(57)【要約】  本発明の課題は、内部標準物質を使用する核酸の検出系において、標的核酸の精確な測定値を確保しつつ、安定した内部標準物質の増幅を行える方法及びそれに用いる試薬キットを提供することである。本発明は、内部標準物質を使用する試料中の標的核酸の増幅法において、内部標準物質を標的核酸よりも先行して増幅させることによって内部標準の増幅産物による標的核酸の増幅反応への影響を防ぐことを特徴とする核酸増幅法、それに用いる試薬並びに試薬キットに関する。
2009051214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部標準物質を用いる核酸増幅法であって、内部標準物質が標的核酸よりも先行して又は遅延して増幅することを特徴とする前記核酸増幅法。
【請求項２】
内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅する核酸増幅法であって、以下の工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅法。
（ａ）標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
（ｂ）標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
（ｃ）前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により測定する工程。
【請求項３】
内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅する核酸増幅法であって、以下の工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅法。
（ａ）標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
（ｂ）標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
（ｃ）前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により、リアルタイム測定し、その結果及び内部標準物質の添加量から、試料中の初期標的核酸濃度又はコピー数を算出する工程。
【請求項４】
標的核酸の定量を行うことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項５】
標的核酸の有無を検出することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項６】
内部標準物質が、少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列を有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項７】
内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーが、内部標準物質と特異的にハイブリダイズし、標的核酸とハイブリダイズしないように設計され、かつ、標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸と特異的にハイブリダイズし、内部標準物質とハイブリダイズしないように設計されていることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項８】
内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅する核酸増幅法であって、標的核酸の増幅より早いタイミングで内部標準物質の増幅が起こるように設計されている内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを用いることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項９】
以下の条件設定により内部標準物質を標的核酸よりも先行して増幅させることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
（ａ）内部標準物質を標的核酸と同時に増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、内部標準物質の濃度を高く設定すること、及び／又は、内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの濃度を低く設定すること、
及び／又は、
（ｂ）内部標準物質を使用せずに同一の標的核酸を増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、基質ヌクレオチド濃度を高く設定すること。
【請求項１０】
増幅反応を等温条件で行う請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項１１】
増幅反応が、以下のプライマー（ａ）及び／又は（ｂ）を用いるものである請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
（ａ）鋳型核酸上の標的配列の３'側から該鋳型核酸上の３'末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５'側から３'側にこの順で含むプライマー、
（ｂ）鋳型核酸上の標的配列の５'側から該鋳型核酸上の５'末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５'側から３'側にこの順で含むプライマー。
【請求項１２】
増幅反応がＬＡＭＰ法である請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の核酸増幅法を実施するために用いることを特徴とする測定試薬又は試薬キット。
【請求項１４】
内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅する核酸増幅法を実施するために用いられ、少なくとも以下の試薬を含むことを特徴とする請求項１３記載の測定試薬又は試薬キット。
（ａ）少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列を有する、濃度又はコピー数既知の内部標準物質、
（ｂ）標的核酸の増幅よりも早いタイミングで内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｃ）標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１５】
さらに、以下の試薬を含むことを特徴とする請求項１４記載の測定試薬又は試薬キット。
（ａ）内部標準物質検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ、
及び、
（ｂ）標的核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の核酸の増幅法及びそれに用いる試薬に関する。より詳しくは、内部標準物質を使用する増幅法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の微量核酸を検出可能な手法として様々な核酸増幅法が開発されている。中でも等温で高効率の増幅を行う方法（ＬＡＭＰ法等）は、温度制御機能の無い安価な装置を用いた簡易迅速検出が可能な技術として、幅広い検査現場で利用されている。【０００３】
本発明者らは、内部標準物質を使用しないＬＡＭＰ法の検出系において、１０３〜１０９コピー／テストの濃度範囲の核酸が定量可能なことを報告している（非特許文献１）。しかし、この方法は内部標準物質を使用していないため、得られる結果は標的核酸の相対量である。【０００４】
一方、ＬＡＭＰ法において内部標準物質を使用する定量法が報告されている（非特許文献２）。この方法は、標的核酸と類似配列を持つ内部標準物質を使用して、標的核酸と内部標準物質を同時増幅させる方法であるが、定量可能な濃度範囲が１０４〜１０８コピー／テストと狭いため、幅広い濃度範囲の核酸を測定するためには、試料を希釈して複数回測定する必要がある。
【非特許文献１】Ｙ．  Ｍｏｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ５９，  １４５−１５７，  ２００４
【非特許文献２】Ｈ．  Ｔａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７９（１５），  ５６０８−５６１３，  ２００７
【発明の開示】
【０００５】
内部標準物質を使用する検出系においては、内部標準物質の増幅産物が標的核酸の増幅反応に影響するため、標的核酸の精確な測定ができないということが、増幅効率の高い等温核酸増幅法の共通の問題点として考えられる。本発明は、係る問題点を解消し、標的核酸の精確な測定値を確保しつつ、安定した内部標準物質の増幅を行える方法及びそれに用いる試薬を提供することを課題とする。
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、内部標準物質の増幅反応を標的核酸の反応と同じタイミングで行わないこと、つまり、内部標準物質の増幅反応を標的核酸の反応よりも先行させるか又は遅延させることにより、内部標準増幅産物による標的核酸増幅反応への影響を防げることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）を提供する。
【０００８】
（１）内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅することを特徴とする核酸増幅法。
【０００９】
（２）以下の工程を含むことを特徴とする上記（１）に記載の核酸増幅法。
【００１０】
（ａ）標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
（ｂ）一定の条件下で標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる、内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー（以下、内部標準プライマーという。）と標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー（以下、標的核酸プライマーという。）を含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
（ｃ）前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により測定する工程。
【００１１】
（３）標的核酸の定量を行うことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の核酸増幅法。
【００１２】
（４）以下の工程を含むことを特徴とする上記（１）に記載の核酸増幅法。
【００１３】
（ａ）標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
（ｂ）一定の条件下で標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる、内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー（以下、内部標準プライマーという。）と標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー（以下、標的核酸プライマーという。）を含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
（ｃ）前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により、リアルタイム測定し、その結果及び内部標準物質の添加量から、試料中の初期標的核酸濃度又はコピー数を算出する工程。
【００１４】
（５）内部標準物質が、少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列であることを特徴とする上記（１）から（４）のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【００１５】
（６）内部標準プライマーが、一定条件下で内部標準物質と特異的にハイブリダイズし、標的核酸とハイブリダイズしないように設計され、かつ、標的核酸プライマーが前記一定条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイズし、内部標準物質とハイブリダイズしないように設計されていることを特徴とする、上記（５）に記載の核酸増幅法。
【００１６】
（７）増幅反応がＬＡＭＰ法である上記（５）又は（６）に記載の核酸増幅法。
【００１７】
（８）上記（１）から（７）のいずれか１項に記載の核酸増幅法を実施するために用いることを特徴とする測定試薬又は試薬キット。
【００１８】
（９）少なくとも以下の試薬を含むことを特徴とする上記（８）記載の測定試薬又は試薬キット。
【００１９】
（ａ）少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列である、濃度又はコピー数既知の内部標準物質、
（ｂ）一定の条件下で標的核酸の増幅よりも早いタイミングで内部標準物質を増幅させうる内部標準プライマー、
（ｃ）標的核酸プライマー。
【００２０】
本発明によれば、内部標準物質の増幅反応を標的核酸の反応よりも先行して行うことにより、標的核酸の精確な測定値を確保しつつ、安定した内部標準物質の増幅を行うことができる。すなわち、定性法においては、各種試料からの抽出精製効率や試料中の成分による増幅反応への影響をモニタリングすることが可能となる。また、定量法においては、７桁以上もの広範囲で核酸の絶対量を測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】１０１から１０７コピー／テストの各濃度の標的核酸（ＮＧプラスミド）及び内部標準核酸（ＣＴプラスミド）を用いてＬＡＭＰ反応を行い、標的核酸の増幅に伴うＱｕｅｎｃｈｉｎｇ  プローブの蛍光消光を、Ｍｘ３０００Ｐでリアルタイム測定した結果を示したグラフである。
【図２】ＮＧプラスミドを用いた検量線を示すグラフである。
【図３】１０１から１０７コピー／テストの各濃度の標的核酸（ＮＧプラスミド）及び内部標準核酸（ＣＴプラスミド）を用いてＬＡＭＰ反応を行い、内部標準核酸の増幅に伴うＱｕｅｎｃｈｉｎｇ  プローブの蛍光消光を、Ｍｘ３０００Ｐでリアルタイム測定した結果を示したグラフである。
【図４】１０１から１０８コピー／テストの各濃度の標的核酸（ＨＢＶプラスミド）及び内部標準核酸（Ａｒｉｔａ２プラスミド）を用いてＬＡＭＰ反応を行い、標的核酸の増幅に伴うＱｕｅｎｃｈｉｎｇ  プローブの蛍光消光を、Ｍｘ３０００Ｐでリアルタイム測定した結果を示したグラフである。
【図５】ＨＢＶプラスミドを用いた検量線を示すグラフである。
【図６】１０１から１０８コピー／テストの各濃度の標的核酸（ＨＢＶプラスミド）及び内部標準核酸（Ａｒｉｔａ２プラスミド）を用いてＬＡＭＰ反応を行い、内部標準核酸の増幅に伴うＱｕｅｎｃｈｉｎｇ  プローブの蛍光消光を、Ｍｘ３０００Ｐでリアルタイム測定した結果を示したグラフである。
【図７】内部標準物質の鋳型濃度、１０２、１０４、１０６コピー／テストにおける標的核酸（ＨＢＶプラスミド）及び内部標準核酸（Ａｒｉｔａ２プラスミド）の増幅時間変化を示したグラフである。
【図８】内部標準プライマー濃度×１と、低濃度のプライマー（×０．２５、×０．３、×０．５）における標的核酸（ＨＢＶプラスミド）及び内部標準核酸（Ａｒｉｔａ２プラスミド）の増幅時間変化を示したグラフである。
【図９】試薬成分Ａ×１と高濃度の試薬成分Ａ×１．２における標的核酸（ＨＢＶプラスミド）及び内部標準核酸（Ａｒｉｔａ２プラスミド）の増幅時間変化を示したグラフである。
【図１０】内部標準核酸（ＣＴプラスミド；Ｉ．Ｃ．）及びＮＧプラスミドの高濃度鋳型（ＮＧ＿Ｈ）を同一の反応液中で増幅させたグラフである。
【図１１】内部標準核酸（ＣＴプラスミド；Ｉ．Ｃ．）及びＮＧプラスミドの低濃度鋳型（ＮＧ＿Ｌ）を同一の反応液中で増幅させたグラフである。
【００２２】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００７−２７１９０２号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の核酸増幅法は、内部標準物質を標的核酸よりも先行して又は遅延して増幅させることを特徴とするものである。先行して増幅するとは、標的核酸鋳型の増幅が開始するよりも早く、内部標準物質に由来する増幅反応が開始するということである。そのためには、早いタイミングで（先行して）増幅する内部標準プライマーを設計することが必要となる。内部標準プライマーとは、内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーをさす。一般に、早いタイミングで増幅するプライマーを設計するための特別な設計条件は確立していない。そのため、専用のソフトウェア等を用い通常の方法で設計したプライマーの中から早いタイミングで増幅するプライマーを選択し、内部標準プライマーとする。【００２４】
遅延して増幅するとは、標的核酸鋳型の増幅が開始するよりも遅く、内部標準物質に由来する増幅反応が開始するということである。そのためには、遅いタイミングで（遅延して）増幅する内部標準プライマーを設計することが必要となる。そのためには、専用のソフトウェア等を用い通常の方法で設計したプライマーの中から遅いタイミングで増幅するプライマーを選択し、内部標準プライマーとする。【００２５】
また、等温核酸増幅法では一般に、標的核酸濃度が高くなるにつれ増幅のタイミングが早くなる傾向がある。そのため、内部標準物質を早いタイミングで増幅させるためには、内部標準物質を高濃度にする必要がある。一方、内部標準物質を遅いタイミングで増幅させるためには、内部標準物質を低濃度にする必要がある。【００２６】
すなわち、本発明では、内部標準物質を早いタイミングで（先行して）増幅させるためには、標的核酸と同時に増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、内部標準物質濃度を高く、好ましくは１０倍以上、より好ましくは１００倍以上に設定する。一方、内部標準物質を遅いタイミングで（遅延させて）増幅させるためには、標的核酸と同時に増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、内部標準物質濃度を低く、好ましくは０．１倍以下、より好ましくは０．０１倍以下に設定する。【００２７】
本発明で使用される内部標準物質は、少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列を有する核酸であれば特に限定されない。このような核酸としては、天然由来の核酸、部分的にあるいは完全に人工的に合成された核酸等が挙げられる。【００２８】
本発明の内部標準プライマー濃度を通常（単一核酸の検出系）よりも低くすることにより、内部標準増幅産物量を抑え、標的核酸の測定精度を上げることが可能である。また、核酸合成の基質ヌクレオチド濃度を通常より高くすることにより、内部標準物質の増幅反応で消費する基質が補われ、標的核酸の増幅の遅れが解消されるため、より高感度、短時間の検出が可能となる。【００２９】
すなわち、本発明では、内部標準物質を早いタイミングで（先行して）増幅させるためには、内部標準物質を標的核酸と同時に増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、内部標準プライマー濃度を低く、好ましくは１倍未満、より好ましくは０．５倍以下に設定する。そうすることにより、内部標準物質の増幅産物量を抑え、標的核酸の測定精度を上げることが可能である。【００３０】
さらに、本発明では、内部標準物質を早いタイミングで（先行して）増幅させるためには、内部標準物質を使用せずに同一の標的核酸を増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、核酸合成の基質ヌクレオチド濃度を高く、好ましくは１倍より高く、より好ましくは１．１倍以上に設定することにより、内部標準物質の増幅反応で消費する基質が補われ、標的核酸の増幅の遅れが解消されるため、より高感度、短時間の検出が可能となる。【００３１】
当業者であれば、以上に記載した反応試薬成分の条件を適宜調節することで、内部標準物質を先行増幅させることが可能である。【００３２】
また、本発明の内部標準プライマーは、ストリンジェントな条件下で内部標準物質と特異的にハイブリダイズし、標的核酸とハイブリダイズしないように設計し、かつ、標的核酸プライマーは、前記と同一のストリンジェントな条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイズし、内部標準物質とハイブリダイズしないように設計する。【００３３】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各核酸に対し高い相同性（相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件としては、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液を用いて室温〜６８℃で洗浄する条件が挙げられる。【００３４】
一実施形態において本発明の核酸増幅法は、以下の工程を含む：
（ａ）標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
（ｂ）標的核酸の増幅よりも早いタイミングで（先行して）前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
（ｃ）前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により測定する工程。【００３５】
別の実施形態において本発明の核酸増幅法は、以下の工程を含む：
（ａ）標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
（ｂ）標的核酸の増幅よりも早いタイミングで（先行して）前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
（ｃ）前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により、リアルタイム測定し、その結果及び内部標準物質の添加量から、試料中の初期標的核酸濃度又はコピー数を算出する工程。【００３６】
本発明に使用される試料は、核酸を含む可能性のある試料であれば特に限定されない。ヒト、他の動物の生体由来、植物、食品、環境由来の検体、部分的あるいは完全に人工的に合成された核酸を含むもの、それらの培養液等が試料として挙げられる。これらの試料は、分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行ってもよい。【００３７】
本発明において標的核酸は、増幅に供する検出すべき核酸を意味し、標的配列とは、標的核酸上の標的となる塩基配列を意味する。標的核酸は、増幅しようとするいずれの核酸であってもよく、特に限定されない。動植物の各種遺伝子、各種ウイルス遺伝子、細菌、カビ、酵母等の各種微生物遺伝子等、ＤＮＡ、ＲＮＡを問わず、標的核酸とすることができる。標的核酸は、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよく、ＰＮＡ等も含まれる。また、１本鎖核酸及び２本鎖核酸の双方を含む。本発明において鋳型核酸とは、本来の検出対象であって、その分子中に標的配列を含み、プライマー設計の基礎となる核酸を意味する。【００３８】
分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行う前に、内部標準物質を試料に添加しておき、前処理後、本発明の方法を行い標的核酸の測定を行うことにより、前処理法の効率をモニタリングすることができる。また、前処理後の試料に内部標準物質を添加して標的核酸の定性的測定を行う場合には、試料中の成分による増幅反応への影響を調べることができ、偽陰性の識別が可能となる。さらに、種々の既知濃度の標的核酸を用いて本発明の方法を行い、予め検量線を作成しておき、未知の被検試料の測定結果をこの検量線と比較することにより、未知の被検試料中の標的核酸を定量することができる。【００３９】
本発明において核酸を検出する方法は、内部標準物質と標的核酸の増幅反応を識別可能であれば特に限定されない。例えば、蛍光標識プローブ、放射性標識プローブ等を使用する方法が適用できる。【００４０】
本発明における核酸増幅法は、増幅効率の高い等温核酸増幅法であれば特に限定されないが、例えばＸ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が好適である。【００４１】
Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法について以下に説明する。Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーは、具体的には以下のようにして設計する。【００４２】
（ａ）鋳型核酸鎖上の標的配列の３'側から当該鋳型核酸鎖上の３'末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５'側から３'側にこの順で含むプライマー、
（ｂ）鋳型核酸鎖上の標的配列の５'側から当該鋳型核酸鎖上の５'末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５'側から３'側にこの順で含むプライマー。【００４３】
なお、上記プライマーは（ａ）（ｂ）をペアとして用いてもよいし、（ａ）（ｂ）どちらか一方と通常のプライマーをペアにして用いてもよい。【００４４】
増幅反応は、ポリメラーゼとして鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用い、等温条件下で行うことができる。これは、プライマーがＸ１ｃ＋Ｘ２の構造を有するため、該プライマーからの伸長生成物はＸ１ｃ＋（Ｘ２＋）Ｘ１の相補的配列（下線部）を含み、これが鎖内アニールして、合成された２本鎖核酸上に１本鎖部分を生成するためである。すなわち、２本鎖を高温で解離させなくとも、伸長生成物上には鎖内アニールによる新たな鎖置換反応の開始点が与えられる。この反応の概略は後述するＬＡＭＰ法を参照されたい。【００４５】
なお、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）等が挙げられる。【００４６】
ＬＡＭＰ法について以下に説明する。「ＬＡＭＰ法」は、納富らが開発した技術（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２８（１２），  ｅ６３，  ２０００）であり、鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法では、プライマーの３'末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。その結果、特異性の高い遺伝子配列の増幅反応が可能となる。【００４７】
ＬＡＭＰ法ではプライマーとして、鋳型核酸の塩基配列上の計６領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマー（インナープライマーＦ（以下、ＦＩＰという。）、インナープライマーＢ（以下、ＢＩＰという。）、アウタープライマーＦ（以下、Ｆ３という。）及びアウタープライマーＢ（以下、Ｂ３という。））が使用されるが、増幅反応の進行に伴い、自己を鋳型としながら合成起点となる３'末端を有した、両端にそれぞれループ構造を有することを特徴とするダンベル型のヌクレオチドが形成される。そして、さらに、このダンベル構造の５'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマー（ループプライマーＦ（以下、ＬＦという。）及び／又はループプライマーＢ（以下、ＬＢという。））を用いた場合、核酸合成の起点が増え、反応時間の短縮と検出感度の上昇を図ることができる。【００４８】
インナープライマーとはＬＡＭＰ法に必須のプライマーであって、鋳型ＤＮＡのそれぞれの鎖において、３'側に存在する任意配列Ｘ２ｃ、これより５'側の任意配列Ｘ１ｃを選択したとき、該Ｘ２ｃに相補的配列Ｘ２と該Ｘ１ｃと同一の配列Ｘ１ｃを３'側から５'側にこの順で含む（Ｘ１ｃ＋Ｘ２の構造をもつ）プライマーをいう。機能的にいえば、インナープライマー上のＸ２は鋳型に特異的にアニールして相補鎖合成の起点を与える部分であり、Ｘ１ｃは増幅（伸長）生成物がループを形成するための相補的配列を与える。そして、このループが新たな相補鎖合成の起点となる。【００４９】
アウタープライマーとは、インナープライマーよりも外側（すなわち鋳型の３'側）の任意配列Ｘ３ｃに相補的配列を有し、これにアニールしうるプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。【００５０】
なお、プライマーの鋳型核酸へのアニールを容易にするため、上記Ｘ１（Ｘ１ｃ）、Ｘ２（Ｘ２ｃ）、Ｘ３（Ｘ３ｃ）の長さは５〜１００塩基が好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましい。【００５１】
上記インナープライマー及びアウタープライマーは、２本鎖（Ｆ及びＲ）のそれぞれについて必要であり、インナープライマー（Ｆ１ｃ＋Ｆ２、Ｒ１ｃ＋Ｒ２）、アウタープライマー（Ｆ３、Ｒ３）の各々２種が設計される。【００５２】
各任意配列は、ＬＡＭＰ法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、分子内アニールを優先的に生じ、末端ヘアピン構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、Ｆ１ｃ配列とＦ２ｃ配列との間の距離及びＲ１配列とＲ１ｃ配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、０〜５００塩基、好ましくは０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜７０塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、Ｆ１ｃ配列及びＦ２ｃ配列自身並びにＲ１配列及びＲ２配列自身を含まない塩基数を示している。【００５３】
また、ループプライマーとは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその３'末端に含むプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。前記アウタープライマーとループプライマーはＬＡＭＰ法に必須のプライマーではないが、これらがあれば増幅（伸長）反応はより効率的に進行する。【００５４】
一連の反応は、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行うことが好ましい。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整すればよい。塩類としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２あるいは（ＮＨ４）２ＳＯ４等が、酵素の活性維持とＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。また、融解温度（Ｔｍ）調整剤としては、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド、あるいはホルムアミドを一般的に利用することができる。【００５５】
ＬＡＭＰ法における反応は、鋳型核酸に対して、以下の成分（i）（ii）（iii）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。【００５６】
（i）インナープライマー２種、あるいはさらにアウタープライマー２種、あるいはさらにループプライマー２種
（ii）鎖置換型ポリメラーゼ
（iii）基質ヌクレオチド
アウタープライマーからのヌクレオチド鎖合成は、インナープライマーからのヌクレオチド鎖合成よりも後に開始される必要がある。これを達成する方法として、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも高く設定する方法などが挙げられる。具体的には、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも、２〜５０倍、好ましくは４〜２５倍高く設定することにより実施することができる。【００５７】
本発明の方法を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。例えば、内部標準物質、内部標準プライマー、標的核酸プライマー、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、緩衝液、塩類、保護剤、標識プローブ等の必要な試薬がキットとして提供される。【００５８】
具体的には、本発明の測定試薬又は試薬キットは、少なくとも以下の試薬を含む：
（ａ）少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列を有する、濃度又はコピー数既知の内部標準物質、
（ｂ）標的核酸の増幅よりも早いタイミングで内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｃ）標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー。【００５９】
本発明の測定試薬又は試薬キットは、さらに、以下の試薬を含んでいてもよい：
（ａ）内部標準物質検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ、
及び、
（ｂ）標的核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ。
【実施例】
【００６０】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。【００６１】
実施例１．ＬＡＭＰ法による淋菌の定量
（１）測定鋳型
内部標準物質鋳型として、クラミジア  トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下、ＣＴプラスミドという。）を作製した。また、標的核酸鋳型として、淋菌ｍｔｒＡ領域の一部をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下、ＮＧプラスミドという。）を作製した。【００６２】
内部標準鋳型配列（ＣＴプラスミド）：（配列番号１）
CTCGAGAAGA TTTATCGTAC GCAAATATCA TCTTTGCGGT TGCGTGTCCT GTGACCTTCA 60
TTATGTCGGA GTCTGAGCAC CCTAGGCGTT TGTACTCCGT CACAGCGGTT GCTCGAAGCA 120
CGTGCGGGGT TATCTTAAAA GGGATTGCAG CTTGTAGTCC TGCTTGAGAG AACGTGCGGG 180
CGATTTGCCT TAACCCCACC ATTTTTCCGG AGCGAGTTAC GAAGACAAAA CCTCTTCGTT 240
GACCGATGTA CTCTTGTAGA AAGTGCATAA ACTTCTGAGG ATAAGTTATA ATAATCCTCT 300
TTTCTGTCTG ACGGTTCTTA AGCTGGGAGA AAGAAATGGT AGCTTGTTGG AAACAAATCT 360
GACTAATCTC CAAGCTTAAG ACTTCAGAGG AGCGTTTACC TCCTTGGAGC ATTGTCTGGG 420
CGATCAAC 428
（２）内部標準プライマー及びＱｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成
クラミジア  トラコマティスの潜在プラスミド領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成は、Ｊ−Ｂｉｏ２１社に依頼した。【００６３】
ＣＴ−ＦＩＰ：（配列番号２）5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3'
ＣＴ−ＢＩＰ：（配列番号３）5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3'
ＣＴ−Ｆ３：（配列番号４）5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3'
ＣＴ−Ｂ３：（配列番号５）5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3'
ＣＴ−ＬＦ：（配列番号６）5'-AAGATAACCCCGCACGT-3'
ＣＴ−ＬＢ：（配列番号７）5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3'
ＣＴ−Ｐｒ（ＴＡＭＲＡ標識）：（配列番号８）5'-ATAACCCCGCACGTGCTTCGAGCAACC-3'
（３）標的核酸プライマー及びＱｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成
淋菌のｍｔｒＡ領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成は、Ｊ−Ｂｉｏ２１社に依頼した。【００６４】
ＮＧ−ＦＩＰ：（配列番号９）5'-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3'
ＮＧ−ＢＩＰ：(配列番号１０)5'-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC -3'
ＮＧ−Ｆ３：（配列番号１１）5'-GCGGTTATCTCTGCATCG-3'
ＮＧ−Ｂ３：（配列番号１２）5'-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3'
ＮＧ−ＬＦ：（配列番号１３）5'-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3'
ＮＧ−ＬＢ：（配列番号１４）5'-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3'
ＮＧ−Ｐｒ（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）：（配列番号１５）5'-CACATTTATGGTCAAACAGTG CGGCAAC-3'
（４）ＬＡＭＰ反応試薬組成及び濃度
ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。【００６５】
・３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
・１５ｍＭ  ＫＣｌ
・１５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
・１２ｍＭ  ＭｇＳＯ４
・０．１５％  Ｔｗｅｅｎ２０
・２．１ｍＭ  ｄＡＴＰ
・２．１ｍＭ  ｄＣＴＰ
・２．１ｍＭ  ｄＧＴＰ
・２．１ｍＭ  ｄＴＴＰ
・３８．４Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）
・１０７コピー  ＣＴプラスミド
・内部標準プライマー
０．８μＭ  ＣＴ−ＦＩＰ（配列番号２）及びＣＴ−ＢＩＰ（配列番号３）
０．１μＭ  ＣＴ−Ｆ３（配列番号４）及びＣＴ−Ｂ３（配列番号５）
０．４μＭ  ＣＴ−ＬＦ（配列番号６）及びＣＴ−ＬＢ（配列番号７）
・０．０６７μＭ  内部標準プローブＣＴ−Ｐｒ（配列番号８）
・標的核酸プライマー
０．８μＭ  ＮＧ−ＦＩＰ（配列番号９）及びＮＧ−ＢＩＰ（配列番号１０）
０．１μＭ  ＮＧ−Ｆ３（配列番号１１）及びＮＧ−Ｂ３（配列番号１２）
０．４μＭ  ＮＧ−ＬＦ（配列番号１３）及びＮＧ−ＬＢ（配列番号１４）
・０．０６７μＭ  標的核酸プローブＮＧ−Ｐｒ（配列番号１５）
（５）検出及び定量値の算出
検出はＱｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ法により行った。内部標準物質及び標的核酸の増幅に伴う蛍光の消光をＭｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてリアルタイムに検出した。定量値は、Ｔｔ値（増幅によって変化する蛍光強度が特定の値に達する時間）が初期鋳型量に依存することに基づき算出した。【００６６】
（６）標的核酸の定量的評価
ＮＧプラスミド１０１から１０７コピーまでの希釈系列を標的核酸とし、上記ＬＡＭＰ反応試薬に添加した。６３℃で６０分間ＬＡＭＰ反応を行い、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ法による蛍光の消光をリアルタイムに測定し、検量線を作成した。【００６７】
その結果、最低検出感度はＮＧプラスミド１０コピー／テスト（図１）であり、定量測定レンジは１０１から１０７コピー／テスト（検量線は相関係数  Ｒ＝０．９９９４）であった（図２）。ＮＧプラスミド、ＣＴプラスミド共に良好な再現性が得られ（図１、３）、また、ＮＧプラスミド１０１から１０７コピー／テストの全ての増幅が６０分以内に終了した。【００６８】
実施例２．ＬＡＭＰ法によるＨＢＶの定量
（１）測定鋳型
内部標準物質鋳型として、人工核酸をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下、Ａｒｉｔａ２プラスミドという。）を作製した。また、標的核酸鋳型として、ＨＢＶ  Ｓ領域の一部をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下、ＨＢＶプラスミドという。）を作製した。【００６９】
内部標準鋳型配列（Ａｒｉｔａ２プラスミド）：（配列番号１６）
ATTCGAAGGG TGATTGGATC GGAGATAGGA TGGGTCAATC GTAGGGACAA TCGAAGCCAG   60
AATGCAAGGG TCAATGGTAC GCAGAATGGA TGGCACTTAG CTAGCCAGTT AGGATCCGAC  120
TATCCAAGCG TGTATCGTAC GGTGTATGCT TCGGAGTAAC GATCGCACTA AGCATGGCTC  180
AATCCTAGGC TGATAGGTTC GCACATAGCA TGCCACATAC GATCCGTGAT TGCTAGCGTG  240
ATTCGTACCG AGAACTCACG CCTTATGACT GCCCTTATGT CACCGCTTAT GTCTCCCGAT  300
ATCACACCCG TTATCTCAGC CCTAATCTCT GCGGTTTAGT CTGGCCTTAA TCCATGCCTC  360
ATAGCTACCC TCATACCATC GCTCATACCT TCCGACATTG CATCCGTCAT TCCAACCCTG  420
ATTCCTACGG TCTAACCTAG CCTCTATCCT ACCCAGTTAG GTTGCCTCTT AGCATCCCTG  480
TTACGTACGC TCTTACCATG CGTCTTACCT TGGCACTATC GATGGGAGTA TGGTAGCGAG  540
TATGGAACGG ACTAACGTAG GCAGTAAGCT AGGGTGTAAG GTTGGGACTA AGGATGCCAG  600
（２）内部標準プライマー及びＱｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成
人工核酸Ａｒｉｔａ２をターゲットとしたプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成は、Ｊ−Ｂｉｏ２１社に依頼した。【００７０】
Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブ（ＱＰ）は、独立行政法人  産業技術総合研究所で開発された蛍光標識プローブであり、標的配列とハイブリダイズすることで、標的配列に存在するグアニンにより蛍光が消光することを原理としている（特許第３４３７８１６号、特許第３９８５９５９号を参照されたい）。【００７１】
Ａｒｉｔａ２−ＦＩＰ：（配列番号１７）5'-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3'
Ａｒｉｔａ２−ＢＩＰ：（配列番号１８）5'-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3'
Ａｒｉｔａ２−Ｆ３：（配列番号１９）5'-GGACAATCGAAGCCAGAA-3'
Ａｒｉｔａ２−Ｂ３：（配列番号２０）5'-ATCACGGATCGTATGTGG-3'
Ａｒｉｔａ２−ＬＦ：（配列番号２１）5'-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3'
Ａｒｉｔａ２−ＬＢ：（配列番号２２）5'-AACGATCGCACTAAGCAT-3'
Ａｒｉｔａ２−Ｐｒ（ＴＡＭＲＡ標識）：（配列番号２３）5'-GCTAGCTAAGTGCCATCCATTCTGCGTACC-3'
（３）標的核酸プライマー及びＱｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成
ＨＢＶのＳ領域をターゲットとしたプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成は、Ｊ−Ｂｉｏ２１社に依頼した。【００７２】
ＨＢＶ−ＦＩＰ：（配列番号２４）5'-CCGCAGACACATCCAGCGATAAACCTCCAATCACTCACCAA-3'
ＨＢＶ−ＢＩＰ：（配列番号２５）
5'-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTCCTGGAATTAGAGGACA-3'
ＨＢＶ−Ｆ３：（配列番号２６）5'-CAAAATTCGCAGTCCC-3'
ＨＢＶ−Ｂ３：（配列番号２７）5'-GCAGGTCTTGCATGGTCC-3'
ＨＢＶ−ＬＦ：（配列番号２８）5'-CAGCGATAGCCAGGACA-3'
ＨＢＶ−ＬＢ：（配列番号２９）5'-TCTGGACTATCAAGGTATGTTGC-3'
ＨＢＶ−Ｐｒ（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）：（配列番号３０）5'-GTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCC-3'
（４）ＬＡＭＰ反応試薬組成及び濃度
ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。【００７３】
・２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
・１２．８ｍＭ  ＫＣｌ
・１２．８ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
・９．７ｍＭ  ＭｇＳＯ４
・０．１０％  Ｔｗｅｅｎ２０
・１．７９ｍＭ  ｄＡＴＰ
・１．７９ｍＭ  ｄＣＴＰ
・１．７９ｍＭ  ｄＧＴＰ
・１．７９ｍＭ  ｄＴＴＰ
・２８．８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）
・１０６コピー  Ａｒｉｔａ２プラスミド
・内部標準プライマー
０．４μＭ  Ａｒｉｔａ２−ＦＩＰ（配列番号１７）及びＡｒｉｔａ２−ＢＩＰ（配列番号１８）
０．０５μＭ  Ａｒｉｔａ２−Ｆ３（配列番号１９）及びＡｒｉｔａ２−Ｂ３（配列番号２０）
０．４μＭ  Ａｒｉｔａ２−ＬＦ（配列番号２１）及びＡｒｉｔａ２−ＬＢ（配列番号２２）
・０．０６７μＭ  内部標準プローブＡｒｉｔａ２−Ｐｒ（配列番号２３）
・標的核酸プライマー
１．６μＭ  ＨＢＶ−ＦＩＰ（配列番号２４）及びＨＢＶ−ＢＩＰ（配列番号２５）
０．２μＭＨＢＶ−Ｆ３（配列番号２６）及びＨＢＶ−Ｂ３（配列番号２７）
０．８μＭＨＢＶ−ＬＦ（配列番号２８）及びＨＢＶ−ＬＢ（配列番号２９）
・０．０６７μＭ  標的核酸プローブＨＢＶ−Ｐｒ（配列番号３０）
（５）検出及び定量値の算出
検出はＱｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ法により行った。内部標準物質及び標的核酸の増幅に伴う蛍光の消光をＭｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてリアルタイムに検出した。定量値は、Ｔｔ値が初期鋳型量に依存することに基づき算出した。【００７４】
（６）標的核酸の定量的評価
ＨＢＶプラスミド１０１から１０８コピーまでの希釈系列を標的核酸とし、上記ＬＡＭＰ反応試薬に添加した。６３℃で６０分間ＬＡＭＰ反応を行い、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ法による蛍光の消光をリアルタイムに測定し、検量線を作成した。【００７５】
その結果、最低検出感度はＨＢＶプラスミド１０コピー／テスト（図４）であり、定量測定レンジは１０１から１０８コピー／テスト（検量線は相関係数  Ｒ＝０．９９９６）であった（図５）。ＨＢＶプラスミド、Ａｒｉｔａ２プラスミド共に良好な再現性が得られ（図４、６）、また、ＨＢＶプラスミド１０１から１０８コピー／テストの全ての増幅が６０分以内に終了した。【００７６】
実施例３．ＨＢＶ検出における内部標準物質濃度変化の影響
先行増幅に必要な内部標準物質の濃度を調べるため、ＨＢＶ検出において内部標準物質（Ａｒｉｔａ２プラスミド）の鋳型量をテストあたり１０２コピー、１０４コピー、または１０６コピーとして検討した。【００７７】
（１）ＬＡＭＰ反応試薬組成及び濃度
内部標準物質の鋳型量以外の反応試薬組成、濃度は実施例２と同様とした。【００７８】
（２）ＨＢＶプラスミド鋳型量と検出
ＨＢＶプラスミド鋳型量をテスト当たり１０１コピー、１０８コピーの２濃度とし、６３℃で６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。各鋳型量についてのＨＢＶプラスミド、内部標準物質（Ａｒｉｔａ２プラスミド）の増幅に伴う蛍光の消光をＭｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてリアルタイムに検出し、Ｔｔ値を求めた。【００７９】
（３）結果
（２）で求めたＴｔ値を増幅時間として表１及び図７に示した。内部標準物質が低濃度（１０２コピー／テスト）の場合、高濃度（１０８コピー／テスト）のＨＢＶプラスミド鋳型が内部標準物質より先に増幅し、その影響を受けて内部標準物質の増幅反応は大きく遅れた。また、ＨＢＶプラスミド鋳型２濃度間の内部標準物質の増幅時間の差は５．６７分と大きかった。一方、内部標準物質が高濃度（１０６コピー）の場合には、内部標準物質の増幅の遅れはなく、また、ＨＢＶプラスミド鋳型濃度によらず内部標準物質の増幅時間はほぼ一定となった。したがって、内部標準物質を早く、かつ、標的核酸鋳型量に関わらず一定の時間で増幅させるためには、内部標準物質鋳型量を高く設定する必要があり、本検討の場合、１０６コピー／テストを選択するのが適当である。
【表１】
2009051214.tif 000003
【００８０】
実施例４．ＨＢＶ検出における内部標準プライマー濃度変化の影響
先行増幅に適した内部標準プライマー濃度を調べるため、ＨＢＶ検出において内部標準プライマー濃度を×１（内部標準物質を先行増幅させない系で使用する濃度）、×０．２５、×０．３、×０．５と変化させて検討した。【００８１】
（１）ＬＡＭＰ反応試薬組成及び濃度
・×１内部標準プライマー
１．３μＭ  Ａｒｉｔａ２−ＦＩＰ（配列番号１７）及びＡｒｉｔａ２−ＢＩＰ（配列番号１８）
０．１７μＭ  Ａｒｉｔａ２−Ｆ３（配列番号１９）及びＡｒｉｔａ２−Ｂ３（配列番号２０）
１．３μＭ  Ａｒｉｔａ２−ＬＦ（配列番号２１）及びＡｒｉｔａ２−ＬＢ（配列番号２２）
なお、内部標準プライマー量以外の反応試薬組成、濃度は実施例２と同様とした。【００８２】
（２）ＨＢＶプラスミド鋳型量と検出
ＨＢＶプラスミド鋳型量をテスト当たり１０１コピー、１０８コピーの２濃度とし、６３℃で６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。各鋳型量についてのＨＢＶプラスミド、内部標準物質の増幅に伴う蛍光の消光をＭｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてリアルタイムに検出し、Ｔｔ値を求めた。【００８３】
（３）結果
（２）で求めたＴｔ値を増幅時間として表２及び図８に示した。内部標準プライマー量が多い場合（×１）、ＨＢＶプラスミドの増幅時間は全体的に遅くなり、感度付近の増幅時間遅延が顕著であった。また、内部標準プライマー量を低減しすぎると（×０．２５）、ＨＢＶプラスミドの濃度によって内部標準物質の増幅時間が乖離し、一定時間での増幅が困難となった。したがって、本検討の場合、内部標準プライマー濃度として×０．３を選択するのが適当である。
【表２】
2009051214.tif 000004
【００８４】
実施例５．ＨＢＶ検出における反応試薬成分濃度の影響
内部標準物質の先行増幅に適した反応試薬成分濃度を調べるため、ＨＢＶ検出において、基質ヌクレオチドを含む反応試薬成分を変化させ、その影響について検討した。【００８５】
（１）ＬＡＭＰ反応試薬組成及び濃度
基質ヌクレオチドを含む試薬成分Ａ×１（単一の標的核酸の検出系で通常使用する濃度）と、その１．２倍濃度の試薬成分×１．２を調製した。【００８６】
・試薬成分Ａ×１
ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度を以下のとおりとする。【００８７】
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ  ＫＣｌ
１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．１０％  Ｔｗｅｅｎ２０
１．４ｍＭ  ｄＡＴＰ
１．４ｍＭ  ｄＣＴＰ
１．４ｍＭ  ｄＧＴＰ
１．４ｍＭ  ｄＴＴＰ
２８．８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）
なお、試薬成分Ａ以外の内部標準物質（Ａｒｉｔａ２プラスミド）、内部標準プライマー、内部標準プローブ、標的核酸プライマー、標的核酸プローブとその濃度は実施例２と同様とした。【００８８】
（２）ＨＢＶプラスミド鋳型量と検出
ＨＢＶプラスミド鋳型量をテスト当たり１０１コピー、１０４コピー、１０８コピーの３濃度とし、６３℃で６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。各鋳型量についてのＨＢＶプラスミド、内部標準物質の増幅に伴う蛍光の消光をＭｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いてリアルタイムに検出し、Ｔｔ値を求めた。【００８９】
（３）結果
（２）で求めたＴｔ値を増幅時間として表３及び図９に示した。試薬成分Ａ×１反応液では、高濃度のＨＢＶプラスミド鋳型（１０８コピー／テスト）が内部標準物質より先に増幅したが、×１．２反応液では、内部標準物質の増幅が先になり、かつ、ＨＢＶプラスミド鋳型の濃度に関わらず、一定時間での内部標準物質の増幅が可能となった。【００９０】
したがって、内部標準物質を先行増幅させるためには、基質ヌクレオチドを含む反応試薬成分濃度を高めに設定するのがよく、本検討の場合、×１．２とするのが適当である。
【表３】
2009051214.tif 000005
【００９１】
実施例６．ＬＡＭＰ法による淋菌の検出
（１）ＬＡＭＰ反応試薬組成及び濃度
実施例１と同様の反応試薬組成及び濃度とした。【００９２】
（２）検出
高濃度のＮＧプラスミドまたは低濃度のＮＧプラスミドを標的核酸として６３℃、６０分間ＬＡＭＰ反応を行い、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ法による蛍光の消光をリアルタイムに検出した。【００９３】
（３）結果
図１０、１１に示したとおり、内部標準物質（ＣＴプラスミド）と標的核酸（ＮＧプ  ラスミド）の同一反応系での増幅が可能であり、標的核酸の鋳型濃度に関わらず、内部標準物質の増幅時間は一定であった。【００９４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
2009051214.tif 000006
【図２】
2009051214.tif 000007
【図３】
2009051214.tif 000008
【図４】
2009051214.tif 000009
【図５】
2009051214.tif 000010
【図６】
2009051214.tif 000011
【図７】
2009051214.tif 000012
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年4月7日(2010.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部標準物質を用いる核酸増幅法であって、内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅することを特徴とする前記核酸増幅法。
【請求項２】
以下の工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅法。
（ａ）標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
（ｂ）標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
（ｃ）前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により測定する工程。
【請求項３】
以下の工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅法。
（ａ）標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
（ｂ）標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
（ｃ）前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により、リアルタイム測定し、その結果及び内部標準物質の添加量から、試料中の初期標的核酸濃度又はコピー数を算出する工程。
【請求項４】
標的核酸の定量を行うことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項５】
標的核酸の有無を検出することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項６】
内部標準物質が、少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列を有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項７】
内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーが、内部標準物質と特異的にハイブリダイズし、標的核酸とハイブリダイズしないように設計され、かつ、標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸と特異的にハイブリダイズし、内部標準物質とハイブリダイズしないように設計されていることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項８】
標的核酸の増幅より早いタイミングで内部標準物質の増幅が起こるように設計されている内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを用いることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項９】
以下の条件設定により内部標準物質を標的核酸よりも先行して増幅させることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
（ａ）内部標準物質を標的核酸と同時に増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、内部標準物質の濃度を高く設定すること、及び／又は、内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの濃度を低く設定すること、
及び／又は、
（ｂ）内部標準物質を使用せずに同一の標的核酸を増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、基質ヌクレオチド濃度を高く設定すること。
【請求項１０】
増幅反応を等温条件で行う請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項１１】
増幅反応が、以下のプライマー（ａ）及び／又は（ｂ）を用いるものである請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
（ａ）鋳型核酸上の標的配列の３'側から該鋳型核酸上の３'末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５'側から３'側にこの順で含むプライマー、
（ｂ）鋳型核酸上の標的配列の５'側から該鋳型核酸上の５'末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５'側から３'側にこの順で含むプライマー。
【請求項１２】
増幅反応がＬＡＭＰ法である請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の核酸増幅法を実施するために用いることを特徴とする測定試薬又は試薬キット。
【請求項１４】
少なくとも以下の試薬を含むことを特徴とする請求項１３記載の測定試薬又は試薬キット。
（ａ）少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列を有する、濃度又はコピー数既知の内部標準物質、
（ｂ）標的核酸の増幅よりも早いタイミングで内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｃ）標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１５】
さらに、以下の試薬を含むことを特徴とする請求項１４記載の測定試薬又は試薬キット。
（ａ）内部標準物質検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ、
及び、
（ｂ）標的核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ。
【国際調査報告】
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