタイル（商標）２９３−Ｆ  哺乳類セルライン由来の組み換え細胞の、生物学的に活性なＤＫＫ１タンパク質、好ましくはマウス由来、の安定かつ高レベルの生産のための使用。
【請求項２】
前記生産が少なくとも１５日間、好ましくは少なくとも１ヶ月間、更により好ましくは２．５ヶ月間にわたって安定である請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記生産が、少なくとも培養培地１リットルあたり２ｍｇのタンパク質、好ましくは少なくとも培養培地１リットルあたり６ｍｇのタンパク質、更により好ましくは少なくとも培養培地１リットルあたり１０ｍｇのタンパク質のものである請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記ＤＫＫ１タンパク質が成熟している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記組み換えセルラインが、それぞれＣＮＣＭ（国立培養微生物収集機関、パスツール研究所、フランス、７５７２４  セデックス１５  パリ、リュ  ドゥ  ドクトゥール  ルー  ２５番地）に０４／０７／２００５に番号１−３４７２およびＩ−  ３４７３で寄託されたライン１Ｂ９および３Ｆ８から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
フリースタイル（商標）２９３−Ｆ  哺乳類セルラインに由来し、それぞれＣＮＣＭ（国立培養微生物収集機関、パスツール研究所、フランス、７５７２４  セデックス１５  パリ、リュ  ドゥ  ドクトゥール  ルー  ２５番地）に０４／０７／２００５に番号１−３４７２および１−３４７３で寄託されたライン１Ｂ９および３Ｆ８から選択され、前記組み換えセルラインは安定的および高レベルで、マウス由来の生物学的に活性なＤＫＫ１を生産できる組み換えセルライン。
【請求項７】
活性ＤＫＫ１タンパク質の安定的および高レベルな生産のための方法であって、少なくとも、ａ）適当な培養条件下での請求項６記載の組み換えセルラインの培養；およびｂ）前記タンパク質の回収を含む方法。
【請求項８】
前記方法がラージスケールで実施される請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な目的、例えば、研究、産業上の応用（特に、農業食品または医薬産業）および医学的な応用（治療または診断用）のための、生物学的に活性なタンパク質の安定かつ高レベルの生産に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、生物学的に活性なＤＫＫ１タンパク質を、安定かつ高レベルで生産するための特定の組み換えセルラインに関する。本発明は、また、これらの組み換えセルラインに関し、ならびに、このような組み換えセルラインを実施し、生物学的に活性なＤＫＫ１タンパク質の安定かつ高レベルの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、胚の発達、様々な細胞型の分化、および腫瘍形成において主要な役割を果たす（ＰｅｉｆｅｒおよびＰｏｌａｋｉｓ、２０００）。
【０００４】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質（ＤＫＫ）は、分泌されたＷｎｔ阻害剤である。（０９／０３／００にＰＲＯ１３１６の表題で公開された特許出願ＷＯ００／１２７０８を参照）。ＤＫＫ−１タンパク質（ＷＯ９９／２２０００、０６／０５／９９公開）は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害によるアフリカツメガエルにおける頭部形成の誘導物質として同定された（Ｇｌｉｎｋａら、１９９８）。
【０００５】
ＤＫＫ−１は肢の発達に関与し（Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄら、１９９９）Ｗｎｔ誘導形態学的変化を阻害する（Ｆｅｄｉら，１９９９）ことも知られている。今日まで、４つのＤＫＫタンパク質が哺乳類で同定されている：ＤＫＫ−１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３およびＤＫＫ−４（Ｋｒｕｐｎｉｋら、１９９９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＫＫタンパク質はＷｎｔ経路の機能不全のためのスクリーニングおよび適当な診断および治療手段の開発における選択の可能性のある標的である。この方法ではこれらのタンパク質、および特にＤＫＫ−１タンパク質は、世界中の多くの科学チームにとって興味のあるものである。しかし、これらのチームによって実行される研究開発が成功するには、多量の生物学的に活性なタンパク質が必要となる。
【０００７】
本発明者らが大量の生物学的に活性なＤＫＫタンパク質、特にＤＫＫ−１を生産する有効な手段および方法を探したことは、まさにこの要求に応答することである。また、本発明に関して提案されるこの手段および方法は、この必要性を、特に（ｉ）平易さと実施時間、（ｉｉ）コスト、および（ｉｉｉ）効率の点で初めて満足に満たすことができるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述の技術的問題を解決する手段に鑑み、本発明者らは生物学的に活性な目的タンパク質、特にＤＫＫタンパク質（例、ＤＫＫ−１）を，一過性の形質移入実験を実施するため通常の市販のライン由来の組み換え細胞を用いることによって生産できることを見出した。さらに、本発明者らは、これらの細胞によるタンパク質生産が、シンプルで、経時的に安定で、高レベルであるという利点を示したと言う事ができた。
【０００９】
従って、本発明の第１の態様は、フリースタイル（商標）２９３−Ｆ哺乳類セルライン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社販売）由来の組み換えセルラインの、生物学的に活性なＤＫＫ１タンパク質（好ましくはマウス由来のもの）の、安定かつ高レベルの生産に関する。
【００１０】
“フリースタイル（商標）２９３−Ｆ哺乳類セルライン由来の組み換えセルライン”なる語は、本明細書中、フリースタイル（商標）２９３−Ｆラインから、慣用の生物学技術である、生産されるべき目的の前記タンパク質をコードする外来核酸配列によって得られたセルラインを意味する。“外来核酸配列”なる語は、本明細書中、フリースタイル（商標）２９３−Ｆ細胞中に天然には存在しない配列を意味する。この配列は、天然物でも、合成物でも、組み換え物であってもよい。これは、本来の、または修飾された配列（特に、１以上の塩基の付加、および／または欠失および／または置換によって）に対応しうる。外来配列は、細胞に含まれたベクター（またはプラスミド）に担持されるか、細胞の染色体に組み込まれうる。これは細胞中に１以上のコピーでも存在しうる。細胞がそれぞれ１コピー以上を含む場合、これらのコピーは、１以上のベクター、またはクロモソームによって運ばれてもよい。それぞれの場合で、フリースタイル（商標）２９３−Ｆ細胞内に導入された外来配列は機能性タンパク質をコードする、すなわち前記タンパク質の生物学的活性は保存される。
【００１１】
本発明に関して、“機能”または“生化学的機能”または“活性”または“生物学的活性”なる用語または表現は同意義である。同様に、“生物学的に活性なタンパク質”または“活性タンパク質”または“機能性タンパク質”なる表現は、以下、交換可能に用いられる。前記タンパク質の生物学的活性は、それが未変性タンパク質のものと一致する場合、“保存されている（ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）”または“保存されている（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）”または“維持されている”。言い換えれば、外来核酸配列によってコードされる前記タンパク質の生物学的活性が未変性タンパク質のものと同一であるか、その２つの活性がわずかである。
【００１２】
本発明の意味において、前記タンパク質が通常のレベルを有し、少なくとも１５日、好ましくは少なくとも１ヶ月、より好ましくは少なくとも１．５ヶ月、更には、少なくとも２ヶ月、少なくとも２．５ヶ月または少なくとも３ヶ月の間にわたって、あるいはさらに長い間にわたって実質的に一定である場合、前記タンパク質の生産は“安定である”と考えられる。
【００１３】
前記タンパク質の生産は、その収率が、培養培地の１リットルあたり少なくとも２ｍｇのタンパク質、好ましくは培養培地の１リットルあたり少なくとも４ｍｇのタンパク質、より好ましくは培養培地の１リットルあたり少なくとも６ｍｇのタンパク質，および更により好ましくは培養培地の１リットルあたり少なくとも８ｍｇのタンパク質、および更には、培養培地の１リットルあたり少なくとも１０ｍｇのタンパク質、およびそれ以上である場合、“高レベル”である。
【００１４】
フリースタイル（商標）２９３−Ｆ細胞は懸濁状態で培養されるので、当業者にとって生産単位（特に、バイオリアクター）の容量および／または数を増やすことは容易である。これは、本発明の手段が有利に前記タンパク質のラージスケールの生産を可能にする理由である。
【００１５】
前記タンパク質生産の質的および量的性質（特に安定性および収率）は、多かれ少なかれ注目すべき様式で、実施条件に依存的でありうる。必要に応じて、当業者は、容易に、単純なルーチン試験を用いて、生産される前記タンパク質に応じて、例えば、下記の実施例に報告した情報に基づいて、本発明の実施条件を適用できる。
【００１６】
生産される前記タンパク質が産業の、医学的なおよび／または研究の目的のものとなることは、目的の事である。
【００１７】
一の実施態様によれば、前記タンパク質は成熟タンパク質である。本明細書中、“成熟タンパク質”とは、１以上の翻訳後修飾を受けた可能性のあるタンパク質をいう。翻訳後修飾の中でも特に下記のものが引用される：グリコシル化、ジスルフィド結合、アセチル化、アミド化、ビオチニル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化および硫酸化。翻訳後修飾は、当業者に周知である。あらゆる場合において、“成熟”タンパク質は、本発明の意味において、（例えば、文献に従い）予想されるものと同じ生物学的活性を有する。
【００１８】
本明細書中、生産される目的タンパク質は、ＤＫＫ１タンパク質である。これは、好ましくはマウス由来のＤＫＫＩタンパク質である。下記の実施例に従い、本発明に従って生産されるＤＫＫ１タンパク質は、特に前記タンパク質の検出や必要に応じて精製を容易にするＶ５および／または６Ｈｉｓタグのような付加的な配列を含みうる。組み換えセルラインは、ＣＮＣＭ（国立培養微生物収集機関、パスツール研究所、フランス、７５７２４  セデックス１５  パリ、リュ  ドゥ  ドクトゥール  ルー  ２５番地）へ０４／０７／２００５に番号１−３４７２および１−３４７３でそれぞれ寄託されたライン１Ｂ９および３Ｆ８（下記の実施例で引用）から有利に選択されうる。好ましい組み換えセルラインは、ＣＮＣＭへ０４／０７／２００５に番号１−３４７３で寄託されたライン３Ｆ８である。本発明の第２の態様は上記の組み換えセルラインに関する。かかるセルラインはフリースタイル（商標）２９３−Ｆ哺乳類セルラインに由来し、生物学的に活性なＤＫＫ１タンパク質を安定かつ高レベルで生産できる。より具体的には、本発明による組み換えセルラインは、ＣＮＣＭへ０４／０７／２００５に番号１−３４７２および１−３４７３でそれぞれ寄託されたライン１Ｂ９および３Ｆ８から選択される。好ましい組み換えセルラインは、ＣＮＣＭに０４／０７／２００５に番号１−３４７３で寄託されたラインである。本発明はまたＤＫＫ１タンパク質の発現ベクターにも関し、これは、必要に応じて、フリースタイル（商標）２９３−Ｆ細胞由来の組み換えラインの細胞内に含有される。マウス由来のＤＫＫＩタンパク質の発現用ベクターの例は、下記の実施例に記載のベクターｐＳＫ−ＧＷ−０３２である。このベクターは、それぞれＣＮＣＭに０４／０７／２００５に番号１−３４７２および１−３４７３で寄託された組み換えセルライン１Ｂ９および３Ｆ８に含有される。第３の態様によれば、本発明は生物学的に活性なＤＫＫ１タンパク質の安定かつ高レベルの生産方法に関し、当該方法は少なくとも：
ａ）適当な条件下での前記組み換えセルラインの培養；および
ｂ）前記タンパク質の回収を含む。
【００１９】
“適当な培養条件”の決定は、当業者の通常の知識に基づき、当該等業者は、フリースタイル（商標）２９３−Ｆラインの製造者の提案も参照しうる。
【００２０】
一の実施態様によれば、工程ａ）の培養は、少なくとも：
ｉ）前記タンパク質の発現用のベクターの構築；
ｉｉ）フリースタイル（商標）２９３−Ｆ哺乳類セルラインの、工程ｉ）で調製されたベクターを用いた形質転換によって実施される。
【００２１】
工程ｉ）およびｉｉ）は、当業者の通常の知識を用いる事ができ、当該当業者は、下記の実施例に記載の実験方法を、有用とみなすなら、参照することができる。別の実施態様によれば、工程ａ）の培養は、懸濁液で実施される。細胞懸濁液は、慣用の方法（例、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ中、または連続モードもしくはバッチモードのバイオリアクター中）生産できる。
【００２２】
更に別の実施態様によれば、工程ａ）の培養は、無動物血清の培地で実施される。当業者は、有利にフリースタイル（商標）２９３−Ｆ発現培地市販培養培地（Ｇｉｂｃｏ、＃１２３３８−０１８）を選択するであろう。
【００２３】
更に別の実施態様によれば、本発明の方法は、前記タンパク質を精製する工程を含み、当該精製は、前記タンパク質の生物学的活性を変化させないか、または有意に変化させない。当該精製は、慣用の方法（例、ニッケルキレートアフィニティーカラム、イオン交換クロマトグラフィー（アニオン性またはカチオン性）、ヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィー，などにおける精製）を用いて実行できる。有利に、このように実行される当該精製工程は、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、およびそれ以上で、純粋なタンパク質を得ることを可能にする。
【００２４】
好ましい具体的態様によれば、本発明の方法はラージスケールで実行される。“ラージスケール”は、本明細書中、大量および／または多数の生産単位を用いる高生産能力を意味する。単なる説明であるが、例えば、少なくとも１００リットルの培養上静が製造される場合、当該生産はラージスケールにおけるものと考えられる（複数のリアクターを用いる場合、そのそれぞれの培養容量は、比例して減少しうるが、それでもなお“ラージスケール”レベルの生産である）。
【００２５】
下記の図は、下記の実施例に関連し、本発明の特定の具体的態様を説明することを意図するものである：
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
他の態様、具体的態様および利点は、本発明の主題の非限定的な説明として意図される、以下の例から、明確になる。
【００２７】
試験例の概要
マウスＤＫＫ１配列を哺乳類細胞による分泌のためのＩｇＫシグナルペプチド配列上流にクローニングし、検出および精製用のＶ５および６Ｈｉｓタグと融合させた。発現は、ｐＥＦ−１アルファ恒常的プロモーターのコントロール下においた。培養培地で、組み換えタンパク質を生産するため、この構築物を５つの異なる哺乳類セルラインに形質移入した。安定な形質移入クローンをこれらの全てのラインから獲得し、商業的に利用可能なフリースタイル（商標）２９３−Ｆセルラインを用いて得られたクローンにおいて最も高いレベルの発現が観察された。これらの細胞は懸濁液中に培養することができ、容易にバイオリアクター（バッチまたは灌流によって）における生産のスケールアップを可能にする。これらの商用培養培地は、動物血清を含まず、これによって潜在的な汚染問題が排除され、１工程の方法による前記タンパク質精製の容易な精製が可能になる。高生産レベルは、困難性無しに、一定期間、特に少なくとも２ヶ月、にわたって可能である。こうして生産されるＤＫＫ１タンパク質は成熟したもの、すなわち翻訳後修飾され、生物学的アッセイにおいて高活性である。
【００２８】
Ｉ−実験方法
【００２９】
１−１−試薬：
Ｔｒｉｚｍａ塩酸塩（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ−３２５３）、ｔｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ−１５０３）、ＮａＣｌ（Ｆｌｕｋａ  ＃７１３７６）、エチレン−ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｅ−５３９１）、イミダゾール（Ｆｌｕｋａ  ＃５６７５０）、硫酸ニッケル６水和物（Ｆｌｕｋａ  ＃７２２８０）。
【００３０】
１−２−ベクター
ｐＳＫ−ＧＷ−０３２ベクター
推定上のシグナルペプチド（ａａ３１の、末端まで）を欠くマウスＤＫＫ１配列をｃＤＮＡライブラリーから、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有するプライマーを用いて増幅させた。まず、ＰＣＲ産物をＨｉｎｄｌｌｌ／ＥｃｏＲＩ−消化ｐＳｅｃＴａｇ−２Ｃプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ついで、得られたＩｇｋ−ＤＫＫ１（ａａ３１−末端）インフレーム配列を、ゲートウェイエントリープラスミドｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への組み換えを可能にするようにデザインされたプライマーを用いて増幅した。最後に、配列Ｉｇｋ−ＤＫＫ１（ａａ３１−末端）を、ゲートウェイアクセプター哺乳類発現プラスミドｐＥＦ−Ｄｅｓｔ５１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への組み換えによってクローニングした。
【００３１】
１−３−細胞培養
これらの試験で用いられた全細胞は、商業的に利用可能な哺乳類セルライン：ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、Ｌ細胞（ＲＩＫＥＮ細胞バンク）およびフリースタイル（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃  Ｒ７９０−０７）であった。
【００３２】
Ｌ細胞をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃３１０５３−０２８）中で、ＣＨＯ細胞をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃３１０５３−０２８）／Ｆ１２（ＨＡＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＃２１７６５−０２９）中で、ＢＨＫ細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２（フェノールレッド無し）（Ｇｉｂｃｏ  ＃  ２１０４１−０２５）中で、およびＨＥＫ−２９３細胞をＤＭＥＭ（グルコース  ４．５ｇ／リットル）（Ｇｉｂｃｏ  ＃０４１−０１９６６）中で生育させた。
【００３３】
以下を、これらの全ての培地に添加した：
５％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｆ２４４２）、１％  ピルビン酸ナトリウム（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  ＃ＢＥ１３−１１５Ｅ）、１％  Ｌ−グルタミン酸（ＢｉｏＷｉｔｔａｋｅｒ  ＃  ＢＥ１７−６０５Ｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  ＃ＤＥ１７−６０２Ｅ）。
【００３４】
フリースタイル（商標）２９３−Ｆ細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するフリースタイル２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃１２３３８−０１８）で生育させた。
【００３５】
安定に形質移入された細胞を選択するためにブラストサイジンを０．５μｇ／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｒ２１０−０１）で添加した。生産のためにヘパリン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｈ３１４９）を０．１ｇ／リットルで添加した。
【００３６】
１−４−安定に発現する細胞の獲得
様々な商業的に利用可能な哺乳類セルライン（ＨＥＫ−２９３、ＢＨＫ−２１、ＣＨＯ、Ｌ−細胞およびフリースタイル（商標）２９３−Ｆ細胞）をｐＳＫ−ＧＷ−０３２ベクターで形質移入した。１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｒ２１０−０１）を用いた選択の後、各セルラインについて安定に発現するクローンを得た。
【００３７】
ブラストサイジンを用いた選択の後、サブクローニングを，細胞の希釈によって９６−ウェルプレートにおいて実施し，およびタンパク質発現を全てのクローンについて“ドットブロット”分析によって試験した。
【００３８】
１−５−生産のスケールアップ−灌流試験
生産スケールアップのための、３Ｆ８クローン（ＣＮＣＭ  Ｉ−３４７３）を選択した。
【００３９】
３つの異なったアプローチ：プラスチック製のＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（８％  ＣＯ２  インキュベーター（ＩＮＦＯＲＳ）内で攪拌）、ＣｅｌｌＳｐｉｎボトル（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（８％  ＣＯ２下でのインキュベーター内）、およびバイオリアクター（バッチモードまたは灌流モードのいずれか）、を用いた試験で、生産が成功した。  
【００４０】
１−６−“ブロット”
ウエスタンブロットのため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に従って電気泳動を実施した。ついで、グリシン  トランスファーバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃ＬＣ  ３６７５）中のトラスファー細胞（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＸ細胞ＩＩ）に４５ｍＡ  定電流を一晩適用することにより、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ）に移した。
【００４１】
“ドットブロット”のため、ウェルあたり１００μｌの馴化培地のローディングの前に、ニトロセルロースフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃ＲＰＮ  ３０３Ｄ、１１ｃｍ×７．５ｃｍ）をＰＢＳとともにインキュベートし、ついで各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。
【００４２】
両方の場合で、フィルターの飽和は、５％  スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ  ＃２３２１００）および０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０（Ｆｌｕｋａ  ＃９３７７３）を含有するＰＢＳ中、室温で１時間であり、次いで、一次抗体（抗−ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ  ＃３４６７０）、最終０．０５μｇ／ｍｌ）と共に、同じバッファー中で、４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳ  １×  ＋  ０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０  ＋  ０．３５Ｍ  ＮａＣｌで１５分間３回洗浄した後、フィルターを二次抗体（ヒツジ  抗−マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃ＮＡ９３１Ｖ）、希釈１／２０００）と共に、ＰＢＳ  １×  ＋  ５％  スキムミルク  ＋  ０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０中で、室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ  １×  ＋  ０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０  ＋  ０．３５Ｍ  ＮａＣｌ中で１５分間３回洗浄した後、次いで、“ドット”をＥＣＬ＋溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃ＲＰＮ  ２１３２）およびＦｘホスフォイメージャーを用いて明らかにした。
【００４３】
１−７−前記タンパク質の精製
馴化培地（ＣＭ）を５００×ｇで１０分間、細胞残骸を除去できるように遠心分離し、次いで、−２０℃で使用時まで保存した。解凍後、１０×バッファーを当該ＣＭに、最終濃度で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭ  イミダゾールになるように添加した。当該溶液の精製を、０．２２μｍＧＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＳＣＧＰＵ０２ＲＥ）における膜濾過、または８０００×ｇ、４℃での３時間３０分での遠心分離のいずれかによって行なった。ついで、最初０．５Ｍ  硫酸ニッケル６水和物溶液でロードし、ついでバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭ  イミダゾール）で平衡化した５０−ｍｌ  アフィニティー  カラム（キレーティングセファロース  ファーストフロー  レジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃１７−０５７５−０２）上に、前記精製培地を５ｍｌ／分（すなわち、５６．６  ｃｍ／ｈ）でロードした。バッファーＡ中での莫大な線上の後、２５０ｍＭまでのイミダゾール勾配を用いて溶出を実施した。
【００４４】
１−８−前記タンパク質の特性解析
慣用の技術（クーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いた。供給者が推奨する条件下で、Ｎ−グリコシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１３６５１６９）またはノイラミニダーゼ（ＳＩＧＭＡ  ＃Ｎ８２７１）を用い、精製したタンパク質において、脱グリコシル化試験を実施した。グリコシル化型翻訳後修飾の存在を、細胞を異なる濃度のツニカマイシン（ＳＩＧＭＡ  ＃Ｔ７７６５）で２４時間処理することによって、インビボで直接確認した。ＤＫＫ１−Ｖ５−６Ｈｉｓのオリゴマー化状態をＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ＨＲ  １０−３０  カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  ＃１７−１０８８０１）を用いた排除クロマトグラフィーで分析した。
【００４５】
１−９−細胞性のＤＫＫ１タンパク質活性アッセイ
形質移入の２４時間前、細胞を２４−ウェルディッシュに２×１０４細胞／ｃｍ２で蒔き、次いで、それを指示された構築物（合計１μｇ  のＤＮＡ）で、Ｆｕｇｅｎｅ  ６  ＤＮＡ−  脂質複合体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いて  製造者のプロトコールに従って一過性に形質移入した。形質移入の１６時間後、細胞を洗浄し、２％  ウシ胎児血清を含有する培地中で更に４８  時間、指示された条件で培養した。次いで、細胞を、ルシフェラーゼ活性について評価した。ＴＣＦｌ発現構築物（３００ｎｇ／ｗｅｌｌ）をＴＯＰＦＬＡＳＨ−ルシフェラーゼ（２００ｎｇ／ｗｅｌｌ）と一緒に形質移入した。形質移入効率を評価するため、最小ＨＳＶ−ＴＫプロモーターの下流のレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子をコードするｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０ｎｇを体系的に形質移入ミックスに加えた。次いで、ルシフェラーゼアッセイをデュアルルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）用い、製造者の説明書に従って実施した。１０μｌの細胞ライセートをルシフェラーゼ活性、次いでレニラ・ルシフェラーゼ活性について分析した。ホタル・ルシフェラーゼ活性をレニラ・ルシフェラーゼ活性に対して正規化した。
【００４６】
組み換えＤＫＫ１タンパク質の活性を試験するため、形質移入された細胞を、Ｗｎｔ３ａ  条件培地の存在下で、指示濃度で処理した。Ｗｎｔ３ａ馴化培地（Ｗｎｔ３ａ−ＣＭ）を、Ｓｈｉｂａｍｏｔｏらによって開示されたように、Ｗｎｔ−３ａを生産するＬ細胞から調製した（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ、１９９８）。コントロールを、組み換えＤＫＫ１タンパク質を欠くＷｎｔ３ａを用いて、またはＷｎｔ３ａ−ＣＭおよび組み換えＤＫＫ１タンパク質の両方を欠く細胞を用いて実施した。
【００４７】
ＩＩ−結果
【００４８】
ＩＩ−１−安定に発現する細胞の獲得およびタンパク質生産
市場で入手可能な様々な哺乳類セルライン（細胞ＨＥＫ−２９３、ＢＨＫ−２１、ＣＨＯおよびＬ細胞）をｐＳＫ−ＧＷ−０３２ベクターを用いて形質移入した。１０μｇ／ｍｌのブラスチサイジンを用いた選択後、安定に発現するクローを各セルラインについて得た。以下の表１は最も興味深い発現クローンの結果を示す。
【００４９】
【表１】
2009512431.tif 000002
【００５０】
各クローンの発現レベルを評価するため、よく規定された量のタンパク質についてのコントロールとしてＧＳＴ−６Ｈｉｓ−ＲＡＮＫタンパク質を用い、半定量的“ドットブロット”分析を実施し、広く用いられている抗−ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて顕示した。培養培地にヘパリンを０．１ｇ／リットルで添加した場合、培養培地中のＤＫＫ１タンパク質の回収率は因子１０（図１Ａ）によって増加した。これらのクローンについて得られた発現レベルは通常哺乳類細胞について得られるものと同様であり、条件培地１リットルあたりのタンパク質０．１と２ｍｇの間であり、分析されたセルラインおよびクローンに依存した（図１Ｂ、表１）。
【００５１】
１００ｍｇ以上のタンパク質を製造することが目的である限り、これらの発現レベルは満足のいくものではなかった。更に、これらの細胞は付着細胞であり、これは容易に生産のスケールアップに用いる事ができなかった。次いで、懸濁液で生育しているＤＫＫ１タンパク質を全く新しい商業的に利用可能なセルライン：フリースタイル（商標）２９３−Ｆ細胞で発現させた。このセルラインは、一過性の形質移入についてのみ記載されていた。製造者によって記載されているように形質移入を実施した。ブラスチサイジンのもとでの選択後、細胞希釈により９６−ウェルプレート中でサブ−クローニングを実施した。発現を全ての抵抗クローンについて“ドットブロット”分析によって試験した。６個のクローンが、高度に陽性であることが分かり、増殖させた。２つのベストのクローン（１Ｂ９  ［ＣＮＣＭ  １−３４７２］および３Ｆ８［ＣＮＣＭ  １−３４７３］）の発現レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ／  クーマシーブルー染色によって試験し、培養条件に依存し、４および１０ｍｇ  ＤＫＫ１タンパク質／リットル−条件培地の間であると見積もった（図１Ｃ）。
【００５２】
異なる培養アプローチ［ＣｅｌｌＳｐｉｎ（１２リットル）、バッチモード（１０  リットル）、または灌流モード（５０  リットル）での制御されたバイオリアクター］  を用い、生産のスケールアップを、同様の発現レベルで実施した。細胞は大変強力（灌流試験中の優れた生存率）であり、発現は、少なくとも  ２ヶ月の間一定であった（データは示さず）。
【００５３】
ＩＩ−２−前記タンパク質の精製
カルボキシ末端６Ｈｉｓタグを用いて前記タンパク質を精製した。細胞上静を低速遠心分離で集めて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを添加し、ｐＨ８．０で緩衝した。ニッケルキレートカラム上での混入タンパク質の非特異的な結合を減少させるため、２０ｍＭのイミダゾールおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを当該溶液に添加した。第２の精製を実施して、高速遠心分離または濾過により不溶性物質を除去した。０．８μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＡＡ  ＭＣＥの膜を用いた場合、非特異的結合が生じた。前記タンパク質は、０．２μｍＭｉｌｌｅｘ  ＧＶ  Ｄｕｒａｐｏｒｅの膜にも０．２２μｍ  ＧＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳの膜にも吸着しなかった（図１Ｄ）。ロードの間、低いが一定の樹脂のニッケルの浸出が観察された。これにより、当該フロースルーにおけるＤＫＫ１−Ｖ５−６Ｈｉｓ  タンパク質の損失無しでカラムにロードできる培地の総量が、カラムの１２０容量（この場合、５０−ｍｌカラムに対して６リットル）までに制限された。これらの条件下、前記タンパク質は、常に９０〜１００ｍＭ  イミダゾールの間で溶出した。
【００５４】
ＩＩ−３−前記タンパク質の特性分析
クーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２Ａ）によって示されるように、前記タンパク質は、ニッケルキレート精製工程尾、純度約９０％であった。前記文献に既に記載されているように、ＤＫＫ１タンパク質は、グルコシル化されたタンパク質に特徴的な、拡散したマルチバンドのパターンとして拡散した。
【００５５】
Ｗｎｔ伝達経路（図２Ｂ）の阻害についての細胞アッセイにおける良好な用量−応答依存活性によって示されるように、試験された全ての前記タンパク質のバッチは生物学的に活性であった。排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００レジン）を用いて  前記タンパク質を分析し、ＵＶ（２８０ｎｍ）によって、凝集物、高分子量複合体、および単量体型に矛盾しない保持時間で、３つの区別されるピークが観察された（図３Ａ）。この結果は、複数の異なる調製で確認された。クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ほとんどの前記タンパク質は、多量体および単量体のものに対応するリテンションタイムで溶出したことを示した（図３Ｂ）。わずかな差は、これらの２つのピークの間のバンドの組成において留意されうる。多量体および単量体型の前記タンパク質をＷｎｔ経路阻害について試験した。これらは、同じ活性を有した（図３Ｃ）。
【００５６】
グリコシル化阻害剤であるツニカマイシンによって処理された３Ｆ８細胞から得られる前記タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動における明白なシフトによって示されるように前記タンパク質はよくグリコシル化された（図４Ａ）。細胞生存率（７６％）および細胞濃度（４．４５×１０５細胞／ｍｌ）は、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）の処理について非処理の細胞（８８％、８×１０５細胞／ｍｌ）にものに対して、減少した。グリコシル化のタイプを、精製したタンパク質を用いて試験した。ＰＮＧａｓｅ処理は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルーによって示される分泌バンドの全てにおいてシフトを誘導し、明らかにＮ−グリコシル化の存在を示した（図４Ｂ）。
【００５７】
それにも関わらず、そのパターンはなおマルチバンドであり、前記タンパク質がまだ不均一であることを示した。ノイラミニダーゼ単独とともにインキュベーションした場合、前記タンパク質のシフトもまた観察され、糖鎖末端のシアル酸の存在を示した。
【００５８】
ＰＮＧａｓｅおよびノイラミニダーゼの共−処理は、前記バンドのより高いシフトを導いたが、状況は不均一に残り、より長い処理後では差は無かった（図４Ｂ）。シアル酸はＰＮＧａｓｅの作用後でも排除されたことが明らかになり、当該酵素は部分的に活性であるか、前記タンパク質に１以上のグリコシル化部位があることを示した。
【００５９】
Ｏ−グリコシダーゼ処理は、前記タンパク質におけるシフトを生じさせなかった。
【００６０】
文献
ＰｅｉｆｅｒおよびＰｏｌａｋｉｓ  ２０００．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：  １６０６−１６０９
Ｇｌｉｎｋａら、１９９８．  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：  ３５７−３６２
Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄら、１９９９．  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  ８９：  １５１−１５３
Ｆｅｄｉら、１９９９．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：  １９４６５−１９４７２
Ｋｒｕｐｎｉｋら、１９９９．  Ｇｅｎｅ  ２３８：  ３０１−３１３
Ｓｈｉｂａｍｏｔｏら、１９９８．  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ３：  ６５９−６７０
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ）】集められたＤＫＫ１−Ｖ５−６Ｈｉｓの量における培養培地へのヘパリン添加効果（半定量的“ドットブロット”）。Ａ、ＢおよびＣは、３つの異なるＤＫＫ１−Ｖ５−６Ｈｉｓ発現クローンの１００μｌの培養上静の蓄積物に対応する（“ドットブロット”）
【図１Ｂ）】異なる細胞のクローンにおける発現分析（“ドットブロット”）
【図１Ｃ）】濃縮された培養培地における発現分析  クーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ  １０〜２０％    レーン１〜３：ＢＳＡ（０．２、１および２μｇ）  レーン４〜６：親細胞２９３−Ｆ、１２．５倍濃縮された培養上静（５、１０、２０μｌ）  レーン７：シーブルーＭＷ（５μｌ）  レーン８〜１０：クローン３Ｆ８、１２．５倍濃縮された培養上静（５、１０、２０μｌ）
【図１Ｄ）】クーマシーブルー染色を用いた、濾過ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０〜２０％による未処理抽出物の精製  １：原料  ２：０．８μｍ（Ｍｉｌｌｅｘ  ＡＡ  ＭＣＥ膜）膜における濾過  ３：０．４５μｍ（Ｍｉｌｌｅｘ  ＡＶ  ＰＶＤＦ膜）膜における濾過  ４：０．２μｍ（Ｍｉｌｌｅｘ  ＡＶ  ＰＶＤＦ膜）膜における濾過  ５：０．２μｍ（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜）膜における２連続濾過
【図１Ｅ）】遠心分離による未処理抽出物の精製  Ａ：細胞培養上静  Ｂ：１６０００ｘｇ、３ｈ、遠心分離によって精製されたＡ  Ｃ：Ｂ＋２０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファー  Ｄ：遠心分離ペレット（１０倍濃縮）  Ｅ：ニッケルカラムの通過物  ＭＷ．分子量標準
【図２Ａ）】ニッケルキレートカラムの溶出フラクションにおいて精製された前記タンパク質の純度分析  クーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０〜２０％  ＭＷ．分子量標準  ロード：４μｌの各フラクション
【図２Ｂ）】Ｗｎｔ伝達における代謝経路ＤＫＫ１−Ｖ５−６Ｈｉｓの阻害作用の分析  Ｌ２１  ＋／−  Ｗｎｔ３ａにおけるＤＫＫ１の用量効果  タンパク質  ＤＫＫ１−Ｖ５−６Ｈｉｓ：ロット１０２９−１２３Ｐ（試験前に４℃で５日間保存）。０．５ｍｇ／ｍｌで測定された濃度。ＯｐｔｉＤＭＥＭ培地における前記タンパク質の希釈。最終ｎｇ／ｍｌで表現されたＤＫＫ１タンパク質濃度。  試験試料：Ｗｎｔで処理されていないが、様々な量のＤＫＫ１に曝された細胞。  コントロール：ＤＫＫ１無しで、Ｗｎｔで処理された細胞。
【図３Ａ）】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０−３０カラム（２４  ｍｌ）における排除クロマトグラフィーによるＤＫＫ１のオリゴマー化状態の分析  バッファー：ＰＢＳ。注入：２５０μｌのロット１０６１−４０Ｐ。流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ  Ｐ１：ピーク１；  Ｐ２：ピーク２；  Ｐ３：ピーク３
【図３Ｂ）】フラクションにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー  ロード：２０μｌの各フラクション
【図３Ｃ）】Ｗｎｔ経路における特異的活性
【図４Ａ）】ツニカマイシンを用いた３Ｆ８細胞の処理の、ＤＫＫ１−Ｖ５−６Ｈｉｓタンパク質の電気泳動における効果の、ウエスタンブロッティングによる分析ロード：指示量のツニカマイシンの存在下で２４時間培養した３Ｆ８クローンの、１６μｌの培養上静。
【図４Ｂ）】未処理の脱グリコシル化の試験  １：無処理  ２：３７℃、脱グリコシル化酵素無しでのインキュベーション  ３：ＰＮＧａｓｅとのインキュベーション  ４：ＰＮＧａｓｅおよびノイラミニダーゼとのインキュベーション  ５：ノイラミニダーゼとのインキュベーション
【図１Ａ）】
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【図１Ｂ）】
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【図１Ｃ）】
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【図１Ｄ）】
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【図１Ｅ）】
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【図２Ａ）】
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【図２Ｂ）】
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【図３Ａ）】
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【図３Ｂ）】
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【図３Ｃ）】
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【図４Ａ）】
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【図４Ｂ）】
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【国際調査報告】
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