(57)【要約】水溶液を用いてファセオラス種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｓｐ．）から抽出して得ることができる抽出物であって、１８００ＵＳＰ／ｍｇ以上（ＨＰＬＣ滴定量１５重量％以上）の活性のα−アミラーゼ阻害物質含量と、１５００〜６０００ＨＡＵ／ｇのフィトヘマグルチニン含量を特徴とする抽出物、およびその調製方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液でファセオラス種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｓｐ．）を抽出して得ることができる抽出物であって、１８００ＵＳＰ／ｍｇ以上（ＨＰＬＣ滴定量１５重量％以上）の活性のα−アミラーゼ阻害物質含量と、１５００〜６０００ＨＡＵ／ｇのフィトヘマグルチニン含量を特徴とする抽出物。
【請求項２】
請求項１に記載の抽出物を調製する方法であって、
ａ）ｐＨが３〜６．５の範囲である水性緩衝剤でファセオラス種を抽出し、続いて、バイオマスから抽出物を分離し、これは必要に応じてα−アミラーゼ阻害物質およびフィトヘマグルチニンが使い尽くされるまで緩衝剤でさらに抽出することができ；
ｂ）併せた抽出物を濾過または遠心分離し、遠心分離後の抽出物の重量の約１０％に相当する体積まで濃縮し、
ｃ）濃縮水性抽出物を、最終アルコール濃度を４０〜５０体積％として希エタノールで分画沈澱（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させ、
ｄ）フィトヘマグルチニンに富む沈澱を分離し、濾液または遠心分離物をエタノールで、アルコール濃度６０〜７０％までさらに希釈し、
ｅ）沈澱を分離しおよび脱塩水から６０％エタノールを用いて再沈澱または１００００Ｄａカットオフの膜を通してダイアフィルトレーションし、沈澱残渣を乾燥する
ことを含む方法。
【請求項３】
燐酸塩、クエン酸塩または酢酸塩緩衝剤、あるいはジカルボン酸アミノ酸緩衝剤を用いる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
食欲抑制剤を調製するための請求項１に記載の抽出物の使用。
【請求項５】
請求項１に記載の抽出物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の概要）
本発明は、ファセオラス属（ｇｅｎｕｓ  Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）の植物の種子から得られる抽出物、およびその調製方法に関する。
【０００２】
より詳しくは、本発明は、食事中の澱粉から生じるグルコースの吸収を減少させると共に繰り返し投与後に食欲を低減させるような確立された比率でα−アミラーゼ阻害物質とフィトヘマグルチニンとを含むことを特徴とする、ファセオラス・ブルガリス種子の抽出物に関する。
【背景技術】
【０００３】
α−アミラーゼ阻害物質（αＡＩ）は、動物起源のアミラーゼ、特にヒトアミラーゼの酵素的活性を示差的種依存的に抑制する、インゲンマメ（ファセオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））の種子に含まれる糖タンパクである。この阻害物質は、ＭａｒｓｈａｌｌおよびＬａｕｄａにより１９７４年（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０（２０），８０３０−８０３７，１９７５）に初めて精製されたものであり、その膵アミラーゼ阻害活性がグルコース（澱粉の酵素的加水分解から誘導）の腸での吸収に対して発揮し得る効果、特に、食事産業におけるその適用可能性故に、注目を集めた。炭水化物は、カロリーの重要な供給源であり、肥満またはＩＩ型糖尿病にかかりやすい個体において脂肪の合成の原因となるものである。天然には、種の発生の頃には、生存のための食事の入手性は断続的であったため、即時使用に必用な量を超えるエネルギーを蓄積する能力が必須であった。身体の異なる部位において発生する脂肪細胞は、エネルギーが蓄積される部位に含まれるので、身体が必要とするときに容易に利用することができる。内分泌およびニューロン分泌により調整されるこの生理的系により、ヒトは、食物の不存在下でも長期間生き延びることが可能となる。しかしながら、食物が豊富な場合、座りがちな生活様式の場合、および先進工業国の生活様式に係わる遺伝的理由がある場合、この系は、美的損失および、その後の心臓循環系の過負荷のような悪い結果を伴う脂肪エネルギーの蓄積を、制御不能に増加させる。主な問題の一つは、米国のような一部の国において高水準に達している肥満である。肥満は、心臓血管疾患、高血圧および糖尿病の主な原因である。男性と女性の両方において一般的である体重過剰は、より多くの量の食物を食べることにつながり、その結果、健康を損なうことになる。過剰血糖はエネルギー蓄積を増加させるので、グルコースの吸収を低減させる物質を入手できることが非常に重要である。
【０００４】
抗肥満物質が世界的に必用とされているので、体重の増加に対抗する食物が調査および研究されるようになった。
【０００５】
異なるマメ科植物およびトウモロコシにおいてα−アミラーゼ阻害物質が古くから確認されており、近年、特異的臨床試験が行われ、種々の結果を得ている。多くの市販製剤が生体内での効果的な活性を欠くと証明されたように、これらの阻害物質の濃縮および単離に用いられる調製プロセス次第で、結果が矛盾したものとなった。Ｌａｙｅｒ、ＣａｒｌｓｏｎおよびＤｉ  Ｍａｇｎｏの最初の研究（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８８（６）：１８９５，１９０２，１９８５）によれば、この問題は、高度に不純な製剤中での阻害剤の高度の希釈が原因であるらしく、実際、精製された阻害剤の調製物は、腸管腔に直接導入されるとα−アミラーゼに対して活性であるとわかっている。
【０００６】
一部の種子およびマメ科植物は、完全に調理される前に食べると、毒性であるまたは正常な食事を低下させ得る物質を含むことが古くから知られている。実際には、α−アミラーゼ阻害物質は、抽出物中に単独で存在するのではなく、インゲン豆において、常に、毒性であると考えられる大量のフィトヘマグルチニンを伴うものである。フィトヘマグルチニンの毒性は、通常、それらが天然に存在する量において高い。フィトヘマグルチニンは、α−アミラーゼ阻害物質と同様に糖タンパクであり、過形成および肥大を引き起こし、高投与量において膵臓機能を高める。フィトヘマグルチニンは、比較的高い投与量において膵臓の腫脹を引き起こす、すなわち、ポリアミン蓄積および酵素分泌を増加させることが知られている。これらの糖タンパクは、腸管輸送を切りぬけ腸細胞に結合し、そこで、膵臓分泌を刺激する栄養ホルモンであるコレシストキニンの分泌を誘発する。膵臓および腸へのこれらの望ましくないと思われる効果とは別に、コレシストキニンは、食欲を阻害する、すなわち、肥満の低減のための生命的特性も奏する。
【０００７】
α−アミラーゼ阻害物質の調製のための文献に記載されている断片的プロセスは、燐酸塩緩衝剤を用いた抽出、および硫酸アンモニウムを用いたタンパクの不溶化を含み、いかなる選択性も示しておらず、得られる抽出物は、高濃度のフィトヘマグルチニンを含み、許容できる程度の毒性を有する抽出物を得るためには希釈しなくてはならない。生物学的局面とは別に、既知のプロセスは、活性かつ安全である生成物を調製することを困難にする幾つかの段階を含む。異なるイオン強度およびｐＨの緩衝剤での抽出中に生じる問題は、タンパクおよび多糖類汚染物質の高い濃度が原因であり、これにより、粘性が高くなり、その結果、濾過性の低下および長い加工時間の問題が生じる。これらは水性抽出液であるので、タンパク抽出物が微生物で汚染される高度の危険性もあり、これは、特に高粘性製剤の場合に制御困難である。これらの全ての条件により、生成物が損失し、フィトヘマグルチニン含量が少なくそれに対応して複数の成分が標準化されている最終抽出物を得ることが困難になる。フィトヘマグルチニンを制限する問題を解決するための種々のプロセスが用いられてきており、これらには熱処理があり、熱処理によりフィトヘマグルチニンのみならずα−アミラーゼ阻害物質も分解され、その結果、得られた生成物はほとんど活性がない。実際には、市場での製品は、αＡＩ含量が非常に低い。α−アミラーゼ阻害物質が豊富過ぎる他の生成物は、多量の投与した場合に、鼓腸の不快な問題を生じる。
【発明の開示】
【０００８】
驚くべきことに、フィトヘマグルチニン含量が完全に寛容され得る制限範囲内でありα−アミラーゼ阻害物質に富む生成物を調製することにより、投与された量に比例した体重減量を得ることができることが発見された。ラットでのデータは、体重減量への効果が、血漿グルコース値の低下のみならず、食物消費の顕著な低下にも関わることを示している。種々の薬理学的実験が、食物を自由に摂取できる状態であるのにこのように食物摂取が低下することが、毒性効果には関わらず、食べる欲求の変化に関わることを示している。最初に動物について、続いてヒトについて行われた長い一連の実験が、望ましくない副作用を引き起こすことなく体重減少の原因となる成分間の適切なバランスを取ることを可能とした。
【０００９】
本発明の生成物は、水性抽出および、その後の、エタノールと水との適当な混合物を用いた分別沈澱により調製される。
【００１０】
本発明の方法は、エタノールと水との混合物を使用し、また、所望の結果を得るために充分に低い投与量で食事用の生成物中に調製することができるように、その活性が１８００ＵＳＰ／ｍｇ以上（ＨＰＬＣ滴定量１５重量％以上）であるようにα−アミラーゼ阻害物質に富み、フィトヘマグルチニン含量が１５００〜６０００ＨＡＵ／ｇである抽出物を提供する。この主要な利点に加えて、本発明の方法は、微生物数を著しく減少させる。もう一つの主要な利点は、出発抽出物中に含まれる主要成分の完全な分離、およびその結果として、阻害剤（αＡＩ）に高度に富みフィトヘマグルチニンの比率が限定されている最終生成物を得る可能性である。
【００１１】
本発明の方法は、ｐＨが３〜６．５、好ましくは３．５〜５．５、より好ましくは４である緩衝剤を用いて２〜２５℃、好ましくは４〜１８℃でバイオマスを抽出し、続いて、遠心分離によりバイオマスから抽出物を分離することを含む。
【００１２】
抽出のための適当な緩衝剤は、典型的には、燐酸塩、クエン酸塩または酢酸塩緩衝剤、あるいはジカルボン酸アミノ酸緩衝剤、好ましくは燐酸塩またはクエン酸塩緩衝剤である。
【００１３】
用いられた抽出剤および抽出サイクルに依存して、出発材料１部当たり５〜２０体積、好ましくは１０〜１２．５部の緩衝剤を用い、混合物を１〜４時間、好ましくは２時間攪拌し、バイオマスを、適当な量の緩衝剤でさらに３回抽出することができ、いずれの場合にも、そのα−アミラーゼ阻害物質およびフィトヘマグルチニン内容物が使い尽くされるまで抽出する。
【００１４】
併せた抽出物を、濾過または遠心分離により清澄化し、２５〜３５℃、好ましくは３０℃の温度で減圧下に、または、限外濾過（１００００Ｄａカットオフ）により、遠心分離後の抽出物の重量の約１０％に相当する体積まで濃縮する。
【００１５】
次の工程は、濃縮された水性抽出物を、最終濃度４０〜５０体積％、好ましくは４５体積％として希エタノールを用いて１８〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の温度で操作して分画沈澱（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させることである。フィトヘマグルチニンに富む沈澱を分離し、濾液をさらに、エタノールで、６０〜７０％、好ましくは６５％のアルコール濃度まで希釈する。
【００１６】
得られた沈澱を、遠心分離および／または濾過、脱塩水に再溶解、および６０％エタノール中で再沈澱させて塩類部分を減少させることができる。あるいは、１００００Ｄａカットオフの膜を通してダイアフィルトレーションすることができる。本発明による抽出物を構成する沈澱の沈降物を乾燥する。
【００１７】
これらのプロセスを用いると、以下の特性を有する抽出物を得ることができる。
【００１８】
ＨＰＬＣ滴定量：１５重量％以上
α−アミラーゼ阻害活性：１８００ＵＳＰ／ｍｇ以上
血球凝集活性：１５００ＨＡＵ／ｇ以上６０００ＨＡＵ／ｇ以下
これらの抽出物の効果が、特別澱粉豊富食からなる食物を自由に食べさせたラットにおいて証明された。一定温度２２±２℃および湿度６０％で個別にケージに入れられたウィスターラットを、８〜９匹の動物からなる群に分け、以下のパターンに従う日用量で５日間、胃プローブで処理した。
【００１９】
第１群：ビヒクル（０．５％メチルセルロース、４ｍｌ／ｋｇ）
第２群：実施例２に記載の抽出物３００ｍｇ／ｋｇ
食物消費を、日毎のセッションの終了直後にペレットを秤量（誤差０．１ｇ）することにより記録した。体重を、各処理の直前に一日一回記録した。処理全体を通して食物消費および体重を記録した。ＡＮＯＶＡテストを用いて統計的分析を行った。
【００２０】
【表１】
2009520715.tif 000002
【００２１】
処理中、実施例２に記載の抽出物は、食物消費を低下させるが、水消費は変わらないままである。
【００２２】
処理の停止後５日間、全ての群について、食物消費は均一であり正常範囲（表１の対照群に対する値）であった。
【００２３】
表２に、処理中の体重増加データを示す。
【００２４】
【表２】
2009520715.tif 000003
【００２５】
本発明の生成物は完全に寛容され、夕食で摂取するためには、１００〜１０００ｍｇの範囲の量で薬剤または食事製剤に混入することができる。抽出物は、食欲抑制剤として摂取するためには、飲用型などとして混入することができる。
【実施例】
【００２６】
以下の実施例により、本発明の製剤および利点を説明する。
【００２７】
（実施例１）
（リン酸緩衝剤で抽出しエタノールで選択的沈澱させることにより得られるαＡＩに富むインゲン豆抽出物の調製）
ｐＨ４．２のリン酸緩衝剤４．９Ｌ中にインゲン豆粉４９０ｇを含む懸濁液を、＋２２℃で１時間攪拌した。
【００２８】
懸濁液を遠心分離し、水性遠心分離物を紙上で清澄化後、抽出された材料に相当する重量まで濃縮した。濃縮物を９５％エタノールを用いて、エタノール４５％の濃度に希釈して沈澱（フィトヘマグルチニンおよび使用に適さないタンパクに富む）を得、それを＋２５℃で遠心分離することにより分離し、廃棄した。遠心分離された液体を、さらに、９５％エタノールを用いて濃度６５％に希釈して沈澱を得、それを、遠心分離および６５％エタノールでの洗浄後、５０℃を超えない温度で減圧下に乾燥した。得られた生成物（収率：１．２％）は、α−アミラーゼ阻害活性が４２００Ｕ／ｍｇであり、血球凝集活性が３５００ＨＡＵ／ｇ（ＨＰＬＣ滴定量が３５．６重量％）である。
【００２９】
（実施例２）
（クエン酸緩衝剤で抽出しエタノールで選択的沈澱させることにより得られるαＡＩに富むインゲン豆抽出物の調製）
クエン酸（５．７５ｇ／Ｌ）１．０Ｌ中にインゲン豆粉１００ｇを含む懸濁液を、＋４℃で４時間攪拌した。
【００３０】
懸濁液を遠心分離し、水性遠心分離物を７．６倍に濃縮した（乾燥残渣：１５．８重量％）。濃縮物を９５％エタノールを用いて、エタノール４５％の濃度に希釈して沈澱（フィトヘマグルチニンおよび使用に適さないタンパクに富む）を得、それを＋２５℃で遠心分離することにより分離し、廃棄した。遠心分離された液体を、さらに、９５％エタノールを用いて濃度６５％に希釈して沈澱を得、それを、遠心分離後、５０℃を超えない温度で減圧下に乾燥した。得られた生成物（収率：１．５９％）は、α−アミラーゼ阻害活性が２２００Ｕ／ｍｇであり、血球凝集活性が１８００ＨＡＵ／ｇおよびＨＰＬＣ滴定量が１７．８重量％である。
【００３１】
（実施例３）
（クエン酸緩衝剤で抽出しエタノールで沈澱させることにより得られるαＡＩに富むインゲン豆抽出物の調製）
クエン酸（５．７５ｇ／Ｌ）１．２Ｌ中にインゲン豆粉１２０ｇを含む懸濁液を、＋４℃で２時間攪拌した。
【００３２】
懸濁液を遠心分離し、水性遠心分離物を６．８倍に濃縮した（乾燥残渣：１０．０重量％）。濃縮物を９５％エタノールを用いて、エタノール４５％の濃度に希釈して沈澱（フィトヘマグルチニンおよび使用に適さないタンパクに富む）を得、それを＋２５℃で遠心分離することにより分離し、廃棄した。遠心分離された液体を、さらに、９５％エタノールを用いて濃度６５％に希釈して沈澱を得、それを、遠心分離後、５０℃を超えない温度で減圧下に乾燥した。得られた生成物（収率：０．８５％）は、α−アミラーゼ阻害活性が３６５０Ｕ／ｍｇであり、血球凝集活性が１９００ＨＡＵ／ｇおよびＨＰＬＣ滴定量が３４．３重量％である。
【国際調査報告】
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