(57)【要約】  チアクミシンＢ、リピアルマイシンＡ４、およびその他の大環式化合物の少なくとも1つを含む混合物の有効量を、必要とする患者に投与することを含む、Clostridium種、Staphylococcus種、Enterococcus種およびそれらの組合せからなる群から選択される細菌の存在が引き起こす疾病または障害を治療する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チアクミシンＢの有効量、ならびに次の化合物：
【化１−１】
2009512691.tif 000032
【化１−２】
2009512691.tif 000033
【化１−３】
2009512691.tif 000034
およびそれらの組合せからなる群から選択される大環式化合物をさらに含み、式XIVの化合物が存在するとき該混合物は式XIVの化合物を約0.1重量％〜約5重量％含む混合物の有効量を、必要とする患者に投与することを含む、細菌の存在によって引き起こされる疾病または障害を治療する方法。
【請求項２】
混合物が、少なくとも90重量％のチアクミシンＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合物が、少なくとも95重量％のチアクミシンＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
混合物が、少なくとも98重量％のチアクミシンＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
混合物が、大環式化合物をさらに全部で少なくとも約1重量％含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
混合物が、大環式化合物をさらに全部で約2％〜約5％含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
混合物が、図5で実質的に示されるHPLCプロファイルを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
混合物が、約0.3〜約5重量％の式XIVの化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
混合物が、約0.3〜約3重量％の式XIVの化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
混合物が、約0.3〜約1.5重量％の式XIVの化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
混合物が、約1重量％の式XIVの化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
混合物が、次の化合物：
【化２】
2009512691.tif 000035
の少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細菌が、Clostridium種、Staphylococcus種、Enterococcus種およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
細菌が、C. difficile、C. perfringens、S. aureusおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細菌がC. difficileである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
混合物が、患者の嫌気性胃腸内微生物叢の主要なメンバーに実質的に影響を及ぼさない、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
障害または疾病の再発率が実質的に低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
疾病が下痢および大腸炎の少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
疾病が感染性の下痢である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
疾病がClostridium difficile関連の下痢である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
混合物が、該混合物を吸着するための吸着剤を含む栄養培地中で、微生物を培養し、栄養培地中に該混合物を蓄積すること；および栄養培地から該混合物を単離することを含む方法により製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
栄養培地が、約0.5〜約15重量％の吸着剤を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
吸着剤が吸着樹脂である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
吸着樹脂が、Amberlite(登録商標) XAD16、XAD16HP、XAD2、XAD7HP、XAD1180、XAD1600、IRC50およびDuolite(登録商標) XAD761からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
微生物がDactylosporangium aurantiacum亜種のhamdenensisである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
疾病が、抗生物質の使用または癌の化学療法もしくは抗ウイルス療法に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
Staphylococcus種がメチシリン耐性Staphylococcus種である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
Staphylococcus種がメチシリン耐性Staphylococcus aureusである、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
Enterococcus種がバンコマイシン耐性Enterococcusである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
混合物が、３〜１５日間にわたって、１日１〜３回、約50 mg〜1000 mgの量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
混合物が、１日１回または２回、約100 mg〜約400 mgの量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
混合物が、１日１回、約200 mgの量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
混合物が、１日２回、約200 mgの量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
患者における混合物の血漿濃度が5 ng/mLより低くなるように投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
患者の尿において、混合物の濃度が5 ng/mLより低くなるように投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
チアクミシンＢ、ならびに次の化合物：
【化３−１】
2009512691.tif 000036
【化３−２】
2009512691.tif 000037
【化３−３】
2009512691.tif 000038
およびそれらの組合せからなる群から選択される大環式化合物をさらに含み、式XIVの化合物が存在するとき、約0.1〜約5重量％の式XIVの化合物を含む医薬混合物。
【請求項３７】
少なくとも90重量％のチアクミシンＢを含む、請求項３６に記載の混合物。
【請求項３８】
少なくとも95重量％のチアクミシンＢを含む、請求項３６に記載の混合物。
【請求項３９】
全部で少なくとも1重量％の大環式化合物をさらに含む、請求項３６に記載の混合物。
【請求項４０】
全部で少なくとも約2重量％〜約5重量％の大環式化合物をさらに含む、請求項３６に記載の混合物。
【請求項４１】
混合物が、図5で実質的に示されるHPLCプロファイルを示す、請求項３６に記載の混合物。
【請求項４２】
混合物が、約0.3重量％〜約5重量％の式XIVの化合物を含む、請求項３６に記載の混合物。
【請求項４３】
混合物が、約0.3重量％〜約3重量％の式XIVの化合物を含む、請求項３６に記載の混合物。
【請求項４４】
混合物が、式XIVの化合物を約0.3重量％〜約1.5重量％含む、請求項３６に記載の混合物。
【請求項４５】
混合物が、約1重量％の式XIVの化合物を含む、請求項３６に記載の混合物。
【請求項４６】
混合物が、次の化合物：
【化４】
2009512691.tif 000039
の少なくとも１つをさらに含む、請求項３６に記載の混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2005年10月21日に出願された米国仮出願シリアル番号60/729,135および2005年12月12日に出願された米国仮出願シリアル番号60/749,641からの利益を主張する。本出願は、2002年7月29日に出願された米国仮出願シリアル番号60/399,956の利益を主張する、2003年7月15日に出願された国際出願番号PCT/US2003/021977の利益を主張する、2005年1月11日に出願された米国特許出願シリアル番号10/520,863の一部継続出願である。本出願は、2004年5月14日に出願された米国仮出願シリアル番号60/570,687の利益を主張する、2005年5月13日に出願された国際出願番号PCT/US05/16750の一部継続出願である。本出願は、さらに2005年1月31日に出願された国際出願番号PCT/US05/02887の一部継続出願である。
【０００２】
上記参照出願は、そっくりそのまま、本明細書中に参照として組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、Clostridium種、Staphylococcus種およびEnterococcus種ならびにそれらの組合せからなる群から選択される細菌の存在によって引き起こされる疾病、特にクロストリジウム  ディフィシレ（Clostridium difficile）（「C. difficile」）、Clostridium perfringens（「C. perfringens」）、Staphylococcus aureus（「S. aureus」）およびそれらの組合せからなる群から選択される細菌の存在によって引き起こされる疾病、具体的にはC. difficileの存在によって引き起こされる疾病の治療に関する。該疾病は、大腸炎、偽膜性大腸炎または下痢であり得る。
【０００４】
２．関連分野の説明
抗生物質関連の下痢（AAD）は、C. difficile、メチシリン耐性Staphylococcus aureus（MRSA）を含むS. aureusおよびClostridium perfringens（C. perfringens）の毒素産生株によって引き起こされる。ADDは、米国単独において、過剰な病院費の1年当たり30〜60億ドルと控えめに見積もられる健康管理システムに主要な経済的負担を示す。
【０００５】
ADDは、病院および長期介護施設および地域社会(community)において、重要な問題である。C. difficileが、ADDの場合の凡そ20％、抗生物質関連の大腸炎（AAC）の場合の大部分の割合を占める、病院環境におけるADDの最も一般的な原因である。C. difficile関連の下痢（CDAD）の上昇する発生は、入院患者へのブロードスペクトルな抗生物質の頻繁な処方によるものである[Wilcoxら、Lancet 1996, 348: 767-8]。
【０００６】
該疾病の最も重篤な形態は、組織学的には粘膜のプラークを伴う大腸炎として、臨床的には激しい下痢、腹部の痙攣および全身毒性によって明らかにされる、偽膜性大腸炎（PMC）である。CDADからの全死亡率は低いが、重篤な大腸炎または全身毒性の症状になる患者においては非常に高い。最近の研究は、死亡がC. difficileの直接的な原因でない場合でも、CDADの患者の死亡率は、症例一致(case-matched)のコントロールと比較して非常に高いことを示している。
【０００７】
下痢および大腸炎は、1以上のC. difficile毒素の産生により引き起こされる。該生物は、ブロードスペクトルな抗生物質を与えられているか、または頻度は低いがガン化学療法を受けている患者の大腸で増殖する。CDADは、そのような薬剤での治療後に下痢の症状になる病院での患者の凡そ20％で診断される。
【０００８】
AADまたはCDADの現在の治療は、関係する抗生物質または化学療法剤の中断、非特異的な支持的措置(supportive measures)およびC. difficileに対する直接的な抗生物質での治療を含む。最も一般的な抗生物質治療の選択肢は、バンコマイシンおよびメトロニダゾールを含む。抗生物質を用いるCDADの治療は、該疾病の臨床的再発に関係する。再発の頻度は、最も一般的に引用される数字である再発率20〜30％を伴い、5〜50％であると報告されている。再発は、上記のいずれの抗生物質を用いる1次治療での薬剤、用量または期間に関係なく、ほとんど等しい頻度で起こる。治療における主な課題は、多重再発を有する患者の管理であり、ここで抗生物質のコントロールが問題となる。
【０００９】
バンコマイシンはこの適用に対してFDAで承認された唯一の薬剤であるけれども、２つの最も一般的に用いられる具体的な治療は、バンコマイシンおよびメトロニダゾールである。しかしながら、バンコマイシンは、主に、それが、いくつかの重大な生命にかかわる多剤耐性細菌に対して活性な唯一の抗生物質あるという主な理由で、CDADの第一選択治療として推奨されない。それゆえ、バンコマイシン耐性Enterococcus(VRE)またはバンコマイシン耐性Staphylococcus aureus(VRSA)の出現を最小にするために、医学界は、絶対的に必要とする以外にはこの薬剤を使用させないようにしている。
【００１０】
バンコマイシン耐性腸微生物叢(flora)、特に腸球菌の助長および淘汰に対する恐れから、初期の治療として、メトロニダゾールが推奨される。いくつかの国でC. difficile耐性の頻度が＞6％であるとの報告にもかかわらず、メトロニダゾールは、バンコマイシンとほとんど同じぐらい有効であり、かなり安上がりで、かつ経口または静注のどちらでも用いることができる。メトロニダゾールは、悪心、神経障害、白血球減少症、発作およびアルコールに対する中毒反応を含む、特筆すべき副作用に関係する。さらに、それは、子供または妊婦においての使用に対して安全ではない。
【００１１】
両薬剤は、感染症を治療することにおいて有効であるけれども、初期に応答する患者の治療不成功の増加する割合および凡そ20％での下痢の再発が標準的治療の欠陥である。メトロニダゾールでの治療は、VREの定着および感染に対しての重大な危険因子であることが報告されている。さらに、現在の治療法は、かなり厄介で、10〜14日間、500 mgまでの qidを要求する。したがって、CDADの症例ならびにその他のAADおよびAACの症例に対するより良い治療の必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それゆえに、耐性発生の低い傾向を有し、既存の抗菌剤に対して減少した交叉耐性もしくは無交叉耐性および／または長期の後抗菌効果（post-antibiotic effect)を有する殺菌性の薬物を開発することの必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要約
本発明は、混合物の有効量を、必要とする患者に投与することを含む、Clostridium種、Staphylococcus種、Enterococcus種およびそれらの組合せからなる群から選択される細菌の存在により引き起こされる疾病または障害を治療する方法を提供する。該混合物は、チアクミシン(tiacumicin)Ｂの有効量、ならびに次の化合物：
【化１−１】
2009512691.tif 000002
【化１−２】
2009512691.tif 000003
【化１−３】
2009512691.tif 000004
およびそれらの組合せからなる群から選択される大環式化合物(macrocycle)をさらに含む。式XIVの化合物が存在するとき該混合物は約0.1〜約5％の式XIVの化合物を含む。
【００１４】
好ましくは、混合物は、少なくとも90重量％のチアクミシンＢを含む。さらに好ましくは、混合物は、少なくとも95重量％のチアクミシンＢを含む。
【００１５】
好ましくは、混合物は、少なくとも1重量％、より好ましくは約2重量％〜約5重量％の大環式化合物をさらに含む。
【００１６】
好ましくは、混合物は、約0.1重量％〜約5重量％、より好ましくは0.3重量％〜3重量％、特に0.3重量％〜1.5重量％、とりわけ約1重量％のリピアルマイシン(lipiarmycin)Ａ４を含む。
【００１７】
好ましくは、リピアルマイシンＡ４が存在するとき、混合物はまた、次の化合物：
【化２】
2009512691.tif 000005
の少なくとも１つを含む。
【００１８】
好ましくは、混合物は、図5で実質的に示されるHPLCプロファイルを示す。
【００１９】
好ましくは、本発明にしたがって治療される疾病または障害は、C. difficile、C. perfringens、S. aureusおよびそれらの組合せに関係する。より好ましくは、本発明にしたがって治療される疾病または障害は、C. difficileに関係する。
【００２０】
好ましくは、本発明にしたがって治療される疾病は、下痢または大腸炎、特に下痢、より具体的にはCDADである。
【００２１】
好ましくは、本発明に基づく混合物は、次の：
該混合物を吸着するための吸着剤を含む栄養培地中で、微生物を培養し、栄養培地中に該混合物を蓄積すること；および栄養培地から該混合物を単離することを含む方法により製造される。
【００２２】
栄養培地は、好ましくは、0.5〜15重量％の吸着剤を含む。吸着剤は、好ましくは、吸着樹脂である。さらに好ましくは、吸着樹脂は、Amberlite(登録商標) XAD16、XAD16HP、XAD2、XAD7HP、XAD1180、XAD1600、IRC50およびDuolite(登録商標) XAD761からなる群から選択される。微生物は、好ましくは、Dactylosporangium aurantiacum亜種のhamdenensisである。栄養培地は、0.2重量％〜10重量％のグルコース、0.02重量％〜0.5重量％のK2HPO4、0.02重量％〜0.5重量％のMgSO4・7H2O、0.01重量％〜0.3重量％のKCl、0.1重量％〜2重量％のCaCO3、0.05重量％〜2重量％のカザミノ酸、0.05重量％〜2重量％の酵母エキス、および0.5重量％〜15重量％のXAD-16樹脂を含む。醗酵工程は、好ましくは、約25〜約35℃の温度で約6.0〜約8.0のpHで行なわれる。
【００２３】
好ましくは、本発明に基づいて治療される疾病は、抗生物質または癌の化学療法もしくは抗ウイルス療法の使用に関連する。
【００２４】
１つの好ましい態様にしたがって、混合物は、約50 mg〜1000 mg、より好ましくは100 mg〜400 mg、特に200 mgの量を、１日１〜３回、より好ましくは１日1回または２回、特に１日２回、３〜１５日間にわたって、特に約１０日間にわたって投与される。経口投与が好ましい。
【００２５】
本発明の治療は、抗生物質の全身投与を損なうことなく、腸内のバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）を増やすことなく、C. difficile、S. aureus、C. perfringensの腸毒素原性株に関連する下痢の効果的な治療を可能にし得る。本発明は、腸内のVREの存在も減少する。
【００２６】
本発明の他の目的および特徴は、添付の図と併せて考慮される以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、図面は、本発明の限定の定義としてではなく、ただ単に説明の目的のためを意図しており、それは添えられたクレームの参照となるべきものであることが理解されるべきである。別の指示がなければ、図面は、必ずしも規模(scale)を表したものではなく、本明細書に記載された構造および方法を概念的に説明することがただ意図されていることをさらに理解すべきである。
【００２７】
図面の簡単な説明
図面において、
【００２８】
図１は、フェーズ1B-MD服薬スケジュールを示す。
【００２９】
図２は、治療後のバクテロイド総数を示す。両側(2 tailed)の符合順位検定。総数＜3 log 10に対して、2.9の値が用いられた。
【００３０】
図３は、バンコマイシン治療対B. fragilis群の効果を示す。
【００３１】
図４は、MCCで治療後のC. difficile生育総数の量的減少を示す。
【００３２】
図５は、本発明の方法で用いられ得る混合物の典型的なHPLCプロファイルである。
【００３３】
現在好ましい態様の詳細な説明
本発明で用いられるいくらかの略号または用語の定義は、次のとおり与えられる：
AAD = 抗生物質関連の下痢
ATCC = American Type Culture Collection
13C = 炭素13
CO2 = 二酸化炭素
N2 = 窒素
H2 = 水素
TAPS = N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸
MOPS = 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸
CDAD = Clostridium difficile関連の下痢
CLSI = Clinical and Laboratory Standards Institute、以前のNCCLS
ED50 = 50%の応答を生じる有効用量
HPLC = 高速液体クロマトグラフィー
IR = 赤外分光分析
LLOQ = 定量化の下限値
MCC = 大環式化合物含有組成物
MIC = 最小阻止濃度
MIC50 = 試験される細菌株の50%を阻止するための最小阻止濃度
MIC90 =試験される細菌株の90%を阻止するための最小阻止濃度
MRSA = メチシリン耐性Staphylococcus aureus
NCCLS = National Committee for Clinical Laboratory Standards、現在CLSI
PMC = 偽膜性大腸炎
VRE = バンコマイシン耐性腸球菌
VRSA = バンコマイシン耐性Staphylococcus aureus
【００３４】
「抗生物質関連の状態」の用語は、抗生物質治療が、腸の微生物叢のバランスを乱すときに生じ、C. difficile、S. aureusおよびC. perfringensの腸内毒素産生菌株のような病原体が繁殖できる状態をいう。これらの微生物は、下痢、偽膜性大腸炎および大腸炎を引き起こし、下痢、尿意促迫、腹部の痙攣、テネスムス、およびその他の症状中の発熱により明らかになる。激しいときに下痢は、脱水症および脱水症に関連する内科的合併症を引き起こす。
【００３５】
「MCC」の用語は、全体の抗生物質に対してチアクミシンＢを主として含む製剤（例えば、HPLC分析で少なくとも90％、好ましくは95％〜98％）を意味する。MCCは、チアクミシンＢ関連化合物、すなわちリピアルマイシンＡ４および前記の式III〜XIVの化合物の少なくとも１つの少量（例えば、少なくとも1％、好ましくは2％〜5％）も含む。国際公開番号WO 2004/014295 A2を有するPCT出願PCT/US03/21977は、チアクミシンＢを含む混合物を作る方法を提供する。このPCT出願の全内容は、参照として本明細書に組み込まれる。しかしながら、もっぱら非ヒトへの使用を意図したMCCは、（HPLC分析で全抗生物質に対して）80％より少ないチアクミシンＢを含み得る。
【００３６】
「賦形剤」の用語は、化合物の投与をさらに容易にするために、薬理学的組成物に加えられる不活性な物質を意味する。賦形剤の例は、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類および種々のタイプの澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールを含む。
【００３７】
「ハロゲン」の用語は、F、Cl、BrおよびIを意味する。
【００３８】
「大環式化合物」の用語は、通常10以上の原子を含む大環構造を有する有機分子を意味する。
【００３９】
「18-員大環式化合物」の用語は、18の原子を含む環構造を有する有機分子を意味する。
【００４０】
「員環」の用語は、前記の炭素環およびヘテロ環を含む、あらゆる環状構造を包含し得る。「員」の用語は、環を構成する骨格原子の数を示すたことが意図される。したがって、例えばピリジン、ピランおよびチオピランは6員環で、ピロール、フランおよびチオフェンは5員環である。
【００４１】
「MIC」または「最小阻止濃度」の用語は、インビトロで細菌の分離株の生育を阻害するために必要とされる抗生物質の最小濃度を意味する。抗生物質のMICを決定するための一般的な方法は、抗生物質の連続希釈液を含むいくつかのチューブを調製し、次に、それに興味ある細菌の分離株を接種する。適当な雰囲気および温度でインキュベーション後、抗生物質のMICが、濁度（生育）を示さない最小の濃度を有するチューブから決定され得る。
【００４２】
「MIC50」の用語は、与えられた細菌の種内で、試験される細菌株の50％の発育を阻止するために必要とされる抗生物質の最小濃度を意味する。
【００４３】
「MIC90」の用語は、与えられた細菌の種内で、試験される細菌株の90％の発育を阻止するために必要とされる抗生物質の最小濃度を意味する。
【００４４】
「患者」の用語は、医学的治療を必要とするヒトまたは動物を意味する。本発明の目的のため、通常は、ヒトの患者は、病院または養護施設のような一次医療施設に収容される。しかしながら、抗生物質または癌化学療法もしくは抗ウイルス治療の使用に関連する疾病の治療は、外来患者中心、一次医療施設からの退院において行なわれ得るか、または一次医療施設に関係する医者ではなく在宅治療のための医者により処方され得る。医学的治療が必要な動物は、通常は、獣医の管理下にある。
【００４５】
「医薬的に許容される担体」の用語は、医薬的に許容される担体または希釈剤を意味する。
【００４６】
「医薬的に許容される塩」の用語は、医薬的に許容される無機および有機塩基から誘導される塩を意味する。適当な塩基から誘導される塩は、アルカリ金属（例えばナトリウムまたはカリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウムおよびN(C1-C4アルキル)4+塩等を含む。それらのいくつかの実例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化コリン、炭酸ナトリウム等を含む。
【００４７】
「医薬組成物」の用語は、本明細書に記載された1以上のチアクミシンまたはそれらの生理学的に許容される塩と、生理学的に許容される担体および／または賦形剤のようなその他の化学的成分との混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生体への化合物の投与を容易にすることである。
【００４８】
「生理学的に許容される担体」の用語は、生体に有意な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性および性質を排除しない担体または希釈剤を意味する。
【００４９】
「偽膜性大腸炎」または「腸炎」の用語は、小腸および大腸両方の粘膜の炎症による偽膜性物質（すなわちフィブリン、粘膜、壊死上皮細胞および白血球から構成される物質）の形成を意味する。
【００５０】
本明細書で使用される「チアクミシン」の用語は、次の式I：
【化３】
2009512691.tif 000006
で示される18員の大環式化合物を含む全ての化合物のファミリーを意味する。
【００５１】
本明細書で使用される「チアクミシンＢ」の用語は、次の式II：
【化４】
2009512691.tif 000007
で示される18員の大環式化合物を意味する。
【００５２】
本明細書で使用される「リピアルマイシンＡ４」の用語は、次の式XIV：
【化５】
2009512691.tif 000008
で示される18員の大環式化合物を意味する。
【００５３】
本発明の一つの態様によれば、多数回経口投与後、低いMCCレベルが血漿中で検出され、それらのほとんどは、定量限界未満であった。対照的に、二つの検討での糞中のレベルは非常に高く、C. difficileに対するMIC90（0.125 μg/mL）の10,000倍を超えていた。
【００５４】
本発明の一つの態様によれば、患者におけるC. difficile関連の下痢の再発は、C. difficileの再発を阻害するのに有効で、患者の正常な腸の微生物叢に影響のない量および期間で、MCCを投与することにより阻害され得る。
【００５５】
一つの態様によれば、CDADに対するMCCの1日の経口投与量は、1日当り活性な作用物質の約50 mg〜約1.0 gの範囲、好ましくは1日当り約100 mg〜約600 mgの範囲であろう。一般的に、治療は、約3日間〜約15日間の範囲の期間続けられるであろう。より多いかまたはより少ない薬物の量および治療の間隔が、必要によって用いられ得る。例えば、本明細書の後記の臨床研究の結果により、1日当りMCCの約100〜400 mgの約10日間に渡っての投与量が、最小の臨床的再発を有してCDADの治療に効果的であることが証明された。
【００５６】
本発明の一つの態様によれば、混合物は以下の一般的な方法により作ることができる。
【００５７】
MCC産生細菌が、振盪フラスコから大きな「バッチ」醗酵槽の範囲の容器中で培養された。大量のMCCの産生のために、タンク中での液中好気醗酵が用いられる。しかしながら、少量は、振盪フラスコ培養により得られ得る。タンク醗酵には、栄養接種物(vegetative inoculum)を用いることが好ましい。栄養接種物は、微生物の新鮮で活性な生育培養物を得るために、微生物の胞子形、菌糸フラグメントを有する小容量の培地または凍結乾燥ペレットを接種することにより製造される。次いで、栄養接種物はより大きなタンクに移され、そこで、好適なインキュベーション時間後、MCC抗生物質が非常に改善された収率で産生される。もし発泡が問題になるなら、大量の醗酵媒体に少量の消泡剤を加えることが必要とされ得る。
【００５８】
その製造は、産生を改善するために、その他の添加剤／成分を有する制御媒体(control medium)中で進行する。MCCの産生のために、液体深部、撹拌培養法が用いられる。醗酵は、25℃〜37℃の範囲の温度で行われる。炭素源の消費は注意深くモニターされ、必要に応じて追加量の炭素源が加えられる。醗酵のpHは、約6.0〜約8.0の間に維持されるのが好ましい。醗酵の接種後、MCCが産生され3〜15日間で蓄積される。
【００５９】
市販の吸着樹脂が、醗酵中のMCCの収率および回収効率を増大することを見出した。吸着剤は、0.5〜15重量％の範囲で存在するのが好ましい。MCCは、樹脂吸着により醗酵ブロスから異例の収率（＞100 mg/Lブロス）で回収され、種々の極性の溶媒で洗浄することにより樹脂および菌糸体から溶出された。
【００６０】
MCCは、まず、Amberlite樹脂（XAD-16）のような吸着樹脂を用いて、醗酵の間にブロスから捕らえられた。醗酵終了時に、篩にかけることにより、（吸着樹脂を含む）固形の塊がブロスから分離される。固形の塊は、酢酸エチルで溶出され、次いで、減圧下に濃縮される。
【００６１】
醗酵終了時に、篩にかけることにより、（吸着樹脂を含む）固形の塊がブロスから分離される。MCCは、酢酸エチル、メタノール、アセトニトリルまたは2以上の有機溶媒の混液を用いて、樹脂から溶出される。次いで、抽出物は減圧下に濃縮される。この残渣は、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサンのような低極性溶媒での摩砕、または酢酸エチル／水；酢酸エチル／塩化ナトリウム水溶液のような2相溶媒系；種々の割合のメタノール／ヘキサン、アセトニトリル／ヘキサンもしくは2以上の溶媒のその他の混液および組合せ間での分配、または適当な有機溶媒系で溶出するカラムクロマトグラフィーによりさらに精製される。MCCの現在の精製法は、溶出液として50:50:1 CH3CN/H2O/AcOHまたは70:30:1 MeOH/H2O/AcOHを用いる中圧逆相(C-18)カラムに基づいている。所期のMCCを含むフラクションは食塩水で洗浄され、濃縮された。残渣を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄し、有機層を蒸発乾固し、黄白色の泡状物質を得、それをイソプロピルアルコールで再度洗浄し、減圧下に乾燥して、白色の粉末を得た。純度＞88％を有するフラクションを合わせる。フラクションを元の容量の半分まで濃縮する。沈殿を濾過し、濾過ケーキを水で洗浄する。固体を高真空で一晩乾燥し、白色粉末を得、HPLCで分析した。通常、混合物は、主成分として90％〜99％の範囲でチアクミシンＢ、リピアルマイシンＡ４（0.1％〜5％）、および前記の式III〜XIVの大環式化合物を少なくとも1以上含む。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は、決して本発明の範囲を限定することを意図しないで、本発明の具体的な態様を記載する目的で提供される。
【００６３】
以下の実施例で用いられる混合物は、前記の製造方法に従って製造される。次の表は、本発明に従って作られたいくつかの典型的な混合物の組成を示す。
【表１】
2009512691.tif 000009
【００６４】
HPLC分析は、次の方法に従って行なわれる。
【００６５】
移動相A： HPLC水2 Lにトリフルオロ酢酸2.0 mLを加え、濾過し、脱気する。
移動相B：アセトニトリル2 Lにトリフルオロ酢酸1.0 mLを加え、濾過し、脱気する。
カラム：多孔性シリカまたは直径3〜10μmのセラミック微粒子(例えばZorbax Eclipse XDB-C8, 3.5μm)に化学的に結合したオクチルシランを含む、4.6×150 mmのカラム。
検出器：230 nm
流速：約1.0 mL/分
注入容量：約10μL
運転時間：約10μL
希釈液：100%アセトニトリル
勾配プログラム：    時間（分）    ％移動相A    移動相B
0                60          40
3.0              50          50
14.0              39          61
14.5              60          40
注：混合物の保持時間は、8〜12分以内でなければならない。
標準品：100 mLの容量フラスコに約20 mgの混合物を正確に秤量し、希釈液に溶解し、希釈液で容量まで希釈する。
試料品：100 mLの容量フラスコに約20 mgの混合物を正確に秤量する。約60 mLの希釈液を加え、溶解するために渦巻く。希釈液で容量まで希釈し、混合する。
システムの適性：手順で指示されているように標準品をクロマトグラフィーにかけ、ピークレスポンスを記録する。5回の反復注入に対するチアクミシンＢのピーク面積の相対標準偏差はNMT 2.0%であり、チアクミシンＢ面積のテーリングファクター(tailing factor)は、NMT 2.0である。
手順：約10μLの希釈液を注入する。別々に、標準品および試料品の等しい容量（約10μL）を注入し、クロマトグラムを記録し、主ピークに対する検出器のレスポンスを測定する。
相対保持時間：
比較物質                                RT比
式IIの化合物（チアクミシンＢ）          1.0
式IIIの化合物                           0.71
式IVの化合物                            0.81
式Vの化合物                             0.84
式VIの化合物（チアクミシンＦ）          0.92
式VIIの化合物（チアクミシンＣ）         0.95
式VIIIの化合物（チアクミシンＡ）        1.10
式IXの化合物                            1.13
式Xの化合物                             1.19
式XIの化合物                            1.24
式XIIの化合物                           1.39
式XIIIの化合物                          1.48
式XIVの化合物（リピアルマイシンＡ４）   0.89
計算：次の式を用いて分析値を計算する：
【数１】
2009512691.tif 000010
ここで、Ru＝分析品から得られるチアクミシンＢのピーク面積
Rs＝標準品から得られるチアクミシンＢのピーク面積
P＝水ファクターを含む、参照標準の純度
Wstd＝標準品の重量（mg）
StdDil＝標準品の希釈量（mL）
Wsam＝試料の重量（mg）
WF＝試料の水ファクター。
希釈液に由来するピークは破棄し、個々の全関連物質のw/wパーセントを次の式で計算する：
【数２】
2009512691.tif 000011
ここで、Ri＝試料品から得られる関連物質のピーク面積
Ru＝試料品から得られるチアクミシンＢのピーク面積
RFi＝関連物質のレスポンスファクター（全ての関連物質に対してRFi＝1.0）。
【００６６】
さらに、本発明に基づいた混合物の典型的なHPLCプロファイルを図5に示す。混合物中に含まれる化合物、例えば式II〜XIVの化合物は、それらのRT比に基づいて、HPLCプロファイル中に検出され得る。図5のPar-101は、1.0のRT比を有するチアクミシンＢを表す。
【００６７】
次いで、上記混合物（50 mg）をAvicel PH 102、FMC（微晶質セルロース）100 mgとサイズ1のカプセルシェル中で混合する。
【００６８】
実施例1． Clostridium difficileに対するMCCのインビトロ活性における接種、pHおよびカチオンの影響
多くの抗生物質に対して測定されるMIC値は、pH、カルシウムおよびマグネシウムのような2価のカチオンの濃度、および細菌密度のような環境変数によって影響されることが知られている。抗菌活性のこれらのファクターへの依存が、特に、これらのファクターが食事および病状で大きく変化し得る、腸での細菌を標的にする抗生物質に対して、重要な考慮すべき事柄である。
【００６９】
これらの環境変数に対するMICの感受性は、今後のインビトロ試験の方法を計画するときに、考慮すべき重要なファクターでもあり得る。The Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI（以前のNCCLS）は、嫌気性菌の最小阻止濃度（MIC）測定に対して、ビタミンK1とヘミンとが追加されたBrucella寒天を用いることを推奨している。しかしながら、この培地中の2価のカチオンのレベルは、標準化されていない。さらに、嫌気グローブボックス下で用いられる培地のpHは、異なるガス混合下でも変わり得る。一般的に、嫌気性菌は、窒素、水素および二酸化炭素の混合中でインキュベートされ、CO2の存在は、培地を酸性化するであろうし、変動の有意な原因になり得る。接種のサイズも、嫌気的感受性試験に利用可能な雰囲気条件（H2/CO2発生器、排出／補充(evacuation/replacement)法、または嫌気チャンバー）の多様性を生じ、標準化を困難にし得る。各実験室で利用可能な嫌気性条件が、作業台の上での操作の間の好気性雰囲気への微生物の曝露期間および嫌気性平衡を決定し、このようにして、培養菌の生存率および実験結果に影響を及ぼすであろう。
【００７０】
この研究において、我々は、2価のカチオンのカルシウムおよびマグネシウムのレベル、pH(5〜10)、接種物密度(3オーダーの大きさに渡って)のMICへの影響、およびBrucellaブロスのロット間変動のMICへの影響についても試験した。
【００７１】
材料および方法
細菌株：
【００７２】
Clostridium difficile 9689、700057、43255、17857およびEubacterium lentum 43055の実験用菌株をAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手した。全ての菌株は、使用前に10％グレセロール中、-78℃に維持された冷凍貯蔵から、ビタミンKとヘミンとが追加されたブルセラ寒天プレートに画線された。
【００７３】
MIC試験
嫌気性ブロスおよび寒天の希釈に対する現在のCLSI手順(4)をMIC評価に用いた。ブロス希釈は、ClostridiumのMIC試験に対する妥当な方法ではないが、嫌気チャンバー内での平衡後、固体寒天のpHを測定することの潜在的な不正確さのため、pHの影響を評価するため両方法を用いて比較した。
【００７４】
MIC値への接種物密度の影響
C. difficileのMCCおよびバンコマイシンへの感受性への接種物密度の影響を、寒天希釈法(4)を用いて測定した。接種物は、最初、〜108 cfu/mLの懸濁液を作り、次いで、105〜108 cfu/mLの範囲の培養密度を得るために10倍のファクターで懸濁液を連続希釈することにより調製され、102〜105 cfu/スポットのスポット密度を与えた。
【００７５】
MIC値へのpHの影響：
C. difficileのMCCへの感受性は、寒天希釈法およびマイクロブロス希釈法の両方を用いて、6〜8の範囲のpHで評価された。
【００７６】
寒天希釈法を用いて、MCCのMICが、2つの別々の実験で、C. difficile株に対して、6.2〜8.0の範囲のpHで測定された。感受性試験のための所望の嫌気性pHを得るために、緩衝液（100 mMのNaH2PO4またはTAPS[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸]）を、それぞれpH 7および8で培地に加えた。強い緩衝においても、嫌気ガス中での平衡後でわずかにpHがシフトし、しがって、いくつかの場合、培地は、上記の所望の嫌気pHまで外気中で滴定された(titered)。実際のpHは、常に、嫌気チャンバー内での平衡後に確認された。コントロールとして用いられたバンコマイシンは、pH 7でのみ試験された。
【００７７】
ブロスマイクロ希釈法を用いて、MCCおよびバンコマイシンのMIC値が、独立の3シリーズで、C. difficile株に対して、6〜8の範囲のpHで測定された。第1のシリーズにおいて、緩衝されないBrucellaブロスが、5〜9の範囲のpHを得るために、外気中で滴定された。しかしながら、グローブボックス環境（10％ H2 / 5% CO2 / 85% N2）中での培地の嫌気平衡は、培地のpHを下げ、5〜7.5の範囲の嫌気pHを生じた（グローブボックスの外で標準緩衝液で較正され、次いで中に移される、平底のpHプローブを有するポータブルpH計を用いての試験による）。次の実験に対して、嫌気平衡により引き起こされるpHシフトを抑えるために、緩衝液が培地に添加された。第2のシリーズにおいて、嫌気平衡後に6〜7.6の範囲のpHを得るために、10 mMの緩衝液（NaH2PO4・H2O pH 7.0、MOPS pH 8.0、またはTAPS pH 9.0、pH値は外気中）が、6より大きなpH値で培地に添加された。第3のシリーズにおいて、6〜8.1の範囲の嫌気pHを得るために、6を超えたpH処理のために、緩衝液濃度は100 mMまで増加された。
【００７８】
2価カチオン濃度のMIC値への影響：
C. difficile株のMCCへの感受性における、カルシウムおよびマグネシウムイオン濃度の影響を測定するために、寒天希釈法が用いられた。製造業者から入手したBrucellaブロス中の2価のカチオンのレベルが、the Laboratory Specialists, Inc.により測定された。2価のカチオンの追加量が、2.1、3.0および5.7 mg/dLのカルシウムイオン濃度ならびに3.3、4.5および7.5 mg/dLのマグネシウムイオン濃度を得るために、（塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの形で）加えられた。
【００７９】
市販の異なるロットの培地を用いたMCC MIC値の再現性：
CLSI寒天希釈法を用いて、C. difficileのMCCへの感受性が、異なるロットのビタミンK（Sigmaロット＃V-3501および0214010）およびヘミン（Sigmaロット＃072K1221および034K7656）が追加された、BBLからの市販の3つの異なるロットのBrucella寒天（ロット＃30768960、211086および3167036）を用いても試験された。
【００８０】
結果
MIC値への接種物密度の影響：
表1および2は、C. difficileの2株（ATCC 9689およびATCC 700057）に対する、MCCおよびバンコマイシンのMICにおける接種物密度の影響を示している。両C. difficile株のMCCへの感受性は、試験された全ての接種物濃度に対して得られた同一のMIC値によって示されるように、105〜108 cfu/ml（102〜105 CFU/スポット）の接種物濃度により影響を受けなかった。しかしながら、バンコマイシンのMICは、接種物濃度の増加と共に次第に増加し、最も高い接種物密度で、最も低い接種物密度と比較して、MICで4倍の増加を示す。これらの結果は、接種物密度は、C. difficileのMCC感受性試験の結果に影響を及ぼす重要なファクターではないことを示している。
表1．MCCのインビトロ活性（μg/mL）対C. difficile ATCC 9689の異なる接種物密度（102〜105 CFU/スポット）
【表２】
2009512691.tif 000012
表2．MCCのインビトロ活性（μg/mL）対C. difficile ATCC 700057の異なる接種物密度（102〜105 CFU/スポット）
【表３】
2009512691.tif 000013
【００８１】
MIC値へのpHの影響：
表3は、2つの別の日に寒天希釈法で測定された、C. difficileのMCCへの感受性における種々のpH値の影響を示している。最初の運転(run)中、両C. difficile株に対して、最も高いpH処理（pH 7.9）は、より低いpH処理（pH 6.2 & pH 7.2）に比べてMIC値で8倍の増加を示した。確認の運転が最も高いpH（pH 8.0）で繰り返されたとき、両菌株に対するMIC値は高いままであった。MCC MICにおける増加は、どちらの菌株に対してpH 6.2およびpH 7の間では観測されなかった。
【００８２】
pHによるMIC値の増加は、生長の増加と一致して相関しなかった。したがって、MICにおけるpHの影響は、より高いpHで微生物の生存能力が高められことによるだけでないように思われた。pH 7での処理は、pH 6.2およびpH 7.9の処理と比較して、より低密度の有機物スポット生長を有した。
表3．寒天希釈MIC値へのpHの影響（緩衝された媒体）
【表４】
2009512691.tif 000014
【００８３】
表4、5および6は、5〜8.1の範囲のpHで3つの独立した日に行なわれたブロスマイクロ希釈感受性法からのMICデータを表す。培地が緩衝されていない第1番目のシリーズにおいて、両C. difficile株に対して、pH 7.5でのMCCのMICは、pH 5.9でのMICの8×の大きさであった（表4）。pH 5でのMICは測定することができなかった。なぜなら、微生物がこのpHでは生長することができなかったからである。緩衝された(10 mM)pH 7.6の処理は、C. difficile ATCC 9689 & ATCC 700057のそれぞれに対して、pH 6の処理よりMCC MICで8-倍および16-倍の増加を示した（表5）。第3番目の強い緩衝(100 mM)シリーズにおいて、両微生物に対して、最も高いpH処理(pH 8.1)が、最も低いpH処理(pH 6)よりMICで16-倍の増加を示す同様の結果が見られた。バンコマイシンは、3つの実験全てにおいて、最も高いpH処理は、最も低いpH処理より4〜8倍大きいMICを生じる同じような傾向を示した。
表4．無緩衝の培地を用いたMICへのpHの影響
【表５】
2009512691.tif 000015
表5．弱く緩衝された培地(10 mM)を用いたMICへのpHの影響
【表６】
2009512691.tif 000016
表6．強く緩衝された培地(100 mm)を用いたMICへのpHの影響
【表７】
2009512691.tif 000017
【００８４】
全てのpH処理での分析プレートは、全体としての生長を目視でも試験された。無緩衝のブロスが用いられた第1番目のシリーズにおいて、全体としての培養濁度は、pHの増加と共に増加した。10 mMの緩衝されたブロスが用いられた第2番目のシリーズにおいて、培養濁度がpH 7.2およびpH 7.6で同じであった以外は、同じ傾向が観測された。第3番目のシリーズにおいて、培養濁度は、最も濁っていたpH 7.5を除いて、pH処理を通してより同等であった。
【００８５】
全体として、感受性試験の2つの方法および緩衝塩の濃度の変化を通して、MCCおよびバンコマイシンのMIC値は、C. difficileの両菌株に対して、pHの増加と共に増加した。
【００８６】
MIC値における2価のカチオン濃度の影響：
市販のBrucellaブロス中のカルシウムおよびマグネシウムのレベルの測定は、21および33 mg/Lのカルシウムおよびマグネシウムイオン濃度をそれぞれ示した。2価のカチオンの種々の追加量が加えられ、C. difficile株に対するMCC MIC値が、3つの異なるカルシウムイオン濃度（21、30および57 mg/L）および3つの異なるマグネシウムイオン濃度（33、45および75 mg/L）で試験された。MIC値はすべてのタイプの培地で同じであった。カチオンの濃度を変えた培地において、C. difficile 9689は、0.063 μg/mlのMIC値およびC. difficile 700057は0.125 μg/mlのMIC値を有した。実験の間のコントロールとして、いかなる付加的なカルシウムまたはマグネシウムなしの追加されたBrucella寒天でコントロールとして試験されたバンコマイシンは、全ての運転に対して1 μg/mlの予測されたMIC値を示した（表7および8）。
表7．2価のカチオンの異なる濃度が追加されたBrucella寒天でのMCCのインビトロ活性
【表８】
2009512691.tif 000018
表8．2価のカチオンの異なる濃度が追加されたBrucella寒天でのMCCのインビトロ活性
【表９】
2009512691.tif 000019
【００８７】
市販の異なるロットの培地を用いたMCC MIC値：
3つの異なるロットの追加されたBurcella寒天培地が、C. difficile株に対するMCCの活性を比較するために、3つの独立した日に用いられた。MIC分析は、CLSI（NCCLS）の許容される範囲、すなわち0.06〜0.25 μg/mL内でのクリンダマイシンに対するQC微生物のEubacterium lentumの活性を試験することによりコントロールされた。MIC分析のためのもう1つのコントロール工程は、メトロニダゾールを含み、我々の研究室で0.25〜0.5 μg/mLの範囲のMIC値を有することが示された、C. difficile株に対するその活性をモニターすることであった。表9に示されるように、C. difficileに対するMCCの活性は、異なるロットの追加されたBrucella寒天により影響を受けなかった。全てのコントロールは、確立された範囲内で活性を示した。
表9．3つの異なるロットの培地で試験されたMCCのインビトロ活性
【表１０】
2009512691.tif 000020
【００８８】
結論
バンコマイシンと対照的に、C. difficileに対するMCCの活性は、接種物濃度、102〜105 cfu/スポットの範囲で影響を受けなかった。
【００８９】
MCCに対するC. difficileの感受性は、カチオン濃度（2.1〜5.7 mg/dLの範囲のカルシウムイオンおよび3.3〜7.5 mg/dLのマグネシウム濃度）および市販の種々のロットの培地により影響を受けなかった。
【００９０】
MCCおよびバンコマイシンの両方に対するMIC値は、6〜8の範囲のpHで、pH増加により増加した。塩基性pHでの高いMIC値は、それらのpKaより上での両化合物のフェノール性ヒドロキシ基の脱プロトン化された形のためかもしれない、そして、そこにおいて、それらは、細菌の細胞への透過性が劣ることが予想される荷電された種を形成する。対照的に、pKaより低い（MCCに対して7.22）と、抗生物質はほとんどプロトン化されるだろうし、したがって、細胞膜をより効果的に透過するであろう。
【００９１】
一般的に、微生物密度は、pHの増加に伴い増加した；pHによる、MICではなく生長密度の依存性は、緩衝化剤の存在により減少した。微生物密度は、緩衝液非存在下の塩基性と明確に相関したが、MICの傾向は、微生物密度だけへのpHの影響の結果ではないようである。このことは、MICとpHとの間の同じ関係が、微生物密度が、おそらく、微生物の生長への緩衝液のタイプの差動効果により、pH処理を通してより同等であった緩衝された実験で観測されたからである。
【００９２】
実施例2．健常者およびClostridium difficile関連の下痢（ADAD）患者における、安全性、薬物動態および成果
フェーズ1B-MD
概要
これは、フロリダ州、マイアミのUniversity of Miami Division of Clinical Pharmacologyで行なわれた、経口、複数回投与、二重盲検、無作為プラセボ比較、用量段階的増大試験であった。Richard Preston, M.D.がこの試験の治験責任者を務めた。MCCの複数回の経口投与の忍容性および薬物動態が、合計24人の健康なボランティアで評価された。評価されたMCCの経口用量（各8人の被験者の3グループに、6アクティブおよび2プラセボで）は、150、300および450 mg（50 mgの試験薬物を含む粉末充填カプセルで）で、10連続日間、朝食後毎日投与された。被験者は、入院患者／通院患者を合わせたベースで投与され、モニターされた。被験者は、10日の投与期間のDay 0およびDay 9に再度、調査施設に収容され、各収容後48時間まで留まらされた。被験者は、予定された事象および処置の終了後、Day 2およびDay 11に解放された。外来期間、被験者は、服用について、毎日、調査施設に報告し、観察下に3時間滞在した。
【００９３】
連続的な血液、尿および糞便の試料が、複数回投与の期間の種々の時点／間隔で採取された。血漿、尿および糞便のMCC濃度が、薬物動態分析のために測定された。フォローアップ試験が、被験者が試験を抜け出す前に、各試験期間のDay 17に予定に入れられた。被験者は、処置期間を通しておよびフォローアップ試験で、あらゆる有害事象または異常な臨床検査所見の発生に対して、厳密にモニターされた。図1、フェーズ1B-MD投与スケジュールを参照。
【００９４】
フェーズ2A
概要
これは、MCCの安全かつ有効な投与量を選択するための投与量決定試験であった。被験者は無作為に選ばれ、それぞれ10日間、100 mg/日（毎12時間で50 mg）、200 mg/日（毎12時間で100 mg）または400 mg/日（毎12時間で200 mg）を受け、ついで臨床評価を受けた。被験者は、全ての徴候を毎日の日誌カードに記録した。排便回数および粘度、便中の血の存在、ならびに腹部不快感に特に注意が向けられた。試験所の評価は、エントリーのためのスクリーニングで、および処置の最後（Day 10〜12）または脱退（より早いどちらか）で行なわれた。臨床観察および日誌カードの評価は、処置の最後（Day 10〜12）に行なわれた。患者のインタビューが、9日経過の処置Day 2、Day 17およびDay 52に行なわれた。エントリー包含クライテリアのために、Clostridium difficile毒素に対する分析が行なわれた。MCC治療に応答しなかった被験者に対しておよび臨床再発の事象において、C. difficile毒素分析および培養の両方が行なわれた。治療に応答しなかった被験者に対して、退出時に、臨床評価、試験所評価および微生物学的評価も行なわれた。薬物動態学の血漿試料は、最初および最後の日の投薬の投薬前0.5時間および投薬後2時間に採取された。
【００９５】
重要な包含クライテリア
被験者は、1) 下痢（24時間で3以上の未定形の排便、または36時間以内に6回より多い下痢気味もしくは水っぽい便を有する用便習慣の変化）および2) 便中にC. difficileの毒素AまたはBのどちらかが存在することによって定義される、C. difficile関連の下痢を有する患者であった。
【００９６】
重要な除外クライテリア
被験者は、1) 重篤なまたは命にかかわるCDAD、2) 命にかかわるかまたは深刻なCDADに無関係の疾病、3) バンコマイシン、メトロニダゾール、バシトラシンまたは関連の薬剤（もし、治験担当医師が、便毒素に対する試験所の結果を知る前に、治療を開始することの臨床的必要性を感じたら、24時間までで、メトロリダゾールおよび／またはバンコマイシンでのたった3回の投与量で治療が許された。）；CDADの治療に用いられるあらゆる薬剤；またはその他の抗生物質の同時使用、4) 潰瘍性大腸炎またはクローン病の病歴および過去3ヶ月以内のCDADの多重再発（1より多い再発として定義される）を有することはできなかった。（CDADのたった1回の再発を有する被験者は、登録を許された。）
事象のスケジュール
表10．フェーズ2A試験における評価手順のスケジュール
【表１１】
2009512691.tif 000021
【００９７】
終点
治療の最後に、治験担当医師は、被験者が治癒したか不成功であったかどうかを決めた。さらに、下痢の解決までの時間（1日当り＜3回の下痢気味のまたは水っぽい便への解決として定義される）および治療のday 10までにCDADの症状の完全な除去（完全な除去は、下痢気味であろと硬かろうと1日当り≦3回の合計便通への解決；熱、上昇する白血球細胞、または腹痛の欠如であった）が、第1の終点として追跡され、治療後6週間以内の再発（陽性の毒素テストを有する、1日当り3回以上の下痢気味／水っぽい便通として定義される、下痢の再発）が、第2の終点として追跡された。
【００９８】
分析
安全集団
安全集団は、治験薬剤の少なくとも1回の投薬を受け、利用可能な安全情報を有する全ての無作為被験者を含むことであった。
【００９９】
有効集団
臨床的成功または不成功が、プロトコール当り処置された患者において測定された。下痢の解決への時間および症状の完全な除去に対して分析された集団が、ベースラインに、治験薬の少なくとも1回の投薬を受け、下痢の病歴を有し、24時間で3回以上の下痢気味の便通およびC. difficle毒素陽性を有する、無作為の全ての被験者からなる、処置集団に対して改良を意味するもの（mITT）であった。
【０１００】
下痢の解決への時間は、治験薬の最初の投薬から下痢解決までの時間（日数で）として定義され；下痢の解決までの時間が、3つの処置グループの間で比較された。下痢の停止日は、24時間以内に＜3回の未定形の便通（水っぽいかまたは下痢気味）が起こり、治験のDay 10までの処置の期間継続した最初の日として定義された。下痢の解決は、被験者の日誌データを利用して、10〜12日間で評価された。
【０１０１】
CDADの症状の完全な除去：
CDADの症状の完全な除去は、治験のDay 10までに、熱（≧37.7 ℃）、腹痛（日誌への無応答）およびWBC（WBCの正常な検査範囲）の上昇のようなその他の関連の徴候／症状を有せずに、≦3回の排便／日（患者の日誌に記録による）への解決として定義された。もし、いずれかの変数が欠けていたら、この結果は、不明と見なされた。
【０１０２】
臨床的再発の評価：
臨床的再発は、治療後6週間以内で≧3回の未定形の便通（下痢気味または水っぽい）かつC. difficile毒素AまたはBに対して陽性の便として定義された。
【０１０３】
結果
登録者および人口統計
【０１０４】
以下のセクションは、フェーズ1B-MDおよび2A試験における治験集団の登録者および人口統計的特性を要約する。合計24人の健常者が、フェーズ1B-MD試験に登録された。男性および女性の交互の被験者が、性差間を等しくするために登録された。被験者は、38〜62歳の年齢の範囲（平均51.6±7.5歳）、55.5〜90 kgの体重の範囲（平均71.5±9.2 kg）および147〜183 cmの身長の範囲（平均164.8±10.8 cm）であった。
【０１０５】
フェーズ2B試験において、合計49人の被験者が登録された。一人の被験者は承諾(consent)を撤回し、いかなる治験薬を受ける前に試験から脱落し、安全性または有効性のどちらかの評価がされなかった。一人の被験者（400 mg投薬グループ）は、36時間で＞6回の便通を有したが、前24時間では＜3回の便通を有し、下痢解決までの時間のための評価はすることはできなかったが、臨床応答および安全性分析のための評価はされた。承諾の解除（一人の被験者、100 mg投薬グループ）、肺炎のために追加の抗生物質の要求（一人の被験者、100 mg投薬グループ）、または治験薬の服用不可能（一人の被験者、200 mg投薬グループ）のために、1または2回の投薬後に3人の患者が中止された。被験者の人口統計が表11に示される。
【０１０６】
表11．フェーズ2A試験の要約の人口統計；安全性についての評価が可能な集団中の48人の被験者に対する人口統計が示される。
【表１２】
2009512691.tif 000022
【０１０７】
有効性
治療の最後での処置の成功または不成功の臨床評価において、低投薬グループの2人の患者（2/14）、中投薬グループの2人の患者（2/15）、一番上の投薬グループの0人の患者（0/16）が、治験担当医師により処置不成功と見なされた。処置不成功であった被験者（n=41）のうち、100 mg/日投薬グループの1人の被験者（1/12）および一番上の投薬グループの1人の被験者（1/16）に、CDADが全体としての再発率2/41（5％）で再発した。両再発は、治療終了後約1ヶ月で起こった。
【表１３】
2009512691.tif 000023
【０１０８】
下痢の解決までの時間は、患者の日誌カードにより、患者が、1日当り3回より少ない未定形の便通に解決する時間として定義された。mITT集団において、除去への中間の時間は、MCCの100 mg/日、200 mg/日および400 mg/日処置グループに対して、それぞれ、5.5日、3.5日および3.0日であった。日数での下痢の解決への平均時間は、100 mg/日-処置被験者において6.3±3.66日、200 mg/日-処置被験者において4.8±3.56日および400 mg/日-処置被験者において3.6±2.03日であった。100 mg/日と200 mg/日の処置グループ間および200 mg/日と400 mg/日の処置グループ間の下痢の解決への時間における統計的有意差はなかった；しかしながら、100 mg/日と400 mg/日の処置グループ間の差は、統計的有意性に達した（Kaplan Meier推定値p=0.0506およびKruskal-Wallis検定p=0.0503）。
表13．1日当り＜3回の未定形の便通（患者の日誌カードによる）に解決する時間として定義される、下痢の解決への時間（mITT集団）
【表１４】
2009512691.tif 000024
【０１０９】
試験の10番目の日までに、≦3回の合計便通／日（患者の日誌カードに記録されているように、定形であろうと未定形であろうと）、発熱無し、WBC数の上昇無し、腹痛無し（患者の日誌カードへの応答による）として定義される、処置の最後までにCDADの症状の完全な除去が表14に示される。完全な除去は、100 mg/日処置グループの37.5％、200 mg/日処置グループの50.0％および400 mg/日処置グループの86.7％に達成された。Day 10までに完全な除去を有しなかった大部分の患者は、それでも処置は成功し、day 17までに症状が解決し、さらなる処置を必要としなかったことは、注目に値する。試験から脱落した3人の患者（1人は承諾の解除のため、1人は除外された抗生物質の要求のため、1人は経口薬の服用不可能のため）も、完全な除去を有しないとして記載されている。
表14．試験のDay 10までに、発熱、腹痛およびWBC上昇のようなその他の関連の徴候／症状を有しないで、≦3回の全便通／日（患者の日誌カードに書き留められているように、定型または不定形）への解決として定義される、mITT集団中の、治療の最後までにCDADの症状の完全な除去
【表１５】
2009512691.tif 000025
【０１１０】
2被験者（100 mg/日処置グループに1人および400 mg/日処置グループに1人）のみが、臨床的再発を体験した。
【０１１１】
安全性
フェーズ1B-MD試験で、MCCは、全ての投薬量で、全ての被験者に十分忍容された。14の有害事象、150 mgグループで7、450 mgグループで2およびプラセボグループで5が報告された。有害事象は次のとおり要約される：頭痛(2)、めまい(1)、脱力感(1)、倦怠感(1)、鼻詰まり(1)、嚥下困難(1)、咽頭炎(1)、結膜炎(1)、上気道感染(2)、発疹(1)および心因性掻痒(1)。MCCを受けている被験者は、薬物に関すると見なされる有害事象を有しなかった。
【０１１２】
フェーズ2A試験において、表15に示されるように、100 mg/日処置グループの4/16(25.0％)の被験者、200 mg/日処置グループの4/16(25.5％)の被験者および400 mg/日処置グループの1/16(6.3％)の被験者が、試験の間に少なくとも1つのAEを報告した。最も高い頻度のAE（3/16；18.8％被験者）は、100 mg/日処置グループの身体組織(body system)への感染症および寄生虫感染症において報告された。100 mg/日処置グループにおいて血管の疾患を報告した2/16(12.5％)の被験者および200 mg/日処置グループにおいて胃腸疾患を報告した2/16(12.5％)の被験者があった。
表15．組織臓器のクラスおよび好ましい用語で要約された、2A試験の安全性集団の有害事象の発生
【表１６−１】
2009512691.tif 000026
【表１６−２】
2009512691.tif 000027
【０１１３】
5人の被験者が、試験の間にSAEを有したとして報告された（表16）。100 mg/日処置グループにおいて、1人の被験者が中程度の重篤度の下痢を有し、もう1人の被験者がうっ血性心不全(CHF)の重篤な悪化を有した。200 mg/日処置グループにおいて、1人の被験者が重篤なブドウ球菌敗血症および重篤な脳出血を有し、もう1人の被験者が中程度の重篤度の胃腸出血を有し、3人目の被験者が中程度の重篤度の胸痛を有した。MCC 400 mg処置グループの被験者は、SAEを有しなかった。全てのSAEは試験薬とは無関係であると見なされた。
表16．2A試験の安全性集団における重大な有害事象の発生
【表１７】
2009512691.tif 000028
【０１１４】
薬物動態
血漿濃度データ
フェーズ1B-MD試験において、複数回投薬の経口投与後、MCCの血漿濃度は、投与量の範囲を通して、ほとんど定量限界より低かった。
【０１１５】
検出可能な血漿濃度は、6被験者からの12試料においてのみで見られた。
【０１１６】
12の検出可能な濃度の中で、2つのみがLLOQを有意に超えていたが、その他は、5 ng/mLのLLOQを辛うじて超えた。
【０１１７】
これら2つの濃度（11.1および48.0 ng/mL)は、被験者021のDay 1、Hour 1およびDay 10の10回目の投薬直前で、それぞれ観測された。
【０１１８】
150 mgの投薬は検出可能な濃度を生じなかったことに注目すべきである。
【０１１９】
投与量の範囲を通しての低いMCC血漿レベルのため、薬物動態分析のためのLLOQを超えた血漿データポイントが不十分であった。
【０１２０】
フェーズ2A試験において、複数回投薬の経口投与後、MCCの血漿濃度は、ほとんど定量限界より低くかったが、測定可能な濃度で、試料の数および被験者の数において、用量依存的な増加を有した。
【０１２１】
検出可能な血漿濃度が、MCC 100 mg/日処置グループの2/15(13.3％)の被験者、MCC 200 mg/日処置グループの9/16(56.3％)の被験者、およびMCC 400 mg/日処置グループの13/17(76.5％)の被験者で見られた。
【０１２２】
観測可能なMCC濃度は、MCC 100 mg/日処置グループで9.45〜12.3 ng/mL、MCC 200 mg/日処置グループで5.12〜93.7 ng/mL、およびMCC 400 mg/日処置グループで5.32〜84.9 ng/mLの範囲であった。
【０１２３】
全ての処置グループでのMCCの検出可能な濃度の中で、大部分（35/41；85.4％）は、21 ng/mL未満であった。
【０１２４】
50 ng/mLを超えたMCCの濃度は、2被験者のみで、200 mg/日および400 mg/日投薬グループのそれぞれ1人に観測された。
【０１２５】
MCCの尿中排泄のデータ
フェーズ1B-MD試験における尿中のMCCレベルは、全て、定量限界（LLOQ = 5 ng/mL）より低かった。
【０１２６】
MCCの糞便中濃度のデータ
表17は、1B-MD試験からの150 mgの投与量に正規化された糞便濃度；糞便MCC平均916.0μg/g（138.4〜1768.9μg/g）を示す。
表17．フェーズ1B-MDにおける150 mgの投与量に正規化されたMCCの糞便濃度
【表１８】
2009512691.tif 000029
【０１２７】
フェーズ2A試験のMCC 100 mg/日処置グループ（n=11 満足な試料(samples sufficient))において、糞便MCCは処置の最後で平均255.6μg/g（範囲：81.9〜558.3μg/ｇ）であった。MCC 200 mg/日処置グループ（n=9 満足な試料）において、、糞便MCCは平均441.7μg/g（範囲：11.7〜786.7μg/g）であった。MCC 400 mg/日処置グループ（n=13 満足な試料）において、、糞便MCCは平均1433.3μg/g（範囲：389.0〜3974.8μg/g）であった。
【０１２８】
表18．フェーズ2A試験における、処置の最後でのMCCの糞便濃度
【表１９】
2009512691.tif 000030
【０１２９】
結論
要約すれば、本試験は、MCCが、450 mgまで複数回の経口投薬後に十分忍容され、作用部位で高いレベルを達成し、C. difficile関連の下痢の治療に有望な成果を収めることを示している。
【０１３０】
この試験は、次のことも認めた：1) どちらの試験においても、もしかしたら薬物に関すると感じられる、治療中に発生した有害事象がなかったこと、2) 複数回投薬の経口投与後、低いMCCレベルが血漿中で検出され、それらのほとんどは定量限界より下にあった。低い血漿濃度の結果として、1B-MD試験の回収された尿中に、そのままのMCCは検出されなかった、3) 対照的に、両試験の糞便レベルは非常に高く、C. difficileに対するMIC90（0.125μg/ｍL）の10,000を超えていた、4) 治療のフルコースで処置された45被験者のうち、4被験者（50-mg q12hr投薬グループの2被験者および100-mg q12h投薬グループの2被験者）のみが10日間の治療の前か最後に不成功と見なされた。200-mg q12hr投薬において不成功は認められなかった(0/16)、5) 成功処置後に2被験者にのみ再発が見られた。両者は、治療の終了後約1ヶ月に再発した、6) 統計学的に有意ではなかったが、下痢の停止までの平均時間は、より多い投薬量がより有効となり得ることを提案する傾向を示した。下痢の停止までの時間は、50-mg q 12hr投薬グループで5.5日、100-mg q 12hr投薬グループで3.5日、および200-mg q 12hr投薬グループで3.0日であることが測定された。
【０１３１】
実施例3．MCCは選択的にインビボのC. difficileに対して有効であり、より低い再発率のカギとなる：糞便の嫌気性微生物叢の主要なメンバーに影響を及ぼさない。
MCCは、インビボで、C. difficileに対して選択的に活性でありかつ糞便の正常な嫌気性微生物叢に対して比較的活性を控えめにすることができるという仮定を試験するために、定量的便培養が、MCC（現在計画のMMC）のフェーズ2A用量変動臨床試験に入った患者から得られた連続的な便試料で行なわれた。C. difficile下痢の最適な抗生物質治療は、増殖型の病原体を絶滅すべきであり、しかも、定着抵抗の役割を担うと推定される正常な微生物叢の主な構成成分に危害を与えるべきではない。
【０１３２】
方法
患者（n=32）はランダム化され、50、100または200 mgのMCCを10日間、1日2回受けた。24被験者には前治療がなされなかった；8被験者は標準治療の1または2の投薬を受けた。生態学的コントロールとして、7人の追加患者が、10日間、バンコマイシン125 mg qidで治療された。新鮮な便試料が、C. difficile増殖型および胞子型に対して、10-2,4,6,8で培養された；便濾液は細胞分析により毒素Bの試験が行なわれた。試験エントリーおよびday 10で、好気性および嫌気性便微生物叢培養が、10-3,5,7,9希釈で、主な微生物叢シフト(shift)の試験が行なわれた。バクテロイデス・グループの微生物は偏在的に存在し、培養できるので、この属が微生物叢の整合性の指標として選択された。
【０１３３】
詳細な方法を次に示す。
1) Calgary Health Region管轄区域、人口〜100万人での単一センター試験
2) CDADの治療として、10日間、p.o.のMCC 50 mg、100 mgまたは200 mg Q 12時間単位を比較する、無作為、オープン・ラベル、用量変動フェーズ2A試験
3) 試験募集の終了に続いて、その他の点では試験に適格である、独立した生態学的コントロールの患者が、治療／生態学的コントロールとして、10日間、バンコマイシン125 mg QIDで治療された。
4) マイルドから中程度のCDAD：試験エントリー時に＞3だが＜12の下痢の試料(samples)／24時間、C. difficile毒素分析陽性、熱＜39℃、WBC＜30,000/mm3、嘔吐無し、深刻な腹部不快感無し
5) 原発性CDADまたは最初の再発症状の発現のみ
6) 可能な場合の単純な治療。プロトコールは、標準治療の3回の前投薬まで許可したが、この評価では、標準治療の最大2投薬を許可した。この試験集団において、24患者は単純な治療であった。
7) あらゆる状態に対して付随の非経口の抗生物質治療はない。
8) 連続便試料：最初の診断試料に加えて、便＞5グラム（通常10〜30グラム）の繰返し採取が、試験エントリー時、試験エントリー後day 4、7、10、14、21、28および42日に行なわれた。
9) この報告のために、day 0およびday 10の便の結果が、C. difficile総数と腸の正常な微生物叢の主な属の総数との変化の比較が行なわれる。
10) C. difficileの量的な総数およびHeLa細胞分析によるC. difficile細胞毒素Bの糞濾過濃度が、冷蔵はC. difficileの量的な総数の測定に有害なので、新しく排泄された試料を用いて測定された。
11) バクテロイデス・グループの微生物は、被験者中に多い数で均等に存在していると考えられ、「定着抵抗」を与える正常な微生物叢の主な成分のおそらく1つであるので、このグループが、糞便嫌気性微生物叢の抑制の指標として用いられた。10日でバクテロイデス・グループ種の復帰を示すことができない患者に対して、このグループの復帰の時間を記録に残すために、それに続く試料が処理された。もし、試料が直ぐに処理されない場合は、後での処理のために、一定量が、15％グリセロール／Brain Heart Infusion Brothと共に-80℃で冷凍された。
12) 嫌気性微生物叢培養のための培地および方法は、Wadsworth-KTL Anaerobic Manual、6版、2002に基づく。C. difficileの総数は、CCFA寒天上に、10-2,4,6,8/便湿潤重量グラムの試料の希釈により測定した。胞子数は、便の一定量を100％エチルアルコールの等容量×1時間処理し、遠心分離し、2回洗浄し、量的な計数のための再懸濁により測定した。
13) 正常な微生物叢培養物は、最初の検査の前に48時間インキュベートされたMacConkey, BAP, m-Enerococcus寒天、Lab M嫌気性血液寒天、BAP、BBE、KVLB、PEA寒天を用いて10-3,5,7,9希釈し、さらに7日間までインキュベートして定量された。
14) バンコマイシン生態学的コントロールのために、バンコマイシン糞便濾液濃度が、指標細菌としてC. perfringensを用いるバイオアッセイにより3重で測定された。
15) 微生物総数の差は、Log10変換後、ウィルコクソン・マッチド(wilcoxon matched)を用いて、決定した。
【０１３４】
結果
試験エントリー時、C. difficileの増殖型の総数の平均log10 CFU±SD（全てのMCC患者）は、6.8±3.6、範囲2〜10.95であり；day 10で、50 mgを受けた1人の患者を除いて、その他の全ての患者は、＜2 log10/糞便gに減少したC. difficileの量的な総数を有した。バンコマイシンは同様の効果であった。正常な総数＞11を有するバクテロイデス・グループの総数は、試験エントリー時、患者の各1/3において、＜3、3〜8 ＆ 8.5〜10 log10 CFU/gであった。バクテロイデス・グループにおけるシフトが、表19に示される。
表19．バクテロイデス・グループの総数のlog10 CFU／糞便湿潤重量gの平均±SD
【表２０】
2009512691.tif 000031
【０１３５】
以下の図は、本試験の結果をさらに説明する。
【０１３６】
結論
量的なバクテロイデス・グループの総数を基に、C. difficile下痢を有する患者は、3 log10 CFU/g範囲に約1/3、4〜7 log10 CFU/gの総数に1/3、より高い総数で残り（11〜12 log10 DFUの正常な範囲にはない）を有して、試験エントリー時に正常な微生物叢を不定に損なっていた。MCCの全ての投薬量は、バンコマイシンのように、C. difficileの総数を減少するように思われる。MCCの投薬量の増加に伴うバクテロイデスの総数の用量依存的減少は、観察されなかった。バンコマイシンは、治療の間にバクテロイデスの総数を大幅に減じ、そして、たいていの患者はそれらの総数を回復するけれど、少数は欠乏が継続する。
【０１３７】
低い再発率を伴う高い応答率を示す、これらのデータおよび臨床成果に基づき、MCCの200 mg投薬は、さらなる臨床試験を受けるための適当な投薬量であるように思える。
【０１３８】
本発明は、例としてのみで提示される前記の実施態様によって限定されないが、付記された特許クレームにより定義される保護の範囲内で、種々の方法で変更され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】フェーズ1B-MD服薬スケジュールを示す図である。
【図２】治療後のバクテロイドの総数を示す図である（両側の符合順位検定。総数＜3 log 10に対して、2.9の値が用いられた）。
【図３】バンコマイシン治療対B. fragilis群の効果を示す図である。
【図４】MCCで治療後のC. difficileの生育総数の量的減少を示す図である。
【図５】本発明の方法で用いられ得る混合物の典型的なHPLCプロファイルである。
【図１】
2009512691.tif 000040
【図２】
2009512691.tif 000041
【図３】
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【図４】
2009512691.tif 000043
【図５】
2009512691.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月24日(2008.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
関連出願
本出願は、2005年10月21日に出願された米国仮出願シリアル番号60/729,135および2005年12月12日に出願された米国仮出願シリアル番号60/749,641からの利益を主張する。
【国際調査報告】
2009512691.tif 000045