(57)【要約】  本発明は、非侵襲的に皮膚から投与し、免疫を獲得するための方法、及び装置を提供することを目的とする。  本発明の製剤は、支持体と、前記支持体上に形成され、皮膚との直接の接触を避けるために絶縁体で一部が保護された電極と、前記電極上に形成され、ワクチンを含有するワクチン含有層と、を有する製剤であって、前記ワクチンが、免疫抑制蛋白質を誘導する抗原であることを特徴とする。本発明のワクチンの投与方法は、本発明の製剤を電極として用いて、イオントフォレーシスによりワクチンを投与することを特徴とする。本発明のイオントフォレーシス装置は、本発明の製剤を電極として用いることを特徴とする。
2009044555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と、前記支持体上に形成され、皮膚との直接の接触を避けるために絶縁体で一部が保護された電極と、前記電極上に形成され、ワクチンを含有するワクチン含有層とを有する製剤であって、前記ワクチンが、免疫抑制蛋白質を誘導する抗原であることを特徴とする製剤。
【請求項２】
免疫抑制蛋白質を誘導する抗原が、ヒストンＨ１、又は配列表の配列番号１〜５のいずれか1つに記載されるペプチドである請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記ワクチン含有層中の薬液のpHを６以上とする請求項１又は2項に記載の製剤。
【請求項４】
前記ワクチンには、キャリアー蛋白質を含む請求項１〜３項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
前記キャリアー蛋白質が、動物蛋白質、植物蛋白質、又は糖蛋白質である請求項４記載の製剤。
【請求項６】
前記キャリアー蛋白質が、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、オボアルブミン（OVA）、牛血清アルブミン（BSA）からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜４項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
前記ワクチンには、アルミニウム化合物、Ｗ／Ｏ型エマルション、Ｏ／Ｗ型エマルション、リポソーム、virosome、サポニン、サポニン含有物、ＭＦ５９（スクアレンエマルション）、monophosphoryl  lipid  A(MPL)、易熱性エンテロトキシン、コレラトキシン、ＣｐＧモチーフオリゴヌクレオチド、サイトカイン、non-ionic block copolymerからなる群から選択される少なくとも1種のアジュバントを含む請求項１〜６項のいずれか1項に記載の製剤。
【請求項８】
前記ワクチンが、免疫抑制蛋白質を誘導する抗原を含むワクチンである請求項１〜７項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項９】
請求項１〜８項のいずれか１項に記載の製剤を電極として用いて、イオントフォレーシスによりワクチンを投与するワクチンの投与方法。
【請求項１０】
前記ワクチンを投与する際に、皮膚免疫シグナルを生じさせ、皮膚免疫の誘導を行う請求項９記載の方法。
【請求項１１】
さらに、電気的刺激による皮膚免疫の誘導を行う請求項９項又は１０項に記載の方法。
【請求項１２】
最初のワクチン投与を、前記ワクチン含有層の薬液のpH６以上の条件下で行う請求項９〜１１項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ワクチン含有層の薬液のpH６以上の条件下で最初のワクチン投与を行った後、さらに2回目以降のワクチン投与を行う請求項９〜１２項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜８項のいずれか１項に記載の製剤を電極として用いるイオントフォレーシス装置。
【請求項１５】
前記製剤を、陰極側の電極として用いる請求項１４記載のイオントフォレーシス装置。
【請求項１６】
前記製剤を、陽極側と陰極側の両方の電極として用いる請求項１４記載のイオントフォレーシス装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製剤、当該製剤を用いたワクチンの投与方法及びイオントフォレーシス装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イオントフォレーシスは、生体に有用なイオン性の薬剤などの成分を、所謂電気泳動を利用して生体に浸透させる方法であり、イオン浸透療法、イオン導入方法などとも呼ばれ、主に全身性の薬物の投与に用いられている。【０００３】
イオントフォレーシス装置は一般に薬効成分（生理活性物質）がプラス又はマイナスのイオン（薬剤イオン）に解離する薬剤液を保持する作用極構造体と、作用極構造体の対極の役割を有する非作用構造体を備えており、これら両構造体を生体（ヒト又は哺乳動物）の皮膚に当接させた状態で、作用極構造体に薬剤イオンと同一極性の電圧を電源装置より印加することによって薬剤イオンが生体内へ投与される（非特許文献１）。まれに両方の極に生理活性物質を含ませ、両極とも作用構造体とすることもある。イオントフォレーシスは一般には単位面積あたり１mA以下の低い電流を流し、痛みを伴うほどのではないが、皮膚に赤みを帯びるなどの電気による皮膚反応を生じることがある。【０００４】
一方、ワクチンは感染症の予防に用いられているものが主であるが、ヒトなどの動物に接種して感染症の予防に用いる医薬品で、一般に毒性を無くしたか、あるいは弱めた病原体から作られ、弱い病原体を注入することで体内に抗体を作り、以後感染症にかかりにくくするためのものである。ワクチンとしては、大別すると生ワクチンと不活化ワクチンとが存在する。生ワクチンは毒性を弱めた微生物やウイルスを使用し、液性免疫のみならず細胞免疫も獲得できるため、一般に不活化ワクチンに比べて獲得免疫力が強く免疫持続期間も長い。これらの例としてはBCG、経口生ポリオワクチン、痘苗、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、麻疹・風疹混合ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、黄熱ワクチン、ロタウイルスワクチン、帯状疱疹ワクチン、麻疹・風疹・おたふく混合ワクチン、MMRV（ 麻疹・風疹・おたふく・水痘）などがある。【０００５】
一方、不活化ワクチンは死ワクチンとも呼ばれる。狭義の不活化ワクチンは化学処理などにより死んだウイルス、細菌、リケッチアを使用する。これらと同様の効果を示すことから、抗原部分のみを培養したものを含めて不活化ワクチンと称されることもある。不活性ワクチンは、生ワクチンより副反応が少ないが、液性免疫しか獲得できずその分免疫の続く期間が短いことがあり、このため複数回接種が必要なものが多い。これらの例としてはインフルエンザウイルスワクチン、狂犬病ワクチン、コレラワクチン、三種混合（DPT）ワクチン（百日咳・ジフテリア・破傷風混合ワクチン）、二種混合（DT）ワクチン（ジフテリア・破傷風混合ワクチン）、日本脳炎ワクチン、百日咳ワクチン、23価肺炎球菌莢膜多糖体ワクチン、A型肝炎ウイルスワクチン、B型肝炎ウイルスワクチン、多価蛋白結合肺炎球菌ワクチン、炭疽菌ワクチン、不活化ポリオワクチン、髄膜炎菌ワクチン、腸チフスワクチン、ダニ媒介脳炎ワクチン、インフルエンザ桿菌b型ワクチン、A型肝炎ワクチン、ジフテリア・破傷風混合ワクチン、新型・不活化経口コレラワクチン、ヒトパピローマウイルス（HPV）ワクチンなどが使用されている。【０００６】
また、肺炎球菌ワクチンなどのように蛋白ではない抗原を用いるワクチンや免疫活性の弱い抗原では、抗原(ハプテン)部分だけでは免疫を惹起できないことがあるため、別の蛋白と抗原を結合させるなどの工夫がされている。【０００７】
最近では、経口ワクチンや経皮ワクチン、経膣ワクチン、経直腸ワクチン、経鼻ワクチン、経肺ワクチンなど、注射とは異なる新たな投与経路を用いたワクチンの開発に伴い、ワクチンはウイルスやバクテリアなどの外来病原因子に対する予防用というこれまでの概念からその応用範囲を広げ、多発性硬化症や重症筋無力症などの自己免疫疾患、癌、痴呆症、高血圧、高脂血症などのすでに罹患した疾患の慢性化予防や非感染性の疾患に対する治療用として開発されるようになってきている。【０００８】
ワクチンの接種方法としては、ポリオのような経口投与のものが存在する。また、数本の針を有するスタンプ式の投与方法で、比較的痛みの少ない接種方法として、ＢＣＧが知られている。【０００９】
また、イオントフォレーシスを用いたワクチンの接種方法として、イオントフォレーシスの一方の極にワクチン、もう一方の極に免疫活性を高めるためにアジュバンドを含有させた例が知られている（特許文献１）。
【特許文献１】特開2006−334292号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス、76巻、341ページ、1987年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ワクチンの接種方法としては、上記ポリオによる経口投与方法以外は、ほとんどが侵襲的な注射による投与が一般的である。このようにポリオ以外はほとんどが侵襲的な投与方法で、感染などの危険性を伴う他、医療機関での投与が必須となるため、数回の投与を必要とするワクチンの投与としては簡便なものではなかった。また、発展途上国では注射によるワクチン投与は、消毒不十分な注射器注射針の再利用による感染が問題となっている。一方で、ワクチン開発が盛んな米国をはじめとした先進国においては、注射投与に技術を要するためバイオテロリズムや毒性の強いインフルエンザ、黄熱病などの致死性感染症の流行の際にワクチンの大規模投与を迅速に実施できないことが問題とされている。さらに、先進国、発展途上国共通の問題として医療従事者の針刺し事故による感染の問題があり、注射投与よりも簡便なワクチン投与方法の確立が望まれている。そこで、注射投与に代わる新たなワクチン投与方法として皮膚免疫を利用した非侵襲的で効果的なワクチン投与方法について研究がされてきた。【００１１】
しかしながら、皮膚は生体の最外殻をなし、バリアー性を有する角質層に覆われているためワクチンを貼付したのみでは、角質層を透過しにくく免疫応答を誘導しにくいのが現状である。またストリプトスキンと呼ばれる角質層を取り除いた皮膚にワクチンを投与しても免疫応答を誘導しにくいという問題点も有する。【００１２】
さらに、上記特許文献１には、イオントフォレーシスを用いて、ワクチンを投与する技術が開示されているが、抗原のみでは効果的な免疫応答を誘導できないことから、当該アジュバンドの使用を前提とするものであった。しかし、アジュバンドを使用した場合、アジュバンド由来の副作用の恐れもあることから、可能であれば、アジュバンドを使用することなしに、ワクチン投与することが望ましい。しかるに、これまでアジュバンドの使用なしに効果的な免疫応答を誘導できるイオントフォレーシスを用いたワクチン投与技術は存在しない。【００１３】
そこで、本発明は、上記問題点を解決すべく、皮膚から非侵襲的にワクチンを投与し、アジュバンドを用いることなく皮膚免疫を利用し、生体内で免疫応答を誘導することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明者らは、ワクチンを投与の非侵襲的投与について検討した結果、本発明を見出すに至った。【００１５】
すなわち、本発明の製剤は、支持体と、前記支持体上に形成され、皮膚との直接の接触を避けるために絶縁体で一部が保護された電極と、前記電極上に形成され、ワクチンを含有するワクチン含有層とを有する製剤であって、前記ワクチンが、免疫抑制蛋白質を誘導する抗原であることを特徴とする。【００１６】
また、本発明の製剤の好ましい実施態様において、免疫抑制蛋白質を誘導する抗原が、ヒストンＨ１、又は配列表の配列番号１〜５のいずれか1つに記載されるペプチドであることを特徴とする。【００１７】
また、本発明の製剤の好ましい実施態様において、前記ワクチン含有層中の薬液のpHを7以上とすることを特徴とする。【００１８】
また、本発明の製剤の好ましい実施態様において、前記ワクチンには、キャリアー蛋白質を含むことを特徴とする。【００１９】
また、本発明の製剤のより好ましい実施態様において、前記キャリアー蛋白質が、動物蛋白質、植物蛋白質、又は糖蛋白質であることを特徴とする。【００２０】
また、本発明の製剤の好ましい実施態様において、前記キャリアー蛋白質が、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、オボアルブミン（OVA）、牛血清アルブミン（BSA）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。【００２１】
また、本発明の製剤の好ましい実施態様において、前記ワクチンには、アルミニウム化合物、Ｗ／Ｏ型エマルション、Ｏ／Ｗ型エマルション、リポソーム、virosome、サポニン、サポニン含有物、ＭＦ５９（スクアレンエマルション）、monophosphoryl  lipid  A(MPL)、易熱性エンテロトキシン、コレラトキシン、ＣｐＧモチーフオリゴヌクレオチド、サイトカイン、non-ionic block copolymerからなる群から選択される少なくとも1種のアジュバントを含むことを特徴とする。【００２２】
また、本発明の製剤の好ましい実施態様において、前記ワクチンが、不活化ワクチンであることを特徴とする。【００２３】
本発明のワクチンの投与方法は、本発明の製剤を電極として用いて、イオントフォレーシスによりワクチンを投与することを特徴とする。【００２４】
本発明のワクチンの投与方法の好ましい実施態様において、前記ワクチンを投与する際に、皮膚免疫シグナルを生じさせ、皮膚免疫の誘導を行うことを特徴とする。【００２５】
本発明のワクチンの投与方法の好ましい実施態様において、さらに、電気的刺激による皮膚免疫の誘導を行うことを特徴とする。【００２６】
本発明のワクチンの投与方法の好ましい実施態様において、最初のワクチン投与を、前記ワクチン含有層の薬液のpH６以上の条件下で行うことを特徴とする。【００２７】
本発明のワクチンの投与方法の好ましい実施態様において、前記ワクチン含有層の薬液のpH６以上の条件下で最初のワクチン投与を行った後、さらに2回目以降のワクチン投与を行うことを特徴とする。【００２８】
本発明のイオントフォレーシス装置は、本発明の製剤を電極として用いることを特徴とする。【００２９】
本発明のイオントフォレーシス装置の好ましい実施態様において、前記製剤を、陰極側の電極として用いることを特徴とする。【００３０】
本発明のイオントフォレーシス装置の好ましい実施態様において、前記製剤を、陽極側と陰極側の両方の電極として用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の製剤、ワクチン投与方法、及びイオントフォレーシス装置は、以下の効果を奏する。【００３２】
(1)ワクチンの投与は特に乳幼児期に多く行われるが、本発明の装置による投与によって、痛みに耐えにくい小児に対して苦痛を与えることなく、免疫を獲得することができる。【００３３】
(2)注射によるワクチン投与が困難である針に対する恐怖症がある患者のコンプライアンスを向上させることができる。【００３４】
(3)注射投与で起こる針刺し事故による医療従事者の感染症の危険性をなくすことができる。【００３５】
(4)免疫原性が弱く、複数回の投与が必要な抗原を含有するワクチンであっても、痛みを伴わないことから、簡便に投与し、容易に免疫応答を誘導することができる。【００３６】
(5)非侵襲的であるので、皮膚からの細菌等による感染を防止できる。【００３７】
(6)ワクチンを含むパッチを皮膚に貼付し、所定の装置から電圧を印加するだけなので、在宅でも投与が可能で、在宅のまま疾病予防が可能となる、などの効果が得られる。【００３８】
(7)従来は美容、疾病治療のために用いることが主だったイオントフォレーシスをワクチン投与に応用することにより、経皮的に免疫応答を誘導し、疾病の発現予防することが可能となる。【００３９】
(8)イオントフォレーシスによれば、抗原投与部位である皮膚近傍にターゲット細胞であるランゲルハンス細胞が豊富に存在しており、効率良く抗原を標的細胞に送達できることから他の投与経路に比べて抗原投与量を下げることができる。また、注射投与用ワクチンで必要とされる生産、輸送、消費までのcold chain（低温温度管理）が不要となることによるコスト低減、投与の簡便性向上による大規模ワクチン投与が可能となるなど有利な効果を奏する。【００４０】
以上のように、本発明によれば、イオントフォレーシスによりワクチンを皮膚から投与することにより、ワクチンの免疫応答能を高めることを可能とした。またワクチンの投与を非侵襲的に行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本発明の一実施態様によるイオントフォレーシス装置の概略を示す図である。
【図２】図２は、本発明の一実施態様による製剤を示す図である。
【図３】図３は、各群の試験開始から25日目の時点における、血清サンプルの吸光度の平均値±標準誤差を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明の製剤は、支持体と、前記支持体上に形成され、皮膚との直接の接触を避けるために絶縁体で一部が保護された電極と、前記電極上に形成され、ワクチンを含有するワクチン含有層と、を有する製剤であって、前記ワクチンが、免疫抑制蛋白質を誘導する抗原であることを特徴とする製剤である。【００４３】
ここで、本発明の製剤の一例を図２を用いて説明すれば、以下のようである。図2に当てはめると、本発明の製剤は、支持体（２４）と、前記支持体上に形成され、皮膚との直接の接触を避けるために絶縁体（２３）で一部が保護された電極（２１）と、前記電極上に形成され、ワクチンを含有するワクチン含有層（２２）と、を有する。例えば、ＰＥＴフィルムや発泡体などの合成高分子フィルムからなる支持体上（２４）に端子部分が皮膚と直接接触しないように絶縁テープ（２３）を施した電極（２１）を粘着材等で固定し、電極上にワクチン含有層（２２）を重ねることができる。支持体は、皮膚へ固定させる役割があれば、特に限定されるものではない。ワクチン含有層は、ワクチンを含有する溶液、薬液等を保持することが可能であれば、特に材質等に限定されるものではない。例えば、不織布などをワクチン含有層に利用することができる。また、絶縁体は、皮膚との直接の接触を避ける役割があれば、特に限定されるものではない。絶縁体は、電極の周囲を取り巻くように構成してもよく、デバイスとの接続様式によって直接接触を避けることが可能であれば、特に構成に限定されるものではない。従って、電極の全部を絶縁体で覆う必要は必ずしも無く、電極は、絶縁体で一部を保護されていれば足りる。リード線等は、図2中の電極のはみ出た部分に接続すれば足りる。好ましい実施態様において、電極層の電極材料が、白金、金、チタン、アルミ、カーボン、銀、銅、ニッケル、亜鉛、炭素などの電子導電体からなる電極、半導体電極、及び銀／塩化銀などの自己犠牲電極、塩化銀／塩化銀から少なくとも１種類が選択されることができる。安価に利用できるという観点から、電極としてはカーボンが望ましい。さらに望ましくは、機能面からｐHの変化を生じさせないという観点から陽極側には銀を含むもの、陰極側には塩化銀を含むものが望ましいが、本発明は、これらに限定されるものではない。これらの電極は、板、シート、メッシュ、繊維を不定形に積層させたペーパー状物に成形加工されたものをそのまま使用することもできる。【００４４】
ここで、従来、一般的にはワクチンとは感染症の予防に用いられているものが主であったが、本明細書において、ワクチンとは、これよりも広い概念を意味する。すなわち、本発明においては、ワクチンとは、感染症に限られず、多発性硬化症や重症筋無力症などの自己免疫疾患、癌、痴呆症、高血圧、高脂血症などのすでに罹患した疾患の慢性化予防や非感染性の疾患に対する治療用のものも含む、広い概念を意味する。【００４５】
これは、最近では、経口ワクチンや経皮ワクチン、経膣ワクチン、経直腸ワクチン、経鼻ワクチン、経肺ワクチンなど、注射とは異なる新たな投与経路を用いたワクチンの開発に伴い、ワクチンはウイルスやバクテリアなどの外来病原因子に対する予防用というこれまでの概念からその応用範囲を広げ、多発性硬化症や重症筋無力症などの自己免疫疾患、癌、痴呆症、高血圧、高脂血症などのすでに罹患した疾患の慢性化予防や非感染性の疾患に対する治療用として開発されるようになってきており、本発明において、感染、非感染を問わず、幅広く適用可能だからである。【００４６】
ワクチン含有層（成分保持部）についても特に限定されるものではないが、成分保持部としては、ワクチンを水等に溶解また一部溶解させたワクチン含有液を多孔質ポリマー、ガーゼなどに含浸させたものや、該液をポリビニルアルコールやポリビニルピロリドンなどを混合して得られるゲルを用いることができる。【００４７】
また、本発明の製剤の好ましい実施態様において、免疫抑制蛋白質を誘導する抗原が、蛋白質としては、ヒストンＨ１である。ここで、ヒストンについて説明すると、ヒストン (histone) は、真核生物のクロマチンを構成するタンパク質の一群をいう。強い塩基性のタンパク質であり、酸性のDNAとの高い親和性を示す。DNAを自身に巻き付けてコンパクトにする役目を持つ。主に、5種類のヒストン（H1、H2A、H2B、H3、H4）が知られている。このうち、H2A、H2B、H3、H4の４種は、コアヒストンと呼ばれ、それぞれ二分子があつまりヒストン八量体（ヒストンオクタマー）を形成する。一つのヒストンオクタマーは、約146bpのDNAを左巻きに約1.65回巻き付ける。この構造はヌクレオソームと呼ばれ、クロマチン構造の最小単位である。H1はリンカーヒストンと呼ばれ、ヌクレオソーム間のDNAに結合する。【００４８】
また、免疫抑制蛋白質を誘導する抗原が、ペプチドとしては、配列表の配列番号１〜５のいずれか1つに記載されるペプチド、具体的には、SSVLYGGPPSAA、HATGTHGLSLSH、NYQTYTPRPPHS、VTNNQTSPRWEI、WKPVSLTLHTHPなどを挙げることができる。【００４９】
好ましい実施態様において、前記ワクチン含有層のpHを６以上とする。これは詳細なメカニズムは不明であるが、皮膚を、pH６以上で処理、好ましくはアルカリ処理、さらに好ましくは、pH7.5〜9.5で処理することで皮膚損傷シグナルが生じ、皮膚免疫の誘導が掛かっていることが考えられる。本発明の製剤の使用は、さらに、後述するように、イオントフォレーシスの電気的刺激による皮膚免疫誘導との相乗効果で予想以上のワクチン効果を奏する。【００５０】
また、本発明の製剤の好ましい実施態様において、前記ワクチンには、キャリアー蛋白質を含む。このようなキャリアー蛋白質としては、特に限定されるものではないが、動物蛋白質、植物蛋白質、又は糖蛋白質などを挙げることができる。例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（OVA）、牛血清アルブミン（BSA）からなる群から選択される少なくとも１種を挙げることができる。ワクチンとキャリアー蛋白質との結合様式は特に限定されず、常法による。免疫原性が弱い抗原（それ単独では抗体を誘導できないもの）に対してはキャリア蛋白と呼ばれる免疫原性が高い蛋白質に抗原を結合させることでキャリア蛋白質に対する抗体を誘導するのと同時に目的の抗原に対する抗体を誘導する手法が一般的に用いられているので、本発明の製剤においても適用する事が可能である。キャリア蛋白質と抗原の結合は色々あるが、抗原を効率良く抗原提示細胞に送達させるという観点から、共有結合で結合させることが好ましい。結合形はグルタルアルデヒドなどを介してもよい。【００５１】
また、前記ワクチンには、アルミニウム化合物、Ｗ／Ｏ型エマルション、Ｏ／Ｗ型エマルション、リポソーム、virosome、サポニン、サポニン含有物、ＭＦ５９（スクアレンエマルション）、monophosphoryl  lipid  A(MPL)、易熱性エンテロトキシン、コレラトキシン、ＣｐＧモチーフオリゴヌクレオチド、サイトカイン、non-ionic block copolymerからなる群から選択される少なくとも1種のアジュバントを含んでもよい。【００５２】
次に、本発明のワクチンの投与方法について説明すれば、以下のようである。すなわち、本発明のワクチンの投与方法は、上述した本発明の製剤を電極として用いて、イオントフォレーシスによりワクチンを投与することを特徴とする。上述した本発明の製剤を用いてイオントフォレーシスによりワクチンを投与することにより、アジュバント無しにワクチンを投与可能になることを本発明者らが見出したことによる。本発明の投与方法に用いる本発明の製剤については、上述の本発明の製剤の説明を、本発明のワクチンの投与方法についてそのまま適用することができる。イオントフォレーシスにより非侵襲的にワクチンを投与し、免疫を獲得することが可能である。【００５３】
また、本発明のイオントフォレーシス装置は、上述した本発明の製剤を電極として用いることを特徴とする。本発明のイオントフォレーシス装置において使用される本発明の製剤ついては、上述の本発明の製剤の説明をそのまま適用することができる。【００５４】
本発明の好ましい態様において、前記ワクチンを投与する際に、皮膚免疫シグナルを生じさせ、皮膚免疫の誘導を行う。皮膚免疫シグナルを生じさせ、皮膚免疫の誘導を行うことについて、特に限定されるものではない。例えば、ワクチン含有層の薬液のpH６以上の条件下での本発明の製剤の使用により、皮膚免疫の誘導を行う事が可能である。【００５５】
また、本発明のワクチン投与方法において、さらに、電気的刺激による皮膚免疫の誘導を行うことができる。電気的刺激、例えば、イオントフォレーシスの利用による皮膚免疫の誘導により、予想以上のワクチン効果を達成することができる。【００５６】
本発明のワクチンの投与方法の好ましい実施態様において、皮膚免疫の誘導を行うという観点から、最初のワクチン投与を、前記ワクチン含有層の薬液のpH６以上の条件下で行う。一般に、初回のワクチン投与を、通常プライミング（初回刺激）といい、2回目以降の投与をブーストという。【００５７】
また、好ましい実施態様において、前記ワクチン含有層の薬液のpH６以上の条件下で最初のワクチン投与を行った後、さらに2回目以降のワクチン投与を行う。なお、2回目以降のワクチン投与は、薬液等の諸条件について特に限定されるものではない。例えば、抗原等のみを投与してもよく、また、抗原等と共に、上述したキャリアー蛋白質と共に投与してもよく、既存のアジュバントと共に投与しても良い。抗原等と共に、キャリアー蛋白質及び既存のアジュバントを投与しても良い。【００５８】
ここで、イオントフォレーシスについて、一例を挙げて簡単に説明すれば、イオントフォレーシスとは、生体に有用なイオン性成分を、電気泳動を利用して生体へ浸透させるものを意味する。図１に投与の一例を示す。皮膚(１３)上に陽極電極（１１）および陰極電極（１２）を貼付し、電源装置(１４)より電圧を印加し、電流を流す。このとき生理活性物質がプラスに帯電するのであれば陽極側に含有させ、マイナスに帯電するのであれば陰極に含有させる。ワクチンのようにアミノ酸やタンパク質からなる両性化合物では溶解させる溶液のｐＨを調整することによってプラスにもマイナスにも帯電させることができ、それによって陽極または陰極、あるいは両方の極に含有させることが可能である。【００５９】
上述した本発明の製剤を電極として適用するには、例えば、ワクチン含有イオントフォレーシス製剤を陽極電極または陰極電極またはその両電極として、図１に例示したように皮膚上に適用することが可能である。【００６０】
なお、一般にワクチンは高分子量化合物であるため、Na＋、Ag+、Cl−、H+、OH−など低分子量化合物に比べ、電気的な移動に寄与する割合が少ない（輸率が小さい）。そのため、電極から通電により生じるイオン（Ag+、Cl−、H+、OH−等）とワクチンの混合をさけ、ワクチンに対する輸率を低下させないために電極とワクチン含有層の間にイオン交換膜やイオン交換樹脂を含有することができる。また生体側から取り出される生体対イオン（生体内に存在するイオンであって、導入すべき成分のイオンとは反対導電型に帯電したイオン）、特に移動度が大きい生体対イオン（例えば、Na＋やCl−など）が主として放出されるが、当該放出を抑制し、輸率を向上させるために、イオン交換膜やイオン交換樹脂を皮膚とワクチン含有層に介して導入すべき成分を投与してもよい。【００６１】
以上のように、本発明の製剤を用いたイオントフォレーシスによるワクチンの投与によれば、アジュバントを使用しなくてもワクチンを投与可能となる。アジュバントを使用しなくてもワクチン投与可能な理由については、本発明の製剤によれば、外的な刺激がアジュバント効果に相当していることが挙げられる。すなわち、一般に経皮免疫は他の投与経路に比べて免疫誘導活性が弱いことが問題であり、そのためアジュバントを用いることが必要である。一方、イオントフォレーシスを用いた場合、その電気的刺激が外的危険シグナルとなって免疫賦活に働いていると考えられる。アジュバントの種類は大きく分けて5種類に分類されるが、その中で外的な刺激、danger signal、（例えば、上述のアルカリ性に薬剤を調整するなど）に相当するアジュバント効果をもたらしていると予測される。【００６２】
すなわち、本発明によれば、外的な刺激、例えば、アルカリ側のｐＨでの薬液調整などによって、皮膚損傷シグナルを生じ、皮膚免疫の誘導を引き出し、さらに、イオントフォレーシスによる電気的刺激による皮膚免疫誘導との相乗効果によって、アジュバントの使用無しに、予想以上のワクチン投与効果を達成可能としている。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。【００６４】
実施例１
まず、イオントフォレーシス＋ワクチンを適用した場合について、本発明の効果について調べた。【００６５】
＜投与、血液採取＞
マウス（Balb/cマウス、４週令、雌）の背部及び腹部をバリカンで注意深く損傷させないように除毛し、さらに市販の脱毛剤（エピラット：カネボウ）を用いてワクチン投与部位を完全に除毛した。図2に示したように、銀／塩化銀電極(21)の一部を絶縁テープ（23）で保護し、支持体（24）上へ重ね、さらにその上に不織布（22  面積3.14cm2）を重ねた。この製剤の不織布部分に処方１に示したワクチン溶液を200μL適用し、これを陽極電極とした。また処方２に示したワクチン溶液を図２の製剤に200μL適用し、これを陰極電極とした。陽極電極、陰極電極を腹部及び背部にそれぞれ貼付し、電源装置（V1002：フレサイスゲージ）より、定電流1.57mAを30分間通電した。投与１週間後に尾静脈より採血し、血液を遠心分離し、血清を得た。この血清中の抗SSV抗体をELISA法により測定した。この投与、採血、測定を１サイクルとして、２週間に１サイクルの頻度で４週間行った。【００６６】
＜定量＞
ELISAによる抗体産生量の測定を行った。各マウスから各血液試料を採取し、その後、マウス血清中の抗体量を以下の手順に従い、ELISA法により測定した。なお、以下において、OVA-SSVとは、オボアルブミンと配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドとの複合体を意味する。OVA-SSVは、上記ペプチド及びKLHの複合体と同様の手法により合成した。【００６７】
すなわち、抗原物質を人為的に合成する場合には、例えば、ペプチド固相合成法、ペプチド液相合成法等の公知のペプチド合成技術を使用することが可能である。また、抗原物質と、担体とを結合する手法として、抗原物質の免疫原性を妨げない限り特に限定されないが、例えば、EDC（Ethylenedichloride）、DCC(dicyclohexyl  carbodiimide)、DIC(1,3-diisopropyl  carbodiimide)等の脱水縮合剤、グルタルアルデヒド、マレイミド、マレイミドベンゾイルオキシコハク酸等の架橋剤、PEG、リンカーペプチド等のリンカーを用いて、抗原物質と、担体とを結合させる手法が挙げられる。抗原物質と上記担体とはカルボジイミドまたはグルタルアルデヒドを介して結合してもよい。ペプチドと担体との結合法の製造方法は、例えば、「ペプチド合成の基礎と実験」泉屋  信夫他著、丸善株式会社）に記載の方法を参照することができる。このように常法を用いて抗原物質を合成した。【００６８】
ペプチドの調製については以下のように行った。
＜抗ヒストンH１モノクローナル抗体の認識部位の特定＞
＜ファージディスプレイ＞
ハイブリドーマ１F5、３F２、15F１１、１７C２また１６G９から産生される抗ヒストンH1抗体に関し、Ph.D．-１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（New  England  BioLabs、Inc.から購入）を用いて、パンニング実験を行った。精製した各モノクローナル抗体を０．１M  NaHCO3（pＨ８．６）に溶解し、直接マイクロタイタープレート（Nunc、catalog#430341）にコートして４℃で一晩インキュベートした。各ウェルにブロッキングバッファー（０．１M  NaHCO3、５ｍｇ/ml  BSA、０．０２％NaN3）を加え、少
なくとも１時間４℃でインキュベートした後、TBST（５０mＭ  Tris、１５０mＭ  NaCl、０．１％Tween  ２０）で洗浄した。１回目のパンニングでオリジナルライブラリーの中の４×１０１０個のファージをスクリーニングに用いた。結合しなかったファージをTBTSによる洗浄を繰り返すことによって除去した。結合したファージを０．２M  Glycine−ＨＣl（pＨ２．２）、１ｍｇ/ｍｌBSAによって溶出した。溶出したファージを２０mＬ  E  Coll  ER２７３８  cultureによって増殖させた。得られたファージを、ポリエチレングリコールを用いて沈殿させて、２回目のパンニングに用いた。さらに、同様の操作手順にしたがって、３回目のパンニングを行った。３回目のパンニングにおいて得られたプラークを１：１００にて希釈し、ER２７３８  cultureを用いて増殖させた。これらを内容物とするチューブを４．５〜５時間振とうしながら３７℃にてインキュベートした。一本鎖ファージDNAをイオジド  バッファー（Iodide  buffer:10mM  Tris-HCl、１mＭ  EDTA、４M  NaI）とエタノールで沈殿、精製した。DNAシークエンス解析のためにファージDNAを２０μL  TEバッファー（１０mＭ  Tris-HCl  pＨ８．０、１mＭ  ＥＤＴＡ）に溶解させた。【００６９】
＜DNAシークエンス解析＞
得られた精製ファージDNAについて、上記Ph.D.−１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキット添付のプライマーDNAおよびDYEnamicTMET  Terminator  Cycle  Sequencing  Premix  Kit(Amercham Biosciences社製)を用いて、シークエンシングPCR反応を行った（PCR反応条件：９５℃（
３０秒）、次いで５０℃(１５秒)、次いで６０℃(１分)３０サイクル）。PCR産物をAutoSeqTMG-５０（Amersham  Biosciences）を用いて精製した。そして、ABIPRISMTM３１０Genetic  Analyzer(PE  Biosystems)を用いてファージペプチドのDNAシークエンスを決定した。決定されたDNAシークエンスに基づくアミノ酸配列は以下に示すとおりであった。【００７０】
＜ハイブリドーマ株、アミノ酸配列＞
１Ｆ５      ：NYQTYTPRPPHS（配列表の配列番号３）
３Ｆ２      ：VTNNQTSPRWEI（配列表の配列番号４）
１５Ｆ１１  ：WKPVSLTLHTHP（配列表の配列番号５)
１７Ｃ２    ：HATGTHGLSLSH（配列表の配列番号２）
１６Ｇ９    ：SSVLYGGPPSAA（配列表の配列番号１）【００７１】
＜競合ＥＬＩＳＡ（Ｃompetition  ELISA）
上記ファージＤＮＡから決定されたアミノ酸配列を有する、各ペプチドを常法に従って合成した。得られたペプチド、精製した各モノクローナル抗体及びヒストンＨ１抗原（Ｒｏｃｈｅ、catalog#1004875）を用いて、競合ＥＬＩＳＡを行った。この際、ヒストンＨ１抗原のビオチニル化にはＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ製）を用い、発色試薬としてＡＢＴＳ溶液（Sigma、Ａ３２１９）を用いた。発色はＥＬＩＳＡ測定器（ThermoLabsystem、Multiskan Ascent）を用いて４０５nｍで検出した。測定値は３回測定した吸収値の平均とした。【００７２】
この結果、合成した上記ペプチドが、精製した各モノクローナル抗体とヒストンＨ１抗原との結合を阻害することが確認された。【００７３】
まず、ヒストンH１溶液（20μg／mＬ、Roche社製）またはOVA-SSV溶液（OVA-SSV；0.387mg/mＬ、溶媒：0.02Mリン酸緩衝液、０．９％NaCl、pH8.0）を０．１M  NaHCO3（pH9.3）溶液を用いて調製した。次に、得られた溶液をそれぞれ、９６穴プレートの各ウエルに５０μLずつ添加し、室温にて1時間放置した。次に、PBSTで各ウエルを３回洗浄した後、PBS溶液（３％milk、１％BSA含有PBS溶液）１５０μLを各ウエルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。次に、PBSTで各ウエルを3回洗浄した後、PBSTで1000倍希釈したマウス血清50μLをウエルに添加し、室温で1時間放置した。次に、PBSTで各ウエルを３回洗浄した後、PBSTで2000〜4000倍希釈した、ペルオキシターゼラベル化マウスＩgＧ（SIGMA社製）50μLをウエルに添加し、室温で1時間放置した。次に、PBSTで各ウエルを３回洗浄した後、発色基質としてABTS（2，2’―azino-bis[3-ethylbenzoline-6-sulfonate]、SIBMA社製）を添加し、30〜60分インキュベートした。その後、各ウエルの吸光度を、Multiscan  Ascent（thermo  Labsystems社製、波長405nm）により測定した。【００７４】
この結果、各群の試験開始から25日目の時点における、血清サンプルの吸光度の平均値±標準誤差は、図３に示される通りであった。【００７５】
測定サンプルの吸光度の平均値±標準誤差は、免疫寛容誘導ワクチン用抗原ペプチドとKLHとの複合体を用いた場合0.524±0.146であった。免疫寛容誘導ワクチン用抗原ペプチドとKLHとの複合体を用いてイオントフォレーシス投与した場合の抗体の産生量は、同じ組成のワクチン溶液を貼付した場合と比較して高いことが確認された。【００７６】
以上の結果、イオントフォレーシスの電気的刺激による皮膚免疫誘導と、皮膚損傷シグナルによる皮膚免疫誘導との相乗効果によって、予想以上のワクチン効果を奏することが判明した。また、皮膚のアルカリ処理+イオントフォレシスによってランゲルハンス細胞が活性化されることも判明した。【００７７】
比較例１
次に、実施例１と同じ組成を単に貼った場合の効果について調べた。【００７８】
＜投与＞
マウス（Balb/cマウス、４週令、雌）の背部及び腹部をバリカンで注意深く損傷させないように除毛し、さらに市販の脱毛剤（エピラット：カネボウ）を用いてワクチン投与部位を完全に除毛した。図２に示した銀／塩化銀電極、支持対、不織布（面積3.14cm2）からなる製剤の不織布部分に処方１に示したワクチン溶液を200μL適用した。この製剤を腹部及び背部に貼付した。投与１週間後に尾静脈より採血し、血液を遠心分離し、血清を得た。この血清中の抗ヒストンH1抗体、抗SSV抗体、又は抗LPQ抗体をELISA法により測定した。この投与、採血、測定を１サイクルとして、２週間に１サイクルの頻度で６〜１０週間行った。【００７９】
＜定量＞
ELISAにより行った。【００８０】
その結果、実施例１と同じ組成のものを単に貼っても、ワクチン投与の効果がないことが判明した。【００８１】
比較例２
次に、テープストリッピングしたマウスに対して、実施例１と同じ組成のものを貼付した場合の効果について調べた。【００８２】
＜投与＞
マウス（Balb/cマウス、４週令、雌）の背部及び腹部をバリカンで注意深く損傷させないように除毛し、さらに市販の脱毛剤（エピラット：カネボウ）を用いてワクチン投与部位を完全に除毛した。腹部および背部にセロハンテープを20回貼付、剥離を繰り返し、角質層を取り除き、ストリプトスキンとした。ここに比較例１と同様の製剤を貼付した。投与１週間後に尾静脈より採血し、血液を遠心分離し、血清を得た。この血清中の抗SSV抗体をELISA法により測定した。この投与、採血、測定を１サイクルとして、２週間に１サイクルの頻度で６週間行った。【００８３】
＜定量＞
ELISAにより行った。【００８４】
その結果、実施例１と同じ組成のものを単に貼っても、ワクチン投与の効果がないことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の製剤、当該製剤を用いたイオントフォレーシスによる投与方法及び装置は、非侵襲的、安全かつ簡便、効果的であり、広く生物化学、生化学、医学、薬学分野における研究指針を提供するものとして極めて有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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