(57)【要約】膜タンパク質を、その局在や機能に影響を与えることなく、細胞膜上に発現させて簡便かつ迅速に検出する方法を提供する。  コイルドコイル２量体を形成する１対のαへリックスペプチドのうち、陰性コイルペプチドを目的膜タンパク質に融合させてタグとし、コイルドコイル２量体を形成する１対のαへリックスペプチドのもう一方のペプチド、陽性コイルペプチドを蛍光色素に結合させてプローブとすることで、目的膜タンパク質と蛍光色素を特異的に結合させ、簡便かつ迅速に該膜タンパク質を検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コイルドコイルを形成し得る陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質を、陰性コイルペプチドが細胞外側に位置するように発現した形質転換体に、コイルドコイルを形成し得る陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブを作用させ；
（ここで、
前記コイルドコイルは、αへリックス構造を有する陰性コイルペプチドとαへリックス構造を有する陽性コイルペプチドからなる２量体コイルドコイルであり；
前記陰性コイルペプチドは、αへリックスの７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇにおいて、生理的ｐＨでｅ及びｇが負に帯電したアミノ酸、ａ及びｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸、ｂ、ｃ及びｆが任意のアミノ酸であって、全体として生理的ｐＨで負に帯電しているαへリックスペプチドであり；
前記陽性コイルペプチドは、αへリックスの７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇにおいて、生理的ｐＨでｅ及びｇが正に帯電したアミノ酸、ａ及びｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸、ｂ、ｃ及びｆが任意のアミノ酸であって、全体として生理的ｐＨで正に帯電しているαへリックスペプチドであり、
前記形質転換体は哺乳類由来細胞又は酵母を形質転換したものである）
当該形質転換体の膜上に存在する該膜タンパク質を検出する方法。
【請求項２】
さらに、陰性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｆが生理的ｐＨで正に帯電したアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、陽性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｆが生理的ｐＨで負に帯電したアミノ酸である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、陰性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｅ及びｇがグルタミン酸である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
さらに、陽性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｅ及びｇがリジンである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
さらに、陰性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｆがリジンである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
さらに、陽性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｆがグルタミン酸である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
陰性コイルペプチドが、１４から１４０アミノ酸残基からなる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
陽性コイルペプチドが、１４から１４０アミノ酸残基からなる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
陰性コイルペプチドが、配列番号３もしくは４の配列からなる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
陽性コイルペプチドが、配列番号１もしくは２の配列からなる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、陰性コイルペプチドが１〜３０アミノ酸残基よりなるリンカーを介して膜タンパク質に融合した、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、蛍光プローブが、陽性コイルペプチドが１〜３０アミノ酸残基よりなるリンカーを介して蛍光分子に結合した蛍光プローブである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
陽性コイルペプチドに蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のためのドナー蛍光分子を結合させた蛍光プローブと、陽性コイルペプチドにＦＲＥＴのための当該ドナー蛍光分子に対応するアクセプター蛍光分子を結合させた蛍光プローブの、２種類の蛍光プローブを同時に形質転換体に作用させ、陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質が２量体を形成し得るかをＦＲＥＴにより検出する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
形質転換体に、陰性コイルペプチドを融合した２種類の膜タンパク質を発現させ、当該２種類の膜タンパク質が２量体を形成し得るかを検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
膜タンパク質が、膜貫通型受容体タンパク質である、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
膜貫通型受容体タンパク質が、ＧＰＣＲである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
蛍光分子が、Ａｌｅｘａ、ローダミン、フルオレセイン、Ｂｏｄｉｐｙ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｒ６Ｇ、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＥＤＡＮＳ、Ｄａｂｃｙｌ、ＳＮＡＲＦ、ＮＢＤ、ピレン、クマリンからなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
形質転換体が、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３、ＣＯＳ−７、ＰＣ１２細胞からなる群より選択される哺乳類由来細胞を形質転換したものである、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法用の陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質をコードする、遺伝子構築物又はベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の遺伝子構築物又はベクターが導入され、陰性コイルペプチドが細胞外側に位置するよう、陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質を発現した形質転換体。
【請求項２２】
請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法により膜貫通型受容体タンパク質を検出した後に、該膜貫通型受容体タンパク質のシグナル応答を指標としてリガンドとなる物質をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
細胞内カルシウムイオン濃度変化をシグナル応答の指標とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法により膜貫通型受容体タンパク質を検出した後に、さらに該膜貫通型受容体タンパク質にリガンドを作用させることで、該膜貫通型受容体タンパク質が細胞内に取り込まれることを検出する方法。
【請求項２５】
請求項１３から１９のいずれか１項に記載の方法により、細胞外側に陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質を発現した形質転換体に、陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブを作用させ、陰性コイルペプチドと陽性コイルペプチドがコイルドコイルを形成した後に、当該両コイルペプチドを化学的手法により架橋してコイルドコイルをさらに安定化する方法。
【請求項２６】
架橋のためのリンカーとして用いられる化合物が、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の方法により、コイルドコイルを安定化した後、さらに当該両コイルペプチドの架橋に寄与しないペプチド部分を切断し、コイルドコイルの大きさを小さくする方法。
【請求項２８】
ペプチド部分の切断が、プロテアーゼを用いて行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
プロテアーゼがＦａｃｔｏｒ  Ｘａである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２５又は２６に記載の方法において、陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブに代えて、陽性コイルペプチドに固体支持体を結合させたものを使用し、陰性コイルペプチドと陽性コイルペプチドがコイルドコイルを形成した後に、当該両コイルペプチドを化学的手法により架橋してコイルドコイルをさらに安定化させ、当該固体支持体を形質転換体から引き離すことにより細胞膜から膜タンパク質を分離させ、当該膜タンパク質及びそれに付着した分子を質量分析装置で解析することで、当該膜タンパク質に付着した分子を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質の細胞内局在及び機能を研究するための方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞膜上で発現したタグ融合膜タンパク質を標識、解析する方法に関する。さらに、本発明は前記タグ融合膜タンパク質をコードする遺伝子構築物及びベクター並びにこれらを導入した形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞に発現しているタンパク質の細胞内局在や機能を研究するうえで、蛍光イメージングは非常に重要な手法である。これまでに、特定のタンパク質だけを蛍光標識する手法として、目的とするタンパク質と例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）といった蛍光タンパク質を遺伝子レベルで融合させて発現させる方法が開発され、現在頻繁に使用されている。しかしながら、蛍光タンパク質の分子サイズは比較的大きく（ＧＦＰで２３８アミノ酸残基；分子量約２６．９  ｋＤａ）、融合するタンパク質本来の局在や機能に大きく影響することがしばしばある。また、蛍光タンパク質は、化学合成による蛍光色素ほど、蛍光団を自由に選ぶことはできない。すなわち蛍光色素の吸収や発光の波長特性、明るさ、安定性、またタンパク質周囲の環境（ｐＨ、極性、イオン組成）の変化に対する応答性などに対して、選択肢が限られる。共焦点レーザー顕微鏡をはじめとする顕微鏡技術の進歩が著しい現在、生細胞でのタンパク質の構造変化やタンパク質間相互作用をより精度よく定量的に可視化したいという要望は高まっており、蛍光ラベルの小分子化および色素選択肢の拡大は重要な課題である。【０００３】
一方、タンパク質に合成蛍光色素などの化学物質を標識する方法は、これまで主として精製したタンパク質のシステインやリジン残基などへの修飾に限られていた。しかし近年、生細胞においても、特定のタンパク質を選択的に標識する小分子ラベル法が開発されてきている。このような小分子ラベル法では、目的のタンパク質に６−２００残基程度のアミノ酸配列（タグ配列）を融合させて発現させ、外部からタグ配列に特異的に結合する蛍光ラベル分子（プローブ）を加え、標識を行う方法を基本とする。当該方法は、上記の蛍光タンパク質を融合させる方法に比べ、目的タンパク質に融合させる分子（タグ）のサイズが一般に小さくすみ、また合成蛍光色素を利用できるために色素選択肢も拡大する。このため、目的タンパク質本来の局在や機能への影響が比較的小さく、複数の蛍光色素の使用やＦＲＥＴを利用した解析も可能であり、大いに注目されている。
ラベル化原理としては、大きく分けて１）既知の分子間相互作用を用いるもの（非特許文献１、２及び３）、２）既知の酵素反応を利用するもの（非特許文献４、５及び６）、が報告されている。しかしこれらの手法においても、１）では、タグとして働くアミノ酸配列と金属イオン間の複合体形成を利用するものが多く、特にこの金属イオンが細胞にとって毒性を持ち、問題となる場合がある。また２）の酵素反応を利用する方法では、ラベル化に時間がかかる（典型的には  ３０分前後）うえに、蛍光ラベル基質を個別に加えなければならないという欠点がある。【０００４】
このように、目的とするタンパク質本来の局在及び機能に影響せず、細胞毒性が少なく、短時間でラベル化が可能である簡便な生細胞蛍光標識法は開発されていないのが現状であり、特に膜タンパク質においては、標識のための様々な処理を行うことで、膜に局在しなくなったり、局在したとしても本来の機能を有さないおそれがある。【０００５】
特に、創薬において重要なターゲットの１つである、膜貫通型受容体タンパク質を簡便に標識して視覚的に確認する標識方法の開発は、待ち望まれていた。【０００６】
これまで、興味ある膜貫通型受容体タンパク質（例えばＧＰＣＲ）と結合するリガンドを探索するため、興味ある膜貫通型受容体タンパク質又は膜貫通型受容体タンパク質と予測されるタンパク質を発現させた形質転換体に様々な分子を作用させ、その応答を検出するという手法が用いられてきた。しかし、この方法では、膜貫通型受容体タンパク質又は膜貫通型受容体タンパク質と予測されるタンパク質が形質転換体の膜上に実際に発現しているか否か確認できず、検出された応答が目的とする興味ある膜貫通型受容体タンパク質を介したものかどうかは不明確であった。また、この問題を解決するため、目的とする興味あるタンパク質に蛍光タンパク質又は合成蛍光色素を結合させ、タンパク質が膜に局在することを確認する試みもなされてきた。しかし、上述したように、これらの手法はいずれも膜貫通型受容体タンパク質の局在及び機能に影響する、あるいは細胞毒性を有するといった、問題を抱えている。
【非特許文献１】Ｂ．  Ａ．  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｓ．  Ｒ．  Ａｄａｍｓ，  Ｒ．  Ｙ．  Ｔｓｉｅｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８１，  ２６９  （１９９８）．
【非特許文献２】Ａ．  Ｏｊｉｄａ，  Ｋ．  Ｈｏｎｄａ，  Ｄ．  Ｓｈｉｎｍｉ，  Ｓ．  Ｋｉｙｏｎａｋａ，  Ｙ．  Ｍｏｒｉ，  Ｉ．  Ｈａｍａｃｈｉ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２８，  １０４５２  （２００６）．
【非特許文献３】Ｃ．  Ｔ．  Ｈａｕｓｅｒ，  Ｒ．  Ｙ．  Ｔｓｉｅｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０４，  ３６９３  （２００７）．
【非特許文献４】Ｂ．  Ｈ．  Ｍｅｙｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｅｇｕｒａ，  Ｋ．  Ｌ．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｒ．  Ｈｏｖｉｕｓ，  Ｎ．  Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｋ．  Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｈ．  Ｖｏｇｅｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０３，  ２１３８  （２００６）．
【非特許文献５】Ｉ．  Ｃｈｅｎ，  Ｍ．  Ｈｏｗａｒｔｈ，  Ｗ．  Ｌｉｎ，  Ａ．  Ｙ．  Ｔｉｎｇ，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２，  ９９  （２００５）．
【非特許文献６】Ｃ．  Ｗ．  Ｌｉｎ，  Ａ．  Ｙ．  Ｔｉｎｇ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２８，  ４５４２  （２００６）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、膜タンパク質又は膜タンパク質と予測されるタンパク質を、その局在や機能に影響を与えることなく、細胞膜上に発現させて簡便かつ迅速に検出する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、タンパク質間相互作用様式の１つであるコイルドコイルに着目して鋭意研究を重ねた結果、コイルドコイル２量体を利用した膜タンパク質標識方法により、上記課題を解決できることを見いだした。すなわち、コイルドコイル２量体を形成する１対のαへリックスペプチドのうち、陰性コイルペプチド（αへリックスの７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇにおいて、生理的ｐＨでｅ及びｇが負に帯電したアミノ酸、ａ及びｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸であって、全体として生理的ｐＨで負に帯電しているαへリックスペプチド）を目的膜タンパク質に融合させてタグとし、コイルドコイル２量体を形成する１対のαへリックスペプチドのもう一方のペプチド、陽性コイルペプチド（αへリックスの７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇにおいて、生理的ｐＨでｅ及びｇが正に帯電したアミノ酸、ａ及びｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸であって、全体として生理的ｐＨで正に帯電しているαへリックスペプチド）を蛍光色素に結合させてプローブとすることで、目的膜タンパク質と蛍光色素を特異的に結合させ、簡便かつ迅速に該膜タンパク質の検出が可能であることを見いだした。（なお、本明細書において、アミノ酸配列の記載は、特に断りがない場合、左側がＮ末端、右側がＣ末端を示す。）【０００９】
さらに、本標識方法は細胞毒性が少なく、本標識方法で標識された膜貫通型受容体タンパク質はその本来の局在及び機能を有する（すなわち、膜に局在し、リガンドとの結合能およびシグナル伝達能力を有する）ことを見いだし、本発明を完成するに至った。なお、本発明はターゲットタンパク質研究プログラムおよびJSTシーズ発掘試験の援助を受けてなされたものである。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
項１．コイルドコイルを形成し得る陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質を、陰性コイルペプチドが細胞外側に位置するように発現した形質転換体に、コイルドコイルを形成し得る陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブを作用させ；
（ここで、
前記コイルドコイルは、αへリックス構造を有する陰性コイルペプチドとαへリックス構造を有する陽性コイルペプチドからなる２量体コイルドコイルであり；
前記陰性コイルペプチドは、αへリックスの７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇにおいて、生理的ｐＨでｅ及びｇが負に帯電したアミノ酸、ａ及びｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸、ｂ、ｃ及びｆが任意のアミノ酸であって、全体として生理的ｐＨで負に帯電しているαへリックスペプチドであり；
前記陽性コイルペプチドは、αへリックスの７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇにおいて、生理的ｐＨでｅ及びｇが正に帯電したアミノ酸、ａ及びｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸、ｂ、ｃ及びｆが任意のアミノ酸であって、全体として生理的ｐＨで正に帯電しているαへリックスペプチドであり、
前記形質転換体は哺乳類由来細胞又は酵母を形質転換したものである）
当該形質転換体の膜上に存在する該膜タンパク質を検出する方法。
項２．さらに、陰性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｆが生理的ｐＨで正に帯電したアミノ酸である、項１に記載の方法。
項３．さらに、陽性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｆが生理的ｐＨで負に帯電したアミノ酸である、項１又は２に記載の方法。
項４．さらに、陰性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｅ及びｇがグルタミン酸である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
項５．さらに、陽性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｅ及びｇがリジンである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
項６．さらに、陰性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｆがリジンである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
項７．さらに、陽性コイルペプチドが、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのｆがグルタミン酸である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
項８．陰性コイルペプチドが、１４から１４０アミノ酸残基からなる、項１から７のいずれか１項に記載の方法。
項９．陽性コイルペプチドが、１４から１４０アミノ酸残基からなる、項１から８のいずれか１項に記載の方法。
項１０．陰性コイルペプチドが、配列番号３もしくは４の配列からなる、項１から９のいずれか１項に記載の方法。
項１１．陽性コイルペプチドが、配列番号１もしくは２の配列からなる、項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
項１２．さらに、陰性コイルペプチドが１〜３０アミノ酸残基よりなるリンカーを介して膜タンパク質に融合した、項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
項１３．さらに、蛍光プローブが、陽性コイルペプチドが１〜３０アミノ酸残基よりなるリンカーを介して蛍光分子に結合した蛍光プローブである、項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
項１４．陽性コイルペプチドに蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のためのドナー蛍光分子を結合させた蛍光プローブと、陽性コイルペプチドにＦＲＥＴのための当該ドナー蛍光分子に対応するアクセプター蛍光分子を結合させた蛍光プローブの、２種類の蛍光プローブを同時に形質転換体に作用させ、陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質が２量体を形成し得るかをＦＲＥＴにより検出する、項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
項１５．形質転換体に、陰性コイルペプチドを融合した２種類の膜タンパク質を発現させ、当該２種類の膜タンパク質が２量体を形成し得るかを検出する、項１４に記載の方法。
項１６．膜タンパク質が、膜貫通型受容体タンパク質である、項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
項１７．膜貫通型受容体タンパク質が、ＧＰＣＲである、項１６に記載の方法。
項１８．蛍光分子が、Ａｌｅｘａ、ローダミン、フルオレセイン、Ｂｏｄｉｐｙ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｒ６Ｇ、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＥＤＡＮＳ、Ｄａｂｃｙｌ、ＳＮＡＲＦ、ＮＢＤ、ピレン、クマリンからなる群から選択される、項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
項１９．形質転換体が、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３、ＣＯＳ−７、ＰＣ１２細胞からなる群より選択される哺乳類由来細胞を形質転換したものである、項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
項２０．項１から１９のいずれか１項に記載の方法用の陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質をコードする、遺伝子構築物又はベクター。
項２１．項２０に記載の遺伝子構築物又はベクターを導入し、陰性コイルペプチドが細胞外側に位置するよう、陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質を発現した形質転換体。
項２２．項１６から１９のいずれか１項に記載の方法により膜貫通型受容体タンパク質を検出した後に、該膜貫通型受容体タンパク質のシグナル応答を指標としてリガンドとなる物質をスクリーニングする方法。
項２３．細胞内カルシウムイオン濃度変化をシグナル応答の指標とする、項２２に記載の方法。
項２４．項１６から１９のいずれか１項に記載の方法により膜貫通型受容体タンパク質を検出した後に、さらに該膜貫通型受容体タンパク質にリガンドを作用させることで、該膜貫通型受容体タンパク質が細胞内に取り込まれることを検出する方法。
項２５．項１３から１９のいずれか１項に記載の方法により、細胞外側に陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質を発現した形質転換体に、陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブを作用させ、陰性コイルペプチドと陽性コイルペプチドがコイルドコイルを形成した後に、当該両コイルペプチドを化学的手法により架橋してコイルドコイルをさらに安定化する方法。
項２６．架橋のためのリンカーとして用いられる化合物が、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳである、項２５に記載の方法。
項２７．項２５又は２６に記載の方法により、コイルドコイルを安定化した後、さらに当該両コイルペプチドの架橋に寄与しないペプチド部分を切断し、コイルドコイルの大きさを小さくする方法。
項２８．ペプチド部分の切断が、プロテアーゼを用いて行われる、項２７に記載の方法。
項２９．プロテアーゼがＦａｃｔｏｒ  Ｘａである、項２８に記載の方法。
項３０．項２５又は２６に記載の方法において、陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブに代えて、陽性コイルペプチドに固体支持体を結合させたものを使用し、陰性コイルペプチドと陽性コイルペプチドがコイルドコイルを形成した後に、当該両コイルペプチドを化学的手法により架橋してコイルドコイルをさらに安定化させ、当該固体支持体を形質転換体から引き離すことにより細胞膜から膜タンパク質を分離させ、当該膜タンパク質及びそれに付着した分子を質量分析装置で解析することで、当該膜タンパク質に付着した分子を同定する方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
コイルドコイルは、αへリックス構造を持つペプチド（αへリックスペプチド）が相互作用して形成される。αへリックスペプチドを、７アミノ酸ごとにグループ化（ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ；各アルファベットは１つのアミノ酸を示す）すると、グループ内でａ〜ｇそれぞれの位置にあるアミノ酸は、へリックスの筒上側から見たとき、ほぼ同じ位置に存在することがよく知られている（以後該グループ配列を７アミノ酸反復配列と記す）。【００１２】
コイルドコイルの形成は、この７アミノ酸反復配列に主に依存している。７アミノ酸反復配列が何回も反復したペプチドがαへリックスを形成し得、特にａ及びｄの位置に存在する疎水性アミノ酸側鎖がコイルドコイル形成のコアとなり、さらにｅ及びｇに位置するアミノ酸がこの疎水性コアを包みこむ（図１）ことで、へリックスどうしの相互作用を引き起こし得る（Ｊ．  Ｒ．  Ｌｉｔｏｗｓｋｉ，  Ｒ．  Ｓ．  Ｈｏｄｇｅｓ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ３７３７２（２００２））。また、ｅ及びｇに位置するアミノ酸が生理的ｐＨで帯電するアミノ酸である場合、生理的ｐＨでｅ及びｇとは逆に帯電するアミノ酸がｆに位置することで、へリックス構造がさらに安定化する。【００１３】
コイルドコイル２量体は、２つのαへリックスペプチドからなる。【００１４】
本発明において、コイルドコイル２量体の一方のαへリックスペプチドは、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇにおいてｅ及びｇが生理的ｐＨで正に帯電したアミノ酸（好ましくはリジン、アルギニン、ヒスチジンであり、特に好ましくはリジン）、ａ及びｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸（好ましくはグリシン、アラニン、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンであり、特に好ましくはバリン、ロイシン、イソロイシン）であり、ｂ、ｃ及びｆが任意のアミノ酸（好ましくはｆは生理的ｐＨで負に帯電したアミノ酸（好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸であり、特に好ましくはグルタミン酸））であり、ペプチド全体として生理的ｐＨで正に帯電しているものである。本明細書では、当該αへリックスペプチドを「陽性コイルペプチド」と表記する。なお、陽性コイルペプチドは、必ずしも７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇの整数倍のアミノ酸、すなわち、Ｎ末端はａ、Ｃ末端がｇである必要はなく、少なくとも７アミノ酸反復配列が２回以上（好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、さらに好ましくは３〜５回）反復して含まれていればよい。また、末端部に７アミノ酸反復配列に寄与しないアミノ酸が数残基（好ましくは１〜５アミノ酸残基、より好ましくは１〜３アミノ酸残基）付加されていても、αへリックス構造をとり得ることから、このようなものも本発明でいう陽性コイルペプチドに含まれる。【００１５】
陽性コイルペプチドは、αへリックス構造を形成し得る程度のアミノ酸残基からなり、１４から１４０アミノ酸残基からなるものが好ましく、１４から７０アミノ酸残基からなるものがより好ましく、２１から３５アミノ酸残基からなるものがさらに好ましい。【００１６】
本発明において、コイルドコイル２量体のもう一方のαへリックスペプチドは、７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇにおいてｅ及びｇが生理的ｐＨで負に帯電したアミノ酸（好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸であり、特に好ましくはグルタミン酸）、ａ及びｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸（好ましくはグリシン、アラニン、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンであり、特に好ましくはバリン、ロイシン、イソロイシン）であり、ｂ、ｃ及びｆが任意のアミノ酸（好ましくはｆは生理的ｐＨで正に帯電したアミノ酸（好ましくはリジン、アルギニン、ヒスチジンであり、特に好ましくはリジン））であり、ペプチド全体として生理的ｐＨで負に帯電している。本明細書では、当該αへリックスペプチドを「陰性コイルペプチド」と表記する。なお、陰性コイルペプチドは、必ずしも７アミノ酸反復配列ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇの整数倍のアミノ酸、すなわち、Ｎ末端はａ、Ｃ末端がｇである必要はなく、少なくとも７アミノ酸反復配列が２回以上（好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、さらに好ましくは３〜５回）反復して含まれていればよい。また、末端部に７アミノ酸反復配列に寄与しないアミノ酸が数残基（好ましくは１〜５アミノ酸残基、より好ましくは１〜３アミノ酸残基）付加されていても、αへリックス構造をとり得ることから、このようなものも本発明でいう陰性コイルペプチドに含まれる。【００１７】
本明細書で「任意のアミノ酸」とは、好ましくはグリシン、アラニン、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸であるが、これに限定されるものではない。【００１８】
陰性コイルペプチドは、αへリックス構造を形成し得、かつ、当該ペプチドをタグとして付する膜タンパク質の局在及び機能に影響しない程度のアミノ酸残基からなり、１４から１４０アミノ酸残基からなるものが好ましく、１４から７０アミノ酸残基からなるものがより好ましく、２１から３５アミノ酸残基からなるものがさらに好ましい。【００１９】
本明細書において、生理的ｐＨとは、細胞（好ましくは形質転換体）の生命活動が支障なく営まれ得るｐＨをいい、好ましくはｐＨ４から１０、より好ましくはｐＨ５から９、さらに好ましくはｐＨ５から８、なおさらに好ましくはｐＨ５から７である。【００２０】
本発明で用いる陽性コイルペプチドは、例えば、化学的合成法、遺伝子工学的手法、又は無細胞合成系を用いた合成法などにより得られる。化学合成的手法としては、例えば固相合成法が挙げられる。遺伝子工学的手法としては、例えば、陽性コイルペプチドをコードする核酸を有するベクターで形質転換した形質転換体により製造する方法が挙げられる。無細胞合成系としては、例えば小麦胚芽無細胞タンパク質合成系が挙げられる。【００２１】
本発明では、陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合させたものを蛍光プローブとして使用する。結合させる蛍光分子としては、蛍光強度が強く、かつ分子量がＧＦＰといった蛍光タンパク質に比べて小さい物が好ましい。例えば、Ａｌｅｘａ、ローダミン各種（ローダミン１１０、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テキサスレッドなど）、フルオレセイン、Ｂｏｄｉｐｙ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｒ６Ｇ、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＥＤＡＮＳ、ＳＮＡＲＦ，  ＮＢＤ等が挙げられる。また、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のためのドナー蛍光分子及びアクセプター蛍光分子をそれぞれ陽性コイルペプチドに結合させ、蛍光プローブを２種類作製し、当該２種類の蛍光プローブを同時に形質転換体に作用させ、ＦＲＥＴにより、陰性コイルペプチドを細胞外側に融合した膜タンパク質が２量体を形成し得るかを検出することも可能である。すなわち、当該膜タンパク質が２量体を形成する場合、ＦＲＥＴが起こるため、これを指標として２量体形成がなされているか否かを調査できる。また、２量体以上の多量体、例えば３量体や６量体を形成する場合もＦＲＥＴは起こりえるが、当該２種類の蛍光プローブ（ドナーとアクセプター）の使用量およびその比率を様々に変更して検討することで、何量体を形成しているのか予測可能である。ＦＲＥＴのためのドナー蛍光分子及びアクセプター蛍光分子としては、例えばNBD-TMR、Alexa488- Alexa568、フルオレセイン- ローダミン、ピレン- クマリン、EDANS- Dabcyl（それぞれ「ドナー蛍光分子−アクセプター蛍光分子」のペアを示す）等が挙げられる。【００２２】
蛍光分子は、例えば、TMRまたはAlexa 488のsuccinimidyl  エステル2当量を5% N,N-diisopropylethylamine を含むジメチルホルムアミド中 で48 時間反応させることにより、樹脂上の陽性コイルペプチドのN末端に結合される。
また、IANBD２当量を緩衝液 (pH 8.0)中で1時間反応させることにより、溶液中の陽性コイルペプチドのシステイン側鎖に結合される。【００２３】
また、蛍光分子と陽性コイルペプチドの間に、リンカーを挿入して融合させたものも、本発明の方法に用いる蛍光プローブの範囲に含まれる。当該リンカーはペプチドからなり、１〜３０アミノ酸からなるペプチドが好ましく、１〜１０アミノ酸からなるペプチドがより好ましく、１〜５アミノ酸からなるペプチドがさらに好ましい。また、当該リンカーを形成するアミノ酸としては、任意のアミノ酸（好ましくはグリシン、アラニン、バリン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり、特に好ましくはグリシン又はアラニン）から選択される。【００２４】
本発明では、蛍光プローブは、用いる濃度は特に限定されないが、好ましくは１０〜５００nMの濃度で、より好ましくは１０〜２００ｎＭの濃度で、さらに好ましくは２０〜１００ｎＭの濃度で、形質転換体に作用させることができる。【００２５】
本発明において、膜タンパク質とは、細胞膜（プラズマメンブレン）の外側にその一部が存在して発現するものを意味し、例えば膜貫通型のタンパク質（膜貫通型受容体タンパク質など）や、ＧＰＩアンカー型タンパク質等が挙げられる。【００２６】
本発明において、膜貫通型受容体タンパク質とは、形質転換体において、細胞膜を貫通した構造を有して発現し得、受容体として働き得るタンパク質をいい、自然界に存在するものはもちろん、それを基に例えば遺伝子工学的手法で改変、修飾等したものも含む。特に１回膜貫通型受容体タンパク質及び７回膜貫通型受容体タンパク質が好ましく列挙できるが、これらに限定されるものではなく、これらとは異なる回数膜を貫通した構造を有する受容体や、前述のように人工的な改変、修飾を施されたものも含む。なお、細胞膜を貫通した構造を有して発現し得、受容体として働き得るとは、実際にそのタンパク質の構造や機能の知見が十分に得られていなくとも、相同性検索等のコンピューターを用いた解析又はプレリミナリーな実験結果等により、膜貫通領域を持ち得、受容体として働く可能性が予測される程度で足りる。【００２７】
本発明において特に好ましい膜貫通型受容体タンパク質としては、例えば、７回膜貫通型受容体タンパク質であるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、特にプロスタグランジン受容体、アドレナリン受容体、ドパミン受容体、ケモカイン受容体などが挙げられる。また、上述のように、これらを遺伝子工学的手法等で改変、修飾等したものも、本発明における膜貫通型受容体タンパク質に含まれる。【００２８】
本発明において、陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質は、陰性コイルペプチドが細胞外側に位置するよう形質転換体で発現される。融合部位は、当該膜タンパク質を形質転換体で発現させた際、細胞外に存在する部位であれば特に限定されるものではないが、Ｃ末端又はＮ末端が細胞外に存在している場合はこれら末端部位が好ましい。例えば、７回膜貫通型受容体タンパク質では、Ｎ末端が細胞外に存在することがよく知られており、７回膜貫通型受容体タンパク質に属する受容体（例えばＧＰＣＲ）を本発明の方法に使用する場合は、Ｎ末端に陰性コイルペプチドを融合させるのが好ましい。【００２９】
また、膜タンパク質と陰性コイルペプチドの間に、ペプチドからなるリンカーを挿入して融合させたものも、本発明の方法に用いるものの範囲に含まれる。特に、膜タンパク質が受容体タンパク質である場合、リンカーを挿入することにより、陰性コイルペプチドを受容体タンパク質のリガンド認識に重要である部位から空間的に離れた部位へ位置させることが可能である。但し、分子量が比較的大きいリンカーを使用すると受容体のリガンド認識を空間的に妨害するおそれもある。よって、当該リンカーとしては、１〜３０アミノ酸からなるペプチドが好ましく、１〜１０アミノ酸からなるペプチドがより好ましく、１〜５アミノ酸からなるペプチドがさらに好ましい。また、当該リンカーのペプチドは任意のアミノ酸からなる。【００３０】
本発明は、細胞外側に陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質を発現した形質転換体に、陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブを作用させ、形質転換体の膜上に発現している当該膜タンパク質を検出する方法に係るものである。上記のように、陰性コイルペプチドと陽性コイルペプチドは、生理的ｐＨにおいて安定な２量体コイルドコイルを形成し得るため、当該膜タンパク質の陰性コイルペプチドのみに蛍光プローブの陽性コイルペプチドが結合し、結果として当該膜タンパク質の特異的な検出が可能となる。【００３１】
しかし、逆に、細胞外側に陽性コイルペプチドを融合した膜タンパク質を発現した形質転換体に、陰性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブを作用させたとしても、形質転換体の膜上に発現している当該膜タンパク質を良好には検出できないことも、本願発明者等は見いだした。【００３２】
細胞表面は一般に生理的ｐＨで負に耐電しているため、陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブを形質転換体に作用させると、細胞表面に非特異的に結合するおそれがあり、陰性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブを用いるのが妥当と考えられるが、本発明はこの考えを覆すものである。【００３３】
また、前述したように、本発明の方法を用いて、興味ある膜タンパク質と２量体を形成する膜タンパク質を検出することも可能である。すなわち、興味ある膜タンパク質及び当該膜タンパク質と２量体を形成する可能性のある膜タンパク質それぞれの細胞外部分に陰性コイルペプチドを融合させて形質転換体で共発現させ、また、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用した分子間相互作用解析のためのドナー蛍光分子及びアクセプター蛍光分子をそれぞれ陽性コイルペプチドと結合させ、これら２種の蛍光プローブを、前記膜タンパク質を共発現させた形質転換体に作用させてＦＲＥＴによる分子相互間作用解析を行うことで、共発現させた膜タンパク質が２量体を形成しているかどうかを確認できる。なお、この場合はあらかじめ、共発現させた膜タンパク質各々が、それ自身で２量体形成しないことを確かめておく必要があり、それ自身が２量体を形成する場合（すなわちホモ２量体を形成する場合）は、他のラベル法との併用が必要である。【００３４】
このように、本発明の方法は、ヘテロ２量体として機能を有する受容体の解析にも有用である。現在までに、ＧＡＢＡＢ  受容体がＧＡＢＡＢ（１）とＧＡＢＡＢ（２）のヘテロ２量体ではじめて機能的受容体となること（Ｎａｔｕｒｅ．１９９８；３９６：６８３−６８７）や、オピオイドκとδ受容体がヘテロ２量体を形成し，かつヘテロ２量体は単独の受容体の薬物特性とは異なること（Ｎａｔｕｒｅ．１９９９；３９９：６９７−７００）等が報告されており、ヘテロ２量体を形成してはじめて特異的な機能を有する受容体の解析への需要は大きい。前述のように、ＦＲＥＴを利用した本発明の方法を利用することで、受容体タンパク質がヘテロ２量体を形成し得るのかを、簡便に検出可能である。【００３５】
なお、ＦＲＥＴは、ある波長で励起された蛍光分子（ドナー蛍光分子）のそばに別の蛍光分子（アクセプター蛍光分子）があって、前者の発光スペクトルと後者の吸収スペクトルに重なりがある場合に、ドナー蛍光分子の励起エネルギーがアクセプター蛍光分子へ移動する現象である。近年、生命科学研究において、特に分子間相互作用解析に広く用いられており、例えば、Ｃｌｅｇｇ，１９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１０３−１１０に概説されている。【００３６】
本発明は、膜貫通型受容体タンパク質を蛍光プローブにより検出する前又は検出した後、さらに種々のリガンド候補分子を作用させたときの、当該膜貫通型受容体タンパク質の応答を検出することで、当該膜貫通型受容体タンパク質のリガンドをスクリーニングする方法をも含む。例えば、当該膜貫通型受容体タンパク質が細胞内にシグナルを伝える際に、セカンドメッセンジャーとして働く物質（例えばカルシウムイオンやサイクリックＡＭＰ等）の濃度変化や、シグナル下流のタンパク質（例えばERKやMEK）のリン酸化を指標として、アゴニストとして働き得るリガンド分子をスクリーニングすることが可能である。さらに、アゴニスト分子を特定した後、アンタゴニストとして働き得る分子をスクリーニングすることも可能である。すなわち、アゴニスト分子を単独で作用させた場合より、混合して作用させると受容体の応答が低くなる（すなわち拮抗して働く）分子を探索することで、アンタゴニスト分子をスクリーニングすることも可能である。【００３７】
また、アドレナリン受容体など、多くの膜貫通型受容体タンパク質において、リガンド結合によってエンドサイトーシスが起こり、当該膜貫通型受容体タンパク質が細胞内に取り込まれてエンドソームに移行することが知られている。本発明は、膜貫通型受容体タンパク質を蛍光プローブにより検出した後、当該膜貫通型受容体タンパク質のリガンド分子を作用させ、当該膜貫通型受容体タンパク質が細胞内に取り込まれるかどうかを検出する方法をも含む。さらに、エンドサイトーシスにより細胞内にとりこまれると、ｐＨ環境が変化することがよく知られている。よって、陽性コイルペプチドに例えばフルオレセインといったｐＨに応じて蛍光励起波長が異なる蛍光分子を結合したものを蛍光プローブとして使用することで、細胞内に取り込まれたどうかを蛍光強度の変化によっても検出できる。【００３８】
本発明は、本発明の方法に用いる、陰性コイルペプチドを融合した膜タンパク質をコードする核酸を有する遺伝子構築物及びベクターを含む。ベクターとしては、例えばプラスミドが使用できる。該遺伝子構築物及びベクターは、形質転換のために好ましく利用される。これらの遺伝子構築物及びベクターを細胞へ導入するために、例えば、カチオン性脂質複合体、HVJエンベロープ、カチオニックポリマー、アデノウイルス等を用いることができる。また、エレクトロポレーション、パーティクルガン等の手法を用い、遺伝子構築物及びベクターを直接細胞へ導入することも可能である。【００３９】
本発明はまた、前記遺伝子構築物及びベクターを用いて形質転換した形質転換体を含む。本発明において、形質転換する細胞は真核生物由来細胞であり、例えば哺乳類由来細胞（好ましくはＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３、ＣＯＳ−７、PC12細胞等）、酵母（好ましくは出芽酵母、分裂酵母等）等が好ましく例示できる。【００４０】
また、本発明の方法は、細胞外側に陰性コイルペプチドを融合した膜貫通型受容体タンパク質を発現した形質転換体に、陽性コイルペプチドに蛍光分子を結合した蛍光プローブを作用させ、陰性コイルペプチドと陽性コイルペプチドがコイルドコイルを形成した後に、当該両コイルペプチドを化学的手法により架橋してさらに安定化する方法、及び、当該安定化の後に当該両コイルペプチドの架橋に寄与しないペプチド部分を切断し、コイルドコイルの大きさを小さくする方法も含む。例えば、リガンド候補分子をスクリーニングする際には、コイルドコイルの大きさが小さいほど、当該膜貫通型受容体タンパク質へのリガンド候補分子の結合がより空間的に妨げられにくくなるため、コイルドコイルの大きさを小さくすることは有用である。【００４１】
当該方法における、架橋のためのリンカーとして用いられる化合物として、例えばＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−EＭCＳ、Ｓｕｌｆｏ−KMUS、BMPS、LC-SMCC、MBSが挙げられるが、好ましくはＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳである。また、当該方法における、架橋に寄与しないペプチド部分の切断方法としては、例えばプロテアーゼによる方法が挙げられる。ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３、ＣＯＳ−７、PC12細胞等、ウシ血清を成分として含む培地で培養する細胞を形質転換して形質転換体として用いる場合は、プロテアーゼの中でも、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａが好ましい。【００４２】
なお、特定のアミノ酸残基又はアミノ酸配列を認識する架橋方法やプロテアーゼを使用する場合は、当該アミノ酸残基またはアミノ酸配列を両コイルペプチドに、さらに融合させておく必要がある。リンカー配列中に当該アミノ酸残基またはアミノ酸配列を含ませてもよい。例えば、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳは反応基がマレイミド基及びＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ基であり、それぞれＳＨ基及びアミノ基と反応することから、側鎖にＳＨ基を有するアミノ酸として例えばシステイン、及び、側鎖にアミノ基を有するアミノ酸として例えばリジン、が架橋のために必要であるし、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａはアミノ酸１文字表記でＩＥＧＲ配列を認識することから、当該配列が必要である。従って、例えば陽性コイルペプチド及び陰性コイルペプチドの各アミノ酸配列に、さらにＩＥＧＲＣ及びＩＥＧＲＫ（ＩＥＧＲはＦａｃｔｏｒ  Ｘａ認識配列であり、その後のＣ及びＫがＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳの架橋に必要なアミノ酸である）配列を加える必要がある。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。本実施例では下記に示すように、陰性コイルペプチドを融合させる膜貫通型受容体タンパク質としてマウス由来ＥＰ３βＲ（ＥＰ３β受容体）を、形質転換させる細胞としてＣｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  由来ＣＨＯ細胞を、陽性コイルペプチドに結合させる蛍光分子としてテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）あるいはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）を、それぞれ使用した。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４４】
本実施例にて用いた発現プラスミド、蛍光プローブ、形質転換体として用いた細胞は以下のように調製した。また、本実施例にて用いた蛍光イメージング、細胞毒性アッセイ方法も以下に示す。【００４５】
タグ配列付加ＥＰ３βＲ発現プラスミド、並びに、タグ配列及びＥＹＦＰ付加ＥＰ３βＲ発現プラスミドの作成
本実施例でタグとして使用した陽性コイルペプチド及び陰性コイルペプチドのアミノ酸配列を、表１に示す。なお、表中に、本明細書中での各配列の表記の仕方も示す（例えば、配列番号１のアミノ酸配列は以後「Ｋ３」と表記する）。【００４６】
【表１】
2009041633.tif 000002
【００４７】
Hatae, N. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 162-168 (2002)に記載の方法に従って、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウス由来ＥＰ３βＲ遺伝子をクローニングした。ＥＰ３βＲ−ｐｃＤＮＡ３をＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＮｈｅ  Ｉで切断し、ここにＫ３またはＥ３タグ配列に、Ｎ末端に開始コドンを、Ｃ末端にＧｌｙＧｌｙＧｌｙ配列をそれぞれ付与したものに対応する合成オリゴヌクレオチド（Ｋ３に対応；配列番号５、Ｅ３に対応；配列番号６）を挿入し、ベクターｐｃＤＮＡ３／Ｋ３−ＥＰ３βＲおよびｐｃＤＮＡ３／Ｅ３−ＥＰ３βＲを得た（タグとＥＰ３βＲ配列の間にリンカーとしてＧｌｙＧｌｙＧｌｙ配列を挿入した）。【００４８】
さらに、ＰＣＲプライマーＴａｇ−ＥＰ３Ｆ（ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣ：配列番号７）およびＴａｇ−ＥＰ３Ｒ（ＴＡＴＣＧＣＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧ：配列番号８）を用いて、Ｋ３−ＥＰ３βＲあるいはＥ３−ＥＰ３βＲコード領域をＰＣＲ法にて増幅し、ＥＹＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）  のＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ａｐａ  Ｉサイトに挿入してベクターＮ１／Ｋ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰ  またはＮ１／Ｋ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰを得た。なお、ＰＣＲはＴａｋａｒａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬを用いて、以下の条件にて行った：９４℃２分を１サイクル、（９４℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１分２０秒）を３０サイクル、その後４℃で保存。（なお、本明細書において、塩基配列の記載は、特に断りがない場合、左側が５’末端、右側が３’末端を示す。）【００４９】
最後に、Ｎ１／Ｋ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰ  またはＮ１／Ｋ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰをＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＮｏｔ  Ｉで切断、ｐｃＤＮＡ３のＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｎｏｔ  Ｉサイトに挿入し、ベクターｐｃＤＮＡ３／Ｋ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰおよびｐｃＤＮＡ３／Ｅ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰを得た。ＤＮＡシーケンスにより目的の塩基配列を得たことを確認した。【００５０】
蛍光プローブの調製
Ｆｍｏｃ固相合成法により、Ｎ末端を蛍光色素テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）あるいはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）でラベルしたＫ３，  Ｋ４，  Ｅ３，  Ｅ４  ペプチドを合成した。ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ  樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）０．３１ｍｍｏｌ／ｇ、０．１ｍｍｏｌに、ＤＭＦ中０．５  ｍｍｏｌのＦｍｏｃアミノ酸、０．５  ｍｍｏｌのＨＯＢｔ、０．５  ｍｍｏｌのジイソプロピルカルボジイミドを加え２時間攪拌した。反応の完了はＫｅｉｓｅｒ試験で確認した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン、２０分間行った。樹脂からの脱保護はＴＦＡ／エタジチオール／ｍ−クレゾール／チオアニソール／水＝１２．５／１／１／１／１（ｖ／ｖ）で３時間行った。ジエチルエーテルでペプチドを沈殿後、ＨＰＬＣにより精製を行った（純度９０％以上）。エレクトロスプレーイオン化質量分析により分子量を測定し、目的とするラベル化ペプチドが合成されたことを確認した。【００５１】
なお、以後、テトラメチルローダミンを結合したＫ３，  Ｋ４，  Ｅ３，  Ｅ４  ペプチドを、それぞれＴＭＲ−Ｋ３、ＴＭＲ−Ｋ４、ＴＭＲ−Ｅ３、ＴＭＲ−Ｅ４、と表記し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を結合したＫ３，  Ｋ４，  Ｅ３，  Ｅ４  ペプチドを、それぞれＡＦ４８８−Ｋ３、ＡＦ４８８−Ｋ４、ＡＦ４８８−Ｅ３、ＡＦ４８８−Ｅ４と表記する。【００５２】
細胞培養およびＥＰ３βＲ変異体の一過性発現
Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  由来ＣＨＯ細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）  を含むａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｓｉｇｍａ）中、５％  ＣＯ２，  ３７°Ｃで行った。ベクターの導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  およびＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１×１０５細胞を３５  ｍｍ径のガラスボトムディッシュ（Ｉｗａｋｉ）に播種して１日後、０．３  μｇのＤＮＡ、２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、３μＬのＰＬＵＳ試薬を加え、３７°Ｃ  で３時間インキュベートした。【００５３】
共焦点レーザー顕微鏡による蛍光イメージング
遺伝子導入後２４−４８時間に、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＰａｓｃａｌまたはＮｉｋｏｎ  Ｃ１）による観察を行った。１０％血清を含む培地１ｍＬにペプチドプローブを希釈して約５分インキュベート後、培地で一度洗浄し、観察を行った。ＥＹＦＰ、Ａｌｅｘａ４８８は励起：４８８  ｎｍ、蛍光５０５−５３０  ｎｍ  ＢＰフィルター、ＴＭＲは励起５４３  ｎｍ、蛍光５６０  ｎｍ  ＬＰフィルターで観察した。ペプチドを滴定する場合は、顕微鏡ステージ上を５％  ＣＯ２，  ３７°Ｃ条件に保った。ペリスタックポンプでペプチド溶液１０ｍＬを循環し、顕微鏡ステージ外を循環している溶液（約５  ｍＬ）にペプチドを順次加えピペッティング混合した。ペプチド濃度が一定になるのを待つために、投与後１０−１５分待ってから各濃度での蛍光画像を取得した。複数の細胞膜領域の蛍光強度の平均値を用いて（ｎ  ＝  １０）定量し、測定した蛍光強度範囲では、色素濃度と蛍光強度がリニアな関係にあることを確かめた。ペプチドを洗浄する場合は、ペプチドを含まない１０％血清培地を毎分１ｍＬ流し続け、蛍光強度の減少を見た。【００５４】
細胞毒性アッセイ
９６ウェルプレートにＣＨＯ細胞（５０００／ウェル）を播種して１２時間後、培地に溶解したＴＭＲ−Ｋ３またはＴＭＲ−Ｋ４（１００μＬ）を投与した。２０時間後、ＷＳＴ試薬１０μＬを加え、１時間後４５０  ｎｍの吸光度を測定した。また、この波長ではＴＭＲの吸収はほとんど見られず、本アッセイ結果にＴＭＲによる吸収の影響は無いこともあらかじめ確認した。【００５５】
Ｆｕｒａ２による細胞内Ｃａ２＋イメージング
遺伝子導入２４−４８時間後、０．５μＭインドメタシン、０．５  ｍＭプロベネシドを含む培地で細胞を洗浄後、１０μＭ  Ｆｕｒａ２−ＡＭで３０分染色した。測定は、２ｍＭ  Ｃａ２＋および２０  ｎＭのＴＭＲ−Ｋ４を含むＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １ｍＬ中で行った。測定開始約２分後に、６μＭのＥＰ３βアゴニスト（Ｓｕｌｐｒｏｓｔｏｎｅ）１ｍＬを混合した（最終濃度３μＭ）。Ｆｕｒａ２蛍光レシオ画像は励起波長を３４０  ｎｍ／３８０  ｎｍで切り替えながら、蛍光５１０  ｎｍで取得した。【００５６】
実施例１：タグ−プローブペアの検討
ＥＰ３βＲ  のＮ末端にＫ３またはＥ３タグ配列を融合させ、Ｃ末端に受容体の局在を調べるためＥＹＦＰを付加した融合膜貫通型受容体タンパク質、Ｋ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰおよびＥ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰをそれぞれＣＨＯ細胞に一過性に発現させ、Ｋ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰに対してはＴＭＲ−Ｅ３、ＴＭＲ−Ｅ４蛍光プローブを、Ｅ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰに対してはＴＭＲ−Ｋ３、ＴＭＲ−Ｋ４プローブを濃度２０  ｎＭで加え、培地で１回洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った（図２Ａ）。その結果、Ｋ３タグに対してＴＭＲ−Ｅプローブを加えた場合にはＴＭＲ蛍光がほとんど観測されなかったのに対して、Ｅ３タグに対してＴＭＲ−Ｋ蛍光プローブを加えた場合には、受容体を発現している細胞だけがＴＭＲ染色された。また、ＥＹＦＰの蛍光は細胞膜、細胞内いずれでも見られるのに対し、ＴＭＲ蛍光は細胞膜のみで見られ、細胞膜表面の受容体のみを蛍光ラベルできることがわかった。ペプチド投与直後（１分以内）から、ＴＭＲの染色が見られた。また、Ｅ３−ＥＰ３βＲをＣＨＯ細胞に一過性に発現させた場合において、蛍光分子ＡＦ４８８でラベルしたＫ４ペプチド（ＡＦ４８８−Ｋ４）でも、ＴＭＲ−Ｋ４と同様にＥ３−ＥＰ３βＲ  をラベルできた（図２Ｂ）。以降、Ｅ３タグ−ＴＭＲ−Ｋプローブ系のみ詳しい検討を行った。【００５７】
実施例２：タグ−プローブの結合力（コイルドコイルの安定性）の検討
ＴＭＲ−Ｋ３、ＴＭＲ−Ｋ４プローブのＥ３タグに対する結合力を調べるため、Ｅ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰ発現ＣＨＯ細胞に、２−１００  ｎＭ程度の濃度範囲でプローブを滴定した（図３）。各プローブ濃度での、共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を図３Ａに、細胞膜のＴＭＲ蛍光強度をプロットした結果を図３Ｂに示す。ここから各プローブの見かけの解離定数を求めた（ＴＭＲ−Ｋ４：Ｋｄ  ＝  ６  ±  ２  ｎＭ，  ＴＭＲ−Ｋ３：Ｋｄ  ＝  ６４  ±  ３１  ｎＭ）。ＴＭＲ−Ｋ３の解離定数は、報告されている緩衝液中のＥ３−Ｋ３の解離定数（約７０  ｎＭ）と同程度だった（非特許文献７；なお、Ｅ３−Ｋ４に関しては報告なし）。従って、ＴＭＲ−Ｋ４を用いれば、２０  ｎＭ程度の低濃度でも、十分なラベル化が行えることが明らかになった。次に、蛍光ラベルされた細胞を、ＴＭＲ−Ｋプローブを含んでいない培地でｗａｓｈ  ｏｕｔ（１ｍＬ／ｍｉｎ）し、一度ラベルされたプローブがどの程度の時間保たれているか調べた（図３Ｃ）。ＴＭＲ−Ｋ３は５０  ｍＬの洗浄で約５０％解離したのに対し、ＴＭＲ−Ｋ４は８０  ｍＬの洗浄後でも約２０％しか解離せず、より長時間結合が保たれることがわかった。【００５８】
実施例３：プローブの細胞毒性、安定性の検討
ＷＳＴ−１アッセイにより、ＴＭＲ−Ｋ３、  ＴＭＲ−Ｋ４のＣＨＯ細胞への毒性を調べた。いずれのペプチドも、１０μＭ、１日程度で毒性は見られず、ラベル化に用いる濃度（数十μＭ）の１００倍程度の濃度でも毒性を示さないことを確認した（図４）。【００５９】
また、ＴＭＲ−Ｋプローブの溶液中での安定性を調べた。４℃、０．５％アジ化ナトリウム中で、１００〜１５０μＭ濃度で１ヶ月間保存した後、ＨＰＬＣにより解析し、少なくとも１ヶ月程度安定に存在すること確認した（図５）。【００６０】
実施例４：受容体の機能の確認
ＴＭＲ−ＫプローブでラベルされたＥ３−ＥＰ３βＲが、受容体の機能を持っているかどうか、Ｃａ２＋感受性蛍光色素Ｆｕｒａ２による細胞内カルシウムイメージングを用いて調べた。Ｅ３−ＥＰ３βＲを発現し、２０  ｎＭのＴＭＲ−Ｋ４で染色された細胞だけが、ＥＰ３βＲのリガンドであるＳｕｌｐｒｏｓｔｏｎｅ投与による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を引き起こした（図６）。このことから、ＴＭＲ−Ｋ４が結合したＥ３−ＥＰ３βＲが受容体の機能を持つことが確認できた。【００６１】
すなわち、本標識方法でラベルした膜貫通型受容体タンパク質は、リガンドとの結合能およびシグナル伝達能力を有することが確認された。【００６２】
このことから、細胞膜に膜貫通型受容体タンパク質を本手法で発現及び標識する前又は後で本形質転換体に対して様々な分子を作用させ、該膜貫通型受容体タンパク質との相互作用を検出することで、該膜貫通型受容体タンパク質のリガンドをスクリーニングすることが可能であることが示された。【００６３】
実施例５：エンドサイトーシスによる受容体の細胞内在化の確認
β２ＡＲ（β２アドレナリン受容体）のＮ末端にＥ３タグを、Ｃ末端にＥＹＦＰを付加したＥ３−β２ＡＲ−ＥＹＦＰをコードするベクターｐｃＤＮＡ３／Ｅ３−β２ＡＲ−ＥＹＦＰを以下の手順により作製した。なお、基本的に各操作の条件は上記ｐｃＤＮＡ３／Ｅ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰを用いた実験と同様とした。
ＰＣＲプライマーＡＲ−Ｆ（ａｔａｇｃｇａｔａａｔａｇｃｔａｇｃｇｇｇｃａａｃｃｃｇｇｇａａｃｇｇ：配列番号９）およびＡＲ−Ｒ（ａｔａａａｔｇｇｇｃｃｃｔｔａｃａｇｃａｇｔｇａｇｔｃａｔｔｔｇｔａｃｔａｃａａｔｔｃｃ：配列番号１０）を用いて、 pDONR223／β２AR (Open Biosystems)をテンプレートとしてβ２ＡＲコード領域をＰＣＲにより増幅し、増幅断片をＮｈｅ  ＩおよびＡｐａ  Ｉで処理した。これをｐｃＤＮＡ３／Ｅ３−ＥＰ３β−ＥＹＦＰをＮｈｅＩ及びＡｐａＩにより処理した断片のＮｈｅ  Ｉ／Ａｐａ  Ｉ  サイトに挿入し、ｐｃＤＮＡ３／Ｅ３−β２ＡＲを得た。
さらに、ＰＣＲプライマーＡＲ−ＦおよびＡＲ−Ｒ２（ａｔａａａｔｇｇｇｃｃｃａｃａｇｃａｇｔｇａｇｔｃａｔｔｔｇｔａｃｔａｃａａｔｔｃｃ  ：配列番号１１）を用いて上記と同様にしてｐｃＤＮＡ３／Ｅ３−β２ＡＲ（Ｓｔｏｐコドンなし）を作成し、そのＡｐａ  Ｉサイトに、ｐｃＤＮＡ３／Ｅ３−ＥＰ３β−ＥＹＦＰからＡｐａ  Ｉで処理した断片（ＹＦＰをコード）を挿入することで得た。【００６４】
さらに、当該ベクターをＣＨＯ細胞に導入して発現させ、ＴＭＲ−Ｋ４  （２０  ｎＭ）  を加え、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った（図７Ａ）。受容体（ＥＹＦＰで標識される、緑）は、細胞膜だけでなく細胞内部にも存在したが、ＴＭＲ−Ｋ４（赤）は、細胞膜上でのみ観察され、細胞膜上の受容体のみラベルしたことが確認された。また、観察後、さらにＴＭＲ−Ｋ４プローブラベルした受容体にアゴニスト（イソプロテレノール）を加え、受容体が内在化することを確認した（図７Ｂ）。ＥＹＦＰラベルでは、もともと細胞内に存在するβ２ＡＲをも検出するため、アゴニスト作用前後を比較して内在化の有無を判定することが困難だが、ＴＭＲ−Ｋ４ラベルの場合は、アゴニスト作用前は膜に発現したβ２ＡＲのみを検出できるため、アゴニスト作用前後での内在化の判定が容易であった（図７ＡのＴＭＲ−Ｋ４及び図７ＢのＴＭＲ−Ｋ４）。【００６５】
実施例６：タグの分子量を小さくする方法（Ｓｍａｌｌ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ−ｔａｇ）
Ｅ３タグとＴＭＲ−Ｋ３プローブ（４２残基）、及び、Ｅ３タグとＴＭＲ−Ｋ４プローブ（４９残基）からなるコイルドコイルをさらに小さくするために、１）タグとプローブがコイルドコイル形成後、２）アミノ基反応性クロスリンカーを用いてプローブとタグを共有結合させ、３）特異的プロテアーゼによりコイルドコイル部分を切り離した（図８）。クロスリンカーには、システイン側鎖のチオール基とリジン側鎖のアミノ基をクロスリンクするＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（図９）を、プロテアーゼとしてＩＥＧＲ配列（アミノ酸１文字表記）のＣ末端側を切断することが知られているＦａｃｔｏｒ  Ｘａを用いた。また、蛍光プローブとして、Ｒ３配列のＮ末端にＴＭＲを、Ｃ末端にフルオレセイン  （ＦＬ）  を結合させたものを使用した。すなわち、当該蛍光プローブ及びタグ融合ＥＰ３βＲは下表に示すものである。【００６６】
【表２】
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【００６７】
プローブＴＭＲ−Ｒ３−Ｘａ−Ｃ−ＦＬは、不必要なクロスリンクを防ぐため、Ｋ３配列のＬｙｓ  をＡｒｇに置換し、プロテアーゼ切断配列ＩＥＧＲおよびクロスリンカーを持つアナログである。蛍光色素としてＮ末端にＴＭＲ、Ｃ末端にフルオレセイン  （ＦＬ）  を持つため、プローブを投与後Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ添加前では、ＦＬからＴＭＲへの蛍光励起エネルギー移動が見られ、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ添加によるＩＥＧＲ配列切断後は、ＦＬの蛍光が観測された（図８）。この方法では、最終的にＫ−リンカー−Ｃ−ＦＬのみが受容体にラベルされるため、大幅にサイズを小さくすることが可能であった。
標的タンパク質の単離
Ｋ４プローブを基盤上に固定し、上述の方法でＥ３タグとクロスリンクさせることで、標的タンパク質を単離することができる（図１０）。この際、細胞膜中において、標的タンパク質と会合している別のタンパク質や、標的タンパク質周囲に存在する脂質分子もともに引き抜かれてくる。これらを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型あるいはＥＳＩ型の質量分析器を用いて解析し、標的膜貫通型受容体タンパク質に付着した分子を同定した。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、コイルドコイル２量体を形成する７アミノ酸反復配列がへリックスを構成する模式図を示す。太い矢印が２つのコイルドペプチドのａ−ｄ、ａ−ａ、ｄ−ｄ間の疎水性相互作用を、細い矢印が２つのコイルドペプチドのｅ−ｇ間の静電相互作用を示す。
【図２】図２は、ＧＰＣＲであるＥＰ３βＲを、本発明の方法で標識できるか検討した結果を示す。Ａは、Ｋ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰおよびＥ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰをそれぞれＣＨＯ細胞に一過性に発現させ、Ｋ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰに対してはＴＭＲ−Ｅ３、ＴＭＲ−Ｅ４蛍光プローブを、Ｅ３−ＥＰ３βＲ−ＥＹＦＰに対してはＴＭＲ−Ｋ３、ＴＭＲ−Ｋ４プローブを濃度２０  ｎＭで加え、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った結果である（Ａの下の行。またＡにおいて左から１列目、２列目、３列目、４列目がそれぞれＴＭＲ−Ｅ３、ＴＭＲ−Ｅ４、ＴＭＲ−Ｋ３、ＴＭＲ−Ｋ４プローブの結果である。）。なお、Ａの中央の行はＥＹＦＰの蛍光観察イメージを、Ａの上の行は微分干渉顕微鏡イメージを示す。また、Ｂは、Ｅ３−ＥＰ３βＲをＣＨＯ細胞に一過性に発現させ、蛍光分子ＡＦ４８８でラベルしたＫ４ペプチド（ＡＦ４８８−Ｋ４）、ＴＭＲ−Ｅ４蛍光プローブをそれぞれ２５  ｎＭ加え、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った結果である。
【図３】図３は、本発明の方法の蛍光プローブの使用濃度による標識効率、及び本発明の方法におけるコイルドコイルの安定性を検討した結果を示す。
【００６９】
Ａは、共焦点レーザー顕微鏡観察イメージであり、プローブ（ＴＭＲ−Ｋ４）の濃度に応じて、細胞膜のＴＭＲ蛍光強度が変化する様子を示す（Ａの中央列）。なお、Ａの左列はＥＹＦＰの蛍光観察イメージを、Ａの右列は微分干渉顕微鏡イメージを示す。加えたＴＭＲ−Ｋ４の濃度は、上から順に０、１．５、４．５、９．０、１７．９、２９．７、５８．８、８７．４ｎＭである。【００７０】
Ｂは、各ＴＭＲ−Ｋ３及びＴＭＲ−Ｋ４プローブ濃度における、ＴＭＲ蛍光強度をプロットした結果を示す。見かけの解離定数は、ＴＭＲ−Ｋ４：Ｋｄ  ＝  ６  ±  ２  ｎＭ、ＴＭＲ−Ｋ３：Ｋｄ  ＝  ６４  ±  ３１  ｎＭであった。【００７１】
Ｃは、蛍光ラベルされた細胞を、ＴＭＲ−Ｋプローブを含んでいない培地でｗａｓｈ  ｏｕｔ（１ｍＬ／ｍｉｎ）したあとの相対蛍光強度をプロットした結果を示す。ＴＭＲ−Ｋ３は５０  ｍＬの洗浄で約５０％解離したのに対し、ＴＭＲ−Ｋ４は８０  ｍＬの洗浄後でも約２０％しか解離しなかった。
【図４】図４は、本発明の方法の細胞毒性を検討した結果を示す。具体的には、ＷＳＴ−１アッセイ（２０時間incubate）により、ＴＭＲ−Ｋ３、ＴＭＲ−Ｋ４のＣＨＯ細胞への毒性を調べた結果を示す。棒グラフは左から順にＴＭＲ−Ｋ３を１μＭ、ＴＭＲ−Ｋ３を１０μＭ、ＴＭＲ−Ｋ４を１μＭ、ＴＭＲ−Ｋ４を１０μＭ加えて検討した結果を示す。また、縦軸はViabilityを示す。
【図５】図５は、本発明の方法の蛍光プローブの安定性を検討した結果を示す。具体的には、４℃、０．５％アジ化ナトリウム中で、１００〜１５０μＭ濃度で１ヶ月間保存した後、ＨＰＬＣにより解析して得られたクロマトグラムを示す。上側は保存開始時、下側は３０日間保存した後のデータを、左側はＴＭＲ−Ｋ３、右側はＴＭＲ−Ｋ４のデータを示す。
【図６】図６は、本発明の方法で標識したＧＰＣＲ（ＴＭＲ−Ｋ４プローブでラベルされた、ＣＨＯ細胞に発現したＥ３−ＥＰ３βＲ）の、シグナル伝達能を検討した結果を示す。Ａの左図は、ＴＭＲ−Ｋ４プローブでラベルされた細胞（すなわち、Ｅ３−ＥＰ３βＲを発現したＣＨＯ細胞）を示し、Ａの右図は、当該Ｅ３−ＥＰ３βＲを発現したＣＨＯ細胞のみが、ＥＰ３βＲのリガンドであるＳｕｌｐｒｏｓｔｏｎｅ投与によって蛍光強度を増しており、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す。Ｂは、ＴＭＲ−Ｋ４プローブでラベルされた細胞及びラベルされていない細胞の蛍光強度を示すものであり、ラベルされた細胞のみ、Ｓｕｌｐｒｏｓｔｏｎｅ投与によって蛍光強度を増している。
【図７】図７は、アゴニストを作用させることで細胞内に取り込まれ得るＧＰＣＲを、本発明の方法により検出可能であることを示す。具体的には、ベクターｐｃＤＮＡ３／Ｅ３−β２ＡＲ−ＥＹＦＰを導入して発現させたＣＨＯ細胞に対し、ＴＭＲ−Ｋ４を２０ｎＭ加え、さらにβ２ＡＲアゴニストであるイソプロテレノールを添加する検討を行った結果を示す。Ａはイソプロテレノール添加前の、Ｂはイソプロテレノール１０μＭ添加３０分後のイメージを示す。Ａ及びＢにおいて、下側はＴＭＲ−Ｋ４の蛍光観察イメージを、中央はＥＹＦＰの蛍光観察イメージを、上側は微分干渉顕微鏡観察イメージを示す。
【図８】図８は、コイルドコイルを化学的手法によりさらに安定化させ、当該コイルドコイルを切断してその大きさを小さくする方法を示す。
【図９】図９は、コイルドコイルの架橋のためのリンカーとして用いられる化合物である、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳの化学式及び分子量を示す。
【図１０】図１０は、本発明のコイルドコイルを利用した標識方法を応用して、膜貫通型受容体タンパク質及びそれに付着した分子を質量分析装置で解析することで、当該膜貫通型受容体タンパク質に付着した分子を同定する方法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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