(57)【要約】ヒト肝幹細胞を提供する。CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞。その調製方法、分化誘導方法及び利用方法なども提供される。
2009139419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞。
【請求項２】
CD318+の表現型を有する請求項１記載のヒト肝幹細胞。
【請求項３】
CD90+の表現型を有する請求項１又は２記載のヒト肝幹細胞。
【請求項４】
CD66-の表現型を有する請求項１〜３のいずれかに記載のヒト肝幹細胞。
【請求項５】
CD318+CD90+CD66-の表現型を有する請求項１記載のヒト肝幹細胞。
【請求項６】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-11108として受託されている細胞クローンLSC-E2である請求項５記載のヒト肝幹細胞。
【請求項７】
CD13+の表現型を有する請求項１〜６のいずれかに記載のヒト肝幹細胞。
【請求項８】
CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞クローンを増殖させて細胞集団とし、この細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取することにより得られた細胞又はその子孫である請求項１記載のヒト肝幹細胞。
【請求項９】
請求項１記載のヒト肝幹細胞にBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞。
【請求項１０】
ヒト肝細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取することを含む、請求項１記載のヒト肝幹細胞の調製方法。
【請求項１１】
ヒト肝細胞集団が、ヒト肝臓から分離した初代肝細胞培養系である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ヒト肝細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取した後に、細胞を増殖させて細胞集団とし、この細胞集団から、再度、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取することを含む請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
細胞の分取と増殖を２回以上繰り返す請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１記載のヒト肝幹細胞及び／又は請求項９記載の形質転換細胞の分化を誘導することにより、薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞を調製する方法。
【請求項１５】
細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子で処理することにより、請求項１記載のヒト組織幹細胞及び／又は請求項９記載の形質転換細胞の分化を誘導する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子が、Laminin, Type I-Collagen, Type IV-Collagen, Fibronectin, Metrigel, Dexamethasone, DMSO, Oncostatin M, Insulin, HGF, EGF, TGFα, HB-EGF, VEGF及びPDGFからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
三次元培養を行うことにより、請求項１記載のヒト組織幹細胞及び／又は請求項９記載の形質転換細胞の分化を誘導する請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４記載の方法で調製した、薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞。
【請求項１９】
薬物代謝酵素が、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2B6、CYP2E1及びCYP2A6から成る群より選択される少なくとも１つである請求項１８記載の肝細胞。
【請求項２０】
トランスポーターが、ABC2、ABCA6、ABCA8、MDR1、MDR3、BSEP、MRP1、MRP2、MRP5、MRP6、ABCG8、NTCP、PEPT1、OATP-C、OATP8、OATP-B、OATP-F、OCT1、OAT2、SLC22A18、CNT1、ENT1、MATE1、MRP3及びBCRPから成る群より選択される少なくとも１つである請求項１８記載の肝細胞。
【請求項２１】
請求項１８記載の肝細胞を用いて、薬の候補化合物の代謝及び/又は輸送を評価する方法。
【請求項２２】
請求項１記載のヒト肝幹細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含むバイオリアクター。
【請求項２３】
人工肝臓として利用される請求項２２記載のバイオリアクター。
【請求項２４】
請求項１記載のヒト肝幹細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含む、ＨＣＶ感染及び／又は複製阻害実験のためのヒトモデル細胞。
【請求項２５】
請求項１記載のヒト肝幹細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含む、糖代謝実験のためのヒトモデル細胞。
【請求項２６】
請求項１記載のヒト肝幹細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含む、脂質代謝実験のためのヒトモデル細胞。
【請求項２７】
請求項１記載のヒト肝幹細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を再生医療において使用する方法。
【請求項２８】
再生医療が細胞治療である請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝幹細胞、その調製方法、分化誘導方法及び利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、幹細胞の分離には、遠心分離法が用いられていた（非特許文献１）。しかし、この方法では幹細胞以外の細胞が混入しやすく、効率よく分離することが困難であった。そこで、より高効率で幹細胞のみを分離する方法の開発が進められてきた。近年の報告によると、各臓器の幹細胞に特異的な細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を利用する分離方法が最も適切であると考えられ、造血幹細胞の分離に頻用されている。肝幹細胞に特異的な細胞表面抗原に関しては、これまで同定されていなかったが、本発明者らのグループにより、５〜６種類の細胞表面抗原の発現を指標として、マウス肝臓から肝幹細胞を濃縮する方法が報告されている（非特許文献２及び３）。宮島らは、マウス胎児および成体肝臓中の肝幹細胞では、dlk(delta-like)やItm2A(Integral membrane protein 2A)遺伝子が特異的に高発現しており、これらのタンパク・mRNAの発現を指標として、肝幹細胞の検出または分離を行うことが可能であることを報告している（特許文献１）。さらに、特異的な糖鎖の発現に基づいてラット肝幹細胞を分離することができることも報告されている（特許文献２）。【０００３】
また、外胚葉系組織における幹細胞のマーカータンパク質と考えられてきたp75NTRが、あらゆる組織において合成されていることが報告され、これを既知のマーカータンパク質と組み合わせると、多能性幹細胞の分離・同定・分化誘導の効率が向上するとされている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Van den Bos, C, et al, Human Cell 1997,10, 45-50
【非特許文献２】Suzuki A et al, Hepatology2000, 32:1230-39
【非特許文献３】Suzuki A et al, J Cell Biology2002,156(1):173-84
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2004-187679公報
【特許文献２】特開2004-344031公報
【特許文献３】特開2006-230235公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肝幹細胞を認識する分子マーカーの同定や解析が進められ、その分離・培養方法が報告されている。しかし、従来の報告はラットあるいはマウス肝幹細胞に関するものであり、ヒト肝幹細胞を対象とした報告はない。実際に、本発明者らは従来のマウスやラットで報告されている肝幹細胞マーカーでは、ヒト肝幹細胞を分離することができないことを確認しており、ヒト肝幹細胞に特異的な分子マーカーを用いた分離方法を明らかにする必要性があった。【０００７】
ヒト肝細胞と実験動物の肝細胞の間では薬物代謝能が大きく異なるため、実験動物あるいはそれらから分離した肝細胞を用いた結果からヒト肝細胞における薬物代謝能を予測することは困難である。したがって、ヒト肝幹細胞を特異的に分離し、培養系においてヒト肝細胞へ分化・増殖させる技術を確立することが必要とされている。【０００８】
また、従来の報告の多くは単一マーカーによる肝幹細胞の分離方法であるが、時間や手間を省くことができる一方で、ヘテロな細胞集団の中から、少数の肝幹細胞のみを分離するための精度に欠けるという欠点がある。【０００９】
本発明は、ヒト肝幹細胞を提供することを目的とする。【００１０】
また、本発明は、ヒト肝幹細胞の調製方法、分化誘導方法及び利用方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明においては、ヒト肝臓細胞集団を対象として発現している複数の細胞表面分子を明らかにし、それらの発現を指標としたヒト肝幹細胞の分離法およびその培養法・利用法を明らかにした。まず、ヒト肝幹細胞を分離する手法として、MACS(Magnetic Cell Sorting)より高精度であるFACS(fluorescence activated cell sorting)を利用した。すなわち、複数の細胞表面分子に対する蛍光標識モノクローナル抗体を用いて細胞を画分化し、FACSで分離した後、クローン性コロニー形成能を指標として高い増殖能力を持ったヒト肝幹細胞を限定的かつ高頻度に含有する細胞画分をスクリーニングした。その結果、ヒト肝臓細胞においては、CD318+CD90+CD66-という表現型を有した細胞画分に限定して、クローン性コロニー形成能を有する細胞が高頻度に存在することが確認された。１個のCD318+CD90+CD66-細胞由来のクローン性コロニーは、3週間で6x104個以上に増殖した（倍加時間31時間）。それらの細胞では、肝細胞、胆管細胞、肝星細胞に特異的な複数の分子マーカー（Albumin, Cytokeratin8/18, Cytokeratin19, Desmin, SMA, Vimentin）が発現していることが判明したことから、CD318+CD90+CD66-細胞は肝臓を構成する複数の異なった細胞系列への多分化能を有していることが明らかとなった。【００１２】
また、FACSで分離したCD318+CD90+CD66-細胞は、肝幹細胞/前駆細胞あるいは癌幹細胞で発現している複数の分子マーカー（AFP, Bmi-1, Dlk, CD133, Vimentin）を強く発現していることが半定量RT-PCRにより確認された。以上の結果は、ヒト胎児肝臓中のCD318+CD90+CD66-細胞画分には、高い増殖能と多分化能を兼ね備えた肝幹/前駆細胞が限定的かつ高頻度に存在することを示している。【００１３】
また、分離されたCD318+CD90+CD66-細胞に、幹細胞に特徴的な自己複製能に関連していることが判明しているポリコーム群タンパク質のひとつであるBMI1遺伝子を導入し、樹立されたヒト肝幹細胞クローンを検討したところ、コロニー形成能が極めて高くなることを見出した。【００１４】
さらに、上記の方法で分離されたCD318+CD90+CD66-細胞由来のヒト肝細胞において、複数の薬物代謝酵素（CYP3A4/2D6/2C9/1A2/2C19/2A6/2B6/2E1）あるいはトランスポーター（MRP2/3, MDR1, BCRP）が発現していることを半定量PCRおよび免疫染色法により確認している。また、これらの遺伝子は、BMI1遺伝子導入ヒト肝幹細胞クローン由来のヒト肝細胞においても、同様に発現していることも確認している。【００１５】
また、FACSで分離したCD318+CD90+CD66-細胞は、C型肝炎ウイルス(HCV)受容体の候補として挙げられているCD81テトラスパニン、スカベンジャー受容体BI(SR-BI)、低比重リポタンパク(LDL)を発現していることをフローサイトメトリー解析より検出した。DNAマイクロアレイ解析より、FACSで分離した肝幹細胞のHCV受容体CD81の発現量は有意に上昇していることを確認した。【００１６】
さらに、分離されたCD318+CD90+CD66-細胞にBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞を三次元培養したもので、ヒト肝組織に相当する脂質代謝と糖新生関連遺伝子の発現が確認された。また、前記三次元培養された形質転換細胞における脂質代謝遺伝子と糖新生関連遺伝子の発現量は、ヒト肝組織の発現レベルに近似していることが確認された。【００１７】
さらにまた、FACSで分離したCD318+CD90+CD66-細胞において、CD13の発現量は初代胎児肝細胞と比べて上昇していた。【００１８】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞。
（２）CD318+の表現型を有する（１）記載のヒト肝幹細胞。
（３）CD90+の表現型を有する（１）又は（２）記載のヒト肝幹細胞。
（４）CD66-の表現型を有する（１）〜（３）のいずれかに記載のヒト肝幹細胞。
（５）CD318+CD90+CD66-の表現型を有する（１）記載のヒト肝幹細胞。
（６）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-11108として受託されている細胞クローンLSC-E2である（５）記載のヒト肝幹細胞。
（７）CD13+の表現型を有する（１）〜（６）のいずれかに記載のヒト肝幹細胞。
（８）CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞クローンを増殖させて細胞集団とし、この細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取することにより得られた細胞又はその子孫である（１）記載のヒト肝幹細胞。
（９）（１）記載のヒト肝幹細胞にBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞。
（１０）ヒト肝細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取することを含む、（１）記載のヒト肝幹細胞の調製方法。
（１１）ヒト肝細胞集団が、ヒト肝臓から分離した初代肝細胞培養系である（１０）記載の方法。
（１２）ヒト肝細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取した後に、細胞を増殖させて細胞集団とし、この細胞集団から、再度、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取することを含む（１０）記載の方法。
（１３）細胞の分取と増殖を２回以上繰り返す（１２）記載の方法。
（１４）（１）記載のヒト肝幹細胞及び／又は（９）記載の形質転換細胞の分化を誘導することにより、薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞を調製する方法。
（１５）細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子で処理することにより、（１）記載のヒト組織幹細胞及び／又は（９）記載の形質転換細胞の分化を誘導する（１４）記載の方法。
（１６）細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子が、Laminin, Type I-Collagen, Type IV-Collagen, Fibronectin, Metrigel, Dexamethasone, DMSO, Oncostatin M, Insulin, HGF, EGF, TGFα, HB-EGF, VEGF及びPDGFからなる群より選択される少なくとも１つである（１５）記載の方法。
（１７）三次元培養を行うことにより、（１）記載のヒト肝幹細胞及び／又は（９）記載の形質転換細胞の分化を誘導する（１４）記載の方法。
（１８）（１４）記載の方法で調製した、薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞。
（１９）薬物代謝酵素が、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2B6、CYP2E1及びCYP2A6から成る群より選択される少なくとも１つである（１８）記載の肝細胞。
（２０）トランスポーターが、ABC2、ABCA6、ABCA8、MDR1、MDR3、BSEP、MRP1、MRP2、MRP5、MRP6、ABCG8、NTCP、PEPT1、OATP-C、OATP8、OATP-B、OATP-F、OCT1、OAT2、SLC22A18、CNT1、ENT1、MATE1、MRP3及びBCRPから成る群より選択される少なくとも１つである（１８）記載の肝細胞。
（２１）（１８）記載の肝細胞を用いて、薬の候補化合物の代謝及び/又は輸送を評価する方法。
（２２）（１）記載のヒト肝幹細胞、（９）記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含むバイオリアクター。
（２３）人工肝臓として利用される（２２）記載のバイオリアクター。
（２４）（１）記載のヒト肝幹細胞、（９）記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含む、ＨＣＶ感染及び／又は複製阻害実験のためのヒトモデル細胞。
（２５）（１）記載のヒト肝幹細胞、（９）記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含む、糖代謝実験のためのヒトモデル細胞。
（２６）（１）記載のヒト肝幹細胞、（９）記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含む、脂質代謝実験のためのヒトモデル細胞。
（２７）（１）記載のヒト肝幹細胞、（９）記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を再生医療において使用する方法。
（２８）再生医療が細胞治療である（２７）記載の方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明では、従来法のようなマウスやラットの細胞ではなく、ヒト肝幹細胞マーカーを発見しているため、ヒト肝幹細胞をより精密に分離することが可能になったと言える。実際、従来のマウス肝幹細胞マーカーでは、幹細胞を特異的に検出することができないことを確認しており、この発明の意義は大きい。【００２０】
また、細胞の分離には抗原抗体反応を利用しているため、mRNAや糖鎖を指標とする方法に比べバックグラウンドが少なく、従来法より特異的に肝幹細胞を分離することが可能である。【００２１】
創薬などの産業応用のためには、成熟機能を保持したヒト肝細胞が必要である。上記技術を用いてヒト肝幹細胞から分化誘導したヒト肝細胞は、各種薬物代謝酵素CYPsやトランスポーターを発現していることを確認しており、薬物代謝などの創薬スクリーニングを行う上で非常に価値が高いものである。【００２２】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2008‐127755の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】低密度培養時におけるヒト初代胎児肝細胞のクローン性コロニー形成能
【図１Ｂ】In vitroにおけるヒト初代胎児肝細胞の二方向性分化能
【図１Ｃ】In vitroにおけるヒト初代胎児肝細胞の分化能（グリコーゲン貯蔵能）
【図１Ｄ】In vitroにおけるヒト初代胎児肝細胞の分化能（遺伝子発現）
【図１Ｅ】フローサイトメトリーを用いたヒト初代胎児肝細胞の表面抗原プロファイリング
【図２Ａ】フローサイトメトリーを用いたヒト肝幹細胞の単離
【図２Ｂ】各細胞画分におけるクローン性コロニーの表現型
【図２Ｃ】肝幹細胞由来のクローン性コロニー
【図２Ｄ】In vitroにおける単一細胞由来のクローン性コロニー形成能（定量解析）
【図２Ｅ】In vitroにおける肝幹細胞の追跡観察
【図２Ｆ】In vitroにおける肝幹細胞の増殖曲線
【図３Ａ】肝幹細胞由来クローン性コロニーにおける遺伝子発現解析
【図３Ｂ】肝幹細胞由来クローン性コロニーにおける肝細胞・胆管細胞マーカーの発現解析
【図３Ｃ】肝幹細胞におけるグリコーゲン貯蔵能
【図３Ｄ】肝幹細胞の長期間培養及びCYP450の発現
【図４Ａ】BMI1過剰発現肝幹細胞における表現型
【図４Ｂ】BMI1遺伝子導入によるクローン性コロニー形成能の亢進
【図４Ｃ】BMI1過剰発現ヒト肝幹細胞における分化能（グリコーゲン貯蔵能）
【図４Ｄ】BMI1過剰発現ヒト肝幹細胞におけるシトクロムP450の発現（免疫細胞化学）
【図４Ｅ】BMI1過剰発現ヒト肝幹細胞における遺伝子発現解析
【図５】ヒト肝幹細胞の樹立。
【図６】BMI1トランスフェクションのストラテジー。
【図７Ａ】三次元培養システムを用いたヒト肝細胞の培養
【図７Ｂ】BMI1導入細胞の三次元培養
【図７Ｃ】二次元及び三次元培養システムを用いた肝細胞の遺伝子発現解析
【図７Ｄ】三次元培養システムにおける遺伝子発現の亢進
【図７Ｅ】三次元培養システムにおけるBMI1導入肝幹細胞の遺伝子発現解析
【図８】フローサイトメトリーを用いたヒト肝幹細胞のHCV受容体の解析
【図９】肝幹細胞から分化誘導したヒト肝細胞の脂質代謝と糖新生関連遺伝子の発現解析
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００２５】
本発明は、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞を提供する。CD318は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞などで発現する抗原分子である。CD90は、神経組織、結合組織、ストロマ細胞などで発現する抗原分子であり、造血幹細胞、間葉系幹細胞と肝前駆細胞においても発現が認められている。CD66は、大腸癌細胞より見出された癌胎児性抗原に関連した顆粒球特異抗原として報告されており、免疫グロブリンスーパーファミリー分子である。CD13は、間葉系幹細胞マーカーの一つである。本発明のヒト肝幹細胞は、CD318+、CD90+、CD66-及びCD13+のうちの少なくとも１つの表現型を有するとよく、CD318+CD90+CD66-の表現型を有することが好ましく、CD318+CD90+CD66- CD13+の表現型を有することがより好ましい。
【００２６】
本発明の幹細胞は、ヒト肝細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取することにより得られる。本発明は、ヒト肝細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取することを含む、ヒト組織幹細胞の調製方法も提供する。ヒト肝細胞集団は、いかなるヒト肝細胞の集団であってもよく、ヒト肝臓から分離した初代肝細胞培養系（例えば、ヒト胎児肝臓細胞（Cat No. CS-ABI-3716, セルシルテムズ社））などを例示することができる。ヒト肝細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取した後に、細胞を増殖させて細胞集団とし、この細胞集団から、再度、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取してもよい（図５）。細胞の分取は、MACS (Magnetic Cell Sorting)やFACS (fluorescence activated cell sorting)などのいかなる方法で行ってもよいが、FACSは高純度で細胞の選別と分離を行うことができるので、FACSを用いて細胞を分取することが好ましい。分取した細胞の培養は、DMEMとF-12 Hamの混合培地、William’s medium E、RPMI1640などの培地にFBS (10%), Insulin (1ug/ml), Dexamethasone (10-7M), HGF (50ng/ml), EGF (20ng/ml) などを添加したもので約2-3週間又はそれ以上の期間にわたり行うことができる。培地の交換は5日毎に行うことが好ましい。細胞の培養には、三次元培養用培養基材やコラーゲンゲルなどを用いた三次元培養系を用いることが好ましい。細胞の分取と増殖は2回以上繰り返してもよい。FACSを用いてクローンソーティングを行った後、単細胞を分離培養し、クローン性コロニー形成能を有する細胞を選択することにより、ヒト組織幹細胞クローンを樹立することができる。このようにして樹立した細胞クローン株の一つがLSC-E2と命名され、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号305-8566））に受託番号FERM BP-11108として受託された（受託日：平成２０年４月３日）。なお、本受託は、平成20年4月3日（国内受託日）に寄託されたFERM P-21563より移管されたものである。LSC-E2は、CD318+CD90+CD66-の表現型を有する。さらに、上記のようにして樹立した細胞クローン株（例えば、LSC-E2）を増殖させて細胞集団とし、この細胞集団から、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により細胞を分取してもよい。
【００２７】
本発明のヒト肝幹細胞は、高い増殖能と肝細胞及び胆管上皮細胞への分化能を有する。本発明のヒト肝幹細胞及びそれから分化誘導した細胞は、人工肝臓や細胞移植などの再生医療に利用することが期待されている。現在、人工肝臓としては、肝細胞と人工装置の組合せからなるハイブリッド型人工肝臓が主流となっている。その一例として、ブタ肝細胞を直径２mm程度の微小ビーズに付着させ、それを中空の半透性膜（中空糸）を束ねたリアクターの中空糸外側に充填した人工肝臓バイオリアクターが臨床試験されており、ある程度の成功を収めている。本発明のヒト肝幹細胞及びそれから分化誘導した細胞は、人工肝臓を包含するバイオリアクターに利用することができる。このようなバイオリアクターは、人工肝臓として利用可能であるばかりでなく、ヒトアルブミンや血液凝固因子などの生理活性物質の生産、薬の候補化合物の代謝や輸送の評価、HCV感染・複製阻害実験、糖代謝実験、脂質代謝実験などに利用することも可能である。本発明のヒト肝幹細胞及びそれから分化誘導した細胞を人工材料などのマトリクスに充填して、肝機能を有するバイオリアクターを作る事が可能である。
【００２８】
本発明のヒト肝幹細胞を細胞移植などの再生医療に利用することが可能である。すなわち、本発明のヒト肝幹細胞を免疫抑制剤投与を施した重篤な肝不全患者の脾臓内、門脈内、腸間膜内あるいは腹腔内に注入することにより、同所性あるいは異所性の細胞移植が可能である。本発明のヒト肝幹細胞及びそれから分化誘導した細胞を、人工材料などのマトリクスに充填して重篤な肝不全患者の脾臓内、門脈内、腸間膜内あるいは腹腔内に注入することにより、同所性あるいは異所性の細胞移植を行うことが可能である。
【００２９】
また、本発明のヒト肝幹細胞から分化誘導した細胞は、各種薬物代謝酵素CYPsやトランスポーターを発現していることが確認されているので、薬物代謝試験などの創薬スクリーニングに利用することができる。
【００３０】
さらに、本発明のヒト肝幹細胞は、HCV受容体の候補として挙げられているCD81テトラスパニン、スカベンジャー受容体BI(SR-BI)、低比重リポタンパク受容体（LDLR）を発現していることが確認されているので、HCVの感染や複製阻害実験のヒトモデル細胞として利用することができる。さらにまた、本発明のヒト肝幹細胞及びそれから分化誘導した細胞は、脂質代謝関連遺伝子や糖新生関連遺伝子を発現することが確認されており、脂質代謝実験や糖代謝実験のためのヒトモデル細胞として利用することができる。
【００３１】
一部のHCVクローンを除いては、HCV 感染細胞の培養系が確立されていないため、
HCV の感染様式は明らかにされていない。また、感受性を示す実験動物もチンパンジー以外確認されておらず、ワクチンや治療薬の開発は困難を極めている。すなわち、HCV 研究で最も重要な点は、再現性の高い、効率のよい培養システムの開発である。hCD81やSR-B1などHCV結合受容体が高発現した本発明のヒト肝幹細胞の三次元培養システムによる培養系の確立が可能となれば、HCV感染実験を行う事で、ウイルス感染で最も重要なウイルス膜と細胞膜の融合や、ウイルスゲノムの細胞内への侵入の仕組みなどを調べることが可能である。新たなHCV感染経路の障害剤のスクーリングなど開発も利用できる。さらに、HCV受容体の結合阻止抗体とウイルス中和抗体、HCVエンベロープ蛋白質に対するヒト型抗体など治療用抗体の開発及びヒ卜型抗体の活性評価などが期待される。
【００３２】
本発明のヒト肝幹細胞及びそれから分化誘導した細胞は、脂質代謝関連遺伝子や糖新生関連遺伝子を発現していることが確認されているので、脂質代謝実験や糖代謝実験のためのヒトモデル細胞として利用することができる。この細胞を用いて、様々な脂質代謝や糖代謝関連薬剤のスクーリングを行うことができる。すなわち、培養液にそれぞれ目的とする薬剤を添加することより、脂質代謝と糖新生を促進或いは阻害する薬剤の影響を予測することが可能である。
【００３３】
また、本発明は、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞にBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞も提供する。BMI1は、細胞の自己複製能に関与していることが判明しているポリコーム群タンパク質の一つであり、その遺伝子情報はNCBI GenBankに登録されている(GenBank accession number: NM_005180.5)。
【００３４】
本発明の形質転換細胞は後述の実施例に記載のようにして調製することができるが、当業者であれば、適宜この調製方法に変更と修正を加えることができるであろう。
【００３５】
本発明の幹細胞にBMI1遺伝子を導入することにより、コロニー形成能が増加することが見出された。また、本発明の幹細胞から分化誘導した細胞が発現している各種薬物代謝酵素CYPsやトランスポーターの遺伝子は、BMI1遺伝子導入ヒト肝幹細胞においても同様に発現していることが確認され、特に、CYP3A4遺伝子の発現量はBMI1遺伝子を導入していない細胞よりも増加することが確認された。従って、BMI1遺伝子導入ヒト肝幹細胞も薬物代謝などの創薬研究に利用することができると考えられる。さらに、本発明の幹細胞から分化誘導した細胞が発現している脂質代謝関連遺伝子や糖新生関連遺伝子は、BMI1遺伝子導入ヒト肝幹細胞においても同様に発現していることが確認され、それらの発現量は、ヒト組織の発現レベルに近似していることが確認された。従って、BMI1遺伝子導入ヒト肝幹細胞も脂質代謝実験や糖代謝実験のためのヒトモデル細胞に利用することができると考えられる。BMI1遺伝子導入ヒト肝幹細胞は、通常の肝細胞培養系では必須の細胞外マトリックスコートディッシュを用いることなく培養することが可能となった。BMI1遺伝子導入ヒト肝幹細胞は、人工肝臓や細胞移植などの再生医療やバイオリアクターなどにも利用することができ、また、HCVの感染や複製阻害実験のヒトモデル細胞としても利用することができる。
【００３６】
さらに、本発明は、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞及び／又はこのヒト組織幹細胞にBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞の分化を誘導することにより、薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞を調製する方法を提供する。薬物代謝酵素としては、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2B6、CYP2E1、CYP2A6などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。また、トランスポーターとしては、MRP2、MRP3、MDR1、BCRPなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。例えば、ABC2、ABCA6、ABCA8、MDR1、MDR3、BSEP、MRP1、MRP2、MRP5、MRP6、ABCG8、NTCP、PEPT1、OATP-C、OATP8、OATP-B、OATP-F、OCT1、OAT2、SLC22A18、CNT1、ENT1、MATE1のうち１つ、あるいは2つ以上を発現する場合がある。
【００３７】
薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞への分化誘導は、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞及び／又はこのヒト組織幹細胞にBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞を細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子で処理することにより行うことができる。細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子としては、Laminin, Type I-Collagen, Type IV-Collagen, Fibronectin, Metrigel, Dexamethasone, DMSO, Oncostatin M, Insulin, HGF, EGF, TGFα, HB-EGF, VEGF、PDGFなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子での処理は、CD318+CD90+CD66-の表現型を有するヒト組織幹細胞を細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子を含有する培地で培養することにより行うことができる。培地としては、DMEMとF-12 Hamの混合培地、William’s Medium E培地、RPMI1640培地などを例示することができるが、これらに限定されることはない。培養は、細胞が培養皿中で90%コンフルエントになるまで行うことができ、90%コンフルエントに達した後は継代を行うとよい。継代は、培養培地を除去し、細胞を0.05%トリプシン-EDTAで室温にて５分間処理して、細胞を優しくタッピングし、培養皿から剥離し、浮遊細胞を10% FBSを含有する培養培地洗浄した後、培養培地中に再播種することにより行うことができる。
【００３８】
また、薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞への分化誘導は、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞及び／又はこのヒト組織幹細胞にBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞の三次元培養を行うことによりなされてもよい。細胞の三次元培養には、三次元培養用培養基材やコラーゲンゲルなどを用いた三次元培養系を用いることが好ましい。
【００３９】
本発明は、CD318、CD90、CD66及びCD13からなる群より選択される少なくとも１個のマーカーの発現の有無により分取されたヒト肝幹細胞及び／又はこのヒト組織幹細胞にBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞を分化誘導して得られた、薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞も提供する。薬物代謝酵素としては、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2B6、CYP2E1、CYP2A6などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。トランスポーターとしては、MRP2、MRP3、MDR1、BCRPなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。例えば、ABC2、ABCA6、ABCA8、MDR1、MDR3、BSEP、MRP1、MRP2、MRP5、MRP6、ABCG8、NTCP、PEPT1、OATP-C、OATP8、OATP-B、OATP-F、OCT1、OAT2、SLC22A18、CNT1、ENT1、MATE1のうち１つ、あるいは2つ以上を発現する場合がある。本発明の薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞を用いて、薬の候補化合物の代謝及び/又は輸送を評価することができる。
【００４０】
従って、本発明は、上記の薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞を用いて、薬の候補化合物の代謝及び/又は輸送を評価する方法も提供する。その一例として、薬物代謝酵素及び/又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する培養肝細胞に薬の候補化合物を添加して、その代謝及び/又は輸送を調べることができる。薬の候補化合物の代謝及び/又は輸送は、質量分析法、HPLC分析などの方法により測定することができる。薬の候補化合物は、いかなる物質であってもよく、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、植物抽出物、植物抽出物の分画物、それらの混合物などを例示することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４２】
〔実施例1〕
材料及び方法【００４３】
ヒト肝細胞の供給源
本研究に用いるヒト胎児肝臓細胞は、米国のACBRI(Applied Cell Biology Research Institute a registered Washington non-profit research institution)により提供者の同意の下に分離され、米国セルシステムズ社により無償で供与されているものである(Cat No. CS-ABI-3716)。本邦においては、大日本製薬株式会社から初代ヒト胎児肝細胞 (Human primary fetal hepatocytes; Cat No. CS-ABI-3716)として供給されており、本研究においてはこれを使用した。感染症の検査(HIV, HBV, HCV)と細菌類検査(真菌、細菌、マイコプラズマ)については陰性である。本研究については、本学倫理委員会において審議され許可されている。【００４４】
細胞培養及び継代
既に確立され、報告されているコロニー形成能を持つ胎児肝細胞低密度培養系(Zheng YW, Taniguchi H, et al. Transplant Proc 2000;32:2372-2373; Suzuki A, Zheng YW, et al. Hepatology 2000;32:1230-1239)に以下のような改変を行った。【００４５】
IV型コラーゲンコートディッシュ(Becton Dickinson Labware) に10%ウシ胎仔血清(FBS)、ヒトγ-インスリン(1.0 μg/ml, Wako, Japan)、ニコチンアミド(10 mM, SIGMA)、デキサメタゾン(1x10-7M, SIGMA)、L-グルタミン(2 mM, GIBCO BRL)を加えたDMEM栄養混合F-12 Ham培地(DMEM/F12 1:1 mixture, SIGMA)を添加し、初代胎児肝細胞、フローサイトメトリーで画分化した細胞又はBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞を播種し、約2-3週間又はそれ以上の期間にわたり、培養した。完全培地交換を5日毎に行った。ヒト組換えHGF (50 ng/ml, SIGMA)及び上皮増殖因子(EGF) (10 ng/ml, SIGMA)のような増殖因子を播種後24時間で添加した。【００４６】
細胞が培養皿中で90%コンフルエントになった際、以下の手順で継代を行った。培養培地を除去し、細胞を0.05%トリプシン-EDTA (GIBCO)で室温にて５分間処理し、細胞を優しくタッピングし、培養皿から剥離し、浮遊細胞を10% FBSを含有する培養培地洗浄した後、培養培地中に再播種した。トリパンブルー染色を行ったところ、解離した細胞の生存率が90%を下回ることはなかった。細胞の播種密度は、実験設計に応じて、単細胞培養（フローサイトメトリーでソーティングした細胞１個/を96穴プレートの1ウェル中で培養する手法）、100-500個の細胞/cm2の低密度細胞培養から1×103個の細胞/cm2の高密度細胞培養から選択した。【００４７】
クローン性コロニーアッセイ
本研究では、フローサイトメトリーソーティング及び単細胞ベースのアッセイを行った。フローサイトメトリーで画分化した細胞のコロニー形成能及び増殖能を調べるために、肝細胞クローン性コロニー形成ユニット(H-CFU-C)及び播種した細胞におけるH-CFU-C形成の相対頻度を２〜３週間培養した後に測定した。H-CFU-Cは、in vitroで増殖可能な単細胞に由来する、500個以上の細胞を含むコロニー形成できるユニットとして定義される。【００４８】
フローサイトメトリーによる細胞プロファイリング及びソーティング
浮遊細胞を、氷上で30分間、蛍光標識モノクローナル抗体(mAb)の至適濃度下で遮光してインキュベートした。2% FBSを添加したPBSを洗浄液及び抗体希釈液として用いた。ビオチン標識一次抗体を用いた際はストレプトアビジン標識の施された蛍光抗体で二次反応を行った。下記に記載したもの以外のすべての蛍光標識モノクローナル抗体はBecton Dickinsonから購入した。フルオレセイン-イソチオシアネート(FITC)結合抗ヒトCD66 (hCD66FITC)、アロフィコシアニン(APC)結合hCD90、フィコエリトリン(PE)結合hCD318、hCD24FITC、hCD29FITC、hCD44PE、hCD49fPE、ビオチン標識hCD54 (eBioscience)、hCD117APC、hCD138PE (Miltenyi Biotec)、hCD140aPE及びストレプトアビジン標識APC。細胞プロファイリング分析及びソーティングは高速セルソーターMoFlo (DakoCytomation)を用いて行った。【００４９】
細胞化学及び免疫細胞化学アッセイ
ＰＡＳ染色（過ヨウ素酸シッフ法）：過ヨウ素酸シッフ染色を行い、培養細胞におけるグリコーゲン合成及び貯蔵を測定した。【００５０】
多重免疫細胞化学染色の際は、細胞を冷エタノールで30分間固定し、10%正常ヤギ血清(NGS)で60分間ブロッキングを行った後、一次抗体を1%NGS添加PBSで希釈し、湿室にて4℃で一晩反応させた。二次抗体を10%グリセロールを含むPBSで希釈し、湿室にて室温で60分間反応させた。細胞核をDAPIで染色し、FAマウント液で封入した。（画像は、Zeiss AxioImager顕微鏡で取得した。）
免疫細胞化学には、一次抗体としてマウス抗ヒトアルブミンmAb(SIGMA)、マウス抗ヒトCK19 mAb (Progen)、及びウサギ抗ヒトCYP 3A4(Chemicon)、CYP 2D6(Chemicon)、CYP 2C9 (第一化学薬品、東京)。二次抗体としてAlexa488結合ヤギ抗マウスIgG、Alexa-555結合ヤギ抗マウスIgG、Alexa647結合ヤギ抗マウスIgG、及びAlexa488結合ヤギ抗ウサギrabbit IgG(Invitrogen, Molecular Probes)を用いた。【００５１】
半定量RT-PCR及びリアルタイムPCR
細胞又は細胞コロニー由来の全RNAをIsogen試薬(Nippon Gene, Toyama, Japan)を用いて抽出した。逆転写(RT)の前に、150 ngのランダムプライマーと1 μlの10 mM dNTP混合物を全RNA溶液に添加した。反応混合物を65℃で5分間加熱し、氷上で1分間インキュベートした後、1x first-strand buffer、0.5 mM dNTP mix、5mM DTT及び200 unitsのSuper Script III (invitrogen)を加え、25℃で5分間、50℃で45分間、70℃で15分間インキュベートし、全RNA からcDNAを合成した。半定量PCRは20 μlの反応混合物(1x PCR buffer, Taq DNA polymerase) (Takara Shuzo Co., Tokyo, Japan)中で、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行った。PCRは、アルブミン(5’-tgttgattgcctttgctcag-3’（配列番号１）及び5’-tggagactggcacacttgag-3’（配列番号２）)、AFP(5’-agcttggtggtggatgaaac -3’（配列番号３）及び5’-ccctcttcagcaaagcagac -3’（配列番号４）)、G6P(5’-gtcaacacattacctccagg -3’（配列番号５）及び5’-gagtagatgtgaccatcacg -3’（配列番号６）)、CYP3A4 (5’-aacagcctgtgctggctatc-3’（配列番号７）及び5’-gatcacatccatgctgtagg-3’（配列番号８）)、CYP2C9 (5’- gcaggaaaacggatttgtgt-3’（配列番号９）及び5’- caggccatctgctcttcttc-3’（配列番号１０）)、CYP2C19 (5’- cttcaccctgtgatcccact-3’（配列番号１１）及び5’- taaagtcccgagggttgttg-3’（配列番号１２）)、CYP2D6 (5’- aggaggagtcgggctttctg-3’（配列番号１３）及び5’- cttggccttctccatctctg-3’（配列番号１４）)、CYP1A2 (5’- cagaatgccctcaacacctt-3’（配列番号１５）及び5’- gctcctggactgttttctgc-3’（配列番号１６）)、CYP2B6 (5’- aacctgcaggaaatcaatgc-3’（配列番号１７）及び5’- attttggctcggtcatgaag-3’（配列番号１８）)、CYP2E1 (5’- acccgagacaccattttcag-3’（配列番号１９）及び5’- agggtgtcctccacacactc-3’ （配列番号２０）)、GAPDH (5’-ctctgctcctcctgttcgac-3’（配列番号２１）及び5’-ttgattttggagggatctcg-3’（配列番号２２）)、EGFP (5’-ctacggcgtgcagtgcttca -3’ （配列番号２３）及び5’-cgctgccgtcctcgatgttg -3’（配列番号２４）)、BMI1 (5’-aatccccacctgatgtgtgt -3’（配列番号２５）及び5’-catttttgaaaagccctgga -3’（配列番号２６）)、TAT (5’-ttctggcagtggctgcac-3’（配列番号２７）及び 5’-cccatctcggatctcattgc-3’（配列番号２８）)、GULU (5’-aaggcatcaagcaggtgtac-3’（配列番号２９）及び 5’-gctggttgctcaccatgtcc-3’（配列番号３０）)、GGT (5’-acaaccatgtgtacaccagg-3’（配列番号３１）及び 5’-ctggtgtgccagctcatacg-3’（配列番号３２)、Desmin (5’-aagctgcaggaggagattca -3’（配列番号３３）及び5’-ggcagtgaggtctggcttag-3’（配列番号３４）)、CYP2A6 (5’- agaggaagagcaaggggaag-3’（配列番号３５）及び 5’- ctgaactcctcagcctggtc-3’（配列番号３６）)、MRP2 (5’- tgcttcctggggataatcag -3’（配列番号３７）及び 5’- cacggataactggcaaacct -3’（配列番号３８）)、MDR1 (5’- gctcctgactatgccaaagc -3’（配列番号３９）及び 5’- tcttcacctccaggctcagt -3’（配列番号４０）)、MRP3 (5’- tgtgctaggtgatggacagg -3’（配列番号４１）及び 5’- tgtcacctgcaccttctctg -3’（配列番号４２）)、BCRP (5’- ttttctgttcccttgccatc -3’（配列番号４３）及び 5’- cctggccctctactctaccc -3’（配列番号４４）)、PROM1 (5’- tccaacagggctatcaatcc -3’（配列番号４５）及び 5’- ccaaagacaaaggtaagaaccac -3’（配列番号４６）)、CD24 (5’- cccatcttctaaacccaatcc -3’（配列番号４７）及び 5’- cattccacaatcccatcctt -3’（配列番号４８）)、CD44 (5’- tttacagcctcagcagagca -3’（配列番号４９）及び 5’- cgatgctcagagctttctcc -3’（配列番号５０）)、ALCAM (5’- cgtctgctcttctgcctctt -3’（配列番号５１）及び 5’- tggttgcttgaacaccttga-3’（配列番号５２）)、EPCAM (5’- tgatcctgactgcgatgaga-3’ （配列番号５３）及び 5��- gcacaacaattccagcaaca-3’（配列番号５４）)用の肝細胞特異的プライマーを用いて行った。PCRは、初期変性94°C、30秒、アニーリング温度60°C、30秒、伸長72°C、30秒の条件で行った。GAPDHについては、アニーリング温度が57°C、EGFP及びBMI1については64°C、TATについては65℃の条件で行った。PCR産物は1.5%アガロースゲル中で電気泳動を行った。【００５２】
ALBUMIN (Hs00609411_m1)、CYP3A4 (Hs01546612_m1)、CYP2C9 (Hs00426397_m1)、CYP2D6 (Hs02576167_m1)及び18S rRNA (4319413E)用のTaqmanプローブ及びプライマーはTaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)から購入した。【００５３】
レトロウイルスベクターの作製およびBMI1導入肝幹細胞株の樹立（図６）
本研究で用いたレトロウイルスベクターには、導入遺伝子の安定した長期発現が期待できるレトロウイルスベクター(pGCDNsam IRES -EGFPベクター(Nabekura T, Otsu M, et al. Mol Ther 2006;13(2):301-9))および、テトラサイクリン薬剤誘導系（TET-ON/OFF）によってウイルスベクター産生の誘導が可能となるパッケージング細胞株 (293GP, 293GPG細胞)（東京大学医科学研究所幹細胞治療研究センターの大津真博士から供与）を用いた(Burns JC, Friendmann T, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:8033-7; Ory DS, Neugeboren BA,et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1996,93: 11400-6)。【００５４】
ヒト胎児肝臓よりクローン化したBMI1のcDNAをpGCDNsam IRES-EGFPベクターのIRES領域上流のマルチクローニングサイト(NotI-BamHI)に組み込んだ後、リン酸カルシウム試薬(Promega)を用いてパッケージング細胞293GP細胞に導入した。さらに産生されたウイルスベクターを293GPG細胞に感染させ、TET-ON条件下で安定発現株を樹立した。【００５５】
これらの細胞を、TET-OFF条件下で培養し、産生されたウイルスベクターを含む培養上清を遠心法(6000xg, 4℃, 16時間)により濃縮した後、StemPro-34 Serum Free Medium (Invitrogen)で懸濁した。さらに、得られたウイルスベクターの力価は、Jurkat細胞（理研BRC）により確認した(7.9×106 infectious units/ml)。【００５６】
また、これらのパッケージング細胞株の培養は、10%FBS(Gibco), 2 mmol/L L-glutamine(Gibco), 2μg/ml Puromycin (Sigma), 0.3mg/ml G418(Sigma), 1x penicillin /streptomycin(Gibco)を含むDMEM培地を用い、37℃ 10% CO2条件下で行った。なお、培養皿にはPoly-L-Lysineでコーティングされたものを用いた。【００５７】
次に、BMI1導入肝幹細胞株の樹立のために、ヒト肝幹細胞を播種した1週間後にprotamin sulfate（10μg/ml,Wako）の存在下でウイルスベクターを導入し、540xg、32℃、30分間遠心した後、37℃ 5% CO2条件下で1.5時間インキュベートを行った。更に、72時間後、フローサイトメトリーを用いて、BMI1導入細胞を純化した。（EGFP陽性率99％）【００５８】
三次元培養
マイクロパターン細胞培養フィルム（PMMA/EH, 株式会社クラレから提供）にタイプIVコラーゲン（新田ゼラチン株式会社、大阪）を表面コーティングし、微細室あたりの細胞数が5つになるように播種してヒト胎児肝細胞又はBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞の培養を行った（7.5x104 cells/well of 24-well-plate）。播種後24時間、その後は1,2日に１回、培地交換を行った。また、培地交換の際には、EGF及びHGF添加を併せて行った。二次元培養と同じ組成の培地を利用した。【００５９】
結果及び考察
ヒト初代胎児肝細胞のプロファイリング（図１）
A. 低密度培養時におけるヒト初代胎児肝細胞のクローン性コロニー形成能（図1A）
幹細胞の同定に際する最も重要な指標の一つとして、クローン性コロニー形成能を評価する必要がある。我々はクローン性コロニー形成能の評価法として広く用いられている低密度培養法を用い、胎生14-18週のヒト胎児肝細胞を異なる播種密度（500, 400, 200, 100cells/cm2）で培養した。その結果、200cells/cm2及び100cells/cm2の播種密度においてクローン性のコロニー形成が確認され、さらに挿入図に示すように、これらのコロニーは典型的な肝細胞の形態を有していた。【００６０】
B. In vitroにおけるヒト初代胎児肝細胞の二方向性分化能（図1B）
In vitroにおけるヒト初代胎児肝細胞を同定するため、肝細胞系列マーカーのアルブミン、胆管細胞系列マーカーのサイトケラチン19、そして未分化肝細胞（肝芽細胞）マーカーのAFPに関して免疫細胞化学を行ったところ、二つの細胞系列マーカーを共発現する二方向性の分化能を有した細胞の存在が確認された。図1A及びBより、我々の用いたヒト初代胎児肝細胞は幹細胞の特性を有していると考えられる。従って、この細胞はより高純度な幹細胞分離に適していると判断し、本研究において用いることとした。【００６１】
C. In vitroにおけるヒト初代胎児肝細胞の分化能（グリコーゲン貯蔵能）（図1C）
幹細胞としての能力を評価する上で、先述のクローン性コロニー形成能の他に、分化能もまた一つの重要な指標である。我々は培養7, 21, 35日目の初代胎児肝細胞に対してPAS染色を行い、グリコーゲンの貯蔵が培養日数に比例して増加することを明らかにした。このことから、初代胎児肝細胞は未分化な肝細胞から機能性肝細胞へと分化することが実証された。上図に明視野像、下図に位相差像を示す。【００６２】
D. In vitroにおけるヒト初代胎児肝細胞の分化能（遺伝子発現）（図1D）
本研究では肝細胞のタンパク質レベルでの発現解析に加え、RNAレベルでの発現解析も行った。肝機能マーカー（左に示す5種類：AFP, ALB, TAT, GLUL, GGT, G6P）、シトクロムP450（中央に示す8種類：CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP1A2, CYP2C19, CYP2A6, CYP2B6, CYP2E1）、そしてトランスポーター(右に示す4種類：MRP2, MRP3, MDR1, BCRP)に関して、遺伝子発現解析を行ったところ、成体肝組織において発現しているこれらのほぼ全ての遺伝子が分化誘導した初代胎児肝細胞において発現しており、さらに分化誘導培養日数に比例してその発現が増大することが確認された。また、ポジティブコントロールとしてヒト成体肝組織を用いた。【００６３】
以上より、ACBRIより取得した初代胎児肝細胞はより高純度な幹細胞分離に適していると判断し、本研究において用いることとした。【００６４】
E.フローサイトメトリーを用いたヒト初代胎児肝細胞の表面抗原プロファイリング(図1E)
フローサイトメトリーと蛍光標識モノクローナル抗体を用いてヒト初代胎児肝細胞の表面抗原のプロファイリングを行った。【００６５】
上図に示すようにCD24, CD29, CD44, CD49fは80%以上の初代胎児肝細胞において発現していた。また、中央に示すCD54, CD117, CD138, CD140aは陽性細胞率が1%未満であった。下図に示すCD66, CD90, CD318は中程度の陽性細胞率であった。【００６６】
このように、極端な陽性もしくは陰性細胞率を与えるような表面抗原の発現を指標に細胞分離を実施することは操作上困難であるため、本研究における肝幹細胞の単離と同定にはプロファイリングにおいて適度な陽性細胞率が確認された表面抗原の発現を指標に分離を行うこととした。【００６７】
ヒト肝幹細胞の単離及び特性解析（図２) 
A. フローサイトメトリーを用いたヒト肝幹細胞の単離（図2A）
フローサイトメトリーを用いた細胞分離のフローチャートを示す。【００６８】
先ずFSC (Forward Scatter) 及びSSC (Side Scatter) の二次元展開より細胞断片などのノイズを除去し、次いでPI陰性細胞（生細胞）画分を分取する。これらの細胞をCD66, CD90, CD318の発現を指標にさらに分画化した。我々は単一マーカーの発現に対応した陽性及び陰性細胞画分、さらに右図に示す1-4の細胞画分に対して単一細胞によるクローン性コロニー形成能評価を実施し、その結果としてCD318+CD90+CD66-の画分に高い増殖活性を有する細胞集団を見出した（定量データは図2Dに示す）。【００６９】
B. 各細胞画分におけるクローン性コロニーの表現型（図2B）
各種モノクローナル抗体を様々な組み合わせで用いて細胞分離を行ったところ、最終的にCD318+CD90+CD66-の画分に高いクローン性コロニー形成能を有する細胞集団を見出した。図に培養20日目のクローン性コロニーを2% PFAで固定したもの示す。右上図ではCD318+CD90+CD66-画分細胞由来の明瞭なクローン性コロニーが容易に見て取れる。肝幹細胞の評価指標として用いられているコロニー形成ユニット（H-CFU-C）はCD318+CD90+CD66-画分由来の細胞において最多であった。【００７０】
C. 肝幹細胞由来のクローン性コロニー（図2C）
肝幹細胞のクローン性コロニー形成と多分化能を観察するため96-wellプレートへの単一細胞ソーティングを実施すると、培養18日目に図のようなクローン性コロニーが形成され、一つの細胞から1.5x104の細胞にまで増殖したことが確認された。これらの細胞は典型的な肝細胞の形態を呈し、高い増殖活性を培養期間を通して維持していた。【００７１】
D. In vitroにおける単一細胞由来のクローン性コロニー形成能（定量解析、図2D）
図に示す各々の細胞画分について単一細胞由来のクローン性コロニー形成能評価を実施した。クローン性コロニー形成能評価はIV型コラーゲンコートの 96-well プレートを用いて行い、培養3週間後に500個以上の肝上皮細胞で形成されるコロニーが観察されたウェルを計上した。その結果、CD318+CD90+CD66-細胞において他の細胞画分と比較して高いクローン性コロニー形成能が確認された。非分画化細胞と比して、肝幹細胞が約7.8倍濃縮されたことが示された。【００７２】
E. In vitroにおける肝幹細胞の追跡観察（図2E）
フローサイトメトリーにより分離した単一の肝幹細胞を培養1日目から培養20日目まで追跡観察したものを図示する。In vitroおいて旺盛な増殖活性を呈する肝幹細胞は、単一の細胞から巨大なコロニーを形成可能である。図には代表的なコロニー像を示したに過ぎないが、図のような単一細胞由来の巨大なコロニーは高頻度で観察された。【００７３】
F. In vitroにおける肝幹細胞の増殖曲線（図2F）
In vitroにおける肝幹細胞の増殖活性を評価するため、単一の肝幹細胞から現在8ヶ月間以上に渡り培養を継続している。この細胞は依然として典型的な肝細胞の形態を保持し、安定した増殖活性を呈している。【００７４】
従って、in vitroにおいて高い増殖能を示すCD318+CD90+CD66-細胞は幹細胞としての性質を持っていると結論づけられる。【００７５】
CD318+CD90+CD66-細胞の表現型を有するヒト肝幹細胞の一つをLSC-E2と命名し、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号FERM BP-11108、受託日：平成２０年４月３日）。【００７６】
ヒト肝幹細胞の多分化能（図３）
A. 肝幹細胞由来クローン性コロニーにおける遺伝子発現解析（図3A）
単離された肝幹細胞が増殖能のみならず多能性を有することを証明するため、遺伝子発現解析を行った。図に示すように、単一な肝幹細胞由来のクローン性コロニーにおいて、肝細胞系列マーカー（AFP, アルブミン）、胆管細胞系列マーカー（サイトケラチン19）、成熟肝細胞で発現が確認されている機能性肝細胞マーカー（GGT,TAT, CYP3A4）、幹細胞関連遺伝子（BMI1, PROM1, CD24, CD44, ALCAM, EPCAM）やその他の遺伝子（デスミン）の発現が確認された。【００７７】
B. 肝幹細胞由来クローン性コロニーにおける肝細胞・胆管細胞マーカーの発現解析（図3B）
単一な肝幹細胞を96-well プレート上で培養し、アルブミンとサイトケラチン19の免疫細胞化学を実施した。図に肝細胞系列マーカーのアルブミン（緑）及び胆管細胞系列マーカーのサイトケラチン19（赤）の発現が確認されたことを示す。アルブミン及びサイトケラチン19共陽性細胞は肝細胞系列もしくは胆管細胞系列の両方向に分化可能な二方向性の分化能を有する細胞であると示唆される。【００７８】
C. 肝幹細胞におけるグリコーゲン貯蔵能（図3C）
図は80日間の長期間分化培養を行った際の肝幹細胞のPAS染色像である。右図に明視野像、左図に位相差像を示す。PAS染色陽性細胞はグリコーゲン貯蔵能を有することを意味するため、肝幹細胞が長期間に渡る培養の結果分化したと考えられる。【００７９】
D. 肝幹細胞の長期間培養及びCYP450の発現（図3D）
3ヶ月間にわたる長期間培養を行った際の肝幹細胞由来クローン性コロニーの分化能を実証した。肝幹細胞由来のクローン性コロニーはアルブミンと同様、シトクロムP450 1A2, 2D6, 3A4のような分化能を示唆するマーカーを発現していた。CYP 3A4及びアルブミン共陽性細胞がコロニー中に存在していたことから、単離した肝幹細胞が分化能を有すること、そして機能性肝細胞が我々の培養系において維持可能であることが考えられる。【００８０】
従って、本研究において分離した肝幹細胞がin vitroで多能性を有し、長期間培養により機能性肝細胞への分化誘導が可能であると結論づけられる。【００８１】
BMI1導入ヒト肝幹細胞におけるコロニー形成能及びシトクロムP450の発現解析（図４）
A. BMI1過剰発現肝幹細胞における表現型（図4A）
GFPの蛍光を指標に、肝幹細胞へのBMI1遺伝子の導入を確認した。BMI1過剰発現細胞及びMOCK、野生型（WT）間において形態的差異は認められなかったが、BMI1過剰発現細胞由来のコロニーはコントロールと比較して大型であった。【００８２】
B. BMI1遺伝子導入によるクローン性コロニー形成能の亢進（図4B）
BMI1過剰発現肝幹細胞由来のクローン性コロニーの細胞数をMOCK及びWTのそれと比較すると、平均で約2倍の増加が観察された。肝幹細胞へのBMI1遺伝子の導入にもかかわらず、WTとの間にH-CFU-C数量の変化は確認されなかった。また、MOCKとの間には3倍のH-CFU-C数量の差が認められた。このことから、肝幹細胞へのBMI1遺伝子の導入は肝幹細胞の増殖能を亢進するものの、肝幹細胞の頻度 (H-CFU-C) には影響を与えないということが明らかとなった。【００８３】
C. BMI1過剰発現ヒト肝幹細胞における分化能（グリコーゲン貯蔵能）（図4C）
BMI1過剰発現細胞の特性を表現型のみで評価することはできないため、次いで、肝細胞系列マーカー及び肝機能マーカーの発現を指標にその分化能を解析した。図はPAS染色法を用い、BMI1過剰発現細胞とMOCK間でのグリコーゲン貯蔵能を比較したものである。その結果、BMI1過剰発現細胞においてMOCKと比して高いグリコーゲン貯蔵能が認められた。さらに、BMI1過剰発現細胞においては培養21日目で半数以上の細胞がPAS陽性を呈した。【００８４】
D. BMI1過剰発現ヒト肝幹細胞におけるシトクロムP450の発現（免疫細胞化学）（図4D）
免疫細胞化学により、BMI1過剰発現細胞においてアルブミン及びCYP3A4, 2C9, 2D6の発現が確認された。アルブミン及びシトクロムP450共陽性細胞は非常に鮮明な染色像を呈していた。【００８５】
E. BMI1過剰発現ヒト肝幹細胞における遺伝子発現解析（図4E）
RT-PCR法及びTaqman real time PCR法より、アルブミン、AFP, G6P, シトクロムP450遺伝子の発現が確認された。図に示すRT-PCRの結果から、BMI1過剰発現細胞ではMOCK及びWTと比較して、より多くの肝細胞系譜マーカーやシトクロムP450遺伝子を発現していることが明らかとなった。さらにTaqman real time PCRの結果から、CYP3A4及び2C9遺伝子に関しては、BMI1過剰発現細胞において有意に発現の増大が見られた。また、アルブミン及びCYP2D6遺伝子の発現量には有意差は認められなかった。【００８６】
要約すると、BMI1過剰発現細胞はWTと比して高いクローン性コロニーの増殖能を有し、シトクロムP450のような肝機能性マーカーを強発現することが示された。【００８７】
三次元培養（図７）
A. 三次元培養システム（図7A）
バイオリアクターシステムは三次元培養システムとして次第に注目を集めつつあり、従来の二次元培養では失われてしまうことの多かったin vivoでの細胞の機能を維持しつつ培養を行うことが可能である。三次元培養システムでは細胞間相互作用が増進するからであると考えられる。我々はクラレ株式会社から提供された模擬in vivo環境である三次元培養システム(無数の微細室(100mm x 100mm x 50mm (L x W x D))を含むマイクロパターンフィルム)用いて実験を行った。【００８８】
細胞を5 cells/cavityの播種密度で培養を行ったところ細胞の接着と増殖が確認され、円滑な培養が可能であることが示された。細胞は最初にフィルム底面に接着し、培養日数を追うごとに、徐々に他の微細室（micro cavity）へと伸展してゆき、微細室中央に細胞凝集体を形成した。【００８９】
B.BMI1遺伝子を導入した形質転換細胞の三次元培養（図７B）
フローサイトメトリーを用いてヒト肝幹細胞画分を分取し、レトロウイルスベクターを用いたBMI1遺伝子の過剰発現を行った（以下、この細胞をBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞と称す。）。BMI1遺伝子の発現はレポーター遺伝子であるGFPの発現を指標として確認することができるため、BMI1遺伝子を導入した形質転換細胞は図7Bのように緑色の蛍光を発する. BMI1遺伝子を導入した形質転換細胞はBMI1遺伝子の導入を行っていない細胞と比して良好な増殖活性を示した。また、培養時に重層化傾向を呈するものの、アルブミンやCYP3A4の局在、グリコーゲン貯蔵能に大きな差は見られなかった。【００９０】
C. 二次元及び三次元培養システムを用いたヒト肝幹細胞の遺伝子発現解析(図7C)
肝細胞系列マーカー及びCYP450遺伝子の発現が見出されたので、次いで、二次元及び三次元培養システムにおける各々の培養期間に対して遺伝子発現の定量解析を行った。その結果、三次元培養システムにおけるアルブミン遺伝子の発現量は培養日数に従って減少していたが、平均値をとると二次元培養システムにおけるアルブミン遺伝子の発現量を上回っていた。また、二次元培養システムにおけるCYP3A4遺伝子の発現量は培養日数に従って大きく減少していたのに対し、三次元培養システムにおいては安定した発現量を維持しており、平均値をとっても二次元培養システムのものを上回っていた。さらに、三次元培養システムにおけるCYP2D6及びCYP2C9遺伝子の発現量は二次元培養システムのそれと比較して、どちらの培養日数においても高いレベルを示した。CYP2D6遺伝子に限れば、三次元培養システムにおけるその発現量は二次元培養システムのそれを遙かに凌駕していた。また、CYP2C9遺伝子の発現量に関しては2週間の培養で高い発現レベルを得ることができ、培養日数の経過によって発現量の減少が見られたものの二次元培養システムのものと比較すると依然として高い発現レベルを維持していた。従って三次元培養システムは、ヒト肝幹細胞の薬物代謝酵素等を発現する肝細胞への分化や分化した幹細胞の機能維持に寄与すると結論づけられる。【００９１】
D. 三次元培養システムにおける遺伝子発現の亢進（図7D）
図7Dに示す値は、二次元及び三次元培養システムより得られたいくつかのサンプル群に対する各々の遺伝子の発現量をリアルタイムPCR法を用いて算出し、三次元培養システムにおける遺伝子発現量を二次元培養システムのそれで除して計上した相対値である。この結果より、肝細胞系列マーカー及び肝機能マーカー遺伝子の発現量は三次元培養システムのものにおいて増大していることが明らかである。三次元培養システムにおける各種遺伝子発現量は二次元培養システムと比して3倍以上の増加が見られ、平均で4.4倍の増加が確認された。また、アルブミンとCYP3A4においては同値を示した。従って、三次元培養システムは薬物代謝酵素を含む肝細胞機能遺伝子の発現亢進に寄与すると考えられる。【００９２】
E. 三次元培養システムにおけるBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞の遺伝子発現解析(図７E)
リアルタイムPCR法を用いて、三次元培養を行ったBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞、ヒト初代胎児肝細胞、成人由来ヒト肝細胞、ヒト肝組織における遺伝子発現解析を行った。その結果、三次元培養を行ったBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞でヒト初代胎児肝細胞に相当する薬物代謝遺伝子の発現が確認された。また、三次元培養を行ったBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞における薬物代謝遺伝子の発現量は、ヒト肝組織や成人由来ヒト肝細胞の発現レベルに近似していることが確認されたことから、三次元培養を行ったBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞を用いた薬剤評価試験の有効性が示された。【００９３】
肝幹細胞のHCV受容体の発現解析（表１、図８）
HCV 研究で最も重要な点は、再現性の高い、効率のよい培養システムの開発である。最近ＨＣＶ受容体としていくつかの候補が挙げられている。例えば、CD81テトラスパニン、スカベンジャー受容体BI（ＳＲ−ＢI）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）受容体などである。Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 ArrayとGeneSpring GX9.0解析ソフトを用いて、ヒト初代胎児肝細胞と分離したヒト肝幹細胞のDNAマイクロアレイ解析の結果より、肝幹細胞のHCV受容体CD81の発現量は有意に上昇していた（表１）。更に、フロサイトメトリー解析より、HCV受容体、CD81とLDLRの発現も検出した（図８）。三次元培養システムに上記の細胞を加えて、HCV研究に利用可能となる。【００９４】
【表１】
2009139419.tif 000003
肝幹細胞から分化誘導したヒト肝細胞の脂質代謝と糖新生関連遺伝子の解析（図９）
半定量PCR法を用いて、三次元培養を行ったBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞及びその血管内皮細胞と共培養細胞、肝幹細胞、初代胎児肝細胞、コントロールとしてヒト肝組織における遺伝子発現解析を行った。表２にプライマーの配列を示す。その結果、三次元培養を行ったBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞でヒト肝組織に相当する脂質代謝と糖新生関連遺伝子の発現が確認された（図９）。また、三次元培養を行ったBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞における脂質代謝遺伝子と糖新生関連遺伝子の発現量は、ヒト肝組織の発現レベルに近似していることが確認された（図９）ことから、三次元培養を行ったBMI1遺伝子を導入した形質転換細胞を用いた脂肪肝発生の機構解明、脂肪代謝制御薬の評価、脂肪から糖新生への促進薬の開発、糖新生と糖尿病関係の解明、培養過程の細胞代謝物のメタボローム解析などの評価試験に利用する可能性が示された。【００９５】
サンプル：
１）BMI1-3D: 三次元培養システムを用いて、培養していたBMI1を導入した形質転換細胞。
２）BMI1-3D co-culture：上述細胞とヒト血管内皮細胞株を三次元培養システムで共培養した細胞。
３）Primary fetal liver cells:初代ヒト胎児肝細胞。
４）Hepatic stem cells: primary fetal liver cellsから分離した肝幹細胞。
５）Fetal Liver： human fetal liver total RNA from Clontech, a Takara Bio Company。
６）Adult liver： human liver total RNA from Clontech, a Takara Bio Company。【００９６】
脂質代謝関連遺伝子:
1) upstream stimulatory factors１(USF１)
2) sterol response element binding protein (SREBP-1) 
3) acetoacetyl-CoA 
4) Isopentenyl pyrophosphate1 (IPP1) 
4) HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A) 
5) STAT3 ( signal transducer and activator of transcription 3)
糖新生関連遺伝子：
１）pyruvate carboxylase (PC)
２）malate dehydrogenase2 (MDH2)
３）phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)【００９７】
【表２】
2009139419.tif 000004
ヒト肝幹細胞におけるCD13の発現解析
間葉系幹細胞マーカーの一つはCD13である。Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 ArrayとGeneSpring GX9.0解析ソフトを用いたDNAマイクロアレイ法の解析の結果、分離した肝幹細胞のCD13の発現量は初代胎児肝細胞と比べて2.7倍上昇していた（4001.1/1457.7）。【００９８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によって、分離したヒト肝幹細胞は、人工肝臓や細胞移植などの再生医療に大きく貢献できるものである。また、分離したヒト肝幹細胞から分化誘導したヒト肝細胞は、in vitroにおける薬物代謝能の解析など創薬研究に使用することが可能である。特にBMI1遺伝子導入ヒト肝幹細胞は、細胞操作上は細胞株と同等に取り扱うことが可能であり、そこから分化誘導したヒト肝細胞の創薬産業上の有用性は極めて高い。さらに、これらの細胞は、ＨＣＶ感染及び／又は複製阻害実験、糖代謝実験、脂質代謝実験などのためのヒトモデル細胞として利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
＜配列番号１及び２＞
配列番号１及び２は、アルブミン用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号３及び４＞
配列番号３及び４は、AFP用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号５及び６＞
配列番号５及び６は、G6P用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号７及び８＞
配列番号７及び８は、CYP3A4用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号９及び１０＞
配列番号９及び１０は、CYP2C9用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号１１及び１２＞
配列番号１１及び１２は、CYP2C19用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号１３及び１４＞
配列番号１３及び１４は、CYP2D6用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号１５及び１６＞
配列番号１５及び１６は、CYP1A2用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号１７及び１８＞
配列番号１７及び１８は、CYP2B6用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号１９及び２０＞
配列番号１９及び２０は、CYP2E1用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号２１及び２２＞
配列番号２１及び２２は、GAPDH用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号２３及び２４＞
配列番号２３及び２４は、EGFP用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号２５及び２６＞
配列番号２５及び２６は、BMI1用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号２７及び２８＞
配列番号２７及び２８は、TAT用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号２９及び３０＞
配列番号２９及び３０は、GULU用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号３１及び３２＞
配列番号３１及び３２は、GGT用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号３３及び３４＞
配列番号３３及び３４は、Desmin 用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号３５及び３６＞
配列番号３５及び３６は、CYP2A6用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号３７及び３８＞
配列番号３７及び３８は、MRP2用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号３９及び４０＞
配列番号３９及び４０は、MDR1用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号４１及び４２＞
配列番号４１及び４２は、MRP3用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号４３及び４４＞
配列番号４３及び４４は、BCRP用肝細胞特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号４５及び４６＞
配列番号４５及び４６は、PROM1用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号４７及び４８＞
配列番号４７及び４８は、CD24用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号４９及び５０＞
配列番号４９及び５０は、CD44用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号５１及び５２＞
配列番号５１及び５２は、ALCAM用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号５３及び５４＞
配列番号５３及び５４は、EPCAM用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号５５及び５６＞
配列番号５５及び５６は、それぞれ、本研究に用いたヒトBMI1のヌクレオチド配列（CDSヌクレオチド配列 (981 bp)）及びアミノ酸配列(326 amino acid)を示す（GenBank accession number: NM_005180.5）。
＜配列番号５７及び５８＞
配列番号５７及び５８は、PEPCK用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号５９及び６０＞
配列番号５９及び６０は、PC用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号６１及び６２＞
配列番号６１及び６２は、MDH2用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号６３及び６４＞
配列番号６３及び６４は、STAT3用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号６５及び６６＞
配列番号６５及び６６は、USF1用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号６７及び６８＞
配列番号６７及び６８は、SREBF1用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号６９及び７０＞
配列番号６９及び７０は、Acetoacetyl-CoA用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号７１及び７２＞
配列番号７１及び７２は、IPP1用特異的プライマーの配列を示す。
＜配列番号７３及び７４＞
配列番号７３及び７４は、HMG-CoA用特異的プライマーの配列を示す。
【図２Ｆ】
2009139419.tif 000005
【図７Ｄ】
2009139419.tif 000006
【図１Ａ】
2009139419.tif 000007
【図１Ｂ】
2009139419.tif 000008
【図１Ｃ】
2009139419.tif 000009
【図１Ｄ】
2009139419.tif 000010
【図１Ｅ】
2009139419.tif 000011
【図２Ａ】
2009139419.tif 000012
【図２Ｂ】
2009139419.tif 000013
【図２Ｃ】
2009139419.tif 000014
【図２Ｄ】
2009139419.tif 000015
【図２Ｅ】
2009139419.tif 000016
【図３Ａ】
2009139419.tif 000017
【図３Ｂ】
2009139419.tif 000018
【図３Ｃ】
2009139419.tif 000019
【図３Ｄ】
2009139419.tif 000020
【図４Ａ】
2009139419.tif 000021
【図４Ｂ】
2009139419.tif 000022
【図４Ｃ】
2009139419.tif 000023
【図４Ｄ】
2009139419.tif 000024
【図４Ｅ】
2009139419.tif 000025
【図５】
2009139419.tif 000026
【図６】
2009139419.tif 000027
【図７Ａ】
2009139419.tif 000028
【図７Ｂ】
2009139419.tif 000029
【図７Ｃ】
2009139419.tif 000030
【図７Ｅ】
2009139419.tif 000031
【図８】
2009139419.tif 000032
【図９】
2009139419.tif 000033
【配列表】
2009139419000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月11日(2010.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３１８＋及び／又はＣＤ６６−の表現型を有し、肝細胞に分化することができるヒト肝未分化細胞。
【請求項２】
ＣＤ３１８＋の表現型を有する請求項１記載の細胞。
【請求項３】
さらに、ＣＤ９０＋の表現型を有する請求項１又は２記載の細胞。
【請求項４】
ＣＤ６６−の表現型を有する請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
ＣＤ３１８＋ＣＤ９０＋ＣＤ６６−の表現型を有する請求項１記載の細胞。
【請求項６】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０８として受託されている細胞クローンＬＳＣ−Ｅ２である請求項５記載の細胞。
【請求項７】
さらに、ＣＤ１３＋の表現型を有する請求項１〜６のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
ＣＤ３１８＋及び／又はＣＤ６６−の表現型を有するヒト肝未分化細胞クローンを増殖させて細胞集団とし、この細胞集団から、ＣＤ３１８＋及び／又はＣＤ６６−の表現型を有する細胞を分取することにより得られた細胞又はその子孫である請求項１記載の細胞。
【請求項９】
請求項１記載のヒト肝未分化細胞にＢＭＩ１遺伝子を導入した形質転換細胞。
【請求項１０】
ヒト肝細胞集団から、ＣＤ３１８＋及び／又はＣＤ６６−の表現型を有するヒト肝未分化細胞を分取することを含む、請求項１記載のヒト肝未分化細胞の調製方法。
【請求項１１】
ヒト肝細胞集団が、ヒト肝臓から分離した初代肝細胞培養系である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ヒト肝細胞集団から、ＣＤ３１８＋及び／又はＣＤ６６−の表現型を有するヒト肝未分化細胞を分取した後に、細胞を増殖させて細胞集団とし、この細胞集団から、再度、ＣＤ３１８＋及び／又はＣＤ６６−の表現型を有する細胞を分取することを含む請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
細胞の分取と増殖を２回以上繰り返す請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１記載のヒト肝未分化細胞及び／又は請求項９記載の形質転換細胞の分化を誘導することにより、薬物代謝酵素及び／又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞を調製する方法。
【請求項１５】
細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子で処理することにより、請求項１記載のヒト肝未分化細胞及び／又は請求項９記載の形質転換細胞の分化を誘導する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
細胞外マトリックス分子及び／又は成長因子が、Ｌａｍｉｎｉｎ，Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｔｙｐｅ  ＩＶ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，Ｍｅｔｒｉｇｅｌ，Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ＤＭＳＯ，Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ，Ｉｎｓｕｌｉｎ，ＨＧＦ，ＥＧＦ，ＴＧＦα，ＨＢ−ＥＧＦ，ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
三次元培養を行うことにより、請求項１記載のヒト肝未分化細胞及び／又は請求項９記載の形質転換細胞の分化を誘導する請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４記載の方法で調製した、薬物代謝酵素及び／又はトランスポーターをタンパク質レベルで発現する肝細胞。
【請求項１９】
薬物代謝酵素が、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ２Ａ６から成る群より選択される少なくとも１つである請求項１８記載の肝細胞。
【請求項２０】
トランスポーターが、ＡＢＣ２、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ８、ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ５、ＭＲＰ６、ＡＢＣＧ８、ＮＴＣＰ、ＰＥＰＴ１、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ８、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｆ、ＯＣＴ１、ＯＡＴ２、ＳＬＣ２２Ａ１８、ＣＮＴ１、ＥＮＴ１、ＭＡＴＥ１、ＭＲＰ３及びＢＣＲＰから成る群より選択される少なくとも１つである請求項１８記載の肝細胞。
【請求項２１】
請求項１８記載の肝細胞を用いて、薬の候補化合物の代謝及び／又は輸送を評価する方法。
【請求項２２】
請求項１記載のヒト肝未分化細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含むバイオリアクター。
【請求項２３】
人工肝臓として利用される請求項２２記載のバイオリアクター。
【請求項２４】
請求項１記載のヒト肝未分化細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含む、ＨＣＶ感染及び／又は複製阻害実験のためのヒトモデル細胞。
【請求項２５】
請求項１記載のヒト肝未分化細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含む、糖代謝実験のためのヒトモデル細胞。
【請求項２６】
請求項１記載のヒト肝未分化細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を含む、脂質代謝実験のためのヒトモデル細胞。
【請求項２７】
請求項１記載のヒト肝未分化細胞、請求項９記載の形質転換細胞及び／又はそれらの細胞から分化誘導された肝細胞を再生医療において使用する方法。
【請求項２８】
再生医療が細胞治療である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ヒト肝未分化細胞が、ヒト肝幹細胞及び／又はヒト肝前駆細胞である請求項１記載の細胞。
【国際調査報告】
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