(57)【要約】本発明は、金属タンパク質のメタル化のためのメタル化経路をスクリーニングする組成物及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞に候補薬剤を添加するステップ、及び
ｂ）標的タンパク質のメタル化の状態を決定するステップ、
を含む前記標的タンパク質のメタル化における変化をスクリーニングする方法。
【請求項２】
メタル化の状態が、タンパク質の生理活性アッセイにより決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質を精製し、そのタンパク質に関連する金属イオンの存在の有無を決定して、メタル化の状態を決定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的タンパク質が細胞表現型に関係し、メタル化の状態が前記細胞表現型を評価することにより決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞表現型が、蛍光活性化細胞分離法（ＦＡＣＳ）を用いて評価されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
候補薬剤のライブラリーを複数の細胞に添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
候補薬剤が標識化されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ａ）候補薬剤のライブラリーと標的経路タンパク質とを接触させるステップ、及び
ｂ）前記タンパク質の活性に対する前記薬剤の影響を決定するステップ、
を含む標的メタル化経路タンパク質のモジュレーションをスクリーニングする方法。
【請求項９】
金属タンパク質への金属結合が減少するように、メタル化経路タンパク質と阻害剤とを接触させることを含む、標的金属タンパク質のメタル化に関連するメタル化経路タンパク質を阻害する方法。
【請求項１０】
メタル化経路タンパク質が、メタロシャペロンタンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
メタル化経路タンパク質が、金属トランスポータータンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
メタル化経路タンパク質が、金属制御タンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
金属タンパク質への金属結合が減少するように、メタル化経路タンパク質と阻害剤とを接触させることを含む、金属タンパク質関連障害の治療方法。
【請求項１４】
メタル化経路タンパク質が、メタロシャペロンタンパク質であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
メタル化経路タンパク質が、金属トランスポータータンパク質であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
メタル化経路タンパク質が、金属制御タンパク質であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属タンパク質のメタル化のためのメタル化経路をスクリーニングする組成物及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
既知の全てのタンパク質の３０％は、金属イオンと密接に相互作用する金属タンパク質である。例を挙げると、既知の酵素類はすべて金属タンパク質を含んでいる。一般的には、金属タンパク質の構造と性質は、金属イオンの存在の有無に大きく依存し、細胞内の金属イオン濃度は、高度に制御されている。重要な金属イオンとしては、鉄、亜鉛、銅、マンガン、マグネシウム、カリウム、カルシウム、モリブデン、バナジウム、タングステン及びコバルトが含まれる。
【０００３】
近年の研究において、細胞に金属イオンを送り込むために機能する特定の内在性膜タンパク質が存在し、細胞内の金属イオン濃度が特別に制御されることが示されている。さらに、メタル化経路が解明されてきている。例えば、近年の研究において、金属イオンを細胞質を通して誘導し保護し、金属を特定のパートナータンパク質に移転するいくつかのメタロシャペロンタンパク質が存在することが解明されている。加えて、近年の研究において、細胞が有する「遊離」金属イオン量はとても少ないことも示されている。例えば、Finney et al., Science 30:931 (2003); Outten et al., Science 292:2488 (2001)を参照のこと。
【０００４】
治療学的な観点から、疾患の状態や状況と関係のある金属タンパク質は無数にある。例えば、循環器系疾患、癌、勃起不全及び緑内障は、すべて金属タンパク質と関連がある（それぞれＡＣＥ〈アンジオテンシン変換酵素〉、ＨＤＡＣ〈ヒストンデアセチラーゼ〉及びファルネシルトランスフェラーゼ、ＰＤＥ−５〈ホスホジエステラーゼ５〉並びに炭素脱水酵素である）。さらに、血色素症、メンケス病、ウィルソン病及びルー・ゲーリック病を含むいくつかの遺伝性疾患は、メタル化障害と関連がある。
【０００５】
金属タンパク質がユビキタスな性質を持ち、全てでないとしても多くのシグナル伝達経路における重要な役割を担うことから、メタル化経路をスクリーニングすることにより、金属タンパク質の生理活性のモジュレーターを開発する必要がある。 
【非特許文献１】Finney et al., Science 30:931 (2003); Outten et al., Science 292:2488 (2001)
【発明の開示】
【０００６】
一つの態様において、本発明は、細胞に候補薬剤（candidate agent）を加え、標的タンパク質のメタル化の状態を決定することを含む、標的タンパク質のメタル化における変化をスクリーニングする方法を提供する。メタル化の状態は、タンパク質の生理活性アッセイにより、又は、選択的に、タンパク質を精製し、かかるタンパク質に関連する金属イオンの存在の有無を決定することにより、決定付けることができる。
【０００７】
別の態様においては、本発明は、候補薬剤のライブラリーを標的経路タンパク質に接触させること、及び経路タンパク質の活性に対する薬剤の影響を決定することを含む、標的メタル化経路タンパク質のモジュレーションをスクリーニングする方法を提供する。経路タンパク質は、メタロシャペロンタンパク質、金属輸送タンパク質、又は金属制御タンパク質であってもよい。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、経路タンパク質とのタンパク質間相互作用のスクリーニングのための組成物及び方法を提供する。 
【０００９】
加えて別の態様において、本発明は、金属タンパク質への金属結合が減少するように、メタル化経路タンパク質に阻害剤を接触させることを含む金属タンパク質関連障害の治療方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本発明は、金属タンパク質そのものであるかもしれないし、そうでないかもしれない金属タンパク質(通常本明細書中で「標的タンパク質」又は「標的金属タンパク質」と記載する)及びメタル化経路におけるタンパク質(通常本明細書中で「メタル化タンパク質」又は「経路タンパク質」と記載する) の活性のモジュレーションをスクリーニングする組成物及び方法に関するものである。近年では、金属タンパク質は、構造が同定されているすべてのタンパク質のおよそ１／３に相当するとみられている。これらのタンパク質の生理活性は、金属イオンに依存している。いくつかの事例において、生理活性は、マトリックス金属タンパク質(ＭＭＰｓ)、ヘムタンパク質及び銅オキシダーゼのように、金属中心部における触媒化学に関連する。その他の事例において、金属関連生理活性は、亜鉛フィンガータンパク質の事例のように、構造的な整合性に関連する。その他のタイプの金属関連生理活性は、メタルシャペロン及び金属トランスポーターなどの金属制御タンパク質、若しくは、金属輸送の場合のように、調節シグナル伝達プロセスに関連する。つまり、金属イオンは、例えば、活性酸素消去酵素(ＳＯＤ)における酵素活性の場合のように金属が直接生理活性に関与するというよりむしろ、生理活性を可能にする正しい構造にとって重要であるかもしれない。さらに、金属タンパク質は、構造用金属及び１又は複数の生理活性金属の両者を含んでいてもよく、これらの金属は同一であっても異なってもよい。例を挙げると、活性酸素消去酵素は、亜鉛金属及び銅金属の両方を含むが、スーパーオキシドアニオン等の基質を触媒不均化するのにに必要とされるのは銅のみである。以上のことから、本発明は、多くの金属タンパク質中の金属イオンの存在が、活性において重要であるという事実に依存している。
【００１１】
驚くべきことに、細胞質内の遊離金属イオン量は、かなり少ない。Changela, A., Chen, K., Xue, Y., Holschen, J., Outten, C.E., O'Halloran, T.V., Mondragon, A. "Molecular Basis of Selectivity and Zeptomolar Sensitivity by CueR." Science, 2003, 301 , 1383-1387.  Finney, L.A., O'Halloran, T.V. "Transition Metal Speciation in the Cell: Insights from the Chemistry of Metal Ion Receptors." Science, 2003, 300, 931-936.  Outten, C.E., O'Halloran, T.V., "Femtomolar Sensitivity of Metalloregulatory Protein Controlling Zinc Homeostasis." Science, 2001 , 292, 2488- 2492.  Rae, T.D., Schmidt, PJ. , Pufahl, R.A., Culotta, V.C., and O'Halloran, T.V. "Undetectable Free Intracellular Copper: the Requirement of a Copper Chaperone for Superoxide Dismutase." Science, 1999, 284, 805-808 を参照。以上の文献はすべて、参照することにより本文に明示的に援用される。
【００１２】
以上のように、金属タンパク質は、金属イオン獲得のために、相互に「競合している」とみられ、また、金属タンパク質の多くは、メタル化のために特定のメタルシャペロンタンパク質を必要とする。事実上全てでないにしても、細胞中の大部分の金属イオンがタンパク質に関連しているという事実から、本発明は、メタル化のモジュレーター、特に阻害剤のスクリーニング方法に関する。つまり、特定の金属タンパク質のメタル化を可能にするためには、１つ又は複数の経路が必要とされ得るが、例えば、細胞内又は生物体内には、金属タンパク質のアポタンパク質の形態に正しい金属イオンを導入することを可能にする「メタル化経路」がある。これらの経路内のタンパク質は、本明細書中において、標的金属タンパク質と区別して、通常「経路タンパク質」又は「メタル化経路タンパク質」と称する。このように、本発明は、直接的又は間接的にメタル化を抑制し、金属タンパク質自体の生理活性を低下させる薬剤のスクリーニングを可能にする。金属タンパク質のアポタンパク質の形態の直接的なスクリーニングは、本願と同時に２００５年１０月２０日に米国特許出願番号６０／７２８，８４０として出願された"Compositions and Methods of Screening Apoproteins"に記載されており、同文参照によりその全体が本文に援用される。
【００１３】
このように、本発明は、特定の標的金属タンパク質の生理活性に関する金属結合及び金属の活性化を抑制するために、メタル化経路に関与する因子、特にタンパク質に結合する候補薬剤のスクリーニングを可能にする方法を提供する。このように、自らメタル化されてもされなくてもよい標的メタル化タンパク質と、活性化に１又は複数の金属イオンを必要とする標的金属タンパク質とが存在する。これらの方法は、いくつかの方式で達成されうる。ある態様において、完全なメタル化経路は未知である例でいえば、本発明は、標的タンパク質のメタル化に対する候補薬剤の効果を検出するための細胞ベースアッセイ（cell-based assays）を提供する。これにより、候補薬剤に曝露された細胞をスクリーニングし、標的金属タンパク質のメタル化の状況を評価することが可能となる。同様に、細胞ベースアッセイは、所望の改変された表現型に基づいてもよい。(例えば、標的タンパク質の阻害によるもの；例として、細胞のアポトーシスが起こりうる、細菌感染の欠如が見られる、等)。表現型が確認された後、薬剤の作用部位を決定するためのアッセイ、及び/又は標的タンパク質のメタル化の状況の評価が続いて行われる。
【００１４】
他の態様では、本発明は、メタル化経路に関与する特定の標的経路タンパク質の活性に基づく生化学的アッセイを提供する。この実施態様においては、メタルシャペロン、内在性膜金属輸送タンパク質等の既知のメタル化経路タンパク質に対して、候補薬剤への曝露時の活性、特に阻害についてのモジュレーションの試験が行われる。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、メタル化経路内のタンパク質を同定する試験法を提供する。この事例においては、特定のメタル化経路のタンパク質を解明するために、メタル化経路タンパク質又は金属タンパク質のいずれかに対して、タンパク質間（protein-protein）相互作用に依存するアッセイを実施する。タンパク質が同定されたら、モジュレーターを発見するため、本明細書に概要を述べる通り、さらなるスクリーンを行うことが可能となる。 
【００１６】
メタル化経路における変化についてのスクリーニング
以上のことから、ある態様において、本発明は、標的タンパク質のメタル化に対する候補薬剤の効果を検出するための、細胞ベースアッセイを提供する。このように、本発明は、メタル化のモジュレーションをスクリーンするための、細胞への候補薬剤の添加を提供する。 
【００１７】
候補薬剤
本明細書中において使用される「候補薬剤」又は「候補薬物」とは、本明細書中で概要を述べるように活性をスクリーニングできる、例えば、抗体及び酵素を含むバイオ治療薬を含むタンパク質、既知の薬物及び候補薬物を含む有機小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、核酸等のあらゆる分子をいう。本発明では、薬剤に関与する新たな経路を解明する（例として、薬物の副作用の研究など）と共に、薬剤（例として、工業用化学薬品、農薬、除草剤などの環境汚染物質）、薬物及び薬物候補、食品添加物、化粧品などの毒性作用を解明するために、金属タンパク質の活性に影響を及ぼし、よって潜在的な疾患の状況にも影響を及ぼす有力な治療剤を発見するため、候補薬剤が評価される。
【００１８】
候補薬剤は、非常に多くの化学薬品類を包含する。一つの実施態様において、候補薬剤は有機分子であり、好ましくは、一分子重量が１００ダルトンより大きく約２５００ダルトン未満の小分子有機化合物である。特に好ましくは、一分子重量が１００ダルトンより大きく約２０００ダルトン未満の小分子有機化合物であり、より好ましくは、約１５００ダルトン未満、さらに好ましくは、約１０００ダルトン未満、さらに好ましくは、５００ダルトン未満のものである。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、通常アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基の中の少なくとも１つを含み、好ましくはその化学官能基の中の２つを含む。候補薬剤は、しばしば、前記官能基の１又は複数で置換された、炭素環式又は複素環式の構造を含む、及び／又は、芳香族構造又はポリ芳香族構造を含む。また、候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、それらの構造的アナログ、又はそれらの組合わせを含む生体分子においても見い出される。
【００１９】
「既知の薬物」又は「既知の薬剤」又は「既に承認されている薬物」とは、米国又は他の司法権限管轄区域において、人体又は動物用薬剤としての治療的使用を認められている薬物（例えば、化学物質又は生物学的因子）を指す。本発明における、「既に承認されている薬物」という表現は、本明細書中で開示されている方法の使用により試験された適用とは異なる適用について承認されていることを意味する。
【００２０】
候補薬剤は、合成又は天然の化合物のライブラリーを含む幅広い多様なソース（source）より入手される。例えば、無作為化したオリゴヌクレオチド及びペプチドの発現及び／又は合成を含む幅広い多様な有機化合物及び生体分子の無作為な及び方向付けられた（directed）合成には、非常に多くのの手法が可能である。また、細菌性、真菌性、植物性、動物性の抽出物の形態をとる天然化合物のライブラリーが、入手可能であるか又は容易に作製される。さらに、天然の又は合成により産出されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的な手法により容易に改変される。既知の薬理学的な薬剤は、構造的アナログを作製するため、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような、方向付けられた又は無作為な化学的改変に供してもよい。
【００２１】
好ましい実施態様において、候補となる生理活性薬剤はタンパク質である。本明細書中に記載の「タンパク質」とは、共有結合した少なくとも２つのアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。タンパク質は、天然のアミノ酸及びペプチド結合、又は、合成のペプチド模倣の構造で構成されていてもよい。このように、本明細書中に記載の「アミノ酸」又は「ペプチド残基」とは、天然のアミノ酸及び合成のアミノ酸の両方を示す。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは本発明の目的のためのアミノ酸とみなされる。「アミノ酸」には、プロリン及びヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含む。側鎖は、(Ｒ)又は(Ｓ)配置のどちらの配置でもよい。好ましい実地態様においては、アミノ酸は(Ｓ)又は(Ｌ)配置となっている。非天然の側鎖が使われている場合は、例えばインビボの分解を阻害又は抑制するために、非アミノ酸置換基を使用することができる。酵素のペプチド阻害剤は、特別に使用される。
【００２２】
好ましい実施態様においては、候補となる生理活性薬剤は、天然のタンパク質又は天然のタンパク質の断片である。このように、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、又は、タンパク質性細胞抽出物の無作為又は方向付けられた消化物を使用することができる。このような方法により、原核及び真核タンパク質のライブラリーが、本明細書中に記載のシステムにおけるスクリーニングのために作製されうる。本実施態様において、特に、細菌性、真菌性、ウイルス性及び哺乳類のタンパク質のライブラリーが好ましく、中でも哺乳類のタンパク質が好ましく、その中で特にヒトのタンパク質が好ましい。 
【００２３】
実施態様の中には、候補薬剤がペプチドであるものがある。この実施例においては、提示構造を１つ含むペプチド構築物を使用することが有用である。本明細書中に記載の「提示構造（presentation structure）」又は文法的に同等な語句は、候補となる生理活性薬剤に結合すると、候補薬剤に立体構造的に制限された形態をとらせる配列を意味する。タンパク質は、大部分は立体構造的に限定された領域を通じて互いに相互作用する。自由に回転するアミノ末端及びカルボキシル末端を有する小ペプチドが当該技術において既知の潜在的な機能を有している可能性があるが、そのようなペプチド構造の薬剤への転換は、ペプチド模倣薬の合成のための側鎖の位置を予測できないことから困難である。したがって、立体構造的に限定された構造でペプチドを提示することは、医薬の後の開発と、標的タンパク質とペプチドのより高いアフィニティー相互作用を導き得る事との双方に利点がある。この事実は、細菌性ファージシステムにおいて生物学的に産生される短ペプチドを利用した組み合わせライブラリー産生システムにおいて確認された。多くの研究者により、無作為化されたペプチド構造物を提示できる小領域分子が構築された。好ましい提示構造は、外部のループ上にペプチドを提示することにより、ペプチドへの接近し易さ(accessibility)を最大にする。したがって、適した提示構造は、小体構造（minibody structure）、構造に重要な影響のない残基が無作為化されたβシートターン上のループ及びコイルドコイルステム構造、亜鉛フィンガードメイン、システイン結合（ジスルフィド）構造、グルタミン転移酵素連結構造、環状ペプチド、Ｂループ構造、螺旋状バレル又は束、ロイシンジッパーモチーフなどを含むが、それらに限定されることはない。その全体が本明細書に援用される、米国特許番号６，１５３，３８０参照のこと。
【００２４】
スクリーニングアッセイには、ファージディスプレイライブラリーが特に役利用される。例えば、米国特許番号５，２３３，４０９；５，４０３，４８４；５，５７１，６９８；及び５，８３７，５００を参照のこと。ファージディスプレイ方法及び構築物について、これらは全て参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される。一般的に、ファージディスプレイライブラリーは、合成タンパク質（例えばペプチド）の挿入（insert）を利用することができ、又は、ゲノム、ｃＤＮＡなどの消化物を利用することができる。
【００２５】
好ましい実施態様において、候補薬剤はタンパク質の一種である抗体である。「抗体」という用語は、当該技術において既知である通り、抗体全体又は組換えＤＮＡの技術を駆使して新規に合成された抗体の改変によって作製された、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、単鎖の抗体（例えばＦｖ）、キメラ抗体、ヒト化及びヒト型抗体などを含む、全長の抗体及び抗体フラグメント並びにその誘導体を含む。
【００２６】
好ましい実施態様においては、候補となる生理活性薬剤は、核酸である。本明細書中に記載の「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は文法的に同等な語句は、共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを示す。本発明の核酸は、一般的にリン酸ジエステル結合を含む。しかし、場合によっては、以下に概要を記載するように、例えば、ホスホルアミド（phosphoramide）(Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993)及びそれに含まれる文献; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81 :579 (1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984), Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc, 110:4470 (1988); and Pauwels, et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986))、ホスホロチオエート（phosphorothioate） (Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991);及び米国特許No. 5,644,048)、ジチオリン酸（phosphorodithioate） (Briu, et al., J. Am. Chem. Soc, 111 :2321 (1989))、Ｏ−メチルフフォスフォロアミダイト（O-methylphophoroamidite）結合(see Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)、及びペプチド核酸骨格及び結合 (see Egholm, J. Am. Chem. Soc, 114:1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31 :1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson, et al., Nature, 380:207 (1996)を参照。これら文献の参照によりその全文を本明細書中に援用する))を含む代替骨格をもつ核酸アナログが含まれている場合がある。その他の核酸アナログには、陽性な骨格（positive backbone）(Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995));非イオン骨格(米国特許番号５，３８６，０２３;５，６３７，６８４;５，６０２，２４０;５，２１６，１４１;及び４，４６９，８６３; Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991 ); Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc, 110:4470 (1988); Letsinger, et al., Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996))及び米国特許番号５，２３５，０３３及び５，０３４，５０６並びにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookに記載の骨格を含む非リボース骨格を有しているもの及びペプチド核酸が含まれる。また、核酸の定義には、１又は複数の炭素環式の糖が含まれている(Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176参照)。いくつかの核酸アナログについては、Rawls, C & E News, June2, 1997, page 35 に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。標識のような追加の構成成分（moieties）の添加を容易にするため、又は、生理学上の環境における前記分子の安定性及び半減期を増大させるために、これらのリボース−リン酸骨格の改変を行う事ができる。さらに、天然の核酸及びそのアナログの混合体を作製することができる。又は、異なる核酸アナログの混合物及び天然の核酸アナログおよびその混合物を作製することができる。核酸は、指定する通り、単鎖でも二本鎖でもよく、二本鎖又は単鎖の配列の両方が配分されていてもよい。核酸が、デオキシリボ−ヌクレオチド及びリボヌクレオチドの全ての組合わせ、及び、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン（xathanine）、ヒポキサンチン（hypoxathanine）、イソシトシン、イソグアニン、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６ メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリン等を含むいずれかの塩基（bases）の組み合わせを含むものであれば、核酸は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡ、ＲＮＡ，又はハイブリッドでもよい。
【００２７】
一つの実施態様において、核酸は、アプタマーである。米国特許番号５，２７０，１６３、５，４７５，０９６、５，５６７，５８８、５，５９５，８７７、５，６３７，４５９、５，６８３，８６７、５，７０５，３３７及び関連特許を参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００２８】
本発明との関連において、ヌクレオシド（リボースプラス塩基）及びヌクレオチド(リボース塩基及び少なくとも１つのリン酸塩)は、特に明記しない限り、本明細書において互換的に使用されることに留意すべきである。
【００２９】
一般的にタンパク質について、以上に記載のとおり、核酸候補生理活性薬剤は天然の核酸、無作為及び／又は合成核酸でありうる。例えば、原核又は真核ゲノムの消化物は、タンパク質について上記に概要を述べたように使用できる。さらに、ＲＮＡｉは本明細書中に含まれる。
【００３０】
「食品添加物」には、感覚刺激性薬剤(例えば、風味、質感、香り及び色を付与する薬剤)、ニトロソアミン、 ニトロソアミド、Ｎ−ニトロソ物質及び同等物質などの保存料、コンジェラント（congealants）、乳化剤、分散剤、燻蒸剤、保湿剤、酸化剤及び還元剤、推進剤、金属イオン封鎖剤、溶剤、界面活性剤、表面処理剤、共力剤、殺虫剤、有機塩素剤、食用動物によって摂取又は食用植物によって吸収されたすべての化学物質、及び包装材料から食物又は飲料に滲出した（又はその他の方法で入り込んだ）すべての化学物質が含まれるが、それらに限定されない。この用語は、製造及び包装過程におけるどこかの段階で食品又は飲料に添加された、又は、食用動物による摂取又は食用植物による取込みによって、若しくは、内毒素及び外毒素(ボツリヌストキシン又はアフラトキシンなどの事前に作られた毒素)などの微生物の副産物を通して、又は調理過程(例えば、２−アミノ−３−メチルイミダゾ−[４，５−ｆ]キノロンなどの複素環アミン)において、若しくは、製造、包装、貯蔵及び取扱い作業中包装材料から滲出又はその他の何らかの過程により、食品中に入り込んだ化学物質を意味する。
【００３１】
「工業用化学薬品」は、揮発性有機化合物、半揮発性有機化合物、洗浄剤、溶剤、希釈剤、混合剤、金属化合物、金属、有機金属、メタロイド、ヘキサンなどの置換及び非置換脂肪族及び非環式炭化水素、ベンゼン及びスチレンなどの置換及び非置換芳香族炭化水素、塩化ビニルなどのハロゲン化炭化水素、アミノ誘導体及びニトロベンゼン、グリコール及びプロピレングリコールなどの誘導体などのニトロ誘導体、シクロヘキサノンなどのケトン、フルフラールなどのアルデヒド、アクリルアミド、フェノール、シアン化物及びニトリルなどのアミド並びに無水物、イソシアネート、及び、農薬、除草剤、殺鼠剤、並びに、殺菌剤を含むが、これらに限定されない。
【００３２】
「環境汚染物質」は、自然において見られないすべての化学物質、又は自然において見られるが、自然において見られる（少なくとも自然におけるアクセス可能な媒体において見られる）水準を上回るまでに人工的に濃縮された化学物質を含む。したがって、例えば、環境汚染物質は、公園、学校又は遊び場などの非業務的又は工業的設備においていつか見つけられる、業務的又は工業的化学物質として同定される全ての非天然の化学物質を含む。又は、環境汚染物質は、鉛、但しバックグラウンドを超えた水準の鉛（例えば、自動車の加鉛ガソリンの燃焼による排出物が堆積した高速道路沿いの土壌中の鉛）、などの自然に発生する化学物質を含みうる。環境汚染物質は、工場の煙突、若しくは、水面又は地下水への工業排水等の点源、又は高速道路を走行する自動車の排出物、都市の街路を走行するバスのディーゼル排気（及びそれに含まれるすべての物質）、若しくは、農地からもたらされた浮遊粉塵により土壌に堆積した農薬などの非点源から発生することがある。本明細書中に記載される「環境汚染物」は、「環境汚染物質」と同義である。
【００３３】
一般的に、候補薬剤のライブラリーは試験を施されている。本明細書中に記載の「ライブラリー」とは、複数個の分子を示し、一般的には少なくとも１０２〜１０８個の分子、約１０２から約１０４〜１０６の個数が好ましい。
【００３４】
候補薬剤は、評価のため細胞に加えられる。先行技術においても認められるように、添加は、さまざまな方法により可能である。一般的には、候補薬剤は細胞培地に加えられ、該混合物は、一定の期間インキュベートされる。リポソーム等の摂取薬剤の使用、又は、エレクトロポレーション、若しくは候補薬剤を細胞に導入するその他の方法によってもよい。一般的には、細胞増殖に適した生理的条件に基づいて、添加工程が施される。 
【００３５】
適した細胞型
アッセイ及び所望の結果により、真核細胞及び原核細胞を含む幅広い細胞型を使用することができる。
【００３６】
適した真核細胞は、全ての動物、植物、酵母、真菌及び原生動物の細胞を含む。ある態様においては、好ましい真菌細胞は、（例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）げっ歯目の、霊長類を含む哺乳類の細胞で、特にヒトの細胞が好ましい。したがって、適した細胞型には、あらゆるタイプ(特に黒色腫、骨髄性白血病、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌及び精巣癌の腫瘍細胞)、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ細胞(Ｔ細胞及びＢ細胞)、マスト細胞、好酸球，血管内膜細胞、肝細胞、単核細胞白血球を含む白血球細胞、造血細胞、神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、及び筋幹細胞などの幹細胞、破骨細胞、軟骨細胞、及びその他の結合組織細胞、ケラチン生成細、メラニン形成細胞、肝細胞、腎細胞、脂肪細胞、膵細胞、ランゲルハンス島、(不死化神経内分泌細胞、神経芽種細胞及びグリア細胞を含む)神経細胞、シュワン細胞系統、培養中の器官型又は混合細胞、及び、ベータ細胞が含まれるが、これらに限定されない。適した細胞は、ジャーカットＴ（Jurkat T）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳなどの既知の研究細胞も含むが、それらに限定されない。ＡＴＣＣ細胞株カタログを参照により、本明細書中に明示的に援用する。 
【００３７】
好ましい真核細胞には、特にサッカロマイセス・セレビシエ、ハンセヌラ・ポリモルファ、クリュイベロミセス・フラギリス及びＫ．ラクティス（K. lactis）、ピチア・ギレリモンディ（Pichia guillerimondi）及びＰ．パトリス（P. pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ、熱帯熱マラリア原虫並びにヤロウィニア・リポティカの酵母細胞を含む。
【００３８】
さらに、好ましい真菌細胞には、アルペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラスマ、コクシジオイデス、ブラストミス（Blastomyces）、ペニシリウム種同様、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、Ｃ．クルセイ（C. krusei）、Ｃ．ルシタニエ（C. lusitaniae）、及びＣ．マルトサ（C. maltosa）を含むカンジダ菌株が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
好ましい原生生物には、体種トリパノソーマ、ドノハンリーリューシュマニアを含むリーシュマニア、マラリア原虫、ニューモシスティス・カリニ、クリストスポリジウム・パルバム、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ及びシクロスポラ・カエタネンシス（Cyclospora cayetanensis）などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
ある実施態様においては、アッセイで使用されている細胞は、例えばメタル化に基づく感染性及び活性の改変の試験をするための、原核（細胞）である。例えば、いくつかの細菌については、病原性が、例えば鉄摂取等の金属摂取に関連している。このように、細菌タンパク質のメタル化のモジュレーション（例えば阻害）試験が提供される。適した細菌には、以下が含まれる。炭疽菌を含むバチルス属；コレラ菌などのビブリオ属；腸管毒素原性大腸菌、志賀菌を含む赤痢菌などのエシェリヒア属;チフス菌などのサルモネラ属；ヒト結核菌、ハンセン菌などのマイコバクテリウム属；ボツリヌス菌、破傷風菌、クロストリジウム・ディフィシレ、ウェルシュ菌などのクロストリジウム属；ジフテリア菌などのコリネバクテリウム属；連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌；黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌；インフルエンザ菌などのヘモフィルス属；髄膜炎菌、淋菌などのナイセリア；Ｙ．ランブリア（Y. lamblia）、ペスト菌どのエルシニア属、緑膿菌、有機溶媒耐性細菌などのシュードモナス菌；クラミジア・トラコマチスなどのクラミジア属；百日咳菌などのボルデテラ属；Ｔ．パラジウム（T. palladium）などのトレポネーマ属；炭疽菌、ペスト菌、ブルセラ菌、野兎病菌、Ｂ．マレイ（B. mallei）、Ｂ．シュードマレイ（B .pseudomallei）、Ｂ．マレイ（B. mallei）、Ｂ．シュードマレイ（B .pseudomallei）、ボツリヌス菌、サルモネラ菌、ＳＥＢ Ｖ．コレラ毒素Ｂ、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、リステリア菌、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii）、赤色酵母（Rhodotorula）種、ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、エンテロバクター属、クレブシエラ菌、リステリア菌、マイコプラズマ菌及び同等のものを含む病原性及び非病原性原核細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
ある実施態様においては、細胞は遺伝子操作されていてもよい。例えば、外因性核酸を含んでいてもよく又は内因性核酸が除去されていてもよい（例えば「ノックアウト」）。以下に詳細に記載されている通り、このことは、細胞株にメタル化タンパク質を含んでいてもよく（例えば内因性金属ポンプが破壊または除去された酵母細胞へのヒト金属イオン細胞膜ポンプの添加）；酵母ツーハイブリッドシステムの成分や精製を容易にするために標的タンパク質に融合パートナーを使用することも含んでもよい。
【００４２】
ある態様において、メタル化に基づくウイルス感染及び活性を調節する薬剤を試験するため、細胞をウイルスで感染させてもよい。これらウイルスには、オルソミクソウイルス、（例えばインフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）、パルボウィルルス、ポックスウイルス（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス(例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス)、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ及びＣを含む）、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス、水疱瘡ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス)、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−I及びIIを含む）、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス及びピコルナウイルスが含まれるが、これらに限定されない。この実施例において、ウイルスの導入の前、同時又は後に候補薬剤に添加することができる。感染効率及びトランスフェクト、複製する能力、さらにその後の放出、再感染周期を経る能力は、標準方法によりスコア付けすることができる。
【００４３】
候補薬剤は、細胞に添加され、適当な期間インキュベートされる。ある実施態様においては、標的金属タンパク質のメタル化状態が評価される。本明細書中に記載の「金属タンパク質（metalloprotein）」とは、少なくとも１つの金属イオンを可逆的に結合するタンパク質を示す。この金属イオンは、１又は複数の側鎖又は骨格原子によって、又は、前記タンパク質に結合されたその他の結合機能によって結合されており、金属タンパク質は、定められた構造及び機能について最小限の金属−タンパク質比率に相当する特徴的な金属−タンパク質間の化学量論を示し、この種のタンパク質の構造、及び／又は、タンパク質の特定の部位に結合する金属に依存しうる。特定の触媒活性の金属占有率が必要な場合は、金属タンパク質は、金属酵素又は金属活性化タンパク質（metal-activated protein）と称される。「ｍｐ」という用語には、アポタンパク質の形態も含まれることを留意しなければならない。つまり、金属タンパク質は、本明細書中に記載の通り、メタル化されていても、されていなくてもよい。 
【００４４】
一般的には、本発明の金属タンパク質は、標的金属タンパク質である。本明細書中に記載の「標的金属タンパク質」とは、細胞機能における役割により、活性のモジュレーターが望まれている特定の金属タンパク質を示す。適した標的金属タンパク質について、以下のその概要を述べる。 
【００４５】
本明細書中に指摘の通り、金属イオンは、銅オキシダーゼ、ヘムタンパク質又はＭＭＰの場合のように生理活性に直接寄与することもあるし、亜鉛フィンガー転写因子の場合のように構造的な整合性を付与するよう機能することもあるし、金属制御タンパク質の場合のように制御的に機能することもある。又は、メタルシャペロンタンパク質の場合のように金属輸送に機能することもある。本文中の「生理活性」には、タンパク質結合(例えば、転写因子)に基づく活性又は酵素活性の両方が含まれ、金属タンパク質の同一性に基づいて決定される。幅広い数の適した金属タンパク質が本発明において使用できる。ある実施態様において、金属タンパク質は、本明細書中にしばしば金属酵素と称される酵素である。金属酵素の適した部類には、タンパク質分解酵素、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ及びヌクレアーゼなどの加水分解酵素；オキシゲナーゼ、オキシダーゼ及び還元酵素などの酸化還元酵素；電子伝達タンパク質；ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ又はムターゼなどの異性化酵素；転移酵素、キナーゼ及びホスファターゼを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
いくつかの実施態様において、金属タンパク質は酵素ではないが、他のタンパク質の特徴に基づく生理活性を有する。亜鉛フィンガータンパク質としては、遺伝子発現又はシグナル伝達経路を制御する金属センサーである、メタロシャペロンなどの金属輸送タンパク質、金属輸送タンパク質及び金属制御タンパク質が挙げられる。
【００４７】
本発明で使用される特定の金属タンパク質には、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６及びＭＭＰ−１７などのマトリックスメタロプロティナーゼ(ＭＴ−ＭＭＰｓを含む)、ミエリン塩基性タンパク質(ＭＢＰ)、ＨＣＶのＮＳ５Ａ、シトクロムｃ酸化酵素、ＶＡＰ−１、活性酸素消去酵素、炭疽菌の致死因子、５−リポキシゲナーゼ、ＣＯＸ−２、ＶＡＰ−１、ＰＤＦ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)、アロマターゼ、メタロ−ベータ−ラクタマーゼ(細菌性)、カルバモイルリン酸シンテターゼ、炭酸脱水酵素II、炭酸脱水酵素Ｉ、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、シクロオキシゲナーゼ(非選択的)、シクロオキシナーゼ２、チトクロームＰ４５０、ＤＮＡポリメラーゼ、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ、ファルネシル二リン酸合成酵素、フマル酸レダクターゼ(ミトコンドリアの)、ヘムオキシゲナーゼ、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ラノステロール・ディメチラーゼ(真菌性)、中性エンドペプチターゼ、ＰＤＥ(非選択的)、ＰＤＥ III選択、ＰＤＥ IV選択、ＰＤＥ Ｖ選択、ピルビン塩酸:フェレドキシン酸化還元酵素、腎性ジペプチターゼ、リボヌクレオチド二リン酸還元酵素、ＲＮＡポリメラーゼ (細菌性)、甲状腺ベルオキシダーゼ及びキサンチン酸化酵素を含むが、これらに限定されない。鉄依存性タンパク質には、ＣＯＸ−２、非ヘム鉄共同因子を必要とするアルファケトグルタル酸依存性酵素を含むヘムタンパク質；リボヌクレオチド還元酵素（多くは活性部位に２つのヘムアイロンを有する）、ペプチド脱ホルミル酵素、炭疽菌の致死因子等を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書中に概要があるように、金属タンパク質は、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、プラチナ、金、水銀を含むが、それらに限定されない１又は複数の金属イオンを含んでいる。  
【００４９】
メタル化状態
候補薬剤及び細胞をインキュベートした後、必要であれば、本発明のいくつかのアッセイにおいて、金属タンパク質のメタル化状態は、メタル化を調節する候補薬剤の能力の読取り（readout）として決定される。本明細書中に記載の「メタル化状態」とは、標的金属タンパク質と関連している１又は複数の金属イオンの存在の有無、つまり、金属タンパク質がアポタンパク質の形態であるかどうかを意味する。本明細書中に記載の「アポタンパク質」とは、少なくとも１つの機能性金属イオンが減少又は除去された金属タンパク質を示す。本文において、「機能性金属イオン」とは、金属タンパク質において欠如していることにより活性の減少又は消去のいずれかの原因となる金属イオンである。金属タンパク質が１つ以上の機能性金属イオンを有している場合、いくつかの実施態様においては、部分的にメタル化されていないタンパク質において、何らかの測定可能な生理活性の喪失が観察されれば、部分的にメタル化されていないタンパク質と判定する。金属タンパク質が、２つ以上の異なる機能性金属イオンを含む場合には、「アポタンパク質」には、片方の金属イオンを欠失しているが他方を欠失していない場合もあり、両方の金属イオンを欠失している場合もある。一般的には、本発明の方法では、全くメタル化されていないタンパク質を活用する。いくつかの場合においては、メタル化の完全な欠如は必要とされないことに留意しなければならない。例えば、サンプル中のいくつかのタンパク質が金属、ひいては活性を保持しているとしても、さらに機能性金属が除去された時に活性の減少が計測可能な限り、サンプルは、本明細書中に概要を述べた方法における使用に適当である。
【００５０】
一般的には、メタル化状態は、特定の標的金属タンパク質の生理活性についてアッセイを施すことにより決定される。これは、一般的に、アッセイ完了後に金属タンパク質を単離又は精製することにより行われる。金属タンパク質は、サンプル中他のどのような成分が存在するかに応じて、当業者に既知の多様な方法で単離又は精製することができる。標準的な精製方法には、イオン交換、疎水性、親和性、及び逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー及びクロマト分画等の、電気泳動技術、分子技術、免疫学的技術及びクロマトグラフ技術が含まれる。例えば、金属タンパク質は、標準的抗金属タンパク質抗体カラムを使用して精製してもよい。タンパク濃度と関連して、限外ろ過及び膜分離技術もまた有用である。適した精製技術の一般的な指針については、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)を参照のこと。必要とされる精製の度合いは、金属タンパク質の使用に依る。いくつかの事例においては、精製は必要ない。 
【００５１】
さらに、いくつかの実施態様において、他の技術による総細胞分画（gross cellular fractionation）は、メタル化状態の決定を十分に可能にする。例えば、元素分析、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル及び質量分析手法は、ある画分中の金属の存在の決定を可能にする。
【００５２】
精製後は、メタル化状態を決定するために多様な方法を使用できる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＩＣＰＭＳを含む、原子吸光、タンパク質加水分解及びマススペクトル法の手法の組み合わせは、特定の金属共同因子の決定を可能にし、さらには、精製されたタンパク質内の金属−タンパク質の比率を明らかにする。これらの方法は、その後のスクリーニングアッセイにおける金属占有率の変化をモニタリングするため、より利便性の高いスペクトル法を調整するために使用される。これらは、タンパク質又は金属を用いた色素分子（chromaphores）及び蛍光色素分子における分光の変化を含むが、これらに限定されない。スペクトル法には、ＵＶ−ＶＩＳ及びその他の光学的手法、蛍光反射、蛍光異方性、電子常磁性共鳴及びマススペクトル法が含まれる。その他のアッセイにおいては、精製されたタンパク質への金属の添加又は金属の欠失により光学的又は蛍光学的特性が増加又は減少する金属結合染料が使用できる；特定の金属タンパク質の生化学的活性に基づく生理活性アッセイ。
【００５３】
一つの実施態様において、（完全に又は部分的に非メタル化されていてもされてなくてもよい）精製された金属タンパク質を、分画し、特徴づけし、及び金属タンパク質中の金属イオンの存在の有無を決定するために、上記のように調節された金属含量を測定する。
【００５４】
一つの実施態様において、精製された金属タンパク質は、光学的に試験される。例えば、いくつかの金属タンパク質は、金属の添加又は欠失により、吸光度スペクトルが変化する。例えば、金属イオンの存在の有無により、いくつかのタンパク質は、異なる分光学的変化（例えば、色）をとる。同様に、紫外／可視の吸光度又は蛍光の使用によって、構造変化が観察される。例えば、構造的金属イオンの欠如は、金属が存在する構造と比較して、トリプトファン及びチロシンの吸光度又は蛍光性が変化するように、立体構造を「緩める」ことがある。 
【００５５】
ある場合においては、競合法によりメタル化状態を決定するために、染料を使用することができる。例えば、亜鉛金属タンパク質については、ジンボ（Zinbo）及びジンキン（Zinquin）ファミリーなどに存在する多くの金属特異的蛍光プローブを使用することができる。これらプローブは、亜鉛結合の際の吸収又は発光スペクトルを改変する亜鉛キレーターと連結された蛍光染料である(Taki et al, JACS 126:712 (2994)及びFahrni et al., JACS 121 :11448 (1999)参照のこと。両文献は参照により全体を本明細書に援用する)。アッセイにおいて所定のインキュベート時間経過後、候補薬剤が、標的タンパク質による亜鉛獲得を阻害する場合、それに引続く亜鉛プローブ複合体の一定分量は、蛍光変化をきたさない。対照アッセイにおいて、標的タンパク質による亜鉛の獲得を阻害しない化合物は、標的アポ−ｍｐが亜鉛プローブ複合体から亜鉛を獲得することを可能にし、サンプルの蛍光変化が観察される。 
【００５６】
このように、本発明は、いくつかの実施態様においてメタル化のモジュレーターを同定する方法に関する。本文において、「モジュレーション」は、活性及び阻害の両方を含み、一般的には、後者が好ましい。いくつかの場合において、モジュレーションは、標的金属タンパク質内の金属の存在の変化を含み、一般的には、標的金属タンパク質の生理活性において相当するモジュレーションを含む。一般的に、少なくとも５〜２５％の変化が好ましく、５０％以上の変化が特に好ましい。 
【００５７】
改変された表現型の読取り
メタル化状態の評価に加えて、又は、それに代わり、いくつかの実施態様において、細胞の、改変された表現型が評価される。
【００５８】
本明細書中に記載の「改変された表現型（altered phenotype）」又は「変更された生理(changed physiology)」又はその他の文法的に同等な語句とは、細胞の表現型が、ある方法により、好ましくは何らかの検出可能な及び/又は測定可能な方法により、改変されることを意味する。当該技術において認められているように、本発明の長所は、本方法を使用することにより試験することが可能な、多種多様な細胞型及び潜在的な表現型の変化である。したがって、観察され、検出され、又は測定されうる表現型変化はすべて、本明細書中のスクリーニング方法の基盤となりうる。適した表現型変化には、細胞形態、細胞成長、細胞の生存、基質又は他の細胞への接着及び細胞密度などの、肉眼で見える生理変化；１又は複数のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン又はその他の分子の発現における変化；１又は複数のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン又はその他の分子の平衡状態(例えば、半減期)における変化；１又は複数のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン又はその他の分子の局在性における変化；１又は複数のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン、レセプター、又はその他の分子の生理活性又は特定の活性における変化；イオン、サイトカイン、ホルモン、成長因子又はその他の分子の分泌における変化；細胞膜電位、分極（polarization）、整合性又は輸送における改変；ウイルス及び病原菌の感染性、感受性、潜伏期間、接着性及び取込みにおける変化；等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中の「表現型を改変しうる」とは、生理活性薬剤が何らかの検出可能及び／又は測定可能な方法により、細胞の表現型を改変しうることを示す。
【００５９】
改変された表現型は、以下に詳細に記載されるように、広範な方法により検出でき、その方法は一般的に、変化した表現型に依存及び対応する。一般的に、変化した表現型は、例えば、細胞形態の顕微鏡分析；例えばウイルス、細菌、細菌性又は合成毒素による細胞死に耐性のある細胞などの、増加した細胞死及び、増加した細胞の生存能力の両方を含む標準的な細胞生存アッセイ；ＦＡＣＳ又はその他の色素染色技術を含む特定の細胞又は分子の存在又は程度についての蛍光分析指標アッセイなどの標準的なラベリングアッセイ；細胞殺傷後の標的化合物の発現の生化学的検出；等で検出される。
【００６０】
改変された表現型が検出されると、多様なさらなるアッセイが施される。ある実施態様においては、標的タンパク質のメタル化状態は、以上に概要を記載の通り行われる。
【００６１】
メタル化経路タンパク質の阻害剤のスクリーニング
細胞ベースのスクリーニングに加えて、特定のメタル化経路タンパク質のモジュレーターのスクリーニングもまた行うことができる。
【００６２】
この実施態様において、既知のメタル化経路タンパク質が試験される。一般的には、経路タンパク質は、内在性膜透過トランスポーター(本明細書中しばしば「金属イオンポンプ」と称する)、金属制御センサータンパク質、タンパク質折り畳みアセンブリ（protein folding assemblies）、鉄−硫黄共同因子のアセンブリのための骨格として働くタンパク質、及び溶解性又は膜結合したメタロシャペロンタンパク質を含むが、これらに限定されない、いくつかの異なるカテゴリーに分類される。
【００６３】
多くの経路タンパク質はそれ自体、定義によれば、金属タンパク質であることに留意しなければならない。例えば、メタロシャペロンの場合、活性は金属イオンの輸送である。このように、活性は金属の存在に依存しており、少なくとも１つの金属イオンと可逆的に結合するタンパク質として、金属タンパク質の定義に含まれる。メタロシャペロンは、メタル化された又は非メタル化された（アポ）形態を有する。同様に、金属制御センサータンパク質の多くは、活性を生じるには金属イオンの存在の有無に依存する。
【００６４】
ある実施態様において、メタルシャペロンタンパク質のスクリーニングが施される。適した推測上のメタロシャペロンタンパク質は、鉄シャペロン(ＨＦＥ、フラタキシン、ＣｃｍＥ並びにそのホモログ及びオーソログを含む)、銅シャペロン(Ａｔｘ１、Ｈａｈ１(別名Ａｔｏｘｉ)、ＣＣＳ、Ｃｏｘ１７、Ｓｃｏ１、Ｓｃｏ２、Ｃｏｘ１９、ＣｏｐＺ、ＣｕｓＦ、ＣｏｐＣ、ＰｃｏＣ、ＰｃｏＥ並びにそのホモログ及びオーソログを含む)、亜鉛シャペロン(メタロチオネイン、カルレティキュリン、ＹｏｄＡ／ＺｉｎＴ、ＺｎｔＡのＮ−端末細胞ドメインであるＨＳＰ３３及びＣＣＳを含む)、ニッケルシャペロン(ＵｒｅＥ並びにホモログ及びオーソログ)を含むが、これらに限定されない。いくつかの場合において、メタロシャペロンは、その多くが金属イオンを最終的な標的金属タンパク質に輸送するために、非標準的なキレート化学を利用していることから、活性のモジュレーションの標的として特に有用である。参照によりその全文及びスクリーニング技術について本明細書中に援用する、同時係属中の２００５年１０月２０日付で提出された"Compositions and Methods of Screening Apoproteins"を名称とする米国特許番号６０／７２８，８４０において概要が記載されている通り、メタロシャペロンは、例えば、メタル化されていない状態において、メタロシャペロンのメタル化阻害剤を発見するため、アポタンパク質としてスクリーンされうる。また、アッセイの読取りは標的金属タンパク質のメタル化の欠如に基づくことができる。あるいは、銅メタロシャペロンタンパク質阻害のアッセイにおいて、読取りは、通常はメタロシャペロンタンパク質から金属を受け取る、対応する金属タンパク質のメタル化及び／又は活性である。これも、本明細書中に概要を述べる通り、直接(例えば、質量分析によって金属の存在の有無を観察することによって)若しくは生理活性アッセイによって、メタル化状態を検出することによって行うことができる。
【００６５】
ある実施態様においては、金属制御センサータンパク質のスクリーニングが行われる。例えば、大腸菌タンパク質Ｚｕｒ及びＺｎｔＲは亜鉛ポンプの転写を制御し、またこれらタンパク質のホモログ及びオーソログが含まれる。繰り返し説明すると、このアッセイは、本明細書中に概要を述べる通り、金属制御タンパク質中に金属が存在するか否かに基づいて、又は、活性化された遺伝子又はタンパク質に基づいて行うことができる（例えば、例としてｍＲＮＡ又は、タンパク質自体の存在を決定するなど）。
【００６６】
ある実施態様において、内在的膜透過トランスポータータンパク質（transmembrane transporter proteins）及びそれらのパートナー(本明細書中しばしば「金属イオンポンプ」と称する)のスクリーニングが行われる。たとえば、大腸菌タンパク質ＺｎｕＡＢＣは、別個の亜鉛結合タンパク質（ＺｎｕＡ）、膜結合された亜鉛透過酵素（ＺｎｕＢ）、及びＡＴＰａｓｅ（ＺｎｕＣ）を含むＡＢＣトランスポートファミリーの一部である。別のトランスポートシステムは、１つのタンパク質を有する。ＺｎｔＡは、亜鉛利用Ｐ型アデノシントリホスファターゼ、すなわち亜鉛ポンプ機能を果たす１つのタンパク質である。他の例においては、ＺＩＰタンパク質(ＺｕｐＴを含むＳＬＣ３９ファミリーとしても知られるＺｒｔ−、Ｉｒｔ−類似タンパク質)及び((ＣｏｍＡ(銅)を含むＣＤＦファミリーが含まれ、また、ホモログ及びオロソローグも同様に含まれる。メンケス及びウィルソン病タンパク質をコードするアデノシントリホスファターゼ７ａ及び７ｂ、ホモログ及びオロソローグをコードするｃｃｃ２及びＣｏｐＡ他、及び、マルチ銅オキシターゼＣｕｅＯ及びＰｃｏＡタンパク質などの非膜補助タンパク質を含む、銅輸送のための平行経路システムが適している。（ＤＣＴ１／ＤＭＴ１／Ｎｒaｍｐ２タンパク質を含む）トランスポーターのＳＬＣ１１ファミリー、及び、親鉄剤生合成及び輸送タンパク質のすべての形態などの、ＣｕｓＲｓ、マンガン、及び鉄輸送経路タンパク質もまた、同様に適当である。
【００６７】
Tottey et al., Acc. Chem. Res. 38:775 (2005)；Hantke, Curr. Opin. Microbio. 8:196 (2005)； Palmiter et al., Eur. J. Physiol. 447:744 (2004)；Schapiro et al., PNAS 100:8496 (2003)； Furukawa et al., EMBO J. 23(10):2872 (2004)； Brown et al., PNAS 101(15):5518 (2004)； Changela et al., Science 301:1383 (2003)； Finney et al., Science 300:931 (2003)； Wommer et al., J. Biol. Chem. 277:24142 (2002)； Arnesano et al., J. Biol. Chem. 279:47998 (2004)； Outten et al., Science 292:2488 (2001)； and Science 1993 Aug 6；261(5122):699-700に列挙されている金属タンパク質及びメタル化経路タンパク質を参照のこと。特に、金属タンパク質及び経路タンパク質について、これら文献はすべて、その参照によりその全体が明示的に援用される。
【００６８】
いくつかの実施態様において、経路タンパク質は、トランケーションなどのアミノ酸置換及び欠失を含む変異体である。例えば、膜透過タンパク質の取扱いが一般的に困難なことから、細胞内領域、細胞外領域、又は金属結合領域のいずれかが、モジュレートされる活性に応じて使用されうる。(例えば、トランスポータータンパク質に対しては、膜透過領域を欠失させてもよい)。
【００６９】
一般的には、以下に概要を記載する通り、経路タンパク質又は関連ドメインを発生させるため、合成ペプチド又は組換え技術を使用することができる。一般的には、経路タンパク質遺伝子は、当該技術分野において既知の通り、Genbankにあるような既知の配列から、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)などのプライマー及び増幅システムを使用することにより単離される。多様な発現ベクターを作製することができる。発現ベクターは、自己再生性染色体外ベクター又は宿主ゲノムに統合されるベクターのいずれでもよい。一般的に、これらの発現ベクターには、経路タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結している転写及び翻訳制御核酸が含まれる。「制御配列」という用語は、ある特定の宿主生物において作動可能に連結しているコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列のことをいう。原核に対して適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意にはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化信号及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００７０】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係におかれた場合、「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列（presequence）又は分泌リーダー（secretory leader）としてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレプロテイン（preprotein）として発現した場合、ポリペプチドのためにＤＮＡに作動可能に連結している。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響する場合コード配列に作動可能に連結している。また、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするため配置されている場合、コード配列に作動可能に連結している。一般的に、「作動可能に連結している」とは、結合されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーにおいては、隣接かつリーディングフェーズにあることを示す。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、簡便な制限酵素認識部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、従来のプラクティスに従って使用される。転写及び翻訳制御性核酸は、一般的に金属タンパク質の発現に使用される宿主細胞に適するとされている。例えば、バチルス属由来の転写及び翻訳制御核酸配列は、バチルス属における金属タンパク質の発現に使用されることが好ましい。多様な宿主細胞について、数多くの適した発現ベクター及び適した制御配列が、当該技術分野において知られている。
【００７１】
一般的には、転写及び翻訳制御配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写起動停止配列、翻訳開始及び停止配列、及びエンハンサー又は活性化配列が含まれうるが、これらに限定されない。好ましい態様においては、制御配列には、プロモーター及び転写開始及び停止配列が含まれる。
【００７２】
プロモーター配列は、構成的又は誘導プロモーターのいずれかをコードする。プロモーターは、天然プロモーター又はハイブリッドプロモーターのどちらでもよい。１つ以上のプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターは、当該技術分野においても既知であり、本発明において有用である。
【００７３】
さらに、発現ベクターは更なる要素を含みうる。例えば、発現ベクターは、発現のためには哺乳類又は昆虫細胞、及びクローニング及び増幅には原核の宿主というように、２つの生物体において維持されるように２つの複製システムを持ちうる。さらに、発現ベクターを統合するために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに少なくとも１つの相同配列を含み、好ましくは、発現コンストラクトに隣接する２つの相同配列を含む。統合ベクターは、ベクターへの包含（inclusion）のため適当な相同配列を選択することにより、宿主細胞における特定の遺伝子座に誘導されてもよい。統合ベクターのコンストラクトは、当該技術分野においてよく知られている。
【００７４】
さらに、好ましい態様においては、発現ベクターには、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子が含まれている。選択遺伝子は、当該技術分野においてよく知られており、使用される宿主細胞により違ってくる。
【００７５】
本発明の金属タンパク質は、金属タンパク質の発現を誘導又は引き起こすために適当な条件下で、金属タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質変換された宿主細胞をインキュベートすることによって製造される。金属タンパク質発現のために適当な条件は、発現ベクター及び宿主細胞の選択により異なり、ルーチンな実験を通して当該技術分野の当業者により容易に解明される。例えば、誘導性プロモーターの使用には誘導のための適当な成長条件を必要とするが、発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用には、宿主細胞の成長及び増殖を最適化することが必要となる。さらに、ある態様においては、採取のタイミングは重要である。例えば、昆虫細胞発現において使用されるバキュロウイルスシステムは、溶解性ウイルスあり、採取時期の選択は、生産収率にとって極めて重要でありうる。
【００７６】
適当な宿主細胞は、酵母、細菌、古細菌、菌類、並びに昆虫及び哺乳類の細胞等の動物細胞を含む。特に注目したいのは、ショウジョウバエ細胞、サッカロマイセス・セレヴィシエ及びその他の酵母、大腸菌株、枯草菌、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、アカバンカビ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、及びヒーラ細胞、線維芽細胞、不死化神経内分泌細胞、神経芽種細胞、グリア細胞、膵臓細胞、神経鞘種細胞株、器官型培養又は培養下の混合型細胞、及びその他の不死化哺乳類細胞株である。
【００７７】
好ましい態様においては、金属タンパク質は、哺乳類の細胞において発現する。哺乳類の発現系もまた当該技術分野において知られており、レトロウイルス系を含む。哺乳類のプロモーターは、哺乳類のＲＮＡポリメラーゼを結合し、ｍＲＮＡへの金属タンパク質のコード配列の下流（３’）転写を開始させることが可能なすべてのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コード配列の５’末端の近位に配置されている転写開始領域、及び、転写開始領域の上流２５〜３０塩基対に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、正しい部位においてＲＮＡ合成を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼIIを誘導すると考えられている。哺乳類のプロモーターはまた、通常ＴＡＴＡボックスの上流１００〜２００塩基対の範囲内に位置する上流プロモーター要素(エンハンサー要素)も含む。上流プロモーター要素は、転写が開始された比率を決定し、いずれの方向にも作用できる。ウイルス遺伝子が頻繁に高度に発現し、広範な宿主範囲をもつことから、哺乳類のウイルス遺伝子由来のプロモーターが、哺乳類プロモーターとして特に利用される。実例には、ＳＶ４０早期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター及びＣＭＶプロモーターを含む。
【００７８】
通常は、哺乳類細胞により認識された転写停止及びポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’に位置する調節領域であり、したがってプロモーター要素と共にコード配列の側面に位置(flank)する。この成熟ｍＲＮＡの３’末端は、翻訳後の部位特異的切断及びポリアデニル化により形成される。転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルの実例には、ＳＶ４０由来のものが含まれる。
【００７９】
他の宿主同様、哺乳類宿主への外因性核酸の導入方法は、当該技術分野においてよく知られており、使用される宿主細胞により異なる。技術は、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポソーム中のポリヌクレオチドのカプセル化及び核内へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションを含む。
【００８０】
ある態様においては、金属タンパク質は、細菌系において発現する。細菌発現システムは、当該技術分野においてよく知られている。適した細菌プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼを結合し、ｍＲＮＡへの金属タンパク質のコード配列の下流（３’）転写を開始することができるすべての核酸配列をいう。細菌性プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近接した転写開始領域を有する。この転写開始領域には、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位が含まれる。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。実例には、ガラクトース、ラクトース及びマルトースなどの糖代謝性酵素由来のプロモーター配列及びトリプトファンなどの生合成酵素由来の配列を含む。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた使用でき、当該技術分野において知られている。さらに、合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターもまた有用である。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼを結合し転写を開始する能力を有する、非細菌性起源の天然プロモーターを含みうる。
【００８１】
機能するプロモーター配列に加えて、効果的なリボソーム結合部位が望ましい。大腸菌においては、リボソーム結合部位はシャイン−ダルガーノ(ＳＤ)配列と称され、開始コドン及び開始コドンの上流３〜１１ヌクレオチドに位置する長さ３〜９ヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
発現ベクターはまた、細菌中の金属タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列を含みうる。シグナル配列は、通常、当該技術分野においてよく知られるように、細胞由来のタンパク質の分泌を導き、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。かかるタンパク質は、成長培地(グラム陽性菌)又は細胞(グラム陰性菌)の内膜及び外膜の間に位置するペリプラスム領域のどちらかに分泌される。
【００８３】
細菌性発現ベクターはまた、形質転換された細胞株の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含みうる。適した選択遺伝子は、アンピリシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンなどの薬剤に耐性を細菌に付与する遺伝子を含む。選択可能なマーカーは、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路などに含まれる生合成遺伝子も含む。 
【００８４】
これらの成分は、発現ベクターに組み入れられる。細菌のための発現ベクターは、当該技術分野においてよく知られており、枯草菌、大腸菌、ストレプトコッカス・クレモリス及びストレプトコッカス・リビダンスのベクターも含む。
【００８５】
細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション等の当該技術分野においてよく知られている技術を用いて細菌宿主細胞に形質転換される。
【００８６】
ある態様において、タンパク質は昆虫細胞において生成される。昆虫細胞の形質転換に用いる発現ベクター、特にバキュロウイルスを用いた（baculovirus-based）発現ベクターは、当該技術分野においてよく知られている。
【００８７】
好ましい態様において、タンパク質は酵母細胞において産出される。酵母発現系は、当該技術分野においてよく知られており、サッカロマイセス・セレヴィシエ、カンディダ・アルビカン及びカンディダ・マルトーサ、ハンセヌラ・ポリモルファ、クリュイベロミセス・フラギリス及びＫ．ラクティス、ピチア・ギレリモンディ、Ｐ．パトリス、シゾサッカロミセス・ポンベ、並びにヤロウィニア・リポティカの発現ベクターを含む。酵母中の発現に好ましいプロモーター配列は、誘導ＧＡＬ１、１０プロモーター、アルコール脱水素酸素由来のプロモーター、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グルセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び酸性ホスファターゼ遺伝子を含む。酵母の選択可能なマーカーには、ツニカマイシンへの耐性を付与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１及びＡＬＧ７；Ｇ４１８への耐性を付与するネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子；及び銅イオンの存在下で酵母の培養を可能にするＣＵＰ１遺伝子が含まれる。
【００８８】
好ましい実地態様においては、タンパク質は、上に概要を記載の通り、発現後精製又は単離される。 
【００８９】
発現し、必要な場合は精製した後、経路タンパク質は、数多くの用途において有用である。特に、経路タンパク質と結合し、標的金属タンパク質のメタル化を阻害し、生理活性が低下するような候補薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。 
【００９０】
スクリーニングは、まず経路タンパク質に結合可能な候補薬剤を見つけ出すよう設計されており、その後これら薬剤は候補薬剤の生理活性をモジュレートする能力を評価するアッセイにおいて使用されうる。このように、当該技術分野において認められるであろう通り、実施し得る数多くの異なるアッセイ、すなわち結合アッセイ及び活性アッセイがある。 
【００９１】
このように、好ましい実施態様においては、この方法は、経路タンパク質と候補生理活性薬剤とを組み合わせること、経路タンパク質への候補薬剤の結合を決定することを含む。 
【００９２】
アッセイの構成要素
候補薬剤は、候補−標的間の相互作用に好ましい反応条件下において、経路タンパク質と接触させる。一般的には、これは生理学的条件となる。インキュベーションは、最適な活性を容易にするいかなる温度、通常４〜４０℃の間で行ってもよい。インキュベーションの期間は、最適な活性のために選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするため最適化することもできる。通常０．１〜１時間の間で十分である。余分な試薬は、固相アッセイの場合、一般的に除去又は洗浄される。アッセイの形式については以下に記載する。
【００９３】
他のさまざまな試薬を、アッセイに含むことができる。これらには、最適なアポタンパク質と薬剤の結合を容易にするため及び／又は非特異的又はバックグラウンドの相互作用を減少させるため使用することができる塩、アルブミン、精製剤などの中性タンパク質のような試薬が含まれる。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等のようにその他の方法でアッセイの効率を向上させる試薬を使用することもできる。構成要素の混合物は、必要な結合を提供すればどのような順番でも添加することができる。
【００９４】
大抵の場合、アッセイは金属イオンの存在下で行われることに留意しなければならない。アポタンパク質形態を利用した、それら自体が金属タンパク質である経路タンパク質のスクリーニングについては、本出願と同時に２００５年１０月２０日に出願された米国特許番号６０／７２８／８４０を参照のこと。
【００９５】
ある実施態様において、溶液相結合アッセイが施される。一般的に、この実施態様においては、重複するスペクトルを伴う異なる蛍光色素分子で候補薬剤及び経路タンパク質の両方を標識化して、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイが施される。エネルギー伝達が距離に依存していることから、結合がない場合、１波長での励起では発光分光を産出しない。２つのラベルが近い場合のみ、例えば結合が発生した場合、１波長での励起によって、第二ラベルの所望の発光分光が得られる。
【００９６】
いくつかの実施態様において、固相（異種）アッセイが行なわれる。この場合、以下に記載する通り、経路タンパク質又は候補薬剤のどちらかが不溶性固定担体（insoluble solid support）に非拡散的に結合され、標識化されたもう１つの要素を添加することにより検出を行うことで、結合アッセイが行われる。不溶性担体は、結合可能な、溶解性マテリアルより容易に単離でき、又は、全体的なスクリーニング方法に準拠したいかなる組成物からも作製することができる。そのような担体の表面は、固相でも多孔質（porous）でもよく、どのような形状でもよい。適した担体には、マイクロタイタープレート、アレイ、膜及びビーズが含まれ、ガラス及び改良又は機能性ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、及びスチレンの共重合体並びにその他のマテリアル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）等を含む）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリコン及び改良型シリコンを含むシリカ又はシリカベースマテリアル、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミック並びにその他の多様なポリマーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様においては、固相担体は光学的検出が可能であり、それ自体では感知できるほどには蛍光を発しない。さらに、当該技術分野において知られるように、固相担体は、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチン、アガロース等のようなポリマーを含む、数多くのマテリアルでコーティングすることができる。典型的な固相担体には、シリコン、ガラス、ポリスチレン及びその他のプラスチック並びにアクリルが含まれる。マイクロタイタープレート及びアレイは、少量の試薬及びサンプルの使用により同時に多数のアッセイを実施することができるため特に便利である。本発明の試薬及び全体的方法に準拠し、組成物の活性を維持し、拡散性でない限り、組成物の結合の方法はさほど重要ではない。
【００９７】
好ましい実施態様においては、経路タンパク質は担体に結合しており、候補生理活性薬剤のライブラリーがアッセイに添加される。あるいは、候補薬剤が担体に結合し、経路タンパク質が添加される。固相担体への結合は、よく知られる方法で行われ、結合されるそれら２つのマテリアルの組成に依存する。一般的には、共有結合については、結合に利用できる各要素の官能基の利用を通じて、結合リンカーが利用される。結合に好ましい官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、ヒドロキシル基及びチオール基である。これらの官能基は、直接的又は間接的なリンカーの使用により結合される。リンカーは、当該技術分野においてよく知られている。例えば、ホモ又はヘテロ二官能性リンカーなどはよく知られている(1994 Pierce Chemical Company社カタログ、架橋剤の技術に関する項、１５５〜２００頁を参照のこと。この文献は参照により本明細書に援用される)。いくつかの実施態様において、吸収又はイオン相互作用が利用される。いくつかの場合においては、小分子の候補薬剤は、例えば、その後本発明のアッセイにおいて使用することができるミクロスフェアに直接合成される。
【００９８】
タンパク質又は薬剤の結合の後、過剰な未結合マテリアルは洗浄により除去される。その後、表面は、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、カゼイン又はその他の無害なタンパク質若しくはその他の構成成分でのインキュベーションによりブロックされる。
【００９９】
結合アッセイにおいては、経路タンパク質、候補薬剤、又は金属イオンを経路タンパク質に放出することができる試薬(例えば金属ドナー)が標識化される。本明細書中の「標識化」とは、その化合物が直接的又は間接的のいずれかにより、例えばラジオアイソトープ、蛍光発光物質、酵素、抗体、磁気粒子等の粒子、化学発光物質又は特定の結合分子等の、検出可能なシグナルを提供する標識で標識化されていることを示す。特異的結合分子メンバーには、ビオチン及びストレプトアビジン、ジゴキシン及び抗ジゴキシン抗体などのペアが含まれる。特異的結合メンバーについては、以上に概要を記載の通り、既知の手順に従って、通常補完的メンバーが、検出を可能とする分子で標識化される。標識は、直接的又は間接的に検出可能なシグナルを提供することができる。特異的な標識には、発色団、蛍光体及び蛍光色素分子等の光学色素を含むが、これらに限定されない。多くの場合、後者が特異的である。蛍光色素分子は、本明細書中に記載の通り「小分子」フルオレ（fluores）又はタンパク性のフルオレのいずれかであり得る。標識化された金属ドナーは、前記にあるように金属イオンを放出する際に分光学的変化を受ける(Zinquin又はZinbo５などの)化学的プローブでもよい。
【０１００】
「蛍光標識」とは、その固有な蛍光特性により検出されうる分子すべてを示す。適した蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、キャスケードブルーＪ（Cascade BlueJ）、テキサスレッド（Texas Red）、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣレッド６４０（LC Red 640）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５（LC Red 705）、オレゴングリーン（Oregon green）、アレクサ−フルオー色素（Alexa-Fluor dyes）(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、キャスケードブルー（Cascade Blue）、キャスケードイエロー（Cascade Yellow）及びＲ−フィコエリスリン（R-phycoerythrin）(ＰＥ)(Molecular Probes社)、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Texas Red）(Pierce社)、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７(Amersham Life Science社)が含まれるが、これらに限定されない。適した光学色素及び蛍光色素分子を含む金属プローブについては、参照により本明細書中に援用されるMolecular Probes Handbook by Richard P. Hauglandに記載されている。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、経路タンパク質は、融合タンパク質である。例えば、経路タンパク質は、別の異種のポリペプチド又はアミノ酸配列に融合させた経路タンパク質を含むキメラ分子を形成する方法で改変することができる。ある実施態様において、そのようなキメラ分子は、抗ｔａｇ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと経路タンパク質との融合を含む。エピトープタグは、一般的に、経路タンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に置かれる。そのようなエピトープタグを付けられた経路タンパク質の形態は、タグポリペプチドに対する抗体を使用することにより検出できる。また、エピトープタグの提供により、経路タンパク質ポリペプチドが、抗ｔａｇ抗体又はエピトープタグに結合する別のタイプのアフィニティーマトリックスを使用したアフィニティー精製により容易に精製されることが可能になる。これらのエピトープタグは、本明細書中に概要を記載のように、固相担体の固定化のため使用することができる。
【０１０２】
多様なタグポリペプチド及びそれぞれの抗体は、当該技術分野においてよく知られている。例として、ポリ−ヒスチジン(poly-his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-his-gly)タグ；ｆｌｕＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５[Field et al., MoI. Cell. Biol.. 8:2159-2165 (1988)]；ｃ−ｍｙｃタグ並びに８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan et al., Molecular and Cellular Biology. 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体[Paborsky et al., Protein Engineering. 3(6):547-553 (1990)]が含まれる。その他のタグポリペプチドには、フラグペプチド[Hopp et al., BioTechnology. 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin et al., Science. 255:192-194 (1992)]；チューブリンエピトープペプチド[Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163- 15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6393-6397 (1990)]が含まれる。
【０１０３】
その他の適した融合パートナーには、銅の表面に付着するヒスチジンタグ、リンカー及び標識などの結合のための機能性要素、及び、タンパク質性標識等のその他の固定成分が含まれる。一般的には、結合は、概して、当該技術分野において知られるように実施され、結合される二つのマテリアルの組成物に依存する。一般的には、結合に利用することのできる、それぞれの要素の官能基を通じて、結合リンカーは利用される。結合に好ましい官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、ヒドロキシル基及びチオール基である。その後これらの官能基は、直接的又は間接的にリンカーを使用することにより、結合することができる。リンカーは、当該技術分野においてよく知られている。例えば、ホモ又はヘテロ二官能性リンカーはよく知られている(1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200を参照。この参照により本明細書中に援用される)。好ましい結合リンカーには、アルキル基(置換アルキル基及びヘテロ原子部分を含むアルキル基を含む)、好ましくは、短アルキル基、エステル、アミド、アミン、エポキシ基、及びエチレングリコール並びに誘導体が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０４】
ある実施態様において、特に候補薬剤が固相担体において固定化される際に適した融合パートナーは、自家蛍光タンパク標識（autofluorescent protein label）である。適したタンパク性蛍光標識にはＧＦＰのウミシイタケ、プチロサルカル又はオワンクラゲ種(Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805)を含むグリーン蛍光タンパク質、ブルー蛍光タンパク質(ＢＦＰ、Quantum  Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1 J9； Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471 ； Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182)、強化イエロー蛍光タンパク質(ＥＹＦＰ、Clontech Laboratories, Inc.製)、レシフェラーゼ(lchiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417)、βガラクトシダーゼ(Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607)及びウミシイタケ(ＷＯ９２／１５６７３，ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許番号５，２９２，６５８、５，４１８，１５５、５，６８３，８８８、５，７４１，６６８、５，７７７，０７９、５，８０４，３８７、５，８７４，３０４、５，８７６，９９５、５，９２５，５５８)もまた含まれるが、これらに限定されない。以上に引用された全ての文献は、本明細書中に明示的に援用される。
【０１０５】
ある実施態様において、経路タンパク質は、担体に結合され標識化された候補薬剤を添加し、余剰試薬を洗浄し、固相担体における標識の存在の有無を決定する。当該技術分野において知られるさまざまなブロッキング及び洗浄工程を利用できる。
【０１０６】
ある実施態様において、候補薬剤は担体に固定化され、標識された経路タンパク質が結合を決定するため添加される。 
【０１０７】
ロボット工学
ある実施態様において、本明細書中に概要を述べたアッセイはすべて、ハイスループットスクリーニングのためのロボットシステムに利用することができる。多くのシステムは、一般的に９６個(またはそれ以上)のウェルマイクロタイタープレートの使用に関するものであるが、当該技術分野において認められているように、異なるプレート又は配置はいくつでも使用することできる。さらに、本明細書中に説明した工程のいずれか又はすべてを自動化できる。したがって、例えばシステムは完全に又は部分的に自動化できる。
当該技術分野において認められているように、多くの要素を利用できる。それらには１又は複数のロボットアーム、マイクロプレートを配置するためのプレートハンドラー、非二次汚染プレートのウェルの蓋を取り外し又は付け戻しのための自動化された蓋ハンドラー、使い捨てチップのサンプル分布のためのチップアセンブリ、サンプル分布のための洗浄可能なチップアセンブリ、９６ウェル積載ブロック、冷却された試薬ラック、(任意に冷却された)マイクロタイタープレートピペット位置、プレート及びチップのための保管塔；及びコンピューターシステムを含むが、それらに限定されない。
【０１０８】
完全なロボットシステム又はマイクロ流体システムには、スクリーニングの全工程を実行するためのハイスループットピペット操作を含む自動化された液体処理、粒子処理、細胞処理及び生物処理を含む。これは、吸引、調剤、混合、希釈、洗浄、正確な容積の移送等の、液体、粒子、細胞及び生物操作；ピペットチップの回収及び廃棄；及び１回のサンプル吸引からの多数供給のための同一容量の反復的ピペッティングなどを含む。これらの操作は、二次汚染を受けない液体、粒子、細胞及び生物の移送である。この機器は、フィルター、細胞膜及び／又はドータープレート（daughter plate）へのマイクロプレートサンプルの自動的複製、高密度移送、全プレート連続希釈並びに大容量操作を行う。
【０１０９】
好ましい実施態様においては、アッセイの成分に対する特異性をもつ化学的に誘導された粒子、プレート、チューブ、磁気粒子又はその他の固相マトリックスが使用される。マイクロプレート、チューブ又はすべての固相担体の結合面は、非分極性表面、高度分極性表面、共有結合を促進する改変されたデキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質又はペプチドを結合するアフィニティー媒体、組換えタンパク質Ａ又はＧ、ヌクレオチド樹脂又はコーティングなどの表面固定タンパク質、その他のアフィニティーマトリックスを含み、本発明において有用である。
【０１１０】
好ましい実施態様においては、マルチウェルプレート、マルチチューブ、ミニチューブ、ディープウェルプレート、マイクロフュージチューブ、クリオビアル（cryovials）、スクウェアウェルプレート、フィルター、チップ、オプティックファイバー、ビーズ及びその他の固相マトリックスのためのプラットホーム又は各種容量のプラットホームは、さらなる容量のためにアップグレードできるモジュール式のプラットホームに収容させられる。このモジュール式プラットホームは、各種スピードのオービタルシェーカー、エレクトロポレーター及びソースサンプル用のマルチ−ポジションワークデッキ、サンプル及び試薬希釈、アッセイプレート、サンプル及び試薬リザーバー、ピペットチップ及びアクティブウォッシュステーションを含む。
【０１１１】
好ましい実施態様においては、制御されたブロック又はプラットホームのようにサーモサイクラー及びサーモレギュレーティングシステムが熱交換器の温度を一定に保ち、４℃〜１００℃まで、サンプルのインキュベートにおいて正確な温度調整を実現するために使用される。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、機器の使用は、検出器を含み、その検出器は、標識及びアッセイに応じて、幅広い種類の異なる検出器であり得る。好ましい実施態様においては、有用な検出器には、以下が例示される。蛍光マルチチャンネルを備えた顕微鏡；シングル及びデュアルにおける波長エンドポイント及びキネティック能を有する蛍光、紫外線及び可視に基づく分光学的検出を行うプレートリーダー、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）、ＳＰＲシステム、ルミネッセンス、クエンチング、ツーフォトンエクサイテーション及びインテンシティーディストリビューション；データ及び画像を互換フォーマットにキャプチャー及びトランスフォームするＣＣＤカメラ；並びにコンピュータステーションが例示される。これらは、細胞、組織及び生物における特異的マーカーのサイズ、増殖及び表現型的発現のモニタリング；ターゲットの有効性；最適化；公的及び独自使用のデータベースを用いたハイスループットスクリーンにおけるデータ分析、マイニング、オーガナイゼーション及びインテグレーションを可能にする。
【０１１３】
これらの手段は、無菌層流若しくはドラフトにフィットすることができ、又は必要に応じて自己完結システムに含まれる。個別の磁気またはその他のビーズ、粒子、細胞及び生物の捕獲のためにフローサイトメトリー又はキャピラリー電気泳動フォーマットが使用できる。
【０１１４】
フレキシブルなハードウェア及びソフトウェアは、無数のアプリケーションへのインスツルメントの適応を可能にする。ソフトウェアプログラムモジュールは、方法のクリエーション、モディフィケーション及びランニングを可能にする。システム診断モジュールは、インスツルメントの調節、正確な接続及びモーター操作を可能にする。カストマイズされたツール、ラボウェア及び、液体粒子、細胞及び生物体トランスファーのパターンは、実施される異なるアプリケーションを可能にする。データベースは、方法及びパラメーターの保存を可能にする。ロボティック及びコンピュータインターフェイスは、インスツルメント間のコミュニケーションを可能にする。
【０１１５】
好ましい実施態様においては、ロボットワークステーションは、１又は複数の加熱又は冷却成分を含む。反応及び試薬によって、冷却又は過熱のいずれかが必要となる。ペルティエシステムを含む既知の加熱及び冷却システムをいくつでも使用することにより行うことができる。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、ロボット装置は、メモリー及びバス（bus）を介した入力／出力デバイス一式(例えばキーボード、マウス、モニター、プリンターなど)と通信するセントラルプロセッシングユニットを含む。セントラルプロセッシングユニット、メモリー、入力／出力デバイス及びバス間の全体的な相互作用は、当該技術分野において既知である。このように、実施される実験により多様な異なる手段がＣＰＵメモリーに貯蔵されている。
【０１１７】
メタル化経路タンパク質の同定
ある態様において、本発明は、さらなるメタル化経路タンパク質の同定を提供する。一般的には、これは、多様な既知のタンパク質間相互作用の方法のいずれかを使用することにより実施される。
【０１１８】
ツーハイブリッドシステム
酵母によるツーハイブリッドシステム
基本的な酵母によるツーハイブリッドシステムは、レポーター遺伝子の転写を開始するために、タンパク質間相互作用を必要とする。それに引続く研究は、哺乳類の細胞について行なわれた。Fields et al., Nature 340:245 (1989); Vasavada et al., PNAS USA88:10686 (1991); Fearon et al., PNAS USA 89:7958 (1992); Dang et al., MoI. Cell. Biol. 11 :954 (1991); Chien et al., PNAS USA 88:9578 (1991); and U.S. Patent Nos. 5,283,173, 5,667,973, 5,468,614, 5,525,490, and 5,637,463, Bartel and Fields, eds., The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press, New York, N.Y., 1997を参照のこと。これらすべての文献を参照により、その全体が本明細書中に明示的に援用される。
【０１１９】
酵母のツーハイブリッド法は、異なる融合タンパク質に含まれる転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインが、互いに接近したときに遺伝子転写を活性化できるという事実に基づく。図１に示すように、酵母のツーハイブリッドシステムにおいては、二つの融合タンパク質が酵母細胞中で発現される。１つは、ベイトタンパク質（bait protein）に融合された転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインを有する。一方、もう１つは、別の試験タンパク質に融合された転写活性化因子の転写活性化ドメインを有する（又はその逆）。転写活性化因子を含む。二つの試験タンパク質がインビボで相互に作用する場合、転写活性化因子の二つのドメインは、転写活性化因子を再構成し、転写活性化因子により制御されたレポーター遺伝子を活性化して一緒になる。例えば、米国特許番号５，２８３，１７３を参照のこと。これを参照により、その全体が本明細書中に明示的に援用される。
【０１２０】
したがって、本発明は、酵母によるツーハイブリッドスクリーンを利用する方法及びシステムを提供する。このように、ツーハイブリッドシステムにおいては、本明細書中で第一タンパク質又は「ベイトタンパク質」と称されるのは、転写活性化因子タンパク質などの核酸結合タンパク質の核酸結合ドメインに融合され、第二タンパク質又は「試験タンパク質」は、転写活性化因子などの活性化ドメインに融合される。ベイトタンパク質及び試験タンパク質が結合すると、つまり特定タンパク質間相互作用がある場合、活性化ドメインは、核酸結合ドメインに接近した位置に置かれ、検出可能な遺伝子の転写が発生する。相互作用がほとんどないか皆無である場合は、検出できるタンパク質はほとんど又は全く無い。
【０１２１】
好ましい実施態様においては、ベクター(特に試験ベクター)又は融合コンストラクトの片方又は両方のいずれかは、「レスキュー（rescue）」配列を含みうる。レスキュー配列とは、試験タンパク質又はベイトタンパク質若しくはそれらをコードする核酸を精製又は単離するために使用できる（核酸又はアミノ酸のいずれかの）配列である。このように、例えば、タンパクレスキュー配列は、Ｎｉアフィニティーカラムで使用するＨｉＳ６タグ、及び、検出、免疫沈降又はＦＡＣＳのためのエピトープタグなどの精製配列を含む。適したエピトープタグは、ｍｙｃ(市販の９Ｅ１０抗体を伴う使用による)、細菌性酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列，ｆｌｕタグ、ｌａｃＺ及びＧＳＴを含む。
【０１２２】
あるいは、レスキュー配列は、ＰＣＲ、関連技術又はハイブリダイゼーションによるレトロウイルスコンストラクトの迅速かつ容易な単離を可能にする、プローブ標的部位として機能する唯一のオリゴヌクレオチド配列になりうる。
【０１２３】
好ましい実施態様において、第一の融合遺伝子は、核酸結合ドメインをコードする第１配列を含み、第２配列はベイトタンパク質をコードする。本明細書中に記載の「核酸結合ドメイン」とは、特定の核酸配列、一般的にはＤＮＡ配列を結合できるタンパク性ドメインを示す。上に記載の通り、転写活性タンパク質は一般的に、少なくとも二つのドメイン、すなわち核酸結合ドメイン及び転写活性ドメインを有する。本発明の目的のために核酸結合ドメイン及び転写活性ドメインは、同一のタンパク質又は異なるタンパク質に由来してもよい。当該技術分野において認められるであろう通り、重要なことは、これら配列に由来する転写活性化因子が機能的に異なるドメインを有することである。適した核酸結合ドメインは、Ｔｅｔ、ＧＡＬ４(アミノ酸１〜１４７; Fields et al., supra; see also Gill et al., PNAS USA 87:2127 (1990); Chasman et al., MoI. Cell. Biol. 9:4746 (1989));ＬｅｘＡ(Thliveris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1992; Hurstels et al., EMBO 1986); Ｓ．セレヴィシエ由来のＧＣＮ４(Hope et al., Cell 46:885 (1986); Ｓ．セレヴィシエ由来のＡＲＤ１(Thukral et al., MoI. Cell. Biol. 9:2360 (1989)、ヒトエストロゲンレセプター(Kumar et al., Cell 51 :941 (1987)、及びＮＦ−ｋＢ ｐ６５及びｐ５３及び機能的に類似したその誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
好ましい実施態様において、第一の融合遺伝子は、さらに、ベイトタンパク質をコードする第２配列を含む。本文中の「タンパク質」は、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を含む。本明細書にある「ベイトタンパク質」とは他のタンパク質との相互作用を試験するタンパク質を示す。一般的には、ベイトタンパク質は、所望の生物学的過程に関わるか機能が追及される標的分子の全部又は一部を含む。適したベイトタンパク質は、本明細書に概要を記載した、全ての金属タンパク質又は経路タンパク質であり、その断片、誘導体及び変異体を含むことができる。
【０１２５】
通例では以下に記載の通り、試験配列のライブラリーを試験するため、１つのベイトタンパク質が使用される。しかし、当該技術分野において認められるように、ベイトタンパク質もまたライブラリーの１つでありうることから、実験的マトリックスを形成しており、二つのライブラリーの（ライブラリーのコート領域は同一でありうるが）タンパク質間相互作用が評価される。好ましい実施態様においては、自己活性ベイトタンパク質は、ベイトタンパク質ライブラリーから除去される。
【０１２６】
本発明は、また、試験ベクターを提供する。一般的には、試験ベクターはベイトベクターと明確に異なったベクターであり、当該技術分野において認められているように、１又は複数の独立したベクターが使用できる。つまり、ベイト及び試験ベクターの要素は、単一のベクター又は二つのベクターに存在することができる。同様に、レポーターベクターは、ベイト若しくは試験ベクターと独立していてもよく、そのいずれかの一部となることが可能である。また、ベクターの大きさが関係ない場合、システム全体が単一のベクターに存在しうる。一般的には、試験タンパク質がライブラリーのメンバーである場合、以下に概要を記載するように、試験ベクターはベイト及びレポーターベクターとは別個のものである。
【０１２７】
試験ベクターはまた、一般的に選択遺伝子を含む。好ましくは、ベイト及び試験ベクターが明確に異なる場合、両方のベクターが細胞中に維持されていることを確認にするために、試験ベクターの選択遺伝子はベイトベクターの選択遺伝子と異なる。しかし、いくつかの実施態様においては、これは必要とされない可能性がある。したがって、第１及び第２の選択遺伝子は同一であっても異なっていてもよい。
【０１２８】
試験ベクターは、さらに、転写化活性ドメインをコードする第３配列及び試験タンパク質をコードする第４配列を含む第２融合遺伝子を含む。上に記載の通り、これらは、直接又はリンカーによって融合できる。本明細書中に記載の「転写活性化ドメイン（transcriptional activator domain）」とは、転写を活性化することができるタンパク質ドメインを示す。
【０１２９】
適した転写活性化ドメインは、ＧＡＬ４、ＧＣＮ４、ＡＲＤ１、ヒトエストロゲンレセプター、ＶＰ１６(Triezenberg et al., Genes Dev. 2(6):718-729 (1988))及びＢ４２(Gyuris et al, Cell 1993)、及びＮＦ−ｋＢ1 ｐ６５、並びに機能的に類似するそれらの誘導体由来の転写活性化ドメインを含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
第４配列は、試験タンパク質をコードする。本明細書中に記載の「試験タンパク質」とは、ベイトタンパク質との相互作用について試験を施される候補タンパク質を示す。本文におけるタンパク質とは、少なくとも二つのアミノ酸が結合している、タンパク質、オリゴペプチド及びペプチドを示す。好ましい実施態様においては、試験タンパク質配列は、試験タンパク質配列のライブラリーの１つである。すなわち、試験タンパク質のライブラリーは、１又は複数のベイトタンパク質への結合について試験を施される。試験タンパク質配列は、ゲノムＤＮＡ, ｃＤＮＡに由来するものでもよく、又はランダムな配列でもよい。あるいは、特定の種類の試験タンパク質を試験してもよい。試験タンパク質をコードする試験タンパク質又は配列のライブラリーは、それぞれ又はほとんどが異なる試験タンパク質配列を含む試験ベクターのライブラリーに組み込まれる。
【０１３１】
好ましい実施態様において、試験タンパク質配列は、ゲノムＤＮＡ配列に由来する。一般的には、当該技術分野において認められているように、ゲノム消化物は試験ベクターにクローニングされる。ゲノムライブラリーは、完全なライブラリーでもよく、当該技術分野において認められているように、分画若しくは濃縮されていてもよい。
【０１３２】
好ましい実施態様において、試験タンパク質配列は、ｃＤＮＡライブラリーに由来する。異なる細胞のｃＤＮＡライブラリーをいくつでも使用でき及び試験ベクターにクローニングすることができる。上に記載の通り、ｃＤＮＡライブラリーは、完全なライブラリーでもよく、また、多数の方法により分画若しくは濃縮されていてもよい。
【０１３３】
レポーターベクターはさらに、ベイト及び試験タンパク質のタンパク質間相互作用により、オペレーターの活性に際し転写される、少なくとも１つの検出可能な遺伝子を含む。本明細書中に記載の「検出可能な遺伝子」とは、その発現が、それ自体又は化合物若しくは物質の添加によって、検出可能な表現型となる遺伝子を意味する。適した検出可能なタンパク質は、グリーン蛍光タンパク質及びは誘導体(上記参照)、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｌａｃＺ及びドラッグ選択遺伝子(好ましくはベイト及び試験ベクターの薬剤選択遺伝子以外を使用する)を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
好ましい実施態様においては、検出可能な遺伝子の発現によって、蛍光活性化細胞分離法、すなわちＦＡＣＳ等による細胞分取が可能となる。
【０１３５】
好ましい実施態様において、改変された表現型を有する細胞が検出されると、その細胞は、改変された表現型を有していない大多数の細胞から単離される。これは、当該技術分野において既知の通り、いく通りの方法によっても行うことができ、いくつかの事例においては、アッセイ又はスクリーニングに依存する。適した単離技術は、薬剤選択、ＦＡＣＳ、コンプリメント（complement）を使用した溶解選択、細胞クローニング、フルオルイメージャーによるスキャニング、「残存」タンパク質の発現、物理的に単離できるように、蛍光若しくはタグを付与することが可能な、細胞表面タンパク質又はその他の分子の誘導された発現；非蛍光分子からの蛍光分子へと変化させる酵素の発現；バックグラウンドである無成長若しくは遅成長に対する過成長；細胞死、及び、ＤＮＡ又はその他の細胞活力を示す染料の単離；蛍光特性の変化等を含むがこれらに限定されない。好まし単離技術は、検出可能な遺伝子発現に基づく薬剤選択及びＦＡＣＳであり、両方を同時に利用することが好ましい。
【０１３６】
タンパク質間相互作用を伴う細胞が検出され及び単離されると、一般的には試験タンパク質（同一性が確認されない場合はさらにベイトタンパク質も）を同定することが望ましい。好ましい実施態様においては、試験タンパク質核酸及び／又は試験タンパク質は陽性細胞（positive cell）から単離されている。これは、多数の方法によって実施することができる。好ましい実施態様においては、特異な試験配列を「レスキュー」するために、上に定義する通り、ベクターに共通しているＤＮＡ領域又はレスキュー配列などのライブラリーの特定要素に相補的なプライマーが使用される。また、レスキュー配列を使用して試験タンパク質を単離する。このように、例えば、試験タンパク質を取り出すため、免疫沈降又はアフィニティーカラムを使用して、エピトープタグ又は精製配列を含むレスキュー配列を使用することができる。いくつかの場合においては、以下に概要を記載する通り、両者間に十分に強力な結合相互作用があれば、ベイトタンパク質を引き出すことができる。また、試験タンパク質は、マススペクトル法の使用により検出できる。
【０１３７】
レスキューされると、試験タンパク質及び／又は試験核酸が決定される。その後、この情報を様々な方法により使用できる。
【０１３８】
好ましい実施態様において、試験タンパク質はその効果を確かめるため、再合成され標的細胞に再導入される。これは、レトロウイルスを使用して、又は代わりに標的細胞への極めて高い取込みを可能とするＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質及びアナログ並びに関連タンパク質に対する融合を使用して、実施することができる。例として、Fawell et al., PNAS USA 91 :664 (1994); Frankel et al., Cell 55:1189 (1988); Savion et al., J. Biol. Chem. 256:1149 (1981); Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444 (1994); and Baldin et al., EMBO J. 9:1511 (1990)を参照のこと。これら文献はすべてその参照により本明細書中に援用する。
【０１３９】
好ましい実施態様において、試験タンパク質又はそれをコードする核酸のいずれかが、その他の標的分子を同定するため使用される。つまり、最初に同定された試験タンパク質は、その後ベイトタンパク質として使用される。また、標識化されたタンパク質を合成によって調製し、それを、タンパク質に結合するｃＤＮＡをスクリーニングするために、バクテリオファージに発現するｃＤＮＡライブラリーに使用することができる。
【０１４０】
同定された経路タンパク質は、その後、２００５年１０月２０日提出の米国特許出願番号６０／７２８，８４０並びに、本発明のいずれの方法によっても使用することができる。
【０１４１】
哺乳類のツーハイブリッドシステム
酵母のツーハイブリッドシステムに加えて、いくつかの哺乳類システムが同定された。米国特許番号６，７８７，３２１；６，４７９，２８９；６，２５１，６７５；６，１１４，１１１及び６，３１６，２２３を参照のこと。これら文献はすべてその参照により本明細書中に援用する。
【０１４２】
ファージディスプレイシステム
ツーハイブリッドシステムに加えて、大規模なスクリーニングにおいて有用な良く知られる方法は、ファージディスプレイ方法である。この方法においては、フィラメント状のバクテリオファージ粒子が、バクテリオファージのカプシド又は外殻タンパク質に融合された所望のペプチド又はタンパク質を発現するために、組換えＤＮＡ技術によって作製される。所望のペプチド又はタンパク質の全ライブラリーが発現でき、また、ベイトタンパク質(例えば経路タンパク質又は金属タンパク質)が、ベイトタンパク質に結合可能なペプチド又はタンパク質を同定するためのライブラリーのスクリーニングに使用できる。例として、米国特許番号５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５７１，６９８及び５，８３７，５００を参照のこと。これら文献はすべて、その参照により本明細書中にファージディスプレイ方法及び構成についてその全体を明示的に援用する。
【０１４３】
様々なその他のタンパク質間相互作用アッセイ
タンパク質間相互作用についての従来の方法は、化学的架橋、免疫共沈降並びに共分画及び共精製が含まれるが、それらに限定されない生化学的技術を使用して実施される。
【０１４４】
阻害方法
さらなる実施態様においては、本発明は、金属タンパク質に結合する金属が減少するように、メタル化経路タンパク質と阻害剤とを接触させることを含む、標的金属タンパク質のメタル化に関するメタル化経路タンパク質の方法を提供する。この場合においては、「減少」とは、一般的には、１つのタンパク質あたりの金属結合量の少なくとも５〜２０〜２５％の減少であり、いくつかの実施態様においては５０〜７５％以上であることが有用であり、さらに、金属の欠失が９５〜９８〜１００％であることが同様に有用である。一般的に、金属の欠失は、金属タンパク質に応じて測定された生理学的活性の欠失と相関し、活性における同様の減少が有用となる。
【０１４５】
さらなる実施態様においては、本発明は、アポタンパク質の形態に結合する金属が減少するように、メタル化経路タンパク質と阻害剤とを接触させることを含む、金属タンパク質関連障害の治療方法を提供する。本文においては、「金属タンパク質関連障害」とは、金属タンパク質に直接的又は間接的に関係する障害をいう。
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月10日(2008.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞に候補薬剤を添加するステップであって、候補薬剤が有機化合物を含むステップ及び
ｂ）標的タンパク質のメタル化の状態を決定するステップ、
を含む前記標的タンパク質のメタル化における変化をスクリーニングする方法。
【請求項２】
メタル化の状態が、タンパク質の生理活性アッセイにより決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質を精製し、そのタンパク質に関連する金属イオンの存在の有無を決定して、メタル化状態を決定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的タンパク質が細胞表現型に関係し、メタル化の状態が前記細胞表現型を評価することにより決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞表現型が、蛍光活性化細胞分離法（ＦＡＣＳ）を用いて評価されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
候補薬剤のライブラリーを複数の細胞に添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
候補薬剤が標識化されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ａ）候補薬剤のライブラリーと標的経路タンパク質とを接触させるステップであって、候補薬剤が有機化合物を含むステップ、及び
ｂ）前記タンパク質の活性に対する前記薬剤の影響を決定するステップ、
を含む標的メタル化経路タンパク質のモジュレーションをスクリーニングする方法。
【請求項９】
金属タンパク質への金属結合が減少するように、メタル化経路タンパク質と阻害剤とを接触させることを含む、標的金属タンパク質のメタル化に関連するメタル化経路タンパク質を阻害する方法。
【請求項１０】
メタル化経路タンパク質が、メタロシャペロンタンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
メタル化経路タンパク質が、金属トランスポータータンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
メタル化経路タンパク質が、金属制御タンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
金属タンパク質への金属結合が減少するように、メタル化経路タンパク質と阻害剤とを接触させることを含む、金属タンパク質関連障害の治療方法。
【請求項１４】
メタル化経路タンパク質が、メタロシャペロンタンパク質であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
メタル化経路タンパク質が、金属トランスポータータンパク質であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
メタル化経路タンパク質が、金属制御タンパク質であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
2009512454.tif 000002
2009512454.tif 000003
2009512454.tif 000004
2009512454.tif 000005
2009512454.tif 000006
2009512454.tif 000007