(57)【要約】IL-28およびIL-29分子を用いる癌および自己免疫障害を有する患者の処置法。IL-28およびIL-29分子には、ヒトIL-28またはIL-29ポリペプチド配列に対する相同性を有するポリペプチドならびにIL-28およびIL-29の機能的活性を有するポリペプチドと融合されたタンパク質が含まれる。この分子は単剤療法としてまたは他の公知の癌および／もしくは自己免疫療法との併用で使用できる。2009502800.tif 000039
2009502800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌を処置する方法。
【請求項２】
ポリペプチドがポリエチレングリコールをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリエチレングリコールがポリペプチドのアミノ末端に共有結合している、請求項2記載の方法。
【請求項４】
ポリエチレングリコールが約20kD、30kD、または40kDである、請求項2記載の方法。
【請求項５】
ポリエチレングリコールが直鎖型または分枝型である、請求項2記載の方法。
【請求項６】
ポリエチレングリコールがモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドである、請求項2記載の方法。
【請求項７】
患者が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
患者がヒトである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌を処置する方法。
【請求項１０】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチドならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌を処置する方法。
【請求項１１】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌を処置する方法。
【請求項１２】
第二のポリペプチドがインターフェロンである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
第二のポリペプチドがインターフェロン-α、インターフェロン-β、またはインターフェロン-γである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の進行を抑制する方法。
【請求項１５】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の進行を抑制する方法。
【請求項１６】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の発症を遅らせる方法。
【請求項１７】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の発症を遅らせる方法。
【請求項１８】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の重症度を軽減する方法。
【請求項１９】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の重症度を軽減する方法。
【請求項２０】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法。
【請求項２１】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法。
【請求項２２】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、頸部、腋窩、または鼠蹊部のリンパ節の無痛性腫脹、寝汗、原因不明の発熱、体重減、および過度の疲労感の群より選択される非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法。
【請求項２３】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、頸部、腋窩、または鼠蹊部のリンパ節の無痛性腫脹、寝汗、原因不明の発熱、体重減、および過度の疲労感の群より選択される非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法。
【請求項２４】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、背痛、身長低下、貧血、腎障害、反復性呼吸器感染、および高カルシウム血症の群より選択される多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法。
【請求項２５】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、背痛、身長低下、貧血、腎障害、反復性呼吸器感染、および高カルシウム血症の群より選択される多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法。
【請求項２６】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍またはびらん領域、嚥下困難、呼吸または会話の問題、口の麻痺感、鼻血、持続性耳痛、難聴、および口または頸部の腫脹またはしこりの群より選択される頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法。
【請求項２７】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍またはびらん領域、嚥下困難、呼吸または会話の問題、口の麻痺感、鼻血、持続性耳痛、難聴、および口もしくは頸部の腫脹またはしこりの群より選択される頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法。
【請求項２８】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群より選択される自己免疫障害を処置する方法。
【請求項２９】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群より選択される自己免疫障害を処置する方法。
【請求項３０】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、癌が多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群より選択される自己免疫障害の方法。
【請求項３１】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、ならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、癌が多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群より選択される自己免疫障害の進行を抑制する方法。
【請求項３２】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチドならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、患者の多発性硬化症の再発を遅らせる方法。
【請求項３３】
SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、患者の再発性多発性硬化症の重症度を軽減する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
サイトカインは一般に造血系細胞の増殖もしくは分化を刺激するか、または体内の免疫反応機序および炎症反応機序に関与する。造血に作用するサイトカインの例は、赤血球の発達を刺激するエリスロポエチン（EPO）；巨核球系細胞の発達を刺激するトロンボポエチン（TPO）；および好中球の発達を刺激する顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）である。これらのサイトカインは、貧血、血小板減少、および好中球減少に罹った患者または癌の化学療法を受けた患者において正常な血球レベルを回復させるのに有用である。
【０００２】
インターロイキンは免疫学的反応を媒介するサイトカインのファミリーである。免疫反応の中心となるT細胞は多くのサイトカインを産生し、抗原に対する適応免疫を担う。T細胞によって産生されるサイトカインは、1型および2型に分類される（Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998（非特許文献1））。1型サイトカインにはIL-2、IFN-γ、LT-αが含まれ、これらは炎症反応、ウイルス免疫、細胞内寄生体免疫、および同種移植拒絶に関与する。2型サイトカインにはIL-4、IL-5、IL-6、IL-10、およびIL-13が含まれ、液性反応、蠕虫免疫、およびアレルギー反応に関与する。1型および2型の両方に属するサイトカインにはIL-3、GM-CSF、およびTNF-αが含まれる。1型産生T細胞集団および2型産生T細胞集団が異なるタイプの炎症組織に優先的に移動することを示唆する証拠がいくつかある。
【０００３】
免疫系は、病原体、すなわち細菌、ウイルス、真菌等に起因する疾患ならびに体内の自己細胞および組織の異常な増殖（すなわち、癌性腫瘍）に起因する疾患に対する身体の一次防御である。通常、免疫系は身体の正常細胞すなわち「自己」と外来の病原体または異常細胞すなわち「非自己」を識別することができる。免疫系がその自己の身体に対する反応を控えるプロセスは寛容とよばれる。免疫系は「自己」を正常と認識する能力を喪失することがあり、それらの組織または細胞に対するその後の反応は寛容性を喪失し、自己免疫の状態を生じる。自己免疫に起因する病理は重大な臨床結果を示すことが多く、世界中、特に先進国における主要な健康問題の一つとなっている。
【０００４】
このような自己免疫障害の一つの例は、中枢神経系（CNS）の進行性疾患である多発性硬化症（MS）である。MS患者において、患者の自己免疫系は、脳および脊髄の神経線維を取り囲み隔離する保護層であるミエリンを破壊する。ミエリン鞘が破壊されると、神経伝達が崩壊し、神経線維に瘢痕性の損傷を与える。その最終結果は、罹患した患者における、刺痛または麻痺、不明瞭言語、視力障害、めまい等を含む多くの症状の発症である。この疾患の過程を通じて四肢の強度が損なわれ運動に問題が生じ、最も重大な症例では肢の麻痺が起きる。現在、臨床診断に基づくMSの分類には4つのタイプがあり、それらは脳または脊髄のどの部分が罹患したのか、重症度、発病頻度等に基づく。
【０００５】
現在のMS治療には、コルチコステロイド薬（急性的エピソードの症状を緩和するため）ならびにIFN-βおよびノバントロン（登録商標）等の他の薬物が含まれる。ノバントロン（登録商標）は、後期段階のMS患者、特に他の療法が効かない患者に対して承認されている。ノバントロン（登録商標）は大部分の細胞に対して細胞傷害性であり、従って想像通り多くの副作用を有し、最大の治療効果に必要な用量では毒性である。IFN-βもまた毒性であり、MS患者における薬物投与は制限される。さらにこれらの薬物の継続的な使用は、同じ薬物のさらなる使用に対する患者の感受性を低下させることが示されており、従ってこれらの薬物を長期的治療として使用するのに限界がある。
【０００６】
治療的見地から特に対象となるのはインターフェロンである（インターフェロンに関する総説は、De Maeyer and De Maeyer-Guignard、「Interferons」、The Cytokine Handbook、第3版、Thompson編、491〜516頁（Academic Press Ltd. 1998）（非特許文献2）およびWalsh、Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology、158〜188頁（John Wiley & Sons 1998）（非特許文献3）によって提供される）。インターフェロンは様々な生物学的活性を示し、特定の自己免疫疾患、特定の癌の処置ならびにウイルス、細菌、真菌、および原生動物を含む感染因子に対する免疫反応の強化に有用である。今日までに、6つの形態のインターフェロンが同定されており、これらは2つの主要なグループに分類される。いわゆる「I型」IFNには、IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-δ、およびインターフェロン-τが含まれる。現在のところ、IFN-γおよびIFN-αの一つのサブクラスのみがII型IFNである。
【０００７】
I型IFNは同じ先祖遺伝子に由来すると考えられており、同じ細胞表面受容体に作用するのに十分類似する構造を保持する。ヒトIFN-α／β受容体のα鎖はクラスIIサイトカイン受容体に特徴的な細胞外N末端ドメインを含む。IFN-γはI型IFNまたはII型IFN-αサブタイプと有意な相同性を共有しないが、I型IFNと多くの生物学的活性を共有する。
【０００８】
臨床医はインターフェロンを幅広い病状の処置に使用することで、このタンパク質の複数の活性を利用している。例えば、IFN-αの一つの形態は、ヘアリーセル白血病、腎細胞癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、AIDS関連カポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、喉頭乳頭腫症、菌状息肉腫、尖圭コンジローマ、慢性B型肝炎、C型肝炎、慢性D型肝炎、および慢性非A非B／C型肝炎等の医学的状態の処置に対して、50ヶ国を超える国で使用が承認されている。米国食品医薬品局は、神経系の慢性疾患である多発性硬化症の処置に対してIFN-βの使用を承認した。IFN-γは、慢性肉芽腫症を処置するのに使用され、この処置においてインターフェロンは感染性の細菌、真菌、および原生成物性病原体を破壊するために患者の免疫反応を強化する。臨床研究はまた、IFN-γがAIDS、リーシュマニア症、およびらい腫らいの処置に有用であり得ることを示す。
【０００９】
IL-28A、IL-28B、およびIL-29は、I型インターフェロンとの配列相同性およびIL-10とのゲノム相同性を有する最近発見された新たなタンパク質ファミリーを含む。この新規ファミリーは共願に係るPCT出願WO 02/086087（特許文献1）およびSheppard et al., Nature Immunol. 4: 63-68, 2003（非特許文献4）に十分記載されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み入れられる。機能的には、IL-28およびIL-29は細胞内で抗ウイルス状態を誘導するそれらの能力についてはI型IFNと共通するが、I型INFとは異なり特定のB細胞系に対する抗増殖活性を示さない。
【００１０】
成熟T細胞は活性化される、すなわち抗原またはその他の刺激によって活性化されると、例えばサイトカイン、生化学的シグナル伝達分子、または受容体を産生することができ、これらはそのT細胞集団の運命にさらに影響する。
【００１１】
B細胞は、B細胞受容体、およびアクセサリー細胞機能、例えばサイトカイン産生を示すその他のアクセサリー分子を含むそれらの細胞表面上の受容体を通じて活性化され得る。B細胞が活性化されると抗体を産生し、抗体は腫瘍細胞の免疫原性細胞表面タンパク質に結合して補体媒介性の細胞溶解を開始し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）のためにNK細胞またはマクロファージに腫瘍を受け渡し、生存を阻止もしくはアポトーシスシグナルを誘導することによって腫瘍細胞の増殖を干渉し、またはAPCによる腫瘍抗原の取り込みおよび提示を促進することによって免疫原性を増加させることができる。従って、インビボでのB細胞反応の強化は、抗腫瘍活性を促進する可能性がある（Blattman et al., Science, 305: 200-205（July 9, 2004）（非特許文献5））。
【００１２】
従って、腫瘍の誘導または進行に対する自然宿主防御を増強できる薬剤は、先行する方法のような細胞傷害性の副作用を伴うことなく寛解率を上げ、患者の生存を増進し得る。
【００１３】
本発明は、このような、単剤療法としてまたは化学療法、放射線療法、低分子もしくはその他の生物学と組み合わせて使用され得るIL-28A、IL-28B、またはIL-29組成物を投与することによる固形腫瘍、リンパ腫、および自己免疫障害を処置するための方法を提供する。これらおよびその他の使用については、本明細書中の教示から当業者に明らかであると思われる。
【００１４】
【特許文献１】WO 02/086087
【非特許文献１】Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317. 1998
【非特許文献２】De Maeyer and De Maeyer-Guignard、「Interferons」、The Cytokine Handbook、第3版、Thompson編、491〜516頁（Academic Press Ltd. 1998）
【非特許文献３】Walsh、Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology、158〜188頁（John Wiley & Sons 1998）
【非特許文献４】Sheppard et al., Nature Immunol. 4: 63-68, 2003
【非特許文献５】Blattman et al., Science, 305: 200-205（July 9, 2004）
【発明の開示】
【００１５】
発明の説明
以下の説明においては、広範囲にわたって多くの用語が用いられている。以下の定義は本発明の理解を容易にするために提供する。
【００１６】
そうでないことが示されない限り、「一つ（a）」、「一つ（an）」、「その（the）」、および「少なくとも一つ（at least）」は互換的に用いられ、一つまたは一つより多いことを意味する。
【００１７】
「親和性タグ」という用語は、本明細書中で、第二のポリペプチドの精製または検出を提供するためまたは第二のポリペプチドが基質に結合する部位を提供するためにその第二のポリペプチドに付加され得るポリペプチドセグメントを表すのに使用される。原理的には、抗体またはその他の特定の結合因子が用いることができる任意のペプチドまたはタンパク質が親和性タグとして使用され得る。親和性タグには、ポリヒスチジン群、プロテインA（Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67: 31, 1988）、Glu-Glu親和性タグ（Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985）、サブスタンスP、フラッグ（商標）ペプチド（Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10, 1988）、ストレプトアビジン結合ペプチド、またはその他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。その一般論については、Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991を参照されたい。親和性タグをコードするDNAは、業者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ）から入手できる。
【００１８】
「対立遺伝子変種体」という用語は、本明細書中で、同じ染色体上の遺伝子座を占有する遺伝子の二つまたはそれ以上の代替形態のうちのいずれかを表すのに使用される。対立遺伝子のバリエーションは変異により自然発生し、集団内で表現型の多型を生じる。遺伝子の変異はサイレントである（そのコードされるポリペプチドは変化がない）こともあるし、アミノ酸配列が変化したポリペプチドがコードされることもある。対立遺伝子変種体という用語はまた、本明細書中で、ある遺伝子の対立遺伝子変種体によってコードされるタンパク質を表すのにも使用される。
【００１９】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、本明細書中で、ポリペプチド内の位置を表すのに使用される。文脈が許す限り、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または部分を参照して、近接性または相対位置を表すのに使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、その参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしもその完全ポリペプチドのカルボキシル末端に位置する必要はない。
【００２０】
「癌」または「癌細胞」という用語は、本明細書中で、正常組織または組織細胞とは異なる特徴を有する新生物中に見出される組織または細胞を表すのに使用される。このような特徴には、退生の程度、形状の不規則性、細胞の輪郭の不明瞭性、核の大きさ、核または細胞質の構造変化、その他の表現型の変化、癌性または前癌性状態を指標となる細胞タンパク質の存在、有糸分裂数の増加、および転移能力が含まれるがこれらに限定されない。「癌」に関連する単語には、癌腫、肉腫、腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、ポリープ、および硬性癌、悪性転換、新生物等が含まれる。
【００２１】
「補体／抗補体対」という用語は、適当な条件下で非共有結合により安定な対を形成する非同一物体を表す。例えば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は補体／抗補体対の代表的存在である。その他の補体／抗補体対の例には、受容体／リガンド対、抗体／抗原（またはハプテンもしくはエピトープ）対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対等が含まれる。補体／抗補体対をその後に解離させるのが望ましい場合、補体／抗補体対は好ましくは、109 M-1未満の結合親和性を有する。
【００２２】
「ポリヌクレオチド分子の相補体」という用語は、参照配列と比較して相補的な塩基配列および逆向き方向を有するポリヌクレオチド分子を表す。
【００２３】
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子と比較して）一つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチド配列を表す。縮重コドンは、異なるヌクレオチド・トリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUおよびGACトリプレットは各々Aspをコードする）。
【００２４】
「発現ベクター」という用語は、関心対象のポリペプチドをコードするセグメントがその転写をもたらす追加のセグメントに機能的に連結された、直鎖又は環状のDNA分子を表すのに使用される。このような追加セグメントにはプロモーターおよびターミネーター配列が含まれ、かつ一つまたは複数の複製起点、一つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等も含まれ得る。発現ベクターは一般的に、プラスミドまたはウイルスDNA由来であるか、またはその両方のエレメントを含み得る。
【００２５】
「単離された」いう用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、その生来の遺伝的環境から取り出され、従って他の外来性または望ましくないコード配列を含まず、かつ遺伝子操作されたタンパク質の生産系において使用するのに適した形態にあることを表す。このような単離された分子は、それらの生来の環境から分離されたものであり、cDNAおよびゲノムクローンを含む。本発明の単離されたDNA分子は、通常付随する他の遺伝子を含まないが、天然に存在する5'および3'非翻訳領域、例えばプロモーターおよびターミネーターを含み得る。付随領域の同定は、当業者に明らかであろう(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774-78, 1985を参照されたい)。
【００２６】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その生来の環境とは異なる状態で、例えば血液および動物組織から離れて見出される、ポリペプチドまたはタンパク質である。好ましい形態では、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物由来の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形態、すなわち、95%超の純度、より好ましくは99%超の純度のポリペプチドを提供することが好ましい。この文脈で使用する場合、「単離された」という用語は、代替の物理的形態、例えば二量体あるいはグリコシル化形態もしくは誘導体化形態の同一ポリペプチドの存在を除外しない。
【００２７】
免疫細胞、例えばNK細胞、T細胞、特に細胞傷害性T細胞、B細胞等に言及する場合の「レベル」という用語に関して、レベルの増加とは、細胞数の増加または細胞機能の活性の増進のいずれかである。
【００２８】
細胞に言及する場合の「新生物形成の」という用語は、特に増殖が制御されず、進行性であり、新生物を生じる組織において、新たなかつ異常な増殖を起こす細胞を示す。新生物形成細胞は、悪性、すなわち浸潤性および転移性、または良性のいずれかであり得る。
【００２９】
「機能的に連結」という用語は、DNAセグメントに言及される場合、それらのセグメントがそれらの意図する目的のために協調的に機能するよう配置されていること、例えば、転写であればプロモーターから開始し、コードセグメントを通ってターミネーターまで進行することを示す。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド塩基もしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーであり、5'末端から3'末端の方向に読み取られる。ポリヌクレオチドにはRNAおよびDNAが含まれ、自然界から単離されるか、インビトロで合成されるか、または天然分子および合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドの大きさは、塩基対(「bp」と省略される)、ヌクレオチド(「nt」)、またはキロ塩基(「kb」)で表される。その文脈が許す場合、後者の二つの用語は、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドを表し得る。この用語が二本鎖分子に適用される場合、全長を表すために用いられ、「塩基対」という用語と等価であることが理解されると思われる。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さが若干異なり得ることおよびそれらの末端は酵素的切断の結果としてずれが生じ得ること、つまり二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対を形成しているとは限らないことは当業者に認識されていると思われる。
【００３１】
「ポリペプチド」は、天然で生産されたものであるか合成されたものであるかに関係なく、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約10未満のアミノ酸残基のポリペプチドは、一般的には「ペプチド」と称される。
【００３２】
「プロモーター」という用語は、本明細書中ではその技術分野で認識されている意味で、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始をもたらすDNA配列を含む遺伝子の一部を表すのに使用される。プロモーター配列は一般的に、しかし必ずそうとは限らないが、遺伝子の5'非コード領域に見られる。
【００３３】
「タンパク質」は、一つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば糖基を含み得る。糖類および他の非ペプチド置換基はそのタンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加され得、それは細胞のタイプによって異なる。タンパク質は、本明細書中ではそれらのアミノ酸骨格構造によって決められ；置換基、例えば糖基は一般に特定されないが、それでも存在してもよい。
【００３４】
「受容体」という用語は、生物活性分子（すなわちリガンド）に結合してそのリガンドの細胞に対する作用を仲介する細胞関連タンパク質を表す。膜結合型受容体は、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインを含む複数ペプチド構造により特徴付けられ、典型的にはシグナル伝達に関与する。リガンドが受容体に結合すると、受容体の立体配座が変化し、そのエフェクタードメインと細胞内の他の分子の間の相互作用を引き起こす。次いでこの相互作用は、細胞の代謝を変化させる。受容体-リガンド相互作用と関連する代謝現象には、遺伝子の転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が含まれる。一般的に、受容体は膜結合型、細胞質ゾル型、または核型であり；単量体型（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、βアドレナリン作用性受容体）または多量体型（例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体、およびIL-6受容体）であり得る。
【００３５】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの一成分として、そのより大きなポリペプチドをその合成された細胞の分泌経路を通るようにするポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするDNA配列を表す。このより大きなポリペプチドは一般的に、その分泌経路を通って移行する間に分泌ペプチドを切り離す。
【００３６】
不正確な分析的方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定された分子量およびポリマー長は、およその値であることが理解されると思われる。このような値が「約」Xまたは「およそ」Xで表現される場合、Xの意味する値は±10％の精度であることが理解されると思われる。
【００３７】
「zcyto20」、「zcyto21」、「zcyto22」は、それぞれヒトIL-28A、ヒトIL-29、およびヒトIL-28Bの以前の名称であり、本明細書において互換的に使用される。IL-28Aのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2に示される。IL-29のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO: 3およびSEQ ID NO: 4に示される。IL-28Bのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6に示される。これらの配列は、同一出願人ZymoGenetics, Inc.によるPCT出願WO 02/086087、米国特許第6,927,040、PCT出願WO 04/037995、PCT出願WO 05/023862、PCT出願WO 05/097165およびPCT出願06/012644に十分に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
【００３８】
「zcyto24」および「zcyto25」はマウスIL-28の以前の名称であり、それぞれSEQ ID NO: 7、8、9、10に示される。そのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、同一出願人ZymoGenetics, Inc.による、参照として本明細書に組み入れられるPCT出願WO 02/086087に十分に記載される。
【００３９】
「zcytor19」はIL-28受容体α-サブユニットの以前の名称であり、SEQ ID NO: 11に示される。そのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、参照として本明細書に組み入れられる、Schering, Inc.名義のPCT出願WO 02/20569およびZymoGenetics, Inc.が譲受したWO 02/44209に記載されている。「IL-28受容体」は、ヘテロ二量体受容体を形成するIL-28 α-サブユニットおよびCRF2-4サブユニットを表す。
【００４０】
本明細書中で参照される全ての参考文献は、それらの全体が参照として組み入れられる。
【００４１】
A.  IL-28、IL-29、およびその受容体
IL-28に言及する場合、この用語はIL-28AおよびIL-28Bの両方を意味する。以前はIL-28Aはzcyto20（SEQ ID NO: 1および2）と呼ばれ、IL-29はzcyto21（SEQ ID NO: 3および4）と呼ばれ、IL-28Bはzcyto22（SEQ ID NO: 5および6）と呼ばれていた（PCT出願WO 02/086087およびSheppard et al., 前出を参照されたい）。IL-28のマウスオルソログは、以前はzcyto24（SEQ ID NO: 7および8）、zcyto25（SEQ ID NO: 9および10）と呼ばれていた。
【００４２】
野生型IL-28A遺伝子は、SEQ ID NO: 2に示されるように200アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Aのシグナル配列は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基-25（Met）からアミノ酸残基-1（Ala）を含むと予測され得る。IL-28Aの成熟ペプチドは、アミノ酸残基1（Val）から始まる。IL-28Aのヘリックスは、SEQ ID NO: 2に示されるように次の通りであると予想される。ヘリックスAはアミノ酸残基24（Leu）から40（Glu）までにより定められ；ヘリックスBはアミノ酸残基58（Thr）から65（Gln）までにより；ヘリックスCはアミノ酸残基69（Arg）から85（Ala）までにより；ヘリックスDはアミノ酸残基95（Val）から114（Ala）までにより；ヘリックスEはアミノ酸残基126（Thr）から142（Lys）までにより；かつヘリックスFはアミノ酸残基148（Cys）から169（Ala）までにより定められる。
【００４３】
野生型IL-29遺伝子は、SEQ ID NO: 4に示されるように200アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-29のシグナル配列は、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 119、またはSEQ ID NO: 121のアミノ酸残基-19（Met）からアミノ酸残基-1（Ala）を含むと予測され得る。IL-29の成熟ペプチドは、アミノ酸残基1（Gly）から始まる。IL-29はPCT出願WO 02/02627に記載される。IL-29のヘリックスは、SEQ ID NO: 4に示されるように次の通りであると予想される。ヘリックスAはアミノ酸残基30（Ser）から44（Leu）までにより定められ；ヘリックスBはアミノ酸残基57（Asn）から65（Val）までにより；ヘリックスCはアミノ酸残基70（Val）から85（Ala）までにより；ヘリックスDはアミノ酸残基92（Glu）から114（Gln）までにより；ヘリックスEはアミノ酸残基118（Thr）から139（Lys）までにより；かつヘリックスFはアミノ酸残基144（Gly）から170（Leu）までにより定められる。
【００４４】
野生型IL-28B遺伝子は、SEQ ID NO: 6に示されるように200アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Bのシグナル配列は、SEQ ID NO: 6のアミノ酸残基-21（Met）からアミノ酸残基-1（Ala）を含むと予測され得る。IL-28Bの成熟ペプチドは、アミノ酸残基1（Val）から始まる。IL-28Bのヘリックスは、SEQ ID NO: 6に示されるように次の通りであると予想される。ヘリックスAはアミノ酸残基8（Leu）から41（Glu）までにより定められ；ヘリックスBはアミノ酸残基58（Trp）から65（Gln）までにより；ヘリックスCはアミノ酸残基69（Arg）から86（Ala）までにより；ヘリックスDはアミノ酸残基95（Gly）から114（Ala）までにより；ヘリックスEはアミノ酸残基126（Thr）から142（Lys）までにより；かつヘリックスFはアミノ酸残基148（Cys）から169（Ala）までにより定められる。
【００４５】
本発明は、単一形態のIL-28分子またはIL-29分子の発現をもたらす、例えばSEQ ID NO: 1、2、3、4、5、および6に示されるIL-28およびIL-29の野生型配列における変異を提供する。形態の異質性は複数の分子内ジスルフィド結合パターンの結果であると考えられるので、本発明の特定の態様は、野生型IL-28およびIL-29配列内のシステイン残基の変異を含む。IL-28およびIL-29が大腸菌において発現される場合、N末端メチオニンが存在する。例えば、SEQ ID NO: 12〜17は、N末端Metが存在する場合のIL-28A、IL-29、およびIL-28Bのヌクレオチドおよびアミノ酸残基の番号を示す。表1は、野生型IL-28A、IL-28B、およびIL-29において分子内でジスルフィド結合する可能性のあるシステイン対の組み合わせを示す。
【００４６】
（表１）
2009502800.tif 000003
【００４７】
本発明のポリヌクレオチド分子およびポリペプチド分子は、野生型IL-28A、IL-29、またはIL-28B分子に存在する一つまたは複数のシステインにおける変異を有し得るが、本明細書中に記載されるいくつかの生物学的活性は依然として保持している。表2は、システイン変異体の例を、特にシステイン（C）からセリン（S）への点変異の例を示す。
【００４８】
（表２）
2009502800.tif 000004
【００４９】
このファミリーのメンバーは全て、同じクラスIIサイトカイン受容体、IL-28Rに結合することが示された。IL-28α-サブユニットは以前はzcytor19受容体と呼ばれていた。理論に拘束されることは望まないが、これらの分子は全て、同じ経路を経てIL-28R受容体を通過するシグナルを送るようである。IL-28受容体は、参照として本明細書に組み入れられる同一出願人によるPCT特許出願WO 02/44209；Sheppard et al., 前出； Kotenko et al., Nature Immunol. 4: 69-77, 2003；およびPCT WO/03/040345に記載される。IL-28Rは、それらの細胞外ドメインに一つまたは複数のサイトカイン受容体モジュール（CRM）が存在することにより特徴付けられるクラスIIサイトカイン受容体のメンバーである。その他のクラスIIサイトカイン受容体には、zcytor11（同一人に付与された米国特許第5,965,704号）、CRF2-4（Genbankアクセッション番号Z17227）、IL-10R（Genbankアクセッション番号U00672およびNM_001558）、DIRS1、zcytor7（同一人に付与された米国特許第5,945,511号）、および組織因子が含まれる。IL-28受容体は、インターフェロン-α／β受容体α鎖を除く全ての公知のクラスII受容体と同様、その細胞外ドメインにクラスII CRMを一つだけ有する。
【００５０】
4ヘリックスバンドル型サイトカインもまた、それらを構成するヘリックスの長さによって分類される。「ロングヘリックス」型サイトカインは一般的に24〜30残基のヘリックスからなり、IL-6、繊毛様神経栄養因子（CNTF）、白血病抑制因子（LIF）、およびヒト成長ホルモン（hGH）がこれに含まれる。「ショートヘリックス」型サイトカインは一般的に18〜21残基のヘリックスからなり、IL-2、IL-4、およびGM-CSFがこれに含まれる。CNTFおよびIL-6を用いた研究は、CNTFのヘリックスをIL-6における等価なヘリックスと交換し、そのキメラ体にCTNF結合特性を付与することが可能であることを実証した。従って、4ヘリックスサイトカインの機能的ドメインは、配列同一性に関係なく構造的相同性に基づき決定され、キメラ体において機能的完全性が維持できるようである（Kallen et al., J. Biol. Chem. 274: 11859-11867, 1999）。従って、IL-28およびIL-29ポリペプチドは、受容体結合特異性を決定および調節するためのキメラ融合分子、特に他のインターフェロンとのキメラ融合分子を調製するのに有用である。インターフェロンおよびサイトカイン、例えばINF-α、IL-10、ヒト成長ホルモン由来のヘリックスドメインおよびループドメインを合わせ持つ融合タンパク質が特に興味深い。
【００５１】
本発明は、IL-28またはIL-29ポリペプチドをコードする、DNAおよびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子を提供する。例えば、本発明は、本明細書中に開示されるIL-28A C48S、Met IL-28A C49S、IL-28A C50S、Met IL-28A C51S、IL-29 C171S、およびMet IL-29 C172Sポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重を考慮すればこれらのポリヌクレオチド分子の間に大きな配列上のばらつきが生じ得ることを容易に認識すると思われる。SEQ ID NO: 30、31、32、33、34、および35は、それぞれIL-28A C48S、Met IL-28A C49S、IL-28A C50S、Met IL-28A C51S、IL-29 C171S、およびMet IL-29 C172Sをコードする全てのDNAを含む縮重DNA配列である。当業者は、SEQ ID NO: 30、31、32、33、34、および35の縮重配列がまた、TをUで置換することによってSEQ ID NO: 30、31、32、33、34、および35をコードする全てのRNA配列を提供し、従ってこれらも本発明によって意図されることを認識すると思われる。
【００５２】
zcyto20すなわちIL-28A遺伝子は、SEQ ID NO: 2に示されるような205アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Aのシグナル配列は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基-25（Met）からアミノ酸残基-1（Ala）、あるいはSEQ ID NO: 2のアミノ酸残基-21（Met）からアミノ酸残基-1（Ala）を含む。IL-28Aの成熟ペプチドはSEQ ID NO: 2のアミノ酸残基1（Val）から始まる。zcyto20のヘリックスは、SEQ ID NO: 2に示されるように次の通りであると予想される。ヘリックスAはアミノ酸残基52（Ala）から66（Leu）までにより定められ；ヘリックスBはアミノ酸残基78（Arg）から87（Val）までにより；ヘリックスCはアミノ酸残基91（Pro）から108（Thr）までにより；ヘリックスDはアミノ酸残基116（Val）から138（Ser）までにより；ヘリックスEはアミノ酸残基151（Thr）から172（Lys）までにより；かつヘリックスFはアミノ酸残基177（Gly）から197（Cys）までにより定められる。マルチプルアラインメントに基づくZcyto20のさらなる分析は、（SEQ ID NO: 2に示されるように）アミノ酸残基37および136；69および197；ならびに71および178のシステインが分子内ジスルフィド結合を形成し得ることを予測する。本明細書中に記載されるZcyto20ポリペプチドの領域、ドメイン、モチーフ、残基、および配列をコードする対応するポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 1に示される。成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を原核生物系、例えば大腸菌において発現させた場合、分泌シグナル配列が必要でない場合があり、N末端Metが存在し、その結果、SEQ ID NO: 13に示されるようなポリペプチドが発現され得る。
【００５３】
本発明のIL-28Aポリペプチドはまた、成熟ポリペプチドの二番目のシステインC2において変異を有する。例えば、SEQ ID NO: 2のポリペプチドのN末端からC2とは、アミノ酸48位、または大腸菌内で発現された場合は49位（N末端メチオニンの追加のため）のシステインである（例えば、SEQ ID NO: 13を参照されたい）。IL-28Aの（IL-28Bと同様、7個あるうちの）この二番目のシステインすなわちC2は、例えば、セリン、アラニン、スレオニン、バリン、またはアスパラギンに変異誘導され得る。本発明のIL-28A C2変異分子には、例えば、SEQ ID NO: 19および21に示されるIL-28A C2変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 18および20に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる。本発明のさらなるIL-28A C2変異分子には、SEQ ID NO: 36、37、および163に示されるポリペプチドが含まれる。
【００５４】
本発明はまた、少なくとも部分的に抗腫瘍活性および／または免疫調節活性を提供する生物学的に活性であるIL-28A C2システイン変異体を含む。IL-28AのN末端から二番目のシステインまたはC2は、別のシステインとジスルフィド結合を形成しない任意のアミノ酸、例えばセリン、アラニン、スレオニン、バリン、またはアスパラギンに変異誘導され得る。本発明の生物学的に活性であるIL-28A C2システイン変異体には、IL-28AのN末端欠失物、C末端欠失物、ならびにNおよびC末端欠失物、例えば、SEQ ID NO: 162のポリヌクレオチドによりコードされるSEQ ID NO: 163のポリペプチドが含まれる。
【００５５】
N末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C2変異体には、例えば、SEQ ID NO: 162のヌクレオチド7〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基3〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド10〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基4〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド13〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基5〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド16〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基6〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド19〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基7〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド22〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基8〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド25〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基9〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド28〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基10〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド31〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基11〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド34〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基12〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド37〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基13〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド40〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基14〜176；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド43〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基15〜176；およびSEQ ID NO: 162のヌクレオチド46〜528によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基16〜176が含まれる。本発明のN末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C2変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００５６】
C末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C2変異体には、例えば、SEQ ID NO: 162のヌクレオチド1〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基1〜175が含まれる。
【００５７】
N末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C2変異体には、例えば、SEQ ID NO: 162のヌクレオチド4〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基2〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド7〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基3〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド10〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基4〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド13〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基5〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド16〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基6〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド19〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基7〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド22〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基8〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド25〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基9〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド28〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基10〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド31〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基11〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド34〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基12〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド37〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基13〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド40〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基14〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド43〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基15〜175；SEQ ID NO: 162のヌクレオチド46〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基16〜175；およびSEQ ID NO: 162のヌクレオチド49〜525によりコードされるSEQ ID NO: 163のアミノ酸残基17〜175が含まれる。本発明のN末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C2変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００５８】
IL-28A C2変異体に加えて、本発明はまた、成熟ポリペプチドの三番目のシステインの位置C3に変異を有するIL-28Aポリペプチドを含む。例えば、SEQ ID NO: 2のポリペプチドのN末端からC3とは、50位、または大腸菌内で発現させた場合は51位（N末端メチオニンの追加のため）のシステインである（例えば、SEQ ID NO: 13を参照されたい）。本発明のIL-28A C3変異分子には、例えば、SEQ ID NO: 23および25に示されるIL-28A C3変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 22および24に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる。本発明のさらなるIL-28A C3変異分子には、SEQ ID NO: 38、39、および165に示されるポリペプチドが含まれる。
【００５９】
本発明はまた、少なくとも部分的に抗腫瘍活性および／または免疫調節活性を提供する生物学的に活性であるIL-28A C3システイン変異体を含む。IL-28AのN末端から三番目のシステインまたはC3は、別のシステインとジスルフィド結合を形成しない任意のアミノ酸、例えばセリン、アラニン、スレオニン、バリン、またはアスパラギンに変異誘導され得る。本発明の生物学的に活性であるIL-28A C3システイン変異体には、IL-28AのN末端欠失物、C末端欠失物、ならびにNおよびC末端欠失物、例えば、SEQ ID NO: 164のポリヌクレオチドによりコードされるSEQ ID NO: 165のポリペプチドが含まれる。
【００６０】
N末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C3変異体には、例えば、SEQ ID NO: 164のヌクレオチド4〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基2〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド7〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基3〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド10〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基4〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド13〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基5〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド16〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基6〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド19〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基7〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド22〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基8〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド25〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基9〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド28〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基10〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド31〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基11〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド34〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基12〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド37〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基13〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド40〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基14〜176；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド43〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基15〜176；およびSEQ ID NO: 164のヌクレオチド46〜528によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基16〜176が含まれる。本発明のN末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C3変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００６１】
C末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C3変異体には、例えば、SEQ ID NO: 164のヌクレオチド1〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基1〜175が含まれる。
【００６２】
N末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C3変異体には、例えば、SEQ ID NO: 164のヌクレオチド4〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基2〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド7〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基3〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド10〜525によりコードされるアミノ酸残基4〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド13〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基5〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド16〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基6〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド19〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基7〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド22〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基8〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド25〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基9〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド28〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基10〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド31〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基11〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド34〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基12〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド37〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基13〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド40〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基14〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド43〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基15〜175；SEQ ID NO: 164のヌクレオチド46〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基16〜175；およびSEQ ID NO: 164のヌクレオチド49〜525によりコードされるSEQ ID NO: 165のアミノ酸残基17〜175が含まれる。本発明のN末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28A C3変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００６３】
本発明のIL-28Aポリペプチドには、例えば、SEQ ID NO: 1、12、18、20、22、24、162、および164に示されるIL-28Aポリヌクレオチド分子によりコードされる、それぞれSEQ ID NO: 2、13、19、21、23、25、163、および165が含まれる。さらに、本発明はまた、SEQ ID NO:36、37、38、および39に示されるIL-28Aポリペプチド、それらのC2変異体、それらのN末端が修飾されたC2変異体、それらのC末端が修飾されたC2変異体、それらのN末端およびC末端のC2変異体、それらのC3変異体、それらのN末端が修飾されたC3変異体、それらのC末端が修飾されたC3変異体、それらのN末端およびC末端が修飾されたC3変異体、それらの断片、ならびにそれらの融合タンパク質を提供する。
【００６４】
Zcyto22すなわちIL-28B遺伝子は、SEQ ID NO:6に示されるような205アミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Bのシグナル配列は、SEQ ID NO: 6のアミノ酸残基-25（Met）からアミノ酸残基0（Ala）、あるいはSEQ ID NO: 6のアミノ酸残基-21（Met）からアミノ酸残基0（Ala）を含む。IL-28Bの成熟ペプチドはSEQ ID NO: 6のアミノ酸残基1（Val）から始まる。IL-28Bのヘリックスは、SEQ ID NO: 6に示されるように次の通りであると予想される。ヘリックスAはアミノ酸残基8（Leu）から41（Glu）までにより定められ；ヘリックスBはアミノ酸残基58（Trp）から65（Gln）までにより；ヘリックスCはアミノ酸残基69（Arg）から86（Ala）までにより；ヘリックスDはアミノ酸残基95（Gly）から114（Ala）までにより；ヘリックスEはアミノ酸残基126（Thr）から142（Lys）までにより；かつヘリックスFはアミノ酸残基148（Cys）から169（Ala）までにより定められる。成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を原核生物系、例えば大腸菌において発現させた場合、分泌シグナル配列が必要でない場合があり、N末端Metが存在し、その結果、SEQ ID NO: 17に示されるようなポリペプチドが発現され得る。
【００６５】
本発明のIL-28Bポリペプチドはまた、成熟ポリペプチドの二番目のシステインC2において変異を有する。例えば、SEQ ID NO: 6のポリペプチドのN末端からC2とは、アミノ酸48位、または大腸菌内で発現された場合は49位（N末端メチオニンの追加のため）のシステインである（例えば、SEQ ID NO: 17を参照されたい）。IL-28Bの（IL-28Aと同様、7個あるうちの）この二番目のシステインすなわちC2は、例えば、セリン、アラニン、スレオニン、バリン、またはアスパラギンに変異誘導され得る。本発明のIL-28B C2変異分子には、例えば、SEQ ID NO: 123および125に示されるIL-28B C2変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 122および124に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる。本発明のさらなるIL-28B C2変異分子には、SEQ ID NO: 131および133に示されるIL-28B C2変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 130および132に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる（PCT公開WO 03/066002（Kotenko et al.））。
【００６６】
本発明はまた、少なくとも部分的に抗腫瘍活性および／または免疫調節活性を提供する生物学的に活性であるIL-28B C2システイン変異体を含む。IL-28BのN末端から二番目のシステインすなわちC2は、別のシステインとジスルフィド結合を形成しない任意のアミノ酸、例えばセリン、アラニン、スレオニン、バリン、またはアスパラギンに変異誘導され得る。本発明の生物学的に活性であるIL-28B C2システイン変異体には、IL-28BのN末端欠失物、C末端欠失物、ならびにNおよびC末端欠失物、例えば、SEQ ID NO: 166のポリヌクレオチドによりコードされるSEQ ID NO: 167のポリペプチドが含まれる。
【００６７】
N末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28B C2変異体には、例えば、SEQ ID NO: 166のヌクレオチド4〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基2〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド7〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基3〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド10〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基4〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド13〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基5〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド16〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基6〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド19〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基7〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド22〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基8〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド25〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基9〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド28〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基10〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド31〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基11〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド34〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基12〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド37〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基13〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド40〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基14〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド43〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基15〜176；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド46〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基16〜176；およびSEQ ID NO: 166のヌクレオチド49〜528によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基17〜176が含まれる。本発明のN末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28 C2変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００６８】
C末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28B C2変異体には、例えば、SEQ ID NO: 166のヌクレオチド1〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基1〜175が含まれる。
【００６９】
N末端およびC末端の生物学的に活性であるIL-28B C2変異体には、例えば、SEQ ID NO: 166のヌクレオチド4〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基2〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド7〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基3〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド10〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基4〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド13〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基5〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド16〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基6〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド19〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基7〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド22〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基8〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド25〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基9〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド28〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基10〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド31〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基11〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド34〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基12〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド37〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基13〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド40〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基14〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド43〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基15〜175；SEQ ID NO: 166のヌクレオチド46〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基16〜175；およびSEQ ID NO: 166のヌクレオチド49〜525によりコードされるSEQ ID NO: 167のアミノ酸残基17〜175が含まれる。本発明のN末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28 C2変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００７０】
IL-28B C2変異体に加えて、本発明はまた、成熟ポリペプチドの三番目のシステインの位置C3に変異を有するIL-28Bポリペプチドを含む。例えば、SEQ ID NO: 6のポリペプチドのN末端からC3とは、50位、または大腸菌内で発現させた場合は51位（N末端メチオニンの追加のため）のシステインである（例えば、SEQ ID NO: 17を参照されたい）。本発明のIL-28B C3変異分子には、例えば、SEQ ID NO: 127および129に示されるIL-28B C3変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 126および128に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる（PCT公開WO 03/066002（Kotenko et al.））。本発明のさらなるIL-28B C3変異分子には、SEQ ID NO: 135および137に示されるIL-28B C3変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 134および136に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる（PCT公開WO 03/066002（Kotenko et al.））。
【００７１】
N末端の生物学的に活性であるIL-28B C3変異体には、例えば、SEQ ID NO: 168のヌクレオチド4〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基2〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド7〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基3〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド10〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基4〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド13〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基5〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド16〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基6〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド19〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基7〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド22〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基8〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド25〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基9〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド28〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基10〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド31〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基11〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド34〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基12〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド37〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基13〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド40〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基14〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド43〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基15〜176；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド46〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基16〜176；およびSEQ ID NO: 168のヌクレオチド49〜528によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基17〜176が含まれる。本発明のN末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28 C3変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００７２】
C末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28B C3変異体には、例えば、SEQ ID NO: 168のヌクレオチド1〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基1〜175が含まれる。
【００７３】
N末端およびC末端の生物学的に活性であるIL-28B C3変異体には、例えば、SEQ ID NO: 168のヌクレオチド4〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基2〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド7〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基3〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド10〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基4〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド13〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基5〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド16〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基6〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド19〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基7〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド22〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基8〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド25〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基9〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド28〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基10〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド31〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基11〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド34〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基12〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド37〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基13〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド40〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基14〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド43〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基15〜175；SEQ ID NO: 168のヌクレオチド46〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基16〜175；およびSEQ ID NO: 168のヌクレオチド49〜525によりコードされるSEQ ID NO: 169のアミノ酸残基17〜175が含まれる。本発明のN末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-28 C3変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００７４】
本発明のIL-28Bポリペプチドには、例えば、SEQ ID NO: 5、16、122、124、126、128、130、132、134、136、166、および168に示されるIL-28Bポリヌクレオチド分子によりコードされる、それぞれSEQ ID NO: 6、17、123、125、127、129、131、133、135、137、167、および169、それらのC2変異体、それらのN末端が修飾されたC2変異体、それらのC末端が修飾されたC2変異体、それらのN末端およびC末端のC2変異体、それらのC3変異体、それらのN末端が修飾されたC3変異体、それらのC末端が修飾されたC3変異体、それらのN末端およびC末端が修飾されたC3変異体、それらの断片、ならびにそれらの融合タンパク質が含まれる。
【００７５】
本発明のZcyto21すなわちIL-29ポリペプチドはまた、成熟ポリペプチドの五番目のシステインC5において変異を有する。例えば、SEQ ID NO: 4のポリペプチドのN末端からC5とは、171位、または大腸菌内で発現された場合は172位（N末端メチオニンの追加のため）のシステインである（例えば、SEQ ID NO: 15を参照されたい）。IL-29のこの五番目のシステインすなわちC5は、例えば、セリン、アラニン、スレオニン、バリン、またはアスパラギンに変異誘導され得る。これらのIL-29 C5変異ポリペプチドは、Cl（SEQ ID NO: 4のCysl5）／C3（SEQ ID NO: 4のCysll2）およびC2（SEQ ID NO: 4のCys49）／C4（SEQ ID NO: 4のCysl45）のジスルフィド結合パターンを有する。本発明のさらなるIL-29 C5変異分子には、SEQ ID NO: 27、29、83、85、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、および161に示されるIL-29 C5変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 26、28、82、84、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、および160に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる。本発明のさらなるIL-29 C5変異分子には、SEQ ID NO: 87、89、95、および97に示されるIL-29 C5変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 86、88、94、および96に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる（PCT公開WO 03/066002（Kotenko et al.））。本発明のさらなるIL-29 C5変異分子には、SEQ ID NO: 103、105、111、および113に示されるIL-29 C5変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 102、104、110、および112に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる（PCT公開WO 02/092762（Baum et al.））。
【００７６】
本発明はまた、少なくとも部分的に抗腫瘍活性および／または免疫調節活性を提供する生物学的に活性であるIL-29 C5システイン変異体を含む。IL-29のN末端から五番目のシステインすなわちC5は、別のシステインとジスルフィド結合を形成しない任意のアミノ酸、例えばセリン、アラニン、スレオニン、バリン、またはアスパラギンに変異誘導され得る。本発明の生物学的に活性であるIL-29 C5システイン変異体には、IL-29のN末端欠失物、C末端欠失物、ならびにNおよびC末端欠失物、例えば、SEQ ID NO: 172および174のポリヌクレオチドによりコードされる、それぞれSEQ ID NO: 173および175のポリペプチドが含まれる。
【００７７】
N末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C5変異体には、例えば、SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド10〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜182；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド4〜528によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基2〜176；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド7〜528によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基3〜176；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド10〜528によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基4〜176；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド13〜528によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基5〜176；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド16〜528によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基6〜176；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド19〜528によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基7〜176；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド22〜528によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基8〜176；およびSEQ ID NO: 149のヌクレオチド25〜528によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基9〜176が含まれる。本発明のN末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C5変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００７８】
C末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C5変異体には、例えば、SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド1〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基1〜172；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜525によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜175；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜522によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜174；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜519によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜173；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜516によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜172；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜513によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜171；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜510によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜170；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜507によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜169；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜504によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜168；SEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜501によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜167；およびSEQ ID NO: 149のヌクレオチド1〜498によりコードされるSEQ ID NO: 150のアミノ酸残基1〜166が含まれる。
【００７９】
N末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C5変異体には、例えば、SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド4〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基2〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド7〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基3〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド10〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド10〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド10〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド10〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜179；SEQ ID NO: 147のヌクレオチド10〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜178；SEQ ID NO: 147のヌクレオチド10〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜177；SEQ ID NO: 147のヌクレオチド10〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜176；SEQ ID NO: 147のヌクレオチド10〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜175；SEQ ID NO: 147のヌクレオチド10〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド10〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド10〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基4〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ��残基5〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド13〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基5〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド16〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基6〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド19〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基7〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜534により���ードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド22〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基8〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド25〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基9〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド28〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基10〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド31〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基11〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜179；SEQ ID NO: 17
2のヌクレオチド34〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド34〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基12〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド37〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基13〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基40〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド40〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基14〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜528に��りコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜173；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド43〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基15〜172；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜546によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜182；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜543によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜181；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜540によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜180；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜537によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜179；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜534によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜178；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜531によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜177；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜528によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜176；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜525によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜175；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜522によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜174；SEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜519によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜173；およびSEQ ID NO: 172のヌクレオチド46〜516によりコードされるSEQ ID NO: 173のアミノ酸残基16〜172が含まれる。本発明のN末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C5変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００８０】
さらなるN末端およびC末端の生物学的に活性であるIL-29 C5変異体には、例えば、SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜528によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜176；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜525によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜175；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜522によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜174；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜519によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜173；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜516によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜172；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜513によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜171；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜510によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜170；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜507によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜169；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜504によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜168；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜501によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜167；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド4〜498によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基2〜166；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜528によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜176；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜525によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜175；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜522によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜174；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜519によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜173；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜516によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜172；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜513によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜171；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜510によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜170；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜507によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜169；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜504によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜168；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜501によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜167；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド7〜498によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基3〜166；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜528によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜176；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜525によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜175；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜522によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜174；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜519によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜173；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜516によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜172；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜513によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜171；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜510によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜170；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜507によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜169；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜504によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜168；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜501によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜167；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド10〜498によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基4〜166；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜528によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜176；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜525によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸��基5〜175；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜522によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜174；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜519によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜173；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜516によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜172；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜513によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜171；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜510によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜170；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜507によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜169；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜504によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜168；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜501によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜167；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド13〜498によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基5〜166；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜528によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜176；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜525によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜175；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜522によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜174；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜519によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜173；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜516によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜172；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜513によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜171；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜510によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜170；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜507によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜169；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜504によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜168；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜501によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜167；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド16〜498によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基6〜166；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜528によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜176；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜525によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜175；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜522によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜174；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜519によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜173；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜516によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜172；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜513によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜171；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜510によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜170；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜507によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜169；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜504によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜168；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜501によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜167；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド19〜498によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基7〜166；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜528によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜176；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜525によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜175；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜522によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜174；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜519によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜173；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜516によりコ���ドされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜172；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜513によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜171；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜510によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜170；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜507によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜169；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜504によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜168；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜501によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜167；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド22〜498によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基8〜166；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜528によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜176；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜525によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜175；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜522によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜174；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜519によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜173；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜516によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜172；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜513によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜171；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜510によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜170；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜507によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜169；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜504によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜168；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜501によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜167；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド25〜498によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基9〜166；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜528によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜176；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜525によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜175；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜522によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜174；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜519によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜173；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜516によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜172；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜513によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜171；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜510によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜170；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜507によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜169；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜504によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜168；SEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜501によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜167；およびSEQ ID NO: 174のヌクレオチド28〜498によりコードされるSEQ ID NO: 175のアミノ酸残基10〜166が含まれる。本発明のN末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C5変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００８１】
IL-29 C5変異体に加えて、本発明はまた、成熟ポリペプチドの一番目のシステインの位置C1に変異を有するIL-29ポリペプチドを含む。例えば、SEQ ID NO: 4のポリペプチドのN末端からC1とは、15位、または大腸菌内で発現させた場合は16位（N末端メチオニンの追加のため）のシステインである（例えば、SEQ ID NO: 15を参照されたい）。これらのIL-29 C1変異ポリペプチドは、C2（SEQ ID NO: 4のCys49）／C4（SEQ ID NO: 4のCysl45）およびC3（SEQ ID NO: 4のCys112）／C5（SEQ ID NO: 4のCysl71）の推定ジスルフィド結合パターンを有する。本発明のさらなるIL-29 C1変異分子には、SEQ ID NO: 75、77、79、および81に示されるIL-29 C1変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 74、76、78、および80に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる。本発明のさらなるIL-29 C1変異分子には、SEQ ID NO: 91、93、99、および101に示されるIL-29 C1変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 90、92、98、および100に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる（PCT公開WO 03/066002（Kotenko et al.））。本発明のさらなるIL-29 C1変異分子には、SEQ ID NO: 107、109、115、および117に示されるIL-29 C1変異ポリペプチドをコードする、それぞれSEQ ID NO: 106、108、114、および116に示される、DNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子が含まれる（PCT公開WO 02/092762（Baum et al.））。
【００８２】
本発明はまた、少なくとも部分的に抗腫瘍活性および／または免疫調節活性を提供する生物学的に活性であるIL-29 C1システイン変異体を含む。IL-29のN末端から一番目のシステインすなわちC1は、別のシステインとジスルフィド結合を形成しない任意のアミノ酸、例えばセリン、アラニン、スレオニン、バリン、またはアスパラギンに変異誘導され得る。本発明の生物学的に活性であるIL-29 C1システイン変異体には、IL-29のN末端欠失物、C末端欠失物、ならびにNおよびC末端欠失物、例えば、SEQ ID NO: 170のポリヌクレオチドによりコードされるSEQ ID NO: 171のポリペプチドが含まれる。
【００８３】
N末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C1変異体には、例えば、SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド22〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基8〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド25〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基9〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜182によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド37〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基13〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜182；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜182；およびSEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜546によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜182が含まれる。本発明のN末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C1変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００８４】
C末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C1変異体には、例えば、SEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜173；およびSEQ ID NO: 170のヌクレオチド1〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基1〜172が含まれる。
【００８５】
N末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C1変異体には、例えば、SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド4〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基2〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド7〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基3〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド10〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基4〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド13〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基5〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド16〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基6〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド19〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基7〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド22〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基8〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド22〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基8〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド22〜537によりコードされるSEQ 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170のヌクレオチド25〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基9〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド25〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基9〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド28〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基10〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド31〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基11〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド34〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基12〜173；SEQ ID NO: 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ID NO: 170のヌクレオチド37〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基13〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド37〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基13〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド37〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基13〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド37〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基13〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド37〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基13〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド37〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基13〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド40〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基14〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜173；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド43〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基15〜172；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜543によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜181；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜540によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜180；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜537によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜179；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜534によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜178；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜531によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜177；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜528によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜176；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜525によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜175；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜522によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜174；SEQ ID NO: 170のヌクレオチド46〜519によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜173；およびSEQ ID NO: 170のヌクレオ���ド46〜516によりコードされるSEQ ID NO: 171のアミノ酸残基16〜172が含まれる。本発明のN末端およびC末端が修飾された生物学的に活性であるIL-29 C1変異体はまた、例えば大腸菌で発現させた場合、N末端メチオニンを含み得る。
【００８６】
本発明のIL-29ポリペプチドには、例えば、SEQ ID NO: 3、14、26、28、40、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、138、140、142、144、146、148、175、152、154、156、158、160、170、172、および174に示されるIL-29ポリヌクレオチド分子によりコードされる、それぞれSEQ ID NO: 4、15、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、171、173、および175、それらのC1変異体、それらのN末端が修飾されたC1変異体、それらのC末端が修飾されたC1変異体、それらのN末端およびC末端のC1変異体、それらのC5変異体、それらのN末端が修飾されたC5変異体、それらのC末端が修飾されたC5変異体、それらのN末端およびC末端が修飾されたC5変異体、それらの断片、ならびにそれらの融合タンパク質が含まれる。IL-29ポリペプチドはさらに、SEQ ID NO: 119に示されるシグナル配列またはSEQ ID NO: 121に示されるシグナル配列を含み得る。SEQ ID NO: 119のシグナル配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO: 118に示される。SEQ ID NO: 120のシグナル配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO: 121に示される。
【００８７】
表3は、SEQ ID 30、31、32、33、34、および35において縮重ヌクレオチドの位置を表示するのに使用する一文字コードを示す。「変換（Resolution）」はコード文字により表わされるヌクレオチドである。「相補体」は相補的なヌクレオチドのコードを示す。例えば、コードYはCまたはTのいずれかを表し、その相補体RはAまたはGを表す。AはTに相補的であり、GはCに相補的である。
【００８８】
（表３）
2009502800.tif 000005
【００８９】
SEQ ID NO: 30、31、32、33、34、および35において使用される縮重コドンを、所定のアミノ酸についての全ての可能性のあるコドンを含めて表4に示す。
【００９０】
（表４）
2009502800.tif 000006
【００９１】
当業者は、各アミノ酸をコードする全ての可能性のあるコドンを代表する縮重コドンを決定する際にある曖昧さを導入するものであることを認識するはずである。例えば、セリンに対する縮重コドン（WSN）は、一部の環境ではアルギニン（AGR）をコードし、アルギニンに対する縮重コドン（MGN）は、一部の環境ではセリン（AGY）をコードする。同様の関係は、フェニルアラニンをコードするコドンとロイシンをコードするコドンの間にも存在する。従って、縮重配列に含まれる一部のポリヌクレオチドは変種アミノ酸配列をコードする場合もあるが、当業者はSEQ ID NO: 19、21、23、25、27、および29のアミノ酸配列を参照することによりそのような変種配列を容易に同定することができる。本明細書に記載されるようにその機能について変種配列を容易に試験することができる。
【００９２】
当業者はまた、異なる種が「優先的なコドンの使用」を示し得ることを認識すると思われる。一般論については、Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982を参照されたい。本明細書中で使用する場合、「優先的なコドンの使用」または「優先コドン」という用語は、特定種の細胞内で最も高頻度で使用されるタンパク質翻訳コドンを意味する専門用語である、つまり、各アミノ酸をコードする可能性のあるコドンの中から一つまたは数個が好まれるのである（表4を参照されたい）。例えば、アミノ酸スレオニン（Thr）は、ACA、ACC、ACG、またはACTによりコードされ得るが、哺乳動物細胞においてはACCが最も一般に使用されるコドンであり；他の種、例えば昆虫細胞、酵母、ウイルス、または細菌においては、異なるThrコドンが優先され得る。特定の種における優先コドンは、当技術分野で公知の様々な方法によって本発明のポリヌクレオチドに導入できる。例えば、優先コドン配列の組換えDNAへの導入は、特定の細胞型または種におけるタンパク質の翻訳の効率を向上させることによって、そのタンパク質の産生を増進し得る。従って、SEQ ID NO: 30、31、32、33、34、および35に開示される縮重コドン配列は、当技術分野で一般的に使用され、本明細書中に開示される様々な細胞型および種におけるポリヌクレオチド発現を最適化するための鋳型の役目を果たす。優先コドンを含む配列は、本明細書中に開示されるように様々な種における発現について試験および最適化でき、機能について試験することができる。
【００９３】
上記のように、本発明の単離されたポリヌクレオチドはDNAおよびRNAを含む。DNAおよびRNAの調製方法は当技術分野で周知である。一般的に、RNAは、多量のIL-28またはIL-29 RNAを産生する組織または細胞から単離される。このような組織および細胞は、ノーザンブロットによって（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980）または標的細胞もしくは組織に対する活性について様々な細胞型由来の条件培地をスクリーニングすることによって同定される。その活性またはRNA産生細胞もしくは組織が同定されれば、総RNAは、イソチオシアン酸グアニジウム抽出およびその後のCsCl勾配下での遠心分離による単離を用いて調製できる（Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979）。ポリ（A）+ RNAは、AvivおよびLederの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972）を用いて総RNAから調製される。相補的DNA（cDNA）は、公知の方法を用いてポリ（A）+ RNAから調製される。代替的にゲノムDNAを単離することもできる。次いで、IL-28またはIL-29ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションまたはPCRによって同定および単離される。
【００９４】
IL-28またはIL-29をコードする全長クローンは、従来のクローニング手順によって獲得できる。相補的DNA（cDNA）クローンが好ましいが、一部の用途（例えば、トランスジェニック動物における発現）については、ゲノムクローンを使用すること、または少なくとも一つのゲノムイントロンを含むようcDNAクローンを改変することが好ましい場合がある。cDNAおよびゲノムクローンの調製方法は周知かつ当技術分野の技術常識レベルであり、ライブラリの探索（probing）または刺激（priming）のための本明細書中に開示される配列またはその一部の使用を含む。発現ライブラリは、IL-28受容体断片または他の特異的結合パートナーに対する抗体を用いて探索され得る。
【００９５】
当業者は、開示される配列、例えば、SEQ ID NO: 1、3、および5のそれぞれに開示される配列が、ヒトIL-28およびIL-29群の中の単一の対立遺伝子の変異を表すこと、および対立遺伝子によるばらつきおよび選択的スプライシングの発生が見込まれることを認識すると思われる。例えば、IL-29変種体は、WO 02/086087に記載されるように、SEQ ID NO: 4に示されるアミノ酸残基169（Asn）がArg残基であることが同定された。このような対立遺伝子変種体は本発明に含まれる。この配列の対立遺伝子変種体は、標準的な手順に従って異なる個体由来のcDNAまたはゲノムライブラリを探索することによってクローニングできる。システイン変異に加えて、沈黙突然変異を含む変種体およびその変異によりアミノ酸が変化した変種体を含むSEQ ID NO: 1、3、および5に示されるDNA配列の対立遺伝子変種体は本発明の範囲内であり、SEQ ID NO: 2、4、および6の対立遺伝子変種体たるタンパク質も同様である。IL-28またはIL-29ポリペプチドの特性を保持する選択的スプライシング後のmRNAから得られたcDNAは本発明の範囲内であり、そのようなcDNAおよびmRNAによりコードされるポリペプチドも同様である。これらの配列の対立遺伝子変種体およびスプライス変種体は、当技術分野で公知の標準的手順に従って異なる個体または組織由来のcDNAまたはゲノムライブラリを探索することによってクローニングでき、システインをコードするポリヌクレオチドまたはシステイン残基に対する変異は本明細書中に記載されるようにして導入することができる。
【００９６】
本発明の態様において、単離されたIL-28またはIL-29をコードする核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO: 1、3、5、12、14、16、18、20、22、24、26、28、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、および174の群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子またはSEQ ID NO: 1、3、5、12、14、16、18、20、22、24、26、28、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、および174と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズし得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融点（Tm）よりも約5℃低い温度となるよう選択される。Tmは、標的配列の50％が完全一致プローブとハイブリダイズする（規定のイオン強度およびpH下の）温度である。
【００９７】
核酸分子の対、例えばDNA-DNA、RNA-RNA、およびDNA-RNAは、そのヌクレオチド配列が一定の相補性を有する場合にハイブリダイズし得る。ハイブリッドはその二重らせん内に不一致の塩基対を許容し得るが、そのハイブリッドの安定性は不一致の程度に影響を受ける。不一致を含むハイブリッドのTmは、1〜1.5％の不一致塩基対ごとに1℃低下する。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることで、ハイブリッド内に存在し得る不一致の程度を制御することが可能である。ストリンジェンシーの程度は、ハイブリダイゼーション温度の上昇およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度の減少に伴って上昇する。
【００９８】
特定のポリヌクレオチドハイブリッドの使用にこれらの条件を適応させることは、当業者の能力のうちである。特定の標的配列についてのTmは、標的配列の50％が完全に一致するプローブ配列にハイブリダイズし得る（規定の条件下の）温度である。Tmに影響する条件には、ポリヌクレオチドプローブの大きさおよび塩基対の内容、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度、ならびにハイブリダイゼーション溶液中の脱安定化剤の存在が含まれる。Tmを算出するための数式は当技術分野で公知であり、それらはDNA、RNA、およびDNA-RNAハイブリッドならびにポリヌクレオチドプローブ配列の長さに特異的である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987);およびWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990)を参照されたい）。OLIGO 6.0（LSR; Long Lake, MN）およびPrimer Premier 4.0（Premier Biosoft International; Palo Alto, CA）等の配列分析ソフトウェアならびにインターネット上のサイトは、所定の配列を分析するためおよびユーザー規定の基準に基づきTmを算出するために使用可能なツールである。このようなプログラムはまた、規定条件下で所定の配列を分析し、適当なプローブ配列を同定することができる。典型的には、50を超える塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、算出されたTmよりも約20〜25℃低い温度で実施される。50未満の塩基対の小さいプローブについては、ハイブリダイゼーションは典型的には、算出されたTmでまたはそれよりも5〜10℃低い温度で実施される。これにより、DNA-DNAおよびDNA-RNAハイブリッドについての最大効率のハイブリダイゼーションが可能になる。
【００９９】
ハイブリダイゼーション後、核酸分子はストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的なストリンジェントな洗浄条件は、55〜65℃で、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する0.5×〜2×SSCの溶液中での洗浄を含む。すなわち、変種体、システイン変異体、またはIL-28もしくはIL-29ポリペプチドをコードする核酸分子は、洗浄のストリンジェンシーが55℃で0.1％ SDSを含有する0.5×SSCまたは65℃で0.1％ SDSを含有する2×SSCを含む55〜65℃で0.1％ SDSを含有する0.5×SSC〜2×SSCに相当するストリンジェントな洗浄条件下で、SEQ ID NO: 1、3、5、12、14、16、18、20、22、24、26、28、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、および174（またはその相補体）の群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズする。当業者は、例えば、洗浄溶液中のSSCをSSPEに置き換えることによって等価な条件を容易に考案することができる。
【０１００】
典型的な高度にストリンジェントな洗浄条件は、50〜65℃で、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する0.1×〜0.2×SSCの溶液中での洗浄を含む。換言すると、IL-28またはIL-29ポリペプチドの変種体をコードする核酸分子は、洗浄のストリンジェンシーが50℃で0.1％ SDSを含有する0.1×SSCまたは65℃で0.1％ SDSを含有する0.2×SSCを含む50〜65℃で0.1％ SDSを含有する0.1×〜0.2×SSCに相当する高度にストリンジェントな洗浄条件下で、SEQ ID NO: 1、3、5、12、14、16、18、20、22、24、26、28、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、および174（またはその相補体）の群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズする。
【０１０１】
本発明はまた、本発明のポリペプチド、例えばSEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175のポリペプチドと実質的に類似の配列同一性を有するIL-28またはIL-29ポリペプチドを提供する。「実質的に類似の配列同一性」という用語は、本明細書中で、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、もしくは175にそれぞれ示される配列またはそれらのオルソログと少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％超、96％超、97％超、98％超、99％超、99.5％超の配列同一性を有するポリペプチドを表すのに使用される。本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはその断片と少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または99.5％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はさらに、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む。本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチドは、好ましくは組換えポリペプチドである。別の局面において、本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチドは、少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有する。例えば、本発明のIL-29ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、または175由来の少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有するポリペプチドに関する。パーセント同一性を決定する方法については以下に記載する。
【０１０２】
本発明はまた、二つの基準： SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、もしくは175のアミノ酸配列を有するコードされるポリペプチドとの間の類似性の決定、および／または上記のようなハイブリダイゼーションアッセイ法、を用いて同定され得る変種の核酸分子を意図する。このような変種体には、（1）洗浄のストリンジェンシーが55〜65℃で0.1％ SDSを含有する0.5×〜2×SSCに相当するストリンジェントな洗浄条件下でSEQ ID NO: 1、3、5、12、14、16、18、20、22、24、26、28、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、もしくは174（もしくはその相補体）のヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズするか；または（2）SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、もしくは175のアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは95％超、96％超、97％超、98％超、99％超の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。あるいは、変種体は、（1）洗浄のストリンジェンシーが50〜65℃で0.1％ SDSを含有する0.1×〜0.2×SSCに相当する高度にストリンジェントな洗浄条件下でSEQ ID NO: 1、3、5、12、14、16、18、20、22、24、26、28、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、または174（またはその相補体）のヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズし；かつ（2）SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、162、164、166、168、170、172、または174のアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％超、96％超、97％超、98％超、99％超の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子と特徴付けることができる。
【０１０３】
本発明はさらに、本明細書中に開示される癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはその重症度を軽減しもしくはその状態もしくは症状の少なくとも一つを抑制する、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１０４】
パーセント配列同一性は従来的な方法によって決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)を参照されたい。簡単に言うと、二つのアミノ酸配列を、ギャップ開始ペナルティ（gap opening penalty）10、ギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）1、および表5（アミノ酸は標準的な一文字コードによって示される）に示されるようなHenikoff and Henikoff （前出）の「BLOSUM62」スコア行列を用いてアラインメントスコアが最適となるよう整列させる。
【０１０５】
2009502800.tif 000007
【０１０６】
（表５）
2009502800.tif 000008
【０１０７】
当業者は、多くの確立されたアルゴリズムが二つのアミノ酸配列を整列させるのに使用可能であることを認識している。PearsonおよびLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列および推定変種IL-28またはIL-29のアミノ酸配列が共有する同一性のレベルを試験するのに適したタンパク質アラインメント法である。FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)およびPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990)に記載される。
【０１０８】
簡単に言うと、FASTAは最初に、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮せずに、クエリー配列（例えば、SEQ ID NO: 2）および試験配列が共有する最も高密度の一致部分（ktup変数が1の場合）または一致部分の対（ktup変数が2の場合）のいずれかを有する領域を同定することによって配列類似性を特徴付ける。次いで、最も高密度の一致部分を有する10個の領域について、アミノ酸置換行列を用いて全てのアミノ酸の対の類似性を比較することによって再計算を行い、最も高いスコアに貢献する残基のみを含むようその領域の両端を「切り落とす（trimmed）」。次いで、（配列の長さおよびktup値に基づき所定の式により算出された）「カットオフ」値を超えるスコアを示す領域がいくつかあった場合、切り出した初期領域が、ギャップを含む近似アラインメントを形成するよう結びつけることができるかどうかを決定する試験を行う。最後に、二つのアミノ酸配列の最高スコアの領域を、アミノ酸の挿入および欠失を許容する改良型ニードルマン-ヴンシュ-セラーズアルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974)）を用いて整列させる。FASTA分析における好ましいパラメータは、ktup=1、ギャップ開始ペナルティ=10、ギャップ伸長ペナルティ=1、および置換行列=BLOSUM62である。これらのパラメータは、Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990)の付属書類2で説明されるように、スコア行列ファイル（「SMATRIX」）を修正することによってFASTAプログラムに組み込むことができる。
【０１０９】
FASTAはまた、上記の比率を用いて核酸分子の配列同一性を決定するのにも使用することができる。ヌクレオチド配列の比較のためのktup値は、その他のパラメータを既定値で設定する場合、1〜6の範囲、好ましくは3〜6の範囲、最も好ましくは3である。
【０１１０】
変種IL-28もしくはIL-29ポリペプチドまたは実質的に類似の配列同一性を有するポリペプチドは、一つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、または付加を含むことで特徴付けられる。これらの変化は、好ましくは微小なもの、すなわち保存的アミノ酸置換（表6を参照されたい）およびそのポリペプチドのフォールディングまたは活性に有意な影響を及ぼさないその他の置換；小さな欠失、典型的には1〜約30アミノ酸の欠失；ならびにアミノ末端もしくはカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基、約20〜25残基までの小型のリンカーペプチド、または親和性タグである。従って本発明は、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、または175の対応する領域と少なくとも80％、少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または99％超の同一性の配列を含むポリペプチドを含む。親和性タグを含むポリペプチドはさらに、IL-28およびIL-29ポリペプチドと親和性タグの間にタンパク質分解切断部位を含み得る。好ましいこのような部位には、トロンビン切断部位および第Xa因子切断部位が含まれる。
【０１１１】
（表６）
2009502800.tif 000009
【０１１２】
構造上の完全性を維持するのに重要な領域またはドメインを含むアミノ酸残基の決定が行われ得る。これらの領域内で、変化に多少の許容性がありその分子の全体の三次元構造を維持し得る特定残基が決定され得る。配列構造を分析する方法には、高いアミノ酸同一性またはヌクレオチド同一性を有する複数配列のアライメント、二次構造の傾向、バイナリパターン、相補的パッキング（complementary packing）、および内部の極性相互作用が含まれるがこれらに限定されない（Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5: 372-376, 1995およびCordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996）。一般的に、分子の修飾の設計または特定の断片の同定においては、構造の決定は修飾分子の活性の評価と共に行われ得る。
【０１１３】
アミノ酸の変更は、IL-28またはIL-29ポリペプチドにおいて、生物学的活性に必須の高次元構造の破壊を最小限に抑えるよう行われる。例えば、IL-28またはIL-29ポリペプチドが一つまたは複数のヘリックスを含む場合、アミノ酸残基の変更は、そのヘリックスの幾何学構造および立体配座の変更が一部の重要機能、例えばその分子の結合パートナーへの結合を減衰させる他の分子要素を破壊しないように行われ得る。アミノ酸配列の変更の効果は、例えば、上記のようなコンピューターモデリングによって予測されるか、または結晶構造の分析によって決定され得る（例えば、Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995を参照されたい）。当技術分野で周知の他の技術は、変種タンパク質と標準分子（例えば、天然タンパク質）のフォールディングを比較するものである。例えば、変種分子および標準分子におけるシステインパターンの比較がなされ得る。質量スペクトルならびに還元およびアルキル化を用いる化学的修飾は、システイン残基がジスルフィド結合に関与するのかそれともそのような関与がないのかを決定する方法を提供する（Bean et al., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2: 1732-1748. 1993;およびPatterson et al., Anal. Chem. 66: 3727-3732, 1994）。一般的に、修飾分子が標準分子と同じシステインパターンを有さない場合、フォールディングが影響を受けていると考えられる。別の周知かつ受け入れられているフォールディング測定方法は、円偏光二色性（circular dichrosism）（CD）である。修飾分子および標準分子により生じたCDスペクトルの測定および比較は慣用的作業である（Johnson, Proteins 7:205-214, 1990）。結晶学は、周知のフォールディングおよび構造を分析する別の方法である。核磁気共鳴（NMR）、消化ペプチドマッピング、およびエピトープマッピングもまた、タンパク質間およびポリペプチド間のフォールディングおよび構造上の類似性を分析するための公知の方法である（Schaanan et al., Science 257: 961-964, 1992）。
【０１１４】
SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、または175に示されるIL-28またはIL-29ポリペプチド配列のホップ／ウッズ親水性プロファイルが作成され得る（Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986およびTriquier et al., Protein Engineering 11: 153-169, 1998）。このプロファイルは、6残基ウィンドウのスライド移動に基づく。埋もれたG残基、S残基、およびT残基、ならびに露出しているH残基、Y残基、およびW残基は無視される。当業者は、IL-28またはIL-29ポリペプチドのアミノ酸配列の修飾を設計する際に、全体の構造的および生物学的プロファイルを壊さないよう、親水性または疎水性を考慮することを認識していると思われる。置換に関して特に関心が持たれるのは、Val、Leu、およびIleからなる群、またはMet、Gly、Ser、Ala、Tyr、およびTrpからなる群より選択される疎水性残基である。
【０１１５】
必須アミノ酸の同一性はまた、IFN-αと(表1および2に示されるような)IL-28A、IL-28B、およびIL-29のファミリーのメンバーとの間の配列類似性の分析から推測され得る。上記の「FASTA」分析等の方法を用いることで、タンパク質ファミリー内で高い類似性のある領域が同定され、これを用いて保存された領域のアミノ酸配列が分析される。構造に基づき変種ポリヌクレオチドを同定する代替のアプローチは、潜在的な変種IL-28またはIL-29遺伝子をコードする核酸分子が、上記の核酸分子とハイブリダイズできるかどうかを決定することである。
【０１１６】
本発明のポリペプチド内の必須アミノ酸を同定する他の方法は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャン突然変異誘発等の当技術分野で周知の手順である（Cunningham and Wells, Science 244: 1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88: 4498 (1991), Coombs and Corey, 「Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering」, Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)）。後者の技術においては、分子内のあらゆる残基に単一アラニン変異を導入し、得られる分子を、以下に開示する生物学的活性または生化学的活性について試験して、その分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699 (1996)もまた参照されたい。
【０１１７】
本発明はまた、IL-28またはIL-29ポリペプチドの機能的断片およびそのような機能的断片をコードする核酸分子を含む。本明細書中で定義される「機能的」なIL-28もしくはIL-29またはそれらの断片は、その増殖活性もしくは分化活性によって、その特定の細胞機能を誘導もしくは抑制する能力によって、またはその抗IL-28抗体もしくは抗IL-29抗体もしくはIL-28受容体(可溶性のもの、もしくは固定化されたもののいずれか)に特異的に結合する能力によって特徴付けられる。IL-28またはIL-29ポリペプチドの特定の活性およびそれらを試験する方法については、本明細書中に開示されている。上記のように、IL-28およびIL-29ポリペプチドは6ヘリックスバンドルにより特徴付けられる。したがって、本発明はさらに、(a)上記のヘリックスの一つまたは複数を含むポリペプチド分子；および(b)これらのヘリックスの一つまたは複数を含む機能的断片を含む融合タンパク質を提供する。融合タンパク質の中のそれ以外のポリペプチド部分には、別のヘリックスバンドル系サイトカインもしくはインターフェロン、例えばIFN-αによって、または融合タンパク質の分泌を促進する非天然および/もしくは無関係の分泌シグナルペプチドが提供され得る。
【０１１８】
全長ポリペプチド、システイン変異ポリペプチド、生物学的に活性である断片、および融合ポリペプチドを含む本発明のIL-28またはIL-29ポリペプチドは、従来の技法に従い、このポリペプチドをコードする発現ベクターを導入した細胞を用いて生成され得る。本明細書中で使用する場合、「発現ベクターを導入した細胞」には、外来DNA分子の導入によって直接的に操作された細胞および導入したDNAを含むその子孫の両方が含まれる。適当な宿主細胞は、外来DNAで形質転換またはトランスフェクションし培養増殖することのできる細胞型であり、これには細菌、真菌細胞、および培養高等真核生物細胞が含まれる。クローニングしたDNA分子を操作する技術および外来DNAを様々な宿主細胞に導入する技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, およびAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987に開示されている。
【０１１９】
一般的に、本発明のIL-28またはIL-29ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内での発現に必要な、一般的には転写プロモーターおよびターミネーターを含む他の遺伝子エレメントに機能的に連結される。ベクターはまた、通常、一つまたは複数の選択マーカーおよび一つまたは複数の複製起点を含み得るが、当業者は、特定の系においては選択マーカーが別のベクターとして提供され得ることおよび外来DNAの複製が宿主細胞ゲノムへの組み込みによって提供され得ることを認識していると思われる。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター、およびその他のエレメントの選択は、当技術分野における技術常識として行われる設計事項である。多くのそのようなエレメントは文献に記載されており、業者を通じて入手することができる。
【０１２０】
IL-28またはIL-29ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導するため、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知である)が発現ベクターに提供される。分泌シグナル配列は、例えば、システイン変異IL-28またはIL-29、例えばSEQ ID NO: 119またはSEQ ID NO: 121のものであり得るし、別の分泌型タンパク質(例えばt-PA；米国特許第5,641,655号を参照されたい)から得たものまたは新たに合成されたものでもよい。分泌シグナル配列はIL-28またはIL-29 DNA配列に機能的に連結される、すなわち二つの配列は正しいリーディングフレームに結合され、新たに合成されるポリヌクレオチドを宿主細胞の分泌経路に誘導するよう配置される。分泌シグナル配列は通常、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列の5'側に配置されるが、特定のシグナル配列は関心対象のDNA配列の別の場所に配置され得る(例えば、Welchらの米国特許第5,037,743号；Hollandらの米国特許第5,143,830号を参照されたい)。
【０１２１】
幅広い適当な組換え宿主細胞には、グラム陰性原核生物宿主生物が含まれるがこれに限定されない。適当な大腸菌株には、W3110、K12由来MM294株、TG-1、JM-107、BL21、およびUT5600が含まれる。他の適切な株には、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DHl、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF、DH5IMCR、DHlOB、DH10B/p3、DH11S、C600、HBlOl、JMlOl、JM105、JM109、JM11O、K38、RRl、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、ER1647、大腸菌K12、大腸菌K12 RV308、大腸菌K12 C600、大腸菌HBlOl、大腸菌K12 C600 R.sub.k-M.sub.k-、大腸菌K12 RRlが含まれる(例えば、Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)を参照されたい)。その他のグラム陰性原核生物宿主には、セラチア属(Serratia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、カウロバクター属(Caulobacter)が含まれ得る。原核生物宿主には、グラム陽性生物、例えばバチルス属(Bacillus)、例えば、枯草菌(B. subtilis)、B. チューリンゲンシス(B. thuringienesis)、およびB. チューリンゲンシス変種イスラエレンシス(B. thuringienesis var. israelensis)、ならびにストレプトマイセス属(Streptomyces)、例えば、S. リビダンス(S. lividans)、S. アンボファシエンス(S. ambofaciens)、S. フラジアエ(S. fradiae)、およびS. グリセオファスカス(S. griseofuscus)が含まれ得る。適当な枯草菌株には、BR151、YB886、MI119、MI120、およびB170が含まれる(例えば、Hardy, 「Bacillus Cloning Methods」, DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)を参照されたい)。原核生物宿主においてベクターを増やす標準的な技術は当業者に周知である(例えば、Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)を参照されたい)。1つの態様において、本発明の方法は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)にATCC # 27325として寄託されたW3110株で発現させたIL-28またはIL-29を使用する。
【０１２２】
本発明の発現系を用いてIL-28またはIL-29を大量生産する必要がある場合は、バッチ発酵が使用され得る。一般的に、バッチ発酵は、IL-28またはIL-29を発現する大腸菌株を振盪フラスコ培養下の適当な培地中で培養し、600nmでの光学密度(OD)が5〜20になるまで培養することによって、初期段階の種培養フラスコを調製することを含む。適当な培地は、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酵母エキス、動物タンパク質加水分解産物、植物タンパク質加水分解産物、またはカゼイン加水分解産物等の供給源由来の窒素を含む。リン酸は、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸、またはリン酸ナトリウムから供給される。その他の成分は、塩化マグネシウムまたは硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄または塩化第一鉄、および他の微量元素である。培養培地には、培養の向上のために、糖類、例えばフルクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、およびグリセロールが補充され得る。あるいは、IL-28またはIL-29タンパク質を高収量で得るために流加培養が用いられる。IL-28またはIL-29を産生する大腸菌株は、バッチ発酵に接種するのに使用する初期段階の容器について記載したのと同様の条件下で培養される。
【０１２３】
細胞は、発酵後に遠心分離により回収し、ホモジナイズ緩衝液に再懸濁し、例えば、APV-Gaulinホモジナイザー(Invensys APV, Tonawanda, New York)または他のタイプの細胞破壊装置、例えばビーズミルもしくは超音波処理機によってホモジナイズされる。あるいは、細胞は発酵槽から直接採取し、APV-Gaulinホモジナイザーでホモジナイズされる。洗浄した封入体調製物は、還元剤、例えばβメルカプトエタノール(10〜100mM)またはジチオスレイトール(5〜50mM)を含む塩酸グアニジン(5〜8M)または尿素(7〜8M)を用いて可溶化され得る。この溶液は、Tris、リン酸、HEPES、または他の適当な緩衝液を用いて調製され得る。封入体はまた、ラウリル硫酸ナトリウム(0.1〜2%)を含む尿素(2〜4 M)により可溶化され得る。IL-28またはIL-29が屈折性封入体（refractile inclusion body）として蓄積される形質転換大腸菌宿主株から精製されたIL-28またはIL-29を回収するプロセスにおいては、細胞を破壊し遠心分離により封入体を回収する。次いで、封入体を、還元剤を含む6M塩酸グアニジン中で可溶化および変性させる。次いで、還元型IL-28またはIL-29を、制御された再生工程により酸化させる。再フォールディングしたIL-28またはIL-29は、清澄化（clarification）および不溶性タンパク質の除去のためにフィルターを通過させ得る。次いで、この溶液を、清澄化および不溶性タンパク質の除去のためにフィルターを通過させる。IL-28またはIL-29タンパク質を再フォールディングおよび濃縮した後、再フォールディングしたIL-28またはIL-29タンパク質を希釈緩衝液中で陽イオン交換カラムに捕捉させ、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製する。
【０１２４】
培養哺乳動物細胞は本発明における適当な宿主である。外来DNAを哺乳動物宿主細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション(Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973)、電気穿孔(Neumann et al., EMBO J. 1: 841-5, 1982)、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション(Ausubel et al.,前出)、およびリポソーム系トランスフェクション(Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993)、ならびにウイルスベクター(Miller and Rosman, BioTechniques 7: 980-90, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2: 714-6, 1996)が含まれる。培養哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、Levinsonらの米国特許第4,713,339号；Hagenらの米国特許第4,784,950号；Palmiterらの米国特許第4,579,821号；およびRingoldの米国特許第4,656,134号に開示される。適切な培養哺乳動物細胞には、COS-1（ATCC番号CRL1650）、COS-7（ATCC番号CRL1651）、BHK（ATCC番号CRL1632）、BHK570（ATCC番号CRL10314）、293（ATCC番号CRL 1573；Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977）、およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、CHO-K1；ATCC番号CCL 61）細胞株が含まれる。さらなる適当な細胞株は当技術分野において公知であり、公的な寄託機関、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Manassas, VA）から入手することができる。一般的に、強力な転写プロモーター、例えばSV-40またはサイトメガロウイルス由来プロモーターが好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号を参照されたい。その他の適当なプロモーターには、メタロチオネイン遺伝子由来プロモーター(米国特許第4,579,821号および同第4,601,978号)およびアデノウイルス主要後期プロモーターが含まれる。
【０１２５】
薬剤選択は一般的に、外来DNAが挿入された培養哺乳動物細胞を選択するために使用される。このような細胞は通常、「トランスフェクタント」と称される。選択剤の存在下で培養され、関心対象の遺伝子を子孫に引き継ぐことのできる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と称される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬剤、例えばG-418等の存在下で行われる。選択系はまた、関心対象の遺伝子の発現レベルを増加させるためにも使用され、このプロセスは「増幅」と称される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、次いで高レベルの導入遺伝子産物を産生する細胞を選択するために、選択剤の量を増加させることによって行われる。好ましい増幅可能な選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。その他の薬剤耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)もまた使用され得る。FACSソーティングまたは磁気ビーズ分離技術などの手段によってトランスフェクト細胞を非トランスフェクト細胞から分別するために表現型の変化を導入する代替のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質または細胞表面タンパク質、例えばCD4、CD8、クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼが使用され得る。
【０１２６】
植物細胞、昆虫細胞、および鳥類細胞を含む、その他の高等真核生物細胞もまた宿主として使用され得る。植物細胞内で遺伝子を発現させるためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)の使用は、Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987に概説されている。昆虫細胞の形質転換およびそれによる外来ポリペプチドの産生は、Guarinoらの米国特許第5,162,222号、およびWIPO公報WO 94/06463に開示される。昆虫細胞には、一般的にはオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)に由来する組換えバキュロウイルスを感染させ得る。King, L.A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994;およびRichardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照されたい。組換えバキュロウイルスを作製する第二の方法は、Luckow(Luckow, V.A, et al., J. Virol 67: 4566-79, 1993)に記載されるトランスポゾン系を用いる。この系は、Bac-to-Bacキット(Life Technologies, Rockville, MD)として販売されている。この系は、IL-28またはIL-29ポリペプチドをコードするDNAを「バクミド（bacmid）」と呼ばれる大型のプラスミドとして大腸菌内で維持されるバキュロウイルスゲノムに移行させるために、Tn7トランスポゾンを含むトランスファーベクターpFastBac1(商標)(Life Technologies)を用いる。pFastBac1(商標)トランスファーベクターは、関心対象の遺伝子(この場合はIL-28またはIL-29)の発現を誘導するために、AcNPVポリヘドリンプロモーターを使用する。しかし、pFastBac1(商標)は大規模な改造が可能である。ポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルス感染初期に発現され分泌型タンパク質の発現に有利なことが示されているバキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター(Pcor、p6.9、またはMPプロモーターとしても公知である)で置換することができる。Hill-Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990；Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994；およびChazenbalk, G.D., and Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995を参照されたい。このようなトランスファーベクター構築物においては、小型または大型の塩基性タンパク質プロモーターが使用され得る。さらに、天然のIL-28またはIL-29分泌シグナル配列を昆虫タンパク質由来の分泌シグナル配列で置換したトランスファーベクターが構築され得る。例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチメリチン(Invitrogen, Carlsbad, CA)、またはバキュロウイルスgp67(PharMingen, San Diego, CA)由来の分泌シグナル配列が、天然のIL-28またはIL-29分泌シグナル配列との置換のために構築物において使用され得る。さらに、トランスファーベクターは、発現されるIL-28またはIL-29ポリペプチドのC末端またはN末端のエピトープタグ、例えばGlu-GluエピトープタグをコードするDNAとのインフレーム融合を含み得る(Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985)。当技術分野で公知の技術を用いて、IL-28またはIL-29を含むトランスファーベクターで大腸菌を形質転換し、組換えバキュロウイルスの指標となる分断されたlacZ遺伝子を含むバクミドがスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドDNAは一般的技術を用いて単離され���スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞、例えばSf9細胞をトランスフェクトするのに使用される。その後、IL-28またはIL-29を発現する組換えウイルスが産生される。組換えウイルスのストックは、当技術分野で一般的に使用される方法によって作製される。
【０１２７】
組換えウイルスは、宿主細胞、典型的にはヨトウガの幼虫、スポドプテラ・フルジペルダ由来の細胞株を感染するのに使用される。一般論については、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994を参照されたい。別の適当な細胞株は、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)由来のHigh FiveO(商標)細胞株(Invitrogen)である(米国特許第5,300,435号)。
【０１２８】
酵母細胞を含む真菌細胞もまた本発明において使用され得る。この点で特に関心がある酵母種には、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、およびピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)が含まれる。外来DNAで出芽酵母細胞を形質転換しその細胞から組換えポリペプチドを得る方法は、例えば、Kawasakiの米国特許第4,599,311号；Kawasakiらの米国特許第4,931,373号；Brakeの米国特許第4,870,008号；Welchらの米国特許第5,037,743号；およびMurrayらの米国特許第4,845,075号に開示される。形質転換細胞は、選択マーカーによって決定される表現型、通常は薬剤耐性かまたは特定の栄養素(例えば、ロイシン)の非存在下で増殖する能力により選択される。出芽酵母で使用するのに好ましいベクター系は、グルコース含有培地における培養によって形質転換細胞を選択できる、Kawasakiら(米国特許第4,931,373号)により開示されるPOT1ベクター系である。酵母における使用に適したプロモーターおよびターミネーターには、解糖系酵素遺伝子(例えば、Kawasakiの米国特許第4,599,311号；Kingsmanらの米国特許第4,615,974号；およびBitterの米国特許第4,977,092号を参照されたい)およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーターおよびターミネーターが含まれる。米国特許第号4,990,446号；同第5,063,154号；同第5,139,936号；および同第4,661,454号もまた参照されたい。ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセス・フラジリス(Kluyveromyces fragilis)、黒穂菌(Ustilago maydis)、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ギリエルモンジイ(Pichia guillermondii)、およびカンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)を含む他の酵母形質転換系もまた、当技術分野において公知である。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986、およびCreggの米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス属(Aspergillus)細胞は、McKnightらの米国特許第4,935,349号の方法に従い用いることができる。アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法は、Suminoらの米国特許第5,162,228号に開示される。ニューロスポラ属(Neurospora)を形質転換する方法は、Lambowitzの米国特許第4,486,533号に開示される。組換えタンパク質産生の宿主としてのピキア・メタノリカの使用は、米国特許第5,955,349号、同第5,888,768号、および同第6,001,597号、米国特許第第5,965,389号、米国特許第5,736,383号、ならびに米国特許第5,854,039号に開示される。
【０１２９】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、高分子、特に他のタンパク質および核酸の混入に関して、≧80%の純度、より好ましくは≧90%の純度、さらにより好ましくは≧95%の純度、特に好ましくは薬学的に純粋な状態、すなわち99.9%超の純度まで精製され、かつ感染因子および発熱因子を含まないことが好ましい。好ましくは、精製されたポリペプチドまたはタンパク質は、他のポリペプチドまたはタンパク質、特に動物由来のポリペプチドまたはタンパク質を実質的に含まない。
【０１３０】
発現された組換えIL-28またはIL-29タンパク質(キメラポリペプチドおよび多量体タンパク質を含む)は、従来的なタンパク質精製方法、典型的にはクロマトグラフィー技術の組み合わせにより精製される。一般論については、Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988；およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994を参照されたい。ポリヒスチジン親和性タグ(典型的には約6個のヒスチジン残基)を含むタンパク質は、ニッケルキレート樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。例えば、Houchuli et al., Bio/Technol. 6: 1321-1325, 1988を参照されたい。glu-gluタグを含むタンパク質は、従来的な手順に従うイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。例えば、Grussenmeyer et al.、前出を参照されたい。マルトース結合タンパク融合物は、当技術分野において公知の方法に従うアミロースカラムにより精製される。
【０１３１】
IL-28またはIL-29ポリペプチドはまた、排他的な固相合成、部分固相法、断片縮合、または古典的な溶液合成を含む当技術分野で公知の方法に従う化学合成を通じて調製され得る。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2nd edition), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3, 1986;およびAtherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989を参照されたい。インビトロ合成は、特に小さなポリペプチドの調製に有利である。
【０１３２】
当技術分野において公知の方法を使用することで、IL-28またはIL-29タンパク質は、単量体または多量体；グリコシル化または非グリコシル化；ペグ化または非ペグ化；融合タンパク質として調製され得；かつ最初のメチオニンアミノ酸残基を含む場合と含まない場合がある。治療に用いられるIL-28またはIL-29複合体は、薬学的に許容される水溶性ポリマー部分を含み得る。インターフェロンを水溶性ポリマーと結合させることにより、インターフェロンの循環半減期が増加し、ポリペプチドの免疫原性が減少することが示されている(例えば、Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59: 636 (1996)およびMonkarsh et al., Anal. Biochem. 247: 434 (1997)を参照されたい)。
【０１３３】
適当な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ-PEG、モノ-(C1-C10)アルコキシ-PEG、アリールオキシ-PEG、ポリ-(N-ビニルピロリドン)PEG、トレシルモノメトキシPEG、モノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒド、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシニミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、モノメトキシ-PEGブチルアルデヒド、PEGブチルアルデヒド、モノメトキシ-PEGアセトアルデヒド、PEGアセトアルデヒド、メトキシPEG-スクシニミジルプロピオネート、メトキシPEG-スクシニミジルブタノエート、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物系ポリマーが含まれる。適当なPEGは、例えば5,000ダルトン、12,000ダルトン、20,000ダルトン、30,000ダルトン、および40,000ダルトンを含む約600〜約60,000の分子量を有し、直鎖型または分岐型であり得る。IL-28またはIL-29複合体はまた、そのような水溶性ポリマーの混合物を含み得る。
【０１３４】
IL-28またはIL-29複合体の一例は、IL-28またはIL-29部分、およびIL-28またはIL-29部分のN末端に付加されたポリアルキルオキシド部分を含む。PEGは、1つの適当なポリアルキルオキシドである。例として、IL-28またはIL-29はPEGで修飾され得、そのプロセスは「PEG化」として公知である。IL-28またはIL-29のPEG化は、当技術分野で公知のPEG化反応のいずれかにより実施され得る(例えば、EP0154316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994),およびFrancis et al., Int J Hematol 68: 1 (1998)を参照されたい)。例えば、PEG化は、反応性ポリエチレングリコール分子を用いたアシル化反応またはアルキル化反応によって行われ得る。代替のアプローチにおいては、IL-28またはIL-29複合体は、PEGの末端ヒドロキシ基またはアミノ基が活性化リンカーによって置換された活性化PEGと縮合させることによって形成される(例えば、Karasiewiczらの米国特許第5,382,657号を参照されたい)。
【０１３５】
アシル化によるPEG化は、典型的にはPEGの活性エステル誘導体とIL-28またはIL-29ポリペプチドとの反応を必要とする。活性化PEGエステルの例は、N-ヒドロキシスクシニミドにエステル化されたPEGである。本明細書中で使用する場合、「アシル化」という用語には、IL-28またはIL-29と水溶性ポリマーの間の結合であって以下のタイプのものが含まれる：アミド、カルバメート、ウレタンなど。アシル化によってPEG化IL-28またはIL-29を調製する方法は、典型的には、(a) 一つまたは複数のPEG基がIL-28またはIL-29に付加する条件下で、IL-28またはIL-29ポリペプチドをPEG(例えば、PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステル)と反応させる工程、および(b) 反応産物を獲得する工程を含む。一般的に、アシル化反応の最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定され得る。例えば、PEG：IL-28またはIL-29の比が大きいほど、ポリPEG化IL-28またはIL-29産物の割合は大きくなる。
【０１３６】
アルキル化によるPEG化は一般的に、還元剤の存在下でPEGの末端アルデヒド誘導体、例えばプロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、アセトアルデヒドなどの誘導体とIL-28またはIL-29との反応を含む。PEG基は好ましくは、-CH2-NH2基を介してポリペプチドに付加される。
【０１３７】
モノPEG化産物を生成するための還元的アルキル化を通じた誘導体化は、誘導体化に用いることができる異なるタイプの一級アミノ基の異なる反応性を利用する。典型的には、その反応はリジン残基のε-アミノ基とそのタンパク質のN末端残基のα-アミノ基の間のpKaの差を利用できるpHで行われる。そのような選択的誘導体化によって、反応基、例えばアルデヒドを含む水溶性ポリマーのタンパク質への付加が制御される。ポリマーとの結合は、主としてタンパク質のN末端で起こり、他の反応基、例えばリジンの側鎖アミノ基が有意に修飾されることはない。
【０１３８】
モノポリマーIL-28またはIL-29複合体分子の実質的に均一な集団を生成するための還元的アルキル化は、(a) IL-28またはIL-29のアミノ末端のα-アミノ基の選択的修飾を行うのに適したpHにおける還元的アルキル化条件下でIL-28またはIL-29ポリペプチドを反応性PEGと反応させる工程、および(b) 反応産物を獲得する工程を含み得る。還元的アルキル化に使用される還元剤は水溶液中で安定であるべきであり、好ましくは還元的アルキル化の初期のプロセスで形成されるシッフ塩基のみを還元し得るものである。好ましい還元剤には、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランが含まれる。
【０１３９】
モノポリマーIL-28またはIL-29複合体の実質的に均一な集団についての還元的アルキル化反応条件は、IL-28またはIL-29のN末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的付加を可能にする条件である。そのような反応条件は一般的に、リジンアミノ基とN末端のαアミノ基との間にpKaの差を提供する。pHはまた、使用するポリマー対タンパク質の比に影響を及ぼす。一般的に、pHが低い場合、タンパク質に対して大過剰のポリマーが望ましい。N末端のα基の反応性が低いほど最適な条件を得るためにより多くのポリマーを必要とされるからである。pHが高い場合、多くの反応基が用いることができるため、ポリマー：IL-28またはIL-29が大きい必要はない。典型的には、pHは3〜9または3〜6の範囲であり得る。考慮すべき別の要因は、水溶性ポリマーの分子量である。一般的に、ポリマーの分子量が大きいほど、タンパク質に付加され得るポリマー分子の数は減少する。PEG化反応についての典型的な分子量は、約2kDa〜約100kDa、約5kDa〜約50kDa、約12kDa〜約40kDa、または約20kDa〜約30kDaである。水溶性ポリマーとIL-28またはIL-29のモル比は一般的に、1:1〜100:1の範囲である。典型的には、水溶性ポリマーとIL-28またはIL-29のモル比は、ポリPEG化については1:1〜20:1、モノPEG化については1:1〜5:1である。
【０１４０】
インターフェロンおよび水溶性ポリマー部分を含む複合体を作製する一般的な方法は、当技術分野で公知である。例えば、Karasiewiczらの米国特許第5,382,657号、Greenwaldらの米国特許第5,738,846号、Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59： 636 (1996)、Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247：434 (1997)を参照されたい。PEG化物は、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の標準的な精製法を用いて、複合体化されていないIL-28またはIL-29ポリペプチドから分離され得る。
【０１４１】
本発明のIL-28またはIL-29分子は、IL-28受容体と特異的に結合しおよび/または抗腫瘍剤として作用し得る。IL-28受容体に対するIL-28またはIL-29ポリペプチドの結合は、確立されたアプローチを用いてアッセイされ得る。IL-28またはIL-29は、ヨードビーズ(Pierce, Rockford, IL)を製造元の説明書に従い用いてヨウ素化され得、次いで125I-IL-28または125I-IL-29は後述のように使用され得る。
【０１４２】
最初のアプローチにおいて、50ナノグラムの125I-IL-28または125I-IL-29が、非標識IL-28またはIL-29を含む潜在的結合競合因子の存在下または非存在下で、1000ngのIL-28受容体ヒトIgG融合タンパク質と混合され得る。同じ結合反応はまた、特異性の対照として他のサイトカイン受容体ヒトIgG融合物で置き換えて実施され得る。4℃でインキュベートした後、プロテイン-G(Zymed, SanFransisco, CA)を反応物に加えてそれらに結合した受容体-IgG融合物および任意のタンパク質を捕捉し、反応物を4℃でさらに数時間インキュベートする。次いでプロテイン-Gセファロースを回収し、PBSで3回洗浄し、結合した125I-IL-28または125I-IL-29をガンマカウンター(Packard Instruments, Downers Grove,IL)で測定する。
【０１４３】
第二のアプローチでは、プレートに結合させた受容体に対する125I-IL-28または125I-IL-29の結合を阻害する分子の能力がアッセイされ得る。細胞外リガンド結合ドメインを含むIL-28受容体の断片は、プレートにて1g/mLの受容体溶液100μlを一晩インキュベートすることにより96ウェルプレートのウェルに吸着され得る。第二の形式では、受容体-ヒトIgG融合体は、その融合タンパク質のヒトIgG部分に対する抗体でコーティングされた96ウェルプレートのウェルに結合され得る。受容体でプレートをコーティングした後、プレートを洗浄し、SUPERBLOCK(Pierce, Rockford, IL)でブロッキングし、再度洗浄する。漸増濃度のIL-28、IL-29、IL-28およびIL-29を含む潜在的結合競合因子と共にまたはこれを含まない固定濃度の125I-IL-28または125I-IL-29を含む溶液を調製し、この溶液100μlをプレートの適当なウェルに加える。4℃で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、結合した125I-IL-28または125I-IL-29の量を計測（Topcount, Packard Instruments, Downers grove, IL）により決定する。125I-IL-28または125I-IL-29の結合特異性は、これらの結合アッセイ法で使用した受容体分子および阻害剤として使用した分子によって規定され得る。
【０１４４】
ペグ化に加えてヒトアルブミンが、半減期を延長させるために本発明のポリペプチドに遺伝子的に結合され得る。ヒトアルブミンはヒト循環系において最も豊富な天然血液タンパク質であり、20日以上体内循環に留まる。ヒトアルブミンに遺伝子的に融合された治療タンパク質はより長い半減期を有することが研究により示されている。IL28またはIL29アルブミン融合タンパク質は、ペグ化と同様、現在用いられている治療と比較して同等またはそれよりも改善された効果および安全性と共により簡便な投与計画を提供する持続的治療の選択肢を患者に提供し得る(米国特許第6,165,470号；Syed et al., Blood, 89(9): 3243-3253 (1997)；Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1904-1908 (1992)；およびZeisel et al., Horm. Res., 37: 5-13 (1992))。
【０１４５】
上記のペグ化およびヒトアルブミンと同様、ヒトIgG分子のFc部分が本発明のポリペプチドに融合され得る。得られる融合タンパク質は、Fc部分により長い循環半減期を有し得る(米国特許第5,750,375号、米国特許第5,843,725号、米国特許第6,291,646号；Barouch et al., Journal of Immunology. 61: 1875-1882 (1998); Barouch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97(8): 4192-4197 (April 11, 2000);およびKim et al., Transplant Proc., 30(8): 4031-4036 (Dec. 1998))。
【０１４６】
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、遺伝子操作された抗体を含めて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その抗原結合断片、例えばF(ab')2およびFab断片、単鎖抗体等を含む。非ヒト抗体は、非ヒトCDRをヒトフレームワークおよび定常領域に移植することによって、または非ヒト可変ドメイン全体を組み込むことによって（任意に、露出した残基の置換によりヒト様の表面でそれらを「一面覆う（cloaking）」ことによって（得られる抗体は「ベニア」抗体である））ヒト化され得る。いくつかの例において、ヒト化抗体は、適当な結合特性を強化するよう、ヒト可変領域フレームワークドメイン内に非ヒト残基を有し得る。抗体のヒト化を通じて生物学的半減期は増加し、ヒトへの投与の際の有害な免疫反応の可能性が減少し得る。当業者は、特定の抗体の定常ドメインに関連する様々な免疫機能を促進または抑制するよう、特有のかつ異なる定常ドメイン（すなわち、異なるIgサブクラス）を有するヒト化抗体を作製し得る。抗体は、IL-28またはIL-29ポリペプチドまたはタンパク質に結合した場合に、対照（非IL-28非IL-29）ポリペプチドまたはタンパク質に対する結合親和性よりも少なくとも10倍高い親和性で特異的に結合するものと定義される。モノクローナル抗体の親和性は、当業者により容易に決定され得る（例えば、Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949を参照されたい）。
【０１４７】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製方法は当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられるHurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982を参照されたい）。免疫原ポリペプチドは、全長分子またはその一部であり得る。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合、そのような部分は、免疫刺激のために高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）、または破傷風トキソイド）に結合または連結させるのが有利であり得る。
【０１４８】
当業者に公知の様々なアッセイ法が、IL-28またはIL-29ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出するのに使用され得る。アッセイ法の例は、Using Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999に詳細に記載される。そのようなアッセイ法の代表例には、平行免疫電気泳動、放射免疫測定、放射性免疫沈降法、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）、ドットブロットアッセイ法、ウェスタンブロットアッセイ法、阻害または競合アッセイ法、およびサンドイッチアッセイ法が含まれる。
【０１４９】
インビトロおよびインビボの診断用途を含む特定の適用においては、標識抗体を用いるのが有利である。適当な直接的タグまたは標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子等が含まれ；間接的タグまたは標識は、中間体としてのビオチン-アビジンまたはその他の補体／抗補体対の使用と特徴とし得る。本発明の抗体はまた、薬物、毒素、放射性核種等に直接的または間接的に結合され得、これらの複合体がインビボの診断適用または治療適用（例えば、細胞増殖の抑制）のために使用され得る。一般論については、Ramakrishnan et al., Cancer Res. 56: 1324-1330, 1996を参照されたい。
【０１５０】
薬学的処方物の患者への投与は、局部カテーテルを通った注入によるまたは直接的な病巣内注射による、局所投与、吸入投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋内投与、皮下投与、胸膜腔内投与、髄腔内投与であり得る。治療用タンパク質が注射により投与される場合、その投与は、連続注入によるものまたは単回もしくは複数回ボーラスによるものであり得る。一般的に、薬学的処方物は、薬学的に許容される媒体、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、5％デキストロース水溶液等と共にIL-28またはIL-29ポリペプチドを含む。処方物はさらに、一つ以上の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面におけるタンパク質の損失を防ぐためのアルブミン等を含み得る。処方法は当技術分野で周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995に開示される。IL-28またはIL-29ポリペプチドは、1ng/ml〜1000μg/mlの範囲の濃度で使用され得るが、好ましくは総量の約10〜100μg/mlの濃度で使用される。局所適用、例えば創傷治癒の促進のための局所適用については、タンパク質は創傷面積1cm2あたり0.1〜10μgの範囲で適用され得るが、正確な用量は、処置される状態の性質および重症度、患者の特性等を考慮しつつ、承認された標準に従い臨床医によって決定される。用量の決定は当技術分野における技術常識レベルである。投薬は処置期間を通じて毎日または間欠的になされる。静脈内投与は、1〜数時間の典型的な期間を通じてボーラス注射または注入によって行われる。徐放性処方物もまた使用され得る。一般的に、IL-28またはIL-29の治療的有効量とは、処置される状態において臨床的に有意な変化、例えば造血機能もしくは免疫機能の臨床的に有意な変化、病的状態の有意な緩和、または組織学的スコアの有意な増加をもたらすのに十分な量である。
【０１５１】
一例として、薬学的処方物は、本発明のIL-28またはIL29ポリペプチドを含む容器を含むキットとして供給され得る。治療用ポリペプチドは、一回量もしくは複数回量の注射溶液の形態で、または注射前に再構成される無菌粉末として提供され得る。あるいは、このようなキットは、治療用ポリペプチドの投与のために乾燥粉末分散器、液体エアゾール発生器、または噴霧器を含み得る。このようなキットはさらに、薬学的組成物の表示および使用法に関する書面情報を含み得る。さらに、このような情報は、IL-28またはIL29ポリペプチド処方物が、IL-28またはIL29ポリペプチドに対して過敏反応を示すことが既知の患者には禁忌である旨の記述を含み得る。
【０１５２】
B. 癌の処置のためのIL-28およびIL-29の使用
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチドは、インターフェロン-αと類似の抗ウイルス作用を有することが示された（WO 04/037995を参照されたい）。インターフェロンは、米国において自己免疫疾患、尖圭コンジローム、慢性C型肝炎、膀胱癌、子宮頸癌、喉頭乳頭腫症、菌状息肉腫、慢性B型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスに感染した患者のカポジ肉腫、悪性黒色腫、ヘアリーセル白血病、および多発性硬化症の処置について承認されている。さらに、IL-28およびIL-29ポリペプチドは、細胞増殖を抑制することにより、動脈硬化症、例えばアテローム硬化症の形成の処置に使用され得る。従って、本発明は、そのような状態を処置するためおよび網膜症を処置するためのIL-28またはIL-29ポリペプチド、融合タンパク質、ならびにIL-28およびIL-29活性を有するそれらの断片の使用を意図する。
【０１５３】
本発明のIL-28ポリペプチドは、IL-28AおよびIL-28Bポリペプチドを含む。本発明のIL-28Aポリペプチドには、例えば、SEQ ID NO: 1、12、18、20、22、24、162、および164に示されるIL-28Aポリヌクレオチド分子によりコードされる、それぞれSEQ ID NO: 2、13、19、21、23、25、163、および165が含まれる。さらに、本発明はまた、SEQ ID NO: 36、37、38、および39に示されるIL-28Aポリペプチド、それらのC2変異体、それらのN末端が修飾されたC2変異体、それらのC末端が修飾されたC2変異体、それらのN末端およびC末端のC2変異体、それらのC3変異体、それらのN末端が修飾されたC3変異体、それらのC末端が修飾されたC3変異体、それらのN末端およびC末端が修飾されたC3変異体、それらの断片、ならびにそれらの融合タンパク質を提供する。本発明のIL-28Bポリペプチドには、例えば、SEQ ID NO: 5、16、122、124、126、128、130、132、134、136、166、および168に示されるIL-28Bポリヌクレオチド分子によりコードされる、それぞれSEQ ID NO: 6、17、123、125、127、129、131、133、135、137、167、および169、それらのC2変異体、それらのN末端が修飾されたC2変異体、それらのC末端が修飾されたC2変異体、それらのN末端およびC末端のC2変異体、それらのC3変異体、それらのN末端が修飾されたC3変異体、それらのC末端が修飾されたC3変異体、それらのN末端およびC末端が修飾されたC3変異体、それらの断片、ならびにそれらの融合タンパク質が含まれる。
【０１５４】
本発明のIL-29ポリペプチドには、例えば、SEQ ID NO: 3、14、26、28、40、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、138、140、142、144、146、148、175、152、154、156、158、160、170、172、および174に示されるIL-29ポリヌクレオチド分子によりコードされる、それぞれ、SEQ ID NO: 4、15、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、171、173、および175、それらのC1変異体、それらのN末端が修飾されたC1変異体、それらのC末端が修飾されたC1変異体、それらのN末端およびC末端のC1変異体、それらのC5変異体、それらのN末端が修飾されたC5変異体、それらのC末端が修飾されたC5変異体、それらのN末端およびC末端が修飾されたC5変異体、それらの断片、ならびにそれらの融合タンパク質が含まれる。IL-29ポリペプチドはさらに、SEQ ID NO: 119に示されるシグナル配列またはSEQ ID NO: 121に示されるシグナル配列を含み得る。SEQ ID NO: 119のシグナル配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO: 118に示される。SEQ ID NO: 120のシグナル配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO: 121に示される。
【０１５５】
本発明は、例えばB細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病を含むリンパ増殖性障害を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減するためのこれらのIL-28およびIL-29タンパク質、ポリペプチド、ならびにIL-28およびIL-29活性を有するペプチドの使用を提供する。加えて、本発明はさらに、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌（例えば、扁平上皮型および腺癌）、頭頸部腫瘍（例えば、下咽頭癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、原因不明の転移性頸部扁平上皮癌、上咽頭癌、中咽頭癌、副鼻腔・鼻腔癌、副甲状腺癌、および唾液腺癌）、黒色腫（例えば、悪性黒色腫、例えば表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、および悪性黒子黒色腫）、甲状腺癌（例えば、乳頭状癌、濾胞状癌、髄様癌、および未分化癌）、悪性神経膠腫（例えば、多型性神経膠芽腫および未分化星状細胞腫）、乳癌（例えば、腺管癌）、結腸癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、例えば扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌、ならびに中皮腫）、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、ならびに骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫）の群より選択される以下の癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはその重症度を軽減しもしくはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを抑制するためのIL-28およびIL-29タンパク質、ポリペプチド、ならびにIL-28およびIL-29活性を有するペプチドの使用を提供する。
【０１５６】
インターフェロンはまた、培養細胞による抗原の発現を誘導することが示された（例えば、Auth et al., Hepatology 18: 546 (1993), Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9: 53 (1994), Girolomoni et al., Eur. J. Immunol. 25: 2163 (1995),およびMaciejewski et al., Blood 85: 3183 (1995)を参照されたい）。この活性は、新規の腫瘍関連抗原をインビトロで同定する能力を強化する。さらに、ヒト腫瘍抗原の発現レベルを亢進するインターフェロンの能力は、インターフェロンが免疫療法下におけるアジュバントとして有用であり得るか、または抗腫瘍抗原抗体を用いる免疫シンチグラフィーを補強し得ることを示す（Guadagni et al., Cancer Immunol. Immunother. 26: 222 (1988); Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9: 53 (1994)）。従って、本発明は、免疫療法のためのアジュバントとしてまたは抗腫瘍抗原抗体を用いる免疫シンチグラフィーを改善するためのIL-28またはIL-29タンパク質、IL-28およびIL-29活性を有するポリペプチドおよびペプチドの使用を含む。
【０１５７】
腫瘍の進行および転移に対するIL-28またはIL-29ポリペプチドの活性および効果は、インビボで測定され得る。腫瘍の進行に対するポリペプチド、化合物、またはその他の処置の影響を研究するため、いくつかの同系マウスモデルが作製された。これらのモデルにおいて、継代培養した腫瘍細胞は、腫瘍ドナーとしての同じ系統のマウスに移植される。細胞はレシピエントマウスにおいて類似の特徴を有する腫瘍に発展し、一部のモデルにおいては転移も起こる。本発明の研究に適した腫瘍モデルには、特に、ルイス肺癌（ATCC番号CRL-1642）およびB16黒色腫（ATCC番号CRL-6323）が含まれる。これらは両方とも、インビトロで容易に培養および操作されるC57BL6マウスと同系の一般的に使用されている腫瘍株である。これらの細胞株のいずれかの移植により生じた腫瘍は、C57BL6マウスにおいて肺に転移し得る。ルイス肺癌モデルは近年、マウスにおいて新脈管形成の阻害剤を同定するために使用されている（O'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328,1994）。C57BL6/Jマウスは、組換えタンパク質、アゴニスト、もしくはアンタゴニストの毎日の注射または組換えアデノウイルスの一回の注射のいずれかを通じて実験薬剤で処置される。この処置の3日後、105〜106の細胞が背面皮膚に移植される。あるいは、細胞自体を組換えアデノウイルス、例えばIL-28およびIL-29を発現するアデノウイルスで感染させた後、タンパク質が全身的にではなく腫瘍部位または細胞内で合成するよう移植され得る。マウスは通常、5日以内に目視できる腫瘍を形成する。この腫瘍は最大3週間増殖させることができ、その間にそれらの対照処置群における大きさは1500〜1800mm3に達する。腫瘍の大きさおよび体重は、実験を通して注意深く観察する。屠殺の際に腫瘍を取り出し、肺および肝臓と共に秤量する。肺重量は、転移性の全身腫瘍組織量と十分相関することが示されている。追加の測定として、肺表面の転移物を計数する。切除した腫瘍、肺、および肝臓は、当技術分野で公知の本明細書中に記載される方法を用いて病理組織学的試験、免疫組織化学、およびインサイチューハイブリダイゼーション用に調製される。このようにして、腫瘍が血管を誘導し転移を起こす能力に対する発現された問題のポリペプチド、例えばシステイン変異IL-28およびIL-29の影響が評価され得る。さらに、アデノウイルスを使用する他に、移植された細胞は、IL-28およびIL-29で一過的にトランスフェクトされ得る。安定なIL-28またはIL-29トランスフェクタントの使用およびインビボでIL-28またはIL-29の発現を活性化する誘導性プロモーターの使用は当技術分野で公知であり、この系において転移の誘導を評価するのに使用され得る。さらに、精製されたIL-28またはIL-29の条件培地はこのマウスモデルに直接注射することができ、従ってこの系において使用され得る。一般的な参照については、O'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328, 1994;およびRusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349-361, 1995を参照されたい。
【０１５８】
本発明は、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌を処置する方法を提供する。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０１５９】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌を処置する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０１６０】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有するポリペプチド；および薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌（例えば、扁平上皮型および腺癌）、頭頸部腫瘍（例えば、下咽頭癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、原因不明の転移性頸部扁平上皮癌、上咽頭癌、中咽頭癌、副鼻腔・鼻腔癌、副甲状腺癌、および唾液腺癌）、黒色腫（例えば、悪性黒色腫、例えば表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、および悪性黒子黒色腫）、甲状腺癌（例えば、乳頭状癌、濾胞状癌、髄様癌、および未分化癌）、悪性神経膠腫（例えば、多型性神経膠芽腫および未分化星状細胞腫）、乳癌（例えば、腺管癌）、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、ならびに骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫）の群より選択される癌を処置する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。第二のポリペプチドはインターフェロン分子、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γ、その他の治療薬剤、例えばIL-2もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１６１】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有するポリペプチド；第二のポリペプチド；薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌（例えば、扁平上皮型および腺癌）、頭頸部腫瘍（例えば、下咽頭癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、原因不明の転移性頸部扁平上皮癌、上咽頭癌、中咽頭癌、副鼻腔・鼻腔癌、副甲状腺癌、および唾液腺癌）、黒色腫（例えば、悪性黒色腫、例えば表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、および悪性黒子黒色腫）、甲状腺癌（例えば、乳頭状癌、濾胞状癌、髄様癌、および未分化癌）、悪性神経膠腫（例えば、多型性神経膠芽腫および未分化星状細胞腫）、乳癌（例えば、腺管癌）、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、ならびに骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫）の群より選択される癌を処置する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。第二のポリペプチドはインターフェロン分子、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γ、その他の治療薬剤、例えばIL-2もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１６２】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の進行を抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０１６３】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド；薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌（例えば、扁平上皮型および腺癌）、頭頸部腫瘍（例えば、下咽頭癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、原因不明の転移性頸部扁平上皮癌、上咽頭癌、中咽頭癌、副鼻腔・鼻腔癌、副甲状腺癌、および唾液腺癌）、黒色腫（例えば、悪性黒色腫、例えば表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、および悪性黒子黒色腫）、甲状腺癌（例えば、乳頭状癌、濾胞状癌、髄様癌、および未分化癌）、悪性神経膠腫（例えば、多型性神経膠芽腫および未分化星状細胞腫）、乳癌（例えば、腺管癌）、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、ならびに骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫）の群より選択される癌の進行を抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。第二のポリペプチドはインターフェロン分子、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γ、その他の治療薬剤、例えばIL-2もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１６４】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の発症を遅らせる方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０１６５】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド；薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌（例えば、扁平上皮型および腺癌）、頭頸部腫瘍（例えば、下咽頭癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、原因不明の転移性頸部扁平上皮癌、上咽頭癌、中咽頭癌、副鼻腔・鼻腔癌、副甲状腺癌、および唾液腺癌）、黒色腫（例えば、悪性黒色腫、例えば表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、および悪性黒子黒色腫）、甲状腺癌（例えば、乳頭状癌、濾胞状癌、髄様癌、および未分化癌）、悪性神経膠腫（例えば、多型性神経膠芽腫および未分化星状細胞腫）、乳癌（例えば、腺管癌）、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、ならびに骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫）の群より選択される癌の発症を遅らせる方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。第二のポリペプチドはインターフェロン分子、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γ、その他の治療薬剤、例えばIL-2もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１６６】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の発症の重症度を軽減する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０１６７】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド；薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌（例えば、扁平上皮型および腺癌）、頭頸部腫瘍（例えば、下咽頭癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、原因不明の転移性頸部扁平上皮癌、上咽頭癌、中咽頭癌、副鼻腔・鼻腔癌、副甲状腺癌、および唾液腺癌）、黒色腫（例えば、悪性黒色腫、例えば表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、および悪性黒子黒色腫）、甲状腺癌（例えば、乳頭状癌、濾胞状癌、髄様癌、および未分化癌）、悪性神経膠腫（例えば、多型性神経膠芽腫および未分化星状細胞腫）、乳癌（例えば、腺管癌）、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、ならびに骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫）の群より選択される癌の発症の重症度を軽減する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。第二のポリペプチドはインターフェロン分子、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γ、その他の治療薬剤、例えばIL-2もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１６８】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、悪性神経膠腫、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、および骨癌の群より選択される癌の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０１６９】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド；薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、腎細胞癌、肝細胞癌、子宮頸癌（例えば、扁平上皮型および腺癌）、頭頸部腫瘍（例えば、下咽頭癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、原因不明の転移性頸部扁平上皮癌、上咽頭癌、中咽頭癌、副鼻腔・鼻腔癌、副甲状腺癌、および唾液腺癌）、黒色腫（例えば、悪性黒色腫、例えば表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、および悪性黒子黒色腫）、甲状腺癌（例えば、乳頭状癌、濾胞状癌、髄様癌、および未分化癌）、悪性神経膠腫（例えば、多型性神経膠芽腫および未分化星状細胞腫）、乳癌（例えば、腺管癌）、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、カポジ肉腫、ならびに骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、紡錘細胞肉腫、および脊索腫）の群より選択される癌の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。第二のポリペプチドはインターフェロン分子、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γ、その他の治療薬剤、例えばIL-2もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１７０】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、頸部、腋窩、または鼠蹊部のリンパ節の無痛性腫脹、寝汗、原因不明の発熱、体重減、および過度の疲労感の群より選択される非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０１７１】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド；ならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、頸部、腋窩、または鼠蹊部のリンパ節の無痛性腫脹、寝汗、原因不明の発熱、体重減、および過度の疲労感の群より選択される非ホジキンリンパ腫の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。第二のポリペプチドはインターフェロン分子、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γ、その他の治療薬剤、例えばIL-2もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１７２】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、背痛、身長低下、貧血、腎障害、反復性呼吸器感染、および高カルシウム血症の群より選択される多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０１７３】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド；ならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、背痛、身長低下、貧血、腎障害、反復性呼吸器感染、および高カルシウム血症の群より選択される多発性骨髄腫の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。第二のポリペプチドはインターフェロン分子、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γ、その他の治療薬剤、例えばIL-2もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１７４】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍またはびらん領域、嚥下困難、呼吸または会話の問題、口の麻痺感、鼻血、持続性耳痛、難聴、および口または頸部の腫脹またはしこりの群より選択される頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０１７５】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも90％または95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド；ならびに薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍またはびらん領域、嚥下困難、呼吸または会話の問題、口の麻痺感、鼻血、持続性耳痛、難聴、および口または頸部の腫脹またはしこりの群より選択される頭頸部腫瘍の状態または症状の少なくとも一つを抑制する方法を提供する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、および175において少なくとも15、少なくとも30、少なくとも45、または少なくとも60の連続するアミノ酸を有し得る。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。第二のポリペプチドはインターフェロン分子、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、もしくはインターフェロン-γ、その他の治療薬剤、例えばIL-2もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１７６】
4つの主要なタイプの悪性黒色腫が皮膚において発症する。これらは皮膚黒色腫として公知である。
【０１７７】
表在拡大型黒色腫は、最も一般的なタイプの黒色腫である。10人中およそ7人（70％）がこのタイプである。それらの大部分は中年期に発症する。女性の場合、脚が最も一般的な部位であり、男性の場合は体幹、特に背部が最も一般的である。それらは皮膚表層を拡散することで始まる傾向があり：これは水平増殖期（radial growth phase）として公知である。黒色腫をこの段階で取り除いた場合、治癒する可能性が非常に高い。黒色腫を取り除かなかった場合、より深い皮膚層に増殖を始めるであろう。次いで、これは血流またはリンパ系を通じて体内の他の部分に拡散する危険がある。結節性黒色腫は胸部または背部において発症する場合が最も多い。これは中年期に最も一般的に見られる。これは取り除かなければ直ちに皮膚深くに増殖する傾向がある。このタイプの黒色腫はしばしば皮膚表面の他の場所を隆起させ、こぶができたようになる。これは濃暗褐色〜黒色または黒色であり得る。悪性黒子型黒色腫は、最も一般的には顔面、特に老齢期の顔面に見られる。これはゆっくり増殖し、発症までに数年を要する場合がある。末端部黒色腫は通常、手掌、足裏、または足指爪周囲に見られる。その他の非常に稀なタイプの皮膚黒色腫には、メラニン欠乏性黒色腫（黒色腫がその色素を失い白色領域として顕れる）および線維硬化性黒色腫（線維性瘢痕組織を含む）が含まれる。悪性黒色腫は、皮膚以外の体の一部から始まり得るが非常に稀である。影響を受け得る体の一部は、眼、口、指爪の下（爪下黒色腫として公知）、外陰組織もしくは膣組織、または内部である（cancerbacupのインターネットウェブサイトより）。
【０１７８】
大部分の黒色腫は、正常な皮膚における外見上の変化と共に始まる。これは異常な新しい母斑のように見え得る。3分の1未満が既存の母斑になる。母斑と黒色腫の違いを言うのは困難であるが、次のチェックリストが補助として使用できる。それはABCDリストとして公知である。非対称性（Asymmetry）- 普通の母斑は通常、対称的な形状である。黒色腫は不規則なまたは非対称的である可能性が高い。輪郭（Border） - 母斑は通常、十分に明確な定まった輪郭を有する。黒色腫は縁にむらのある不規則な輪郭を有する可能性が高い。色（Colour） - 母斑は通常均一な茶色である。黒色腫は一色以上を有する傾向がある。それらは茶色と黒色、赤色、ピンク色、白色、または薄青色が混ざった様々な色合いであり得る。径（Diameter） - 母斑は通常、鉛筆（直径約6mm）の平滑端を超えることはない。黒色腫は通常、直径7mmを超える。正常な母斑は、皮膚から隆起し、および／または毛が生えている場合がある。黒色腫においては、かゆみ、痂皮、または出血も生じ得る。つまり、これらは一般性の低い徴候であるが無視すべきではない（cancerbacupのインターネットウェブサイトより）。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、Hermans et al., Cancer Res. 2003 Dec l; 63(23): 8408-13; Ramont et al., Exp Cell Res. 2003 Nov 15; 291(l): l-10; Safwat et al., J Exp Ther Oncol. 2003 Jul-Aug; 3(4): 161-8; およびFidler, I.J., Nat New Biol. 1973 Apr 4; 242(118): 148-9に記載されるのと同様のマウス黒色腫モデルにおいて評価され得る。
【０１７９】
慢性骨髄性白血病（CML）は、稀なタイプの癌であり影響を受けるのはほとんど成人である。これは顆粒球（白血球の主要なタイプの一つ）の癌である。CMLにおいては、過剰な顆粒球が産生され、それらは未熟で適当な働きができない状態で血液中に放出される。未熟な白血球は芽細胞として公知である。他のタイプの血球の産生も破壊される。通常、白血球は、秩序のある制御された様式で自己を修復および再生するが、慢性骨髄性白血病においてはそのプロセスが制御できず、細胞は異常な分裂および成熟を続ける。この疾患は通常、非常にゆっくりと発展し、それが「慢性」骨髄性白血病と呼ばれるゆえんである（cancerbacupのインターネットウェブサイトより）。
【０１８０】
CMLはゆっくりと発展（進行）するので、その早期段階で検出するのは困難である。別の理由で血液検査が行われた場合にたまに発見されるのみである。CMLの症状は曖昧で非特異的な場合が多く、骨髄における異常な白血球数の増加および正常な血球数の減少により引き起こされ：左腹部に膨満感または圧痛のあるしこりを感じる。CMLにおいては脾臓が肥大するためである。脾臓は左腹部の肋骨直下に位置する器官である。脾臓は血液を濾過し、古くなった赤血球を取り除く。脾臓の腫脹はまた胃を圧迫して消化不良および食欲不振を引き起こし、一部の人間は倦怠感を感じ、顔色が悪化し、一部の人間は、血液中の血小板数の減少による赤血球不足（貧血）によりより容易に出血しまたはあざができるようになることに気付く。正常時よりも容易に打ち傷ができるのに加えて、特有のタイプの打ち傷が見られることがある。これは、通常足または口内に見られる小さな血様の班からなり、点状出血と呼ばれる。女性の場合は自身の月経がずっと重くなることに気付くかもしれない。しかし、これらの症状および徴候は稀であり、一部の人間は一般的なかゆみと感じるかもしれない。慢性骨髄性白血病は、あらゆる年齢で発症し得るが、中年期および老齢期が影響を受けるのがより一般的である。年少期では稀である（cancerbacupのインターネットウェブサイトより）。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、Ren, R., Oncogene. 2002 Dec 9; 21(56): 8629-42; Wertheim et al., Oncogene. 2002 Dec 9; 21(56): 8612-28; およびWolff et al., Blood. 2001 Nov l; 98(9): 2808-16に記載されるのと同様のマウス慢性骨髄性白血病モデルにおいて評価され得る。
【０１８１】
非ホジキンリンパ腫は、リンパ系の癌のタイプである。リンパ腫には二つの主要なタイプが存在する。一つはホジキン病と呼ばれる（これを最初に発見したホジキン博士の名をとってそう呼ばれている）。もう一方は非ホジキンリンパ腫と呼ばれる。非ホジキンリンパ腫には約20の異なるタイプが存在する。ほとんどのホジキン病の症例において、リード-スターンバーグ細胞として公知の特定の細胞が生検で見られる。この細胞は通常他のリンパ腫では見られないので、それらは非ホジキンリンパ腫と呼ばれている。これはあまり大きな差ではないようにも思えるかもしれないが、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の処置は非常に困難であるため重要である（cancerbacupのインターネットウェブサイトより）。
【０１８２】
多くの場合、非ホジキンリンパ腫の最初の徴候は、頸部、腋窩、または鼠蹊部のリンパ節の無痛性腫脹である。他の症状には、以下のいずれかが含まれ得：寝汗または原因不明の高温（発熱）；食欲低下、原因不明の体重減および過度の疲労感；子供の場合は咳または息切れを起こし得る。彼らは腹痛を訴えることもあるし、あなたはあなたの子供の腹部のしこりや体全体の皮膚の持続的なかゆみに気付くかもしれない（cancerbacupのインターネットウェブサイトより）。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、Ansell et al., Leukemia. 2004 Mar; 18(3): 616-23; De Jonge et al., J Immunol. 1998 Aug 1; 161(3): 1454-61; およびSlavin et al., Nature. 1978 Apr 13; 272(5654): 624-6に記載されるのと同様のマウス非ホジキンリンパ腫モデルにおいて評価され得る。
【０１８３】
腎細胞癌は腎尿細管細胞の癌性変化を伴う腎臓癌の一形態であり、成人において最も一般的なタイプの腎臓癌である。なぜ細胞が癌性になるのかは分かっていない。喫煙歴は腎細胞癌が発症する危険を大きく増加させる。一部の人間においては腎細胞癌を発症する危険の高さを受け継ぐ場合もあり、腎臓癌の家族歴がその危険を増加させる。脳の毛細管に影響を及ぼす遺伝性疾患であるフォンヒッペル・リンダウ病患者は、一般的に腎細胞癌も発症する。処置のために透析が必要となる腎臓障害もまた、腎細胞癌の発症する危険を増加させる。最初の症状は通常、血尿である。たまに両方の腎臓で併発する。癌は、多くの場合肺およびその他の器官に容易に転移または拡散し、患者の約3分の1は診断時に転移を有する（Medline Plus Medical Encyclopediaのインターネットウェブサイトより）。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、Sayers et al., Cancer Res. 1990 Sep l; 50(17): 5414-20; Salup et al., Immunol. 1987 Jan 15; 138(2):641-7;およびLuan et al., Transplantation. 2002 May 27; 73(10): 1565-72に記載されるのと同様のマウス腎細胞癌モデルにおいて評価され得る。
【０１８４】
子宮頸部は、膣に通じる子宮の首である。子宮頸癌は、子宮頸癌腫とも呼ばれ、子宮頸部表面の異常な細胞から発症する。子宮頸癌は女性が影響を受ける最も一般的な癌の一つである。子宮頸癌は通常、子宮頸部表面の細胞の前癌性変化である異形成に続いて発症する。これらの異常な細胞は、浸潤癌に発展し得る。癌が顕在化した後、4つの段階を通じて発展し得る。これらの段階は、癌の拡散の程度によって定義される。癌が拡散が大きくなれば、処置は大規模になる可能性が高い。子宮頸癌には2つの主要なタイプが存在する。（1）扁平上皮型（類表皮癌）：これは最も一般的なタイプであり、子宮頸癌の約80％〜85％を占める。この癌は性感染症により引き起こされ得る。このような性病の一つは、性病いぼの原因となるヒトパピローマウイルスである。癌性腫瘍は子宮頸部でおよび子宮頸部へと増殖する。この癌は一般的に子宮頸部の表面から始まり、パパニコラウスミアにより早期段階で診断され得る。（2）腺癌：このタイプの子宮頸癌は、子宮頸管の子宮頚管腺組織から発症する。早期の子宮頸癌は通常症状を示さない。この癌は通常、パパニコラウスミアおよび婦人科内診によって検出される。あなたが性行為を行うようになった後できるだけ早期にパパニコラウスミアおよび婦人科内診の受診を開始すべきなのはこの理由からである。性経験のない健常な若い女性であれば、18歳までに最初の年に一度の婦人科内診を受けるべきである。子宮頸癌の後期段階は、予期せぬ時期、例えば月経周期の間、性交後、または閉経後に異常な膣出血または血だらけの分泌を起こす。異常な膣分泌物は濁ったまたは血みどろの場合もあるし、悪臭のする粘液を含む場合もある。この癌の進行段階は疼痛を伴い得る（University of Michigan Health Systemのインターネットウェブサイトより）。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、Ahn et al., Hum Gene Ther. 2003 Oct 10; 14(15): 1389-99; Hussain et al., Oncology. 1992; 49(3): 237-40; およびSengupta et al., Oncology. 1991; 48(3): 258-61に記載されるのと同様のマウス子宮頸癌モデルにおいて評価され得る。
【０１８５】
ほとんどの頭頸部の癌は、癌腫（特に扁平上皮癌）と呼ばれるタイプである。頭頸部の癌腫は、口、鼻、咽喉もしくは耳の内層または舌を覆う表層を形成する細胞から始まる。しかし、頭頸部癌はその他のタイプの細胞からも発症し得る。リンパ腫はリンパ系の細胞から発症する。肉腫は筋肉、軟骨、または血管を形成する支持細胞から発症する。黒色腫は、眼および皮膚に色素を与えるメラノサイトと呼ばれる細胞から始まる。頭頸部癌の症状はその部位に依存し得る。つまり、例えば、舌の癌は不明瞭言語を引き起こし得る。最も一般的な症状は、数週間以内に治癒しない頭部または頸部の潰瘍またはびらん領域；嚥下困難または咀嚼もしくは嚥下時の疼痛；呼吸または会話の問題、例えば持続性のぜーぜー呼吸（noisy breathing）、不明瞭言語、または嗄声；口の麻痺感、持続性の鼻詰まりまたは鼻血；持続性耳痛、耳鳴り、または難聴；口または頸部の腫脹またはしこり；顔面または上顎の疼痛であり；喫煙者または噛みたばこ利用者にあっては、口の内層または舌において前癌性の変化が起こり得る。これらは持続性の白色の班（白斑症）または赤色の班（紅板症）として顕れ得る。これらは通常無痛性であるが、たまにヒリヒリ感があり出血する場合がある（Cancerbacupのインターネットウェブサイトより）。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、Kuriakose et al., Head Neck. 2000 Jan; 22(l): 57-63; Cao et al., Clin Cancer Res. 1999 Jul; 5(7): 1925-34; Hier et al., Laryngoscope. 1995 Oct; 105(10): 1077-80; Braakhuis et al., Cancer Res. 1991 Jan l; 51(l): 211-4; Baker, S.R., Laryngoscope. 1985 Jan; 95(l): 43-56; およびDong et al., Cancer Gene Ther. 2003 Feb; 10(2): 96-104に記載されるのと同様のマウス頭頸部腫瘍モデルにおいて評価され得る。
【０１８６】
甲状腺乳頭癌および濾胞性甲状腺癌は、全ての甲状腺癌の80％〜90％を占める。両方のタイプは、甲状腺の濾胞上皮細胞から始まる。ほとんどの甲状腺乳頭癌および濾胞性甲状腺癌はゆっくりと増殖する傾向がある。それらが早期に検出された場合、ほとんどは処置に成功し得る。甲状腺髄様癌は甲状腺癌の症例の5〜10％を占める。これは濾胞上皮細胞ではなくC細胞から生じる。甲状腺髄様癌は、体内の他の部分に拡散する前に発見および処置された場合、制御が容易になる。未分化甲状腺癌は最も一般性の低いタイプの甲状腺癌である（症例のわずか1〜2％）。これは濾胞上皮細胞から生じる。癌細胞は極めて異常でありかつ認識するのが困難である。このタイプの癌は通常、癌細胞が非常に迅速に増殖および拡散する傾向があるため、制御するのが非常に困難である。早期の甲状腺癌は多くの場合症状を示さない。しかし癌が増殖すると、症状は：のど仏付近の前頸部のしこりもしくは小結節；嗄声もしくは正常な発声の困難；リンパ節の腫れ、特に頸部リンパ節の腫れ；嚥下困難もしくは呼吸困難；または咽喉もしくは頸部の疼痛を含み得る（National Cancer Instituteのインターネットウェブサイトより）。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、Quidville et al., Endocrinology. 2004 May; 145(5): 2561-71 (マウスモデル); Cranston et al., Cancer Res. 2003 Aug 15; 63(16): 4777-80 (マウスモデル); Zhang et al., Clin Endocrinol (Oxf). 2000 Jun; 52(6): 687-94 (ラットモデル); およびZhang et al., Endocrinology. 1999 May; 140(5): 2152-8 (ラットモデル)に記載されるのと同様のマウスまたはラット甲状腺腫瘍モデルにおいて評価され得る。
【０１８７】
脳組織から始まる腫瘍は、原発性脳腫瘍として公知である。原発性脳腫瘍は、その出発点となる細胞のタイプまたは脳の部分に従って命名される。最も一般的な原発性脳腫瘍は神経膠腫である。それらは膠細胞から始まる。神経膠腫には多くのタイプがある。（1）星状細胞腫 - この腫瘍は星状細胞と呼ばれる星型の膠細胞から生じる。成人期において、星状細胞腫は大脳から生じる場合が最も多い。年少期においては、それらは脳幹、大脳、および小脳から生じる。グレードIIIの星状細胞腫は未分化星状細胞腫と呼ばれることもある。グレードIVの星状細胞腫は通常、多形膠芽腫と呼ばれる。（2）脳幹神経膠腫 - この腫瘍は脳の最下部から生じる。脳幹神経膠腫は幼少期および中年期に診断される場合が最も多い。（3）上衣腫 - この腫瘍は脳室または脊髄の中心管に並ぶ細胞から生じる。これらは年少期および青年期に発見される場合が最も多い。（4）希突起膠腫 - この稀な腫瘍は神経を覆い保護する脂肪質体を形成する細胞から生じる。これらの腫瘍は通常、大脳に生じる。これらはゆっくりと増殖し、通常周辺の脳組織に拡散しない。これらは中年期に最も多い。脳腫瘍の症状は、腫瘍の大きさ、タイプ、および部位に依存する。症状は、腫瘍が神経を圧迫するかまたは脳の特定領域に損傷を与えた場合に生じ得る。これらはまた、脳が腫れるかまたは体液が頭蓋内に蓄積された場合に生じ得る。これらは脳腫瘍の最も一般的な症状である：頭痛（通常、午前中に悪化する）；悪心または嘔吐；発語、視力、または聴力の変化；平衡感覚または歩行の問題；気分、人格、集中力の変化；記憶力の問題；筋肉の痙動または単収縮（発作または痙攣）；および手足の麻痺または刺痛（National Cancer Instituteのインターネットウェブサイトより）。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、Schueneman et al., Cancer Res. 2003 Jul 15; 63(14): 4009-16; Martinet et al., Eur J Surg Oncol. 2003 May; 29(4): 351-7; Bello et al., Clin Cancer Res. 2002 Nov; 8(ll): 3539-48; Ishikawa et al., Cancer Sci. 2004 Jan; 95(l): 98-103; Degen et al., J Neurosurg. 2003 Nov; 99(5): 893-8; Engelhard et al., Neurosurgery. 2001 Mar; 48(3): 616-24; Watanabe et al., Neurol Res. 2002 Jul; 24(5): 485-90; およびLumniczky et al., Cancer Gene Ther. 2002 Jan; 9(l): 44-52に記載されるのと同様の神経膠腫動物モデルにおいて評価され得る。
【０１８８】
多発性骨髄腫は、癌の一つのタイプである。これはプラスマ細胞と呼ばれる特定の白血球に影響を及ぼす。癌がプラズマ細胞に及んだ場合、身体はこれらの細胞を休みなく産生し続ける。これらの不必要なプラズマ細胞 - 全てが異常であり全てが酷似する - は骨髄腫細胞と呼ばれる。骨髄腫細胞は骨髄および骨の硬い外側部分に集まる傾向がある。これらはときどき単一の骨に集まり、プラスマ細胞腫と呼ばれる一つの塊すなわち腫瘍を形成する。しかし、ほとんどの症例では、骨髄腫細胞は多くの骨に集まり、多くの腫瘍を形成して他の問題を引き起こすことが多い。このような事態が起きた場合、その疾患は多発性骨髄腫と呼ばれる。
【０１８９】
骨髄腫細胞は骨髄および骨の硬い外側部分に集まる傾向がある。これらはときどき単一の骨に集まり、プラスマ細胞腫と呼ばれる一つの塊すなわち腫瘍を形成する。しかし、ほとんどの症例では、骨髄腫細胞は多くの骨に集まり、多くの腫瘍を形成して他の問題を引き起こすことが多い。このような事態が起きた場合、その疾患は多発性骨髄腫と呼ばれる。多発性骨髄腫患者は異常に多い同一のプラズマ細胞を有するので、彼らはまた一つのタイプの抗体を過剰に有する。これらの骨髄腫細胞および抗体は、多くの深刻な医学的問題の原因となり得る。（1）骨髄腫細胞数が増加すると、それらは骨を損傷および脆弱化して疼痛およびときには骨折を引き起こす。骨痛により患者は運動が困難になり得る。（2）骨が損傷を受けた場合、カルシウムが血中に放出される。これは、高カルシウム血症 - 血中の過剰なカルシウムの原因となり得る。高カルシウム血症は、食欲低下、嘔吐、渇き、疲労、筋力低下、不穏状態、および錯乱の原因となり得る。（3）骨髄腫細胞は、骨髄が正常なプラズマ細胞および免疫系に重要なその他の白血球を形成するのを妨げる。患者は、感染および疾患に抗うことができなくなる場合がある。（4）癌細胞もまた、新しい赤血球の成長を妨げ、貧血を引き起こし得る。貧血患者は尋常ではない疲労または衰弱を感じる場合がある。ならびに（5）多発性骨髄腫患者は、腎臓に深刻な問題を有し得る。過剰な抗体タンパク質およびカルシウムは、腎臓が血液を適当に濾過および浄化するのを妨げ得る。多発性骨髄腫の症状は、その疾患がどの程度進行しているかに依存する。この疾患の早期段階においては症状は見られない場合もある。症状が見られる場合、患者は一般的に骨痛、多くの場合背部または肋骨の骨痛を有する。患者はまた、骨折、衰弱、疲労、体重減、または反復性感染症を起こし得る。この疾患が進行した場合、症状には、悪心、嘔吐、便秘、排尿の問題、および足の衰弱または麻痺が含まれ得る（National Cancer Instituteのインターネットウェブサイトより）。腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、Oyajobi et al., Blood. 2003 Jul l; 102(l): 311-9; Croucher et al., J Bone Miner Res. 2003 Mar; 18(3): 482-92; Asosingh et al., Hematol J.2000; 1(5): 351-6; およびMiyakawa et al., Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 9; 313(2): 258-62に記載されるのと同様のマウス多発性骨髄腫モデルにおいて評価され得る。
【０１９０】
腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、ヒト小細胞／非小細胞肺癌異種移植モデルにおいて評価され得る。簡単に言うと、ヒト腫瘍を免疫不全マウスに移植し、これらのマウスをIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、もしくは融合タンパク質単独でまたは腫瘍の増殖を評価することによって処置の有効性を実証するのに使用され得るその他の薬剤と共に処置する（Nemati et al., Clin Cancer Res. 2000 May; 6(5): 2075-86; およびHu et al., Clin Cancer Res. 2004 Nov 15; 10(22): 7662-70）。
【０１９１】
原発性肝臓癌には二つの異なるタイプが存在する。最も一般的な種類は、ヘパトームまたは肝細胞癌（HCC）と呼ばれ、肝臓の主要な細胞（肝細胞）から生じる。このタイプは通常肝臓に限定的であるが、たまに他の器官に拡散することがある。これは、ほとんどの場合、肝硬変と呼ばれる肝臓の疾患を有する患者において起こる。年少期に起こり過去の肝臓疾患と関連しない線維層板ヘパトームと呼ばれるヘパトームの稀なサブタイプも存在する。原発性肝臓癌のその他のタイプは、胆管に並ぶ細胞から始まることから胆管細胞癌または胆管癌と呼ばれる。ヘパトームを発症した大部分の患者は、通常肝硬変と呼ばれる状態も有する。これは、感染および長期間の過度のアルコール摂取を含む様々な原因に起因する肝臓全体の緻密な瘢痕化である。しかし、肝硬変患者でも僅かな率でしか原発性肝臓癌を発症しない。B型肝炎ウイルスまたはC型肝炎ウイルスのいずれかの感染は肝臓癌を引き起こし得、肝硬変の原因にもなり得、ヘパトームの発症の危険を増加させる。体内における過度の鉄の沈着を引き起こす血色素症と呼ばれる稀な状態を有する患者は、ヘパトームを発症する可能性が高い。従って、本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、断片、ならびに／または融合タンパク質は、肝細胞癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはその重症度を軽減しもしくはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを抑制するのに使用され得る。肝細胞癌は、肝炎（例えば、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、およびD型肝炎）感染に関連する場合もそうでない場合もあり得る。
【０１９２】
腫瘍反応に対するIL-28もしくはIL-29ポリペプチド、断片、または融合タンパク質の効果は、トランスホーミング増殖因子α（TFG-α）単独（Jhappan et al., Cell 61: 1137-1146 (1990); Sandgren et al., Mol. Cell, Biol., 13: 320-330 (1993); Sandgren et al., Oncogene, 4: 715-724 (1989); およびLee et al., Cancer Res., 52: 5162: 5170 (1992)）またはc-myc（Murakami et al., Cancer Res., 53: 1719-1723 (1993)）、変異型H-ras（Saitoh et al., Oncogene, 5: 1195-2000 (1990)）、HbsAgおよびHBxをコードするB型肝炎ウイルス遺伝子（Toshkov et al., Hepatology, 20: 1162-1172 (1994)およびKoike et al., Hepatology, 19: 810-819 (1994)）、SV40ラージT抗原（Sepulveda et al., Cancer Res., 49: 6108-6117 (1989)およびSchirmacher et al., Am. J. Pathol., 139: 231-241 (1991)）、ならびにFGF19（Nicholes et al., American Journal of Pathology, 160(6): 2295-2307 (June 2002)）と組み合わせて過剰発現させる肝細胞癌トランスジェニックマウスモデルにおいて評価され得る。
【０１９３】
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、タンパク質、融合物、ならびにそれらの断片は、肝細胞癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する上で、他の薬剤と組み合わせて使用され得、そのような他の薬剤には、化学療法剤（例えば、アドリアマイシン、5-FU）、ベバシズマブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、サリドマイド、ゲムシタビン、オキサリプラチン、およびエピルビシンが含まれる。
【０１９４】
強力なアポトーシス誘導因子、Apo2L/TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）は、正常細胞との対比で選択的に形質転換した細胞においてアポトーシスを誘導するので、潜在的な腫瘍特異的癌治療剤として大きな期待がかけられている。インターフェロン（IFN）は、TRAILの発現の重要なモジュレーターであり、従ってこのリガンドはウイルス感染および悪性転換の監視において重要な役割を果たすようだ。Fiorucci et al., Curr Pharm Des. 2005; 11(7): 933-44。IL-28およびIL-29はまた、TRAILの重要なレギュレーターのようである（TRAILがIL-29によりアップレギュレートされることを示す実施例41を参照されたい）。
【０１９５】
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、タンパク質、融合物、ならびにそれらの断片は、前立腺癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する上で、他の薬剤、例えば放射線療法、化学療法（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン、ミトキサントロン）、エストラムスチン、ドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン／エトポシド、エストラムスチン／ビンブラスチン、エストラムスチン／パクリタキセル、ミトキサントロン、ゾレドロネート、プレドニゾロン、セレコキシブ、エトポシド、エルロチニブ、ラパチニブ、ならびにソラフェニブと組み合わせて使用され得る。
【０１９６】
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、タンパク質、融合物、ならびにそれらの断片は、膵癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する上で、他の薬剤、例えばフルオロウラシル（5-FU）化学療法、放射線療法、ゲムシタビン、フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、ロイコボリン、カペシタビン、ダルテパリン、ベバシズマブ、およびタルセバと組み合わせて使用され得る。
【０１９７】
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、タンパク質、融合物、ならびにそれらの断片は、結腸直腸癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する上で、他の薬剤、例えば葉酸、フルオロウラシル［5-FU］、イリノテカン、ロイコボリン、イリノテカン、レバミソール、ベバシズマブ、IFL-ベバシズマブ、およびセツキシマブと組み合わせて使用され得る。
【０１９８】
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、タンパク質、融合物、ならびにそれらの断片は、腎細胞癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する上で、他の薬剤、例えばキナーゼ阻害剤（例えばスチニニブ（sutininib）およびソラフェニブ）、IL-2、インターフェロン-α、およびビンブラスチンと組み合わせて使用され得る。
【０１９９】
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、タンパク質、融合物、ならびにそれらの断片は、黒色腫を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する上で、他の薬剤、例えばインターフェロンα2b、ダカルバジン（DTIC）、ニトロソ尿素類、カルムスチン（BCNU）、ロムスチン、タモキシフェン、シスプラチン、およびIL-2と組み合わせて使用され得る。
【０２００】
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、タンパク質、融合物、ならびにそれらの断片は、食道癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する上で、他の薬剤、例えば化学療法剤（例えば、シスプラチン、ブレオマイシン、5FU、パクリタキセル、VP-16；イリノテカン、インターフェロン-α、タキソテール、ゲムシタビン、ベノレルビン（venorelbine）、カルボプラチン、マイトマイシン-C、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、メトトレキサート、メチル-GAG）と組み合わせて使用され得る。
【０２０１】
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、タンパク質、融合物、ならびにそれらの断片は、上皮性卵巣癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する上で、他の薬剤、例えば化学療法剤（パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド）、トポテカン、リポソーム性ドキソルビシンおよびトポテカン、ゲムシタビン、フルオロウラシルおよびロイコボリン、タモキシフェン、エトポシド、イホスファミド、ヘキサメチルメラミン（HMM）、ならびにカペシタビンと組み合わせて使用され得る。
【０２０２】
本発明のIL-28およびIL-29ポリペプチド、タンパク質、融合物、ならびにそれらの断片は、非小細胞肺癌を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する上で、他の薬剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、トポテカン、イリノテカン、ビノレレビン（vinorelebine）、ビノレルビン、ゲムシタビン、IRESSA、TARCEVA、ベバシズマブ、ソラフェニブ、セレコキシブと組み合わせて使用され得る。
【０２０３】
自己免疫障害を処置するためのIL-28およびIL-29の使用
本発明は、SEQ ID NO: 2、4、6、13、15、17、19、21、23、25、27、29、36、37、38、39、40、41、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、および161の群より選択される治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群より選択される自己免疫障害を処置し、予防し、その進行を抑制し、その発症を遅らせ、および／またはそれに関連する状態もしくは症状の少なくとも一つを軽減する方法を提供する。このポリペプチドはさらに、このポリペプチドに（例えば、アミノ末端に）共有結合できるポリエチレングリコール部分を任意で含み得る。ポリエチレングリコールは直鎖型または分枝型であり得る。ポリエチレングリコールは約20kD、30kD、または40kDの分子量を有し得る。ポリエチレングリコールはモノメトキシ-PEGプロピオンアルデヒドであり得る。このポリペプチドを投与される患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
【０２０４】
本発明は、SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群より選択される自己免疫障害を処置する方法を提供する。
【０２０５】
本発明は、SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有する治療有効量のポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群より選択される自己免疫障害を処置する方法を提供する。
【０２０６】
本発明は、SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群より選択される自己免疫障害の方法を提供する。
【０２０７】
本発明は、SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、第二のポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、および乾癬の群より選択される自己免疫障害の進行を抑制する方法を提供する。
【０２０８】
本発明は、SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、患者の多発性硬化症の再発を遅らせる方法を提供する。
【０２０９】
本発明は、SEQ ID NO: 163、165、167、169、171、173、および175の群より選択される配列と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、薬学的に許容される媒体を含む治療有効量の処方物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、患者の再発性多発性硬化症の重症度を軽減する方法を提供する。
【０２１０】
関節リウマチ
関節リウマチは、身体の免疫反応が体内の自己タンパク質、特に複数の組織、特に関節の基礎をなすタンパク質であるコラーゲンを標的化する自己免疫障害である。コラーゲンに対して生じた免疫反応は関節を破壊する。やがて患者は自身の指およびつま先を動かす能力を失い、関節および膝の急性痛を経験し得る。関節炎患者由来の血清においては、TNFα（腫瘍壊死因子）およびコラーゲンに対する抗体の量が増加しており、その両方ともが慢性疾患の指標となるだけでなく、この疾患の病理にも寄与する（Smolen and Stein+er G, Nat. Rev. Drug Discov., 2: 473-488, 2003; Firestein, Nature 423: 356-361, 2003）。さらに、この疾患はCD4+ T細胞により開始および媒介される。DCはコラーゲンを抗原としてCD4+ T細胞に提示する。コラーゲン誘導性関節炎（CIA）モデルは、ヒトにおいて見られるこの疾患の大部分を反映する関節リウマチのマウスモデルである（Moore, Methods Mol. Biol. 225: 175-179, 2003: Waksman, Scand. J. Immunol., 56: 12-34, 2002）。マウスは、CFAに乳化させた2回量のコラーゲンによって、尾の基部から免疫刺激される。これにより足の腫脹が時間と共に大きくなり、目視によるスコア付けおよびカリパスを用いた測定の両方が行われ得る。IL-28A、IL-28B、またはIL-29はコラーゲン免疫マウス群に投与され、疾患スコアに対する効果が評価される。IL-28A、IL-28B、およびIL-29による足のスコアおよび厚みの抑制は、現存する自己免疫反応に対する抑制効果の指標となる。
【０２１１】
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（IBD）として公知の、免疫調節不全に起因する腸の炎症は、二つの大まかな疾患の定義、クローン病（CD）および潰瘍性大腸炎（UC）に分類される。一般的にCDはTh1反応の調節における障害に起因すると考えられ、UCはTh2反応の調節における障害に起因すると考えられている。複数のサイトカイン、ケモカイン、およびマトリックスメタロプロテアーゼが、IBD患者の炎症病巣においてアップレギュレートされることが示されている。これらには、IL-1、IL-12、IL-18、IL-15、TNF-α、IFN-γ、MIP1α、MIP1β、およびMIP2が含まれる。現在、REMICADE（登録商標）（Centocor, Malvern, PA）が、CD患者を処置した場合にこの疾患自体を標的化するのに成功した唯一の薬物であり、他の処置は全般的に患者の生活水準を向上させるものであった。IBDに関連する自己免疫反応のIL-28A、IL-28B、およびIL-29による抑制は、IBDモデル、例えばマウスDSS、TNBS、CD4+CD45Rbhi、mdr1a-/-、および対宿主性移植片病（GVHD）腸炎症モデルにおいて実証される（Stadnicki A and Colman RW, Arch Immunol Ther Exp 51: 149-155, 2003; Pizarro TT et al., Trends in Mol Med 9: 218-222, 2003）。ヒトIBDの一つの実験モデルは、齧歯類へのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の経口投与である。DSSは、ヒトにおける組織学的知見とある程度類似する特徴を有する急性および慢性の両方の潰瘍性大腸炎を誘導する。DSSにより誘導された大腸炎は、腸内細菌、マクロファージおよび好中球に関係するものであり、T細胞およびB細胞の役割は小さい（Mahler et al., Am. J. Physiol. 274: G544-G551, 1998; Egger et al., Digestion 62: 240-248, 2000）。TNBS誘導性大腸炎はTh1媒介性疾患とみなされ、従ってヒトにおいてはUCよりもCDに類似する。トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）は、Th1様サイトカインIL-12、IL-18、およびIFNγの分泌を伴う抗原特異的（TNBS）T細胞反応を誘導するために、様々な用量（系統依存的）でマウスに直腸内注入される。大腸炎は、炎症部位への抗原特異的T細胞、マクロファージ、および好中球の動員を伴う（Neurath et al., Int. Rev. Immunol., 19: 51-62, 2000; Dohi T et al., J. Exp. Med. 189: 1169-1179, 1999）。別の比較的新しい大腸炎モデルはSCIDマウスへのCD4+CD45RBhi移植モデルである。CD4+ T細胞は、CD45Rbの発現に基づき大まかに二つのカテゴリーに分類できる。CD4+CD45RBhi細胞は、ナイーブT細胞とみなされ、CD4+CD45Rblo細胞は調節性T細胞とみなされる。同系SCIDマウスへの総CD4+ T細胞の移植は大腸炎の症状を誘導しない。しかし、SCIDマウスにCD4+CD45RBhi T細胞のみが注射された場合、マウスは3〜6週間で大腸炎を発症する。ナイーブT細胞と共にCD4+CD45Rblo調節性T細胞を移植した場合は大腸炎が抑制され、これにより調節性T細胞が免疫反応の調節において重要な役割を担うことが示唆される（Leach et al., Am. J. Pathol., 148: 1503-1515, 1996; Powrie et al., J. Exp. Med., 179: 589-600, 1999）。このモデルは、IL-28A、IL-28B、およびIL-29が、マウスにおいて免疫寛容誘発性DCを発生させる能力を通じてT調節機能をアップレギュレートすることによって大腸炎を抑制することを実証する。骨髄移植に関連する大腸炎に臨床的に関係するモデルはGVHD誘導性大腸炎である。対宿主性移植片病（GVHD）は、免疫能力不全の、組織適合性のレシピエントにおいて、増殖し宿主細胞を攻撃するエフェクター細胞を生成する。同種異系の骨髄移植を受けた患者または重度の再生不良性貧血患者はGVHDの危険��ある。マウスおよびヒトの両方において、下痢はこの症状の一般的かつ深刻な症状である。ヒトにおいては、結腸および小腸の両方の疾患が観察された。GVHD誘導性大腸炎のマウスモデルは、ヒトにおいて見られるのと類似の組織学的疾患を示す。従ってこれらのマウスモデルは、GVHDに対する大腸炎抑制薬の効果を評価するのに使用され得る（Eigenbrodt et al., Am. J. Pathol., 137: 1065-1076, 1990; Thiele et al., J. Clin. Invest., 84: 1947-1956, 1989）。
【０２１２】
全身性エリテマトーデス
全身性エリテマトーデス（SLE）は、遍在的な自己抗原に対する慢性的なIgG抗体の産生（抗dsDNA）により特徴付けられる免疫複合体関連障害である。SLEの影響は特定器官に限定されるものではなく、全身的なものである。複数の染色体座がこの疾患に関連し、この疾患の異なる局面、例えば抗dsDNA抗体および糸球体腎炎に寄与し得る。CD4+ T細胞は、SLEのマウスモデルにおいて積極的な役割を担うことが示された（Horwitz, Lupus 10:319-320, 2001; Yellin and Thienel, Curr. Rheumatol. Rep., 2:24-37, 2000）。CD8+ T細胞の役割は明確に規定されていないが、「サプレッサー」としてのCD8+ T細胞の機能が狼瘡患者において低下していることを示唆する証拠が存在する（Filaci et al., J. Immunol., 166: 6452-6457, 2001; Sakane et al, J. Immunol., 137: 3809-3813, 1986）。
【０２１３】
ヒトSLE患者およびマウスモデル由来の血清は、IL-28A、IL-28B、およびIL-29の活性についてアッセイされる。IL-28A、IL-28B、またはIL-29と共に培養した後のヒトSLE患者由来のPBLにおけるCD8+ T細胞のサプレッサー活性がインビトロで評価される。SLE患者由来のCD8+ T細胞のサプレッサー活性は、それらが自己PBMCの抗CD3誘導性増殖を抑制する能力によって評価される。抑制機能は、培養物中のIFNγおよびIL-6の分泌と相関する。IL-28A、IL-28B、またはIL-29処置患者由来の培養物においてIFNγおよびIL-6が増加することは、サプレッサー活性が高いことを示す（Filaci et al., J. Immunol.166: 6452-6457, 2001）。
【０２１４】
乾癬
乾癬は、過形成性の表皮ケラチノサイトならびにCD4+メモリーT細胞、好中球、およびマクロファージを含む浸潤性の単核細胞と関連する慢性的な炎症性皮膚疾患である（Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110: 199, 1996）。現在は、環境抗原がこの疾患の病理を開始し助長する上で重要な役割を果たすと考えられている。しかし、乾癬の病理を媒介すると考えられるのは自己抗原に対する寛容の喪失である。樹状細胞およびCD4+ T細胞は、この病理をもたらす免疫反応を媒介する抗原提示および認識において重要な役割を果たすと考えられる。最近、CD4+CD45RB移植モデルに基づく乾癬モデルが作製された（Davenport et al., Internat. Immunopharmacol., 2: 653-672 (2002)）。IL-28A、IL-28B、またはIL-29は、乾癬誘導細胞を注射されたマウスに投与され、臨床スコア（皮膚疾患）に対する効果が評価され、IL-28A、IL-28B、およびIL-29の有益な効果が示される。
【０２１５】
IL-28A、IL-28B、またはIL-29は、インターフェロン-α（IFN-α、例えばPEGASYS（登録商標）、PEG-INTRON（登録商標）、INFERGEN（登録商標）、Albuferon-Alpha（商標））、インターフェロン-β（IFN-β、例えばAVONEX（登録商標）、BETASERON（登録商標）、REBIF（登録商標））、インターフェロン-γ（INFγ、例えばACTIMMUNE（登録商標））、NOVANTRONE（登録商標）、ENBREL（登録商標）、REMICADE（登録商標）、LEUKINE（登録商標）、APO2L/TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、IL-21、およびIL-2等の薬剤を含む、すでに自己免疫ならびに／または癌に対して使用されている他の薬剤と共に投与され得る。IL-28A、IL-28B、およびIL-29についての最適な用量レベルおよび投薬計画の作成は、IL-28A、IL-28B、およびIL-29の薬物動態および薬力学の研究；動物モデルにおける有効用量の決定、ならびにIL-28A、IL-28B、およびIL-29の毒性評価を含む様々な手段により行われる。次いで、霊長類において行われる直接的な薬物動態の測定および臨床試験が、患者における生物学的反応を達成するのに十分な規模および持続期間の血漿IL-28A、IL-28B、およびIL-29レベルを達成する、患者における理論上の用量を推測するのに使用され得る。
【０２１６】
以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに説明する。
【０２１７】
実施例
実施例1
哺乳動物用発現プラスミド
zcyto20およびzcyto21を含む発現プラスミドは相同組換えによって構築した。zcyto20およびzcyto21のcDNA断片をPCR増幅を用いて生成した。PCR用プライマーは以下の通りであった。
【０２１８】
zcyto20/pZMP21: zc40923およびzc43152、それぞれSEQ ID NO: 42および43；ならびにzcyto21/pZMP21: zc40922およびzc43153、それぞれSEQ ID NO: 72および73。
【０２１９】
PCR反応混合物を1％アガロースゲルを用いて泳動させ、挿入断片の大きさに対応するバンドを、QIAquick（商標）ゲル抽出キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いてゲル抽出を行った。
【０２２０】
BglIIで切断したプラスミドpZMP21を、PCR挿入断片を用いた組換えに使用した。プラスミドpZMP21はMPSVプロモーターおよびコード配列の挿入のための複数の制限酵素部位；大腸菌複製起点；SV40プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物用選択マーカー発現ユニット；ならびに出芽酵母における選択および複製のために必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物用発現ベクターである。これは、pRS316（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209）にアクセッション番号77145として寄託）から得た酵母遺伝子エレメント、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入部位（IRES）エレメント、および膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインを用いて、pZP9（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209）にアクセッション番号98668として寄託）から構築した。
【０２２１】
100マイクロリットルのコンピテントな酵母（出芽酵母）細胞を、10μlの挿入DNAおよび100ngの上記pZMP21ベクター切断物と別々にあわせ、その混合物を0.2cm電気穿孔用キュベットに移した。0.75kV（5kV/cm）、∞ ohms、および25μFに設定した電源（BioRad Laboratories, Hercules, CA）を用いて酵母／DNA混合物に電気パスルを加えた。600μlの1.2Mソルビトールをキュベットに加え、酵母を100μlおよび300μlアリコートの二つのURA-Dプレートにプレーティングし、30℃でインキュベートした。約72時間後、1枚のプレートからのUra+酵母形質転換体を1ml H2Oに再懸濁し、軽く遠心して酵母細胞をペレットにした。この細胞ペレットを0.5mlの溶解緩衝液（2% Triton X-100、1% SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH8.0、1mM EDTA）に再懸濁した。500マイクロリットルの溶解混合物を、250μlの酸洗浄済ガラスビーズおよび300μlのフェノール-クロロホルムを含むエッペンドルフチューブに入れ、3分間ボルテックスし、エッペンドルフ用遠心分離機で最大速度で5分間遠心した。300マイクロリットルの水相を別のチューブに移し、600μlのエタノール（EtOH）および30μlの3M酢酸ナトリウムを用いてDNAを沈殿させ、その後に最大速度で30分間遠心分離した。このDNAペレットを30μlのTEに再懸濁した。
【０２２２】
エレクトロコンピテントな大腸菌宿主細胞（MC1061）の形質転換は、5μlの酵母DNAプレップおよび50μlの細胞を用いて行った。細胞に2.0kV、25μF、および400 ohmsの電気パルスを加えた。電気穿孔後、1mlのSOC（2％ Bacto（商標）トリプトン（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母エキス（Difco）、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース）を加え、次いで細胞を50μlおよび200μlのアリコートの二つのLB AMPプレート（LBブロス（Lennox）、1.8％ Bacto（商標）寒天（Difco）、100mg/Lアンピシリン）にプレーティングした。
【０２２３】
各構築物について三つのクローンの挿入断片を配列分析に供し、正確な配列を含むクローンを各構築物につき一つ選択した。より多量のプラスミドDNAを、市販のキット（QIAGENプラスミドメガキット、Qiagen, Valencia, CA）を製造元の説明書に従い用いて単離した。この正確な構築物をzcyto20/pZMP21およびzcyto21/pZMP21と名付けた。
【０２２４】
実施例2
CHO細胞における哺乳動物用構築物の発現
200μgのzcyto20/pZMP21およびzcyto21/pZMP21構築物を37℃で3時間、200ユニットのPvuIで切断し、次いでIPAで沈殿させ、1.5mL微量遠心チューブ内で遠心した。その上清をデカントしてペレットを得、そのペレットを1mLの70％エタノールで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。このチューブを微量遠心機により14,000RPMで10分間遠心し、その上清を吸引してペレットを得た。次いでそのペレットを、無菌環境下で750μlのPF-CHO培地に再懸濁し、60℃で30分間インキュベートした。CHO細胞を遠心し、DNA培地溶液を用いて再懸濁した。このDNA／細胞混合物を0.4cmギャップのキュベットに入れ、以下のパラメータを用いて電気穿孔した：950μF、高キャパシタンス、および300V。次いでキュベット内容物を取り出し、PF-CHO培地を用いて25mLに希釈し、125mL振盪フラスコに入れた。このフラスコを37℃、6％ CO2のシェーカーに設置したインキュベーターに入れ、120RPMで振盪した。
【０２２５】
実施例3
zcyto20-CHOタンパク質の精製および分析
zcyto20-CHOタンパク質の精製
組換えzcyto20（IL-28A）タンパク質は、DXB11-CHO細胞株のプールから得た。培養物を回収し、培地を0.2μmフィルターを用いて濾過滅菌した。
【０２２６】
zcyto20-CHOタンパク質の精製は、Poros HS 50カラム（Applied Biosystems, Framingham, MA）、Monolithic WCXカラム（Isco, Inc., Lincoln, NE）、ToyoPearl Butyl 650Sカラム（TosoH, Montgomeryville, PA）、およびSuperdex 75カラム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を順次用いることによって行った。DXB111-CHO由来の培養培地をpH 6.0に調整した後、Poros 50 HSカラムにロードした。カラムを50mM MES（2-モルホリノエタンスルホン酸）、100mM NaCl、pH6で洗浄し、結合したタンパク質を、50mM MES、2M NaCl、pH6の60％までの10カラム量（CV）の直線勾配を用いて溶出した。溶出画分を回収し、zcyto20タンパク質の存在をSDS-PAGEおよびクマシー染色によって確認した。zcyto20タンパク質を含有するこの画分をプールし、伝導率が約20mSとなるよう再蒸留水で希釈し、Monolithic WCXカラムにロードした。このカラムを、93％の50mM MES、100mM NaCl、pH6および7％の50mM MES、2M NaCl、pH6で洗浄した。結合したタンパク質を、50mM MES、2M NaCl、pH6の7％〜50％の25CVの直線勾配を用いて溶出した。溶出画分を回収し、zcyto20タンパク質の存在をSDS-PAGEおよびクマシー染色によって確認した。zcyto20タンパク質を含有する画分をプールし、1M硫酸アンモニウムで調整し、ToyoPearl Butyl 650Sカラムにロードした。zcyto20は、硫酸アンモニウムの漸減勾配を用いて溶出し、純粋なzcyto20を含有する画分をプールし、Superdex75カラムへの注入のために濃縮した。ゲル濾過カラムから回収したzcyto20タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、0.2μmフィルターを通して濾過し、-80℃で保存した。最終精製タンパク質の濃度はBCAアッセイ法（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）およびHPLC-アミノ酸分析によって決定した。
【０２２７】
zcyto20-CHOタンパク質のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析
組換えzcyto20タンパク質をSDS-PAGE（Nupage 4-12％ Bis-Tris, Invitrogen, Carlsbad, CA）およびzcyto20-CHOタンパク質と交差反応するウサギ抗zcyto21-CEE-BV IgGを一次抗体として用いるウェスタンブロットによって分析した。Invitrogen社のXcell IIミニセル（Carlsbad, CA）を用いてゲルを電気泳動し、Invitrogen社のXcell IIブロットモジュールを機器マニュアルに提供された指示に従って用いて0.2μmニトロセルロースメンブレン（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）に転写した。転写は、25mM Tris塩基、200mMグリシン、および20％メタノールを含む緩衝液中、500mA下で50分間行った。このメンブレンを1×PBS中10％脱脂粉乳を用いて10分間ブロッキングした後、2.5％脱脂粉乳を含む1×PBS中で一次抗体でプローブした。ブロットを振盪しながら室温で1時間標識した。二次抗体の標識のために、ブロットをPBSを用いて各々10分間、3回洗浄し、次いでヤギ抗ウサギIgG-HRP（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）で1時間プローブした。このブロットを1×PBSで各々10分間、3回洗浄し、SuperSignal（登録商標）ULTRA試薬（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）の1：1混合物を用いて現像し、Lumi-Imager（Boehringer Mannheim GmbH, Germany）を用いてシグナルを捕捉した。
【０２２８】
タンパク質の精製および分析の概要
CHO培地から精製したzcyto20タンパク質は、非還元条件下の4〜12％ Bis-Trisゲルにおいて、大部分が二重バンドとしておよそ20kDaに、および微量に三重バンドの二量体として約38kDaに移動した。これらは全て、還元条件下では一本の20kDaのバンドに分解した。MSペプチドマッピングは、ジスルフィド結合についての二つの異性体の混合物およびO結合型グリコシル化部位の存在を示した。
【０２２９】
実施例4
zcyto21-CHOタンパク質の精製および分析
Zcyto21-CHOタンパク質の精製
組換えzcyto21は、安定なDXB11-CHO細胞株から得た。培養物を回収し、培地を0.2μmフィルターを用いて濾過滅菌した。最初に陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせを、その後に疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを行うことによって、タンパク質を条件培地から精製した。DXB111-CHOカラム培地をpH6.0に調整した後、Poros 50 HSカラム（Applied Biosystems, Framingham, MA）にロードした。このカラムを1×PBS、pH6で洗浄し、結合したタンパク質を5×PBS、pH8.4によって溶出した。溶出画分を回収し、zcyto21タンパク質の存在をSDS-PAGEおよびクマシー染色によって確認した。次いでこの画分を伝導率が13mSとなるように希釈してそのpHを8.4に調整し、Poros 50 HQカラム（Applied Biosystems, Framingham, MA）を通した。次いでzcyto21タンパク質を含む流出画分を硫酸アンモニウムで約127mSに調整し、ToyoPearl Phenyl 650 Sカラム（TosoH, Montgomeryville, PA）にロードした。zcyto21タンパク質を硫酸アンモニウムの漸減勾配によって溶出し、純粋なzcyto21を含む画分をプールし、Superdex 75カラム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）に注入するため濃縮した。最終精製タンパク質の濃度はBCAアッセイ法（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）およびHPLC-アミノ酸分析によって決定した。
【０２３０】
zcyto21-CHOタンパク質のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析
組換えzcyto21タンパク質をSDS-PAGE（Nupage 4-12％ Bis-Tris, Invitrogen, Carlsbad, CA）およびウサギ抗zcyto21-CEE-BV IgGを一次抗体として用いるウェスタンブロットによって分析した。InvitrogenのXcell IIミニセル（Carlsbad, CA）を用いてゲルを電気泳動し、InvitrogenのXcell IIブロットモジュールを機器マニュアルに提供された指示に従い用いて0.2μmニトロセルロースメンブレン（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）に転写した。転写は、25mM Tris塩基、200mMグリシン、および20％メタノールを含む緩衝液中、500mA下で50分間行った。転写したブロットを1×PBS中10％脱脂粉乳を用いて10分間ブロッキングした後、2.5％脱脂粉乳を含む1×PBSにおいて一次抗体でプローブした。このブロットを振盪させながら室温で1時間標識した。二次抗体の標識のために、このブロットをPBSで各々10分間、3回洗浄し、次いでヤギ抗ウサギIgG-HRP（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）で1時間プローブした。このブロットを1×PBSで各々10分間、3回洗浄し、SuperSignal（登録商標）ULTRA試薬（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）の1：1混合物を用いて現像し、Lumi-Imager（Boehringer Mannheim GmbH, Germany）を用いてシグナルを捕捉した。
【０２３１】
タンパク質の精製および分析の概要
CHO培地から精製されたzcyto21タンパク質は、還元条件下および非還元条件下の両方の4〜12％ Bis-Trisゲルにおいて、およそ28 kDaの二つ以上のバンドとして移動した。MSペプチドマッピングは、ジスルフィド結合についての二つの異性体の混合物、ならびに一つのN結合型グリコシル化部位およびいくつかのO結合型グリコシル化部位の存在を示した。
【０２３２】
実施例5
IL-29の形態の同定
精製したIL-29のプール由来のピーク画分を、ジスルフィドの再形成を制限するために、およそpH6.3のリン酸緩衝液中の配列分析グレードのトリプシン（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を用いて37℃で一晩消化した。各消化物を、四重極飛行時間ハイブリッド型質量分析計（Micromass, Milford MA）に直列接続された逆相HPLC（Agilent, Palo Alto, CA）によって分析した。スペクトルを収集し、質量から質量電荷比に変換し、IL-29のトリプシン消化によって生じる全ての理論上のペプチドおよびジスルフィド結合型ペプチド群と比較した。ジスルフィドは還元前後のスペクトルを比較することによって割り当て、適当な質量をIL-29におけるジスルフィド結合ペプチドに割り当てた。画分＃20の物質は、ジスルフィドパターンC15〜C112およびC49〜C145を示し、C171はS-グルタチオニルシステインとして観察された（全てSEQ ID NO: 4を参照）。画分＃51の物質は、ジスルフィドパターンC49〜C145およびC112〜C171を示し、C15はS-グルタチオニルシステインとして観察された（SEQ ID NO: 4を参照）。
【０２３３】
実施例6
大腸菌発現用プラスミド
発現ベクターpTAP237の構築
プラスミドpTAP237は、相同組換えによってPCRにより作製したリンカーをpTAP186のSmaI部位に挿入することによって作製した。プラスミドpTAP186は、プラスミドpRS316（出芽酵母シャトルベクター）ならびに、pKK223-3に由来しtacプロモーターおよびrrnBターミネーターを含む大腸菌発現用プラスミドpMAL-c2から得た。プラスミドpTAP186はSmaI部位が破壊されたカナマイシン耐性遺伝子を含み、かつNotI切断によるプラスミドからの切り出しを容易にするため、酵母ARS-CEN6およびURA3配列に隣接してNotIおよびSfiI部位を有する。PCRにより作製したリンカーによって、pTAP186における発現カプラー配列を合成RBS II配列に置換した。これは、SEQ ID NO: 44および45に示されるそれぞれオリゴヌクレオチドzc29,740およびzc29,741の各々100pmol、ならびにSEQ ID NO: 46および47に示されるそれぞれオリゴヌクレオチドzc29,736およびzc29,738の各々およそ5pmolから調製した。これらのオリゴヌクレオチドを、94℃で30秒間、50℃で30秒間、および72℃で30秒間を10サイクル、その後の4℃での浸積を行うPCRによって組み合わせた。得られたPCR産物を2倍量の100％エタノールを用いた沈降によって濃縮した。ペレットを10μlの水に再懸濁し、SmaIで切断したレシピエントベクターpTAP186への組換えによる合成RBS II配列を含む構築物の作製のために使用した。およそ1μgのPCRにより作製したリンカーおよび100ngのSmaIで切断したpTAP186を混合し、コンピテントな酵母細胞（出芽酵母）を形質転換した。次いでこの酵母を-URA Dプレートにプレーティングし、室温で約72時間静置した。次に、1枚のプレートからのUra+形質転換体を1mLのH2Oに再懸濁し、軽く遠心して酵母細胞をペレットにした。細胞ペレットを0.5 mLの溶解緩衝液に再懸濁した。DNAを回収し、これを用いて大腸菌MC1061を形質転換した。SEQ ID NO: 44および45に示されるそれぞれオリゴヌクレオチドzc29,740およびzc29,741を各々20pmol用いる上記のコロニーPCRによってクローンをスクリーニングした。アガロースゲル上で正確な大きさのバンドを示すクローンを配列分析に供した。正確なプラスミドをpTAP237と名付けた。
【０２３４】
実施例7
IL-29システイン変異体のコドンの最適化
IL-29野生型発現構築物のコドン最適作製
天然のヒトIL-29遺伝子配列は大腸菌W3110株において十分に発現されなかった。IL-29コード配列において使用されるコドンの試験は、CAI値が0.206の、大腸菌において最も使用頻度の低いコドンが多く含まれることを示した。CAIは、同義のコドンの偏りについての統計学的測定法であり、タンパク質の産生レベルを予測するのに使用され得る（Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15(3): 1281-95, 1987）。高度に発現されるタンパク質をコードする遺伝子は高いCAI値（＞0.6）を有する傾向があり、低いCAI値（≦0.2）を有する遺伝子によってコードされるタンパク質は一般的に発現が不十分である。これにより、大腸菌におけるIL-29の産生の乏しさの理由が示唆された。さらに、稀なコドンはメッセージの後半に集中しており、それが翻訳の停止、翻訳の中途半端な終了、およびアミノ酸の誤導入の確率を高めている（Kane JF. Curr. Opin. Biotechnol. 6(5)：494〜500, 1995）。
【０２３５】
遺伝子内に稀なコドンを含むタンパク質の発現レベルは、特定の稀なtRNAのレベルを宿主において増加させた場合に劇的に改善できることが示された（Zdanovsky et al., Applied Enviromental Microb. 66: 3166-3173, 2000; You et al., Biotechniques 27: 950-954, 1999）。pRAREプラスミドは大腸菌においてほとんど使用されないいくつかのコドン（argU、argW、leuW、proL、ileX、およびglyT）に対するtRNAをコードする遺伝子を有する。これらの遺伝子は、その本来のプロモーターの制御下にある（Novy、前出）。pRAREとの共発現は大腸菌におけるIL-29の産生を増強し、およそ200mg/Lを生成する。これらのデータは、IL-29をコードする遺伝子をより適当なコドン用法によって再・再合成することが、多量のIL-29を発現させるための改善されたベクターを提供することを示唆する。
【０２３６】
コドンを最適化したIL-29コード配列は、16個のオーバーラップオリゴヌクレオチドから構築した：zc44,566（SEQ ID NO: 48）、zc44,565（SEQ ID NO: 49）、zc44,564（SEQ ID NO: 50）、zc44,563（SEQ ID NO: 51）、zc44,562（SEQ ID NO: 52）、zc44,561（SEQ ID NO: 53）、zc44,560（SEQ ID NO: 54）、zc244,559（SEQ ID NO: 55）、zc44,558（SEQ ID NO: 56）、zc44,557（SEQ ID NO: 57）。これらのオーバーラップオリゴヌクレオチドのプライマー伸長およびその後のPCR増幅により、大腸菌における発現に最適化されたコドンを有する全長IL-29遺伝子を得た。最終的なPCR産物を、酵母相同的組換えによって発現ベクターpTAP237に挿入した。この発現構築物を酵母から抽出し、コンピテントな大腸菌MC1061を形質転換した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによって同定した。陽性クローンを配列分析によって確認し、その後にこれを用いて生産用宿主W3110株を形質転換した。最適化されたIL-29配列を有する発現ベクターをpSDH184と名付けた。得られた遺伝子は大腸菌において非常によく発現し、新しい構築物による発現レベルは250 mg/Lあたりまで増加した。
【０２３７】
コドンを最適化したzcyto21 C172Sシステイン変異体発現構築物の作製
zcyto21 C172Sシステイン変異体を作製するのに使用したストラテジーは、QuikChange部位特異的変異誘発キット（Stratagene）に基づく。製造元の提案に基づきC172S変異を導入するためのプライマーを設計した。これらのプライマーをZG44,340（SEQ ID NO: 58）およびZG44,341（SEQ ID NO: 59）と名付けた。QuikChange変異誘発キットの説明書に従ってPCRを行いzcyto21 C172Sシステイン変異体を作製した。同一反応物50μlを5つ準備した。2.5μlのpSDH175（酵母ベクター骨格配列を含まない）DNAを反応の鋳型として用いた。以下の量の試薬を用いてPCRカクテルを調製した： 30μlの10×PCR緩衝液、125ng（27.42μl）のZG44,340、125ng（9.18μl）のZG44,341、6μlのdNTP、6μlのPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）、および206.4μlの水。47.5μlのカクテルを各反応に分配した。PCR条件は以下の通りであった：95℃で30秒間を1サイクル、その後に95℃で30秒間、55℃で1分間、68℃で7分間を16サイクル、その後に68℃で7分間を1サイクル、最後に4℃で維持。5つのPCR反応物を全て1つのチューブにまとめた。製造元の説明書に従い、5μlのDpnI制限酵素をPCR反応物に加え、37℃で2時間インキュベートした。10％の3モル濃度の酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを加えることによってDNAを沈殿させた。沈殿は-20℃で20分間行った。DNAを14,000 rpmで5分間遠心し、ペレットをspeed-vacで乾燥させた。DNAペレットを20μlの水に再懸濁した。PCRにより得たDNAで大腸菌DH10B株を形質転換した。5μlのDNAを40μlのElectroMAX DH10B細胞（Invitrogen）と混合した。次いで細胞およびDNAの混合物を、1.75kV、100Ω、および25μFに設定したBio-Rad Gene Pulser II（商標）を用いて0.1 cmキュベット（Bio-Rad）内で電気穿孔した。次いで電気穿孔した細胞を37℃で1時間培養した。混合物をLB+25μg/mlカナマイシンプレートにプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。10個のクローンをzcyto21 C172S挿入断片の存在についてスクリーニングした。QIAprep（商標）Spin Miniprepキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて10個全てのクローンからDNAを単離し、XbaIおよびPstI制限酵素で切断することによって挿入断片の存在について分析した。9個のクローンが挿入断片を含んでいたので、これらをzcyto21 C172S変異が導入されていることを確認するため配列分析した。クローンの配列を確認した後これをpSDH188を名付けた。
【０２３８】
実施例8
大腸菌用IL-29発現構築物
野生型配列を含むIL-29のDNA断片をPCRによって単離した。41塩基対（bp）のベクター隣接配列およびIL-29のアミノ末端に対応する24bpを含むプライマーzc41,212（SEQ ID NO: 60）、およびzcyto21挿入断片を含むベクターの3'末端に対応する38bpを含むプライマーzc41,041（SEQ ID NO: 61）をこの反応に使用した。PCR条件は以下の通りであった：94℃で30秒間、50℃で30秒間、および72℃で1分間を25サイクル、その後に4℃の浸積。分析のために少量（2〜4μL）のPCR試料を、1×TBE緩衝液を用いて1％アガロースゲル上を泳動させ、予想されたおよそ500bpの断片のバンドを確認した。残りの100μLの反応物を200μLの無水エタノールで沈殿させた。そのペレットを10μLの水に再懸濁し、これをSmaIで切断したレシピエントベクターpTAP238への組換えに使用し、上記のようなzcyto21をコードする構築物を得た。正確な配列を有するクローンをpTAP377と名付けた。クローンpTAP377をNot1/Nco1（10μlのDNA、5μLの緩衝液3（New England BioLabs）、2μLのNot1、2μLのNco1、31μLの水、37℃で1時間）で切断し、T4 DNAリガーゼ緩衝液（7μLの上記切断産物、2μLの5×緩衝液、1μLのT4 DNAリガーゼ）を用いて再連結した。この工程において、ベクターの合理化のために酵母配列CEN-ARSを除去した。pTAP337 DNAを診断のためにPvu2およびPst1で切断し、酵母配列の不存在を確認した。P/taP377 DNAを用いて、稀な大腸菌tRNA遺伝子のコピーを多量に有する宿主株である大腸菌W3110/pRARE株を形質転換した。
【０２３９】
実施例9
大腸菌用IL-28A発現構築物
（SEQ ID NO: 1に示される）zcyto20の野生型配列を含むDNA断片をPCRによって単離した。41bpのベクター隣接配列およびzcyto20のアミノ末端に対応する24bpを含むプライマーzc43,431（SEQ ID NO: 62）、およびzcyto20挿入断片を含むベクターの3'末端に対応する38bpを含むプライマーzc43,437（SEQ ID NO: 63）。PCR条件は以下の通りであった：94℃で30秒間、50℃で30秒間、および72℃で1分間を25サイクル、その後に4℃の浸積。分析のために少量（2〜4μL）のPCR試料を、1×TBE緩衝液を用いて1％アガロースゲル上を泳動させ、予想されたおよそ500bpの断片のバンドを確認した。残りの100μLの反応物を200μLの無水エタノールで沈殿させた。そのペレットを10μLの水に再懸濁し、これをSmaIで切断したレシピエントベクターpTAP238への組換えに使用し、上記のようなzcyto20をコードする構築物を得た。正確な配列を有するクローンをpYEL7と名付けた。これをNot1/Nco1（10μlのDNA、5μLの緩衝液3（New England BioLabs）、2μLのNot1、2μLのNco1、31μLの水、37℃で1時間）で切断し、T4 DNAリガーゼ緩衝液（7μLの上記切断産物、2μLの5×緩衝液、1μLのT4 DNAリガーゼ）を用いて再連結した。この工程において、ベクターの合理化のために酵母配列CEN-ARSを除去した。再連結したpYEL7 DNAを診断のためにPvu2およびPst1で切断し、酵母配列の不存在を確認した。PYEL7 DNAを用いて大腸菌W3110/pRARE株を形質転換した。
【０２４０】
実施例10
zcyto21 C172Sシステイン変異体発現構築物
zcyto21 C172Sシステイン変異体（SEQ ID NO: 28）を作製するのに使用したストラテジーは、QuikChange（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA）に基づく。製造元の提案に基づきC172S変異を導入するためのプライマーを設計した。これらのプライマーをZG44,327およびZG44,328（それぞれ、SEQ ID NO: 64および65）と名付けた。QuikChange変異誘発キットの説明書に従ってPCRを行いzcyto21 C172Sシステイン変異体を作製した。同一反応物50μlを5つ準備した。2.5μlのpTAP377（酵母ベクター骨格配列を含まない）DNAを反応の鋳型として用いた。以下の量の試薬を用いてPCRカクテルを調製した： 30μlの10×PCR緩衝液、125ng（27.42μl）のZG44,327（SEQ ID NO: 64）、125ng（9.18 μl）のZG44,328（SEQ ID NO: 65）、6μlのdNTP、6μlのPfu Turboポリメラーゼ（Strategene）、および206.4μlの水。47.5μlのカクテルを各反応に分配した。PCR条件は以下の通りであった：95℃で30秒間を1サイクル、その後に95℃で30秒間、55℃で1分間、68℃で7分間を16サイクル、その後に68℃で7分間を1サイクル、最後に4℃で維持。5つのPCR反応物を全て1つのチューブにまとめた。製造元の説明書に従い、5μlのDpnI制限酵素をPCR反応物に加え、37℃で2時間インキュベートした。10％の3モル濃度の酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノール（Aaper Alcohol, Shelbyville, KY）を加えることによってDNAを沈殿させた。沈殿は-20℃で20分間行った。DNAを14,000 rpmで5分間遠心し、ペレットをspeed-vacで乾燥させた。DNAペレットを20μlの水に再懸濁させた。PCRにより得たDNAで大腸菌DH10B株を形質転換した。5μlのDNAを40μlのElectroMAX DH10B細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）と混合した。次いで細胞およびDNAの混合物を、1.75kV、100Ωおよび、25μFに設定したBio-Rad Gene Pulser II（商標）を用いて0.1 cmキュベット（Bio-Rad, Hercules, CA）内で電気穿孔した。次いで電気穿孔した細胞を37℃で1時間培養した。混合物をLB+25μg/mlカナマイシンプレートにプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。10個のクローンをIL-29挿入断片の存在についてスクリーニングした。QIAprep（商標）Spin Miniprepキット（Qiagen）を用いて10個全てのクローンからDNAを単離し、XbaI（Roche）およびPstI（New England Biolabs）制限酵素で切断することによって挿入断片の存在について分析した。9個のクローンが挿入断片を含んでいたので、これらをzcyto21 C172S変異が導入されていることを確認するため配列分析した。クローン（単離体＃6）の配列を確認した後にこれをpSDH171を名付けた。zcyto21 C15S変異体を作製するために同様のストラテジーを遂行した。
【０２４１】
実施例11
zcyto20 C49Sシステイン変異体発現構築物
zcyto20 C49Sシステイン変異体をコードする配列は、オーバーラップPCRにより作製した（SEQ ID NO: 20）。野生型IL-28A配列（SEQ ID NO: 1）の最初の187塩基は、テンプレートとしてのpYEL7（SEQ ID NO: 67）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc43,431（SEQ ID NO: 62）およびzc45,399（SEQ ID NO: 66）を用いたPCR増幅によって作製した。塩基105〜531の第二のDNA断片は、テンプレートとしてのpYEL7（SEQ ID NO: 67）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc45,398（SEQ ID NO: 68）およびzc43,437（SEQ ID NO: 63）を用いたPCR増幅によって作製した。プライマーzc45,399（SEQ ID NO: 66）およびzc45,398（SEQ ID NO: 68）は、システイン49をセリンに変えた特有の修飾配列を含んだ。これら二つのPCR産物をまとめ、オリゴヌクレオチドプライマーzc43,431（SEQ ID NO: 62）およびzc43,437（SEQ ID NO: 63）を用いてオーバーラップPCR増幅を行った。酵母相同組換えによって最終PCR産物を発現ベクターpTAP238に挿入した（Raymond et al. Biotechniques. Jan. 26(1): 134-8, 140-1, 1999）。この発現構築物を酵母から抽出し、コンピテントな大腸菌DH10Bを形質転換した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによってスクリーニングした。陽性クローンを配列分析によって確認し、その後にこれを用いて生産用宿主W3110/pRARE株を形質転換した。zcyto20 C49Sシステイン変異体をコードする配列を有する発現構築物をpCHAN9と名付けた。
【０２４２】
実施例12
zcyto20 C51Sシステイン変異体発現構築物
zcyto20 C51Sシステイン変異体をコードする配列は、オーバーラップPCRにより作製した（SEQ ID NO: 24）。野生型IL-28A配列の最初の193塩基は、テンプレートとしてのpYEL7（SEQ ID NO: 67）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc43,431（SEQ ID NO: 62）およびzc45,397（SEQ ID NO: 63）を用いたPCR増幅によって作製した。塩基111〜531の第二のDNA断片は、テンプレートとしてのpYEL7（SEQ ID NO: 67）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc45,396（SEQ ID NO: 70）およびzc43,437（SEQ ID NO: 63）を用いたPCR増幅によって作製した。プライマーzc45,397（SEQ ID NO: 69）およびzc45,396（SEQ ID NO: 70）は、システイン51をセリンに変えた特有の修飾配列を含んだ。これら二つのPCR産物をまとめ、オリゴヌクレオチドプライマーzc43,431（SEQ ID NO: 62）およびzc43,437（SEQ ID NO: 63）を用いてオーバーラップPCR増幅を行った。酵母相同組換えによって最終PCR産物を自家製の発現ベクターpTAP238に挿入した（Raymond et al. 前出）。この発現構築物を酵母から抽出し、コンピテントな大腸菌DH10Bを形質転換した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによってスクリーニングした。陽性クローンを配列分析によって確認し、その後にこれを用いて生産用宿主W3110/pRARE株を形質転換した。zcyto20 C50Sシステイン変異体をコードする配列を有する発現構築物をpCHAN10と名付けた。
【０２４３】
実施例13
大腸菌におけるIL-28A、IL-29、およびCysからSerへのシステイン変異体の発現
個別の実験において、実施例6〜9に記載の各発現ベクターで形質転換した大腸菌を、0.01％ Antifoam 289（Sigma Aldrich, St.Louis, MO）、30μg/mlカナマイシン、35μg/mLクロラムフェニコールを含む100mLのSuperbroth II培地（Becton Dickinson, San Diego, CA）に接種し、37℃で一晩培養した。5mlの接種物を2L培養フラスコ中の同じ培地500mLに加え、これを培養物のOD600が4に達するまで37℃、250rpmで振盪した。次いでIPTGを終濃度が1 mMになるよう加え、さらに2.5時間振盪を続けた。この細胞を4,000×g、4℃で10分間遠心分離した。細胞ペレットを後で使用するまで-80℃で凍結した。
【０２４４】
実施例14
IL-28の再フォールディングおよび精製
封入体の調製
ヒト野生型IL-29を、上記のように封入体として大腸菌W3110株において発現させた。フェドバッチ発酵物由来の細胞ペレットを50mM Tris、pH 7.3に再懸濁した。この懸濁物は、APV-Gaulinホモジナイザー（Invensys APV, Tonawanda, New York）を8000psiで3回通過させた。不溶物を15,000 gで30分間の遠心分離によって回収した。このペレットを50mM Tris、1％（v/v）Triton X100、pH7.3、および4M尿素で連続的に洗浄した。次いて封入体を、室温で1時間、50mM Tris、6M塩酸グアニジン、5mM DTTに分散させた。次いでこの物質を15,000gで1時間遠心分離した。この工程で得た上清は還元型不溶性IL-29を含んだ。
【０２４５】
再フォールディング
可溶化させたIL-29を、室温で攪拌しながら50mM Tris、pH8、0.75Mアルギニン、0.05％ PEG3350、2mM MgCl2、2mM CaCl2、0.4mM KCl、10mM NaCl、4mM還元型グルタチオン、0.8mM酸化型グルタチオンにゆっくりと希釈した。再フォールディング緩衝液におけるIL-29の終濃度は0.1mg/mlであった。再フォールディング混合物を室温で一晩静置した。次いで濃酢酸を用いて懸濁物のpHを5に調整した。次いで懸濁物を、0.2μmフィルターにより濾過した。再フォールディング混合物のRP-HPLC分析は二つの顕著なピークを示した。
【０２４６】
精製
再フォールディング混合物をpH5の50mM NaOAcで直線的に希釈（1：2）し、Pharmacia SP Sepharose Fast Flow陽イオン交換カラム（North Peapack, NJ）にロードした。このカラムを3カラム量の50mM NaOAc、400mM NaCl、pH5で洗浄した。結合したIL-29を50mM NaOAc、1.4M NaCl、pH5で溶出させた。固体の(NH4)2SO4を、(NH4)2SO4の終濃度が0.5Mとなるように陽イオン交換工程の溶出液プールに加えた。次いでこの物質をToyoPearl Phenyl 650S HICカラム（Tosoh Biosep, Montgomery, PA）にロードした。次いでカラムを3カラム量の50mM NaOAc、1M (NH4)2SO4、pH5で洗浄した。50mM NaOAc、1M (NH4)2SO4、pH5から50mM NaOAc、pH5への10カラム量の直線勾配を用いて結合したzcyto21を溶出させた。溶出液の画分を回収した。この工程において二つの顕著なピークが観察された。溶出画分のRP-HPLC分析を行った。二つのジスルフィド結合異性体に対応する二つの産物は、PBS、pH7.3への最後の緩衝液の交換後に得た。
【０２４７】
実施例15
IL-29システイン変異体の再フォールディングおよび精製
実施例3に記載されるように、IL-29の精製により二つのジスルフィド結合異性体を得た。この二つの形態を分離するのにHIC FPLC工程を用いた。分離はそのままでは果たせなかった。実質的に純粋な異性体（＞95％）を得るためには、強めの「ピークシェービング（Peak Shaving）」を用いる必要があった。この工程の収量およびその延長でプロセス全体の収量は悪化した。最終的な収量はC15-C112型およびC112-C171型についてそれぞれ8％および9％であった。CHOおよびバキュロウイルス（BV）系において産生された野生型IL-29も同様の現象を示した。C15-C112型異性体は、ジスルフィド結合パターンに関してI型INFと同種であることが確認された。C15-C112型はまた、ISREアッセイ法においてC112-C171型より30倍高い生物活性を実証した（下記を参照されたい）。
【０２４８】
zcyto21 Cys172Serムテインの再フォールディングおよび精製
zcyto21 C172Sポリペプチド（SEQ ID NO: 29）の封入体の調製、再フォールディング、および精製は、IL-29野生型（SEQ ID NO: 4）と本質的に同じである。このムテインの再フォールディング混合物のRP-HPLC分析は、野生型IL-29のC15-C112型に対応する唯一の顕著なピークを示した。その後のHICクロマトグラフィーは、単一のピークのみを示した。したがって、強めの「ピークシェービング」を用いる必要はなかった。プロセス全体の最終収量はほぼ50％である。zcyto21 Cys172Serポリペプチド（SEQ ID NO: 29）は、実施例16に示されるISREアッセイ法において野生型IL-29のC15-C112型と同等の生物活性を示した。
【０２４９】
実施例16
肝臓およびリンパ球サブセットにおけるIL-28RA mRNAの発現
IL-28RAのmRNA分布をさらに試験するため、SDS 7900HTシステム（Applied Biosystems, CA）を用いて半定量RT-PCRを行った。各試料につき100ngの総RNAおよび遺伝子特異的プライマーを用いて一段階RT-PCRを行った。各プライマー対の標準曲線はBjab RNAを用いて作成し、全ての試料の値をHPRTに対して正規化した。IFNAR2およびCRF2-4の正規化した値も示す。
【０２５０】
表7：B細胞およびT細胞は、有意レベルのIL-28RA mRNAを発現する。樹状細胞および大部分の単球においては低レベルが見られる。
【０２５１】
（表７）
2009502800.tif 000010
【０２５２】
表8に示されるように、正常な肝臓組織および肝臓由来細胞株は、相当レベルのIL-28RAおよびCRF2-4 mRNAを示す。
【０２５３】
（表８）
2009502800.tif 000011
【０２５４】
表9に示されるように、初代気道上皮細胞は、大量レベルのIL-28RAおよびCRF2-4を含む。
【０２５５】
（表９）
2009502800.tif 000012
【０２５６】
表10に示されるように、IL-28RAは正常な肝臓のおよび病変した肝臓の検体に存在し、C型肝炎およびB型肝炎に感染した検体由来の組織においては発現が増加する。
【０２５７】
（表１０）
2009502800.tif 000013
【０２５８】
表11〜15に示されるように、IL-28RAは正常B細胞、Bリンパ腫細胞株、T細胞、Tリンパ腫細胞株（ジャーカット）、正常リンパ球および変形リンパ球（B細胞およびT細胞）、ならびに正常ヒト単球において検出できる。
【０２５９】
（表１１）
2009502800.tif 000014
【０２６０】
（表１２）
2009502800.tif 000015
【０２６１】
（表１３）
2009502800.tif 000016
【０２６２】
（表１４）
2009502800.tif 000017
【０２６３】
（表１５）
2009502800.tif 000018
【０２６４】
実施例17
マウスIL-28はマウスB細胞に対する抗増殖作用を有さない
マウスB細胞を、MACS磁気ビーズを用いてCD43+細胞を枯渇させることによって2つのBalb/C脾臓(7月齢)から単離した。精製したB細胞をLPS、抗IgM、または抗CD40モノクローナル抗体と共にインビトロで培養した。マウスIL-28またはマウスIFNαをこの培養物に加え、3H-チミジンを48時間目に加え、72時間培養後に3H-チミジン取り込みを測定した。
【０２６５】
10ng/mlのIFNαは、LPSまたは抗IgMのいずれかで刺激したマウスB細胞による3H-チミジン取り込みを阻害した。しかし、マウスIL-28は、1000ng/mlを含む試験した全ての濃度において3H-チミジン取り込みを阻害しなかった。対照的に、mIFNαおよびマウスIL-28は両方とも、抗CD40 MAbで刺激されたマウスB細胞による3H-チミジン取り込みを増加させた。
【０２６６】
これらのデータは、マウスIL-28が、IFNaとは異なり、高濃度であっても抗増殖活性を示さないことを実証する。さらに、zcyto24は、抗CD40 MAbの存在下において増殖を増進する。この結果は、マウスIL-28が高濃度であってもマウスB細胞に対する抗増殖活性を示さない点で、マウスIL-28がIFNαと異なることを例証する。さらに、マウスIL-28は、抗CD40モノクローナル抗体の存在下で増殖を増進する。
【０２６７】
実施例18
骨髄増殖アッセイ法
新鮮なヒト骨髄単核細胞(Poietic Technologies, Gaithersburg, Md.)を、αMEM、10%FBS、50マイクロモル濃度のβ-メルカプトエタノール、2ng/ml FLT3L中、37℃で2時間、プラスチックへ付着させた。次いで非付着細胞を、1000ng/ml IL-29-CEE、100ng/ml IL-29-CEE、10ng/ml IL-29-CEE、100ng/ml IFN-α2a、10ng/ml IFN-α2a、または1ng/ml IFN-α2aの存在下または非存在下で、αMEM、10%FBS、50マイクロモル濃度のβ-メルカプトエタノール、2ng/ml FLT3Lに、25,000〜45,000細胞/ウェル(96ウェル組織培養プレート)になるようプレーティングした。これらの細胞を、骨髄由来の造血細胞の増殖または分化について試験するため、様々なサイトカインと共にインキュベートした(20ng/ml IL-2、2ng/ml IL-3、20ng/ml IL-4、20ng/ml IL-5、20ng/ml IL-7、20ng/ml IL-10、20ng/ml IL-12、20ng/ml IL-15、10ng/ml IL-21、またはサイトカイン添加なし)。8〜12日後、20マイクロリットル/ウェルのアラマーブルー(Accumed, Chicago, Ill)を加えた。プレートを37℃、5%CO下で24時間さらにインキュベートした。プレートを、SoftMax(商標)Proプログラムを用いるFmax(商標)プレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.)によって、544(励起)および590(発光)の波長で読み取った。アラマーブルーは細胞の代謝活性に基づき蛍光を発し、従って、陰性対照との比較で細胞増殖を直接的に測定できる。
【０２６８】
IFN-α2aは、全ての試験条件下において、有意な骨髄増殖抑制をもたらした。対照的に、IL-29は、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-21の存在下またはサイトカイン添加なしにおいて、骨髄細胞の増殖に有意な効果を有さなかった。IL-2またはIL-15の存在下においては、わずかな骨髄細胞増殖抑制が見られた。
【０２６９】
実施例19
可溶型受容体(zcytoR19/CRF2-4)によるIL-28およびIL-29のシグナル伝達の阻害
シグナル伝達レポーターアッセイ法
シグナル伝達レポーターアッセイ法は、zcyto20、zcyto21、およびzcyto24のシグナル伝達に対するzcytor19-Fc4ホモ二量体およびzcytor19-Fc/CRF2-4-Fcヘテロ二量体の可溶型受容体の阻害特性を示すために使用され得る。zcytor19受容体を過剰発現するヒト胎児腎(HEK)細胞を、ルシフェラーゼ受容体遺伝子の転写を誘導するインターフェロン刺激応答配列(ISRE)を含むレポータープラスミドでトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞のリガンド(zcyto20(SEQ ID NO: 2)、zcyto21(SEQ ID NO: 15)、zcyto24(SEQ ID NO: 8)を含む)による刺激後のルシフェラーゼ活性は、リガンドと可溶型受容体との相互作用を反映する。
【０２７０】
細胞のトランスフェクション
zcytor19を過剰発現する293HEK細胞を以下のようにしてトランスフェクトした。700,000個の293細胞/ウェル(6ウェルプレート)を、トランスフェクションのおよそ18時間前に、2ミリリットルのDMEM＋10%ウシ胎仔血清にプレーティングした。ウェルあたり1マイクログラムのpISRE-ルシフェラーゼDNA(Stratagene)および1マイクログラムのpIRES2-EGFP DNA(Clontech)を、計100マイクロリットルのDMEM中6マイクロリットルのFugene6試薬(Roche Biochemicals)に加えた。30分後にこのトランスフェクション混合物を前もってプレーティングしておいた293細胞に加えた。24時間後、トランスフェクトした細胞をトリプシン-EDTAを用いてプレートから収集し、およそ25,000細胞/ウェルとなるよう96ウェルマイクロタイタープレートに再プレーティングした。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM＋0.5%FBSに交換した。
【０２７１】
シグナル伝達レポーターアッセイ法
シグナル伝達レポーターアッセイ法は以下のようにして行った。DMEM＋0.5%FBS中、37℃で18時間のインキュベーションの後、トランスフェクトした細胞を、10ng/ml zcyto20、zcyto21、またはzcyto24、および10マイクログラム/mlの以下の可溶型受容体で刺激した；ヒトzcytor19-Fcホモ二量体、ヒトzcytor19-Fc/ヒトCRF2-4-Fcヘテロ二量体、ヒトCRF2-4-Fcホモ二量体、マウスzcytor19-Igホモ二量体。37℃で4時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後にルミノメーターで相対発光量（relative light unit）(RLU)を測定した。得られた結果は、PBS単独の存在下におけるシグナル伝達に対する、可溶型受容体の存在下におけるリガンド誘導シグナル伝達のパーセント阻害として示す。表16は、ヒトzcytor19-Fc/ヒトCRF2-4ヘテロ二量体の可溶型受容体が、zcyto20、zcyto21、およびzcyto24により誘導されるシグナル伝達を対照の16%〜45%阻害できることを示す。ヒトzcytor19-Fcホモ二量体の可溶型受容体もまた、zcyto21誘導シグナル伝達を45%阻害できる。huCRF2-4-Fcまたはmuzcytor19-Igのホモ二量体の可溶型受容体によっては有意な効果が見られなかった。
【０２７２】
（表１６）リガンドにより誘導されるインターフェロン刺激応答配列（ISRE）のシグナル伝達の可溶型受容体によるパーセント阻害
2009502800.tif 000019
【０２７３】
実施例20
IL-28およびIL-29によるインターフェロン刺激遺伝子の誘導
ヒト末梢血単核細胞
新たに単離したヒト末梢血単核細胞を、IL-29(20ng/mL)、IFNα2a(2ng/ml)(PBL Biomedical Labs, Piscataway,NJ)の存在下でまたは培地のみ下で培養した。細胞を6、24、48、または72時間インキュベートし、次いで総RNAを単離し、RNaseフリーのDNaseで処理した。100 ngの総RNAを、製造元(Applied Biosystems, Branchburg, NJ)の提案の通り、Taqman一段階RT-PCRマスターミックス(登録商標)試薬および遺伝子特異的プライマーを用いる一段階半定量RT-PCR(登録商標)のための鋳型として用いた。結果はHPRTに対して正規化し、各時点における培地のみの対照に対する誘導倍率で示す。表17は、IL-29が試験した全ての時点において、ヒト末梢血単核細胞におけるインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示す。
【０２７４】
（表１７）
2009502800.tif 000020
【０２７５】
活性化型ヒトT細胞
ヒトT細胞を、Pan T-cell Isolation(登録商標)キットを製造元(Miltenyi, Auburn, CA)の説明書に従い用いて、新たに採取した末梢血単核細胞からの陰性選択により単離した。次いでT細胞を、プレートに結合した抗CD3、可溶性抗CD28(0.5ug/ml)(Pharmingen, San Diego, CA)およびインターロイキン2(IL-2; 100U/ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN)下で5日間、活性化および拡大培養し、洗浄し、次いでIL-2下でさらに5日間拡大培養した。活性化および拡大培養の後、細胞を、IL-28A(20ng/ml)、IL-29(20ng/ml)、または培地のみで3、6、または18時間刺激した。総RNAを単離し、RNaseフリーのDNaseで処理した。一段階半定量RT-PCR(登録商標)を上記実施例に記載の通りに実施した。結果はHPRTに対して正規化し、各時点における培地のみの対照に対する誘導倍率で示す。表18は、IL-28およびIL-29が試験した全ての時点において活性化型ヒトT細胞におけるインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示す。
【０２７６】
（表１８）
2009502800.tif 000021
【０２７７】
初代ヒト肝細胞
2名の別々のドナーから新たに単離したヒト肝細胞(Cambrex, Baltimore, MDおよびCellzDirect, Tucson, AZ)を、IL-28A(50ng/ml)、IL-29(50ng/ml)、IFNα2a(50ng/ml)、または培地のみで24時間刺激した。刺激後、総RNAを単離し、RNaseフリーのDNaseで処理した。一段階半定量RT-PCRを上記実施例に記載の通りに実施した。結果はHPRTに対して正規化し、各時点における培地のみの対照に対する誘導倍率で示す。表19は、IL-28およびIL-29が、24時間の刺激後に初代ヒト肝細胞におけるインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示す。
【０２７８】
（表１９）
2009502800.tif 000022
【０２７９】
HepG2およびHuH7：ヒト肝臓ヘパトーム細胞株
HepG2およびHuH7細胞(ATCC NOS. 8065, Manassas, VA)をIL-28A(10ng/ml)、IL-29(10ng/ml)、IFNα2a(10ng/ml)、IFNB(1ng/ml)(PBL Biomedical Piscataway, NJ)、または培地のみで24時間または48時間刺激した。別の培養において、HepG2細胞を20ng/mlのMetIL-29C172S-PEGまたはMetIL-29-PEGで上記のように刺激した。総RNAを単離し、RNaseフリーのDNaseで処理した。100ngの総RNAを、上記のように一段階半定量RT-PCRの鋳型として用いた。結果はHPRTに対して正規化し、各時点における培地のみの対照に対する誘導倍率で示す。表20は、IL-28およびIL-29が、24時間および48時間後にHepG2およびHuH7肝臓ヘパトーム細胞株においてISG発現を誘導することを示す。
【０２８０】
（表２０）
2009502800.tif 000023
【０２８１】
（表２１）
2009502800.tif 000024
【０２８２】
示されたデータは、24時間の培養後の20ng/mlのmetIL-29-PEG型およびmetIL-29C172S-PEG型のIL-29についてのものである。
【０２８３】
示されたデータはHPRTに対して正規化し、未刺激細胞に対する誘導倍率で示す。
【０２８４】
実施例21
IL-28、IL-29、metIL-29-PEG、およびmetIL-29C172S-PEGはマウス肝臓細胞AML-12株においてISG誘導を刺激する
インターフェロン刺激遺伝子(ISG)は、I型インターフェロン(IFN)により誘導され、IL-28およびIL-29ファミリーの分子によっても誘導される遺伝子であり、このことはIFNならびにIL-28およびIL-29が抗ウイルス活性につながる類似の経路を誘導することを示唆している。ヒトI型IFN(IFNα1〜4およびIFNβ)は、マウス細胞に対してほとんどまたは全く活性を有さず、これは種間交差反応性の欠如に起因するものと考えられる。ヒトIL-28およびIL-29がマウス細胞に対する作用を有するか否かを試験するため、ヒトIL-28およびIL-29によるISG誘導を、マウス肝臓由来細胞AML-12株におけるリアルタイムPCRにより評価した。
【０２８５】
2×106細胞/ウェルの濃度のAML-12細胞を、6ウェルプレート上の完全DMEM培地にプレーティングした。細胞のプレーティングから24時間後、ヒトIL-28およびIL-29を、濃度が20ng/mlとなるよう培養物に加えた。対照として、細胞をマウスIFNαで刺激するか(陽性対照)または刺激しなかった(陰性)。細胞は、CHO由来ヒトIL-28A(SEQ ID NO: 2)またはIL-29(SEQ ID NO: 15)の添加から8、24、48、および72時間後に収集した。RNAはRNAEasyキット(登録商標)(Qiagen, Valencia, CA)を用いて細胞ペレットから単離した。任意の混入DNAをRNAから除去するため、RNAをDNase(Millipore, Billerica, MA)で処理した。cDNAはPerkin-Elmer RTミックスを用いて作製した。ISG遺伝子の誘導は、マウスOAS、Pkr、およびMx1に特異的なプライマーおよびプローブを用いるリアルタイムPCRにより評価した。定量的データを得るため、HPRTのリアルタイムPCRをISGのPCRとあわせて行った。標準曲線は、IFN刺激したマウスPBL由来の既知量のRNAを用いて得た。全てのデータは内部HPRT発現に対する発現として示す。
【０２８６】
ヒトIL-28AおよびIL-29はマウス肝細胞細胞AML-12株においてISG誘導を刺激し、IL-28/29ファミリータンパク質は、I型IFNとは異なり、異種間反応性を示すことを実証した。
【０２８７】
（表２２）
2009502800.tif 000025
【０２８８】
示された全てのデータは、HPRT遺伝子の発現に対する倍率で表現した。OAS mRNAのng＝内部HPRT mRNAのngに対するOAS mRNA量の正規化された値。
HPRTはハウスキーピング遺伝子である。
【０２８９】
例として、48時間の時点についてのデータを示す。
【０２９０】
（表２３）
2009502800.tif 000026
【０２９１】
細胞は、20ng/ml metIL-29-PEGまたはmetIL-29C172S-PEGで24時間刺激した。
【０２９２】
示されたデータはHPRTに対して正規化し、未刺激の細胞に対する誘導倍率で示す。
【０２９３】
実施例22
ISGはヒトIL-29を発現するトランスジェニックマウスの脾臓において効果的に誘導される
Eu-lckプロモーターの制御下でヒトIL-29を発現すトランスジェニック(Tg)マウスを作製した。ヒトIL-29がマウスにおいてインビボで生物活性を有するか否かを研究するため、ISGの発現をEu-lck IL-29トランスジェニックマウスの脾臓におけるリアルタイムPCRにより分析した。
【０２９４】
トランスジェニックマウス(C3H/C57BL/6)は、Eu-lckプロモーターの制御下でヒトIL-29遺伝子を発現する構築物を用いて作製した。このプロモーターは、T細胞およびB細胞において活性である。トランスジェニックマウスおよびそれらの非トランスジェニック同腹仔(n=2/gp)を約10週齢で屠殺した。マウスの脾臓を単離した。RNAはRNAEasyキット(登録商標)(Qiagen)を用いて細胞ペレットから単離した。任意の混入DNAをRNAから除去するためにDNaseで処理した。cDNAはPerkin-Elmer RT(登録商標)ミックスを用いて作製した。ISG遺伝子の誘導は、マウスOAS、Pkr、およびMx1に特異的なプライマーおよびプローブ(5'FAM、3'NFQ)を用いるリアルタイムPCRにより評価した。定量的データを得るため、HPRTのリアルタイムPCRをISGのPCRとあわせて行った。さらに、既知量のIFN刺激マウスPBLを用いて標準曲線を得た。全てのデータは内部HPRT発現に対する発現として示す。
【０２９５】
IL-29 Tgマウスから単離された脾臓は、それらの非Tg同腹仔対照と比較してOAS、Pkr、およびMx1のISGの高レベル誘導を示し、これによりヒトIL-29がマウスにおいてインビボで生物学的に活性であることが示唆された。
【０２９６】
（表２４）
2009502800.tif 000027
【０２９７】
示された全てのデータはHPRT遺伝子の発現に対する発現倍率である。2匹のマウスにおける発現の平均を示す。
【０２９８】
実施例23
ヒトIL-28およびIL-29タンパク質は、マウスの肝臓、脾臓、および血液におけるISG遺伝子の発現を誘導する
ヒトIL-28およびIL-29がインビボでインターフェロン刺激遺伝子を誘導するか否かを決定するため、CHO由来のヒトIL-28AおよびIL-29タンパク質をマウスに注射した。さらに、大腸菌由来のIL-29もまた、MetIL-29C172S-PEGおよびMetIL-29-PEGを用いて上記のようにインビボアッセイ法で試験した。ISG遺伝子の誘導は、様々な時点および異なる用量で、マウスの血液、脾臓、および肝臓において測定した。
【０２９９】
C57BL/6マウスに、一定範囲の用量(10μg〜250μg)のCHO由来ヒトIL-28AおよびIL-29またはMetIL-29C172S-PEGおよびMetIL-29C16-C113-PEGを腹腔内または静脈内注射した。マウスを様々な時点(1時間〜48時間)で屠殺した。脾臓および肝臓をマウスから単離し、RNAを単離した。RNAは血液細胞からも単離した。細胞をペレットにし、RNAをRNAEasy(登録商標)キット(Qiagen)を用いてペレットから単離した。任意の混入DNAをRNAから除去するため、RNAをDNase(Amicon)で処理した。cDNAはPerkin-Elmer RTミックス(Perkin-Elmer)を用いて作製した。ISG遺伝子の誘導は、マウスOAS、Pkr、およびMx1に特異的なプライマーおよびプローブを用いるリアルタイムPCRにより測定した。定量的データを得るため、HPRTのリアルタイムPCRをISGのPCRとあわせて行った。標準曲線は、既知量のIFN刺激マウスPBLを用いて計算した。全てのデータは内部HPRT発現に対する発現として示す。
【０３００】
ヒトIL-29は、用量依存的な様式で、マウスの肝臓、脾臓、および血液においてISG遺伝子の発現(OAS、Pkr、Mx1)を誘導した。ISGの発現は、注射後の1〜6時間の間にピークに達し、48時間まで対照マウスよりも高い発現を維持することを示した。本実験において、ヒトIL-28AはISG遺伝子の発現を誘導しなかった。
【０３０１】
（表２５）
2009502800.tif 000028
【０３０２】
示された結果は、HPRT遺伝子の発現に対する発現倍率である。250μgの単回静脈内注射を行った際に肝臓においてIL-29により誘導されたOASについての試料データセットを示す。示されたデータは、5匹の異なる動物／グループにおける発現の平均である。
【０３０３】
（表２６）
2009502800.tif 000029
【０３０４】
（表２７）
2009502800.tif 000030
【０３０５】
マウスに100μgのタンパク質を静脈内注射した。示されたデータは、マウスの肝臓からのHPRTの発現に対する発現倍率である。同様のデータがマウスの血液および脾臓から得られた。
【０３０６】
実施例24
IL-28およびIL-29はマウスにおいてISGタンパク質を誘導する
ISGタンパク質(OAS)の誘導に対するヒトIL-28およびIL-29の効果を分析するため、IL-28およびIL-29で処理したマウス由来の血清および血漿をOAS活性について試験した。
【０３０７】
C57BL/6マウスに、PBSまたは一定範囲の濃度(10μg〜250μg)のヒトIL-28もしくはIL-29を静脈内注射した。血清および血漿を様々な時点でマウスから単離し、OAS活性をEiken Chemicals(Tokyo, Japan)製のOAS放射免疫測定(RIA)キットを用いて測定した。
【０３０８】
IL-28およびIL-29はマウスの血清および血漿においてOAS活性を誘導し、これらのタンパク質がインビボで生物学的に活性であることが示された。
【０３０９】
（表２８）
2009502800.tif 000031
【０３１０】
OAS活性は、単一濃度(250μg)のヒトIL-29についての血漿のpmol/dLで示す。
【０３１１】
実施例25
シグナル伝達レポーターアッセイ法
ヒトおよびマウスIL-28およびIL-29とIL-28受容体の機能的相互作用を決定するために、シグナル伝達レポーターアッセイ法が使用できる。ヒト胎児腎（HEK）細胞を、クラスIIサイトカイン受容体（ヒトDIRS1、IFNαR1、IFNαR2、およびIL-28受容体を含む）のcDNAを含むpZP7発現ベクターの存在下または非存在下、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を促進するインターフェロン刺激応答配列（ISRE）を含むレポータープラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をクラスIIリガンド（IL-28A（SEQ ID NO: 2）、IL-29（SEQ ID NO: 4）、IL-28B（SEQ ID NO: 6）、zcyto10、huIL10、およびhuIFNa-2aを含む）で刺激した後のルシフェラーゼ活性は、細胞表面のトランスフェクトおよび未処理のサイトカイン受容体とリガンドとの相互作用を反映する。結果および方法を以下に記載する。
【０３１２】
細胞のトランスフェクション
293HEK細胞を以下のようにトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ18時間前に、700,000個の293細胞/ウェル（6ウェルプレート）を2ミリリットルのDMEM＋10％ウシ胎仔血清にプレーティングした。1ウェルあたり1マイクログラムのpISRE-ルシフェラーゼDNA（Stratagene）、1マイクログラムのサイトカイン受容体DNA、および1マイクログラムのpIRES2-EGFP DNA（Clontech）を、計100マイクロリットルのDMEM中9マイクロリットルのFugene 6試薬（Roche Biochemicals）に加えた。サイトカイン受容体DNAを含めない場合には、2マイクログラムのpIRES2-EGFP DNAを用いた。このトランスフェクション混合物を、予めプレーティングした293細胞に30分後に加えた。24時間後、トランスフェクトした細胞を、トリプシン-EDTAを用いてプレートから採取し、96ウェルマイクロタイタープレートにおよそ25,000細胞/ウェルとなるよう再プレーティングした。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM＋0.5％FBSに交換した。
【０３１３】
シグナル伝達レポーターアッセイ法
シグナル伝達レポーターアッセイ法は、以下のように実施した。DMEM＋0.5％FBS中、37℃で18時間インキュベートした後、トランスフェクトした細胞を以下のクラスIIリガンド：IL-28A、IL-29、IL-28B、zcyto10、huIL10、およびhuIFNa-2aの希釈物（DMEM＋0.5％FBS中）によって刺激した。37℃で4時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後にルミノメーターで相対発光量(RLU)を測定した。得られた結果を培地のみの対照に対する実験試料のRLUの誘導倍率（実験試料のRLU／培地単独のRLU＝誘導倍率）として示す。表29は、IL-28A、IL-29、およびIL-28Bが、ISRE-ルシフェラーゼをトランスフェクトした293細胞においてISREシグナル伝達を誘導し、培地単独の15〜17倍のルシフェラーゼ活性を誘導することを示す。内因性のCRF2-4（SEQ ID NO: 71）を用いてIL-28受容体αサブユニットDNA（SEQ ID NO: 11）をトランスフェクション混合物に添加すると、IL-28A、IL-29、およびIL-28Bはさらに6〜8倍のISREシグナル伝達を誘導し、最終的な誘導は104〜125倍となる。他のトランスフェクトしたクラスIIサイトカイン受容体DNAはいずれもISREのシグナル伝達を増加させなかた。これらの結果は、IL-28A、IL-29、およびIL-28BがIL-28サイトカイン受容体と機能的に相互作用することを示す。表29はまた、huIFNa-2aがISRE-ルシフェラーゼトランスフェクト293細胞においてISREシグナル伝達を誘導することができ、培地単独と比較して205倍のルシフェラーゼ活性を誘導することを示す。しかし、トランスフェクションにIL-28受容体DNAを加えるとISRE-シグナル伝達は（ISRE-ルシフェラーゼDNA単独と比較して）11倍減少し、このことはIL-28受容体の過剰発現がIL-28A、IL-29、およびIL-28Bのシグナル伝達に対してIL-28受容体の過剰発現の正の影響を及ぼすのとは対称的に、インターフェロンのシグナル伝達には負の影響を及ぼすことを示唆する。
【０３１４】
（表２９）クラスIIサイトカイン刺激後のトランスフェクト293細胞におけるインターフェロン刺激応答配列（ISRE）のシグナル伝達（誘導倍率）
2009502800.tif 000032
【０３１５】
実施例26
IL-29システイン変異体を用いたシグナル伝達アッセイ法
細胞のトランスフェクション
ヒトIL-28受容体を安定して過剰発現する293HEK細胞を作製するため、以下のように293細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ6時間前に、300,000個の293細胞/ウェル（6ウェルプレート）を2ミリリットルのDMEM＋10％ウシ胎仔血清にプレーティングした。1ウェルあたり、ヒトIL-28受容体αサブユニット（SEQ ID NO: 11）のcDNAを含むpZP7発現ベクター2マイクログラムを、計100マイクロリットルのDMEM中6マイクロリットルのFugene 6試薬（Roche Biochemicals）に加えた。このトランスフェクション混合物を、予めプレーティングした293細胞に30分後に加えた。48時間後、トランスフェクトした細胞を2マイクログラム/ミリリットルのピューロマイシンの選択下に置いた。ピューロマイシン耐性細胞を細胞集団として得た。
【０３１６】
ヒトIL-28受容体を過剰発現する293HEK細胞は、以下のようにしてトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ18時間前に、700,000個の293細胞/ウェル（6ウェルプレート）を、2ミリリットルのDMEM＋10％ウシ胎仔血清にプレーティングした。1ウェルあたり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を促進するインターフェロン刺激応答配列（ISRE）を含むKZ157、1マイクログラムを、計100マイクロリットルのDMEM中3マイクロリットルのFugene 6試薬（Roche Biochemicals）に加えた。このトランスフェクション混合物を、予めプレーティングした293HEK細胞に30分後に加えた。48時間後、トランスフェクト細胞をトリプシン-EDTAを用いてプレートから収集し、500マイクログラム/mlのG418（Geneticin, Life Technologies）下に再プレーティングした。ピューロマイシンおよびG418耐性細胞を細胞集団として得た。
【０３１７】
シグナル伝達レポーターアッセイ法
シグナル伝達レポーターアッセイ法は以下のようにして実施した。ヒトIL-28受容体を過剰発現しKZ157を含む293HEK細胞をトリプシン-EDTAで処理し、およそ25,000細胞/ウェルとなるよう96ウェルマイクロタイタープレートに再プレーティングした。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM＋0.5％FBSに交換した。
【０３１８】
DMEM＋0.5％FBS中、37℃で18時間インキュベートした後、トランスフェクトした細胞を、異なるシステイン結合パターンを含む異なる形態の大腸菌由来zcyto21の希釈物（DMEM＋0.5％FBS中）で刺激した。37℃で4時間インキュベートした後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後にルミノメーターで相対発光量(RLU)を測定した。得られた結果を培地のみの対照に対する実験試料のRLUの誘導倍率（実験試料のRLU／培地単独のRLU＝誘導倍率）として示す。
【０３１９】
表30は、野生型大腸菌由来IL-29のC1-C3型（C16-C113）が、野生型C3-C5型（C113-C172）または野生型C1-C3型およびC3-C5型（C16-C113、C113-C172）の混合物よりもISREのシグナル伝達を多く誘導できることを示す（全てSEQ ID NO: 15を参照）。
【０３２０】
表31は、野生型大腸菌由来IL-29のC1-C3（C16-C113）、およびシステイン変異体（C172S）大腸菌由来IL-29（SEQ ID NO: 29）のC1-C3（C16-C113；SEQ ID NO: 15）が、ヒトIL-28受容体を過剰発現する293HEK細胞においてISREのシグナル伝達を同程度誘導できることを示す。
【０３２１】
（表３０）異なる形態の大腸菌由来IL-29によるISREシグナル伝達（誘導倍率）
2009502800.tif 000033
【０３２２】
（表３１）異なる形態の大腸菌由来IL-29によるISREシグナル伝達（誘導倍率）
2009502800.tif 000034
【０３２３】
実施例27
B細胞およびIL-29の毒素サポリン融合体に対するヒトIL-29の効果
以下のヒトB細胞株に対するヒトIL-29の効果を試験する：ヒトバーキットリンパ腫細胞Raji株（ATCC No.CCL-86）およびRamos株（ATCC No.CRL-1596）；ヒトEBV B細胞リンパ腫細胞RPMI 1788株（ATCC No.CRL-156）；ヒト骨髄腫／プラスマ細胞腫細胞IM-9株（ATCC No.CRL159）；ならびにヒトEBV形質転換B細胞DAKIKI株（ATCC No.TIB-206）およびHS Sultan細胞株（ATCC No.CRL-1484）。IL-29で約2〜5日間処理した後のこれらの細胞における表面マーカーの発現の変化は、これらの細胞がIL-29に反応し得ることを示す。IL-29で処理したヒトB細胞株は、細胞培養皿に再プレーティングした際、未処理細胞よりも増殖がずっと遅くなる。これらの細胞はまた、フローサイトメトリーにより評価したところ、FASリガンドの発現が増加し（実施例27Dおよび実施例27E）、かつ活性化型FAS抗体に対する感受性がやや増加する（実施例27A）。これらの結果は、IL-29が、いくつかのタイプのB細胞新生物の、より低増殖性および／またはよりFASリガンド感受性の状態への分化を誘導することによってこれらを制御できることを示す。さらに、いくつかのB細胞株およびT細胞株の表面にIL-28受容体が発現される（実施例16）。従ってIL-29およびヒトIL-29-サポリン免疫毒素複合体（以下の実施例27B）またはその他のIL-29-毒素融合体は、B細胞白血病およびB細胞リンパ腫に対して治療的に使用できる。
【０３２４】
B細胞株に対するヒトIL-29の効果
IM-9細胞を、50μg/mlの精製ヒトIL-29の存在下／非存在下で約50,000細胞／mlになるよう接種する。3日間の培養後に細胞を収集し、洗浄および計数し、次いで0、0.033、0.1、または0.33μg/mlの抗FAS抗体（R&D Systems, Minneapolis）を含む96ウェルプレートに約2500細胞／mlとなるよう再プレーティングする。2日後、アラマーブルー蛍光アッセイ法を行い（米国特許第6,307,024号を参照されたい）、細胞の増殖を評価する。
【０３２５】
IL-29で処理したIM-9細胞の増殖は、抗FAS抗体の非存在下において未処理細胞の増殖よりも抑制される。0.33μg/mlの抗FAS抗体の存在下では、IL-29処理細胞はさらに抑制される。
【０３２６】
B細胞株に対するヒトIL-29-サポリン免疫毒素の効果
ヒトIL-29-サポリン免疫毒素複合体（IL-29-sap）の構築および精製については実施例28に記載される。ヒトIL-29-sapは、細胞増殖の抑制に関してサポリン単独よりもずっと強力であった。その処理細胞を3日間または4日間の処理後に再プレーティングしたところ、ヒトIL-29-sap処理細胞の増殖は非常に乏しくなる。
【０３２７】
IM-9細胞、Ramos細胞、およびK562（ATCC No.CCL-243）細胞を、0〜250ng/mlのヒトzalpha11L-sap複合体または対照として0〜250ng/mlのサポリンのみ（Stirpe et al., Biotechnology 10:405-412, 1992）を含む96ウェルプレートに約2500細胞／ウェルとなるよう接種する。このプレートを4日間インキュベートし、次いでアラマーブルー増殖アッセイ法を行う（米国特許第6,307,024号）。ヒトIL-29-sap複合体の最大濃度において細胞増殖が抑制される。フローサイトメトリーでIL-28受容体の発現について低／陰性である細胞株はIL-29-sapの影響を受けず、これはこの複合体の効果の特性を示している。
【０３２８】
IM-9細胞を、0および50ng/mlのヒトzalpha11L-sap複合体を含む6ウェルプレートに50,000細胞／mlになるよう接種する。3日後、細胞を収集および計数し、次いでヒトIL-29-サポリン免疫毒素を加えずに2倍連続希釈で100〜0.8細胞／ウェル、かつ12ウェル／細胞希釈物となるよう再プレーティングする。6日後、各細胞希釈率において増殖のみられたウェルの数を、アラマーブルー増殖アッセイ法の結果に従いスコア付けする。
【０３２９】
アラマーブルーアッセイ法によって細胞数を評価すると、処理されたIM-9の生存細胞の増殖は、IL-29-sap免疫毒素の再プレーティングによる除去後に顕著に減少する。
【０３３０】
ヒトIL-28受容体の限定的な組織分布およびIL-29-sapの受容体発現細胞株に対する作用の特異性は、この複合体がインビボで寛容され得ることを示唆する。
【０３３１】
B細胞株の生存率に対するヒトIL-29-サポリン免疫毒素の効果
HS Sultan細胞（ATCC No.CRL-1484）を、約40,000細胞／mlとなるよう12ウェルプレートに接種し、サイトカインの添加なし若しくは40ng/mlの精製ヒトIL-29若しくは25ng/mlのヒトIL-29-sap複合体（以下の実施例28）の存在下または20ng/mlのIFN-α（RDI）もしくはIL-29およびIFN-αの存在下で5日間培養する。IL-29およびIFN-αは細胞の増殖を抑制し、これによりヒトIL-29およびIFN-αの増殖抑制効果が付加的なものであり得ることが示される。
【０３３２】
上記の結果は、悪性疾患またはIL-28受容体を発現するその他の疾患、特にB細胞起源の疾患の処置におけるIL-29またはヒトIL-29-sapの使用の可能性を支持する。IL-29とIFN-αの併用については、HS Sultan細胞の抑制におけるそれらの付加的効果によって特に示唆される。いくつかのその他のタイプのリンパ系悪性疾患および疾患もまたIL-28受容体を発現する。活性化型T細胞もまたこの受容体のmRNAを発現し得、これらの疾患の一部はまたIL-29-毒素融合体療法においてIL-29に対して反応性であり得るからである。
【０３３３】
ヒトB細胞株におけるFAS（CD95）の発現はヒトIL-29刺激により増加する
ヒトB細胞HS Sultan株（ATCC No.CRL-1484）、IM-9株（ATCC No.CRL159）、RPMI 8226株（ATCC No.CCL-155）、RAMOS株（ATCC No.CRL-1596）、DAKIKI株（ATCC No.TIB-206）、およびRPMI 1788株（ATCC No.CRL-156）の全てを、精製された10〜50ng/mlのヒトIL-29の存在下または非存在下で2〜8日間処理する。次いでこの細胞を抗CD95 PE結合抗体（PharMingen, San Diego, CA）を製造元のプロトコルに従い用いて染色し、FACSキャリバー（Becton Dickinson, San Jose, CA）で分析する。全ての細胞株における抗CD95（FASまたはAPO-1）染色は、ヒトIL-29処理により増加する。
【０３３４】
初代マウス脾B細胞におけるFAS（CD95）の発現はヒトIL-29刺激によって増加する
初代マウス脾細胞は8〜12週齢のC57/BL6マウス由来の脾臓を切り刻むことによって獲得する。この調製物を水で5秒間処理することによって赤血球を溶解させ、次いで70μmのふるいを通す。残った脾細胞を洗浄し、上記のように、10％ HIA-FBS（Hyclone, Logan, UT）、IL-2（R & D Systems）を含み、ヒトIL-29を含むまたは含まないRPMI（JRH Bioscience）にプレーティングする。次いでこれらを5％ CO2下、37℃で5日間インキュベートした。この脾細胞を収集し、抗CD95 PE結合抗体（PharMingen）および抗CD19 FITC結合抗体（PharMingen）を製造元のプロトコルに従い用いて染色した。この細胞を、FACSキャリバー（Becton Dickinson）によるフローサイトメトリーによって分析する。
【０３３５】
実施例28
IL-29毒素融合体の構築および精製
10mgのヒトIL-29を植物毒素サポリン（Stirpe et al., Biotechnology 10,:405-412, 1992）に結合する。得られた1.3mgのタンパク質複合体は、1分子のヒトIL-29あたり1.1分子のサポリンで構成され、20nMリン酸ナトリウム、300nM塩化ナトリウム、pH7.2中1.14mg/mlの濃度に処方される。
【０３３６】
実施例29
インビボIL-29毒素融合体
マウスにおけるIL-29-サポリン複合体の試験
IL-29-サポリン複合体（実施例27）を、二つの異なる用量：0.5および0.05mg/kgでC57BL6マウス（雌、12週齢、Taconic社から購入）に投与する。注射は、0.1％ BSA（ICN, Costa Mesa, CA）からなる媒体を用いて静脈に行う。一週間の間に三回（第0日、第2日、第7日）の注射を行う。第0日（注射前）ならびに第2日および第8日（注射後）にマウスから血液試料を採取する。血液をヘパリン化チューブ（Bectin Dickenson, Franklin Lakes, NJ）に収集し、全自動血液学分析装置（Abbot Cell-Dyn model No. CD-3500CS, Abbot Park, IL）を用いて細胞計数を行う。第8日の採血後に動物を安楽死させ検死を行う。組織病理学のために脾臓、胸腺、肝臓、腎臓、および骨髄を収集する。脾臓および胸腺を秤量し、追加の血液試料を血清分離チューブに収集する。血清を標準的な化学パネルで試験する。試料は本明細書中に記載されるようなフローサイトメトリー分析のためにも収集する。
【０３３７】
インビボでのB細胞由来の腫瘍に対するIL-29毒素サポリン融合体の試験
ヒト腫瘍細胞に対するヒトIL-29およびヒトIL-29毒素サポリン融合体（実施例28）の効果を、本明細書中に記載のマウス腫瘍異種移植モデルを用いてインビボで試験する。異種移植モデルは、最初に実施例27に記載されるようなインビトロ実験に基づき選択した細胞株を用いて試験する。これらの細胞株には、ヒトバーキットリンパ腫細胞Raji株（ATCC No.CCL-86）およびRamos株（ATCC No.CRL-1596）；ヒト細胞RPMI 1788株（ATCC No.CRL-156）；ヒト骨髄腫／プラスマ細胞腫細胞IM-9株（ATCC No.CRL159）；ヒト細胞DAKIKI株（ATCC No.TTB-206）、ならびにHS Sultan細胞株（ATCC No.CRL-1484）が含まれるがこれらに限定されない。ヒト腫瘍から直接得た細胞もまた、このタイプのモデルに使用できる。この方法において、抗癌療法におけるzalpha11の使用についての最適な指標を選択するため、IL-29またはIL-29毒素サポリン融合体による処置に対する感受性についての患者試料のスクリーニングが使用され得る。
【０３３８】
上記の適当な異種移植インビボモデルを選択した後、IL-29により誘導されるナチュラルキラー細胞の活性および／またはB細胞由来の腫瘍に対するIL-29の効果をインビボで評価する。本明細書中に記載のマウス腫瘍異種移植モデルを用いて、B細胞由来の腫瘍に対する活性を有する細胞傷害性エフェクター細胞（例えば、NK細胞）を生成する能力についてヒトIL-29を試験する。さらに、腫瘍に対するヒトIL-29の直接的影響を評価できる。使用する異種移植モデルは、上記のようにして選択する。IL-29刺激したヒト細胞を用いるプロトコルを構築し、腫瘍細胞を枯渇させ細胞株または原発性腫瘍を接種したマウスの生存を促進する上での効果について試験する。
【０３３９】
実施例30
インビボでのB細胞由来の腫瘍に対するIL-29の効果
ミニ浸透圧ポンプを用いたIL-29の注入
ミニ浸透圧ポンプを通った継続的な注入によるIL-29の投与は、ポンプに含まれるIL-29の濃度に比例する定常状態の血清濃度を作り出す。リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）に2mg/mlまたは0.2mg/mlの濃度で含まれる0.22mlのヒトIL-29を無菌条件下でAlzetミニ浸透圧ポンプ（モデル2004；Alza corporation Palo Alto, CA）に充填する。ポンプは、1cmの背面皮膚の切口を通じてマウス皮下に埋め込み、無菌的な創縫合によって皮膚を閉じる。これらのポンプは28日間の間、1時間あたり0.25μlの速度でそれらの内容物を送達するよう設計される。この投与方法は、腫瘍細胞を注射したマウスの生存率を有意に増加させる（下記）。
【０３４０】
B細胞由来の腫瘍に対するインビボでのIL-29の効果
ヒトIL-29の効果を、本明細書中に記載のマウス腫瘍異種移植モデルを用いてインビボで試験する。試験する異種移植モデルはヒトリンパ芽球腫細胞IM-9株（ATCC No.CRL159）である。C.B-17 SCIDマウス（雌性C.B-17/IcrHsd-scid; Harlan, Indianapolis, Indiana）を4つのグループに分ける。第0日にIM-9細胞（ATCC No.CRL159）を培養物から収集し、全てのマウスに尾静脈によって静脈内注射する（1匹のマウスあたり約1,000,000細胞）。第1日に、試験物または対照物を含むミニ浸透圧ポンプをマウスの皮下に埋め込む。グループ1〜3のマウス（1グループあたりn=9）は漸増濃度のIL-29で処置し；グループ1は2.0mg/mLのヒトIL-29を含み、1日あたり12μgが送達され；グループ2は0.20mg/mLのヒトIL-29を含み、1日あたり1.2μgが送達され；グループ3は0.02mg/mLのヒトIL-29を含み、1日あたり0.12μgが送達される。グループ4のマウス（n=9）は対照であり、媒体（PBS pH6.0）で処置する。
【０３４１】
12μg／日または1.2μg／日のいずれかのIL-29注入により処置したマウスは、媒体処置マウスと比較して生存率が増加する（生存関数のログランク検定を用いると、12μg／日または1.2μg／日 対 媒体についてそれぞれp＜0.0001およびp＜0.005）。これらの結果は、IL-29がインビボでB細胞腫瘍細胞の影響を有意に減少させ、生存率を有意に増加させることを示す。
【０３４２】
実施例31
B16-F10黒色腫モデルおよびEG.7胸腺腫モデルにおけるIL-29のインビボ抗腫瘍効果
インビボにおけるB16-F10黒色腫の転移増殖に対するマウスIL-29の効果
マウス（雌、C57B16、9週齢；Charles River Labs, Kingston, NY）を3つのグループに分ける。第0日にB16-F10黒色腫細胞（ATCC No.CRL-6475）を培養物から収集し、全てのマウスに尾静脈によって静脈内注射する（1匹のマウスあたり約100,000細胞）。次いで、マウスを0.1mlの目的の溶液の腹腔内注射により、試験物または関連する媒体で処置する。第一グループのマウス（n=24）は、媒体（PBS pH6.0）を第0日、第2日、第4日、第6日、および第8日に注射することにより処置する。第二グループのマウス（n=24）は、zcyto24またはzcyto25を第0日、第2日、第4日、第6日、および第8日に75μgの用量で注射することにより処置する。第三グループのマウス（n=12）は、zcyto24またはzcyto25を第0日〜第9日まで毎日75μgの用量で注射することにより処置する。全てのマウスを第18日に屠殺し、腫瘍の定量のために肺を採取する。各々の肺葉の全ての表面において直径が0.5mmを超える腫瘍の増殖がみられる病巣を計数する。zcyto24またはzcyto25で処置した両グループのマウスにおける肺に存在する腫瘍病巣の平均数は、媒体で処置したマウスと比較して有意に減少する。より高頻度で（すなわち毎日）処置したマウスは、隔日に処置したマウスよりも小さい腫瘍病巣を有する。
【０３４３】
これらの結果は、zcyto24またはzcyto25による処置がB16黒色腫腫瘍の増殖を緩慢にするかまたはその腫瘍細胞を破壊する免疫系の能力を強化するかのいずれかであることを示した。腫瘍細胞に対する処置の効果は、IL-29に対する受容体を有する免疫系細胞を通じて媒介される可能性が高い。
【０３４４】
インビボにおけるEG.7胸腺腫の増殖に対するマウスIL-29の効果
マウス（雌、C57B16、9週齢；Charles River Labs, Kingston, NY）を3つのグループに分ける。第0日にEG.7細胞（ATCC No.CRL-2113）を培養物から収集し、1,000,000細胞を全てのマウスに腹腔内注射する。次いで、マウスを0.1mLの目的の溶液の腹腔内注射により、試験物または関連する媒体で処置する。第一グループのマウスは（n=6）、媒体（PBS pH6.0）を第0日、第2日、第4日、および第6日に注射することにより処置する。第二グループのマウス（n=6）は、zcyto24またはzcyto25を第0日、第2日、第4日、および第6日に10μgの用量で注射することにより処置する。第三グループのマウス（n=6）は、zcyto24またはzcyto25を第0日、第2日、第4日、および第6日に75μgの用量で注射することにより処置する。zcyto24またはzcyto25で処置した両グループのマウスにおける生存時間は、媒体で処置したマウスと比較して有意に増加する。これらの結果は、zcyto24またはzcyto25による処置がEG.7腫瘍の増殖を緩慢にするかまたはその腫瘍細胞を破壊する免疫系の能力を強化するかのいずれかであることを示す。
【０３４５】
実施例32
IL-28受容体発現のフローサイトメトリー分析
非ホジキンリンパ腫（NHL）検体由来の腫瘍性B細胞におけるIL-28受容体の発現を評価する。複数のMAbを使用して腫瘍性B細胞を同定し、IL-28受容体を共局在化（co-localize）する。抗IL-28受容体MAbまたはビオチン-IL-29による免疫蛍光染色を平均蛍光ピーク値として記録する。定性スコアは、アイソタイプの一致する対照MAbに対する平均蛍光ピーク値のシフトに基づき評価する。
【０３４６】
免疫蛍光染色により腫瘍性B細胞におけるIL-28受容体を検出するために、抗IL-28受容体MAbまたはビオチン-IL-29を使用する。染色シグナルの強度はIL-28受容体レベルに相関する。これらのデータはIL-28受容体が非ホジキンリンパ腫の治療標的となりうることを示唆する。
【０３４７】
実施例33
B細胞リンパ腫に対するIL-29のインビボ効果
ヒトBリンパ腫細胞株は、培養培地で継代することによりインビトロで維持する。これらの細胞をPBSで十分に洗浄し、培養成分を除去する。
【０３４８】
SCIDマウスに、尾静脈によって（典型的には）100マイクロリットル量の1,000,000個のリンパ腫細胞を注射する。確実に望ましい挙動を示す腫瘍を得るために注射する細胞の最適数は、パイロット研究から経験的に決定する。IL-29処置は、次の日から、ALZET（登録商標）浸透圧ミニポンプ（ALZET, Cupertino, CA）の皮下移植またはIL-29もしくは媒体の毎日の腹腔内注射のいずれかによって開始する。生存および重篤な病的状態についてマウスを観察する。初期体重の20％超を喪失したマウス、および実質的な病的状態、例えば後肢の麻痺を示したマウスを屠殺する。使用したリンパ腫細胞株に依存するが、未処置のマウスは典型的には3〜6週で死亡する。IgGまたはIgMを分泌するB細胞リンパ腫については、この疾患の進行は、毎週採血し、ELISAによって血清ヒト免疫グロブリンレベルを測定することによっても観察できる。
【０３４９】
IL-29の用量応答／IM-9モデル
マウスに1×106個のIM-9細胞を注射し、次の日に28日間浸透圧ミニポンプを埋め込む。以下の濃度のIL-29を送達するためにポンプを充填する：1つの投薬グループあたり8匹のマウスに1日あたり0、0.12、1.2、または12マイクログラム。IL-29は、腫瘍細胞株からのマウスの保護においてはっきりとした用量依存的効果を示す。IL-29の効果は用量依存的である。実験終了時に生存しているマウスは疾患の徴候を有さず、血清中に検出可能なヒトIgGを有さない。
【０３５０】
これらのデータは、SCIDマウスリンパ腫モデルにおけるIL-29の効果がインビボでリンパ腫細胞株の増殖を抑制する能力と相関することを実証する。
【０３５１】
実施例34
マウス同系卵巣癌モデルにおけるIL-29の効果
Zhang et al., Am. J. of Pathol. 161: 2295-2309, 2002に記載されるマウス同系モデルを用いて卵巣癌における効果についてIL-29の効果を試験する。簡単に言うと、レトロウイルストランスフェクションおよび蛍光標識細胞分取法を用いて、マウスVEGF164アイソフォームおよび強化版緑色蛍光タンパク質（GFP）を安定に過剰発現するC57BL6マウスID8卵巣癌細胞株を作製する。VEGF164およびGFPのcDNAを含むレトロウイルス構築物でBOSC23細胞をトランスフェクトした。この細胞をFACS細胞分取法により分析し、高GFP陽性細胞を同定する。
【０３５２】
ID8 VEGF164/GFPトランスフェクト細胞を培養してサブコンフルエントな状態にし、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）および低温のMATRIGEL（BD Biosciences, Bedford, MA）中の単一細胞懸濁物として調製する。6〜8週齢の雌性C57BL6マウスの側腹部に5×106細胞または非トランスフェクト対照細胞を皮下注射する。あるいは、このマウスに7×106細胞または対照細胞を腹腔内注射することもできる。動物は、生存率について追跡するかまたは接種の8週後に屠殺し腫瘍の増殖について評価するかのいずれかである。腫瘍移植の3〜14日後からまたは腫瘍が生着し増殖率が一定になった場合に組換えzcyto24またはzcyto25によるマウスの処置を開始する。0.5〜5mg/kgの処置レベルを5〜14日間毎日投与し、中和抗体が形成された証拠が得られなければその後もこれを継続する。
【０３５３】
実施例35
マウスRENCAモデルにおけるIL-29の効果
腎細胞癌モデルにおけるIL-29の効果を、基本的にはWigginton et al., J. Nat. Cancer Instit. 88: 38-43, 1996に記載される自然発生的なマウス腎腺癌であるRENCA細胞を注射したBALB/cマウスを用いて評価する。
【０３５４】
簡単に言うと、8〜10週齢のBALB/cマウスの腎被膜にR 1×105のRENCA細胞を注射する。腫瘍細胞の移植から12日後、マウスの腎摘出を行い原発性腫瘍を除去する。このマウスをIL-29の投与前に手術から復帰させる。腫瘍移植の3〜14日後からまたは腫瘍が生着し増殖率が一定になった場合に組換えzcyto24またはzcyto25によるマウスの処置を開始する。0.5〜5mg/kgの処置レベルを5〜14日間毎日投与し、中和抗体が形成された証拠が得られなければその後もこれを継続する。あるいは、RENCA細胞は皮下（5×10e5細胞）または静脈内（1×10e5細胞）注射によって導入してもよい。
【０３５５】
このマウスを、未処置マウスとの比較で腫瘍反応について評価する。生存率をカプラン・マイヤー法を用いて比較し、腫瘍量も評価する。
【０３５６】
実施例36
マウス結腸直腸腫瘍モデルにおけるIL-29の効果
結腸直腸マウスモデルにおけるIL-29の効果は、Yao et al., Cancer Res. 63: 586-592, 2003に記載されるように試験する。このモデルにおいて、MC-26マウス結腸腫瘍細胞をBALB/cマウスの脾臓被膜下に移植する。14日後、処置マウスにIL-29を投与する。腫瘍移植の3〜14日後からまたは腫瘍が生着し増殖率が一定になった場合に組換えzcyto24またはzcyto25によるマウスの処置を開始する。0.5〜5mg/kgの処置レベルを5〜14日間毎日投与し、中和抗体が形成された証拠が得られなければその後もこれを継続する。
【０３５７】
生存の長期化または腫瘍反応の促進におけるIL-29の効果は、本明細書中に記載される標準的な技術を用いて評価する。
【０３５８】
実施例37
マウス膵癌モデルにおけるIL-29の効果
マウス膵癌モデルにおけるIL-29の効果を、Mukherjee et al., J. Immunol. 165: 3451-3460, 2000により開発されたプロトコルに従い評価する。簡単に言うと、MUC1トランスジェニック（MUC1.Tg）マウスを、MET.MUC1.Tgマウスと名付けた膵臓の腫瘍を自然発生的に生じる癌遺伝子発現マウス（ETマウス）と交配させる。ETマウスはラットエラスターゼプロモーターの制御下でSV40ラージT Agの最初の127aaを発現する。この動物の50パーセントは約21週齢までに生命にかかわる膵臓腫瘍を発生させる。MUC1の存在について細胞をフローサイトメトリーにより慣用的に試験する。全てのマウスのバックグラウンドはC57BL/6である。3〜24週の間、3週間隔で動物を屠殺し特徴付けを行う。嗜眠、膨満、飲食不良、顕著な体重減、顔面蒼白、および猫背を含む病気-健康の徴候についてマウスを注意深く観察する。
【０３５９】
全膵臓を脂肪およびリンパ節を含まないよう切除し、秤量し、写真撮影のためにビブルス紙（bibulus paper）に広げる。小結節を数え、膵臓をメタカンに固定し、従来的な方法により顕微鏡検査用に処理し、5μmのステップセクションを行い（1つのマウス膵臓あたり約10セクション）、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡により試験する。腫瘍は、腫瘍の進行過程の様々な時点でMETマウスから獲得し、メタカン（60％メタノール、30％クロロホルム、10％氷酢酸）に固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学分析のために切片化する。使用するMUC1抗体はCT1であり、これはマウスおよびヒトのMUC1、HMFG-2、BC2、およびSM-3の細胞質尾部領域を認識するウサギポリクローナルAbであり、MUC1のTRドメインにエピトープを有する。
【０３６０】
CTL活性の決定は、6日間のインビトロペプチド刺激後に追加のサイトカインを加えずに標準的な51Cr放出法を用いて行う。個々のMETマウスから脾細胞を、ナイロンメッシュの通過およびその後のRBCの溶解によって採取する。
【０３６１】
METマウスの脾臓由来の単一細胞を、リンパ球の亜集団：CD3、CD4、CD8、Fas、FasL、CDl1c、ならびにMHCクラスIおよびIIにおける変化について二色免疫蛍光により分析する。細胞内サイトカインレベルは、細胞をMUC1ペプチドで刺激（10μg/mlで6日間）し、ブレフェルジンA（ゴルジストップとも呼ばれる。PharMingen）を製造元の推奨（4μl/1.2×107細胞/6ml、染色前に37℃で3時間）に従い用いて処理した後に決定した。PharMingen透過キットを用いて細胞を透過処理し、PharMingenに記載されるように細胞内IFN-γ、L-2、IL-4、およびIL-5について染色する。全ての蛍光標識AbsはPharMingen社から購入する。フローサイトメトリー分析は、CellQuestプログラム（Becton Dickinson, Mountain View, CA）を用いてBecton Dickinson FACscanにより行う。
【０３６２】
腫瘍移植の3〜14日後からまたは腫瘍が生着し増殖率が一定になった場合に組換えzcyto24またはzcyto25によるマウスの処置を開始する。0.5〜5mg/kgの処置レベルを5〜14日間毎日投与し、中和抗体が形成された証拠が得られなければその後もこれを継続する。
【０３６３】
実施例38
マウス乳癌モデルにおけるIL-29の効果
乳癌のマウスモデルにおけるIL-29の効果を、Colombo et al., Cancer Research 62: 941-946, 2002に記載されるように同系モデルを用いて試験する。簡単に言うと、BALB/Cマウスの自然発生的な乳癌であるTS/A細胞をおよそ1週間培養してクローンを選択する。選択したTS/A細胞を培養し、2×102のTS/A細胞をCD-1 nu/nu BRマウス（Charles River Laboratories）の側腹部に皮下注射することによりこのマウスを刺激する。
【０３６４】
腫瘍移植の3〜14日後からまたは腫瘍が生着し増殖率が一定になった場合に組換えzcyto24またはzcyto25によるマウスの処置を開始する。0.5〜5mg/kgの処置レベルを5〜14日間毎日投与し、中和抗体が形成された証拠が得られなければその後もこれを継続する。動物屠殺後に腫瘍を切除し、容積についておよび組織化学を用いて免疫組織化学について分析する。
【０３６５】
実施例39
マウス前立腺癌モデルにおけるIL-29の効果
腫瘍反応に対するIL-29の効果を、Kwon et al., PNAS 96: 15074-15079, 1999に記載されるのと同様のモデルを用いるマウス前立腺癌モデルにおいて評価する。このモデルにおいては、C57BL/6マウスに移植したマウス前立腺のトランスジェニック腺癌（TRAMP）由来の前立腺癌細胞TRAMP-C2株が転移増殖する。転移性の再発は確実で、主に原発性腫瘍付近の流入領域リンパ節に生じる。
【０３６６】
簡単に言うと、使用するC2細胞株は、前立腺限局的なSV40抗原の発現に寄与する自所性腫瘍を自然発生的に生じるTRAMPマウス由来の初期継代株である。この細胞を培養し、C57BL/6マウスに2.5〜5×106細胞／0.1ml培地を皮下注射する。腫瘍移植の3〜14日後からまたは腫瘍が生着し増殖率が一定になった場合に組換えzcyto24またはzcyto25によるマウスの処置を開始する。0.5〜5mg/kgの処置レベルを5〜14日間毎日投与し、中和抗体が形成された証拠が得られなければその後もこれを継続する。動物屠殺後に腫瘍を切除し、容積についておよび組織化学を用いて免疫組織化学について分析する。
【０３６７】
実施例40
マウス実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）モデルにおけるIL-28およびIL-29の効果
実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）はヒト多発性硬化症（MS）のマウスモデルである（Gold et al., Mol. Med. Today, 6: 88-91, 2000; Anderton et al., Immunol. Rev., 169: 123-137, 1999）。マウスにおいて疾患を誘導するには複数の方法がある。一つのこのような方法は、ミエリンタンパク質であるミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（MOG）のペプチドでマウスを免疫刺激することである。このタンパク質は、ミエリン鞘の外側に存在し、ミエリンの保護層として作用する。RIBIアジュバントに乳化したMOGペプチド（MOG35-55）を用いて第0日にマウスを皮下から免疫刺激した。次いで第2日にマウスに百日咳毒素（PT）を静脈内注射した。このマウスは、尾の引きずり、動作のぐらつきから始まる麻痺の症状を示し始め、続いて後肢および前肢の麻痺を示し、これらに対していくつかの異なるパラメータに従いスコア付けを行い、疾患の時期、程度、および重症度を測定した。疾患の発症の遅延は、薬物がマウスにおける疾患プロセスを修正していることを示す。発症率の減少は、薬物が病に罹るマウスの数に対して効果を有することを示す。臨床スコアの減少は、薬物が疾患の重症度に対して効果を有することを示す。マウスのグループにPBSまたはマウスIL28（SEQ ID NO: 8）もしくはヒトIL29C172S（SEQ ID NO: 29）-PEGのいずれかを与えた。IL-28/29処置マウスにおける症状の発症、疾患発症率のスコア、および疾患重症度のスコアは、このモデルにおけるこれらのパラメータに対するIL-28/29の効果を示す。第0日にRIBIアジュバント中100ugのMOG35-55を用いてマウス（n=13/gp）の皮下から免疫刺激した。第2日に全てのマウスに静脈から200ngの百日咳毒素を与えた。マウスのグループをPBS、25ugのヒトIL29C172Sを用いて第1〜18日の間一日おき（EOD）に、またはPBS、BSA、もしくはマウスIL28を用いて腹腔内処置した。上記のように、臨床的徴候および体重減について第0〜30日の間毎日マウスをスコア付けした。IL29C172S（SEQ ID NO: 29）-PEGまたはマウスIL28（SEQ ID NO: 8）で処置したマウスは、PBS処置動物と比較して疾患発症の遅延を示した。
【０３６８】
（表３２）
2009502800.tif 000035
【０３６９】
（表３３）
2009502800.tif 000036
【０３７０】
（表３４）
2009502800.tif 000037
【０３７１】
IL-29は、多発性硬化症のマウスモデルにおける疾患の発症を遅らせる
概要
ヒトIL-29が多発性硬化症に対して何らかの効果を有するか否かを試験するため、MSのマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を抑制するIL-29の能力を試験した。十分に特徴付けられたC57BL/6マウスのミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（MOG）35-55ペプチド免疫モデルを使用した。この実験は、IL-29がEAEを遅らせおよび／またはその疾患スコアを抑制することができることを決定するため実施した。IL-29はEAEモデルにおける疾患の発症を遅らせ、これによりIL-29の使用がMSに有益であり得ることが示唆された。
【０３７２】
研究の設計
実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）はMSのマウスモデルである。一つのこのようなモデルにおいて、C57BL/6マウスをRIBIアジュバントに乳化させた100μgのMOGペプチド（MOG35-55）で免疫刺激する。RIBIのバイアルに0.5mg/mlのPBS中MOG35-55調製物を2ミリリットル加え、激しくボルテックスしてこの溶液を乳化させる。マウスの背部を剃毛し、マウスの背部に100μgのMOG/RIBIを皮下注射した。免疫刺激の2日前および免疫刺激後毎日マウスの体重を測定した。次いで第2日にマウスに200μlの百日咳毒素（PT）を静脈内注射し、終濃度を200ng／マウスとした。臨床スコアについてマウスを毎日観察した。第0〜18日までEODで、マウスのグループに200μlのPBSまたは200μl量の25μgのIL-29C172S（SEQ ID NO: 29）-PEGを腹腔内注射した。マウスの体重、臨床スコア、および発症率を評価し、分析のためにプロットした。
【０３７３】
結果および結論
第0〜18日のIL-29のEOD投与はこのモデルにおいて疾患の発症を遅らせた。この遅延はPBS処置マウスと比較して有意であった（p=0.0006、マントル・コックス検定）。
【０３７４】
IL-28は多発性硬化症のマウスモデルにおける疾患の発症を遅らせる
概要
マウスIL-28が多発性硬化症に対して何らかの効果を有するか否かを試験するため、MSのマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を抑制するIL-28の能力を試験した。十分に特徴付けられたC57BL/6マウスのミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（MOG）35-55ペプチド免疫モデルを使用した。この実験は、IL-28がEAEを遅らせおよび／またはその疾患スコアを抑制することができることを決定するため実施した。IL-28はEAEモデルにおける疾患の発症を遅らせ、これによりIL-28の使用がMSの処置に有益であり得ることが示唆された。
【０３７５】
研究の設計
実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）はMSのマウスモデルである。一つのこのようなモデルにおいて、C57BL/6マウスをRIBIアジュバントに乳化させた100μgのMOGペプチド（MOG35-55）で免疫刺激する。RIBIのバイアルに0.5mg/mlのPBS中MOG35-55調製物を2ミリリットル加え、激しくボルテックスしてこの溶液を乳化させた。マウスの背部を剃毛し、マウスの背部に100μgのMOG/RIBIを皮下注射した。免疫刺激の2日前および免疫刺激後毎日マウスの体重を測定した。次いで第2日にマウスに200μlの百日咳毒素（PT）を静脈内注射し、終濃度を200ng／マウスとした。臨床スコアについてマウスを毎日観察した。第一の実験において、第1〜11日の間EODで、マウスのグループに200μlのPBS、200μl量の50ugのmIL28もしくは200ugのmIL28（SEQ ID NO: 8）を腹腔内注射した。第二の実験において、第1〜21日の間EODで、マウスのグループに200μlのPBS、200μl量の130ugのBSAもしくは130ugのmIL28（SEQ ID NO: 8）を腹腔内注射した。マウスの体重、臨床スコア、および発症率を評価し、分析のためにプロットした。
【０３７６】
結果および結論
IL-28のEOD投与はこのモデルにおいて用量依存的様式で疾患の発症を遅らせた。この遅延はPBSまたはBSA処置マウスと比較して有意であった。
【０３７７】
実施例41
ヘパトーム細胞HepG2株におけるIL-29およびIFNα2aのマイクロアレイによる比較
導入
1型インターフェロン（IFN）は、ウイルス感染後にウイルスに対する身体の免疫反応の一部として誘導される。これらのタンパク質は、ウイルスの複製を直接的に阻害する作用をするインターフェロン刺激遺伝子（ISG）の誘導を通じてウイルスの複製を阻害し、NK細胞の溶解力を増加させ（Biron, C. A. 1998. Role of early cytokines, including alpha and beta interferons (IFN-alpha/beta), in innate and adaptive immune responses to viral infections. Semin Immunol 10: 383-90）、および抗原提示を促進するMHCクラスIの発現を増加させることによって適応免疫反応を調節し（Fellous, M., Nir, U., Wallach, D., Merlin, G., Rubinstein, M., and Revel, M. 1982. Interferon-dependent induction of mRNA for the major histocompatibility antigens in human fibroblasts and lymphoblastoid cells. Proc Natl Acad Sci USA 79: 3082-6）、T細胞の生存を促進し（Marrack, P., Kappler, J., and Mitchell, T. 1999. Type I interferons keep activated T cells alive. J Exp Med 189: 521-30）、ならびに樹状細胞の成熟を刺激する（Buelens, C., Bartholome, E. J., Amraoui, Z., Boutriaux, M., Salmon, I., Thielemans, K., Willems, F., and Goldman, M. 2002. Interleukin-3 and interferon beta cooperate to induce differentiation of monocytes into dendritic cells with potent helper T-cell stimulatory properties. Blood 99: 993-8）。ウイルスのライフサイクルに対するこの大きな効果から、IFNα2aはC型肝炎の処置に有益な治療薬剤であることが証明されている。
【０３７８】
I型インターフェロンに加えて、ウイルス感染は、近年発見されたIFNαおよびIL-10と遠い関係の新規のクラスIIサイトカインのファミリーであるIL-28およびIL-29（IFNλ1〜3）の産生を誘導する。I型IFNと同様、IL28/29は多くのウイルスに対して抗ウイルス活性を有する（Sheppard, P. et al., 2003. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R. Nat Immunol 4: 63-8; Kotenko, S. V. et al., 2003. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nat Immunol 4: 69-77; およびRobek, M. D. et al., 2005. Lambda interferon inhibits hepatitis B and C virus replication. J Virol 79: 3851-4）。本発明者らは以前、IL-29が初代ヒト肝細胞ならびにヒトへパトーム細胞株、例えばHuH7およびHepG2においてMx1、PRKR、およびOASのISGを誘導することを示した。従って、IL28/29はIFNα2aと類似の生物学を調節し得、ヒト患者における慢性ウイルス肝炎に対する治療的価値を有する。しかし、IL-29およびIFNαは別個の受容体を用い、これによりこれら二つのサイトカインが他のサイトカイン特異的遺伝子サブセットおよび生物学的プロセスを潜在的に調節することが可能になる。従って、これら二つのサイトカインの遺伝子調節プロファイルをグローバルなスケールで比較することに関心を抱いた。従って、HepG2細胞を総RNAの単離前に様々な時間IL-29およびIFNα2aで処置し、DNAマイクロアレイ分析を用いて遺伝子調節を分析した。
【０３７９】
研究の設計
肝細胞においてIL-29およびIFNα2aにより調節される遺伝子を同定するため、ヘパトーム細胞HepG2株を用いてマイクロアレイ実験を行った。これらの研究のために、三つのHepG2細胞培養物を、陰性対照としての培地、50μg/mlのヒトIL-29（SEQ ID NO: 4）、または5μg/mlのヒトIFNα2aで1、6、または24時間処理した。刺激後、総RNAをQIAGEN社のRNeasy Miniキットを用いて抽出し、RNAの質および量をRNA 6000 Nano Assay（Agilent）を製造元の説明書に従い用いてAgilent 2100 Bioanalyzerにより評価した。簡単に言うと、ビオチン標識したcRNAをAffymetrix製のGeneChip（登録商標）One-Cycle Target Labeling and Control Reagentsを用いて合成した。各試料の断片化したcRNAをAffymetrix Human Genome Focus Arrayにハイブリダイズさせ、製造元の説明書に従い染色した。次いで、アレイをAffymetrix GeneChip（登録商標）Scanner 3000でスキャンし、生データをAffymetrix GeneChip（登録商標）Operating Software（GCOS）データマイニングソフトウェアを用いて生成した。次いでデータ分析の目的で生データをGeneSpring 7.0マイクロアレイ分析プログラム（Silicon Genetics）に読み込んだ。0.01未満の値は0.01に変換した。各アレイの強度は、50以上の生の値を有する残った全ての値を用いて全てのアレイの50パーセンタイルに正規化した。一遺伝子毎の値は、全てのアレイにおいて50以上の生の値を有する値に対して算出された中央値に対して正規化した。フィルター処理を行っていないデータを用いて散布図を作成した。IL-29により調節される遺伝子を、一元配置分散分析（ANOVA）において0.05以下のp値、IL-29処置試料における600（バックグラウンドの3倍）以上の生の強度、および対応する時点の培地処置試料と比較して2倍以上の変化を有するものとして判断した。最も強い遺伝子誘導を6時間の時点で観察した。
【０３８０】
結果および考察
マイクロアレイ分析の結果から、HepG2細胞におけるIL-29およびIFNα2aの両方による遺伝子調節は一過的なものであり、6時間でピークがあった後は徐々に下降することが明らかになった。IL-29処置試料のデータをIFNα2a処置試料のデータと比較したところ、全ての遺伝子がこの二つのサイトカインによって同様に調節されることが見出され、これによりIL-29およびIFNα2aが肝細胞において同一の遺伝子サブセットを調節することが示された。しかし、HepG2細胞においてIFNα2aによる誘導の程度は、IL-29による惹起よりも大きかった。研究設計において列挙した基準による決定でIL-29によりアップレギュレートされることが同定された全ての遺伝子のリストを以下の表35に列挙する。これらの遺伝子は、抗ウイルス反応（OAS遺伝子、MX遺伝子、およびPRKR、ADAR）、増殖の調節（IFITM1、IFITM3、CEB1）、アポトーシス（TNFSF10）、およびシグナル伝達（NMI、STAT1、IRF9）に関与するタンパク質をコードする公知のインターフェロン刺激遺伝子（ISG）で排他的に構成されることが見出された。これらのデータは、IL-29が、IL-28受容体を発現する細胞、例えば肝細胞において1型インターフェロンにより調節されるのと同一の生物学を媒介することを示唆する。
【０３８１】
（表３５）
2009502800.tif 000038
【０３８２】
実施例42
マウスIL28プラスミドはマウスにおける腎細胞癌RENCA腫瘍の増殖を抑制する
概要
IL28/IL29がマウスにおける腫瘍の増殖に対して効果を有するか否かを決定するため、第0日にマウスのグループにRENCA腫瘍を皮下注射した。次いで第5日および第12日に水力学装置（HDD）によってマウスに50ugの対照ベクタープラスミドまたはmIL28プラスミド（SEQ ID NO: 7）を注射した。腫瘍の容積は5週間の間、週3回観察した。マウスIL28タンパク質の血清レベルはELISAによって測定した。mIL28プラスミドを注射したマウスは、対照プラスミドを注射したマウスと比較して有意に縮小した腫瘍を示し、これによりマウスIL28が抗腫瘍活性を有することが示唆された。
【０３８３】
研究の設計
10週齢の雌性BALB/cマウス（Charles River Laboratories）の右側腹部に第0日に0.1×106のRENCA細胞を皮下注射した。第5日および第12日に、水力学的押出法を用いてマウスのグループ（n=10／グループ）に50ugの空のpZP-7プラスミドまたはpZP-7/mIL28のいずれかを静脈内注射した（1.6mlの生理食塩水に懸濁したプラスミドを5〜8秒の間に尾静脈によって注射した）。プラスミド注射から24時間後にマウスから採血し（第6日および第13日）、ELISAによって血清mIL28レベルを評価した。腫瘍の増殖は、カリパスによる測定を用いて5週間の間、毎週3回観察した。腫瘍の容積は、式1/2*（B）2*L（mm3）を用いて算出した。
【０３８４】
結果および結論
mIL28プラスミドの注射は、プラスミド送達から24時間後に50〜200ng/mlのタンパク質の発現をもたらした。mIL-28プラスミドの注射は、RENCAモデルにおける腫瘍の増殖を抑制した。対照プラスミド注射マウスとIL28プラスミド注射マウスの間の腫瘍容積差は統計的に有意であった（第36日の対照との比較でp=0.0125）（図1）。これらのデータは、IL28が抗腫瘍活性を有し、潜在的な癌治療剤であることを示唆する。
【０３８５】
実施例43
マウスIL28プラスミドおよびヒトIL29 C172S-PEGタンパク質はマウスにおけるRENCA腫瘍の増殖を抑制する
概要
IL28/IL29がマウスにおける腫瘍の増殖に対して効果を有するか否かを決定するため、第0日にマウスのグループにRENCA腫瘍を皮下注射した。次いで第5日および第12日に水力学装置（HDD）によってマウスに50ugの対照ベクタープラスミド、mIL28プラスミド（SEQ ID NO: 7）、またはmIFNαプラスミドを注射した。別の腫瘍保有マウスのグループに、第5〜21日の間一日おき（EOD）に腹腔内注射により25ugのヒトIL29 C172S（SEQ ID NO: 29）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）タンパク質を与えた。腫瘍の容積は4週間の間、週3回観察した。マウスIL28およびIFNαタンパク質の血清レベルはELISAによって測定した。mIL28またはmIFNαプラスミドを注射したマウスは、対照プラスミドを注射したマウスと比較して有意に縮小した腫瘍を示し、これによりマウスIL28が抗腫瘍活性を有することが示唆された。さらに、IL29 C172S-PEGタンパク質を注射したマウスもまた、対照と比較して腫瘍容積の減少を示した。これらのデータは、IL28およびIL29の両方が抗腫瘍活性を有することを示唆する。
【０３８６】
研究の設計
10週齢の雌性BALB/cマウス（Charles River Laboratories）の右側腹部に第0日に0.1×106のRENCA細胞を皮下注射した。第5日および第12日に、水力学的押出法を用いてマウスのグループ（n=10／グループ）に50ugの空のpZP-7プラスミド、pZP-7/mIL28、またはpORF/mIFNaのいずれかを静脈内注射した（1.6mlの生理食塩水に懸濁したプラスミドを5〜8秒の間に尾静脈によって注射した）。別のマウスグループ（n=10）に25ugのヒトIL29 C172S-PEGを第5〜21日の間EODで腹腔内注射した。腹腔内注射は、総量200ulで行った。プラスミド注射から24時間後にマウスから採血し（第6日および第13日）、ELISAによって血清mIL28レベルおよび血清mIFNαレベルを評価した。腫瘍の増殖は、カリパスによる測定を用いて4週間、毎週3回観察した。腫瘍の容積は、式1/2*（B）2*L（mm3）を用いて算出した。
【０３８７】
結果および結論
mIL-28またはmIFNαプラスミドの投与は、このRENCAモデルにおいて腫瘍の増殖を有意に抑制した（第28日の対照グループとの比較で全3グループについてp＜0.001）（図2）。ヒトIL-29 C172S-PEGタンパク質の注射もまた、対照と比較して腫瘍の増殖を有意に抑制した。これらのデータは、mIL28およびヒトIL29が抗腫瘍活性を有し、癌の潜在的な治療剤であることを示唆する。
【０３８８】
実施例44
少量の2つの異なる形態のヒトIL29タンパク質はRENCAモデルにおいて抗腫瘍活性を示す
概要
IL29の抗腫瘍活性が上記の用量よりも少量で達成できるか否かを決定するため、第0日にマウスのグループにRENCA腫瘍を皮下注射した。腫瘍保有マウスのグループ（n=10／グループ）に、第5〜23日の間一日おき（EOD）に腹腔内注射により1ug、5ug、25ugのヒトIL29 C172S（SEQ ID NO: 29）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）またはヒトIL29 C172S d2-7（SEQ ID NO: 159）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）タンパク質を与えた。腫瘍の容積は4週間、週3回観察した。1、5、または25ugのIL29 C172S-PEGタンパク質を注射したマウスは、対照と比較して腫瘍容積の減少を示した。さらに、1、5、または25ugのヒトIL29 C172S d2-7-PEGタンパク質を注射したマウスもまた、対照と比較して有意な腫瘍容積の減少を示した。これらのデータは、少量の2つの異なる形態のヒトIL29タンパク質がマウスにおいて抗腫瘍活性を有することを示唆する。
【０３８９】
研究の設計
10週齢の雌性BALB/cマウス（Charles River Laboratories）の右側腹部に第0日に0.1×106のRENCA細胞を皮下注射した。マウスグループ（n=10／グループ）に1ug、5ug、または25ugのヒトIL29 C172S-PEGまたはヒトIL29 C172S d2-7-PEGを第5〜23日の間EODで腹腔内注射した。腹腔内注射は、総量200ulで行った。腫瘍の増殖は、カリパスによる測定を用いて4週間、毎週3回観察した。腫瘍の容積は、式1/2*（B）2*L（mm3）を用いて算出した。
【０３９０】
結果および結論
1ug、5ug、または25ugのヒトIL29 C172S-PEGタンパク質の投与は、腫瘍の増殖を有意に抑制した。さらに、1ug、5ug、または25ugのヒトIL29 C172S d2-7-PEGタンパク質の注射もまた、媒体処置マウスと比較して腫瘍の増殖を抑制した（図3）。これらのデータは、ヒトIL29タンパク質が抗腫瘍活性を有し、様々な腫瘍の潜在的な治療剤である証拠を提供する。
【０３９１】
実施例45
ペグ化ヒトIL29による治療的処置はRENCAモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す
概要
IL29による治療的処置が抗腫瘍活性を誘導できるか否かを決定するため、マウスのグループに第0日にRENCA腫瘍を皮下注射した。腫瘍の容積が100mm3に達したら、マウスに媒体、5ugもしくは25ugのヒトIL29 C172S d2-7（SEQ ID NO: 159）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）タンパク質を一日おき（EOD）に10回の注射でまたは5ugのヒトIL29 C172S d2-7（SEQ ID NO: 159）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）タンパク質を毎日（ED）20回の注射で与えた。対照として、一つのマウスグループを、腫瘍注射の第5日目から始まる20日の間（第5〜23日）EODで5ugのヒトIL29 C172S d2-7-PEGにより予防的に処置した。個々のマウス各々に対しては、腫瘍の容積が100mm3に達した後のみ注射を行った。全てのタンパク質の注射は腹腔内投与による。腫瘍の容積は4週間、週3回観察した。5ugもしくは25ugでEODまたは5ugでEDの注射をしたマウスは、対照と比較して腫瘍の増殖の有意な減少を示した。これまでの結果と同様、5ugのIL29で予防的処置を施したマウスもまた、対照と比較して腫瘍増殖の減少を示した。これらのデータは、ヒトIL29タンパク質による治療的処置がマウスにおいて抗腫瘍活性を有することを示唆する。
【０３９２】
研究の設計
10週齢の雌性BALB/cマウス（Charles River Laboratories）の右側腹部に第0日に0.1×106のRENCA細胞を皮下注射した。腫瘍容積がおよそ100mm3になったのを期にマウスグループ（n=10／グループ）に媒体、5ugもしくは25ugのヒトIL29 C172S d2-7-PEGを20日間EODで、または5ugのヒトIL29 C172S d2-7-PEGを20日間EDで腹腔内注射した。別のマウスグループには、実験第5日から、5ugのヒトIL29 C172S d2-7-PEGを20日間EODで与えた（予防的処置）。腹腔内注射は、総量200ulで行った。腫瘍の増殖は、カリパスによる測定を用いて4週間、毎週3回観察した。腫瘍の容積は、式1/2*（B）2*L（mm3）を用いて算出した。
【０３９３】
結果および結論
5ugもしくは25ugをEODでまたは5ugをEDで注射したマウスは対照と比較して腫瘍の増殖の有意な減少を示した。これまでの結果と同様、5ugのIL29で予防的処置を施したマウスもまた、対照と比較して腫瘍増殖の減少を示した（図4）。これらのデータは、ヒトIL29タンパク質が抗腫瘍活性を有し、様々な腫瘍の潜在的治療剤である証拠を提供する。
【０３９４】
実施例46
ペグ化ヒトIL29による予防的処置はE.G7胸腺腫モデルにおける腫瘍の増殖を抑制する
概要
IL29が他の腫瘍において抗腫瘍活性を誘導できるか否かを決定するため、マウスのグループに第0日にE.G7腫瘍を皮下注射した。マウスのグループに媒体または25ugのヒトIL29 C172S d2-7（SEQ ID NO: 159）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）タンパク質を一日おき（EOD）に10回の注射でを与えた（第0〜18日）。全てのタンパク質の注射は腹腔内投与により行った。腫瘍の容積は4週間、週3回観察した。25ugをEODで注射をしたマウスは、対照と比較して腫瘍の増殖の有意な減少を示した。これらのデータは、ヒトIL29タンパク質による処置がマウスにおいて抗腫瘍活性を有することを示唆する。
【０３９５】
研究の設計
10週齢の雌性C57BL/6マウス（Charles River Laboratories）の右側腹部に第0日に0.4×106のE.G7細胞を皮下注射した。マウスのグループ（n=10／グループ）に媒体または25ugのヒトIL29 C172S d2-7-PEGを20日間EODで腹腔内注射した。腹腔内注射は、総量200ulで行った。腫瘍の増殖は、カリパスによる測定を用いて4週間、毎週3回観察した。腫瘍の容積は、式1/2*（B）2*L（mm3）を用いて算出した。
【０３９６】
結果および結論
25ugをEODで注射したマウスは対照と比較して腫瘍の増殖の有意な減少を示し、また対照動物と比較してマウスの生存を長引かせた（図5Aおよび5B）。これらのデータは、ヒトIL29タンパク質が抗腫瘍活性を有し、様々な腫瘍の潜在的治療剤である証拠を提供する。
【０３９７】
実施例47
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bはヒト肝細胞癌細胞C3AおよびHuH7の増殖をインビボで抑制する
概要
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bの抗腫瘍活性がヒト肝細胞癌細胞に対してインビボで達成され得るか否かを試験するため、BALB/cヌードマウスのグループに第0日にHuH7またはC3Aのいずれかの肝細胞癌細胞を注射する。腫瘍保有マウスのグループ（n=10／グループ）に第5〜33日の間一日おき（EOD）に腹腔内または腫瘍周囲注射により5ug〜75ugのヒトPEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質を与える。腫瘍の容積は6週間、週3回観察する。PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bのいずれかのタンパク質による腫瘍増殖の抑制は、各タンパク質がヒト肝細胞癌に対してインビボで抑制効果を有することを示唆する。
【０３９８】
研究の設計
8週齢の雌性BALB/cヌードマウス（Charles River Laboratories）の右側腹部に第0日に0.6×106のHuH7またはC3A細胞を皮下注射する。マウスのグループ（n=10／グループ）に第5〜33日の間、5ug〜75ugのヒトPEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質を腹腔内または腫瘍周囲注射する。腹腔内注射は、総量200ulで行う。腫瘍の増殖は、カリパスによる測定を用いて6週間、毎週3回観察する。腫瘍の容積は、式1/2*（B）2*L（mm3）を用いて算出した。
【０３９９】
結果および結論
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質による腫瘍増殖の抑制は、各タンパク質がヒト肝細胞癌に対してインビボで抑制効果を有することを示唆する。
【０４００】
実施例48
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bはヒト前立腺癌細胞PC-3およびDU145の増殖をインビボで抑制する
概要
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bの抗腫瘍活性がヒト前立腺癌細胞に対してインビボで達成され得るか否かを試験するため、BALB/cヌードマウスのグループに第0日にPC-3またはDU-145のいずれかの前立腺癌細胞を注射する。腫瘍保有マウスのグループ（n=10／グループ）に第5〜33日の間一日おき（EOD）の腹腔内または腫瘍周囲注射により5ug〜75ugのヒトPEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質を与える。腫瘍の容積は6週間、週3回観察する。PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bのいずれかのタンパク質による腫瘍増殖（容積または重量）の抑制は、各タンパク質がヒト前立腺癌に対してインビボで抑制効果を有することを示唆する。
【０４０１】
研究の設計
第0日に、8週齢の雌性BALB/cヌードマウス（Charles River Laboratories）の右側腹部皮下にまたは前立腺葉に正所的（orthotopically）に10×106のPC-3または6×106のDU-145細胞を注射する。マウスのグループ（n=10／グループ）に第5〜33日の間、5ug〜75ugのヒトPEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質を腹腔内または腫瘍周囲注射（皮下モデルのみ）する。注射は総量200ulで行う。皮下腫瘍について、腫瘍の増殖をカリパスによる測定を用いて6週間、毎週3回観察する。腫瘍の容積は、式1/2*（B）2*L（mm3）を用いて算出した。正所性腫瘍（orthotopic tumor）については、腫瘍性評価（tumor load assessment）を行うためにマウスを研究終了時に屠殺し腫瘍を秤量する。
【０４０２】
結果および結論
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質による腫瘍増殖（容積または重量）の抑制は、各タンパク質がヒト前立腺癌に対してインビボで抑制効果を有することを示唆する。
【０４０３】
実施例49
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bは、ヒト結腸癌細胞DLD-1およびHCT-116の増殖をインビボで抑制する
概要
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bの抗腫瘍活性がヒト結腸癌細胞に対してインビボで達成され得るか否かを試験するため、BALB/cヌードマウスのグループに第0日にDLD-1またはHCT-116のいずれかの結腸癌細胞を注射する。腫瘍保有マウスのグループ（n=10／グループ）に第5〜33日の間一日おき（EOD）に腹腔内または腫瘍周囲注射により5ug〜75ugのヒトPEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質を与える。腫瘍の容積は6週間、週3回観察する。PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質による腫瘍増殖（容積または重量）の抑制は、各タンパク質がヒト結腸癌に対してインビボで抑制効果を有することを示唆する。
【０４０４】
研究の設計
第0日に、8週齢の雌性BALB/cヌードマウス（Charles River Laboratories）の右側腹部皮下にまたは結腸壁に正所的に6×106のDLD-1またはHCT-116細胞を注射する。マウスのグループ（n=10／グループ）に第5〜33日の間、5ug〜75ugのヒトPEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質を腹腔内または腫瘍周囲注射（皮下モデルのみ）する。注射は総量200ulで行う。皮下腫瘍について、腫瘍の増殖をカリパスによる測定を用いて6週間、毎週3回観察する。腫瘍の容積は、式1/2*（B）2*L（mm3）を用いて算出した。正所性腫瘍については、腫瘍性評価を行うためにマウスを研究終了時に屠殺し腫瘍を秤量する。
【０４０５】
結果および結論
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質による腫瘍増殖（容積または重量）の抑制は、各タンパク質がヒト結腸癌に対してインビボで抑制効果を有することを示唆する。
【０４０６】
実施例50
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bはヒト膵癌細胞BxPC-3およびHPAF-IIの増殖をインビボで抑制する
概要
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bの抗腫瘍活性がヒト膵癌細胞に対してインビボで達成され得るか否かを試験するため、BALB/cヌードマウスのグループに第0日にBxPC-3またはHPAF-IIのいずれかの膵癌細胞を注射する。腫瘍保有マウスのグループ（n=10／グループ）に第5〜33日の間一日おき（EOD）に腹腔内または腫瘍周囲注射により5ug〜75ugのヒトPEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質を与える。腫瘍の容積は6週間、週3回観察する。PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質による腫瘍増殖（容積または重量）の抑制は、各タンパク質がヒト膵癌に対してインビボで抑制効果を有することを示唆する。
【０４０７】
研究の設計
第0日に、8週齢の雌性BALB/cヌードマウス（Charles River Laboratories）の右側腹部皮下にまたは膵葉に正所的に6×106のBxPC-3またはHCT-116細胞を注射する。マウスのグループ（n=10／グループ）に第5〜33日の間、5ug〜75ugのヒトPEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質を腹腔内または腫瘍周囲注射（皮下モデルのみ）する。注射は総量200ulで行う。皮下腫瘍について、腫瘍の増殖をカリパスによる測定を用いて6週間、毎週3回観察する。腫瘍の容積は、式1/2*（B）2*L（mm3）を用いて算出した。正所性腫瘍については、腫瘍性評価を行うためにマウスを研究終了時に屠殺し腫瘍を秤量する。
【０４０８】
結果および結論
PEG-rIL-29、rIL-29、PEG-rIL-28A、rIL-28A、PEG-rIL-28B、またはrIL-28Bタンパク質による腫瘍増殖（容積または重量）の抑制は、各タンパク質がヒト膵癌に対してインビボで抑制効果を有することを示唆する。
【０４０９】
実施例51
多発性硬化症（MS）のEAEマウスモデルにおけるIL-29
実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）はヒトMSのマウスモデルである（Gold et al., Mol. Med. Today, 6: 88-91, 2000; Anderton et al., Immunol. Rev., 169: 123-131, 1999）。ヒトにおけるMSは、広義には、慢性進行型および再発寛解型の疾患表現型に分類され得る。これらの疾患表現型は複数の方法を用いてマウスでモデル化できる。マウスにおいて慢性進行型MSを誘導する一つのこのような方法は、ミエリンタンパク質MOG（ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質）のペプチドでマウスを免疫刺激することである。このタンパク質は、ミエリン鞘の外側に存在し、ミエリンの保護層として作用する。RIBIアジュバントに乳化したMOGペプチド（MOG35-55）を用いて第0日にマウスを皮下から免疫刺激する。次いで第2日にマウスに百日咳毒素（PT）を静脈内注射する。このマウスは、尾の引きずり、動作のぐらつきから始まる麻痺の症状を示し始め、続いて後肢および前肢の麻痺を示し、これらに対していくつかの異なるパラメータに従いスコア付けを行い、疾患の時期、程度、および重症度を測定する。疾患の発症の遅延は、薬物がマウスにおける疾患プロセスを修正していることを示す。発症率の減少は、薬物が病に罹るマウスの数に対して効果を有することを示す。臨床スコアの減少は、薬物が疾患の重症度に対して効果を有することを示す。マウスのグループにPBSまたはマウスIL28もしくはヒトIL29C172S-PEGのいずれかを与える。IL-28/29処置マウスにおける症状の発症、疾患発症率のスコア、および疾患重症度のスコアは、このモデルにおけるこれらのパラメータに対するIL-28/29の効果を示す。第0日にRIBIアジュバント中100μgのMOG35-55を用いてマウス（n=13/gp）の皮下から免疫刺激する。第2日に全てのマウスに静脈から200ngの百日咳毒素を与える。マウスのグループをPBS、25μgのヒトIL29C172Sを用いて第1〜18日の間一日おき（EOD）に、またはPBS、BSA、もしくはマウスIL28を用いて腹腔内処置する。上記のように、臨床的徴候および体重減について第0〜30日の間毎日マウスをスコア付けする。IL29 C172S-PEGまたはマウスIL28で処置したマウスは、PBS処置動物と比較して疾患発症の遅延を示す。
【０４１０】
再発寛解型疾患をモデル化するため、マウス（SJL）をタンパク脂質性タンパク質（PLP）由来のペプチドで免疫刺激する。マウスの背部皮下から、完全フロイントアジュバント（CFA）に乳化したPLP139-151ペプチドで免疫刺激する。このマウスは、尾の引きずり、動作のぐらつきから始まる麻痺の症状を示し始め、続いて後肢および前肢の麻痺を示し、これらに対していくつかの異なるパラメータに従いスコア付けを行い、疾患の時期、程度、および重症度を測定する。RR-EAEモデルの疾患過程において、マウスは自然に短期間の寛解を起こし、その後にマウスはこれも自然に再発を起こす。マウスは疾患過程においてこれらの再発・寛解サイクルを複数回起こす。疾患の発症の遅延は、薬物がマウスにおける疾患プロセスを修正していることを示す。発症率の減少は、薬物が病に罹るマウスの数に対して効果を有することを示す。臨床スコアの減少は、薬物が疾患の重症度に対して効果を有することを示す。このモデルにおける、再発数の減少、再発時に到達する最大臨床スコアの減少、およびマウスの完全寛解状態での維持は全て、治療薬の指標である。免疫マウスのグループに、異なる用量のPEG-rIL-29またはPEG-mIL-28を予防的（免疫刺激後第3日目から開始）または治療的（臨床スコアの第1日目から開始）のいずれかで与える。再発、疾患の重症度、および発症率の減少、または完全な寛解の誘導は、PEG-rIL-29またはPEG-mIL-28がRR-EAEを抑制し、ヒトにおけるRR-MSの治療剤であり得ることを示す。
【０４１１】
PEG-mIL-28またはPEG-rIL-29の予防的投与はSJLマウスのRR-EAEモデルにおける疾患の重症度および疾患の発症率を抑制する
概要
マウスIL-28またはヒトIL-29が再発寛解型多発性硬化症に対して何らかの効果を有するか否かを試験するため、PEG-mIL-28またはPEG-rIL-29がRR-MSのマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を抑制する能力を試験した。十分特徴付けられたタンパク脂質性タンパク質PLP139-151ペプチドで免疫刺激したSJLマウスモデルを使用した。本実験は、IL-28またはIL-29がRR-EAEの疾患スコアを遅延および／または抑制できることを決定するために行った。PEG-rIL-29およびPEG-mIL-28のいずれかの予防的投与はRR-EAEモデルにおける疾患の発症を遅らせ、疾患の発症率を減らし、これによりIL-28またはIL-29の使用がMSにおいて有益であり得ることが示唆された。
【０４１２】
研究の設計
実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）はMSのマウスモデルである。一つのこのようなモデルにおいて、CFAアジュバントに乳化した（1：1の比率）100μgのPLPペプチド（PLP139-151）でSJLマウスを免疫刺激する。PLP139-151ペプチドの1mg/mL PBS調製物を調製した。1mg/mLの熱不活性化結核菌（Mtb）を含有するCFA（Sigma Aldrich Ltd）にさらに1mg/mLのMtb（Difco Laboratories）を補充し、終濃度を2mg/mL Mtbとした。このCFAおよびPLPペプチド溶液の1：1乳化物を乳化用注射器を用いて作製した。マウス背部を剃毛し、100μgのPLP/CFA（200uL乳化物）をマウス背部に皮下注射した。免疫刺激の2日前および免疫刺激後毎日マウスの体重を測定した。臨床スコアについてマウスを毎日観察した。第3〜23日の間EODで、マウスのグループに、100μlのPBS、または100uL量の5〜75ugのPEG-mIL-28（マウスIL-28（SEQ ID NO: 8）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）もしくは25ugのPEG-rIL-29（IL29 C172S d2-7（SEQ ID NO: 159）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）を腹腔内注射した。一部の実験においては、第4、8、12、および16日に25ugのノバントロンを腹腔内投与した。マウスの体重、臨床スコア、および発症率を評価し、分析のためにプロットした。
【０４１３】
結果および結論
5ug、25ug、または75ugのPEG-mIL-28の予防的投与は、RR-EAEモデルにおいて疾患の発症率を有意に抑制し、疾患の発症を遅らせた（図6および7参照、全PEG-mIL-28グループ対媒体についてp＜0.0001 - カプラン・マイヤー検定）。25ugのPEG-rIL-29の予防的投与は、RR-EAEモデルにおいて疾患の発症率を有意に抑制し、疾患の発症を遅らせた（図8および9、媒体との比較でp＜0.0001、カプラン・マイヤー検定）。
【０４１４】
PEG-mIL-28の治療的投与はSJLマウスのRR-EAEモデルにおける疾患の重症度および疾患の再発を抑制する
概要
マウスIL-28の治療的投与が再発寛解型多発性硬化症に対して何らかの効果を有するか否かを試験するため、PEG-mIL-28がRR-MSのマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を抑制する能力を試験した。十分特徴付けられたタンパク脂質性タンパク質PLP139-151ペプチドで免疫刺激したSJLマウスモデルを使用した。本実験は、IL-28を治療的に（疾患の最初の臨床的徴候の後に）与えた場合にRR-EAEの疾患スコアを抑制し再発を防止することができることを決定するために行った。PEG-mIL-28の治療的投与はRR-EAEモデルにおける疾患重症度を抑制かつ再発を防止し、これによりIL-28の使用がMSにおいて有益であり得ることが示唆された。
【０４１５】
研究の設計
実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）はMSのマウスモデルである。一つのこのようなモデルにおいて、CFAアジュバントに乳化した（1：1の比率）100μgのPLPペプチド（PLP139-151）でSJLマウスを免疫刺激した。PLP139-151ペプチドの1mg/mL PBS調製物を調製した。1mg/mLの熱不活性化結核菌（Mtb）を含有するCFA（Sigma Aldrich Ltd）にさらに1mg/mLのMtb（Difco Laboratories）を補充し、終濃度を2mg/mL Mtbとした。このCFAおよびPLPペプチド溶液の1：1乳化物を乳化用注射器を用いて作製した。マウス背部を剃毛し、100μgのPLP/CFA（200uL乳化物）をマウス背部に皮下注射した。免疫刺激の2日前および免疫刺激後毎日マウスの体重を測定した。臨床スコアについてマウスを毎日観察した。個々のマウス各々における最初の臨床スコアの第1日から始まる30日間の間毎日（ED）、マウスのグループに、100μlのPBS、または100uL量の25ugもしくは50ugのPEG-mIL-28（マウスIL-28（SEQ ID NO: 8）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）を腹腔内注射した。マウスの体重、臨床スコア、および発症率を評価し、分析のためにプロットした。
【０４１６】
結果および結論
25ugまたは50ugのPEG-mIL-28の治療的投与は、RR-EAEモデルにおいて疾患の重症度を有意に抑制した（図10および11）。PEG-mIL-28はまたRR-EAEマウスにおいて再発を減らし、寛解を持続した（図12）。
【０４１７】
PEG-rIL-29の治療的投与はSJLマウスのRR-EAEモデルにおける疾患の重症度および疾患の再発を抑制する
概要
ヒトIL-29の治療的投与が再発寛解型多発性硬化症に対して何らかの効果を有するか否かを試験するため、PEG-rIL-29がRR-MSのマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を抑制する能力を試験した。十分特徴付けられたタンパク脂質性タンパク質PLP139-151ペプチドで免疫刺激したSJLマウスモデルを使用した。本実験は、IL-29を治療的に（疾患の最初の臨床的徴候の後に）与えた場合にRR-EAEの疾患スコアを抑制し再発を防止することができることを決定するために行った。PEG-rIL-29によるRR-EAEモデルにおける疾患重症度の抑制および再発の防止は、ヒトMSにおけるこのタンパク質の臨床的用途を示唆する。
【０４１８】
研究の設計
実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）はMSのマウスモデルである。一つのこのようなモデルにおいて、CFAアジュバントに乳化した（1：1の比率）100μgのPLPペプチド（PLP139-151）でSJLマウスを免疫刺激した。PLP139-151ペプチドの1mg/mL PBS調製物を調製した。1mg/mLの熱不活性化結核菌（Mtb）を含有するCFA（Sigma Aldrich Ltd）にさらに1mg/mLのMtb（Difco Laboratories）を補充し、終濃度を2mg/mL Mtbとした。このCFAおよびPLPペプチド溶液の1：1乳化物を乳化用注射器を用いて作製した。マウス背部を剃毛し、100μgのPLP/CFA（200uL乳化物）をマウス背部に皮下注射した。免疫刺激の2日前および免疫刺激後毎日マウスの体重を測定した。臨床スコアについてマウスを毎日観察した。個々のマウス各々における最初の臨床スコアの第1日から始まる30日の間毎日(ED)または一日おき（EOD）に、マウスのグループに、100μlのPBS、または100uL量の5ug〜75ugのPEG-rIL-29（IL29 C172S d2-7（SEQ ID NO: 159）-PEG（20kD N末端結合メトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド）を腹腔内注射した。マウスの体重、臨床スコア、および発症率を評価し、分析のためにプロットした。
【０４１９】
結果および結論
PEG-rIL-29の治療的投与後、RR-EAEモデルにおける疾患重症度および再発防止は抑制された。このことは、ヒトMSにおけるこのタンパク質の臨床的用途を示唆する。
【０４２０】
本明細書中で引用した全ての特許、特許出願、および公報、ならびに電磁的に用いることができる資料（例えば、GenBankアミノ酸およびヌクレオチド配列の投稿）の全開示が参照により組み入れられる。上記の詳細な説明および実施例は、理解を助ける目的でのみ提供される。これらから不必要な制限が課されるべきではない。本発明は、示され記載された詳細に厳密に限定されるものではなく、当業者に自明のバリエーションも特許請求の範囲により規定される本発明に範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０４２１】
【図１】第5日および第12日にマウスIL-28プラスミドを注射したマウスがインビボでRENCA腫瘍の増殖を抑制することを示す。
【図２】マウスIL-28プラスミド、マウスIFN-αプラスミド、およびN末端に20kDメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが結合したヒトIL-29 C172Sポリペプチドを注射したマウスがインビボでRENCA腫瘍の増殖を抑制することを示す。プラスミドの注射は第5日および第12日に行った。タンパク質は、第5〜21の間一日おきに与えた。
【図３】N末端に20kDメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが結合したヒトIL-29 C172SポリペプチドおよびN末端に20kDメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが結合したヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド1μg、5μg、および25μgがインビボでRENCA腫瘍の増殖を抑制することを示す。全てのタンパク質は、第5〜23日の間一日おきに与えた。
【図４】媒体(■)、N末端に20kDメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが結合したヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド5μg(▼)およびN末端に20kDメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが結合したヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド25μg(◆)を腫瘍の容積が100mm3に達してから20日の間一日おきに注射したマウス、N末端に20kDメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが結合したヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド5μg(●)を腫瘍の容積が100mm3に達してから20日の間毎日注射したマウス、ならびにN末端に20kDメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが結合したヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド5μgを腫瘍を注射した第5日から始まる20日の間一日おきに予防的に投与したマウス(▲)を示す。
【図５】図5Aは、N末端に20kDメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが結合したヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド25μgまたは媒体の注射を第0日に始め、その後一日おきに10回腹腔内注射したマウスが、E.G7胸腺腫モデルのマウスの生存を延ばすことを示す。図5Bは、N末端に20kDメトキシ-ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが結合したヒトIL-29 C172S d2-7ポリペプチド25μgまたは媒体の注射を第0日に始め、その後一日おきに10回腹腔内注射したマウスが、E.G7胸腺腫モデルにおける腫瘍の増殖を抑制することを示す。
【図６】PEG-mIL-28の予防的投与がRR-EAEモデルにおける疾患重症度および発症率を抑制することを示す。
【図７】PEG-mIL-28の予防的投与がRR-EAEマウスにおける臨床的疾患の発症率を有意に減少することを示す。
【図８】PEG-rIL-29の予防的投与がRR-EAEマウスモデルにおける疾患重症度および発症率を抑制することを示す。
【図９】PEG-rIL-29の予防的投与がRR-EAEマウスにおける臨床的疾患の発症率を有意に減少することを示す。
【図１０】PEG-mIL-28の治療的投与がRR-EAEモデルにおける疾患重症度を有意に抑制することを示す。
【図１１】PEG-mIL-28の治療的投与がRR-EAEモデルにおける臨床的重症度を減少することを示す。研究期間中の総臨床スコアの平均値を示す。
【図１２】PEG-mIL-28の治療的投与がRR-EAEモデルにおける完全寛解マウスの割合を増加することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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