(57)【要約】  カンプトテシン誘導体のサブクラスは、薬物耐性腫瘍を治療する、および／またはDNAトポイソメラーゼIをコードする遺伝子に多型を示す患者に投与するための医薬の調製に有用であることを開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物耐性腫瘍を治療する、および／またはDNAトポイソメラーゼIをコードする遺伝子に多型を示す患者に投与するための医薬を調製するための、式Iの化合物の使用：
【化１】
2009520754.tif 000005
［式中、Rは水素またはC1-C4アルキルである］。
【請求項２】
Rが水素またはメチルである、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
薬物耐性腫瘍が以下を含む群から選択される、請求項1または2に記載の使用：肉腫、癌腫、カルチノイド骨腫瘍、神経内分泌腫瘍、リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、骨髄性白血病、単球性白血病、巨核芽球性白血病およびホジキン病。
【請求項４】
腫瘍が前立腺癌である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
カンプトテシンに耐性の腫瘍を治療する、および／またはDNAトポイソメラーゼIをコードする遺伝子に多型を示す患者に投与するための医薬組成物を調製する方法であって、式Iの化合物を製薬的に許容される担体および／または賦形剤と混合することを含む方法：
【化２】
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［式中、Rは水素またはC1-C4アルキルである］。
【請求項６】
薬物耐性腫瘍に罹患した哺乳動物を治療する、および／またはDNAトポイソメラーゼIをコードする遺伝子に多型を示す患者に投与する方法であって、治療上有効量の式Iの化合物または製薬的に許容される担体および／または賦形剤を含有する医薬組成物を投与することを含む方法：
【化３】
2009520754.tif 000007
［式中、Rは水素またはC1-C4アルキルである］。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物耐性腫瘍を治療する、および／またはDNAトポイソメラーゼI（topoisomerase I）をコードする遺伝子に多型を示す患者へ投与するための医薬を調製するための、カンプトテシン（camptothecin）誘導体のサブクラスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンプトテシン誘導体は、優れた部類の抗癌剤として現れたDNA-トポイソメラーゼI阻害剤である。トポイソメラーゼI阻害剤は、タキサン（taxane）類とともに、おそらく臨床診療に導入されている最も重要な新しい部類の抗癌剤である。臨床前試験において、カンプトテシンおよびその誘導体などのトポイソメラーゼI阻害剤は、広範な腫瘍に対して顕著なイン・ビトロおよびイン・ビボ活性を示している。臨床試験の結果が将来有望とされたことは、２つのトポイソメラーゼ阻害剤、トポテカン（topotecan）およびイリノテカン（irinotecan）（CPT-11としても知られる）が、それぞれ卵巣癌および結腸直腸癌に罹患した患者の治療のために多くのヨーロッパ諸国およびアメリカ合衆国において登録されたことからも分かる。現在、他の誘導体も、様々な臨床開発段階にある。
【０００３】
欧州特許第1044977号明細書およびJ. Med. Chem. 2001, 44, 3264-3274において、7位にてO-置換されたアルキルオキシムを有し、参照化合物のトポテカンよりも高い抗腫瘍活性を有するカンプトテシン誘導体が記載されている。さらに、7位にイミノ基を有するこれらのカンプトテシン誘導体は、改善された治療指数を示す。これらの化合物のうち、好ましい分子の１つは7-t-ブトキシイミノメチルカンプトテシン（CPT 184、ST1481またはギマテカン（gimatecan）としても知られる）であることが示されている。
【０００４】
カンプトテシン類似体類の主な特性は、DNAトポイソメラーゼIに対する活性であるが、これらの化合物のこの類似点以外に関しては、抗腫瘍活性、薬理学および代謝の観点において広範に異なっている。動物モデルにおいてはカンプトテシン類は良好な耐容性および有効性を示すにもかかわらず、臨床使用においては、緩徐に成長する腫瘍に対する効果を妨げる、三元複合体（薬物−酵素−DNA）における薬物相互作用の可逆性、およびラクトン環の不安定性とあいまって、治療指数が低いことが主な弱点として残っている。最後に、カンプトテシン類の抗腫瘍活性は、薬物投与計画に強く依存し、実際に、低用量にて投与を延長する計画、または頻繁な間欠投薬計画のいずれかが要求されることが、実験モデルにより示されている。
【０００５】
癌の新薬が開発され、その結果、現在いくつかの悪性腫瘍は根治可能であるが、カンプトテシン誘導体を含む化学療法に対する薬物耐性が、いくつかのヒト腫瘍の治療において主な制限因子となっており、原発性および再発性の難治性症例が未だ多数存在する。DNAトポイソメラーゼIは、トポテカンまたはCPT-11に対する先天性または後天性耐性のメカニズムを明らかにするために近年調査されており、ヒトトポイソメラーゼIのいくつかの領域にカンプトテシン誘導体に対する耐性に影響する変異がいくつか同定された（Benedetti et al. 1993. Cancer Res 53. 4343; Fiorani et al. J Biol.Chem.2003;Oct31;278（44）:43268-75; Chrencik et al. 2004; JMB 339, 773-784）。
【０００６】
さらに、NSCLC患者のCPT-11による化学療法の後にトポイソメラーゼIの変異が生じたことは、一部の患者におけるイリノテカンへの耐性の発達は、トポイソメラーゼIの変異と関係している可能性があることを示唆している（Tsurutani et al. 2002 Lung cancer 35. 299-304）。
【０００７】
CPT耐性におけるトポイソメラーゼIの変異の重要性はさらに調べる必要があるが、典型的な薬理学的特性に加えて、変異したトポイソメラーゼIに対して活性を示すカンプトテシン誘導体を得ることは、大きな臨床的関心事であると考えられる。
【発明の開示】
【０００８】
［発明の説明］
野生型トポイソメラーゼI、およびカンプトテシン誘導体（すなわちカンプトテシン、トポテカン、SN-38）に耐性を持つ２つの変異型ヒトトポイソメラーゼIを用いて、発明者らは、いくつかのカンプトテシン誘導体（ST1968およびST1969についての結果を参照）が、野生型トポイソメラーゼIのみならず変異型ヒトトポイソメラーゼIも阻害することができることを驚くべきことに発見した。
【０００９】
従って、本発明の主目的は、薬物耐性腫瘍を治療する、および／またはDNAトポイソメラーゼIをコードする遺伝子に多型を示す患者に投与するための医薬を調製するための、式Iの化合物の使用である：
【化１】
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［式中、Rは水素またはC1-C4アルキルである］。
【００１０】
DNAトポイソメラーゼIをコードする遺伝子におけるかかる多型は、天然であり得、または、一部の患者においては薬品治療に対して、例えばカンプトテシンによる処置に対してさらに増大し得る。
【００１１】
式（Ｉ）の化合物はまた、式（Ｉ）の化合物の互変異性体、幾何異性体、エナンチオマー、ジアステレオマーおよびラセミ体のような光学活性型、ならびに製薬的に許容される塩も含む。
【００１２】
式（Ｉ）の化合物の好ましい製薬的に許容される塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩または重硫酸塩、リン酸塩またはリン酸水素塩、酢酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩およびパラ-トルエンスルホン酸塩のような、製薬的に許容される酸により形成される酸付加塩である。
【００１３】
好ましくはRは水素またはメチルである。
【００１４】
好ましい式（Ｉ）の化合物は、7-（2-アミノ）エトキシイミノメチルカンプトテシン（ST1968、CPT188としても知られる）および7-（2-ジメチルアミノ）エトキシイミノメチルカンプトテシン（ST1969）である。
【００１５】
本発明により治療することができる薬物耐性腫瘍の病態は、以下からなる群から選択される：肉腫、卵巣癌、特に前立腺癌、カルチノイド骨腫瘍、神経内分泌腫瘍、リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、骨髄性白血病、単球性白血病、巨核芽球性白血病およびホジキン病。
【００１６】
式（Ｉ）の化合物は、容易に入手できる出発物質から、以下の一般的な方法および手順を用いて調製することができる。典型的なまたは好ましい実験条件（つまり反応温度、時間、試薬のモル数、溶媒など）が記載されている場合、特に断りのない限り、他の実験条件も用いることができると解釈されたい。最適な反応条件は、具体的に用いる反応物または溶媒によって変化しうるが、そのような条件は日常的な最適化の手順により当業者によって決定することができる。詳しくは、欧州特許第1044977号明細書およびJ. Med. Chem. 2001, 44, 3264-3274に記載の方法を参照のこと。
【００１７】
薬物耐性腫瘍の病態に罹患した哺乳動物を治療する方法であって、治療上有効量の上記式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法は、本発明の代表的な一局面である。
【００１８】
従って、本発明によると、腫瘍病態に罹患しており、カンプトテシン（例えばイリノテカン、トポテカン、ギマテカン）、白金錯体（例えばカルボプラチン（carboplatin））またはタキサン（例えばパクリタキセル（paclitaxel）、ドセタキセル（docetaxel））などの一般的な抗腫瘍処方薬による処置に耐性であると診断された患者は、式（Ｉ）の化合物により成功裡に治療できる可能性がある。
「治療上有効量」なる用語は本明細書にて用いる場合、標的とした疾患または状態を治療する、改善させるのに必要な、または検出可能な治療効果を示すのに必要な治療剤の量を意味する。
【００１９】
あらゆる化合物について、治療上有効用量は、まず初めに例えば腫瘍細胞の細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常マウスまたはラットにおいて推定することができる。
【００２０】
動物モデルは、適切な濃度範囲および投与経路の決定にも用いることができる。そのような情報は、後にヒトにおいて有用な用量および投与経路を決定する際に利用することができる。
【００２１】
ヒト対象のための正確な有効量は、疾患状態の重症度、対象の一般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食餌、投与期間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感度および治療に対する耐性／反応性に依拠するであろう。この量は日常実験により決定でき、臨床医の判断の範疇である。一般に、有効用量は0.01 mg/kgから100 mg/kg、好ましくは0.05 mg/kgから50 mg/kgであろう。組成物は患者に個々に投与してもよく、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて投与してもよい。
【００２２】
本医薬は、治療剤の投与のための製薬的に許容される担体も含み得る。そのような担体は、抗体および他のポリペプチド、遺伝子およびリポソームなどの他の治療剤を含み、ただし、担体それ自体は、組成物を投与した個体において有害な抗体の産生を誘導せず、かつ過度の毒性を伴わず投与され得るものである。
【００２３】
適切な担体は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体および不活性ウイルス粒子などの、大きく、緩徐に代謝される高分子であり得る。
【００２４】
製薬的に許容される担体についての徹底的な議論は「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Pub. Co. , N. J.1991）に見ることができる。
【００２５】
治療用組成物の製薬的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセリンおよびエタノールなどの液体をさらに含有し得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助剤も、かかる組成物に含有され得る。患者による接種のために、そのような担体により、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。
【００２６】
ひとたび製剤化すれば、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。処置する対象は動物であり得；特にヒト対象を処置することができる。
【００２７】
本発明の医薬は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（transdermalまたはtranscutaneous）適用、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内、直腸手段、または外科術後の疾患組織上に局所的に投与することを含むがこれらに限定されない不特定多数の経路により投与され得る。
【００２８】
投与の処置は、単回投与計画であっても、または複数回投与計画であってもよい。
【００２９】
ここで、限定する意味ではない実施例および図面により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３０】
［実施例１］
ヒトDNAトポイソメラーゼIの野生型またはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において発現した変異体に対するいくつかのカンプトテシン誘導体のイン・ビボにおける効果。
【００３１】
方法
野生型ヒトトポイソメラーゼI（hTOP1）および変異型トポイソメラーゼIをクローニングするために用いたサッカロマイセス・セレビシエ株は：EKY2（MATα、ura3-52、his3Δ200、leu 2Δ1、trp1Δα63、top1::TPR1）であり、Bjornsti et al 1989 （Cancer Res. 49, 6318-6323）に記載されている。野生型完全長ヒトトポイソメラーゼIを担持するよう酵母を形質転換するために用いたプラスミド（YCpGAL1hTOP1）は、Bjornsti et al 1989 （Cancer Res. 49, 6318-6323）に記載されており、変異型トポイソメラーゼI YCpGAL1htop1K720Eは、Fiorani et al.1998（J.Biol.Chem. 14, 8425-8433）に記載の方法を用いてオリゴヌクレオチド特異的（directed）突然変異誘発により作製し：両プラスミドにおいて、トポイソメラーゼ発現は、酵母のGAL1のガラクトース誘導性プロモーターの制御下にあった。
【００３２】
酵母細胞をDNAにより形質転換する前に（酢酸リチウム法）、酵母を固体培地上にて成長させた。滅菌固体培地（YPDA）（1リットルにつき酵母10 g、ペプトン20 g、デキストロース20 g、アデニン0.7 g、グルコース20 g、寒天20 g）を含有する90 mmプレート上にその培養した酵母をストリークした。その後48時間コロニーを30℃にて成長させた。形質転換の１日前に、形質転換すべき株の単一の酵母コロニーを滅菌液体YPDA（上述の培地の寒天を含まないもの）5 ml中に播種した。コロニーを30℃にて攪拌しながら一晩飽和状態まで成長させた。翌日、飽和培養物5 mlをYPDA液体培地100 mlに希釈し、600 nmにおける光学密度が1.0に達するまで30℃にて成長させた。細胞を室温で4000 x gにて5分間遠心分離し、生じたペレットを10 mM トリス-EDTA pH7.5、1 mM EDTAおよび100 mM酢酸リチウムを含有する溶液（T/E）25 mlに再懸濁した。酵母懸濁液を室温で4000 x gにて5分間遠心分離した。生じたペレットを新しい上記溶液（約 500μl）に再懸濁して2x109細胞／mlの懸濁液を得た。形質転換を行うために、エッペンドルフチューブ中にてトランスフォーミングDNA 1μgおよび酵母細胞200μlと、DNA担体200μgとを混合した。次いで、40％PEGを含有するTE／酢酸リチウム溶液1.2 mlを加え、酵母懸濁液を30℃にて30分間攪拌した。酵母懸濁液を42℃に15分間おいて熱ショックを行った。次いで、室温にて5秒間遠心分離した。酵母をTE緩衝液に再懸濁し、プレートのCM（完全最小）ドロップアウト（dropout）培地上に広げた。１リットルに付き、種々のアミノ酸を含有するウラシル不含ドロップアウトパウダー1.3 g、アミノ酸および硫酸アンモニウム不含酵母ニトロゲンベース（yeast nitrogen base）1.7 g、硫酸アンモニウム5 g、グルコース20 gおよび寒天20により、CMを予め調製しておいた。形質転換体が生じるまでプレートを30℃にてインキュベートした。
【００３３】
イン・ビボにおけるスポット試験を行うために、滅菌液体CM培地5 mlに形質転換体を播種し、30℃にて一晩攪拌して成長させた。翌日、酵母コロニーを600 nmにおける光学密度が0.3に達するまで希釈した。この初めの希釈の次に、96ウェルプレートにおいて他の連続希釈（1:10、1:100、1:1000）を行った。固体CM培地を含有する90 mmプレート上に各希釈分から5μlをおいた。対照サンプルについては、2％グルコースまたは2％ガラクトースを加え；カンプトテシン誘導体処理サンプルについては2％ガラクトースおよび濃度45μMの薬物を加えた。酵母コロニーを48-72時間30℃にてインキュベートし、肉眼にて分析した。
【００３４】
結果
カンプトテシン誘導体の活性を、ヒトDNAトポイソメラーゼI野生型（YCpGAL1hTOP1）またはヒトDNAトポイソメラーゼI変異体YCpGAL1htop1K720Eにより形質転換した酵母細胞の生存率について、寒天中の酵母成長コロニー数によって評価した。ST1968、ST1969、ST1481（ギマテカン）、ST1600（7-［2-（4-モルホリニル）エトキシ］イミノメチルカンプトテシン）およびST1976（7-（4-アミノ）ベンジルオキシイミノメチルカンプトテシン）およびカンプトテシン（CPT）は、DNAトポイソメラーゼI野生型により形質転換した酵母の成長を阻害することが示された（図１）。驚くべきことに、ST1968およびST1969のみがYCpGAL1htop1K720E形質転換変異体の成長を阻害することができた（図１を参照）。
【００３５】
YcpGal1hTOP1（WT）、YcpGal1htop1K720EおよびYcpGal1（空のベクター）により形質転換した酵母細胞の培養物を、連続的に希釈し（左から右へ10倍希釈）、2％ガラクトースならびに45μMカンプトテシン、ST1481、ST1968、ST1969、ST1600およびST1976を含有するウラシル不含最小寒天プレート上にスポットした。
【００３６】
［実施例２］
薬物耐性腫瘍異種移植モデルに対するイン・ビボ抗腫瘍活性
ST1968は、種々の耐性異種移植腫瘍モデルに対して広範に有効性を示した。以下を含む種々のヒト腫瘍モデルに対して、q4d投与計画を採用して投与を3-5回繰り返し、イリノテカンまたは他の既知の化学療法薬と、ST1968とを比較した（表２）：PgP糖タンパク質を過剰発現するA2780/ADR多剤耐性卵巣癌、A2780/DDP白金耐性卵巣癌、および親の感受性DU145を9-ニトロ-カンプトテシンへ連続的に曝露することにより予め選択したDU145RC1カンプトテシン耐性前立腺癌（Urasaki Y et al., 2001, Cancer Res 61, 1964-9）。この選択した腫瘍細胞株において、アルギニン364コドンがヒスチジンに変化した（R364H）トポイソメラーゼIの変異を発見した。364H点変異は、高度に保存されたコアである、トポイソメラーゼIのカンプトテシン耐性に重要なアミノ酸残基361-364内領域に位置していた。さらに、この変異部位は、触媒性チロシンに近接している。トポイソメラーゼI／R364Hの耐性はおそらく、R364とカンプトテシンE環ラクトン部分の間に決め手となるH結合が欠損していることに起因している。
【００３７】
方法
指数関数的増殖期の腫瘍細胞を胸腺欠損ヌードマウスにs.c.注射した。成長曲線により腫瘍細胞数を予め選択しておいた。ステンレス鋼にて被覆した餌供給装置および滅菌した埃のない寝わらの塊（bedding cob）を備えたマクロロン（makrolon）のケージ（33.2 x 15 x 13 cm）の中にマウスを収容した。動物を明暗サイクル下におき、温度と湿度を一定に保った。動物の部屋のパラメーターを評価したところ、以下の通りであった：温度22±2℃、相対湿度55±10％、フィルターを通した空気の交換約15-20回／時および12時間の人工光の概日サイクル（午前7時、午後7時）。要請により、環境条件をモニターし、データを動物住居アーカイブ（Animal Housing Archives）に保存した。飲用水は自由に飲めるよう不断に供給した。実験を通じて、各マウスに完全固形飼料（complete pellet diet）（GLP 4RF21, Mucedola）を毎日与えた。動物食および水の分析証明書はSigma-Tauの施設内に保管している。全ての動物は、実験開始前に体重を量り、投与量ごとにグループ分けした。各ケージは以下を記した紙のタグにより同定した：ケージ番号、グループ、腫瘍注射の日、処置の開始日、試験物質の名称、投与用量および経路、屠殺日。
【００３８】
週に２回（biweekly）腫瘍の直径をノギスにより測定して腫瘍成長を追跡した。腫瘍体積（TV、mm3）は以下のように算出した：［長さ（mm） x 幅（mm）2］／2（ここで、幅および長さはそれぞれ各腫瘍において最も短い直径および最も長い直径である）。
【００３９】
薬物処置の有効性を以下のように評価した：a）次のように算出した対照マウスに対する処置マウスの腫瘍体積抑制率（TVI％）：100−［（処置動物の平均腫瘍体積／対照動物の平均腫瘍体積）x100］；b）次の式により算出したLCK（log10細胞死）：式LCK＝（T−C）／3.32 x DT（ここでTおよびCはそれぞれ、処置（T）および対照（C）腫瘍が1000 mm3に達するのに要した平均時間（日）であり、DTは対照腫瘍の体積倍増時間である）；CRは少なくとも10日間腫瘍の証拠がない状態が続いたことを意味する。
【００４０】
薬物処置の毒性は以下のように測定した：体重損失率（最大BWL％）＝100−（x日目の平均BW／1日目の平均BW x 100）（ここで、x日目のBWは、処置期間中の最大損失日の平均体重であり、1日目のBWは処置の初日の平均体重である）。
【００４１】
結果
３つの異なる耐性腫瘍異種移植モデルに対する腫瘍体積抑制（TVI％）または対数細胞死（LCK）または完全寛解（CR）についてのST1968の有効性は、イリノテカンまたはトポテカンまたはパクリタキセルおよびカルボプラチンのような化学療法薬と比較して実質的に改善されたものであった（表2を参照）。特に、ST1968は、最後の処置から少なくとも10日間の完全寛解数において、より高い抗腫瘍効果を示した。さらにST1968は他の薬物に見られるよりもLCKがより高かったことから、処置終了後の腫瘍成長に対しても高持続性の作用があることが分かった。
【００４２】
驚くべきことに、変異型トポイソメラーゼI DU145RC.1に対する腫瘍体積抑制（TVI％）または対数細胞死（LCK）についてのST1968の有効性は、DU145感受性前立腺癌に対して観察されたものよりも増大していた。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ヒトDNAトポイソメラーゼIの野生型または酵母サッカロマイセス・セレビシエにおいて発現された変異体に対するいくつかのカンプトテシン誘導体のイン・ビボにおける効果を示す。YcpGal1hTOP1（WT）、YcpGal1htop1K720EおよびYcpGal1（空のベクター）により形質転換した酵母細胞の培養物を連続的に希釈し（左から右へ10倍希釈）、2％ガラクトースおよび45μMのカンプトテシン、ST1481、ST1968、ST1969、ST1600およびST1976を含有するウラシル不含最小寒天プレート上にスポットした。
【図１】
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【国際調査報告】
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