(57)【要約】  本発明は、未切断NS2/3の存在下でNS2/3切断産物NS2またはNS3を検出するための新規アッセイを提供する。NS2/3が自己切断されてNS2およびNS3切断産物が生じた後、未切断NS2/3の存在下でNS2またはNS3切断産物を特異的に認識するリガンドと共に試料をインキュベートする。NS2/3を含有する試料中でNS2/3自己切断産物を検出し、それによって、検出されたNS2またはNS3に結合したリガンドの量をNS2/3自己切断活性と関連付ける方法が提供される。本方法はまた、HCV感染の潜在的治療薬としての候補NS2/3阻害化合物をスクリーニングするためのアッセイとして有用である。本発明はまた、未切断NS2/3および他の切断産物に対して最小の交差反応性を示す切断NS2産物または切断NS3産物の1つを選択的に認識する抗体を提供する。
2009520465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
NS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS2/3自己切断産物を検出するための方法であって、
a)NS2/3プロテアーゼの少なくとも一部が自己切断されて切断NS2およびNS3産物を生じる適切な条件に前記試料を供すること;
b)前記NS2およびNS3産物を、NS2/3に優先してNS2またはNS3産物のいずれか1つに選択的に結合できるリガンドと共に、前記リガンドがNS2またはNS3に結合するのに適した条件下でインキュベートすること;および、
c)ステップb)において生成されたNS2またはNS3に結合したリガンドを検出すること、
を含み、
検出された結合したリガンドの量がNS2/3自己切断活性と関連づけられる、前記方法。
【請求項２】
自己切断を阻害するためにNS2/3試料中にLDAOが最初に存在する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
LDAOが少なくとも約1%の濃度で存在する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
ステップa)において、LDAO濃度が少なくとも約1.5倍低下するように試料が希釈され、活性化剤の存在下で前記試料がインキュベートされて自己切断が誘導される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
活性化剤がCHAPS、トリトンX-100、NP-40およびn-ドデシル-β-D-マルトシド(DM)からなる群から選択される界面活性剤である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
活性化剤として作用する界面活性剤がそのCMCを超えて存在する、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ステップa)において、自己切断を促進するためにグリセロールをさらに含む溶液中でプロテアーゼがインキュベートされる、請求項6記載の方法。
【請求項８】
グリセロールが約20%の濃度で存在する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ステップb)において、リガンドが抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
抗体がNS2切断産物に特異的なアミノ酸配列に対する抗体であり、前記抗体がNS3切断産物および未切断NS2/3に対して交差反応性を示さないかまたは低い交差反応性を示す点で選択的である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
NS2選択的抗体が、
Ser-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu-Leu[配列番号6];
Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu-Leu[配列番号8];
Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu[配列番号9];
Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg[配列番号10];
Pro-Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp[配列番号11];
Gly-Pro-Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly[配列番号12];および
Ser-Ala-Arg-Arg-Gly-Arg-Glu-Ile-Leu-Leu[配列番号13]
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
抗体がNS3切断産物に特異的なアミノ酸配列に対する抗体であり、前記抗体がNS2切断産物および未切断NS2/3に対して交差反応性を示さないかまたは低い交差反応性を示す点で選択的である、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
NS3選択的抗体が、
Ala-Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr[配列番号5];
Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr[配列番号14];
Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr-Arg[配列番号15];
Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr-Arg-Gly[配列番号16];および
Arg-Gly-Leu-Leu-Gly-Cys-Ile-Ile-Thr-Ser[配列番号17]
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
抗体がアミノ酸配列:APITAYSQQT[配列番号5]を含むペプチドに対するものである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
抗体がK147ウサギポリクローナル抗体である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
抗体が検出可能な標識を用いて検出される、請求項9記載の方法。
【請求項１８】
検出可能な標識が蛍光標識、化学発光標識、比色標識、酵素マーカーおよび放射性同位体からなる群から選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
検出可能な標識がユーロピウムである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
検出可能な標識が抗体に直接に結合されている、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
検出可能な標識が、NS2またはNS3選択的抗体に対する抗体に結合している、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
K147抗体が、検出可能な標識に結合した抗ウサギ抗体を用いて検出される、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
約1%のLDAOの存在下、NS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS3産物を検出するための方法であって、
a)活性化剤の存在下で前記試料を希釈して前記NS2/3プロテアーゼの少なくとも一部が自己切断されて切断NS2およびNS3産物を生じるのを可能にすること;
a’)前記試料をさらに希釈して自己切断を停止させること;
a”)ステップa’)からのNS3産物を固定化すること;
b)NS2切断産物および未切断NS2/3に対して交差反応性を示さないかまたは低い交差反応性を示すNS3選択的抗体と共にステップa”)の固定化したNS3産物をインキュベートすること;
c)ステップb)において生成された固定化したNS3に結合した抗体を検出すること、
を含み、
検出された抗体の量がNS2/3自己切断活性と関連づけられる、前記方法。
【請求項２４】
ステップa’)およびa”)が順次または逆順または同時に同一ステップで行うことができ、ステップa’)における試料の希釈が固定化試料を洗浄することにより行うことができる、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
抗体が、アミノ酸配列:APITAYSQQT[配列番号5]を含むペプチドに対するものである、請求項23の方法。
【請求項２６】
抗体がユーロピウムで標識されている、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
抗体がK147ウサギポリクローナル抗体であり、ユーロピウムで標識された抗ウサギ抗体を用いて検出される、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
NS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS2/3切断阻害活性について候補化合物をスクリーニングするためのアッセイであって、
a)候補化合物の非存在下で、NS2/3プロテアーゼを含む第1の試料を、NS2/3の少なくとも一部が自己切断されて切断NS2およびNS3産物を生じる適切な条件に供すること;
b)候補化合物の存在下で、NS2/3プロテアーゼを含む第2の試料をステップa)と同じ条件に供すること;
c)前記第1および第2の試料を、NS2/3に優先してNS2またはNS3産物のいずれか1つに選択的に結合するリガンドと共に、前記リガンドがNS2またはNS3に結合するのに適した条件下でインキュベートすること;
d)ステップc)において生成された第2の試料および第1の試料に結合したリガンドの量を測定することを含み、
第1の試料中のリガンドの量と比較した第2の試料中のリガンドの量の減少により、前記候補化合物がNS2/3自己切断活性の阻害因子であり得ることが示される、前記アッセイ。
【請求項２９】
自己切断を阻害するためにNS2/3試料中にLDAOが最初に存在する、請求項28記載のアッセイ。
【請求項３０】
LDAOが約1%の濃度で存在する、請求項29記載のアッセイ。
【請求項３１】
ステップa)において、LDAO濃度が少なくとも約1.5倍低下するように試料が希釈され、前記試料が活性化剤の存在下でインキュベートされて自己切断が誘導される、請求項28記載のアッセイ。
【請求項３２】
活性化剤がCHAPS、トリトンX-100、NP-40およびn-ドデシル-β-D-マルトシド(DM)からなる群から選択される界面活性剤である、請求項31記載のアッセイ。
【請求項３３】
活性化剤として作用する界面活性剤がそのCMCを超えて存在する、請求項32記載のアッセイ。
【請求項３４】
ステップa)において、自己切断を促進するためにグリセロールをさらに含む溶液中でプロテアーゼをインキュベートする、請求項33記載のアッセイ。
【請求項３５】
グリセロールが約20%の濃度で存在する、請求項34記載のアッセイ。
【請求項３６】
ステップb)において、リガンドが抗体である、請求項28記載のアッセイ。
【請求項３７】
抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項36記載のアッセイ。
【請求項３８】
抗体がNS2切断産物に特異的なアミノ酸配列に対する抗体であり、前記抗体がNS3切断産物および未切断NS2/3に対して交差反応性を示さないかまたは低い交差反応性を示す点で選択的である、請求項37記載のアッセイ。
【請求項３９】
NS2選択的抗体が、
Ser-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu-Leu[配列番号6];
Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu-Leu[配列番号8];
Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu[配列番号9];
Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg[配列番号10];
Pro-Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp[配列番号11];
Gly-Pro-Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly[配列番号12];および
Ser-Ala-Arg-Arg-Gly-Arg-Glu-Ile-Leu-Leu[配列番号13]
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体である、請求項38記載のアッセイ。
【請求項４０】
抗体がNS3切断産物に特異的なアミノ酸配列に対する抗体であり、前記抗体がNS2切断産物および未切断NS2/3に対して交差反応性を示さないかまたは低い交差反応性を示す点で選択的である、請求項37記載のアッセイ。
【請求項４１】
NS3選択的抗体が、
Ala-Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr[配列番号5];
Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr[配列番号14];
Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr-Arg[配列番号15];
Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr-Arg-Gly[配列番号16];および
Arg-Gly-Leu-Leu-Gly-Cys-Ile-Ile-Thr-Ser[配列番号17]
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体である、請求項40記載のアッセイ。
【請求項４２】
抗体がアミノ酸配列:APITAYSQQT[配列番号5]を含むペプチドに対するものである、請求項41記載のアッセイ。
【請求項４３】
抗体がK147ウサギポリクローナル抗体である、請求項42記載のアッセイ。
【請求項４４】
抗体が検出可能な標識を用いて検出される、請求項36記載のアッセイ。
【請求項４５】
検出可能な標識が蛍光標識、化学発光標識、比色標識、酵素マーカーおよび放射性同位体からなる群から選択される、請求項44記載のアッセイ。
【請求項４６】
検出可能な標識がユーロピウムである、請求項45記載のアッセイ。
【請求項４７】
検出可能な標識が抗体に直接に結合している、請求項44記載のアッセイ。
【請求項４８】
検出可能な標識が、NS2またはNS3選択的抗体に対する抗体に結合している、請求項44記載のアッセイ。
【請求項４９】
K147抗体が、検出可能な標識に結合している抗ウサギ抗体を用いて検出される、請求項43記載のアッセイ。
【請求項５０】
約1%のLDAOの存在下、NS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS2/3切断阻害活性候補化合物スクリーニングするためのアッセイであって、
a)候補化合物の非存在下、活性化剤の存在下でNS2/3プロテアーゼを含む第1の試料を希釈してNS2/3の少なくとも一部が切断されて切断NS2およびNS3産物が生じるのを可能にすること;
a’)前記第1の試料中のプロテアーゼをさらに希釈して自己切断を停止させること;
a”)ステップa’)におけるNS3産物を固定化すること;
b)候補化合物の存在下、NS2/3プロテアーゼを含む第2の試料をステップa)と同じ条件に供すること;
b’)前記第2の試料中のプロテアーゼを希釈してステップa’)と同じ条件を達成すること;
b”)もしあれば、ステップb’)によるNS3産物を固定化すること;
c)検出可能なマーカーで直接または間接に標識されたNS3選択的抗体と共にステップa”)における固定化したNS3をインキュベートすること、ここで前記抗体はNS2/3に優先してNS3に選択的に結合するものであり;
c’)ステップc)におけると同じ抗体と共にステップb”)の固定化したNS3をインキュベートすること;
d)ステップc)およびc’)のそれぞれにおいて固定化された標識抗体の量を測定すること、
を含み、
ステップc)における固定化された標識抗体の量と比較したステップc’)において固定化された標識抗体の量の減少により、前記候補化合物がNS2/3自己切断活性の阻害因子であり得ることが示されるアッセイ。
【請求項５１】
ステップa’)およびa”)が順次または逆順または同時に同一ステップで行うことができ、ステップa’)における試料の希釈が固定化試料を洗浄することにより行うことができる、請求項50記載のアッセイ。
【請求項５２】
抗体がペプチドAPITAYSQQT[配列番号5]に対するものである、請求項50記載のアッセイ。
【請求項５３】
抗体がユーロピウムで標識されている、請求項52記載のアッセイ。
【請求項５４】
抗体がK147ウサギポリクローナル抗体であり、ユーロピウムで標識されている抗ウサギ抗体を用いて検出される、請求項52記載のアッセイ。
【請求項５５】
NS3切断産物に特異的なアミノ酸配列に対する抗体であって、NS2切断産物および未切断NS2/3に対して交差反応性を示さないかまたは低い交差反応性を示す前記抗体。
【請求項５６】
抗体がNS2産物および未切断NS2/3に対するよりもNS3切断産物に対して少なくとも約2倍高いシグナルを生じる、請求項55記載の抗体。
【請求項５７】
NS3選択的抗体が、
Ala-Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr[配列番号5];
Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr[配列番号14];
Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr-Arg[配列番号15];
Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr-Arg-Gly[配列番号16];および
Arg-Gly-Leu-Leu-Gly-Cys-Ile-Ile-Thr-Ser[配列番号17]
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体である、請求項55記載の抗体。
【請求項５８】
抗体がペプチドAPITAYSQQT[配列番号5]に対するものである、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
抗体がK147ポリクローナル抗体である、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
NS2切断産物に特異的なアミノ酸配列に対する抗体であって、NS3切断産物および未切断NS2/3に対して交差反応性を示さないかまたは低い交差反応性を示す前記抗体。
【請求項６１】
抗体がNS3産物および未切断NS2/3に対するよりもNS2切断産物に対して少なくとも約2倍高いシグナルを生じる、請求項60記載の抗体。
【請求項６２】
NS2選択的抗体が、
Ser-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu-Leu[配列番号6];
Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu-Leu[配列番号8];
Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu[配列番号9];
Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg[配列番号10];
Pro-Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp[配列番号11];
Gly-Pro-Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly[配列番号12];および
Ser-Ala-Arg-Arg-Gly-Arg-Glu-Ile-Leu-Leu[配列番号13]
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体である、請求項60記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のHCVタンパク質の切断を検出するためのアッセイに関し、より具体的には、HCV NS2/3自己切断活性を選択的に検出するアッセイに関し、さらにより具体的には、潜在的HCV阻害化合物の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎ウイルス(HCV)は、世界中に分布する、輸血後および市中の非A非B肝炎の主要な病原体である。キャリアは高率に慢性感染に移行し、多くは慢性肝疾患であるいわゆる慢性C型肝炎に移行する。この群は、重篤な肝疾患、例えば肝硬変、肝細胞癌および死に至る末期肝疾患などになる危険性も大きい。
【０００３】
HCVは、フラビウイルス科(Flaviviridae)のエンベローププラス鎖RNAウイルスである。一本鎖HCV RNAゲノムは正の極性を有し、長さおおよそ9600ヌクレオチドの1つのオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、これはおおよそ3010アミノ酸の線状ポリタンパク質をコードする。感染細胞内で、このポリタンパク質は、細胞性およびウイルス性プロテアーゼにより複数の部位で切断されて構造タンパク質および非構造(NS)タンパク質を生じる。構造タンパク質(C、E1、E2およびp7)はウイルス粒子を構成するポリペプチドを含む。構造タンパク質のプロセシングは宿主細胞のプロテアーゼにより引き起こされる。非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)は、HCV RNAゲノムの複製を触媒し調節する酵素またはアクセサリーファクターをコードする。成熟非構造タンパク質の生成はウイルスによりコードされる2つのプロテアーゼにより触媒される。第1のプロテアーゼは、NS2とNS3との間の切断を自己触媒するNS2/3プロテアーゼである。NS3はN末端セリンプロテアーゼドメインを含有し、ポリタンパク質からの残りの切断を触媒する。遊離されるNS4Aタンパク質は少なくとも2つの役割を有する。第1の役割は、NS3タンパク質との安定な複合体を形成してNS3/NS4A複合体の膜局在化を助けることであり;第2の役割は、NS3プロテアーゼ活性の補助因子として作用することである。この膜結合型複合体はまた、ポリタンパク質の残りの部位の切断を触媒し、それによりNS4B、NS5AおよびNS5Bの遊離をもたらす。
【０００４】
C型肝炎ウイルス(HCV)ポリタンパク質の、非構造タンパク質であるNS2とNS3との間の切断は、切断部位の両側に位置するNS2領域および最小NS3プロテアーゼドメインによりコードされるプロテアーゼ活性であるNS2/3プロテアーゼにより媒介される。NS2/3プロテアーゼはウイルスに感染した肝細胞で発現され、ウイルス増殖および疾患におけるその重要な役割と実験データは矛盾しない。実際、チンパンジーにおいて、NS2/3プロテアーゼ活性を破壊する変異を有するHCVクローンの接種により増殖感染は観察されなかったが、このことは、HCVによりコードされるこの酵素がin vivoでの増殖複製に必須であることを示唆している(文献1)。
【０００５】
NS2/3プロテアーゼの最小触媒領域は同定されており、NS2のC末端およびN末端NS3プロテアーゼドメインを含む(2-5)。既述のように、HCV遺伝子型1bのNS2/3(904-1206)変種を大腸菌封入体から精製し、ゲル濾過クロマトグラフィーによりリフォールディングさせた(2,3)。精製されたNS2/3の不活性型(904-1206)は、グリセロールおよび界面活性剤を添加して活性化することができ、予測された部位であるロイシン1026とアラニン1027残基間の自己切断を誘導することができる(2,3)。
【０００６】
SDS-PAGEおよびHPLCによるNS2/3前駆体からのNS2およびNS3産物の分離に基づくNS2/3プロテアーゼ切断検出アッセイが報告されているのに加えて、NS2/3タンパク質のNS3プロテアーゼ活性に基づくアッセイもまた報告されているが、この場合も同様にNS3プロテアーゼ産物からのNS2/3未切断前駆体の分離を必要とする(2-5)。このような方法は時間がかかる恐れがあり、迅速なスクリーニングには適していない。さらに、未切断NS2/3の存在下でNS2/3切断産物を検出する選択性を有するアッセイは未だ開発されていない。
【発明の開示】
【０００７】
このように、現行のアッセイの不都合の1以上を克服する効率的なNS2/3切断アッセイを開発することが望ましい。
試料中でのNS2/3プロテアーゼの切断および、その中での切断産物NS2またはNS3の検出を可能にする切断試料の処理を含む新規選択的アッセイ法が提供される。
【０００８】
発明の概要
本発明はNS2/3切断検出のための新規アッセイを提供する。より具体的には、本発明は、未切断NS2/3の存在下でNS2/3切断産物NS2またはNS3を検出するための新規アッセイを提供する。
本発明において、NS2/3が自己切断されてNS2およびNS3切断産物が生じた後、未切断NS2/3の存在下でNS2またはNS3切断産物を特異的に認識するリガンドと共に試料をインキュベートする。
本発明の第1の側面において、リフォールディングした不活性なNS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS2/3自己切断産物を検出する方法が提供される。前記方法は、
a)前記NS2/3プロテアーゼの少なくとも一部が自己切断されて切断NS2およびNS3産物を生じる適切な条件に前記試料を供すること;
b)前記NS2およびNS3産物を NS2/3に優先してNS2またはNS3産物のいずれか1つに選択的に結合できるリガンドと共に、前記リガンドがNS2またはNS3に結合するのに適した条件下でインキュベートすること;および、
c)ステップb)において生成されたNS2またはNS3に結合したリガンドを検出すること、
を含み、
それによって、検出された結合したリガンドの量がNS2/3自己切断活性と関連付けられる。
【０００９】
本方法はまた、候補NS2/3阻害化合物をスクリーニングするためのアッセイとしても有用である。
第2の側面は、リフォールディングした不活性なNS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS2/3切断阻害活性候補化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。前記アッセイは、
a)候補化合物の非存在下で、NS2/3プロテアーゼを含む第1の試料を、NS2/3の少なくとも一部が自己切断されて切断NS2およびNS3産物を生じる適切な条件に供すること;
b)候補化合物の存在下で、NS2/3プロテアーゼを含む第2の試料をステップa)と同じ条件に供すること;
c)前記第1および第2の試料を、NS2/3に優先してNS2またはNS3産物のいずれか1つに選択的に結合するリガンドと共に、前記リガンドがNS2またはNS3に結合させるのに適した条件下でインキュベートすること;および、
d)ステップc)において生成された第2の試料および第1の試料に結合したリガンドの量を測定すること、
を含み、
それによって、第1の試料中のリガンドの量と比較した第2の試料中のリガンドの量の減少により、前記候補化合物がNS2/3自己切断活性の阻害因子であることができることが示される。
【００１０】
本発明のさらなる側面は、未切断NS2/3および他の切断産物に対して最小の交差反応性を示す、NS2切断産物またはNS3切断産物の1つを選択的に認識するリガンドに関する。特に、本発明は、未切断NS2/3およびNS2切断産物に対して最小の交差反応性を示す切断NS3産物を選択的に認識する抗体を提供する。あるいはまた、本発明は、未切断NS2/3およびNS3切断産物に対して最小の交差反応性を示す切断NS2産物を選択的に認識する抗体を提供する。
【００１１】
当業者には明らかなように、HCV NS2/3プロテアーゼに類似または相同な自己切断性プロテアーゼの他のタイプを、それぞれの阻害因子の探索において本発明の方法/アッセイに使用できる。このような他のプロテアーゼは、ペスチウイルス、例えば限定するものではないが:GBウイルスA、B、またはC;牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV);豚コレラウイルス;ボーダー病ウイルス;牛ペスチウイルス;および豚ペスチウイルスなどにおいて見いだすことができる。
本明細書において、本発明のこれらおよび他の側面は、添付の図面を参照して説明される。
【００１２】
発明の詳細な説明
定義
特記しない限り、本明細書に用いるすべての学術用語は、本発明に関連する当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、タンパク質精製、分子生物学的方法などのための手順には、当該技術分野で用いられる通常の方法を用いる。このような技術は、リファレンスマニュアル、例えば、Sambrookら(2001, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press); Ausubelら(1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York) および Coliganら(1995, Current Protocols in Protein Science, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc., New York)中に見いだすことができる。
本明細書において、ヌクレオチド配列は、当該技術分野で一般的に用いられる、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (Biochemistry, 1972, 11:1726-1732) の推奨による1文字のヌクレオチド記号を用い、5’から3’の方向へ左から右に一本鎖により示される。本明細書において、示されるすべての値および濃度は、生物科学において許容される±10%の誤差の範囲内の固有の変動を示す。用語“約”もこの許容される変動を指す。
【００１３】
NS2/3プロテアーゼ
本明細書において同義で使用される用語“NS2/3”、“NS2/3タンパク質”、“NS2/3プロテアーゼ”または“未切断NS2/3プロテアーゼ”は、NS3ドメイン(1027-1615)からのNS2ドメイン(810-1026)の切断を触媒するC型肝炎ウイルス(HCV全遺伝子型)ポリタンパク質の領域ならびにその機能的に等価な変種を指す。本明細書記載の一実施形態において、本明細書において810*-1206[配列番号1;*アミノ酸810は配列番号1のアミノ酸1に対応する]と呼ぶ、ポリタンパク質(遺伝子型1a H77の配列(GenBankアクセッション番号AAB67036)に従って番号付けした)の天然NS2領域(具体的にはアミノ酸810-1026)および最小NS3プロテアーゼドメイン(1027-1206)によりそれはコードされる。
NS2/3プロテアーゼの機能的に等価な変種は、用語“NS2/3”、“NS2/3タンパク質”、“NS2/3プロテアーゼ”または“未切断NS2/3”に包含されるが、機能的に等価とは、他のHCV分離株/遺伝子型からの変種などの、NS2/3の切断を触媒することができる変種のことを言う。用語“変種”はまた、天然NS2/3由来ではあるが、1以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換または修飾により配列が改変されたタンパク質をも指す。アミノ酸置換に関しては、これらは一般に、当業者には明らかなように、タンパク質のNS2/3機能に影響を与えない保存的アミノ酸置換を含む。これはまた、修飾アミノ酸、例えば修飾側鎖を含むアミノ酸もまた含む。
【００１４】
さらにまた、“機能的に等価な変種”は、NS2のC末端(ポリタンパク質のおよそのアミノ酸位置907から開始)およびNS3のN末端(アミノ酸位置1206まで)を含むと決定されている(5)NS2/3プロテアーゼの最小触媒領域を含む短縮体を指す。従って、“NS2/3フラグメント”と称するこれらのアミノ酸欠失を含むNS2/3短縮体は、本発明記載の変種の例、例えば(907-1206;配列番号2)または(904-1206;配列番号3)などである。さらに、NS2/3の天然配列(810-1615または810-1206)の間の任意の数のアミノ酸欠失を含むNS2/3欠失変異体および短縮型NS2/3(907-1206)もまた本発明記載の変種であると考えられる。他の変種も同様に当該技術分野で公知であり、例えばWO01/68818(5)、WO02/48375とUS6,815,159(2)に記載されているものが知られている。
当該技術分野で公知のように、用語“変種”は、抽出/精製または検出/測定を容易にするための、アフィニティタグまたは検出可能な標識を付すなどのタンパク質への修飾もまた含む。同様に、置換または挿入、例えば溶解性を増すためのアミノ酸(単数または複数)(例えばリジン)の付加などもまた用語“変種”に含まれる。このような変種の1例は(Lys4-His6-904-1206-Strep Tag-Lys4)[配列番号4]である。
本発明記載のアッセイにNS2/3プロテアーゼの機能的に等価な変種が用いられる場合、修飾タンパク質がNS2/3自己切断活性を保持することを確認する必要がある。このことは、標準的な切断アッセイ、例えば本明細書に記載の文献2-5に記載のアッセイを用いて行うことができる。
用語“NS2/3プロテアーゼの少なくとも一部が切断される”は、アッセイ混合物中に存在するNS2/3プロテアーゼの総量の少なくとも一部が1026-1027切断部位で切断されることを意味する。
【００１５】
NS2産物
本明細書において、用語“NS2産物”は、NS2/3プロテアーゼから切断または遊離されるNS2ドメインを指す。NS2産物は天然NS2と一致するものであってもよく、機能的に同等のその変種でもあり得る。本明細書記載の構築物における一実施形態において、天然NS2はアミノ酸810-1026[配列番号1の1-217]で表される。しかしながら、本発明記載のNS2産物は、前述のとおり、1以上のアミノ酸の挿入、欠失、修飾、置換により改変されたものであり得ることは当業者には明らかであろう。このような改変は、本アッセイにおいて用いられるNS2/3プロテアーゼのNS2部分に存在する改変と一致すると考えられる。本明細書において、用語“NS2産物”は用語“NS2”または“切断NS2産物”と同義で用いられる。
従って、例えば配列番号2からのフラグメント907-1026または配列番号3からのフラグメント904-1026などの“NS2フラグメント”と呼ぶアミノ酸欠失を含むNS2短縮体は、本発明記載の変種の例である。さらに、天然配列のNS2(810-1026)と短縮型NS2(907-1026)との間の任意の数のアミノ酸欠失を含むNS2欠失変異体もまた本発明記載の変種であると考えられる。
【００１６】
NS3産物
本明細書において、用語“NS3プロテアーゼ産物”は、NS2/3プロテアーゼから切断または遊離されるNS3プロテアーゼドメインを指す。NS3産物は、天然NS3(1027-1615)、NS3プロテアーゼドメイン(1027-1206)と一致するものであってもよく、あるいは機能的に同等のその変種、すなわちNS3プロテアーゼ活性を保持する変種でもあり得る。NS3産物はまた、NS3プロテアーゼ活性を欠く非機能性変種(例えばS1165A変異体)に対応するものでもあり得る。本明細書記載の構築物における一実施形態において、NS3プロテアーゼドメインはアミノ酸1027-1206[配列番号1の218-397]で表される。しかしながら、本発明記載のNS3プロテアーゼ産物は、前述のとおり1以上のアミノ酸の挿入、欠失、修飾、置換により改変されたものであり得ることは当業者には明らかであろう。このような改変は、本アッセイにおいて用いられるNS2/3プロテアーゼのNS3ドメインに存在する改変と一致すると考えられる。本明細書において、用語“NS3プロテアーゼ産物”は用語“NS3産物”、“NS3プロテアーゼ”または“切断NS3産物”と同義で用いられる。
従って、フラグメント1027-1187からフラグメント1027-1205までなどの"NS3フラグメント”と呼ぶアミノ酸欠失を含むNS3短縮体は、本発明記載の変種[NS2/3自己切断を可能とする長さであるが、NS3プロテアーゼ活性を必要としないNS3フラグメント]の例である。さらに、NS3の天然配列(1027-1206)と1027-1187から1027-1205)までのNS3の各短縮体の間の任意の数のアミノ酸欠失を含むNS3欠失変異体(活性NS2/3プロテアーゼに変換される場合)もまた本発明記載の変種であると考えられる。
本発明の他の有用なタンパク質、酵素または産物には、物理的分離にかけることなく反応容器中での単離/分離を容易にし、容易に他の容器に移すことができるようにアフィニティタグに結合されているものがある。
【００１７】
アフィニティタグ
本明細書において、用語“アフィニティ標識”または“アフィニティタグ”は、受容体(または相補的リガンド)に対するその親和性を、リガンドが共有結合している化合物を抽出(例えば溶液から)または選択的に捕捉するために使用できるリガンドを意味する。アフィニティタグは、組換えタンパク質の検出および精製を容易にするために開発された不可欠なツールである。アフィニティタグは2つのカテゴリー:1)固体担体に結合した小分子リガンドに結合するペプチドまたはタンパク質融合体を用いるアフィニティタグ(固定化したニッケルなどの遷移金属へのヘキサヒスチジンタグ結合またはグルタチオンへのGST結合);2)または固定化したタンパク質結合パートナー(抗体を含む)、例えばFLAGタグ、カルモジュリン結合ペプチド、Strep-tagまたはStrep-tag IIおよびビオチン受容体ペプチドへのペプチドタグ結合、などに分類することができる。アフィニティタグ/アフィニティリガンドの組の例は、限定するものではないが、マルトース結合タンパク質(MBP)/マルトース;グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)/グルタチオン;ヒスチジン(His)/金属;アビジン/ビオチン;Strep tag/ストレプトアビジンまたはニュートラビジン（neutravidin）を含む。アフィニティリガンドとして使用される金属は、コバルト、亜鉛、銅、鉄およびニッケルからなる群から選択されることができる。アフィニティ標識はタンパク質のN末端、C末端または中央に位置することができるが、特にタンパク質のN末端に位置することができる。特に、選択される金属はニッケルである。アフィニティークロマトグラフィーによる分離を容易にするために、アフィニティリガンドをカラム内に配置することができる。参考として、最近総説が公表されている(6)。
【００１８】
特異的リガンド
本明細書において、用語“特異的リガンド”、“選択的リガンド”、“指向性リガンド”または“優先的リガンド”は、特異的に他の標的分子に結合する任意の分子を意味する。本発明においては、NS2またはNS3産物に結合するリガンドは、NS2またはNS3タンパク質の特異的部分(ペプチド)に対して惹起された抗体であり得る。前記抗体は、同じ反応容器中に存在する他の分子、すなわち未切断NS2/3プロテアーゼおよび他の切断産物に対して最小の交差反応性を示す。
【００１９】
本明細書において、用語“抗体”は、特異的アミノ酸配列を有し、それにより抗体がリンパ系の細胞内で抗体の合成を誘導した抗原またはそれに密接に関連した抗原と選択的に相互作用する免疫グロブリン分子を意味する。このような抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができ、後者は単一の産生クローンから製造される。
特に、本明細書において同義で用いられる用語“特異的抗体”、“選択的抗体”、“指向性抗体”または“優先的抗体”は、抗体が他の切断産物および未切断NS2/3に対するよりもその標的に対して少なくとも約2倍高いシグナル(すなわちシグナルウィンドウ)を生じることを意味する。より具体的には、選択的抗体は約5倍以上のシグナルウィンドウを生じる。最も具体的には、選択的抗体は約15倍以上のシグナルウィンドウを生じる。
本発明の他の有用なリガンドは、検出および測定を容易にするために検出可能な標識に結合されているリガンドである。
【００２０】
検出可能な標識
本明細書において、用語“標識"、“検出可能な標識”または”検出可能なマーカー”は、得られたリガンド結合分子を直接または間接に認識して、それを検出、測定および定量できることを可能にするために、特異的リガンドに結合し得る任意の基を指す。このような“標識”の例は、限定するものではないが、蛍光標識、化学発光標識、比色標識、酵素マーカー、放射性同位体およびアフィニティタグ(ビオチンなど)を含む。このような標識は、公知の方法によりペプチドまたは抗体に結合される。本発明の標識または多重標識は、ペプチドの任意の位置に導入することができる。例えば、標識は、その特異的標的分子を認識するその機能特性を阻害しない限り、ペプチドまたは抗体のC末端もしくはN末端のいずれかあるいは内部に位置することができる。
【００２１】
実用的で有用な検出可能な標識には、放射性標識、例えば125I、蛍光標識、例えばフルオレセインもしくはランタニド錯体(すなわちEu+3)または比色標識、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはβ-ガラクトシダーゼおよびそれらのそれぞれの基質がある。このような他の検出可能な標識は、Invitrogen- Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technology, 10th ed. 2005 またはA guide to HTS Assay Development, D&MD publications ed. April 2004 (およびその中の引用文献)中に見いだすことができる。
【００２２】
本明細書において、用語“界面活性剤”は、極性および非極性ドメインを有する両性の界面活性分子を意味する。界面活性剤は疎水性分子または分子ドメインに強く結合して水溶性を与える。界面活性剤の例は、限定するものではないが、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、脂肪酸塩、トリトン(Triton)(登録商標)類、オクチルグリコシド、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチル-アンモニオ]-1-プロパンスルホナート(CHAPS)、ドデシルマルトシドナトリウム(DM)、ラウリルジエチルアミンオキシド(LDAO)、NP-40およびツイーン(Tween)(登録商標)類を含む。
【００２３】
本明細書において、用語“阻害する”または“阻害因子”は、NS2/3プロテアーゼに関連して用いるとき、自己切断するプロテアーゼの能力が抑制されることを意味するものとする。NS2/3プロテアーゼを阻害することができる薬剤またはリガンド(以後潜在的“阻害因子”と呼ぶ)は、細胞集団におけるHCV感染を調節するのに有用であることができ、従って、細胞内のHCVの存在を特徴とする病態の治療薬として有用であることができる。
【００２４】
好ましい実施形態
本発明の特定の実施形態において、NS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS3産物を検出する方法が提供される。前記方法は、
a)NS2/3プロテアーゼの少なくとも一部が切断されて切断NS2およびNS3産物を生じる適切な条件に前記試料を供すること;
a’)前記試料中のプロテアーゼを希釈して、自己切断を停止させるのに適切な条件を達成すること;
a”)ステップa’)におけるNS3産物を固定化すること;
b)検出可能なマーカーで直接または間接に標識されたリガンドと共にステップa”)の固定化したNS3産物をインキュベートすること、ここで前記リガンドはNS2/3に優先してNS3に選択的に結合するものであり; 
c)ステップb)において生成された固定化したNS3に結合したリガンドを検出すること、
を含み、
それによって、検出されるリガンドの量がNS2/3自己切断活性と関連付けられる。
【００２５】
本発明の他の実施形態において、NS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS2産物を検出する方法も提供される。前記方法は、
a)NS2/3プロテアーゼの少なくとも一部が切断されて切断NS2およびNS3産物を生じる適切な条件に前記試料を供すること;
a’)前記試料中のプロテアーゼを希釈して、自己切断を停止させるのに適切な条件を達成すること;
a”)ステップa’)におけるNS2産物を固定化すること;
b)検出可能なマーカーで直接または間接に標識されたリガンドと共にステップa”)の固定化したNS2産物をインキュベートすること、ここで前記リガンドはNS2/3に優先してNS2に選択的に結合するものであり; 
c)ステップb)において生成されたNS2に結合したリガンドを検出すること、
を含み、
それによって、検出されたリガンドの量がNS2/3自己切断活性と関連付けられる。
【００２６】
本発明の方法は、NS2/3阻害活性を有する候補医薬化合物を同定するためのスクリーニングアッセイとして有用である。従って、候補化合物がNS2/3自己切断に影響を及ぼすかどうかを決定するために、前記候補化合物の存在下または非存在下で本発明のアッセイを行うことができる。候補化合物の存在下において検出しうるNS2産物またはNS3産物が減少することは、NS2/3阻害の指標である。
【００２７】
同様に、本発明の他の側面において、NS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS2/3切断阻害活性候補化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供される。前記アッセイは、
a)候補化合物の非存在下、NS2/3の少なくとも一部が切断されて切断NS2およびNS3産物を生じる適切な条件にNS2/3プロテアーゼを含む第1の試料を供すること;
a’)前記第1の試料中のプロテアーゼを希釈して、自己切断を停止させるのに適切な条件を達成すること;
a”)ステップa’)におけるNS3産物を固定化すること;
b)候補化合物の存在下、NS2/3プロテアーゼを含む第2の試料をステップa)と同じ条件に供すること;
b’)前記第2の試料中のプロテアーゼを希釈して、自己切断を停止させるのに適切な条件を達成すること;
b”)もしあれば、ステップb’)におけるNS3産物を固定化すること;
c)検出可能なマーカーで直接または間接に標識されたリガンドと共にステップa”)において固定化したNS3をインキュベートすること、ここで前記リガンドはNS2/3に優先してNS3に選択的に結合するものであり; 
c’)検出可能なマーカーで直接または間接に標識されたリガンドと共にステップb”)において固定化したNS3をインキュベートすること、ここで前記リガンドはNS2/3に優先してNS3に選択的に結合するものであり; 
d)ステップc)およびc’)のそれぞれにおいて生成された、固定化された標識リガンドの量を測定すること、
を含み、
それによって、ステップc)と比較したステップc’)における固定化された標識リガンドの量の減少により、前記候補化合物がNS2/3切断活性の阻害因子であり得ることが示される。
【００２８】
同様に、本発明の他の側面において、NS2/3プロテアーゼを含有する試料中でNS2/3切断阻害活性候補化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供される。前記アッセイは、
a)候補化合物の非存在下、NS2/3の少なくとも一部が切断されて切断NS2およびNS3産物を生じる適切な条件にNS2/3プロテアーゼを含む第1の試料を供すること;
a’)前記第1の試料中のプロテアーゼを希釈して自己切断を停止させるのに適切な条件を達成すること;
a”)ステップa’)によるNS2産物を固定化すること;
b)候補化合物の存在下、NS2/3プロテアーゼを含む第2の試料をステップa)と同じ条件に供すること;
b’)前記第2の試料中のプロテアーゼを希釈して自己切断を停止させるのに適切な条件を達成すること;
b”)もしあれば、ステップb’)におけるNS2産物を固定化すること;
c)検出可能なマーカーで直接または間接に標識されたリガンドと共にステップa”)による固定化したNS2をインキュベートすること、ここで前記リガンドはNS2/3に優先してNS2に選択的に結合するものであり;
c’)検出可能なマーカーで直接または間接に標識されたリガンドと共にステップb”)の固定化したNS2をインキュベートすること、ここで前記リガンドはNS2/3に優先してNS2に選択的に結合するものであり;
d)ステップc)およびc’)のそれぞれにおいて生成された、固定化された標識リガンドの量を測定すること、
を含み、
ステップc)と比較したステップc’)における固定化された標識リガンドの量の減少により、候補化合物がNS2/3切断活性の阻害因子であり得ることが示される。
【００２９】
NS2/3プロテアーゼおよび変種
NS2/3プロテアーゼ810-1206[配列番号1]ばかりでなく、機能的に同等な変種もまた本発明の実施形態に使用できる。特に、本発明記載の変種の例は、(907-1206;配列番号2)または(904-1206;配列番号3)である。特に配列番号4のNS2/3変種(4K-6H-904-1206-ST-4K)は本発明のアッセイに使用される。
【００３０】
NS2/3自己切断アッセイ条件
本方法の第1のステップにおいて、NS2/3が切断されてNS2産物およびNS3産物を生じる条件に試料をさらす。活性化剤としての界面活性剤の使用を含むこのような条件は当該技術分野で公知(2-5、すべてが参照により本願に組み込まれる)であり、本明細書において適切な条件もまた例示されている。
リフォールディングしたNS2/3プロテアーゼの活性化には、界面活性剤をそれらの臨界ミセル濃度以上で使用することを必要とするが、界面活性剤には自己切断を促進しないものもある。同様に、界面活性剤のNS2/3自己切断活性に対する効果はグリセロールの存在下で促進される2)。以前報告されたNS2/3プロテアーゼ自己切断反応の濃度依存性(4)は、SDS-PAGE/ウェスタンブロット分析を用いて確認される。200nMを超える濃度で濃度依存性は観察されない(データは示さず)。自己切断に対するグリセロール、pHおよびDMSOの効果もまた評価される。20%または30%グリセロールを含有する緩衝液中で同様な切断キネティクスが観察される(データは示さず)。最後に、自己切断はpH7.5で最適であり、DMSOは0.5〜5%の濃度で活性に対して影響を示さない(データは示さず)。
【００３１】
具体的には、アッセイ開始前の自己切断を防ぐために、始めにNS2/3をLDAO溶液中に調製する。具体的には、自己切断を遮断するために、LDAO濃度は臨界ミセル濃度(CMC)を十分に上回っていなければならない。より具体的には、本アッセイ条件において、LDAOは溶液中に0.5〜1.5%存在しなければならないし、最も具体的には、約1%存在しなければならない。その後、NS2/3溶液はLDAOを含有しない溶液で希釈されて、自己切断を進行させるためのより低い濃度が達成される。
従って、自己切断反応は活性化剤の存在下でLDAO濃度を低下させることにより誘導され、活性化剤は、限定するものではないが、CHAPS、トリトンX-100、NP-40およびn-ドデシル-β-D-マルトシド(DM)からなる群から選択される界面活性剤である。典型的には、活性化剤として作用する界面活性剤はそのCMCを超えて存在する。
典型的には、自己切断を促進するために、グリセロールは、具体的には0%〜50%、より具体的には、20%〜50%、最も具体的には20%含有される。
ついで、第2の反応容器に反応試料のアリコートを移し、それにより自己切断反応混合物を希釈し、自己切断を停止させることによりNS2/3プロテアーゼ自己切断を停止させる。この移行は、1)NS2/3プロテアーゼ濃度を低下させ、2)活性化剤の量を希釈することにより自己切断を停止させるのに寄与する。
具体的な一実施形態において、50mM HEPES(pH7.5)、10%グリセロールおよび1mM TCEPを含有する緩衝液中に自己切断反応混合物を5倍希釈することにより反応を停止させる。
【００３２】
固定化
NS2産物、NS3産物および何らかの残存未切断NS2/3を含有する切断混合物を移す際に、切断混合物は希釈され(かつそれにより自己切断が停止され)ると同時に、検出のために好ましくは固定化の標準手段を用いて固定化される。一実施形態において、切断されてもタグを保持している切断NS2産物の固定化を容易にするために、NS2/3プロテアーゼ前駆体のNS2部分にタグをつける(残存未切断NS2/3もまた固定化される)。他の実施形態において、NS2/3プロテアーゼ前駆体のNS3部分にタグをつける。この場合、タグをつけたNS3が容易に結合する固定化表面に切断反応混合物を浸漬する。具体的には、測定される標識産物の測定を妨害せずに複数回洗浄することを容易にするために、対応するアフィニティ受容体を反応容器または固定化表面上にコーティングすることができる。
アフィニティタグ/アフィニティ受容体の好ましい組は、MBP/マルトース;GST/グルタチオン;His/Ni;Strep tag/ストレプトアビジンまたはneutravidinから選択される。
具体的には、NS2ドメインのN末端にヘキサヒスチジンタグでタグをつけ、反応容器をニッケルでコーティングする。好ましくは、NS3ドメインのC末端にStrep tagでタグをつけ、反応容器をストレプトアビジンまたはニュートラビジンでコーティングする。具体的には、反応は適切なアフィニティ受容体で前もってコーティングした96ウェルまたは384ウェルプレート中で起こる。あるいはまた、これらのプレートは販売元(すなわちPierce)から購入することもできる。
【００３３】
特異的リガンド
切断混合物(NS2またはNS3切断産物のいずれかおよび何らかの残存未切断NS2/3)が固定化されれば、特異的リガンドの優先的結合を可能にするための適切な条件下で、NS2/3に優先して切断NS2またはNS3を選択的に認識する特異的リガンドの適切な量とその混合物が合わされる。NS2産物またはNS3産物へのリガンドの優先的結合および未切断NS2/3プロテアーゼへの低い結合性が切断の正確な測定のために好ましい。
具体的には、前記特異的リガンドはNS2切断産物に対するものである。あるいはまた、前記リガンドはNS3切断産物に対するものである。当該技術分野で公知のように、本アッセイに用いられるNS2またはNS3選択的リガンドの量は、反応中生じうる切断NS2またはNS3のあり得る総量に基づいて決定できる。
【００３４】
具体的な側面において、前記特異的リガンドは抗体である。具体的には、前記抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。NS2優先的リガンドの例は、NS2に特異的なアミノ酸配列に対する抗体を含む。具体的には、抗体を生じさせるために用いられる特異的アミノ酸配列は、免疫反応を誘導するのに十分な長さを有し、NS2産物に対して選択的な抗体、すなわち、NS3産物および未切断NS2/3に対して低い交差反応性を示すかまたは交差反応性を示さない抗体を生じさせるのに適切な配列を有する。もちろん、当業者には明らかなように、このような短いペプチドは免疫反応を誘導するために担体タンパク質に結合していることが必要な場合がある(以下の実施例2に示す)。
【００３５】
特に、これらのペプチドはタンパク質のNS2部分から選択され、少なくとも10個の連続アミノ酸を含む多岐にわたるペプチドを評価することにより見いだすことができる。限定するものではないが、NS2に選択的な免疫反応を誘導するために、例えば、配列番号1に由来する短いペプチドを複合体化し、注射することができる。
【００３６】
特に、本発明記載の以下のアミノ酸配列を含むペプチドを使用することができる:
Ser-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu-Leu[配列番号6]
Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu-Leu[配列番号8];
Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg-Leu[配列番号9];
Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp-Arg[配列番号10];
Pro-Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly-Trp[配列番号11];
Gly-Pro-Ala-Asp-Asn-Phe-Glu-Gly-Gln-Gly[配列番号12];
Ser-Ala-Arg-Arg-Gly-Arg-Glu-Ile-Leu-Leu[配列番号13];など。
本発明記載の抗体を生じるのに有用な他のペプチドは、当業者が容易に決定することができる。
【００３７】
別の側面において、優先的リガンドはNS3に特異的なアミノ酸配列に対する抗体である。具体的には、前記抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。NS3優先的リガンドの例は、NS3に特異的なアミノ酸配列に対する抗体を含む。具体的には、抗体を生じさせるために用いられる特異的アミノ酸配列は、免疫反応を誘導するのに十分な長さを有し、NS3産物に対して選択的な抗体、すなわち、NS2産物および未切断NS2/3に対して低い交差反応性を示すかまたは交差反応性を示さない抗体を生じさせるのに適切な配列を有する。もちろん、当業者には明らかなように、免疫反応を誘導するために、このような短いペプチドは担体タンパク質に結合していることが必要な場合がある(以下の実施例2に示す)。
【００３８】
特に、これらのペプチドはタンパク質のNS3部分から選択され、少なくとも10個の連続アミノ酸を含む多岐にわたるペプチドを評価することにより見いだすことができる。限定するものではないが、NS3に選択的な免疫反応を誘導するために、例えば、配列番号1に由来する短いペプチドを複合体化し、注射することができる。
【００３９】
特に、本発明記載の以下のアミノ酸配列を含むペプチドを使用することができる:
Ala-Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr[配列番号5];
Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr[配列番号14];
Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr-Arg[配列番号15];
Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr-Thr-Arg-Gly[配列番号16];
Arg-Gly-Leu-Leu-Gly-Cys-Ile-Ile-Thr-Ser[配列番号17];など。
本発明記載の抗体を生じるのに有用な他のペプチドは、当業者が容易に決定することができる。
【００４０】
一実施形態において、NS3のN末端領域に対する抗体、例えば、ペプチドAPITAYSQQT[配列番号5]に対する抗体、具体的には、K147ポリクローナル抗体は、NS3優先的リガンドとして使用される。
特定の実施形態において、優先的リガンドはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。具体的には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、その標的分子の検出を容易にするために検出可能な標識に結合している。具体的には、前記リガンドが検出可能な標識に直接に結合している場合、そのリガンドが直接に検出でき、あるいはまた、特異的抗体は、特異的抗体に対する第2の抗体であって検出可能な標識に結合した第2の抗体を用いて間接的に検出することができる。このような第2の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、切断産物の検出に用いられる特異的リガンドの性質に応じて、モノクローナル抗体(例えば抗IgG、抗IgM)またはポリクローナル抗体(例えば:抗ウサギ、抗マウスまたは抗ヤギ抗体など)から選択することができる。特定の実施形態において、特異的リガンドは、ユーロピウムで標識された抗ウサギ抗体を用いて検出されるウサギ由来のポリクローナル抗体である。
他の好ましい実施形態において、ステップc)およびc’)のそれぞれにおいて生成される固定化されたリガンドの量は、固定化されたリガンドに直接または間接に結合した標識のシグナルを測定することにより決定できる。
【００４１】
検出
本発明の特定の実施形態において、切断NS2産物またはNS3産物を同定および/または定量できるように、NS2またはNS3優先的リガンドが、従来用いられている任意の検出可能な標識に(直接または間接に)結合している。ついで、固定化NS2またはNS3に結合した検出可能な標識を検出/測定するために慣用される検出法を使用できることになる。このような検出可能な標識の実施形態は、例えば、当該分野で公知の放射性標識または比色標識を含み、“Amersham Blotting, Labeling and Detection” catalog, GE Healthcare @ www.Amershambiosciences.com. などのカタログで入手できる。
一実施形態において、検出可能な標識は蛍光マーカーである。この検出可能な標識の検出/測定は、当該分野で公知の方法、例えば“Invitrogen- Molecular Probes Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technology, 10th ed. 2005”に記載の方法により実施される。
あるいはまた、検出可能な標識は、上記の抗NS3ウサギ抗体を認識する抗ウサギ抗体に結合したユーロピウムである。この検出可能な標識の検出/測定は、当該分野で公知の方法、例えばPerkinElmer Life Sciencesにより商業化されている方法(DELFIA(登録商標)システム)などにより実施される。
【００４２】
本明細書において開示および請求されている本実施形態および種々の他の実施形態において、用いる緩衝液、用いる緩衝液および溶液のpH、用いる温度および反応時間を含む一般条件は、対象とする種々のステップを妨げないものを含み、当業者により容易に決定されることが理解されるべきである。
本発明の実施形態を以下の実施例を参照することにより説明するが、これらを限定的なものと解釈してはならない。
【００４３】
実施例
略語
Ab:抗体;
BSA:ウシ血清アルブミン;
CHAPS:3-[(3-クロロアミドプロピル)ジメチル-アンモニオ]-1-プロパンスルホネート;
DMSO:ジメチルスルホキシド;
DM:n-ドデシル-β-D-マルトシド;
DTPA:ジエチレントリアミンペンタ酢酸;
HEPES:4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸;
LDAO:ラウリルジエチルアミンオキシド;
mcKLH:マリカルチャーキーホールリンペットヘモシアニン(Mari culture keyhole limpet hemocyanin);
NZW:ニュージーランド白ウサギ(New Zealand White rabbit);
PBS:リン酸緩衝化生理食塩水;
PBS-T:リン酸緩衝化生理食塩水-ツイーン;
PNPP:p-ニトロフェニルリン酸;
PVDF:ポリビニリデンジフルオリド;
TCEP:トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩
【００４４】
材料および方法
アッセイ試薬
BSA、グリセロール、DTPA、塩化亜鉛、HEPESおよびDMSOはSigma-Aldrichから購入した。界面活性剤DMおよびLDAOはそれぞれAnathrace Inc.およびFlukaから購入した。DELFIA(登録商標)試薬はPerkinElmer Life Sciencesから購入した。TCEPはPierceから、ツイーン(登録商標)20はBio-Radから、そして塩化ナトリウムはEM Scienceから購入した。
【００４５】
NS2/3プロテアーゼの調製
NS2/3プロテアーゼの発現、産生および精製は、以前報告された手順に従って行った(2)。実際には、リフォールディング緩衝液(50mMトリス、pH8.0、0.5アルギニンHCl、1%LDAO、5mM TCEP)中のリフォールディングした不活性なNS2/3タンパク質のアリコートを-80℃で冷凍保存し、後に解凍し、活性化剤および場合によりグリセロールの存在下で希釈して自己切断を誘導することができる。
【００４６】
ポリクローナル抗体の生成
本発明の重要な側面は、NS2またはNS3とNS2/3の混合物の存在下でNS2/3に優先してNS2またはNS3に選択的に結合するリガンドとしての抗体の使用である。
NS2/3からの切断NS2を認識する抗体を得るために、NS2のC末端の最後の10アミノ酸の配列に対応するペプチドが合成される。合成ペプチド(SFEGQGWRLL;配列番号6)と担体タンパク質が共役され、免疫感作に用いられる。
NS2/3からの切断NS3を認識する抗体を得るために、NS3のN末端の最初の10アミノ酸の配列に対応するペプチドが合成される。合成ペプチド(APITAYSQQT)[配列番号5]と担体タンパク質が共役され、免疫感作に用いられる。
【００４７】
実施例１
NS3特異的ポリクローナル抗体(K147)の生成
NS2/3からの切断NS3を認識するポリクローナル抗体を得るために、NS3のN末端の最初の10アミノ酸配列に対応するペプチド(APITAYSQQT;配列番号5)をキーホールリンペットヘモシアニン(mcKLH)担体タンパク質に結合させ、ウサギに免疫するために用いる。
【００４８】
ペプチドの合成および免疫原の調製
ペプチドH2N-APITAYSQQT-COOHをNeo MPS,Inc.(San Diego,CA)から購入する。免疫原を調製するために、Pierce製のImject(登録商標)Immunogen EDC結合キットを用い、このペプチドをマリカルチャーキーホールリンペットヘモシアニン(mcKLH)担体タンパク質に結合させる。基本的には、ImjectR EDC 結合緩衝液 0.5mlにペプチド2mgを可溶化する。このペプチド溶液を再構成mcKLH担体タンパク質溶液0.2mlに加える。10mg/mlで用事調製したEDC試薬50μlをこの結合反応物に加え、次いで反応物を室温で2時間インキュベートする。Imject(登録商標)immunogen EDC kitで提供される脱塩カラム(desalting column)および精製用緩衝液(purification buffer)を用いて脱塩することによりこの結合体を精製する。免疫原を含有する画分(OD280で測定する)をプールし、-20℃で保存する。
【００４９】
免疫感作
このペプチド-担体タンパク質結合体をPBSで希釈して50μg/mlにし、等容量の完全フロイントアジュバントで乳化する。このエマルジョンを用いて、雄のNZW(ニュージーランド白ウサギ)2匹を皮下注射で(s.c.)免疫感作する(容量2ml、50μg/ウサギ)。第4週および第8週において、不完全フロイントアジュバントで乳化した同じ投与量のペプチド結合体でこのウサギに追加免疫する。各追加免疫注射の10〜14日後に血液を採取し、ELISAでペプチド特異的抗体を試験する。各動物の対照血清として使用するために、最初の免疫感作の1日前に免疫前血清を採取する。各ウサギ由来の血清をウェスタンブロットで分析し、ペプチド抗原をコーティングしたプレートを用いてELISAで分析する。
【００５０】
ELISAアッセイ
このアッセイのために、マイクロタイタープレート(NUNC製)をペプチド抗原(12.5μg/ml溶液を100μl/ウェル)で終夜4℃でコーティングする。PBS、3%BSAおよび0.05%ツイーン20を含有するブロッキング緩衝液200μlでプレートを3回洗浄し、ブロッキング緩衝液200μlで室温で1時間インキュベートする。0.05%ツイーン20を含有するPBS(PBS-T)でこれらのウェルを3回洗浄する。ついでペプチドを含有するこれらのウェルをウサギ抗血清のPBS-T連続希釈液(1/5〜1/390,625)で室温で2時間インキュベートする。並行して、免疫前血清の希釈曲線もまた試験する。これらのウェルをPBS-T 200μlで3回洗浄し、ついでヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ結合体(1/5000)(Gibco BRL)100μlで室温で1時間インキュベートする。これらのウェルをPBS-Tで2回洗浄し、PNPP緩衝液200μlですすぐ。このステップに続いて4-ニトロフェニルホスファート(5ng/ml、PNPP緩衝液で希釈)100μlとインキュベートする。405nmで吸光度を読み取る。
【００５１】
図2Aは、2回目の追加免疫後の1匹の動物からの採血から得た抗体希釈曲線であり、ELISAにおいて抗血清がペプチド抗原と反応することを示している。ペプチド(1:625)抗原に対する抗血清の力価は1回目と2回目の追加免疫の間で維持される。ELISA測定によれば、免疫感作したウサギはいずれもペプチド抗原に対して免疫反応を起こす。
【００５２】
ウェスタンブロット
NS2/3タンパク質試料を自己切断反応にかけ、NS2/3プロテアーゼからのNS3切断産物を選択的に認識するポリクローナル抗体の能力をウェスタンブロットにより評価するために用いる。NS2/3自己切断反応の前(-)および後(+)のタンパク質試料(100ng)を15%ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分離する。エレクトロブロッティングによりタンパク質をPVDF膜上に転写する。5%スキムミルク/PBS-ツイーン(ツイーン20を0.05%含有するリン酸緩衝生理食塩水)で膜をブロッキングする。ついで室温で1時間、膜を一次抗体でインキュベートする。K147抗血清を1:1000に希釈し、対照のNS3に対するポリクローナル抗体[K135](Thibeault et al.,2001)を1:5000に希釈する。4回の洗浄後、ブロットを1:20,000ヤギ抗ウサギHRP結合二次抗体(Gibco BRL)で室温で1時間インキュベートする。4回の洗浄後、Pierce製ECLplusウェスタンブロッティング基質を用いて反応を視覚化し、STORM(登録商標)画像解析システム(Amersham製)で化学発光シグナルを読み取る。
【００５３】
図2Bで観察される、NS3のN末端に対するK147抗血清でインキュベートした試料を用いた場合のシグナルにより、触媒ドメインに対する対照抗NS3抗体(K135;パネルC)によっては未切断NS2/3が認識されているレーン（−）においてシグナルがほとんど観察されないので、この抗体は、NS2/3プロテアーゼから切断された場合にNS3(+)を選択的に認識することができることが示される。この抗血清の選択性は、実施例2で説明されるNS2/3自己切断アッセイのための96ウェルフォーマットでさらに明らかにされる。
免疫反応を生じさせる2匹のウサギのうち、1匹のウサギからNS3に選択的な抗血清が得られる。ついでこの免疫感作プロトコルを6匹のウサギを用いて2回目に繰り返す。今回は、4匹のウサギからNS3に選択的な抗血清が得られた。
【００５４】
実施例２
ポリクローナル抗体(K147)の評価
NS2/3プロテアーゼとNS3産物を識別するポリクローナル抗体の能力についてポリクローナル抗体を評価するために下記のアッセイ条件を用いる。
【００５５】
NS2/3プロテアーゼ自己切断
NS2/3プロテアーゼ(50mM HEPES、pH7.5、30%グリセロール、1mM TCEP中に最終濃度0.2μMに希釈した配列番号4)30μLに自己切断緩衝液(50mM HEPES、pH7.5、30%グリセロール、0.5%DM、1mM TCEP)20μLを加えることにより自己切断反応を開始させる。反応混合物を30℃で90分間インキュベートする。ブランク反応において、移行ステップの直前にDM含有緩衝液を加える。また、陰性対照として、抗体が未切断NS2/3に対して最小の交差反応性を示すことを確認するために、活性部位変異体NS2/3[H952A]を用いる。
【００５６】
Eu+3標識抗ウサギAbを用いる検出ステップのための抗体評価
ニュートラビジンをコーティングした96ウェルプレート(Pierceから購入)中で、80μLの50mM HEPES、pH7.5、10%グリセロール、1mM TCEPに自己切断混合物20μLを加える。アッセイ混合物を室温で60分間インキュベートする。ついでプレートを200μLのPBS、0.05%ツイーン20で3回洗浄する。ついでウェルあたり100μLのPBS、0.05%ツイーン20、3%BSAを加え、ついで室温で30分間インキュベートし、上記のように3回洗浄する。
【００５７】
PBS、pH7.5、0.05%ツイーン20、0.3%BSAで1/500に希釈したポリクローナル抗体をウェルあたり100μL加え、ついで室温で30分間インキュベートする。ついで上記のようにプレートを3回洗浄する。
ポリクローナル抗体の結合を検出するために、PBS、pH7.5、0.05%ツイーン20、0.3%BSA、100μM DTPAで8nMに希釈したDELFIA(登録商標)Eu-N1標識抗ウサギ抗体(PerkinElmer Life Sciences)をウェルあたり100μL加え、ついで室温で30分間インキュベートする。ついでDELFIA(登録商標)洗浄用緩衝液(PerkinElmer Life Sciences)200μLでプレートを3回洗浄する。最後に、DELFIA(登録商標)エンハンスメントソリューション（Enhancement Solution）(PerkinElmer Life Sciences)100μLを各ウェルに加え、ついで室温で少なくとも15分間インキュベートする。340nmの励起フィルターおよび615nmの放出光フィルターを備えたWallac Victor(登録商標)1420 マルチラベルHTSカウンター（Multilabel HTS Counter）(PerkinElmer Life Sciences)で時間分解蛍光をモニターする。
このアッセイフォーマットを用いれば、NS2/3自己切断によって蛍光の増加が観察され、一方でNS2/3プロテアーゼ活性部位変異体H952A(図3)では蛍光の増加が観察されないので、K147は切断NS3に選択的であり、その検出はNS2/3自己切断活性と関連することが示される。
【００５８】
実施例３
NS2/3プロテアーゼ時間分解蛍光アッセイプロトコル
30μLの50mM HEPES、pH7.5、20%グリセロール、0.266%n-ドデシル-β-D-マルトシド、1mM TCEPに、NS2/3プロテアーゼ(50mM HEPES、pH7.5、20%グリセロール、1mM TCEP中に最終濃度800nMに希釈した配列番号4)10μLを加え、DMSO最終含有量を5%に保って自己切断反応を開始させる。反応混合物を室温で45分間インキュベートする。
ブランクウェルにおいて、10μM ZnCl2または50μM NS4Aペプチド[配列番号7]を加えることにより自己切断を阻害する。
図4に示すように、自己切断の濃度依存性に基づいて、NS2/3プロテアーゼ最終濃度200nMを選択する。自己切断反応の時間的経過を図5に示す。
【００５９】
ニュートラビジンをコーティングした96ウェルプレート(Pierceから購入)中で、40μLの50mM HEPES、pH7.5、10%グリセロール、1mM TCEPに自己切断混合物10μLを加える。アッセイ混合物を室温で60分間インキュベートする。ついでプレートを100μLの50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン20で3回洗浄する。ついで、50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン(登録商標)20、0.3%BSAで6000倍に希釈したポリクローナル抗体K147をウェルあたり50μL加え、ついで室温で30分間インキュベートする。ついでプレートを上記のように3回洗浄する。ついで50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン(登録商標)20、0.3%BSA、100μM DTPAで希釈した1.0nM DELFIA Eu-N1標識抗ウサギ抗体(PerkinElmer Life Sciences)をウェルあたり50μL加え、ついで室温で30分間インキュベートする。ついでDELFIA(登録商標)洗浄用緩衝液100μLでプレートを3回洗浄する。最後に、DELFIA(登録商標)enhancement solution 50μLを各ウェルに加え、ついで室温で少なくとも15分間インキュベートする。340nmの励起フィルターおよび615nmの放出光フィルターを備えたWallac Victor(登録商標)1420 Multilabel HTS Counter(PerkinElmer Life Sciences)で時間分解蛍光をモニターする。抗体K147の濃度の増加とともに蛍光の増加が見られ18〜20の対照対ブランク比が見られるが、これはこの抗体がNS2/3前駆体とNS3産物を識別できることを明白に示す(図6)。アッセイの概略図を図7Aに示す。
【００６０】
結論として、本明細書に記載のNS2/3プロテアーゼ時間分解蛍光アッセイにおいて、NS2/3未切断前駆体およびNS3産物はどちらもそれらのC末端Strep-tagを介してニュートラビジンをコーティングしたウェルプレート上に捕捉され、NS3産物はNS2/3前駆体とNS3産物とを識別することができるウサギポリクローナル抗体およびユーロピウム標識抗ウサギ抗体により検出される。
【００６１】
実施例４
NS2検出に基づく固定化アッセイ
同様に、NS2産物を検出するためにペプチドSFEGQGWRLL(配列番号6)に対して抗体を生成する。
96ウェル丸底ポリプロピレンプレート(Falcon)中で、30μLの50mM HEPES、pH7.5、20%グリセロール、0.266% DM、1mM TCEPに、NS2/3プロテアーゼ(50mM HEPES、pH7.5、20%グリセロール、1mM TCEP中に最終濃度800nMに希釈した配列番号4)10μLを加え、DMSO最終含有量を5%に保って自己切断反応を開始させる。反応混合物を室温で45分間インキュベートする。陰性対照ウェルにおいて、10μM ZnCl2または50μM NS4Aペプチド[配列番号7]を加えることにより自己切断を阻害する。
ニッケルをコーティングした96ウェルプレート(Pierceから購入)中で、40μLの50mM HEPES、pH7.5、10%グリセロール、1mM TCEPに自己切断混合物10μLを加える。アッセイ混合物を室温で60分間インキュベートする。ついでプレートを100μLの50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン(登録商標)20で3回洗浄する。ついで、50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン(登録商標)20、0.3%BSAで希釈した抗NS2抗体(希釈率を決定するために前もって滴定する)をウェルあたり50μL加え、ついで室温で30分間インキュベートする。ついでプレートを上記のように3回洗浄する。50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン(登録商標)20、0.3%BSA、100μM DTPAで希釈した1.0nM DELFIA(登録商標)Eu-N1標識抗ウサギ抗体(PerkinElmer Life Sciences)をウェルあたり50μL加え、ついで室温で30分間インキュベートする。ついでDELFIA(登録商標)洗浄用緩衝液(PerkinElmer Life Sciences)100μLでプレートを3回洗浄する。最後に、DELFIA(登録商標)enhancement solution(PerkinElmer Life Sciences)50μLを各ウェルに加え、ついで室温で少なくとも15分間インキュベートする。340nmの励起フィルターおよび615nmの放出光フィルターを備えたWallac Victor(登録商標)1420 Multilabel HTS Counter(PerkinElmer Life Sciences)で時間分解蛍光をモニターする。アッセイの概略図を図7Bに示す。
【００６２】
実施例５
ウルトラハイスループットスクリーニングプロトコル
384ウェル丸底ポリプロピレンプレート(Greiner)中で、試験化合物のDMSO溶液(50mM HEPES、pH7.5、20%グリセロール、1mM TCEPで希釈)10μLおよび10μLの50mM HEPES、pH7.5、20%グリセロール、0.6%DM、1mM TCEPにNS2/3プロテアーゼ(50mM HEPES、pH7.5、20%グリセロール、1mM TCEP中に最終濃度600nMに希釈した配列番号4)10μLを加えて自己切断反応を開始させる。DMSO最終含有量を5%に保つ。反応混合物を室温で45分間インキュベートする。ブランクウェルにおいて、10μM ZnCl2または50μM NS4Aペプチド[配列番号7]を加えることにより自己切断を阻害する。
ニュートラビジンをコーティングした384ウェルプレート(Pierceから購入)中で、20μLの50mM HEPES、pH7.5、10%グリセロール、1mM TCEPに自己切断混合物5μLを加える。アッセイ混合物を室温で60分間インキュベートする。ついでプレートを50μLの50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン20(登録商標)で3回洗浄する。ついで、50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン(登録商標)20、0.3%BSAで0.03μg/mlに希釈したポリクローナル抗体K147をウェルあたり25μL加え、ついで室温で30分間インキュベートする。ついでプレートを上記のように3回洗浄する。ついで50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン(登録商標)20、0.3%BSA、100μM DTPAで1.0nMに希釈したDELFIA(登録商標)Eu-N1標識抗ウサギ抗体(PerkinElmer Life Sciences)をウェルあたり25μL加え、ついで室温で30分間インキュベートする。ついでDELFIA(登録商標)洗浄用緩衝液(PerkinElmer Life Sciences)50μLでプレートを3回洗浄する。
【００６３】
あるいはまた、1)リガンドとしてAPITAYSQQTを用いるペプチドカラムで前もって精製したK147ポリクローナル抗体0.03μg/mL、および、2)50mM HEPES、pH7.5、0.15M NaCl、0.05%ツイーン(登録商標)20、0.3%BSA、100μM DTPAで希釈した0.5nM DELFIA(登録商標)Eu-N1標識抗ウサギ抗体(PerkinElmer Life Sciences)、から構成される抗体溶液をウェルあたり25μL加え、ついで室温で30分間インキュベートする。ついでDELFIA(登録商標)洗浄用緩衝液(PerkinElmer Life Sciences)50μLでプレートを3回洗浄する。最後に、DELFIA(登録商標)enhancement solution(PerkinElmer Life Sciences)25μLを各ウェルに加え、ついで室温で少なくとも15分間インキュベートする。340nmの励起フィルターおよび615nmの放出光フィルターを備えたWallac Victor(登録商標)1420 Multilabel HTS Counter(PerkinElmer Life Sciences)で時間分解蛍光をモニターする。アッセイの統計データを図8に示す。この図から、陽性対照(最大NS2/3プロテアーゼ活性)とブランク(バックグラウンドNS2/3プロテアーゼ活性)の間で20〜25というシグナルウィンドウが認められ、Z’は0.70〜0.75であることがわかる[Z’は文献（７）において定義されている統計パラメータである]。図9に、種々の濃度に希釈した試験化合物Aによる同一アッセイによって得られる結果を示す。次の方程式を用いて、阻害因子を含有する各ウェルの阻害レベル(阻害率(%))を算出した。
【００６４】
【数１】
2009520465.tif 000003
【００６５】
化合物Aの濃度に対して阻害率（％）をプロットし、Hillモデルに従って阻害率(％)-濃度データに非線形曲線を当てはめた。ついで、次の方程式により、算出された阻害率(％)を用いて、SASソフトウェア(Statistical Software System;SAS Institute,Inc.,Cary,N.C.)のNLIN手順に従って半効果濃度(IC50)、勾配因子(n)および最大阻害率(Imax)を決定した。
【００６６】
【数２】
2009520465.tif 000004
【００６７】
化合物Aについては、おおよそ31μMのIC50が得られる。
【００６８】
参考文献
(1)Kolykhalov, A.A., Mihalik, K., Feinstone, S.M. and C.M. Rice. (2000) Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3'-nontranslated region are essential for virus replication in vivo. J. Virol. 74: 2046-2051.
(2)Thibeault, D., Maurice, R., Pilote, L., Lamarre, D. and Pause, A. (2001) In vitro characterization of a purified NS2/3 protease variant of hepatitis C virus.  J. Biol. Chem. 276 (49): 46678-46684.
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(4)Pallaoro, M., Lahm, A., Biasiol, G., Brunetti, M., Nardella, C., Orsatti, L., Bonelli, F., Orru, S, Narjes, F. and Steinkuhler, C. (2001) Characterization of the hepatitis C virus NS2/3 processing reaction by using a purified precursor protein.  J. Virol. 75: 9939-9946.
(5)Istituto di ricerche di biologia molecolare P. Angeletti, Italy. Patent application WO 01/68818 A2 (priority 17 March 2000), HCV NS2/3 fragments and uses thereof.
(6)Waugh, D.S. 2005; Making the most of affinity tags; Trends Biotechnology 23: 316-320.
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【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ】本発明の一側面に従ったNS2/3プロテアーゼアッセイの概略図である。
【図１Ｂ】本発明の他の側面に従ったNS2/3プロテアーゼアッセイの概略図である。
【図２Ａ】ELISAアッセイにより測定されたK147ポリクローナル抗体の希釈曲線である。
【図２Ｂ】未切断NS2/3(-)と比較した切断NS3産物(+)へのK147抗体の選択的結合を示すウェスタンブロットである。
【図３】実施例2記載の方法による、NS2/3プロテアーゼの自己切断活性とK147抗体の結合との相関を示す図である。
【図４】実施例3記載の方法による、切断ステップにおけるNS2/3プロテアーゼの濃度を示す図である。
【図５】実施例3記載の方法による、NS2/3プロテアーゼ切断ステップの時間依存性を示す図である。
【図６】NS3選択的ウサギポリクローナル抗体K147の滴定を示す図である。
【図７Ａ】本発明の特定の実施形態に従った、NS2/3プロテアーゼアッセイの概略図である。
【図７Ｂ】本発明の他の実施形態に従った、NS2/3プロテアーゼアッセイの概略図である。
【図８】実施例5記載の本NS2/3プロテアーゼアッセイの実施形態により得られるZ’を示す図である。
【図９】実施例5に従ってNS2/3プロテアーゼアッセイにより得られる化合物AのIC50曲線を示す図である。
【図２Ａ】
2009520465.tif 000005
【図３】
2009520465.tif 000006
【図４】
2009520465.tif 000007
【図５】
2009520465.tif 000008
【図６】
2009520465.tif 000009
【図９】
2009520465.tif 000010
【図１Ａ】
2009520465.tif 000011
【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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