(57)【要約】  本発明の課題は、低酸素障害の保護、並びに低酸素障害の予防または治療のための新規な手段を提供することである。本発明によれば、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを有効成分として含有する、低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤が提供される。
2009153972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを有効成分として含有する、低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
【請求項２】
miRNAが、配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５〜４０塩基からなり、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖である、請求項１に記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
【請求項３】
miRNAが、配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５〜４０塩基からなるRNA鎖と９０％以上の相同性を有し、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖である、請求項１又は２に記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
【請求項４】
miRNAが、配列番号４〜６の何れかに記載の塩基配列からなるRNA鎖である、請求項１から３の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
【請求項５】
miRNAが、配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列からなるPre-miRNAから誘導されたものである、請求項１から４の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
【請求項６】
miRNAが、配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列からなるPre-miRNAをコードするDNAから転写され誘導されたものである、請求項１から５の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
【請求項７】
HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素状態の細胞を低酸素障害から保護する方法。
【請求項８】
HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素条件下での血管新生因子（VEGF）の産生を増大させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はmiRNAを有効成分とする、低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロRNA（以下、microRNAあるいはmiRNAという）は、蛋白質に翻訳されない約22ヌクレオチドの小さなnon-coding RNAであり、small RNAの一員である。small RNA研究の最近の進歩に従い、miRNAが発生と分化に重要な調節因子として作用していることが分かった。miRNAの機能に関する知見は線虫（シーエレガンス：C.elegans）で発見されたmiRNAであるlin-4とlet-7の発生調節に関する研究から始まった。これらlin-4 miRNA及びlet-7 miRNAは、発生タイミングに欠陥がある突然変異体線虫の遺伝的分析により 同定された。線虫において、let-7 miRNAは後期発生段階の間に発現し始める。そして、let-7 miRNAは、lin-41などの標的遺伝子の転写後リプレッサーとして作用する。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNAの3’非翻訳領域上にあるlet-7 miRNAに相補的な配列にlet-7 miRNAが結合することで、その後のmRNAからタンパク質への翻訳を阻害する。すなわちlin-4 miRNAとlet-7 miRNAは標的mRNAに結合して翻訳を抑制することにより初期の発生時期の調節に重要な役目をする。更に、他の例としてはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）で究明されたbantamRNAで、発生過程で一時的に組織特異的に発現し、hid mRNAの転写抑制により細胞増殖を刺激し、アポトーシスを抑制する作用があることが知られている。最近、miR181を含むいくつかのマウスmiRNAは血液生成(hematopoiesis)を調節するものと報告された。【０００３】
miRNAはヒトを含む生物に多数存在することが確認されており、系統的に十分に保存されている。これまで、ヒトを含む様々な生物に置いて約600種類のmiRNAが発見されている。miRNAは単一又はクラスター化されたmiRNA前駆体に転写される遺伝子から生成される。すなわち、先ず、遺伝子から一次転写産物であるpri-miRNAが転写される。次いで、 pri-miRNAから成熟型miRNAへの段階的なプロセシングにおいて、pri-miRNAから特徴的なヘアピン構造を有する約70塩基のpre-miRNAが生成される。さらにDicer介在のプロセシングによりpre-miRNAから成熟型miRNAが生成される（非特許文献１）。【０００４】
少数のmiRNAを除いては、miRNA の生理学的および病理学的役割はほとんど知られていない。しかしながら、miRNAを含む複合体に置いては、脊髄性筋萎縮症や脆弱X症候群などの神経筋変性疾患に関与する蛋白質が存在する。また、癌とmiRNAの関連については、リンパ性白血病において、miRNAであるmiR15およびmiR16が頻繁に発現が低下していることが報告されている。【０００５】
HIF(低酸素誘導性因子)はヘテロ二量体の主要転写因子であり、低酸素下で活性化する。HIFは、ほ乳類において低酸素状態に対する赤血球新生、血管新生および解糖などの恒常性反応を媒介するだけでなく、主要の血管新生および成長をも促進する。HIFは二つのサブユニット、HIF-1αおよびHIF-1βから構成されており、HIF1-βはARNT（Aryl Receptor Nuclear Transclocator）としても知られている。この二つのサブユニットはbHLH(basic helix-loop-helix)およびPAS(Per, ARNT, Sim)ファミリーに属している。これらの因子のbHLHドメインの2つのへリックスは二量体形成に、ベーシック領域はDNA結合に関与する。HIF-1αおよびHIF-2α内のこれら2つのドメインは、低酸素シグナル経路に応答する。前者は酸素依存性分解ドメインで、正常酸素圧下で酸素依存性プロリル水酸化酵素による翻訳後修飾を受ける(非特許文献２)。水酸化したプロリンは、HIFとVHL(von Hippel-Lindau)ユビキチンリガーゼ複合体との相互作用を促進し、素早いユビキチン化の後、プロテアソームによりHIF１αタンパク質が破壊される。HIF1αのCOOH末端トランス活性化ドメインのアスパラギンの水酸化は、p300/CBPコアクチベーターとの相互作用が抑制し、正常酸素圧下でHIF-1転写活性を抑制することが示されている(非特許文献３)。このように、アスパラギン水酸化酵素はプロリル水酸化酵素とともに、細胞内の酸素レベルで調節される低酸素スイッチとして作用する。最近の研究で、水酸化と同様に、ユビキチン化およびリン酸化、アセチル化がHIF-1の安定性の調節に重要な役割を持っていることが示された(非特許文献４)。低酸素状態では、活性化に酸素分子を要する水酸化酵素が非活性になり、HIF-1αは水酸化されず、従って、HIF-1αはpVHLに認識されず細胞内に蓄積する。その後、HIF-1αは核に移動し、恒常的に存在するHIF-1βサブユニットと二量体を形成する(非特許文献５)。その後、二量体は標的遺伝子内の低酸素応答要素(hypoxia responsive element)と結合し、エリスロポエチン、VEGF(非特許文献６)、血小板由来成長因β(PDGF-β)、グルコース輸送体(GLUT1)および亜酸化窒素合成酵素(非特許文献７)のような遺伝子がトランス活性化する。特定のホルモンおよび成長因子もまた、HIF-1α濃度を増加させ、そして、特定の発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子、例えばVHLの突然変異頻度も上昇させるので、結果としてHIF-1αレベルが増加する(非特許文献８)。水酸化またはそれに代わる機構が、この低酸素非依存性HIF活性化に関与しているかどうかは興味深い問題であり、HIF-1αタンパク質の発現を制御するmiRNAは知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hutvagner G, McLachlan J, Pasquinelli AE, Balint E, Tuschl T, Zmore PD, Science, 293：834-8, 2001
【非特許文献２】Jaakkola et al.,Science, 292:468-472, 2001
【非特許文献３】Lando et al.,Science, 295:858-861, 2002
【非特許文献４】Jeong et al.,Cell,111:709-720, 2002
【非特許文献５】Semenza, Genes & Development,14:1983-1991,1985
【非特許文献６】Forsythe et al., Mol. Cell. Biol., 16:4604-4613, 1996
【非特許文献７】Neckers, J. Natl. Cancer Ins.,91:106-107, 1999
【非特許文献８】Ivan and Kaelin, Current Opinion in Genetics & Development, 11:27-34, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、低酸素障害の保護、並びに低酸素障害の予防または治療のための新規な手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、転写因子HIF-1αは、生体内における酸素恒常性の維持に重要な役割を果たしており、このようなHIF-1αが、マイクロRNA、例えばmiR130a、miR130b、miR301によって制御されることを見出した。さらに、低酸素で活性化される転写因子HIF-1αタンパク質の発現および/または活性を調節可能な小核酸分子、例えばmiR130a、miR130b、miR301分子を細胞内に導入することにより、転写因子HIF-1αの活性化が促進し、血管内皮細胞増殖因子VEGFなどの発現が促進することを見いだした。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。【０００９】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを有効成分として含有する、低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（２）  miRNAが、配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５〜４０塩基からなり、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖である、（１）に記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（３）  miRNAが、配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５〜４０塩基からなるRNA鎖と９０％以上の相同性を有し、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖である、（１）又は（２）に記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（４）  miRNAが、配列番号４〜６の何れかに記載の塩基配列からなるRNA鎖である、（１）から（３）の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。【００１０】
（５）  miRNAが、配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列からなるPre-miRNAから誘導されたものである、（１）から（４）の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（６）  miRNAが、配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列からなるPre-miRNAをコードするDNAから転写され誘導されたものである、（１）から（５）の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（７）  HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素状態の細胞を低酸素障害から保護する方法。
（８）  HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素条件下での血管新生因子（VEGF）の産生を増大させる方法。【００１１】
（９）  HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを患者に投与することを含む、低酸素障害を保護する方法、又は低酸素障害を予防若しくは治療する方法。
（１０）  低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤の製造のための、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAの使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規な低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、各micro RNAの配列を示す。アンダーラインはｍRNAへの結合に重要と考えられる領域を示す。
【図２】図２は、成熟型のmiR130aの発現量が低酸素によって変動するかを調べた結果を示す。成熟型のmiR130aの発現量が低酸素によって増加することが確認された。
【図３】図３は、成熟型のmiR130bの発現量が低酸素によって変動するかを調べた結果を示す。成熟型のmiR130bの発現量が低酸素によって増加することが確認された。
【図４】図４は、各マイクロRNA ( 10 nM )をHEK２９３細胞にトランスフェクションし２日間培養後、 各酸素濃度でさらに８時間培養し、HIF-1αの発現を調べた結果を示す。HIF-1αの発現は増加することが確認された。
【図５】図５は、図に示す各濃度のマイクロRNA ( Pre-miR130a またはPre-miR130b )をHEK２９３細胞にトランスフェクションし２日間培養後、21%または0.1％酸素濃度でさらに８時間培養し、HIF-1αとHIF-1βの発現を調べた結果を示す。蛋白量を最大に発現することが確認された。
【図６】図６は、図２Ａにおける0.1%酸素濃度下のHIF-1αのバンド( density値 )をActinのバンドで補正した値をHIF-1αの発現量とし、Mock（トランスフェクションなし）のHIF-1αの発現量に対するPre-miR130a量ごとのHIF-1αの発現量の割合を算出した結果を示す( N=3, Error bar : S.E. )。
【図７】図７は、図２Ａにおける0.1%酸素濃度下のHIF-1αのバンド( density値 )をActinのバンドで補正した値をHIF-1αの発現量とし、Mock（トランスフェクションなし）のHIF-1αの発現量に対するPre-miR130b量ごとのHIF-1αの発現量の割合を算出した結果を示す( N=3, Error bar : S.E. )。
【図８】図８は、HRE-Lucレポーター活性を測定した結果を示す。HRE-Lucレポーター活性は低酸素暴露で上昇するが、その上昇がPre-miR130a, Pre-miR130bの導入により有意に上昇することが明らかとなった。
【図９】図９は、pNFkB-Lucレポーター活性を測定した結果を示す。pNFkB-Lucレポーター活性は、Pre-miR130a, Pre-miR130bの導入により変化がなかった。
【図１０】図１０は、正常酸素濃度においてPre-miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入することによるVEGF の発現の変化を調べた結果を示す。VEGF の発現は、有意に増加することが明らかとなった。
【図１１】図１１は、0.1％の酸素濃度においてPre-miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入することによるVEGF の発現の変化を調べた結果を示す。0.1％の酸素濃度においても低酸素暴露ではPre-miR130a, Pre-miR130bの細胞内導入により、有意にVEGF発現を増加させることが確認された。
【図１２】図１２は、低酸素濃度においてPre-miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入し、細胞の増殖を調べた結果を示す。細胞の増殖は濃度依存的に増加することが明らかとなった。
【図１３】図１３は、miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入し、DDX6量を調べた結果を示す。DDX6は減少することが確認された。
【図１４】図１４は、DDX6 蛋白質とHIF-1αmRNA又はHIF-1βmRNAとの結合を調べた結果を示す。DDX6 蛋白質はHIF-1αのmRNAに結合するが、HIF-1βのmRNAには結合しないことが明らかとなった。
【図１５】図１５は、DDX6遺伝子に対するsiRNA(100nM)を用いて、内在性DDX6をノックダウンし、低酸素下におけるHIF-1αの発現をウエスタンブロットにより検出した結果を示す。Negative control siRNAを導入したものに比べDDX6 siRNAを導入したものは、HIF-1αの蛋白質レベルが増加した。
【図１６】図１６は、Pre-miR130a, Pre-miR130bの構造を示す。
【図１７】図１７は、Pre-miR130a, Pre-miR130bに対するsiRNAを示す。
【図１８】図１８は、Pre-miR130a, Pre-miR130bに対するsiRNAを細胞内に導入し、HIF-1αの蛋白質の増減を調べた結果を示す。si130a, si130bの導入により、HIF-1αの蛋白質のみ減少することが確認された。
【図１９】図１９は、マウス胎児（E18.5） の各組織におけるmiR130aの分布をin situ hybridizationにより調べた結果を示す。Pri-miR130aの組織分布については、Antisense probe ( A )とコントロールとしてSense probe ( B )を用いてしらべた。Mature miR130a については、Antisense Locked probe(C, E, G, I, K),とコントロールとしてAntisense two miss match Locked probe(D, F, H, J, L)を用いた。大脳皮質(C,D)、小脳(E,F)、神経節(G-J)、腎臓(K,L)
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明による低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤は、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを有効成分として含有する。本発明で用いるmiRNAは、HIF-1α（低酸素誘導性因子1α）をコードする核酸を標的として、HIF-1αタンパク質の発現を調節するmiRNAである。また、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素障害から細胞を保護する方法、並びに低酸素条件下での血管新生因子（VEGF）の産生を増大させる方法も本発明に含まれる。
【００１５】
本発明において、このようなmiRNAとしては、好ましくは、配列番号１から３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５〜４０塩基からなりHIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖が用いられる。上記miRNAの鎖長は、好ましくは１５〜４０塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩基、最も好ましくは２０〜２５塩基である。さらには、上記配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５〜４０塩基からなるRNA鎖と、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖も用いられる。あるいは、上記配列番号１〜３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５〜４０塩基からなるRNA鎖において、１個から数個（好ましくは１個又は２個）の塩基が欠失、置換、及び／又は付加されていて、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖を用いてもよい。
【００１６】
本発明で用いられるmiRNAとして最も好ましいRNA鎖は配列番号４〜６に記載されたものであり、それぞれmiR130a（配列番号４）、miR130b（配列番号５）、及びmiR301（配列番号６）である。
【００１７】
以下、上記miRNAを「本発明のmiRNA」と称することがある。
本発明のmiRNAは、それ自体公知の方法を用いて合成することができる。また、本発明のmiRNAの前駆体であるPre-miRNAをコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な細胞で転写させて得ることもできる。本明細書において、Pre-miRNAをコードするDNAとは、Pre-miRNAが誘導されるPri-miRNAの鋳型となるものである。上記の組み換え法によるRNA鎖の合成方法はそれ自体公知の方法であるので、用いるmiRNAに応じて適宜選択して用いることができる。また、上記の組み換え法では、Pri-miRNA及びPre-miRNAが生成するので、これを公知の方法で修飾してmiRNAとすることができる。このような修飾方法として、例えば、インビトロショウジョウバエ細胞溶解システム（米国特許公開番号2002/0086356号公開公報に記載）や、大腸菌RNAseIIIシステム（米国特許公開番号2004/0014113号公開公報に記載）などを用いることができる。
【００１８】
本発明では、細胞を通常の酸素濃度から低酸素状態濃度、例えば21％から0.1％に下げて48時間置くことで、上記  成熟型miR130aとmiR130b及びmiR301の量は2倍以上に増加することが定量的リアルタイムPCRにより明らかになった。同様の事実はノーザンブロットによる発現量の検討に依っても確認できる。これらの所見は、成熟型miR130a, 130b及びmiR301が低酸素により増加するmiRNAであることを示唆する。
【００１９】
マイクロRNAはmRNAより２段階の切断を受けて成熟型になり機能を発揮する。図１に示すように、Pre-miR130a, Pre-miR130bが修飾を受けて、最終的なmiR130a, 130bになる。即ち、Dicerが介在するプロセシングによりpre-miRNAから成熟型miRNAが生成されるので、本発明では、配列番号１から３に記載の塩基配列からなるPre-miR130a, Pre-miR130b、又はPre-miR301を有効成分として用いることができる。即ち、本発明で言うmiRNAとは、成熟型miRNAでもよいし、Pre-miRNAから生体内で誘導されたものでもよい。さらに、本発明のmiRNAは、Pre-miRNAをコードするDNAが、本発明の薬物を投与された生体内で転写され、誘導されたものも含む。さらに、本発明のmiRNAは、その安定性を高めるために例えば、核酸誘導体及び／または改変型ヌクレオシド間結合を有する核酸が用いられる。これらの核酸誘導体は、公知のものを適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、ホスホネートホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ポスホラミデートメトキシエチルホスホラミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン−スルフィド、ジメチレン−スルホキシド、ジメチレン−スルホン、２‘−Ｏ−アルキル、および２’−デオキシ−２’−フルオロホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を含む核酸等が挙げられる（Uhlmannら、1990、Chem.Rev.90:543-584、Schneiderら、1990、Tetrahedron  Lett.31:335）。さらには、Locked Nucleic Acid等の誘導体も挙げられる。
【００２０】
細胞にPre-miR130a、Pre-miR130b及びPre-miR301を導入し、その後、低酸素状態に暴露するとHIF-1αの蛋白質が増加していた。さらにPre-miR130の量を変化させて、例えば0.1nMから100nMまで1000倍程度変化させて、導入すると発現するHIF-1αの蛋白量がPre-miRNA濃度依存的に増加することが明らかとなった。
【００２１】
さらに本発明では、HIF-1αが転写を活性化させるHypoxia response element (HRE)をプロモーターとして持つレポーターを使い、Pre-miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301がHREレポーターを活性化することができるかどうかを検討した。トランスフェリンのプロモーターからの低酸素症応答要素の6コピーを含むpHRE-Lucと、pNFkB-Luc（BD Clonetech）を使った。HRE-Lucレポーター活性は低酸素暴露で上昇するが、その上昇がPre-miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301の導入により有意に上昇することが明らかとなった。しかしながら、pNFkB-Lucレポーター活性は、Pre-miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301の導入により変化がなかった。以上の結果より、miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301はHIF-1αのタンパク量を増加させ、ゲノムの低酸素応答性の転写領域に結合し、下流の遺伝子発現を増加させる機能があることが判明した。
【００２２】
低酸素応答性の転写によって内在性の遺伝子が実際に上昇するかを検討するために、低酸素で発現が上昇し血管新生作用のある血管内皮細胞増殖因子VEGFの発現変化を調べた。その結果、正常酸素濃度においてもmiR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301を細胞内に導入することにより、VEGF の発現が有意に増加することが判明した。また、0.1％の酸素濃度でも低酸素暴露ではPre-miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301の細胞内導入により、有意にVEGF発現を増加させることが確認された。
【００２３】
miR130aがどの臓器に発現しているかをインサイチューハイブリダイゼイションで検討した結果、miR130aは脳と腎臓に高発現していることが判明した。脳では、大脳皮質、小脳では顆粒細胞、腎臓では尿細管周辺の細胞に発現している。以上の結果より、miR130aに関しては、脳と腎臓で酸素濃度変動に対する恒常性維持の機能があると考えられる。
【００２４】
miR130a, miR130b及びPre-miR301の転写は、低酸素状態において増加し、miR130aとmiR130b分子をHEK293細胞に導入することで、HIF-1αの発現亢進が、miR130aとmiR130bの濃度依存的に認められた。また、血管新生因子であるVEGFの発現は、低酸素において、miR130aとmiR130b及びPre-miR301によって有意に増加することが明らかになった。これらのことからmiR130aとmiR130b及びPre-miR301は、HIF-1αの発現・機能に関わる分子であることがわかった。さらにmiR130aは、脳や腎臓に多く局在することから、これらの臓器での酸素恒常性の維持にmiR130aが関与すると考えられる。
【００２５】
miR130aとmiR130b及びPre-miR301などの本発明のmiRNAは、低濃度で標的遺伝子の翻訳を調節し、低酸素適応を可能にすることより、新たな低酸素障害保護剤として期待される。 本発明において、低酸素障害とは、低酸素に起因する虚血性疾患をいい、具体的には脳梗塞、心筋梗塞、腎不全、心不全、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸炎、潰瘍、脊髄障害、視神経障害、視細胞障害、神経障害などである。
【００２６】
本発明の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤（以下、本発明の薬剤とも言う）における有効成分である本発明のmiRNAは、miRNA、Pre-miRNAあるいはこれらが誘導されるPri-miRNAの鋳型となるDNAを適当な発現ベクターに挿入したものとして、送達試薬と組み合わせて対象に投与される。投与方法は、経口投与でもよいし、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）でもよい。
【００２７】
本発明の薬剤で用いられる送達試薬としては、低酸素障害が起きている箇所へ本発明のmiRNAあるいはそれを誘導し得るRNAやDNAを送達し得るものであれば特に制限はなく、公知の試薬あるいは方法を適宜選択して用いることができる。具体的には、たとえば、Mirus Transit TKO親油性試薬、リポフェクチン、セルフェクチン、ポリカチオン、リポソームなどが挙げられる。リポソームの場合には、送達対象細胞で特異的に発現している受容体に結合するリガンド分子を含むことが好ましい。
【００２８】
本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。  薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
【００３０】
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水などが挙げられる。
【００３１】
さらに、本発明の薬剤の有効成分であるHIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。このような投与形態は、当該分野において公知である。
【００３２】
非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ-リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Gene Gun）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。
【００３３】
また、本発明のmiRNAを生体内で転写、誘導させる場合には、各Pre-miRNAをコードするDNAを発現ベクターに挿入して投与する方法も用いられる。ここで、発現ベクターとしては、例えば、pCAGGS、pBJ-CMV、pcDNA3.1、pZeoSV（Invitrogen社又はStratagene社から入手可能）などが挙げられる。リポフェクションを用いる場合、例えば、リポフェクトアミン2000、オリゴフェクトアミン（silencer siRNA TransfectionKit,GeneSilencer siRNA Transfection Reagent）などを用いることができる。本発明のmiRNAの前駆体であるPre-miRNAは、本発明のmiRNAが誘導され得るものであれば特に制限はないが、具体的には、配列番号１から３の何れかに記載の塩基配列からなるものが挙げられる。
【００３４】
また、本発明のmiRNAの前駆体であるPre-miRNAをコードするDNAは、これを適当な発現ベクターに挿入して生体細胞内へ入れた場合に、転写が起こり、該Pre-miRNAが誘導されるPri-miRNAが産出されるものであれば何れのものでもよい。具体的には、ヒトゲノムの染色体番号11の57165247から57165335（配列番号１のRNAの鋳型となるDNA）、染色体番号22の20337593から20337674（配列番号２のRNAの鋳型となるDNA）、あるいは染色体番号11の86926506から86926591（配列番号３のRNAの鋳型となるDNA）で示されるDNAが用いられる。また、Pre-mRNAをコードするDNAは、上記配列を有するものに限定されるものではなく、生体内に存在する本発明のmiRNAのPri-mRNAやPre-miRNAを経由して、本発明のmiRNAが誘導されるものにも限定されず、最終的に本発明のmiRNAが誘導され得る構造であれば何れのものでもよい。
【００３５】
HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、SV40などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAのPre-miRNAをコードする上記ＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に本発明のmiRNAを導入することができる。また、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAは、生体の器官や組織などに直接注入することもできる。この際、上記送達試薬を同時に投与することも好ましい。
【００３６】
本発明の薬剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分の種類などを考慮して、当業者が決定することができる。有効成分であるHIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAの投与量は特に限定されないが、例えば、成人一人当たり、約０．１ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【００３７】
また本発明の薬剤の投与頻度としては、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の頻度で投与することができる。
【００３８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
成熟型のmiR130a, miR130bの発現量が低酸素によって変動するかを検討した。HEK293細胞は100mmディッシュに2×105細胞になるような濃度で蒔き込んだ。翌日に培地を新鮮なDMEM培地に交換して、その後48時間低酸素状態に置いた。細胞を正常酸素状態と低酸素状態で培養してから回収した。RNAはTrizol（Invitrogen）を用いて使用説明書の手順にしたがって抽出した。1μgの全RNA を5μgのランダム6オリゴマーとExScript RT reagent キット（Takara）の20μl反応液中で42℃15分間、95℃2分間、4℃で逆転写反応させた。RT-PCR産物は20倍に希釈し、SYBR Premix Ex Taq kit（Takara）を使って2μlを定量的リアルタイムPCRにかけた。定量的リアルタイムPCRとデータ解析はライトサイクラー1.5システム（Roche）によって成熟型miR130a, 130bの定量を行った。その結果miR130a（図２A）, miR130b(図３A)ともに低酸素によって発現量が増加することが確認された。【００４０】
また、発現量をノーザンブロットで検討した。RNAは上記のように回収し、260nmの光吸収で定量し、全RNAの40μgを15％TBE/尿素ゲル（Invitrogen）による電気泳動で分離した。電気泳動後、ゲルはセミドライ転写装置（Taitech）で200mAで90分かけてHybond N+膜(Amersham)に転写した。RNAはUVクロスリンカーで膜に固定し、5mlの  PerfectHyb ハイブリダイズ溶液で37℃、60分前処理した。DIG標識した固定化核酸プローブのmiR130a LNA-Bを5mlのPerfectHyb ハイブリダイズ溶液に加えた。ハイブリダイズは25℃で24時間行った。膜を0.1％SDS入りの2倍濃度SSC溶液で、55℃、5分間3回洗浄し、抗DIG-AP抗体（ROCHE）をブロッキング液で1000倍に希釈したものと室温で1時間反応させた。シグナルはGDP-starを使って検出し、X線フィルムに露光して可視化した。以下のプローブを検出に使用した：
miR130a LNA-B、ATGcCCtAAcATTgCAcTG（配列番号７）、miR130a 2ミスマッチ LNA-B、ATGaCCtTTtAAcATTgCAaTG（配列番号８）。固定化核酸は小文字で、ミスマッチは下線付きで表示されている。その結果、低酸素によりmiR130a, 130bともに発現増加する結果を得た（２図B,  図３B）。以上より、成熟型miR130a, 130bは低酸素により増加するマイクロRNAであることが明らかとなった。【００４１】
（実施例２）
Pre-miR130a, Pre-miR130bの低酸素応答の中心的転写因子であるHIF-1αへの影響を検討した。実験の前日に、35mmプラスチックディッシュに4×105個のHEK293細胞を蒔いた。この細胞にDharmaFECT1試薬を用い、常法に従って、Negative control, Pre-miR130a, Pre-miR130bを導入し、その2日後に細胞を0.1％低酸素状態に暴露した。
低酸素状態に8時間暴露してから、細胞を2倍濃度のSDSサンプルバッファー（250mM Tris/HCL, pH6.8, 4%SDS, 20%glycerol, 10% β-ME,0.01% bromophenol blue）200μlを加えて破壊し、回収して超音波をかけた。2分間煮沸してから、蛋白質を10％SDS-PAGEで分離してニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を５％(w/v)スキムミルク入りTBST（50mM Tris/HCL, pH7.2, 140mM NaCl, 0,05% Tween-20）に1時間浸して非特異的結合部位をブロックした。HIF-1α、HIF-1βの抗体（NOVUS）（1％ミルク入りTBSTで1000倍希釈）、アクチン抗体（SIGMA）（1％ミルク入りTBSTで10000倍希釈）には４℃で一晩浸けた。その後、ニトロセルロース膜はTBSTで10分間3回洗った。ブロットはHRP標識したヤギの抗マウス二次抗体（BIORAD）（1％ミルク入りTBSTで1000倍希釈）に1時間浸して、TBSTで10分間3回洗った。検出はECLで行った。その結果、図４に示すようにPre-miR130a, Pre-miR130b,Pre-miR301を導入した細胞では、HIF-1αの蛋白質を増加させた（図４）。【００４２】
（実施例３）
Pre-miR130a, Pre-miR130bのHIF1αへの濃度依存的変化を検討した。実験手技は実施例１と同様である。Pre-miR130a, Pre-miR130bの細胞内への導入により、濃度依存的にHIF1αのタンパク量が増加することが確認された（図５）。この変化をPre-miR130a（図６）、Pre-miR130b（図７）それぞれで、ECLの発光をVERSADOC (BIORAD社)で定量を行なった。その結果、Pre-miR130a, Pre-miR130bともに導入濃度（10nM）でHIF1αのタンパク量を最大に発現することが確認された。【００４３】
（実施例４）
Pre-miR130a, Pre-miR130bが実施例３に示すように、HIF1αの蛋白質量を増加させることが明らかとなったので、HIF1αが転写を活性化させるHypoxia response element (HRE)をプロモーターとして持つレポーターを使い、Pre-miR130a, Pre-miR130bがHREレポーターを活性化することができるか検討した。 HEK293細胞は24穴プレート(Iwaki)に5×104個（/穴）を蒔いた。
Lipofectamine LTX 導入試薬を使い(Invitrogen)、細胞に170 ngの蛍ルシフェラーゼレポータープラスミドと80 ngのウミシタケルシフェラーゼプラスミドpGL4.74を導入した。蛍フシフェラーゼレポータープラスミドとしては、トランスフェリンのプロモーターからの低酸素症応答要素の6コピーを含むpHRE-Lucと、pNFkB-Luc（BD Clonetech）を使った。
レポータープラスミド導入から5時間後にDharma FECT1導入試薬(Dharma) を使って10μMのpre-miRNA130a, 130bを細胞に導入した。Pre-miRNAsの導入から48時間後に細胞を0.1％酸素に暴露、あるいは20 ng/ml TNF-αで12時間処理した。細胞抽出液はPassive Lysis Buffer（Promega）で調製し、ルシフェラーゼアッセイはDual-Luciferase assy キット（Promega）で使用説明に従って行った。HREルシフェラーゼとNFkBルシフェラーゼの数値は導入効率によるばらつきを補正するためにウミシイタケルシフェラーゼの数値で割り付けた。【００４４】
HRE-Lucレポーター活性は低酸素暴露で上昇するが、その上昇がPre-miR130a, Pre-miR130bの導入により有意に上昇することが明らかとなった（図８）。しかしながら、pNFkB-Lucレポーター活性は、Pre-miR130a, Pre-miR130bの導入により変化がなかった（図９）。以上の結果より、miR130a, Pre-miR130bはHIF1αのタンパク量を増加させ、ゲノムの低酸素応答性の転写領域に結合し、下流の遺伝子発現を増加させる機能がある。【００４５】
（実施例５）
低酸素応答性の転写によって内在性の遺伝子が実際に上昇するかを検討するために、低酸素で発現が上昇し血管新生作用のある、VEGFの発現変化を調べた。RNAの回収法は、実施例２と同様である。PCRは95℃2分間で前変性させて、95℃10秒間の変性、55℃20秒間のアニーリング、72℃30秒間の伸張を50〜60サイクル行った。全量ではβ-actin mRNA を使って標準曲線を計算し、VEGF mRNA量は内部標準にβ-actin mRNAを使って基準化した。
Actinの順方向プライマー：5'-ACCATGGATGATGATATCGCC-3' （配列番号９）
Actinの逆方向プライマー：5'-GCCTTGCACATGCCGG-3' （配列番号１０）
VEGFの順方向プライマー：5'-CCCTGATGAGATCGAGTACAT-3' （配列番号１１）
VEGFの逆方向プライマー：5'-CGGCTTGTCACATCTGCAAGT-3' （配列番号１２）【００４６】
その結果、正常酸素濃度においてもmiR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入することにより、VEGF の発現が有意に増加することが明らかとなった（図１０）。また、0.1％の酸素濃度でも低酸素暴露ではPre-miR130a, Pre-miR130bの細胞内導入により、有意にVEGF発現を増加させることが確認された（図１１）。以上のことより、Pre-miR130a, Pre-miR130bはVEGFを増加させることによる血管新生作用もあることが示された。【００４７】
（実施例６）
Pre-miR130a, Pre-miR130bの細胞内への導入が低酸素性の細胞障害、増殖抑制から細胞を守ることができるかを検討した。実験前日にHEK293細胞を24穴プレート(Iwaki)に5 x 104個/穴で藩種した。翌日、miRNAまたはsiRNAを細胞に導入し、37℃で48時間培養を行った。その後、低酸素条件下で、8時間培養し、培地を新鮮な培地に交換し、CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay 試薬（Promega）を用いて使用説明書に従い、マイクロプレートリーダー680 (BIORAD)で、ホルマザン産物の吸光度490 nmを測定することで、細胞増殖および細胞死を検出した。その結果、低酸素濃度においてmiR130a,Pre-miR130bを細胞内に導入することにより、細胞の増殖 が濃度依存的に増加することが明らかとなった（図１２）。【００４８】
（実施例７）
Pre-miR130a, Pre-miR130bの標的遺伝子をTARGET SCAN, miRandaなどのデータベースより検索し、その候補遺伝子としてDDX6を調べた。DDX6蛋白質はmRNAの貯蔵、分解を制御するP bodyを構成する蛋白質であることが判明している。そのため、HIF-1αのmRNAの転写後制御をしていると考え第一候補とした。実験の前日に、35mmディッシュに4×105個のHEK293細胞を藩種した。【００４９】
各Pre-miR130a, pre-miR130bを導入したHEK293細胞を48時間後に、SDSサンプルバッファー（250mM Tris/HCL, pH6.8, 4%SDS, 20%glycerol, 10% β-ME,0.01% bromophenol blue）200μlを加えて細胞を破壊し、超音波処理および2分間の煮沸処理を行い、蛋白質を8％SDS-PAGEで分離してニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜は、５％(w/v)スキムミルク入りTBST溶液（50mM Tris/HCL, pH7.2, 140mM NaCl,0,05% Tween-20）に1時間浸して非特異的結合部位をブロックし、次にDDX6抗体 ( BETHYL )（5％ミルク入りTBSTで1000倍希釈）、アクチン抗体（SIGMA）（5％ミルク入りTBSTで10000倍希釈）を含む5％(w/v)スキムミルク入りTBST溶液に４℃で一晩浸けた。【００５０】
その後、ニトロセルロース膜はTBST溶液で10分間3回洗った。ブロットはHRP標識したヤギの抗マウス二次抗体（BIORAD）（5％ミルク入りTBSTで1000倍希釈）に1時間浸して、TBST溶液で10分間3回洗った。シグナルは、Immun-Star HRP 試薬( BIORAD)で化学発光として検出し、VarsaDoc (BIORAD)にて可視化した。その結果、miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入することにより、DDX6の蛋白質が減少することが確認された（図1３）。【００５１】
また、このDDX6蛋白質がHIF-1αのmRNAに結合してmRNAの安定性や翻訳制御をしているとすると、DDX6はHIF-1αのmRNAに結合すると考えられる。これを証明するため、以下の実験を行なった。【００５２】
実験の前日に、100mmディッシュに2 x 106個のHEK293細胞を藩種した。翌日に細胞を5mlのPBSで一度洗浄した後、Lysis buffer ( 10mM HEPES pH 7.0, 100mM KCl, 5mM MgCl, 0.5% NP-40, 1mM DTT, 100units/ml RNaseOUT (Invitrogen), Protease inhibitor cocktail (Roch) )を500 μl加え破砕し、抗DDX6抗体( BETHYL )を3 μg加え、4℃で一晩攪拌した。その後、50% surraly Protein G sepharose 4 FF (GE Healthcare)を100μl加え4℃で一時間攪拌し、遠心 (10000 rpm, 10秒)によりレジンを回収した。回収したレジンは、500 μl のNT2 buffer ( 50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM MgCl, 0.05% NP-40)で５回洗浄し、20unitのDNase Iを含むNT2 buffer 100μlをレジンに加え、15分間30℃で加熱した。DNase処理を行ったレジンは、遠心により回収し、TRIzolを加えRNAを抽出した。RNAは、260nmの光吸収で定量し、全RNAの1μgを用いてPrimeScript RT reagent Kit ( TaKaRa )によりcDNAを合成した。PCRは、全量25 μl に対して、cDNA 1 μlを鋳型とし、ExTaq DNAポリメラーゼ ( TaKaRa)およびHIF-1αプライマーまたはHIF-1βプライマーを用いて行った。PCRで使用したプライマーを以下に示す。
HIF-1αの順方向プライマー : 5'-CTTGCTCATCAGTTGCCACTT-3' （配列番号１３）
HIF-1αの逆方向プライマー : 5'-GCCATTTCTGTGTGTAAGCAT-3' （配列番号１４）
HIF-1βの順方向プライマー : 5'-ATTCAAGGTGGAGGAGCCATTGTC-3' （配列番号１５）
HIF-1βの逆方向プライマー : 5'-ATAGGAGCCATCAGTGGATGTGTT-3' （配列番号１６）【００５３】
その結果、DDX6 蛋白質はHIF-1αのmRNAに結合するが、HIF-1βのmRNAには結合しないことが明らかとなった（図１４）。以上の結果より、miR130a, miR130bはDDX6に作用し、DDX6の蛋白レベルを減少することにより、HIF-1αのP-bodyよりの遊離を促し、翻訳活性を高めていると考えられる。【００５４】
HIF-1αの翻訳制御にDDX6が直接関与することを証明するために、DDX6遺伝子をsiRNAでknock downし、HIF-1αの蛋白レベルをウエスタンブロットで調べた。実験の前日に、35mmディッシュに4 x 105個のHEK293細胞を藩種した。翌日、QIAGENから購入したDDX6 siRNAを最終濃度100nMとなるようにDharmaFECT1試薬 ( Dharmacon ）を用いて、HEK293細胞に導入した。導入方法は、DharmaFECT1試薬取り扱い説明書に従って行った。細胞は、DDX6 siRNAの導入から48時間後に低酸素状態に暴露した。その後、細胞を回収し、ウエスタンブロットにより、HIF-1αの発現を確認した。その結果、DDX6遺伝子のknock downは、HIF-1αの蛋白レベルを増加させた（図１５）。このことは、miR130, miR130bによるDDX6の減少が、HIF-1αの蛋白レベルを増加させること証明する。【００５５】
（実施例８）
Pre-miR130a, Pre-miR130bのHIF-1αへの影響を、確証するために、これらのmicroRNAに対するsiRNAをそれぞれのループ領域（図１６）に対してデザインした（図１７）。このsiRNAを細胞内に導入することにより、HIF-1αの蛋白質の増減を検証した。siRNAの導入、ウエスタンブロットによる検出は同様の方法を用いている。【００５６】
その結果、si130a, si130bの導入により、HIF-1αの蛋白質のみ減少することが確認された（図１８）。図５および図１８の結果より、miR130a, miR130bがHIF-1αの蛋白質レベルを制御することは明らかである。【００５７】
（実施例９）
miR130aがどの臓器に発現しているかをインサイチューハイブリダイゼイションで検討した。熟成miR130a(22n.t.)のアンチセンスプローブはDIG標識の固定化核酸を用意した。インサイチューハイブリダイゼイション用のパラフィン包埋ブロックとマウス胎児(E18.5)の切片はGenostaff社から入手した。ハイブリダイズはDIG標識固定化miR130aプローブをProbe Diluentで濃度100ng/mlに調製して行った。切片はAP 標識のDIG抗体（ROCHE）と2時間反応させた。発色反応はNBT/BCIPで一晩行った。切片はKernechtrotでカウンター染色し、脱水して、malinol で標本にした。【００５８】
その結果、miR130aは脳と、腎臓に高発現していることが判明した（図1９）。脳では、大脳皮質（C- a, b）、小のでは顆粒細胞（D-a,b）、腎臓では尿細管周辺の細胞に発現している（E-a）。
以上の結果より、miR 130aに関しては、脳と腎臓で酸素濃度変動に対する恒常性維持の機能があると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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