(57)【要約】本発明は、ＲＮＡまたはＤＮＡを試料から単離するための装置、材料および方法を扱う。
2009512445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気処理アセンブリ；および
磁気エレベーターアセンブリを含み、
磁気処理アセンブリは少なくとも一つのチューブを保持するように構成され、磁気エレベーターアセンブリは磁石取付アセンブリを含み、磁石取付アセンブリは少なくとも第一の位置および第二の位置を取ることができる少なくとも一つの磁石を含み、第一の位置では、その少なくとも一つの磁石は磁気処理アセンブリから遠側へ移動し、および第二の位置では、その少なくとも一つの磁石は試料チューブが磁気処理チューブアセンブリ内にある際にチューブに隣接するよう移動する、
処理アセンブリ。
【請求項２】
磁石取付アセンブリが駆動系を使用して少なくとも第一および第二の位置を取ることができる、請求項１の処理アセンブリ。
【請求項３】
駆動系が旋回バーおよび／または一つ以上のスプリングのどちらかまたは両方を含む、請求項２の処理アセンブリ。
【請求項４】
磁気処理チューブがコニカルチューブである、請求項１の処理アセンブリ。
【請求項５】
ピストン；
シリンダーアクチュエーターロッド；および
シリンダーを一つ以上のピペッターアセンブリへ液体連絡させるための上部および下部ポート：
を含む少なくとも一つのシリンダー：
を含むポンプアセンブリ。
【請求項６】
（ａ）（ｉ）一つ以上のチューブ用の少なくとも一つのホルダー；（ｉｉ）請求項１の磁気処理アセンブリを受容するための受容機構；および（ｉｉｉ）試薬を受容するための第一のおよび第二の容器；を含む取付プレートを含む処理アセンブリ；
（ｂ）Ｙ方向駆動機構を含む請求項５のポンプアセンブリを含む上部デッキアセンブリ；
（ｃ）吸引ピペッターアセンブリ；および
（ｄ）分注ピペッターアセンブリ：
を含み、吸引ピペッターアセンブリおよび分注ピペッターアセンブリがＹ方向駆動機構と液体連絡している、核酸単離のための装置。
【請求項７】
取付プレートがさらに、少なくとも一つの使い捨てチップのための使い捨てチップホルダーを含む、請求項６の装置。
【請求項８】
取付プレートがチューブ用の少なくとも二つのホルダーを含む、請求項６の装置。
【請求項９】
一方のホルダーが出力チューブ用でありおよび他方のホルダーが廃棄物チューブ用である、請求項８の装置。
【請求項１０】
試薬が試薬パック内に含まれる、請求項６の装置。
【請求項１１】
試薬が試薬パック１および試薬パック２内に含まれる、請求項６の装置。
【請求項１２】
さらに磁気処理アセンブリを含む、請求項６の装置。
【請求項１３】
請求項６の装置；および電子制御系を含み、電子制御系がプログラム式マイクロコントローラー；およびユーザーインターフェイスを含む、核酸の自動単離のためのシステム。
【請求項１４】
ユーザーインターフェイスがディスプレイである、請求項１３のシステム。
【請求項１５】
さらに磁気処理アセンブリを含む、請求項１３のシステム。
【請求項１６】
（ａ）生物開始材料を含む試料を磁気処理チューブに入れる、但し、磁気処理チューブはシリカ被覆された磁気粒子、および任意に酵素溶液を含む；
（ｂ）核酸を単離するための装置を起動する、但し、その装置は分注ピペッターアセンブリ；吸引ピペッターアセンブリ；任意の溶解溶液、任意の核酸結合溶液、洗浄Ｉ溶液、任意の洗浄ＩＩ溶液、任意の洗浄ＩＩＩ溶液、任意の洗浄ＩＶ溶液、および溶出溶液を含む試薬パック；使い捨てチップ；出力チューブ、廃棄物チューブ；磁気エレベーターアセンブリ；および磁気処理チューブを含み、この装置は下記の段階を実施する：
（１）任意に、試料の存在および／または量を検出手段によって確認する；
（２）任意に、溶解溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、および試料を加熱してインキュベートする；
（３）任意に、核酸結合溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（４）洗浄Ｉ溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（５）任意に、洗浄ＩＩ溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（６）洗浄ＩＩＩ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（７）溶出溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動して精製核酸試料を生じ、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ；および
（８）精製核酸試料を磁気処理チューブから吸引ピペッターアセンブリによって出力チューブへ移動する
：段階を含む、核酸を含む生物試料から核酸を単離するための自動化方法。
【請求項１７】
段階（ｂ）（２）、（ｂ）（３）、（ｂ）（４）、（ｂ）（５）、（ｂ）（６）、および／または（ｂ）（５）がさらに、吸引ピペッターアセンブリによって試料をピペッティングで上下することによる試料の混合を含む、請求項１６の自動化方法。
【請求項１８】
生物開始材料を含む試料が、この試料が磁気処理チューブへ添加される前に溶解溶液と混合される、請求項１６の方法。
【請求項１９】
核酸がＤＮＡである、請求項１６の方法。
【請求項２０】
核酸がＲＮＡである、請求項１６の方法。
【請求項２１】
結合溶液が、５０から１５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）をｐＨ約７から１０で、錯体化塩を濃度約５から１５Ｍで、および界面活性剤を濃度約５から１５％で含む、請求項１６の方法。
【請求項２２】
錯体化塩が塩化リチウムである、請求項１６の方法。
【請求項２３】
結合溶液がさらにアルコールを含む、請求項１６の方法。
【請求項２４】
結合溶液が実質的にアルコールから成る、請求項１６の方法。
【請求項２５】
酵素溶液がプロテイナーゼＫ約１０から２５ｍｇ／ｍＬおよび／またはＲＮアーゼＡ約２からｍｇ／ｍＬを含む、請求項１６の方法。
【請求項２６】
段階（６）の後に下記の段階をさらに含む、請求項１６の方法：
（ｉ）ＤＮアーゼＩ溶液および再結合溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（ｉｉ）洗浄ＩＶ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（ｉｉｉ）洗浄ＩＩＩ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する。
【請求項２７】
ＤＮアーゼＩ溶液が、濃度約０．２５から１．０Ｕ／ｍＬで存在するＤＮアーゼＩを含む、請求項２６の方法。
【請求項２８】
再結合溶液が、塩を濃度約５から１５Ｍでおよび／またはアルコールを含む、請求項２６の方法。
【請求項２９】
溶解溶液がリチウム塩を濃度約２Ｍから約９Ｍで、一つ以上の両親媒性試薬を濃度少なくとも１０〜４０％ｗ／ｖで、および緩衝剤を含み、溶液がｐＨ少なくとも７である、請求項１６の自動化方法。
【請求項３０】
洗浄Ｉ溶液がリチウム塩を濃度４〜１０Ｍで，およびアルコールを濃度約１５〜８０％ｖ／ｖで含む、請求項１６の方法。
【請求項３１】
洗浄Ｉ溶液が５Ｍ ＬｉＣｌおよび５５％エタノールを含む、請求項１６の方法。
【請求項３２】
洗浄ＩＩ溶液がアルコールを含む、請求項１６の方法。
【請求項３３】
洗浄ＩＩ溶液が１００％イソプロピルアルコールを濃度１００％ｖ／ｖで含む、請求項１６の方法。
【請求項３４】
洗浄ＩＩＩ溶液が緩衝剤、アルコール、およびキレート剤を含む、請求項１６の方法。
【請求項３５】
洗浄ＩＩＩ溶液が、５０から１５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）をｐＨ約６から９で、アルコールを濃度約５０から９０％ｖ／ｖで、および約１から２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む、請求項１６の方法。
【請求項３６】
洗浄ＩＩＩ溶液が、７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ６〜８）および５ｍＭ ＥＤＴＡを含む、請求項１６の方法。
【請求項３７】
洗浄ＩＶ溶液が、４〜１０Ｍリチウム塩、アルコールを濃度約５から３０％ｖ／ｖで含む、請求項１６の方法。
【請求項３８】
洗浄ＩＶ溶液が６Ｍ ＬｉＣｌおよび１８％メタノールを含む、請求項１６の方法。
【請求項３９】
磁気粒子がグリセロールを含む混合物中で包装されている、請求項１６の自動化方法。
【請求項４０】
磁気エレベーターアセンブリが、磁石取付アセンブリおよび、磁石取付アセンブリと操作可能に接続された少なくとも一つの磁石を含み、その少なくとも一つの磁石は少なくとも第一の位置および第二の位置を取ることができ、第一の位置では、その少なくとも一つの磁石は磁気処理チューブホルダーから遠側へ移動し、および第二の位置では、その少なくとも一つの磁石は磁気処理チューブホルダーに隣接するよう移動する、請求項１６の自動化方法。
【請求項４１】
精密ポンプが、ピストン；シリンダーアクチュエーターロッド；およびシリンダーを一つ以上のピペッターアセンブリへ液体連絡させるための上部および下部ポートを含む、少なくとも一つのシリンダーを含む、請求項１６の自動化方法。
【請求項４２】
（ａ）ｐＨ少なくとも９である第一の試薬、試料、および磁気粒子を磁気処理チューブ内で混合して、試料が溶解されて試料中の核酸を放出するようにする、但し、第一の試薬が（１）リチウム塩を濃度約２〜５Ｍで；（２）界面活性剤を容量にして濃度約２０〜４０％で；（３）緩衝剤；（４）キレート剤を約５〜２０ｍＭで；（５）洗浄剤を約０．０５〜２％で；（６）消泡剤を容量にして約０．００５〜０．１％で含み、溶解物を生成する；
（ｂ）任意に第二の試薬を溶解物に加えて、ＤＮＡが磁気粒子と結合するようにする、但し、第二の試薬が（１）リチウム塩を濃度少なくとも９Ｍで；（２）界面活性剤を濃度少なくとも５％で、および（３）緩衝剤を含み；および
（ｃ）磁力を磁気処理チューブに加える；
：段階を含む、
ＤＮＡが試料から遊離される、
ＤＮＡを含む生物試料からＤＮＡを単離するための自動化方法。
【請求項４３】
（ａ）ｐＨ少なくとも７である第一の試薬、試料、および磁気粒子を磁気処理チューブ中で混合して、試料が溶解されて試料中の核酸を放出して溶解物を生成するようにする、但し、第一の試薬が（１）リチウム塩を濃度約２〜１０Ｍで；（２）界面活性剤を容量にして濃度約５〜２０％で；（３）緩衝剤；（４）キレート剤を約５〜２０ｍＭで；（５）洗浄剤を約０．０５〜５％で；および（６）消泡剤を容量にして約０．００５〜０．１％で含む；
（ｂ）ｐＨ少なくとも７である第二の試薬を溶解物に加えて、ＤＮＡが磁気粒子と結合するようにする、但し、第二の試薬が（１）リチウム塩を濃度少なくとも５Ｍで、界面活性剤を濃度少なくとも５％で、緩衝剤、および任意にアルコールを含む緩衝結合溶液、または（２）リチウム塩を濃度少なくとも５Ｍでおよびアルコールを濃度少なくとも３５％ｖ／ｖで含むアルコール結合溶液のどちらかである；および
（ｃ）磁力を磁気処理チューブに加える；
：段階を含む、
ＤＮＡが試料から遊離される、
ＤＮＡまたはＲＮＡを含む生物試料からＤＮＡまたはＲＮＡを単離するための自動化方法。
【請求項４４】
緩衝結合溶液が、リチウム塩を濃度少なくとも９Ｍで、界面活性剤を濃度少なくとも１０％で、およびｐＨ８を含む、請求項４３の方法。
【請求項４５】
アルコール結合溶液が、リチウム塩を濃度少なくとも５Ｍで、およびアルコールを濃度少なくとも５５％ｖ／ｖで含む、請求項４３の方法。
【請求項４６】
アルカリ金属塩を濃度約２Ｍから約１０Ｍで、洗浄剤を濃度０．０５から２．０％ｗ／ｖで、界面活性剤を濃度約５から４０％ｗ／ｖで、キレート剤を濃度約５から２０ｍＭで、消泡剤、緩衝剤、および消泡剤約０．００５％から約０．１％を含む、溶液がｐＨ少なくとも７である、細胞を溶解するための溶解溶液。
【請求項４７】
溶液がｐＨ少なくとも９である、請求項４６の溶液。
【請求項４８】
溶液がｐＨ少なくとも１１である、請求項４６の溶液。
【請求項４９】
アルカリ金属塩が塩化リチウムまたは臭化リチウムである、請求項４６の溶液。
【請求項５０】
洗浄剤が非イオン性洗浄剤である、請求項４６の溶液。
【請求項５１】
非イオン性洗浄剤が、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類洗浄剤、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類洗浄剤、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）洗浄剤、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）またはイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）である、請求項５０の溶液。
【請求項５２】
洗浄剤が陰イオン性洗浄剤である、請求項４６の溶液。
【請求項５３】
陰イオン性洗浄剤がＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）である、請求項５２の溶液。
【請求項５４】
界面活性剤がジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）である、請求項４６の溶液。
【請求項５５】
消泡剤がダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドである、請求項４６の溶液。
【請求項５６】
緩衝剤がトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤である、請求項４６の溶液。
【請求項５７】
リチウム塩が濃度約２Ｍから約５Ｍで存在する、請求項４６の溶液。
【請求項５８】
５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ１０〜１１）、２Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％ＳＤＳ、３０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭクエン酸および０．０５％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドを含む、請求項４６の溶液。
【請求項５９】
１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７）、８Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ、１０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０１％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドを含む、請求項４６の溶液。
【請求項６０】
２０ｍＭ ＴＣＥＰをさらに含む、請求項５９の溶液。
【請求項６１】
別々の区画を有する容器を含み、溶解溶液、任意の結合溶液、一つ以上の洗浄溶液、および溶出溶液を含み、溶解溶液、結合溶液、一つ以上の洗浄溶液および溶出溶液が別々の区画に入っている、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を精製するための試薬パック。
【請求項６２】
溶解溶液が請求項３０の溶解溶液である、請求項６１の試薬パック。
【請求項６３】
密封されたカバーをさらに含む、請求項６１の試薬パック。
【請求項６４】
密封されたカバーが針刺しできる材料である、請求項６３の試薬パック。
【請求項６５】
密封されたカバーがポリプロピレンカバーである、請求項６３の試薬パック。
【請求項６６】
密封されたカバーがシリコーン蒸発バリアである、請求項６３の試薬パック。
【請求項６７】
包装材料および、グリセロール、緩衝剤、およびシリカ被覆された常磁性粒子を含む磁気ビーズ用保存媒体を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料からＲＮＡまたはＤＮＡを単離するための装置、材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）といった核酸は、分子生物学の分野で研究および臨床分析のために広範囲に使用されている。ＤＮＡおよびＲＮＡを単離するための、細胞の破壊および核酸を溶液中へ遊離させることを含む、いくつかの方法が存在する。ＲＮＡは分解に対して非常に感受性である。したがって、ＲＮＡ分解酵素（たとえばＲＮアーゼ）による酵素的分解からＲＮＡを保護するための方法もまた存在する。ＲＮＡはその後、ＤＮＡおよびタンパク質から分離されうる。ＤＮＡおよびＲＮＡについての分離工程は通常は段階的な方法で行われ、そこでＤＮアーゼまたはＲＮアーゼを阻害する条件下で細胞が溶解され、および、固相との結合と混入物を除去するためのその後の洗浄によって、または混入物から核酸を分離するための選択的沈澱によって、混入する細胞材料から核酸が精製される。
【０００３】
さらに、核酸を単離および精製する段階を自動化する機器が入手可能である。そのような機器によって用いられる方法は、ガラス繊維カラムおよび他の膜といった固相担体の使用、またはグアニジンのようなカオトロピック塩と組み合わせた磁気粒子の使用を含むことができ、またはフェノール／クロロホルムまたは塩析法といった液相法を使用しうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が扱う小型装置、処方および方法は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方の、同一試料からの経済的な抽出および精製を可能にし、それによって使用者に利益を与える。
【０００５】
本発明は、磁気処理アセンブリ；および磁気エレベーターアセンブリを含む処理アセンブリを提供し、磁気処理アセンブリは少なくとも一つのチューブ（たとえばコニカルチューブ）を保持するように構成され、磁気エレベーターアセンブリは磁石取付アセンブリを含み、磁石取付アセンブリは少なくとも第一の位置および第二の位置を取ることができる少なくとも一つの磁石を含み、第一の位置では、その少なくとも一つの磁石は磁気処理アセンブリから遠側へ移動し、および第二の位置では、その少なくとも一つの磁石はチューブが磁気処理チューブアセンブリ内にある際にチューブに隣接するよう移動する。この磁気処理アセンブリの一実施形態では、磁石取付アセンブリは駆動系を使用して少なくとも第一および第二の位置を取ることができる。この磁気処理アセンブリの一部の実施形態では、その駆動系は旋回バーおよび／または一つ以上のスプリングのどちらかまたは両方を含みうる。
【０００６】
本発明は、ピストン、シリンダーアクチュエーターロッド、およびシリンダーを一つ以上のピペッターアセンブリへ液体連絡させるための上部および下部ポートを有する、少なくとも一つのシリンダーを含むポンプアセンブリを提供する。
【０００７】
本発明は、（ａ）取付プレートが（ｉ）一つ以上のチューブ用の少なくとも一つのホルダー；（ｉｉ）磁気処理アセンブリを受容するための受容機構；および（ｉｉｉ）試薬を受容するための第一のおよび第二の容器を有する、取付プレートを有する処理アセンブリ；（ｂ）Ｙ方向駆動機構を含む上記のポンプアセンブリを含む上部デッキアセンブリ；（ｃ）吸引ピペッターアセンブリ；および（ｄ）分注ピペッターアセンブリを含み、吸引ピペッターアセンブリおよび分注ピペッターアセンブリがＹ方向駆動機構と液体連絡している、核酸単離のための装置を提供する。一部の実施形態では、取付プレートはさらに、少なくとも一つのピペットチップ用のホルダーを有する。一部の実施形態では、取付プレートはチューブ用の少なくとも二つのホルダーを含みうる（たとえば、出力チューブ用の一方のホルダー、および廃棄物チューブ用の他方のホルダー）。一部の実施形態では、試薬は一つ以上の試薬パック内に含まれる。一部の実施形態では、装置はまた磁気処理アセンブリも有する。
【０００８】
本発明は、一要素として上記の装置および、マイクロコントローラー（たとえばプログラム式マイクロコントローラー）およびユーザーインターフェイス（たとえばディスプレイ）を含む電子制御系を有する、核酸の自動単離のための系を提供する。一実施形態では、その装置はまた磁気処理アセンブリも有する。
【０００９】
本発明は、核酸を含む生物試料から核酸を単離するための、いくつかの自動化方法を提供する。一実施形態では、自動化方法は下記の段階を用いて、核酸を含む生物試料から核酸を単離する：（ａ）生物開始材料を含む試料を磁気処理チューブに入れる、但し、磁気処理チューブはシリカ被覆された磁気粒子、および任意に酵素溶液を含む；および（ｂ）核酸を単離するための装置を起動する、但し、その装置は分注ピペッターアセンブリ；吸引ピペッターアセンブリ；任意の溶解溶液、任意の核酸結合溶液、洗浄Ｉ溶液、任意の洗浄ＩＩ溶液、洗浄ＩＩＩ溶液、任意の洗浄ＩＶ溶液、および溶出溶液を含む試薬パック；使い捨てチップ；出力チューブ、廃棄物チューブ；磁気エレベーターアセンブリ；および磁気処理チューブを含み、その装置は下記の段階を実施する：
（１）任意に、試料の存在および／または量を検出手段によって確認する；
（２）任意に、溶解溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、および試料を加熱してインキュベートする；
（３）任意に、核酸結合溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（４）洗浄Ｉ溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（５）任意に、洗浄ＩＩ溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（６）洗浄ＩＩＩ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（７）溶出溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動して精製核酸試料を生じ、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ；および
（８）精製核酸試料を磁気処理チューブから吸引ピペッターアセンブリによって出力チューブへ移動する。
【００１０】
一部の実施形態では、試料は、分注ピペッターアセンブリが溶液を分注後に、吸引ピペッターアセンブリによって混合される。吸引ピペッターアセンブリは、試料をピペッティングで上下することによってこの混合を達成する。
【００１１】
一部の実施形態では、単離すべき試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方である。
【００１２】
一部の実施形態では、結合溶液は５０から１５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）をｐＨ約７から１０で、錯体化塩を濃度約５から１５Ｍで、および界面活性剤を濃度約５から１５％で含む。錯体化塩は塩化リチウムでありうる。溶液はさらにアルコールを含みうる。代替的な一実施形態では、結合溶液はアルコールだけを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、酵素溶液はプロテイナーゼＫ約１０から２５ｍｇ／ｍＬおよび／またはＲＮアーゼＡ約２から２０ｍｇ／ｍＬを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本方法は段階（６）の後に下記の段階を含む：
（ｉ）ＤＮアーゼＩ溶液および再結合溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（ｉｉ）洗浄ＩＶ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（ｉｉｉ）洗浄ＩＩＩ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する。
【００１５】
一部の実施形態では、ＤＮアーゼＩ溶液は、濃度約０．２５から１．０Ｕ／μＬで存在するＤＮアーゼＩを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、再結合溶液は、塩化リチウムといった塩を濃度約５から１５Ｍ（たとえば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｍ）で、および／またはエタノールまたはイソプロパノールといったアルコールを約２０から１００％ｖ／ｖ（たとえば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％ｖ／ｖ）で含む。
【００１７】
一部の実施形態では、溶解溶液はリチウム塩を濃度約２Ｍから約９Ｍで、一つ以上の両親媒性試薬を濃度少なくとも１０〜４０％ｗ／ｖで、および緩衝剤を含み、溶液はｐＨ少なくとも７である。
【００１８】
一部の実施形態では、洗浄Ｉ溶液はリチウム塩を濃度４〜１０Ｍで（たとえば、５Ｍ ＬｉＣｌ）、およびアルコールを濃度約１５〜８０％ｖ／ｖで（たとえば、５５％エタノール）含む。
【００１９】
一部の実施形態では、洗浄ＩＩ溶液はアルコールである（たとえば、濃度１００％ｖ／ｖの１００％イソプロピルアルコール）。
【００２０】
一部の実施形態では、洗浄ＩＩＩ溶液は、緩衝剤（たとえば、５０から１５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）をｐＨ約６から９で）、５０から９０％ｖ／ｖ開始濃度のアルコール、およびキレート剤（たとえば、１から２０ｍＭ ＥＤＴＡ）を含む。一例では、洗浄ＩＩＩ溶液は７０％エタノール（開始濃度、ｖ／ｖ）、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ６〜８）および５ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、洗浄ＩＶ溶液は４〜１０Ｍリチウム塩（たとえば、６Ｍ ＬｉＣｌ）、アルコールを濃度約５から３０％ｖ／ｖで（たとえば、１８％メタノール、終濃度）含む。
【００２２】
一部の実施形態では、磁気粒子はグリセロールを含む混合物中で包装され、およびその混合物はさらに緩衝剤を含みうる。
【００２３】
一部の実施形態では、磁気エレベーターアセンブリは、磁石取付アセンブリおよび、磁石取付アセンブリと操作可能に接続された少なくとも一つの磁石を含み、その少なくとも一つの磁石は少なくとも第一の位置および第二の位置を取ることができ、第一の位置では、その少なくとも一つの磁石は磁気処理チューブホルダーから遠側へ移動し、および第二の位置では、その少なくとも一つの磁石は磁気処理チューブホルダーに隣接するよう移動する。
【００２４】
一部の実施形態では、精密ポンプは、ピストン；シリンダーアクチュエーターロッド；およびシリンダーを一つ以上のピペッターアセンブリへ液体連絡させるための上部および下部ポートを含む、少なくとも一つのシリンダーを有する。
【００２５】
本発明の方法の一実施形態（ＤＮＡ直接溶解手順）は下記の段階を有する：（ａ）生物開始材料を含む試料を磁気処理チューブに入れる；および（ｂ）ＤＮＡ用の直接溶解手順を用いる、核酸を単離するための装置を起動する、ここでその装置は分注ピペッターアセンブリ；吸引ピペッターアセンブリ；溶解溶液、結合溶液、洗浄Ｉ溶液、洗浄ＩＩ溶液、洗浄ＩＩＩ溶液および溶出溶液を含む試薬パック；使い捨てチップ；出力チューブ、廃棄物チューブ；磁気エレベーターアセンブリ；および、シリカ被覆された磁気粒子のような磁気粒子、緩衝剤、グリセロールおよびプロテイナーゼＫを含む磁気処理チューブを有する。その装置は下記の段階を実施する：
（１）試料の存在および量を検出手段によって確認する；
（２）溶解溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動し、および試料を加熱してインキュベートする；
（３）ＤＮＡ結合溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（４）洗浄Ｉ溶液を一回以上、試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（５）洗浄ＩＩ溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（６）洗浄ＩＩＩ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（７）溶出溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合して、精製核酸試料を溶出し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ；および
（８）精製ＤＮＡ試料を磁気処理チューブから吸引ピペッターアセンブリによって出力チューブへ移動する。
【００２６】
本発明の方法の別の一実施形態（ＤＮＡ溶解物手順）は下記の段階を有する：（ａ）ＤＮＡを含む溶解物を磁気処理チューブに加える、および（ｂ）ＤＮＡ用の溶解物手順を用いる、核酸を単離するための装置を起動する、ここでその装置は分注ピペッターアセンブリ；吸引ピペッターアセンブリ；瓶入りの溶解溶液、ＲＮアーゼ試薬、任意の結合溶液、洗浄Ｉ溶液、洗浄ＩＩＩ溶液、および溶出溶液を含む試薬パック；使い捨てチップ；出力チューブ、廃棄物チューブ；磁気エレベーターアセンブリ；および、シリカ被覆された磁気粒子、緩衝剤、およびグリセロールを含む磁気処理チューブを有する。その装置は下記の段階を実施する：
（１）試料の存在および量を検出手段によって確認する；
（２）任意の結合溶液を加え、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（３）洗浄Ｉ溶液を一回以上、試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（４）洗浄ＩＩＩ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（５）溶出溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合して、精製核酸試料を溶出し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ；および
（６）精製ＤＮＡ試料を磁気処理チューブから吸引ピペッターアセンブリによって出力チューブへ移動する。
【００２７】
本発明の方法の別の一実施形態（ＲＮＡ溶解物手順）は下記の段階を有する：（ａ）核酸（総核酸）を含む溶解物を磁気処理チューブに加える、および（ｂ）ＲＮＡ用の溶解物手順を用いる、核酸を単離するための装置を起動する、ここでその装置は、分注ピペッターアセンブリ；吸引ピペッターアセンブリ；瓶入りの溶解溶液、還元剤、任意の結合溶液、洗浄Ｉ溶液、洗浄ＩＩＩ溶液、ＤＮアーゼ溶液、再結合溶液、洗浄ＩＶ溶液、および溶出溶液を含む試薬パック；使い捨てチップ；出力チューブ、廃棄物チューブ；磁気エレベーターアセンブリ；および、シリカ被覆された磁気粒子、緩衝剤、およびグリセロールを含む磁気処理チューブを有する。その装置は下記の段階を実施する：
（１）試料の存在および量を検出手段によって確認する；
（２）任意の結合溶液を加え、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（３）洗浄Ｉ溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（４）洗浄ＩＩＩ溶液を試薬パックから、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（５）ＤＮアーゼ溶液を試薬パックから、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、；
（６）再結合溶液を試薬パックから、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（７）洗浄ＩＶ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（８）洗浄ＩＩＩ溶液を試薬パックから、一回以上、磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合し、磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ、および液体を磁気処理チューブから廃棄物チューブへ吸引する；
（９）溶出溶液を試薬パックから磁気処理チューブへ分注ピペッターアセンブリによって移動しおよび混合して、精製核酸試料を溶出し、および磁気処理チューブを磁気エレベーターアセンブリと接触させ；および
（１０）精製ＲＮＡ試料を磁気処理チューブから吸引ピペッターアセンブリによって出力チューブへ移動する。
【００２８】
本発明の一部の実施形態では、磁気粒子は、グリセロールを含む混合物中で包装されており、および、ビーズをチューブの底に固定化しおよび酵素を安定化するために乾燥された緩衝剤および酵素をさらに含むことができる。一実施形態では、磁気エレベーターアセンブリは、磁石取付アセンブリおよび、磁石取付アセンブリと操作可能に接続された少なくとも一つの磁石を含み、その少なくとも一つの磁石は少なくとも第一の位置および第二の位置を取ることができ、第一の位置では、その少なくとも一つの磁石は磁気処理チューブホルダーから遠側へ移動し、および第二の位置では、その少なくとも一つの磁石は磁気処理チューブホルダーに隣接するよう移動する。一実施形態では、精密ポンプは、ピストン；シリンダーアクチュエーターロッド；およびシリンダーを一つ以上のピペッターアセンブリへ液体連絡させるための上部および下部ポートを含む、少なくとも一つのシリンダーを有する。
【００２９】
本発明は、ＤＮＡを含む生物試料からＤＮＡを単離するための自動化方法を提供し、それは三つの段階を有する。第一の段階は、ｐＨ少なくとも９である第一の試薬（溶解試薬）、試料、および磁気粒子（グリセロールに含まれうる、プロテイナーゼＫもまた存在するかまたはしない）を混合することを含み、試料中の細胞を溶解しおよびそれによって核酸を試料から放出する。溶解段階は熱の存在下で起こりうる。第一の（溶解）試薬は、（１）リチウム塩を濃度約２〜５Ｍで；（２）界面活性剤を容量にして濃度約２０〜４０％で；（３）緩衝剤；（４）キレート剤を約５〜２０ｍＭで；（５）洗浄剤を約０．０５〜２％で；（６）消泡剤を容量にして約０．００５〜０．１％で含み、溶解物を生成する。第二の段階は、第二の試薬を溶解物に加えることを含み、そのためＤＮＡが定量的に磁気粒子と結合し、第二の試薬は（１）リチウム塩を濃度少なくとも９Ｍで；（２）界面活性剤を濃度少なくとも５％で、および（３）緩衝剤を含む。第三の段階は、磁力を磁気処理チューブに加えることを含み、ＤＮＡが試料から遊離される。
【００３０】
本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む生物溶解物からＤＮＡまたはＲＮＡを単離するための自動化方法を提供し、自動化方法は三つの段階を有する。第一に、ｐＨ少なくとも７である第一の試薬（溶解溶液）を試料に混合し、および試料をホモジナイズして試料中の細胞が溶解されて核酸を試料から放出し溶解物を生成し、およびその溶解物を磁気処理チューブ内でグリセロール中の磁気粒子と混合する。この実施形態では、溶解試薬は（１）リチウム塩を濃度約２〜１０Ｍで；（２）界面活性剤を容量にして濃度約５〜２０％で；（３）緩衝剤；（４）キレート剤を約５〜２０ｍＭで；（５）洗浄剤を約０．０５〜５％で；および（６）消泡剤を容量にして約０．００５〜０．１％で含む。二つめに、任意に第二の試薬を溶解物に加え、ＤＮＡまたはＲＮＡが定量的に磁気粒子と結合するようにする；第二の試薬は（１）リチウム塩を濃度少なくとも５Ｍで；（２）界面活性剤を濃度少なくとも５％で；（３）緩衝剤；および（４）任意に、エタノールまたはイソプロパノールといったアルコールを含み、または第二の試薬はエタノールまたはイソプロパノールといったアルコールでありうる。三つめに、磁力を磁気処理チューブに加え、ＤＮＡまたはＲＮＡが試料から遊離される。一部の実施形態では、緩衝結合溶液は、リチウム塩を濃度少なくとも９Ｍで、界面活性剤を濃度少なくとも１０％で、およびｐＨ８を含む。一部の実施形態では、アルコール結合溶液は、リチウム塩を濃度少なくとも５Ｍで、およびアルコールを濃度少なくとも５５％ｖ／ｖで含む。
【００３１】
本発明は、細胞を溶解するための、リチウム塩（たとえば、塩化リチウムまたは臭化リチウム）を濃度約２Ｍから約１０Ｍで、界面活性剤を約５％から約４０％で、溶液がｐＨ値少なくとも７から約１１を有する緩衝剤（たとえば、トリス（Ｔｒｉｓ））を含み、それぞれキレート剤約５ｍＭから２０ｍＭを含み、それぞれ洗浄剤約０．０５％から約２％を含み、およびそれぞれ消泡剤（たとえば、ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンド）約０．００５％から約０．１％を含む、溶解溶液を提供する。一部の実施形態では、溶解溶液は２０ｍＭ ＴＣＥＰを含みうる。一部の実施形態では、界面活性剤はジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）である。一部の実施形態では、緩衝剤はトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤である。一部の実施形態では、溶液はｐＨ少なくとも約９、または少なくとも約１１さえ有する。一部の実施形態では、洗浄剤は非イオン性洗浄剤、たとえばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類洗浄剤、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類洗浄剤、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）洗浄剤、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）またはイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）である。一部の実施形態では、洗浄剤は陰イオン性洗浄剤、たとえばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）である。一部の実施形態では、界面活性剤はジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）である。一部の実施形態では、リチウム塩は濃度約２Ｍから約５Ｍで存在する。一部の実施形態では、溶解溶液は、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ１０〜１１）、２Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％ＳＤＳ、３０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭクエン酸および０．０５％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドを含む。代替的な一実施形態では、溶解溶液は、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７）、８Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ、１０％ ＤＧＭＥ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０１％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、緩衝剤はクエン酸緩衝剤である。一部の実施形態では、キレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。一部の実施形態では、キレート剤はクエン酸である。一部の実施形態では、洗浄剤は非イオン性洗浄剤、たとえばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類洗浄剤、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類洗浄剤、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）洗浄剤、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔｓ）またはイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）である。一部の実施形態では洗浄剤はイオン性洗浄剤、たとえば陰イオン性洗浄剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。一部の実施形態では、消泡剤はダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドである。
【００３３】
本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を精製するための試薬パックを提供し、試薬パックは精製試薬の入ったいくつかの別々の区画を有する。ＤＮＡ用の一実施形態では、試薬パックは、溶解溶液、結合溶液、一つ以上の洗浄溶液および溶出溶液を含む。ＤＮＡ用の別の一実施形態では、試薬パックは、一つ以上の洗浄溶液、および溶出溶液を含む。ＲＮＡ用の一実施形態では、試薬パックは、一つ以上の洗浄溶液、ＤＮアーゼ溶液、ＲＮＡ再結合溶液、および溶出溶液を含む。一部の実施形態では、試薬パックはさらに、密封カバー、たとえば針刺しできる材料（たとえば、ポリプロピレンカバー）および／またはシリコーン蒸発バリアを含む。本発明は、包装材料および、グリセロール、シリカ被覆された磁気粒子、緩衝剤、および一部の実施形態ではプロテイナーゼＫを含む磁気ビーズ用保存媒体を含む、キットを提供する。
【００３４】
本発明の他の特性および長所は下記の詳細な説明から、および請求項から明らかになる。別に定義されない限り、ここで使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解される意味を有する。ここで言及されるすべての出版物、特許出願、特許、および他の参照文献は参照により全体が本開示に含まれる。矛盾する場合は、定義を含め本明細書が支配する。開示される材料、方法、および実施例は例示のみでありおよび限定することを意図しない。当業者は、ここに記載されるものと同様または等価の方法および材料が本発明を実施するために使用されうることを理解する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
生物科学、医学および薬学の発展は、遺伝子の研究への興味を高めており、およびさまざまな試料から核酸を得るための洗練された方法の必要性を強めている。たとえば、リボ核酸は細胞の遺伝的起源および機能的活動の広範囲な情報を提供する。そのような情報は、たとえば、臨床医療において、感染の診断、がん遺伝子を発現している細胞の存在の検出、遺伝疾患の検出、宿主防御機構の状態の監視、代謝疾患の研究および診断、患者における遺伝子発現に対する薬剤の影響の研究、および薬剤の副作用および毒性作用の研究に使用されうる。
【００３６】
液相精製および固相精製の二つの一般的分類に該当する、多数の核酸精製方法が存在する。液相精製では、核酸は液相に留まり、一方で不純物は沈澱および／または遠心分離によって除去される。代替的に、核酸が溶液から沈澱される一方で不純物が留まる。固相精製では、核酸は固相担体に結合し、一方で不純物は選択的に溶出される。たとえば、液相精製によって単離されるＲＮＡは液相に留まり、一方で不純物は沈澱および／または遠心分離といった工程によって除去される。固相精製では、ＲＮＡは固相担体に結合し、一方でＤＮＡ、タンパク質、およびリン脂質といった不純物は選択的に溶出される。両方の精製戦略は従来の方法を利用し、多数の段階を必要とし、および危険な試薬を使用する可能性があり、およびより迅速な方法はより少数の段階および通常はより危険性の低い試薬を必要とする。ＤＮＡおよびＲＮＡ精製の場合、開始材料（たとえば、生物材料）が細胞を含むならば、液相法および固相法の両方が、細胞の破壊、または溶解段階を必要とする。溶解段階は、タンパク質、脂質、糖質、などといった混入物と混合したＤＮＡおよびＲＮＡを結果として生じる。そのような混合物はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡを分解するＤＮアーゼおよびＲＮアーゼを含み、およびそれらは相当に未分解のＤＮＡまたはＲＮＡを与え干渉しないように除去および／または不活性化されなければならない。
【００３７】
機器構成部品
試料から核酸を得ることを可能にする多数の機器が存在する。たとえば、多数の市販の液体取扱システムは、一般の分子生物学研究用の、日常の液体取扱業務および核酸精製を自動化するための、ワークステーション周辺で液体を方々に移動するモジュール式装置を有する。そのような機器は一般的に、吸引用のピペット、液面用の検出機構、および試料および液体をワークステーションに沿った指定範囲へ動かすための他のロボットを含む。たとえば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，４４３，７９１ および ６，０６０，０２２を参照。これらのワークステーションは、診断分析を実施するための分析機能をさらに含みうる（たとえば、 Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，６０５，２１３を参照）。核酸を単離するための一部の市販機器は、たとえば、テカン（Ｔｅｃａｎ）（商標）およびパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ブランドで販売されているリキッドハンドラーを含む。核酸単離用の他の機器は、バイオロボット（ＢｉｏＲｏｂｏｔ）（商標）（キアゲンＡＧ社（Ｑｉａｇｅｎ ＡＧ））、マグナピュア（ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ）（商標）（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））、オートピュアＬＳ（Ａｕｔｏｐｕｒｅ ＬＳ）（商標）（ジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））、およびオートジェンプレップ（Ａｕｔｏｇｅｎｐｒｅｐ）（商標）（オートジェン社（ＡｕｔｏＧｅｎ））のブランドで販売されている。これらの機器の大部分は大型でおよび嵩張り、実験室スペースの２０立方フィート以上を占め、および非常に高価である。
【００３８】
近年、いくつかの会社が、核酸精製用のより小さいよりコンパクトな機器を開発している。たとえば、マグナピュアコンパクト（ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｃｏｍｐａｃｔ）（商標）（ロシュアプライドサイエンス社（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ））は低処理量（運転１回当たり１〜８単離）核酸精製用である。その機器の機能は、充填済み使い捨て試薬カートリッジおよびバーコードリーダーを含む。ＥＺ１（商標）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））もまた入手可能である。ロシュ社およびキアゲン社の機器は、磁気粒子およびグアニジンのようなカオトロピック試薬を使用する点で、ＤＮＡを単離および精製する方法が同一である。使い捨ての消耗品、およびこれらの機器の内部構成品のために、核酸単離用にこれらの機器を購入および使用することは高価になりうる（機器購入に＄２５，０００に加えその後の１試料当たり＄６．００〜＄１０）。
【００３９】
本発明は、核酸（たとえば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を生物試料から単離するための小型のおよび経済的な装置を提供する。本発明の基本構成部品は、多目的試薬パック２４および他の使い捨て品、処理アセンブリ１０、磁気エレベーターアセンブリ２８、上部デッキアセンブリ５６、およびユーザーインターフェイス８２を有する電子制御系７８、およびピペッター（リキッドハンドラーアセンブリ）を含むがそれらに限定されない。
【００４０】
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、処理アセンブリ１０、および他の構成部品のそれぞれ平面図、側面図および透視図を示す。処理アセンブリ１０は、使い捨て品および試薬が位置するところである。処理アセンブリ１０は、 積載のために機器から一部引き出すことができおよび清掃のために機器から完全に引き出すことができる、取付プレート１２を含む。取付プレート１２は、磁気処理チューブ１８を保持する磁気処理チューブホルダー１６を有する磁気処理アセンブリ１４、および出力チューブ２０を保持する出力チューブホルダー２１、および廃棄物チューブ２２を保持する廃棄物チューブホルダー２３、試薬パック２４を保持する試薬パックホルダー２５、および使い捨てピペットチップ２６を保持する使い捨てピペットチップホルダー２７を含む。処理アセンブリ１０は、核酸単離工程に使用される使い捨て品（たとえば、チューブ、チップ、および試薬パック）を入れることができ、および影響を受けやすい構成部品のために液体進入防護を提供する。使い捨て品（たとえば、チューブ、チップ、および試薬パック）は列に配置され、および一実施形態では、取付プレート内で下記の順に存在しうる（取付プレートの前から後ろへ）：１〜８列中の１列に出力チューブ２０；１〜８列中の２列に使い捨てチップ２６；１〜８列中の１列に粒子を含む磁気処理チューブ１８；１〜８列中の１列に廃棄物チューブ２２、および１〜８列中の１列に試薬パック２４。機器使い捨て品の順序は別の実施形態では異なりうる。磁気処理チューブ１８および廃棄物チューブ２２に使用されうるチューブの例は、たとえば、１０ｍＬキャップ付きコニカル底チューブ（ザルスタット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））を含む。出力チューブ２０に使用されうるチューブの例は、たとえば、１．５ｍＬエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心チューブを含む。
【００４１】
核酸単離に使用されるいくつかの異なる試薬がありうる。ここで記載される通り、取付プレート１２は試薬のための領域を含む。さまざまな試薬、または試薬の組み合わせが、核酸単離手順に応じて使用される。試薬、または試薬の組み合わせは、試薬パック２４に処方されおよび取付プレート１２に適当に配置されうる。試薬パック２４の数は、処理すべき試料の数に応じて、１から８まで変化しうる。一部の実施形態では、試薬パック２４はＤＮＡ単離に使用される７個のウェルを有しうる。そのウェルは、直接溶解法での使用のための溶解溶液、結合溶液、一つ以上の洗浄溶液、溶出溶液、およびたとえばＲＮＡを単離する際のＤＮアーゼ試薬のような他の補助試薬を含みうる。別の一実施形態では、試薬パック２４は、機器および／または装置を維持するためのクリーニング溶液を含みうる。試薬パック２４中のウェルの数は、望まれる試薬の数に依存する。試薬パック２４の一例を図７Ａに示す。試薬パック２４は任意の数の材料を用いて作製されうる。一部の実施形態では、試薬は、試薬パック２４の一次シール９１および二次シール９２を、少なくとも一つのピペットチップで突き刺すことによってアクセスされる。一次シール９１および／または二次シール９２は、試薬パック２４に入っている試薬の汚染および／または蒸発を避けるため、再密封可能な材料製でありうる。別の実施形態では、試薬は試薬パック２４のセプタムまたはポートを通じてアクセスされる。複数の試薬パック２４が取付プレート１２に配置されうる。
【００４２】
処理アセンブリ１０の取付プレート１２は、吸引ピペッターアセンブリ３８が自動的に使い捨てチップ２６を装着できるように、使い捨てチップホルダー２７を有する。この自動化は、チップ装着の労働集約的作業、および使用者による潜在的なチップの汚染を無くす。すべてのチップは一般的に、同時に装着される。吸引ピペットアセンブリ３８はこれを、使い捨てチップホルダー２７より上の位置に移動し、および力を加えながら使い捨てチップ２６へ下降することによって行う。
【００４３】
図２Ｂは、試料の処理の大部分が磁気粒子を用いて行われる、磁気処理アセンブリ１４の一実施形態を示す。磁気処理アセンブリ１４は、磁気処理チューブ１８を保持する磁気処理チューブホルダー１６を含み、および磁気エレベーターアセンブリ２８中の磁石３２が磁気処理チューブ１８の壁のごく近傍（０．０３２インチ以内）に移動することを可能にする。旋回磁石ホルダー３４および／またはスプリング３３を無制限に含みうる磁気エレベーターアセンブリは、駆動系を用いて動かされる。駆動系は、無制限に、旋回磁石ホルダー３４および／またはスプリング３３を含みうる。磁石３２は典型的には試料チューブ（たとえば、コニカルチューブ）のカーブを辿る。磁気処理チューブホルダー１６は、試料をたとえば４５±２℃へ加熱できる一体化ヒーターを有しうる。そのヒーターは、ＤＮＡ処理の必要に応じてスイッチオンおよびオフされ、および通常はＲＮＡ処理には使用されない。磁気処理チューブ１８は、磁気処理ホルダー１６の加熱された壁と、たとえば、チューブの底から１０ｍＬチューブの８ｍＬ秤線付近までの範囲を壁に沿って動くことによって、接触しうる。
【００４４】
図２Ｃは、処理されている液体の容量と相対的に磁石３２（磁気粒子を捕捉するための）を最適に配置する新規の手段を提供する、磁気エレベーターアセンブリ２８の一実施形態を示す。磁気エレベーターアセンブリ２８は、磁石取付アセンブリ３４および駆動系３６から成る。磁石取付アセンブリ３４は、たとえば、磁気処理チューブ１８の位置に対応する位置に８個の磁石３２を取り付ける。そのような磁石３２はたとえば、ネオジム・鉄・ホウ素（ＮｄＦｅＢ）から作製されうる。
【００４５】
磁気エレベーターアセンブリ２８は、アセンブリの旋回点によって処理中に「移動頂点」および「ホーム」位置の間の任意の場所に磁石３２を配置させることができる。磁気エレベーターアセンブリ２８の移動速度は典型的には０インチ／秒から１．５インチ／秒である。たとえば、ここでは「移動頂点」位置とは、１０ｍＬチューブの６．０ｍＬ秤線にまたはその上にある磁石３２の最高部をいうことができる（またはチューブのサイズに応じてたとえばチューブの最高部から２／３。ここでは「ホーム」位置とは、チューブの底のすぐ下にある磁石の最高部をいうことができる。
【００４６】
図３は、吸引ピペッターアセンブリ３８および分注ピペッターアセンブリ４８の概略図である。吸引ピペッターアセンブリ３８は、磁気処理チューブ１８内で試料および試薬を操作、廃棄物磁気処理チューブ１８から廃棄物チューブ２２へ輸送、および精製された核酸を出力チューブ２０へ輸送するために用いられる。吸引ピペッターアセンブリ３８はこれらの機能を、ポンプアセンブリ６０と連動して実行する。吸引ピペッターアセンブリ３８はまた、試料の処理および試料レベルの検出に用いられる使い捨てチップ２６を自動的に装着および取り外すことができる。一実施形態では、吸引ピペッターアセンブリ３８は、使い捨てチップ２６と接続するためのチップ取付システム４０、チップ取付を垂直に配置するための吸引駆動系４２、およびチップ排出系４４から成り、および吸引液体レベル検出回路４６を含みうる。吸引ピペッターアセンブリ３８は、処理アセンブリ１０のチップホルダー２７上の適当な位置から使い捨てチップ２６を取ることができる。吸引ピペッターアセンブリ３８は、チップを、たとえば廃棄物チューブ２２へ、自動的に排出できる。一部の実施形態では、吸引ピペッターアセンブリ３８は１個から８個のチップを受け取ることができる。一部の実施形態では、チューブおよびチップの数を増やしそれによって本装置によって処理される試料の数を増やすために、取付プレートに追加の列を加えることができる。使用されうるチップは、たとえば、無制限に、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）使い捨てチップを含む。一部の実施形態では、チップ取付系４０は、調節された力によるピペットチップの取り付けを可能にするようスプリング装着式でありうる。
【００４７】
一般的に、吸引ピペッターアセンブリ３８は、使用者がドアを開けるかまたはドアを開けるよう指示する際に、装置の後部に位置する。一部の実施形態では、ここに記載の装置のドアが閉まっている際、吸引ピペッターアセンブリは介入前にその位置に戻ることができる。吸引ピペッター３８は、試料の存在および量を判定するための吸引液体レベル検出回路４６を装備しうる。
【００４８】
図３はまた、試薬を積載された試薬パック２４から磁気処理チューブ１８へ配送するために使用される分注ピペッターアセンブリ４８の概略図を示す。分注ピペッターアセンブリ４８はこれらの機能を、ポンプアセンブリ６０と連動して実行する。分注ピペッターアセンブリ４８は、チップを取り付けるための分注チップ取付系５０、一般的に固定されたチップ４９（すなわち、使い捨てでないチップ）、チップ取付を垂直に配置するための分注駆動系５２、および分注液体レベル検出回路５４から成る。分注ピペッターアセンブリ４８は、一部の実施形態では、チップ排出系４４を吸引ピペッターアセンブリ３８上で動かすために使用されうる。
【００４９】
下記の規格はここに記載の分注ピペッターアセンブリ４８について代表的なものである。ホームＺ位置は、本質的に「移動頂点」と等しく、固定チップが最高の障害物（たとえば、最高のチューブの最高部）を０．１インチより大きく越えなければならないことを意味する。分注ピペッターアセンブリの位置精度要件は±０．００５インチである。本発明の一部の実施形態では、ここに記載のシステムは、処理中にピペットチップを、ホームＺ位置および最大伸長（すなわち、移動下端）間の任意の位置に配置することができる。一部の実施形態では、総移動距離は４．１インチ以上であり、および代表的な移動速度要件は、たとえば、０インチ／秒から２．５インチ／秒である。ここに記載の分注ピペッターアセンブリ４８は、アセンブリがホームＺ位置にある時を判定するための機構を含みうる。一部の実施形態では、固定チップ端位置は直径０．０３２インチ以内の許容範囲を有する。
【００５０】
一実施形態では、分注ピペッターアセンブリ４８は、それぞれ容量１０００μｌを有し分注チップ取付系に着けられた最大８個の固定チップ４９を有しうる。分注ピペッターアセンブリ４８は、手順が開始する前にすべての試薬のレベルを確認するための液体レベル検出回路を装備されうる。ここに記載の装置は、試薬間交差汚染の可能性を最小化する。加えて、ここに記載の装置は、たとえば試薬パック２４中の、汚染除去試薬を用いて洗浄および汚染除去の能力を有しうる。
【００５１】
図４は、上部デッキアセンブリ５６の概略図を示し、ピペットを操作するための一つ以上の「Ｙ」方向駆動機構４２、５２、およびケーブルおよび配管の管理用の構成部品を含む。駆動機構は、試薬パック、チューブ、またはチップにアクセスできるようピペッターアセンブリを配置する。上部デッキアセンブリ５６は典型的には、吸引ピペッターアセンブリ３８が試薬パック２４に届かないことを確実にするよう、吸引ピペッターアセンブリ３８の動作を制限する機構を有する。一部の実施形態では、上部デッキアセンブリ５６は、吸引ピペッターアセンブリ３８がホームＹ位置にある際に検出する機器を含む。ホームＹ位置は吸引ピペッターアセンブリが後方位置に移動する際である（たとえば、操作者から最遠）。
【００５２】
吸引３８および分注４８ピペッターアセンブリの両方が、磁気処理チューブ１８と個別にアクセスしなければならないため、システムソフトウェアは、アセンブリ間で衝突が起こらないことを確実にできる。また、安全のために、吸引ピペッターアセンブリ３８はアクセスドアが開く際はいつでも後方位置へ引き込まれうる。
【００５３】
図４はまた、ポンプアセンブリ６０を上部デッキアセンブリ５６と共に示す。ポンプアセンブリ６０は、試薬を試薬パック２４から取り出しおよび配送するため、および試料を試薬と混合、廃棄物を除去、および精製された核酸を出力チューブ２０へ送るために使用される。ポンプアセンブリ６０は典型的には、８個の標準複動式空気シリンダー６２、基礎構造６４、およびモーター６８（たとえば、ステッピングモーター）から成る。対応する数の分注固定チップ４９および使い捨てチップ２６は空気シリンダーを共有する。試薬を分注するためのチップは、分注ピペッターアセンブリ４８を経由してシリンダーの「開」端へ接続され、および吸引用のチップは、シリンダーアクチュエーターロッド７４の入ったシリンダーの端へ吸引ピペッターアセンブリ３８を経由して接続される。
【００５４】
ポンプアセンブリ６０は、たとえば、８個のシリンダーおよび１個のモーターを使用して、液体調節のための１６個のチャンネルを提供する。図５は、ここに記載のポンプアセンブリ６０内の個々のシリンダーの概略図を示す。各複動式空気シリンダー６２は２つの接続部；頂部ポート６８および底部ポート７０を有する。Ｔｈｅ頂部ポート６８はバルブを介して後方（分注）ピペッター（計８チャンネル）へ接続され、およびｔｈｅ底部ポート７０はバルブを介して前方（吸引）ピペッター（さらに８チャンネル）へ接続される。複動式空気シリンダー６２は、その２個の出口ポート間の中間点に位置する内部のピストン７２を有する。後方ピペッターへの往復ポンピングが必要な場合、８個全部のピストンが複動式空気シリンダー６２の内部で動き、およびシリンダーおよびピペッターの間のバルブが開かれる。言い換えると、複動式空気シリンダー６２は試料が存在する時だけ動く（すなわち、動いているシリンダーの数はその処理における試料の数に等しい）。前方ピペッターへのバルブは通気へ切り替えられ、それは前方ピペッターを後方ピペッターから効率的に分離する。前方ピペッターを使用すべき場合は、状況は逆転し、後方ピペッターを分離することを可能にする。本質的に、２個の異なるピペッターに役立つ１個のポンプが、２個の独立したポンプの代わりに使用されている。一実施形態では、「前方」ピペッターは吸引ピペッターアセンブリ３８でありおよび「後方」ピペッターは分注ピペッターアセンブリ４８である。
【００５５】
ポンプアセンブリ６０は、分注ピペッターアセンブリ４８を精製処理に必要な分注試薬と接続する。当該装置は試薬を試薬パック２４から固定分注チップおよび接続された配管へ吸引する。ポンプアセンブリ６０はまた、試料および試薬を混合および再分配する吸引ピペッターアセンブリ３８と接続する。当該装置は試料を磁気処理チューブ１８から使い捨てチップ（たとえば、使い捨てろ過チップ）へ吸引する。ポンプアセンブリ６０は移動センサーを有することができ、および各分注動作後にその位置を確認できる。
【００５６】
ピペッターアセンブリ中の各ピペットチップへの各接続は、バルブコネクター７６を有する。このバルブコネクター７６は、チップが使用されていないならば閉じるようにソフトウェアによって制御されている。各バルブコネクター７６はバルブの適切な動作を決定するために用いられる流れを監視する電子回路と接続されうる。ポンプの各チャンネルは、吸引および分注による圧力変化を確認するための圧力トランスデューサーを装備されうる。材料およびフィッティングは、クリーニング液（たとえば漂白剤）を含む、装置で使用される試薬と適合性である材料から作製されうる。
【００５７】
図６は、プログラム可能マイクロコントローラー８０、ディスプレイ付きのユーザーインターフェイス８２、ユニバーサル電力変換器８４、および専用データＩ／Ｏポート８６を含む、電子制御系７８を示す。電子制御系７８はまた、たとえば、８チャンネルレベルセンサー、電源管理システム、ヒーター、および／または６モーションコントロールチャンネルを有しうる。独自の制御ソフトウェアが、この機器のすべての電子および液体機能を実施するために使用されうる。電子制御系７８は、たとえば、導電性分注チップを介して液体のレベルを検出することを可能にする。代表的な導電性分注チップは、８ｘ３個の不連続な試料／処理位置および２ｘ６個の試薬位置で検出できる。データ入力および出力は、たとえば、独自のポータブルなデータキー型「メモリースティック」によって行われうる。
【００５８】
一部の実施形態では、一次システム制御機能は富士通Ｆ2ＭＣ−１６ＬＸマイクロコントローラーによって管理される。この１６ビットマイクロコントローラーは１６メガヘルツで動作し、１２８Ｋバイトのプログラム可能フラッシュメモリ、８１の多目的制御ポート、２つのシリアル通信ポート、および８つのＡ／Ｄコンバーターを有する。
【００５９】
ユーザーインターフェイス８２は一般的に、白黒ディスプレイ、メンブレンスイッチキーパッド、データ転送デバイス、および警報器から成る。たとえば、ディスプレイは蛍光表示管技術を使用でき、および１１５ｍｍ×２８ｍｍの表示面積を有しうる。ユーザーインターフェイス８２の要素は、防水および防沫、および一般的な実験装置クリーニング剤に耐性である。ユーザーインターフェイス８２は典型的には、システムソフトウェアアップデートおよび新しいプロトコルを機器へダウンロードするのに用いられるメモリーチップのような、データ転送デバイスを含む。プロトコルは、たとえばここで下に記載される血液、組織、細胞、植物、細菌、および他の試料からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡの抽出を含みうる。ユーザーインターフェイス８２は一般的に、プロトコルを正常に停止しおよびプロトコルを再スタートすることを可能にする「一時停止」キーを含む。ユーザーインターフェイス８２の要素は、装置の前方の囲みパネルに搭載でき、および一般的に機器の操作のための基本制御点である。
【００６０】
モーター（たとえば、ステッピングモーター）は、マイクロプロセッサー８０によって、個別のモーションコントローラーを用いて独立して制御されうる。ヒーターは、専用回路によって制御される断熱された抵抗加熱エレメントを用いて試料を加熱できる。たとえば、最高到達温度を５０℃に設定でき、および加熱エレメントは適当な温度カットオフを有しうる。その系はまた、使用されていない際のスリープモード電源セーブ機能を有しうる。
【００６１】
本装置は、たとえば、機器の主要な要素を支持しおよび位置づけるフレームアセンブリ内に構築されうる。フレームアセンブリは、たとえば、ハウジングおよび電源アセンブリから構成されうる。ハウジングおよび／または電源アセンブリは、システム電源装置および電源部品（たとえば、給電モジュール、主電源スイッチ、電源装置、および／または冷却ファン）を装着する構造を提供しうる。一部の実施形態では、フレームアセンブリの左右パネルは、上部デッキアセンブリ５６を支持し、および上部デッキアセンブリ５６が処理アセンブリ１０と平行であるように調整を可能にする。一部の実施形態では、フレームアセンブリの後部パネルは、液体取扱部品、ポンプアセンブリ６０、吸引駆動系４２、および分注駆動系５２を支持しうる。
【００６２】
フレームアセンブリは、固定外板、取り外しパネル（たとえば、サービスアクセス用）、および／または蝶番ドア（たとえば、ユーザーアクセス用）の任意の組み合わせによって囲むことができる。フレームアセンブリの囲み部品の主な目的は、動作部品および電子機器との接触から操作者を保護することである。加えて、漏出封じ込めが、フレームアセンブリの設計および囲み方法で対処されうる。
【００６３】
試料
生物試料のような試料は、さまざまな手段によって回収されうる。たとえば、試料回収容器が、試料を回収および保存するために使用される。一部の実施形態では、回収容器は、弾力性の栓を有するガラスまたはプラスチック製チューブである。別の実施形態では、採血チューブが用いられ、ここでチューブはある容量の血液をチューブに採るために真空である。一部の実施形態では、回収チューブは、血液試料を特定の試験用に準備するため、チューブに入っているエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のようなさまざまな添加物を有しうる。一部の実施形態では、試料は体液である（たとえば、全血、骨髄、血液スポット、血清、血漿、バフィーコート調製物、唾液および脳脊髄液、頬粘膜スワブ培養細胞、細菌の細胞懸濁液、心臓・肝臓・および脳のような固形動物組織、糞便および尿のような体老廃物、空気・水・堆積物または土壌から採取された環境試料、植物組織、酵母、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、原虫、リケッチア、および他の小型微生物細胞）。別の実施形態では、試料は生物材料の溶解物、ホモジネート、または部分精製試料である。他の場合には、生物材料は核酸の粗または部分精製混合物を含む。
【００６４】
機器消耗品
本機器は、試薬パック２４に含まれる試薬、磁気処理チューブ１８内に含まれる磁気粒子のような固相担体、廃棄物チューブ２２、出力チューブ２０、および使い捨てピペットチップ２６といった消耗品を使用する。
【００６５】
試薬パック２４は、試薬を保持するためのさまざまな区画を有するトレイである。トレイはプラスチックまたは他の適当な材料から作製されうる。試薬パック２４は、接着剤、熱密封または超音波溶着といった本分野で公知である方法を用いて密封される。一実施形態では、試薬パック２４はポリプロピレンを用いて密封される。一実施形態では、試薬パック２４はシリコーン蒸発バリアを用いて密封される。別の一実施形態では、試薬パック２４は二つのシール、一次シールおよび二次シール９２を有する（図７Ａ）。一次シール９１はポリエステルおよびポリプロピレンのラミネートでありうる。二次シール９２は一次シール９１の上に位置することができ、およびシリコーンのような自己密封材料製でありうる。これは、試薬パックを繰り返し針刺しすることを可能にし、そのため蒸発が妨げられおよび試薬安定性が維持され、試薬パックを長期にわたって複数回の精製に使用することを可能にする。試薬パック２４は、複数の反応用に十分な量の試薬を保持する。たとえば、試薬パック２４は、１回から８回の精製に十分な試薬を保持しうる。別の核酸精製機器では、試薬パック２４は使い捨てでありおよびしたがって高価である。本発明の試薬パック２４は、溶解溶液、任意の結合溶液、一つ以上の洗浄溶液、溶出溶液、および核酸の精製におよび機器のクリーニングおよび維持に必要な補助試薬を含みうる。
【００６６】
本機器のもう一つの消耗部品は、磁気処理チューブ１８である。そのチューブは固相担体を含み、および包装試薬を含みうる。包装試薬とは、輸送中に磁気処理チューブ１８内に固相担体を入れておくことを可能にする試薬である。
【００６７】
さまざまな固相担体が本発明に使用されうる。適当な固相担体は、たとえば、シリカ磁気粒子またはガラス粒子のようなシリカ基礎の担体を含む。一部の実施形態では、固相担体をチューブのような容器に入れるかまたは固定化することができる。一部の実施形態では、固相担体は複数の常磁性粒子である。一部の実施形態では、常磁性粒子は酸化鉄（酸化第二鉄、磁鉄鉱）コア製であり、および二酸化ケイ素で被覆されている。二酸化ケイ素は、末端Ｓｉ−ＯＨ結合で親水性表面を生じる。その粒子は２〜１０μｍのサイズ分布を有しうる。一部の実施形態では、粒子は５．０ないし８．５μｍ、たとえば約６μｍのサイズ分布を有する。粒子は５００オングストロームより大の孔径を有しうる。一部の実施形態では、孔径は６００から７００オングストロームである。一部の実施形態では、粒子は無孔性でありうる。適当な粒子は、たとえば、マグネシル（ＭａｇｎｅＳｉｌ）（登録商標）粒子（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））またはＭＰ−５０磁性基質（ＷＲグレース社（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ））を含む。
【００６８】
磁気粒子用の許容される包装試薬は、ゲル、ポリマー流体、または粘稠性液体を含み、入っている粒子を磁気処理チューブの底に保持し、そのため粒子が輸送および使用中にチューブ内で実質的に流れたりおよび飛散したりしない。一実施形態では（たとえば下記の２００μＬ ＤＮＡ直接溶解全血手順）、磁気粒子懸濁液は、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液６〜９μＬ、緩衝粒子水懸濁液４６μＬ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、およびグリセロール１１μＬを１０ｍＬコニカルチューブの底に加えることによって処理される。チューブはプロテイナーゼＫを変性することなく水を除去するためにオーブン内で乾燥され、結果として磁気粒子、プロテイナーゼＫおよび緩衝剤のグリセロール中の懸濁液を生じる。第二の実施形態では（たとえば下記の５００μＬ ＤＮＡ直接溶解全血、２００μＬ ＤＮＡバフィーコート、および５００μＬ ＤＮＡバフィーコート手順）、磁気粒子懸濁液は、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液１３〜１７μＬ、緩衝粒子水懸濁液１３０μＬ（プロメガ社）、およびグリセロール２８μＬを１０ｍＬコニカルチューブの底に加えることによって処理される。チューブはまた水を除去するためにオーブン内で乾燥され、結果として磁気粒子、プロテイナーゼＫおよび緩衝剤のグリセロール中の懸濁液を生じる。第三の実施形態では（たとえば、下記のＤＮＡ溶解物およびＲＮＡ溶解物手順）、磁気粒子懸濁液は、緩衝粒子水懸濁液１３０μＬ（プロメガ社）、およびグリセロール３３μＬを１０ｍＬコニカルチューブの底に加えることによって処理される。チューブはまた水を除去するためにオーブン内で乾燥され、結果として磁気粒子および緩衝剤のグリセロール中の懸濁液を生じる。
【００６９】
他の磁気粒子包装方法もまた使用されうる。別の実施形態では、粒子は溶液中に、ポリマー中に、または天然フィルム、または乾燥形でありうる。一部の場合には、粒子は水溶液中に存在する。一部の場合には、粒子は凍結乾燥されている。一部の場合には、粒子は成形試薬と混合されおよび乾燥されてフィルムになりまたは球形に成形される。一部の場合には、粒子は酵素と前処理または結合されうる。一部の場合には、粒子溶液は、試料（たとえば生物試料）中に存在するＲＮＡを分解するため、ＲＮアーゼ溶液を含みうる。
【００７０】
試薬
本発明は試薬の５つの分類：溶解溶液、結合および再結合溶液、洗浄溶液および溶出溶液を扱う。
【００７１】
１．溶解溶液
溶解溶液は、核酸を放出するための効率的な溶解（たとえば、生物試料中の細胞の）を可能にし、核酸分解酵素の活性を効果的に阻害し、および一部の実施形態では核酸が最適な固相担体へ定量的に結合することを可能にする。本発明の溶解溶液は、緩衝剤（たとえばトリス（Ｔｒｉｓ）および／またはクエン酸）、アルカリ金属塩（たとえばリチウム塩、たとえば塩化リチウム）、洗浄剤（たとえばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）またはＳＤＳ）、界面活性剤（たとえばＤＧＭＥ）、キレート剤（たとえばＥＤＴＡまたはクエン酸）、および消泡剤（たとえばダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンド）を含む。本発明の溶解溶液は、グアニジウム塩または尿素といったカオトロピック塩の添加を必要としない点で独自である。グアニジウム塩および尿素は、水の構造を破壊する傾向がありおよび溶液中の化合物の疎水性相互作用の安定性を低下させる傾向がある、強カオトロピック化合物である。グアニジウム塩および尿素は、吸熱反応で水に溶解する。グアニジニウム塩および尿素は両方とも、相対カオトロピック強度に従って陽イオンおよび陰イオンを順位づける広く用いられている系であるホフマイスター系列によって定義される通り、強いカオトロピック塩と考えられている（Ｆ．ホフマイスター（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ），塩の作用の理解に関して（Ｏｎ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｔｓ ），Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋｏｌ．（Ｌｅｉｐｚｉｇ） ２４ （１８８８） ２４７−２６０）。本発明は、たとえば、塩化リチウムおよび臭化リチウムを含む、リチウム塩の使用を含む。リチウムイオンは、その高い表面電荷密度および強い水和特性のため、非常にコスモトロピックと考えられている。リチウムイオンは、小さい直径、およびしたがって高い電荷密度を有する点で独特である。より大きな表面電荷密度は、水分子とのリチウムイオンの甚だしい相互作用の原因である。リチウムイオンのようなコスモトロープは、自身の周囲の水分子を組織化し、および、溶液中で水分子によって安定化される核酸のような極性分子の溶液安定性を破壊する傾向がある。水中でのリチウム塩の溶解反応は高度に発熱反応であり、および強いコスモトロピックなリチウムイオンによって水と示される甚だしいイオン−双極子相互作用を示す。塩化リチウムおよび臭化リチウムのようなリチウム塩は、リチウムイオンのイオン−双極子相互作用、および水への溶解に際してこれらの塩について結果として生じる溶液の発熱反応熱のために、水溶液に非常に溶けやすい。
【００７２】
溶解溶液の第一の成分は、溶液のｐＨを維持する緩衝剤である（たとえば、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤または任意の公知の緩衝剤）。たとえば、緩衝剤のｐＨは、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、または少なくとも約１１、１１．５または１２（たとえば、６．８、６．９、７．０、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．８、８．０、８．１、８．４、８．６、８．７、８．９、９．１、９．５、９．８、１０．１、１０．３、１０．５、１０．７、１０．９、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．８、１２、１２．１、１２．３または１２．５）でありうる。溶解溶液の最適ｐＨは、操作者がＤＮＡ直接溶解手順を実施しているか、またはＤＮＡまたはＲＮＡ溶解物手順を実施しているかに応じて異なる。ＤＮＡ直接溶解手順では、ｐＨは約１０より大のｐＨで緩衝され、一方、溶解物手順では、ｐＨはｐＨ約７で緩衝される。トリス（Ｔｒｉｓ）は濃度５０〜１５０ｍＭ（たとえば、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、または１４０ｍＭ）で使用されうる。一部の実施形態では、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤が適当な緩衝剤である。一部の実施形態では、たとえばＤＮＡ直接溶解手順用に、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤はｐＨ１１および濃度５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）塩基で処方される。別の実施形態、たとえば、ＤＮＡおよびＲＮＡ溶解物手順では、ｐＨ７および総酸および塩基濃度１００ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤が使用される。
【００７３】
溶解溶液のもう一つの成分は、核酸に独特の結合特性を与える（たとえば、ＲＮＡまたはＤＮＡ錯体化塩）、アルカリ金属塩、または「錯体化塩」（たとえばリチウム塩、たとえば塩化リチウム）である。核酸はリン酸基と結合するリチウムイオンによって電荷が中和され、それによって溶液中での安定性が低下し、そのため核酸がシリカ被覆された磁気粒子へ優先的に結合する。アルカリ金属塩はまた、核酸の周囲の溶液中の水分子の組織化に対してその塩が有するコスモトロピック作用のため、核酸の可溶化を補助する。一部の実施形態では、そのような錯体化塩は、リチウム塩、たとえば塩化リチウムまたは臭化リチウムでありうる。その塩は２〜１０Ｍの間（たとえば、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍまたは１０Ｍ）の濃度で存在しうる。一部の実施形態では、塩化リチウムは溶解溶液に濃度２Ｍで使用される（ＤＮＡ直接溶解手順）。一部の実施形態では、塩化リチウムは溶解溶液に濃度８Ｍで使用される（ＤＮＡおよびＲＮＡ溶解物手順）。
【００７４】
溶解溶液はさらに洗浄剤を含む。任意の洗浄剤（陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、および双性イオン性洗浄剤）が使用されうるが、核酸単離は、非イオン性洗浄剤（ＤＮＡおよびＲＮＡ溶解物手順）または陰イオン性洗浄剤（ＤＮＡ直接溶解手順）の使用によって最適に達成される。任意の非イオン性洗浄剤が使用されうるが、非イオン性洗浄剤の例は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類（ツイーン−２０、ツイーン−４０、ツイーン−６０、など）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類（Ｘ−１００、Ｘ−１１４、など）、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）またはイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）（ＮＰ−４０など）からのものである。非イオン性洗浄剤は濃度０．０５〜５％で使用されうる（たとえば、約０．１％、０．３％、０．５％、１％で）。任意の陰イオン性洗浄剤が使用されうるが、および陰イオン性洗浄剤の例はＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）である。陰イオン性洗浄剤は濃度０．０５〜２％で使用されうる（たとえば、約０．１％、０．３％、０．５％、１％で）。
【００７５】
溶解溶液はさらに、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）のような界面活性剤を含む。界面活性剤は濃度５〜４０％で使用されうる（たとえば、１０％、１５％、２０％、３０％または４０％）。本発明の方法を用いた実験を通じて、すべての成分が溶解溶液に可溶化するのを助けることに加えて、ＤＧＭＥのような界面活性剤はより極性の低い環境を作ることによって溶解溶液の溶媒特性を変化させ、そのため、シリカ被覆された磁気粒子への核酸の結合がエネルギー的に有利となることが観察された。
【００７６】
溶解溶液はさらに、溶解手順中に放出される外来性金属イオンを結合するためのキレート剤を含む。金属イオンは一定の条件下で核酸の分解を触媒しうる。キレート剤は濃度５〜２０ｍＭ（たとえば、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭまたは２０ｍＭ）で存在しうる。一部の実施形態ではキレート剤はＥＤＴＡであり（ＤＮＡおよびＲＮＡ溶解物手順）、および別の実施形態ではキレート剤はクエン酸である（ＤＮＡ直接溶解手順）。
【００７７】
溶解溶液はさらに、ポリジメチルシロキサン液およびシリカの混合物のような消泡剤を含む（たとえば、ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンド）。
【００７８】
本発明の溶解溶液は有利である。高濃度のコスモトロピック錯体化塩および洗浄剤の、中性ないし高ｐＨ緩衝液中での独自の組み合わせは、核酸に対して有害な酵素（たとえばＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ）を、フェノール、クロロホルム、およびグアニジウム塩といった試薬の使用無しに不活性化する。ＲＮアーゼ酵素をさらに不活性化するため、トリス（Ｔｒｉｓ）（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）のような還元剤もまたＲＮＡ溶解物手順において溶解溶液に添加される。好ましい還元剤は、濃度約５〜５０ｍＭのＴＣＥＰである。さらに、溶解溶液は、高濃度のコスモトロピック塩および溶媒極性修飾剤ＤＧＭＥの使用によって、シリカ被覆磁気粒子に高い核酸結合特性を与える。消泡剤のダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドは、洗浄剤が溶解溶液中で作用するのを可能にし、一方、機器において溶解物がピペッティングされる間に生じる泡を最小化する。
【００７９】
一実施形態では、血球のＤＮＡ直接溶解用の溶解溶液は、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ１０〜１１）、２Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％ＳＤＳ、３０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭクエン酸および０．０５％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドを含むように処方される。
【００８０】
第二の実施形態では、培養細胞、白血球ペレット、組織などのためのＤＮＡ溶解物手順用の溶解溶液は、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７）、８Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ、１０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０１％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドを含むように処方される。
【００８１】
第三の実施形態では、培養細胞、白血球ペレット、組織などのためのＲＮＡ溶解物手順用の溶解溶液は、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７）、８Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ、１０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＴＣＥＰおよび０．０１％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドを含むように処方される。
【００８２】
酵素溶液
ＤＮＡ直接溶解手順では、磁気処理チューブ１８はプロテイナーゼＫを含む。適当なプロテイナーゼＫ溶液は、約１０〜２５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含む（たとえば、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、または２５ｍｇ／ｍＬ）。一実施形態では、適当なプロテイナーゼＫ溶液は２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含む。
【００８３】
ＤＮＡ溶解物手順では、溶解物を機器に負荷する前に、ＤＮＡ精製からＲＮＡ混入物を除去するために、ＲＮアーゼＡ酵素が添加されおよび溶解物とインキュベートされる。適当なＲＮアーゼＡ溶液は、ＲＮアーゼＡ約２〜２０ｍｇ／ｍＬ（たとえば、２ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、または２０ｍｇ／ｍＬ）を含む。一実施形態では、適当なＲＮアーゼＡ溶液は４ｍｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡを含む。
【００８４】
ＲＮＡ溶解物手順では、ＲＮＡ精製からＤＮＡ混入物を除去するために、ＤＮアーゼＩ酵素がシリカ被覆磁気粒子へ第一の洗浄段階後に添加される。適当なＤＮアーゼＩ酵素溶液は、５０〜２００単位（たとえば、５０単位、１００単位、１５０単位または２００単位）の酵素活性を２００μＬに、ＤＮアーゼ緩衝液中に含む。一実施形態では、適当なＤＮアーゼＩ溶液は、酵素活性１００単位をＤＮアーゼ緩衝液２００μＬに含む。
【００８５】
結合溶液
結合溶液は溶解物中に存在するコスモトロピック塩、好ましくはリチウム塩の量を顕著に増大させ、そのためＤＮＡがシリカ被覆磁気粒子へ完全に結合するので、ＤＮＡを試料からＤＮＡ直接溶解法を用いて精製する際に、結合溶液が用いられる。磁気処理チューブ中で溶解溶液およびプロテイナーゼＫ中で血球が溶解された後、ＤＮＡ結合を引き起こすために、溶解物中の塩濃度を高める結合溶液が添加される。本発明は、下記の成分を有するＤＮＡ直接溶解結合溶液を扱う；緩衝剤、コスモトロピック塩、および界面活性剤。
【００８６】
結合溶液の第一の成分は、溶液のｐＨを維持する緩衝剤である。たとえば、ｐＨは少なくとも約７〜１０（たとえば、７、８、９、１０）でありうる。緩衝剤は濃度５０〜１５０ｍＭ（たとえば、５０ｍＭ、１００ｍＭ、または１５０ｍＭ）で使用されうる。一部の実施形態では、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤が適当な緩衝剤である。たとえば、一部の実施形態ではトリス（Ｔｒｉｓ）は濃度５０ｍＭで使用されうる。
【００８７】
結合溶液のもう一つの成分は、核酸に独特の結合特性を与える（たとえば、ＲＮＡまたはＤＮＡ錯体化塩）錯体化塩であり、そのため、核酸がリン酸基に結合するリチウムイオンによって電荷中和されおよびしたがって溶液中での溶解度が低下するからだけでなく、また一部は核酸周囲の水分子の組織化に対してその塩が有するコスモトロピック作用により、核酸がシリカ被覆された磁気粒子へ優先的に結合する。一部の実施形態では、そのような錯体化塩は、リチウム塩、たとえば塩化リチウムまたは臭化リチウムでありうる。その塩は、錯体化塩の高濃度によって固相担体へのＤＮＡの優先的結合が促進されるため、５〜１５Ｍの間（５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、１０Ｍ、１１Ｍ、１２Ｍ、１３Ｍ、１４Ｍまたは１５Ｍ）の濃度で存在しうる。たとえば、一部の実施形態では塩化リチウムは濃度１０Ｍで使用されうる。
【００８８】
結合溶液のもう一つの成分は界面活性剤である。一部の場合には、ＤＧＭＥが用いられる。濃度は５〜１５％（たとえば、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％）でありうる。たとえば、一部の実施形態ではＤＧＭＥは濃度１０％で使用されうる。
【００８９】
結合溶液は、ＤＮＡ溶解物法またはＲＮＡ溶解物法を用いてＤＮＡまたはＲＮＡを精製する際に、任意に用いられうる。結合溶液は、少なくとも５Ｍのリチウム塩、濃度少なくとも５％の界面活性剤、緩衝剤、および任意にエタノールまたはイソプロパノールのようなアルコールから構成されるかまたは結合溶液はエタノールまたはイソプロパノールのようなアルコールでありうるようにＤＮＡ直接溶解法と組成が似ている可能性がある。
【００９０】
再結合溶液は、ＲＮＡ溶解物手順においてＤＮアーゼ処理後に用いられる。最適ＤＮアーゼ活性は、核酸を固相担体から解離させることができる条件の使用を必要とする。再結合溶液はしたがって、粒子を含むＤＮアーゼ溶液に添加され、混合されたＤＮアーゼおよび再結合溶液の除去前に、ＲＮＡ粒子がシリカ被覆磁気粒子へ「再結合」することを確実にする。再結合溶液は、高濃度の塩、たとえば塩化リチウムの、濃度約５〜１５Ｍで、またはアルコールを含む溶液、またはアルコールの組み合わせでありうる。一実施形態では再結合溶液はイソプロピルアルコールである。
【００９１】
洗浄溶液
本発明はまた、タンパク質、リン脂質、ヘムなどといった非核酸混入物を除去するため、核酸が結合しているシリカ被覆磁気粒子を洗浄するのに用いられる、一つ以上の洗浄溶液を教示する。洗浄溶液は、アルコールを、５０％を越える濃度（たとえば、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）で含みうる。アルコールは、たとえば、エタノール、メタノールまたはイソプロピルアルコールでありうる。一部の実施形態では、エタノールが濃度約５５％または７０％で用いられる。別の実施形態では、イソプロピルアルコールが濃度約１００％で用いられる。別の実施形態では、メタノールが濃度約２０％で用いられる。
【００９２】
洗浄Ｉ溶液は、溶解物または溶解物／結合溶液が粒子からピペットで除かれた後に、血液成分、細胞膜成分、ヘモグロビン、ヘムなどといった混入物を実質的に洗い去るために、すべての手順で第一の洗浄溶液として用いられる。洗浄Ｉ溶液は、高いリチウム塩濃度、たとえば塩化リチウムの濃度４〜１０Ｍの間（たとえば、５〜６Ｍ、４〜７Ｍ、５〜８Ｍ、６〜９Ｍ、６〜１０Ｍ、７〜１０Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ、または１０Ｍ）を含む。本発明の目的のためには、高い塩濃度とは、ＲＮアーゼ酵素活性を阻害しおよび核酸を磁気粒子に結合したまま留まらせるために十分高い塩濃度を意味する。洗浄Ｉ溶液はさらに、アルコール（たとえばエタノール、メタノールまたはイソプロピルアルコール）を含む。アルコール濃度は１５〜８０％である（たとえば、１５〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、３５〜４５％、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、１５％、１８％、２０％、３０％、４０％、５５％、６０％、７０％、または７５％）。一部の実施形態では、洗浄Ｉ溶液はエタノールを濃度５５％で含む。一実施形態では、洗浄Ｉ溶液は５Ｍ ＬｉＣｌおよび５５％エタノールを含む。
【００９３】
洗浄ＩＩ溶液は、ＤＮＡ直接溶解手順のみにおいて、脂質といった極性のより低い化合物をシリカ被覆磁気粒子から洗い去るために用いられる。直接溶解法における細胞材料の多量のため、洗浄Ｉ段階が完了した後に粒子に混入する相当量の脂質様物質が存在する。洗浄ＩＩ溶液はアルコールを含む。一部の実施形態では、洗浄ＩＩ溶液は１００％イソプロピルアルコールである。
【００９４】
洗浄ＩＩＩ溶液は、すべての手順で「脱塩洗浄」として用いられ、およびＲＮＡ手順ではＤＮアーゼ段階の前に、またはすべての手順で溶出段階の前に、残留する生物材料をさらに除去する。洗浄ＩＩＩ溶液は、緩衝剤、アルコール、およびキレート剤（たとえばＥＤＴＡ、ＣＤＴＡ、またはクエン酸）を含む。一部の実施形態では、緩衝剤組成は約ｐＨ６〜９（たとえば、ｐＨ６．５、７、７．５、８．０または８．５）のトリス（Ｔｒｉｓ）でありうる。緩衝剤は濃度５０〜１５０ｍＭ（たとえば、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、または１４０ｍＭ）でありうる。洗浄ＩＩＩ溶液はさらに、アルコールを５０〜９０％（たとえば、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、５５％、６０％、６０％、７５％、８０％、または８５％）で含む。一部の実施形態ではキレート剤濃度は１〜２０ｍＭである。一実施形態では、洗浄ＩＩＩ溶液は、７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ６〜８）および５ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
【００９５】
洗浄ＩＶ溶液は、ＲＮＡ溶解物手順において、ＤＮアーゼ段階が実施された後に残っている可能性のある、最後のＲＮアーゼ酵素活性があれば除去するために用いられる。それは、高いリチウム塩濃度、好ましくは４ないし１０Ｍの塩化リチウムを含むＲＮアーゼ変性洗浄である。本発明の目的のためには、高い塩濃度とは、ＲＮアーゼ酵素活性を阻害しおよび核酸を磁気粒子に結合したまま留まらせるために十分高い塩濃度を意味する。洗浄ＩＶ溶液はさらに、アルコール（たとえば、エタノール、メタノールまたはイソプロピルアルコール）を含む。アルコール濃度は５〜３０％である。一部の実施形態では、洗浄ＩＶ溶液はメタノールを濃度１８％で含む。一実施形態では、洗浄ＩＶ溶液は６Ｍ ＬｉＣｌおよび１８％メタノール．を含む。
【００９６】
溶出溶液
単離手順の結果として固相担体に結合している実質的に未分解の核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、溶出溶液（水和溶液ともいう）を用いて溶出されうる。本発明によって教示される、生物材料の溶解および核酸の固相担体への結合に、および固相担体の洗浄に用いられる試薬の単純さは、単純な溶出溶液に結びつく。さまざまな溶出溶液が当業者に公知である。一部の実施形態では、ベルサジーン（Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ）（商標）ＤＮＡ溶出溶液（ジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ））が、結合した実質的に未分解のＤＮＡを溶出するために使用されうる。一部の場合には、トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ（ＴＥ）が、結合した実質的に未分解のＤＮＡを溶出するために使用されうる。
【００９７】
固相担体に結合している、実質的に未分解のＲＮＡは、ＲＮＡ溶出溶液を用いて溶出されうる。一部の場合には、ベルサジーン（Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ）（商標）ＲＮＡ溶出溶液（ジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ））が、結合した実質的に未分解のＲＮＡを溶出するために使用されうる。一部の実施形態では、ＲＮアーゼフリー水が、結合した実質的に未分解のＲＮＡを溶出するために使用されうる。別の実施形態では、水が、ＲＮアーゼを不活性化する物質、たとえば二炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）で処理されおよびＲＮＡを溶出するのに使用されうる。当業者に公知である、他のＲＮＡ溶出溶液もまた使用されうる。
【００９８】
精製／単離方法
本発明はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡを材料（たとえば、生物材料）から精製するための方法を提供する。
【００９９】
一部の場合には、溶解溶液は、溶解物を固相担体（たとえば、磁気処理チューブ１８に入った磁気粒子）へ加える前に、材料（たとえば、生物材料）を溶解しおよび溶解物中へ核酸を放出するのに用いられる。さらに、溶解溶液は、ヌクレアーゼといった有害な酵素の悪影響を防ぐ。一部の場合には、溶解溶液は材料および固相担体（たとえば、磁気処理チューブ１８に入った磁気粒子）と混合される。試料中に存在する混入ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質を分解するために、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、またはプロテイナーゼＫといった酵素を、溶解後に加えることができ、または代替的に、酵素をチューブへ固相担体と共に直接加えるかまたは溶解溶液へ加えることができる。
【０１００】
ＤＮＡ精製の一部の実施形態では、溶解後、固相担体への核酸の結合は、結合溶液を用いることによって改善されうる。
【０１０１】
ＤＮＡ直接溶解手順では、試料は機器上で溶解され、および結合溶液が溶解物に添加される。試料（たとえば、血液、バフィーコートなど）の溶解およびＤＮＡの結合後、残存する生物材料（タンパク質、リン脂質など）があれば、磁場を磁気粒子に加えて、粒子に結合したＤＮＡを残りの溶解物から引き離すことによって除去される。溶解物は粒子から吸引除去され、および廃棄物チューブに入れられる。洗浄Ｉ溶液が粒子沈澱へ一回以上添加され、およびそのつど粒子はピペッティングによって洗浄液に混合される。粒子は次いで磁石へ引きつけられ、および洗浄Ｉ溶液は粒子から吸引除去される。洗浄ＩＩおよび洗浄ＩＩＩ溶液について同一の手順に従い、そのため、残存する生物混入物があれば、および最後に高濃度塩を含む洗浄溶液に由来する塩が、溶出前に粒子から洗浄される。その後、結合しているＤＮＡは、当業者に公知である溶出溶液の適量を用いて溶出される。粒子は溶出溶液中でピペッティングされて混合され、およびＤＮＡを含む溶出液が回収される。
【０１０２】
ＤＮＡ溶解物手順では、試料は機器への負荷前に溶解され、およびＲＮアーゼ酵素で処理される。試料（たとえば、培養細胞、白血球、組織）の溶解後、溶解物は機器へ負荷され、結合溶液が任意に溶解物へ添加され、およびＤＮＡが粒子へ結合される。残存する生物材料（タンパク質、リン脂質など）があれば、磁場を磁気粒子に加えて、粒子に結合したＤＮＡを残りの溶解物から引き離すことによって除去される。溶解物は粒子から吸引除去され、および廃棄物チューブに入れられる。洗浄Ｉ溶液が粒子沈澱へ一回以上添加され、およびそのつど粒子はピペッティングによって洗浄液に混合される。粒子は次いで磁石へ引きつけられ、および洗浄Ｉ溶液は粒子から吸引除去される。洗浄ＩＩＩ溶液について同一の手順に従い、そのため、残存する生物混入物があれば、および高濃度塩を含む洗浄Ｉ溶液に由来する塩が、溶出前に粒子から洗浄される。その後、結合しているＤＮＡは、当業者に公知である溶出溶液の適量を用いて溶出される。粒子は溶出溶液中でピペッティングされて混合され、およびＤＮＡを含む溶出液が回収される。
【０１０３】
ＲＮＡ溶解物手順では、試料は機器への負荷前に溶解され、および試料（たとえば、培養細胞、白血球、組織）の溶解後、溶解物は機器へ負荷され、結合溶液が任意に溶解物へ添加され、および核酸（総核酸）が粒子へ結合される。残存する生物材料（タンパク質、リン脂質など）があれば、磁場を磁気粒子に加えて、粒子に結合した核酸を残りの溶解物から引き離すことによって除去される。溶解物は粒子から吸引除去され、および廃棄物チューブに入れられる。洗浄Ｉ溶液が粒子沈澱へ一回以上添加され、およびそのつど粒子はピペッティングによって洗浄液に混合される。粒子は次いで磁石へ引きつけられ、および洗浄Ｉ溶液は粒子から吸引除去される。洗浄ＩＩＩ溶液について同一の手順に従い、そのため、残存する生物混入物があれば、および高濃度塩を含む洗浄Ｉ溶液に由来する塩が、ＤＮアーゼ段階前に粒子から洗浄される。緩衝ＤＮアーゼ溶液が添加され、および粒子沈澱に混合されおよびインキュベートされ、その後、再結合溶液もまたＤＮアーゼおよび粒子混合物に添加される。粒子は磁石へ引きつけられ、および溶液混合物は粒子から吸引される。その後、洗浄ＩＶおよび洗浄ＩＩＩが一回以上添加され、混合され、および粒子から吸引除去される。洗浄ＩＶは残存するＲＮアーゼ酵素活性があれば粒子から除去し、および洗浄ＩＩＩは生物混入物があれば、および高濃度塩を含む洗浄ＩＶ溶液に由来する塩を除去する。結合しているＲＮＡは、当業者に公知である溶出溶液の適量を用いて溶出される。粒子は溶出溶液中でピペッティングされて混合され、およびＲＮＡを含む溶出液が回収される。
【０１０４】
自動機器を用いて核酸を単離する方法。
一部の実施形態では、血液、培養細胞、体液などといった試料は、一次回収チューブから磁気処理チューブ１８へ操作者によって手動で移動される。磁気処理チューブ１８は磁気粒子を含み、および任意にプロテイナーゼＫを含みうる。試料および粒子（および任意に酵素）を含む磁気処理チューブ１８は、処理アセンブリ１０の取付プレートに位置する磁気処理ホルダー１６に、最後方位置（最後列）に置かれる。一つ以上の試料が積載されうる。磁気処理チューブ１８、使い捨てチップ２６、廃棄物チューブ２２、および出力チューブ２０が、処理アセンブリ１０の取付プレート１２の対応する区画へ積載される。目的の手順に適した包装済み試薬パック２４が機器に積載される。目的の手順はユーザーインターフェイス８２を通じて選択される。システムは、ユーザーが選択可能な、複数手順を処理する能力を提供する。各手順は、目的の試料種類および容量について最適化されている処理パラメーターを提供する。
【０１０５】
一実施形態では、全血またはバフィーコートの直接溶解のための試料量は、２００μＬから最大８００μＬ、たとえば、２００μＬまたは５００μＬ、最大８００μＬでありうる。一実施形態では、培養細胞溶解物由来の核酸の単離のための試料量は、細胞１，０００個から最大１０００万個、たとえば細胞１，０００個から最大５００万個、または細胞１００万個ないし２００万個でありうる。別の一実施形態では、全血についてＤＮＡまたはＲＮＡ溶解物手順のための試料量は、５００μＬから３ｍＬでありうる。
【０１０６】
いったん試料（または複数の試料）が一次試料チューブから磁気処理チューブ１８へ移動されれば、操作者は残りの使い捨て品および試薬パック２４を処理アセンブリ１０の取付プレート１２へ取り付ける。操作者は自動機器を起動し、機器が精製処理を開始できるようにして機器が必要な一連の段階を経るようにする。
【０１０７】
一実施形態では、下記の手順が、全血またはバフィーコートの２００μＬまたは５００μＬ試料由来のＤＮＡを、直接溶解手順を用いて処理するのに用いられる。最初に、操作者は、全血またはバフィーコート２００μＬまたは５００μＬを、プロテイナーゼＫおよび磁気粒子を含むグリセロールの入った１０ｍＬ磁気処理チューブ１８へ加える。操作者はすべての使い捨て品（チップ、チューブ）および、「ＤＮＡ全血」または「ＤＮＡバフィーコート」のどちらかの試薬パック２４を、機器の処理アセンブリ１０の取付プレート１２に沿ったホルダーに積載する。使い捨て品の積載順序は、機器の前方から後方へ、図７Ｂに描く通り示され、すなわち：出力チューブ２０、使い捨てチップ２６、磁気処理チューブ１８、廃棄物チューブ２２、および試薬パック２４。
【０１０８】
機器は下記の段階を実施する：使い捨てチップ２６を吸引ピペッターアセンブリ３８に装着する；試料の存在、数、および量を確認する；分注ピペッターアセンブリ４８を用いて、溶解溶液を磁気処理チューブ１８中の試料へ添加する；吸引ピペッターアセンブリ３８を用いて、ピペッティングで上下して混合する；試料を４５℃にて１０分間インキュベートする（インキュベート中、試料は混合される）；吸引ピペッターアセンブリ３８を用いて、廃棄物を廃棄物チューブ２２へ移動する；分注ピペッターアセンブリ４８を用いて、結合溶液を試料へ加え、および吸引ピペッターアセンブリ３８を用いて、ピペッティングで１０回上下して混合する；室温にて１０分間インキュベートする；磁気エレベーターアセンブリ２８が磁石３２を磁気処理チューブ１８に接する位置へ運び、２０秒間インキュベートし、および廃棄物を廃棄物チューブ２２へ吸引ピペッターアセンブリ３８を用いて移動する；分注ピペッターアセンブリ４８を用いて、洗浄Ｉ溶液５００μＬから１ｍＬを試料へ加える；磁気エレベーターアセンブリ２８が磁石３２を磁気処理チューブ１８に接する位置へ運び、２０秒間インキュベートし、および廃棄物を廃棄物チューブ２２へ吸引ピペッターアセンブリ３８を用いて移動する（前の２つの段階は必要に応じて反復されうる）；分注ピペッターアセンブリ４８を用いて、洗浄ＩＩ溶液５００μＬから１ｍＬを試料へ加える；磁気エレベーターアセンブリ２８が磁石３２を磁気処理チューブ１８に接する位置へ運び、２０秒間インキュベートし、および廃棄物を廃棄物チューブ２２へ吸引ピペッターアセンブリ３８を用いて移動する（前の２つの段階は必要に応じて反復されうる）；洗浄ＩＩＩは洗浄Ｉおよび洗浄ＩＩについての記載と同様に扱う；分注ピペッターを用いて、ａｄｄｓ溶出溶液１００μＬを試料へ加え、および吸引ピペッターアセンブリ３８を用いて、ピペッティングで複数回上下して混合する；室温にて５分間インキュベートする；および磁気エレベーターアセンブリ２８が磁石３２を磁気処理チューブ１８に接する位置へ運び、１分間インキュベートし、およびＤＮＡを出力チューブ２０へ吸引ピペッターアセンブリ３８を用いて移動する（溶出段階は、ＤＮＡ収量を増やすために必要に応じて反復されうる）。
【０１０９】
製品
本発明で扱われる試薬、方法およびキットは、相対的に少ない混入不純物を含む実質的に純粋なおよび未分解の核酸を提供し、そのため核酸は当業者に公知である下流工程に使用されうる。本発明は、特に、特定の手順を含むキットを提供し、それはここに記載の試薬および固相担体と共に、本発明の方法にしたがってＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を試料から精製するために使用されうる。本発明はさらに、費用効率の高い機器および費用効率の高い多目的試薬パック２４を提供することによって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を費用効率が高い方法で精製するための自動機器を含む。実質的に純粋な、未分解の核酸は、核酸定量、制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定、サザンブロッティングなどといったハイブリダイゼーション法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己維持的配列複製（ＳＳＲまたは３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅（ＴＭＡ）といった増幅法、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、または他のＤＮＡ分析、およびＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ分析および他のＲＮＡ分析を含むがそれらに限定されない後続の分析での使用に適した核酸である。
【０１１０】
本発明はここに含まれる詳細な実施例によってさらに説明される。これらの実施例はさまざまな具体的なおよび例証となる実施形態および方法をさらに説明するために提供される。しかし、本発明の範囲に留まりながら多数の変形および改変がなされうることが理解されるべきである。
【実施例】
【０１１１】
実施例１−磁気処理チューブの調製
２００μＬ ＤＮＡ直接溶解全血手順処理チューブのためのチューブ製造工程は、１０ｍＬコニカルチューブの底に分注されたプロテイナーゼＫ溶液７μＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）、次いでプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）マグネシル（Ｍａｇｎｅｓｉｌ）（登録商標）常磁性粒子溶液４６μＬおよびグリセロール（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））１１μＬから成った。チューブは真空乾燥機で２８℃にて３時間から５時間乾燥され、約１００％グリセロールおよびプロテイナーゼＫ中に懸濁された粒子４．６ｍｇの入った磁気処理チューブを生じた。
【０１１２】
２００μＬおよび５００μＬ ＤＮＡ直接溶解バフィー手順、および５００μＬＤＮＡ直接溶解全血手順処理チューブのためのチューブ製造工程は、１０ｍＬコニカルチューブの底に分注されたプロテイナーゼＫ溶液１５μＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）、次いでプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）マグネシル（Ｍａｇｎｅｓｉｌ）（登録商標）常磁性粒子溶液１３０μＬおよびグリセロール（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））２８μＬから成った。チューブは真空乾燥機で３０℃にて８時間から１６時間乾燥され、約１００％グリセロールおよびプロテイナーゼＫ中に懸濁された粒子１３ｍｇの入った磁気処理チューブを生じた。
【０１１３】
ＲＮＡ溶解物およびＤＮＡ溶解物手順のためのチューブ製造工程は、１０ｍＬコニカルチューブの底に分注されたプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）マグネシル（Ｍａｇｎｅｓｉｌ）（登録商標）常磁性粒子溶液１３０μＬおよびグリセロール（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））３３μＬから成った。チューブは真空乾燥機で３０℃にて８時間から１６時間乾燥され、約１００％グリセロール中に懸濁された粒子１３ｍｇの入った磁気処理チューブを生じた。
【０１１４】
実施例２−ＲＮＡ溶解物手順を用いた培養細胞、白血球または組織からのＲＮＡの単離および精製
この実施例では、真核Ｋ５６２細胞１００万個および５００万個の沈澱に由来するＲＮＡが、ＲＮＡ溶解物手順を用いて精製された。白血球または組織もまた、この手順を用いて精製されうる。ホモジナイズ後に結合溶液が溶解物へ添加された際に、これらの細胞数について、収量改善が観察されるかどうかを決定するために、結合溶液の使用が試験された。これは自動化された機器手順であるが、しかしこれらの段階のうち一つ以上が手動でも実行されうる。
【０１１５】
溶解物生成。真核Ｋ５６２細胞１００万個および５００万個を含む細胞沈澱が、溶解溶液４００μＬ（８Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンド、２０ｍＭ ＴＣＥＰを含む１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．０）中で溶解された。試料を溶解および均一化するため、細胞を１分間ボルテックスした。
【０１１６】
粒子へのＲＮＡ結合。各溶解物を、粒子の入った磁気処理チューブへ移動し、および機器に負荷した。試料は３０回ピペッティングすることによって粒子に混合された。ＲＮＡ収量を改善するための結合溶液の使用の効果を試験するため、チューブの半分に結合溶液が粒子および溶解物混合物へ添加され（細胞１００万個について、１００％エタノール６００μＬ；細胞５００万個について、５５％エタノール２００μＬ、５Ｍ ＬｉＣｌ）および３０回ピペッティングすることによって混合物に混合され、一方、残りの試料には結合溶液は添加されなかった。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１１７】
一回目洗浄。洗浄Ｉ溶液８００μＬ（５５％エタノール、５Ｍ ＬｉＣｌ）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１１８】
二回目洗浄。洗浄ＩＩＩ溶液５００μＬ（７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１１９】
ＤＮアーゼ処理。ＤＮアーゼ溶液２００μＬ（１００単位／２００μＬを含むＤＮアーゼ緩衝液：６ｍＭ ＣａＣｌ2、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ））が粒子に添加され、および２０回ピペッティングすることによって混合され、および室温にて２０分間インキュベートされた。溶液はこのインキュベート時間内に２回混合された。
【０１２０】
粒子へのＲＮＡ再結合。再結合溶液２００μＬ（１００％イソプロパノール）がＤＮアーゼおよび粒子混合物に添加され、および２０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１２１】
三回目洗浄。洗浄ＩＶ溶液８００μＬ（１８％メタノール、６Ｍ ＬｉＣｌ）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄は再び繰り返された。
【０１２２】
最終洗浄。洗浄ＩＩＩ溶液５００μＬ（７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄は再び繰り返された。
【０１２３】
試料溶出。トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液１００μＬ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）が粒子に添加され、および４０回ピペッティングすることによって混合された。試料は５分間インキュベートされた。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。ＲＮＡを含む溶液が吸引されおよび出力チューブへ移動された。溶出段階は再び繰り返され、および２回の溶出量が１つの最終出力チューブに合わされた。
【０１２４】
結果。精製ＲＮＡ試料は、アガロースゲル電気泳動によって、安定なおよび未変化のリボソームＲＮＡバンドについて分析された（図８Ａ）。５００万沈澱試料各１５μＬが１．４％アガロースゲルに負荷され、および８０Ｖにて４５分間電気泳動された。結果は、綺麗な（すなわち、未変化のおよびＤＮＡを実質的に含まない）および安定なＲＮＡが培養細胞から得られたことを示した。グラフ１は、２６０ｎｍでのＵＶ吸収測定によって決定された細胞１００万個当たりｍｇＲＮＡでの、Ｋ５６２細胞１００万個および５００万個沈澱からの収量データを含む。
【０１２５】
グラフ１のデータは、溶解物吸引および後続の洗浄段階の前に、溶解物へ結合溶液を添加することによって、より高いＲＮＡ収量が得られることを示す。培養細胞５００万個についてのゲルは、結合溶液有りおよび無しで、リボソームバンド強度に差を示す。この実験研究は、本発明の方法および溶液が、ＲＮＡを精製するための迅速なおよび効果的な方法を提供することを示した。
【０１２６】
実施例３：ＲＮＡ溶解物手順を用いた培養細胞または組織からのＲＮＡの単離および精製
この実施例は、培養細胞または組織からのＲＮＡの精製のための手順を含む。一部の細胞株または組織は、ＲＮアーゼ酵素活性をより徹底的に除去するために、溶解溶液中に還元剤としてＴＣＥＰを必要とする可能性がある。
【０１２７】
これは自動化された機器手順であるが、しかしこれらの段階のうち一つ以上が手動でも実行されうる。
【０１２８】
粒子へのＲＮＡ結合。試料中の細胞は、溶解溶液８００μＬ（８ＭＬｉＣｌ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、を含む１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．０）を用いて溶解された。溶解物は粒子（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）マグネシル（Ｍａｇｎｅｓｉｌ）（登録商標）常磁性粒子１００μＬ）の入った磁気処理チューブへ移動され、および機器へ負荷された。溶解物および粒子は２０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１２９】
一回目洗浄。洗浄Ｉ溶液８００μＬ（５５％エタノール、５Ｍ ＬｉＣｌ）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１３０】
二回目洗浄。洗浄ＩＩＩ溶液５００μＬ（７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１３１】
ＤＮアーゼ処理。ＤＮアーゼ溶液２００μＬ（１００単位／２００μＬを含むＤＮアーゼ緩衝液：６ｍＭ ＣａＣｌ2、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ））が粒子に添加され、２０回ピペッティングすることによって混合され、および室温にて１０分間インキュベートされた。溶液はこのインキュベート時間内に２回混合された。
【０１３２】
粒子へのＲＮＡ再結合。再結合溶液２００μＬ（１００％イソプロパノール）がＤＮアーゼおよび粒子混合物に添加され、および２０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１３３】
最終洗浄。洗浄ＩＩＩ溶液８００μＬ（７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄は再び繰り返された。
【０１３４】
試料溶出。トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液１００μＬ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）が粒子に添加され、および４０回ピペッティングすることによって混合された。試料は５分間インキュベートされた。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。ＲＮＡを含む溶液が吸引されおよび出力チューブへ移動された。溶出段階は再び繰り返され、および２回の溶出量が１つの最終出力チューブに合わされた。
【０１３５】
実施例４−ＤＮＡ溶解物手順を用いた培養細胞、白血球または組織からのＤＮＡの単離および精製
この実施例では、真核Ｋ５６２細胞５００万個の沈澱に由来するＤＮＡが、ＤＮＡ溶解物手順を用いて精製された。白血球または組織もまた、この手順を用いて精製されうる。不要なＲＮＡ混入を除去するためのＲＮアーゼＡ酵素の使用がゲル電気泳動によって試験され、およびＲＮアーゼＡ酵素が精製に使用されなかった試料と比較された。この実施例では、結合溶液は溶解物へ添加されなかったが、しかし結合溶液を溶解物へ添加することは、実施例２で観察されたＲＮＡ収量の増加と同様に、ＤＮＡ収量を増加する。これは自動化された機器手順であるが、しかしこれらの段階のうち一つ以上が手動でも実行されうる。
【０１３６】
溶解物生成。
真核Ｋ５６２細胞５００万個を含む細胞沈澱が、溶解溶液６００μＬ（８ＭＬｉＣｌ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ダウコーニング（ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンドを含む１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．０）中で溶解された。試料を溶解および均一化するため、細胞を１分間ボルテックスした。溶解物は４ｍｇ／ｍＬＲＮアーゼＡ溶液２μＬで処理されおよび１０分間インキュベートされた。
【０１３７】
粒子へのＤＮＡ結合。各溶解物を、粒子の入った磁気処理チューブへ移動し、および機器に負荷した。試料は２０回ピペッティングすることによって粒子に混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１３８】
一回目洗浄。洗浄Ｉ溶液８００μＬ（５５％エタノール、５Ｍ ＬｉＣｌ）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄段階は少なくとも１回繰り返された。
【０１３９】
二回目洗浄。洗浄ＩＩＩ溶液８００μＬ（７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄段階は少なくとも１回繰り返された。
【０１４０】
試料溶出。トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液２００μＬ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）が粒子に添加され、および４０回ピペッティングすることによって混合された。試料は５分間インキュベートされた。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。ＤＮＡを含む溶液が吸引されおよび出力チューブへ移動された。溶出段階は再び繰り返され、および２回の溶出量が１つの最終出力チューブに合わされた。
【０１４１】
結果。精製試料は、ゲノムＤＮＡについて、およびＲＮアーゼＡで処理された試料および未処理の試料におけるＲＮＡ混入について調べるために、アガロースゲル電気泳動によって分析された（図９Ａ）。各試料２０μＬが１．４％アガロースゲルに負荷され、および１００Ｖにて６０分間電気泳動された。
【０１４２】
図９Ｂおよびゲル電気泳動結果（図９Ａ）の両方が、未処理ＲＮアーゼＡ群が最終収量計算でＲＮＡ由来のＵＶ吸収寄与を有するにもかかわらず、粒子への結合前に、溶解物からＲＮＡ混入を除去するためにＲＮアーゼＡを溶解物へ加えることによってゲノムＤＮＡのより高い収量が得られることを示す。ＤＮＡ結合の前に溶解物からＲＮＡが除去されない場合、そうでなければ利用可能であるＤＮＡ結合部位について、ＲＮＡがＤＮＡと競合するのは明らかである。この実験研究は、本発明の方法および溶液が、ＤＮＡを精製するための迅速なおよび効果的な方法を提供することを示した。
【０１４３】
実施例５−ＤＮＡ溶解物手順を用いた培養細胞からのＤＮＡの単離および精製
この実施例では、培養細胞または組織がＤＮＡ溶解物手順を用いて精製されうる。これは自動化された機器手順であるが、しかしこれらの段階のうち一つ以上が手動でも実行されうる。
【０１４４】
溶解物生成。細胞が溶解溶液８００μＬ（８Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．０）中で溶解された。試料は１分間均一化された。溶解物は４ｍｇ／ｍＬＲＮアーゼＡ溶液２μＬで処理されおよび１０分間インキュベートされた。
【０１４５】
粒子へのＤＮＡ結合。各溶解物を、粒子９０μＬ（シリカ被覆された酸化第一鉄粒子）の入った磁気処理チューブへ移動し、および機器に負荷した。試料は２０回ピペッティングすることによって粒子に混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１４６】
洗浄。洗浄ＩＩＩ溶液８００μＬ（（７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１４７】
試料溶出。トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液２００μＬ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）が粒子に添加され、および４０回ピペッティングすることによって混合された。試料は５分間インキュベートされた。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。ＤＮＡを含む溶液が吸引されおよび出力チューブへ移動された。溶出段階は再び繰り返され、および２回の溶出量が１つの最終出力チューブに合わされた。
【０１４８】
実施例６−直接溶解手順を用いた全血からのＤＮＡの単離および精製
この実施例では、全血２００μＬ由来のＤＮＡが本機器で直接溶解手順を用いて精製された。全血５００μＬ由来のＤＮＡを同様の手順を用いて、溶解および結合溶液量の増加および追加洗浄段階を用いて得ることができる。これは自動化された機器手順であるが、しかしこれらの段階のうち一つ以上が手動でも実行されうる。
【０１４９】
試料溶解および結合段階。血液試料２００μＬが、粒子およびプロテイナーゼＫを含むグリセロール入りの磁気処理チューブへピペットで入れられ、および機器に負荷された。溶解溶液６００μＬ（５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ１０〜１１、２Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％ＳＤＳ、３０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭクエン酸、０．０５％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンド）が粒子へ添加され、および試料は２０回ピペッティングすることによって混合された。試料は４５℃にて１０分間、インキュベート中に定期的に混合しながらインキュベートされた。溶解された全血試料は第二の処理チューブへ移され、および結合溶液１２００μＬ（５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、１０Ｍ ＬｉＣｌ、１０％ＤＧＭＥ）が溶解物へ添加され、および２０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１５０】
一回目洗浄。洗浄Ｉ溶液５００μＬ（５５％エタノール、５Ｍ ＬｉＣｌ）が粒子に添加され、および１５回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄は再び繰り返された。
【０１５１】
二回目洗浄。洗浄ＩＩ溶液８００μＬ（１００％イソプロパノール）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１５２】
三回目洗浄。洗浄ＩＩＩ溶液５００μＬ（７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄は再び繰り返された。
【０１５３】
溶出予洗（エタノール除去段階）。トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液２００μＬ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）が、磁石がチューブに隣接している間に粒子沈澱上を洗い流し、および速やかに吸引され、および廃棄物チューブへ移動された。
【０１５４】
試料溶出。トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液１００μＬ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）が粒子に添加され、および試料が５分間インキュベートされる間に１５０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。ＤＮＡを含む溶液が吸引されおよび出力チューブへ移動された。溶出段階は再び繰り返され、および２回の溶出量が１つの最終出力チューブに合わされた。
【０１５５】
結果。８つの精製試料の２回の機器運転がそれぞれ、アガロースゲル電気泳動によってゲノムＤＮＡについて分析された（ゲル３）。各試料１５μＬが１％アガロースゲルに負荷され、および１００Ｖにて６０分間電気泳動された。
【０１５６】
グラフ３のデータは、各回８つの試料の２回の機器運転についてＤＮＡ収量をμｇで示す。結果は自動化方法が全血由来の綺麗なおよび安定なＤＮＡの一貫したおよび競争力のある収量を提供したことを示し、本発明の小型機器が、ＤＮＡを精製するための迅速なおよび効果的な方法を提供することを示す。
【０１５７】
実施例７−直接溶解手順を用いたバフィーコートからのＤＮＡの単離および精製
この実施例では、白血球が全血から遠心分離によって濃縮され、および直接溶解法によるＤＮＡ精製のために濃縮白血球の層がチューブから取り出された。バフィーコート２００μＬおよび５００μＬのための手順は、溶解および結合溶液量の増加および追加段階を用いる以外は、全血の直接溶解のためのものと同様である。より高いＤＮＡ収量を得るために、白血球数が増えたら、溶解および結合溶液量を増やす必要があった。５００μＬバフィーコート試料の４試料が処理され、ＤＮＡについてどちらの条件の組がより高い収量を与えるかを決定するため、２試料は溶解溶液２０００μＬおよび結合溶液３２００μＬを用い、および２試料は溶解溶液１５００μＬおよび結合溶液３０００μＬを用いた。これは自動化された機器手順であるが、しかしこれらの段階のうち一つ以上が手動でも実行されうる。
【０１５８】
試料溶解および結合段階。バフィーコート５００μＬ試料が、磁気粒子およびプロテイナーゼＫを含むグリセロール入りの磁気処理チューブへピペットで入れられ、および機器に負荷された。溶解溶液２０００μＬまたは１５００μＬ（５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ１０〜１１、２Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％ＳＤＳ、３０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭクエン酸、０．０５％ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標） アンチフォームＡ（Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ）コンパウンド）が粒子へ添加され、および２０回ピペッティングすることによって混合された。試料は４５℃にて１０分間、インキュベート中に定期的に混合しながらインキュベートされた。溶解された全血試料は第二の処理チューブへ移され、および結合溶液３２００μＬまたは３０００μＬ（５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、１０Ｍ ＬｉＣｌ、１０％ＤＧＭＥ）が溶解物へ添加され、および３０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１５９】
一回目洗浄。洗浄Ｉ溶液１０００μＬ（５５％エタノール、５Ｍ ＬｉＣｌ）が粒子に添加され、および１５回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄は洗浄Ｉ溶液５００μＬを用いて再び繰り返された。
【０１６０】
二回目洗浄。洗浄ＩＩ溶液８００μＬ（１００％イソプロパノール）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１６１】
三回目洗浄。洗浄ＩＩＩ溶液１０００μＬ（７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄は洗浄ＩＩＩ溶液５００μＬを用いて再び繰り返された。
【０１６２】
溶出予洗（エタノール除去段階）。トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液２００μＬ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）が、磁石がチューブに隣接している間に粒子沈澱上を洗い流し、および速やかに吸引され、および廃棄物チューブへ移動された。
【０１６３】
試料溶出。トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液４００μＬ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）が粒子に添加され、および試料が５分間インキュベートされる間に１５０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。ＤＮＡを含む溶液が吸引されおよび出力チューブへ移動された。溶出段階は再びトリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液３００μＬを用いて、および三度目にトリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液１００μＬを用いて繰り返された。３回の溶出量が１つの最終出力チューブに合わされた。
【０１６４】
結果。精製ＤＮＡ試料がアガロースゲル電気泳動によって分析された（ゲル４）。各試料１８μＬが１．４％アガロースゲルに負荷され、および１００Ｖにて６０分間電気泳動された。ゲルは、バフィーコート試料の両方の組から、綺麗な未分解のゲノムＤＮＡが精製されたことを示す。
【０１６５】
グラフ４のデータは、溶解溶液および結合溶液の多量および少量を用いたバフィーコート試料についてＤＮＡ収量をμｇで示す。２６０ｎｍでのＵＶ吸収を用いて、各群からのＤＮＡ収量が計算された。結果は、より高い収量が、より多い量の溶解溶液２０００μＬおよび結合溶液３２００μＬを用いて得られることを示す。結果は自動化方法がバフィーコート由来の綺麗なおよび安定なＤＮＡの一貫したおよび競争力のある収量を提供したことを示し、本発明の小型機器が、ＤＮＡを精製するための迅速なおよび効果的な方法を提供することを示す。
【０１６６】
実施例８−直接溶解手順を用いたバフィーコートからのＤＮＡの単離および精製
この実施例では、バフィーコート２００μＬ試料由来のＤＮＡが直接溶解手順を用いて精製され、しかし他の量のバフィーコートもまた同様の手順を用いて精製されうる。これは自動化された機器手順であるが、しかしこれらの段階のうち一つ以上が手動でも実行されうる。この実施例では、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）マグネシル（Ｍａｇｎｅｓｉｌ）（登録商標）常磁性粒子１００μＬが１０ｍＬコニカル磁気処理チューブへ加えられる。代替的に、ミクロモード社（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ）シカスター（Ｓｉｃａｓｔｅｒ）−Ｍ−ＣＴ粒子１５０μＬまたはノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）マグプレップ（ＭａｇＰｒｅｐ）粒子１００μＬが使用されうる。磁石が付けられおよび粒子溶液からの残余の液体が除去された。
【０１６７】
試料溶解および結合段階
プロテイナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）４．５μＬ量が磁気処理チューブへ入れられた。バフィーコート２００μＬ試料が、粒子およびプロテイナーゼＫ混合物へ添加され、および機器に負荷された。溶解溶液７００μＬ（２Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％ＳＤＳ、３０％ＤＧＭＥ、１０ｍＭクエン酸）が粒子へ添加され、および２０回ピペッティングすることによって混合された。試料は４５℃にて１０分間、インキュベート中に定期的に混合しながらインキュベートされた。ＤＮＡ結合溶液８００μＬ（５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、１０Ｍ ＬｉＣｌ、１０％ＤＧＭＥ）が溶解物へ添加され、および５回ピペッティングすることによって混合された。チューブは室温にて１０分間インキュベートされた。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。
【０１６８】
一回目洗浄。洗浄Ｉ溶液１０００μＬ（５５％エタノール、５Ｍ ＬｉＣｌ）が粒子に添加され、および１５回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄段階は５回繰り返された。
【０１６９】
二回目洗浄。７０％エタノール１０００μＬが粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄段階は５回繰り返された。
【０１７０】
最終洗浄。洗浄ＩＩＩ溶液５００μＬ（７０％エタノール、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）が粒子に添加され、および１０回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。廃棄物は粒子から廃棄物チューブへ吸引除去され、および磁石がチューブから外された。この洗浄段階は５回繰り返された。
【０１７１】
試料溶出。トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ溶液１５０〜２００μＬ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）が粒子に添加され、および試料が５分間インキュベートされる間に５回ピペッティングすることによって混合された。磁石がチューブに接する位置へ動かされ、および粒子が溶液からチューブの側面へ除かれた。ＤＮＡを含む溶液が吸引されおよび出力チューブへ移動された。溶出段階は溶出溶液５０〜２００μＬを用いて再び繰り返された。
【０１７２】
本発明のいくつかの実施形態が記載されている。にもかかわらず、本発明の精神および範囲を離れることなくさまざまな改変がなされうることが理解される。したがって、他の実施形態は下記の請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１Ａ】図１は、処理アセンブリの一実施形態の平面図（Ａ）、側面図（Ｂ）および透視図（Ｃ）の概略図を示す。
【図１Ｂ】図１は、処理アセンブリの一実施形態の平面図（Ａ）、側面図（Ｂ）および透視図（Ｃ）の概略図を示す。
【図１Ｃ】図１は、処理アセンブリの一実施形態の平面図（Ａ）、側面図（Ｂ）および透視図（Ｃ）の概略図を示す。
【図２Ａ】図２は、処理アセンブリ（Ａ）、磁気処理アセンブリ（Ｂ）、および磁気エレベーターアセンブリ（Ｃ）の一実施形態の概略図を示す。
【図２Ｂ】図２は、処理アセンブリ（Ａ）、磁気処理アセンブリ（Ｂ）、および磁気エレベーターアセンブリ（Ｃ）の一実施形態の概略図を示す。
【図２Ｃ】図２は、処理アセンブリ（Ａ）、磁気処理アセンブリ（Ｂ）、および磁気エレベーターアセンブリ（Ｃ）の一実施形態の概略図を示す。
【図３】図３は、ここに記載の核酸を単離するための装置の一実施形態の概略図を示す。
【図４】図４は、上部デッキアセンブリおよびポンプアセンブリの一実施形態の概略図を示す。
【図５】図５は、ポンプアセンブリからの単一シリンダーの一実施形態の概略図を示す。頂部ポート６９は、分注ピペッターアセンブリ４８と接続するバルブと接続する。底部ポート７０は、吸引ピペッターアセンブリ３８と接続するバルブと接続する。
【図６】図６は、本発明の電子制御系の一実施形態の概略図を示す。
【図７Ａ】図７Ａは試薬パックの一実施形態を示し、および図７Ｂは、ここに記載の直接溶解手順に使用されうる一連の試薬パックを保持する典型的な試薬パックホルダーを示す。
【図７Ｂ】図７Ａは試薬パックの一実施形態を示し、および図７Ｂは、ここに記載の直接溶解手順に使用されうる一連の試薬パックを保持する典型的な試薬パックホルダーを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ゲル電気泳動によって分析されたＲＮＡ試料を示す。試料はＲＮＡ溶解物手順にしたがって処理された。Ｋ５６２細胞５００万個が、結合溶液添加段階有りまたは無しで用いられた。
【図８Ｂ】図８Ｂは、細胞１００万個当たりのＲＮＡ溶解物手順収量を示す。Ｋ５６２細胞１００万個および５００万個が、結合溶液添加段階有りまたは無しで用いられた。
【図９Ａ】図９ＡはＤＮＡ溶解物電気泳動ゲルを示す。培養細胞５００万個が、ＲＮアーゼＡ有りまたは無しで処理された。
【図９Ｂ】図９ＢはＤＮＡ溶解物収量グラフである。培養細胞５００万個が、ＲＮアーゼＡ処理有りまたは無しで用いられた。
【図１０Ａ】図１０ＡはＤＮＡ直接溶解電気泳動ゲルを示す。全血２００ｍＬが、各回８つの試料の２回の機器運転で試験された。図１０ＢはＤＮＡ直接溶解収量グラフである。全血２００ｍＬ試料が、各回８つの試料の２回の機器運転のそれぞれで用いられた。
【図１０Ｂ】図１０ＢはＤＮＡ直接溶解収量グラフである。全血２００ｍＬ試料が、各回８つの試料の２回の機器運転のそれぞれで用いられた。
【図１１Ａ】図１１ＡはＤＮＡ直接溶解電気泳動ゲルを示す。バフィーコート５００ｍＬ溶解および結合容量変動が試験された。図１１ＢはＤＮＡ直接溶解収量グラフを示す。バフィーコート５００ｍＬが用いられた。グラフは溶解および結合容量変動を示す。
【図１１Ｂ】図１１ＢはＤＮＡ直接溶解収量グラフを示す。バフィーコート５００ｍＬが用いられた。グラフは溶解および結合容量変動を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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