(57)【要約】  本発明は、ポリマー粒子の微小球を結晶性の薬物で負荷するために、結晶化抑制剤の存在下で負荷を行い、それによって薬物の結晶化を抑制する方法に関する。本発明はとりわけ、ポリマーのビーズをパクリタキセル、イブプロフェンおよび／またはデキサメタゾンで負荷するのに有用である。ポリマーは陰イオン性ポリビニルアルコールポリマーであってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非水溶性で非油溶性のポリマーの膨潤性ビーズを、ビーズに浸透可能な有機溶媒の中で、結晶性の薬物の溶液と接触させることにより、薬物をビーズ中に吸収させる方法であって、前記溶液はさらに、前記薬物の結晶化を抑制する結晶改質剤を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ビーズから過剰な溶媒を除去することによって、乾燥した負荷されたビーズが生産され、前記除去は、好ましくは、ビーズ／液体の分離を行う工程と、前記溶媒の蒸発または昇華を行う工程を含む工程によって行われ、より好ましくは、昇温下でおよび／または減圧下で、蒸発を行う工程によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記乾燥した負荷されたビーズが、過剰な水系保存液と接触させられることによって、平衡に達するまで膨潤し、続いて、加熱されることによって滅菌され、前記加熱は、好ましくは90℃以上の温度で5秒間以上行われ、より好ましくはオートクレーブ中で121℃の温度で15分間以上行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記結晶改質剤が、81℃を越える沸点を有し、好ましくは90℃を越える沸点を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記結晶改質剤が、前記有機溶媒と混和性であり、好ましくは油またはグリコールであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記油が、ダイズ油、ケシの実油、ヒマワリ油、およびミネラルオイルから選択されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記油がヨード化されていることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒が、揮発性溶媒であり、好ましくは90℃未満の沸点を有し、より好ましくは80℃未満の沸点を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒が、１価のＣ１−１２脂肪族アルコールから選択され、好ましくはエタノールまたはプロパノールであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液中の薬物の濃度が、1〜1000 mg/mlの範囲であり、好ましくは10〜500 mg/mlの範囲であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液中の結晶改質剤の濃度が、前記薬物に基づき、1〜99重量％の範囲であり、好ましくは5〜50重量％の範囲であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
薬物の負荷効率が、前記ビーズと接触した全薬物と前記ビーズ中に負荷された薬物の量に基づき、1〜100％の範囲であり、好ましくは5％以上であり、より好ましくは10％以上であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記負荷の工程における薬物対ポリマーの重量比が、10:1〜1:10の範囲であり、好ましくは2:1〜1:2の範囲であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーが、陰イオンによって荷電しており、前記陰イオンは、好ましくはスルホン酸基、ホスホン酸基、およびカルボン酸基から選択され、より好ましくはスルホン酸基から選択されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、架橋されたポリビニルアルコールであり、好ましくは、エチレン系不飽和ポリビニルアルコールマクロマーをエチレン系不飽和コモノマーと共重合させることによって形成されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記膨潤性ビーズが実質的に球形であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ビーズが、前記方法の最初の時点において、20℃にてリン酸緩衝液中で平衡に達するまで膨潤すると、平均直径が50〜1500μｍの範囲となるようなサイズを有し、好ましくは、平均直径が100〜1200μｍの範囲となるようなサイズを有していることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ビーズが、20℃にてリン酸緩衝液中で平衡に達するまで膨潤すると、ビーズのうちの90重量％の直径が300μｍ以下の範囲内となるようなサイズを有していることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬物が、化学療法剤、抗炎症剤、ステロイド、および鎮痛剤から選択されることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記薬物が、パクリタキセル、イブプロフェン、およびデキサメタゾンから選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
非水溶性で非油溶性のポリマーの膨潤性ビーズと、結晶性の薬物と、前記薬物の結晶化を抑制する結晶改質剤とを含む組成物であって、前記薬物と前記結晶改質剤は前記ビーズ中に吸収され、前記ポリマーは架橋されたポリビニルアルコールであることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
前記結晶改質剤が、81℃を越える沸点を有し、好ましくは90℃を越える沸点を有することを特徴とする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記結晶改質剤が油またはグリコールであることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記油が、ダイズ油、ケシの実油、ヒマワリ油、およびミネラルオイルから選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記油がヨード化されていることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記架橋されたポリビニルアルコールポリマーが、エチレン系不飽和ポリビニルアルコールマクロマーをエチレン系不飽和コモノマーと共重合させることによって形成されることを特徴とする、請求項２１〜２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記ポリマーが、陰イオンによって荷電していることを特徴とする、請求項２１〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
前記ポリマーが、スルホン酸陰イオン基を含むことを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ポリマーが、ホスホン酸陰イオン基を含むことを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ポリマーが、カルボン酸陰イオン基を含むことを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記膨潤性ビーズが実質的に球形であることを特徴とする、請求項２１〜３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
滅菌されており、且つ、過剰な水系保存液をさらに含み、前記水系保存液は前記ビーズと接触しており、前記ビーズは平衡に達するまで膨潤していることを特徴とする、請求項２１〜３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
前記水系保存液がリン酸緩衝液であり、前記ビーズは、平衡に達するまで膨潤すると、平均直径が50〜1500μｍの範囲となるようなサイズを有し、好ましくは、平均直径が100〜1200μｍの範囲となるようなサイズを有していることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ビーズのうちの90重量％が300μｍ以下の範囲内であることを特徴とする、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記薬物が、化学療法剤、抗炎症剤、ステロイド、および鎮痛剤から選択されることを特徴とする、請求項２１〜３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
前記薬物が、パクリタキセル、イブプロフェン、およびデキサメタゾンから選択されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記薬物対ポリマーの比率が、10:1〜1:10の範囲であり、好ましくは2:1〜1:2の範囲であることを特徴とする、請求項２１〜３６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
前記結晶改質剤が、前記ビーズ中の薬物の合計量に基づき、1〜99重量％の範囲で含まれ、好ましくは5〜50重量％の範囲で含まれることを特徴とする、請求項２１〜３７のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達の媒体として用いるためのポリマーのビーズを、薬物で負荷する方法に関する。本方法は、結晶化しやすい薬物をそのような媒体中へ負荷することができるので、バースト効果を最小限にする。好ましい態様においては、ビーズは放射線不透過性である。
【背景技術】
【０００２】
塞栓形成治療では、特定の脈管の意図的な閉塞を引き起こすために、脈管構造へ薬剤を導入する。この種の治療は、特に、動脈と静脈との間の異常な連結（例えば動静脈吻合異常、ＡＶＭ）を阻止するために有用であり、またある種の血管過多の腫瘍に血液を供給する血管を閉鎖し、異常組織を餓死させて壊死と縮小を引き起こすためにも有用である。
【０００３】
塞栓形成の方法は、塞栓形成の程度に応じて、腫瘍の虚血または壊死を引き起こしてもよい。低酸素環境に対する腫瘍細胞の応答は、引き続いて血管形成をもたらすこともあり、その場合、塞栓形成によって減少した腫瘍への血流が補償される。従って、塞栓形成は、続く血管形成性の応答を阻止できる薬剤の投与と組み合わせることが望ましいであろう。さらにこの効果は、塞栓形成によって死滅しなかった細胞において細胞死を引き起こすために、細胞毒性のある薬剤、または他の抗腫瘍性の薬剤の放出と組み合わせることが望ましいかも知れない。固体腫瘍を治療するための、治療剤で負荷されたポリマービーズの塞栓形成剤が多数開示されており、例えば、国際公開公報WO2004/000548、WO2005/087193、PCT/GB2004/003347、およびPCT/GB2005/003431等の文献が挙げられる。
【０００４】
医薬の調剤や調合の技術では油が広く用いられている。ＦＤＡ不活性成分指針（静脈注射、経口カプセル、非経口調合）においては、ダイズ油が広く用いられている。
【０００５】
リピオドール（Lipiodol）は、油性のヨード化されたＸ線造影剤であり、ケシ油を重量比で40％程度までヨード化したものである。リピオドールは、ある種の放射学的研究において、放射線不透過性の物質を直接注入された粘性構造またはその他の構造の輪郭を描くことが求められる場合に用いることができる。 リピオドールはまた、狭い通路内に導入するのに適しており、従って塞栓形成法に用いることもできる。さらに、子宮卵管造影法（ＨＳＧ）にも広く用いられている。ＨＳＧは、子宮と輸卵管の放射線（またはＸ線）造影法で、婦人科における問題点、とくに女性の生殖能力に影響を及ぼす問題点を検出するために行われる。
【０００６】
リピオドールはまた、リンパ管造影法にも用いられるが、これは、リンパ節とリンパ管を調べるもので、特に白血病、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の予後診断のために行われる。リピオドールは、唾液腺や唾液管の疾患を検出するためにも用いられる。
【０００７】
リピオドールは、化学療法との組み合わせにおいても、標識されることなしに広く用いられる。この場合、リピオドールと薬物の乳剤が、細胞毒性剤や他の抗腫瘍剤と共に動脈に注射され、肝細胞癌の高度に選択的な治療に用いられる。
【０００８】
イブプロフェン（ＩＢＵ）は、疎水性の薬物で、多種類の結晶を形成することが知られている。ＩＢＵの結晶の性質は、製剤処理に影響を及ぼすことが知られている（Romero, A Jら、1991 Pharma Acta Helv 66(2) 34-43）。ＩＢＵの結晶の形状は溶媒に依存し、適切な溶媒を選択することによって改善することができる（Garekam HAら、「IBLIの晶癖の改変と、その物理機械的特性」、Drug Dev Ind Pharm 27(8):803-9, 2001）。
【０００９】
われわれは国際公開公報WO2004/000698において、ＩＢＵを含有する微小球を子宮類線維腫の治療に用いる方法を記載した。
【００１０】
他のグループもまた、薬物を封入するための微小球の使用法について記載している。Boudy Vらは、J. Pharm Clin 18(1) (1999) において、インドメタシンで負荷した微小球を予備形成してから、エチルセルロースとポリイソブチレンのコアセルベート混合物を封入した。
【００１１】
Song C. X.らは、Journal of Controlled Release 43(1997) 197-212において、各種の薬物を負荷した、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）のナノ粒子を、乳化／溶媒蒸発法を用いて調製している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、これまでのところ、封入を行う際の薬物の結晶化の問題は解決されていない。  
塞栓性の微小球（ＭＳ）上における結晶の形成は、製品の製造の際に種々の問題を引き起こす。薬物はほとんどがＭＳの内部に取り込まれるものの、薬物の一部は表面に残る。これらが表面上で結晶になると、バースト効果の増大が引き起こされ、高用量の薬物が急激に放出されてしまう。結晶はまた、疎水性相互作用によって、ビーズを互いに凝集させて集塊を形成させ、注射器のハブに固着させてしまうので、ビーズの投与を困難にし、さらにビーズを破壊されやすくして、送達の際にカテーテルの目詰まりを起こしやすくしてしまう。
【００１３】
ＩＢＵ−ビーズを滅菌するため１２０℃にて１５分間オートクレーブする間に、結晶はビーズ表面上で融解すると見られ、ＩＢＵの融点（７８℃）以上での加熱によって油滴を生じる。これらの油滴が核形成の原因となり、バイアルが開封されて製品が外気に曝された時に再結晶化を引き起こす。この結晶は前述のような問題を生じ、使用時のカテーテルとハブの目詰まりや薬物のバースト効果の増大を引き起こす。
【００１４】
ＩＢＵの結晶の特性は、結晶化が起きる際の条件に依存することが示されており、結晶の形成過程を制御して、望ましい特性を有するような希釈剤と共にＩＢＵの組成物を作成する努力が続けられている。ＩＢＵの結晶は、Eudragit R S100 ポリマーの存在下では変化することが見いだされている（Kachrimanisら、1998、「溶媒交換法によって調製したＩＢＵ−Eudragit S100 球状結晶凝集塊の結晶化条件と物理機械的特性」、Int J Pharm 173,61-74）。Rasenackらは、ＩＢＵ結晶を改変する試みとして水溶性の添加物を使用した（「最適化した特性を有するＩＢＵ結晶」、 Int J Pharm 245 (1-2):9-24, 2002）。彼らは、添加物は、ＩＢＵの結晶化の際に形成される水素結合と相互作用できるので、得られる結晶の特性を変化させられるとしている。Francescoらは、ＩＢＵの結晶化を抑制するために低分子量の希釈剤を用いて、経皮システムにおけるパッチの効果と品質を維持し、製品の保存期間を延ばすことを検討している（「ＩＢＵ含有単層経皮パッチにおける結晶化改変剤としてのポリメタクリレート」、 E.J.P.B., 60:61-66, 2005）。彼らは、プロピレングリコールを添加すると、ＩＢＵの結晶化が最大５０日間抑制され、Eudragit E （ＥＵＥ）およびEudragit RL（ＥＵＲＬ）によって、結晶化が１２ヶ月以上防止できたことを報告している。Campbellらにより、乾燥条件または最後の加熱硬化は、結晶化を防止することが報告された。米国特許第4,832,953号において、非水系基質中の懸濁液における、結晶性水和物の生成を防止する方法が記載されている。
【００１５】
ＩＢＵの物理化学的性質に影響を与えるには、適切な多形型を選んだり、適切な晶癖を選んだり、特別な結晶化法を用いたり、結晶形成を改変して核形成過程を遅らせるための希釈剤を含んだ適切な調合を用いたりすればよい。脂質の代謝経路の生化学を利用して、標的化された送達と腫瘍形成性の低減とを可能にするために、ＩＢＵの担体として、脂質が用いられてきた（Lambert DM, 2000, Eur J Pharm Sci 11 Suppl 2: Sl5-27）。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様によれば、非水溶性で非油溶性のポリマーの膨潤性ビーズを、ビーズに浸透可能な有機溶媒の中で、結晶性の薬物の溶液と接触させることにより、薬物をビーズ中に吸収させる方法であって、溶液は、薬物の結晶化を抑制する結晶改質剤をさらに含むことを特徴とする方法が提供される。
【００１７】
本発明の第２の態様によれば、非水溶性で非油溶性のポリマーの膨潤性ビーズと、結晶性の薬物と、薬物の結晶化を抑制する結晶改質剤とを含む組成物であって、薬物と結晶改質剤はビーズ中に吸収され、ポリマーは架橋されたポリビニルアルコールであることを特徴とする組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明において使用される薬物は、一般に結晶化しやすいものであって、例えば、溶媒を（通常は蒸発によって）除去した直後に、あるいは滅菌の工程の後に、吸収された薬物が融点以上の温度へ移行すると液滴を形成し、準安定相となって、遅れて結晶化を起こしやすくなるような薬物である。
【００１９】
結晶性を有する薬物が当業者の間で知られている。本発明が特に有用である薬物群の１つは、例えばイブプロフェンのような、ＣＯＸ（１または２）阻害剤である。そのような結晶形成性の薬物の他の分類としては、例えばパクリタキセルのような、抗腫瘍剤が挙げられる。もう一つの薬物の分類として、例えば抗炎症特性を有するようなコルチコステロイドがあり、一例としてデキサメタゾンが挙げられる。
【００２０】
本発明においてビーズを形成するポリマーは、非水溶性であって、非油溶性でなければならない。ポリマーは、生体分解性であってもよく、その場合、浸食によりポリマー基質の分解が起こって表面から薬物が実質的に放出されてもよいが、好ましくは、ポリマーは実質的に生体安定性（すなわち非生物分解性）である。ポリマーは水によって膨潤可能である。本発明において有用である水膨潤性のポリマーは、室温にてリン酸緩衝液中で膨潤すると、好ましくは平衡量の水を含有し、重量分析によれば、４０〜９９重量％の、好ましくは７５〜９５重量％の範囲の水を含有する。そのような水溶性特性は、一般に、架橋されたポリマーの使用により実現され、この場合、架橋は、例えばファンデルワールス力によって形成されるが、より好ましくは、静電的相互作用（陰イオンと陽イオンの間の引力）によって形成され、もっとも好ましくは、共有結合によって形成される。架橋の密度は、膨潤の工程の際にポリマー分子が相対的に移動できる程度のものでなくてはならない。従ってビーズは、膨潤可能であると定義されてもよく、本特許を請求する方法の開始時点において、膨潤溶媒と接触すると、少なくともある程度まで膨潤可能でなくてはならない。ビーズは、薬物／溶媒液との接触に先立って、あらかじめ部分的に膨潤されていてもよいが、好ましくは、本方法の最初の時点においては実質的には膨潤されていない。
【００２１】
ビーズは、薬物送達への適用に有用なサイズを有している。例えば、5mm以上の直径を有するような非常に大きなビーズを使用してもよいが、ビーズの直径は、好ましくは2mm以下であり、より好ましくは1500μｍ以下である。本方法は、非常に小さなビーズを、例えば、直径が10μｍ未満のビーズや、直径が１μｍしかないビーズを負荷するためにも有用かもしれないが、そのようなビーズは、乾燥状態において、例えば膨潤可能であるような状態においては、取り扱いが難しい。さらに、本発明は、塞栓の形成においてビーズを負荷するために最も有益である。従って、ビーズの直径は、25〜1500μｍの範囲であって、好ましくは、50〜1200μｍの範囲であり、例えば100〜1200μｍの範囲であることが好ましい。
【００２２】
本発明においては、ビーズという語は、あらゆる形状の粒子を含むことが意図されており、例えば、ロッド状、立方体、不規則形、および不均一形の粒子を含む。しかし本発明は、ビーズが球形、回転楕円形、ペレット形、またはディスク形であるときに最も有益である。粒子がペレット形、回転楕円形やディスク形のような非球形の場合は、粒子の最大寸法は、最小直径の３倍以下であり、好ましくは、最小直径の２倍未満であって、例えば約1.5倍以下であることが好ましい。上述したサイズの限定は、膨潤性のビーズのサンプルを、リン酸緩衝液中で室温にて平衡に達するまでビーズを膨潤させる条件で試験し、サイズを光学顕微鏡下で測定することによって決定される。
【００２３】
本材料は塞栓形成に用いるための組成物を形成するのに特に有用である。本組成物は、好ましくは、直径の分布を定義する、特定の粒子サイズの規格を有している。ビーズは、好ましくは、精密に塞栓形成を行えるよう、検量されたサイズの範囲に類別される。粒子のサイズは、室温にてリン酸緩衝液中で平衡化されると、好ましくは100〜1500μmの範囲にあり、より好ましくは100〜1200μmの範囲にある。検量された範囲には、約100〜300μｍの帯域幅の直径を有するビーズが含まれてもよい。サイズの範囲は、例えば、100〜300μｍ、300〜500μｍ、500〜700μｍ、700〜900μｍ、および900〜1200μｍであってもよい。
【００２４】
本発明の第１の態様による方法の一実施態様においては、天然の原料に由来するポリマーが用いられ、原料の例としては、アルブミン、アルギン酸塩、ゼラチン、デンプン、キトサン、あるいはコラーゲン等、いずれも塞栓剤として用いられてきたものが挙げられる。好ましい実施態様においては、本ポリマーは、天然に存在するポリマーまたはその誘導体を実質的に含まない。本ポリマーは、好ましくは、２価以上の架橋性モノマーの存在下で、エチレン系不飽和モノマーを重合させることによって形成される。エチレン系不飽和モノマーは、イオン性モノマー（双性イオン性モノマーを含む）を含んでもよい。
【００２５】
ヒドロキシエチルメタクリレートと、アクリル酸と、例えばエチレングリコールジメタクリレートやメチレンビスアクリルアミドなどの、エタフィルコンＡ系のコンタクトレンズに用いられるような、架橋性モノマーとのコポリマーを用いてもよい。N-アクリロイル-2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-l,3-ジオールとN,N-ビスアクリルアミドとのコポリマーもまた用いることができる。
【００２６】
他のポリマーとしては、例えばイオン置換基を有する、分離媒体またはイオン交換媒体として用いられる種類の、架橋性スチレン系ポリマーがある。
【００２７】
水膨潤性で非水溶性の基質を形成するために使用できるもう一つの種類のポリマーは、例えばグルタールアルデヒドのようなアルデヒド型架橋剤を用いて架橋した、ポリビニルアルコールである。そのような製品のために、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、官能性イオン基を有する化合物を水酸基と反応させてイオン性ペンダント基を供給することによって、イオン性となるようにしてもよい。水酸基と反応させるのに適した官能基の例としては、カルボン酸もしくはその誘導体、またはエステルを形成できるその他の酸性基のような、アシル化剤が挙げられる。
【００２８】
本発明の第２の態様による組成物は、非水溶性で非油溶性のポリマーの膨潤性ビーズを含み、ポリマーはポリビニルアルコールであることを特徴とする。
【００２９】
本発明が特に価値をもつのは、１分子当たり１つ以上のエチレン系不飽和ペンダント基を有するポリビニルアルコールのマクロマーから、エチレン基をラジカル重合させることによってポリマー基質を形成する場合である。ＰＶＡのマクロマーは、好ましくは、例えば非イオン性モノマー、および／または陰イオン性モノマーを含むイオン性モノマーなどの、エチレン系不飽和モノマーと共重合させられる。
【００３０】
ＰＶＡのマクロマーは、例えば、適切な分子量のＰＶＡポリマー、例えば分子量が1000〜500,000 Dの範囲、好ましくは10,000〜100,000 Dの範囲のポリマーに、ビニル系またはアクリル系ペンダント基を供給することによって生成してもよい。アクリル系ペンダント基は、例えばアクリル酸またはメタクリル酸をＰＶＡと反応させて、水酸基の一部を介してエステル結合を形成させることによって供給してもよい。重合可能なビニル基をポリビニルアルコール上に結合させるための、その他の方法としては、例えば米国特許第4,978,713号に記載された方法があり、好ましくは、米国特許第5,508,317号および米国特許第5,583,163号に記載された方法がある。従って、好適なマクロマーは、ポリビニルアルコール骨格を含み、環状アセタール結合を介して（アルク）アクリルアミノアルキル部分が骨格に結合される。実施例１は、そのようなマクロマーの一例である、ネルフィルコンＢという承認名で知られるマクロマーの合成について記載している。ＰＶＡのマクロマーは、好ましくは１分子当たり約２〜２０個、例えば５〜１０個のエチレン系ペンダント基を有する。
【００３１】
ＰＶＡのマクロマーが、イオン性モノマーを含むエチレン系不飽和モノマーと共重合させられる場合、このイオン性モノマーは、好ましくは下記の一般式Ｉで表される。  
Y1BQ1                    Ｉ
上式中、Y1は下式のうちから選択される：
2009524621.tif 000002
CH2=C(R10)-CH2-O-、CH2=C(R10)-CH2 OC(O)-、CH2=C(R10)OC(O)-、CH2-C(R10)-O-、CH2=C(R10)CH2OC(O)N(R11)-、R12OOCCR10=CR10C(O)-O-、R10CH=CHC(O)O-、R10CH=C(COOR12)CH2-C(O)-O-、
2009524621.tif 000003
（上式中、
R10は、水素またはC1-C4アルキル基であり、
R11は、水素またはC1-C4アルキル基であり、
R12は、水素またはC1-4アルキル基、あるいはBQ1であって、ここにBおよびQ1は以下に定義され、
A1は、-O-または-NR11-であり、
K1は、-(CH2)rOC(O)-、-(CH2)rC(O)O-、-(CH2)rOC(O)O-、-(CH2)rNR13-、-(CH2)rNR13C(O)-、-(CH2)rC(O)NR13-、-(CH2)rNR13C(O)O-、-(CH2)rOC(O)NR13-、-(CH2)rNR13C(O)NR13-（ここに、複数の基R13は互いに同じまたは異なる)、-(CH2)rO-、-(CH2)rSO3-のいずれかの基、または、任意に原子価結合Bとの組み合わせであり、rは1〜12であり、R13は水素またはC1-C4アルキル基であり、
Bは、直鎖状のまたは分枝した、アルカンジイル鎖、オキサアルキレン鎖、アルカンジイルオキサアルカンジイル鎖、もしくはアルカンジイルオリゴ（オキサアルカンジイル）鎖であって、任意に１つ以上で全置換に至るまでのフッ素で置換されてもよく、または、Bは、Q1またはY1がBと結合された末端炭素原子を含んでいる場合は、原子価結合であり、
Q1は、イオン基である）。
【００３２】
好ましくは、Q1が陰イオン基である化合物も含まれる。
【００３３】
Q1が陰イオン基である場合、Q1は例えば、カルボキシル基、炭酸基、スルホン酸基、硫酸基、硝酸基、ホスホン酸基、またはリン酸基であってもよい。モノマーは、遊離酸として重合してもよく、あるいは塩として重合してもよい。共役酸のpKaは、好ましくは５未満である。
【００３４】
Q1が陽イオン基である場合に適している基としては、N+R143、P+R153、またはS+R152があり、ここに、複数の基R14は、互いに同じでも異なってもよく、それぞれ、水素、C1-4アルキル、もしくはアリール（好ましくはフェニル）であり、または、複数の基R14のうちの２つは、それらが結合するヘテロ原子と共に、５〜７個の原子を有する飽和または不飽和複素環を形成し、複数の環R15は、それぞれOR14またはR14である。陽イオン基は、好ましくは、持続的に陽イオン性である、すなわち、R14のそれぞれは水素以外である。陽イオン基Q1は、好ましくはN+R143であり、ここにR14のそれぞれはC1-4アルキルであり、好ましくはメチルである。
【００３５】
Q1が両性イオン基である場合、Q1は総電荷を有してもよく、例えば、２価の陰イオン電荷中心と１価の陽イオン電荷中心を有するか、もしくはその逆であってもよく、または、２価の陽イオン電荷中心と１価の陰イオン電荷中心を有するか、もしくはその逆であってもよい。しかしながら、両性イオンは、好ましくは、総電荷を有さず、最も好ましくは、１価の陽イオン電荷中心と１価の陰イオン電荷中心を有する。
【００３６】
本発明におけるQ1として用いうる両性イオン基の例は、国際公開公報WO-A-0029481に記載されている。
【００３７】
エチレン系不飽和モノマーが、例えば両性イオンモノマーを含む場合、それによって粒子の親水性、潤滑性、生体適合性および／または血液適合性が向上することがある。適切な両性イオンモノマーは、我々の以前の国際公開公報WO-A-9207885、WO-A-9416748、WO-A-9416749、およびWO-A-9520407に記載されている。両性イオンモノマーは、好ましくは、2-メタクリロイルオキシ-2'-トリメチルアンモニウムエチルリン酸の分子内錯塩（ＭＰＣ）である。
【００３８】
一般式Ｉのモノマーにおいて、Y1は、好ましくは基CH2=CR10COA1-であり、ここに、R10は、Ｈまたはメチルであって、好ましくはメチルであり、A1は、好ましくはNHである。Bは、好ましくは、炭素原子が１〜１２個、好ましくは２〜６個のアルカンジイル基である。そのようなモノマーとしてはアクリル酸モノマーがある。
【００３９】
エチレン系不飽和モノマー中には、希釈剤モノマー、例えば非イオン性モノマーが含まれていてもよい。そのようなモノマーは、酸性基のpKaを調節したり、製品の親水性や疎水性を調節したり、ポリマー中に疎水性領域をもたらしたり、あるいは単に不活性の希釈剤として機能するのに役立つことがある。非イオン性の希釈剤モノマーの例としては、例えば、アルキル（アルク）アクリル酸や（アルク）アクリルアミドがあり、特に、炭素原子数が１〜１２のアルキル基を有する化合物、ヒドロキシ置換またはジヒドロキシ置換された、アルキル（アルク）アクリル酸および（アルク）アクリルアミド、ビニルラクタム、スチレン、およびその他の芳香族モノマー、が挙げられる。
【００４０】
ポリマー基質中では、陰イオンの量は、好ましくは0.1〜10 meq g-1の範囲であり、好ましくは1.0 meq g-1以上である。好適な陰イオンは、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、およびカルボン酸塩などの強酸に由来する陰イオンである。
【００４１】
ＰＶＡのマクロマーが、他のエチレン系不飽和モノマーと共重合される場合、ＰＶＡのマクロマーと他のモノマーとの重量比は、好ましくは50:1〜1:5の範囲であり、より好ましくは20:1〜1:2の範囲である。エチレン系不飽和モノマー中には、陰イオンモノマーが、好ましくは10〜100モル％の範囲で存在し、より好ましくは25モル％以上存在する。
【００４２】
架橋されたモノマーは、例えば、連続的な不混和性担体中の分散層の中で、モノマーの液滴として重合させることによって、粒子状となるように形成されてもよい。膨潤させたときに望みのサイズとなるような粒子を形成するのに適した油中水型の重合化法の例が知られている。例えば、米国特許第4,224,427号は、懸濁剤の存在下で水溶性モノマーを連続的な溶媒相中へ分散させることによって、直径が5 mm以下の均一な球状ビーズ（微小球）を形成する方法を記載している。分散相の粒子のサイズを調節するための安定化剤および界面活性剤が存在してもよい。架橋された微小球は、重合化の後に、既知の方法で回収され、洗浄されて、要すれば任意に滅菌される。この粒子（たとえば微小球）は、好ましくは、水系液体中で膨潤され、サイズに従って類別される。
【００４３】
本発明の第１の態様による方法においては、有機溶媒は、薬物を溶解させ、ビーズ中へ浸透することができる。そのような好適な実施態様においては、薬物を溶解可能であるような有機溶媒が選択される。溶媒を、それ自身が結晶改質剤として働くようにさせ、従って負荷した製品中に残留させることもでき、その場合、有機溶媒は、浸透させるためまたは平衡に達するまで負荷させるために必要な量よりは少ない量で使用してもよい。しかし、取り扱いを容易にするために、溶媒は過剰量で用いることが好ましい。薬物の負荷を行う際には、接触の期間の後に、過剰な溶媒を、負荷されなかった薬物と過剰な結晶化抑制剤とともに、ビーズ（膨潤していてもよい）から互いに分離させてもよい。適切な分離法には、通常、遠心および／または濾過のような固体−液体分離法が含まれる。通常は、それに続いて、例えばビーズを加熱するおよび／または減圧することによって、溶媒をさらに蒸発させる。そのような蒸発法が用いられる場合には、結晶改質剤は、必要以上に失われてしまうことのない程度に不揮発性であることが必要である。
【００４４】
好ましい方法においては、過剰な有機溶媒の除去に続いて、乾燥した負荷されたビーズは水系の保存液と接触させられ、保存液は、好ましくはビ−ズに浸透するよう過剰量であって、好ましくは平衡に達するまでビーズを膨潤させることができ、ビーズの外には、そこへビーズを懸濁することのできる液体、あるいは実際にビーズの懸濁した液体が存在してもよい。ビーズは、好ましくは、そのような水系保存液に懸濁された状態で、懸濁液を入れた容器を加熱することによって滅菌され、例えば、90℃以上にて、より好ましくは、100℃以上にて加熱されてもよく、好ましくは、５秒以上の時間にわたって、より好ましくは15分以上の時間にわたって121℃にて加熱されてもよい。
【００４５】
結晶改質剤として、有機溶媒とは不混和性である材料を用いることもできるが、この場合、負荷を行う段階で、結晶改質剤の溶媒中での分散液が用いられる。そのような分散液は、液中液分散液でもよく、通常はエマルジョン（すなわち比較的安定な二相性液体）であるか、あるいはそれほど安定ではないが撹拌などの物理的手段によって液中液懸濁液として維持されるような懸濁液であってもよい。結晶改質剤は、好ましくは液体であり、実質的に有機溶媒と混和性である。過剰な溶媒は蒸発を含む手段によって除去されることが好ましいので、結晶改質剤は、好ましくは溶媒除去の条件下において実質的に不揮発性である。結晶改質剤は、好ましくは81℃を越える沸点を有し、より好ましくは90℃を越える沸点を有している。好ましい実施態様の場合のように、本方法に滅菌工程が含まれるときは、結晶改質剤の材料はその滅菌の条件下においても安定でなくてはならない。この材料は、保存用および／または送達用媒体に対して等浮揚性となるよう、密度を考慮して選択してもよく、それによって、保存液の中で懸濁液となってもよく、および／または、患者への送達の直前に調製される造影剤との混合物の中で懸濁液となってもよい。一実施態様において、結晶改質剤の密度は、水の密度より僅かに高く、たとえば1 .01〜1.30 g/mlの範囲である。これは例えばリピオドールが結晶改質剤として用いられる場合に当てはまる。あるいは、異なる実施態様においては、結晶改質剤は水よりも密度が低くてもよい。２種以上の成分を結晶改質剤として用いてもよい。
【００４６】
不揮発性の混和性材料の例としては、油やグリコールやグリコールエーテルがある。グリコールの一例はグリセロールである。油の例としては、ダイズ油（密度0.91〜0.92 g/ml）、綿実油、アーモンド油、ヒマワリ油（密度0.92 g/ml）、ケシの実油、およびミネラルオイル（密度0.84〜0.87 g/ml）が挙げられる。
【００４７】
特に好適な実施例においては、結晶改質剤は、造影剤として有用な性質を有し、例えば放射線不透過性の材料であり、そのため、患者への組成物の送達に続いて放射線造影法を行うことができる。本発明の極めて好適な実施例においては、結晶改質剤は、放射線不透過性の油系材料であり、例えば、ヨード化脂肪酸の低級アルキルエステルのようなヨード化油やその混合物でもよく、それらの例として、リピオドールやエチオドール（Ethiodol）が挙げられる。リピオドールは、ヨード化されたケシの実油と、少しの非ヨード化油性安定剤とからなっている。リピオドールは約38〜42重量％のヨウ素を含み、それらの一部はジヨード化誘導体となり、一部はモノヨード化誘導体となっている。
【００４８】
本発明の方法においては、有機溶媒は、好ましくは１価のＣ１−１２脂肪族アルコールから選択され、好ましくはエタノールとプロパノールから選択される。溶媒は、好ましくは結晶改質剤と比べてより揮発性でなくてはならない。穏和な条件下での有機溶媒の除去、たとえば、低温下、好ましくは低圧化での蒸発を含む方法での除去が可能となるように、有機溶媒は、90℃未満の沸点を有することが好ましく、80℃未満の沸点を有することがより好ましい。
【００４９】
本方法は、多様な薬物とともに用いるのに適している。薬物の負荷量は、所望の用量に依存し、薬物の活性、ビーズからの放出の特性、および治療すべき適応症に関する知見に基づき、当業者が適宜選択してもよい。同様に、負荷混合物中の薬物の濃度も、所望の薬物負荷に従って選択される。負荷溶液中の薬物の濃度は、好ましくは1〜1000 mg/mlの範囲であり、好ましくは10〜500 mg/mlの範囲である。負荷溶液には、最終産物において結晶形成を適度に調節するのに充分なだけ残存できるような量の、結晶改質剤が含まれていなければならない。この量は当業者が決定することができ、そのためには、異なる量の薬物と結晶改質剤とを特定の種類のポリマー中に負荷し、薬剤組成物を処理するのと同じ方法で処理して、薬物の結晶化に所望の効果を及ぼす、すなわち結晶化の発生を防止するのに最低限必要な改質剤の量を決定する、という一連の試験を行ってもよい。適切な結晶改質剤（すなわち結晶化防止剤）の量は、ビーズ中の薬物の合計量に基づき、1〜99重量％の範囲であり、好ましくは5〜50％の範囲である。
【００５０】
適切な薬物対ポリマーの比率は、ビーズ中の乾物（すなわちポリマー）に基づき、10:1〜1:10の範囲であり、好ましくは2:1〜1:2の範囲である。
【００５１】
本発明の方法は、とりわけ、パクリタキセル（ＰＴＸ）、イブプロフェン、およびデキサメタゾン（ＤＥＸ）で負荷したビーズを生産するのに適していることが分かっている。薬物と油で負荷したビーズは、ビーズ表面上での結晶の形成が抑制されるという利点を有している。また、ビーズの内部での結晶の形成も抑制されていると考えられ、そのため、ビーズ中での薬物のより均等な分布がもたらされる。ＰＴＸ負荷ビーズは抗腫瘍性塞栓剤として作用してもよく、他方、ＩＢＵおよびＤｅｘ負荷ビーズは、抗炎症性作用を有するとともに、ＣＯＸ阻害における作用様式を介した抗腫瘍性作用も有していてもよい。結晶形成を減少させることの利点としては、例えば、ビーズ表面の結晶に起因するバースト効果の低減、注射器に用いられるプラスチック等の包装へのビーズの付着性の低減、包装中およびカテーテル中での自己凝集性の低減、それによる負荷の均質性や送達可能性の向上、などが挙げられる。加えて、改質剤が存在することによって安定性が向上し、従って製品の保存期間が延びる可能性もある。油系造影剤（リピオドールのようなヨード化油）を結晶改質剤として使用することは、送達の際にビーズを可視化することを可能にし、塞栓形成後にはビーズの追跡を可能にするという利点ももたらすことができる。ヨード化油は、水よりも高い密度を有し、結晶改質剤として用いると薬物で負荷した微小球の総密度も増加させるので、送達のために通常用いられる生理的食塩水と造影剤との混合物中にビーズを加えたときの懸濁性を調節することができる。リピオドールは15℃にて1.280 g/mlの密度を有している。
【００５２】
本発明においては、ＦＤＡによって不活性成分として承認された油を使用することが好ましく、それらの油は、イブプロフェン、パクリタキセル、およびデキサメタゾンの結晶生成を変化させることが見いだされている。本発明の利点の一例として、ビーズの凝集と、取り扱いおよび送達の際に用いられるプラスチックへの付着とを低減させる効果が挙げられる。さらに、リピオドールが結晶改質剤である場合、放射線造影法によってビーズを可視化できることが示されており、有用な複数の特性の有意義な組合せがもたらされる。結晶改質剤として高密度油を用いると、負荷ビーズの密度を、水系の保存媒体の密度に近くなるまで調節できるので、送達に先立って負荷ビーズを生理的食塩水および／または造影剤と混合しても直ぐに沈降してしまうことがない、というさらなる利点も得られる。従って、本発明においては、製品ビーズは、塞栓形成に一般的に用いられる方法を用いて投与することができ、任意に、放射線造影法によってさらに可視化を行うために追加の造影剤に懸濁してもよい。
【実施例】
【００５３】
本発明について以下の実施例によって説明する。
【００５４】
〔比較例：ＩＢＵ負荷Bead Block（ＩＢＵ−ＢＢ）の調製〕
サイズが500〜700μｍで、滅菌注射器にて2 mlのビーズとして供給される市販製品のビーズである「Bead Block(商標)」を用いて、ＩＢＵで負荷されたビーズを製造した。そのようなビーズの製造については、国際公開公報WO2004/000548の実施例１において「低ＡＭＰＳ」製品として記載されている。簡潔に述べると、アセタール結合したエチレン系不飽和基と2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸とを重量比約12:1で含むポリビニルアルコールマクロマーの水系混合液を、セルロースアセテート酪酸塩安定化剤を含有する酢酸ブチルの連続相中で撹拌器を用いて懸濁し、レドックス開始を用いたラジカル重合を行ってビーズを形成させ、得られたビーズを洗浄し、染色して、サイズ分画に従ってふるい分けした。そのうち500〜700μｍ分画と700〜900μｍ分画を以下の実施例で使用した。Bead Blockを、１瓶当たり2 mlの分量でガラスバイアルへ移した。次に、余剰の生理的食塩水を除去し、ビーズを凍結乾燥させた。ＩＢＵ／エタノール溶液を、所要の最終濃度となるよう調製した。この溶液1 mlを凍結乾燥したビーズに加えて1時間かけて（静置して）負荷した。その後、余剰の負荷溶液を除去し、ビーズ試料を45℃の真空オーブン中で一晩乾燥させた。乾燥試料に2 mlの水を加えてビーズを水和させ（図１Ａ）、121℃で15分間オートクレーブして滅菌した（図１Ｃ）。図１Ｃには、比較例を用いた負荷を行った後のビーズ（注：１Ｄに比べてビーズの不透明度にばらつきがある）によるイブプロフェンの不均一な取り込みと、溶液中に生じた薬物の結晶が示されている。
【００５５】
〔実施例１：ＩＢＵ−リピオドール負荷微小球（ＩＢＵ−ＬＢＢ）の調製〕
ビーズを、次の２つの点を除いて比較例と同じ方法で負荷した。負荷溶液はリピオドール（Ｌ）の33％ＩＢＵ／エタノール中溶液からなることと、150 rpmに設定した振盪器上で1時間かけてビーズ試料を振盪したことである。余剰の負荷溶液を除去し、試料を50℃の真空オーブン中で一晩乾燥させた。その後、負荷ビーズを2 mlの水で水和させ、比較例と同様にして蒸気滅菌した。  
この方法で製造された最初の微小球（ＩＢＵ−ＬＢＢ）は、スラリー状であって、肉眼では青／白のビーズであった。それらの微小球はガラスバイアルに付着せず、ビーズ表面での白色の結晶の生成は認められなかった。
【００５６】
＜サイズと画像分析＞  光学顕微鏡を用いてビーズのサイズを測定し、Colour View IIIビデオカメラを用いてビーズを可視化した。ビーズは、凍結乾燥の前に球状の形態を回復し、不透明に見え（肉眼では白／青）、均一な外観を有していた（図１Ｂおよび１Ｄ）。これらの微小球のサイズの分布を最初のビーズと比較した（図２）。
【００５７】
＜溶出＞  水和水を取り出し、ＨＰＬＣバイアル中に入れて、製造途中での薬物の損失を求めた（希釈なし）。各バイアル（2 mlのビーズ）を200 mlのＰＢＳ中へ24時間かけて溶出させた。所定の時点（10、20、40、60分後、および、2、4、24時間後）において、溶液の1 mlを取り出してＨＰＬＣバイアルに入れ、薬物の溶出、分解および純度を求めた。ビーズ中へ負荷された薬物の量は、リピオドールの添加をしない場合の量と同様であった。ＩＢＵの純度は99％を越えており、ＩＢＵによる干渉はなかったことを示している。溶出後のビーズの画像は、ＩＢＵ負荷ビーズ（図１Ｄ）の外観と同様な不透明なビーズを示していた。このことは、リピオドールのビーズによる取り込みが、不透明色に寄与しており、ＰＢＳ中へは溶出しないことを示している。
【００５８】
＜送達可能性試験＞  ビーズの送達可能性の試験を、臨床環境における実施可能性試験と同様にして行った。50:50の割合のVisipaque 320と水から10 mlの造影剤を調製した。混合液の9 mlをバイアルに加えた。試料の3 mlずつを用いて、2.7Fr Progreat(登録商標)カテーテルを使用して3回の注射を行った。
ＩＢＵ−ＬＢＢビーズは、バイアルを開封したときに凝集せず、生理的食塩水中で自由に分散した。700〜900μｍのビーズは、送達可能性試験により、2.7Fr Progreatマイクロカテーテルから問題なく送達できることが示された。
【００５９】
〔実施例２：ＩＢＵと濃度5％および30％のリピオドールとで負荷されたビーズを使用したときの水和媒体とその種類および液量の効果〕
本実施例は、ビーズによる水の取り込みの程度と、用いる水和媒体の効果を調べるために行われた。サイズが700〜900μｍのBead Blockを、5％または30％のリピオドールを含有するＩＢＵエタノール溶液を用いて、実施例１と同じ一般的な方法によって1時間かけて負荷した。余剰の負荷溶液を除去し、50℃に設定した真空オーブン中で試料を一晩乾燥させた。2 mlの水、3 mlの水、または2 mlの生理的食塩水のいずれかを用いて試料を水和させ、続いて121℃で15分間かけて蒸気滅菌した。  
実施例１に記載した方法でサイズを測定した。サイズ分布のヒストグラムが図３Ａ〜Ｅに示されている。各グループは、対照のビーズ（凍結乾燥と負荷の前）と比較して統計学的に有意な差（p < 0.0001）を有していた。5％リピオドールを含む2 mlの水を使用した場合と、30％リピオドールを含む2 mlの生理的食塩水を用いた場合との間に有意差はなかった（p = 0.5158）。両方の場合において、サイズの範囲は、許容されるサイズ分布の指針の範囲内に収まっており、全体的にはより高いビーズのサイズの方へシフトしていた（図２）。
【００６０】
＜500〜700μｍビーズおよび700〜900μｍビーズ上のＩＢＵ−5％ＬＢＢおよびＩＢＵ−30％ＬＢＢからの溶出＞
実施例２に従い、水和水を取り出し、ＨＰＬＣバイアル中に入れて、製造途中での薬物の損失を求めた（希釈なし）。各バイアル（2 mlのビーズ）を200 mlのＰＢＳ中へ24時間かけて溶出させた。所定の時点（10、20、40、60分後ならびに2、4、24時間後）において、溶液の1 mlを取り出してＨＰＬＣバイアルに入れ、薬物の溶出、分解および純度を求めた。その結果、サイズが700〜900μｍのビーズについては、5％リピオドールを用いたビーズと30％リピオドールを用いたビーズとの間で溶出速度に違いはなかったことが示された。図４Ａは、両方のリピオドール濃度について、最初の2時間のうちに、全ＩＢＵ用量の99％を越える量が、サイズが700〜900μｍのビーズから溶出したことを示している。500〜700μｍの範囲についても同様に、最初の2時間で99％を越える量が溶出したが、30％リピオドールを用いた場合の方が、より早い溶出の方へ少しシフトしていた（図４Ｂ）。
【００６１】
〔実施例３：種々の濃度のリピオドールを含有するＩＢＵビーズの圧縮試験〕
サイズが700〜900μｍのBead Blockを、5％、30％、50％、70％、80％、90％のリピオドールを含むＩＢＵエタノール溶液で1時間かけて負荷した。余剰の負荷溶液を除去し、試料を50℃に設定した真空オーブン中で一晩乾燥させた。試料を2 mlの水で水和させ、続いて121℃で15分間かけて蒸気滅菌した。  
5％、30％、70％リピオドールを用いたＩＢＵ−ビーズの圧縮試験が図５に表されており、各リピオドール濃度のＩＢＵ−ＬＢＢは、リピオドールなしの比較製品と同様であって、いずれも、水で水和すると、Bead Blockに比べて圧縮性が高かったことが示されている。30％リピオドールＩＢＵ−ＬＢＢの水和に生理的食塩水を用いた場合は、負荷を行わなかった対照よりも圧縮性が高かった。
【００６２】
〔実施例４：ヒマワリ油で負荷した微小球の調製〕
リピオドールの代わりに33％のヒマワリ油／エタノール溶液を用いて、実施例１に記載した方法でBead Blockを負荷した。ビーズは実際に油を取り込み、色を白／青に変化させた。この濃度では、水相の中に油滴が認められた。顕微鏡で観察すると、ＩＢＵ負荷ビーズ（図１Ｄ）と同様の外観であった。
【００６３】
〔実施例５：Ｘ線透視検査のための、薬物なしでの各種濃度のリピオドールによる負荷〕
前述のＩＢＵ／リピオドール溶液の場合（実施例３）と同様の方法において、ＩＢＵ／リピオドール溶液を30％、50％、70％、80％、90%の各濃度のリピオドール／エタノール溶液に置き換えて、700〜900μｍビーズを用いて試料を調製した。100％リピオドール試料は、ビーズにリピオドールを直接加えて1時間かけて調製した。続いて余剰液を除去してから、エタノールで軽く一度洗浄した。ＩＢＵ／リピオドールビーズについて記載したのと同様にして、余剰のエタノールを除去し、乾燥させ、水和させて、蒸気滅菌した。試料をＸ線透視法で観察した。ビーズはＸ線で観察可能であって、異なるビーズの間で明白な違いは見られなかった。
【００６４】
〔実施例６：種々の油性希釈剤を使用したＩＢＵの負荷〕
リピオドール、ダイズ油、綿実油、ミネラルオイル、アーモンド油のいずれかを5％含有するＩＢＵエタノール溶液を用いて、サイズが500〜700μｍのBead Blockを1時間かけて負荷した。余剰の負荷溶液を除去し、試料を50℃に設定した真空オーブン中で2時間かけて乾燥させた。全ての試料を水で水和させ、続いて121℃で15分間かけて蒸気滅菌した。  
全てのバイアルは、油の種類に関わらず肉眼でも画像解析でも同様に見えた。５種類の油の全てについて、実施例２に記載したのと同様にして溶出試験を行った。24時間で溶出した総用量は25 mg/mlビーズ±5 mgであった（図６Ａ）。その結果、綿実油を除く全ての油は同様の溶出プロフィールを示したが、綿実油は溶出速度を遅くしてしまうようであった。綿実油を除く全ての油が最初の1時間のうちに85％溶出し、綿実油は72％だけ溶出した。全ての試料で4時間以内に99％を超える量が溶出した（図６Ｂ）。  
ビーズのサイズは、それぞれの油の間で互いに、またリピオドールに対して、統計学的に有意な差がなかった（図７）。
【００６５】
〔実施例７：市販の他の塞栓形成性ビーズの負荷〕
市販の塞栓形成性ビーズである、Embosphere（直径が700〜900μｍでコラーゲンにより被覆されたトリスアクリル／ゼラチン微小球の製品）、Embogold（直径300〜500μｍの製品）、Contour SE（直径500〜700μｍの非イオン性架橋ポリビニルアルコールの製品）といった微小球を、同一のＩＢＵ／エタノール／5％リピオドール負荷溶液（125 mg/mL）を用いてＩＢＵで負荷した。負荷の手順は実施例２に記載したものと同様である。  
外見的には、Bead Blockの場合を除いてビーズの色は変わらなかったが、Bead Blockは典型的な青／白の色に変化した。Embosphereは非常にガラスバイアルに付着しやすい傾向を示した一方、Contour SEは相当な凝集を示した。付着性と凝集の両方とも、ビーズ表面のＩＢＵの結晶と関連していた。溶出後の画像から、Embosphereは僅かに不透明であって（図９Ｂ）、Embogoldは（非常に不透明なBead Block（図９Ａ）に比べて）透明な赤色であったことが示されており、これらのことは、リピオドールの取り込みが少なく、結晶形成の抑制が低いことを示している。Contour SEは不透明であったが、ほとんどのビーズは凝集して油の被膜に封入さていた（図９Ｃ）。このことはビーズの不透明色はＩＢＵの取り込みのためであったことを示唆している。凝集は、凍結乾燥段階の後でのビーズ表面のＩＢＵによって引き起こされたのかもしれない。リピオドールによるContour SEの封入は、ＩＢＵの溶出が遅いことに現れていた（図８）一方、その他の種類のビーズは、いずれも最初の2時間で98％を超える量が溶出していた。
【００６６】
〔実施例８：リピオドールBead Blockへのパクリタキセル（ＰＴＸ）の負荷〕
ＰＴＸ負荷ビーズを実施例２に記載したのと同じ方法で調製した。Bead Block（500〜700μｍと700〜900μｍ）をまず2 mlガラスバイアル中へ取り分けた。次に余剰の生理的食塩水を除去し、ビーズを凍結乾燥させた。ＰＴＸ−リピオドール−エタノール溶液を所要の最終濃度となるよう調製し、続いて凍結乾燥したビーズに加えて、プレート振盪器上で150 rpmにて1時間かけて負荷させた。そして余剰の負荷溶液を除去し、ビーズ試料を真空オーブン中で45℃にて一晩乾燥させた。乾燥した試料に2 mlの水を加えてビーズを水和させ、続いて121℃で15分間オートクレーブして蒸気滅菌した。  
負荷されたＰＴＸを超音波処理下でＤＭＳＯを用いて抽出して、ＰＴＸの負荷量を決定した。抽出液をＨＰＬＣで分析した結果が、以下の表１に示されている。
【００６７】
＝＝＝表１：リピオドールBead BlockにおけるＰＴＸの負荷効率＊＝＝＝
2009524621.tif 000004
＊リピオドールは負荷溶液中では23％(v/v)である。
【００６８】
〔実施例９：リピオドールBead BlockからのＰＴＸの溶出〕
実施例８の試料３および４をＰＴＸの溶出試験に用いた。1.2 mlの各試料を200 mlのＰＢＳ緩衝液と回転混合器上で室温にて混合した。所定の時間間隔で50または100 mlの溶液を除去して、50または100 mlの新しいＰＢＳを添加した。ＨＰＬＣ処理後の溶出プロフィールが図１３に示されている。
【００６９】
〔実施例１０：リピオドールを使用したデキサメタゾン（Ｄｅｘ）の負荷と溶出〕
Ｄｅｘ負荷溶液（5 mg/ml）をエタノール中で調製した。この溶液を用いて実施例１に記載した方法でビーズを負荷した。対照として、リピオドールを使用せずにＤｅｘエタノール溶液で別のビーズを負荷した。  
リピオドールを使用しないで負荷したビーズはＤｅｘを取り込まなかったことが、画像によって示された。ビーズの表面にはＤｅｘの結晶が存在していた（図１１Ａ）。ＩＢＵ−リピオドールを用いて負荷したビーズは不透明であって、ビーズ表面に結晶は認められなかった（図１１Ｂ）。
【００７０】
〔実施例１１：異なるビーズを用いた負荷と溶出〕
２種類のイオン交換樹脂（Amberlyst（SIGMA社、スルフォン酸系、交換容量1.9 mg/ml）および Amberlite（Sigma、IRA700（クロライド）四級アンモニウム基含有スチレン−ＤＶＢ樹脂、総交換容量1.4 mg/ml、密度 0.7 g/ml））をＩＢＵ−リピオドールで負荷した。負荷と溶出の手順は実施例１と同様に行い、100 mg/mLのＩＢＵを含有する溶液を使用した。  
AmberliteによるＩＢＵの取り込みは、ビーズ当たり1 mg/mL未満であった（図１２Ｂ）。Amberlystは、約15 mg/mLのＩＢＵで負荷された（図１２Ａ）。
【００７１】
〔実施例１２：ヒツジ子宮動脈の塞栓形成炎症モデルにおける、イブプロフェンと結晶化抑制剤としてダイズ油とを含有する塞栓形成性ビーズの使用〕
ヒツジの子宮動脈において、塞栓形成後の12週間にわたってイブプロフェン負荷ビーズの効果を評価した。血管の塞栓形成は、疼痛や炎症などを含む種々の副作用を引き起こすことがある。本実施例の目的は、ヒツジ子宮動脈モデルにおいて、結晶化抑制剤としてダイズ油を含有するイブプロフェン負荷ビーズからのイブプロフェンの放出と、異物炎症反応に及ぼす効果とを評価することであった。以下の事項が評価された。  
・血管網内におけるビーズの特性と分布。  
・塞栓形成性ビーズに対する異物炎症反応に及ぼすイブプロフェン／ダイズ油の放出の効果。  
・ビーズ中に存在するイブプロフェンの量の時間経過。
【００７２】
＜方法＞
本実施例で試験したのは、実施例6で記載したものと同じく、結晶化抑制剤としてダイズ油を含有する、イブプロフェンで負荷したビーズ（イブプロフェンビーズ）である。イブプロフェンビーズと同様の方法で処理した製造対照である未負荷のBead Blockの微小球と比較して、試料の試験を行った。2 mlのビーズを比較例１に記載したのと同様に凍結乾燥させ、10容量％のダイズ油と400 mgのイブプロフェンとを含有するエタノール1 ml中に入れた。実施例６と同様の処理を行ってから、抽出とＨＰＬＣ分析を行った結果、最終製品は、水和したビーズ1 ml当たり125 mgのイブプロフェンと約10 mgのダイズ油を含んでいた。
【００７３】
妊娠しておらずホルモン的に妊娠可能な状態にある24頭の成体のPre-Alpesヒツジを、未負荷のBead Blockの群（対照群、ＢＢ；500-700μｍ）と、イブプロフェン負荷ビーズの群（試験群、イブプロフェンビーズ；500-700μｍ）の２つに分けた。各群を４つの時点（24時間、1週、3週、12週）に分割し、各時点で３頭ずつとなるようにした。
【００７４】
臨床で用いられるのと同じシ−ス、カテーテル、ガイドワイヤを使用して、塞栓形成を実施した。標準的なセルディンガー法により無菌的条件下で4-Fr血管シースを大腿動脈内に挿入した。4-Frのピッグテールカテーテル（Optitorque Radifocus、Terumo社）を腸骨動脈分枝の位置に留置し、デジタル減算大動脈造影法を行って、卵巣および子宮の動脈を同定した。4-Frのコブラ型カテーテル（Radiofocus血管造影カテーテル、Terumo社）を使用して、対側内腸骨動脈への選択的カテーテル挿入と子宮動脈への超選択的カテーテル挿入を実施した。次に放射線科医により、塞栓形成剤（イブプロフェンビーズまたはBead Block）のうちからランダム化序列に従い選んたものを用いて塞栓形成を行った。
【００７５】
0.5 mL容量のビーズ（Vispaque 270と生理的食塩水との等量混合液中に1/10希釈で懸濁したもの）をＸ線透視下でゆっくりと注入した。0.5 mLのビーズが各々の子宮動脈に送達された時点で塞栓形成が完了したものとした。
【００７６】
組織中でのビーズの分布を評価し、臓器の肉眼観察を実施した。各種炎症細胞に対するＣＤ抗体による免疫組織染色の後にビデオ解析を行うことにより、準定量的なリンパ球の類別を行って、炎症を組織学的に評価した。
【００７７】
＜結果＞
［塞栓形成法］
ビーズの送達は各動物において優秀であった。全ての動物で塞栓形成が成功した。各動物には両方の子宮動脈に0.5 mLずつ（合計1 mL）のビーズが注入された。
【００７８】
［ビーズの性能］
２つのビーズ製品の間で、子宮の異なるゾーンにおける閉塞血管の分布に統計学的な差（p<0.0001、Χ2）があった。すなわち、イブプロフェンビーズは、Bead Blockよりも若干多くの近位の血管を閉塞させた（図１４）。図１４中においては、ＥＭは子宮内膜を、ＭＭは子宮筋層を、ＰＸは近位をそれぞれ表している。血管の直径はイブプロフェンビーズの場合の方が増大していたが（498μｍ対436μｍ、P=0.0001）、閉塞した血管中に見いだされたビーズの平均数には差異がなかった。  
塞栓形成後２４時間と１週間の時点で、イブプロフェンビーズの場合のほうがBead Blockよりも多くの血管の壊死が認められたが（それぞれ、25.8％対4.9％、32.8％対4.3％）、３週間後と３ヶ月後にはどちらの群においても壊死は見いだされなかった。
【００７９】
［炎症反応］
特定の時点において、Bead Blockとイブプロフェンビーズとの間で好中球および好酸球の数にわずかな違いが見られた。１週間の時点で、巨細胞は、イブプロフェンビーズの場合の方がBead Blockよりも統計学的により少数であった（p=0.01）。２４時間の時点では、両群ともほとんどリンパ球が認められず、両者の数の間に有意な差はなかった。１週間後には、イブプロフェンビーズの周囲では、Bead Blockと比べて有意にリンパ球の数が少なかった（図１５）。３週間後と３ヶ月後では、リンパ球の数は、イブプロフェンビーズの場合に顕著に増大し、Bead Blockとの間には有意な差がなかった。  
組織スライドの幾つかにおいては、ＢＢとイブプロフェンビーズの両製品の再吸収の兆候として、明らかな食作用、巨細胞の数の増加、およびＣＤ４とＣＤ８の持続的な存在が認められた。このことは、以前のＰＶＡ塞栓形成剤を用いた長期的な観察結果からすると予測できたことであった。
【００８０】
［ＣＤマーカー］
１週間目の時点で、イブプロフェンビーズ群においてＣＤ１７２ａ陽性細胞の数が低下していたことから、炎症反応が低減したことが確認された。さらに、結晶化抑制剤を添加してもＣＤ８陽性Ｔ細胞やＣＤ２１Ｂ細胞の浸潤は生じなかったことから、最適化されたイブプロフェンビーズの処方には副作用がないことが分かった。その他のＣＤマーカーは両群の間で差異がなかったが、３ヶ月後の時点で、ＣＤ１７２，ＣＤ３，ＭＨＣ−ＩＩはいずれも低いままであって、「リバウンド作用」はなかったこと、そしてＣＤ２１陽性細胞も好酸球も存在せず、過敏性の兆候もなかったことが、本研究により確認できた。
【００８１】
［イブプロフェンの量］
抗イブプロフェン抗体により特異的に染色された部位が、「レチクル」パターンを有する部位として同定された。高濃度の染色が塞栓形成後24時間の時点で観察された。１週間後もなおイブプロフェンは検出可能であったが、ずっと低い濃度であった。塞栓形成後３週間後と３ヶ月後になると、ビーズ中にイブプロフェンは検出されなかった。
【００８２】
＜結論＞
本実施例から、イブプロフェンビーズを用いた塞栓形成は、塞栓形成性ビーズに対する異物炎症反応を低減できることが確認される。イブプロフェンは、塞栓形成後１週間までビーズ中で検出できるが、３週間後以降は検出されなくなる。さらに、塞栓形成後１週間の時点での炎症反応の低減は、３週間および３ヶ月の時点で炎症反応に対する有害なリバウンド作用をもたらさない。ダイズ油結晶化抑制剤を含有させたことによる明らかな生体内作用は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１ＡおよびＣは、比較例１を使用した場合の、ビーズ表面のイブプロフェンの結晶を示している。図１ＢおよびＤは、油（リピオドール）−実施例１を用いた負荷の後のイブプロフェンビーズを示している。
【図２】図２は、実施例２に記載したように、異なる濃度のリピオドールで負荷した後のイブプロフェンビーズのサイズの分布を、未負荷の対照と比較して示している。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、異なる量の水または生理的食塩水2 mLを用いて水和した後のイブプロフェン負荷ビーズのサイズ分布のヒストグラムを、0.9％生理的食塩水中の対照と比較したものである（Ｗ＝水、ＰＢＳ＝リン酸緩衝液）。実施例２を参照のこと。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例２において、700〜900μｍビーズの負荷に5％と30％のリピオドールを用いたときの溶出プロフィールを示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例２において、500〜700μｍビーズの負荷に5％と30％のリピオドールを用いたときの溶出プロフィールを示している。
【図５】図５は、5％，30％，70％のリピオドールを使用したときのイブプロフェン負荷ビーズの圧縮を、未負荷の対照および油なしで負荷したビーズと比較して示している（実施例３）。
【図６Ａ】図６Ａは、異なる油を用いて負荷した後に溶出したイブプロフェンのＰＢＳ中の濃度を示している（実施例６）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、異なる油を用いて負荷したビーズから溶出したイブプロフェンの％を示している（実施例６）。
【図７】図７は、異なる油を用いてイブプロフェンで負荷した後の500〜700μｍビーズのサイズ分布を示している（実施例６）。
【図８】図８は、イブプロフェン−５％リピオドールで負荷した各種ビーズから溶出したイブプロフェンの％を示している（実施例７）。
【図９】図９は、２４時間の溶出後の各種ビーズを示している。図９Ａ：ＩＢＵ−５％リピオドール負荷Bead Block、図９Ｂ：ＩＢＵ−５％リピオドール負荷Embosphere、図９Ｃ：ＩＢＵ−５％リピオドール負荷Contour SE（実施例７）。
【図１０】図１０は、リピオドールと共にパクリタキセルで負荷したBead Blockを示している。（Ａ）試料１、（Ｂ）試料２（実施例８）。
【図１１】図１１は、リピオドールなしで（Ａ）、または10％リピオドールを用いて（Ｂ）、デキサメタゾンで負荷したBead Blockを示している（実施例１０）。
【図１２】図１２Ａは、イブプロフェン−リピオドールで負荷したAmberlystを示している（実施例１１）。図１２Ｂは、イブプロフェン−リピオドールで負荷したAmberliteを示している（実施例１１）。
【図１３】図１３は、リピオドール−パクリタキセルで負荷したBead Blockからの、パクリタキセルの放出プロフィールを示している（実施例９）。
【図１４】図１４は、塞栓形成後の子宮内での、イブプロフェンビーズ（ＩＢＵ−ＢＢ）とBead Block（ＢＢ）の分布を示している（実施例１２）。
【図１５】図１５は、１週間の時点でイブプロフェンビーズ（ＩＢＵ−ＢＢ）とBead Block（ＢＢ）の周囲に観察されたリンパ球の数を示している（実施例１２）。
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月24日(2009.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非水溶性で非油溶性のポリマーの膨潤性ビーズを、ビーズに浸透可能な有機溶媒中の結晶性薬物の溶液と接触させることにより、前記薬物をビーズ中に吸収させる方法であって、前記溶液はさらに、前記薬物の結晶化を抑制する結晶改質剤を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ビーズから過剰な溶媒を除去することによって、乾燥した担持されたビーズが生産されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記乾燥した担持されたビーズが、過剰な水系保存液と接触させられることによって、平衡に達するまで膨潤し、続いて、加熱されることによって滅菌されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記結晶改質剤が、81℃を越える沸点を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記結晶改質剤が、前記有機溶媒と混和性であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記結晶改質剤が、油またはグリコールであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記結晶改質剤が、ダイズ油、ケシの実油、ヒマワリ油、およびミネラルオイルから選択される油であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記油がヨード化されていることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒が、揮発性溶媒であり、かつ90℃未満の沸点を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒が、１価のＣ１−１２脂肪族アルコールから選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液中の薬物の濃度が、1〜1000 mg/mlの範囲であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液中の結晶改質剤の濃度が、前記薬物に基づき、1〜99重量％の範囲であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマーが、陰イオンによって荷電しており、かつ、前記陰イオンは、スルホン酸基、ホスホン酸基、およびカルボン酸基から選択されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーが、架橋されたポリビニルアルコールであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、エチレン系不飽和ポリビニルアルコールマクロマーをエチレン系不飽和コモノマーと共重合させることによって形成されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビーズが、前記方法の最初の時点において、20℃にてリン酸緩衝液中で平衡に達するまで膨潤すると、平均直径が50〜1500μｍの範囲となるようなサイズを有していることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記薬物が、化学療法剤、抗炎症剤、ステロイド、および鎮痛剤から選択されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記薬物が、パクリタキセル、イブプロフェン、およびデキサメタゾンから選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
非水溶性で非油溶性のポリマーの膨潤性ビーズと、結晶性薬物と、前記薬物の結晶化を抑制する結晶改質剤とを含む組成物であって、前記薬物と前記結晶改質剤は前記ビーズ中に吸収され、前記ポリマーは架橋されたポリビニルアルコールであることを特徴とする組成物。
【請求項２０】
前記結晶改質剤が油またはグリコールであることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記結晶改質剤が、ダイズ油、ケシの実油、ヒマワリ油、およびミネラルオイルから選択される油であることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記油がヨード化されていることを特徴とする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
滅菌されており、且つ、過剰な水系保存液をさらに含み、前記水系保存液は前記ビーズと接触しており、前記ビーズは平衡に達するまで膨潤していることを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記水系保存液がリン酸緩衝液であり、前記ビーズは、平衡に達するまで膨潤すると、平均直径が50〜1500μｍの範囲となるようなサイズを有し、好ましくは、平均直径が100〜1200μｍの範囲となるようなサイズを有していることを特徴とする、請求項１９〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
前記ビーズのうちの90重量％が300μｍ以下の範囲内であることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記ポリマーが、陰イオンによって荷電しており、前記陰イオンは、スルホン酸基、ホスホン酸基、およびカルボン酸基から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ポリマーが、エチレン系不飽和ポリビニルアルコールマクロマーをエチレン系不飽和コモノマーと共重合させることによって形成されることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２８】
前記薬物が、化学療法剤、抗炎症剤、ステロイド、および鎮痛剤から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２９】
前記薬物が、パクリタキセル、イブプロフェン、およびデキサメタゾンから選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【国際調査報告】
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