(57)【要約】  純度の高いステビオサイド甘味料を提供する。交配と選別による品種改良を実施し、ＤＮＡ鑑定法を用いて、ステビア・レバウディアナ・ベルトニーの品種を特定した。そしてそれらの交配により、特定の品種が継続して栽培可能な新品種を開発した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７０）。該品種の乾燥葉を抽出すると、ステビオサイドを高濃度で含む甘味成分が安定して得られ、これより好ましい各種ステビオサイド甘味料を製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオサイド１００重量部に対してレバウデイオサイドＡを多くとも８重量部しか含まないステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種であって、ＲＡＰＤ法によるＤＮＡ解析において２１０ｂｐの位置に特徴的な塩基配列を示す植物体。
【請求項２】
ステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７０）の種子より得られる、請求項１の植物体。
【請求項３】
請求項１に記載の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出することを特徴とする甘味料の製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出することを特徴とする甘味料の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法により得られる甘味料から、ステビオサイド１００重量部に対してレバウデイオサイドＡを多くとも５重量部しか含まず、かつ純度が９３％以上である高純度ステビオサイドを得る方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法により得られる甘味料から、ステビオサイド１００重量部に対してレバウデイオサイドＡを多くとも５重量部しか含まず、かつ純度が９３％以上である高純度ステビオサイドを得る方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法により得られる甘味料からα−グルコシルステビオサイドを得る方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法により得られる甘味料からα−グルコシルステビオサイドを得る方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法により得られる甘味料から、付加糖鎖を調整したα−グルコシルステビオサイドを得る方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法により得られる甘味料から、付加糖鎖を調整したα−グルコシルステビオサイドを得る方法。
【請求項１１】
下記のプライマー
順方向プライマー：ＣＡＣＧＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＧＡＣＣ
逆方向プライマー：ＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＡＴＣ
を用いてＲＡＰＤ法によるＤＮＡ解析を実施し、請求項１のステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステビオサイドの含有比率が極めて高く、かかる形質を有する植物体を種子により継続的に生産することのできるステビア・レバウディアナ・ベルトニーの品種に属する植物体、該植物体から得られる種子を用いた植物体、および／またはその乾燥葉より抽出される甘味料の製造方法、およびそれら甘味料からα−グルコシルステビオサイドを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia Rebaudiana Bertoni)という。ステビアは砂糖の３００倍以上の甘味を持つ成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。
ステビアの甘味成分としては、ステビオサイド(Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１８)、レバウディオサイドＡ(Ｃ４４Ｈ７０Ｏ２３)、レバウディオサイドＣ、Ｄ、Ｅ、ズルコサイドＡ等が知られている。一般に栽培されているステビア品種では上記甘味成分の内ステビオサイド(以下、ＳＴ)が主成分で、ＳＴ１００重量部に対してレバウディオサイドＡ(以下、ＲＡ)の含有量は４０重量部程度、レバウディオサイドＣの含量はそれよりやや少ない。しかし、品種によってはレバウディオサイドＣを主成分とするものなどもあり、様々である。【０００３】
ＳＴは砂糖の３００倍の甘味度を有するので天然甘味料として食品工業界で広く用いられており、その甘味は比較的砂糖に似ているが、ＲＡと比較すると苦み等の不快味が後味に残ることが知られている。これに対して、ＲＡは良質の甘味質とＳＴに対して１.３倍〜１.５倍の甘味度を有するので、一般にはＳＴよりもＲＡの含有率の高いステビア甘味料が好ましいとされている。
例えば、本発明者らは従来品種から交配選抜を繰り返して品種改良を行い、ＲＡに対してＳＴが極微量しか含有されないステビア品種を得、それら品種から得られた種子による、育苗が容易でかつ甘味成分内容を継続栽培できる新品種の開発をした（後記特許文献１、２参照）。
しかしながら、渋み、辛み等の舌で知覚される味の中でも甘みの質は非常に微妙である。ＲＡと比較した場合苦み等の不快味が後味に残るとされているＳＴであっても、その濃度、純度を高めることにより雑味が除去されて甘味の質が改善され、甘味料としての用途が広がる。例えばＳＴの後味に感じる甘味質は塩性食品に使用することにより塩カドをマスキングすることができる。また、果汁の渋みや有機酸、その塩類のマスキング剤としての利用が可能であり、ＲＡとは異なる甘味料としてＳＴ甘味料も食品分野で必要とされている。
また、αーグルコシル化とそれに続く糖鎖調整によりステビア抽出物の甘味を改善する方法は知られている（後記特許文献３参照）。かかる方法により得られるαーグルコシルステビオサイドを主体とする甘味料は、一般的なステビア抽出物に比べて、ＳＴ以外の甘味成分による甘味質の妨害が少ないことが特徴である。
もとよりＳＴはステビア甘味料の主成分であるから、その利用を促進することは資源の有効活用の観点からも好ましい。
【特許文献１】特開２００２−２６２８２２号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０９３２２９号パンフレット
【特許文献３】特開平０２−１６３０５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来、高純度のＳＴを得るには再結晶を繰り返すしか方法が無かった。再結晶ではステビアに含まれるＳＴ以外の成分が再結晶収率を低下させる原因となっており、取り分けＲＡはＳＴに次ぐステビアの甘味成分であることから、高純度ＳＴの生産コストの削減と安定した収量を保つためにはＲＡ含量の低いステビア新品種の開発が求められていた。
また、ステビア植物の品種改良においては草丈、葉形だけではその識別が不可能であり、また、ステビア植物は自家不和合性により雑種化が容易に生じるため種子を用いた栽培では甘味成分を一定に保つのは不可能とされていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは従来品種から交配選抜を繰り返して品種改良を行い、ＳＴに対してＲＡを極微量しか含有しないステビア品種を得、それから種子による育苗が容易で、甘味成分内容を継続して栽培できる品種の開発に成功した。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のステビア新品種の乾燥葉より得られるステビア抽出物はＲＡの含量が低くＳＴの含量が高いので、一度再結晶すれば実質上ＲＡを含まない高純度のＳＴ甘味料が得られる。或いは、当該抽出物を酵素処理することにより甘味質の改善されたＳＴ甘味料を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の第１の態様は、ＳＴ１００重量部に対してＲＡを多くとも８重量部しか含まないステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種である。このため、後述するように交配と選別を繰り返してＳＴ１００重量部に対してＲＡを多くとも８重量部しか含まないステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種に属する新たな植物体を創造し、特定のプライマーを用いたＤＮＡ解析によりにその品種を特定した。【０００８】
本発明の第２の態様は、ＳＴ１００重量部に対してＲＡを多くとも８重量部しか含まない高純度ＳＴ甘味料の製造方法であり、上記の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた粗生成物を再結晶する甘味料の製造方法である。【０００９】
本発明の第３の態様は、α−グルコシル化ステビオサイド甘味料の製造方法であって、上記の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出し、得られた粗生成物または該粗生成物の再結晶により得られた高純度ＳＴに例えばシクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼを作用させ、グルコースをα付加させる方法である。【００１０】
本発明の第４の態様は、糖鎖調整を行ったα−グルコシル化ステビオサイド甘味料の製造方法であって、上記第３の態様で得られる甘味料を例えばグルコアミラーゼのようなα−１，４−グルコシダーゼで処理し、付加する糖鎖を調製する方法である。【００１１】
本発明の第５の態様は、後述する如く特定のプライマーを用いたＲＡＰＤ(Random Amplified Polymorphic DNA；増幅断片多型ＤＮＡ)法によるＤＮＡ解析である。【００１２】
これら目的を達成するために本発明者らは交配と選別による品種改良を実施した。この場合、選別された品種の特定方法が重要な意味を持つ。前述のとおりステビアは自家不和合性が強いために特定された品種間での交配が重要で、本発明者らは、ＲＡＰＤ法によって、ＤＮＡ鑑定による品種の特定方法を検討した。
ＲＡＰＤ法はＤＮＡの解析手法の１つであり、複数のプライマーを用いてＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)を行うと、用いたプライマーと同一または類似の配列に挟まれたＤＮＡの領域が増幅されるので、その増幅されたＤＮＡのパターンを電気泳動で解析する方法である。また、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(ＣＴＡＢ：Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)は長鎖アルキル基をもつ第４級アンモニウム塩基であり、核酸のようなポリアニオンと不溶性の複合体を形成するために核酸の単離に利用することができる。【００１３】
ＤＮＡの違いにより品種識別する手段はＣＴＡＢにより植物体からゲノムＤＮＡを単離し、リボ核酸(ＲＮＡ)を除去し、プライマーミックスを用いてＰＣＲ法により得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって得られるＤＮＡフィンガープリントの違いにより区別する。本発明の植物体の場合、後述するように２１０ｂｐ上部に特徴的な塩基配列を示すことが確認された。
実際には、原料の植物体について、選択的に沈殿させたゲノムＤＮＡを雛型とし、プライマーとして例えば
順方向プライマー：ＣＡＣＧＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＧＡＣＣ
逆方向プライマー：ＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＡＴＣ
を用いて96℃10秒、65℃30分、72℃30秒35サイクル、さらに72℃で２分間反応させた。反応後、ＰＣＲ産物を6％変性ポリアクリルアミド電気泳動により分画し、SYBR Goldにより染色後、青色光トランスイルミネーターにて可視化した。その結果、供試した10品種では約190bpおよび210bpの位置に多型を示すバンドが検出され、Ｆ１タイプの遺伝子型が確認された。これらのバンドは再現性良く増幅されることを確認し、特定のＤＮＡバンドにより植物体が確認できる。【００１４】
甘味料の製造には、当該植物体および／またはその乾燥葉から水、または含水有機溶媒にて抽出し、次いで抽出液をそのまま濃縮するか、または必要に応じて陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、活性炭等でイオン性不純物を除去し、吸着樹脂に甘味成分を吸着させ親水性溶媒で溶離して，必要に応じて陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、活性炭等で処理し溶離液を濃縮、乾燥して甘味料が得られる。甘味料の製造方法はその他脱色等の慣用精製手段を適宣施すことが出来、高純度ＳＴを得る方法は膜分離、アルコール抽出、結晶化等の慣用手段を適宜施すことができる。また、結晶化の方法は結晶溶媒としてエタノール、メタノール等の有機溶媒に要すれば水を加えて、適宣使用することができる。得られた甘味料は他の天然、人工甘味料、希釈剤等を加えることもできる。【００１５】
得られた甘味料はキャンデー、ゼリー、飲料、粉末飲料、インスタント麺、ジャム、冷菓、チューインガム、和菓子、健康食品、チョコレート、卓状甘味料、焼き菓子、珍味，水練り食品、乳酸飲料、乳酸菌飲料、コーヒー飲料、ココア飲料、茶飲料、リキュール、ワイン、シャーベット、シリアル食品、植物繊維含有食品、ソース、醤油、味噌、食酢，ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、カレー、スープ、米菓、アラレ類、パン類、ビスケット、クラッカー、ホットケーキの素、果物缶詰、野菜缶詰、食肉製品、魚肉練り製品、塩性食品、漬物、複合調味料、嗜好性食品、化粧品などに使用することにより、カロリー低下、糖類削減、融点降下、甘味質改善、およびマスキング効果等が得られ、また他の甘草グリチルリチン、羅漢果、ソーマチン等の高甘味度天然甘味料、サイクラミン酸ソーダ、サッカリンナトリウム、アスパラテーム、スクラロース、ネオテーム等に人工甘味料、オリゴ糖類、糖アルコール類、糖類、デキストリンなどの希釈剤等をさらに添加することもできる。【００１６】
〔ＳＴを高濃度で含有する品種の育種過程〕
育種は従来ステビア品種の交配による選抜にて行い、まず、ＳＴを従来品よりも高濃度で含有する品種ＳＳを交配し、得られた種子から比較的ＳＴを多く含む品種ＳＳ−１を選択して、それらを更に人工的に交配し、得られた種子から、さらにＲＡの含有濃度の低い品種同士を交配し、ＳＴ１００重量部に対してＲＡを５重量部以下しか含まない品種を１０品種開発し、内１品種は耐寒性が悪いことから他の９品種をＦ１ＳＴ-１〜Ｆ１ＳＴ-９の高ＳＴ品種とした。
これら高ＳＴから得られた種子を播種し、植物体を育成してそれらから得られた乾燥葉を分析し、甘味成分が高ＳＴ品種と差がないことを確認し、その遺伝子を検索し、同一遺伝子を有する品種をＦ１ＳＴ品種とした。【００１７】
さらに出願人は、今回、本発明に係るＦ１ＳＴ品種より得られた種子について、既に国際寄託を完了した（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター：茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、２００７年７月１３日、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７０）。従って、その寄託に係るＦ１ＳＴ品種の種子から、容易に本発明の植物体を容易に入手することができる。ステビアは自家不和合性であり、種子から常に目的の植物体が得られるとは限らないとされていたが、本願に記載されたＤＮＡ鑑定に従って選別した品種による交配では常に目的とする植物体を得ることができる。
また必要ならば、他のステビア種と交配し、後記実施例１に準じて選別を行えば、ＳＴを高濃度で含有する植物体を極めて容易に入手することができる。これら植物体はすべて、国際寄託をしたＳＴ品種の種子から得られる植物体に含まれる。
【実施例】
【００１８】
以下に、育種過程およびその特性等を具体的に記載する。本発明は本育種過程、栽培方法に限定されるものでない。
実施例１
ＳＴを比較的高濃度に含有する品種の交配で得られた種子より、２００１年にＳＴ比較的高含有する品種を選抜し、守田化学工業(株)新見工場内ビニールハウス内で人工的にかけ合わせ、得られた種子を０２年３月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、５月上旬に苗丈８cm程度以上の苗５００本を工場内圃場に１０アール当たり窒素、リン、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間後に移植した。７月上旬に追肥として１０アール当たり窒素、リン、カリの肥料成分各１０kgを追肥した。【００１９】
９月上旬に調査し、その甘味成分を分析し、ＳＴ１００部に対してＲＡを３０部以下しか含まない株ＳＳ品種を選抜した。２００２年にＳＳ品種を新見工場内ビニールハウス内で人工的にかけ合わせ、得られた種子を２００３年３月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、５月上旬に苗丈７cm程度以上の苗３００本を工場内圃場に１０アール当たり窒素、リン、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間後に移植した。７月上旬に追肥として１０アール当たり窒素、リン、カリの肥料成分各１０kgを追肥した。【００２０】
９月上旬に調査し、その甘味成分を分析し、ＳＴ１００部に対してＲＡを１５重量部以下しか含まない株ＳＳ−１を選抜し、０３年にそれらを交配させて得られた種子を０４年３月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、５月上旬に苗丈７cm程度以上の苗３００本を工場内圃場に１０アール当たり窒素、リン、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間後に移植した。７月上旬に追肥として１０アール当たり窒素、リン、カリの肥料成分各１０kgを追肥した。【００２１】
９月上旬に調査し、その甘味成分を分析し、ＳＴ１００部に対してＲＡを８重量部以下しか含まない株９株をＦ1ＳＴ品種とし、２００４年にＦ１ＳＴ品種を交配して得られた種子を０５年３月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、５月上旬に苗丈７cm程度以上の苗１０００本を工場内圃場に１０アール当たり窒素、リン、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間後に移植した。７月上旬に追肥として１０アール当たり窒素、リン、カリの肥料成分各１０kgを追肥した。
９月上旬に全てを収穫し、その乾燥葉の甘味成分を分析し、ＳＴ１００部に対してＲＡを８重量部以下しか含まないことを確認した。【００２２】
比較試験１（５月）
ＳＴ品種との他品種ＳＮとの比較のために、２００６年３月にＦ１ＳＴ品種、ＳＮ品種から得られた種子各１５００粒を新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、５月上旬に生育の同程度の苗各４００本を工場内圃場に１０アール当たり窒素、リン、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間後に移植した。【００２３】
５月中旬にＦ1ＳＴ、ＳＮの各品種２００本の葉部を分離し、乾燥後分析試料とした。
甘味成分の測定は下記条件の高速液体クロマトグラフィーにより行った。
高速クロマトグラフィー分析方法
使用カラム    リクロソルブNH2  ５μ  ４ｍｍ×250ｍｍ
流速          １．５ｍｌ/分
展開溶媒      アセトニトリル：水＝82：18
測定波長      210nm
分析結果は次のとおりであった。
【表１】
2009093610.tif 000002
【００２４】
比較試験２（９月）
７月中旬に追肥を行い、９月上旬に各品種１５０本を地上部から刈り取った後、葉部を分離し、乾燥後平均甘味成分を測定し、分析試料とした。
分析結果は次のとおりであった。
【表２】
2009093610.tif 000003
Ｆ１ＳＴ、ＳＮ品種は生育につれて甘味成分含量が増える傾向が見られたが、Ｆ１ＳＴ品種ではＲＡの含量に大きな増加は見られなかった。【００２５】
遺伝子塩基配列の特定
＜ＤＮＡ抽出＞  
ＤＮＡ抽出はＣＴＡＢ法により行い、各サンプルより採取した葉、約0.2ｇを乳鉢中で液体窒素により凍結し、乳棒にて粉砕した。粉砕したサンプルは1.5mlマイクロチューブ中で0.5mlの２％ＣＴＡＢ溶液（100mM Tris-HCl pH 8.0, 20mM EDTA pH 8.0, 2% CTAB, 1.4M NaCl, 1% PVP）と混和し、65℃で30分インキュベートした。0.5mlのクロロホルム/イソアミルアルコール（24：1）を加え、10分間撹拌した後、15000rpmで15分遠心分離し、水層を別の1.5mlマイクロチューブに移した。さら等量の100％イソプロパノールを加え、15000rpmで15分遠心分離し、沈殿を75％エタノールでリンスした後、乾燥させ400μlのTEバッファーで溶解した。RNase溶液（1mg/ml）を1μl加え、37℃で1時間インキュベートしたのち、等量のTE飽和フェノールを加え混和してから15000rpmで30分間遠心分離した。水層を別のマイクロチューブに移し1/10量の3Ｍ酢酸ナトリウムと等量のイソプロパノールを加え、混和し15000rpmで30分間遠心分離した。得られた沈殿を75％エタノールで2回リンスしたのち乾燥させ50μlのTEバッファーに溶解しDNAサンプルとした。【００２６】
＜ＰＣＲ分析＞
得られたDNAサンプルを鋳型として下記の反応液組成にてPCR反応を行った。PCRサイクルは96℃で30秒反応させた後、96℃10秒、65℃30分、72℃30秒35サイクル、さらに72℃で2分反応させた。反応後、PCR産物は6％変性ポリアクリルアミド電気泳動により分画し、SYBR Goldにより染色後、青色光トランスイルミネーターにて可視化した。その結果、供試した10品種では約190bpおよび210bpの位置に多型を示すバンドが検出され、Ｆ１ＳＴタイプの遺伝子型が確認された。これらのバンドは再現性良く増幅されることを確認しており、識別マーカーとして有効である。【００２７】
2009093610.tif 000004
【００２８】
実施例２  高純度ＳＴ甘味料の製造
（１）抽出
５月および９月にＦ１ＳＴ１〜９品種から得られた乾燥葉各２ｇをそれぞれ混合して１８ｇとし、２０倍量の水で甘味が感じられなくなるまで数回抽出した。陰イオン交換樹脂(デュオライトＡ−４)２０ml、および粒状活性炭５mlを充填したカラムに通液し、次いで通過液を吸着樹脂(ダイヤイオンＨＰ−２０)１００mlを充填したカラムに通して甘味成分を吸着させ、十分水洗後メタノール３００mlで溶離した。溶離液を減圧下に濃縮し、乾燥して淡黄白色の粉末を得た。
（２）再結晶
上記の抽出精製物（Ｆ１ＳＴ品種５月、９月）各１０ｇを１０倍量の９５％メタノールに加熱溶解した後に、４℃に６日間冷却放置し、得られた結晶を分離し、冷メタノールで洗浄後、減圧乾燥し、白色の結晶７．５ｇおよび７．４ｇを得た。
比較のためにＳＮからも同様の処理をしてそれぞれ白色の結晶(ＳＮ-ＣＲＹ)４．６ｇを得、高速液体クロマトグラフィー（条件は実施例１と同様）でこれを分析した。【００２９】
表３に抽出精製物の分析結果を示す。表中のＳＴはステビオサイド、ＲＡはレバウディオサイドＡである。
【表３】
2009093610.tif 000005
本発明のＦ１ＳＴ１〜９品種より得られたＳＴを一度再結晶するだけで、実質上ＲＡを含まない高純度のＳＴ甘味料が得られた。【００３０】
官能試験１
実施例２で得られたＦ１ＳＴ５月およびＳＮ−ＣＲＹの粉末の各０.０２％溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラー１０人により苦み、渋み、および甘味質を比較した。
【表４】
2009093610.tif 000006
各試料において苦味、渋みに大きな差は無いが、Ｆ１ＳＴ品種は、味質の切れが他の試料より改善されていることが分かる。【００３１】
実施例３  α−グルコシルステビオサイド甘味料の製造
実施例２に準じて得られたＦ１ＳＴ９月、実施例３で得られた粉末の各４ｇとα−グルコシル糖化物としてＤＥ（デンプン分解率）：１０のデキストリン８ｇを水２０ｍｌに加熱溶解した後、７０℃に冷却し、塩化カルシウムを基質総量に対して１mmolとなる様に添加すると共に、ｐＨを６．０に調整して、シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼを１００単位加え、温度７０℃で２４時間反応させた。その後、各反応液を９５℃に３０分間保持して酵素を加熱失活させた。【００３２】
各反応液を濾過して浮遊物を除去した後、それぞれ濾液を合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ-２０を１００ｍｌ充填したカラムに通し、十分に水洗を行った後、メタノール３００ｍｌで溶離した。溶離液を、陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９４）を充填したカラムに通し、脱塩、脱色を行った後、減圧下で濃縮、乾燥してα―グルコシルステビオサイドである酵素処理α−Ｆ１ＳＴを２.６ｇおよび酵素処理α−Ｆ１ＳＴ-ＣＲＹを２．５ｇ、それぞれ白色粉末として得た。【００３３】
実施例４  付加糖鎖の調整
実施例３の酵素処理α−Ｆ１ＳＴと酵素処理α−Ｆ１ＳＴ-ＣＲＹ各１ｇに市販のグルコアミラーゼ〔グルコチーム長瀬産業(株)製〕を固形分に対して１％添加し、温度５０℃で５時間反応させた。反応後、９５℃に３０分間加熱して酵素を失活させた。各反応液を濾過して浮遊物を除去した後、濾液をそれぞれ、合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ-２０を１００ｍｌ充填したカラムに通し、十分に水洗を行った後、メタノール３００ｍｌで溶離した。溶離液は陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９４）を充填したカラムに通し、脱塩、脱色を行った後、減圧下で濃縮、乾燥して付加糖鎖調整済みα−Ｆ１ＳＴを０．７ｇ、および付加糖鎖調整済みα−Ｆ１ＳＴ-ＣＲＹを０．６ｇ、それぞれ白色粉末として得た。
比較試験として実施例２で得られたＦ１ＳＮ品種から得られた淡黄白色の粉末を同様に酵素処理α−ＳＮ．さらに糖鎖調整して付加糖鎖調整α−ＳＮ-ＣＲＹを得た。【００３４】
官能試験２
官能試験１と同様にして、酵素処理α−Ｆ１ＳＴと酵素処理α−ＳＮの甘味質を比較した。
【表５】
2009093610.tif 000007
本発明のステビア新品種より得られるＳＴはその純度が高いので、α−グルコシル化を行うことにより後味および甘味質が改善される。【００３５】
官能試験３
官能試験１と同様にして、糖鎖調整α−ＳＴ-ＣＲＹと糖鎖調整α−ＳＮ-ＣＲＹの甘味質を比較した。
【表６】
2009093610.tif 000008
本発明のステビア新品種より得られるＳＴはその純度が高いので、α−グルコシル化および糖鎖調整をすることにより、雑味がなく、後味および甘味質が改善されたＳＴ甘味料を与える。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のステビア・レバウディアナ・ベルトニー新品種はＲＡの含量が低くＳＴの含量が高いので、これを育成して得られる乾燥葉から各種の好適なステビオサイド甘味料を製造することができる。
【配列表】
2009093610000001.app
【国際調査報告】
2009093610.tif 000009
2009093610.tif 000010
2009093610.tif 000011
2009093610.tif 000012