(57)【要約】Ｎｏｇｏ受容体１（ＮｇＲ１）は軸索再生をモジュレートするシグナリング複合体の部分を形成するロイシンリッチリピート蛋白である。以前の研究によれば、ＬＲＲのＣ末端であるＬＲＲＣＴを包含するＮｏｇｏ受容体−１の全ＬＲＲ領域がリガンド結合に必要であること、及び、Ｎｏｇｏ受容体−１の隣接するＣＴ幹部が共受容体との相互作用に寄与していることがわかっている。本発明はＣＮＳニューロンにおけるニューライト成長、ニューロン生存及び軸索再生を促進するための特定のＮｏｇｏ受容体−１及びＮｏｇｏ受容体−２ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントの使用に関する。本発明はニューライト成長の抑制を抑制するため、ニューロン生存を促進するため、及び／又は、ＣＮＳニューロンにおける軸索再生を促進するために有用な分子及び方法を特徴としている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つまでのアミノ酸置換を除き配列番号２のアミノ酸３０９〜３４４と同一のアミノ酸配列を含む、４０残基以下の単離されたポリペプチドフラグメント。
【請求項２】
前記アミノ酸置換少なくとも１つがＣ３０９、Ｃ３３５及びＣ３３６よりなる群から選択されるシステイン残基において起こっている請求項１記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項３】
前記システイン残基がＣ３０９である請求項２記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項４】
前記システイン残基がＣ３３５である請求項２記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項５】
前記システイン残基がＣ３３６である請求項２記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項６】
前記システイン残基がアラニン、セリン又はスレオニンよりなる群から選択される異なるアミノ酸で置換されている請求項２〜５の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項７】
前記異なるアミノ酸がアラニンである請求項６記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項８】
環状である請求項１〜７の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項９】
Ｎ末端で連結している第１の分子及びＣ末端で連結している第２の分子を更に含み；該第１の分子及び該第２の分子が相互に連結して前記環状分子を形成している請求項８記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１０】
前記第１及び前記第２の分子がビオチン分子、システイン残基及びアセチル化システイン残基よりなる群から選択される請求項９記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１１】
前記第１の分子がＮ末端に結合したビオチン分子であり、前記第２の分子が前記ポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である請求項１０記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１２】
前記第１の分子がＮ末端に連結したアセチル化システイン残基であり、前記第２の分子が前記ポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である請求項１０記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１３】
前記Ｃ末端システインが結合したＮＨ２部分を有する請求項１０〜１２の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１４】
非相同ポリペプチドに融合した請求項１〜１３の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１５】
前記非相同ポリペプチドが血清アルブミンである請求項１４記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１６】
前記非相同ポリペプチドがＦｃ領域である請求項１４記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１７】
前記非相同ポリペプチドがシグナルペプチドである請求項１４記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１８】
前記非相同ポリペプチドがポリペプチドタグである請求項１４記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項１９】
前記Ｆｃ領域がＩｇＡＦｃ領域；ＩｇＤＦｃ領域；ＩｇＧＦｃ領域、ＩｇＥＦｃ領域；及びＩｇＭＦｃ領域よりなる群から選択される請求項１６記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項２０】
前記ポリペプチドタグがＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリ−ヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；及びｃ−Ｍｙｃタグよりなる群から選択される請求項１８記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項２１】
前記ポリペプチドがポリアルキレングリコール部分１つ以上に結合している請求項１〜２０の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項２２】
前記ポリアルキレングリコール部分１つ以上がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である請求項２１記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項２３】
前記ポリペプチドがＰＥＧ部分１〜５個に結合している請求項２２記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ヌクレオチド配列が発現制御エレメントに作動可能に連結している請求項２４記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記発現制御エレメントが誘導性プロモーター、構成性プロモーター；及び分泌シグナルよりなる群から選択される請求項２５記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２４〜２６の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２８】
請求項２７記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１〜２３の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメント及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２４〜２６の何れか１項に記載のポリヌクレオチド及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２７記載のベクター又は請求項２８記載の宿主細胞及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
下記群：
（ａ）請求項１〜２３の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメント；
（ｂ）請求項２４〜２６の何れか１項に記載のポリヌクレオチド；及び、
（ｃ）請求項２９〜３１の何れか１項に記載の組成物；
よりなる群から選択される薬剤にニューロンを接触させることを含むニューライト成長を促進する方法であって、ここで該薬剤がＮｏｇｏ受容体１媒介ニューライト成長抑制を抑制する、方法。
【請求項３３】
前記ニューロンが哺乳動物中にある請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物がヒトである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
下記群：
（ａ）請求項１〜２３の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメント；
（ｂ）請求項２４〜２６の何れか１項に記載のポリヌクレオチド；及び、
（ｃ）請求項２９〜３１の何れか１項に記載の組成物；
よりなる群から選択される薬剤の有効量にニューロンを接触させることを含むＮｇＲ１シグナリング複合体によるシグナル伝達を抑制する方法であって、ここで該薬剤がＮｇＲ１シグナリング複合体によるシグナル伝達を抑制する、方法。
【請求項３６】
前記ニューロンが哺乳動物中にある請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物がヒトである請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
下記群：
（ａ）請求項１〜２３の何れか１項に記載のポリペプチドフラグメント；
（ｂ）請求項２４〜２６の何れか１項に記載のポリヌクレオチド；及び、
（ｃ）請求項２９〜３１の何れか１項に記載の組成物；
よりなる群から選択される薬剤の有効量を中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害又は傷害の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるその治療の方法。
【請求項３９】
前記疾患、障害又は傷害が多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、卒中、外傷性脳傷害、脊髄傷害、視神経炎、緑内障、聴力喪失及び副腎白質萎縮症よりなる群から選択される請求項３８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は神経生物学、神経学及び薬学に関する。より詳細には、本発明はニューロン及び軸索成長を媒介するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ニューロンの軸索及び樹状突起はニューロンから生じる長い細胞伸長部である。伸長する軸索の遠位の尖端、即ちニューライトは成長円錐として知られている特殊化された領域を含み、これは局所的環境を感知し、軸索成長をニューロンの標的細胞に向かうように方向付ける。円錐における生育の方向付けには種々のクラスの接着分子、細胞間シグナル、並びに成長円錐を刺激及び抑制する因子が関与している。
【０００３】
神経細胞の機能はニューロンとその直接の環境における他の細胞の間の接触により大きく影響される。これ等の細胞は特殊神経膠細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）中のオリゴ樹状細胞、及び末梢神経系（ＰＮＳ）中のシュワン細胞を包含し、これ等はニューロン軸索をミエリン（多層膜の絶縁構造）で被覆する。ＣＮＳニューロンは傷害後に再生する能力を有するが、これは、ミエリン中に存在する抑制蛋白の存在のため、及び、恐らくは更にその局所環境中に通常存在する分子の他の型により、妨害される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
オリゴ樹状細胞上に存在する数種のミエリン抑制蛋白が特性化されており、例えば、ＮｏＧｏＡ（非特許文献４；非特許文献５）、ミエリン関連等蛋白（非特許文献６；非特許文献７）及びオリゴ樹状細胞等蛋白（非特許文献８）が挙げられる。これ等の蛋白の各々は別個にニューロンＮｏｇｏ受容体−１（ＮｇＲ１）のリガンドであることが解っている（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献５；非特許文献４；非特許文献１１）。Ｎｏｇｏ−６６はニューライト成長を抑制し、そして成長円錐の崩壊を誘発する能力を有するＮｏｇｏＡ由来の６６アミノ酸ペプチドである（非特許文献１２）。Ｎｏｇｏ受容体−１（ＮｇＲ１）はＮ末端及びＣ末端のシステインリッチドメインによりフランキングされた８ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）（それぞれＬＲＲＮＴ及びＬＲＲＣＴ領域）、及びＬＲＲＣＴとグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー部位との間にＳｅｒ−、Ｔｈｒ−、Ｐｒｏ−及びＧｌｙ−リッチの幹部領域（ＣＴ幹部）を含有するＬＲＲ蛋白である。ＮｇＲ１はＬＩＮＧＯ−１及びｐ７５又はＴａｊ（ＴＲＯＹとしても知られている）とシグナリング複合体を形成する。抑制蛋白（例えばＮｏｇｏＡ、ＭＡＧ及びＯＭ−ｇｐ）と相互作用すると、ＮｇＲ１複合体は成長円錐の崩壊及びニューライト成長の抑制をもたらすシグナルを伝達する。以前の研究によれば、ＬＲＲのＣ末端、ＬＲＲＣＴを包含するＮｏｇｏ受容体−１の全ＬＲＲ領域がリガンド結合のために必要とされること、及び、Ｎｏｇｏ受容体−１の隣接するＣＴ幹部が共受容体との相互作用に寄与していることが解っている。
【０００５】
軸索損傷は中枢神経系（ＣＮＳ）の多くの傷害、例えば脊髄傷害、外傷性脳傷害及び卒中、並びに多発性硬化症（ＭＳ）における重要な病理である。ＣＮＳ傷害及びＣＮＳ疾患を治療するための最近開発された方策は、ミエリン蛋白のその軸索受容体、例えばＮｇＲ、ＬＩＮＧＯ−１及びｐ７５又はＴａｊとの相互作用を介して生じる軸索生育抑制を妨害することである。例えば、抗ＮｏｇｏＡ抗体Ｉｎ−１は脊髄切断を起こしているラットにおける機能回復を上場させることがわかっている（非特許文献１３）。更に又、ＮｏｇｏＡの拮抗剤であるＮＥＰ１−４０として知られている４０残基ペプチドは成長円錐崩壊及びニューライト成長に対するミエリン又はＮｏｇｏ−６６の作用を減衰させることが解り、そして、脊髄傷害後のインビボの結果を向上させている（非特許文献１３）。これ等の試薬はＣＮＳに対する傷害の治療において信頼できることがわかっているが、ＮｇＲシグナリングを抑制、及び／又は、ミエリン媒介成長円錐崩壊を減衰、及び／又はニューライト成長抑制を抑制する追加的な化合物が当該分野でなお必要とされている。
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｔｉｓ  ａｎｄ  Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｎｅｕｒｏｎ  ２００１，３０，ｐｐ．１１−１４
【非特許文献２】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２，２２，ｐｐ．２７９２−２８０３
【非特許文献３】Ｇｒｉｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２，２２，ｐｐ．３１４４−３１６０
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９
【非特許文献５】Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３，４３９−４４４
【非特許文献６】ＭＡＧ，ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １９９４，１３，８０５−８１１
【非特許文献７】Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １９９４，１３，７５７−７６７
【非特許文献８】ＯＭ−ｇｐ，Ｍｉｋｏｌ  ａｎｄ  Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８８，１０６，１２７３−１２７９
【非特許文献９】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１７，９４１−９４４
【非特許文献１０】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２，２９７，１１９０−９３
【非特許文献１１】Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２００２，３５，２８３−９０
【非特許文献１２】Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４０９，３４１−３４６
【非特許文献１３】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００３，２，１−７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明はＣＮＳニューロンにおけるニューライト成長、ニューロン生存及び軸索再生を促進するための特定のＮｏｇｏ受容体、そのポリペプチド、例えばＮｇＲ１及びＮｇＲ２及びポリペプチドフラグメントの使用に関する。本発明はＣＮＳニューロンにおけるニューライト成長抑制を抑制、ニューロン生存を促進、及び／又は、軸索再生を促進するために有用な分子及び方法を特徴とする。
【０００７】
一部の実施形態においては、本発明は３つまでのアミノ酸置換を除き配列番号２のアミノ酸３０９〜３４４と同一のアミノ酸配列を含む４０残基以下の単離されたポリペプチドフラグメントを提供する。
【０００８】
一部の実施形態においては、本発明は環状である本発明のポリペプチドを提供する。一部の実施形態においては、環状ポリペプチドはＮ末端で連結している第１の分子及びＣ末端で連結している第２の分子を更に含み；ここで第１の分子及び第２の分子が相互に連結して環状分子を形成している。一部の実施形態においては、第１及び第２の分子がビオチン分子、システイン残基及びアセチル化システイン残基よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、第１の分子がＮ末端に結合したビオチン分子であり、第２の分子が本発明のポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である。一部の実施形態においては、第１の分子がＮ末端に連結したアセチル化システイン残基であり、第２の分子が本発明のポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である。一部の実施形態においては、第１の分子がＮ末端に連結したアセチル化システイン残基であり、第２の分子が本発明のポリペプチドのＣ末端に結合したシステイン残基である。一部の実施形態においては、Ｃ末端システインは結合したＮＨ２部分を有する。
【０００９】
一部の実施形態においては、本発明はシステイン残基少なくとも１つが異なるアミノ酸で置換された本発明のポリペプチドを提供する。一部の実施形態においてはシステイン残基少なくとも１つはＣ３０９である。一部の実施形態においてはシステイン残基少なくとも１つはＣ３５５である。一部の実施形態においてはシステイン残基少なくとも１つはＣ３３６である。一部の実施形態においてはシステイン残基少なくとも１つはアラニン、セリン又はスレオニンよりなる群から選択される異なるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態においては、異なるアミノ酸はアラニンである。
【００１０】
一部の実施形態においては、本発明は更に、ポリペプチドが非相同ポリペプチドに融合したものを提供する。一部の実施形態においては非相同ポリペプチドは血清アルブミンである。一部の実施形態においては、非相同ポリペプチドはＦｃ領域である。一部の実施形態においては、非相同ポリペプチドはシグナルペプチドである。一部の実施形態においては非相同ポリペプチドはポリペプチドタグである。一部の実施形態においては、本発明は更に、Ｆｃ領域がＩｇＡＦｃ領域；ＩｇＤＦｃ領域；ＩｇＧＦｃ領域、ＩｇＥＦｃ領域；及びＩｇＭＦｃ領域よりなる群から選択されるものを提供する。一部の実施形態においては、本発明は更に、ポリペプチドタグがＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリ−ヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；及びｃ−Ｍｙｃタグよりなる群から選択されるものを提供する。
【００１１】
一部の実施形態においては、本発明はポリアルキレングリコール部分１つ以上に結合している。本発明のポリペプチドを提供する一部の実施形態においては、本発明は更にポリアルキレングリコール部分１つ以上がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であるものを提供する。一部の実施形態においては、本発明は更にポリペプチドがＰＥＧ部分１〜５個に結合しているものを提供する。
【００１２】
一部の実施形態においては本発明は本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態においては、本発明は更に、ヌクレオチド配列が発現制御エレメント（例えば誘導性プロモーター、構成性プロモーター又は分泌シグナル）に作動可能に連結しているものを提供する。別の実施形態は本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター及び該ベクターを含む宿主細胞を包含する。
【００１３】
本発明の別の実施形態は本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター又は宿主細胞、及び一部の実施形態においては製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物を包含する。
【００１４】
本発明の実施形態は又、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は組成物を包含する薬剤にニューロンを接触させることを含むニューライト成長を促進するための方法を包含し、ここで該薬剤はＮｏｇｏ受容体１媒介ニューライト成長抑制を抑制する。一部の実施形態においては、ニューロンは哺乳動物中にあり、そして特定の実施形態においては哺乳動物はヒトである。
【００１５】
別の実施形態は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は組成物を包含する薬剤の有効量にニューロンを接触させることを含むＮｇＲ１シグナリング複合体によるシグナル伝達を抑制する方法を包含し、ここで該薬剤はＮｇＲ１シグナリング複合体によるシグナル伝達を抑制する。一部の実施形態においては、ニューロンは哺乳動物中にあり、そして特定の実施形態においては哺乳動物はヒトである。
【００１６】
他の実施形態は本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は組成物を包含する薬剤の有効量を中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害又は傷害の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるその治療の方法を包含し、ここで該薬剤はＮｏｇｏ受容体１媒介ニューライト成長抑制を抑制する。特定の実施形態においては、疾患、障害又は傷害は多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、卒中、外傷性脳傷害、脊髄傷害、視神経炎、緑内障、聴力喪失及び副腎白質萎縮症よりなる群から選択される
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的及び専門的な用語は本明細書が属する分野の当業者により通常理解されるものと同様の意味を有する。矛盾がある場合は、定義を包含する本出願が優先する。内容により要求されない限り、単数標記用語は複数を包含し、複数標記用語は単数を包含する。本明細書において言及する全ての公開物、特許及び他の参考文献は書く公開物又は特許出願が特定的及び個別的に参照により本明細書に組み込まれるが如く、全ての目的の為に参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本明細書に記載するものと同様又は等価な方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用できるが、適当な方法及び材料を以下に説明する。材料、方法及び例は説明を目的とするのみであり、限定する意図は無い。本発明の他の特徴及び利点は詳細な説明及び請求項から明らかにされる。
【００１９】
本発明を更に定義するために、以下の用語及び定義を提示する。
【００２０】
「ある」単数標記の実体はその実体の１つ以上を指し；例えば単数標記の「ある免疫グロブリン分子」は１つ以上の免疫グロブリン分子を表すものとする。従って、「ある」、「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」は本明細書においては互換的に使用できる。
【００２１】
本明細書及び請求項の全体を通じて、「含む」という用語及びその変化形「含んでいる」等は何れかの標記された整数又は整数の群の包含を示すが、如何なる他の整数又は整数の群の排除示すものでも無い。
【００２２】
本明細書においては、「よりなる」という用語及びその変化形、例えば「よりなっている」等は、本明細書及び請求項の全体を通じて、何れかの標記された整数又は整数の群の包含を示すが、別の整数又は整数の群を特定の方法、構造又は組成に付加してはならないことを意味する。
【００２３】
本明細書においては、「本質的になる」という用語又はその変化形、例えば「本質的になっている」等は、本明細書及び請求項の全体を通じて、何れかの標記された整数又は整数の群の包含、そして特定の方法、構造又は組成の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない何れかの標記された整数又は整数の群の任意の包含を示す。
【００２４】
本明細書においては、「ポリペプチド」という用語は単数標記の「ポリペプチド」並びに複数標記の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、そしてアミド結合（ペプチド結合としても知られている）により線状に連結された単量体（アミノ酸）を含む分子を指す。「ポリペプチド」という用語はアミノ酸２つ以上の何れかの鎖を指し、そして特定の長さの生成物を指さない。即ち、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「蛋白」、「アミノ酸鎖」又はアミノ酸２つ以上の鎖を指すために使用される何れかの他の用語は「ポリペプチド」の定義に包含され、そして「ポリペプチド」という用語はこれ等の用語の何れとも、その代替として、又は互換的に使用してよい。「ポリペプチド」という用語は又、ポリペプチドの発現後修飾、例えば限定しないが、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、既知保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解的切断又は非天然存在アミノ酸による修飾の産物も指すことを意図している。ポリペプチドは天然の生物学的原料から誘導してよく、又は、組み換え技術により製造してよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳しなくともよい。化学合成を包含する何れかの態様において形成してよい。
【００２５】
本発明のポリペプチドはアミノ酸約３以上、約５以上、約１０以上、約２０以上、約２５以上、約５０以上、約７５以上、約１００以上、約２００以上、約５００以上、約１，０００以上、又は約２，０００以上の大きさであってよい。ポリペプチドは所定の３次元構造を有してよいが、必ずしもそのような構造を有する必要は無い。所定の３次元構造を有するポリペプチドは折畳型と称し、そして所定の３次元構造を有さないポリペプチドはむしろより多数の異なるコンホーメーションを適合でき、そして非折畳型と称する。本明細書においては、等蛋白という用語は、アミノ酸残基、例えばセリン残基又はアスパラギン残基の酸素含有又は窒素含有側鎖を介して蛋白に結合している炭水化物部分少なくとも１つにカップリングした蛋白を指す。
【００２６】
「単離された」ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体又は誘導体とは、その天然の環境には無いポリペプチドを意図する。特定の水準の精製を必要としない。例えば、単離されたポリペプチドはそのネイティブ又は天然の環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現された組み換え生産されたポリペプチド及び蛋白を本発明の目的の為には、何れかの適当な手法で分離、分画又は部分的又は完全に精製されているネイティブ又は組み換えポリペプチドと同様に単離されたと見なされる。
【００２７】
本発明の方法においては、「ポリペプチドフラグメント」とはより大きいポリペプチドの短いアミノ酸配列を指す。蛋白フラグメントは「フリースタンディング」であるか、又はそのフラグメントが領域の一部を形成するより大きいポリペプチド内に含まれていてよい。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例は、例えば、長さにおいて、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、３０アミノ酸、約４０アミノ酸、５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸及び約１００アミノ酸以上を含むフラグメントを包含する。
【００２８】
フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「類縁体」という用語は、本発明のポリペプチドに言及する場合の「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「類縁体」という用語は、少なくとも一部の生物学的活性を保持している何れかのポリペプチドを包含する。本明細書に記載するポリペプチドは、その内部のフラグメント、変異体又は誘導体の分子を、ポリペプチドがなおその機能を発揮する限り限定することなく包含してよい。本発明のＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントは蛋白分解性のフラグメント、欠失フラグメント、及び、特に、動物に送達した場合に作用部位により容易に到達するフラグメントを包含してよい。ポリペプチドフラグメントは更に、線状及び３次元のエピトープを包含するネイティブポリペプチドの抗原性又は免疫原性のエピトープを含むポリペプチドの何れかの部分を包含する。本発明のＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントは変異体領域、例えば上記したフラグメント、及び、アミノ酸の置換、欠失又は挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含んでよい。変異体は対立遺伝子変異体のように天然に存在するものであってよい。「対立遺伝子変異体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子の代替形態を意図する。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。非天然存在の変異体は当該分野で知られた突然変異誘発手法を用いて製造してよい。本発明のＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントは保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、欠失又は付加を含んでよい。本発明のＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントはまた誘導体分子を包含してよい。変異体ポリペプチドは又本明細書においては「ポリペプチド類縁体」とも称してよい。本明細書においては、ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの「誘導体」とは官能性の側部基の反応により化学的に誘導体化された残基１つ以上を有する要件ポリペプチドを指す。「誘導体」にやはり包含されるものは２０標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体１つ以上を含有するペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換されてよく；５−ヒドロキシリジンはリジンと置換されてよく；３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換されてよく；ホモセリンはセリンと置換されてよく；そしてオルニチンはリジンと置換されてよい。
【００２９】
本明細書においては、「ジスルフィド結合」という用語はイオウ原子２つの間に形成される共有結合を包含する。アミノ酸システインは第２のチオール基とジスルフィド結合を形成するか、架橋することができるチオール基を含む。
【００３０】
本明細書においては、「融合蛋白」とは、第２のポリペプチドにペプチド結合を介して線状に連結された第１のポリペプチドを含む蛋白を意味する。第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは同じかまたは異なっていてよく、そしてそれらは直接連結されるか、ペプチドリンカーを介して連結されてよい（後述）。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」という用語は単一の核酸、並びに複数の核酸を包含することを意図しており、そして単離された核酸の分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは未翻訳の５’及び３’配列、コーディング配列を含む完全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を含有できる。ポリヌクレオチドは従来のホスホジエステル結合又は非従来の結合を含んでよ（例えばアミド結合、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）中に存在するもの）。ポリヌクレオチドは何れかのポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、これ等は未修飾のＲＮＡ又はＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。例えば、ポリヌクレオチドは１本鎖及び２本鎖のＤＮＡ、１本及び２本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、１本及び２本鎖のＲＮＡ、及び、１本及び２本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖、又はより典型的には２本鎖又は１本及び２本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含できる。本明細書においては更に、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を含むことができる。ポリヌクレオチドはまた１つ以上の修飾された塩基又は安定性又は他の理由の為に修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡの骨格も包含してよい。「修飾された」塩基とは例えば、トリチル化された塩基及び非通常の塩基、例えばイノシンを包含する。ＤＮＡ及びＲＮＡには種々の修飾を行うことができ；即ち「ポリヌクレオチド」とは化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態を包含する。
【００３２】
「核酸」という用語はポリヌクレオチド中に存在する何れかの１つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを指す。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドとは、そのネイティブの環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクター中に含有される本発明のＮｇＲポリペプチド又はポリペプチドフラグメントをコードする組み換えポリヌクレオチドは本発明の目的のためには単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドの別の例は非相同宿主細胞中に維持されている組み換えポリヌクレオチド又は溶液中の精製された（部分的又は実質的に）ポリヌクレオチドを包含する。単離されたＲＮＡ分子は本発明のポリヌクレオチドのインビボ及びインビトロのＲＮＡ転写物を包含する。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は更に合成により製造された分子も包含する。更に又、ポリヌクレオチド又は核酸は調節エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターであるか、これ等を包含してよい。
【００３３】
本明細書においては、「コーディング領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンよりなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、それらはコーディング領域の部分と見なしてよく、しかしながら、何れかのフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等はコーディング領域の部分ではない。本発明のコーディング領域２つ以上が単一のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば単一のベクター上、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば別個（異なる）ベクター上に存在することができる。更に又、如何なるベクターも単一のコーディング領域を含有してよく、又は２つ以上のコーディング領域を含んでよく、例えば単一のベクターが別個に免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードしてよい。更に又、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は本発明のＮｇＲポリペプチド又はポリペプチドフラグメントをコードする核酸に融合した又は融合していない非相同コーディング領域をコードしてよい。非相同コーディング領域は限定しないが特殊化されたエレメント又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は非相同機能性ドメインを包含する。
【００３４】
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常はコーディング領域１つ以上に作動可能に会合したプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御エレメントを包含してよい。作動可能な会合は遺伝子産物、例えばポリペプチドに対するコーディング領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下又は制御下とするような態様において調節配列の１つ以上と会合している場合である。２ＤＮＡフラグメント（例えば追い終えコーディング領域及びそれと会合しているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び、２ＤＮＡフラグメントの間の連結部の性質が遺伝子産物の発現を試行する発現調節配列の能力を妨害しないか、又は、ＤＮＡ鋳型が転写される能力を妨害しなければ、「作動可能に会合している」ことになる。即ち、プロモーター領域はプロモーターがポリペプチドをコードする核酸の転写を起こすことができた場合に、その核酸に作動可能に会合していることになる。プロモーターは所定の細胞内でＤＮＡのみの実質的転写を指向する細胞特異的なプロモーターであってよい。プロモーター、例えばエンハンサー、オペレーター、受容体及び転写終止シグナル以外の他の転写制御エレメントは、細胞特異的転写を指向するポリヌクレオチドと作動可能に会合していることができる。適当なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示する通りである。
【００３５】
種々の転写制御領域が当該分野で知られている。これ等には限定しないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域、例えば限定しないが、サイトメガロウィルス（最初期プロモーター、イントロン−Ａと連携）、シミアンウィルス４０（初期プロモーター）及びレトロウィルス（例えばラウス肉腫ウィルス）由来のプロモーター及びエンハンサーを包含する。他の転写制御領域はアクチン、熱ショック蛋白、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンのような脊椎動物遺伝子から誘導したもの、並びに、真核生物細胞における遺伝子発現を制御できる他の配列を包含する。他の適当な転写制御領域は組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに、リンホカイン誘導性プロモーター（例えばインターフェロン又はインターロイキンにより誘導されるプロモーター）を包含する。
【００３６】
同様に種々の翻訳制御エレメントが当該分野で知られている。これ等は限定しないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及び、ピコナウィルスから誘導されたエレメント（特に内部リボソーム進入部位、即ちＩＲＥＳ、別名ＣＩＴＥ配列）を包含する。
【００３７】
他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指向する分泌又はシグナルペプチドをコードする別のコーディング領域と会合していてよい。シグナル仮説に基づけば、哺乳動物細胞により分泌された蛋白は、粗面小胞体を通過する成長中の蛋白鎖の移出が開始された後に成熟蛋白から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当該分野で知られており、脊椎動物細胞により分泌されたポリペプチドは一般的に、完全又は「完全長」のポリペプチドから切断されて分泌された、又は「成熟した」形態のポリペプチドを生成する、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有する。特定の実施形態においては、ネイティブのシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖のシグナルペプチド、又は自身と作動可能に会合したポリペプチドの分泌を指向する能力を保持している配列の機能的誘導体を使用する。或いは、非相同の哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体を使用してよい。例えば、野生型リーダー配列とヒト組織プラスミノーゲン活性化物質（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼとを置き換えてもよい。
【００３９】
本明細書においては、「操作された」とは核酸又はポリペプチド分子の合成手段による操作を包含する（例えば組み換え手法、インビトロペプチド合成、酵素的又は化学的なペプチドカップリング、又は、これ等の手法の何らかの組合せ）。
【００４０】
本明細書においては、「連結する」、「融合する」又は「融合」という用語は互換的に使用する。これ等の用語は、化学的なコンジュゲーション又は組み換えの手段を包含する何らかの手段による２つ以上の要素又は成分の連結を指す。「インフレーム融合」とは２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がもとのＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持する態様において連結することにより連続したより長いＯＲＦを形成することを指す。即ち、組み換え融合蛋白は元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに相当するセグメント２つ以上を含有する単一の蛋白である（このセグメントは天然においてそのようには通常連結しない）。読み枠はこのようにして融合セグメント全体に渡って連続して形成されるが、セグメントは例えばインフレームリンカー配列により物理的又は空間的に分離されていてよい。
【００４１】
「リンカー」配列は融合蛋白における２ポリペプチドコーディング領域を分離するアミノ酸１つ以上のシリーズである。典型的なリンカーは少なくとも５アミノ酸を含む。別のリンカーは少なくとも１０又は少なくとも１５アミノ酸を含む。特定の実施形態においては、ペプチドリンカーのアミノ酸はリンカーが親水性になるように選択される。リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号３）はそれが十分な柔軟性を与えることから多くの抗体に広範に適用できる好ましいリンカーである。他のリンカーは：
【００４２】
【数１】
2009505665.tif 000002
を包含する。より短いリンカーの例は上記リンカーのフラグメントであり、そしてより長いリンカーの例は上記リンカーの組合せ、上記リンカーのフラグメントの組合せ、及び、上記リンカーと上記リンカーのフラグメントの組合せを包含する。
【００４３】
ポリペプチドに関する場合、「線状配列」又は「配列」とは配列内の相互に近隣である残基がポリペプチドの一次構造において隣接しているアミノからカルボキシ末端方向におけるポリペプチド中のアミノ酸の順序である。
【００４４】
「発現」という用語は本明細書においては、遺伝子が生物化学物質、例えばＲＮＡ又はポリペプチドを生産する過程を指す。過程は細胞内の遺伝子の機能的存在の何れかの顕在化、例えば限定しないが遺伝子ノックダウン並びに一過性の発現及び安定な発現の両方を包含する。それに含まれるものは、限定しないが、遺伝子からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は何れかの他のＲＮＡ産物への転写、及び、このようなｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳、並びに転写又は翻訳のいずれかを調節する何れかの過程である。最終的に所望の生成物が生物化学物質である場合、発現は生物化学物質及び何れかの前駆体の生成を包含する。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を生産する。本明細書においては、遺伝子産物は核酸、例えば遺伝子の転写により生産されるメッセンジャーＲＮＡ又は転写物から翻訳されるポリペプチドの何れかであることができる。本明細書に記載する遺伝子産物は更に転写後修飾、例えばポリアデニル化を有する核酸、又は翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシルか、脂質付加、他の蛋白サブユニットとの会合、蛋白分解性の切断等を有するポリペプチドを包含する。
【００４５】
本明細書においては、「治療する」又は「治療」という用語は施療的治療及び予防的又は防止的な処置の両方を指し、ここでその目的とは、望ましくない生理学的変化又は障害、例えば多発性硬化症の進行を防止又は緩徐化（低減）することである。有利又は望ましい臨床結果は限定しないが、検出可能か又は検出不可能かに関わらず、症状の軽減、疾患の範囲の減少、疾患の安定化（即ち悪化しない）状態、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の緩解又は緩和及び沈静化（部分的又は完全）を包含する。「治療」はまた治療を受けない場合に予測される生存と比較して延長された生存も意味することができる。治療の必要な者は既に状態又は障害を有する者、並びに状態又は障害を有し易いもの、又は状態又は障害を防止すべき者を包含する。
【００４６】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は施療が望まれる何れかの対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は限定しないが、ヒト、家畜動物、牧場動物、動物園動物、競技用動物、愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛；霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータン及びチンパンジー；イヌ科、例えばイヌ及びオオカミ；ネコ科、例えばネコ、ライオン及びトラ；ウマ科、例えばウマ、ロバ及びシマウマ；食用動物、例えばウシ、ブタ及びヒツジ；有蹄類、例えばシカ及びキリン；げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター及びモルモット等を包含する。特定の実施形態においては、哺乳動物はヒト対象である。
【００４７】
本明細書においては、「本発明のＮｇＲポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの投与から利益を被る対象」及び「治療の必要な動物」という表現は、例えば本発明のＮｇＲポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを用いたＭＳのような疾患の検出のため（例えば診断処置のため）及び／又は治療、即ち緩和又は防止のために使用される本発明のＮｇＲポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの投与から利益を被る哺乳動物対象のような対象を包含する。本明細書においてより詳細に説明する通り、ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントは未コンジュゲート型で使用することができ、又は、薬品、プロドラッグ又は同位体にコンジュゲートすることができる。
【００４８】
本明細書においては、「治療有効量」とは、必要な投薬回数及び時間において、所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。治療結果は、症状の減少、延長された生存、改善された運動性等であってよい。治療結果は「治癒」である必要は無い。
【００４９】
本明細書においては、「予防有効量」とは、必要な投薬回数及び時間において、所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。典型的には、予防的な用量は疾患の前又はより早期において使用されることから、予防有効量は治療有効量より低値となる。
【００５０】
本発明はニューロン、例えばＣＮＳニューロンのニューロン生存、ニューライト成長及び軸索再生を促進する特定のＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントに関する。例えば、本発明は軸索生育が通常は抑制される条件下に軸索生育を刺激するＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントを提供する。即ち本発明のＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントは、ＣＮＳにおいて、ニューロン生存を促進することにより、又は軸索の生育又は再生の刺激により軽減することのできる傷害、疾患又は障害を治療する場合に有用である。
【００５１】
例示されるＣＮＳ疾患、障害又は傷害は、限定しないが、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、腺白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）及びウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後傷害、化学療法の神経学的合併症、卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛及びベル麻痺を包含する。これ等の疾患のうち、ＭＳが最も蔓延しており、全世界で約２．５百万人が罹患している。
ＮｇＲポリペプチド及びポリペプチドフラグメント
本発明は例えばニューライト成長の促進、ニューロン生存の促進、軸索生存の促進又はＮｇＲシグナリング複合体によるシグナル伝達の抑制のために有用な特定のＮｏｇｏ受容体ポリペプチド、例えばＮｇＲ１及びＮｇＲ２及びポリペプチドフラグメントに関する。典型的には本発明のポリペプチド及びポリペプチドフラグメントは中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンのニューロン生存、ニューライト成長又は軸索再生のＮｇＲ媒介抑制をブロックする作用を有する。
【００５２】
ヒトＮｇＲ１ポリペプチドは配列番号２として以下に示す通りであり、そしてゲンバンクアクセッション番号はＮＰ＿０７５３８０である。
完全長ヒトＮｇＲ１（配列番号２）
【００５３】
【数２】
2009505665.tif 000003
ラットＮｇＲ１ポリペプチドは配列番号２３として以下に示す通りであり、そしてゲンバンクアクセッション番号はＮＰ＿４４６０６５である。
完全長ラットＮｇＲ１（配列番号２３）
【００５４】
【数３】
2009505665.tif 000004
ヒトＮｇＲ２ポリペプチドは配列番号２４として以下に示す通りであり、そしてゲンバンクアクセッション番号はＮＰ＿８４８６５５である。
完全長ヒトＮｇＲ１（配列番号２４）
【００５５】
【数４】
2009505665.tif 000005
１つの実施形態において、本発明は、４０残基以下の単離されたポリペプチドフラグメントを提供し、ここでポリペプチドフラグメントは１、２、３、４、１０又は２０個までの個々のアミノ酸の置換を除き、配列番号２のアミノ酸３０９〜３４４のアミノ酸と同一のアミノ酸配列を含む。
【００５６】
「ＮｇＲ１レファレンスアミノ酸配列」、「ＮｇＲ２レファレンスアミノ酸配列」又は「レファレンスアミノ酸配列」とは、何れのアミノ酸置換の導入も伴わない特定の配列を意味する。当該分野で知られる通り、置換が無い場合は、本発明の「単離されたポリペプチド」はレファレンスアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明は４０残基以下の単離されたポリペプチドフラグメントを提供し、ここでポリペプチドフラグメントは３つまでのアミノ酸置換を除き配列番号２のアミノ酸３０９〜３４４と同一のアミノ酸配列を含む。
【００５８】
別の実施形態において、本発明は４０残基以下の単離されたポリペプチドフラグメントを提供し、ここでポリペプチドフラグメントは１、２又は３アミノ酸置換を除き配列番号２のアミノ酸３０９〜３４４と同一のアミノ酸配列を含むか、これよりなる、又は本質的になる。
【００５９】
本実施形態によるポリペプチドフラグメントに関する例示されるアミノ酸置換は本発明のポリペプチド中の個々のシステイン残基と異なるアミノ酸との置換を包含する。本発明のポリペプチド中のシステイン残基は何れかの非相同アミノ酸と置換されてよい。どの異なるアミノ酸を使用するかは、多くの基準、例えばポリペプチドフラグメントのコンホーメーション、ポリペプチドフラグメントの電荷、又は、ポリペプチドフラグメントの親水性に対する置換の作用に応じたものである。本発明のポリペプチドのアミノ酸及びレファレンスアミノ酸配列に関するアミノ酸置換は、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含できる。レファレンスアミノ酸におけるシステインを置換するための典型的なアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニンを包含し、特にアラニンである。ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドの操作を介してそのような置換を行うことは当業者の日常的な専門技術の範囲内である。特定の実施形態においては、システインはポリペプチドの３次元コンホーメーションを改変する可能性が最も低い小型の非荷電のアミノ酸、例えばアラニン、セリン、スレオニンで置換する。特定の実施形態においては、置換されたアミノ酸はアラニンである。
【００６０】
別の実施形態においては、本発明は少なくとも１つのシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている本発明の単離されたポリペプチドを提供する。置換できるシステイン残基は限定しないがＣ２７、Ｃ３１、Ｃ３３、Ｃ４３、Ｃ８０、Ｃ１４０、Ｃ２６４、Ｃ２６６、Ｃ２８７、Ｃ３０９、Ｃ３３５、Ｃ３３６、Ｃ４１９、Ｃ４２９、Ｃ４５５及びＣ４７３を包含する。本発明は更に、Ｃ３０９が置換されているか、Ｃ３３５が置換されているか、Ｃ３３６が置換されているか、Ｃ３０９及びＣ３３５が置換されているか、Ｃ３０９及びＣ３３６が置換されているか、Ｃ３３５及びＣ３３６が置換されているか、又はＣ３０９、Ｃ３３５およびＣ３３６が置換されていることを除いて配列番号２のアミノ酸２０９〜３４４と同一のアミノ酸配列をポリペプチドフラグメントが含んでいる、４０残基以下の単離されたポリペプチドフラグメントを提供する。
【００６１】
１つの特徴において、本発明は融合蛋白において上記したポリペプチドフラグメント２つ以上を含むポリペプチド、並びに、非相同アミノ酸配列に融合した上記ポリペプチドフラグメントを含む融合蛋白を包含する。本発明は更に上記ポリペプチドフラグメントの変異体、類縁体又は誘導体を包含する。
【００６２】
本明細書においては、ポリペプチドはペプチド結合又は修飾されたペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸、即ちペプチドアイソスターを含むことができ、そして２０遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸（例えば非天然存在のアミノ酸）を含有してよい。本発明のポリペプチドは天然の過程、例えば翻訳後プロセシングによるか、又は当該分野で良く知られている化学的修飾の手法により修飾してよい。そのような修飾は基本書に十分記載されており、そしてモノグラフ並びに大量の研究論文に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端を包含するポリペプチド内の何所かで起こることができる。当然ながら、修飾の同じ型が同じか異なる程度で数箇所において所定ポリペプチド内に存在してよい。更に又、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含有してよい。ポリペプチドは例えばユビキチン化の結果として分枝鎖化されてよく、そしてそれらは分枝鎖を伴うか伴うことなく環状であってよい。環状、分枝鎖化及び分枝鎖化環状ポリペプチドは、翻訳後の天然の過程により生じるか、又は合成法により作成してよい。修飾はアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビン共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、交差結合環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合交差結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、蛋白分解性プロセシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、蛋白へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、例えばアルギニル化及びユビキチン化を包含する（例えばＰｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【００６３】
本明細書に記載するポリペプチドは環状であってよい。ポリペプチドの環化は線状ペプチドのコンホーメーション的自由度を低減し、より構造的に制約された分子をもたらす。ペプチド環化の多くの方法が当該分野で知られている。例えば、ペプチドのＮ末端及びＣ末端のアミノ酸残基の間のアミド結合の形成による「骨格から骨格へ」の環化が有る。「骨格から骨格へ」の環化の方法は、２つのω−チオアミノ酸残基（例えばシステイン、ホモシステイン）の間のジスルフィド結合の形成を包含する。本発明の特定のペプチドは環状ポリペプチドを形成するためのペプチドのＮ及びＣ末端上の修飾を包含する。このような修飾は限定しないが、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分を有するシステイン残基及びビオチンに対するものを包含する。ペプチド環化の他の方法は参照により全体が本明細書に組み込まれるＬｉ＆Ｒｏｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）に記載されている。
【００６４】
本発明の方法において、本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントが予め形成されたポリペプチドとして直接、又は、核酸ベクターを介して間接的に投与できる。本発明の一部の実施形態においては、本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントは（１）本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを発現する核酸、例えばベクターにより移植可能な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすること；及び（２）形質転換された宿主細胞を、疾患、障害又は傷害の部位において、哺乳動物に移植すること、を包含する投与方法において投与される。例えば、形質転換された宿主細胞はＭＳの慢性患部の部位に移植できる。本発明の一部の実施形態においては、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から取り出し、一時的に培養し、本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントをコードする単離された核酸で形質転換又はトランスフェクトし、そしてそれを取り出した哺乳動物と同じ哺乳動物に移植し戻す。細胞は必須ではないがそれを移植した部位と同じ部位から取り出すことができる。場合によりエクスビボ遺伝子療法として知られているそのような実施形態は限定された時間に渡り作用部位に局在化した本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの持続的供給を可能にする。
【００６５】
本発明の別の例示されるＮｇＲポリペプチド及び本発明を実施するためのそのような分子を獲得するための方法及び材料は以下に説明する通りである。
融合蛋白及びコンジュゲートされたポリペプチド
本発明の一部の実施形態では、非相同ポリペプチド部分に融合することにより融合蛋白を形成した完全長ではないＮｇＲポリペプチド、例えばＮｇＲのポリペプチドフラグメントの使用を行う。そのような融合蛋白は種々の目的、例えば、増大した血清中半減期、向上した生体利用性、特定の臓器又は組織型のインビボのターゲティング、向上した組み換え体発現効率、向上した宿主細胞分泌、精製の容易さ及び高い親和力を達成するために使用できる。達成すべき目的に応じて、非相同部分は不活性であるか、生物学的に活性であることができる。更に又、それは本発明のＮｇＲポリペプチド部分に適当に融合するか、インビトロ又はインビボで切断されるように選択できる。これ等の他の目的を達成するための非相同部分は当該分野で知られている。
【００６６】
融合蛋白の発現の代替として、選択された非相同部分を予め形成し、そして本発明のＮｇＲポリペプチド部分に化学的にコンジュゲートすることガでいる。大部分の場合においては、選択された非相同部分はＮｇＲポリペプチド部分に融合されるかコンジュゲートされるかに関わらず同様に機能することになる。従って非相同アミノ酸配列の以下の考察においては、特段の記載が無い限り、非相同配列は融合蛋白の形態において、又は化学的コンジュゲートとして、ＮｇＲポリペプチドに連結することができるものと理解すべきである。
【００６７】
ＮｇＲポリペプチドのような薬理学的に活性なポリペプチドは急速なインビボクリアランスを呈する場合があり、身体内で治療有高濃度を達成するためには大量の用量を必要とする。更に又約６０ｋＤａより小さいポリペプチドは潜在的に糸球体濾過に付され、これが場合により腎毒性をもたらす。ＮｇＲシグナリングドメインのポリペプチドフラグメントのような比較的小型のポリペプチドの融合又はコンジュゲーションはこのような腎毒性の危険を低減又は回避するために使用できる。治療用ポリペプチドのインビボの安定性、即ち血清中半減期を増大させるための種々の非相同アミノ酸配列、即ちポリペプチド部分又は「担体」が知られている。例としては血清アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が包含される。
【００６８】
長い半減期、広範なインビボの分布及び酵素的又は免疫学的な機能が欠如していることから、本質的に完全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡフラグメントが非相同部分として通常使用されている。Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１９０４−０８（１９９２）及びＳｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）に記載されているような方法及び材料の適用により、ＨＳＡは、例えば１０倍〜１００倍高値の有意に増大したインビボ安定性を示しつつＮｇＲポリペプチド部分による薬理学的活性を呈する融合蛋白又はポリペプチドコンジュゲートを形成するために使用できる。ＨＳＡのＣ末端はＮｇＲポリペプチド部分のＮ末端に融合できる。ＨＳＡは天然に分泌される蛋白であることから、融合蛋白が真核生物、例えば哺乳動物の発現系において生産される場合、ＨＳＡシグナリング配列を使用して細胞培地中への融合蛋白の分泌を達成することができる。
【００６９】
一部の実施形態においては、本発明の方法における使用のためのＮｇＲポリペプチドは更にターゲティング部分を含む。ターゲティング部分は身体の特定の部分への、例えば脳又はそのコンパートメントへの局在化を指向する蛋白又はペプチドを包含する。特定の実施形態においては、本発明の方法における使用のためのＮｇＲポリペプチドは脳ターゲティング部分に結合又は融合させる。脳ターゲティング部分は共有結合的に結合（例えば直接、翻訳融合又は直接かスペーサー分子を介した化学的連結部、これ等は場合により切断可能である）するか、又は非共有結合的（例えば可逆的相互作用、例えばアビジン：ビオチン、蛋白Ａ：ＩｇＧ等）に結合する。他の実施形態において、その本発明の方法における使用のためのＮｇＲポリペプチドはもう１つの脳ターゲティング部分に結合する。別の実施形態においては、脳ターゲティング部分は本発明の方法における使用のためのＮｇＲポリペプチド複数に結合する。
【００７０】
ＮｇＲポリペプチドに会合している脳ターゲティング部分はそのようなＮｇＲポリペプチドの脳送達を増強する。蛋白又は治療薬に融合すると血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して蛋白又は治療薬を送達する多くのポリペプチドが報告されている。非限定的な例は単一ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４）；ｍＡＢ８３１４，ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２，８０７−８１６）；ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合するＢ２、Ｂ６及びＢ８ペプチド（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６）；トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０）；ジフテリン毒素コンジュゲート（例えばＧａｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  １２７７：１８５−１９８（２００５）参照）；及び米国特許６，３０６，３６５の配列番号１〜１８を包含する。上記参考文献の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００７１】
ＮｇＲ組成物の増強された脳送達は当該分野で十分確立された多くの手段により測定される。例えば脳ターゲティング部分に連結した放射標識ＮｇＲポリペプチドの動物への投与；脳局在化の測定；及び脳ターゲティング部分に会合していない等価な放射標識ＮｇＲポリペプチドの局在化との比較がある。増強されたターゲティングを測定する他の手段は上記参考文献に記載されている。
【００７２】
本発明の一部の実施形態はＩｇ重鎖定常領域のヒンジ及びＦｃ領域、即ちＣ末端部分に融合したＮｇＲポリペプチド部分を使用する。一部の実施形態においては、ヒンジ領域のアミノ酸は異なるアミノ酸で置換されていてよい。これ等の実施形態によるヒンジ領域に関する例示されるアミノ酸置換は、異なるアミノ酸によるヒンジ領域の個々のシステイン残基の置換を包含する。何れかの異なるアミノ酸がヒンジ領域のシステインと置換されてよい。本発明のポリペプチドのアミノ酸及びレファレンスアミノ酸配列に関するアミノ酸置換は、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含できる。レファレンスアミノ酸におけるシステインを置換するための典型的なアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニンを包含し、特にセリン及びアラニンである。ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドの操作を介してそのような置換を行うことは当業者の日常的な専門技術の範囲内である。
【００７３】
ＮｇＲ−ポリペプチド−Ｆｃ融合の潜在的利点は溶解度、インビボ安定性及び多価度、例えば２量化を包含する。使用されるＦｃ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＧのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であることができる。或いは、これはＩｇＥ又はＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であることができる。ＩｇＧＦｃ領域、例えばＩｇＧ１Ｆｃ領域又はＩｇＧ４Ｆｃ領域を一般的には使用する。Ｆｃ融合をコードするＤＮＡを構築して発現させるための材料及び方法は当該分野で知られており、予定外の実験を行うことなく融合を達成するために適用できる。本発明の一部の実施形態はＣａｐｏｎ等の米国特許５，４２８，１３０及び５，５６５，３３５に記載されているもののような融合蛋白を使用する。
【００７４】
シグナル配列は小胞体の膜を通過する蛋白の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。イムノフシンを構築するために有用なシグナル配列は抗体軽鎖シグナル配列、例えば抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖シグナル配列、例えばＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））を包含する。或いは、他のシグナル配列を使用できる。例えばＷａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照できる。シグナルペプチドは通常はシグナルペプチダーゼにより小胞体管腔において切断される。これによりＦｃ領域及びＮｇＲポリペプチド部分を含有するイムノフシン蛋白の分泌が起こる。
【００７５】
一部の実施形態においてはＤＮＡ配列は分泌カセットとＮｇＲポリペプチド部分の間の蛋白分解性の切断部位をコードしてよい。そのような切断部位は例えばコードされた融合蛋白の蛋白分解性の切断を可能にし、これにより標的蛋白からＦｃドメインを分離する。有用な蛋白分解性切断部位はトリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子又はエンテロキナーゼＫのような蛋白分解性酵素により認識されるアミノ酸配列を包含する。
【００７６】
分泌カセットは複製可能な発現ベクター内に取り込ませることができる。有用なベクターは線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド等を包含する。例示される発現ベクターはｐｄＣであり、これにおいては、イムノフシンＤＮＡの転写はヒトサイトメガロウィルスのエンハンサー及びプロモーターの制御下に置かれる。例えばＬｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）；及びＬｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）を参照できる。適切な宿主細胞を本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡで形質転換又はトランスフェクトし、そしてポリペプチドの発現及び分泌の為に使用することができる。典型的に使用される宿主細胞は不朽化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞及びＣＯＳ細胞を包含する。
【００７７】
完全未損傷の野生型Ｆｃは、本発明の方法において使用されるＦｃ融合蛋白においては通常は不必要で望ましくないエフェクター機能を示す。従って、特定の結合部位は典型的には分泌カセットの構築中はＦｃ領域から欠失させる。例えば軽鎖との同時発現は不必要であるため、重鎖結合蛋白Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４（１９８７））の結合部位をＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失させることによりこの部位がイムノフシンの効率的な分泌を妨害しないようにする。膜貫通ドメイン配列、例えばＩｇＭ中に存在するものもまた一般的に欠失させる。
【００７８】
ＩｇＧ１Ｆｃ領域が最も頻繁に使用される。或いは、免疫グロブリンガンマの他のサブクラス（ガンマ−２、ガンマ−３及びガンマ−４）のＦｃ領域を分泌カセット中にしようできる。免疫グロブリンガンマ−１のＩｇＧ１Ｆｃ領域は一般的に分泌カセットに使用され、そしてヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも部分を包含する。一部の実施形態においては、免疫グロブリンガンマ−１のＦｃ領域はＣＨ２欠失Ｆｃであり、これはヒンジ領域及びＣＨ３領域の部分を包含するが、ＣＨ２領域は包含しない。ＣＨ２欠失ＦｃはＧｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ１：４７（１９９０）に記載されている。一部の実施形態においては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭの１つのＦｃ領域を使用する。
【００７９】
ＮｇＲ−ポリペプチド−部分−Ｆｃ融合蛋白は数種の異なる配置に構築できる。１つの実施形態において、ＮｇＲポリペプチド部分のＣ末端はＦｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合する。僅かに異なる配置において、短鎖ポリペプチド、例えば２〜１０アミノ酸をＮｇＲポリペプチド部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端との間において融合に組み込ませる。代替の配置においては、短鎖ポリペプチドは、ＮｇＲポリペプチド部分のＣ末端とＦｃ部分のＮ末端との間において融合に組み込ませる。このようなリンカーはコンホーメーションの柔軟性を与え、これが一部の状況においては生物学的活性を向上させる場合がある。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分において保持されている場合、ＮｇＲ−ポリペプチド−部分−Ｆｃ融合は２量化することになり、これにより２価の分子が形成される。単量体Ｆｃ融合の均質な集団は単一特異的な２価の２量体を与える。各々が異なる特異性を有する２つの単量体Ｆｃ融合の混合物は二重特異性の２価の２量体を与えることになる。
【００８０】
相当するアミノ反応性基及びチオール反応性基を含有する多くの交差結合剤の何れかを用いて本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを血清アルブミンに連結することができる。適当なリンカーの例はチオール反応性のマレイミドを挿入するアミン反応性の交差結合剤、例えばＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ及びＧＭＢＳを包含する。他の適当なリンカーはチオール反応性ハロアセテート基、例えばＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢを挿入する。還元可能な連結部を生成するためのスルフィドリル基との反応のための保護された又は未保護のチオールを与えるリンカーはＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ及びＳＡＴＰを包含する。このような試薬は市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
【００８１】
コンジュゲーションにおいては本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメント又は血清アルブミンのチオール部分のＮ末端が関与する必要はない。例えばＮｇＲ−ポリペプチド−アルブミン融合は遺伝子操作法を用いて得ることができ、その場合、ＮｇＲポリペプチド部分は血清アルブミン遺伝子にそのＮ末端、Ｃ末端又は両方で融合する。
【００８２】
本発明のＮｇＲポリペプチドはポリペプチドタグに融合できる。「ポリペプチドタグ」という用語は本明細書においては、ＮｇＲポリペプチドに結合、接続又は連結することができ、そしてＮｇＲポリペプチドを発見、精製、濃縮又は単離するために使用できるアミノ酸の何れかの配列を意味することを意図している。ＮｇＲポリペプチドへのポリペプチドタグの結合は、例えば（ａ）ポリペプチドタグをコードする核酸配列、及び（ｂ）ＮｇＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を構築することにより行ってよい。例示されるポリペプチドタグが例えば翻訳後修飾可能なアミノ酸配列、例えばビオチニル化されたアミノ酸配列を包含する。他の例示されるポリペプチドタグは、例えば抗体（又はそのフラグメント）又は他の特異的結合試薬により認識及び／又は結合されることができるアミノ酸配列を包含する。抗体（又はそのフラグメント）又は他の特異的結合試薬により認識されることができるポリペプチドタグは、例えば当該分野で「エピトープタグ」として知られているものを包含する。エピトープタグは天然又は人工のエピトープタグであってよい。天然及び人工のエピトープタグは当該分野で知られており、例えば人工エピトープ、例えばＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ又はポリヒスチジンペプチドを包含する。ＦＬＡＧペプチドは配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１１）又はＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１２）を包含する（Ｅｉｎｈａｕｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：１−３：４５５−４６５（２００１））。Ｓｔｒｅｐエピトープは配列Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（」配列番号１３）を有する。ＶＳＶ−Ｇエピトープもまた使用でき、そして配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号１４）を有する。別の人工エピトープは６ヒスチジン残基を有するポリＨｉｓ配列である（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１５））。天然に存在するエピトープはモノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるインフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号１６）（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：１７０−１７９（１９９５））及びモノクローナル抗体９Ｅ１０により認識されるヒトｃ−ｍｙｃ（Ｍｙｃ）由来の１１アミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号１７）（Ｍａｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６２：１２９−１３４（１９９５））を包含する。他の有用なエピトープはモノクローナル抗体ＹＬ１／２により認識されるトリペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅである（Ｓｔａｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８３：２９８−３０２（１９９１））。
【００８３】
特定の実施形態においては、ＮｇＲポリペプチド及びポリペプチドタグは連結アミノ酸配列を介して接続してよい。本明細書においては、「連結アミノ酸配列」はプロテアーゼ１つ以上により認識及び／又は切断されることができるアミノ酸配列であってよい。プロテアーゼ１つ以上により認識及び／又は切断されることができるアミノ酸配列は当該分野で知られている。例示されるアミノ酸配列は以下のプロテアーゼ、即ち：第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、ＡＰＣ、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、カテプシンＧ、レニン、アンジオテンシン変換酵素、マトリックスメタロプロテイナーゼ（コラゲナーゼ、ストロメリシン、ゼラチナーゼ）、マクロファージエラスターゼ、Ｃｉｒ及びＣｉｓにより認識されるものである。上記したプロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列は当該分野で知られている。特定のプロテアーゼにより認識される例示される配列は例えば米国特許５，８１１，２５２に記載されている。
【００８４】
ポリペプチドタグは市販のクロマトグラフィー媒体を用いた精製を容易にする。
【００８５】
本発明の一部の実施形態においては、ＮｇＲポリペプチド融合コンストラクトを用いることにより細菌におけるＮｇＲポリペプチド部分の生産を増強する。そのようなコンストラクトにおいて、高水準で通常発現及び／又は分泌される細菌蛋白を本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントのＮ末端融合相手として使用する。例えばＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）を参照できる。
【００８６】
適当な融合相手のアミノ及びカルボキシ末端においてＮｇＲポリペプチド部分を融合することにより、本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの２価又は４価の形態を得ることができる。例えばＮｇＲポリペプチド部分をＩｇ部分のアミノ又はカルボキシ末端に融合することによりＮｇＲポリペプチド部分２つを含有する２価の単量体ポリペプチドを生成することができる。Ｉｇ部分によりこれ等の単量体２つが２量化すれば、ＮｇＲポリペプチドの４量体形態が得られる。このような多価の形態を使用することにより標的に対する増大した結合親和性を達成できる。本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの多価形態はまた、単独で使用するかＩｇ又はＨＳＡのような融合相手と融合することができる、コンカタマーを形成するためにＮｇＲポリペプチド部分を直列に配置することにより得ることができる。
コンジュゲートした重合体（ポリペプチド以外）
本発明の一部の実施形態は重合体の１つ以上がＮｇＲポリペプチドにコンジュゲート（共有結合的に連結）している本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを包含する。そのようなコンジュゲーションに適する重合体の例はポリペプチド（上記）、糖重合体及びポリアルキレングリコール鎖を包含する。必然ではないが典型的には、重合体は、溶解性、安定性又は生体利用性の１つ以上を向上させる目的の為に本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントにコンジュゲートする。
【００８７】
本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントへのコンジュゲーションの為に一般的に使用される重合体のクラスはポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も頻繁に使用される。ＰＥＧ部分、例えば１、２、３、４又は５ＰＥＧ重合体を各ＮｇＲポリペプチドにコンジュゲートすることによりＮｇＲポリペプチド単独と比較して血清中半減期を増大することができる。ＰＥＧ部分は非抗原性であり、本質的には生物学的に不活性である。本発明の実施において使用されるＰＥＧ部分は分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。
【００８８】
ＮｇＲポリペプチドに結合するＰＥＧ部分の数及び個々のＰＥＧ鎖の分子量は変動してよい。一般的に、重合体分子量が高値であるほど、ポリペプチドに結合する重合体鎖は少なくなる。通常はＮｇＲポリペプチド又はポリペプチドフラグメントに結合する総重合体質量は２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。即ち、１重合体鎖を結合する場合、鎖の分子量は一般的に２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖を結合する場合、各鎖の分子量は一般的に１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖を結合する場合、分子量は一般的に７〜１４ｋＤａである。
【００８９】
重合体、例えばＰＥＧは、ポリペプチド上の何れかの適当な曝露された反応性の基を介してＮｇＲポリペプチドに連結できる。曝露された反応性の基は、例えばＮ末端アミノ基又は内部リジン残基のイプシロンアミノ基、又は両方であることができる。活性化された重合体はＮｇＲポリペプチド上の何れかの有利のアミノ基において反応及び共有結合することができる。ＮｇＲポリペプチドの遊離のカルボキシル基、適当に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化された炭水化物部分及びメルカプト基（存在すれば）もまた重合体結合のための反応性の基として使用できる。
【００９０】
コンジュゲーション反応においては、ポリペプチド濃度に応じてポリペプチド分子当たり活性化重合体約１．０〜１０モルを典型的には使用する。通常は選択された比は反応を最大にしつつＮｇＲポリペプチド部分の所望の薬理学的活性を損なう可能性の有る副反応（非特異的である場合が多い）を最小限にするようにバランスを持たされる。好ましくはＮｇＲポリペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％が（例えば本明細書に記載するか当該分野で知られている試験の何れかにおいて明らかにされる通り）保持され、そして最も好ましくはほぼ１００％が保持される。
【００９１】
重合体は従来の化学的特徴を利用してＮｇＲポリペプチドにコンジュゲートできる。例えば、ポリアルキレングリコール部分をＮｇＲポリペプチドのリジンイプシロンアミノ基にカップリングできる。リジン側鎖への連結はＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、例えばＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）及びスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）を用いて実施できる。適当なポリアルキレングリコール部分は例えばカルボキシメチル−ＮＨＳ及びノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣを包含する。これ等の試薬は市販されている。別のアミン反応性ＰＥＧリンカーをスクシンイミジル部分の代替にすることができる。これ等には、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾールカーボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール及びＰＮＰカーボネートが包含される。条件は通常は選択性及び反応の範囲が最大限となるように最適化される。そのような反応条件最適化は当業者の知る通りである。
【００９２】
ＰＥＧ化は当該分野で知られたＰＥＧ化反応の何れかにより実施できる。例えばＦｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２及び欧州特許出願ＥＰ０１５４３１６及びＥＰ０４０１３８４を参照できる。ＰＥＧ化は反応性のポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性の水溶性重合体）とのアシル化反応又はアルキル化反応を用いて実施してよい。
【００９３】
アシル化によるＰＥＧ化では一般的にポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させる。何れかの反応性ＰＥＧ分子をＰＥＧ化において使用できる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧが頻繁に使用される活性化ＰＥＧエステルである。本明細書においては、「アシル化」とは、治療用蛋白とＰＥＧのような水溶性重合体の間の以下の型の連結部、即ち、アミド、カーバメート、ウレタン等を包含するがこれ等に限定されない。例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照できる。反応パラメーターは一般的に、ＮｇＲポリペプチドを損傷又は不活性化するような温度、溶媒及びｐＨの条件を回避するように選択される。
【００９４】
一般的に、接続の連結部はアミドであり、そして典型的には得られる生成物の少なくとも９５％がモノ、ジ又はトリＰＥＧ化されている。しかしながら、より高度のＰＥＧ化を有する一部の物質種も使用する特定の反応条件に応じた量において形成してよい。場合により、精製されたＰＥＧ化物質種は、混合物、特に未反応の物質種から、従来の精製方法、例えば透析、塩析、限外濾過、イオン交換、クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィー及び電気泳動により分離される。
【００９５】
アルキル化によるＰＥＧ化では一般的に還元剤の存在下に本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントにＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を反応させる。更に又、ＮｇＲポリペプチドのＮ末端アミノ基に実質的に限定されてＰＥＧ化が起こるように、即ちモノＰＥＧ化蛋白となるように反応条件を操作することができる。モノＰＥＧ化及びポリＰＥＧ化の何れの場合にも、ＰＥＧ基は典型的には−ＣＨ２−ＮＨ−基を介して蛋白に結合する。−ＣＨ２−基に特に言及すれば、この型の連結部は「アルキル」連結部として知られている。
【００９６】
Ｎ末端ターゲティングモノＰＥＧ化生成物を製造するための還元的アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に使用できる第１アミノ基の異なる型の異なる反応性を利用している（リジンｖｓＮ末端）。反応はリジン残基のイプシロンアミノ基と蛋白のＮ末端アミノ基のそれとの間のｐＫａの差を利用することができるｐＨにおいて実施される。そのような選択的誘導体化により、アルデヒドのような反応性の基を含有する水溶性重合体の蛋白への結合が制御され：重合体とのコンジュゲーションが蛋白のＮ末端において優先的に起こり、そしてリジン側鎖アミノ基のような他の反応性の基の有意な修飾が起こらない。
【００９７】
アシル化及びアルキル化の方法の両方において使用する重合体分子は水溶性重合体の中から選択される。選択される重合体は典型的には、重合の程度を本発明の方法において提示される通り制御されるように、単一の反応性の基、例えばアシル化用の活性エステル又はアルキル化用のアルデヒドを有するように修飾される。例示される反応性のＰＥＧアルデヒドは、水安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド又はそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はアリールオキシ誘導体である（例えばＨａｒｒｉｓ等の米国特許５，２５２，７１４参照）。重合体は分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。アシル化反応のためには、選択される重合体は典型的には単一の反応性のエステル基を有する。還元的アルキル化のためには、選択される重合体は典型的には単一の反応性のアルデヒド基を有する。一般的に、水溶性重合体は、それらが通常は哺乳動物組み換え発現系によりより好都合に作成されるため、天然に存在するグリコシル残基からは選択されない。
【００９８】
本発明のＰＥＧ化ＮｇＲポリペプチドを製造するための方法は一般的に（ａ）ＰＥＧ基１つ以上に分子が結合する条件下でポリエチレングリコール（例えばＰＥＧの反応性のエステル又はアルデヒド誘導体）に本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを反応させること、及び（ｂ）反応産物を得ること、の工程を包含する。一般的に、アシル化反応のための最適な反応条件は既知パラメーター及び所望の結果に基づいて事例毎に決定される。例えば、ＰＥＧの蛋白に対する比が高値であるほど、一般的にポリＰＥＧ化生成物のパーセンテージが高値となる。
【００９９】
モノ重合体／ＮｇＲポリペプチドの実質的に均質な集団を製造するための還元的アルキル化は一般的に（ａ）ＮｇＲのＮ末端アミノ基の選択的修飾を可能にするために適するｐＨにおいて、還元的アルキル化条件下、反応性ＰＥＧ分子に本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを反応させること；及び（ｂ）反応産物を得ること、の工程を包含する。
【０１００】
モノ重合体／ＮｇＲポリペプチドの実質的に均質な集団については、還元的アルキル化反応条件は、本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントのＮ末端への水溶性重合体部分の選択的結合を可能にするものである。そのような反応条件は一般的に、リジン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基の間のｐＫａの相違をもたらす。本発明の目的のためには、ｐＨは一般的に３〜９、典型的には３〜６の範囲である。
【０１０１】
本発明のＮｇＲポリペプチドはタグ、例えば蛋白分解により実質的に放出されることができる部分を包含することができる。即ち、リジン部分は先ずリジン及びＮ末端の両方と反応することになるＴｒａｕｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のような低分子量リンカーで修飾されたＨｉｓタグを反応させ、次に、Ｈｉｓタグを放出することにより選択的に修飾できる。次にポリペプチドは、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基又は遊離又は保護されたＳＨのようなチオール反応性ヘッド基を含有するＰＥＧで選択的に修飾できる遊離のＳＨ基を含有することになる。
【０１０２】
Ｔｒａｕｔ試薬はＰＥＧ結合のための特定の部位を設定することになる何れかのリンカーと置き換えることができる。例えばＴｒａｕｔ試薬はＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ又はＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と置き換えることができる。同様に、マレイミド（例えばＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ及びＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）又はビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーに蛋白を反応させ、そして得られた生成物を遊離のＳＨを含有するＰＥＧと反応させることができる。
【０１０３】
一部の実施形態においては、ポリアルキレングリコール部分はＮｇＲポリペプチドのシステイン基にカップリングする。カップリングは例えばマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基又はチオール基を用いて行うことができる。
【０１０４】
或いは、ＮｇＲポリペプチドは不安定な結合を介してポリエチレングリコール部分にコンジュゲートする。不安定な結合は、例えば生化学的加水分解、蛋白分解又はスルヒドリル切断において切断できる。例えば、結合はインビボ（生理学的）条件下に切断できる。
【０１０５】
反応は、反応性の基がＮ末端のアルファアミノ基上にある場合は、不活性重合体に生物学的に活性な物質を反応させるために用いられる何れかの適当な方法により、一般的に約ｐＨ５〜８、例えばｐＨ５、６、７又は８において行ってよい。一般的に、プロセスにおいては活性化重合体を製造し、その後、蛋白を活性化重合体と反応させることにより製剤に適する可溶性蛋白を製造する。
【０１０６】
本発明のＮｇＲポリペプチドは、一部の実施形態においては、可溶性ポリペプチドである。ポリペプチドを可溶性にするため、又は、ポリペプチドの溶解性を向上させるための方法は当該分野で良く知られている。
ポリヌクレオチド
本発明は又、本発明のＮｇＲポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを包含する。本発明は又、本発明のポリペプチドの何れかをコードするポリヌクレオチドの非コーディング鎖又は相補体に対して中等度にストリンジェントか、又は高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。ストリンジェントな条件は当該分野で知られており、そしてＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。
【０１０７】
ヒトＮｏｇｏ受容体−１ポリヌクレオチドを配列番号１として以下に示す。
【０１０８】
完全長ヒトＮｏｇｏ受容体−１は配列番号１のヌクレオチド１６６〜ヌクレオチド１５８７によりコードされる。
【０１０９】
【数５】
2009505665.tif 000006
ラットＮｏｇｏ受容体−１ポリヌクレオチドは配列番号２５として以下に示す通りであり、そしてゲンバンクアクセッション番号はＮＭ＿０５３６１３である。
【０１１０】
【数６】
2009505665.tif 000007
ヒトＮｏｇｏ受容体−２ポリヌクレオチドは配列番号２６として以下に示す通りであり、そしてゲンバンクアクセッション番号はＢＫ００１３０２である。
【０１１１】
【数７】
2009505665.tif 000008
ベクター
本発明のＮｇＲポリペプチドをコードする核酸を含むベクターもまた本発明の方法における使用のためのポリペプチドを製造するために使用してよい。ベクター及びそのような核酸を作動可能に連結する相手となる発現制御配列の選択は所望の機能的特性、例えば蛋白発現及び形質転換すべき宿主細胞に応じたものである。
【０１１２】
作動可能に連結したコーディング配列の発現を調節するために有用な発現制御エレメントは当該分野で知られている。例としては、限定しないが、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル及び他の調節エレメントを包含する。誘導性プロモーターを使用する場合は、それは、例えば宿主細胞培地における栄養状態の変化、又は温度の変化により制御することができる。
【０１１３】
ベクターは原核生物レプリコン、即ち細菌宿主細胞内において染色体外で組み換えＤＮＡ分子の自律的複製及び維持を指向する能力を有するＤＮＡ配列を包含できる。そのようなレプリコンは当該分野で良く知られている。更に又、原核生物レプリコンを含むベクターは、発現すれば薬品耐性のような検出可能なマーカーを付与する遺伝子も包含してよい。細菌性薬品耐性遺伝子の例はアンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【０１１４】
原核生物レプリコンを含むベクターはまた細菌宿主細胞におけるコーディング遺伝子配列の発現を指向するための原核生物又はバクテリオファージのプロモーターを包含できる。細菌宿主に適合するプロモーター配列は典型的には発現すべきＤＮＡセグメントの挿入のための好都合な制限部位を含有するプラスミドベクターにおいて与えられる。そのようなプラスミドベクターの例はｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ｐＰＬ及びｐＫＫ２２３である。何れかの適当な原核生物宿主を使用することにより本発明の方法において使用する蛋白をコードする組み換えＤＮＡ分子を発現することができる。
【０１１５】
本発明の目的のためには、多くの発現ベクター形を使用してよい。例えば１つのクラスのベクターはウシパピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス、レトロウィルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウィルスのような動物ウィルスから誘導したＤＮＡエレメントを利用する。そのほか、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン系も使用される。更に、自身の染色体内にＤＮＡを組み込んでいる細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にするマーカー１つ以上導入することにより選択してよい。マーカーは独立栄養性の宿主に対する原栄養性、生物致死物質（例えば抗生物質）耐性又は銅のような重金属に対する耐性を与えてよい。選択可能なマーカー遺伝子は発現すべきＤＮＡ配列に直接連結するか、又は、同時形質転換により同じ細胞内に導入することができる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は選択可能なマーカー遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。別のエレメントもまたｍＲＮＡの最適な合成の為に必要である場合がある。これ等のエレメントはシグナル配列、スプライス配列並びに転写プロモーター、エンハンサー及びターミネーターシグナルを包含してよい。
【０１１６】
１つの実施形態において、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許６，１５９，７３０）と称されるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．，の専売の発現ベクターを使用してよい。このベクターはサイトメガロウィルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１及びエクソン２、ジヒドロホレート還元酵素遺伝子及びリーダー配列を含有している。このベクターはＣＨＯ細胞における形質転換時に極めて高水準の発現とその後のＧ４１８含有培地中の分泌及びメトトレキセート増幅をもたらすことが解っている。当然ながら、真核生物細胞において発現を誘発することができる何れかの発現ベクターを本発明において使用してよい。適当なベクターの例は、限定しないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１及びｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより入手可能）及びプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手可能）を包含する。別の真核生物細胞発現ベクターは当該分野で知られており、市販されている。典型的には、そのようなベクターは所望のＤＮＡセグメントの挿入のための好都合な制限部位を含有している。例示されるベクターはｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）、レトロウィルス発現ベクターｐＭＩＧ及びｐＬＬ３．７、アデノウィルスシャトルベクターｐＤＣ３１５及びＡＡＶベクターを包含する。他の例示されるベクター系は例えば米国特許６，４１３，７７７に記載されている。
【０１１７】
一般的に、多数の形質転換された細胞をスクリーニングして拮抗剤の適当な高値の水準を発現するものを得ようとすることは、日常的な実験であり、これは例えばロボットシステムにより実施できる。
【０１１８】
哺乳動物宿主細胞発現の為に頻繁に使用される調節配列は、哺乳動物細胞中の蛋白発現の高水準を指向するウィルスエレメント、例えばレトロウィルスＬＴＲ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウィルス４０（例えばＳＶ４０プロモーターエンハンサー）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス主後期プロモーター（ＡｄｍｉｌＰ））、ポリオーマから誘導されたプロモーター及びエンハンサー、及び強力な哺乳動物プロモーター、例えばネイティブの免疫グロブリン及びアクチンプロモーターを包含する。ウィルス調節エレメント及びその配列に関する追加的説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉの米国特許５，１６８，０６２；Ｂｅｌｌの米国特許４，５１０，２４５；及びＳｃｈａｆｆｎｅｒの米国特許４，９６８，６１５を参照できる。
【０１１９】
組み換え発現ベクターは宿主細胞内におけるベクターの複製を調節するための配列（例えば複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子を担持してよい。選択可能なマーカー遺伝子はベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えばＡｘｅｌの米国特許４，３９９，２１６；４，６３４，６６５及び５，１７９，０１７参照）。例えば、典型的には選択可能なマーカー遺伝子はベクターが導入されている宿主細胞に対してＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与する。頻繁に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロホレート還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅によるｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を包含する。
【０１２０】
ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントをコードするベクターを適当な宿主細胞の形質転換の為に使用できる。形質転換は何れかの適当な方法によることができる。哺乳動物細胞への外因性ＤＮＡの導入のための方法は当該分野で良く知られており、そしてデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内のポリヌクレオチドのカプセル化及び核へのＤＮＡの直接のマイクロンジェクションを包含する。更に又、核酸分篩はウィルスベクターにより哺乳動物細胞内に導入してよい。
【０１２１】
宿主細胞の形質転換は使用するベクター及び宿主細胞に適する好都合な方法で達成できる。原核生物宿主細胞の形質転換のためには、エレクトロポレーション及び塩処理方法が使用できる（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換のためには、エレクトロポレーション、カチオン性脂質又は塩による処理の方法が使用できる。例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６（１９７９）を参照できる。
【０１２２】
蛋白発現の為に使用される宿主細胞系統は最も好ましくは哺乳動物起源であり；所望の遺伝子産物を自身内部に発現させるために最適な特定の宿主細胞系統を優先的に決定することは当業者の能力の範囲内である。例示される宿主細胞系統は、限定しないが、ＮＯＳ、ＳＰ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト頚部癌腫）、ＣＶＩ（サル腎系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原によるＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎細胞）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ２ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎）を包含する。宿主細胞系統は典型的には商業的事業、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、又は公開された文献から得られる。
【０１２３】
産生細胞系統からのポリペプチドの発現は既知手法を用いて増強できる。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）系が特定の条件下における発現を増強するために一般的に使用される。例えば欧州特許０２１６８４６、０２５６０５５及び０３２３９９７及び欧州特許出願８９３０３９６４．４を参照できる。
【０１２４】
真核生物細胞発現ベクターは当該分野で知られており、そして市販されている。典型的には、このようなベクターは所望のＤＮＡセグメントの挿入のための好都合な制限部位を含有している。例示されるベクターはｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウィルス発現ベクターｐＭＩＧ、アデノウィルスシャトルベクターｐＤＣ３１５及びＡＡＶベクターを包含する。
【０１２５】
真核生物細胞発現ベクターは選択可能なマーカー、例えば薬物耐性遺伝子を包含してよい。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子がこのような遺伝子の例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。
【０１２６】
哺乳動物宿主細胞発現の為に頻繁に使用される調節配列は、哺乳動物細胞中の蛋白発現の高水準を指向するウィルスエレメント、例えばレトロウィルスＬＴＲ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウィルス４０（例えばＳＶ４０プロモーターエンハンサー）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス主後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマから誘導されたプロモーター及びエンハンサー、及び強力な哺乳動物プロモーター、例えばネイティブの免疫グロブリン及びアクチンプロモーターを包含する。ウィルス調節エレメント及びその配列に関する追加的説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉの米国特許５，１６８，０６２；Ｂｅｌｌの米国特許４，５１０，２４５；及びＳｃｈａｆｆｎｅｒの米国特許４，９６８，６１５を参照できる。
【０１２７】
組み換え発現ベクターは宿主細胞内におけるベクターの複製を調節するための配列（例えば複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子を担持してよい。選択可能なマーカー遺伝子はベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えばＡｘｅｌの米国特許４，３９９，２１６；４，６３４，６６５及び５，１７９，０１７参照）。例えば、典型的には選択可能なマーカー遺伝子はベクターが導入されている宿主細胞に対してＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与する。頻繁に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロホレート還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅によるｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を包含する。
【０１２８】
本発明のＮｇＲポリペプチドをコードする核酸分子及びこれ等の核酸分子を含むベクターを適当な宿主細胞の形質転換の為に使用できる。形質転換は何れかの適当な方法によることができる。哺乳動物細胞への外因性ＤＮＡの導入のための方法は当該分野で良く知られており、そしてデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内のポリヌクレオチドのカプセル化及び核へのＤＮＡの直接のマイクロンジェクションを包含する。更に又、核酸分篩はウィルスベクターにより哺乳動物細胞内に導入してよい。
【０１２９】
宿主細胞の形質転換は使用するベクター及び宿主細胞に適する好都合な方法で達成できる。原核生物宿主細胞の形質転換のためには、エレクトロポレーション及び塩処理方法が使用できる（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換のためには、エレクトロポレーション、カチオン性脂質又は塩による処理の方法が使用できる。例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６（１９７９）を参照できる。
宿主細胞
本発明の方法において使用するための本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの発現のための宿主細胞は原核生物又は真核生物であってよい。例示される真核生物宿主細胞は限定しないが、コウボ及び哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨＳｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ１６５８）及びベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）を包含する。他の有用な真核生物宿主細胞は昆虫細胞及び植物細胞を包含する。例示される原核生物宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。
【０１３０】
発現のための宿主として使用できる哺乳動物細胞系統は当該分野で知られており、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手可能な多くの不朽化された細胞系統を包含する。これ等には特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞及び多くの他の細胞系統が包含される。
【０１３１】
産生細胞系統からのポリペプチドの発現は既知手法を用いて増強できる。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）系が特定の条件下における発現を増強するために一般的に使用される。例えば欧州特許０２１６８４６、０２５６０５５及び０３２３９９７及び欧州特許出願８９３０３９６４．４を参照できる。
【０１３２】
遺伝子療法
本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントは、ＮｇＲ媒介シグナリングを拮抗することが治療上有益である神経系の疾患、障害又は傷害の治療のための遺伝子療法の方策を用いながら、哺乳動物、例えばヒト患者においてインビボで生産することができる。この場合、適当な発現制御配列に作動可能に連結した適当なＮｇＲポリペプチドコード核酸を投与する。一般的には、これ等の配列はウィルスベクター内に取り込まれる。このような遺伝子療法のための適当なウィルスベクターはアデノウィルスベクター、レンチウィルスベクター、バキュロウィルスベクター、エプスタインバーウィルスベクター、パポバウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、及びアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクターを包含する。ウィルスベクターは複製欠損型ウィルスベクターであることができる。自身のＥ１遺伝子又はＥ３遺伝子において欠失を有するアデノウィルスベクターが典型的には使用される。アデノウィルスベクターを使用する場合は、ベクターは通常は選択可能なマーカー遺伝子を有さない。
【０１３３】
医薬組成物
本発明のＮｇＲポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞はヒトを包含する哺乳動物への投与のための医薬組成物に製剤してよい。本発明の方法において使用する医薬組成物は製薬上許容しうる担体、例えばイオン交換物質、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛の塩、コロイド状シリカ、３ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含む。
【０１３４】
本発明の方法において使用する組成物は何れかの適当な方法、例えば非経腸、脳室内、経口により、吸入スプレーにより、局所、直腸、経鼻、口内、膣内又は移植されたリザーバーを介して投与してよい。「非経腸」という用語は本明細書においては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸腔内、髄腔内、肝内、患部内及び頭蓋内への注射又は注入の手法を包含する。前述した通り、本発明のＮｇＲポリペプチドはＮｇＲ媒介シグナリングを抑制するように神経系において作用する。従って、本発明の方法において、ＮｇＲポリペプチドはそれらが血液脳関門を通過するような態様において投与する。この通過はＮｇＲポリペプチド分子自身に生得的な物理化学的性質に起因するか、医薬品製剤中の他の成分に起因するか、又は、血液脳関門を突破する機械的装置、例えば針、カニューレ又は外科的機器の使用に起因するものであることができる。ＮｇＲポリペプチドが生得的に血液脳関門を通過しない分子、例えば通過を促進する部分への融合である場合、投与の適当な経路は、例えば髄腔内又は頭蓋内であり、例えばＭＳの慢性患部に直接行う。ＮｇＲポリペプチドが生得的に血液脳関門を通過する分子である場合、投与経路は以下に記載する種々の経路の１つ以上によるものであってよい。
【０１３５】
本発明の方法において使用する組成物の滅菌注射剤形態は水性又は油性の懸濁液であってよい。これらの懸濁液は適当な分散剤又は水和剤及び懸濁剤を用いて当該分野で知られた手法に従って製剤してよい。滅菌注射剤の調製品はまた非毒性の非経腸的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌された注射可能な溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の懸濁液であってよい。使用してよい許容されるベヒクル及び溶媒としてはリンゲル液及び等張性の塩化ナトリウム溶液である。更に又、滅菌された固定油が溶媒又は懸濁媒体として従来より使用されている。この目的のためには、合成のモノ又はジグリセリドを包含する何れかの銘柄の固定油を使用してよい。脂肪酸、例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体は注射剤の製剤に有用であり、天然の製薬上許容しうる油脂、例えばオリーブ油又はヒマシ油、特にこれ等のポリオキシエチル化された型も同様である。これ等の油脂溶液又は懸濁液は又、長鎖のアルコール希釈剤又は分散剤、例えばカルボキシメチルセルロース又は乳液及び懸濁液を包含する製薬上許容しうる剤型の製剤中に一般的に使用されている同様の分散剤を含有してよい。他の一般的に使用されている界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ及び製薬上許容しうる個体、液体又は他の剤型の製造において一般的に使用されている他の乳化剤又は生体利用性増強剤もまた製剤の目的の為に使用してよい。
【０１３６】
非経腸製剤は単回瞬時用量、注入又はローディング瞬時用量、その後の維持用量であってよい。これらの組成物は特定の固定された、又は変動する時間間隔において、例えば一日一回、又は「必要時」を基本として投与してよい。
【０１３７】
本発明の方法において使用する特定の医薬組成物は許容される剤型、例えばカプセル、錠剤、水性の懸濁液又は溶液において経口投与してよい。特定の医薬組成物は又、経鼻エアロゾル又は吸入により投与してよい。そのような組成物はベンジルアルコール又は他の適当な保存料、生体利用性を増強するための吸収促進剤及び／又は他の従来の可溶化剤又は分散剤を用いながら食塩水中の溶液として製造してよい。
【０１３８】
単回剤型を製造するために担体物質と組み合わせてよい本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの量は治療される宿主及び特定の投与様式に応じて変動することになる。組成物は単一用量、多用量として、又は注入において所定時間に渡って投与してよい。用量用法は最適な所望の応答（例えば治療的又は予防的な応答）が得られるように調節してよい。
【０１３９】
本発明の方法はＮｇＲポリペプチドの「治療有効量」又は「予防有効量」を使用する。このような治療又は予防有効量は個体の疾患状態、年齢、性別及び体重のような要因に応じて変動してよい。治療又は予防有効量は又、如何なる毒性又は有害な作用も治療上有益な作用により相殺されるものである。
【０１４０】
何れかの特定の患者に対する特定の用量及び治療用法は種々の要因、例えば使用する特定のＮｇＲポリペプチド、患者の年齢、体重、全身状態、性別及び食餌、及び投与の時期、排出速度、薬剤の組合せ、及び、治療すべき特定の疾患の重症度に応じたものとなる。医療従事者によるそのような要因の判断は当業者の知る通りである。量は又治療すべき個体患者、投与経路、製剤の型、使用する化合物の特性、疾患の重症度及び所望の作用に応じたものとなる。使用する量は当該分野で良く知られている薬理学的及び薬物動態の原理により決定できる。
【０１４１】
本発明の方法において、ＮｇＲポリペプチドは一般的に直接神経系に、脳室内に、又は髄腔内に、例えばＭＳの慢性患部内に投与される。本発明の方法による投与のための組成物は一日当たり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量のＮｇＲポリペプチドが投与されるように製剤できる。本発明の一部の実施形態においては、用量は一日当たり０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一部の実施形態においては、用量は一日当たり０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１４２】
補助的な活性化合物もまた本発明の方法において使用される組成物中に配合できる。例えば本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメント又はその融合蛋白は追加的治療薬１つ以上と同時製剤及び／又は同時投与してよい。
【０１４３】
本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを用いた治療のためには、用量は例えば約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）の範囲であることができる。例えば、プロセスは１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇの範囲内であることができる。上記範囲における用量の中間値もまた本発明の範囲内であることを意図している。対象にはそのような用量を毎日、又は隔日、毎週又は実験的分析により決定される何れかの他の日程に従って投与できる。例示される治療は、例えば少なくとも６ヶ月の長期間に渡り、多用量において投与することを包含する。別の例示される治療用法は２週毎に一回、又は１ヶ月に１回、又は３〜６ヶ月毎に１回投与することを包含する。例示される投薬日程は１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇを毎日、３０ｍｇ／ｋｇを隔日、又は６０ｍｇ／ｋｇを毎週投与を包含する。
【０１４４】
一部の方法において、２種以上のＮｇＲポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを同時に投与し、その場合、投与される各ポリペプチドの用量は記載した範囲内となる。補助的な活性化合物もまた本発明の方法において使用される組成物中に配合できる。例えば抗ＮｇＲ１抗体又は他のＮｇＲ１拮抗剤を追加的治療薬１つ以上と同時製剤及び／又は同時投与してよい。
【０１４５】
本発明は選択された標的組織へのＮｇＲポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの何れかの適当な送達方法を包含し、これには水溶液の瞬時注射又は制御放出系の移植が包含される。制御放出系の移植の使用は反復注射の必要性を低減する。
【０１４６】
本発明の方法において使用されるＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントは脳内に直接注入してよい。化合物の直接脳注入のための種々のインプラントが知られており、そして、神経学的障害に罹患しているヒト患者への治療用化合物の送達において有効である。これ等にはポンプを用いた脳への長期注入、定位移植暫定的間質カテーテル、永久頭蓋内カテーテルインプラント、及び、外科的に移植された生体分解性のインプラントが包含される。例えばＧｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，上出；Ｓｃｈａｒｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｖｓ．２４（４）：５８３−９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５Ｉ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−８２（１９９９）；６６章，  ｐ．５７７−５８０，  Ｂｅｌｌｅｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；及びＢｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）を参照できる。
【０１４７】
組成物は又、化合物のための適当な送達又は支持体の系として機能する生体適合性の担体物質中に分散された本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを含んでよい。除放性担体の適当な例は座薬又はカプセルのような形状付与された物品の形態の半透過性の重合体マトリックスを包含する。移植可能又はマイクロカプセルの除放性マトリックスはポリラクチド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．３，７７３，３１９；ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））又はポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を包含する。
【０１４８】
一部の実施形態においては、本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントは脳の適切な領域内への直接の注入により患者に投与する。例えばＧｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照できる。代替の手法が使用でき、本発明によるＮｇＲポリペプチドの投与に適用してよい。例えば、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−Ｍｕｎｄｉｎｇｅｒ装置及びＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化装置を用いながらカテーテル又はインプラントの定位設置を達成できる。コントラスト増強コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンをオムニパーク１２０ｍｌ注入、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌ、２ｍｍスライス厚みで使用することにより、３次元多平面治療計画が可能になる（ＳＴＰ、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この装置は明確な標的の確認のためのＣＴ及びＭＲＩの標的情報を併合しながら、磁気共鳴画像化試験に基づいた計画を可能にする。
【０１４９】
ＧＥのＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）と共に使用するように改変されたＬｅｋｓｅｌｌ定位システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒｅ，ＧＡ）並びにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をこの目的の為に使用できる。即ち、移植当日の朝、ＢＲＷ定位フレームの環状ベースリングを患者の頭蓋に装着できる。ベースプレートに固定されたグラファイトロッドローかライザーフレームを用いて（標的組織）領域に渡り３ｍｍ間隔で一連のＣＴ断面を獲得できる。グラファイトロッド画像のＣＴ座標を用いながらＶＡＸ１１／７８０コンピューター（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）上でコンピューター治療計画プログラムを実行することによりＣＴスペースとＢＲＷスペースとの間をマッピングすることができる。
【０１５０】
インビトロの方法
本発明は又ニューロン細胞成育抑制をインビトロで鎮圧する方法を包含する。例えば本発明は正常な状況下ではニューロン細胞生育抑制又は成長円錐崩壊を誘発する因子の存在下にニューロン細胞成育を刺激するためのインビトロの方法を包含する。
【０１５１】
本発明のこの特徴による方法は、単離された本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの存在下及び非存在下に、ＮｇＲ媒介生育抑制を誘発する薬剤にＮｏｇｏ受容体を発現するニューロン細胞を接触させることを含む。本明細書においては、「ＮｇＲ媒介生育抑制を誘発する薬剤」という表現はＮｏｇｏ受容体シグナル伝達経路の成分（例えばＮｇＲ又はＮｇＲ相互作用蛋白）と相互作用することによりニューロン細胞生育抑制又は成長円錐崩壊を刺激する何れかの化合物を意味する。ＮｇＲ媒介生育抑制を誘発する薬剤の例は、Ｎｏｇｏ（例えばＮｏｇｏＡ、Ｎｏｇｏ−６６）、ミエリン関連糖蛋白（ＭＡＧ）、オリゴ樹状細胞糖蛋白（ＯＭｇｐ）、及びＮｏｇｏ受容体を発現する細胞の成育を抑制するこれ等のフラグメント及び誘導体を包含する。ミエリンそのものはＮｇＲ媒介生育抑制を誘発する別の例示される薬剤である。
【０１５２】
本発明のインビトロの方法の実施において使用されるニューロン細胞は、特定の実施形態においては、内因性Ｎｏｇｏ受容体を発現する。他の実施形態においてはニューロン細胞はベクター由来の外因性Ｎｏｇｏ受容体を発現する。ニューロン細胞は内因性Ｎｏｇｏ受容体及び外因性Ｎｏｇｏ受容体の両方を発現してよい。
【０１５３】
本発明のこの特徴による方法は、単離された本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの存在下及び非存在下に、ニューロン生育抑制又は成長円錐崩壊の程度をモニタリングすることを含んでよい。本発明のインビトロの方法を用いることにより、ＮｇＲ媒介生育抑制を誘発する薬剤の存在下では通常起こるニューロン細胞成育抑制又は成長円錐崩壊を候補ＮｇＲポリペプチドが鎮圧できる程度を特性化することができる。即ち、本発明の方法はニューロン細胞成育抑制を鎮圧する能力を有するＮｇＲポリペプチドの全範囲を発見して特性化するために有用である。本発明のこの特徴による方法は高スループットのフォーマットで実施してよい。
【０１５４】
ＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントがニューライト成長を抑制する能力を試験するための他のインビトロ及びインビボの方法はＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０１６９５５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１５５】
当然ながら、本明細書に記載した方法及び用途に対する他の適当な変更及び適合は当業者には明白であり、本発明又はその何れの実施形態の範囲からも逸脱せずに実施してよい。以上詳細に本発明を説明したが、これは以下の実施例を参照することにより更に明確に理解されるが、これは説明を目的とするのみであり、本発明を限定する意図はない。
【実施例】
【０１５６】
実施例１  ＮｇＲ１蛋白の純度及び生物学的活性
以前の欠失分析によれば、ＬＲＲのＣ末端キャップＬＲＲＣＴを含むＮｏｇｏ受容体−１の全ＬＲＲ領域がリガンド結合に必要であること、及び、Ｎｏｇｏ受容体−１の隣接ＣＴ幹部がその共同受容体（例えばｐ７５、ＴＡＪ及びＬＩＮＧＯ−１）との相互作用に寄与することが示唆されている。ＮｇＲ１のどの領域がその共同受容体との相互作用に関与しているかを更に解明するために、ＮｇＲ１の種々のコンストラクトの共同受容体結合能力を分析した。自身のＮ末端にｆｌａｇタグを有するＧＰＩドメインを除くヒトＮｇＲ１（ＦＬ−ＮｇＲ１、残基２７〜４３８、図１（配列番号２２））をＣＨＯ細胞中で発現し、ＴＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（ＥＭ  Ｍｅｒｃｋ）及びＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）上で逐次的クロマトグラフィー工程によりコンディショニングされた培地から可溶性蛋白として精製する。ヒトＮｇＲ１（３１０）（残基２７〜３１０）及びヒトＮｇＲ１（３４４）（残基２７〜３４４）を昆虫細胞中ヒスチジンタグ付蛋白（Ｃ末端タグ）として発現させ、そしてＳＰ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）及びＮｉ−ＮＴＡアガロース上の逐次的工程により精製した。ラットＮｇＲ１（３４４）（残基２７〜３４４）−ｒａｔ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）及びラットＮｇＲ１（３１０）（残基２７〜３１０）をＣＨＯ細胞中で発現させた。ラットＮｇＲ１（３４４）−ｒａｔ−ＦｃはプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）上で、そしてラットＮｇＲ１（３１０）はＳＰ−セファロース上で精製した。試料は純度に関しては４〜２０％勾配ゲル（ＮＯＶＥＸ）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、そして凝集に関してはＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）上のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。カラムは２０ｍＬ／ｈの流速でＰＢＳで溶離し、カラム溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度をモニタリングした。
【０１５７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによればＦＬ−ＮｇＲ１の純度は９０％超であり、平均分子質量は約６５ｋＤａであった（図２Ａ）。サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ）においては、蛋白は質量約８０ｋＤａの単一ピークとして溶出した（図２Ｂ）。ＦＬ−ＮｇＲ１の結合を当該分野で知られた方法によりＥＬＩＳＡで試験したところ、ＬＲＲ領域のみを含有するトランケーションされた型と同等又はそれより良好にＬＩＮＧＯ−１、ＯＭｇｐ、Ｎｏｇｏ−６６、ｐ７５及びＴＡＪに結合することが解った。例えばＳｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｎｅｕｒｏｎ  ４５，３５３−３５９参照。上述の通りＬＲＲ領域だけを含有するトランケーションされた型のＮｇＲ１（３１０）と比較してＦＬ−ＮｇＲ１を使用した場合にＴａｊについて１０倍高い親和性が観察された。ＮｇＲ１へのＡＰ−ＯＭｇｐ及びＡＰ−Ｌｉｎｇｏ−１の結合をブロックするために抗ＮｇＲ１抗体を用いた競合的ＥＬＩＳＡにおいて更に結合を分析することによりＦＬ−ＮｇＲ１の活性を確認した（図２Ｃ）。
【０１５８】
実施例２  完全長ヒトＮｇＲ１蛋白のアミノ酸配列の分析
ＦＬ−ＮｇＲ１のアミノ酸配列をＬＣ−ＭＳシステム上のトリプシンペプチドマッピングにより確認した。ペプチドマッピングはＰＮＧａｓｅＦ処理を行うか行うことなく蛋白試料に対して実施した。第１にＮ連結グリカンをＰＮＧａｓｅＦを用いてネイティブの蛋白から除去した。ＰＮＧａｓｅＦ約１μＬ（２．５ｍＵ／μＬ、Ｐｒｏｚｙｍｅ）を蛋白約２０μｇを含有する溶液２５μＬに添加し；溶液を２４時間３７℃でインキュベートした。次にＰＮＧａｓｅＦ１μＬを更に添加し、溶液を更に２４時間室温で維持した。アルキル化は変性させるが非還元の条件下で行った。４−ビニルピリジン約０．３μｌを蛋白溶液５０μｌに添加し、その直後に塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）５０ｍｇを溶液に添加した。溶液を６０分間暗所室温でインキュベートした。アルキル化蛋白はＰｅｐｉｎｓｋｙ，Ｒ．Ｂ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５，１７７−１８１に記載の通り冷エタノール４０容量で沈殿させることにより回収した。溶液を１時間−２０℃で保存し、次に４℃で８分間１４０００ｘｇで遠心分離した。上澄みを廃棄し、沈殿（〜２０μｇ／バイアル）を冷エタノールで一回洗浄した。
【０１５９】
トリプシンはシステイン含有ペプチドの最も単純なセットを発生させると予測されたため、これをジスルフィド結合連結の試験のための切断酵素として選択した。ジスルフィド交換を最小限にするためにｐＨ６．５で消化を行った。ｐＨ６．５ではトリプシンによる加水分解が低比率となるという問題点を克服するために、トリプシン切断の前に蛋白をエンド−Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼで処理した。脱グリコシル化又は完全グリコシル化されたアルキル化蛋白各々約２０μｇを室温で５時間１Ｍ尿素、０．２Ｍトリス塩酸、ｐＨ６．５、１０ｍＭメチルアミン、１ｍＭＣａＣｌ２中でエンド−プロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（エンド−Ｌｙｓ−Ｃ、Ｗａｋｏ）５％（ｗ／ｗ）で消化し；次に５％（ｗ／ｗ）トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、そして溶液を室温で更に１０〜１２時間インキュベートした。最終容量を５５μＬとした。液体クロマトグラフィー／質量スペクトル分析（ＬＣ−ＭＳ）システム上での消化物の分析の前に、新しく調製した８Ｍ尿素５５μＬを添加し、そして溶液を２分割し、一方を４０ｍＭＤＴＴで３７℃で１時間還元した後に分析し、もう一方は還元せずに直接分析した。還元及び非還元の消化物をＨＰＬＣ（２６９０  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ）、２４８７型２波長ＵＶ検出器及びＬＣＴ質量スペクトル分析器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）よりなるＬＣ−ＭＳシステム上で分析した。ＨＰＬＣには１．０ｍｍｘ２５ｃｍのＹＭＣ  Ｃ１８カラム（ＡＡ１２Ｓ０５２５０１ＷＴ）又は１．０ｍｍｘ２５ｃｍのＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（２１８ＴＰ５１）を装着し、３０℃の温度において０．０７ｍＬ／分の流量で０．０３％トリフルオロ酢酸中２００分勾配（０〜７０％アセトニトリル）で溶離した。
【０１６０】
ペプチドはオンラインＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析器を伴ったＣ１８逆相カラム上で分離した。全ての有意なピークが同定され、そして予測されたＮｇＲ１配列の９７％に相当した（表１）。ペプチドマップ中未検出であるものは恐らくは溶媒ピークと同時溶出した小型の親水性ペプチドであった。同定されたペプチドのうち、予測されなかった８部位の翻訳後修飾は、プロリン−３５２におけるヒドロキシル化（約７５％；ピークは図２において５１．５分で溶出、表１ではＴ３１＜Ｈｙｐ−３５２＞と表記）及びペプチドＴ３４中の７部位におけるＯ連結グリコシル化を包含していた（残基３７８〜４１４、表１）。ヒドロキシル化部位は１６５２．９−Ｄａペプチド上の直列質量スペクトル分析（ＭＳ／ＭＳ）配列決定により同定した（データ示さず）。トリプシングリコペプチドＴ３４（残基３７８〜４１４）を含有するピークを収集し、ペプチド約０．１μｇを真空下に乾燥し、ＰＢＳ１０μｌに再懸濁した。シアル酸を除去するために、シアリダーゼ（１０ｍＵ／μＬ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）０．５μＬの小分量を添加し、その後溶液を２０時間室温でインキュベートした。エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ（エンド−Ｇｌｕ−Ｃ、配列決定等級、Ｒｏｃｈｅ）消化は２４時間室温で酵素０．０５μｇでグリコペプチドを処理することにより実施した。シアリダーゼ処理トリプシンペプチドＴ３４はマトリックスとしてＤＨＢを使用しながらＶｏｙａｇｅｒ  ＳＴＲ質量スペクトル分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で分析した。脱シアル化Ｔ３４のエンド−Ｇｌｕ−Ｃ消化物をナノフローＬＣ−ＭＳシステム上で上記した通り分析した。分析によれば、Ｔ３４中のアスパラギン−３８０におけるＮ連結グリコシル化部位は占有されておらずペプチドにおける全ての４セリン及び３スレオニン残基はある程度までグリコシル化されていたが、ペプチドは主に合計４〜６のＯ連結グリカンを含有していた（データ示さず）。分析結果はプログラムＮｅｔＯＧｌｙｃ３．１を用いて行った予測と合致している。
【０１６１】
【表１−１】
2009505665.tif 000009
【０１６２】
【表１−２】
2009505665.tif 000010
￥の標示はＴ１がＮ末端ペプチドであり、Ｔ４１がＣ末端ペプチドであるＦＬ−ＮｇＲ１配列由来の予測されたトリプシンペプチドを示す。＊ＬｅｕはＦＬ−ＮｇＲ１のＮ末端におけるＦｌａｇタグ由来を示す。§は質量スペクトル分析の前にシアリダーゼで処理した画分である。
【０１６３】
実施例３  ヒトＮｇＲ１蛋白中の遊離のシステイン及びジスルフィド連結システイン残基の分析
成熟構造中のシステイン残基のどれが遊離であるかを直接試験するために、ピリジルエチル化された非還元ＦＬ−ＮｇＲ１のトリプシン消化物を、ＤＴＴで消化物を還元した後にＬＣ−ＭＳ上で分析した。ネイティブの蛋白は酵素切断前に４−ビニルピリジンでアルキル化したため、遊離のチオール型のシステイン残基は全てピリジルエチル化され、各アルキル基について１０５−Ｄａ増加しているはずである。一方、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基は遊離のシステイン、即ち還元後遊離のチオール基を有するモノとして検出されるはずである。ＦＬ−ＮｇＲ１は１４システイン残基、即ちＬＲＲＮＴに４つ、ＬＲＲに２つ、ＬＲＲＣＴに４つ、そしてＣＴ幹部に４つを含有している。還元型消化物のトリプシンペプチドマップにおける予測されるシステイン含有ペプチドは、小型であり恐らくは溶媒ピークと共に溶出し、分析されなかったシステイン−８０及びシステイン−４２９を含有するものを除き、全てが同定された。図３の下パネルは還元後のピリジルエチル化されたＦＬ−ＮｇＲ１に関するトリプシンペプチドマップを示す。全ての同定されたペプチドは表１に列挙するとおりであり、システイン含有ペプチドは太字とした。これ等のデータの分析によれば、同定されたシステイン残基１２中１１は還元後遊離のチオール型であり、そしてペプチドＴ１０（残基１４０〜１５１）中のシステイン−１４０はピリジルエチル化されていた。従って、ネイティブのＦＬ−ＮｇＲ１中の１２システイン残基が６ジスルフィド結合に関与し、そして２つが非対形成であると考えられる。更に又、ＮｇＲ１（３１０）の結晶構造からの情報を利用すれば、システイン−８０は、結晶構造においてそれがＬＲＲ領域に埋没していることから、遊離のチオールとして存在していると考えられる。推論すれば、結晶構造にはないＣＴ幹部領域中のシステイン−４２９はジスルフィド結合の形成に関与していなければならない。
【０１６４】
実施例４  ＦＬ−ＮｇＲ１蛋白におけるジスルフィド連結部の分析
非還元消化物のペプチドマップを分析することによりＮｇＲ１内のジスルフィド構造を調べた。Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｅｕｒｏｎ，３８，１７７−１８５及びＢａｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２２，３２９１−３３０２に記載されたＮｇＲ１（３１０）の結晶構造において観察されたジスルフィド構造に基づけば、非還元消化物はジスルフィド連結ペプチド２種、即ち１つはＬＲＲＮＴ領域由来、そしてもう１つはＬＲＲＣＴ領域由来のものを含有しなければならない。実際、非還元消化物のペプチドマップの分析では、７４．３分に溶出するＬＲＲＮＴ領域由来のジスルフィド連結ペプチド（Ｔ１／Ｔ２）種が判明している（図３、上パネル）。ピークの質量スペクトル分析によれば、これは２つのジスルフィド結合により連結されている２種のペプチド、即ちＴ１（残基２７〜３８）及びＴ２（残基３９〜６１）を含有していることがわかった（質量測定値３６９８．７７Ｄａ；質量計算値３６９８．７７Ｄａ；表２）。消化物をＤＴＴで還元した場合にはＴ１及びＴ２のペプチドを含有するピークは消失し、そして同時に、還元マップ上では、個々のペプチドＴ１及びＴ２に相当する２つの新しいピーク（図３、下パネル）が観察された。ペプチドＴ１は３システインを含有する。システイン−２７とシステイン−２９、及び、システイン−２９とシステイン−３３の間を切断できるプロテアーゼがないため、Ｔ１／Ｔ２の厳密なジスルフィド連結部は塩酸トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ，Ｐｉｅｒｃｅ）による部分的還元及びＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ，Ｐｉｅｒｃｅ）によるアルキル化とその後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により調べなければならなかった。これを達成するために、ジスルフィド連結トリプシンペプチドをＢｕｒｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５６，２６４８−２６５０に記載の通り６Ｍ塩酸グアニジンを含有する０．１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ３中ＴＣＥＰ，Ｐｉｅｒｃｅで部分的に還元した。種々の量のＴＣＥＰを溶液に添加することにより最適な条件を求めた。ＴＣＥＰの最適な量はＬＲＲＮＴ領域のジスルフィド連結ペプチド２０ｐｍｏｌに対しては５ｎｍｏｌであり、そしてＬＲＲＣＴ及びＣＴ幹部領域中のジスルフィド連結ペプチド１０ｐｍｏｌに対しては５ｎｍｏｌであることが解った。溶液の総容量は２．５μｌであった。還元は１５分間３７℃で実施し、そして６Ｍ塩酸グアニジンを含有する０．４Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ４．５中ＮＥＭ過剰量を用いて部分還元ペプチドをアルキル化することにより停止した。溶液（５ｐｌ）中のＮＥＭの終濃度は１０ｍＭであり；溶液は１時間３７℃に維持した。部分還元され、ＮＥＭアルキル化されたペプチドは直接、又は、１．０ｍｍｘ１５ｃｍのＡｔｌａｎｔｉｃ  ｄＣ１８カラム（１８６００１２８３、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）を装着した２６９０  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ上で更に分画した後に、上記した通りナノフローＬＣ−ＭＳシステム上で分析した。分画は３０℃において０．０７ｍＬ／分の流量で０．１％トリフルオロ酢酸中７０分勾配（５〜７０％アセトニトリル）を用いた。ペプチドマップ上のピ���クの成分はＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．０ソフトウエア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて同定した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは上記した通りナノフローＬＣ−ＭＳシステム上のデータ依存性獲得機能（ＤＤＡ）を用いて獲得した。ＭＳ／ＭＳ実験のためにはランプドコリジョンエネルギー２１〜４０ｅｖを使用し、そしてＭＳ／ＭＳスペクトルはｍ／ｚ領域５０〜１８００において収集し、０．５秒毎のサンプリング、連続スペクトル間の分離０．０５秒とした。Ｑ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒから獲得したＭＳ又はＭＳ／ＭＳスペクトルはＭａｘＥｎｔ  ３プログラムにより逆重畳した。ジスルフィド結合により連結されたペプチドは更に、非還元消化物のマップを相当する還元試料のマップと比較することにより同定した。
【０１６５】
Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｅｕｒｏｎ，３８，１７７−１８５及びＢａｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２２，３２９１−３３０２に記載されたＮｇＲ１（３１０）の結晶構造から、Ｔ１はペプチド内ジスルフィド結合を有することになり、そしてペプチド間ジスルフィド結合によりＴ２に連結すると推測できる。Ｃ１８カラム上の分離の後の部分還元及びアルキル化の生成物の質量スペクトル分析では、以下の予測された部分還元ＮＥＭアルキル化ペプチド、即ち、１ジスルフィド結合及び１Ｎ−エチルスクシンイミジル（ＮＥＳ）基を含有するＴ１（ＭＨ＋測定値＝１５１９．６４、ＭＨ＋計算値＝１５１９．６４）、１ＮＥＳ基を有するＴ２（ＭＨ＋測定値＝２４３３．２６、ＭＨ＋計算値＝２４３３．２５）及び１ペプチド間ジスルフィド結合及び２ＮＥＳ基を含有するＴ１／Ｔ２（ＭＨ＋測定値＝３９５１．９０、ＭＨ＋計算値＝３９５１．８９Ｄａ）が検出された。図４に示す２ジスルフィド結合及び１ＮＥＳ基を含有するＴ１のＭＳ／ＭＳスペクトルによれば、ＮＥＳ基はシステイン−２９上にあり（内部フラグメントイオン、ＰＧＡＣ（ＮＥＳ）及びＰＧＡＣ（ＮＥＳ）Ｖ、ｙ１１関連イオン、図４）、このことはシステイン−３３がペプチド内ジスルフィド結合によりシステイン−２７に連結し、そしてシステイン−２９がペプチド間ジスルフィド結合によりＴ２のシステイン−４３に連結していることを意味している。１ペプチド間ジスルフィド結合及び２ＮＥＳ基を含有するＴ１／Ｔ２に関するＭＳ／ＭＳ配列決定結果は、分析が２ＮＥＳ基がシステイン−２７及びシステイン−３３にあることを示していたことから、上記結論と合致している（データ示さず）。
【０１６６】
Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｅｕｒｏｎ，３８，１７７−１８５及びＢａｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２２，３２９１−３３０２に記載されたＮｇＲ１（３１０）のＬＲＲＣＴ領域の結晶構造は、システイン−２６４からシステイン−２８７及びシステイン−２６６からシステイン−３０９へのジスルフィド連結部を明らかにしている。従って、ＬＲＲＣＴ領域の４システイン残基は２ペプチド間ジスルフィド結合により共に連結されているＴ２１（残基２５７〜２６７）、Ｔ２４（残基２８０〜２９２）及びＴ２８（残基３０１〜３２３）の３トリプシンペプチド内に含有されなければならない（このクラスターに関する質量計算値は５０８８．６８Ｄａとならなければならない）。３つの独立したペプチド、Ｔ２１、Ｔ２４及びＴ２８（図３の下パネル及び表１）は還元消化物のマップ中では容易に同定で来たが、非還元消化物のマップ中にはこれ等のペプチドクラスターＴ２１／Ｔ２４／Ｔ２８に相当する有意なピークは観察されなかった。代わりに、３ジスルフィド結合により連結されたＴ２１、Ｔ２４、Ｔ２８及びＴ３０（残基３３５〜３４３）を含有する４ペプチドクラスターに相当する質量６０３２．６２Ｄａの顕著なピークが生じている（質量計算値＝６０３２．６８Ｄａ；図３の上パネル、及び表２）。ペプチドＴ２１及びＴ３０は各々２システイン残基を含有しているため、厳密な連結部は決定できなかったが、ペプチドＴ２１中の１システインはペプチドＴ３０の１つとのジスルフィド結合に由来すべきである。トリプシンペプチドマッピング分析は又、１９．０分のピークはＣＴ幹部領域に他の２システイン含有ペプチドを含有すること、及び、それらがシステイン−４１９とシステイン−４２９の間のジスルフィド結合により連結されていることを示している（表２及び図３、上パネル）。
【０１６７】
ペプチドＴ２１／Ｔ２３／Ｔ２８／Ｔ３０複合体におけるジスルフィド連結部を決定するために、トリプシンペプチドマップ上のＬＲＲＣＴ及び幹部領域のジスルフィド連結ペプチドを含有するピークを収集し、真空下に乾燥し、そして１０μｌの０．１Ｍトリス塩酸ｐＨ６．５，１ｍＭＭｇＣｌ２中に再懸濁した。エンド−プロテアーゼＡｓｐ−Ｎ（エンド−Ａｓｐ−Ｎ配列決定等級、Ｒｏｃｈｅ）約０．０２μｇをペプチド０．６μｇに添加し、その後、溶液を６時間室温でインキュベートした。消化物はナノフローＨＰＬＣ（ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）及びＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量スペクトル分析器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）よりなるナノフローＬＣ−ＭＳシステム上で分析した。０．１ｍｍｘ１０ｃｍのＡｔｌａｎｔｉｃ  ｄＣ１８カラム（１８６００２８３１、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）を４００ｎＬ／分の流量で０．１％ギ酸中５０分勾配（０〜７０％アセトニトリル）を用いた分離の為に使用した。温度は３５℃とした。
【０１６８】
ペプチドＴ２１及びＴ３０は各々２Ｃｙｓ残基を含有するため、ペプチド２１の１ＣｙｓはペプチドＴ３０の１つとジスルフィド結合を形成しなければならない（図８）。ペプチドＴ２１／Ｔ２３／Ｔ２８／Ｔ３０クラスターについては８つの可能なジスルフィド構造が存在する（図８）。
【０１６９】
非還元消化物における質量スペクトル分析により２つの顕著なピークが検出された（データ示さず）。第２のピークにおいて検出されたＭＨ＋２０７６．８９（図５）はＮｇＲ１（３１０）の結晶構造で観察されたとおり、システイン−２６４及びシステイン−２８７の間のジスルフィド結合により連結されたペプチドＴ２１及びペプチドＴ２４に関する計算ＭＨ＋値と合致している。このフラグメントの実体はインソースフラグメント化イオンの観察により確認された（図５）。他のピーク中で観察されたＭＨ＋２８７９．５０Ｄａは２つのペプチド間ジスルフィド結合により連結された残基２６５〜２６７（Ｔ２１から誘導）、残基３０５〜３２３（Ｔ２８から誘導）及び残基３３５〜３３８（Ｔ３０から誘導）の３ペプチドのグループに関する計算ＭＨ＋値２８７９．２５Ｄａと合致しており、これはＬＲＲＣＴ領域にけるシステイン−２６６及びシステイン−３０９がＣＴ幹部領域のシステイン−３３５及びシステイン−３３６とジスルフィド結合を形成していることを示している（データ示さず）。この場合、システイン−２６６とシステイン−３０９、及び、システイン−３３５とシステイン−３３６の厳密なジスルフィドの対形成の決定は、システイン−３３５とシステイン−３３６の間の骨格を切断できる試薬が存在しないという事実により、複雑化している。
【０１７０】
Ｔ２１／Ｔ２３／Ｔ２８／Ｔ３０複合体におけるジスルフィド対形成の配置はこれをＴＣＥＰを用いた部分的還元とその後のＮＥＭによるアルキル化及びナノ−ＬＣ−ＭＳによる分析により更に解明した。図６はナノフローＬＣ−ＭＳの結果（ＴＩＣ）を示し、表３はピーク中の成分の実体を列挙している。特定のペプチドについて観察される二重線のピークはＮＥＭアルキル化により生じた立体異性体によるものである。ＭＳ／ＭＳスペクトルは各二十戦における個々のピークについて同様である（データ示さず）。ジスルフィド結合及びＮＥＳ基を有するＴ２８／Ｔ３０を含有する二重線ピークを１ｍｍｘ１５０ｍｍカラム上の分画試行から収集し、これをＤＴＴで完全に還元した後にナノ−ＬＣＭＳ／ＭＳシステム上で更に分析した。図７はＮＥＳ基を含有するペプチドＴ３０のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。ＭＳ／ＭＳ配列決定により検出されたｂ１及びｙ８のイオンは両方とも、観察されたｍ／ｚがｂでは２２９．０８、そしてｙ８では８４７．３８であったことから、ＮＥＳ基がシステイン−３６６ではなくシステイン−３５６にあることを示しており（システイン−３３５がＮＥＭでアルキル化されていればｍ／ｚ計算値はｂ１で２２９．０６、ｙ８で８４７．３６；システイン−３３６がＮＥＭでアルキル化されていればｍ／ｚ計算値はｂ１で１０４．１０、ｙ８で９７２．４６である）、このことは、システイン−３３６がシステイン−３０９とジスルフィド結合を形成していることを示している。そしてその結果、システイン−３３５はシステイン−２６６に連結されなければならない。Ｔ２１／Ｔ２３／Ｔ２８／Ｔ３０複合体における実験的に決定されたジスルフィド連結部を図９に示す。ＦＬ−ＮｇＲ１のＬＲＲＣＴドメインにおけるジスルフィド構造の本発明者等による分析はＮｇＲ１のＬＲＲＣＴに関する予測されたジスルフィド構造が誤りだったことのみならず、代替となるシステイン対形成構造を発見している。理論に制約されないが、ＮｇＲ１（３１０）に観察されるＣｙｓ−２６６からＣｙｓ−３０９の連結部はトランケーションにより人工的に生じたものと考えられる。
【０１７１】
【表２】
2009505665.tif 000011
【０１７２】
【表３】
2009505665.tif 000012
実施例５  異なるコンストラクトから作成したＮｇＲ１及びＮｇＲ２蛋白のジスルフィド構造の分析
ヒトＮｇＲ２（ＦＬ）−Ｆｃ、ヒトＮｇＲ１（３１０）蛋白、ヒトＮｇＲ１（３４４）蛋白、ラットＮｇＲ１（３１０）蛋白及びラットＮｇＲ１（３４４）−ラットＦｃ（ＩｇＧ１）融合蛋白［ラットＮｇＲ１（３４４）−Ｆｃ］におけるジスルフィド構造もまたトリプシンペプチドマッピングにより分析した。配列のアライメントを図１０に示す。図１１は例としてラットＮｇＲ１（３１０）のトリプシンペプチドマップを示す。結果は表４及び図１２に総括する。これ等の分析によれば、ＣＴ幹部領域においてシステイン−３３５及びシステイン−３３６の２システイン残基を欠失しているヒトＮｇＲ２（ＦＬ）−Ｆｃ、ラットＮｇＲ１（３１０）及びヒトＮｇＲ１（３１０）蛋白におけるジスルフィド構造はヒトＮｇＲ１（３１０）の結晶構造中に観察されるものと同様であること、及び、ＣＴ幹部領域において２システイン残基を有するラットＮｇＲ１（３４４）−Ｆｃ及びヒトＮｇＲ１（３４４）におけるジスルフィド構造はＦＬ−ＮｇＲ１において観察されるものと同様であることを示している。質量スペクトル分析は、ＮｇＲ２（ＦＬ）−ＦｃのＣＴ幹部における２Ｃｙｓ残基はＮｇＲ１において観察されるジスルフィド結合により連結されていることを示している。分析では又、ＮｇＲ２（ＦＬ）−ＦｃのＬＲＲＣＴにおけるＯ−連結グリコシル化部位Ｔｈｒ−３１３が発見された。グリコシル化部位の占有率は約３５％である。
【０１７３】
【表４】
2009505665.tif 000013
実施例６  ニューライト成長試験
本発明の可溶性Ｎｏｇｏ受容体ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントのニューライト成長に対する作用をラミニン存在下及び非存在下に生育した細胞を用いて実験を行うことにより試験する。ラミニンを含有しない培地中のニューロン細胞の成育は不良であり、ニューロンストレス状態をモデル化している。
【０１７４】
脊髄神経節（ＤＲＧ）を生後６〜７日のラット新生仔（Ｐ６−７）から摘出し、単細胞となるまで解離させ、０．１ｍｇ／ｍＬポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））で予備コーティングした９６穴プレート上にプレーティングする。一部のウェルでは２μｇ／ｍｌのラミニンを２〜３時間添加し、細胞プレーティング前に洗浄除去する。１８〜２０時間のインキュベーションの後、プレートを４％パラホルムアルデヒドで固定し、１：５００希釈ウサギ抗ベータＩＩＩチューブリン抗体（Ｃｏｎｖａｎｃｅ（登録商標））及び１：１００希釈抗ＨｕＣ／Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、そして蛍光二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１：２００希釈で添加する。
【０１７５】
ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＩＩ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標））を使用して５ｘデジタル画像をキャプチャーし、そして、ニューライト成長アプリケーションを使用することによりウェル当たりの平均ニューライト成長／ニューロンとしてニューライト成長を定量する。十分な画像を分析することにより結果の統計学的分析が可能になる。
【０１７６】
一部の実験において、ＰＣ１２細胞（Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ）のサブクローンを使用する（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）。Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ細胞は２００ｎｇ／ｍｌＮＧＦと共に７日間予備分化し、脱着させ、ポリ−Ｄ−リジン予備コーティング９６穴プレートに再プレーティングする。一部のウェルでは５μｇ／ｍｌのラミニンを２〜３時間添加し、細胞プレーティング前に洗浄除去する。２日間のインキュベーションの後、プレートを４％パラホルムアルデヒドで固定し、１：５００希釈ウサギ抗ベータＩＩＩチューブリン抗体（Ｃｏｎｖａｎｃｅ（登録商標））及びＨｏｅｃｈｓｔ（核染色）で染色する。ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＩＩを使用することにより上記した通りＤＲＧ細胞中のニューライト成長を定量する。
【０１７７】
本発明のＮｇＲ１ポリペプチド及びポリペプチドフラグメント、例えばＮｇＲ１（３０９〜３４４）ポリペプチドフラグメントを溶液としてプレーティング時にＰ６−７ＤＲＧニューロン及び分化したＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎＴＭ細胞に添加する。
【０１７８】
ＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントのニューライト成長に対する作用を評価する。
【０１７９】
実施例７  ニューライト成長試験
Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド（４ウェル）に０．１ｍｇ／ｍＬポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）をコーティングする。ＣＮＳミエリン単独又は本発明のＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメント、例えばＮｇＲ１（３０９〜３４４）ポリペプチドフラグメントと混合したものを別個に３μｌ液滴としてスポットする。蛍光微小球（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）をミエリン／ＰＢＳに添加することにより後に液滴が発見できるようにする（Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，（２０００））。次にＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）スライドを洗浄し、１０μｇ／ｍｌラミニン（Ｇｉｂｃｏ  ＴＭ）でコーティングする。
【０１８０】
Ｐ３〜４のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット新生仔から採取した脊髄神経節（ＤＲＧ）を１ｍｇ／ｍＬの１型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）で解離させ、火炎研磨したパスツールピペットで磨砕し、ニューロン細胞がリッチ化されるように予備プレーティングし、そして最後に予備コーティングしたＬａｂｔｅｋ培養スライド上に２３，０００細胞／ウェルとなるようにプレーティングする。バイ値は例えば５％熱不活性化ドナーウマ血清、５％熱不活性化ウシ胎児血清及び５０ｎｇ／ｍｌｍＮＧＦを含有するＦ１２とし、そして６時間３７℃及び５％ＣＯ２においてインキュベートする。
【０１８１】
スライドを２０％スクロース含有４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、１：５００希釈されたニューロンマーカーウサギ抗ベータＩＩＩチューブリン（Ｃｏｎｖａｎｃｅ  ＴＵＪ１）抗体について染色する。二次抗体として抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１：３００希釈し、スライドはＧｅｌ／ＭｏｕｎｔＴＭ（ＢｉｍｅｄａＴＭ）でカバーガラス被覆する。ＯｐｅｎＬａｂソフトウエアを用いて５ｘデジタル画像を獲得し、ニューライト成長の定量のためにＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）を用いて分析する。
【０１８２】
ニューライト成長のミエリン媒介抑制からＤＲＧニューロンを保護するＮｇＲ１ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントの能力を試験する。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１はＧＰＩドメインを除外したヒトＦＬ−ＮｇＲ１配列を示す（配列番号２２）。ＬＲＲＮＴはアミノ酸２７〜７３により表される。８ＬＲＲ領域はアミノ酸７４〜２４９により表される。ＬＲＲＣＴドメインはアミノ酸２５０〜３１０により表される。伸長ＬＲＲＣＴ領域はアミノ酸３１１〜３３７により表される。幹部領域はアミノ酸３３８〜４３８により表される。本試験において測定したジスルフィド結合は特定のＣｙｓ残基を繋げる黒線により示す。遊離チオール型のＣｙｓ残基は灰色のハイライトとする。ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）残基は二重下線；グリコシル部位は下線を付した。シグナルペプチド及びフラグ配列は図示しない。ヒトＦＬ−ＮｇＲ１の模式図を配列の下に示す。
【図２】図２Ａは種々のＮｇＲＩ蛋白のＳＤＳＰＡＧＥを示す。図２ＢはＦＬ−ＮｇＲ１のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。図２ＣはＡＰ−ＯＭｇ及びＡＰ−Ｌｉｎｇｏ−１からＦＬ−ＮｇＲ１への結合をブロックするために抗−ＮｇＲ１抗体を使用するＥＬＩＳＡ区画を示す。
【図３】図３はピリジルエチル化ＦＬ−ＮｇＲ１のトリプシンペプチドマップを示す。上パネルは非還元消化物；下パネルは還元消化物を示す。
【図４】図４はＮＥＳ基を含有する部分還元ペプチドＴ１（配列番号１８）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図５】図５はＦＬ−ＮｇＲ１由来のエンド−Ａｓｐ−Ｎ処理ジスルフィド連結トリプシンペプチドクラスターＴ２１／Ｔ２４／Ｔ２８／Ｔ３０由来のピーク２の逆重畳質量スペクトルを示す。ｙおよびｂイオンはインソースフラグメント化による。図はペプチドＴ２１（配列番号１９）の部分的配列及びペプチドＴ２４（配列番号２０）の完全配列を示す。
【図６】図６はＦＬ−ＮｇＲ１由来の部分還元されたＮＥＭ−アルキル化ジスルフィド連結ペプチドクラスターＴ２１／Ｔ２４／Ｔ２８／Ｔ３０由来の総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示す。各ピークの成分の名称は表３に列挙する。
【図７】図７は部分還元ジスルフィド連結トリプシンペプチド３３５〜３４３及びトリプシンペプチド３０１〜３２３の還元により生成されたＮＥＳ基を有する残基３３５〜３４３を含有するペプチドＴ３０のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図８】図８はペプチドＴ２１／Ｔ２４／Ｔ２８／Ｔ３０クラスターにおける可能なジスルフィド連結部を示す。図はペプチドＴ２４（配列番号２０）、Ｔ２１（配列番号２７）、Ｔ３０（配列番号２８）、Ｔ２８（配列番号２９）の完全配列を示す。
【図９】図９はペプチドＴ２１／Ｔ２４／Ｔ２８／Ｔ３０クラスターにおけるジスルフィド連結部を示す。図はペプチドＴ２４（配列番号２０）、Ｔ２１（配列番号２７）、Ｔ３０（配列番号２８）、Ｔ２８（配列番号２９）の完全配列を示す。
【図１０】図１０は異なるＮｇＲ形態の蛋白配列アライメントを示す。
【図１１】図１１はピリジルエチル化ラットＮｇＲ１（３１０）のトリプシンペプチドマップを示す。ジスルフィド結合を形成するＣｙｓ含有ペプチドをマップ上で標識する。図はラットＮｇＲ１のペプチドＴ２１（配列番号３０）、Ｔ１８（配列番号３１）及びＴ２５（配列番号３２）を示す。
【図１２】図１２は異なるコンストラクトから作成したＮｇＲ２及びＮｇＲ１におけるジスルフィド構造を示す。図は配列番号２（ヒトＮｇＲ１）のアミノ酸２７〜４７３、配列番号２３（ラットＮｇＲ１）のアミノ酸２７〜４７３及び配列番号２４（ヒトＮｇＲ２）のアミノ酸３１〜４２０を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月20日(2008.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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