(57)【要約】  顕微鏡システムは、光源（１１）と、コンデンサレンズ（１３）とを有する透過照明光学系と、微分干渉観察法および変調コントラスト観察法の少なくともいずれか一方による観察が可能である２０倍以上４０倍以下の第１の乾燥系対物レンズ（１５ａ）と、微分干渉観察法による観察が可能である６０倍以上１００倍以下の第２の乾燥系対物レンズ（１５ｂ）とを備え、第１の対物レンズ（１５ａ）と第２の対物レンズ（１５ｂ）とは切り替え使用可能であることを特徴とする。
2009093530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、コンデンサレンズとを有する透過照明光学系と、
微分干渉観察法および変調コントラスト観察法の少なくともいずれか一方による観察が可能である２０倍以上４０倍以下の第１の乾燥系対物レンズと、
微分干渉観察法による観察が可能である６０倍以上１００倍以下の第２の乾燥系対物レンズとを備え、
前記第１の対物レンズと前記第２の対物レンズとは切り替え使用可能であることを特徴とする顕微授精用の顕微鏡システム。
【請求項２】
前記第２の対物レンズの開口数をＮＡとし、焦点距離をｆとし、作動距離をＷＤとしたとき、次式
０．７８≦ＮＡ＜１．０
ｆ／３  ≦ＷＤ＜２ｆ
の条件を満足することを特徴とする請求項１に記載の顕微授精用の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記第２の対物レンズを用いて微分干渉観察法による観察を行う場合に、物体面におけるシア量をＳとし、前記第２の対物レンズの開口数をＮＡとし、観察する光の波長をλとしたとき、次式
０．３≦Ｓ≦０．６１λ／ＮＡ
の条件を満足することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微授精用の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記第２の対物レンズは、カバーガラスの厚さや温度等の変化による収差変動を補正する補正環を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微授精用の顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微分干渉観察法および変調コントラスト観察法による観察を可能にした顕微授精用の顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、顕微授精法の一つとして、ＩＣＳＩ（Intra-cytoplasmic Sperm Injection：卵細胞質内精子注入法）が普及している。これは、変調コントラスト観察法（例えば、特許文献１を参照）を用いて精子の選別を行い、良好な運動性と形態とを持ちあわせた精子を卵子に注入する顕微授精法である。しかしながら、近年、ＩＶＦ（In Vitro Fertilization：体外受精）研究の進歩により、精子頭部内の空胞の有無、大きさや数等がＩＶＦ成功率に大きく関係していることが統計的に分かってきたが、この精子頭部内の空胞は従来のＩＣＳＩを行うための変調コントラスト観察法では観察が困難である。そこで、従来のＩＣＳＩに加えて、精子頭部内を詳細に観察して選別した上で顕微授精を行うＩＭＳＩ（Intra-cytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection：高倍率下で精子を選んで顕微授精を行う方法）を行える顕微鏡システムが提案されており、例えば、ＩＣＳＩに用いる変調コントラスト観察法と、ＩＭＳＩに用いる高倍対物レンズによる微分干渉観察法（例えば、特許文献２および３を参照）を併用して構成されている。【０００３】
【特許文献１】特開昭５１−１２８５４８号公報
【特許文献２】特許第３４５６２５２号公報
【特許文献２】特許第３４１５２９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上記のような顕微授精など、生物顕微鏡分野における微分干渉観察法では、できるだけ微細な構造が観察できることが求められてきたため、一般に高倍レンズでは開口数（ＮＡ）の高い、液浸系の対物レンズが用いられてきた。その結果、従来の顕微鏡システムでは、高倍対物レンズには液浸系が、中低倍対物レンズには乾燥系が用いられることとなり、液浸系の高倍対物レンズでＩＭＳＩ観察を行った後、ＩＣＳＩ観察を行う乾燥系の中低倍対物レンズに切り換える際に、浸液が妨げとなってしまい、ＩＶＦの作業性を著しく損なうという問題があった。そこで、この問題を解決するため、ＩＣＳＩ観察を行う中低倍対物レンズにも、高倍対物レンズと同様に、液浸系対物レンズを用いるシステムが提案されている。しかしながら、このシステムでは、液浸系対物レンズ同士を切り替えて使用する際に浸液の粘度に起因してサンプル（一般にはディッシュ）が移動してしまい、高倍対物レンズで選別した精子を見失ったり、浸液中に気泡等が混入したりしやすいため、対物レンズの切り替え後のＩＣＳＩ観察に著しく困難をきたすおそれがあった。【０００５】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、乾燥系の高倍対物レンズによる微分干渉観察法で精子の観察および選別を行った後、切り替えた同じく乾燥系の低倍対物レンズによる微分干渉観察法もしくは変調コントラスト観察法で卵子内への前記選別した精子の注入を行うことにより、分解能を確保しつつ顕微授精の一連の作業を的確かつ迅速に行うことができる、ＩＭＳＩ／ＩＣＳＩに好適な顕微鏡システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的を達成するため、本発明は、顕微授精用に好適な顕微鏡システムであり、光源と、コンデンサレンズとを有する透過照明光学系と、微分干渉観察法および変調コントラスト観察法の少なくともいずれか一方による観察が可能である２０倍以上４０倍以下の第１の乾燥系対物レンズと、微分干渉観察法による観察が可能である６０倍以上１００倍以下の第２の乾燥系対物レンズとを備え、前記第１の対物レンズと前記第２の対物レンズとは切り替え使用可能であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
以上説明したように、本発明によれば、適切な分解能を確保しつつ、顕微受精における一連の作業を迅速かつ的確に、作業性良く行うことができる、顕微授精用に好適な顕微鏡システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態に係る微分干渉観察法を用いた顕微鏡システムの概略断面図である。
【図２】本実施形態の顕微鏡システムに用いる別の観察法である、変調コントラスト観察法の原理を説明するための図である。
【図３】本実施形態に係る変調コントラスト観察法において、開口像と変調器との位置関係を説明するための図であり、（ａ），（ｂ），（ｃ）は図２の（ａ），（ｂ），（ｃ）にそれぞれ対応している。
【図４】本実施形態に係る変調コントラスト観察法において、（ａ）は試料の一形状例を、（ｂ）はこの試料に対応して現れる濃淡をそれぞれ示したものである。
【図５】本実施形態に係るインコヒーレント光学系のＭＴＦカーブを示す図である。
【図６】本実施形態に係る微分干渉観察法における位相試料のコントラストＭＴＦカーブを示す図である。
【図７】第１実施例に係る第２の対物レンズ（乾燥系高倍対物レンズ）の構成を示す断面図である。
【図８】第１実施例に係る第２の対物レンズの諸収差図であり、（ａ）は球面収差図、（ｂ）は非点収差図、（ｃ）は歪曲収差図である。
【符号の説明】
【０００９】
１１    光源（透過照明光学系）
１２    コレクタレンズ
１３    コンデンサレンズ（透過照明光学系）
１４    試料
１５    対物レンズ
１５ａ  （微分干渉観察法による観察が可能な）中倍対物レンズ（第１の対物レンズ）
１５ｂ  高倍対物レンズ（第２の対物レンズ）
１６  ターレット
ＢＰ１  照明側複屈折光学部材  
ＢＰ２  結像側複屈折光学部材
Ｐ    偏光子
Ａ    検光子
２２    （変調コントラスト観察法による観察が可能な）中倍対物レンズ（第１の対物レンズ）
２３    開口板
２３ａ  矩形状開口
２４  変調器
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、好ましい実施形態について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る、主として顕微授精用に好適な顕微鏡システムの概略断面図を示す。本実施形態に係る顕微鏡システムは、ＩＭＳＩ（Intra-cytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection：高倍率下で精子を選んで顕微授精を行う方法）およびＩＣＳＩ（Intra-cytoplasmic Sperm Injection：卵細胞質内精子注入法）に好適であり、図１に示すように、光源１１およびコンデンサレンズ１３とからなる透過照明光学系と、コレクタレンズ１２と、試料１４と、対物レンズ１５と、ターレット１６と、照明側複屈折光学部材ＢＰ１と、結像側複屈折光学部材ＢＰ２と、偏光子Ｐと、検光子Ａとを有する。【００１１】
図１において、光源１１からの照明光はコレクタレンズ１２によって集光された後、偏光子Ｐに入射して直線偏光に変換される。偏光子Ｐと試料１４との間の光路中には光源１１側から順に、照明側複屈折光学部材ＢＰ１と、試料１４に照明光を照射するコンデンサレンズ１３とが配置されており、偏光子Ｐを射出された直線偏光は照明側複屈折光学部材ＢＰ１に入射して複屈折作用により振動方向が互いに直交する２つの直線偏光成分に分離され、コンデンサレンズ１３に入射する。照明側複屈折光学部材ＢＰ１で分離された２光線はわずかな分離角αを持って進行し、コンデンサレンズ１３の集光作用によって互いにわずかなシア量Ｓだけ離れた平行光線となって試料１４を照明する。試料１４上のわずかに離れた位置を透過した２光線は、対物レンズ１５を介して結像側複屈折光学部材ＢＰ２に入射し、結像側複屈折光学部材ＢＰ２の複屈折作用により合成されて同一光路上を進行する。合成された光線は検光子Ａに入射し、検光子Ａによって互いに直交する直線偏光中の同一方向振動成分だけが取り出されて干渉する。その結果、試料１４内のわずかに異なる位置を透過する際に２光線間に付与された位相差に応じた干渉縞が、像面上で拡大像（干渉像）１７を形成する。観察者は図示しない接眼光学系を介して、この拡大像１７を観察することができる。【００１２】
試料１４が平面で均質の場合には、（分離した２光線の間には位相の差がないため、）拡大像１７は強度分布が一様なコントラストのない像になる。一方、試料１４が不均質で、かつ勾配や段差がある場合、（分離した２光線の間に位相差が生じるため、）拡大像１７には屈折率変化のある部分や勾配、段差に相当する部分にコントラストが生じる。よって、屈折率の変化や勾配、段差が可視化され、試料１４を拡大観察することが可能となる。【００１３】
なお、対物レンズ１５は、２０倍以上４０倍以下の第１の対物レンズ（以下、乾燥系中倍対物レンズや中倍対物レンズと称することもある）１５ａと、微分干渉観察法によるコントラスト観察が可能である６０倍以上１００倍以下の第２の対物レンズ（以下、乾燥系高倍対物レンズや高倍対物レンズと称することもある）１５ｂとからなり、これら中倍対物レンズ１５ａと高倍対物レンズ１５ｂとはターレット１６等により切り替え使用可能に構成されている。【００１４】
また、第１の対物レンズ１５ａは、上記の微分干渉観察法、もしくは変調コントラスト観察法の少なくともいずれか一方による観察が可能であることが好ましい。ここで、変調コントラスト観察法について、図２〜図４を用いてその原理を簡単に説明する。図中、２１はコンデンサレンズ、Ｓは試料、２２は対物レンズ、２３は開口板、２４は円盤状の変調器である。なお、開口板２３は、コンデンサレンズ２１の光源側焦点位置で、中心部から離れた位置に矩形状開口２３ａを有している。また、変調器２４は、開口板２３と略共役な位置に配置され、開口２３aの像を含み得る透過率１００％の領域２４ａと、例えば透過率１５％の領域２４ｂと、透過率０％の領域２４ｃとが順に隣接して配置形成されている。【００１５】
この光学系では、矩形状開口２３ａが光軸から偏心した位置に配置されているので、コンデンサレンズ２１に入射した光は試料Ｓを斜め方向から照明するように射出する。このとき、透明な試料Ｓが図２（ａ）に示すように扁平であると、試料Ｓを透過した光束は対物レンズ２２により変調器２４の領域２４ｂ内に結像し、図３（ａ）に示すように領域２４ｂ内に開口像２３ａ´が形成される。また、試料Ｓの表面が図２（ｂ）に示すように右肩上がりの斜面となっていると、試料Ｓを透過するとき光束は右方へ屈折して変調器２４の領域２４ｃ内に結像し、図３（ｂ）に示すように領域１４ｃ内に開口像２３ａ´が形成される。また、試料Ｓの表面が図２（ｃ）に示すように左肩上がりの斜面となっていると、試料Ｓを透過するとき光束は左方へ屈折して変調器２４の領域２４ａ内に結像し、図３（ｃ）に示すように領域２４ａ内に開口像２３ａ´が形成される。【００１６】
この説明で明らかなように、試料Ｓが図４（ａ）に示すような平坦面と斜面とを有する無色透明体である場合、その観察像は図４（ｂ）に示すように平坦面部分は灰色に、斜面部分は黒または白く見える。このように、変調コントラスト観察法では、変調器２４に設けた異なる透過率領域と偏斜照明の効果とにより、無色透明な試料でも陰影を持つ立体感のある像として観察することが可能となる。【００１７】
なお、本顕微鏡システムにおいて、変調コントラスト観察法によるコントラスト観察が可能な中倍対物レンズ１５ａを採用する場合は、上記した微分干渉観察法による観察のために用いた部材である、照明側複屈折光学部材ＢＰ１、結像側複屈折光学部材ＢＰ２、偏光子Ｐおよび検光子Ａに換えて、光源１１とコンデンサレンズ１３との間に（光源１１側から順に）開口板２３と変調器２４を配置すればよい。【００１８】
本実施形態に係る顕微鏡システムにおいて、乾燥系の第２の対物レンズ（高倍対物レンズ）の開口数をＮＡとし、焦点距離をｆとし、作動距離をＷＤとしたとき、次式（１）および（２）の条件式を満足することが好ましい。【００１９】
０．７８≦ＮＡ＜１．０  …（１）
ｆ／３  ≦ＷＤ＜２ｆ    …（２）【００２０】
また、前記第２の対物レンズを用いて微分干渉観察法による観察を行う場合に、物体面におけるシア量をＳとし、前記第２の対物レンズの開口数をＮＡとし、観察する光の波長をλとしたとき、次式（３）の条件式を満足することが好ましい。【００２１】
０．３≦Ｓ≦０．６１λ／ＮＡ  …（３）【００２２】
従来、生物顕微鏡の分野における、高倍（６０倍以上１００倍以下）で高開口数の液浸対物レンズによる微分干渉観察法による観察では、重要視されるのは分解性能の良さについてであり、ビデオエハンス等の画像処理手法を介在することが前提となっていた。ところが、ＩＭＳＩ等の顕微授精を行う際には、精子を高倍観察して広範囲の（多くの）精子からより良好なものを選別した後に、この選別した精子を中倍観察下で卵子に注入するという一連の作業を迅速かつ的確に行うため、あくまで目視観察が基本である。このため、目視において十分なコントラストが得られることが望まれていたが、これを満足するような微分干渉観察法による観察可能な対物レンズの最適条件の提示は今までなかった。そこで、本顕微鏡システムでは、微分干渉観察法による観察が可能な第２の対物レンズ（高倍対物レンズ）の最適な条件式（１）〜（３）を導き出した。以下、これら条件式（１）〜（３）について順に説明する。【００２３】
まず、高倍対物レンズの適切な開口数ＮＡの範囲を規定する、条件式（１）について説明する。本顕微鏡システムにおいて、観察対象である精子の頭部の大きさは４〜５μｍ程度であり、一つのピント面に頭部の空胞は１個乃至１０個程度の大小様々な大きさのものが散らばっていることが確認されている。従って、０．４〜０．５μｍ程度の大きさがコントラスト良く可視化・識別できれば、ＩＭＳＩ用途として十分使えるレベルであることが分かる。【００２４】
図５に、顕微鏡光学系で一般に用いられるインコヒーレント光学系のＭＴＦカーブ（すなわち、縦軸に示すコントラストと横軸に示す光学系の分解能との関係）を示す。なお、図５の横軸ｆ／ｆ０は、空間周波数をｆとし、対物レンズの開口数をＮＡとし、観察する光の波長をλとしたとき、空間周波数ｆをｆ０＝ＮＡ／λで規格化したものである。顕微鏡光学系の横分解能をＲＥＳとすると、前記空間周波数ｆに対応する横分解能ＲＥＳとの関係は次式（４）で示される。【００２５】
ＲＥＳ＝１／ｆ＝｛１／（ｆ／ｆ０）｝×｛λ／ＮＡ｝  …（４）【００２６】
ここで、図５に示す横軸ｆ／ｆ０の最大値＝２．０が、顕微鏡光学系における限界分解能ＲＥＳ（max）と対応している。そこで、上記の式（４）にｆ／ｆ０＝２．０を代入することにより、顕微鏡光学系における限界分解能ＲＥＳ（max）を示す、次式（５）が得られる。この条件式（５）で規定される限界分解能ＲＥＳ（max）に相当する開口数ＮＡよりもさらに余裕を持たないと、目視で像を視認することが難しい。【００２７】
ＲＥＳ（max）＝｛１／２．０｝×｛λ／ＮＡ｝＝０．５λ／ＮＡ  …（５）【００２８】
また、一般に、人間の眼は、コントラストの値が０．１以下であれば見分けることが困難であることと、コントラストの値が０．２以上であれば視感度が良いことが知られている。図５において、コントラストの値が０．１となる空間周波数ｆ／ｆ０は１．６付近であることから、横分解能ＲＥＳが０．４μｍ（観察対象である精子頭部の空胞の大きさ）となるためには、式（４）にこれらの値を代入して、次式（６）を満足する必要がある。【００２９】
ＲＥＳ＝｛１／１．６｝×｛λ／ＮＡ｝＝０．４  …（６）【００３０】
なお、本顕微鏡システムの使用目的であるＩＭＳＩやＩＣＳＩでは目視観察が前提となるため、眼の視感度を考えると、観察時の中心波長λは５００ｎｍ〜５５０ｎｍ近傍であることが望ましい。これは、５００ｎｍは暗所、５５０ｎｍは明所における眼の視感度のピークだからである。よって、観察の中心波長λ＝５００ｎｍ＝０．５μｍとして式（６）に代入すると、高倍対物レンズに必要な開口数ＮＡの最下限値として、次式（７）が得られる。【００３１】
ＮＡ＝｛１／１．６｝×０．５［μｍ］／０．４［μｍ］＝０．７８  …（７）【００３２】
また、視感度が良いとされるコントラストの値が０．２となる空間周波数ｆ／ｆ０は図５より１．４付近であることから、上記と同様に式（６）に代入すると、より好ましい開口数ＮＡの最下限値として、次式（８）が得られる。【００３３】
ＮＡ＝｛１／１．４｝×０．５［μｍ］／０．４［μｍ］＝０．８９  …（８）【００３４】
また、開口数ＮＡは、対物レンズと試料間の媒質の屈折率ｎと対物レンズの開口角φを用いるとＮＡ＝ｎ・sin（φ／２）で表され、本実施形態においては媒質が空気（屈折率ｎ＝１）である。ゆえに、開口数ＮＡの上限値は１となる。【００３５】
以上まとめると、本実施形態の顕微鏡システムにおいて、コントラスト良く目視観察可能に構成するための好ましい高倍対物レンズの開口数ＮＡの範囲は、条件式（１）すなわち０．７８≦ＮＡ＜１．０となる。さらに、より好ましくは、条件式（８）より、高倍対物レンズの開口数ＮＡの範囲は、０．８９≦ＮＡ＜１．０となる。【００３６】
次に、高倍対物レンズにおける作動距離ＷＤの適切な範囲を規定する、上記条件式（２）について説明する。従来の顕微鏡システムにおいて、高倍対物レンズとして用いられていた高開口数の液浸系対物レンズは、一般に作動距離が大きく取ることが難しかった。このため、操作時のサンプルを保温装置等により３７℃に保温することが絶対条件であるＩＣＳＩ観察やＩＭＳＩ観察で用いようとすると、高倍から中倍への対物レンズ切り替え時に対物レンズの先端部と保温装置が干渉しやすいという問題があった。また、作動距離が大きく取れないことから、高開口数の液浸系対物レンズではカバーガラス直下近傍しか観察することができず、カバーガラスから離れた位置にある精子を選別対象にすることができないという問題があった。そこで、本顕微鏡システムは、高倍の対物レンズを乾燥系レンズで構成することで、条件式（１）で示される開口数ＮＡの条件に加えて、条件式（２）で示される作動距離ＷＤが大きいという条件も兼ね備える。【００３７】
作動距離を決定する一つの要素として、対物レンズの倍率がある。対物レンズの倍率は、無限遠補正光学系の場合、結像レンズと対物レンズの焦点距離との比によって決定されるものであり（本実施形態のように６０倍以上１００倍以下の高倍対物レンズでは、例えば、結像レンズの焦点距離を２００ｍｍとすると、対物レンズの焦点距離は２．００〜３．３３ｍとなる）、高倍になるほど焦点距離は短くなる。一般に、作動距離は対物レンズの焦点距離に比例するため、対物レンズの倍率が高倍になるほど作動距離は減少する。また、作動距離を決定する他の要素として、開口数がある。開口数の大きさが同じであれば、作動距離が長くなるほど、対物レンズの第１レンズ面（物体側レンズ面）における光線高さが高くなり、収差補正をより困難にする。【００３８】
つまり、対物レンズの長作動距離化と高倍率化・高開口数化とは相反する関係にあるため、従来の顕微鏡システムにおける高倍対物レンズでは、作動距離を重視したものと、倍率・開口数を重視したものとに二極化していた。具体的には、前者では倍率６０倍／開口数０．７／作動距離２ｍｍ前後が、後者では倍率１００倍／開口数１．４／作動距離０．１ｍｍ前後が、代表的なスペックである。しかしながら、ＩＭＳＩの観察を用途とするならば、上記条件式（１）に示すように必ずしも開口数ＮＡが１を超える必要はなく、その分作動距離を長くするほうが作業効率の向上につながる。【００３９】
そこで、高倍対物レンズ（第２の対物レンズ）の開口数をＮＡとし、焦点距離をｆとし、作動距離をＷＤとしたとき、本実施形態では条件式（２）すなわちｆ／３≦ＷＤ＜２ｆを満足することが好ましい。この条件式（２）が下限値を下回ると、対物レンズの切り替え時に対物レンズの先端部が保温装置と干渉する等の不具合を引き起こす可能性が高くなる。一方、条件式（２）が上限値を上回ると、対物レンズの第１レンズ面における光線高さが高くなり過ぎて、条件式（１）で規定された開口数ＮＡを確保するのが困難となる。【００４０】
続いて、微分干渉観察法におけるシア量Ｓの最適な範囲を規定する、上記条件式（３）について説明する。図６に、シア量Ｓを１．５λ／ＮＡから０．１５λ／ＮＡまで変化させたときの位相コントラストＭＴＦカーブを示す（なお、微分干渉観察法における位相コントラストＭＴＦの算出方法については、特許文献３に詳しい）。図６において、横軸ｆ／ｆ０は空間周波数ｆを対物レンズの開口数ＮＡで規定される基準周波数ｆ０＝ＮＡ／λで規格化したものを、縦軸は各周波数における位相物体のコントラストＭＴＦを示す。【００４１】
図６から、微分干渉観察法における位相コントラストＭＴＦは、インコヒーレントＭＴＦカーブよりも大きなコントラストの値を取らないことが分かる。また、図６から、（例えば１．５λ／ＮＡのように）シア量Ｓが大きいと位相コントラストＭＴＦが負値を取ることが分かるが、これは偽解像と呼ばれる白黒が反転した状態である。一般に、微分干渉観察法による観察では、上記のような偽解像が起こらない、すなわち位相コントラストＭＴＦが負値を取らない状態が好ましいとされている。【００４２】
そこで、位相コントラストＭＴＦが負値を取らない条件を満たす、低空間周波数帯域（横軸ｆ／ｆ０の値が小さい領域）の限界についてまず考える。図６より、低空間周波数帯域の最大のシア量Ｓは、約０．６１λ／ＮＡ乃至０．５λ／ＮＡであることが分かり、これらの値はちょうど顕微鏡光学系の点分解能や線分解能に相当している。図６においてシア量Ｓが０．６１λ／ＮＡのカーブを見ると、低空間周波数帯域のコントラストの値は高いが、高空間周波数帯域の横軸ｆ／ｆ０＝１．４付近でのコントラストの値が０．１程度となり、ちょうど視認度の限界に当たることが分かる。よって、本実施形態における対物レンズのシア量Ｓの上限値は、点分解能を維持できる０．６１λ／ＮＡとなる。また、より好ましいシア量Ｓの上限値は、（前記０．６１λ／ＮＡのカーブよりインコヒーレントＭＴＦカーブにより近くであり、）線分解能を維持できる０．５λ／ＮＡとなる。【００４３】
次に、位相コントラストＭＴＦが負値を取らない条件を満たす、高空間周波数帯域（横軸ｆ／ｆ０の値が大きい領域）の限界を考える。図６より、高空間周波数帯域の最大のシア量Ｓは、横軸ｆ／ｆ０＝１．６付近で最大コントラストを取るカーブ、すなわち０．３λ／ＮＡのカーブであることが分かる。このとき、低空間周波数帯域のコントラストをある程度犠牲にする代わりに、高空間周波数帯域での視認度を、インコヒーレントＭＴＦのコントラストの値とほぼ同等の０．１に保つことができる。また、これによりもシア量Ｓを小さくすると、低空間周波数帯域でも高空間周波数帯域でもそれぞれコントラストが低下するため、本実施形態の使途には好ましくない。よって、本実施形態における対物レンズのシア量Ｓの下限値は０．３λ／ＮＡとなる。【００４４】
以上まとめると、上記条件式（３）すなわち０．３λ／ＮＡ≦Ｓ≦０．６１λ／ＮＡを満足する、より好ましくは０．３λ／ＮＡ≦Ｓ≦０．５λ／ＮＡを満足するシア量Ｓを設定することにより、微分干渉観察法において対物レンズの分解能を殆ど損なわず、且つ目視にて精子頭部内の空胞を高いコントラストで観察することが可能となる。【００４５】
なお、本実施形態に係る第２の対物レンズ（高倍対物レンズ）は、カバーガラスの厚さや温度等の変化による収差変動を補正する補正環を有することが好ましい。これは、補正環を用いることによって、カバーガラスの厚み誤差や温度等により発生した収差を打ち消し、対物レンズの解像度およびコントラストを共に最良となるところで調整をすることができるからである。
【実施例】
【００４６】
以下、本実施形態に係る第２の対物レンズ（乾燥系高倍対物レンズ）の実施例について説明する。【００４７】
（第１実施例）
第１実施例について、図７、図８及び表１を用いて説明する。図７は、本実施例に係る第２の対物レンズ（乾燥系高倍レンズ）のレンズ構成を示す断面図である。図７に示すように、本実施例に係る顕微鏡用対物レンズは、物体側より順に並んだ、物体側に凹面を向けた正メニスカスレンズＬ１と、物体側に凹面を向けた正メニスカスレンズＬ２と、両凹レンズＬ３と両凸レンズＬ４とからなる接合レンズと、両凹レンズＬ５と両凸レンズＬ６とからなる接合レンズと、平凹レンズＬ７と両凸レンズＬ８とからなる接合レンズと、両凸レンズＬ９と、像側に凹面を向けた負メニスカスレンズＬ１０と両凸レンズＬ１１と物体側に凹面を向けた負メニスカスレンズＬ１２とからなる接合レンズと、両凸レンズＬ１３と両凹レンズＬ１４とからなる接合レンズと、両凹レンズＬ１５と両凸レンズＬ１６とからなる接合レンズとを有して構成されている。なお、正メニスカスレンズＬ１の物体側には、カバーガラスＣが配置されている。【００４８】
表１は、本実施例に係る第２の対物レンズを構成する各レンズの諸元値を示している。表１に示す諸元の表において、ｍは光線の進行する方向に沿った物体側からのレンズ面の順序（以下、面番号と称する）を、ｒは各レンズの曲率半径を、ｄは各光学面から次の光学面（又は像面）までの光軸上の距離を、ｎｄはｄ線（波長587.6ｎｍ）に対する屈折率を、νｄはｄ線を基準としたアッベ数を示している。なお、表１における面番号１〜２５は、図７に示す面１〜２５に対応している。また、表中において、βは倍率を、ＷＤは作動距離を、ＮＡは開口数を表している。【００４９】
なお、表中において、曲率半径ｒ、面間隔ｄ、その他の長さの単位は、一般に「ｍｍ」が使われている。但し、光学系は、比例拡大または比例縮小しても同等の光学性能が得られるので、単位は「ｍｍ」に限定されることなく、他の適当な単位を用いることが可能である。また、表中において、曲率半径の「∞」は平面を示し、空気の屈折率「1.00000」の記載は省略している。【００５０】
（表１）
［レンズ諸元］
β＝100、ＷＤ＝1.4、ＮＡ＝0.85
ｍ          ｒ            ｄ          ｎｄ        νｄ
∞          0.17000      1.52216      58.80  （カバーガラスＣ）
∞          2.50462
１      -6.47161        2.37000      1.81600      46.621
２      -4.72849        0.10000
３      -83.0402        2.83000      1.49782      82.557
４      -10.6607        0.15000
５      -46.5266        1.00000      1.61340      44.266
６      24.27074        4.95000      1.43385      95.247
７      -14.7782        0.20000
８      -174.834        1.00000      1.61340      44.266
９      24.11495        4.95000      1.43385      95.247
１０    -14.5394        0.20000
１１        ∞          1.00000      1.61340      44.266
１２    28.67355        4.20000      1.43385      95.247
１３    -23.0153        0.20000
１４    48.93548        3.00000      1.49782      82.557
１５    -65.8669        1.52002
１６    21.78198        1.00000      1.72916      54.660
１７    11.99437        6.30000      1.49782      82.557
１８    -12.5334        1.20000      1.75500      52.318
１９    -59.9845        7.75003
２０    27.89895        3.35000      1.59240      68.328
２１    -7.03528        8.40000      1.65412      39.682
２２     5.87805        1.40000
２３    -4.44814        1.00000      1.80440      39.567
２４     11.0118        1.90000      1.92286      18.896
２５    -11.4804【００５１】
図８は、本実施例に係る顕微鏡用対物レンズの諸収差図であり、（ａ）は球面収差図、（ｂ）は非点収差図、（ｃ）は歪曲収差図を示す。また、図８において、ＮＡは開口数を、ｙは像高（ｍｍ）を、実線はｄ線（波長587.6nm）を、破線はＣ線（波長656.3nm）を、一点鎖線はＦ線（波長486.1nm）を、二点鎖線はｇ線（波長435.8nm）をそれぞれ示している。また、非点収差図において、実線はサジタル像面、破線はメリディオナル像面をそれぞれ示している。【００５２】
図８に示す各収差図から明らかであるように、本実施例に係る第２の対物レンズ（乾燥系高倍対物レンズ）は、諸収差が良好に補正され、優れた結像性能が確保されていることが分かる。【００５３】
以上説明したように、本発明によれば、乾燥系の高倍（６０倍以上１００倍以下）対物レンズによる微分干渉観察法により、精子頭部内の空胞の有無など精子の観察および選別を行った後、ターレット１６等により対物レンズの切り替えを行い、選別した精子を同じく乾燥系の中倍（２０倍以上４０倍以下）対物レンズによる微分干渉観察法もしくは変調コントラスト観察法で卵子に注入するという一連の作業を、的確かつ迅速に作業性良く行うことができる、ＩＭＳＩ／ＩＣＳＩに好適な顕微鏡システムを提供することができる。【００５４】
なお、本発明を分かりやすくするために、実施形態の構成要件を付して説明したが、本発明がこれに限定されるものではないことは言うまでもない。
【図１】
2009093530.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月12日(2010.7.12)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
６０倍以上１００倍以下の乾燥系対物レンズを用いて微分干渉観察法によって、精子を目視観察し、選別する第１のステップと、
２０倍以上４０倍以下の乾燥系対物レンズを用いて、微分干渉観察法および変調コントラスト観察法のいずれか一方によって、選別された前記精子及び卵子を目視観察し、選別された前記精子を前記卵子に注入する第２のステップと、
を順次行うことを特徴とする顕微鏡授精観察方法。
【請求項２】
前記６０倍以上１００倍以下の乾燥系対物レンズの開口数をＮＡとし、焦点距離をｆとし、作動距離をＷＤとしたとき、次式
０．７８  ≦  ＮＡ  ＜１．０
ｆ／３  ≦  ＷＤ  ＜２ｆ
の条件を満足することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡授精観察方法。
【請求項３】
前記６０倍以上１００倍以下の乾燥系対物レンズを用いて微分干渉観察法による観察を行う場合に、物体面におけるシア量をＳとし、前記６０倍以上１００倍以下の乾燥系対物レンズの開口数をＮＡとし、観察する光の波長をλとしたとき、次式
０．３  ≦  Ｓ  ≦  ０．６１λ／ＮＡ
の条件を満足することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡授精観察方法。
【請求項４】
前記６０倍以上１００倍以下の乾燥系対物レンズは、カバーガラスの厚さや温度等の変化による収差変動を補正する補正環を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡授精観察方法。
【請求項５】
光源と、コンデンサレンズとを有する透過照明光学系と、
微分干渉観察法および変調コントラスト観察法の少なくともいずれか一方による観察が可能である２０倍以上４０倍以下の第１の乾燥系対物レンズと、
微分干渉観察法による観察が可能である６０倍以上１００倍以下の第２の乾燥系対物レンズとを備え、
前記第１の対物レンズと前記第２の対物レンズとは切り替え使用可能であることを特徴とする顕微授精用の顕微鏡システム。
【請求項６】
前記第２の対物レンズの開口数をＮＡとし、焦点距離をｆとし、作動距離をＷＤとしたとき、次式
０．７８≦ＮＡ＜１．０
ｆ／３  ≦ＷＤ＜２ｆ
の条件を満足することを特徴とする請求項５に記載の顕微授精用の顕微鏡システム。
【請求項７】
前記第２の対物レンズを用いて微分干渉観察法による観察を行う場合に、物体面におけるシア量をＳとし、前記第２の対物レンズの開口数をＮＡとし、観察する光の波長をλとしたとき、次式
０．３≦Ｓ≦０．６１λ／ＮＡ
の条件を満足することを特徴とする請求項５または６に記載の顕微授精用の顕微鏡システム。
【請求項８】
前記第２の対物レンズは、カバーガラスの厚さや温度等の変化による収差変動を補正する補正環を有することを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の顕微授精用の顕微鏡システム。
【国際調査報告】
2009093530.tif 000011
2009093530.tif 000012
2009093530.tif 000013
2009093530.tif 000014