(57)【要約】本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が担持された炭素粒子と、前記炭素粒子と接する電極層から構成される酵素電極において、前記炭素粒子及び／又は前記電極層が、粒径１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上である炭素粒子から構成されていることを特徴とする酵素電極を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が担持された炭素粒子と、前記炭素粒子と接する電極層から構成される酵素電極において、前記炭素粒子及び／又は前記電極層が、粒径１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上である炭素粒子から構成されていることを特徴とする酵素電極。
【請求項２】
前記グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が酸化還元酵素触媒サブユニット又は酸化還元触媒サブユニットと電子伝達サブユニットの複合体である請求項１に記載の酵素電極。
【請求項３】
前記電極層が金属から構成される請求項１又は２に記載の酵素電極。
【請求項４】
前記電極層が金属のワイヤーから構成される請求項３に記載の酵素電極。
【請求項５】
グルコースセンサとして使用される請求項１ないし４のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項６】
フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）と、１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上である炭素粒子を含むことを特徴とする酵素電極に使用するためのインク材料。
【請求項７】
前記グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が、酸化還元酵素触媒サブユニット又は酸化還元酵素触媒サブユニットと電子伝達サブユニットの複合体である請求項６に記載のインク材料。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のインク材料を、電極層の表面に塗布した後、乾燥させることを特徴とする酵素電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース脱水素酵素を含むインクが担持されている酵素電極、特にグルコースセンサとして使用される酵素電極、この酵素電極の製造のために使用されるインク、およびこの酵素電極の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵素電極とは、通常、金電極、白金電極、カーボン電極等の電極表面上に酵素が固定化された電極のことをいう。酵素電極は、酵素の反応特異性を利用して、種々の生理活性物質を特異的に検出するバイオセンサーとして広く使用されている。特に、糖尿病に重要なマーカーとして血中のグルコース濃度を測定するためのグルコースセンサとして使用することができる。【０００３】
酵素電極に使用される酸化還元酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に代表される脱水素酵素、及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）に代表される酸化酵素がある。ＧＯＤは、グルコースに対する基質特異性が高くて熱安定性に優れており、酵素の量産化が可能であるために生産コストが他の酵素と比べて安価であるという利点がある。また、ＧＤＨを使用した系は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けにくいため、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酵素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、精度よくグルコースを測定することができる。【０００４】
これらの酸化還元酵素を酵素電極に応用する場合、電極の応答電流値が低いことが問題であった。そこで、本発明の発明者らは、電極の応答電流値を向上するために、電子メディエータと共に電子伝達蛋白質を有する酵素電極を提案した（下記特許文献２参照）。【０００５】
電子メディエータとは、酸化還元酵素から電極への電子伝達を媒介し得る非蛋白質性の金属錯体、有機化合物などの酸化還元物質をいい、例えば、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート、フェロセンおよびこれらの誘導体が挙げられる。【０００６】
電子伝達蛋白質とは、生体の酸化還元系において、電子供与体から電子を受け取って還元され、次いで電子受容体に電子を渡して酸化されることのできる蛋白質をいう。電子伝達蛋白質の例としては、チトクロームｂ、チトクロームＣ，好ましくはチトクロームｂ５６２などが挙げられる。【０００７】
特許文献１においては、電子伝達蛋白質を酸化還元酵素とともに電極上に固定化することにより、酸化還元元素から電極への、あるいは電子メディエータへの電子伝達を促進することができ、これにより応答電流値の高い酵素電極を得ている。【０００８】
これらの酵素電極を用いたグルコース濃度の測定は、一般に、恒温セルに緩衝液を入れ、補酵素、ＣａＣｌ２及び電子メディエータを加えて一定温度に維持した後に、作用電極として例えばカーボン電極上に酵素を固定化した酵素電極を使用し、対極（例えば白金電極）及び参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。上記カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。【０００９】
このように、これら従来の方法では、電子メディエータを電極内に含有又は電極表面に固定化するか、あるいは恒温セルに水溶液として加えなければならず、酸化還元酵素とは別に電子メディエータを準備しなければならない。したがって、プロセスが複雑化し、量産化するにはコスト的に難点があった。
【特許文献１】特開２００３−１２１４０７号公報
【特許文献２】国際公開０２／７３１８１号パンフレット
【特許文献３】国際公開２００５／０２３１１１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、電子メディエータを使用することなく、電子メディエータを使用した場合に比べて遜色がなく、特にグルコースセンサとして使用する際に高い応答電流値が得られ、かつダイナミックレンジも広く得られる酵素電極を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明においては、グルコース計測用のセンサとして、グルコース脱水素酵素が担持された炭素粒子と前記炭素粒子と接触する電極層から構成される酵素電極を用いたとき、前記炭素粒子及び／又は前記電極層を構成する炭素粒子の粒径が１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上とすることにより、前記電極層とグルコース脱水素酵素を担持している炭素粒子間、あるいは電極層を構成する炭素粒子とグルコース脱水素酵素を担持している炭素粒子との間での電子の移動がスムーズになり、酵素電極としての機能を果たせることを見出したものである。【００１２】
すなわち、本発明は、上記のように構成される酵素電極において、グルコース脱水素酵素が担持された炭素粒子と接触する電極材料の形状・大きさにかかわらず、グルコース脱水素酵素が担持された炭素粒子の粒径および比表面積を調整することで、応答電流を高めることを可能にするものである。【００１３】
また、本発明は、上記のように構成される酵素電極において、グルコース脱水素酵素が担持された炭素粒子と接触する電極材料として、炭素粒子を使用して、その粒径および比表面積も合わせて調整することで、さらに、応答電流を高めることを可能にするものである。【００１４】
本発明の具体的構成は次のとおりである。
（１）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が担持された炭素粒子と、前記炭素粒子と接する電極層から構成される酵素電極において、前記炭素粒子及び／又は前記電極層が、粒径１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上である炭素粒子から構成されていることを特徴とする酵素電極。
（２）前記グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が酸化還元酵素触媒サブユニット又は酸化還元触媒サブユニットと電子伝達サブユニットの複合体である上記（１）に記載の酵素電極。
（３）前記電極層が金属から構成される上記（１）又は（２）に記載の酵素電極。
（４）前記電極層が金属のワイヤーから構成される上記（３）に記載の酵素電極。
（５）グルコースセンサとして使用される上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の酵素電極。
（６）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）と、１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上である炭素粒子を含むことを特徴とする酵素電極に使用するためのインク材料。
（７）前記グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が、酸化還元酵素触媒サブユニット又は酸化還元酵素触媒サブユニットと電子伝達サブユニットの複合体である上記（６）に記載のインク材料。
（８）上記（６）又は（７）に記載のインク材料を、電極層の表面に塗布した後、乾燥させることを特徴とする酵素電極の製造方法。【００１５】
本発明で使用するフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が担持された炭素粒子は粒径が小さく、比表面積が大きいことを特徴とするが、好ましくは、粒径１００ｎｍ以下、より好ましくは粒径５０ｎｍ以下であり、かつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上である炭素粒子がよい。このような炭素粒子としては例えば、市販されているケッチェンブラック（粒径３４ｎｍ、比表面積１４００ｍ２/ｇ）、バルカン（粒径３０ｎｍ、比表面積２５４ｍ２／ｇ）およびケッチェンブラックを含むライオンペースト（ライオン社商標）などが挙げられる。【００１６】
本発明において、上記の炭素粒子と共にフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（本明細書において、「ＦＡＤＧＤＨ」という）、を混合して酵素電極を構成するインク材料を作成する。インク材料は、炭素粒子、例えば、ケッチェンブラックに溶媒、例えば、プロパノール水溶液を加えてよく混合することにより製造することができる。【００１７】
本発明において、一般的には、酵素電極は上記のインク材料を電極層に塗布することによって酵素電極を作成する。【００１８】
本発明で使用する電極層には、炭素粒子または金属を使用することができる。炭素粒子は特に限定されないが、好ましくは、粒径が小さく、比表面積が大きいものがよく、より好ましくは、粒径１００ｎｍ以下、より好ましくは粒径５０ｎｍ以下であり、でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上である炭素粒子がよい。このような炭素粒子としては例えば、市販されている市販されているケッチェンブラック（粒径３４ｎｍ、比表面積１４００ｍ２/ｇ）、バルカン（粒径３０ｎｍ、比表面積２５４ｍ２／ｇ）およびケッチェンブラックを含むライオンペースト（ライオン社商標）などが挙げられる。金属を用いる場合は、好ましくは、金属ワイヤー、より好ましくは、金またはステンレスのワイヤーを用いることができる。【００１９】
本発明において使用されるグルコース脱水素酵素は、天然の酸化還元酵素の一部が化学的に改変されている改変型酸化還元酵素であってもよい。このような改変型酵素は、例えば、蛋白質の１またはそれ以上のアミノ酸残基を他の天然のまたは天然に存在しないアミノ酸残基で置換することにより、あるいは１またはそれ以上のアミノ酸を欠失させるかまたは付加することにより製造することができる。【００２０】
本発明の酵素電極は、先述のように、グルコース脱水素酵素が担持された炭素粒子の粒径および比表面積も合わせて調整することで、電極層との電子の移動の際に、電子メディエータを必要としない。本発明で使用されるグルコース脱水素酵素は、機能面から、グルコース脱水素活性を有する触媒活性サブユニットと、前記触媒サブユニットから供与された電子を電極層に授与するための電子伝達蛋白質からなる電子伝達サブユニットから構成される。このとき、本発明では、酸化還元酵素として触媒サブユニットのみで使用してもよいし、触媒サブユニットと電子伝達サブユニットの複合体を使用してもよい。【００２１】
触媒サブユニットは、試料中のグルコースから電子を取り出し、この電子を電子伝達サブユニットに供与する役割を果たすものであり、好ましくは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補酵素とするＦＡＤＧＤＨ触媒サブユニットが使用される。したがって、電子伝達サブユニットに対しては、還元型ＦＡＤを介して、触媒サブユニットから電子が供与される。【００２２】
触媒サブユニットの含有量は、例えば、活性に換算して５〜１００Ｕに相当する量とされる。ここで、酵素１単位（１Ｕ）は、各酵素ごとにその定義が知られており、例えばＧＤＨの場合は、標準検定条件（ｐＨ６．０、３７℃）の下でＤＣＩＰ（２，６−ジクロロインドフェノール）の還元にもとづく退色を、ＤＣＩＰの吸収波長である６００ｎｍにおいて経時的に計測したときに、１分ごとに１μＭグルコースを酸化する量（モル吸光係数は４．７６×１０００μＭ／ｃｍ）として定義される。【００２３】
ＦＡＤＧＤＨは、グルコース脱水素活性を有する触媒サブユニット又はＦＡＤＧＤＨ複合体として前記触媒サブユニットに電子伝達サブユニットが結合したものであれば特に限定されないが、その中でもブルクホルデリア・セパシア、特にブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（本明細書では「ＫＳ１株」という）を用いるのが好ましい。【００２４】
ＫＳ１株は、温泉付近の土壌から分離した新規菌株であるが、その菌学的性質からブルクホルデリア・セパシアであると同定されており、平成１２年９月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に微生物受託番号第ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０６として寄託されている。ＫＳ１株は、その詳細については、国際公開ＷＯ０２／３６７７９号公報に開示されているが、触媒サブユニットであるαサブユニット（分子量約６０ｋＤａ）、電子伝達サブユニットであるシトクロムＣに相当するβサブユニット（分子量約４３ｋＤａ）及びγサブユニット（分子量約１４ｋＤａ）を含むＧＤＨを産出することができる。ただし、分子量は、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において測定したものである。【００２５】
本発明の酵素電極を製造するためには、グルコース脱水素酵素、又はその複合体を炭素粉末と共によく混合して電極に装着する。グルコース脱水素酵素又はその複合体を炭素粒子に固定化するためには、上記のように電極に装着後、例えば、グルタルアルデヒドなどの二架橋性試薬で架橋処理する。あるいは固体高分子電解質を用いて固定化することもできる。固体高分子電解質として最もよく用いられているのがNafion（ナフィオン）である。ナフィオンをはじめとする固体高分子電解質をイソプロパノールなどの溶媒に溶解し、これを酵素吸着あるいは塗布乾燥させた酵素膜の上に滴下、あるいは酵素とともにナフィオン溶液を混合し乾燥することで酵素固定化膜を作成することがきる。【００２６】
本発明の酵素電極は、原則として電子メディエータなしで動作するが、これを排除するものではない。電子メディエータを使用する場合は、特に限定されないが、例えばフェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフォート、ルテニウム錯体などを使用することができる。【００２７】
本発明の酵素電極をグルコースセンサとして使用する場合は、上述の酵素電極を作用極として使用する。対極としては例えば白金電極を、参照電極として例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いることができる。恒温セルに緩衝液を入れてこれらの電極を装置し、作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにグルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。【００２８】
また、グルコースセンサとして使用する場合、例えば、グルコース濃度を連続的に測定し数回のグルコース測定を継続的に行うことができるように構成することもできる。この場合、グルコースセンサは、皮下組織から血液または間質液を採取するための採取要素をさらに備え、採取要素によって採取した血液または間質液を、電極に接触させることができるように構成される。【００２９】
上記グルコースセンサは、電極の少なくとも一部を、皮下組織に埋め込んで使用するように構成することもできる。この場合、電極は絶縁基板上に形成される。【００３０】
本発明の酵素電極は酵素燃料電池のアノードとして使用することができる。この際、酵素の基質特異性に従った物質を燃料とすることができる。カソードには、白金担持カーボン電極、白金電極などを使用することができ、隔壁のない酵素燃料電池を構築することができる。反応溶液としては、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液を用いることもできるが、さらには体液中においても使用できる。外部回路にかける抵抗値を変えることで起電力を調整することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】FADGDH酵素固定化層がケッチェンブラック／電極層がケッチェンブラックを用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図２】FADGDH酵素固定化層がカーボンペースト／電極材料がケッチェンブラックを用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図３】FADGDH酵素固定化層ケッチェンブラック／電極材料カーボンペーストを用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図４】FADGDH酵素固定化層がカーボンペースト／電極材料がカーボンペーストを用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図５】FADGDH酵素固定化層がケッチェンブラック、ライオンペースト、バルカンおよびデンカブラック／電極材料がグラッシーカーボンを用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図６】酵素固定化層の炭素粒子の比表面積と応答電流値の相関を示す。
【図７】FADGDH酵素固定化層がライオンペースト（Ｗ−３１１Ｎ，Ｗ−３７０）／電極材料がグラッシーカーボンを用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図８】FADGDH酵素固定化層バルカン／電極材料バルカンを用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図９】FADGDH酵素固定化層がライオンペースト（Ｗ−３１１Ｎ）／電極材料が金ワイヤーを用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図１０】FADGDH酵素固定化層がライオンペースト（Ｗ−３１１Ｎ）／電極材料がステンレスワイヤーを用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図１１】FADGDH酵素固定化層がライオンペースト（Ｗ−３１１Ｎ）／電極材料がステンレス製一体型電極を用いた場合のグルコース濃度と電流値の相関を示す。
【図１２】炭素粒子がポリマー基板に担持されて作成されている市販の電極を示す。
【図１３】図12に示される電極に酵素インクを塗布して作成した酵素電極にグルコースを含む試料を滴下し、電位を印加した後の応答曲線を示す。
【図１４】図13に示される応答曲線において、試料中のグルコース濃度と電位印加後５秒後の電流値との相関を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、実施例として本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
電極層として炭素粒子を使用する場合の実施例
まず、電極層、酵素層を共に炭素粒子を使用した場合の実施例を示す。
【実施例１】
【００３３】
炭素粒子として、粒径34  nm、比表面積1400  m2/g、空隙率78  vol%のケッチェンブラック（以下、KB）  を用意した。KB  100  mgにミリQ  水400  μl、5  %  Nafion（1−プロパノール48％水溶液）  1  mlを加えよく混合した後、3日間静置したものをKBインクとし、KBインク10  μlに100  mM  p.p.b.(pH  7.0)  10  μl、8.4  U/ml  FADGDH  40  μlを混合したものをFADGDH/KBインクとした。KBを電極材料として充填した一体型電極（φ0.4  mm）にFADGDH/KBインクを25  U/mm2となるように滴下し、4  ℃で2時間乾燥させた。作製した酵素電極を作用極、Ptを対極、Ag/AgCl参照電極を参照極とした。3電極方式で、100  mM  p.p.b.（pH  7.0）  10  mlを反応溶液とし、+250  mV  vs.  Ag/AgClの電位を印加した際のグルコース添加に伴う応答電流値を測定した結果を図1に示す。測定は、反応溶液を250  rpmで撹拌し、37℃で行った。応答電流値は、各グルコース濃度において測定された電流値からグルコース0  mMにおいて得られた電流値を差し引いたものとした。【００３４】
図１に示されるように、グルコース濃度を徐々に高めていくことで、観測される電流値は増加した。グルコースの終濃度55  mMにおける応答電流値はそれぞれ約1500nＡであった。５mMグルコースにおける電流密度は6998  nA/mm2であった。粒径100nm以下でかつ比表面積が少なくとも200m2／g以上あることを満たすKB炭素粒子を用いれば、十分な応答電流値が得られることが確認された。【００３５】
比較例１
炭素粒子としてKBの代わりに粒径7000  nｍ、比表面積1m２/gのCPを用いて、実施例１と同様の手順で酵素電極を作成した。すなわち、CP100  mgにミリQ  水400  μl、5  %  Nafion（1−プロパノール48％水溶液）  1mlを加えよく混合した後、3日間静置したものをCPインクとし、CPインク10  μlに100  mMp.p.b.(pH  7.0)  10  μl、8.4  U/ml  FADGDH  40  μlを混合したものをFADGDH/CPインクとした。KBを電極材料として充填した一体型電極（φ0.4  mm）にFADGDH/CPインクを25  U/mm2となるように滴下し、4  ℃で2時間乾燥させた。作製した酵素電極を作用極、Ptを対極、Ag/AgCl参照電極を参照極とした。3電極方式で、100  mMp.p.b.（pH  7.0）  10  mlを反応溶液とし、+250  mV  vs.  Ag/AgClの電位を印加した際のグルコース添加に伴う応答電流値を測定した結果を図３に示す。測定は、反応溶液を250  rpmで撹拌し、37  ℃で行った。応答電流値は、各グルコース濃度において測定された電流値からグルコース0  mMにおいて得られた電流値を差し引いたものとした。【００３６】
図２に示されるように、グルコース濃度を徐々に高めていくことで、観測される電流値は増加した。グルコースの終濃度55  mMにおける応答電流値はそれぞれ約800nAであった。５mMグルコースにおける電流密度は3160  nA/mm2であった。図１と図２を比較することにより、電極層して同じKBを充填した一体型電極を用いた場合において、これに塗布されるインク材料をFADGDH/KBインクから、FADGDH/CPインクに変えることにより、応答電流値が1500nＡから約800nＡに低下することが確認された。すなわち、同じ電極層を用いた場合に、酵素が担持されている炭素粒子は、粒径が小さいほど、また比表面積が大きいほど高い応答電流が得られることが確認された。
【実施例２】
【００３７】
KB  100  mgにミリQ  水400  μl、5  %  Nafion（1−プロパノール48％水溶液）1  mlを加えよく混合した後、3日間静置したものをKBインクとし、KBインク10  μlに100  mM  p.p.b.(pH  7.0)  10  μl、8.4  U/ml  FADGDH  40  μlを混合したものをFADGDH/KBインクとした。カーボンペースト（ＣＰ）を電極材料として充填した一体型電極（φ0.4  mm）にFADGDH/KBインクを25  U/mm2となるように滴下し、4  ℃で2時間乾燥させた。定常になる電流値と反応溶液中のグルコース濃度との相関を図３に示した。図３に示されるように、本酵素の場合は55ｍＭにおける電流値は同じ電極面積、酵素量を用いているにも関わらず110nA程度であった。本酵素電極の５mMグルコースにおける電流密度は690  nA/mm2であった。【００３８】
比較例２
炭素粒子としてKBの代わりに粒径7000  nｍ、比表面積1m２/gのカーボンペースト（以下CP）を用いて、実施例１と同様の手順で酵素電極を作成した。すなわち、CP100  mgにミリQ  水400  μl、5%  Nafion（1−プロパノール48％水溶液）  1  mlを加えよく混合した後、3日間静置したものをCPインクとし、CPインク10  μlに100  mM  p.p.b.(pH  7.0)  10  μl、8.4  U/ml  FADGDH  40  μlを混合したものをFADGDH/CPインクとした。CPを電極材料として充填した一体型電極（φ0.4  mm）にFADGDH/CPインクを25  U/mm2となるように滴下し、4  ℃で2時間乾燥させた。定常になる電流値と反応溶液中のグルコース濃度との相関を図４に示した。図４に示されるように、FADGDH+CP電極の場合は55ｍMにおける電流値は同じ電極面積、酵素量を用いているにも関わらず55nA程度であった。本酵素電極の５mMグルコースにおける電流密度は330  nA/mm2であった。【００３９】
図３と図４を比較することにより、電極層して同じCPを充填した一体型電極を用いた場合において、これに塗布されるインク材料がFADGDH/KBインクから、FADGDH/CPインクに変えることにより、応答電流値が690nＡから約55nＡに低下することが確認された。すなわち、同じ電極層を用いた場合に、酵素が担持されている炭素粒子は、粒径が小さいほど、また比表面積が大きいほど高い応答電流が得られることが確認された。
【実施例３】
【００４０】
同じグラッシーカーボン（GC）電極を電極層として用いて、酵素が担持される炭素粒子の比表面積の影響を見るために、炭素粒子として、上記で使用したKB以外に、粒径30  nｍ、比表面積254m２/gのバルカン(VC、Cabot社の商標)、粒径35  nｍ、比表面積68m２/gのアセチレンブラック（デンカブラック、DB、電気化学工業社の商標）およびKBからなるペーストであるライオンペースト（LP、ライオン社の商標）を用いて応答電流を測定した。【００４１】
まず、KB１００  mgにミリQ  200  μl、5  %  Nafion  1200  μlを混合したものをKBインクとし、VC１００  mgにミリQ  200  μl、5  %  Nafion  1200  μlを混合したものをVCインクとした。KBインクまたはVCインク：100  mM  p.p.b.  (pH  7.0)：  4.6  U/μl  FADGDHを1：3.8：3.2の体積比で混合したものをそれぞれKB酵素インクあるいはVC酵素インクとした。次に、DB  50  mgにミリQ  850  μl、5  %  Nafion  600  μlを混合したものをDBインクとし、DBインク：100  mM  p.p.b.  (pH  7.0)：  4.6  U/μl  FADGDHを1：1.4：1.6の体積比で混合したものをDB酵素インクとした。また、KBを主成分とするライオンペーストを用いて、ライオンペーストW-311N：5  %  Nafion：100  mM  p.p.b.（pH  7.0）：4.6  U/μｌ  FADGDHを1：1：4：4の体積比で混合したものLP酵素インクとした。さらに、炭素粒子を使用しないで、5  %  Nafion：100  mM  p.p.b.  (pH  7.0)：  4.6  U/μl  FADGDHを1：5：4の体積比で混合したものを酵素インクとした。【００４２】
KB酵素インク(図５におけるKBink)、VC酵素インク(図５におけるKBink)、DB酵素インク(図５におけるDBink)、ライオンペースト酵素インク(図５におけるLPink)または酵素インク(図５におけるink)を研磨したグラッシーカーボン（GC）電極（φ  3  mm）に5  μlを滴下し、4  ℃で2時間乾燥させた。この電極を25  ％グルタルアルデヒド溶液の蒸気を用いて30分間架橋処理した後、10  mM  Tris-HCｌ（ｐH  7.0）に20分間浸漬した。この電極を100  mM  p.p.b.（ｐH  7.0）に浸漬して4  ℃で一晩平衡化した。作製した酵素電極を作用極、Ptを対極、Ag/AgClを参照極とした3電極方式で、100  mM  p.p.b.（pH  7.0）  10  mlを反応溶液とし、+250  mV  vs.  Ag/AgClの電位を印加した際のグルコース添加に伴う応答電流値を測定３、キャリブレーションカーブを作製した（150  rpm、37  ℃)。【００４３】
このようにして作成した酵素電極を用いてグルコースを計測した結果を図５に示した。グルコース濃度の上昇とともにいずれの酵素電極においても電流の増加が観測された。その中で、KB酵素インクおよびライオンペースト酵素インクを用いた場合は同等でかつ、他のインクに比べずばぬけて高い応答が得られた。VC酵素インクを用いた場合も前2者には劣るものの、実用上問題のない高い応答が得られた。これに対して、DB酵素インクを用いた場合には炭素粒子を使用しない酵素インクを用いた場合と同等の低いシグナルしか得られなかった。これらのセンサのグルコース濃度５mMにおける応答電流値と用いているインクの炭素粒子の比表面積との相関を図６に示す。比表面積254m２/gのバルカン(VC)では、ほぼ満足する応答電流が得られるのに対し、比表面積68m２/gの  アセチレンブラックでは、満足する応答電流が得られなかった。こように、応答電流値は用いる炭素粒子の比表面積と高い相関があり、比表面積が少なくとも200m2／g以上である炭素粒子を使用することが必要であることが示された。また、粒径は、いずれも100nm以下であることが必要とされた。
【実施例４】
【００４４】
5  %  Nafion：ライオンペーストW-311NあるいはW-370C：100  mM  p.p.b.（pH  7.0）：8.4U/μｌADGDHを  1：1：4：4の体積比でそれぞれ混合し、酵素インクとした。各酵素インクを、研磨したグラッシーカーボン（GC）電極（φ3  mm）にFADGDHの量が17  U（2.4  U/mm2）となるように滴下し、4  ℃で2時間乾燥させた。この電極を25  ％グルタルアルデヒド溶液の蒸気を用いて30分間架橋処理し、10  mMTris-HCｌ（ｐH  7.0）に室温で20分間浸漬して未反応のグルタルアルデヒドを除去し、さらに100  mM  p.p.b.（ｐH  7.0）に30分間浸漬して平衡化した。これらを作用極、白金線を対極、Ag/AgCl参照電極を参照極とし、100mM  p.p.b.（pH  7.0）  10  mlを反応溶液として、+250  mV  vs.  Ag/AgClの電位を印加した際のグルコース添加に伴う応答電流値を測定した。測定は、反応溶液を250  rpmで撹拌し、37  ℃で行った。応答電流値は、各グルコース濃度において測定された定常電流値からグルコース0  mMにおいて得られた定常電流値を差し引いたものとした。【００４５】
このようにして作成した酵素電極を用いてグルコースを計測した結果を図７に示した。グルコース濃度の上昇とともに電流の増加が観測された。酵素層に用いる炭素粒子としてライオンペーストW-311NあるいはW-370Cを用いた場合にグルコース濃度5mMで観測された電流密度はそれぞれ1684  nA/mm2、1452  nA/mm2であった。KBを主成分とするライオンペーストの場合、製品の種類に限らず、高い応答電流が得られることが確認された。
【実施例５】
【００４６】
炭素粒子として、粒径30  nm、比表面積254  m2/gのバルカン（VULCAN:VC）を用意した。VC  100  mgにミリQ  水400  μl、5  %  Nafion（1−プロパノール48％水溶液）  1  mlを加えよく混合した後、3日間静置したものをVCインクとし、VCインク10  μlに100  mM  p.p.b.(pH  7.0)  10  μl、8.4  U/ml  FADGDH  40  μlを混合したものをFADGDH/VULインクとした。VCを電極材料として充填した一体型電極（φ0.75  mm）にFADGDH/VCインクを25  U/mm2となるように滴下し、4  ℃で2時間乾燥させた。作製した酵素電極を作用極、Ptを対極、Ag/AgCl参照電極を参照極とした。3電極方式で、100  mM  p.p.b.（pH  7.0）  10  mlを反応溶液とし、+250  mV  vs.  Ag/AgClの電位を印加した際のグルコース添加に伴う応答電流値を測定した結果を図5に示す。測定は、反応溶液を250  rpmで撹拌し、37  ℃で行った。応答電流値は、各グルコース濃度において測定された電流値からグルコース0  mMにおいて得られた電流値を差し引いたものとした。【００４７】
図８に示されるように、グルコース濃度を徐々に高めていくことで、観測される電流値は増加した。グルコースの終濃度  55  mMにおける応答電流値はそれぞれ約3500nＡであった。5mMグルコースにおける電流密度は2327  nA/mm2であった。以上のように、粒径30  nm、比表面積254  m2/gのVCを用いたVCインクでは、電極層が実施例３に示されるようにグラッシックカーボンであっても、また、本実施例のようにVCであっても、満足する応答電流が得られることが確認できた。【００４８】
以上のように、電極層、酵素層を共に炭素粒子を使用した場合、同じ種類の炭素粒子を電極層に使用すれば、酵素層に使用する炭素粒子の粒径が小さいほど、また比表面積が大きいほど高い応答電流が得られ、特に、粒径１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上である炭素粒子を使用すれば、満足する応答電流が得られることが確認された。また、同じ種類の炭素粒子を酵素層に使用した場合には、電極層に使用する炭素粒子の粒径が小さいほど、また比表面積が大きいほど高い応答電流が得られ、特に、粒径１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ2／ｇ以上である炭素粒子を使用すると応答電流が向上することが確認された。【００４９】
電極層として金属ワイヤーを使用する場合の実施例  
次に、電極層として金属ワイヤーを使用し、酵素層としてLPインクを使用した場合の実施例を示す。
【実施例６】
【００５０】
金ワイヤー（φ0.5  mm）をピランハ溶液（過酸化水素：濃硫酸=1：3）に5分間×3回浸漬し洗浄した。この金ワイヤーに、ライオンペーストW-311Nを用いて実施例４の説明に記した同様の条件で作製した酵素インクを塗布し、4  ℃で2時間乾燥させた。この電極を実施例４の説明に記した同様の方法で架橋処理、平衡化して作用極とし、対極として何も塗布していない金ワイヤー、参照極としてAg/AｇCl参照電極を用いた3電極方式で、実施例４の説明と同様にグルコース添加に伴う応答電流値を測定した。【００５１】
このようにして作成した酵素電極を用いてグルコースを計測した結果を図9に示した。グルコース濃度の上昇とともに電流の増加が観測された。5  mMグルコースにおける電流密度は20１  nA/mm2であった。
【実施例７】
【００５２】
5  %  Nafion：ライオンペーストW-311N：100  mM  p.p.b.（pH  7.0）：8.4  U/μｌ  FADGDHを1：1：4：4の体積比で混合し、酵素インクとした。酵素インクにステンレスワイヤーφ0.5  mmの先端10  mmに塗布し、4  ℃で2時間乾燥させた。このステンレスワイヤーを25  ％グルタルアルデヒド溶液の蒸気を用いて30分間架橋処理し、10  mM  Tris-HCｌ（ｐH  7.0）に室温で20分間浸漬して未反応のグルタルアルデヒドを除去し、さらに100  mM  p.p.b.（ｐH  7.0）に1時間浸漬して平衡化した。これを作用極、白金線を対極、Ag/AgClを参照極とし、100  mM  p.p.b.（pH  7.0）  10  mlを反応溶液として、+400mV  vs.  Ag/AgClの電位を印加した際のグルコース添加に伴う応答電流値を測定した。測定は、反応溶液を250  rpmで撹拌し、37  ℃で行った。応答電流値は、各グルコース濃度において測定された定常電流値からグルコース0  mMにおいて得られた定常電流値を差し引いたものとした。【００５３】
酵素を固定した各ステンレスワイヤーを作用極とした際の、グルコース添加に伴う応答電流値を図10に示した。グルコース濃度の上昇とともに電流の増加が観測された。5  mMグルコースにおける電流密度は232  nA/mm2であった。
【実施例８】
【００５４】
ステンレス製一体型電極の先端のステンレス部位（0.165  mm2）を作用極、もう一方のステンレス部位（0.942  mm2）を対極として用いることとする。5  %  Nafion：ライオンペーストW-311N：100  mM  p.p.b.（pH  7.0）：8.4  U/μｌ  FADGDHを1：1：4：4の体積比で混合した酵素インクに、作用極を浸漬し、その後、4  ℃で2時間乾燥させた。この電極を25  ％グルタルアルデヒド溶液の蒸気を用いて30分間架橋処理した後、100  mM  p.p.b.（ｐH  7.0）に30分間浸漬して平衡化した。この電極をポテンシオスタットを用い、Ag/AgClを参照極とした3電極方式で+400  mV  vs.Ag/AgClを印加した際のグルコース添加に伴う応答電流値を測定した。測定は、100  mM  p.p.b.（pH  7.0）  10  mlを反応溶液とし、撹拌速度150rpm、37  ℃で行った。応答電流値は、各グルコース濃度において測定された定常電流値からグルコース0  mMにおいて得られた定常電流値を差し引いたものとした。【００５５】
作製したステンレス製一体型電極の、グルコースに対する応答電流値のキャリブレーションカーブを図11に示す。電極方式での測定で、5  mMグルコースに対する応答電流値は134  nA/mm2であった。この値は、0.5  ｍｍのステンレスワイヤーを用いて試作した酵素電極実施例７から得られた値と同程度である。このことから、このステンレス製一体型電極を用いたグルコースセンサが構築できた。【００５６】
酵素電極の作製例
【実施例９】
【００５７】
図12に示すような炭素粒子がポリマー基板に担持されて作成されている市販の電極（（有）バイオデバイステクノロジー社製  DepChip丸型カーボン電極）に酵素インクを塗布することで酵素電極を構築した。酵素インクとしては、5  %  Nafion：ライオンペーストW-311N：100  mM  p.p.b.（pH  7.0）：4.0  U/μｌ  FADGDHを1：1：1：7の体積比で混合したものを使用した。この酵素インクを1.5μリットルを図12の電極に塗布し、その後、4℃で2時間乾燥させた。この電極をポテンシオスタットを用い、同電極上のAg/AgClを参照極とした3電極方式で+250  mV  vs.Ag/AgClを印加した際のグルコース添加に伴う応答電流値を測定した。【００５８】
測定はまず電位を電極に印加しない状態で100  mM  p.p.b.（pH  7.0）に溶解した種々の濃度のグルコースを含む試料溶液５μlを酵素電極に滴下した。５秒後、ポテンシオスタットを用い、同電極上のAg/AgClを参照極とした3電極方式で+250  mV  vs.Ag/AgClを印加した。種々の濃度を含む試料を添加したときに観察される電流値変化を図13に示す。このように添加するグルコース濃度によって観察される電流値が異なる。電位印加後、５秒後の電流値を指標としてグルコース濃度との相関を検討した。縦軸に、５秒後の電流値を、横軸に試料中のグルコース濃度をとったグラフを図14に示す。このように、本酵素電極を用いて、電子メディエータを加えることなく、グルコース濃度が計測できた。【００５９】
以上の実施例は、本発明の例示であって、ここに示した実施例以外の材料、条件を用いても本発明の特許請求の範囲に包含され限り、同様の効果を奏するものであり、また、他の様々な変更、改良等が可能であることはいうまでもない。例えば、本発明のインク材料を用いた酵素電極は、詳述したようにグルコースセンサにおける作用極として用いることができ、また、グルコースを燃料とする燃料電池におけるアノード触媒として好ましく応用することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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