(57)【要約】    本発明は、粒子径が1000nm以下、比吸収率SARが10〜7000W/gFeの磁気粉体であるエフェクター分子と、抗体または配位子と磁気粉体とを含むガイダンス分子とを1：0.0001〜0.20の重量配合比で含有し、粒子径が2〜1000nmである、ナノ磁気粉体標的薬物及びその製造方法を提供する。当該製造方法は、磁気粉体とガイダンス分子との重量配合比を1：0.0001〜0.20とし、該磁気粉体と該ガイダンス分子とを水又は有機物質、無機物質及びそれらの混合溶液でカップリングさせてナノ磁気粉体標的薬物を得ることを含むものである。上記得られたナノ磁気粉体標的薬物は腫瘍に標的温熱、高熱磁気温熱治療及び予防を実施することができ、効率的に癌細胞を殺傷し死滅させて、悪性腫瘍を治癒することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子径が1000nm以下であり比吸収率SARが10〜7000W/gである磁気粉体であるエフェクター分子、及び、
抗体または配位子と、磁気標的機能を有する磁気粉体とを含むガイダンス分子
を1：0.0001〜0.20の質量配合比で含有すること；及び
粒子径が2〜1000nmであること
を特徴とするナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項２】
前記磁気粉体の比吸収率SARが500〜7000W/gである請求項1に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項３】
前記磁気粉体が界面活性剤及び／又は表面改質剤で変性修飾処理されたものであって、前記磁気粉体と、界面活性剤及び／又は表面改質剤との質量比が1：0.0001〜0.20である請求項1に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項４】
前記界面活性剤及び／又は表面改質剤がラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ｎ-デカン酸、有機シリコンカップリング剤、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ヌクレオチド又はポリペプチドから選ばれたいずれか1つ又は2つ以上の組み合わせである請求項1に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項５】
前記磁気粉体がフェロ磁性ナノ磁気粉体、フェリ磁性ナノ磁気粉体、または超常磁性ナノ磁気粉体である請求項1に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項６】
前記抗体が腫瘍特異的抗原、腫瘍相関抗原、イディオタイプ決定基、サイトカインの受容体を標的とし、ホルモン及び腫瘍遺伝子の生成物を標的分子とする抗体であり、異種ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体を含む請求項1に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項７】
前記配位子が、葉酸リガンド、トランスフェリン、糖類配位子、ポリペプチド、核酸とホルモン中のいずれか1つ又は2つ以上の組み合わせを含み、前記葉酸リガンドが葉酸、フォリン酸、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、テトラヒドロプテリン、プテロイルポリグルタミン酸、 2-デアミノ-ヒドロキシ葉酸、1-デアミノ-ヒドロキシ葉酸、1-脱窒素葉酸、3-脱窒素葉酸、8-脱窒素葉酸、5-メチルテトラヒドロ葉酸（5-CH3H4 folate）、5-ホルミルテトラヒドロ葉酸(5-CHOH4 folate)、抗葉酸剤であるメトトレキサート(methotrexate,MTX)及び5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸(5,10-CHH folate,DDATHF)からなる群のうちいずれか1つ又は2つ以上の組み合わせを含む請求項1に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項８】
前記抗体が抗CEA、AFP、CA19-9、CA125、PSA、Trigen、TheraCIMh-R3、Smart ID10、Vitaxin、4B5、SS1(dsFv)PE38、ABX-EGF、BrevaRex、CA15-3、PAP、CA50、hCG、SCC 、β2M、Rituxan、anti-VEGF、epratuzmab、NSE、 HER2、TPA抗体及び抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18から選択されるいずれか1つ又は2つ以上の組み合わせである請求項1に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項９】
前記磁気粉体が、表面が有機物質又は無機物質で被覆されたものである請求項1に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項１０】
前記有機物質がリポソーム、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール、グルコサン、キトサン、デキストラン又は蛋白質を含み、無機物質がシリカ、アルミナ又は金である請求項9に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項１１】
前記磁気粉体と有機物質又は無機物質との原料質量比が1：0.01〜5.0である請求項10に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項１２】
当該薬物が注射剤であり、固体又は粉末注射剤としてもよい請求項10に記載のナノ磁気粉体標的薬物。
【請求項１３】
質量配合比が1：0.0001〜0.20の磁気粉体とガイダンス分子とを、水、或いはエタノール、酢酸、トルエン、ジメチルスルホキシドという有機物質、燐酸という無機物質、又はそれらを混合してなる溶媒でカップリングさせ、ナノ磁気粉体標的薬物を得ることを含む請求項1に記載のナノ磁気粉体標的薬物の製造方法。
【請求項１４】
まず、磁気粉体と界面活性剤及び／又は表面改質剤との重量比を1：0.0001〜0.20として、前記磁気粉体をラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ｎ-デカン酸、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、有機シリコンカップリング剤、ヌクレオチド又はポリペプチドから選ばれる界面活性剤及び／又は表面改質剤により処理した後、水又は溶液中でガイダンス分子と混合することを含む請求項13に記載の製造方法。
【請求項１５】
まず、磁気粉体と有機又は無機物質包埋体との重量比を1：0.01〜5.0の重量比として、前記磁気粉体をリポソーム、ポリエチレングリコール、グルコサン、キトサン、デキストラン、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン又は蛋白質を含む有機物質又はシリカ、アルミナ、金などの無機物質で包埋した後、溶液又は水中でガイダンス分子と混合してカップリングさせることを含む請求項13に記載の製造方法。
【請求項１６】
請求項1〜12のいずれかに記載のナノ磁気粉体標的薬物を用いる腫瘍治療及び予防用薬物の製造への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍の磁気温熱治療用ナノ標的薬物及びその製造方法並びに応用に関する。即ち、高比吸収率の悪性腫瘍の磁気温熱治療用ナノ磁気粉体-抗体/配位子標的薬物及びナノ磁気粉体磁気標的薬物に関する。
【背景技術】
【０００２】
2000年に、世界中悪性腫瘍の新しい発病例が約1000万例、死亡例が620万例、罹患例が2200万例であった。2020年には、悪性腫瘍の新しい発病例が1500万例、死亡例が1000万例、罹患例が3000万例に達すると予測されている。悪性腫瘍が、新世紀における人間の最大キラーとなり、世界経済に莫大な損失を与えつつあるので、悪性腫瘍に対する新しい薬物と治療法の開発には、重大な意義がある。
【０００３】
従来の悪性腫瘍治療法として、主に手術、放射線療法と化学療法であった。一般的に、悪性腫瘍患者の10%-20%にしか手術の機会がないが、当該患者は手術による大きな苦痛を受け、手術後の再発や転移が発生しやすい。一方、放射線療法と化学療法では、ターゲットが明確ではなく、腫瘍細胞が殺されるとともに正常細胞も破壊され、毒副作用が大きい。近年、効率的、低毒性、副作用が少ない、等の特徴を有する標的薬物の出現により、放射性核種、毒素、化学療法剤、プロドラッグなどのエフェクター分子とカップリングされている抗体及び配位子の標的薬物は、広く検討並びに応用されている抗腫瘍の新規薬物と悪性腫瘍治療の新規手段となりつつあり、抗体や配位子などの標的薬物の検討及び応用は、悪性腫瘍の治療と予防に新しい機会と効果を提供している。しかし、前記標的薬物において、抗体や配位子などとカップリングしている放射性核種、毒素、化学薬物、プロドラッグなどのエフェクター分子は、依然として毒副作用が強く、臨床応用を著しく制限するという欠点があり、悪性腫瘍治療用標的薬物には、毒副作用がない新しいエフェクター分子が望まれている。
【０００４】
悪性腫瘍磁気温熱治療は、（1）磁気温熱シード（即ち、磁気粒子又は材料、例えばナノ磁気粉体である）が、体外の交番磁界による磁気温熱効果に感応できる；（2）悪性腫瘍の血流量が正常組織の血流量の10%〜15%だけであり、腫瘍を加熱した後、腫瘍周囲の正常組織の血流は速くなり、放熱が速く、昇温の幅が小さいのに対し、腫瘍内は放熱しにくく、温度が周囲の正常組織より5℃〜10℃高い；（3）正常細胞は48℃以上になると死亡してしまうが、悪性腫瘍細胞は、42℃を越えると死亡してしまい、腫瘍細胞の耐熱性が悪い；（4）低周波の交番磁界は人体組織での浸透性が良く、減衰や正常組織を損なうことなく、深部や体積の大きい腫瘍内部まで安全的・効率的に達する、という4種類の物理的および生物学的な効果によるものであり、腫瘍病巣に導入された磁気温熱シードが、磁気温熱治療計の交番磁界により、磁気ヒステリシス放熱効果を発生し、悪性腫瘍を42℃〜48℃に加熱した際、正常組織が殆ど昇温しないため、正確な位置決めと毒副作用を伴わずに選択的に悪性腫瘍を殺すことを可能とする。近年、多くの動物試験と臨床試験の研究結果により、磁気温熱治療を用いる悪性腫瘍の治療は、効率的に腫瘍を殺し、腫瘍を完全に消滅させるのみならず、毒副作用もないことが明らかになった。磁気温熱治療は広い応用の見込みがある腫瘍治療の新しい方法であり、その出現が、悪性腫瘍の安全治癒に希望を与えた。多くの研究結果により、磁気温熱治療中の磁気温熱シードは毒副作用が無い標的薬物の物理エフェクター分子であることが分かった。現在まで、依然として、磁気温熱治療中に磁気温熱シードを植え込み、局所注射などの手段で腫瘍病巣に導入する必要があり、抗体もしくは配位子と磁気温熱シード（ナノ磁気粉体である）とをカップリングさせることにより磁気温熱治療用の積極的な標的薬物を製造すること、磁気温熱シードの磁気性能を利用して磁気温熱治療用磁気標的薬物の製造が可能であること、及び薬物の積極的磁気標的機能を利用して薬物を標的の腫瘍病巣に導入し悪性腫瘍の磁気温熱治療に応用できることについては開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来技術の欠点に対して、高発熱能の悪性腫瘍の磁気温熱治療用ナノ磁気粉体-抗体標的薬物、ナノ磁気粉体-配位子標的薬物及びナノ磁気粉体磁気標的薬物であるナノ標的薬物、即ち、比吸収率やエネルギー吸収率（SAR，specific absorption rate）が高い悪性腫瘍の磁気温熱治療用の、抗体や受容体を介したナノ磁気粉体標的薬物及び磁気ガイドされるナノ磁気粉体標的薬物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のナノ磁気粉体標的薬物（ナノ磁気粉体-抗体ナノ標的薬物とナノ磁気粉体-配位子ナノ標的薬物を含む）とは、ガイダンス分子（例えば、抗体や配位子）とナノ磁気粉体（磁気温熱シード）とがカップリングしてなる積極的なナノ標的薬物である。ナノ磁気粉体標的薬物は、ナノ磁気粉体が表面変性修飾や被覆、包埋された磁気温熱治療用磁気ナノ標的薬物も指し、また、用いられるナノ磁気粉体のSARが10〜7000W/gFe、特に500〜7000W/gFeであった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は以下の技術手段で達成されたものである。
【０００８】
本発明は、粒子径が1000nm以下、比吸収率SARが10〜7000W/gFeのナノ磁気粉体であるエフェクター分子と、抗体または配位子を含み、さらに磁気標的機能を有する磁気粉体を含んでもよいガイダンス分子とを1：0.0001〜0.20の質量配合比で含有し、かつ粒子径が2〜1000nmであることを特徴とする悪性腫瘍の磁気温熱治療用ナノ標的薬物を提供する。
【０００９】
上記悪性腫瘍の磁気温熱治療用ナノ標的薬物は、前記ナノ磁気粉体と抗体或いは配位子とが溶液混合によりカップリングしてなるカップリング体からなり、前記ナノ磁気粉体が表面変性修飾や被覆、包埋されてなる磁気粒子であっても、処理されていないものであってもよい。カップリング体は、ナノ磁気粉体と抗体或いは配位子との質量配合比が1：0.0001〜0.20であり、カップリング体のナノ磁気粉体の表面にカップリングされた抗体あるいは配位子は少なくとも一つあり、複数あってもよい。カップリング体の粒子は、粒子径が2〜1000nmであり、カップリングされた抗体や配位子の生体活性を保ち、抗体や受容体を介した積極的な標的機能、磁気標的機能及びナノ粒子受動的な標的機能を有する。
【００１０】
本発明の悪性腫瘍の磁気温熱治療用ナノ磁気粉体磁気標的薬物は、主にナノ磁気粉体が表面変性や、修飾、被覆、包埋を経てなる磁気粒子、或いはそのまま処理されていないナノ磁気粉体からなる磁気粒子で構成されている。表面変性修飾や被覆、包埋を経てなる磁気粒子は、ナノ磁気粉体と表面変性修飾体との質量配合比が1：0.0001〜0.20で、ナノ磁気粉体と表面被覆体または包埋体との質量配合比は1：0.01〜5.0である。変性、修飾や被覆、包埋を経てなる磁気粒子は、粒子径が2〜1000nmであり、磁気標的機能とナノ粒子受動的な標的機能を有する。
【００１１】
本発明の標的薬物の粒子径は2〜400nmであることが好ましい。薬物の粒子径が100nm未満の場合には、ナノ標的薬物は、優れた体内血液長循環安定性があり、腫瘍のEPR効果（enhancing permeability and retention effects）を効率的に利用することができるため、通常、標的薬物の粒子径が100nm未満であるのが良い。
【００１２】
上記カップリング体又は磁気粒子と、複合溶媒及び／又は水（好ましくは、脱イオン水）を含む溶液とを混合して、ナノ標的薬物が製造される。前記のナノ標的薬物は、主に注射剤であるが、注射液は、薬物の優れた分散性と安定性が維持されて、優れた浸透性及び優れた悪性腫瘍細胞抗原または受容体との特異性と親和性とを有する。前記のナノ標的薬物は、インビボでも、インビトロでも優れた標的機能がありながら、正常細胞との交差反応がないものであった。
【００１３】
本発明のナノ標的薬物は、動静脈注射、腹腔注射および直接（低侵襲、介入、注射などを含む）導入などにより投与され、高濃度で、抗体や配位子との特異性や親和性が高い悪性腫瘍の病巣部に局在して、さらに、高濃度で、内又は外に磁石が置かれた悪性腫瘍の病巣部に局在して、積極的な標的機能と磁気標的機能を示し、そして、磁気温熱治療計の交番磁界により、腫瘍病巣部に高濃度で局在した薬物中のナノ磁気粉体が、磁気温熱効果により、腫瘍を42〜48℃及び48℃以上に加熱し、腫瘍に標的温熱や高熱磁気温熱治療と予防を行うことにより、癌細胞を効率的に殺し、悪性腫瘍を治癒することができる。貯蔵のために、本発明のナノ標的薬物は、固体や粉末状の薬物粉体として製造されても良い。
【００１４】
標的薬物の粒子径が100nm未満の場合、ナノ標的薬物は、優れた体内血液長循環の安定性を有し、且つ、腫瘍のEPR効果を効率的に利用することができるので、本発明に用いられるナノ磁気粉体の粒子の粒子径は、1〜400nmが好ましく、100nm未満がより好ましい。ナノ磁気粉体は、フェロ磁性、フェリ磁性及び超常磁性のナノ磁気粉体を含み、例えば、Fe2O3、Fe3O4、Feなどのフェロ磁性やフェリ磁性ナノ磁気粉体、及び粒子径が臨界尺寸より小さいFe2O3、Fe3O4、Feなどの超常磁性ナノ磁気粉体が挙げられる。
【００１５】
上記ナノ磁気粉体は、表面変性、修飾や被覆、包埋を経てなるものが好ましく、特にナノ磁気粉体の表面を界面活性剤/表面改質剤で変性や修飾すること、又は、有機物質/無機物質で被覆や包埋することが好ましい。ナノ磁気粉体が、例えばアニオン化表面、カチオン化表面、ノニオン化表面、又はアミノ化表面、メルカプト化表面、水酸基化表面、カルボキシ化表面、又は表面性能が親和的なポリマー表面、生体大分子表面、無機物質表面などの機能化表面、即ち小分子、大分子又は直接結合を介して、静電力、疎水作用、共有結合、ファンデルワールス力、近距離分子間力及び吸着などにより抗体、配位子とカップリングすることができる機能化表面を有する目的で、ナノ磁気粉体の表面を界面活性剤、表面改質剤で一回又は複数回変性、修飾すること又は有機物質で被覆、包埋することができる。前記界面活性剤又は表面改質剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ｎ-デカン酸、ポリエチレングリコール（PEG）、グルコサン、ポリグルタミン酸、カルボキシメチルグルコサン、アミノグルコサン、デキストラン、鉄アンモニウム（DF）、エチレンジアミン、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）、ヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）、ヌクレオチド、ポリペプチドが含まれ、カップリング剤には、3-アミノプロピル-トリメトキシシラン、アミノプロピルトリメチルシラン、γ-メチルアクリルロイルオキシプロピルトリメトキシシランが含まれ、また、その他のナノ磁気粉体表面変性修飾剤も使用することができる。ナノ磁気粉体と界面活性剤や表面改質剤の質量配合比は、1：0.0001〜0.20である。有機物質は、リポソーム、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、キトサン又は蛋白質などを含み、無機物質は、シリカ、アルミナ又は金などである。ナノ磁気粉体と有機/無機物質との質量比は1：0.01〜5.0である。
【００１６】
前記抗体は、腫瘍特異的抗原及び腫瘍相関抗原、イディオタイプ決定基、あるサイトカインの受容体、ホルモン及び一部の腫瘍遺伝子の生成物を相関ターゲット分子とする様々の抗体であり、異種ポリクローナル抗体、免疫学と細胞工学との組み合わせによるマウスモノクローナル抗体（ McAb ）および/またはヒトモノクローナル抗体（ McAb ）、例えば、一本鎖抗体（ScFv）、多価ミニ抗体、シングルドメイン抗体、ヒト化抗体とヒト抗体などが挙げられ、中でも、分子量が小さく、特異性と親和力が高い抗体Fabフラグメント又は遺伝子工学抗体などの抗体が、免疫原性、浸透性及び各種加水分解酵素に対する耐性の点で、一般的なモノクローナル抗体より好ましく、一般的なモノクローナル抗体より腫瘍部まで浸透しやすい。抗体は、抗CEA(carcinoembryonic antigen)、AFP(alpha- fetoprotein)、CA19-9(carbohydrate antigen 19-9)、CA125(cancer antigen 125)、PSA(prostate soecific antigen)、hCG(hunan chorionic gonadotropin)、Trigen、TheraCIMh-R3、Smart ID10、Vitaxin、4B5、SS1(dsFv)PE38、ABX-EGF、BrevaRex、CA15-3、PAP、CA50、SCC、β2M(β2-microglobulin)、Rituxan、anti-VEGF、epratuzmab、NSE(neuro-specific enolase)、 HER2とTPA(tissue polypeptide antigen)抗体及び抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18(humanized antibody 18)から選ばれたいずれか1つ又は2つ以上の組み合わせであるが、その他の抗体を選んで使用してもよい。
【００１７】
前記配位子は、葉酸リガンド、トランスフェリン、糖類配位子、ポリペプチド（例えば、抗体フラグメント）、核酸、ホルモン、およびその他の内因性分子などを含み、前記葉酸リガンドは、葉酸、フォリン酸、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、テトラヒドロプテリン、プテロイルポリグルタミン酸、 2-デアミノ-ヒドロキシ葉酸、1-デアミノ-ヒドロキシ葉酸、1-脱窒素葉酸、3-脱窒素葉酸、8-脱窒素葉酸、5-メチルテトラヒドロ葉酸（5-CH3H4 folate）、5-ホルミルテトラヒドロ葉酸(5-CHOH4 folate)、抗葉酸剤であるメトトレキサート(methotrexate,MTX)と5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸(5,10-CHH folate,DDATHF)等の中のいずれか1つ又は2つ以上の組み合わせであるが、その他の配位子を選んで使用してもよい。
【００１８】
前記抗体とナノ磁気粉体とのカップリングには、薬物が小分子を介して抗体と結合するグルタルアルデヒド法、無水シス-アコニット酸法、活性エステル法、N-スクシンアミド-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸（SPDP）法、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸、ヒドラジン、オリゴペプチド、ヒドラゾン誘導体法及びペプチド結合接続法など抗体の直接架橋法、又は高分子例えばグルコサン、ポリグルタミン酸、カルボキシメチルグルコサン、アミノグルコサンやポリ-ポリペプチド担体などを担体とする間接結合架橋法がある。
【００１９】
前記配位子とナノ磁気粉体とのカップリングは、配位子が小分子、大分子や直接結合により形成された吸着型カップリングや共有カップリングであり、例えば、アビジン-ビオチンの反応カップリング、アシルアミド結合でカップリングしている配位子-ナノ粒子カップリング、チオエーテル結合でカップリングしている配位子-ナノ粒子カップリング、Schiff結合でカップリングしている配位子-ナノ粒子カップリングが挙げられる。
【００２０】
一般に、前記葉酸カップリングには、リガンドである鉄アンモニウム（DF）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）とヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）が必要であり、これらのリガンド自体にアミノ基やカルボキシ基があるが、カップリングは、リガンド中のアミノ基と葉酸中のカルボキシ基との反応を利用して、リガンドが二官能性キレート剤の役割を果たし、葉酸とその他のものとを結合させることができる。リガンドにアミノ基が無い場合、葉酸分子中にエチレンジアミンやヒドラジンアームが必要となる。
【００２１】
前記の溶液混合することによるカップリングは、水又は有機物質と無機物質（例えば、エタノール、酢酸、トルエン、燐酸、ジメチルスルホキシド）及びそれらの混合溶液におけるカップリングであって、前記溶媒は有機物質、無機物質又はそれらの混合物を含み、当該有機物質はエタノール、酢酸、トルエン又はジメチルスルホキシドである。
【００２２】
前記標的薬物が注射剤においてナノ粒子として存在することは、標的薬物に優れた浸透性を与え、且つ、相関の腫瘍細胞との優れた特異性と親和性とを与えるためである。当該標的薬物は、注射により積極的に標的悪性腫瘍病巣の周囲に高濃度で局在して、当該病巣での濃度が正常組織血液中の薬物濃度の1〜1000倍になり、磁気温熱治療計の交番磁界の働きによりナノ磁気粉体のSARが10-7000W/gFeになり、中でも、磁気粉体のSARが501〜7000W/gFeであることが好適である。
【００２３】
本発明における前記ナノ磁気粉体標的薬物注射剤には、標的薬物がカップリングして製作された注射剤と使用する前に標的薬物干燥固体粉体から調製される注射剤が含まれる。
【００２４】
前記複合溶媒又は水（好ましくは脱イオン水である）による標的薬物注射剤は、標的薬物が生理食塩水、ホスフェートバッファー（PBS）、ポリエチレングリコール、ヌクレオチドなどの無機、有機、生体物質、非生体物質の複合溶媒に分散された製剤であるか、又は薬物が水、脱イオン水に分散された製剤である。但し、標的薬物と複合溶媒や水との重量比は1：0.5〜100であり、溶媒における溶質と水との重量比は1：5以下である。
【００２５】
本発明者は、ナノ磁気粉体を抗体標的薬物の毒副作用のない物理的なエフェクター分子とする新概念を提供するとともに、悪性腫瘍標的磁気温熱治療のために、ナノ磁気粉体をエフェクター分子とし、抗体や配位子を標的ガイダンス分子として、カップリングすることにより、ナノ磁気粉体-抗体ナノ標的薬物またはナノ磁気粉体-配位子ナノ標的薬物を製造する新手段、即ちナノ磁気粉体と抗体とをカップリングして、悪性腫瘍の磁気温熱治療用標的薬物を製造し、静動脈や腹腔注射により、標的薬物が積極的に腫瘍病巣を標的として局在し、体外の磁気温熱治療計の交番磁界の働きにより、病巣に局在したナノ磁気粉体が、磁気ヒステリシス発熱効果を発生して、腫瘍を42〜48℃及び48℃以上に加熱する一方で、正常組織は殆ど加熱されずに、悪性腫瘍を選択的に殺す、効率的に悪性腫瘍を殺す安全で無毒副作用の標的磁気温熱治療と予防とを実現できる新手段を提供する。また、SARが7000W/gFeとなるナノ磁気粉体の製造方法を開発した。動物実験によって、本発明のナノ標的薬物を利用して、標的による磁気温熱治療をすることで、無毒副作用で完全に悪性腫瘍を治癒することができる。
【００２６】
本発明の標的薬物は、抗体と粒子径が異なるナノ磁気粉体とをカップリングしてなるナノ粒子薬物であって、薬物がナノ化を達成したため、体内で優れた浸透性、生体適合性を有し、血液中で長循環安定性があるので、抗体にガイドされる積極的な標的機能があるだけでなく、磁気担持薬物の磁気標的機能と腫瘍のEPR効果によるナノ薬物粒子の受動的な標的機能もあり、積極的な標的機能と様々なその他標的機能の複合標的薬物である。
【００２７】
本発明の標的薬物中の抗体Fabフラグメント、遺伝子工学抗体は、分子量が小さいので、一般的なモノクローナル抗体より腫瘍部まで浸透しやすい。分子量が小さく、特異性と親和力が高い抗体を用いてなる磁気温熱治療用ナノ磁気粉体-抗体標的薬物は、より優れた浸透機能と標的機能を有する。
【００２８】
本発明の標的薬物は、ナノ磁気粉体を磁気温熱治療用磁気温熱シードとし、抗体や配位子をガイダンス分子とし、当該ナノ磁気粉体が、動静脈又は腹腔注射や導入などの投与経路で、抗体と配位子の介在などの標的機能や磁気標的機能により、薬物の積極的な標的と磁気標的により腫瘍の病巣部に局在し、磁気温熱治療計の交番磁界の働きにより、患者の病巣にあるナノ磁気粉体が著しい磁気ヒステリシス放熱効果を発生して、腫瘍の病巣を42〜95℃に速やかに昇温して、腫瘍に42〜48℃の磁気温熱治療を行うことができ、48℃を超える磁気温熱治療を行うこともできる。
【００２９】
本発明の磁気温熱治療用標的薬物の利用により、通常1回1時間又は1時間以上の磁気温熱治療で抗体との特異性と親和性が高い悪性腫瘍を効率的に殺すまたは完全になくすことができ、また、1時間や1時間以上の数回の磁気温熱治療で抗体との特異性と親和性が高い悪性腫瘍を効率的に殺すまたは完全になくすことができるが、通常、治療用薬物剤量は100mg未満である。
【００３０】
本発明の標的薬物は、抗体との特異性と親和性が高い悪性腫瘍の標的磁気温熱治療に利用できるだけでなく、抗体との特異性と親和性が高い悪性腫瘍の磁気温熱予防にも適用できる。即ち、検出されている悪性腫瘍および検出されていない悪性腫瘍の積極的な標的磁気温熱治療や、極小さい悪性腫瘍で、画像装置で検出できないような早期の悪性腫瘍の積極的な標的磁気温熱治療、幾つかの細胞しかない場合の早期の悪性腫瘍の積極的な標的磁気温熱治療、積極的な標的磁気温熱治療により転移悪性腫瘍細胞及び腫瘍栓を殺傷し死滅させる治療、および健常人の定期的及び非定期的な積極的な標的磁気温熱治療により悪性腫瘍細胞を殺傷し死滅させる予防治療に適用することができる。
【００３１】
また、本発明は、質量配合比が1：0.0001〜0.20で磁気粉体とガイダンス分子とを、水や有機物質であるエタノール、酢酸、トルエン、ジメチルスルホキシド又は無機物質である燐酸又はそれらの混合溶液を含む溶液中で、カップリングさせナノ磁気粉体標的薬物を製造する方法を提供し、中でも、前記磁気粉体を上記界面活性剤及び／又は表面改質剤により1：0.0001〜0.20の重量比で処理してから、上記溶液中にガイダンス分子と混合してカップリングさせることが好ましい。
【００３２】
さらに、本発明は、上記ナノ磁気粉体標的薬物の腫瘍治療及び予防用薬物の製造への使用を提供する。
【００３３】
本発明のナノ標的薬物は、（1）ナノ磁気粉体-抗体およびナノ磁気粉体-配位子積極的な標的薬物はナノ磁気粉体をエフェクター分子とする抗体や受容体を介した積極的な標的磁気温熱治療ナノ薬物であって、積極的な標的機能、磁気薬物の磁気標的機能とナノ担体薬物の受動的な標的機能を持つこと（前記抗体や配位子は本発明のガイダンス分子である）；（2）ナノ磁気粉体磁気標的薬物は、優れた体内生体適合性のナノ磁気粉体をエフェクター分子とする磁気介在の磁気標的磁気温熱治療ナノ薬物であること；（3）標的薬物にSARが10〜500W/gFeのナノ磁気粉体が選択的に使用されるだけでなく、使用された磁気粉体のSARが500〜7000W/gFeと高くなっても良い；SARが10〜500W/gFeのナノ磁気粉体や500〜7000W/gFeのナノ磁気粉体から調製された標的薬物はいずれも腫瘍磁気温熱治療ナノ標的薬物に適用できるが、熱エネルギー12Wで加熱することを必要とする5×6×7cm脳腫瘍磁気温熱治療に適用する場合、理論上腫瘍病巣が10 W/gFe、500 W/gFeおよび7000W/gFeの磁気粉体をそれぞれ1.2g、0.024g、0.0017g必要とし、鉄と酸化鉄の密度がそれぞれ7.9 g/cm3および5.25g/cm3である点で、理論上脳腫瘍磁気温熱治療が必要とする磁気粉体の体積が、鉄と酸化鉄でそれぞれ約150μl、3μl、0.22μlと230μl、4.6μl、0.32μlであり、500〜7000W/gFeのナノ磁気粉体から調製されたナノ標的薬物の方が治療に必要なナノ磁気粉体やナノ標的薬物がより少ないので、より高い臨床実用性と経済性があること；（4）薬物中のナノ磁気粉体は、人体や動物体への毒副作用が無く、ヒトや動物体内で生分解することができ、悪性腫瘍標的磁気温熱治療と予防に適用する際、安全で毒副作用がないこと；（5）ナノサイズのナノ磁気粉体-抗体、配位子標的薬物及びナノ磁気粉体磁気標的薬物は優れた浸透性があるため、動静脈注射、腹腔注射、又は直接（低侵襲、介入、注射などを含む）導入などの投与経路で、薬物を悪性腫瘍病巣に積極的な標的や磁気標的に局在させること；（6）本発明の悪性腫瘍の磁気温熱治療用ナノ標的薬物が悪性腫瘍積極的な標的や磁気標的磁気温熱治療と予防に適用されると、完全に悪性腫瘍とガン細胞を殺すことにより、悪性腫瘍の治療と予防に標的磁気温熱治療で完全に治愈することができる安全で毒副作用のない新規手段を提供できること；を特徴とする。
【実施例】
【００３４】
本発明の目的と技術手段をより明白に示すために、以下の実施例によりさらに詳しく説明する。
【００３５】
実施例1
粒子径の分布がそれぞれ1〜5nm、10〜20nm、20〜40nm、50〜100nm、350〜390nm又は950nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を、ナノ磁気粉体とオレイン酸ナトリウムとの質量配合比がそれぞれ1：0.0001、1：0.05、1：0.20のオレイン酸ナトリウム水溶液に加え、超音波により10分間混合した。85℃の水浴に置いて、600r/minで8時間攪拌してから、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗浄して、オレイン酸ナトリウム変性ナノ磁気粉体を得た。
【００３６】
実施例2
粒子径の分布がそれぞれ5〜10nm、50〜100nm、200〜300nm又は950nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を、ナノ磁気粉体とｎ-デカン酸との質量配合比がそれぞれ1：0.0001、1：0.01、1：0.20のｎ-デカン酸水溶液に加え、超音波により10分間混合した。70℃の水浴に置いて、1000r/minで6時間攪拌してから、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗浄して、ｎ-デカン酸変性ナノ磁気粉体を得た。
【００３７】
実施例3
粒子径の分布がそれぞれ30〜50nm、40〜80nm、50〜100nm又は250〜350nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を、ナノ磁気粉体とラウリル硫酸ナトリウムとの質量配合比がそれぞれ1：0.0001、1：0.01、1：0.20のラウリル硫酸ナトリウム水溶液に加え、超音波により10分間混合した。80℃の水浴に置いて、800r/minで1時間攪拌してから、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗浄して、ラウリル硫酸ナトリウム変性ナノ磁気粉体を得た。
【００３８】
実施例4 
粒子径の分布がそれぞれ1〜5nm、10〜20nm、20〜40nm、40〜80nm又は150〜200nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を、ナノ磁気粉体とラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムとの質量配合比がそれぞれ1：0.0001、1：0.01、1：0.20のラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液に加え、超音波により10分間混合した。85℃の水浴に置いて、500r/minで1時間攪拌してから、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗浄して、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム変性ナノ磁気粉体を得た。
【００３９】
実施例5
上記実施例1、2、3の変性ナノ磁気粉体を、それぞれナノ磁気粉体とラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムとの質量配合比がそれぞれ1：0.01、1：0.10、1：0.20のラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液に加え、超音波により10分間混合した。85℃の水浴に置いて、1000r/minで1時間攪拌してから、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗浄して、オレイン酸とラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｎ-デカン酸とラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムとラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム層の二分子層変性ナノ磁気粉体を得た。
【００４０】
実施例6
粒子径の分布がそれぞれ1〜5nm、10〜20nm、20〜40nm、40〜80nm、350〜390nm又は950nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を、ナノ磁気粉体とデキストラン（WM10000）との質量配合比がそれぞれ1：0.01、1：0.50、1：1.00、1：2.00、1：5.0のデキストラン水溶液に加え、超音波により10分間混合した。70℃の水浴に置いて、1000r/minで1時間攪拌してから、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗浄して、デキストラン被覆ナノ磁気粉体を得た。
【００４１】
実施例7
粒子径の分布がそれぞれ1〜5nm、10〜20nm、20〜40nm、40〜80nm又は350〜390nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を、ナノ磁気粉体とグルコサン40000や20000との質量配合比がそれぞれ1：0.01、1：0.50、1：1.00、1：2.00、1：5.0のグルコサン水溶液に加え、超音波により10分間混合した。70℃の水浴に置いて、1000r/minで1時間攪拌してから、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗浄して、グルコサン被覆ナノ磁気粉体を得た。
【００４２】
実施例8
粒子径の分布がそれぞれ1〜5nm、10〜20nm、20〜40nm、40〜80nm、350〜390nm又は950nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を、ナノ磁気粉体とヒト血清アルブミンとの質量配合比がそれぞれ1：0.05、1：0.20、1：1.00のヒトアルブミン水溶液に加え、超音波により10分間混合した。遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗浄して、ヒト血清アルブミン被覆ナノ磁気粉体を得た。
【００４３】
実施例9
粒子径の分布がそれぞれ1〜5nm、10〜20nm、20〜40nm、40〜80nm、350〜390nm又は950nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を、ナノ磁気粉体とキトサンとの質量配合比がそれぞれ1：0.05、1：0.20、1：1.00のキトサン水溶液に加え、超音波により10分間混合した。70℃の水浴に置いて、800r/minで1時間攪拌してから、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗浄して、キトサン被覆ナノ磁気粉体を得た。
【００４４】
実施例10
粒子径の分布がそれぞれ1〜5nm、10〜20nm、20〜40nm、40〜80nm又は350〜390nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を、ナノ磁気粉体とポリエチレングリコール2000、4000、6000、20000との質量配合比が1：0.05、1：0.20、1：0.50、1：1.00のポリエチレングリコール水溶液に加え、超音波により10分間混合した。80℃の水浴に置いて、500r/minで10時間攪拌してから、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水で十分に洗淨して、ポリエチレングリコール修飾ナノ磁気粉体を得た。
【００４５】
実施例11
モル比が2：1の大豆レシチンとコレステロールとのエタノール溶液を調製して、エタノール溶液をシリンジで速やかに1〜5nm、10〜20 nm、20〜40nm、40〜80nm又は350〜390nmのFe2O3やFe3O4やFeナノ磁気粉体を含むホスフェートバッファーに注ぎ、300、400、600rpm及び40℃でそれぞれ30分間攪拌し、エタノールを除去した。遠心により包埋されていない磁気粉体および磁気粉体を包埋していないリポソームを除去し、リポソーム包埋ナノ磁気粉体を得た。粒子径が40nm未満のナノ磁気粉体を使用すれば、平均粒子径が50nm未満のリポソーム包埋ナノ磁気粉体が得られる。
【００４６】
実施例12
20〜40nmのナノ磁気粉体をエタノール/水の比が1：1の溶液400mlに加え、超音波で10分間強力に攪拌した。さらに、体積比が2%のγ-メチルアクリルロイルオキシプロピルトリメトキシシラン（CH2C(CH3)C(O)OC3H6Si(OCH3)3、シランカップリング剤KH-570）を加え、溶媒を揮発させないように系の密閉を保ち、50℃で5時間強く攪拌し、冷却して磁気分離を行った。エタノールで洗浄し、脱イオン水で洗浄した後、ナノSiO2：ナノ磁気粉体の質量配合比がそれぞれ5.0、1.0、0.5、0.1：1となるようにナノSiO2を添加して、強力に超音波で10分間分散させ、磁気分離を行った。無水エタノールで3回洗浄し、上澄みを除去してから、1%PBSを添加し、厚みが異なるSiO2に包埋されたナノ磁気粉体を得た。
【００４７】
実施例13
0.6%HAuCl4水溶液2.5mlに、再蒸留水120mlを加え、0.2mol/lK2CO3でpH7.2に調整し、金と磁気粉体の質量配合比が5、3、0.01：1となるようにナノ磁気粉体を添加して、白燐のエチルエーテル溶液1ml(1部の白燐飽和エチルエーテル溶液あたり4部のエチルエーテル)、室温で15分間振動したところ、溶液が赤褐色になり、ワインレッドになるまで加熱して、厚みが異なるナノ金に包埋されたナノ磁気粉体を得た。
【００４８】
実施例14
上記実施例11で得られたリポソーム包埋ナノ磁気粉体と同体積の質量が2%PEG5000のPBS溶液溶液とを混合して、10℃で60分間放置した。さらに、同体積のPBS溶液を添加し、10℃で800r/minで1時間攪拌して、遠心分離により上澄みを除去し、脱イオン水でよく洗浄して、PEG修飾された体内長循環安定なリポソーム包埋ナノ磁気粉体を得た。
【００４９】
実施例15
上記実施例6における鉄含有量が20mgのデキストラン被覆ナノ磁気粉体水溶液と500mgNaIO4とを混合し、室温下遮光条件で60分間酸化させ、さらに、 20mMホウ酸ナトリウム（pH8.5）1000mlで20時間透析し、その1/10を1.0mgモノクローナル抗体HAb18の20mM NaIO4バッファー0.5mlと混合して、室温で4時間反応させ、さらに、50μlの0.25M NaBH4を用いて、4℃で30分間還元させたところ、ナノ磁気粉体の表面のデキストラングリコシル基がアルデヒド基になり、モノクローナル抗体分子のアミノ基と共有結合した。磁気分離後、脱イオン水で洗浄し、上澄みを除去してから1%PBSを添加して、ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物を得た。
【００５０】
実施例16
上記実施例7における鉄含有量が20mgのグルコサン被覆ナノ磁気粉体水溶液と500mg NaIO4とを混合し、室温下遮光条件で60分間酸化させ、 さらに、20mMホウ酸ナトリウム（pH8.5）1000mlと20時間透析し、その1/10を0.25mgモノクローナル抗体HAb18フラグメントHAb18F（ab'）2の20Mm NaIO4バッファー0.5mlと混合して、室温で4時間反応させ、さらに、50μlの0.25M NaBH4を用いて、4℃で30分間還元させた。磁気分離後、1%PBSで洗淨し、ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18フラグメントHAb18F（ab'）2ナノ標的薬物を得た。
【００５１】
実施例17
ナノ磁気粉体をエタノール/水の比例が1：1の溶液400mlに加え、超音波で10分間強力に攪拌した。さらに、体積比が2%のγ-メチルアクリルロイルオキシプロピルトリメトキシシラン（CH2C(CH3)C(O)OC3H6Si(OCH3)3、シランカップリング剤KH-570）を加え、溶媒を揮発させないように系の密閉を保ち、50℃で5時間強く攪拌し、冷却して磁気分離を行った。エタノールで洗浄し、脱イオン水で洗浄した後、磁気粉体：抗体の質量配合比がそれぞれ20：0.01、1、5、10となるようにABX-EGF抗体を添加して、強力に超音波で10分間分散させ混合し、磁気分離を行った。脱イオン水で3回洗浄し、上澄みを除去してから、1%PBSを添加し、ナノ磁気粉体-ABX-EGF抗体ナノ標的薬物を得た。
【００５２】
実施例18
抗CEA抗体3mgを一晩PBS透析させて、体積を2mlに調整して、無水エタノールで調製した20mmol/lヘテロ二機能架橋剤であるN-スクシンアミド-3- (2-ピリジルジチオ) プロピオナート（SPDP）10μlを添加し、室温でゆっくり60分間攪拌し、sephadex G25カラムで流し、PBSで溶出して、第一のピークを集め、2mlに濃縮し、ろ過で滅菌して、精製した抗CEA抗体-PDPが得られた。60Co照射で滅菌された上記実施例8のヒト血清アルブミン被覆の鉄含有量が30mgであるナノ磁気粉体を均一に3mlに分散させ、10〜20μl SPDPを添加して、60分間攪拌して、残留したSPDPを遠心により除去して、磁気粉体が被覆されたPDPが得られた。さらに、超音波で、濃度が0.05mmol/l、pH4.5の酢酸バッファー3mlに分散させ、濃度が50mmol/lになるまでジチオトレイトール（DTT）を加えて、ヒト血清アルブミン-PDPを還元させるために室温で30分間攪拌した。残留されたDTTを遠心により除去し、PBSで沈殿を洗浄して、ヒト血清アルブミン-PDP-SHメルカプト基が得られた。PBS  2mlに懸濁してから、直ちに抗CEA抗体-PDPと混合して、室温で24時間攪拌するか超音波で強力に10分間分散させ、遠心後、1%生理食塩水で沈殿を洗浄し、ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物を得た。
【００５３】
実施例19
上記実施例9の鉄が10mg含有されているキトサン被覆ナノ磁気粉体水溶液を、界面活性剤を溶解したスルホコハク酸ジエチルオクチルナトリウムのトルエン溶液に滴下して、機械的に攪拌して乳化させた。25%グルタルアルデヒド溶液を滴下して、2000r/minで機械的に攪拌しながら、1時間反応させた。反応後、エタノール、アセトン、蒸留水で繰り返し洗浄して、界面活性剤と有機溶媒を除去して、磁気分離器で磁気成分を分離し、洗浄して、4℃の蒸留水に分散して、表面に多くのアルデヒド基があるキトサン被覆ナノ磁気粉体を得た。該当ナノ磁気粉体を5%グルタルアルデヒド溶液に分散させ、室温で2時間振動させた。PBSバッファーで洗浄して、磁気粉体：抗体の質量配合比がそれぞれ20：0.01、0.1、1.0、10となるように、抗HER2抗体を添加して、4℃で12時間反応させ、PBSと0.2% NaN3の1%PBSバッファーでそれぞれ3回洗浄して、PBS  2mlに分散させて、ナノ磁気粉体-抗HER2抗体ナノ標的薬物を得た。
【００５４】
実施例20
粒子径の分布が1〜5nm、10〜20nm、20〜40nm、50〜100nm又は950nmのナノ磁気粉体（そのSARが501〜7000W/gFeである）を、脱イオン水に超音波で10分間強力に分散させ、抗体とナノ磁気粉体の質量比が0.001、0.1、1、2：10となるように、Rituxan抗体を添加して、速やかに攪拌混合して、超音波で強力に10分間混合分散させた。濃度1%のBPSを加えて、遠心して、1%PBSで3回洗浄して、ナノ磁気粉体-Rituxan抗体標的薬物を得た。
【００５５】
実施例21
上記実施例1〜5で得られた界面活性剤変性ナノ磁気粉体を脱イオン水に超音波で10分間強力に分散させ、抗体とナノ磁気粉体の質量配合比がそれぞれ0.001、0.1、1、2：10となるように抗CEA抗体を添加して、速やかに攪拌混合して、超音波で強力に10分間混合分散させた。濃度1%のBPSを加えて、遠心して、1%PBSで3回洗浄して、ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物を得た。
【００５６】
実施例22
60Co照射で滅菌された上記実施例8のヒト血清アルブミン被覆の鉄含有量が30mgのナノ磁気粉体を均一に3mlに分散させ、10〜20μl SPDPを添加して、60分間攪拌して、残留したSPDPを遠心により除去して、磁気粉体が被覆されたPDPが得られた。0.1、1.0、5.0、10mgトランスフェリンを燐酸バッファーに溶解して、質量比0.1〜50%の溶液を調製して、−20〜30℃及び800〜1200r/minで攪拌しながら、その中にSPDPカップリングナノ磁気粉体を急速に添加して、強力に超音波で分散混合し、磁気分離し、1%生理食塩水で3回洗浄し、ナノ磁気粉体-トランスフェリンナノ標的薬物を得た。
【００５７】
実施例23
−20〜30℃及び800〜1200r/minで攪拌しながら、上記実施例10のポリエチレングリコール修飾ナノ磁気粉体を、0.1、1.0、5.0、10mgトランスフェリンを燐酸バッファーに溶解してなる質量比0.1〜50%の溶液に急速に添加して、強力に超音波で分散混合し、磁気分離し、1%PBSで3回洗浄して、ナノ磁気粉体-トランスフェリンナノ標的薬物を得た。
【００５８】
実施例24
2-デアミノ-ヒドロキシ葉酸FA  13.2mgをジメチルスルホキシドDMSO  1mlに溶解して、攪拌しながら、予定量のジシクロヘキサカルボジイミドDCCとN-ヒドロキシコハク酸イミドNHSを加えて、100mgポリエチレングリコールジアミンPEG-NH2を加えて、室温で4時間反応させ、脱イオン水を5ml添加した。ろ過により不溶物を除去して、上澄みを凍結乾燥させて、エチルエーテルで乾燥物を洗浄して、黄色固体であるFA-PEG-NH2を得た。上記実施例9の、10 mgあるいは100mg含有されているキトサン被覆ナノ磁気粉体を脱イオン水1mlに溶解して、超音波で10分間分散混合して、FA-PEG-NH2 0.1mgを加えて、アミノと粒子とのカップリングにより、常温で3時間成長させ、磁気分離後、洗浄し、上澄みを除去し、生理食塩水を加えて、ナノ磁気粉体-葉酸ナノ標的薬物を得た。
【００５９】
実施例25
5-メチルテトラヒドロ葉酸FA 13.2mgをジメチルスルホキシドDMSO  1mlに溶解して、攪拌しながら、予定量のジシクロヘキサカルボジイミドDCCとN-ヒドロキシコハク酸イミドNHSを加えて、100mgポリエチレングリコールジアミンPEG-NH2を加えて、室温で4時間反応させ、脱イオン水を5ml添加した。ろ過により不溶物を除去して、上澄みを凍結乾燥させて、エチルエーテルで乾燥物を洗浄して、黄色固体であるFA-PEG-NH2を得た。上記実施例7の10 mgあるいは100mgが含有されているグルコサン被覆ナノ磁気粉体を脱イオン水1mlに溶解して、超音波で10分間分散混合して、FA-PEG-NH2 0.1mgを加えて、アミノと粒子とのカップリングにより、常温で3時間成長させ、磁気分離後、洗浄し、上澄みとカップリング葉酸で被覆されていないナノ磁気粉体を除去して、1%PBSを添加して、ナノ磁気粉体-葉酸標的薬物を得た。
【００６０】
実施例26
攪拌しながら、ジメチルスルホキシド（但し、その中にトリエチルアミン0.025mlが含まれている）1mlに溶解した葉酸50mgに適量なジシクロヘキサカルボジイミドとN-ヒドロキシコハク酸イミドNHSを加えて、室温で一晩反応させ、ろ過により反応で副生されたジシクロヘキシル尿素を除去して、減圧下乾固まで濃縮し、黄色固体の粉末である葉酸活性エステルを得た。上記実施例8の100、200または500mg鉄が含有されているヒト血清アルブミン被覆ナノ磁気粉体のコロイド水剤をpH9に調整して、適量の葉酸活性エステルのジメチルスルホン溶液を添加して、室温で攪拌した。磁気分離で集めて、1%生理食塩水で洗浄して、ナノ磁気粉体-葉酸標的薬物を得た。
【００６１】
実施例27
Mathias法（1998,Nuclear Medicine and Biology,25:585〜587を参照）により、ジエチレントリアミンペンタ酢酸-葉酸（即ちDTPA-Folate）を合成し、DTPA-Folate  10mgを1.5mlの水に溶解して、粒子径の分布が1〜5nm、5〜10nm 10〜20nm、20〜40nmや 50〜100nmのナノ磁気粉体100mgを添加し、超音波で10分間強力に分散させ、室温で400r/minで1時間攪拌した。磁気分離し、1%PBSで3回洗浄し、1%PBSを加えて、ナノ磁気粉体-葉酸標的薬物を得た。
【００６２】
以上の実施例で得られた薬物は一般的な方法で測定したところ、薬物の粒子径は2−1000nmであった。
【００６３】
実施例28
皮下に結腸癌細胞LS174Tを接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、2群につき、1匹あたりのヌードマウスに、上記実施例7で得られた鉄含有量40mg、粒子径約300〜400nmのグルコサン被覆ナノ磁気粉体の脱イオン水溶液0.2mlを静脈注射したが、その中の1群について、体外腫瘍部に0.6Tの磁界を30分間加えて、第一鉄イオンのフェナントリジン定量法で測定したところ、体外腫瘍部に磁界を加えた腫瘍部の磁気粉体含有量が磁界を加えていないものより約7倍高いものであった。
【００６４】
実施例29
皮下に結腸癌細胞LS174Tを接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、2群につき、1匹あたりのヌードマウスに、上記実施例10で得られた鉄含有量40mg、粒子径約3〜20nmのポリエチレングリコール修飾体内長循環安定なナノ磁気粉体の脱イオン水溶液0.2mlを静脈注射したが、その中の1群について、体外腫瘍部に0.8Tの磁界を30分間加えて、第一鉄イオンのフェナントリジン定量法で測定したところ、体外腫瘍部に磁界を加えた場合、50%以上のナノ磁気粉体が腫瘍部に局在した。
【００６５】
実施例30
皮下に結腸癌細胞LS174Tを接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、2群につき、1匹あたりのヌードマウスに、上記実施例14で得られた鉄含有量40mg、粒子径約50〜100nmのPEG修飾体内長循環安定なリポソーム包埋ナノ磁気粉体の脱イオン水溶液0.2mlを静脈注射したが、その中の1群について、体外で0.6Tの磁界を30分間加えて、第一鉄イオンのフェナントリジン定量法で測定したところ、体外腫瘍部に磁界を加えた腫瘍部の磁気粉体含有量が磁界を加えていないものより約9倍高いものであった。
【００６６】
実施例31
皮下に肝臓癌細胞HHCCを接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、2群につき、1匹あたりのヌードマウスに、上記実施例15で得られた鉄含有量30mg、粒子径約20〜40nmのナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物1%PBS水溶液0.2mlを静脈注射したが、その中の1群について、体外で0.3Tの磁界を60分間加えて、第一鉄イオンのフェナントリジン定量法で測定したところ、体外腫瘍部に磁界を加えた腫瘍部の磁気粉体含有量が磁界を加えていないものより約138倍高いものであった。
【００６７】
実施例32
皮下に肉腫S-180を接種された昆明種マウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、2群に付き、1匹あたりのマウスに、上記実施例23で得られた鉄含有量40mg、粒子径約10〜30nmのナノ磁気粉体-トランスフェリンナノ標的薬物の1%PBS水溶液0.2mlを静脈注射した。体外で0.3Tの磁界を30分間加えて、第一鉄イオンのフェナントリジン定量法で測定したところ、体外腫瘍部に磁界を加えた腫瘍部の磁気粉体含有量が磁界を加えていないものより約43倍高いものであった。
【００６８】
実施例33
皮下に肝臓癌細胞BEL7404を接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、2群につき、1匹あたりのヌードマウスに、上記実施例26で得られた鉄含有量40mg、粒子径約5〜30nmのナノ磁気粉体-葉酸ナノ標的薬物の生理食塩水溶液0.2mlを静脈注射したが、その中の1群について、体外で0.3Tの磁界を30分間加えて、第一鉄イオンのフェナントリジン定量法で測定したところ、体外腫瘍部に磁界を加えた腫瘍部の磁気粉体含有量が磁界を加えていないものより約31倍高いものであった。
【００６９】
実施例34
レーザー回折式粒度分布測定装置（Zetasizer3000）と高分解能透過型電子顕微鏡（JEM-2010 UHR）で、上記実施例の変性、修飾や被覆、包埋を経たナノ磁気粉体粒子、ナノ磁気粉体-抗体や配位子カップリング体の粒子の粒子径と表面変化を観察したところ、（1）上記実施例1、2、3と4では、一般に1nm未満の界面活性剤層が形成されたが、実施例5では、約1nmの界面活性剤層が形成されたこと；（2）上記実施例6、7、8、9、10と14では、約10-20nmの有機物質層が形成できたが、実施例11では、約8-10nmのリポソーム層が形成され、実施例12、13では、約5-50nmの無機物質層が形成されたこと；（3）上記実施例15、16、17、18、19、20と21のナノ磁気粉体-抗体カップリング体の粒子径がカップリングする前のナノ磁気粉体変性修飾体、被覆包埋体とヌードナノ磁気粉体より、約6〜20nmだけ増えたこと；（4）上記実施例22と23のナノ磁気粉体-トランスフェリンカップリング体の粒子径が、カップリングする前のナノ磁気粉体変性修飾体、被覆包埋体とヌードナノ磁気粉体より、約8〜20nmだけ増えたこと；（5）上記実施例24、25、26と27のナノ磁気粉体-葉酸カップリング体の粒子径がカップリングする前のナノ磁気粉体変性修飾体、被覆包埋体とヌードナノ磁気粉体より、約5〜10nmだけ増えたことを発見した。1〜40nmのナノ磁気粉体を選び製造された上記ナノ磁気粉体-抗体ナノ標的薬物、ナノ磁気粉体-配位子ナノ標的薬物の安定分散性又はナノ磁気粉体磁気ナノ標的薬物は、優れた分散性及び数ヶ月ないしは4年以上の長期間の分散安定性を有している。
【００７０】
実施例35
JEM-2010 UHR高分解能透過型電子顕微鏡で分析したところ、上記実施例では、粒子径が約10nmの超常磁性ナノ磁気粉体と抗CEA抗体、抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18フラグメントHAb18F（ab'）2と抗HER2抗体などからなるナノ標的薬物（カップリング体）の粒子径が約20nmであり、薬物中のナノ磁気粉体と抗体とが優れたカップリングを形成することがができ、薬物におけるナノ磁気粉体の表面は、少なくとも一つの抗体をカップリングしていることがわかった。
【００７１】
実施例36
上記実施例で得られた標的薬物とナノ磁気粉体変性修飾体、被覆包埋体は、長期貯蔵と使用上の便宜上の濃度を経て、凍結乾燥を経て使用される。実際に使用する場合、それぞれの上記標的薬物の凍結乾燥粉を、脱イオン水、1%  PBS水溶液、1%生理食塩水溶液またはヌクレオチド水溶液（但し、注射剤溶媒に、脱イオン水とヌクレオチドの重量比が1：0.20である）で標的薬物と脱イオン水、PBS水溶液、生理食塩水溶液、およびヌクレオチド水溶液との質量比が1：≦0.5の標的薬物注射剤に調製すればよい。同様に、上記ナノ磁気粉体変性修飾体および被覆包埋体の凍結乾燥粉に適量な水溶液を添加すれば、更なる工程に使用することができる。通常、上記実施例で得られた標的薬物は、直接に標的薬物と脱イオン水、PBS水溶液、生理食塩水溶液やヌクレオチド水溶液の質量比が1：≦0.5の標的薬物注射剤に調製して使用しても良い。
【００７２】
実施例37
（1）ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)実験で測定された粒子径が20〜70nmのナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物の免疫適格性は63%であった。（2）体外安定性の実験により、粒子径が20〜70nmのナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物注射液を37℃で24時間培養した後、生理食塩水においても、ヒト血清アルブミンにおいても、ナノ磁気粉体の脱落が5%未満であり、当該ナノ標的薬物が体外で安定であることを確認した。
【００７３】
実施例38
（1）ELISA実験で測定された粒子径が40〜80nm のナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物の免疫適格性は57%であった。（2）体外安定性の実験により、粒子径が40〜80nmのナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物注射液を37℃で24時間培養した後、生理食塩水およびヒト血清アルブミンにおいて、ナノ磁気粉体の脱落が5%未満であり、ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物が体外で安定であることを確認した。
【００７４】
実施例39
（1）粒子径が40〜80nmのフェロ磁性ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物と結腸癌細胞LS174Tを混合して、超音波の出力が1〜25Wである時、レーザー回折式粒度分布測定装置（Zetasizer2000）で測定したところ、ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物と癌細胞及びナノ磁気粉体粒子と抗体は、はずれることなく、結合した。（2）粒子径が40〜80nmのフェリ磁性ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物と結腸癌細胞LS174T、血細胞、正常肝細胞とを混合して、磁気分離を経て、結腸癌細胞LS174Tのみ磁界で滞留して、血細胞や正常肝細胞が結腸癌細胞LS174Tと完全に分離した。実験の結果により、ナノ磁気粉体と抗CEA抗体は、強いカップリング結合力と安定性があり、ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物と結腸癌細胞LS174Tとが優れた標的性、強い親和力を持ち、血液及び肝臓などと優れた生体適合性を持つことがわかった。
【００７５】
実施例40
（1）粒子径が20〜70nmのフェロ磁性ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物とヒト肝臓癌細胞HHCCを混合して、超音波の出力が1〜25Wである時、レーザー回折式粒度分布測定装置（Zetasizer2000）で測定したところ、ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物と癌細胞及びナノ磁気粉体粒子と抗体は、はずれることなく、結合した。（2）粒子径が20〜70nmのナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物とヒト肝臓癌細胞HCC、血細胞、正常肝細胞とを混合して、磁気分離を経て、ヒト肝臓癌細胞HCCのみ磁界で滞留して、血細胞や正常肝細胞が肝臓癌細胞HHCCと完全に分離した。実験の結果により、ナノ磁気粉体と抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18は、強いカップリング結合力と安定性があり、ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物と肝臓癌細胞HHCCが優れた標的性、強い親和力を持ち、ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物が血液及び肝臓などと優れた生体適合性を持つことがわかった。
【００７６】
実施例41
皮下に結腸癌細胞LS174T腫瘍を担持したヌードマウスに、粒子径が20〜50nmの超常磁性ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物30mgを尾静脈に注射してから30分間後、殺して、腫瘍と心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って、走査型電子顕微鏡で観察した。電子顕微鏡とエネルギースペクトルによる分析結果から、ナノ標的薬物を注射されたヌードマウスの腫瘍毛細血管の血液と腫瘍組織にあるFe元素（Fe元素がナノ磁気粉体の主元素であり、ナノ磁気粉体質量の約70%を占める。）が組織中のFe、Ca、Si、Al、Mg、K、Na、P、O、Cなど10種類の主元素に占める重量比は、それぞれ、対照群（標的薬物を注射されていない群）のヌードマウスの腫瘍の毛細血管中の血液中における0.08%および0%から、腫瘍組織中における23.11%および0.83%に上昇し、標的薬物を注射されたヌードマウスの非腫瘍血管の血液中において0.14%、正常肝臓組織中において0.14%、その他の臓器中において0.14%以下と高いことがわかった。ヌードマウス腫瘍毛細血管の血液と腫瘍組織中にあるナノ標的薬物は、対照群（ナノ標的薬物を注射しされていない群）のヌードマウスの腫瘍毛細血管の血液と腫瘍組織中及びナノ標的薬物を注射されたヌードマウスの非腫瘍血管の血液と正常肝組織中のナノ標的薬物に対して、それぞれ、少なくとも289倍（対照群では、腫瘍にFeの検出ができなかったので、算出不能）及び165倍と165倍に上昇し、即ち、ナノ標的薬物は、腫瘍中における薬物含有量がその他の部位より少なくとも165倍と高くなり、ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物は、体内で著しい標的機能があり、標的薬物を高濃度で腫瘍病巣に局在させるが、その他の部位には局在させないことがわかった。
【００７７】
実施例42
皮下に肝臓癌細胞HHCC腫瘍を担持したヌードマウスに、粒子径が20〜50nm的超常磁性ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物30mgを尾静脈に注射してから30分間後、殺して、腫瘍と心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って、走査型電子顕微鏡で観察した。電子顕微鏡とエネルギースペクトルによる分析結果から、ナノ標的薬物を注射されたヌードマウスの腫瘍毛細血管の血液と腫瘍組織にあるFe元素（Fe元素がナノ磁気粉体の主元素であり、ナノ磁気粉体質量の約70%を占める）が組織中のFe、Ca、Si、Al、Mg、K、Na、P、O、Cなど10種類の主元素に占める重量比は、それぞれ、対照群（標的薬物を注射されていない群）のヌードマウスの腫瘍の毛細血管中の血液中における0.08%および0%から、腫瘍組織中における24.38%および0.76%に上昇し、標的薬物を注射されたヌードマウスの非腫瘍血管の血液中において0.14%、正常肝臓組織中において0.14%、その他の臓器中において0.14%以下と高いことがわかった。ヌードマウス腫瘍毛細血管の血液と腫瘍組織中にあるナノ標的薬物は、対照群（ナノ標的薬物を注射されていない群）のヌードマウスの腫瘍毛細血管の血液と腫瘍組織中及びナノ標的薬物を注射されたヌードマウスの非腫瘍血管の血液と正常肝組織中のナノ標的薬物に対して、それぞれ、少なくとも304倍（対照群では、腫瘍にFeの検出ができなかったので、算出不能）及び174倍と174倍に上昇し、即ち、ナノ標的薬物は、腫瘍中における薬物含有量がその他の部位より少なくとも174倍と高くなり、ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物は、体内で著しい標的機能があり、標的薬物を高濃度で腫瘍病巣に局在させるが、その他の部位には局在させないことがわかった。
【００７８】
実施例43
皮下に人胃癌細胞N87を接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに脱イオン水0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスは、腹腔に1匹あたり30〜50nm超常磁性酸化鉄ナノ磁気粉体（SARが1000W/gFeである）−抗HER2抗体ナノ標的薬物30mgを含有した注射剤0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で1時間の治療を2回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が2.36±0.53g、 第二群の腫瘍重量が0.97±0.29gであり、治療群の腫瘍抑制率が59%であり、P値が0.01未満であった。
【００７９】
実施例44
皮下に肝臓癌細胞HHCCを接種したヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに脱イオン水0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり腹腔に20〜40nm超常磁性酸化鉄（SARが2000W/gFeである）−抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物30mg を含有した注射剤0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で65分間の治療を2回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が2.97±0.65g、 第二群の腫瘍重量が1.02±0.31gであり、治療群の腫瘍抑制率が66%であり、P値が0.01未満であった。
【００８０】
実施例45
皮下にヒト肺癌A549を接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに脱イオン水0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり腹腔に50〜100nm超常磁性酸化鉄ナノ磁気粉体（SARが200W/gFeである）−抗CEA抗体ナノ標的薬物30mgを含有した注射剤0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で65分間の治療を2回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が1.97±0.53g、 第二群の腫瘍重量が0.79±0.37gであり、治療群の腫瘍抑制率が60%であり、P値が0.01未満であった。
【００８１】
実施例46
皮下に結腸癌細胞LS174Tを接種されたヌードマウス、16匹で、雌雄半分半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに脱イオン水0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり尾静脈に鉄含有量50mgの40〜80nmナノ磁気粉体（SARが300W/gFeである）−抗CEA抗体ナノ標的薬物の注射剤0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で、1時間の治療を1回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が2.97±0.65g、 第二群の腫瘍重量が0.12±0.31gであり、治療群の腫瘍抑制率が96%であり、P値が0.01未満であった。中でも、2匹のヌードマウスにおいては、腫瘍が完全に無くなり、3匹のヌードマウスにおいては、腫瘍の残った組織の病理図により、腫瘍細胞が全く全て凝固壊死となることを見つけ、2匹のヌードマウスにおいては、腫瘍の残った組織の病理図により、わずかな壊死していない腫瘍細胞があったことを見つけたという結果になった。また、治療から10日後、第二群のヌードマウスについて、体重と不良反応を観察し、また、ヌードマウスを殺した後、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って、病理観察したところ、著しい異常はなかった。動物実験の結果により、ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物で、磁気温熱治療を行なうことにより、標的、効率的、安全、無毒作用で腫瘍を殺傷し死滅させるか又は完全に無くすことが実現できることがわかった。
【００８２】
実施例47
皮下に肝臓癌細胞HHCCを接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに脱イオン水0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり鉄含有量50mgの40〜80nmナノ磁気粉体（SARが300W/gFeである）−抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18フラグメントHAb18F（ab'）2ナノ標的薬物の注射剤0.3mlを尾静脈に注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で1時間の治療を1回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が2.97±0.65g、 第二群の腫瘍重量が0.12±0.31gであり、治療群の腫瘍抑制率が96%であり、P値が0.01未満であった。中でも、2匹のヌードマウスにおいては、腫瘍が完全に無くなり、2匹のヌードマウスにおいては、腫瘍の残った組織の病理図により、腫瘍細胞が全て凝固壊死となり、3匹のヌードマウスにおいては、腫瘍の残った組織の病理図により、わずかな壊死していない腫瘍細胞があったという結果になった。また、治療から10日後、第二群のヌードマウスについて、体重と不良反応を観察したところ、著しい異常はなかった。ヌードマウスを殺した後、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って、病理観察したところ、著しい異常はなかった。動物実験の結果より、ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物で磁気温熱治療を行なうことにより、標的、効率的、安全、無毒作用で腫瘍を殺傷し死滅させるか又は完全に無くすことが実現できることがわかった。
【００８３】
実施例48
皮下に肉腫S-180を接種された昆明種マウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのマウスに生理食塩水0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり上記実施例22で得られた鉄含有量60mgの20〜50nmのナノ磁気粉体（SARが510W/gFeである）−トランスフェリンナノ標的薬物の1%PBS水溶液0.3mlを静脈注射し、体外で0.3Tの磁界を30分間与えた後、第二群のマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で1時間の治療を2回行って、治療から10日後、上記マウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が2.13±0.46g、 第二群の腫瘍重量が0.64±0.42gであり、治療群の腫瘍抑制率が70%であり、P値が0.01未満であった。
【００８４】
実施例49
皮下に結腸癌細胞LS174Tを接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに生理食塩水0.5mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり上記実施例7で得られた鉄含有量100mgの20〜30nmのグルコサン被覆ナノ磁気粉体（SARが110W/gFeである）の脱イオン水溶液0.5mlを静脈注射し、体外で0.6Tの磁界を30分間与えた後、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で2時間の治療を1回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が1.86±0.39g、 第二群の腫瘍重量が0.65±0.41gであり、治療群の腫瘍抑制率が65%であり、P値が0.01未満であった。
【００８５】
実施例50
皮下に結腸癌細胞LS174Tを接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに生理食塩水0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり上記実施例14で得られた鉄含有量60mgの10〜20nmのポリエチレングリコール修飾体内長循環安定なナノ磁気粉体（SARが210W/gFeである）の脱イオン水溶液0.3mlを静脈注射し、体外で0.8Tの磁界を30分間与えた後、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて42〜43℃で、1時間の治療を1回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が2.23±0.61g、 第二群の腫瘍重量が0.61±0.36gであり、治療群の腫瘍抑制率が73%であり、P値が0.01未満であった。
【００８６】
実施例51
皮下に結腸癌細胞LS174Tを接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに生理食塩水0.2mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり上記実施例18で得られた鉄含有量20mgの20〜40nmのナノ磁気粉体（SARが7000W/gFeである）-抗CEA抗体ナノ標的薬物の生理食塩水溶液0.2mlを静脈注射し、体外で0.3Tの磁界を60分間与えた後、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、45〜48℃で1時間の治療を1回行って、治療後の1ヵ月のうちに、腫瘍が完全になくなり、12ヵ月のうちに、腫瘍の再発や転移が見出されず、治療後のヌードマウスの体重と寿命は、腫瘍を接種されない対照群のヌードマウスと殆ど同じであった。動物実験の結果より、本発明のナノ標的薬物で磁気温熱治療を行なうことで、毒副作用がなく悪性腫瘍を完全に殺傷し死滅させるかまたは治癒できることがわかった。
【００８７】
実施例52
皮下に肉腫S-180を接種された昆明種マウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに、2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに生理食塩水0.3mlを注射し、第二群のマウスに1匹あたり上記実施例22で得られた60mgの30〜50nm超常磁性酸化鉄（SARが5000W/gFeである）−トランスフェリンナノ標的薬物の注射剤0.3mlを腹腔注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、95℃で1分間の治療を1回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が2.09±0.46g、 第二群の腫瘍重量が0.44±0.31gであり、治療群の腫瘍抑制率が79%であり、P値が0.01未満であった。
【００８８】
実施例53
皮下に肝臓癌細胞BEL7404を接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに生理食塩水0.3mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり30〜50nmの上記実施例25で得られた超常磁性酸化鉄（SARが1500W/gFeである）−葉酸ナノ標的薬物80mgを含有した注射剤0.3mlを腹腔注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で1時間の治療を1回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が2.03±0.57g、 第二群の腫瘍重量が0.54±0.36gであり、治療群の腫瘍抑制率が73%であり、P値が0.01未満であった。
【００８９】
実施例54
皮下に肝臓癌細胞BEL7404を接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに生理食塩水0.2mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり20〜40nmの上記実施例26で得られた超常磁性酸化鉄（SARが6000W/gFeである）−葉酸ナノ標的薬物50mgを含有した注射剤0.2mlを腹腔注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で1時間の治療を1回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が2.13±0.65g、 第二群の腫瘍重量が0.66±0.32gであり、治療群の腫瘍抑制率が69%であり、P値が0.01未満であった。
【００９０】
実施例55
皮下に胃癌細胞SGC-7901を接種されたヌードマウスは、16匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに生理食塩水0.2mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり20〜40nmの上記実施例27で得られたナノフェロ磁性粉体（SARが500W/gFeである）−葉酸のナノ標的薬物30mgを含有した注射剤0.2mlを腹腔注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で1時間の治療を1回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一群の腫瘍重量が1.76±0.39g、 第二群の腫瘍重量が0.58±0.41gであり、治療群の腫瘍抑制率が67%であり、P値が0.01未満であった。
【００９１】
実施例56
皮下に結腸癌細胞LS174Tを接種された雌性ヌードマウス16匹は、腫瘍が約5〜10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに2群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに生理食塩水0.2mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり鉄含有量30mg、20〜40nmの上記実施例18で得られたナノ酸化フェロ磁性粉体（SARが7000W/gFeである）−抗CEA抗体ナノ標的薬物の生理食塩水溶液0.2mlを静脈注射し、第二群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜45℃で1時間の治療を3回行って、治療後1ヵ月のうちに、腫瘍が完全になくなり、12ヵ月のうちに、腫瘍の再発や転移が見出されず、治療後のヌードマウスの体重と寿命が、腫瘍を接種されない対照群のヌードマウスと殆ど同じであった。動物実験の結果より、本発明のナノ標的薬物で磁気温熱治療を行なうことで、毒副作用がなく悪性腫瘍を完全に殺傷し死滅させるかまたは治癒できることがわかった。
【００９２】
実施例57
皮下に肝臓癌細胞BEL7404を接種されたヌードマウスは、24匹で、雌雄半々であり、腫瘍が約10mmになったとき、腫瘍体積を測定して算出後、腫瘍体積で、ランダムに3群に分けて、第一群が対照群で、1匹あたりのヌードマウスに3回で生理食塩水1.0mlを注射し、第二群のヌードマウスに1匹あたり鉄含有量100mg、400nmの上記実施例24で得られた磁気酸化鉄（磁気粉体の粒子径が約350-400nm、SARが30W/gFeである）−葉酸ナノ標的薬物の生理食塩水溶液1.0mlを3回で注射により導入し、第三群のヌードマウスに1匹あたり鉄含有量200mg、1000nmの上記実施例22で得られた磁気酸化鉄（磁気粉体の粒子径が約950-1000nm、SARが10W/gFeである）−葉酸ナノ標的薬物の生理食塩水溶液1.0mlを3回、注射により導入した。第二、三群のヌードマウスを磁気温熱治療計の交番磁界に置いて、42〜43℃で1時間の治療を2回行って、治療から10日後、上記ヌードマウスを殺して、腫瘍を分離して、腫瘍の重量を測ったところ、第一、二、三群の腫瘍重量がそれぞれ2.76±0.69g、0.24±0.16g、0.48±0.33gであり、第二治療群と第三治療群の的抑瘤率がそれぞれ91%と83%であり、いずれのP値が0.01未満であった。
【００９３】
実施例58
白マウスとモルモットは10匹ずつで、雌雄半々であり、白マウスとモルモットにそれぞれ上記実施例18のナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物0.1ｇを含有した0.5ml、1.0gを含有した 1.5mlを腹腔注射し、7日および30日の観察を経た後、不良反応と体重減量は見出されず、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って切片で病理観察したところ、著しい異常は無かった。30日の観察を経た後、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器に磁気温熱治療試験を行ったところ、放熱は無かった。一般的に、腫瘍の磁気温熱治療は、ナノ磁気粉体-抗CEA抗体ナノ標的薬物を5〜100mgだけ必要とするが、上記の初歩的な毒副実験結果より、本発明のナノ磁気粉体標的薬物は毒副作用がなく、生体分解性を有することがわかった。
【００９４】
実施例59
白マウスとモルモットは10匹ずつで、雌雄半々であり、白マウスとモルモットにそれぞれ上記実施例2のｎ-デカン酸変性ナノ磁気粉体0.3ｇを含有した0.5ml、1.0ｇを含有した1.5mlを腹腔注射し、7日および30日の観察を経た後、不良反応と体重減量は見出されず、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って切片で病理観察したところ、著しい異常は無かった。30日の観察を経た後、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器に磁気温熱治療試験を行ったところ、放熱は無かった。一般的に、腫瘍の磁気温熱治療は、ｎ-デカン酸変性ナノ磁気粉体を5〜100mgだけ必要とするが、上記の初歩的な毒副実験結果より、本発明のｎ-デカン酸変性ナノ磁気粉体は毒副作用がなく、生体分解性を有することがわかった。
【００９５】
実施例60
白マウスとモルモットは10匹ずつで、雌雄半々であり、白マウスとモルモットにそれぞれ上記実施例14のPEG修飾体内長循環安定なリポソーム包埋ナノ磁気粉体0.3gを含有した0.5ml、1.0gを含有した1.5mlを腹腔注射し、7日および30日の観察を経た後、不良反応と体重減量は見出されず、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って切片で病理観察したところ、著しい異常は無かった。30日の観察を経た後、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器に磁気温熱治療試験を行ったところ、放熱は無かった。一般的に、腫瘍の磁気温熱治療は、PEG修飾体内長循環安定なリポソーム包埋ナノ磁気粉体を5〜100mgだけ必要とするが、上記の初歩的な毒副実験結果より、本発明のPEG修飾体内長循環安定なリポソーム包埋ナノ磁気粉体は毒副作用がなく、生体分解性を有することがわかった。
【００９６】
実施例61
白マウスとモルモットは10匹ずつで、雌雄半々であり、白マウスとモルモットにそれぞれ上記実施例16のナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物0.3gを含有した0.5ml、1.0gを含有した1.5mlを腹腔注射し、7日および30日の観察を経た後、不良反応と体重減量は見出されず、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って切片で病理観察したところ、著しい異常は無かった。30日の観察を経た後、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器に磁気温熱治療試験を行ったところ、放熱は無かった。一般的に、腫瘍の磁気温熱治療は、ナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物を5〜100mgだけ必要とするが、上記の初歩的な毒副実験結果より、本発明のナノ磁気粉体-抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体HAb18ナノ標的薬物は毒副作用がなく、生体分解性を有することがわかった。
【００９７】
実施例62
白マウスとモルモットは10匹ずつで、雌雄半々であり、白マウスとモルモットにそれぞれ上記実施例22のナノ磁気粉体-トランスフェリンナノ標的薬物0.3gを含有した0.5ml、1.0gを含有した1.5mlを腹腔注射し、7日および30日の観察を経た後、不良反応と体重減量は見出されず、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って切片で病理観察したところ、著しい異常は無かった。30日の観察を経た後、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器に磁気温熱治療試験を行ったところ、放熱は無かった。一般的に、腫瘍の磁気温熱治療は、ナノ磁気粉体-トランスフェリンナノ標的薬物を5〜100mgだけ必要とするが、上記実験結果より、本発明のナノ磁気粉体-トランスフェリンナノ標的薬物は毒副作用がなく、生体分解性を有することがわかった。
【００９８】
実施例63
白マウスとモルモットは10匹ずつで、雌雄半々であり、白マウスとモルモットにそれぞれ上記実施例25のナノ磁気粉体-葉酸ナノ標的薬物0.3gを含有した0.5ml、1.0gを含有した1.5mlを腹腔注射し、7日および30日の観察を経た後、不良反応と体重減量は見出されず、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器を取って切片で病理観察したところ、著しい異常は無かった。30日の観察を経た後、殺して、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肝臓などの重要な臓器に磁気温熱治療試験を行ったところ、放熱は無かった。一般的に、腫瘍の磁気温熱治療は、ナノ磁気粉体-葉酸ナノ標的薬物を5〜100mgだけ必要とするが、上記の初歩的な毒副実験結果より、本発明のナノ磁気粉体-葉酸ナノ標的薬物は毒副作用がなく、生体分解性を有することがわかった。
【国際調査報告】
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