(57)【要約】本発明は、宿主微生物においてモジュラー型置換ゲノムを構成するための方法及び組成物を提供する。このような構成の後、宿主生物のゲノムを不活性化又は除去することで、置換ゲノムにより宿主細胞機能を完全に制御することが可能となる。モジュラー型置換ゲノムは、１つ以上の天然の生物又は合成ポリヌクレオチド或いはこれらの両方の組み合わせに由来する核酸断片又はセグメントの集合体を含む。置換ゲノムを構成するセグメントのこのような集合体又は組は、所定の培養条件において最小限の生命機能を実施するための実質的に完全な組の遺伝子及び調節因子を含む。本発明は、容易な置換、欠失及び／又は追加に適したモジュールを有するモジュール型ゲノムを提供する。
2009524406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主ゲノムを有する宿主生物の置換ゲノムを構成する方法であって、
（ａ）各セグメントが１つ以上の組換え要素と結合している、置換ゲノムをカバーする複数のセグメントを提供する手順；
（ｂ）１つ以上のセグメントを使用して前記宿主生物を形質転換又は共形質転換して、前駆体ゲノムを形成する手順であって、前記前駆体ゲノムは、前記１つ以上のセグメントの組換え体、又は先の前駆体ゲノム及び前記１つ以上のセグメントの組換え体であって、このような組換え体は、前記１つ以上のセグメントと結合している組換え要素の組換えにより形成される、手順；
（ｃ）前記置換ゲノムが形成されるまで所定の順序のセグメントを使用して手順（ｂ）を反復する手順；並びに
（ｄ）前記宿主ゲノムを除去する手順、
を含む、方法。
【請求項２】
前記形質転換又は共形質転換の手順が、前記置換ゲノムが形成されるように、前記複数のセグメントを使用して前記宿主生物を共形質転換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の前記セグメントの各末端が前記複数の別の前記セグメントの末端と重複する固有の配列領域を有し、前記置換ゲノムの形成時に前記所定の順序を確立する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記形質転換又は共形質転換の手順が、セグメントを使用して前記宿主生物を形質転換して、前駆体ゲノムを形成することを含み、前記前駆体ゲノムが、前記セグメント、又は前記セグメント及び先の前駆体ゲノムの組換え体であり、このような組換え体が前記セグメントと結合した前記組換え要素に作用する少なくとも１種のリコンビナーゼにより形成され、前記反復の手順が、前記複数の前記セグメントの前記所定の順序をそれぞれ使用して前記手順（ｂ）を反復することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記セグメントの１つが、前記宿主生物において作動可能な複製起点を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記セグメントがそれぞれ、セグメント及び先の前駆体ゲノムの組換え体を含む前記宿主生物の同定を可能にする選択マーカーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記形質転換の手順が更に、前記選択マーカーにより前記組換え体を含むものとして同定される前記宿主生物を選択することも含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記セグメントがドナー生物由来のゲノムの断片である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主生物が原核生物であり、前記ドナー生物が原核生物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主生物及び前記ドナー生物がそれぞれ細菌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記セグメントがそれぞれ、別々の大きな挿入ベクターにより担持される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主ゲノムを除去する前記手順が、細胞分配中に前記宿主ゲノムを喪失する前記宿主生物を選択することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記所定の順序の前記セグメントがそれぞれ、その直前のセグメントと同じ種類の少なくとも１つの第１の組換え要素、並びにその直後のセグメントと同じ種類の少なくとも１つの第２の組換え体要素を含み、このような第１及び第２の組換え要素がそれぞれ異なる種類である、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え要素の少なくとも１つがｌｏｘＰ部位であり、前記リコンビナーゼの少なくとも１つがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記セグメントがそれぞれ、第１の種類の組換え要素及び第２の種類の組換え要素を含む１対の組換え要素と結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記セグメントがそれぞれ、セグメント及び先の前駆体ゲノムの組換え体を含む前記宿主生物の同定を可能にする選択マーカーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記形質転換の手順が、前記選択マーカーにより、前記組換え体を含むものとして同定される前記宿主生物を選択することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記形質転換の手順によって、同種の１対の組換え要素を含む前駆体ゲノムが産生され、前記形質転換の手順が更に、同種の前記１対の組換え要素の１つを無能にすることも含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の種類の組換え要素及び前記第２の種類の組換え要素がそれぞれｌｏｘＰ部位であり、前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記セグメントがそれぞれ、複数の異なる種類の組換え要素から選択される少なくとも１つの組換え要素と結合し、前記所定の順序の連続するセグメントがそれぞれ、前記複数から選択される異なる種類の組換え要素と結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記セグメントがそれぞれ、セグメント及び前駆体ゲノムの組換え体を含む前記宿主生物の同定を可能にする選択マーカーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記形質転換の手順が更に、前記選択マーカーにより、前記組換え体を含むものとして同定される前記宿主生物を選択することも含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記形質転換の手順によって、前記同種の１対の組換え要素を含む前駆体ゲノムが産生され、前記形質転換の手順が更に、異なる種類の組換え要素と反応するように前記同種の前記１対の組換え要素の１つを修飾することも含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主生物が原核生物であり、前記セグメントがそれぞれ別々の大きな挿入ベクターにより担持される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換え要素の少なくとも１つがｌｏｘＰ組換え要素であり、前記リコンビナーゼの少なくとも１つがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
宿主生物において順序付けられた複数のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ環を形成する方法であって、
（ａ）各ポリヌクレオチドが１つ以上の組換え要素と結合している、順序付けられた複数のポリヌクレオチドを提供する手順；
（ｂ）１つ以上のポリヌクレオチドを使用して前記宿主生物を形質転換又は共形質転換して、前駆体ＤＮＡ環を形成する手順であって、前記前駆体ＤＮＡ環は、前記１つ以上のポリヌクレオチドの組換え体、又は先の前駆体ＤＮＡ環及び前記１つ以上のポリヌクレオチドの組換え体であって、このような組換え体が前記１つ以上のポリヌクレオチドと結合している前記組換え要素の組換えにより形成される、手順；並びに
（ｃ）ＤＮＡ環が形成されるまで前記順序付けられた複数のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドを使用して手順（ｂ）を反復する、手順
を含む、方法。
【請求項２７】
前記形質転換又は共形質転換の手順が、前記ＤＮＡ環が形成されるように前記複数の前記ポリヌクレオチドを使用して前記宿主生物を共形質転換することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドの順序が前記順序付けられた複数と対応する前記ＤＮＡ環において確立されるように、前記複数の前記ポリヌクレオチドの各末端が、前記複数の別の前記ポリヌクレオチドの末端と重複する固有の配列領域を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記形質転換又は共形質転換の手順が、ポリヌクレオチドを使用して前記宿主生物を形質転換して、前駆体ＤＮＡ環を形成する手順を含み、前記前駆体ＤＮＡ環が該前記ポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド及び先の前駆体ＤＮＡ環の組換え体であって、このような組換え体が前記ポリヌクレオチドと結合する前記組換え要素に作用する少なくとも１つのリコンビナーゼにより形成され、そして前記反復の手順が、前記ＤＮＡ環が形成されるまで前記順序付けられた複数の前記ポリヌクレオチドをそれぞれ使用して手順（ｂ）を反復することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記順序付けられた複数の前記ポリヌクレオチドの１つが、前記宿主生物において作動可能な複製起点を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドがそれぞれ、ポリヌクレオチド及び先の前駆体ＤＮＡ環の組換え体を含む前記宿主生物の同定を可能にする選択マーカーを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記形質転換の手順が更に、前記選択マーカーにより、前記組換え体を含むものとして同定される前記宿主生物を選択することも含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主生物が原核細胞であり、前記ポリヌクレオチドがそれぞれ、別々の大きな挿入ベクターにより担持される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記宿主生物が細菌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記順序付けられた複数の前記ポリヌクレオチドの２つ以上が３００キロ塩基を超える長さを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記セグメントがそれぞれ、複数の異なる種類の組換え要素から選択される少なくとも１つの組換え要素と結合し、前記所定の順序の連続するセグメントがそれぞれ、前記複数から選択される異なる種類の組換え要素と結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記セグメントがそれぞれ、セグメント及び先の前駆体ＤＮＡ環の組換え体を含む前記宿主生物の同定を可能にする選択マーカーを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記形質転換の手順が更に、前記選択マーカーにより前記組換え体を含むものとして同定される前記宿主生物を選択することも含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記形質転換の手順によって同種の１対の組換え要素を含む前駆体ＤＮＡ環が産生され、前記形質転換の手順が更に、異なる種類の組換え要素と反応するように前記同種の前記１対の組換え要素の１つを修飾することも含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記宿主生物が原核生物であり、前記セグメントがそれぞれ、別々の大きな挿入ベクターにより担持される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記組換え要素の少なくとも１つがｌｏｘＰ組換え要素であり、前記リコンビナーゼの少なくとも１つがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
モジュラー型細菌ゲノムを含む組成物であって、前記モジュラー型細菌ゲノムは、以下：
（ａ）各ゲノム断片が１つ以上の組換え要素と結合している、細菌ゲノムをカバーする複数のゲノム断片を提供する手順；
（ｂ）ゲノム断片を使用して宿主ゲノムを有する宿主細胞を形質転換して前駆体ゲノムを形成する手順であって、前記前駆体ゲノムは、前記ゲノム断片、又は前記ゲノム断片及び先の前駆体ゲノムの組換え体であり、このような組換え体が、前記ゲノム断片と結合する前記組換え要素に作用する少なくとも１つのリコンビナーゼにより形成される、手順；
（ｃ）前記モジュラー型ゲノムが形成されるまで所定の順序のゲノム断片をそれぞれ使用して手順（ｂ）を反復する手順；並びに
（ｄ）前記宿主ゲノムを除去する手順、
により産生される、組成物。
【請求項４３】
前記ゲノム断片の１つが、前記宿主細胞において作動可能な複製起点を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ゲノム断片がそれぞれ、ゲノム断片及び先の前駆体ゲノムの組換え体を含む前記宿主細胞の同定を可能にする選択マーカーを含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記形質転換の手順が更に、前記選択マーカーにより、前記組換え体を含むものとして同定される前記宿主細胞を選択することも含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ゲノム断片がそれぞれ、別々の大きな挿入ベクターにより担持される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ゲノム断片がそれぞれ、複数の異なる種類の組換え要素から選択される少なくとも１つの組換え要素と結合し、前記所定の順序の一連のゲノム断片がそれぞれ、前記複数から選択される異なる種類の組換え要素と結合する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ゲノム断片がそれぞれ、ゲノム断片及び先の前駆体ゲノムの組換え体を含む前記宿主生物の同定を可能にする選択マーカーを含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記形質転換の手順が更に、前記選択マーカーにより、前記組換え体を含むものとして同定される前記宿主生物を選択することも含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記形質転換の手順によって、前記同種の１対の組換え要素を含む前駆体ゲノムを産生し、前記形質転換の手順が更に、異なる種類の組換え要素と反応するように前記同種の前記１対の組換え要素の１つを修飾することも含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記宿主生物が原核生物であり、前記ゲノム断片がそれぞれ、別々の大きな挿入ベクターにより担持される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記所定の順序の前記ゲノム断片の少なくとも２つ以上が３００キロ塩基を超える長さを有する、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記組換え要素がそれぞれｌｏｘＰ部位であり、前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
モジュラー型原核ゲノムを産生するためのキットであって、
順序付けられた複数の大きな挿入ベクターを含み、大きな挿入ベクターがそれぞれ、１つ以上の組換え要素と結合し、挿入物を組み込むことが可能であり、且つ前記順序付けられた複数の直前の大きな挿入ベクターに共通する少なくとも１つの第１の組換え要素並びに前記順序付けられた複数の直後の大きな挿入ベクターに共通する少なくとも１つの第２の組換え要素を含有し、このような第１及び第２の組換え要素がそれぞれ異なる、キット。
【請求項５５】
少なくとも１つのリコンビナーゼも更に含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記組換え要素がそれぞれｌｏｘＰ部位であり、前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記大きな挿入ベクターがそれぞれＢＡＣ、コスミド及びプラスミドからなる群から選択される、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
モジュラー型原核ゲノムを産生するキットであって、
順序付けられた複数の大きな挿入ベクターを含み、大きな挿入ベクターがそれぞれ、１つ以上の組換え要素と結合し、挿入物を組み込むことができ、前記順序付けられた複数の連続する大きな挿入ベクターがそれぞれ、複数の異なる種類の組換え要素から選択される少なくとも１つの組換え要素を有し、前記順序付けられた複数の連続する大きな挿入ベクターがそれぞれ、前記複数から選択される異なる種類の組換え要素と結合する、キット。
【請求項５９】
少なくとも１つのリコンビナーゼも更に含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
前記組換え要素の少なくとも１つがｌｏｘＰ部位であり、前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記大きな挿入ベクターがそれぞれＢＡＣ、コスミド及びプラスミドからなる群から選択される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
順序付けられた複数のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ環を含む宿主生物であって、前記ＤＮＡ環が、
（ａ）各ポリヌクレオチドが１つ以上の組換え要素と結合する、順序付けられた複数のポリヌクレオチドを提供する手順；
（ｂ）１つ以上のポリヌクレオチドを使用して前記宿主生物を形質転換又は共形質転換して前駆体ＤＮＡ環を形成する手順であって、前駆ＤＮＡ環は前記１つ以上のポリヌクレオチドの組換え体又は先の前駆体ＤＮＡ環及び前記１つ以上のポリヌクレオチドの組換え体であって、このような組換え体が前記１つ以上のポリヌクレオチドと結合する前記組換え要素の組換えにより形成される、手順；並びに
（ｃ）前記ＤＮＡ環が形成されるまで前記順序付けられた複数のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドを使用して手順（ｂ）を反復する手順、
により産生される、宿主細胞。
【請求項６３】
前記形質転換又は共形質転換の手順が、前記ＤＮＡ環が形成されるように前記複数の前記ポリヌクレオチドを使用して前記宿主生物を共形質転換することを含む、請求項６２に記載宿主生物。
【請求項６４】
前記複数の前記ポリヌクレオチドの各末端が、前記複数の別の前記ポリヌクレオチドの末端と重複する固有の配列領域を有し、前記ポリヌクレオチドの順序が前記順序付けられた複数に対応する前記ＤＮＡ環において確立されるようにする、請求項６３に記載の宿主生物。
【請求項６５】
前記形質転換又は共形質転換の手順が、ポリヌクレオチドを使用して前記宿主生物を形質転換して、前駆体ＤＮＡ環を形成することを含み、前記前駆体ＤＮＡ環が前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド及び先の前駆体ＤＮＡ環の組換え体であって、このような組換え体が前記ポリヌクレオチドと結合する前記組換え要素に作用する少なくとも１つのリコンビナーゼにより形成され、前記反復の手順が、前記ＤＮＡ環が形成されるまで前記順序付けられた複数のポリヌクレオチドをそれぞれ使用して前記手順（ｂ）を反復することを含む、請求項６２に記載の宿主生物。
【請求項６６】
前記順序付けられた複数の前記ポリヌクレオチドの１つが、前記宿主生物において作動可能な複製起点を含む、請求項６５に記載の宿主生物。
【請求項６７】
前記ポリヌクレオチドがそれぞれ、ポリヌクレオチド及び先の前駆体ＤＮＡ環の組換え体を含む前記宿主生物の同定を可能にする選択マーカーを含む、請求項６６に記載の宿主生物。
【請求項６８】
前記形質転換の手順が更に、前記選択マーカーにより前記組換え体を含むものとして同定される前記宿主生物を選択することも含む、請求項６７に記載の宿主生物。
【請求項６９】
前記宿主生物が原核細胞であり、前記ポリヌクレオチドがそれぞれ、別々の大きな挿入ベクターにより担持される、請求項６８に記載の宿主生物。
【請求項７０】
前記宿主生物が細菌である、請求項６９に記載の宿主生物。
【請求項７１】
前記順序付けられた複数の前記ポリヌクレオチドの２つ以上が３００キロ塩基を超える長さを有する、請求項７０に記載の宿主生物。
【請求項７２】
前記セグメントがそれぞれ、複数の異なる種類の組換え要素から選択される少なくとも１つの組換え要素と結合し、前記所定の順序の連続するセグメントがそれぞれ、前記複数から選択される異なる種類の組換え要素と結合する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記セグメントがそれぞれ、セグメント及び先の前駆体ＤＮＡ環の組換え体を含む前記宿主生物の同定を可能にする選択マーカーを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記形質転換の手順が更に、前記選択マーカーにより、前記組換え体を含むものとして同定される前記宿主生物を選択することも含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記形質転換の手順が、前記同種の１対の組換え要素を含む前駆体ＤＮＡ環を産生し、前記形質転換の手順が更に、異なる種類の組換え要素と反応するように前記同種の前記１対の組換え要素の１つを修飾することも含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記宿主生物が原核生物であり、前記セグメントがそれぞれ、別々の大きな挿入ベクターにより担持される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記組換え要素の少なくとも１つがｌｏｘＰ組換え要素であり、前記リコンビナーゼの少なくとも１つがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に、微生物を遺伝的に修飾するための方法及び組成物に関し、より具体的には、所定の組の遺伝子及び／又は遺伝的要素を含む遺伝領域を選択的に修飾するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
メタゲノミクス、並びにＤＮＡの大きな断片を容易に産生及び操作するための技法の開発では、多くの重要な産業及び医学用途を対象とした微生物の操作に関心が高まっている（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。メタゲノミクスとは、微生物の天然の環境直接におけるこれらの群生の研究にゲノミクスの技法を応用することであり、個々の種を分離し、実験室で培養する必要性がなくなる（例えば、非特許文献５）。このような研究によって、新規の生化学経路及び生体触媒をコードする遺伝子が数多く明らかにされており、これらは、産業プロセス、例えば耐火性石油鉱床からの燃料の抽出、バルク化学品及び特殊化学品への農業原料の転換、再生可能な資源からの燃料の生成、治療的に有用な産物の発見及び開発等において重要な役割を果たす可能性がある（例えば、非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。具体的に、メタゲノミクスが代謝操作に重要な原料源を提供する、即ち、組換えＤＮＡ技術を使用した細胞の酵素、輸送及び調節機能の操作による細胞活性の改良を可能にすることが期待されている（非特許文献９）。
【０００３】
上記の開発と並行して、操作の応用だけでなく、自由生活性微生物の基本的生命プロセスの解明においても遺伝的に十分に定義され、ある意味最小限となる宿主生物を設計することも非常に注目されている（例えば、非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４等）。このような研究の主な手法は、関連する種又は菌株のゲノムを比較して、共通する遺伝子を同定した後、共有しない遺伝子又は要素を体系的に欠失するか、又は無作為に遺伝子を破壊し、生物の生存能力に対する影響を測定する手法であった（例えば、非特許文献１５）。細菌のゲノムの減少は、タンパク質産生に幾つかの利点をもたらすようであるが、このような生物の基本的なゲノム構造は、進化によりもたらされる遺伝子、オペロン及び遺伝子群の本質的に不規則な集合体から変化しておらず、全ての生命機能に関与する遺伝的要素がゲノム全体に拡散している（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。このような順序の欠如が、同じ代謝経路に含まれる可能性がある同義遺伝子及び／又は調節因子の操作を更に難しくしている。
【０００４】
上記の点から、共通する領域における機能的に関連する遺伝子及び遺伝的要素の配置が可能であり、且つこのような領域の置換を容易にするモジュラー型ゲノム構造を有する宿主生物を、代謝操作に利用できるようにし、それによって大きな断片のポリヌクレオチド合成及び操作における最新の進歩を活用することが有用であると思われる。
【非特許文献１】Ｌｏｒｅｎｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ３：５１０−５１６  （２００５）
【非特許文献２】Ｂｒａｎｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ，  ６：７−２８  （２００４）
【非特許文献３】Ｋｏｄｕｍａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １０１：１５５７３−１５５７８  （２００４）
【非特許文献４】Ｔｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３２：１０５０−１０５４  （２００４）
【非特許文献５】Ｒｅｉｓｅｎｆｅｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ３８：５２５−５５２  （２００４）
【非特許文献６】Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  Ｒｅｖ．，  ６８：６６９−６８５  （２００４）
【非特許文献７】Ｖａｎ  Ｈａｍｍｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ６７：５０３−５４９  （２００３）
【非特許文献８】Ａｉｔｋｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３１：２９１−２９４  （２００４）
【非特許文献９】Ｂａｉｌｅｙ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５２：１６６８−１６７４  （１９９１）
【非特許文献１０】Ｋｏｏｎｉｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １：９９−１１６  （２０００）
【非特許文献１１】Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２：６４０−６４７  （２００２）
【非特許文献１２】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １００：４６７８−４６８３  （２００３）
【非特許文献１３】Ｇｌａｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １０３：４２５−４３０  （２００６）
【非特許文献１４】Ｐｏｓｆａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１２：１０４４−１０４６  （２００６）
【非特許文献１５】Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８６：２１６５  （１９９９）
【非特許文献１６】Ｗｏｌｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １１：３５６−３７２  （２００１）
【非特許文献１７】Ｂｅｎｔｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ３８：７７１−７９２  （２００４）
【非特許文献１８】Ｏｃｈｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６：１０９−１１３  （２００３）
【非特許文献１９】Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，８：５６４−５７１（２００５）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、大きな核酸構築物、例えば、宿主微生物のモジュラー型置換ゲノムを構成するための方法及び組成物を提供する。このような構成の後、宿主生物のゲノムを不活性化又は除去することで、置換ゲノムにより宿主細胞機能を完全に制御することが可能となる。モジュラー型置換ゲノムは、１つ以上の天然の生物又は合成ポリヌクレオチド或いはこれらの両方の組み合わせに由来する核酸断片又はセグメントの集合体を含む。置換ゲノムを構成するセグメントのこのような集合体又は組は、所定の培養条件において最小限の生命機能を実施するための実質的に完全な組の遺伝子及び調節因子を含む。このような遺伝子及び／又は調節因子の組に関する「実質的に完全な」とは、１つ以上の少数の遺伝子及び／又は調節因子がプラスミド等のエピソーム要素によりもたらされ、置換ゲノムから分離する場合があることを意味する。一態様において、置換ゲノムの遺伝子及び調節因子は、宿主ゲノム対応物に実質的に適合可能となるように選択される。通常このような適合は、宿主ゲノムと置換ゲノムの対を選択することによって達成され、これらの配列は十分にオルソログなものであり、（ｉ）実質的に大部分の置換遺伝子が、宿主生物の成長又は複製を干渉せず、さもなければ宿主生物に対して毒性を有さない遺伝子産物をコードするか、又は代謝物を生じ、（ｉｉ）干渉する又は毒性を有する遺伝子産物又は代謝産物を生じる幾つかのサブセットの置換遺伝子を誘導制御下に配置することができる。
【０００６】
一態様において、置換ゲノムの構成要素の断片、又はセグメントは、大きな挿入ベクターにおいて別々に調製され、この場合、それぞれの異なる断片は、１つ以上の固有の組換え要素と結合する。このようなセグメントを含む複数のベクターは、置換ゲノムの完全な配列を集合的に提供し、宿主生物の形質転換の反復サイクルにより所定の順序で段階的に構成される。一連の各サイクルにおいては、完全な置換ゲノムが形成されるまで、追加のセグメントを含む前駆体置換ゲノムが形成される。或いは、このような複数のセグメントは、適切な宿主の共形質転換の１つ以上のサイクルにより並行又は連続して構成される場合があり、この宿主は、非交差反応する部位特異的組換え要素を有する多様なセグメントを提供するか、二本鎖切断を結合するための頑丈なＤＮＡ修復系の存在（例えば、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓの場合）の何れかによって多様なセグメントの自己集合を可能となる。完全な置換ゲノムが形成されると、宿主ゲノムは、細胞分配中に不活性化、切除又は欠損により除去又は操作不能となり、宿主に有害な何れかの遺伝子が、誘導条件を提供することによって「オン」となり、それにより置換ゲノムを使用して自由生活性合成細胞を形成する。
【０００７】
別の態様において、置換ゲノムは、宿主ゲノムの構成及び除去後、置換ゲノムのセグメントが選択的に修飾セグメントと置き換えられる場合もあれば、又はその最初の構成で残った組換え要素を使用して新しいセグメントを挿入することにより追加される場合もあるという点で、モジュラー型である。
【０００８】
別の態様において、本発明は、以下の手順を含む宿主生物の組換えゲノムを構成する方法を提供する：（ａ）各セグメントが１つ以上の組換え要素と結合する、置換ゲノムをカバーする複数のセグメントを提供する；（ｂ）１つ以上のセグメントを使用して宿主生物を形質転換又は共形質転換して、１つ以上のセグメントの組換え体、又は先の前駆体ゲノム及び１つ以上のセグメントの組換え体であって、このような組換え体が１つ以上のセグメントと結合する組換え要素の組換えにより形成される、前駆体ゲノムを形成する；（ｃ）置換ゲノムが形成されるまで所定の順序のセグメントを使用して手順（ｂ）を反復する；並びに（ｄ）宿主ゲノムを除去する。一実施形態において、形質転換又は共形質転換の手順は、置換ゲノムが１つの手順で形成されるように複数のセグメントを使用して宿主生物を共形質転換することを含む。別の実施形態においては、所定の順序が置換ゲノムの形成時に確立されるように、複数の各セグメントの各末端は、複数の別のセグメントの末端と重複する固有の配列領域を有する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、以下の手順を含む宿主生物の置換ゲノムを構成する方法を提供する：（ａ）各セグメントが１つ以上の組換え要素と結合する、置換ゲノムをカバーする複数のセグメントを提供する；（ｂ）１つ以上のセグメントを使用して宿主生物を形質転換して、セグメント、又はセグメント及び先の前駆体ゲノムの組換え体であって、このような組換え体がセグメントと結合する組換え要素に作用する少なくとも１つのリコンビナーゼにより形成される、前駆体ゲノムを形成する；（ｃ）置換ゲノムが形成されるまで所定の順序のセグメントをそれぞれ使用して手順（ｂ）を反復する；並びに（ｄ）宿主ゲノムを除去する。一実施形態において、各セグメントは、複数の異なる種類の組換え要素から選択される少なくとも１つの組換え要素と結合し、所定の順序の連続するセグメントがそれぞれ複数から選択される異なる種類の組換え要素と結合する。具体的に、一連の組換え要素は、交差反応しない突然変異体ｌｏｘＰ部位である場合がある。このような構成プロセスの１つの手法において、形質転換の手順は、同種の１対の組換え要素を含む前駆体ゲノムを産生する場合があり、この場合、一実施形態において、形質転換の手順は更に、異なる種類の組換え要素、例えば、次のセグメントの組換え要素と反応するように同種の前記組換え要素の対の１つを修飾することを含む場合もある。
【００１０】
別の態様において、本発明は、連続する部位特異的組換えにより作製された核酸構築物、並びにこれらが構成及び複製される宿主生物を提供する。
【００１１】
更に別の態様において、本発明は、宿主生物の構成要素のポリヌクレオチド、又はセグメントから核酸構築物を構成するためのキットであって、順序付けられた複数の大きな挿入ベクターを含むキットを提供し、これらの大きな挿入ベクターはそれぞれ、１つ以上の組換え要素と結合し、挿入物を組み込むことが可能であり、且つ順序付けられた複数の直前の大きな挿入ベクターに共通する少なくとも１つの第１の組換え要素並びに順序付けられた複数の直後の大きな挿入ベクターに共通する少なくとも１つの第２の組換え体要素を含有し、この場合、このような第１及び第２の組換え要素はそれぞれ異なる。別の実施形態において、本発明のキットは、順序付けられた複数の大きな挿入ベクターを含み、これらの大きな挿入ベクターはそれぞれ、１つ以上の組換え要素と結合し、挿入物を組み込むことができ、順序付けられた複数の連続した大きな挿入ベクターは、それぞれ複数の異なる種類の組換え要素から選択される少なくとも１つの組換え要素を有し、この場合、順序付けられた複数の連続する大きな挿入ベクターはそれぞれ、複数から選択される異なる種類の組換え要素と結合する。このようなキットは更に、少なくとも１つのリコンビナーゼ、緩衝液、共因子等を含めた構成プロセスの組換え反応を実施するための試料も含む。
【００１２】
本発明は、例えば５〜１０ｋｂの数千塩基対から例えば５０〜１００ｋｂの数万塩基対までの大きさのモジュールを有し、容易な置換、欠失及び／又は追加に適しているモジュラー型ゲノムを提供することにより本技術の欠点に好都合に対処する。このようなモジュールは、合成ポリヌクレオチドである場合があり、又、１）遺伝子量を制御する（例えば、多段階の代謝経路又は多くの相互作用経路若しくは分岐経路の遺伝子全てが、単一モジュール上に含有される場合がある）、２）阻害因子又はさもなければ所望の代謝／合成プロセスから宿主細胞を転用する望ましくない競合酵素をコードする遺伝子を除外する、３）タンパク質産生を最大限又は最小限にするためにコドン利用頻度を修飾する、４）遺伝子発現を調節するためにプロモーター、エンハンサー、リプレッサー、アクチベーター、ターミネーター等を含めた調節因子を修飾する、５）非天然アミノ酸由来のコドンを組み込み、それによって全く新しいタンパク質機能を可能にする、６）基質、中間体及び代謝経路の産物並びに同様の対象のフラックスを最適にするために酵素及び輸送活性の平衡を保つように設計される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明の実施では、他に明記されない限り、当該技術分野の範囲に含まれる有機化学、分子生物学（組換え技術を含める）、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技法及び説明を使用する場合がある。このような従来の技法には、ベクター構築、微生物宿主形質転換、遺伝子マーカーの選択及び適用、大きなポリヌクレオチド断片の操作技術、合成ポリヌクレオチドの調製、組換え系の適用、核酸配列決定及び分析等が含まれるが、これらに限定されない。適切な技法の具体的な説明は、本明細書の以下の実施例を参考とすることができる。しかし、他の等しい従来の手法も、当然ながら使用することができる。このような従来の技法及び説明については、全てがあらゆる目的のために全体が参考として本明細書により援用される、以下の標準的な実験マニュアルに記載されている：Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．  Ｉ−ＩＶ），  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ａｌｌ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），  Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．  （１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｇａｉｔ，  “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  １９８４，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ  （２０００），  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄＥｄ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．，  Ｃａｓａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｅ．  Ｃｏｌｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  ２００３）。
【００１４】
一態様において、本発明は、所定の順序のポリヌクレオチドセグメントにおいて構成することにより微生物ゲノムを宿主細胞に構築する方法を提供する。セグメントを１つ以上のドナー生物から合成又は得ることができる。一態様において、このような構成は、組換え系を使用することにより実施することができ、この系は、ポリヌクレオチド対を結合させ、又は互いに連結し、所定の構造の単一の大きなポリヌクレオチドを形成することを可能にする。一般的に、このような対のメンバーは、それぞれ二重鎖の複製可能なポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ等であり、或いはこのような複製可能なポリヌクレオチドの部分を含む。組換え系は、１つ以上のリコンビナーゼ及び１つ以上の組換え要素、或いは核酸配列を含み、この核酸配列は、リコンビナーゼにより具体的に認識され、１対のポリヌクレオチド間の結合部位として作用する。一般的に、組換え系を使用する反応は、宿主細胞内で生じる。幾つかの場合、組換え系を使用する反応は、多様な産物を生じ、この産物から、所望の産物を、選択マーカー、サイズ分離等により選択する。本発明によれば、一連の反応それぞれにおいて、結合された１対のポリヌクレオチドの１つのメンバーが前述の反応の産物であるように配列の組換え反応を実施する。特定の実施形態において、得られた産物は、「前駆体置換ゲノム」と呼ばれる。従って、このような配列の反応により、置換ゲノムが完了されるまで、置換ゲノムを構成するポリヌクレオチドセグメントをセグメント毎に構成する。組換え系を、様々なセグメントがそれぞれ１つ以上の固有の組換え要素と結合し、それにより以前に構成されたセグメントを干渉することなく所定の順序に構成することが可能になるように選択する。好ましくは、同じ組換え系を構成後に使用して、完全な置換ゲノムのセグメントを選択的に置換し、これらのセグメントから欠失し、これらのセグメントに追加し、又はさもなければこれらのセグメントを変更することができる。
【００１５】
本発明の一態様において、複数のセグメントを続けて構成し、宿主細胞内に複製する核酸構築物を形成し、この場合、構築物の大きさは、従来で扱うゲノムＤＮＡ、例えば、従来の実験室での操作、例えば、ピペット、混合、撹拌、形質転換等で扱うことが予想される大きさ以上である。別の態様において、このような構築物の大きさは、少なくとも５００キロ塩基（ｋｂ）、若しくは少なくとも６００ｋｂ、又は少なくとも７００ｋｂ或いは少なくとも８００ｋｂである。一般的には、このような構築物は、それ自体が置換ゲノムではないが、前駆体置換ゲノムであってよい。更に別の態様において、複数のセグメントは、集合的に、置換ゲノムの完全なコピーを含み、即ち、複数のセグメントが置換ゲノムをカバーする。このようなカバー倍数は、複数の幾つかのセグメントの配列が重複することができる点において冗長であってもよく、又はなくてもよい。他の態様において、このようなカバー倍数は、複数のセグメントの配列間で重複がない点において非冗長である。置換ゲノムは、微生物の天然の菌株又は種から直接得ることができ、これは、本明細書において、「ドナーゲノム」と呼ばれる。ドナーゲノムは、天然又は未修飾であってよく、又は、それは遺伝子、調節因子、オペロン又は他の要素を追加、欠失、置換又はさもなければ変更するよう修飾されていてよい。一般的に、ドナーゲノムを含む複数のセグメントを、これらがドナーゲノムの実質的に完全な配列を集合的に含有し、重複を最小限にするように選択し、即ち、各セグメントが、複数の他の幾つかのセグメントの配列と重複する幾つかの配列を含まず、或いはこのような重複が発生する場合、それは最小、例えば、何れかのセグメントの１０％以下若しくは何れかのセグメントの５％以下又は何れかのセグメントの２％以下或いは何れかのセグメントの１％以下である。他に言いかえれば、幾つかの場合、このようなセグメントは、ドナーゲノムの最小タイリング路程を表す。ドナーゲノム由来の１組のセグメントに関する「実質的に完全」とは、組が定義された培養条件において成長及び複製に必要なドナーゲノムの配列を含むことを意味する。従って、「実質的に完全」とは、全体のゲノム配列を含むより少ない状況を含む。一態様において、「実質的に完全」とは、ドナーゲノムの少なくとも８５％若しくはドナーゲノムの少なくとも９０％又はドナーゲノムの少なくとも９５％或いはドナーゲノムの少なくとも９８％を意味する。ドナーゲノムを構成する複数のセグメントが本発明において構成される場合、それは、本明細書において、置換ゲノムと呼ばれる。得られた合成生物の性能の増強し、又はこれに新しい機能性を追加するために、遺伝子、調節因子、オペロン、遺伝子群等の順序及び／又は組成物を再編成するために、天然の配列構成要素を含むセグメントを合成ポリヌクレオチドと選択的に置換することにより、ドナーゲノム由来の置換ゲノムを後から調整することができる。
【００１６】
幾つかの場合、構成プロセスの開始サイクル中、その構築に使用される大きな挿入ベクターからの複製起点を操作することにより、宿主生物の前駆体置換ゲノムを複製することができる。この場合、後のサイクルの複製は、ドナーゲノム由来の複製起点により制御される。他の場合において、構成の最初の数サイクル、例えば１〜２若しくは２〜４又は３〜６の構成サイクル直後又は間、ドナーゲノム由来の複製起点を操作することにより、前駆体置換ゲノムを複製する。このような実施形態において、早期に構成されたセグメント、例えば、セグメント１〜４等は、ドナー複製起点を含む配列を含む。何れかの場合において、宿主は、複製に関与する核酸及びタンパク質がドナーゲノムによりコードされるものと実質的に機能横断的であるように選択することが好ましい。即ち、複製に関与する宿主生物タンパク質は、ドナー複製起点を使用して作動可能である。幾つかの実施形態において、ドナー転写因子は、例えば、宿主プラスミドを介して追加され、前駆体置換ゲノム複製に必要なタンパク質が利用可能であることを確認することができる。幾つかの場合、他のドナー転写因子を提供して、他の必要なタンパク質、例えば、機能横断的宿主タンパク質等がない特定のドナー複製タンパク質が利用可能であることを確認することができる。更に、一態様において、構成プロセスの早期のセグメント（１〜２若しくは１〜４又は１〜６サイクル）は、（ドナーゲノム複製起点であってよい）置換ゲノム複製起点及び必要な複製因子又はタンパク質をコードする全ての遺伝子を含むことが好ましい。
【００１７】
同様に、ドナーゲノムが宿主生物の成長及び複製と不適合な産物をコードする遺伝子を含む場合は常に、その後、必ず必要である場合は、このような遺伝子を構成プロセスの最終セグメントに移動することができ、又は、必要でない場合、このような遺伝子を欠失することができる。場合により、このような遺伝子を、誘導性制御下において配置することができ、そのため、これらは、構成が完了後に活性化することができ、宿主ゲノム及び結合した支持機能を、もはや必要としない。一態様において、宿主生物と適合しないドナー遺伝子（又はその他の配列）は、従来の技法を使用するホールゲノムショットガン配列決定により同定することができる（例えば、参考として援用される、Ｗｅｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ７：４０１−４０９  （１９９７）；Ａｄａｍｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８７：２１８５−２１９５  （２０００）；Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９９：３７１２−３７１６  （２００２）；Ｒｅｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，  １２９：９１−９６  （２００５）等）。即ち、ホールゲノムショットガン配列決定において、ドナー生物のゲノムＤＮＡは、任意に共有され、小、中及び大の挿入発現ベクターにおいてクローン化され、宿主生物に形質転換され、任意に選択されたクローンを配列決定する。配列決定は、十分な大きさで実施し、それは、構成されたドナーゲノムにギャップが残存する場合、宿主生物と不適合なクローン化配列の存在によるものに違いなく、ドナーゲノム断片のサンプリング下において残存しないようにするためである。不適合のドナー配列を構成されたドナーゲノムのギャップの位置により同定することができる。或いは、又は確認として、個々に選択されたドナー配列を適切な発現ベクターの宿主に取り込むことにより検討することができる。
【００１８】
一態様において、宿主生物及びドナー生物を、複製に関与するタンパク質が実質的に機能横断的であるように選択し、それにより宿主複製タンパク質による前駆体置換ゲノムの複製を可能にする。これを達成する１つの手法には、例えば、ゲノム配列相同性、特に中核的な機能遺伝子、例えば、複製、転写、タンパク質合成、基質輸送、エネルギー代謝、細胞分裂等に関与するものの相同性により測定される、進化的に近い宿主生物及びドナー生物を選択する方法がある。コードされたタンパク質の機能横断性を測定するための中核的な機能遺伝子を選択する手引きについては、参考として援用される以下の参考文献をはじめとする、最小微生物ゲノムに関する広範な参考文献に記載されている：Ｋｏｏｎｉｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｍｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １：９９−１１６  （２０００）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １００：４６７８−４６８３  （２００３）；Ｇｌａｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １０３：４２５−４３０  （２００６）；Ｇｉｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ６８：５１８−５３７  （２００４）；米国特許第６，６７３，５６７号；米国特許第６，２０７，３８４号等。一態様において、宿主及びドナーゲノムの中核的な機能遺伝子は、少なくとも５０％相同であり、別の態様において、宿主及びドナーゲノムの中核的な機能遺伝子は、少なくとも６０％相同であり、若しくは、少なくとも７０％相同であり、又は少なくとも８０％相同であり、又は少なくとも９０％相同であり、又は少なくとも９５％相同であり、或いは少なくとも９８％相同である。一態様において、機能横断性を測定するための中核的な機能遺伝子は、ゲノム複製に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）が宿主生物として使用される場合は常に、ゲノム複製のための中核的な機能遺伝子は、参考として援用される以下の学術論文により明らかにされている通り、当業者に周知である：Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  １９９２）。一態様において、このような遺伝子は、ポリメラーゼ、プライマーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ及びジャイレースをコードするものを含む。別の態様において、このような遺伝子は、以下の組から選択される：ｄｎａＡ、ｄｎａＢ、ｄｎａＣ、ｄｎａＥ、ｄｎａＧ、ｄｎａＪ、ｄｎａＫ、ｄｎａＮ、ｄｎａＱ、ｄｎａＴ、ｄｎａＸ、ｄｎａＹ、ｄｎａＺ、ｄｕｔ、ｇｒｐＥ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｌｉｇ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｏｒｉ、ｐｏｌＡ、ｐｏｌＢ、ｐｒｉＡ、ｐｒｉＢ、ｐｒｉＣ、ｒｅｐ、ｒｎｈＡ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｒｐｏＤ、ｓｓｂ、ｔｅｒ、ｔｏｐＡ、ｔｒｘＡ及びｔｕｓ、この場合、これらの遺伝子表示は、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ（前記）において定義され、公で利用可能なデータベース、例えば、ＮＣＢＩ、Ｅｓｎｅｍｂｌ、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列により定義される。特に、Ｅ．  ｃｏｌｉ株Ｋ−１２の配列は、参考として援用されるＢｌａｔｔｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７：１４５３−１４７４  （１９７７）に開示されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓが宿主生物として使用される場合は常に、ゲノム複製のための中核的な機能遺伝子は以下の組から選択することができる：ｄｎａＡ、ｄｎａＢ、ｄｎａＣ、ｄｎａＤ、ｄｎａＥ、ｄｎａＦ、ｄｎａＧ、ｄｎａＨ、ｄｎａＩ、ｄｎａｘ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｎｒｄＡ等。
【００１９】
或いは、ドナー機能を実施する場合に選択された宿主タンパク質の活性を、経験的に評価することができ、この場合、例えば、複製のドナー源が利用可能な分析では、ベクターを使用して宿主にクローン化することができ、このベクター自体の複製起点が条件付き制御下、例えば、温度感受性制御下にあり、そのためベクター源が無能の場合、機能的横断性を、ベクターがどのように、及びどの程度まで複製するかを（宿主複製タンパク質を使用して）評価することにより検討することができる。
【００２０】
本発明によれば、多種多様の宿主生物において、置換ゲノムを構成することができる。好ましくは、宿主生物は、原核生物である。一態様において、宿主生物は、細菌であり、より一般的には、腸内細菌、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉである。別の態様において、宿主生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓである。好ましくは、ドナー生物は、原核生物である。一態様において、ドナー生物は細菌である。Ｅ．  ｃｏｌｉ宿主を使用するドナー生物の例として、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓがあり、より具体的には、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ及びより具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａがある。
【００２１】
一態様において、置換ゲノムを構成する場合に使用されるセグメントを、プラスミド、ファージ、コスミド及び／又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）及びＰ１由来人工染色体（ＰＡＧ）、Ｐ１ベクター等を含めた従来のクローニングベクターの技法を使用してクローン化又は構築する。構成手順を最小限にするために、好ましくは、全部ではない場合、殆どのセグメントを大きな挿入クローニングベクターの挿入物、例えば、ＢＡＣ又はＰＡＣとして提供する。置換ゲノムの構成が完了後、追加の変更に使用されるベクターの型及び置換断片の大きさは、特定の用途により左右される。大きな挿入ベクターは、５０ｋｂ〜３００ｋｂ又はそれ以上の長さを有する挿入物を含むことができ、原核宿主生物、例えば、細菌を形質転換することができるベクターである。特に、大量のＢＡＣは、ＲｅｃＡ−Ｅ．  ｃｏｌｉ宿主生物の使用に利用可能である。一態様において、置換ゲノムを構成するための１組のセグメントは、同じ型のクローニングベクター又は異なる型のクローニングベクターの挿入物を含む場合があり、例えば、大部分が大きな断片、即ちＢＡＣ中１００ｋｂ以上を含み、少数が他のクローニングベクター、例えばファージ、コスミド及び／又はプラスミドの小断片を含む場合がある。別の態様において、ＢＡＣは、置換ゲノムのセグメントの主なクローニングベクターとして使用され、即ち、大部分の置換ゲノムの配列は、ＢＡＣにおいて提供される。複数のセグメント長は、ドナーゲノムの大きさ、所望の構成プロセスの手順の最小化、所望の遺伝子配列、オペロン、遺伝子群等、予想されるセグメント置換（例えば、単一の大きな合成セグメントよりむしろ別々に幾つかのより小さな合成セグメントを使用がより効率的となりうる）等を含めた幾つかの因子に応じて多様に変化することができる。一態様において、セグメントは、例えば２〜１０ｋｂの数千塩基対〜例えば１００〜３００ｋｂの数十万塩基対の長さを有する。別の態様において、セグメントは、例えば１０〜５０ｋｂの数万塩基対〜例えば１００〜３００ｋｂの数十万塩基対の長さを有する。好ましくは、セグメントはＢＡＣベクターでクローン化され、これらについては、参考として援用される以下の参考文献に記載される：Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  ２００４）；Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ３４：２１３−２１８  （１９９６）；Ｓｈｉｚｕｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８９：８７９４−８７９７  （１９９２）；米国特許第５，８７４，２５９号及び第６，４７２，１７７号等。幾つかの小片からＢＡＣに挿入物を構成する技法は、当該技術分野で周知であり、参考として援用される以下の参考文献により明らかされている：Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １３０７−１３１２  （１９８９）。本発明で使用されることができるベクターの例として、修飾が全くなく、又は少なく、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１、ｐＢＡＣｅ３．６、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＳＭＡＲＴＶＣ、ｐＩｎｄｉｇｏＢＡＣ−５、ＳｕｐｅｒＣ��ｓ１等を含み、これらは、ＧｅｎＢａｎｋにおいて市販されており、又は記載されている。
【００２２】
置換ゲノムの構成を、断片を挿入するための制限エンドヌクリアーゼ及びリガーゼの使用、丈夫なＤＮＡ修復機構を有する宿主の使用及び部位特異的挿入のための組換え系方法の使用を含めた種々の技法を使用して実施することができる。本発明で使用する部位特異的組換え系は、一般的に、１対の反応性組換え要素（又は部位）上で操作し、鎖切断及び再結合を触媒する少なくとも１つのリコンビナーゼを含む。一般的に、反応性組換え要素は、必然ではないが、組換え部位が同一の配列を有する。組換え系は又、操作上、リコンビナーゼと結合する場合がある追加の補助タンパク質も含む場合がある。一態様において、異なるセグメントを成長する前駆体置換ゲノムに続けて構成するために、リコンビナーゼを、異なる組換え要素間で顕著な交差反応を生じることなく、異なる配列を有する組換え要素を使用して別々の組換え事象を触媒することができる。従って、一手法において、十分な数の様々な非交差反応する組換え要素は、完全な置換ゲノムの構成に利用可能でなければならない。別の手法において、非交差反応する組換え要素は、構成の代替手順において再使用される場合があり、従って、２つの非交差反応する組換え要素のみを必要とする。多くの組換え系は、本発明において有用であり、単独及び互いに組み合わせて使用することができる。適切な組換え系には、１）目的の配列の末端近くで２つの交差部位を使用する線状の相同組換え、例えば、Ｒｅｄ／ＥＴ系；２）環の相同組込み後、第２の組換えを分解、例えば、組換え介在性カセット交換（ＲＭＣＥ）法のＣｒｅ−ｌｏｘ又はｆｌｐ−ｆｒｔ部位；３）線状の配列特異的組換え（例えば、λ又はｐｈｉＣ３１等のファージインテグラーゼを介する）及び４）配列特異的な環の組込みが含まれるが、これらに限定されない。部位特異的及び相同組換え系の例には、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ、Ｆｌｐ−ＦＲＴ、ａｔｔ−Ｉｎｔ（Ｇａｔｅｗａｙ）、Ｒｅｄ／ＥＴ、ＲｅｃＡ等が含まれるが、これらに限定されない。これら及び他の組換え系は、当業者に周知であり、参考として援用される以下の参考文献に記載されている：Ｂｒａｎｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ，  ６：７−２８  （２００４）；Ｂａｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １２：４７３−４８０  （２００１）；Ｓａｕｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２４：４６０８−４６１３  （１９９６）；Ｙｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９７：５９７８−５９８３  （２０００）；Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ７３：５６−６５  （２００１）；Ｍｕｙｒｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，  １：２３９−２４３  （２０００）；Ｃｈｅｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １４：２１１１−２１２０  （２００４）；Ｍｉｓｓｉｒｌｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ７：７３  （２００６）；米国特許第６，５０９，１５６号；第６，４６５，２５４号；第６，７２０，１４０号；第５，７７６，４４９号；第５，８８８，７３２号等。リコンビナーゼは、遺伝子発現により提供されることができ、こ��発現を、宿主ゲノムにより、又はプラスミド等のエピソームにより、或いは前駆体置換ゲノムの１つ以上のセグメントにより実施することができる。好ましくは、リコンビナーゼの発現は、構成プロセス中の擬性又は望ましくない組換えの発生を最小限にするために誘発性制御下にある。又、好ましくは、宿主生物は、置換ゲノム（又はＤＮＡ環）構成プロセスに使用される組換え要素がないように選択され、又は選択された生物は、擬性又は望ましくない組換え反応を防ぐためにこのような要素を処置し、除去又は無能にする。
【００２３】
一態様において、本発明の構成プロセスは、宿主生物において、以前に構成されているセグメントを使用して置換ゲノムの新規のセグメントを組換える一連の手順を含み、これは、前駆体置換ゲノムを構成する。このような手順を組換え系と合わせて、従来のベクター及び形質転換技法、例えば、上記に示されるものの１つを使用して実施する。一般的に、場合によって、このような手順は、それぞれベクターを使用して宿主を形質転換するサブ手順を含み、このベクターは、１つ以上の固有の組換え要素と操作上結合する新規のセグメントを含有し、形質転換された宿主生物を培養し、組換え体、例えば、新規のセグメントと連続的に組換える前駆体組換えゲノムを含む宿主生物を選択し、一連の前駆体組換えゲノム（又は完全な置換ゲノム）を産生する。幾つかの実施形態においては、複数のセグメントが単一サイクルにおいて、例えば、参考として本明細書で援用されるＣｈｕｒｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．、国際特許公開第ＷＯ２００６／０５５８３６号の手法を使用して、前駆体置換ゲノムと組み換えられる場合がある。
【００２４】
本発明の一態様において、セグメント構成を図１Ａ〜１Ｇに示す通り、部位特異的組換えを使用して実施する。部位特異的組換え要素を選択し、ベクターに配列し、所望の産物への組換え反応を促進する。提供される部位特異的組換え要素の組は、（ｉ）実質的に互いに交差反応がなく、（ｉｉ）各構成プロセスの手順において、安定した組込みが生じるように方向付ける。Ｂｒａｎｄａ，  ｅｔ  ａｌ．（前記）にて考察される通り、例えば、ｌｏｘＰ及びＦＲＴを含む部位特異的組換え要素のλインテグラーゼファミリーは、鎖切断、鎖交換及びライゲーションを含むＤＮＡ組換えの一般的な機構を共有する。核酸段階で明確であるが、ｌｏｘＰ及びＦＲＴ部位は、全体の構造を共有し、この構造は、２つの１３塩基対回文配列を含み、又は逆方向反復配列、８塩基対の不斉コアにより分離された配列或いはスペーサー配列を含む。２つの部位の存在下において、逆方向反復に結合されたリコンビナーゼモノマーは、２部位間のシナプス複合体の形成及び組換えを促進する。鎖切断、交換及びライゲーションは、スペーサー内で生じる。スペーサーが非対称であるため、鎖交換は、標的部位が一方向のシナプスにより接続される場合にのみ可能である。結果として、互いにの標的部位の相対的な方向が組換えの結果を決定する：Ｃｒｅ及びＦｌｐリコンビナーゼは、２つの直接反復する標的部位間からの環状分子を運動させ、標的部位をプロセッシングする線状分子それぞれに環状分子を組込み、２つの逆方向部位間のＤＮＡを反転させ、２つの線状分子に存在する標的部位に遠位の配列を交換する。たいてい、挿入によりｃｉｓ構造の２つの同一部位が残り、これらの部位自体が組換えの基質であるため、安定した挿入に２つの野生型部位を使用することは難しく又は不可能である。しかし、Ｃｒｅ及びＦｌｐ等の多くのリコンビナーゼは、これらの標的配列の特定の変動を許容し、代替部位の特定のサブセット間のみにて組換えを効率的に触媒する。この特性を利用して、置換ゲノム構成のための一連の組換え事象を可能にする。Ｃｒｅ及びＦｌｐ等のλインテグラーゼリコンビナーゼの変異体標的部位は、スペーサー変異体及び逆方向反復変異体の２つのクラスに分類される。１つ目のクラスは、スペーサー配列内でヌクレオチド置換を含有し、関与する部位が同一間の配列である限り、効率のよい組換えに重要な因子は、配列ではなくスペーサー長であることを利用する。それゆえ、組換えは、同型（例えば、ＦＲＴ／ＦＲＴ又はＦ３／Ｆ３）であるが異型（例えば、ＦＲＴ／Ｆ３）部位ではない対間で効率よく媒介される。又、２つ目のクラスの代替部位（逆方向反復変異体）も利用して、安定した挿入を提供することができる。「左側」逆方向反復（「ＬＥ」突然変異体部位）のヌクレオチド置換を含む標的部位は、「右末端」逆方向反復（「ＲＥ」突然変異体部位）の類似の置換を含む部位と組換えることができるが、野生型配列に比べて、反応速度は遅い。このような突然変異体は、組換え産物を１つの野生型部位及び事実上不活性である１つのＬＥ／ＲＥ二重突然変異部位を保有するように設計される。従って、このような単一の突然変異体ＬＥ及びＲＥ部位を用いた挿入は、１つの潜在的な活性組換え要素のみ���形成し、これ自体は、不活性化、又は修飾され、続く挿入に使用されることができる。これらの概念を、本発明の幾つかの実施形態において図１Ａ〜１Ｇに説明する。
【００２５】
図１Ａは、ベクターｌｏｘ１〜ｌｏｘｋとして担持される複数のセグメント（１００）を示し、それぞれは、「Ａ０１」、「Ａ１０」、「Ｂ０１」、「Ｂ１０」、「Ｃ０１」．．．「Ｋ１０」と標識された部位特異的組換え要素の固有の組み合わせを有し、この場合、それぞれの異なる文字「Ａ」、「Ｂ」等は、異なる非交差反応する部位特異組換え要素を示し、この場合、下付き「０１」及び「１０」は、ＲＥ突然変異体部位（「０１」）又はＬＥ突然変異体部位（「１０」）を有する組換え要素を示す。これに対して、下付き文字「１１」は、二重突然変異体部位を示し、下付き文字「００」は非突然変異体部位を示す。ベクターの図は、記号的な表記に過ぎず、大きさ又は形状に対するものではないことを注記する。例えば、部位特異的組換え要素がベクターの反対側に示されている場合でも、構成は必要ではない。この組換え要素を並列することができ、或いはこれらは、ベクター又はセグメントに散在することができる。開始セグメント（１０２）を含むベクターｌｏｘ１（１０１）は、本実施形態において単一の組換え要素「Ａ０１」（１０４）のみを必要とする。同様に、最終セグメント（１０８）を含むベクターｌｏｘＫ（１０６）は、単一の組換え要素「Ｋ１０」（１１０）のみを必要とする。ベクターｌｏｘ２〜ｌｏｘＫ−１それぞれは、２つの異なる組換え要素を有し、例えば、ベクターｌｏｘ４（１１２）は、セグメント（１１４）、組換え要素「Ｃ１０」（１１６）、組換え要素「Ｄ０１」（１１８）及び部分（１２０）を含み、これは、セグメント（１１４）の一部又は２つの組換え要素間の単なる接合（例えば、２つの隣接する配列、又は干渉ポリヌクレオチドを接合する結合）であってよい。本実施形態において、複数（１００）のセグメント含有ベクターは、それぞれ最初（ｌｏｘ１）及び最後（ｌｏｘＫ）を除き、示された所定の順序のベクター（即ちｌｏｘ１の「Ａ０１」）の直前に共通して少なくとも１つの第１の組換え要素（例えば、ｌｏｘ２の「Ａ１０」）及びベクター（即ち、ｌｏｘ３の「Ｂ１０」）の直後に共通して少なくとも１つの第２の組換え要素（例えば、ｌｏｘ２の「Ｂ０１」）を含有し、この場合、このような第１及び第２の組換え要素は異なる（即ち、本実施形態において、第１は、「Ａ」型及び第２は、「Ｂ」型である）。又、様々な型（又は種類）の組換え要素の重要な特性は、１つの型（又は種類）のメンバー又は変異体が、別の型（又は種類）のメンバー又は変異体と交差反応しない（又は実質的に交差反応しない）ことである。図１Ｂに示す通り、複数（１００）のセグメントを一度にセグメントに添加することにより段階的に構成され、一連の前駆体置換ゲノムを形成する。一態様において、構成プロセスの手順は、それぞれ宿主の形質転換及び選択マーカーを使用して得られた形質転換細胞の選択を含めた手順（又はサブ手順）のサイクルを含む。組換え要素の相対的な順序を第１の組換え体（１２２）に示し、これは、第１の前駆体置換ゲノムである。部位特異的組換えは、保存されているので、ＤＮＡ合成は必要でなく、配列は反応において増減しないという点で、第１の組換え体（１２２）は、結合された２つのベクターの組換え要素全ての小片、即ち、二重突然変異体形態（１０４）及び非突然変異体形態（１０５）の「Ａ」型の組換え要素の２つコピー並びに組換え要素「Ｂ０１」（１２４）の１つのコピーを含有し、これは、次のベクターであるｌｏｘ３の固有の組換え部位として作用する。形質転換、組換え及び選択後、得られた第１の組換え体（１２２）を保有する宿主を、ベクターｌｏｘ３を使用して形質転換し、次の組換え体又は、前駆体置換ゲノム（１２６）を形成する。又、配列は、（１２２）の組換え体及びｌｏｘ３に保存され、そのため、前駆体置換ゲノム（１２６）は、５つの組換え要素を含む：「Ａ００」（活性）、「Ａ１１」（不活性）、「Ｂ００」（活性）、「Ｂ１１」（不活性）及び「Ｃ０１」（１２８）、これは、又、次のベクターであるｌｏｘ４の固有の組換え部位である。プロセスは、置換ゲノムが完了するまで継続する。不活性組換え要素（「Ａ１１」、「Ｂ１１」、「Ｃ１１」等）に対して活性組換え要素（「Ａ００」、「Ｂ００」、「Ｃ００」等）の順序は、ベクター（１００）のＬＥ及びＲＥ突然変異体部位の順序を変えることにより変化させることができる。例えば、ｌｏｘ２が「Ｂ１０」を含有し、ｌｏｘ３が「Ｂ０１」を含有した場合、次いで、「Ｂ１１」及び「Ｂ００」の位置をスワップし、（１２６）に対応して得られたベクターは、「Ａ００」及び「Ｂ００」間にはさまれた不活性部位「Ａ１１」を有する。本実施形態において示されたように、組換えは、例えば、図１Ｃに図示されるように、宿主細胞で起こる。宿主生物（１３０）は、開始ベクター（１０１）により形質転換され、宿主ゲノム（１３２）及びベクター（１０１）を含む宿主を形成する。構成プロセスに続くサイクルにおいて、連続する大きな組換え体（１３４）、即ち、前駆体置換ゲノムは、完全な置換ゲノム（１３６）が存在するまで形成される。次いで、宿主ゲノム（１３２）を、除去し、又は切除し、置換ゲノム（１３６）のみを含む合成細胞（１３８）を得る。
【００２６】
以下で詳細に考察する通り、上記のプロセスは、参考として援用されるＭｉｓｓｉｒｌｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ７：７３（０４  Ａｐｒｉｌ  ２００６）にて教示される通り、「Ａ」〜「Ｋ」の各型のＬＥ及びＲＥ突然変異体組換え要素の対を使用して実施される場合がある。即ち、ＬＥ及びＲＥ突然変異体対は、各型の組換え要素を調製する。組換え事象が発生する場合（例えば、ｌｏｘ３の要素「Ｂ１０」の一部がｌｏｘ３の要素「Ｂ０１」と結合する）、両方の突然変異体は、産物部位の一方のみに存在し、他方の産物部位は、突然変異しない。これは、直接モジュラー型置換ゲノムを生じる。即ち、作動可能な組換え部位を、組換え系を使用して使用し、この系を使用して、例えばＲＭＣＥ手法を使用して、合成生物の特性を修飾するセグメントを交換する。
【００２７】
別の態様において、図１Ｄ及び１Ｅに示す通り、少数の組換え要素を使用することにより、セグメントを置換ゲノムに構成することができる。複数のセグメントをベクターＶ１〜Ｖｋ（１５０）において提供する。本実施形態において、ベクターは、それぞれ１つ以上の固有の組換え要素を持たず、代わりに、組換え要素は、セグメント組込みの代替サイクルにおいて再使用される。このような組換え要素の再循環は、複数の異なる型の組換え要素を使用して行われることでき、このそれぞれが、互いに組換えることができる１対の単一の突然変異体として提供され、活性非突然変異体形態及び不活性二重突然変異体形態を産生する。又、このような複数の様々な組換え要素は、２、３、４、５、６、７、８個の組換え要素を含む場合がある。一態様において、従来、例えば、米国特許第６，５０９，１５６号及びＹｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９７：５９７８−５９８３  （２０００）に開示されているＲｅｄ／ＥＴ組換え及び／又はＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ（ドイツ  ドレスデン）から市販されている試料を使用することによりセグメントを運ぶＢＡＣに組換え要素を取り込むことができる。特に、適当な宿主細菌を使用して、ＢＡＣに挿入される配列をＰＣＲにより調製することができ、この場合、得られたアンプリコンは、固有の側面配列３０〜５０塩基対を含む。このようなアンプリコンは、同じ固有の配列により結合されたＢＡＣの領域と組換えられる。
【００２８】
図１Ｄの第１のセグメントを含むベクターＶ１及び最後のセグメントを含むベクターＶｋにおいて、Ｖｋは、それぞれ単一の組換え要素を有し、残りのベクターのＶ２〜Ｖｋ−１は、それぞれ２つを有する。Ｖ１の組換え要素Ａ０１（１５２）は、Ｖ２の組換え要素Ａ１０（１５４）を使用して作動可能である単一の突然変異体部位であり、これは異なる単一の突然変異体部位である。同様に、Ｖ２の組換え要素Ｂ０１（１５６）は、Ｖ３の組換え要素Ｂ１０（１５８）を使用して作動可能である単一の突然変異体部位であり、これは、異なる単一の突然変異体部位である。以下のように使用する場合、同じ４部位をベクターＶ１〜Ｖｋの全てを使用して使用することができる。Ｖ１及びＶ２は、Ｒｅｄ／ＥＴ構成要素の宿主に形質転換し、これは又、適当なリコンビナーゼを発現し、組換え体（１６０）を形成し、この場合、組換え要素Ａ０１（Ｖ１）及びＡ１０（Ｖ２）を機能的Ａ００部位（１６２）及び非機能的Ａ１１部位（１６４）に変更する。アンプリコンは、３０〜５０塩基対の側面配列を含むように調製し、これは、組換え体（１６０）のＡ００の側面にある配列と同一である。組換え体（１６０）を含む宿主細菌を、Ａ００（１６２）を含む組換え体（１６０）の部分と組換え（１６６）し、組換え体（１６９）を産生するようにアンプリコンを使用して形質転換し、これは、無能にされた組換え部位「Ｘ」（１６８）を有することが示される。Ｒｅｄ／ＥＴ系の利点は、組換え体がＰＣＲにより検出することができ、選択的培地の成長を必要としないことである。次いで、次の構成手順において、第３セグメント及び組換え要素Ｂ１０及びＡ０１を含むベクターＶ３を使用して、その宿主を形質転換することにより、修飾組換え体（１６９）を使用し、組換え体（１７９）を形成（１７１）することができ、これは、機能的Ｂ００部位及び非機能的Ｂ１１部位を含む。上記の通り、組換え体（１７９）の選択後、機能的Ｂ００部位は、破壊され（１７６）、修飾組換え体（又は前駆体置換ゲノム）（１８０）を形成する。残りのセグメントにおいて同様な様式で、置換ゲノムの構成が継続する。
【００２９】
Ｒｅｄ／ＥＴ等の組換え系も又、図１Ｆ〜１Ｇに示す通り使用し、セグメント−追加サイクル内で望ましくない機能的組換え要素を修飾することができる。複数のベクター（１８０）は、それぞれ１つの型の組換え要素の単一の突然変異体形態のみを含むことを提供する。上記の通り、２つの型の組換え要素のみを図１Ｆの実施形態（Ａ及びＢの実施形態）に示すが、追加の組換え要素の型を、代替の実施形態において使用することができる。ベクターＶ１及びＶ２を組換え、活性組換え要素Ａ００（１８４）及び不活性組換え要素Ａ１１（１８６）を含む組換え体（１８２）を形成することができる。本実施形態において、要素Ａ００を不活性化する代わりに、Ｒｅｄ／ＥＴ等の相同組換え系を使用して、挿入される次のベクターの要素に相補的な組換え要素と活性組換え要素Ａ００を交換する。（上記の通り、これは、続く手順においてＡ型組換え要素が再使用されることを可能にする）。このような交換（１８８）後、形成された前駆体置換ゲノム  （１９０）は、１つの不活性組換え要素Ａ１１（１９２）及び１つの活性組換え要素Ｂ０１  （１９４）を有する。次いで、前駆体置換ゲノム  （１９０）は、要素Ｂ０１がベクターＶ３の要素Ｂ１０と組換え  （１９５）、活性Ｂ００（１９８）及び不活性Ｂ１１（１９９）を含む前駆体置換ゲノム  （１９６）を形成するように、ベクターＶ３と結合する。次の手順において、Ｂ００は、Ａ０１と交換し（１９０１）、前駆体置換ゲノム（１９０２）を産生する。セグメントを添加するための形質転換及び組換え要素を交換するための形質転換の同様なサイクル（１９０４）は、置換ゲノムが構成されるまで実施される。
【００３０】
上述のように、核酸構築物、ＤＮＡ環又は置換ゲノムの構成も又、共形質転換後の部分的又は完全な自己構成により、部分的に、又は全体に平行して実施されることができる。本実施形態の一態様において、多様なセグメントを宿主生物に共形質転換し、この場合、各セグメントは、その共形質転換するセグメントと交差反応しない部位特異的組換え要素と結合し、そのため、組換えが、前駆体置換ゲノム又は完全な置換ゲノムにかかわらず、産生された核酸構築物の正しく順序付けられたセグメントを生じる。セグメントは、共形質転換細胞の同定が成功するように多様な独立した選択的マーカーを含む場合がある。適切な非交差反応する組換え要素を以下に開示された突然変異体ｌｏｘＰ組換え要素群から選択することができる。本実施形態の別の態様において、同一又は相同配列の固有の重複する末端を有する複数のセグメント（即ち、各重複領域が固有の配列を含み、又は他の重複領域から少なくとも区別される）を、頑丈なＤＮＡ修復システムを有する適切な宿主、例えば、放射活性により汚染された環境の潜在的なバイオレメディエーションの適用に研究されているＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓに共形質転換することにより並行して構成することができる（例えば、参考として本明細書で援用される、Ｚａｈｒａｄｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４４３：５６９−５７３  （２００６）；Ｍａｋａｒｏｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ６５：４４−７９  （２００１）；Ｂｒｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １８：８５−９０  （２０００）；Ｌａｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １６：９２９−９３３  （１９９８）；Ｎａｒｕｍｉ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，７７０，４７６号）。適切な重複配列は、例えば１００〜１０００の数百塩基対〜例えば１０００〜２０，０００の数千塩基対の長さを有することができる。更に別の実施形態において、上記の通り同一又は相同配列の固有の重複する末端を有する複数のセグメントを、相同組換え系を有する適切な宿主に共形質転換することにより並行して構成することができ、この組換え系は、重複する末端、例えばＲｅｄ／ＥＴ系等を組換える。
【００３１】
一般的に、及び上記の詳細な実施例において、セグメントを運ぶベクターを用いた宿主微生物の形質転換は、従来技法を使用して実施される。本明細書において使用される、「形質転換」及び「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共析出物、ＤＥＡＢ−デキストラン介在性トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法、光穿孔法、機械的注入、微粒子銃注入等を含めた宿主細胞に外因性核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を取り込むための種々の当該技術分野で認知された技法を指すことを意図する。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションするのに適した方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．，  １９８９）及び同様の実験マニュアルに記載されている。
【００３２】
形質転換された微生物、即ち、組換え体分子を含むものを種々の正及び／又は負の選択方法又はマーカーを使用して選択することができる。特定の態様において、正の選択マーカーは、必須栄養素、例えば、アミノ酸の非存在下において成長が可能な遺伝子である。例えば、チミン及びチミジンの非存在下において、ｔｈｙＡ遺伝子を発現する細胞は生存するが、この遺伝子を発現しない細胞は生存しない。種々の適切な正／負の選択対は、当該技術分野で利用可能である。例えば、当該技術分野で既知の種々のアミノ酸類似体を負の選択として使用することができるが、（アミノ酸類似体に対する）最少培地での成長は、正の選択として使用することができる。視覚的に検出可能なマーカーも又、本発明の使用に適しており、例えば、蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ）又はマイクロ流体工学の技術を使用して正及び負の選択及び／又はスクリーニングすることができる。検出可能なマーカーの例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光性マーカー、生物発光性マーカー等が含まれる。適切な蛍光タンパク質の例には、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオレセインイソチオシアン酸、ローダミン、ジチオロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン等が含まれるが、これらに限定されない。適切な生物発光性マーカーの例には、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシ等）、ルシフェリン、エクオリン等が含まれるが、これらに限定されない。視覚的に検出可能な信号を有する適切な酵素系の例には、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペロキシダーゼ、コリンエステラーゼ等が含まれるが、これらに限定されない。他の態様において、正の選択マーカーは、遺伝子の非存在下において細胞に致死的であろう化合物に耐性を与える遺伝子である。例えば、抗生物質耐性遺伝子を発現する細胞は、抗生物質の存在下において生存するが、その遺伝子のない細胞は生存しない。例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子の存在は、テトラサイクリンの存在下において、正の選択をし、フザリン酸の存在下に対して負の選択をすることができる。適切な抗生物質耐性遺伝子には、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、負の選択マーカーは、特定の基質の存在下において、標的細胞に致死的である遺伝子である。例えば、ｔｈｙＡ遺伝子は、トリメトプリムの存在下において致死的である。更に、トリメトロプリム存在下において成長する細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子を発現しない。負の選択マーカーには、ｔｈｙＡ、ｓａｃＢ、ｇｎｄ、ｇａｐＣ、ｚｗＪ、ｔａｌＡ、ｔａｉＢ、ｐｐｃ、ｇｄｈＡ、ｐｇｉ、Ｊｂｐ、ｐｙｋＡ、ｃｉｔ、ａｃｓ、ｅｄｄ、ｉｃｄＡ、ｇｒｏＥＬ、ｓｅｃＡ等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
多様な手順の構成プロセスにおいて、選択方法及び／又はマーカーを効率よく使用することができ、例えば、本発明において、１対の選択方法又はマーカーを使用することが必要とされ、これらは、例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１３０７−１３１２  （１９８９）；Ｋｏｄｕｍａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １０１：１５５７３−１５５７８  （２００４）；等により教示されているように、一連の組換え手順間でスイッチされ、又は相互に使用される。例えば、図２ａに図示されたように、第１のセグメント含有ベクター  （２００）は、正の選択マーカー（「マーカー１」）（２０２）、例えばＳａｃＢＩＩの遺伝子に組み込まれた組換え要素（２０１）を含む宿主に形質転換（２１１）する。ＳａｃＢＩＩ遺伝子は、スクロースからレバンスクラーゼに変換する酵素にコードし、これは、細菌性細胞に毒性がある（Ｐｉｅｒｃｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ８９；２０５６−２０６０．  １９９２を参照）。要素（２０１）は、マーカー（２０２）を２つの部分（２０３）及び（２０４）に分ける。連続するセグメントを含むベクター（２０６）は、前組換え体のものと相補的な組換え要素（２０１）と、第２の選択マーカー遺伝子（「マーカー２」）（２０８）に組み込まれた第２の非相補的組換え要素（２０５）を含む宿主に形質転換（２１１）する（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、これは、フザリン酸に対する感受性を与える。例えば、Ｂｏｃｈｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １４３；９２６−９３３．  １９８０）。上記の通り、組換え要素（２０５）は、マーカー２遺伝子（２０８）を２つの部分（２０９）及び（２１０）に分ける。セグメント（２１２）を含むクローン１  （２００）とベクター（２０６）との間の組換えは、クローン２（２１９）を形成し、これは、マーカー１遺伝子は破壊されているが（部分（２０３）及び（２０４）の分離を参照）、組換え要素（２０５）を含む完全に機能的なテトラサイクリン耐性遺伝子（２０８）を有し、従って、スクロースを含む固体培地に入れた場合、組換え体クローンのみが成長する。次いで、クローン２（２１９）を、（ｉ）相補的組換え要素（２０５）、（ｉｉ）組み込まれた組換え要素（２１５）を含むマーカー１遺伝子（２１４）（これは、マーカー１を部分（２１６）及び（２１７）に分ける）及びセグメント（２１８）を含むベクター（２２７）を使用して組換える（２２２）ことができる。上記の通り、ベクター（２２７）の組換え要素（２０５）は、クローン２（２１９）の要素（２０５）と反応し、クローン３（２３１）を形成し、この時、クローン２のマーカー２（２０８）は、部分（２０９）及び（２１０）の分離により破壊されるが、クローン３は又、テトラサイクリンへの暴露により組換え体の選択が可能になる機能的マーカー（２１４）を含む。又、機能的マーカー（２１４）は、組み込まれた組換え要素（２１５）を含む。セグメント（２１２）及び（２１８）は、クローン３を含む。構成は、次のセグメント（２２４）を含むベクター（２３３）及び別の組み込ま��た組換え要素（２２９）を含むマーカー２遺伝子（２２５）並びにクローン３への挿入に相補的な組換え要素（２１５）を提供することにより継続する。ベクター（２３３）及びクローン３（２３１）は、組換え体クローン４（２４０）及び３つのセグメントを形成し、これらの最後のセグメント（２２４）は、マーカー１遺伝子（２１４）を破壊し（そのコード領域の分裂による。（２１６）及び（２１７）を参照）、新しい任意選択のマーカー２遺伝子（２２５）を提供する。この様式において破壊可能な正の選択マーカーを代替することにより、宿主生物のドナーゲノムセグメントが段階的に増加することを可能にする。又、破壊可能な正の選択マーカーは、マーカー遺伝子とそのプロモーター部位との間に位置する組換え要素も含む場合がある。
【００３４】
置換ゲノムが構成され、宿主生物内において作動可能になると、宿主ゲノムを除去又は切除した。一態様において、宿主生物に対して、宿主ゲノムを保持する宿主生物を選択する条件を構成することにより、宿主ゲノムを除去する。別の態様において、宿主ゲノムの切除には、例えば、抗生物質耐性マーカーを介して置換ゲノムを選択し、かつ宿主ゲノムに対して、例えば、宿主ゲノムにおいて誘導性ＳａｃＢ又は同様の遺伝子を挿入することを選択する両方の条件を構成することを含む。更に別の態様において、宿主及びドナーゲノムの特定の選択において、制限エンドヌクレアーゼは、宿主ゲノムＤＮＡを切断することに利用可能であるが、ドナーゲノムＤＮＡでは利用できない。このような状況において、このような制限エンドヌクリアーゼ発現する誘導性遺伝子を提供し、宿主ゲノムを除去することができる。例えば、制限酵素ＦｓｅＩは、Ｅ．  ｃｏｌｉの４部位にて切断するが、Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅでは全くない。
【００３５】
連続部位特異的組換えの突然変異体ＬｏｘＰ部位
一態様において、ｌｏｘＰ部位の対を使用して、本発明における置換ゲノム又は大きなＤＮＡ環を構成することができる。図４に示す通り、ｌｏｘＰ部位は、左末端（４００）、即ち「ＬＥ」Ｃｒｅ認識部位、又は「アーム」である右末端（４０４）、即ち「ＲＥ」Ｃｒｅ認識部位、或いは「アーム」を含み、ＬＥとＲＥアームとの間のスペーサー領域（４０２）をはさむ。殆どの野生型及び突然変異体ｌｏｘＰ部位において、ＬＥ及びＲＥアーム（４００及び４０４）は、それぞれ１３塩基対長であり、スペーサー領域（４０２）は、８塩基対長である。又、野生型及び殆どの突然変異体ｌｏｘＰ部位において、ＬＥ及びＲＥアームは、逆方向反復である。ｌｏｘＰ部位の構成要素を、図４に示す通り、突然変異体ｌｏｘＰ対の組を産生するよう修飾することができ、これは、以下の特性を有する：（ｉ）１対のメンバーが互いに反応する（即ち、組換え体を形成する）が、本質的にその組の他のメンバーの対と反応せず、（ｉｉ）１対のメンバー間の反応産物が、１つの操作不能なｌｏｘＰ部位（即ち、Ｃｒｅが本部位を含む組換えを実質的に触媒することができない）又は１つの活性ｌｏｘＰ部位（即ち、Ｃｒｅが本部位を含む組換えを触媒することができる）である。一態様において、後者の活性ｌｏｘＰ部位は、野生型ｌｏｘＰ部位である。このようなｌｏｘＰ部位の対を図４に示す通り操作する。単一の突然変異体ｌｏｘＰ部位（４０８）は、単一の突然変異体ｌｏｘＰ部位（４１０）を使用して組換え、二重の突然変異体ｌｏｘＰ部位（４２２）及び非突然変異体ｌｏｘＰ部位（４２４）を有する組換え体（４２０）を産生する。単一の突然変異体ｌｏｘＰ部位（４０８）は、突然変異体ＬＥ（４００）、野生型ＲＥ（４０２）及びスペーサー領域（４０２）を含む。単一の突然変異体ｌｏｘＰ部位（４１０）は、野生型ＬＥ（４１４）、突然変異体ＲＥ（４１６）及びスペーサー領域（４１８）を含む。スペーサー領域（４０２）及び（４１８）は、一般的に（必然ではないが）、１対の相互作用する（又は適合する）部位内で同じ配列を有する。一態様において、非相互作用するｌｏｘＰ部位は、異なる配列を有するスペーサー領域を有する。突然変異体ｌｏｘＰ部位（４０８）及び（４１０）のＣｒｅ触媒された組換えは、２つの分離ｌｏｘＰ部位を含む産物（４２０）を産生（４２５）し、この場合、両方の突然変異体アームを合わせ、両方の野生型アームを合わせる。二重の鎖突然変異体ｌｏｘＰが産生される場合は常に、この部位が追加のＣｒｅ触媒された組換えに対して実質的に操作不能であるように、突然変異体ｌｏｘＰ部位を選択する。これにより、連続部位特異的組換えの後の手順においてＣｒｅを使用する場合、その部位を含めて望ましくない組換えを防止する。別の態様において、組換え体（４２０）の第２のｌｏｘＰ部位（これは、一般的に野生型ｌｏｘＰ部位である）は、他の適合性ｌｏｘＰ部位（例えば、同じスペーサー領域を有する）で完全に活性する。従って、このような部位を使用して更なるセグメントを置換ゲノムに追加する場合もあれば、このような部位の対を使用して、例えば、リコンビナーゼ介在性カセット交換（ＲＭＣＥ）型の反応において、置換ゲノムの断片を交換する場合もある（参考として援用される、Ｓｅｉｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３６：１７４０−１７４７  （１９９７）；及びＢｏｄｅ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，９９２，２３５号）。
【００３６】
多くの突然変異体ｌｏｘＰ部位を本発明の使用に利用できる。例えば、本発明で使用される場合がある６つの突然変異体スペーサー部位については、以下の参考文献に記載されている：例えば、参考として援用される、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４，  ２２８７−２３００  （１９８６）；Ｇｅｎｅ２１６，  ５５−６５  （１９９８）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０，  ３０６７−３０７７  （２００２）；及び米国特許第６，４６５，２５４号。追加のｌｏｘＰ突然変異体は、種々のスクリーニング法により得られる場合がある（例えば、参考として援用される、Ｍｉｓｓｉｒｌｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．（前記）；Ｌａｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３０：３０６７−３０７７  （２００２）等に開示）。表Ｉは、公表されているｌｏｘＰ部位を記載する。以下の一般式は、本発明において使用することができるｌｏｘＰ部位の対の一般的な記載を提供し、図１Ａ〜１Ｅに示す通り、この場合、１対の第１のメンバーは、
ＬＥ１−Ｓ１−ＲＥ１
の通りに定義され、その対の第２メンバーは、
ＬＥ２−Ｓ２−ＲＥ２
の通りに定義される。
式中：
ＬＥ１は、突然変異体又は野生型左末端ｌｏｘＰ部位Ｃｒｅ認識配列であり、ＲＥ１は、突然変異体又は野生型右末端ｌｏｘＰ部位Ｃｒｅ認識配列であり、この場合、ＬＥ１が野生型配列である場合は常に、ＲＥ１が突然変異体配列であり、ＬＥ１が突然変異体である場合は常に、ＲＥ１は野生型配列であり；
ＬＥ２は、突然変異体又は野生型左末端ｌｏｘＰ部位Ｃｒｅ認識配列であり、ＲＥ２は、突然変異体又は野生型右末端ｌｏｘＰ部位Ｃｒｅ認識配列であり、この場合、ＬＥ２が野生型配列である場合は常に、ＲＥ２が突然変異体配列であり、ＬＥ２が突然変異体配列である場合は常に、ＲＥ２が野生型配列であり：但し、ＬＥ１が突然変異体配列である場合は常に、ＬＥ２が野生型配列であることを除き；
Ｓ１及びＳ２は、適合性非広域のｌｏｘＰスペーサー領域である。本明細書で使用される、ｌｏｘＰスペーサー配列に関する「非広域」とは、このような配列（又は非自己組換えする配列の対）を含むｌｏｘＰ部位が他のスペーサー配列を含むｌｏｘＰ部位と実質的に未反応又は非交差反応であることを意味する。一態様において、非広域は、このような配列又は配列の対が、一般式ＮＮＮＴＡＮＮＮにより定義される組から選択されたスペーサーを有する他のｌｏｘＰ部位１００以下と交差反応し、別の態様において、このような交差反応がこのような部位５０以下で、別の態様において、このような交差反応がこのような部位２０以下で、及び別の態様において、このような交差反応がこのような部位１０以下で行われることを意味する。
【００３７】
一態様において、ＬＥ１は、突然変異体配列である場合は常に、ｌｏｘ７１左末端ｌｏｘＰ部位Ｃｒｅ認識配列であり、ＲＥ１は、突然変異体配列である場合は常に、ｌｏｘ６６右末端ｌｏｘＰ部位Ｃｒｅ認識配列である。同様に、ＬＥ２は、突然変異体配列である場合は常に、ｌｏｘ７１左末端ｌｏｘＰ部位Ｃｒｅ認識配列であり、ＲＥ２は、突然変異体配列である場合は常に、ｌｏｘ６６右末端ｌｏｘＰ部位Ｃｒｅ認識配列である。
【００３８】
別の態様において、Ｓ１及びＳ２は共に、
【００３９】
【化１】
2009524406.tif 000003
からなる群から選択される同じ配列である。
【００４０】
更に別の態様において、Ｓ１及びＳ２は共に、
【００４１】
【化２】
2009524406.tif 000004
からなる群から選択される同じ配列である。
【００４２】
別の態様において、Ｓ２がＧＴＧＴＡＣＧＧである場合は常に、Ｓ１はＧＴＧＴＡＣＧＣであり、Ｓ１がＧＴＧＴＡＣＧＧである場合は常に、Ｓ２はＧＴＧＴＡＣＧＣである。
【００４３】
【表１】
2009524406.tif 000005
図３は、代表的なｐＬＯＸベクターの遺伝子マップであり、このベクターを使用して、置換ゲノムに構成する複数のセグメントを維持することができる。各ベクターは、前駆体置換ゲノムを使用して組み込むための突然変異体ｌｏｘＰ部位及び続く構成手順において次に生じるクローンを受け取るためのレシピエントｌｏｘＰ部位を有する。ベクターのレプリコン領域は、形質転換の前にＦｓｅ１消化により除去される。
【００４４】
本発明のキット
一態様において、本発明のキットは、挿入物としてセグメントを受け入れるための複数のベクターを含み、各ベクターは、少なくとも１つの組換え要素を含む。本発明の方法で使用するベクターはそれぞれ、組換え分子の存在を測定する１つ以上の選択マーカーも更に含む場合がある。本発明のキットは、キットのベクターの組換え要素を含めた組換え反応を触媒する１つ以上のリコンビナーゼ及び補助タンパク質、共因子並びに組換え反応を実施するために必要な緩衝液及び塩も更に含む場合がある。一実施形態において、本発明のキットは、少なくとも１つのＣｒｅリコンビナーゼを含む。本発明のキットは、正及び／又は負の選択の試料を含めた、所望の組換え分子を運ぶ宿主生物を選択する試料も更に含む場合がある。
又、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための材料及び試料を送達するための幾つかの送達系を含む。核酸構築物を構成する組換え反応に関して、このような送達系は、ある位置から別の位置に、反応試料（例えば、適当な容器のベクター、酵素等）及び／又は支持材料（例えば、反応を行うための指示書に書かれた緩衝液等）を保存、輸送又は送達することを可能にする系を含む。例えば、キットは、該反応試料及び／又は支持材料を含む１つ以上の封入物（例えば、箱）を含む。このような内容物を一緒に又は別々に意図されたレシピエントに送達することができる。例えば、第１の容器は、反応に使用する酵素を含むことでき、一方第２の容器はベクターを含む。
【実施例】
【００４５】
実施例１
Ｅ．  ｃｏｌｉ宿主に対するゲノムドナーとしてのＨ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの使用
本実施例において、Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを、その自由生活性状態及びその相対的に小型ゲノム（１．８３Ｍｂｐ）であることからドナー生物として選択した。使用されたＨ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株は、ＲｄＫＷ２０であり、これは、カナマイシン耐性及びＲｅｃＡ陰性（相同組換えを交絡する可能性を排除する）である。Ｅ．  ｃｏｌｉを宿主生物として選択し、具体的には、Ｋ１２のバックグランドを有する場合、ＨＭＳ１７４株（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、ＩＰＴＧ誘導性組換え体タンパク質発現を支持し、ＲｅｃＡ陰性である。Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びＥ．  ｃｏｌｉは密接に関連した共生のガンマプロテオバクテリアであり、両生物において、完全なゲノム配列が利用可能である［（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，  ４９６−５１２  （１９９５）；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７；１４５３−１４５２  （１９９７）］。
【００４６】
ＢＡＣライブラリは、Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｇＤＮＡのＭｂｏＩ部分消化から構築された。このライブラリ由来のＢＡＣクローンを高冗長度（＞２００ｘクローンカバー倍数）時にて末端配列し、Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの基準ゲノム配列にマップした。完全なオペロンを予測した場合の９５％Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅゲノム及び９８．６％Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ遺伝子を表す１９ＢＡＣクローンの最小タイリング路程を選択した。ゲノムカバー倍数を最大にし、クローン重複を最小限にし、遺伝子及び予測オペロンの破壊が最も少ないように、タイリングセットを選択した。このドナークローンの組（即ち、セグメント）を、宿主生物の再構成に使用した。又、必要な場合は、ＢＡＣタイリング路程の殆どのギャップを閉じることができる１５プラスミドの選択につながるように、プラスミドライブラリ１０ｋｂを構築し、末端配列する。
【００４７】
分析を実施し、以下を評価した：（ｉ）Ｅ．  ｃｏｌｉにおいてクローン化できないＨ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ遺伝子。物理的ギャップに存在する少なくとも２４個の存在注釈が付けられた遺伝子があり、このギャップは、最小タイリングセットのクローン間に残存する（一般的に、様々な最小タイリングセットは、このような様々な遺伝子数を有することができる）。現在選択された最小タイリングセットのこの遺伝子組において明らかなパターンはないが、ガラクトース代謝に含まれる数種類の遺伝子があり、更に数種類の未分類の遺伝子があり、これは必要ではないかもしれない。しかし、３種のリボソームタンパク質、ＧＴＰ結合タンパク質及びＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットを含めた必須タンパク質であると思われるものをコードする５種の遺伝子がある。これらの遺伝子は、最近のメタ分析の実験的及び生物情報学的手法全てから予測された２０６種の必須遺伝子の組に存在し、現在、これらの手法により、自由生活性生物の必須遺伝子の中核的な組を定義することが試みられている（Ｇｉｌ，  ｅｔ  ａｌ．，前記）。非必須毒性遺伝子を同様に無関係とすることができるが、毒性はあるが、必須であるものは、置換ゲノムに含まれる。このような遺伝子を最終的な混成生物のドナー及び宿主生物を解析する場合に利用することができる。（ｉｉ）どのクローン化Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅがＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現するのか。予測遺伝子１３５個を含む最小タイリングセットのＢＡＣクローン（Ｍ０１）の１つから、主なｃＤＮＡライブラリを構築した。合計９２１６個のＥＳＴを配列決定し、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子に対して明確にヒットした合計１２３個は、ＢＡＣＭ０１に存在した。これらのＥＳＴは、１７群に崩壊した（即ち、１７遺伝子を表す）。従って、本サンプリング手法の限界、この場合、殆どのヒットが宿主細胞（Ｅ．  ｃｏｌｉ）転写物に対するものであるにもかかわらず、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓＢＡＣでコードされた遺伝子が宿主細胞機構により転写されることは明らかである。次に、機能的発現試験を行った。注目すべきことに、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ制限系は、Ｅ．  ｃｏｌｉでクローン可能であるようであった。これは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をメチラーゼ遺伝子を使用して共転写することにより生じることができ、このメチラーゼ遺伝子は、自己消化から細胞を保護する。ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素系を、最小タイリングセットのクローンＣ０９によりコードし、ＨｉｎｄＩＩＩメチラーゼの発現により、このＥ．  ｃｏｌｉクローンから抽出されたゲノムＤＮＡを実際に保護することが実証され、それは、ＨｉｎｄＩＩＩメチラーゼがＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化に耐性があるためである。
【００４８】
実施例２
Ｅ．  ｃｏｌｉのエピソーム要素のＩｎ  ｖｉｖｏ構成
本実施例において、突然変異体ＬｏｘＰ部位を含むエピソーム要素を標準的な分子生物学的手法を使用して構築する。これらの構築物を、続けてＥ．  ｃｏｌｉ宿主に形質転換し、宿主細胞内のＣｒｅ発現の誘導により、融合を媒介する。別々に、Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅゲノムの大きなセグメントを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）を、ＲＥＤ／ＥＴ系を使用して突然変異体ｌｏｘ部位及び選択マーカーでレトロフィットする。本様式においてレトロフィットされたＢＡＣは、Ｃｒｅ発現するＲＥＤ／ＥＴのＥ．  ｃｏｌｉ宿主細胞における連続組換えに適している。
【００４９】
短鎖ＤＮＡセグメントは、一方の末端にＥｃｏＲ１適合性突出部と他方の末端にＨｉｎｄＩＩＩ適合性突出部を有し、ＬＥアーム突然変異体（ＡＴＡＡＣ対ＴＡＣＣＧ）及びスペーサー突然変異体（スペーサー２位にてＣ対Ｇ及びスペーサー７位にてＡ対Ｃ）の両方を有するＬｏｘＰ部位を含有し、このセグメントを、ＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩカット及びゲル精製したｐＥＴ１９ｂ発現ベクターにライゲーションした。このアンピシリン耐性ｐＥＴ１９ｂ構築物は、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下において、多様なクローニング領域のＮｄｅ１部位に挿入されたＣｒｅ酵素のコード配列を含む。この構築物を、ＨＭＳ  １７４  Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、ｐＥＴ１９ｂ構築物を含む一群の電気的構成要素細胞を調製した。別々に、上記部位のように同じ突然変異体のスペーサー領域及び右要素のアーム突然変異（ＧＴＴＡＴ対ＣＧＧＴＡ）を含むように相補的突然変異体ＬｏｘＰ部位を設計した。この部位を、Ｓａｃ１及びＮｏｔ１制限部位で末尾付加した末端プライマーを使用して、融合ＰＣＲによりプラスミドｐＢＲ３２２のｔｅｔＡ（テトラサイクリン耐性）遺伝子に挿入した。組み込まれたＲＥ突然変異体ｌｏｘＰ部位を有するｔｅｔＡ遺伝子からなるＰＣＲ産物をＳａｃ１及びＮｏｔで消化し、ゲル精製し、次いで、Ｓａｃ１／Ｎｏｔ１消化し、ゲル精製したＢＡＣベクターのｐＥＣＢＡＣ１にライゲーションした。この構築物をＥ．  ｃｏｌｉのＤＨ１０Ｂ細胞において増殖させ、ＤＮＡをアルカリ溶解により分離し、すでに、ｐＥＴ１９ｂＬＥ突然変異体ＬｏｘＰ構築物を保有する電気的構成要素ＨＭＳ  １７４  Ｅ．  ｃｏｌｉ宿主細胞に形質転換した。細胞は、最初、ＩＰＴＧ及びアンピシリンを含む固体培地上で成長後、採取し、テトラサイクリン及びフザリン酸を含むプレートに移した。フザリン酸は、機能的ｔｅｔＡ遺伝子を発現する細胞に毒性がある。ｐＥＣＢＡＣ１構築物は、ｐＥＣＢＡＣ１及びｐＥＴ１９ｂ構築物を結合するＣｒｅ介在性組換え上において、ｔｅｔＡ遺伝子に組み込まれたＲＥ突然変異体ＬｏｘＰ部位を含むため、ｐＥＣＢＡＣ１ｔｅｔＡ挿入物を破壊し、組換え体がフザリン酸含有固体培地上で成長することを可能にする。合計９６個のクローンを、ｐＥＴ１９ｂ構築物のＣｒｅ遺伝子に相補的な左プライマー及びｐＥＣＢＡＣ１構築物のｔｅｔＡ遺伝子の領域に相補的な右プライマーを使用してコロニーＰＣＲによる組換えにおいてスクリーニングした。スクリーニングされた９６個クローンのうち２個に、期待された接合断片が認められた。続くこれらの陽性クローンの配列決定は、ｔｅｔＡ及びＣｒｅ遺伝子の融合及び単一アーム突然変異体ｌｏｘＰ部位の野生型部位への変換を示し、従って、ｉｎ  ｖｉｖｏ組換えの成功を実証した。
【００５０】
ＲＥＤ／ＥＴ系を使用して、突然変異体ＬｏｘＰ部位を有するＨ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅゲノムの大きな（１０４ｋｂｐ）セグメントを含むＢＡＣ（ＢＡＣＩ）をレトロフィットした。二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＬＥアーム突然変異（ＡＴＡＡＣ対ＴＡＣＣＧ）を有するＬｏｘＰ部位、野生型スペーサー領域及び一方の末端にＥｃｏＲ１適合性突出部と他方の末端にＨｉｎｄＩＩＩ適合性突出部を含むように調製した。このオリゴヌクレオチドをＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩカット及びゲル精製したｐＥＴ１９ｂベクターにライゲーションした。続けて、挿入されたＬＥ突然変異体ＬｏｘＰ部位の隣にアンピシリン耐性のβラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子を含むこのｐＥＴ１９ｂ構築物のセグメントをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーを、ｐＥＣＢＡＣ１ベクターの骨格の非必須セグメントに相同な４４ｂｐ配列で末尾付加した。Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＢＡＣＩを電気的構成要素ＥＬ３５０細胞に形質転換した。これらの細胞は、アラビノース誘導性プロモーターの制御下のＣｒｅ遺伝子及び温度感受性リプレッサーの制御下のエキソ、ベータ及びガンマ遺伝子をコードするバクテリオファージのラムダゲノムのセグメントを運ぶ（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ，  ２０００）。クロラムフェニコール耐性ｐＥＣＢＡＣ１のＨ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅゲノムセグメント１０４ｋｂｐを運ぶ熱誘導された電気構成要素ＥＬ３５０細胞を調製し、ｂｌａ遺伝子、突然変異体ｌｏｘ部位及びｐＥＣＢＡＣ１相同アームを含むＰＣＲ産物を使用して形質転換した。形質転換された細胞をクロラムフェニコール及びアンピシリンを含む固体培地に入れる。多くのコロニーを選定し、突然変異体ＬｏｘＰカセット挿入の標的化により、配列を実証した。
【００５１】
Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ前駆体ゲノム構成において、Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢＡＣ最小タイリング路程（ＢＡＣＩＩ）に隣接するクローンを、相補的ＬｏｘＰ部位を含むカセットを使用してレトロフィットする。二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＲＥアーム突然変異体（ＧＴＴＡＴ対ＣＧＧＴＡ）、野生型スペーサー領域及びＳｐｅ１適合性突出部を有するＬｏｘＰ部位を含むように調製する。このオリゴヌクレオチドをＳｐｅ１カット及びゲル精製したｐＧＰＳ１．１ベクターにライゲーションした。続けて、挿入されたＲＥ突然変異体ＬｏｘＰ部位の隣にカナマイシン耐性遺伝子を含有しているこのｐＧＰＳ１．１構築物のセグメントを、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーを、上記の通り、ｐＥＣＢＡＣ１ベクターの骨格の非必須セグメントに相同な４４ｂｐ配列で末尾付加した。ＢＡＣＩＩを電気構成要素ＥＬ３５０細胞に形質転換し、クロラムフェニコール耐性ｐＥＣＢＡＣ１のＨ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅセグメントを運ぶ熱誘導された電気構成要素ＥＬ３５０細胞を調製後、カナマイシン耐性遺伝子、ＲＥ突然変異体ｌｏｘ部位及びｐＥＣＢＡＣ相同性アームを含むＰＣＲ産物を形質転換し、このカセットをＢＡＣＩＩに組み込む。
【００５２】
ＲＥｌｏｘＰレトロフィットＢＡＣＩＩを含む細胞を成長させ、ＢＡＣ  ＤＮＡを標準的なアルカリ溶解手法により分離し、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により精製した。ＬＥｌｏｘＰレトロフィットされたＢＡＣＩを含む電気構成要素ＥＬ３５０細胞を調製し、精製レトロフィットされたＢＡＣＩＩ  ＤＮＡで形質転換し、Ｃｒｅ遺伝子発現の誘導と二重抗生物質（アンピシリン及びカナマイシン）においてＬ（＋）アラビノース存在下の液体培地で成長させ、この二重抗体は、宿主細胞のレトロフィットＢＡＣＩ及びレトロフィットＢＡＣＩＩ両方を維持し、組換えを可能にするために必要である。ＢＡＣベクターのＦレプリコンにより、１個又は２個のコピーのみが細胞当たりに存在するようにストリンジェントなコピー数の制御を維持する。細胞を入れ、コロニーを選定し、ＢＡＣ１／ＢＡＣＩＩ融合の存在をスクリーニングし、これは、モジュラー型ゲノム構築プロセスの最初の組換え前駆体ゲノムを表す。統合されたＢＡＣの２つのゲノムセグメントの方向は、ＢＡＣ、ＢＡＣＩ及びＢＡＣＩＩ源に取り込まれるＬｏｘＰ部位のスペーサー領域の方向を定義することにより予め決定した。組換え後、統合された環状ＤＮＡ分子（ＢＡＣＩ／ＩＩ）は、１つの反応性野生型ＬｏｘＰ部位、不活性二重アーム突然変異体ＬｏｘＰ部位、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子及びｐＥＣＢＡＣ１ベクター骨格の２つの並列コピーを有する。ＲＥＤ／ＥＴ組換えを使用して、野生型ＬｏｘＰ部位及び隣接する抗生物質耐性マーカーを新しいカセットと置換し、このカセットは、新しいＬＥアーム突然変異体ｌｏｘＰ部位及び以前に使用されていない抗生物質耐性マーカー、例えば、ゼオシン耐性遺伝子又はゲンタマイシン耐性遺伝子を含む。タイリング路程の次に隣接するクローン（ＢＡＣＩＩＩ）は、上記の通り、相補的ＲＥアーム突然変異体部位及び抗生物質耐性遺伝子とレトロフィットし、これは、ＢＡＣ１／ＩＩ又は異なる抗生物質耐性遺伝子から取り出された抗生物質耐性遺伝子であってよい。ＤＮＡは、ＢＡＣＩＩＩから調製され、ＢＡＣＩ／ＩＩを保有する宿主細胞に形質転換される。細胞を、Ｃｒｅ遺伝子発現の誘導及び適当な二重抗生物質においてＬ（＋）アラビノース存在下の液体培地で成長させ、宿主細胞のＢＡＣＩ／ＩＩ及びＢＡＣＩＩＩ両方を維持し、これらの組換えを可能にする。この様式において、タイリング路程のゲノムが完全に再構成されるまで、又は所望の再構成の状態が実現するまで、タイリング路程の各ＢＡＣを、成長する前駆体ゲノムに追加する。
【００５３】
定義
本明細書において使用される核酸化学、生化学、遺伝学及び分子生物学の用語及び記号は、当分野の標準的な学術論文及びテキストのものに従う（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１）；Ｇａｉｔ，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８４）等）。
【００５４】
「アンプリコン」は、ポリヌクレオチド増幅反応の産物を意味する。即ち、それは、１群のポリヌクレオチドであり、一般的に二本鎖であり、これは、１つ以上の出発配列から複製される。この１つ以上の出発配列は、同じ配列の１つ以上のコピーであってよく、又はそれは、異なる配列の混合物であってよい。アンプリコンを、種々のアンプリコン反応により産生することができ、その産物は、多様な１つ以上の標的核酸の複製である。一般的に、アンプリコンを産生する増幅反応は、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのどちらかの反応物質の塩基対の「鋳型主導（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｒｉｖｅｎ）」であり、反応産物の生成に必要とされる鋳型ポリヌクレオチドの補体を有する。一態様において、鋳型主導反応は、核酸ポリメラーゼを有するプライマー伸長又は核酸リガーゼを有するオリゴヌクレオチドライゲーションである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル型増幅等を含むがこれらに限定されないこのような反応は、参考として本明細書で援用される以下の参考文献に開示されている：Ｍｕｌｌｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，９６５，１８８号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号（ＰＣＲ）；Ｇｅｌｆａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２１０，０１５号（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ”ｔａｑｍａｎ”  ｐｒｏｂｅｓ）；Ｗｉｔｔｗｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，１７４，６７０号；Ｋａｃｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，３９９，４９１号（“ＮＡＳＢＡ”）；Ｌｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号；Ａｏｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．、日本特許公開第ＪＰ  ４−２６２７９９号（ローリングサークル型増幅）等。一態様において、本発明のアンプリコンは、複数のＰＣＲにより産生される。分析化学が、増幅反応の経過時に反応産物の測定に利用可能な場合、増幅反応は「リアルタイム」増幅、例えば、以下に記載の「リアルタイムＰＣＲ」又はＬｅｏｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２６：２１５０−２１５５  （１９９８）及び同様の参考文献に記載の「リアルタイムＮＡＳＢＡ」であってよい。本明細書において使用される、「増幅する」は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」は、反応を行うために必要な反応物質全てを含む溶液を意味し、これには、反応中の選択された濃度のｐＨを維持するための緩衝剤、塩、共因子、スカベンジャー等が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
「二本鎖体」は、完全な又は部分的に相補的である少なくとも２つのオリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドを意味し、これらのヌクレオチドの全て又は殆どでワトソン−クリック型塩基対形成をなし、そのため、安定した複合体を形成する。「アニーリング」及び「ハイブリット形成」は、同義語として使用し、安定した二本鎖体の形成を意味する。一態様において、安定した二本鎖体は、二本鎖体構造がストリンジェントな洗浄、例えば、二重鎖体の鎖のＴｍを約５℃下げた温度及び低濃度の一価塩、例えば０．２Ｍ以下又は０．１Ｍ以下を含む条件により破壊されないことを意味する。二本鎖体に関する「好ましくは一致」とは、各鎖のヌクレオチドがそれぞれ他の鎖のヌクレオチドを使用してワトソン−クリック型塩基対形成をなすように、二本鎖体を構成するポリ又はオリゴヌクレオチド鎖が互いに二本鎖構造を形成することを意味する。「二本鎖体」は、ヌクレオシド類似体、例えばデオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシド、ＰＮＡ等の対形成を包含し、これを使用することができる。２つのオリゴヌクレオチド間又はポリヌクレオチド間の二本鎖体の「不一致」は、二本鎖体の１対のヌクレオチドがワトソン−クリック結合していないことを意味する。
【００５６】
「ハイブリット形成」は、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合し、安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを意味する。「ハイブリット形成」は又、三本鎖ハイブリット形成を指すことができる。（一般的に）得られた二本鎖ポリヌクレオチドは、「混成種」又は「二本鎖体」である。「ハイブリット形成条件」は、一般的に約１Ｍ以下、より一般的に約５００ｍＭ以下及び約２００ｍＭ以下の塩濃度を含む。ハイブリット形成温度は、５℃ほど低温であるが、一般的には、２２℃以上、より一般的には、約３０℃以上及び好ましくは約３７℃を超えることができる。一般的に、ハイブリット形成は、ストリンジェントな条件下、即ち、プローブがその標的配列にハイブリット形成する条件において行われる。ストリンジェントな条件は、配列依存であり、様々な状況において異なる。より長い断片は、特定のハイブリット形成において、より高いハイブリット形成温度を必要としうる。他の因子が相補鎖の塩基組成物及び長さ、有機溶媒の存在及び塩基不一致の程度を含めたハイブリット形成のストリンジェント性に影響しうる場合、何れか１つのみの絶対的な測定に比べて、パラメータの組み合わせがより重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨにて特定の配列のＴｍに比べて約５℃低く選択される。ストリンジェントな条件の例には、ｐＨ７．０〜８．３及び少なくとも２５℃にて少なくとも０．０１Ｍの塩濃度〜１Ｍ以下のＮａイオン濃度（又は他の塩）が含まれる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸Ｎａ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）及び２５〜３０℃の条件は、対立遺伝子特異的プローブハイブリット形成に適している。ストリンジェントな条件については、例えば、上記のあらゆる目的のために全体が参考として本明細書により援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ．  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；及びＡｎｄｅｒｓｏｎ  “Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  １ｓｔ  Ｅｄ．，  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （１９９９）を参照されたい。「〜に具体的にハイブリット形成する」又は「具体的に〜にハイブリット形成する」又は同様の表現は、実質的に又は唯一に特定のヌクレオチド配列又はこの配列が複合体混合物（例えば全部の細胞の）ＤＮＡ又はＲＮＡに存在する場合のストリンジェントな条件下の配列に、分子を結合、二本鎖体形成又はハイブリット形成することを指す。
【００５７】
遺伝子発現に関する「誘導性」又は「誘導的な制御」とは、遺伝子発現がプロモーター及び可能性のある調節因子により制御されることを意味し、この場合、プロモーターは特定の組の条件、例えば、ｐＨ、温度、塩濃度等の変化等の物理的条件の変化、或いは例えば、プロモーターに対する転写アクチベーターの結合に影響し、及び／又は転写アクチベーター自体の機能に影響する特定の化学信号又は化学信号の組み合わせの存在下において、転写により活性する。
【００５８】
「ライゲーション」は、鋳型主導反応において、２つ以上の核酸、例えばオリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドの末端間の共有化結合又は連結を形成することを意味する。結合又は連結の特性は、多様に変化することができ、ライゲーションを、酵素により又は化学的に実施することができる。本明細書において使用される、ライゲーションを、一般的に、酵素により実施し、一方のオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの５位の炭素間のリン酸ジエステル連鎖を他方のオリゴヌクレオチドの３位の炭素を使用して形成する。種々の鋳型主導ライゲーション反応は、参考として援用される以下の参考文献に記載される：Ｗｈｉｔｅｌｙ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８８３，７５０号；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，４７６，９３０号；Ｆｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５９３，８２６号；Ｋｏｏｌ、米国特許第５，４２６，１８０号；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，８７１，９２１号；Ｘｕ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２７：８７５−８８１  （１９９９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６８：５０−７１  （１９７９）；Ｅｎｇｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，  １５：３−２９  （１９８２）；及びＮａｍｓａｒａｅｖ、米国特許公開第２００４／０１１０２１３号。
【００５９】
「核酸構築物」は、「組換え体ＤＮＡ分子」と同意語として使用される。
【００６０】
本明細書において使用される「ヌクレオシド」は、２´デオキシ及び２´ヒドロキシ形態を含めた天然のヌクレオシドを含み、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  （Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  １９９２）に記載されている。ヌクレオシドに関する「類似体」とは、修飾塩基部分及び／又は修飾糖部分を有する合成ヌクレオシドを含み、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８０）；Ｕｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ９０：５４３−５８４  （１９９０）等により記載され、但し、これらは、特定のハイブリット形成をすることができる。このような類似体は、結合特性を高め、複雑性を少なくし、特異性を高める等のために設計された合成ヌクレオシドを含む。ハイブリット形成又はヌクレアーゼ耐性特性が高い類似体を含むポリヌクレオチドについては、Ｕｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ（前記）；Ｃｒｏｏｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ，  ６：８５５−８７０  （１９９６）；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５：３４３−３５５  （１９９５）等に記載されている。二本鎖体の安定性を高めることができるポリヌクレオチドの型の例には、オリゴヌクレオチドＮ３´→Ｐ５´ホスホルアミデート（本明細書において「アミデート」を称する）、ペプチド核酸（本明細書において「ＰＮＡ」を称する）、オリゴ−２´−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、Ｃ−５プロピニルピリミジンを含むポリヌクレオチド、固定された核酸（ＬＮＡ）及び同等の化合物がある。このようなオリゴヌクレオチドは、市販又は参考文献に記載の方法を使用して合成することができるかのどちらかである。
【００６１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、ＤＮＡ相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅における反応を意味する。換言すれば、ＰＣＲは、プライマー結合部位に隣接する標的核酸の多様なコピー又は複製を作成する反応であり、このような反応は、以下の手順を１回又は複数回反復することを含む：（ｉ）標的核酸を変性させ（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニーリングし、（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下において核酸ポリメラーゼによるプライマーを伸長させる。一般的に、この反応は、温度循環装置により、各手順に最適な様々な温度を通して循環する。特定の温度、各手順の時間及び手順間の変化の割合は、当業者に周知の多くの因子に左右され、例えば、以下の参考文献に例示される：Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｎｄ  ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９９１  ａｎｄ  １９９５，  ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）。例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲにおいて、二本鎖標的核酸は、＞９０℃にて変性し、プライマーを、５０〜７５℃にてアニーリングし、７２〜７８℃にて伸長することができる。反応は、一般的に数百ナノリットル、例えば２００ｎＬ〜数百μＬ、例えば２００μＬの量である。「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」は、同義語として使用され、それぞれは、ヌクレオチドモノマーの線状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、具体的に、モノマー対モノマーの相互作用、例えばワトソン−クリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対形成等の一定のパターンにより天然のポリヌクレオチドに結合することができる。このようなモノマー及びこれらのヌクレオシド間連鎖は、天然である場合もあれば、その類似体、例えば、天然又は非天然の類似体である場合もある。非天然の類似体は、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間連鎖、標識の付着が可能な結合基を含む塩基、例えば、フルオロフォア又はハプテン等を含む場合がある。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用が酵素によるプロセッシング、例えば、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーション等を必要とする場合は常に、当業者は、これらの例のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが何れかの又は幾つかの位置にてヌクレオシド間連鎖、糖部分又は塩基の特定の類似体を含有しないことを理解する。一般的に、ポリヌクレオチドは、少数のモノマー単位、例えば５〜４０であり、この時、一般的に、これらは数千のモノマー単位に対して「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが文字の配列（ｕｐｐｅｒ又はｌｏｗｅｒプライマーの場合）、例えば「ＡＴＧＣＣＴＧ」により表される場合は常に、他に明記されず、又は内容から明白ではない限り、ヌクレオチドが左から右の５´→３´の順序であり、「Ａ」は、デオキシアデノシンを示し、「Ｃ」は、デオキシシチジンを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを示し、「Ｔ」は、チミジンを示し、「Ｉ」はデオキシイノシンを示し、「Ｕ」は、ウリジンを表すことが理解される。他に明記されない限り、専門用語及び原子の番号付けの規則は、Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９）に開示されているものに従う。一般的に、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル連鎖により結合された４つの天然のヌクレオシド（例えば、ＤＮＡのデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又は、ＲＮＡのこれらのリボース対応物）を含む。しかし、これらは又、例えば修飾塩基、糖又はヌクレオシド間連鎖を含めた非天然のヌクレオチド類似体を含む場合がある。それは、当業者に明らかであり、この場合、酵素は、活性に必要な特定のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質、例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖体等を有し、次いで、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質の適当な組成物の選択は、当業者の周知の範囲内、特に、学術論文のガイダンス、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）及び同様の参考文献で十分に行われる。
【００６２】
「プライマー」は、天然又は合成のどちらかのオリゴヌクレオチドを意味し、即ち、ポリヌクレオチド鋳型を使用して二本鎖体を形成する場合、伸長された二本鎖体を形成するように核酸合成開始点として作用し、鋳型にそってその３´末端から伸長することができる。伸長プロセス中に追加されたヌクレオチドの配列を、鋳型ポリヌクレオチドの配列により決定する。一般的に、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。一般的に、プライマーは、１４〜３６ヌクレオチドの長さを有する。
【００６３】
「組換え要素」は、組換え反応において、ＤＮＡ配列の組換え部位である配列を意味する。組換え要素は、組換え反応に関与する別のセグメントと相同であるＤＮＡのセグメント（例えば、相同組換えの場合）であってよく、又は具体的な配列であってよく、この場合、結合されるリコンビナーゼの活性及び追加の補助因子により組換えが生じ、この補助因子は、特定の配列の全て又は一部を認識する（例えば、部位特異的組換えの場合）。一態様において、組換え要素は、部位特異的組換え系の組換え部位、例えば、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ、Ｆｌｐ−ＦＲＴ等である。
【００６４】
遺伝子発現に関する「調節因子」とは、１つ以上の遺伝子の発現に操作上、連結されるＤＮＡ配列を意味する。このような因子は、通常、発現された遺伝子に隣接して位置し、プロモーター、ターミネーター、アンチターミネーター、アクチベーター、アテニュエーター等を含んでよい（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  １９９２），  Ｍａｋｒｉｄｅｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ６０：５１２−５３８  （１９９６））。多くの場合、１つ以上の共調節遺伝子は、オペロンの同じ組の調節因子と結合する。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドセグメントに関する「合成」とは、セグメントの全て又は一部が最初に化学的に合成された１つ以上のポリヌクレオチドから構築されることを意味する。合成後、このような合成ポリヌクレオチドセグメントを、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの酵素法、例えば、従来のクローニング又は増幅、例えばＰＣＲ、ＲＣＲ等により複製することができる。本発明で使用する合成ポリヌクレオチドセグメントを構築するには、参考として本明細書で援用される以下の参考文献に記載されるものを含むがこれらに限定されない、種々の手法が使用される場合がある：Ｔｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３２：１０５０−１０５４  （２００４）；Ｓｏｌｄａｔｏｖ，  ｅｔ  ａｌ、国際特許公開第ＷＯ  ２００４／０９２３７５号；米国特許公開第２００３／０１３８７８２Ａ１号；米国特許公開第２００３／０１６５９４６Ａ１号；米国特許公開第２００５／０１０６６０６Ａ１号；国際特許公開第ＷＯ  ２００６／０４４９５６号；Ｃｌｅａｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １：２４１−２４８  （２００４）；Ｚｈｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３２：５４０９−５４１７  （２００４）；Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１６：８７９９−８８００  （１９９４）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ６８：１０１−１０７  （１９８８）；Ｋｏｄｕｍａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １０１：１５５７３−１５５７８  （２００４）；Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １００：１５４４０−１５４４５  （２００３）等。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１Ａ〜１Ｇは、宿主生物のドナーゲノムセグメントにおいて置換ゲノムに構成する幾つかの方法の概略図である。
【図２】図２は、セグメントの構成プロセスにおいて２つの正の選択マーカーを連続的に使用する代替的又は反復的な正の選択を示す。
【図３】図３は、ドナーゲノムセグメントを成長する前駆体置換ゲノムに組み込むためのｌｏｘＰ組換え要素を組み込むベクターの遺伝マップである。
【図４】図４は、組換え産物において、非突然変異部位及び二重突然変異部位を生じる２つの単一突然変異ｌｏｘＰ部位間の組換え反応を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月27日(2008.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009524406000001.app
【国際調査報告】
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