(57)【要約】  不溶性担体粒子量およびモノクローナル抗体量が抑制され、低濃度範囲の測定対象物に対する測定感度が向上し、広い濃度範囲で測定対象物を測定可能であり、かつ、試験片等の検体分析用具にも適用可能な免疫比濁法に用いる測定試薬を提供する。前記測定試薬は、平均粒子径が異なる２種類の不溶性担体粒子群を含み、一方の不溶性担体粒子群に含まれる不溶性担体粒子は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、他方の不溶性担体粒子群に含まれる不溶性担体粒子は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持する構成とする。前者が小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群であり、後者が大きい平均粒子径の不溶性担体粒子群であることが好ましい。
2009066731.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫比濁法に用いる測定試薬であって、
前記測定試薬は、抗体を担持した不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群を含み、
前記不溶性担体粒子群は、平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群を含み、
前記平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群において、
少なくとも１種類の不溶性担体粒子群に含まれる不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
その他の種類の不溶性担体粒子群に含まれる不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持することを特徴とする測定試薬。
【請求項２】
前記不溶性担体粒子群は、平均粒子径が異なる２種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記２種類の不溶性担体粒子群において、
小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
大きい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持する請求の範囲１記載の測定試薬。
【請求項３】
前記不溶性担体粒子群は、平均粒子径が異なる２種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記２種類の不溶性担体粒子群において、
大きい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持する請求の範囲１記載の測定試薬。
【請求項４】
前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である請求の範囲１記載の測定試薬。
【請求項５】
前記小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子に感作させる前記ポリクローナル抗体と前記モノクローナル抗体の抗体濃度比が、１：９〜７：３である請求の範囲２記載の測定試薬。
【請求項６】
抗体を担持した不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群を有する測定試薬を用い、抗原となる測定対象物と、前記抗体とを反応させることにより、前記不溶性担体粒子群を凝集させる免疫比濁法であって、
前記測定試薬として、請求の範囲１記載の測定試薬を使用することを特徴とする免疫比濁法。
【請求項７】
前記測定試薬における前記不溶性担体粒子群が、平均粒子径が異なる２種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記２種類の不溶性担体粒子群において、
小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
大きい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持する請求の範囲６記載の免疫比濁法。
【請求項８】
前記測定試薬における前記不溶性担体粒子群が、平均粒子径が異なる２種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記２種類の不溶性担体粒子群において、
大きい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持する請求の範囲６記載の免疫比濁法。
【請求項９】
前記測定試薬における前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である請求の範囲６記載の免疫比濁法。
【請求項１０】
前記小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子に感作させる前記ポリクローナル抗体と前記モノクローナル抗体の抗体濃度比が、１：９〜７：３である請求の範囲７記載の免疫比濁法。
【請求項１１】
基板と測定試薬とを有し、前記基板上に前記測定試薬が配置されている、免疫比濁法に用いる検体分析用具であって、
前記測定試薬が、請求の範囲１記載の測定試薬であることを特徴とする検体分析用具。
【請求項１２】
前記測定試薬における前記不溶性担体粒子群が、平均粒子径が異なる２種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記２種類の不溶性担体粒子群において、
小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
大きい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持する請求の範囲１１記載の検体分析用具。
【請求項１３】
前記測定試薬における前記不溶性担体粒子群が、平均粒子径が異なる２種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記２種類の不溶性担体粒子群において、
大きい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持する請求の範囲１１記載の検体分析用具。
【請求項１４】
前記小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子に感作させる前記ポリクローナル抗体と前記モノクローナル抗体の抗体濃度比が、１：９〜７：３である請求の範囲１２記載の検体分析用具。
【請求項１５】
前記検体分析用具が、試験片、カートリッジまたはマイクロチップである請求の範囲１１記載の検体分析用具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定試薬、それを用いた免疫比濁法および検体分析用具に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、臨床検査における免疫学的測定方法として、エンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ法）、免疫比濁法等が利用されてきた。中でも、不溶性担体粒子としてラテックス粒子を用いた免疫比濁法は、測定感度が改良され（例えば、特許文献１〜４参照）、かつ自動分析機器を利用できることから、近年汎用されている。【０００３】
前記ラテックス粒子を用いた免疫比濁法は、ラテックス凝集免疫比濁法とも呼ばれる。この方法は、測定対象物の抗体を担持させたラテックス粒子を用い、前記担持された抗体と検体中の測定対象物（抗原）とが抗原抗体反応して、前記ラテックス粒子が凝集することを利用した測定方法である。前記検体中の測定対象物には、例えば、体内で炎症反応等が起きているときに血液中に現れるＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）のように、幅広い濃度範囲で血液中に存在するものがある。そのため、前記ラテックス粒子を用いた免疫比濁法には、前述の感度の向上に加え、幅広い濃度範囲において前記測定対象物の定量を可能にすることが求められている。そこで、例えば、下記特許文献１から４に記載されるような、２種類のラテックス粒子を用いる方法が提案されている。【０００４】
特許文献１には、異なる量の同一抗原または同一抗体が付加された、平均粒子径の異なる２種類のラテックス粒子を用いる方法が開示されている。また、特許文献２には、抗体もしくは抗原を感作させた、平均粒子径の異なる２種類以上のラテックス粒子を混合し、特定波長光を照射する方法が開示されている。そして、特許文献３には、モノクローナル抗体が固定化された、平均粒子径の異なる２種類のラテックス粒子を用いる方法が開示されている。さらに、特許文献４には、異なるモノクローナル抗体をそれぞれ感作させた２種類の抗体感作ラテックス粒子を、特定割合で混合させたものを用いる方法が開示されている。【０００５】
【特許文献１】特公昭６３−１４７８３号公報
【特許文献２】特許第２５８８１７４号公報
【特許文献３】特開２００５−１０６６０９号公報
【特許文献４】特許第３５９８７０１号公報
【発明の開示】
【０００６】
しかしながら、前記特許文献１〜３に開示されるような、平均粒子径の異なる２種類のラテックス粒子を用いた免疫比濁法は、例えば、以下のように、測定対象物（抗原）の測定可能な濃度範囲および測定感度の確保が困難である。すなわち、前記免疫比濁法においては、例えば、低濃度の測定対象物に対する測定感度を確保するため、平均粒子径の大きい粒子（大粒子）の抗体感作量を多くし、平均粒子径の小さい粒子（小粒子）の抗体感作量を少なくする必要がある。しかし、前記小粒子への抗体感作量を減少させると、測定対象物の測定可能な濃度範囲を確保するために、抗原抗体反応時の小粒子量を増やす必要がある。その結果、ラテックス粒子に要するコストが高くなる。また、抗原抗体反応時の全体の粒子濃度が高くなることにより、非特異的凝集が起こりやすくなる。さらに、抗原抗体反応時の小粒子量を増やしすぎると、逆に、低濃度の測定対象物に対する測定感度が低下する。他方、抗原抗体反応時の小粒子量を増やす代わりに、感作反応時に小粒子に感作させる抗体量を増やすと、測定対象物が低濃度の場合に、小粒子が大粒子より先に、より多く測定対象物と反応するために、低濃度の測定対象物に対する測定感度の確保が困難となる。さらに、小粒子量を減らすと、プロゾーン現象が起きることがあり、また、凝集する粒子数が減るため、高濃度側の感度が得られにくい。このように、平均粒子径の異なる２種類のラテックス粒子を用いた免疫比濁法では、例えば、最適な平均粒子径の組み合わせ、ラテックス粒子に感作させる抗体の割合、２種類のラテックス粒子の混合割合、抗原抗体反応時のラテックス粒子濃度等によるコントロールが難しく、低濃度の測定対象物に対する測定感度および測定対象物の測定可能な濃度範囲を確保し難い。
【０００７】
一方、前記特許文献３および４に開示されるような、モノクローナル抗体を担持したラテックス粒子を用いる方法は、前述の非特異的凝集の防止や測定感度の確保を目的としている。しかし、この方法は、モノクローナル抗体を用いるため、コストが高くなるという問題がある。さらに、モノクローナル抗体は、抗原認識部位が一つのため、測定対象物の抗原が多価あるいは多量体である場合を除き、使用する抗体が一種類のみでは、抗原抗体反応により凝集できない。したがって、モノクローナル抗体を使用する場合には、複数を組み合わせる必要があるが、互いに抗原認識部位が異なり、近接せず、立体障害を受けない等の条件を満たす抗体を選択する必要があるため、煩雑である。そして、一般的に、モノクローナル抗体のみでは、低濃度の測定対象物に対する測定感度が低い。また、ラテックス凝集免疫比濁法には、検体中の測定対象物（抗原）の濃度が高い場合、例えば、前記検体の希釈率が低いと、希釈した検体（測定サンプル）中の測定対象物の濃度が依然高いため、測定範囲が狭くなるという問題がある。そのため、ラテックス凝集免疫比濁法は、例えば、マイクロチップを用いた測定方法のように、検体希釈率が低くなる測定方法への適用が困難である。
【０００８】
そこで、本発明は、例えば、不溶性担体粒子量およびモノクローナル抗体量が抑制され、低濃度範囲の測定対象物（抗原）に対する測定感度が向上し、広い濃度範囲の測定対象物を測定可能であり、かつ、試験片等の検体分析用具にも適用可能な測定試薬、それを用いた免疫比濁法および検体分析用具の提供を目的とする。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明の測定試薬は、免疫比濁法に用いる測定試薬であって、
前記測定試薬は、抗体を担持した不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群を含み、
前記不溶性担体粒子群は、平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群を含み、
前記平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群において、少なくとも１種類の不溶性担体粒子群に含まれる不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
その他の種類の不溶性担体粒子群に含まれる不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持することを特徴とする。
【００１０】
本発明の免疫比濁法は、抗体を担持した不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群を有する測定試薬を用い、
抗原となる測定対象物と、前記抗体とを反応させることにより、
前記不溶性担体粒子群を凝集させる免疫比濁法であって、
前記測定試薬として、本発明の測定試薬を使用することを特徴とする。
【００１１】
本発明の検定分析用具は、基板と測定試薬とを有し、前記基板上に前記測定試薬が配置されている、免疫比濁法に用いる検体分析用具であって、
前記測定試薬が、本発明の測定試薬であることを特徴とする。
【００１２】
本発明者等は、前記目的を達成するために、一連の研究を重ねた。その結果、測定試薬として、不溶性担体粒子群を含み、前記不溶性担体粒子群が平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群を含み、少なくとも１種類の不溶性担体粒子群に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持させ、別の不溶性担体粒子群に、前記両抗体の少なくとも一方の抗体を担持させた測定試薬を用いれば、少ない粒子量およびモノクローナル抗体量で低濃度から高濃度の測定対象物（抗原）を測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明によれば、幅広い濃度範囲の測定対象物を定量でき、また、低濃度の測定対象物を高感度に測定できる。また、本発明によれば、検体分析用具等を利用でき、かつコストの低減化が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の測定試薬において、前記不溶性担体粒子群は、平均粒子径が異なる２種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記２種類の不溶性担体粒子群において、小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
大きい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持することが好ましい。なお、本発明の測定試薬は、上記態様に限られず、例えば、下記態様であってもよい。【００１４】
すなわち、本発明の測定試薬において、前記不溶性担体粒子群は、平均粒子径が異なる２種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記２種類の不溶性担体粒子群において、大きい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、
小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持する態様であってもよい。【００１５】
本発明の測定試薬において、前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子であってもよい。【００１６】
本発明の測定試薬において、前記小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子に感作させる前記ポリクローナル抗体と前記モノクローナル抗体の抗体濃度比が、１：９〜７：３であることが好ましい。【００１７】
本発明の検体分析用具は、前記小さい平均粒子径の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子に感作させる前記ポリクローナル抗体と前記モノクローナル抗体の抗体濃度比が、１：９〜７：３であるのが好ましい。本発明の検体分析用具は、例えば、試験片、カートリッジおよびマイクロチップのいずれかであってもよい。【００１８】
以下、本発明について詳しく説明する。ただし、本発明は、これに限定されない。【００１９】
＜免疫比濁法＞
本発明の免疫比濁法は、前述のように、抗体を担持した不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群を有する測定試薬を用い、抗原となる測定対象物と、前記抗体とを反応させることにより、前記不溶性担体粒子群を凝集させる免疫比濁法であって、前記測定試薬として、本発明の測定試薬を使用することを特徴とする。すなわち、前記測定試薬として、抗体を担持した不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群を含み、前記不溶性担体粒子群が、平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群を含み、前記平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群において、少なくとも１種類の不溶性担体粒子群に含まれる不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を担持し、その他の種類の不溶性担体粒子群に含まれる不溶性担体粒子が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくとも一方の抗体を担持する測定試薬を使用する。【００２０】
本発明においては、平均粒子径が異なる不溶性担体粒子群を２種類以上使用すればよく、例えば、従来公知の所定の方法で平均粒子径を求めた際に、異なる平均粒子径を示す２種類以上の不溶性担体粒子群を使用することが好ましい。本発明において、「平均粒子径」の種類は、特に制限されないが、一般的に、個数平均径、長さ平均径、体面積平均径、質量平均径、体積平均径、平均表面積径、比表面積球相当径、中位径、モード径等があげられ、これらの平均粒子径の測定には、それぞれに応じた公知の測定方法が採用できる。また、目の大きさが異なる２種類のふるいによって分類可能な２種類以上の不溶性担体粒子群を使用することもできる。【００２１】
また、本発明において、「前記不溶性担体粒子群が、平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群を含む」とは、例えば、使用する全不溶性担体粒子の粒径分布を測定した際に、ヒストグラムにおいて、２つ以上のピークを示すという意味であってもよい。すなわち、本発明において、「平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群を含む前記不溶性担体粒子群」とは、例えば、「その粒度分布が２つ以上のピークを有する不溶性担体粒子群」ということもできる。また、前記粒度分布の測定方法としては、例えば、光学顕微鏡や電子顕微鏡を用いた顕微鏡法、光散乱法、光遮蔽法、レーザー回折法、電気抵抗法、電気的検知帯法、ふるい分け法、液相沈降法、遠心沈降法、慣性衝突法等があげられる。また、このような粒度分布から平均粒子径を算出することも可能である。【００２２】
また、前記不溶性担体粒子群に含まれる平均粒子径が異なる２種類以上の不溶性担体粒子群は、それぞれの平均粒子径を基準として、例えば、平均粒子径±１５％の粒子径の粒子を含んでもよく、好ましくは、平均粒子径±５％の粒子径の粒子を含んでもよい。【００２３】
前記平均粒子径の異なる不溶性担体粒子群の種類は、２種類以上であればよく、特に制限されず、例えば、２〜５種類であり、好ましくは、２〜３種類であり、より好ましくは、２種類である。【００２４】
前記不溶性担体粒子群の前記平均粒子径は、特に限定されないが、例えば、０．０３〜２μｍであり、好ましくは、０．０５〜１μｍであり、より好ましくは、０．０７〜０．５μｍである。本発明において、例えば、平均粒子径の異なる２種類の粒子群を使用する場合、前記平均粒子径が小さい粒子（以下、「小粒子」という。）群の前記平均粒子径は、例えば、０．０３〜０．２μｍ、好ましくは、０．０５〜０．１５μｍ、より好ましくは、０．０７〜０．１２μｍであり、同場合において、前記平均粒子径が大きい粒子（以下、「大粒子」という。）群の前記平均粒子径は、特に制限されず、例えば、０．０８〜２μｍ、好ましくは、０．１〜１μｍ、より好ましくは、０．１２〜０．５μｍである。【００２５】
前記不溶性担体粒子の材質としては、特に制限されないが、例えば、合成高分子等の有機化合物、多孔性ガラス、シリカゲル等の無機化合物等を用いることができる。前記不溶性担体粒子の形態は、特に制限されず、例えば、ラテックス粒子、ビーズ、プレート等があげられ、好ましくは、ラテックス粒子である。【００２６】
前記ラテックス粒子の材質としては、特に制限されないが、例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリレート共重合体等があげられる。また、前記ラテックス粒子は、例えば、粒子表面に官能基等を付加させていてもよい。前記官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基、カルビノール基、アミド基等があげられる。【００２７】
本発明において、前記２種類以上の不溶性担体粒子群は、前述のように、少なくとも１種類の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が担持され、平均粒子径の異なる別の不溶性担体粒子群の不溶性担体粒子に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくともいずれか一方が担持されている。後者の粒子群は、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれか一方のみでもよいし、両者を担持してもよく、好ましくは、ポリクローナル抗体、またはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方であり、より好ましくは、前記両方である。本発明において、平均粒子径の異なる２種類の不溶性担体粒子群を用いる場合、例えば、前記小粒子にポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を担持させ、前記大粒子にポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくともいずれか一方を担持させてもよい。また、それとは逆に、例えば、前記小粒子にポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の少なくともいずれか一方を担持させ、前記大粒子にポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を担持させてもよい。中でも、前記小粒子は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を担持することが好ましく、前記大粒子は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の少なくともいずれか一方を担持することが好ましく、より好ましくは、ポリクローナル抗体、または、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方である。【００２８】
ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を担持する前記不溶性担体粒子において、担持する前記ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との比率は、特に制限されない。具体例としては、前記小粒子の場合、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体は、例えば、１：９〜７：３が好ましく、より好ましくは、１：９〜５：５である。一方、大粒子の場合、前記ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体は、例えば、１：９〜５：５が好ましい。なお、前記不溶性担体粒子が担持する前記ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との比率は、例えば、重量比または抗体分子数の比である。【００２９】
前記不溶性担体粒子への抗体の担持は、特に制限されないが、例えば、前記粒子への抗体の感作により行うことができる。前記粒子への前記抗体の感作反応は、特に制限されないが、例えば、物理吸着法や化学結合法等の公知の方法等を用いて、適宜実施できる。また、前記不溶性担体粒子の表面に前記官能基が付加されている場合には、例えば、前記官能基を活性化処理した後、前記感作反応を行ってもよい。【００３０】
前記感作反応時において、前記不溶性担体粒子の濃度は、特に制限されない。前記不溶性担体粒子の濃度とは、例えば、前記不溶性担体粒子に前記抗体を感作させる反応時における、感作反応液中の不溶性担体粒子の濃度をいう。前記不溶性担体粒子濃度は、例えば、０．００１〜５ｗ／ｖ％であり、好ましくは、０．０１〜２ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、０．１〜１ｗ／ｖ％である。【００３１】
前記感作反応時において、前記不溶性担体粒子に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の濃度は、特に限定されず、例えば、前記不溶性担体粒子の濃度に応じて適宜決定できる。前記抗体の濃度とは、例えば、前記不溶性担体粒子に前記抗体を感作させる反応時における、感作反応液中の抗体の濃度をいう。前記大粒子にポリクローナル抗体を担持させる場合、例えば、１ｗ／ｖ％不溶性担体粒子を含む前記反応液における前記ポリクローナル抗体の濃度は、例えば、０〜２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．００１〜２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．００５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬである。また、前記大粒子にモノクローナル抗体を担持させる場合、例えば、１ｗ／ｖ％不溶性担体粒子を含む前記反応液における前記モノクローナル抗体の濃度は、好ましくは、０〜２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０〜１．５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、０〜１ｍｇ／ｍＬである。一方、前記小粒子にポリクローナル抗体を担持させる場合、例えば、１ｗ／ｖ％不溶性担体粒子を含む前記反応液における前記ポリクローナル抗体の前記抗体濃度は、例えば、０〜２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．００１〜２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．００５〜１ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、０．０１〜０．５ｍｇ／ｍＬである。また、前記小粒子にモノクローナル抗体を担持させる場合、例えば、１ｗ／ｖ％不溶性担体粒子を含む前記反応液における前記モノクローナル抗体の濃度は、例えば、０〜２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．００１〜２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．００５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬである。【００３２】
前記不溶性担体粒子にポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を担持させる場合、前記感作反応時における前記全抗体の濃度は、特に制限されない。前記小粒子に両抗体を担持させる場合、例えば、１ｗ／ｖ％不溶性担体粒子を含む前記反応液における全抗体の濃度は、例えば、０．００１〜５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬである。前記大粒子に両抗体を担持させる場合、例えば、１ｗ／ｖ％不溶性担体粒子を含む前記反応液における全抗体の濃度は、例えば、０．００１〜５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．０１〜２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｍＬである。【００３３】
また、前述のように、前記不溶性担体粒子にポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を担持させる場合、前記感作反応時における、前記不溶性担体粒子に対する前記ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の抗体濃度の比は、特に制限されない。前記抗体濃度比とは、例えば、前記不溶性担体粒子に前記両抗体を感作させる反応時における、感作反応液中の前記両抗体濃度の比（ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体）である。なお、前記抗体濃度比は、例えば、重量比である。前記大粒子に前記ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を担持させる場合、例えば、１ｗ／ｖ％不溶性担体粒子を含む前記反応液における前記ポリクローナル抗体と前記モノクローナル抗体の抗体濃度比は、特に限定されないが、例えば、１：９〜５：５が好ましい。一方、前記小粒子に、前記ポリクローナル抗体と前記モノクローナル抗体とを担持させる場合、例えば、１ｗ／ｖ％不溶性担体粒子を含む前記反応液における前記ポリクローナル抗体と前記モノクローナル抗体の濃度比は、例えば、１：９〜７：３が好ましく、より好ましくは、１：９〜５：５である。【００３４】
前記抗体としては、測定対象となる抗原と抗原抗体反応を生じるものであればよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗体フラグメント、免疫グロブリン分子等があげられる。前記ポリクローナル抗体は、従来公知の方法を用いて、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等由来の血清から採取したものでもよく、あるいは市販の各種抗体でもよい。また、前記モノクローナル抗体も特に制限されず、例えば、市販の各種抗体を用いてもよいし、細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を用いた公知の方法により作製したものを適宜用いてもよい。【００３５】
つぎに、本発明の免疫比濁法について、具体的な方法の一例を以下に示すが、これには制限されない。【００３６】
まず、前述した２種類以上の不溶性担体粒子群を用いて、これらの粒子が担持する抗体と、検体中の測定対象物（抗原）とを抗原抗体反応させ、前記不溶性担体粒子群を凝集させる。【００３７】
前記測定対象物（抗原）としては、抗原抗体反応を生じるものであればよく、何ら制限されない。具体例としては、例えば、Ｃ反応性蛋白、ＡＳＯ（抗ストレプトリジンＯ）、リウマチ因子、ＨｂＡ１ｃ、クレアチニン、肝炎ウイルス、各種酵素等があげられる。【００３８】
前記測定対象物（抗原）を含む検体は、特に限定されず、例えば、臨床検査における一般的検体があげられる。前記検体としては、例えば、全血、血球、血清、血漿、尿等の生体試料があげられる。本発明において、例えば、採取した前記検体をそのまま測定サンプルとして使用してもよいし、抗原抗体反応に先立って、予め、検体に希釈処理、ろ過処理、加熱処理等を施したものを測定サンプルとして使用してもよい。前記希釈処理に使用する溶媒としては、特に制限されず、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。前記緩衝液の緩衝剤としては、例えば、前記反応を妨げるものでなければよく、例えば、ＭＥＳ（２−Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）、リン酸、Ｔｒｉｓ等があげられる。前記緩衝液には、例えば、その他の成分が添加されてもよく、例えば、反応安定化の目的で、ＢＳＡ等が添加されてもよい。また、前記希釈処理における検体の希釈率は、特に制限されないが、例えば、後述するような試験片を用いた測定の場合、低率でもよく、希釈率の具体例は、例えば、５〜１００倍が好ましく、より好ましくは、１０〜８０倍、さらに好ましくは、１５〜５０倍である。【００３９】
前記抗体を担持した不溶性担体粒子と前記測定対象物（抗原）とを抗原抗体反応させる方法としては、特に制限されず、例えば、公知の方法を用いることができる。前記反応方法としては、例えば、前記測定サンプルに、前記不溶性担体粒子群を分散させた分散液を添加して反応させてもよいし、前記不溶性担体粒子群に、前記測定サンプルを添加して反応させてもよい。後者の場合、前記不溶性担体粒子群は、例えば、分散液であってもよいし、乾燥状態であってもよい。前記後者の方法としては、例えば、後述するような、試験片、マイクロチップ、カートリッジ等の検体分析用具を適用することができる。具体的には、基板の試薬部に、前記不溶性担体粒子群を、例えば、分散液または乾燥状態で配置しておき、前記試薬部に、前記測定サンプルを添加することで、抗原抗体反応を行うことができる。【００４０】
前記抗原抗体反応時における、前記不溶性担体粒子濃度は、特に限定されない。前記不溶性担体粒子濃度とは、例えば、前記不溶性担体粒子の抗体と測定対象物との抗原抗体反応時における、抗原抗体反応液中の不溶性担体粒子の濃度をいう。前記不溶性担体粒子濃度としては、例えば、好ましくは、０．０１１〜１ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、０．０３３〜０．５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは、０．０５５〜０．３ｗ／ｖ％である。また、前記不溶性担体粒子濃度のうち、前記小粒子群の前記粒子濃度は、好ましくは、０．０１〜０．５ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、０．０３〜０．３ｗ／ｖ％、さらに好ましくは、０．０５〜０．２ｗ／ｖ％である。また、前記不溶性担体粒子濃度のうち、前記大粒子群の粒子濃度は、好ましくは、０．００１〜０．０５ｗ／ｖ％、より好ましくは、０．００３〜０．０４ｗ／ｖ％、さらに好ましくは、０．００５〜０．０３ｗ／ｖ％である。【００４１】
前記抗原抗体反応時において、前記小粒子群の粒子と前記大粒子群の粒子との割合は、特に制限されない。具体例としては、前記小粒子群の粒子と前記大粒子群の粒子との重量比は、好ましくは、１００：１〜１：１００であり、より好ましくは１０：１〜１：１０であり、さらに好ましくは５：１〜１：５である。【００４２】
具体例として、血液を検体として、免疫比濁によるＣＲＰを検出するための反応液の条件を以下に示すが、本発明はこれには制限されない。前記抗原抗体反応時における、前記不溶性担体粒子濃度は、特に限定されない。前記不溶性担体粒子濃度とは、例えば、前記不溶性担体粒子の抗体と測定対象物との抗原抗体反応時における、抗原抗体反応液中の不溶性担体粒子の濃度をいう。前記不溶性担体粒子濃度としては、例えば、好ましくは、０．０１１〜１ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、０．０３３〜０．５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは、０．０５５〜０．３ｗ／ｖ％である。また、前記不溶性担体粒子濃度のうち、前記小粒子群の前記粒子濃度は、好ましくは、０．０１〜０．５ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、０．０３〜０．３ｗ／ｖ％、さらに好ましくは、０．０５〜０．２ｗ／ｖ％である。また、前記不溶性担体粒子濃度のうち、前記大粒子群の粒子濃度は、好ましくは、０．００１〜０．０５ｗ／ｖ％、より好ましくは、０．００３〜０．０４ｗ／ｖ％、さらに好ましくは、０．００５〜０．０３ｗ／ｖ％である。【００４３】
続いて、前述の抗原抗体反応を測定する。すなわち、例えば、前記抗原抗体反応により生成した前記不溶性担体粒子群の凝集程度を検出することによって、前記抗原抗体反応を測定する。これによって、前記測定対象物を間接的に定量することができる。【００４４】
前記抗原抗体反応の測定方法としては、特に制限されず、例えば、抗原抗体反応後の反応液の吸光度や散乱光等を光学的手法により測定する方法があげられる。前記光学的手法には、例えば、汎用の光学的測定機器を使用できる。また、測定結果の評価方法も、特に制限されないが、例えば、前記抗原抗体反応の反応開始後一定時間内の吸光度変化量を指標にしてもよい。この場合、前記反応開始後一定時間としては、特に制限されないが、好ましくは、反応開始後０〜５分間であり、より好ましくは、３０〜１８０秒間、さらに好ましくは、３０〜１５０秒間である。【００４５】
前記定量は、例えば、既知濃度の測定対象物を含む標準サンプルの検量線に基づいて行うことができる。具体例としては、まず、目的の濃度範囲に設定した複数の標準サンプルを準備し、これらを同様の条件で抗原抗体反応させ、その凝集程度を検出する。そして、前記凝集程度を示す吸光度等の測定値と前記既知濃度とから検量線を作成し、検体についての測定値を前記検量線に代入することで、前記検体における測定対象物を定量することができる。【００４６】
＜測定試薬＞
本発明の測定試薬は、本発明の免疫比濁法に用いる測定試薬であって、前述した前記不溶性担体粒子群を含む。本発明の測定試薬は、前述の前記不溶性担体粒子群を含んでいればよく、その他の構成や条件は何ら制限されない。なお、特に示さない限り、前記本発明の免疫比濁法で述べた通りである。【００４７】
本発明において、前記２種類以上の不溶性担体粒子群のそれぞれの含有割合は、特に制限されないが、例えば、本発明の測定試薬を免疫比濁法に使用した際に、抗原抗体反応時における各粒子群の割合が、前記本発明の免疫比濁法で述べたような条件となるように、前記各粒子群が含まれていることが好ましい。【００４８】
本発明の測定試薬は、前記不溶性担体粒子群の他に、例えば、前述のような緩衝剤、分散剤、安定化剤等を含んでいてもよい。また、本発明の測定試薬は、例えば、乾燥体でも、液体でもよい。【００４９】
＜検体分析用具＞
本発明の検体分析用具は、前述のように、本発明の測定試薬を含むことを特徴とする。具体的には、本発明の検体分析用具は、基板と測定試薬とを有し、前記基板上に前記測定試薬が配置されている、免疫比濁法に用いる検体分析用具であって、前記測定試薬が本発明の測定試薬であることを特徴とする。本発明の検体分析用具は、本発明の測定試薬を含んでいればよく、その他の構成や条件は何ら制限されない。本発明の検体分析用具において、前記測定試薬は、例えば、その形態に応じて、乾燥体で配置されてもよいし、液体（分散液）で配置されてもよい。【００５０】
本発明の検体分析用具の形態は、何ら制限されず、例えば、カートリッジ、試験片、マイクロチップ等のチップ等があげられる。前記検体分析用具は、例えば、前述したような抗原抗体反応による凝集程度を検出するための汎用の測定機器に、接続可能であることが好ましい。前記カートリッジとしては、例えば、前記基板が、前記測定試薬が配置された試薬槽を備える形態があげられる。前記カートリッジは、例えば、前記測定機器に接続する前または後に、前記測定試薬が配置された前記試薬槽に測定サンプルを導入し、抗原抗体反応の後、前記測定機器により、前記試薬槽内における凝集程度を測定できる。また、前記カートリッジは、例えば、前記基板が、さらに、流路を介して前記試薬槽と連結した反応槽を有してもよい。この場合、前記試薬槽に測定サンプルを導入し、前記測定サンプルと前記測定試薬との混合液を、前記流路を介して前記反応槽に移動させ、前記反応槽内における凝集程度を測定してもよい。前記カートリッジの前記試薬槽に配置する前記本発明の測定試薬は、例えば、液体（分散液）でもよいし、乾燥体であってもよい。また、前記試験片としては、例えば、短冊状等の基板上に、本発明の測定試薬を有する試薬部が配置された形態があげられる。前記試薬部の材質としては、例えば、ろ紙や各種ポリマー製の多孔質体があげられる。このような試験片は、例えば、前記測定試薬が配置された前記試薬部に測定サンプルを添加し、抗原抗体反応の後、前記測定機器により、前記試薬部における凝集程度を測定できる。前記試験片において前記本発明の測定試薬は、例えば、乾燥状態で配置されていることが好ましい。例えば、前記多孔質体等を前記基板に配置する前または後、前記多孔質体等に分散液状の前記測定試薬を供給してから、これを乾燥させればよい。また、前記マイクロチップ等のチップは、例えば、前記基板が、試料の導入口と試薬部と流路とを有し、前記導入口と前記試薬部とが前記流路を介して連結している形態があげられる。このようなチップは、例えば、前記導入口から測定サンプルを導入し、前記流路を通じて前記試薬部に前記測定サンプルを移動させ、前記試薬部で抗原抗体反応を行った後、前記測定機器により、前記試薬部内における凝集程度を測定できる。前記チップの前記試薬部に配置する前記本発明の測定試薬は、例えば、液体でもよいし乾燥体であってもよい。また、これらの検体分析用具は、例えば、前記試薬部や試薬槽が、さらに、必要に応じて、凝集体を検出するための検出試薬を含んでもよい。【００５１】
以下に、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。なお、本発明は、以下の実施例および比較例によって限定ないし制限されない。
【実施例】
【００５２】
〔実施例１〕
本例では、平均粒子径が異なる不溶性担体粒子群として、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を担持させた小粒子群と、ポリクローナル抗体を担持させた大粒子群とを用い、下記ＡおよびＢ工程により、測定試薬を調製した。【００５３】
Ａ．不溶性担体粒子の調製
本例では、前記小粒子群の不溶性担体粒子（小粒子）として平均粒子径０．０９６μｍのカルボキシル基変性ポリスチレンラテックス粒子（セラダイン社製）を用い、前記大粒子群の不溶性担体粒子（大粒子）として平均粒子径０．２１３μｍのカルボキシル基変性ポリスチレンラテックス粒子（セラダイン社製）を用いた。まず、前記小粒子を含む下記組成の活性化液を撹拌しながら混合し、室温（２５℃）で１時間反応させて、粒子表面の官能基を活性化させた。反応終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分）して上清を除去し、官能基を活性化させた前記小粒子を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．１）４ｍＬに懸濁し、超音波で再分散させて洗浄した。前記洗浄操作を再度行った後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分）して上清を除去した。得られた前記小粒子を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．１）を用いて懸濁し、超音波で再分散させ、小粒子のラテックス分散液を得た。なお、前記ラテックス分散液における前記小粒子の濃度は、２ｗ／ｖ％とした。他方、前記カルボキシル基変性ポリスチレンラテックス粒子として前記大粒子を用いたこと以外は、前記小粒子のラテックス分散液の調製と同様にして、大粒子のラテックス分散液を調製した。【００５４】
2009066731.tif 000003
【００５５】
つぎに、前記小粒子のラテックス分散液２ｍＬに、泡立たないように撹拌しながら、下記組成の小粒子の感作用抗体液２ｍＬを添加し、室温（２５℃）で１時間反応させて、小粒子への感作反応を行った。下記組成に示す濃度は、感作反応液における各成分の最終濃度であり、前記感作反応液における小粒子の最終濃度は、１ｗ／ｖ％とした。なお、前記感作反応液において、前記小粒子に担持させるポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝７：３であった。【００５６】
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【００５７】
反応終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分）して上清を除去し、感作させた前記小粒子を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．１）４ｍＬ中に懸濁し、超音波処理により分散させて洗浄した。再度遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分）して上清を除去後、洗浄した前記小粒子を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．１）２ｍＬに懸濁し、超音波処理により再分散させた。再分散させた前記小粒子を、ブロッキングバッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．１）、４ｗ／ｖ％  ＢＳＡ）２ｍＬと混合し、超音波処理による分散後、４℃で一晩静置し、ブロッキング処理を行った。ブロッキング処理終了後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分）して上清を除去し、下記組成の分散液を用いて、前記小粒子を、小粒子の分散濃度が３．３３ｗ／ｖ％となるように分散させた。【００５８】
2009066731.tif 000005
【００５９】
他方、前記大粒子は、下記組成の大粒子の感作用抗体液を用い、感作反応液における大粒子の最終濃度を０．５ｗ／ｖ％とし、ポリクローナル抗体の最終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体を未添加とした以外は、前記小粒子と同様にして感作反応を行い、さらに、大粒子の分散濃度を１．６７ｗ／ｖ％とした以外は、前記小粒子と同様にして、分散液に分散させた。前記感作反応液において、前記大粒子に担持させるポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１０：０であった。なお、下記組成に示す濃度は、感作反応液における各成分の最終濃度を示す。【００６０】
2009066731.tif 000006
【００６１】
Ｂ．測定試薬の調製
まず、調製した前記小粒子を含む分散液と前記大粒子を含む分散液とを、前記小粒子と前記大粒子との濃度比（重量比）が１０：１となるように混合し、ラテックス混合液を得た。そして、前記小粒子濃度が０．３７２ｗ／ｖ％、前記大粒子濃度が０．０３６ｗ／ｖ％となるように、前記ラテックス混合液を前記分散液で希釈し、本例の測定試薬を調製した。なお、前記ラテックス混合液において、前記小粒子と前記大粒子との重量比は、小粒子：大粒子＝１０：１である。【００６２】
〔実施例２〕
本例の測定試薬は、小粒子の感作反応において、感作反応液におけるポリクローナル抗体液およびモノクローナル抗体液の最終濃度を、各々０．２ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして調製した。なお、前記感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝５：５である。【００６３】
〔実施例３〕
本例の測定試薬は、小粒子の感作反応において、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度を０．１２ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．２８ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして調製した。なお、前記感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝３：７である。【００６４】
〔実施例４〕
本例の測定試薬は、小粒子の感作反応において、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度を０．０４ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．３６ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして調製した。なお、前記感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１：９である。【００６５】
〔比較例１〕
本例の測定試薬では、小粒子にポリクローナル抗体のみを担持させた。具体的には、本例の測定試薬は、小粒子の感作反応において、感作反応液におけるポリクローナル抗体の最終濃度を０．４ｍｇ／ｍＬ（モノクローナル抗体未添加）とした以外は、前記実施例１と同様にして調製した。なお、前記感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１０：０である。【００６６】
〔比較例２〕
本例の測定試薬では、小粒子にモノクローナル抗体のみを担持させた。具体的には、本例の測定試薬は、小粒子の感作反応において、感作反応液におけるモノクローナル抗体の最終濃度を０．４ｍｇ／ｍＬ（ポリクローナル抗体未添加）とした以外は、前記実施例１と同様にして調製した。なお、前記感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝０：１０である。【００６７】
前記実施例１〜４、比較例１および２の測定試薬を用い、以下のようにして、免疫比濁法によるＣＲＰの測定を行った。ＣＲＰは、Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ（Ｃａｐｒｉｃｏｎ社製）を用いた。【００６８】
すなわち、まず、前記ＣＲＰを、希釈液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ナカライテスク社製）、１ｗ／ｖ％  ＢＳＡ）を用いて希釈し、所定濃度（０、０．０５、０．１、０．１５、０．５、１、２．５、５、１０、２０ｍｇ／１００ｍＬ）のＣＲＰ溶液（検体）を調製した。そして、前記各ＣＲＰ溶液（検体）を、さらに前記希釈液を用いて１．６６倍に希釈し、測定サンプルを調製した。前記各測定サンプル６μＬに、反応バッファー（１．２８ｗ／ｖ％  ＮａＣｌ）６３μＬおよび前記各測定試薬２１μＬを添加して、３７℃で反応させた。反応開始（添加）から５分間、自動汎用測定機器（商品名Ｂｉｏ−ｍａｊｅｓｔｙ（ＢＭ−８）、日本電子社製）を用いて、前記反応液の６５８ｎｍにおける吸光度を測定した。そして、前記反応開始１５０秒後の吸光度測定値から前記反応開始３０秒後の吸光度測定値を差し引いて、吸光度の変化量を算出し、この変化量を測定評価に用いた。なお、前記反応液におけるラテックス粒子濃度は、前記小粒子の前記濃度が０．０８７ｗ／ｖ％であり、前記大粒子の前記濃度が０．００８ｗ／ｖ％であり、全ラテックス粒子の濃度は０．０９５ｗ／ｖ％であった。【００６９】
図１のグラフに、実施例１〜４、比較例１および２の測定試薬による測定結果を示す。同グラフにおいて、横軸は、各ＣＲＰ溶液（検体）のＣＲＰの濃度（ｍｇ／１００ｍＬ）であり、縦軸は、各ＣＲＰ濃度における前記吸光度の変化量である。なお、同図のグラフにおいて、各実施例および比較例のプロットは、実施例１が◆、実施例２が▲、実施例３が■、実施例４が●、比較例１が○、比較例２が□である。同図に示すように、前記小粒子にポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を両方担持させた実施例１〜４の測定試薬を用いた場合、ＣＲＰ濃度の増加に伴い、吸光度の変化量が大きくなった。これに対して、前記小粒子にいずれか一方の抗体のみを担持させた比較例の測定試薬を用いた場合、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／１００ｍＬを超えると、比較例２では吸光度変化量がほとんど変化せず、比較例１では逆に減少した。このように、前記小粒子にポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を両方担持させることにより、低濃度から高濃度まで幅広い濃度範囲において、高い感度で測定できることが示された。そして、実施例１〜４の測定試薬を用いた測定結果に示すように、担持させるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の割合を変化させることによって、感度を容易に調整できた。また、前記反応液における前記ＣＲＰ溶液（検体）の希釈率が約２５倍と非常に低率であるにもかかわらず、実施例１〜４の測定試薬を用いた場合、ＣＲＰ濃度の増加に応じて吸光度変化量が増大し、良好な測定結果を得ることができた。さらに、担持させるモノクローナル抗体の割合を減少させた実施例１〜４の測定試薬を用いた測定では、モノクローナル抗体のみを担持させた比較例２の測定試薬を用いた場合と比べて、吸光度増加量が大きく、いずれも測定感度が向上した。【００７０】
〔実施例５〕
本例では、小粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度を０．０４ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．３６ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして行った。なお、感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１：９である。他方、大粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度を０．２５ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．２５ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして行った。なお、感作反応液において、前記大粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝５：５である。そして、本例の測定試薬は、小粒子を含む分散液と大粒子を含む分散液とを、前記小粒子と大粒子の濃度比（重量比）が５：１となるように混合し、さらに、前記小粒子の濃度が０．４１７ｗ／ｖ％、前記大粒子の濃度が０．０８３ｗ／ｖ％となるように前記分散液で希釈した以外は、前記実施例１と同様に調製した。【００７１】
〔実施例６〕
本例では、小粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度０．０４ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．３６ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして行った。なお、感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１：９である。他方、大粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度を０．１５ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．３５ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして行った。なお、感作反応液において、前記大粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝３：７である。そして、本例の測定試薬は、小粒子を含む分散液と大粒子を含む分散液とを、前記小粒子と大粒子の濃度比（重量比）が５：１となるように混合し、さらに、前記小粒子の濃度が０．４１７ｗ／ｖ％、前記大粒子の濃度が０．０８３ｗ／ｖ％となるように前記分散液で希釈した以外は、実施例１と同様に調製した。【００７２】
〔実施例７〕
本例において、小粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度を０．０４ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．３６ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして行った。なお、感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１：９である。他方、大粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度を０．１ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．４ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様に行った。なお、感作反応液において、前記大粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝２：８である。そして、本例の測定試薬は、小粒子を含む分散液と大粒子を含む分散液とを、前記小粒子と大粒子の濃度比（重量比）が５：１となるように混合し、さらに、前記小粒子の濃度が０．４１７ｗ／ｖ％、前記大粒子の濃度が０．０８３ｗ／ｖ％となるように前記分散液で希釈した以外は、実施例１と同様に調製した。【００７３】
〔実施例８〕
本例において、小粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体の最終濃度を０．０４ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．３６ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして行った。なお、感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１：９である。他方、大粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度を０．０５ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．４５ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様に行った。なお、感作反応液において、前記大粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１：９である。そして、本例の測定試薬は、小粒子を含む分散液と大粒子を含む分散液とを、前記小粒子と大粒子の濃度比（重量比）が５：１となるように混合し、さらに、前記小粒子の濃度が０．４１７ｗ／ｖ％、前記大粒子の濃度が０．０８３ｗ／ｖ％となるように前記分散液で希釈した以外は、実施例１と同様に調製した。【００７４】
〔実施例９〕
本例において、小粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体の最終濃度を０．０４ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体液の最終濃度を０．３６ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして行った。なお、感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１：９である。他方、大粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体液の最終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体を未添加とした以外は、前記実施例１と同様に行った。なお、感作反応液において、前記大粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１０：０である。そして、本例の測定試薬は、小粒子を含む分散液と大粒子を含む分散液とを、前記小粒子と大粒子の濃度比（重量比）が５：１となるように混合し、さらに、前記小粒子の濃度が０．４１７ｗ／ｖ％、前記大粒子の濃度が０．０８３ｗ／ｖ％となるように前記分散液で希釈した以外は、実施例１と同様に調製した。【００７５】
前記測定試薬として、前記実施例５〜９の測定試薬を用い、抗原抗体反応時の前記反応液におけるラテックス粒子濃度について、前記小粒子の前記濃度を０．０９７ｗ／ｖ％とし、前記大粒子の前記濃度を０．０１９ｗ／ｖ％とした（全ラテックス粒子濃度は０．１１６ｗ／ｖ％）以外は、前述の実施例１〜４、比較例１および２の測定と同様にして、免疫比濁法による測定を行った。【００７６】
図２のグラフに、実施例５〜９の測定試薬による測定結果を示す。同グラフにおいて、横軸は、各ＣＲＰ溶液（検体）のＣＲＰの濃度（ｍｇ／１００ｍＬ）であり、縦軸は、各ＣＲＰ濃度における前記吸光度の変化量である。なお、各実施例の同グラフ中プロットは、実施例５が◆、実施例６が■、実施例７が▲、実施例８が●、実施例９が□である。同図に示すように、実施例５〜９のいずれの測定試薬を用いた場合も、ＣＲＰの濃度の増加に伴い、吸光度の変化量が大きくなり、広い濃度範囲で測定可能であった。また、大粒子に前記両抗体を担持させた大粒子を用いた実施例５〜８の測定試薬を用いた測定は、ポリクローナル抗体のみを担持させた実施例９の測定試薬を用いた測定に比べて、高濃度範囲における測定感度がさらに向上した。【００７７】
〔実施例１０〕
本例において、小粒子の感作反応は、感作反応液におけるポリクローナル抗体の最終濃度を０．０４ｍｇ／ｍＬとし、モノクローナル抗体の最終濃度を０．３６ｍｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１と同様にして行った。なお、感作反応液において、前記小粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１：９である。他方、大粒子の感作反応は、前記実施例１と同様に行った。なお、感作反応液において、前記大粒子に担持させる抗体の濃度比（重量比）は、ポリクローナル抗体：モノクローナル抗体＝１０：０である。また、本例において、小粒子を含む分散液および大粒子を含む分散液の調製は、それぞれ、下記組成の分散液を用いて、前記分散液中の前記小粒子の濃度が２ｗ／ｖ％、前記分散液中の前記大粒子の濃度が０．４ｗ／ｖ％となるように分散させた以外は、実施例１と同様にして行った。そして、前記小粒子の分散液と前記大粒子の分散液とを１：１の容積比で混合し、下記組成の測定試薬を調製した。なお、本例の測定試薬において、前記小粒子と大粒子の濃度比（重量比）は５：１である。【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
つぎに、以下に示す本例の検体分析用具１を作製した。図３に、本例の検体分析用具１を示す。同図（Ａ）は、前記検体分析用具１の平面図であり、同図（Ｂ）は、同図（Ａ）の前記検体分析用具１を、Ｉ−Ｉ方向からみた断面図である。なお、同図は、本例の検体分析用具１の概略図であり、全体および各構成の大きさや比率等は、実際とは異なる。検体分析用具１は、上基板２ａと下基板２ｂとを備え、前記下基板２ｂ上に前記上基板２ａが積層されている。前記下基板２ｂは、長手方向の左端付近と中央付近にそれぞれ凹部が形成されており、前者が測定試薬６を配置する試薬部３、後者が反応液の測定部４となる。前記下基板２ｂにおいて、前記試薬部３と前記測定部４との間および前記測定部４と長手方向の右端部との間には、それぞれ溝が形成されており、これらは、前記上基板２ａの積層により、流路５ａ、５ｂとなる。また、検体分析用具１において、流路５ｂの右端の開口部８は、流路５ａ、５ｂ内部を陰圧にするための陰圧発生装置（例えば、ピペット）との連結部である。他方、上基板２ａは、長手方向の左端付近であり且つ前記下基板２ｂの試薬部３と対応する部位に貫通孔７を有し、これが測定サンプルの導入口７となる。上基板２ａの材質は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）であり、下基板２ｂの材質は、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）である。【００８１】
本例では、まず、下基板２ｂに上基板２ａを積層し、ピペットを用いて、前記下基板２ｂの前記試薬部３に、前記導入口７より前記測定試薬２．４５μＬを添加し、室温で２時間乾燥後、湿度１％以下の環境下で３日間放置し、検体分析用具１を作製した。前記検体分析用具１は、使用時までシリカゲル入りのアルミパックに保存した。【００８２】
血液を採血管に採取し、遠心分離後、血漿を除去した。得られた血球を、生理食塩水を用いて３回洗浄し、洗浄血球を調製した。他方、ＣＲＰフリー血清（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製）に、所定濃度（０、０．２、０．４、２０、４０、８０ｍｇ／１００ｍＬ）となるようにＣＲＰを添加して、ＣＲＰ溶液を調製した。そして、前記ＣＲＰフリー血清６０μＬおよび前記洗浄血球９０μＬに前記ＣＲＰ溶液５０μＬを添加して、合計２００μＬとした。この混合液２００μＬのうち２５μＬを、さらに、生理食塩水６００μＬを用いて２５倍に希釈し、ＣＲＰ−洗浄血球溶液を調製した。これらを測定サンプルとした。前記ＣＲＰ−洗浄血球溶液におけるＣＲＰ濃度は、それぞれ、０、０．０５、０．１、５、１０、２０ｍｇ／１００ｍＬである。前記ＣＲＰ−洗浄血球溶液２１μＬを前記試薬部３に滴下して、乾燥させた前記測定試薬６を懸濁した。そして、直ちに、流路５ｂ端部の開口部８に連結したピペットにより、同図（Ｂ）の矢印方向に吸引して、前記流路５ｂ内部を陰圧とし、前記懸濁液を測定部４に移動させ、ＣＲＰと本例の測定試薬とを反応させた。なお、前記反応時の前記懸濁液における不溶性担体粒子濃度は、小粒子が０．１１７ｗ／ｖ％であり、大粒子が０．０２３ｗ／ｖ％であり、全粒子濃度は、０．１４ｗ／ｖ％であった。前記懸濁液が前記測定部４に移動した時点を反応開始とし、前記反応開始１分後および４分後に、分光光度計を用いて、測定波長６６０ｎｍにおける前記測定部４の吸光度を測定した。前記反応開始４分後における吸光度から、前記反応開始１分後における吸光度を差し引き、３分間の吸光度変化量を算出した。【００８３】
図４のグラフに、前記吸光度変化量の測定結果を示す。同図において、縦軸は、吸光度変化量であり、横軸は、ＣＲＰ−洗浄血球溶液中のＣＲＰ濃度（ｍｇ／１００ｍＬ）である。同図に示すように、本例の検体分析用具１を用いた測定では、ＣＲＰの濃度の増加に伴い、吸光度の変化量が大きくなり、広い濃度範囲で測定可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の用途は、例えば、臨床検査や各種スクリーニング等があげられ、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、本発明の実施例において、各種測定試薬を用いて、ＣＲＰ濃度と吸光度変化量との関係を測定した結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のその他の実施例において、各種測定試薬を用いて、ＣＲＰ濃度と吸光度変化量との関係を測定した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の検体分析用具の一例であり、（Ａ）は、前記検体分析用具の平面図であり、（Ｂ）は、前記（Ａ）に示す検体分析用具のＩ−Ｉ方向からみた断面図である。
【図４】図４は、本発明のその他の実施例において、ドライ系の測定試薬を配置した検体分析用具を用いて、ＣＲＰ濃度と吸光度変化量との関係を測定した結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８６】
１              検体分析用具
２ａ            上基板
２ｂ            下基板
３              試薬部
４              測定部
５ａ、５ｂ      流路
６              測定試薬
７              貫通孔、導入口
８              開口部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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